(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列ＶＥＶＫＧＰＶＧＬＩＧＶＥＶＫ（配列番号：８２）を含む、自己組織化ペプチド。
【請求項２】
アミノ酸配列ＶＥＶＫＧＰＶＧＬＩＧＶＥＶＫ（配列番号：８２）からなる、請求項１記載のペプチド。
【請求項３】
請求項１記載の自己組織化ペプチドを含んでなる、患者において歯の組織を再生するための医薬組成物。
【請求項４】
該歯の組織が、歯周靭帯組織である、請求項３記載の医薬組成物。
【請求項５】
請求項１記載の自己組織化ペプチドを含んでなる、患者において歯周疾患を治療するための医薬組成物。
【請求項６】
請求項１記載の自己組織化ペプチドを含んでなる、歯周組織再生のための骨格。
【請求項７】
アミノ酸配列ＶＥＶＫＧＰＶＧＬＩＧＶＥＶＫ（配列番号：８２）からなる、請求項６記載の骨格。
【請求項８】
請求項６記載の骨格および固体の生体材料を含んでなる、患者において歯周疾患を治療するための医薬組成物。
【請求項９】
該生体材料が、カルシウム、リンまたはそれらの組み合わせを含む、請求項８記載の医薬組成物。
【請求項１０】
該生体材料が、約１００ミクロン〜約５００ミクロンの直径を有する孔を含む、請求項８記載の医薬組成物。
【請求項１１】
２つの区画を有するシリンジであって、第１の区画は、ペプチド溶液を含み、第２の区画は、ゲル化液（gelation fluid）を含み、該ペプチド溶液は、請求項１記載の自己組織化ペプチドを含む水溶液である、シリンジ。
【請求項１２】
複数の自己組織化ペプチドを含む巨視的骨格（macroscopic scaffold）であって、該ペプチドは、アミノ酸配列ＶＥＶＫＧＰＶＧＬＩＧＶＥＶＫ（配列番号：８２）を含む、巨視的骨格。
【請求項１３】
アミノ酸配列ＶＥＶＫＶＥＶＫＶ（配列番号：２）またはＶＥＶＫＶＥＶＫＶＥＶＫ（配列番号：３）を含む自己組織化ペプチドをさらに含む、請求項１２記載の巨視的骨格。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
細胞外マトリックス(ECM)は、タンパク質および多糖類の両方を含む多様な型の巨大分子で構成され、該巨大分子は、体内で細胞が存在する三次元環境を形成し、細胞間の空間充填物質を構成する。ECMはまた、基底板または基底膜として知られるシート様の層に組織化され得る。ECMは、主に、局所的に分泌される分子からなり、該分子は、細胞層および組織の物理的構造を安定化し、かつ支持する骨格に組織化する。しかしながら、細胞の結合のための単なる不活性な基板であるよりむしろ、ECMは、生物学的情報に富んだ環境を構成する。ECMおよびECMに関連する種々の生体分子(例えば局所的に分泌されるか、または他の場所から特定の部位に移送される)は、細胞の挙動および表現型の多くの局面に重大な影響を及ぼし、移動および増殖などのプロセスを制御し、細胞の発達および分化に影響を及ぼし、細胞の形状および機能に作用することが受け入れられている。次いで、ECMの構造は、ECM中の細胞に影響を受ける。これらの細胞は多くのECM構成物を分泌するだけでなく、マトリックスのパターン付けの補助もする。したがって、細胞ECM相互作用は極めて重要なものであることが明らかである。天然供給源由来の生成物に伴う欠点を有することなく、天然の細胞環境の重要な局面を模倣する細胞環境の作製を可能にする、組織工学目的のための合成組成物および物質の必要性が残されている。体内への埋め込みを含む適用のために、免疫応答または炎症応答を誘発しないかまたは最小限で誘発するかかる組成物および物質の特定の必要性、ならびに体内で分解可能な組成物および物質の特定の必要性が残されている。また、望ましい方法で細胞の特性および機能に影響を及ぼす組成物および物質の必要性が当該技術分野に残されている。
【０００２】
ある部類の特製自己組織化ペプチド骨格が、三次元(3-D)細胞培養、薬物送達、再生医学および組織工学などの広範な用途を有することが以前に報告されている[1a]〜[5a]。該ある部類の自己組織化ペプチド物質は、5〜200nmの孔および90%を超える水分含有量を有する約10nmの繊維径の充分に秩序だったナノ繊維および骨格へと自発的に組織化し得る[6a]。これらのペプチド骨格は、コラーゲンなどの天然の細胞外マトリックスと同様の3-Dナノ繊維構造を有する。さらに、該骨格は、組織に対して優れた生体適合性を有する体内の種々のプロテアーゼにより生分解可能である[7a]。さらに、これらの骨格は、公知の生物学的に機能的なペプチドモチーフを用いたペプチドの直接伸長により改変され、かつ機能化されて、特定の細胞応答を促進し得る。これらのペプチド骨格のあるファミリーである機能化RADA16は、骨、軟骨、神経の再生および脈管形成の促進について研究されている[8a]〜[11a]。
【０００３】
歯周疾患の治療において、誘導された組織再生[12a]〜[14a]、骨移植[15a]、[16a]、エナメルマトリックス誘導体[17a]〜[19a]および成長因子の使用[20a]〜[25a]などの歯周組織を再生するための多くの外科的技術が開発されている。しかしながら、例えば動物からヒトに感染因子を移送する危険性および動物由来生体材料の取り扱いの困難性などのこれらの動物由来生体材料の使用に関する懸念がある。したがって、当該技術分野において、歯周組織再生のための改善された方法の必要性が残されている。
【発明の概要】
【０００４】
発明の概要
本発明は、新規の部類の自己組織化ペプチド(self-assembling peptides)、その組成物、その調製方法およびその使用方法に関する。本発明はまた、組織再生のための方法、細胞外マトリックスタンパク質の産生を増加させる方法および自己組織化ペプチドを投与する工程を含む治療方法を包含する。
【０００５】
一局面において、本発明は、配列VEVK(配列番号:1)を含む自己組織化ペプチドに関し、ここで、該ペプチドは、自己組織化し得る。さらなる局面において、本発明は、配列VEVKVEVKV(配列番号:2)またはVEVKVEVKVEVK(配列番号:3)を有する自己組織化ペプチドを包含する。本発明はまた、配列VEVKVEVKV(配列番号:2)またはVEVKVEVKVEVK(配列番号:3)を含む自己組織化ペプチドを含む。
【０００６】
別の局面において、本発明は、自己組織化ペプチドに関し、ここで該自己組織化ペプチドは：
a. 自己組織化を媒介する第1のアミノ酸ドメイン、ここで該第1のアミノ酸ドメインは、配列VEVK(配列番号:1)を含み、該ドメインは、単離された形態で自己組織化し得る；および
b. 単離された形態で自己組織化を媒介しない第2のアミノ酸ドメイン
を含む。
【０００７】
いくつかの態様において、第2のアミノ酸ドメインは、生物学的に活性なモチーフを含む。あるさらなる局面において、第1のアミノ酸ドメインはVEVKVEVKV(配列番号:2)またはVEVKVEVKVEVK(配列番号:3)である。さらなる局面において、生物学的に活性なモチーフは、ラミニン細胞接着モチーフである。またさらなる局面において、第2のアミノ酸ドメインは、PDGSR(配列番号:4)、YIGSR(配列番号:5)、IKVAV(配列番号:6)、LRE(配列番号:7)、RNIAEIIKDI(配列番号:8)、RYVVLPR(配列番号:9)、LGTIPG(配列番号:10)、PVGLIG(配列番号:11)およびGPVGLIG(配列番号:12)からなる群より選択される配列を含む。ある態様において、第2のアミノ酸ドメインは、PRGDS(配列番号:13)、YRGDS(配列番号:14)およびPRGDSGYRGDS(配列番号:15)などのRGDペプチドを含む。あるさらなる態様において、第2のアミノ酸ドメインは、マトリックスメタロプロテイナーゼ切断可能基質を含む。例示的なマトリックスメタロプロテイナーゼ切断可能基質は、配列PVGLIG(配列番号:16)を含む。
【０００８】
本発明のさらに別の態様において、本発明は、自己組織化ペプチドに関し、ここで、該自己組織化ペプチドは：
a. 自己組織化を媒介する第1のアミノ酸ドメイン、ここで該ドメインは、相補的であり、かつ構造的に適合性である疎水性アミノ酸と親水性アミノ酸を交互に含み、該ドメインは、非改変の(unmodified)形態で存在する場合に巨視的構造に自己組織化する；および
b. 単離された形態で自己組織化を媒介しない第2のアミノ酸ドメイン、ここで該第2のアミノ酸ドメインは生物学的に活性なモチーフを含み、該第2のアミノ酸ドメインは、PDGSR(配列番号:4)、YIGSR(配列番号:5)、LRE(配列番号:7)、RNIAEIIKDI(配列番号:8)、RYVVLPR(配列番号:9)、LGTIPG(配列番号:10)およびGPVGLIG(配列番号:12)からなる群より選択される配列を含む、
を含む。
【０００９】
ある局面において、該ペプチドの第1のアミノ酸ドメインは、複数のRADA(配列番号:17)ペプチドサブユニット、例えばAcN-RADARADARADARADA-CONH2(配列番号:18)を含む。さらに別の局面において、第1のアミノ酸ドメインは、配列VEVK(配列番号:1)、例えばVEVKVEVKV(配列番号:2)またはVEVKVEVKVEVK(配列番号:3)を含む。
【００１０】
さらに別の局面において、本発明は、歯の組織の再生を必要とする患者の歯の組織に、有効量の自己組織化ペプチドを投与する工程を含む、該患者において歯の組織を再生するための方法に関し、ここで、該自己組織化ペプチドは：
a. 自己組織化を媒介する第1のアミノ酸ドメイン、ここで該ドメインは、相補的であり、かつ構造的に適合性である疎水性アミノ酸と親水性アミノ酸を交互に含み、該ドメインは、非改変形態で存在する場合に巨視的構造に自己組織化する；および
b. 単離された形態で自己組織化を媒介しない第2のアミノ酸ドメイン、ここで第2のアミノ酸ドメインは、生物学的に活性なモチーフを含む、
を含む。
【００１１】
いくつかの局面において、歯の組織は歯周靭帯組織であり、自己組織化ペプチドは歯根膜(peridontium)に投与される。さらなる局面において、生物学的に活性なモチーフは、ラミニン細胞接着モチーフ、RGDペプチドまたはマトリックスメタロプロテアーゼ切断可能基質である。さらなる態様において、第2のアミノ酸ドメインは、PDGSR(配列番号:4)、YIGSR(配列番号:5)、IKVAV(配列番号:6)、LRE(配列番号:7)、RNIAEIIKDI(配列番号:8)、RYVVLPR(配列番号:9)、LGTIPG(配列番号:10)、PVGLIG(配列番号:19)、GPVGLIG(配列番号:12)、PRGDS(配列番号:13)、YRGDS(配列番号:14)、PRGDSGYRGDS(配列番号:15)およびPVGLIG(配列番号:19)からなる群より選択される配列を含む。さらに別の局面において、第1のアミノ酸ドメインは、複数のRADA(配列番号:17)ペプチドサブユニット、例えばAcN-RADARADARADARADA-CONH2(配列番号:18)を含む。さらなる局面において、第1のアミノ酸ドメインは、配列VEVK(配列番号:1)、例えばVEVKVEVKV(配列番号:2)またはVEVKVEVKVEVK(配列番号:3)を含む。
【００１２】
本発明はまた、歯周疾患の治療および/または歯周靭帯組織の再生を必要とする患者の歯根膜に有効量の自己組織化ペプチドを投与する工程を含む、該患者において歯周疾患を治療および/または歯周靭帯組織を再生する方法を包含し、ここで、該自己組織化ペプチドは：
a. 自己組織化を媒介する第1のアミノ酸ドメイン、ここで該ドメインは、相補的であり、かつ構造的に適合性である疎水性アミノ酸と親水性アミノ酸を交互に含み、該ドメインは、非改変形態で存在する場合に巨視的構造に自己組織化する；および
b. 単離された形態で自己組織化を媒介しない第2のアミノ酸ドメイン、ここで該第2のアミノ酸ドメインは、生物学的に活性なモチーフを含む、
を含む。
【００１３】
別の態様において、本発明は、前記患者の組織に、有効量の自己組織化ペプチドを投与する工程を含む、組織において細胞外マトリックスタンパク質産生を増加させる方法であり、ここで、該自己組織化ペプチドは：
a. 自己組織化を媒介する第1のアミノ酸ドメイン、ここで該ドメインは、相補的であり、かつ構造的に適合性である疎水性アミノ酸と親水性アミノ酸を交互に含み、該第1のドメインは、非改変形態で存在する場合に巨視的構造に自己組織化する；および
b. 単離された形態で自己組織化を媒介しない第2のアミノ酸ドメイン、ここで該第2のアミノ酸ドメインは、生物学的に活性なモチーフを含む、
を含む。
【００１４】
さらなる態様において、細胞外マトリックスはコラーゲンである。
【００１５】
さらに、本発明は、損傷した組織の再生を必要とする患者に有効量の自己組織化ペプチドを投与する工程を含む、該患者において損傷した組織を再生するための方法を含み、ここで、該自己組織化ペプチドは：
a. 自己組織化を媒介する第1のアミノ酸ドメイン、ここで該ドメインは、相補的であり、かつ構造的に適合性である疎水性アミノ酸と親水性アミノ酸を交互に含み；該第1のドメインは、非改変形態で存在する場合に巨視的構造に自己組織化する；および
b. 単離された形態で自己組織化を媒介しない第2のアミノ酸ドメイン、ここで該第2のアミノ酸ドメインは、生物学的に活性なモチーフを含む、
を含む。
【００１６】
ある局面において、第1のアミノ酸ドメインは、配列VEVK(配列番号:1)を含む。VEVK(配列番号:1)を含む例示的な配列としては、例えばVEVKVEVKV(配列番号:2)またはVEVKVEVKVEVK(配列番号:3)が挙げられる。さらなる態様において、該患者は、関節炎、神経学的状態、筋肉消耗状態(muscle wasting condition)、神経内分泌障害、筋肉変性、筋腱欠損(musculotendenous failure)、外傷、組織壊死、心臓障害、外科的切除、成長異常、骨粗しょう症、骨折または末梢脈管疾患のための虚血性損傷に苦しんでいる。さらなる局面において、損傷した組織は、骨格組織、骨組織、腱組織、結合組織または歯の組織からなる群より選択される。
【００１７】
さらなる局面において、本発明は：
