(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
有機化合物を水溶液から取り出す方法であって、
ａ）  前記有機化合物を含んだ水溶液と、液状陽イオン交換体を含有した疎水性有機溶液（ここで、前記液状陽イオン交換体は疎水性を有する）とを準備するステップと、
ｂ）  前記水溶液と前記有機溶液とを接触させるステップと、
ｃ）  前記有機溶液を前記水溶液から分離するステップと
を含み、前記有機化合物は式Ｉ
ＮＨ3+−Ａ−ＣＯＯＲ1  （Ｉ）
［式中、
Ｒ1は、水素、メチル基、エチル基または１つの負電荷であり、
Ａは、少なくとも３個の炭素原子を有する非置換直鎖アルキレン基である］の化合物であり、かつ前記液状陽イオン交換体は脂肪酸である前記方法。
【請求項２】
ステップｂ）の温度は２８〜７０℃である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップｂ）のｐＨ値は６〜８である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
液状陽イオン交換体の有機化合物に対する物質量比は少なくとも１である、請求項１から３までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
有機溶液の水溶液に対する容量比は１：１０〜１０：１である、請求項１から４までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記液状陽イオン交換体は、１２個を上回る数の炭素原子を有する脂肪酸である、請求項１から５までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記液状陽イオン交換体は不飽和脂肪酸である、請求項１から６までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記水溶液は、さらに細胞を含有している、請求項１から７までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞は、組み換えアルカンモノオキシゲナーゼ、組み換えトランスアミナーゼならびに、さらに加えて、アルコール脱水素酵素、アラニン脱水素酵素およびＡｌｋＬ遺伝子産物またはその変異体を含む群からの少なくとも１の酵素を有している、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記有機溶液は、さらに少なくとも１の有機溶媒を含んでいる、請求項１から９までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記有機溶液は、液状陽イオン交換体として２０〜８０容量％のオレイン酸および、溶媒としてラウリン酸メチルエステルを含有し、前記有機化合物は１２−アミノラウリン酸メチルエステルであり、かつ、前記水溶液中に、組み換えアルカンモノオキシゲナーゼ、組み換えトランスアミナーゼならびに、さらに加えて、アルコール脱水素酵素、アラニン脱水素酵素およびＡｌｋＬ遺伝子産物またはその変異体を含む群からの少なくとも１の酵素を有する細菌細胞が存在している、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
水溶液と疎水性有機溶液を含有する反応混合物であって、
前記疎水性有機溶液は、液状陽イオン交換体として脂肪酸を含有し、
前記水溶液は、式（Ｉ）
ＮＨ3+−Ａ−ＣＯＯＲ1  （Ｉ）
［式中、
Ｒ1は、水素、メチル基、エチル基または１つの負電荷であり、
Ａは、少なくとも３個の炭素原子を有する非置換直鎖アルキレン基である］の化合物である、前記反応混合物。
【請求項１３】
前記水溶液は、さらに、組み換えアルカンモノオキシゲナーゼ、組み換えトランスアミナーゼならびに、さらに加えて、アルコール脱水素酵素、アラニン脱水素酵素およびＡｌｋＬ遺伝子産物またはその変異体を含む群からの少なくとも１の酵素を有する細胞を含有している、請求項１２に記載の反応混合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、１以上の正電荷を有する有機化合物を水溶液から取り出す方法であって、ａ）当該有機化合物を含んだ水溶液と、液状陽イオン交換体を含有した疎水性有機溶液（ここで、当該液状陽イオン交換体は疎水性を有する）とを準備するステップと、ｂ）当該水溶液と当該有機溶液とを接触させるステップと、ｃ）当該有機溶液を当該水溶液から分離するステップ（ここで、当該有機化合物は式ＮＨ3+−Ａ−ＣＯＯＲ1の化合物ならびに該化合物と関連した反応混合物である）とを含んでなる方法に関する。
【０００２】
従来は化石燃料から出発して合成されるファインケミカルを、再生可能原材料から出発してバイオテクノロジーによって製造する方法の根本的な問題は、通常多量の水相中に存在する一旦得られた生成物を有機相に移行させる点にある。この移行は、一方で、完成中間生成物または最終生成物を濃縮し、場合により、爾後の反応ステップにおいて有機溶液中での合成加工を可能にするために行われ、他方で、所望の生成物を取り出すことによって水相での反応の収率を改善しあるいはそもそも技術的に有意なレベルでの反応の進行を初めて可能とするために行われる。しばしば低い濃度で存在する生成物を多量の水溶液から直接熱的に濃縮することは、通常、有効ではない。
【０００３】
混合しない水性親水相と有機疎水相とからなる２相系における化合物の分配は、それぞれの化合物の物理化学的特性に決定的に依存している。非置換炭化水素の割合の高いまたはもっぱら非置換炭化水素からなる化合物は主として疎水相に集積するが、極性基の割合の高いたとえばヘテロ原子含有官能価数の高い化合物および、なかんずく特に、電荷を有する化合物は主としてまたは実際にもっぱら水相中に存在するため、これによって、有機相への移行は困難とされる。
【０００４】
平衡が生じた後の上記２相系における化合物の分配は、しばしば、分配係数を用い、たとえばネルンストの式
α＝ｃ相１／ｃ相２
によって記述される。特別な分配係数は、オクタノール相と水相との化合物の分配平衡を特徴づける（Ｐ値とも称される）Ｋowである：
Ｋow＝Ｐ＝ｃオクタノール／Ｃ水
工業的に非常に需要の高い正電荷を帯びた有機化合物の一例を表しているのは、１２−アミノラウリン酸（ＡＬＳ）とその誘導体とくに同メチルエステル（ＡＬＳＭＥ）である。ＡＬＳは、たとえば配管系およびナイロンを製造するためのポリマー製造に際する重要な出発材料である。これまでのところ、ＡＬＳは、化石原料から出発して、ブタジエンの三量化、続いてシクロドデカン形成下での水素化、続いての酸化によるシクロドデカノン生成、ヒドロキシラウリンとの反応およびそれに続くベックマン転位によって合成されるラウリンラクタムを経て低収率の方法で製造されている。ＡＬＳないしＡＬＳＭＥをバイオテクノロジー法によって製造するための有望な方途はドイツ特許第１０２００７１００６０７０５号に開示されている。
【０００５】
従来の技術は、生物剤を含有した水性反応混合物を、有機溶媒を含有した有機相と接触させることにより、正電荷を帯びた化合物が得られることを示している。したがって、たとえばドイツ特許第１０２００７１００６０７０５号は、水性反応混合物から酢酸エチルエステルによる溶媒抽出によって、製品としてのＡＬＳＭＥを得ることを開示している。Ａｓａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）は、ＡＬＳ合成酵素を含有する水性反応溶液からトルエンによってＡＬＳを抽出することを開示している。
【０００６】
そこで、本発明の課題は、正電荷を帯びた化合物、特に、少なくとも１つの正電荷を有するω−アミノカルボン酸を、水性反応混合物から取り出す方法であって、反応混合物と抽出剤として使用された疎水性有機相との分配平衡状態はできるだけ有利であるのが望ましく、換言すれば、分配平衡ができるだけ大幅に疎水性有機相側にあるようにする方法を開発することである。
【０００７】
本発明のさらに別の課題の本旨は、少なくとも１つの正電荷を有する有機化合物とくにω−アミノカルボン酸を、生物剤を含有した水溶液から疎水性有機相を抽出剤として使用して取り出す方法であって、分配平衡ができるだけ大幅に疎水性有機相側にあるようにする方法を開発することにある。
【０００８】
本発明のさらに別の課題の本旨は、少なくとも１つの正電荷を有する有機化合物とくにω−アミノカルボン酸を、水溶液から疎水性有機溶液を抽出剤として使用して取り出す方法であって、バイオテクノロジー上重要な微生物とくにＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉの増殖をできるだけ毀損ないし緩慢化させることなくおよび／または、その際、分裂可能および／または生存可能および／または呼吸活性および／または代謝・合成活性を有する細胞の数をできるだけ減少させない方法を開発することにある。
