(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
炎症誘発性成熟ＤＣの源以外の個体における癌の処置のため腫瘍内に注入される医薬の製造のための、炎症誘発性成熟ＤＣの使用方法であって、
前記炎症誘発性成熟ＤＣは、物質ポリイノシン酸−ポリシチジル酸ナトリウム塩（ポリ−Ｉ：Ｃ）、レシキモド（Ｒ８４８）およびインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）を用いた処理によってエキソビボで成熟へとすでに刺激された炎症誘発性樹状細胞（ＤＣ）であり、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）を伴わない、炎症誘発性成熟ＤＣの使用方法。
【請求項２】
前記炎症誘発性成熟ＤＣが、加えて、インターフェロンα（ＩＦＮ−α）、インターロイキン１、β（ＩＬ−１β）および腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）からなる群から選択される物質のうちの少なくとも１つですでに刺激された、請求項１に記載の炎症誘発性成熟ＤＣの使用方法。
【請求項３】
炎症誘発性成熟ＤＣまたは末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の源以外の個体における癌の処置のための医薬の製造のための、請求項１又は２に記載の炎症誘発性成熟ＤＣと、前記ＰＢＭＣとを含む、腫瘍内に注入される組成物の使用方法。
【請求項４】
前記組成物が、超抗原をさらに含む、請求項３に記載の組成物の使用方法。
【請求項５】
前記組成物が、薬学的に許容できる賦形剤をさらに含む、請求項３に記載の組成物の使用方法。
【請求項６】
前記癌は、乳癌、前立腺癌、腎癌、腸癌、悪性神経膠腫、骨肉腫、悪性黒色腫、膵臓癌、悪性リンパ腫および食道癌からなる群から選択される、請求項１又は２に記載の炎症誘発性成熟ＤＣの使用方法。
【請求項７】
前記癌は、乳癌、前立腺癌、腎癌、腸癌、悪性神経膠腫、骨肉腫、悪性黒色腫、膵臓癌、悪性リンパ腫および食道癌からなる群から選択される、請求項３から請求項５のいずれか１項に記載の組成物の使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、癌治療の分野に関する。より具体的には、本発明は、癌免疫療法に、より具体的には腫瘍細胞増殖を阻害するための細胞ベースの免疫療法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ワクチンは、ウイルス感染または微生物感染などの感染症の予防のために長い間使用されてきた。免疫系の細胞介在性アームは、宿主に、感染から防御し回復する能力、および同じ抗原によるさらなる感染を予防する能力を与えることに広く関与している。細胞介在性の免疫機構は、癌に対しても有用であると考えられる。
【０００３】
最も強力な抗原提示細胞（ＡＰＣ）である樹状細胞（ＤＣ）は、免疫反応の開始および制御において中心的な役割を果たす。樹状細胞（ＤＣ）は、ナイーブＴ細胞をプライミングする能力、ならびに効果的な細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の応答を誘発および誘導する能力というユニークな能力を有する。ＤＣ前駆体は、循環血液の中に存在し、感染または炎症の部位へと素早く動員されることができる。ＤＣ前駆体が未熟ＤＣへと分化するとき、ＤＣ前駆体は、外因性のタンパク質抗原を取り込みしプロセシングする上で非常に有効になる。Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）リガンドを発現する細菌性およびウイルス性の成分、炎症性サイトカインならびに／または特異的Ｔ細胞相互作用（ＣＤ４０／ＣＤ４０リガンド相互作用）などの種々の成熟刺激に応答して、ＤＣ前駆体は分化プロセスを開始し、抗原の取り込みおよびプロセシング能力の減少ならびに共起刺激分子およびＭＨＣ分子の発現の増大を導く。重要なことは、直接の病原体認識（例えば、ＴＬＲ）またはＣＤ４０ライゲーションによって誘導されるシグナルのシグナル強度および持続性は、特定のＤＣ機能の非常に重要な決定因子であると示されているとうことである。それゆえ、ＤＣは、末梢部位で活性化因子によって末期に誘導され、２つの相互に排他的な機能のうちの１つ  −つまり、効率的なＴ細胞相互作用のためにリンパ節へと（成熟した遊走ＤＣとして）遊走するか、または（成熟した炎症誘発性ＤＣとして）ケモカインおよびサイトカインなどの大量の炎症メディエーターを産生することにより微小環境を調節するかのいずれか−  を果たす。
【０００４】
ＤＣに焦点を当てた既存の癌免疫療法戦略はすべて、Ｔ細胞反応の質は、遊走ＤＣが、二次性リンパ性器官において腫瘍抗原をプロセシングして腫瘍抗原をＴ細胞へと提示し、従って腫瘍特異的ＣＴＬ応答（これは、癌細胞への免疫学的な攻撃を導く）を作り出す能力に主に依存するという前提に基づく。異なるマウス腫瘍モデルからのデータは、このような応答は、当業者にとっては周知である３つの主要な戦略のうちの１つに従って引き金を引かれうるということを示した。これらの免疫療法的抗癌戦略は、ヒトにおいて現在活発に試験されているが、すべて限定的な成功しか収めていない。
【０００５】
第１の戦略は、腫瘍保有患者からの抗原を負荷された遊走ＤＣをエキソビボで活性化し成熟させて、その後それらを同じ患者に再導入することである。抗原負荷は、典型的には、腫瘍関連抗原（溶解した腫瘍細胞、タンパク質、ペプチドまたはこのような抗原をコードする核酸）を単球由来の未熟ＤＣに加え、次いで、抗原を負荷されたＤＣを、起炎因子の異なる組み合わせを用いて活性化し／成熟させることにより、実施される。再導入されたＤＣは、流入領域リンパ節へと遊走して、そこでＤＣは腫瘍特異的Ｔリンパ球をプライミングすると想定される。ＤＣによってプライミングされたＴリンパ球、特にＣＴＬは、その後腫瘍部位へと移動し、そこでＴリンパ球、特にＣＴＬは、その後、腫瘍細胞アポトーシスを誘導する。
【０００６】
しかしながら臨床の現場では、患者自身の、すなわち自家の、ＤＣのエキソビボ操作は時間がかかり、患者を感染のリスクの増加に曝す。また、ＤＣが腫瘍抗原でパルスされ腫瘍抗原を効率的に提示する遊走ＤＣへと活性化される操作プロセスは、単調で退屈である。
【０００７】
第２の主要な戦略は、患者由来の遊走ＤＣのエキソビボでの増殖の必要性を回避するが、この戦略は、無傷の正常な組織への、腫瘍抗原（照射された同種異系の腫瘍細胞を含む）、または腫瘍抗原をコードするプラスミドの投与（皮下注射または筋肉内注射を含む）を含む。腫瘍抗原は、ＤＣ介在性免疫反応をインビボで誘発することが意図された、いわゆるアジュバントが補われる。最も一般的には、ケモカイン、サイトカインもしくはこれらの因子をコードするプラスミド、および／または腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）などのＤＣ成熟化因子、および／またはＴＬＲアゴニストがアジュバントとして使用される。
【０００８】
しかしながら、外因性の腫瘍抗原の投与は、単調で退屈なプロセスである。
【０００９】
第３の主要な戦略は、同じく、第１の主要な戦略に含まれる患者由来の遊走ＤＣのエキソビボでの増殖の必要性を回避し、加えて、第２の主要な戦略に含まれる外因性の腫瘍抗原の必要性を回避するが、この戦略は、腫瘍へと直接注入されるアジュバントに関する。つまり、アジュバントはインビボで標的指向化ＤＣに向けられ、患者の腫瘍は腫瘍関連抗原の源として作用する。試験されたアジュバントは、第２の主要な戦略で記載したものと同様である：ケモカイン、サイトカインまたはこれらの因子をコードするプラスミド、および／またはＴＮＦ−αなどのＤＣ成熟化因子、およびＴＬＲアゴニスト。しかしながら、生きた腫瘍は、これらのＤＣによって飲み込まれうる（好ましくはアポトーシスによって誘導された）臨死腫瘍細胞の数が不十分であるために、動員された未熟ＤＣにとっては腫瘍関連抗原の質の悪い供給源である可能性がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上述の３つの戦略はすべて、ヒトの癌患者で試験されたが、限られた成功しか収めなかった。従って、より効率的な治療ワクチンおよび癌の改善された処置方法についての明らかなニーズがある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
