(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物における膵機能障害に関連する疾病又は疾患の治療又は予防のための医薬製剤であって、該医薬製剤は、Foxo1の発現を減少させる有効量の薬剤を含み、該薬剤は、Foxo1をコードする遺伝子又はmRNAのいずれかに十分に相補的である単離されたshRNA、siRNA、アンチセンスRNA、アンチセンスDNA、及びキメラアンチセンスDNA/RNAからなる群から選択され、該薬剤は、腸内分泌前駆細胞を有する腸の領域において治療有効量を放出する腸溶性の形態で提供されているか、又は該領域に直接的に局所投与されるためのものであり、且つ該疾病又は疾患が、１型糖尿病、２型糖尿病、メタボリックシンドローム、グルコース不耐性、高血糖、インスリン感受性の減少、空腹時血糖の増加、食後血糖の増加及び肥満からなる群から選択されるものである、医薬製剤。
【請求項２】
有効量が、グルコース耐性の増加、血清中インスリンの増加、インスリン感受性の増加、空腹時血糖の減少、食後血糖の減少、体重増加の減少、体脂肪量の減少、体重減少の増加及びインスリンを産生し分泌する消化管における腸内分泌細胞の生成からなる群から選択される効果を生じさせる量である、請求項１に記載の医薬製剤。
【請求項３】
哺乳動物においてインスリンを産生し分泌する腸内分泌細胞を産生させるための医薬製剤であって、該医薬製剤は、Foxo1の発現を減少させる有効量の薬剤を含み、該薬剤は、Foxo1をコードする遺伝子又はmRNAのいずれかに十分に相補的である単離されたshRNA、siRNA、アンチセンスRNA、アンチセンスDNA、及びキメラアンチセンスDNA/RNAからなる群から選択され、該薬剤は、腸内分泌前駆細胞を有する腸の領域において治療有効量を放出する腸溶性の形態で提供されているか、又は該領域に直接的に局所投与されるためのものである、医薬製剤。
【請求項４】
インスリン産生腸内分泌細胞が、該薬剤の投与に応答して、グルカゴン、膵ポリペプチド、グルコキナーゼ、及びglut2からなる群から選択される１以上の膵ホルモンを更に産生する、請求項３に記載の医薬製剤。
【請求項５】
インスリン産生腸内分泌細胞が、プロホルモン転換酵素Pc2、Pdx1、MafA、Nkx6.1、Nkx2.2、及びPax4からなる群から選択される１以上のタンパク質も産生する、請求項３に記載の医薬製剤。
【請求項６】
哺乳動物においてグルコース耐性を増加させるか又はインスリン感受性を増加させるための医薬製剤であって、該医薬製剤は、Foxo1の発現を減少させる治療有効量の薬剤を含み、該薬剤は、Foxo1をコードする遺伝子又はmRNAのいずれかに十分に相補的である単離されたshRNA、siRNA、アンチセンスRNA、アンチセンスDNA、及びキメラアンチセンスDNA/RNAからなる群から選択され、該薬剤は、腸内分泌前駆細胞を有する腸の領域において治療有効量を放出する腸溶性の形態で提供されているか、又は該領域に直接的に局所投与されるためのものである、医薬製剤。
【請求項７】
哺乳動物における膵機能障害に関連する疾病又は疾患を予防するための医薬であって、該医薬は、Foxo1の発現を減少させる薬剤を治療有効量で含み、該薬剤は、Foxo1をコードする遺伝子又はmRNAのいずれかに十分に相補的である単離されたshRNA、siRNA、アンチセンスRNA、アンチセンスDNA、及びキメラアンチセンスDNA/RNAからなる群から選択され、該薬剤は、腸内分泌前駆細胞を有する腸の領域において治療有効量を放出する腸溶性の形態で提供されているか、又は該領域に直接的に局所投与されるためのものであり、且つ該疾病又は疾患が、１型糖尿病、２型糖尿病、メタボリックシンドローム、グルコース不耐性、高血糖、インスリン感受性の減少、空腹時血糖の増加、食後血糖の増加及び肥満からなる群から選択されるものである、医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府の権利に関する陳述
本発明は、国立衛生研究所により交付された助成DK057539及びDK58282のもとで、政府の援助によりなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
１．発明の分野
１型及び２型糖尿病の治療及び予防方法
【０００３】
２．関連技術の説明
糖尿病（Diabetes mellitus）は、慢性高血糖及び長期の合併症の発症によって特徴付けられる一群の疾患である。この一群の疾患は、１型糖尿病、２型糖尿病、妊娠糖尿病、及び他の種類の糖尿病を含む。免疫介在性（１型）糖尿病（又はインスリン依存性糖尿病（insulin dependent diabetes mellitus）、IDDM）は、治癒又は予防のための適切な手段が現在のところ存在しない、子供及び成人の疾病である。１型糖尿病は、全てのヒト糖尿病のおよそ１０％に相当する。
【０００４】
１型糖尿病は、１型のみが膵ランゲルハンス島のインスリンを産生するベータ細胞の特異的な破壊を伴う点で、非インスリン依存性糖尿病（non-insulin dependent diabetes）（NIDDM）とは異なる；膵島内のアルファ細胞（グルカゴンを産生する）又はデルタ細胞（ソマトスタチンを産生する）は免れる。膵ベータ細胞の進行性の喪失は、不十分なインスリン産生をもたらし、それゆえ、付随する合併症と共にグルコース代謝の障害をもたらす。１型糖尿病は、主に遺伝的に罹りやすい人において発症する。１型糖尿病の病因において主要な遺伝的要素が存在するが、環境又は非生殖細胞系遺伝因子も重要な役割を果たすように見える。１型糖尿病は、米国において３００人中１人に発症する。１型糖尿病の発症は、１年当たり約３％〜５％の割合で上昇している。
【０００５】
１９２２年以降、インスリンは、型糖尿病（type diabetes）及びインスリンの産生の欠如又は減少に関連する他の状態の治療のための唯一の使用可能な治療法である。しかしながら、それは血管、神経、目、及び腎臓への傷害（それは視野、腎機能、心機能及び血圧に影響し得、循環器系の合併症を引き起こし得る）を含む疾病の長期の合併症は予防しない。これは、インスリン治療が欠損した膵機能を完全には代替できないからである。数十年の研究並びに１９７４年の膵島細胞移植及び島細胞移植のためのエドモントンプロトコールに起因する成功のより新たな主張の登場にもかかわらず、インスリン産生細胞を置換することの成功は控えめである。島又は膵移植に付随する問題点には、十分な量の組織を入手すること及び移植された島がレシピエントにおいて生存しうまく機能する割合が比較的低いことがまだ克服されていないことが含まれる。移植後４年で、島細胞移植を受けた患者の１０％未満がインスリン非依存のままである。また、新たな免疫抑制プロトコールにもかかわらず、患者当たり１８％の割合の深刻な副作用が存在する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、糖尿病又は膵機能障害に関連する他の疾患の治療、予防、及び／又は発症リスクの低減のための更なる治療計画の必要性が存在する。
【０００７】
本発明の実施形態が記載されるのに先立ち、記載された特定の処理、組成物、又は方法論は変化し得るため、本発明はこれらに限定されないことが理解されるべきである。本明細書中で使用される用語は、特定の説明又は実施形態を記載する目的のためだけのものであり、添付の特許請求の範囲のみによって限定される本発明の範囲を限定することを意図するものでないことも理解されるべきである。特に定義しない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語及び科学用語は、当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中に記載されるものと類似又は同等のあらゆる方法及び材料が、本発明の実施形態の実施又は試験に用いられ得るが、好ましい方法、装置、及び材料がここに記載される。本明細書中で言及される全ての刊行物は、参照によってそれらの全体が組み込まれる。本明細書中のいかなる箇所も、本発明が先行発明によるそのような開示に先行する権利を与えられないことの承認として解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
本発明は、以下の添付の図面の図に、例として、そして限定としてではなく、説明される。
【図１−１】NKOマウスにおける腸インスリン産生細胞。（Ａ）Neurog3-Gfpレポーターマウスと交雑させた対照及びNKOマウスの腸におけるNeurog3-Gfp（赤）及びFoxo1（緑）の同時局在。（Ｂ）NKOマウスにおけるFoxo1とNeurog-Gfpの同時局在の欠如。（Ｃ）膵臓（白抜き）及び腸におけるインスリン免疫組織化学（赤）。元の倍率：200X。1日齢マウスから試料を得た。（Ｄ）Ins2-Gfpノックインマウスと交雑させた対照及びNKOマウスの膵臓（上）及び絨毛（下）における直接蛍光。（Ｅ）NKO:Ins2-Gfpマウスにおけるインスリン（赤）及びGfp（緑）での二重免疫蛍光。（Ｆ）NKO:Rosa26eGfpマウス及び対照のヘテロ接合同腹子における系統追跡実験。Gfp（緑）及びインスリン（赤）で免疫組織化学を実施した。Gfp+/Ins+細胞（矢印により示した）は、Cre媒介組換えが起きた細胞の子孫である。図１  １Ｇ（仮出願（prov）の旧図１Ｌ）Ins2+細胞の局在の概要。NKO:Ins2‐Gfp及びNKO:ニューロゲニン3‐GFPマウスから推測される、ニューロゲニン3‐Gfp+（赤三角）及びIns2+細胞の局在を示す、成体マウス腸の模式図。図のPPTの1Fの後ろにこれを挿入せよ。
【図１−２】NKOマウスにおける腸インスリン産生細胞。（Ａ）Neurog3-Gfpレポーターマウスと交雑させた対照及びNKOマウスの腸におけるNeurog3-Gfp（赤）及びFoxo1（緑）の同時局在。（Ｂ）NKOマウスにおけるFoxo1とNeurog-Gfpの同時局在の欠如。（Ｃ）膵臓（白抜き）及び腸におけるインスリン免疫組織化学（赤）。元の倍率：200X。1日齢マウスから試料を得た。（Ｄ）Ins2-Gfpノックインマウスと交雑させた対照及びNKOマウスの膵臓（上）及び絨毛（下）における直接蛍光。（Ｅ）NKO:Ins2-Gfpマウスにおけるインスリン（赤）及びGfp（緑）での二重免疫蛍光。（Ｆ）NKO:Rosa26eGfpマウス及び対照のヘテロ接合同腹子における系統追跡実験。Gfp（緑）及びインスリン（赤）で免疫組織化学を実施した。Gfp+/Ins+細胞（矢印により示した）は、Cre媒介組換えが起きた細胞の子孫である。図１  １Ｇ（仮出願（prov）の旧図１Ｌ）Ins2+細胞の局在の概要。NKO:Ins2‐Gfp及びNKO:ニューロゲニン3‐GFPマウスから推測される、ニューロゲニン3‐Gfp+（赤三角）及びIns2+細胞の局在を示す、成体マウス腸の模式図。図のPPTの1Fの後ろにこれを挿入せよ。
【図１Ｆ】NKOマウスにおける腸インスリン産生細胞。（Ａ）Neurog3-Gfpレポーターマウスと交雑させた対照及びNKOマウスの腸におけるNeurog3-Gfp（赤）及びFoxo1（緑）の同時局在。（Ｂ）NKOマウスにおけるFoxo1とNeurog-Gfpの同時局在の欠如。（Ｃ）膵臓（白抜き）及び腸におけるインスリン免疫組織化学（赤）。元の倍率：200X。1日齢マウスから試料を得た。（Ｄ）Ins2-Gfpノックインマウスと交雑させた対照及びNKOマウスの膵臓（上）及び絨毛（下）における直接蛍光。（Ｅ）NKO:Ins2-Gfpマウスにおけるインスリン（赤）及びGfp（緑）での二重免疫蛍光。（Ｆ）NKO:Rosa26eGfpマウス及び対照のヘテロ接合同腹子における系統追跡実験。Gfp（緑）及びインスリン（赤）で免疫組織化学を実施した。Gfp+/Ins+細胞（矢印により示した）は、Cre媒介組換えが起きた細胞の子孫である。図１  １Ｇ（仮出願（prov）の旧図１Ｌ）Ins2+細胞の局在の概要。NKO:Ins2‐Gfp及びNKO:ニューロゲニン3‐GFPマウスから推測される、ニューロゲニン3‐Gfp+（赤三角）及びIns2+細胞の局在を示す、成体マウス腸の模式図。図のPPTの1Fの後ろにこれを挿入せよ。
【図２−１】腸Ins+細胞は、膵ベータ細胞と必須の特徴を共有する。（Ａ）グルコキナーゼ（Gck）、（Ｂ）プロホルモン転換酵素2（Pc2)、（Ｃ）スルホニル尿素受容体1（Sur1)、（Ｄ）グルコース輸送体2（Glut2)、及び（Ｅ）シナプトフィシンの免疫蛍光。Ｃにおける挿入図は、二重陽性の細胞の例を示す。元の倍率：100X（Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ)、及び200X（Ｂ）。
【図２−２】腸Ins+細胞は、膵ベータ細胞と必須の特徴を共有する。（Ａ）グルコキナーゼ（Gck）、（Ｂ）プロホルモン転換酵素2（Pc2)、（Ｃ）スルホニル尿素受容体1（Sur1)、（Ｄ）グルコース輸送体2（Glut2)、及び（Ｅ）シナプトフィシンの免疫蛍光。Ｃにおける挿入図は、二重陽性の細胞の例を示す。元の倍率：100X（Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ)、及び200X（Ｂ）。
【図３−１】インスリン分泌及び生物活性。（Ａ、Ｂ）表示濃度のグルコース及び0.5 mMジアゾキシド（Dzx)、又は10 nMグリベンクラミド（Glib)を補充したHEPES-クレブス・リンガー緩衝液中でインキュベートしたNKO（青色棒）及び対照（黒色棒）腸からのグルコース依存性インスリン及びCペプチド分泌。成体の腸（n=4)を使用して実験を行なった。WTの島を対照として使用した。（Ｃ）NKO（青色棒）又は対照マウス（黒色棒）からの酸−エタノール抽出物の、５日齢マウスにおける腹腔内注射後の血漿グルコースレベルへの影響。試料を、抗インスリン中和抗体（Ins Ab）又はアイソタイプを合わせた対照IgG（IgG)と共にプレインキュベートした。組換えヒトインスリンを、注射の前に酸−エタノール沈殿に供した（acid/EtOH）（a及びbにおいてn= 8、cにおいてn=12）。
【図３−２】インスリン分泌及び生物活性。（Ａ、Ｂ）表示濃度のグルコース及び0.5 mMジアゾキシド（Dzx)、又は10 nMグリベンクラミド（Glib)を補充したHEPES-クレブス・リンガー緩衝液中でインキュベートしたNKO（青色棒）及び対照（黒色棒）腸からのグルコース依存性インスリン及びCペプチド分泌。成体の腸（n=4)を使用して実験を行なった。WTの島を対照として使用した。（Ｃ）NKO（青色棒）又は対照マウス（黒色棒）からの酸−エタノール抽出物の、５日齢マウスにおける腹腔内注射後の血漿グルコースレベルへの影響。試料を、抗インスリン中和抗体（Ins Ab）又はアイソタイプを合わせた対照IgG（IgG)と共にプレインキュベートした。組換えヒトインスリンを、注射の前に酸−エタノール沈殿に供した（acid/EtOH）（a及びbにおいてn= 8、cにおいてn=12）。
【図４−１】STZ媒介除去後の腸Ins+細胞の再生。（Ａ）NKOマウス（四角）及び対照マウス（菱形)において与えたグルコースレベル。矢印は、STZ投与（STZ）及び殺処分（SAC)のタイミングを示す。インスリン（2-4U/qd）を、WT対照において3日目から28日目に投与した（n=16)。（Ｂ）STZ後のNKOマウス及びWT対照の生存曲線（それぞれn=16)。（Ｃ）STZ投与前及び後のNKOマウス、及びSTZ後のWT対照における経口グルコース耐性試験。（Ｄ）抗インスリン（D0及びD3）並びに抗インスリン及び抗Pc2抗体（D28)を用いた、STZ注射の前（D0)、及び後（D3及びD28）のNKO腸における、腸Ins+細胞の免疫組織化学。STZ注射前（D0）及び後（D28）の対照膵臓切片のインスリン免疫染色を右側のパネルに示す。（Ｅ）STZ後の腸Ins+細胞の系統追跡。NKO:Ins2-Gfp二重変異マウスを、方法において示したようにSTZで処理し、腸切片を、Gfp（緑）又はPc2（赤）に対する抗体を用いて染色した。D及びEにおいて、本発明者らは、各領域から、十二指腸、空腸、回腸及び結腸の３レベルを調査した（n=4）。元の倍率：200X。
【図４−２】STZ媒介除去後の腸Ins+細胞の再生。（Ａ）NKOマウス（四角）及び対照マウス（菱形)において与えたグルコースレベル。矢印は、STZ投与（STZ）及び殺処分（SAC)のタイミングを示す。インスリン（2-4U/qd）を、WT対照において3日目から28日目に投与した（n=16)。（Ｂ）STZ後のNKOマウス及びWT対照の生存曲線（それぞれn=16)。（Ｃ）STZ投与前及び後のNKOマウス、及びSTZ後のWT対照における経口グルコース耐性試験。（Ｄ）抗インスリン（D0及びD3）並びに抗インスリン及び抗Pc2抗体（D28)を用いた、STZ注射の前（D0)、及び後（D3及びD28）のNKO腸における、腸Ins+細胞の免疫組織化学。STZ注射前（D0）及び後（D28）の対照膵臓切片のインスリン免疫染色を右側のパネルに示す。（Ｅ）STZ後の腸Ins+細胞の系統追跡。NKO:Ins2-Gfp二重変異マウスを、方法において示したようにSTZで処理し、腸切片を、Gfp（緑）又はPc2（赤）に対する抗体を用いて染色した。D及びEにおいて、本発明者らは、各領域から、十二指腸、空腸、回腸及び結腸の３レベルを調査した（n=4）。元の倍率：200X。
【図５】腸Neurog3局在。Neurog3-Gfpトランスジェニックマウス由来の新生仔の腸における、抗Neurog3（赤）及び抗Gfp（緑）を用いた免疫組織化学。２つの検出方法の間の完全な重なりは、Gfpが腸におけるNeurog3局在の忠実なマーカーであることを示す。元の倍率：100X。
【図６】腸内分泌前駆細胞におけるFoxo1除去は、Neurog3+細胞のプールを増加させる。（Ａ）WT及びNKOマウスにおける、抗Neurog3抗体（緑）を用いた免疫組織化学。（Ｂ）Neurog3-Gfp及びNKO:Neurog3-Gfpマウスにおける、抗Gfp抗体及び抗クロモグラニンA抗体（それぞれ、緑及び赤）を用いた免疫組織化学。元の倍率：Ａ及びＢの両方において20X。（Ｃ）腸上皮細胞調製物におけるNeurog3 mRNAレベル（n=8）。（Ｄ）Neurog3-Gfp及びNKO:Neurog3-Gfpマウスから単離した腸上皮細胞調製物からのフローサイトメトリーデータ。（Ｅ）Ｄにおけるデータの定量（n=6）。*= P<0.05、**= P<0.01。
【図７】Foxo1を除去した腸における膵ホルモン産生細胞。NKO（しかし、対照マウスはそうではない）からの遠位回腸及び結腸におけるGcg+及びPp+細胞（緑）を実証する蛍光免疫組織化学。元の倍率：200X。
【図８】4月齢における成体NKOマウスの結腸におけるIns+細胞の存在を実証する抗インスリン抗体（赤）を用いた蛍光免疫組織化学。元の倍率：100X。
【図９】NKOマウス（青）におけるDTZ濃縮断片及び対照マウス（黒）における解剖学的に合わせた区域から単離された腸上皮細胞調製物における、Ins1及びIns2 mRNA発現のqPCR分析（n= 8）。*= P<0.05。
【図１０】PKOマウスの作製及び分析。（Ａ）Neurog3-Gfpトランスジェニックレポーターマウスと交雑させた、1日齢PKO及び対照マウスにおけるFoxo1（緑）及びGfp免疫化学（赤）。（Ｂ）、9月齢PKOマウスにおける遠位回腸におけるインスリン免疫染色（赤）。（Ｃ）1日齢PKO:Neurog3-Gfp及びNeurog3-Gfp対照マウスの十二指腸におけるインスリン（赤）及びGfp免疫染色（緑）。元の倍率：200X。
【図１１】NKOマウス（青）におけるDTZ濃縮断片及び対照マウス（黒）における解剖学的に合わせた区域から単離された腸上皮細胞調製物における、ベータ細胞分化のマーカーGck、Pc2、Kir6.2及びSur1のmRNA発現のqPCR分析（n= 8)。*= P<0.05、**= P<0.01。
【図１２】NKOマウス（青）におけるDTZ濃縮断片及び対照マウス（黒）における解剖学的に合わせた区域から単離された腸上皮細胞調製物における、膵ベータ細胞分化を調節する転写因子Nkx6.1、MafA、Pdx1、NeuroD1、Pax4、Nkx2.2、及びArxのmRNA発現のqPCR分析（n= 8）。*= P<0.05、**= P<0.01。
【図１３】ベータ細胞転写因子の発現の免疫組織化学的分析。NKOマウス及びWT対照の成体結腸及び遠位回腸における、（Ａ）Pdx1の発現及び（Ｂ）Nkx6.1（緑）。両方のパネルセットにおいて、インスリン免疫反応物を赤で示す。2つの転写因子の細胞質局在は、固定手順に起因する可能性がある。元の倍率：400X（上）、及び200X（下）。
【図１４】NKOマウスにおけるAes発現。NKOマウス（青）におけるDTZ濃縮断片及び対照マウス（黒）における解剖学的に合わせた区域から単離された腸上皮細胞調製物におけるAes mRNA発現のqPCR分析。**= P<0.01。（Ｂ）STZ投与後の、成体NKO及びWT対照マウスの結腸における、抗インスリン（緑）及びAes（赤）との免疫反応性。元の倍率：200X。（Ｃ）NKO:Rosa26eGfp及び対照マウスの膵臓及び腸における、Pc2及びAes抗体（赤）を用いた免疫組織化学。元の倍率：20X。
【図１５】Foxo1機能のモデル。膵臓において、N3 progは、全ての内分泌細胞型（オレンジ色シンボル）を生じる。腸において、それらは、腸内分泌細胞（オレンジ色シンボル）を生じ、それらの一部は膵臓と共通しており、またそれらの一部は腸に特異的である。これらの過程において、Foxoは許容的である、即ち、それはこれらの事象が起こることを可能にする。膵臓特異的細胞型（インスリン産生ベータ細胞、グルカゴン産生アルファ細胞、及び膵ポリペプチド産生細胞を含む）は、正常な腸においては認められない。本発明者らは、Foxoが通常は腸におけるこれらの細胞型の生成への抑制的効果を発揮すること、そしてFoxo阻害が腸におけるそれらの出現につながることを提案する。
【図１６】100Xにおけるライブ蛍光顕微鏡像。陰窩を、Ins2遺伝子座にGFPレポーターを保持するWT又はNKOの遠位回腸及び結腸から単離し、in vitroで培養した。3日目：正常及びNeurog3-Foxo1ノックアウトマウスの両方において緑色の細胞が存在しないことから、陰窩細胞のIns-GFP細胞への転換は見られない
【図１７】6日目：インスリン+GFP細胞を示す緑色によって明示されるFoxo1 DNA不活性化に起因する、陰窩細胞のインスリン+GFP細胞への転換。陰窩を、Ins2遺伝子座にGFPレポーターを保持するWT又はNKOの遠位回腸及び結腸から単離し、in vitroで培養した。単離した腸細胞を、培地1中に3日間維持し、培地2に3日間切り替えた。100Xにおけるライブ蛍光顕微鏡像。
