(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の式
【化１】
0005973459.tif 000027
のｄ−ネビボロール及び／又はｌ−ネビボロールの合成のための方法であって、下記の工程：
ａ）６−フルオロ−２−カルボキシル酸エステル（１）、式中、Ｒ１は、直鎖又は分岐Ｃ１−５アルキル基である、のエナンチオマーの混合物を加水分解して、
【化２】
0005973459.tif 000028
酸（２）及びエステル（３）の混合物を与える工程、
【化３】
0005973459.tif 000029
ｂ）かくして得られた酸（２）及びエステル（３）を、エポキシドの混合物（４）及び（５）のそれぞれの合成のために使用する工程、
【化４】
0005973459.tif 000030
ｃ）エポキシドの混合物（４）及び（５）を分割（ｒｅｓｏｌｖｅ）させて、化合物（６）＋（７）及び（８）＋（９）をそれぞれ得る工程、
【化５】
0005973459.tif 000031
ｄ）アミノアルコール（６）及び（８）をエポキシド（７）及び（９）と反応させて、ｌ−ベンジルネビボロール（１０）及びｄ−ベンジルネビボロール（１１）を得る工程、
【化６】
0005973459.tif 000032
ｅ）ベンジル保護基を除去する工程
を含み、
工程（ａ）において、立体選択的酵素的加水分解反応によって加水分解して、＞７０％のエナンチオマー過剰度を伴うＲ酸（２）及び＞７０％のエナンチオマー過剰度を伴うＳエステル（３）の混合物を与え、かつ、工程（ｃ）において、エポキシドの混合物（４）及び（５）を、それらをベンジルアミンと立体障害アルコールの中で反応することによって、動力学的に分割させて、実施することを特徴とし、
前記酵素的加水分解反応が、オフィオストマ（Ｏｐｈｉｏｓｔｏｍａ）属から得られたエステラーゼの使用により実施され、
ベンジルアミンでのエポキシドの混合物（４）及び（５）の動力学的分割が、イソプロパノール、ｓｅｃ−ブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール、２−メチル−２−ブタノール、イソアミルアルコール、２−メチル−２−ペンタノールから選択される立体障害アルコールの中で行われる、
上記方法。
【請求項２】
前記酵素的加水分解反応が、Ｏｐｈｉｏｓｔｏｍａ  ｎｏｖｏ−ｕｌｍｉのＡＪ３株に由来するエステラーゼの使用により実施される、請求項１に記載の合成方法。
【請求項３】
前記酵素的加水分解反応が、８及び１１の間に包含されるｐＨで行われる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記酵素的加水分解反応が、８．５及び１０の間に包含されるｐＨで行われる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記酵素的加水分解反応が、１０°及び３５℃の間に包含される温度で行われる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項６】
前記酵素的加水分解反応が、２０°及び２５℃の間に包含される温度で行われる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記酵素的加水分解反応が、水性環境の中で又は水非混和性溶媒の存在下で行われる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項８】
エステルの混合物（１）の酵素的加水分解反応が、（Ｒ）酸（２）及び（Ｓ）エステル（３）の両方の成分において＞８０％又は＞９０％のエナンチオマー過剰度を伴う混合物を産するように進行する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項９】
前記酸（２）が、ＲＲ＋ＲＳエポキシドの混合物（４）へと変換され、片や、前記エステル（３）が、ＳＳ＋ＳＲエポキシドの混合物（５）へと変換される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
エポキシドの混合物（４）のベンジルアミンとの動力学的分解が、イソプロパノール、ｓｅｃ−ブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール、２−メチル−２−ブタノール、イソアミルアルコール、２−メチル−２−ペンタノールから選択される立体障害アルコールの中で行われ、アミノアルコールＲＳ（６）のみを得て、一方で、エポキシドＲＲ（７）が、変化しないで回収される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
エポキシドの混合物（５）のベンジルアミンとの動力学的分解が、イソプロパノール、ｓｅｃ−ブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール、２−メチル−２−ブタノール、イソアミルアルコール、２−メチル−２−ペンタノールから選択される立体障害アルコールの中で行われ、アミノアルコールＳＲ（８）のみを得て、一方で、エポキシドＳＳ（９）が、変化しないで回収される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記立体障害アルコールが、２−メチル−２−ブタノールである、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
