(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
藍藻又はトレボウクシア藻（Trebouxiophyceae）を、一般式（Ｉ）
【化１】
0005855939.tif 000009
のセレノヒドロキシ酸化合物、或いは該化合物の塩又はエステル若しくはアミド誘導体、を含んでなる培地で培養することを特徴とする、藍藻又はトレボウクシア藻の有機セレンを濃縮するための方法であって、
上記藍藻又はトレボウクシア藻が人工的な突然変異処理を施されていない、方法。
【請求項２】
前記有機セレンの濃縮された藍藻又はトレボウクシア藻が、セレノメチオニンが濃縮されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記式（Ｉ）の化合物が：
-Ｌ−２−ヒドロキシ−４−メチルセレノブタン酸，
-Ｄ−２−ヒドロキシ−４−メチルセレノブタン酸，
-ＤＬ−２−ヒドロキシ−４−メチルセレノブタン酸，
又はこれらの化合物の塩から選択されることを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記式（Ｉ）の化合物が、カルシウム塩、亜鉛塩又はマグネシウム塩の形態であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記藍藻又はトレボウクシア藻が、トレボウクシア藻綱のクロレラ及び藍藻綱のスピルリナ（Spirulina）又はアースロスピラ（Arthrospira）で形成されるグループから選択されることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法に従って得られる、有機セレンが濃縮された藍藻又はトレボウクシア藻であって、上記有機セレンがセレノメチオニンであり、セレノメチオニンの形態での有機セレンの含有量が、乾燥重量で１０００μｇＳｅ／ｇ以上であることを特徴とし、人工的な突然変異処理が施されていない、藍藻又はトレボウクシア藻。
【請求項７】
請求項６に記載の有機セレンが濃縮された藍藻又はトレボウクシア藻であって、
該藍藻又はトレボウクシア藻のセレノメチオニンの形態でのセレンの含有量が、該藍藻又はトレボウクシア藻に存在する全セレンに対して、セレンの５０質量％以上を示すことを特徴とする、藍藻又はトレボウクシア藻。
【請求項８】
前記藍藻又はトレボウクシア藻が、全セレンに対して無機セレンを１．５質量％未満含んでなることを特徴とする、請求項６又は７に記載の有機セレンが濃縮された藍藻又はトレボウクシア藻。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法に従って得られる、有機セレンが濃縮されたトレボウクシア藻であって、上記有機セレンがセレノメチオニンであり、セレノメチオニンの形態での有機セレンの含有量が、乾燥重量で１０００μｇＳｅ／ｇ以上であり、且つ含有するセレンの全質量の５０％以上を示すことを特徴とし、人工的な突然変異処理が施されていない、トレボウクシア藻。
【請求項１０】
無機セレンの残存量が含有する全セレンに対して、２質量％未満であることを特徴とする、請求項９に記載のトレボウクシア藻。
【請求項１１】
クロレラである、請求項９又は１０に記載のトレボウクシア藻。
【請求項１２】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法に従って得られる、有機セレンが濃縮された藍藻であって、上記有機セレンがセレノメチオニンであり、セレノメチオニンの形態での有機セレンの含有量が、乾燥重量で１０００μｇＳｅ／ｇ以上であり、且つ含有するセレンの全質量の５０％以上を示すことを特徴とし、人工的な突然変異処理が施されていない、藍藻。
【請求項１３】
無機セレンの残存量が含有する全セレンに対して、２質量％未満であることを特徴とする、請求項１２に記載の藍藻。
【請求項１４】
スピルリナ（Spirulina）又はアースロスピラ（Arthrospira）属に属することを特徴とする、請求項１２又は１３に記載の藍藻。
【請求項１５】
化粧剤、医薬、又は栄養剤の製造における使用のための、請求項６〜１４のいずれか１項に記載の有機セレンが濃縮された藍藻又はトレボウクシア藻。
【請求項１６】
請求項６〜１４のいずれか１項に記載の、有機セレンが濃縮された少なくとも１つの藍藻又はトレボウクシア藻を含んでなる組成物。
【請求項１７】
化粧、医薬又は栄養組成物であることを特徴とする、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
請求項１に記載の式（Ｉ）のセレノヒドロキシ酸化合物を含んでなることを特徴とする、藍藻又はトレボウクシア藻のための培地。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特にセレノヒドロキシ酸化合物を使用した、より詳細には（Ｄ，Ｌ）形態での２−ヒドロキシ−４−メチルセレノブタン酸、或いはこの化合物のエナンチオマー、塩又はエステル若しくはアミド誘導体を使用した光合成微生物の有機セレンの濃縮（enrichment）、並びにこれによって濃縮された（enriched）光合成微生物の、動物又はヒトの栄養上、化粧品又は医薬での使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
