(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも６７％の総脂肪を含む藻類バイオマスを生産する方法であって、藻類を２種以上の培養培地で連続的に培養することを含み、
前記培養は、前記藻類を炭素源、酵母抽出物、マグネシウム源、およびカルシウム源を含む培地で培養し、続いて、前記藻類を炭素源、酵母抽出物、窒素源、リン酸塩源、マグネシウム源、カルシウム源、および４ｇ／Ｌ以下の塩化ナトリウムを含み、窒素およびリン酸塩の比が５０：１〜４：１である培養培地で培養することを含み、
前記藻類の種類がスラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、およびオーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属からなる群から選択される、方法。
【請求項２】
前記２種以上の培養培地のうちの１つの培養培地が、５０ｇ／Ｌの炭素源、７．５ｇ／
Ｌの酵母抽出物、０．１５ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム、０．１５ｇ／Ｌの塩化カルシウムおよび０．１５ｇ／Ｌの塩化マグネシウムを含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記炭素源が糖である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記糖がグルコースである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記２つ以上の培養培地のうちの１つの培養培地が、５０ｇ／Ｌの炭素源、７．５ｇ／Ｌの酵母抽出物、４．０ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム、１ｇ／Ｌの尿素、２ｇ／Ｌの塩化カルシウム、２ｇ／Ｌの塩化マグネシウムおよび０．２５ｇ／Ｌの一カリウムリン酸を含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記炭素源が糖である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記２つ以上の培養培地のうちの１つの培養培地が、炭素源、酵母抽出物および海塩を含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記炭素源が糖である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記糖がグルコースである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
更に、前記藻類を、炭素源、酵母抽出物、マグネシウム源、およびカルシウム源を含む培養培地での培養に先立って、グルコース、酵母抽出物および海塩を含有する培養培地で培養することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記培養培地が炭素源、酵母抽出物、窒素源、リン酸塩源、マグネシウム源、カルシウム源、および４ｇ／Ｌ以下の塩化ナトリウムを含み、窒素およびリン酸塩の比が５０：１〜４：１であり、該培養培地にフェドバッチ供給物を補充する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記フェドバッチ供給物が尿素および一カリウムリン酸を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記フェドバッチ工程の停止１２〜２４時間後に、前記培養培地から前記藻類バイオマスを回収する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
すべての栄養分が前記培養培地から除去または消費された後に、前記培地から前記藻類バイオマスを回収する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記藻類バイオマスを含む前記培養培地の遠心分離によって、前記藻類バイオマスを回収する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記藻類バイオマスを回収する前に前記培養培地を冷却する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記培養培地を５〜２５℃に冷却する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記藻類がシゾキトリウム・リマシナム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｌｉｍａｃｉｎｕｍ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記培養培地が、５０ｇ／Ｌのグルコース、１０ｇ／Ｌの酵母抽出物および４ｇ／Ｌの海塩を含有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項２０】
前記培養条件が、溶存酸素を１０％に維持するように気流および撹拌条件下、３０℃で前記藻類培養を行うことを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
