(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ピラセタムまたはレベチラセタムを含む、タンパク質の糖化を阻害し、糖尿病のアテローム性動脈硬化症または糖尿病の腎症を予防または治療するための薬剤。
【請求項２】
タンパク質の糖化を阻害し、糖尿病のアテローム性動脈硬化症または糖尿病の腎症を予防または治療するための薬物を製造するためのピラセタムまたはレベチラセタムの適用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬において知られている物質の新規な適用に関する。特に、本発明は、タンパク質の糖化を阻害するための2-ピロリドン誘導体(ラセタム)の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病およびその合併症は、社会規模の主要な健康問題の1つである。高血糖は、糖尿病における臓器障害に関与する主要な因子である。グルコースは、タンパク質中のリシンの遊離アミノ基と自発的に反応してシッフ塩基を形成し、さらなる変質を受ける。この一連の反応は、非酵素的メイラード反応(non-enzymatic Maillard reaction)と呼ばれ、この方法の特定の段階で生成された生成物は、アテローム性動脈硬化症、腎症、網膜症、白内障または神経障害に関与する。
【０００３】
タンパク質の糖化は、多工程のプロセスである。最初の工程(いわゆる糖化の初期段階)は、N-末端またはリシン側鎖のε-アミノ基におけるタンパク質の遊離アミノ基(-NH2)と、グルコースの還元形態のカルボニル基との間の求核付加反応であり、これは不安定な生成物であるシッフ塩基をもたらし、アマドリ転移(Amadori rearrangement)を受けて安定なケトアミン、いわゆるアマドリ生成物を与える。次の工程において、アマドリ生成物は、さらなる酸化および脱水を受けて、エノール形態を介して様々な遊離カルボニル化合物(例えば、グリオキサル、メチルグリオキサルまたは3-デオキシグルコソン)に分解され、これらは糖よりも非常に反応性が高い。これらのプロパゲータと呼ばれるジカルボニル化合物は、後期糖化最終生成物(AGE)の形態で関与する。酸化、脱水および環化の反応を介するプロパゲータは、タンパク質の遊離アミノ基と反応し、安定な黄褐色の、たいてい蛍光性の不溶性化合物であるAGEを生成する。AGEは長寿命のタンパク質に蓄積することができ、例えば特定の細胞表面受容体(RAGE)の刺激によって、糖尿病における臓器障害に関与するものとして広く認識されている。
【０００４】
薬物であるタンパク質糖化阻害剤の使用によるAGE形成の予防は、糖尿病の動物モデルにおける臓器障害の発生または重症度を低減し得ることが示され、同様の効果が予備臨床試験において確認された。
【０００５】
しかし、糖化の有効かつ安全な阻害剤はまだ不足している。知られている強力な阻害剤、例えばアミノグアニジン(Pimagedine、Alteon Inc.)またはALT-711(塩化アラゲブリウム、Synvista Therapeutics Inc.)の研究により副作用が明らかになり、これはアミノグアニジンの使用を制限するか、アラゲブリウムによる臨床試験の停止を導く。糖化の非酵素的特徴により、潜在的な阻害剤は、高い濃度で対象とするタンパク質の近くに存在するべきであり、高用量および悪影響のリスクの増加に関与することに注意すべきである。したがって、糖尿病の合併症の治療に有効であり、悪影響のリスクが最小であるタンパク質の糖化を阻害することができる薬物を特定する強い要求が存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第3,459,738号
【特許文献２】米国特許第4,145,347号
【特許文献３】加国特許第1059137号
【特許文献４】米国特許第7,217,826号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、1リットルあたり数百マイクロモルから数ミリモルの組織濃度を達成することができる用量における、他の適応の臨床において使用されている、広く知られており安全な薬物によるタンパク質の糖化を阻害する能力を示すことである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、知られている薬物である、ピラセタムの一般名称を有する2-(2-オキソ-1-ピロリジン-1-イル)アセトアミドの、新規な治療適応における適用に関する。
【０００９】
