(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検者より単離された血漿中のプラスミノゲンアクチベータインヒビター活性または濃度を測定する工程と、
被検者より単離された血漿にカルシウムイオンを添加しない場合のユーグロブリン溶解時間と被検者より単離された血漿にカルシウムイオンを添加した場合のユーグロブリン溶解時間との比率（ＲｅｇｕｌａｒＥＣＬＴ／Ｃａ添加ＥＣＬＴ）を求める工程と、
前記活性または前記濃度が正常妊婦血漿における値よりも低く、かつ、前記比率が５．０以下であるかどうかを決定する工程と、
を含む、早産または流産の発症危険度を判定するための方法。
【請求項２】
血漿中のプラスミノゲンアクチベータインヒビター濃度を、プラスミノゲンアクチベータインヒビター−１に結合する抗体を用いた免疫学的な測定方法によって測定する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
血漿中のプラスミノゲンアクチベータインヒビター濃度をＥＬＩＳＡ法によって測定する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
血漿中のプラスミノゲンアクチベータインヒビター濃度をＡｌｐｈａＬＩＳＡ法によって測定する、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
早産または流産が、絨毛膜下血腫または胎盤剥離に起因する早産または流産である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
プラスミノゲンアクチベータインヒビター−１に結合する抗体、α−トロンビン、およびカルシウムイオンを含む水溶液を含む、早産または流産の発症危険度診断用キットであって、
被検者より単離された血漿中のプラスミノゲンアクチベータインヒビター活性または濃度が正常妊婦血漿における値よりも低く、かつ、被験者から単離された血漿にカルシウムイオンを添加しない場合のユーグロブリン溶解時間とカルシウムイオンを添加した場合のユーグロブリン溶解時間との比率が５．０よりも低い場合に早産または流産の発症の危険性が高いと診断するための診断キット。
【請求項７】
早産または流産が、絨毛膜下血腫または胎盤剥離に起因する早産または流産である、請求項６に記載のキット。
【請求項８】
プラスミノゲンアクチベータインヒビター−１を含む医薬組成物であって、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法により、または請求項６若しくは７に記載の診断キットにより早産または流産を起こす危険性が高いと診断された患者において早産または流産を予防するための医薬組成物。
【請求項９】
早産または流産が、絨毛膜下血腫または胎盤剥離に起因する早産または流産である、請求項８に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血漿中のプラスミノゲンアクチベータインヒビター活性または濃度を測定することを特徴とする、早産または流産の発症危険度を診断する方法に関する。詳しくは、プラスミノゲンアクチベータインヒビター活性または濃度が正常妊婦のものよりも低いときに早産または流産を起こす危険性が高いと判断することを特徴とする、早産または流産の発症危険度を診断する方法、早産または流産の発症危険度診断用キット、およびプラスミノゲンアクチベータインヒビター−１を含む早産または流産を予防するための医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
早産および流産の主たる原因として、絨毛膜下血腫が知られている。現在、絨毛膜下血腫に対しては、超音波断層法による画像診断が行われているが、血液学的診断法や治療法は確立されていない。したがって、いったん絨毛膜下血腫が発生し進行すると、早産および流産は回避することができなかった。【０００３】
プラスミノゲンアクチベータインヒビター−１（Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１（ＰＡＩ−１））は、セリンプロテアーゼインヒビター（ｓｅｒｉｎｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＳＥＲＰＩＮ））スーパーファミリーの一つであり、ウロキナーゼ型プラスミノゲンアクチベータおよび組織型プラスミノゲンアクチベータの主要な生理的な制御因子である。ＰＡＩ−１のレベルの上昇が動脈血栓（非特許文献１）やガン患者の予後不良（非特許文献２）等いくつかの病態に関連することが多くの研究によって示されているが、ＰＡＩ−１欠損の症例数が少ないことから、ＰＡＩ−１欠損に関する知見は未だに限られている。本発明者らは、近年、ヒトにおいて遺伝的に同定された完全なＰＡＩ−１欠損のケースについて報告した（非特許文献３）。係る患者は大出血する傾向を示したが、これはこれまでの報告においてＰＡＩ−１欠損患者にも見られた傾向である（非特許文献４）。【０００４】
出血の素因となり得る遺伝子の変化は、妊娠中の合併症に関連する。そのような関連の最も顕著な実例は、先天性の無フィブリノゲン血症や先天性の凝固因子ＸＩＩＩ（ＦＸＩＩＩ）欠損であり、これらは治療しないままでいると、性器出血や妊娠６〜８週での自然流産を引き起こす（非特許文献５および６）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Semin Thromb Hemost 2009; 35: 468-77