セレンは、特にヒトや哺乳類に必須の微量栄養素である（Wendel, A.; Phosphorus, Sulfur Silicon Relat Elem., 1992, 67, 1-4, 404-415）。特に、これはＬ（+）−セレノシステイン又はＬ（+）−セレノメチオニンの形態での、セレン含有タンパク質、例えばグルタチオンペルオキシダーゼ、チオレドキシン還元酵素及びセレノプロテインＰ等の生合成に関与する（Muller, S. 等, Arch. Microbiol., 1997, 168, 421）。
セレン欠乏症は、ヒトにおいて、特に非経口摂取を長期にわたり受けた患者において報告されている（Von Stockhausen, H.B., Biol. Trace Elem. Res., 1988, 15:147-155）。２００μｇのセレンの毎日の補給は、平均体重の成人に安全且つ十分であると考えられる（Schrauzer, G.N., J. Am. Col. Nutr., 2001, 20:1-14）。
【０００３】
セレンは天然に、有機及び無機の２つの形態、で確認される。
【０００４】
この無機化合物は、最も一般的には塩、例えば亜セレン酸ナトリウム又はセレン酸ナトリウム等である。これらの化合物は、ヒトや大抵の動物に非常に有毒である。
【０００５】
有機化合物（有機セレン化合物）は、生体中で、特に、アミノ酸Ｌ（+）−セレノメチオニン、Ｌ（+）−メチルセレノシステイン及びＬ（+）−セレノシステインの形態により表される。
【０００６】
Ｌ（+）−セレノメチオニンは、ヒト及び動物の有機セレンの主たる供給源である。しかしながら、食事を通してのみ得ることができるこのアミノ酸に対して、ヒト及び動物は栄養要求性を有する。
【０００７】
従って、セレンは、理想的にはセレン欠乏症の治療または予防を目的とする食物サプリメント中にこの有機形態により取り込まれるべきである。
【０００８】
よって、Ｌ（+）−セレノメチオニンを食事に補充することはそれほど有毒でなく、亜セレン酸ナトリウムの形態での摂取より良好なバイオアベイラビリティを供することを示すことは可能である、とされてきた（Mony, M.C.等, J. of Trace Elem. Exp. Med., 2000, 13:367-380）。
【０００９】
現在のところ、基質として主として亜セレン酸ナトリウム、及びセレノメチオニンの形態での無機セレンを使用したもの以外、生体によるセレンの取り込みに関する代謝経路は知られていない。
【００１０】
有機セレンの適当な供給は、高等植物（特に小麦、トウモロコシ、大豆）で確認することができ、８０％を上回るセレンが、Ｌ（+）−セレノメチオニンから構成される（Schrauzer, G.N., J. Am. Coll. Nutrit., 2001, 20(1):1-4）。しかしながら、これらの植物のセレン濃度は、食品添加物を容易に且つ安価に生産することができるほど十分ではない。
【００１１】
セレノメチオニンが豊富な組成物を得ることについて検討される１つのアプローチは、一定の微生物を無機セレンを使用して有機セレンを濃縮することである。一度濃縮されると、これらの微生物は出発原料として食品又は化粧品の調製のために使用することができる。
【００１２】
多数の出版物は、例えば、セレン濃縮された酵母、より詳細には酵母サッカロマイセスセレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の調製を記載しており（Oh Tae-Kwang 等, patent KR950006950 of 06.26.1995）、これらをそれ自体として使用する又はこれらを食品組成物中に取り込む（Moesgaard S.等, patent DK200200408 of 09.16.2003）；或いはセレン濃縮由来の製品、例えばセレン濃縮されたパン（Wang Boaquan, patent CN 1817143 of 08.16.2006）、牛乳（Jeng Chang-Yi, patent TW565432 of 12.11.2003）、卵（Cui Li等, patent CN1302723C of 03.07.2007）、チョコレート（In Gyeong Suk等, patent KR20040101145 of 11.08.2004）又はビール（Jakovleva L.G. 等, patent RU2209237 of 07.27.2003）を得ることを目的とするものである。健康食品領域では、セレン濃縮された酵母を含有する調製はまた、妊娠した女性（Wang Weiyi, patent CN1778199 of 05.31.2006）、又は低血糖患者の腸微小環境を改善するために提案される（Li Tao Zhao, patent CN1810161 of 08.02.2006)）。