以前の文献から知られているとおり、ピラセタムは中枢神経系内の細胞のエネルギー代謝に影響し、酸素およびグルコースの使用を増加させる。これは、高エネルギー化合物の合成の促進および増加したエネルギー保存をもたらす。他の作用の中で、ピラセタムは、中枢神経系の代謝を改善する神経伝達物質を合成するための神経の能力を増強する。ピラセタムは、炎症、ストローク、ショックおよび外科手術−特に神経外科手術による脳機能の低下の症候群に主に使用される。
【００１０】
N-置換ラクタムおよびそれを得る方法、ならびに医薬におけるそれらの適用、例えば運動障害の治療のための適用は、米国特許第3,459,738号に記載されている。他の薬理学的に有用な化合物である、N-置換アミンアルキル-2-オキソ-1-ピロリジンアセトアミドは、米国特許第4,145,347号に開示されており、2-オキソ-1-ピロリジンアセテートエステルと適切なアミンとの反応でそれを得る方法も記載されている。
【００１１】
2-オキソ-1-ピロリジンアセトアミドまたはピラセタムの合成方法は、加国特許第1059137号に開示されている。米国特許第7,217,826号には、てんかんなどの神経障害の治療に有用な、2-オキソ-1-ピロリジンまたはそれらの塩の新規な誘導体が記載されている。この発明は、2-オキソ-1-ピロリジンの誘導体、それを得る方法、およびそれらの医薬の使用に関する。2-オキソ-1-ピロリジンの不飽和誘導体からのアルファ-エチル-2-オキソ-1-ピロリジンアセトアミドおよびその誘導体の形成の合成方法が記載されている。
【００１２】
EP 99 99123803およびEP 99 99124269の優先権に基づく特許出願P 357472には、ニューロン活動阻害剤を製造するための(S)-(-)-α-エチル-2-オキソ-1-ピロリジンアセトアミドの適用、ならびに(S)-(-)-α-エチル-2-オキソ-1-ピロリジンアセトアミドを含有する新規な医薬が開示されている。双極性障害、躁病および神経障害痛を治療するためのレベチラセタムの適用が記載されている。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実施形態としての本発明の主題を示す。
【図２】調べた化合物の、ストレプトゾトシンで誘発された糖尿病のモデルにおける、ラットの腎糸球体内のタンパク質の糖化の程度に与える影響を示す(8週間)。
【図３】2つの2-ピロリドン誘導体(薬物1-ピラセタム、薬物2-レベチラセタム)およびアミノグアニジンの、4週間グルコース(0.5M)と培養したアルブミンの糖化に依存する蛍光に与える影響の比較を示す(n=4)。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、タンパク質の糖化を阻害するための2-ピロリドン誘導体の新規な適用に関し、この誘導体は、以下:
a. 一般式Iの化合物:
【化１】
0005898084.tif 000002
(式中、R1、R2は、水素原子またはハロゲン原子、あるいはアミノ基(-NH2)、ヒドロキシル基(-OH)、直鎖もしくは分岐状C1〜5アルキル基、直鎖もしくは分岐状C1〜4アルキル-アミノ基またはグアニジン基であり、
R3は、水素原子またはハロゲン原子、あるいはアミノ基(-NH2)、ヒドロキシル基(-OH)、直鎖もしくは分岐状C1〜5アルキル基、直鎖もしくは分岐状C1〜4アルキル-アミノ基またはグアニジン基、フェニル基(C6H5-)または1つ以上のヒドロキシル基、メチル基、アミノ基、アルキル-アミノ基もしくはハロゲン原子によって置換されたフェニル基である)、
b. 一般式IIの化合物:
【化２】
0005898084.tif 000003
(式中、R1、R2は上のとおりを意味し、R4はC6H4-OCH3基である)、
c. 一般式IIIの化合物:
【化３】
0005898084.tif 000004
(式中、R1は上のとおりを意味し、R5はC6H5基である)
からなる群から選択される。
【００１５】
好ましくは、本発明によると、使用される2-ピロリドン誘導体は、ピラセタム、オキシラセタム、レベチラセタム、ブリバラセタム、プラミラセタム、ネフィラセタム、アニラセタムまたはネブラセタムから構成される群から選択される。
【００１６】
上で述べた薬物は文献に記載されており、これらを表1に表す。
【００１７】
【表１】
0005898084.tif 000005
【００１８】
本発明の別の主題は、糖尿病の合併症を予防または治療するための薬物を製造するための、2-ピロリドン誘導体の適用であり、この誘導体は、以下:
a. 一般式Iの化合物:
【化４】
0005898084.tif 000006
(式中、R1、R2は、水素原子またはハロゲン原子、あるいはアミノ基(-NH2)、ヒドロキシル基(-OH)、直鎖もしくは分岐状C1〜5アルキル基、直鎖もしくは分岐状C1〜4アルキル-アミノ基またはグアニジン基であり、