a. 自己組織化を媒介する第1のアミノ酸ドメイン、ここで該ドメインは、相補的であり、かつ構造的に適合性である疎水性アミノ酸と親水性アミノ酸を交互に含み、該ドメインは、非改変形態で存在する場合に巨視的構造に自己組織化する；および
b. 単離された形態で自己組織化を媒介しない第2のアミノ酸ドメイン、ここで第2のアミノ酸ドメインは、生物学的に活性なモチーフを含む、
を含む、歯周組織再生のための骨格に関する。
【００１８】
いくつかの局面において、生物学的に活性なモチーフは、ラミニン細胞接着モチーフ、RGDペプチドまたはマトリックスメタロプロテアーゼ切断可能基質である。さらなる局面において、第2のアミノ酸ドメインは、PDGSR(配列番号:4)、YIGSR(配列番号:5)、IKVAV(配列番号:6)、LRE(配列番号:7)、RNIAEIIKDI(配列番号:8)、RYVVLPR(配列番号:9)、LGTIPG(配列番号:10)、PVGLIG(配列番号:19)、GPVGLIG(配列番号:12)、PRGDS(配列番号:13)、YRGDS(配列番号:14)、PRGDSGYRGDS(配列番号:15)およびPVGLIG(配列番号:19)からなる群より選択される配列を含む。さらに別の局面において、第1のアミノ酸ドメインは、複数のRADA(配列番号:17)ペプチドサブユニット、例えばAcN-RADARADARADARADA-CONH2(配列番号:18)を含む。さらなる局面において、第1のアミノ酸ドメインは、配列VEVK(配列番号:1)ペプチドサブユニット、例えばVEVKVEVKV(配列番号:2)またはVEVKVEVKVEVK(配列番号:3)を含む。
【００１９】
さらなる態様において、本発明は：
a. 自己組織化を媒介する第1のアミノ酸ドメイン、ここで該ドメインは、相補的であり、かつ構造的に適合性である疎水性アミノ酸と親水性アミノ酸を交互に含み、該ドメインは、非改変形態で存在する場合に巨視的構造に自己組織化する；および
b. 単離された形態で自己組織化を媒介しない第2のアミノ酸ドメイン、ここで該第2のアミノ酸ドメインは、生物学的に活性なモチーフを含む、
を含む、歯周組織再生のための骨格を、歯周疾患の治療を必要とする患者に投与する工程を含む、歯周疾患を治療する方法に関する。
【００２０】
さらなる局面において、該方法はさらに、固体生体材料を投与する工程を含む。
【００２１】
本発明はまた、2つの区画を有するシリンジを包含し、第1の区画はペプチド溶液を含み、第2の区画は、ゲル化液(gelation fluid)を含み、該ペプチド溶液は、自己組織化ペプチドを含む水溶液であり、該ペプチドは：
a. 自己組織化を媒介する第1のアミノ酸ドメイン、ここで該ドメインは、相補的であり、かつ構造的に適合性である疎水性アミノ酸と親水性アミノ酸を交互に含み、該ドメインは、非改変形態で存在する場合に巨視的構造に自己組織化する；および
b. 単離された形態で自己組織化を媒介しない第2のアミノ酸ドメイン、ここで該第2のアミノ酸ドメインは、生物学的に活性なモチーフを含む、
を含む。
【００２２】
本発明はまた、配列VEVK(配列番号:1)を含む複数の自己組織化ペプチドを含む、巨視的な骨格を包含する。
【００２３】
本発明はさらに、複数の自己組織化ペプチドを含む巨視的な骨格を包含し、該ペプチドは：
a. 自己組織化を媒介する第1のアミノ酸ドメイン、ここで該ドメインは、相補的であり、かつ構造的に適合性である疎水性アミノ酸と親水性アミノ酸を交互に含み、該ドメインは、非改変形態で存在する場合に巨視的構造に自己組織化する；および
b. 単離された形態で自己組織化を媒介しない第2のアミノ酸ドメイン、ここで該第2のアミノ酸ドメインは、生物学的に活性なモチーフを含む、
を含み、該骨格は、その表面に結合するかまたは該骨格内に包まれる生細胞をさらに含む。
【００２４】
ある態様において、本発明は巨視的な骨格であり、ここで、該骨格の表面上の細胞または該骨格内に包まれる細胞は、歯周靭帯線維芽細胞である。さらに別の態様において、本発明は巨視的な骨格であり、ここで、該第1のアミノ酸ドメインは配列VEVK(配列番号:1)を含み、任意に、該細胞は、骨芽細胞、セメント芽細胞、骨髄細胞、線維芽細胞、歯周靭帯線維芽細胞、間葉細胞、間葉幹細胞、脂肪由来細胞、脂肪由来幹細胞、歯周靭帯幹細胞、歯髄幹細胞、脱落乳歯由来の幹細胞および胚性幹細胞からなる群より選択される。さらなる態様において、細胞は、歯周靭帯線維芽細胞である。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
前述およびその他の本発明の課題、特徴および利点は、添付の図面に図示されるように、以下の本発明の好ましい態様のより具体的な説明から明らかであろう。図面において、同じ参照記号は異なる図を通して同じ部分を言及する。図面は必ずしも同じ縮尺ではなく、代わりに発明の原理の説明に重点が置かれる。
【図１】図1は、歯、歯肉、歯周靭帯、セメント質および歯槽骨を示す図である。
【図２】図2は、2週間の細胞培養後、異なる混合比を使用したそれぞれの機能化ペプチド骨格上の細胞数を示す棒グラフである(PRG(1:9)は、PRG:RADA16=1:9の混合比を意味する。#は、p<0.01のt検定を示す)；PRGおよびRADA16は、実施例セクションにて詳細に説明される)。
【図３Ａ】図3Aは、2週間の細胞培養後のそれぞれの機能化ペプチド骨格上の細胞の形態を示す写真である。
【図３Ｂ】図3Bは、2週間の細胞培養後のそれぞれの機能化ペプチド骨格上の細胞の形態を示す写真である。
【図４】図4は、2週間の細胞培養後の細胞のペプチド骨格内への移動を示す共焦点顕微鏡画像である。
【図５】図5は、細胞培養6週間後のペプチド骨格上のI型(緑)コラーゲン産生およびIII型(赤)コラーゲン産生の蛍光免疫染色画像である。
【図６】図6は、ペプチド骨格PDSにおける歯周靭帯線維芽細胞と歯肉線維芽細胞の間の比較試験を示す(PDSは、実施例セクションにて詳細に説明される)。
【図７】図7は、ペプチド骨格vPDS_9、vYIG_9およびvIKV_9(実施例セクションにて詳細に説明される)における歯周靭帯線維芽細胞と歯肉線維芽細胞の間の比較試験を示す。
【図８】図8は、機能化ペプチドvPVGが細胞移動を促進することを示す共焦点顕微鏡画像である。
【図９】図9は、細胞培養3週間後のそれぞれの示される機能化ペプチド骨格上の細胞数を示す棒グラフである。(A；VEVK9、B；vPRG_9、C；vPVG_vPRG_9、D；vYIG_9、E；vPVG_YIG_9、F；vIKV_9、G；vPVG_vIKV_9、H；VEVK12、I；vPRG_12、J；vPVG_vPRG_12、K；vYIG_12、L；vPVG_vYIG_9、M；vIKV_12、N；vPVG_vIKV_12)。
【図１０】図10Aおよび10Bは、機能化ペプチド骨格vPVG_vPRG_9における細胞増殖を示す線グラフである。1日、7日、11日および21日の培養後に(A)細胞数および(B)侵入深さを測定した。
【図１１】図11Aは、示される機能化ペプチドの分子モデルを示す。図11BおよびCは、VEVK12(b)およびvPVG_vPRG_9(c)のAFM画像を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
発明の詳細な説明
本発明の好ましい態様の説明は以下の通りである。
【００２７】
単語「a」または「an」は、そうでないと特定されない限りは、1つ以上を包含することを意味する。例えば、用語「a peptide」は、そうでないと示されない限りは、1つ以上のペプチドを包含する。
【００２８】
用語「自己組織化」は、水性媒体に添加される場合などの環境中の条件に応答した、分子またはペプチドが規則的な形状の構造または凝集物を形成するプロセスである。
【００２９】
用語「自己組織化ペプチド」は、自己組織化モチーフを含むペプチドのことをいう。自己組織化ペプチドは、巨視的な膜、ナノ構造等を含むが限定されない構造に自己組織化し得るペプチドである。種々の自己組織化ペプチドおよびその調製方法は、これまでに、例えば米国特許第5,670,483号；第5,955,343号；第6,368,877号；第7,098,028号および第7,449,180号ならびに米国特許出願公開第2002/0160471号、第2005/0181973号および第2007/0203062号に記載されており、それぞれの内容は参照により本明細書中に援用される。
【００３０】
用語「自己組織化モチーフ」は、自己組織化し得るペプチド配列またはモチーフのことをいう。
【００３１】
用語「イオン性自己組織化ペプチド」は、疎水性アミノ酸と親水性アミノ酸が交互にある配列を含む自己組織化ペプチドのことをいい、前記親水性アミノ酸は荷電アミノ酸である。いくつかの態様において、イオン性自己組織化ペプチドは、疎水性アミノ酸と親水性アミノ酸が交互にある配列を含み、前記親水性アミノ酸は、酸性または塩基性のアミノ酸である。イオン性自己組織化ペプチドは、例えば米国特許第5,670,483号に記載される。
【００３２】
本明細書で使用する場合、用語「アミノ酸」は、天然に存在するアミノ酸または天然には存在しないアミノ酸を包含する。天然には存在しないアミノ酸はまた、本明細書では「非天然アミノ酸」と称される。天然に存在するアミノ酸は、本明細書では「天然アミノ酸」とも称される。天然アミノ酸は、それらの周知の一文字表記：アラニンについてA、システインについてC、アスパラギン酸についてD、グルタミン酸についてE、フェニルアラニンについてF、グリシンについてG、ヒスチジンについてH、イソロイシンについてI、リジンについてK、ロイシンについてL、メチオニンについてM、アスパラギンについてN、プロリンについてP、グルタミンについてQ、アルギニンについてR、セリンについてS、トレオニンについてT、バリンについてV、トリプトファンについてWおよびチロシンについてYにより表される。
【００３３】
用語「生理学的pH」は、約7のpHである。
【００３４】
用語「巨視的」は、10倍以下の拡大下で可視的であるほどに充分に大きい寸法を有することを意味する。巨視的構造体は、二次元または三次元であり得る。用語「巨視的構造(macroscopic structure)」および「巨視的な物質(macroscopic material)」は、本明細書において互換的に使用される。
【００３５】
「生物学的に活性なペプチドモチーフ」または「生物学的に活性なモチーフ」または「生物学的に活性なドメイン」は、生物学的に活性なモチーフを含むペプチドに細胞を接触させた場合に、適切な細胞型において表現型的な応答または変化を誘導するペプチドモチーフである。生物学的に活性なモチーフは、例えばその内容が本明細書中で参照により明示的に援用される米国特許第7,713,923号に記載される。いくつかの局面において、生物学的に活性なモチーフは、天然に存在するタンパク質中に見られるモチーフである。生物学的に活性なペプチドモチーフは、単離された形態で存在し得るか、またはより大きなポリペプチドもしくは他の分子の一部として存在し得る。ペプチドが応答を誘起する能力は、例えば、該ペプチドの非存在下での応答を比較することにより(例えば、通常より大きなポリペプチド中に正常に存在する場合にペプチドを変異させるか除去することにより)決定され得る。本発明のいくつかの態様において、表現型的な応答または変化としては、限定されないが、細胞の拡散、結合、接着、増殖、細胞外マトリックス(ECM)分子の分泌、または特定の分化した細胞型の表現型特徴の発現の促進が挙げられる。
【００３６】
本明細書で使用する場合、「単離された」は、1)天然において、通常それに結合しているまたは天然にそれに付随する、成分の少なくともいくつかから分離されたこと；2)人の手を含む方法により調製または精製されたこと；および/または3)天然には存在しないことを意味する。
【００３７】
本発明によると、「ペプチド」、「ポリペプチド」または「タンパク質」は、ペプチド結合により互いに連結した少なくとも2つのアミノ酸の配列を含む。本明細書に記載されるアミノ酸配列および式は、配列が左から右に読まれるように慣例に従って記載され、ここで左はN末端に対応し、右はC末端に対応する。
【００３８】
自己組織化しないアミノ酸ドメインは、以下に記載されるような非改変自己組織化ペプチドの自己組織化をもたらす条件(例えば、イオン濃度、ペプチド濃度、pH、温度)下で、単離されたペプチドとして存在する場合(すなわち、自己組織化ペプチドに結合または連結していない場合)に、自己組織化しないアミノ酸ドメインである。「自己組織化しない」は、アミノ酸ドメインまたはペプチドが、ナノフィラメントまたはナノ繊維を形成しないこと、巨視的構造体を形成しないこと、または典型的に、βシート、ナノ繊維もしくは巨視的構造体のいずれかを形成しないことを意味する。
【００３９】
「治療する」または「治療」は、疾患の症状、合併症もしくは生化学的徴候の開始を予防または遅らせるための本発明の局面の組成物、化合物もしくは薬剤の投与、該症状を緩和もしくは改善すること、および/または該疾患、状態もしくは障害のさらなる発症を阻止または阻害することを含む。
【００４０】
「治療有効量」は、単独で、または1つ以上の他の活性剤と組み合わせて、治療対象の疾患または状態の1つ以上の症状を制御、低減、阻害、改善、予防、またはそうでなければ作用し得る量である。
【００４１】
「有効量」は、単独で、または1つ以上の他の活性剤と組み合わせて、示される目標を達成するのに充分な量である。例えば、組織再生の文脈において、薬剤の「有効量」は、該薬剤の量が組織再生をもたらすのに充分であることを意味する。
【００４２】
自己組織化ペプチド
上述のように、本発明は、非改変形態で存在する場合に自己組織化し得る第1のアミノ酸ドメインおよび単離されたまたは非改変形態で自己組織化しない第2のアミノ酸ドメインを含む自己組織化ペプチドを含む方法および組成物に関する。自己組織化ペプチドは、限定されないが、巨視的な膜、ナノ構造等を含む構造に自己組織化し得るペプチドである。かかる自己組織化ペプチドおよび本明細書に記載されるペプチドの第1のアミノ酸ドメインにおいて使用され得る例示的なペプチドは、例えば、米国特許第5,670,483号、第5,955,343号、第6,368,877号、第7,098,028号および第7,449,180号ならびに米国特許出願公開公報第2005/0181973号、第2007/0203062号および第2009/0162437 A1号に記載され、それぞれの内容は本明細書において参照により明示的に援用される。