【０００９】
最後に、本発明の課題は、少なくとも１つの正電荷を有する有機化合物とくにω−アミノカルボン酸を、生物剤を含有した水溶液から疎水性有機相を抽出剤として使用して取り出す方法であって、収率、総代謝率および基礎をなすバイオテクノロジー合成法の速やかな実施可能性にとって決定的な特性の全体、特に、生物剤に対する有機相の毒性および有機抽出剤への化合物の吸収が、総収率またはより速やかな反応進行または、連続法において、とりわけ、少なくとも１つの正電荷を有する有機化合物が生物剤の触媒活性の関与下で合成される合成法の産物または中間産物である場合、当該生物剤のできるだけ長期的な使用可能性という点から見て、最適化された方法を見出すことである。
【００１０】
上記の課題およびその他の課題は、本出願の対象および特にまた添付の独立請求項の対象によって解決され、その際、従属請求項から一連の実施形態が判明する。
【００１１】
本発明の上記課題は、第１の態様において、１以上の正電荷を有する有機化合物を水溶液から取り出す方法であって、
ａ）当該有機化合物を含んだ水溶液と、液状陽イオン交換体を含有した疎水性有機溶液（ここで、当該液状陽イオン交換体は疎水性を有する）とを準備するステップと、
ｂ）当該水溶液と当該有機溶液とを接触させるステップと、
ｃ）当該有機溶液を当該水溶液から分離するステップと
を含み、当該有機化合物は式Ｉ
ＮＨ3+−Ａ−ＣＯＯＲ1  （Ｉ）
［式中、
Ｒ1は、水素、メチル基、エチル基または１つの負電荷であり、
Ａは、少なくとも３個、好ましくは少なくとも８個の炭素原子を有する非置換直鎖アルキレン基である］の化合物であり、当該液状陽イオン交換体は脂肪酸である方法によって解決される。
【００１２】
上記第１の態様の第一の実施形態において、上記問題は請求項１に記載の方法によって解決され、その際、ステップｂ）の温度は２８〜７０℃、好ましくは３０〜３７℃である。
【００１３】
上記第１の態様の上記第一の実施形態の１実施形態でもある第二の実施形態において、上記問題は請求項１〜２のいずれか１項に記載の方法によって解決され、その際、ステップｂ）のｐＨ値は６〜８、好ましくは６．２〜７．２である。
【００１４】
上記第１の態様の上記第一〜第二の実施形態の１実施形態でもある第三の実施形態において、上記問題は、液状陽イオン交換体の有機化合物に対する物質量比が少なくとも１である方法によって解決される。
【００１５】
上記第１の態様の上記第一〜第三の実施形態の１実施形態でもある第三の実施形態において、上記問題は、有機溶液の水溶液に対する容量比が１：１０〜１０：１である方法によって解決される。
【００１６】
上記第１の態様の上記第一〜第三の実施形態の１実施形態でもある第四の実施形態において、上記問題は、当該液状陽イオン交換体が、１２個を上回る数、好ましくは１４〜２２個、より好ましくは１６〜１８個の炭素原子を有する脂肪酸である方法によって解決される。
【００１７】
上記第１の態様の上記第一〜第四の実施形態の１実施形態でもある第五の実施形態において、上記問題は、当該液状陽イオン交換体は不飽和脂肪酸、好ましくはオレイン酸またはエルカ酸である方法によって解決される。
【００１８】
上記第１の態様の上記第一〜第五の実施形態の１実施形態でもある第六の実施形態において、上記問題は、当該水溶液がさらに触媒活性を有する生物剤を含有している方法によって解決される。
【００１９】
上記第１の態様の上記第一〜第六の実施形態の１実施形態でもある第七の実施形態において、上記問題は、当該生物剤が細胞、好ましくは細菌細胞であり、該細胞は、より好ましくは、組み換えアルカンモノオキシゲナーゼ、組み換えトランスアミナーゼならびに、好ましくはさらに加えて、アルコール脱水素酵素、アラニン脱水素酵素およびＡｌｋＬ遺伝子産物またはその変異体を含む群からの少なくとも１の酵素を有している方法によって解決される。
【００２０】
上記第１の態様の上記第一〜第七の実施形態の１実施形態でもある第八の実施形態において、上記問題は、当該有機化合物の存在は、好ましくは、当該有機化合物が上記細胞にとって毒性を有する化合物であることにより、当該触媒活性に不適な作用をもたらす方法によって解決される。
【００２１】
上記第１の態様の上記第一〜第八の実施形態の１実施形態でもある第九の実施形態において、上記問題は、当該有機溶液が、さらに、少なくとも１の有機溶媒、好ましくは脂肪酸および／または脂肪酸エステルを含んでいる方法によって解決される。
【００２２】
上記第１の態様の上記第一〜第九の実施形態の１実施形態でもある第十の実施形態において、上記問題は、当該有機溶液が、液状陽イオン交換体として２０〜８０容量％、好ましくは２５〜７５容量％のオレイン酸および、溶媒としてラウリン酸メチルエステルを含有し、当該有機化合物は１２−アミノラウリン酸メチルエステルであり、かつ、当該水溶液中に、組み換えアルカンモノオキシゲナーゼ、組み換えトランスアミナーゼならびに、好ましくはさらに加えて、アルコール脱水素酵素、アラニン脱水素酵素およびＡｌｋＬ遺伝子産物またはその変異体を含む群からの少なくとも１の酵素を有する細菌細胞が存在している方法によって解決される。
【００２３】
第２の態様において、本発明が解決しようとする問題は、水溶液と疎水性有機溶液（ここで、
当該疎水性有機溶液は、液状陽イオン交換体として脂肪酸、好ましくは１２個を上回る数の炭素原子を有する脂肪酸、より好ましくは不飽和脂肪酸を含有し、
当該水溶液は、式（Ｉ）
ＮＨ3+−Ａ−ＣＯＯＲ1  （Ｉ）
［式中、
Ｒ1は、水素、メチル基、エチル基または１つの負電荷であり、
Ａは、少なくとも３個、好ましくは少なくとも８個の炭素原子を有する非置換直鎖アルキレン基である］の化合物である）とを含有した反応混合物によって解決される。
【００２４】
上記第２の態様の１実施形態において、本発明が解決しようとする問題は、上記第１の態様に記載した反応混合物（ここで、当該水溶液は、さらに、組み換えアルカンモノオキシゲナーゼ、組み換えトランスアミナーゼならびに、好ましくはさらに加えて、アルコール脱水素酵素、アラニン脱水素酵素およびＡｌｋＬ遺伝子産物またはその変異体を含む群からの少なくとも１の酵素を有する細菌細胞を含有している）によって解決される。
【００２５】
上記第２の態様のその他の実施形態は上記第１の態様のすべての実施形態を包含している。
【００２６】
本発明が解決しようとする課題は、第４の態様において、１以上の正電荷を有する有機化合物を水溶液から取り出す方法であって、
ａ）当該有機化合物を含んだ水溶液と、液状陽イオン交換体を含有した疎水性有機溶液（ここで、当該液状陽イオン交換体は疎水性を有し、かつ、当該液状陽イオン交換体は１以上の負電荷および全負電荷を有する）とを準備するステップと、
ｂ）当該水溶液と当該有機溶液とを接触させるステップと、
ｃ）当該有機溶液を当該水溶液から分離するステップと
を含んでなる方法によって解決される。
【００２７】
本発明の上記第一の実施形態の１実施形態でもある、本発明の上記第４の態様の第二の実施形態において、上記方法は、
ｄ）好ましくは当該有機化合物をさらに別の水溶液に逆抽出することにより、当該有機溶液を再生するステップ
を含んでいる。
【００２８】
本発明の上記第一〜第二の実施形態の１実施形態でもある、本発明の第４の態様の第三の実施形態において、本発明による方法のステップｂ）の温度は２８〜７０℃、好ましくは３０〜３７℃である。
【００２９】
本発明の上記第一〜第三の実施形態の１実施形態でもある、本発明の第４の態様の第四の実施形態において、本発明による方法のステップｂ）のｐＨ値は３〜８、好ましくは６〜８、特に好ましくは６．２〜７．２である。
【００３０】
本発明の上記第一〜第四の実施形態の１実施形態でもある、本発明の第４の態様の第五の実施形態において、本発明による方法における液状陽イオン交換体の有機化合物に対する物質量比は少なくとも１である。
【００３１】
本発明の上記第一〜第五の実施形態の１実施形態でもある、本発明の第４の態様の第六の実施形態において、有機溶液の水溶液に対する容量比は１：１０〜１０：１である。
【００３２】
本発明の上記第一〜第六の実施形態の１実施形態でもある、本発明の第４の態様の第七の実施形態において、当該有機化合物は、式（Ｉ）
−Ｎ+Ｒ2Ｒ3Ｒ4  （Ｉ）
［式中、
Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、互いに独立して、水素、メチル基、エチル基、プロピル基、２−プロピル基、ブチル基、ｔ−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ベンジル基、ヒドロキシル基、置換または非置換および／または直鎖または分枝または環状アルキル基またはアルケニル基からなる群から選択されている］の少なくとも１つの正電荷を帯びた置換基を有するかまたは、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4からなる群のうちの少なくともいずれか１置換基が水素である限り、非プロトン化された形のそれを有する。
