(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（Ｉ）〜（ＩＩＩ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドまたはそれを含んでなる組換えベクターを導入してなる微生物を、ピリピロペンＥとともに培養して、ピリピロペンＯを経由してピリピロペンＡを単離することを特徴とする、ピリピロペンＡの製造法：
（Ｉ）配列番号２６９、２７０、および２７５を含むアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有する単離されたポリヌクレオチド、
（ＩＩ）配列番号２６９に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ水酸化酵素活性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド、
配列番号２７０に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ水酸化酵素活性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド、および
配列番号２７５に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつアセチル化酵素活性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド、
（ＩＩＩ）下記の（１）〜（３）のいずれかに記載されたヌクレオチド配列を有する単離されたポリヌクレオチド：
（１）下記（ａ）−（ｃ）に記載されたヌクレオチド配列：
（ａ）配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の１３２６６番から１５１４４番までのヌクレオチド配列、
（ｂ）配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の１６２２０番から１８０１８番までのヌクレオチド配列、および
（ｃ）配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の２５８２４番から２７１７８番までのヌクレオチド配列、
（２）（１）（ａ）において記載されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにおいて、１〜４個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入もしくは付加されたヌクレオチド配列であり、かつ水酸化酵素活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（１）（ｂ）において記載されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにおいて、１〜４個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入もしくは付加されたヌクレオチド配列であり、かつ水酸化酵素活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および
（１）（ｃ）において記載されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにおいて、１〜４個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入もしくは付加されたヌクレオチド配列であり、かつアセチル化酵素活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（３）（１）（ａ）において記載されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列であり、かつ水酸化酵素活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（１）（ｂ）において記載されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列であり、かつ水酸化酵素活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および
（１）（ｃ）において記載されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列であり、かつアセチル化酵素活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列。
【請求項２】
配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の１３２６６番から１５１４４番までのヌクレオチドを含むプラスミド、配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の１６２２０番から１８０１８番までのヌクレオチドを含むプラスミド、および配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の２５８２４番から２７１７８番までのヌクレオチドを含むプラスミドを含む微生物を、ピリピロペンＥとともに培養して、ピリピロペンＯを経由してピリピロペンＡを単離することを特徴とする、請求項１に記載のピリピロペンＡの製造法。
【請求項３】
下記（ＩＶ）〜（ＶＩ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドまたはそれを含んでなる組換えベクターを導入してなる微生物を、デアセチルピリピロペンＥとともに培養して、ピリピロペンＥおよびピリピロペンＯを経由してピリピロペンＡを単離することを特徴とする、ピリピロペンＡの製造法：
（ＩＶ）配列番号２６９、２７０、２７４、および２７５を含むアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有する単離されたポリヌクレオチド、
（Ｖ）配列番号２６９に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、水酸化酵素活性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド、
配列番号２７０に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、水酸化酵素活性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド、
配列番号２７４に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、アセチル化酵素活性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド、および
配列番号２７５に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、アセチル化酵素活性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド、
（ＶＩ）下記の（１）〜（３）のいずれかに記載されたヌクレオチド配列を有する単離されたポリヌクレオチド：
（１）下記（ａ）−（ｄ）に記載されたヌクレオチド配列：
（ａ）配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の１３２６６番から１５１４４番までのヌクレオチド配列、
（ｂ）配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の１６２２０番から１８０１８番までのヌクレオチド配列、
（ｃ）配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の２３２０５番から２４７７３番までのヌクレオチド配列、および
（ｄ）配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の２５８２４番から２７１７８番までのヌクレオチド配列、
（２）（１）（ａ）において記載されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにおいて、１〜４個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入もしくは付加されたヌクレオチド配列であり、かつ水酸化酵素活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（１）（ｂ）において記載されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにおいて、１〜４個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入もしくは付加されたヌクレオチド配列であり、かつ水酸化酵素活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（１）（ｃ）において記載されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにおいて、１〜４個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入もしくは付加されたヌクレオチド配列であり、かつアセチル化酵素活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および
（１）（ｄ）において記載されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにおいて、１〜４個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入もしくは付加されたヌクレオチド配列であり、かつアセチル化酵素活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（３）（１）（ａ）において記載されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列であり、かつ水酸化酵素活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（１）（ｂ）において記載されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列であり、かつ水酸化酵素活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（１）（ｃ）において記載されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列であり、かつアセチル化酵素活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および
（１）（ｄ）において記載されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列であり、かつアセチル化酵素活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列。
【請求項４】
配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の１３２６６番から１５１４４番までのヌクレオチドを含むプラスミド、配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の１６２２０番から１８０１８番までのヌクレオチドを含むプラスミド、配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の２３２０５番から２４７７３番までのヌクレオチドを含むプラスミド、および配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の２５８２４番から２７１７８番までのヌクレオチドを含むプラスミドを含む微生物を、デアセチルピリピロペンＥとともに培養して、ピリピロペンＥおよびピリピロペンＯを経由してピリピロペンＡを単離することを特徴とする、請求項３に記載のピリピロペンＡの製造法。
【請求項５】
下記（ＶＩＩ）〜（ＩＸ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドまたはそれを含んでなる組換えベクターを導入してなる微生物を、４−オキソ−６−（３−ピリジル）−α−ピロンとともに培養して、４−ヒドロキシ−６−（ピリジン−３−イル）−３−（（２Ｅ,６Ｅ）−３，７，１１−トリメチルドデカ−２，６，１０−トリエニル）−２Ｈ−ピラン−２−オンを単離することを特徴とする、４−ヒドロキシ−６−（ピリジン−３−イル）−３−（（２Ｅ,６Ｅ）−３，７，１１−トリメチルドデカ−２，６，１０−トリエニル）−２Ｈ−ピラン−２−オンの製造法：
（ＶＩＩ）配列番号２７３のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有する単離されたポリヌクレオチド、
（ＶＩＩＩ）配列番号２７３に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつプレニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド、
（ＩＸ）下記の（１）〜（３）のいずれかに記載されたヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド：
（１）配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の２１７９３番から２２８７７番までのヌクレオチド配列、
（２）（１）において記載されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにおいて、１〜４個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入もしくは付加されたヌクレオチド配列であり、かつプレニルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（３）（１）において記載されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列であり、かつプレニルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列。
【請求項６】
配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の２１７９３番から２２８７７番までのヌクレオチドを含むプラスミドを含む微生物を、４−オキソ−６−（３−ピリジル）−α−ピロンとともに培養して、４−ヒドロキシ−６−（ピリジン−３−イル）−３−（（２Ｅ,６Ｅ）−３，７，１１−トリメチルドデカ−２，６，１０−トリエニル）−２Ｈ−ピラン−２−オンを単離することを特徴とする、請求項５に記載の４−ヒドロキシ−６−（ピリジン−３−イル）−３−（（２Ｅ,６Ｅ）−３，７，１１−トリメチルドデカ−２，６，１０−トリエニル）−２Ｈ−ピラン−２−オンの製造法。
【請求項７】
下記（Ａ）、（Ｂ）、および（Ｃ）から選択される、単離されたポリヌクレオチド：
（Ａ）配列番号２７５から選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（Ｂ）配列番号２７５に記載のアミノ酸配列において、１〜４０個のアミノ酸の置換、欠失、付加、または挿入によって改変されたアミノ酸配列を有し、アセチル化酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（Ｃ）配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の２５８２４番から２７１７８番までのヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド。
【請求項８】
配列番号２７５に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードし、アセチル化酵素活性を有するポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項９】
配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の２５８２４番から２７１７８番までのヌクレオチドを含むプラスミドである、組換えベクター。
【請求項１０】
配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の２５８２４番から２７１７８番までのヌクレオチドを含むプラスミドであるベクターを含んでなる、形質転換体。
【請求項１１】
ピリピロペンＡおよび／またはその製造中間体の製造のための、請求項９に記載の組換えベクターの使用。
【請求項１２】
ピリピロペンＡおよび／またはその製造中間体の製造のための、請求項１０に記載の形質転換体の使用。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の参照】
【０００１】
本特許出願は、２０１０年１月２６日に出願された日本出願特願２０１０−１４７２７号に基づく優先権の主張を伴うものであり、この日本出願の全開示内容は、引用することにより本願の開示の一部とされる。
【発明の背景】
【０００２】
技術分野
本発明は、ピリピロペンの製造法に関し、さらに詳細にはピリピロペンＡ、Ｅ、Ｏ等の製造法に関する。
【０００３】
背景技術
ピリピロペンＡは、特開平4−360895号公報（特許文献１）およびJournal of Antibiotics（1993），46（7），1168−9（非特許文献１）に開示されるように、ACAT（アシルCoA・コレステロールアシルトランスフェラーゼ）阻害活性を有し、コレステロール蓄積に起因する疾患の治療等への応用が期待されている。
【０００４】
一方、ピリピロペンＡの生産菌として、特開平4−360895号公報（特許文献１）には、アスペルギルス  フミガタスFO-1289株、Applied and Environmental Microbiology（1995），61（12），4429−35．（非特許文献２）には、ユーペニシリウム  レティキュロスポラムNRRL-3446株、WO2004／060065号公報（特許文献２）には、ペニシリウム  グリセオフルバムF1959株、および公開技報2008-500997号（特許文献３）には、ペニシリウム  コピロビウムPF1169株が開示されている。
【０００５】
また、ピリピロペンＡの生合成ルートとして、Journal of Organic Chemistry(1996), 61,882-886. （非特許文献３）およびChemical Review(2005), 105, 4559-4580. （非特許文献４）には、アスペルギルス  フミガタスFO-1289株での推定生合成ルートが開示されており、アスペルギルス  フミガタスFO-1289株においてポリケチド合成酵素およびプレニルトランスフェラーゼのそれぞれによって合成された部分構造が結合され、環化酵素によりピリピロペンＡが合成されることが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平4−360895号公報
【特許文献２】WO2004／060065号公報
【特許文献３】公開技報2008-500997号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Journal of Antibiotics（1993），46（7），1168−9
【非特許文献２】Applied and Environmental Microbiology（1995），61（12），4429−35．
【非特許文献３】Journal of Organic Chemistry(1996), 61,882-886.
【非特許文献４】Chemical Review(2005), 105, 4559-4580.