デルモコスメティクス（dermocosmetics）分野において、セレン濃縮された酵母を含有する組成物が脱毛を減少する目的で（Kasik Heinz, patent DE19858670 of 06.21.2000）又は光老化の予防（Kawai Norihisa等, patent JP07300409 of 11.14.1995）で、開発される。セレン濃縮された酵母を含有する医薬製剤は、炎症性病態、例えば糖尿病に関連した網膜症等（Crary Ely J., patent US5639482 of 06.17.1997）、又は心臓血管系の炎症性病態（Nagy P.L. 等, patent HUT060436 of 09.28.1992）の予防及び治療で使用されている。
【００１３】
細菌、より詳細にはプロバイオティック細菌は、それ自体もまたセレン濃縮の対象となる（Calomme M. 等, Biol. Trace Elem. Res., 1995, 47, 379-383）。ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）だけでなく、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ラクトバシラス・フェリントシェンシス(Lactobacillus ferintoshensis)、及びラクトバシラス・ブッフネリ／パラブッフネリ（Lactobacillus buchneri/parabuchneri）（Andreoni V. 等, patent US0258964）もまた、セレン濃縮された食物サプリメントとして記載される。酵母及び乳酸桿菌から産生されるプロバイオティックスの混合物は、免疫システム及び疾患に対する抵抗力を強化する目的で調製されている（Huang Kehe Qin, patent CN1283171C of 11.08.2006）。
【００１４】
しかしながら、これらの調製物全てにおいて、セレン濃縮された微生物は無機セレンだけから調製される。従って、最も一般的に使用されるセレンの供給源は、微生物培地の可溶化された亜セレン酸ナトリウム又はセレン酸ナトリウムから成る。従って、濃縮された微生物は、人体で同化することができる有機セレンの十分な量を合成しているにも関わらず、未転換の無機セレンの高残留レベルをしばしば示し、これは同様の物を消費している人にとって危険であることがわかる。
【００１５】
公開された先願のＷＯ２００６／００８１９０で、セレノヒドロキシ酸タイプの新規の有機化合物が、ヒト及び動物でのＬ（+）−セレノメチオニンの合成のための前駆物質として供給することができるとして記載される。
【００１６】
驚くことに出願人は、セレノヒドロキシ酸タイプの有機化合物、例えばＷＯ２００６／００８１９０に記載されるものを、様々な光合成微生物の有機セレンを濃縮するために、培地に取り込むことができると記載している。得られた結果から、これらの化合物、特にＬ（+）−セレノメチオニンで、通常使用される無機化合物を使用して得られるものと同等の、又はそれを上回る収率で、このような微生物の濃縮を非常に効果的に可能にすることは明らかである。
【００１７】
従って、セレノヒドロキシ酸タイプの有機化合物を使用した、光合成微生物の有機セレンの濃縮により、無機セレンを含まない有機セレンを産生し、そして先行技術の方法に関連した毒性の問題を解決することが可能となるのは明らかである。
【００１８】
よって、濃縮された光合成微生物は、セレン欠乏症の予防又は治療に関して食品取引で、特に医薬、栄養又は化粧製品及び組成物を産生する目的で、直接使用することができる。
【発明の概要】
【００１９】
本発明の詳細な説明
本願は、光合成微生物、つまり成長が光エネルギー源に依存的である微生物を得ることに関する。
【００２０】
用語「微生物」は、以下の界：顕微鏡又は超顕微鏡レベルのサイズの真核又は原核細胞構造、並びに代謝及び生殖能を有するモネラ、原生生物、真菌又は原生動物、の１つに属する任意の生存している単細胞生物を意味することを目的とする。当該単細胞微生物は、フィラメント又はバイオフィルムの形成に関与してよい。
【００２１】
好適には、本発明の光合成微生物は、真核性の微細藻類、より好適にはクロレラ（Chlorella）属のトレボウクシア藻（Trebouxiophyceae）綱、或いは原核の微細藻類、例えばシアノ細菌、好適にはスピルリナ（Spirulina）又はアースロスピラ（Arthrospira）属（スピルリナ属（spirulin））のものである。後者は、食物サプリメントとして使用されるものとして、特に開発途上国で周知である。
【００２２】
用語「有機セレン」は、少なくとも１つのセレン原子を化学構造に有する化合物を、少なくとも１つ含有する分子の集合体を意味することを目的とし、これらは生体によって生成されることができる、例えば特に、アミノ酸セレノメチオニン、メチルセレノシステイン及びセレノシステイン、或いはこれらを含むペプチド又はタンパク質である。
【００２３】