従って、本発明は、好ましくは、単独のまたはいずれかの組み合わせの当該技術分野の上で特定した欠点を克服することを目指し、そして、高レベルの望ましいケモカインおよびインターロイキン１２（ＩＬ−１２）を産生する炎症誘発性の成熟した樹状細胞、このような炎症誘発性樹状細胞を含む組成物、このような炎症誘発性樹状細胞を製造するための方法、医薬としての、この炎症誘発性樹状細胞またはこの組成物の使用、ならびに癌を処置するための、この樹状細胞またはこの組成物の使用を提供することにより、少なくとも上記の課題を解決する。
【００１２】
従って、第１の態様では、物質ポリイノシン酸−ポリシチジル酸ナトリウム塩（ポリ−Ｉ：Ｃ）、レシキモド（Ｒ８４８）およびインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）を用いた処理によってエキソビボで成熟へとすでに刺激された炎症誘発性樹状細胞（ＤＣ）が提供される。
【００１３】
第２の態様では、第１の態様に係る炎症誘発性ＤＣと、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）とを含む組成物が提供される。
【００１４】
第３の態様では、第１の態様に係る炎症誘発性ＤＣを製造するための方法が提供される。この方法は、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を準備する工程と、上記ＰＢＭＣから単球を単離する工程と、この単球から未熟ＤＣ（ｉＤＣ）を生成する工程と、ポリ−Ｉ：Ｃ、Ｒ８４８およびＩＦＮ−γをｉＤＣに加えることによりこのｉＤＣの成熟を誘導して、炎症誘発性ＤＣを得る工程とを含む。
【００１５】
第４の態様では、第２の態様に係る組成物を製造するための方法が提供される。この方法は、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を準備する工程と、第１の態様に係る炎症誘発性成熟ＤＣを得る工程と、このＰＢＭＣおよびこの炎症誘発性成熟ＤＣを混合する工程とを含む。
【００１６】
第５の態様では、医薬として使用するための、第１の態様に係る炎症誘発性ＤＣまたは第２の態様に係る組成物が提供される。
【００１７】
第６の態様では、上記炎症誘発性成熟ＤＣまたはＰＢＭＣの源以外の個体において医薬として使用するための、第１の態様に係る炎症誘発性ＤＣまたは第２の態様に係る組成物が提供される。
【００１８】
第７の態様では、癌の処置において使用するための、第１の態様に係る炎症誘発性ＤＣ、または第２の態様に係る組成物が提供される。
【００１９】
第８の態様では、上記炎症誘発性成熟ＤＣまたはＰＢＭＣの源以外の個体において癌の処置において使用するための、第１の態様に係る炎症誘発性ＤＣ、または第２の態様に係る組成物が提供される。
【００２０】
本発明のさらなる実施形態は、独立請求項において定められる。
【００２１】
本発明が、活性化刺激を取り除いた後に高レベルの望ましいサイトカイン、例えばケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド９（ＣＸＣＬ９）（ＭＩＧとしても知られる）、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン３（ＣＣＬ３）（マクロファージ炎症タンパク質１−α（ΜΙΡ−１α）としても知られる）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、ＩＬ−１β、およびＩＬ−１２を産生するという点で、本発明は先行技術とは異なり、従って、外因性の成熟刺激因子の存在なしに例えば注射などの使用に好適である。
【００２２】
同種異系の様式で患者に腫瘍内に注入されるとき、すなわち患者が炎症誘発性ＤＣまたはこの炎症誘発性ＤＣを作り出すために使用されたＰＢＭＣが由来するドナーとは異なるとき、このような炎症誘発性ＤＣは、その患者自身のＤＣが腫瘍を負荷された遊走ＤＣへと発育するように、その患者自身のＤＣを活性化するであろう。この効果は、注入された炎症誘発性ＤＣの、大量の、望ましいサイトカインおよびＩＬ−１２の組み合わせ、例えばＤＣ、ＮＫ細胞および記憶Ｔ細胞の動員ケモカインＭＩＰ−１α／ＣＣＬ３、ＮＫ細胞および記憶Ｔ細胞の動員ケモカインＭＩＧ／ＣＸＣＬ９、ならびにＮＫ活性化サイトカインＩＬ−１２を産生する能力に起因する。さらに、未熟ＤＣに勝る、成熟したＤＣ、例えば炎症誘発性成熟ＤＣを用いる優位点によって、細胞−細胞接触によりＮＫ細胞活性化を増進できる。当該炎症誘発性ＤＣが強力な外因性の活性化（例えば成熟化）因子を含まないという事実は優位点である。なぜなら、腫瘍内での強力な外因性の活性化因子の存在は、本発明とは異なる機構で、患者自身の腫瘍内に動員されたＤＣを、望ましい患者特異的な、すなわち自身の、遊走ＤＣへではなく、患者特異的な炎症誘発性ＤＣへの分化へと引き金を引く可能性があるからである。従って、ＮＫ細胞を活性化する最適能力を成熟するＤＣに与えるために、成熟するＤＣ上でのＣＤ８６のような分子の高発現を成し遂げるために少なくとも１８時間の刺激がおそらく必要とされよう。先行技術によれば、活性化された／成熟したＤＣは、１８時間後には顕著な量のＩＬ−１２を産生することができない。わずか８時間後に活性化を打ち切れば、産生は残る。しかしながら、これらのＤＣは、関連するＮＫ活性化分子を上方制御するための時間を持っていない。
【００２３】
同種異系の器官、組織または成熟したＤＣを用いた移植は、強い免疫化を誘導し、自己ＭＨＣクラスＩＩ分子上に提示された同種異系のＭＨＣ由来のペプチドに特異的である同種抗原反応性のＣＤ４＋  Ｔ細胞の膨張を導く（非自己認識の間接的経路と呼ばれる）ことがさらに公知である。腫瘍内注入に関して同種異系の炎症誘発性ＤＣを使用することにより、このＤＣは、その後、宿主免疫系によって死滅し（拒絶され）、これにより、非常に免疫原性のＣＤ４＋  ヘルパーＴ細胞エピトープ（同種異系のＭＨＣ由来のペプチド）の供給源になるであろう。このＣＤ４＋  ヘルパーＴ細胞エピトープは、動員された自身のＤＣによって捕捉されるであろうし、非常に高い可能性で、腫瘍保有患者において腫瘍抗原に対するＣＤ８耐性を破ることに寄与するであろう。従って、炎症誘発性ＤＣは、アジュバントとして作用し、遊走ＤＣとしては作用せず、このことは、先行技術と比較して有利でもあり異なる点でもある。例えば、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）が異なるＤＣ成熟カクテルに含まれる場合、成熟したＤＣは、注入部位（腫瘍）をすぐに離れるであろう遊走ＤＣとなるであろうが、これは、本発明に関する限りでは、不利である。
【００２４】
同種異系のＤＣを、すなわち炎症誘発性成熟ＤＣまたはＰＢＭＣの源、またはドナー以外の個体においてＤＣを使用することにより、そのような潜在的なアジュバントは、各特定の患者に対して個々に調製される必要はなく、後のより低い製造原価でもって大規模生産が可能になる。加えて、当該ワクチンは凍結して長い距離を輸送することができ、このことは、当該ワクチンの商業上の実現性をさらに高める。
【００２５】
本発明がすることができるもののこれらおよび他の態様、特徴および利点は、添付の図面を参照してなされる以下の本発明の実施形態の説明から明らかであろうし、説明もされる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】第３の態様に係る方法の概略図である。
【図２】第４の態様に係る方法の概略図である。
【図３】第１の態様に係る炎症誘発性成熟ＤＣによる、ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１α（図３Ｃ）、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ（図３Ａ）およびＣＸＣＬ９／ＭＩＧ（図３Ｂ）の産生を示すグラフである。
【図４】第１の態様に係る炎症誘発性成熟ＤＣによる、ＩＬ−１２の産生を示すグラフである。
【図５】第２の態様に係る組成物による、ＩＬ−１βおよびＴＮＦ−αの産生を示すグラフである。
【図６】第２の態様に係る組成物による、ＩＬ−１βおよびＴＮＦ−αの産生を示すグラフである。
