(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のヒトパピローマウイルス核酸をインビトロで検出する方法であって、
（ｉ）ヒトパピローマウイルスＬ１遺伝子又は相補体の一部の増幅を促進するのに適した条件下で、前記試料を、前記ヒトパピローマウイルスＬ１遺伝子又はその相補体中の標的部位に結合するフォワードオリゴヌクレオチドプライマー及びリバースオリゴヌクレオチドプライマーと接触させることによりアンプリコンを作製するステップであって、前記フォワードプライマーが配列番号１の配列を有する標的部位に結合し、前記リバースプライマーが配列番号２の配列を有する標的部位に結合する、ステップ；
（ii）前記アンプリコンを、該アンプリコン内の標的部位に結合するプローブのセットと接触させるステップ；及び
（iii）前記プローブと前記アンプリコンとの結合を検出するステップを含み、
前記プローブのセットが、
（ｉ）配列番号１５の核酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列を含むプローブ、
（ii）配列番号１６の核酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列を含むプローブ、
（iii）配列番号１７の核酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列を含むプローブ、及び
（iv）配列番号１８の核酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列を含むプローブを含む、方法。
【請求項２】
プローブのセットが、
（ｉ）配列番号１５の核酸配列を含むプローブ、
（ii）配列番号１６の核酸配列を含むプローブ、
（iii）配列番号１７の核酸配列を含むプローブ、及び
（iv）配列番号１８の核酸配列を含むプローブ、
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
プローブのセットが、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、及び配列番号３４から選択される核酸配列と少なくとも８５％の配列同一性を有する核酸配列を含む少なくとも１つの他のプローブをさらに含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
少なくとも１つの他のプローブが、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、及び配列番号３４からなる群から選択される核酸配列を含むか、該核酸配列からなる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
フォワードプライマーが配列番号３の配列を有する核酸配列を含むか、又は配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８から選択される核酸配列と少なくとも８５％の配列同一性を有する核酸配列を含み、
リバースプライマーが配列番号９の配列を有する核酸配列を含むか、又は配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３及び配列番号１４から選択される核酸配列と少なくとも８５％の配列同一性を有する核酸配列を含む、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
アンプリコンを作製するステップが、試料を、配列番号１の配列を有する標的部位に結合する少なくとも２つの異なるフォワードプライマー及び配列番号２の配列を有する標的部位に結合する少なくとも２つの異なるリバースプライマーと接触させることを含む、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
少なくとも２つのフォワードプライマーがそれぞれ配列番号３の核酸配列、並びに、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８から選択される核酸配列と少なくとも８５％の配列同一性を有する核酸配列から選択される異なる核酸配列を含み、少なくとも２つのリバースプライマーがそれぞれ配列番号９の核酸配列、並びに、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、及び配列番号１４から選択される核酸配列と少なくとも８５％の配列同一性を有する核酸配列から選択される異なる核酸配列を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
フォワードプライマーのそれぞれが、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８から選択される異なる核酸配列からなり、リバースプライマーのそれぞれが、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３及び配列番号１４から選択される異なる核酸配列からなる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
アンプリコンを作製するステップが、試料を
（ｉ）配列番号４の核酸配列からなるフォワードプライマー、
（ii）配列番号５の核酸配列からなるフォワードプライマー、
（iii）配列番号１０の核酸配列からなるリバースプライマー、及び
（iv）配列番号１１の核酸配列からなるリバースプライマー、
と接触させることを含む、請求項６〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
プローブのセットのそれぞれのプローブが、異なる固体担体又はプラットホーム上に固定化されている、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
異なる固体担体又はプラットホームのそれぞれが、一意的に同定可能なビーズ又はマイクロスフェアである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
異なる固定化されたプローブの結合に続いて、ビーズ又はマイクロスフェアをその一意的同定に従ってソーティングすることをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
アンプリコンと、検出可能な分子を含み、且つ前記アンプリコンに結合するレポーター構築物とを接触させることを含む、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
フォワード及び／又はリバースプライマーが標識を含み、アンプリコンを作製するステップが前記標識をアンプリコンに組み込むステップを含み、
（ｉ）前記標識が検出可能な分子を含むか、又は
（ii）前記標識が第１の結合分子を含み、
前記第１の結合分子と、該第１の結合分子に結合する第２の結合分子を含み、且つ検出可能な分子を含むレポーター構築物とを接触させることをさらに含む、請求項１〜１２に記載の方法。
【請求項１５】
第１の結合分子がビオチンである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
検出可能な分子が蛍光分子である、請求項１３〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
対象試料中のヒトパピローマウイルス病原体負荷をインビトロで定量する方法であって、（ａ）前記対象試料に対して請求項１〜１６のいずれかに記載の方法を実施すること；及び
（ｂ）所定の既知のヒトパピローマウイルス病原体負荷の試験試料に対して請求項１〜１６のいずれかに記載の方法を実施すること；及び
（ｃ）前記対象試料から検出されるシグナルを試験試料から検出されるシグナルと比較することを含み、
それにより前記対象試料中のヒトパピローマウイルス病原体負荷を定量する方法。
【請求項１８】
薬物療法の期間の経過にわたって、薬物の有効性をインビトロで判定する方法であって、（ａ）薬物療法の期間内の又は先立つ最初の時点で得られる最初の試料に対して請求項１〜１６のいずれかに記載の方法を実施すること；
（ｂ）薬物療法の期間内の又は後の１又は複数の後の時点で得られる１又は複数の後期試料に対して請求項１〜１６のいずれかに記載の方法を実施すること；及び
（ｃ）最初の試料から検出されるシグナルを、前記１又は複数の後期試料から検出されるシグナルと比較することを含み、
それにより薬物療法の期間の経過にわたって薬物の有効性を判定する方法。
【請求項１９】
薬物療法がワクチン療法である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
試料中のヒトパピローマウイルスをインビトロで分類する方法であって、
（ａ）試料に対して請求項１〜１６のいずれかに記載の方法を実施すること；及び
（ｂ）ヒトパピローマウイルス核酸に結合しているプローブ又は複数のプローブを同定すること
を含む方法。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれかに記載の方法において使用するためのプローブのセットであって、プローブがヒトパピローマウイルスＬ１遺伝子又はその相補体内の標的配列に結合し、
前記プローブのセットが、
（ｉ）配列番号１５の核酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列を含むプローブ、