【発明の概要】
【０００８】
本発明者らは、今般、特定のポリヌクレオチドまたはそれを含んでなる組換えベクターを導入してなる微生物を、ピリピロペンＡの生合成に必要な中間化合物とともに培養して、ピリピロペンＡ等を製造できることを見出した。本発明は、かかる知見に基づくものである。
【０００９】
従って、本発明の目的は、ピリピロペンＡの製造法を提供することにある。
【００１０】
そして、本発明の一つの態様によれば、下記（I）〜（III）に記載の少なくとも一種のポリヌクレオチドまたはそれを含んでなる組換えベクターを導入してなる微生物を、ピリピロペンＥとともに培養して、ピリピロペンＯを経由してピリピロペンＡを単離することを特徴とする、ピリピロペンＡの製造法が提供される：
（I）下記の(a)〜(d)に記載されたヌクレオチド配列から選択された少なくとも１個のヌクレオチド配列を有する単離されたポリヌクレオチド：
(a)配列番号２６６のヌクレオチド配列、
(b)配列番号２６６のヌクレオチド配列の相補配列と厳密な条件下でハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列であり、かつ配列番号２６６のヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
(c) 配列番号２６６のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにおいて、１もしくは複数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入もしくは付加されたヌクレオチド配列であり、かつ配列番号２６６のヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
(d) 配列番号２６６のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列であり、かつ配列番号２６６のヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（II）配列番号２６７〜２７５から選択される少なくとも一つのアミノ酸配列またはそれと実質的に同等なアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有する単離されたポリヌクレオチド、
（III）下記の(１)〜(４)に記載されたヌクレオチド配列から選択された少なくとも１個のヌクレオチド配列を有する単離されたポリヌクレオチド：
（１）下記(a)−(i)に記載されたヌクレオチド配列：
(a) 配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の３３４２番から５１５８番までのヌクレオチド配列、
(b) 配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の５３８２番から１２７７７番までのヌクレオチド配列、
(c) 配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の１３２６６番から１５１４４番までのヌクレオチド配列、
(d) 配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の１６２２０番から１８０１８番までのヌクレオチド配列、
(e) 配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の１８５０６番から１９２９６番までのヌクレオチド配列、
(f) 配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の１９７７９番から２１３８９番までのヌクレオチド配列、
(g) 配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の２１７９３番から２２８７７番までのヌクレオチド配列、
(h) 配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の２３２０５番から２４７７３番までのヌクレオチド配列、および
(i) 配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の２５８２４番から２７１７８番までのヌクレオチド配列
（２）（１）において記載されたヌクレオチド配列の相補配列と厳密な条件下でハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列であり、かつそれぞれのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（３）（１）において記載されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにおいて、１もしくは複数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入もしくは付加されたヌクレオチド配列であり、かつそれぞれのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（４）（１）において記載されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列であり、かつそれぞれのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列。
【００１１】
また、本発明の別の態様によれば、前記（I）〜（III）に記載の少なくとも一種のポリヌクレオチドまたはそれを含んでなる組換えベクターを導入してなる微生物を、デアセチルピリピロペンＥとともに培養して、ピリピロペンＥおよびピリピロペンＯを経由してピリピロペンＡを単離することを特徴とするピリピロペンＡの製造法が提供される。
【００１２】
さらに、本発明の別の態様によれば、前記（I）〜（III）に記載の少なくとも一種のポリヌクレオチドまたはそれを含んでなる組換えベクターを導入してなる微生物を、４−オキソ−６−（３−ピリジル）−α−ピロンとともに培養して、４−ヒドロキシ−６−（ピリジン−３−イル）−３−（（２Ｅ,６Ｅ）−３，７，１１−トリメチルドデカ−２，６，１０−トリエニル）−２Ｈ−ピラン−２−オン(4-hydroxy-6-(pyridin-3-yl)-3-((2E,6E)-3,7,11-trimethyldodeca-2,6,10-trienyl)-2H-pyran-2-one)を単離することを特徴とする４−ヒドロキシ−６−（ピリジン−３−イル）−３−（（２Ｅ,６Ｅ）−３，７，１１−トリメチルドデカ−２，６，１０−トリエニル）−２Ｈ−ピラン−２−オンの製造法が提供される。
【００１３】
本発明の別の態様によれば、前記（I）〜（III）に記載の少なくとも一種の単離されたポリヌクレオチドが提供される。
【００１４】
また、本発明の別の態様によれば、ｐＰＰ６（プラスミドｐＰＰ６で形質転換されたAspergillus oryzae（アスペルギルス・オリザエ）の受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１２１８）、ｐＰＰ７（プラスミドｐＰＰ７で形質転換されたAspergillus oryzaeの受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１２１９）、およびｐＰＰ９（プラスミドｐＰＰ９で形質転換されたAspergillus oryzaeの受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１２２０）からなる群より選択される組換えベクターが提供される。
【００１５】
さらに、本発明の別の態様によれば、プラスミドｐＰＰ６、ｐＰＰ７、およびｐＰＰ９からなる群より選択されるベクターを一種またはそれ以上を含んでなる形質転換体が提供される。
【００１６】
本発明の別の態様によれば、ピリピロペンＡの製造のための前記組換えベクターの使用が提供される。
【００１７】
本発明の別の態様によれば、ピリピロペンＡの製造のための前記形質転換体の使用が提供される。
【００１８】
本発明の製造方法によれば、ピリピロペンＡ、Ｅ、Ｏなどを遺伝子組換え技術により製造することができる。従って、本発明の製造方法は、ピリピロペンＡ、Ｅ、Ｏなどの大量生産技術に多大な貢献をなすものである。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】は、ＰＣＲ産物のアガロースゲルによる電気泳動パターンを示す。電気泳動は、以下のプライマーを用いて増幅させたＰＣＲ産物を用いた。Ｍ：分子量マーカー(100bp ラダー)、レーン１：配列番号１および２のプライマー、レーン２：配列番号２３９および２４０のプライマー、レーン３：配列番号２３７および２３８のプライマー、レーン４：配列番号２４１および２４２のプライマー、レーン５：配列番号２４７および２４８のプライマー、レーン６：配列番号２５１および２５２のプライマー、レーン７：配列番号２４５および２４６のプライマー、レーン８：配列番号２４３および２４４のプライマー、レーン９：配列番号２４９および２５０のプライマー、レーン１０：配列番号２３５および２３６のプライマー、レーン１１：配列番号２３３および２３４のプライマー、レーン１２：配列番号２２７および２２８のプライマー、レーン１３：配列番号２２９および２３０のプライマー、レーン１４：配列番号２３１および２３２のプライマー。
【図２】は、図１と同様、ＰＣＲ産物のアガロースゲルによる電気泳動パターンを示す。電気泳動は、以下のプライマーを用いて増幅させたＰＣＲ産物を用いた。Ｍ：分子量マーカー(100bp ラダー)、レーン１：配列番号２５３および２５４のプライマー、レーン２：配列番号２５７および２５８のプライマー、レーン３：配列番号２５９および２６０のプライマー、レーン４：配列番号２５５および２５６のプライマー、レーン５：配列番号２６１および２６２のプライマー。
【図３】は、図１と同様、ＰＣＲ産物のアガロースゲルによる電気泳動パターンを示す。電気泳動は、以下のプライマーを用いて増幅させたＰＣＲ産物を用いた。レーン１：分子量マーカー(100bp ラダー)、レーン２：配列番号２６４および２６５のプライマー(400bp増幅断片)。
【図４】は、pUSAのプラスミドマップを表す。
【図５】は、ｐＰＰ２のプラスミドマップを表す。
【図６】は、P450-2 cDNA増幅のスキームを表す。
【図７】は、ｐＰＰ３のプラスミドマップを表す。
【図８】は、ピリピロペンＥの重アセトニトリル中での１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを表す。
【図９】は、プラスミドｐＰＰ２で形質転換されたAspergillus oryzaeの培養生成物の重アセトニトリル中での１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを表す。
【図１０】は、ピリピロペンＯの重アセトニトリル中での１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを表す。
【図１１】は、プラスミドｐＰＰ３で形質転換されたAspergillus oryzaeの培養生成物の重アセトニトリル中での１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを表す。
【図１２】は、プラスミドｐＰＰ６、ｐＰＰ７、およびｐＰＰ９のプラスミドマップを表す。
【発明の具体的説明】
【００２０】
微生物の寄託
プラスミドｐＣＣ１−ＰＰ１で形質転換された大腸菌（Escherichia coli ＥＰＩ３００ＴＭ−Ｔ１Ｒ）は、２００８年１０月９日（原寄託日）付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託 センター（〒３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に、受託番号がＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１３３（国内寄託ＦＥＲＭ  Ｐ−２１７０４より移管）（寄託者が付した識別のための表示：Escherichia coli ＥＰＩ３００ＴＭ−Ｔ１Ｒ／ｐＣＣ１−ＰＰ１）として寄託されている。
【００２１】
プラスミドｐＰＰ２で形質転換されたAspergillus oryzaeは、２００９年６月２３日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託 センター（〒３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に、受託番号がＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１３７（寄託者が付した識別のための表示：Aspergillus oryzae PP2-1）として寄託されている。
【００２２】
プラスミドｐＰＰ３で形質転換されたAspergillus oryzaeは、２００９年７月３日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託 センター（〒３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に、受託番号がＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１４１（寄託者が付した識別のための表示：Aspergillus oryzae PP3-2）として寄託されている。
【００２３】
プラスミドｐＰＰ６で形質転換されたAspergillus oryzaeは、２００９年１２月２１日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託 センター（〒３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に、受託番号がＦＥＲＭ  ＢＰ−１１２１８（寄託者が付した識別のための表示：Aspergillus oryzae PP6）として寄託されている。
【００２４】
プラスミドｐＰＰ７で形質転換されたAspergillus oryzaeは、２００９年１２月２１日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託 センター（〒３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に、受託番号がＦＥＲＭ  ＢＰ−１１２１９（寄託者が付した識別のための表示：Aspergillus oryzae PP7）として寄託されている。
【００２５】
プラスミドｐＰＰ９で形質転換されたAspergillus oryzaeは、２００９年１２月２１日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託 センター（〒３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に、受託番号がＦＥＲＭ  ＢＰ−１１２２０（寄託者が付した識別のための表示：Aspergillus oryzae PP9）として寄託されている。
【００２６】
ピリピロペンの製造法
本発明は、ピリピロペンＡの生合成に関与する遺伝子を導入した微生物をピリピロペンＡの生合成に必要な中間化合物とともに培養して二次代謝産物を得る、ピリピロペンの製造方法に関する。
【００２７】
ピリピロペンＡの生合成経路を示せば、例えば以下のスキーム１が挙げられる。
【表１】
0005898960.tif 000002
0005898960.tif 000003
0005898960.tif 000004
スキーム１
【００２８】
上記スキーム１の各生合成経路を以下に詳細に記載する。
１．ニコチン酸をCoA ligase（CoAリガーゼ）と反応させ、さらにその生成物をLovB-like polyketide synthase（LovB様ポリケチド合成酵素）(PKS)と反応させることにより５−（３−ピリジル）−３，５−ジオキソペンタン酸が生成される。
２．５−（３−ピリジル）−３，５−ジオキソペンタン酸をLovB-like polyketide synthase(PKS)と反応させることにより、４−オキソ−６−（３−ピリジル）−α−ピロンが生成される。
３．４−オキソ−６−（３−ピリジル）−α−ピロンと、farnesylpyrophosphate（ファルネシルピロリン酸）(FPP)とを、UbiA-like prenyltransferase （UbiA様プレニルトランスフェラーゼ）(UbiAPT)と反応させることにより、4-hydroxy-6-(pyridin-3-yl)-3-((2E,6E)-3,7,11-trimethyldodeca-2,6,10-trienyl)-2H-pyran-2-one（４−ヒドロキシ−６−（ピリジン−３−イル）−３−（（２Ｅ,６Ｅ）−３，７，１１−トリメチルドデカ−２，６，１０−トリエニル）−２Ｈ−ピラン−２−オン）が生成される。
４．４−ヒドロキシ−６−（ピリジン−３−イル）−３−（（２Ｅ,６Ｅ）−３，７，１１−トリメチルドデカ−２，６，１０−トリエニル）−２Ｈ−ピラン−２−オンをFAD-dependent monooxygenase（FAD依存性モノオキシゲナーゼ）(FMO)と反応させ、さらにその生成物をCyclase（シクラーゼ）(IMP: Integral membrane protein)と反応させることにより、デアセチルピリピロペンＥが生成される。