【図７】第２の態様に係る組成物による、ＩＦＮ−γの産生を示すグラフである。
【図８】ｉＤＣの成熟に対する異なる物質の影響を示すＦＡＣＳグラフである。
【図９】ｉＤＣの成熟に対する第１の態様に係る炎症誘発性成熟ＤＣ、または第２の態様に係る組成物の影響を示すＦＡＣＳグラフである。
【図１０】１つの実施形態に関する研究における腫瘍体積を示すグラフである。
【図１１】１つの実施形態に関する研究における、病理組織学的な結果（原発性腫瘍）の写真を示す。
【図１２】１つの実施形態に関する研究における、病理組織学的な対照結果（原発性腫瘍）の写真を示す。
【図１３】１つの実施形態に関する研究における、病理組織学的な結果（続発性腫瘍）の写真を示す。
【図１４】１つの実施形態に関する研究における、病理組織学的な対照結果（続発性腫瘍）の写真を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
当業者が本発明を実施することができるために、本発明のいくつかの実施形態が、添付の図面を参照して、以降でより詳細に記載される。しかしながら、本発明は多くの異なる形態で具体化されてもよく、本願明細書に示される実施形態に限定されると解釈されるべきではない。むしろ、これらの実施形態は、本開示が十分かつ完全であるように、および本発明の範囲を十分に当業者に伝えるように与えられる。実施形態は本発明を限定せず、本発明は添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。さらには、添付の図面に示される特定の実施形態の詳細な説明の中で使用される専門用語は、本発明を限定するものであるとは意図されていない。
【００２８】
効率的な抗腫瘍性の免疫反応を誘導することを意図した腫瘍内に注入されたアジュバントは、非常に高い可能性で、注入された腫瘍内部で、すべてＣＴＬ介在性腫瘍の根絶を成し遂げるために重要である３つの事象を誘導する必要がある。
【００２９】
第一に、未熟ＤＣ（ｉＤＣ）は、腫瘍抗原に曝されるために、腫瘍へと動員される必要がある。ケモカインＭＩＰ−１α／ＣＣＬ３が、インビボでのｉＤＣの腫瘍内動員を含めて、ｉＤＣの動員を刺激する強い能力を有するということが、当該技術分野で十分に確立されている。
【００３０】
第二に、腫瘍抗原を動員されたｉＤＣに利用できるようにするために、腫瘍細胞のアポトーシスを誘導することが重要である。これを成し遂げるためのいくつかの異なる方法が、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の腫瘍内動員および活性化を誘発する方法を含めて、当該技術分野に存在する。異なるマウスモデルにおける、主にアポトーシスの誘導に起因する、感受性のある腫瘍細胞のＮＫ細胞介在性の初期の死滅は、その後の、親の、ＮＫ細胞耐性の腫瘍細胞に対する腫瘍特異的な細胞毒性Ｔ細胞反応のＤＣ介在性発生を効率的に惹起することが繰り返し示されている。ＮＫ細胞は、ケモカイン受容体ＣＸＣＲ３を発現することが公知であり、ＮＫ細胞のＣＸＣＲ３依存的動員は、いくつかの動物モデルで実証されている。１つの周知のＣＸＣＲ３リガンドはＭＩＧ／ＣＸＣＬ９であり、ＭＩＧ／ＣＸＣＬ９の腫瘍内注入後にＮＫ細胞が蓄積するというエビデンスがある。
【００３１】
動員されたＮＫ細胞が効果的に腫瘍細胞を死滅させるために、インビトロおよびインビボでのＮＫ細胞死滅活性の強力な活性化因子であるＩＬ−１２などのＮＫ細胞活性化因子の存在も必要である可能性が非常に高い。
【００３２】
第三に、動員されたｉＤＣの成熟した遊走ＤＣへの成熟が誘導される必要がある。
【００３３】
ウイルス感染症（通常、Ｔｈ１に偏った免疫反応を導く）の初期段階は、通常は、ＤＣおよびＮＫ細胞の両方の局所的な動員および活性化と関連づけられる。最近の研究では、短い（一晩の）インキュベーションの間ＩＬ−１２またはＩＬ−４のいずれかに曝露されたことがあるヒトの末梢血ＮＫ細胞が、ＤＣの成熟を誘導する能力に関して検討された。注目すべきことに、ＩＬ−１２で刺激されたＮＫ細胞だけが、実質的なＤＣ成熟を誘導することができた。それゆえ、インビボ応答と適合する時間間隔のあいだＩＬ−１２に曝露されたＮＫ細胞は、二次性リンパ性器官（５）におけるその後のＴｈ１細胞プライミングのための適切な成熟したＤＣの選択に好都合である可能性があると結論された。これらのヒトのインビトロデータは、抗原を負荷されたＤＣをマウスへ注入した後にＮＫ細胞の蓄積された動員が起こるとき、ＮＫ動員が観察されない状況と比較してＴｈ１応答が著しく高められるということを示すマウスモデルからのインビボデータと一致する。
【００３４】
Ｔｈ１へと偏向するＤＣの成熟は、ポリクローナルに活性化されたＴ細胞によって産生される可溶性因子によって誘導されることも示されている。抗ＣＤ３活性化Ｔ細胞、または抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８での二重刺激によって活性化されたＴ細胞の無細胞上清から調製されるＴ細胞馴化培地（ＴＣＣＭ）で未熟ＤＣを処理したものは、ＣＤ４０−リガンド、ＴＮＦ−α、およびＩＦＮ−γなどのいくつかの可溶性因子を含有することが示されている。個々のサイトカインまたは単球馴化培地の添加による共起刺激分子の中程度の上方制御とは対照的に、未熟ＤＣをＴＣＣＭで処理すると、共起刺激分子の発現の顕著な増大が用量依存的に誘導されるということが示されている。このような表現型の変化を誘導するというＴＣＣＭの能力は、ＣＤ４０Ｌ、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γに特異的な中和抗体によってさらに排除され、これは、ＴＣＣＭの中に存在するこれらの因子がＤＣの成熟に主に関与しているということを示す。重要なことは、ＴＣＣＭで処理したＤＣが高レベルのＴｈ１に偏らせるＩＬ−１２を産生することができるということである。
【００３５】
最後に、ＣＤ４＋  Ｔ細胞は、流入領域リンパ節の中での遊走ＤＣと抗原特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞との同種の相互作用の際に遊走ＤＣを「助ける」ことにより、ＣＤ８＋  ＣＴＬのプライミング、膨張、および記憶および生存において非常に重要な役割を果たすということが知られている。癌免疫療法の領域内でのいくつかの研究は、野生型腫瘍抗原由来のＭＨＣクラスＩＩペプチドのＣＤ４＋  Ｔ細胞認識は、ＣＴＬ誘導のために必要とされる助けを提供するであろうというアプローチに依拠してきた。しかしながら、腫瘍抗原由来のペプチドによってもたらされる助けは、腫瘍進行の間に進化するこれらの自己タンパク質に対するＣＤ４＋  Ｔ細胞の耐性誘導に起因して弱いかまたは存在しないことが多いであろう。これは、ワクチンの治療効果を妨げる可能性がある。最近の知見は、マウスモデルにおいて、ワクチン接種部位で非自己ＣＤ４＋  ヘルパーＴエピトープを腫瘍関連自己タンパク質に添加することが、確立された、腫瘍関連抗原に対するＣＤ８耐性を破壊するのには十分であるということを実証した。
【００３６】
まとめると、すべてのこれらのデータは、効率的な抗腫瘍性の適応性のある（Ｔ細胞介在性）免疫反応を誘導することを意図した腫瘍内に注入されたアジュバントは、ＭＩＰ−１α／ＭＩＰ−１α／ＣＣＬ３の高くかつ持続的な産生（ＤＣ、ＮＫおよび記憶Ｔ細胞の動員）、ＭＩＧ／ＣＸＣＬ９（ＮＫ細胞および記憶Ｔ細胞の動員）、ＩＬ−１２ｐ７０（腫瘍抗原のＮＫ細胞介在性放出および遊走ＤＣのＮＫ細胞介在性成熟）ならびに最後に、流入領域リンパ節の中での腫瘍特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞のＤＣ介在性プライミングの際にＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞エピトープとして作用する可能性がある免疫原性の非自己タンパク質の存在によって特徴づけられるべきであるということを示す。
【００３７】
