(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチド又はそれをコードする核酸の、NF-кB活性上昇に関連する疾患を治療するための医薬の製造における使用であって、
上記ペプチドが、
(c) 配列番号3に示すアミノ酸配列からなり、あるいは
(d) (c)のアミノ酸配列における1個または数個のアミノ酸の欠失もしくは置換を介して得られたアミノ酸配列からなり、且つNF-кBシグナル経路を抑制する作用を有し、あるいは
(e) (c)のアミノ酸配列と少なくとも95％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つNF-кBシグナル経路を抑制する作用を有し、
上記NF-кBの活性上昇に関連する疾患が、多発性骨髄腫、白血病、マントル細胞リンパ腫、粘膜関連リンパ組織リンパ腫、びまん性大細胞型性リンパ腫、ホジキンリンパ腫、骨髄異形成症候群、乳癌、卵巣腫、肺癌、子宮頸癌、前立腺癌、肝癌、膵臓癌、食道癌、胃癌、咽頭癌、胆管癌、甲状腺癌、副甲状腺腫および皮膚と頭頚の扁平上皮癌からなる群から選ばれる、
使用。
【請求項２】
上記ペプチドが、(c)のアミノ酸配列と少なくとも96％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つNF-кBシグナル経路を抑制する作用を有する、請求項1に記載の使用。
【請求項３】
上記ペプチドが、(c)のアミノ酸配列と少なくとも97％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つNF-кBシグナル経路を抑制する作用を有する、請求項1に記載の使用。
【請求項４】
上記ペプチドが、(c)のアミノ酸配列と少なくとも98％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つNF-кBシグナル経路を抑制する作用を有する、請求項1に記載の使用。
【請求項５】
上記ペプチドが、(c)のアミノ酸配列と少なくとも99％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つNF-кBシグナル経路を抑制する作用を有する、請求項1に記載の使用。
【請求項６】
上記疾患が、白血病である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
上記白血病が、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、成人型T細胞白血病からなる群から選ばれる、請求項6に記載の使用。
【請求項８】
ペプチド又はそれをコードする核酸及び任意に存在する薬学的に許容できる担体又は賦形剤を含む医薬組成物であって、
上記ペプチドが、
(c) 配列番号3に示すアミノ酸配列からなり、あるいは
(d) (c)のアミノ酸配列における1個または数個のアミノ酸の欠失もしくは置換を介して得られたアミノ酸配列からなり、且つNF-кBシグナル経路を抑制する作用を有し、あるいは
(e) (c)のアミノ酸配列と少なくとも95％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つNF-кBシグナル経路を抑制する作用を有する、
医薬組成物。
【請求項９】
上記ペプチドが、(c)のアミノ酸配列と少なくとも96％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つNF-кBシグナル経路を抑制する作用を有する、請求項8に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
上記ペプチドが、(c)のアミノ酸配列と少なくとも97％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つNF-кBシグナル経路を抑制する作用を有する、請求項8に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
上記ペプチドが、(c)のアミノ酸配列と少なくとも98％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つNF-кBシグナル経路を抑制する作用を有する、請求項8に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
上記ペプチドが、(c)のアミノ酸配列と少なくとも99％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つNF-кBシグナル経路を抑制する作用を有する、請求項8に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
多発性骨髄腫、白血病、マントル細胞リンパ腫、粘膜関連リンパ組織リンパ腫、びまん性大細胞型性リンパ腫、ホジキンリンパ腫、骨髄異形成症候群、乳癌、卵巣腫、肺癌、子宮頸癌、前立腺癌、肝癌、膵臓癌、食道癌、胃癌、咽頭癌、胆管癌、甲状腺癌、副甲状腺腫および皮膚と頭頚の扁平上皮癌からなる群から選ばれる疾患の治療における使用のためのものである、請求項8〜12のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
上記疾患が、白血病である、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
上記白血病が、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、成人型T細胞白血病からなる群から選ばれる、請求項１４に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はヒトの腫瘍および炎症の治療に関し、特にカルシニューリン１調節タンパク質(RCAN1)による核内因子-kappaB(NF-кB)の阻害及びNF-кBに関わる疾病、例えば腫瘍の治療におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
先進国において死亡の主な原因は癌であり、最新のデーターによると、中国では四分の一から五分の一の死亡者が癌を原因とする。多数の腫瘍に対する有効な治療方法はなく、癌は、全世界に厳重な社会または経済問題を生じさせる。
【０００３】
正常な生理的条件下で核内因子-kappaB(NF-кB)が転写制御因子として主に免疫学的応答、細胞死および炎症反応に関与する(Baud and Karin, 2009)。NF-кBは、in vivoでの主要な細胞内抗アポトーシス因子であり、NF-кBシグナル伝達経路の異常は血液および固形腫瘍を含む多数の腫瘍の発生、発達並びにそれらの化学療法及び放射線療法に対する耐性に関わっている。NF-кB活性が異常に増加し続けることが発見された血液腫瘍は、多発性骨髄腫、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、マントル細胞リンパ腫、粘膜関連リンパ組織リンパ腫、びまん性大細胞型リンパ腫、ホジキンリンパ腫、骨髄異形成症候群、成人型T細胞白血病を含み、NF-кB活性が異常に増加し続けることが発見された固形腫瘍は、乳癌、卵巣腫、肺癌、子宮頸癌、前立腺癌、肝癌、膵臓癌、食道癌、胃癌、咽頭癌、胆管癌、甲状腺癌、副甲状腺腫及び皮膚と頭頚の扁平上皮癌を含む(Basseres and Baldwin, 2006)。ヒト急性Ｔ細胞性白血病のマウスモデルの研究によると、白血病の発生がNF-кBの欠失によって遅れることが指摘されている(dos Santos et al., 2008)。研究によって、天然存在あるいは合成した多数のステロイドホルモンが、NF-кBの抑制によって腫瘍の抑制作用を示すことが示されている。
【０００４】
NF-кBは、主に細胞増殖、血管新生、腫瘍転移、炎症反応およびアポトーシス抑制などによって腫瘍の発生及び発達を促進する。最近の研究では、約1/5の多発性骨髄腫患者にNF-кBシグナル経路の遺伝子変異が存在していることが発見された。2008年に、ボルテゾミブ（Bortezomib）の多発性骨髄腫の治療への使用がアメリカ食品医薬品局(FDA)に許可された。ボルテゾミブはプロテアーゼ阻害剤として、NF-кBシグナル伝達経路を抑制することにより腫瘍を治療する作用を示すと考えられているが、広域のプロテアーゼ阻害剤として、ボルテゾミブは、一般的且つ重篤な副作用が現れるので、腫瘍治療への広範囲の応用が非常に制限されている(Delforge et al., 2010)。急性前骨髄球性白血病に用いられる三酸化ヒ素(白ヒとも呼ばれる)の主な作用も、NF-кBの活性を抑制することであるが、その毒性が原因で腫瘍治療への応用は限定されている。
【０００５】
NF-кBは腫瘍に対する重要な作用を持つことに加え、非常に重要な炎症因子、例えばインターロイキン、腫瘍壊死因子などの調節因子であり、炎症反応においても重要な機能を有する。更にその上、細胞生存に影響する重要な分子として、老年性痴ほう症及び脳卒中を含む神経変性疾患においても重要な機能を有する。
【０００６】
そのため、NF-кBシグナル伝達経路は非常に重要な腫瘍薬物の標的であり、国内外における薬物開発の注目点になっている。現在NF-кBの活性を特異的に抑制するが、副作用もより少なく、腫瘍の治療に用いられる薬物に対する差し迫った要求が存在する。
【０００７】
カルシニューリン抑制因子1(RCAN1)は初めてカルシニューリンの(calcineurin)の内在性抑制因子として発見され、RCAN1のC-末端にカルシニューリンを抑制する活性を有することが発見された(Arron et al., 2006; Chan et al., 2005; Fuentes et al., 2000)。スプライシングの差異によって、RCAN1は四つのスプライシングアイソフォームを有し、そのうちのスプライシングアイソフォーム1であるRCAN1.1(配列番号1)及びスプライシングアイソフォーム4であるRCAN1.4(配列番号2)は、in vivoで比較的に高いレベルで発現される。RCAN1.1とRCAN1.4との異なる点は僅かN末端の28のアミノ酸にあり、RCAN1.1の神経組織における発現は比較的に高く、RCAN1.4の末梢組織、例えば筋肉における発現は比較的に高い。各組織における発現が異なっても、両者は機能において類似である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Alkalay, I., Yaron, A., Hatzubai, A., Orian, A., Ciechanover, A., and Ben-Neriah, Y. (1995). Stimulation-dependent I kappa B alpha phosphorylation marks the NF-kappa B inhibitor for degradation via the ubiquitin-proteasome pathway. Proc Natl Acad Sci U S A 92, 10599-10603.