【図１８】6日目：Foxo1を除去した陰窩（即ち、NKOマウス）における、陰窩細胞のIns+GFP細胞への転換の増加。200Xにおけるライブ蛍光顕微鏡像。陰窩を、Ins2遺伝子座にGFPレポーターを保持するWT又はNKOの遠位回腸及び結腸から単離し、in vitroで培養した。単離された腸細胞を、培地1中に1日間、培地2中に2日間維持し、培地4bに3日間切り替えた場合、転換効率は、インスリン+GFP細胞を表す緑色細胞の増加によって示されるように、改善する。
【図１９】6日目のインスリン+GFP細胞は、生細胞である。緑色細胞は、インスリン+GFP細胞を示す。青色は、死細胞を示す。陰窩を、Ins2遺伝子座にGFPレポーターを保持するWT又はNKOの遠位回腸及び結腸から単離し、in vitroで培養した。単離した腸細胞を、培地1中に1日間、培地2中に2日間維持し、培地4bに3日間切り換えた。
【図２０】6日目：Foxo1 RNAの阻害に起因する、陰窩細胞のIns+GFP細胞（Ins+GFP is cells）への転換；緑色細胞は、インスリン+GFP細胞を示す。200Xにおけるライブ蛍光顕微鏡像。陰窩を、Ins2遺伝子座にGFPレポーターを保持するWTの遠位回腸及び結腸から単離し、in vitroで培養した。単離した腸細胞を、培地1中に1日間、培地2中に2日間維持し、正常マウスからの腸細胞を、培地4b中で72時間、50nMのFoxo1のsiRNA（右）又はGC含量を合わせた陰性対照（左）で処理した。
【０００９】
発明の概要
哺乳動物における膵機能障害に関連する疾病又は疾患の治療又は予防方法であって、該方法は、１以上のFoxoタンパク質又はその生物活性のある断片若しくは変異体の発現又は生物活性を減少させる治療有効量の薬剤を哺乳動物に投与することを含み、該薬剤は、該Foxoタンパク質の１以上をコードする遺伝子又はmRNAのいずれかに十分に相補的である単離されたshRNA、siRNA、アンチセンスRNA、アンチセンスDNA、キメラアンチセンスDNA/RNA、マイクロRNA、及びリボザイム、並びに１以上のFoxoタンパク質に特異的に結合し、それにより該１以上のタンパク質の生物活性を減少させる抗体又はその生物活性のある断片若しくは変異体からなる群から選択される、方法。疾病又は疾患は、１型糖尿病、２型糖尿病、メタボリックシンドローム、グルコース不耐性、高血糖；インスリン感受性の減少、空腹時血糖の増加、食後血糖の増加及び肥満からなる群から選択される。治療有効量は、グルコース耐性の増加、血清中インスリンの増加、インスリン感受性の増加、空腹時血糖の減少、食後血糖の減少、体重増加の減少、体脂肪量の減少、体重減少の増加及びインスリンを産生し分泌する消化管における腸内分泌細胞の生成からなる群から選択される効果を生じさせる量である。好ましい実施形態において、薬剤は消化管に投与される。
【００１０】
他の実施形態は、哺乳動物における膵機能障害に関連する疾病又は疾患の治療又は予防のための医薬製剤であって、該医薬製剤は、１以上のFoxoタンパク質又はその生物活性のある断片若しくは変異体の発現又は生物活性を減少させる有効量の薬剤を含み、該薬剤は、該Foxoタンパク質の１以上をコードする遺伝子又はmRNAのいずれかに十分に相補的である単離されたshRNA、siRNA、アンチセンスRNA、アンチセンスDNA、キメラアンチセンスDNA/RNA、マイクロRNA、及びリボザイム、並びに１以上のFoxoタンパク質に特異的に結合し、それにより該１以上のタンパク質の生物活性を減少させる抗体又はその生物活性のある断片若しくは変異体からなる群から選択される、医薬製剤を対象にする。いくつかの実施形態において、有効量は、グルコース耐性の増加、血清中インスリンの増加、インスリン感受性の増加、空腹時血糖の減少、食後血糖の減少、体重増加の減少、体脂肪量の減少、体重減少の増加及びインスリンを産生し分泌する消化管における腸内分泌細胞の生成からなる群から選択される効果を生じさせる量である。
【００１１】
別の実施形態は、哺乳動物においてインスリンを産生し分泌する腸内分泌細胞の製造方法であって、該方法は、該哺乳動物に１以上のFoxoタンパク質又はその生物活性のある断片若しくは変異体の発現又は生物活性を減少させる薬剤を投与することを含み、該薬剤は、該Foxoタンパク質の１以上をコードする遺伝子又はmRNAのいずれかに十分に相補的である単離されたshRNA、siRNA、アンチセンスRNA、アンチセンスDNA、キメラアンチセンスDNA/RNA、マイクロRNA、及びリボザイム、並びに１以上のFoxoタンパク質に特異的に結合し、それにより該１以上のタンパク質の生物活性を減少させる抗体又はその生物活性のある断片若しくは変異体からなる群から選択される、方法を対象にする。一実施形態において、インスリン産生腸内分泌細胞は、該薬剤の投与に応答して、グルカゴン、膵ポリペプチド、グルコキナーゼ、及びglut2からなる群から選択される１以上の膵ホルモンを更に産生する。一実施形態において、インスリン産生腸内分泌細胞は、プロホルモン転換酵素Pc2、Pdx1、MafA、Nkx6.1、Nkx2.2、及びPax4からなる群から選択される１以上のタンパク質も産生する。
【００１２】
別の実施形態は、哺乳動物においてグルコース耐性を増加させるか又はインスリン感受性を増加させる方法であって、該方法は、該哺乳動物に１以上のFoxoタンパク質又はその生物活性のある断片若しくは変異体の発現又は生物活性を減少させる治療有効量の薬剤を投与することを含み、該薬剤は、該Foxoタンパク質の１以上をコードする遺伝子又はmRNAのいずれかに十分に相補的である単離されたshRNA、siRNA、アンチセンスRNA、アンチセンスDNA、キメラアンチセンスDNA/RNA、マイクロRNA、及びリボザイム、並びに１以上のFoxoタンパク質に特異的に結合し、それにより該１以上のタンパク質の生物活性を減少させる抗体又はその生物活性のある断片若しくは変異体からなる群から選択される、方法である。
【００１３】
一実施形態は、インスリン産生腸内分泌細胞の製造方法であって、ａ．非インスリン産生腸内分泌前駆細胞の集団を哺乳動物から得ること、ｂ．該集団を、集団の大部分がインスリンを産生することを可能にする量及び条件下で、１以上のFoxoタンパク質、又はその生物活性のある断片若しくは変異体の発現又は生物活性を減少させる薬剤と接触させること、及びｃ．インスリン産生腸内分泌細胞を回収すること、を含む方法を対象にする。別の実施形態は、哺乳動物における膵機能障害に関連する疾病又は疾患の治療又は予防方法であって、該インスリン産生腸内分泌細胞を、該疾病又は疾患を治療又は予防するために十分な数で、該哺乳動物へと再導入することを含む、方法を対象にする。別の実施形態は、該方法によって製造されるインスリン産生腸内分泌細胞及び該細胞を含む医薬製剤を対象にする。
【００１４】
別の実施形態は、哺乳動物における膵機能障害に関連する疾病又は疾患を予防するための医薬であって、該医薬は、１以上のFoxoタンパク質又はその生物活性のある断片若しくは変異体の発現又は生物活性を減少させる薬剤を治療有効量で含み、該薬剤は、該Foxoタンパク質の１以上をコードする遺伝子又はmRNAのいずれかに十分に相補的である単離されたshRNA、siRNA、アンチセンスRNA、アンチセンスDNA、キメラアンチセンスDNA/RNA、マイクロRNA、及びリボザイム、並びに１以上のFoxoタンパク質に特異的に結合し、それにより該１以上のタンパク質の生物活性を減少させる抗体又はその生物活性のある断片若しくは変異体からなる群から選択される、医薬である。
【００１５】
他の実施形態は、哺乳動物の腸の非インスリン産生腸内分泌前駆細胞がインスリンを発現することを誘導する薬剤の同定のための、ハイスループットスクリーニング細胞ベースアッセイの変形であって、ａ．腸の非インスリン産生腸内分泌前駆細胞を含む細胞の集団を単離すること、及びインスリンの産生及び分泌に適した条件下でそれらをインキュベートすること、ｂ．非インスリン産生腸内分泌前駆細胞の対照及び被験集団を提供すること、ｃ．被験集団を被験薬剤と接触させること、ｄ．対照及び被験集団におけるインスリン発現のレベルを決定すること、並びにｅ．被験集団におけるインスリンのレベルが対照におけるレベルよりも有意に高い場合に該被験薬剤を選択することを含む、アッセイの変形を対象にする。いくつかの実施形態において、腸の腸内分泌細胞においてインスリンをコードする遺伝子は、視覚化され得るタンパク質又はペプチドに作動可能に連結されている。
【００１６】
定義
本明細書中で使用される場合、用語「動物」、「患者」、又は「対象」は、哺乳動物（例、ヒト、イヌ、ウシ、ウマ、カンガルー、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、マウス、ウサギ、ラット、及びトランスジェニック非ヒト動物）を含む。好ましい動物、患者、又は対象はヒトである。
【００１７】
「列挙された疾病又は疾患」とは、不適切に低いインスリンレベル、１型及び２型糖尿病、メタボリックシンドローム、肥満、グルコース不耐性、高血糖；インスリン感受性の減少、空腹時血糖の増加、食後血糖の増加を含む、膵機能障害によって特徴付けられる疾病又は疾患を意味する。不適切に低いインスリンレベルとは、該疾病又は疾患の少なくとも１つの症状に寄与するために十分低いインスリンレベルを意味する。膵機能障害は、対象において膵臓がインスリンを産生及び／又は分泌する能力の減少及び／又は膵臓ペプチド（グルカゴン、膵ポリペプチド、ソマトスタチンなど）を分泌する能力の変化（増加又は減少）を伴う病態である。膵機能障害に関連する疾患としては、成人潜在性自己免疫性糖尿病と呼ばれることもある病態、糖尿病前症、空腹時血糖の障害、グルコース耐性の障害、空腹時高血糖、インスリン抵抗性症候群、及び高血糖状態が挙げられる。
【００１８】
該実施形態における使用のための蛍光トレーサーとしては、GFP及び誘導体、ジアミジノイエロー、ファーストブルー、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、コレラ毒素B、仮性狂犬病ウイルス、ヒドロキシスチルバミジン、テキサスレッド、及びフルオレセインイソチオシアネート、並びに当該分野において公知の任意の他のものが挙げられる。本明細書中に記載された実験において緑色蛍光タンパク質（GFP）が使用されたが、GFPの多くの異なる変異体が現在存在する［Shaner N, Steinbach P, Tsien R（2005）. "A guide to choosing fluorescent proteins"（PDF）. Nat Methods 2（12）: 905-9.］。種々の蛍光タンパク質のリストが、http://nic.ucsf.edu/dokuwiki/doku.php?id=fluorescent_proteinsに見出され得る。
「活性薬剤」とは、任意の腸内分泌前駆Ins-細胞をIns+細胞へと分化させる、任意の薬剤、ポリペプチド、核酸、低分子を意味する。好ましい活性薬剤は、Foxoタンパク質の発現又は生物活性を減少させるそれらである（遺伝子又はmRNAのそれぞれ転写又は翻訳を減少させるか、或いは生物活性を減少させることによるものを含む）。核酸活性薬剤としては、si RNA、sh RNA及びアンチセンスRNA又はDNAが挙げられ、ポリペプチドとしては、抗体及び抗体断片、並びにCOP1のような酵素が挙げられる。
【００１９】
「幹細胞」とは、無制限の分裂のために自己複製することができ、かつ複数の細胞型へと分化することができる、未分化細胞を意味する。PKOマウス実験（図４）は、幹細胞を含む全ての腸細胞においてFoxo1をノックアウトするためであり、結果はNKOと類似の表現型を示す。
【００２０】
腸における「前駆細胞」とは、多能性であるが、自己複製特性は制限されている、幹細胞に由来する細胞を意味する。
【００２１】
「N3腸内分泌前駆細胞」及び「N3 Prog」とは、Ins-腸内分泌細胞を生じる、ニューロゲニン3を発現するインスリン陰性腸前駆細胞のサブ集団を意味する。腸におけるN3 Prog（以下、「腸N3 Prog」）は、インスリンを産生し分泌する細胞（「腸Ins+細胞」）へと分化する能力を有するが、この運命は、発生の間、Foxo1によって制限されることが発見されている。膵臓N3 Progは、胎児発生の間、膵臓インスリン産生細胞へと分化するが、出生後に膵臓N3 Progが存在するか否か、或いは膵臓N3 Progが、正常又は疾患状態の下で出生後に膵ホルモン産生細胞へと分化し得るか否かは、不明なままである。ここで、腸内分泌（腸）及び膵臓N3 progは、共通してN3細胞と呼ばれるものの、それらは異なる特性を有することに注意しなければならない。
【００２２】
「非インスリン産生腸前駆細胞」又は「Ins-腸Prog」とは、インスリンを産生する腸細胞（腸Ins+細胞）へと分化することが可能な任意の腸前駆細胞を広く意味する（幹細胞及びN3 Progを含む）。
【００２３】
「腸内分泌細胞」とは、消化管に特化した内分泌細胞を意味し、それらのほとんどはもはやニューロゲニン3を産生しないN3 Prog細胞の娘細胞である。腸内分泌細胞は、インスリン陰性細胞（腸Ins-）である。それらは、種々の他のホルモン（ガストリン、グレリン、ニューロペプチドY、ペプチドYY 3-36（PYY 3-36）セロトニン、セクレチン、ソマトスタチン、モチリン、コレシストキニン、胃抑制ペプチド、ニューロテンシン、血管作用性小腸ペプチド、グルコース依存性インスリン分泌性ポリペプチド（GIP）及びグルカゴン様ペプチド1など）を産生する。
【００２４】
「腸Ins+細胞」及び「インスリン陽性腸細胞」とは、Ins-腸に由来する、インスリンを産生し分泌する任意の腸内分泌細胞を意味する。腸Ins+細胞は、インスリン陽性表現型（Ins+）を有し、それゆえ、それらは、成熟ベータ細胞のマーカーを発現し、グルコース及びスルホニルウレアに応答してインスリン及びCペプチドを分泌する。腸Ins+細胞は、主にN3 Progから生じ、腸幹細胞からも生じる。これらの細胞は、NKO（Foxo1ノックアウト）マウスにおいて予期せず発見された。膵ベータ細胞とは異なり、腸Ins+細胞は、ベータ細胞毒素ストレプトゾトシンによる除去後に、再生し、マウスにおける高血糖を改善する。
【００２５】
「NKOマウス」又は「Foxo1ノックアウトマウス」とは、N3 ProgにおいてFoxo1を発現しないトランスジェニックマウスを意味する。Foxo1ノックアウトマウス（以下、「NKOマウス」）の腸における全ての腸内分泌細胞がインスリンを産生し分泌する訳ではなく、一部は非インスリン産生性である（以下、「Ins-」）。
【００２６】
Foxoタンパク質の発現又は生物活性を減少させるという文脈の中で、有意に低いとは、腸内分泌又は他の非インスリン産生細胞がIns+表現型（インスリンを発現することを含む）を獲得するように、十分にFoxoタンパク質のレベルを低くすることを意味する。
【００２７】
アッセイにおいて対照におけるレベルよりも有意に高いとは、一般的に用いられるアッセイ（elisa又はria）によって検出可能であるのに対して、対照集団においてはインスリンをそのようなアッセイによって検出することができないことを意味する。Foxoタンパク質発現のレベルの有意な減少は、対照値の50%よりも大きい減少として意図される（注記：本発明者らは、50%までの減少では何も起こらないので、減少は50%よりも大きくなければならないことを知っている）。
【００２８】
対照及び、被験集団をインスリン産生細胞にならしめる薬剤と接触させた後の被験集団における、インスリン発現のレベルを決定するという文脈の中で、有意に高いとは、未処理細胞は非インスリン産生性であるため、インスリンのあらゆる確かに検出可能なレベルを意味する。スクリーニングアッセイの分野に精通した者は、アッセイに応じて有意に高い又は有意に低いことを決めることができる。
【００２９】
「疾病を予防すること」としては、疾病（又は疾患）にかかりやすいかもしれないが、該疾病を有するとはまだ診断されていない対象において該疾病が生じることを予防すること；疾病を抑えること（例えば、疾病の進展を停止すること）；疾病を緩和すること（例えばその退縮を引き起こすことによる）；疾病により引き起こされた状態を緩和すること（例えばその症状を減少させること、及び／又は疾病の発症を遅らせることによる）が挙げられるがこれらに限定されない。一例は、高血糖の対象において血中グルコースレベルを減少させること、及び／又は該対象における血中グルコースレベルの許容可能な調節を維持することである。そのような治療、予防、症状及び／又は状態は、当業者によって決定され得、標準的な教科書に記載されている。
【００３０】
患者における疾病、疾患又は状態を「治療すること」とは、有益な又は所望の結果（臨床結果を含む）を得るための処置をとることをいう。本発明の目的で、有益な又は所望の臨床結果としては、疾病の１以上の症状の緩和又は改善；疾病の程度を軽減すること；疾病進行を遅らせること又は遅くすること；疾病状態の改善及び寛解又は安定化が挙げられるがこれらに限定されない。
【００３１】
疾病が１型糖尿病である場合、症状としては、頻尿、多渇、極度の飢え、異常な体重減少、疲労の増加、過敏性、ぼやけた視野、性器のかゆみ、奇妙な痛み及び苦痛、ドライマウス、皮膚の乾燥又はかゆみ、インポテンス、膣カンジダ症、切り傷及びすり傷の不十分な治癒、過度の又は異常な感染が挙げられる。これらの症状は、高血糖（血中糖濃度の過剰な上昇、即ち>125 mg/dl)、血糖調節の喪失（即ち、生理的範囲（一般に40-125 mg/dlの間に維持される)の上下への血糖値の頻繁且つ過度の振れ）、食後血中グルコースの変動、血中グルカゴンの変動、血中トリグリセリドの変動を含み、そして糖尿病によって促進され、且つ／又は糖尿病に起因して起こるか若しくはより頻繁には糖尿病と共に起こる状態（微小血管及び微小血管障害（卒中を伴うか若しくは伴わない脳血管の傷害を含むが、これに限定されない）、アンギナ、冠動脈性心疾患、心筋梗塞、末梢血管疾患、腎障害、腎臓の傷害、蛋白尿の増加、網膜症、網膜における血管の新血管新生、ニューロパシー（手足の感覚の喪失及び切断につながり得、且つ／又はニューロパシー若しくは血流の減少からもたらされ得る、中枢性、自立神経性及び末梢性ニューロパシーを含む）、皮膚状態（糖尿病性皮膚障害、糖尿病性リポイド類壊死症、糖尿病性水泡、糖尿病性強皮症、環状肉芽腫、細菌の皮膚感染（より重度の感染をもたらし得る、ブドウ球菌に限る）が挙げられるがこれらに限定されない）、及び胃不全麻痺（異常な空腹）を含む）の割合の減少又はその縮小又はその改善された結果を含む、特徴的な臨床検査所見に関連する。１型糖尿病は、当業者に周知の方法により診断され得る。例えば、一般に、糖尿病患者は、空腹時血糖の結果が126 mg/dLグルコースよりも高い血漿を有する。糖尿病前症は、一般に、100から125 mg/dLグルコースの間の血糖値を有する患者において診断される。他の症状も、糖尿病、関連する疾病及び状態、並びに膵機能の減少により影響を受ける疾病及び状態を診断するために使用され得る。
【００３２】
症状の「減少」とは、症状の深刻さ若しくは頻度の減少、又は症状の消失を意味する。
【００３３】
「膵機能障害に関連する病態」又は膵臓機能不全は、対象における、膵臓が１以上の膵ホルモン（インスリン及び／又は膵臓ペプチド（グルカゴン、膵ポリペプチド、又はソマトスタチンなど）を含む）を産生及び／又は分泌する能力の減少に関連する病態である。膵機能障害に関連する病態としては、１型糖尿病、及び２型糖尿病が挙げられる。他の病態としては、成人潜在性自己免疫性糖尿病と呼ばれることもあるもの、糖尿病前症、空腹時血糖の障害、グルコース耐性の障害、空腹時高血糖、インスリン抵抗性症候群、及び高血糖状態が挙げられる。
【００３４】
当該分野において公知の任意の方法により、対象に薬物又は治療的医薬組成物を「投与すること」又はその「投与」は、直接投与（自己投与（経口投与又は静脈内、皮下、筋肉内若しくは腹腔内注射、坐薬による直腸投与を含む）を含む）、標的組織（腸Ins- Prog（腸N3 Progなど）を有する腸の領域など）の中又は上への直接的な局所投与、或いは治療有効量の薬物又は組成物をそれが標的とする細胞又は組織に送達する任意の経路又は方法による投与の両方を含む。
【００３５】
「対象」又は「患者」は、哺乳動物、典型的にはヒトであるが、随意に獣医学的に重要な哺乳動物であってもよく、ウマ、ウシ、ヒツジ、イヌ、及びネコが挙げられるがこれらに限定されない。
【００３６】
活性薬剤又は医薬組成物の「治療有効量」は、目的とする治療効果（例えば、対象における疾病又は状態の１以上の発現の緩和、改善、寛解又は消失）を達成する量である。完全な治療効果は、一回の用量の投与により必ずしも起こらず、一連の用量の投与の後にのみ起こる場合がある。従って、治療有効量は、１回以上の投与で投与され得る。
【００３７】
薬物の「予防有効量」は、対象に投与された場合、目的とする予防効果（例えば、疾病若しくは症状の発症（若しくは再発）を予防すること若しくは遅らせること、又は疾病若しくは症状の発症（若しくは再発）の可能性を減らすこと）がある薬物の量である。完全な予防効果は、一回の用量の投与により必ずしも起こらず、一連の用量の投与の後にのみ起こる場合がある。従って、予防有効量は、１回以上の投与で投与され得る。糖尿病に関して、治療有効量は、インスリン分泌を増加させるか、インスリン感受性を増加させるか、グルコース耐性を増加させるか、又は体重増加、体重減少、若しくは体脂肪量を減少させる量でもあり得る。
【００３８】
薬剤の「有効量」は、所望の効果を生じさせる量である。
【００３９】
「医薬上許容される」とは、担体、希釈剤又は賦形剤が、製剤の他の成分と適合性でなければならず、そのレシピエントに有害であってはならないことを意味する。
【００４０】
「Foxoタンパク質」は、マウス由来のFoxo1、Foxo2、Foxo3及びFoxo4；ヒト由来のFOXO 1、FOXO 2、1FOXO3及びFOXO4、並びに任意の他の動物由来のFoxo 1-4タンパク質（それらの変異体、及びオーソログ、並びに生物活性のある断片を含む。)を含む。FOXO2は独立に発見されたが、FOXO3と同じ遺伝子であることが判明したことに留意すべきである。2つのNM番号があるが、それらは同じ遺伝子位置を指す。
【００４１】
