(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の非天然ジンクフィンガーモジュールを含むジンクフィンガータンパク質であって、非天然ジンクフィンガーＤＮＡ結合モジュールの少なくとも２つは、Ｎ−末端ジンクフィンガーモジュールの最後の残基とＣ−末端ジンクフィンガーモジュールの最初の残基との間に５〜２０個のアミノ酸残基のアミノ酸リンカー配列で接続され、前記リンカーが、Ｎ末端ジンクフィンガーモジュールに隣接したＮ末端アミノ酸残基と、Ｃ末端ジンクフィンガーモジュールに隣接したＣ末端アミノ酸残基と、Ｎ−及びＣ−末端アミノ酸リンカー残基の内部にあるアミノ酸残基を含み、並びに
（i）前記アミノ酸リンカーのＮ末端アミノ酸残基又は内部にあるアミノ酸残基は、少なくとも１個のプロリン残基を含み、
（ii）前記ジンクフィンガータンパク質は、各フィンガーモジュールによって結合された標的サブサイトを含む標的部位に結合し、
（iii）前記アミノ酸リンカーによって接続されたジンクフィンガーＤＮＡ−結合モジュールによって結合された標的サブサイト間に０、１、２又は３個の塩基対のギャップが存在する、
ジンクフィンガータンパク質。
【請求項２】
前記リンカーが、少なくとも２個の塩基性アミノ酸残基を更に含む、請求項１に記載のジンクフィンガータンパク質。
【請求項３】
前記塩基性アミノ酸残基が、アルギニン残基、ヒスチジン残基、リジン残基及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２に記載のジンクフィンガータンパク質。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のジンクフィンガータンパク質及び調節ドメインを含む、融合タンパク質。
【請求項５】
前記調節ドメインが、転写モジュレートドメインである、請求項４に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
前記調節ドメインが、活性化ドメイン又は抑制ドメインである、請求項５に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
前記調節ドメインが、開裂ドメイン又は開裂ハーフドメインである、請求項４に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のタンパク質のいずれかをコードするポリヌクレオチド。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のタンパク質のいずれか及び／又は請求項８に記載のポリヌクレオチドを含む細胞。
【請求項１０】
請求項１〜７に記載のいずれか一項に記載のタンパク質又は請求項８に記載のポリヌクレオチドを含む、細胞中の遺伝子の発現をモジュレートするための組成物であって、前記細胞に投与される、組成物。
【請求項１１】
前記モジュレートが、前記遺伝子の上方制御又は下方制御を含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記モジュレートが、前記遺伝子の開裂を含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
前記遺伝子が内因性細胞遺伝子である、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明の開示は、ゲノム及びタンパク質工学の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、その開示を本明細書にそれらの全体を参照として援用する、２０１０年５月３日に出願された米国特許仮出願第６１／３４３，７２９号の利益を主張するものである。
【０００３】
連邦政府の委託研究下でなされる発明に対する権利についての記述
適用せず。
【０００４】
背景
選択された標的部位に結合するように操作された認識領域を有するジンクフィンガータンパク質は、他のジンクフィンガータンパク質並びに調節ドメインに規則的に連結され、遺伝子発現及びゲノム標的部位を改変するために使用される。例えば、開裂ドメインに操作可能となるように連結されたＤＮＡ結合ドメインを含む人工ヌクレアーゼは、外因性配列の挿入、１つ以上の内因性遺伝子の不活性化、生物体の作製（例えば、動物又は穀物）並びに変更された遺伝子発現パターンを有する細胞系などが挙げられるゲノム配列の標的化変更に使用されてきた。例えば、米国特許公開第２００５００６４４７４号、同第２００６００６３２３１号、同第２００７０１３４７９６号、及び同第２００８００１５１６４号、並びに国際特許公開第２００７／１３９９８２号を参照されたい。
【０００５】
ジンクフィンガータンパク質モジュール（例えば、１つ以上のフィンガーの操作されたジンクフィンガー）は、典型的には、ＴＧＥＫＰ（配列番号１）などの５個のアミノ酸の「カノニカル」リンカー配列又はより長い可撓性リンカーを使用して、互いに対して連結される。米国特許第６，４７９，６２６号、同第６，９０３，１８５号、及び同第７，１５３，９４９号並びに米国特許公開第２００３０１１９０２３号を参照されたい。しかしながら、これらのカノニカルリンカーを介して連結されたジンクフィンガータンパク質モジュールは、標的核酸分子内の連結したモジュール標的サブサイト間にギャップがない場合にのみ最も効果的に結合する。更には、連結されたモジュールが１、２又は３個の塩基対ギャップを有する標的部位に結合することができるように設計された、先に述べられた長い可撓性リンカーは、結合に関して、これらの異なる塩基対ギャップ間を識別しない。米国特許第６，４７９，６２６号、同６，９０３，１８５号、及び同７，１５３，９４９号、並びに米国特許公開第２００３０１１９０２３号を参照されたい。したがって、１、２、又は３塩基対モジュール間ギャップにまたがるタンパク質の双方の親和性を改善し、同様に所望の長さのギャップにまたがり、またその所望の長さのギャップを持たない他の標的に対しては非選択的に結合しない標的を結合するためのこれらのタンパク質の選択性を改善する、ジンクフィンガーモジュールを互いに対して連結させるための方法又は組成物が望まれている。隣接するモジュールサブサイト間の０、１、２、３個又はそれより多くの塩基対間を識別するジンクフィンガーモジュールに対するリンカーは、ジンクフィンガー転写因子（ＺＦＰ−ＴＦ）及びジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を含む任意のジンクフィンガー融合タンパク質のより大きな設計機能を可能にする。
【発明の概要】
【０００６】
概要
本明細書には、ＤＮＡ−結合モジュール（例えば、ジンクフィンガーモジュール）の互いに対する連結において使用されるリンカーが開示される。更に、例えば、転写調節ドメインなどの調節ドメインに又はヌクレアーゼに順番に融合されるこれらのリンカーを含むジンクフィンガータンパク質などの融合タンパク質が記載される。本開示はまた、これらの融合タンパク質及びその組成物を、遺伝子発現のモジュレーション、対象のある領域内での細胞ＤＮＡ（例えば内因性細胞クロマチン）の標的開裂及び／又は細胞内の対象のある所定領域にての相同組換えのために使用する方法を更に提供する。
【０００７】
したがって、一態様では、本明細書には、アミノ（Ｎ）−末端フィンガーの最後の残基（典型的には、カルボキシ（Ｃ）末端亜鉛配位結合残基）とＣ末端フィンガーの最初の残基（典型的には、最初の（Ｎ末端）保存芳香族残基）との間に５個又はそれ以上のアミノ酸を含む、例えば７〜１７個のアミノ酸を含むリンカーが記載される。ある実施形態では、このリンカーは、Ｎ末端残基と、Ｃ末端残基と、これらの末端残基の内部の残基とを含み、更にここにおいて、Ｎ末端残基又は内部残基が少なくとも１個のプロリン残基を含み、例えば、リンカーは、アミノ酸配列ＸN末端−Ｘn−ＸC末端を含み、式中のＸは任意のアミノ酸残基であり、Ｘnは少なくとも３個のアミノ酸残基と少なくとも１個のＸN末端とを含み、並びにＸnはプロリン残基を含む。ある実施形態では、このリンカーは、少なくとも２個のプロリン残基（例えば２、３、４個又はそれ以上）を含む。他の実施形態では、このリンカーは少なくとも１個のプロリン残基と少なくとも１個の塩基性残基（例えば、Ａｒｇ、Ｈｉｓ又はＬｙｓ）とを含む。他の実施形態では、このリンカーは少なくとも２個の塩基性残基（例えば、Ａｒｇ、Ｈｉｓ又はＬｙｓ）を含む。ある実施形態では、このリンカーは、表４、５、６、９、１０、１１又は１３のいずれかに示されるリンカーである。
【０００８】
別の態様では、本明細書に記載のリンカーを含む融合ポリペプチドを提供する。
【０００９】
別の態様では、本明細書に記載のリンカー又は融合タンパク質のいずれかをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００１０】
更に別の態様では、本明細書に記載のポリペプチド（例えば、融合ポリペプチド）及び／又はポリヌクレオチドのいずれかを含む細胞もまた提供する。
【００１１】
更に他の態様では、本明細書に記載のポリペプチド（例えば、融合ポリペプチド）及び／又はポリヌクレオチドを含む生物体（例えば、哺乳類、菌類及び植物）をもまた提供する。
【００１２】
融合タンパク質は、例えば、この融合タンパク質を細胞へ送達することによって又はこの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを細胞に送達することによって、細胞内で発現され得る。このポリヌクレオチドがＤＮＡである場合、転写かつ翻訳され、融合タンパク質を生成する。ＲＮＡ分子として送達される場合、即時に翻訳され、その結果、融合タンパク質を生成する。ポリヌクレオチド及びポリペプチドの細胞への送達のための方法は、本開示の別の箇所で提示される。
【００１３】
これらの態様及び他の態様は、本明細書の開示に照らして、当業者には全体として容易に明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１Ａ−Ｂ】図１のパネルＡ及びＢは、本発明の例示的ジンクフィンガータンパク質及びリンカーのアミノ酸配列を示す。図１Ａは、これらの研究で使用されるそれぞれのホストＺＦＰのアミノ酸配列を示している（ＺＦＰ  ８１９６のＦ１〜Ｆ４は、配列番号１３０；配列番号１３１；配列番号１３２及び配列番号１３３で示され、ＺＦＰ  ７２６３のＦ１〜Ｆ４は、配列番号１３４；配列番号１３５；配列番号１３６及び配列番号１３７で示され、ＺＦＰ  ７２６４のＦ１〜Ｆ４は、配列番号１３８；配列番号１３９；配列番号１４０及び配列番号１４１で示されている）。アミノ酸は１つの文字コードによって示されている。各々の配列は、アミノ末端→カルボキシ末端方向に表示され、これによって各タンパク質のアミノ末端はフィンガー１の最初のメチオニンであり、またカルボキシ末端は、フィンガー４の最後のセリンとなる。「Ｆ１」、「Ｆ２］、「Ｆ３」及び「Ｆ４」は、各タンパク質の第１、第２、第３及び第４番目のフィンガーをそれぞれ示している。下線部は、リンカー配列であると便宜上考えられるフィンガー接合部にてのアミノ酸残基を意味する。認識ヘリックスは枠で囲まれている。図１Ｂは、リンカーライブラリーデザインを示していて、その中で各々のライブラリーは、中心リンカー内の２個又は３個の残基についてのコドンを、２個〜１２個の完全無作為割付されたコドンの混合物で置き換えることによって生成されたものである。ライブラリーコドンは、（ＮＮＳ）2-12によって示されている。
【図２Ａ−Ｄ】図２のパネルＡ〜Ｄは、本発明の表示されたジンクフィンガータンパク質及びリンカーによるファージプールのギャップ選択性を示す。図２Ａは、表２Ｃで各ＺＦＰ８１９６標的への結合をテストされたものである１塩基対挿入塩基（ＡＴＡＡＡＣＴＧｄＣＡＡＡＡＧＧＣ（配列番号３３）（表２Ａ））を有する標的を使用するＺＦＰ８１９６ライブラリーから選択されたファージプールを示している。図２Ｂは、表２Ｃで各ＺＦＰ７２６３標的への結合をテストされたものである１塩基対挿入塩基（ＣＣＡＣＴＣＴＧｈＴＧＧＡＡＧＴＧ（配列番号４３）（表２Ａ））を有する標的を使用するＺＦＰ７２６３ライブラリーから選択されたファージプールを示している。図２Ｃは、表２Ｃで各ＺＦＰ７２６４標的への結合をテストされたものである１塩基対挿入塩基（ＴＴＡＡＡＧＣＧｈＧＣＴＣＣＧＡＡ（配列番号３８）（表２Ａ））を有する標的を使用するＺＦＰ７２６４ライブラリーから選択されたファージプールを示している。図２Ｄは、表２Ｃの各ＺＦＰ８１９６への結合をテストされたものである２塩基対挿入塩基（ＡＴＡＡＡＣＴＧｄｂＣＡＡＡＡＧＧＣ（配列番号３４））を有する標的を使用するＺＦＰ８１９６ライブラリーから選択されたファージプールを示している。各々のテストはまた、ＤＮＡへの非特異的結合を除外するための他の２つのホストＺＦＰに対する２つの対照標的、並びに標的部位を含有しない陰性対照試料も包含した。各標的への結合に成功したファージの％が示されている。各ファージプールは、選択の第５ラウンドからのものであった。保持効率は、以前の記載（Ｒｅｂaｒら著、Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９９６年（２６７）：１２９−１４９頁）のように実質的に決定された。
【図３Ａ−Ｂ】図３のパネルＡ及びＢは、本発明の表示されたギャップを封入する標的部位に対して選択されたリンカーを示す。図３Ａは、ＺＦＰ８１９６、ＺＦＰ７２６３、及びＺＦＰ７２６４（配列番号１４２〜１６６）における１塩基対ギャップを読み飛ばす（スキッピングする）ために選択されたリンカー配列を示している。図３Ｂは、ＺＦＰ８１９６における２塩基対ギャップを読み飛ばすためのリンカー配列（配列番号１６７〜１７４）を示している。選択されたリンカーは、プロリン及びアルギジンを豊富に含む（隈取りされ表示）。長さ優先性もまた明らかであり、これは読み飛ばした塩基の数に依存する。