（ii）配列番号１６の核酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列を含むプローブ、
（iii）配列番号１７の核酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列を含むプローブ、及び
（iv）配列番号１８と少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列を含むプローブを含む、プローブのセット。
【請求項２２】
（ｉ）配列番号１５の核酸配列を含むプローブ、
（ii）配列番号１６の核酸配列を含むプローブ、
（iii）配列番号１７の核酸配列を含むプローブ、及び
（iv）配列番号１８の核酸配列を含むプローブ
を含む、請求項２１に記載のプローブのセット。
【請求項２３】
プローブのセットが、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、及び配列番号３４からなる群から選択される核酸配列と少なくとも８５％の配列同一性を有する核酸配列を含む少なくとも１つの他のプローブをさらに含む、請求項２１又は２２に記載のプローブのセット。
【請求項２４】
少なくとも１つの他のプローブが、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、及び配列番号３４からなる群から選択される核酸配列を含むか、該核酸配列からなる、請求項２３に記載のプローブのセット。
【請求項２５】
プローブのセットにおけるそれぞれのプローブが、異なる固体担体又はプラットホーム上に固定化されている、請求項２１〜２４のいずれかに記載のプローブのセット。
【請求項２６】
異なる固体担体又はプラットホームが、一意的に同定可能なビーズ又はマイクロスフェアである、請求項２５に記載のプローブのセット。
【請求項２７】
請求項２１〜２６のいずれかに記載のプローブのセットを含み、ヒトパピローマウイルスＬ１遺伝子又はその相補体中の標的部位に結合するフォワードオリゴヌクレオチドプライマー及びリバースオリゴヌクレオチドプライマーをさらに含む、請求項１〜２０のいずれかに記載の方法において使用するためのキット。
【請求項２８】
フォワードプライマーが、配列番号３の配列を有する核酸配列を含むか、又は配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８から選択される核酸配列と少なくとも８５％の配列同一性を有する核酸配列を含み；及び／又は
リバースプライマーが、配列番号９の配列を有する核酸配列を含むか、又は配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３及び配列番号１４から選択される核酸配列と少なくとも８５％の配列同一性を有する核酸配列を含む、請求項２７に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、パピローマウイルス、特にヒトパピローマウイルスの検出並びにそのための試薬及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
パピローマウイルスは、ヒトの皮膚及び粘膜並びに種々の動物に感染する多種多様なグループの二本鎖ＤＮＡウイルスである。
【０００３】
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）には１００を超える様々な遺伝子型があり、そのうち３０が肛門性器管に存在している。一部のＨＰＶ遺伝子型は、良性皮膚疣又はこのウイルス科の名称の由来となる乳頭腫（papilloma）を引き起こす。尋常性疣贅の発生に関連するＨＰＶ感染は、環境的に又は偶然の皮膚と皮膚の接触により伝播する。
【０００４】
ＨＰＶ感染は性交を通じて伝播することもある。生殖器疣又は肛門疣は、生殖器ＨＰＶ感染の最も簡単に認識される徴候である。生殖器ＨＰＶ感染は非常によく見られ、推定では女性の最大７５％が成人期中のある時点で１又は複数の性的伝播ＨＰＶ遺伝子型に感染することが示唆されている。
【０００５】
ＨＰＶ遺伝子型は、「低」及び「高」リスク遺伝子型に分類される。「低」リスク遺伝子型には、遺伝子型５、６、及び１１が挙げられる。遺伝子型５は、いかなる臨床症状も示すことなく任意の個人において生涯存続する感染を確立することがある。遺伝子型６及び１１は、生殖器疣の約９０％の症例に関連しており、癌に関連することは稀である。ＨＰＶ遺伝子型６及び１１は、疣が咽頭又は気道のその他の領域上に形成される再発性呼吸器乳頭腫症として知られる希な状態にも関連している。
【０００６】
「高」リスク遺伝子型（例えば、遺伝子型１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５３、５６、５８、５９、６６、６８、６９、７３及び８２）は、「高リスク」遺伝子型として知られる。なぜならば、これらの遺伝子型は癌に、特に子宮頸癌に高い頻度で存在するからである。この点に関して、１又は複数の「高」リスクＨＰＶ遺伝子型の感染は、すべての子宮頸癌のほぼ１００％において同定されており、特に、遺伝子型１６及び１８は子宮頸癌の７０％超で同定されている。世界中で毎年ほぼ２５０，０００人の女性が子宮頸癌で亡くなっている。
【０００７】
ＧｅｎＢａｎｋ受託番号がＨＰＶ遺伝子型に付与されている。
【０００８】
【表１】
0005898831.tif 000002
【０００９】
２００６年６月８日、米国ＦＤＡはMerck社により開発された予防ＨＰＶワクチン、Gardasilを認可した。前記ワクチンはＨＰＶ遺伝子型６、１１、１６及び１８による初期感染から女性を保護する。
【００１０】
このワクチン計画及び類似のワクチン計画が進むに従って、包括的ＨＰＶ検出及び遺伝子型分類アッセイが、すでに感染している患者のＨＰＶの根絶、又はＨＰＶ感染の予防における上記ワクチン計画の有効性を評価するのに不可欠となるであろう。
【００１１】
ＨＰＶは、疫学的立場から研究するのが特に困難なウイルスである。この点に関して、研究室で増殖させるのに成功した例はごく限られており、ＨＰＶの専在種（exclusive species）特異性も、動物モデルでＨＰＶを増殖させる能力を制限している。さらに、ＨＰＶは弱抗原性にすぎず、前記ウイルスに対する免疫応答は個体により変わりやすい。さらに、異なるＨＰＶサブタイプのカプシドタンパク質は抗原的に極めて類似しているために、これらの技法でのウイルスのサブ遺伝子型分類は問題が多い。
【００１２】
頸部パパニコロー（Ｐａｐ）スミアは、ＨＰＶ感染の一般的及び潜在的に重大な臨床的徴候の最も効果的な指標の１つである。Ｐａｐスミアにより明らかにされるＨＰＶ細胞変性又は頸部形成異常を示唆する異常は、コルポスコピー及び必要に応じてバイオプシーによりさらに評価される。
【００１３】
ＨＰＶのインビトロ培養には困難が伴うため、ＨＰＶ感染の同定は試料中のＨＰＶ ＤＮＡの検出に依拠している。
【００１４】
ＨＰＶゲノムは「初期」遺伝子（Ｅ１、Ｅ２、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６及びＥ７）並びに「後期」遺伝子（Ｌ１及びＬ２：それぞれメジャー及びマイナーカプシドタンパク質をコードしている）に系統化されている。Ｌ１（メジャーカプシドタンパク質）遺伝子は、ＨＰＶ検出及び遺伝子型同定のための標的として広く研究されてきた。
【００１５】
核酸プローブを使用してＨＰＶを検出し、必要に応じて遺伝子型分類するための試験は、１９８０年代後半以降市販されている。一例として、ＨＰＶ ＤＮＡを検出するための既知の方法には、サザンブロット法、ドットブロット法、逆ラインブロット法、ＥＬＩＳＡ並びに特にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用したシグナル及び／又は標的核酸増幅でのインサイツハイブリダイゼーション法が挙げられる。
【００１６】
しかし、初期の試験は、すべての発癌性ＨＰＶ遺伝子型を検出することができたわけではなく、低感度及び／又は特異性に阻まれたため、広範囲の用途を実現することはなかった。この点に関して、異なるＨＰＶ遺伝子型間のヌクレオチドレベルで著しい異質性が同定されており、このためにすべてのＨＰＶ遺伝子型の検出のための簡単な万能試験の開発が妨げられてきた。
【００１７】
これらの既知の方法に伴うさらなる問題は、これらの方法を容易に自動化したり、高性能プラットホーム上に展開することができず、したがって、多くの患者がいる場合には不適切であることである。
【００１８】
ＰＣＲは、ＨＰＶ検出、遺伝子型同定及びウイルス負荷測定のために利用されてきた。一般的又はコンセンサスプライマー媒介ＰＣＲアッセイは、単回ＰＣＲ反応を使用した臨床試料中の広範囲のＨＰＶ遺伝子型のスクリーニングを可能にした。リアルタイム量的ＰＣＲ試験（ＲＱ−ＰＣＲ）においてコンセンサスプライマーを使用すると、ＰＣＲ反応速度をリアルタイムでモニターすることにより生じる反応曲線からウイルス負荷（濃度）データを出すことが可能である。
【００１９】
１つの市販されているＨＰＶ ＤＮＡ検出試験は、Hybrid Capture（登録商標）2 ＨＰＶ ＤＮＡ試験（Digene社製）であり、これは女性用のＰａｐスミア試験への添加剤として使用されてきたもので、異常なＰａｐスミア結果に応じて注文することができる。Hybrid Capture（登録商標）技術は、標的ＤＮＡへのＲＮＡプローブのハイブリダイゼーション、標識抗体を使用したＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド捕獲、及びシグナル増幅を基にしている。Hybrid Capture（登録商標）2試験では、５つの低リスク及び１３の高リスクＨＰＶ遺伝子型が検出される。