ヒトの単球由来のＤＣは、同じくそれらの成熟を導く特定のＴＬＲ−リガンドによる持続的な刺激の間に高レベルのＭＩＰ−１α／ＣＣＬ３、ＩＬ−１２ｐ７０およびＭＩＧ／ＣＸＣＬ９を産生する潜在的可能性を有する。このような持続的に活性化された炎症誘発性成熟ＤＣを腫瘍内に注入するために、それら炎症誘発性成熟ＤＣは、腫瘍内導入に先立って洗浄される必要がある。洗浄されなければ、（エキソビボで炎症誘発性ＤＣを誘導することを意図した）刺激剤の同時の投与は、腫瘍内に動員される未熟ＤＣの強くかつ持続的な活性化も導き、これが未熟ＤＣの、遊走性の成熟したＤＣへの所望の分化ではなく炎症誘発性成熟ＤＣへの分化を導くであろう可能性が非常に高い。残念ながら、ＤＣが成熟したＤＣへと分化した時点（通常、刺激から１２時間よりも長く経過した後）でのＴＬＲ４リガンドまたはＣＤ４０Ｌのような成熟化刺激の停止は、炎症性サイトカイン産生（ＩＬ−１２産生を含む）の迅速な下方制御を誘導することが知られている。それゆえ、活性化誘導性因子の停止後、望ましい因子の持続的な産生を伴ってＤＣを炎症誘発性成熟ＤＣへと活性化する活性化方法が使用される必要がある。
【００３８】
本発明者らは、強い活性化因子による持続的な刺激を取り除いた後、従ってＤＣを刺激因子を含まないようにした後で、驚くべきことに高レベルの望ましいケモカインおよびＩＬ−１２を産生する炎症誘発性成熟ＤＣを生成するための方法を見出した。この炎症誘発性成熟ＤＣは、同種異系の態様で患者に、すなわちこのＤＣの源以外の患者に投与されてもよい。
【００３９】
この炎症誘発性成熟ＤＣは、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）と混合され、従って組成物を形成してもよい。この炎症誘発性成熟ＤＣは、ＰＢＭＣ集団内でＴ細胞のポリクローナル活性化を引き起こすであろう超抗原、例えば黄色ブドウ球菌エンテロトキシンＢ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ  Ｂ、ＳＥＢ）でコーティングされてもよい。
【００４０】
患者に投与されたとき、当該炎症誘発性成熟ＤＣまたは組成物は、腫瘍を死滅させる、腫瘍に対する細胞免疫反応を導くであろう免疫反応を誘導するであろう。
【００４１】
この効果は、患者がＰＢＭＣそれ自体のまたは炎症誘発性成熟ＤＣの源としてのドナーではない場合、すなわちそれらが患者にとって同種異系である場合、非常に強い。この場合、炎症誘発性成熟ＤＣまたは組成物は、非自己ＣＤ４＋  ヘルパーＴエピトープとして作用するであろう。
【００４２】
当該炎症誘発性成熟ＤＣまたは組成物は、炎症誘発性成熟ＤＣの、高レベルの関連するケモカイン、例えばＭＩＰ−１α／ＣＣＬ３を産生し、動員されたＮＫ細胞を細胞−細胞依存的な相互作用によって活性化する能力、および炎症誘発性成熟ＤＣの、高レベルのサイトカインＩＬ−１２（これは、患者自身の動員されたＤＣを、ＮＫ細胞によって死滅した腫瘍細胞由来の免疫原性の腫瘍物質で抗原負荷することを導くであろう）を産生する能力によって、患者自身のＤＣ、ＮＫ細胞およびＴ細胞を注入部位に引き付けることに寄与するであろう。
【００４３】
好ましくは、組成物１００は、腫瘍へと直接注入される。ＤＣを腫瘍へとおよび腫瘍全体にわたって引き付ける能力は重要である。なぜなら、ほとんどの検討された癌患者において、ＤＣは、主に腫瘍の周辺で見出されており、この主に腫瘍の周辺で見出されるということは、ＤＣと腫瘍細胞との相互作用を限定する可能性があるからである。重要なことは、患者自身の循環しているＤＣを腫瘍部位へと動員するケモカインの能力は、（局所的なＤＣとは反対に）腫瘍細胞を新しく生成された／動員されたＤＣへと曝し、これは、免疫抑制性の腫瘍環境によってあまり影響を受けない可能性があるということである。
【００４４】
図１に係る実施形態では、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）１０１が準備される１１方法１０が与えられる。単球１０２は、ＰＢＭＣ  １０１から単離１２される。未熟ＤＣ（ｉＤＣ）１０３は、単球１０２から生成１３され、ｉＤＣ  １０３の成熟は、活性化誘導因子ポリ−Ｉ：Ｃ、Ｒ８４８およびＩＦＮ−γをｉＤＣ  １０３に添加することにより誘導１４され、次いで洗浄してすべての活性化因子を除去され、こうして刺激因子を含まない炎症誘発性成熟ＤＣ  １０４を生じる。
【００４５】
１つの実施形態では、ｉＤＣ  １０３の成熟の誘導１４は、ＩＦＮ−α、ＩＬ−１βおよびＴＮＦ−αからなる群から選択される物質のうちの少なくとも１つを添加することをさらに含む。
【００４６】
１つの実施形態では、ｉＤＣの生成１３は、単球を、ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦを含む水系媒体の中で２〜７日間、例えば３〜５日間、または３日間もしくは５日間培養することにより誘導される。
【００４７】
図２Ａに係る実施形態では、組成物１００、例えば炎症誘発性ＤＣ１０４およびＰＢＭＣ１０１の共培養物、を製造するための方法２０が提供される。この方法は、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）１０１を準備２１する工程と、炎症誘発性成熟ＤＣ  １０４を得る２２工程と、ＰＢＭＣ  １０１および炎症誘発性成熟ＤＣ  １０４を混合２３する工程とを含む。
【００４８】
図２Ｂに係る実施形態では、組成物１００を製造するための方法２０は、混合する工程の前に、炎症誘発性成熟ＤＣ  １０４を超抗原２００で処理する２２ｂ工程をさらに含む。
【００４９】
上記の実施形態は、以下でさらに詳細に説明される。
【実施例】
【００５０】
以下の実験の実施形態は、本願明細書に示された具体的な形態に限定されることは意図されていない。むしろ、本発明は添付の特許請求の範囲によってのみ限定され、具体的な上述の実施形態以外の実施形態は、添付の特許請求の範囲の範囲内で等しく可能である。
【００５１】
ＰＢＭＣおよび単球の単離
健康なドナーから入手した末梢血（サールグレンスカ大学総合病院（Ｓａｈｌｇｒｅｎｓｋａ  ｓｊｕｋｈｕｓｅｔ）、スウェーデン、エーテボリ（Ｇｏｔｅｂｏｒｇ））から、当業者にとっては周知であるＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ｎｙｃｏｍｅｄ、Ｐｈａｒｍａ、ノルウェー、オスロ）を使用する密度勾配遠心分離によって末梢血単核球（ＰＢＭＣ）１０１を分離した。ＰＢＭＣ  １０１を、Ｃｅｌｌｇｒｏ培地（Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｉｘ、ドイツ、フライブルク（Ｆｒｅｉｂｕｒｇ））に２．５×１０６／ｍＬの最終濃度で再懸濁させ、次いで３７℃、６％  ＣＯ２の中、平底の２４穴プレート（１ｍｌ／ウェル）の中でインキュベーションした。２時間後、浮遊細胞を取り除き、一方で、残っている接着細胞をＰＢＳで２回洗浄し、単離された単球１０２（主にＣＤ１４＋細胞からなる）を得た。
【００５２】
ＤＣの生成
単球１０２を未熟ＤＣ  １０３へと分化させるために、上記単離工程から得た単球１０２を、新しい水系媒体、例えば誘導因子、すなわち１０００Ｕ／ｍＬ組み換えヒトＩＬ−４および１０００Ｕ／ｍＬ組み換えヒトＧＭ−ＣＳＦ（すべて、Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｉｘ、ドイツ、フライブルク（Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）製）を補ったＣｅｌｌｇｒｏ培地の中で３日間または５日間のいずれか、培養した。
【００５３】
ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦ中での単球由来の未熟ＤＣ（ｉＤＣ）１０３の生成は十分に受け容れられたインビトロモデルであり、これらの細胞は末梢組織ＤＣと同様であると考えてもよい。
【００５４】
ＤＣの成熟
ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦを補ったＣｅｌｌｇｒｏ培地中での３日間または５日間の培養の後、２０μｇ／ｍＬ  ｐｏｌｙＩ：Ｃ（Ｓｉｇｍａ、ドイツ、シュタインハイム（Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ））、ポリイノシン酸：ポリシチジル酸またはポリイノシン酸−ポリシチジル酸ナトリウム塩としても知られる、ＴＬＲ−３受容体に特異的な免疫刺激物質、および２．５μｇ／ｍＬ  Ｒ８４８（Ｓｉｇｍａ、ドイツ、シュタインハイム（Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ））、レシキモドとしても知られるｔｏｌｌ様受容体７／８−リガンド、または１０００Ｕ／ｍｌインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、米国、ミネアポリス）を補ったｐｏｌｙＩ：ＣおよびＲ８４８の組み合わせのいずれかを培地に添加して未熟ＤＣ  １０３の成熟を誘導した。１８時間のインキュベーション後、細胞を３回洗浄し、（外因性の活性化因子の添加なしの）新しい培地の中で２４時間さらにインキュベーションし、１つの態様に係る炎症誘発性成熟ＤＣ  １０４を得た。