【非特許文献２】Immunol Lett 2008; 118: 116-24
【非特許文献３】J Thromb Haemost 2011; 9: 1200-6
【非特許文献４】N Engl J Med 1992; 327: 1729-33
【非特許文献５】Curr Drug Targets 2005; 6: 535-9
【非特許文献６】Obstet Gynecol Surv 2007; 62: 255-60
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、絨毛膜下血腫の簡便かつ精度の高い新たな診断方法および絨毛膜下血腫を治療する方法を提供し、それらの方法により絨毛膜下血腫に起因する早産および流産の発症危険度を早期診断することにより、早産および流産を予防することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、ＰＡＩ−１欠損症の患者は、妊娠すると絨毛膜下血腫を発症して流産すること、および係る患者にＰＡＩ−１を含む新鮮凍結血漿を投与すると絨毛膜下血腫の進行を阻止し、妊娠維持が可能であることを見出した（Thrombosis  Research  129:4,  e161-e163）。さらに、本発明者らはこれら知見に基づき、ＰＡＩ活性に基づいて絨毛膜下血腫に起因する流早産の発症危険性を判定できることを見出し、本発明を完成させた。【０００８】
すなわち、本発明は、以下の［１］〜［１４］を提供する。
［１］被検者より単離された血漿中のプラスミノゲンアクチベータインヒビター活性または濃度を測定することを特徴とする、早産または流産の発症危険度を診断する方法。
［２］血漿中のプラスミノゲンアクチベータインヒビター活性を、ユーグロブリン溶解時間を指標として測定する、［１］に記載の方法。
［３］ユーグロブリン溶解時間が５００分以下であるときに早産または流産を起こす危険性が高いと判断する、［２］に記載の方法。
［４］ユーグロブリン溶解時間が３５０分以下であるときに早産または流産を起こす危険性が高いと判断する、［２］または［３］に記載の方法。
［５］血漿にカルシウムを添加してユーグロブリン溶解時間を測定する工程、および、カルシウムを添加しない場合のユーグロブリン溶解時間とカルシウムを添加した場合のユーグロブリン溶解時間との比率を求める工程をさらに含み、当該比率に基づいて早産または流産を起こす危険性が高いと判断する、［２］〜［４］のいずれかに記載の方法。
［６］血漿中のプラスミノゲンアクチベータインヒビター濃度を、プラスミノゲンアクチベータインヒビター−１に結合する抗体を用いた免疫学的な測定方法によって測定する、［１］に記載の方法。
［７］血漿中のプラスミノゲンアクチベータインヒビター濃度をＥＬＩＳＡ法によって測定する、［６］に記載の方法。
［８］血漿中のプラスミノゲンアクチベータインヒビター濃度をＡｌｐｈａＬＩＳＡ法によって測定する、［６］に記載の方法。
［９］早産または流産が、絨毛膜下血腫に起因する早産または流産である、［１］〜［８］のいずれかに記載の方法。
［１０］α−トロンビン、およびカルシウムイオンまたはカオリンを含む水溶液を含む、早産または流産の発症危険度診断用キット。
［１１］プラスミノゲンアクチベータインヒビター−１に結合する抗体を含む、早産または流産の発症危険度診断用キット。
［１２］早産または流産が、絨毛膜下血腫に起因する早産または流産である、［１０］または［１１］に記載のキット。
［１３］プラスミノゲンアクチベータインヒビター−１を含む、早産または流産を予防するための医薬組成物。
［１４］早産または流産が、絨毛膜下血腫に起因する早産または流産である、［１３］に記載の医薬組成物。
【発明の効果】
【０００９】
本発明を用いると、従来、超音波断層法による画像診断でしか診断できなかった絨毛膜下血腫および早産または流産の発症危険度を、血液学的かつ定量的に診断することが可能となる。そのため、早産または流産の発症危険度を早期に診断することおよび診断の精度を向上させることができる。また、本発明により、絨毛膜下血腫が発生した場合であっても妊娠を維持し、流早産を防ぐことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、ＰＡＩ−１欠損症の患者の３回の妊娠経過中に観察された性器出血（Ｇ．Ｂ．）（ｇ）、投与した新鮮凍結血漿（ＦＦＰ）（Ｕ：１Ｕ＝２００ｍＬの血液から分離された血漿）、および血漿Ｄ−ダイマー濃度（μｇ／ｍＬ）を示す。黒い矢印は流産した日を示し、白い矢印は緊急帝王切開を行ったときを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
１．定義