【００２０】
Hybrid Capture（登録商標）2 ＨＰＶ ＤＮＡ試験の不利点は、高偽陽性率であり、典型的運用条件下では１７％にもなる。
【００２１】
Luminex xMAP液体ビーズマイクロアレイフローサイトメトリー技術（Luminex社製、オースティン、テキサス州）を用いるいくつかのＨＰＶ遺伝子型同定アッセイ法が最近記載されている。
【００２２】
Luminex xMAP技術を使用すると、最大１００の異なるＰＣＲ増幅遺伝子標的の同時検出が単回反応で可能になる（多重化）。Luminexシステムは、一意的に同定されるマイクロスフェアのセットを用い、各セットは独自のスペクトルサイン（マイクロスフェアは、赤色及び赤外線蛍光体の混合物で内部的に染色されている）及びその表面に結合している異なる特異的オリゴヌクレオチドプローブ（各マイクロスフェアセット内部では、結合したプローブは同一である）を有する。
【００２３】
Luminex技術を使用するにあたって、一意的に同定可能なマイクロスフェアセット（結合したプローブ付き）は、ビオチン標識ＰＣＲ増幅標的核酸配列と組み合わされて、標的核酸−プローブ−マイクロスフェアハイブリッドを形成する。蛍光色素標識コンジュゲート（例えば、ストレプトアビジンＲ−フィコエリトリン）はこのステップで反応液に添加されて、結合標的核酸分子に結合する。
【００２４】
この混合物をLuminex 100（商標）機器に注入すると、マイクロスフェアに検出室を通過させる前に、マイクロスフェアを縦一列に整列させる。レーザー光がマイクロスフェアの赤色及び赤外線色素を照射し、それにより前記マイクロスフェアをマイクロスフェアセットの１つに分類することが可能になる。レーザー光は、結合した標的核酸に結合している蛍光色素も励起する。色シグナルはリアルタイムで捕獲され、レポーター分子の蛍光強度を使用して、マイクロスフェアの各セットに結合している標的核酸分子の量を測定する。
【００２５】
これらの既知のＨＰＶLuminexアッセイの不利点は、その感度が悪いことである。
【００２６】
したがって、ヒトパピローマウイルスを検出するための代替及び／又改良システムを提供する必要がある。
【発明の概要】
【００２７】
したがって、本発明は、試料中のヒトパピローマウイルス核酸を検出するインビトロ方法であって、（ｉ）ヒトパピローマウイルスＬ１遺伝子又は相補体の一部の増幅を促進するのに適した条件下で、前記試料を、前記ヒトパピローマウイルスＬ１遺伝子又はその相補体中の標的部位に結合するフォワードオリゴヌクレオチドプライマー及びリバースオリゴヌクレオチドプライマーと接触させることによりアンプリコンを作製すること；（ii）前記アンプリコンを、前記アンプリコン内の標的部位に結合するプローブと接触させること；及び（iii）前記プローブと前記アンプリコンの結合を検出することを含み、前記フォワードプライマーが配列番号１の配列を有する標的部位に結合し、前記リバースプライマーが配列番号２の配列を有する標的部位に結合する、方法を提供する。
【００２８】
本発明は、試料中のヒトパピローマウイルス核酸を検出するインビトロ方法であって、（ｉ）前記試料を、ヒトパピローマウイルスＬ１遺伝子又はその相補体内の標的部位に結合する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブと接触させること；及び（ii）前記プローブと前記標的部位の結合を検出することを含み、前記プローブは、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３及び配列番号３４から選択される核酸配列と少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む、方法をさらに提供する。
【００２９】
性感染症を検出し診断する分野では、患者にとって試験結果が微妙な性質のものであること、不適当な治療を受けた場合のコスト及び影響、並びに不正確な結果を提供した場合の法律上の影響に鑑み、「偽陽性」結果の発生をできる限り低く抑えることが特に重要である。
【００３０】
有利なことに、本発明の方法は、ヒトパピローマウイルスを検出するための既存の試験法と比べると、改良された特異性及び感度を提供する。
【００３１】
一態様では、本発明の検出アッセイを使用すると、ほぼ１時間の単回ハイブリダイゼーション反応において最大２０ＨＰＶ遺伝子型の検出及び同定が可能になる。
【００３２】
試料は、例えば、食糧試料、下水道試料、環境試料、家畜試料、臨床試料であってよい。臨床試料は、尿道スワブ、膣スワブ、子宮頸部スワブ、直腸スワブ、陰茎スワブ、咽喉／口スワブ、気道試料、尿、血液、脳脊髄液、液体ベースの細胞学的試料、組織生検材料及び他の任意のヒト由来試料が挙げられる。
【００３３】
本発明における使用に適したプローブは、ヒトパピローマウイルス核酸に特異的に結合する。したがって、適切なプローブは、オリゴヌクレオチドでもよく、タンパク質リガンド、例えば、抗体でもよい。
【００３４】
プローブは、相補的塩基対合によりヒトパピローマウイルス核酸内のその標的部位に結合するオリゴヌクレオチドプローブであることが好ましい。誤解を避けるために、本発明の文脈では、オリゴヌクレオチドプローブの定義には、全長Ｌ１遺伝子（又はその相補体）は含まれない。
【００３５】
本発明の文脈では、ポリヌクレオチドに用いる場合の用語「単離された」は、ポリヌクレオチドがその天然の遺伝子環境から取り出されており、したがって、他の外来の又は好ましくないコード配列を含まないことを意味する。
【００３６】
プローブは、従来のソフトウェアを使用して、所望のパラメータの選択に基づいて標的遺伝子配列に結合するように設計されている。結合条件は、高レベルの特異性が提供される、すなわち、結合が「厳密な条件」の下で起きるようなものであることが好ましい。一般に、厳密な条件は、限定されたイオン強度及びｐＨで特定の配列の熱融点（Ｔｍ）より約５℃低くなるように選択される。Ｔｍとは、標的配列の５０％が、完全に適合するプローブに結合する温度（限定されたイオン強度及びｐＨの下で）である。この点に関して、ｐＨ７、約０．０２Ｍ以下の塩濃度で、本発明のプローブのＴｍは、好ましくは４０℃より上で且つ好ましくは７０℃未満、さらに好ましくは約５３℃である。予混合結合溶液が入手可能であり（例えば、CLONTECH Laboratories社製のEXPRESSHYB Hybridisation Solution）、結合は製造元の使用説明書に従って実施することができる。代わりに、当業者であれば、これらの結合条件を変化させたものを考案することができる。
【００３７】
結合に続いて、厳密な（好ましくは高度に厳密な）条件下で洗浄すれば、非結合核酸分子は除去される。典型的な厳密な洗浄条件には、５５〜６５℃で０．１％ＳＤＳを含む０．５〜２×ＳＳＣ溶液中で洗浄することが挙げられる。典型的な高度に厳密な洗浄条件には、５５〜６５℃で０．１％ＳＤＳを含む０．１〜０．２×ＳＳＣ溶液中で洗浄することが挙げられる。当業者であれば、例えば、洗浄溶液中でＳＳＣに代わってＳＳＰＥを使用することにより、容易に同等の条件を考案することができる。
【００３８】
ハイブリダイゼーション特異性は、ハイブリダイゼーション条件の厳密さ以外に、全体的配列類似性、不適合塩基の分布及び位置、並びにプローブと標的配列により形成されるＤＮＡ二重鎖の自由エネルギーの量を含む種々のプローブ設計要素に影響されることがある。
【００３９】
自己相補性及びダイマー形成（プローブとプローブの結合）を最小限に抑えるプローブをスクリーニングするのが好ましい。本発明の好ましいプローブは、ヒトＤＮＡとの最小限の相同性を有するように選択される。選択過程は、候補プローブ配列をヒトＤＮＡと比較し、相同性が５０％よりも大きい場合はそのプローブを退けることを含んでいてよい。この選択過程の目的は、プローブと汚染（contaminating）ヒトＤＮＡ配列とのアニーリングを減らし、したがって、前記アッセイ特異性の向上を可能にすることである。
【００４０】
一態様では、オリゴヌクレオチドプローブは、１〜４０ヌクレオチド長である。好ましくは、プローブは少なくとも１０ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも１５、最も好ましくは少なくとも２０ヌクレオチド長であり、好ましくはプローブは最大３５ヌクレオチド長、さらに好ましくは最大３０ヌクレオチド長、最も好ましくは最大２６ヌクレオチド長である。したがって、一態様では、プローブは２０〜２６ヌクレオチド長である。短いプローブを使用するのが有利である。なぜなら、これにより標的ヒトパピローマウイルス核酸へのより迅速なアニーリングが可能になるからである。
【００４１】
核酸配列の「相補体」は、相補的塩基対合を介して前記核酸配列に結合する。非コード（アンチセンス）核酸鎖もまた、それが相補的塩基対合を介してコード（センス）鎖に結合するために、「相補鎖」として知られている。
【００４２】
したがって、一態様では、プローブは、標的ヒトパピローマウイルス核酸のコード（センス）鎖内の標的配列に結合する。代わりに、別の態様では、プローブは標的ヒトパピローマウイルス核酸の相補的、非コード（アンチセンス）鎖内の標的配列に結合する。
【００４３】
プローブが結合する標的部位は、約１〜４０ヌクレオチド長、好ましくは約１５〜３０ヌクレオチド長、最も好ましくは約２０〜２６ヌクレオチド長でよい。
【００４４】
