(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｃ）：
（ａ）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列を有するタンパク、
（ｂ）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、グルタチオンの排出活性を有するタンパク、および
（ｃ）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、グルタチオンの排出活性を有するタンパク、
からなる群から選択されるタンパクの活性が親株より向上した酵母を培養し、
グルタチオンを培地中に生産、蓄積させる
ことを特徴とするグルタチオンの製造方法。
【請求項２】
酵母が、前記タンパクをコードする塩基配列を含むＤＮＡで親株を形質転換して得られる酵母である、
請求項１に記載のグルタチオンの製造方法。
【請求項３】
ＤＮＡが、以下の（Ａ）〜（Ｃ）：
（Ａ）配列表の配列番号２に示す塩基配列を含むＤＮＡ、
（Ｂ）配列表の配列番号２に示す塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡ、および
（Ｃ）配列表の配列番号２に示す塩基配列において１もしくは複数個の塩基が置換、欠失、挿入および／または付加されたＤＮＡ、
からなる群から選択される、
請求項２に記載のグルタチオンの製造方法。
【請求項４】
酵母が、グルタチオン分解活性が親株より低下した酵母である
請求項１〜３のいずれかに記載のグルタチオンの製造方法。
【請求項５】
グルタチオン分解活性がγ−グルタミルトランスペプチダーゼの活性である
請求項４に記載のグルタチオンの製造方法。
【請求項６】
酵母が、グルタチオン細胞取り込み活性が親株より低下した酵母である
請求項１〜５のいずれかに記載のグルタチオンの製造方法。
【請求項７】
グルタチオン細胞取り込み活性がオリゴペプチドトランスポーターの活性である
請求項６に記載のグルタチオンの製造方法。
【請求項８】
オリゴペプチドトランスポーターが以下の（ｄ）〜（ｆ）：
（ｄ）配列表の配列番号３に示すアミノ酸配列を有するタンパク、
（ｅ）配列表の配列番号３に示すアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、グルタチオン細胞取り込み活性を有するタンパク、および
（ｆ）配列表の配列番号３に示すアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、グルタチオン細胞取り込み活性を有するタンパク、
からなる群から選択される、
請求項７に記載のグルタチオンの製造方法。
【請求項９】
酵母が、γ−グルタミルシステイン合成酵素（ＧＳＨＩ）またはグルタチオン合成酵素（ＧＳＨＩＩ）の活性が親株より向上した酵母である
請求項１〜８のいずれかに記載のグルタチオンの製造方法。
【請求項１０】
以下の（Ａ）〜（Ｃ）：
（Ａ）配列表の配列番号２に示す塩基配列を含むＤＮＡ、
（Ｂ）配列表の配列番号２に示す塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡ、および
（Ｃ）配列表の配列番号２に示す塩基配列において１もしくは複数個の塩基が置換、欠失、挿入および／または付加されたＤＮＡ、
からなる群から選択されるＤＮＡにより形質転換して得られる酵母。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は酵母によるグルタチオンを製造する方法に関し、更に詳しくはグルタチオンを菌体外に生産する方法に関する。グルタチオンは、食品、医薬品又は化粧品として有用である。
【背景技術】
【０００２】
グルタチオンは、システイン、グルタミン酸、及びグリシンの３つのアミノ酸から成るペプチドで、人体だけでなく、他の多くの動物や植物、微生物などの生体内に存在し、活性酸素の消去作用、解毒作用、アミノ酸の代謝など、生体にとって重要な化合物である。そのため医薬品、食品、化粧品産業で注目されている。また、近年、グルタチオンに植物の生長を促進する効果があることの知見も得られるなど、農業を含めたさまざまな分野での用途が期待されている。
【０００３】
グルタチオンは、現在工業的には、酵母を用いた発酵法により生産されている。グルタチオンは酵母の細胞内に蓄積されるため、実際には、酵母を培養し、その菌体中からグルタチオンを抽出する方法が広く用いられている。それ故に、これまで、グルタチオン生産に使用する酵母への突然変異処理（特許文献１〜３）やグルタチオンの合成に関与する酵素を遺伝子組換えにより導入すること（特許文献４〜８）、また、培地中にグルタチオンを構成する３種のアミノ酸であるＬ−グルタミン酸、Ｌ−システイン、グリシンを添加することにより、培養菌体中のグルタチオン含量を向上させてグルタチオン生産性を向上させる試みがなされてきた。しかし、菌体内のグルタチオン含量に限りがあり、また培地中の菌体濃度にも限りがあるため、発酵法では培地液量あたりのグルタチオン生産量は十分ではなかった。
【０００４】
一方、微生物菌体を界面活性剤、有機溶剤、細胞壁溶解酵素などで処理して細胞膜の透過性を高め、その処理菌体をグルタチオンの構成成分であるグルタミン酸、システイン、グリシンと接触させることにより、菌体外にグルタチオンが生産されることが報告されている（特許文献９〜１２）。しかしながら、これらの方法において界面活性剤のみの処理ではグルタチオンの生産量は満足のいくものではなく（特許文献１０）、また高価なアデノシン−５’−３リン酸（ＡＴＰ）（特許文献９，１２）や細胞壁溶解酵素（特許文献１１）を界面活性剤とともに使用する方法は、生産コストがアップし、いずれの方法も工業的には実施しうるものではなかった。
【０００５】
このような背景のもと、菌体外にグルタチオンを生産する方法において、簡便で安価にその生産性を向上させる方法の開発が待望されていた。大腸菌にて、グルタチオンを細胞外に排出する活性を有するタンパク（トランスポーター）が報告されているが（特許文献１３）、酵母においては、そのようなグルタチオンのトランスポーターは報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開昭５９−１５１８９４号公報
【特許文献２】特開平０３−１８８７２号公報
【特許文献３】特開平１０−１９１９６３号公報
【特許文献４】特開昭６１−５２２９９号公報
【特許文献５】特開昭６２−２７５６８５号公報
【特許文献６】特開昭６３−１２９９８５号公報
【特許文献７】特開昭６４−５１０９８号公報
【特許文献８】特開平４−１７９４８４号公報
【特許文献９】特開昭５１−１４４７８９号公報