滅菌条件下で藻類を培養する、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記培養培地が炭素源、酵母抽出物、窒素源、リン酸塩源、マグネシウム源、カルシウム源、および４ｇ／Ｌ以下の塩化ナトリウムを含み、窒素およびリン酸塩の比が５０：１〜４：１であり、マグネシウムおよびカルシウムの比が４．５：１〜１：１である、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記窒素源が、尿素、ペプトン、麦芽抽出物、肉抽出物、カザミノ酸（ｃａｓａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ）、トウモロコシ浸出液、グルタミン酸ナトリウム、酢酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、または硝酸アンモニウムのうちの少なくとも１つである、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１１年７月１３日に出願された米国仮出願第６１／５０７，３９０号の優先権を主張するものであり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、高脂質含有量の藻類を含む組成物ならびにその生産方法および利用方法に関する。特に、本発明は、高脂質含有量の藻類バイオマスおよびそれに由来する藻類脂質物質、その生産方法、ならびにそれを含むかまたはそれから生産されたバイオ燃料（例えば、バイオディーゼル）および食品組成物（例えば、動物飼料）に関する。本発明の組成物および方法は、バイオ燃料、食事（例えば、ヒトおよび動物の栄養）、治療および研究用途を含む様々な用途において使用される。
【背景技術】
【０００３】
この数年以内で、藻類からのバイオ燃料（例えば、バイオディーゼル）の製造が関心領域になっている。部分的には、これは、藻類（藻類バイオマス）の成長のために高品質な農地を必要としないことが原因である。しかしながら、藻類からのバイオ燃料（例えば、バイオディーゼル）の商業的な製造には、依然として課題がある。
【０００４】
加えて、この５０年間にわたって、動物栄養の提供に対する取り組みが変化した。もはや、利用可能な秣またはその他の物質を何でも動物に与えるのではない。その代わりに、動物の食事は、総栄養価および費用について厳密にモニタリングされている。非常に多くの場合、特定の食事をしている動物は、品質および能力の特性についてモニタリングされており、飼料の栄養成分は、飼料の栄養価および動物の能力特性の最適化を最大にするように調整されている。
【０００５】
しかしながら、費用は、重要な要素である。動物に給養するだけではなく、多くの場合に成長および価値の増大をもたらすための費用効果的な動物飼料について、継続的に追求されている。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、高脂質含有量の藻類を含む組成物ならびにその生産方法および利用方法に関する。特に、本発明は、高脂質含有量の藻類バイオマスおよびそれに由来する藻類脂質物質、その生産方法、ならびにそれを含むかまたはそれから生産されたバイオ燃料（例えば、バイオディーゼル）および食品組成物（例えば、動物飼料）に関する。本発明の組成物および方法は、バイオ燃料、食事（例えば、ヒトおよび動物の栄養）、治療および研究用途を含む様々な用途において使用される。
【０００７】
したがって、本発明は、所望の高脂肪含有量（例えば、少なくとも６７％の総脂肪）を含む藻類バイオマスを生産する方法であって、所望の高脂肪含有量を含む藻類バイオマスを提供するのに十分な培養条件下で藻類を培養することを含む方法を提供する。本発明は、所望レベルの総脂肪（例えば、少なくとも６７％の総脂肪）を含む藻類バイオマスを得ることが可能な培養条件を特定した。本発明は、本発明にしたがって生成された藻類バイオマスの総脂肪含有量（例えば、重量による）に限定されない。好ましい実施形態では、本発明にしたがって生成および／または使用された藻類バイオマスは、少なくとも６７重量％の脂肪含有量を含む。しかしながら、本発明はまた、より多い（例えば、６８％超、６９％超、７０％超、７１％超、７２％超、７３％超、７４％超、７５％超、７６％超、７７％超、７８％超、７９％超、８０％超、８１％超、８２％超、８５％超またはそれ以上）またはより少ない（例えば、約６６％、約６５％、約６４％、約６３％、約６２％、約６１％、約６０％、約５９％、約５８％、約５７％、約５６％、約５５％、約５４％またはそれ以下）量の総脂肪を含有する藻類バイオマスを生成する組成物および方法を提供する。実際、本明細書において記載される方法および組成物は、任意の所望レベルの総脂肪含有量を含有する藻類バイオマスを生成するのに用いられ得る。いくつかの実施形態では、藻類バイオマスを２種類以上の培養培地で連続的に培養する。例えば、いくつかの実施形態では、２つ以上の培養培地のうちの１つの培養培地は、５０ｇ／Ｌの炭素源、約７．５ｇ／Ｌの酵母抽出物、約０．１５ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム、約０．１５ｇ／Ｌの塩化カルシウムおよび０．１５ｇ／Ｌの塩化マグネシウムを含有する。本発明は、炭素源によって限定されない。実際、限定されないが、炭水化物、例えばグルコース、フルクトース、キシロース、サッカロース、マルトース、または可溶性デンプン、ならびにオレイン酸、脂肪、例えば大豆油、糖蜜、グリセロール、マンニトールおよび酢酸ナトリウム、綿実粉、グリセロール、糖蜜およびトウモロコシ浸出液を含む様々な炭素源が使用され得る。いくつかの実施形態では、２つ以上の培養培地のうちの別の培養培地は、５０ｇ／Ｌの炭素源、約７．５ｇ／Ｌの酵母抽出物、約４．０ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム、約１ｇ／Ｌの尿素、約２ｇ／Ｌの塩化カルシウム、約２ｇ／Ｌの塩化マグネシウムおよび約０．２５ｇ／Ｌの一カリウムリン酸を含有する。いくつかの実施形態では、２つ以上の培養培地のうちの１つの培養培地は、炭素源、酵母抽出物および海塩を含有する。いくつかの実施形態では、本明細書において記載されるように、藻類を、（例えば、グルコース、酵母抽出物および海塩を含有する）第１の培養培地で培養し；（例えば、グルコース、酵母抽出物、硫酸マグネシウム、塩化カルシウムおよび塩化マグネシウムを含有する）第２の培養培地に移してインキュベーションし；そして、（例えば、グルコース、酵母抽出物、硫酸マグネシウム、尿素、塩化カルシウム、塩化マグネシウムおよび一カリウムリン酸を含有する）第３の培養培地に移してインキュベーションする。いくつかの実施形態では、培養培地の１つにフェドバッチ供給物を補充する。好ましい実施形態では、第３の培養培地にフェドバッチ供給物を補充する。本発明は、用いられるフェドバッチ供給物の種類または継続時間によって限定されない。いくつかの実施形態では、フェドバッチ供給物は、尿素および一カリウムリン酸を含む。本発明は、培養において使用される培地成分の量および／または比率によって限定されない。