【図４Ａ−Ｅ】図４のパネルＡ〜Ｅは、本発明のＺＦＰ８１９６と称されたジンクフィンガータンパク質内の１塩基対を読み飛ばすように選択されたリンカーについてのギャップ選択性を示すグラフである。各々のパネルにおいて、ＥＬＩＳＡスコアが、親の非スキッピングリンカーにそのギャップ非形成部位上で正規化された。「ギャップ配列」とは、（−）がギャップ非形成標的を示しているところのモジュールサブサイト間の塩基（複数可）の同一性を指す。図４Ａ〜４Ｃは、３つの１塩基対ギャップスキッピングリンカー（ｌｆ（配列番号５４）、ｌｄ（配列番号５６）及びｌｃ（配列番号５５）と称されるリンカー）からの結果を示している。図４Ｄは、ヒト細胞内の内因性遺伝子座の改変が可能であることが先に示されている標準可撓性リンカーでの結果を示し（ＴＧＧＧＧＳＱＫＰ、配列番号２）（Ｈｏｃｋｅｍｅｙｅｒら著、（２００９年）Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２７：８５１〜８５７ページを参照）、並びに図４Ｅは、先に公開された可撓性リンカーでの結果を示している（ＬＲＱＫＤＥＲＰ、配列番号３）（Ｋｉｍ  ＪＳ及びＰａｂｏ  ＣＯ（１９９８年）Ｐｒｏc  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９５（６）：２８１２〜２８１７頁を参照）。これらの選択されたリンカーｌｃ、ｌｄ及びｌｆ（図４Ａ〜４Ｃ）は、単一の塩基対ギャップを有する４つの標的部位に対して全て明白な優先性を示すが、一方図４Ｄ及び４Ｅ中の対照リンカーは、有効性で劣る全体の結合を示し、並びにギャップ選択性がほとんどないことを示している。
【図５Ａ−Ｄ】図５のパネルＡ〜Ｄは、本発明のＺＦＰ７２６４内の１塩基対を読み飛ばすように選択されたリンカーについてのギャップ選択性を示すグラフである。図５Ａ〜５Ｃは、ＺＥＰ７２６４のバックグラウンド内のｌｅリンカー（配列番号１２）のＥＬＩＳＡテストからの結果を示している。図５Ａは、モジュールサブサイト間の１塩基対ギャップを読み飛ばすように選択されたｌｅリンカーに関する結果を示している。図５Ｂは、標準可撓性リンカー（ＴＧＧＧＧＳＱＫＰ、配列番号２）に関する結果を示し、並びに図５Ｃは、可撓性リンカー（ＬＲＱＫＤＥＲＰ、配列番号３）に関する結果を示している。ＥＬＩＳＡスコアは、親の非スキッピングリンカーＺＦＰ７２６４に、そのギャップ非形成部位上で正規化された。「ギャップ配列」とは、（−）がギャップ非含有標的を示すモジュールサブササイト間の読み飛ばされた塩基（複数可）と同一であることを指す。図５Ｄは、ＥＬＩＳＡスコア範囲が、他のパネルでは０〜５であるものと比較すると０〜０．６である図５Ｂからのデータの拡大版を示している。
【図６Ａ−Ｆ】図６のパネルＡ〜Ｆは、本発明のＺＦＰ８１９６内の２塩基対を読み飛ばすように選択されたリンカーについてのギャップ選択性を示しているグラフである。図６Ａ〜６Ｅは、ＺＦＰ８１９６のバックグラウンド内のモジュールサブサイト間の２塩基対ギャップを読み飛ばすように選択されたリンカーのＥＬＩＳＡテストからの結果を示している。図６Ａ〜６Ｃは、選択されたリンカー２ｆ（配列番号６９）、２ｄ（配列番号７０）及び２ｅ（配列番号７１）に関する結果を示し、一方図６Ｄは、先に公開された可撓性リンカー（ＬＲＱＫＤＧＧＧＳＥＲＰ（配列番号６８））に関する結果を示し、並びに図６Ｅは、標準可撓性リンカー（ＴＧＧＧＧＳＧＧＳＱＫＰ（配列番号１４））に関する結果を示している。図６Ｆは、ＥＬＩＳＡスコア範囲が、他のパネルでは０〜１であるのに比較して０〜０．１である図６Ｅで示されたデータの拡大版を示している。「ギャップ配列」とは、（−）がギャップ非形成標的を示すモジュールサブササイト間の塩基（複数可）の同一性である。選択されたリンカー（図６Ａ〜６Ｃ）は、１塩基対ギャップ又はギャップがない場合と比較しての２塩基対ギャップに対する明らかな優先性を立証したが、一方図６Ｄ及び６Ｅ中の対照リンカーは、有効性の劣った全体の結合を示し、並びにギャップ選択性がほとんどないことを示した。
【図７Ａ−Ｂ】図７のパネルＡ及びＢは、本発明の異なるＺＦＰのバックグラウンドに対する１塩基対スキッピングリンカーの可搬性を分析するように設計された研究からのＥＬＩＳＡデータの概要を示すパネルである。１２個の異なるＺＦＰがテストされた（ＺＦＰ1，ＺＦＰ２等として表示）。図７Ａは、ＺＦＮとして使用される場合、内因性ＩＬ２Ｒγ遺伝子座を効果的に改変することが示された（Ｕｒｎｏｖら著（２００５年）Ｎａｔｕｒｅ  ４３５（７０４２）：６４６〜６５１頁）標準陽性対照ＺＦＰに正規化されたＥＬＩＳＡスコアを示している。図７Ｂは、標準可撓性リンカーＴＧＧＧＧＱＫＰ（配列番号２）を有する各々の親ＺＦＰに更に正規化された全てのスコアを示している。図７Ｂ中の下線が施された数値は、可撓性リンカーＴＧＧＧＧＱＫＰ（配列番号２）を有する同一のホストＺＦＰと比較して、選択されたリンカー（ｌｅ（配列番号１２）、ｌｆ（配列番号５４）、ｌｄ（配列番号５６）、及びｌｃ（配列番号５５））を有するＺＦＰについてのＥＬＩＳＡスコアでの４倍を超える改善を示している。全体として、リンカーｌｅ、ｌｆ、ｌｄ及びｌｃは、可撓性リンカーを超える３〜５倍のＥＬＩＳＡスコアでの一般的増大へと誘導する。
【図８Ａ−Ｂ】図８のパネルＡ及びＢは、本発明の異なるＺＦＰのバックグラウンドに対する２塩基対スキッピングリンカーの可搬性を分析するように設計された研究からのＥＬＩＳＡデータの概要を示すパネルである。６種の異なるＺＦＰがテストされた（ＺＦＰ１３、ＺＦＰ１４等として表示）。図８Ａは、ＺＦＮとして使用された場合、内因性ＩＬ２Ｒγ遺伝子座を効果的に改変することが示された（Ｕｒｎｏｖら著（２００５年）Ｎａｔｕｒｅ  ４３５（７０４２）：６４６〜６５１頁）標準陽性対照ＺＦＰに正規化されたＥＬＩＳＡスコアを示している。図８Ｂは、標準可撓性リンカーＴＧＧＧＧＳＧＧＳＱＫＰ（配列番号１４）を有する各々の親ＺＦＰに更に正規化された全てのスコアを示している。図８Ｂ中の下線が施された数値は、可撓性リンカーＴＧＧＧＧＳＧＧＳＱＫＰ（配列番号１４）を有する同一のホストＺＦＰと比較して、選択されたリンカー（２ｆ（配列番号６９）、２ｄ（配列番号７０）及び２ｅ（配列番号７１））を有するＺＦＰについてのＥＬＩＳＡスコアでの２倍を超える改善を示している。全体として、リンカー２ｆ（配列番号６９）、２ｄ（配列番号７０）及び２ｅ（配列番号７１）は、可撓性リンカーを超える１．９〜２．４倍のＥＬＩＳＡスコアでの一般的増大へと誘導した。
【図９Ａ−Ｂ】図９のパネルＡ及びＢは、本発明の選択されたリンカーを含有するＺＦＮを使用した、ＣＥＬ-Ｉアッセイによって決定されるような、内因性遺伝子改変研究の結果を示すパネルである。図９Ａ及び９Ｂは、異なるＺＦＮにおいて本明細書に記載のようなリンカーが使用され得るかどうかを決定するために、ＣＥＬ−Ｉアッセイ（非相同末端結合（ＮＨＥＪ）活性を測定すること、Ｓｕｒｖｅｙｏｒ（商標）、Ｔｒａｎｓｋａｒｙｏｔｉｃ社）によって、内因性遺伝子座にてのＺＦＮヌクレアーゼ活性を決定するために使用される実施例のゲルを示している。図９Ａに示されるゲルは、ＺＦＮ３及びＺＦＮ４バックグラウンド中のｌｅ（配列番号１２）、ｌｆ（配列番号５４）、ｌｄ（配列番号５６）、及びｌｃ（配列番号５５）リンカーからの結果を示している。図９Ｂに示されるゲルは、ＺＦＮ１４バックグラウンド中の２ｆ、２ｄ及び２ｅからの結果を示している。ＮＨＥＪによる遺伝子改変％である「Ｇｅｎｅ  ｍｏｄ．（％）」が、レーンの下に表示されている。陰性対照「ｎｅｇ」は、ＧＦＰを有するプラスミドでトランスフェクトされた試料である。標準可撓性リンカー（図９Ａに関してはＴＧＧＧＧＳＱＫＰ（配列番号２）及び図９Ｂに関してはＴＧＧＧＧＳＧＧＳＱＫＰ（配列番号１４））を使用するＺＦＮからの結果が、「Ｃ」のラベルを付けたレーンで示されている。ラベル付けされていないレーンは、これらの研究では更には展開されなかった他のリンカーを有するＺＦＮの試料を含有する。ゲル中のデータは、本明細書に記載のようなリンカーが、可撓性リンカーと比較して、遺伝子改変のレベルを著しく増大させることを立証している。
【図１０Ａ−Ｂ】図１０のパネルＡ及びＢは、１塩基対を読み飛ばすために選択された表示されたリンカーを含有する、本発明の図９に関して上述されたような、ＺＦＮに対する遺伝子改変研究の概要を示すパネルである。図１０Ａは、テストされる５つのリンカーのセット（可撓性、ｌｅ（配列番号１２）、ｌｆ（配列番号５４）、ｌｄ（配列番号５６）、及びｌｃ（配列番号５５））を有する各々のＺＦＮについての遺伝子改変％の定量結果である。図１０Ｂは、可撓性リンカー（ＴＧＧＧＧＳＱＫＰ、配列番号２）に正規化された、この同一のデータを示し、並びに全ての活性ＺＦＮ対全体にわたる遺伝子改変における平均増加も示している。高発現条件（実施例３を参照）を使用して生成された試料は、灰色で強調されている。遺伝子改変のレベルを２倍を超えるまで改善した例示的リンカーを有するＺＦＮは、図１０Ｂで下線が施されている。全体として、リンカーｌｅ（配列番号１２）、ｌｆ（配列番号５４）、ｌｄ（非列番号５６）、及びｌｃ（配列番号５５）を有するＺＦＮは、可撓性リンカーを有するそれらの各ホストＺＦＮを超える１．８〜２．８倍の遺伝子改変における平均増加へと導く。
【図１１Ａ−Ｂ】図１１のパネルＡ及びＢは、６つのホストＺＦＮのモジュールサブセット間の２塩基対を読み飛ばすように選択された表示されたリンカーを含有するＺＦＮについての、本発明の図９について記載されたような遺伝子改変研究の概要を示すパネルである。図１１Ａは、テストされる４つのリンカーのセット（可撓性、２ｆ（配列番号６９）、２ｄ（配列番号７０）、及び２ｅ（配列番号７１））を有する各々のＺＦＮについての遺伝子改変の％の定量結果である。図１１Ｂは、可撓性リンカー（ＴＧＧＧＧＳＧＧＳＱＫＰ、配列番号１４）に正規化された、この同一のデータを示し、並びに活性ＺＦＮ対の全体にわたる遺伝子改変における平均増加も示している。高発現条件（実施例３を参照）を使用して生成された試料は、灰色で強調されている。遺伝子改変のレベルを２倍を超えるまで改善した例示的リンカーを有するＺＦＮは、図１１Ｂで下線が施されている。リンカー２ｆ（配列番号６９）、２ｄ（配列番号７０）、及び２ｅ（配列番号７１）を有するＺＦＮは、可撓性リンカーを有するそれらの各ホストＺＦＮを超える１．５〜２．０倍の遺伝子改変における平均増加へと導いた。
【図１２】本発明の２塩基対ギャップをスパンするリンカーについての二次選択のために使用されたホストＺＦＰ８１９６のアミノ酸配列を示す図である。アミノ酸配列は、単一文字コードで示されている。この配列は、アミノ末端→カルボキシ末端方向で表示されていて、これによって、タンパク質のアミノ末端が、図１の最初のメチオニンであり、並びにカルボキシ末端が、図４の最後のセリンとなる。「Ｆ１］（配列番号１３０）、「Ｆ２]（配列番号１３１）、「Ｆ３」（配列番号１３２）及び「Ｆ４」（配列番号１３３）は、タンパク質の第１、第２、第３及び第４番目のフィンガーをそれぞれ示す。認識ヘリックスは四角で囲まれている。リンカーライブラリ-は、中心リンカー中の２つの残基に関するコドンを、５〜７個の完全に無作為割付されたコドンの混合物で置き換えることによって、次に、得られたフェニルアラニン（Ｆ）、リジン（Ｌ）、又はチロシン（Ｙ）残基のいずれかに１個のコドンを無作為割付することによって、並びに最後に、３個のコドンをアルギニン（Ｒ）、プロリン（Ｐ）、及びプロリン（Ｐ）に固定させることによって生成された。ライブラリーコドンは、（ＮＮＳ）5-7及び（Ｆ／Ｌ／Ｙ）によって示されている。
【図１３Ａ−Ｂ】本発明の２塩基対ギャップをスパンするリンカーに関する二次選択からのファージプールのギャップ選択性及びこの選択で取得されたクローンの結果的に得られたアミノ酸配列を示すパネルである。図１３Ａは、表２Ｃ中の各ＺＦＰ８１９６標的への結合についてテストされた、２塩基対挿入ギャップ（ＡＴＡＡＡＣＴＧｄｂＣＡＡＡＡＧＧＣ（配列番号３４）（表２））を有する標的を使用して、ＺＦＰ８１９６ライブラリーから選択されたファージプールを示している。各々のテストはまた、ＤＮＡへの非特異的結合並びに標的部位を包含しない陰性対照試料を除外するために、１つの他のホストＺＦＰについての対照標的を包含する。各標的に結合されることに成功したファージの％が示されている。ファージプールは、選択の６ラウンドから取得されたものであった。保持効率が、先に記載されたように（Ｒｅｂａｒら著、Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９９６年（２６７）：１２７〜１４９頁）、実質的に決定された。図１３Ｂは、２ＺＦＰ８１９６における二次選択からの塩基対ギャップを読み飛ばすように選択されたリンカーのアミノ酸配列（配列番号１７５〜２１０）を示している。選択されたリンカーは、プロリン及びアルギニンを豊富に含む（隈取りされて表示）。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
詳細な説明
本明細書には、ＤＮＡ結合ドメイン、特にジンクフィンガーモジュールを、他のジンクフィンガーモジュール連結させるための組成物が記載される。先に記載されたリンカーとは異なり、本明細書に記載のリンカーにより、１塩基対又は２塩基対のモジュールサブサイト間にギャップを有する標的の優先的及び／又は選択的結合が可能となる。このリンカーはまた、現行のリンカー設計よりもより高い親和性で、１塩基対又は２塩基対ギャップを有する標的を結合することが可能である。例示的リンカーが表１１及び１３に示されている。したがって、本明細書に記載のあるリンカーは、特異的標的部位に結合するジンクフィンガータンパク質を設計するための上記能力を著しく高め、これによって、これらのリンカーを含む融合タンパク質（例えば、ＺＦＰ−ＴＦ又はＺＦＮ）の活性を増加させる。
【００１６】
概要
本明細書に開示された方法の実行、並びに組成物の調製及び使用は、特記されない限り、当業者の技術内であるような分子生物学、バイオ化学、クロマチン構造及び分析、計算化学、細胞培養、組換え体ＤＮＡ及び関連分野の慣用的技術を採用する。これらの技法は、文献に完全な形で説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら著、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９年及び第３版、２００１年；Ａｕｓｕｂｅｌら著、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７年及び定期的更新；ＭＥＴＨＯＤ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹシリーズ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９８年；Ｗｏｌｆｆｅ著、ＣＨＲＯＭＡＴＩＮ  ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ  ＡＮＤ  ＦＵＮＣＴＩＯＮ，第３版、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９８年；ＭＥＴＨＯＤ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，第３０４巻、「Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ」（Ｐ．Ｍ．Ｗａｓｓａｒｍａｎ及びＡ．Ｐ．Ｗｏｌｆｆｅ編集），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９９年；並びにＭＥＴＨＯＤ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，第１１９巻，「Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」（Ｐ．Ｂ．Ｂｅｃｋｅｒ編集）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，１９９９年を参照されたい。