【特許文献１０】特開昭５３−９４０８９号公報
【特許文献１１】特開昭５３−９４０９０号公報
【特許文献１２】特開昭６０−２７３９６号公報
【特許文献１３】ＷＯ２００８／１２６７８４
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】熊谷英彦：化学と生物，２４，１３５，（１９８６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、効率のよいグルタチオンの製造方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上述の課題を解決すべく本発明者らが鋭意検討した結果、酵母においてグルタチオンを菌体外に排出する活性を有するタンパク（トランスポーター）を見出し、これを強発現させることで、グルタチオンを菌体外に高濃度で生産できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【００１０】
即ち、本発明の方法は、以下の通りである。
以下の（ａ）〜（ｃ）：
（ａ）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列を有するタンパク、
（ｂ）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、グルタチオンの排出活性を有するタンパク、および
（ｃ）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、グルタチオンの排出活性を有するタンパク、
からなる群から選択されるタンパクの活性が親株より向上した微生物を培養し、
グルタチオンを培地中に生産、蓄積させる
ことを特徴とするグルタチオンの製造方法。
【００１１】
微生物が、前記タンパクをコードする塩基配列を含むＤＮＡで親株を形質転換して得られる微生物であることが好ましい。
【００１２】
ＤＮＡが、以下の（Ａ）〜（Ｃ）：
（Ａ）配列表の配列番号２に示す塩基配列を含むＤＮＡ、
（Ｂ）配列表の配列番号２に示す塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、および
（Ｃ）配列表の配列番号２に示す塩基配列において１もしくは複数個の塩基が置換、欠失、挿入および／または付加されたＤＮＡ、
からなる群から選択されることが好ましい。
【００１３】
微生物が、グルタチオン分解活性が親株より低下した微生物であることが好ましい。
【００１４】
グルタチオン分解活性がγ−グルタミルトランスペプチダーゼの活性であることが好ましい。
【００１５】
微生物が、グルタチオン細胞取り込み活性が親株より低下した微生物であることが好ましい。
【００１６】
グルタチオン細胞取り込み活性がオリゴペプチドトランスポーターの活性であることが好ましい。
【００１７】
オリゴペプチドトランスポーターが以下の（ｄ）〜（ｆ）：
（ｄ）配列表の配列番号３に示すアミノ酸配列を有するタンパク、
（ｅ）配列表の配列番号３に示すアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、グルタチオン細胞取り込み活性を有するタンパク、および
（ｆ）配列表の配列番号３に示すアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、グルタチオン細胞取り込み活性を有するタンパク、
からなる群から選択されることが好ましい。
【００１８】
微生物が、γ−グルタミルシステイン合成酵素（ＧＳＨＩ）またはグルタチオン合成酵素（ＧＳＨＩＩ）の活性が親株より向上した微生物であることが好ましい。
【００１９】
また、本発明は、
以下の（Ａ）〜（Ｃ）：
（Ａ）配列表の配列番号２に示す塩基配列を含むＤＮＡ、
（Ｂ）配列表の配列番号２に示す塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、および
（Ｃ）配列表の配列番号２に示す塩基配列において１もしくは複数個の塩基が置換、欠失、挿入および／または付加されたＤＮＡ、
からなる群から選択されるＤＮＡにより形質転換して得られる形質転換体に関する。
【発明の効果】
【００２０】
本発明の方法によれば、界面活性剤などの処理をせず、また高価なＡＴＰや細胞壁分解酵素を使用することなく、グルタチオンを菌体外に効率よく生産することが可能となる。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本発明の方法を詳細に説明する。
本発明のグルタチオンの製造方法は、グルタチオンの生産能を有する微生物菌体を用いてグルタチオンを微生物菌体外に生産する場合に、該微生物としてグルタチオンの排出活性が向上した微生物を使用する方法である。
【００２２】
グルタチオンの排出活性が向上した微生物としては、親株と比較してグルタチオンの排出活性を有するタンパクの活性が向上していればよく、特に限定されないが、例えば、グルタチオンの排出活性が向上するように改変された株が挙げられる。
【００２３】
本発明における微生物は、グルタチオンの生産能を有する微生物であり、グルタチオンの排出活性が向上した菌株であれば、特に制限はなく、例えば、酵母、細菌が挙げられ、酵母としてはサッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、サッカロマイセス・カールスベルゲンシス(Saccharomyces carlesbergensis)、サッカロマイセス・フラギリス(Saccharomyces fragilis)、サッカロマイセス・ルーキシー(Saccharomyces rouxii)などのサッカロマイセス属、キャンディダ・ユーティリス(Candida utilis)、キャンデ
ィダ・トロピカリス(Candida tropicalis)などのキャンディダ属、シゾサッカロマオセス・ポンべ(Schizosaccaromyces pombe)などのシゾサッカロミセス属、トルロプシス・バーサティリス(Toluropsis versatilis)、トルロプシス・ペトロフィラム(Toluropsis petrophilum)などのトルロプシス属、その他（Pichia）属、ブレタノマイセス(Brettanomyces)属、マイコトルラ(Mycotorula)属、ロードトルラ(Rhodotorula)属、ハンゼニュラ(Hansenula)属、エンドマイセス(Endomyces)属などの酵母が挙げられ、細菌としては大腸菌(Escherichia coli)が挙げられる。これら微生物の野生株、突然変異処理や遺伝子操作によりグルタチオンの合成に関与する酵素活性が高められた改良株を使用することができる。中でも本発明者らの検討結果によればサッカロマイセス属のサッカロマイセス・セレビシエ、キャンディダ属のキャンディダ・ユーティリスが好ましい。