種々の各培地（例えば、第１の培養培地、第２の培養培地、バッチ培地およびフェドバッチ培地）の成分として用いられ得る例は、本明細書において詳細に記載される。いくつかの実施形態では、フェドバッチ工程の停止１２〜２４時間後に、培地から（例えば、第３の培養培地から）藻類バイオマスを回収する。いくつかの実施形態では、すべての栄養分が培地から除去／消費された後に、第３の培養培地から藻類バイオマスを回収する。本発明は、藻類バイオマスを回収する方法によって限定されない。実際、限定されないが、本明細書において記載される方法を含む様々な方法が、バイオマスを回収するのに使用され得る。いくつかの実施形態では、遠心分離によって藻類バイオマスを回収する。いくつかの実施形態では、藻類バイオマスを回収する前に、藻類バイオマスを含む培養培地を冷却する。本発明は、回収前に、藻類バイオマスを含む培養培地を冷却する温度によって限定されない。実際、限定されないが、本明細書において記載される温度を含む様々な温度が使用され得る。いくつかの実施形態では、藻類バイオマスを含む培養培地を約５〜２５℃に冷却する。本発明は、本発明において使用される藻類の種類によって限定されない。実際、限定されないが、本明細書において記載される藻類を含む様々な藻類が（例えば、独立してまたは組み合わせて）使用され得る。いくつかの実施形態では、藻類は、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属またはクリプテコジニウム（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ）属に由来する株または種である。好ましい実施形態では、藻類は、シゾキトリウム・リマシナム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｌｉｍａｃｉｎｕｍ）である。いくつかの実施形態では、第１の培養培地は、約５０ｇ／Ｌのグルコース、約１０ｇ／Ｌの酵母抽出物および約４ｇ／Ｌの海塩を含有する。いくつかの実施形態では、第２の培養培地は、約５０ｇ／Ｌのグルコース、約７．５ｇ／Ｌの酵母抽出物、約０．１５ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム、約０．１５ｇ／Ｌの塩化カルシウムおよび約０．１５ｇ／Ｌの塩化マグネシウムを含有する。いくつかの実施形態では、第３の培養培地は、約５０ｇ／Ｌのグルコース、約７．５ｇ／Ｌの酵母抽出物、約４．０ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム、約１ｇ／Ｌの尿素、約２ｇ／Ｌの塩化カルシウム、約２ｇ／Ｌの塩化マグネシウムおよび約０．２５ｇ／Ｌの一カリウムリン酸を含有する。いくつかの実施形態では、培養条件は、溶存酸素を約１０％に維持するように気流および撹拌条件下、３０℃で藻類培養を行うことを含む。いくつかの実施形態では、第３の培養培地（例えば、主発酵槽（例えば、７０，０００Ｌ、１２０，０００Ｌ、２５６，０００Ｌの容器）の接種時に存在する培養培地）は、窒素（Ｎ）：リン（Ｐ）：カリウム���Ｋ）の初期比が４６：１３：８．５である培地を含有する。好ましい実施形態では、Ｎ：Ｐ：Ｋの比は、バッチ培養モードおよびフェドバッチ培養モードで同じである。いくつかの実施形態では、マグネシウム（Ｍｇ）：カルシウム（Ｃａ）の比は、バッチモードおよびフェドバッチモードの両方において使用される培養培地では３：１であるが、より高い（例えば、４：１、４．５：１またはそれ以上）またはより低い（例えば、２．５：１、２：１、１．５：１またはそれ以下）比を使用してもよい。別の実施形態では、１：１の塩化物（Ｃｌ２）：硫酸塩（ＳＯ４））比が、バッチモードおよびフェドバッチモードの両方において使用される培養培地で使用されるが、より高い（例えば、２：１、３：１、４：１、５：１またはそれ以上）またはより低い（例えば、１：２、１：３、１：４、１：５またはそれ以下）比を使用してもよい。いくつかの実施形態では、主発酵槽（例えば、７０，０００Ｌ、１２０，０００Ｌ、２５６，０００Ｌの容器）の接種時における培地中の硫酸塩（ＳＯ４）：リン酸塩（ＰＯ４）の比は１６：１であるが、より高い（例えば、２０：１、２５：１、３０：１、３２：１またはそれ以上）またはより低い（例えば、１０：１、８：１、５：１、３：１またはそれ以下）比を使用してもよい。いくつかの実施形態では、所望の脂肪含有量（例えば、６７％超の脂肪）を含有する藻類バイオマスを生成する（例えば、接種材料、第１シード段階、第２シード段階および主発酵槽の培養を含む）完全培養の終了時におけるバッチおよび供給された硫酸塩（ＳＯ４）：リン酸塩（ＰＯ４）の総比率は５．３：１であるが、より高い（例えば、５．５：１、５．７：１、６：１、７：１、８：１またはそれ以上）またはより低い（例えば、５：１、４．５：１、４：１、３：１またはそれ以下）比を使用してもよい。いくつかの実施形態では、主発酵槽（例えば、７０，０００Ｌ、１２０，０００Ｌ、２５６，０００Ｌの容器）の接種時における培地中の塩化物（Ｃｌ２）：リン酸塩（ＰＯ４）の比は１６：１であるが、より高い（例えば、２０：１、２５：１、３０：１、３２：１またはそれ以上）またはより低い（例えば、１０：１、８：１、５：１、３：１またはそれ以下）比を使用してもよい。いくつかの実施形態では、所望の脂肪含有量（例えば、６７％超の脂肪）を含有する藻類バイオマスを生成する（例えば、接種材料、第１シード段階、第２シード段階および主発酵槽の培養を含む）完全培養の終了時におけるバッチおよび供給された塩化物（Ｃｌ２）：リン酸塩（ＰＯ４）の総比率は５．３：１であるが、より高い（例えば、５．５：１、５．７：１、６：１、７：１、８：１またはそれ以上）またはより低い（例えば、５：１、４．５：１、４：１、３：１またはそれ以下）比を使用してもよい。
【０００８】
