(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
２’，６’−ジクロロ−３’−フルオロアセトフェノン基質を生成物である（Ｓ）−１−（２，６−ジクロロ−３−フルオロフェニル）エタノールに立体選択的に還元することができる、野生型Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓケトレダクターゼに由来する、ケトレダクターゼポリペプチドであって、該ポリペプチドは、配列番号２、４または９８の１９０位のアミノ酸残基がプロリンに変更された参照配列と少なくとも９４％同一であるアミノ酸配列を含み、そして、該アミノ酸配列は、Ｘ１９０に対応する残基にプロリンを有し、かつ、Ｘ１９６に対応する残基にロイシン、メチオニン、フェニルアラニンまたはイソロイシンを有し、該アミノ酸配列は、Ｘ９４に対応する残基にアラニン、バリンまたはシステインを有し、該アミノ酸配列は、Ｘ２０６に対応する残基にメチオニンまたはチロシンを有するが、ただし、Ｘ１５３およびＸ１９９に対応する残基は修飾されておらず、該ポリペプチドは、２’，６’−ジクロロ−３’−フルオロアセトフェノン基質を生成物である（Ｓ）−１−（２，６−ジクロロ−３−フルオロフェニル）エタノールに、少なくとも９９％の立体異性体過剰率で立体選択的に還元することができ、そして、該ポリペプチドはさらに、配列番号６の配列を有するケトレダクターゼポリペプチドによって可能な率よりも少なくとも４５０％大きい率で該基質を該生成物に変換することが可能である、ケトレダクターゼポリペプチド。
【請求項２】
前記ポリペプチドが、配列番号１０、１４、１８、２２、２４、２８、３２、３６、３８、４０、４２、４４、４６、５６、５８、６０、６２、６４、６８、７０、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、および９４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
２’，６’−ジクロロ−３’−フルオロアセトフェノン基質を生成物である（Ｓ）−１−（２，６−ジクロロ−３−フルオロフェニル）エタノールに立体選択的に還元することができる、野生型Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓケトレダクターゼに由来する、ケトレダクターゼポリペプチドであって、該ポリペプチドは、配列番号２０、４８、５０および５２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項４】
次の特徴：
Ｘ７に対応する残基が、トレオニン、プロリン、トリプトファン、アルギニン、ヒスチジン、またはアスパラギンである；
Ｘ１６に対応する残基が、セリンである；
Ｘ４３に対応する残基が、イソロイシンである；
Ｘ９５に対応する残基が、イソロイシンまたはロイシンである；
Ｘ９６に対応する残基が、セリン、アスパラギン、トレオニンまたはグルタミン酸である；
Ｘ９７に対応する残基が、リジン、トレオニン、バリン、アルギニン、メチオニン、またはイソロイシンである；
Ｘ１２０に対応する残基が、フェニルアラニンまたはバリンである；
Ｘ１２５に対応する残基が、グリシンまたはセリンである；
Ｘ１４７に対応する残基が、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、またはグルタミンである；
Ｘ１５２に対応する残基が、セリン、トレオニン、またはメチオニンである；
Ｘ２０２に対応する残基が、アラニン、トリプトファン、チロシン、またはメチオニンである；および
Ｘ２０５に対応する残基が、アルギニンである、の１つ以上をさらに有するアミノ酸配列を含み；ならびに
前記アミノ酸配列が、前記参照配列と比較して他のアミノ酸残基に１つ以上の残基相違を有する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記ポリペプチドが、配列番号６の配列を有する前記ケトレダクターゼポリペプチドによって可能な率よりも少なくとも１５００％大きい率で前記基質を前記生成物に変換することがさらに可能であり、かつ
該ポリペプチドが、配列番号１８、３２、３６、３８、４０、４２、４４、４６、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、および９４から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６】
請求項１〜２および４〜５のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドは、配列番号９、１３、１７、２１、２３、２７、３１、３５、３７、３９、４１、４３、４５、５５、５７、５９、６１、６３、６７、６９、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、および９３から成る群より選択される、ポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項３に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドが、配列番号１９、４７、４９および５１からなる群より選択される、ポリヌクレオチド。
【請求項８】
宿主細胞での発現を導くのに好適な少なくとも１つの制御配列に操作可能に連結された請求項６または７に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【請求項９】
請求項８に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１０】
３’、４’、および５’位の１つ以上で置換された２’，６’置換アセトフェノン基質を対応する置換（Ｓ）−１−フェネタノールに立体選択的に還元するための方法であって、該基質を対応する（Ｓ）−アルコール生成物に立体選択的に還元または変換するのに好適な反応条件下で、該基質を請求項１〜２および４〜５のいずれか一項に記載のケトレダクターゼポリペプチドと接触させるステップを含み、該ケトレダクターゼポリペプチドが、配列番号１０、１４、１８、２２、２４、２８、３２、３６、３８、４０、４２、４４、４６、５６、５８、６０、６２、６４、６８、７０、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、および９４から選択されるアミノ酸配列を含む、方法。
【請求項１１】
３’、４’、および５’位の１つ以上で置換された２’，６’置換アセトフェノン基質を対応する置換（Ｓ）−１−フェネタノールに立体選択的に還元するための方法であって、該基質を対応する（Ｓ）−アルコール生成物に立体選択的に還元または変換するのに好適な反応条件下で、該基質を請求項３に記載のケトレダクターゼポリペプチドと接触させるステップを含み、該ケトレダクターゼポリペプチドが、配列番号２０、４８、５０および５２から選択されるアミノ酸配列を含む、方法。
【請求項１２】
前記基質が２’，６’−ジクロロ−３’フルオロアセトフェノンであり、前記対応する（Ｓ）−アルコール生成物が（Ｓ）−１−（２，６−ジクロロ−３−フルオロフェニル）エタノールであり、かつ、該（Ｓ）−１−（２，６−ジクロロ−３−フルオロフェニル）エタノールが９９％を超える立体異性体過剰率で形成される、
請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
構造式（ＶＩＩ）の化合物またはその塩、水和物、もしくは溶媒和物を生成するための方法であって、該方法は、好適な反応条件下で請求項１〜２および４〜５のいずれか一項に記載のケトレダクターゼポリペプチドを使用して、式（Ｉ）の化合物を式（ＩＩ）の化合物に還元または変換するステップを含み、該ケトレダクターゼポリペプチドが、配列番号１０、１４、１８、２２、２４、２８、３２、３６、３８、４０、４２、４４、４６、５６、５８、６０、６２、６４、６８、７０、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、および９４から選択されるアミノ酸配列を含む、方法。
【請求項１４】
構造式（ＶＩＩ）の化合物またはその塩、水和物、もしくは溶媒和物を生成するための方法であって、該方法は、好適な反応条件下で請求項３に記載のケトレダクターゼポリペプチドを使用して、式（Ｉ）の化合物を式（ＩＩ）の化合物に還元または変換するステップを含み、該ケトレダクターゼポリペプチドが、配列番号２０、４８、５０および５２から選択されるアミノ酸配列を含む、方法。
【請求項１５】
構造式（ＶＩＩＩ）の化合物またはその塩、水和物、もしくは溶媒和物を生成するための方法であって、該方法は、好適な反応条件下で請求項１〜２および４〜５のいずれか一項に記載のケトレダクターゼポリペプチドを使用して、式（Ｉ）の化合物を式（ＩＩ）の化合物に還元または変換するステップを含み、該ケトレダクターゼポリペプチドが、配列番号１０、１４、１８、２２、２４、２８、３２、３６、３８、４０、４２、４４、４６、５６、５８、６０、６２、６４、６８、７０、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、および９４から選択されるアミノ酸配列を含む、方法。
【請求項１６】
構造式（ＶＩＩＩ）の化合物またはその塩、水和物、もしくは溶媒和物を生成するための方法であって、該方法は、好適な反応条件下で請求項３に記載のケトレダクターゼポリペプチドを使用して、式（Ｉ）の化合物を式（ＩＩ）の化合物に還元または変換するステップを含み、該ケトレダクターゼポリペプチドが、配列番号２０、４８、５０および５２から選択されるアミノ酸配列を含む、方法。
【請求項１７】
３’，４’および５’位の１つ以上にて置換された２’，６’−置換アセトフェノン、および／または対応する置換（Ｓ）−１−フェネタノール、ならびに請求項１〜２および４〜５のいずれか一項に記載のケトレダクターゼを含む、組成物であって、その基質は、式（Ｉ）の２’，６’−ジクロロ−３’−フルオロアセトフェノンであり、および該対応する置換（Ｓ）−１−フェネタノールが式（ＩＩ）の（Ｓ）−１−（２，６−ジクロロ−３−フルオロフェニル）エタノールであり、該ケトレダクターゼポリペプチドが、配列番号１０、１４、１８、２２、２４、２８、３２、３６、３８、４０、４２、４４、４６、５６、５８、６０、６２、６４、６８、７０、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、および９４から選択されるアミノ酸配列を含む、組成物。
【請求項１８】
３’，４’および５’位の１つ以上にて置換された２’，６’−置換アセトフェノン、および／または対応する置換（Ｓ）−１−フェネタノール、ならびに請求項３に記載のケトレダクターゼを含む、組成物であって、その基質は、式（Ｉ）の２’，６’−ジクロロ−３’−フルオロアセトフェノンであり、および該対応する置換（Ｓ）−１−フェネタノールが式（ＩＩ）の（Ｓ）−１−（２，６−ジクロロ−３−フルオロフェニル）エタノールであり、該ケトレダクターゼポリペプチドが、配列番号２０、４８、５０および５２から選択されるアミノ酸配列を含む、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連する出願への相互参照
本願は、米国特許法§１１９（ｅ）のもとに、２００７年９月１３日に出願された出願番号第６０／９７２，０５８号の利益を主張し、出願番号第６０／９７２，０５８号の内容は、参考として本明細書中に援用される。
【０００２】
配列表、表またはコンピュータプログラムへの参照
米国特許法施行規則§１．８２１のもと、３７６２４７−０１７．ｔｘｔのファイル名でＥＦＳ−ＷＥＢを介してコンピュータ読み取り可能形態（ＣＲＦ）で、ここに同時に提出された配列表は、参考として本明細書中に援用される。配列表の電子コピーは、２１３キロバイトのファイルサイズで２００８年９月１３日に作成された。
【背景技術】
【０００３】
ケトレダクターゼ（ＫＲＥＤ）またはカルボニルレダクターゼクラス（ＥＣ１．１．１．１８４）に属する酵素は、対応するプロ立体異性ケトン基質からの、および対応するラセミアルデヒド基質の立体特異性還元による光学活性アルコールの合成に有用である。ＫＲＥＤは通例、ケトンおよびアルデヒド基質を対応するアルコール生成物に変換するが、多くは逆反応、すなわちアルコール基質の対応するケトン／アルデヒド生成物への酸化も触媒し得る。ＫＲＥＤなどの酵素によるケトンおよびアルデヒドの還元ならびにアルコールの酸化は、補因子、最も一般的には還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）または還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）、ならびに酸化反応のためのニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）を必要とする。ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨは電子供与体として作用するが、ＮＡＤおよびＮＡＤＰは電子受容体として作用する。ケトレダクターゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼは、（その酸化および還元状態で）ホスホリル化または非ホスホリル化補因子のどちらかを受容するが、両方は受容しないことが頻繁に観察される。
【０００４】
ＫＲＥＤ酵素は、広範な細菌および酵母に見出すことができる（総説については、非特許文献１；非特許文献２；および非特許文献３を参照）。いくつかのＫＲＥＤ遺伝子および酵素配列、例えば、Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｇｎｏｌｉａｅ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＪＣ７３３８；ＧＩ：１１３６０５３８）Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＢＡＡ２４５２８．１；ＧＩ：２８１５４０９）、Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ  ｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ１６０７９９；ＧＩ：６５３９７３４）が報告されている。
【０００５】
主要な化合物を生成するための多くの化学合成手順を回避するために、ケトレダクターゼは、各種のケトおよびアルデヒド基質のキラルアルコール生成物への酵素変換にますます利用されるようになっている。このような用途は、生体触媒によるケトンおよびアルデヒド還元のためにケトレダクターゼを発現する全細胞を利用できるか、または全細胞中の複数のケトレダクターゼの存在によって所望の生成物の立体純度および収率に悪影響を及ぼす例では精製酵素を使用できる。インビトロ用途では、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）、ギ酸デヒドロゲナーゼなどの補因子（ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ）再生酵素をケトレダクターゼと併せて使用する。有用な化学化合物を産生するためにケトレダクターゼを使用する例は、４−クロロアセトアセテートエステルの不斉還元（非特許文献４；非特許文献５；米国特許第５，５５９，０３０号；米国特許第５，７００，６７０号および米国特許第５，８９１，６８５号）、ジオキソカルボン酸の還元（例えば、米国特許第６，３９９，３３９号）、（Ｓ）クロロ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルノの還元（例えば、米国特許第６，６４５，７４６号および特許文献１）、ピロロトリアジン系化合物の還元（例えば、米国特許第２００６／０２８６６４６号）；置換アセトフェノンの還元（例えば、米国特許第６，８００，４７７）；およびケトチオランの還元（特許文献２）を含む。
【０００６】
各種のケト基質のその対応するキラルアルコール生成物への変換を実施するために使用可能である他のケトレダクターゼ酵素を同定することが望ましい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第０１／４０４５０号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２００５／０５４４９１号パンフレット
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｋｒａｕｓ  ａｎｄ  Ｗａｌｄｍａｎ，１９９５，Ｅｎｚｙｍｅ  ｃａｔａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  ｏｒｇａｎｉｃ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｖｏｌｓ．１＆２．ＶＣＨ  Ｗｅｉｎｈｅｉｍ
【非特許文献２】Ｆａｂｅｒ，Ｋ．，２０００，Ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｏｒｇａｎｉｃ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４ｔｈ  Ｅｄ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｂｅｒｌｉｎ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ
【非特許文献３】Ｈｕｍｍｅｌ  ａｎｄ  Ｋｕｌａ，１９８９，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８４：１−１３
【非特許文献４】Ｚｈｏｕ，１９８３，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０５：５９２５−５９２６
【非特許文献５】Ｓａｎｔａｎｉｅｌｌｏ，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．（Ｓ）１９８４：１３２−１３３
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本開示は、所定のケト基質をその対応するアルコール生成物に立体選択的に還元することと、Ｌ．ｋｅｆｉｒ（配列番号４）もしくはＬ．ｂｒｅｖｉｓ（配列番号２）もしくはＬ．ｍｉｎｏｒ（配列番号９８）より得た天然に存在する野生型ＫＲＥＤ酵素と比較したとき、または他の改変ケトレダクターゼ酵素と比較したとき、改良された特性を有することとが可能である、改変ケトレダクターゼ（「ＫＲＥＤ」）酵素を提供する。本開示では、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種由来の天然に存在するケトレダクターゼが化合物アセトフェノンを（Ｒ）−１−フェネタノールに還元することが示されている。野生型酵素はアセトフェノンのその対応する（Ｒ）−アルコールへの変換について一般に選択的であるため、これらの天然に存在する酵素は（Ｒ）−選択性ケトレダクターゼ、すなわち（Ｒ）−ケトレダクターゼである。置換アセトフェノン、例えば、２’，６’−ジクロロ−３’−フルオロアセトフェノンでは、このような野生型Ｌ．ｋｅｆｉｒまたはＬ．ｂｒｅｖｉｓまたはＬ．ｍｉｎｏｒケトレダクターゼ酵素は、置換アセトフェノン基質に対して、存在するとしてもわずかな活性を示す。しかし、野生型Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種ケトレダクターゼに由来する本開示の改変ケトレダクターゼ酵素は、アセトフェノンを（Ｓ）−１−フェネタノールに還元することができる。それゆえ、本明細書に記載するケトレダクターゼは、アセトフェノンの還元では野生型Ｌ．ｋｅｆｉｒまたはＬ．ｂｒｅｖｉｓまたはＬ．ｍｉｎｏｒケトレダクターゼと比較して、逆のエナンチオ選択性を特徴とする。したがって、開示のこのようなポリペプチドは、（Ｓ）−選択性ケトレダクターゼ、すなわち（Ｓ）−ケトレダクターゼと呼ばれる。逆のエナンチオ選択性は、野生型ケトレダクターゼ酵素の１９０位の残基（すなわちＸ１９０）をチロシンでない残基に、好ましくは非芳香族残基に、特にプロリン残基に変異させることに基づいている。
【００１０】
さらに、本明細書に記載した改変酵素は、変更された立体選択性に加えて、１つ以上の改良された特性を有することができる。例えば、改変ケトレダクターゼポリペプチドは、基質を生成物に還元するための野生型ケトレダクターゼ酵素と比較して酵素活性の上昇を有することが可能である、および／または（Ｓ）エナンチオマーに対する立体選択性をさらに上昇させる。酵素特性の改良は特に、熱安定性、溶媒安定性の向上、または生成物阻害の低下も含み得る。本明細書でさらに開示するように、野生型ケトレダクターゼは置換アセトフェノンの還元でわずかな活性を示すが、開示は、置換アセトフェノンの２’，６’−ジクロロ−３’−フルオロアセトフェノンを（Ｓ）−１−［２，６−ジクロロ−３−フルオロフェニル］−エタノールに還元または変換することができるケトレダクターゼを提供する。
【００１１】
したがって、いくつかの実施形態において、本開示は、配列番号２、４または９８のＸ１９０に対応する残基にチロシンでない残基を有するケトレダクターゼポリペプチドに関する。いくつかの実施形態において、この残基は非芳香族残基、例えば、脂肪族、拘束された、非極性、またはシステイン残基である。いくつかの実施形態において、本残基はプロリンである。
【００１２】
Ｘ１９０に対応する残基での特徴に加えて、ケトレダクターゼは、配列番号２、４、または９８の配列と比較して他の残基位置に１つ以上の残基相違を有することができる。いくつかの実施形態において、本明細書のケトレダクターゼポリペプチドは、Ｘ１９０に対応する残基に脂肪族、拘束された、非極性、またはシステイン残基、特にアラニン、イソロイシン、システイン、またはプロリンを含む非芳香族残基を有する、配列番号２、４または９８に基づく参照配列と比較して少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含むが、但し、そのケトレダクターゼポリペプチドがＸ１９０に対応する残基にチロシン以外、特に非芳香族残基である残基を有することを条件とする。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、Ｘ１９０に対応する残基が脂肪族、拘束された、非極性、またはシステイン残基であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、Ｘ１９０に対応する残基がアラニン、イソロイシン、システイン、またはプロリン、特にプロリンであるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、これらの残基相違は、基質に対する酵素活性の上昇などの改良された特性を生じる。改良された特性は野生型ケトレダクターゼ酵素に関連または改変ケトレダクターゼ酵素に関連し得る。例えば、いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼ酵素の改良は、測定可能な活性によって９９％を超える立体異性体過剰率で基質を生成物に変換することが可能であり、したがって野生型Ｌ．ｋｅｆｉｒまたはＬ．ｂｒｅｖｉｓまたはＬ．ｍｉｎｏｒケトレダクターゼと比較して改良された、配列番号６に対応するアミノ酸配列を有する改変酵素の特性と比較される。１つ以上の改良された酵素特性を生じ得る各種の残基相違は、詳細に説明される。いくつかの実施形態において、これらの改変ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号９５、９６および１１９（または残基９０〜２１１などのその領域）に配列された配列式に基づく。
【００１３】
いくつかの実施形態において、本開示のケトレダクターゼポリペプチドは、２’，６’−ジクロロ−３’−フルオロアセトフェノンを（Ｓ）−１−［２，６−ジクロロ−３−フルオロフェニル］−エタノールに、９９％を超える立体異性体過剰率で、配列番号６を有するケトレダクターゼポリペプチドよりも改良された率で変換することができる。酵素活性に関して配列番号６よりも改良されている例示的なポリペプチドは、これに限定されるわけではないが、配列番号８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、および９４に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【００１４】
いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、２’，６’−ジクロロ−３’−フルオロアセトフェノンを（Ｓ）−１−［２，６−ジクロロ−３−フルオロフェニル］−エタノールに、９９％を超える立体異性体過剰率で、配列番号６を有するケトレダクターゼポリペプチドよりも改良された率で変換することができ、ポリペプチドは、配列番号６の配列を有するポリペプチドと比較して改良された熱安定性も有する。このような改良を有する例示的なポリペプチドは、これに限定されるわけではないが、配列番号８、１６、１８、２０、２２、２６、２８、３０、３２、３４、３８、４０、４２、４４、４６、５４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、および９４に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【００１５】
いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、２’，６’−ジクロロ−３’−フルオロアセトフェノンを（Ｓ）−１−［２，６−ジクロロ−３−フルオロフェニル］−エタノールに、９９％を超える立体異性体過剰率で、配列番号６を有するケトレダクターゼポリペプチドよりも少なくとも約４５０％大きい率で変換することができる。このような改良が可能である例示的なポリペプチドは、これに限定されるわけではないが、配列番号８、１０、１４、１６、１８、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、および９４に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【００１６】
いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、２’，６’−ジクロロ−３’−フルオロアセトフェノンを（Ｓ）−１−［２，６−ジクロロ−３−フルオロフェニル］−エタノールに、９９％を超える立体異性体過剰率で、配列番号６を有するケトレダクターゼポリペプチドよりも少なくとも約４５０％大きい率で変換することができ、ポリペプチドは、配列番号６の配列を有するポリペプチドと比較して改良された熱安定性も有する。このような特性を有する例示的なポリペプチドは、これに限定されるわけではないが、配列番号８、１６、１８、２２、２６、２８、３０、３２、３４、３８、４０、４２、４４、４６、５４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、および９４に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【００１７】
いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、２’，６’−ジクロロ−３’−フルオロアセトフェノンを（Ｓ）−１−［２，６−ジクロロ−３−フルオロフェニル］−エタノールに、９９％を超える立体異性体過剰率で、配列番号６を有するケトレダクターゼポリペプチドよりも少なくとも約１５００％大きい率で変換することができる。このような改良が可能である例示的なポリペプチドは、これに限定されるわけではないが、配列番号１８、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、および９４に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【００１８】
いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、２’，６’−ジクロロ−３’−フルオロアセトフェノンを（Ｓ）−１−［２，６−ジクロロ−３−フルオロフェニル］−エタノールに、９９％を超える立体異性体過剰率で、配列番号６を有するケトレダクターゼポリペプチドよりも少なくとも約１５００％大きい率で変換することができ、ポリペプチドは、配列番号６の配列を有するポリペプチドと比較して改良された熱安定性も有する。このような特性を有する例示的なポリペプチドは、これに限定されるわけではないが、配列番号１８、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、および９４に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【００１９】
いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、２’，６’−ジクロロ−３’−フルオロアセトフェノン基質の量に対して約１重量％未満の量のポリペプチドを用いて実施するとき、約２４時間未満で２’，６’−ジクロロ−３’−フルオロアセトフェノンの少なくとも約９５％を（Ｓ）−１−［２，６−ジクロロ−３−フルオロフェニル］−エタノールに少なくとも約９９％の立体異性体過剰率で変換することができる。この能力を有する例示的なポリペプチドは、これに限定されるわけではないが、１８、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、および９４に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【００２０】
いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、２’，６’−ジクロロ−３’−フルオロアセトフェノンを（Ｓ）−１−［２，６−ジクロロ−３−フルオロフェニル］−エタノールに、９９％を超える立体異性体過剰率で、配列番号６を有するケトレダクターゼポリペプチドよりも少なくとも約４５０％大きい率で変換することができ、ポリペプチドは５０℃で２時間の熱処理の後に、配列番号１６の配列を有するポリペプチドよりも少なくとも約４００％大きい率で基質を生成物に変換することもできる（配列番号１６のポリペプチドも同じ熱処理によって処理された場合）。このような特性を有する例示的なポリペプチドは、これに限定されるわけではないが、配列番号１８、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、および９４に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【００２１】
いくつかの実施形態において、２’，６’−ジクロロ−３’−フルオロアセトフェノンを（Ｓ）−１−［２，６−ジクロロ−３−フルオロフェニル］−エタノールに変換できる改良されたケトレダクターゼポリペプチドは、Ｘ１９０に対応する残基に脂肪族、拘束、非極性、またはシステイン残基、特にアラニン、イソロイシン、システイン、またはプロリンを含む非芳香族残基を有する、配列番号２、４または９８に基づく参照配列の残基９０〜２１１に対応する領域またはドメインと少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を有する領域またはドメインを含むが、但し、そのケトレダクターゼポリペプチド領域またはドメインがＸ１９０に対応する残基にチロシン以外の残基を有することを条件とする。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、Ｘ１９０に対応する残基が非芳香族残基である参照配列の残基９０〜２１１に対応する領域またはドメインを有する。いくつかの実施形態において、Ｘ１９０に対応するこの残基は、脂肪族、拘束された、非極性、またはシステイン残基であり得る。いくつかの実施形態において、Ｘ１９０に対応する残基は、アラニン、イソロイシン、システイン、またはプロリン、特にプロリンであり得る。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、参照配列と比較してドメインまたは領域に１つ以上の残基相違を有することができる。参照配列と異なり得る各種の残基位置について詳細な説明を与える。
【００２２】
別の態様において、本開示は、本明細書に記載した改変ケトレダクターゼをコードするポリヌクレオチドまたは高ストリンジェント条件でこのようなポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドは、プロモータおよびコードされた改変ケトレダクターゼに有用な他の制御要素を含むことができ、特定の所望の発現系に対して最適化されたコドンを利用できる。改変ケトレダクターゼをコードする例示的なポリヌクレオチドは、これに限定されるわけではないが、配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、および９３に対応する配列を含むポリヌクレオチドを含む。
【００２３】
別の態様において、本開示は、本明細書に記載するポリヌクレオチドおよび／または発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。宿主細胞はＬ．ｋｅｆｉｒもしくはＬ．ｂｒｅｖｉｓであり得るか、またはそれらは異なる生物であり得る。宿主細胞は本明細書に記載する改変ケトレダクターゼ酵素の発現および単離に使用できるか、またはそれらは式（Ｉ）もしくは（ＩＩＩ）の置換アセトフェノン基質の、式（ＩＩ）もしくは（ＩＶ）の対応する（Ｓ）−アルコール生成物への変換にそれぞれ直接使用できる。
【００２４】
全細胞、細胞抽出物または精製ケトレダクターゼ酵素を用いて方法を実施するかにかかわらず、単一のケトレダクターゼ酵素が使用され得るか、または２つ以上のケトレダクターゼ酵素の混合物が使用され得る。
【００２５】
上記のように、本明細書に記載するケトレダクターゼは、３’、４’、および５’位の１つ以上において場合により置換可能である２’，６’−置換アセトフェノンの、対応する（Ｓ）−アルコール生成物への還元反応を触媒できる。
【００２６】
いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼ酵素は、構造式（Ｉ）のケトン、２’，６’−ジクロロ−３’−フルオロアセトフェノンを
【００２７】
【化１】
0005973131.tif 000002
構造式（ＩＩ）の対応するキラルアルコール生成物、（Ｓ）−１−［２，６−ジクロロ−３−フルオロフェニル］−エタノールに還元または変換することができる。
【００２８】
【化２】
0005973131.tif 000003
いくつかの実施形態において、本明細書に記載するケトレダクターゼ酵素は、３’、４’、および５’位の１つ以上で場合により置換された構造式（ＩＩＩ）の２’，６’−置換アセトフェノン化合物
【００２９】
【化３】
0005973131.tif 000004
（式中、ＹおよびＺは、ＣＨ３、ＣＦ３、ＮＨ２、ＯＨ、ＯＣＨ３、Ｃｌ、およびＢｒより独立して選択される）の、構造式（ＩＶ）の対応するキラルアルコール生成物への還元を触媒できる。
【００３０】
【化４】
0005973131.tif 000005
したがって、いくつかの実施形態において、本開示は、３’、４’、および５’位の１つ以上で場合により置換された２’，６’置換アセトフェノン基質を対応する置換（Ｓ）−フェネタノールに還元する方法を提供し、該方法は、基質を対応する置換（Ｓ）−フェネタノールに還元または変換するのに好適な反応条件下で、基質を本明細書に記載するケトレダクターゼと接触させるステップを含む。本方法のいくつかの実施形態において、基質は約２５％、５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または９９．９％を超える立体異性体過剰率で生成物に還元される。
【００３１】
いくつかの実施形態において、本開示は、式（ＩＩＩ）の２’，６’置換アセトフェノンを式（ＩＶ）の対応する置換（Ｓ）−フェネタノールに還元する方法を提供し、該方法は、式（ＩＩＩ）の基質を式（ＩＶ）の対応する置換（Ｓ）−フェネタノール生成物に還元または変換するのに好適な反応条件下で、基質を本明細書に記載するケトレダクターゼと接触させるステップを含む。本方法のいくつかの実施形態において、基質は約２５％、５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または９９．９％を超える立体異性体過剰率で生成物に還元される。
【００３２】
いくつかの実施形態において、本開示は、式（Ｉ）の２’，６’−ジクロロ−３’−フルオロアセトフェノン基質を式（ＩＩ）のその対応する（Ｓ）−アルコール生成物、（Ｓ）−１−［２，６−ジクロロ−３−フルオロフェニル］−エタノールに還元する方法を提供し、該方法は、２’，６’−ジクロロ−３’−フルオロアセトフェノンを（Ｓ）−１−［２，６−ジクロロ−３−フルオロフェニル］−エタノールに還元または変換するのに好適な反応条件下で、２’，６’−ジクロロ−３’−フルオロアセトフェノンを本明細書に記載するケトレダクターゼと接触またはインキュベートするステップを含む。本方法のいくつかの実施形態において、基質は約８５％、９０％、９５％、９９％、または９９．９％を超える立体異性体過剰率で生成物に還元される。いくつかの実施形態において、基質は約８５％を超える立体異性体過剰率で生成物に還元され、ケトレダクターゼポリペプチドは配列番号９５、９６または１１９の配列式に基づくアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、基質は約９９％を超える立体異性体過剰率で生成物に還元され、該方法に使用されるケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、および９４に対応するアミノ酸配列を含む。
【００３３】
この方法のいくつかの実施形態において、方法が２’，６’−ジクロロ−３’−フルオロアセトフェノン基質の量に対して約１重量％未満の量でケトレダクターゼポリペプチドを用いて実施されるとき、基質の少なくとも約９５％が２４時間未満で約９９％を超える立体異性体過剰率で生成物に還元され、ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号１８、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、および９４に対応するアミノ酸配列を含む。
【００３４】
いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書に記載するケトレダクターゼならびに３’，４’または５’位の１つ以上にて場合により置換された２，６置換アセトフェノン、および／または対応する置換（Ｓ）−フェネタノールの組成物を提供する。いくつかの実施形態において、組成物は本明細書に記載するケトレダクターゼならびに式（Ｉ）の化合物および／または式（ＩＩ）の化合物を含む。いくつかの実施形態において、組成物は本明細書に記載するケトレダクターゼならびに式（ＩＩＩ）の化合物および／または式（ＩＶ）の化合物を含む。いくつかの実施形態において、組成物は本明細書に記載するケトレダクターゼ、ならびに式（Ｖ）の化合物および／または式（ＶＩ）の化合物を含む。いくつかの実施形態において、組成物は補因子再成系をさらに含むことができる。
【００３５】
いくつかの実施形態において、本開示は、ＷＯ０６０２１８８６、ＷＯ０６０２１８８４、ＷＯ０６０２１８８１、およびＷＯ０４０７６４１２に記載されたタンパク質キナーゼ阻害薬の合成での改変ケトレダクターゼの使用に関する。いくつかの実施形態において、プロテインキナーゼ阻害薬の合成方法において、方法のステップは、基質である式（Ｉ）の２’，６’−ジクロロ−３’−フルオロアセトフェノンを本開示のケトレダクターゼを用いて、式（ＩＩ）のその対応する（Ｓ）−アルコール生成物、（Ｓ）−１−［２，６−ジクロロ−３−フルオロフェニル］−エタノールに還元または変換することを含むことができる。
したがって、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
２’，６’−ジクロロ−３’−フルオロアセトフェノン基質を（Ｓ）−１−（２，６−ジクロロ−３−フルオロフェニル）エタノールに少なくとも約８５％の立体異性体過剰率で立体選択的に還元することができるケトレダクターゼポリペプチド。
（項目２）
Ｘ１９０に対応する残基にプロリンを有する配列番号２、４または９８に基づく参照配列と少なくとも約８５％同一であるアミノ酸配列を含むが、但し、ケトレダクターゼアミノ酸配列がＸ１９０に対応する残基に非芳香族残基を有することを条件とする、項目１に記載のポリペプチド。
（項目３）
上記ケトレダクターゼアミノ酸配列が、Ｘ１９０に対応する残基に脂肪族、非極性、拘束された、またはシステイン残基を有する、項目２に記載のポリペプチド。
（項目４）
上記ケトレダクターゼアミノ酸配列が、Ｘ１９０に対応する残基にプロリンを有する、項目２に記載のポリペプチド。
（項目５）
上記ケトレダクターゼが、次の特徴：
Ｘ７に対応する残基が、芳香族、非極性、極性、拘束された、または塩基性残基である；
Ｘ１６に対応する残基が、極性残基である；
Ｘ４３に対応する残基が、非極性または極性残基である；
Ｘ６０に対応する残基が、芳香族または非極性、または脂肪族残基である；
Ｘ９４に対応する残基が、システイン、非極性または脂肪族残基である；
Ｘ９５に対応する残基が、非極性または脂肪族残基である；
Ｘ９６に対応する残基が、極性または酸性残基である；
Ｘ９７に対応する残基が、極性、非極性、脂肪族、または塩基性残基である；
Ｘ１２０に対応する残基が、芳香族、非極性または脂肪族残基である；
Ｘ１２５に対応する残基が、極性または非極性残基である；
Ｘ１４２に対応する残基が、極性残基、特にセリンまたはアスパラギンである；
Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、極性、非極性、または脂肪族残基である；
Ｘ１４９に対応する残基が、非極性または芳香族残基である；
Ｘ１５０に対応する残基が、拘束されたまたは酸性残基である；
Ｘ１５２に対応する残基が、非極性または極性残基である；
Ｘ１９６に対応する残基が、脂肪族、非極性、または芳香族残基である；
Ｘ２０２に対応する残基が、脂肪族、芳香族、または非極性残基である；
Ｘ２０５に対応する残基が、塩基性、非極性または脂肪族残基である；
Ｘ２０６に対応する残基が、非極性または芳香族残基である、の１つ以上をさらに有するアミノ酸配列を含み；ならびに
上記アミノ酸配列が、上記参照配列と比較して他のアミノ酸残基に１つ以上の残基相違を場合により有する、項目２に記載のポリペプチド。
（項目６）
次の特徴：
Ｘ７に対応する残基が、トレオニン、プロリン、トリプトファン、アルギニン、ヒスチジン、またはアスパラギンである；
Ｘ１６に対応する残基が、セリンである；
Ｘ４３に対応する残基が、イソロイシンである；
Ｘ６０に対応する残基が、アラニンである；
Ｘ９４に対応する残基が、アラニン、バリンまたはシステインである；
Ｘ９５に対応する残基が、イソロイシンまたはロイシンである；
Ｘ９６に対応する残基が、セリン、アスパラギン、トレオニンまたはグルタミン酸である；
Ｘ９７に対応する残基が、リジン、トレオニン、バリン、アルギニン、メチオニン、またはイソロイシンである；
Ｘ１２０に対応する残基が、フェニルアラニンまたはバリンである；
Ｘ１２５に対応する残基が、グリシンまたはセリンである；
Ｘ１４２に対応する残基が、アスパラギンである；
Ｘ１４７に対応する残基が、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、またはグルタミンである；
Ｘ１４９に対応する残基が、グリシンまたはフェニルアラニンである；
Ｘ１５０に対応する残基が、アスパラギン酸またはヒスチジンである；
Ｘ１５２に対応する残基が、セリン、トレオニン、またはメチオニンである；
Ｘ１９６に対応する残基が、バリン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、またはイソロイシンである；
Ｘ２０２に対応する残基が、アラニン、トリプトファン、チロシン、またはメチオニンである；
Ｘ２０５に対応する残基が、アルギニンである；および
Ｘ２０６に対応する残基が、メチオニンまたはチロシンである、の１つ以上をさらに有するアミノ酸配列を含み；ならびに
上記アミノ酸配列が、上記参照配列と比較して他のアミノ酸残基に１つ以上の残基相違を場合により有する、項目２に記載のポリペプチド。
（項目７）
次の特徴：
Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、極性、非極性、または脂肪族残基である；および
Ｘ２０２に対応する残基が、脂肪族、芳香族、または非極性残基である、の１つ以上を有するアミノ酸配列を含み；ならびに
上記アミノ酸配列が、上記参照配列と比較して他のアミノ酸残基に１つ以上の残基相違を場合により有する、項目２に記載のポリペプチド。
（項目８）
次の特徴：
Ｘ７に対応する残基が、芳香族、非極性、極性、拘束された、または塩基性残基である；
Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、極性、非極性、または脂肪族残基である；および
Ｘ２０２に対応する残基が、脂肪族、芳香族、または非極性残基である、の１つ以上を有するアミノ酸配列を含み；ならびに
上記アミノ酸配列が、上記参照配列と比較して他のアミノ酸残基に１つ以上の残基相違を場合により有する、項目２に記載のポリペプチド。
（項目９）
次の特徴：
Ｘ７に対応する残基が、芳香族、非極性、極性、拘束された、または塩基性残基である；
Ｘ９７に対応する残基が、極性、非極性、脂肪族、または塩基性残基である；および
Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、極性、非極性、または脂肪族残基である；
Ｘ２０２に対応する残基が、脂肪族、芳香族、または非極性残基である、の１つ以上を有するアミノ酸配列を含み；ならびに
上記アミノ酸配列が、上記参照配列と比較して他のアミノ酸残基に１つ以上の残基相違を場合により有する、項目２に記載のポリペプチド。
（項目１０）
次の特徴：
Ｘ９４に対応する残基が、システイン、非極性または脂肪族残基である；
Ｘ９６に対応する残基が、極性または酸性残基である；
Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、極性、非極性、または脂肪族残基；
特にグルタミン、イソロイシン、またはロイシンである、の１つ以上を有するアミノ酸配列を含み；ならびに
上記アミノ酸配列が、上記参照配列と比較して他のアミノ酸残基に１つ以上の残基相違を場合により有する、項目２に記載のポリペプチド。
（項目１１）
次の特徴：
Ｘ７に対応する残基が、芳香族、非極性、極性、拘束された、または塩基性残基である；
Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、極性、非極性、または脂肪族残基である；
Ｘ１９６に対応する残基が、脂肪族、非極性、または芳香族残基である；
Ｘ２０２に対応する残基が、脂肪族、芳香族、または非極性残基である、の１つ以上を有するアミノ酸配列を含み；ならびに
上記アミノ酸配列が、上記参照配列と比較して他のアミノ酸残基に１つ以上の残基相違を場合により有する、項目２に記載のポリペプチド。
（項目１２）
次の特徴：
Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、極性、非極性、または脂肪族残基である；
Ｘ１９６に対応する残基が、脂肪族、非極性、または芳香族残基である；
Ｘ２０２に対応する残基が、脂肪族、芳香族、または非極性残基である、の１つ以上を有するアミノ酸配列を含み；ならびに
上記アミノ酸配列が、上記参照配列と比較して他のアミノ酸残基に１つ以上の残基相違を場合により有する、項目２に記載のポリペプチド。
（項目１３）
上記立体異性体過剰率が少なくとも約９０％である、項目１に記載のポリペプチド。
（項目１４）
上記立体異性体過剰率が少なくとも約９９％である、項目１に記載のポリペプチド。
（項目１５）
配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、および９４から選択されるアミノ酸配列を含む、項目１４に記載のポリペプチド。
（項目１６）
上記ポリペプチドが、配列番号６の配列を有する上記ケトレダクターゼポリペプチドによって可能な率よりも高い率で基質を生成物に還元することがさらに可能である、項目１に記載のポリペプチド。
（項目１７）
配列番号８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、および９４から選択されるアミノ酸配列を含む、項目１６に記載のポリペプチド。
（項目１８）
上記ポリペプチドが、配列番号６の配列を有する上記ケトレダクターゼポリペプチドによって可能な率よりも少なくとも約４５０％大きい率で基質を生成物に還元することがさらに可能である、項目４に記載のポリペプチド。
（項目１９）
配列番号８、１０、１４、１６、１８、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、および９４から選択されるアミノ酸配列を含む、項目１８に記載のポリペプチド。
（項目２０）
上記ポリペプチドが、配列番号６の配列を有する上記ケトレダクターゼポリペプチドによって可能な率よりも少なくとも約１５００％大きい率で基質を生成物に還元することがさらに可能である、項目４に記載のポリペプチド。
（項目２１）
配列番号１８、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、および９４から選択されるアミノ酸配列を含む、項目２１に記載のポリペプチド。
（項目２２）
２’，６’−ジクロロ−３’−フルオロアセトフェノン基質の量に対して約１重量％未満の量のポリペプチドを用いて実施するとき、約２４時間未満で２’，６’−ジクロロ−３’−フルオロアセトフェノン基質の少なくとも約９５％を（Ｓ）−１−（２，６−ジクロロ−３−フルオロフェニル）エタノールに変換することができる、項目４に記載のポリペプチド。
（項目２３）
配列番号１８、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、および９４から選択されるアミノ酸配列を含む、項目２２に記載のポリペプチド。
（項目２４）
ケトレダクターゼポリペプチドであって、Ｘ１９０に対応する残基にプロリンを有する配列番号２、４または９８に基づく参照配列の残基９０〜２１１と少なくとも約８５％同一であるアミノ酸配列を有するドメインを含むが、但し、ケトレダクターゼポリペプチドアミノ酸配列がＸ１９０に対応する残基に非芳香族残基を有することを条件とする、ケトレダクターゼポリペプチド。
（項目２５）
上記ケトレダクターゼドメインは、Ｘ１９０に対応する残基が脂肪族、非極性、拘束された、またはシステイン残基であるアミノ酸配列を含む、項目２４に記載にポリペプチド。
（項目２６）
上記ケトレダクターゼドメインは、Ｘ１９０に対応する残基がプロリンであるアミノ酸配列を含む、項目２４に記載にポリペプチド。
（項目２７）
上記ケトレダクターゼポリペプチドドメインが、次の特徴：
Ｘ９４に対応する残基が、システイン、非極性または脂肪族残基である；
Ｘ９５に対応する残基が、非極性または脂肪族残基である；
Ｘ９６に対応する残基が、極性または酸性残基である；
Ｘ９７に対応する残基が、極性、非極性、脂肪族、または塩基性残基である；
Ｘ１２０に対応する残基が、芳香族、非極性、または脂肪族残基である；
Ｘ１２５に対応する残基が、極性または非極性残基である；
Ｘ１４２に対応する残基が、極性残基、特にセリンまたはアスパラギンである；
Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、極性、非極性、または脂肪族残基である；
Ｘ１４９に対応する残基が、非極性または芳香族残基である；
Ｘ１５０に対応する残基が、拘束されたまたは酸性残基である；
Ｘ１５２に対応する残基が、非極性または極性残基である；
Ｘ１９６に対応する残基が、脂肪族、非極性、または芳香族残基である；
Ｘ２０２に対応する残基が、脂肪族、芳香族、または非極性残基である；
Ｘ２０５に対応する残基が、塩基性、非極性または脂肪族残基である；
Ｘ２０６に対応する残基が、非極性または芳香族残基である、の１つ以上を有するアミノ酸配列を含み；ならびに
上記アミノ酸配列が、上記参照配列と比較して残基９０〜２１１に対応するドメイン内の他のアミノ酸残基に１つ以上の相違を場合により有し得る、項目２４に記載のポリペプチド。
（項目２８）
残基９０〜２１１に対応する上記ケトレダクターゼポリペプチドドメインが、次の特徴：
Ｘ９４に対応する残基が、アラニン、バリンまたはシステインである；
Ｘ９５に対応する残基が、イソロイシンまたはロイシンである；
Ｘ９６に対応する残基が、セリン、アスパラギン、トレオニンまたはグルタミン酸である；
Ｘ９７に対応する残基が、リジン、トレオニン、バリン、アルギニン、メチオニン、またはイソロイシンである；
Ｘ１２０に対応する残基が、フェニルアラニンまたはバリンである；
Ｘ１２５に対応する残基が、グリシンまたはセリンである；
Ｘ１４２に対応する残基が、アスパラギンである；
Ｘ１４７に対応する残基が、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、またはグルタミンである；
Ｘ１４９に対応する残基が、グリシンまたはフェニルアラニンである；
Ｘ１５０に対応する残基が、アスパラギン酸またはヒスチジンである；
Ｘ１５２に対応する残基が、セリン、トレオニン、またはメチオニンである；
Ｘ１９０に対応する残基が、アラニン、イソロイシン、システイン、またはプロリンである；
Ｘ１９６に対応する残基が、バリン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、またはイソロイシンである；
Ｘ２０２に対応する残基が、アラニン、トリプトファン、チロシン、またはメチオニンである；
Ｘ２０６に対応する残基が、メチオニンまたはチロシンである、の１つ以上を有するアミノ酸配列を含み；ならびに
上記アミノ酸配列が、上記参照配列と比較して残基９０〜２１１に対応するドメイン内の他のアミノ酸残基に１つ以上の相違を場合により有し得る、項目２４に記載のポリペプチド。
（項目２９）
残基９０〜２１１に対応する上記ケトレダクターゼポリペプチドドメインが、次の特徴：
Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、極性、非極性、または脂肪族残基である；
Ｘ２０２に対応する残基が、脂肪族、芳香族、または非極性残基である、の１つ以上を有するアミノ酸配列を含み；ならびに
上記アミノ酸配列が、上記参照配列と比較して残基９０〜２１１に対応するドメイン内の他のアミノ酸残基に１つ以上の相違を場合により有し得る、項目２４に記載のポリペプチド。
（項目３０）
残基９０〜２１１に対応する上記ケトレダクターゼポリペプチド領域が、次の特徴：
Ｘ９７に対応する残基が、極性、非極性、、脂肪族、または塩基性残基である；
Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、極性、非極性、または脂肪族残基である；
Ｘ２０２に対応する残基が、脂肪族、芳香族、または非極性残基である、の１つ以上を有するアミノ酸配列を含み；ならびに
上記アミノ酸配列が、上記参照配列と比較して残基９０〜２１１に対応するドメイン内の他のアミノ酸残基に１つ以上の相違を場合により有し得る、項目２４に記載のポリペプチド。
（項目３１）
残基９０〜２１１に対応する上記ケトレダクターゼポリペプチド領域が、次の特徴：
Ｘ９４に対応する残基が、システイン、非極性または脂肪族残基である；
Ｘ９６に対応する残基が、極性または酸性残基である；
Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、極性、非極性、または脂肪族残基である、の１つ以上を有するアミノ酸配列を含み；ならびに；
上記アミノ酸配列が、上記参照配列と比較して残基９０〜２１１に対応するドメイン内の他のアミノ酸残基に１つ以上の相違を場合により有し得る、項目２４に記載のポリペプチド。
（項目３２）
残基９０〜２１１に対応する上記ケトレダクターゼポリペプチド領域が、次の特徴：
Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、極性、非極性、または脂肪族残基である；
Ｘ１９６に対応する残基が、脂肪族、非極性、または芳香族残基である；
Ｘ２０２に対応する残基が、脂肪族、芳香族、または非極性残基である、の１つ以上を有するアミノ酸配列を含み；ならびに
上記アミノ酸配列が、上記参照配列と比較して残基９０〜２１１に対応するドメイン内の他のアミノ酸残基に１つ以上の相違を場合により有し得る、項目２４に記載のポリペプチド。
（項目３３）
残基９０〜２１１に対応する上記ケトレダクターゼポリペプチド領域が、次の特徴：
Ｘ１４７に対応する残基が、ロイシンである；
Ｘ１９６に対応する残基が、ロイシンである；
Ｘ２０２に対応する残基が、トリプトファンである、の１つ以上を有するアミノ酸配列を含み；ならびに
上記アミノ酸配列が、上記参照配列と比較して残基９０〜２１１に対応するドメイン内の他のアミノ酸残基に１つ以上の相違を場合により有し得る、項目２４に記載のポリペプチド。
（項目３４）
配列番号２、４または９８に基づく上記参照配列の残基１〜８９に対応するアミノ酸配列を有する領域をさらに含み、残基１〜８９に対応する上記領域が次の特徴：
Ｘ７に対応する残基が、芳香族、非極性、極性、拘束された、または塩基性残基である、を有し；ならびに
上記アミノ酸配列が、上記参照配列と比較して残基１〜８９に対応するドメイン内の他のアミノ酸残基に１つ以上の相違を場合により有し得る、項目２４に記載のポリペプチド。
（項目３５）
配列番号２、４または９８に基づく上記参照配列の残基１〜８９に対応するアミノ酸配列を有する領域をさらに含み、残基１〜８９に対応する上記領域が次の特徴：
Ｘ７に対応する残基が、芳香族、非極性、極性、拘束された、または塩基性残基である；
Ｘ１６に対応する残基が、極性残基である；
Ｘ４３に対応する残基が、非極性または極性残基である、を有し；ならびに
上記アミノ酸配列が、上記参照配列と比較して残基１〜８９に対応するドメイン内の他のアミノ酸残基に１つ以上の相違を場合により有し得る、項目２４に記載のポリペプチド。
（項目３６）
配列番号２、４または９８に基づく上記参照配列の残基１〜８９に対応するアミノ酸配列を有する領域をさらに含み、残基１〜８９に対応する上記領域が次の特徴：
Ｘ７に対応する残基が、トレオニン、プロリン、トリプトファン、アルギニン、ヒスチジン、またはアスパラギンである；
Ｘ１６に対応する残基が、セリンである；
Ｘ４３に対応する残基が、イソロイシンである、を有し；ならびに
上記アミノ酸配列が、上記参照配列と比較して残基１〜８９に対応するドメイン内の他のアミノ酸残基に１つ以上の相違を場合により有し得る、項目２４に記載のポリペプチド。
（項目３７）
配列番号２、４または９８に基づく上記参照配列の残基１〜８９に対応するアミノ酸配列を有する領域をさらに含み、残基１〜８９に対応する上記ケトレダクターゼポリペプチド領域が次の特徴：
Ｘ７に対応する残基が、芳香族、非極性、極性、拘束された、または塩基性残基である；
Ｘ１６に対応する残基が、極性残基である；
Ｘ４３に対応する残基が、非極性または極性残基である；
Ｘ６０に対応する残基が、芳香族または非極性、または脂肪族残基である、を有し；ならびに
上記アミノ酸配列が、上記参照配列と比較して残基１〜８９に対応するドメイン内の他のアミノ酸残基に１つ以上の相違を場合により有し得る、項目２４に記載のポリペプチド。
（項目３８）
配列番号２、４または９８に基づく上記参照配列の残基１〜８９に対応するアミノ酸配列を有する領域をさらに含み、残基１〜８９に対応する上記ケトレダクターゼポリペプチド領域が次の特徴：
Ｘ７に対応する残基が、グリシン、ヒスチジン、トレオニン、プロリン、トリプトファン、アルギニン、ヒスチジン、またはアスパラギンである；
Ｘ１６に対応する残基が、セリンである；
Ｘ４３に対応する残基が、イソロイシンである；
Ｘ６０に対応する残基が、アラニンである、を有し；ならびに
上記アミノ酸配列が、上記参照配列と比較して残基１〜８９に対応するドメイン内の他のアミノ酸残基に１つ以上の相違を場合により有し得る、項目２４に記載のポリペプチド。
（項目３９）
改変ケトレダクターゼポリペプチドであって、上記改変ケトレダクターゼポリペプチドが由来する野生型ケトレダクターゼと比較して、２’，６’−ジクロロ−３’−フルオロアセトフェノン基質を（Ｓ）−１−（２，６−ジクロロ−３−フルオロフェニル）エタノールに還元するための逆の立体選択性が可能である、改変ケトレダクターゼポリペプチド。
（項目４０）
アセトフェノンを（Ｓ）−１−フェネタノールに立体選択的に還元することができる、野生型Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓケトレダクターゼに由来する、改変ケトレダクターゼポリペプチド。
（項目４１）
上記ポリペプチドがアセトフェノンを（Ｓ）−１−フェネタノールに少なくとも約９０％の立体異性体過剰率で立体選択的に還元することができる、項目４０に記載のポリペプチド。
（項目４２）
上記ポリペプチドがアセトフェノンを（Ｓ）−１−フェネタノールに少なくとも約９９％の立体異性体過剰率で立体選択的に還元することができる、項目４０に記載のポリペプチド。
（項目４３）
上記改変ポリペプチドが配列番号２または４または９８のＸ１９０に対応する残基に非芳香族残基を含む、項目４０に記載のポリペプチド。
（項目４４）
項目１〜４３のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（項目４５）
配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、および９３から成る群より選択される、項目４４に記載のポリヌクレオチド。
（項目４６）
宿主細胞での発現を導くのに好適な少なくとも１つの制御配列に操作可能に連結された項目４４に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
（項目４７）
上記制御配列がプロモータを含む、項目４６の記載の発現ベクター。
（項目４８）
上記プロモータがＥ．ｃｏｌｉプロモータを含む、項目４７に記載のベクター。
（項目４９）
上記制御配列が分泌シグナルを含む、項目４７の記載の発現ベクター。
（項目５０）
項目４６に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
（項目５１）
Ｅ．ｃｏｌｉである、項目５０に記載の宿主細胞。
（項目５２）
発現ベクターを含むコドンが宿主細胞での発現に最適化されている、項目５０に記載の宿主細胞。
（項目５３）
３’、４’、および５’位の１つ以上で場合により置換された２’，６’置換アセトフェノン基質を対応する置換（Ｓ）−１−フェネタノールに立体選択的に還元する方法であって、上記基質を対応する置換（Ｓ）−アルコール生成物に立体選択的に還元または変換するのに好適な反応条件下で、上記基質を項目１〜４３のいずれか一項に記載のケトレダクターゼポリペプチドと接触させるステップを含む、方法。
（項目５４）
上記基質が２’，６’−ジクロロ−３’フルオロアセトフェノンであり、上記対応する（Ｓ）−アルコール生成物が（Ｓ）−１−（２，６−ジクロロ−３−フルオロフェニル）エタノールである、項目５３に記載の方法。
（項目５５）
（Ｓ）−１−（２，６−ジクロロ−３−フルオロフェニル）エタノールが９９％を超える立体異性体過剰率で形成される、項目５３に記載の方法。
（項目５６）
上記ケトレダクターゼポリペプチドが、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、および９４から選択されるアミノ酸配列を含む、項目５３に記載の方法。
（項目５７）
上記方法が少なくとも２００ｇ／Ｌの基質および２ｇ／Ｌ未満のポリペプチドを用いて実施されるとき、上記基質の少なくとも約９５％が２４時間未満で上記生成物に還元される、項目５３に記載の方法。
（項目５８）
上記ケトレダクターゼ酵素を発現する全細胞、またはそのような細胞の抽出物もしくは溶解物を用いて実施される、項目５３に記載の方法。
（項目５９）
上記ケトレダクターゼが、単離および／または精製され、そして上記還元反応が該ケトレダクターゼの補因子および場合によっては該補因子の再生系の存在下で行われる、項目５３に記載の方法。
（項目６０）
上記補因子再生系がグルコースデヒドロゲナーゼおよびグルコース；ギ酸デヒドロゲナーゼおよびギ酸エステル；またはイソプロパノールおよび第二級アルコールデヒドロゲナーゼを含む、項目５９に記載の方法。
（項目６１）
上記第二級アルコールデヒドロゲナーゼが、ケトレダクターゼである、項目６０に記載の方法。
（項目６２）
３’，４’および５’位の１つ以上にて場合により置換された２’，６’−置換アセトフェノン、および／または対応する置換（Ｓ）−１−フェネタノール、ならびに項目１に記載のケトレダクターゼを含む、組成物。
（項目６３）
上記基質が式（Ｉ）の２’，６’−ジクロロ−３’−フルオロアセトフェノンであり、および上記対応する置換（Ｓ）−１−フェネタノールが式（ＩＩ）の（Ｓ）−１−（２，６−ジクロロ−３−フルオロフェニル）エタノールである、項目６２に記載の組成物。
（項目６４）
補因子再生系をさらに含む、項目６２に記載の組成物。
（項目６５）
上記補因子再生系がグルコースデヒドロゲナーゼおよびグルコース；ギ酸デヒドロゲナーゼおよびギ酸エステル；またはイソプロパノールおよび第二級アルコールデヒドロゲナーゼを含む、項目６４に記載の組成物。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】式（Ｉ）の基質化合物、２’，６’−ジクロロ−３’−フルオロアセトフェノンを式（ＩＩ）の、対応するキラルアルコール生成物、（Ｓ）−１−［２，６，−ジクロロ−３−フルオロフェニル］−エタノールへの変換におけるケトレダクターゼ（ＫＲＥＤ）の役割を示す。この反応において、基質は生体触媒的に対応する（Ｓ）−アルコールに還元される。この還元は、本明細書に記載するＫＲＥＤおよびＮＡＤＰＨなどの補因子を使用する。グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）を使用してＮＡＤＰ＋をＮＡＤＰＨに変換／リサイクルする。グルコースはグルコン酸に変換され、グルコン酸は次に水酸化ナトリウムの添加によってそのナトリウム塩（グルコン酸ナトリウム）に変換される。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
定義
本明細書において用いる場合、以下の用語は、以下の意味を有すると解釈する。
【００３８】
「ケトレダクターゼ」および「ＫＲＥＤ」は、カルボニル基をその対応するアルコールに還元する酵素能力を有するポリペプチドを指すために、本明細書では交換可能に用いている。より具体的には、本明細書のケトレダクターゼポリペプチドは、上記の式（Ｉ）の化合物を上記の式（ＩＩ）の対応する生成物に立体選択的に還元することができる。前記ポリペプチドは、還元剤として補因子である還元ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）または還元ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）を代表的に利用する。本明細書において用いる場合のケトレダクターゼは、天然由来（野生型）ケトレダクターゼ、ならびに人間の操作によって生成された非天然由来の操作されたポリペプチドを含む。
【００３９】
「コーディング配列」は、タンパク質のアミノ酸配列をコードする、核酸のその部分（例えば、遺伝子）を指す。
【００４０】
「天然由来の」または「野生型」は、自然界で見つけられる形態を指す。例えば、天然由来または野生型ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、自然界の源から単離することができ、人間の操作によって故意に修飾されていない、生物体内に存在する配列である。
【００４１】
例えば細胞、核酸またはポリペプチドに関して用いるときの「組換え体」は、そうしなければ自然界に存在しないであろう方法で修飾された、またはそれと同一のものであるが合成材料からおよび／もしくは組換え技術を用いる操作によって生産もしくは誘導された、材料、またはその材料の自然なもしくは天然の形態に対応する材料を指す。非限定的な例としては、数ある中でも、天然（非組換え）形態のその細胞内では見つけられない遺伝子を発現する組換え細胞、またはそうでなければ異なるレベルで発現される天然遺伝子を発現する組換え細胞が挙げられる。
【００４２】
「配列同一性百分率」および「相同性百分率」は、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド間の比較を指すために本明細書では交換可能に用いており、これらは、ある比較ウインドウに関して２つの最適にアラインされた配列を比較することによって決定され、この場合、その比較ウインドウ内のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の部分は、それら２配列の最適なアラインメントのために、（付加または欠失を含まない）参照配列と比較して付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含むことがある。前記百分率は、同一核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列内に出現する位置の数を決定して一致した位置の数を得、その一致した位置の数を比較ウインドウ内の全位置数で割り、その結果に１００をかけて配列同一性百分率を得ることによって計算することができる。あるいは、前記百分率は、同一核酸塩基もしくはアミノ酸残基が両方の配列内に出現する位置または核酸塩基もしくはアミノ酸残基がギャップとアラインされる位置の数を決定して一致した位置の数を得、その一致した位置の数を比較ウインドウ内の全位置数で割り、その結果に１００をかけて配列同一性百分率を得ることによって計算することができる。２つの配列をアラインするために利用できる多くの確立されたアルゴリズムがあることは当業者に理解される。比較のための最適な配列アラインメントは、例えば、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ，１９８１，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２の局所的相同性アルゴリズムによって、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の相同性アラインメントアルゴリズムによって、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２４４４の類似性探索法によって、これらのアルゴリズム（ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅの中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）のコンピュータでの実施によって、または目視検査（一般に、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．とＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．との合同ベンチャー（１９９５年補遺）（Ａｕｓｕｂｅｌ）参照）によって行うことができる。配列同一性パーセントおよび配列類似性パーセントの決定に適するアルゴリズムの例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、これらは、それぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌら，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０およびＡｌｔｓｃｈｕｌら，１９７７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３３８９−３４０２に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、米国国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）ウェブサイトを通して公的に入手することができる。このアルゴリズムは、データベース配列内の同じ長さのワードとアラインしたときある正の値の閾値スコアＴと一致するまたはある���の値の閾値スコアＴを満たす、クエリ配列中の長さＷの短いワードを特定することによって、高いスコアになる配列の対（ｈｉｇｈ  ｓｃｏｒｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｐａｉｒ）（ＨＳＰ）を先ず特定することを含む。Ｔは、隣接ワードスコア閾値と呼ばれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、上記文献）。これらの最初の隣接ワードヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを見つける検索を開始するためのシードとしての役割を果たす。その後、累積アラインメントスコアを増加することができる限り、そのワードヒットをそれぞれの配列に沿って両方向に伸長する。累積スコアは、ヌクレオチド配列については、パラメータＭ（１対の一致残基に対する報酬スコア；常に、＞０）およびＮ（不一致残基に対するペナルティスコア；常に、＜０）を用いて計算する。アミノ酸配列については、スコアリング行列を用いて累積スコアを計算する。それぞれの方向におけるワードヒットの伸長は、累積アラインメントスコアがその最大達成値から量Ｘだけ落ちると；累積スコアが１つ以上の負のスコアの残基アラインメントの累積に起因してゼロ以下になると；またはいずれかの配列の末端に達すると、停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、ＴおよびＸによって、アラインメントの感度および速度が決まる。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列について）は、デフォルトとして１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両鎖の比較を用いる。アミノ酸配列についてのＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして３のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリング行列を用いる（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ，１９８９，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：１０９１５参照）。配列アラインメントおよび配列同一％の例示的判定には、用意されたデフォルトパラメータを用いて、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｐａｃｋａｇｅ（ウィスコンシン州、マディソンのＡｃｃｅｌｒｙｓ）の中のＢＥＳＴＦＩＴまたはＧＡＰプログラムを利用することができる。
【００４３】
「参照配列」は、配列比較のための基準として用いられる規定された配列を指す。参照配列は、より大きな配列のサブセット、例えば、完全長遺伝子またはポリペプチド配列のセグメントである場合もある。一般に、参照配列は、少なくとも２０ヌクレオチドもしくはアミノ酸残基の長さ、少なくとも２５残基の長さ、少なくとも５０残基の長さ、または核酸もしくはポリペプチドの完全長である。２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、それぞれ、（１）２つの配列間に類似した配列（すなわち、その完全配列の一部分）を含むことがあり、ならびに（２）２つの配列間に互いに異なる配列をさらに含むことがあるので、２つ（またはそれ以上）のポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の配列比較は、「比較ウインドウ」に関して２つのポリヌクレオチドの配列を比較して局所的な配列類似性領域を特定し、比較することによって、代表的に行われる。
【００４４】
一部の実施形態において、「参照配列」は、一次アミノ酸配列に基づく場合があり、この場合の参照配列は、その一次配列内に１つ以上の変更を有し得る配列である。例えば、「Ｘ１９０に対応する残基にプロリンを有する配列番号４に基づく」参照配列は、配列番号４のＸ１９０における対応する残基がプロリンに変更された参照配列を指す。
【００４５】
「比較ウインドウ」は、配列を少なくとも２０の連続するヌクレオチドまたはアミノ酸の参照配列と比較することができ、且つ、その比較ウインドウ内の配列の一部分が、２つの配列の最適なアラインメントのために、（付加または欠失を含まない）参照配列と比較して２０パーセント以下の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含むことがある、少なくとも約２０の連続するヌクレオチド位置またはアミノ酸残基の概念上のセグメントを指す。比較ウインドウは、２０連続残基より長いことがあり、場合によっては、３０、４０、５０、１００、またはそれより長いウインドウを含む。
【００４６】
「実質的同一性」は、少なくとも２０の残基位置の比較ウインドウに関して、多くの場合、少なくとも３０〜５０残基のウインドウに関して参照配列を比較すると、少なくとも８０パーセントの配列同一性、少なくとも８５パーセントの同一性および８９から９５パーセントの配列同一性、より普通には少なくとも９９パーセントの配列同一性を有する、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を指し、この場合の配列同一性百分率は、その比較ウインドウに関して参照配列とその参照配列の総計２０パーセント以下になる欠失または付加を含む配列とを比較することによって計算される。ポリペプチドに適用される特定の実施形態において、用語「実質的な同一性」は、デフォルトギャップ重みづけを用いてプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴなどによって最適にアラインしたとき、２つのポリペプチド配列が、少なくとも８０パーセントの配列同一性、好ましくは、少なくとも８９パーセントの配列同一性、少なくとも９５パーセントの配列同一性またはそれ以上（例えば、９９パーセントの配列同一性）を共有することを意味する。好ましくは、同一でない残基位置は、保存的アミノ酸置換により異なる。
【００４７】
所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列の番号付けに関連して用いるときの「に対応する」、「への参照」または「基準として」は、その所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列を参照配列と比較するときのその指定参照配列の残基の番号付けを指す。言い換えると、所与のポリマーの残基数または残基位置は、その所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列内の残基の実際の数値の位置によってではなく参照配列を基準にして指定される。例えば、所与のアミノ酸配列、例えば操作されたケトレダクターゼのもの、と参照配列とを、ギャップを導入してそれら２配列間の残基一致を最適化することによって、アラインすることができる。これらの場合では、ギャップは存在するが、アラインした参照配列を基準にしてその所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列内の残基の番号付けを行う。
【００４８】
「立体選択性」は、化学反応または酵素的反応における１つの立体異性体の別のものに勝る優先的形成を指す。立体選択性は、部分的である場合があり、この場合は１つの立体異性体の形成が他のものより有利であり、または完全であることもあり、この場合は１つだけの立体異性体が形成される。立体異性体がエナンチオマーであるとき、その立体選択性はエナンチオ選択性と呼ばれ、これは、一方のエナンチオマーの両方の合計中の分率である（代表的に、百分率として報告される）。それは、当該技術分野では、一般に、代替的に、式［主エナンチオマー−副エナンチオマー］／［主エナンチオマー＋副エナンチオマー］に従ってそれから算出されるエナンチオマー過剰率（ｅ．ｅ．）として（代表的に、百分率として）報告される。これは、立体異性体過剰率（ｓ．ｅ．）と呼ばれる場合もある。立体異性体が、ジアステレオマーである場合、その立体選択性は、ジアステレオ選択性とも呼ばれ、これは、２つのジアステレオマーの混合物中の１つのジアステレオマーの分率である（代表的に、百分率で報告される）。
【００４９】
「高立体選択的」は、少なくとも約８５％の立体異性体過剰率で２’，６’−ジクロロ−３’−フルオロアセトフェノン（式（Ｉ））を対応する（Ｓ）−アルコール生成物の（Ｓ）−１−［２，６−ジクロロ−３−フルオロフェニル］−エタノール（式（ＩＩ））に変換または還元することができるケトレダクターゼポリペプチドを指す。
【００５０】
「改善された酵素特性」は、参照ケトレダクターゼと比較して何らかの酵素特性の改善を示すケトレダクターゼポリペプチドを指す。本明細書に記載する操作されたケトレダクターゼポリペプチドについて、その比較は、一般に、野生型ケトレダクターゼ酵素に対して行われるが、一部の実施形態では、その参照ケトレダクターゼが、別の改善された操作されたケトレダクターゼである場合もある。改善が望ましい酵素特性としては、酵素活性（基質の変換パーセントによって表すことができる）、熱安定性、ｐＨ活性プロフィール、補因子要件、阻害因子（例えば、生成物阻害）に対する不応性、立体特異性、および立体選択性（立体選択性を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５１】
「増大された酵素活性」は、操作されたケトレダクターゼポリペプチドの改善された特性を指し、参照ケトレダクターゼ酵素と比較して比活性（例えば生成される生成物／時間／タンパク質重量）の増加、または基質の生成物への変換パーセント（例えば、指定量のＫＲＥＤの使用による指定時間内の生成物への基質の出発量の変換パーセント）の増加がその代表であり得る。酵素活性を判定するための例示的方法は、実施例に提供する。Ｋｍ、Ｖｍａｘまたはｋｃａｔの古典的酵素特性を含めて、その変化が増加された酵素活性につながり得る酵素活性に関するいずれの特性も対象となり得る。酵素活性の改善は、対応する野生型ケトレダクターゼ酵素の酵素活性の約１．５倍から、２倍ほどにもなる場合がある。天然由来のケトレダクターゼまたはそのケトレダクターゼポリペプチドが誘導された別の操作されたケトレダクターゼより５倍、１０倍、２０倍、２５倍、５０倍、７５倍、１００倍、またはそれより大きい酵素活性。特定の実施形態において、前記操作されたケトレダクターゼ酵素は、親ケトレダクターゼ酵素のものより１．５から５０倍、１．５から１００倍大きい範囲の改善された酵素活性を示す。いずれの酵素の活性も、その触媒回転速度が基質（任意の必要補因子を含む）の拡散速度を超えることができないように、拡散制限されることは、当業者には理解される。その拡散限界、すなわちｋｃａｔ／Ｋｍ、の理論的最大値は、一般に、約１０８から１０９（Ｍ−１  ｓ−１）である。それ故、ケトレダクターゼの酵素活性のいずれの改善も、そのケトレダクターゼ酵素による作用を受ける基質の拡散速度に関連した上限を有する。ケトレダクターゼ活性は、ケトレダクターゼを測定するために用いられる標準的なアッセイのいずれか１つ、例えば、その酸化とケトンのアルコールへの付随的還元に起因する、ＮＡＤＰＨの吸光度もしくは蛍光の減少（実施例５参照）によって、または結合アッセイにおいて生成される生成物によって、測定することができる。酵素活性の比較は、本明細書中で詳細にさらに説明するような、酵素の規定された調製、設定条件下での規定されたアッセイ、および１つ以上の規定された基質を用いて行われる。一般に、溶解産物を比較するとき、宿主細胞によって生産されるおよび溶解産物中に存在する酵素の量の変化を最小にするために同一の発現系および同一の宿主細胞を使用するばかりでなく、アッセイする細胞の数およびタンパク質の量も決定する。
【００５２】
「変換」は、基質の対応する生成物への酵素的還元を指す。「変換パーセント」は、ある期間内に指定条件下で生成物に還元される基質のパーセントを指す。従って、ケトレダクターゼポリペプチドの「酵素活性」または「活性」は、基質の生成物への「変換パーセント」として表すことができる。
【００５３】
「熱安定性」は、ある期間（例えば、０．５〜２４時間）、高温（例えば、４０〜８０℃）への暴露後、未処理の酵素と比較して同様の活性（例えば、６０％から８０％より多く）を維持するケトレダクターゼポリペプチドを指す。
【００５４】
「溶媒安定性」は、ある期間（例えば、０．５〜２４時間）、様々な濃度（例えば、５〜９９％）の溶媒（例えば、イソプロピルアルコール、テトラヒドロフラン、２−メチルテトラヒドロフラン、アセトン、トルエン、酢酸ブチル、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルなど）への暴露後、未処理の酵素と比較して同様の活性（例えば、６０％から８０％より多く）を維持するケトレダクターゼポリペプチドを指す。
【００５５】
「ｐＨ安定性」は、ある期間（例えば、０．５〜２４時間）、高いまたは低いｐＨ（例えば、４．５〜６または８から１２）への暴露後、未処理の酵素と比較して同様の活性（例えば、６０％から８０％より多く）を維持するケトレダクターゼポリペプチドを指す。
【００５６】
「熱および溶媒安定性」は、熱安定性でもあり、溶媒安定性でもある、ケトレダクターゼポリペプチドを指す。
【００５７】
操作されたケトレダクターゼ酵素に関連して本明細書において用いる場合の「から誘導される」は、その操作の基礎になった、元のケトレダクターゼ酵素、および／またはそのようなケトレダクターゼ酵素をコードする遺伝子を特定する。例えば、配列番号３８の操作されたケトレダクターゼ酵素は、配列番号４のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒケトレダクターゼ酵素をコードする遺伝子を何世代にもわたって人工的に進化させることによって得られた。従って、この操作されたケトレダクターゼ酵素は、配列番号４の野生型ケトレダクターゼ「から誘導される」。
【００５８】
「親水性アミノ酸または残基」は、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇら，１９８４，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７９：１２５−１４２の正規化コンセンサス疎水性尺度に従ってゼロ未満の疎水性を示す側鎖を有するアミノ酸または残基を指す。遺伝子コード化された親水性アミノ酸としては、Ｌ−Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｌ−Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｌ−Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｌ−Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｌ−Ａｓｎ（Ｎ）、Ｌ−Ｇｌｎ（Ｑ）、Ｌ−Ａｓｐ（Ｄ）、Ｌ−Ｌｙｓ（Ｋ）およびＬ−Ａｒｇ（Ｒ）が挙げられる。
【００５９】
「酸性アミノ酸または残基」は、そのアミノ酸がペプチドまたはポリペプチドに含まれているときに約６未満のｐＫ値を示す側鎖を有する親水性アミノ酸または残基を指す。酸性アミノ酸は、ヒドロニウムイオン喪失のため、生理学的ｐＨで負の電荷を有する側鎖を代表的に有する。遺伝子コード化された酸性アミノ酸としては、Ｌ−Ｇｌｕ（Ｅ）およびＬ−Ａｓｐ（Ｄ）が挙げられる。
【００６０】
「塩基性アミノ酸または残基」は、そのアミノ酸がペプチドまたはポリペプチドに含まれているときに約６より大きいｐＫ値を示す側鎖を有する親水性アミノ酸または残基を指す。塩基性アミノ酸は、水素イオンとの会合のため、生理学的ｐＨで正の電荷を有する側鎖を代表的に有する。遺伝子コード化された塩基性アミノ酸としては、Ｌ−Ａｒｇ（Ｒ）およびＬ−Ｌｙｓ（Ｋ）が挙げられる。
【００６１】
「極性アミノ酸または残基」は、生理学的ｐＨで電荷を有さない側鎖を有するが、２個の原子によって共同で共有される電子対がそれらの原子のうちの１つによってより近くに保持される少なくとも１つの結合を有する、親水性アミノ酸または残基を指す。遺伝子コード化された極性アミノ酸としては、Ｌ−Ａｓｎ（Ｎ）、Ｌ−Ｇｌｎ（Ｑ）、Ｌ−Ｓｅｒ（Ｓ）およびＬ−Ｔｈｒ（Ｔ）が挙げられる。
【００６２】
「疎水性アミノ酸または残基」は、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇら，１９８４，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７９：１２５−１４２の正規化コンセンサス疎水性尺度に従ってゼロより大きい疎水性を示す側鎖を有するアミノ酸または残基を指す。遺伝子コード化された疎水性アミノ酸としては、Ｌ−Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｌ−Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｌ−Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｌ−Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌ−Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｌ−Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｌ−Ｍｅｔ（Ｍ）、Ｌ−Ａｌａ（Ａ）およびＬ−Ｔｙｒ（Ｙ）が挙げられる。
【００６３】
「芳香族アミノ酸または残基」は、少なくとも１つの芳香族またはヘテロ芳香族環を含む側鎖を有する、親水性または疎水性アミノ酸または残基を指す。遺伝子コード化された芳香族アミノ酸としては、Ｌ−Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｌ−Ｔｙｒ（Ｙ）およびＬ−Ｔｒｐ（Ｗ）が挙げられる。そのヘテロ芳香族窒素原子のｐＫａのせいでＬ−Ｈｉｓ（Ｈ）は、時として、塩基性残基として分類され、またはその側鎖がヘテロ芳香族環を含むので芳香族残基として分類されるが、本明細書では、ヒスチジンを親水性残基として、または「拘束残基」（下記参照）として分類する。
【００６４】
「拘束アミノ酸または残基」は、拘束された幾何学的配置を有する、アミノ酸または残基を指す。本明細書において、拘束残基としては、Ｌ−ｐｒｏ（Ｐ）およびＬ−ｈｉｓ（Ｈ）が挙げられる。ヒスチジンは、比較的小さいイミダゾール環を有するため、拘束された幾何学的配置を有する。プロリンは、これも５員環を有するため、拘束された幾何学的配置を有する。
【００６５】
「非極性アミノ酸または残基」は、生理学的ｐＨで電荷を有さない側鎖を有し、且つ、２個の原子によって共同で共有される電子対がそれら２個の原子それぞれによってほぼ同等に保持される結合を有する（すなわち、側鎖が非極性である）、疎水性アミノ酸または残基を指す。遺伝子コード化された非極性アミノ酸としては、Ｌ−Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｌ−Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｌ−Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌ−Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｌ−Ｍｅｔ（Ｍ）およびＬ−Ａｌａ（Ａ）が挙げられる。
【００６６】
「脂肪族アミノ酸または残基」は、脂肪族炭化水素側鎖を有する、疎水性アミノ酸または残基を指す。遺伝子コード化された脂肪族アミノ酸としては、Ｌ−Ａｌａ（Ａ）、Ｌ−Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌ−Ｌｅｕ（Ｌ）およびＬ−Ｉｌｅ（Ｉ）が挙げられる。
【００６７】
「システイン」。アミノ酸Ｌ−Ｃｙｓ（Ｃ）は、他のＬ−Ｃｙｓ（Ｃ）アミノ酸または他のスルファニル含有もしくはスルフヒドリル含有アミノ酸とジスルフィド架橋を形成することができる点で独特である。「システイン様残基」は、システイン、およびジスルフィド架橋の形成に利用できるスルフヒドリル部分を含有する他のアミノ酸を含む。Ｌ−Ｃｙｓ（Ｃ）（および−ＳＨ含有側鎖を有する他のアミノ酸）が、還元された遊離−ＳＨ形態または酸化されたジスルフィド架橋形態のいずれかでペプチド中に存在できることが、Ｌ−Ｃｙｓ（Ｃ）がペプチドに正味の疎水性をもたらすのか、親水性をもたらすのかに影響を及ぼす。Ｌ−Ｃｙｓ（Ｃ）は、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇの正規化コンセンサス尺度（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇら，１９８４、上記文献）に従って０．２９の疎水性を示すが、本発明の開示のために、Ｌ−Ｃｙｓ（Ｃ）がそれ独自の独特な群に類別されることは理解されるべきである。
【００６８】
「小アミノ酸または残基」は、合計３個以下の炭素および／またはヘテロ原子（α−炭素および水素を除く）から構成される側鎖を有するアミノ酸または残基を指す。小アミノ酸または残基は、上の定義に従って、脂肪族、非極性、極性または酸性小アミノ酸または残基としてさらに類別することができる。遺伝子コード化された小アミノ酸としては、Ｌ−Ａｌａ（Ａ）、Ｌ−Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌ−Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｌ−Ａｓｎ（Ｎ）、Ｌ−Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｌ−Ｔｈｒ（Ｔ）およびＬ−Ａｓｐ（Ｄ）が挙げられる。
【００６９】
「ヒドロキシル含有アミノ酸または残基」は、ヒドロキシル（−ＯＨ）部分を含有するアミノ酸を指す。遺伝子コード化されたヒドロキシル含有アミノ酸としては、Ｌ−Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｌ−Ｔｈｒ（Ｔ）およびＬ−Ｔｙｒ（Ｙ）が挙げられる。