アミノアルコールＲＳ（６）が、エポキシドＳＳ（９）と反応して、ｌ−ベンジル化ネビボロール（１０）を得るか、及び／又は、アミノアルコールＳＲ（８）が、エポキシドＲＲ（７）と反応して、ｄ−ベンジル化ネビボロール（１１）を得る、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
化合物（１０）及び（１１）が、１：１比で混合され、ベンジル基から脱保護化されて、最終産物ネビボロールを得る、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記最終産物ネビボロールが、塩酸で塩化され、対応する塩酸塩を得る、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ネビボロールの合成のための新規な方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ネビボロールは、２つのエナンチオマー［２Ｓ［２Ｒ［Ｒ［Ｒ］］］］α，α’−［イミノ−ビス（メチレン）］ビス［６−フルオロ−クロマン−２−メタノール］及び［２Ｒ［２Ｓ［Ｓ［Ｓ］］］］α，α’−［イミノ−ビス（メチレン）］ビス［６−フルオロ−クロマン−２−メタノール］のラセミ混合物である（図１）。
【化１】
0005973459.tif 000002
【０００３】
特に、生来又は組換え形態での、微生物Ｏｐｈｉｏｓｔｏｍａ  ｎｏｖｏ−ｕｌｍｉからも取得可能な、エステラーゼのファミリーに属する立体選択性酵素での処理による原料クロマニルエステル（１）の酵素的分割（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）が報告されている。
【０００４】
かくして得られたエステル及び酸は、当業者に知られる方法によって、対応する「半キラル」エポキシド、すなわちスキーム（１）の（ＲＲ＋ＲＳ、４）及び（ＳＳ＋ＳＲ、５）のペアへと変換することができる。
【０００５】
次には、各ペアの成分は、第三級アルコールからなる溶媒の中でのベンジルアミンとのそれらの異なる反応性を利用して分離することができる。動力学的分割のこれらの条件下で、エポキシドＲＳ及びＳＲは、対応する開環産物（６及び８）へと変換されるであろう、片や、エポキシドＲＲ及びＳＳは、変化しないままとなっているであろう。
【０００６】
次いで、エポキシドＲＲ（７）は、アミンＲＳ（６）から分離され、エポキシドＳＳ（９）は、当業者に知られた方法で、そして優先的に塩基性成分の結晶化によってアミンＳＲ（８）から分離される。
【０００７】
次いで、アミンＲＳは、エポキシドＳＳと反応して、ｌ−ベンジルネビボロールを得る。同様に、アミンＳＲは、エポキシドＲＲと反応して、ｄ−ベンジルネビボロールを得る。
【０００８】
かくして得られたｌ−及びｄ−ベンジルネビボロールは、等モル量でプールされ、結晶化されそして当業者に知られた方法に従ってネビボロールＨＣｌへと変換される。
【０００９】
（技術常識）
ネビボロールは、アドレナリンβ受容体アンタゴニスト、抗高血圧剤、血小板凝集阻害剤及び血管拡張剤として知られている。
【００１０】
ネビボロールは、塩基性の特性を有し、酸との処理によって受容可能な医薬的塩へと変換してもよい。塩酸塩の塩は、市場形態である。
【００１１】
ネビボロールは、４つの非対称中心を含み、それゆえに１６個の立体異性体が理論的に可能である。しかしながら、分子の特別な構造（対称の軸の存在）が要因で、１０個の立体異性体のみが実際には形成することができる（スキーム２）。
【化２】
0005973459.tif 000003
【００１２】
実際、分子の対象性が要因で、ＲＳＳＳ＝ＳＳＳＲ、ＲＲＳＳ＝ＳＳＲＲ、ＳＲＳＳ＝ＳＳＲＳ、ＲＲＳＲ＝ＲＳＲＲ、ＳＲＳＲ＝ＲＳＲＳ及びＲＲＲＳ＝ＳＲＲＲである。
【００１３】
米国特許第４，６５４，３６２号（欧州特許第０１４５０６７号、Ｊａｎｓｓｅｎ）には、合成の鍵となる中間体としてのエポキシド異性体の使用によるネビボロールシリーズの産物の合成が記載されている。産物は、絶対配置を定義しないで、時として混合物で、時としてエナンチオ純粋体として得られる。特に、前記特許の実施例８４には、スキーム３で定義される異性体の混合物の取得が記載されている。
【化３】
0005973459.tif 000004
【００１４】
これらは、クロマトグラフィカラムによって、２つのエポキシドラセミ体（ＲＳ／ＳＲ、４／５）及び（ＲＲ／ＳＳ、７／９）へと分離される。引き続いて、エポキシドのペアのベンジルアミンによる開環、及び前記反応（６＋８）の産物を使用して第２のエポキシドのペア（７＋９）の開環が起こる。この操作は、４つのベンジル化されたジアステレオ異性体の産生へと導く。
【００１５】