「Foxo遺伝子」とは、Foxoタンパク質（そのオーソログ及び生物活性のある断片を含む）をコードする任意の遺伝子を意味する。
【００４２】
「Foxo mRNA」とは、Foxoタンパク質（そのオーソログ及び生物活性のある断片を含む）をコードする任意のmRNAを意味する。
【００４３】
「と組み合わせた」薬剤の投与は、一定期間にわたる患者への２つの薬剤の並行投与（一定期間にわたるモノクローナル抗FOXO1、3及び／若しくは4抗体（若しくは抗Foxo1-4）又は任意の他のオーソログに対する抗体）並びにFOXO1、3及び／又は4発現又は生物活性を減少させる薬剤の投与等）、同時投与（薬剤は、ほぼ同時に（例えば、互いに約数分から数時間以内に)投与される）、及び共製剤化（薬剤は、経口、皮下又は非経口投与に適した単一の剤形へと合せられるか又は調合される）が挙げられる。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
詳細な説明
本発明の実施形態は、Neurog3-Foxo1ノックアウト（NKO）マウスにおけるFoxo1タンパク質をコードする遺伝子の体細胞性除去が、顕著な割合の腸N3 Prog細胞を、インスリン陽性腸内分泌細胞（腸Ins+細胞）（生物活性のあるインスリン及びCペプチド、並びに他の膵ホルモン及び転写因子を産生し分泌する）へと分化させたことの発見に部分的に基づく。重要なことに、腸Ins+細胞は、グルコースに応答して用量依存的な様式でインスリンを分泌し、NKO変異マウスの腸由来の酸−エタノール抽出物は、in vivoでグルコース低下効果を有していた。更に、NKOマウスについてのin vivo研究は、膵ベータ細胞（毒素ストレプトゾトシンを用いた治療の後、再生しない）とは異なり、完全に機能的な腸Ins+細胞は、NKOマウスにおいて再生し、ちょうど１０日後に高血糖の自発的な逆転をもたらし、９２日間の実験を通して未治療の動物よりも有意に低い血中グルコースレベル（不断給餌時（in ad libitum）約250 mg/dL、又は絶食後で約160 mg/dL）を維持することを示した。重要なことに、未治療の動物（インスリン治療なしでは必ず死亡した）とは異なり、NKO動物の７５％は、いかなる追加の治療なしでも生存した。環境中のグルコースの濃度と正比例してインスリンを分泌する腸Ins+細胞の能力は、これまで他のグループが再現できていない、膵臓における健康なインスリン産生細胞の重要な特性である。
【００４５】
該データは、腸N3 Progはインスリンを産生し分泌する細胞へと分化する潜在力を有しているが、この能力はFoxo1遺伝子発現によって抑制されることを示した。いくつかの腸幹細胞もIs+細胞へと分化し得ることから、用語「腸Ins- Prog」は、本明細書中、Ins+細胞になることができる任意の腸前駆細胞を含むように使用される。
【００４６】
これまでに誰も、インスリン産生細胞へと分化する潜在力を保持する、腸における前駆細胞の存在を記載することも仮説を立てることもしなかった。従って、活性薬剤は、腸Ins_細胞への腸Ins- Prog細胞の分化を引き起こす任意の薬剤を広く含む。Foxoタンパク質の発現又は生物活性を減少させる薬剤が好ましい。本明細書中、活性薬剤を同定するためのスクリーニングアッセイが記載される。レプチン（摂食を調節するホルモン）を用いた治療が、腸におけるIns+細胞の出現をもたらし得るという、当該分野における先例があるが、この方法は、別の腸細胞型である「Ｌ」細胞（腸内分泌細胞である）の部分的な形質転換を必要とする点で、本明細書中に記載される方法とは異なる。従って、腸N3細胞が腸ins+細胞を生じ得ることを誰も報告しておらず、レプチン治療後のIns+細胞がインスリンを産生することが機能的にできること、ましてやグルコース用量依存的な様式でそれを産生することは、誰も報告していない。
【００４７】
動物（ヒト及びマウスを含む）における、種々のFoxoタンパク質（Foxo1、3又は4タンパク質）をコードする遺伝子の間、及びFoxoタンパク質自体の間で、それぞれ顕著な核酸及びアミノ酸配列相同性がある。Foxo1を減少させることは腸Ins+細胞を作り出すために好ましいが、任意の１若しくは１より多くのFoxo遺伝子若しくはmRNAの発現の減少又は１以上のFoxoタンパク質の生物活性の減少は、顕著な割合の腸Ins- Progを腸Ins+細胞へ分化させることが期待される。
【００４８】
陰窩に富む腸の区域及び正常マウスからの単離細胞である腸Ins- Progの培養集団を使用した特定の実験は、腸Ins- ProgのsiRNA（マウスFoxo1 mRNAに十分に相補的であり、Foxo1発現を減少させる）との接触が、腸Ins+細胞を作り出すことを示した。このことは、インスリン産生細胞へと転換する腸腸内分泌前駆細胞の能力が、Foxo1遺伝子（即ち、DNA)の操作に限定されず、Foxo1 mRNAの阻害を介しても影響され得ることを示す。
これらの発見に少なくとも部分的に基づき、本発明の特定の実施形態は、腸Ins- Progを、該細胞を腸Ins+細胞にする薬剤と接触させることによる、哺乳動物腸Ins+細胞の製造方法を対象にする。好ましい薬剤としては、１以上のFoxoタンパク質をコードする１以上のFoxo遺伝子若しくはmRNAの発現を減少させるか、又は１以上のFoxoタンパク質の生物活性を、腸Ins- Progが腸Ins+細胞表現型を有する細胞へ分化することを可能にするレベルに減少させる薬剤が挙げられる。腸Ins--Prog細胞が、動物においてin situで薬剤と接触され得、又は腸Ins- Progの濃縮された集団が腸から単離され得、又は培養した腸の外植片が使用され得る。これらの方法の一部は、実施例１０に記載される。特定の他の実施形態は、単離された腸Ins+細胞自体、及び腸Ins+細胞を含む組織外植片（好ましくは腸組織であるが人工組織も含まれる）を対象にする。更なる方法は、腸N3 progになるようin vitroで再プログラムされた細胞からのIns+細胞の作製を含む。換言すれば、他の細胞型の操作を介して間接的に得られた腸N3細胞である。例えば、他のものは、細胞を「再プログラム」することにより、皮膚生検からインスリン産生細胞を作製した。著者らはそれを具体的に試験しなかったが、おそらく、これらの細胞は、インスリン産生性となるためにN3 prigの段階を経た。これらの方法及び当該分野において公知の他のものは、本発明の実施形態において使用され得る。Maehr R, et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2009 Sep 15;106(37):15768-73. Epub 2009 Aug 31, Generation of pluripotent stem cellsfrom patientss with type 1 diabetes.
【００４９】
本明細書中に記載される治療方法の有効性は、該方法が、治療される疾病の症状のいずれかを寛解させるか否かを決定することにより、観察され得る。或いは、血清中インスリン又はCペプチド（インスリン分泌の副産物であり、機能的なIns+細胞の指標）のレベルを観察することができ、そのレベルは、治療に応答して増加するはずである。或いは、有効性は、糖血症、グルコース耐性、体脂肪量、体重増加、ケトン体、又は治療される対象における列挙された疾病又は疾患の他の兆候を観察することにより測定され得る。
【００５０】
インスリン分泌の減少に加えて、膵機能障害としては、１以上の膵臓ペプチド（グルカゴン、膵ポリペプチド、ソマトスタチン、又はグレリン等）を含む１以上の膵ホルモンを産生及び／又は分泌する能力の変化が挙げられる。周知の膵機能障害に関連する病態としては、１型糖尿病、及び２型糖尿病が挙げられる。他の病態としては、成人潜在性自己免疫性糖尿病と呼ばれることもあるもの、糖尿病前症、空腹時血糖の障害、グルコース耐性の障害、空腹時高血糖、インスリン抵抗性症候群、及び高血糖状態が挙げられる。これらの全ては、糖尿病を治療及び予防することの意味の中に入る。
【００５１】
他の実施形態は、例えば被験薬剤のライブラリーを使用する、腸Ins- Progの腸Ins+細胞への分化を誘導するものを同定するための、スクリーニング方法を対象にする。これらの方法の一部は、下記のスクリーニングアッセイと題されたセクションにおいて記載される。スクリーニングは、ハイスループットin vitroアッセイであり得る。in vitro系は、試験管内で非インスリン産生腸前駆細胞から腸Ins+細胞を作り出すためにも開発されている。実施例１０。特定の他の実施形態は、腸Ins+細胞が、特定の糖尿病患者又は糖尿病を発症するリスクのある患者からの腸生検由来のインスリン陰性前駆細胞から生物工学により作られること（次いで、該細胞は患者へと移植により戻され、自己の腸Ins+細胞からの調節されたインスリン分泌の供給源を提供し得る）を対象にする。
【００５２】
腸Ins+細胞によるインスリン分泌が薬物ジアゾキシドを使用して遮断され得ることも発見されており、このことは、低インスリン産生又は膵機能障害に関連する疾病の治療のための治療方法として、腸Ins+細胞を産生するよう誘導されたか又は腸Ins+細胞を投与することにより治療された動物における、いかなる望ましくないインスリン産生も制御するための重要な安全対策である。
【００５３】
本明細書中に記載されるデータは、腸Ins-Progが、環境中のグルコースの濃度と正比例して生物活性のあるインスリンを分泌する腸Ins+細胞へと分化するよう誘導され得ること、及び腸Ins+細胞がジアゾキシドにより制御され得ることの、直接的証拠を提供する。
【００５４】
従って、本発明の特定の実施形態は、腸Ins-Progの腸Ins+細胞への分化を誘導する薬剤の治療有効量を投与することによる、１型又は２型糖尿病、或いは動物における不適切に低いインスリン又は膵機能障害に関連する、本明細書中で定義された、列挙された疾病又は疾患のうちの別のものの治療又は予防方法を対象にする。そのような薬剤としては、Foxo又はFoxo遺伝子若しくはmRNA発現を減少させるか、或いは１以上のFoxoタンパク質の生物活性を、Ins-腸Progが腸Ins+細胞になることを可能にするレベルに減少させる薬剤が挙げられる。いくつかの他の実施形態において、これらの疾患は、治療有効量の腸Ins+細胞（好ましくは自己の又は部分的に自己の細胞）を、そのような治療を必要とする動物に投与することにより治療又は予防される。
【００５５】
概要
再生医学の長年のゴールは、１型糖尿病を有する患者において行われる細胞置換のリストにインスリン産生β細胞を入れることを目的として、該細胞の生成を支配する遺伝的経路、細胞経路、及び生化学的経路を同定することである。原始内胚葉前駆体が内分泌系への運命を採る過程は、詳細に調べられている3。ニューロゲニンは、一般にニューロン分化を指定することに関与するbHLH転写因子の一群である。ニューロゲニン-3（Neurog3又はN3）は、膵臓内分泌系の発達を促進する。膵臓及び腸内分泌細胞は、転写因子Neurog3の一過性発現によって特徴付けられる前駆細胞から生じる(1-3)。重要なステップは、全ての公知の膵島細胞型へと分化するニューロゲニン3発現細胞の形成であるように見える（1、22-23)。興味深いことに、ニューロゲニン3+内分泌系前駆細胞（本明細書中N3 Prog）は、膵臓に制限されず、胃及び腸において見出され、そこでそれらは腸内分泌系（体内における最大の内分泌系器官）における細胞のほとんどを生じる（2-3)。しかしながら、それらが共通して内胚葉起源であるにもかかわらず、膵臓及び腸N3前駆細胞は、あるとしてもわずかの特性しか共有せず、それらは、別個のペプチドホルモンを産生し、著しく異なる発生運命及び寿命を有する細胞型を生じる（8)。膵臓内分泌系前駆細胞は、胚発生の間に形成され、特別な状況下（24)を除き、成体器官においては再び生じないが（7)、腸N3 Progは、腸幹細胞から継続的に再生し、ターンオーバーの速い腸内分泌細胞を再配置させることに寄与する（3)。
【００５６】
これら2つの細胞集団の別個の特性は、位置特定（positional specification）（それにより部分的に運命決定された前駆細胞は、具体的な運命を指示する位置依存的な特性を獲得する）の古典的理論とつながり合っている(25)。哺乳動物細胞の分化は、階層的フィードフォワードプロセスとみなされ、そこでは、多能性前駆細胞は、位置の合図によって運命が制限される。従って、ニューロゲニン3陽性内分泌系前駆細胞（N3 Prog）は、位置特定の現在の理論に基づき、腸においてではなく、膵臓においてインスリン産生細胞へと分化することが予測される。これまでに、腸におけるFOXO1、3及び／又は4発現細胞の発生、局在、及び機能的な特性について、実質的に何も知られていなかった。
【００５７】
転写因子Foxo1は、膵臓ベータ細胞機能の複数の面を調節し（4）、Neurog3+膵臓内分泌系前駆細胞において広く発現している(5)。単離されたヒト胎児膵臓上皮において、FOXO1ノックダウンは、NEUROG3+の数を増加させる（39)。膵臓と同様に、Foxo1は、二重免疫組織化学によって確認されるように、ほとんどのNeurog3+腸内分泌前駆細胞において発現している（図1a及び5)。
【００５８】
マウス腸Ins-細胞におけるFoxo1の役割が検討され、それが腸N3 Progが分化する細胞型の決定において役割を果たすか否かを決定した。腸Ins+細胞への腸Ins- Progの分化におけるFoxo1の役割を説明する実験の詳細、及びFoxo1が腸腸内分泌前駆細胞を非インスリン産生性の表現型に制限するという発見は、腸Ins-細胞の特性及びそれらの治療用途を決める実験の記載とともに、実施例において説明される。理論によって制約されることなく、データは、腸N3 ProgにおけるFoxo1の生理的機能が、それらを腸内分泌系統に制限することであり、それにより膵臓内分泌系系統を抑制することを示す。FOXO1は、膵臓においてニューロゲニン3と同時発現するが、FOXO1除去は、様々な膵臓内分泌細胞型の生成に影響しない（28-29)。
【００５９】
PKO及びNKOマウスの間の類似性は、上皮幹細胞分化におけるより早い段階でのFoxo1発現の減少も、膵臓内分泌系系統のFoxo1依存的抑制を解除することを示す。重要なことに、腸N3 Prog細胞は、マウスの生存期間を通じて腸Ins-細胞を生み出す。同じことがヒトにおいても当てはまることが期待される。これらの経路は高度に保存されており、ニューロゲニン3をコードする遺伝子におけるヒト変異があり、そこでは腸機能の異常が説明されている。従って、腸N3 ProgにおけるFoxoタンパク質の発現又は生物活性を減少させる薬剤は、内分泌系膵臓分化表現型を惹起するために随時投与され得る。このことは、図２０においても示され、siRNAによるFoxo1阻害が、正常マウスにおける腸細胞がIns+になることを誘導し得ることを実証する。腸の細胞は急速にターンオーバーすることから、治療は、以下に記載されるように、これらの薬剤の定期的な再投与を必要とし得る。ストレプトゾトシンで処理されたNKOマウスが腸においてインスリン産生細胞を再生することができることを示す結果は、表現型が、一細胞世代よりも長い間持続することを示す。
【００６０】
FOXOタンパク質
FOXO転写因子は、ホルモン及び栄養の合図を細胞の転写応答と統合し、細胞生存、細胞周期進行、DNA修復、及びインスリン感受性を含む、多様な細胞プロセスを調節する（Tran et al., 2003に総説されている)。それらの代謝機能に加えて、Foxoタンパク質は、複数の細胞型における最終分化を阻害する（31-32)。膵臓において、FOXO1は、重要な機能を果たし、内分泌細胞量を負に調節し（26-28)、ストレスへのベータ細胞応答を促進する（29-30)。FOXO1除去は、様々な膵臓内分泌細胞型の生成に影響しない（28-29)。
【００６１】
Nakae et al（2002）は、マウスFoxo1が様々な組織において発現し、肝臓、膵ベータ細胞、及び脂肪細胞におけるインスリン感受性の負の調節因子であることを示した。FOXO1へのインスリンシグナル伝達の障害は、２型糖尿病の代謝異常についての統一したメカニズムを提供する。ヒトにおける研究は、FOXO1が、ヒトPKB/Akt（インスリンシグナル伝達カスケードにおいてPI3キナーゼの下流に位置するセリン／スレオニンキナーゼ）により負に調節されることを示す。この調節は、３つのPKB/Aktリン酸化コンセンサス部位におけるFOXO1の急速且つ階層的なリン酸化を含む（Tran et al., 2003)。
【００６２】
Foxoタンパク質の決定的な特性は、フォークヘッドボックス又はモチーフ（3つのへリックス及び2つの特徴的な大きなループ、又は「ウィング（wings）」からなる約80から100アミノ酸を有するDNA結合ドメイン）である。これらのタンパク質についての標準化された命名法に従い（Kaestner et al., 2000)、ヒトについては全て大文字が使用され（例、FOXO1)、マウスについては最初の文字のみが大文字で書かれる（例、Foxo1)。Genbank NM_002015.3)において特定されるFOXO1遺伝子（以前はFOXO1；FKH1；FKHR；及びFOXO1Aとも表記）は、インスリン応答性組織（肝細胞、脂肪細胞、及び膵臓細胞等）中に最も多いFOXOアイソフォームである。FOXO4（別名AFX；AFX1；MLLT7；MGC120490；FOXO4）は、Genbank NM_005938.3)において説明される；FOXO3（別名、FOXO2；AF6q21；FKHRL1；FOXO3A；FKHRL1P2；MGC12739；MGC31925；DKFZp781A0677)はGenbank  NM_001455.3において説明される。全てが参照により本明細書中に組み込まれる。当業者は、この配列に基づき当該分野において公知の方法を使用して、適切なアンチセンスヌクレオチド及びsiRNAを構築することができる。
【００６３】
動物（ヒト及びマウスを含む）における種々のFoxoタンパク質をコードする遺伝子及びタンパク質自体の間の顕著な相同性とは、FOXO1 mRNA又は該遺伝子を標的とするshRNA、SiRNA及びアンチセンスRNA又はDNAが、FOXO3及びFOXO4に十分に相補的でもあり、それらの発現を減少させ得ることを意味する。同様に、FOXO4又はFOXO3を標的とするように設計されたsiRNA及びアンチセンスは、FOXO1に十分に相補的であり、その発現を減少させ得る。実験をマウスについて行なったことから、全体を通して小文字の命名法を使用したが、しかしながら、本明細書中で使用される場合「Foxo」とは、任意の種由来の任意のFoxoタンパク質、遺伝子又はmRNAを意味する。本発明の方法及び組成物のために、「Foxoタンパク質」は、Foxo1及びその生物活性のある断片のようなオーソログ（異なる種における類似体）を含む。特定の実施形態において、所望の腸Ins+ 表現型は、１以上のFoxoタンパク質（好ましくはFoxo1を含む）の発現又は活性を減少させることにより作り出される。従って、FOXO2、FOXO4及びFOXO3を含む他のフォークヘッドタンパク質を減少させることも、単独で又はFOXO1の減少とともに、非インスリン産生細胞をインスリン産生細胞に変えることが期待される。
【００６４】
配列相同性に起因して、マウスFoxo1に対して作製されたアンチセンス又はsiRNAは、ヒトを含む他の動物において使用され得、逆もまた同様である。全ての遺伝子ID及びアクセッション番号並びにFoxoタンパク質をコードする対応するヌクレオチド、遺伝子、mRNA及びcDNAは、それらの全体が参照により本明細書中に明確に組み込まれる。
【００６５】
【表１】
0005866106.tif 000002
【００６６】
Homo sapiens forkhead box O1（FOXO1), mRNA
NCBI Reference Sequence：NM_002015.3
Mus musculus forkhead box O1（Foxo1), mRNA
NCBI Reference Sequence：NM_019739.3
Rattus norvegicus forkhead box O1（Foxo1), mRNA
NCBI Reference Sequence：NM_001191846.1
Homo sapiens forkhead box O3（FOXO3), transcript variant1, mRNA
NCBI Reference Sequence：NM_001455.3
Homo sapiens forkhead box O3（FOXO3), transcript variant2, mRNA
NCBI Reference Sequence：NM_201559.2
Mus musculus forkhead box O3（Foxo3), mRNA
NCBI Reference Sequence：NM_019740.2
Rattus norvegicus forkhead box O3（Foxo3), mRNA
NCBI Reference Sequence：NM_001106395.1
Homo sapiens forkhead box O4（FOXO4), transcript variant2, mRNA
NCBI Reference Sequence：NM_001170931.1
Homo sapiens forkhead box O4（FOXO4), transcript variant1, mRNA
NCBI Reference Sequence：NM_005938.3
Rattus norvegicus forkhead box O4（Foxo4), mRNA
NCBI Reference Sequence：NM_001106943.
Mus musculus forkhead box O4（Foxo4), mRNA
NCBI Reference Sequence：NM_018789.2
Genomic RefSeqGene, FOXO1 ヒト , NG_023244.1.
Foxo1 Mus musculus strain C57BL/6J chromosome 3, MGSCv37 C57BL/6J, NC_000069.5.
Foxo1 ラット、NC_005101.2、NW_047625.2.
FOXO3 ヒト、NC_000006.11.
Foxo3 マウス、NC_000076.5.
Foxo3 ラット、NC_005119.2.
FOXO4 ヒト、NC_000023.10.
Foxo4 マウス、NC_000086.6.