【００１７】
定義
用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」、及び「オリゴヌクレオチド」は、互換的に用いられ、線状若しくは環状構造の、及び単鎖形若しくは二重鎖形のいずれかのデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドポリマーを指す。本開示の目的のために、これらの用語は、ポリマーの長さに関して限定するものとみなされるべきではない。この用語は、天然ヌクレオチドの既知の類似体、並びに塩基、糖及び／又はリン酸部分（例えば、ホスホロオチオエート骨格）で改変されているヌクレオチドを包含し得る。概して、特定のヌクレオチドの類似体（analogue）は、同じ塩基対特異性をもつ、すなわちＡの類似体はＴと塩基対合する。
【００１８】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを指すために互換的に用いられる。この用語はまた、その１つ以上のアミノ酸が、対応する天然発生型アミノ酸の化学的類似体又は改変された誘導体であるアミノ酸ポリマーに適用される。
【００１９】
例えば、２つのペプチドが保存的置換によってのみ異なる場合、典型的には、１つのポリペプチドは第２のポリペプチドと実質的に同一である。タンパク質を説明する場合、「保存的置換」とは、そのタンパク質の活性を実質的に変更しないタンパク質のアミノ酸組成物での変化を指す。したがって、特定のアミノ酸配列の「保存的に改変された変形形態」とは、タンパク質活性に関して重要ではないようなアミノ酸の配列のアミノ酸置換を指すか、又は重要なアミノ酸の置換でさえも実質的に活性を変更しないように、同様な特性（例えば、酸性の、塩基性の、負荷電又は正荷電の、極性又は非極性のなど）を有する他のアミノ酸でのアミノ酸の置換を指す。機能的に同様なアミノ酸をもたらす保存的置換表は、当該分野で周知である。例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ（１９８４年）Ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙを参照されたい。更には、コード化された配列内の単一のアミノ酸又はアミノ酸の少ない割合を変更、付加、又は欠失する個々の置換、欠失又は付加もまた、「保存的に改変された変形形態」である。
【００２０】
「結合」は、巨大分子間（例えば、タンパク質と核酸との間）の配列特異的、非共有結合的相互作用を指す。その相互作用が全体として配列特異的である限りにおいて、結合相互作用の全ての成分が配列特異的である（例えば、ＤＮＡ骨格中のリン酸塩基と接触すること）必要はない。このような相互作用は、１０-6Ｍ-1又はそれ以下の解離定数（Ｋd）によって概ね特徴付けられる。「親和性」は、結合の強度を指し、増大した結合親和性は、より低いＫdによって定義される。
【００２１】
「結合タンパク質」は、別の分子に非共有結合的に結合することが可能なタンパク質である。結合タンパク質は、例えば、ＤＮＡ分子（ＤＮＡ結合タンパク質）、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ結合タンパク質）及び／又はタンパク質分子（タンパク質結合タンパク質）に結合し得る。タンパク質結合タンパク質の場合、結合タンパク質はそれ自体に結合し得（ホモ二量体、ホモ三量体などを形成するために）及び／又は１つの異なるタンパク質又はタンパク質（複数）の１つ以上の分子に結合し得る。結合タンパク質は、結合活性の１つ以上の型を有することができる。例えば、ジンクフィンガータンパク質は、ＤＮＡ結合活性、ＲＮＡ結合活性及びタンパク質結合活性を有する。
【００２２】
「ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質」（又は結合ドメイン）は、１つ以上のジンクフィンガーにより配列特異的様式でＤＮＡを結合するタンパク質、又はより大きなタンパク質内のドメインであり、このジンクフィンガーとは、その構造が亜鉛イオンの配位を通して安定化される結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域である。用語ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質は、ジンクフィンガータンパク質又はＺＦＰとしてしばしば略記される。
【００２３】
ジンクフィンガー結合ドメイン（例えば、ジンクフィンガーの認識領域）は、所定のヌクレオチド配列に結合するように「操作され」得る。ジンクフィンガータンパク質を操作するための方法の非限定的例は、設計及び選択である。設計されたジンクフィンガータンパク質は、その設計／組成物が、原則的に合理的な基準から生じる天然に存在しないタンパク質である。設計のための合理的基準は、現存するＺＦＰ設計及び結合データの情報を保存するデータベース内の処理情報に関する置換規則及びコンピュータ処理アルゴリズムの適用を包含する。例えば、米国特許第６，１４０，０８１号、同第６，４５３，２４２号、及び同第６，５３４，２６１号を参照されたく、並びに国際公開第９８／５３０５８号、同第９８／５３０５９号、同第０２／０１６５３６号及び同第０３／０１６４９６号もまた参照されたい。
【００２４】
「選択された」ジンクフィンガータンパク質とは、その生成がファージ提示、相互作用捕捉又はハイブリッド選択などの経験的過程から主にもたらされる天然では見出されないタンパク質である。例えば、米国特許第５，７８９，５３８号、同第５，９２５，５２３号、同第６，００７，９８８号、同第６，０１３，４５３号及び同第６，２００，７５９号、並びに国際公開第９５／１９４３１号、同第９６／０６１６６号、同第９８／５３０５７号、同第９８／５４３１１号、同第００／２７８７８号、同第０１／６０９７０号、同第０１／８８１９７号及び同第０２／０９９０８４号を参照されたい。
【００２５】
「調節ドメイン」又は「機能ドメイン」とは、ＤＮＡ結合ドメイン、すなわちＺＦＰに連結された場合、転写モジュレーション活性を有するタンパク質又はタンパク質ドメインを指す。典型的には、調節ドメインは、転写モジュレーションをもたらすために、ＺＦＰに共有結合的に又は非共有結合的に連結されている（例えば、融合分子を形成するために）。調節ドメインは、活性化ドメイン又は抑制ドメインであり得る。活性化ドメインとしては、限定されるものではないが、ＶＰ１６、ＶＰ６４及び核因子カッパＢのｐ６５サブユニットが挙げられる。抑制ドメインとしては、限定されるものではないが、ＫＯＸ、ＫＲＡＢ、ＭＢＤ２Ｂ及びｖ−ＥｒｂＡが挙げられる。追加的な調節ドメインとしては、例えば転写因子及びコファクター（例えば、ＭＡＤ、ＥＲＤ、ＳＩＤ、初期成長応答因子１、及び核ホルモンレセプター）、エンドヌクレアーゼ、インテグラーゼ、レコンビナーゼ、メチルトランスフェラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼなどが挙げられる。アクチベーター及びリプレッサーには、コアクチベーター及びコリプレッサー（例えば、Ｕｔｌｅｙら著、Ｎａｔｕｒｅ  ３９４：４９８〜５０２頁（１９９８年））を含める。あるいは、ＺＦＰは、転写モジュレーションをもたらすために、調節ドメインを有せずに単独で作用することができる。調節ドメインはまた、開裂ドメイン又は開裂ハーフドメインなどのヌクレアーゼであり得る。
【００２６】
「開裂」とは、ＤＮＡ分子の共有結合骨格の切断を指す。開裂は、限定されるものではないが、ホスホジエステル結合の酵素的又は化学的加水分解が挙げられる種々の方法によって開始され得る。単鎖開裂及び二重鎖開裂の双方ともに可能であり、並びに二重鎖開裂は、２本の別個の単鎖開裂事象の結果として生じ得る。ＤＮＡ開裂は、平滑末端又は付着末端のいずれかの生成をもたらすことができる。ある実施形態では、融合ポリペプチドは、標的二重鎖ＤＮＡ開裂のために用いられる。
【００２７】
「開裂ハーフドメイン」とは、ポリペプチド配列であり、これは第２のポリペプチド（同一又は異なるポリペプチドのいずれか）と併せて、開裂活性（好ましくは二重鎖開裂活性）を有する複合体を形成する。用語「第１及び第２の開裂ハーフドメイン」、「＋及び−開裂ハーフドメイン」、並びに「右及び左開裂ハーフドメイン」は、二量体化された開裂ハーフドメインの対を指すように互換的に使用される。
【００２８】
「操作された開裂ハーフドメイン」とは、別の開裂ハーフドメイン（例えば、別の操作された開裂ハーフドメイン）と共に絶対的ヘテロ二量体を形成するように改変された、開裂ハーフドメインである。その全体が参照により本明細書に組み込まれた、米国特許公開第２００５００６４４７４号及び国際公開第２００７／１３９８９号もまた参照されたい。
【００２９】
「クロマチン」とは、細胞ゲノムを含む核タンパク質構造である。細胞クロマチンは、核酸、一次ＤＮＡ、並びにヒストン及び非ヒストン染色体タンパク質を包含するタンパク質を含む。真核細胞クロマチンの大部分は、ヌクレオソームの形で存在し、その中でヌクレオソーム核は、それぞれのヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３及びＨ４の２つを含む八量体に結合されたＤＮＡの約１５０個の塩基対を含み、並びにリンカーＤＮＡ（生物体に依存して種々の長さの）が、ヌクレオソーム核の間に延びている。ヒストンＨ１の１つの分子は、一般的にリンカーＤＮＡと結びついている。本開示の目的のために、用語「クロマチン」は、原核細胞及び真核細胞の双方で、細胞ヌクレオソームの全ての型を包含することを意味する。細胞クロマチンには、染色体クロマチン及びエピソームクロマチンの両方を含める。
【００３０】
「染色体」とは、細胞のゲノムの全て又はその一部を含むクロマチン複合体である。細胞のゲノムは、その核型によってしばしば特性評価され、これは、細胞のゲノムを含む全ての染色体の集合体である。細胞のゲノムは、１つ以上の染色体を含むことができる。
【００３１】
「エピソーム」とは、複製する核酸、核タンパク質複合体又は細胞の染色体の核型の一部ではない核酸を含む他の構造である。エピソームの例としては、プラスミド及び特定のウィルスゲノムが挙げられる。
【００３２】
「アクセス可能な領域」とは、細胞染色体内にある部位であり、核酸内に存在する標的部位が、その標的部位を認識する外因性分子によって結合され得る。いかなる特定の理論によって束縛されることは望まないが、アクセス可能な領域は、ヌクレオソーム構造中に収容されていない領域であると考えられる。アクセス可能な領域の明確な構造は、例えば、ヌクレアーゼなどの化学的及び酵素的プローブに対する感応性によって頻繁に検出され得る。
【００３３】
「標的部位」又は「標的配列」とは、結合のための十分な条件が存在するならば、結合分子がそれに結合するであろう核酸の一部を画定する核酸配列である。例えば、配列５’−ＧＡＡＴＴＣ−３’は、Ｅｃｏ  ＲＩ制限エンドヌクレアーゼのための標的部位である。
【００３４】
「モジュールサブサイト」とは、結合のための十分な条件がもたらされた場合、それにより大きなジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質内のジンクフィンガーモジュール（例えば、１、２、３個又はそれ以上のジンクフィンガー）が結合するであろう核酸の一部分を画定する核酸配列である。
【００３５】
「外因性」分子とは、細胞内に通常存在しないが、１つ以上の遺伝的方法、生化学的方法又は他の方法によって細胞内に導入され得る分子である。「細胞内に通常存在する」は、細胞の特定の発生段階及び環境条件に関して決定される。したがって、例えば、筋肉の胚発生中にだけ存在する分子は、成人筋肉細胞に関しては外因性分子である。同様に、熱ショックによって誘導された分子は、非熱ショック細胞に関しては外因性分子である。外因性分子は、例えば、機能不良な内因性分子の機能する変型、正常に機能する内因性分子の機能不良変型又はオルソローグ（異種からの内因性分子の機能する変型）を含むことができる。
【００３６】
外因性分子は、とりわけ、組み合わせ化学プロセスによって生成されるような小分子、又はタンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖類、上記分子の任意の改変誘導体、又は１つ以上の上記分子を含む任意の複合体などの巨大分子であり得る。ＤＮＡ及びＲＮＡを含める核酸は、単鎖又は二重鎖であり得、線状、分岐状又は環状であり得、又、任意の長さであり得る。核酸としては、二重鎖を形成可能な核酸、並びに三重鎖形成核酸が挙げられる。例えば、米国特許第５，１７６，９９６号及び同第５，４２２，２５１号を参照されたい。タンパク質としては、限定されるものではないが、ＤＮＡ結合タンパク質、転写因子、クロマチン再構成因子、メチル化ＤＮＡ結合タンパク質、ポリメラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、インテグラーゼ、レコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ギラーゼ及びヘリカーゼが挙げられる。
【００３７】
外因性分子は、内因性分子、例えば外因性タンパク質又は核酸などの、内因性分子と同一型であり得る。例えば、外因性核酸は、感染ウィルスゲノム、細胞内に導入されたプラスミド若しくはエピソーム、又は細胞内に通常存在しないような染色体を含み得る。外因性分子の細胞内への導入方法は当業者に既知であり、限定されるものではないが、脂質仲介輸送（すなわち、天然脂質及びカチオン性脂質を含めるリポソーム）、電気穿孔法、直接注入法、細胞融合、粒子照射、リン酸カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン仲介輸送及びウィルスベクター仲介輸送が挙げられる。