欧州特許第０３３４４２９号（Ｊａｎｓｓｅｎ）には、欧州特許第０１４５０６７号で報告されたものと同じ方法が記載されているが、より多くの実験的詳細と、ネビボロールの単一の異性体の調製に焦点を当てた注目をもって記載されている。この場合では、具体的に６−フルオロクロマンカルボン酸が（＋）−デヒドロアビエチルアミンでの処理によって個々のエナンチオマーへと分割される。かくして得られた個々のエナンチオマーは、下記の合成スキーム（異性体Ｓが示される）に従って対応する半キラルエポキシドへと変換される。
【化４】
0005973459.tif 000005
【００１６】
異性体［２Ｒ，αＳ，２’Ｓ，α’Ｓ］−α，α’−［イミノビスメチレン］ビス［６−フルオロ−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−メタノール］の立体選択性合成を記載する。
【００１７】
使用される酸エステルの分割のための方法は、それの産業的適用に関連するいくつかの欠点に見舞われる。実際に、追加の工程（アミド形成、画分化結晶化、アミド加水分解）が導入され、そしてさらには全体的な収量はむしろ低い。かくして得られたジアステレオ異性体のエポキシドの混合物は、調製用ＨＰＬＣ上でランされて所望のキラリティの異性体を単離する。
【００１８】
Ｈｅｔｅｒｏ  Ｄｒｕｇｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄは、ＷＯ２００６/０１６３７６及び引き続いてのＷＯ２００７/０８３３１８において、ベンジルネビボロールのジアステレオ異性体混合物（１０、１１、１３、１４）のレベルで適用された画分化結晶化方法を記載し、同様にこの場合において、欲していないジアステレオ異性体を除去する必要に関した、原料の約５０％の廃棄へと導く。
【００１９】
ＷＯ２００４／０４１８０５（Ｅｇｉｓ  Ｇｙｏｇｙｓｚｅｒｇｙａｒ）には、非常に異なる化合物から出発する［２Ｓ＊［Ｒ＊［Ｒ＊［Ｒ＊］］］］及び［２Ｒ＊［Ｓ＊［Ｓ＊［Ｓ＊］］］］−（±）−α，α’−［イミノビス（メチレン）］ビス［６−フルオロ−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−メタノール］並びにそれの個々の純粋な［２Ｓ＊［Ｒ＊［Ｒ＊［Ｒ＊］］］］及び［２Ｒ＊［Ｓ＊［Ｓ＊［Ｓ＊］］］］エナンチオマーの調製のための方法が記載される。エナンチオマーの混合物としてのネビボロール合成のために使用される工程は、約３０個であり、合成を非常に長大に及び非経済的にする。
【化５】
0005973459.tif 000006
【００２０】
ＷＯ２００８／０１００２２（Ｃｉｍｅｘ  Ｐｈａｒｍａ）では、その文献における方法に従って分割された６−フルオロクロマンカルボン酸から出発して、２つの分離したシーケンス（ｄ−ネビボロールについてのスキーム５）に従っての２つのネビボロールエナンチオマーの合成へと導く経路が報告されている。
【００２１】
ベンジルアミンによるエポキシドの開環において、単独の開環産物が反応混合物から結晶化するが、他のジアステレオ異性体は、母液によって除去され、同様にこの場合において、合成シーケンスのすでにかなり進行したステージにおいて相当な画分の材料の除去へと導く。また、最後のキラル中心が、最後から２番目の工程で、ケトンの還元によって追加され、非常に敏感な反応であり、最適な結果を得るためには、ＢＫＨ４及びチタニウムイソプロポキシドの使用を想定する。
【００２２】
ＷＯ２００８／０６４８２６（Ｚａｃｈ  Ｓｙｓｔｅｍ）には、エポキシドの分割のための方法が報告され、かつては、ジアステレオ異性体のペア（ＲＳ／ＳＲ及びＲＲ／ＳＳ）が、コバルトＩＩのキラル複合体によって媒介される同じエポキシドのエナンチオ選択性開環を通じて、分離されてきている（スキーム６）。この場合では、その方法の見地からの実際的なものよりも少ない、クロマトグラフィの分離工程が必要であり、一方でコバルト複合体は、取り扱い及び廃棄において注意を要する。
【化６】
0005973459.tif 000007
【００２３】
ＷＯ２００８／０６４８２７（Ｚａｃｈ  Ｓｙｓｔｅｍ）には、２，２−ジメチルアセタールといった、保護されたグリセルアルデヒドの２つの光学異性体から開始するｄ−及びｌ−ネビボロールの分離した及びエナンチオ選択性の合成が記載されている（スキーム７）。ジアステレオ異性体は、知られているが記載されていない方法によって分離される。合成工程の数は、古典的な合成のものよりも多く、一方でアルデヒド前駆体は、それほど安定ではない化合物として知られ、純粋な形態で室温で保存した場合に重合化する傾向がある。
【化７】
0005973459.tif 000008
【００２４】
６−フルオロ−クロマン−２−カルボン酸のレベルでのエナンチオマー分離については、（＋）−デヒドロアビエチルアミンでのアミド形成、次いで画分化結晶化及びアミド加水分解をして酸を回収するための方法（欧州特許第０３３４４２９号）が労力が多く、及びむしろ低い収量を供することが知られている。
【００２５】
カルボン酸のエステルの酵素的分割に関して、これは、その文献において知られている方法であるが、クロマン−２−カルボン酸のフッ素誘導体のエステルに用いられたことは決してなく、あるいは結果としてネビボロール合成のためにも使用されたことはなかった。