【００４３】
多数の自己組織化自己相補性ペプチドは、アミノ酸配列を変化させ、かつ周期的なパターンに従うことにより設計される。ある態様において、自己組織化ペプチドは、溶液(例えば水溶液)中で、規則的な二次構造、例えばβシート構造を採る。このことは、ペプチドが、1つは親水性でありもう一方は親水性である2つの異なる表面を含み、親水性表面上で規則的な繰り返しと相補的なイオン結合を形成するという事実に起因し得る。該ペプチドの側鎖は、荷電したイオン性側鎖で構成される極性面および疎水性基で構成される非極性面の2つの面に区分される。イオン性側鎖は、正に荷電アミノ酸残基および負に荷電アミノ酸残基が相補的なイオン対を形成し得るという点で互いに自己相補的である。相補的なイオン側鎖は、いくつかのモジュラス(moduli)、すなわちモジュラス(modulus)I、II、III、IV等および混合されたモジュラスに分類される。モジュラスIペプチドは、イオン性残基が1つの正に荷電した残基と1つの負に荷電した残基が交互になっているペプチドである(-+-+-+-+)。モジュラスIIペプチドは、イオン性残基が、2つの正に荷電した残基と2つの負に荷電した残基が交互になっているペプチドである(--++--++)。モジュラスIVペプチドは、イオン性残基が、4つの正に荷電した残基と2つの負に荷電した残基が交互になっているペプチドである(----++ ++)。
【００４４】
単離された形態で自己組織化するペプチドは、それらを、(単離された形態で自己組織化する第1のアミノ酸ドメインに加えて、さらに単離された形態で存在する場合に自己組織化しない1つ以上のさらなるアミノ酸ドメインを含む)「改変された」自己組織化ペプチドまたは「機能化」自己組織化ペプチドと区別するために、本明細書において非改変自己組織化ペプチドと称され得る。改変された自己組織化ペプチドおよびそれから形成されたヒドロゲルはまた、本明細書において「機能化された」と記載される。
【００４５】
一態様において、自己組織化し得る第1のアミノ酸ドメインは、疎水性アミノ酸と親水性アミノ酸を交互に有する。いくつかの局面において、自己組織化し得る第1のアミノ酸ドメインは、少なくとも8アミノ酸長である。該ペプチドの最適な長さは、アミノ酸組成に応じて変化する。
【００４６】
それらの親水性側鎖の間でイオン化対(ionized pair)を形成し得るペプチドは、「相補的(complementary)」ペプチドと称される。対形成の際に一定の距離を保ち得るペプチドは、「構造的に適合性(structurally compatible)」であると称される。上述の基準を満たすペプチドは、均質なペプチド溶液中で巨視的な膜に自己組織化すると予想され、本明細書において「自己相補的ペプチド」または「疎水性アミノ酸と親水性アミノ酸を交互に有するペプチド」と称される。かかる巨視的な膜はまた、ペプチドが互いに相補的であり、かつ構造的に適合性である場合に、ペプチドの異成分からなる混合物でも形成され得る(該ペプチドのそれぞれは単独では膜を形成しない)。ペプチドの異成分からなる混合物の例は、(Lys-Ala-Lys-Ala)4および(Glu-Ala-Glu-Ala)4の混合物、または(Lys-Ala-Lys-Ala)4および(Ala-Asp-Ala-Asp)4の混合物である。水中では巨視的な膜は形成されないが、塩を含む溶液中では形成される。一価の金属カチオンが存在することで、膜形成が誘導されるが、二価のカチオンは、主に非構造化凝集物を誘導する。これらの巨視的な膜は、水、リン酸緩衝化食塩水(PBS)、血清およびエタノールを含むが限定されない種々の水溶液中で安定である。
【００４７】
本発明のある態様において、アシル基(RCO--、式中Rは、有機基である)、例えばアセチル基(CH3CO- -)などの基またはラジカルは、そうでなければ存在し得る余分の正電荷(例えば、N末端アミノ酸の側鎖から生じない電荷)を中和するためにペプチドのN末端に存在することに留意のこと。同様に、アミン基(NH2)などの基は、余分の負電荷(例えばC末端アミノ酸の側鎖から生じない電荷)を中和するために使用され得、それに従って、C末端がアミド(--CONH2)に変換される。何ら理論に拘束されることを望まないが、N末端およびC末端の分子上の電荷の中和は、自己組織化を容易にし得る。他の適切な基を選択することは、充分に当業者の視野内にある。
【００４８】
自己相補的ペプチドは、巨視的な多孔質マトリックスを形成するのに充分なイオン濃度(例えば一価のカチオンを含む)に曝された場合、種々の巨視的構造体に自己組織化する。これらのマトリックスは、限定されないが、リボン、テープ様構造、二次元および三次元骨格等を含む種々の物理的形態を採り得る。一態様において、該マトリックスは、フィラメントの直径が約10〜約20nmであり約50〜約100nmの直径の孔径を有する織り合わされたフィラメントで構成される。巨視的構造体の調製のための詳細な方法は、米国特許第5,670,483号、第5,955,343号および第6,368,877号に記載され、それぞれの内容は参照により本明細書中に明示的に援用される。自己相補的ペプチドの自己組織化は、一価のカチオンを実質的に含まないかまたはわずかに低い濃度のかかるイオンを含む溶液(例えば約10nM未満)に該ペプチド溶解し、次いでペプチド溶液にイオン溶質を添加するか、または溶液のpHを変化することにより開始され得る。自己相補的ペプチドの巨視的構造体への組織化は、自己組織化を開始させるのに充分な濃度の一価のイオンを含む溶液にペプチドを添加することによっても開始され得る。
【００４９】
一態様において、均質な混合物中で巨視的構造体を形成することが予想される自己組織化ペプチドは、以下の式：
0005855651.tif 000002
(式中：
Φ、ΨおよびΓは、それぞれ組成および構造を決定する中性アミノ酸、正荷電アミノ酸および負荷電アミノ酸を示し、
i、j、kおよびtは整数であり、変数を示し；
nは、オリゴペプチドの長さも決定する繰り返し単位の数を表す)
の1つで表される。
【００５０】
上述のように、いくつかの態様において、自己組織化ペプチドは、ナノ繊維のネットワークを形成するように自己組織化し、1〜10mg/mlの範囲で水に溶解した場合に99%より高い水含有量のヒドロゲルを生じる。ナノ繊維ネットワークは、ヒドロゲル形成をもたらし、好ましくは肉眼で観察し得かつ三次元であり得るサイズの巨視的構造体を生成し得る。巨視的構造体を形成するペプチドは、8〜200アミノ酸、8〜64アミノ酸、8〜36アミノ酸または8〜16アミノ酸(両端を含む)を含み得る。自己組織化の前のペプチドの濃度は、例えば、約0.01%(0.1mg/ml)〜約99.99%(999.9mg/ml)(両端を含む)の範囲であり得る。また、自己組織化の前のペプチドの濃度は、特に細胞培養および/または治療適用のために、約0.1%(1mg/ml)〜約10%(100mg/ml)(両端を含む)であり得る。本発明のある態様において、自己組織化の前のペプチドの濃度は、約0.1%(1mg/ml)〜約5%(50mg/ml)(両端を含む)、または約0.5%(5mg/ml)〜約5%(50mg/ml)(両端を含む)である。ある態様において、自己組織化の前のペプチドの濃度は、約5mg/ml、約10mg/ml、約15mg/mlまたは約20mg/mlである。
【００５１】
所望の場合、所定の形状または体積を有するペプチド骨格が形成され得る。所望の幾何構造または寸法を有する骨格を形成するために、水性ペプチド溶液は、予め形作られた鋳型中に入れられ得、ペプチドは、本明細書において記載されるようにイオンを添加することで骨格への自己組織化が誘導される。代替的に、実質的な組織化が起こる前に注意して溶液を鋳型に入れるとの条件で、溶液を鋳型に入れる少し前に、ペプチド溶液にイオンが添加され得る。得られた物質の特徴、組織化に要する時間、ならびに巨視的なペプチド骨格の幾何構造および寸法は、適用されるペプチド溶液の濃度および量、骨格の組織化を誘導するために使用されるイオンの濃度、pH、特定の自己組織化ペプチドの配列および鋳造装置の寸法などのパラメーターにより支配される。ペプチド構造または骨格が体内に埋め込まれる場合、形状は、意図される埋め込み部位に基づいて選択され得る。骨格は、本発明の種々の態様に従って、例えば従来の組織培養の底部を被覆するまたは溶液中に浮かぶ薄層として存在し得る。該層は、例えば数ミクロンの厚さ、例えば10ミクロン、10〜50ミクロン、50〜100ミクロン、100〜200ミクロンなどであり得る。該層は、例えば複数のβシート層を含み得る。剛性または弾性の程度が異なる自己組織化したナノスケールの骨格は、形成され得る。典型的に、ペプチド骨格は、例えば標準的なコーンプレート型レオメーター中で測定した場合、1〜10kPaの範囲の低い弾性率を有する。
【００５２】
本明細書に記載の組成物および方法に使用され得る自己相補的なペプチドの非限定的な特定の例は、以下の表1に列挙される：
0005855651.tif 000003
0005855651.tif 000004
【００５３】
VEVK9およびVEVK12は、以下により詳細に記載される。自己相補的なペプチドの他の例は、例えば米国特許第5,670,483号、第5,955,343号、第6,368,877号および米国特許出願公開第20090162437A1号に記載され、それぞれの内容が本明細書中に明示的に援用される。
【００５４】
さらに、自己組織化ペプチドのアミノ酸は、天然アミノ酸である。別の態様において、自己組織化モチーフのアミノ酸は、非天然アミノ酸を含む。さらに別の局面において、該ペプチドは、L-アミノ酸、D-アミノ酸、天然アミノ酸、非天然アミノ酸またはそれらの組合せを含み得る。D-アミノ酸を含む多数の部類の非天然アミノ酸は記載されている(Luo et al. (2008), PLoS ONE 3(5): e2364. doi: 10.1371/journal.pone.0002364、その内容は、参照により本明細書中に援用される)。例示的な非天然アミノ酸は、ヒドロキシプロリンである。骨格中にL-アミノ酸が存在する場合、分解により、例えば培養物中の細胞または宿主組織中の細胞が再利用し得るアミノ酸が生成される。該ペプチドは、化学的に合成され得るか、または天然もしくは組換え供給源から精製され得、該ペプチドのアミノ末端およびカルボキシ末端は、保護されてもよく保護されなくてもよい。該ペプチド骨格は、互いに相補的かつ構造的に適合性であるペプチドの1つ以上の異なる分子種から形成され得る。隣接するペプチド由来の2つの同様に荷電した残基の反発性ペアなどのミスマッチペアを含むペプチドはまた、ペプチド間の相互作用を安定化することにより分裂力が抑えられる場合に構造を形成し得る。
【００５５】
アミノ酸配列VEVK(配列番号:1)を含むペプチド
上述のように、いくつかの自己組織化ペプチドは文献に記載されている。これらの自己組織化ペプチドは、ナノ繊維および巨視的な骨格などの構造への自発的な組織化を経験する。例示的なペプチドは、相補的かつ構造適合性であり、交互にある親水性アミノ酸と疎水性アミノ酸の繰り返し単位で構成され、荷電した残基は、交互にある正電荷および負電荷を含み得る。例示的な自己組織化ペプチドは、RADA-16-I(Ac-RADARADARADARADA-CONH2(配列番号:18)である。RADA-16-Iを含む機能化骨格は、骨、軟骨および神経の再生において有用性を有することが記載される[6b〜10b]。機能化RADA-16-1は、比較的長いペプチド配列を生じ得る。いくつかの状況下で、より短いペプチド骨格を製造することが望ましくあり得る。
【００５６】
自己組織化ペプチド骨格の形成およびその特性は、疎水性のレベルを含む多くの要因に影響を受ける。そのため、イオン性相補的相互作用に加えて、疎水性残基の程度は、骨格の機械的特性および自己組織化の速度に影響を及ぼし得る。ペプチドのより高い疎水性は、自己組織化に必要なペプチドの長さがより短いことおよび骨格の特性がより簡単であることに相当する。疎水性である天然のアミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、チロシン、フェニルアラニンおよびトリプトファンが挙げられる。
【００５７】
いくつかの態様において、本発明は、アミノ酸配列VEVK(配列番号:1)を含む自己組織化ペプチドに関する。ある態様において、配列VEVK(配列番号:1)を含む自己組織化ペプチドは、7〜16アミノ酸長、8〜14アミノ酸長または9〜12アミノ酸長である。VEVK (配列番号:1)を含むペプチドの非限定的な例は、VEVKVEVKV(配列番号:2)およびVEVKVEVKVEVK(配列番号:3)である。さらなる態様において、VEVK(配列番号:1)を含むアミノ酸は、配列VEVKVEVKV(配列番号:2)または配列VEVKVEVKVEVK(配列番号:3)を含む。
【００５８】
さらなる局面において、本発明は：
a. 自己組織化を媒介する第1のアミノ酸ドメイン、ここで該第1のアミノ酸ドメインは、配列VEVK(配列番号:1)を含み、該ペプチドは、単離された形態で自己組織化し得る；および
b. 単離された形態で自己組織化を媒介しない第2のアミノ酸ドメイン、ここで該第2のアミノ酸ドメインは、生物学的に活性なモチーフを含む、
を含む、自己組織化ペプチドである。
【００５９】
例示的な生物学的に活性なモチーフは、例えば米国特許出願公開第20090162437A1号、第20050181973号および第20070203062号ならびにGelain et al. (2006). PLoS ONE 1(1): el 19. doi: 10.1371/journal.pone.0000119などの科学文献および特許文献に記載され、その内容は参照により本明細書中に明示的に援用される。例示的な生物学的に活性なモチーフはまた、以下により詳細に記載される。