従って、セレンが濃縮された光合成微生物は、それ自体として、又は食品添加物として使用することができる。これらは、例えば、トランスフォーム（transformed）製品の調製のための塩基として機能する組成物中に取り込むことができる安定な粉末を形成するように脱水してよく、また食品トランスフォーメーション方法でプロバイオティックスとして、例えば、発酵乳又は飲料を得る目的のために、生で使用することができる。
【００２４】
従って、本発明の対象は、光合成微生物をセレノメチオニン及び／又はセレノシステインで濃縮するための新規の方法であり、光合成微生物がセレノヒドロキシ酸タイプの化合物を含んでなる培地で培養されることを特徴とする。
【００２５】
好適には、セレノヒドロキシ酸タイプの化合物が一般式（Ｉ）の化合物、或いはこれらの前駆物質、塩又はエステル若しくはアミド誘導体であって：
【化１】
0005855939.tif 000002
式中：
ｎが、０，１又は２であり；
Ｒ１が、ＯＨ，ＯＣＯＲ３，ＯＰＯ３Ｈ２，ＯＰＯ３Ｒ４Ｒ５又はＯＲ６基であり；
Ｒ２が、ＯＨ，Ｒ３，ＮＨＲ７，Ｓ−システイニル又はＳ−グルタチオニル基であり；ｎ＝１であり且つＲ２がＯＨの場合は、Ｒ１はＯＨとすることはできないと理解され；
Ｒ３が、アルコキシル，セラミド１，セラミド２，セラミド３，セラミド４，セラミド５，セラミド６ａ及び６ｂ，Ｓ−システイニル又はＳ−グルタチオニル基，或いは以下：
【化２】
0005855939.tif 000003
から選択される基、
である化合物。
【００２６】
好適には、Ｒ３は、アルコキシル，Ｓ−システイニル又はＳ−グルタチオニル基であり；
ＯＲ４は、（C1-C26）アルコキシル，セラミド１，セラミド２，セラミド３，セラミド４，セラミド５又はセラミド６ａ及び６ｂ基、或いは以下：
【化３】
0005855939.tif 000004
から選択される基である。
【００２７】
好適には、ＯＲ４は（C1-C26）アルコキシル基であり；
ＯＲ５は、（C1-C26）アルコキシル，セラミド１，セラミド２，セラミド３，セラミド４，セラミド５又はセラミド６ａ及び６ｂ基，或いは以下：
【化４】
0005855939.tif 000005
の基から選択される基である。
好適には、ＯＲ５は、（C1-C26）アルコキシル基であり；
ＯＲ６は、ピルビン酸，乳酸，クエン酸，フマル酸，マレイン酸，ミリスチン酸，パルミチン酸，ステアリン酸，パルミトレイン酸，オレイン酸又はリノール酸基，天然脂肪酸基或いは１３−シス−レチノア−ト基であり；
Ｒ７は、Ｈ又は（C1-C26）アルキル基，天然アミノ酸或いは天然アミンである。
【００２８】
上記の式（Ｉ）において：
用語「アルキル」は、直鎖又は環状、任意に分岐した、任意にフッ素化又はポリフッ素化の、１〜２６個の炭素原子を含有し、且つ任意に１又は複数の炭素−炭素二重結合を含んでなる基、例えば、メチル、エチル、イソプロピル、トリフルオロメチル、リノレイル、リノレニル又はパルミトイルを意味することを目的とし；
【００２９】
用語「アルコキシル」は、直鎖又は環状、任意に分岐した、任意にフッ素化した或いはポリフッ素化した、１〜２６個の炭素原子を含む、並びに任意に１又は複数の炭素−炭素二重結合を含んでなる一級、二級又は三級アルコールに由来する基、例えばメトキシル、エトキシル、イソプロポキシル、トリフルオロメトキシル、リノレオキシル（linoleoxyl）、リノレノキシル（linolenoxyl）又はパルミトキシル（palmitoxyl）を意味することを目的とし；
セラミドタイプのラジカルの構造は、特に「Cosmetic Lipids and the Skin Barrier」, Ｔｈｏｍａｓ Ｆｏｒｓｔｅｒ Ｅｄ． ２００２， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， ｐ．２， 図２に記載され；
【００３０】
用語「天然」は、植物及び動物界の生物の代謝、並びにヒトの代謝で確認される任意の対応する化合物を意味することを目的とし（Steglich W., Rompp Encyclopedia Natural Products, G. Thieme ed.）；
用語「オリゴマー」は、互いにエステルタイプの結合によって結合する２〜１５個のモノマーの結合によって形成される任意の化合物を意味することを目的とし；
用語「ポリマー」は、エステルタイプの結合によって互いに結合した、１５個より多いモノマーの結合によって形成される任意の化合物を意味することを目的とする。
【００３１】
本発明によれば、式（Ｉ）の化合物は好適には、カルシウム塩、亜鉛塩又はマグネシウム塩の形態で使用され、通常これによって培地における良好な溶解性、及び光合成微生物による良好な同化もまた得ることが可能である。
【００３２】
本発明の好適な一実施形態では、光合成微生物は藍藻綱及びトレボウクシア藻（Trebouxiophyceae）綱によって形成されるグループから選択される。従って、光合成微生物は、好適には藍藻綱又はトレボウクシア藻（Trebouxiophyceae）綱、好適にはクロレラ属のトレボウクシア藻（Trebouxiophyceae）及びスピルリナ（Spirulina）又はアースロスピラ（Arthrospira）属の藍藻綱で構成されるグループから選択される。