【００２４】
グルタチオンの排出活性を有するタンパクとしては、
（ａ）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列を有するタンパク、
（ｂ）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、グルタチオンの排出活性を有するタンパク、
（ｃ）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、グルタチオンの排出活性を有するタンパク、
などが挙げられる。なお、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列は、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の酵素ＡＤＰ１に由来する。
【００２５】
配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を有するタンパクは、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  １９８９）」等に記載の公知の方法に準じて調製することができ、グルタチオンを細胞外に排出する活性を有する限り上記タンパクに包含される。
【００２６】
置換、欠失、挿入および／または付加により改変されたアミノ酸配列としては、１種類のタイプ（例えば置換）の改変のみを含むものであっても良いし、２種以上の改変（例えば、置換と挿入）を含んでいても良い。また、置換の場合には、置換するアミノ酸は、置換前のアミノ酸と類似の性質を有するアミノ酸（同族アミノ酸）であることが好ましい。ここでは、以下に挙げる各群の同一群内のアミノ酸を同族アミノ酸とする。
（第１群：中性非極性アミノ酸）Ｇｌｙ，Ａｌａ，Ｖａｌ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｍｅｔ，Ｃｙｓ，Ｐｒｏ，Ｐｈｅ
（第２群：中性極性アミノ酸）Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｇｌｎ，Ａｓｎ，Ｔｒｐ，Ｔｙｒ
（第３群：酸性アミノ酸）Ｇｌｕ，Ａｓｐ
（第４群：塩基性アミノ酸）Ｈｉｓ，Ｌｙｓ，Ａｒｇ。
【００２７】
上記の記載で複数個のアミノ酸とは、例えば、６０個、好ましくは２０個、より好ましくは１５個、さらに好ましくは１０個、さらにより好ましくは５個、４個、３個、または２個以下のアミノ酸を意味する。
【００２８】
配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列との配列同一性は、６０％以上が好ましいが、７０％以上がより好ましく、８０％以上がさらに好ましく、８５％以上がさらにより好ましく、９０％以上が特に好ましく、９５％以上が最も好ましい。
【００２９】
アミノ酸配列の配列同一性は、配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列と評価したいアミノ酸配列とを比較し、両方の配列でアミノ酸が一致した位置の数を比較総アミノ酸数で除して、さらに１００を乗じた値で表される。
【００３０】
グルタチオンを細胞外に排出する活性を有する限り、配列番号１に記載のアミノ酸配列に、付加的なアミノ酸配列を結合することができる。また、他のタンパク質との融合タンパク質とすることもできる。また、グルタチオンを細胞外に排出する活性を有する限り、ペプチド断片であってもよい。
【００３１】
グルタチオンの排出活性が向上するように改変された株は、ＵＶ、エチルメタンスルフォン酸、ニトロソグアニジン、或いはその他放射線等通常変異操作に使われる変異誘発剤による変異処理により得ることが可能であり、また、遺伝子操作的手法で得ることが可能である。例えば、上記（ａ）〜（ｃ）のいずれか記載のグルタチオンを細胞外に排出する活性を有するタンパクをコードする塩基配列からなるＤＮＡをベクターＤＮＡにクローニングした発現ベクターなどを用いて強発現させる方法、または酵素活性が向上するような変異を有する遺伝子を含むＤＮＡを用いた遺伝子置換方法により取得することができる。強発現させる方法として、例えば、グルタチオンの排出活性を有するタンパクをコードする塩基配列を含むＤＮＡで、親株を形質転換して得られる微生物が挙げられる。
【００３２】
グルタチオンを細胞外に排出する活性を有するタンパクをコードする塩基配列からなるＤＮＡとしては、
（Ａ）配列表の配列番号２に示す塩基配列を含むＤＮＡ、
（Ｂ）配列表の配列番号２に示す塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、
（Ｃ）配列表の配列番号２に示す塩基配列において１もしくは複数個の塩基が置換、欠失、挿入および／または付加されたＤＮＡ、
などが挙げられる。なお、配列表の配列番号２に示す塩基配列は、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の酵素ＡＤＰ１をコードする遺伝子に由来する。
【００３３】
ここで、配列表の配列番号２に示す塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとは、配列表の配列番号２に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡをプローブとして、ストリンジェントな条件下にコロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、あるいはサザンハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味する。
【００３４】
ハイブリダイゼーションは、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，  ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８９）」等に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、ストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡとは、例えば、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃の条件下でフィルターを洗浄することにより取得できるＤＮＡをあげることができる。好ましくは６５℃で１倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄、より好ましくは６５℃で０．５倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄、さらに好ましくは６５℃で０．２倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄、最も好ましくは６５℃で０．１倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄することにより取得できるＤＮＡである。