【非特許文献２】Arron, J.R., Winslow, M.M., Polleri, A., Chang, C.P., Wu, H., Gao, X., Neilson, J.R., Chen, L., Heit, J.J., Kim, S.K., et al. (2006). NFAT dysregulation by increased dosage of DSCR1 and DYRK1A on chromosome 21. Nature 441, 595-600.
【非特許文献３】Basseres, D.S., and Baldwin, A.S. (2006). Nuclear factor-kappaB and inhibitor of kappaB kinase pathways in oncogenic initiation and progression. Oncogene 25, 6817-6830.
【非特許文献４】Baud, V., and Karin, M. (2009). Is NF-kappaB a good target for cancer therapy? Hopes and pitfalls. Nat Rev Drug Discov 8, 33-40.
【非特許文献５】Chan, B., Greenan, G., McKeon, F., and Ellenberger, T. (2005). Identification of a peptide fragment of DSCR1 that competitively inhibits calcineurin activity in vitro and in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A 102, 13075-13080.
【非特許文献６】Delforge, M., Blade, J., Dimopoulos, M.A., Facon, T., Kropff, M., Ludwig, H., Palumbo, A., Van Damme, P., San-Miguel, J.F., and Sonneveld, P. (2010). Treatment-related peripheral neuropathy in multiple myeloma: the challenge continues. Lancet Oncol 11, 1086-1095.
【非特許文献７】dos Santos, N.R., Williame, M., Gachet, S., Cormier, F., Janin, A., Weih, D., Weih, F., and Ghysdael, J. (2008). RelB-dependent stromal cells promote T-cell leukemogenesis. PLoS One 3, e2555.
【非特許文献８】Fuentes, J.J., Genesca, L., Kingsbury, T.J., Cunningham, K.W., Perez-Riba, M., Estivill, X., and de la Luna, S. (2000). DSCR1, overexpressed in Down syndrome, is an inhibitor of calcineurin-mediated signaling pathways. Hum Mol Genet 9, 1681-1690.
【非特許文献９】Imbert, V., Rupec, R.A., Livolsi, A., Pahl, H.L., Traenckner, E.B., Mueller-Dieckmann, C., Farahifar, D., Rossi, B., Auberger, P., Baeuerle, P.A., et al. (1996). Tyrosine phosphorylation of I kappa B-alpha activates NF-kappa B without proteolytic degradation of I kappa B-alpha. Cell 86, 787-798.
【非特許文献１０】Kordes, U., Krappmann, D., Heissmeyer, V., Ludwig, W.D., and Scheidereit, C. (2000). Transcription factor NF-kappaB is constitutively activated in acute lymphoblastic leukemia cells. Leukemia 14, 399-402.
【非特許文献１１】Sethi, G., Ahn, K.S., Chaturvedi, M.M., and Aggarwal, B.B. (2007). Epidermal growth factor (EGF) activates nuclear factor-kappaB through IkappaBalpha kinase-independent but EGF receptor-kinase dependent tyrosine 42 phosphorylation of IkappaBalpha. Oncogene 26, 7324-7332.
【非特許文献１２】Waris, G., Livolsi, A., Imbert, V., Peyron, J.F., and Siddiqui, A. (2003). Hepatitis C virus NS5A and subgenomic replicon activate NF-kappaB via tyrosine phosphorylation of IkappaBalpha and its degradation by calpain protease. J Biol Chem 278, 40778-40787.
【発明の概要】
【０００９】
一つの態様において、本発明はペプチドあるいはそれをコードする核酸のNF-кB活性上昇に関連する疾患を治療するための医薬の製造における使用であり、前記ペプチドが、
(a) 配列番号3に示すアミノ酸配列を含み、あるいは、 
(b) 配列番号3に示すアミノ酸配列における1個又は複数のアミノ酸の修飾、例えば欠失、置換、挿入もしくは付加を介して得られたアミノ酸配列を含み、且つ前記ペプチドがNF-кBシグナル経路を抑制する作用を有する、
使用を提供する。
【００１０】
一つの態様において、本発明は、ペプチドあるいはそれをコードする核酸ならびに任意に存在する薬学的に許容できる担体または賦形剤を含む医薬組成物であり、前記ペプチドが、
(a) 配列番号3に示すアミノ酸配列を含み、あるいは、
(b) 配列番号3に示すアミノ酸配列における1個又は複数のアミノ酸の修飾、例えば欠失、置換、挿入もしくは付加を介して得られたアミノ酸配列を含み、前記ペプチドがNF-кBシグナル経路を抑制する作用を有する、
医薬組成物を提供する。
【００１１】
一つの態様において、本発明はNF-кBの活性上昇に関連する疾患を治療する方法であり、前記疾患を患っている患者にペプチドあるいはそれをコードする核酸を投与し、
前記ペプチドが、
(a) 配列番号3に示すアミノ酸配列を含み、あるいは、
(b) 配列番号3に示すアミノ酸配列における1個又は複数のアミノ酸のが修飾、例えば欠失、置換、挿入もしくは付加を介して得られたアミノ酸配列を含み、前記ペプチドがNF-кBシグナル経路を抑制する作用を有する、
方法を提供する。
【００１２】
一つの実施態様において、前記ペプチドは、
(a) 配列番号1に示すアミノ酸配列からなり、あるいは、 
(b) 配列番号2に示すアミノ酸配列からなり、あるいは、
(c) 配列番号3に示すアミノ酸配列からなり、あるいは
(d)  (a)−(c)のアミノ酸配列のいずれかにおける1個又は複数のアミノ酸の修飾、例えば欠失、置換、挿入もしくは付加を介して得られたアミノ酸配列からなり、且つNF-кBシグナル経路を抑制する作用を有し、あるいは、