５．デアセチルピリピロペンＥをAcetyltransferase（アセチルトランスフェラーゼ）(AT)と反応させることにより、ピリピロペンＥが生成される。
６．ピリピロペンＥをCytochrome P450 monooxygenase（シトクロームP450モノオキシゲナーゼ）（１）(P450-1)と反応させることにより11位デアセチルピリピロペンＯが生成される。
７．11位デアセチルピリピロペンＯをAcetyltransferase-2(AT-2)と反応させることにより、ピリピロペンＯが生成される。
８．ピリピロペンＯをCytochrome P450 monooxygenase（２）(P450-2)と反応させることにより、７位デアセチルピリピロペンＡが生成される。
９．７位デアセチルピリピロペンＡをAcetyltransferase-2(AT-2)と反応させることにより、ピリピロペンＡが生成される。
【００２９】
デアセチルピリピロペンＥは、例えば下記参考例３に記載の方法により合成することができる。
【００３０】
ピリピロペンＥは、例えば特開平8-239385号公報に記載の方法により取得することができる。
【００３１】
１１位デアセチルピリピロペンＯは、例えば下記参考例４に記載の方法により合成することができる。
【００３２】
ピリピロペンＯは、例えばJ. Antibiot. 1996, 49, 292. に記載の方法で取得することができる。
【００３３】
７位デアセチルピリピロペンＡは、例えば特開平8-259569号公報に記載の方法で合成することができる。
【００３４】
４−オキソ−６−（３−ピリジル）−α−ピロンは、例えば、J. Org. Chem. 1983. 48. 3945. に記載の方法により合成することができる。
【００３５】
ピリピロペンＥとともに培養する本発明の製造方法の好ましい態様によれば、プラスミドｐＣＣ１−ＰＰ１、ｐＰＰ２、ｐＰＰ３、ｐＰＰ６、ｐＰＰ７、およびｐＰＰ９からなる群より選択されるベクターを一種またはそれ以上含む微生物を、ピリピロペンＥとともに培養して、ピリピロペンＯを経由してピリピロペンＡを単離することを特徴とするピリピロペンＡの製造法が提供される。
【００３６】
ピリピロペンＥとともに培養する本発明の製造方法の好ましい態様によれば、下記（IV）〜（V）に記載の少なくとも一種のポリヌクレオチドまたはそれを含んでなる組換えベクターを導入してなる微生物を、ピリピロペンＥとともに培養して、ピリピロペンＯを経由してピリピロペンＡを単離することを特徴とするピリピロペンＡの製造法が提供される：
（IV）配列番号２６９、２７０、および２７５からなる群から選択される少なくとも一つのアミノ酸配列またはそれと実質的に同等なアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列から選択された少なくとも１個のヌクレオチド配列を有する単離されたポリヌクレオチド、
（V）下記の(１)〜(４)に記載されたヌクレオチド配列から選択された少なくとも１個のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド：
（１）下記(a)−(c)に記載されたヌクレオチド配列：
(a) 配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の１３２６６番から１５１４４番までのヌクレオチド配列、
(b) 配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の１６２２０番から１８０１８番までのヌクレオチド配列、および
(c) 配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の２５８２４番から２７１７８番までのヌクレオチド配列
（２）（１）において記載されたヌクレオチド配列の相補配列と厳密な条件下でハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列であり、かつそれぞれのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（３）（１）において記載されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにおいて、１もしくは複数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入もしくは付加されたヌクレオチド配列であり、かつそれぞれのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（４）（１）において記載されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列であり、かつそれぞれのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列。
【００３７】
ピリピロペンＥとともに培養する本発明の製造方法の好ましい態様によれば、プラスミドｐＰＰ２、ｐＰＰ３、およびｐＰＰ９からなる群より選択されるベクターを一種またはそれ以上含む微生物を、ピリピロペンＥとともに培養して、ピリピロペンＯを経由してピリピロペンＡを単離することを特徴とするピリピロペンＡの製造法が提供される。
【００３８】
ピリピロペンＥとともに培養する本発明の製造方法のより好ましい態様によれば、プラスミドｐＰＰ２、ｐＰＰ３、およびｐＰＰ９を含む微生物を、ピリピロペンＥとともに培養して、ピリピロペンＯを経由してピリピロペンＡを単離することを特徴とするピリピロペンＡの製造法が提供される。
【００３９】
デアセチルピリピロペンＥとともに培養する本発明の製造方法の好ましい態様によれば、上記（I）〜（III）に記載の少なくとも一種のポリヌクレオチドまたはそれを含んでなる組換えベクターを導入してなる微生物を、デアセチルピリピロペンＥとともに培養して、ピリピロペンＥおよびピリピロペンＯを経由してピリピロペンＡを単離することを特徴とするピリピロペンＡの製造法が提供される。
【００４０】
デアセチルピリピロペンＥとともに培養する本発明の製造方法の好ましい態様によれば、プラスミドｐＣＣ１−ＰＰ１、ｐＰＰ２、ｐＰＰ３、ｐＰＰ６、ｐＰＰ７、およびｐＰＰ９からなる群より選択されるベクターを一種またはそれ以上含む微生物を、デアセチルピリピロペンＥとともに培養して、ピリピロペンＥおよびピリピロペンＯを経由してピリピロペンＡを単離することを特徴とするピリピロペンＡの製造法が提供される。
【００４１】
デアセチルピリピロペンＥとともに培養する本発明の製造方法の好ましい態様によれば、下記（VI）および（VII）に記載の少なくとも一種のポリヌクレオチドまたはそれを含んでなる組換えベクターを導入してなる微生物を、デアセチルピリピロペンＥとともに培養して、ピリピロペンＥおよびピリピロペンＯを経由してピリピロペンＡを単離することを特徴とするピリピロペンＡの製造法が提供される：
（VI）配列番号２６９、２７０、２７４、および２７５からなる群から選択される少なくとも一つのアミノ酸配列またはそれと実質的に同等なアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列から選択された少なくとも１個のヌクレオチド配列を有する単離されたポリヌクレオチド、
（VII）下記の（１）〜（４）に記載されたヌクレオチド配列から選択された少なくとも１個のヌクレオチド配列を有する単離されたポリヌクレオチド：
（１）下記(a)−(d)に記載されたヌクレオチド配列：
(a) 配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の１３２６６番から１５１４４番までのヌクレオチド配列、
(b) 配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の１６２２０番から１８０１８番までのヌクレオチド配列、
(c) 配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の２３２０５番から２４７７３番までのヌクレオチド配列、および
(d) 配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の２５８２４番から２７１７８番までのヌクレオチド配列、
（２）（１）において記載されたヌクレオチド配列の相補配列と厳密な条件下でハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列であり、かつそれぞれのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（３）（１）において記載されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにおいて、１もしくは複数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入もしくは付加されたヌクレオチド配列であり、かつそれぞれのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（４）（１）において記載されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列であり、かつそれぞれのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列。
【００４２】
デアセチルピリピロペンＥとともに培養する本発明の製造方法の好ましい態様によれば、プラスミドｐＰＰ２、ｐＰＰ３、ｐＰＰ７、およびｐＰＰ９からなる群より選択されるベクターを一種またはそれ以上含む微生物を、デアセチルピリピロペンＥとともに培養して、ピリピロペンＥおよびピリピロペンＯを経由してピリピロペンＡを単離することを特徴とするピリピロペンＡの製造法が提供される。
【００４３】
デアセチルピリピロペンＥとともに培養する本発明の製造方法のより好ましい態様によれば、プラスミドｐＰＰ２、ｐＰＰ３、ｐＰＰ７、およびｐＰＰ９を含む微生物を、デアセチルピリピロペンＥとともに培養して、ピリピロペンＥおよびピリピロペンＯを経由してピリピロペンＡを単離することを特徴とするピリピロペンＡの製造法が提供される。
【００４４】
４−オキソ−６−（３−ピリジル）−α−ピロンとともに培養する本発明の製造方法の好ましい態様によれば、上記（I）〜（III）に記載の少なくとも一種のポリヌクレオチドまたはそれを含んでなる組換えベクターを導入してなる微生物を、４−オキソ−６−（３−ピリジル）−α−ピロンとともに培養して、４−ヒドロキシ−６−（ピリジン−３−イル）−３−（（２Ｅ,６Ｅ）−３，７，１１−トリメチルドデカ−２，６，１０−トリエニル）−２Ｈ−ピラン−２−オンを単離することを特徴とする４−ヒドロキシ−６−（ピリジン−３−イル）−３−（（２Ｅ,６Ｅ）−３，７，１１−トリメチルドデカ−２，６，１０−トリエニル）−２Ｈ−ピラン−２−オンの製造法が提供される。この場合、前記微生物は、farnesylpyrophosphate(FPP)をその体内で生合成できるものを用いることが好ましく、そのような微生物としてはアスペルギルス属に属する微生物が挙げられる。
【００４５】
４−オキソ−６−（３−ピリジル）−α−ピロンとともに培養する本発明の製造方法の好ましい態様によれば、プラスミドｐＣＣ１−ＰＰ１、ｐＰＰ２、ｐＰＰ３、ｐＰＰ６、ｐＰＰ７、およびｐＰＰ９からなる群より選択されるベクターを一種またはそれ以上含む微生物を、４−オキソ−６−（３−ピリジル）−α−ピロンとともに培養して、４−ヒドロキシ−６−（ピリジン−３−イル）−３−（（２Ｅ,６Ｅ）−３，７，１１−トリメチルドデカ−２，６，１０−トリエニル）−２Ｈ−ピラン−２−オンを単離することを特徴とする４−ヒドロキシ−６−（ピリジン−３−イル）−３−（（２Ｅ,６Ｅ）−３，７，１１−トリメチルドデカ−２，６，１０−トリエニル）−２Ｈ−ピラン−２−オンの製造法が提供される。
【００４６】
４−オキソ−６−（３−ピリジル）−α−ピロンとともに培養する本発明の製造方法の好ましい態様によれば、下記（VIII）および（IX）に記載の少なくとも一種のポリヌクレオチドまたはそれを含んでなる組換えベクターを導入してなる微生物を、４−オキソ−６−（３−ピリジル）−α−ピロンとともに培養して、４−ヒドロキシ−６−（ピリジン−３−イル）−３−（（２Ｅ,６Ｅ）−３，７，１１−トリメチルドデカ−２，６，１０−トリエニル）−２Ｈ−ピラン−２−オンを単離することを特徴とする４−ヒドロキシ−６−（ピリジン−３−イル）−３−（（２Ｅ,６Ｅ）−３，７，１１−トリメチルドデカ−２，６，１０−トリエニル）−２Ｈ−ピラン−２−オンの製造法が提供される：
（VIII）配列番号２７３のアミノ酸配列またはそれと実質的に同等なアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列から選択される少なくとも１個のヌクレオチド配列を有する単離されたポリヌクレオチド、
（IX）下記の（１）〜（４）に記載されたヌクレオチド配列から選択された少なくとも１個のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド：
（１）配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の２１７９３番から２２８７７番までのヌクレオチド配列、
（２）（１）において記載されたヌクレオチド配列の相補配列と厳密な条件下でハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列であり、かつそのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（３）（１）において記載されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにおいて、１もしくは複数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入もしくは付加されたヌクレオチド配列であり、かつそのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（４）（１）において記載されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列であり、かつそのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列。
【００４７】
４−オキソ−６−（３−ピリジル）−α−ピロンとともに培養する本発明の製造方法のより好ましい態様によれば、プラスミドｐＰＰ６を含む微生物を、４−オキソ−６−（３−ピリジル）−α−ピロンとともに培養して、４−ヒドロキシ−６−（ピリジン−３−イル）−３−（（２Ｅ,６Ｅ）−３，７，１１−トリメチルドデカ−２，６，１０−トリエニル）−２Ｈ−ピラン−２−オンを単離することを特徴とする、４−ヒドロキシ−６−（ピリジン−３−イル）−３−（（２Ｅ,６Ｅ）−３，７，１１−トリメチルドデカ−２，６，１０−トリエニル）−２Ｈ−ピラン−２−オンの製造法が提供される。
【００４８】
デアセチルピリピロペンＥとともに培養する本発明の製造方法の好ましい態様によれば、上記（I）〜（III）に記載の少なくとも一種のポリヌクレオチドまたはそれを含んでなる組換えベクターを導入してなる微生物を、デアセチルピリピロペンＥとともに培養して、ピリピロペンＥを単離することを特徴とするピリピロペンＥの製造法が提供される。
【００４９】
デアセチルピリピロペンＥとともに培養する本発明の製造方法の好ましい態様によれば、プラスミドｐＣＣ１−ＰＰ１、ｐＰＰ２、ｐＰＰ３、ｐＰＰ６、ｐＰＰ７、およびｐＰＰ９からなる群より選択されるベクターを一種またはそれ以上含む微生物を、デアセチルピリピロペンＥとともに培養して、ピリピロペンＥを単離することを特徴とするピリピロペンＥの製造法が提供される。
【００５０】
デアセチルピリピロペンＥとともに培養する本発明の製造方法の好ましい態様によれば、下記（X）および（XI）に記載の少なくとも一種のポリヌクレオチドまたはそれを含んでなる組換えベクターを導入してなる微生物を、デアセチルピリピロペンＥとともに培養して、ピリピロペンＥを単離することを特徴とするピリピロペンＥの製造法が提供される：
（X）配列番号２７４のアミノ酸配列またはそれと実質的に同等なアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列から選択される少なくとも１個のヌクレオチド配列を有する単離されたポリヌクレオチド、
（XI）下記の（１）〜（４）に記載されたヌクレオチド配列から選択された少なくとも１個のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド：
（１）配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の２３２０５番から２４７７３番までのヌクレオチド配列、
（２）（１）において記載されたヌクレオチド配列の相補配列と厳密な条件下でハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列であり、かつそのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（３）（１）において記載されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにおいて、１もしくは複数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入もしくは付加されたヌクレオチド配列であり、かつそのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（４）（１）において記載されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列であり、かつそのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列。