【００３３】
本発明の上記第一〜第七の実施形態の１実施形態でもある、本発明の第４の態様の第八の実施形態において、当該有機化合物は、式（ＩＩ）
Ｚ−Ａ−Ｎ+Ｒ2Ｒ3Ｒ4  （ＩＩ）
［式中、
Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、互いに独立して、水素、メチル基、エチル基、プロピル基、２−プロピル基、ブチル基、ｔ−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ベンジル基、ヒドロキシル基、置換または非置換および／または直鎖または分枝または環状アルキル基またはアルケニル基からなる群から選択されており、
Ａは、少なくとも３個の炭素原子を含んだ炭化水素鎖、好ましくは非置換アルケニル基を表し、
Ｚは、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯＲ5、−ＣＯＨ、−ＣＨ2ＯＨおよび非プロトン化されたそれら（ここでＲ5は、水素、メチル基、エチル基、プロピル基、２−プロピル基、ブチル基、ｔ−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ベンジル基、ヒドロキシル基、置換または非置換および／または直鎖または分枝または環状アルキル基またはアルケニル基からなる群から選択されている）からなる群から選択されている］を有するかまたは、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4からなる群のうちの少なくとも１の置換基が水素である限り、非プロトン化された形のそれを有する。
【００３４】
本発明の上記第一〜第八の実施形態の１実施形態でもある、本発明の第４の態様の第九の実施形態において、当該有機化合物は、式（ＩＩＩ）
ＮＨ3+−Ａ−ＣＯＯＲ1  （ＩＩＩ）
［式中、
Ｒ1は、水素、メチル基、またはエチル基であり、
Ａは、少なくとも３個の炭素原子を有する非置換直鎖アルキレン基である］を有するか、または非プロトン化された形のそれを有する。
【００３５】
本発明の上記第一〜第九の実施形態の１実施形態でもある、本発明の第４の態様の第十の実施形態において、当該液状陽イオン交換体は、少なくとも６個の炭素原子を有する少なくとも１のアルキル基またはアルケニル基ならびに、−ＣＯＯＨ、−ＯＳＯ2Ｈ、−ＯＰＯ（ＯＨ）2−および−ＯＰＯ（ＯＨ）Ｏ−および非プロトン化されたそれらからなる群のうちのいずれかの末端置換基を有している。
【００３６】
本発明の上記第一〜第十の実施形態の１実施形態でもある、本発明の第４の態様の第十一の実施形態において、当該液状陽イオン交換体は、不飽和脂肪酸、好ましくはオレイン酸である。
【００３７】
本発明の上記第一〜第十一の実施形態の１実施形態でもある、本発明の第４の態様の第十二の実施形態において、当該水溶液は、さらに、触媒活性を有する生物剤を含有している。
【００３８】
本発明の上記第一〜第十二の実施形態の１実施形態でもある、本発明の第４の態様の第十三の実施形態において、当該生物剤は細胞、好ましくは細菌細胞である。
【００３９】
本発明の上記第一〜第十三の実施形態の１実施形態でもある、本発明の第４の態様の第十四の実施形態において、当該有機化合物の存在は上記触媒活性に不適に作用する。
【００４０】
本発明の上記第一〜第十四の実施形態の１実施形態でもある、本発明の第４の態様の第十五の実施形態において、当該有機溶液は、さらに、少なくとも１の有機溶媒、好ましくは脂肪酸および／または脂肪酸エステルを含有している。
【００４１】
本発明の上記第一〜第十五の実施形態の１実施形態でもある、本発明の第４の態様の第十六の実施形態において、当該有機溶液は、液状陽イオン交換体として２０〜８０容量％、好ましくは２５〜７５容量％のオレイン酸を、溶媒としてラウリン酸メチルエステルを含有し、当該有機化合物は１２−アミノラウリン酸メチルエステルであり、当該水溶液中には１２−アミノラウリン酸メチルエステルの合成に係わる触媒活性を有する細菌細胞が存在している。
【００４２】
第５の態様において、本発明が解決しようとする課題は、水溶液と、生物剤と、液状陽イオン交換体を含有した疎水性有機溶液とを含んだバイオリアクターによって解決される。本発明の好ましい実施形態において、本願明細書に使用される"バイオリアクター"なる用語は、同所においてバイオテクノロジー法によって使用可能な微生物が制御された条件下で培養されおよび／または同所において当該微生物がバイオテクノロジー法（好ましくは有機化合物の合成）に使用可能な任意の容器として理解される。
【００４３】
本発明の上記第３の態様の上記第一の実施形態の１実施形態でもある、上記第５の態様の第二の実施形態において、当該液状陽イオン交換体は脂肪酸、好ましくはオレイン酸である。
【００４４】
本発明の上記第３の態様の上記第一〜第二の実施形態の１実施形態でもある、上記第５の態様の第三の実施形態において、当該疎水性有機溶液は、さらに、脂肪酸エステル、好ましくはラウリン酸メチルエステルを含有している。
【００４５】
本発明の上記第２の態様の第一〜第三の実施形態の１実施形態でもある、上記第５の態様の第四の実施形態において、当該疎水性有機溶液は、陽イオン交換体としてオレイン酸を、溶媒として２５〜７５容量％のラウリン酸メチルエステルを含有している。
【００４６】
本発明の上記第５の態様の第一〜第四の実施形態の１実施形態でもある、第五の実施形態において、当該有機化合物は本発明の上記第１の態様の一連の実施形態のいずれか１つに記載の化合物である。
【００４７】
第６の態様において、本発明が解決しようとする課題は、１以上の正電荷を有する有機化合物（ここで、当該有機化合物は、当該有機化合物の合成に関与する細胞、好ましくは、当該合成の少なくとも１ステップを触媒する細胞を、液状陽イオン交換体および場合により有機溶媒を含有する疎水性有機溶液の存在において、水溶液中で培養することを含め、当該細胞に対して毒性を有する）の製造方法によって解決される。
【００４８】
本発明の第６の態様の第二の実施形態において、当該有機化合物は１２−アミノラウリン酸または同メチルエステルであり、当該有機溶媒はラウリン酸メチルエステルである。
【００４９】
上記第４、第５および第６の態様のその他の実施形態は、本発明の上記第１および第２の態様のすべての実施形態を含んでいる。
【００５０】
本発明の発明者らは、１以上の正電荷を有する有機化合物を水溶液から取り出して疎水性有機溶液中にもたらす効率は、この有機溶液が液状陽イオン交換体を含有していれば、驚異的に高められるとのことを見出した。なんらの理論に依拠することもなく、本発明の発明者らは、液状陽イオン交換体の負電荷（単数／複数）は当該有機化合物の正電荷（単数／複数）とイオン性相互作用を行い、この相互作用によって、有機相での溶解性を高める少なくとも１つの正電荷がマスキングされることになると推定している。
【００５１】
好ましい実施形態において、本願明細書に使用される"液状陽イオン交換体"なる用語は、疎水性有機溶媒に可溶であって、１以上の永久負電荷を有することにより少なくとも１つの陽イオンとイオン性相互作用可能な化合物を意味している。一般に、液状陽イオン交換体は、直鎖状または分枝していてよい少なくとも１つの飽和または不飽和炭化水素鎖ならびに、負電荷を帯びた基たとえばカルボキシ基を含んでいる。好ましい実施形態において、当該液状イオン交換体は脂肪酸であり、より好ましい実施形態においては、不飽和脂肪酸たとえばオレイン酸である。好ましい実施形態において、当該液状イオン交換体はジ（２−エチルヘキシル）リン酸（ＤＥＨＰＡまたはＤ２ＥＨＰＡとも称される）である。
【００５２】
好ましい実施形態において、当該液状イオン交換体は全負電荷を有しているだけでなく、正電荷をまったく有していない。好ましい実施形態において、本願明細書に使用される、当該イオン交換体またはその他の分子の"全電荷"なる用語は、当該分子と共有結合しているすべての官能基の電荷の総和として理解されることとする。たとえば、ラウリン酸はｐＨ７にて、当該水溶液中に存在しているその他の分子または反対イオンたとえばカリウムイオンの存在にかかわりなく、全電荷として１つの負電荷を有している。
【００５３】
本発明の好ましい実施形態において、本願明細書に使用される"接触"なる用語は、２つの相が直接に、特に、物理的バリアたとえば膜などが中間介在することなく、互いに直に曝露されることとして理解される。こうした接触は、最も簡単なケースでは、双方の相が同一の容器に入れられ、適切な方法たとえば攪拌によって混合されることによって行われる。
【００５４】
好ましい実施形態において、当該有機化合物は、全正電荷を有している。さらに別の好ましい実施形態において、当該有機化合物は、負電荷をまったく有していない。好ましい実施形態において、当該有機化合物はω−アミノカルボン酸である。