プローブが結合する標的部位は、ヒトパピローマウイルスＬ１遺伝子内、又はその相補体内に位置している。一態様では、プローブが結合する標的部位は、標的部位を含むヒトパピローマウイルスＬ１遺伝子（又はその相補体）の一部の増幅により作製されるアンプリコン内に位置している。プローブが結合すると、試料にヒトパピローマウイルス核酸が含有されることが示される。
【００４５】
プローブは好ましくは、既知のヒトパピローマウイルス遺伝子型特異的多型を含む標的部位に結合する、すなわち、標的配列はヒトパピローマウイルスの特定の遺伝子型に特有の核酸配列を含む。プローブの結合により、試料に既知の遺伝子型特異的多型を含むヒトパピローマウイルス核酸が含有されることが示され、試料中のヒトパピローマウイルス遺伝子型の同定が可能になる。
【００４６】
この点に関して、異なるヒトパピローマウイルス遺伝子型のＬ１遺伝子間には著しい異質性が存在する。
【００４７】
したがって、一態様では、プローブは遺伝子型特異的プローブである。好ましくは、遺伝子特異的多型は、ＨＰＶの「低リスク」遺伝子型（例えば、遺伝子型６又は１１）又はＨＰＶの「高リスク」遺伝子型（例えば、遺伝子型１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５３、５６、５８、５９、６６、６８、６９、７３及び８２）に関連している。
【００４８】
この点に関して、下の表１に示される遺伝子型特異的プローブ配列番号１５〜３４から選択される１又は複数のプローブを使用して良好な結果が得られている。
【００４９】
【表２】
0005898831.tif 000003
【００５０】
しかし、上記のプローブ配列とは１又は複数のヌクレオチド異なる変異体が用いられてもよいことが認識されるであろう。この点に関して、保存的置換体が好ましい。
【００５１】
したがって、一態様では、プローブは、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３及び配列番号３４から選択される核酸配列と少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％及び最も好ましくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【００５２】
一態様では、プローブは、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３及び配列番号３４から選択される核酸配列と少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％及び最も好ましくは１００％の配列同一性を有する核酸配列からなる。
【００５３】
変異プローブ配列を定義するための別の手段は、変異配列と特定のプローブ配列間で異なるヌクレオチドの数を定義することによる。この点に関して、本発明は、配列番号１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３又は３４とは、５ヌクレオチド位置のみで、好ましくは４、３若しくは２ヌクレオチド位置のみで、最も好ましくは１ヌクレオチド位置のみで異なる変異プローブ配列を包含する。
【００５４】
一態様では、ヒトパピローマウイルス核酸と前記プローブの結合を検出する前に、全ての非結合ヒトパピローマウイルス核酸を、結合ヒトパピローマウイルス核酸から分離する。非結合ヒトパピローマウイルス核酸は、好ましくは、厳密（好ましくは高度に厳密）な条件下で洗浄により除去される。
【００５５】
一態様では、プローブは担体又はプラットホーム上に固定化されてもよい。プローブを固定化すると、プローブに物理的位置が与えられ、プローブを所望の位置に固定する及び／又はプローブの回収若しくは分離を促進するのに役立つ可能性がある。
【００５６】
担体は、例えば、ガラス若しくはプラスチックで作製された強固な固体担体でもよく、又は担体は、ナイロン若しくはニトロセルロース膜などの膜でもよい。三次元マトリックス、例えば、ポリアクリルアミド又はＰＥＧゲルは、本発明での使用に適した担体である。
【００５７】
一実施形態では、担体は、１又は複数のビーズ又はマイクロスフェアの形、例えば、液体ビーズマイクロアレイの形でもよい。適切なビーズ又はマイクロスフェアは市販されている（例えば、Luminex社製、オースティン、テキサス州）。ビーズの表面は、ＤＮＡの結合のためにカルボキシル化されていてよい。ビーズ又はマイクロスフェアは、一意的に同定され、それにより、その独自の特徴に従って（例えば、ビーズサイズ若しくはビーズ色、又は独自の標識により）ソーティングすることが可能になる。一態様では、ビーズ／マイクロスフェアはフルオロフォア（例えば、赤色及び／又は赤外フルオロフォア）で内部的に染色されており、その異なる蛍光強度により互いに識別することができる。
【００５８】
プローブは、種々の手段により担体／プラットホームに固定化してよい。一例として、プローブは、ＵＶ架橋結合によりナイロン膜などの担体上に固定化してもよい。ビオチン標識プローブをストレプトアビジン被膜基質に結合させてもよく、アミノリンカーで調製したプローブをシラン処理表面に固定化してもよい。
【００５９】
プローブを固定化する別の手段は、例えば、３’又は５’末端のポリＴテイル又はポリＣテイルを介してである。ポリＴテイルは典型的には、ターミナルトランスフェラーゼと共にプローブ（典型的には３’末端で）に付加される一続きの１〜１００チミン残基からなる。好ましくは、１〜２０チミン残基が付加される。ポリＣテイルは典型的にはＣ６、Ｃ１２又はユニリンカー（典型的にはプローブの５’末端で付加される）である。適切なユニリンカーは市販されている（例えば、Operon Technilogies社製）。ポリＴ又はポリＣテイルは典型的には、固体基質上にベーキングされるか、又はＵＶ架橋結合される。
【００６０】
ポリＴ又はポリＣテイルの付加は、２つの機能を有するように思われる。第１に、テイルは固体担体上へ固定化されるプローブの量を増加させる。第２に、テイルは標的核酸へのプローブの到達性を決定し、ハイブリダイゼーションの効率を改善するような形でプローブを同調させる。
【００６１】
ヒトパピローマウイルスＬ１遺伝子又はその相補体内の（又はＬ１遺伝子若しくは相補体由来のアンプリコン内の）標的部位へのプローブの結合は、既知の手段により検出される。一例として、標的部位にプローブが結合すれば、検出可能シグナルを生じる場合がある。検出可能シグナルは、例えば、放射性シグナルでもよく、蛍光の変化などの蛍光シグナルでもよい。
【００６２】
一態様では、プローブはレポーター分子などの標識で標識されており、アッセイは標識を検出し、標識の存在とヒトパピローマウイルス核酸の存在を相互に関連付けることを含む。
【００６３】
別の実施形態では、標的ヒトパピローマウイルス核酸（例えば、アンプリコン）は標識を含み、アッセイは前記標識を検出し、標識の存在とヒトパピローマウイルス核酸の存在を相互に関連付けることを含む。前記標識は、試料をプローブと接触させる前に、ヒトパピローマウイルス核酸に存在していてもよい。一例として、前記標識は、増幅ステップ中にヒトパピローマウイルス核酸に組み込まれてもよい。
【００６４】
標識は、放射標識又は蛍光分子などの検出可能な標識を含んでいてよい。一例として、標識は、ジゴキシゲニン、フルオレセインイソチオシアネート（fluorescein-isothiocyanate、ＦＩＴＣ）又はＲ−フィコエリトリンでもよい。標識は、写真用又はＸ線用フィルムへの曝露によるなどの、直接検出されるレポーター分子でもよい。代わりに、標識は、直接的に検出可能ではないが、間接的に、例えば、二相システムで検出されてもよい。間接的標識検出の例は、標識への坑体の結合である。
【００６５】
一態様では、方法は、前記ヒトパピローマウイルス核酸（例えば、アンプリコン）を、検出可能な分子を含み、前記ヒトパピローマウイルス核酸に結合するレポーター構築物と接触させることを含む。ヒトパピローマウイルス核酸をレポーター構築物と接触させることは、ヒトパピローマウイルス核酸をプローブと接触させる前、後又はそれと同時に実施される。レポーター構築物の検出可能な分子成分は、蛍光分子（Ｒ−フィコエリトリンなどの）でもよく、検出可能なシグナルを生じる酵素でもよい。
【００６６】
前記レポーター構築物とヒトパピローマウイルス核酸（例えば、アンプリコン）の結合は、いかなる既知の手段によって実現してもよい。一例として、レポーター構築物は、ヒトパピローマウイルス核酸とハイブリダイズする検出可能的に標識されたオリゴヌクレオチドを含んでいてよい。代わりに、ヒトパピローマウイルス核酸は、第１の結合分子で標識されていてよく、前記レポーター構築物は、第１の結合分子に結合する第２の結合分子を含んでいてよい。
【００６７】
結合分子の例には、ビオチン及びストレプトアビジンが挙げられる。したがって、第１の結合分子がビオチンであり、第２の結合分子がストレプトアビジンであること（又はその逆であること）は選択可能なことである。結合分子の他の例示的な対には、レポーター／リガンド対及び抗体／抗原（又はハプテン又はエピトープ）対が挙げられる。
【００６８】
一態様では、検出可能なシグナルの強度を測定すれば、試料中のＨＰＶ核酸の量、又は試料中の異なるＨＰＶ遺伝子型の量（若しくは相対量）の定量化が可能になる。
【００６９】
一態様では、方法は、試料を、ヒトパピローマウイルスＬ１遺伝子又はその相補体内の（又はアンプリコン内の）標的部位に結合し、それぞれが異なる核酸配列を含む複数の（すなわち、少なくとも２つの）異なるオリゴヌクレオチドプローブと接触させること、及び前記プローブと前記標的部位の結合を検出することを含む。