【００５１】
デアセチルピリピロペンＥとともに培養する本発明の製造方法のより好ましい態様によれば、プラスミドｐＰＰ７を含む微生物を、デアセチルピリピロペンＥとともに培養して、ピリピロペンＥを単離することを特徴とするピリピロペンＥの製造法が提供される。
【００５２】
ピリピロペンＥとともに培養する本発明の製造方法のより好ましい態様によれば、上記（I）〜（III）に記載の少なくとも一種のポリヌクレオチドまたはそれを含んでなる組換えベクターを導入してなる微生物を、ピリピロペンＥとともに培養して、ピリピロペンＯを単離することを特徴とするピリピロペンＯの製造法が提供される。
【００５３】
ピリピロペンＥとともに培養する本発明の製造方法のより好ましい態様によれば、プラスミドｐＣＣ１−ＰＰ１、ｐＰＰ２、ｐＰＰ３、ｐＰＰ６、ｐＰＰ７、およびｐＰＰ９からなる群より選択されるベクターを一種またはそれ以上含む微生物を、ピリピロペンＥとともに培養して、ピリピロペンＯを単離することを特徴とするピリピロペンＯの製造法が提供される。
【００５４】
ピリピロペンＥとともに培養する本発明の製造方法のより好ましい態様によれば、下記（XII）および（XIII）に記載の少なくとも一種のポリヌクレオチドまたはそれを含んでなる組換えベクターを導入してなる微生物を、ピリピロペンＥとともに培養して、ピリピロペンＯを単離することを特徴とするピリピロペンＯの製造法：
（XII）配列番号２６９および２７５からなる群から選択される少なくとも一つのアミノ酸配列またはそれと実質的に同等なアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列から選択される少なくとも１個のヌクレオチド配列を有する単離されたポリヌクレオチド、
（XIII）下記の（１）〜（４）に記載されたヌクレオチド配列から選択された少なくとも１個のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド：
（１）下記(a)−(b)に記載されたヌクレオチド配列：
(a)配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の１３２６６番から１５１４４番までのヌクレオチド配列
(b) 配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の２５８２４番から２７１７８番までのヌクレオチド配列、
（２）（１）において記載されたヌクレオチド配列の相補配列と厳密な条件下でハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列であり、かつそれぞれのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（３）（１）において記載されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにおいて、１もしくは複数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入もしくは付加されたヌクレオチド配列であり、かつそれぞれのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（４）（１）において記載されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列であり、かつそれぞれのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列。
【００５５】
ピリピロペンＥとともに培養する本発明の製造方法のより好ましい態様によれば、プラスミドｐＰＰ２およびｐＰＰ９からなる群より選択されるベクターを一種またはそれ以上含む微生物を、ピリピロペンＥとともに培養して、ピリピロペンＯを単離することを特徴とするピリピロペンＯの製造法。
【００５６】
ピリピロペンＥとともに培養する本発明の製造方法のより好ましい態様によれば、プラスミドｐＰＰ２およびｐＰＰ９を含む微生物を、ピリピロペンＥとともに培養して、ピリピロペンＯを単離することを特徴とするピリピロペンＯの製造法が提供される。
【００５７】
ピリピロペンＥとともに培養する本発明の製造方法のより好ましい態様によれば、上記（I）〜（III）に記載の少なくとも一種のポリヌクレオチドまたはそれを含んでなる組換えベクターを導入してなる微生物を、ピリピロペンＥとともに培養して、１１位デアセチルピリピロペンＯを単離することを特徴とする１１位デアセチルピリピロペンＯの製造法が提供される。
【００５８】
ピリピロペンＥとともに培養する本発明の製造方法のより好ましい態様によれば、プラスミドｐＣＣ１−ＰＰ１、ｐＰＰ２、ｐＰＰ３、ｐＰＰ６、ｐＰＰ７、およびｐＰＰ９からなる群より選択されるベクターを一種またはそれ以上含む微生物を、ピリピロペンＥとともに培養して、１１位デアセチルピリピロペンＯを単離することを特徴とする１１位デアセチルピリピロペンＯの製造法が提供される。  
【００５９】
ピリピロペンＥとともに培養する本発明の製造方法のより好ましい態様によれば、下記（XIV）および（XV）に記載の少なくとも一種のポリヌクレオチドまたはそれを含んでなる組換えベクターを導入してなる微生物を、ピリピロペンＥとともに培養して、１１位デアセチルピリピロペンＯを単離することを特徴とする１１位デアセチルピリピロペンＯの製造法が提供される：
（XIV）配列番号２６９のアミノ酸配列またはそれと実質的に同等なアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列から選択される少なくとも１個のヌクレオチド配列を有する単離されたポリヌクレオチド、
（XV）下記の（１）〜（４）に記載されたヌクレオチド配列から選択された少なくとも１個のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド：
（１）配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の１３２６６番から１５１４４番までのヌクレオチド配列
（２）（１）において記載されたヌクレオチド配列の相補配列と厳密な条件下でハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列であり、かつそれぞれのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（３）（１）において記載されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにおいて、１もしくは複数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入もしくは付加されたヌクレオチド配列であり、かつそれぞれのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（４）（１）において記載されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列であり、かつそれぞれのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列。
【００６０】
ピリピロペンＥとともに培養する本発明の製造方法のより好ましい態様によれば、プラスミドｐＰＰ２を含む微生物を、ピリピロペンＥとともに培養して、１１位デアセチルピリピロペンＯを単離することを特徴とする１１位デアセチルピリピロペンＯの製造法が提供される。
【００６１】
１１位デアセチルピリピロペンＯとともに培養する本発明の製造方法の好ましい態様によれば、上記（I）〜（III）に記載の少なくとも一種のポリヌクレオチドまたはそれを含んでなる組換えベクターを導入してなる微生物を、１１位デアセチルピリピロペンＯとともに培養して、ピリピロペンＯを単離することを特徴とするピリピロペンＯの製造法が提供される。
【００６２】
１１位デアセチルピリピロペンＯとともに培養する本発明の製造方法の好ましい態様によれば、プラスミドｐＣＣ１−ＰＰ１、ｐＰＰ２、ｐＰＰ３、ｐＰＰ６、ｐＰＰ７、およびｐＰＰ９からなる群より選択されるベクターを一種またはそれ以上含む微生物を、１１位デアセチルピリピロペンＯとともに培養して、ピリピロペンＯを単離することを特徴とするピリピロペンＯの製造法が提供される。  
【００６３】
１１位デアセチルピリピロペンＯとともに培養する本発明の製造方法の好ましい態様によれば、下記（XIV）および（XV）に記載の少なくとも一種のポリヌクレオチドまたはそれを含んでなる組換えベクターを導入してなる微生物を、１１位デアセチルピリピロペンＯとともに培養して、ピリピロペンＯを単離することを特徴とするピリピロペンＯの製造法が提供される：
（XIV）配列番号２７５のアミノ酸配列またはそれと実質的に同等なアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列から選択される少なくとも１個のヌクレオチド配列を有する単離されたポリヌクレオチド、
（XV）下記の（１）〜（４）に記載されたヌクレオチド配列から選択された少なくとも１個のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド：
（１）配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の２５８２４番から２７１７８番までのヌクレオチド配列
（２）（１）において記載されたヌクレオチド配列の相補配列と厳密な条件下でハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列であり、かつそのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（３）（１）において記載されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにおいて、１もしくは複数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入もしくは付加されたヌクレオチド配列であり、かつそのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（４）（１）において記載されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列であり、かつそのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列。
【００６４】
１１位デアセチルピリピロペンＯとともに培養する本発明の製造方法のより好ましい態様によれば、プラスミドｐＰＰ９を含む微生物を、１１位デアセチルピリピロペンＯとともに培養して、ピリピロペンＯを単離することを特徴とするピリピロペンＯの製造法が提供される。
【００６５】
ピリピロペンＯとともに培養する本発明の製造方法の好ましい態様によれば、上記（I）〜（III）に記載の少なくとも一種のポリヌクレオチドまたはそれを含んでなる組換えベクターを導入してなる微生物を、ピリピロペンＯとともに培養して、７位デアセチルピリピロペンＡを単離することを特徴とする７位デアセチルピリピロペンＡの製造法が提供される。
【００６６】
ピリピロペンＯとともに培養する本発明の製造方法の好ましい態様によれば、プラスミドｐＣＣ１−ＰＰ１、ｐＰＰ２、ｐＰＰ３、ｐＰＰ６、ｐＰＰ７、およびｐＰＰ９からなる群より選択されるベクターを一種またはそれ以上含む微生物を、ピリピロペンＯとともに培養して、７位デアセチルピリピロペンＡを単離することを特徴とする７位デアセチルピリピロペンＡの製造法が提供される。  
【００６７】
ピリピロペンＯとともに培養する本発明の製造方法の好ましい態様によれば、下記（XIV）および（XV）に記載の少なくとも一種のポリヌクレオチドまたはそれを含んでなる組換えベクターを導入してなる微生物を、ピリピロペンＯとともに培養して、７位デアセチルピリピロペンＡを単離することを特徴とする７位デアセチルピリピロペンＡの製造法が提供される：
（XIV）配列番号２７０のアミノ酸配列またはそれと実質的に同等なアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列から選択される少なくとも１個のヌクレオチド配列を有する単離されたポリヌクレオチド、
（XV）下記の（１）〜（４）に記載されたヌクレオチド配列から選択された少なくとも１個のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド：
（１）配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の１６２２０番から１８０１８番までのヌクレオチド配列
（２）（１）において記載されたヌクレオチド配列の相補配列と厳密な条件下でハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列であり、かつそのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（３）（１）において記載されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにおいて、１もしくは複数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入もしくは付加されたヌクレオチド配列であり、かつそのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（４）（１）において記載されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列であり、かつそのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列。
【００６８】
ピリピロペンＯとともに培養する本発明の製造方法の好ましい態様によれば、プラスミドｐＰＰ３を含む微生物を、ピリピロペンＯとともに培養して、７位デアセチルピリピロペンＡを単離することを特徴とする７位デアセチルピリピロペンＡの製造法が提供される。
【００６９】
７位デアセチルピリピロペンＡとともに培養する本発明の製造方法の好ましい態様によれば、上記（I）〜（III）に記載の少なくとも一種のポリヌクレオチドまたはそれを含んでなる組換えベクターを導入してなる微生物を、７位デアセチルピリピロペンＡとともに培養して、ピリピロペンＡを単離することを特徴とするピリピロペンＡの製造法が提供される。
【００７０】
７位デアセチルピリピロペンＡとともに培養する本発明の製造方法の好ましい態様によれば、プラスミドｐＣＣ１−ＰＰ１、ｐＰＰ２、ｐＰＰ３、ｐＰＰ６、ｐＰＰ７、およびｐＰＰ９からなる群より選択されるベクターを一種またはそれ以上含む微生物を、７位デアセチルピリピロペンＡとともに培養して、ピリピロペンＡを単離することを特徴とするピリピロペンＡの製造法が提供される。  
【００７１】
７位デアセチルピリピロペンＡとともに培養する本発明の製造方法の好ましい態様によれば、下記（XVI）および（XVII）に記載の少なくとも一種のポリヌクレオチドまたはそれを含んでなる組換えベクターを導入してなる微生物を、７位デアセチルピリピロペンＡとともに培養して、ピリピロペンＡを単離することを特徴とするピリピロペンＡの製造法が提供される：
（XVI）配列番号２７５のアミノ酸配列またはそれと実質的に同等なアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列から選択される少なくとも１個のヌクレオチド配列を有する単離されたポリヌクレオチド、
（XVII）下記の（１）〜（４）に記載されたヌクレオチド配列から選択された少なくとも１個のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド：
（１）配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の２５８２４番から２７１７８番までのヌクレオチド配列
（２）（１）において記載されたヌクレオチド配列の相補配列と厳密な条件下でハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列であり、かつそのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（３）（１）において記載されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにおいて、１もしくは複数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入もしくは付加されたヌクレオチド配列であり、かつそのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（４）（１）において記載されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列であり、かつそのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列。
