(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物夾雑物を含む被検体、ライセート試薬およびパラメトキシアニリンが結合したペプチドを接触させて、多段階反応により前記ペプチドからパラメトキシアニリンの遊離反応を生じさせる反応工程と、
前記遊離反応後の、前記被検体、前記ライセート試薬および前記ペプチドの混合物に対して、電気化学反応により測定される電流値に基づいて微生物夾雑物を定量する測定工程と
を有することを特徴とする微生物夾雑物の濃度検出方法。
【請求項２】
前記微生物夾雑物がエンドトキシンまたは（１→３）−β−Ｄ−グルカンであることを特徴とする請求項１に記載の微生物夾雑物の濃度検出方法。
【請求項３】
前記ペプチドは、一端にパラメトキシアニリンが結合し、他端にペプチドの保護基が結合したオリゴペプチドであることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の微生物夾雑物の濃度検出方法。
【請求項４】
前記電気化学反応による測定方法がアンペロメトリ法であることを特徴とする請求項１から請求項３までのいずれかに記載の微生物夾雑物の濃度検出方法。
【請求項５】
前記多段階反応および前記遊離反応時に加温することを特徴とする請求項１から請求項４までのいずれかに記載の微生物夾雑物の濃度検出方法。
【請求項６】
基板と、
前記基板上に形成され、微生物夾雑物を含む被検体を収容し得る収容部と、
前記収容部内に配置された電極と
を有し、
前記被検体を導入する導入口から前記収容部の間にパラメトキシアニリンが結合したペプチドが配置されていることを特徴とする電極チップ。
【請求項７】
一端が前記収容部に接続され、他端が前記導入口に接続された流路をさらに有することを特徴とする請求項６に記載の電極チップ。
【請求項８】
前記導入口から前記収容部の間にライセート試薬が配置されていることを特徴とする請求項６または請求項７に記載の電極チップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エンドトキシンや（１→３）−β−Ｄ−グルカン等の微生物夾雑物の濃度検出方法ならびにそれに用いられる電極チップおよびオリゴペプチドに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
エンドトキシンはグラム陰性菌の細胞壁に存在する物質であり、また（１→３）−β−Ｄ−グルカンは酵母やカビ等の真菌の細胞壁に存在する物質であり、発熱性等の種々の生物活性を有している。そのため、例えば透析液、注射薬、移植組織片、人工授精の受精卵の培養溶液等の医薬品や医療用具がエンドトキシンや（１→３）−β−Ｄ−グルカン等の微生物夾雑物で汚染された場合、極微量でも重篤な結果を招くことがあり、これらの微生物夾雑物の汚染量は厳密に管理されなければならない。しかしながら、エンドトキシンや（１→３）−β−Ｄ−グルカン等の微生物夾雑物は環境中に普遍的に存在し、さらに耐熱性を有するために加熱除去が困難であり、混入防止管理は非常に難しい。
【０００３】
エンドトキシンや（１→３）−β−Ｄ−グルカンの検出試験には定性試験および定量試験があり、定性試験としてはゲル化法、定量試験としては比濁法、比色法、蛍光法が一般に知られている。いずれの方法においても、高精度の検出を行うには煩雑な手順や長時間を要する。そのため、簡便な操作で迅速な検出方法が求められている。
【０００４】
そこで、本発明者らの一部は、特許文献１に記載するように、色素が結合したペプチドを用い、ディファレンシャルパルスボルタンメトリを適用したエンドトキシンの濃度検出方法を提案している。この方法においては、ディファレンシャルパルスボルタンメトリを適用することにより、ペプチドから遊離した色素の還元に由来する電流ピークと、ペプチドに結合した色素の還元に由来する電流ピークとを分離して得ることができ、エンドトキシンの濃度を高い精度で検出することができる。
しかしながら、ディファレンシャルパルスボルタンメトリでは、測定結果を解析し、測定電流ピークが測定対象物に由来するピークであるのか見極める必要があり、分析が複雑である。さらに、電位の走査に時間がかかるという問題もある。
また、色素が結合したペプチドを用いる場合、ペプチドから遊離した色素と、ペプチドに結合した色素とは、酸化還元電位が非常に近接しており、一般に分離が非常に困難であると考えられている。また、これらの濃度が微量であるほど、酸化還元電流を得ることは難しい。そのため、ディファレンシャルパルスボルタンメトリ以外の電気化学測定法では検出が困難である。
【０００５】
上記問題を解決するために、本発明者らの一部は、非特許文献１に記載するように、パラアミノフェノールが結合したペプチドを用いた電気化学的なエンドトキシンの濃度検出方法を提案している。パラアミノフェノールが結合したペプチドを用いることにより、ディファレンシャルパルスボルタンメトリよりも簡易な電気化学測定法であるアンペロメトリによる検出が可能になる。
しかしながら、パラアミノフェノールは、その電気化学活性が分単位の速い速度で経時的に失われていき、不安定であるという問題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１２−１２７６９５号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｋ．Ｙ．Ｉｎｏｕｅ  ｅｔ．ａｌ，Ａｎａｌｙｓｔ，（２０１３）１３８，６５２３−６５３１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであり、極微量の微生物夾雑物であっても、簡易に高感度かつ安定的な検出を行うことが可能な微生物夾雑物の濃度検出方法、ならびにそれに用いる電極チップおよび新規なオリゴペプチドを提供することを主目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するために、本発明は、微生物夾雑物を含む被検体、ライセート試薬および下記一般式（ａ）で示した化合物が結合したペプチドを接触させて、多段階反応により上記ペプチドからの上記一般式（ａ）で示した化合物の遊離反応を生じさせる反応工程と、上記遊離反応後の、上記被検体、上記ライセート試薬および上記ペプチドの混合物に対して、電気化学反応により測定される電流値に基づいて微生物夾雑物を定量する測定工程とを有することを特徴とする微生物夾雑物の濃度検出方法を提供する。
【００１０】
【化１】
0005916176.tif 000002
【００１１】
（式（ａ）中、Ｒは、−Ｏ−ＣｎＨ２ｎ＋１または−Ｓ−ＣｎＨ２ｎ＋１であり、ｎは１から４までの整数である。）
【００１２】
本発明によれば、一般式（ａ）で示した化合物が結合したペプチドを用い、電気化学反応を利用することにより、ペプチドと結合した一般式（ａ）で示した化合物をはじめ、被検体を含む混合物に存在するその他の物質の影響を受けることなく、ペプチドから遊離して生じる一般式（ａ）で示した化合物の濃度を定量することができ、これにより微生物夾雑物の濃度を定量することができる。したがって、極微量の微生物夾雑物であっても、簡易に高感度で検出することが可能である。また、一般式（ａ）で示した化合物は、その電気化学活性が安定であるため、正確かつ安定的な検出が可能となる。