【００７０】
「保存的」アミノ酸置換または突然変異は、類似した側鎖を有する残基の交換可能性を指し、従って、アミノ酸の同じまたは類似した規定されたクラスの中のアミノ酸でのポリペプチド内のアミノ酸の置換を代表的に含む。しかし、本明細書において用いる場合、一部の実施形態において、保存的突然変異は、その保存的突然変異が、代わりに、脂肪族残基から脂肪族残基、非極性残基から非極性残基、極性残基から極性残基、酸性残基から酸性残基、塩基性残基から塩基性残基、芳香族残基から芳香族残基、または拘束残基から拘束残基への置換であり得る場合、親水性残基から親水性残基、疎水性残基から疎水性残基、ヒドロキシル含有残基からヒドロキシル含有残基、または小残基から小残基への置換を含まない。さらに、本明細書において用いる場合、Ａ、Ｖ、Ｌ、またはＩは、別の脂肪族残基または別の非極性残基のいずれかに保存的に突然変異させることができる。下の表は、例示的保存的置換を示すものである。
【００７１】
【表１】
0005973131.tif 000006
「非保存的置換」は、有意に異なる側鎖特性を有するアミノ酸でのポリペプチド内のアミノ酸の置換または突然変異を指す。非保存的置換は、上に列挙した規定された群内ではなく、群間でのアミノ酸を用いるものであり得る。１つの実施形態において、非保存的突然変異は、（ａ）置換領域内のペプチド骨格の構造（例えば、グリシンの代わりにプロリン）（ｂ）電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖の嵩に影響を及ぼす。
【００７２】
「欠失」は、参照ポリペプチドからの１つ以上のアミノ酸の除去によるポリペプチドへの修飾を指す。アミノ酸配列における欠失は、操作されたケトレダクターゼ酵素の酵素活性を維持しながらおよび／または改善された特性を維持しながらの、その参照酵素を構成する１つ以上のアミノ酸、２つ以上のアミノ酸、３つ以上のアミノ酸、４つ以上のアミノ酸、５つ以上のアミノ酸、６つ以上のアミノ酸、８つ以上のアミノ酸、１０以上のアミノ酸、１５以上のアミノ酸、または２０以上のアミノ酸、総アミノ酸数の１０％以下、総アミノ酸数の１５％以下、または総アミノ酸数の２０％以下の除去を含むことができる。欠失は、ポリペプチドの内部に関する場合があり、および／または末端部分に関する場合がある。様々な実施形態において、欠失は、連続セグメントを含み得、または非連続的である場合がある。
【００７３】
「挿入」は、参照ポリペプチドからの、１つ以上のアミノ酸の付加によるポリペプチドへの修飾を指す。一部の実施形態において、前記改善された操作されたケトレダクターゼ酵素は、天然由来のケトレダクターゼポリペプチドへの１つ以上のアミノ酸の挿入、ならびに他の改善されたケトレダクターゼポリペプチドへの１つ以上のアミノ酸の挿入を含む。挿入は、ポリペプチドの内部でのものである場合があり、またはカルボキシもしくはアミノ末端へのものである場合がある。本明細書において用いる場合の挿入物は、当該技術分野において公知であるような融合タンパク質を含む。前記挿入物は、アミノ酸の連続セグメントである場合があり、または天然由来ポリペプチド内での１つ以上のアミノ酸によって隔てられている場合がある。
【００７４】
本明細書中で用いられる「フラグメント」は、アミノ末端および／またはカルボキシ末端の欠失を有するが、残りのアミノ酸配列はその配列の対応する位置と同じである、ポリペプチドを指す。フラグメントは、少なくとも１４アミノ酸長、少なくとも２０アミノ酸長、少なくとも５０アミノ酸長またはそれ以上で、配列番号２または配列番号４の完全長の天然に存在するケトレダクターゼポリペプチドの７０％、８０％、９０％、９５％、９８％および９９％までであり得る。
【００７５】
「単離されたポリペプチド」は、本来それに随伴する他の不純物、例えばタンパク質、脂質およびポリヌクレオチド、から実質的に分離されているポリペプチドを指す。この用語は、それらの自然発生環境または発現系（例えば、宿主細胞またはインビトロ合成）から除去または精製されたポリペプチドを包含する。前記改善されたケトレダクターゼ酵素は、細胞内に存在することもあり、細胞の培地に中に存在することもあり、または溶解産物もしくは単離された製剤などの様々な形態で調製することができる。従って、一部の実施形態において、前記改善されたケトレダクターゼ酵素は、単離されたポリペプチドであり得る。
【００７６】
「実質的に純粋なポリペプチド」は、そのポリペプチド種が、存在する優勢な種である（すなわち、ｍｏｌまたは重量ベースで、それがその組成物中のいずれの他の個々の高分子種よりも豊富である）組成物を指し、一般に、対象種がモルまたは重量％でその存在する高分子種の少なくとも約５０パーセントを構成する場合には実質的に精製されている組成物である。一般に、実質的に純粋なケトレダクターゼ組成物は、その組成物中に存在するすべての高分子種のモルまたは重量％で約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上、約９５％以上、および約９８％以上を構成する。一部の実施形態において、対象種は、その組成物が単一の高分子種から本質的に成る、本質的均質（すなわち、従来の検出方法によってその組成物中で汚染種を検出できない）へと精製される。溶媒種、小分子（＜５００ダルトン）、および元素イオン種は、高分子種とはみなされない。一部の実施形態において、単離された改善されたケトレダクターゼポリペプチドは、実質的に純粋なポリペプチド組成物である。
【００７７】
「ストリンジェントハイブリダイゼーション」は、核酸ハイブリッドが安定している条件を指すために本明細書では用いる。当業者には公知であるように、ハイブリッドの安定性は、そのハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）に反映される。一般に、ハイブリッドの安定性は、イオン強度、温度、Ｇ／Ｃ含有率、およびカオトロピック剤の存在の関数である。ポリヌクレオチドのＴｍ値は、融解温度の公知予測方法を用いて計算することができる（例えば、Ｂａｌｄｉｎｏら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １６８：７６１−７７７；Ｂｏｌｔｏｎら，１９６２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ４８：１３９０；Ｂｒｅｓｓｌａｕｅｒら，１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８３：８８９３−８８９７；Ｆｒｅｉｅｒら，１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８３：９３７３−９３７７；Ｋｉｅｒｚｅｋら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２５：７８４０−７８４６；Ｒｙｃｈｌｉｋら，１９９０，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １８：６４０９−６４１２（ｅｒｒａｔｕｍ，１９９１，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １９：６９８）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，上記文献；Ｓｕｇｇｓら，１９８１，Ｉｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｕｓｉｎｇ  Ｐｕｒｉｆｉｅｄ  Ｇｅｎｅｓ（Ｂｒｏｗｎら編），ｐｐ．６８３−６９３，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；およびＷｅｔｍｕｒ，１９９１，Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２６：２２７−２５９参照）。すべての出版物は、参照により本明細書に援用されている）。一部の実施形態において、ポリヌクレオチドは、本明細書に開示するポリペプチドをコードし、ならびに規定された条件下、例えば中ストリンジェントまたは高ストリンジェント条件下で、本開示の操作されたケトレダクターゼ酵素をコードする配列の補体にハイブリダイズする。
【００７８】
「ハイブリダイゼーションストリンジェンシー」は、核酸のハイブリダイゼーションにおけるハイブリダイゼーション条件、例えば洗浄条件に関する。一般に、ハイブリダイゼーション反応は、より低いストリンジェンシーの条件下で行われ、その後、様々だがより高いストリンジェンシーの洗浄が行われる。用語「中ストリンジェントハイブリダイゼーション」は、標的ＤＮＡが、その標的ＤＮＡとの約６０％の同一性、好ましくは約７５％の同一性、約８５％の同一性と、標的ポリヌクレオチドとの約９０％より高い同一性とを有する相補的核酸に結合できる条件を指す。例示的中ストリンジェント条件は、５０％ホルムアミド、５×デンハルト溶液、５×ＳＳＰＥ、０．２％  ＳＤＳ中、４２℃でのハイブリダイゼーション、その後、０．２×ＳＳＰＥ、０．２％  ＳＤＳ中、４２℃での洗浄に相当する条件である。「高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション」は、規定されたポリヌクレオチド配列についての溶解条件のもとで決定されるような熱融解温度Ｔｍから約１０℃またはそれより低い条件を一般に指す。一部の実施形態において、高ストリンジェンシー条件は、０．０１８Ｍ  ＮａＣｌ中、６５℃で安定なハイブリッドを形成する核酸配列のみのハイブリダイゼーションを可能にする条件を指す。（すなわち、ハイブリッドが０．０１８Ｍ  ＮａＣｌ中、６５℃で不安定な場合、それは、ここで考えられる場合には高ストリンジェンシー条件下で不安定であある）。高ストリンジェンシー条件は、例えば、５０％ホルムアルデヒド、５×デンハルト溶液、５×ＳＳＰＥ、０．２％  ＳＤＳ中、４２℃でのハイブリダイゼーション、その後、０．１×ＳＳＰＥ、および０．１％ＳＤＳ中、６５℃での洗浄に相当する条件によって規定され得る。別の高ストリンジェンシー条件は、０．１％（ｗ：ｖ）ＳＤＳを含有する５×ＳＳＣ中、６５℃でのハイブリダイゼーション、および０．１％ＳＤＳを含有する０．１×ＳＳＣ中、６５℃での洗浄に相当する条件でのハイブリダイゼーションである。他の高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件、ならびに中ストリンジェント条件は、上で引用した参考文献に記載されている。
【００７９】
「異種」ポリヌクレオチドは、実験技術によって宿主細胞に導入される任意のポリヌクレオチドを指し、および宿主細胞から除去され、実験操作に付され、その後、宿主細胞に再び導入されるポリヌクレオチドを含む。
【００８０】
「コドン最適化される」は、そのコードされたタンパク質がその対象生物において効率的に発現されるように、タンパク質をコードするポリヌクレオチドのコドンを特定の生物において優先的に用いられるものに変更することを指す。遺伝子コードは、大部分のアミノ酸が、「シノニム」または「同義」コドンと呼ばれる幾つかのコドンによって表される点で縮重しているが、特定の生物によるコドン使用頻度が無作為でなく、特定のコドントリプレット偏ることは周知である。このコドン使用頻度の偏りは、所定の遺伝子、共通の機能または先祖起源の遺伝子、低コピー数タンパク質に対して高度に発現されるタンパク質、および生物のゲノムの総タンパク質コーディング領域に関して、より高いことがある。一部の実施形態において、ケトレダクターゼ酵素をコードするポリヌクレオチドを、発現のために選択される宿主生物からの最適な生産のためにコドン最適化することができる。
【００８１】
「好ましい、最適な、大いにコドン使用頻度に偏りのあるコドン」は、同義で、タンパク質コーディング領域内の同じアミノ酸をコードする他のコドンより高い頻度で使用されるコドン、を指す。単一の遺伝子のコドン使用頻度、共通の機能または起源の遺伝子のセット、高度に発現される遺伝子、生物全体の総タンパク質コーディング領域におけるコドン頻度、関連生物の総タンパク質コード領域におけるコドン頻度、またはそれらの組み合わせに関して、好ましいコドンを決定することができる。遺伝子発現レベルに伴って頻度が増加するコドンは、代表的に、発現に最適なコドンである。例えばクラスター分析または応答分析を用いる、多変量解析をはじめとする、特定の生物におけるコドン頻度（例えば、コドン使用頻度、相対同義コドン使用頻度）およびコドン選好性を判定するための様々な方法、ならびに遺伝子において使用されるコドンの有効数を決定するための様々な方法が公知である（ＧＣＧ  ＣｏｄｏｎＰｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ；ＣｏｄｏｎＷ，Ｊｏｈｎ  Ｐｅｄｅｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ；ＭｃＩｎｅｒｎｅｙ，Ｊ．Ｏ，１９９８，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １４：３７２−７３；Ｓｔｅｎｉｃｏら，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２２４３７−４６；Ｗｒｉｇｈｔ，Ｆ．，１９９０，Ｇｅｎｅ  ８７：２３−２９参照）。コドン使用頻度表は、増えつつある生物リストに利用できる（例えば、Ｗａｄａら，１９９２，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：２１１１−２１１８；Ｎａｋａｍｕｒａら，２０００、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８：２９２；Ｄｕｒｅｔら，上記文献；ＨｅｎａｕｔおよびＤａｎｃｈｉｎ，「Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｎｄ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ」，１９９６，Ｎｅｉｄｈａｒｄｔら編，ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．，ｐ．２０４７−２０６６参照）。コドン使用頻度を得るためのデータ源は、タンパク質をコードすることができる任意の利用可能なヌクレオチド配列に依存し得る。これらのデータセットは、発現されるタンパク質をコードすることが実際に知られている核酸配列（例えば、完全タンパク質コーディング配列−ＣＤＳ）、発現される配列タグ（ＥＳＴＳ）、またはゲノム配列の予測コーディング領域を含む（例えば、Ｍｏｕｎｔ，Ｄ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，第８章，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，２００１；Ｕｂｅｒｂａｃｈｅｒ，Ｅ．Ｃ．，１９９６，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：２５９−２８１；Ｔｉｗａｒｉら，１９９７，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：２６３−２７０参照）。
【００８２】
「制御配列」は本明細書で、対象のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現に必要または好都合であるすべての成分を含むとして定義される。各制御配列は、未変性であり得るか、またはポリペプチドをコードする核酸配列にとって外来性であり得る。このような制御配列は、これに限定されるわけではないが、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモータ、シグナルペプチド配列、および転写ターミネータを含む。制御配列は最低限、プロモータ、ならびに転写および翻訳停止シグナルを含む。制御配列には、制御配列と対象のポリヌクレオチド、例えば、ポリペプチドをコードする核酸配列のコード領域との結合を促進する特異的制限部位を導入する目的で、リンカーが提供され得る。
【００８３】
「操作可能に連結された」は本明細書で、制御配列がポリヌクレオチドおよび／またはポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドの発現を指示するように、制御配列がポリヌクレオチド配列に対する位置に（すなわち機能的関係で）適切に配置された立体配置として定義される。
【００８４】
「プロモータ配列」は、ポリヌクレオチドの発現のために宿主細胞によって認識される核酸配列である。制御配列は、適切なプロモータ配列を含むことができる。プロモータ配列は、ポリヌクレオチドの発現を媒介する転写制御配列を含有する。プロモータは、ミュータント、切断、およびハイブリッドプロモータを含む最適な宿主細胞において転写活性を示す任意の核酸配列であり、宿主細胞に対して相同または非相同のどちらかである細胞外または細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得られる可能性がある。
【００８５】
ケトレダクターゼ酵素
本開示は、所定のケト基質をその対応するアルコール生成物に立体選択的に還元することと、Ｌ．ｋｅｆｉｒ（配列番号２）もしくはＬ．ｂｒｅｖｉｓ（配列番号４）もしくはＬ．ｍｉｎｏｒ（配列番号９８）より得た天然に存在する野生型ＫＲＥＤ酵素と比較したとき、または他の改変ケトレダクターゼ酵素と比較したとき、改良された特性を有することとが可能である、改変ケトレダクターゼ（「ＫＲＥＤ」）酵素を提供する。本開示で示すように、野生型Ｌ．ｋｅｆｉｒまたはＬ．ｂｒｅｖｉｓまたはＬ．ｍｉｎｏｒケトレダクターゼ酵素は、２’，６’−ジクロロ−３’−フルオロアセトフェノンの還元について、持っているとしても、非常に低い活性しか持っていない（実施例を参照）。野生型酵素がより高い活性を有するあまり置換されていないアセトフェノン基質では、野生型酵素は、アセトフェノンのその対応する（Ｒ）−アルコールへの還元について一般に選択的である。野生型Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種ケトレダクターゼは、原型の参照化合物アセトフェノンを（Ｒ）−１−フェネタノールに還元して、その結果として（Ｒ）−選択性ケトレダクターゼ、すなわち（Ｒ）−ケトレダクターゼと呼ばれる。しかし、野生型Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種ケトレダクターゼ酵素に由来する本開示の改変レダクターゼ酵素は、アセトフェノンを（Ｓ）−１−フェネタノールに還元して、その結果として（Ｓ）−選択性ケトレダクターゼ、すなわち（Ｓ）−ケトレダクターゼと呼ばれる。それゆえ、本開示の改良されたケトレダクターゼポリペプチドは、野生型Ｌ．ｋｅｆｉｒまたはＬ．ｂｒｅｖｉｓまたはＬ．ｍｉｎｏｒケトレダクターゼと比較して、アセトフェノンの還元の逆のエナンチオ選択性が可能である。この逆のエナンチオ選択性は、野生型酵素の１９０位の残基を好ましくは非芳香族残基に、特にプロリン残基に変異させることに基づいている。理論に縛られることなく、１９０位の野生型チロシン残基は、プロ−Ｓ配座にて基質と衝突するように思われる。それゆえ、いくつかの実施形態において、本開示のケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２または４または９８の１９０位に対応する残基にチロシンでない残基を有する。好ましくは、この残基は非芳香族残基、例えば、脂肪族、拘束された、非極性、またはシステイン残基である。いくつかの実施形態において、本残基はプロリンである。
【００８６】
いくつかの実施形態において、上記のように、改良された酵素特性を備えた改変ケトレダクターゼは、配列番号４のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒケトレダクターゼまたは配列番号２のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓケトレダクターゼまたは配列番号９８のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｉｎｏｒケトレダクターゼに関して記載される。アミノ残基位置は、開始メチオニン（Ｍ）残基から開始してケトレダクターゼにおいて決定されるが（すなわち、Ｍは残基位置１を表す）、この開始メチオニン残基は宿主細胞またはインビトロ翻訳系におけるように生物処理機構によって除去されて、開始メチオニン残基のない成熟タンパク質を産生し得ることが当業者によって理解される。特定のアミノ酸またはアミノ酸変化がアミノ酸配列中に存在するアミノ酸残基位置は、「Ｘｎ」、または「ｎ位」という用語によって本明細書に時々記載され、ここでｎは残基位置を指す。ケトレダクターゼの間で同じ残基位置のアミノ酸残基が異なる場合、異なる残基は「／」によって示されることがあり、配置は「ｋｅｆｉｒ残基／ｂｒｅｖｉｓ残基／ｍｉｎｏｒ」である。参照配列、例えば、配列番号２および配列番号４および配列番号９８の野生型ケトレダクターゼにおけるアミノ酸残基の異なるアミノ酸残基との交換である置換変異は、記号「→」によって示され得る。本明細書では、変異は、ある種のアミノ酸「へ（ｔｏ  ａ）」の変異として時々記載される。例えば、配列番号２の残基１６は極性残基「へ」変異させることができる。しかし、「へ」という句の使用は、あるクラスの１つのアミノ酸から同じクラスの別のアミノ酸への変異を除外しない。例えば、配列番号２の残基１６は極性残基トレオニンであるが、トレオニンは異なる極性残基に変異させることができ、例えば、変異は「Ｔ１６Ｓ」（１６→Ｓ）変異であり得る。
【００８７】
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ、またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｉｎｏｒの天然に存在するケトレダクターゼ（「ＡＤＨ」または「アルコールデヒドロゲナーゼ」とも呼ばれる）をコードする天然に存在するポリヌクレオチドは、ケトレダクターゼ活性をコードすることが公知の単離ポリヌクレオチド（例えばＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒでは、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＰ９４０２９  ＧＩ：３３１１２０５６または配列番号３；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓでは、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＣＡＤ６６６４８  ＧＩ：２８４００７８９または配列番号：１およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｉｎｏｒでは配列番号９７）から得ることができる。
【００８８】
いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドの（野生型または別の改変ポリペプチドと比較して）改良された特性は、式（ＩＩＩ）の置換アセトフェノン基質を式（ＩＶ）のその対応する（Ｓ）−アルコール生成物に還元または変換するためのその立体選択性の上昇に関する。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼ特性の改良された特性は、２’，６’−ジクロロ−３’−フルオロアセトフェノンを（Ｓ）−１−（２，６−ジクロロ−３−フルオロフェニル）エタノールに還元する立体選択性の上昇に関する。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドの改良された特性は、基質の生成物へのその変換率の上昇に関する。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドの改良された特性は、その安定性または熱安定性に関する。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは２つ以上の改良された特性を有する。
【００８９】
いくつかの実施形態において、本明細書のケトレダクターゼポリペプチドは、ケトレダクターゼ特性の改良を生じさせるために、参照配列（例えば、天然に存在するポリペプチドまたは改変ポリペプチド）に対するいくつかの修飾を有することができる。本明細書で使用するように、「修飾」はアミノ酸の置換、欠失、および挿入を含む。任意の１つの修飾または修飾の組み合せを天然に存在するまたは改変ポリペプチドに導入して、改変酵素を産生することができる。このような実施形態において、アミノ酸配列に対する修飾の数は、参照ポリペプチド配列の、１個以上のアミノ酸、２個以上のアミノ酸、３個以上のアミノ酸、４個以上のアミノ酸、５個以上のアミノ酸、６個以上のアミノ酸、８個以上のアミノ酸、１０個以上のアミノ酸、１５個以上のアミノ酸、または２０個以上のアミノ酸、アミノ酸の総数の１０％まで、アミノ酸の総数の１５％まで、アミノ酸の総数の２０％まで、またはアミノ酸の総数の３０％を含むことができる。いくつかの実施形態において、改良されたケトレダクターゼ特性を生じる天然に存在するポリペプチドまたは改変ポリペプチドに対する修飾の数は、参照配列の約１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の修飾を含み得る。いくつかの実施形態において、修飾の数は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個のアミノ酸残基であり得る。修飾は、挿入、欠失、置換、またはその組み合せを含むことができる。
【００９０】
いくつかの実施形態において、修飾は参照配列に対するアミノ酸置換を含む。改良されたケトレダクターゼ特性を生じる置換は、参照酵素配列の、１個以上のアミノ酸、２個以上のアミノ酸、３個以上のアミノ酸、４個以上のアミノ酸、５個以上のアミノ酸、６個以上のアミノ酸、８個以上のアミノ酸、１０個以上のアミノ酸、１５個以上のアミノ酸、または２０個以上のアミノ酸、アミノ酸の総数の１０％まで、アミノ酸の総数の２０％まで、またはアミノ酸の総数の３０％までであり得る。いくつかの実施形態において、改良されたケトレダクターゼ特性を生じる天然に存在するポリペプチドまたは改変ポリペプチドに対する置換の数は、参照配列の約１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、置換の数は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個のアミノ酸残基であり得る。
【００９１】
いくつかの実施形態において、本明細書のケトレダクターゼポリペプチドは、Ｘ１９０に対応する残基に非芳香族残基（例えば、脂肪族、拘束された、非極性、またはシステイン残基）、好ましくはアラニン、イソロイシン、システイン、またはプロリン、特にプロリンを有する、配列番号２、４または９８に基づく参照配列と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含むが、但し、そのケトレダクターゼポリペプチドがＸ１９０に対応する残基にチロシン以外、特に非芳香族残基である残基を有することを条件とする。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、Ｘ１９０に対応する残基が脂肪族、拘束された、非極性、またはシステイン残基であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼは、Ｘ１９０に対応する残基がアラニン、イソロイシン、システイン、またはプロリン、特にプロリンであるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、これらのケトレダクターゼポリペプチドは、参照アミノ酸配列と比較して他の残基位置に１つ以上の残基相違を有することができる。この相違は、置換、欠失、および挿入などの各種の修飾を含む。置換は、非保存的置換、保存的置換、または非保存的および保存的置換の組み合せであり得る。いくつかの実施形態において、これらのケトレダクターゼポリペプチドは、参照配列と比較して他のアミノ酸残基に約１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の残基相違を場合により有することができる。いくつかの実施形態において、相違の数は、参照配列と比較して他のアミノ酸残基における１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。
【００９２】
いくつかの実施形態において、これらの立体選択性または高立体選択性（本明細書では、少なくとも約８５％のエナンチオマー過剰率で基質を生成物に変換することができる）ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号９５、９６および１１９に配列したような配列式、または残基９０〜２１１などのその領域もしくはドメインに対応するアミノ酸配列を含む。配列番号９５は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓケトレダクターゼの野生型アミノ酸配列（配列番号２）に基づき；配列番号９６は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒケトレダクターゼの野生型アミノ酸配列（配列番号４）に基づき；および配列番号１１９は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｉｎｏｒケトレダクターゼの野生型アミノ酸配列（配列番号９８）に基づく。>配列番号９５、９６、または１１９の配列式に基づくケトレダクターゼは、Ｘ１９０に対応する配列が非芳香族残基であることを規定する。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、Ｘ１９０に対応する残基がアラニン、イソロイシン、システイン、またはプロリンであるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、Ｘ１９０に対応する残基がプロリンであるアミノ酸配列を有する。
【００９３】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載するような残基Ｘ１９０について規定された特徴を有する、配列番号９５、９６、または１１９の配列式に基づくアミノ酸配列、またはその領域、例えば、残基９０〜２１１を含むケトレダクターゼポリペプチドは、次のもの：Ｘ７に対応する残基が、芳香族、非極性、極性、拘束された、酸性または塩基性残基である；Ｘ１６に対応する残基が、極性残基である；Ｘ４３に対応する残基が、非極性または極性残基である；Ｘ６０に対応する残基が、芳香族、非極性、または脂肪族残基である；Ｘ９４に対応する残基が、システイン、非極性または脂肪族残基である；Ｘ９５に対応する残基が、非極性または脂肪族残基である；Ｘ９６に対応する残基が、極性または酸性残基である；Ｘ９７に対応する残基が、極性、非極性、脂肪族、または塩基性残基である；Ｘ１２０に対応する残基が、芳香族、非極性または脂肪族残基である；Ｘ１２５に対応する残基が、極性または非極性残基である；Ｘ１４２に対応する残基が、極性残基である；Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、極性、非極性、または脂肪族残基である；Ｘ１４９に対応する残基が、非極性または芳香族残基である；Ｘ１５０に対応する残基が、拘束されたまたは酸性残基である；Ｘ１５２に対応する残基が、非極性または極性残基である；Ｘ１９６に対応する残基が、脂肪族、非極性、または芳香族残基である；Ｘ２０２に対応する残基が、脂肪族、芳香族、または非極性残基である；Ｘ２０５に対応する残基が、塩基性、非極性または脂肪族残基である；およびＸ２０６に対応する残基が、非極性または芳香族残基である、から選択される１つ以上の特徴をさらに有することができる。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列は、２、３、４、５、６つ以上の特徴を有することができる。いくつかの実施形態において、配列番号９５、９６、または１１９で与えられる配列式（またはその領域）に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドは、配列番号２、４または９８の参照配列と比較して変異されるＸによって規定されない１つ以上の残基をさらに有することができる。いくつかの実施形態において、変異は、上でＸによって定義されない他のアミノ酸残基における約１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の変異からであり得る。いくつかの実施形態において、変異の数は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の他のアミノ酸残基であり得る。いくつかの実施形態において、変異は保存的変異を含む。
【００９４】
いくつかの実施形態において、配列番号９５、９６、または１１９の配列式、またはその領域、例えば、残基９０〜２１１に基づくアミノ酸配列を含むポリペプチドは、配列番号２、４または９８のアミノ酸配列と比較して１つ以上の保存的変異を有することができる。例示的な保存的変異は、これに限定されるわけではないが：Ｘ１６トレオニン（Ｔ）に対応する残基の、別の極性残基、例えば、アスパラギン、グルタミン、またはセリンによる置換；Ｘ４３バリンに対応する残基の、別の非極性または脂肪族残基、例えば、イソロイシンによる置換；Ｘ６０に対応する残基の、脂肪族または芳香族残基、例えば、アラニンによる置換；Ｘ９４アラニン（Ａ）に対応する残基の、別の非極性または脂肪族残基、例えば、バリン、ロイシン、またはイソロイシンによる置換；Ｘ９５バリン（Ｖ）に対応する残基の、別の非極性または脂肪族残基、例えば、アラニン、ロイシン、またはイソロイシンによる置換；Ｘ９６セリン（Ｓ）に対応する残基の、別の極性残基、例えば、アスパラギン、グルタミン、またはトレオニンによる置換；Ｘ１４２セリン（Ｓ）に対応する残基の、別の極性残基、例えば、セリンまたはアスパラギンによる置換；Ｘ１９６バリン（Ｖ）に対応する残基の、別の非極性または脂肪族残基、例えば、アラニン、ロイシン、またはイソロイシンによる置換；およびＸ２０５アラニン（Ａ）に対応する残基の、別の非極性または脂肪族残基、例えば、バリン、ロイシン、またはイソロイシンによる置換などのアミノ酸置換を含む。
【００９５】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載するような残基Ｘ１９０について規定された特徴を有する、配列番号９５、９６、または１１９の配列式に基づくアミノ酸配列、またはその領域、例えば、残基９０〜２１１を含むケトレダクターゼポリペプチドは、次のもの：Ｘ７に対応する残基が、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、プロリン、ヒスチジン、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、またはリジン、特にグリシン、ヒスチジン、トレオニン、プロリン、トリプトファン、アルギニン、ヒスチジン、またはアスパラギンである；Ｘ１６に対応する残基が、セリン、トレオニン、アスパラギン、またはグルタミン、特にセリンである；Ｘ４３に対応する残基が、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、またはイソロイシン、特にイソロイシンである；Ｘ６０に対応する残基が、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、またはイソロイシン、特にアラニンである；Ｘ９４に対応する残基が、システイン、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、またはイソロイシン、特にアラニン、バリンまたはシステインである；Ｘ９５に対応する残基が、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、特にイソロイシンまたはロイシンである；Ｘ９６に対応する残基が、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、アスパラギン、またはグルタミン、特にセリン、アスパラギン、トレオニンまたはグルタミン酸である；Ｘ９７に対応する残基が、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、リジンまたはアルギニン、特にリジン、トレオニン、バリン、アルギニン、メチオニン、またはイソロイシンである；Ｘ１２０に対応する残基が、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、またはイソロイシン、特にフェニルアラニンまたはバリンである；Ｘ１２５に対応する残基が、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、またはイソロイシン、特にグリシンまたはセリンである；Ｘ１４２に対応する残基が、セリン、トレオニン、アスパラギン、またはグルタミン残基、特にアスパラギンである；Ｘ１４７に対応する残基が、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、アスパラギン、またはグルタミン、特にフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、またはグルタミンである；Ｘ１４９に対応する残基が、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、チロシン、フェニルアラニン、またはトリプトファン、特にグリシンまたはフェニルアラニンである；Ｘ１５０に対応する残基が、プロリン、ヒスチジン、アスパラギン酸、またはグルタミン酸、特にアスパラギン酸またはヒスチジンである；Ｘ１５２に対応する残基が、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、アスパラギン、またはグルタミン、特にセリン、トレオニン、またはメチオニンである；Ｘ１９６に対応する残基が、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、またはイソロイシン、特にバリン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、またはイソロイシンである；Ｘ２０２に対応する残基が、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、またはイソロイシン、特にアラニン、トリプトファン、チロシン、またはメチオニンである；Ｘ２０５に対応する残基が、リジン、アルギニン、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、またはイソロイシン、特にアルギニンである；およびＸ２０６に対応する残基が、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、特にメチオニンまたはチロシンである、から選択される１つ以上の特徴をさらに有することができる。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列は、２、３、４、５、６つ以上の特徴を有することができる。いくつかの実施形態において、配列番号９５、９６、または１１９で与えられる配列式（またはその領域）に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドは、配列番号２、４または９８の参照配列と比較して変異されるＸによって指定されない１つ以上の残基をさらに有することができる。いくつかの実施形態において、変異は、上でＸによって定義されない他のアミノ酸残基における約１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の変異からであり得る。いくつかの実施形態において、変異の数は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の他のアミノ酸残基であり得る。いくつかの実施形態において、変異は保存的変異を含む。
【００９６】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載するようなＸ１９０に対応する残基に特徴を有する、配列番号９５、９６、もしくは１１９の配列式に基づくアミノ酸配列、またはその領域、例えば、残基９０〜２１１を含む立体選択性ケトレダクターゼポリペプチドは、次の特徴：Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、極性、非極性、または脂肪族残基、特にグルタミン、イソロイシン、またはロイシンである、およびＸ２０２に対応する残基が、脂肪族、芳香族、または非極性残基、特にトリプトファン、メチオニン、またはチロシンである、の１つ以上または少なくともすべてをさらに有することができる。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２、４または９８の参照配列と比較して他のアミノ酸残基に１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の残基相違をさらに有することができる。いくつかの実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基において１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。いくつかの実施形態において、相違は保存的変異を含む。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも先行する特徴を備えたアミノ酸配列を含み、アミノ酸配列は、先行する特徴を備えた配列番号２、４または９８に基づく参照配列に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。
【００９７】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載するようなＸ１９０に対応する残基に特徴を有する、配列番号９５、９６、もしくは１１９の配列式に基づくアミノ酸配列、またはその領域、例えば、残基９０〜２１１を含む立体選択性ケトレダクターゼポリペプチドは、次の特徴：Ｘ７に対応する残基が、芳香族、非極性、極性、拘束された、または塩基性残基、特にヒスチジン、トリプトファン、プロリン、トレオニン、またはアルギニンである；Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、極性、非極性、または脂肪族残基、特にグルタミン、イソロイシン、またはロイシンである；およびＸ２０２に対応する残基が、脂肪族、芳香族、または非極性残基、特にトリプトファン、メチオニン、またはチロシンである、の１つ以上または少なくともすべてをさらに有することができる。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２、４または９８の参照配列と比較して他のアミノ酸残基に１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の残基相違をさらに有することができる。いくつかの実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基において１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。いくつかの実施形態において、相違は保存的変異を含む。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも先行する特徴を備えたアミノ酸配列を含み、アミノ酸配列は、先行する特徴を備えた配列番号２、４または９８に基づく参照配列に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。
【００９８】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載するようなＸ１９０に対応する残基に特徴を有する、配列番号９５、９６、もしくは１１９の配列式に基づくアミノ酸配列、またはその領域、例えば、残基９０〜２１１を含む立体選択性ケトレダクターゼポリペプチドは、次の特徴：Ｘ７に対応する残基が、芳香族、非極性、極性、拘束された、または塩基性残基、特にヒスチジン、トリプトファン、プロリン、トレオニン、またはアルギニンである；Ｘ９７に対応する残基が、極性、非極性、脂肪族、または塩基性残基、特にメチオニン、バリン、イソロイシン、トレオニン、またはアルギニンである；Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、極性、非極性、または脂肪族残基、特にグルタミン、イソロイシン、またはロイシンである；Ｘ２０２に対応する残基が、脂肪族、芳香族、または非極性残基、特にトリプトファン、メチオニン、またはチロシンである、の１つ以上または少なくともすべてをさらに有することができる。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２、４または９８の参照配列と比較して他のアミノ酸残基に１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の残基相違をさらに有することができる。いくつかの実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基において１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。いくつかの実施形態において、相違は保存的変異を含む。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも先行する特徴を備えたアミノ酸配列を含み、アミノ酸配列は、先行する特徴を備えた配列番号２、４または９８に基づく参照配列に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。
【００９９】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載するようなＸ１９０に対応する残基に特徴を有する、配列番号９５、９６、もしくは１１９の配列式に基づくアミノ酸配列、またはその領域、例えば、残基９０〜２１１を含む立体選択性ケトレダクターゼポリペプチドは、次の特徴：Ｘ９４に対応する残基が、システイン、非極性または脂肪族残基、特にシステインまたはバリンである；Ｘ９６に対応する残基が、極性または酸性残基、特にトレオニンである；およびＸ１４７に対応する残基が、芳香族、極性、非極性、または脂肪族残基、特にグルタミン、イソロイシン、またはロイシンである、の１つ以上または少なくともすべてをさらに有することができる。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２、４または９８の参照配列と比較して他のアミノ酸残基に１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の残基相違をさらに有することができる。いくつかの実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基において１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。いくつかの実施形態において、相違は保存的変異を含む。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも先行する特徴を備えたアミノ酸配列を含み、アミノ酸配列は、先行する特徴を備えた配列番号２、４または９８に基づく参照配列に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。