(e) (a)−(c)のアミノ酸配列のいずれかと少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％または少なくとも99％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つNF-кBシグナル経路を抑制する作用を有する。
【００１３】
一つの実施態様において、前記NF-кBの活性上昇に関連する疾患は、多発性骨髄腫、白血病、マントル細胞リンパ腫、粘膜関連リンパ組織リンパ腫、びまん性大細胞型性リンパ腫、ホジキンリンパ腫、骨髄異形成症候群、乳癌、卵巣腫、肺癌、子宮頸癌、前立腺癌、肝癌、膵臓癌、食道癌、胃癌、咽頭癌、胆管癌、甲状腺癌、副甲状腺腫および皮膚と頭頚の扁平上皮癌からなる群から選ばれる。一つの好ましい実施態様において、前記疾患は白血病であり、例えば急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、成人型T細胞白血病からなる群から選ばれる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】RCAN1はNF-кBの核転移およびNF-кBの転写活性を低減できる。(A) RCAN1の発現ベクターであるpcDNA3.1(-)RCAN1.1-mycおよびpcDNA3.1(-)RCAN1.4-myc、および遺伝子ノックアウトベクターのsi-RCAN1を使って、HEK293細胞をトランスフェクションし、48時間後細胞を収集し、細胞核を単離し、溶解し（lyse）、SDS-PAGEを行い、抗-NF-кB抗体を使ってwestern blotを行い、抗-TBP抗体により検出されたTBP(TATA結合タンパク質)を核タンパク質の内部参照とした。(B) RCAN1の発現ベクターであるpcDNA3.1(-)  RCAN1.1-mycならびにpcDNA3.1(-)RCAN1.4-myc、および遺伝子ノックアウトベクターのsi-RCAN1およびNF-кBの転写活性指示ベクターであるpNF-кBlucを使って、HEK293細胞を同時にトランスフェクションし、24時間後、ルシフェラーゼキットにより、細胞内におけるNF-кBの転写活性を反映するルシフェラーゼ活性を測定した。*：統計的に有意を意味する、p<0.05。対照:空ベクター。
【図２】免疫共沈降により、RCAN1とIKBタンパク質との間にタンパク質−タンパク質相互作用があることが分かる。RCAN1の発現ベクターであるpcDNA3.1(-)RCAN1.1-mycを使ってHEK293細胞をトランスフェクションし、48時間後細胞を収集し、溶解し、さらに(A)抗-myc抗体(9E10)を使って免疫沈殿を行い、抗-IKBα抗体を使ってwestern blotを行った；(B)抗-IKBα抗体を使って免疫沈殿を行い、抗-myc抗体(9E10)を使ってwestern blotを行った。インプットは免疫沈殿前の細胞溶解液であった。
【図３】RCAN1の低レベル発現は、IKBの42位にあるチロシンリン酸化を明らかに増加する。遺伝子ノックアウトベクターsi-RCAN1を使ってHEK293細胞をトランスフェクションし、48時間後細胞を収集し、溶解し、さらに(A)抗-IKBα抗体を使って免疫沈殿を行い、IKBの42位にあるチロシンリン酸化抗体を使ってwestern blotを行った。(B) IKBの42位にあるチロシンリン酸化抗体を使って免疫沈殿を行い、抗-IKBα抗体を使ってwestern blotを行った。*：統計的に有意を意味する、p<0.05。対照:空ベクター。
【図４】RCAN1の高レベル発現は、急性白血病の細胞系および初代急性白血病細胞を死滅させる。RCAN1のアデノウイルスを導入した急性白血病細胞系(A)および急性前骨髄球性白血病細胞系(B)を使って、48時間後細胞生存率キットにより細胞生存率を測定した。(C)白血病患者、病状の緩和した患者および対照群の正常ヒトの末梢血から遊離単核細胞を単離し、RCAN1のアデノウイルスを使って初代培養した白血病細胞に導入し、48時間後細胞生存率キットにより細胞生存率を測定した。Av-GFPは緑色の蛍光を発現するアデノウイルスであり、Av-RCAN1.1はRCAN1.1タンパク質を発現するアデノウイルス(実施例1.2.2に記載のAd-RCAN1.1ベクター)であり、Av-RCAN1.4はRCAN1.4タンパク質を発現するアデノウイルス(実施例1.2.2に記載のAd-RCAN1.4ベクター)であった。
【図５】RCAN1のN-末端にある103個アミノ酸はIKBと結合し、NF-кBの転写活性を抑制し、急性白血病細胞を殺傷することができる。(A) RCAN1のN-末端にある103個アミノ酸の発現ベクターであるpcDNA3.1  RCAN1-103mychisあるいは(B) 103−197アミノ酸を発現するpcDNA3.1RCAN103-197mycベクターを使って、HEK293細胞をトランスフェクションし、48時間後細胞を収集、溶解し、抗-myc抗体(9E10)を使って免疫沈殿を行い、抗-IKBα抗体を使ってwestern blotを行った。(C) RCAN1のN-末端にある103個アミノ酸の発現ベクターであるpcDNA3.1RCAN1-103mychisあるいは103−197アミノ酸を発現するpcDNA3.1RCAN103-197mycベクターを使って、NF-кBの転写活性指示ベクターpNF-кBlucと一緒にHEK293細胞を同時にトランスフェクションし、24時間後、ルシフェラーゼキットにより、細胞内のNF-кB転写活性を反映するルシフェラーゼ活性を測定した。(D) RCAN1のN-末端にある103個アミノ酸の発現ベクターであるpcDNA3.1RCAN1-103mychisあるいは103−197アミノ酸を発現するpcDNA3.1RCAN103-197mycプラスミドを使って、Jurkat白血病細胞系にトランスフェクションし、48時間後細胞生存率キットにより細胞生存率を測定した。*：統計的に有意を意味する、p<0.05。対照:空ベクター。
【図６】精製したTAT-RCAN1-103ポリペプチドは白血病細胞を死滅させる。(A) SDS-PAGEで、精製したTAT-RCAN1-103ポリペプチドの単一のバンドが見られる。(B) Jurkat細胞にTAT-RCAN1-103ポリペプチドを加え、48時間後細胞生存率キットにより細胞生存率を測定した。*：統計的に有意を意味する、p<0.05。対照:空ベクター。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
特別に説明する場合以外、本明細書に用いられる科学ならび技術用語は当業者に通常知られている意味を指す。特別に必要な場合以外、単数で表される用語は複数を含み、複数で表される用語は単数を含む。前記の技術また方法は一般的に本分野に広く知られているあるいは本発明に引用されている参考文献に記載の常用方法に準じて行う。例えば、参照として本明細書に導入されるSambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (2001))に記載の内容を参照する。
【００１６】
いかなる理論に制限されなく、in vivoにおけるNF-кBシグナル経路の調節は主にкB抑制因子IKBに依存する。プロテオソームにおけるIKBの分解は IKBの32位および36位にあるセリンのリン酸化により促進される。IKB分解後NF-кB分子の核定位配列が露見され、その後NF-кB分子は細胞核内に転入し、標的遺伝子にあるкB反応エレメントに結合して、標的遺伝子の転写を調節する ADDIN EN.CITE  ADDIN EN.CITE.DATA (Alkalay et al., 1995)。そのほかに、IKBの42位にあるチロシンのリン酸化はIKBの安定性に影響を与えることにより、NF-кBシグナル経路の活性にも影響することも分かっている ADDIN EN.CITE  ADDIN EN.CITE.DATA (Imbert et al., 1996; Sethi et al., 2007; Waris et al., 2003)。