R3は、水素原子またはハロゲン原子、あるいはアミノ基(-NH2)、ヒドロキシル基(-OH)、直鎖もしくは分岐状C1〜5アルキル基、直鎖もしくは分岐状C1〜4アルキル-アミノ基またはグアニジン基、フェニル基(C6H5-)または1つ以上のヒドロキシル基、メチル基、アミノ基、アルキル-アミノ基もしくはハロゲン原子によって置換されたフェニル基である)、
b. 一般式IIの化合物:
【化５】
0005898084.tif 000007
(式中、R1、R2は上のとおりを意味し、R4はC6H4-OCH3基である)、
c. 一般式IIIの化合物:
【化６】
0005898084.tif 000008
(式中、R1は上のとおりを意味し、R5はC6H5基である)
からなる群から選択される。
【００１９】
好ましくは、本発明によると、使用される2-ピロリドン誘導体は、ピラセタム、オキシラセタム、レベチラセタム、ブリバラセタム、プラミラセタム、ネフィラセタム、アニラセタムまたはネブラセタムから構成される群から選択される。
【００２０】
特に、利益は、アテローム性動脈硬化症、腎症、網膜症、白内障または神経障害などの糖尿病の合併症のいずれかを予防または治療するための、上で述べた2-ピロリドン誘導体のいずれかの適用である。
【００２１】
実施形態としての本発明の主題を図１に示し、これは、
A) 調べた化合物の、4週間グルコース(0.5M)と培養したアルブミン(50mg/ml)の分子量の増加に与える影響、
B) 調べた化合物およびアミノグアニジンの、4週間グルコース(0.5M)と培養したアルブミンの糖化に依存する蛍光に与える影響(n=4)
*p<0.05 スチューデントのt検定
を示す。
【００２２】
図2は、調べた化合物の、ストレプトゾトシンで誘発された糖尿病のモデルにおける、ラットの腎糸球体内のタンパク質の糖化の程度に与える影響を示す(8週間)。
【００２３】
A - 対照ラットの腎臓(糖尿病なし)
B - 糖尿病ラットの腎臓
C - 調べた化合物で治療した糖尿病ラットの腎臓。
【００２４】
矢印は腎糸球体を示す。画像はn=3の動物の代表例である。
【００２５】
図3は、2つの2-ピロリドン誘導体(薬物1-ピラセタム、薬物2-レベチラセタム)およびアミノグアニジンの、4週間グルコース(0.5M)と培養したアルブミンの糖化に依存する蛍光に与える影響の比較を示す(n=4)。
*p<0.05 スチューデントのt検定
【実施例】
【００２６】
In vitroの実験
(実施例1)
調べる薬物の糖化阻害作用の効能を調べるために、2つの別々の方法: 質量分析および蛍光分光分析を使用し、効能の知られている糖化阻害剤である塩酸アミノグアニジンの影響と比較した、調べる薬物の相対的な作用を示した。
【００２７】
in vitroのタンパク質の糖化を、以下の手順に従って行った:
50mgのタンパク質(アルブミン、ミオグロビン)を、D-グルコース(0.1; 0.3; 0.5; 1M)および5mMのトルエン(静菌性化合物として)を含有する1mlの0.01M PBS(pH 7.4)中に溶解した。調べる薬物または塩酸アミノグアニジンを0.1mMから5mMの最終濃度で試料に加えた。試料を特定の期間(1、2、3および4週間)、暗室中で37℃で培養した。その後、タンパク質を、50kDaのカットオフのAmicon 50カートリッジ(Millipore)で(アルブミンの場合)、または10kDaのカットオフのAmicon 10カートリッジで(ミオグロビンの場合)、限外濾過(4000x g、16℃で30分)によって濃縮した。濃縮されたタンパク質の試料は、半透膜: Spectra Por(アルブミンに対して50kDaのカットオフ、およびミオグロビンに対して12〜14kDaのカットオフ)を使用して、蒸留水に対して24時間透析した。その後、試料を終夜凍結乾燥した。
【００２８】
対照の試料を、グルコース (対照I)または薬物(対照II)の添加を除いて、上のとおりに調製した。
【００２９】
(実施例2)
質量分析による糖化の測定
この方法は、タンパク質の分子量(アルブミン、ミオグロビン)の測定に基づいており、これは結合した糖部分の数に比例して増加する。薬物の作用-糖化の阻害-は、タンパク質の分子量の増加を阻害する程度で表される。
【００３０】
タンパク質の凍結乾燥された試料を、酵素的に消化した: 1mgのタンパク質を1.3mlの50mM炭酸水素アンモニウム緩衝液(pH 8.3)中に溶解した。二硫化物の結合を破壊するために、15μlのDTT(45mM)を加え、試料を60℃で1時間加熱した。室温まで冷却した後、二硫化物の結合を形成することを防ぐために、20μlの55mMのIAAをそれぞれの試料に加えた。その後、これらを暗所で30分保った。その後、新たに調製したトリプシンの溶液(200μl、水中の100ng/ml)を加え、混合物を終夜37℃で培養した。次の日、5μlの濃縮ギ酸を加えることによって、反応を停止した。ミオグロビンを含有する試料を同様に調製したが、二硫化物の結合を破壊する工程およびIAAによってシステインをブロックする工程を省略した(ミオグロビン分子はシステイン残基を含有しない)。