【００１３】
上記発明においては、上記一般式（ａ）で示した化合物がパラメトキシアニリンであることが好ましい。上記一般式（ａ）で示した化合物のアルキル鎖が短い程、水溶性が高くなり、かつ、酵素が上記一般式（ａ）で示した化合物を認識しやすくなるため、酵素との反応性が高まるからである。
【００１４】
上記発明においては、上記微生物夾雑物がエンドトキシンまたは（１→３）−β−Ｄ−グルカンであることが好ましい。
【００１５】
また本発明においては、上記ペプチドは、一端に上記一般式（１）で示した化合物が結合し、他端にペプチドの保護基が結合したオリゴペプチドであることが好ましい。このようなオリゴペプチドは、多段階反応により生じる活性型凝固酵素の作用を受け、容易に一般式（１）で示した化合物を放出するため、微生物夾雑物の検出精度を向上することができ、効率的な測定が可能となる。
【００１６】
さらに本発明においては、上記電気化学反応による測定方法がアンペロメトリ法であることが好ましい。アンペロメトリ法は、ディファレンシャルパルスボルタンメトリ法とは異なり、測定結果の測定電流ピーク解析が不要であり、微生物夾雑物の検出を簡略化することができる。
【００１７】
また本発明においては、上記多段階反応および上記遊離反応時に加温することが好ましい。反応を活性化することができるからである。
【００１８】
また本発明は、基板と、上記基板上に形成され、微生物夾雑物を含む被検体を収容し得る収容部と、上記収容部内に配置された電極とを有し、上記被検体を導入する導入口から上記収容部の間に一般式（１）で示した化合物が結合したペプチドが配置されていることを特徴とする電極チップを提供する。
【００１９】
【化２】
0005916176.tif 000003
【００２０】
（式（ａ）中、Ｒは、−Ｏ−ＣｎＨ２ｎ＋１または−Ｓ−ＣｎＨ２ｎ＋１であり、ｎは１から４までの整数である。）
【００２１】
本発明によれば、電極チップに一般式（１）で示した化合物が結合したペプチドが予め配置されており、電気化学的に測定を行うため、微量の被検体であっても微生物夾雑物の濃度検出を簡易かつ迅速に高感度で行うことができ、安価に微生物夾雑物の濃度検出を行うことができる。
【００２２】
上記発明においては、上記一般式（ａ）で示した化合物がパラメトキシアニリンであることが好ましい。上記一般式（ａ）で示した化合物のアルキル鎖が短い程、水溶性が高くなり、かつ、酵素が上記一般式（ａ）で示した化合物を認識しやすくなるため、酵素との反応性が高まるからである。
【００２３】
また本発明の電極チップは、一端が上記収容部に接続され、他端が上記導入口に接続された流路をさらに有していてもよい。この場合、例えば流路に上記ペプチドを配置することができる。
【００２４】
また本発明においては、上記導入口から上記収容部の間にライセート試薬が配置されていてもよい。電極チップにライセート試薬も予め配置されている場合には、被検体のみを導入すればよく、簡単な操作で測定が可能となる。
【００２５】
さらに本発明は、一端に一般式（１）で示した化合物が結合し、他端にペプチドの保護基が結合していることを特徴とするオリゴペプチドを提供する。
【００２６】
【化３】
0005916176.tif 000004
【００２７】
（式（ａ）中、Ｒは、−Ｏ−ＣｎＨ２ｎ＋１または−Ｓ−ＣｎＨ２ｎ＋１であり、ｎは１から４までの整数である。）
【００２８】
本発明のオリゴペプチドは、多段階反応により生じる活性型凝固酵素の作用を受け、容易に一般式（１）で示した化合物を放出するため、微生物夾雑物の検出精度を向上することができ、効率的な測定を実現することができる。
【００２９】
上記発明においては、上記一般式（ａ）で示した化合物がパラメトキシアニリンであることが好ましい。上記一般式（ａ）で示した化合物のアルキル鎖が短い程、水溶性が高くなり、かつ、酵素が上記一般式（ａ）で示した化合物を認識しやすくなるため、酵素との反応性が高まるからである。
【発明の効果】
【００３０】
本発明は、極微量の微生物夾雑物であっても、簡易に高感度かつ安定的な検出を行うことが可能であるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】本発明における多段階反応の一例を示す模式図である。
【図２】本発明における多段階反応の他の例を示す模式図である。
【図３】本発明の電極チップの一例を示す概略平面図および断面図である。
【図４】本発明の電極チップの他の例を示す概略平面図および断面図である。
【図５】参考例におけるｐＭＡのサイクリックボルタモグラムである。
【図６】実施例２におけるｐＭＡおよびＬＧＲ−ｐＭＡのサイクリックボルタモグラムである。
【図７】実施例２におけるｐＭＡおよびＬＧＲ−ｐＭＡのサイクリックボルタモグラムである。
【図８】実施例３におけるサイクリックボルタモグラムである。
【図９】実施例３におけるサイクリックボルタモグラムである。
【図１０】実施例３におけるアンペログラムである。
【図１１】比較例１におけるディファレンシャルパルスボルタモグラムである。
【図１２】比較例１におけるエンドトキシンの検量線である。
【図１３】比較例２におけるアンペログラムである。
【図１４】比較例２におけるエンドトキシンの検量線である。
【図１５】比較例２におけるサイクリックボルタモグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
以下、本発明の微生物夾雑物の濃度検出方法ならびにそれに用いられる電極チップおよびオリゴペプチドについて詳細に説明する。
【００３３】
Ａ．微生物夾雑物の濃度検出方法
本発明の微生物夾雑物の濃度検出方法は、微生物夾雑物を含む被検体、ライセート試薬および下記一般式（ａ）で示した化合物が結合したペプチドを接触させて、多段階反応により上記ペプチドからの上記一般式（ａ）で示した化合物の遊離反応を生じさせる反応工程と、上記遊離反応後の、上記被検体、上記ライセート試薬および上記ペプチドの混合物に対して、電気化学反応により測定される電流値に基づいて微生物夾雑物を定量する測定工程とを有することを特徴とする。
【００３４】
【化４】
0005916176.tif 000005
【００３５】
（式（ａ）中、Ｒは、−Ｏ−ＣｎＨ２ｎ＋１または−Ｓ−ＣｎＨ２ｎ＋１であり、ｎは１から４までの整数である。）
【００３６】
以下、上記一般式（ａ）で示した化合物として、具体的に、パラメトキシアニリンについて説明する。なお、本明細書中にて、パラメトキシアニリンをｐＭＡと略称する場合がある。
【００３７】
図１は、多段階反応の一例を示す模式図であり、微生物夾雑物がエンドトキシンの場合の例である。図１に例示するように、多段階反応においては、エンドトキシンを含む被検体をライセート試薬のＣ因子に作用させることにより、Ｃ因子から活性型Ｃ因子を、Ｂ因子から活性型Ｂ因子を、凝固酵素前駆体から活性型凝固酵素を次々に発生させ、この活性型凝固酵素により、ｐＭＡが結合したペプチドからｐＭＡを遊離させる。
【００３８】
図２は、多段階反応の他の例を示す模式図であり、微生物夾雑物が（１→３）−β−Ｄ−グルカンの場合の例である。図２に例示するように、多段階反応においては、（１→３）−β−Ｄ−グルカンを含む被検体をライセート試薬のＧ因子に作用させることにより、Ｇ因子から活性型Ｇ因子を、凝固酵素前駆体から活性型凝固酵素を次々に発生させ、この活性型凝固酵素により、ｐＭＡが結合したペプチドからｐＭＡを遊離させる。