【０１００】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載するようなＸ１９０に対応する残基に特徴を有する、配列番号９５、９６、もしくは１１９の配列式に基づくアミノ酸配列、またはその領域、例えば、残基９０〜２１１を含む立体選択性ケトレダクターゼポリペプチドは、次の特徴：Ｘ７に対応する残基が、芳香族、非極性、極性、拘束された、または塩基性残基、特にヒスチジン、トリプトファン、プロリン、トレオニン、またはアルギニンである；Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、極性、非極性、または脂肪族残基、特にグルタミン、イソロイシン、またはロイシンである；Ｘ１９６に対応する残基が、脂肪族、非極性、または芳香族残基、特にバリン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、またはイソロイシンである；およびＸ２０２に対応する残基が、脂肪族、芳香族、または非極性残基、特にトリプトファン、メチオニン、またはチロシンである、の１つ以上または少なくともすべてをさらに有することができる。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２、４または９８の参照配列と比較して他のアミノ酸残基に１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の残基相違をさらに有することができる。いくつかの実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基において１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。いくつかの実施形態において、相違は保存的変異を含む。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも先行する特徴を備えたアミノ酸配列を含み、アミノ酸配列は、先行する特徴を備えた配列番号２、４または９８に基づく参照配列に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。
【０１０１】
いくつかの実施形態において、立体選択性ケトレダクターゼポリペプチドは、本明細書に記載するようなＸ１９０に対応する残基に特徴を有する、配列番号９５、９６、もしくは１１９の配列式に基づくアミノ酸配列、またはその領域、例えば、残基９０〜２１１を含み、次の特徴：Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、極性、非極性、または脂肪族残基、特にグルタミン、イソロイシン、またはロイシンである；Ｘ１９６に対応する残基が、脂肪族、非極性、または芳香族残基、特にバリン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、またはイソロイシンである；およびＸ２０２に対応する残基が、脂肪族、芳香族、または非極性残基である、の１つ以上または少なくともすべてをさらに有することができる。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２、４または９８の参照配列と比較して他のアミノ酸残基に１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の残基相違をさらに有することができる。いくつかの実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基において１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。いくつかの実施形態において、相違は保存的変異を含む。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも先行する特徴を備えたアミノ酸配列を含み、アミノ酸配列は、先行する特徴を備えた配列番号２、４または９８に基づく参照配列に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。
【０１０２】
いくつかの実施形態において、立体選択性ケトレダクターゼポリペプチドは、本明細書に記載するようなＸ１９０に対応する残基に特徴を有する、配列番号９５、９６、もしくは１１９の配列式に基づくアミノ酸配列、またはその領域、例えば、残基９０〜２１１を含み、次の特徴：Ｘ７に対応する残基が、芳香族、非極性、極性、拘束された、または塩基性残基、特にヒスチジン、トリプトファン、プロリン、トレオニン、またはアルギニンである；Ｘ９６に対応する残基が、極性または酸性残基、特にトレオニンである；Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、極性、非極性、または脂肪族残基、特にグルタミン、イソロイシン、またはロイシンである；Ｘ１９６に対応する残基が、脂肪族、非極性、または芳香族残基、特にバリン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、またはイソロイシンである；およびＸ２０２に対応する残基が、脂肪族、芳香族、または非極性残基、特にトリプトファン、メチオニン、またはチロシンである、の１つ以上または少なくともすべてをさらに有することができる。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２、４または９８の参照配列と比較して他のアミノ酸残基に１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の残基相違をさらに有することができる。いくつかの実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基において１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。いくつかの実施形態において、相違は保存的変異を含む。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも先行する特徴を備えたアミノ酸配列を含み、アミノ酸配列は、先行する特徴を備えた配列番号２、４または９８に基づく参照配列に関して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、改良されたケトレダクターゼは、配列番号９５、９６、もしくは１１９の配列式に基づくアミノ酸配列、またはその領域、例えば、残基９０〜２１１を含み、アミノ酸配列は、少なくとも次の特徴：Ｘ１９０に対応する残基が、非芳香族残基、特にアラニン、イソロイシン、システイン、またはプロリンである、およびＸ７に対応する残基が、芳香族、非極性、極性、拘束、または塩基性残基、特にヒスチジン、トリプトファン、プロリン、トレオニン、またはアルギニンである、を有する。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２、４または９８の参照配列と比較して他のアミノ酸残基に１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の残基相違をさらに有することができる。いくつかの実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基において１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。いくつかの実施形態において、相違は保存的変異を含む。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも先行する特徴を備えたアミノ酸配列を含み、アミノ酸配列は、先行する特徴を備えた配列番号２、４または９８に基づく参照配列に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。
【０１０４】
いくつかの実施形態において、改良されたケトレダクターゼは、配列番号９５、９６、もしくは１１９の配列式に基づくアミノ酸配列、またはその領域、例えば、残基９０〜２１１を含み、アミノ酸配列は、少なくとも次の特徴：Ｘ１９０に対応する残基が、非芳香族残基、特にアラニン、イソロイシン、システイン、またはプロリンである、およびＸ１６に対応する残基が、極性残基、特にセリンである、を有する。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２、４または９８の参照配列と比較して他のアミノ酸残基に１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の残基相違をさらに有することができる。いくつかの実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基において１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。いくつかの実施形態において、相違は保存的変異を含む。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも先行する特徴を備えたアミノ酸配列を含み、アミノ酸配列は、先行する特徴を備えた配列番号２、４または９８に基づく参照配列に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。
【０１０５】
いくつかの実施形態において、改良されたケトレダクターゼは、配列番号９５、９６、もしくは１１９の配列式に基づくアミノ酸配列、またはその領域、例えば、残基９０〜２１１を含み、アミノ酸配列は、少なくとも次の特徴：Ｘ１９０に対応する残基が、非芳香族残基、特にアラニン、イソロイシン、システイン、またはプロリンである、およびＸ４３に対応する残基が、非極性または脂肪族残基、特にイソロイシンである、を有する。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２、４または９８の参照配列と比較して他のアミノ酸残基に１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の残基相違をさらに有することができる。いくつかの実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基において１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。いくつかの実施形態において、相違は保存的変異を含む。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも先行する特徴を備えたアミノ酸配列を含み、アミノ酸配列は、先行する特徴を備えた配列番号２、４または９８に基づく参照配列に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。
【０１０６】
いくつかの実施形態において、改良されたケトレダクターゼは、配列番号９５、９６、もしくは１１９の配列式に基づくアミノ酸配列、またはその領域、例えば、残基９０〜２１１を含み、アミノ酸配列は、少なくとも次の特徴：Ｘ１９０に対応する残基が、非芳香族残基、特にアラニン、イソロイシン、システイン、またはプロリンである、およびＸ６０に対応する残基が、芳香族、非極性または脂肪族残基、特にアラニンである、を有する。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２、４または９８の参照配列と比較して他のアミノ酸残基に１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の残基相違をさらに有することができる。いくつかの実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基において１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。いくつかの実施形態において、相違は保存的変異を含む。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも先行する特徴を備えたアミノ酸配列を含み、アミノ酸配列は、先行する特徴を備えた配列番号２、４または９８に基づく参照配列に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、改良されたケトレダクターゼは、配列番号９５、９６、もしくは１１９の配列式に基づくアミノ酸配列、またはその領域、例えば、残基９０〜２１１を含み、アミノ酸配列は、少なくとも次の特徴：Ｘ１９０に対応する残基が、非芳香族残基、特にアラニン、イソロイシン、システイン、またはプロリンである、およびＸ９４に対応する残基が、システイン、非極性または脂肪族残基、特にシステインまたはバリンである、を有する。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２、４または９８の参照配列と比較して他のアミノ酸残基に１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の残基相違をさらに有することができる。いくつかの実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基において１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。いくつかの実施形態において、相違は保存的変異を含む。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも先行する特徴を備えたアミノ酸配列を含み、アミノ酸配列は、先行する特徴を備えた配列番号２、４または９８に基づく参照配列に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。
【０１０８】
いくつかの実施形態において、改良されたケトレダクターゼは、配列番号９５、９６、もしくは１１９の配列式に基づくアミノ酸配列、またはその領域、例えば、残基９０〜２１１を含み、アミノ酸配列は、少なくとも次の特徴：Ｘ１９０に対応する残基が、非芳香族残基、特にアラニン、イソロイシン、システイン、またはプロリンである、およびＸ９５に対応する残基が、非極性または脂肪族残基、特にロイシンまたはイソロイシンである、を有する。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２、４または９８の参照配列と比較して他のアミノ酸残基に１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の残基相違をさらに有することができる。いくつかの実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基において１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。いくつかの実施形態において、相違は保存的変異を含む。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも先行する特徴を備えたアミノ酸配列を含み、アミノ酸配列は、先行する特徴を備えた配列番号２、４または９８に基づく参照配列に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。
【０１０９】
いくつかの実施形態において、改良されたケトレダクターゼは、配列番号９５、９６、もしくは１１９の配列式に基づくアミノ酸配列、またはその領域、例えば、残基９０〜２１１を含み、アミノ酸配列は、少なくとも次の特徴：Ｘ１９０に対応する残基が、非芳香族残基、特にアラニン、イソロイシン、システイン、またはプロリンである、およびＸ９６に対応する残基が、極性または酸性残基、特にトレオニンまたはグルタミン酸である、を有する。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２、４または９８の参照配列と比較して他のアミノ酸残基に１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の残基相違をさらに有することができる。いくつかの実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基において１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。いくつかの実施形態において、相違は保存的変異を含む。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも先行する特徴を備えたアミノ酸配列を含み、アミノ酸配列は、先行する特徴を備えた配列番号２、４または９８に基づく参照配列に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。
【０１１０】
いくつかの実施形態において、改良されたケトレダクターゼは、配列番号９５、９６、もしくは１１９の配列式に基づくアミノ酸配列、またはその領域、例えば、残基９０〜２１１を含み、アミノ酸配列は、少なくとも次の特徴：Ｘ１９０に対応する残基が、非芳香族残基、特にアラニン、イソロイシン、システイン、またはプロリンである、およびＸ９７に対応する残基が、極性、非極性、脂肪族、または塩基性残基、特にメチオニン、バリン、イソロイシン、トレオニン、またはアルギニンである、を有する。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２、４または９８の参照配列と比較して他のアミノ酸残基に１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の残基相違をさらに有することができる。いくつかの実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基において１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。いくつかの実施形態において、相違は保存的変異を含む。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも先行する特徴を備えたアミノ酸配列を含み、アミノ酸配列は、先行する特徴を備えた配列番号２、４または９８に基づく参照配列に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。
【０１１１】
いくつかの実施形態において、改良されたケトレダクターゼは、配列番号９５、９６、もしくは１１９の配列式に基づくアミノ酸配列、またはその領域、例えば、残基９０〜２１１を含み、アミノ酸配列は、少なくとも次の特徴：Ｘ１９０に対応する残基が、非芳香族残基、特にアラニン、イソロイシン、システイン、またはプロリンである、およびＸ１２０に対応する残基が、芳香族、非極性または脂肪族残基、特にバリンである、を有する。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２、４または９８の参照配列と比較して他のアミノ酸残基に１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の残基相違をさらに有することができる。いくつかの実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基において１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。いくつかの実施形態において、相違は保存的変異を含む。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも先行する特徴を備えたアミノ酸配列を含み、アミノ酸配列は、先行する特徴を備えた配列番号２、４または９８に基づく参照配列に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。
【０１１２】
いくつかの実施形態において、改良されたケトレダクターゼは、配列番号９５、９６、もしくは１１９の配列式に基づくアミノ酸配列、またはその領域、例えば、残基９０〜２１１を含み、アミノ酸配列は、少なくとも次の特徴：Ｘ１９０に対応する残基が、非芳香族残基、特にアラニン、イソロイシン、システイン、またはプロリンである、およびＸ１２５に対応する残基が、極性または非極性残基、特にセリンである、を有する。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２、４または９８の参照配列と比較して他のアミノ酸残基に１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の残基相違をさらに有することができる。いくつかの実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基において１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。いくつかの実施形態において、相違は保存的変異を含む。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも先行する特徴を備えたアミノ酸配列を含み、アミノ酸配列は、先行する特徴を備えた配列番号２、４または９８に基づく参照配列に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。
【０１１３】
いくつかの実施形態において、改良されたケトレダクターゼは、配列番号９５、９６、もしくは１１９の配列式に基づくアミノ酸配列、またはその領域、例えば、残基９０〜２１１を含み、アミノ酸配列は、少なくとも次の特徴：Ｘ１９０に対応する残基が、非芳香族残基、特にアラニン、イソロイシン、システイン、またはプロリンである、およびＸ１４２に対応する残基が、極性残基、特にアスパラギンである、を有する。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２、４または９８の参照配列と比較して他のアミノ酸残基に１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の残基相違をさらに有することができる。いくつかの実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基において１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。いくつかの実施形態において、相違は保存的変異を含む。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも先行する特徴を備えたアミノ酸配列を含み、アミノ酸配列は、先行する特徴を備えた配列番号２、４または９８に基づく参照配列に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。
【０１１４】
いくつかの実施形態において、改良されたケトレダクターゼは、配列番号９５、９６、もしくは１１９の配列式に基づくアミノ酸配列、またはその領域、例えば、残基９０〜２１１を含み、アミノ酸配列は、少なくとも次の特徴：Ｘ１９０に対応する残基が、非芳香族残基、特にアラニン、イソロイシン、システイン、またはプロリンである、およびＸ１４７に対応する残基が、芳香族、極性、非極性または脂肪族残基、特にグルタミン、ロイシンまたはイソロイシンである、を有する。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２、４または９８の参照配列と比較して他のアミノ酸残基に１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の残基相違をさらに有することができる。いくつかの実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基において１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。いくつかの実施形態において、相違は保存的変異を含む。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも先行する特徴を備えたアミノ酸配列を含み、アミノ酸配列は、先行する特徴を備えた配列番号２、４または９８に基づく参照配列に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。
【０１１５】
いくつかの実施形態において、改良されたケトレダクターゼは、配列番号９５、９６、もしくは１１９の配列式に基づくアミノ酸配列、またはその領域、例えば、残基９０〜２１１を含み、アミノ酸配列は、少なくとも次の特徴：Ｘ１９０に対応する残基が、非芳香族残基、特にアラニン、イソロイシン、システイン、またはプロリンである、およびＸ１４９に対応する残基が、非極性または芳香族残基、特にフェニルアラニンである、を有する。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２、４または９８の参照配列と比較して他のアミノ酸残基に１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の残基相違をさらに有することができる。いくつかの実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基において１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。いくつかの実施形態において、相違は保存的変異を含む。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも先行する特徴を備えたアミノ酸配列を含み、アミノ酸配列は、先行する特徴を備えた配列番号２、４または９８に基づく参照配列に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。
【０１１６】
いくつかの実施形態において、改良されたケトレダクターゼは、配列番号９５、９６、もしくは１１９の配列式に基づくアミノ酸配列、またはその領域、例えば、残基９０〜２１１を含み、アミノ酸配列は、少なくとも次の特徴：Ｘ１９０に対応する残基が、非芳香族残基、特にアラニン、イソロイシン、システイン、またはプロリンである、およびＸ１５０に対応する残基が、拘束されたまたは酸性残基、特にヒスチジンである、を有する。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２、４または９８の参照配列と比較して他のアミノ酸残基に１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の残基相違をさらに有することができる。いくつかの実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基において１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。いくつかの実施形態において、相違は保存的変異を含む。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも先行する特徴を備えたアミノ酸配列を含み、アミノ酸配列は、先行する特徴を備えた配列番号２、４または９８に基づく参照配列に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。
【０１１７】
いくつかの実施形態において、改良されたケトレダクターゼは、配列番号９５、９６、もしくは１１９の配列式に基づくアミノ酸配列、またはその領域、例えば、残基９０〜２１１を含み、アミノ酸配列は、少なくとも次の特徴：Ｘ１９０に対応する残基が、非芳香族残基、特にアラニン、イソロイシン、システイン、またはプロリンである、およびＸ１５２に対応する残基が、非極性または極性残基、特にメチオニンである、を有する。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２、４または９８の参照配列と比較して他のアミノ酸残基に１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の残基相違をさらに有することができる。いくつかの実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基において１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。いくつかの実施形態において、相違は保存的変異を含む。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも先行する特徴を備えたアミノ酸配列を含み、アミノ酸配列は、先行する特徴を備えた配列番号２、４または９８に基づく参照配列に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。
【０１１８】
いくつかの実施形態において、改良されたケトレダクターゼは、配列番号９５、９６、もしくは１１９の配列式に基づくアミノ酸配列、またはその領域、例えば、残基９０〜２１１を含み、アミノ酸配列は、少なくとも次の特徴：Ｘ１９０に対応する残基が、非芳香族残基、特にアラニン、イソロイシン、システイン、またはプロリンである、およびＸ１９６に対応する残基が、脂肪族、非極性または芳香族残基、特にメチオニン、イソロイシン、ロイシン、またはフェニルアラニンである、を有する。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２、４または９８の参照配列と比較して他のアミノ酸残基に１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の残基相違をさらに有することができる。いくつかの実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基において１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。いくつかの実施形態において、相違は保存的変異を含む。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも先行する特徴を備えたアミノ酸配列を含み、アミノ酸配列は、先行する特徴を備えた配列番号２、４または９８に基づく参照配列に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。
【０１１９】
いくつかの実施形態において、改良されたケトレダクターゼは、配列番号９５、９６、もしくは１１９の配列式に基づくアミノ酸配列、またはその領域、例えば、残基９０〜２１１を含み、アミノ酸配列は、少なくとも次の特徴：Ｘ１９０に対応する残基が、非芳香族残基、特にアラニン、イソロイシン、システイン、またはプロリンである、およびＸ２０２に対応する残基が、脂肪族、芳香族、または非極性残基、特にメチオニン、チロシンまたはトリプトファンである、を有する。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２、４または９８の参照配列と比較して他のアミノ酸残基に１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の残基相違をさらに有することができる。いくつかの実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基において１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。いくつかの実施形態において、相違は保存的変異を含む。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも先行する特徴を備えたアミノ酸配列を含み、アミノ酸配列は、先行する特徴を備えた配列番号２、４または９８に基づく参照配列に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。
【０１２０】
いくつかの実施形態において、改良されたケトレダクターゼは、配列番号９５、９６、もしくは１１９の配列式に基づくアミノ酸配列、またはその領域、例えば、残基９０〜２１１を含み、アミノ酸配列は、少なくとも次の特徴：Ｘ１９０に対応する残基が、非芳香族残基、特にアラニン、イソロイシン、システイン、またはプロリンである、およびＸ２０５に対応する残基が、塩基性、非極性または脂肪族残基、特にアルギニンまたはバリンである、を有する。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２、４または９８の参照配列と比較して他のアミノ酸残基に１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の残基相違をさらに有することができる。いくつかの実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基において１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。いくつかの実施形態において、相違は保存的変異を含む。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも先行する特徴を備えたアミノ酸配列を含み、アミノ酸配列は、先行する特徴を備えた配列番号２、４または９８に基づく参照配列に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。
【０１２１】
いくつかの実施形態において、改良されたケトレダクターゼは、配列番号９５、９６、もしくは１１９の配列式に基づくアミノ酸配列、またはその領域、例えば、残基９０〜２１１を含み、アミノ酸配列は、少なくとも次の特徴：Ｘ１９０に対応する残基が、非芳香族残基、特にアラニン、イソロイシン、システイン、またはプロリンである、およびＸ２０６に対応する残基が、非極性または芳香族残基、特にチロシンである、を有する。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２、４または９８の参照配列と比較して他のアミノ酸残基に１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の残基相違をさらに有することができる。いくつかの実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基において１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。いくつかの実施形態において、相違は保存的変異を含む。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも先行する特徴を備えたアミノ酸配列を含み、アミノ酸配列は、先行する特徴を備えた配列番号２、４または９８に基づく参照配列に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。
【０１２２】
いくつかの実施形態において、本開示の改良されたケトレダクターゼポリペプチドは、下の表２に挙げた変異のセットのいずれか１つを有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、および９４から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有し、ケトレダクターゼポリペプチドアミノ酸配列は、表２に挙げた置換組み合せのセットのいずれか１つを含む。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、参照配列と比較して他のアミノ酸残基に１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の残基相違をさらに有することができる。いくつかの実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基において１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。いくつかの実施形態において、相違は保存的変異を含む。
【０１２３】
いくつかの実施形態において、改良されたケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、および９４から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０１２４】
いくつかの実施形態において、改良されたケトレダクターゼは、配列番号９５、９６、もしくは１１９の配列式に基づくアミノ酸配列、またはその領域、例えば、残基９０〜２１１を含み、アミノ酸配列は、少なくとも次の特徴：Ｘ１９０に対応する残基が、非芳香族残基、特にアラニン、イソロイシン、システイン、またはプロリンである、およびＸ１９６に対応する残基が、脂肪族、非極性または芳香族残基、特にメチオニン、イソロイシン、ロイシン、またはフェニルアラニンである、を有する。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号８、１０、１４、１６、２４、２６または４８などの先行する特徴を備えた配列番号２、４または９８の参照配列と比較して他の残基位置に１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の残基相違をさらに有することができる。いくつかの実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基において１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。いくつかの実施形態において、相違は保存的変異を含む。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、先行する特徴を備えたアミノ酸配列を含み、アミノ酸配列は、先行する特徴（例えば、配列番号８、１０、１４、１６、２４、２６または４８）を備えた配列番号２、４または９８に基づく参照配列に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。
【０１２５】
いくつかの実施形態において、改良されたケトレダクターゼは、配列番号９５、９６、もしくは１１９の配列式に基づくアミノ酸配列、またはその領域、例えば、残基９０〜２１１を含み、アミノ酸配列は、少なくとも次の特徴：Ｘ１９０に対応する残基が、非芳香族残基、特にアラニン、イソロイシン、システイン、またはプロリンである；Ｘ１２５に対応する残基が、極性または非極性残基、特にセリンである；およびＸ１９６に対応する残基が、脂肪族、非極性または芳香族残基、特にメチオニン、イソロイシン、ロイシン、またはフェニルアラニンである、を有する。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号５２などの先行する特徴を備えた配列番号２、４または９８の参照配列と比較して他の残基位置に１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の残基相違をさらに有することができる。いくつかの実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基において１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。いくつかの実施形態において、相違は保存的変異を含む。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、先行する特徴を備えたアミノ酸配列を含み、アミノ酸配列は、先行する特徴（例えば、配列番号５２）を備えた配列番号２、４または９８に基づく参照配列に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。
【０１２６】
いくつかの実施形態において、改良されたケトレダクターゼは、配列番号９５、９６、もしくは１１９の配列式に基づくアミノ酸配列、またはその領域、例えば、残基９０〜２１１を含み、アミノ酸配列は、少なくとも次の特徴：Ｘ１９０に対応する残基が、非芳香族残基、特にアラニン、イソロイシン、システイン、またはプロリンである；Ｘ９５に対応する残基が、非極性または脂肪族残基、特にロイシンまたはイソロイシンである；およびＸ１９６に対応する残基が、脂肪族、非極性または芳香族残基、特にメチオニン、イソロイシン、ロイシン、またはフェニルアラニンである、を有する。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２０、６２、または６４などの先行する特徴を備えた配列番号２、４または９８の参照配列と比較して他の残基位置に１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の残基相違をさらに有することができる。いくつかの実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基において１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。いくつかの実施形態において、相違は保存的変異を含む。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、先行する特徴を備えたアミノ酸配列を含み、アミノ酸配列は、先行する特徴（例えば、配列番号２０、６２、または６４）を備えた配列番号２、４または９８に基づく参照配列に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。
【０１２７】
いくつかの実施形態において、改良されたケトレダクターゼは、配列番号９５、９６、もしくは１１９の配列式に基づくアミノ酸配列、またはその領域、例えば、残基９０〜２１１を含み、アミノ酸配列は、少なくとも次の特徴：Ｘ１９０に対応する残基が、非芳香族残基、特にアラニン、イソロイシン、システイン、またはプロリンである；Ｘ１９６に対応する残基が、脂肪族、非極性または芳香族残基、特にメチオニン、イソロイシン、ロイシン、またはフェニルアラニンである；およびＸ２０６に対応する残基が、非極性または芳香族残基、特にチロシンである、を有する。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号３６などの先行する特徴を備えた配列番号２、４または９８の参照配列と比較して他の残基位置に１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の残基相違をさらに有することができる。いくつかの実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基において１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。いくつかの実施形態において、相違は保存的変異を含む。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、先行する特徴を備えたアミノ酸配列を含み、アミノ酸配列は、先行する特徴（例えば、配列番号３６）を備えた配列番号２、４または９８に基づく参照配列に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。
【０１２８】
いくつかの実施形態において、改良されたケトレダクターゼは、配列番号９５、９６、もしくは１１９の配列式に基づくアミノ酸配列、またはその領域、例えば、残基９０〜２１１を含み、アミノ酸配列は、少なくとも次の特徴：Ｘ１９０に対応する残基が、非芳香族残基、特にアラニン、イソロイシン、システイン、またはプロリンである；Ｘ７に対応する残基が、芳香族、非極性、極性、拘束、または塩基性残基、特にヒスチジン、トリプトファン、プロリン、トレオニン、またはアルギニンである；およびＸ１９６に対応する残基が、脂肪族、非極性または芳香族残基、特にメチオニン、イソロイシン、ロイシン、またはフェニルアラニンである、を有する。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号５４または５６などの先行する特徴を備えた配列番号２、４または９８の参照配列と比較して他の残基位置に１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の残基相違をさらに有することができる。いくつかの実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基において１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。いくつかの実施形態において、相違は保存的変異を含む。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、先行する特徴を備えたアミノ酸配列を含み、アミノ酸配列は、先行する特徴（例えば、配列番号５４または５６）を備えた配列番号２、４または９８に基づく参照配列に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。
【０１２９】
いくつかの実施形態において、改良されたケトレダクターゼは、配列番号９５、９６、もしくは１１９の配列式に基づくアミノ酸配列、またはその領域、例えば、残基９０〜２１１を含み、アミノ酸配列は、少なくとも次の特徴：Ｘ１９０に対応する残基が、非芳香族残基、特にアラニン、イソロイシン、システイン、またはプロリンである；Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、極性、非極性、または脂肪族残基、特にグルタミン、ロイシン、またはイソロイシンである；およびＸ１９６に対応する残基が、脂肪族、非極性または芳香族残基、特にメチオニン、イソロイシン、ロイシン、またはフェニルアラニンである、を有する。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２２、６６、６８または７２などの先行する特徴を備えた配列番号２、４または９８の参照配列と比較して他の残基位置に１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の残基相違をさらに有することができる。いくつかの実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基において１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。いくつかの実施形態において、相違は保存的変異を含む。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、先行する特徴を備えたアミノ酸配列を含み、アミノ酸配列は、先行する特徴（例えば、配列番号２２、６６、６８または７２）を備えた配列番号２、４または９８に基づく参照配列に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。
【０１３０】