【００３５】
以上のようにハイブリダイゼーション条件を記載したが、ハイブリダイゼーション条件はこれらの条件に特に制限されない。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで最適なストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００３６】
上記の条件にてハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、配列番号２に示されるＤＮＡとの配列同一性が７０％以上、好ましくは７４％以上、より好ましくは７９％以上、さらに好ましくは８５％以上、さらにより好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上のＤＮＡをあげることができ、コードされるポリペプチドが、上記のグルタチオン排出活性を有する限り、上記ＤＮＡに包含される。
【００３７】
ここで、ＤＮＡの配列同一性（％）とは、対比される２つのＤＮＡを最適に整列させ、核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＩ）が両方の配列で一致した位置の数を比較塩基総数で除し、そして、この結果に１００を乗じた数値で表される。
【００３８】
ＤＮＡの配列同一性は、例えば、以下の配列分析用ツールを用いて算出し得る：ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ（Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  Ｔｈｅ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ，  Ｖｅｒｓｉｏｎ８，  １９９４年９月，  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，  ５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ  Ｍｅｄｉｓｏｎ，  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，  ＵＳＡ  ５３７１１；  Ｒｉｃｅ，  Ｐ．  （１９９６）  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  ＥＧＣＧ  Ｐａｃｋａｇｅ，  Ｐｅｔｅｒ  Ｒｉｃｅ，  Ｔｈｅ  Ｓａｎｇｅｒ  Ｃｅｎｔｒｅ，  Ｈｉｎｘｔｏｎ  Ｈａｌｌ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  ＣＢ１０  １ＲＱ，  Ｅｎｇｌａｎｄ）、および、ｔｈｅ．ｅ．ｘＰＡＳｙ  Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂ分子生物学用サーバー（Ｇｅｎｅｖａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ａｎｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｖａ，  Ｇｅｎｅｖａ，  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）。
【００３９】
ここで、配列表の配列番号２に示す塩基配列において１もしくは複数個の塩基が置換、欠失、挿入および／または付加されたＤＮＡとは、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  １９８９）」等に記載の公知の方法に準じて調製することができる。
【００４０】
置換、挿入、欠失および／または付加により改変された塩基配列としては、１種類のタイプ（例えば置換）の改変のみを含むものであっても良いし、２種類以上の改変（例えば、置換と挿入）を含んでいても良い。
【００４１】
上記の記載の複数個の塩基とは例えば１５０個、好ましくは１００個、より好ましくは５０個、さらに好ましくは２０個、さらにより好ましくは１０個、５個、４個、３個、または２個以下の塩基、を意味する。
【００４２】
本発明の実施形態のＤＮＡを宿主微生物内に導入して発現させるために用いるベクターＤＮＡとしては、適切な宿主微生物内で該ＤＮＡがコードする遺伝子を発現できるものであればいずれでもよい。このようなベクターＤＮＡとしては、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベクターなどが挙げられる。また、他の宿主株との間での遺伝子交換が可能なシャトルベクターも使用され得る。このようなベクターは、作動可能に連結されたプロモーターなどの等の制御因子を含み、制御因子とは、機能的プロモーターおよび、任意の関連する転写要素（例えばエンハンサー、ＣＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス、ＳＰＩ部位など）を有する塩基配列をいう。  また、作動可能に連結とは、遺伝子の発現を調節するプロモーター、エンハンサー等の種々の調節エレメントと遺伝子が、宿主細胞中で作動し得る状態で連結されることをいう。制御因子のタイプおよび種類が、宿主に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。
【００４３】
各種生物において利用可能なベクター、プロモーター等に関しては、「微生物学基礎講座８遺伝子工学（共立出版、１９８７）」などに詳細に記述されている。
【００４４】