【００５５】
好ましい実施形態において、本願明細書に使用される"電荷を有する"なる用語は、そのように称される化合物が水溶液中で、ｐＨ０〜１４、好ましくは２〜１２、２〜６、８〜１２、３〜１０、６〜８、最も好ましくはｐＨ７にて、当該電荷を有することを意味している。好ましい実施形態において、これは永久電荷である。さらに別の好ましい実施形態において、本願明細書に使用される"電荷を有する"なる用語は、当該官能基または化合物がｐＨ７にて圧倒的に、つまり、少なくとも５０％、好ましくは９０％、より好ましくは９９％が当該電荷を有して存在していることを意味している。
【００５６】
本発明の好ましい実施形態において、"含んでいる（ｅｎｔｈａｌｔｅｎｄ）"なる用語は"含有している（ｕｍｆａｓｓｅｎｄ）"の趣旨で理解されなければならず、つまり、非限定的に理解されなければならない。この意味で、Ａを含んだ混合物とは、Ａ以外にその他の成分を有していてもよい。"１以上の電荷"なる表現は、当該性質の少なくとも１の電荷ということを意味している。
【００５７】
好ましい実施形態において、本願明細書に使用される"疎水性"なる用語は、水相の存在において明瞭な境界をなして水相から区分される固有の液相を形成する液体の性質として理解される。後者は、一体液相またはエマルジョンであってよい。さらに別の好ましい実施形態において、本願明細書に使用される"疎水性"なる用語によって、基本的に水に不溶という化合物の性質が理解される。最後に、本願明細書に使用されるこの用語は、さらに別の好ましい実施形態において、このように称される化合物がＰ値（Ｊ．Ｓａｎｇｓｔｅｒ，  Ｏｃｔａｎｏｌ−Ｗａｔｅｒ  Ｐａｒｔｉｔｉｏｎ  Ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｓ：  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  Ｖｏｌ．２  ｏｆ  Ｗｉｌｅｙ  Ｓｅｒｉｅｓ  ｉｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ，  １９９７）を有し、その常用対数が０を上回り、好ましくは０．５を上回り、より好ましくは１を上回り、最も好ましくは２を上回っていることとして理解される。
【００５８】
本発明のさらに別の実施形態において、当該液状イオン交換体は、バイオテクノロジー上重要な微生物に対してなんらの毒性作用も有していないかまたは中度の毒性作用を有しているだけである。本願明細書に使用される"毒性作用"なる用語は、本発明の好ましい実施形態において、当該微生物との接触時にそれらの増殖速度を低下させ、それらの代謝活性を低下させ、それらのエネルギー消費を増加させ、それらの光学密度または生存細胞の数を低下させおよび／または直接にそれらの死滅および溶解を結果する化合物の性質として理解される。好ましい実施形態において、毒性化合物が有する上記作用の少なくともいずれか１つは、低濃度で、好ましくは１０００ｍｇ／Ｌの濃度で、好ましくは１００、より好ましくは５０または２５、最も好ましくは５ｍｇ／Ｌの濃度ですでに達成される。当業者には、毒性の調査に用いることのできる数多くの日常的に使用可能な方法が知られている。こうした方法に数え入れられるのは、たとえば、Ｏ2電極を介した当該微生物の呼吸測定あるいは微生物試料の比較プレーティングとそれに続くコロニー形成単位（ｃｆｕ）のカウントである。好ましい実施形態において、"中度の毒性作用"とは、増殖相にある微生物が当該化合物の存在において増殖し続けおよび／または代謝活性を有するが、その程度は同一条件下で当該化合物の不在において培養される対照群の場合よりも低度でありおよび／またはＬａｇ相が延長することとして理解される。
【００５９】
水相と有機相との接触は、適切な条件下で、特に、当該有機化合物が水相から有機相へ移動するのに十分な期間にわたって、理想的には、まさしく当該平衡が生ずるのに十分な期間にわたって生ずる。当業者は、こうした期間および条件を、日常的な実験の範囲で決定することができる。
【００６０】
特に好ましい実施形態において、１以上の正電荷を有する有機化合物とは、末端位がアミノ化された脂肪酸、特に１２−アミノラウリン酸またはそのエステルまたは双方の化合物の混合物である。当業者は、脂肪酸のエステルは、エステラーゼ活性を含んだ生物系の存在において、部分的に相応した酸の形で存在可能であり、双方の化合物はこの点で、その限りにおいて、等価と見なすことができる旨認めるであろう。したがって、特に好ましい実施形態において、本願明細書で使用される脂肪酸または脂肪酸誘導体は、当該エステル、好ましくは当該メチルエステルを含み、またその逆も可能である。
【００６１】
特に好ましい実施形態において、本願明細書に使用される"アルキレン基"なる用語は、式−（ＣＨ2）n−の基、つまり、２個の未定の、好ましくは末端置換基を有するアルカンである。これらの２個の置換基は、たとえば、アミン基およびカルボキシ基であってよい。好ましい実施形態において、ｎは、少なくとも３、より好ましくは少なくとも６、さらに好ましくは１１である。"置換アルキレン鎖"の場合、少なくとも１個の水素原子は、水素原子以外の置換基またはアルキル基、好ましくは、水素原子以外の原子によって置換されている。他方、特別な実施形態において、本願明細書に使用される"非置換アルキレン基"なる用語は、この種の置換基を持たない式−（ＣＨ2）n−の炭化水素鎖を意味している。
【００６２】
ステップｂ）の温度は、当該液状陽イオン交換体の性質に依存しているだけでなく、特に、当該水溶液と有機溶液との接触が水相中での反応進行時に生ずる場合には、水相中で生ずる当該反応の温度要件にも依存している。特に、生物剤たとえば生細胞が水相中で触媒活性を有している場合には、温度はこの活性の維持に適していなければならない。好ましい実施形態において、ステップｂ）の温度は、０〜１００℃、好ましくは２０〜８０℃、２８〜７０℃、３０〜３７℃、３５〜４０℃である。
【００６３】
ステップｂ）のｐＨ値も、同時に進行する反応があればそれらの反応の要件、反応体、生成物、中間生成物または試剤の安定性を考慮に入れなければならない。好ましい実施形態において、当該ｐＨ値は、３〜８、好ましくは６〜８、より好ましくは６．２〜７．２である。
【００６４】
当該有機化合物を水相からできるだけ完全に有機相に移動させるには、十分な量の当該液状陽イオン交換体が必要である。本発明の好ましい実施形態において、液状陽イオン交換体の有機化合物に対する物質量比は、少なくとも１つのステップにつき、連続的プロセスの場合には反応の全経過にわたって積算して、少なくとも１であり、換言すれば、当該有機化合物の１分子当たり、液状陽イオン交換体の少なくとも１分子が使用される。より好ましい実施形態において、この比は、２、３、５、１０、１５または２０を上回っており、好ましくは１．５〜３である。
【００６５】
当該有機溶液の水溶液に対する容量比は、陽イオン交換体／有機化合物の物質量比と共に、効率的な方法にとって重要である。特に好ましい実施形態において、これは、１００：１〜１：１００、より好ましくは２０：１〜１：２０、さらに好ましくは１０：１〜１：１０、４：１〜１：４、３：１〜１：３または最も好ましくは１：２〜２：１である。
【００６６】
本発明の好ましい実施形態において、脂肪酸は液状陽イオン交換体として使用される。本発明の好ましい実施形態において、本願明細書に使用される"脂肪酸"なる用語は、少なくとも６個、好ましくは８個、より好ましくは１０個、最も好ましくは１２個の炭素原子を有するカルボン酸、好ましくはアルカン酸として理解される。好ましい実施形態において、それは直鎖脂肪酸であり、さらに別の実施形態において、それは分枝脂肪酸である。好ましい実施形態において、それは飽和脂肪酸である。特に好ましい実施形態において、それは不飽和脂肪酸である。さらに別の好ましい実施形態において、それは少なくとも１２個の炭素原子を有する、好ましくは第９位に二重結合を含んだ直鎖脂肪酸である。さらに別の好ましい実施形態において、それは第９位および／または第１１位に二重結合が位置する一価不飽和脂肪酸である。さらに別の好ましい実施形態において、液状陽イオン交換体は、オレイン酸、パルミトレイン酸およびガドレイン酸およびイコセン酸からなる群から選択された不飽和脂肪酸である。好ましい実施形態において、それは、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個の炭素原子、好ましくは１２個を上回る数の炭素原子、より好ましくは１４個以上の数の炭素原子、より好ましくは１４〜２８、１４〜２２個の炭素原子、最も好ましくは１６〜１８個の炭素原子を有する脂肪酸である。
【００６７】
さらに別の好ましい実施形態において、液状イオン交換体として、たとえば大豆油またはヒゴタイ油の形で存在しているさまざまな脂肪酸の混合物が使用される。これは必要に応じ、当該脂肪酸がエステルとして存在していれば、事前の加水分解を含んでいる。