「プラスミノゲンアクチベータインヒビター−１（Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１（ＰＡＩ−１））」は、セリンプロテアーゼインヒビター（ｓｅｒｉｎｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＳＥＲＰＩＮ））スーパーファミリーの一つであり、ウロキナーゼ型プラスミノゲンアクチベータ（ｕｒｏｋｉｎａｓｅ  ｔｙｐｅ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ（ｕＰＡ））および組織型プラスミノゲンアクチベータ（ｔｉｓｓｕｅ  ｔｙｐｅ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ（ｔＰＡ））の主要な生理的な制御因子である。
【００１２】
「プラスミノゲンアクチベータインヒビター−２（Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−２（ＰＡＩ−２））」は、ＳＥＲＰＩＮスーパーファミリーの一つであり、ｕＰＡおよびｔＰＡの生理的な制御因子である。ＰＡＩ−２は胎盤由来であり、非妊娠時にはほとんど発現されていない。
【００１３】
本発明において、「プラスミノゲンアクチベータインヒビター活性」、「ＰＡＩ活性」および「ＰＡＩの活性」とは、ＰＡＩ−１およびＰＡＩ−２が有する、プラスミノゲンアクチベータを不活化して線維素溶解系（線溶系）を抑制する活性のことをいい、ＰＡＩ−１およびＰＡＩ−２が有する線溶抑制活性の総和を意味する。妊娠中は胎盤よりＰＡＩ−２も分泌されるが、線溶抑制活性は妊婦でもＰＡＩ−１活性が主たるものであることから、本発明において測定されるＰＡＩ活性は、主にＰＡＩ−１に起因する活性を示す。なお、プラスミノゲンアクチベータインヒビター活性が高いほど、線溶系が強く抑制される。
【００１４】
「絨毛膜下血腫」とは、妊娠初期から中期にかけてしばしば見られる、胎盤と脱落膜との間に現れる血腫で、胎盤の辺縁に沿って形成されるのが特徴である。妊娠初期に見られる絨毛膜下血腫のほとんどは自然退縮するが、妊娠中期まで持続する場合もある。絨毛膜下血腫が持続した場合、子宮収縮抑制不能、性器出血の増加、子宮内感染等により、胎盤機能不全や流早産の確率が高くなる。
【００１５】
本発明において、「早産」とは妊娠２２週以降３７週未満での出産をいい、「流産」とは妊娠２２週未満における妊娠喪失をいう。また、本明細書においては、早産および流産を指して、「流早産」とも記載する。
【００１６】
本発明において、「早産または流産の発症危険度」または「流早産の発症危険度」とは、被検者が流早産するか否かを判断するための、検査判定基準をいう。流早産の発症危険度が高いほど流早産する可能性が高いと判断され、低いほど流早産する可能性が低いまたは正常な妊娠であると判断される。
【００１７】
２．早産または流産の発症危険度を判定する方法
本発明は、血漿中のプラスミノゲンアクチベータインヒビター活性または濃度を測定することを特徴とする、早産または流産の発症危険度を判定する方法に関する。
【００１８】
（１）血漿の単離
本発明において測定される試料は、被検者より通常採取した血液から、血漿を調製して用いる。採血は、本分野において周知の方法を用いることができ、当業者であれば適宜選択できるが、凝固系因子の保存が良好な、抗凝固剤としてクエン酸ナトリウムを用いる方法が好ましい。本発明は、末梢血を試料として用いることができる。血漿を調製する方法としては、遠心等、本分野において周知の方法を用いることができる。取得した血漿は、測定するまで凍結保存してもよい。
【００１９】
（２）プラスミノゲンアクチベータインヒビター活性または濃度の測定
本発明において、プラスミノゲンアクチベータインヒビター活性を測定する方法として、当業者に周知の方法である、ユーグロブリンクロット溶解時間（ｅｕｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｃｌｏｔ  ｌｙｓｉｓ  ｔｉｍｅ（ＥＣＬＴ））の測定方法を使用することができる。ここで、ユーグロブリンクロット溶解時間とは、血漿ユーグロブリン分画中で作製されたクロットが自然溶解するまでの時間を測定したものであり、主にＰＡＩ−１とｔＰＡとのバランスにより決まる血漿の有する線溶活性を包括的に表すものとされている。ただし妊娠中は胎盤よりプラスミノゲンアクチベータインヒビター−２も分泌されるので、妊婦のＥＣＬＴで得られた結果は厳密にはプラスミノゲンアクチベータインヒビター−１の活性とプラスミノゲンアクチベータインヒビター−２の活性の総和である。しかし線溶抑制活性は妊婦でもプラスミノゲンアクチベータインヒビター−１活性が主たるものであることから、本発明においてＥＣＬＴを用いて測定されるＰＡＩ活性は、主にＰＡＩ−１に起因する活性を示す。
【００２０】
ユーグロブリンクロット溶解時間の測定方法は、アンチプラスミンを除いて、フィブリンの溶解時間を測定する方法であり、当業者であれば適宜実施することができる。具体的には、血漿を酢酸緩衝液で希釈して静置した後、遠心して沈渣を採取し、その沈渣をトリス緩衝液で混和してユーグロブリン分画を得る。そしてα−トロンビンおよびカルシウムイオンあるいはカオリンを含む溶液にユーグロブリン分画のサンプルを添加し、沈渣の溶解時間を測定する。本発明においては、この溶解時間をＰＡＩ活性の指標とする。ユーグロブリンクロット溶解時間が短いほどＰＡＩ活性が低い、すなわち、線溶活性が高いことを示す。
【００２１】