グルタチオンの排出活性が向上するように改変された株を遺伝子操作的手法で取得する方法の具体的な一例を以下に示す。宿主微生物のゲノム配列のうち、ＡＤＰ１をコードしている遺伝子配列の上流領域と相同な配列に制限酵素Ａの切断配列を付加した配列をもつＤＮＡ−Ｆ２を合成する。一方で、ＡＤＰ１をコードしている遺伝子配列の下流領域と相同な配列に制限酵素Ｂの切断配列を付加した配列をもつＤＮＡ−Ｒ２を合成する。次に、宿主微生物のゲノムＤＮＡをテンプレートとして、ＤＮＡ−Ｆ２およびＤＮＡ−Ｒ２をプライマーとして、ＰＣＲ増幅を行い、増幅されたＤＮＡを制限酵素Ａおよび制限酵素Ｂで切断し、同様に制限酵素Ａおよび制限酵素Ｂで切断された、選択マーカーをもつベクターに連結して発現用プラスミドを作製し、宿主微生物に導入する。ＤＮＡの導入の方法には、形質転換、形質導入、トランスフェクション、コトランスフェクション、エレクトロポレーションなどの方法があり、具体的には、酢酸リチウムを用いる形質転換方法、プロトプラスト法などがある。ＡＤＰ１遺伝子と選択マーカー遺伝子で形質転換された株は、当該マーカー化合物を含まない選択培地プレートにて、コロニーを形成させることで選抜することができる。
【００４５】
また、グルタチオンの排出活性が向上されるように改変された株は、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）、ＵＶ照射などの通常の変異処理によって取得することもできる。
【００４６】
さらに本発明においては、好ましい実施態様として、グルタチオンの細胞取り込み活性あるいは分解活性が、消失または低下した株において、グルタチオンの排出活性を向上させることで、グルタチオンの菌体外での生産性を向上させることができる。グルタチオンの細胞取り込み活性あるいは分解活性が、消失または低下した株としては、親株と比較してグルタチオンの細胞取り込み活性あるいは分解活性が低下していればよく、特に限定されないが、例えば、グルタチオンの細胞取り込み活性あるいは分解活性が低下または消失されるように改変された株が挙げられる。
【００４７】
グルタチオンの細胞取り込み活性を示すタンパクとして、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅには、グルタチオンに対する親和性の高いグルタチオントランスポーター（ＧＳＨ−Ｐ１；Ｋｍ＝４５μＭ）と、親和性の低いグルタチオントランスポーター（ＧＳＨ−Ｐ２；Ｋｍ＞２ｍＭ）の２つの存在が示唆されている（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９８）６２：１８５８−１８６４）。また、実際にオリゴペプチドトランスポーター１（遺伝子はＯＰＴ１、ＨＧＴ１あるいはＧＳＨ１１と呼ばれる）がクローニングされ、グルタチオンに対して高い親和性（Ｋｍ＝４５μＭ）と取り込み活性を有することが示された（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２０００）２７５：１３２５９−１３２６５）。しかしながら、ＧＳＨ−Ｐ１とＯＰＴ１遺伝子産物との関連性はこれまでのところ不明である（ＦＥＭＳ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｓ. （２００２）２：２９５―３０５）。
【００４８】
本発明におけるオリゴペプチドトランスポーターは、以下の（ｄ）〜（ｆ）：
（ｄ）配列表の配列番号３に示すアミノ酸配列を有するタンパク、
（ｅ）配列表の配列番号３に示すアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、グルタチオン細胞取り込み活性を有するタンパク、
（ｆ）配列表の配列番号３に示すアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、グルタチオン細胞取り込み活性を有するタンパク、
のいずれかであることが好ましい。
【００４９】
上記の記載で複数個のアミノ酸とは、例えば、６０個、好ましくは２０個、より好ましくは１５個、さらに好ましくは１０個、さらにより好ましくは４個、３個、２個以下のアミノ酸を意味する。
【００５０】
配列表の配列番号３に示すアミノ酸配列との配列同一性は、６０％以上が好ましいが、７０％以上がより好ましく、８０％以上がさらに好ましく、８５％以上がさらにより好ましく、９０％以上が特に好ましく、９５％以上が最も好ましい。
【００５１】
グルタチオンの分解活性を示すタンパクは、特に限定されないが、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．（２００１）３５９：６３１−６３７）であることが好ましい。
【００５２】
本発明におけるγ−グルタミルトランスペプチダーゼは、特に限定されないが、例えば、以下の（ｇ）〜（ｉ）：
（ｇ）配列表の配列番号８に示すアミノ酸配列を有するタンパク、
（ｈ）配列表の配列番号８に示すアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、グルタチオン分解活性を有するタンパク、
（ｉ）配列表の配列番号８に示すアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、グルタチオン分解活性を有するタンパク、
のいずれかであることが好ましい。
【００５３】
上記の記載で複数個のアミノ酸とは、例えば、６０個、好ましくは２０個、より好ましくは１５個、さらに好ましくは１０個、さらにより好ましくは４個、３個、２個以下のアミノ酸を意味する。
【００５４】
配列表の配列番号８に示すアミノ酸配列との配列同一性は、６０％以上が好ましいが、７０％以上がより好ましく、８０％以上がさらに好ましく、８５％以上がさらにより好ましく、９０％以上が特に好ましく、９５％以上が最も好ましい。
【００５５】
グルタチオンの細胞取り込み活性あるいは分解活性が低下または消失するように改変された株は、ＵＶ、エチルメタンスルフォン酸、ニトロソグアニジン、或いはその他放射線等通常変異操作に使われる変異誘発剤による変異処理により得ることが可能であり、また、遺伝子操作的手法で得ることが可能である。例えば、オリゴペプチドトランスポーター１遺伝子（ＯＰＴ１遺伝子）あるいはγ−グルタミルトランスペプチダーゼ遺伝子（ＣＩＳ２遺伝子）の部分配列を欠失し、正常に機能する酵素を産生しないように改変した遺伝子、または酵素活性が低下するような変異を有する遺伝子を含むＤＮＡを用いた遺伝子置換により取得することができる。
【００５６】
グルタチオンの細胞取り込み活性あるいは分解活性が低下または消失するように改変された株の遺伝子操作的手法による取得法の具体的な一例を以下に示す。宿主微生物のゲノム配列のうち、ＯＰＴ１あるいはＣＩＳ２をコードしている遺伝子配列の上流領域と相同な配列および選択マーカー遺伝子の５’領域と相同な配列を結合させたＤＮＡ−Ｆ１を合成する。一方で、ＯＰＴ１あるいはＣＩＳ２をコードしている遺伝子配列の下流領域と相同な配列および選択マーカー遺伝子の３’領域と相同な配列を結合させたＤＮＡ−Ｒ１を合成する。次に、選択マーカー遺伝子を含むプラスミドをテンプレートとし、ＤＮＡ−Ｆ１およびＤＮＡ−Ｒ１をプライマーとして、ＰＣＲ増幅を行い、増幅されたＤＮＡを宿主微生物に導入する。ＤＮＡの導入の方法には、形質転換、形質導入、トランスフェクション、コトランスフェクション、エレクトロポレーションなどの方法があり、具体的には、酢酸リチウムを用いる形質転換方法、プロトプラスト法などがある。ＯＰＴ１遺伝子あるいはＣＩＳ２遺伝子と選択マーカー遺伝子が組み換わった目的の遺伝子組み換え株は、当該マーカー化合物を含まない選択培地プレートにて、コロニーを形成させることで選抜することができる。