本発明はまた、所望の高脂肪含有量（例えば、少なくとも６７重量％の総脂肪含有量）を有する藻類バイオマスを提供する。いくつかの実施形態では、バイオマスは、約１７０〜２５０ｍｇ／ｇのドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）および／または約１５０〜４００ｍｇ／ｇのパルミチン酸を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、藻類バイオマス（例えば、乾燥藻類バイオマス）もしくはその成分（例えば、その脂肪酸成分）を含む脂質組成物、食品製品またはその他の物質を提供する。いくつかの実施形態では、藻類バイオマス（例えば、（例えば、本明細書において記載される方法にしたがって生成された）乾燥藻類バイオマス）は、所望量の総脂肪および／またはその他の成分（例えば、約６８％超の総脂肪、約６９％超の総脂肪、約７０％超の総脂肪、約７１％超の総脂肪、約７２％超の総脂肪、約７３％超の総脂肪、約７４％超の総脂肪、約７５％超の総脂肪、約７６％超の総脂肪、約７７％超の総脂肪または約７８％超の総脂肪）を含有する。いくつかの実施形態では、（例えば、６７％超の総脂肪を含有する）本発明の藻類バイオマスを、バイオマスが５％未満の水分（例えば、４．５％未満の水分、４％未満の水分、３．５％未満の水分、３％未満の水分、２．５％未満の水分、２％未満の水分または１．５％未満の水分）を含有するように乾燥させる。いくつかの実施形態では、本発明の藻類バイオマス（例えば、５％未満の水分を含有する乾燥バイオマス）は、約１７０〜２５０ｍｇ／ｇ以上のドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）（例えば、約１７０〜１８０ｍｇ／ｇのＤＨＡ、約１８０〜１９０ｍｇ／ｇのＤＨＡ、約１９０〜２００ｍｇ／ｇのＤＨＡ、約２００〜２１０ｍｇ／ｇのＤＨＡ、約２１０〜２２０ｍｇ／ｇのＤＨＡ、約２２０〜２３０ｍｇ／ｇのＤＨＡ、約２３０〜２４０ｍｇ／ｇのＤＨＡ、約２４０〜２５０ｍｇ／ｇのＤＨＡまたは２５０ｍｇ／ｇ超のＤＨＡ）を含有する。いくつかの実施形態では、本発明の藻類バイオマス（例えば、５％未満の水分を含有する乾燥バイオマス）は、約１５０〜４００ｍｇ／ｇ以上のパルミチン酸（ＩＵＰＡＣ名称：ヘキサデカン酸（例えば、約１５０〜２００ｍｇ／ｇ、約２００〜２２５ｍｇ／ｇ、約２２５〜２５０ｍｇ／ｇ、約２５０〜２７５ｍｇ／ｇ、約２７５〜３００ｍｇ／ｇ、約３００〜３２５ｍｇ／ｇ、約３２５〜３５０ｍｇ／ｇ、約３５０〜３７５ｍｇ／ｇ、約３７５〜４００ｍｇ／ｇまたは４００ｍｇ／ｇ超））を含有する。いくつかの実施形態では、本発明の藻類バイオマス（例えば、５％未満の水分を含有する乾燥バイオマス）は、約３００〜６００ｍｇ／ｇ以上の総脂肪酸（例えば、約３００〜３５０ｍｇ／ｇ、約３５０〜４００ｍｇ／ｇ、約４００〜４５０ｍｇ／ｇ、約４５０〜５００ｍｇ／ｇ、約５００〜５５０ｍｇ／ｇ、約５５０〜６００ｍｇ／ｇまたは６００ｍｇ／ｇ超の脂肪酸））を含有する。いくつかの実施形態では、本発明の藻類バイオマス（例えば、５％未満の水分を含有する乾燥バイオマス）は、約１５％未満のタンパク質（例えば、約１４％未満のタンパク質、約１３％未満のタンパク質、約１２％未満のタンパク質、約１１％未満のタンパク質、約１０％未満のタンパク質、約９％未満のタンパク質または約８％未満のタンパク質）を含有する。いくつかの実施形態では、本発明の藻類バイオマスまたはその成分は、バイオ燃料（例えば、バイオディーゼル）を調製するのに使用される。いくつかの実施形態では、本発明の藻類バイオマスまたはその成分は、食品製品（例えば、動物飼料または飼料成分）を調製するのに使用される。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、本発明の態様による従属栄養性藻類バイオマスの大規模製造で作成したデータを表す。
【図２】図２は、数回の独立した大規模藻類培養から回収した藻類バイオマスの脂肪酸プロファイルを示す。
【図３】図３は、本明細書において記載される物質および方法を用いて回収したバイオマスの複合的な脂肪酸プロファイルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
定義
本明細書において使用される「リン脂質」は、以下の一般構造：
【化１】
0006055469.tif 000002
（式中、Ｒ１は脂肪酸残基であり、Ｒ２は脂肪酸残基または−ＯＨであり、Ｒ３は−Ｈまたは窒素含有化合物コリン（ＨＯＣＨ２ＣＨ２Ｎ＋（ＣＨ３）３ＯＨ−）、エタノールアミン（ＨＯＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、イノシトールまたはセリンである）を有する有機化合物を指す。Ｒ１およびＲ２は、同時にＯＨであることはできない。Ｒ３が−ＯＨである場合、この化合物はジアシルグリセロリン酸であるが、Ｒ３が窒素含有化合物である場合、この化合物は、レシチン、ケファリン、ホスファチジルセリンまたはプラズマロゲンなどのリン脂質である。
【００１１】
本明細書において使用される「エーテルリン脂質」は、グリセロール骨格の１位にエーテル結合を有するリン脂質を指す。エーテルリン脂質の例としては、限定されないが、アルキルアシルホスファチジルコリン（ＡＡＰＣ）、リゾ−アルキルアシルホスファチジルコリン（ＬＡＡＰＣ）およびアルキルアシルホスファチジルエタノールアミン（ＡＡＰＥ）が挙げられる。「非エーテルリン脂質」は、グリセロール骨格の１位にエーテル結合を有しないリン脂質である。
【００１２】
本明細書において使用される「ω−３脂肪酸」という用語は、分子のメチル末端から３番目の炭素原子と４番目の炭素原子との間の炭化水素鎖に最終二重結合を有する多価不飽和脂肪酸を指す。ω−３脂肪酸の非限定的な例としては、５，８，１１，１４，１７−エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）および７，１０，１３，１６，１９−ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）が挙げられる。
【００１３】
本明細書において使用される「トリアシルグリセリド」、「トリグリセリド」および「トリアシルグリセロール」および「ＴＡＧ」という用語は、グリセロールおよび３個の脂肪酸に由来するエステルを指し、この場合の「脂肪酸」は、長い非分岐状の脂肪族末端（鎖）を有する飽和カルボン酸または不飽和カルボン酸を指す。パルミチン酸は、トリアシルグリセリドの非限定的な一例である。
【００１４】
本明細書において使用される「％ｗ／ｗ（重量／重量）」および「ｗ／ｗ％」という用語ならびに文法上の同義語は、組成物中の所定物質についての重量：重量基準の量（パーセント）を指す。例えば、５０％ｗ／ｗのリン脂質を含む組成物は、リン脂質の質量が組成物の総質量の５０％（すなわち、油などの組成物１００グラム中にリン脂質５０グラム）であることを意味する。