本発明の一態様においては、カルシウムイオンを添加せずに測定したユーグロブリンクロット溶解時間（ＲｅｇｕｌａｒＥＣＬＴ）と、カルシウムイオンを添加して測定したユーグロブリンクロット溶解時間（Ｃａ添加ＥＣＬＴ）との比率を求め、当該比率をＰＡＩ活性の指標とすることもできる。なお、カルシウムイオンを添加しない場合のユーグロブリン溶解時間は、上記と同様に調製したユーグロブリン分画のサンプルを、α−トロンビンを含む溶液に添加し、沈渣の溶解時間を測定することにより求められる。
【００２２】
プラスミノゲンアクチベータインヒビター濃度を測定する方法として、当業者に周知の方法である、抗ＰＡＩ−１抗体を用いた免疫学的な測定方法を使用することができる。具体的には、ウエスタンブロッティング法、免疫沈降法、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、およびＡｌｐｈａＬＩＳＡ法（登録商標、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）などを使用することができる。
【００２３】
Ａｌｐｈａｌｉｓａ法は、ドナービーズに結合した分子がアクセプタービーズに結合した分子と生物学的に相互作用して２つのビーズが近接した状態の時にのみ検出される発光シグナルを利用したアッセイ方法である。具体的には、抗原の存在下でこれら２つのビーズは緊密に接近し、レーザーによるドナービーズの励起が一重項酸素分子の放出を惹起し、これがアクセプタービーズ内のチオキシン誘導体と反応して化学発光反応が開始され、この反応から生じた発光エネルギーが同じビーズ内にある蛍光物質に転移されることで光が放出される。よって、本発明において、抗ＰＡＩ−１抗体を結合したドナービーズおよびアクセプタービーズを使用してＡｌｐｈａＬＩＳＡ法を行うと、ＰＡＩ−１濃度を定量することができる。また、本発明において、抗ＰＡＩ−１抗体およびｕＰＡをドナービーズまたはアクセプタービーズにそれぞれ結合させて、抗ＰＡＩ−１抗体を結合したドナービーズおよびｕＰＡを結合したアクセプタービーズ、またはｕＰＡを結合したドナービーズおよび抗ＰＡＩ−１抗体を結合したアクセプタービーズを調製し、係るビーズを用いてＡｌｐｈａＬＩＳＡ法を実施することができる。この場合、サンプル中の活性をもったＰＡＩ−１のみがのドナービーズおよびアクセプタービーズと結合するので、結果としてＰＡＩ−１活性を測定することが可能である。
【００２４】
プラスミノゲンアクチベータインヒビター活性または濃度の測定は、上記の方法に限定されず、当該活性または濃度を測定できる当業者に周知の方法を使用することができる。また、それらの測定方法を複数利用してもよい。
【００２５】
（３）流早産の発症危険度の判定
本発明者らは、ＰＡＩ−１欠損症の患者は、妊娠すると絨毛膜下血腫を発症して流産すること、および係る患者にＰＡＩ−１を含む新鮮凍結血漿を投与すると絨毛膜下血腫の進行を阻止し、妊娠維持が可能であることを見出した。また、係る患者においては、ＰＡＩ−１欠損により血液の線溶系が異常亢進し卵膜と子宮の接着性が低下し絨毛膜下血腫が発生することを明らかにした。さらに、本発明者らはこれら知見に基づき、ＰＡＩ活性または濃度に基づいて絨毛膜下血腫の診断ができること、および絨毛膜下血腫に起因する流早産の発症危険性を判定できることを見出した。
【００２６】
これらの知見に基づき、本発明では、上述の方法により測定したプラスミノゲンアクチベータインヒビター活性または濃度が正常妊婦の標準値−標準誤差よりも低い場合に、絨毛膜下血腫発症のおそれがあり、被検者の流早産の発症危険度が高いと判断する。
【００２７】
具体的には、ユーグロブリンクロット溶解時間を指標として用いる場合には、ＰＡＩ活性が正常妊婦血漿よりも低い場合、例えばユーグロブリンクロット溶解時間が約５００分以下、約４００分以下、約３５０分以下、または約２００分以下であるときに、被検者の流早産の発症危険度が高いと判断する。カルシウムイオンを添加せずに測定したユーグロブリンクロット溶解時間（ＲｅｇｕｌａｒＥＣＬＴ）と、カルシウムイオンを添加して測定したユーグロブリンクロット溶解時間（Ｃａ添加ＥＣＬＴ）との比率（ＲｅｇｕｌａｒＥＣＬＴ／Ｃａ添加ＥＣＬＴ）を指標として用いる場合には、例えば、約５．０以下、約４．０以下、約３．０以下、または約１．５以下であるときに、被検者の流早産の発症危険度が高いと判断する。
【００２８】
また、プラスミノゲンアクチベータインヒビター濃度を指標として用いる場合には、プラスミノゲンアクチベータインヒビター濃度が正常妊婦血漿よりも低い場合、例えば、正常妊婦の０．７５倍未満、０．５倍未満、０．２５倍未満、または０．１倍未満であるときに、被検者の流早産の発症危険度が高いと判断する。ＥＬＩＳＡ法に従ってＰＡＩ−１濃度を測定する場合、ＰＡＩ−１濃度が例えば約４ｎｇ／ｍｌ以下、約３ｎｇ／ｍｌ以下、約２ｎｇ／ｍｌ以下、約１．６ｎｇ／ｍｌ以下、または約１ｎｇ／ｍｌ以下であるときに、被検者の流早産の発症危険度が高いと判断する。ＡｌｐｈａＬＩＳＡ法に従ってＰＡＩ−１濃度を測定する場合、ＰＡＩ−１濃度が例えば約６０ｎｇ／ｍｌ以下、約４０ｎｇ／ｍｌ以下、約２０ｎｇ／ｍｌ以下、または約１０ｎｇ／ｍｌ以下であるときに、被検者の流早産の発症危険度が高いと判断する。
【００２９】
本発明においては、１つの測定方法によって得られたＰＡＩ−１活性または濃度に基づいて被検者の流早産の発症危険度を判定してもよく、複数の測定方法によって得られたＰＡＩ−１活性または濃度に基づいて被検者の流早産の発症危険度を判定してもよい。
【００３０】
３．流早産の発症危険度判定用キット