【００５７】
さらに本発明においては、別の好ましい実施態様として、グルタチオンの合成活性が増加した株において、グルタチオンの排出活性を向上させることで、グルタチオンの菌体外での生産性を向上させることができる。グルタチオン合成活性が増加した株としては、親株と比較してグルタチオンの合成活性が増加していればよく、特に限定されないが、例えば、グルタチオンの合成活性が増加されるように改変された株が挙げられる。
【００５８】
グルタチオン合成活性を有するタンパクは、特に限定されないが、γ−グルタミルシステイン合成酵素（ＧＳＨＩ）、又はグルタチオン合成酵素（ＧＳＨＩＩ）であることが好ましい。
【００５９】
本発明におけるγ−グルタミルシステイン合成酵素は、特に限定されないが、例えば、以下の（ｊ）〜（ｌ）：
（ｊ）配列表の配列番号９に示すアミノ酸配列を有するタンパク、
（ｋ）配列表の配列番号９に示すアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、グルタチオン合成活性を有するタンパク、
（ｌ）配列表の配列番号９に示すアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、グルタチオン合成活性を有するタンパク、
のいずれかであることが好ましい。
【００６０】
本発明におけるグルタチオン合成酵素は、特に限定されないが、例えば、以下の（ｍ）〜（ｏ）：
（ｍ）配列表の配列番号１０に示すアミノ酸配列を有するタンパク、
（ｎ）配列表の配列番号１０に示すアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、グルタチオン合成活性を有するタンパク、
（ｏ）配列表の配列番号１０に示すアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、グルタチオン合成活性を有するタンパク、
のいずれかであることが好ましい。
【００６１】
上記の記載で複数個のアミノ酸とは、例えば、６０個、好ましくは２０個、より好ましくは１５個、さらに好ましくは１０個、さらにより好ましくは４個、３個、２個以下のアミノ酸を意味する。
【００６２】
配列表の配列番号９或いは１０に示すアミノ酸配列との配列同一性は、６０％以上が好ましいが、７０％以上がより好ましく、８０％以上がさらに好ましく、８５％以上がさらにより好ましく、９０％以上が特に好ましく、９５％以上が最も好ましい。
【００６３】
グルタチオンの合成活性が向上するように改変された株の遺伝子操作的手法による取得法の具体的な一例を以下に示す。宿主微生物のゲノム配列のうち、γ−グルタミルシステイン合成酵素（ＧＳＨＩ）および／またはグルタチオン合成酵素（ＧＳＨＩＩ）をコードしている遺伝子配列の上流領域と相同な配列に制限酵素Ｃの切断配列を付加した配列をもつＤＮＡ−ＦＧを合成する。一方で、γ−グルタミルシステイン合成酵素および／またはグルタチオン合成酵素をコードしている遺伝子配列の下流領域と相同な配列に制限酵素Ｄの切断配列を付加した配列をもつＤＮＡ−ＲＧを合成する。次に、宿主微生物のゲノムＤＮＡをテンプレートとして、ＤＮＡ−ＦＧおよびＤＮＡ−ＲＧをプライマーとして、ＰＣＲ増幅を行い、増幅されたＤＮＡを制限酵素Ｃおよび制限酵素Ｄで切断し、同様に制限酵素Ｃおよび制限酵素Ｄで切断された選択マーカーをもつベクターに連結したプラスミドを作製し、宿主微生物に導入する。ＤＮＡの導入の方法には、形質転換、形質導入、トランスフェクション、コトランスフェクション、エレクトロポレーションなどの方法があり、具体的には、酢酸リチウムを用いる形質転換方法、プロトプラスト法などがある。γ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子および／またはグルタチオン合成酵素遺伝子と選択マーカー遺伝子が形質転換された株は、当該マーカー化合物を含まない選択培地プレートにて、コロニーを形成させることで選抜することができる。
【００６４】
また、グルタチオンの合成活性が向上されるように改変された株は、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）、ＵＶ照射などの通常の変異処理によって取得することもできる。
【００６５】
グルタチオンの排出活性が向上した微生物の培養は、通常の微生物の培養と同様に行えばよい。すなわち炭素源、窒素源、無機物その他の栄養等をほどよく含有しておれば、合成培地、半合成培地、天然（複合）培地のいずれも使用可能である。
【００６６】
炭素源としてはグルコース、グリセロール、フラクトース、シュクロース、マルトース、マンノース、マニトール、キシロース、ガラクトース、デンプン、デンプン加水分解物液、糖蜜などの種々の炭水化物原料が使用できる。またピルビン酸、酢酸、乳酸などの各種有機酸、アスパラギン酸、アラニンなどの各種アミノ酸類も使用可能である。
【００６７】
窒素源としてはアンモニアあるいは塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウムなどの各種の無機および有機アンモニウム塩類、あるいは尿素その他の窒素含有化合物ならびにペプトン、ＮＺアミン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物、フィッシュミールあるいはその消化物、脱脂大豆あるいはその消化物や加水分解物などの窒素性有機物質あるいはアスパラギン酸、グルタミン酸、スレオニンなどの各種アミノ酸が使用可能である。
【００６８】
更に無機物としてはリン酸第一水素カリウム、リン酸第二水素カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、炭酸カルシウムなどが使用できる。
【００６９】