【００７０】
一態様では、方法は、前記試料を前記異なるプローブの少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０と接触させることを含む。
【００７１】
本発明のこの態様では、複数の（すなわち、少なくとも２つの）異なる遺伝子型特異的ＨＰＶ核酸標的配列を同時に検出することにより、単回反応で複数の（すなわち、少なくとも２つの）異なるＨＰＶ遺伝子型の同時検出が可能になる。
【００７２】
したがって、一態様では、前記方法は、試料を複数の異なる遺伝子型特異的プローブと接触させることにより、例えば、混合感染中に存在することがある広い範囲のＨＰＶ遺伝子型の同時検出を可能にすることを含む。
【００７３】
一態様では、前記プローブのそれぞれは、（ａ）配列番号１５と少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有する核酸配列；（ｂ）配列番号１６と少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有する核酸配列；（ｃ）配列番号１７と少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有する核酸配列；（ｄ）配列番号１８と少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有する核酸配列；（ｅ）配列番号１９と少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有する核酸配列；（ｆ）配列番号２０と少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有する核酸配列；（ｇ）配列番号２１と少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有する核酸配列；（ｈ）配列番号２２と少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有する核酸配列；（ｉ）配列番号２３と少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有する核酸配列；（ｊ）配列番号２４と少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有する核酸配列；（ｋ）配列番号２５と少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有する核酸配列；（ｌ）配列番号２６と少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有する核酸配列；（ｍ）配列番号２７と少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有する核酸配列；（ｎ）配列番号２８と少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有する核酸配列；（ｏ）配列番号２９と少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有する核酸配列；（ｐ）配列番号３０と少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有する核酸配列；（ｑ）配列番号３１と少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有する核酸配列；（ｒ）配列番号３２と少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有する核酸配列；（ｓ）配列番号３３と少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有する核酸配列；（ｔ）配列番号３４と少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有する核酸配列からなる群から選択される異なる核酸配列を含む。
【００７４】
好ましくは、前記方法は、プローブのそれぞれが、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、及び配列番号１８（又はそれと少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する配列）から選択される異なる核酸配列を含む少なくとも４つの異なるプローブを用いる。上記の表１に示されるように、これらのプローブにより、最も一般的なＨＰＶ遺伝子型、すなわち、それぞれＨＰＶ−６及びＨＰＶ−１１（低リスク）、並びにＨＰＶ−１６及びＨＰＶ−１８（高リスク）の検出が可能になる。
【００７５】
したがって、一態様では、本発明では単一試料中の複数のＨＰＶ遺伝子型を同時に遺伝子型分類することが可能になる。
【００７６】
１つの遺伝子型特異的プローブ（例えば、配列番号１５）と標的ヒトパピローマウイルス核酸の結合を、異なる遺伝子型特異的プローブ（例えば、配列番号１６）と標的ヒトパピローマウイルス核酸の結合と区別することができるのが好ましい。これにより、複数のハイブリダイゼーション反応を同一反応容器で同時に実施することが可能になり、試料中に存在するＨＰＶ遺伝子型の区別が促進される。
【００７７】
したがって、一態様では、各異なる遺伝子型特異的プローブは、異なる固体担体又はプラットホーム上に、好ましくは異なるビーズ又はマイクロスフェア（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０の異なるビーズ／マイクロスフェア）上に固定化される。好ましくは、前記異なる固体担体又はプラットホームは一意的に同定可能である。
【００７８】
一例として、異なる担体（例えば、ビーズ／マイクロスフェア）は、サイズ若しくは色が異なっていてもよく、又は独自の標識を含んでいてもよい。一態様では、異なる担体（例えば、ビーズ／マイクロスフェア）は、異なる色素で又は異なる蛍光強度の色素で、内部的に染めるなどして、染色される。一例として、上記のように、異なる市販のマイクロスフェアは、異なる強度の赤色及び／又は赤外フルオロフォアで内部的に染めてもよく、それにより、その蛍光強度によって互いに識別可能である。
【００７９】
固定化プローブを標的ヒトパピローマウイルス核酸（例えば、アンプリコン）とハイブリダイズさせることにより、複数の一意的に同定可能な標的核酸−プローブ−固体担体ハイブリッドが生成される。
【００８０】
一態様では、固定化プローブとヒトパピローマウイルス核酸中のその標的部位との結合に続いて、前記方法は、その一意的同定により担体（例えば、ビーズ／マイクロスフェア）を識別することをさらに含む。
【００８１】
一態様では、本方法は、Luminex液体ビーズマイクロアレイフローサイトメトリー技術を利用する。この技術の使用にあたって、ビーズ／マイクロスフェアに検出チャンバーを通過させる前に、ビーズ／マイクロスフェア（その結合した遺伝子型特異的プローブ及びハイブリダイズした標的核酸を有する）をLuminex100（商標）機器中で単一ファイルに整列させる。レーザーがマイクロスフェア内部の赤色及び赤外色素を照射し、それによりマイクロスフェアの分類が可能になる（したがって、結合した核酸が属する遺伝子型の同定が可能になる）。
【００８２】
各分類（category）のマイクロスフェアに結合している標的核酸の量（すなわち、各遺伝子型の量）は、結合した核酸に会合している標識の量を検出することにより、定量してもよい。一態様では、会合した標識は蛍光分子（例えば、Ｒ−フィコエリチン）であり、前記分子はLuminex100（商標）機器中でレーザーにより励起される。色シグナルはリアルタイムで捕獲され、標識（例えば、Ｒ−フィコエリチン）の蛍光強度を使用して、各セットのマイクロスフェアに結合している標的核酸分子の量を測定する。
【００８３】
したがって、一態様では、Luminex技術を使用すると、試料中の異なるＨＰＶ遺伝子型の定量が可能になる。
【００８４】
一態様では、前記方法は、ヒトパピローマウイルス核酸を前記オリゴヌクレオチドプローブと接触させる前に、ヒトパピローマウイルスＬ１遺伝子又はその相補体の一部を増幅することによりアンプリコンを作製するステップをさらに含む。
【００８５】
試料が小さい及び／又はＤＮＡ配列の不均一な収集物を含む場合には、標的ヒトパピローマウイルス核酸を増幅するのが望ましいこともある。
【００８６】
増幅は、当技術分野では公知の方法により実施してよく、好ましくはＰＣＲにより実施される。当業者であれば、核酸配列の増幅を促進するのに適した条件を決定することができるであろう。
【００８７】
したがって、一態様では、増幅は、プライマーが相補的塩基対合によりヒトパピローマウイルスＬ１遺伝子又はその相補体中の標的部位に結合する、一対の配列特異的プライマーを使用して実施される。適切なＤＮＡポリメラーゼ及びＤＮＡ前駆体（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ）の存在の下で、プライマーは伸長され、それにより、標的核酸の個々の鎖に相補的な新しい核酸鎖の合成を開始する。プライマーはそれによりヒトパピローマウイルスＬ１遺伝子又はその相補体の一部の増幅を推進し、それによりアンプリコンを作製する。このアンプリコンはプローブが結合する標的配列を含む。
【００８８】
誤解を避けるために、本発明の文脈では、オリゴヌクレオチドプライマーの定義は、全長Ｌ１遺伝子（又はその相補体）を含まない。
【００８９】