Foxo4 ラット、NC_005120.2.
forkhead box O1 [Mus musculus]
GenBank：EDL35224.1
Forkhead protein FKHR1 [マウス]
Swiss-Prot：Q9WVH5
forkhead box protein O1 [Homo sapiens]
NCBI Reference Sequence：NP_002006.2
forkhead box protein O1 [Rattus norvegicus]
NCBI Reference Sequence：NP_001178775.1
forkhead box protein O3 [Homo sapiens]
NCBI Reference Sequence：NP_963853.1
forkhead box protein O3 [Homo sapiens]
NCBI Reference Sequence：NP_001446.1
forkhead box protein O3 [Rattus norvegicus]
NCBI Reference Sequence：NP_001099865.1
forkhead box protein O3 [Mus musculus]
NCBI Reference Sequence：NP_062714.1
forkhead box protein O4 [Rattus norvegicus]
NCBI Reference Sequence：NP_001100413.1
forkhead box protein O4 isoform2 [Homo sapiens]
NCBI Reference Sequence：NP_001164402.1
forkhead box protein O4 isoform1 [Homo sapiens]
NCBI Reference Sequence：NP_005929.2
forkhead box protein O4 [Mus musculus]
NCBI Reference Sequence：NP_061259.1
【００６７】
Foxoタンパク質の発現を減少させるために使用されるアンチセンス及び低分子干渉RNAが作製され得、それらは、Foxoタンパク質をコードする遺伝子及び／又はmRNAに特異的にハイブリダイズし、且つそれぞれ転写又は翻訳のいずれかを阻害することによりタンパク質発現を阻害するために十分に相補的である。Foxo1発現を減少させることは、腸Ins-細胞の腸Ins+細胞への分化を引き起こし、そしてそれは処理前のレベルと比較して上昇したインスリンレベルをもたらす。
【００６８】
腸及び膵臓の内分泌細胞においてFoxo遺伝子が遮断されたNKOマウスは、それにもかかわらず、健康に見え、癌を含めて明らかな疾病を有さなかった。同様に、肝臓において全てのFoxo遺伝子（1、3、及び4）を欠くマウスは、健康であり、極度にインスリン感受性であり、肝臓機能試験又は肝臓病態のいかなる異常も発現しなかったが、これらのことはFoxo阻害が安全であり、望ましくない副作用がないこと示す。従って、糖尿病及び膵臓機能不全に関連する他の疾患を治療又は予防するために膵ホルモン分泌腸腸内分泌細胞を生じさせるために、特に一過性の様式で、ヒト対象においてFOXO1、3及び／又は4の発現或いはその生物活性を減少させることは、有害作用がほとんどないようである。このことは、全てのFoxoタンパク質の発現又は生物活性を劇的に減少させたとしても同じであろう。
【００６９】
本発明者らの以前の研究（Matsumoto et al The Journal of Clinical Investigation、Volume 116 Number 9 September 2006）においては、shRNAが使用され、コントロールsiRNA標的配列として低分子ヘアピン型RNA（BD Biosciencesから）を使用して配列GCACCGACTTTATGAGCAACC（配列番号１）のFoxo1を標的化することによりFoxo1発現を減少させた。配列相同性に起因して、この配列又はヒトFOXO1において実質的に相同な配列は、良い標的となり得る。Liuら、Cancer Gene Therapy 14, 945-952 December 2007も、マウスにおいて骨格筋においてFoxo1の発現を減少させるためにRNA阻害剤を使用することを記載する。本明細書中に記載された実験において使用されたsiRNAは、実施例１０において特定される。Labied, S,ら、Molecular Endocrinology 20(1):35-44は、以下を含む種々のヒトFoxoタンパク質を不活性化するアンチセンス分子の記載を提供する：FOXO1-antisense（TTG GGT CAG GCG GTT CA 配列番号２)；FOXO3a-sense（CCC AGC CTA ACC AGG GAA GT 配列番号３）及びFOXO3a-antisense（AGC GCC CTG GGT TTG G 配列番号４)；FOXO4-sense（CCT GCA CAG CAA GTT CAT CAA 配列番号５）及びFOXO4-antisense（TTC AGC ATC CAC CAA GAG CTT 配列番号６)。S. Stephenら、Cancer Research 70, 367, January 1, 2010は、ヒト子宮内膜癌細胞株においてFOXO1転写産物の3'-非翻訳領域（UTR）に結合し、それによりFOXO1発現を阻害する、いくつかのmiRを特定するために、マイクロRNA（miR）標的予測アルゴリズムを使用することを記載する。
【００７０】
アンチセンスヌクレオチド及びsiRNA
本発明の他の実施形態は、標的Foxoタンパク質の発現、従って生物活性を減少させるか又は阻害するための、アンチセンス核酸又は低分子干渉RNA（siRNA）又はshRNAの使用を対象にする。標的Foxoタンパク質及びそれらをコードする遺伝子のこれらの公知の配列に基づき、発現を遮断するか又は減少させるためにそれぞれの遺伝子又はmRNAに十分に相補的であるアンチセンスDNA又はRNAは、当該分野において公知の方法を使用して、容易に設計され、操作され得る。本発明の特定の実施形態において、本発明における使用のためのアンチセンス又はsiRNA分子は、Genbank番号によって特定される１以上のFoxoタンパク質をコードする標的mRNA又は標的遺伝子、或いは１以上のFoxoタンパク質をコードするmRNA又は遺伝子に実質的に相同な変異体又は断片に、ストリンジェントな条件下で結合する分子である。本発明のアンチセンス化合物は、in vitroで合成され、生物起源のアンチセンス組成物を含まない。
【００７１】
アンチセンス核酸の作製方法は、当該分野において周知である。更に、非インスリン産生性の腸前駆細胞において１以上のFoxo遺伝子及びmRNAの発現を減少させる方法であって、１以上の本発明のアンチセンス化合物又は組成物と、該細胞をin situで接触させるか、或いは該細胞の単離及び濃縮された集団又は該細胞を含む培養組織外植片を接触させることによる、方法が提供される。本明細書中で使用される場合、用語「標的核酸」は、１以上のFoxoタンパク質をコードするDNA、及びそのようなDNAから転写されるRNA（プレmRNA及びmRNAを含む）を包含する。核酸オリゴマー化合物のその標的核酸との特異的ハイブリダイゼーションは、標的核酸の正常な機能を妨げる。標的核酸に特異的にハイブリダイズする化合物によるこの標的核酸の機能の調節は、一般に「アンチセンス」と呼ばれる。妨げられるべきDNAの機能は、複製及び転写を含む。妨げられるべきRNAの機能は、すべての生体機能（例えば、タンパク質翻訳部位へのRNAの輸送、RNAからのタンパク質の翻訳、及びRNAによって行われるか又は促進される触媒活性）を含む。そのような標的核酸機能の妨害の全体的効果は、DNA又はRNAによってコードされるタンパク質の発現の調節又は減少である。本発明の文脈の中で「調節」とは、１以上のFoxoタンパク質の遺伝子又はmRNAの発現における減少又は阻害を意味する。
【００７２】
ターゲッティングプロセスは、所望の阻害効果が得られるようにアンチセンス相互作用が起こる、Foxoタンパク質をコードする標的DNA又はRNA内の１つ又は複数の部位の決定を含む。本発明の文脈の中で、好ましい遺伝子内部位は、標的タンパク質のmRNAのオープンリーディングフレーム（ORF）の翻訳開始又は終止コドンを包含する領域である。当該分野において公知である通り、翻訳開始コドンは、典型的には5'-AUG（転写されたmRNA分子において；対応するDNA分子においては5'-ATG）であることから、翻訳開始コドンは、「AUGコドン」、「開始コドン」又は「AUG開始コドン」とも称される。少数の遺伝子は、5'-GUG、5'-UUG又は5'-CUGのRNA配列を有する翻訳開始コドンを有し、5'-AUA、5'-ACG及び5'-CUGは、in vivoにおいて機能することが示されている。従って、用語「翻訳開始コドン」及び「開始コドン」は、各例における開始アミノ酸は真核生物においては典型的にはメチオニンであるが、多くのコドン配列を包含し得る。真核生物の遺伝子は、２つ以上の選択的開始コドンを有し得、それらのいずれかが、特定の細胞型又は組織における、或いは特定の条件下での翻訳開始のために、優先的に利用され得ることも、当該分野において公知である。本発明の文脈において、「開始コドン」及び「翻訳開始コドン」とは、遺伝子から転写されるmRNA分子の翻訳を開始するためにin vivoで使用される１つ又は複数のコドンをいう。通常の実験は、アンチセンス又はsiRNAの最適な配列を決定する。
【００７３】
遺伝子の翻訳終止コドン(又は「終止コドン」)は、３つの配列、すなわち5'-UAA、5'-UAG及び5'-UGA（対応するDNA配列は、それぞれ5'-TAA、5'-TAG及び5'-TGAである）のうちの１つを有し得ることも、当該分野において公知である。用語「開始コドン領域」及び「翻訳開始コドン領域」とは、翻訳開始コドンからいずれかの方向（すなわち5'又は3'）への約25から約50の連続するヌクレオチドを包含するようなmRNA又は遺伝子の一部分をいう。同様に、用語「終止コドン領域」及び「翻訳終止コドン領域」とは、翻訳終止コドンからいずれかの方向（すなわち5'又は3'）への約25から約50の連続するヌクレオチドを包含するようなmRNA又は遺伝子の一部分をいう。
【００７４】
当該分野において翻訳開始コドンと翻訳終止コドンとの間の領域をいうことが公知である、オープンリーディングフレーム(ORF)又は「コード領域」も、効果的に標的とされ得る領域である。他の標的領域は、当該分野において翻訳開始コドンから5'方向にあるmRNAの一部分をいうことが公知である、5'非翻訳領域(5'UTR)（従って5'キャップ部位とmRNA(または遺伝子上の対応するヌクレオチド)の翻訳開始コドンとの間のヌクレオチドを含む）、及び当該分野において翻訳終止コドンから3'方向にあるmRNAの一部分をいうことが公知である、3'非翻訳領域(3'UTR)（従って翻訳終止コドンとmRNA（又は遺伝子上の対応するヌクレオチド）の3'末端との間のヌクレオチドを含む）を含む。
【００７５】
変異体は、転写を開始するか又は終止するための選択的シグナルの使用を通じて産生され得、プレmRNA及びmRNAは、１つより多い開始コドン又は終止コドンを有し得ることも、当該分野において公知である。選択的開始コドンを使用するプレmRNA又はmRNA由来の変異体は、そのプレmRNA又はmRNAの「選択的開始変異体」として公知である。選択的終止コドンを使用するそれらの転写産物は、そのプレmRNA又はmRNAの「選択的終止変異体」として公知である。選択的終止変異体の特定の１種類は、転写装置による「ポリA終止シグナル」のうちの１つの代替選択（それにより特有なポリA部位で終結する転写産物を産生する）から生じる、複数の転写産物が産生される「ポリA変異体」である。
【００７６】
ひとたび１以上の標的部位が同定されると、標的に十分に相補的である核酸が選択される。それは、該核酸が、遺伝子の発現及び転写又はmRNAの翻訳の阻害という所望の効果を得るために、十分に良く、且つ十分な特異性をもってハイブリダイズすることを意味する。
【００７７】
本発明の文脈において、「ハイブリダイゼーション」とは、相補的ヌクレオシド又はヌクレオチド塩基間の、ワトソン−クリック、フーグスティーン又は逆フーグスティーン水素結合であり得る水素結合を意味する。例えば、アデニン及びチミンは、水素結合の形成を通じて対形成する相補的核酸塩基である。「相補的」とは、本明細書中で使用される場合、２つのヌクレオチドの間の正確な対形成のための能力をいう。例えば、核酸の特定の位置のヌクレオチドが、DNA又はRNA分子の同じ位置のヌクレオチドと水素結合できる場合、該核酸と該DNA又はRNAは、その位置において互いに相補的であるとみなされる。該核酸と該DNA又はRNAは、各分子における十分な数の対応する位置が、互いに水素結合できるヌクレオチドによって占められる場合に、互いに相補的である。従って、「特異的にハイブリダイズできる」及び「相補的」は、該核酸と該DNA又はRNA標的との間に安定かつ特異的な結合が生じるような、十分な程度の相補性又は正確な対形成を示すために使用される用語である。アンチセンス化合物の配列が、特異的にハイブリダイズできるその標的核酸の配列に１００％相補的である必要はないことは、当技術分野において理解される。アンチセンス化合物は、標的DNA又はRNA分子への該化合物の結合が、標的DNA又はRNAの正常な機能を妨害し、機能の喪失を引き起こす場合、並びに特異的な結合が望ましい条件下、即ち、in vivoアッセイ又は治療的処置の場合は生理的条件下、及びin vitroアッセイの場合はアッセイが実施される条件下で、アンチセンス化合物の非標的配列への非特異的な結合を避けるために十分な程度の相補性がある場合、特異的にハイブリダイズできる。
【００７８】
アンチセンス核酸は、アンチセンス化合物の好ましい形態であるが、本発明は、他のオリゴマーアンチセンス化合物（オリゴヌクレオチド模倣体を含むがそれに限定されない）を包含する。本発明に従うアンチセンス化合物は、好ましくは約8〜約50個の核酸塩基（即ち、約8〜約50個の連結されたヌクレオシド）を含む。特に好ましいアンチセンス化合物は、約12〜約30個の核酸塩基を含むアンチセンス核酸である。アンチセンス化合物は、標的核酸にハイブリダイズしてその発現を調節する、リボザイム、外部ガイド配列（external guide sequence）（EGS）核酸（オリゴザイム）、及び他の短い触媒性ＲＮＡ又は触媒性核酸を含む。本発明の文脈における核酸は、「オリゴヌクレオチド」（リボ核酸(RNA)若しくはデオキシリボ核酸(DNA)のオリゴマー若しくはポリマー、又はそれらの模倣体をいう）を含む。この用語は、天然に存在する核酸塩基、糖及びヌクレオシド間(骨格)共有結合から構成されるオリゴヌクレオチド、並びに同様に機能する天然に存在しない部分を有するオリゴヌクレオチドを含む。そのような修飾されたか又は置換されたオリゴヌクレオチドは、例えば細胞への増強された取り込み、核酸標的に対する増強された親和性及びヌクレアーゼの存在下での増大した安定性などの望ましい特性から、しばしば天然形態よりも好ましい。
【００７９】
アンチセンス核酸は、動物及びヒトにおける疾病状態の治療において治療的部分として用いられてきた。リボザイムを含むアンチセンス核酸薬は、ヒトに安全且つ有効に投与されており、現在多数の臨床試験が進行中である。従って、核酸が、細胞、組織及び動物、特にヒトの治療（例えば、１以上のFoxoタンパク質の発現を下方調節すること）のための治療計画において有用であるように形成され得る有用な治療様式であり得ることは確立されている。
【００８０】
本発明のアンチセンス及びsi RNA化合物は、診断、治療、及び予防のため、並びに研究試薬及びキットとして、利用され得る。治療のためには、１以上のFoxoタンパク質の発現を減少させることにより治療され得る疾病又は疾患（糖尿病、メタボリックシンドローム、グルコース不耐性、及び／又はインスリンが不適切に低いレベルである肥満など）を有すると思われる動物（好ましくはヒト）は、本発明に従うアンチセンス化合物の投与により治療される。本発明の化合物は、有効量のアンチセンス化合物を適切な医薬上許容される希釈剤又は担体に加えることにより、医薬組成物において利用され得る。本発明のアンチセンス化合物及び方法は、予防的にも、例えば、糖尿病、グルコース不耐性、メタボリックシンドローム又は肥満の出現を予防するか又は遅らせるためにも、有用である。本発明のアンチセンス化合物及び方法は、メタボリックシンドローム、グルコース不耐性、糖尿病、アテローム性動脈硬化症又は肥満の進行を遅らせるためにも有用である。
【００８１】
本発明は、本明細書中に記載されるアンチセンス化合物を含む医薬組成物及び製剤も含む。
【００８２】
siRNA
米国特許出願2004/0023390（その内容全体が、本明細書中に完全に記載されたかのように、参照により本明細書中に組み込まれる）は、二本鎖RNA（dsRNA）が、RNA干渉（RNAi)として知られるプロセスにより、多くの生物において配列特異的な転写後遺伝子サイレンシングを誘導し得ることを説明する。しかしながら、哺乳動物細胞において、30塩基対又はより長いdsRNAは、タンパク質合成の停止、及びアポトーシスを介した細胞死さえも引き起こす、配列非特異的な応答を誘導し得る。最近の研究は、RNA断片が、RNAiの配列特異的なメディエーターであることを示す（Elbashir et al., 2001)。これらの低分子干渉RNA（siRNA）による遺伝子発現の妨害は、現在、C. elegans、Drosophila、植物において、並びにマウス胚性幹細胞、卵母細胞及び初期胚において、遺伝子をサイレンシングするための天然に存在する戦略として認識されている（Cogoni et al., 1994；Baulcombe, 1996；Kennerdell, 1998；Timmons, 1998；Waterhouse et al. , 1998；Wianny and Zernicka-Goetz, 2000；Yang et al. , 2001；Svoboda et al. , 2000)。
【００８３】
哺乳動物細胞培養において、siRNAを介した遺伝子発現の減少は、合成RNA核酸を用いて細胞をトランスフェクトすることにより達成されてきた（Caplan et al., 2001；Elbashir et al., 2001)。2004/0023390出願（その内容全体が、本明細書中に完全に記載されたかのように、参照により本明細書中に組み込まれる）は、目的とする遺伝子に対してターゲッティングされた低分子干渉RNA分子（siRNA）をコードする核酸配列に作動可能に連結されたpol IIプロモーターを含む発現カセットを含むウイルスベクターを使用する、典型的な方法を提供する。
【００８４】
本明細書中で使用される場合、RNAiは、RNA干渉のプロセスである。典型的なmRNAは、およそ5,000コピーのタンパク質を産生する。RNAiは、妨害するか、又はmRNAによって作られるタンパク質のコピー数を顕著に減少させるプロセスである。例えば、二本鎖の短い干渉RNA（siRNA）分子は、妨害されるべき標的mRNAの、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を相補し、且つ一致するように操作される。細胞内送達の後、siRNA分子は、RNA誘導サイレンシング複合体（RNA-induced silencing complex）（RISC）と会合する。siRNAが会合したRISCは、塩基対合相互作用を介して標的に結合し、それを分解する。RISCは、標的mRNＡの更なるコピーを分解することができる状態で存続する。短いヘアピン型RNA及びより長いRNA分子などの、他の形態のRNAが使用され得る。より長い分子は、例えば、アポトーシスを起こさせ、インターフェロン応答を誘導することにより、細胞死を引き起こす。30ヌクレオチドよりも長いdsRNAは、防御機構を活性化させ、RNA転写産物の非特異的な分解及び宿主細胞の全般的な機能停止をもたらしたことから、細胞死は、哺乳動物においてRNAiを達成するための主要な障害であった。哺乳動物細胞において遺伝子特異的な抑制を媒介するために約20〜約29ヌクレオチドのsiRNAを使用することは、この障害を明らかに克服した。これらのsiRNAは、遺伝子抑制を引き起こすために十分長い。
【００８５】
本発明の特定の実施形態は、動物における、FOXO1、3及び／又は4或いはそのオーソログ、類似体及び変異体の発現を阻害するためのshRNA、アンチセンス又はsiRNAの使用を対象にする。アンチセンスヌクレオチドは、以下により詳細に記載されるように、Foxoタンパク質をコードするヒトDNA又はmRNAを標的とするために、当該分野における通常の技術を使用して設計され得る。本発明のアンチセンス化合物は、in vitroで合成され、生物起源のアンチセンス組成物、又はアンチセンス分子のin vivo合成を指示するよう設計された遺伝子ベクターコンストラクトを含まない。
【００８６】
発現を減少させるために１以上のFoxoタンパク質に十分に相補的であるsiRNAを腸細胞に送達するための、種々の実施形態がある。リポソーム又はナノ粒子でsiRNAをコーティングすることなどの、in vivoトランスフェクションを達成するための、試験された送達方法がある。「トランスキングダムRNA干渉（Transkingdom RNA interference）」と呼ばれる、siRNA送達を腸上皮へ特異的に標的化する新規技術もある。この技術の発明者らは、哺乳動物の遺伝子を標的とする低分子ヘアピン型RNA（shRNA）を産生することができる非病原性E. Coli細菌を遺伝子操作した（Xiang, S., et al., 2009. In vitro and in vivo gene silencing by TransKingdom RNAi（tkRNAi). Methods Mol Biol 487:147-160.)。shRNA導入を促進するために2つの因子が使用された：インベイシン（Inv）及びリステリオリシンO（HlyA）遺伝子。彼らは、組換えE. coliが、血流への細菌の漏出に起因する明らかな全身性の合併症もなく、カテニンb1（Ctnnb1）に対するshRNA（腸上皮細胞においてこの遺伝子の発現を阻害する）を送達するために、経口投与され得ることを示した。本発明の特定の実施形態は、１以上のFoxoタンパク質をサイレンシングするsiRNAに適合させたトランスキングダムRNA干渉法を使用することを対象にする。
【００８７】
他の者は、この技術を、Abcb1をノックダウンするために使用した（Kruhn, A., et al., 2009. Delivery of short hairpin RNAs by transkingdom RNA interference modulates the classical ABCB1-mediated multidrug-resistant phenotype of cancer cells. Cell Cycle 8)。
【００８８】
Foxo1 shRNAをコードする細菌は、Cequent Technologiesから購入することができ、特にそれを推奨される濃度で経口経管栄養により投与することができる。用量は、例えば生検中の、又は被験動物中の、腸細胞におけるFoxo1ノックダウンの分析を使用して決定され得る。
【００８９】
本発明の文脈において、用語「オリゴヌクレオチド」とは、リボ核酸(RNA)若しくはデオキシリボ核酸(DNA)のオリゴマー若しくはポリマー、又はそれらの模倣体をいう。この用語は、天然に存在する核酸塩基、糖及びヌクレオシド間(骨格)共有結合から構成されるオリゴヌクレオチド、並びに同様に機能する天然に存在しない部分を有するオリゴヌクレオチドを含む。そのような修飾されたか又は置換されたオリゴヌクレオチドは、例えば細胞への増強された取り込み、核酸標的に対する増強された親和性及びヌクレアーゼの存在下での増大した安定性などの望ましい特性から、しばしば天然形態よりも好ましい。
【００９０】
本発明のキメラアンチセンス化合物は、2つ以上のオリゴヌクレオチド、修飾されたオリゴヌクレオチド、上記のオリゴヌクレオシド及び／又はオリゴヌクレオチド模倣体の複合構造として形成され得る。そのような化合物は、当該分野においてハイブリッド又はギャップマーとも称されている。そのようなハイブリッド構造の調製を説明する代表的な米国特許としては、米国特許第5,013,830号、第5,149,797号、第5,220,007号、第5,256,775号、第5,366,878号、第5,403,711号、第5,491,133号、第5,565,350号、第5,623,065号、第5,652,355号、第5,652,356号および第5,700,922号が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９１】