培養は振盪培養、通気攪拌深部培養などの好気的培養条件下で実施する。培養時ｐＨは、好ましくは３．０〜８．０、より好ましくは４．０〜６．０、最も好ましくは５．０に制御される。ｐＨ制御の中和剤としてはアンモニア水、水酸化ナトリウム、炭酸アンモニウムなどが使用可能である。好気的培養時の培地への空気供給量は、培地１Ｌに対し、好ましくは０．２Ｌ／分以上、より好ましくは０．５Ｌ／分以上、さらに好ましくは１Ｌ／分以上である。また、総容量２Ｌのジャーファーメンターを使用して培養する場合、好気的培養条件としては上記通気量に加え、攪拌数は好ましくは２００ｒｐｍ以上、より好ましくは３００ｒｐｍ以上、さらに好ましくは４００ｒｐｍ以上である。また、培養時の温度は、好ましくは２０〜４５℃、より好ましくは２５〜３５℃、さらに好ましくは２８〜３２℃である。培地中への初期細胞濃度（仕込み濃度）は酵母の種類、培地組成などにより異なるが、初発濁度（ＯＤ６００）は好ましくは０．０１〜２．０、より好ましくは０．０２〜１．０、さらに好ましくは０．１〜０．４である。グルコースなどの上記炭素源に関しては培養初期に一括に仕込んで培養する回分方式、培養期間を通じて少しずつ添加する半回分方式のいずれの方式も適用可能であるが、本発明者らの検討結果によれば、使用する微生物にもよるが、半回分方式の方が増殖速度が向上し、最終菌濃度もより高位となり、菌体内のグルタチオン合成関連酵素の活性も高まるのでより好ましい。半回分方式でグルコースなどの炭素源の流加速度を決定する指標としては培養液の濁度、酸素消費速度、二酸化炭素発生速度、ｐＨ調整用中和剤の消費量などが有効利用でき、使用する酵母に合わせて適切な指標を選び、その変化に対応させて炭素源の流加速度を変化させることにより、酵母培養の最適化が図れ、最終菌濃度およびグルタチオン合成関連酵素の活性向上、その結果グルタチオンの生産性向上が実現できる。
【００７０】
グルタチオンの排出活性が向上した微生物を培養することにより、グルタチオンを培地中に生産、蓄積させることができる。このように、培地中に生産されたグルタチオンを含む培養液からは、通常の方法でグルタチオンを含有する溶液を得ることができる。例えば、培養液から濾過や遠心分離により菌体を除去することによりグルタチオンを含有する溶液を得ることができる。また、培養液に対し、熱水抽出、アルカリ抽出法、酵素分解法、自己消化法、物理的な破砕操作などを行うことにより、菌体内に存在するグルタチオンを抽出することもできる。これらの方法を組み合わせることで、菌体内外に生産されたグルタチオンを含有する液体を得ることができる。さらに、得られたグルタチオンを含有する溶液から、通常の方法、例えば銅塩沈殿、またはイオン交換樹脂を用いたクロマトグラフィ―などの手法で精製することにより、グルタチオンを高濃度に含有する分画を得ることができる。また、グルタチオンを含有する分画から、真空凍結乾燥、スプレードライ、ドラムドライなどの手法によりグルタチオン粉末を得ることができ、さらにアルコール沈殿操作等を必要に応じて数回繰り返すことにより、高純度の精製グルタチオン粉末を得ることができる。
【実施例】
【００７１】
［製造例１］ＡＤＰ１の発現を強化した株の作製
Ｐｕｔａｔｉｖｅ ＡＴＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｅｒｍｅａｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ＡＢＣ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ遺伝子 (ＡＤＰ１)をＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＹＰＨ４９９株のゲノムＤＮＡをテンプレートとし、プライマーとして、５’−ＧＧＣＣＧＣＴＡＧＣＡＴＧＧＧＡＡＧＴＣＡＴＣＧＡＣＧＴＴＡＴＣ−３’（配列番号４）および５’−ＧＧＣＣＧＴＣＧＡＣＣＴＡＣＴＴＴＴＧＴＴＣＣＡＣＡＡＣＴＡＴＣＣ−３’（配列番号５)を用いてＰＣＲ増幅を行い、増幅物をＮｈｅIおよびＳａｌＩで消化して、配列表の配列番号２に示す塩基配列を含む、ＡＤＰ１遺伝子ＮｈｅＩ−ＳａｌＩ断片を得た。この断片を文献（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２００９）１４５：７０１−７０８）に記載のｐＧＫ４０５のＮｈｅＩ−ＳａｌＩ消化部位に連結し、ＡＤＰ１発現プラスミドｐＧＫ４０５−ＡＤＰ１を得た。得られたプラスミドｐＧＫ４０５−ＡＤＰ１を制限酵素ＫａｓＩで消化した。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＹＰＨ４９９株を宿主酵母株とし、形質転換を行い、形質転換体ＹＰＨ４９９／ｐＧＫ４０５−ＡＤＰ１株を得た。
【００７２】
［製造例２］ＡＤＰ１増強＋ＯＰＴ１破壊＋ＣＩＳ２破壊株の作製
ＹＰＨ４９９株のゲノム配列のうち、γＧＴＰをコードしている遺伝子配列ＣＩＳ２の上流領域５０塩基と相同な配列およびＨＩＳ３遺伝子の開始コドンから２５塩基と相同な配列を結合させたＤＮＡ−ＦＨを合成する。一方で、ＣＩＳ２遺伝子配列の下流領域５０塩基と相同な配列およびＨＩＳ３遺伝子の終止コドンから２５塩基と相同な配列を結合させたＤＮＡ−ＲＨを合成する。次に、ＨＩＳ３遺伝子を含むプラスミドをテンプレートとし、ＤＮＡ−ＦＨおよびＤＮＡ−ＲＨをプライマーとして、ＰＣＲ増幅を行い、増幅されたＤＮＡを酢酸リチウムを用いた形質転換方法によりＹＰＨ４９９株に導入し、組換え酵母ＹＰＨ４９９／ΔγＧＴＰ株を得た。さらに、ＹＰＨ４９９株のゲノム配列のうち、グルタチオンの取り込みトランスポーターをコードしている遺伝子配列ＯＰＴ１の上流領域５０塩基と相同な配列およびＵＲＡ３遺伝子の開始コドンから２５塩基と相同な配列を結合させたＤＮＡ−ＦＵを合成する。一方で、ＯＰＴ１遺伝子配列の下流領域５０塩基と相同な配列およびＵＲＡ３遺伝子の終止コドンから２５塩基と相同な配列を結合させたＤＮＡ−ＲＵを合成する。次に、ＵＲＡ３遺伝子を含むプラスミドをテンプレートとし、ＤＮＡ−ＦＵおよびＤＮＡ−ＲＵをプライマーとして、ＰＣＲ増幅を行い、増幅されたＤＮＡをＹＰＨ４９９／ΔγＧＴＰ株に導入した。この結果、組換え酵母ＹＰＨ４９９／ΔγＧＴＰ、ΔＯＰＴ１株を得た。ＯＰＴ１遺伝子とＵＲＡ３遺伝子が組み換わった目的の遺伝子組み換え株は、ウラシルを含まない選択培地プレートにて、コロニーを形成させることで選抜することができる。
【００７３】
また、製造例１で取得したｐＧＫ４０５−ＡＤＰ１を制限酵素ＫａｓＩで消化し、ＹＰＨ４９９／ΔγＧＴＰ、ΔＯＰＴ１株を宿主酵母株とし、形質転換を行い、形質転換体ＹＰＨ４９９／ＡＤＰ１、ΔγＧＴＰ、ΔＯＰＴ１株を得た。
【００７４】
［製造例３］ＡＤＰ１増強＋ＯＰＴ１破壊＋ＣＩＳ２破壊＋ＧＳＨＩ増強＋ＧＳＨＩＩ増強株の作製