本発明に係るキットは、上記２．欄で説明した流早産の発症危険度を判定する方法を実施するためのものであればよく、これに含まれる具体的な構成、材料、機器などは、特に限定されるものではない。
【００３１】
本発明の一態様において、本発明のキットは、α−トロンビン、および塩化カルシウム等のカルシウムイオンを含む水溶液またはカオリンを含む。さらに、本発明のキットは、酢酸緩衝液、トリス緩衝液、およびリン酸緩衝液等の緩衝液を含んでもよい。また、本発明のキットは、クエン酸ナトリウム緩衝液入りの採血管も含んでもよい。
【００３２】
本発明の別の態様において、本発明のキットは、抗プラスミノゲンアクチベータインヒビター−１に対する抗体（一次抗体）を含む。抗体は、プラスミノゲンアクチベータインヒビター−１を認識できる抗体であればよく、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよい。また、場合によっては、抗体フラグメント、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２などを用いることもできる。さらに、本発明のキットは、固相担体、標準物質、および二次抗体を含んでもよい。また、本発明のキットは、さらに、プラスミノゲンアクチベータインヒビター−１の標準、希釈液、緩衝液、ならびに、抗原抗体複合体の検出反応のための基質および停止溶液を含むこともできる。
【００３３】
固相担体としては、例えば、ガラス、プラスチック、天然もしくは修飾セルロース、ポリアクリルアミド、アガロース、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、マグネタイト、または当業者によく知られているその他適した材料からなるものが挙げられ、該固相担体の形状としては、例えば、プレート、ウェル、スライド、ビーズ、粒子、チューブ、ファイバー、メンブレンの形としてもよい。また、標準物質としては、免疫学的方法において使用可能な物質であれば使用することができ、例えば、酵素、蛍光物質、発光物質等が挙げられる。抗体は、固相担体に固定されていてもよい。
【００３４】
本発明のキットは、さらに、二次抗体として、プラスミノゲンアクチベータインヒビター−１に対する抗体に結合する抗体、または一次抗体とは異なるエピトープを認識するプラスミノゲンアクチベータインヒビター−１に対する抗体を含んでもよい。二次抗体は、酵素、放射性同位体、蛍光色素、アビジン、ビオチンなどで標識されていてもよい。
【００３５】
４．プラスミノゲンアクチベータインヒビター−１を含む、流早産を予防するための医薬組成物
本発明の医薬組成物は、主成分として、プラスミノゲンアクチベータインヒビター−１（ＰＡＩ−１）を含む。また、本発明の医薬組成物は、ＰＡＩ−１と同等以上の活性を有する変異型プラスミノゲンアクチベータインヒビター−１（変異型ＰＡＩ−１）を主成分としてもよい。ここで、「同等の活性」とは、ＰＡＩ−１が有する、プラスミノゲンアクチベータを不活化して線溶系を抑制する活性の強さが、実質的に同一であることを指し、「変異型プラスミノゲンアクチベータインヒビター−１」とは、野生型ＰＡＩ−１のアミノ酸配列において１個若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、付加又は挿入を有するものを指す。上記「１個若しくは数個」とは、１０以下の整数個、例えば１〜１０個程度、好ましくは１〜５個程度である。
【００３６】
また、本発明の医薬組成物は、早産および／または流産を予防するという効果を損なわない限り、薬学的に許容可能な担体、または剤型によって当該技術分野において一般的に使用される添加剤をさらに含んでもよい。添加剤として、例えば、着色剤、保存剤、風味剤、香り改善剤、呈味改善剤、甘味剤、または安定剤、その他薬学的に許容される添加剤を含有することができる。
【００３７】
本明細書において明示的に引用される全ての特許および参考文献の内容は全て参照として本明細書に組み込まれる。また、本出願が有する優先権主張の基礎となる出願である日本特許出願2011-249523号（2011年11月15日出願）の明細書および図面に記載の内容は全て参照として本明細書に組み込まれる。
【００３８】
以下、実施例をもって本発明をさらに詳しく説明するが、これらの実施例は本発明を制限するものではない。
【実施例】
【００３９】
１．ＰＡＩ−１欠損症の患者における妊娠経過
（１）１回目の妊娠
患者は、頻回の大量出血の発作を経験している４７歳の女性である。最初の妊娠は２６歳である。妊娠経過は順調で、胎児の成長は１６週まで正常であった。妊娠１６週の終わりに、少量の性器出血が観察され、患者は入院した。患者のプロトロンビン時間、活性化部分トロンボプラスチン時間、および血漿フィブリノゲン濃度は通常の範囲内であった（それぞれ１３．０秒、３４．９秒、および１６５ｍｇ／ｄＬ）。しかし、血漿Ｄ−ダイマー濃度が少し上昇していた（２．４μｇ／ｍＬ、通常の範囲は  ＜０．５μｇ／ｍＬ）。なお、Ｄ−ダイマーは、プラスミンによるフィブリン分解産物であり、Ｄ−ダイマーのモニタリングは、臨床病態において用いられる線溶動態解析法の一つである。新鮮凍結血漿（ｆｒｅｓｈ  ｆｒｏｚｅｎ  ｐｌａｓｍａ（ＦＦＰ））を週に２回投与して、性器出血をコントロールし、妊娠を維持した。血漿Ｄ−ダイマー濃度は、妊娠１８週の終わりに突然上昇し、妊娠１９週に大量の性器出血が観察された。胎盤後方および周辺にエコーフリースペース（echo-free space）は観察されなかったが、胎児の心拍は停止し、患者の子宮頸部が完全に開いているのが発見された。血漿Ｄ−ダイマー濃度は減少し、性器出血は、胎児（２２０ｇ）の除去から１週間後に止まった。流産した胎児は男児で、外見は正常だった。【００４０】