【００６８】
本発明の特に好ましい実施形態において、２つの液状陽イオン交換体（好ましくはそのうち少なくとも一方は脂肪酸である）の組み合わせが使用される。
【００６９】
本発明の特別な利点は、本発明による方法とバイオテクノロジー法ならびにその際に使用される生物剤との適合性にある。本発明の特に好ましい実施形態において、本願明細書に使用される"触媒活性を有する生物剤"なる用語は、細胞によって合成された、全細胞から、単離された分子までに及ぶ、あらゆる精製レベルにおける生体触媒として理解される。好ましい実施形態において、それは触媒活性を有する酵素発現細胞である。この細胞は、始原菌を含んだ原核生物または、好ましくはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍおよびＥ．ｃｏｌｉからなる群のうちのいずれかの真核生物であってよい。より好ましい実施形態において、当該生物剤はバクテリア細胞であり、より好ましくはグラム陰性バクテリア細胞であり、最も好ましくはＥ．ｃｏｌｉである。さらに別の好ましい実施形態において、それは真核細胞、より好ましくは真菌細胞、さらに好ましくは酵母細胞、最も好ましくはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓまたはＣａｎｄｉｄａ、Ｐｉｃｈｉａ、とくにＣａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓである。特別な実施形態における"細胞"なる用語は、本出願において、用語"微生物"なる用語と同一の意味であって、交換可能な概念として使用される。さらに、細胞とは、単離された細胞または培養体の混合物であってよい。
【００７０】
生物剤として使用される細胞は生存細胞であってよく、またはその調剤たとえば膜画分または細胞画分または粗細胞抽出物であってよい。
【００７１】
当該生物剤がさまざまな精製レベルの単離分子である場合には、それは１つの細胞から製造された触媒活性を有するあらゆる分子であってよい。特に好ましい実施形態において、それは、ペプチド、ポリペプチド、炭水化物、核酸またはそれらの混合体からなる群のうちのいずれかの分子である。より好ましい実施形態において、それは触媒作用を有するポリペプチドである。さらに別の好ましい実施形態において、それは固定化された分子である。
【００７２】
バイオテクノロジー合成法に必要とされる触媒機能は多様である。好ましい実施形態において、本願明細書に使用される"触媒活性"なる用語は合成活性のことであり、つまり、少なくとも１つの新たな共有結合の形成を含んだ化学反応の触媒を意味している。さらに別の好ましい実施形態において、それは輸送活性のことであり、つまり、分子輸送能力であって、他の分子を１つの区画から他の区画への輸送を実施すること、たとえば、物質を水性溶媒から細胞膜を経て細胞内部に取り込むことを意味している。
【００７３】
特に好ましい実施形態において、生物剤は、当該液状陽イオン交換体の存在において触媒作用のために使用される生細胞、好ましくは、続いてまたは同時に当該液状イオン交換体によって疎水性有機相に取り出される１以上の正電荷を有する有機化合物を合成するために使用される生細胞である。
【００７４】
特に好ましい実施形態において、当該有機化合物の存在は触媒活性に不適に作用する。一実施形態において、これは存在する活性量を減少させることがあり、これは酵素のｋcatの低下として表すことができる。さらに別の実施形態において、触媒活性を有する生物剤の（酵素のＫMの高まりとしての）親和性が損なわれることがある。さらに別の実施形態において、たとえば、好ましくは所望の基質分子以外の分子を転換または好ましくは反応させることにより、触媒活性の特異性が変化することがある。さらに別の実施形態において、当該有機化合物は生物剤としての細胞に対して毒性作用を有している。
【００７５】
さらに別の実施形態において、当該有機化合物は、不可欠なＣｏ基質またはＣｏ酵素の利用率を低下させる有機化合物である。これは、たとえば、当該有機化合物が当該再生反応を阻止する場合がそうである。
【００７６】
当該疎水性有機相は、当該液状陽イオン交換体のほかに、さらに、疎水性溶媒を含んでいてよい。これは、疎水相における液状陽イオン交換体の吸収能を高め、望ましくない挙動たとえば凝降を阻止するのに有用である。好ましい実施形態において、当該溶媒は水溶液中で進行する反応の反応物、極めて好ましくは、水溶液中で進行する酵素触媒反応の基質である。好ましい実施形態において、それは脂肪酸エステルである。特に好ましい実施形態において、当該溶媒は脂肪酸エステル、好ましくは、液状陽イオン交換体として機能する脂肪酸のメチルエステルである。
【００７７】
それが存在する場合の、疎水性有機相に占める当該溶媒の割合は、好ましい実施形態において、１〜９９容量パーセント（Ｖｏｌ．−％）である。好ましい実施形態において、当該溶媒の割合は、１０〜９０、より好ましくは２０〜８０、最も好ましくは２５〜７５容量％である。
【００７８】
本方法の好ましい実施形態において、当該有機化合物は、ドイツ特許第１０２００７１００６０７０５号に開示されているような、組み換えＥ．ｃｏｌｉ株の水相中でラウリン酸メチルエステルの末端位炭素原子の段階的な酸化によって製造される１２−アミノラウリン酸および／または１２−アミノラウリン酸メチルエステルであり、疎水相は、反応の基質としてのラウリン酸メチルエステルに溶解された液状陽イオン交換体としての２５〜７５％のオレイン酸を含有している。
【００７９】
本発明の技術思想は、本願明細書に開示された生体高分子の正確なアミノ酸配列または核散配列の使用下で実施可能であるだけでなく、１個以上のアミノ酸または核酸の欠失、付加または置換によって得られるこの種の高分子の変異体の使用下でも実施可能である。好ましい実施形態において、本願明細書に使用される核酸配列またはアミノ酸配列の"変異体"なる用語（これは以下、"同族体"なる用語と同一の意味であって、それと交換可能な用語として使用可能である）は、当該の元来の野生型の核酸配列またはアミノ酸配列の点で、本願明細書において同一性と同じ意味で使用される、７０、７５、８０、８５、９０、９２、９４、９６、９８、９９％またはそれ以上の相同性を有する別の核酸配列またはアミノ酸配列を意味しており、この場合、好ましくは、触媒活性中心を形成するアミノ酸以外または構造もしくは畳み込みに不可欠なアミノ酸以外のアミノ酸は欠失しているかまたは置換されておりあるいは後者は単に保守的に、たとえば、アスパラギン酸塩に代えてグルタミン酸塩またはバリンに代えてロイシンのように、置換されているにすぎない。従来の技術は、２つの配列の相同性の程度の計算に使用可能なアルゴリズムを述べている。たとえば、Ａｒｔｈｕｒ  Ｌｅｓｋ  （２００８），  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，  ３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ。本発明のさらに別の好ましい実施形態において、アミノ酸配列または核酸配列の変異体は、好ましくは、上述した配列相同性に加えて、基本的に同一の、野生型分子ないし元来の分子の酵素活性を有している。たとえば、プロテアーゼとして酵素活性を有するポリペプチドの変異体はポリペプチド酵素と同一のまたは基本的に同一のタンパク質分解活性、つまり、ペプチド結合の加水分解を触媒する能力を有している。好ましい実施形態において、"基本的に同一の酵素活性"なる用語は、野生型ポリペプチドの基質の点で、バックグラウンド活性を顕著に上回る活性または／および、野生型ポリペプチドが同一の基質に関して有するＫM値および／またはｋcat値との相違が３桁を下回る、好ましくは２桁を下回る、より好ましくは１桁を下回る活性を意味している。さらに別の好ましい実施形態において、核酸配列またはアミノ酸配列の"変異体"なる用語は、当該核酸配列またはアミノ酸配列の１活性部分またはフラグメントを含んでいる。さらに別の好ましい実施形態において、本願明細書に使用される"活性部分"なる用語は、当該アミノ酸配列の全長よりも短い長さを有するアミノ酸配列または核酸配列ないし当該アミノ酸配列の全長よりも短い長さをコードするアミノ酸配列または核酸配列を意味し、この場合、当該野生型アミノ酸配列よりも短い長さを有するアミノ酸配列またはコードされたアミノ酸配列は野生型ポリペプチドまたはその変異体と同じ、たとえばアルコール脱水素酵素、モノオキシゲナーゼまたはトランスアミナーゼとしての酵素活性を有している。特別な実施形態において、核酸の"変異体"なる用語は、その相補的鎖状分子が、好ましくは厳密な条件下で、野生型核酸に結合する核酸を含んでいる。ハイブリダイゼーション反応の厳密性は当業者によって容易に決定可能であり、それは一般にプローブの長さ、洗浄時の温度および塩濃度に依存している。一般に、より長いプローブはハイブリダイゼーションにより高い温度を要するが、短いプローブは低い温度で十分である。ハイブリダイゼーションが生ずるか否かは、一般に、変性したＤＮＡがその周囲に存在する相補的鎖状分子に、しかも溶融温度以下で、環付加し得る能力に依存している。ハイブリダイゼーション反応の厳密性と当該条件は、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  １９９５により詳細に述べられている。好ましい実施形態において、本願明細書に使用される核酸の"変異体"なる用語は、元来の核酸と同じアミノ酸配列またはこのアミノ酸配列の変異体を遺伝コードの縮重の範囲内でコードする任意の核酸配列を含んでいる。