いくつかの実施形態において、改良されたケトレダクターゼは、配列番号９５、９６、もしくは１１９の配列式に基づくアミノ酸配列、またはその領域、例えば、残基９０〜２１１を含み、アミノ酸配列は、少なくとも次の特徴：Ｘ１９０に対応する残基が、非芳香族残基、特にアラニン、イソロイシン、システイン、またはプロリンである；Ｘ１９６に対応する残基が、脂肪族、非極性または芳香族残基、特にメチオニン、イソロイシン、ロイシン、またはフェニルアラニンである；およびＸ２０２に対応する残基が、脂肪族、芳香族、または非極性残基、特にメチオニン、チロシン、またはトリプトファンである、を有する。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２８、３０、または３２などの先行する特徴を備えた配列番号２、４または９８の参照配列と比較して他の残基位置に１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の残基相違をさらに有することができる。いくつかの実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基において１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。いくつかの実施形態において、相違は保存的変異を含む。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、先行する特徴を備えたアミノ酸配列を含み、アミノ酸配列は、先行する特徴（例えば、配列番号２８、３０、または３２）を備えた配列番号２、４または９８に基づく参照配列に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。
【０１３１】
いくつかの実施形態において、改良されたケトレダクターゼは、配列番号９５、９６、もしくは１１９の配列式に基づくアミノ酸配列、またはその領域、例えば、残基９０〜２１１を含み、アミノ酸配列は、少なくとも次の特徴：Ｘ１９０に対応する残基が、非芳香族残基、特にアラニン、イソロイシン、システイン、またはプロリンである；Ｘ１５２に対応する残基が、非極性または極性残基、特にメチオニンである；Ｘ１９６に対応する残基が、脂肪族、非極性または芳香族残基、特にメチオニン、イソロイシン、ロイシン、またはフェニルアラニンである；およびＸ２０５に対応する残基が、塩基性、非極性または脂肪族残基、特にアルギニンまたはバリンである、を有する。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２０などの先行する特徴を備えた配列番号２、４または９８の参照配列と比較して他の残基位置に１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の残基相違をさらに有することができる。いくつかの実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基において１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。いくつかの実施形態において、相違は保存的変異を含む。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、先行する特徴を備えたアミノ酸配列を含み、アミノ酸配列は、先行する特徴（例えば、配列番号２０）を備えた配列番号２、４または９８に基づく参照配列に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。
【０１３２】
いくつかの実施形態において、改良されたケトレダクターゼは、配列番号９５、９６、もしくは１１９の配列式に基づくアミノ酸配列、またはその領域、例えば、残基９０〜２１１を含み、アミノ酸配列は、少なくとも次の特徴：Ｘ１９０に対応する残基が、非芳香族残基、特にアラニン、イソロイシン、システイン、またはプロリンである；Ｘ４３に対応する残基が、非極性または脂肪族残基、特にイソロイシンである；Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、極性、非極性、または脂肪族残基、特にグルタミン、ロイシン、またはイソロイシンである；およびＸ１９６に対応する残基が、脂肪族、非極性または芳香族残基、特にメチオニン、イソロイシン、ロイシン、またはフェニルアラニンである、を有する。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号７０などの先行する特徴を備えた配列番号２、４または９８の参照配列と比較して他の残基位置に１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の残基相違をさらに有することができる。いくつかの実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基において１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。いくつかの実施形態において、相違は保存的変異を含む。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、先行する特徴を備えたアミノ酸配列を含み、アミノ酸配列は、先行する特徴（例えば、配列番号７０）を備えた配列番号２、４または９８に基づく参照配列に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。
【０１３３】
いくつかの実施形態において、改良されたケトレダクターゼは、配列番号９５、９６、もしくは１１９の配列式に基づくアミノ酸配列、またはその領域、例えば、残基９０〜２１１を含み、アミノ酸配列は、少なくとも次の特徴：Ｘ１９０に対応する残基が、非芳香族残基、特にアラニン、イソロイシン、システイン、またはプロリンである；Ｘ９４に対応する残基が、システイン、非極性または脂肪族残基、特にシステインまたはバリンである；Ｘ１９６に対応する残基が、脂肪族、非極性または芳香族残基、特にメチオニン、イソロイシン、ロイシン、またはフェニルアラニンである；およびＸ２０５に対応する残基が、芳香族、極性、非極性、または脂肪族残基、特にグルタミン、ロイシン、またはイソロイシンである、を有する。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号３４などの先行する特徴を備えた配列番号２、４または９８の参照配列と比較して他の残基位置に１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の残基相違をさらに有することができる。いくつかの実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基において１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。いくつかの実施形態において、相違は保存的変異を含む。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、先行する特徴を備えたアミノ酸配列を含み、アミノ酸配列は、先行する特徴（例えば、配列番号３４）を備えた配列番号２、４または９８に基づく参照配列に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。
【０１３４】
いくつかの実施形態において、改良されたケトレダクターゼは、配列番号９５、９６、もしくは１１９の配列式に基づくアミノ酸配列、またはその領域、例えば、残基９０〜２１１を含み、アミノ酸配列は、少なくとも次の特徴：Ｘ１９０に対応する残基が、非芳香族残基、特にアラニン、イソロイシン、システイン、またはプロリンである；Ｘ９７に対応する残基が、極性、非極性、脂肪族または塩基性残基、特にアルギニン、バリン、メチオニン、トレオニンまたはイソロイシンである；Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、極性、非極性、または脂肪族残基、特にグルタミン、ロイシン、またはイソロイシンである；およびＸ１９６に対応する残基が、脂肪族、非極性または芳香族残基、特にメチオニン、イソロイシン、ロイシン、またはフェニルアラニンである、を有する。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号７４などの先行する特徴を備えた配列番号２、４または９８の参照配列と比較して他の残基位置に１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の残基相違をさらに有することができる。いくつかの実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基において１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。いくつかの実施形態において、相違は保存的変異を含む。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、先行する特徴を備えたアミノ酸配列を含み、アミノ酸配列は、先行する特徴（例えば、配列番号７４）を備えた配列番号２、４または９８に基づく参照配列に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。
【０１３５】
いくつかの実施形態において、改良されたケトレダクターゼは、配列番号９５、９６、もしくは１１９の配列式に基づくアミノ酸配列、またはその領域、例えば、残基９０〜２１１を含み、アミノ酸配列は、少なくとも次の特徴：Ｘ１９０に対応する残基が、非芳香族残基、特にアラニン、イソロイシン、システイン、またはプロリンである；Ｘ７に対応する残基が、芳香族、非極性、極性、拘束、または塩基性残基、特にヒスチジン、トレオニン、プロリン、トリプトファン、またはアルギニンである；Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、極性、非極性、または脂肪族残基、特にグルタミン、ロイシン、またはイソロイシンである；Ｘ１９６に対応する残基が、脂肪族、非極性または芳香族残基、特にメチオニン、イソロイシン、ロイシン、またはフェニルアラニンである；およびＸ２０２に対応する残基が、脂肪族、芳香族、または非極性残基、特にメチオニン、チロシン、またはトリプトファンである、を有する。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号４０、７６、７８、８０、または８２などの先行する特徴を備えた配列番号２、４または９８の参照配列と比較して他の残基位置に１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の残基相違をさらに有することができる。いくつかの実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基において１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。いくつかの実施形態において、相違は保存的変異を含む。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、先行する特徴を備えたアミノ酸配列を含み、アミノ酸配列は、先行する特徴（例えば、配列番号４０、７６、７８、８０、または８２）を備えた配列番号２、４または９８に基づく参照配列に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。
【０１３６】
いくつかの実施形態において、改良されたケトレダクターゼは、配列番号９５、９６、もしくは１１９の配列式に基づくアミノ酸配列、またはその領域、例えば、残基９０〜２１１を含み、アミノ酸配列は、少なくとも次の特徴：Ｘ１９０に対応する残基が、非芳香族残基、特にアラニン、イソロイシン、システイン、またはプロリンである；Ｘ７に対応する残基が、芳香族、非極性、極性、拘束、または塩基性残基、特にヒスチジン、トレオニン、プロリン、トリプトファン、またはアルギニンである；Ｘ９４に対応する残基が、システイン、非極性または脂肪族残基、特にシステインまたはバリンである；Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、極性、非極性、または脂肪族残基、特にグルタミン、ロイシン、またはイソロイシンである；Ｘ１９６に対応する残基が、脂肪族、非極性または芳香族残基、特にメチオニン、イソロイシン、ロイシン、またはフェニルアラニンである；およびＸ２０２に対応する残基が、脂肪族、芳香族、または非極性残基、特にメチオニン、チロシン、またはトリプトファンである、を有する。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号４２などの先行する特徴を備えた配列番号２、４または９８の参照配列と比較して他の残基位置に１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の残基相違をさらに有することができる。いくつかの実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基において１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。いくつかの実施形態において、相違は保存的変異を含む。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、先行する特徴を備えたアミノ酸配列を含み、アミノ酸配列は、先行する特徴（例えば、配列番号４２）を備えた配列番号２、４または９８に基づく参照配列に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。
【０１３７】
いくつかの実施形態において、改良されたケトレダクターゼは、配列番号９５、９６、もしくは１１９の配列式に基づくアミノ酸配列、またはその領域、例えば、残基９０〜２１１を含み、アミノ酸配列は、少なくとも次の特徴：Ｘ１９０に対応する残基が、非芳香族残基、特にアラニン、イソロイシン、システイン、またはプロリンである；Ｘ７に対応する残基が、芳香族、非極性、極性、拘束、または塩基性残基、特にヒスチジン、トレオニン、プロリン、トリプトファン、またはアルギニンである；Ｘ９４に対応する残基が、システイン、非極性または脂肪族残基、特にシステインまたはバリンである；Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、極性、非極性、または脂肪族残基、特にグルタミン、ロイシン、またはイソロイシンである；Ｘ１４９に対応する残基が、非極性または芳香族残基、特にフェニルアラニンである；Ｘ１５０に対応する残基が、拘束または酸性残基、特にヒスチジンである；Ｘ１９６に対応する残基が、脂肪族、非極性または芳香族残基、特にメチオニン、イソロイシン、ロイシン、またはフェニルアラニンである；およびＸ２０２に対応する残基が、脂肪族、芳香族、または非極性残基、特にメチオニン、チロシン、またはトリプトファンである、を有する。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号８４などの先行する特徴を備えた配列番号２、４または９８の参照配列と比較して他の残基位置に１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の残基相違をさらに有することができる。いくつかの実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基において１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。いくつかの実施形態において、相違は保存的変異を含む。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、先行する特徴を備えたアミノ酸配列を含み、アミノ酸配列は、先行する特徴（例えば、配列番号８４）を備えた配列番号２、４または９８に基づく参照配列に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。
【０１３８】
いくつかの実施形態において、改良されたケトレダクターゼは、配列番号９５、９６、もしくは１１９の配列式に基づくアミノ酸配列、またはその領域、例えば、残基９０〜２１１を含み、アミノ酸配列は、少なくとも次の特徴：Ｘ１９０に対応する残基が、非芳香族残基、特にアラニン、イソロイシン、システイン、またはプロリンである；Ｘ７に対応する残基が、芳香族、非極性、極性、拘束、または塩基性残基、特にヒスチジン、トレオニン、プロリン、トリプトファン、またはアルギニンである；Ｘ９６に対応する残基が、極性または酸性残基、特にトレオニンまたはグルタミン酸である；Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、極性、非極性、または脂肪族残基、特にグルタミン、ロイシン、またはイソロイシンである；Ｘ１９６に対応する残基が、脂肪族、非極性または芳香族残基、特にメチオニン、イソロイシン、ロイシン、またはフェニルアラニンである；およびＸ２０２に対応する残基が、脂肪族、芳香族、または非極性残基、特にメチオニン、チロシン、またはトリプトファンである、を有する。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号４４または４６などの先行する特徴を備えた配列番号２、４または９８の参照配列と比較して他の残基位置に１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の残基相違をさらに有することができる。いくつかの実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基において１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。いくつかの実施形態において、相違は保存的変異を含む。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、先行する特徴を備えたアミノ酸配列を含み、アミノ酸配列は、先行する特徴（例えば、配列番号４４または４６）を備えた配列番号２、４または９８に基づく参照配列に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。
【０１３９】
いくつかの実施形態において、改良されたケトレダクターゼは、配列番号９５、９６、もしくは１１９の配列式に基づくアミノ酸配列、またはその領域、例えば、残基９０〜２１１を含み、アミノ酸配列は、少なくとも次の特徴：Ｘ１９０に対応する残基が、非芳香族残基、特にアラニン、イソロイシン、システイン、またはプロリンである；Ｘ７に対応する残基が、芳香族、非極性、極性、拘束、または塩基性残基、特にヒスチジン、トレオニン、プロリン、トリプトファン、またはアルギニンである；Ｘ９６に対応する残基が、極性または酸性残基、特にトレオニンまたはグルタミン酸である；Ｘ１２０に対応する残基が、芳香族、非極性または脂肪族残基、特にバリンである；Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、極性、非極性、または脂肪族残基、特にグルタミン、ロイシン、またはイソロイシンである；Ｘ１９６に対応する残基が、脂肪族、非極性または芳香族残基、特にメチオニン、イソロイシン、ロイシン、またはフェニルアラニンである；およびＸ２０２に対応する残基が、脂肪族、芳香族、または非極性残基、特にメチオニン、チロシン、またはトリプトファンである、を有する。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号８６などの先行する特徴を備えた配列番号２、４または９８の参照配列と比較して他の残基位置に１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の残基相違をさらに有することができる。いくつかの実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基において１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。いくつかの実施形態において、相違は保存的変異を含む。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、先行する特徴を備えたアミノ酸配列を含み、アミノ酸配列は、先行する特徴（例えば、配列番号８６）を備えた配列番号２、４または９８に基づく参照配列に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。
【０１４０】
いくつかの実施形態において、改良されたケトレダクターゼは、配列番号９５、９６、もしくは１１９の配列式に基づくアミノ酸配列、またはその領域、例えば、残基９０〜２１１を含み、アミノ酸配列は、少なくとも次の特徴：Ｘ１９０に対応する残基が、非芳香族残基、特にアラニン、イソロイシン、システイン、またはプロリンである；Ｘ７に対応する残基が、芳香族、非極性、極性、拘束された、または塩基性残基、特にヒスチジン、トレオニン、プロリン、トリプトファン、またはアルギニンである；Ｘ９７に対応する残基が、極性、非極性、脂肪族、または塩基性残基、特にバリン、メチオニン、トレオニン、またはイソロイシンである；Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、極性、非極性、または脂肪族残基、特にグルタミン、ロイシン、またはイソロイシンである；Ｘ１９６に対応する残基が、脂肪族、非極性または芳香族残基、特にメチオニン、イソロイシン、ロイシン、またはフェニルアラニンである；およびＸ２０２に対応する残基が、脂肪族、芳香族、または非極性残基、特にメチオニン、チロシン、またはトリプトファンである、を有する。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号８８、９０、９２または９４などの先行する特徴を備えた配列番号２、４または９８の参照配列と比較して他の残基位置に１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の残基相違をさらに有することができる。いくつかの実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基において１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。いくつかの実施形態において、相違は保存的変異を含む。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、先行する特徴を備えたアミノ酸配列を含み、アミノ酸配列は、先行する特徴（例えば、配列番号８８、９０、９２または９４）を備えた配列番号２、４または９８に基づく参照配列に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。
【０１４１】
いくつかの実施形態において、本開示の改良されたケトレダクターゼは、Ｘ１９０に対応する残基がチロシンではない、配列番号９５、９６、または１１９の配列式の残基９０〜２１１に対応する領域またはドメインを有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、残基９０〜２１１に対応する領域またはドメインは、Ｘ１９０に対応する残基が非芳香族残基、例えば、脂肪族、拘束、非極性、またはシステイン残基であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、残基９０〜２１１に対応する領域またはドメインは、Ｘ１９０に対応する残基がアラニン、イソロイシン、システイン、またはプロリン、特にプロリンであるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、残基９０〜２１１に対応する領域またはドメインは、配列番号２、４または９８の参照配列の対応するドメインと比較して他のアミノ酸残基に１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、または１〜２０個の残基相違をさらに有することができる。いくつかの実施形態において、相違の数は、ドメイン内の他のアミノ酸残基にて１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、または約２０個の残基相違であり得る。いくつかの実施形態において、相違は保存的変異を含む。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、Ｘ１９０に対応する残基が少なくとも先行する特徴を有する配列番号９５、９６、または１１９の配列式の残基９０〜２１１に対応するドメインまたは領域を備えたアミノ酸配列を含み、ドメインまたは領域のアミノ酸配列は、先行する特徴を備えた配列番号２、４または９８に基づく参照配列の残基９０〜２１１に対応するアミノ酸配列に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。
【０１４２】
いくつかの実施形態において、配列番号９５、９６、または１１９の配列式の残基９０〜２１１に対応するドメインまたは領域を備え、本明細書に記載するＸ１９０に対応する残基に規定された特徴を有するケトレダクターゼポリペプチドは領域またはドメイン内に、次のもの：Ｘ９４に対応する残基が、システイン、非極性または脂肪族基である；Ｘ９５に対応する残基が、非極性または脂肪族残基である；Ｘ９６に対応する残基が、極性または酸性残基である；Ｘ９７に対応する残基が、極性、非極性、脂肪族、または塩基性残基である；Ｘ１２０に対応する残基が、芳香族、非極性または脂肪族残基である；Ｘ１２５に対応する残基が、極性または非極性残基である；Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、極性、非極性、または脂肪族残基である；Ｘ１４９に対応する残基が、非極性または芳香族残基である；Ｘ１５０に対応する残基が、拘束または酸性残基である；Ｘ１５２に対応する残基が、非極性または極性残基である；Ｘ１９６に対応する残基が、脂肪族、非極性、または芳香族残基である；Ｘ２０２に対応する残基が、脂肪族、芳香族、または非極性残基である；Ｘ２０５に対応する残基が、塩基性、非極性または脂肪族残基である；およびＸ２０６に対応する残基が、非極性または芳香族残基である、から選択される１つ以上の特徴をさらに含むことができる。いくつかの実施形態において、残基９０〜２１１に対応する領域またはドメインは、配列番号２、４または９８の参照配列の対応するドメインと比較して他のアミノ酸残基に約１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、または１〜２０個の残基相違をさらに有することができる。いくつかの実施形態において、相違の数は、ドメイン内の他のアミノ酸残基にて１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、または約２０個の残基相違であり得る。いくつかの実施形態において、相違は保存的変異を含む。
【０１４３】
いくつかの実施形態において、上記のような、配列番号９５、９６、または１１９の配列式の残基９０〜２１１に対応するアミノ酸配列を備えたドメインまたは領域を有するケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２、４または９８の対応するドメインのアミノ酸配列と比較してドメインまたは領域内に１つ以上の保存的変異を有することができる。このような保存的変異の例は、これに限定されるわけではないが：Ｘ９４アラニン（Ａ）に対応する残基の、別の極性または脂肪族残基、例えば、バリン、ロイシン、またはイソロイシンによる置換；Ｘ９５バリン（Ｖ）に対応する残基の、別の非極性または脂肪族残基、例えば、アラニン、ロイシン、またはイソロイシンによる置換；Ｘ９６セリン（Ｓ）に対応する残基の、別の極性残基、例えば、アスパラギン、グルタミン、またはトレオニンによる置換；Ｘ１９６バリン（Ｖ）に対応する残基の、別の非極性または脂肪族残基、例えば、アラニン、ロイシン、またはイソロイシンによる置換；およびＸ２０５アラニン（Ａ）に対応する残基の、別の非極性または脂肪族残基、例えば、バリン、ロイシン、またはイソロイシンによる置換などのアミノ酸置換を含む。
【０１４４】
いくつかの実施形態において、配列番号９５、９６または１１９の配列式の残基９０〜２１１に対応するドメインまたは領域を備え、本明細書に記載するようなＸ１９０に対応する残基に規定された特徴を有するケトレダクターゼポリペプチドは領域またはドメイン内に、次のもの：Ｘ９４に対応する残基が、システイン、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、またはイソロイシン、特にアラニン、バリンまたはシステインである；Ｘ９５に対応する残基が、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、特にイソロイシンまたはロイシンである；Ｘ９６に対応する残基が、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、アスパラギン、またはグルタミン、特にセリン、アスパラギン、トレオニンまたはグルタミン酸である；Ｘ９７に対応する残基が、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、リジンまたはアルギニン、特にリジン、トレオニン、バリン、アルギニン、メチオニン、またはイソロイシンである；Ｘ１２０に対応する残基が、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、またはイソロイシン、特にフェニルアラニンまたはバリンである；Ｘ１２５に対応する残基が、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、またはイソロイシン、特にグリシンまたはセリンである；Ｘ１４２に対応する残基が、セリン、トレオニン、アスパラギン、またはグルタミン残基、特にアスパラギンである；Ｘ１４７に対応する残基が、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、アスパラギン、またはグルタミン、特にフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、またはグルタミンである；Ｘ１４９に対応する残基が、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、チロシン、フェニルアラニン、またはトリプトファン、特にグリシンまたはフェニルアラニンである；Ｘ１５０に対応する残基が、プロリン、ヒスチジン、アスパラギン酸、またはグルタミン酸、特にアスパラギン酸またはヒスチジンである；Ｘ１５２に対応する残基が、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、アスパラギン、またはグルタミン、特にセリン、トレオニン、またはメチオニンである；Ｘ１９６に対応する残基が、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、またはイソロイシン、特にバリン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、またはイソロイシンである；Ｘ２０２に対応する残基が、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、またはイソロイシン、特にアラニン、トリプトファン、チロシン、またはメチオニンである；Ｘ２０５に対応する残基が、リジン、アルギニン、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、またはイソロイシン、特にアルギニンである；およびＸ２０６に対応する残基が、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、特にメチオニンまたはチロシンである、から選択される１つ以上の特徴をさらに含むことができる。いくつかの実施形態において、残基９０〜２１１に対応する領域またはドメインは、配列番号２、４または９８の参照配列の対応するドメインと比較して他のアミノ酸残基に約１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、または１〜２０個の残基相違をさらに有することができる。いくつかの実施形態において、相違の数は、ドメイン内の他のアミノ酸残基にて１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、または約２０個の残基相違であり得る。いくつかの実施形態において、相違は保存的変異を含む。
【０１４５】
いくつかの実施形態において、配列番号９５、９６または１１９の配列式の残基９０〜２１１に対応するドメインまたは領域を備え、本明細書に記載するようなＸ１９０に対応する残基に規定された特徴を有するケトレダクターゼポリペプチドは領域またはドメイン内に、次のもの：Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、極性、非極性、または脂肪族残基、特にグルタミン、ロイシン、またはイソロイシンである、およびＸ２０２に対応する残基が、脂肪族、芳香族、または非極性残基、特にトリプトファン、メチオニン、またはチロシンである、から選択される１つ以上またはすべての特徴をさらに含むことができる。いくつかの実施形態において、残基９０〜２１１に対応する領域またはドメインは、配列番号２、４または９８の参照配列のドメインと比較して他のアミノ酸残基に１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、または１〜２０個の残基相違をさらに有することができる。いくつかの実施形態において、相違の数は、ドメイン内の他のアミノ酸残基にて１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、または約２０個の残基相違であり得る。いくつかの実施形態において、相違は保存的変異を含む。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも先行する特徴を備えたアミノ酸配列を含み、アミノ酸配列は、先行する特徴を備えた配列番号２、４または９８に基づく参照配列の残基９０〜１１１に対応するアミノ酸配列と比較して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。
【０１４６】
いくつかの実施形態において、配列番号９５、９６または１１９の配列式の残基９０〜２１１に対応するドメインまたは領域を備え、本明細書に記載するようなＸ１９０に対応する残基に規定された特徴を有するケトレダクターゼポリペプチドは領域またはドメイン内に、次のもの：Ｘ９７に対応する残基が、極性、非極性、脂肪族、または塩基性残基、特にメチオニン、バリン、イソロイシン、トレオニン、またはアルギニンである；Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、極性、非極性、または脂肪族残基、特にグルタミン、ロイシン、またはイソロイシンである；Ｘ２０２に対応する残基が、脂肪族、芳香族、または非極性残基、特にトリプトファン、メチオニン、またはチロシンである、から選択される１つ以上またはすべての特徴をさらに含むことができる。いくつかの実施形態において、残基９０〜２１１に対応する領域またはドメインは、配列番号２、４または９８の参照配列のドメインと比較して他のアミノ酸残基に１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、または１〜２０個の残基相違をさらに有することができる。いくつかの実施形態において、相違の数は、ドメイン内の他のアミノ酸残基にて１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、または約２０個の残基相違であり得る。いくつかの実施形態において、相違は保存的変異を含む。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも先行する特徴を備えたアミノ酸配列を含み、アミノ酸配列は、先行する特徴を備えた配列番号２、４または９８に基づく参照配列の残基９０〜２１１に対応するアミノ酸配列と比較して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。
【０１４７】
いくつかの実施形態において、配列番号９５、９６または１１９の配列式の残基９０〜２１１に対応するドメインまたは領域を備え、本明細書に記載するようなＸ１９０に対応する残基に規定された特徴を有するケトレダクターゼポリペプチドは領域またはドメイン内に、次のもの：Ｘ９４に対応する残基が、システイン、非極性または脂肪族残基、特にシステインまたはバリンである；Ｘ９６に対応する残基が、極性または酸性残基、特にトレオニンである；およびＸ１４７に対応する残基が、芳香族、極性、非極性、または脂肪族残基、特にグルタミン、イソロイシン、またはロイシンである、から選択される１つ以上またはすべての特徴をさらに含むことができる。いくつかの実施形態において、残基９０〜２１１に対応する領域またはドメインは、配列番号２、４または９８の参照配列のドメインと比較して他のアミノ酸残基に１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、または１〜２０個の残基相違をさらに有することができる。いくつかの実施形態において、相違の数は、ドメイン内の他のアミノ酸残基にて１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、または約２０個の残基相違であり得る。いくつかの実施形態において、相違は保存的変異を含む。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも先行する特徴を備えたアミノ酸配列を含み、アミノ酸配列は、先行する特徴を備えた配列番号２、４または９８に基づく参照配列の残基９０〜２１１に対応するアミノ酸配列と比較して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。
【０１４８】
いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号９５、９６または１１９の配列式の残基１〜８９に対応するドメインまたは領域をさらに含むことができる。いくつかの実施形態において、残基１〜８９に対応する領域またはドメインは、次の特徴：Ｘ７に対応する残基が、芳香族、非極性、極性、拘束、または塩基性残基である；Ｘ１６に対応する残基が、極性残基である；Ｘ４３に対応する残基が、非極性または極性残基である；およびＸ６０に対応する残基が、芳香族または極性、または脂肪族残基である、の１つ以上を有することができる。
【０１４９】
いくつかの実施形態において、残基１〜８９に対応するドメインまたは領域は、Ｘ７に対応する残基に芳香族、非極性、極性、拘束、または塩基性残基、特にヒスチジンを有する配列番号２、４、または９８に基づく参照配列の残基１〜８９に対応するアミノ酸配列に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有することができるが、但し、ケトレダクターゼポリペプチドの領域またはドメインが、Ｘ７に対応する残基が芳香族、非極性、極性、拘束、または塩基性残基、特にヒスチジンであるアミノ酸配列を有することを条件とする。いくつかの実施形態において、残基１〜８９に対応する領域またはドメインは、配列番号２、４または９８の参照配列のドメインと比較して他のアミノ酸残基に１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、また１〜１６個の残基相違をさらに有することができる。いくつかの実施形態において、相違の数は、ドメイン内の他のアミノ酸残基にて１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、または約１６個の残基相違であり得る。いくつかの実施形態において、相違は保存的変異を含む。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも先行する特徴を備えたアミノ酸配列を含み、アミノ酸配列は、先行する特徴を備えた配列番号２、４または９８に基づく参照配列の残基１〜８９に対応するアミノ酸配列と比較して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。
【０１５０】
いくつかの実施形態において、残基１〜８９に対応する領域またはドメインは、次の特徴：Ｘ７に対応する残基が、芳香族、非極性、極性、拘束、または塩基性残基である；Ｘ１６に対応する残基が、極性残基である；Ｘ４３に対応する残基が、非極性または極性残基である；およびＸ６０に対応する残基が、芳香族または極性、または脂肪族残基である、の１つ以上または少なくともすべてを有することができる。いくつかの実施形態において、残基１〜８９に対応する領域またはドメインは、配列番号２、４または９８の参照配列のドメインと比較して他のアミノ酸残基に１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、また１〜１６個の残基相違をさらに有することができる。いくつかの実施形態において、相違の数は、ドメイン内の他のアミノ酸残基にて１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、または１６個の残基相違であり得る。いくつかの実施形態において、相違は保存的変異を含む。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも先行する特徴を備えたアミノ酸配列を含み、アミノ酸配列は、先行する特徴を備えた配列番号２、４または９８に基づく参照配列の残基１〜８９に対応するアミノ酸配列と比較して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。
【０１５１】
いくつかの実施形態において、残基１〜８９に対応する領域またはドメインは、次の特徴：Ｘ７に対応する残基が、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、プロリン、ヒスチジン、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、またはリジン、特にグリシン、ヒスチジン、トレオニン、プロリン、トリプトファン、アルギニン、ヒスチジン、またはアスパラギンである；Ｘ１６に対応する残基が、セリン、トレオニン、アスパラギン、またはグルタミン、特にセリンである；Ｘ４３に対応する残基が、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、またはイソロイシン、特にイソロイシンである；およびＸ６０に対応する残基が、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、またはイソロイシン、特にアラニンである、の１つ以上または少なくともすべてを有することができる。いくつかの実施形態において、残基１〜８９に対応する領域またはドメインは、配列番号２、４または９８の参照配列のドメインと比較して他のアミノ酸残基に１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、また１〜１６個の残基相違をさらに有することができる。いくつかの実施形態において、相違の数は、ドメイン内の他のアミノ酸残基にて１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、または１６個の残基相違であり得る。いくつかの実施形態において、相違は保存的変異を含む。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも先行する特徴を備えたアミノ酸配列を含み、アミノ酸配列は、先行する特徴を備えた配列番号２、４または９８に基づく参照配列の残基１〜８９に対応するアミノ酸配列と比較して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。
【０１５２】
下の表２は、本発明で開示した配列番号のいくつかのリストを、置換アセトフェノンの還元に関する関連する活性レベルと共に示す。下のすべての配列は、別途規定しない限り、野生型Ｌ．ｋｅｆｉｒケトレダクターゼ配列（配列番号３および４）に由来する。
【０１５３】
【表２】
0005973131.tif 000007
上の表２では、活性の欄で、プラス１個「＋」は、配列番号６の活性の１００〜４５０％の活性改良を表し、プラス２個「＋＋」は、配列番号６の４５０〜１５００％の活性改良を表し、プラス３個「＋＋＋」は、配列番号６の１５００％を超える活性改良を表す。安定性の欄において、プラス１個「＋」は、５０℃にて２時間の処理後にポリペプチドが測定可能な活性を示すことを表し、プラス２個「＋＋」は、５０℃にて２時間の熱処理後に両方のタンパク質の活性を比較したときに、ポリペプチドが配列番号１６と比較して活性の４００％を超える改良を有することを表す。
【０１５４】
いくつかの実施形態において、本開示のケトレダクターゼポリペプチドは、（Ｓ）選択性、例えば、配列番号６を有する改変ＫＲＥＤ酵素と比較して、その酵素活性の率、例えば、基質を生成物に変換する率に関して改良されている。配列番号６の配列を有するポリペプチドが本明細書で参照ポリペプチドとして使用されるのは、野生型Ｌ．ｋｅｆｉｒまたはＬ．ｂｒｅｖｉｓ  ＫＲＥＤが、２’，６’−ジクロロ−３’−フルオロアセトフェノンを（Ｓ）−１−［２，６−ジクロロ−３−フルオロフェニル］−エタノールに変換するための感知可能な活性を示さないためである。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号６の率の少なくとも５倍、１０倍、２５倍、５０倍、７５倍、１００倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、または３００倍の率で基質を生成物に変換することができる。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号６の率の少なくとも１００％、１５０％、２５０％、３００％、４００％、４５０％、５００％、７５０％、１０００％、１２５０％、または１５００％である率で基質を生成物に変換することができる。
【０１５５】
いくつかの実施形態において、本開示のケトレダクターゼポリペプチドは、２’，６’−ジクロロ−３’−フルオロアセトフェノンを（Ｓ）−１−［２，６−ジクロロ−３−フルオロフェニル］−エタノールに、９９％を超える立体異性体過剰率で、および配列番号６を有するケトレダクターゼポリペプチドよりも改良された率で変換することができる。酵素活性に関して配列番号６よりも改良されている例示的なポリペプチドは、これに限定されるわけではないが、配列番号８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、および９４に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【０１５６】