【００１５】
本明細書において使用される「藻類」という用語は、以前は植物として分類されていた単細胞生物または多細胞生物であって、淡水または海水中に存在し、独立栄養性または従属栄養性であるが、真の茎、根および葉を持たないものを指す。本明細書において使用される「従属栄養性」という用語は、自らの食物を合成できず、栄養分を有機物（例えば、複雑なおよび／または単純な有機物）に依存している生物を指す。したがって、「従属栄養性藻類」という用語は、自らの食物を合成できず、栄養分を有機物に依存している藻類を指す。本明細書において使用される「独立栄養性」という用語は、光または化学エネルギーを使用して無機物から自らの食物を合成できる生物を指す。「藻類」という用語の使用はまた微細藻類に関するので「微細藻類」の意味を包含する。「藻類組成物」という用語は、藻類を含む任意の組成物、例えば水生組成物を指し、藻類が培養される水域または培養液に限定されない。藻類組成物は、藻類培養物、藻類バイオマス、濃縮藻類培養物または脱水された藻類塊でもよいし、液体、半固体または固体の形態でもよい。非液体藻類組成物は、固体の水分レベルまたは重量パーセンテージの観点から説明され得る。「藻類培養物」は、生きている藻類を含む藻類組成物である。「藻類」という用語は、大型藻類（一般的には海藻として公知である）および微細藻類を含む。
【００１６】
本明細書において使用される「藻類バイオマス」または「バイオマス」という用語は、所定の領域または生態系で成長した所定の時点の藻類細胞の集合物または塊を指す。この領域または生態系は、天然に存在する環境（例えば、水域）でもよいし、合成環境（例えば、（例えば、開放型または密閉型の）発酵槽またはバイオリアクタ）でもよい。
【００１７】
本明細書において使用される「総脂肪」という用語は、物質中に存在するトリグリセリド、リン脂質、ワックスエステルおよびステロールの合計を指す。例えば、藻類バイオマスの「総脂肪」含有量は、バイオマス中に存在するトリグリセリド、リン脂質、ワックスエステルおよびステロールの合計を指す。加えて、総脂肪は、飽和脂肪および不飽和脂肪の両方を含む。
【００１８】
本明細書において使用される「防腐剤」という用語は、風味、香り、色、風合い、外観、栄養価または安全性の劣化を遅延または防止することによって、食品製品または非食品製品の保存期間を延長する物質を指す。防腐剤は、部分的または完全な微生物細胞の破壊または無能力化をもたらす致死的な不可逆性の作用を提供することを必要としない。滅菌剤、清浄薬、消毒薬、殺胞子剤、殺ウイルス剤および結核菌殺菌剤は、このような不可逆性の作用様式（「殺菌」作用と称されることもある）を提供する。対照的に、防腐剤は、防腐剤が除去されると標的微生物が繁殖を再開し得るという点で可逆性である阻害作用または静菌作用を提供し得る。防腐剤と清浄薬との間の主な違いは、主に、作用様式（防腐剤は、微生物を殺傷するのではなく成長を防止する）および曝露時間（防腐剤は数日間〜数カ月間作用するのに対して、清浄薬は多くとも数分間作用するまで）に関係するものである。
【００１９】
本明細書において使用される「酵母」および「酵母細胞」という用語は、菌界に分類されている真核微生物であって、細胞壁、細胞膜および細胞内成分を有する真核微生物を指す。酵母は、特定の分類学的または系統学的な集団を形成しない。現在、約１，５００種が公知であり、すべての酵母種の１％しか特定されていないと推定される。「酵母」という用語はサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の同義語としてみなされることが多いが、子嚢菌類および担子菌類の両区分に分類されていることが酵母の系統的多様性を示している。出芽酵母（「真正酵母」）は、サッカロミセス目に分類される。ほとんどの酵母種は出芽によって無性生殖するが、一部は二分裂によって生殖する。酵母は単細胞であるが、一部の種は、仮性菌糸または偽性菌糸として公知の一連の結合出芽細胞の形成によって多細胞になる。酵母の大きさは種に応じて大きく変化し得るところ、典型的には直径３〜４μｍと測定されるが、一部の酵母は４０μｍ超に達し得る。
【００２０】
本明細書において使用される「セレン強化酵母」および「セレン化酵母」という用語は、無機セレン塩を含有する培地で培養される任意の酵母（例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））を指す。本発明は、使用されるセレン塩によって限定されない。実際、限定されないが、亜セレン酸ナトリウム、セレン酸ナトリウム、亜セレン酸コバルトまたはセレン酸コバルトを含む様々なセレン塩が本発明において有用であると企図される。（例えば、細胞または酵母に結合しない）遊離セレノメチオニンは、酵母がこの形態のセレンを取り込むのでセレン強化酵母用のセレン源としても使用され得る。培養中、セレンと硫黄との間の化学的類似性により、酵母は、通常は細胞内の硫黄含有有機化合物であるものに含まれる硫黄の代わりにセレンを取り込む。このような酵母調製物中のセレン含有化合物は、ポリペプチド／タンパク質に取り込まれている形態で存在するセレノメチオニンである。このような調製物中にセレノメチオニン形態で存在する総細胞セレン量は様々であるが、１０％〜１００％、２０％〜６０％、５０％〜７５％および６０％〜７５％であり得る。セレン化酵母調製物中の有機セレンの残りは、セレノメチオニン生合成経路における中間体から主に構成されている。これらのものとしては、限定されないが、セレノシステイン、セレノシスタチオニン、セレノホモシステインおよびセレノ−アデノシルセレノメチオニンが挙げられる。最終生成物中に残った無機セレン塩量は、一般に、非常に少ない（＜２％）。しかしながら、本発明はこの割合によって限定されず、この割合よりも高く（例えば、２％〜７０％）または低く（例えば、０．１％〜２％）含有する調製物も本発明によって包含される。
【００２１】