【００８０】
式（Ｉ）の有機化合物の製造に使用可能な適切なポリペプチド、特に、アルカンモノオキシゲナーゼ、ＡｌｋＬ、トランスアミナーゼ、アルデヒド・デヒドロゲナーゼおよびアラニン脱水素酵素は従来の技術、たとえば、ドイツ特許第１０２００７１００６０７０５号、欧州特許第１１００４０２９号またはＰＣＴ／ＥＰ２０１１／０５３８３４号に述べられている。
【００８１】
最も好ましい実施形態において、アルカンモノオキシゲナーゼはＡｌｋＢ型のアルカンモノオキシゲナーゼである。ＡｌｋＢは、その水酸化酵素活性によって知られている、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａに由来するＡｌｋＢＧＴ系の酸化還元酵素を表している。これはさらに２つのポリペプチド、ＡｌｋＧおよびＡｌｋＴに依存している。ＡｌｋＴは、電子をＮＡＤＨからＡｌｋＧに転送するＦＡＤ依存性ルブレドキシン還元酵素として特徴づけられる。ＡｌｋＧはルブレドキシンであり、ＡｌｋＢの直接の電子供与体として機能する鉄含有酸化還元タンパク質である。好ましい実施形態において、本願明細書に使用される"ａｌｋＢ型のアルカンモノオキシゲナーゼ"なる用語は、膜結合型アルカンモノオキシダーゼとして理解される。さらに別の好ましい実施形態において、"ａｌｋＢ型のアルカンモノオキシゲナーゼ"なる同じ用語は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  Ｇｐｏｌ（データバンク・コード：  ＣＡＢ５４０５０．１）のＡｌｋＢの配列と少なくとも（好ましくはより高いパーセンテージにて）７５、８０、８５、９０、９２、９４、９６、９８または９９％の配列相同性を有するポリペプチドとして理解される。さらに別の好ましい実施形態において、同じ用語は、シトクロム非依存性モノオキシゲナーゼとして理解される。さらに別の好ましい実施形態において、"ａｌｋＢ型のアルカンモノオキシゲナーゼ"５なる用語は、少なくとも１つのルブレドキシンまたは同族体を電子供与体として使用するシトクロム非依存性モノオキシゲナーゼとして理解される。特に好ましい実施形態において、同じ用語は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ＧｐｏｌのＡｌｋＢの配列と少なくとも（好ましくはより高いパーセンテージにて）６０、７０、８０、８５、９０、９２、９４、９６、９８または９９％の配列相同性を有し、電子供与体として少なくともＡｌｋＧ（ＣＡＢ５４０５２．１）、ただし、好ましくはＡｌｋＧと還元酵素ＡｌｋＴ（ＣＡＢ５４０６３．１）との組み合わせ（ここで、ａｌｋＧおよび／またはａｌｋＴはそれぞれのポリペプチドの同族体であってもよい）を必要とする膜結合型シトクロム非依存性アルカンモノオキシゲナーゼとして理解される。本願明細書に使用される"配列"なる用語は、ポリペプチドのアミノ酸配列および／またはそれをコードする核酸配列を基礎としていてよい。さらに別の好ましい実施形態において、本願明細書に使用される"ａｌｋＢ型のアルカンモノオキシゲナーゼ"は、シトクロム非依存性酸化還元酵素、つまり、シトクロムを補因子として含まない酸化還元酵素である。
【００８２】
以下、本発明を、本発明のその他の特徴、実施形態、態様および利点を看取することのできる以下の図ならびに本発明を制限するものではない実施例によってさらに具体的に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】図１は、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０株を用いて検査し、陰性対照としてのリン酸カリウム緩衝液（Ｋｐｉ）と比較した、ＬＳＭＥが毒性作用を持たないことを証明するための対照実験を示した図である。
【図２】図２は、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０株の生存能力を、液状陽イオン交換体の不在下およびさまざまな液状陽イオン交換体の存在下において当該株が０時間後、４時間後および２４時間後に形成し得るｃｆｕの数の形で示した図である。
【図３】図３は、液状陽イオン交換体が毒性に及ぼす使用効果を、ＡＬＳＭＥ  ０．２％、アンモニアで標定したＤＥＨＰＡ（"Ｄ２ＥＨＰＮＨ３  ２％"）ないし、ＡＬＳＭＥ  ０．２％の存在におけるＤＥＨＰＡ／ＬＳＭＥ混合物の存在下におけるそれぞれのＥ．ｃｏｌｉ−Ｗ３１１０株の生存細胞数の変化によって示した図である。
【図４】図４は、さまざまな液状陽イオン交換体がアミノラウリン酸メチルエステル産生Ｅ．ｃｏｌｉ株のＯＴＲに及ぼす効果を示した図である。この実験は実施例４に述べたのと同様にして実施された。
【図５】図５は、さまざまな液状陽イオン交換体が、適切な遺伝子組み換えによるＥ．ｃｏｌｉ株の産生するアミノラウリン酸メチルエステルの収量に及ぼす影響を示した図である。この実験は実施例４に述べたのと同様にして実施された。
【００８４】
実施例１：液状陽イオン交換体と共に使用される溶媒ＬＳＭＥの毒性に関する検査
この試験によって、ＬＳＭＥを本発明による方法の適切な有機溶媒とする、バイオテクノロジー上重要な微生物に対するＬＳＭＥの相対的に僅かな毒性が明らかとなった。
【００８５】
ＣＦＵの決定を実施可能とする前に、プレートＬＢ（カゼイン由来のペプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  １０ｇ／Ｌ）にＥ．ｃｏｌｉ  ＢＷ３１１０を塗布して、２４時間培養を行った。その翌日の夕方に、先に塗布したこのプレートの予備培養体を接種した。この予備培養体は体積５０ｍＬのＬＢ培養基を有しており、一晩約１６時間にわたって培養された。翌日、０．２のＯＤ600を有するこの予備培養体を、２００ｍＬのＭ９培養基（Ｎａ２ＨＰＯ４  ６．７９ｇ／Ｌ；ＫＨ２ＰＯ４  ３．０ｇ／Ｌ；ＮａＣｌ  ０．５ｇ／Ｌ；ＮＨ４Ｃｌ  １ｇ／Ｌ；１ｍＬ／Ｌ微量元素溶液、ｐＨ７．４、微量元素溶液：ＨＣｌ  ３７％（＝４５５．８ｇ／Ｌ）３６．５０ｇ／Ｌ；ＭｎＣｌ２＊７Ｈ２Ｏ  １．９１ｇ／Ｌ；ＺｎＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ  １．８７ｇ／Ｌ；Ｎａ−ＥＤＴＡ＊２Ｈ２Ｏ（ＴｉｔｒｉｐｌｅｘＩＩＩ）０．８４ｇ／Ｌ；Ｈ３ＢＯ３  ０．３０ｇ／Ｌ；Ｎａ２ＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ  ０．２５ｇ／Ｌ；ＣａＣｌ２＊２Ｈ２Ｏ  ４．７０ｇ／Ｌ；ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ  １７．８０ｇ／Ｌ；ＣｕＣｌ２＊２Ｈ２Ｏ  ０．１５ｇ／Ｌ）中に、３％のグルコース（ｗ／ｖ）と共に接種し、約２０時間培養を行った。この主培養体の培養後に細胞を採取し、５２５８ｇで４℃にて１０分間遠心分離を行い、３０のＯＤ600にて、１０ｍｌの５０ｍＭ  Ｋｐi緩衝液、ｐＨ７．４（または、ＡＬＳＭＥによるＣＦＵ決定を実施した場合には、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．４）に再懸濁した。使用した双方の緩衝液は５％のグルコース（ｗ／ｖ）を含んでいた。続いて、このバクテリア懸濁液を振とうフラスコに移し、それぞれの物質溶液と混合した。フラスコの振とうによる十分な混合を行った後、１００μｌの懸濁液をピペットで取り出して、あらかじめ設けておいた滅菌塩水に加えた。これは時点ｔ0でのサンプリングに相当した。続いて、２５０Ｕｐｍ、３０℃にて、試料の培養を行った。ＣＦＵは２２時間にわたって調査された。サンプリングは、先ず、時点ｔ0、ｔ3、ｔ6およびｔ22に行った。少なからぬ試料につき、さらに別のサンプリング時点ｔ１．５を追加し、加えてさらに、誤差を最小化するため、さらに別の追加連続希釈プレーティングを行った。
【００８６】
ＯＤ600は６０であった。細胞は１０ｍｌのＫｐi緩衝液に再懸濁され、続いて、フラスコ中で５ｍＬのＬＳＭＥ  ９８％（ｗ／ｖ）と混合された。試料当たり１希釈レベルがプレーティングされた。ＣＦＵ数／ｍＬは６時間不変であった。２２時間後、単に３０．３％の生細胞数のパーセンテージ減退が記録されただけであった。