本発明のアンチセンス核酸分子は、それらが目的のタンパク質をコードする細胞のmRNA及び／又はゲノムDNAに十分にハイブリダイズするか又は結合し、それにより、例えば、転写及び／又は翻訳を減少させることにより、該タンパク質の発現を減少させるように、典型的には対象に投与され、又はin situで作り出される。ハイブリダイゼーションは、安定な二本鎖を形成する通常のヌクレオチドの相補性によるか、又は、例えば、DNA二本鎖に結合するアンチセンス核酸分子の場合には、二重らせんの主溝における特異的な相互作用を介してなされ得る。本発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の例としては、組織部位における直接注入が挙げられる。或いは、アンチセンス核酸分子は、選択された細胞を標的とするように修飾され、次いで全身性に投与され得る。例えば、全身投与のために、アンチセンス分子は、それらが選択された細胞の表面上に発現した受容体又は抗原に特異的に結合するように、例えば、細胞表面受容体又は抗原に結合するペプチド又は抗体にアンチセンス核酸分子を連結することにより、修飾され得る。アンチセンス核酸分子はまた、本明細書中に記載されるベクターを使用して細胞に送達され得る。アンチセンス分子の十分な細胞内濃度を達成するために、アンチセンス核酸分子が強力なpol II又はpol IIIプロモーターの制御下に置かれたベクターコンストラクトが好ましい。
【００９２】
本発明のアンチセンス核酸分子は、アルファ−アノマー核酸分子であり得る。アルファ−アノマー核酸分子は、相補的ＲＮＡと特異的二本鎖ハイブリッドを形成し、ここで、通常のベータ−ユニットとは反対に、鎖は互いに平行となる（Gaultier et al. （1987）Nucleic Acids. Res. 15:6625-6641）。アンチセンス核酸分子は、2'-o-メチルリボヌクレオチド（Inoue et al.（1987）Nucleic Acids Res.15:6131-6148）又はキメラRNA-DNAアナログ（Inoue et al.（1987）FEBS Lett.215:327-330）を含むこともできる。アンチセンス技術に関して上記論文中に記載される全ての方法は、参照により本明細書中に組み込まれる。
【００９３】
本発明は、リボザイムも包含する。リボザイムは、相補的な領域を有する一本鎖核酸（mRNAなど）を切断することができる、リボヌクレアーゼ活性を有する触媒RNA分子である。従って、リボザイム（例えば、ハンマーヘッドリボザイム（Haselhoff and Gerlach（1988）Nature 334:585-591に記載される））は、標的mRNA転写産物を触媒的に切断し、それにより翻訳を阻害するために使用され得る。標的をコードする核酸に特異性を有するリボザイムは、そのcDNAのヌクレオチド配列に基づき設計され得る。例えば、活性部位のヌクレオチド配列が標的mRNA中の切断されるべきヌクレオチド配列に相補的であるテトラヒメナL-19 IVS RNAの誘導体が構築され得る。例えば、Cech et al. U.S.Pat. No. 4,987,071及びCech et al. U.S. Pat. No. 5,116,742を参照されたい。或いは、標的FOXO mRNAは、RNA分子のプールから、特異的なリボヌクレアーゼ活性を有する触媒RNAを選択するために使用され得る。例えば、Bartel and Szostak（1993）Science 261:1411-1418（参照により本明細書中に組み込まれる）を参照されたい。
【００９４】
本明細書中で使用される場合、用語「核酸」は、cDNA、ゲノムDNA、及び合成（例えば、化学合成された）DNAを含む、RNA及びDNAの両方をいう。核酸は、二本鎖又は一本鎖（即ち、センス又はアンチセンス一本鎖)であり得る。本明細書中で使用される場合、「単離された核酸」とは、哺乳動物のゲノム中の核酸の片側又は両側に隣接する核酸（例えば、ARPKD遺伝子に隣接する核酸)を通常含む、哺乳動物のゲノム中に存在する他の核酸分子から分離された核酸をいう。用語「単離された」は、核酸に関して本明細書中で使用される場合、天然に存在しない配列は天然に見出されず、天然に存在するゲノム中に直接隣接する配列を有さないため、任意の天然に存在しない核酸配列も含む。
【００９５】
単離された核酸は、例えば、天然に存在するゲノム中で通常はそのDNA分子に直接隣接して見出される核酸配列の１つが除去されるか又は存在しない限り、DNA分子であり得る。従って、単離された核酸としては、他の配列とは独立して異なる分子として存在するDNA分子（例えば、化学合成された核酸、又はPCR若しくは制限酵素処理によって生成されるcDNA若しくはゲノムDNA）、並びにベクター、自律複製プラスミド、ウイルス（例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、又はヘルペスウイルス)に、或いは原核生物又は真核生物のゲノムDNAに組み込まれたDNAが挙げられるが、これらに限定されない。また、単離された核酸は、ハイブリッド又は融合核酸の一部であるDNA分子などの操作された核酸を含み得る。例えば、cDNAライブラリー又はゲノムライブラリー、或いはゲノムDNA制限酵素消化物を含むゲル切片中の数百〜数百万の他の核酸の中に存在する核酸は、単離された核酸とはみなされない。
【００９６】
低分子干渉RNA
RNA干渉（以下、「RNAi」）は、多くの真核生物の間で保存されている転写後遺伝子調節の方法である。RNAiは、細胞内に存在する短い（即ち、<30ヌクレオチド）二本鎖RNA（「dsRNA」）分子によって誘導される（Fire A et al.（1998), Nature 391：806-811)。これらの短い、dsRNA分子（「短い干渉RNA」又は「siRNA」と呼ばれる）は、一ヌクレオチド以内の解像度で、siRNAと配列相同性を共有するメッセンジャーRNA（「mRNA」）の破壊を引き起こす（Elbashir S M et al.（2001), Genes Dev, 15：188-200)。siRNA及び標的mRNAは、「RNA誘導サイレンシング複合体（RNA-induced silencing complex）」又は「RISC」に結合し、これが標的mRNAを切断すると考えられている。siRNAは、多重代謝回転酵素とよく似た形で再利用されるようであり、1個のsiRNA分子はおよそ1000個のmRNA分子の切断を誘導することができる。従って、mRNAのsiRNA媒介RNAi分解は、標的遺伝子の発現を阻害するために現在利用可能な技術よりも効果的である。
【００９７】
当業者は、標的タンパク質のcDNA遺伝子配列に基づき、任意の数の異なるsiRNAを作製することができる。特許出願20040023390（その内容全体が、本明細書中に完全に記載されたかのように、参照により本明細書中に組み込まれる）は、二本鎖RNA（dsRNA）が、RNA干渉（RNAi)として知られるプロセスにより、多くの生物において配列特異的な転写後遺伝子サイレンシングを誘導し得ることを説明する。しかしながら、哺乳動物細胞において、30塩基対又はより長いdsRNAは、タンパク質合成の停止、及びアポトーシスを介した細胞死さえも引き起こす、配列非特異的な応答を誘導し得る。最近の研究は、RNA断片が、RNAiの配列特異的なメディエーターであることを示す（Elbashir et al., 2001)。これらの低分子干渉RNA（siRNA）による遺伝子発現の妨害は、現在、C. elegans、Drosophila、植物において、並びにマウス胚性幹細胞、卵母細胞及び初期胚において、遺伝子をサイレンシングするための天然に存在する戦略として認識されている（Cogoni et al., 1994；Baulcombe, 1996；Kennerdell, 1998；Timmons, 1998；Waterhouse et al. , 1998；Wianny and Zernicka-Goetz, 2000；Yang et al. , 2001；Svoboda et al. , 2000)。
【００９８】
哺乳動物細胞培養において、siRNAを介した遺伝子発現の減少は、合成RNA核酸を用いて細胞をトランスフェクトすることにより達成されてきた（Caplan et al., 2001；Elbashir et al., 2001)。20040023390出願（その内容全体が、本明細書中に完全に記載されたかのように、参照により本明細書中に組み込まれる）は、目的とする遺伝子に対してターゲッティングされた低分子干渉RNA分子（siRNA）をコードする核酸配列に作動可能に連結されたpol IIプロモーターを含む発現カセットを含むウイルスベクターを使用する、方法を提供する。
【００９９】
本明細書中で使用される場合、RNAiは、RNA干渉のプロセスである。典型的なmRNAは、およそ5,000コピーのタンパク質を産生する。RNAiは、妨害するか、又はmRNAによって作られるタンパク質のコピー数を顕著に減少させるプロセスである。例えば、二本鎖の短い干渉RNA（siRNA）分子は、妨害されるべき標的mRNAの、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を相補し、且つ一致するように操作される。細胞内送達の後、siRNA分子は、RNA誘導サイレンシング複合体（RNA-induced silencing complex）（RISC）と会合する。siRNAが会合したRISCは、塩基対合相互作用を介して標的mRNA（標的Foxoタンパク質をコードするmRNAなど）に結合し、それを分解する。RISCは、標的mRNAの更なるコピーを分解することができる状態で存続する。短いヘアピン型RNA及びより長いRNA分子などの、他の形態のRNAが使用され得る。より長い分子は、例えば、アポトーシスを起こさせ、インターフェロン応答を誘導することにより、細胞死を引き起こす。30ヌクレオチドよりも長いdsRNAは、防御機構を活性化させ、それはRNA転写産物の非特異的な分解及び宿主細胞の全般的な機能停止をもたらしたことから、細胞死は、哺乳動物においてRNAiを達成するための主要な障害であった。哺乳動物細胞において遺伝子特異的な抑制を媒介するために約20〜約29ヌクレオチドのsiRNAを使用することは、この障害を明らかに克服した。これらのsiRNAは、遺伝子抑制を引き起こすために十分長いが、インターフェロン応答を誘導する長さのものではない。
【０１００】
本明細書中で使用される場合、siRNAの「治療有効量」は、標的mRNAのRNAi媒介分解を引き起こすために十分な量、或いは対象における列挙された疾病の進行を阻害するか又はインスリン- N3 Prog若しくはIns-腸内分泌細胞の表現型をIns+細胞に変えるために十分な量である。
【０１０１】
本明細書中で使用される場合、「単離された」とは、ヒトの介入を介して天然の状態から改変されたか、又は取り出されたことを意味する。例えば、生きている動物中に天然に存在するsiRNAは「単離され」ていないが、合成siRNA、或いはその天然の状態において同時に存在する物質から部分的に又は完全に分離されたsiRNAは「単離され」ている。単離されたsiRNAは、実質的に精製された形で存在することができ、又は、例えば、当該siRNAが送達された細胞などの非天然の環境中に存在することもできる。特に明記しない限り、本明細書における全ての核酸配列は、5'から3'の方向で示される。また、核酸配列中の全てのデオキシリボヌクレオチドは、大文字（例えば、デオキシチミジンは「T」である）によって表わされ、核酸配列中のリボヌクレオチドは、小文字（例えば、ウリジンは「u」である）で表わされる。
【０１０２】
抗体
Foxoタンパク質の生物活性を減少させる薬剤は、目的とするFoxoタンパク質に特異的な結合親和性を有し、それによりその生物活性を妨害する抗体（一部若しくは断片又は抗体断片の変異体、又は抗体の変異体を含む）を含む。これらの抗体は、標的タンパク質又はその生物活性のある断片、即ちFoxo 1、2、3又は4中のエピトープを認識する。特定の実施形態において、抗体は、Foxoの能力を減少させ、N3合成を増加させる。
【０１０３】
「抗体」とは、完全な免疫グロブリン、又は特異的な結合について完全な抗体と競合するその抗原結合部分（断片）をいい、生物活性な抗体断片を含むことが意図されている。列挙された疾病の治療又は予防、或いは記載されたような表現型の変化において治療上有用な抗体は、腸Ins- Prog細胞（腸N3 Prog細胞など）における各Foxoタンパク質の生物活性を減少させる、任意のFoxoタンパク質又はその類似体、オーソログ若しくは変異体（好ましくはFOXO1、2、3又は4）に対する任意の抗体を含む。
【０１０４】
ひとたび製造されると、抗体又はそれらの断片は、標準的なイムノアッセイ法（例えば酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）又はラジオイムノアッセイ（RIA）を含む）により、標的ポリペプチドの認識に関して試験され得る。Short Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., Green Publishing Associates and John Wiley & Sons (1992)を参照されたい。
【０１０５】
用語「エピトープ」とは、抗体が結合する抗原上の抗原決定基をいう。エピトープは、通常、アミノ酸又は糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面基からなり、典型的には、特定の三次元構造特性、及び特定の電荷特性を有する。エピトープは、一般に、少なくとも5個の連続するアミノ酸を有する。用語「抗体（単数）」及び「抗体（複数）」は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化又はキメラ抗体、一本鎖Fv抗体断片、Fab断片、及びF(ab')2断片を含む。ポリクローナル抗体は、特定抗原に特異的である抗体分子の不均一集団であり、一方、モノクローナル抗体は、抗原内に含まれる特定のエピトープに対する抗体の均一集団である。モノクローナル抗体は、本発明において特に有用である。
【０１０６】
目的のポリペプチドに対する特異的結合親和性を有する抗体断片は、公知の技術により作り出され得る。このような抗体断片としては、抗体分子のペプシン消化により生成され得るF(ab')2断片、及びF(ab')2断片のジスルフィド架橋を還元することにより生成され得るFab断片が挙げられるが、これらに限定されない。或いは、Fab発現ライブラリーが構築され得る。例えば、Huse et al.（1989）Science 246:1275-1281を参照されたい。一本鎖Fv抗体断片は、アミノ酸架橋（例えば、15〜18アミノ酸）を介してFv領域の重鎖及び軽鎖断片を連結して、一本鎖ポリペプチドを生じることにより形成される。一本鎖Fv抗体断片は、標準技術（米国特許第4,946,778号に開示されるものなど）により製造され得る。
【０１０７】
「単離された抗体」は、(1)天然に会合する成分（その天然の状態で、それに付随する、他の天然に会合する抗体を含む）と会合していない、(2)同じ種に由来する他のタンパク質を含まない、(21)異なる種に由来する細胞により発現される、又は(4)天然に存在しない、抗体である。
【０１０８】
用語「ヒト抗体」は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する１つ以上の可変領域及び定常領域を有する全ての抗体を含む。好ましい実施形態において、全ての可変領域及び定常領域が、ヒト免疫グロブリン配列由来である（完全ヒト抗体）。これらの抗体は、以下に記載のように、種々の様式において調製され得る。
【０１０９】
ヒト化抗体は、非ヒト種に由来する抗体であり、この非ヒト種抗体において、重鎖及び軽鎖のフレームワークドメイン及び定常ドメイン中の特定のアミノ酸が、ヒトにおける免疫応答を回避又は排除するように変異されている。或いは、ヒト化抗体は、ヒト抗体に由来する定常ドメインを、非ヒト種の可変ドメインに融合することによって製造され得る。ヒト化抗体を作製する方法の例は、米国特許第6,054,297号、第5,886,152号及び第5,877,293号（参照により本明細書中に組み込まれる）に見出され得る。
【０１１０】
用語「キメラ抗体」とは、１つの抗体に由来する１つ以上の領域及び１つ以上の他の抗体に由来する１つ以上の領域を含む抗体をいう。
【０１１１】
抗体の断片、部分又は類似体は、本明細書の教示に従って、当業者によって容易に調製され得る。断片又は類似体の好ましいアミノ末端及びカルボキシ末端は、機能的ドメインの境界近くに生じる。構造的及び機能的ドメインは、ヌクレオチド及び／又はアミノ酸配列データの、公的又は所有配列データベースとの比較によって、特定され得る。好ましくは、コンピューターを使用した比較方法を使用して、公知の構造及び／又は機能の他のタンパク質において生じる配列モチーフ又は予想タンパク質コンフォメーションドメインが特定される。公知の三次元構造をとるタンパク質配列を特定する方法は、公知である。Bowieら、Science 253:164（1991)。
【０１１２】
種々の抗Foxoタンパク質抗体が既に公知である（リスト確認（CONFIRM LIST））。本明細書中に記載されるin vitroスクリーニングアッセイを使用してFoxoタンパク質を阻害する抗体を特定することは、通常の実験の問題である。
【０１１３】
スクリーニング方法
特定の実施形態は、Foxo1除去の化学的模倣体を特定するためのハイスループットスクリーニングアッセイのための、腸上皮細胞のex vivo培養の使用を含む。哺乳動物の腸の腸内分泌細胞（腸Ins- Prog）がインスリンを発現するよう誘導することにおける薬剤の有効性を試験するハイスループットスクリーニングアッセイのための方法であって、記載された腸Ins-細胞を単離すること、並びにインスリンの産生及び分泌に適した条件下でそれらをインキュベートすること、単離された腸Ins-細胞の対照及び被験集団を提供すること、腸Ins-細胞の被験集団を被験薬剤と接触させること；直接的にか又はレポーターマーカーによるかのいずれかで、対照及び被験集団におけるインスリン発現のレベル（又は随意に、培地中に分泌されたインスリンの存在）を決定すること；並びに被験集団におけるインスリンのレベルが対照におけるレベルよりも高い場合、被験薬剤を選択すること、を含む、方法が提供される。そのようにして特定された活性薬剤は、記載された本発明の実施形態において使用され得る。このアッセイは、例えば、インスリン発現のレベルへの薬剤の効果を決定するために、腸Ins-細胞のみを研究することによる他の方法でなされ得る。従って、インスリン発現のレベルを増加させる活性薬剤についてスクリーニングするか、又はアッセイするための、細胞ベースの方法が提供される。本発明の特定の実施形態において、インスリン発現のレベルは、細胞の集団（例えば腸Ins-細胞）において測定され、（a）非インスリン産生性の腸Ins- Prog細胞（哺乳動物の消化管のニューロゲニン3陽性前駆細胞及び／又は幹細胞??を含む）の集団を取り出すこと、（b）細胞の集団を、該細胞におけるFoxoタンパク質（FOXO1、FOXO4及び／又はFOXO3）の発現又は生物活性、或いはその生物活性のある断片、オーソログ、又は変異体のそれを減少させる薬剤と接触させること、（c）インスリン発現のレベルを決定すること、並びに（d）被験集団におけるインスリン発現のレベルが対照におけるよりも高い場合に、薬剤を特定すること、を含む。当業者には、この方法を変化させる方法が知られている。本発明の種々の実施形態の範囲内に含まれるいくつかの活性薬剤は、Foxoタンパク質のリン酸化、分解又は核からの移行を増加させる薬剤を含む。
【０１１４】
一実施形態において、被験細胞の集団は、腸Ins- N3 Prog、及び遷移増幅Prog及び腸幹細胞に富むが、他の細胞型（他の分泌性のもの（例、パネート細胞)、腸内分泌、幹細胞及び遷移増幅前駆細胞を含む）も含む、腸の陰窩を含む。
【０１１５】
腸上皮細胞を機能的なインスリン産生細胞へと変換する低分子のスクリーニング。Foxo1ノックアウトは、Pdx1-Foxo1lox/loxマウス（Foxo1が全ての腸の細胞型（幹細胞及び遷移増幅細胞を含む）において除去された）の腸において機能的なインスリン産生細胞を、十二指腸において腸インスリン産生細胞をもたらす。これらの結果は、複数の腸上皮細胞型が、膵臓発現プロファイルを有するインスリン産生細胞になるよう誘導され得ることを示しており、従って、腸におけるインスリン産生細胞の生成は、限られた数の腸Neurog3+ Prog細胞に限定されない。更に、強固なスクリーニングアッセイを開発する観点から、陰窩から単離された腸上皮細胞が使用され得る。それらが比較的多く、取得が容易であるためである。
【０１１６】
インスリン-GFPノックイン対立遺伝子は、インスリン陽性細胞の生成に関する敏感且つ特異的な読み出し情報である。スクリーニングアッセイの種々の実施形態は、インスリン-GFPノックイン対立遺伝子を有するマウスから腸上皮細胞を単離すること、例えば、低分子ライブラリーを使用するハイスループットスクリーニングに供される初代培養を確立すること、を含む。
【０１１７】
読み出し情報は、緑色の細胞の出現によって表され、検出系は適宜選択される。一実施形態は、2つの陽性読み出し情報を使用する。第一の読み出し情報は、自然蛍光性であるFoxo1ノックアウトNKOマウス由来の培養された細胞を使用する。これは、蛍光細胞が陰性細胞の背景の中で検出され得ることから、陽性対照を提供することと、アッセイの感度を較正することの二重の目的を果たす。第二の陽性対照として、Foxo1 siRNAで形質導入し、in vitroでの腸インスリン産生細胞の生成を再現する条件を最適化した細胞が使用される。該細胞は、Foxo1が阻害された場合、緑色に変わる。別の実施形態は、後期胚の腸から単離された細胞、又は3つのFoxoアイソフォーム（1、3、及び4)に対するsiRNAの混合物で形質導入された細胞を使用する。
【０１１８】
この最初のスクリーニングのいくつかの変形が可能である。?-様細胞であるIns+細胞の出現を導く条件を確立するために、Ins2-Gfpノックイン対立遺伝子を有するマウス由来の初代腸上皮細胞は、Foxo1 siRNAで処置され、Ins-Gfp+細胞の数を最適化するために膵臓分化培地中で培養される。次いで、Ins-Gfp+細胞を生じる低分子をスクリーニングするために、これらの検証された条件が使用され得る。別の実施形態は、細胞を緑色に変え、インスリン分泌を促進させる低分子の能力に関するアッセイを更に含む。これは、増加させたグルコース中、又はさもなくばグルコース及びスルホニルウレア中で初代腸細胞の培養を確立することにより達成され得る。アッセイの第三のセットにおいて、マウスにおけるSTZ誘導糖尿病を改善する能力について陽性ヒットが試験される。
【０１１９】
別の実施形態において、腸内分泌前駆細胞の数を増加させる能力について化合物ライブラリーをスクリーニングするために、Neurog3-Gfpノックインマウスが使用される。アッセイは、上記の方法に従って為される。
【０１２０】
他の実施形態は、動物において、膵機能障害に関連する列挙された疾病又は疾患のいずれかを治療又は予防する、候補薬剤の能力を決定する方法であって、以下を含む方法を対象にする:（ａ）膵臓機能障害に起因する糖尿病である被験動物（例えばKOマウス又はストレプトゾトシン処理マウス又はdb/db若しくはob/obマウス（２型糖尿病及び肥満の2つの動物モデル）又はZDFラット（db/dbマウスと同様の変異を有するラット）又はNZOマウス（やせ型２型糖尿病のモデル）又はfa/faラット（肥満及び糖尿病のモデル）又はGKラット（ラット糖尿病のモデル））及び対照動物を提供すること、（ｂ）候補薬剤を被験動物に投与すること、（ｃ）被験動物におけるインスリン発現のレベルを対照動物におけるインスリン発現のレベルと比較すること、並びに（ｄ）インスリン発現のレベルが、対照動物においてよりも被験動物において高い場合、候補薬剤を選択すること。インスリン発現のレベルは、異なる方法（例えば、血清中インスリンレベル、グルコース耐性の増加、又はインスリン感受性を測定することによるか、或いは腸Ins+細胞の可視化又は検出による）で測定され得る。
【０１２１】
本明細書中で使用される場合、用語「薬剤」又は「外因性化合物」は、腸Ins- Progの腸Ins+細胞への分化を直接的又は間接的に誘導する能力を有する任意の分子（例えば、タンパク質、オリゴペプチド、低分子有機分子、多糖、ポリヌクレオチド、脂質など、又はそれらの混合物）を含む。一般に、種々の濃度への示差的応答を得るために、複数のアッセイ混合物が異なる薬剤濃度で並行して進められる。典型的には、これらの濃度のうち１つは、陰性対照（即ち、ゼロ濃度、又は検出レベル未満で）として働く。
【０１２２】