【００６０】
さらなる局面において、本発明は、複数の自己組織化ペプチドを含む巨視的な骨格を包含し、ここで、該ペプチドは、配列VEVK(配列番号:1)を含む自己組織化ドメインを含み、自己組織化し得る。ある局面において、本発明は、自己組織化モチーフを含む複数のペプチドを含む水性組成物に関し、ここで、それぞれの自己組織化モチーフは、アミノ酸配列VEVK(配列番号:1)を含み、該ペプチドは、自己組織化し得る。別の態様において、本発明は、自己組織化したナノ構造であり、該ナノ構造は、配列VEVK(配列番号:1)を含むペプチドを含み、ここで、該ペプチドは、自己組織化し得る。さらに別の態様において、本発明は、配列VEVK(配列番号:1)を含むペプチドの水性混合物を形成する工程を含む、自己組織化したナノ構造を調製する方法であり、ここで、該ペプチドは、ペプチドの自己組織化に適した条件下で自己組織化し得る。さらなる態様において、本発明は、複数のペプチドを含む巨視的な物質であり、ここで、それぞれのペプチドは、配列VEVK(配列番号:1)を含み、該ペプチドは、自己組織化し得る。いくつかの局面において、該物質は、βシートで構成される。さらなる局面において、本発明は、細胞を含む細胞培養培地に本発明の巨視的な膜を添加して、それにより膜/培養物混合物を形成する工程；およびb)該混合物を、細胞増殖に充分な条件下で維持する工程を含む、インビトロ細胞培養のための方法である。さらに別の態様において、本発明は、複数の自己組織化ペプチドを含む巨視的な骨格であり、ここで、該ペプチドは、アミノ酸配列VEVK(配列番号:1)を含む自己組織化モチーフを含み、自己組織化し得、該ペプチドは、βシート巨視的骨格に自己組織化し、該巨視的骨格は、生細胞を包み、該細胞は、三次元配置で該巨視的骨格中に存在する。ある態様において、配列VEVK(配列番号:1)を含むペプチドは、VEVKVEVKV(配列番号:2)またはVEVKVEVKVEVK(配列番号:3)である。あるさらなる局面において、配列VEVK(配列番号:1)を含むペプチドは：
a. 自己組織化を媒介する第1のアミノ酸ドメイン、ここで該第1のアミノ酸ドメインは、配列VEVK(配列番号:1)を含み、該ペプチドは、単離された形態で自己組織化し得る；および
b. 単離された形態で自己組織化を媒介しない第2のアミノ酸ドメイン、ここで該第2のアミノ酸ドメインは、生物学的に活性なモチーフを含む、
を含む。
【００６１】
生物学的に活性なモチーフ
改変されたペプチドが自己組織化して巨視的構造体を形成する能力を消すことなく、自己組織化しないさらなるドメインを組み込むことにより、上述のペプチド等の自己組織化し得るペプチドを改変することが可能であることが以前に記載されている(例えば、米国特許出願公開第2009/0162437号)。そのため、一態様において、自己組織化ペプチドは、(a)自己組織化を媒介する第1のアミノ酸ドメイン、ここで該ドメインは、相補的であり、かつ構造的に適合性である疎水性アミノ酸と親水性アミノ酸を交互に含み、該ドメインは、非改変形態で存在する場合に巨視的構造体に自己組織化する；および(b)単離された形態で自己組織化しない第2のアミノ酸ドメインを含む。かかる自己組織化ペプチドは、例えば米国特許出願公開第2005/0181973号および第2009/0162437A1号に記載され、その内容は参照により本明細書中に援用される。
【００６２】
本発明のいくつかの態様において、第2のアミノ酸ドメインは、生物学的に活性なペプチドモチーフである。本発明に従って使用し得る生物学的に活性なモチーフとしては、米国特許出願公開第2005/0181973号およびGelain et al. (2006). PLoS ONE 1(1): el 19. doi: 10.1371/journal.pone.0000119に記載されるものが挙げられ、その内容は参照により本明細書中に援用される。生物学的に活性なモチーフとしては、例えば細胞の結合、増殖、分化および移動などのいくつかの生物学的機能に関与するものとして同定された細胞基底膜中のタンパク質由来の短いペプチド配列が挙げられる(Iwamoto et al. (1987). Science 238: 1132-34; Kleinman et al. (1989), PNAS 87: 2279-83; Koliakos et al. ((1989), J. Biol. Chem. 264, 2313-2323)。種々の生物学的に活性なモチーフは、例えば、ラミニン、コラーゲンIV、ナイドジェン、プロテオグリカンおよび血管内皮細胞中で同定された。例えば、生物学的に活性なモチーフは、PRGDSGYRGDS(配列番号:15)などの反復性RGD配列などのRGDペプチドであり得る。生物学的に活性なモチーフの別の例は、PC12細胞による神経突起伸長の活性を促進するラミニンα鎖由来の配列AASIKVAVSADR(配列番号:49)、ヒト臍静脈内皮細胞(HIVEC)によるマトリゲル(Matrigel)マトリックスの分解を誘導するペプチドCSRARKQAASIKVAVSADR(配列番号:50)である。また、ラミニンのβ1鎖上に位置する配列YIGSR(配列番号:5)、PDSGR(配列番号:4)およびRYVVLPR(配列番号:9)は、細胞接着を促進した。ラミニンγ1鎖由来の配列KAFDITYVRLKF(配列番号:51)も、HUVEC接着および管形成、ならびに神経細胞接着および神経突起伸長を促進した。IV型コラーゲン由来のペプチド配列TAGSCLRKFSTM(配列番号:52)は、ヘパリンに特異的に結合することが見出された。さらに例えば、ナイドジェン中で見出されるRGD配列は、細胞結合部位として作用する。
【００６３】
本発明に従って使用され得る、生物学的に活性なモチーフの非限定的な例を以下の表2に示す：
0005855651.tif 000005
0005855651.tif 000006
【００６４】
いくつかの態様において、生物学的に活性なモチーフは、組織再生に関与するアミノ酸モチーフである。さらに別の態様において、生物学的に活性なモチーフは、歯周組織再生に関与するアミノ酸モチーフである。歯周組織再生に関与する生物学的に活性なモチーフの非限定的な例としては、限定されないが、ラミニン細胞接着モチーフ、RGDペプチドおよびマトリックスメタロプロテイナーゼ分解可能モチーフが挙げられる。
【００６５】
ラミニンは、細胞を支持する構造的成分であり、細胞の機能を調節する有益な微小環境を細胞に提供する基底膜の主要な成分である。ラミニンは、特異的な細胞接着特性を有し、そこに歯周靭帯線維芽細胞および/または骨芽細胞が接着し得ることが報告されている(Palaiologou et al. (2001), J. Periodontal. 72: 798-807; Giannopoulou et al. (1996), J Dent Res 75: 895-902; Grzesik et al. (1998), J. Dent. Res. 77: 1606-1612)。ラミニン細胞接着モチーフの非限定的な例は、IKVAV(配列番号:6)、LGTIPG(配列番号:10)、RYVVLPR(配列番号:9)、PDSGR(配列番号:4)、YIGSR(配列番号:5)、LRE(配列番号:7)およびRNIAEIIKDI(配列番号:8)である。
【００６６】
RGDペプチドは、RGD(Arg-Gly-Asp)アミノ酸配列を含むペプチドである。RGDは、細胞と細胞外マトリックス(ECM)の接着を媒介する細胞表面受容体であるインテグリンのための重要な結合配列または認識配列である。RGDペプチドは、例えばRuoslahti et al. (1996), Annual Review of Cell and Development Biology, 12: 697-715 and D'Souza et al., Trends in Biochemical Sciences 16: 246-50に概説されており、それぞれの内容は参照により本明細書に明示的に援用される。PRGDS(配列番号:13)およびYRGDS(配列番号:14)は、天然のタンパク質において最も一般的に存在するRGDモチーフである。さらなる例示的なRGD配列は、PRGDSGYRGD(配列番号:15)、GRGDSP(配列番号:83)である。RGD結合配列の反復により、細胞への結合の可能性が高まる。反復は、効果的なコンホメーションの可能性を高めるので、結合は、構造的コンホメーションによりさらに影響を受ける(Kantlehner et al. (2000))。反復的RGD配列は、少なくとも2つのRGD配列を含むペプチド配列であり、例えばPRGDSGYRGD(配列番号:15)は2つのRGD配列を含む。
【００６７】
マトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)は、細胞外マトリックス成分を分解し、組織再生に重要な役割を果たすプロテアーゼのファミリーに属する。これらのタンパク質は、細胞が拡張する道筋を作り、細胞外マトリックスのリモデリングを可能にし、細胞外マトリックスから埋まっていた成長因子および他のシグナルを放出させて細胞分化および組織成長を刺激する。MMP切断可能基質を自己組織化ペプチド骨格に組み込むことは、細胞および組織のリモデリング活性を誘発するための動的機構を作り変えるための魅力的なストラテジーである(Turk et al. (2001), Nat. Biotechnol. 19: 661-7)。例示的なMMP分解可能モチーフは、PVLIG(配列番号:11)である。
【００６８】
本発明のある態様において、非自己組織化アミノ酸ドメインの添加は、改変されたペプチドが自己組織化すること、例えばナノ繊維、巨視的構造体またはその両方を形成することを防がない。あるさらなる局面において、改変されたペプチドは自己組織化して、ナノ繊維で構成される巨視的構造体を形成する。非改変自己組織化ペプチドは、該ペプチドへのアミノ酸の添加を含まない上述のいくつかの方法のいずれかで変更され得、これらの変更は、本明細書において変更および/または誘導体化と称されることが理解される。本発明の改変された自己組織化ペプチドは、天然に存在する分子とは異なり、例えば該ペプチドは、天然に存在する分子には見られないが、本発明のペプチドのアミノ酸ドメインの1つ以上は、天然に存在する分子中に存在してもよい。そのため、該ペプチドは、「単離された」または「合成」とみなされ、該ペプチドの全体の配列は、人の介入なしで天然には存在しないことを意味する。
【００６９】
生物学的に活性なモチーフが、単離された形態で自己組織化するペプチドを含む第1のドメインのN末端またはC末端の近位に位置し得る(例えば連結基を介して結合される)ことがさらに理解される。同じであり得るかまたは異なり得る生物学的に活性なモチーフは、さらに、第1のドメインのN末端およびC末端の両方に位置し得る。
【００７０】
本発明のある態様において、改変された自己組織化ペプチドの自己組織化が起こる条件は、対応する非改変自己組織化ペプチドが組織化する条件と同じである。本発明の他の態様において、改変された自己組織化ペプチドの自己組織化が起こる条件は、対応する非改変自己組織化ペプチドが組織化する条件とは異なる。この場合、改変された自己組織化ペプチドの自己組織化のための条件は、異なる(対応しない)非改変自己組織化ペプチドが自己組織化する条件と同じである。
【００７１】
ある局面において、第2のアミノ酸ドメインは、ペプチドが組織化してナノ繊維および/または巨視的構造体を形成するような第1のアミノ酸ドメインの組織化を可能にする。本発明の好ましい態様において、ペプチドはβシートを形成する。本発明のある態様において、アミノ酸ドメインは、少なくとも3アミノ酸、少なくとも4アミノ酸、少なくとも5アミノ酸、少なくとも6アミノ酸、少なくとも7アミノ酸、少なくとも8アミノ酸、少なくとも9アミノ酸、少なくとも10アミノ酸、またはそれ以上、例えば15または16アミノ酸、20アミノ酸などである。しかしながら、一般的に、第2のアミノ酸ドメインの長さは、自己組織化にあまりにも大きく干渉しないように制限することが望ましい。例えば、第2のアミノ酸ドメインの長さを、20アミノ酸以下、16アミノ酸以下、12アミノ酸以下、10アミノ酸以下、8アミノ酸以下などに制限することが好ましくあり得る。ペプチドの自己組織化部分と非自己組織化部分中でアミノ酸の一定の割合を維持することが望ましくあり得る。例えば、本発明のある態様において、非自己組織化ドメインが、ペプチド中のアミノ酸の総数の50%以下を構成することが望ましくあり得る。
【００７２】
いくつかの状況下で、N末端またはC末端ではなくむしろ自己組織化部分の間に非自己組織化ドメインを含むことは、非自己組織化部分がこのような場合において自己組織化した構造から自由に伸長することができないので、自己組織化を破壊する可能性がより高くなることがあり得る。さらに、2つの自己組織化部分の間に含まれる場合、該モチーフが細胞および／または培養環境中に存在するタンパク質などの分子と自由に相互作用する機会がより少なくなる可能性がある。したがって、様々な理由のために、非自己組織化部分を、2つの自己組織化部分の間に挿入するのではなく、N末端またはC末端に付加することが好ましくあり得る。
【００７３】
配列が上述のものなどの天然に存在するタンパク質由来であるアミノ酸ドメインに加えて、成長因子、サイトカイン、ケモカイン、ペプチドホルモン、ペプチド神経伝達物質、体内に見られる他の生物学的に活性なペプチド等に由来するアミノ酸ドメインも使用され得る(例えば、Goodman and Gilman, The Pharmacological Basis of Therapeutics, 第10版、McGraw Hill, 2001 and Kandel et al, Principles of Neural Science, 第4版、McGraw Hill, 2000参照)。
【００７４】