【００１７】
本発明は、RCAN1タンパク質のスプライシングアイソフォームであるRCAN1.1(配列番号1)およびRCAN1.4  (配列番号2)がNF-кBシグナル経路を抑制し、腫瘍細胞の生存を低減することを発見した。さらに、RCAN1.1のN-末端にある103個アミノ酸のペプチド(配列番号3)はIKBと互いに作用し、NF-кBの活性を抑制し、腫瘍細胞の生存を低減することも初めて本発明者に発見された。そのため、RCAN1タンパク質はNF-кBの内在性調節タンパク質であり、NF-кBシグナル経路に影響を与え、NF-кBの抑制因子のIKBと互いに作用し、42位のチロシンのリン酸化にも影響することが初めて本発明者に解明された。
【００１８】
一つの態様において、本発明はペプチドあるいはそれをコードする核酸のNF-кB活性上昇に関連する疾患を治療するための医薬の製造における使用であり、前記ペプチドが、
(a) 配列番号3に示すアミノ酸配列を含み、あるいは 、
(b) 配列番号3に示すアミノ酸配列における1個または複数のアミノ酸の修飾、例えば欠失、置換、挿入もしくは付加を介して得られたアミノ酸配列を含み、且つ前記ペプチドがNF-кBシグナル経路を抑制する作用を有する、
使用を提供する。
【００１９】
一つの実施態様において、前記ペプチドは、
(a) 配列番号1に示すアミノ酸配列からなり、あるいは、
(b) 配列番号2に示すアミノ酸配列からなり、あるいは、
(c) 配列番号3に示すアミノ酸配列からなり、あるいは、
(d) (a)−(c)のアミノ酸配列のいずれかにおける1個または複数のアミノ酸の修飾、例えば欠失、置換、挿入もしくは付加を介して得られたアミノ酸配列からなり、且つNF-кBシグナル経路を抑制する作用を有し、あるいは、
(e) (a)−(c)のアミノ酸配列のいずれかと少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％または少なくとも99％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つNF-кBシグナル経路を抑制する作用を有する。
【００２０】
用語の“含む”が本発明の明細書および特許請求の範囲に使われる場合、ほかの要素あるいはステップは排除しない。本発明の目的のために、用語の“からなる”は用語の“含む”の好ましい態様であると考える。
【００２１】
本明細書に用いられる「ペプチド」、「ポリペプチド」と「タンパク質」は互いに交換でき、アミノ酸残基の重合体であり、ペプチド結合によって結合されてなる二つあるいは多数のアミノ酸を指す。重合体は線状、分岐状あるいは環状であり、天然存在および/またはアミノ酸類似物を含むことができ、非アミノ酸で中断されてもいい。通常、アミノ酸重合体が長い(例えば50個のアミノ酸残基を超える)場合は 「ポリペプチド」あるいは「タンパク質」と呼ばれることが好ましく、50個のアミノ酸からなりあるいはそれより短い場合は 「ペプチド」と呼ばれることが好ましい。
【００２２】
本明細書に記載のペプチドは、任意の適切な従来の技術方法、例えば化学合成、組換え発現により製造されることができ、例えばSambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (2001))およびBlackwell Scientific Publicationsに出版された、Nicholson編『Peptide Synthesis』におけるAthertonとSheppardの第9章「Peptide Synthesis」の記載を参照することができる。
【００２３】
本明細書において、「修飾」は本分野に広く知られている保存配列の修飾であり、アミノ酸置換、付加あるいは欠失を含む。アミノ酸修飾は本分野に既知の標準な技術により導入され、例えばタンパク質をコードする核酸内の部位特異的変異、分子クローニング、オリゴヌクレオチド特異的変異またはPCRを介したランダム変異を行う。保存アミノ酸置換はアミノ酸残基が類似な構造あるいは化学性質を備えるアミノ酸残基に置換されるものを含む。類似な側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、本分野で既に確認されている。それらファミリーは、塩基性側鎖を有するアミノ酸(例えばリシン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖を有するアミノ酸(例えばアスパラギン酸、グルタミン酸)、電荷を持たない極性側鎖を有するアミノ酸(例えばアスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン)、非極性側鎖を有するアミノ酸(例えばグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン)、分岐状側鎖を有するアミノ酸(例えばトレオニン、バリン、イソロイシン)および芳香族側鎖を有するアミノ酸(例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン)を含む。当業者は上記以外の他のアミノ酸ファミリーを使用できることを知っている。類似な小さい変化は、また、アミノ酸の欠失あるいは挿入、あるいは両方を含む。本分野におけるよく知られたコンピュータープログラムにより、免疫学活性を失うことなく、どのようにアミノ酸残基を置換、挿入あるいは欠失できるかを見つけることができる。本分野における既知のコンピューター計算方法、例えばGapあるいはBestfitは、アミノ酸配列のアライメントを最適化して、類似あるいは同じアミノ酸残基を整列または定義することができる。
【００２４】
例えば、前記の一個または複数のアミノ酸の置換は、配列番号1、2あるいは3のアミノ酸残基を類似な構造あるいは化学性質を有するアミノ酸残基（例えばアルギニンとリシン、グルタミン酸とアスパラギン酸と、セリンとトレオニンと、グルタミンとアスパラギンと、バリンとロイシンとイソロイシン）に変えることができる。
【００２５】
例えば、前記の一個または複数のアミノ酸の欠失は、配列番号1の第1位にあるアミノ酸残基、配列番号2の第1位にあるアミノ酸残基、あるいは配列番号3の第9位にあるアミノ酸残基とすることができる。
【００２６】
例えば、前記の一個または複数のアミノ酸の付加は、配列番号1の第1位にアミノ酸残基Alaを、配列番号2の第1位にアミノ酸残基Alaを、あるいは配列番号3の第9位にアミノ酸残基Alaを付加することができる。
【００２７】
本明細書に用いられる用語“NF-кBシグナル経路を抑制する”は、転写因子とするNF-кBを抑制し、下流にある標的遺伝子の活性を調節することを指す。
【００２８】
本明細書に用いられる用語“同一性”は、対応する二つのタンパク質鎖の中の同一あるいは類似な位置にある同じアミノ酸に対応するパーセンテージである。BLOSUM 62 arrayを用いたBLASTアルゴリズムにより、相同性のパーセンテージを計算する。そのアルゴリズムはNCBIウェブサイト(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)から得られる。好ましい態様において、前記の配列同一性を有しているペプチドは機能的なホモログであり、即ち顕著な同一性(例えばアミノ酸レベルにおいて約50％の配列同一性)を示し、またその対応するタンパク質と同様に機能を発揮する。好ましい機能的なホモログは、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約96％、少なくとも約97％、少なくとも約98％、少なくとも約99％あるいはそれより高い配列同一性を有している。
【００２９】