【００３８】
対照的に、「内因性」分子は、特定の環境条件下、特定の発生段階にて特定の細胞内に通常存在する分子である。例えば、内因性核酸は、染色体、ミトコンドリアのゲノム、葉緑体若しくは他の細胞内小器官、又は天然発生型エピソーム核酸を含むことができる。追加的な内因性分子としては、例えば、転写因子及び酵素を挙げることができる。
【００３９】
「融合」分子とは、その中で２つ以上のサブユニット分子が、好ましくは共有結合で連結されている分子である。このサブユニット分子は、分子の同一の化学的型であり得、又は分子の異なる化学的型であり得る。融合分子の第１の型としては、限定されるものではないが、融合タンパク質（例えば、ＺＥＰ  ＤＮＡ結合ドメインと開裂ドメインとの間の融合）及び融合核酸（例えば、前述の融合タンパク質をコードする核酸）が挙げられる。融合分子の第２の型の例としては、限定されるものではないが、三重鎖形成核酸と１つのポリペプチドとの間の融合、及び小溝結合剤と核酸との間の融合が挙げられる。
【００４０】
細胞内での融合タンパク質の発現は、この融合タンパク質の細胞への送達による、又はこの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの送達による結果生じ得、ここにおいて、このポリヌクレオチドが転写され、次いで転写物が翻訳され、融合タンパク質を生成する。トランススプライシング、ポリペプチド開裂及びポリペプチド連結もまた、細胞内でのタンパク質の発現に含まれ得る。細胞へのポリヌクレオチド及びポリペプチド送達に関する方法は、本開示の別の箇所で提示されている。
【００４１】
本開示の目的のために、「遺伝子」とは、遺伝子産物（以下を参照）をコードするＤＮＡ領域、並びに遺伝子産物の生成を調節する全てのＤＮＡ領域（このような調節配列が、コード化配列及び／又は転写された配列に隣接していようがいまいが）が挙げられる。したがって、遺伝子としては、限定されるものではないが、プロモーター配列、ターミネーター、リボソーム結合部位及び内部リボソーム侵入部位などの翻訳調節配列、エンハンサー、サイレンサー、インシュレーター、境界因子、複製開始点、マトリックス付着部位及び遺伝子座制御領域が挙げられる。
【００４２】
「遺伝子発現」とは、遺伝子内に封入された情報の遺伝子産物への変換を指す。遺伝子産物は、遺伝子の直接転写産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造ＲＮＡ又はＲＮＡの任意の他の型）又はｍＲＮＡの翻訳によって生成されたタンパク質であり得る。遺伝子産物はまた、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化、及びエディティングによって改変されるＲＮＡ、並びに、例えばメチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰ−リボシル化、ミリスチル化、及びグリコシル化によって改変されたタンパク質が挙げられる。
【００４３】
遺伝子発現の「モジュレーション」とは、遺伝子の活性における変化を指す。発現のモジュレーションとは、限定されるものではないが、遺伝子活性化及び遺伝子抑制が挙げられ得る。遺伝子不活性化とは、本明細書に記載のＺＦＰを含まない細胞と比較した場合の遺伝子発現における任意の減少を指す。したがって、遺伝子不活性化は、部分的又は完全的であってよい。
【００４４】
「真核」細胞とは、限定されるものではないが、菌類細胞（酵母など）、植物細胞、動物細胞、哺乳類細胞及びヒト細胞（例えば、Ｔ細胞）が挙げられる。
【００４５】
「対象領域」とは、例えば、外因性分子に結合することが望ましいような、遺伝子内又はその遺伝子に隣接する遺伝子又は非コード化配列などの細胞クロマチンの任意の領域である。結合は、標的ＤＮＡ開裂及び／又は標的組換えのためであり得る。対象領域は、例えば、染色体、エピソーム、細胞内小器官ゲノム（例えば、ミトコンドリア、葉緑体）、又は感染ウィルスゲノム中に存在し得る。対象領域は、遺伝子のコード化領域内、例えば先導配列、トレーラー配列若しくはイントロンなどの転写された非コード領域内、又はコード領域の上流若しくは下流のいずれかの非転写領域内であり得る。対象領域は、長さで２０，０００ヌクレオチド対までの単ヌクレオチド対、又はヌクレオチド対の任意の整数値、又は最大で染色体の長さほどであり得る。対象領域は、連続的核酸配列だけを含む必要はない。
【００４６】
用語「作動可能な連結（operative linkage）」及び「作動可能に連結された（operatively linked）」（「作動可能に連結された（operably linked）」）とは、両構成要素が正常に機能し、又、その構成要素の少なくとも１つが、他の構成要素の少なくとも１つに及ぼされる機能を仲介し得るように構成要素が配置されている、２つ以上の構成要素（配列要素など）の並置に関して互換的に用いられる。実例として、１つ以上の転写調節因子の存在又は不在に応答して、転写調節配列がコード化配列の転写のレベルを制御する場合、プロモーターなどの転写調節配列が、コード化配列に作動可能に連結される。転写調節配列は、コード化配列と概ねシスで作動可能に連結されるが、これに直接的に隣接する必要はない。例えば、エンハンサーは、それらが連続的でなくとも、コード化配列に作動可能に連結される転写調節配列である。
【００４７】
融合ポリペプチドに関して、用語「作動可能に連結された」とは、構成要素のそれぞれが、このように連結されなかった場合と同様に、他の構成要素への連結において同一の機能を実行する。例えば、ＺＥＰ  ＤＮＡ結合ドメインが開裂ドメインに融合されているような融合ポリペプチドに関して、この融合ポリペプチドにて開裂ドメインが標的部位の近くでＤＮＡを開裂させることが可能であると同時に、このＺＦＰ  ＤＮＡ結合ドメイン部分がその標的部位及び／又はその結合部位に結合することができる場合、このＺＥＰ  ＤＮＡ結合ドメイン及び開裂ドメインは、作動可能な連結の状態にある。
【００４８】
タンパク質、ポリペプチド又は核酸の「機能的断片」とは、その配列が完全長のタンパク質、ポリペプチド又は核酸に同一ではないが、完全長のタンパク質、ポリペプチド又は核酸の１つ以上の機能を維持しているタンパク質、ポリペプチド又は核酸である。機能的断片は、対応する天然分子よりも多い、少ない、又は同一の数の残基を所有し得、及び／又は１つ以上のアミノ酸置換若しくはヌクレオチド置換を含有し得る。核酸の機能（例えば、コード機能、別の核酸にハイブリダイズする能力）を決定するための方法は、当該技術分野では周知である。同様に、タンパク質機能を決定する方法も周知である。例えば、ポリペプチドのＤＮＡ結合機能は、例えば、フィルター結合、電気泳動移動シフト、又は免疫沈降アッセイによって決定される。ＤＮＡ開裂は、ゲル電気泳動によって検定される。上記のＡｕｓｕｂｅｌら著の文献を参照されたい。別のタンパク質と相互作用するタンパク質の能力は、例えば、遺伝的又は生化学的方法の双方で、共免疫沈降法、２種ハイブリッドアッセイ又は相補性によって決定され得る。例えば、Ｆｉｅｌｄｓら著（１９８９年）Ｎａｔｕｒｅ  ３４０：２４５〜２４６頁、米国特許第５，５８５，２４５号及びＰＣＴ国際公開第９８／４４３５０号を参照されたい。
【００４９】
リンカー
本明細書に記載されたものは、ＤＮＡ結合モジュール（例えば、ジンクフィンガーモジュール）を互いに対して融合（連結）させるアミノ酸配列である。本明細書に記載のリンカーを使用して融合されたジンクフィンガーモジュールは、１、２、３、４つ又はそれ以上のジンクフィンガーを含有してよい。ある実施形態において、ジンクフィンガーモジュールは、１、２、又は３つのジンクフィンガーを含有し、一緒に連結される場合、それらは３つまたはそれ以上のフィンガーのジンクフィンガータンパク質を形成する。
【００５０】
本明細書に記載のリンカー配列は、ジンクフィンガー中のαヘリックスの最後の残基と次のジンクフィンガー中のβシートの最初の残基との間に延びている。したがって、このリンカー配列は、２つのジンクフィンガーを一緒に連結する。典型的には、ジンクフィンガー中の最後の（Ｃ末端）アミノ酸は、Ｃ末端亜鉛配位残基であり、一方芳香族残基（例えばＰｈｅ）は、典型的には次のジンクフィンガーの最初のアミノ酸である。したがって、「野生型」ジンクフィンガーでは、スレオニンがリンカーの最初の残基であり、プロリンがリンカーの最後の残基である。故に、例えば、Ｚｉｆ２６８に対するカノニカルリンカー配列は、ＴＧ（Ｅ／Q）（Ｋ／Ｒ）Ｐ（配列番号１２９）である。例えば、米国特許第６，４７９，６２６号、同第６，９０３，１８５号及び同第７，１５３，９４９号を参照されたい。
【００５１】
更なるリンカーが、例えば米国特許公開第２００３０１１９０２３号に記載され、複数のグリシン残基（例えば、ＴＧＧＧＧＳＱＫＰ（配列番号２）、ＴＧＧＧＧＳＧＧＳＱＫＰ（配列番号１４）及びＴＧＧＧＧＳＧＧＳＧＧＳＱＫＰ（配列番号１５）、ＴＧＧＥＫＰ（配列番号１６）、ＴＧＧＱＫＰ（配列番号１７）、ＴＧＧＳＧＥＫＰ（配列番号１８）、ＴＧＧＳＧＱＫＰ（配列番号１９）、ＴＧＧＳＧＧＳＧＥＫＰ（配列番号２０）、及びＴＧＧＳＧＧＳＧＱＫＰ（配列番号２１）を含むリンカーが記載されている。
【００５２】
典型的には、リンカーは、そのリンカーをコードする組換え体核酸と、そのリンカーアミノ酸配列により融合されている核酸結合モジュールとを使用して作製される。リンカーはまた、ペプチド合成を用いて作られ、次いで核酸結合モジュールに連結されてもよい。核酸の操作法及びペプチド合成法は、当該技術分野で既知である（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら著、１９９１年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂoｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，Ｃｏｌd  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓを参照）。
【００５３】
本明細書に記載のリンカーは、先に使用されたリンカーよりもより厳密（rigid）であり、サブサイトが特定数の塩基対によって分離される場合だけに、各ジンクフィンガーとその標的部位とが効率的に結合することが可能となる。
【００５４】
したがって、先行のリンカーとは異なり、本明細書に記載のリンカーは、少なくとも１つの内部残基又はＮ末端プロリン残基、すなわち、リンカーのＣ末端ではないプロリン残基を含む。本明細書に記載のリンカーは、次の一般アミノ酸構造：
ＸN末端−Ｘn−ＸC末端
（式中、Ｘは任意のアミノ酸残基であり、Ｘnは少なくとも３個のアミノ酸残基と少なくとも１個のＸN末端を含み、並びにＸnはプロリン残基を含む）
を有する。このようなリンカーの非限定的例が、表４、５、６、９、１０、１１又は１３中に示されている。更には、本明細書に記載のリンカーはまた、少なくとも２個の塩基残基、例えば１個以上のアルギニン残基、１個以上のヒスチジン残基、１個以上のリジン残基又はこれらの組み合わせを典型的に含む。
【００５５】
本発明のリンカーは、典型的には、長さで５個又はそれ以上のアミノ酸の、任意の長さであり得る。ある実施形態では、このリンカーは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又はそれ以上の個数のアミノ酸長である。
【００５６】
ＤＮＡ結合モジュール
本明細書に記載のリンカー配列は、ＤＮＡ結合モジュールを連結させるために好都合に用いられる。
【００５７】
任意のＤＮＡ結合ドメインが、本明細書で開示された方法で使用され得る。ある実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ジンクフィンガータンパク質を含む。好ましくは、ジンクフィンガータンパク質は、選択の標的部位に結合するよう操作されているという点で、非天然発生型である。例えば、Ｂｅｅｒｌｉら著、（２００２年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１３５〜１４１頁；Ｐａｂｏら著（２００１年）Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０：３１３〜３４０頁；Ｉｓａｌａｎら著（２００１年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.１９：６５６〜６６０頁；Ｓｅｇａｌら著（２００１年）Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：６３２〜６３７頁；Ｃｈｏｏら著（２０００年）Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．  １０：４１１〜４１６頁を参照されたい。操作されたジンクフィンガー結合ドメインは、天然発生型ジンクフィンガータンパク質に比べて、新規の結合特異性を有し得る。操作法としては、限定されるものではないが、合理的設計及び選択の種々の型が挙げられる。合理的設計としては、例えば、三重鎖（又は四重鎖）ヌクレオチド配列と個々のジンクフィンガーアミノ酸配列を含むデータベースを使用するものが挙げられ、そこにおいて、それぞれの三重鎖又は四重鎖ヌクレオチド配列は、特定の三重鎖又は四重鎖配列を結合するジンクフィンガーの１個以上のアミノ酸配列に関連付けられている。例えば、それらの全体を参照により本明細書に組み込んだ、共同所有の米国特許第６，４５３，２４２号及び同第６，５３４，２６１号を参照されたい。
【００５８】
例示的選択方法としては、ファージディスプレイ及び２種ハイブリッドシステムが挙げられ、これらは、米国特許第５，７８９，５３８号、同第５，９２５，５２３号、同第６，００７，９８８号、同第６，０１３，４５３号、同第６，４１０，２４８号、同第６，１４０，４６６号、同第６，２００，７５９号及び同第６，２４２，５６８号、並びに国際公開第９８／３７１８６号、同第９８／５３０５７号、同第００／２７８７８号、同第０１／８８１９７号及び英国特許第２，３３８，２３７号に開示されている。更には、ジンクフィンガー結合ドメインに対する結合特異性の強化が、例えば共同所有の国際公開第０２／０７７２２７号に記載されている。
【００５９】