他の生物学的に活性なモチーフは、限定されないが、Yamada (1991), J. Biol. Chem, 266: 12809-12812により記載されるものを含むいくつかの基準に従って同定され得る。Yamadaには、接着認識配列の場合についての生物学的関連性のための試験が記載されるが、記載される該基準は、より広く適用され得る。推定活性ペプチドモチーフは、基板にコンジュゲートした場合にも活性を示し得るが、ガラス、プラスチックなどの基板に直接吸着した場合に不活性であるとしても、配列を含む合成ペプチドが、キャリア(例えばIgG、アルブミン、ビーズ)へのコンジュゲート後に活性を示す場合、生物学的に活性であると同定され得る。生物学的に活性なペプチドモチーフの可溶性形態は、モチーフが天然に見られるインタクトなタンパク質の機能を競合的に阻害し得る。ペプチド配列の変更は、ペプチドの機能を除去し得る。生物学的に活性なペプチドは、該ペプチドを含む天然に存在するタンパク質と同じ細胞の受容体または天然に存在する生体分子に結合し得る。異なるペプチドの濃度の範囲を試験し得、種々の組合せを使用し得る。
【００７５】
2つ以上のアミノ酸ドメインは、当業者に公知の方法を使用して連結され得る。非限定的な例としては、1つ以上のアミノ酸または異なる分子実体であり得るリンカーまたは架橋の使用が挙げられる。1つ以上のグリシン(G)残基、例えば1、2、3、4、5個などのグリシンからなるリンカードメインが使用され得る。リンカードメイン中のグリシンの使用は、このアミノ酸が小さく、非極性側鎖を有し、そのため自己組織化との実質的な相互作用の可能性が最小限になるので有利である。他の例示的なアミノ酸はアラニンであるか、または非極性側鎖を有する他のアミノ酸も使用し得る。
【００７６】
実施例に記載される改変されたペプチドは、直鎖を生じる伸長したペプチドの固相合成により作製されたものであるが、改変モチーフが側鎖にコンジュゲートまたは架橋された変形物も、本発明に包含される。かかるコンジュゲートまたは架橋を達成するための方法は、当該技術分野において周知である。例えば、システイン残基(または硫黄原子を含むように改変された任意のアミノ酸)を含むペプチドは、ジスルフィド結合の形成により硫黄原子を含む第2のペプチドに結合され得る。したがって、一般的に、改変された自己組織化ペプチドは、ペプチド結合により連結されたアミノ酸の一本の直鎖ポリマーであり得る(好ましくあり得る構造)か、またはアミノ酸の2つのポリマー(それぞれが、ペプチド結合により連結されたアミノ酸のポリマーである)が互いに共有結合または非共有結合(例えばビオチン-アビジン相互作用を介して)のいずれかをした分岐の構造を有し得る。架橋方法の非限定的な例としては、限定されないが、主にVアミノ基およびWアミノ基を介して結合するグルタルアルデヒド法、マレイミド-スルフヒドリルカップリング化学(例えば、マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(MBS)法)、および過ヨウ素酸酸化法が挙げられる。また、多数の架橋剤が公知である。例示的な架橋剤としては、例えば、カルボジイミド(carboiimide)、N-ヒドロキシスクシンイミジル-4-アジドサリチル酸(NHS-ASA)、ジメチルピメリミデートジヒドロクロライド(DMP)、ジメチルスベルイミデート(DMS)、3,3'-ジチオビスプロピオンイミデート(DTBP)等が挙げられる。コンジュゲーション法および架橋剤についてのさらなる情報については、一般的に、雑誌、Bioconjugate Chemistry、American Chemical Society発行、Columbus Ohio, PO Box 3337, Columbus, Ohio, 43210を参照。また、URL www.piercenet.comのウェブサイトで入手可能な「Cross-Linking」、Pierce Chemical Technical Libraryおよび1994〜95年に最初に発行されたPierce Catalogおよび本明細書に引用される参考文献およびWong SS, Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking, CRC Press Publishers, Boca Raton, 1991を参照。二官能性架橋試薬は、2つの反応基を含み、それにより2つの標的基を共有結合する手段を提供する。化学架橋試薬中の反応基は、典型的にスクシンイミジルエステル、マレイミドおよびヨードアセトアミドを含む官能基の部類に属する。ヘテロコンジュゲート(heteroconjugate)を形成するためのいくつかの一般的なスキームは、通常2工程または3工程の反応シークエンスによる1つの生体分子上のアミノ基の第2の生体分子上のチオール基への間接的なカップリングを含む。ほとんどの生体分子中のチオールの高い反応性およびその比較的希少な性質(rarity)は、チオール基を制御された化学的架橋のための良好な標的にする。いずれの分子もチオール基を含まない場合は、いくつかのチオール化法の1つを使用して、1つ以上が導入され得る。チオール含有生体分子は、次いで、ヘテロ二官能性架橋試薬、例えばスクシンイミジルエステルおよびマレイミドまたはヨードアセトアミドのいずれかの両方を含む試薬を使用して、アミン含有生体分子と反応され得る。アミン-カルボン酸架橋およびチオール-カルボン酸架橋も使用され得る。例えば、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDAC)は、生体分子と反応して、通常分子内��あるかまたはタンパク質複合体のサブユニットの間にある「ゼロ距離(zero-length)」架橋を形成し得る。この化学において、架橋試薬は、最終生成物中には組み込まれない。
【００７７】
チオールを生体分子に導入するために、内在ジスルフィドの還元、およびアミン、アルデヒドまたはカルボン酸基のチオール基への変換を含むいくつかの方法が利用可能である。タンパク質中のシステインのジスルフィド架橋は、ジチオトレイトール(DTT)、トリス-(2-カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)、またはトリス-(2-シアノエチル)ホスフィンによりシステイン残基に還元され得る。アミンは、スクシンイミジル3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート(SPDP)との反応、次いでDTTまたはTCEPによる3-(2-ピリジルジチオ)プロピニルコンジュゲートの還元により、間接的にチオール化され得る。アミンは、スクシンイミジルアセチルチオアセテートとの反応、次いで中性pH付近の50mMヒドロキシルアミンまたはヒドラジンを用いたアセチル基の除去により間接的にチオール化され得る。チオール非含有タンパク質中のトリプトファン残基は、メルカプトトリプトファン残基に酸化され、次いでヨードアセトアミドまたはマレイミドにより改変され得る。
【００７８】
自己組織化および自己組織化ペプチドの使用のための方法
上述のように、(改変および非改変自己組織化ペプチドの両方を含む) 自己組織化ペプチドは、例えば水性ペプチド溶液への一価のカチオンの添加時、または一価のカチオンを含む溶液へのペプチド溶液の導入時に、種々の条件下で自己組織化して巨視的構造体を形成する。自己組織化の前に、実質的に一価のイオン(例えばカチオン)を含まないかまたは低濃度、例えば10、5、1、0.5もしくは0.1mM未満のかかるイオンのみを含む溶液にペプチドを溶解し得る。自己組織化は、ペプチド溶液へのイオン性溶質の添加またはpHの変化により開始または実質的に加速され得る。例えば、5mM〜5Mの濃度のNaClは、ペプチドの組織化を誘導して、数分以内に巨視的構造体を形成させる。より低い濃度のNaClも、組織化を誘導し得るが、より遅い速度である。いくつかのペプチドは、また、有意な濃度のイオンの非存在下、pHに依存し得るプロセスにおいて自己組織化し得る。例えば、いくつかのペプチドは、約3.0のpHで溶液中に維持されるが、pHが上昇すると自己組織化し得る。代替的に、イオンを含む溶液、例えば標準的なリン酸緩衝化食塩水(PBS)、組織培養培地、または例えば、血液、脳脊髄液(CSF)等の生理学的液体(fluid)にペプチドを導入することにより自己組織化は開始され得る。したがってペプチドは、インビボの場所で自己組織化し得る。好ましいイオンとしては、Li+、Na+、K+およびCs+などの一価のカチオンが挙げられる。好ましくは、該イオンの濃度は、自己組織化を誘導するかまたは実質的に加速させるために、少なくとも5、10、20または50mMである。当業者は、特定のペプチド配列および/または濃度および組織化の所望の速度に基づいて、好ましいイオン濃度を選択し得る。一般的に、得られる構造の強度は、イオンの非存在下またはより低いイオン濃度での強度と比較して、イオンの存在下で増加する(しかし、イオン濃度の増加が強度の増加を生じないプラトーに達することがあることに注意)。
【００７９】
一態様において、本発明は、本発明の複数の自己組織化ペプチドを含むナノ構造である。例示的なナノ構造としては、ナノフィラメント、ナノ繊維およびナノ骨格が挙げられる。別の態様において、本発明は、本明細書に記載される複数の自己組織化ペプチドを含む巨視的構造体である。一態様において、巨視的構造体は、均一な自己組織化ペプチドを含む。別の態様において、巨視的構造体は、異成分からなる自己組織化ペプチドを含む。用語「均一な自己組織化ペプチド」は、複数の同一または同じ自己組織化ペプチドのことをいう。用語「異成分からなる自己組織化ペプチド」は、複数の異なる自己組織化ペプチドのことをいう。自己組織化ペプチドは、混合物中で2つ以上のペプチドが異なる場合に異なり得ることが理解される。いくつかの態様において、巨視的構造体は巨視的な膜である。該巨視的な膜は、例えば、本発明の自己組織化ペプチドを含む複数の織り込まれたナノフィラメントを含む。最初のペプチド濃度は、形成される膜の大きさおよび厚さの要因となる。一般的に、ペプチド濃度が高くなると、膜形成の程度は高くなる。さらなる態様において、巨視的な膜は、βシートの形態をとる。一態様において、本発明は、本明細書に記載される複数の自己組織化ペプチドを含む巨視的な骨格であり、ここで、該自己組織化ペプチドは、βシート巨視的骨格に自己組織化する。
【００８０】
自己組織化した構造の形成は、βシート構造を優先的に染色し、組織内の異常なタンパク質沈着を可視化するために一般的に使用される色素であるコンゴレッドを用いた染色後に、肉眼で観察され得る。さらなる構造的な詳細は、拡大下で観察され得る。走査型電子顕微鏡(SEM)により、ナノ構造の構造的な詳細を観察することが可能になる。膜のβシート二次構造は、円偏光二色性(CD)分光学によりさらに確認され得る(Zhang et al (1993), PNAS 90: 3334-8；Zhang et al (1995). Biomaterials 16:1385；Zhang & Rich 1997, PNAS 94, 23-28、Yokoi et al, 2005. PNAS 102, 8414)。
【００８１】
ある局面において、本発明は、本発明の自己組織化ペプチドおよびその自己組織化した構造体を、細胞培養支持体として、固相支持体に刻印(imprint)された自己組織化した単層として、種々の組織の修復および置き換えのため、生細胞を包むための骨格として、制御送達される薬物送達系の一部としてならびに止血の促進のために使用する方法を包含する。ある局面において、自己組織化ペプチドは、配列VEVK(配列番号:1)を含む。自己組織化ペプチドの他の使用は、例えば米国特許出願公開第2002/0072074号；第2002/0160471号；第2004/0087013号；第2004/0242469号；第2005/0287186号および第2007/0203062号に記載され、それぞれの内容は参照により本明細書に援用される。
【００８２】
また、本明細書に記載されるペプチドの自己組織化により形成される巨視的構造体、巨視的な膜およびナノ構造は、血清中で安定であり、タンパク質分解性消化およびアルカリ性pHおよび酸性pHに耐性であり、非細胞毒性であるので、該物質、膜およびフィラメントは、医薬製品(例えば縫合糸)、人工皮膚または内層(internal lining)、インビトロ細胞増殖または培養のための遅延拡散薬物送達系支持体およびインビボ使用のための人工組織のための支持体などの生体材料用途に有用である。該構造は、分離マトリックス(例えば透析膜、クロマトグラフィーカラム)などの透過性かつ水不溶性である物質が適切な多数の用途においてさらに使用され得る。その透過性のために、本明細書に記載される巨視的な膜は、遅延拡散薬物送達ビヒクルとして有用である。該膜は、プロテアーゼおよび胃酸(pH1.5)による分解に耐性であるので、これらの膜で作製された薬物送達ビヒクルは、経口摂取され得る。小さな孔径の膜は、該膜を、例えばウイルスおよび他の微小な汚染物を除去するためのフィルターとしても有用にする。膜中の孔径(フィラメント間(interfilament)距離)およびフィラメントの直径は、膜を形成するために使用されるペプチドの長さおよび配列を変えることにより変化し得る。
【００８３】
巨視的な膜はまた、改変されて、さらなる特性が付与され得る。例えば、該膜は、標準的な方法による膜の形成後にペプチドを架橋することによりさらに強化され得る。コラーゲンと該ペプチドを合わせて、人工皮膚としての使用により適した膜を作製し得、コラーゲンは、膜中で、タンパク質分解性消化に対し安定化され得る。さらに、リン脂質と該ペプチドを合わせることで、小胞(vesicle)が作製され得る。
【００８４】