【００８７】
実施例２：バイオテクノロジー上重要な微生物に対するさまざまな液状陽イオン交換体の毒性に関する比較試験
この実施例は、その他の液状陽イオン交換体たとえばＤＥＨＰＡならびに分枝および非分枝飽和脂肪酸に比較した非分枝脂肪酸の低毒性を示している。
【００８８】
先ず、２０ｍｌのＬＢ培養基を含んだ予備培養体に、１００ｍｌ三角フラスコ中で、当該株の低温培養体を接種した。この培養体を一晩、３７℃、２００Ｕｐｍの振とうにて培養し、翌日、同じ主培養体を０．２のＯＤ上に接種するために使用した。この主培養体（それぞれ３０ｍＬのＬＢ培養基）を続いて同一条件下で培養続行した。ＯＤ０．４〜０．５にて、主培養体をそれぞれ同じ容量（３０ｍｌ）の溶媒で覆い、引き続き、培養続行した。
【００８９】
ｃｆｕ（ｃｏｌｏｎｙ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔｓまたはコロニー形成単位）の数を決定するため、以下の試験に際し、０．１ｍｌの試料を採取し、滅菌した０．９％ＮａＣｌ溶液で希釈した。適切な希釈レベルをＬＢ寒天プレートにプレーティングした。３４℃にて一晩培養した後、形成されたコロニーを正確にカウントして、ｃｆｕを決定した。
【００９０】
試験１：液状陽イオン交換体としてのＤＥ２ＨＰＡと飽和脂肪酸との毒性比較
それぞれＬＳＭＥに溶解され、ＡＬＳＭＥを等モルないし２５モル％含有した液状陽イオン交換体としての５０％ＤＥＨＰＡないしラウリン酸（１５％）を、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）株と接触させて、この株がコロニーを形成する能力に対するそれら双方の化合物の影響（ｃｆｕで表現）を検査した。予備試験において、ラウリン酸メチルエステル（これは電荷を欠いているために液状陽イオン交換体として機能不能である）は、使用された株によって十分に耐えられる旨、明らかにすることができた。
【００９１】
第１表：
【表１】
0005936627.tif 000002
【００９２】
双方の液状陽イオン交換体は、ＤＥＨＰＡに比較してラウリン酸使用時には、ｃｆｕの数を顕著に低下させるが、なお若干の生存細胞が存在しており、したがって、液状陽イオン交換体としては飽和脂肪酸の方が好ましい旨、明らかである。
【００９３】
試験２：液状イオン交換体としての分枝飽和脂肪酸とさまざまな量のオレイン酸との毒性比較
この場合、２つの異なった濃度のオレイン酸を使用し、相応した量のＬＳＭＥ（ラウリン酸メチルエステル）の添加によって量の適合化を行った。
【００９４】
第２表：
【表２】
0005936627.tif 000003
【００９５】
不飽和脂肪酸たるオレイン酸をＬＳＭＥと共に使用する際の生存細胞の数は、分枝飽和脂肪酸を使用する場合に比較して一貫して著しく高い旨、明らかである。
【００９６】
試験３：液状陽イオン交換体としての非分枝飽和脂肪酸と不飽和脂肪酸との毒性比較
この場合、さまざまな量の不飽和脂肪酸と不飽和脂肪酸とが、液状陽イオン交換体として使用される際の毒性の点で比較された。不飽和脂肪酸たるラウリン酸の溶解性が低いために、これは少量で使用された。さまざまな陽イオン交換体の容量はＬＳＭＥで一様化された。ｃｆｕの数は、当初時、４．５時間後および２４時間後に決定された。
【００９７】
図２から、液状陽イオン交換体としての飽和脂肪酸の添加は、たとえ不飽和脂肪酸の濃度より低濃度であっても、ｃｆｕの減少をもたらし、他方、不飽和脂肪酸の場合には、ｃｆｕの増加が認められる旨、看取することができる。
【００９８】
総じて、検査されたさまざまな液状陽イオン交換体の毒性の低下は、以下の順序：ＤＥＨＰＡ＞飽和脂肪酸＞不飽和脂肪酸であることが明らかである。
【００９９】
実施例３：液状陽イオン交換体との接触による、正電荷を有する有機化合物の毒性の低下
この試験は、液状陽イオン交換体の存在により、発酵培養液たる水相中での正電荷を帯びた有機化合物の毒性作用は、この化合物が有機相中に抽出されることによって、低下され得る旨、明らかにしている。
【０１００】
基本的な実験手順は実施例１の場合と同じであった。
【０１０１】
水系中に溶解されたＡＬＳＭＥ  ０．２％（ｗ／ｖ）は殺菌作用を有するために、この試験は、Ｄ２ＥＨＰＮＨ３／ＬＳＭＥ  ２／９８％（ｗ／ｗ）との組み合わせで、あらためて、振とうフラスコ中で実施されたが、Ｄ２ＥＨＰＮＨ３は定量的にアンモニアを含有するＤ２ＥＨＰＡであった。液状陽イオン交換体の使用により、有機相へのＡＬＳＭＥの移動が改善され、それによって、細胞も存在している水相中におけるその濃度は低下する。Ｄ２ＥＨＰＡに起因する毒性作用を減少させるため、２％（ｗ／ｖ）の低濃度のＤ２ＥＨＰＮＨ３が使用された。
【０１０２】
バクテリアを、先ず、５ｍＬ（緩衝液容積の１／２に相当）に再懸濁した。さらに５ｍＬの緩衝液を、場合により、０．４％（ｗ／ｖ）のＡＬＳＭＥと混合し、続いて、場合により、５ｍＬのＤ２ＥＨＰＮＨ３／ＬＳＭＥ  ２／９８％（ｗ／ｗ）と共に１分間３０００Ｕｐｍにてボルテックスした。この溶液を、あらかじめ振とうフラスコに入れておいたバクテリア懸濁液に加え、混合した。その後に最初のサンプリングを行った。
【０１０３】
当該溶液は、試験の開始時には、泡沫状の稠度を有していたが、それは２つの試験の２回目のサンプリング時には消失していた。略語"Ｄ／Ｌ"はＤ２ＥＨＰＮＨ３（アンモニア含有Ｄ２ＥＨＰＡ）／ＬＳＭＥ  ２／９８％（ｗ／ｗ）に代えて使用された。サンプリングｔ0とｔ1.5hとの間に、ＣＦＵ／ｍＬの数は３４．３％だけ増加した。サンプリング（ｔ1.5）から最後のサンプリング（ｔ22）までに、ＣＦＵ／ｍＬの数は５４．９％だけ減少した。ＡＬＳＭＥ  ０．２％（ｗ／ｖ）の添加なしの、Ｄ２ＥＰＨＮＨ３／ＬＳＭＥ  ２／９８％（ｗ／ｗ）を有する試料に比較して、増殖性細胞の数は２２時間後には４．５倍になり、３．４％で、ＨＥＰＥＳ緩衝液中の対照試料の平均値を有意に下回ってはいなかった（図４、参照）。有機相の添加なしの、振とうフラスコ中のＡＬＳＭＥ  ０．２％（ｗ／ｖ）を有する試料に比較して、ＣＦＵ／ｍＬの数は２８００倍であった。
【０１０４】
当該液状陽イオン交換体の存在は、ここで、残存ｃｆｕの数で確認されたように、正電荷を帯びた化合物の毒性を低下させることは明白である。
【０１０５】
実施例４：ω−アミノラウリン酸（ＡＬＳ）およびメチルエステル（ＡＬＳＭＥ）産生微生物に対するさまざまな液状陽イオン交換体の毒性の比較試験
ラウリン酸メチルエステルからアミノラウリン酸メチルエステルへの生体内変換は、さまざまなイオン交換体を有するＤａｓＧｉｐの８重並行発酵系でテストされた。
【０１０６】
発酵には１Ｌ反応器を使用した。ｐＨプローブを、ｐＨ４．０とｐＨ７．０の標準溶液を用いた２点キャリブレーションによって目盛り定めした。反応器に３００ｍＬの水を満たし、滅菌を確実にするため、２０分間１２１℃にてオートクレーブ滅菌した。続いて、ｐＯ２プローブを一晩（少なくとも６時間）にわたって二極化した。翌朝、クリーン・ベンチ下で水を取り出し、５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンと３４ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールを有した高細胞密度培養基と交換した。続いて、ｐＯ２プローブを１点キャリブレーション（攪拌機；６００ｒｐｍ／ガス導通：１０ｓＬ／ｈ空気）で目盛り定めし、フィード区間、修正培地区間および誘導培地区間をクリーン・イン・プレースで浄化した。そのために、チューブを、７０％エタノール、続いて１ＭのＮａＯＨ、次いで滅菌した純水を用いて洗い流し、最後に、それぞれの培養基で満たした。
【０１０７】
ＡＬＳおよびＡＬＳＭＥ産生Ｅ．ｃｏｌｉ株ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｔ１ｒ  ｐＢＴ１０  ｐＡＣＹＣ：Ｄｕｅｔ［ＴＡｃｖ］を、先ず、５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンと３４ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールを有したＬＢ培養基（１００ｍＬの三角フラスコ中、２５ｍＬ）の低温培養体から、一晩、３７℃、２００ｒｐｍにて、約１８時間にわたって吸収した。続いて、それぞれ２ｍＬを、５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンと３４ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールを有した高細胞密度培養基（グルコース１５ｇ／Ｌ（３０ｍＬ／１％のＭｇＳＯ4＊７Ｈ2Ｏと２．２％のＮＨ4Ｃｌとを有した別個にオートクレーブ滅菌された５００ｇ／Ｌの原液Ｌ当たり）、（ＮＨ4）2ＳＯ４  １．７６ｇ／Ｌ、Ｋ2ＨＰＯ4  １９．０８ｇ／Ｌ、ＫＨ2ＰＯ4  １２．５ｇ／Ｌ、酵母エキス６．６６ｇ／Ｌ、クエン酸三ナトリウム二水和物１１．２ｇ、クエン酸アンモニウム鉄溶液１７ｍＬ／別個にオートクレーブ滅菌された１％原液Ｌ当たり、微量元素溶液５ｍｌ／別個にオートクレーブ滅菌された原液（ＨＣｌ（３７％）３６．５０ｇ／Ｌ、ＭｎＣｌ2＊４Ｈ2Ｏ  １．９１ｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ4＊７Ｈ2Ｏ  １．８７ｇ／Ｌ、エチレンジアミン四酢酸二水和物０．８４ｇ／Ｌ、Ｈ3ＢＯ3  ０．３０ｇ／Ｌ、Ｎａ2ＭｏＯ4＊２Ｈ2Ｏ  ０．２５ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ2＊２Ｈ2Ｏ  ４．７０ｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ4＊７Ｈ2Ｏ  １７．８０ｇ／Ｌ、ＣｕＣｌ2＊２Ｈ２Ｏ  ０．１５ｇ／Ｌ）Ｌ当たり）（３×１００ｍＬの三角フラスコ中それぞれ２５ｍＬ）に接種して、３７℃／２００ｒｐｍにて、さらに６時間にわたって培養した。