【００３３】
本発明は、より詳細には、式（Ｉ）の化合物の使用であって、当該化合物は：
− Ｌ−２−ヒドロキシ−４−メチルセレノブタン酸，
− Ｄ−２−ヒドロキシ−４−メチルセレノブタン酸，
− ＤＬ−２−ヒドロキシ−４−メチルセレノブタン酸，
又はこれらの化合物の塩から選択される（又は得られる）使用に関する。
【００３４】
これらの化合物は、ＷＯ２００６／００８１９０に記載される。
【００３５】
本発明の対象はまた、有機セレンが濃縮された光合成微生物であって、本発明の方法に従って得ることができる。このような微生物は、セレン当量に基づき通常５００ｐｐｍ以上、好適には１０００ｐｐｍ以上、より好適には２０００ｐｐｍ以上の有機セレン含有量、並びに微生物の乾燥重量で０．５％未満、好適には０．２％未満、より好適には０．１％未満の無機セレン含有量を有する。好適には、本発明は、光合成微生物が全セレンに対して無機セレンを１．５質量％未満、好適には０．５質量％未満、より好適には０．１質量％未満含んでなる場合に関する。
【００３６】
言い換えれば、本発明の方法に従って濃縮された光合成微生物に存在する無機形態でのセレンの残渣は、通常微生物に存在する全セレンの１．５％未満の割合を占め、これは通常当該微生物の全乾燥バイオマス（乾燥重量）の０．５％未満を示す。
【００３７】
本発明は、最も詳細には、有機セレンが濃縮された光合成微生物に関し、微生物のセレノメチオニンの形態でのセレンの含有量が、光合成微生物に存在する全セレンに対して、５０質量％以上、好適には７０質量％以上、より好適には８０質量％以上、さらに好適には９０質量％以上を示すことを特徴とする。このようなセレノメチオニンの割合は、微生物に存在する有機セレンの量及び質に関して、先行技術で得られたものと比較して、相当且つ著しく好適な改善を示す。
【００３８】
特に、本発明は、微生物がセレン濃縮された緑藻綱微細藻類、好適にはクロレラ属のものであり、微生物が微生物の乾燥重量で１グラムあたり通常５０マイクログラムセレン当量（μｇSe/g）以上、好適には７０μｇＳｅ／ｇ以上、より好適には１００μｇＳｅ／ｇ以上のセレノメチオニン含有量を有することを特徴とする場合に関する。
【００３９】
微生物の内部に有機分子の形態（セレノメチオニン、セレノシステイン等）又は無機分子の形態（セレン塩）で固定されたセレンの量は、微生物の乾燥重量の１グラムあたりのセレンの質量（μｇSe/g）として表す。言い換えれば、光合成微生物のセレン含有量は、微生物の全乾燥バイオマスに対して、これらの有機又は無機分子で存在するセレン質量を算出することによって規定される。さらに、有機及び無機形態で存在するセレンの質量による割合はまた全セレンの質量に対するパーセンテージとして規定され表される。
【００４０】
本発明の光合成微生物の全セレン及びセレノメチオニンの形態でのセレンの含有量は、それぞれ微生物の遠心分離及び凍結乾燥後のミネラル化（mineralization）及び酵素消化によって、例えば以下のＭｅｓｔｅｒ， Ｚ．等の（2006）Ａｎｎａｌ． Ｂｉｏａｎａｌ． Ｃｈｅｍ．３８５：１６８−１８０に記載されるＬｏｂｉｎｓｋｙ等の方法によって、測定することができる。
【００４１】
本願の実施例で説明する、本発明に従って得られた結果は、光合成微生物、より詳細には緑藻綱及び藍藻綱微細藻類が、これらの微細藻類の乾燥重量で通常１グラムあたり１００マイクログラムセレン当量（μｇSe/g）以上、好適には２００μｇＳｅ／ｇ以上、より好適には５００μｇＳｅ／ｇ以上、さらに好適には１０００μｇＳｅ／ｇ以上、さらに１４００μｇＳｅ／ｇ以上の含有量で、セレノメチオニンの形態でセレンを蓄積することを示す。
【００４２】
従って、本発明はより詳細には、有機セレンのセレノメチオニンの形態での含有量が、乾燥重量で通常１００μｇＳｅ／ｇ以上、好適には２００μｇＳｅ／ｇ以上、より好適には５００μｇＳｅ／ｇ以上、さらに好適には１０００μｇＳｅ／ｇ以上であることを特徴とする有機セレンが濃縮された緑藻綱又は藍藻綱に関する。
【００４３】
有機セレンが濃縮されたこのような緑藻綱又は藍藻綱は、セレノメチオニンの形態での有機セレンの含有量が含有する全セレンの５０％以上、好適には７０％以上、より好適には８０％以上、さらに好適には９０％以上、さらに９５％を示し、そして無機セレンの残存量が含有する全セレンの通常１．５％未満、好適には０．５％未満、より好適には０．１％未満であることを通常特徴とする。通常は、無機セレンの残存量は、乾燥重量で緑藻綱の全バイオマスの１％未満、好適には０．５％未満、より好適には０．２％未満、さらに好適には０．１％未満である。
【００４４】
本発明はまた、本発明の方法に従ってセレンが濃縮された当該光合成微生物由来の、食品、化粧品又は医薬製品の製造に関する。この製造では、当業者に周知の技術を使用する。
【００４５】