巨視的構造体はまた、細胞の培養に有用であり得る。線維芽細胞成長因子などの成長因子をペプチドの巨視的構造体に添加することで、結合、細胞増殖および神経突起伸長がさらに改善され得る。多孔性のマクロ構造体はまた、細胞を包むためにも有用であり得る。膜の孔径は、細胞産物および栄養分子の拡散を可能にするほどに充分大きくあり得る。一般的に、細胞は、孔よりもかなり大きいので、封じ込められる。別の態様において、本発明は、本発明の複数の自己組織化ペプチドを含む巨視的な骨格であり、ここで、該自己組織化ペプチドは、βシート巨視的骨格に自己組織化し、該巨視的な骨格は、生細胞を包み、該細胞は、三次元配置で該巨視的な骨格中に存在する。巨視的な骨格は、自己組織化ペプチドおよび生細胞を、自己組織化に適した条件下、水溶液中でインキュベートすることにより調製され得る。本発明はまた、組織の再生方法を含み、ここで、該方法は、哺乳動物に、本発明の自己組織化ペプチドを含む巨視的な骨格を投与する工程を含み、該ペプチドはβシート巨視的骨格に自己組織化し、該巨視的な骨格は生細胞を包み、該細胞は、三次元配置で該巨視的な骨格内に存在する。包まれた細胞は、三次元配置で巨視的な骨格中に存在する。いくつかの態様において、該方法は、軟骨欠損、結合組織欠損、神経組織欠損、上皮内層(lining)欠損、内皮内層(lining)欠損または関節炎の治療または予防のために使用される。巨視的な骨格は、経口的、経皮的、筋内的、静脈内的、皮下的にまたは任意の他の適切な様式で投与され得る。別の態様において、本発明は、(a)本発明の自己組織化ペプチドの水溶液中での自己組織化により形成される巨視的な膜を、細胞を含む細胞培養培地に添加して、それにより膜/培養物混合物を形成する工程；および(b)該混合物を、細胞増殖に充分な条件下で維持する工程を含むインビトロでの細胞培養のための方法である。
【００８５】
巨視的な膜は、βアミロイドタンパク質の凝集体および凝集したスクレイピータンパク質を含むが限定されない、極端な不溶性およびタンパク質分解性消化に対する耐性などの通常にない性質を有する生物学的タンパク質構造の性質を調査するためのモデル系としても使用され得る。本発明はまた、自己組織化ペプチドを含む構造体を用いた神経の再生のための方法を包含する。例えば、神経再生は、自己組織化したナノ構造を、それらの標的に対する正確な経路に沿って移植することにより促進され、誘導され得る。
【００８６】
本明細書に記載のペプチドヒドロゲル(例えば、配列VEVK(配列番号:1)を含む改変自己組織化ペプチドおよび/または非改変自己組織化ペプチド)は、細胞および組織の培養に使用され得る。かかる方法は、米国特許出願公開第2009/0162437A1号に詳細に記載される。一態様において、細胞および組織は、ヒドロゲル構造の表面上で培養され得る。別の態様において、細胞はまた、ヒドロゲル中に包まれ得る。ペプチド構造体中に細胞を包むために、ペプチドおよび生細胞を、細胞生存能力を支持するのに適切な濃度で等浸透圧性溶質を有する水溶液中で、ペプチドが実質的に自己組織化しない条件下でインキュベートし得る。本発明のある態様において、該溶液は、10、5、1または0.1mM未満の濃度の一価のカチオンを含むか、または実質的に一価のカチオンを含まない。該溶液はまた、10、5、1または0.1mM未満の他のイオン種、例えば他のカチオンまたはアニオンを含み得るか、または実質的に該他のイオン種を含み得ない。ペプチドの巨視的構造体への自己組織化を開始させるために、該溶液に充分なイオン(例えば一価のカチオン)が添加されて、それにより細胞は、巨視的構造体の形成により包まれる。包まれた細胞は、三次元配置で巨視的構造体中に存在する。溶液は、巨視的構造体の所望の体積または形状を確立するための大きさにされた前もって形が決められた型に含まれ得る。自己組織化は、また、pHの変化(例えば、低いpHから高いpHへの上昇)により影響を受け得る。
【００８７】
細胞および生物活性分子などの薬剤(例えば分化誘導剤、増殖剤)、治療化合物はまた、自己組織化前にペプチド溶液に導入され得る。次いで自己組織化プロセスは、細胞または分子を包む構造体を形成する。構造体中の細胞または分子の均一な分布を達成するために、自己組織化の開始前に溶液を徹底的に混合することが望ましくあり得る。自己組織化の開始または加速を回避するために、細胞または薬剤とペプチド溶液を合わせてすぐに、実質的にイオンを含まないかまたは低い濃度のイオンのみを含む溶液中で細胞または薬剤を維持することが望ましくあり得る。この場合、好ましくは、細胞は、ペプチド溶液と合わせる前に、スクロースなどの等浸透圧溶質中に維持される。ペプチド自体は、細胞(例えば細胞ペレット)または薬剤が添加される等浸透圧性溶液に溶解され得る。得られた組成物は混合されて、より均一な細胞および/または薬剤の分布を達成し得、次いで該組成物は、イオンに暴露される(例えば、イオンが組成物に添加されるか、または組成物がイオンを含む溶液と混合される)。
【００８８】
細胞は、組織培養皿もしくはスライドガラス、または例えば、コラーゲン、マトリゲル(Matrigel)などの生物由来の物質でコートされた組織培養皿もしくはスライドガラスなどの従来の基板上で細胞が培養されるのと同様の様式で、ペプチドヒドロゲル構造体の表面上で培養され得る。一般的に、細胞は任意の望ましいコンフルエンスの程度で培養され得る。包まれる場合、細胞は、好ましくは、三次元配置で巨視的構造体内に存在する。培養の条件は、好ましくは、生理学的条件の近くにあるべきである。例えば、培養培地のpHは、好ましくは、生理学的pHの近くにあるべきであり、好ましくはpH6〜8、例えば約pH7〜7.8、特にpH7.4である。生理学的温度は、約30℃〜40℃の範囲である。
【００８９】
細胞は、所望の細胞数および細胞密度、細胞の増殖速度、ならびに所望の細胞のリプログラミングが起こるのに要する時間に応じて、任意の適切な時間、ペプチド構造体上またはペプチド構造体内で培養され得る。これらのパラメーターは、特定の細胞および本発明が使用される目的に応じて変化する。当業者は、細胞を該構造体上または該構造体中の培養において維持するための最適な時間を決定するために、これらのパラメーターを変化させ得、そうすることの効果を観察し得る。本発明のある態様において、細胞は、約3日間、7日間、14日間、21日間、28日間、56日間または90日間培養される。
【００９０】
いくつかの局面において、(表面上で培養されるかまたは包まれるかのいずれかの)細胞の少なくとも40、50、60、70、80、90または95%は、巨視的な骨格の形成後、1、2、4、6またはそれ以上の週、生存可能である。別の態様において、細胞の少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%または90%は、巨視的な骨格の形成後、1日または1週間生存可能である。
【００９１】
一般的に、血管内皮細胞およびその前駆細胞、骨髄細胞、骨膜細胞、軟骨膜細胞、線維芽細胞、骨格筋芽細胞または骨格筋細胞、神経細胞、海馬細胞、上皮細胞、非血管内皮細胞または平滑筋細胞、ケラチノサイト、基底細胞、棘状細胞(spinous cell)、顆粒細胞、胚性幹細胞、肺細胞、免疫系細胞、卵巣細胞、膵臓細胞、頚部細胞、肝臓細胞、包皮細胞または歯周靭帯線維芽細胞を含むが限定されない任意の細胞型が、本発明に従って培養され得るかおよび/または包まれ得る。該細胞は、胚性、胎児性、または成体性の幹細胞、例えば前述の細胞型のいずれかへの分化が誘導され得る幹細胞を含み得る。ある局面において、該細胞は、歯周靭帯線維芽細胞である。
【００９２】
上述の自己組織化ペプチドはまた、標的組織中での創傷治癒、組織再生、歯周組織再生および/またはマトリックスメタロプロテアーゼ産生の増加に使用され得る。ペプチドヒドロゲル構造体の表面上で増殖するかまたはその中に包まれる細胞を任意に含むペプチドヒドロゲル構造体は、任意の適切な方法を使用して体内に移植され得る。非限定的な方法としては、外科的手法および/または注入による手法が挙げられる。経口、経皮、筋内、静脈内、皮下または非経口の経路を含むが限定されない投与経路が利用され得る。当業者は、適切な送達技術を容易に選択し得る。
【００９３】
損傷の部位または組織損傷もしくは再生の部位(換言すると、組織再生を必要とする部位)に自己組織化ペプチドを投与するためにいくつかの異なる種類のデバイスが使用され得る。送達は、シリンジまたはカテーテルを使用して達成され得ることが理解される。本発明のいくつかの局面において、自己組織化ペプチドは、シリンジを使用して投与される。いくつかの態様において、溶液中のペプチドは、組織化しないかまたは最低限に組織化して(例えばそこでは溶液がゲルを形成しない)、患者に投与され、投与後に組織化が起こる。さらなる局面において、ペプチドは、インビトロで自己組織化し、組織化したマトリックスとして体内に導入される。かかる方法は、米国特許出願公開第2009/0162437号に詳細に記載される。あるさらなる態様において、本発明は、2つの区画を有するシリンジに関し、ここで、第1の区画は、自己組織化ペプチドを含む溶液を含み、第2の区画は、ゲル化液を含む。ゲル化液は、ペプチド溶液と合わされた場合、ヒドロゲルの形成を生じる液体である。例示的なゲル化液としては、例えば詳細に上述される一価のカチオンを含む液体が挙げられる。
【００９４】
ある局面において、本発明は、本明細書に記載される自己組織化ペプチドを投与する工程を含む、損傷した組織の再生を必要とする患者において損傷した組織を再生する方法である。当業者に理解されるように、いくつかの状態で組織が損傷し得、その結果、組織の再生が治療的に有用である。かかる状態としては、限定されないが、関節炎、種々の神経学的状態、神経内分泌障害、筋肉変性、筋腱欠損(muculotendenous failure)、加齢性変性、外傷、壊死、心臓障害および外科的切除が挙げられる。損傷した組織は、例えば骨格組織、骨、腱、結合組織または歯の組織であり得る。
【００９５】
いくつかの態様において、本発明は、歯周疾患を治療するおよび/または歯の組織を再生する方法である。ある態様において、歯の組織は、歯周靭帯組織である。例示的な歯周疾患は、歯周炎、歯肉炎、インプラント周囲炎(periimplantitis)およびインプラント周囲(peri-implant)粘膜炎である。歯周炎において、歯肉は歯から後退して、ポケットを形成し、そこが感染する。細菌性毒素および感染と戦う免疫系は実際に、歯を所定の場所で保持する骨および結合組織を傷害し始める。インプラント周囲炎は、アロプラスチック(alloplastic)物質の顎の骨への外科的な埋め込み後の合併症であり、骨に組み込まれた(osseointegrated)機能しているインプラントの周囲の組織を冒し、骨の支持の喪失をもたらす。ある態様において、治療有効量の自己組織化ペプチドが歯根膜に投与される。歯根膜(peridontium)および歯根膜を形づくる組織は、図1に図示される。歯根膜は、歯肉、歯周靭帯、セメント質および歯槽骨の4つの組織からなる。歯肉は、歯の一部および歯槽骨の一部を被覆する桃色の角質化粘膜である。歯周靭帯は、歯を歯槽骨に結合させる結合組織繊維の一群である。セメント質は、歯の低部を被覆する石灰化構造である。歯槽骨は、歯が埋まっている顎の骨(上顎骨および下顎骨)からの突起の一組である。歯周疾患が発症する領域は、歯と歯肉の間のポケットである歯肉溝である。
【００９６】
さらなる局面において、本発明は、本明細書に記載される自己組織化ペプチドを含む、歯周組織再生のための骨格である。組織再生および/または歯周組織再生の文脈において本明細書で使用する場合、骨格は、分解可能ヒドロゲルである。あるさらなる局面において、自己組織化ペプチドは、ラミニン細胞接着モチーフ、RGDペプチドおよびマトリックスメタロプロテアーゼ切断可能基質からなる群より選択される生物学的に活性なモチーフを含む。さらなる態様において、自己組織化ペプチドは、ラミニン細胞接着モチーフを含む。歯周組織工学における骨格の使用は、例えばMa et al. (2006) Scaffolding in tissue engineering. CRC Press Pp 438; Akman et al. (2010), J Biomed Mater Res 92(3): 953-62; Hollister (2005), Nature Mat. 4: 518-524において議論され、その内容は参照により本明細書に明示的に援用される。骨格は、例えば治療物質および/または生物学的に活性な物質を創傷へと送達するため、ならびに選択的なコロニー形成(colonization)および増殖を促進するためのビヒクルとして、組織体積を維持するために使用される。歯周疾患の治療の目標は、歯周靭帯の生成である。歯周疾患の治療のための従来の誘導された組織再生は、歯肉組織侵入(invasion)を機械的にブロックし(これは、歯根吸収と関連があると示される)、歯周靭帯線維芽細胞の結合を可能にする[28a]。本発明のいくつかの局面において、歯周組織再生のための骨格は、歯肉細胞侵入(invasion)を生物学的にブロックし、歯周靭帯の成長を促進させる。例えば、骨格がラミニン細胞接着モチーフを含む場合、歯周靭帯線維芽細胞は、該モチーフに接着し得るが、歯肉細胞は、歯周靭帯線維芽細胞よりも、該モチーフに結合する能力が低い[27a〜29a]。一態様において、本発明は、細胞をさらに含む組織再生のための骨格であり、ここで、該細胞は、歯周靭帯線維芽細胞である。さらに別の局面において、該骨格は、歯周靭帯線維芽細胞が接着し得る生物学的に活性なモチーフを含む自己組織化ペプチドを含む。
【００９７】
さらなる態様において、本発明は、本明細書に記載される骨格を投与する工程を含む、歯周疾患を治療する方法である。本発明はさらに、本発明の骨格を投与する工程および固体生体材料をさらに投与する工程を含む、歯周疾患を治療する方法を包含する。ある局面において、固体生体材料は、骨伝達性(osteoconductive)である。当業者に理解されるように、固体生体材料は、カルシウムおよび/またはリンを含むが限定されない任意の適切な物質で作製され得る。例示的な物質は、カルシウム三リン酸およびヒドロキシアパタイト(hydroxylapatite)を含む。生体材料のさらなる例は、βリン酸三カルシウムで作製される。かかる生体材料は、例えばGEM 21S(登録商標)成長因子促進性マトリックスである。該生体材料は、例えば粉体の形態、塊の形態および/または顆粒を採り得る。さらなる局面において、固体生体材料は、約100〜約500ミクロンの直径を有する孔を含む。歯周疾患を治療する方法は、本明細書に記載される骨格および固体生体材料を投与する工程を含み、ならびに薬剤(例えば低分子およびペプチドなど)などのさらなる生物活性剤を投与する工程をさらに含む。いくつかの態様において、該薬剤は、組換えヒトタンパク質および/または成長因子を含む。さらなる態様において、該成長因子はヒト組換え成長因子タンパク質である。例示的な組換えヒトタンパク質は、組換えヒト血小板由来成長因子(rh-PDGF)、組換えヒト骨形成タンパク質-7(rh-BMP-7)および組換えヒト基底線維芽細胞成長因子(rh-bFGF)である。