【００３９】
本発明においては、遊離反応後の、被検体、ライセート試薬およびペプチドの混合物に対して、電気化学反応により測定される電流値に基づいて微生物夾雑物を定量する。すなわち、反応後の被検体、ライセート試薬およびペプチドの混合物には、ペプチドから遊離したｐＭＡが存在しており、特定の電位においてｐＭＡが酸化反応する。このｐＭＡの酸化反応に由来する電流値と、ｐＭＡの濃度、すなわちエンドトキシンや（１→３）−β−Ｄ−グルカンの濃度との間には相関が成り立ち、この相関を利用して、ｐＭＡの濃度を定量する。
【００４０】
具体的には、電極電位が酸化電位以上になると、ｐＭＡは下記式（１）のスキームに従って電子を放出し、酸化される。
【００４１】
【化５】
0005916176.tif 000006
【００４２】
このときにｐＭＡから放出されて作用極が受け取る電子が電流として観察される。電気化学反応により測定される電流値は、ｐＭＡの濃度に比例する。エンドトキシンや（１→３）−β−Ｄ−グルカンの濃度および多段階反応の進行には相関があるため、エンドトキシンや（１→３）−β−Ｄ−グルカンの濃度および生じたｐＭＡの濃度、すなわち電流値にも相関が生じる。したがって、エンドトキシンや（１→３）−β−Ｄ−グルカンの濃度および電流値の相関を示した検量線を予め作成することにより、電流値から、エンドトキシンや（１→３）−β−Ｄ−グルカンの濃度を測定することができる。
【００４３】
ここで、被検体、ライセート試薬およびペプチドの混合物には、ペプチドから遊離したｐＭＡの他に、ペプチドに結合したｐＭＡも存在する。しかしながら、ペプチドから遊離したｐＭＡとペプチドに結合したｐＭＡとは、酸化還元電位が異なっており、その差が比較的大きい。そのため、ペプチドから遊離したｐＭＡの酸化反応に由来する電流と、ペプチドに結合したｐＭＡの酸化反応に由来する電流とを容易に分離して得ることができる。したがって本発明においては、ｐＭＡが結合したペプチドを用いることにより、ペプチドから遊離したｐＭＡの濃度が極微量であっても、エンドトキシンや（１→３）−β−Ｄ−グルカンの濃度を高い精度で検出することができる。
【００４４】
また、一般に、被検体には酸素が溶存しており、酸素は特定の電位において還元反応する。そのため、還元反応に由来する電流に基づいて微生物夾雑物の濃度を測定する場合には、酸素の還元反応に由来する電流も影響することから、微生物夾雑物の濃度を精度良く検出することが困難である。特許文献１に記載されているような、色素が結合したペプチドを用いる場合には、ペプチドから遊離した色素の還元反応に由来する電流ピークに基づいてエンドトキシンの濃度を測定するため、高精度な検出は難しい。
これに対し、本発明においては、上述したように、ペプチドから遊離したｐＭＡの酸化反応に由来する電流に基づいてエンドトキシンや（１→３）−β−Ｄ−グルカンの濃度を測定することができる。
したがって本発明においては、ペプチドと結合したｐＭＡをはじめ、被検体を含む混合物に存在するその他の物質の影響を受けることなく、極微量の微生物夾雑物であっても高感度に検出することが可能である。
【００４５】
また本発明においては、電気化学測定を行うため、電極表面での反応の検出が可能となり、微量の被検体でも微生物夾雑物の濃度を測定することができる。したがって、微量の被検体でも微生物夾雑物の濃度検出が可能になるのみならず、迅速な検出が可能となる。さらに、高価なライセート試薬の使用を大幅に節減することができ、安価な微生物夾雑物の濃度検出方法の提供が可能になる。
【００４６】
また本発明においては、パラメトキシアニリンが結合したペプチドを用いており、パラメトキシアニリンは、その電気化学活性が安定であるため、正確かつ安定的な検出が可能となる。特に、例えば３０分以上の長時間測定で高感度検出が必要な場合には、安定性に優れた検出が可能になる。
【００４７】
また本発明の微生物夾雑物の濃度検出方法は、比色法のように、光により検出する方法ではないため、透明性の低い被検体や、組織液等の多成分系の被検体も測定対象にできると考えられ、実用性が極めて高い。
【００４８】
このように本発明においては、医療現場で、手軽で迅速かつ高精度な微生物夾雑物の定量が可能となり、血液と直接接する医薬品や医療器具に対して、微生物夾雑物の厳重な混入防止管理を行うことができる。
【００４９】
本発明が適用される微生物夾雑物としては、ライセート試薬反応性物質であればよく、エンドトキシン、（１→３）−β−Ｄ−グルカンを例示することができる。
【００５０】
以下、本発明の微生物夾雑物の濃度検出方法における各工程について説明する。
【００５１】
１．反応工程
本発明における反応工程では、微生物夾雑物を含む被検体と、ライセート試薬およびパラメトキシアニリンが結合したペプチドとを接触させて、多段階反応により上記ペプチドからの上記パラメトキシアニリンの遊離反応を生じさせる。
【００５２】
ライセート試薬としては、Ｌｉｍｕｌｕｓ  Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓａｔｅ（ＬＡＬ）といわれるカブトガニの血球抽出成分により調製されたものを用いることができる。また、ライセート試薬として、生体由来成分から単離精製されたＣ因子、Ｇ因子、凝固酵素等や、遺伝子組換え技術によって作製された組換えＣ因子等を適宜使用して調製した「ＬＡＬの同等物」を用いることもできる。
【００５３】
パラメトキシアニリンが結合したペプチドとしては、一端にパラメトキシアニリンが結合し、他端にペプチドの保護基が結合したオリゴペプチドを用いることができる。このようなオリゴペプチドは、例えば、Ｘ−Ａ−ｐＭＡで示されるものを挙げることができる。ここで、Ｘは保護基、Ａはオリゴペプチドを表す。
保護基Ｘは、ペプチドの保護基、例えば、ｔ−ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ）、ベンゾイル基、アセテート基等を挙げることができる。
【００５４】
オリゴペプチドとしては、ライセート試薬の作用によってパラメトキシアニリンを遊離することができるものであれば特に限定されるものではない。中でも、オリゴペプチドは、アミノ酸数が２〜１０、特に２〜５、さらには３〜４のものが好ましい。
例えば、トリペプチドとしては、Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ、Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ等を例示することができる。また、例えば、一般式：Ｒ１−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＭＡにおけるＬ−アミノ酸を有するトリペプチドを挙げることができる。ここで、Ｒ１はＮ−ブロックされたアミノ酸を表す。
また、一般式：Ｒ２−Ａ１−Ａ２−Ａ３−Ａ４−ｐＭＡにおけるテトラペプチドを挙げることができる。ここで、Ｒ２は水素、ブロックしている芳香族炭化水素またはアシル基を表し、Ａ１はＩｌｅ、ＶａｌまたはＬｅｕから選択されるＬ−アミノ酸またはＤ−アミノ酸を表し、Ａ２はＧｌｕまたはＡｓｐを表し、Ａ３はＡｌａまたはＣｙｓを表し、Ａ４はＡｒｇを表す。