いくつかの実施形態において、本開示のケトレダクターゼポリペプチドは、２’，６’−ジクロロ−３’−フルオロアセトフェノンを（Ｓ）−１−［２，６−ジクロロ−３−フルオロフェニル］−エタノールに、９９％を超える立体異性体過剰率で、および配列番号６を有するケトレダクターゼポリペプチドよりも改良された率で変換することができ、ポリペプチドは、配列番号６の配列を有するポリペプチドと比較して改良された熱安定性も有する。このような改良を有する例示的なポリペプチドは、これに限定されるわけではないが、配列番号８、１６、１８、２０、２２、２６、２８、３０、３２、３４、３８、４０、４２、４４、４６、５４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、および９４に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【０１５７】
いくつかの実施形態において、本開示のケトレダクターゼポリペプチドは、２’，６’−ジクロロ−３’−フルオロアセトフェノンを（Ｓ）−１−［２，６−ジクロロ−３−フルオロフェニル］−エタノールに、９９％を超える立体異性体過剰率で、および配列番号６を有するケトレダクターゼポリペプチドよりも少なくとも約４５０％大きい率で変換することができる。このような改良が可能である例示的なポリペプチドは、これに限定されるわけではないが、配列番号８、１０、１４、１６、１８、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、および９４に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【０１５８】
いくつかの実施形態において、本開示のケトレダクターゼポリペプチドは、２’，６’−ジクロロ−３’−フルオロアセトフェノンを（Ｓ）−１−［２，６−ジクロロ−３−フルオロフェニル］−エタノールに、９９％を超える立体異性体過剰率で、および配列番号６を有するケトレダクターゼポリペプチドよりも少なくとも約４５０％大きい率で変換することができ、ポリペプチドは、配列番号６の配列を有するポリペプチドと比較して改良された熱安定性も有する。このような特性を有する例示的なポリペプチドは、これに限定されるわけではないが、配列番号８、１６、１８、２２、２６、２８、３０、３２、３４、３８、４０、４２、４４、４６、５４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、および９４に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【０１５９】
いくつかの実施形態において、本開示のケトレダクターゼポリペプチドは、２’，６’−ジクロロ−３’−フルオロアセトフェノンを（Ｓ）−１−［２，６−ジクロロ−３−フルオロフェニル］−エタノールに、９９％を超える立体異性体過剰率で、および配列番号６を有するケトレダクターゼポリペプチドよりも少なくとも約１５００％大きい率で変換することができる。このような改良が可能である例示的なポリペプチドは、これに限定されるわけではないが、配列番号１８、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、および９４に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【０１６０】
いくつかの実施形態において、本開示のケトレダクターゼポリペプチドは、２’，６’−ジクロロ−３’−フルオロアセトフェノンを（Ｓ）−１−［２，６−ジクロロ−３−フルオロフェニル］−エタノールに、９９％を超える立体異性体過剰率で、および配列番号６を有するケトレダクターゼポリペプチドよりも少なくとも約１５００％大きい率で変換することができ、ポリペプチドは、配列番号６の配列を有するポリペプチドと比較して改良された熱安定性も有する。このような特性を有する例示的なポリペプチドは、これに限定されるわけではないが、配列番号１８、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、および９４に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【０１６１】
いくつかの実施形態において、本開示のケトレダクターゼポリペプチドは、２’，６’−ジクロロ−３’−フルオロアセトフェノン基質の量に対して約１重量％未満の量のポリペプチドを用いて実施するときに、約２４時間未満で２’，６’−ジクロロ−３’−フルオロアセトフェノンを（Ｓ）−１−（２，６−ジクロロ−３−フルオロフェニル）エタノールに少なくとも約９９％の立体異性体過剰率で変換することができる。この能力を有する例示的なポリペプチドは、これに限定されるわけではないが、１８、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、および９４に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【０１６２】
いくつかの実施形態において、本開示のケトレダクターゼポリペプチドは、２’，６’−ジクロロ−３’−フルオロアセトフェノンを（Ｓ）−１−［２，６−ジクロロ−３−フルオロフェニル］−エタノールに、９９％を超える立体異性体過剰率で、および配列番号６を有するケトレダクターゼポリペプチドよりも少なくとも約４５０％大きい率で変換することができ、ポリペプチドは５０℃で２時間の熱処理の後に、配列番号１６の配列を有するポリペプチドよりも少なくとも約４００％大きい率で基質を生成物に変換することもできる（配列番号１６のポリペプチドも同じ熱処理によって処理された場合）。このような特性を有する例示的なポリペプチドは、これに限定されるわけではないが、配列番号１８、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、および９４に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【０１６３】
いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも約９９％であるエナンチオマー過剰率で基質を生成物に立体選択的に還元することが可能であり、ポリペプチドは、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、または９４に対応するアミノ酸配列を含む。
【０１６４】
いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも約２５％、５０％、７５％、８０％、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、または９９．９９％の立体異性体過剰パーセントで、２’，６’−ジクロロ−３’−フルオロアセトフェノンを（Ｓ）−１−（２，６−ジクロロ−３−フルオロフェニル）エタノールに立体選択的に還元することができる。
【０１６５】
いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２、４もしくは９８、またはその領域もしくはドメイン、例えば、残基９０〜２１１に少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むことができるが、但し、残基Ｘ１９０に対応する残基がチロシン、特に非芳香族残基でないことを条件とし、ポリペプチドは少なくとも約８５％のエナンチオマー過剰率で基質を生成物に還元できる。いくつかの実施形態において、Ｘ１９０に対応する残基は、脂肪族、拘束された、非極性、またはシステイン残基である。いくつかの実施形態において、Ｘ１９０に対応する残基はプロリンであり、ポリペプチドが（立体選択性、酵素活性、および／または熱安定性について）野生型Ｌ．ｋｅｆｉｒケトレダクターゼまたは別の改変ケトレダクターゼよりもさらに改良されるように、次の置換：７→Ｈ、Ｔ、Ｐ、Ｗ、Ｒ、Ｎ（すなわち配列番号２、４、または９８の残基７に対応する残基が、ヒスチジン、トレオニン、プロリン、トリプトファン、アルギニン、またはアスパラギンに置換される）；１６→Ｓ；４３→Ｉ；６０→Ａ；９４→Ｃ、Ｖ；９５→Ｉ、Ｌ；９６→Ｅ、Ｔ；９７→Ｒ、Ｖ、Ｍ、Ｔ、Ｉ；１２０→Ｖ；１２５→Ｓ；１４２→Ｎ；１４７→Ｌ、Ｑ、Ｉ、Ｖ；１４９→Ｆ；１５０→Ｈ；１５２→Ｈ；１９６→Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ；２０２→Ｗ、Ｍ、Ｆ；および２０６→Ｙ、の１つ以上をさらに有する。いくつかの実施形態において、Ｘ１９０に対応する残基はプロリンであり、ポリペプチドが野生型ｋｅｆｉｒケトレダクターゼまたは別の改変ケトレダクターゼよりもさらに改良されるように、次の置換：７→Ｈ；９４→Ｖ；９６→Ｔ；１４７→Ｌ；１９６→Ｌ；および２０２→Ｗの１つ以上をさらに有する。
【０１６６】
当業者に認識されるように、上で定義したカテゴリのいくつかは、別途規定しない限り、相互に排他的ではない。それゆえ、２つ以上の物理化学特性を示す側鎖を有するアミノ酸は、複数のカテゴリに含まれ得る。任意のアミノ酸または残基の適切な分類は、特に本明細書に与える詳細な開示を考慮すれば、当業者に明らかとなるだろう。
【０１６７】
いくつかの実施形態において、改良された改変ケトレダクターゼ酵素は、天然に存在するケトレダクターゼポリペプチドの欠失または他の改変ケトレダクターゼポリペプチドの欠失を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載する改良された改変ケトレダクターゼ酵素はそれぞれ、本明細書に記載する欠失を含むことができる。それゆえ、本開示のケトレダクターゼポリペプチドの１つ１つの実施形態では、欠失は、ケトレダクターゼ活性の機能活性が維持される限り、ケトレダクターゼポリペプチドの、１個以上のアミノ酸、２個以上のアミノ酸、３個以上のアミノ酸、４個以上のアミノ酸、５個以上のアミノ酸、６個以上のアミノ酸、８個以上のアミノ酸、１０個以上のアミノ酸、１５個以上のアミノ酸、または２０個以上のアミノ酸、アミノ酸の総数の１０％まで、アミノ酸の総数の２０％まで、またはアミノ酸の総数の３０％を含むことができる。いくつかの実施形態において、欠失は、約１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個のアミノ酸残基を含むことができる。いくつかの実施形態において、欠失の数は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個のアミノ酸であり得る。いくつかの実施形態において、欠失は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、または２０個のアミノ酸残基であり得る。
【０１６８】
本明細書に記載するように、本開示のケトレダクターゼポリペプチドは、ケトレダクターゼポリペプチドが他のポリペプチド、例えば、抗体タグ（例えば、ｍｙｃエピトープ）または精製配列（例えば、Ｈｉｓタグ）に融合された融合ポリペプチドの形であり得る。それゆえ、ケトレダクターゼポリペプチドは、他のポリペプチドへの融合があってもなくても使用できる。
【０１６９】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載するポリペプチドは、遺伝的にコードされたアミノ酸に限定されない。遺伝的にコードされたアミノ酸に加えて、本明細書に記載するポリペプチドは、全部または一部のどちらかが、天然に存在するおよび／または合成非コードアミノ酸より成り得る。本明細書に記載するポリペプチドの、ある一般に見られる非コードアミノ酸は、これに限定されるわけではないが：遺伝的にコードされたアミノ酸のＤ−立体異性体；２，３−ジアミノプロピオン酸（Ｄｐｒ）；α−アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）；ε−アミノヘキサン酸（Ａｈａ）；δ−アミノ吉草酸（Ａｖａ）；Ｎ−メチルグリシンまたはサルコシン（ＭｅＧｌｙまたはＳａｒ）；オルニチン（Ｏｒｎ）；シトルリン（Ｃｉｔ）；ｔ−ブチルアラニン（Ｂｕａ）；ｔ−ブチルグリシン（Ｂｕｇ）；Ｎ−メチルイソロシン（ＭｅＩｌｅ）；フェニルグリシン（Ｐｈｇ）；シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）；ノルロイシン（Ｎｌｅ）；ナフチルアラニン（Ｎａｌ）；２−クロロフェニルアラニン（Ｏｃｆ）；３−クロロフェニルアラニン（Ｍｃｆ）；４−クロロフェニルアラニン（Ｐｃｆ）；２−フルオロフェニルアラニン（Ｏｆｆ）；３−フルオロフェニルアラニン（Ｍｆｆ）；４−フルオロフェニルアラニン（Ｐｆｆ）；２−ブロモフェニルアラニン（Ｏｂｆ）；３−ブロモフェニルアラニン（Ｍｂｆ）；４−ブロモフェニルアラニン（Ｐｂｆ）；２−メチルフェニルアラニン（Ｏｍｆ）；３−メチルフェニルアラニン（Ｍｍｆ）；４−メチルフェニルアラニン（Ｐｍｆ）；２−ニトロフェニルアラニン（Ｏｎｆ）；３−ニトロフェニルアラニン（Ｍｎｆ）；４−ニトロフェニルアラニン（Ｐｎｆ）；２−シアノフェニルアラニン（Ｏｃｆ）；３−シアノフェニルアラニン（Ｍｃｆ）；４−シアノフェニルアラニン（Ｐｃｆ）；２−トリフルオロメチルフェニルアラニン（Ｏｔｆ）；３−トリフルオロメチルフェニルアラニン（Ｍｔｆ）；４−トリフルオロメチルフェニルアラニン（Ｐｔｆ）；４−アミノフェニルアラニン（Ｐａｆ）；４−ヨードフェニルアラニン（Ｐｉｆ）；４−アミノメチルフェニルアラニン（Ｐａｍｆ）；２，４−ジクロロフェニルアラニン（Ｏｐｅｆ）；３，４−ジクロロフェニルアラニン（Ｍｐｃｆ）；２，４−ジフルオロフェニルアラニン（Ｏｐｆｆ）；３，４−ジフルオロフェニルアラニン（Ｍｐｆｆ）；ピリジ−２−イルアラニン（２ｐＡｌａ）；ピリジ−３−イルアラニン（３ｐＡｌａ）；ピリジ−４−イルアラニン（４ｐＡｌａ）；ナフチ−１−イルアラニン（１ｎＡｌａ）；ナフチ−２−イルアラニン（２ｎＡｌａ）；チアゾリルアラニン（ｔａＡｌａ）；ベンゾチエニルアラニン（ｂＡｌａ）；チエニルアラニン（ｔＡｌａ）；フリルアラニン（ｆＡｌａ）；ホモフェニルアラニン（ｈＰｈｅ）；ホモチロシン（ｈＴｙｒ）；ホモトリプトファン（ｈＴｒｐ）；ペンタフルオロフェニルアラニン（５ｆｆ）；スチリルアラニン（ｓＡｌａ）；アウトリルアラニン（ａＡｌａ）；３，３−ジフェニルアラニン（Ｄｆａ）；３−アミノ−５−フェニペンタン酸（Ａｆｐ）；ペニシラミン（Ｐｅｎ）；１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸（Ｔｉｃ）；β−２−チエニルアラ���ン（Ｔｈｉ）；メチオニンスルホキシド（Ｍｓｏ）；Ｎ（ｗ）−ニトロアルギニン（ｎＡｒｇ）；ホモリジン（ｈＬｙｓ）；ホスホノメチルフェニルアラニン（ｐｍＰｈｅ）；ホスホセリン（ｐＳｅｒ）；ホスホトレオニン（ｐＴｈｒ）；ホモアスパラギン酸（ｈＡｓｐ）；ホモグルタニン酸（ｈＧｌｕ）；１−アミノシクロペンタ−（２または３）−エン−４カルボン酸；ピペコリン酸（ＰＡ）、アゼチジン−３−カルボン酸（ＡＣＡ）；１−アミノシクロペンタン−３−カルボン酸；アリルグリシン（ａＯｌｙ）；プロパギルグリシン（ｐｇＧｌｙ）；ホモアラニン（ｈＡｌａ）；ノルバリン（ｎＶａｌ）；ホモロイシン（ｈＬｅｕ）、ホモバリン（ｈＶａｌ）；ホモイソロイシン（ｈＩｌｅ）；ホモアルギニン（ｈＡｒｇ）；Ｎ−アセチルリジン（ＡｃＬｙｓ）；２，４−ジアミノ酪酸（Ｄｂｕ）；２，３−ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）；Ｎ−メチルバリン（ＭｅＶａｌ）；ホモシステイン（ｈＣｙｓ）；ホモセリン（ｈＳｅｒ）；ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）およびホモプロリン（ｈＰｒｏ）を含む。本明細書に記載するポリペプチドが構成され得るさらなる非コードアミノ酸は、当業者に明らかになるだろう（例えば、Ｆａｓｍａｎ，１９８９，ＣＲＣ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，ｐｐ．３−７０および本明細書で引用した参考文献に示された各種のアミノ酸を参照、そのすべては参照により組入れられている）。これらのアミノ酸は、Ｌ−またはＤ−立体配置のどちらかであり得る。
【０１７０】
当業者は、側鎖保護基を持つアミノ酸または残基も本明細書に記載するポリペプチドを構成し得ることを認識するであろう。このような保護アミノ酸の非制限的な例は、この場合は芳香族カテゴリに属し（保護基はカッコ内に挙げる）、これに限定されるわけではないが：Ａｒｇ（ｔｏｓ）、Ｃｙｓ（メチルベンジル）、Ｃｙｓ（ニトロピリジンスルフェニル）、Ｇｌｕ（δ−ベンジルエステル）、Ｇｌｎ（キサンチル）、Ａｓｎ（Ｎ−δ−キサンチル）、Ｈｉｓ（ｂｏｍ）、Ｈｉｓ（ベンジル）、Ｈｉｓ（ｔｏｓ）、Ｌｙｓ（ｆｍｏｃ）、Ｌｙｓ（ｔｏｓ）、Ｓｅｒ（Ｏ−ベンジル）、Ｔｈｒ（Ｏ−ベンジル）およびＴｙｒ（Ｏ−ベンジル）を含む。
【０１７１】
本明細書に記載するポリペプチドが構成され得る立体配座的に制限された非コードアミノ酸は、これに限定されるわけではないが、Ｎ−メチルアミノ酸（Ｌ−立体配置）；１−アミノシクロペンタ−（２または３）−エン−４−カルボン酸；ピペコリン酸；アゼチジン−３−カルボン酸；ホモプロリン（ｈＰｒｏ）；および１−アミノシクロペンタン−３−カルボン酸を含む。
【０１７２】
上記のように、改変ケトレダクターゼ酵素を産生するために天然に存在するポリペプチドに導入された各種の修飾は、酵素の特異的な特性を標的とすることができる。
改変ケトレダクターゼをコードするポリヌクレオチド
別の態様において、本開示は、改変ケトレダクターゼ酵素をコードするポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドは、遺伝子発現を制御してポリペプチドを発現できる組み換えポリヌクレオチドを生成する１つ以上の異種調節配列に動作可能に結合され得る。改変ケトレダクターゼをコードする異種ポリヌクレオチドを含有する発現構築物は、対応するケトレダクターゼポリペプチドを発現するために適切な宿主細胞中に導入できる。
【０１７３】
各種のアミノ酸に対応するコドンが知られているため、タンパク質配列が入手できることによって対象をコードできるすべてのポリヌクレオチドの記述が得られる。同じアミノ酸が代わりのまたは同義のコドンによってコードされる、遺伝コードの縮重によって極めて多数の核酸が作製され、その核酸はすべて本明細書に開示される改良ケトレダクターゼ酵素をコードする。それゆえ、当業者は、特定のアミノ酸配列を同定すると、タンパク質のアミノ酸配列を変えない方法で１つ以上のコドンの配列を修飾するだけで任意の数の異なる核酸を作製できる。この点で、本開示は、可能なコドン選択に基づいて組み合せを選択することによって作製できる１つ１つの可能なポリヌクレオチドの変形を特に考慮しており、このような変形はすべて、表２に示したアミノ酸配列を含めて本明細書に開示する任意のポリペプチドについて特に開示されると見なされる。各種の実施形態において、コドンは好ましくは、タンパク質が産生される宿主細胞に適合するように選択される。例えば、細菌で使用される好ましいコドンは、細菌中で遺伝子を発現するために使用される；酵母で使用される好ましいコドンは、酵母中での発現に使用される；および哺乳動物で使用される好ましいコドンは、哺乳動物細胞での発現に使用される。一例として、配列番号３のポリヌクレオチドは、Ｅ．ｃｏｌｉ中での発現に最適化されたコドンであるが、そうでなければＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒの天然に存在するケトレダクターゼをコードする。
【０１７４】
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載する参照改変ケトレダクターゼポリペプチドのいずれかに対して少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を備えたケトレダクターゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、コードされたケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２、４または９８のＸ１９０に対応する残基がチロシンでないアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、Ｘ１９０に対応する残基が非芳香族残基であるアミノ酸配列を含むケトレダクターゼポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、Ｘ１９０に対応する残基がアラニン、イソロイシン、システイン、またはプロリン、特にプロリンであるアミノ酸配列を含むケトレダクターゼポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、および９４から選択されるアミノ酸配列を含む改変ケトレダクターゼポリペプチドをコードする。
【０１７５】
いくつかの実施形態において、改変ケトレダクターゼをコードするポリヌクレオチドは、配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、および９３から選択される。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、高ストリンジェント条件下で配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、および９３を含むヌクレオチドにハイブリダイズすることが可能であり、高ストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドは、置換アセトフェノン基質に対して（Ｓ）−選択性を有し、例えば、構造式（Ｉ）の基質を構造式（ＩＩ）の生成物に還元または変換することができる。いくつかの実施形態において、高ストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドは、構造式（ＩＩＩ）の基質を構造式（ＩＶ）の生成物に還元または変換できる。
【０１７６】
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは本明細書に記載するポリペプチドをコードするが、改変ケトレダクターゼをコードする参照ポリヌクレオチドに対してヌクレオチドレベルで、約８０％またはそれ以上の配列同一性、約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％またはそれ以上の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、参照ポリヌクレオチドは、配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、および９３に対応するポリヌクレオチド配列から選択される。
【０１７７】
改良されたケトレダクターゼポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドは、ポリペプチドの発現を与える各種の方法で操作され得る。単離ポリヌクレオチドの操作は、発現ベクターによってベクターへのその挿入前であることが所望または必要であり得る。組み換えＤＮＡ法を利用してポリヌクレオチドおよび核酸配列を修飾する技法は、当分野で周知である。ガイダンスは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ．Ｆ．ｅｄ．，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，１９９８，ｕｐｄａｔｅｓ  ｔｏ  ２００６に与えられている。
【０１７８】
細菌宿主細胞では、本開示の核酸構築物の転写を指示する好適なプロモータは、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｌａｃオペロン、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒアガラーゼ遺伝子（ｄａｇＡ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓレバンスクラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓアルファ−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓマルトジェニックアミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓアルファ−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓペニシリナーゼ遺伝子（ｐｅｎＰ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｘｙｌＡおよびｘｙｌＢ遺伝子、ならびに原核生物ベータ−ラクタマーゼ遺伝子（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆら、１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５：３７２７−３７３１）から得られたプロモータはもちろんのこと、ｔａｃプロモータ（ＤｅＢｏｅｒら、１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：２１−２５）も含む。さらなるプロモータは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、同上に記載されている。
【０１７９】
糸状真菌宿主細胞では、本開示の核酸構築物の転写を指示する好適なプロモータは、アスＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＴＡＫＡアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ中性アルファ−アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ酸安定性アルファ−アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉグルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉリパーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅアルカリ性プロテアーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅトリオースリン酸異性化酵素、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓアセトアミダーゼ、およびＦｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼ（ＷＯ  ９６／００７８７）の遺伝子から得られたプロモータはもちろんのこと、ＮＡ２−ｔｐｉプロモータ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ中性アルファ−アミラーゼおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅトリオースリン酸異性化酵素の遺伝子からのプロモータのハイブリッド）、ならびにそのミュータント、切断、およびハイブリッドプロモータも含む。
【０１８０】
酵母宿主では、有用なプロモータは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ（ＥＮＯ−１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ３−ホスホグリセレートキナーゼの遺伝子からであり得る。酵母宿主細胞の他の有用なプロモータは、Ｒｏｍａｎｏｓら、１９９２，Ｙｅａｓｔ  ８：４２３−４８８に記載されている。
【０１８１】
制御配列は、好適な転写ターミネータ配列、すなわち転写を終了することが宿主によって認識された配列でもあり得る。ターミネータ配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の３’末端に操作可能に結合される。最適な宿主細胞中で機能性であるいずれのターミネータも本発明で使用され得る。
【０１８２】
例えば、糸状真菌宿主細胞の例示的な転写ターミネータは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓアントラニル酸合成酵素、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒアルファ−グルコシダーゼ、およびＦｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼの遺伝子から得られる。
【０１８３】
酵母宿主細胞の例示的なターミネータは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅチトクロムＣ（ＣＹＣ１）、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ３−ホスフェートデヒドロゲナーゼの遺伝子から得られる。酵母宿主細胞の他の有用なターミネータは、Ｒｏｍａｎｏｓら、１９９２，同上に記載されている。
【０１８４】
制御配列は、好適なリーダー配列、すなわち宿主細胞による翻訳にとって重要であるｍＲＮＡの領域の非翻訳領域でもあり得る。リーダー配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の５’末端に操作可能に連結される。最適な宿主細胞において機能性であるいずれのリーダー配列も使用され得る。糸状真菌宿主細胞のための例示的なリーダー配列は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＴＡＫＡアミラーゼおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓトリオースリン酸異性化酵素の遺伝子から得られる。酵母宿主細胞に好適なリーダーは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ（ＥＮＯ−１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ３−ホスホグリセレートキナーゼ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルファ因子、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）の遺伝子から得られる。
【０１８５】
制御配列は、ポリアデニル化配列、すなわち核酸配列の３’末端に操作可能に連結され、転写されるときに、転写ｍＲＮＡにポリアデノシン残基を付加するシグナルとして宿主細胞によって認識される配列ででもあり得る。最適な宿主細胞中で機能性であるいずれのポリアデニル化配列も本発明で使用され得る。糸状真菌宿主細胞の例示的なポリアデニル化配列は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓアントラニル酸合成酵素、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼ、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒアルファ−グルコシダーゼの遺伝子から得られる。酵母宿主細胞の有用なポリアデニル化配列は、Ｇｕｏ  ａｎｄ  Ｓｈｅｒｍａｎ，１９９５，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ  １５：５９８３−５９９０によって記載されている。
【０１８６】
制御配列は、ポリペプチドのアミノ末端に連結されたアミノ酸配列をコードして、コードされたポリペプチドを細胞の分泌経路に向けるシグナルペプチドをコードする領域でもあり得る。核酸配列のコード配列の５’端は、分泌ポリペプチドをコードするコード領域のセグメントを備えた翻訳読み枠内に自然に結合されたシグナルペプチドをコードする領域を固有に含有することができる。または、コード配列の５’端は、コード配列に外来性であるシグナルペプチドをコードする領域を含有することができる。外来性シグナルペプチドをコードする領域は、コード配列がシグナルペプチドをコードする領域を自然に含有していない場合に要求され得る。
【０１８７】
または、外来性シグナルペプチドをコードする領域は、ポリペプチドの分泌を促進するために、シグナルペプチドをコードする領域を単に置換することがある。しかし、発現されたポリペプチドを最適な宿主細胞の分泌経路に向けるいずれのシグナルペプチドをコードする領域も本発明で使用され得る。
【０１８８】
細菌宿主細胞の有効シグナルペプチドをコードする領域は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ＮＣｌＢ  １１８３７マルトジェニックアミラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓアルファ−アミラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓスブチリシン、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓベータ−ラクタマーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ、ｎｐｒＳ、ｎｐｒＭ）、およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｐｒｓＡの遺伝子から得たシグナル・ペプチド・コード領域である。さらなるシグナルペプチドは、Ｓｉｍｏｎｅｎ  ａｎｄ  Ｐａｌｖａ，１９９３，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ  ５７：１０９−１３７に記載されている。
【０１８９】
糸状真菌宿主細胞の有効なシグナルペプチドをコードする領域は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ中性アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓセルラーゼ、およびＨｕｍｉｃｏｌａ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａリパーゼの遺伝子から得たシグナルペプチドをコードする領域であり得る。
【０１９０】
酵母宿主細胞の有用なシグナルペプチドは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルファ因子およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅインベルターゼの遺伝子からであり得る。他の有用なシグナルペプチドをコードする領域は、Ｒｏｍａｎｏｓら、１９９２，同上に記載されている。
【０１９１】
制御配列は、ポリペプチドのアミノ末端に位置するアミノ酸配列をコードするプロペプチドコード領域でもあり得る。得られたポリペプチドは、プロ酵素またはプロポリペプチド（またはいくつかの場合ではチモーゲン）として公知である。プロポリペプチドは一般に不活性であり、プロポリペプチドからのプロペプチドの触媒的または自己触媒的切断によって成熟した活性ポリペプチドに変換できる。プロペプチドコード領域は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓアルカリプロテアーゼ（ａｐｒＥ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルファ因子、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、およびＭｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａラクターゼ（ＷＯ  ９５／３３８３６）の遺伝子から得られる。
【０１９２】
シグナルペプチドおよびプロペプチド領域の両方がポリペプチドのアミノ末端に存在する場合、プロペプチド領域はポリペプチドのアミノ末端に隣接して位置しており、シグナルペプチド領域はプロペプチド領域のアミノ末端に隣接して位置している。
【０１９３】
宿主細胞の成長に対するポリペプチドの発現の調節を可能にする調節配列を付加することも所望であり得る。調節系の例は、調節化合物の存在を含む化学的または物理的刺激に応答して遺伝子の発現のオンまたはオフを引き起こす調節系である。原核宿主細胞では、好適な調節配列はｌａｃ、ｔａｃおよびｔｒｐオペレータ系を含む。酵母宿主細胞では、好適な調節系は例として、ＡＤＨ２系またはＧＡＬ１系を含む。糸状真菌では、好適な調節配列は、ＴＡＫＡアルファ−アミラーゼプロモータ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼプロモータ、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅグルコアミラーゼプロモータを含む。
【０１９４】
調節配列の他の例は、遺伝子増幅を可能にする調節配列である。真核系では、これらはメトトレキサートの存在下で増幅されるジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子と、重金属によって増幅されるメタロチオネインとを含む。これらの場合では、本発明のＫＲＥＤポリペプチドをコードする核酸配列は調節配列と操作可能に連結されるであろう。
【０１９５】
それゆえ、いくつかの実施形態において、本開示は、改変ケトレダクターゼポリペプチドまたはその変異体をコードするポリヌクレオチド、およびそれらが導入される宿主の種類に応じたプロモータおよびターミネータ、複製起点などの１つ以上の発現調節領域を含む組み換え発現ベクターにも関する。上述の各種の核酸および制御配列は共に結合されて、１つ以上の好都合な制限部位を含むことができる組み換え発現ベクターを生成して、制限部位はこのような部位でのポリペプチドをコードする核酸配列の挿入または置換を可能にする。または、本開示の核酸配列は、核酸配列または配列を含む核酸構築物を発現に適切なベクターに挿入することによって発現され得る。発現ベクターを作製する際に、コード配列が発現に適切な制御配列と操作可能に連結するように、コード配列はベクター内に配置される。
【０１９６】
組み換え発現ベクターは、組み換えＤＮＡ手順に従って好都合に組み換えすることができ、ポリヌクレオチド配列の発現を引き起こすことができる、任意のベクター（例えば、プラスミドまたはウイルス）であり得る。ベクターの選択は通例、ベクターとベクターが導入される宿主細胞との適合性によって変わるであろう。ベクターは直鎖状または閉環状プラスミドであり得る。
【０１９７】
発現ベクターは、自己複製ベクター、すなわち、その増幅が染色体複製とは無関係である染色体外実体として存在するベクター、例えば、プラスミド、染色体外要素、ミニ染色体、または人工染色体であり得る。ベクターは確実に自己複製するための任意の手段を含有することができる。または、ベクターは、宿主細胞中に導入されるときに、ゲノムに組み込まれ、ベクターが中に組み込まれた染色体と共に増幅されるベクターであり得る。さらに、宿主細胞のゲノムに導入される全ＤＮＡ、またはトランスポゾンを共に含有する１つのベクターまたはプラスミドまたは２つ以上のベクターまたはプラスミドが使用され得る。
【０１９８】
本発明の発現ベクターは好ましくは、形質転換された細胞を容易に選択できるようにする１つ以上の選択可能なマーカーを含む。選択可能なマーカーは遺伝子であり、その生成物は殺生物剤またはウイルス耐性、重金属耐性、原栄養体から栄養要求体などを供給する。細菌性の選択可能なマーカーの例は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓまたはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓからのｄａｌ遺伝子、またはアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール（実施例１）もしくはテトラサイクリン耐性などの抗生物質耐性を与えるマーカーである。酵母宿主細胞の適切なマーカーは、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＭＥＴ３、ＴＲＰ１、およびＵＲＡ３である。
【０１９９】
糸状真菌宿主細胞で使用するための選択可能なマーカーは、これに限定されるわけではないが、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）、ｈｐｈ（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（ニトレートレダクターゼ）、ｐｙｒＧ（オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ）、ｓＣ（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）、およびｔｒｐＣ（アントラニル酸合成酵素）はもちろんのこと、その同等物も含む。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ細胞で使用するための実施形態は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅのａｍｄＳおよびｐｙｒＧ遺伝子ならびにＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓのｂａｒ遺伝子を含む。
【０２００】
本発明の発現ベクターは、宿主細胞ゲノムへのベクターの組み込またはゲノムとは無関係の細胞内でのベクターの自己複製を可能にする要素を含有できる。宿主細胞ゲノムへの組み込では、ベクターは、相同または非相同組み換えによるゲノム内へのベクターの組み込のためにベクターのポリペプチドまたはその他の要素をコードする核酸配列に依存し得る。
【０２０１】
または、発現ベクターは、宿主細胞のゲノム内への相同組み換えによる組み込を指示するためのさらなる核酸配列を含有することができる。さらなる核酸配列によって、ベクターの宿主細胞ゲノム内で染色体の正確な位置への組み込が可能となる。正確な位置に組み込まれる可能性を上昇させるために、組み込要素は好ましくは、相同組み換えの確率を上昇させるために対応する標的配列と高度に相同性である、１００〜１０，０００個の塩基対、好ましくは４００〜１０，０００個の塩基対、最も好ましくは８００〜１０，０００個の塩基対などの十分な数の核酸を含有すべきである。組み込要素は、宿主細胞のゲノム内の標的配列と相同性である任意の配列であり得る。さらに組み込要素は、非コードまたはコード核酸配列であり得る。他方、ベクターは非相同組み換えによって宿主細胞のゲノム内に組み込まれ得る。
【０２０２】
自己複製では、ベクターは、ベクターが問題の宿主細胞内で自己複製できるようにする複製起点をさらに含むことができる。細菌複製起点の例は、Ｐ１５Ａ  ｏｒｉまたはプラスミドｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣｌ７７（プラスミドがＰ１５Ａｏｒｉを有する）、もしくはＥ．ｃｏｌｉにおける増幅を可能にするｐＡＣＹＣ１８４、およびＢａｃｉｌｌｕｓでの増幅を可能にするｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＴＡ１０６０、またはｐＡＭβ１の複製起点である。酵母宿主細胞で使用する複製起点の例は、２ミクロン複製起点、ＡＲＳ１、ＡＲＳ４、ＡＲＳ１およびＣＥＮ３の組み合せ、ならびにＡＲＳ４およびＣＥＮ６の組み合せである。複製起点は、宿主細胞中でその機能を温度感受性にする変異を有する複製起点であり得る（例えば、Ｅｈｒｌｉｃｈ，１９７８，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５：１４３３を参照）。
【０２０３】
本発明の核酸配列の１つ以上のコピーは、遺伝子産物の生成を増加するために宿主細胞内に挿入され得る。核酸配列のコピー数は、配列の少なくとも１つのさらなるコピーを宿主細胞ゲノムに組み込むことによって、または増幅可能な選択可能マーカー遺伝子を細胞が選択可能マーカー遺伝子の増幅されたコピーを含有する核酸配列と共に含めることによって増加させることができ、それにより核酸配列のさらなるコピーは、適切な選択可能因子の存在下で細胞を培養するために選択できる。
【０２０４】
本開示で使用する発現ベクターの多くは市販されている。適切な市販発現ベクターは、哺乳動物宿主細胞における発現のためのＣＭＶプロモータおよびｈＧＨポリアデニル化部位ならびにｐＢＲ３２２複製起点およびＥ．ｃｏｌｉにおける増幅のためのアンピシリン耐性マーカーを含む、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ．によるｐ３ｘＦＬＡＧＴＭ（商標）発現ベクターを含む。他の適切な発現ベクターは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＬａＪｏｌｌａ  ＣＡより市販されているｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（-）およびｐＢＫ-ＣＭＶ、ならびにｐＢＲ３２２（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、ｐＵＣ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、ｐＲＥＰ４、ｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはｐＰｏｌｙ（Ｌａｔｈｅら、１９８７、Ｇｅｎｅ  ５７、１９３-２０１）に由来するプラスミドである。
ケトレダクターゼポリペプチド発現のための宿主細胞
別の態様において、本開示は、本開示の改良ケトレダクターゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供し、ポリペプチドは宿主細胞でのケトレダクターゼ酵素の発現のための１つ以上の制御配列に操作可能に連結されている。本発明の発現ベクターによってコードされるＫＲＥＤポリペプチドを発現するのに使用される宿主細胞は、当分野で周知であり、これに限定されるわけではないが、細菌細胞、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｉｎｏｒ、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞；真菌細胞、例えば、酵母細胞（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＡＴＣＣアクセッション番号２０１１７８））；昆虫細胞、例えば、ショウジョウバエＳ２およびヨトウＳｆ９細胞；動物細胞、例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＢＨＫ、２９３、およびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞；ならびに植物細胞を含む。上述の宿主細胞に適切な培地および増殖条件は当分野で周知である。
【０２０５】
ケトレダクターゼの発現のためのポリヌクレオチドは、当分野で公知の各種の方法によって細胞内に導入され得る。技法は特に、電気穿孔、微粒子銃、リポソーム媒介トランスフェクション、塩化カルシウムトランスフェクション、および原形質体融合を含む。ポリヌクレオチドを細胞内に導入するための各種の方法は、当業者に明らかになるであろう。
【０２０６】