【００９８】
さらなる局面において、本発明は、本明細書に記載の自己組織化ペプチドを投与する工程を含む、組織において細胞外マトリックスタンパク質産生を増加させる方法に関する。好ましい細胞外マトリックスタンパク質はコラーゲンである。
【００９９】
以下の実施例は、本発明をさらに例示するが、いかなる方法においても発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１００】
例示
最近、RGDおよびラミニン細胞接着モチーフを含むいくつかのペプチド分子が、歯周靭帯線維芽細胞の活性を促進することが報告されている[27a]〜[29a]。RGD(Arg-Gly-Asp)は、細胞結合のための中心的な結合配列であることが周知であり、特にインテグリンと共に働く。ラミニンは、基底膜の主要な成分である。基底膜は、細胞を支持する構造成分として重要であるだけでなく、細胞に、細胞の機能を調節する有益な微小環境を与える。細胞接着は、細胞/物質相互作用の第1の段階であり、細胞が増殖、移動および分化する能力に影響を及ぼす。そのため、RGDおよびラミニン細胞接着モチーフにより機能化された完全に合成されたペプチド骨格は、歯周治療のための単純で、安全で、安価な物質として有望性を示す。
【０１０１】
以下に記載される試験において、本発明者らは、2つの特製自己組織化ペプチド骨格PRGおよびPDSについて、インビトロで歯周靭帯線維芽細胞活性を試験した。PRGは、2ユニットRGD結合配列PRGDSGYRGDS(配列番号:15)への直接結合を介するペプチド骨格RADA16である。PDSは、ラミニン接着モチーフPDSGR(配列番号:4)への直接結合を介するRADA16である。そして、これらの骨格は、歯周靭帯線維芽細胞の細胞接着、増殖、移動および細胞外マトリックスタンパク質産生、特に歯周靭帯の主要な細胞外マトリックスタンパク質成分であるI型コラーゲンおよびIII型コラーゲンの産生を有意に促進する[30a]、[31a]。
【０１０２】
自己組織化ペプチド骨格の形成およびその機械的な特性は、いくつかの要因により影響を受けることが知られており、その1つが疎水性の程度である[11b〜16b]。すなわち、イオン性相補的相互作用に加えて、疎水性残基Ala、Val、Ile、Leu、Tyr、Phe、Trp(または一文字コード、A、V、I、L、Y、F、W)の程度は、骨格の機械的な特性および骨格の自己組織化の速度に有意に影響を及ぼし得る。より高い疎水性は、自己組織化に必要なペプチドのより短い長さ、より簡単な骨格形成およびより良好な機械的特性に対応する。しかしながら、この特性は、細胞移動を必ずしも促進しないので、細胞接着を刺激するためにさらなる活性モチーフが必要となり得る。
【０１０３】
細胞とマトリックスの間の接着は、細胞増殖に非常に重要である。細胞接着モチーフRGD(Arg-Gly-Asp)およびラミニン由来の細胞接着モチーフでのペプチド骨格の機能化は、細胞の増殖、移動および分化の増加に効果的であることが示されている[8b、9b]。最近、マトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)の酵素切断に感受性のペプチドが、合成ポリマーおよびペプチド-両親媒性化合物に付加された17-24。MMPは、細胞外マトリックス成分を分解し、したがって、組織再生に重要な役割を果たすプロテアーゼのファミリーに属する。MMPは、マトリックス中に細胞が増殖および移動するための空間を作り、細胞外マトリックスリモデリングおよび組織成長を可能にする。細胞接着モチーフに加えて、自己組織化ペプチド骨格にMMP切断可能基質を組み込むことは、細胞および組織においてリモデリング活性を誘発するための動的機構を作り変える魅力的なストラテジーである。
【０１０４】
2つの自己組織化ペプチドVEVK9(Ac-VEVKVEVKV-CONH2)(配列番号:2)およびVEVK12(Ac-VEVKVEVKVEVK-CONH2)(配列番号:3)の設計、ならびに設計された2ユニットRGD結合配列(PRGDSGYRGDS(配列番号:15))またはラミニン由来の2つの細胞接着モチーフ(YIGSR(配列番号:5)、IKVAV(配列番号:6))の1つを、C末端に付加した伸長配列を合成することによるVEVK9の機能化が以下に記載される。設計された2ユニットRGD配列は、骨芽細胞および内皮細胞の成長に有効であることがこれまでに示されている[8b、25b]。自己組織化ペプチドVEVK9は、9個のみのアミノ酸残基を有し、その機能化されたペプチドは、16個のアミノ酸残基を有するRADA16-Iよりも短く、VEVK9は、同様の方法で細胞活性を促進する潜在能力を有する。本発明者らはまた、MMP-2切断可能配列を用いたVEVK9の機能化を報告する。本発明者らは、MMP-2切断可能配列(PVGLIG((配列番号:19))を自己組織化ペプチドVEVK9に挿入した。この配列は、最適なMMP基質についてコンビナトリアルペプチドライブラリーをスクリーニングすることにより選択された[26b]。この配列で機能化された自己組織化ペプチド骨格(RADA)3PVGLIG(RADA)3(配列番号:84)は、MMP-2により分解可能であることが示され、組織工学骨格としての使用に有望さを示す[19b]。
【０１０５】
まとめると、本発明者らは、歯周組織再生のための機能的モチーフの潜在能力を試験した。本発明者らは、増殖、移動およびマトリックスタンパク質産生に対するこれらのモチーフの効果を、対照としての非機能化自己組織化ペプチド骨格RADA16、VEVK9、VEVK12と比較するために、ヒト一次歯周靭帯線維芽細胞(HPDLF)を使用した。
【０１０６】
実施例1：ペプチド骨格上の歯周靭帯線維芽細胞の接着、移動およびマトリックスタンパク質産生
方法
ペプチド骨格；
1% RADA16溶液を、PuraMatrix(3DM Inc./BD Bioscience)として得た。VEVK9、VEVK12および機能化ペプチドは、CPC Scientific (San Jose, CA)から得て、1%(v/w)の終濃度で水に溶解した。次いで機能化ペプチド溶液を1% RADA16、VEVK9またはVEVK12溶液と、1:1の比で混合した。次いで、それぞれのペプチド溶液を細胞培養プレート挿入物(BD Bioscience, Bedford, MA)中に充填した。下記の培地を添加してヒドロゲル形成を誘導した。
【０１０７】
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0005855651.tif 000008
【０１０８】
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【０１０９】
歯周靭帯線維芽細胞の細胞培養
単離された一次ヒト歯周靭帯線維芽細胞は、Lonza Inc. (HPDLF, Walkersville, MD)から市販されており、通常の細胞培養フラスコ上で、培養培地(SCGM, Walkersville, MD)中で常套的に増殖させた。細胞を、挿入物中のゲル上に2x104細胞で平板培養した。培養培地は3日ごとに交換した。さらなる成長因子は使用しなかった。
【０１１０】
蛍光顕微鏡検査
その後の実験で、ゲル上の細胞を4%パラホルムアルデヒドで15分間固定して、0.1% Triton X-100で、5分間、室温で浸透性にした(permeabilized)。F-アクチンおよび核をそれぞれ標識するために蛍光ローダミンファロイジンおよびSYTOX(登録商標)グリーン(Molecular Probes, Eugene, OR)を使用した。蛍光顕微鏡(Axiovert 25, ZEISS)またはレーザー共焦点走査型顕微鏡(Olympus FV300)を使用して画像を得た。
【０１１１】
I型コラーゲンおよびIII型コラーゲンの可視化のための蛍光免疫染色。
細胞の固定後、I型コラーゲンに対する一次抗体(5%抗I型コラーゲン、Millpore, MA)を添加して、37℃で40分間インキュベートし、次いで、1% BSAを有するPBSで6回洗浄した。二次抗体(0.5% Alexa fluor 488ヤギ抗ウサギIgG、Invitrogen)を添加して、37℃でさらに40分間インキュベートし、次いで同様に洗浄した。その後、III型コラーゲンに対する一次抗体(0.5%抗III型コラーゲン、Millpore, MA)を添加して、37℃で40分間インキュベートし、次いで洗浄した。最後に、二次抗体(0.5% Alexa fluor 594ヤギ抗マウスIgG、Invitrogen)を添加して、37℃でさらに40分間インキュベートした。対照として非特異的染色を、一次抗体を省略することにより、行なった。
【０１１２】
結果および考察
細胞接着および細胞増殖
機能化ペプチド骨格は、RADA16、VEVK9またはVEVK12と比較して、より多くの細胞の接着および増殖を促進した(図2、3Aおよび3B)。本発明者らはまた、異なる混合比を試験した。PRG(1:9)は、PRG:RADA16 = 1:9の混合比を意味する。#は、p<0.01 t検定を意味する。
【０１１３】
ペプチド骨格への細胞移動
機能化ペプチド骨格PRGおよびPDSは、RADA16と比較して、ペプチド骨格中へのより多くの細胞移動を促進した(図4)。
【０１１４】
マトリックスタンパク質産生
機能化ペプチド骨格PRGおよびPDSは、RADA16と比較して、より多くのI型コラーゲンおよびIII型コラーゲンを促進した(図5)。I型コラーゲンおよびIII型コラーゲンは、歯周靭帯の主要なマトリックスタンパク質であることが周知である。
【０１１５】
実施例2：ペプチド骨格の選択的細胞再生(歯周靭帯線維芽細胞と歯肉線維芽細胞の比較)
本発明者らは、2種類の歯周細胞である歯周靭帯線維芽細胞および歯肉線維芽細胞を使用して、機能的骨格の選択的な細胞再生特性を試験した。
【０１１６】
方法
歯肉線維芽細胞の細胞培養
ヒト歯肉線維芽細胞はATCCから市販されており(HGF-1)、通常の細胞培養フラスコ上、培養培地(DMEM+10%FBS)中で常套的に増殖させた。挿入物中のゲル上で、細胞を2x104細胞で平板培養した。培養培地は3日ごとに交換した。
【０１１７】
結果および考察
機能化ペプチド骨格PDSは、選択的な細胞の接着および移動を示した(図6)。骨格の表面上に広げた歯周靭帯線維芽細胞は、骨格中に移動した。比較すると、歯肉線維芽細胞は骨格に充分に接着せず、骨格内に全く移動しなかった。ペプチド骨格RADA16は、両方の線維芽細胞中で移動を示さなかった(示さず)。これらの結果は、該骨格は、歯周靭帯線維芽細胞が成長するための空間および好ましい隙間(niche)を提供し、歯周組織を再構築する良好な潜在能力を有し得、歯肉線維芽細胞による空間の再集合化(repopulation)を制限することを示唆する。機能化ペプチド骨格vPDS_9、vYIG_9およびvIKV_9はまた、選択的な細胞接着を示した(図7)。
【０１１８】
実施例3：MMP分解可能モチーフで機能化されたペプチド骨格への歯周靭帯線維芽細胞の移動。
本発明者らは、歯周靭帯線維芽細胞の移動の効果によるMMP分解可能モチーフで機能化されたペプチド骨格の能力を潜在試験した。
【０１１９】
方法
ペプチド骨格
機能化ペプチドは、CPC Scientific (San Jose, CA)から得て、1%(v/w)の終濃度で同様に水に溶解した。次いで、機能化ペプチド溶液を1% VEVK9またはVEVK12溶液と混合した。それぞれのペプチド溶液を、細胞培養プレート挿入物(BD Bioscience, Bedford,  MA)中に充填した。下記の培地を添加して、ヒドロゲル形成を誘導した。
【０１２０】
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【０１２１】
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【０１２２】
結果
ペプチド骨格vPVG_vPRG_9、vPVG_vPRG_12は、骨格への有意な細胞移動を示した(図8)。これらの結果は、機能化ペプチド配列LのMMP切断部位PVGLIG(配列番号:19)は、歯周靭帯線維芽細胞に産生されたMMPにより切断され、次いで該線維芽細胞は骨格内に容易に移動し得たことを示唆する。
【０１２３】
考察
上述の実施例1〜3において、本発明者らは、歯周組織再生について、天然の細胞外マトリックスタンパク質と同様の性質を有する自己組織化ペプチド骨格の開発を記載した。例えば、2ユニットRGD結合配列PRGDSGYRGDS(配列番号:15)およびラミニン細胞接着モチーフPDSGR(配列番号:4)から2つの配列モチーフを選択した。2つのモチーフは、歯周靭帯線維芽細胞の3-D増殖および該線維芽細胞からのコラーゲン産生に効果的であるように思われた。特製ペプチド骨格PRGは、インテグリン受容体に対するRGD細胞結合モチーフを含む。PRGは、骨組織再生のために骨芽細胞活性および脈管形成のために内皮細胞活性を促進することが報告されている[10a]、[11a]。別の特製ペプチド骨格PDSは、ラミニンのPDSGR(配列番号:4)細胞接着モチーフを含む。歯周靭帯線維芽細胞は、RGDモチーフ、フィブロネクチンおよびラミニンに接着し、これらの細胞外マトリックスタンパク質への結合に関連するインテグリンサブユニットを発現したことが報告されている[27a]、[28a]。この試験において、本発明者らは、PRGおよびPDSが、歯周靭帯線維芽細胞活性を促進したことを示した。このことは、歯周靭帯線維芽細胞が、RGDモチーフまたはラミニンPDSGRの細胞接着モチーフについて、インテグリン受容体を介してそれぞれの骨格に結合した露出した接着モチーフを本当に認識したことを示唆する。これらのペプチドの表面に接着した歯周靭帯線維芽細胞は、骨格の内部の接着モチーフを同様に認識し、次いでこれらの骨格内に移動した。