本明細書において使用される「ＳＥＬ−ＰＬＥＸ」という用語は、酵母の成長速度に対するセレン塩の有害効果を最小限にし、細胞有機物への無機セレンの最適な取り込みを可能にする形で漸増量のサトウキビ糖蜜およびセレン塩を提供するフェドバッチ発酵で培養された生育不能なセレン強化乾燥酵母（例えば、アクセッション番号ＣＮＣＭ  Ｉ−３０６０のサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈｏｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  Ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  Ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ），Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ，Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）を指す。残った無機セレンは（例えば、厳密な洗浄工程を使用して）除去し、総セレン含有量の２％を超えない。
【００２２】
本明細書において使用される「有機セレン」という用語は、硫黄がセレンに置換されている任意の有機化合物を指す。したがって、有機セレンは、酵母によって生合成された任意のこのような化合物を指すこともできるし、化学合成される遊離有機セレン含有化合物を指すこともできる。後者の例は、遊離セレノメチオニンである。
【００２３】
本明細書において使用される「無機セレン」という用語は、一般に、任意のセレン塩（例えば、亜セレン酸ナトリウム、セレン酸ナトリウム、亜セレン酸コバルトおよびセレン酸コバルト）を指す。様々なその他の無機セレン源もある（例えば、Ｍｅｒｃｋ  ｉｎｄｅｘに列挙されているものを参照のこと）。セレン化酵母は、限定されないが、亜セレン酸ナトリウム、セレン酸ナトリウム、亜セレン酸コバルト、セレン酸コバルト、セレン酸、亜セレン酸、臭化セレン、塩化セレン、六フッ化セレン、酸化セレン、オキシ臭化セレン、オキシ塩化セレン、オキシフッ化セレン、硫化セレン、四臭化セレン、四塩化セレンおよび四フッ化セレンを含む無機セレン源を使用して生成され得る。
【００２４】
本明細書において使用される「酵母細胞壁」（「ＹＣＷ」とも称される）という用語は、酵母の原形質膜および細胞内成分を取り囲む酵母生物の細胞壁を指す。酵母細胞壁は、酵母細胞壁の外層（主にマンナン）および内層（主にグルカンおよびキチン）の両方を含む。細胞壁の機能は、構造を提供し、代謝活性細胞質を保護することである。シグナル伝達および認識経路は、酵母細胞壁において行われる。酵母細胞壁の組成は、株によって、および酵母の成長状態にしたがって変化する。
【００２５】
本明細書において使用される「精製した」または「精製する」という用語は、試料から成分を除去することを指す。例えば、酵母細胞壁または酵母細胞壁抽出物は、非酵母細胞壁成分（例えば、原形質膜および／または酵母細胞内成分）の除去によって精製される。それらは、混入物質または酵母細胞壁以外のその他の物質の除去によっても精製される。非酵母細胞壁成分および／または非酵母細胞壁混入物質の除去は、試料中の酵母細胞壁またはその成分の割合の増加をもたらす。
【００２６】
本明細書において使用される「インビボ」という用語は、生きている生物内で行われた研究および／または実験を指し、生物有機体内で起こる。
【００２７】
本明細書において使用される「インビトロ」という用語は、生きている生物外の人工環境、および通常は生物内で起こるが、人工環境で起こるようにされる生物学的な過程または反応を指す。インビトロ環境は、限定されないが、試験管および細胞培養液を含み得る。
【００２８】
本明細書において使用される「高速液体クロマトグラフィー」という用語および「ＨＰＬＣ」という用語は、化合物を分離するための液体クロマトグラフィーの一形態を指す。化合物は、溶液に溶解される。化合物は、試料混合物のプラグをカラム上に注入することによって分離される。ＨＰＬＣ機器は、移動相の貯蔵器、ポンプ、注入器、分離カラムおよび検出器を含む。カラム流出液中の分析物の存在は、屈折率、設定波長におけるＵＶ−ＶＩＳ吸収、適切な波長で励起した後の蛍光、または電気化学応答の変化を定量的に検出することによって記録される。
【００２９】
本明細書において使用される「走査電子顕微鏡法」という用語および「ＳＥＭ」という用語は、ラスター走査パターンで電子の高エネルギービームにより走査することによって、試料表面を撮像する電子顕微鏡の一種を使用することを指す。電子は試料を構成する原子と相互作用して、試料の表面トポグラフィ、組成およびその他の特性、例えば電気伝導度についての情報を含有するシグナルを生成する。
【００３０】
本明細書において使用される「固定剤」という用語は、物質をその現在の形態に「固定」、安定化または別の方法で保存して、物質が分解または別の方法で変化するのを防ぐように、ある物質を別の物質に固定できる化学物質を指す。多くの場合、固定剤は、走査電子顕微鏡法（ＳＥＭ）において試料を調製するのに使用される。一次固定剤：本明細書において使用される「一次固定剤」という用語は、物質を「固定」するのに使用される第１の固定剤を指す。二次固定剤：本明細書において使用される「二次固定剤」という用語は、物質を「固定」するのに使用される第２の固定剤を指す。三次固定剤：本明細書において使用される「三次固定剤」という用語は、物質を「固定」するのに使用される第３の固定剤を指す。
【００３１】
本明細書において使用される「分析物」という用語は、原子、分子、原子および／もしくは分子の集団、物質または化学成分を指す。分析物それ自体は測定できない。そうではなく、分析物の性質または特性（物理的、化学的、生物学的など）が、ＨＰＬＣなどの分析手順を使用して決定され得る。例えば、「椅子」（分析物成分）それ自体は測定できないが、椅子の高さ、幅などは測定できる。同様に、マイコトキシンは測定できないが、その濃度に関連するマイコトキシンの蛍光は測定できる。
【００３２】
本明細書において使用される「シグナル」という用語は、一般に、反応が起こったこと（例えば、抗原への抗体の結合）を示す任意の検出可能な過程に関連して使用される。シグナルは、定性的および定量的に評価され得る。「シグナル」の種類の例としては、限定されないが、放射性シグナル、蛍光シグナルまたは比色生成物／試薬シグナルが挙げられる。
【００３３】