例示的な宿主細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０である。発現ベクターは、改良ケトレダクターゼをコードするポリヌクレオチドを、ｌａｃＩリプレッサの制御下でｌａｃプロモータに操作可能に連結されたプラスミドｐＣＫ１１０９００内に操作可能に連結することによって作製した。発現ベクターは、Ｐ１５ａ複製起点およびクロラムフェニコール耐性遺伝子も含有していた。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０内に主題のポリヌクレオチドを含有する細胞は、細胞にクロラムフェニコール選択を受けさせることによって単離できる。
改変ケトレダクターゼポリペプチドを産生する方法
いくつかの実施形態において、本開示の改良ＫＲＥＤポリヌクレオチドおよびポリペプチドを作製するために、還元反応を触媒する天然に存在するケトレダクターゼ酵素は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓまたはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｉｎｏｒより得た（または由来する）。いくつかの実施形態において、親ポリヌクレオチド配列は、規定された宿主細胞におけるケトレダクターゼの発現を増強するためにコドン最適化される。例として、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒの野生種ＫＲＥＤポリペプチドをコードする親ポリヌクレオチド配列は、Ｇｅｎｂａｎｋデータベースで入手可能なＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒ  ＫＲＥＤの公知のポリペプチド配列（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＰ９４０２９  ＧＩ：３３１１２０５６）に基づいて調製されたオリゴヌクレオチドから作製した。配列番号３と呼ばれる親ポリヌクレオチド配列はＥ．ｃｏｌｉでの発現のためにコドン最適化し、コドン最適化したポリヌクレオチドを発現ベクター内にクローニングして、ｌａｃプロモータおよびｌａｃＩリプレッサ遺伝子の制御下でケトレダクターゼ遺伝子を発現させた。Ｅ．ｃｏｌｉにおいて活性ケトレダクターゼを発現するクローンを同定し、遺伝子を配列決定してその同一性を確認した。指定された配列（配列番号３）は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒケトレダクターゼから進化した改変ケトレダクターゼの大半の実験の起始点およびライブラリ構築として利用される親配列であった。
【０２０７】
改変ケトレダクターゼは、上述したように、天然に存在するケトレダクターゼをコードするポリヌクレオチドに突然変異誘発および／または定方向進化法を受けさせることによって得られる。例示的な定方向進化技法は、Ｓｔｅｍｍｅｒ，１９９４，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９１：１０７４７−１０７５１；ＷＯ  ９５／２２６２５；ＷＯ  ９７／００７８；ＷＯ  ９７／３５９６６；ＷＯ  ９８／２７２３０；ＷＯ  ００／４２６５１；ＷＯ  ０１／７５７６７および米国特許第６，５３７，７４６号に記載されているような突然変異誘発および／またはＤＮＡシャッフリングである。利用できる他の定方向進化手順は、特にねじれ形伸長プロセス（ＳｔＥＰ）、インビトロ組み換え（Ｚｈａｏら、１９９８，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：２５８−２６１）、突然変異誘発ＰＣＲ（Ｃａｌｄｗｅｌｌら、１９９４，ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ．３：Ｓ１３６−Ｓ１４０）、およびカセット突然変異誘発（Ｂｌａｃｋら、１９９６，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９３：３５２５−３５２９）を含む。本明細書の目的に有用なさらなる突然変異誘発および定方向進化は、次の文献に見出すことができる：Ｌｉｎｇら、１９９７，“Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ＤＮＡ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：ａｎ  ｏｖｅｒｖｉｅｗ，”Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５４（２）：１５７−７８；Ｄａｌｅら、１９９６，“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｒａｎｄｏｍ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ  ｍｅｔｈｏｄ，”Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５７：３６９−７４；Ｓｍｉｔｈ，１９８５，“Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，”Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１９：４２３−４６２；Ｂｏｔｓｔｅｉｎら、１９８５，“Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１１９３−１２０１；Ｃａｒｔｅｒ，１９８６，“Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，”Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２３７：１−７；Ｋｒａｍｅｒら、１９８４，“Ｐｏｉｎｔ  Ｍｉｓｍａｔｃｈ  Ｒｅｐａｉｒ，”Ｃｅｌｌ，３８：８７９−８８７；Ｗｅｌｌｓら、１９８５，“Ｃａｓｓｅｔｔｅ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｔ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｓｉｔｅｓ，”Ｇｅｎｅ  ３４：３１５−３２３；Ｍｉｎｓｈｕｌｌら、１９９９，“Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｂｙ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｒｅｅｄｉｎｇ，”Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  ３：２８４−２９０；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓら、１９９９，“Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｆｏｒ  ＡＺＴ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ＤＮＡ  ｆａｍｉｌｙ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ，”Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １７：２５９−２６４；Ｃｒａｍｅｒｉら、１９９８，“ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｇｅｎｅｓ  ｆｒｏｍ  ｄｉｖ���ｒｓｅ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｓ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，”Ｎａｔｕｒｅ  ３９１：２８８−２９１；Ｃｒａｍｅｒｉら、１９９７，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ａｒｓｅｎａｔｅ  ｄｅｔｏｘｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙ  ｂｙ  ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ，”Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １５：４３６−４３８；Ｚｈａｎｇら、１９９７，“Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｆｒｕｃｔｏｓｉｄａｓｅ  ｆｒｏｍ  ａ  ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ  ｂｙ  ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，”Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９４：４５−４−４５０９；Ｃｒａｍｅｒｉら、１９９６，“Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｙ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ，”Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １４：３１５−３１９；およびＳｔｅｍｍｅｒ，１９９４，“Ｒａｐｉｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｂｙ  ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ，”Ｎａｔｕｒｅ  ３７０：３８９−３９１。すべての刊行物は参照により本明細書に組入れられている。
【０２０８】
突然変異誘発処理後に得たクローンは、所望の改良酵素特性を有する改変ケトレダクターゼについてスクリーニングする。発現ライブラリからの酵素活性の測定は、それがＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋に変換されるときのＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ濃度の低下率（吸収または蛍光の低下による）を監視する標準生化学技法を使用して実施できる（例えば、実施例７を参照）。この反応では、ケトレダクターゼがケトン基質を対応するヒドロキシル基に還元するときに、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨはケトレダクターゼによって消費（酸化）される。単位時間当りの吸収または蛍光の低下によって測定されるようなＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ濃度の低下率は、固定量の溶解液（またはそれから作製した凍結乾燥粉末）中でのＫＲＥＤポリペプチドの相対（酵素）活性を示す。生成物の空間的配置は各種の公知の技法によって、実施例で与えられているように確認できる。所望の改良酵素特性が熱安定性である場合、酵素活性は、酵素調製物を所定の温度にさらした後に測定でき、熱処理後に残存する酵素活性の量を測定する。ケトレダクターゼをコードするポリヌクレオチドを含有するクローンを次に単離し、配列決定してヌクレオチド配列の変化（存在する場合）を同定し、宿主細胞中で酵素を発現するために使用する。
【０２０９】
改変ポリペプチドの配列が公知である場合、酵素をコードするポリヌクレオチドは、公知の合成方法に従って標準固相方法によって調製できる。いくつかの実施形態において、約１００塩基までの断片を個別に合成し、次に（例えば、酵素もしくは化学連結、またはポリメラーゼ媒介方法によって）結合して任意の所望の連続配列を形成できる。例えば、本発明のポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドは、例えば、Ｂｅａｕｃａｇｅら、１９８１，Ｔｅｔ  Ｌｅｔｔ  ２２：１８５９−６９に記載された古典的なホスホラミダイト法、または例えば、自動合成法で通例実施されるような、Ｍａｔｔｈｅｓら、１９８４，ＥＭＢＯ  Ｊ．３：８０１−０５に記載された方法を使用する化学合成によって調製できる。ホスホラミダイト法により、オリゴヌクレオチドを例えば、自動ＤＮＡ合成装置で合成して、精製し、アニーリングして、適切なベクター中に連結およびクローニングする。さらに本質的にどの核酸もＴｈｅ  Ｍｉｄｌａｎｄ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｍｉｄｌａｎｄ，ＴＸ，Ｔｈｅ  Ｇｒｅａｔ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒａｍｏｎａ，ＣＡ，ＥｘｐｒｅｓｓＧｅｎ  Ｉｎｃ．Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ，Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ、およびその他多数などの各種の市販元のいずれからでも入手できる。
【０２１０】
宿主細胞で発現した改変ケトレダクターゼ酵素は、特にリゾチーム処理、超音波処理、濾過、塩析出、超遠心分離、およびクロマトグラフィーを含む、タンパク質精製の周知の技法のいずれか１つ以上を使用して細胞または培地から回収できる。Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌からのタンパク質の溶解および高効率抽出のための好適な溶液は、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ．のＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから商標名ＣｅｌＬｙｔｉｃ  Ｂ（商標）で市販されている。
【０２１１】
ケトレダクターゼポリペプチドの単離のためのクロマトグラフィー技法は特に、逆相クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、およびアフィニティクロマトグラフィーを含む。特定の酵素を精製するための条件は、一部は正味電荷、疎水性、親水性、分子量、分子形状などの因子によって変わるであろうし、当業者に明らかとなるであろう。
【０２１２】
いくつかの実施形態において、アフィニティ技法を使用して改良ケトレダクターゼ酵素が分離され得る。アフィニティクロマトグラフィー精製では、ケトレダクターゼポリペプチドに特異的に結合する任意の抗体が使用され得る。抗体の生成では、これに限定されるわけではないが、ウサギ、マウス、ラットなどを含む各種の宿主動物がケトレダクターゼ注射によって免疫化され得る。ケトレダクターゼポリペプチドは、側鎖官能基または側鎖官能基に結合されたリンカーによって、ＢＳＡなどの好適な担体に結合され得る。これに限定されるわけではないが、フロイント（完全または不完全）、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲル、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性エマルジョン、キーホールリンペットへモシアニン、ジニトロフェノールなどの界面活性物質、ならびにＢＣＧ（バチルスカルメットゲラン）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍなどの潜在的に有用なヒトアジュバントを含む各種のアジュバントが、宿主種に応じて、免疫応答を上昇させるために使用され得る。
【０２１３】
ケトレダクターゼは、酵素を発現する細胞の形で、粗抽出物として、または単離もしくは精製調製物として調製および使用され得る。ケトレダクターゼは、凍結乾燥物として、粉末形（例えば、アセトン粉末）で調製され得るか、または酵素溶液として調製され得る。いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼは実質的に純粋な調製物の形であり得る。
【０２１４】
いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは固体基質に結合できる。基質は固相、表面、および／または膜であり得る。固体支持体は、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリフルオロエチレン、ポリエチレンオキシ、およびポリアクリルアミドなどの有機ポリマーはもちろんのこと、そのコポリマーおよびグラフトによっても構成できる。固体支持体は、ガラス、シリカ、孔径制御ガラス（ＣＰＧ）、逆相シリカまたは金もしくは白金などの金属でもあり得る。基質の配置はビーズ、球、粒子、顆粒、ゲル、膜または表面の形であり得る。表面は、平面、実質的に平面、または非平面であり得る。固体支持体は多孔性または非多孔性であり、膨潤または非膨潤特徴を有することができる。固体支持体は、ウェル、くぼみ、または他のコンテナ、容器、機構、もしくは位置の形で構成され得る。試薬のロボット送達で、または検出方法および／または器具によって処置できるように、複数の支持体をアレイとして各種の位置に構成できる。
改変ケトレダクターゼ酵素の使用方法およびそれを用いて調製した化合物
本明細書に記載するケトレダクターゼ酵素は、３’、４’、および５’位の１つ以上において場合により置換された２’，６’置換アセトフェノン基質におけるケト基の、対応する置換（Ｓ）フェネタノールへの還元反応を触媒できる。
【０２１５】
いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼは、構造式（Ｉ）の基質化合物（２’，６’−ジクロロ−３’−フルオロアセトフェノン）を
【０２１６】
【化５】
0005973131.tif 000008
構造式（ＩＩ）の対応するキラルアルコール生成物、（Ｓ）−１−［２，６−ジクロロ−３−フルオロフェニル］−エタノールに還元または変換することができる。
【０２１７】
【化６】
0005973131.tif 000009
いくつかの実施形態において、本明細書に記載するケトレダクターゼは、構造式（ＩＩＩ）の２’，６’−置換アセトフェノン化合物
【０２１８】
【化７】
0005973131.tif 000010
（式中、ＹおよびＺは、ＣＨ３、ＣＦ３、ＮＨ２、ＯＨ、ＯＣＨ３、Ｃｌ、およびＢｒから独立して選択される）を構造式（ＩＶ）の対応するキラルアルコール生成物に還元または変換できる。
【０２１９】
【化８】
0005973131.tif 000011
いくつかの実施形態において、本明細書に記載するケトレダクターゼは、３’、４’、および５’位の１つ以上において同様に置換可能である、構造式（ＩＩＩ）の２’，６’−置換アセトフェノン化合物の、対応する（Ｓ）−アルコール生成物への還元反応を触媒できる。アセトフェノンに加えて、特異的なさらに置換された２’，６’−置換アセトフェノン化合物の還元反応を触媒する、本明細書に記載するケトレダクターゼの能力は、日常的な実験によって、例えば、実施例に記載したような方法によって決定できる。構造式（Ｉ）の化合物２’，６’−ジクロロ−３’−フルオロアセトフェノンは、さらに置換された２’，６’−置換アセトフェノン化合物の一例である。したがって、いくつかの実施形態において、本明細書で開示するケトレダクターゼ酵素は、構造式（Ｖ）の化合物
【０２２０】
【化９】
0005973131.tif 000012
（式中、ＹおよびＺは、ＣＨ３、ＣＦ３、ＮＨ２、ＯＨ、ＯＣＨ３、Ｃｌ、およびＢｒから独立して選択され、Ｗは、ＨまたはＦ、Ｃｌ、もしくはＢｒから選択される）の、構造式（ＩＶ）の対応する（Ｓ）アルコール生成物への還元反応を触媒できる。
【０２２１】
【化１０】
0005973131.tif 000013
それゆえ、いくつかの実施形態において、本明細書に記載したケトレダクターゼは、３’、４’、または５’位の１つ以上で場合により置換された２’，６’置換アセトフェノン基質を対応する置換（Ｓ）−フェネタノールに還元する方法で使用可能であり、該方法は、置換アセトフェノンを対応する置換（Ｓ）−フェネタノールに還元または変換するのに好適な反応条件下で、置換アセトフェノン基質を本明細書に記載するケトレダクターゼと接触させるステップを含む。この方法のいくつかの実施形態において、基質は約２５％、５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または９９．９％を超える立体異性体過剰率で生成物に還元される。
【０２２２】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載したケトレダクターゼは、式（ＩＩＩ）の２’，６’−置換アセトフェノン基質を式（ＩＶ）の対応する置換（Ｓ）−フェネタノール化合物に還元する方法で使用することが可能であり、該方法は、式（ＩＩＩ）の化合物を式（ＩＶ）の対応する置換（Ｓ）−フェネタノール化合物に還元または変換するのに好適な反応条件下で、式（ＩＩＩ）の化合物を本明細書に記載するケトレダクターゼと接触またはインキュベートさせるステップを含む。この方法のいくつかの実施形態において、基質は約２５％、５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または９９．９％を超える立体異性体過剰率で生成物に還元される。
【０２２３】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載するケトレダクターゼは、式（Ｉ）の２’，６’−ジクロロ−３’−フルオロアセトフェノン基質を式（ＩＩ）のその対応する（Ｓ）−アルコール生成物、（Ｓ）−１−（２，６−ジクロロ−３−フルオロフェニル］−エタノールに還元する方法で使用することが可能であり、該方法は、２’，６’−ジクロロ−３’−フルオロアセトフェノンを（Ｓ）−１−［２，６−ジクロロ−３−フルオロフェニル］−エタノールに還元または変換するのに好適な反応条件下で、２’，６’−ジクロロ−３’−フルオロアセトフェノンを本明細書に記載するケトレダクターゼポリペプチドと接触またはインキュベートするステップを含む。いくつかの実施形態において、基質は約８５％、９０％、９５％、９９％、または９９．９％を超える立体異性体過剰率で生成物に還元される。いくつかの実施形態において、基質は約８５％を超える立体異性体過剰率で生成物に還元され、ここで、ケトレダクターゼポリペプチドは配列番号９５、９６または１１９の配列式に基づくアミノ酸配列を含む。
【０２２４】
いくつかの実施形態において、野生型Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種ケトレダクターゼ酵素に由来する改変（Ｓ）−選択性ケトレダクターゼ酵素は、約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．９％またはそれ以上よりも大きい立体異性体過剰率でアセトフェノンを（Ｓ）−１−フェネタノールに還元する方法で使用できる。
【０２２５】
いくつかの実施形態において、基質は約９９％を超える立体異性体過剰率で生成物に還元され、該方法に使用されるケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、および９４から選択されるアミノ酸配列を含む。本方法のいくつかの実施形態において、該方法が２’，６’−ジクロロ−３’−フルオロアセトフェノン基質の量に対して約１重量％未満の量でケトレダクターゼポリペプチドを用いて実施されるとき、基質の少なくとも約９５％が２４時間未満で約９９％を超える立体異性体過剰率で生成物に還元される。
【０２２６】
方法のいくつかの実施形態において、該方法が少なくとも約２００ｇ／Ｌの基質および約１ｇ／Ｌ未満のケトレダクターゼポリペプチドを用いて実施されるとき、基質の少なくとも約９５％が２４時間未満で少なくとも約９９％の立体異性体過剰率で生成物に還元され、該方法に使用されるケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号１８、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、および９４から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０２２７】
いくつかの実施形態において、本開示のケトレダクターゼポリペプチドおよび方法は、ＷＯ２００６０２１８８６（アミノヘテロアリール化合物）、ＷＯ２００６０２１８８４（エナンチオマー的に実質的に純粋なアミノヘテロアリール化合物）、ＷＯ２００６０２１８８１（ピラゾール置換アミノヘテロアリール化合物）、およびＷＯ２００４０７６４１２（アミノヘテロアリール化合物））に記載されているプロテインチロシンキナーゼ阻害化合物の合成に使用可能であり、その合成は中間体としての式（ＩＩ）の化合物に依存している。すべての参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み入れられている。
【０２２８】
したがって、いくつかの実施形態において、本明細書に記載するケトレダクターゼポリペプチドおよび方法は、構造式（ＶＩＩ）のプロテインチロシンキナーゼ阻害薬
【０２２９】
【化１１】
0005973131.tif 000014
（その塩、水和物、および溶媒和物を含む）を、参考文献ＷＯ０４０７６４１２およびＷＯ０６０２１８８４に記載されているように生成するのに使用可能であり、式中、Ｒ１、Ｒ２、ＹおよびＮはそこで記載されている通りである。いくつかの実施形態において、式（ＶＩＩ）の化合物では、
Ｙは、ＮまたはＣＲ１２であり；
Ｒ１は、水素、ハロゲン、Ｃ６−１２アリール、５〜１２員ヘテロアリール、Ｃ３−１２シクロアルキル、３〜１２員ヘテロ脂環式、−Ｏ（ＣＲ６Ｒ７）ｎＲ４、−Ｃ（Ｏ）Ｒ４、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ４、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｓ（Ｏ）ｍＲ４、−ＳＯ２ＮＲ４Ｒ５、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ４Ｒ５、−ＮＲ４Ｃ（Ｏ）Ｒ５、−Ｃ（＝ＮＲ６）ＮＲ４Ｒ５、Ｃ１−８アルキル、Ｃ２−８アルケニル、およびＣ２−８アルキニルより選択され；ならびにＲ１の各水素は、１つ以上のＲ３基によって場合により置換され；
Ｒ２は、水素、ハロゲン、Ｃ１−２アルキル、Ｃ２−１２アルケニル、Ｃ２−１２アルキニル、Ｃ３−１２シクロアルキル、Ｃ６−１２アリール、３〜１２員ヘテロ脂環式、５〜１２員ヘテロアリール、−Ｓ（Ｏ）ｍＲ４、−ＳＯ２ＮＲ４Ｒ５、−Ｓ（Ｏ）２ＯＲ４、−ＮＯ２、−ＮＲ４Ｒ５、−（ＣＲ６Ｒ７）ｎＯＲ４、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ４、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ４、−Ｏ（ＣＲ６Ｒ７）ｎＲ４、−ＮＲ４Ｃ（Ｏ）Ｒ５、−（ＣＲ６Ｒ７）ｎＣ（Ｏ）ＯＲ４、−（ＣＲ６Ｒ７）ｎＮＣＲ４Ｒ５、−Ｃ（＝ＮＲ６）ＮＲ４Ｒ５、−ＮＲ４Ｃ（Ｏ）ＮＲ５Ｒ６、−ＮＲ４Ｓ（Ｏ）ＰＲ５または−Ｃ（Ｏ）ＮＲ４Ｒ５であり、Ｒ２の各水素は、Ｒ８によって場合により置換され；
各Ｒ３は独立して、ハロゲン、Ｃ１−２アルキル、Ｃ２−１２アルケニル、Ｃ２−１２アルキニル、Ｃ３−１２シクロアルキル、Ｃ６−１２アリール、３〜１２員ヘテロ脂環式、５〜１２員ヘテロアリール、−Ｓ（Ｏ）ｍＲ４、−ＳＯ２ＮＲ４Ｒ５、−Ｓ（Ｏ）２ＯＲ４、−ＮＯ２、−ＮＲ４Ｒ５、−（ＣＲ６Ｒ７）ｎＯＲ４、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ４、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ４、−Ｏ（ＣＲ６Ｒ７）ｎＲ４、−ＮＲ４Ｃ（Ｏ）Ｒ５、−（ＣＲ６Ｒ７）ｎＣ（Ｏ）ＯＲ４、−（ＣＲ６Ｒ７）ｎＯＲ４、−（ＣＲ６Ｒ７）ｎＣ（Ｏ）ＮＲ４Ｒ５、−（ＣＲ６Ｒ７）ｎＮＣＲ４Ｒ５、−Ｃ（＝ＮＲ６）ＮＲ４Ｒ５、−ＮＲ４Ｃ（Ｏ）ＮＲ５Ｒ６、−ＮＲ４Ｓ（Ｏ）ＰＲ５または−Ｃ（Ｏ）ＮＲ４Ｒ５であり、Ｒ３の各水素は、Ｒ８によって場合により置換され、隣接原子のＲ３基は一緒になって、Ｃ６−１２アリール、５〜１２員ヘテロアリール、Ｃ３−１２シクロアルキルまたは３〜１２員ヘテロ脂環式基を形成してもよく；
各Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は独立して、水素、ハロゲン、Ｃ１−１２アルキル、Ｃ２−１２アルケニル、Ｃ２−１２アルキニル、Ｃ３−１２シクロアルキル、Ｃ６−１２アリール、３〜１２員ヘテロ脂環式、５〜１２員ヘテロアリールであり；または同じ窒素原子に結合したＲ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７のいずれか２つが、それらが結合した窒素と共に一緒になって、Ｎ、Ｏ、およびＳより選択される１〜３個のさらなるヘテロ原子を場合により含有する３〜１２員ヘテロ脂環式もしくは５〜１２員ヘテロアリール基を形成してもよく；または同じ炭素原子に結合したＲ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７のいずれか２つが一緒になって、Ｃ３−１２シクロアルキル、Ｃ６−１２アリール、３〜１２員ヘテロ脂環式または５〜１２員ヘテロアリール基を形成してもよく；Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７の各水素は、Ｒ８によって場合により置換され；
各Ｒ８は独立して、ハロゲン、Ｃ１−１２アルキル、Ｃ２−１２アルケニル、Ｃ２−１２アルキニル、Ｃ３−１２シクロアルキル、Ｃ６−１２アリール、３〜１２員ヘテロ脂環式、５〜１２員ヘテロアリール、−ＮＨ２、−ＣＮ、−ＯＨ、−Ｏ−Ｃ１−１２アルキル、−Ｏ−（ＣＨ２）ｎＣ３−１２シクロアルキル、−Ｏ−（ＣＨ２）ｎＣ６−１２アリール、−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ（３〜１２員ヘテロ脂環式）または−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ（５〜１２員ヘテロアリール）であり；Ｒ８の各水素は、Ｒ１１によって場合により置換され；
各Ｒ９およびＲ１０は独立して、水素、ハロゲン、Ｃ１−１２アルキル、Ｃ３−１２シクロアルキル、Ｃ６−１２アリール、３〜１２員ヘテロ脂環式、５〜１２員ヘテロアリール、−Ｓ（Ｏ）ｍＲ４、−ＳＯ２ＮＲ４Ｒ５、−Ｓ（Ｏ）２ＯＲ４、−ＮＯ２、−ＮＲ４Ｒ５、−（ＣＲ６Ｒ７）ｎＯＲ４、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ４、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ４、−ＮＲ４Ｃ（Ｏ）Ｒ５、−（ＣＲ６Ｒ７）ｎＣ（Ｏ）ＯＲ４、−（ＣＲ６Ｒ７）ｎＮＣＲ４Ｒ５、−ＮＲ４Ｃ（Ｏ）ＮＲ５Ｒ６、−ＮＲ４Ｓ（Ｏ）ＰＲ５または−Ｃ（Ｏ）ＮＲ４Ｒ５であり；Ｒ９またはＲ１０は、Ａの環原子またはＡの置換基と一緒になって、Ａに縮合したＣ３−１２シクロアルキル、３〜１２員ヘテロ脂環式、Ｃ６−１２アリールまたは５〜１２員ヘテロアリール環を形成してもよく；Ｒ９またはＲ１０の各水素は、Ｒ３によって場合により置換され；
各Ｒ１１は独立して、ハロゲン、Ｃ１−１２アルキル、Ｃ１−１２アルコキシ、Ｃ３−１２シクロアルキル、Ｃ６−１２アリール、３〜１２員ヘテロ脂環式、５〜１２員ヘテロアリール、−Ｏ−Ｃ１−１２アルキル、−Ｏ−（ＣＨ２）ｎＣ３−１２シクロアルキル、−Ｏ−（ＣＨ２）ｎＣ６−１２アリール、−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ（３〜１２員ヘテロ脂環式）、−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ（５〜１２員ヘテロアリール）または−ＣＮであり、Ｒ１１の各水素は、ハロゲン、−ＯＨ、−ＣＮ、部分的または完全にハロゲン化され得る−Ｃ１−１２アルキル、部分的または完全にハロゲン化され得る−Ｏ−Ｃ１−１２アルキル、−ＣＯ、−ＳＯまたは−ＳＯ２によって場合により置換され；
Ｒ１２は、水素、ハロゲン、Ｃ１−１２アルキル、Ｃ２−１２アルケニル、Ｃ２−１２アルキニル、Ｃ３−１２シクロアルキル、Ｃ６−１２アリール、３〜１２員ヘテロ脂環式、５〜１２員ヘテロアリール、−Ｓ（Ｏ）ｍＲ４、−ＳＯ２ＮＲ４Ｒ５、−Ｓ（Ｏ）２ＯＲ４、−ＮＯ２、−ＮＲ４Ｒ５、−（ＣＲ６Ｒ７）ｎＯＲ４、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ４、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ４、−Ｏ（ＣＲ６Ｒ７）ｎＲ４、−ＮＲ４Ｃ（Ｏ）Ｒ５、−（ＣＲ６Ｒ７）ｎＣ（Ｏ）ＯＲ４、−（ＣＲ６Ｒ７）ｎＮＣＲ４Ｒ５、−Ｃ（＝ＮＲ６）ＮＲ４Ｒ５、−ＮＲ４Ｃ（Ｏ）ＮＲ５Ｒ６、−ＮＲ４Ｓ（Ｏ）ＰＲ５または−Ｃ（Ｏ）ＮＲ４Ｒ５であり、Ｒ１２の各水素は、Ｒ３によって場合により置換され；
各Ｒ１３は独立して、ハロゲン、Ｃ１−１２アルキル、Ｃ２−１２アルケニル、Ｃ２−１２アルキニル、Ｃ３−１２シクロアルキル、Ｃ６−１２アリール、３〜１２員ヘテロ脂環式、５〜１２員ヘテロアリール、−Ｓ（Ｏ）ｍＲ４、−ＳＯ２ＮＲ４Ｒ５、−Ｓ（Ｏ）２ＯＲ４、−ＮＯ２、−ＮＲ４Ｒ５、−（ＣＲ６Ｒ７）ｎＯＲ４、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ４、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ４、−Ｏ（ＣＲ６Ｒ７）ｎＲ４、−ＮＲ４Ｃ（Ｏ）Ｒ５、−（ＣＲ６Ｒ７）ｎＣ（Ｏ）ＯＲ４、−（ＣＲ６Ｒ７）ｎＯＲ４、−（ＣＲ６Ｒ７）ｎＣ（Ｏ）ＮＲ４Ｒ５、−（ＣＲ６Ｒ７）ｎＮＣＲ４Ｒ５、−Ｃ（＝ＮＲ６）ＮＲ４Ｒ５、−ＮＲ４Ｃ（Ｏ）ＮＲ５Ｒ６、−ＮＲ４Ｓ（Ｏ）ＰＲ５、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ４Ｒ５、（ＣＲ６Ｒ７）ｎ（３〜１２員ヘテロ脂環式）、−（ＣＲ６Ｒ７）ｎ（Ｃ３−１２シクロアルキル）、−（ＣＲ６Ｒ７）ｎ（Ｃ６−１２アリール）、−（ＣＲ６Ｒ７）ｎ（５〜１２員ヘテロアリール）、−（ＣＲ６Ｒ７）ｎＣ（Ｏ）ＮＲ４Ｒ５、または−（ＣＲ６Ｒ７）ｎＣ（Ｏ）Ｒ４であり、隣接原子のＲ１３基は一緒になって、Ｃ６−１２アリール、５〜１２員ヘテロアリール、Ｃ３−１２シクロアルキルまたは３〜１２員ヘテロ脂環式基を形成してもよく、Ｒ１３の各水素は、Ｒ３によって場合により置換され；
式中、各ｍは独立して、０、１または２であり；各ｎは独立して、０、１、２、３または４であり；各ｐは独立して、１または２である。式（ＶＩＩ）に含まれる具体的な化合物と同様に各種の置換基の説明は、ＷＯ０４０７６４１２およびＷＯ０６０２１８８４に記載されている。
【０２３０】
したがって、構造式（ＶＩＩ）のエナンチオマー的に純粋な化合物を生成する方法において、方法のステップは、式（Ｉ）の基質化合物を式（ＩＩ）の生成物化合物に還元または変換するのに好適な反応条件下で本明細書に記載するケトレダクターゼポリペプチドを使用して、式（Ｉ）の化合物を式（ＩＩ）の化合物に還元または変換することを含むことができる。式（ＩＩ）の化合物からの式（ＶＩＩ）の化合物の合成は、引用した参考文献に記載されている。
【０２３１】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載するケトレダクターゼポリペプチドおよび方法は、構造式（ＶＩＩＩ）のプロテインチロシンキナーゼ阻害薬
【０２３２】
【化１２】
0005973131.tif 000015
（その塩、水和物、および溶媒和物を含む）を、ＷＯ０６０２１８８６に記載されているように生成するのに使用可能であり、式中、Ｒ１０、Ｒ２、ＹおよびＮはそこで記載されている通りである。いくつかの実施形態において、式（ＶＩＩＩ）の化合物では、
Ｙは、ＮまたはＣＲ１であり；
Ｒ１は、水素、ハロゲン、Ｃ１−２アルキル、Ｃ２−１２アルケニル、Ｃ２−１２アルキニル、Ｃ３−１２シクロアルキル、Ｃ６−１２アリール、３〜１２員ヘテロ脂環式、５〜１２員ヘテロアリール、−Ｓ（Ｏ）ｍＲ４、−ＳＯ２ＮＲ４Ｒ５、−Ｓ（Ｏ）２ＯＲ４、−ＮＯ２、−ＮＲ４Ｒ５、−（ＣＲ６Ｒ７）ｎＯＲ４、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ４、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ４、−Ｏ（ＣＲ６Ｒ７）ｎＲ４、−ＮＲ４Ｃ（Ｏ）Ｒ５、−（ＣＲ６Ｒ７）ｎＣ（Ｏ）ＯＲ４、−（ＣＲ６Ｒ７）ｎＮＣＲ４Ｒ５、−Ｃ（＝ＮＲ６）ＮＲ４Ｒ５、−ＮＲ４Ｃ（Ｏ）ＮＲ５Ｒ６、−ＮＲ４Ｓ（Ｏ）ＰＲ５または−Ｃ（Ｏ）ＮＲ４Ｒ５であり、Ｒ１の各水素は、Ｒ３によって場合により置換され；
Ｒ２は、水素、ハロゲン、Ｃ１−２アルキル、Ｃ２−１２アルケニル、Ｃ２−１２アルキニル、Ｃ３−１２シクロアルキル、Ｃ６−１２アリール、３〜１２員ヘテロ脂環式、５〜１２員ヘテロアリール、−Ｓ（Ｏ）ｍＲ４、−ＳＯ２ＮＲ４Ｒ５、−Ｓ（Ｏ）２ＯＲ４、−ＮＯ２、−ＮＲ４Ｒ５、−（ＣＲ６Ｒ７）ｎＯＲ４、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ４、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ４、−Ｏ（ＣＲ６Ｒ７）ｎＲ４、−ＮＲ４Ｃ（Ｏ）Ｒ５、−（ＣＲ６Ｒ７）ｎＣ（Ｏ）ＯＲ４、−（ＣＲ６Ｒ７）ｎＮＣＲ４Ｒ５、−Ｃ（＝ＮＲ６）ＮＲ４Ｒ５、−ＮＲ４Ｃ（Ｏ）ＮＲ５Ｒ６、−ＮＲ４Ｓ（Ｏ）ＰＲ５または−Ｃ（Ｏ）ＮＲ４Ｒ５であり、Ｒ２の各水素は、Ｒ８によって場合により置換され；
各Ｒ３は独立して、ハロゲン、Ｃ１−１２アルキル、Ｃ２−１２アルケニル、Ｃ２−１２アルキニル、Ｃ３−１２シクロアルキル、Ｃ６−１２アリール、３〜１２員ヘテロ脂環式、５〜１２員ヘテロアリール、−Ｓ（Ｏ）ｍＲ４、−ＳＯ２ＮＲ４Ｒ５、−Ｓ（Ｏ）２ＯＲ４、−ＮＯ２、−ＮＲ４Ｒ５、−（ＣＲ６Ｒ７）ｎＯＲ４、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ４、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ４、−Ｏ（ＣＲ６Ｒ７）ｎＲ４、−ＮＲ４Ｃ（Ｏ）Ｒ５、−（ＣＲ６Ｒ７）ｎＣ（Ｏ）ＯＲ４、−（ＣＲ６Ｒ７）ｎＯＲ４、−（ＣＲ６Ｒ７）ｎＣ（Ｏ）ＮＲ４Ｒ５、−（ＣＲ６Ｒ７）ｎＮＣＲ４Ｒ５、−Ｃ（＝ＮＲ６）ＮＲ４Ｒ５、−ＮＲ４Ｃ（Ｏ）ＮＲ５Ｒ６、−ＮＲ４Ｓ（Ｏ）ｐＲ５または−Ｃ（Ｏ）ＮＲ４Ｒ５であり、Ｒ３の各水素は、Ｒ８によって場合により置換され、隣接原子のＲ３基は一緒になって、Ｃ６−１２アリール、５〜１２員ヘテロアリール、Ｃ３−１２シクロアルキルまたは３〜１２員ヘテロ脂環式基を形成してもよく；
各Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は独立して、水素、ハロゲン、Ｃ１−１２アルキル、Ｃ２−１２アルケニル、Ｃ２−１２アルキニル、Ｃ３−１２シクロアルキル、Ｃ６−１２アリール、３〜１２員ヘテロ脂環式、５〜１２員ヘテロアリールであるか；または同じ窒素原子に結合したＲ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７のいずれか２つがそれらが結合した窒素と共に一緒になって、Ｎ、Ｏ、およびＳより選択される１〜３個のさらなるヘテロ原子を場合により含有する３〜１２員ヘテロ脂環式もしくは５〜１２員ヘテロアリール基を形成してもよく；または同じ炭素原子に結合したＲ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７のいずれか２つが一緒になって、Ｃ３−１２シクロアルキル、Ｃ６−１２アリール、３〜１２員ヘテロ脂環式または５〜１２員ヘテロアリール基を形成してもよく；Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７の各水素は、Ｒ８によって場合により置換され；
各Ｒ８は独立して、ハロゲン、Ｃ１−１２アルキル、Ｃ２−１２アルケニル、Ｃ２−１２アルキニル、Ｃ３−１２シクロアルキル、Ｃ６−１２アリール、３〜１２員ヘテロ脂環式、５〜１２員ヘテロアリール、−ＮＨ２、−ＣＮ、−ＯＨ、−Ｏ−Ｃ１−１２アルキル、−Ｏ−（ＣＨ２）ｎＣ３−１２シクロアルキル、−Ｏ−（ＣＨ２）ｎＣ６−１２アリール、−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ（３〜１２員ヘテロ脂環式）または−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ（５〜１２員ヘテロアリール）であり；Ｒ８の各水素は、Ｒ９によって場合により置換され；
各Ｒ９は独立して、ハロゲン、Ｃ１−１２アルキル、Ｃ１−１２アルコキシ、Ｃ３−１２シクロアルキル、Ｃ６−１２アリール、３〜１２員ヘテロ脂環式、５〜１２員ヘテロアリール、−Ｏ−Ｃ１−１２アルキル、−Ｏ−（ＣＨ２）ｎＣ３−１２シクロアルキル、−Ｏ−（ＣＨ２）ｎＣ６−１２アリール、−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ（３〜１２員ヘテロ脂環式）、−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ（５〜１２員ヘテロアリール）または−ＣＮであり、Ｒ９の各水素は、ハロゲン、−ＯＨ、−ＣＮ、部分的または完全にハロゲン化され得る−Ｃ１−１２アルキル、部分的または完全にハロゲン化され得る−Ｏ−Ｃ１−１２アルキル、−ＣＯ、−ＳＯまたは−ＳＯ２によって場合により置換され；
Ｒ１０は、１、２または３個の任意の置換基、独立して、ハロゲン、Ｃ１−１２アルキル、Ｃ２−１２アルケニル、Ｃ２−１２アルキニル、Ｃ３−１２シクロアルキル、Ｃ６−１２アリール、３〜１２員ヘテロ脂環式、５〜１２員ヘテロアリール、−Ｓ（Ｏ）ｍＲ４、−ＳＯ２ＮＲ４Ｒ５、−Ｓ（Ｏ）２ＯＲ４、−ＮＯ２、−ＮＲ４Ｒ５、−（ＣＲ６Ｒ７）ｎＯＲ４、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ４、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ４、−Ｏ（ＣＲ６Ｒ７）ｎＲ４、−ＮＲ４Ｃ（Ｏ）Ｒ５、−（ＣＲ６Ｒ７）ｎＣ（Ｏ）ＯＲ４、−（ＣＲ６Ｒ７）ｎＯＲ４、−（ＣＲ６Ｒ７）ｎＣ（Ｏ）ＮＲ４Ｒ５、−（ＣＲ６Ｒ７）ｎＮＣＲ４Ｒ５、−Ｃ（＝ＮＲ６）ＮＲ４Ｒ５、−ＮＲ４Ｃ（Ｏ）ＮＲ５Ｒ６、−ＮＲ４Ｓ（Ｏ）ＰＲ５、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ４Ｒ５、（ＣＲ６Ｒ７）ｎ（３〜１２員ヘテロ脂環式）、−（ＣＲ６Ｒ７）ｎ（Ｃ３−１２シクロアルキル）、−（ＣＲ６Ｒ７）ｎ（Ｃ６−１２アリール）、−（ＣＲ６Ｒ７）ｎ（５〜１２員ヘテロアリール）、または−（ＣＲ６Ｒ７）ｎＣ（Ｏ）ＮＲ４Ｒ５を表し、Ｒ１０の各水素は、Ｒ３によって場合により置換され；
式中、各ｍは独立して、０、１または２であり；各ｎは独立して、０、１、２、３または４であり；各ｐは独立して、１または２である。式（ＶＩＩＩ）に含まれる具体的な化合物と同様に各種の置換基の説明は、ＷＯ０６０２１８８６に記載されている。
【０２３３】
したがって、構造式（ＶＩＩＩ）の化合物を生成する方法において、方法のステップは、式（Ｉ）の基質化合物を式（ＩＩ）の生成物化合物に還元または変換するのに好適な反応条件下で本明細書に記載するケトレダクターゼポリペプチドを使用して、式（Ｉ）の化合物を式（ＩＩ）の化合物に還元または変換することを含むことができる。式（ＩＩ）の化合物からの式（ＶＩＩＩ）の化合物の合成は、引用した参考文献に記載されている。
【０２３４】
当業者には公知であるように、ケトレダクターゼ触媒還元反応は、代表的に補因子を必要とする。本明細書に記載する操作されたケトレダクターゼ酵素によって触媒される還元反応も代表的に補因子を必要とするが、本操作されたケトレダクターゼの多くの実施形態は、野生型ケトレダクターゼ酵素で触媒される反応よりはるかに少ない補因子しか必要としない。本明細書において用いる場合、用語「補因子」は、ケトレダクターゼ酵素との組み合わせで動作する非タンパク質化合物を指す。本明細書に記載する操作されたケトレダクターゼ酵素と共に使用するために適する補因子としては、ＮＡＤＰ＋（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）、ＮＡＤＰＨ（ＮＡＤＰ＋の還元形）、ＮＡＤ＋（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）およびＮＡＤＨ（ＮＡＤ＋の還元形）が挙げられるが、これらに限定されない。一般に、前記補因子の還元形を反応混合物に添加する。前記還元ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ形は、場合によっては、補因子再生系を使用してその酸化ＮＡＤ（Ｐ）＋形から再生させることができる。
【０２３５】
用語「補因子再生系」は、補因子の酸化形を還元する反応（例えば、ＮＡＤＰ＋からＮＡＤＰＨ）に関与する１セットの反応物を指す。ケト基質のケトレダクターゼ触媒還元によって酸化された補因子は、補因子再生系によって還元形に再生される。補因子再生系は、還元性水素等価物の源であり、且つ、その補因子の酸化形を還元できる、化学量論的量の還元剤を含む。補因子再生系は、その還元剤によるその補因子の酸化形の還元を触媒する触媒、例えば酵素触媒、をさらに含み得る。ＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋からそれぞれＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを再生するための補因子再生系は、当該技術分野において公知であり、本明細書に記載する方法においてそれらを使用することができる。
【０２３６】
利用することができる、適する例示的補因子再生系としては、グルコースおよびグルコースデヒドロゲナーゼ、ホルマートおよびギ酸デヒドロゲナーゼ、グルコース−６−リン酸塩およびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、第二級（例えば、イソプロパノール）アルコールおよび第二級アルコールデヒドロゲナーゼ、亜リン酸塩および亜リン酸デヒドロゲナーゼ、分子水素およびヒドロゲナーゼなどが挙げられるが、これらに限定されない。これらの系を、補因子としてＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤ＋／ＮＡＤＨいずれかと併用することができる。ヒドロゲナーゼを使用する電気化学的再生も、補因子再生系として用いることができる。例えば、米国特許第５，５３８，８６７号および同第６，４９５，０２３号参照（これらの両方が参照により本明細書に援用されている）。金属触媒および還元剤（例えば、分子水素またはホルマート）を含む化学的補因子再生系も適する。例えば、ＰＣＴ公報ＷＯ  ２０００／０５３７３１参照（これは参照により本明細書に援用されている）。
【０２３７】
用語「グルコースデヒドロゲナーゼ」および「ＧＤＨ」は、グルコン酸およびＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨへのＤ−グルコースおよびＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋の変換をそれぞれ触媒する、ＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋依存性酵素を指すために本明細書では交換可能に用いている。下の反応式（１）は、グルコースによるＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋のグルコースデヒドロゲナーゼ触媒還元を説明する。