（２）２回目の妊娠
２回目の妊娠は２７歳の時である。妊娠７週に妊娠を確認後すぐに、患者は本発明者らの病院に入院した。妊娠８週に少量の性器出血が観察されたが、この妊娠は１１週まで順調だった。妊娠１１週の終わりから、持続的ではあるが少量の性器出血が観察されたため、週に２〜３回のＦＦＰ投与を開始した。性器出血は妊娠２０週で止まったが、ＦＦＰの投与を継続して妊娠を安定化した。妊娠２８週で血漿Ｄ−ダイマー濃度が少し上昇したので、ＦＦＰの投与頻度を週に２〜３回から一日おきに変更した。しかし、血漿Ｄ−ダイマー濃度は上昇を続け、妊娠３２週で１２８μｇ／ｍＬに達し、超音波検査により、胎盤剥離を伴うコントロールできない子宮収縮が起きていると診断した。よって、緊急帝王切開を行い、患者は１７３６ｇの女児を出産した。手術前後の失血量は４５００ｍＬであり、これは４２Ｕ  ＦＦＰの投与によってコントロールした。【００４１】
（３）３回目の妊娠
３回目の妊娠は２９歳の時である。以前の妊娠において成功した管理に基づいて、患者は妊娠８週で入院し、継続的なＦＦＰの投与を開始した。ＦＦＰは妊娠１６週まで週２回投与し、妊娠１９週まで徐々に増やした。妊娠２０週の後、ＦＦＰの投与を毎日行った。今回の妊娠は、妊娠２４週まで安定していたが、血漿Ｄ−ダイマー濃度は妊娠２５週から継続的に上昇し、妊娠２７週で５７．９μｇ／ｍＬに達し、胎盤剥離を伴うコントロールできない子宮収縮が起きていると診断した。そこで再度緊急帝王切開を行い、患者は９７８ｇの女児を出産した。手術前後の失血量は１０３７ｍＬだった。これら二人の娘は健康で、症状はなかった。【００４２】
（４）小括
これらの結果から、ＰＡＩ−１はヒトの妊娠維持のために重要な役割を果たすことが示された。したがって、ＰＡＩ−１が低濃度であることは、ヒトにおける自然流産および／または早産のリスクファクターとなり得ると考えられる。【００４３】
２．ＰＡＩ活性の測定
Ａ．ユーグロブリンクロット溶解時間の測定方法
（１）ＰＡＩ活性の測定法
クエン酸採血した患者血液を３０００ｇで１０分遠心して上清を採取し、これを血漿サンプルとした。この血漿を１０ｍＭ、ｐＨ４．５の酢酸緩衝液で２０倍に希釈し、４℃で１時間静置した。その後４℃、１５００ｇで１０分遠心し、沈渣を採取し、その沈渣を０．１Ｍ、ｐＨ７．４のトリス緩衝液で混和した。これをユーグロブリン分画とする。【００４４】
α−トロンビン１２．５Ｕ／ｍｌ（最終濃度）にユーグロブリン分画のサンプル１５０μｌを添加した。その沈渣の溶解時間を測定した（ＲｅｇｕｌａｒＥＣＬＴ）。α−トロンビン２．５．Ｕ／ｍｌ（最終濃度）、カルシウムイオン１０ｍＭ（最終濃度）の溶液にユーグロブリン分画のサンプル１５０μｌを添加した。そしてその沈渣の溶解時間を測定した（Ｃａ添加ＥＣＬＴ）。なお、カルシウムイオンの代替としてカオリン（カルシウムと同じ濃度）を添加しても可能である。【００４５】
（２）ＰＡＩ活性（ユーグロブリン溶解時間）
絨毛膜下血腫により切迫早産または切迫流産をした患者および正常妊婦について、上記（１）の方法に従ってＰＡＩ活性（Ｃａ添加ＥＣＬＴ）を測定した。結果を表１にまとめる。上記患者血液は、いずれも妊娠初期（〜１５週）の患者から採血したものである。【００４６】
【表１】
0005924625.tif 000002
【００４７】
さらに、絨毛膜下血腫の患者７名（うち、早産歴および／または流産歴のある患者は４名）、正常妊婦５名について、上記（１）と同じ方法に従ってＰＡＩ−１活性（ユーグロブリン溶解時間）を測定した結果を表２にまとめる。表２の測定値は、それぞれユーグロブリン溶解時間（ＲｅｇｕｌａｒＥＣＬＴ）と、カルシウムを添加した場合のユーグロブリン溶解時間（Ｃａ添加ＥＣＬＴ）、ＥＣＬＴ比率（ＲｅｇｕｌａｒＥＣＬＴ／Ｃａ添加ＥＣＬＴ）である。患者血液は、いずれも妊娠初期（〜１５週）の患者から採血したものである。【００４８】
【表２】
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【００４９】
（３）測定結果について
以上の結果より、絨毛膜下血腫による流産・早産の既往または検体採取時に絨毛膜下血腫と診断されている症例（症例１〜７）では、正常妊娠経過の症例と比較してユーグロブリン溶解時間が短い傾向がうかがわれた。
妊婦は一般に、凝固系が亢進し線溶系が抑制されており、これが妊娠維持と分娩時の止血に寄与していることがよく知られている。また、線溶系の抑制傾向は妊娠週の増加にともない強くなることも知られており、正常妊娠症例のＲｅｇｕｌａｒＥＣＬＴの値が非常に大きいこと（＞１２００を示すこと）および妊娠週の増加に伴いＣａ添加ＥＣＬＴが大きくなることは、この線溶抑制を反映したものと考えられる。【００５０】
対して症例１〜７ではユーグロブリン溶解時間は比較的短く、線溶抑制効果が正常妊娠症例ほどみられていない。Ｃａ添加ＥＣＬＴが短いことからも、ＰＡＩ−１の活性が低く線溶抑制が働いていないことが推測される。【００５１】