スクリーニングにおける使用のための被験薬剤は、多数の化学物質クラスを包含するが、典型的には、それらは有機分子であり、好ましくは100ダルトンより大きく、且つ約2,500ダルトン未満（好ましくは約500ダルトン未満）の分子量を有する小有機化合物である。いくつかの被験薬剤は、それらがタンパク質と構造的相互作用（特に水素結合）することを可能にする官能基を含み、典型的には、少なくともアミン、カルボニル、ヒドロキシル又はカルボキシル基を含み、好ましくは該機能的化学基の少なくとも2つを含む。このような薬剤は、多くの場合１以上の上記官能基で置換された環式炭素又は複素環式構造及び／又は芳香族又は多環芳香族構造を含む。被験薬剤は、生体分子（ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造類似体又はそれらの組み合わせを含む）中にも見出される。十分に実証された薬理学的活性を有する高純度な小有機リガンド及びペプチドのライブラリーは、多数の供給源から入手可能である。一例は、1,866個の薬物様化合物(小さい、中程度の疎水性)を含有するNCI diversity setである。他には、多くの広範囲の柔軟な化合物を含む公知の生物活性体のInstitute of Chemistry and Cell Biology(ICCB;Harvard Medical Schoolによって管理)set(467個の化合物)がある。ICCBライブラリーのいくつかの他の例は、以下の通りである：Chem Bridge DiverSet E (16,320個の化合物)；Bionet 1 (4,800個の化合物)；CEREP (4,800個の化合物)；Maybridge 1 (8,800個の化合物)；Maybridge 2 (704個の化合物)；Maybridge HitFinder (14,379個の化合物)；Peakdale 1 (2,816個の化合物)；Peakdale 2 (352個の化合物)；ChemDiv Combilab and International (28,864個の化合物)；Mixed Commercial Plate 1 (352個の化合物)；Mixed Commercial Plate 2 (320個の化合物)；Mixed Commercial Plate 3 (251個の化合物)；Mixed Commercial Plate 4 (331個の化合物)；ChemBridge Microformat (50,000個の化合物)；Commercial Diversity Set1 (5,056個の化合物)。他のNCI Collectionsは、以下の通りである：Structural Diversity Set, version 2 (1,900個の化合物)；Mechanistic Diversity Set (879個の化合物)；Open Collection 1 (90,000個の化合物)；Open Collection 2 (10,240個の化合物)；Known Bioactives Collections:NINDS Custom Collection (1,040個の化合物)；ICCB Bioactives 1 (489個の化合物)；SpecPlus Collection (960個の化合物)；ICCB Discretes Collections。以下のICCB化合物は、ICCB、Harvard、及び他の共同機関の化学者らから個々に収集した:ICCB1 (190個の化合物)；ICCB2 (352個の化合物)；ICCB3 (352個の化合物)；ICCB4 (352個の化合物)。Natural Product Extracts:NCI Marine Extracts (352ウェル)；Organic画分--NCI Plant and Fungal Extracts (1,408ウェル)；Philippines Plant Extracts 1 (200ウェル)；ICCB-ICG Diversity Oriented Synthesis (DOS) Collections;DDS1 (DOS Diversity Set) (9600ウェル)。化合物ライブラリーは、ActiMol、Albany Molecular、Bachem、Sigma-Aldrich、TimTec、及び他等の商業上の供給業者からも入手可能である。
【０１２３】
化合物をスクリーニングするか、設計するか又は修飾する場合、考慮するべき他の因子としては、Lipinskiのrule-of-five (5つ以下の水素結合ドナー(OH及びNH基)；10個以下の水素結合アクセプター(特にN及びO)；500g/mol未満の分子量；5未満の分配係数log P)、並びにVeber基準が挙げられる。それらは製薬分野において認識されており、分子を多かれ少なかれ薬物様にする特性及び構造的特徴に関する。
【０１２４】
ライブラリーは、あらゆる位置での配列優先性又は不変性を伴わないで、完全にランダム化されてもよい。ライブラリーは偏っていてもよい。即ち、配列内のいくつかの位置は、一定に保たれるか、又は限られた数の可能性のあるものから選択される。例えば、ヌクレオチド又はアミノ酸残基は、架橋結合のためのシステイン、SH-3ドメインのためのプロリン、リン酸化部位のためのセリン、トレオニン、チロシン又はヒスチジン等の生成のために、例えば、疎水性アミノ酸、親水性残基、立体的に偏った(小さいか又は大きな)残基の規定されたクラス内で、或いはプリン等に対してランダム化される。
【０１２５】
いくつかの好ましい実施形態において、活性物質は、十分な相補性（本明細書中に記載される）で目的のタンパク質をコードする遺伝子又はそのmRNAのいずれかに結合し、それぞれ遺伝子発現又はmRNAの翻訳を阻害する単離された核酸、好ましくはアンチセンス、siRNA、又はcDNAである。本明細書中、「核酸」若しくは「オリゴヌクレオチド」又は文法上の等価物は、共に共有結合された少なくとも2つのヌクレオチドを意味する。そのような核酸は、一般に、リン酸ジエステル結合を含有するが、いくつかの場合では、下記に概説されるように、例えばホスホルアミド(Beaucage et al., Tetrahedron 49)10):1925 (1993)及びその参考文献；Letsinger, J. Org. Chem. 35:3800 (1970)；Sprinzl et al., Eur. J. Biochem. 81:579 (1977)；Letsinger et al., Nucl. Acids Res. 14:3487 (1986)；Sawai et al, Chem. Lett. 805 (1984)；Letsinger et al., J. Am. Chem. Soc. 110:4470 (1988)；及びPauwels et al., Chemica Scripta 26:141 91986))、ホスホロチオエート(Mag et al., Nucleic Acids Res. 19:1437 (1991)；及び米国特許第5,644,048号)、ホスホロジチオエート(Briu et al., J. Am. Chem. Soc. 111:2321 (1989)、O-メチルホスホロアミダイト結合(Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Pressを参照されたい)、並びにペプチド核酸骨格及び結合(Egholm, J. Am. Chem. Soc. 114:1895 (1992)；Meier et al., Chem. Int. Ed. Engl. 31:1008 (1992)；Nielsen, Nature, 365:566 (1993)；Carlsson et al., Nature 380:207 (1996)を参照されたい、これらのすべては参照によって組み込まれる)を含む代替の骨格を有してもよい核酸類似体が含まれる。
【０１２６】
他の類似体核酸は、陽性の骨格(Denpcy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:6097 (1995)；非イオン性骨格(米国特許第5,386,023号、第5,637,684号、第5,602,240号、第5,216,141号及び第4,469,863号；Kiedrowshi et al., Angew. Chem. Intl. Ed. English 30:423 (1991)；Letsinger et al., J. Am. Chem. Soc. 110:4470 (1988)；Letsinger et al., Nucleoside & Nucleoside 13:1597 (1994)；Chapters 2 and 3, ASC Symposium Series 580, "Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Ed. Y. S. Sanghui and P. Dan Cook；Mesmaeker et al., Bioorganic & Medicinal Chem. Lett. 4:395 (1994)；Jeffs et al., J. Biomolecular NMR 34:17 (1994)；Tetrahedron Lett. 37:743 (1996))、並びに非リボース骨格（米国特許第5,235,033号及び第5,034,506号、並びにChapters 6 and 7, ASC Symposium Series 580, "Carbohydrate Modifications in antisense Research", Ed. Y. S. Sanghui and P. Can Cookに記載されるものを含む）を有するものを含む。１以上の炭素環式糖を含有する核酸も、核酸の定義内に含まれる(Jenkins et al., Chem. Soc. Rev. (1995) pp 169〜176を参照されたい)。いくつかの核酸類似体は、Rawls, C & E News Jun. 2, 1997 page 35に記載される。これらの参考文献は全て、参照により本明細書中に明確に組み込まれる。リボースリン酸骨格のこれらの修飾は、標識等の更なる部分の追加を容易にするために、又は生理的環境中でのそのような分子の安定性及び半減期を増加させるために行われてもよい。また、天然に存在する酸及び類似体の混合物が作られ得る。或いは、異なる核酸類似体の混合物、並びに天然に存在する核酸及び類似体の混合物が作られ得る。核酸は、明示されるように、一本鎖又は二本鎖であり得、或いは二本鎖配列又は一本鎖配列の両方の部分を含有し得る。核酸は、DNA（ゲノム及びcDNAの両方）、RNA又はハイブリッドであり得、核酸は、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドの任意の組み合わせ、並びに塩基（ウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン  ヒポキサンチン、イソシトシン、イソグアニン等を含む）の任意の組み合わせを含有する。
【０１２７】
薬剤は、コンビナトリアルケミカルライブラリーから取得されてもよく、多種多様のものが文献において利用可能である。本明細書中、「コンビナトリアルケミカルライブラリー」とは、規定されたか又はランダムな様式で、一般に化学合成により生成された多様な化合物のコレクションを意味する。数百万の化合物が、コンビナトリアル混合を通して合成され得る。
【０１２８】
スクリーニングにおいて同定された公知の及び新規の薬剤（pharmacological agent）は、構造的類似体を製造するために、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化等の指向性の又はランダムな化学修飾に更に供され得る。薬剤は、タンパク質であり得る。この文脈において「タンパク質」とは、少なくとも2つの共有結合されたアミノ酸を意味し、タンパク質、ペプチド、オリゴペプチド及びペプチドを含む。タンパク質は、天然に存在するアミノ酸及びペプチドが結合したもの、又は合成ペプチド模倣体構造から作り上げられ得る。従って、本明細書中で使用される場合、「アミノ酸」又は「ペプチド残基」は、天然に存在するアミノ酸及び合成アミノ酸の両方を意味する。例えば、ホモフェニルアラニン、シトルリン及びノルロイシンは、本発明のためのアミノ酸とみなされる。「アミノ酸」は、プロリン及びヒドロキシプロリン等のイミノ酸残基も含む。側鎖は、(R)又は(S)配置のいずれかであり得る。好ましい実施形態において、アミノ酸は、(S)又はL配置である。天然に存在しない側鎖が使用される場合、非アミノ酸置換基は、例えば、in vivo分解を予防するか又は遅らせるために使用され得る。
【０１２９】
薬剤は、天然に存在するタンパク質又は天然に存在するタンパク質の断片若しくは変異体であり得る。従って、例えば、タンパク質を含有する細胞抽出物、又はタンパク質性細胞抽出物のランダム若しくは指向性消化物が使用され得る。このように、原核生物及び真核生物のタンパク質のライブラリーは、腸Ins- Prog細胞のIns+細胞への分化を誘導する能力についてスクリーニングするために作られ得る。細菌、真菌、ウイルス、及び哺乳動物タンパク質（後者が好ましく、ヒトタンパク質が特に好ましい）のライブラリーが使用され得る。薬剤は、約5〜約30アミノ酸のペプチドであり得、約5〜約20アミノ酸が好ましく、約7〜約15が特に好ましい。ペプチドは、上記に概説される天然に存在するタンパク質の消化物、ランダムなペプチド、又は「偏った」ランダムなペプチドであり得る。本明細書中、「ランダム化された」又は文法上の等価物は、各核酸及びペプチドが、それぞれ、ランダムなヌクレオチド及びアミノ酸から本質的になることを意味する。一般に、これらのランダムなペプチド(又は下記に論じられる核酸)は化学合成されるため、それらは、任意の位置に任意のヌクレオチド又はアミノ酸を組み込み得る。合成プロセスは、ランダム化されたタンパク質又は核酸を生成するように設計され得、配列の全長にわたり全ての又はほとんどの可能な組み合わせの形成を可能にし、従って、ランダム化された薬剤生物活性タンパク質性薬剤のライブラリーを形成する。更なる変形及び詳細は、Karsentyの米国出願20100190697に説明される。
【０１３０】
薬剤の生物活性のある断片又は変異体
治療剤の生物活性のある断片若しくは変異体も、本発明の範囲内である。本明細書中に記載される場合、「生物活性のある」とは、膵機能障害を有する（即ち、正常レベルのインスリンを産生又は分泌しない）動物において、哺乳動物の腸の腸内分泌細胞（腸Ins-細胞）がインスリンを発現するよう誘導すること、インスリン感受性を増加させること、グルコース耐性を増加させること、体重増加を減少させること、体脂肪量を減少させること、体重減少を増加させること、を含む群から選択される少なくとも１つの効果を増加させることを意味する。断片及び変異体は、以下に記載される。断片は、別個に（他のアミノ酸又はペプチドに融合されず）あり得、或いはより大きなペプチド内にあり得る。更に、いくつかの断片は、単一のより大きなペプチド内に含まれ得る。
【０１３１】
ペプチドの他の変異体は、薬剤に有用且つ新規な特徴をもたらすものが含まれる。例えば、ペプチド薬剤の変異体は、減少した免疫原性、増加した血清中半減期、増加した生物学的利用性及び／又は増加した有効性を有し得る。「ペプチド薬剤の変異体」とは、それらのアミノ酸配列中に修飾（１つ以上のアミノ酸の置換、追加、欠失及び／又は挿入等）を含むが、それでも生物活性のあるペプチドをいう。場合によっては、変異体の抗原性及び／又は免疫原性は、変異体が由来した対応するペプチドに比べて、実質的に変化しない。そのような修飾は、例えばAdelmanら(DNA, 2:183, 1983)によって教示されるように、オリゴヌクレオチド指定部位特異的突然変異誘発等の標準の突然変異誘発技術を使用するか、又は化学合成により、容易に導入され得る。変異体及び断片は、相互に排他的な用語ではない。断片は、該断片がそれでも生物活性のあるように１つ以上のアミノ酸の置換、追加、欠失及び／又は挿入を含み得るペプチドも含む。完全に機能的な変異体は、典型的には、保存的変異又は重要ではない残基若しくは重要ではない領域における変異のみを含む。機能的な変異体は、機能の変化をもたらさないか又はわずかな変化しかもたらさない、類似アミノ酸の置換も含み得る。或いは、そのような置換は、ポジティブに又はネガティブに、ある程度まで機能に影響を与え得る。そのような機能的な薬剤変異体の活性は、本明細書に記載されるアッセイ等のアッセイを使用して決定され得る。
【０１３２】
いくつかの変異体は、薬剤の誘導体でもある。誘導体化は、誘導体と呼ばれる類似する化学構造の生成物へと化合物を変換する、化学において使用される技術である。一般に、化合物の特異的官能基は、誘導体化反応に関与し、反応性、溶解性、沸点、融点、凝集状態、機能的活性、又は化学組成が異なる誘導物に遊離体を変換する。結果として生じる新しい化学的特性は、遊離体の定量若しくは分離に使用され得るか、又は化合物を治療薬として最適化するために使用され得る。誘導体化のための周知の技術は、薬剤に適用され得る。従って、上記ペプチド薬剤の誘導体は、それらが天然のアミノ酸と異なるように、ある方法で化学的に修飾されたアミノ酸を含有する。
【０１３３】
薬剤模倣体も提供される。「模倣体」とは、天然に存在するペプチド又は天然に存在しないペプチドと同じ構造的及び機能的特徴を実質的に有する合成化合物をいい、例として、修飾された骨格、側鎖、及び／又は塩基を有するペプチド様及びポリヌクレオチド様ポリマーを含む。ペプチド模倣体は、鋳型ペプチドの特性と類似の特性を有する非ペプチド薬物として医薬品産業において通常使用される。一般に、模倣体は、生物活性又は薬理学的活性を有するが、１つ以上のペプチド結合が交換されているパラダイムペプチドに構造的に類似している(即ち、同じ形状を有する)。模倣体は、完全にアミノ酸の合成非天然類似体から構成され得るか、或いは部分的に天然のペプチドアミノ酸及びアミノ酸の部分的に非天然の類似体のキメラ分子である。天然のアミノ酸の保存的置換が模倣体の構造及び／又は活性をも実質的に変化させない限り、模倣体は任意の量のそのような置換を組み込むこともできる。
【０１３４】
本発明の範囲内に含まれる活性薬剤になされ得る種々のタンパク質修飾の簡単な説明は、Karsentyの米国出願20100190697に記載される。
【０１３５】
医薬調製物
本発明の特定の実施形態は、本明細書中に定義される１以上の活性薬剤を含む医薬組成物及び製剤を対象にし、それらとしては、腸Ins- Prog細胞、特にN3 Progにおいて、１以上のFoxoタンパク質の発現及び／又は生物活性を減少させ、それによりインスリンを産生し分泌する腸Ins+細胞へとそれらを分化させる、低分子、ポリペプチド、抗体、核酸（アンチセンスRNA、siRNA、マイクロRNAを含む）、Cop1（カスパーゼリクルートメントドメイン含有タンパク質16）及びリボザイムが挙げられるが、これらに限定されない。医薬組成物は、以下の、インスリン分泌及び血清中インスリンの増加、インスリン感受性の増加、グルコース耐性の増加、体重増加の減少、体脂肪量の減少、並びに体重減少を引き起こすことという効果の１つ以上を有する。
【０１３６】
一般に、治療剤は、対象における１及び２型糖尿病、メタボリックシンドローム、並びに肥満を治療又は予防するために、或いは体脂肪量を減少させるために、十分な量で投与される。本発明の医薬組成物は、列挙された疾病又は疾患を治療又は予防するために有効である活性薬剤の量を提供する。
【０１３７】
治療剤の生物活性のある断片若しくは変異体も、本発明の範囲内である。「生物活性のある」とは、Foxoタンパク質の発現又は生物活性を減少させることができることを意味する。候補薬剤は、腸Ins-細胞によるその取り込みを促進するために、化学修飾され得る。例えば、それは、腸細胞による取り込みを促進するために、胆汁酸又は脂肪酸に融合され得る。或いは、それは、その取り込みを促進するために、リポソーム又は他の脂質ベースのエマルション系にパッケージされ得る。それは、腸上皮細胞（N3 Progを含む）へのその結合を促進する修飾細胞表面抗原を発現する細菌によってコードされ得る。細胞への取り込みを改善するために、細胞透過性ペプチドが使用された。（Gratton et al., Nature Medicine  9, 357 - 362（2003））。
【０１３８】
用語「投与する」は、その最も広い意味で使用され、対象に本発明の組成物を導入する任意の方法を含む。
【０１３９】
本発明の医薬組成物は、局所性又は全身性治療のいずれが所望されるか及び治療される領域に応じて、多数の方法で投与され得る。NKOマウスにおいて最も高い密度の腸Ins+細胞を有する腸の領域は、STZ処理NKOマウスにおいて、遠位回腸及び結腸及び十二指腸に位置する。従って、いくつかの実施形態において、医薬組成物は、結腸に経口的若しくは局所的に、又は十二指腸における吸収のためにそれらをターゲッティングする製剤で、投与されるか、或いは、浸透圧ポンプを、好ましくは、十二指腸、遠位回腸又は結腸に近位の部位又は皮下に、移植することにより、投与され得る。投与は、静脈内、非経口／動脈内、皮下、腹腔内若しくは筋肉内注射又は注入、或いは頭蓋内（例えば、髄腔内又は脳室内）投与でもあり得る。坐薬も使用され得る。いくつかの実施形態において、活性薬剤を含む徐放製剤が製剤化される。用語「徐放」とは、１日を超える一定期間にわたるポリマードラッグデリバリーシステムからの薬物の放出をいい、ここで活性薬剤は、有効濃度の薬物を放出するポリマードラッグデリバリーシステムに製剤化される。
【０１４０】
特定の薬物（例えば、胆汁酸吸収を防ぐレジン、又は糖分解の阻害剤）は、２型糖尿病の治療において使用され、血漿中で全く吸収されない。そのような製剤は、本発明の医薬製剤のために有用である。
【０１４１】
特定の実施形態において、本発明の医薬組成物は、約0.1 mg〜5 g、約0.5 mg〜約1 g、約1 mg〜約750 mg、約5 mg〜約500 mg、又は約10 mg〜約100 mgの治療剤を含む。
【０１４２】
浸透圧ポンプを使用する継続投与に加えて、活性薬剤は、単回治療として投与され得、又は、好ましくは、列挙された疾病の１以上の症状を減少させるか又は寛解させるか、或いは、インスリン分泌及び血清中インスリンの増加、インスリン感受性の増加、グルコース耐性の増加、体重増加の減少、体脂肪量の減少、並びに体重減少を引き起こすことという効果を含む所望の効果を達成する、頻度と期間で継続される一連の治療を含み得る。
【０１４３】
活性薬剤の適切な用量は、通常の技術を有する医師、獣医又は研究者の知識の範囲内である、多くの因子に依存することが理解される。用量（複数可）は、例えば、処置される対象又は試料の性質、大きさ、及び状態に依存して、更には組成物が投与される経路、及び活性薬剤が有することを開業医が所望する効果に依存して、変わる。更に、活性薬剤の適切な用量は、調節されるべき発現又は活性に関する有効性に依存することが理解される。そのような適切な用量は、本明細書中に記載されるアッセイを使用して決定され得る。これらの活性薬剤の１以上が、Foxoタンパク質の発現又は活性を調節するために動物（例えば、ヒト）に投与される場合、最初に比較的低用量が処方され得、続いて用量は適切な応答が得られるまで増やされる。また、任意の特定の対象のための特定の用量レベルは、用いられる特定の化合物の活性、対象の年齢、体重、全般的健康状態、性別、及び食事、投与期間、投与経路、排出速度、任意の薬物の組み合わせ、並びに調節されるべき発現又は活性の程度を含む、種々の因子に依存することが理解される。
【０１４４】
１型糖尿病は、通常、小児及び若年成人において診断される−しかし、任意の年齢において起こり得、以前は若年性糖尿病として知られていた。１型糖尿病において、生体は、インスリンを産生しない。インスリンは、糖（グルコース）、デンプン及び他の食物を、日常生活に必要なエネルギーへと変換するために必要とされるホルモンである。１型糖尿病に関連する状態としては、高血糖、低血糖症、ケトアシドーシス及びセリアック病が挙げられる。
【０１４５】
２型糖尿病は、最も一般的な形の糖尿病である。２型糖尿病においては、生体が十分なインスリンを産生しないか、又は細胞がインスリンを無視するかのいずれかである。２型糖尿病に関連する状態としては、高血糖及び低血糖症が挙げられる。
【０１４６】
エネルギー代謝に関連する疾患としては、糖尿病、グルコース不耐性、インスリン感受性の減少、膵臓ベータ細胞増殖の減少、インスリン分泌の減少、体重増加、体脂肪量の増加及び血清アディボネクチンの減少が挙げられる。
【０１４７】
治療剤は、当該分野において周知の方法を使用して、許容可能な担体と共に製剤化され得る。治療剤の実際の量は、医薬組成物の特定の製剤、投与経路、及び用量、治療されるべき状態の特定の性質、並びにおそらく個々の対象に応じて、必然的に変わる。本発明の医薬組成物の用量は、所望の効果、治療上の兆候、及び投与経路、計画、並びに組成物の純度及び活性に依存して、広範にわたり得る。
【０１４８】