本明細書において、用語“核酸”、“核酸分子”、“ポリヌクレオチド”または“ヌクレオチド配列”は互いに交換でき、いかなる長さの重合物、例えばポリ-デオキシリボヌクレオチド(DNA)(例えばcDNA、ゲノムDNA、プラスミド、ベクター、単離したDNAまたはその混合物)、あるいはポリ-リボヌクレオチド(RNA)分子(例えばmRNA)、あるいは混合したポリ-デオキシリボヌクレオチドおよびポリ-デオキシリボヌクレオチドを指す。単鎖あるいは二本鎖、線状あるいは環状の、天然あるいは合成のポリヌクレオチドを含む。
【００３０】
ある核酸に関して、“コードする”あるいは“コードされた”は、あるタンパク質に翻訳する情報を含むことを指す。タンパク質をコードする核酸は、核酸の翻訳領域内に非翻訳配列(例えばイントロン)が含まれ、あるいは(例えばcDNAにおいて)挿入された非翻訳配列を欠けることもできる。タンパク質をコードする情報はコドンにより指定される。
【００３１】
一つの好ましい実施態様において、本発明の核酸は、ベクター、例えば発現ベクター、プラスミド、ウイルス、ファージミド、ファージ、コスミドあるいは人工染色体に含有される。本明細書に用いられる場合、“発現ベクター”は、一連の核酸エレメントを有する、組換えにより、あるいは合成により調製した核酸構築物である。この核酸エレメントによって、特定な核酸が宿主細胞内において転写されることが可能となる。例えば発現ベクターは、発現しようとする核酸配列をコードするほかに、発現する宿主に由来し適合できる複製またはコントロール配列、及びトランスフェクションされた細胞に選択可能な表現型を与える選択マーカーを含む。本発明の核酸は、プラスミド、染色体、ミトコンドリアDNA、プラスミドDNA、ウイルスあるいは核酸断片に導入されることができる。多くの適切な発現ベクターは、本分野において既知であり、且つ購入でき、例えば原核発現ベクター、酵母発現ベクター、哺乳動物発現ベクター、昆虫細胞発現ベクター、植物細胞発現ベクターがある。一つの好ましい実施態様において、本発明の核酸配列(配列番号1、2または3)は、発現ベクター、例えばpcDNA3.1(-)mychis(c) (Invitrogen)、pSuper (Oligoengine)において発現される。
【００３２】
“宿主細胞”とは、ベクターを含んでおり、このベクターの複製または/あるいは発現をサポートする細胞である。宿主細胞は大腸菌細胞のような原核細胞、あるいは酵母細胞、昆虫細胞、両生動物細胞または哺乳動物細胞のような真核細胞としうる。本明細書に記載のタンパク質を発現する宿主細胞は本分野に用いられるいかなる真核細胞あるいは原核細胞、例えばHEK293、HEK293T、大腸菌細胞などであればよい。各種細胞の培養および発現、発現されたタンパク質の収集、精製ならび検出技術は既に当業者に知られている。それについて、例えばJ. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989)またはF.M. Ausubel et al. (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988), Ed Harlow and David Lane (editors)を参照すること。
【００３３】
もう一つの態様において、本発明はペプチドあるいはそれをコードする核酸のNF-кB活性上昇に関連する疾患を治療するための医薬としての使用であって、前記ペプチドが、
(a) 配列番号3に示すアミノ酸配列を含み、あるいは
(b) 配列番号3に示すアミノ酸配列における1個または複数のアミノ酸の修飾、例えば欠失、置換、挿入もしくは付加を介して得られたアミノ酸配列を含み、且つ前記のペプチドがNF-кBシグナル経路を抑制する作用を有する、
使用を提供する。
【００３４】
もう一つの態様において、本発明は、NF-кBの活性上昇に関連する疾患を治療する医薬薬物組成物であり、ペプチドあるいはそれをコードする核酸ならびに任意に存在する薬学的に許容できる担体または賦形剤を含み、前記のペプチドが、
(a) 配列番号3に示すアミノ酸配列を含み、あるいは、 
(b) 配列番号3に示すアミノ酸配列における1個または複数のアミノ酸の修飾、例えば欠失、置換、挿入もしくは付加を介して得られたアミノ酸配列を含み、且つNF-кBシグナル経路を抑制する作用を有する、
医薬組成物を提供する。
【００３５】
一つの実施態様において、前記ペプチドは、
(a) 配列番号1に示すアミノ酸配列からなり、あるいは
(b) 配列番号2に示すアミノ酸配列からなり、あるいは
(c) 配列番号3に示すアミノ酸配列からなり、あるいは
(d) (a)−(c)のアミノ酸配列における1個または複数のアミノ酸の修飾、例えば欠失、置換、挿入もしくは付加を介して得られたアミノ酸配列からなり、且つNF-кBシグナル経路を抑制する作用を有し、あるいは
(e) (a)−(c)のアミノ酸配列と少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％または少なくとも99％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つNF-кBシグナル経路を抑制する作用を有する。ペプチドあるいは核酸分子を医薬組成物へと調合することについては、Gennaro, A.L. and Gennaro, A.R. (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Ed., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA; Crowder, T.M. et al. (2003) A Guide to Pharmaceutical Particulate Science. Interpharm/CRC, Boca Raton, FL;およびNiazi, S.K. (2004) Handbook of Pharmaceutical Manufacturing Formulations, CRC Press, Boca Raton, FLを参考すること。
【００３６】
もう一つの態様において、本発明は、NF-кBの活性上昇に関連する疾患を治療する方法であって、前記疾患を患っている患者にペプチドあるいはそれをコードする核酸、またはそれを含む医薬組成物を投与し、前記ペプチドが、
(a) 配列番号3に示すアミノ酸配列を含み、あるいは
(b) 配列番号3に示すアミノ酸配列における1個または複数のアミノ酸の修飾、例えば欠失、置換、挿入もしくは付加を介して得られたアミノ酸配列を含み、且つ前記のペプチドはNF-кBシグナル経路を抑制する作用を有することを含む、
方法を提供する。
【００３７】
本発明に用いられる用語“投与”は、適切な方法により予定量の物質を患者に導入することを示す。本発明において、単離されたペプチド、単離された核酸分子、発現ベクター、組み換え細胞、医薬組成物あるいはワクチンは、所望の組織に到達しさえすれば、任意に常用な経路により投与されることができる。腹膜内、静脈内、筋肉内、皮下、経皮、経口、局部、鼻内、肺内または直腸内のような多種の投与経路を採用してもよいが、本発明においては、以上挙げた例に制限しない。
【００３８】
一つの実施態様において、前記ペプチドは、
(a) 配列番号1に示すアミノ酸配列からなり、あるいは 
(b) 配列番号2に示すアミノ酸配列からなり、あるいは
(c) 配列番号3に示すアミノ酸配列からなり、あるいは
(d)(a)−(c)のアミノ酸配列おける1個または複数のアミノ酸の修飾、例えば欠失、置換、挿入もしくは付加を介して得られたアミノ酸配列からなり、且つNF-кBシグナル経路を抑制する作用を有し、あるいは
(e)(a)−(c)のアミノ酸配列と少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％または少なくとも99％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つNF-кBシグナル経路を抑制する作用を有する。
【００３９】