本発明の光合成微生物はまた、動物の栄養において、特に有機セレンが濃縮された二次誘導体、例えば魚、牛乳、又は卵を得る目的に対しても有用である。
【００４６】
従って、生成され得られた製品及び分子は、前置きで概要を述べたものを含むさまざまな応用で、特に化粧剤、医薬又は栄養剤として有用である。
【００４７】
本発明の対象はまた、本発明のセレン濃縮された光合成微生物の、化粧品、医薬品（若しくは治療薬）又は栄養製品（若しくは剤）としての使用である。
【００４８】
本発明はまた、光合成微生物を含んでなる組成物、通常化粧組成物、医薬組成物又は栄養組成物に関する。
【００４９】
本発明はまた、光合成微生物のための培地に関し、１又は複数の上に定義した式（Ｉ）の化合物を含んでなることを特徴とする。このような培地は、光合成微生物のセレンを濃縮する本発明の方法を実行するために有用である。
【００５０】
特に、本発明は、少なくとも１つの式（Ｉ）の化合物、好適には２−ヒドロキシ−４−メチルセレノブタン酸又はこの塩を、０．５〜２０００ｍｇ／ｌ、好適には１〜１０００ｍｇ／ｌ、より好適には２〜５００ｍｇ／ｌ、すなわちそれぞれセレン当量に基づき当該化合物の約０．２〜８００ｍｇ／ｌ、好適にはセレン当量に基づき当該化合物の０．４〜４００ｍｇ／ｌ、より好適にはセレン当量に基づき当該化合物の０．８〜２００ｍｇ／ｌの濃度で含んでなる固体又は液体培地に関する。
【００５１】
海洋起源の微細藻類に関して、最少培地を形成するために、式（Ｉ）の化合物は細菌濾過海水、又は、例えば、Ａｑｕａｒｉｕｍ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．社由来の「リーフクリスタル（Reef Crystal）」培地から生成した人工海水で希釈することができる。
【００５２】
本発明の微細藻類の調製方法は、特に１又は複数の以下の：
−培地、好適には微細藻類の成長に必須の化学元素を含む最少培地を調製する段階；
-培地中に、式（Ｉ）の化合物、好適には２−ヒドロキシ−４−メチル−セレノブタン酸をセレンの有機供給源として導入する段階；
-混合物のｐＨを６〜１０の値に調整する段階；
-このように形成された混合物で培養下の当該微細藻類の前培養の播種菌液を、温度１２〜４５℃で、軌道振盪１００〜５００ｒｐｍで、さらに０〜２０％の酸素及び０．３％〜２０％の二酸化炭素を含有する雰囲気で、好適には２４〜１２０時間置く段階；
-混合物を４０００〜１００００ｒｐｍで数分間遠心分離する、又は０．２マイクロメータフィルターを通して混合物を濾過しフィルターを生理食塩水でリンスする段階；
-細胞ペレットを生理食塩水に取り込む段階；
-４０００〜１００００ｒｐｍで数分間、再度遠心分離する段階；
-セレン濃縮された微細藻類を含有するモイストの細胞ペレットを回収する段階、
を含むことができる。
【００５３】
モイストの細胞ペレットは、凍結乾燥又は風乾してよい。
【００５４】
本発明の他の特徴及び利点は、以下の実施例において示す。以下の実施例は、説明の目的でのみ供され、本発明の範囲を何ら限定することはできない。
【実施例】
【００５５】
実施例１：独立栄養条件下での、２−ヒドロキシ−４−メチルセレノブタン酸（THD-177）含有培地での、セレン濃縮されたクロレラブルガリス（chlorella vulgaris）微細藻類の産生
【００５６】
実験条件
光独立栄養条件下で使用した株は、クロレラブルガリス（chlorella vulgaris）ＳＡＧ２１１−１１Ｂ：ゲッティンゲン（Goettingen）大学のＳＡＧコレクション（collection）に由来する純粋培養株（SAG: Sammlung von Algenkulturen der Universitat Goettingen [ゲッティンゲン大学の藻類培養のコレクション]）である。
【００５７】
この株を、Ｓｔａｎｌｅｙ ＲＹ等（1971 Bacteriol. Rev. 35:171-205）によって記載されたＢＧ−１１培地（青緑色の培地）で培養し、この組成は以下の通りである（１リットルあたり）：
（１）ＮａＮＯ３：１．５ｇ
（２）Ｋ２ＨＰＯ４：０．０４ｇ
（３）ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：０．０７５ｇ
（４）ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ：０．０３６ｇ
（５）クエン酸：０．００６ｇ
（６）クエン酸鉄アンモニウム：０．００６ｇ
（７）ＥＤＴＡ−Ｎａ２：０．００１ｇ
（８）Ｎａ２ＣＯ３：０．０２ｇ
（９）蒸留水：１．０Ｌ
（１０）微量元素溶液：１ｍｌ／Ｌ
Ｈ３ＢＯ３：２．８６ｇ
ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ：１．８１ｇ
ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：０．２２２ｇ
Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２：０．３９ｇ
ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ：０．０８ｇ
Ｃｏ（ＮＯ３）２・６Ｈ２Ｏ：０．０５ｇ
【００５８】
ｐＨを７．１に調整し、そして培地を１２１℃で１５分間オートクレーブした。
【００５９】
この株を、２５℃、２４００＋／−２００Ｌｕｘで、光独立栄養条件下で、軌道振盪（80 rpm）、ＯＤｉｎｉｔ６６０ｎｍ＝０．０５で２〜７日間培養した。株のＯＤ６６０ｎｍは、４８時間で０．５に到達する。
【００６０】
培養条件
セレンの有機供給源、主として２−ヒドロキシ−４−メチルセレノブタン酸（THD-177, Tetrahedron SAS, France, CAS: 873660-49-2）を、セレン当量に基づき０．５ｍｇ／ｌ〜１００ｍｇ／ｌの濃度で、すなわち、１．２５ｍｇ／ｌ〜２５０ｍｇ／ｌの２−ヒドロキシ−４−メチルセレノブタン酸を投与した。培養の初めに、セレン含有の化合物を一度だけ（すなわち、培養液100mlあたり、0.125mg〜25mgの量）、又は一定時間ごとに数回添加した。なおこの間隔は６〜２４時間であり、培養は２〜７日間維持した。
【００６１】
実施例２：２−ヒドロキシ−４−メチルセレノブタン酸（THD-177）（本発明の実施例）含有培地、又は亜セレン酸ナトリウム（比較例）含有培地での、混合栄養条件（光の存在及び培地中に炭水化物-グルコースの存在）下でのセレン濃縮されたクロレラブルガリス（chlorella vulgaris）微細藻類の産生：
【００６２】
これらの試験において、使用した株は、クロレラブルガリス（chlorella vulgaris）ＳＡＧ２１１−１１Ｂ株：ゲッティンゲン大学のＳＡＧコレクションに由来する純粋培養の株（SAG: Sammlung von Algenkulturen der Universitat Goettingen [ゲッティンゲン大学の藻類培養コレクション]）であって、混合栄養条件下で以下の培地で培養した：
酵母抽出物  ０．３３ｇ
牛肉抽出物  ０．３３ｇ
トリプトース  ０．６６ｇ
ＦｅＳＯ４  ０．６６ｍｇ
グルコース  ３．３ｇ
蒸留水  ｑｓｐ １．０Ｌ
【００６３】
ｐＨを７．２に調整し、そして培地を１２１℃で１５分間オートクレーブした。
【００６４】
セレンの有機供給源、主として２−ヒドロキシ−４−メチルセレノブタン酸（THD-177, Tetrahedron SAS, France, CAS: 873660-49-2）をセレン当量に基づき濃度２０ｍｇ／ｌで、すなわち５０ｍｇ／ｌの２−ヒドロキシ−４−メチルセレノブタン酸を投与した。
【００６５】
無機セレン供給源（NaSe, 亜セレン酸ナトリウム）をセレン当量に基づき濃度２０ｍｇ／ｌ、すなわち４３．９ｍｇ／ｌの亜セレン酸ナトリウムを投与した。
【００６６】
セレン含有の化合物を、クロレラブルガリス（chlorella vulgaris）株の指数増殖期（すなわち播種の3日後）に一度だけ添加した。
【００６７】
分析用サンプルの調製：
７日間のインキュベーション後、０．２ミクロンのＮａｌｇｅｎｅの膜（a-PES, 直径90mmを参照されたい）を通して培地を濾過し、細胞残余分を生理食塩水でリンスした。セレン（セレン, セレノメチオニン及び亜セレン酸ナトリウム全て）含有の成分分析のために、ウェットの細胞集団を凍結乾燥した。
【００６８】
クロレラブルガリス（chlorella vulgaris）のセレン含有成分の分析
サンプルのミネラル化後に、結合ＩＣＰ質量分析（ICP coupled to detection by mass）によって全セレンをアッセイした。サンプルの酵素消化後に、Ｍｅｓｔｅｒ, Ｚ.等の（2006）Ａｎｎａｌ．Ｂｉｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．３８５：１６８−１８０においてＬｏｂｉｎｓｋｙ等によって記載される方法に従って、高速液体クロマトグラフィータンデム質量分析によってセレンのスペシエーションを行った。
【００６９】
結果
以下の表１は、インキュベーション時間７日間で、３通りに得られた、セレン当量に基づく平均値を示す。
【００７０】
【表１】
0005855939.tif 000006
【００７１】
ＴＨＤ１７７又はＮａＳｅの形態で、この場合に２０ｍｇＳｅ／ｌで添加したセレンの同用量に関して得られた結果から：
-添加をＮａＳｅの形態で行う場合よりも、添加をＴＨＤ１７７の形態で行う場合の方が９倍の全Ｓｅが検出され；
-ＴＨＤ１７７の添加によって得られた、セレノメチオニンの形態で細胞内に蓄積されたセレンのレベルが、ＮａＳｅの形態での添加によって得られたものの４４倍であり；
-細胞内にセレノメチオニンの形態で蓄積されたセレンのレベルは、ＮａＳｅでは２０％のレベルであるのに比べ、ＴＨＤ１７７の形態で添加を行った場合は、実質的にセレン含有の細胞内化合物形態の１００％（98.5%）に達し；そして
-添加がＴＨＤ１７７の場合は、全セレン中にＳｅ（IV）が０．４％だけ検出され、一方ＮａＳｅの添加の場合は、全セレン中にＳｅ（IV）が２．７％検出された、ことが示された。
【００７２】