【００２６】
具体的に、クロマン−２−カルボン酸塩に関する公知の例が報告されている。
【００２７】
米国特許第５，０３７，７４７号では、（２Ｒ）−ヒドロキシ−置換ベンゾピラン−２−カルボキシルエステル及び（２Ｓ）−ヒドロキシ−置換ベンゾピラン−２−カルボキシルエステルは、対応するラセミ体のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓリパーゼで触媒された選択性加水分解によって調製される。
【００２８】
Ｕｒｂａｎ（米国特許番号第５，０８９，６３７号、欧州特許第０４４８２５４号）には、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓに由来するエステラーゼによる酵素的加水分解をして一般式（Ｉ）のラセミ混合物、式中、Ｒ＝Ｃ１−Ｃ３アルキル、を分割することが記述される。
【化８】
0005973459.tif 000009
【００２９】
ＷＯ９６／４０９７５には、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓに由来する微生物エステラーゼの、同じ一般式のしかしＲ＞Ｃ３のクロマン−２−カルボキシルアルキルの分割のための使用が報告されている。
【００３０】
ドイツ特許第４４３００８９号には、クロマン−２−カルボキシルエステルが選択された群の酵素（キモトリプシン、Ｃａｎｄｉｄａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ由来のリパーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ由来のリパーゼ、Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｃａｎｄｉｄｕｍ由来のリパーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ由来のリパーゼ）での酵素的加水分解に供される一連の例が報告されている。
【００３１】
最後に、Ｏｐｈｉｏｓｔｏｍａ  ｎｏｖｏ−ｕｌｍｉ子嚢菌に由来するエステラーゼについて、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）の中でクローニングしてのそれの単離及びエステルの分割におけるそれの使用に関した詳細が、例えば、Ｍ．Ｎ．ＩｓｕｐｏｖらによってＡｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ−Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ  Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ｄ６０，ｐ．１８７９−１８８２（２００４）において、又は欧州特許第０６８７３０５号において報告され、一方で、アリールアルカノイド酸の、そしてより具体的にはケトプロフェンの、エナンチオマーの分割におけるそれの使用が、欧州特許第０６９３１３４号に記載される。
【００３２】
今日まで利用可能な文献証拠に基づいて、ネビボロール合成は、依然として多数の合成上の問題を伴う。エポキシドを通過する原始的なＪａｎｓｓｅｎ合成（スキーム３、混合物６）は、確かにより短いものであるが、２つのジアステレオ異性体エポキシドペアの調製用ＨＰＬＣによる分離を必要とする。他の方法は、一般的により多くの合成工程を想定する。
【００３３】
報告された合成のかなりの部分において、５０％まで到達し得る、中間体産物百分率が、適用された合成シーケンスにおいて不可避的に産生されてきた要求されていないジアステレオ異性体を除去するために、廃棄される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３４】
それゆえに、産業的使用に適しかつクロマトグラフィ分離の使用を回避する新規の合成方法を開発する必要性、及び限定された数の合成工程を維持しながらもかなりの百分率の中間体化合物を排除する必要性が、著しく感じられる。
【課題を解決するための手段】
【００３５】
今まさに、驚くべきことにネビボロールの合成のためのより効果的な方法（スキーム１）を見出した。その方法は、本明細書において強調された以前知られていた合成経路のための欠点を排除することを可能にする。すなわち、それは、
ａ）  エポキシドエナンチオマーのペア（ＲＲ／ＳＳ  ＲＳ／ＳＲ）の又は他のジアステレオ異性体中間体の調製用ＨＰＬＣによる分離を、回避又は相当低減させる、
ｂ）  望ましくない異性体で代表される産物の損失を目立って低減させ、結果的に全体的な収量の増加を伴う。
【００３６】
６−フルオロクロマン−２−カルボン酸エステルの２つのエナンチオマーの混合物の処理は、Ｏｐｈｉｏｓｔｏｍａ属から得られ得る真菌エステラーゼ（リパーゼ）によって行われる。好ましい種は、Ｏｐｈｉｏｓｔｏｍａ  ｎｏｖｏ−ｕｌｍｉ由来のエステラーゼであり、その文献においてナプロキセン又はケトプロフェン化合物のエステルに対する立体選択的活性についてすでに記載されている。
【００３７】