本明細書について、本発明に記載のペプチドはほかのペプチドと融合でき、ペプチドの生理学的あるいは薬学的な性質を修飾し、例えば安定性あるいは膜浸透性を増加させることができる。一つの実施態様において、本発明ペプチド(例えば配列番号3)は、ヒト免疫不全ウイルスHIVにおけるTat(例えば第47-57目のアミノ酸RKKRRQRRRG  (配列番号14))タンパク質と融合でき、ペプチドの膜浸透性を促進する。
【００４０】
本明細書について、前記NF-кB活性の上昇に関連する疾患は、疾患の発生、発達、持続あるいは再発がNF-кB活性の上昇に関連する任意の疾患を指す(Basseres and Baldwin, 2006)。例えば、前記疾患が、多発性骨髄腫、白血病、マントル細胞リンパ腫、粘膜関連リンパ組織リンパ腫、びまん性大細胞型リンパ腫、ホジキンリンパ腫、骨髄異形成症候群、乳癌、卵巣腫、肺癌、子宮頸癌、前立腺癌、肝癌、膵臓癌、食道癌、胃癌、咽頭癌、胆管癌、甲状腺癌、副甲状腺腫および皮膚と頭頚の扁平上皮癌からなる群から選ばれてもよい。一つの実施態様において、前記疾患は白血病であり、例えば急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、成人型T細胞白血病からなる群から選ばれる。
【００４１】
本明細書について、治療は、疾患の病状を軽減、緩和、除去、干渉、阻止する、及び/又は疾患の発生または/あるいは発達を遅らせることを指す。疾患の病状は臨床医師によりいかなる手段または方法で監視または/あるいは測量できる。
【００４２】
ペプチドあるいはそれをコードする核酸がNF-кBの活性を抑制するかどうかは、細胞核内のNF-кBタンパクの量を測ることにより判断できる。本分野においてNF-кBタンパク質を測る多くのアッセイが知られている。例えば細胞核タンパク質ウェスタンブロッティング、単離された核タンパク質を使う電気泳動移動アッセイ、レポーター遺伝子システムにより転写因子とするNF-кBタンパク質の活性を測ること(Imbert et al., 1996)である。本発明の一つの実施態様において、ウェスタンブロッティングにより細胞核内のNF-кBタンパク質の量を測定して、NF-кB活性に対するRCAN1の抑制作用を研究する。
【００４３】
本分野において、動物実験のようなin vivo実験あるいは細胞アッセイのようなin vitro実験により、ペプチドあるいはそれをコードする核酸がNF-кBの活性上昇に関連する疾患の治療に用いられるかどうかを研究する(Kordes et al., 2000)。例えば、白血病がNF-кBの活性上昇に関連する疾患であることが知られている。白血病は血液類腫瘍に属し、JURKATなどのような白血病細胞系は優れた白血病細胞モデルであり、特に短期培養した初代白血病細胞は、患者の末梢血から分離した直後に薬物検査に用いられ、細胞生存率に基づく細胞アッセイは薬物の効果およびメカニズムを反映できる。本発明において、白血病細胞系ならびに初代培養した白血病細胞をモデルとして、RCAN1の白血病治療効果を研究する。このモデルは、RCAN1が白血病を治療する優れた候補薬であることを証明できる。
【００４４】
本発明のRCAN1タンパク質あるいはそのN末端にある103個のアミノ酸断片が新規NF-кB抑制剤とする利点は以下のとおりである。RCAN1はヒトの体内に自然に存在している内在性タンパク質であるので、ヒトの体内においての免疫原性は非常に弱く、ヒトの体内における免疫システムにより急に除去されない。小分子化合物と比較して、ポリペプチド医薬は生物活性が高く、作用特異性が強いなどの利点を備えるので、ポリペプチド医薬の副作用は少なく、治療効果も顕著である。
【００４５】
実施例
本発明を下記の実施例によりさらに説明するが、実施例あるいはそれらの組み合わせは、本発明の範囲あるいは実施形態を制限すると解釈すべきではない。本発明の範囲は添付した特許請求の範囲において定義され、本発明書または本分野の一般的な常識に基づいて、本分野の当業者は、特許請求の範囲に定義される範囲を明瞭に理解する。本発明の主旨または範囲を外れない限り、当業者は、本発明に任意に変形あるいは変更してもよく、この変形また変更も本発明の範囲内に含まれる。
【００４６】
実施例１：RCAN1発現ベクターの調製
1.1  材料
PCR増幅用の酵素およびdNTP：Takarra社から購入；
PCR増幅プライマー：上海生工社で合成；
Takarra制限酵素(EcoR I、Kpn I、Hind III、Bgl II)：New England Biolab社から購入；
Takara T4リガーゼ：大連宝生物社から購入；
真核発現ベクターpcDNA3.1(-)mychis(c)：Invitrogen社から購入；
遺伝子ノックアウトベクターpSuper：Oligoengine社から購入；
アデノウイルス発現ベクターAdeno-X：Clontech社から購入；
大腸菌DH5をInvitrogen社から購入。
特別に説明される以外、ほかの慣用の化学試薬はすべて中国国内の分析試薬である。
細胞系：HEK293細胞系をATCC社から購入した。HEK293細胞をウシ胎児血清を10％含むDMEM培地に培養し、培養条件は、37℃の定温とし、CO2を5％含む細胞インキュベーターとした。細胞培養に関する用品をすべてInvitrogenから購入した。
【００４７】
1.2  実験手順
1.2.1  プラスミドの構築
(1)RCAN1の高発現ベクターを構築するために、pcDNA3.1(-)RCAN1.1-myc組換えプラスミドを構築し、以下のプライマーを用いてPCRによりヒトcDNAライブラリーを増幅させ、EcoR 1ならびにKpn Iにより酵素切断し、同じ酵素で切断されたpcDNA3.1(-)mychis(c)ベクターとライゲーションした。
【００４８】
RCAN1.1をクローニングするためのPCRプライマー：
上流プライマー：ccgCTCGAGgccaccATGGAGGAGG TGGACCTGCA  (配列番号4)
下流プライマー：atggtacc CCTCTTCTTCCTCCTTC  (配列番号5)
【００４９】
ヒトcDNAライブラリー(Clontech社から購入)をテンプレートとし、それぞれ前記プライマーを使って通常のPCR  (PCR条件：94℃ 10min、30サイクル、94℃、30s，55℃、30s，72℃、30s、最後72℃ 、5min)により遺伝子断片を増幅させ、アガロースゲル電気泳動によりPCR増幅断片を分離また収集し、この断片の上流にEcoR1酵素切断サイトを、下流にKpn I酵素切断サイトをもたせた。PCRから得られたDNA断片はEcoR 1+Kpn I二重酵素切断され、同じようにEcoR 1+Kpn I二重酵素切断されたpcDNA3.1(-)mychis(c)ベクターとライゲーションし、pcDNA3.1(-)RCAN1.1-myc組換発現プラスミドを得た。
【００５０】
(2) (1)と同様な方法により、RCAN1ホモログアイソフォーム4用の真核発現ベクターであるpcDNA3.1（-）RCAN1.4-mycを構築した。
【００５１】
RCAN1.4をクローニングするPCRプライマー：
上流プライマー：ccgCTCGAGgccaccATGCATTTTA GAAACTTTAA  (配列番号6)
下流プライマー：atggtacc CCTCTTCTTCCTCCTTC  (配列番号7)
【００５２】
(3) RCAN1遺伝子ノックアウトベクターを得るために、二本鎖のヌクレオチドをアニーリングし（即ち、95℃、5分間）、自然に冷却し、二重鎖を形成させた後、Hind IIIならびBgl IIで酵素切断されたpSuperベクターに挿入し、Si-RCAN1を得た。二本鎖のヌクレオチドの配列は：
DS-511super sense：
GatccccGAGGAAATGGAAAGAATGAGGttcaagagaCCTCATTCTTTCCATTTCCTCttttta  (配列番号8)
DS-511super 
AS：AgcttaaaaaGAGGAAATGGAAAGAATGAGGTCTCTTGAACCTCATTCTTTCCATTTCCTC ggg  (配列番号9)
【００５３】
1.2.2  アデノウイルスベクターの構築