【００５５】
この培養物の培養物上清を、当業者にとっては周知であるプロトコルに従って回収した。
【００５６】
ケモカインＣＣＬ３／ＭＩＰ−１α、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ、ＣＸＣＬ９／ＭＩＧ、ＣＣＬ２／単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）、およびサイトカイン  インターロイキン１２（ＩＬ−１２）のレベルを分析するために、後述するようにして、この上清に対してＥＬＩＳＡ分析を実施した。
【００５７】
ＤＣおよびＰＢＭＣの共培養
ＰＢＭＣ  １０１を上記に従って得て、炎症誘発性成熟ＤＣ  １０４も上記に従って得た。
【００５８】
ＰＢＭＣ  １０１由来のＴ細胞の迅速な成熟およびポリクローナル活性化を成し遂げるために、０．０１μｇ／ｍｌ  ＳＥＢ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、米国、ミネアポリス）を、上記成熟工程でのＤＣ培養物に加え、３０分後に洗浄した。ＰＢＳ中で３回洗浄した後、炎症誘発性成熟ＤＣ  １０４（２．５×１０５細胞／ｍＬ）を、１×１０６細胞／ｍＬの同種異系のＰＢＭＣ（上記のとおり、健康なドナーの末梢血から単離した）とともに、全量１ｍＬで、２４時間、共培養した。
【００５９】
炎症誘発性成熟ＤＣ  １０４および同種異系のＰＢＭＣの共培養物の培養物上清、いわゆるＭＬＲ上清、を回収し、その後−８０℃で保存した。これらの上清を、あとで記載するＥＬＩＳＡによって、周知のＤＣ活性化／成熟化因子ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βの存在について分析した。これらの上清は、ｉＤＣの表現型上の成熟の誘導についても検討した（後述のとおり）。
【００６０】
ＥＬＩＳＡ
Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、米国、ミネアポリス製のＤｕｏ  Ｓｅｔ  ＥＬＩＳＡ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍを製造業者の取扱説明書に従って使用して、酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）によってＣＣＬ３／ＭＩＰ−１α、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ、ＣＸＣＬ９／ＭＩＧ、ＣＣＬ２／ＭＣＰ−１、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１βおよびＩＦＮ−γのレベルを測定した。
【００６１】
表現型上の成熟の検討
単球由来の樹状細胞１０３（ｉＤＣ）を上記のとおりにして生成した。ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦを補ったＣｅｌｌｇｒｏ中での５日間のインキュベーションの後、未熟ＤＣ  １０３を、３００μｌの上記のＭＬＲ上清および１００μｌの新しいＣｅｌｌｇｒｏ培地の中で、３７℃で２４時間インキュベーションした。上清を加えることなく培養したＤＣを対照として使用した。ＭＬＲ上清が成熟を誘導しているかどうかを判定するために、試料を、ＦＩＴＣ抗ヒトＣＤ８３と組み合わせたＰＥ抗ヒトＣＤ８６で染色した。ＦＩＴＣおよびＰＥで染色したマウスＩｇＧ１およびＩｇＧ２をアイソタイプ対照として使用した（すべて、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国、カリフォルニア州製）。これらの試料を、Ｃｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、米国、カリフォルニア州）を使用してフローサイトメトリ（ＦＡＣＳ）によって分析した。
【００６２】
結果
以下で、この実験部から得た結果を論じる。
【００６３】
望ましい炎症性ケモカインの持続的な産生
図３に示すように、３人の検討した血液ドナー由来の炎症誘発性成熟ＤＣ  １０４によるＣＣＬ３／ＭＩＰ−１α（図３Ｃ）、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ（図３Ａ）およびＣＸＣＬ９／ＭＩＧ（図３Ｂ）の産生は、ｉＤＣが、複合ＴＬＲ刺激、すなわち成熟の誘導１４の前に、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４の中での５日間の培養によって誘導された場合、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４の中での３日間の培養と比較して、高かった。さらに、ＩＦＮ−γの添加による複合ＴＬＲ刺激は、最高レベルのＣＣＬ３／ＭＩＰ−１αおよびＣＸＣＬ９／ＭＩＧを与えたが、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳの産生はＩＦＮ−γの添加によって影響を受けなかった。
【００６４】
従って、物質ポリイノシン酸−ポリシチジル酸ナトリウム塩（ポリ−Ｉ：Ｃ）、レシキモド（Ｒ８４８）およびインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）を用いた処理によってエキソビボで成熟へとすでに刺激された炎症誘発性樹状細胞（ＤＣ）。
【００６５】
１つの実施形態では、炎症誘発性樹状細胞（ＤＣ）は、加えて、インターフェロンα（ＩＦＮ−α）、インターロイキン１、β（ＩＬ−１β）および腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）からなる群から選択される物質のうちの少なくとも１つですでに刺激されている。
【００６６】
注目すべきことに、高レベルを記録した関連するケモカインは、成熟刺激を取り除いた後に産生された。炎症誘発性成熟ＤＣ  １０４が強い外因性の活性化（例えば、成熟化）因子を含まないという事実は優位点である。なぜなら、腫瘍内での強い外因性の活性化因子の存在は、本発明とは異なる機構で、患者自身の腫瘍内に動員されたＤＣを、望ましい患者特異的な、すなわち自身の、遊走ＤＣへではなく、患者特異的な炎症誘発性ＤＣへの分化を誘発する可能性があるからである。
【００６７】
当該炎症誘発性成熟ＤＣは、刺激を取り除いた後２４時間の間に、少なくとも２５  ０００ｐｇ  ＩＬ−１２／ｍＬ／１０６細胞、例えば１２０  ０００ｐｇ／ｍＬ／１０６細胞、少なくとも１００  ０００ｐｇ  ＣＸＣＬ９／ｍＬ／１０６細胞、例えば４００  ０００ｐｇ／ｍＬ／１０６細胞、および少なくとも４０  ０００ｐｇ  ＣＣＬ３／ｍＬ／１０６細胞、例えば１８０  ０００ｐｇ／ｍＬ／１０６細胞を産生する。
【００６８】
当該炎症誘発性成熟ＤＣは、刺激を取り除いた後２４時間の間に、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ、例えば１７５００ｐｇ／ｍＬ／１０６細胞も産生する可能性がある。
【００６９】
検出可能なレベル（検出レベル３１２ｐｇ／ｍＬ）のＣＣＬ２／ＭＣＰ−１は見出されなかった（データは示さず）。図３は、ＥＬＩＳＡ分析によって得られた、ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１α（図３Ｃ）、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ（図３Ａ）およびＣＸＣＬ９／ＭＩＧ（図３Ｂ）のレベルを示す。示した結果は３人の個体からの平均値±ＳＤである。それぞれのＹ軸は、刺激を取り除いた後２４時間の間の、産生したそれぞれの物質の量をｐｇ／ｍＬ／２．５×１０５細胞単位で示す。Ｘ軸は、測定した異なる組み合わせを示す。