適切な対象は、列挙された疾病、及び当業者によって決定され得るような同様の状態を、有することが疑われるか、有すると診断されたか、又は発症するリスクがある、個体又は動物であり得る。
【０１４９】
製剤化及び投与のための技術は、「Remington：The Science and Practice of Pharmacy」（20thedition, Gennaro（ed.）and Gennaro, Lippincott, Williams & Wilkins, 2000）（参照により本明細書中に組み込まれる）に見出され得る。本発明の医薬組成物は、これらに限定されないが、カテーテル、バルーン、移植可能装置、生物分解性植込錠、人工器官、移植片、縫合糸、パッチ、シャント、又はステント等の医療装置によって対象に投与され得る。オリゴヌクレオチドの医薬製剤の詳細な説明は、米国特許第7,563,884号に記載される。
【０１５０】
本発明の医薬組成物は、局所性又は全身性治療のいずれが所望されるか及び治療される領域に応じて、多数の方法で投与され得る。投与は、局所（眼を含み、膣及び直腸送達を含む粘膜に対するものを含む）、肺（例えば、ネブライザーによるものを含む、粉末又はエアロゾルの吸入又は吹き込みによるもの）；気管内、鼻内、表皮及び経皮）、経口又は非経口によるものであり得る。非経口投与としては、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内又は筋肉内注射又は注入；又は頭蓋内（例えば、髄腔内又は脳室内）投与が挙げられる。少なくとも１つの2'-O-メトキシエチル修飾を有するオリゴヌクレオチドは、経口投与のために特に有用であると考えられている。
【０１５１】
活性薬剤は、取り込み、分散、及び／又は吸収を支援するために、他の分子、分子構造体又は化合物の混合物（例として、リポソーム、受容体標的分子、経口製剤、直腸製剤、局所的製剤又は他の製剤）と、混合されるか、カプセルに包まれるか、コンジュゲートされるか、又は他の方法で会合され得る。そのような取り込み、分散及び／又は吸収を支援する製剤の調製を教示する代表的な米国特許としては、米国特許第5,108,921号、第5,354,844号、第5,416,016号、第5,459,127号、第5,521,291号、第5,543,158号、第5,547,932号、第5,583,020号、第5,591,721号、第4,426,330号、第4,534,899号、第5,013,556号、第5,108,921号、第5,213,804号、第5,227,170号、第5,264,221号、第5,356,633号、第5,395,619号、第5,416,016号、第5,417,978号、第5,462,854号、第5,469,854号、第5,512,295号、第5,527,528号、第5,534,259号、第5,543,152号、第5,556,948号、第5,580,575号、及び第5,595,756号（これらのそれぞれは参照により本明細書中に組み込まれる）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５２】
本発明の医薬組成物としては、溶液、エマルション、及びリポソーム含有製剤が挙げられるが、これらに限定されない。これらの組成物は、種々の構成要素（既成液体、自己乳化性固体及び自己乳化性半固体が挙げられるが、これらに限定されない）から生成され得る。
【０１５３】
本発明の医薬製剤（単位用量形態中に都合よく提供され得る）は、医薬品産業において周知の従来技術に従って調製され得る。そのような技術は、有効成分を医薬担体（複数可）又は賦形剤（複数可）に合わせる工程を含む。一般的に、製剤は、均一且つ緊密に、有効成分を液体担体又は微粉化した固体担体又はその両方と合わせ、次いで必要な場合には生成物を成型することにより、調製される。
【０１５４】
非経口、皮内、又は皮下適用のために使用される溶液又は懸濁液は、以下の成分を含み得る：注射のための水、生理食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール又は他の合成溶媒等の無菌希釈剤；ベンジルアルコール又はメチルパラベン等の抗細菌剤；アスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウム等の酸化防止剤；エチレンジアミン四酢酸等のキレート剤；アセテート、シトレート又はホスフェート等のバッファー、及び塩化ナトリウム又はデキストロース等の浸透圧の調節のための薬剤。pHは、塩酸又は水酸化ナトリウム等の酸又は塩基を用いて調節され得る。非経口調製物は、ガラス又はプラスチックで作られたアンプル、使い捨ての注射器又は複数用量バイアル中に封入され得る。
【０１５５】
注射可能な使用に適した医薬組成物は、無菌水性溶液（ここで治療剤は水溶性である）又は分散液及び無菌の注射可能な溶液若しくは分散液の即席調製のための無菌粉末を含む。静脈内投与のために、適切な担体は、生理食塩水、静菌水、Cremophor EL.RTM.(BASF、Parsippany、N.J.)又はリン酸緩衝食塩水(PBS)を含む。全ての場合において、組成物は無菌でなければならず、容易な注射可能性（syringability）が存在する程度まで流動性であるべきである。それは、製造及び保管の条件下で安定であるべきであり、細菌及び菌類等の微生物の汚染作用に対して保存されるべきである。
【０１５６】
担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど)、並びにそれらの適切な混合物を含有する溶媒又は分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチン等のコーティングの使用によって、分散液の場合は必要とされる粒子径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって、維持され得る。微生物の作用の予防は、様々な抗細菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成され得る。多くの場合、組成物中に等張剤（例えば、糖、ポリアルコール（マンニトール、ソルビトール等）、及び塩化ナトリウム）を含むことが好ましい。注射可能な組成物の吸収の延長は、組成物中に吸収を遅延させる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチン）を含むことによってもたらされ得る。
【０１５７】
無菌の注射可能な溶液は、活性薬剤を、必要とされる量で、適切な溶媒中で、上記列挙された成分の１つ又はその組み合わせと共に組み込み、必要に応じて、その後濾過滅菌することにより調製され得る。一般に、分散液は、基本的な分散媒及び上記列挙された成分からの必要とされる他の成分を含有する無菌のビヒクルの中に活性薬剤を組み込むことにより調製される。無菌の注射可能な溶液の調製のための無菌の粉末の場合、好ましい調製方法は、前もって滅菌濾過したその溶液から有効成分及び任意の追加の所望の成分の粉末をもたらす真空乾燥及び凍結乾燥である。
【０１５８】
経口組成物は、一般に、不活性希釈剤又は食用の担体を含む。それらは、ゼラチンカプセル中に封入されるか、又は錠剤へと圧縮される。治療される特定の状態に依存して、アテローム性動脈硬化症又はメタボリックシンドロームの他の要素の治療のための本発明の医薬組成物は、製剤化され、全身投与又は局所投与され得る。製剤及び投与のための技術は、「Remington: The Science and Practice of Pharmacy」(20th edition, Gennaro（ed.）and Gennaro, Lippincott, Williams & Wilkins, 2000)に見出され得る。経口投与のために、薬剤は、胃に耐えるように腸溶性の形態に含有されるか、又は公知の方法によって消化管の特定の領域中に放出されるように更にコーティングされるか若しくは混合され得る。経口治療投与の目的で、活性薬剤は、賦形剤と共に組み込まれ、錠剤、トローチ、又はカプセルの形態で使用され得る。経口組成物はまた、うがい薬としての使用のための流動性担体を使用して調製され得、ここで流動性担体中の化合物は、経口的に適用され、そしてシュッとすすいで吐き出されるか又は飲み込まれる。医薬上適合性の結合剤、及び／又はアジュバント物質は、組成物の一部として含まれ得る。錠剤、ピル、カプセル、トローチなどは、以下の成分又は類似する性質の化合物のうちのいずれかを含有し得る：微結晶性セルロース、トラガカントゴム若しくはゼラチン等の結合剤；デンプン若しくはラクトース等の賦形剤、アルギン酸、PRIMOGEL.RTM.、若しくはコーンスターチ等の崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム若しくはSTEROTES.RTM.等の滑沢剤；コロイド状二酸化ケイ素等の滑剤；スクロース若しくはサッカリン等の甘味料；又はペパーミント、サリチル酸メチル、若しくはオレンジ香料等の香料。
【０１５９】
吸入による投与のために、化合物は、適切な噴霧剤（例えば、二酸化炭素等のガス）を含有する加圧容器若しくはディスペンサー、又はネブライザーから、エアロゾルスプレーの形態で送達される。
【０１６０】
全身投与は、経粘膜手段又は経皮手段によるものでもあり得る。経粘膜投与又は経皮投与のために、透過されるべき障壁に適切な浸透剤が製剤中に使用される。そのような浸透剤は、当該分野において一般に知られており、例えば、経粘膜投与のために、界面活性剤、胆汁酸塩、及びフシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は、鼻腔スプレー又は坐剤の使用を通して達成され得る。経皮投与のために、活性薬剤は、当該分野において一般に知られている軟膏剤、軟膏、ゲル、又はクリームへと製剤化される。
【０１６１】
適切な場合、化合物は、直腸送達のために坐剤(例えば、ココアバター及び他のグリセリド等の従来の坐剤基剤と共に)又は保持浣腸剤の形態でも調製され得る。
【０１６２】
一実施形態において、活性薬剤は、植込錠及びマイクロカプセル化送達系を含む、制御放出製剤等の、生体からの急速な排出に対して化合物を防御する担体を用いて調製される。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸等の、生物分解性の生体適合性ポリマーが使用され得る。そのような製剤の調製方法は、当業者に明白である。原料も、Alza Corporation及びNova Pharmaceuticals, Inc.から商業的に取得され得る。リポソーム懸濁液(例えば、モノクローナル抗体を用いて特定の細胞にターゲッティングされるリポソームを含む)も、医薬上許容される担体として使用され得る。これらは、例えば、米国特許第4,522,811号に記載されるように、当業者に知られている方法に従って調製され得る。
【０１６３】
投与の容易性及び用量の均一性のために、単位用量形態で経口組成物又は非経口組成物を製剤化することは、特に有利である。本明細書中で使用される場合、「単位用量形態」とは、治療される対象のための単一の用量として適した、物理的に別々の単位をいう。各単位は、必要とされる医薬担体と共に、所望の治療効果を生み出すように計算された所定の量の活性薬剤を含有する。本発明の単位用量形態の規格は、活性薬剤の特有の特徴及び達成される特定の治療効果、並びに個人の治療のためにそのような活性薬剤を配合する、当該分野で固有の制限によって決定され、それらに直接依存する。
【０１６４】
前に述べたように、薬剤は、ポンプによって継続的に、又は長時間、日中頻繁に、投与され得る。特定の実施形態において、薬剤は、約0.3〜100 ng/時、好ましくは約1〜75 ng/時、より好ましくは約5〜50 ng/時、そしてなおより好ましくは約10〜30 ng/時の速度で投与され得る。薬剤は、約0.1〜100 pg/時、好ましくは約1〜75 マイクログラム/時、より好ましくは約5〜50マイクログラム/時、そしてなおより好ましくは約10〜30 マイクログラム/時の速度で投与され得る。治療のために使用される抗体、タンパク質、又はポリペプチドの有効な用量は、特定の治療の経過にわたり増加又は減少し得ることも理解されるであろう。用量の変化は、インスリンのレベルのモニタリング並びに／又は生物学的試料、好ましくは血液若しくは血清中の血糖症コントロールのモニタリングに起因してもよく、それから明白になってもよい。
【０１６５】
本発明の一実施形態において、薬物は、所望の時間、所望の用量の薬剤を注入するために浸透圧ポンプを使用して、皮下の、長期的な、自動化された薬剤送達によって送達され得る。インスリンポンプは、広く入手可能であり、長時間にわたりインスリンを自動的に送達するために糖尿病患者によって使用される。そのようなインスリンポンプは、薬剤を送達するように適合され得る。グルコース不耐性、１型又は２型糖尿病をコントロールするための薬剤の送達速度は、個人の変化するインスリン必要量に対応するように広い範囲で容易に調節され得る(例えば、基本的な速度及びボーラス用量)。新しいポンプは、定期的な投与様式を可能にする、即ち、液体は、継続的な流動様式ではなく、少ない固定容量の定期的な別々の用量で送達される。装置についての全体的な液体送達速度は、投与期間を制御及び調節することにより、制御及び調節される。ポンプは、「Analyte Monitoring Device and Methods of Use」と題する米国特許第6,560,471号に記載されるシステム等の継続的な血糖モニタリングデバイス及び遠隔ユニットとつながれ得る。そのような設備においては、継続的血糖モニタリングデバイスを制御する携帯型遠隔ユニットは、血糖モニタリングユニット及び本発明の治療剤を送達する流動性送達デバイスの両方と無線で通信し、それらを制御することができるであろう。
【０１６６】
本発明の組成物は、錠剤、カプセル、液体シロップ、軟ゲル、坐剤、及び浣腸剤などの、しかしこれらに限定されない、多くの可能な剤形のいずれかへと製剤化され得る。本発明の組成物は、水性媒体、非水性媒体又は混合媒体中の懸濁剤としても製剤化され得る。水性懸濁剤は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール及び／又はデキストランを含む懸濁剤の粘度を増加させる物質を更に含有し得る。懸濁剤は、安定化剤も含有し得る。
【実施例】
【０１６７】
実施例１
方法
抗体及び免疫組織化学
組織固定及び免疫組織化学のための処理は、記載されたように実施した（26）。Foxo1及びグルコキナーゼ（Santa Cruz）、Pdx1（C. Wrightからの贈与）、グルカゴン（Sigma、Phoenix Peptide）、GFP（Invitrogen）、クロモグラニンA、Glut2（全てChemiconから）、PC2（US Biologicals）に対するウサギ一次抗体；インスリン（Dako）、膵臓ペプチド（Linco）、GFP（Rockland）に対するモルモット一次抗体、シナプトフィシン（Millipore）に対するマウス一次抗体並びにTLE5/Aes、Neurog3（Santa Cruz）、及びPdx1（C. Wrightから）に対するヤギ一次抗体。FITC-、Cy3-、及びAlexa-コンジュゲートロバ二次抗体（Jackson Immunoresearch Laboratories、及びMolecular Probes Inc）、又は記載されたペルオキシダーゼ染色を使用した（26）。核をDAPIで染色した。画像取得及び分析は、記載されたように行なった（26）。
【０１６８】
動物
Pdx1-Cre (9)、Neurog3-Cre (3)、Rosa26-eGfp、及びNeurog3-Gfp (7)は、記述されている。これらの動物を、Foxo1flox/+雄マウス (33)と交雑させ、Neurog3-cre:Foxo1lox/lox（NKO）及びPdx1-cre:Foxo1lox/lox（PKO）を作り出した。Ins2-Gfpノックインマウスを作り出すために、組換えてIns2コード配列をGfpと置き換えることにより、BACクローンRP22-342（CHORI、Oakland、CA）を改変した。ES細胞に組換えクローンをトランスフェクトし、サザンブロッティングにより相同組換え体を選択した。以前に記載されたように、生殖系列キメラを作り出した(34)。
【０１６９】
生理学的研究。10‐12月齢マウスへのストレプトゾトシン（STZ）（250 mg/kg）の腹腔内注射により、糖尿病を誘導した。NPH‐インスリン（Eli Lilly）2‐4Uを毎日注射することで、対照マウスを処理した。一晩絶食させた3‐4月齢雄マウスにおいて、経口経管栄養（胃への直接のグルコース送達を可能にする先端を長くした針を使用した）又はグルコース溶液の腹腔内注射（2 mg/g体重）により、グルコース耐性試験を実施した。
【０１７０】
インスリンバイオアッセイ。新生仔（P3）の腸、肝臓、及び膵臓から、酸−エタノール抽出物を調製した（35）。組織抽出物又は組換えヒトインスリン（Humulin R、Eli Lilly）(酸−エタノール中10U/ml)を、50マイクロリットルの量での皮下注射のために、インスリン中和抗体（Thermo Scientific）又はアイソタイプ適合マウスIgG1（Ebiosciences）のいずれかと混合した。注射の直前及び5分後に、グルコースを測定した。
【０１７１】
インスリン分泌。成体の腸を0.12 mMジチゾン（DTZ）（10）を含有する培地中で染色し、NKOマウス又は解剖学的に合わせた対照マウスから5インチ長のDTZ+断片を選択した。腸を切り開き、10% FBS及び20 mMグルコースを補充したグルコース不含DMEM中で30分間インキュベートした。インキュベーションの終了時に、ELISA（Millipore）により、培地中のインスリン及びCペプチド2含量を測定した。14週齢WTマウスからのコラゲナーゼ精製膵島を対照とした(5)。
【０１７２】
腸上皮細胞の単離
腸を正面向きに（en face）切開し、氷冷PBS（Mg2+/Ca2+）で洗浄し、5〜10 mm長の小片に刻んだ。腸の断片を20 mM EDTA中37度でインキュベートし、続いて10-mlピペットを使用して冷PBS中に勢い良く再懸濁した。次いで、分泌及びRNAアッセイのために、遊離させた上皮細胞を回収した。
【０１７３】
FACS分析のための腸上皮の単細胞単離は、絨毛画分を試料に含めたことを除き、記載されたように行なった（36）。
【０１７４】
Golaz et al., In vitro Cell. Dev. Biol. 2007からの十二指腸培養プロトコール（イヌ）
培地1:
FCM：OptiMEM GlutaMax
Anti-anti
mEGF（20ng/ml）（Sigma）
ウシ膵臓由来インスリン（10 ug/ml）(Sigma)
ヒドロコルチゾン21ヘミスクシナートナトリウム塩（150nM)(Sigma)
N2 supplement（0.5X)（R&D system)
B27（0.5X)（R&D system)
10% FCS（Hyclone；Thermo Scientific)
Primocin（InVivoGen）
培地2（光から保護した）=
培地1に加えて
+ m-Wnt3a（50ng/mL)（R&D system)
+Chir99021 3uM（Stemgent)
+LDN-193189 25uM（Stemgent)
培地3
+ m-Wnt3a（100ng/mL)（R&D system)
+Chir99021 6uM（Stemgent)
+LDN-193189 25uM（Stemgent)
+ FGF4 50ng/ml
+ 2% FCS
培地3b
+ m-Wnt3a（100ng/mL)（R&D system)
+Chir99021 6uM（Stemgent)
+LDN-193189 25uM（Stemgent)
+ FGF4 50ng/ml
+ 2% FCS
培地4
= 培地3b + 0% FCS
【０１７５】
腸及び結腸から陰窩を単離する方法
１．マウスから6インチの遠位回腸及び4インチの結腸を取り出し、それらを氷冷DPBS/10%FBS中に回収する。
２．該区域を切り開き、氷冷強化培養培地（fortified culture medium）(FCM)で5回洗浄する。
３．十二指腸の各小片を無菌のペトリ皿上に広げ、無菌の外科用メスの刃を用いて穏やかに管腔表面をこすり、粘液及びほとんどの絨毛を除去する。（こすり取ったものは廃棄する）
４．残った漿膜を50mlチューブ（FCM）中に入れる
５．沈降によりペレットを洗浄し、上清を吸引する。
６．PBS中、2mM EDTAで30分間キレート化を行なう。
７．EDTAとのインキュベーションの後、小片を沈降させ、上清を除去する。
８． 10 ml PBSO 10% FBSを添加し、数回（3-5回）ピペットで吸出しし、次いでそれを70μMストレーナーを通過させることにより上清を回収し、新しいストレーナーを使用してこれを更に3回繰り返す（これらは、異なる陰窩溶出画分である）
９．陰窩画分を800 rpmで5分スピンダウンし、ペレットを形成させる。
１０．ペレットを10ml 冷FCMで再懸濁し、チューブを低速で遠心し（600rpm、2分）、単細胞（ほとんどがリンパ球）を除去する。
１１．顕微鏡を使用して、各画分からの、ストレーナー通過後の陰窩の大きさをチェックし、画分ごとの陰窩の数を見積もり、それらを600 rpmで5分間4℃でスピンする。
１２．所望の量の陰窩を600 rpmで5分間再びスピンし、上清のほとんどを除去し、ペレットを氷上に置く。（24ウェルプレート中の1個のウェルのために、100-1000個の陰窩を50 μlマトリゲルドロップ中に希釈することが必要である）
１３．20個のウェルのために、1 mlの解凍したマトリゲルを1000 - 10,000個の陰窩を含むペレットに添加し、冷1000 μlチップを使用して穏やかにピペットで吸出しする（マトリゲルは、陰窩ペレット及びチップのように、氷上にあるべきである）。
１４．培地1（上記）中で37℃にて3日間培養し、次いで培地2に変え、1日おきに培地を変えて3日間培地2中で維持する。
１５．4〜6日目は、細胞を培地3又は培地4のいずれか中に維持した。培地4はsiRNA研究用に使用する。
【０１７６】
RNA手順。mRNA単離及び定量PCRのための標準の技術を使用した。RT-PCRを35サイクル行なった。Pc2、Gck、Kir6.1、Sur1 ニューロゲニン3、Pdx1、MafA、Nkx6.1、NeuroD1、Nkx2.2、Arx、Pax4、チューブリン2（37）、インスリン1、インスリン2（38）、Glp132、Math1及びHes138Hes1（38）のためのプライマー配列は、記述されている。
【０１７７】
統計分析。スチューデントのt検定を使用してデータを分析した。1つのアステリスク：P< 0.05；2つのアステリスク：P< 0.01。平均± SEMとしてデータを表す。
【０１７８】
実施例２
Foxo1除去は、腸におけるNeurog3+細胞の数の10倍の増加をもたらした
転写因子Foxo1は、膵臓ベータ細胞機能の複数の面を調節し（4t）、Neurog3+ 膵臓内分泌系前駆細胞において広く発現する（5）。単離されたヒト胎児膵臓上皮において、FOXO1ノックダウンは、NEUROG3+細胞の数を増加させる（6t）。膵臓と同様に、Foxo1は、二重免疫組織化学によって確認されるように、ほとんどのNeurog3+腸内分泌前駆細胞（EEP）においても発現する（7t）（図1a及び5）。成体マウスにおけるFoxo1発現（ヒトFOXO1、3及び／又は4の構造的及び機能的なオーソログ）は、一部の細胞（形態及び局在に基づき、腸全体にわたる分泌細胞、内分泌系及び幹細胞を含む）に局在する。腸内分泌細胞は、一部の分泌細胞である。3つの分泌細胞型がある：杯細胞、パネート細胞、及び腸内分泌細胞。杯細胞及びパネート細胞は、通常、ホルモンを産生しない。通常の条件下のFOXO1産生ニューロゲニン3+腸内分泌前駆細胞（N3 Prog）は、N3もインスリンも産生しない消化管ホルモン陽性娘細胞へと分化する（それらはIns-である）。
【０１７９】
腸内分泌細胞におけるFoxo1の役割を検討するために、Neurog3+腸内分泌前駆細胞におけるFoxo1の体細胞性欠失を有するマウスを作り出した（NKO、又はNeurog3駆動（-driven）Foxo1ノックアウト）（21）。Neurog3+細胞におけるCre媒介組換えを評価するために、NKO及びNeurog3-Gfpトランスジェニックマウスを交雑させた。免疫組織化学は、Foxo1が、Gfp標識細胞において、もはや検出可能でないことを示し、欠失が効率よく起きたことを示した（図1b）。
【０１８０】
Foxo1除去は、以下により実証されたように、Neurog3+細胞の数の10倍の増加をもたらした（図6）：
(i)    抗Neurog3抗体を用いる免疫組織化学
(ii)   フローソートしたGfp+細胞におけるNeurog3 mRNA測定（図6）。