まず、pRCAN1.1-EGFPおよびpRCAN1.4-EGFPベクターを構築した。EcoR IまたはKpn I酵素でpcDNA  3.1(-)RCAN1.1-mycあるいはpcDNA3.1(-)RCAN1.4-mycプラスミドを切断し、挿入物とする0.7kbのDNA断片を回収し、同じ酵素で切断されたpEGFP-N3(clonetech社から購入)ベクターに挿入し、pRCAN1.1-  EGFPおよびpRCAN1.4-EGFPベクターを得た。
【００５４】
Ad-RCAN1.1およびAd-RCAN1.4ベクターを構築した。Nhe IまたはNot I酵素でpRCAN1.1-EGFPおよびpRCAN1.4-EGFPベクターを切断し、挿入物とする1.4kbのDNA断片を回収し、同じ酵素で切断されたpShuttle2(clonetech社から購入)ベクターに挿入し、pShuttle2-RCAN1.1-EGFPおよびpShuttle2-RCAN  1.4-EGFPを得て、I-ceuIまたはPI-SceI酵素でpShuttle2-RCAN1.1-EGFPおよびpShuttle2-RCAN1.4-EGFPを切断し、挿入物とする1.4kbの断片を回収し、同じ酵素で切断されたAdeno-Xアデノウイルスベクター(clonetech社から購入)に挿入し、Ad-RCAN1.1およびAd-RCAN1.4ベクターを得た。
【００５５】
1.2.3  アデノウイルスの生産
白血病細胞系は、一般的なトランスフェクション方法でトランスフェクションできないので、アデノウイルスを使用し、RCAN1タンパク質を発現させた。トランスフェクションの一日前、約106個のHEK293細胞を60mmのシャーレに接種し、リボソームLF2000(invitrogenから購入)または5μgのPac 1(NEB社から購入)酵素切断されたアデノウイルスベクターAdeno-X、あるいはAd-RCAN1.1およびAd-RCAN1.4を利用し、細胞をトランスフェクションした(具体的な方法についてInvitrogenのLF2000トランスフェクションキットの説明書参照)。7日後、細胞を収集し、3回の凍結融解により細胞を溶解し、ウイルスを含んでいる溶解液を集め、0.5mlの細胞溶解液で60mmのシャーレに接種したHEK293細胞をトランスフェクトし、48時間後細胞を凍結融解してウイルスを集め、さらに同じ方法によりHEK293を二回トランスフェクトし、ウイルスを集めて実験に供した。ウイルス力価が約4 × 108 /mlであった。本発明において、特別な説明がある場合以外、細胞系および初代細胞に使われるトランスフェクト回数(MOI)は30であった。
【００５６】
実施例２：RCAN1の高レベル発現がNF-кB活性を抑制するのに対して、RCAN1の低レベル発現がNF-кB活性を増加する
2.1  NF-кB核移植の実験手順
HEK293細胞へRCAN1発現ベクターpcDNA3.1(-)RCAN1.1-mycをトランスフェクションする：リボソームLF2000(invitrogenから購入)でHEK293細胞をトランスフェクションし、4μlのLF2000を100μlのopti-MEM(invitrogen社から購入)に加え、5分間後2μgのRCAN1発現ベクターpcDNA3.1(-)RCAN1.1-mycが添加された100μlのopti-MEMと混合し、室温で15分間静置し、培養したHEK293を含む35mmシャーレに加えた。
【００５７】
48時間後細胞を単離し、溶解した：細胞核タンパク質抽出キット(Millipore社から購入)で細胞核を単離し、溶解した。
【００５８】
12％グリシンSDS-PAGE(Biorad社から購入)により細胞溶解液中のタンパク質を単離した。電気泳動および膜転写装置は、Biorad社のmini-protean 3垂直電気泳動装置であった。
【００５９】
Western Blot法：anti-NF-кB抗体(Sigma社から購入)により細胞核内のNF-кBレベルを検出した(具体的な方法についてSigma社の操作説明書参照)。Anti-TBP抗体(Sigma社から購入)により検出されたTBPタンパク質を内部参考とした。SDS-PAGEゲルおよびWestern Blotの具体的な方法はMolecular Cloning: A  Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989)に参照する。
【００６０】
2.2 NF-кB核移植の実験結果
RCAN1の高レベル発現を示した細胞の細胞核内におけるNF-кB活性は顕著に低くなり(図１に示す)、NF-кBの核転移がRCAN1によって顕著に抑制されることが示された。RCAN1ノックアウトによりNF-кBの核転移が顕著に高められることが示された(図1A)。
【００６１】
2.3 NF-кB活性蛍光指示システムの実験手順
RCAN1発現ベクターならびにpNF-кB-luc(Clontech社から購入)、pRL-TK(Promega社から購入)でHEK293細胞を同時にトランスフェクションし(プラスミドの使用比例が1:1:0.02であり、具体的な方法についてInvitrogenのLF2000トランスフェクションキット参照)、24時間後細胞を溶解し、Dual-Luciferase（登録商標） Reporter Assay(Promega社から購入)で蛍光を測定した。
【００６２】
2.4 NF-кB活性蛍光指示システムの実験結果
その結果は、RCAN1高レベル発現がNF-кB活性を抑制し、RCAN1ノックアウトがNF-кB活性を顕著に高めることを示す(図1B)。
【００６３】
実施例３：RCAN1とIKBとの結合
3.1方法手順
(実施例2の2.1に示すように)HEK293細胞によってRCAN1発現ベクターをトランスフェクションした；
48時間後細胞を収集し、溶解した；
20μlの免疫共沈試薬Protein A/G agarose(Santa Cruz社から購入)および2μlの抗-IKBα抗体(Cell Signaling社から購入)を加え、4℃において一晩振とうした。
2000g遠心で上澄みを除去し、PBSで沈殿を二回洗い、ローディングバッファを加えた；
12％グリシンSDS-PAGEでタンパク質を単離し、タンパク質をPVDF膜に転移した。
Western Blot：anti-myc抗体(Abcam社から購入)によりタンパク質を検出した（具体的な方法についてAbcamの操作説明書参照）。
反対に、anti-myc抗体を使用してタンパク質を沈殿させ、更にIKB抗体を使用し、Western Blotを行った。SDS-PAGE及びWestern Blot法は、具体的には実施例2の2.1を参照。
【００６４】
3.2結果
図に示すように、RCAN1タンパク質はIKBタンパク質と相互作用があった(図2)。
【００６５】
実施例４：RCAN1がIKBのチロシンリン酸化に影響を与えた。
4.1 実験手順
HEK293によってRCAN1ノックアウトベクターsi-RCAN1をトランスフェクションした(実施例2の2.1に示す方法を用いた、ベクターsi-RCAN1の使用量も2μgであった)。
48時間後細胞を収集し、溶解し、IKB抗体(Cell Signaling社から購入)を使って免疫沈殿をした(具体な方法についてCell Signalingの操作説明書を参照する)。
免疫沈殿においては、タンパク質を12％SDS-PAGEゲルで分離し、PVDF膜に移した。
Western blotは、抗IKB-Y42リン酸化抗体(ABcam社から購入)を使って検出した。SDS-PAGE及びWestern Blot法は、具体的には実施例2の2.1を参照。
【００６６】
4.2 結果
その結果は、IKBの42位におけるチロシンリン酸化はRCAN1ノックアウトにより顕著に増加された(図3)。
【００６７】
実施例5：RCAN1アデノウイルス導入による白血病細胞の死滅
5.1 材料
白血病細胞株Jurkat、NALM-6、CEM、MOLT-4、Kasumi、HL-60、THP-1、HELを全てATCCから購入した。白血病初代細胞および細胞株はすべて10％ウシ胎児血清を含むRPMI 1640培地に培養され、細胞培養のための用品をすべてInvitrogenから購入した。培養条件は37℃の定温で、CO2を5％含む細胞インキュベーターとした。