ＹＰＨ４９９株のゲノム配列のうち、γ−グルタミルシステイン合成酵素およびグルタチオン合成酵素をコードしている遺伝子配列ＧＳＨＩおよびＧＳＨＩＩの上流領域２５塩基と相同な配列ＤＮＡ−ＦＧ１およびＤＮＡ−ＦＧ２を合成した。一方で、ＧＳＨＩおよびＧＳＨＩＩ遺伝子配列終止コドンから２５塩基と相同な配列ＤＮＡ−ＲＧ１およびＤＮＡ−ＲＧ２を合成した。次に、ＹＰＨ４９９株のゲノムからクローニングしたＧＳＨＩ遺伝子を含むプラスミドｐＧＫ４０２−ＧＣＳ（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１１）８９：１４１７−１４２２）をＫｐｎＩおよびＳａｃＩで消化して、ＧＳＨＩ遺伝子ＫｐｎＩ−ＳａｃＩ断片を得た。この断片をタカラバイオ社製のｐＡＵＲ１０１のＫｐｎＩ−ＳａｃＩ消化部位に連結し、ｐＡＵＲ１０１−ＧＳＨＩを得た。次に、ＹＰＨ４９９株のゲノムからクローニングしたＧＳＨＩＩ遺伝子を含むプラスミドｐＧＫ４０５−ＧＳ（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１１）８９：１４１７−１４２２）をテンプレートにして、５’−ＧＧＣＣＧＣＴＡＧＣＡＧＣＴＴＴＡＡＣＧＣＡＧＡＡＴ−３’（配列番号６）および５’−ＧＧＣＣＧＣＡＴＧＣＧＧＧＴＡＣＣＧＧＧＣＣＣＣＣＣＣＴＣＧＡＧＡＡＡＧ−３’（配列番号７）を用いてＰＣＲ増幅を行い、増幅物をＳｐｈＩで消化して、ＧＳＨＩＩ遺伝子ＳｐｈＩ断片を得た。この断片をｐＡＵＲ１０１―ＧＳＨＩのＳｐｈＩ消化部位に連結し、ＧＳＨＩ、ＧＳＨＩＩ発現プラスミドｐＡＵＲ１０１−ＧＳＨＩ、ＧＳＨＩＩを得た。得られたプラスミドｐＡＵＲ１０１−ＧＳＨＩ、ＧＳＨＩＩを制限酵素ＢｓｉＷＩで消化し、ＹＰＨ４９９／ＡＤＰ１、ΔγＧＴＰ、ΔＯＰＴ１株を宿主酵母株とし、形質転換を行い、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｎ  Ａに対する抵抗性を指標に形質転換体ＹＰＨ４９９／ＡＤＰ１、ΔγＧＴＰ、ΔＯＰＴ１、ＧＳＨＩ、ＧＳＨＩＩ株を得た。
【００７５】
［実施例１］ＡＤＰ１の発現を強化した株によるグルタチオンの生産
製造例１で取得したＡＤＰ１の発現を強化したＹＰＨ４９９／ｐＧＫ４０５−ＡＤＰ１株をＳＤ培地（６．７ｇ／Ｌ Ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）、２０ｇ／Ｌグルコース）５ｍｌで３０℃、１６時間振盪することにより種母培養を行った。次にＳＤ培地２０ｍｌを含むバッフル付き三角フラスコにＯＤ６００＝０．１５となるよう植菌し、３０℃、攪拌１５０ｒｐｍの条件で２４時間および４８時間培養を行い、培地中（菌体外）のグルタチオン濃度を測定した。その結果を表１に示す。
【００７６】
［比較例１］
ＡＤＰ１の発現を強化したＹＰＨ４９９／ｐＧＫ４０５−ＡＤＰ１株に代えて、親株であるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＹＰＨ４９９株を使用した以外は、実施例１と同様の操作で培養を行い、培地中（菌体外）のグルタチオン濃度を測定した。その結果を表１に示す。
【００７７】
【表１】
0006020875.tif 000002
【００７８】
表１からわかるように、ＡＤＰ１の発現を強化することにより、培地中のグルタチオン蓄積量が向上することから、ＡＤＰ１遺伝子産物がグルタチオンを菌体外に排出するグルタチオン輸送活性を有していることが判明した。
【００７９】
尚、培地中（菌体外）のグルタチオン濃度は、培地０．２ｍｌ〜１ｍｌを遠心分離し、得られた上清を水にて適宜希釈し、ＤＴＮＢ法にて分析した。
【００８０】
［実施例２］ＡＤＰ１の発現を強化し、グルタチオン分解活性およびグルタチオン細胞取り込み活性を低下させた株によるグルタチオンの生産
製造例２で取得した、γＧＴＰ遺伝子、ＯＰＴ１遺伝子を破壊し、ＡＤＰ１の発現を強化した、ＹＰＨ４９９／ＡＤＰ１、ΔγＧＴＰ、ΔＯＰＴ１株をＳＤ培地（６．７ｇ／Ｌ Ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）、２０ｇ／Ｌグルコース）５ｍｌで３０℃、１６時間振盪することにより種母培養を行った。次にＳＤ培地２０ｍｌを含むバッフル付き三角フラスコにＯＤ６００＝０．１５となるよう植菌し、３０℃、攪拌１５０ｒｐｍの条件で２４時間および４８時間培養を行い、培地中（菌体外）のグルタチオン濃度を実施例１記載の方法で測定した。その結果を表２に示す。
【００８１】
［比較例２］
ＹＰＨ４９９／ＡＤＰ１、ΔγＧＴＰ、ΔＯＰＴ１株に代えて、親株であるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＹＰＨ４９９株を使用した以外は、実施例２と同様の操作で培養を行い、培地中（菌体外）のグルタチオン濃度を測定した。その結果を表２に示す。
【００８２】
［比較例３］
ＹＰＨ４９９／ＡＤＰ１、ΔγＧＴＰ、ΔＯＰＴ１株に代えて、製造例２で取得したＹＰＨ４９９／ΔγＧＴＰ、ΔＯＰＴ１株を使用した以外は、実施例２と同様の操作で培養を行い、培地中（菌体外）のグルタチオン濃度を測定した。その結果を表２に示す。
【００８３】
【表２】
0006020875.tif 000003
【００８４】
表２からわかるように、γＧＴＰ遺伝子およびＯＰＴ１遺伝子を破壊し、グルタチオンの分解および細胞取り込み活性を低下させることで、培地中のグルタチオン濃度は、親株より向上し、これに加えてＡＤＰ１遺伝子発現を強化することで、培地中のグルタチオン濃度はさらに向上した。このことから、ＡＤＰ１遺伝子産物がグルタチオンを菌体外に排出するグルタチオン輸送活性を有していることを確認できた。
【００８５】
［実施例３］ＡＤＰ１の発現を強化し、グルタチオン分解活性およびグルタチオン細胞取り込み活性を低下させ、ＧＳＨＩおよびＧＳＨＩＩの発現を強化した株によるグルタチオンの生産
製造例３で取得した、γＧＴＰ遺伝子、ＯＰＴ１遺伝子を破壊し、ＡＤＰ１遺伝子、ＧＳＨＩ遺伝子、ＧＳＨＩＩ遺伝子の発現を強化した、ＹＰＨ４９９／ＡＤＰ１、ΔγＧＴＰ、ΔＯＰＴ１、ＧＳＨＩ、ＧＳＨＩＩ株をＳＤ培地（６．７ｇ／Ｌ Ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）、２０ｇ／Ｌグルコース）５ｍｌで３０℃、１６時間振盪することにより種母培養を行った。次にＳＤ培地２０ｍｌを含むバッフル付き三角フラスコにＯＤ６００＝０．１５となるよう植菌し、３０℃、攪拌１５０ｒｐｍの条件で２４時間および４８時間培養を行い、培地中（菌体外）のグルタチオン濃度を実施例１記載の方法で測定した。その結果を表３に示す。
【００８６】
【表３】
0006020875.tif 000004
【００８７】
表３からわかるように、ＧＳＨＩ遺伝子、ＧＳＨＩＩ遺伝子の発現を強化することで、実施例２と比較しても、培地中のグルタチオン濃度はさらに向上した。このことから、グルタチオン合成系が強化されることにより、グルタチオンの合成量が増加し、それに伴ってグルタチオンの菌体外への排出量が増加することが確認できた。
【配列表】
0006020875000001.app