一端にパラメトキシアニリンが結合し、他端にペプチドの保護基が結合したオリゴペプチドとしては、具体的には、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＭＡ、アセテート−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ−ｐＭＡ等が挙げられる。
【００５５】
微生物夾雑物を含む被検体と、ライセート試薬およびパラメトキシアニリンが結合したペプチドとを接触させる際には、ｐＨ６．０〜９．０、中でもｐＨ７．０〜８．５の緩衝液を併用することが好ましい。これにより、パラメトキシアニリンの遊離量を増加させることができる。緩衝液としては、例えば、Ｔｒｉｓ−Ａｃ緩衝液、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、リン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＰＩＰＥＳ緩衝液等が挙げられる。
【００５６】
多段階反応により生じた活性型凝固酵素によって、被検体、ライセート試薬およびパラメトキシアニリンが結合したペプチドの混合物中には、パラメトキシアニリンが結合したペプチドからパラメトキシアニリンが遊離する。
多段階反応および遊離反応時には、反応を活性化するために、加温することが好ましい。多段階反応および遊離反応の反応温度としては、好ましくは２０℃〜５０℃の範囲内、より好ましくは２５〜４５℃の範囲内、特に好ましくは３７℃程度である。また、反応時間は、好ましくは３０分間以上、より好ましくは１時間以上、さらに好ましくは２時間以上である。これにより、充分な量の遊離したパラメトキシアニリンを得ることができる。
なお、被検体とライセート試薬とパラメトキシアニリンが結合したペプチドとの合計容量が１ｍｍ３〜２００ｍｍ３の範囲内、特に１ｍｍ３〜１００ｍｍ３の範囲内、さらには１ｍｍ３〜５０ｍｍ３の範囲内のように少ない場合は、反応温度を３０℃〜４０℃程度とし、反応時間を１５分間〜１時間程度とすることができる。
【００５７】
２．測定工程
本発明における測定工程では、上記遊離反応後の、上記被検体、上記ライセート試薬および上記ペプチドの混合物に対して、電気化学反応により測定される電流値に基づいて微生物夾雑物を定量する。すなわち、反応後の被検体、ライセート試薬およびペプチドの混合物には、ペプチドから遊離したパラメトキシアニリンが存在しており、特定の電位において、パラメトキシアニリンが酸化反応する。この酸化反応に由来する電流値と、パラメトキシアニリンの濃度、すなわち微生物夾雑物の濃度との間には相関が成り立ち、この相関を利用して、パラメトキシアニリンの濃度を定量する。
【００５８】
電気化学反応による測定方法としては、電気化学反応により測定される電流値に基づいて微生物夾雑物を定量できる方法であれば特に限定されるものではなく、例えばアンペロメトリ法、ボルタンメトリ法等が挙げられる。アンペロメトリ法としては、クロノアンペロメトリ法、ディファレンシャルパルスアンペロメトリ法等が例示される。ボルタンメトリ法としては、ノーマルパルスボルタンメトリ法、ディファレンシャルパルスボルタンメトリ法、サイクリックボルタンメトリ法等が例示される。中でも、測定が簡単であることから、アンペロメトリ法が好ましい。
【００５９】
アンペロメトリ法による測定においては、例えば、被検体、ライセート試薬およびパラメトキシアニリンが結合したペプチドの混合物に、電極を入れ、アンペロメトリ法に基づく測定を行う。すなわち、作用極に一定電位を印加した状態で、流れる電流を測定する。電位は参照極に対して制御し、電流は作用極および対極の間を流れる。電流値が小さいとき等には、対極を設けずに、参照極に対極の役割を担わせてもよい。電圧印加時間を横軸に、電流値を縦軸にプロットしたグラフを用いることで、上記の一定電位を電極に印加開始してから一定時間経過後の電流を測定する。微生物夾雑物の濃度および一定時間経過後の電流値の相関を示した検量線を予め作成することにより、測定電流値から微生物夾雑物の濃度を算出することができる。
【００６０】
使用する電極としては特に限定されるものではなく、電気化学測定に用いられる一般的な電極を使用することができる。例えば、作用極としては、グラッシーカーボン、カーボンペースト、グラファイト、ダイヤモンドライクカーボン等の炭素電極、Ａｕ、Ｐｔ等の電気化学的に安定な貴金属を用いることができる。対極としては、Ａｕ、Ｐｔ等の電気化学的に安定な貴金属を用いることができる。参照極としては、Ａｇ／ＡｇＣｌ電極等を用いることができる。
また、測定装置としては、一般に電気化学測定に使用される装置を用いることができ、例えばポテンショスタット、電流増幅器、これらと同等の機能を持つ装置を挙げることができる。
【００６１】
３．その他
上述のように、本発明の微生物夾雑物の濃度検出方法については、パラメトキシアニリンを例に挙げて説明したが、本発明においては、上述した一般式（ａ）で示した他の化合物についても、パラメトキシアニリンと同様の電気化学特性を有することから、正確かつ安定的な検出が可能となる。
【００６２】
Ｂ．電極チップ
本発明の電極チップは、基板と、上記基板上に形成され、微生物夾雑物を含む被検体を収容し得る収容部と、上記収容部内に配置された電極とを有し、上記被検体を導入する導入口から上記収容部の間に下記一般式（ａ）で示した化合物が結合したペプチドが配置されていることを特徴とするものである。
【００６３】
【化６】
0005916176.tif 000007
【００６４】
（式（ａ）中、Ｒは、−Ｏ−ＣｎＨ２ｎ＋１または−Ｓ−ＣｎＨ２ｎ＋１であり、ｎは１から４までの整数である。）
【００６５】
以下、上記一般式（ａ）で示した化合物として、具体的に、パラメトキシアニリンについて説明する。
【００６６】
図３（ａ）、（ｂ）は、本発明の電極チップの一例を示す概略平面図および断面図であり、図３（ｂ）は図３（ａ）のＡ−Ａ線断面図である。図３（ａ）、（ｂ）に例示する電極チップ１においては、基板２上に複数の電極３および端子４がそれぞれ配列して形成され、電極３および端子４を一対にして両者を電気的に接続する導線５が複数形成されており、導線５を覆うように絶縁層６が形成されている。また、基板２上には、複数の貫通孔１２を有する上部基板１１が、電極３上に貫通孔１２が位置するように配置されており、貫通孔１２によって収容部７が形成されている。収容部７の上部は開口しており、被検体を導入する導入口になっている。そして、収容部７内の電極３の近傍にはパラメトキシアニリンが結合したペプチド９が固定されている。この電極チップ１は、内部に電極３およびパラメトキシアニリンが結合したペプチド９が配置された収容部７を複数有している。なお、図３（ａ）において絶縁層は省略している。
【００６７】