単核細胞用の単離液体Histopaque-1077：Sigma社から購入。
細胞生存率キットCelltiter-Glo発光キット：Promega社から購入。
【００６８】
5.2 実験手順
白血病初代細胞の単離は、Histopaque試薬を使い、15mlの遠心管に3mlのHistopaque-1077試薬を加えたところ、上層が3mlの白血病患者の新鮮な末梢血となった。300gで30分間遠心し、第二層の単核細胞を採取し、10mlのPBSバッファ液で一回洗浄し、シャーレに接種した。
【００６９】
白血病細胞株あるいは白血病初代細胞を、RCAN1.1及びRCAN1.4を発現するアデノウイルスを用いてトランスフェクトし、48時間後、細胞生存率キットで細胞生存率を測定した。
【００７０】
5.3 結果
その結果は、RCAN1.1あるいはRCAN1.4の高レベル発現が、急性リンパ性白血病細胞系Jurkat、NALM-6、CEM、MOLT-4を死滅させ、生存率が約30-60%であった(図4A)。RCAN1.1あるいはRCAN1.4の高レベル発現が、急性骨髄性白血病細胞系Kasumi、HL-60、THP-1、HELを死滅させ、生存率が約40-80%であった(図4B)。急性白血病初代細胞におけるRCAN1.1の高レベル発現は顕著な細胞死滅死亡を引き起こすことができ、生存率が約55%であったが、正常な血液細胞および病状の緩和した白血病患者の血液細胞に対し、殺傷作用はほとんどなかったことから、RCAN1が特異的に白血病細胞の死滅を引き起こすことが判明した(図4C)。
【００７１】
実施例６：NF-кBを抑制するRCAN1の構造ドメインを確認する
6.1 材料
pcDNA3.1RCAN1-103mychisプラスミドの構築：プライマーT7(TAATACGA CTCACTATAGGG(配列番号10))または逆方向プライマーDS103KpnR：AtggtaccG CTTGTCTGGATTTGGCGGA(配列番号11)、およびpcDNA3.1(-)RCAN1.1-mycを基質として、1-103断片を増幅し、酵素切断サイトEcoR 1ならびKpn1によりpcDNA3.1(-)mychis(c)に挿入し、pcDNA3.1RCAN1-103mychis組換プラスミドを得た。
【００７２】
pcDNA3.1RCAN103-197mycプラスミドの構築：プライマーDSCR1-103F：ccgCTCGAGgccaccatg C AGTTTCTGAT CTCCCCT(配列番号12)または逆方向プライマーBGH(TAGAAGGCACAGTCGAGG  (配列番号13))を使って、pcDNA3.1(-)RCAN1.1-mycを基質として、103-197断片を増幅し、酵素切断サイトEcoR 1ならびKpn1によりpcDNA3.1(-)mychis(c)に挿入し、pcDNA3.1RCAN103-197myc組換プラスミドを得た。
核トランスフェクションキットVCA-1003：Lonza社から購入。
【００７３】
6.2 実験手順
(1)免疫共沈：HEK293細胞にRCAN1のN-あるいはC-末端を発現するベクターpcDNA3.1RCAN1-103  mychisおよびpcDNA3.1RCAN103-197mycをそれぞれトランスフェクションし、実施例3に示す実験方法により免疫共沈実験を行った。
【００７４】
(2)NF-кB活性蛍光指示システム：HEK293細胞にRCAN1のN-あるいはC-末端を発現するベクターpcDNA3.1RCAN1-103mychisおよびpcDNA3.1RCAN103-197mycをそれぞれトランスフェクションし、実施例2に示す方法によりNF-кB活性を検出した。
【００７５】
(3)白血病細胞株Jurkat生存率の検出：RCAN1のN末端にある103個のアミノ酸を発現するプラスミドpcDNA3.1RCAN1-103mychisを使って、核トランスフェクション法(Amaxa VCA-1003キットの説明書を参照する)によりJurkat細胞をトランスフェクションし、Celltiter-Glo発光キット(Promega)で細胞生存率を検出した。
【００７６】
6.3 結果
その結果、RCAN1のN末端にある103個のアミノ酸はIKBと互いに作用し、NF-кBの活性を抑制することができたのに対して、RCAN1のC末端はNF-кBの活性と関係がないことが判明した(図5A、B)。RCAN1のN末端にある103個のアミノ酸が白血病細胞株Jurkatの生存率を低減できた(図5C)。
【００７７】
実施例７：NF-кBを抑制するRCAN1ポリペプチドの精製および活性の測定
7.1実験手順
pTAT-RCAN1N-103プラスミドの構築：TAT配列はヒト免疫不全ウイルスHIVにおけるTatタンパク質の第45-57個のアミノ酸(RKKRRQRRRG(配列番号14))であり、このTAT配列はRCAN1のN末端ポリペプチドと融合され、ポリペプチドの細胞膜浸透性を促進させた。TAT断片を含むコードオリゴヌクレオチドTatg agg aagaagcggagacagcgacgaaga ggatcc c(配列番号15)を、Nde IまたはXho I制限酵素(New England Biolabsから購入)で切断したpet-28b原核発現ベクター(Novagen社から購入)に挿入し、pet-28bTATベクターを得て、さらにBamh IまたはXho I酵素でpet-28bTATベクターを切断し、RCAN1 1-103のPCR断片を挿入した；当該PCRに関しては、
PCR上流プライマー：CGGGATCCATGGAGGAGGTGGACCTG(配列番号16)、
下流プライマー：CCGCTCGAGCTTGTCTGGATTTGGCGGA(配列番号17)
であった。
PCRのテンプレートはpcDNA3.1(-)RCAN1.1-myc発現ベクターであった。
【００７８】
RCAN1 N-103ポリペプチドの精製：50ngのpTAT-RCAN1N-103発現ベクターを100μlのBL21(DE3)  pLysS細胞(Promega社から購入)にトランスフェクトし、その方法は氷浴で30分間、熱ショックで40秒、氷浴で5分間であった。TAT-RCAN1N-103を発現するクーロンを100μg/mlのアンピシリンを含んでいる200mlのLB培地に接種し、37℃、225rpmで16時振とうし、再び100μg/mlのアンピシリンを含んでいる1リットルのLB培地に接種し、37℃で一晩振とうした。10分間、5000gで遠心した後細胞沈殿を収集し、PBSで一回洗浄し、細胞沈殿を20mlの細胞混濁液(8M尿素、100mM塩化ナトリウム、20mM HEPEsを含む、PH8.0)に溶解し、15秒の超音波処理を3回供し細胞を粉砕し、16000g、4℃で15分間遠心し、上澄みを集め、クロマトグラフィーカラムHisTrapTM(amersham pharmacia社から購入)を通した。500mMのイミダゾールを含んだ細胞混濁液でカラムからタンパク質を溶出し、PD-10脱塩化カラム(GE社から購入)により脱塩してから、10％グリセリンのPBS(invitrogen社から購入)において-80℃保存した。SDS-PAGEゲル電気泳動後に、クマシーブリリアントブルー染色を使用して、単離および精製した後のタンパク質バンドを示した。(図6A)。
【００７９】
その精製したTAT-RCAN1N-103ポリペプチドでJurkat細胞を処理した：10μMのTAT-RCAN1N-103ポリペプチドでJurkat細胞を処理し、24時間後MTTで細胞生存率を検出した結果、TAT-RCAN1N-103処理群のJurkat細胞生存率は正常な対照群より顕著に低くなった(図6B)。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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