本明細書において使用される「バイオアベイラビリティ」という用語は、生物に利用可能であるか、または体循環に達する分子または成分の割合を指す。分子または成分が静脈内投与される場合、そのバイオアベイラビリティは１００％である。しかしながら、分子または成分がその他の経路を介して（例えば、経口的に）投与される場合、そのバイオアベイラビリティは（不完全な吸収および初回通過代謝により）減少する。栄養学的な背景において、バイオアベイラビリティは、栄養分の吸収率および利用率を指す。例えば、同じ栄養分の異なる形態が、異なるバイオアベイラビリティを有してもよい。
【００３４】
本明細書において使用される「有効量」という用語は、有益な結果または所望の結果をもたらすのに十分な組成物の量を指す。有効量は、１つ以上の投与、適用もしくは投与量で投与し、および／または別の物質と組み合わせることができ、特定の配合または投与経路に限定されない。
【００３５】
本明細書において使用される「消化」という用語は、吸収可能な形態への食物、飼料原料またはその他の有機化合物の変換、つまり熱および水分または化学作用による軟化、分解または破壊を指す。
【００３６】
本明細書において使用される「消化系」は、消化が起こり得るか、または消化が起こる系（胃腸系を含む）を指す。
【００３７】
本明細書において使用される「飼料原料」という用語は、哺乳動物（例えば、ヒトおよび動物）によって消費され、哺乳動物の食餌にエネルギーおよび／または栄養分を与える物質を指す。飼料原料の例としては、限定されないが、完全混合飼料（ＴＭＲ）、秣、ペレット、濃縮物、プレミックス、副産物、穀物、醸造かす、糖蜜、ファイバー、飼い葉、草、干草、穀粒、葉、穀粉、溶解物およびサプリメントが挙げられる。
【００３８】
本明細書において使用される「食品サプリメント」、「食物サプリメント」、「食物サプリメント組成物」などの用語は、食事の一環として使用されるべき食物サプリメントまたは栄養サプリメントとして配合された食品製品を指す。例示的な食物サプリメント組成物は、本明細書において記載される。
【００３９】
本明細書において使用される「動物」という用語は、動物界の動物を指す。これには、限定されないが、畜産動物、農場動物、家畜動物、愛玩動物、海洋動物および淡水動物ならびに野生動物が挙げられる。
【００４０】
本明細書において使用される「投与」という用語および「投与する」という用語は、薬物、プロドラッグもしくはその他の薬剤を含む物質、または治療的処置を被験体（例えば、被験体またはインビボ、インビトロまたはエクスビボ細胞、組織および器官）に与える行為を指す。例示的な投与経路は、眼（点眼）、口（経口）、皮膚（局所または経皮）、鼻（鼻腔）、肺（吸入）、経口粘膜（頬）、耳、直腸、膣、注射（例えば、静脈内、皮下、腫瘍内、腹腔内など）などによるものであり得る。
【００４１】
本明細書において使用される「同時投与」という用語および「同時投与する」という用語は、少なくとも２つの薬剤または治療薬を被験体および／または物質（例えば、飼料原料）に投与することを指す。２つ以上の薬剤または治療の同時投与（同時施行）を同時にすることもできるし、第１の薬剤／治療を第２の薬剤／治療の前に投与（施行）することもできる。
【００４２】
本明細書において使用される「処置」という用語は、疾患の症状の改善および／または回復を促進する取られた措置を指す。「処置」という用語は、治療的処置および予防的または回避的措置の両方を指す。例えば、本発明の組成物および方法による処置から恩恵を受け得る被験体としては、疾患および／または障害を既に有する被験体、ならびに（例えば、本発明の予防的処置を使用して）疾患および／または障害が回避されるべき被験体が挙げられる。
【００４３】
本明細書において使用される「疾患のリスクがある」という用語は、特定の疾患をきたす素因を有する被験体を指す。この素因は遺伝的（例えば、遺伝性障害などの疾患をきたす特定の遺伝的傾向）でもよいし、その他の因子（例えば、年齢、体重、環境条件、環境中に存在する有害成分への曝露など）によるものでもよい。
【００４４】
本明細書において使用される「疾患」という用語、「感染症」という用語および「病的状態または病的反応」という用語は、生きている動物またはその器官もしくは組織のいずれかの正常な状態の機能障害であって、正常な機能の働きを妨害または改変する機能障害に関連する状態、兆候および／または症状を指し、環境因子（例えば、栄養失調、工業災害または風土、例えばマイコトキシン症）、特定の感染体（例えば、寄生虫、細菌またはウイルス）、生物固有の欠陥（例えば、種々の遺伝子異常）、またはこれらのおよびその他の因子の組み合わせに対する反応であり得る。
【００４５】
本明細書において使用される「疾患を患う」という用語は、特定の疾患をきたしている被験体（例えば、動物またはヒト被験体）を指し、任意の特定の兆候もしくは症状または疾患に限定されない。
【００４６】
本明細書において使用される「毒性」という用語は、被験体、細胞または組織に対する任意の効果であって、毒素／毒物の接触または投与前の同じ細胞または組織と比較して不利益な、有毒な、有害な、または別の形でマイナスな効果を指す。
【００４７】
本明細書において使用される「医薬組成物」という用語は、活性薬剤と、不活性または活性な担体であって、組成物をインビトロ、インビボまたはエクスビボにおける診断用途または治療用途に特に適切なものにする担体との組み合わせを指す。
【００４８】
本明細書において使用される「薬学的に許容される」という用語および「薬理学的に許容される」という用語は、有益な既知反応よりも多くの有害な既知反応を実質的にもたらさない組成を指す。
【００４９】
本明細書において使用される「接種」という用語は、培養培地に微生物を導入するか、または微生物（例えば、藻類、酵母、真菌、細菌など）を懸濁する行為を指す。接種は、何かをそれが成長または繁殖する環境に導入する行為または工程である。
【００５０】
本明細書において使用される「接種材料」という用語および「前接種材料」という用語は、接種において使用される細胞、例えば培養を開始するために追加される細胞を指す。
【００５１】
本明細書において使用される「遠心分離」という用語は、固定軸を中心に物体を回転させて軸に対して垂直な力を加える回転ロータによって発生する遠心力を使用することによって、大きさまたは密度ごとに分子を分離することを指す。遠心分離機は、求心加速度を使用して、より高密度およびより低密度の物質を異なる密度層に均等に分散させる沈降原理を使用して機能する。