【００３１】
質量分析の検出を、ESI源(エレクトロスプレーイオン化)を備えたLCQイオン-トラップ質量分析計(Finnigan、San Jose、USA)を使用して行った。主な動作パラメータは、以下のとおりである: シースガス(窒素)の流速 60psi、イオンスプレー電圧 4.5kV、キャピラリー温度 200℃。1mgの凍結乾燥されたタンパク質を1mlのメタノール/水(50/50)中の0.2%のギ酸中に溶解した。質量分析計に注入する直前に、試料を0.1%のギ酸で10倍に希釈した。得られたMSスペクトルに基づいて、タンパク質の平均分子量を、BioWorks 1.0ソフトウェア(Finnigan、San Jose、USA)を使用して計算した。
【００３２】
ペプチドの分離を、直線勾配を有するPepMap 100 C18カラム(150mm×1mm ID、5μm粒子径)(LC Packings、Dionex Comp.、USA)を使用して、45μl/minの流速で、逆相高速クロマトグラフィー(HPLC)システムで行った:
A- 水およびアセトニトリル(95:5)中の0.1%のギ酸 (相A)
B- 水およびアセトニトリル(5:95)中の0.1%のギ酸 (相B)。
【００３３】
質量の検出を、Triple Play mode(フルスキャン;MS/MSおよびズームスキャン)で行った。ペプチドの配列およびアミノ酸残基の可能な修正を決定するために、MSデータをX!tandem(the Global Proteome Machine Organization)によって分析した。
【００３４】
(実施例3)
蛍光分光法を使用したアルブミンの糖化の測定
糖残基は、蛍光であるEx/Em 370/440nmによって特徴付けられる。薬物の作用は、蛍光の強度の抑制によって表される。
【００３５】
凍結乾燥したタンパク質の試料を、0.5mgタンパク質/1ml緩衝液の濃度で0.01MのPBS(pH 7.4)中に溶解した。測定を、Perkin Elmer LS 50B蛍光分光計を使用して行った。蛍光強度を、370nmの励起に対して440nmの発光で測定した。
【００３６】
In vivoの実験
(実施例4)
動物を使用する全ての実験研究は、Jagiellonian UniversityのEthical Committeeによって承認された。糖尿病のモデルを、3ヶ月のSprague-Dawleyラットに対してストレプトゾシン(STZ、シトレート緩衝液中の75mg/kg、pH 4.5)の腹腔内単独投与によって定めた。350から450mg/dLの血糖を維持するために、動物を1週間に2回、インスリン(中間型インスリン、NPH、2〜3U/300gの体重)によって治療した。
【００３７】
ラットを3つのグループに分けた(それぞれn=4の動物): 「対照」グループ-シトレート緩衝液のみを注射された動物(擬似動物、sham animal)、「糖尿病」グループ-STZで処理されたグループ、および「STZ+薬物」グループ-調べる薬物(飲料水中の354±40mg/kg/日)で治療されたSTZラット。実験を8週間継続した。動物に麻酔をかけて殺し、両方の組織の試料(腎臓、心臓、肺、脳)、ならびに血液の試料を採取した。AGEの存在を、特定の抗体(Abcam、USA)を使用して、免疫組織化学によって評価した。
【００３８】
結果
In vitroモデルにおいて、調べられた薬物は、知られている糖化の強い阻害剤であるアミノグアニジン(図1)に匹敵する強さで、用量に依存してアルブミンに対するグルコース部分の追加を阻害した。質量分析法によって証明されたとおり、5mMの濃度において、試験された化合物はタンパク質の糖化を33%(グルコース単独で培養されたアルブミンの質量と比較して)阻害した(図1A)。5mMの濃度において、試験された化合物は、蛍光分光法によって証明されたとおり、45%(同じ濃度においてアミノグアニジンは糖化を67%阻害した)糖化を阻害した(図1B)。
【００３９】
試験された薬物は、STZ(429±65.0 vs. 399±42.8mg/dL)で注入されたラットにおいて血糖に影響をなかった。AGEの免疫組織化学において、薬物は、AGEの正の糸球体の数および糸球体における変化の厳しさの両方を十分に低減した。
【００４０】
結論として、調べられた薬物は、in vitroおよびin vivoの両方で、知られている糖化の阻害剤と同様の濃度でタンパク質の糖化を阻害した。
【図２】
0005898084.tif 000009
【図１】
0005898084.tif 000010
【図３】
0005898084.tif 000011