【００７０】
ＩＬ−１２ｐ７０持続的な産生
ＩＦＮ−γによる同時の刺激を伴うかまたは伴わない複合ＴＬＲ刺激、すなわち成熟の誘導１４は、炎症誘発性成熟ＤＣ  １０４においてＮＫ細胞を動員するケモカイン（ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１α、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳおよびＣＸＣＬ９／ＭＩＧ）の持続的かつ強い産生を誘導することが見出されたので、そのようなＤＣが同時にＩＬ−１２、例えば周知のＮＫ細胞活性化因子であるＩＬ−１２ｐ７０を放出することができるのかどうかを検討することに興味が持たれた。図４に示すように、ＴＬＲの二重刺激（例えばＲ８４８およびＰｏｌｙＩ：Ｃ）は、活性化誘導因子などの成熟刺激を取り除いた後、ＩＬ−１２ｐ７０の強くかつ持続的な産生を誘導することが示された。さらに、活性化の際にＩＦＮ−γを添加するとＩＬ−１２ｐ７０の産生がさらに増進した。ケモカインの産生と同様に、ＩＬ−１２ｐ７０産生は、単球を活性化の前にＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４の中で５日間培養したとき、３日間と比較して、最適であった（４つの実験のうちで３つ）。図４は、ＤＣ成熟の誘導後のＩＬ−１２ｐ７０の産生を示す。提示したデータは、異なるドナーによる３つの実験の平均±ＳＤである。Ｙ軸は、刺激を取り除いた後２４時間の間の、産生した物質の量をｐｇ／ｍＬ／２．５×１０５細胞単位で示す。Ｘ軸は、測定した異なる組み合わせを示す。
【００７１】
成熟したＤＣまたはＳＥＢコーティングした成熟したＤＣと同種異系のＰＢＭＣとの共培養は、ＤＣ成熟化因子の産生を誘導する
活性化されたＮＫ細胞およびＴ細胞によって産生される炎症誘発性の可溶性因子は、バイスタンダー（ｂｙｓｔａｎｄｅｒ）の未熟ＤＣの成熟を促進することが知られている。それゆえ、炎症誘発性成熟ＤＣ  １０４が、組成物１００の中で（動員される免疫細胞を模倣する）同種異系のＰＢＭＣと共培養されたとき、ＤＣの成熟にとって重要であることが公知のサイトカインの産生を誘導することができるかどうかを調べることに興味が持たれた。ＤＣによって誘導されたＴ細胞の活性化を最適化するために、二重のＴＬＲアゴニストおよびＩＦＮ−γによる刺激期間の最後（洗浄の３０分前）にＳＥＢをＤＣ培養物に加えることにより、ＤＣを超抗原であるブドウ球菌エンテロトキシンＢ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ  Ｂ）（ＳＥＢ）でコーティングした。ＳＥＢなどの超抗原は、ＡＰＣ上でＭＨＣクラスＩＩと複合体を形成し、Ｔ細胞受容体を介してＴ細胞を刺激することが公知である。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞の両方の迅速なポリクローナル活性化が、ＳＥＢに応答して起こり、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１およびＩＦＮ−γなどの炎症メディエーターの産生の増加が導かれる。Ｔ細胞レパートリーのうちの２０％もの割合をＳＥＢによって刺激することができ、一般に、ＳＥＢへの曝露後の４８時間以内にＴ細胞の「過剰活性化」が起こる。
【００７２】
繰り返し洗浄した後、ＳＥＢによる同時の「コーティング」を伴うかまたは伴わない炎症誘発性成熟ＤＣ  １０４を同種異系のＰＢＭＣとともに２４時間共培養し、上清中に放出されたＴＮＦ−α、ＩＬ−１βおよびＩＦＮ−γのレベルをＥＬＩＳＡによって測定した。他の種類の超抗原、例えばブドウ球菌エンテロトキシン（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ）Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、ＨおよびＪ、ならびにブドウ球菌性毒素ショック症候群毒素１（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  ｔｏｘｉｃ  ｓｈｏｃｋ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｔｏｘｉｎ−１）（ＴＳＳＴ−１）も使用してよい。図５Ａに示すように、（複合されたＴＬＲリガンドで刺激された）ＳＥＢコーティングした、しかし未熟ＤＣではない炎症誘発性成熟ＤＣ  １０４の共培養物は、同種異系のＰＢＭＣとの共培養の後に、ＩＬ−１βの実質的な産生を誘導した。ＳＥＢコーティングした未熟ＤＣと同種異系のＰＢＭＣとの共培養は、成熟したＤＣを使用することによってはほとんど増大させることができなかったＴＮＦ−αの実質的な産生を誘導した。ＩＬ−１βまたはＴＮＦ−αの産生は、ＤＣ成熟の際の二重ＴＬＲ刺激にＩＦＮ−γを加えることによっては、実質的に影響を受けなかった。注目すべきことに、ＳＥＢコーティングは、当該共培養モデルではＩＬ−１βおよびＴＮＦ−αの放出に顕著に寄与した（図６）が、これは、これらのサイトカインの際立った供給源としてのポリクローナルに活性化されたＴ細胞を示す。
【００７３】
このように、当該炎症誘発性成熟ＤＣは、刺激を取り除いた後２４時間の間に、少なくとも２  ０００ｐｇ  ＴＮＦ−α／ｍＬ／１０６細胞、例えば３２  ０００ｐｇ／ｍＬ／１０６細胞、および少なくとも５００ｐｇ  ＩＬ−１β／ｍＬ／１０６細胞、例えば２５００ｐｇ／ｍＬ／１０６細胞を産生する可能性がある。
【００７４】
ＩＬ−１βおよびＴＮＦ−αの産生と同様に、ＩＦＮ−γ産生は、共培養の中でＳＥＢでコーティングされている成熟したＤＣを使用するとき最も豊富に産生されることが示されたが（図７）、これは、Ｔ細胞のポリクローナル活性化に起因する可能性が最も高い。ＰＢＭＣをＴＬＲおよびＩＦＮ−γで刺激したＤＣに加えることで、ＩＦＮ−γの産生がわずかに誘導されたが、これはおそらく、炎症誘発性成熟ＤＣ  １０４によって産生されるＩＬ−１２によって活性化されたＮＫ細胞によって分泌されたものである。
【００７５】
図５は、ＥＬＩＳＡによって測定した、ＩＬ−１β（図５Ａ）およびＴＮＦ−α（図５Ｂ）のサイトカインレベルを示す。図６は、ＥＬＩＳＡによって測定した、しかし培地、ＰＢＭＣまたはＰＢＭＣ／ＳＥＢが添加されている場合の、ＩＬ−１β（図６Ａ）およびＴＮＦ−α（図６Ｂ）のサイトカインレベルを示す。図５に示すデータは４人の個体からの平均値±ＳＤであり、図６は１つの実験からの結果を示す。
【００７６】
図７は、ＥＬＩＳＡによって測定した、上清中のＩＦＮ−γのサイトカインレベルを示す。図７に示すデータは１つの実験に由来する。
【００７７】
図５、６および７のそれぞれのＸ軸は、刺激を取り除いた後２４時間の間の、産生されたそれぞれの物質の量をｐｇ／ｍＬ／２．５×１０５細胞単位で示す。それぞれのＹ軸は、測定した異なる組み合わせを示す。
【００７８】
バイスタンダーの未熟ＤＣの表現型上の成熟
コーティングしていないまたはＳＥＢコーティングした炎症誘発性成熟ＤＣ  １０４と同種異系のＰＢＭＣ  １０１との共培養物からの上清を、その後、バイスタンダーの未熟ＤＣの表現型上の成熟を誘導する能力について検討した。従って、先行する請求項のいずれか１項に係る炎症誘発性成熟ＤＣ  １０４と末梢血単核球（ＰＢＭＣ）１０１とを含む組成物１００が準備される。これらの細胞共培養物からの上清を、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４の中で５日間培養した付着単球から得た未熟のバイスタンダーＤＣを刺激するために使用した。刺激の２４時間後、細胞をＦＡＣＳ分析のために回収した。抗ヒトＣＤ８６およびＣＤ８３を使用して、それぞれ共起刺激分子（ＣＤ８６）および成熟マーカー（ＣＤ８３）の発現を調べた。複合ＴＬＲ刺激によって、すなわちポリ−Ｉ：Ｃ、Ｒ８４８をｉＤＣ  １０３に加えることによって成熟し、次いでＳＥＢ−コーティングした炎症誘発性成熟ＤＣ  １０４の共培養物からの上清は、図８に示すように、バイスタンダーＤＣのＣＤ８６およびＣＤ８３の際立った発現を誘導した。従って、組成物１００は超抗原を含んでもよい。ワクチンＤＣのＴＬＲ介在性成熟の際のＩＦＮ−γの添加は、図８Ｃに見られるとおり、バイスタンダーの未熟ＤＣのいずれのさらなる、上清によって誘導される、表現型上の成熟にも寄与しなかった。