これより、ユーグロブリン溶解時間が５００分以下の患者は、ＰＡＩ−１活性が低く、絨毛膜下血腫を発症している可能性が高く、早産・流産の発症危険度があると考えられる。また、ユーグロブリン溶解時間が３５０分以下の患者については早産・流産の発症危険度が高いと考えられる。【００５２】
また、ユーグロブリン溶解時間とカルシウム添加時の短縮された溶解時間の比率（ＲｅｇｕｌａｒＥＣＬＴ／Ｃａ添加ＥＣＬＴ）が４．０以下の患者は、ＰＡＩ−１活性が低く、絨毛膜下血腫を発症している可能性が高く、早産・流産の発症危険度があると考えられる。上記比率が１．５以下の患者については早産・流産の発症危険度が高いと考えられる。【００５３】
Ｂ．ＥＬＩＳＡ法
（１）ＰＡＩ活性の測定法
クエン酸採血した患者血液を３０００ｇで１０分遠心して上清を採取し、これを血漿サンプルとした。Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社のｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｐｉｎ  Ｅ１／ＰＡＩ−１  ＤｕｏＳｅｔ  Ｋｉｔを使用し、下記の通りＰＡＩ−１濃度（抗原値）を測定した。【００５４】
捕獲抗体（マウス由来抗ヒトＳｅｒｐｉｎ  Ｅ１抗体）をリン酸緩衝生理食塩水で４μｇ／ｍＬに希釈し、この捕獲抗体でマイクロプレートの各ウェルをコーティングした。キット添付のリコンビナントｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｐｉｎ  Ｅ１を１％ウシ血清アルブミン含有リン酸緩衝生理食塩水（以下、Ｒ．Ｄ．）で希釈し２０ｎｇ／ｍＬ〜０．３１２５ｎｇ／ｍＬに希釈し、ＰＡＩ−１標準溶液とした。この標準溶液と患者血漿サンプルを捕獲抗体でコーティングしたマイクロプレートの各ウェルに１００μＬずつ滴下し、室温で２時間静置した後、洗浄バッファーで３回洗浄した。キット添付のビオチン化ヤギ由来抗ヒトＳｅｒｐｉｎ  Ｅ１抗体をＲ．Ｄ．で希釈し、加熱処理後正常ヤギ血清を２％添加し、４００ｎｇ／ｍＬの検出抗体溶液を調整した。この検出抗体溶液を各ウェルに１００μＬずつ滴下し、室温で２時間静置した後、洗浄バッファーで３回洗浄した。ストレプトアビジン（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）つきＨＲＰ溶液を各ウェルに１００μＬずつ滴下し、遮光して室温で２０分間静置した後、洗浄バッファーで３回洗浄した。その後、２０分間プレートを発色させ、反応停止液を添加した。マイクロプレートリーダーを用い、５４０ｎｍの波長でフィルターし４５０ｎｍの波長で吸光度を測定した。ＰＡＩ−１標準溶液の既知濃度と吸光度からＰＡＩ−１濃度標準曲線を作成し、血漿サンプルのＰＡＩ−１濃度を算出した。【００５５】
（２）ＰＡＩ活性（ＰＡＩ−１濃度）
絨毛膜下血腫により早産または流産をした患者および正常妊婦について、上記（１）の方法に従ってＰＡＩ−１濃度（抗原値）を測定した結果を表３にまとめる。上記患者血液は、いずれも妊娠初期（〜１５週）の患者から採血したものである。なお、症例１はＰＡＩ−１欠損症の患者である。【００５６】
【表３】
0005924625.tif 000004
【００５７】
（３）測定結果について
以上の結果より、絨毛膜下血腫による流産・早産の既往または検体採取時に絨毛膜下血腫と診断されている症例（症例１〜７）では、正常妊娠経過の症例と比較してＥＬＩＳＡ法により測定されたＰＡＩ−１濃度が低い傾向がうかがわれた。【００５８】
これより、ＥＬＩＳＡ法を用いてＰＡＩ−１濃度（抗原値）を測定する場合、ＰＡＩ−１濃度が４ｎｇ／ｍｌ以下の患者は、ＰＡＩ−１活性が低く、絨毛膜下血腫を発症している可能性が高く、早産・流産の発症危険度があると考えられる。また、ＰＡＩ−１濃度（抗原値）が１．６ｎｇ／ｍｌ以下の患者については早産・流産の発症危険度が非常に高いと考えられる。【００５９】
Ｃ．ＡｌｐｈａＬＩＳＡ法
（１）ＰＡＩ活性の測定法
ＡｌｐｈａＬＩＳＡは、ビオチン化抗ＰＡＩ−１抗体が結合したストレプトアビジンドナービーズと抗ＰＡＩ−１抗体が化学結合したＡｌｐｈａＬＩＳＡアクセプタービーズを用いた濃度測定法である。ＰＡＩ−１が両者のビーズに結合すると、２種のビーズが近接し、励起光６８０ｎｍを照射するとドナービーズ中の光感受性物質が周囲の酸素を一重項励起状態にし、近接したアクセプタービーズ内で化学反応を起こし、波長６１５ｎｍの発光が検出される。発光シグナルはサンプ中のＰＡＩ−１量に比例するため、標準曲線を用いた解析によりＰＡＩ−１濃度の定量が可能となる。【００６０】
クエン酸採血した患者血液を３０００ｇで１０分遠心して上清を採取し、これを血漿サンプルとした。この血漿をＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社のＡｌｐｈａＬＩＳＡ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１  （ＰＡＩ−１）  Ｋｉｔを用いて、下記通りＰＡＩ−１濃度を測定した。【００６１】