プライマー対はフォワードオリゴヌクレオチドプライマー及びリバースオリゴヌクレオチドプライマーを含む。フォワードプライマーは標的核酸の相補的非コード（アンチセンス）鎖に結合するプライマーであり、リバースプライマーは標的核酸の対応するコード（センス）鎖に結合するプライマーである。
【００９０】
本発明のプライマーは、Primer Express（Applied Biosystems社製）などの従来のソフトウェアを使用して、所望のパラメータの選択に基づいて標的遺伝子配列に結合するよう設計されている。この点に関して、結合条件は高レベルの特異性が与えられるような条件であることが好ましい。プライマーの溶融温度（Ｔｍ）は、好ましくは５０℃を超え、最も好ましいのは約６０℃である。本発明のプライマーは、好ましくは標的ヒトパピローマウイルス核酸に結合するが、好ましくは、自己相補性及びダイマー形成（プライマー−プライマー結合）を最小限に抑えるようにスクリーニングされる。
【００９１】
前記フォワードオリゴヌクレオチドプライマー及びリバースオリゴヌクレオチドプライマーは典型的には１〜４０ヌクレオチド長である。短いプライマーを使用するのが有利である。なぜならば、これにより標的核酸へのより迅速なアニーリングが可能になるからである。
【００９２】
好ましくは、フォワードプライマーは少なくとも１０ヌクレオチド長であり、さらに好ましくは少なくとも１５ヌクレオチド長、さらに好ましくは少なくとも１８ヌクレオチド長、最も好ましくは少なくとも２０ヌクレオチド長であり、フォワードプライマーは好ましくは最大３５ヌクレオチド長、さらに好ましくは最大３０ヌクレオチド長、さらに好ましくは最大２８ヌクレオチド長、最も好ましくは最大２５ヌクレオチド長である。一実施形態では、フォワードプライマーは約２０〜２１ヌクレオチド長である。
【００９３】
好ましくは、リバースプライマーは少なくとも１０ヌクレオチド長であり、さらに好ましくは少なくとも１５ヌクレオチド長、さらに好ましくは少なくとも２０ヌクレオチド長、最も好ましくは少なくとも２５ヌクレオチド長であり、リバースプライマーは好ましくは最大３５ヌクレオチド長、さらに好ましくは最大３０ヌクレオチド長、最も好ましくは最大２８ヌクレオチド長である。一実施形態では、リバースプライマーは約２６ヌクレオチド長である。
【００９４】
アンプリコンは、好ましくは１５０〜２５０ヌクレオチド長の範囲にあり、好ましくは１６５〜２２５ヌクレオチド長の範囲にあり、好ましくは１７５〜２００ヌクレオチド長の範囲にあり、最も好ましくは１８０〜１９５ヌクレオチド長の範囲にある。一実施形態では、アンプリコンは約１８２〜１９１ヌクレオチド長である。
【００９５】
下の表２に示すように、アンプリコン長は、異なるヒトパピローマウイルス遺伝子型間で異なるであろう。
【００９６】
【表３】
0005898831.tif 000004
【００９７】
フォワードプライマーはヒトパピローマウイルスＬ１遺伝子の相補体内の標的部位に結合する。下の表３に示すように、フォワードプライマーの結合部位は配列番号１の配列を含む。一態様では、フォワードプライマーの結合部位は配列番号１の配列を含む。
【００９８】
リバースプライマーはヒトパピローマウイルスＬ１遺伝子内の標的部位に結合する。下の表３に示すように、リバースプライマーの結合部位は配列番号２の配列を含む。一態様では、リバースプライマーの結合部位は配列番号２の配列からなる。
【００９９】
【表４】
0005898831.tif 000005
【０１００】
この点に関して、配列番号１及び２はコンセンサス配列であることは明らかとなり、Ｈ＝Ａ、Ｃ、又はＴ；Ｎ＝Ａ、Ｔ、Ｃ、又はＧ；Ｗ＝Ａ又はＴ；Ｙ＝Ｔ又はＣ；Ｒ＝Ａ又はＧ；Ｄ＝Ａ、Ｔ、又はＧ；Ｂ＝Ｃ、Ｔ、又はＧ；及びＶ＝Ｇ、Ｃ、又はＡである。
【０１０１】
一態様では、下の表４に示すように、フォワードプライマーは、配列番号３の配列を有する核酸配列を含む。一態様では、フォワードプライマーは、配列番号３の配列を有する核酸配列からなる。
【０１０２】
一態様では、下の表４に示すように、リバースプライマーは、配列番号９の配列を有する核酸配列を含む。一態様では、リバースプライマーは、配列番号９の配列を有する核酸配列からなる。
【０１０３】
【表５】
0005898831.tif 000006
【０１０４】
この点に関して、配列番号３及び９はコンセンサス配列であることは明らかとなり、Ｈ＝Ａ、Ｃ、又はＴ；Ｎ＝Ａ、Ｔ、Ｃ、又はＧ；Ｗ＝Ａ又はＴ；Ｙ＝Ｔ又はＣ；Ｒ＝Ａ又はＧ、及びＤ＝Ａ、Ｔ、又はＧである。
【０１０５】
特に、下の表５に示すように、配列番号４、５、６、７又は８のフォワードプライマーを使用して良好な結果が得られている。
【０１０６】
【表６】
0005898831.tif 000007
【０１０７】
この点に関して、配列番号４〜７はコンセンサス配列であることは明らかとなり、Ｈ＝Ａ、Ｃ、又はＴ；Ｎ＝Ａ、Ｔ、Ｃ、又はＧ；Ｍ＝Ａ又はＣ；Ｙ＝Ｔ又はＣ、及びＲ＝Ａ又はＧである。
【０１０８】
特に、下の表６に示すように、配列番号１０、１１、１２、１３又は１４のリバースプライマーを使用しても良好な結果が得られている。
【０１０９】
【表７】
0005898831.tif 000008
【０１１０】
この点に関して、配列番号１０〜１４はコンセンサス配列であることは明らかとなり、Ｋ＝Ｇ又はＴ；Ｍ＝Ａ又はＣ；Ｗ＝Ａ又はＴ；Ｙ＝Ｔ又はＣ及びＲ＝Ａ又はＧである。
【０１１１】
上記のフォワードプライマー配列とは１又は複数のヌクレオチドが異なる変異体を用いてもよいことは認識されるであろう。この点に関して、保存的置換体が好ましい。
【０１１２】
したがって、一態様では、フォワードプライマーは、配列番号４、５、６、７又は８の核酸配列と少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０１１３】
したがって、一態様では、リバースプライマーは、配列番号１０、１１、１２、１３又は１４の核酸配列と少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０１１４】
好ましくは、フォワードプライマーは、配列番号４、５、６、７又は８の核酸配列と少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有する核酸配列からなる。
【０１１５】
好ましくは、リバースプライマーは、配列番号１０、１１、１２、１３又は１４の核酸配列と少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有する核酸配列からなる。
【０１１６】
変異プライマー配列を定義するための別の手段は、変異配列と特定のプライマー配列間で異なるヌクレオチドの数を定義することによる。したがって、一態様では、変異プライマー配列と配列番号４、５、６、７、８、１０、１１、１２、１３又は１４との相違は、３ヌクレオチド位置のみ、好ましくは２ヌクレオチド位置のみ、最も好ましくは１ヌクレオチド位置のみである。
【０１１７】
一態様では、ヒトパピローマウイルス核酸を増幅するステップは、標識をアンプリコンに組み込むことを含む。
【０１１８】
この点に関して、必要に応じ、プライマーのうちの少なくとも１つ（好ましくはリバースプライマー）が標識を含む（例えば、プライマーの５’末端に）ことができ、増幅が進行するときに、そうして得られるアンプリコンはこの標識を取り込むことになる。標識により、アンプリコンを検出し、必要に応じて定量が可能になる。
【０１１９】
この点に関して、標識は、蛍光分子（例えば、Ｒ−フィコエリトリン）などの検出可能な分子を含んでいてよい。代わりに、標識は、ビオチンなどの結合分子を含んでいてよく、その場合、前記方法は、前記第１の結合分子を、第１の結合分子に結合する第２の結合分子を含み、蛍光分子などの検出可能な分子を含むレポーター構築物と接触させることをさらに含んでいてよい。
【０１２０】
一態様では、検出方法は、前記試料を、ヒトパピローマウイルスＬ１遺伝子又はその相補体中の標的部位に結合する複数の（すなわち、少なくとも２つの）異なるフォワードプライマー及び複数の（すなわち、少なくとも２つの）異なるリバースプライマーと接触させることを含む。この点に関して、フォワードプライマーは、異なる核酸配列を含んでいるために互いに異なる。同様に、リバースプライマーは、異なる核酸配列を含んでいるために互いに異なる。
【０１２１】
一態様では、前記異なるフォワードプライマーのそれぞれは、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８から選択される異なる核酸配列（又はそれと少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９７％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有する配列）を含み、前記異なるリバースプライマーのそれぞれは、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３又は配列番号１４から選択される異なる核酸配列（又はそれと８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９７％の配列同一性を有する配列）を含む。
【０１２２】