水性又は水性／有機性媒質の中で実施される反応は、選択的様式で２つのエナンチオマーの中から１つのカルボン酸への加水分解へと導き、一方で、他の１つは、エステルの形態のままである。その反応は、迅速にかつ高い立体選択性を伴って進行する。かくして産生された２つの化合物は、酸−塩基抽出によって容易に分離することができる。
【００３８】
それゆえに、本発明の目的は、ネビボロールの調製のための方法であって、その方法は、下記の工程を含む：
ａ．  酵素的加水分解反応によって、６−フルオロ−２−カルボン酸エステル（１）、式中Ｒ１は、直鎖又は分岐Ｃ１−５アルキル基である、のエナンチオマーの混合物を分割して、
【化９】
0005973459.tif 000010
酸（２）及びエステル（３）の混合物を得る工程、
【化１０】
0005973459.tif 000011
式中、Ｒ酸（２）が、＞７０％のエナンチオマー過剰度で存在し、かつＳエステル（３）が、＞７０％のエナンチオマー過剰度で存在し、エナンチオマー過剰度が、両方の成分において、好ましくは＞８０％であり、さらにより好ましくは９０％である、
ｂ．  かくして得られた酸（２）及びエステル（３）をエポキシドの混合物（４）及び（５）の合成のために使用する工程、
【化１１】
0005973459.tif 000012
ｃ．１）  ベンジルアミンによるエポキシドの混合物（４）及び（５）に対する立体障害アルコールの中での動力学的分割をして、化合物（６）＋（７）及び（８）＋（９）をそれぞれ得てそれらの分離をする工程、
【化１２】
0005973459.tif 000013
ｃ．２）  ｃ．１）で記載した動力学的分割に代えて、エポキシドの混合物（４）及び（５）のクロマトグラフィ分離及び、引き続いてのＲＳエポキシドのベンジルアミンでの反応をしてアミノアルコールＲＳ（６）を得ること及び引き続いてのエポキシドＳＲのベンジルアミンでの反応をしてアミノアルコールＳＲ（６）を得ることの工程、
ｄ．  アミノアルコールＲＳ（６）をエポキシド（９）と反応させてｌ−ベンジルネビボロール（１０）を得ること及びアミノアルコールＳＲ（８）をエポキシド（７）と反応させてｄ−ベンジルネビボロール（１１）を得ることの工程、
【化１３】
0005973459.tif 000014
ｅ．  脱保護化して、ベンジル基の除去を伴い、ネビボロール形成を伴う工程。
【化１４】
0005973459.tif 000015
【００３９】
本発明の最後まで、直鎖又は分岐Ｃ１−５アルキル基として定義されるＲ１は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、アミル、ｔｅｒｔ−アミルから選択されるラジカルを表し、好ましくは、メチル、エチル、プロピルから選択されるラジカルであり、さらにより好ましくは、エチル基である。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
本発明によれば、ネビボロール化合物は、スキーム１に記載される６−フルオロクロマン−２−カルボン酸エステル（１）のラセミ混合物から出発する方法により得られる。
【００４１】
６−フルオロクロマン−２−カルボキシレート（１）は、Ｏｐｈｉｏｓｔｏｍａ属から得られ得る真菌エステラーゼ（リパーゼ）により触媒されるエナンチオ選択性加水分解を通じて高い立体選択性を伴ってそれの２つのエナンチオマーへと分割され得る。好ましい種は、Ｏｐｈｉｏｓｔｏｍａ  ｎｏｖｏ−ｕｌｍｉ由来のエステラーゼであり、その文献においてナプロキセン又はケトプロフェン化合物のエステルに対する立体選択的活性についてすでに記載されている。
【００４２】
酵素は、単離され及び結晶化された発現タンパク質の形態で、Ｍ．Ｎ．ＩｓｕｐｏｖらによってＡｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ−Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ  Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ｄ６０，ｐ．１８７９−１８８２（２００４）に記載されている。酵素は、欧州特許第Ｂ１−０６８７３０５号（ＷＯ９４／２０６３４）、欧州特許第０６９３１３４号、米国特許第５９１２１６４号、及び欧州特許第１６２６０９３号にもまた記載されている。
【００４３】
大腸菌の中での酵素発現は、Ｍ．Ｎ．Ｉｓｕｐｏｖら（前出）によって又は欧州特許第Ｂ１−０６８７３０５  号（ＷＯ９４／２０６３４）において記載されるように実施してもよい。
【００４４】
この株は、活性の良好な例を提供するが、広範な種類の関連する株においてむしろ広がった性質の活性があれば、本発明の範囲はこれにのみ限定されることを意図しない。Ｏｐｈｉｓｔｏｍａ属の微生物及びそれらの酵素的活性は、６−フルオロクロマン−２−カルボキシル化エチルのラセミエステルを立体選択的方法で加水分解し、それによってエナンチオマーＲがかなり富化された、例えば４５〜５０％の変換で９３〜１００％のエナンチオマー過剰度での酸をもたらし、かつ富化された残存エステルがエナンチオマーＳのままとなるために、使用してもよい。