【００７２】
７位デアセチルピリピロペンＡとともに培養する本発明の製造方法の好ましい態様によれば、プラスミドｐＰＰ９を含む微生物を、７位デアセチルピリピロペンＡとともに培養して、ピリピロペンＡを単離することを特徴とするピリピロペンＡの製造法が提供される。
【００７３】
ここで、本発明で用いられる微生物は、下記組換えベクターを用いてポリヌクレオチドを導入してもよいが、例えば、エレクトロポレーション法、ポリエチレングリコール法、アグロバクテリウム法、リチウム法、または塩化カルシウム法等によってポリヌクレオチドを微生物に導入してもよい。
【００７４】
本発明で用いられる微生物は、ポリヌクレオチドまたはそれを含んでなる組換えベクターを導入できる微生物であれば特に限定されないが、アスペルギルス属に属する微生物が好ましく、Aspergillus oryzaeが特に好ましい。
【００７５】
本発明において、微生物の培養は、例えば、好気的条件での固体培養法、振とう培養法、通気撹拌培養法、または深部好気培養法により行うことができるが、特に振とう培養法が好ましい。微生物の培養に用いられる培地としては、慣用の成分、例えば炭素源としてはグルコース、シュクロース、水飴、デキストリン、澱粉、グリセロール、糖蜜、動・植物油等が使用できる。また、窒素源としては大豆粉、小麦胚芽、コーン・スティープ・リカー、綿実粕、肉エキス、ポリペプトン、マルトエキス、イーストエキス、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、尿素等が使用できる。その他必要に応じ、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、コバルト、塩素、リン酸(リン酸水素2カリウム等)、硫酸(硫酸マグネシウム等)、およびその他のイオンを生成することのできる無機塩類を添加することも有効である。また、必要に応じてチアミン(チアミン塩酸塩等)等の各種ビタミン、グルタミン酸(グルタミン酸ナトリウム等)、アスパラギン(DL-アスパラギン等)等のアミノ酸、ヌクレオチド等の微量栄養素、抗生物質等の選抜薬剤を添加することもできる。
さらに、菌の発育を助け、ピリピロペンＡの生産を促進するような有機物および無機物を適当に添加することができる。
【００７６】
培地のpHは、例えばpH 5.5〜pH 8程度である。培養に適当な温度は、15℃〜40℃であるが、多くの場合22℃〜30℃付近で生育する。４−ヒドロキシ−６−（ピリジン−３−イル）−３−（（２Ｅ,６Ｅ）−３，７，１１−トリメチルドデカ−２，６，１０−トリエニル）−２Ｈ−ピラン−２−オン、デアセチルピリピロペンＥ、ピリピロペンＥ、ピリピロペンＯ、およびピリピロペンＡの生産は、培地および培養条件、または使用した宿主により異なるが、何れの培養法においても通常2日〜10日間でその蓄積が最高に達する。培養中のピリピロペンＡの量が最高になった時に培養を停止し、培養物から目的物質を単離、精製する。
【００７７】
培養物から５−（３−ピリジル）−３，５−ジオキソペンタン酸、４−オキソ−６−（３−ピリジル）−α−ピロン、デアセチルピリピロペンＥ、ピリピロペンＥ、ピリピロペンＯ、７位デアセチルピリピロペンＡ、およびピリピロペンＡ等を単離するためには、その性状を利用した通常の分離手段、例えば溶剤抽出法、イオン交換樹脂法、吸着または分配カラムクロマトグラフィー法、ゲル濾過法、透析法、沈殿法、結晶化法等を単独で、または適宜組み合わせて抽出精製することができるが、溶媒抽出法が特に好ましい。
【００７８】
本発明において「実質的に同等なアミノ酸配列」とは、一つ若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、付加、または挿入による改変を有するが、ポリペプチドの活性に影響を与えないアミノ酸配列を意味する。アミノ酸の置換、欠失、付加、または挿入によって改変されたアミノ酸配列は、改変等される前のアミノ酸配列に対して、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに一層好ましくは９８％以上の配列同一性を有することが好ましい。また、改変されるアミノ酸残基の数は、好ましくは1〜40個、より好ましくは1〜20個、さらに好ましくは1〜10個、さらに一層好ましくは1〜8個、最も好ましくは1〜4個である。
【００７９】
そして、活性に影響を与えない改変の例としては、保存的置換が挙げられる。「保存的置換」とは、ポリペプチドの活性を実質的に変化しないように、好ましくは1〜40個、より好ましくは1〜20個、さらに好ましくは1〜10個、さらに一層好ましくは1〜8個、最も好ましくは1〜4個のアミノ酸残基を、別の化学的に類似したアミノ酸残基によって置き換えることを意味する。例えば、ある疎水性アミノ酸残基を別の疎水性アミノ酸残基によって置換する場合、ある極性アミノ酸残基を同じ電荷を有する別の極性アミノ酸残基によって置換する場合などが挙げられる。このような置換を行うことができる機能的に類似したアミノ酸は、アミノ酸毎に当該技術分野において公知である。具体例を挙げると、非極性(疎水性)アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニン等が挙げられる。極性(中性)アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システイン等が挙げられる。陽電荷をもつ(塩基性)アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジン等が挙げられる。また、負電荷をもつ(酸性)アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸等が挙げられる。
【００８０】
本発明において「厳密な条件」とは、ハイブリダイゼーション後のメンブレンの洗浄操作を、高温度低塩濃度溶液中で行うことを意味し、当業者であればその条件は適宜決定できるものであるが、例えば、２×ＳＳＣ濃度（１×ＳＳＣ：１５ｍＭクエン酸３ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム）、０．５％ＳＤＳ溶液中で、６０℃、２０分間の洗浄条件、または０．２×ＳＳＣ濃度（１×ＳＳＣ：１５ｍＭクエン酸３ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム）、０．１％ＳＤＳ溶液中で６０℃、１５分間の洗浄条件を意味する。
【００８１】
ハイブリダイゼーションは、公知の方法に従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。
【００８２】
本願明細書において、ヌクレオチド配列についての「同一性」（相同性という場合もある）とは、比較される配列間において、各々の配列を構成する塩基の一致の程度の意味で用いられる。このとき、ギャップの存在およびアミノ酸の性質が考慮される。本明細書において示した「同一性」の数値はいずれも、当業者に公知の相同性検索プログラムを用いて算出される数値であればよく、例えばＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ等においてデフォルト（初期設定）のパラメータを用いることにより、容易に算出することができる。
【００８３】
本願明細書において、ヌクレオチド配列についての「同一性」は９０％以上であり、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上である。
【００８４】
本願明細書において、「ポリヌクレオチドにおいて、１もしくは複数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入もしくは付加された」とは、部位特異的突然変異誘発法等の周知の方法により、または天然に生じ得る程度の複数個のヌクレオチドの置換等により改変がなされたことを意味する。ヌクレオチドの改変の個数は、１個または複数個（例えば、１個ないし数個あるいは１、２、３、または４個）である。
【００８５】
「そ（れぞれ）のヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列」とは、「そ（れぞれ）のヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質」と同等な活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を意味する。
【００８６】
配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の３３４２番から５１５８番までのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質は、CoA ligase活性を有することが好ましい。
【００８７】
配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の５３８２番から１２７７７番までのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質は、LovB-like polyketide synthase(PKS)活性を有することが好ましい。
【００８８】
配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の１３２６６番から１５１４４番までのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質は、Cytochrome P450 monooxygenase（１）(P450-1)活性を有することが好ましい。
【００８９】
配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の１６２２０番から１８０１８番までのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質は、Cytochrome P450 monooxygenase（２）(P450-2)活性を有することが好ましい。
【００９０】
配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の１８５０６番から１９２９６番までのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質は、Cyclase(IMP: Integral membrane protein)活性を有することが好ましい。
【００９１】
配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の１９７７９番から２１３８９番までのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質は、FAD-dependent monooxygenase(FMO)活性を有することが好ましい。
【００９２】
配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の２１７９３番から２２８７７番までのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質は、UbiA-like prenyltransferase(UbiAPT)活性を有することが好ましい。
【００９３】
配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の２３２０５番から２４７７３番までのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質は、Acetyltransferase(AT)活性を有することが好ましい。
【００９４】
配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の２５８２４番から２７１７８番までのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質は、Acetyltransferase-2(AT-2)活性を有することが好ましい。
【００９５】
単離ポリヌクレオチドの取得
本発明による単離ポリヌクレオチドの取得方法は、特に限定されないが、以下の方法によりペニシリウム  コピロビウムPF1169株または糸状菌から単離することができる。本発明による単離ポリヌクレオチドの取得方法は、具体的に、例えば下記の実施例９の方法等で得られる相同配列を元に、ピリピロペンＡの生合成に関与する、ポリケチド合成酵素遺伝子、プレニルトランスフェラーゼ遺伝子、水酸化酵素遺伝子、アセチル化酵素遺伝子、またはアデニル酸合成酵素遺伝子等のいずれか一つまたはそれ以上の遺伝子を特異的に増幅することのできるプライマーを合成し、別途作成したペニシリウム  コピロビウムPF1169株のフォスミドゲノムライブラリーに対してPCRを行い、さらにコロニーハイブリダイゼーションを行って、本発明において用いられる単離ポリヌクレオチドを取得する。
【００９６】
本発明の好ましい態様によれば、単離されたポリヌクレオチドは、上記（I）〜（III）に記載の少なくとも一種の単離されたポリヌクレオチドが提供される。具体的には、下記（I）〜（III）に記載の少なくとも一種のポリヌクレオチドが提供される：
（I）下記の(a)〜(d)に記載されたヌクレオチド配列から選択された少なくとも１個のヌクレオチド配列を有する単離されたポリヌクレオチド：
(a)配列番号２６６のヌクレオチド配列、
(b)配列番号２６６のヌクレオチド配列の相補配列と厳密な条件下でハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列であり、かつ配列番号２６６のヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
(c) 配列番号２６６のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにおいて、１もしくは複数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入もしくは付加されたヌクレオチド配列であり、かつ配列番号２６６のヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
(d) 配列番号２６６のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列であり、かつ配列番号２６６のヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（II）配列番号２６７〜２７５から選択される少なくとも一つのアミノ酸配列またはそれと実質的に同等なアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有する単離されたポリヌクレオチド、
（III）下記の(１)〜(４)に記載されたヌクレオチド配列から選択された少なくとも１個のヌクレオチド配列を有する単離されたポリヌクレオチド：
（１）下記(a)−(i)に記載されたヌクレオチド配列：
(a) 配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の３３４２番から５１５８番までのヌクレオチド配列、
(b) 配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の５３８２番から１２７７７番までのヌクレオチド配列、
(c) 配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の１３２６６番から１５１４４番までのヌクレオチド配列、
(d) 配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の１６２２０番から１８０１８番までのヌクレオチド配列、
(e) 配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の１８５０６番から１９２９６番までのヌクレオチド配列、
(f) 配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の１９７７９番から２１３８９番までのヌクレオチド配列、
(g) 配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の２１７９３番から２２８７７番までのヌクレオチド配列、
(h) 配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の２３２０５番から２４７７３番までのヌクレオチド配列、および
(i) 配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の２５８２４番から２７１７８番までのヌクレオチド配列
（２）（１）において記載されたヌクレオチド配列の相補配列と厳密な条件下でハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列であり、かつそれぞれのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（３）（１）において記載されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにおいて、１もしくは複数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入もしくは付加されたヌクレオチド配列であり、かつそれぞれのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（４）（１）において記載されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列であり、かつそれぞれのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列。