【０１０８】
３つの培養体を１つの振とうフラスコにまとめ、光学密度７．２を測定した。反応器に０．１の光学密度を接種するため、５ｍＬの注射器にそれぞれ４．２ｍＬを吸い上げて、反応器に隔壁を越えてカニューレで接種した。
【０１０９】
以下の標準プログラムを使用した：
【表３】
0005936627.tif 000004
【０１１０】
実施した実験は２つの相、細胞が所定の光学密度に達するようにする培養と、それに続く、バイオテクノロジーによるＡＬＳＭＥ製造法に必要な遺伝子の発現を誘導した生体内変換、に区分することができる。ｐＨ値は、一方で、アンモニア（１２．５％）によってｐＨ６．８にコントロールされた。培養および生体内変換の間、培地中の溶存酸素（ＤＯ、ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ  Ｏｘｙｇｅｎ）は攪拌機回転数とガス導通速度とによって３０％にコントロールされた。発酵は供給バッチとして実施され、その際、供給スタート（５ｇ／Ｌｈグルコース供給（１％ＭｇＳＯ4＊７Ｈ2Ｏおよび２．２％ＮＨ４Ｃｌを有したグルコース５００ｇ／Ｌ））は、ＤＯピークを越えて、トリガされた。供給スタートと共に、温度も３７℃から３０℃に低下された。トランスアミナーゼの発現は、供給スタートから２時間後に、ＩＰＴＧ（１ｍＭ）の自動添加によって誘導された。ａｌｋ遺伝子の誘導は、供給スタートから１０時間後に、手動によるＤＣＰＫ（０．０２５％ｖ／ｖ）の添加によって行われた。生体内変換のスタート前に、培養液の光学密度が決定された。
【０１１１】
生体内変換のスタートは、供給スタートから１４時間後に行った。そのため、ラウリン酸メチルエステルとその都度のイオン交換体（１０％ｗ／ｗ）とからなる混合物１５０ｍＬを、バッチとして、発酵培養液に加えた。イオン交換体としては、ジ−（２−エチルヘキシル−）リン酸（ＤＥＨＰＡ）、ラウリン酸、オレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸および、ヒゴタイ油の鹸化に由来する遊離脂肪酸からなる混合物を使用した。トランスアミナーゼのアミノ基ドナーを供するために、有機相の添加と同時に、１０．７ｍＬのアラニン溶液（１２５ｇ／Ｌ）が発酵培養液に加えられた。サンプリングのために、２ｍＬの発酵培養液を容器から取り出し、そのうちの一部１／２０をアセトン−ＨＣｌ−混合液（ｃ（ＨＣｌ）＝０．１ｍｏｌ／Ｌ）で希釈し、抽出した。試料は、生体内変換のスタートから１．２５時間後、３時間後、５時間後、２０時間後、２２時間後および２５時間後に、８つの反応器のすべてから採取された。酸素の代謝率（ＯＴＲ＝ｏｘｙｇｅｎ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｒａｔｅ）および炭素の代謝率（ＣＴＲ＝ｃａｒｂｏｎ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｒａｔｅ）は、発酵中、ＤａｓＧｉｐ系につき排気分析によって決定した。発酵終了は生体内変換のスタートから２２時間後に行われた。
【０１１２】
発酵試料中のＡＬＳ、ＡＬＳＭＥ、ＤＤＳ、ＤＤＳＭＥ、ＬＳ、ＬＳＭＥ、ＨＬＳ、ＨＬＳＭＥ、ＯＬＳおよびＯＳＬＭＥの量定は、すべての検体の外部キャリブレーションに依拠し、かつ、内部標準アミノウンデカン酸（ＡＵＤ）を使用して、ＬＣ−ＥＳＩ／ＭＳ2によって行った。
【０１１３】
その際、以下の機器が使用された：
・  ＨＰＬＣ装置１２６０（Ａｇｉｌｅｎｔ；Ｂｏｅｂｌｉｎｇｅｎ）：自動サンプラー（Ｇ１３６７Ｅ）、バイナリポンプ（Ｇ１３１２Ｂ）およびカラムオーブン（Ｇ１３１６Ａ）付き
・  質量分析計ＴｒｉｐｅｌＱｕａｄ  ６４１０（Ａｇｉｌｅｎｔ；Ｂｏｅｂｌｉｎｇｅｎ）：ＥＳＩソース付き
・  ＨＰＬＣカラム：Ｋｉｎｅｔｅｘ  Ｃ１８、１００×２．１ｍｍ、粒子サイズ：２．６μｍ、ポアサイズ１００Å（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ；Ａｓｃｈａｆｆｅｎｂｕｒｇ）
・  プレカラム：ＫｒｕｄＫａｔｃｈｅｒ  Ｕｌｔｒａ  ＨＰＬＣ  Ｉｎ−Ｌｉｎｅ  Ｆｉｌｔｅｒ；０．５μｍフィルタ深さおよび０．００４ｍｍ内径（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ；Ａｓｃｈａｆｆｅｎｂｕｒｇ）
【０１１４】
試料は、１９００μＬの溶媒（アセトン／０．１  Ｎ  ＨＣｌ−混合液＝１：１）および１００μＬの試料をピペットで２−ｍＬ−反応容器に移して準備された。この混合物を、約１０秒間ボルテックスし、続いて、約１３０００ｒｐｍにて５分間遠心分離した。透明な上澄み液をピペットで採取し、希釈剤（８０％（ｖ／ｖ）ＡＣＮ、２０％重蒸留Ｈ２Ｏ（ｖ／ｖ）、＋０．１％ギ酸）で相応した希釈を行った後に、分析した。それぞれ９００μＬずつの試料に、ピペットにて、１００μＬのＩＳＴＤを加えた（９０μＬの試料容積につき１０μＬ）。
【０１１５】
ＨＰＬＣ分離は、上述したカラムないしプレカラムによって行われた。注入量は０．７μＬ、カラム温度は５０℃、フロー速度は０．６ｍＬ／ｍｉｎ．であった。移動相は溶離剤Ａ（０．１％（ｖ／ｖ）の水性ギ酸）と溶離剤Ｂ（０．１％（ｖ／ｖ）のギ酸を有するアセトニトリル）で構成された。以下の勾配プロファイルが利用された。
【０１１６】
【表４】
0005936627.tif 000005
【０１１７】
ＥＳＩ−ＭＳ2分析は、以下のＥＳＩソースのパラメータを用い、正モードで行われた：
・  ガス温度  ２８０℃
・  ガスフロー  １１Ｌ／ｍｉｎ
・  噴霧圧力  ５０ｐｓｉ
・  毛管張力  ４０００Ｖ
【０１１８】
個々の化合物の検出および量定は以下のパラメータを用いて行われ、その際、それぞれ１つの生成物イオンが限定子、１個のイオンが量化子として利用された。
【０１１９】
【表５】
0005936627.tif 000006
【０１２０】
結果：
ＤＥＨＰＡが従来の技術に述べられているように陽イオン交換体として使用される場合には、培養体への当該化合物の添加直後に、ＯＴＲの落ち込みが生ずる。この曲線は短時間で０にまで低下するが、このことは培養体中にもはや代謝活性を有する細胞が存在しないことを示している。したがって、ＤＥＨＰＡは細胞に対して高度な毒性作用を有する。
【０１２１】
ＤＥＨＰＡに代えてラウリン酸が液状陽イオン交換体として使用される場合には、同様にＯＴＲの落ち込みが生ずるが、その落ち込みはそれほど強いものではなく、続く２２時間で細胞は回復し、代謝活性の上昇を示す。したがって、ラウリン酸はＤＥＨＰＡほど顕著な毒性を有していない。
【０１２２】
比較的長い炭化水素鎖を有する飽和脂肪酸を使用する場合には、さらに著しく良好な結果を観察することができる。パルミチン酸およびステアリン酸が使用される場合には、ＯＴＲカーブの落ち込みは、ラウリン酸またはＤＥＨＰＡさえも使用される場合に比較して、遥かに僅かなものである。このことから、この脂肪酸の毒性作用は著しく低いものであると結論することができる。
【０１２３】
不飽和脂肪酸たとえばパルミトレイン酸、鹸化ヒゴタイ油（主としてリノール酸を含有している）およびオレイン酸を使用する場合には、驚くべきことに、さらに著しく良好な結果がもたらされる。これらの脂肪酸は、驚くべきことに、飽和脂肪酸よりもさらに低い毒性を示している。
【０１２４】
参考文献
0005936627.tif 000007
【図１】
0005936627.tif 000008
【図２】
0005936627.tif 000009
【図３】
0005936627.tif 000010
【図４】
0005936627.tif 000011
【図５】
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