【００４５】
それゆえに、（Ｒ）６−フルオロクロマン−２−カルボン酸（２）は、＞７０％のエナンチオマー過剰度で、好ましくは＞８０％のエナンチオマー過剰度で及びさらに好ましくは＞９０％のエナンチオマー過剰度で産生され、一方で、（Ｓ）６−フルオロカルボン酸は、エステル（３）の形態のままであり、＞７０％のエナンチオマー過剰度で、好ましくは＞８０％のエナンチオマー過剰度で及びさらに好ましくは＞９０％のエナンチオマー過剰度を伴う。
【００４６】
反応は、エナンチオマーの任意の混合物に対して行ってもよいが、一般的にラセミ体を使用する。
【００４７】
この反応のために使用されるエステルは、６−フルオロ−２−カルボン酸エステル（１）であり、式中、Ｒ１は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、アミル、ｔｅｒｔ−アミルから包含される群から、好ましくはメチル、エチル、プロピルから、さらに好ましくはエチル基から選択される、直鎖又は分岐Ｃ１−５アルキル基である。
【００４８】
反応は、好ましくはｐＨ８〜１１で、好ましくは８．５〜１０．０で行われる。
【００４９】
温度は、１０及び３５℃の間に、しかし好ましくは２０及び２５℃の間に包含されていてもよい。
【００５０】
反応混合物は、水性環境の中に、又は水非混和性溶媒の存在下にあっていてもよい。
【００５１】
両方の化合物の回収は、当業者に知られた方法によって、好ましくは一連の酸−塩基抽出を通じて可能である。
【００５２】
両方の化合物は次いで、ネビボロール合成（スキーム１）のために使用される。
【００５３】
当業者に知られた方法を通じて（ＷＯ２００８／０１００２２に記載されたものに類似して、非限定的な例によって）、酸（２）は、それらの間でジアステレオ異性体となる、エポキシド（ＲＳ）及び（ＲＲ）の混合物（４）へと転換され、一方で、エステル（３）は、エポキシド（ＳＲ）＋（ＳＳ）の混合物（５）へと変換される。
【化１５】
0005973459.tif 000016
【００５４】
エポキシドの混合物（４）のベンジルアミンでの立体障害アルコール溶媒（例えば、イソプロパノール、ｓｅｃ−ブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール、２−メチル−２−ブタノール、イソアミルアルコール、２−メチル−２−ペンタノール）の中での開環の反応を実施することによって、単独でのアミノアルコールＲＳ（６）の形成を伴う動力学的分割を受け、一方で、エポキシドＲＲ（７）は、変化せずに回収される。
【化１６】
0005973459.tif 000017
【００５５】
同じ手順を、混合物（５）に適用させ、アミノアルコールＳＲ（８）及びエポキシドＳＳ（９）を産生する。
【００５６】
記載された動力学的分割に代えて、エポキシドの混合物（４）は、２つのエポキシドＲＳ及びＲＲへと、及びエポキシドの混合物（５）は、２つのエポキシドＳＲ及びＳＳへと、クロマトグラフィによって分離してもよく、引き続いて、エポキシドＲＳは、ベンジルアミンと反応して、アミノアルコールＲＳ（６）を得て、一方で、エポキシドＳＲは、ベンジルアミンと反応して、アミノアルコールＳＲ（８）を得る。
【００５７】
最後に、アミノアルコール（６）のエポキシド（７）との反応は、ｌ−ネビボロールのＮ−ベンジル化誘導体（１０）を産生し、同様にアミノアルコール（８）のエポキシド（９）の反応は、ｄ−ネビボロールのＮ−ベンジル化誘導体（１１）を産生する。
【化１７】
0005973459.tif 000018
【００５８】
化合物（１０）及び（１１）は、等モル量でプールされ、結晶化によって精製され（それによって原料のエステル／酸の不完全なエナンチオマー純度に由来する望まれないジアステレオ同位体化合物により構成されるあらゆる不純物を除外する）、脱ベンジル化され、及び引き続いて塩化されて所望の最終ネビボロール塩を得る。
【実施例】
【００５９】
本発明は、以降において下記の実施例により詳細に記載され、純粋に例示によるものであり、限定的な目的のためではない。
【００６０】
（例１）
欧州特許第０６８７３０５号に記載されるように、Ｏｐｈｉｏｓｔｏｍａ  ｎｏｖｏ−ｕｌｍｉにおいて本来は発現するエステラーゼを含む組換え大腸菌の株を、当業者に周知の技術に従って培養する。細胞画分を超音波によって溶解し、溶解物は遠心されて無細胞上清溶液を得る。１．６ｍＬのＯｐｈｉｏｓｔｏｍａ  ｎｏｖｏ−ｕｌｍｉから得られたエステラーゼ（リパーゼ）酵素を含有する溶液（６８００単位／ｍＬ）及び約２５ｇのエチル６−フルオロクロマン−２−カルボン酸（１）の２５ｍＬの脱イオン水及び１００mＬのＴｗｅｅｎ８０の中での懸濁液を、５００ｍＬの０．１Ｎ  ＮａＨＣＯ３緩衝溶液（ｐＨ９．７）に加え、任意でｐＨを２Ｎ  ＮａＯＨで９．７の値へと調整する。かくして得られた混合物を穏やかに攪拌する。
【００６１】
ｐＨは、２Ｎ  ＮａＯＨ溶液の制御された添加により９．７の値で自動的に維持される。
【００６２】
反応の進展は、ＨＰＬＣによって制御される。
【００６３】
加水分解反応の最後で、混合物をジクロロメタンで抽出し、それによってエステルを有機相中に得る。水性溶液を１Ｎ塩酸でｐＨ１へと酸性化し、次いでジクロロメタンで酸の回収のために抽出する。