実施例３：２−ヒドロキシ−４−メチルセレノブタン酸（THD-177）含有培地（本発明の実施例）又は亜セレン酸ナトリウム含有培地（比較例）で、独立栄養条件下での、セレン濃縮されたアースロスピラ・プラテンシス（Arthrospira platensis）微細藻類の産生：
これらの試験において、使用した株は、アースロスピラ・プラテンシス（Arthrospira platensis）３０５４−Ｅ０００１の株である。
【００７３】
３０５４−Ｅ０００１株を独立栄養条件下で、以下の培地で培養した：
酵母抽出物  ０．３３g
牛肉抽出物  ０．３３g
トリプトース  ０．６６g
ＦｅＳＯ４  ０．６６ｍｇ
蒸留水  ｑｓｐ １．０Ｌ
【００７４】
ｐＨを７．２に調整し、培地を１２１℃で１５分間オートクレーブした。
【００７５】
セレンの有機供給源、主として２−ヒドロキシ−４−メチルセレノブタン酸（THD-177, Tetrahedron SAS, France, CAS: 873660-49-2）を、セレン当量に基づき濃度２５ｍｇ／ｌ、すなわち濃度６２．５ｍｇ／ｌの２−ヒドロキシ−４−メチルセレノブタン酸を投与した。
【００７６】
無機セレン供給源（NaSe, 亜セレン酸ナトリウム）を、セレン当量に基づき濃度２５ｍｇ／ｌで、すなわち５４．４ｍｇ／ｌの亜セレン酸ナトリウムを投与した。
【００７７】
アースロスピラ・プラテンシス（Arthrospira platensis）株の播種直後に、一度だけセレン含有の化合物を添加した（すなわち. T = 0）。
【００７８】
分析用のサンプルの調製：
１０日間のインキュベーション後、０．２ミクロンのＮａｌｇｅｎｅの膜を通して細胞ペレットを濾過し、細胞残余分を生理食塩水でリンスした。セレン（全セレン, セレノメチオニン及び亜セレン酸ナトリウム）含有の成分分析のために、ウェットの細胞集団を凍結乾燥した。
【００７９】
アースロスピラ・プラテンシス（Arthrospira platensis）のセレン含有成分の分析
サンプルのミネラル化後に、全セレンを結合ＩＣＰ質量分析によってアッセイした。サンプルの酵素消化の後に、Ｍｅｓｔｅｒ，Ｚ.等の（2006）Ａｎｎａｌ． Ｂｉｏａｎａｌ． Ｃｈｅｍ．３８５：１６８−１８０においてＬｏｂｉｎｓｋｙ等によって記載された方法に従って、高速液体クロマトグラフィータンデム質量分析によってセレンのスペシエーションを行った。
【００８０】
結果
以下の表２は、１０日間のインキュベーション期間で３通りに得られた、セレン当量に基づく平均値を示す。
【００８１】
【表２】
0005855939.tif 000007
【００８２】
得られた結果から、ＴＨＤ１７７又はＮａＳｅの形態で添加したセレンの同一用量、この場合は２５ｍｇＳｅ／ｌに関して：
−ＴＨＤ１７７の形態で行った添加に関しては、ＮａＳｅの形態で行った添加よりも８倍の全Ｓｅが検出され；
-ＴＨＤ１７７の添加によって得られた、セレノメチオニンの形態で細胞内に蓄積されたセレンのレベルは、ＮａＳｅの形態での添加によって得られたものより１０８倍高く；
-セレノメチオニンの形態で細胞内に蓄積されたセレンのレベルは、ＮａＳｅでは７％のレベルであるのに比べ、ＴＨＤ１７７の形態で添加を行った場合は、セレン含有の細胞内化合物形態の９８％に達し；そして
-ＮａＳｅの添加の場合には全セレン中で２．９％のＳｅ（IV）が検出されたのに対して、添加がＴＨＤ１７７の場合には、全セレン中の１．２％のＳｅ（IV）だけが検出された、
ことが示された。
【００８３】
実施例４：２−ヒドロキシ−４−メチルセレノブタン酸（THD-177）含有培地での、セレン濃縮されたアースロスピラ・プラテンシス（Arthrospira platensis）微細藻類の産生（本発明の実施例）
この試験において、使用した株はアースロスピラ・プラテンシス（Arthrospira platensis）３０５４−Ｅ０００１株である。比較は、
-本発明に従って、セレンＴＨＤ−１７７含有の化合物の添加を、アースロスピラ・プラテンシス（Arthrospira platensis）株の播種直後に一度だけ行った、前回の実施例である実施例３の結果、と
-実施例２のように、アースロスピラ・プラテンシス（Arthrospira platensis）株の培養の指数増殖期において、本発明に従って、セレンＴＨＤ−１７７の含有の化合物の添加を行った、新たな実験結果、との間で行った。
【００８４】
結果
以下の表３は、１０日間のインキュベーション期間で３通りに得られた、セレン当量に基づく平均値を示す。
【００８５】
【表３】
0005855939.tif 000008
【００８６】
結果から、「指数増殖期中の添加」試験と比較して、「Ｔ０での添加」試験で全セレンが１２％より多く、且つセレノメチオニンの形態でのセレンが３０％より多く得られたことが示された。この違いは、「指数増殖期中の添加」試験よりも、「Ｔ０での添加」試験における、バイオマスとＴＨＤ１７７との長い接触時間の結果によるものとすることができる。
いずれの場合においても、細胞内Ｓｅ（IV）レベルは全セレンの１％と低い状態である。