【０１２４】
成長因子および機械的シグナルは、線維芽細胞の細胞外マトリックスタンパク質の産生を調節することが知られている[26a]、[31a]〜[38a]。余分な成長因子が添加されていないことを考慮すると、本発明者らの結果は、それぞれの異なるペプチド骨格からの生化学的かつおそらく機械的なシグナルが、細胞外マトリックスタンパク質の産生を誘導したことを示唆する。線維芽細胞は、機械的シグナルを、インテグリンを介して細胞外マトリックス産生の変化に翻訳することが以前に報告されている[39a]〜[41a]。これらは、マトリックス-インテグリン接触の伸長が、アクチンフィラメントを含む細胞骨格成分の再配列ならびにフォーカルアドヒージョンキナーゼ(FAK)およびSrcなどのキナーゼの補充による細胞骨格媒介性シグナルをもたらすことを示した。FAKおよびSrcの活性化はさらに、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ(MAPK)シグナル伝達経路を活性化して、遺伝子転写を促進する。変更された遺伝子転写により翻訳改変および翻訳後修飾が生じ、細胞外マトリックスタンパク質が選択的に合成され分泌される。本発明者らの研究において、線維芽細胞のインテグリン-骨格PRGおよびPDSの細胞接着モチーフの間の相互作用により、上述の細胞内シグナル伝達経路が誘導され、次いで線維芽細胞がI型コラーゲンおよびIII型コラーゲンを合成および分泌すると思われる。一方で、ペプチド骨格RADA16は細胞接着モチーフを有さないので、歯周靭帯線維芽細胞は、異なる様式でペプチドに接着すると思われる。RADA16の荷電した残基と細胞表面成分の間の相互作用は、ペプチド骨格に対する非インテグリン媒介性細胞結合において役割を果たし[42a]、細胞は、添加された培養培地の血清由来または細胞により産生されたかいずれかのものであり得る接着タンパク質を介してペプチド骨格に接着する[43a]と推定される。歯周靭帯線維芽細胞は、インテグリン-骨格の細胞接着モチーフの間の相互作用なしで、ペプチド骨格RADA16に接着し、機能化ペプチド骨格PRGおよびPDSの場合と同様にはコラーゲンを産生しないと思われる。これらの結果は、インテグリンと相互作用する細胞接着モチーフによるペプチド骨格機能化は、線維芽細胞からのマトリックスタンパク質産生を刺激するのに有用であり得ることを示唆する。
【０１２５】
VEVK9およびVEVK12は、ナノ繊維構造に自己組織化するアミノ酸VEVK(バリン-グルタミン酸-バリン-リジン)の単純な繰り返しユニットである。自己組織化ペプチドVEVK9は、細胞外マトリックスを模倣して、細胞維持および細胞培養中の機能を高めるために、RGD、ラミニン細胞接着モチーフまたはMMP切断可能モチーフのいずれかで機能化される。機能化ペプチドvPRG、vYIGおよびvIKVは、VEVK9配列、および固相合成を使用してC末端に付加されるさらなるモチーフにより合成された。1つのモチーフは、RGD配列の2つの繰り返し(PRGDSGYRGDS(配列番号:15))を含み、他のモチーフは、ラミニンの細胞接着モチーフ(YIGSR(配列番号:5)、IKVAV(配列番号:6))である。自己組織化モチーフVEVKVEVKV(配列番号:2)と機能性モチーフの間で、機能的ペプチドの可とう性を維持するための空間を空けるリンカーとしてグリシン残基が使用された。MMP-2切断可能モチーフ(PVGLIG(配列番号:11))は、2つのVEVKユニットの間に挿入された。RADA16-Iおよびその機能化ペプチドと比較すると、これらのペプチドは短い配列で、最大20アミノ酸(vPRG中)であり、経済的であると思われる。該ペプチドを10mg/ml(1%w/v)の濃度で水に可溶化した。ペプチドは容易に自己組織化して、柔らかいヒドロゲルを形成する。自己組織化ペプチドVEVK9またはVEVK12と混合することで、自己組織化およびゲル化が容易になった。タッピングモードAFMは、本発明者らがペプチドフィラメントを損傷することなく観察することを可能にするので、タッピングモードAFMを使用してナノ繊維の形成を分析した。機能化ペプチドvPRGおよびvPVGと混合した自己組織化ペプチドVEVK12およびVEVK9は、水溶液中でナノ繊維を形成した。
【０１２６】
それぞれのペプチド骨格上の細胞接着を評価するために、同数の細胞をそれぞれの骨格上に播種し、3週間培養した。線維芽細胞は、vPRG、vYIGおよびvIKVで機能化されたペプチド骨格、特にvYIGおよびvIKVと混合されたVEVK9上で良好な接着および伸長を示した。対照的に、非機能化ペプチド骨格VEVK9およびVEVK12上では、細胞は散在し、丸い形態を有する。ここで試験した全ての機能化ペプチドは、特にVEVK9を用いて作製された骨格中で細胞増殖を有意に促進した。
【０１２７】
歯周靭帯線維芽細胞は、RGDモチーフ、フィブロネクチンおよびラミニンに結合し、これらの細胞外マトリックスタンパク質への結合と関連するインテグリンサブユニットを発現することが知られている[28b、29b]。したがって、ペプチド骨格中にこれらの細胞接着モチーフを含ませることにより、線維芽細胞のインテグリン受容体との相互作用を介した線維芽細胞の接着、増殖および3-D移動が促進されると思われる。興味深いことに、これらの結果は、自己組織化ペプチドVEVK9とVEVK12の間で機能化モチーフの効果の差を示した。ペプチド骨格VEVK9に含まれる機能化ペプチドモチーフは、細胞増殖についてVEVK12中のものよりも効果的である。骨格のナノ繊維中に物理的に組み込まれた機能的モチーフは、細胞増殖に影響を及ぼすことが報告されている8b。この研究において、機能化ペプチドは、自己組織化ペプチドVEVK9中に良好に組み込まれ、機能的モチーフと共にナノ繊維を形成すると思われる。
【０１２８】
本発明者らは以前、共焦点顕微鏡により得られた3-D画像収集物および3-D画像再構成を使用して、細胞は自発的に3D骨格中に移動することを示した[8b]。ペプチド骨格VEVK9、機能化ペプチドvPRGのみと混合したVEVK9、vPRGおよびvPVGと混合したVEVK9、vYIGおよびvPVGと混合したVEVK9、ならびにvIKVおよびvPVGと混合したVEVK9中の歯周靭帯線維芽細胞の再構成した画像。移動細胞は、共焦点画像化により明らかに識別可能であり、これらの骨格の特性の違いが見られた。わずかな数の線維芽細胞のみがVEVK9を有するペプチド骨格に接着し、これらは表面付近に残った。VEVK9と機能化ペプチドを混合したペプチド骨格において、多くの細胞が骨格の表面上および内部に見られた。さらに、本発明者らは、1日目に骨格の表面に最初に接着した線維芽細胞は、増殖し、自発的に骨格中に移動したことを示した。画像は、機能化ペプチドvPRGおよびvPVGの効果による線維芽細胞の増殖および移動の有意な増加を示す。骨格の表面上の線維芽細胞が骨格中に移動して、その活性の範囲を増大したようである。
【０１２９】
歯周靭帯線維芽細胞は、分解のためにMMP-2を分泌し、かつ置換のために細胞外マトリックスタンパク質を合成することにより、歯周組織のリモデリングに大きく貢献することが知られている[30b]。また、MMPの制御は、インテグリン結合、例えば主要なRGD結合インテグリンであるαvβ3により起こることも知られている[31b]。これらは、線維芽細胞が、インテグリン受容体を介して骨格の露出したRGD接着モチーフを認識して、骨格に接着したことを示唆する。インテグリンとRGDモチーフの間の相互作用は、線維芽細胞によるMMP-2産生をもたらす。結果的に、線維芽細胞は骨格のより深くに移動し、骨格に組み込まれたMMP切断可能部位を切断した。興味深いことに、vPVGのみ(vPRGなし)と混合したVEVK9の場合、線維芽細胞は骨格の表面上で丸まり、VEVK9の場合と同様に増殖または骨格内へと移動しなかった。したがって、インテグリンと相互作用する細胞接着モチーフは、酵素的に分解可能な骨格内へのタンパク質分解性の細胞移動のための刺激因子として重要な役割を果たすと思われる[21b]。ラミニン細胞接着モチーフvYIGおよびvIKVで機能化された骨格の場合、線維芽細胞は同様の様式で骨格内に移動すると思われる。
【０１３０】
種々の機能化ペプチド骨格が開発されており、組織工学および再生医学について大きな可能性が示されている[7b、8b、25b]。これらのほとんどは、細胞外マトリックスタンパク質由来の細胞接着モチーフで機能化される。該モチーフは、細胞とマトリックスの間の最初の相互作用に寄与し、細胞増殖を促進する細胞接着は細胞の移動を含んだ。しかし、これらの機能化ペプチド骨格は酵素により分解可能でないので、細胞移動を促進するそれらの能力は制限される。非分解性骨格において、細胞は、骨格のナノ繊維の間の空間を何とか進むと思われる。アメーバ様の細胞移動はペプチド骨格の機械的特性に依存するので、細胞接着モチーフを使用するストラテジーは、細胞が通過し得る比較的大きな孔および柔らかいナノ繊維を有する骨格に限定される。対照的に、酵素により分解され得るペプチド骨格は、細胞移動を有意に増大させ得る。vPVGで機能化されたペプチド骨格は、酵素により分解可能であり、タンパク質分解性細胞移動を促進させると思われる。ここで試験されたMMP切断可能モチーフは、機械的特性を考慮することなく、ほとんどの自己組織化ペプチドの機能化に有用であり得る。また、様々な割合で細胞接着モチーフと合わされた場合、特定の用途に適切なペプチド骨格を設計することが可能である。例えば、これらのペプチド骨格は、困難な精製手順を必要とし、免疫原性および疾患の伝染の危険性を有するフィブリンまたはコラーゲンなどの天然に存在する細胞外マトリックス由来物質の代替物として有用であり得る。
【０１３１】
本発明者らはここで、完全な特製ペプチド骨格は、歯周靭帯の増殖および移動を有意に促進させることを示した。このことは、これらの単純なモチーフが線維芽細胞の活性に劇的な影響を有し得るという重要な所見である。ペプチド骨格を作製することは、同様の細胞挙動を示す複雑で高価な可溶性因子を使用するよりもかなり容易で安価である。これらのペプチド骨格は、組織工学および再生医学、例えば歯周組織再構築のための骨格物質として、潜在的な価値を有する。
【０１３２】
歯の器官を支持する歯根膜は、歯肉、歯周靭帯、セメント質および歯槽骨の4つの組織からなる。歯根膜の多様な組成は、硬い結合組織と柔らかい結合組織の相互作用のために、歯周の創傷治癒を、新しい歯周靭帯、セメント質および歯槽骨の細胞成分および細胞外成分を再形成し得る細胞による、歯根表面の選択的な再集合化を含む複雑なプロセスにしている[44a]。歯周組織再構築のための従来の方法は誘導(guided)組織再生であり、これは、上皮細胞および歯肉結合細胞による歯周欠損の再集合化を排除または制限し、歯周靭帯線維芽細胞、セメント芽細胞および骨芽細胞が選択的に移動、増殖および分化することを最大にするための空間および好ましい隙間を提供することにより誘導され得る。歯周組織再構築のためのこれらの骨格の臨床的な使用を考慮すると、該骨格は、選択的な細胞の再集合化を提供することを必要とする。ペプチド骨格PRGは、2ユニットのRGDを含む特製ペプチドの濃度を変化することにより骨芽細胞活性を制御し得ることが以前に報告されている[10a]。歯肉線維芽細胞と比較して、歯周靭帯線維芽細胞および骨芽細胞が良好に接着し得るラミニンは、特異的な細胞接着特性を有することも報告されている[27a]〜[29a]。これらのことは、ラミニン細胞接着モチーフを有するこれらのペプチド骨格PRGおよびPDSが、選択的な細胞再集合化特性を有する歯周組織充填剤として有用であり得ることを示唆する。
【０１３３】
歯周組織再構築における成功裡な臨床使用のために、機能化ペプチド骨格は、選択的な細胞再集合化を可能にし、脈管形成を促進することが必要である。RGDで機能化されたペプチド骨格は、機能化ペプチドの濃度を変化させることにより骨芽細胞の活性を制御し得ることが以前に報告されている8。ラミニンは、歯肉線維芽細胞による接着よりも、歯周靭帯線維芽細胞および骨芽細胞による接着を好む特異的な細胞接着特性を有することも報告されている[28b、29b]。脈管形成のために、RGDで機能化された上述のペプチド骨格はまた、内皮細胞成長を促進することが示された[25b]。さらに、本実施例で試験された機能化ペプチドvPVGは、内皮細胞のタンパク質分解性移動に効果的であると思われる。自己組織化ペプチドの種々の機能化により、歯周組織再構築を含む多くの用途のための骨格物質の最適化が可能になる。
【０１３４】
上述の研究において、特製機能化ペプチド骨格PRGおよびPDSは、細胞培養中の歯周靭帯線維芽細胞の増殖、移動ならびに細胞外マトリックスタンパク質I型コラーゲンおよびIII型コラーゲンの産生を有意に高めることが示されている。さらに、本発明者らは、自己組織化ペプチドVEVK9、VEVK12ならびに細胞接着モチーフおよびMMP切断可能部位で機能化された特製自己組織化ペプチド骨格を開発し、評価した。これらの機能化ペプチド骨格は、骨格の硬さに非依存的に、3D細胞培養における歯周靭帯線維芽細胞の増殖および移動を有意に高めることが示されている。したがって、本明細書に記載される特製骨格は、組織の作り変えおよび再生医学において広く有用である。
【０１３５】
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【０１３６】
本発明は、その好ましい態様を参照して、具体的に示され、記載されているが、添付の特許請求の範囲に包含される発明の範囲を逸脱することなく、形態および詳細における種々の変更が、本発明になされ得ることが当業者に理解されよう。
【図１】
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【図１１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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