標的部位、すなわちＺＦＰの選択並びに融合タンパク質（及び融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド）の設計及び構築のための方法は、当業者に既知であり、本明細書にその全体を参照として組み込んだ、米国特許出願公開第２００５００６４４７４号及び同第２００６０１８８９８７号に詳しく記載されている。
【００６０】
更には、これらの参照及び他の参照に開示されているように、ジンクフィンガードメイン及び／又は複数フィンガーのジンクフィンガータンパク質は、例えば、長さが５個又はそれ以上のアミノ酸のリンカーを含む任意の好適なリンカー配列を使用して、一緒に連結されてもよい。長さが６個又はそれ以上のアミノ酸の例示的リンカー配列に関しては、米国特許第６，４７９，６２６号、同第６，９０３，１８５号、及び同第７，１５３，９４９号もまた参照されたい。本明細書に記載のタンパク質は、タンパク質の個々のジンクフィンガー間で、好適なリンカーの任意の組み合わせを含んでもよい。
【００６１】
あるいは、ＤＮＡ結合ドメインは、ヌクレアーゼから誘導され得る。例えばＩ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ及びＩ−ＴｅｖＩＩＩなどの、ホーミングエンドヌクレアーゼ及びメガヌクレアーゼの認識配列が既知である。米国特許第５，４２０，０３２号、同第６，８３３，２５２号、Ｂｅｌｆｏｒｔら著（１９９７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３７９〜３３８８頁、Ｄｕｊｏｎら著（１９８９年）Ｇｅｎｅ  ８２：１１５-１１８頁、Ｐｅｒｌｅｒら著（１９９４年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２２，１１２５〜１１２７頁、Ｊａｓｉｎ著（１９９６年）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．  １２：２２４-２２８頁、Ｇｉｍｂｌｅら著（１９９６年）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２６３：１６３-１８０頁、Ａｒｇａｓｔら著（１９９８年）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２８０：３４５-３５３頁及びＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓカタログもまた参照されたい。更に、ホーミングエンドヌクレアーゼ及びメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合特異性は、非天然標的部位に結合するよう操作され得る。例えば、Ｃｈｅｖａｌｉｅｒら著（２００２年）Ｍｏｌｅｃ．  Ｃｅｌｌ  １０：８９５−９０５頁、Ｅｐｉｎａｔら著（２００３年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３１：２９５２−２９６２頁、Ａｓｈｗｏｒｔｈら著（２００６年）Ｎａｔｕｒｅ  ４４１：６５６−６５９頁、Ｐａｑｕｅｓら著（２００７年）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ７：４９−６６頁、及び米国特許出願公開第２００７０１１７１２８号を参照されたい。
【００６２】
いくつかの実施形態において、ＤＮＡ結合ドメインは、植物病原菌キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）由来のＴＡＬエフェクター（ＴＡＬＥ）からの操作されたドメインであり（Ｍｉｌｌｅｒら著（２０１０年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１２月２２日、２２[印刷に先駆け電子書籍公開]、Ｂｏｃｈら著（２００９年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９、２００９年１０月（１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１１７８８１）及びMｏｓｃｏｕ及びＢｏｇｄａｎｏｖｅ著（２００９年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９、２００９年１０月（１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１１７８８１７）を参照）、また更に、その開示が参照としてその全体が本明細書に組み込まれた、２０１０年５月１７日に出願された米国特許仮出願第６１／３９５，８３６号、２０１０年８月２１日に出願された同第６１／４０９，４２１号、２０１０年１０月１３日に出願された同第６１／４５，１２１号、２０１０年１２月２０日に出願された同第６１／４５９，８９１号、２０１１年２月２日に出願された米国特許出願第６１／４６２，４８２号、２０１１年３月２４日に出願された同第６１／４６５，８６９号を参照されたい。
【００６３】
調節ドメイン
本明細書に記載の連結されたジンクフィンガーモジュールは、融合タンパク質としての外因性ドメイン（又はその機能的断片）でしばしば発現される。ＺＦＰに付加するための通常の調節ドメインとしては、例えば、転写因子ドメイン（アクチベーター、レプレッサー、コアクチベーター、コレプレッサー）サイレンサー、癌遺伝子（例えば、ｍｙｃ、ｊｕｎ、ｆｏｓ、ｍｙｂ、ｍａｘ、ｍａｄ、ｒｅｌ、ｅｔｓ、ｂｃｌ、ｍｏｓ族のメンバーなど）、ＤＮＡ修復酵素及びそれらに関連する因子及び修飾子、ＤＮＡ再構成酵素及びそれらに関連する因子及び修飾子、クロマチン関連タンパク質及びそれらの修飾子（例えばキナーゼ、アセチラーゼ及びデアセチラーゼ）、及びＤＮＡ修飾酵素（例えば、メチルトランスフェラーゼ、トポイソメラーゼ、ヘリカーゼ、リガーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、ポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼ）並びにそれらに関連する因子及び修飾子が挙げられる。
【００６４】
遺伝子の発現を抑制するために使用される、例えばＺＦＰなどのＤＮＡ結合ドメインと融合するための例示的な機能ドメインは、ヒトＫＯＸ-１タンパク質からのＫＲＡＢ抑制ドメインである（例えば、Ｔｈｉｅｓｅｎら著、Ｎｅｗ  Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ  ２：３６３−３７４頁（１９９０年）、Ｍａｒｇｏｌｉｎら著、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９１：４５０９〜４５１３頁（１９９４年）、Ｐｅｎｇｕｅら著、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２２：２９０８−２９１４頁（１９９４年）、Ｗｉｔｚｇａｌｌら著、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９１：４５１４〜４５１８頁（１９９４年）を参照されたい）。別の好適な抑制ドメインは、メチル結合ドメインタンパク質２Ｂ（ＭＢＤ−２Ｂ）である（ＭＢＤタンパク質の記載に関しては、Ｈｅｎｄｒｉｃｈら著（１９９９年）Ｍａｍｍ．  Ｇｅｎｏｍｅ  １０：９０６〜９１２頁をまた参照されたい）。別の有用な抑制ドメインは、ｖ−ＥｒｂＡタンパク質に関連するものである。例えば、Ｄａｍｍら著（１９８９年）Ｎａｔｕｒｅ  ３３９：５９３〜５９７頁、Ｅｖａｎｓ著（１９８９年）Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｕｐｐｌ．  ４：２６〜２８頁、Ｐａｉｎら著（１９９０年）Ｎｅｗ  Ｂｉｏｌ．  ２：２８４〜２９４頁、Ｓａｐら著（１９８９年）Ｎａｔｕｒｅ  ３４０：２４２〜２４４頁、Ｚｅｎｋｅら著（１９８８年）Ｃｅｌｌ  ５２：１０７〜１１９、及びＺｅｎｋｅら著（１９９０年）Ｃｅｌｌ  ６１：１０３５〜１０４９頁を参照されたい。
【００６５】
更なる例示的抑制ドメインとしては、限定されるものではないが、ＫＲＡＢ（「ＫＯＸ」としても呼ばれる）、ＳＩＤ、ＭＢＤ２、ＭＢＤ３、ＤＮＭＴ族のメンバー（例えば、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ）、Ｒｂ、ＭｅＣＰ２が挙げられる。例えば、Ｂｉｒｄら著（１９９９年）Ｃｅｌｌ  ９９：４５１〜４５４頁、Ｔｙｌｅｒら著（１９９９年）Ｃｅｌｌ  ９９：４４３〜４４６、Ｋｎｏｅｐｆｌｅｒら著（１９９９年）Ｃｅｌｌ  ９９：４４７〜４５０頁、及びＲｏｂｅｒｔｓｏｎら著（２０００年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．  ２５：３３８〜３４２頁を参照されたい。追加の例示的抑制ドメインとしては、限定されるものではないが、ＲＯＭ２及びＡｔＨＤ２Ａが挙げられる。例えば，Ｃｈｅｍら著（１９９６年）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ８：３０５〜３２１頁及びＷｕら著（２０００年）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  ２２：１９〜２７頁を参照されたい。
を参照されたい。
【００６６】
活性化を達成するための好適なドメインとしては、ＨＳＶ  ＶＰ１6活性化ドメイン（例えば、Ｈａｇｍａｎｎら著、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７１：５９５２〜５９６２頁（１９９７年）を参照）核ホルモンレセプター（例えばＴｏｒｃｈｉａら著、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  １０：３７３〜３８３頁（１９９８年）を参照）、核因子カッパＢのｐ６５サブユニット（Ｂｉｔｋｏ及びＢａｒｉｋ著、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７２：５６１０〜５６１８頁（１９９８年）及びＤｏｙｌｅ及びＨｕｎｔ著、Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ  ８：２９３７〜２９４２頁（１９９７年）、Ｌｉｕら著、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ５：３〜２８頁（１９９８年））、又はＶＰ６４などの人工キメラ型機能ドメイン（Ｓｅｉｆｐａｌら著、ＥＭＢＯ  Ｊ．  １１、４９６１〜４９６８頁（１９９２年））が挙げられる。更なる例示的活性化ドメインとしては、限定されるものではないが、ＶＰ１６、ＶＰ６４、ｐ３００、ＣＢＰ、ＰＣＡＦ、ＳＲＣ１  ＰｖＡＬＦ、ＡｔＨＤ２Ａ及びＥＲＦ−２が挙げられる。例えば、Ｒｏｂｙｒら著（２０００年）Ｍｏｌ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  １４：３２９〜３４７頁、Ｃｏｌｌｉｎｇｗｏｏｄら著（１９９９年）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  ２３：２５５〜２７５、Ｌｅｏら著（２０００年）Ｇｅｎｅ  ２４５：１−１１頁、Ｍａｎｔｅｕｆｆｅｌ−Ｃｙｍｂｏｒｏｗｓｋａ著（１９９９年）Ａｃｔａ  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｐｏｌ．  ４６：７７−８９頁、ＭｃＫｅｎｎａら著（１９９９年）Ｊ．  Ｓｔｅｒｏｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ６９：３−１２頁、Ｍａｌｉｋら著（２０００年）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｃｉ．  ２５：２７７〜２８３頁、及びＬｅｍｏｎら著（１９９９年）Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｇｅｎｅｔ．  Ｄｅｖ．  ９：４９９〜５０４頁を参照されたい。更なる例示的活性化ドメインとしては、ＯｓＧＡＩ、ＨＡＬＦ−１、Ｃ１、ＡＰ１、ＡＲＦ−５、−６、−７、及び−８、ＣＰＲＦ１、ＣＰＲＦ４、ＭＹＣ−ＲＰ／ＧＰ、及びＴＲＡＢ１が挙げられるが、限定されるものではない。例えば、Ｏｇａｗａら著（２０００年）Ｇｅｎｅ  ２４５：２１〜２９頁、Ｏｋａｎａｍｉら著（１９９６年）Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  １：８７〜９９頁、Ｇｏｆｆら著（１９９１年）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  ５：２９８〜３０９頁、Ｃｈｏら著（１９９９年）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂiｏｌ．  ４０：４１９〜４２９頁、Ｕｌｍａｓｏｎら著（１９９９年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９６：５８４４〜５８４９頁、Ｓｐｒｅｎｇｅｒ−Ｈａｕｓｓｅｌｓら著（２０００年）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  ２２：１〜８頁、Ｇｏｎｇら著（１９９９年）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４１：３３〜４４頁、及びＨｏｂｏら著（１９９９年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９６：１５，３４８〜１５，３５３頁を参照されたい。
【００６７】
ある実施形態では、調節ドメインは、ヌクレアーゼ（例えば、開裂ドメイン）を含む。このような操作されたヌクレアーゼは、標的ヌクレオチド配列で二重鎖切断を作り出すよう使用され得、これは、１０００倍を超える標的遺伝子座（標的組み込み）での相同組換えを介するドナー核酸導入の頻度を増大させる。更には、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）による部位特異的ＤＳＢの不正確な複製はまた、遺伝子破壊をもたらす。ヌクレアーゼは、細胞系工学並びに治療的用途のような広範な種々の目的のために使用され得る。
【００６８】