図４（ａ）、（ｂ）は、本発明の電極チップの他の例を示す概略平面図および断面図であり、図４（ｂ）は図４（ａ）のＢ−Ｂ線断面図である。図４（ａ）、（ｂ）に例示する電極チップ１においては、基板２上に作用極３ａ、対極３ｂおよび参照極３ｃを含む電極３ならびに端子４が形成され、作用極３ａ、対極３ｂおよび参照極３ｃのそれぞれと端子４とを一対にして両者を電気的に接続する導線５が形成されており、導線５を覆うように絶縁層６が形成されている。基板２上には、収容部７、流路２２および導入口２３を形成するための開口部を有するスペーサ２５が配置されており、このスペーサ２５は、スペーサ２５の収容部７に相当する開口部が電極３上に位置するように、かつ端子４が露出するように配置されている。スペーサ２５上には、スペーサ２５の収容部７および流路２２に相当する開口部を覆うように、かつ導入口２３が確保されるように、上部基板２１が配置されている。また、流路２２にはパラメトキシアニリンが結合したペプチド９およびライセート試薬１０が固定されている。なお、図４（ａ）において絶縁層は省略している。
【００６８】
本発明においては、電極チップにパラメトキシアニリンが結合したペプチドが予め配置されており、電気化学的に測定を行うため、電極表面での反応の検出が可能となり、微量の被検体でも微生物夾雑物の濃度を測定することができる。したがって、微量の被検体であっても、簡易かつ迅速に、高感度で安定的な検出が可能となる。さらに、高価なライセート試薬の使用を大幅に節減することができ、安価に微生物夾雑物の濃度検出を行うことができる。
また、本発明の電極チップが収容部を複数有する場合には、連続的に測定が可能であり、かつ、小型化が可能であるため、医療用現場で実用的に使用することができる。
【００６９】
以下、本発明の電極チップにおける各構成について説明する。
【００７０】
１．収容部
本発明における収容部は、基板上に形成され、微生物夾雑物を含む被検体を収容し得るものであり、その内部に電極が配置されるものである。
収容部の形状としては特に限定されるものではなく、収容部の平面視形状としては、例えば円形、楕円形、矩形等を挙げることができる。
本発明の電極チップにおいては、被検体を数μＬ〜数十μＬ程度導入して測定を行うことができることから、収容部の容量としては、１ｍｍ３〜２００ｍｍ３の範囲内であることが好ましく、中でも１ｍｍ３〜１００ｍｍ３の範囲内、特に１ｍｍ３〜５０ｍｍ３の範囲内であることが好ましい。収容部の大きさとしては、例えば収容部の平面視形状が円形の場合には、直径が１ｍｍ〜５ｍｍ程度、深さが１ｍｍ〜１０ｍｍ程度とすることができる。
【００７１】
収容部の配置としては、被検体を収容することができ、その内部に電極を配置することができれば特に限定されるものではない。例えば図３に示すように上部が導入口となるように収容部７が配置されていてもよく、図４に示すように流路２２に接続して収容部７が配置されていてもよい。
収容部の数は、１つでもよく複数でもよい。
【００７２】
２．流路
本発明の電極チップは、一端が上記収容部に接続され、他端が導入口に接続された流路を有していてもよい。
流路は、上部基板の溝によって形成されていてもよく、また基板と上部基板との間にスペーサを配置することによって形成されていてもよい。
流路の幅や高さとしては、被検体を収容部に導くことができれば特に限定されるものではなく、例えば０．１ｍｍ〜５ｍｍ程度とすることができる。
【００７３】
３．パラメトキシアニリンが結合したペプチド
本発明においては、被検体を導入する導入口から収容部の間にパラメトキシアニリンが結合したペプチドが配置されている。
パラメトキシアニリンが結合したペプチドの配置としては、導入口から収容部の間までであればよく、例えば収容部内や流路等にパラメトキシアニリンが結合したペプチドを配置することができる。また、パラメトキシアニリンが結合したペプチドは、基板側に配置されていてもよく、上部電極側に配置されていてもよい。
パラメトキシアニリンが結合したペプチドを配置する方法としては、例えばパラメトキシアニリンを蒸留水や上述の緩衝液等に溶解させ、ディスペンサーを用いた方法やインクジェット法等にて塗布し、乾燥する方法が挙げられる。
【００７４】
４．ライセート試薬
本発明においては、被検体を導入する導入口から収容部の間にライセート試薬が配置されていてもよい。
ライセート試薬の配置としては、導入口から収容部の間までであればよく、例えば収容部内や流路等にライセート試薬を配置することができる。また、ライセート試薬は、基板側に配置されていてもよく、上部電極側に配置されていてもよい。
また、ライセート試薬は、パラメトキシアニリンが結合したペプチドとは別に配置されていてもよく、パラメトキシアニリンが結合したペプチドと混合して配置されていてもよい。
ライセート試薬を配置する方法としては、上記のパラメトキシアニリンが結合したペプチドを配置する方法と同様とすることができる。
【００７５】
５．電極
本発明における電極は、上記収容部内に配置されるものである。
電極としては、特に限定されるものではなく、電気化学測定に用いられる一般的な電極を使用することができる。例えば、グラッシーカーボン、カーボンペースト、グラファイト、ダイヤモンドライクカーボン等の炭素電極や、Ａｕ、Ｐｔ等の電気化学的に安定な貴金属の電極を用いることができる。
基板上には、電極として、作用極のみが形成されていてもよく、作用極および対極が形成されていてもよく、作用極、対極および参照極が形成されていてもよい。
【００７６】
また、基板上には、電極と電気的に接続された導線および端子を形成することができる。導線および端子の材料は、電極の材料と同様とすることができる。導線および端子の材料は、検出電流値に影響を及ぼさない導電性が確保されればよく、一般的な導電材料を使用することができるが、中でも、導電性の観点から、Ａｕ、Ｐｔ、Ａｇ等の貴金属であることが好ましい。
【００７７】
電極の形成方法としては、例えば導電膜が形成された基板を用い、フォトリソグラフィー法により導電膜をパターニングする方法や、マスク蒸着法、スクリーン印刷法、グラビア印刷法、フレキソ印刷法、インクジェット法等が挙げられる。
導線および端子の形成方法は、電極の形成方法と同様とすることができる。
また、導線および端子は、電極と同時に形成してもよく、電極とは別に形成してもよい。
【００７８】
６．基板
本発明に用いられる基板としては、電極が形成可能であり、表面が絶縁性を有するものであれば特に限定されるものではなく、例えばガラス基板、樹脂基板、セラミック基板等が挙げられる。
基板の形状としては、特に限定されるものではなく、例えば正方形、矩形、円形、楕円形等、任意の形状とすることができる。
【００７９】
７．上部基板
本発明においては、基板上に上部基板が配置されていてもよい。
【００８０】
上部基板は貫通孔を有していてもよい。貫通孔を導入口とすることができる。また、図３に例示するように貫通孔によって収容部を形成することもできる。
貫通孔の大きさとしては、図３に例示するように貫通孔によって収容部を形成する場合には、収容部の大きさと同様とすることができる。また、図示しないが貫通孔が導入口であり流路に接続されている場合には、被検体を導入可能な大きさであればよい。
貫通孔の形状としては特に限定されないが、貫通孔の形成し易さから、貫通孔の平面視形状は円形、楕円形が好ましい。
【００８１】
また、上部基板の基板との対向面には、流路および収容部を形成するための溝が形成されていてもよい。流路や収容部を形成するための溝の大きさとしては、流路や収容部の大きさと同様とすることができる。
【００８２】
上部基板としては、表面が絶縁性を有するものであれば特に限定されるものではなく、例えばガラス基板、樹脂基板等が挙げられる。
上部基板の形状としては、特に限定されるものではなく、例えば正方形、矩形、円形、楕円形等、任意の形状とすることができる。