【００７９】
図８は、未熟ＤＣ  １０３に対する、ＳＥＢおよびＴＬＲリガンド、すなわち成熟の誘導因子の影響を示す。付着単球をＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４の中で５日間インキュベーションしｉＤＣ  １０３を得た。ＳＥＢ／ＴＬＲで刺激した炎症誘発性成熟ＤＣ  １０４およびＰＢＭＣ  １０１を用いたＭＬＲからの上清を５日目に加え、その後、さらに２４時間インキュベーションした。上記共起刺激分子および成熟マーカーを検討するために、細胞を回収し、抗ヒトＣＤ８６およびＣＤ８３で染色した。成熟および共起刺激表面マーカーは、ＴＬＲリガンドおよびＳＥＢによって高く誘導された。示した結果は、２つのうちの１つの代表的な実験に由来する。
【００８０】
複合ＴＬＲ刺激＋ＩＦＮ−γで成熟させた炎症誘発性成熟ＤＣ  １０４を含有するだけの細胞培養液からの上清は、図９Ｂに見られるとおり、バイスタンダーＤＣ上でＣＤ８３の実質的な発現を誘導した。図９Ｃに見られるとおり、ＣＤ８３発現は、同種異系のＰＢＭＣおよび炎症誘発性成熟ＤＣ  １０４を用いた共培養物からの上清によってさらに増進された。最後に、ＳＥＢコーティングした炎症誘発性成熟ＤＣ  １０４および同種異系のＰＢＭＣ  １０１を用いた共培養物からの上清は、図９Ｄに見られるとおり、ＣＤ８３の最も強い発現を誘導し、これらは、炎症誘発性成熟ＤＣ  １０４−同種異系のＰＢＭＣ  １０１の共培養物１００にＳＥＢを含めることが、未熟のバイスタンダーＤＣの最大の、上清によって誘導される成熟を誘導するために重要であるということを示す。
【００８１】
上述の結果を考慮して、１つの態様によれば、医薬として使用するための、炎症誘発性成熟ＤＣ  １０４、または組成物１００が提供される。
【００８２】
１つの態様によれば、癌の処置において使用するための、炎症誘発性成熟ＤＣ  １０４、または組成物１００が提供される。
【００８３】
１つの態様によれば、癌の処置のための医薬の製造のための炎症誘発性成熟ＤＣ  １０４、または組成物１００の使用が提供される。
【００８４】
炎症誘発性成熟ＤＣ  １０４、または組成物１００は、腫瘍内に注入されてもよい。
【００８５】
１つの実施形態では、癌は、乳癌、前立腺癌、腎癌、腸癌、悪性神経膠腫、骨肉腫、悪性黒色腫、膵臓癌、悪性リンパ腫および食道癌からなる群から選択される。
【００８６】
１つの態様によれば、炎症誘発性成熟ＤＣ  １０４またはＰＢＭＣ  １０１の源（例えばドナー）以外の個体において医薬として使用するための、炎症誘発性成熟ＤＣ  １０４、または組成物１００が提供される。
【００８７】
１つの態様によれば、炎症誘発性成熟ＤＣ  １０４またはＰＢＭＣ  １０１の源（例えばドナー）以外の個体における癌の処置において使用するための、炎症誘発性成熟ＤＣ  １０４、または組成物１００が提供される。
【００８８】
腫瘍内注入
上記のように、炎症誘発性成熟ＤＣ  １０４、または組成物１００は、腫瘍成長に対する阻害効果を生成するために腫瘍内に注入されてもよい。
【００８９】
これを示すために、以下の説明に従ってスウェーデン、ウプサラ（Ｕｐｐｓａｌａ）のＶｉｓｉｏｎａｒ  Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ＡＢでラット研究を実施した。
【００９０】
１５匹の雌のＦｉｓｃｈｅｒラットをこの研究で使用した。馴化（最低１週間）後、ＲＰＭＩ培地中に１０６  ＭＡＴ  Ｂ  ＩＩＩ細胞（もともとはラットの乳腺癌から単離された）を含む細胞懸濁液１００μｌを、動物の左脾腹に皮下注射した（−４日目）。４日後、第２の腫瘍を右脾腹に誘導した（０日目）。炎症誘発性成熟ＤＣ  １０４（上記のとおりに生成した）またはビヒクルのみ（１０％（体積）ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含むＰＢＳバッファー）を、第２の（右脾腹の）腫瘍を導入してから４日後（４日目）に、第１の（左脾腹の）腫瘍に注入した。炎症誘発性成熟ＤＣ  １０４の投与量は、動物１匹あたり２０μｌであり、これは１０５の炎症誘発性成熟ＤＣ細胞１０４を含んでいた。第１および第２の腫瘍の成長を、この研究全体にわたって記録した。この研究の動物実験の部は、スウェーデン、ウプサラ（Ｕｐｐｓａｌａ）の地域動物実験倫理委員会（ｒｅｇｉｏｎａｌ  ａｎｉｍａｌ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｅｔｈｉｃｓ  ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）によって承認された（Ｃ３２０／９）。
【００９１】
実験計画の概略は下記表１にある。
【表１】
0005855018.tif 000002
表１。実験計画。それぞれ、第１の縦列は群であり、次いで、関与しているラットの数（Ｎ）、関与しているラットの固有のＩＤ、腫瘍１および２の誘導の仕様、そして最後に処置の仕様である。
【００９２】
第１の、左脾腹の腫瘍での腫瘍内ワクチン接種の日（４日目）に、動物を、左の腫瘍の体積に基づいて２つの異なる群へと無作為化した。対照群および炎症誘発性成熟ＤＣ  １０４群の両方において、１０％（体積）ウシ胎仔血清を含むＰＢＳバッファーのビヒクルを用いて腫瘍内注入を行った。
【００９３】
１日おきに、動物を腫瘍成長についてチェックした。触知できるときは、カリパスを使用して腫瘍のサイズを測定した。腫瘍の長さおよび幅を記録した。腫瘍体積を次式によって算出した：長さ（ｃｍ）×幅（ｃｍ）×幅（ｃｍ）×０．４４。
【００９４】
もともとの計画は、炎症誘発性成熟ＤＣ  １０４群からの３匹の動物を７日目に安楽死させ、すべての他の動物を１５日目（第２の腫瘍の注入後１１日間）に安楽死させることであった。しかしながら、７日目に、１匹の対照動物において、および炎症誘発性成熟ＤＣ  １０４群の７匹の動物において（それぞれ、ビヒクルまたはビヒクル＋ワクチン細胞を与えた）、左の腫瘍は２ｃｍ３よりも大きくなり、それゆえこれらの８匹の動物は、安楽死させた。２日後（９日目）、残りの７匹の動物の左の（第１の）腫瘍も倫理的限界を超えて成長したので、これらの動物は安楽死させた。
【００９５】
これらの腫瘍を切開し、秤量し、ドライアイスの中で凍結し、後の組織病理学のために−７０℃で保存した。
【００９６】
病理組織学的な分析のためにＭｉｃｒｏＭｏｒｐｈに送った凍結した腫瘍（左および右の両方）を下記表２に示す。８μｍの凍結切片を調製し、当業者にとっては周知である方法に従って、ヘマトキシリン／エオシンを用い、ＤＣ／マクロファージ（マウス抗ラットＣＤ６８）、ＮＫ細胞（マウス抗ラットＣＤ１６１ａ）、ならびにＣＤ８陽性細胞（ＣＤ８＋  Ｔ細胞およびＣＤ８＋  ＤＣ／マクロファージ）について染色した。
【００９７】
異なる腫瘍における免疫原性細胞の数を盲検的に以下のとおり採点した：いくつかの陽性細胞（１＋）、中程度の数の陽性細胞（２＋）または多数の陽性細胞（３＋）。
【表２】
0005855018.tif 000003
表２。病理組織学的な分析のために送った凍結腫瘍。縦列は、それぞれラットＩＤ、群および安楽死の実験日を示す。
【００９８】
腫瘍体積に関する異なる群からの結果の分析を、ｔ検定および反復測定ＡＮＯＶＡ（ＨＰ  Ｃｏｍｐａｃ  ｄｃ  ７７００ｐコンピューター上でのＰＡＳＷ  ｖ  １８）を使用して実施した。腫瘍体積の記述統計学を下記表３および４に提示する。
【表３】
0005855018.tif 000004
表３。異なる日（ｄ＊）における腫瘍体積（ＴＶ）。この表は、この研究全体にわたる平均腫瘍体積（ｍＬ）、標準誤差（ＳＥＭ）、および動物の数（Ｎ）を示す。
【００９９】
反復測定ＡＮＯＶＡは、６日目〜９日目に腫瘍体積を分析するために使用した。第１および第２の腫瘍は、別々に分析した。反復測定分析における欠落値の取り扱いのため、最後に測定した値は、繰り越した。
【表４】
0005855018.tif 000005
表４。平均腫瘍体積（ｍＬ）、標準誤差（ＳＥＭ）、および動物の数（Ｎ）（最後に測定した値は繰り越してある）。＊Ｐ＜０．０５  群内の６日目と比較した。＃Ｐ＜０．０５  全体にわたって対照群の中の対応する腫瘍と比較した。‡Ｐ＜０．０５  対照群の中の対応する腫瘍と比較した。