本明細書に開示された融合タンパク質の開裂ドメインは、任意のエンドヌクレアーゼ又はエキソヌクレアーゼから得られ得る。開裂ドメインがそれから誘導され得る例示的エンドヌクレアーゼとしては、制限エンドヌクレアーゼ及びホーミングエンドヌクレアーゼが挙げられるが、これらに限定されるものではない。例えば、２００２〜２００３年カタログ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ及びＢｅｌｆｏｒｔら著（１９９７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５：３３７９〜３３８８頁を参照されたい。ＤＮＡを開裂させる更なる酵素は既知である（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ、大豆ヌクレアーゼ、膵臓ＤＮａｓｅＩ、小球菌ヌクレアーゼ、酵母ＨＯエンドヌクレアーゼなどで、Ｌｉｎｎら著（編集）Ｎｕｃｌｅａｓｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９３年）もまた参照されたい）。これらの酵素（又はその機能的断片）の１つ以上は、開裂ドメイン及び開裂ハーフドメインの供給源として使用され得る。
【００６９】
同様に、開裂ハーフドメインは、上述したように、開裂活性のために二量体化が必要とされる任意のヌクレアーゼ又はその一部から誘導され得る。一般的に、融合タンパク質が開裂ハーフドメインを含む場合、２つの融合タンパク質が開裂のために必要である。あるいは、２つの開裂ハーフドメインを含む単一タンパク質が使用され得る。この２つの開裂ドメインは、同一のエンドヌクレアーゼ（又はその機能的断片）から誘導され得るか、又は各開裂ハーフドメインが、異なるエンドヌクレアーゼ（又はその機能的断片）から誘導され得る。
【００７０】
更には、２つの融合タンパク質のための標的部位が、互いに対して配置されることが好ましく、これによって、２つの融合タンパク質のそれらの各標的部位への結合が、例えば二量体化によって開裂ハーフドメインに機能的開裂ドメインを形成させるように、互いに対して空間的配向で開裂ハーフドメインを配置させることになる。したがって、ある実施形態では、標的部位の端部付近が５〜８個のヌクレオチド又は１５〜１８個のヌクレオチドによって分離されている。しかしながら、いかなる整数のヌクレオチド又はヌクレオチドも、２つの標的部位間に介在することができる（例えば２〜５０個のヌクレオチド対またはそれ以上）。概して、開裂の部位は、標的部位間にある。
【００７１】
制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は、多くの種で存在し、ＤＮＡへの配列特異的結合（認識部位にての）及び結合の部位又はその付近でＤＮＡを開裂させることが可能である。ある制限酵素（例えば、ＩＩＳ型）は、認識部位から取り除かれた部位にてＤＮＡを開裂し、また分離可能な結合ドメイン及び開裂ドメインを有する。例えば、ＩＩＳ型酵素ＦｏｋＩは、１つの鎖上でその認識部位から９ヌクレオチドの位置で、またもう一方の鎖上でその認識部位から１３ヌクレオチドの位置で、ＤＮＡの二重鎖開裂を触媒する。例えば、米国特許第５，３５６，８０２号、同第５，４３６，１５０号及び同第５，４８７，９９４号、並びにＬｉら著（１９９２年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９：４２７５〜４２７９頁、Ｌｉら著（１９９３年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：２７６４〜２７６８頁、Ｋｉｍら著（１９９４ａ）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９１：８８３〜８８７、Ｋｉｍら著（１９９４ｂ）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６９：３１，９７８−３１，９８２頁を参照されたい。したがって、一実施形態では、融合タンパク質は、少なくとも１つのＩＩＳ型制限酵素からの開裂ドメイン（又は開裂ハーフドメイン）と、操作されても操作されなくともよい１つ以上のジンクフィンガー結合ドメインとを含む。
【００７２】
その開裂ドメインが結合ドメインから分離可能である例示的ＩＩＳ型制限酵素は、ＦｏｋＩである。この特別な酵素は、二量体として活性である（Ｂｉｔｉｎａｉｔｅら著（１９９８年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９５：１０，５７０〜１０，５７５頁を参照）。したがって、本開示の目的のために、開示された融合タンパク質で使用されるＦｏｋＩ酵素の一部が、開裂ハーフドメインであると考えられる。このようなことから、ジンクフィンガー-ＦｏｋＩ融合を用いる細胞配列の標的二重鎖開裂及び／又は標的置換については、それぞれがＦｏｒｋＩ開裂ハーフドメインを含む２つの融合タンパク質が、触媒的に活性な開裂ドメインを再構成するために使用され得る。別の方法としては、１つのジンクフィンガー結合ドメインと２つのＦｏｋＩ開裂ハーフドメインとを含有する単一のポリペプチド分子がまた使用され得る。ジンクフィンガー−ＦｏｋＩ融合を使用する標的開裂及び標的配列変更に関するパラメータは、本開示の別の箇所で提供される。
【００７３】
開裂ドメイン又は開裂ハーフドメインは、機能的開裂ドメインを形成するために、開裂活性を保持する、又は多量体化（例えば二量体化）のため能力を保持するタンパク質の任意の部分であり得る。
【００７４】
例示的ＩＩＳ型制限酵素は、その全体を参照により本明細書に組み込んだ、国際公開第０７／０１４２７５号に記載されている。更なる制限酵素は、分離可能な結合及び開裂ドメインも含有し、これらは本開示によって意図されたものである。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓら著（２００３年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３１：４１８〜４２０頁を参照されたい。
【００７５】
ある実施形態において、それらの全ての開示を参照としてその全体を本明細書に組み込んだ、例えば米国特許公開第２００５００６４４７４号及び同第２００６０１８８９８７号、並びに米国特許出願第１１／８０５，８５０号（２００７年５月２３日出願）に記載されているように、ホモ二量体化を最小化又は防止するために、開裂ドメインは、１つ以上の操作された開裂ハーフドメイン（二量体化ドメイン変異体とも呼ばれる）を含む。ＦｏｋＩの４４６、４４７、４７９、４８３、４８４、４８６、４８７、４９０、４９１、４９６、４９８、４９９、５００、５３１、５３４、５３７、及び５３８位のアミノ酸残基は、ＦｏｋＩ開裂はハーフドメインの二量体化に影響を及ぼす全ての標的である。
【００７６】
例示的な絶対ヘテロ二量体を形成するＦｏｋＩの操作された開裂ハーフドメインは、その中で第１の開裂ハーフドメインが、ＦｏｋＩの４９０位と５３８位のアミノ酸残基で突然変異を含み、第２の開裂ハーフドメインが、４８６位と４９９位のアミノ酸残基で突然変異を含む１つの対を含有する。
【００７７】
したがって、一実施形態において、４９０位での突然変異はＧｌｕ（Ｅ）をＬｙｓ（Ｋ）で置き換え、５３８位での突然変異はＩｓｏ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）で置き換え、４８６位での突然変異はＧｌｎ（Ｑ）をＧｌｕ（Ｅ）で置き換え、また４９９位での突然変異はＩｓｏ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）で置き換える。特に、本明細書に記載された操作された開裂ハーフドメインは、「Ｅ４９０Ｋ：Ｉ５３８Ｋ」で示される操作された開裂ハーフドメインを生成するために、１つの開裂ハーフドメイン中の４９０位（Ｅ→Ｋ）及び５３８位（Ｉ→Ｋ）を突然変異させることによって、及び「Ｑ４８６Ｅ：Ｉ４９９Ｌ」で示される操作された開裂ハーフドメインを生成するために、別の開裂ハーフドメイン中の４８６位（Ｑ→Ｅ）及び４９９位（Ｉ→Ｌ）を突然変異させることによって調製された。本明細書に記載された操作された開裂ハーフドメインは、その中での異常な開裂が最小化又は消失されている絶対ヘテロ二量体変異体である。例えば、国際公開第０７／１３９８９８号の実施例１を参照されたい。ある実施形態では、操作された開裂ハーフドメインは、４８６、４９９及び４９６位（野生型ＦｏｋＩに関して番号付けされた）での突然変異を含み、例えば、４８６位の野生型Ｇｌｎ（Ｑ）残基をＧｌｕ（Ｅ）残基で置き換え、４９９位の野生型Ｉｓｏ（Ｉ）残基をＬｅｕ（Ｌ）残基で置き換え、並びに４９６位のＡｓｎ（Ｎ）残基をＡｓｐ（Ｄ）又はＧｌｕ（Ｅ）残基で置き換えたものである（それぞれ「ＥＬＤ」及び「ＥＬＥ」ドメインとも呼ばれる）。他の実施形態では、操作された開裂ハーフドメインは、４９０、５３８及び５３７位（野生型ＦｏｋＩに関して番号付けされた）にての突然変異を含み、例えば、４９０位の野生型Ｇｌｕ（Ｅ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基で置き換え、５３８位の野生型Ｉｓｏ（Ｉ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基で置き換え、及び５３７位のＨｉｓ（Ｈ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基又はＡｒｇ（Ｒ）残基で置き換えたものである（それぞれ「ＫＫＫ」及び「ＫＫＲ」ドメインとも呼ばれる）。他の実施形態では、操作された開裂ハーフドメインは、４９０及び５３７位（野生型ＦｏｋＩに関して番号付けされた）にての突然変異を含み、例えば、４９０位での野生型Ｇｌｕ（Ｅ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基で置き換え、並びに５３７位のＨｉｓ（Ｈ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基又はＡｒｇ（Ｒ）残基で置き換えたものである（それぞれ「ＫＩＫ」及び「ＫＩＲ」ドメインとも呼ばれる）（米国特許出願第１２／９３１，６６０号を参照されたい）。
【００７８】
本明細書に記載の操作された開裂ハーフドメインは、例えば、米国特許公開第２００５００６４４７４号（例えば実施例５を参照）及び国際公開第０７／１３９８９８号で記載されているような、野生型開裂ハーフドメイン（ＦｏｋＩ）の位置指示突然変異生成によるような、任意の好適な方法を用いて調製され得る。
【００７９】
あるいは、いわゆる「スプリット酵素」技術（米国特許公開第２００９００６８１６４号を参照）を使用して、核酸標的部位にてインビボでヌクレアーゼが組み立てられてもよい。このようなスプリット酵素の構成成分は、別個の発現構成上のいずれかで発現されてもよく、又は、例えば自己開裂２Ａペプチド若しくはＩＲＥＳ配列によって個々の構成成分が分離されているところの１つのオープンリーディングフレーム内に連結され得る。構成成分は、個々のジンクフィンガー結合ドメイン又はメガヌクレアーゼ核酸結合ドメインのドメインであってよい。
【００８０】
融合分子は、当業者に周知であるクローニング及び生化学的接合の方法によって構築される。融合タンパク質は、ＤＮＡ結合ドメインと機能ドメイン（例えば転写活性化又は抑制ドメイン）とを含む。融合分子は、必要に応じて、核局在化シグナル（例えば、ＳＶ４０メディアムＴ抗原からのシグナルなど）とエピトープタグ（例えば、ＦＬＡＧ及びヘマグルチニンなど）とを更に含む。融合タンパク質（及びそれらをコードする核酸）は、翻訳リーディングフレームが融合の構成成分中に保存されるように設計される。
【００８１】
このような用途では、当業者に既知のように、融合分子は薬学的に許容可能なキャリアで典型的に製剤化される。例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎのＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１７版、（１９８５年）及び共同所有の国際公開第００／４２２１９号を参照されたい。
【００８２】
キット
本明細書に記載のリンカーのいずれかを含み及び／又は上記の方法のいずれかを実施するキットもまた提供する。このキットは、本明細書に記載のリンカー配列（又は本明細書に記載のリンカーをコードするポリヌクレオチド）を典型的に含有する。このキットは、リンカー単独を供給してもよく、又はＤＮＡ結合ドメイン及び／又は選択のヌクレアーゼが容易にその中に挿入されるようなベクター供給してもよい。このキットはまた、細胞、細胞の形質転換のための緩衝液、細胞のための培養基、及び／又はアッセイを実行するための緩衝液を具備することができる。典型的には、このキットはまた、キットの他の構成成分に貼付されるか又は別様に添付する取扱説明書、包装材料又は製品宣伝リーフレットなどの任意の材料を含むラベルも具備する。
【００８３】
用途
開示されたリンカーは、操作されたジンクフィンガータンパク質のための標的部位の許容範囲を増強させるために有効に用いられる。例えば、本明細書に記載のリンカーは、モジュールサブサイトが隣接していない場合、所望の標的部位への結合を促進する。したがって、所定の許容サイズに関して、所定の核酸配列を標的化するように構築され得たＺＦＰの数の増加が効果的に存在する。また、記載されたリンカーは種々のモジュールサブサイト分離（例えば０、１及び２塩基対ギャップ）間を識別するために、それらはＺＦＰの不適切な標的部位への結合を減少させる。例えば、２塩基対（例えば、ＴＧＧＧＧＳＧＧＳＱＫＰ（配列番号１４））を読み飛ばすように設計された可撓性リンカーを有するＺＦＰは、モジュールサブサイト間の０、１、又は２塩基対のいずれかを有する標的部位に結合することが可能である。本明細書に記載の２塩基スキッピングリンカーを有するこの同じＺＦＰは、モジュールサブサイト間の２塩基対を有する標的に良好に結合するはずであるが、モジュールサブサイト間０又は１塩基対を有する標的（不適切または意図されない標的部位）には効果的に結合しないはずである。
【００８４】