【００８３】
上部基板は、少なくとも端子が露出するように基板上に配置される。また、上部基板の貫通孔によって収容部を形成する場合には、貫通孔が電極上に位置するように、上部基板が配置される。また、上部基板の溝によって流路および収容部を形成する場合には、溝の一部が電極上に位置するように、上部基板が配置される。
上部基板は、例えば接着剤や粘着剤を介して基板に貼付することができる。
【００８４】
８．スペーサ
本発明においては、基板と上部基板との間にスペーサが配置されていてもよい。スペーサは収容部および流路を形成するために設けられるものである。
スペーサは収容部および流路に相当する開口部を有することができる。開口部の大きさおよび形状としては、収容部および流路の大きさおよび形状と同様とすることができる。
【００８５】
スペーサとしては、絶縁性を有するものであれば特に限定されるものではなく、例えば樹脂基板等が挙げられる。
スペーサの形状としては、特に限定されるものではなく、例えば正方形、矩形、円形、楕円形等、任意の形状とすることができる。
【００８６】
スペーサは、少なくとも端子が露出し、スペーサの開口部が電極上に位置するように基板上に配置される。
スペーサは、例えば接着剤や粘着剤を介して基板に貼付することができる。
【００８７】
９．絶縁層
本発明においては、導線を覆うように絶縁層を形成することができる。絶縁層により、導線の酸化を抑制するとともに、ショートを防ぐことができる。
絶縁層の材料としては、例えば熱硬化性樹脂、光硬化性樹脂等を用いることができる。
絶縁層の形成方法としては、導線を覆い、電極および端子を覆わないように絶縁層をパターン状に形成することができる方法であればよく、例えばフォトリソグラフィー法、スクリーン印刷法、グラビア印刷法、フレキソ印刷法、インクジェット法等が挙げられる。
【００８８】
１０．電極チップの使用方法
本発明の電極チップを用いた微生物夾雑物の濃度検出方法の一例について説明する。
まず、図３に例示するような電極チップにおいては、微生物夾雑物を含む被検体とライセート試薬とを混合した混合物を電極チップ１の導入口から導入して、収容部７に収容する。この際、ｐＭＡが結合したペプチド９は被検体とライセート試薬との混合物に溶解する。また、図４に例示するような電極チップにおいては、微生物夾雑物を含む被検体を電極チップ１の導入口２３から導入し、毛細管現象により流路２２に流入させ、収容部７まで移動させる。この際、ｐＭＡが結合したペプチド９およびライセート試薬１０は被検体に溶解する。そして、被検体とライセート試薬とｐＭＡが結合したペプチドとを収容部にて一定時間反応させる。
次に、アンペロメトリ法の場合には、電極に一定電位を印加する。一定時間経過後の電流を測定することにより、微生物夾雑物の濃度を算出することができる。このとき、ペプチドから遊離したｐＭＡとペプチドに結合したｐＭＡとは、酸化還元電位が異なっており、その差が比較的大きいため、ｐＭＡが結合したペプチドから分離して生じるｐＭＡのみを、選択的かつ高精度に検出することができる。
【００８９】
１１．その他
上述のように、本発明の電極チップについては、パラメトキシアニリンを例に挙げて説明したが、本発明においては、上述した一般式（ａ）で示した他の化合物についてもパラメトキシアニリンと同様の電気化学特性を有することから、同様の効果を得ることができる。
【００９０】
Ｃ．オリゴペプチド
本発明のオリゴペプチドは、一端に下記一般式（ａ）で示した化合物が結合し、他端にペプチドの保護基が結合していることを特徴とするものである。
【００９１】
【化７】
0005916176.tif 000008
【００９２】
（式（ａ）中、Ｒは、−Ｏ−ＣｎＨ２ｎ＋１または−Ｓ−ＣｎＨ２ｎ＋１であり、ｎは１から４までの整数である。）
【００９３】
以下、上記一般式（ａ）で示した化合物として、具体的に、パラメトキシアニリンについて説明する。
なお、一端にパラメトキシアニリンが結合し、他端にペプチドの保護基が結合したオリゴペプチドについては、上記「Ａ．微生物夾雑物の濃度検出方法」に記載したので、ここでの説明は省略する。
本発明のオリゴペプチドは、公知の方法に準拠して合成することができる。例えばＢｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＭＡは下記のスキームに示すように合成することができる。
【００９４】
【化８】
0005916176.tif 000009
【００９５】
なお、本発明のオリゴペプチドについては、上述のように、パラメトキシアニリンを例に挙げたて説明したが、本発明においては、上述した一般式（ａ）で示した他の化合物についてもパラメトキシアニリンと同様の電気化学特性を有することから、同様の効果を得ることができる。
【００９６】
本発明は、上記実施形態に限定されるものではない。上記実施形態は例示であり、本発明の特許請求の範囲に記載された技術的思想と実質的に同一な構成を有し、同様な作用効果を奏するものは、いかなるものであっても本発明の技術的範囲に包含される。
【実施例】
【００９７】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。
【００９８】
［準備］
１．試薬
本実施例で使用した試薬は以下の通りである。
【００９９】
（１）標準エンドトキシン溶液
エンドトキシン標準品は、生化学工業社製のＥ．Ｃｏｌｉ  Ｏ１１３：Ｈ１０株由来ＵＳＰ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎを用いた。標準エンドトキシン溶液は、生化学工業社製のエンドスペシーＥＳ２４Ｓに添付されているエンドトキシンフリー水を用いて調製し、使用の直前に３０分間ボルテックスミキサーで激しく攪拌した。なお、エンドトキシン濃度は測定溶液中の最終濃度で示した。
【０１００】
（２）ライセート試薬
ライセート試薬としては、ライセート試薬が凍結乾燥状態で１テスト分ずつ専用の試験管に封入されている、生化学工業社製のエンドスペシーＥＳ２４Ｓを用いた。
【０１０１】
（３）ＬＧＲ−ｐＭＡおよびｐＭＡ
合成したＬＧＲ−ｐＭＡは、大塚製薬社製の注射用水に溶解し、１０ｍＭのストック溶液として−２０℃で保管した。和光純薬工業社製のｐＭＡは、測定毎に大塚製薬社製の注射用水に溶解し、１０ｍＭ溶液とした。ＬＧＲ−ｐＭＡおよびｐＭＡの希釈には生化学工業社製のエンドスペシーに添付されている緩衝液を用いた。
【０１０２】
２．装置および測定法
本実施例における電気化学測定法で用いた装置および測定法は以下の通りである。
【０１０３】
（１）測定装置
Ｉｖｉｕｍ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製のポテンショスタットＣｏｍｐａｃｔＳｔａｔ
【０１０４】
（２）電極
（ａ）９６ウェルプレートを用いる測定
作用極にはＢＡＳ株式会社製の直径１ｍｍのグラッシーカーボンディスク電極を、対極にはＰｔ板を、参照極にはＡｇ／ＡｇＣｌをそれぞれ用いた。作用極表面の状態を一定に保つため、１回の測定ごとにＧＣ電極表面をＢＡＳ社製の０．０５μｍのアルミナスラリーで１分以上研磨した。
（ｂ）電極チップを用いる測定