【０１００】
腫瘍重量の記述統計学を下記表５に提示する。
【表５】
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表５。異なる安楽死の日における平均腫瘍重量（ＴＷ、ｇ）、標準誤差（ＳＥＭ）、および動物の数（Ｎ）。＊Ｐ＜０．０５  対照群の中の対応する腫瘍と比較した（ｔ検定）。
【０１０１】
図１０は、異なる群における異なる腫瘍の腫瘍体積（ｍＬ）を示すグラフである（ＣＯＭＢＩＧ−ＤＣは炎症誘発性成熟ＤＣ  １０４を表す）。動物がこの研究から除外されたとき、最後に測定した値は繰り越した。値は平均±ＳＥＭである。炎症誘発性成熟ＤＣ  １０４で処置したラットは、第１および第２の腫瘍の両方に関して、より小さい腫瘍体積を有するということが明確に分かる。
【０１０２】
第１の腫瘍は、非常に早く成長し、大きい腫瘍体積のため、すべての動物を、計画したよりも早く安楽死させる必要があった。炎症誘発性成熟ＤＣ  １０４群の中の９匹の動物のうちの７匹および対照群の中の６匹の動物のうちの１匹は、７日目に安楽死させる必要があり、残りの動物は９日目に安楽死させる必要があった。これらの材料に対して統計解析を実施することができるように、７日目からの最後に測定した腫瘍体積を９日目へ繰り越した。これにより、なんとか９日目の第１の（ワクチン注入した）腫瘍の不実に小さい体積を与えることができたが、第１の（左の）腫瘍の体積および重量に関する結果を分析するときに、より多くの動物が炎症誘発性成熟ＤＣ  １０４群から除外されたという事実が考慮されるべきである。次いで反復測定ＡＮＯＶＡを使用して６日目〜９日目の腫瘍体積を分析した。第１および第２の腫瘍を別々に分析した。
【０１０３】
７日目の炎症誘発性成熟ＤＣ  １０４群の第１の腫瘍のより大きい腫瘍体積は、注入した樹状細胞に対する進行中の炎症反応によって説明することができた。なぜなら、免疫組織化学により、対照群と比較して、炎症誘発性成熟ＤＣ  １０４群のこれらの第１の腫瘍における浸潤する炎症細胞の数の増加が明らかになったからである（下記を参照）。
【０１０４】
炎症誘発性成熟ＤＣ  １０４群の第２の腫瘍は、対照群と比較して、腫瘍体積の統計的に有意な減少を有した。さらには、対照群と比較して、炎症誘発性成熟ＤＣ  １０４群の９日目に除外した２つの第２の腫瘍の統計的に有意な低い重量が判明した。
【０１０５】
これらの腫瘍を凍結し、凍結切片を調製し、ヘマトキシリン／エオシンを用い、ＤＣ／マクロファージ（マウス抗ラットＣＤ６８）、ＮＫ細胞（マウス抗ラットＣＤ１６１ａ）、およびＣＤ８陽性細胞（ＣＤ８＋  Ｔ細胞およびＣＤ８＋  ＤＣ／マクロファージ）について染色した。これらの腫瘍は、様々な厚さの緩く結合するカプセルによって取り囲まれた悪性の腫瘍細胞から構成されていた。結合する線維のストランドは、腫瘍細胞と相互に混ざり合っていることが判明した。壊死腫瘍細胞の領域が、すべての試料で見て取れる。結晶化した材料のプールが、第１の腫瘍（注入した）のいくつかにおいて見て取れる。これは第１の腫瘍でのみ見出されるので、これは、注入した材料の残骸である可能性が最も高い。
【０１０６】
この要約を下記表６に提示する。
【表６】
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表６。異なる安楽死の日（実験日）における組織病理学的分析の結果。値は、ＤＣ／マクロファージ（ＣＤ６８）、ＮＫ細胞（ＣＤ１６１ａ）、ＤＣ／マクロファージ（ＣＤ８ａ）および細胞毒性Ｔ細胞（ＣＤ８ａ）の数のスコアである。Ｈ／Ｅ染色を用いて、切片に対して腫瘍の形態学的な評価を行った。
【０１０７】
腫瘍に浸潤するＣＤ８ａ、ＣＤ６８およびＣＤ１６１ａ陽性細胞は、すべての分析した試料で見出された。陽性細胞は、腫瘍を取り囲むカプセルの中および腫瘍細胞領域の中の両方に見られた。これらの結果は決定的なものではないが、炎症誘発性成熟ＤＣ  １０４で処置した動物は、当該検討した細胞のより高い存在を有していたという傾向があるようである。
【０１０８】
従って、炎症誘発性成熟ＤＣ  １０４の腫瘍内注入を用いた処置は腫瘍への、ＤＣ／マクロファージ、ＮＫ細胞および細胞毒性Ｔ細胞の動員の増加を誘導し、このあと第２の腫瘍の体積および重量の減少を伴うという傾向があった。
【０１０９】
図１１は、原発性腫瘍に炎症誘発性成熟ＤＣ  １０４を腫瘍内注入して３日後のマクロファージ、ＮＫ細胞、細胞毒性Ｔ細胞（ＤＣ／ＣＤ８＋）についての病理組織学的な結果の写真を示す。
【０１１０】
図１２は、ビヒクルのみの腫瘍内注入による対応する対照の病理組織学的な結果の写真を示す。
【０１１１】
このように、炎症誘発性成熟ＤＣ  １０４を用いた注入の後にＤＣ／マクロファージ、ＮＫ細胞および細胞毒性Ｔ細胞が腫瘍に動員されたが、ビヒクルのみの注入後は動員されなかったということが分かる。図１３は、原発性腫瘍に炎症誘発性成熟ＤＣ  １０４を腫瘍内注入して５日後の、続発性腫瘍のＤＣ／マクロファージ、ＮＫ細胞および細胞毒性Ｔ細胞についての病理組織学的な結果の写真を示す。
【０１１２】
図１４は、ビヒクルのみの腫瘍内注入による対応する対照の病理組織学的な結果の写真を示す。
【０１１３】
このように、原発性腫瘍での炎症誘発性成熟ＤＣ  １０４を用いた注入の後にＤＣ／マクロファージ、ＮＫ細胞および細胞毒性Ｔ細胞が続発性腫瘍（転移）にさえも動員されたが、ビヒクルのみの注入後はより低い程度にしか動員されなかったということが分かる。
【０１１４】
まとめると、腫瘍モデルにおけるこのワクチン研究は、炎症誘発性成熟ＤＣ  １０４の腫瘍内注入により、注入部位（第１の腫瘍）への、ＤＣ、ＮＫ細胞およびＴ細胞などの炎症細胞の際立った動員が誘導されるということを示した。このような、炎症細胞の強力な動員は、おそらく、注入後の最初の２〜３日間の観察された腫瘍体積の増加を説明する。炎症誘発性成熟ＤＣ  １０４の腫瘍内注入は、さらに、離れた腫瘍（右の腫瘍）の減少を誘導し、これは全身性抗腫瘍性効果を示す。
【０１１５】
１つの実施形態では、癌は、乳癌、前立腺癌、腎癌、腸癌、悪性神経膠腫、骨肉腫、悪性黒色腫、膵臓癌、悪性リンパ腫および食道癌からなる群から選択される。
【０１１６】
１つの実施形態では、上記の炎症誘発性成熟ＤＣ  １０４、または組成物１００は、薬学的に許容できる賦形剤、例えば担体、防腐剤、アジュバントなどをさらに含む。
【０１１７】
１つの実施形態では、賦形剤は生理ＮａＣｌ溶液中で準備された２％  ヒト血清アルブミンである。
【０１１８】
１つの実施形態では、成熟したＤＣ  １０４および末梢血単核球（ＰＢＭＣ）１０１の両方が、対象（被験者）に関して同種異系である、すなわち対象に対してＭＨＣ非適合性である、例えば完全にＭＨＣ非適合性であるドナーに由来する。
【０１１９】
これは、当該治療用組成物を予め製造して、使用に先立って、例えば凍結状態で保存することができるという優位点を有する。また、患者に関する当該組成物の同種異系という特性は、上で論じたように、当該組成物をより効果的にするであろう。
【０１２０】
１つの態様では、腫瘍を有する哺乳類患者を処置する方法が提供される。この方法は、その患者に、１回または数回、治療上有効量の炎症誘発性成熟ＤＣ  １０４、または組成物１００を投与することを含み、炎症誘発性成熟ＤＣ  １０４および／またはＰＢＭＣ  １０１が採取されるドナーは当該患者ではない。
【０１２１】
この投与は腫瘍内注入であってもよい。
【０１２２】
特許請求の範囲では、用語「を含む」は、他の要素または工程の存在を排除しない。さらには、個々に列挙されているが、複数の要素または方法工程は、例えば、１つの工程で実施されてもよい。加えて、個々の特徴が異なる請求項に含まれてもよいが、これらは、可能であれば有利に組み合わされてもよく、異なる請求項に含まれていることは、特徴の組み合わせが実行可能ではなくかつ／または有利でないということを暗に含むものではない。加えて、単数形の指示対象は、複数形を排除しない。用語「１つの」、「第１の」、「第２の」などは複数形を除外しない。請求項の中の引用符号は、明快にする例としてのみ提供され、請求項の範囲をいくらかでも限定するとは解釈されるべきではない。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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