【００９７】
本発明のより好ましい態様によれば、単離されたポリヌクレオチドは、下記(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、および(h)から選択される単離されたポリヌクレオチドが提供される：
(a) 配列番号２６６のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、
(b) 配列番号２６９、２７０、２７３、２７４、および２７５から選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
(c) 配列番号２６９に記載のアミノ酸配列と実質的に同等なアミノ酸配列を有し、水酸化酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
(d) 配列番号２７０に記載のアミノ酸配列と実質的に同等なアミノ酸配列を有し、水酸化酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
(e) 配列番号２７３に記載のアミノ酸配列と実質的に同等なアミノ酸配列を有し、プレニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
(f) 配列番号２７４に記載のアミノ酸配列と実質的に同等なアミノ酸配列を有し、アセチル化酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および
(g) 配列番号２７５に記載のアミノ酸配列と実質的に同等なアミノ酸配列を有し、アセチル化酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
(h) 下記(i)、(ii)、(iii)、(iv)、および(v)から選択されるヌクレオチド配列を有する、単離されたポリヌクレオチド：
(i) 配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の１３２６６番から１５１４４番までのヌクレオチド配列、
(ii) 配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の１６２２０番から１８０１８番までのヌクレオチド配列、
(iii) 配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の２１７９３番から２２８７７番までのヌクレオチド配列、
(iv) 配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の２３２０５番から２４７７３番までのヌクレオチド配列、および
(v) 配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の２５８２４番から２７１７８番までのヌクレオチド配列。
【００９８】
本発明のより好ましい態様によれば、ポリヌクレオチドは、下記 (A)、(B)、および(C)から選択される単離されたポリヌクレオチドが提供される：
(A) 配列番号２７５から選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
(B) 配列番号２７５に記載のアミノ酸配列と実質的に同等なアミノ酸配列を有し、アセチル化酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
(C) 配列番号２６６で示されるヌクレオチド配列の２５８２４番から２７１７８番までのヌクレオチド配列を有する、単離されたポリヌクレオチド。
【００９９】
本発明のさらに好ましい態様によれば、前記(c)、(d)、(e)、(f)、および(g)のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列が、それぞれ、配列番号２６９、２７０、２７３、２７４、および２７５に記載のアミノ酸配列と９０％以上の配列同等性を有するポリヌクレオチドが提供される。
【０１００】
本発明のさらに好ましい態様によれば、前記(B)に記載のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号２７５に記載のアミノ酸配列と９０％以上の配列同等性を有するポリヌクレオチドが提供される。
【０１０１】
組換えベクター
本発明による組換えベクターは、上記（I）〜（III）に記載のポリヌクレオチドのいずれか一種またはそれ以上を、例えば、［サンブルーク(Sambrook, J.)ら著,「モレキュラー・クローニング(Molecular cloning):ア・ラボラトリー・マニュアル(a laboratory manual)」,(米国),第2版,コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー(Cold Spring Harbor Laboratory),1989年］に記載の遺伝子組換え技術の常法に従って目的に応じて適当な形態に修飾し、ベクターに連結することによって作製することができる。
【０１０２】
本発明において使用される組換えベクターは、ウイルス、プラスミド、フォスミド、またはコスミドベクター等から適宜選択することができる。例えば、宿主細胞が大腸菌の場合はλファージ系のバクテリオファージ、pBR、pUC系のプラスミド、枯草菌の場合はpUB系のプラスミド、酵母の場合はYEp、YRp、YCp、YIp系のプラスミドベクターが挙げられる。
【０１０３】
使用されるプラスミドの内の少なくとも一つは、形質転換体を選抜するための選択マーカーを含むのが好ましく、選択マーカーとしては薬剤耐性遺伝子、栄養要求性を相補する遺伝子を使用することができる。その好ましい具体例としては、使用する宿主が細菌の場合は、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子などであり、酵母の場合はトリプトファン生合成遺伝子(TRP1)、ウラシル生合成遺伝子(URA3)、ロイシン生合成遺伝子(LEU2)などであり、カビの場合はハイグロマイシン耐性遺伝子、ビアラホス耐性遺伝子、ブレオマイシン耐性遺伝子、オーレオバシジン耐性遺伝子などであり、植物の場合にはカナマイシン耐性遺伝子、ビアラホス耐性遺伝子などが挙げられる。
【０１０４】
また、本発明において利用される発現ベクターとしてのＤＮＡ分子は、各遺伝子の発現に必要なＤＮＡ配列、例えばプロモーター、転写開始信号、リボソーム結合部位、翻訳停止シグナル、転写終結信号などの転写調節信号、翻訳調節信号を有しているのが好ましい。プロモーターとしては、大腸菌においてはラクトースオペロン、トリプトファンオペロンなどのプロモーター、酵母ではアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子、酸性フォスファターゼ遺伝子、ガラクトース資化性遺伝子、グリセロアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子などのプロモーター、カビではα−アミラーゼ遺伝子、グルコアミラーゼ遺伝子、セロビオハイドロラーゼ遺伝子、グリセロアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、abp1遺伝子などのプロモーター、植物ではCaMV 35S RNAプロモーター、 CaMV 19S RNAプロモーター、ノパリン合成酵素遺伝子プロモーターが好ましく用いることができるものとして挙げられる。
【０１０５】
本発明による組換えベクターは、好ましくは、プラスミドｐＰＰ６、ｐＰＰ７、およびｐＰＰ９からなる群より選択される組換えベクターである。
【０１０６】
また、本発明の好ましい態様によれば、ピリピロペンＡの製造のための、プラスミドｐＰＰ６、ｐＰＰ７、およびｐＰＰ９からなる群より選択される組換えベクターの使用が挙げられる。
【０１０７】
形質転換体
本発明による単離されたポリヌクレオチドを導入する宿主は、用いるベクターの種類に応じて、放線菌、大腸菌、枯草菌、酵母、糸状菌、植物細胞等の中から適宜選択されて良い。
【０１０８】
組換えベクターの宿主への導入方法としては、接合伝達、ファージによる形質導入、さらにカルシウムイオン法、リチウムイオン法、エレクトロポレーション法、PEG法、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法といった形質転換の方法の中から、供試する宿主細胞に応じて用いれば良い。
【０１０９】
本発明において複数の遺伝子を宿主細胞に導入する場合には、各遺伝子は同一または別々のＤＮＡ分子に含まれていても良い。さらに、宿主細胞が細菌である場合には、各遺伝子をポリシストロン性mRNAとして発現させるように設計し、一つのＤＮＡ分子とすることも可能である。
【０１１０】
本発明による形質転換体は、好ましくは、プラスミドｐＰＰ６、ｐＰＰ７、およびｐＰＰ９からなる群より選択されるベクターを一種またはそれ以上を含んでなる形質転換体である。
【０１１１】
本発明の好ましい態様によれば、ピリピロペンＡの製造のための、プラスミドｐＰＰ６、ｐＰＰ７、およびｐＰＰ９からなる群より選択されるベクターを一種またはそれ以上を含んでなる形質転換体の使用が挙げられる。
【実施例】
【０１１２】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【０１１３】
実施例１：ペニシリウム  コピロビウムPF1169株のゲノムＤＮＡの調製
三角フラスコ（１L）に滅菌したNB培地  500mlを入れ、1/2CMMY寒天培地において、28℃で、4日間前培養していたペニシリウム  コピロビウムPF1169株（公開技報2008-500997号（特許文献３））を上記の培地に加え、28℃で、4日間液体培養した。ミラクロスで濾過により、菌体５ｇを得た。この菌体よりゲノムＤＮＡ精製キット Genomic-tip 100/G（キアゲン株式会社製）を、添付のマニュアルに従い、30μgのゲノムＤＮＡを取得した。【０１１４】
実施例２：ポリケチド合成酵素(PKS)増幅用縮重プライマーとその増幅断片
種々の糸状菌ポリケチド合成酵素に保存されているアミノ酸配列より増幅用縮重プライマーとして  下記プライマーをデザインし、合成した：
ＬＣ１  ： ＧＡＹＣＣＩＭＧＩＴＴＹＴＴＹＡＡＹＡＴＧ（配列番号１）
ＬＣ２ｃ： ＧＴＩＣＣＩＧＴＩＣＣＲＴＧＣＡＴＹＴＣ（配列番号２）
（ただし、R=A/G、Y=C/T、M=A/C、I=イノシン）。
この縮重プライマーを使用して、実施例１において調製したゲノムＤＮＡと、ExTaqポリメラーゼ（タカラバイオ株式会社製）とを、添付のマニュアルに従い反応させ、約700bpの増幅断片を検出した（図１参照）。そして、前記増幅断片を解析し、その内部500bpの配列を特定した（配列番号３）。【０１１５】
実施例３：ゲノムＤＮＡの大量シークエンスとアミノ酸配列相同性検索
実施例１において得られたペニシリウム  コピロビウムPF1169株のゲノムＤＮＡを大量シークエンスと、アミノ酸配列の相同性検索とに供した。具体的にはゲノムＤＮＡ  50μgの一部を前処理の後、Roche社４５４FLX  ＤＮＡシークエンサーに供し、約250bp、10.3万本のフラグメント配列（総計49Mbの配列）を取得した。【０１１６】
この配列に対し、ポリケチド合成酵素およびプレニルトランスフェラーゼで既知である配列として、下記の五種の配列（ポリケチド合成酵素：Aspergillus(A.) fumigatus PKS 2146a.a.およびPenicillium(P.) griseofluvum 6-methylsalycilic acid synthase 1744a.a.、プレニルトランスフェラーゼ：Aspergillus (A.) fumigatus Prenyltransferase、Aspergillus(A.) fumigatus Prenyltransferase（4-hydroxybezoate octaprenyltransferase）、およびPenicillium(P.) marneffei Prenyltransferase由来の配列）を選定し、相同配列検索ソフトblastxによる検索を実施した。それぞれ８９本、８６本、２本、１本、および３本の相同配列を取得した（表１参照）。さらに、A. fumigatus PKS 2146a.a.およびP. griseofluvum 6-methylsalycilic acid synthase 1744a.a.の相同配列から、それぞれ１９本、２３本のコンティグ配列を取得した（A. fumigatus PKS 2146a.a.のコンティグ配列：配列番号１７９〜１９７、P. griseofluvum 6-methylsalycilic acid synthase 1744a.a.のコンティグ配列：配列番号１９８〜２２０）（表２参照）。【０１１７】
【表２】
0005898960.tif 000005
【０１１８】
実施例４：ゲノムＤＮＡからのPCR増幅
実施例３において取得したblastxの検索結果より、ポリケチド合成酵素に対して、配列番号２２７〜２５２に示す１３種のプライマー対を合成した。同様に、プレニルトランスフェラーゼに対して、配列番号２５３〜２６２に示す５種のプライマー対を合成した。これらのプライマーを用いて、ゲノムＤＮＡに対するPCRを行ったところ、全プライマー対について期待される大きさの増幅断片を認めた（図１および図２参照）。【０１１９】
実施例５：ファージゲノムライブラリーの作製
ペニシリウム  コピロビウムPF1169株のλファージゲノムライブラリーを、λBlueSTAR Xho I Half-site Arms Kit ( タカラバイオ株式会社製 Cat. No. 69242-3)を用いて、添付のマニュアルに従い、構築した。すなわち、ゲノムＤＮＡを、制限酵素Sau3A1を用いて部分分解し、約20kbのＤＮＡ断片0.5μgをキットに添付されたλBlueSTAR  ＤＮＡ0.5μgに連結した。このライゲーション溶液をLambda INN Packaging kit(株式会社ニッポンジーン製)を用い、キットに添付のマニュアルに基づいてin vitroパッケージングを行い、1mlの溶液を取得した。このパッケージングされたファージ溶液１０μlを大腸菌ER1647株100μlに感染させ、プラーク形成培地において、37℃で、一晩培養後、約500クローンのプラークを得た。このように感染により10〜20kbのペニシリウム  コピロビウムPF1169株のゲノム ＤＮＡ が導入されたファージ約50000クローンからなるゲノムライブラリーを作製した。 【０１２０】
実施例６：ファージライブラリーからのスクリーニング
実施例５において調製したファージライブラリー10000クローンに対して、上記で調製したLC1−LC2cプライマー対により増幅させたPCR産物をプローブとして、プラークハイブリダイゼーションによる１次スクリーニングを行った。プローブの標識と検出にはAlkPhos Direct Labelling and Detection System with CDP-Star（GEヘルスケア株式会社製 Cat. No. RPN3690）を用いた。前記ハイブリダイゼーションは、添付のマニュアルに従い、実施した。【０１２１】
１次スクリーニングにより、６クローンが候補として残った。さらに、プラークハイブリダイゼーションによる２次スクリーニングの結果、４クローンを取得した。これらの陽性クローンは大腸菌BM25.8株に感染させ、添付のマニュアルに従いファージをプラスミドに変換させ、目的領域を含む４種のプラスミドを取得した。【０１２２】
実施例７：フォスミドゲノムライブラリーの作製
ペニシリウム  コピロビウムPF1169株のゲノムライブラリーは、CopyControl Fosmid Library Production Kit（EPICENTRE社製、Cat. No.CCFOS110）を、添付のマニュアルに従い、構築した。すなわち、約40 kbのゲノムＤＮＡ0.25μgのＤＮＡ断片を末端の平滑化を行った後、フォスミドベクターpCCFOS（Epicentre社製）に組み込んだ。このライゲーション溶液を同キット添付のMaxPlaxLambda Packaging Extractを用い、キットに添付のマニュアルに基づいて、in vitroパッケージングを行った。このパッケージングされたウィルス溶液10μlを大腸菌EPI300TM-T1R株100μlに感染させ、クロラムフェニコール含有培地において、37℃で、一晩培養し選抜したところ、300クローンのコロニーを得た。このように感染により40kbのペニシリウム  コピロビウムPF1169株のゲノムＤＮＡ が導入されたフォスミド約30000クローンを取得した。1wellあたり約50クローンとなるように96wellプレートに分注し、つまり、９６のプール、約4800クローンからなるゲノムライブラリーを作製した。 【０１２３】
実施例８：フォスミドライブラリースクリーニング