電極チップの電極を作用極、対極および参照極として使用し、測定を行った。あるいは、電極チップの直径１．０ｍｍの炭素電極を作用極として使用し、Ａｇ／ＡｇＣｌ参照極とＰｔ対極を収容部へ挿入して測定を行った。
【０１０５】
（３）測定法
サイクリックボルタンメトリ（ＣＶ）では走査速度を２０ｍＶ／ｓとした。また、アンペロメトリ法では初期電位を−０．２Ｖに設定し、１０秒間印加を行った後、電位を０．６Ｖにステップし、３０秒間印加を行った。
【０１０６】
［参考例］
溶解したｐＭＡの安定性の評価を行った。
緩衝液は、生化学工業社製のエンドスペシー添付の試薬を用いた。緩衝液を用いて濃度が１ｍＭとなるようにｐＭＡ溶液を調製した。ｐＭＡ溶液をそれぞれ３０分、１時間、２時間、３時間、７２時間の間３７℃の暗所で保存した後、９６ウェルプレートでＣＶ測定を行った。電位は０．２Ｖ→０．７Ｖ→−０．４Ｖ→０．２Ｖの範囲で走査した。
図５に０分、３０分、１時間、２時間、３時間、７２時間後のボルタモグラムを示す。０．５Ｖ付近にｐＭＡの酸化反応由来のピークが確認され、その電流値はｐＭＡ溶液調製直後から７２時間後までほぼ一定だった。この結果から、ｐＭＡが非常に安定であることがわかった。
【０１０７】
［実施例１］
パラメトキシアニリンが結合したペプチドであるＢｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＭＡは、上記「Ｃ．オリゴペプチド」に示すスキームにより合成した。なお、以下、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＭＡはＬＧＲ−ｐＭＡと略称する場合がある。
【０１０８】
［実施例２］
１．電極チップの作製
電極チップは、下記に示す方法により作製した。
（１）導線および端子の形成
ＰＥＴ基材（東レ社製、ルミラー３５０Ｈ１０）上にスクリーン印刷にてＡｇペーストをパターン状に塗布し、１３０℃で３０分間焼成することで導線および端子を形成した。
（２）電極の形成
次に、上記ＰＥＴ基材上にスクリーン印刷によりカーボンペーストをパターン状に塗布し、１２０℃で１５分間焼成することで作用極および対極を形成した。また、上記ＰＥＴ基材上にスクリーン印刷によりラサ工業製のＡｇ／ＡｇＣｌペーストをパターン状に塗布し、８０℃で１０分間焼成することで参照極を形成した。
（３）絶縁層の形成
次に、導線を被覆する目的で、上記ＰＥＴ基材上にＵＶ硬化性樹脂をスクリーン印刷によりパターン状に塗布し、ウシオ社製Ｄｅｅｐ  ＵＶランプにて１００秒間露光して硬化させた。
【０１０９】
（４）流路および収容部の形成およびＬＧＲ−ｐＭＡの配置
１００μｍ厚みのＰＥＴ基材（東レ社製、Ａ４１００）の両面に２５μｍ厚みのアクリル粘着シートをラミネーターにて貼り合わせ、積層基材とした。次いで、被検体液が通過する流路、収容部および導入口を形成すべく、ＧＲＡＰＨＴＥＣ社製のカッティングマシーンにて、上記積層基材を裁断し、上記積層基材の流路、収容部および導入口に相当する領域を除去することで流路、収容部および導入口に相当する開口部を形成した。
次に、流路、収容部および導入口に相当する開口部が形成された積層基材を、上記の導線、端子および電極等が形成されたＰＥＴ基材にラミネーターにて貼り合わせることで積層し、高さ１５０μｍの流路および収容部を形成した。
次に、ＬＧＲ−ｐＭＡの希釈には生化学工業社製のエンドスペシーＥＳ２４Ｓに添付されている緩衝液を用いた。ＬＧＲ−ｐＭＡの希釈液をディスペンサーにて、上記絶縁層上の収容部滴下し、室温にて乾燥させた。あるいは、ＬＧＲ−ｐＭＡの希釈液をディスペンサーにて、後述のスリーエムヘルスケア社製の親水カバーフィルムの収容部に相当する領域に滴下し、室温にて乾燥させた。
次に、流路および収容部に蓋をするように、上記積層基材にスリーエムヘルスケア社製の親水カバーフィルムを貼り合わせ接着させた。
【０１１０】
２．評価
作製した電極チップの評価を行った。測定試料としては、濃度１．０ｍＭに調製したｐＭＡおよびＬＧＲ−ｐＭＡを使用した。試料の調製には、生化学工業社製のエンドスペシーＥＳ２４Ｓに添付されている緩衝液を使用した。
まず、電極チップにおいて、親水カバーフィルムを含まないものを用いて評価を行った。電極チップの電極部分に１００μＬの試料を滴下し、ＣＶ測定を行った。測定には、電極チップの作用極、対極および参照極を使用した。電位は０．２Ｖ→１．５Ｖ→−０．４Ｖ→０．２Ｖの範囲で、２０ｍＶ／ｓの速度で走査した。
図６に（Ａ）ｐＭＡおよび（Ｂ）ＬＧＲ−ｐＭＡのそれぞれの場合のボルタモグラムを示す。０．４Ｖ付近にｐＭＡの酸化反応に由来するピークが、０．９５Ｖ付近にＬＧＲ−ｐＭＡの酸化反応に由来するピークが確認された。この結果から、電極チップを使用した電気化学測定が可能であることが示された。
【０１１１】
次に、電極チップを用いて評価を行った。導入口より試料を電極チップ内に導入し、収容部が試料で満たされたのを確認した後、ＣＶ測定を行った。測定条件は、上述と同様とした。
図７に（Ａ）ｐＭＡおよび（Ｂ）ＬＧＲ−ｐＭＡの場合のボルタモグラムを示す。０．４Ｖ付近にｐＭＡの酸化反応に由来するピークが、１．０Ｖ付近にＬＧＲ−ｐＭＡの酸化反応に由来するピークが確認された。この結果から、電極チップを使用した電気化学測定が可能であることが示された。さらに、ｐＭＡの酸化反応に由来するピークが０．４Ｖであり、ＬＧＲ−ｐＭＡの酸化反応に由来するピークがｐＭＡの酸化反応に由来するピークである０．４Ｖ以上の１．０Ｖ付近に確認されたため、アンペロメトリ法によりｐＭＡのみの酸化反応を検出することが可能であることが示された。
【０１１２】
［実施例３］
ＬＡＬカスケード反応を用いてエンドトキシンの濃度検出を行った。
ライセート試薬および緩衝液は、生化学工業社製のエンドスペシー添付の試薬を用いた。凍結乾燥状態のライセート試薬が入った試験管へ、ＬＧＲ−ｐＭＡ、緩衝液２００μＬおよびエンドトキシン標準溶液２００μＬを添加して撹拌した。３７℃で最長６０分間反応を行った後、混合液２００μＬを９６ウェルプレートへ移した。エンドトキシンがＣ因子へ結合する反応がトリガーとなり、Ｂ因子、凝固酵素を次々に活性化してＬＡＬカスケード反応が進む。凝固酵素によりＬＧＲ−ｐＭＡから遊離したｐＭＡを直径１ｍｍのグラッシーカーボン電極でＣＶ法およびアンペロメトリ法を用いて検出した。ＣＶ法は走査速度を２０ｍＶ／ｓとし、範囲を０．２Ｖ→１．５Ｖ→−０．４Ｖ→０．２Ｖとした。アンペロメトリ法では−０．２Ｖの初期電位を１０秒間印加した後、０．６Ｖに電位をステップして３０秒間印加し、ｐＭＡの酸化反応に由来する電流を記録した。
【０１１３】
図８に、反応時間をそれぞれ（Ａ）０分、（Ｂ）１０分、（Ｃ）２０分、（Ｄ）３０分、（Ｅ）４０分、（Ｆ）５０分、（Ｇ）６０分に設定し、濃度１００ＥＵ／Ｌのエンドトキシン標準溶液とライセート試薬とを反応させた時のボルタモグラムを示す。ＬＡＬカスケード反応によってＬＧＲ−ｐＭＡから遊離するｐＭＡの酸化反応に由来するピークが０．５Ｖ付近に確認された。その電流値は１０分〜４０分の範囲では時間に依存して増加し、４０分以降は一定となった。
図９に、反応時間を３０分に設定し、それぞれ濃度が（Ａ）１ＥＵ／Ｌ、（Ｂ）１０ＥＵ／Ｌ、（Ｃ）１００ＥＵ／Ｌ、（Ｄ）１０００ＥＵ／Ｌのエンドトキシン標準溶液とライセート試薬とを反応させた時のボルタモグラムを示す。ＬＡＬカスケード反応によってＬＧＲ−ｐＭＡから遊離するｐＭＡの酸化反応由来のピークが０．５Ｖ付近に確認された。その電流値はエンドトキシン濃度に依存して増加した。