(iii)  NKO:Neurog3-Gfp二重トランスジェニックマウス由来Gfp+細胞のフローサイトメトリー分析（//2011年3月の論文中の補足図2）Neurog3-Gfpトランスジェニックを用いる系統追跡研究（7）。
【０１８１】
正常な動物において、腸N3 Prog細胞は、非インスリン産生腸内分泌細胞のみを作る。マウス腸におけるFoxo1のノックアウトが、腸N3プール細胞の約10倍の増加をもたらすことを発見した。それらは領域特異的である（即ち、Ins+細胞は、典型的には、NKOマウスの遠位回腸及び結腸においてより高い頻度で見出されるが、STZ後の実験は、腸Ins+細胞が再生し、腸全体にわたって見出されることを示した）と思われることから、インスリン産生細胞になる腸N3 Prog Foxo1（-/-）プールから細胞の％を見積もることは困難である。このことは、腸の別の場所にある腸N3 Prog Foxo1(-/-)細胞も、炎症シグナル等の追加の合図に応答して、Ins+細胞を産生する潜在力を有することを示唆する。
【０１８２】
Neurog3+細胞の増加は、クロモグラニン（Chromagranin）A（Neurog3活性化の後に発現する、腸内分泌細胞分化のマーカー）を発現する細胞の同様の増加に関連しており、このことは、Foxo1除去が、腸Neurog3+前駆細胞及びそれらの娘細胞を増加させることを示した（8）（図6）。
【０１８３】
実施例３
Foxo1除去は、腸の腸内分泌細胞が、インスリンを作り、且つ膵臓細胞発現プロファイルを備える腸Ins+細胞へと分化することを誘導した
正常マウス（Foxo1fl/fl）を、Foxo1遺伝子の体細胞性欠失を有するFoxo1ノックアウトマウス（NKO、又はニューロゲニン3駆動Foxo1ノックアウトと呼ばれる）と比較した。組織学的研究は、特に、Foxo1が、正常マウスにおいて、腸N3前駆細胞（図1b）及びそれらのN3-、インスリン-陰性（Ins-）子孫（腸Ins-細胞）の両方に局在することを示した。
対照的に、新生仔のNKO（P1）マウスの腸を消化管及び膵島ホルモンに対する抗体を用いる免疫組織化学により調査した場合、正常マウスとは異なり、新生仔のNKOマウスが多くのインスリン陽性（インスリン免疫反応性）腸Ins+細胞を有することを発見した（図1c）。
【０１８４】
膵臓特異的ホルモンであるグルカゴンと免疫反応性である細胞（Gcg+）又は膵ポリペプチドと免疫反応性である細胞（Pp+）（図7）も、新生仔及び成体マウスの両方においてより低い頻度ではあるが見られた。Ins+細胞は、結腸を含む腸全体にわたり存在した（図8）。また、RT‐PCR分析は、NKOマウス腸内の細胞から抽出したRNA中のIns1及びIns2転写産物の存在を確認したが、対照腸については確認されなかった（図9）。
【０１８５】
従って、NKO動物におけるFoxo1除去は、一部の腸の腸内分泌細胞における広範な膵臓内分泌系発現プログラムを活性化し、それらの表現型を非インスリン産生性（腸Ins-）からインスリン産生性（腸Ins+細胞）に変えた。
【０１８６】
実施例４
腸Ins+細胞はインスリン陰性前駆細胞に由来する
これらのIns+細胞の起源を検討し、それらの正体についての独立した証拠を提供するために、マウスにおいて3つの追加の遺伝的モデルを作り出した。NKOマウスにおけるデータは、ニューロゲニン3腸内分泌系前駆細胞におけるFoxo1除去が、膵臓様内分泌系分化を活性化するために十分であることを示すが、これが、運命決定されていない腸の前駆細胞（幹細胞、遷移増幅前駆細胞、又は分泌性前駆細胞21等）の一般的特徴ではなく、ニューロゲニン3+細胞の特異的な特性であることは実証しない。最初に、Foxo1を、Pdx-creを使用して、十二指腸上皮前駆細胞（Neurog3+細胞腸内分泌前駆細胞の先駆けである）において除去した（9）（Pdx1駆動Foxo1ノックアウト、又はPKO）。NKOマウスと同様に、PKOマウスは、十二指腸におけるIns+細胞、及びNeurog3-Gfp+細胞の顕著な増加を示した（図10）。PKOマウスを、Neurog3-Gfpレポーターマウスと交雑させ、Foxo1除去を確認した。これらの実験は、腸におけるIns+細胞が、ニューロゲニン3+前駆細胞（N3 Prog）の増加したプールから生じることを確認した。腸Ins+細胞は、腸の幹細胞又は遷移増幅前駆細胞におけるFoxo1機能によって影響を受けなかった。腸の前駆体（全ての腸上皮細胞が生じる細胞であって、分泌細胞を含む）における全般的なFoxo1ノックアウトは、腸内分泌前駆細胞（腸内分泌細胞が生じる細胞）におけるFoxo1ノックアウトを表現型模写した。腸の前駆体は、全ての腸の細胞型（ひいてはN3 前駆細胞細胞を生じる、幹細胞及び遷移増幅前駆細胞を含む）を生じる。この実験は、腸幹細胞及び腸N3 Prog並びにそれらの子孫においてFoxo1をノックアウトすることも、腸内分泌Ins+細胞表現型の形成をもたらすことを強調する。Foxoタンパク質を減少させることにより、一部の既存の腸腸内分泌Ins-細胞がIns+表現型を獲得し得ることも可能性がある。
【０１８７】
内因性Ins2転写の敏感且つ特異的な読み出し情報を提供するために、遺伝子ターゲティングにより、インスリン2-Gfpノックイン対立遺伝子を有するマウスを作り出した。Ins2-Gfp対立遺伝子をNKOマウス（NKO-インスリン2-Gfp）へと導入した場合、変異マウスの腸におけるIns2-Gfp+細胞は容易に検出されたが、WT同腹子においてはそのような細胞はなかった。対照的に、Ins2-Gfp発現は、両方の遺伝子型の膵島において検出された（図1d）。インスリン及びGfp抗体を用いる二重免疫組織化学は、Ins+細胞としてのGfp+細胞の正体を確認した（図1e）。
【０１８８】
最後に、遺伝的系統追跡実験を使用して、Ins+細胞が、細胞自律的又は非自律的メカニズムのいずれから生じるかを検討した。これを行なうために、成体の腸においてNeurog3-Cre-活性細胞及びそれらの娘細胞を標識するためにRosa26eGFPレポーター対立遺伝子を有するNKOマウスを作り出した（NKO- Rosa26eGfp）。膵臓において、全てのベータ細胞は、NKOマウス及び対照同腹子の両方においてGfp+であった（図1f）。NKOマウスにおいては、腸Ins+細胞のみがGfp+であり（確認（CONFIRM））、このことは、インスリン発現がCre媒介組換えを受けた細胞において起きたことを示した（図1f）。
【０１８９】
実施例６
腸Ins+細胞は最終分化しており、膵ベータ細胞と系統を共有する
腸Ins+細胞が最終分化しているか否かを検討するために、適切なマーカーを用いる免疫組織化学を実施した。プロホルモン転換酵素2（Pc2）、グルコキナーゼ（Gck）、スルホニル尿素受容体（Sur1）及びグルコース輸送体2（Glut2）の発現（図2a-d）を検出した。これらのマーカーは、最終分化した膵臓ベータ細胞において発現する。Pc2は、特に、正常マウスにおけるベータ細胞に特異的である。腸Ins+細胞は、汎内分泌系（pan-endocrine）マーカーであるシナプトフィシンに対する抗体によっても修飾され（図2e）、このことは、それらがホルモン産生細胞であることを示した。要するに、腸Ins+細胞は、膵ベータ細胞と重要な特徴を共有する。免疫組織化学的知見は、腸上皮細胞の単離物におけるPc2、Gck、Kir6.2、及びSur1をコードするmRNAのレベルの増加に関連していた（図11）。
【０１９０】
Znキレート剤であるジチゾン（DTZ）（生きている膵島のためのマーカー（10））を使用して、更なる分析のために、Ins+細胞に富む腸試料を局在化した。ベータ細胞分化の転写調節因子であるPdx1、MafA、Nkx6.1、Nkx2.2及びPax4をコードするmRNAを、DTZ濃縮NKO腸由来の単離された上皮細胞において検出した（図12）。Pdx1及びNkx6.1の発現は、免疫組織化学により確認した（図13）。低密度PCRアレイを使用して、NKO腸上皮細胞において、groucho関連遺伝子Aes（Amino-terminal enhancer of split、Tle5としても知られる）（11）をコードする転写産物の実質的な（>100倍）増加を検出した（図14）。Aesは、発生中及び成体の膵臓において発現し（12）、異所性Aes発現は、Nkx 2.2及びNkx 6.1ニューロンドメインの増加に関連する（13）。免疫組織化学により、Aes発現は、腸Ins+細胞に局在化された。更に、系統追跡実験は、NKO:Rosa26eGfpマウスにおけるGfp+細胞がAes抗体によって修飾されることを示し（図14）、このことは、Foxo1除去が細胞自律的様式でAes発現を促進することを実証した。これらの知見は、腸Ins+細胞と膵ベータ細胞との間の系統の共有の更なる証拠を提供する。
【０１９１】
実施例7
NKO腸は、グルコース用量依存的様式で、インスリン及びCペプチドを分泌する
調節されたインスリン分泌は、ES細胞由来インスリン産生細胞において再現するのが難しいことが証明されている、膵ベータ細胞の重要な特性である（14）。腸Ins+細胞が機能的にインスリンを分泌する能力があるか否かを決定するために、本発明者らは、NKOマウスからのIns+細胞に富む腸区域及び対照マウスからの解剖学的に合わせた区域を選択するために、DTZ染色を使用して、グルコース及びKATPチャネルモジュレーターに応答するインスリン分泌のex vivoアッセイを実施した。NKO腸は、グルコース用量依存的様式でインスリン及びCペプチドを放出した。即ち、11 mMグルコースにおけるインキュベーションは2.5倍のインスリン分泌の増加をもたらしたのに対し、22 mMグルコースにおけるインキュベーションは>7倍のインスリン分泌の増加をもたらした。スルホニル尿素グリベンクラミド（KATPチャネル遮断剤）は、グルコース誘導インスリン放出を増加させ、一方KATPチャネル活性化剤ジアゾキシドはそれを鈍らせた（図3a-b）。
【０１９２】
グルコース依存性インスリン及びCペプチド分泌アッセイ
0.12 mMジチゾン（DTZ）（Tuttle et al Nat Med, 2001）を含有する培地中で成体の腸を染色し、NKOマウスからの5インチ長のDTZ+断片又は対照WTマウスからの解剖学的に合わせた断片を選択した。本発明者らは、腸のen face調製物を作り、それらを、1時間、種々の濃度のグルコース、0.5 mMジアゾキシド（Sigma）、又は10 nMグリベンクラミド（Tocris）を補充したHEPES-クレブス・リンガー緩衝液中でインキュベートした。インキュベーションの終了時に、本発明者らは、ELISA（Millipore）により、培地中のインスリン及びCペプチド2含量を測定した。14週齢WTマウスからのコラゲナーゼ精製膵島を対照とした（Kitamura et al., MCB 2009）。成体の腸を使用して、実験を行なった（n=4）。
【０１９３】
実施例８
腸Ins+細胞により分泌される腸のインスリンは生物活性である
腸Ins+細胞によって分泌された腸のインスリンが生物活性であるか否かを調べるために、NKO腸から酸−エタノール抽出物を調製し、WTマウスの腸、膵臓及び肝臓からも抽出物を調製し、新生仔マウスへと注入した。新生仔のNKO腸からの抽出物は、年齢を合わせた対照マウスからの膵臓抽出物又は組換えヒトインスリンと同様に、血中グルコースを約20%低下させた（図3c）。対照的に、対照腸又は肝臓からの抽出物は、影響しなかった。血中グルコースを低下させるNKO腸抽出物の能力（腸Ins+細胞の存在を反映している）は、対照マウスからの膵臓抽出物及び組換えインスリンがそうであったのと同様に、インスリン中和抗体の添加により阻止された。対照的に、アイソタイプを合わせた対照IgGとNKO 腸抽出物をインキュベートすることは、糖血症を下げるそれらの能力に影響せず（図3c）、このことは、血糖低下効果は、NKO腸抽出物中の他の因子ではなく、インスリンに起因することを示した。これらの結果は、腸Ins+細胞によるインスリン分泌がグルコース及びKATPチャネルモジュレーターによって調節され得ること、及び腸由来インスリンが生物活性であること、を示す。
【０１９４】
実施例９
in vivoにおけるストレプトゾトシン処理NKOマウスは、正常に近い経口グルコース耐性を示した
膵臓内分泌細胞とは異なり、腸の腸内分泌細胞は、生涯を通じてNeurog3+ 前駆細胞から生じる（21）。従って、腸Ins+細胞が、毒素誘導糖尿病モデルにおいて島ベータ細胞よりも高い再生能力を有する可能性がある。これを試験するために、ストレプトゾトシン（STZ）をNKO及び対照マウスに投与し、それは高血糖をもたらした（図4a）。対照マウスにおけるグルコースレベルは、28日間毎日のインスリン投与により約500mg/dlに維持された。対照的に、NKOマウスはインスリンを受けなかったが、それらのグルコースレベルは、STZの9日後に自発的に減少し始め、給餌状態において約250 mg/dlで安定した（図4a）。
【０１９５】
インスリンを中止すると、100%の対照マウスは60日目までに死亡し、一方75%のNKOマウスは92日目の実験の終了時まで生存した（図4b）。STZ処理NKOマウスは、正常に近い経口グルコース耐性を示した（図4c）。免疫組織学的分析は、STZが、膵臓及び腸の腸Ins+細胞のいずれかを除去することを明らかにした（図4d）。STZ除去への腸Ins+細胞の感受性は、それらが膵ベータ細胞と類似していることの更なる証拠を提供する（15）。
【０１９６】
STZ後28日目に取得した試料において、腸Ins+細胞は、STZ処理前と比較してより高い頻度でNKO腸中に存在し、それらは成熟ベータ細胞のマーカー、Pc2（図4d）及びAes（図14）を発現しており、それらの機能的な特性が完全なままであることを示唆した。細胞を系統追跡するためにNKO:Ins2-Gfpノックインマウスを使用して、本発明者らは、STZ後、腸Ins+細胞が内因性Pc2発現を活性化すること（それは、STZ前に観察した腸Ins+細胞と同様である）を決定した（図2b）。腸とは対照的に、免疫組織化学的調査は、NKOマウスにおける膵臓ベータ細胞再生の証拠は示さず（図4d）、実験の終了時の膵臓インスリン含量は、ビヒクル処理対照と比較してほぼ検出不能であり（0.1±0.08 μg/ STZ後膵臓 vs. 26±2.25 ｜g/STZ前膵臓）、従って観察された表現型への膵臓ベータ細胞再生の寄与は除外された（16）。対照マウスからの腸又は膵臓においては、いかなる段階においても、Ins+細胞はなかった（図4d）。PKOマウスにおける腸Ins+細胞は、STZ処理前と比較してより高い頻度で見出された。
【０１９７】
実施例１０
Foxo1とハイブリダイズするsiRNAは、腸インスリン- Progを腸Ins+細胞へと分化させる
siRNAがFoxoタンパク質の発現を減少させ得るか否かを決定するために、一連の実験では、対照WTマウス及びNeurog3-Foxo1ノックアウト（NKO）マウス（それらの両方とも、Ins2遺伝子座にGFPレポーターを保持するように遺伝子操作した）の両方の遠位回腸及び結腸から単離した陰窩を使用した。最初に、細胞を、in vitroで培地1中で培養した。培養3日後、正常又はNKO-GFPマウスのいずれにおいてもGFP-Ins+細胞は無かった。図16。3日目に細胞を培地2に変え、そして6日目までのライブ蛍光顕微鏡像は、NKOマウスにおけるインスリン- Prog細胞の一部が、緑色蛍光タンパク質を発現するインスリン+細胞に分化／転換したことを示した。図17。記載したように単離した陰窩を培地1中で1日間、培地2中で2日間、次いで培地4b中で3日間インキュベートした場合、インスリン+細胞の%は、更により高いレベルに増加した。図18。これらの陰窩を分析した場合、緑色細胞は生きており、青色細胞は死んでいると決定された。図19。
【０１９８】
最後に、正常なWT Ins- Prog細胞をインスリン産生細胞へと分化させるsiRNAと正常なWT Ins- Prog細胞を接触させることにより、正常なWT Ins- Prog細胞がFoxo1の不活性化に応答するか否かを決定するために、実験を行なった。単離された陰窩を、培地1中に1日間、培地2中に2日間維持した。3日目に、細胞を培地4bに交換し、それにはトランスフェクションリポソーム（MirusによるTrans-IT）中で送達される50nMのsiRNAを含める//総最終濃度 = 50nMを細胞に曝露する（50nMのsiRNAを添加するのではない）//Foxo1遺伝子（確認（CONFIRM））に十分に相補的であり、その発現を不活性化する。次いで、陰窩を、siRNAと更に72時間インキュベートした。現在の用量において、既に相当に有毒である//図20に示すように、Foxo1発現（遺伝子転写）のsiRNA阻害は、インスリン+細胞の出現をもたらした。このことは、正常WT腸Ins- Prog細胞をFoxo1に対するsiRNAと接触させることは、細胞をインスリン+ 腸内分泌表現型へと転換させることを示す。
【０１９９】
細胞を単離し、（培地1及び2）中で3日間、非siRNA実験と同様に増殖させた。1:5希釈マトリゲル（BDbiosciences.）中、96ウェルプレート中1ウェル当たり100個の陰窩を播種した。
【０２００】
siRNAを50nMの終濃度に希釈し、製品（Trans-It、Mirus）に応じたプロトコールを使用して、72時間、4b培地（簡潔には、培地 2 + 0 % FCS、100ng/ml mWnt3a、50ng/ml FGF4）中でトランスフェクトした。
【０２０１】
Thermo Scientific（Dharmacon Accell SMARTpool、Mouse FOXO1、E-041127-00-0010、3'-UTR）並びに陰性対照及びトランスフェクション対照（Dharmacon Accell Mouse Control siRNA Kit - Red、K-005000-R1-02、4つの対照）を使用して、実験を行なった。
【０２０２】
各条件を四連（quad-duplicates）で行なった。
【０２０３】
96ウェルプレート中のウェル毎に表現型変化（生きている緑色細胞の#）についてsiRNAをアッセイし、Foxo1ノックダウンをqPCRにより確認した。
Foxo1 siRNA処理細胞は、1ウェル当たり2%の緑色細胞を生じさせた。
Accell SMARTpool siRNA A-041127-13、
標的配列：     CUAUUAUUGUACAUGAUUG FOXO1                 配列番号7
Mol. Wt. 13,501.1（g/mol）
xt. Coeff. 372,198（L/mol・cm)
Accell SMARTpoolsiRNA A-041127-14、FOXO1
標的配列：     CGAUGAUACCUGAUAAUG                             配列番号8
Mol. Wt. 13,521.4（g/mol）
Ext. Coeff. 365,968（L/mol・cm)
Accell SMARTpool siRNA A-041127-15、FOXO1
標的配列：UCGUAAACCAUUGUAAUUA                                   配列番号9
Mol. Wt. 13,489.3（g/mol）
Ext. Coeff. 376,470（L/mol・cm)
Accell SMARTpool siRNA A-041127-16、FOXO1
標的配列：CCAGGAUAAUUGGUUUUAC                                    配列番号10
Mol. Wt. 13,519.3（g/mol）
Ext. Coeff. 361,874（L/mol・cm）
カタログアイテム
K-005000-R1-02
Accell Mouse Control siRNA Kit - Red
The
ON-TARGETplus SMARTpool siRNA J-041127-05、FOXO1
標的配列：GGUGUCAGGCUAAGAGUUA                                   配列番号11
Mol. Wt. 13,429.9（g/mol）
Ext. Coeff. 371,219（L/mol・cm)
ON-TARGETplus SMARTpool siRNA J-041127-06、FOXO1
Mol. Wt. 13,414.8（g/mol）
Ext. Coeff. 377,004（L/mol・cm)
標的配列：GUAAUGAUGGGCCCUAAUU                                   配列番号12
ON-TARGETplus SMARTpool siRNA J-041127-07、FOXO1
Mol. Wt. 13,459.8（g/mol）
Ext. Coeff. 357,691（L/mol・cm)
標的配列：GCAAACGGCUUCGGUCAAC                                  配列番号13
ON-TARGETplus SMARTpool siRNA J-041127-08、FOXO1
Mol. Wt. 13,384.9（g/mol）
Ext. Coeff. 384,302（L/mol・cm)
標的配列：GGACAACAACAGUAAAUUU                                   配列番号14
【０２０４】
要約
要約すると、腸の腸内分泌前駆細胞における単一の転写因子、Foxo1の体細胞性除去は、膵ベータ細胞と同等のインスリン産生、グルコース応答性細胞（図15）という系統及び機能的な特性を有する腸Ins+細胞の生成をもたらす。プロインスリン導入遺伝子を発現するよう操作された、腸の胃抑制ポリペプチド（gastric inhibitory polypeptide）（GIP）産生細胞（17）とは異なり、Ins2-Gfpノックイン対立遺伝子の活性化により示されるように、腸Ins+細胞は内因性ベータ細胞と同じ発生経路をたどるように見える。この特性は、胚性幹細胞由来インスリン産生細胞が移植されたマウス（14）におけるよりも、NKOマウスにおけるSTZ糖尿病のより急速な回復を説明し得る。グルコース依存性であり且つジアゾキシドで阻害され得る様式でインスリンを分泌する腸Ins+細胞の能力は、１型糖尿病に対する細胞置換アプローチを悩ませてきた調節されないインスリン分泌のおそれを鎮める。より広い文脈において、腸の腸内分泌前駆細胞の可塑性は、肥満外科手術後の糖尿病の驚くべき回復（19）を含む、腸の多方面の代謝機能（18）において、重要な役割を果たし得る。
【０２０５】
本発明は、上記の実験によって及び続く実施例によって本明細書中に説明され、それらは限定として解釈されるべきではない。本出願全体にわたり引用された全ての参考文献、係属中の特許出願及び公開された特許の内容は、参照により本明細書中に明確に組み込まれる。当業者は、本発明が多くの異なる形態で実施され得、本明細書に説明される実施形態に限定されるように解釈されるべきでないことを理解するであろう。むしろ、これらの実施形態は、本開示が本発明を当業者に完全に伝えるために提供される。本発明の多くの改変及び他の実施形態を、先の説明において示される教示の利益を有する、本発明が属する技術分野に精通した者は思い浮かべるであろう。特定の用語が用いられるが、それらは特に明記しない限り当該分野のものとして使用される。
【０２０６】
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【図４−１】
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【図１−１】
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【図１−２】
0005866106.tif 000005
【図１Ｆ】
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【図２−１】
0005866106.tif 000007
【図２−２】
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【図３−１】
0005866106.tif 000009
【図３−２】
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【図４−２】
0005866106.tif 000011
【図５】
0005866106.tif 000012
【図６】
0005866106.tif 000013
【図７】
0005866106.tif 000014
【図８】
0005866106.tif 000015
【図９】
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【図１０】
0005866106.tif 000017
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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