フォスミド添付のマニュアルに従い、実施例７において作成したライブラリーの９６プールより各プラスミドＤＮＡを調製した。実施例２で合成したポリケチド合成酵素増幅用縮重プライマーを用いて、この９６プールのプラスミドＤＮＡサンプルに対して、PCRを行った。その結果、約700bpのＤＮＡ断片が、９プールより増幅した。さらにこのポジティブプールから、約３００クローン以上のコロニーを含むシャーレを作製し、コロニーハイブリダイゼーションにより再スクリーニングした。その結果、LC1-LC2cプライマー対を用いて、約4800クローンより９種のフォスミドを取得した。【０１２４】
実施例９：ゲノムＤＮＡの大量シークエンスとアミノ酸配列相同性検索
実施例１において得られたペニシリウム  コピロビウムPF1169株のゲノムＤＮＡを大量シークエンスと、アミノ酸配列の相同性検索とに供した。具体的にはゲノムＤＮＡ  50μgの一部を前処理の後、Roche社４５４FLX  ＤＮＡシークエンサーに供し、平均コンティグ長19.621kb、1405本のフラグメント配列（総塩基長27.568160Mbの配列）を取得した。
この配列に対し、ポリケチド合成酵素およびプレニルトランスフェラーゼで既知である配列として、下記の五種の配列（ポリケチド合成酵素： Penicillium(P.) griseofluvum 6-methylsalycilic acid synthase 1744a.a.(P22367) およびAspergillus(A.) fumigatus PKS 2146a.a.(Q4WZA8)、プレニルトランスフェラーゼ：Penicillium(P.) marneffei Prenyltransferase(Q0MRO8)、Aspergillus (A.) fumigatus Prenyltransferase(Q4WBI5)、およびAspergillus(A.) fumigatus Prenyltransferase（4-hydroxybezoate octaprenyltransferase）(Q4WLD0)由来の配列)を選定し、相同配列検索ソフトblastxによる検索を実施した。それぞれ２２本(P22367)、２１本(Q4WZA8)、２本(Q0MRO8)、３本(Q4WBI5)、および３本(Q4WLD0)の相同配列を取得した。【０１２５】
実施例１０：フォスミドライブラリースクリーニング及びクラスター遺伝子の配列解析
フォスミドキット（EPICENTRE社製 CopyControl Fosmid Library Production Kit）に添付されているマニュアルに従い、実施例７において作成したライブラリーの９６プールより各プラスミドDNAを調製した。Roche社４５４FLX ＤＮＡシークエンサーにより決定された塩基配列に基づいてアミノ酸配列の相同性検索を行い、ポリケチド合成酵素とプレニルトランスフェラーゼが近接する領域を検索した。得られた領域のプレニルトランスフェラーゼの塩基配列より400bpのDNA断片を増幅しうるプライマー対（No.27）を合成した。
このプライマーを用いて、この４８プールのプラスミドDNAサンプルに対して、PCRを行った。その結果期待される約400bpのDNA断片（配列番号２６３）が、１１プールより増幅した（図３参照）。さらに、このポジティブプールのうち６プールから、約３００クローン以上のコロニーを含むシャーレを作製し、コロニーハイブリダイゼーションにより再スクリーニングした。その結果、27F + 27Rのプライマー対（27Fプライマー：配列番号２６４、27Rプライマー：配列番号２６５）を用いて、約4800クローンより４種のフォスミドを取得した。この内の一つをpCC1-PP1と命名し、挿入断片の全配列を決定した（配列番号２６６）。
得られたpCC1-PP1により大腸菌Escherichia coli EPI300TM-T1R株（フォスミドキットに付属）を形質転換することにより大腸菌Escherichia coli EPI300TM-T1R株／pCC1-PP1を得た。
なお、前記配列番２６６の配列とCoA ligase、LovB-like polyketide synthase(PKS)、水酸化酵素であるCytochrome P450 monooxygenase、Cyclase(IMP: Integral membrane protein)、FAD-dependent monooxygenase(FMO)、UbiA-like prenyltransferase(UbiAPT)、アセチル化酵素であるAcetyltransferase(AT)、Acetyltransferase-2(AT-2)、およびCation transporting ATPase（上記酵素は、いずれもAspergillus fumigatus Af293株由来）との、相同性検索をそれぞれ行ったところ、いずれも７０％以上の高い相同性を示した。
配列番号２６６のヌクレオチド３３４２−５１５８は、CoA ligaseをコードし、その対応するポリペプチドは、配列番号２６７に記載したアミノ酸配列で示され、配列番号２６６のヌクレオチド５３８２−１２７７７は、LovB-like polyketide synthase(PKS)をコードし、対応するポリペプチドは、配列番号２６８に記載したアミノ酸配列で示され、配列番号２６６のヌクレオチド１３２６６−１５１４４（以下、このポリヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質をCytochrome P450 monooxygenase（１）（P450-1）とする）および１６２２０−１８０１８（以下、このポリヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質をCytochrome P450 monooxygenase（２）（P450-2）とする）は、Cytochrome P450 monooxygenaseをコードし、対応するポリペプチドは、それぞれ、配列番号２６９、２７０に記載したアミノ酸配列で示され、配列番号２６６のヌクレオチド１８５０６−１９２９６は、Cyclaseをコードし、対応するポリペプチドは、配列番号２７１に記載したアミノ酸配列で示され、配列番号２６６のヌクレオチド１９７７９−２１３８９は、FAD-dependent monooxygenase(FMO)をコードし、対応するポリペプチドは、配列番号２７２に記載したアミノ酸配列で示され、配列番号２６６のヌクレオチド２１７９３−２２８７７は、UbiA-like prenyltransferase(UbiAPT)をコードし、対応するポリペプチドは、配列番号２７３に記載したアミノ酸配列で示され、配列番号２６６のヌクレオチド２３２０５-２４７７３は、Acetyltransferase(AT)をコードし、対応するポリペプチドは、配列番号２７４に記載したアミノ酸配列で示され、配列番号２６６のヌクレオチド２５８２４−２７１７８は、Acetyltransferase-2(AT-2)をコードし、対応するポリペプチドは、配列番号２７５に記載したアミノ酸配列で示され、配列番号２６６のヌクレオチド２７７９８−３１８５５は、Cation transporting ATPaseをコードし、対応するポリペプチドは、配列番号２７６に記載したアミノ酸配列で示された。【０１２６】
実施例１１：Aspergillus Oryzaeの形質転換による遺伝子の機能解析
以下で用いるピリピロペンＥは、特開平8−239385号公報、WO94／09147号公報、または米国特許5597835号公報に記載される方法に準じた微生物培養法によるか、Tetrahedron Letters, vol. 37, No.36, 6461-6464, 1996に記載される全合成の方法によって製造することができた。また、以下で用いるピリピロペンＯは、J. Antibiotics 49, 292-298, 1996またはWO94／09147号公報に記載される方法に準じた微生物培養法によって製造することができた。【０１２７】
（１）糸状菌導入用発現ベクターの作製
pUSA（図４）とpHSG399（タカラバイオ社）をそれぞれKpnＩ切断し、連結することにより、pUSA-HSGを取得した。このプラスミドをSmaＩ、KpnＩの順で切断し、ゲル精製することで、KpnＩの粘着末端とSmaＩの平滑末端を有す線状ベクターDNAを取得した。【０１２８】
（２）ｐＰＰ２のプラスミドの作製
Fosmid pCC1-PP1を鋳型として、プライマー対P450-1 with Kpn F（配列番号２７７）/P450-1 with Swa R（配列番号２７８）を用いて前記P450-1のポリヌクレオチドを増幅し、精製したDNA断片をpCR-Blunt（Invitorogen社  Cat.No.K2700-20）にクローン化した。
得られたプラスミドをKpnＩとSwaＩで切断し、前記P450-1断片を上述したベクターpUSA-HSGにライゲーションし、図５に示すｐＰＰ２のプラスミドを取得した。【０１２９】
（３）ｐＰＰ３のプラスミドの作製
Fosmid pCC1-PP1を鋳型としてとして、図６に示す流れに従い、まず、プライマー対F1（配列番号２７９）/R1（配列番号２８０）、F2（配列番号２８１）/R2（配列番号２８２）、F3（配列番号２８３）/R3（配列番号２８４）、F4（配列番号２８５）/R4（配列番号２８６）、F5（配列番号２８７）/R5（配列番号２８８）、およびF6（配列番号２８９）/R6（配列番号２９０）を用い、エキソンのみを増幅し、六つの断片を取得した。次にこれらの断片を鋳型としてF1/R2、F3/R4、およびF5/R6のプライマー対により増幅し、より長い断片を取得した。さらに、F1/R4およびF1/R6のプライマー対により増幅を繰り返すことによって前記P450-2のポリヌクレオチドのイントロンを含まないcDNAを作製した。このcDNA断片をpCR-Blunt（Invitorogen社  Cat.No.K2700-20）に導入し、得られたプラスミドを鋳型として、プライマー対infusion F of P450-2-cDNA（配列番号２９１）/infusion R of P450-2-cDNA（配列番号２９２）により増幅した。キットのマニュアルに基づいて、In-Fusion Advantage PCR Cloning Kit（Clontech社）を用い、図７に示すｐＰＰ３のプラスミドを取得した。【０１３０】
（４）ｐＰＰ６、ｐＰＰ７、およびｐＰＰ９の各プラスミドの作製
上記実施例１１（１）で取得した糸状菌形質転換用ベクターpUSA-HSGを使って、以下のｐＰＰ６、ｐＰＰ７、およびｐＰＰ９の各プラスミドを取得した。
１）プラスミドｐＰＰ６の作製（UbiA PT）
Fosmid pCC1-PP1を鋳型として、UbiA PT F with Kpn（配列番号２９３）とUbiA PT R with Swa（配列番号２９４）を用いて前記UbiA PTのポリヌクレオチドを各々増幅し、精製したDNA断片をPCR断片用ベクターpCR-Blunt（Invitorogen社Cat.No.K2700-20）にクローン化した。得られたプラスミドをKpnＩとSwaＩとで切断し、各断片を精製した後、前記糸状菌ベクターpUSA-HSGのKpnIとSmaIにライゲーションし、図１２に示すpPP6のプラスミドを取得した。【０１３１】
２）ｐＰＰ７のプラスミドの作製（AT）
Fosmid pCC1-PP1を鋳型として、プライマー対AT F with Swa （配列番号２９５）とAT R with Kpn（配列番号２９６）を用いてATのポリヌクレオチドを各々増幅し、精製した断片をPCR断片用ベクターpCR-Blunt（Invitorogen社Cat.No.K2700-20）にクローン化した。得られたプラスミドをKpnＩとSwaＩで切断し、各断片を前記糸状菌ベクターpUSA-HSGのKpnIとSmaIにライゲーションし、図１２に示すｐＰＰ７のプラスミドを取得した。【０１３２】
３）ｐＰＰ９のプラスミドの作製(AT-2)
Fosmid pCC1-PP1を鋳型として、プライマー対infusion F of Toxin（配列番号２９７）とinfusion R of Toxin（配列番号２９８）を用いてToxin断片を増幅、In-Fusion Advantage PCR Cloning Kit（Clontech社製  Cat.No.639619）をキットのマニュアルに基づいて前記糸状菌ベクターpUSA-HSGのKpnIと、SmaIとの間に挿入し、図１２に示すｐＰＰ９のプラスミドを取得した。【０１３３】
（５）Aspergillus Oryzae（A. oryzae）の形質転換体の取得
CD-Met（L-Methionine 40μg/ml含有）寒天培地でA. oryzae（HL-1105株）を30℃で1週間培養した。このシャーレから分生子（＞108）を回収し、500ml のフラスコに100mlのYPD液体培地に接種した。20時間培養（30℃、180rpm）後、毬藻状の菌体を取得した。菌体を３G-1 グラスフィルターで集め、0.8M NaClで洗浄し、よく脱水し、TF溶液Ｉ(プロトプラスト化溶液)で懸濁後、30℃、60rpmで2時間振盪した。なお、30分間ごとに顕微鏡で観察し、プロトプラストの存在を確認した。その後、培養液を濾過し、遠心（2000rpm、5分間）によりプロトプラストを回収後、TF溶液IIで洗浄した。洗浄後、0.8容量のTF溶液IIおよび0.2容量のTF溶液IIIを加え混和して、プロトプラスト懸濁液を取得した。【０１３４】
この懸濁液200μlにプラスミドDNA（ｐＰＰ２あるいはｐＰＰ３）10μgを加え、氷上で30分間静置し、TF溶液III（1mL）を加え穏やかに混和した。その後、室温で15分間静置して、前記プロトプラストにプラスミドDNAを導入した。これにTF溶液II(8mL)を加え、遠心（2000rpmで5分間）し、1〜2ml残してプロトプラストを回収した。再生培地（下層）に回収したプロトプラスト液を滴下し、再生培地（上層）を流し込み、シャーレを廻して混和後、30℃で4〜5日培養した。出てきたクローンを再生培地（下層）に単離し、植え継ぎ純化することにより形質転換体（Aspergillus oryzae PP2-1および Aspergillus oryzae PP3-2）を取得した。【０１３５】
上記実施例１１の（５）に記載される方法に準じて各プラスミドDNA（ｐＰＰ６、ｐＰＰ７、およびｐＰＰ９）を導入した形質転換体（Aspergillus oryzae ＰＰ６、Aspergillus oryzae ＰＰ７、およびAspergillus oryzae ＰＰ９）を取得した。【０１３６】
上記TF 溶液I(プロトプラスト化溶液)は下記組成を用いて調製した。
0005898960.tif 000006
上記組成を調製後(pH5.5)、ろ過滅菌を行った。【０１３７】
上記TF溶液IIは下記組成を用いて調製した。 
0005898960.tif 000007
更に水を加えて全量を200mlとした。    
上記組成を調製後、オートクレーブ滅菌を行った。【０１３８】
上記TF溶液III は下記組成を用いて調製した。
0005898960.tif 000008
更に水を加えて全量を10mlとした。
上記組成を調製後、ろ過滅菌を行った。【０１３９】
上記再生培地は下記組成を用いて調製した。
0005898960.tif 000009
更に水を加えて全量を1Lとした。
上記組成を調製後（pH 5.5）、オートクレーブ滅菌を行った。【０１４０】
また、上記で用いたTrace elements solutionは下記組成を用いて調製した。
0005898960.tif 000010
更に水を加えて全量を1Lとした。
上記組成を調製後、オートクレーブ滅菌を行った。【０１４１】
（６）P450-1の機能解析および添加培養試験
1% (w/v)マルトースを含むYPD培地(1% (w/v) 酵母エキス(Yeast Extract)、2% (w/v) ペプトン、2% (w/v) デキストロース（Dextrose）)に、1/100容のピリピロペンＥの2 mg/mLジメチルスルホキシド溶液を添加した培地を培地Aとした。ツァペックドックス寒天培地に培養したAspergillus oryzae PP2-1の菌叢より分生子を採取し、滅菌水に懸濁した。
この分生子懸濁液を104 spore/mLに調製し、この調製した分生子懸濁液のうち100 μLを10 mLの培地Aに添加し、25℃で96時間振盪培養した。この培養液に10 mLのアセトンを添加し、よく混合した後、遠心濃縮器を用いてアセトンを留去した。これに10 mLの酢酸エチルを添加し、よく混合した後、酢酸エチル層のみを分取した。遠心濃縮器を用いて酢酸エチルを留去して得られた乾固物を1000 μLのメタノールに溶解した。これをサンプルとして用い、LC-MS(ウォーターズ社、Micromass ZQ、2996PDA、2695 Separation module、Column：Waters XTerra C18 (Φ4.5 x 50 mm、5 μm))、およびLC-NMR (Burker  Daltonik社製  Avance500)により分析した。【０１４２】
上記LC-MS測定の結果、得られた化合物はピリピロペンＥよりも16分子量増加した単一の化合物Aであることを確認した。また、LC-NMR測定の結果、この化合物AはピリピロペンＥの11位水酸化体であることを確認した。前記Cytochrome P450 monooxygenase（１）はピリピロペンＥを基質とし、ピリピロペンＥの11位を水酸化する酵素活性を有することを確認した。【０１４３】
前記化合物Aの物理化学的性状を下に示す。
1．マススペクトラム：ES-MS 468M/Z(M+H)+
2．分子式：C27H33NO6
3．HPLC：カラムWaters XTerra Column C18 (5 μm、4.6mm×50mm）、40℃、移動相20％アセトニトリル水から10分間で100% アセトニトリル（リニアグラジエント）、流速0.8ml/分、検出：UV323nmで保持時間  6.696分