キット添付のＡｌｐｈａＬＩＳＡ  ｈｕｍａｎ  ＰＡＩ−１をウシ胎児血清で希釈し１０００ｎｇ／ｍＬ〜０．００３ｎｇ／ｍＬのＰＡＩ−１標準溶液を調整した。また、患者血漿サンプルをウシ胎児血清で２倍希釈した。マイクロプレートに５μＬのＰＡＩ−１標準溶液と希釈済血漿サンプルを滴下した。さらに１０μＬのＡｌｐｈａＬＩＳＡ  Ａｎｔｉ−ＰＡＩ−１  Ａｃｃｅｐｔｏｒ  ｂｅａｄｓ（最終濃度１０μｇ／ｍＬ）を滴下し２３℃で３０分間静置した。その後、１０μＬのＢｉｏｔｙｎｙｌａｔｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ａｎｔｉ−ＰＡＩ−１（最終濃度１ｎＭ）を滴下し６０分間静置した。最後に２５μＬのＳｔｒｅｐｔａｖｉｃｉｎ−ｃｏａｔｅｄ  Ｄｏｎｏｒ  ｂｅａｄｓ（最終濃度４０μｇ／ｍＬ）を滴下し、遮光したうえ２３℃で３０分間静置した後、６８０ｎｍの励起光を照射し検出された６１５ｎｍの発光シグナルを得た。ＰＡＩ−１標準溶液からの発光シグナルをもとにＰＡＩ−１濃度の標準曲線を作成し、血漿サンプルのＰＡＩ−１濃度を算出した。【００６２】
（２）ＰＡＩ活性（ＰＡＩ−１濃度）
絨毛膜下血腫により早産または流産をした患者（２名）および正常妊婦（２名）、非妊婦（２名）について、上記（１）の方法に従ってＰＡＩ−１濃度（抗原値）を測定した結果を表４にまとめる。上記患者血液は、いずれも妊娠初期（〜２０週）の患者から採血したものである。なお、症例１はＰＡＩ−１欠損症の患者である。【００６３】
【表４】
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【００６４】
（３）測定結果について
以上の結果より、非妊婦と比較して妊婦ではＰＡＩ−１濃度が高く、絨毛膜下血腫による流産・早産例ではＰＡＩ−１濃度が明らかに低いことがわかる。これより、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ法を用いてＰＡＩ−１濃度（抗原値）を測定する場合、ＰＡＩ−１濃度が６０ｎｇ／ｍＬ以下の患者は、ＰＡＩ−１活性が低く、絨毛膜下血腫を発症している可能性が高く、早産・流産の発症危険度があると考えられる。また、ＰＡＩ−１濃度（抗原値）が２０ｎｇ／ｍＬ以下の患者については早産・流産の発症危険度が非常に高いと考えられる。
【００６５】
（４）ＡｌｐｈａＬＩＳＡ法の改変
ＡｌｐｈａＬＩＳＡでのＰＡＩ−１濃度測定法を改変し、ビオチン化抗ＰＡＩ−１抗体の代わりにビオチン化ｕＰＡを用いることで、サンプル中の活性をもったＰＡＩ−１のみがドナービーズ・アクセプタービーズの２種のビーズと結合し、結果としてＰＡＩ−１活性を測定することが可能である。この方法を用いることで、ＰＡＩ−１活性をより高感度に測定することが可能となり、これまで記した他の測定法同様、絨毛膜下血腫に起因する流産・早産の早期発見に有用であると考えられる。【００６６】
Ｄ．小括
以上より、ユーグロブリン溶解時間を測定する方法、ＰＡＩ−１抗原値を測定する方法のいずれの結果においてもＰＡＩ活性と絨毛膜下血腫による流早産とには相関があり、正常妊婦よりもＰＡＩ活性が低い場合に線溶系が亢進し、絨毛膜下血腫に起因する流早産が起こりやすいことがわかる。【００６７】
今回の結果では、ＥＬＩＳＡ法とＡｌｐｈａＬＩＳＡ法との間でＰＡＩ−１濃度の測定値に誤差を認める。これは測定法の違いにより良好な感度を得られる範囲（測定可能域）が異なること、測定時の標準曲線が異なること、免疫学的手法における使用抗体が同一でないことなどの理由が考えられる。今回、ＥＬＩＳＡ法による測定で利用したＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社のｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｐｉｎ  Ｅ１／ＰＡＩ−１  ＤｕｏＳｅｔ  ＫｉｔのＰＡＩ−１濃度の測定領域は２ｎｇ／ｍｌ以上であり、今回の症例サンプルの測定結果はいずれもその領域から外れたものとなっている。
しかしながらいずれの測定法においてもＰＡＩ−１活性と絨毛膜下血腫による流早産に相関がある点については矛盾なく示されているので、ＰＡＩ活性または濃度の測定は絨毛膜下血腫による流早産の予知には有用な検査であると考えられる。【００６８】
実施例においては、本発明の早産または流産の発症危険度を判定する方法として、ユーグロブリンクロット溶解時間、Ｃａを添加しない場合とＣａを添加した場合のユーグロブリンクロット溶解時間の比、ＥＬＩＳＡ法により測定したＰＡＩ−１濃度、およびＡｌｐｈａＬＩＳＡ法により測定したＰＡＩ−１濃度に基づいてＰＡＩ−１活性を評価し、早産または流産の発症危険度を判定する方法を例示したが、妊婦のＰＡＩ−１活性または濃度を測定できる方法であればよく、上記方法に限定されるものではない。
また、早産または流産の発症危険度を判定する方法は、上記した１つの測定方法で得られたＰＡＩ−１活性に基づいて判定を行うものであっても、複数の測定方法で得られたＰＡＩ−１活性に基づいて判定するものであってもよい。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
本発明を用いると、従来、超音波断層法による画像診断でしか診断できなかった絨毛膜下血腫を、血液学的に診断することが可能となるため、早期に診断することおよび診断の精度を向上させることができる。また、本発明を用いると、絨毛膜下血腫が発生した場合であっても、妊娠を維持し、流早産を防ぐことができる。
【図１】
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