一態様では、配列番号４（又はそれと８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９７％の配列同一性を有する配列）を含むフォワードプライマーは、配列番号１０、１１又は１４から選択される核酸配列（又はそれと８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９７％の配列同一性を有する配列）を含むリバースプライマーと組み合わせて使用され、配列番号１７、１９、２４又は３３から選択される核酸配列（又はそれと８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する配列）を含む１又は複数の異なるプローブと組み合わせて使用されてもよい。
【０１２３】
一態様では、配列番号５（又はそれと８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９７％の配列同一性を有する配列）を含むフォワードプライマーは、配列番号１０、１１又は１３から選択される核酸配列（又はそれと８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９７％の配列同一性を有する配列）を含むリバースプライマーと組み合わせて使用され、配列番号１５、１６、１８、２３又は２６から選択される核酸配列（又はそれと８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する配列）を含む１又は複数の異なるプローブと組み合わせて使用されてもよい。
【０１２４】
一態様では、配列番号６（又はそれと８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９７％の配列同一性を有する配列）を含むフォワードプライマーは、配列番号１１又は１２から選択される核酸配列（又はそれと８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９７％の配列同一性を有する配列）を含むリバースプライマーと組み合わせて使用され、配列番号２２又は２８から選択される核酸配列（又はそれと８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する配列）を含む１又は複数の異なるプローブと組み合わせて使用されてもよい。
【０１２５】
一態様では、配列番号７（又はそれと８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９７％の配列同一性を有する配列）を含むフォワードプライマーは、配列番号１０、１２又は１３から選択される核酸配列（又はそれと８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９７％の配列同一性を有する配列）を含むリバースプライマーと組み合わせて使用され、配列番号２０、２１又は３４から選択される核酸配列（又はそれと８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する配列）を含む１又は複数の異なるプローブと組み合わせて使用されてもよい。
【０１２６】
一態様では、配列番号８（又はそれと８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９７％の配列同一性を有する配列）を含むフォワードプライマーは、配列番号１４（又はそれと８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９７％の配列同一性を有する配列）を含むリバースプライマーと組み合わせて使用され、配列番号２７（又はそれと８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する配列）を含むプローブと組み合わせて使用されてもよい。
【０１２７】
同様に、一態様では、配列番号１０（又はそれと８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９７％の配列同一性を有する配列）を含むリバースプライマーは、配列番号４、５又は７から選択される核酸配列（又はそれと８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９７％の配列同一性を有する配列）を含むフォワードプライマーと組み合わせて使用され、配列番号１７、１８、２１又は２３から選択される核酸配列（又はそれと８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する配列）を含む１又は複数の異なるプローブと組み合わせて使用されてもよい。
【０１２８】
一態様では、配列番号１１（又はそれと８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９７％の配列同一性を有する配列）を含むリバースプライマーは、配列番号４、５又は６から選択される核酸配列（又はそれと８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９７％の配列同一性を有する配列）を含むフォワードプライマーと組み合わせて使用され、配列番号１５、２２又は２４から選択される核酸配列（又はそれと８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する配列）を含む１又は複数の異なるプローブと組み合わせて使用されてもよい。
【０１２９】
一態様では、配列番号１２（又はそれと８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９７％の配列同一性を有する配列）を含むリバースプライマーは、配列番号６又は７から選択される核酸配列（又はそれと８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９７％の配列同一性を有する配列）を含むフォワードプライマーと組み合わせて使用され、配列番号２０又は２８から選択される核酸配列（又はそれと８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する配列）を含む１又は複数の異なるプローブと組み合わせて使用されてもよい。
【０１３０】
一態様では、配列番号１３（又はそれと８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９７％の配列同一性を有する配列）を含むリバースプライマーは、配列番号５又は７から選択される核酸配列（又はそれと８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９７％の配列同一性を有する配列）を含むフォワードプライマーと組み合わせて使用され、配列番号２６又は３４から選択される核酸配列（又はそれと８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する配列）を含む１又は複数の異なるプローブと組み合わせて使用されてもよい。
【０１３１】
一態様では、配列番号１４（又はそれと８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９７％の配列同一性を有する配列）を含むリバースプライマーは、配列番号４又は８から選択される核酸配列（又はそれと８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９７％の配列同一性を有する配列）を含むフォワードプライマーと組み合わせて使用され、配列番号１９、２７又は３３から選択される核酸配列（又はそれと８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する配列）を含む１又は複数の異なるプローブと組み合わせて使用されてもよい。
【０１３２】
上記のように、本発明により、判定されるべき病原体負荷の定量的評価が可能になる。ＨＰＶ負荷を判定することは、臨床指導のため及び治療を決定するため、患者管理のため及びワクチン有効性を評価するためなどの、多数の有用な用途を有する。
【０１３３】
したがって、一態様では、本発明は、対象の試料中のヒトパピローマウイルス病原体負荷を定量するインビトロ方法であって、（ａ）前記対象の試料に対して本発明による検出方法を実施すること、及び（ｂ）所定の既知ヒトパピローマウイルス病原体負荷の試験試料に対して前記方法を実施すること、及び（ｃ）対象の試料から検出されるシグナルを試験試料から検出されるシグナルと比較することを含み、それにより対象の試料中のヒトパピローマウイルス病原体負荷を定量する、方法を提供する。
【０１３４】
別の態様では、本発明は、ある期間にわたる治療経過、例えばワクチン療法などの薬物療法の経過の有効性を判定するのに有用である。
【０１３５】
したがって、一態様では、本発明は、薬物療法の期間の経過にわたって薬物の有効性を判定するインビトロ方法であって、（ａ）薬物療法の期間内の又は先立つ最初の時点で得られる最初の試料に対して本発明による検出方法を実施すること、（ｂ）薬物療法の期間内の又は後の１又は複数の後の時点で得られる１又は複数の試料に対して前記方法を実施すること、及び（ｃ）最初の試料から検出されるシグナルを、１又は複数の後期試料から検出されるシグナルと比較することを含み、それにより薬物療法の期間の経過にわたって薬物の有効性を判定する、方法を提供する。
【０１３６】
別の態様では、本発明は、ヒトパピローマウイルスに対するワクチンの有効性を判定するのに有用である。したがって、一態様では、本発明は、ヒトパピローマウイルスに対するワクチンの有効性を判定するインビトロ方法であって、（ａ）ワクチン接種の前の最初の時点で患者から得られる最初の試料に対して本発明による検出方法を実施すること、（ｂ）ヒトパピローマウイルスでのチャレンジの後の１又は複数の後の時点で前記患者から得られる試料に対して前記方法を実施すること、及び（ｃ）最初の試料から得られる結果を、１又は複数の後期試料から得られる結果と比較することを含み、それによりワクチン有効性を判定する、方法を提供する。