【０２３８】
【化１３】
0005973131.tif 000016
本明細書に記載する方法の実施の際の使用に適するグルコースデヒドロゲナーゼは、天然由来グルコースデヒドロゲナーゼと非天然由来グルコースデヒドロゲナーゼの両方を含む。天然由来グルコースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、文献に報告されている。例えば、Ｂａｃｃｉｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ６１２９７  ＧＤＨ遺伝子が、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現され、そしてその天然宿主において生産された酵素と同じ物理化学的性質を示すと報告されている（Ｖａｓａｎｔｈａら，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：７８５）。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ１２２７６に対応するＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＧＤＨ遺伝子の遺伝子配列は、Ｌａｍｐｅｌら，１９８６，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６６：２３８〜２４３により報告されており、そして補正された形のものは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｄ５０４５３としてＹａｍａｎｅら，１９９６，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４２：３０４７〜３０５６により報告されている。天然由来のＧＤＨ遺伝子は、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ  １４５７９からのＧＤＨをコードするもの（Ｎａｔｕｒｅ，２００３，４２３：８７〜９１；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＥ０１７０１３）およびＢ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍからのＧＤＨをコードするもの（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９８８，１７４：４８５〜４９０，ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ１２３７０；Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉｏｅｎｇ．，１９９０，７０：３６３〜３６９，ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＧＩ２１６２７０）も含む。Ｂａｃｉｌｌｕｓ種からのグルコースデヒドロゲナーゼは、ＰＣＴ公報ＷＯ  ２００５／０１８５７９に、（そのＰＣＴ公報の配列番号９および１１にそれぞれ対応するポリヌクレオチド配列によってコードされる）配列番号１０および１２として提供されており、その開示は参照により本明細書に援用される。
【０２３９】
非天然由来グルコースデヒドロゲナーゼは、例えば突然変異誘発、定方向進化などのような公知の方法を用いて生じさせることができる。天然由来であろうと、非天然由来であろうと、適する活性を有するＧＤＨ酵素は、ＰＣＴ公報ＷＯ  ２００５／０１８５７９の実施例４に記載されているアッセイを用いて容易に同定することができ、その開示は参照により本明細書に援用される。例示的非天然由来グルコースデヒドロゲナーゼは、ＰＣＴ公報ＷＯ  ２００５／０１８５７９に配列番号６２、６４、６６、６８、１２２、１２４、および１２６として提供されている。それらをコードするポリヌクレオチド配列は、ＰＣＴ公報ＷＯ  ２００５／０１８５７９に、それぞれ、配列番号６１、６３、６５、６７、１２１、１２３、および１２５として提供されている。これらの配列のすべてが参照により本明細書に援用される。本明細書に開示するケトレダクターゼ触媒還元反応において使用するために適する追加の非天然由来グルコースデヒドロゲナーゼは、米国特許出願公開第２００５／００９５６１９号および同第２００５／０１５３４１７号に提供されており、これらの開示は、参照により本明細書に援用される。
【０２４０】
本明細書に記載するケトレダクターゼ触媒還元反応に利用されるグルコースデヒドロゲナーゼは、ＰＣＴ公報ＷＯ  ２００５／０１８５７９の実施例４に記載されているアッセイにおいて、少なくとも約１０μｍｏｌ／分／ｍｇの、および時として少なくとも約１０２μｍｏｌ／分／ｍｇまたは約１０３μｍｏｌ／分／ｍｇ、約１０４μｍｏｌ／分／ｍｇまで、またはそれより高い活性を示すことができる。
【０２４１】
本明細書に記載するケトレダクターゼ触媒還元反応は、一般に、溶媒中で行われる。適する溶媒としては、水、有機溶媒（例えば、酢酸エチル、酢酸ブチル、１−オクタノール、ヘプタン、オクタン、メチルｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）、トルエンなど）、イオン性液体（例えば、テトラフルオロホウ酸１−エチル−４−メチルイミダゾリウム、テトラフルオロホウ酸１−ブチル−３−メチルイミダゾリウム、ヘキサフルオロリン酸１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムなど）が挙げられる。一部の実施形態では、水および水性共溶媒系をはじめとする水性溶媒が、使用される。
【０２４２】
例示的水性共溶媒系は、水および１つ以上の有機溶媒を有する。一般に、水性共溶媒系の有機溶媒成分は、それがケトレダクターゼ酵素を完全には不活性化しないように選択される。適切な共溶媒系は、本明細書に記載するものなどの酵素活性アッセイを利用して、候補溶媒系中での対象となる規定された基質を用いて特定の操作されたケトレダクターゼ酵素の酵素活性を測定することによって、容易に特定することができる。
【０２４３】
水性共溶媒系の有機溶媒成分は、その水性成分と混和性であって、単一の液相を生じさせる場合もあり、またはその水性成分と部分混和性もしくは不混和性であって、２つの液相を生じさせる場合もある。一般に、水性共溶媒系を利用するときには、有機溶媒に分散された水、またはその逆で、二相性になるように選択する。一般に、水性共溶媒系を利用するときには、水相から容易に分離することができる有機溶媒を選択することが望ましい。一般に、前記共溶媒系中の水の有機溶媒に対する比率は、代表的に、有機溶媒対水  約９０：１０から約１０：９０（ｖ／ｖ）の範囲、および有機溶媒対水  ８０：２０と２０：８０（ｖ／ｖ）の間である。前記共溶媒系は、反応混合物に添加する前に前もって形成される場合もあり、または反応容器内でインサイチュで形成される場合もある。
【０２４４】
水性溶媒（水または水性共溶媒系）は、ｐＨ緩衝されていても、緩衝されていなくてもよい。一般に、前記還元は、約１０以下、通常は約５から約１０の範囲のｐＨで行うことができる。一部の実施形態において、前記還元は、約９以下、通常は約５から約９の範囲のｐＨで行われる。一部の実施形態において、前記還元は、約８以下、多くの場合、約５から約８の範囲、および通常は約６から約８の範囲のｐＨで行われる。前記還元は、約７．８以下、または約７．５以下のｐＨで行われる場合もある。あるいは、前記還元は、中性ｐＨ、すなわち約７、で行われる場合がある。
【０２４５】
前記還元反応の過程で、反応混合物のｐＨが変わることがある。反応の過程で酸または塩基を添加することにより、その反応混合物のｐＨを所望のｐＨでまたは所望のｐＨ範囲内で維持することができる。あるいは、緩衝剤を含む水性溶媒を使用することによって、ｐＨを制御することができる。所望のｐＨ範囲を維持するために適する緩衝剤は、当該技術分野において公知であり、それらとしては、例えば、リン酸緩衝液、トリエタノールアミン緩衝液などが挙げられる。緩衝と酸または塩基添加とを併用してもよい。
【０２４６】
グルコース／グルコースデヒドロゲナーゼ補因子再生系を用いる場合、反応式（１）で表されるようなグルコン酸の共生成（ｐＫａ＝３．６）は、結果として生ずる水性グルコン酸を別の方法で中和しなければ、その反応混合物のｐＨを低下させる。反応混合物のｐＨは、備わっている緩衝能まで緩衝剤がグルコン酸を中和する標準的な緩衝技術によって、またはその変換の過程で並行して塩基を添加することによって、所望のレベルで維持することができる。緩衝と塩基添加とを併用してもよい。所望のｐＨ範囲を維持するために適する緩衝剤は、上に記載されている。グルコン酸の中和に適する塩基は、有機塩基、例えばアミン、アルコキシドなど、および無機塩基、例えば水酸化物塩（例えば、ＮａＯＨ）、炭酸塩（例えば、ＮａＨＣＯ３）、重炭酸塩（例えば、Ｋ２ＣＯ３）、塩基性リン酸塩（例えば、Ｋ２ＨＰＯ４、Ｎａ３ＰＯ４）などである。前記変換の過程と並行した塩基の添加は、その反応混合物のｐＨをモニターしながら手作業で、またはより適便には、ｐＨスタットのような自動滴定装置を使用することによって、行うことができる。プロセス制御のために、部分緩衝能と塩基添加とを併用することもできる。
【０２４７】
ケトレダクターゼ触媒還元反応中に放出されるグルコン酸を中和するために塩基添加を用いる場合、ｐＨを維持するために添加する塩基の量によってその変換の進行をモニターすることができる。代表的に、還元の過程で緩衝されていない反応混合物または部分緩衝反応混合物に添加される塩基は、水溶液で添加される。
【０２４８】
一部の実施形態において、前記補因子再生系は、ギ酸デヒドロゲナーゼを含み得る。用語「ギ酸デヒドロゲナーゼ」および「ＦＤＨ」は、二酸化炭素およびＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨへのホルマートおよびＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋の変換をそれぞれ触媒する、ＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋依存性酵素を指すために、本明細書では交換可能に用いている。本明細書に記載するケトレダクターゼ触媒還元反応における補因子再生系としての使用に適するギ酸デヒドロゲナーゼは、天然由来のギ酸デヒドロゲナーゼと、非天然由来ギ酸デヒドロゲナーゼの両方を含む。ギ酸デヒドロゲナーゼとしては、ＰＣＴ公報２００５／０１８５７９の配列番号６９および７１にそれぞれ対応するポリヌクレオチド配列によってコードされる、ＰＣＴ公報ＷＯ  ２００５／０１８５７９の配列番号７０（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種）および７２（Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｉｄｉｎｉｉ）に対応するものが挙げられ、これらの開示は参照により本明細書に援用される。本明細書に記載する方法において用いられるギ酸デヒドロゲナーゼは、天然由来であろうと、または非天然由来であろうと、少なくとも約１μｍｏｌ／分／ｍｇ、時として少なくとも約１０μｍｏｌ／分／ｍｇ、または少なくとも約１０２μｍｏｌ／分／ｍｇ、約１０３μｍｏｌ／分／ｍｇまで、またはそれより高い活性を示すことができ、およびＰＣＴ公報ＷＯ  ２００５／０１８５７９の実施例４に記載されているアッセイで活性について容易にスクリーニングすることができる。
【０２４９】
本明細書において用いる場合、用語「ホルマート」は、ギ酸アニオン（ＨＣＯ２−）、ギ酸（ＨＣＯ２Ｈ）、およびこれらの混合物を指す。ホルマートは、塩の形態、代表的にアルカリまたはアンモニウム塩（例えば、ＨＣＯ２Ｎａ、ＫＨＣＯ２ＮＨ４など）の形態で、ギ酸、代表的にギ酸水溶液、の形態で、またはそれらの混合物で供給することができる。ギ酸は、穏やかな酸である。そのｐＫａ（水中で、ｐＫａ＝３．７）の数ｐＨ単位以内の水溶液中では、ホルマートは、平衡濃度でＨＣＯ２−とＨＣＯ２Ｈの両方として存在する。約ｐＨ４より高いｐＨ値では、ホルマートは、主としてＨＣＯ２−として存在する。ホルマートをギ酸として供給する場合、代表的に、塩基の添加によってその反応混合物を緩衝してまたはより低酸性にして、代表的に約ｐＨ５以上の、所望のｐＨを生じさせる。ギ酸の中和に適する塩基としては、有機塩基、例えばアミン、アルコキシドなど、および無機塩基、例えば水酸化物塩（例えば、ＮａＯＨ）、炭酸塩（例えば、ＮａＨＣＯ３）、重炭酸塩（例えば、Ｋ２ＣＯ３）、塩基性リン酸塩（例えば、Ｋ２ＨＰＯ４、Ｎａ３ＰＯ４）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２５０】
ホルマートが主としてＨＣＯ２−として存在する約ｐＨ５より高いｐＨ値については、下の反応式（２）によって、ホルマートによるＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋のギ酸デヒドロゲナーゼ触媒還元が説明される。
【０２５１】
【化１４】
0005973131.tif 000017
ホルマートおよびギ酸デヒドロゲナーゼを補因子再生系として用いる場合、備わっている緩衝能まで緩衝剤がプロトンを放出する標準的な緩衝技術によって、またはその変換の過程と並行して酸を添加することによって、その反応混合物のｐＨを所望のレベルで維持することができる。ｐＨを維持するためにその反応の過程で添加される適する酸としては、有機酸、例えばカルボン酸、スルホン酸、ホスホン酸など、および鉱酸、例えば、ハロゲン化水素酸（例えば、塩化水素酸）、硫酸、リン酸など、酸性塩、例えば二水素リン酸塩（例えば、ＫＨ２ＰＯ４）、重硫酸塩（例えば、ＮａＨＳＯ４）などが挙げられる。一部の実施形態は、ギ酸を利用し、それによって、その溶液のホルマート濃度とｐＨの両方を維持する。
【０２５２】
ホルマート／ギ酸デヒドロゲナーゼ補因子再生系を使用する還元反応中にｐＨを維持するために酸添加を用いる場合、そのｐＨを維持するために添加する酸の量によって、その変換の進行をモニターすることができる。代表的に、変換の過程で緩衝されていない反応混合物または部分緩衝反応混合物に添加される酸は、水溶液で添加される。
【０２５３】
用語「第二級アルコールデヒドロゲナーゼ」および「ｓＡＤＨ」は、ケトンおよびＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨへの第二級アルコールおよびＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋の変換をそれぞれ触媒する、ＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋依存性酵素を指すために、本明細書では交換可能に用いている。下の反応式（３）は、イソプロパノールによって例証される第二級アルコールによるＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋の還元を説明する。
【０２５４】
【化１５】
0005973131.tif 000018
本明細書に記載するケトレダクターゼ触媒還元反応において補因子再生系としての使用に適する第二級アルコールデヒドロゲナーゼは、天然由来第二級アルコールデヒドロゲナーゼと、非天然由来第二級アルコールデヒドロゲナーゼの両方を含む。天然由来第二級アルコールデヒドロゲナーゼとしては、Ｔｈｅｒｍｏａｎｅｒｏｂｉｕｍ  ｂｒｏｃｋｉｉ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｔｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒ、およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓからの公知アルコールデヒドロゲナーゼが挙げられ、そして非天然由来第二級アルコールデヒドロゲナーゼとしては、それらから誘導された操作されたアルコールデヒドロゲナーゼが挙げられる。本明細書に記載する方法において用いられる第二級アルコールデヒドロゲナーゼは、天然由来であろうと、または非天然由来であろうと、少なくとも約１μｍｏｌ／分／ｍｇ、時として少なくとも約１０μｍｏｌ／分／ｍｇ、または少なくとも約１０２μｍｏｌ／分／ｍｇ、約１０３μｍｏｌ／分／ｍｇまで、またはそれより高い活性を示すことができる。
【０２５５】
適する第二級アルコールとしては、低級第二級アルコールおよびアリール−アルキルカルビノールが挙げられる。低級第二級アルコールの例としては、イソプロパノール、２−ブタノール、３−メチル−２−ブタノール、２−ペンタノール、３−ペンタノール、３，３−ジメチル−２−ブタノールなどが挙げられる。１つの実施形態において、前記第二級アルコールは、イソプロパノールである。適するアリール−アルキルカルビノールとしては、非置換および置換１−アリールエタノールが挙げられる。
【０２５６】
第二級アルコールおよび第二級アルコールデヒドロゲナーゼを補因子再生系として用いる場合、結果として生ずるＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋は、その第二級アルコールデヒドロゲナーゼによるその第二級アルコールのケトンへの共役酸化によって還元される。一部の操作されたケトレダクターゼは、第二級アルコール還元体を脱水素する活性も有する。還元体として第二級アルコールを使用する一部の実施形態では、その操作されたケトレダクターゼとその第二アルコールケトレダクターゼが同じ酵素である。
【０２５７】
補因子再生系を用いる本明細書に記載するケトレダクターゼ触媒還元反応の実施形態を行う場合、最初にその補因子の酸化形を供給してもよいし、還元形を供給してもよい。上で説明したように、補因子再生系は、酸化された補因子をその還元形に変換し、その後、それがケトレダクターゼ基質の還元に利用される。
【０２５８】
一部の実施形態では、補因子再生系を使用しない。補因子再生系を使用せずに行われる還元反応については、補因子を還元形で反応混合物に添加する。
【０２５９】
一部の実施形態において、宿主生物の全細胞を使用して前記プロセスを行う場合、その全細胞は、生得的に補因子を提供することができる。あるいは、または併せて、前記細胞は、生得的にまたは組換えにより、グルコースデヒドロゲナーゼを提供することができる。
【０２６０】
本明細書に記載する立体選択的還元反応を行う場合、前記操作されたケトレダクターゼ酵素、および任意の補因子再生系を構成する任意の酵素は、精製された酵素の形態、それらの酵素をコードする遺伝子（単数もしくは複数）で形質転換された全細胞の形態、ならびに／またはそのような細胞の細胞抽出物および／もしくは溶解産物の形態で、その反応混合物に添加することができる。操作されたケトレダクターゼ酵素および任意の補因子再生酵素をコードする遺伝子（単数または複数）は、宿主細胞に別々に形質転換することができ、または一緒に同じ宿主細胞に形質転換することができる。例えば、一部の実施形態では、前記操作されたケトレダクターゼ酵素をコードする遺伝子（単数または複数）で１セットの宿主細胞を形質転換し、前記補因子再生酵素をコードする遺伝子（単数または複数）で別のセットを形質転換することができる。形質転換された細胞の両方のセットを、一緒に、全細胞の形態で、またはそれから誘導した溶解産物もしくは抽出物の形態で、反応混合物に用いることができる。他の実施形態では、前記操作されたケトレダクターゼ酵素と前記補因子再生酵素の両方をコードする遺伝子（単数または複数）で宿主細胞を形質転換することができる。
【０２６１】
前記操作されたケトレダクターゼ酵素および／もしくは任意の補因子再生酵素をコードする遺伝子（単数もしくは複数）で形質転換された全細胞、またはそれらの細胞抽出物および／もしくは溶解産物は、固体（例えば、凍結乾燥されたもの、噴霧乾燥されたものなど）または半固体（例えば、粗製ペースト）をはじめとする様々な異なる形態で用いることができる。
【０２６２】
前記細胞抽出物または細胞溶解産物は、沈殿（硫酸アンモニウム、ポリエチレンイミンまたは熱処理など）、続いて脱塩手順、その後凍結乾燥（例えば、限外濾過、および透析など）によって部分的に精製することができる。いずれの細胞調製物も、例えばグルタルアルデヒドなどの公知架橋剤を使用する架橋または固相への固定化（例えば、Ｅｕｐｅｒｇｉｔ  Ｃなど）によって安定させることができる。
【０２６３】
固体反応物（例えば、酵素、塩など）は、粉末（例えば、凍結乾燥されたもの、噴霧乾燥されたものなど）、溶液、乳濁液、懸濁液などをはじめとする様々な異なる形態で反応に供給することができる。前記反応物は、当業者に公知である方法および装置を用いて容易に凍結乾燥または噴霧乾燥させることができる。例えば、前記タンパク質溶液を−８０℃で少量ずつ凍結させ、その後、予冷した凍結乾燥チャンバにそれを添加し、その後、真空を適用することができる。それらのサンプルから水を除去した後、代表的にその温度を２時間、４℃に上昇させ、その後、真空を解放し、凍結乾燥サンプルを回収する。
【０２６４】
一般に、還元反応に使用される反応物の量は、所望される生成物の量によって、および付随して、利用されるケトレダクターゼ基質の量によって変わる。以下のガイドラインを用いて、使用するケトレダクターゼ、補因子および任意の補因子再生系の量を決定することができる。一般に、ケト基質は、約５０ｍｇから約５ｇのケトレダクターゼおよび約１０ｍｇから約１５０ｍｇの補因子を使用して、約２０から３００グラム／リットルの濃度で利用することができる。所望の生産性レベルおよび生産規模に合わせるためにこれらの量を変える方法は、当業者には容易にわかるであろう。任意の補因子再生系の適切な量は、用いる補因子および／またはケトレダクターゼの量に基づき慣用的実験によって容易に決定することができる。一般に、還元体（例えば、グルコース、ホルマート、イソプロパノール）をケトレダクターゼ基質の等モルレベルより高いレベルで用いて、そのケトレダクターゼ基質の本質的に完全なまたはほぼ完全な変換を達成する。
【０２６５】
反応物の添加順序は、重要でない。反応物を一緒に溶媒（例えば、単相溶媒、二相水性共溶媒系など）に添加してもよいし、あるいは反応物の一部を別々に、および一部を異なる時点で一緒に添加してもよい。例えば、補因子再生系、補因子、ケトレダクターゼ、およびケトレダクターゼ基質を最初に溶媒に添加してもよい。
【０２６６】
水性共溶媒系を使用する際の混合効率改善のために、補因子再生系、ケトレダクターゼ、および補因子を最初に水相に添加して混合する。その後、有機相を添加して混合し、その後、ケトレダクターゼ基質を添加することができる。あるいは、水相に添加する前に、ケトレダクターゼ基質を有機相に予め混合することができる。
【０２６７】
本明細書に記載するケトレダクターゼ触媒還元反応を行うために適する条件は、操作されたケトレダクターゼ酵素と基質とを実験ｐＨおよび温度で接触させ、例えば本明細書に提供する実施例において説明する方法を用いて、生成物を検出することを含む（しかし、これらに限定されない）慣用的な実験によって、容易に最適化することができる、多種多様な条件を含む。
【０２６８】
前記ケトレダクターゼ触媒還元は、代表的に、約１５℃から約７５℃の範囲の温度で行われる。一部の実施形態について、前記反応は、約２０℃から約５５℃の範囲の温度で行われる。さらに他の実施形態では、約２０℃から約４５℃の範囲の温度で行われる。前記反応は、周囲条件下で行われる場合もある。
【０２６９】
一般に、前記還元反応を本質的に完了またはほぼ完了するまで進行させ、基質の還元を達成する。基質および／または生成物を検出することによる公知の方法を用いて、基質の生成物への還元をモニターすることができる。適する方法としては、ガスクロマトグラフィー、ＨＰＬＣなどが挙げられる。前記反応混合物において生成されるアルコール還元生成物の変換収率は、一般に約５０％より高く、約６０％より高い場合もあり、約７０％より高い場合もあり、約８０％より高い場合もあり、約９０％より高い場合もあり、および多くの場合、約９７％より高い。
【実施例】
【０２７０】
本開示の各種の特徴および実施形態は、例証的であり、限定するものではない、次の代表的な実施例で説明する。
【０２７１】
次の説明において、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）を使用する場合は必ず、Ｊｕｌｉｃｈ  Ｃｈｉｒａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｊuｌｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙから入手できるＧＤＨ  ＣＤＸ９０１である。
【０２７２】
（実施例１）
野生型ケトレダクターゼ遺伝子獲得および発現ベクターの構築
参照により本明細書に組入れられている米国特許仮出願番号第６０／８４８，９５０号およびＷＯ２００８０４２８７６の実施例１に記載された、ケトレダクターゼの報告されたアミノ酸配列およびコドン最適化アルゴリズムに基づいて、Ｅ．ｃｏｌｉ中での発現のためにケトレダクターゼ（ＫＲＥＤ）コード遺伝子を設計した。遺伝子は、４２ヌクレオチドで構成されたオリゴヌクレオチドを使用して合成し、ｌａｃプロモータの制御下で発現ベクターｐＣＫ１１０９００（米国特許出願公開第２００６０１９５９４７号の図３として示されている）中にクローニングした。発現ベクターは、Ｐ１５ａ複製起点およびクロラムフェニコール耐性遺伝子も含有していた。得られたプラスミドは標準方法を使用してＥ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０に形質転換した。コドン最適化遺伝子およびコード化ポリペプチドも表３に示す。野生型ケトレダクターゼの活性は、米国特許仮出願番号第６０／８４８，９５０号に記載されているように確認した。
【０２７３】
【表３】
0005973131.tif 000019
本開示の改変ケトレダクターゼをコードするポリヌクレオチドは、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０での発現のためにベクターｐＣＫ１１０９００内に同様にクローニングした。
【０２７４】
（実施例２）
ケトレダクターゼ粉末の生成：振とうフラスコ手順
対象のケトレダクターゼ遺伝子を持つプラスミドを含有するＥ．ｃｏｌｉの単一の菌コロニーを、３０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールおよび１％グルコースを含有するＬＢ培地５０ｍＬに接種した。細胞を、３０℃のインキュベータにおいて２５０ｒｐｍで振とうしながら、一晩（少なくとも１６時間）増殖させた。培養物を１ｌフラスコ内でＴＢ培地２５０ｍＬ（１２ｇ／Ｌバクトトリプトン、２４ｇ／Ｌ酵母抽出物、４ｍＬ／Ｌグリセロール、６５ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．０、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４、３０μｇ／ｍＬクロラムフェニコール）に６００ｎｍの吸光度（ＯＤ６００）０．２まで希釈し、３０℃で増殖した。培養物のＯＤ６００が０．６〜０．８であるとき、ケトレダクターゼ遺伝子の発現は１ｍＭ  ＩＰＴＧによって誘導され、一晩（少なくとも１６時間）インキュベートされた。細胞を遠心分離（５０００ｒｐｍ、１５分、４℃）によって収集して、上清は廃棄した。細胞ペレットを、等量の１００ｍＭ冷（４℃）トリエタノールアミン（塩化物）緩衝液、ｐＨ７．０（ＡＤＨ−ＬＫおよびＡＤＨ−ＬＢならびにそれに由来した改変ケトレダクターゼの場合、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４を含む）で再懸濁し、遠心分離により上記のように収集した。洗浄した細胞を２倍量の冷トリエタノールアミン（塩化物）緩衝液に再懸濁し、４℃に維持しながらフレンチプレスに１２０００ｐｓｉで２回通した。細胞片を遠心分離（９０００ｒｐｍ、４５分、４℃）によって除去した。透明溶解液上清を収集して、−２０℃で貯蔵した。凍結した透明溶解液の凍結乾燥により、粗ケトレダクターゼ酵素の乾燥粉末を得た。
【０２７５】
（実施例３）
ケトレダクターゼの生成：発酵手順
通気撹拌１５Ｌ発酵槽で、０．８８ｇ／Ｌ硫酸アンモニウム、０．９８ｇ／Ｌクエン酸ナトリウム；１２．５ｇ／Ｌリン酸水素二カリウム三水和物、６．２５ｇ／Ｌリン酸二水素カリウム、６．２ｇ／ＬＴａｓｔｏｎｅ−１５４酵母抽出物、０．０８３ｇ／Ｌクエン酸第二鉄アンモニウム、ならびに２ｇ／Ｌ塩化カルシウム二水和物、２．２ｇ／Ｌ硫酸亜鉛七水和物、０．５ｇ／Ｌ硫酸マンガン一水和物、１ｇ／Ｌ硫酸第一銅七水和物、０．１ｇ／Ｌモリブデン酸アンモニウム四水和物および０．０２ｇ／Ｌ四ホウ酸ナトリウム十水和物を含有する８．３ｍＬ／Ｌ微量元素溶液を含有する成長培地６．０Ｌの温度を３０℃とした。発酵槽に、対象のケトレダクターゼ遺伝子を持つプラスミドを含有し、実施例３に記載するように振とうフラスコ内で０．５〜２．０の開始ＯＤ６００まで増殖させた、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０の指数後期培養物を接種した。発酵槽を５００〜１５００ｒｐｍで撹拌し、空気を発酵容器に１．０〜１５．０Ｌ／分にて供給して溶解酸素レベルを３０％飽和またはそれ以上に維持した。２０％ｖ／ｖ水酸化アンモニウムの添加により、培養物のｐＨを７．０に制御した。５００ｇ／Ｌセレロース、１２ｇ／Ｌ塩化アンモニウムおよび１０．４ｇ／Ｌ硫酸マグネシウム七水和物を含有する供給溶液の添加により、培養物の増殖を維持した。培養物はＯＤ６００が５０に達した後、イソプロピル−ｂ−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）の添加により、ケトレダクターゼの発現を最終濃度１ｍＭまで誘導した。培養物をさらに１４時間増殖させた。次に培養物を４℃まで冷却して、収集するまで４℃に維持した。細胞を、４℃でＳｏｒｖａｌ  ＲＣ１２ＢＰ遠心分離機において５０００Ｇで４０分間遠心分離して、収集した。収集した細胞は次の下流回収プロセスで直接使用するか、またはそのように使用するまで４℃にて貯蔵した。
【０２７６】
細胞ペレットを、湿潤細胞ペーストの各量に対して２倍量の１００ｍＭトリエタノールアミン（塩化物）緩衝液、ｐＨ６．８に４℃で再懸濁した。１２０００ｐｓｉｇの圧力を使用して２ステージ・ホモジナイズ・バルブ・アセンブリを装着したホモジナイザに懸濁液を通過させることによって、細胞内ケトレダクターゼを細胞から放出させた。破壊直後に、細胞ホモジネートを４℃まで冷却した。１０％ｗ／ｖポリエチレンイミン溶液、ｐＨ７．２を溶解液に最終濃度０．５％ｗ／ｖまで添加して、３０分間撹拌した。得られた懸濁物を、標準実験用遠心分離機において５０００Ｇで３０分間遠心分離にして、清澄にした。透明上清をデカンテーションして、分子量カットオフが３０Ｋｄのセルロース限外濾過膜を使用して１０倍に濃縮した。最終濃縮物を浅型コンテナに分配して、−２０℃で凍結し、凍結乾燥し、粉末とした。ケトレダクターゼ粉末は−８０℃で貯蔵した。
【０２７７】
（実施例４）
２’，６’−ジクロロ−３’−フルオロアセトフェノンの（Ｓ）−１−［２，６−ジクロロ−３−フルオロフェニル］−エタノールへの変換およびエナンチオマー過剰率を決定する分析方法
２’，６’−ジクロロ−３’−フルオロアセトフェノンの還元およびアルコール生成物のキラル純度は、逆相キラルＨＰＬＣ（４．６×１５０ｍｍ  Ｃｈｉｒａｌｐａｋ  ＡＤ−ＲＨカラム（ガードカートリッジなし）；０．８ｍＬ／分にて５０：５０  ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ；２５ｏＣ；次の保持時間による２５４ｎｍにおける検出：（Ｓ）−アルコール５．７７分；（Ｒ）−アルコール６．１９分；ケトン７．４９分）または順相キラルＨＰＬＣ（４．６×２５０ｍｍ  Ｃｈｉｒａｌｐａｋ  ＡＤカラム（ガードカートリッジなし）；室温で２．５ｍＬ／分にて２：９８  ＩＰＡ／ヘキサン（調節せず）；次の保持時間による２２０ｎｍにおける検出：（Ｓ）−アルコール４．７２分；（Ｒ）−アルコール５．３０分；ケトン２．０３分）によって決定した。
【０２７８】
または、次のガスクロマトグラフィー分析方法を使用した：５０℃／分での１００℃（１分）〜２００℃（４分）の温度プログラムによるＨＰ−５カラム（３０ｍ×０．２５ｍｍ）を使用するアキラル方法（保持時間は、ケトンで４．３３分、アルコールで４．７０分であった）および１６５℃等温にてベータシクロデキストリン（ＤＭ）カラム（３０ｍ×０．２５ｍｍ）を使用するキラル方法（保持時間は、ケトンで３．４２分、Ｒ−異性体で５．９２分、およびＳ−異性体で６．２５分であった）。
【０２７９】
（実施例５）
２’，６’−ジクロロ−３’−フルオロアセトフェノンの還元についての野生型ケトレダクターゼの評価
実施例１の表３に記載したＫＲＥＤを、化学量論的ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを補因子として使用してスクリーニングした。９６ウェル深型プレートの各ウェルに、ＫＲＥＤ  ５〜１０ｍｇ、１００ｍＭ  ｐＨ７．０トリエタノールアミン（塩化物）緩衝液５００μＬ中のＮＡＤ（Ｐ）Ｈ２０ｍｇおよび基質１５μＬを添加した（基質約４０ｇ／Ｌ；補因子により変換は約２５に制限）。プレートを密封して、６時間振とうした。ＥｔＯＡｃ１ｍＬを添加して、反応を停止した。生成物の変換および立体純度を実施例４に記載するようにアッセイした。
【０２８０】
これらの条件下で、ＹＤＬ、ＹＧＬ、ＧＲＥ、ＡＤＨ−ＲＥ、ＡＤＨ−ＳＢ、ＡＤＨ−ＳＣ、ＡＤＨ−ＨＬ、ＬＤＨ−ＬＬ、ＡＤＨ−ＣＰ、ＡＤＨ−ＣＢ、およびＤＲ−ＬＢは、ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨのどちらでも検出可能な変換は見られなかったのに対して、ＡＤＨ−ＬＢ、およびＹＰＲでは＜０．５％の変換が見られた。ＡＤＨ−ＬＫは、基質の＜１％をキラルアルコールに変換した。
【０２８１】
この実施例は、野生型ケトレダクターゼが２’，６’−ジクロロ−３’−フルオロアセトフェノンに対して、有するとしてもごくわずかな活性しか有さないことを示している。
【０２８２】
（実施例６）
２’，６’−ジクロロ−３’−フルオロアセトフェノンの還元についてのＡＤＨ−ＬＫ変異体の評価
２００７年８月２４日に出願された米国特許仮出願番号第６０／９５７，９７４号および２００８年８月２４日に出願された米国特許仮出願番号第１２／１９７，２８６号に記載されているように産生された複数のＡＤＨ−ＬＫ変異体は、実施例５に記載された条件下で評価したとき、表４に挙げるように基質の＞０．５％をキラルアルコールに変換した。
【０２８３】
【表４】
0005973131.tif 000020
本実施例は、１９０位のチロシン残基がフェニルアラニン、プロリン、システインまたはアラニンに変更されたＡＤＨ−ＬＫ変異体が２’，６’−ジクロロ−３’−フルオロアセトフェノンを対応するＳ−アルコールに還元したことを示す。
【０２８４】
（実施例７）
２’，６’−ジクロロ−３’−フルオロアセトフェノンを還元する酵素を同定するための、高スループットＮＡＤＰＨ蛍光プレスクリーン
定方向進化によって得られ、進化したケトレダクターゼ遺伝子を含有するプラスミドライブラリをＥ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０に形質転換して、１％グルコースおよび３０μｇ／ｍＬクロラムフェニコール（ＣＡＭ）を含有するルリア−ベルターニ（ＬＢ）寒天培地で培養した。３０℃にて少なくとも１６時間のインキュベーションの後、Ｑ−ｂｏｔ（登録商標）ロボット・コロニー・ピッカー（Ｇｅｎｅｔｉｘ  ＵＳＡ，Ｉｎｃ．，Ｂｅａｖｅｒｔｏｎ，ＯＲ）を使用して、ＴＢ培地１８０μＬ、１％グルコースおよび３０μｇ／ｍＬクロラムフェニコール（ＣＡＭ）を含有する９６ウェル浅型ウェル・マイクロタイター・プレートにコロニーをピッキングした。細胞を、２００ｒｐｍで振とうしながら３０℃にて一晩増殖した。次に、この培養物５μＬを、ＴＢ培地３８０μＬ、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４および３０μｇ／ｍＬ  ＣＡＭを含有する９６ウェル深型ウェルプレートに移した。３０℃にて２５０ｒｐｍで振とうしながらの２．５〜３時間にわたる深型ウェルプレートでのインキュベーションの後、イソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）によって細胞培養物による組み換え遺伝子発現を最終濃度１ｍＭまで誘導した。次に、プレートを２５０ｒｐｍで振とうしながら３０℃にて１５〜１７時間インキュベートした。
【０２８５】
細胞を遠心分離によってペレット化して、溶解緩衝液３００μＬに懸濁させ、室温にて少なくとも１時間振とうすることによって溶解させた。溶解緩衝液は、１００ｍＭトリエタノールアミン（塩化物）緩衝液、ｐＨ７．０〜７．２、１ｍｇ／ｍＬリゾチームおよび７５０μｇ／ｍＬポリミキシンＢサルフェートを含有していた。次にプレートを遠心分離機で４００ＲＰＭにて２０分間、４℃で回転させ、透明上清（溶解液）を蛍光アッセイで分析した。
【０２８６】
９６ウェル黒色マイクロタイタープレートで、各溶解液２０μｌ（４０〜５０℃にて０〜２４時間前処理；必要な場合、１００ｍＭトリエタノールアミン（塩化物）緩衝液、ｐＨ７．０、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４で希釈）を１００ｍＭトリエタノールアミン（塩化物）緩衝液、ｐＨ７．０、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．２ｇ／Ｌ  ＮＡＤＰＨ、１００〜６００ｍＭグルコース、６００〜９００ｍＭグルコン酸ナトリウムおよび０．２ｇ／Ｌ  ２’，６’−ジクロロ−３’−フルオロアセトフェノンより成るアッセイ混合物１８０μｌに添加して、Ｆｌｅｘｓｔａｔｉｏｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＵＳＡ）で、３３０ｎｍでの励起後に４４５ｎｍでのＮＡＤＰＨの蛍光の低下を追跡することによって、反応の進行を測定した。
【０２８７】
本実施例は、２’，６’−ジクロロ−３’−フルオロアセトフェノンの還元率を改良したＫＲＥＤ変異体を同定するために使用された方法を説明している。
【０２８８】
（実施例８）
ＡＤＨ−ＬＫに由来する改変ケトレダクターゼによる２’，６’−ジクロロ−３’−フルオロアセトフェノンの還元
２’，６’−ジクロロ−３’−フルオロアセトフェノンの（Ｓ）−１−［２，６−ジクロロ−３−フルオロフェニル］−エタノールへの還元のための改良ＡＤＨ−ＬＫ変異体を、小規模な化学反応で分析した。ＰＴＦＥコート磁気撹拌棒および要求に応じて塩基を容器へ供給管を介してｐＨ制御によって添加するための自動滴定装置に連結されたｐＨ電極を装備した１００ｍＬ３口容器に、２５℃の１００ｍＭトリエタノールアミン（塩化物）緩衝液（ｐＨ７）３０ｍＬ、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４）、下の表に記載するような配列番号を持つＫＲＥＤ２００ｍｇ、ＧＤＨ５０ｍｇ、ＮＡＤＰ−Ｎａ１５ｍｇ、グルコース３．１３ｇ、２’，６’−ジクロロ−３’−フルオロアセトフェノン（２００ｇ／Ｌ）６ｇを注入した。自動滴定装置は、４Ｎ  ＮａＯＨの添加によってｐＨを７に維持し、このことを継続的に記録した。反応の進行は、塩基の率および累積添加量ならびに実施例４の方法による酢酸エチルでの抽出および分析のための反応混合物の定期的サンプリングによって監視した。
【０２８９】
表５に、ケトレダクターゼに対応する配列番号、野生型ＡＤＨ−ＬＫからのアミノ酸変異の数および２’，６’−ジクロロ−３’−フルオロアセトフェノンから（Ｓ）−１−［２’，６’−ジクロロ−３’−フルオロフェニル］−エタノールへの変換を示す。Ｓ−アルコールの立体純度は常に＞９９．９％であった。
【０２９０】
【表５】
0005973131.tif 000021
本実施例は、野生型ケトレダクターゼＡＤＨ−ＬＫに由来する改変ケトレダクターゼにより、ＡＤＨ−ＬＫと比較して改良された活性が与えられることを示している。
【０２９１】
（実施例９）
ＡＤＨ−ＬＢに由来する改変ケトレダクターゼによる２’，６’−ジクロロ−３’−フルオロアセトフェノンの還元
２’，６’−ジクロロ−３’−フルオロアセトフェノンの（Ｓ）−１−［２’，６’−ジクロロ−３’−フルオロフェニル］−エタノールへの還元のための改良ＡＤＨ−ＬＢ変異体を、実施例８でＡＤＨ−ＬＫ変異体について記載したような小規模な化学反応で分析した。表６に、ケトレダクターゼに対応する配列番号、野生型ＡＤＨ−ＬＫからのアミノ酸変異の数および２’，６’−ジクロロ−３’−フルオロアセトフェノンから（Ｓ）−１−［２’，６’−ジクロロ−３’−フルオロフェニル］−エタノールへの変換を示す。Ｓ−アルコールの立体純度は常に＞９９．９％であった。
【０２９２】
【表６】
0005973131.tif 000022
本実施例は、野生型ケトレダクターゼＡＤＨ−ＬＢに由来する改変ケトレダクターゼによっても、ＡＤＨ−ＬＢと比較して改良された活性が与えられることを示している。
（実施例１０）
（Ｓ）−１−［２’，６’−ジクロロ−３’−フルオロフェニル］−エタノールの調製規模での生成
Ａｃｅガラス機械式スターラ（７５ｍｍ径テフロン（登録商標）製スターラブレード）と、要求に応じて塩基を送達管を介して容器へｐＨ制御によって添加するための自動滴定装置に連結されたｐＨ電極とを装備した、５００ｍＬジャケット付き３口丸底フラスコに、水（１２０ｍＬ）、トリエタノールアミン（１．８ｇ）および次に塩酸を添加してｐＨを７．０に調整した。硫酸マグネシウムを１Ｍ溶液（ＭｇＳＯ４、１２０μＬ、０．１２ｍｍｏｌ、１４．４ｍｇ）として添加した。フラスコのジャケット内に加熱流体を循環させて溶液を３０℃まで加熱した。グルコース（２０ｇ）に続いて、Ｎａ−ＮＡＤＰ（１２０ｍｇ）、ＧＤＨ（０．５０ｇ）および配列番号３８を有するＫＲＥＤ（０．５０ｇ）を添加した。送達管を通じての４Ｎ  ＮａＯＨの添加により、ｐＨスタットがｐＨ７．０±０．１を維持するように設定した。２’，６’−ジクロロ−３’−フルオロアセトフェノン（５０ｇ）を添加して反応を開始させた。酵素由来の物質を除去するために、電極を定期的にすすぐ必要があった。反応が進行するにつれて、さらなるグルコースを数回に分けて添加した：１０４分に１０ｇ（４Ｎ  ＮａＯＨ１７．５ｍＬを添加した後）、２７５分に５ｇ（４Ｎ  ＮａＯＨ３５．２ｍＬを添加した後）、３７９分に５ｇ（４Ｎ  ＮａＯＨ４２ｍＬを添加した後）、および４８８分に８ｇ（４Ｎ  ＮａＯＨ４７ｍＬを添加した後）。反応は２４時間後に停止させた。次にヘプタン（１５０ｍＬ）を添加して、混合物を４０℃にて４５分間加熱した。３０℃に冷却した後、得られた混合物を分液漏斗に注入すると、下部の水層の大半が排出された。上層のヘプタンエマルジョンは真空下、セライトパッドを通して濾過した（３５０ｍＬ、８５ｍｍ径粗目フィルタ）。フィルタをヘプタン（１５０ｍＬ）で洗浄して、濾液を分液漏斗に移し、２相を分離した。ヘプタン相を回転蒸発器で濃縮して（〜５０℃、〜１５０ｍｍＨｇ、４０ｍｍＨｇまで上昇）、（Ｓ）−１−［２’，６’−ジクロロ−３’−フルオロフェニル］−エタノールを油（４７．８ｇ、９４％）として得たが、これを静置すると結晶化した。
（実施例１１）
ＡＤＨ−ＬＫに由来する改変ケトレダクターゼによる２’，６’−置換アセトフェノンの還元
２’，６’−ジクロロ−３’−フルオロアセトフェノンの（Ｓ）−１−［２’，６’−ジクロロ−３’−フルオロフェニル］−エタノールへの還元のために改良された野生型ＡＤＨ−ＬＫおよびＡＤＨ−ＬＫ変異体を、２つの他の２’，６’−置換アセトフェノンに対する活性について試験した。１００ｍＭトリエタノールアミン（塩化物）緩衝液５ｍＬ（ｐＨ７、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４）、配列番号１０を有するＫＲＥＤ３３ｍｇ、ＧＤＨ８ｍｇ、ＮＡＤＰ−Ｎａ３ｍｇおよびグルコース３３０ｍｇの溶液を調整した。この溶液１ｍＬを２５℃の１ｍＭトリエタノールアミン（塩化物）緩衝液、ｐＨ７、０．３ｍＬおよび２’，６’−置換アセトフェノン２０ｍｇで処理した。反応サンプル（２４時間）を実施例５の方法で分析した。
【０２９３】
表７に、ＡＤＨ−ＬＫおよび配列番号１０を持つＡＤＨ−Ｋ変異体による、２つの２’，６’−置換アセトフェノンの変換および得られたキラルアルコールのエナンチオマー純度を示す。
【０２９４】
【表７】
0005973131.tif 000023
本実施例は、Ｙ１９０Ｐ変異を含有するＡＤＨ−ＬＫ変異体が２’，６’−置換アセトフェノンに改良された活性をもたらし、対応する２’，６’−置換（Ｓ）−１−フェネタノールを与えることを示す。
（実施例１２）
ＡＤＨ−ＬＫおよびＹ１９０の変異を含有するＡＤＨ−ＬＫに由来した改変ケトレダクターゼによる非置換アセトフェノンの還元
実施例７に記載したように調製した、ウェル当り細胞溶解液１００μＬを含有する９６ウェルプレートの各プレートに：１００ｍＭトリエタノールアミン（塩化物）緩衝液ｐＨ７．０中の７ｍＭ  Ｎａ−ＮＡＤＰ＋５０μＬ、イソプロパノール３００μＬ、およびＴＨＦ中の１００ｍｇ／ｍＬのアセトフェノン５０μＬを添加した。プレートを密封して、オービタルシェーカーで８５０ｒｐｍ、室温にて２４時間撹拌した。メチルｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）１ｍＬを各ウェルに添加して、プレートを密封し、次に８５０ｒｐｍ、室温にて１０分間振とうした。プレートを４，０００ｒｐｍ（３２２０ｘｇ）で２分間遠心分離にかけて相を分離し、各ウェルの有機相５０μＬを、ＭＴＢＥ１５０μＬを含有する浅型ウェルプレートのウェルに移した。プレートを密封して、順相ＨＰＬＣ（ＯＤ−Ｈガードカラムを装備したＤａｉｃｅｌ  Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ  ＯＤ−Ｈカラム（４．６×２５０ｍｍ）；注入２．５μＬ；移動相：９５：５ｖ／ｖヘプタン−ＩＰＡ；流速：１．５ｍＬ分−１；カラム温度：４０℃；波長：２１５ｎｍ）によって分析した。保持時間：アセトフェノン：３．５分；（Ｒ）−１−フェニルエタノール：５．３分；（Ｓ）−１−フェニルエタノール：５．８分。
【０２９５】
表８は、ＡＤＨ−ＬＫおよびＡＤＨ−ＬＫ変異体によるアセトフェノンの変換および得られたキラルアルコールの立体異性純度を示す。
【０２９６】
【表８】
0005973131.tif 000024
本実施例は、野生型Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓケトレダクターゼがアセトフェノンに対してＲ−選択性であり、それに由来する本発明の改変ケトレダクターゼがアセトフェノンに対してＳ−選択性であることを示す。
【０２９７】
各種の具体的な実施形態が例証および説明されたが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく各種の変更を行えることが認識されるであろう。
【０２９８】
本願で引用されるすべての刊行物、特許、特許出願および他の文書は、各刊行物、特許、特許出願および他の文書それぞれがあらゆる目的のために参照により組入れられるように個別に指示されたのと同じ程度まで、あらゆる目的でその全体が参照により本明細書に組入れられている。
【図１】
0005973131.tif 000025
【配列表】
0005973131000001.app