4．1H -NMRスペクトル (CD3CN, 2H：3.134、3.157  H-11)
ピリピロペンＥおよび上記４に記載の1H -NMRスペクトルのチャートは、それぞれ、図８および図９に示される通りであった。【０１４４】
（７）P450-2の機能解析および添加培養試験
1% (w/v)マルトースを含むYPD培地(1% (w/v) 酵母エキス、2%(w/v) ペプトン、2%(w/v) デキストロース)に1/100容のピリピロペンＥの2mg/mLジメチルスルホキシド溶液を添加した培地を培地A、同じく1/100容のピリピロペンＯの2 mg/mLジメチルスルホキシド溶液を添加した培地を培地Bとした。ツァペックドックス寒天培地に培養したAspergillus oryzae PP3-2の菌叢より分生子を採取し、滅菌水に懸濁した。この分生子懸濁液を104 spore/mLに調製し、このうち500μLを50 mLの培地Aまたは培地Bに添加し、25℃で96時間振盪培養した。この培養液に50 mLのアセトンを添加し、よく混合した後、遠心濃縮器を用いてアセトンを留去した。これに50 mLの酢酸エチルを添加し、よく混合した後、酢酸エチル層のみを分取した。遠心濃縮器を用いて酢酸エチルを留去して得られた乾固物を1500μLのメタノールに溶解した。これをサンプルとし、LC-MS(ウォーターズ社製  Micromass ZQ、2996PDA、2695 Separation module、Column：Waters XTerra C18 (Φ4.5 x 50mm、5μm))およびLC-MNR(Burker  Daltonik社製  Avance500)で分析した。LC-MS測定の結果、培地Aから得られたサンプルから、ピリピロペンＥより32分子量の増加した化合物Bを検出した。また、培地Bから得られたサンプルから、ピリピロペンＯより32分子量の増加した化合物Cを検出した。さらに、LC-NMR測定の結果、化合物CはピリピロペンＯの7位および13位水酸化体であることが確認された。前記Cytochrome P450 monooxygenase（２）は、ピリピロペンＥまたはピリピロペンＯのそれぞれ7位および13位を水酸化する酵素活性を有することが確認された。【０１４５】
化合物Bの物理化学的性状を下に示す。
1．マススペクトラム：ES-MS 484M/Z(M+H)+
2．分子式：C27H33NO7
3．HPLC：カラムWaters XTerra Column C18 (5 μm、4.6mm×50mm）、40℃、移動相20％アセトニトリル水から10分間で100% アセトニトリル（リニアグラジエント）、流速0.8ml/分、検出：UV323nmで保持時間  5.614  分【０１４６】
化合物Cの物理化学的性状を下に示す。
1．マススペクトラム：ES-MS 542M/Z(M+H)+、
2．分子式：C29H35NO9
3．HPLC：カラムWaters XTerra Column C18 (5 μm、4.6mm×50mm）、40℃、移動相20％アセトニトリル水から10分間で100% アセトニトリル（リニアグラジエント）、流速0.8ml/分、検出：UV323nmで保持時間  5.165  分
4．1H -NMRスペクトル (CD3CN, 1H  4.858  H-13)、(CD3CN, 1H  3.65  H-7)
ピリピロペンＯおよび上記化合物Cの1H -NMRスペクトルのチャートは、それぞれ、図１０および図１１に示される通りであった。【０１４７】
（８）Prenyltransferaseの機能解析および添加培養試験
1% (w/v)マルトースを含むYPD培地(1% (w/v) 酵母エキス、2% (w/v) ペプトン、2% (w/v) デキストロース)に1/100容の化合物D（４−オキソ−６−（３−ピリジル）−α−ピロン、以下同じ）（参考例１参照）の2 mg/mLジメチルスルホキシド溶液を添加した培地を培地Cとした。ツァペックドックス寒天培地に培養したAspergillus oryzae ＰＰ６の菌叢より分生子を採取し、滅菌水に懸濁した。この分生子懸濁液を104 spore/mLに調整し、このうち200 μLを20 mLの培地Cに添加し、25°Cで96時間振盪培養した。この培養液に20 mLのアセトンを添加し、よく混合した後、遠心濃縮器を用いてアセトンを留去した。これに20 mLの酢酸エチルを添加し、よく混合した後、酢酸エチル層のみを分取した。遠心濃縮器を用いて酢酸エチルを留去して得られた乾固物を1,000 μLのメタノールに溶解した。これをサンプルとし、LC-MS (ウォーターズ社製  Micromass ZQ、2996PDA、2695 Separation module、Column; Waters XTerra C18 (Φ4.5 x 50 mm、5 μm))で分析した。【０１４８】
LC-MS測定の結果、化合物Dにファルネシル基が付加した化合物F（４−ヒドロキシ−６−（ピリジン−３−イル）−３−（（２Ｅ,６Ｅ）−３，７，１１−トリメチルドデカ−２，６，１０−トリエニル）−２Ｈ−ピラン−２−オン、以下同じ）を検出し、参考例２に記載の化合物FとLC-MS上での保持時間、分子イオンピーク、UV吸収の一致を確認した。
このことから、Prenyltransferaseは化合物Dにファルネシル基を付加するプレニルトランスフェラーゼ活性を有することが確認された。【０１４９】
（９）Acetyltransferase-1の機能解析および添加培養試験
1% (w/v)マルトースを含むYPD培地(1% (w/v) 酵母エキス、2% (w/v) ペプトン、2% (w/v) デキストロース)に1/100容のデアセチルピリピロペンＥ(参考例３参照)の2 mg/mLジメチルスルホキシド溶液を添加した培地を培地D、1/100容の11位デアセチルピリピロペンＯ（参考例４参照）の2 mg/mLジメチルスルホキシド溶液を添加した培地を培地E、７位デアセチルピリピロペンＡ(参考例５参照)の2 mg/mLジメチルスルホキシド溶液を添加した培地を培地Fとした。ツァペックドックス寒天培地に培養したAspergillus oryzae  ＰＰ７の菌叢より分生子を採取し、滅菌水に懸濁した。この分生子懸濁液を104 spore/mLに調整し、このうち200 μLを20 mLの培地D、培地E、または培地Fに添加し、25°Cで96時間振盪培養した。この培養液に20 mLのアセトンを添加し、よく混合した後、遠心濃縮器を用いてアセトンを留去した。これに20 mLの酢酸エチルを添加し、よく混合した後、酢酸エチル層のみを分取した。遠心濃縮器を用いて酢酸エチルを留去して得られた乾固物を1,000 μLのメタノールに溶解した。これをサンプルとし、LC-MS (ウォーターズ社製  Micromass ZQ、2996PDA、2695 Separation module、Column; Waters XTerra C18 (Φ4.5 x 50 mm、5 μm))で分析した。【０１５０】
LC-MS測定の結果、培地DからデアセチルピリピロペンＥよりも４２分子量増加した単一化合物を検出し、ピリピロペンＥ(参考例６参照)と保持時間、分子イオンピーク、UV吸収が一致することを確認した。一方、培地Eおよび培地Fからは新たに生成した化合物を検出しなかった。このことから、Acetyltransferase-1はデアセチルピリピロペンＥの1位を特異的にアセチル化するアセチル化酵素活性を有することが確認された。【０１５１】
（１０）Acetyltransferase-2の機能解析および添加培養試験
1% (w/v)マルトースを含むYPD培地(1% (w/v) 酵母エキス、2% (w/v) ペプトン、2% (w/v) デキストロース)に1/100容のデアセチルピリピロペンＥ(参考例３参照)の2 mg/mLジメチルスルホキシド溶液を添加した培地を培地D、1/100容の11位デアセチルピリピロペンＯ(参考例４参照)の2 mg/mLジメチルスルホキシド溶液を添加した培地を培地E、7位デアセチルピリピロペンＡ(参考例５参照)の2 mg/mLジメチルスルホキシド溶液を添加した培地を培地Fとした。ツァペックドックス寒天培地に培養したAspergillus oryzae ＰＰ９の菌叢より分生子を採取し、滅菌水に懸濁した。この分生子懸濁液を104 spore/mLに調整し、このうち200 μLを20 mLの培地D、培地Eまたは培地Fに添加し、25°Cで96時間振盪培養した。この培養液に20 mLのアセトンを添加し、よく混合した後、遠心濃縮器を用いてアセトンを留去した。これに20 mLの酢酸エチルを添加し、よく混合した後、酢酸エチル層のみを分取した。遠心濃縮器を用いて酢酸エチルを留去して得られた乾固物を1,000 μLのメタノールに溶解した。これをサンプルとし、LC-MS (ウォーターズ社製  Micromass ZQ、2996PDA、2695 Separation module、Column; Waters XTerra C18 (Φ4.5 x 50 mm、5 μm))で分析した。【０１５２】
LC-MS測定の結果、培地Eから11位デアセチルピリピロペンＯよりも４２分子量増加した単一化合物を検出し、ピリピロペンＯ（参考例７参照）と保持時間、分子イオンピーク、UV吸収が一致することを確認した。また、培地Fから7位デアセチルピリピロペンＡよりも４２分子量増加した単一化合物を検出し、ピリピロペンＡ（参考例８参照）と保持時間、分子イオンピーク、UV吸収が一致することを確認した。一方、培地Dからは新たに生成した化合物を検出しなかった。このことから、Acetyltransferase-2は11位デアセチルピリピロペンＯの11位および7位デアセチルピリピロペンＡの7位を特異的にアセチル化するアセチル化酵素活性を有することが確認された。【０１５３】
参考例１：化合物D（４−オキソ−６−（３−ピリジル）−α−ピロン）の合成 
前記化合物Dは、J. Org. Chem. 1983. 48. 3945. に記載の方法で取得した。【０１５４】
参考例２：化合物F（４−ヒドロキシ−６−（ピリジン−３−イル）−３−（（２Ｅ,６Ｅ）−３，７，１１−トリメチルドデカ−２，６，１０−トリエニル）−２Ｈ−ピラン−２−オン）の取得および構造解析
公開技法2008-500997号（特許文献３）に記載の方法で取得したピリピロペン類を含有する培養ブロスを酢酸ブチルで抽出した後、セライトを用いて濾過した。濾過時に用いたセライト(2.5 g)を取り出し、メタノール(30mL)を加えた。室温で23時間撹拌後、不溶物を濾過で取り除き、減圧下でメタノールを留去することで化合物F（191 ｍｇ）を得た。
ESI-MS；m/z 394 (M+H)+
1H-NMR (DMSO) δ(ppm) 1.48 (3H, s), 1.51 (3H, s), 1.55 (3H, s), 1.69 (3H, s), 1.85 (2H, t, J = 7.5 Hz), 1.91-1.95 (4H, m), 2.01 (2H, dt, J = 6.9, 6.9 Hz), 3.03 (2H, d, J = 7.1 Hz), 4.98 (1H, t, J = 7.0 Hz), 5.02 (1H, t, J = 6.9 Hz), 5.13 (1H, t, J = 7.0 Hz), 6.75 (1H, s), 7.54 (1H, dd, J = 4.8, 8.2 Hz), 8.09 (1H, ddd, J = 1.4, 1.9, 8.2 Hz), 8.66 (1H, dd, J = 1.4, 4.8 Hz), 8.91 (1H, d, J = 1.9 Hz)【０１５５】
参考例３：デアセチルピリピロペンＥの合成および構造解析
ピリピロペンＥ（29 mg）をメタノール-水（19:1、1 mL）に溶解して、炭酸カリウム（53 mg）を加えた。44時間撹拌した後、減圧下で溶媒を留去し、クロロホルム-メタノール（10:1）の混合溶媒を加えた。濾過により不溶物を取り除き、減圧下で溶媒を留去することで、粗生成物を得た。粗生成物を分取薄層クロマトグラフィー（Merck シリカゲル60F254 0.5mm、クロロホルム:メタノール=10:1）にて精製して、デアセチルピリピロペンＥ（18 ｍｇ）を得た。
ESI-MS；m/z 410 (M+H)+
1H-NMR (CDCL3) δ(ppm) 0.82 (3H, s), 0.92 (3H, s), 1.00-1.03 (1H, m), 1.04 (3H, s), 1.12 (1H, dt, J = 4.0, 13.2 Hz), 1.27 (3H, s), 1.41-1.53 (2H, m), 1.59-1.75 (3H, m), 1.80-1.84 (2H, m), 2.15 (1H, dt, J = 3.2, 12.4 Hz), 2.18-2.29 (1H, m), 2.54 (1H, dd, J = 3.2, 17.6 Hz), 3.25 (1H, dd, J = 4.4, 11.2 Hz), 6.43 (1H, s), 7.39 (1H, dd, J = 4.8, 8.0 Hz), 8.11 (1H, d, J = 8.0 Hz), 8.65 (1H, d, J = 4.8 Hz), 8.99 (1H, d, J = 1.6 Hz)【０１５６】
参考例４：１１位デアセチルピリピロペンＯの合成および構造解析
ピリピロペンＯ（30 mg）をメタノール-水（19:1、2 mL）に溶解して、炭酸カリウム（20 mg）を加えた。22時間撹拌した後、酢酸（0.1 ml）を加え、減圧下で溶媒を留去した。酢酸エチルと水を加え、酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下で溶媒を留去することで、1位、11位デアセチルピリピロペンＯの粗生成物（30 ｍｇ）を得た。
1位、11位デアセチルピリピロペンＯの粗生成物（23 ｍｇ）をN,N-ジメチルホルムアミド（0.4ｍL）に溶解してトリエチルアミン（8 mg）、無水酢酸(7 mg)を加えた。室温で23時間撹拌した後、水を加えて、酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧下で溶媒を留去することで、1位デアセチルピリピロペンＯの粗生成物（28 ｍｇ）を得た。
1位デアセチルピリピロペンＯの粗生成物（28 ｍｇ）をトルエンに溶解して、1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]-7-ウンデセン(20 mg)を加えた。70℃で20時間撹拌した後、放冷し、酢酸エチルと水を加え、酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧下で溶媒を留去することで、11位デアセチルピリピロペンＯの粗生成物（20 ｍｇ）を得た。
これをメタノールで溶解後サンプルとし、HPLC（SHIMADZU製LC−6AD,SPD-M20A PDA,CBM-20A, Column; Waters XTerra C18 (Φ4.5 x 50 mm、5 μm）で移動相30％ アセトニトリル水から25分で55％アセトニトリル水（リニアグラジエント）、流速1.0ml/分、保持時間18分から  19分を繰り返し分取し11位デアセチルピリピロペンＯ（4.0mg）を得た。
ESI-MS；m/z 468 (M+H) +
1H-NMR (CDCl3) δ(ppm); 0.68 (3H, s), 0.95 (3H, s), 1.21-2.21 (10H, m), 1.25 (3H, s), 2.05 (3H,s), 2.20 (1H, dd, J = 4.63, 17.3 Hz), 2.50 (1H, dd, J = 4.63, 17.3 Hz), 2.94 (1H, d, J = 12.5 Hz), 3.33 (1H, d, J = 12.5 Hz), 4.87 (1H, dd, J = 4.6, 12.2 Hz), 6.48 (1H, s), 7.57 (1H, dd, J = 5.1, 8.1 Hz), 8.29(1H, d, J = 8.3 Hz), 8.68 (1H, d, J = 4.6 Hz), 9.04 (1H, s)【０１５７】
参考例５：７位デアセチルピリピロペンＡの合成
7位デアセチルピリピロペンＡは、特開平8-259569号公報に記載の方法で合成された。【０１５８】
参考例６：ピリピロペンＥの取得
ピリピロペンＥは、特開平8-239385号公報に記載の方法で取得した。【０１５９】
参考例７：ピリピロペンＯの取得
ピリピロペンＯ は、J. Antibiot. 1996, 49, 292に記載の方法で取得した。【０１６０】
参考例８：ピリピロペンＡの合成
ピリピロペンＡは、ＷＯ９４／０９１４７号公報に記載の方法で取得した。
【受託番号】
【０１６１】
ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１３３
ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１３７
ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１４１
ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１２１８
ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１２１９
ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１２２０                          
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
0005898960000001.app