【０１３７】
別の態様では、本発明は、試料中のヒトパピローマウイルスの遺伝子型を分類するインビトロ方法であって、（ａ）１又は複数の遺伝子型特異的プローブを使用して試料に対して本発明による方法を実施すること、及び（ｂ）ヒトパピローマウイルス核酸に結合しているプローブ又は複数のプローブを同定することを含む、方法を提供する。
【０１３８】
本発明は、本発明の上記の方法において使用するための試薬も提供する。
【０１３９】
したがって、一態様では、本発明は、本発明に従って使用するための上記のプローブを提供する。
【０１４０】
一態様では、本発明は、本発明に従って使用するための上記のプローブのセットを提供する。
【０１４１】
一態様では、本発明は、本発明に従って使用するための上記のフォワードプライマーを提供する。別の態様では、本発明は、本発明に従って使用するための上記のリバースプライマーを提供する。別の態様では、本発明は、本発明による方法で使用するための上記のフォワードプライマー及びリバースプライマーを含むプライマーセットを提供する。
【０１４２】
本発明により、上記のプローブ又はプローブのセットを含む、試料中のヒトパピローマウイルス核酸を検出するためのキットも提供される。キットには上記のフォワードプライマーが含まれていてもよい。キットには上記のリバースプライマーが含まれていてもよい。キットには（上記のフォワードプライマー及びリバースプライマーを含む）プライマーセットが含まれていてもよい。
【図面の簡単な説明】
【０１４３】
【図１】既知のRoche Lineblotアッセイと比較した場合の、本発明の一態様（「高リスク」遺伝子型のみ）に従ったＨＰＶ遺伝子型同定アッセイを使用して生み出されるデータを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０１４４】
本発明は以下の実施例によりさらに詳細に議論される。
［実施例］
【実施例１】
【０１４５】
ＨＰＶ遺伝子型同定アッセイ
オリゴヌクレオチドのLuminexマイクロスフェアへのコンジュゲーション
冷蔵庫から試薬（０．１％ＳＤＳ、Tween 20及び０．１Ｍ  ＭＥＳ）を取り出し、室温に適合させる。チューブ上の「ｎｍｏｌ」濃度に等しい容量の製薬純水を添加することにより凍結乾燥したプローブを再懸濁し、１ｍＭの保存濃度を与える。ビーズセットを選択し、ペレットを分散させ、超音波処理し、１分間ボルテックスする。５．０×１０６ビーズ（総量１．２５×１０７のうち）を１．５ｍｌチューブに分散させる（１ｍｌ総量のうち４００μｌに相当する）。チューブにプローブＩＤ及びLuminexビーズ領域ＩＤ、例えばＨＰＶ１６［０１］を貼ることに留意されたい。新しいプローブを試験するために、１５０μｌのビーズストックを使用し、最終再懸濁液のために３００μｌの０．１Ｍ  ＭＥＳを添加する。１０，０００ｒｐｍで１分間遠心分離にかけ、次に、ビーズを除去しないように注意して上澄みを除去する。５０μｌの０．１Ｍ  ＭＥＳを添加し、ボルテックスして、超音波処理する。
【０１４６】
０．２ｎＭのプローブ（すなわち、０．２μｌの１ｍＭ溶液）を添加し、短時間ボルテックスする。これにより、５０μｌ中８μＭのプローブ濃度が得られる。
【０１４７】
使用する直前に、１．０ｍｌ滅菌水を１０ｍｇ（０．０１ｇ）のＥＤＣパウダー（−２０℃冷凍庫で乾燥させて保存する）に添加し、溶解するまでボルテックスする。２．５μｌの新鮮なＥＤＣ溶液をマイクロスフェアに添加し、直ちにボルテックスする。暗所中室温で３０分間インキュベートする。新鮮なＥＤＣで繰り返す（総計で２回ＥＤＣ添加）。
【０１４８】
１．０ｍｌのTween 20（０．０２％ｖ／ｖ）を添加し、ボルテックスする。ビーズを１０，０００ｒｐｍで１分間微量遠心分離にかける。ペレットをかきまぜないように注意して上澄みを除去する。１．０ｍｌのＳＤＳ（０．１％ｗ／ｖ）を添加し、ボルテックスする。ビーズを１０，０００ｒｐｍで１分間微量遠心分離にかける。ペレットをかきまぜないように注意して上澄みを除去する。ビーズを８００μｌの０．１Ｍ  ＭＥＳ（ｐＨ４．５）に再懸濁する。「速読」計測チャンバーを使用してビーズを数え上げる。ボルテックスし、ビーズを１分間超音波処理する。
【０１４９】
１０μｌをチャンバーの一区域にピペットで取り、ＭＲＵ中光学顕微鏡の下に置き、格子の４隅を計測する。（全読み取りは８０と１４０ビーズの間であるのがよい）。光から保護して２〜８℃で保存する。
【０１５０】
緩衝液の調製
０．１Ｍ  ＭＥＳ：４．８８ｇのＭＥＳ（2[N-Morpholino] Ethanesulphonic acid）を２５０ｍｌのSigma水に添加し、次にほぼ５滴の５ＮのＮａＯＨを添加することによりｐＨを４．５に調整し、ろ過滅菌する。
０．０２％Tween 20：５０μｌのTween 20を２５０ｍｌのSigma水に添加し、次にろ過滅菌する。
０．１％ＳＤＳ：２．５ｍｌのＳＤＳ（ラウリル硫酸１０％溶液）を２５０ｍｌのSigma水に添加し、ろ過滅菌する。
【０１５１】
ＨＰＶＬ１遺伝子のＰＣＲ増幅
一反応用のＰＣＲマスター混合（４５μｌ）を、Qiagen Hot Start PCRキットを使用して以下の通りに作製する。
【０１５２】
【表８】
0005898831.tif 000009
【０１５３】
・試験する各試料からの５μｌＤＮＡを、数によってＰＣＲプレート又はチューブに添加する。
・ＰＣＲプレート又はチューブを、以下のサイクリングパラメータで熱循環装置にセットする：９５℃／１５分に続いて８サイクルの９５℃／３０秒、５４℃／１分及び７２℃／４５秒、確実にアニーリング温度は各サイクルで１．５℃下がるようにする。これに続いて、３５サイクルの９５℃／３０秒、４２℃／１分、７２℃／４５秒、さらに７２℃／７分の最終伸長、その後４℃で保持する。
・２％アガロースゲルを使用した電気泳動ステップを含めて、ＰＣＲアンプリコンサイズ及びバンド強度を確認してもよい。
【０１５４】
直接ＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイのためのプロトコル
１．１．５×ＴＭＡＣで複数分析物（ビーズ）溶液を用意する（添加する各ビーズセットの容積は、以前計算したμｌあたりのビーズの濃度に基づく）。
２．１２μｌ  ＴＥ緩衝液をＰＣＲプレート（Millipore社製）に、５μｌビオチン標識ＰＣＲ産物及び３３μｌのビーズ調製物を各ウェルに添加する。確実に産物とビーズ溶液が十分混ざり合うようにする。
３．プレートを以下のパラメータでプログラムされた熱循環装置に移す：９５℃／５分に続いて５３℃を１５分。サイクルが進行している間、Luminexゴールドブロックを−２０℃冷凍庫に移す。
４．プレートを熱循環装置から取り出し、冷却ブロックに移して１分間「スナップ冷凍する」。プレートをブロックから取り出し、２２５０×ｇ／３分で遠心分離し、プレートを反転させることによって液体を吸引し、ビーズを１つも失わないように注意して８０×ｇ／２０秒で穏やかに遠心分離する。ゴールドブロックを５３℃まで加熱するように設定されたBioPlex／Luminex機器に移す。
５．ストレプトアビジン−Ｒ−フィコエリトリン（Ｓ−ＰＥ）コンジュゲートを１×ＴＭＡＣで１：１０００に希釈する（ウェルの数に７５μｌを掛けることにより準備する容量を計算する）。
６．７０μｌの１：１０００希釈Ｓ−ＰＥを添加し、プレートを２０秒間振動させることによりビーズを再懸濁し、その後熱循環装置に戻して、さらに５分間５３℃でインキュべートする。
７．プレートを熱循環装置から取り出し、BioPlex／Luminex機器中の予熱されたブロックに移す。BioPlex／Luminex機器で読み取る。
【０１５５】
Bio-Plex／Luminex上での読み取りアッセイのためのプロトコル
１．確実にレーザーを使用前に予熱しておくようにする。機械にすでに３０分以上スイッチが入っている場合は、これはすでに自動的に実行されている。前もって実行されていない場合は、「始動」オプションを選択する。機械は、ＭＣＶプレートでの滅菌水及び７０％イソプロパノールの位置決めを指示する。「始動」プロセスは約４分かかる。
２．メニューからオプション「オープンプロトコル」を選択し、ファイルＨＰＶを開く。メニューから、オプション「分析物を選択する」及びアッセイにおいて試験中の分析物、すなわち１６、１８等を「添加する」を選ぶ。
３．Ｘ（＝未知）をクリックし、カーソルを試験中のウェル上にドラッグすることにより鋳型を定義する。適切な数の「Ｂ」として示される空白ウェルを含める。
４．メニュー上の「イジェクト／リトラクト」ボタンを使用してマイクロタイタープレートを挿入し、「ラン」ボタンを押す。機器は試料ごとのビーズ／プローブごとに一連の平均蛍光強度（ＭＦＩ）値を計算する。
５．機器が読み取りを終えたら、オプションを選択してデータを解析のためにエクセルファイルに移す。
【０１５６】
データ解析
１．アッセイのためのカットオフを１５００ＭＦＩに設定し、試験を繰り返すべき「グレーゾーン」は１５００と２０００ＭＦＩ間である。
２．確実に「空白」ウェル中のＭＦＩ値すべてが＜１０００であるようにする。
３．試料中に存在するいかなるＨＰＶ遺伝子型（複数可）もＭＦＩ値＞２０００ＭＦＩを与える。
【０１５７】
結果
【０１５８】
【表９】
0005898831.tif 000010
【図１】
0005898831.tif 000011
【配列表】
0005898831000001.app