これらの結果から、本手法により３０分で１０ＥＵ／Ｌのエンドトキシンを検出できることが分かった。さらにこれらの結果から、ｐＭＡの酸化反応由来のピーク電位はＬＧＲ−ｐＭＡの酸化反応由来のピーク電位よりも低く、アンペロメトリ法によりｐＭＡの酸化反応のみを検出することができることが示された。
【０１１４】
図１０（ａ）にＬＡＬ反応を３０分行った溶液に対してアンペロメトリ法による検出を行った際に得られたアンペログラムを示す。また、図１０（ｂ）に図１０（ａ）の拡大図を示す。エンドトキシンの濃度は（Ａ）０ＥＵ／Ｌ、（Ｂ）１ＥＵ／Ｌ、（Ｃ）１０ＥＵ／Ｌ、（Ｄ）１００ＥＵ／Ｌ、（Ｅ）１０００ＥＵ／Ｌであり、１ＥＵ／Ｌ〜１０００ＥＵ／Ｌの範囲でエンドトキシン濃度が高くなるに従って、ｐＭＡの酸化反応由来の電流値が増大することが確認された。
【０１１５】
［比較例１］
パラニトロアニリンが結合されたペプチドとしてＢｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡを用いた。
ＬＡＬ酵素溶液としては、Ｃ因子、Ｂ因子および凝固酵素前駆体を含むライセート試薬と、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡとが凍結乾燥状態で１テスト分ずつ専用の試験管に封入されている、生化学工業社製のエンドスペシーＥＳ−２４Ｓセットの試薬を用いた。なお、以下、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡをＬＧＲ−ｐＮＡと略称する場合がある。
ライセート試薬および緩衝液は、生化学工業社製のエンドスペシー添付の試薬を用いた。凍結乾燥状態のライセート試薬およびＬＧＲ−ｐＮＡが入った試験管へ、緩衝液２００μＬおよびエンドトキシン標準溶液２００μＬを添加して撹拌し、２００μＬを９６ウェルプレートへ移した。室温で１時間または２時間反応を行った後、直径１ｍｍのグラッシーカーボン電極を用いてディファレンシャルパルスボルタンメトリ（ＤＰＶ）法による測定を行った。
【０１１６】
図１１（ａ）に反応時間１時間後、図１１（ｂ）に反応時間２時間後のボルタモグラムを示す。ＬＧＲ−ｐＮＡおよびｐＮＡの還元反応由来のピークがそれぞれ−０．６４Ｖおよび−０．７５Ｖ付近に観察された。ＬＧＲ−ｐＮＡの還元反応由来のピークには−０．６Ｖ付近に見られる別のピークが重なっていた。エンドトキシンの濃度は、（Ａ）０ＥＵ／Ｌ、（Ｂ）１ＥＵ／Ｌ、（Ｃ）１０ＥＵ／Ｌ、（Ｄ）１００ＥＵ／Ｌ、（Ｅ）１０００ＥＵ／Ｌであり、エンドトキシンの濃度が高くなるに従って−０．６４Ｖ付近のＬＧＲ−ｐＮＡの還元反応由来のピークが減少し、−０．７５Ｖ付近のｐＮＡの還元反応由来のピークが増大した。
図１２に、０ＥＵ／Ｌの電流値を基準とした−０．７５Ｖ付近のピーク電流値をシグナルに採用し、エンドトキシン濃度に対してプロットしたグラフを示す。それぞれの点は５回の繰り返し実験の平均値であり、エラーバーは±標準偏差を示す。ＤＰＶのシグナルはエンドトキシン濃度および反応時間に依存した。本手法によって反応時間１時間では５ＥＵ／Ｌ以上のエンドトキシンの検出が可能であり、反応時間２時間では０．５ＥＵ／Ｌ以上の検出が可能であった。
しかし、上述の通りディファレンシャルパルスボルタンメトリは、測定結果の測定電流ピーク解析を行う必要があり、分析が複雑である。さらにｐＮＡとＬＧＲ−ｐＮＡのシグナルの分離はディファレンシャルパルスボルタンメトリ以外の方法では難しい。例えば、アンペロメトリ法を用いようとした場合、ｐＮＡのほうがＬＧＲ−ｐＮＡよりも低電位で還元されるため、ｐＮＡが還元される電位を印加するとＬＧＲ−ｐＮＡも還元されてしまうため、ｐＮＡのみの検出は不可能である。
【０１１７】
［比較例２］
パラアミノフェノールが結合したペプチドとしてＢｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＡＰを用いた。なお、以下、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＡＰをＬＧＲ−ｐＡＰと略称する場合がある。
ライセート試薬および緩衝液は、生化学工業社製のエンドスペシー添付の試薬を用いた。凍結乾燥状態のライセート試薬が入った試験管へ、ＬＧＲ−ｐＡＰ、緩衝液２００μＬを添加しライセート試薬を溶解した。この混合液９０μＬおよびエンドトキシン標準溶液９０μＬを９６ウェルプレートへ移し撹拌した。３７℃で３０分、１時間または２時間後、アンペロメトリ法による測定を行った。測定には直径１ｍｍのグラッシーカーボン電極、Ａｇ／ＡｇＣｌ参照極およびＰｔ対極を使用した。
【０１１８】
図１３にアンペロメトリ法による検出の反応２時間後のアンペログラムを示す。エンドトキシンの濃度は（Ａ）０ＥＵ／Ｌ、（Ｂ）０．５ＥＵ／Ｌ、（Ｃ）１ＥＵ／Ｌ、（Ｄ）１０ＥＵ／Ｌ、（Ｅ）１００ＥＵ／Ｌ、（Ｆ）１０００ＥＵ／Ｌであり、１ＥＵ／Ｌ〜１０００ＥＵ／Ｌの範囲でエンドトキシン濃度が高くなるに従って、ｐＡＰ由来の電流値が増大した。
図１４に、電位を−０．２Ｖから０．３Ｖに切り替えてから１９秒後から２１秒後の電流値の平均値をシグナルとして採用し、エンドトキシン濃度に対してプロットしたグラフを示す。反応時間は（Ａ）３０分、（Ｂ）１時間、（Ｃ）２時間となっており、それぞれの点は３回の繰り返し実験の平均値、エラーバーは±標準偏差を示す。本手法から、反応時間３０分では１００ＥＵ／Ｌ〜２０００ＥＵ／Ｌの範囲、１時間では１ＥＵ／Ｌ〜１０００ＥＵ／Ｌの範囲、２時間では０．５ＥＵ／Ｌ〜１０００ＥＵ／Ｌの範囲でエンドトキシン濃度と電流値の間に相関があることが分かった。超純粋透析液の管理等、医療現場では１ＥＵ／Ｌの検出法が求められていることから、本手法の場合では、検出には１時間以上の反応時間が必要となる。
【０１１９】
しかし、ここでｐＡＰの電気化学活性の低下が問題となる。溶媒をリン酸緩衝液ＰＢＳ（−）として、１．０ｍＭとなるように調製したｐＡＰを３７℃、遮光条件で保存した時のｐＡＰ酸化シグナルの変化を評価した結果を図１５に示す。測定にはＣＶ法を用い、電位は２０ｍＶ／ｓの速度で、−０．２Ｖ→０．８Ｖ→−０．８Ｖ→−０．２Ｖの範囲で走査した。保存時間は溶液調製時を開始とし、（Ａ）０分、（Ｂ）３０分、（Ｃ）１時間、（Ｄ）４時間であり、時間経過とともに０．２Ｖ付近に現れるｐＡＰの酸化反応由来のピークが小さくなった。０分のときの電流値を１００とすると、３０分で９７、１時間後および４時間後で８７となり、１割以上減少する結果となった。また、時間の経過とともに０．３Ｖ付近に新たなピークが現れ始め、ｐＡＰが別物質へ変化していることが示唆された。
【符号の説明】
【０１２０】
１  …  電極チップ
２  …  基板
３  …  電極
４  …  端子
５  …  導線
７  …  収容部
９  …  パラメトキシアニリンが結合したペプチド
１０  …  ライセート試薬
１１、２１  …  上部基板
１２  …  貫通孔
２２  …  流路
２３  …  導入口
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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