したがって、本明細書に記載のリンカーは、ジンクフィンガーが現在使用されているいかなる用途でも使用され得、これらは、限定されるものではないが、遺伝子発現のモジュレーションのためのジンクフィンガー転写因子（ＺＦＰ−ＴＦ）への用途及び／又は開裂のためのジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）での用途が挙げられる。例えば、参照によりその全体を本明細書に組み込んだ、米国特許第６，５３４，２６１号、同第６，５９９，６９２号、同第６，６８９，５５８号、同第７，０６７，３１７号、同第７，２６２，０５４号及び同第７，２５３，２７３号、並びに米国特許公開第２００５００６４４７４号、同第２００６／００６３２３１号、同第２００７／０１３４７９６号、同第２００７／０２１８５２８号、同第２００８／００１５１６４号、同第２００８／０１８８０００号、同第２００８／０２９９５８０号及び同第２００８／０１５９９９６号を参照されたい。
【００８５】
したがって、開示されたリンカーは、特異的に標的化されたモジュレーション又は開裂が望ましいような任意の方法のために任意のＺＦＰ又はＺＦＮで使用され得る。例えば、ＺＦＰ−ＴＦ及びＺＦＮは、遺伝性疾患、感染症（ウィルス又は細菌）を治療するために、相同組換え及び／又はノックイン若しくはノックオウトによって所望の遺伝子が活性化され、抑制され、標的化されている細胞系、動物及び／又は植物を産生するために使用され得る。したがって、本明細書に記載のリンカーはまた、より有効にＤＮＡをクローンするために使用され得、並びにＺＦＮによって促進されるゲノム改変で使用され得、これは、バイオテクノロジー及び基礎科学の多くの領域で広範囲で適用可能である。
【実施例】
【００８６】
実施例１：リンカーの選択
リンカー選択を、それぞれが4つのフィンガーを含有する、３つの異なるホストＺＦＰ「ＺＦＰ７２６３」、「ＺＦＰ７２６４」及び「ＺＦＰ８１９６」において実施し（７２６３及び７２６４については米国特許公開第２００５００６４４７４号、並びに８１９６については同第２００８０１５９９９６号を参照されたい）。各ホストＺＦＰについての各フィンガーの認識ヘリックスが、表１に提供されていて、一方、各ホストＺＦＰの完全長配列を図１Ａに提供する。選択を次のように実行し、（ｉ）初めに、中心リンカー中のコドンを２〜１２個の完全無作為割付されたコドンの混合物で置き換える各ホストＺＦＰ内でライブラリーを産生し（図１Ｂ）、未処置ライブラリーの配列決定は、一度より多く確認されたクローンがなく、良好な配列の多様性を示した；（ｉｉ）次に、このライブラリーを、糸状バクテリオファージの表面で発現させた；（ｉｉｉ）ファージ発現されたＺＦＰライブラリーを、次いでホストタンパク質結合部位の中心で（すなわち、無作為割付されたリンカーによってスパンされた領域内で）１塩基対又は２塩基対挿入物を含有するビオチニル化標的変異体に結合するように選択した（表２Ａ）。各々の挿入物は、効率的な結合を可能にするために、より長いリンカーによって架橋されねばならないホストタンパク質の第２のフィンガーと第３のフィンガーのための結合配列の間にギャップを具備した（表２Ａ）。固有塩基特異性を有さないリンカーの選択を有効にするために、挿入物は塩基の混合物から構成された。５つの選択サイクルが実施された。最後の４サイクル中に、ビオチニル化されておらず、並びに非標的ギャップ長を含有する結合部位の１０００倍モル過剰で、対抗選択を採用した（すなわち、１塩基対ギャップ長を有する標的配列を用いてファージが選択された場合、対抗選択は０、２、３及び４塩基対ギャップを有する標的を含み、２塩基対ギャップ長を有する標的配列を用いてファージが選択された場合、対抗選択は、０、１及び３並びに４塩基対ギャップを有する標的を含んだ。表２Ｂ参照）。
【００８７】
選択の第５ラウンドからのファージプールを、標的ギャップ長を有する配列を選択的に結合させるための能力について評価し、これらの研究がギャップ選択的結合を明らかにした（図２）。特に、ＺＦＰ８１９６において１塩基対を読み飛ばすように選択されたファージプールは、ギャップを持たない標的と比べて、１塩基対ギャップを有する標的に対して２５倍の優先性を示した。ＺＦＰ７２６３において１塩基対を読み飛ばすように選択されたファージプールは、ギャップを持たない標的と比べて、１塩基対ギャップを有する標的に対して２６倍の優先性を示した。ＺＦＰ７２６４において１塩基対を読み飛ばすように選択されたファージプールは、ギャップを持たない標的と比べて、１塩基対ギャップを有する標的に対して５．５倍の優先性を示した。これらのプールのそれぞれはまた、より長いギャップ長（２、３又は４塩基対）を有する標的へほとんど結合しないこと又は全く結合しないことも認められた。
【００８８】
ＺＦＰ８１９６において２塩基対を読み飛ばすように選択されたファージプールは、１塩基対ギャップの標的に比べて２塩基対ギャップを有する標的に対して７倍の優先性を示し、並びに０、３及び４塩基対ギャップを有する標的全体にわたって３０倍を超える優先性を示した。
【表１】
0005898179.tif 000002
【００８９】
【表２】
0005898179.tif 000003
表２Ａ：選択のために使用された標的部位。ファージ研究で使用された二重鎖ＤＮＡ標的部位は、ＴＡＴＡＡＴ（Ｘ）17-18ＴＴＣＡＣＡＧＴＣＡＧＴＣＣＡＣＡＣＧＴＣ（配列番号６７）の一般形を有し、式中の（Ｘ）17-18は、表中に表示された配列で置き換えられた。ＤＮＡ二重鎖は、イタリック体で表された配列にアニーリングされ、またその５’末端でビオチニル化されたプライマーを伸長することによって生成された。下線が施された塩基は、各ホストＺＦＰの４つのフィンガーに対する結合配列を示し、一方小文字の塩基は、選択されたリンカーによってスパンされるべきである挿入されたヌクレオチド（又は「ギャップ」塩基）を示している。ギャップ塩基についての縮重コードは次のようである：「ｄ」はＡ、Ｇ、及びＴの混合を示し、「ｂ」はＣ、Ｇ、及びＴの混合を示し、「ｈ」はＡ、Ｃ、及びＴの混合を示し、並びに「ｖ」はＡ、Ｃ、及びＧの混合を示す。
【００９０】
【表３】
0005898179.tif 000004
表２Ｂ：選択中に使用された競合部位。二重鎖ＤＮＡ競合部位は、ＴＡＴＡＡＴ（Ｘ）16-20ＴＴＣＡＣＡＧＴＣＡＧＴＣＣＡＣＡＣＧＴＣ（配列番号６７）の一般形を有し、式中の（Ｘ）16-20は、表中に表示されている配列で置き換えられた。ＤＮＡ二重鎖は、イタリック体の配列部分にアニーリングされた（非ビオチニル化）プライマーを伸長することによって生成された。下線が施された塩基は、各ホストＺＦＰの４つのフィンガーに対する結合配列を示し、一方小文字の塩基は、挿入されたヌクレオチド（又は「ギャップ」塩基）を示している。ギャップ塩基についての縮重コードは次のようである：「ｄ」はＡ、Ｇ、及びＴの混合を示し、「ｂ」はＣ、Ｇ、及びＴの混合を示し、「ｈ」はＡ、Ｃ、及びＴの混合を示し、並びに「ｖ」はＡ、Ｃ、及びＧの混合を示す。
【００９１】
【表４】
0005898179.tif 000005
表２Ｃ：ファージプールギャップ選択性研究で使用された標的。ファージプールギャップ選択性研究で使用された二重鎖ＤＮＡ部位は、ＴＡＴＡＡＴ（Ｘ）16-20ＴＴＣＡＣＡＧＴＣＡＧＴＣＣＡＣＡＣＧＴＣ（配列番号６７）の一般形を有し、式中（Ｘ）16-20は、表中に表示されている配列で置き換えられた。ＤＮＡ二重鎖は、イタリック体の配列部分にアニーリングされた、ビオチニル化プライマーを伸長することによって生成された。下線が施された塩基は、各ホストＺＦＰの４本のフィンガーに対する結合配列を示し、一方小文字の塩基は、挿入されたヌクレオチド（又は「ギャップ」塩基）を示している。ギャップ塩基についての縮重コードは次のようである：「ｄ」はＡ、Ｇ、及びＴの混合を示し、「ｂ」はＣ、Ｇ、及びＴの混合を示し、「ｈ」はＡ、Ｃ、及びＴの混合を示し、並びに「ｖ」はＡ、Ｃ、及びＧの混合を示す。
【００９２】
配列決定
選択されたＺＦＰをコードする遺伝子を、サブクローン化して配列決定した。図３Ａは、全ての３つのホストタンパク質において１塩基対ギャップを読み飛ばすように選択されたリンカーを提示していて、一方図３Ｂは、「ＺＦＰ８１９６」ホストにおいて２塩基対のスキッピングのために選択されたリンカーを示している。配列決定結果は、選択されたリンカーでのプロリン及びアルギニンを豊富に含む配列に向けられる強い組成上の偏りを明らかにした。明確なリンカー長傾向もまた明らかとなり、開始ライブラリーが１１種の異なるリンカー長（２〜１２個の残基）のほぼ等しい比率をコード化したが、選択されたリンカーは、５〜８個の残基（１塩基対ギャップに関して）又は９〜１１個の残基（２塩基対ギャプに関して）のより狭い分布を特徴とした。
【００９３】
実施例２：選択されたＺＦＰの初期特性
１塩基対を読み飛ばすように選択されたリンカーの初期機能的評価として、図３Ａで表示されたリンカーを有するＺＦＰをサブクローンし、インビトロ転写−翻訳キットを使用して遊離タンパク質として発現し、選択されたリンカーと反対側の０、１又は２塩基対の挿入物を有する標的への結合について、ＥＬＩＳＡによって評価した。これらの研究のための標的は、表３に表示されている。各ホストＺＦＰの中心リンカーを、１塩基対のスパンのための最新技術を集合的に表わす３つの代替物である、先に特性評価されたリンカー配列で置き換えることによって、９つの追加の対照タンパク質を生成した。これらの対照リンカーの配列は、ＬＲＱＫＤＥＲＰ（配列番号３）（米国特許第６，４７９，６２６号を参照）、ＴＧＥＧＧＫＰ（配列番号４８）、ＴＧＧＧＧＳＱＫＰ（配列番号２）であった。これらの対照タンパク質、並びにホストＺＦＰは、ＥＬＩＳＡ研究にも含められた。
【００９４】
表３は、１塩基対を読み飛ばすように選択されたＺＦＰのＥＬＩＳＡ研究で使用された標的を示している。これらの研究で使用された二重鎖ＤＮＡ部位は、ＴＴＡＧ（Ｘ）16-18ＴＡＴＣ（配列番号９４）の一般形を有し、式中の（Ｘ）16-18は表中に表示された配列で置き換えられた。各二重鎖ＤＮＡ標的を、その５’末端にビオチンを有する相補的オリゴヌクレオチドをアニーリングすることによって生成した。下線部は、各ホストＺＦＰの４つのフィンガーについての結合配列を示し、一方で小文字は、挿入されたヌクレオチド（又は「ギャップ」塩基）を示している。
【００９５】
これらの研究の結果は、表４、５及び６に提供されていて、各表は、異なるホストＺＦＰから誘導されたタンパク質に関するデータを表示している。表４は、ＺＦＰ８１９６由来のタンパク質に関するデータを提供し、表５は、ＺＦＰ７２６３由来のタンパク質に関するデータを提供し、また表６は、ＺＦＰ７２６４由来のタンパク質に関するデータを提供している。それぞれの表において、ホストＺＦＰに関する結合データが最上段に表示され、３つの対照タンパク質に関する結合データが２〜４段に続き、ファージディスプレイライブラリーから選択されたＺＦＰに関するデータが続く。この数値は、親ＺＦＰのその非改変標的への結合から得られたＥＬＩＳＡシグナルに正規化されている。
【００９６】
タンパク質の各セットは、３つの重要な観点で、結合挙動の同様なパターンを示し、これらの観点は、第１に、各親ＺＦＰはその非改変標的（表４、５及び６中の「０塩基対ギャップ」標的）には良好に結合したが、１又は２塩基対の挿入物を有するいかなる変異体にも結合しなかったことである。親リンカー（ＴＧＥＫＰ（配列番号１）（ＺＦＰ８１９６に関して）又はＴＧＳＱＫＰ（配列番号７２）（ＺＦＰ７２６３及びＺＦＰ７２６４にに関して）のいずれか）がいずれかの追加的に挿入された塩基をスパンするには短すぎるために、これは予期されたことである。
【００９７】
第２に、ほとんどすべての場合で、対照タンパク質は、１塩基対挿入物を有する標的にほとんど十分に結合しなかったことである（正規化ＥＬＩＳＡ値は、３６個の測定値の３１個が０．１０又はそれ以下であった）。このことは、これらの研究前での利用可能なリンカーの性能不良を示唆している。更には、これらのタンパク質によって使用されたリンカーは、１塩基対挿入物を有する標的に対して一貫した優先性を示さなかった（０塩基対挿入物に対して）。
【００９８】
第３には、対照タンパク質の挙動とは対照的に、ファージ選択されたＺＦＰは、１塩基対挿入物を有する標的に対して非常に高い親和性で、並びに挿入された塩基を含有しない結合標的に対して高レベルの識別性で結合した。これらのタンパク質は、２塩基対挿入物を有する標的に対して、１塩基対を有する結合標的に関してもまた非常に選択性であった。
【００９９】
【表５】
0005898179.tif 000006
【０１００】
【表６】
0005898179.tif 000007
【０１０１】
【表７】
0005898179.tif 000008
【０１０２】
【表８】
0005898179.tif 000009
【０１０３】
ＥＬＩＳＡ研究で得られた結果を裏付けかつ展開するために、選択されたリンカーを有するＺＦＰを、国際公開第２００９／０４２１６３号に記載されている酵母スクリーニングアッセイを用いて、種々の標的部位にて、インビボ開裂活性について評価した。これらの実験は、多大の労力を要するために、より少ないＺＦＰで実施した。これらの研究のために、表５からの６個のＺＦＰ及び表６からの５個のＺＦＰを、国際公開第２００７／１３９９８２号に記載されているようなジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）としての発現を可能にする構成に組み立てた。次いで、種々の標的部位を有する酵母菌種からのＭＥＬ−１分泌を評価することによって、インビボ活性を測定した。これらの研究のために使用された標的配列が、表７及び８に提供されていて、０、１又は２塩基対の中心挿入物を有する７２６３及び７２６４結合部位の変型も含められている。
【０１０４】
【表９】
0005898179.tif 000010
【０１０５】
ヌクレアーゼ標的部位を有するレポータープラスミドを、ヌクレアーゼ標的カセットが、ＧＡＴＣＴＧＴＴＣＧＧＡＧＣＣＧＣＴＴＴＡＡＣＣＣ（Ｘ）12-14ＴＧＣＴＣＧＣＧ（配列番号１０３）の一般式を有する以外は、実質的に国際公開第２００９／０４２１６３号で記載されているように構築し、式中、（１）両端の４個の下線が施された塩基は、ＢａｍＨＩ／ＢｓｓＨＩＩ消化レポータープラスミド中へのクローニングのために使用されるオーバーハングを表し、（２）イタリック体の配列は、アンチセンス鎖に結合し、これらのスクリーンに対して不変異体であった７２６４ＺＦＮに関する結合部位を表し、並びに（３）（Ｘ）12-14は、表中に表示された配列で置き換えられた。大文字の塩基は、各ホストＺＦＰの４つのフィンガーについての結合配列を示し、一方で小文字は、挿入されたヌクレオチド（又は「ギャップ」塩基）を示している。
【０１０６】
【表１０】
0005898179.tif 000011
【０１０７】