【００６４】
２つの有機相を、別々に塩水で洗い、及び濃縮してそれぞれ１２．２ｇのエチルエステル及び１１．０ｇの酸を得る。
エナンチオマー比（ＨＰＬＣ）：
（Ｓ）エステル（３）／（Ｒ）エステル：９５．３１／４．６９
（Ｒ）酸（２）／（Ｓ）酸：９５．３６／４．６４
【００６５】
ＤＭＦ中で２５℃での酸の混合物（酸（２）を含む）についての旋光能の評価は、当該混合物が左旋回性であることを示し、欧州特許第０３３４４２９号においてＲ異性体について報告されたものと合致する。
【化１８】
0005973459.tif 000019
【００６６】
分析方法：Ｋｒｏｍａｓｉｌ５−ＡｍｙＣｏａｔ（４．６×２５０ｍｍ）カラム；溶出液：（Ａ）ヘキサン（０．１％ＴＦＡ）、（Ｂ）イソプロパノール、均一溶媒（Ａ）／（Ｂ）  ８５／１５；流量：１ｍＬ／分、温度：４０℃；検出器：２８０ｎｍでのＵＶ。
【００６７】
（例２．アシルメルドラム誘導体の調製）
【化１９】
0005973459.tif 000020
２８ｇの分割された（Ｒ）酸を２５０ｍＬ無水ジクロロメタン中に溶解し、結果として得られた溶液に、１．４当量の塩化オキサリル及びＤＭＦ滴下を添加する。溶液を攪拌下で室温でＮ２下で維持し、１．５時間後に溶媒を蒸発させ、油分を得て、２００ｍＬ無水ジクロロメタン中へと再溶解させる。別個に、メルドラム酸（１．０５当量）及びピリジン（２当量）を無水ジクロロメタン（１５０ｍＬ）中に溶解して攪拌下０℃で１５分間おく。この溶液に以前形成した酸塩化物を添加する。添加の最後で、混合物を攪拌下０℃で１時間、及び他に４５分室温で置く。次いで、それを他の５００ｍＬジクロロメタンで希釈し及び有機相をＨ２Ｏ（２×２００ｍＬ）、２Ｎ  ＨＣｌ（１００ｍＬ）、水、及び塩水で洗浄して、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させる。２０体積のジイソプロピルエーテル（ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｅｔｅｒ）で溶かし込んだ油分が得られ、濾過され及び乾燥された茶色の固体（４０ｇ、ＨＰＬＣ純度＝８１％、λ＝２８０ｎｍ）を得る。得られた個体を、さらなる精製をせずに引き続いての反応において使用する。
【００６８】
（例３．βーケトエステルの調製）
【化２０】
0005973459.tif 000021
４０グラムの粗製アシルメルドラム誘導体（Ｒ）を、攪拌下で１１０ｍＬ  ｔｅｒｔ−ブタノールとともに置き、ＨＰＬＣによる制御が原料産物の消滅を呈示するまで、結果として得られる混合物を８０℃へと１時間加熱する。反応の最後で、ｔｅｒｔ−ブタノールを減圧下で蒸発させ、それを５００ｍＬエチルアセテートで溶かし込んで、有機相を飽和ＮａＨＣＯ３溶液で、中性までＨ２Ｏで、塩水で洗浄してそれをＮａ２ＳＯ４上で乾燥させる。次いで、溶媒を蒸発させ、粗製βーケトエステル（ＨＰＬＣ純度＝６９％、λ＝２８０ｎｍ）を油分として得て、さらなる精製をせずに引き続いての反応において使用する。
【００６９】
（例４．クロロβーケトエステルの調製）
【化２１】
0005973459.tif 000022
２８ｇの粗製βーケトエステル（Ｒ）を２５０ｍＬエチルアセテート中に溶解して、この溶液に０．２６当量のＭｇ（ＣｌＯ４）２を添加する。３０分後、０．９５当量のＮ−クロロスクシンイミドを２時間で添加する。添加の最後で、結果として得られる混合物を１時間の間室温で攪拌する。次いで、形成された固体を除去し、他の３５０ｍＬのエチルアセテートでの希釈の後に、清澄な溶液を分液漏斗へと移送し、有機相を塩水、Ｈ２Ｏで洗浄して、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させる。溶媒を蒸発させ、３４ｇの粗製塩素誘導体（ＨＰＬＣ純度＝７９．４０％、λ＝２８０ｎｍ）を得て、さらなる精製をせずに引き続いての反応において使用する。
【００７０】
（例５．αークロロケトン（ｃｌｏｒｏｃｈｅｔｏｎｅ）の調製）
【化２２】
0005973459.tif 000023
３４ｇの粗製βーケトエステル（Ｒ）をＨＣＯＯＨ（１００ｍＬ）、ＣＨ３ＣＯＯＨ（１２０ｍＬ）及びＨ２Ｏ（３０ｍＬ）で還流し、１．５時間後ＨＰＬＣによる制御が反応の最後を呈示する。次いで、混合物を減圧下で蒸発させ、エチルアセテートに溶かし込んで、有機相を塩水、飽和ＮａＨＣＯ３、Ｈ２Ｏで洗浄して、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させる。次いで、溶媒を減圧下で蒸発させ、２１ｇのα−クロロ−ケトン（ＨＰＬＣ純度＝６０％、λ＝２８０ｎｍ）を油分として得て、そのままで（ｔｅｌ  ｑｕｅｌ）、さらなる精製をせずに引き続いての反応において使用する。
【００７１】
（例６．αークロロアルコールの調製）
【化２３】
0005973459.tif 000024
前出の反応から得られた油分の２１ｇを１５体積のＭｅＯＨ中に溶解し、この溶液に２．０当量のＮａＢＨ（ＯＣＯＣＨ３）３をスパチュラで添加して、それを磁気攪拌下で室温で保持する。４５分後に他の当量のＮａＢＨ（ＯＣＯＣＨ３）３を添加する。最後の添加から１時間後、ＨＰＬＣによる制御が反応の最後を表す。溶媒を減圧下で蒸発させ、全部をエチルアセテートとともに分液ロートへと移送して、有機相をＨ２Ｏ及び塩水で洗浄して、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させる。２１ｇの油分が得られ、フラッシュクロマトグラフィ（シリカ／粗製物比：３０：１、溶出液：石油エーテル／ＡｃＯＥｔ  ９２：８）によって精製され、１４．２ｇのαークロロ−アルコールを得る（ＨＰＬＣ純度＝８６．５％、λ＝２８０ｎｍ）。
【００７２】
（例７．（ＲＲ＋ＲＳ）エポキシド（４）の調製）
【化２４】
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１４ｇのα−クロロ−アルコールを２０体積の無水Ｅｔ２Ｏ中に溶解して、この溶液に２．８ｇの前出のＮａＨを、石油エーテルで洗浄したものを、添加する。１時間後、ＴＣＬ（シリカゲル、溶出液：石油エーテル／ＡｃＯＥｔ  ８５：１５）が原料クロロアルコールの消滅（ＴＣＬ中の１個のブロット）及び２つのエポキシドの形成（ＴＣＬ上の２個の明確に異なったブロット）を表す。次いで、反応混合物を他の３０体積のＥｔ２Ｏで希釈して、全部を１００ｍＬの１Ｍ  ＮａＨＳＯ４中に注ぎ、勢いのよい攪拌を維持する。有機相をＮａＨＣＯ３、Ｈ２Ｏ、塩水で洗浄して、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させる。次いで、溶媒を減圧下で蒸発させ、１１．４ｇのエポキシドの混合物を油分として（ＨＰＬＣ純度＞９８％、λ＝２８０ｎｍ）、５１：４８の比にて得る。
【００７３】
キラルＨＰＬＣでの分析において示された、その比においてわずか２個の主要ピークのみが存在することは、（Ｒ）酸からジアステレオ異性体（ＲＲ＋ＲＳ）エポキシドの混合物へと進む反応シーケンスにおいて、立体中心キラリティの明白な保持を伴って、ラセミ化がもたらされなかったことを示す。
【００７４】
（ＳＲ＋ＳＳ）エポキシドの混合物（５）を、例２〜７に記載されたものと同様に、エステル（３）から開始し、加水分解の後に対応する酸へと向かって、調製する。この場合では、かくして得られた酸についてのＤＭＦ中で２５℃での旋光能の評価は、それが右旋回性であることを示し、欧州特許第０３３４  ４２９Ａ１号においてＳ異性体について報告されたものと合致する。
【００７５】
（例８．（ＳＳ＋ＳＲ）エポキシドの混合物に対する動力学的分割）
（ＳＳ＋ＳＲ）エポキシドの混合物（４．５０ｇ，２２．５ｍｍｏｌ）及びベンジルアミン（３．８ｍＬ，３５ｍｍｏｌ）の２−メチル−２−ブタノール（３８  ｍＬ）中の溶液を、室温で１２時間の間混合する。反応の最後で、形成された（ＳＲ）アミン８を真空下で濾過し、そして乾燥させる（１．９０ｇ，６．３０ｍｍｏｌ）。濾過された溶液をシクロヘキサン（２５０ｍＬ）中に注ぎ、そしてかくして得られた溶液を１Ｍ  ＮａＨＳＯ４（１００ｍＬ）及びＨ２Ｏ（５０ｍＬ×２）で洗浄して、次いで減圧下で濃縮して１．３０（６．００ｍｍｏｌ）ｇの（ＳＳ）エポキシド９を得る。
【００７６】
（ＲＳ＋ＲＲ）の混合物に対する動力学的分割を、例８に記載されたものと同様に行う。
【００７７】
（例９．ｌ−ベンジルネビボロール（ＳＳＳＲ）の合成）
化合物（ＲＳ）−２−ベンジルアミノ−１−（６−フルオロクロマン−２−イル）エタノール及び（ＳＳ）エポキシドを絶対エタノール（６  ｍＬ）中に溶解して、原料試薬の消滅まで還流で維持する。反応の最後で、混合物を放置して室温に到達させ、そして溶媒を減圧下で除去する。
【００７８】
（例１０．ｄ−ベンジルネビボロール（ＲＲＲＳ）の合成）
化合物（ＳＲ）−２−ベンジルアミノ−１−（６−フルオロクロマン−２−イル）エタノール及び（ＲＲ）エポキシドを例９でのように処理してｄ−ベンジルネビボロールを得る。
【００７９】
（例１１．ｄ，ｌ−ベンジルネビボロールの合成）
例９に記載されたｌ−ベンジルネビボロール（３．００ｇ）及び例１０に記載されたｄ−ベンジルネビボロール（３．００ｇ）をプールして、かくして得られた混合物（６．０ｇ）を結晶化によって精製し、５．０ｇのＮ−ベンジルネビボロールを得た（８３％、ＨＰＬＣ純度＝９９．６％）。結晶化による精製の間に、原料エチル６−フルオロクロマン−２−カルボン酸（１）の不完全なエナンチオ選択性加水分解に由来する望ましくない異性体からなる不純物もまた除去される。
【００８０】
（例１２．ネビボロール塩酸塩の合成）
化合物ｄ，ｌ−ベンジルネビボロール（５．０ｇ，４１０ｍｍｏｌ）をメタノール（４００ｍＬ）並びに２０％Ｐｄ（ＯＨ）２／Ｃ（１％ｂ／ｗ）中に溶解する。混合物を攪拌下で水素雰囲気下で維持する。反応の最後で、触媒を多孔隔膜上で濾過して、濃縮ＨＣｌ（３６ｍＬ）を濾液に添加する。溶液を減圧下で濃縮して得られた残渣を絶対エタノール（５０ｍＬ）とともに加熱処理する。得られた固体を濾過して真空下で乾燥させる（１．０ｇ、収量：８２％、ＨＰＬＣ純度：９９．９％）。
【表１】
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