ヌクレアーゼ標的部位を有するレポータープラスミドを、ヌクレアーゼ標的カセットが、ＧＡＴＣＴＧＴＴ（Ｘ）12-14ＡＡＣＣＣＡＣＴＣＴＧＴＧＧＡＡＧＴＧＣＴＣＧＣＧ（配列番号１１２）の一般式を有する以外は、実質的に国際公開第２００９／０４２１６３号で記載されているように構築し、式中、（１）両端の４個の下線が施された塩基は、ＢａｍＨＩ／ＢｓｓＨＩＩ消化レポータープラスミド中へのクローニングで使用されるオーバーハングを表し、（２）イタリック体の配列は、これらのスクリーンに対して不変異体であった７２６３ＺＦＮに関する結合部位を表し、並びに（３）（Ｘ）12-14は、表中に表示された配列で置き換えられた。大文字の塩基は、各ホストＺＦＰの４つのフィンガーについての結合配列を示し、一方小文字は、挿入されたヌクレオチド（又は「ギャップ」塩基）を示している。表中に表示された標的部位は、７２６４ＺＦＮがアンチセンス鎖に結合するので、標的カセット中に存在するものの逆相補体であることに注意されたい。
【０１０８】
これらの実験のデータは、表９及び１０に示され、各表は、異なるホストＺＦＮから誘導されたタンパク質に関するデータを表示している。表９は、７２６３由来のＺＦＮに関するデータを提供し、また表１０は、７２６４由来のＺＦＮに関するデータを提供している。それぞれの表において、ホストＺＦＰに関するヌクレアーゼ活性データが最上段に表示され、１つの対照タンパク質に関するヌクレアーゼ活性データが２段目に続き、ファージディスプレイライブラリーから選択されたＺＦＰに関するデータが続く。ＺＦＰ７２６３とＺＦＰ７２６４は、同じジンクフィンガーヌクレアーゼ二量体の二等分であるために、ホストＺＦＮに関するデータは、それぞれの表で同じである。これらの研究の結果は、ファージ選択されたリンカーを有するＺＦＮが、対照リンカーを有するＺＦＰよりも１塩基対挿入物を有する標的に対して、より高い活性並びにより良好な優先性の両方を示したＥＬＩＳＡ研究で観測されたパターンと概ね合致した。
【０１０９】
【表１１】
0005898179.tif 000012
【０１１０】
【表１２】
0005898179.tif 000013
【０１１１】
ＥＬＩＳＡが、酵母スクリーニングデータと緊密に一致したために、発明者らはＥＬＩＳＡアッセイで最良のものの間で性能を発揮した例示的な１塩基対スキッピングリンカーのセットを選択した。これらは表１１中に表示され、「ｌｃ」、「ｌｄ」、「ｌｅ」及び「ｌｆ」と命名されている。これらの記号は、表４、６、及び１０で表されたデータでも含まれている。これらの例示的リンカーに関するＥＬＩＳＡデータはまた、図４及び５にも示されている。
【０１１２】
【表１３】
0005898179.tif 000014
【０１１３】
実施例１で先に述べたように、選択のために使用された標的部位（表２ａ）は、特定のギャップ配列に対して固有の優先性を示さなかったリンカーの選択を導くために、ギャップ中に変性した塩基を含有した。図４及び５に示されるデータは、この選択法が成功を収めたことを示唆し、なぜなら、例示的リンカーを有するタンパク質が、Ａ、Ｇ、Ｃ又はＴのギャップ塩基を有する標的間での結合でほとんど変化を示さないからである。更に、観測される少量の変化が、フィンガー周辺部分の特性であることを示唆している対照可撓性リンカーで得られた結果（例えば、可撓性リンカー（ＴＧＧＧＧＳＱＫＰ）（配列番号２）に関する図５Ｄを参照）で写し出されている。
【０１１４】
類似のＥＬＩＳＡ実験を、ＺＦＰ８１９６における２塩基対ギャップを読み飛ばすように選択されたリンカーについて実施した。各ホストＺＦＰの中心リンカーを、２塩基対のスパンニングに関する最新技術を集合的に表した、２つの代替的な先に特性評価されたリンカー配列で置き換えることによって、２つの追加的な対照タンパク質を生成した。これらの対照リンカーの配列は、ＴＧＧＧＧＳＧＧＳＱＫＰ（配列番号１４）及びＬＲＱＫＤＧＧＧＳＥＲＰ（配列番号６８）であった。これらの対照タンパク質、並びにホストＺＦＰもまた、ＥＬＩＳＡ研究に含められた。ギャップがない、４つの可能な１塩基対ギャップのそれぞれ、及び１６個の可能な２塩基対ギャップのそれぞれのいずれかを含有する標的部位への結合について、ＺＦＰをテストした。標的部位は、表１２に表示されている。ＥＬＩＳＡスコアは、そのギャップ非形成標的部位に結合された８１９６ＺＦＰのスコアに正規化された。例示的リンカーは、１塩基対スキッピングリンカーと同様な様式で、それらのＥＬＩＳＡ挙動に基づいて選択された。これらの例示的リンカーは、「２ｄ」、「２ｅ」、及び「２ｆ」と命名された。８１９６ＺＦＰ及び対照ＺＦＰ内の例示的リンカーに関するＥＬＩＳＡ結果が、図６に示されている。図６に見られるように、対照リンカーを有するＺＦＰのいずれも２塩基対ギャップを有する標的部位に対する優先性を示さなかった。しかしながら、選択されたリンカーを有するＺＦＰは、１塩基対及びギャップ非形成標的部位の双方を超える２塩基対ギャップに対する明確な優先性を示した。
【０１１５】
【表１４】
0005898179.tif 000015
表１２：ＥＬＩＳＡ特性評価研究で使用された二重鎖ＤＮＡ標的部位は、ＴＴＡＧ（Ｘ）16-18ＴＡＴＣ（配列番号９４）の一般形を有し、式中のＸ）16-18は、表中に配列で置き換えられた。ＤＮＡ二重鎖は、相補的オリゴヌクレオチドをアニーリングすることで生成された。表中に表示された配列に対する相補的オリゴヌクレオチドは、５’ビオチンを含有した。下線が施された塩基は、各ホストＺＦＰの４つのフィンガーについての結合配列を示し、一方小文字の塩基は挿入されたヌクレオチド（又は「ギャップ」塩基）を示している。
【０１１６】
実施例１に先に述べられたように、選択のために用いられた標的部位（表２ａ）は、特定のギャップ配列に対する固有の優先性を示さなかったリンカーの選択を誘導するために、ギャップ内に変性塩基を含有した。図６に示されているものは、可撓性リンカー（ＴＧＧＧＧＳＧＧＳＱＫＰ（配列番号１４））のうちの１つについてのスケールの拡大である。この可撓性リンカーは、標的部位とのいかなる相互作用も有するべきではなく、したがって見られるパターンは、ジンクフィンガータンパク質の結合によるものである可能性が高い。例示的リンカーが、２塩基対ギャップ標的部位への結合の同様なパターンを示すという事実は、選択されたリンカーがまた、ＺＦＰ結合においていかなるギャップ組成上の偏りも課せられるべきではないことを示唆している。
【０１１７】
このデータのより簡潔な概要を、表１３に表し、ここでは、ＥＬＩＳＡスコアは、１又は２塩基対ギャップ組成物の全てで平均値となった。更に報告されていることは、１塩基対ギャップ及びギャップ非形成標的に勝る２塩基対ギャップに対する倍増した優先性である。最も選択的なリンカー（ＴＰＮＰＨＲＲＴＤＰＳＨＫＰ（配列番号６８）、「２ｆ」）は、対照リンカーと比較して、０塩基対ギャップでは１００倍を超えて勝る、並びに１塩基対ギャップでは２０倍を超えて勝る２塩基対ギャップ選択性での改善を示している。
【０１１８】
【表１５】
0005898179.tif 000016
【０１１９】
実施例３：種々のホストＺＦＰ中のリンカーのＥＬＩＳＡ特性評価
例示的リンカーの一般性を立証するために、表１１に表示された４つの１塩基対スキッピングリンカー（ｌｃ〜ｌｆ）を、１２個の異なるホストＺＦＰ中にクローンした。このホストＺＦＰは、ＺＦＰ１、ＺＦＰ２などと示された。得られたタンパク質を、上記のようにインビトロ転写及び翻訳を介して発現し、並びにＥＬＩＳＡを介してテストした。比較のために、可撓性リンカー（ＴＧＧＧＧＳＱＫＰ）（配列番号２））を有するホストＺＦＰもテストし、結果が図７に表示されている。このデータは、アッセイを飽和させる（ＺＦＰ１及びＺＦＰ２）か又はその結合が検出不能なほど低い（ＺＦＰ１１及びＺＦＰ１２）のいずれかであるＺＦＰだけを除いて、標準可撓性リンカーに対して、新しいリンカーが、ほとんどのホストＺＦＰのＥＬＩＳＡスコアを著しく増加させたことを立証している。ホストＺＦＰ全体のＥＬＩＳＡスコアでの平均倍増数は、３〜５であった。
【０１２０】
同様な研究において、表１３中に表示された２塩基対ギャップを読み飛ばすように選択された３個の例示的リンカー（２ｄ〜２ｆ）が、上記のように異なる６個のホストＺＦＰ（ＺＦＰ１３、ＺＦＰ１４など）でテストされ、これらの結果が図８に示されている。これらの実験では、ホストＺＦＰ全体にわたるＥＬＩＳＡスコアでの平均倍増数は、１．９〜２．４の範囲であった。
実施例４：哺乳類細胞中の内因性遺伝子座にての例示的リンカーを有するＺＦＮの特性評価
【０１２１】
次いで、ＺＦＮを、内因性遺伝子座にて二重鎖切断を誘導するそれらの能力についてテストした。簡単に言うと、上記（実施例３）の１８個のＺＦＮをコードするプラスミドを、それらの適切なパートナーＺＦＮと対にして、Ａｍａｘａ（商標）ヌクレオフェクチンキットを製造業者によって指示されたように使用するトランスフェクションによって、Ｋ５６２細胞に導入した。標的遺伝子座でのＺＦＮ活性を、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）のレベルによって測定されたものとして決定するために、ＣＥＬ−Ｉミスマッチアッセイを、基本的に製造業者の使用説明書（ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ  ＳＵＲＶＥＹＯＲ（商標））通りに実行した。細胞を収穫し、製造業者の説明書（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ（登録商標））に従って、Ｑｕｉｃｋｅｘｔｒａｃｔ（商標）キットを使用して染色体ＤＮＡを調製した。標的遺伝子座の適切な領域を、Ａｃｃｕｐｒｉｍｅ（商標）Ｔａｑ高性能再現性ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＰＣＲ増幅し、続いてＣＥＬ-Ｉ酵素で処理した。
【０１２２】
ＣＥＬ−１アッセイで生成された実施例のゲルが図９に示されている。図９Ａは、ホストＺＦＮとしてのＺＦＮ３及びＺＦＮ４（１塩基対をスキッピングするＺＦＮ）についてのスクリーニングデータを示し、一方で図９Ｂは、ホストＺＦＮとしてのＺＦＮ１４（２塩基対をスキッピングするＺＦＮ）についてのスクリーニングデータを示している。１塩基対をスキッピングする例示的リンカーの全てについてのデータは、図１０に概説されている（ＺＦＮ１〜ＺＦＮ１２）。ＺＦＮのいくつかは、高発現条件を用いて発現された。この高発現は、ゲノムＤＮＡを単離する前に、細胞を３７℃で２４時間インキュベートし、次いで３０℃で４８時間インキュベートすることによるトランスフェクション後に取得される。この条件を用いるＺＦＮは、図１０で強調表現されている。注目すべきことに、ＴＧＧＧＧＳＱＫＰ（配列番号２）リンカー（「可撓性リンカー」）で不活性化された３個のＺＦＮ（ＺＦＮ４、９及び１０）は、本明細書に記載のリンカーを使用する場合に活性化した。このような場合について、１．０％改変率の数値が、正規化の目的で、可撓性リンカーに割り当てられた（このアッセイの検出限界）。新しいリンカーでテストされたＺＦＮの８５％において、９個の活性ＺＦＮ対全体で約１．８〜２．８倍での平均増加を伴い、遺伝子改変のレベルでの増加が観測された。
【０１２３】
同様に、２塩基対をスキッピングする例示的リンカーを含有する上記（実施例３）のＺＦＮ（ＺＦＮ１３〜ＺＦＮ１８）を、内因性遺伝子座でテストし、その結果が図１１に概説されている。この研究では、本明細書に記載のリンカーの置換は、可撓性リンカーに比べて、４個の活性ＺＦＮのうちの３個について活性を改善し、平均改善率は、活性ＺＦＮ対全体で１，５〜２倍であった。
【０１２４】
実施例５：２塩基対スキッピングリンカーの二次選択
ライブラリーの二次セットを、２塩基スキッピングリンカーについての初期選択から得られた情報（実施例３及び図３）に基づいて構築した。これらのライブラリーは、ＲＰＰ（リジン、プロリン、プロリン）などのリンカーの３個のカルボキシ末端残基を固定化し、残りのアミノ末端残基を無作為割付した。ライブラリーデザインは、図１２に示されている。
【０１２５】
ＺＦＰ８１９６をホストタンパク質として使用して、実施例１と同じ方法で選択を実施した。選択されたファージプールのギャップ選択性が図１３Ａに示され、また個々のクローンからのリンカーの配列が図１３Ｂに示されている。
【０１２６】
実施例２で示されたものと同様に、二次選択からの個々のクローン（図１３Ｂ）のそれぞれで、ＥＬＩＳＡ実験を実施した。ギャップを含まない、４個の可能な１塩基対ギャップのプール、及び１６個の可能な２塩基対ギャップのプールのいずれかを含む標的部位への結合について、ＺＦＰをテストした。標的部位は、表１２に表示されている。ＥＬＩＳＡスコアは、そのギャップ非形成標的部位に結合されたホストＺＦＰ８１９６のスコアに正規化された。２塩基対ギャップ標的部位への良好な正規化ＥＬＩＳＡスコア及び良好な選択性を示したリンカーを有するＺＦＰに関するＥＬＩＳＡの結果が、表１４に示されている。
【０１２７】
【表１６】
0005898179.tif 000017
【０１２８】
表示されたように、選択されたリンカーを有するＺＦＰは、１塩基対及びギャップ非形成標的部位に勝る、２塩基対ギャップに対する明確な優先性を示した。
【０１２９】
本明細書で記載した全ての特許、特許出願及び公開は、それらの全体を参照により本明細書に組み込む。
【０１３０】
本開示が、理解を明確にする目的で、図面及び実施例によって若干の詳細をもって示されてきたが、本開示の精神及び範囲を逸脱しない限りにおいて、種々の変更及び修正が実行され得ることが当業者には明らかであろう。したがって、上記説明及び実施例は、制限するものと解釈されるべきではない。
【図１Ａ−Ｂ】
0005898179.tif 000018
【図２Ａ−Ｄ】
0005898179.tif 000019
【図３Ａ−Ｂ】
0005898179.tif 000020
【図４Ａ−Ｅ】
0005898179.tif 000021
【図５Ａ−Ｄ】
0005898179.tif 000022
【図６Ａ−Ｆ】
0005898179.tif 000023
【図７Ａ−Ｂ】
0005898179.tif 000024
【図８Ａ−Ｂ】
0005898179.tif 000025
【図９Ａ−Ｂ】
0005898179.tif 000026
【図１０Ａ−Ｂ】
0005898179.tif 000027
【図１１Ａ−Ｂ】
0005898179.tif 000028
【図１２】
0005898179.tif 000029
【図１３Ａ−Ｂ】
0005898179.tif 000030
【配列表】
0005898179000001.app