【００５２】
本明細書において使用される「濃度」という用語は、規定の空間あたりの物質量を指す。濃度は、通常、容量単位あたりの質量の観点から表される。溶液を希釈するためには、より多くの溶媒を追加するか、または（例えば、濃縮酵母細胞壁抽出物または濃縮改変酵母細胞壁抽出物を、例えば選択的蒸散、噴霧乾燥、凍結乾燥することによって）溶質の量を減少させなければならない。対照的に、溶液を濃縮するためには、より多くの溶質を追加するか、または溶媒の量を減少させなければならない。
【００５３】
本明細書において使用される「層」という用語は、遠心分離によって物質の密度特性に関して分離した後に得られた重なる部分またセグメントを形成する物質層中に組織化された通常は水平の堆積物を指す。
【００５４】
本明細書において使用される「回収する」という用語は、製造された物質を収集するか、またはまとめる（例えば、酵母産生で産生された物質をまとめる）行為を指す。
【００５５】
本明細書において使用される「乾燥」という用語は、噴霧乾燥、凍結乾燥、空気乾燥、真空乾燥、または物質中の液体を減少または排除する任意のその他の種類の工程を指す。
【００５６】
本明細書において使用される「噴霧乾燥」という用語は、液体を含有する物質を乾燥させる一般的に使用されている方法であって、熱ガスを使用して液体を蒸発させて、物質中の液体を減少または排除する方法を指す。換言すれば、物質は、加熱した乾燥空気流に噴霧または霧化することによって乾燥される。
【００５７】
本明細書において使用される「凍結乾燥(フリーズドライ)」という用語および「凍結乾燥（リョフィリゼーション）」という用語および「冷凍乾燥」という用語は、昇華によって凍結状態の物質から溶媒を除去することを指す。これは、乾燥させるべき物質をその共晶点未満で凍結させ、次いで昇華潜熱を提供することによって達成される。入熱を正確に制御することにより、生成物のメルトバックを伴わずに凍結状態から乾燥させることが可能になる。実際の適用では、減圧条件下でこの工程を加速させ、正確に制御する。
【００５８】
本明細書において使用される「乾燥自由流動性粉末」という用語は、自由流動性乾燥粉末、例えば大きな塊による支障もなくコンテナ、袋、容器などから注入できる粉末を指す。
【００５９】
本明細書において使用される「破砕」という用語は、衝撃、剪断または磨耗によって粒径を減少させることを指す。
【００６０】
本明細書において使用される「試料」という用語は、任意の起源から得られた検体または培養物、ならびに生体試料および環境試料を含む広い意味で使用される。生体試料は動物（ヒトを含む）から得てもよく、液体、固体、組織およびガスを包含する。生体試料としては、血液製剤、例えば血漿、血清などが挙げられる。環境的試料としては、環境物質、例えば表面物質、土壌、水、結晶および工業試料が挙げられる。
【００６１】
発明の詳細な説明
本発明は、高脂質含有量の藻類を含む組成物ならびにその生産方法および利用方法に関する。特に、本発明は、高脂質含有量の藻類バイオマスおよびそれに由来する藻類脂質物質、その生産方法、ならびにそれを含むかまたはそれから生産されたバイオ燃料（例えば、バイオディーゼル）および食品組成物（例えば、動物飼料）に関する。本発明の組成物および方法は、バイオ燃料、食事（例えば、ヒトおよび動物の栄養）、治療および研究用途を含む様々な用途において使用される。
【００６２】
したがって、本発明の一態様では、（例えば、ｗ／ｗ基準で）増大した量の総脂肪を含有する藻類バイオマスを調製するための方法が提供される。例えば、本明細書において記載されるように、いくつかの実施形態では、本発明は、所望の高レベルの総脂肪含有量（例えば、有意に低いレベルの総脂肪含有量（例えば、６０％以下の総脂肪）を含有する藻類バイオマスを生成する従来の方法とは対照的に、６０％超の総脂肪）を含有する藻類バイオマスを生成する方法を提供する。藻類系バイオ燃料（例えば、バイオディーゼル）の大きな課題は、最終燃料製品で得られるよりも多くのエネルギー消費でバイオマスが生産されないようにすることである。したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、６５％超の総脂肪を含有する藻類バイオマスを生成する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、６６％超の総脂肪を含有する藻類バイオマスを生成する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、６７％超の総脂肪を含有する藻類バイオマスを生成する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、６８％超の総脂肪を含有する藻類バイオマスを生成する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、６９％超の総脂肪を含有する藻類バイオマスを生成する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、７０％超の総脂肪を含有する藻類バイオマスを生成する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、ｗ／ｗ基準で７０％超（例えば、７１％超、７２％超、７３％超、７４％超、７５％超、７６％超、７７％超、７８％超、７９％超、８０％超、８１％超、８２％超、８３％超、８４％超、８５％超、８６％超、８７％超、８８％超、８９％超、９０％超またはそれ以上）の総脂肪を含有する藻類バイオマスを生成する方法を提供する。いくつかの実施形態では、この方法は、密閉型のバイオリアクタシステム（例えば、発酵槽）を用いるが、本発明はそれに限定されない（例えば、いくつかの実施形態では、開放型のバイオリアクタを用いてもよい）。好ましい実施形態では、本発明の藻類バイオマスの成長は、無菌条件下で行う。別の好ましい実施形態では、フェドバッチ法で（例えば、高脂肪含有量（例えば、６７％超の脂肪）を含有する藻類バイオマスを生成するように）藻類を成長させる。
【００６３】
いくつかの実施形態では、本発明は、実施例１および実施例２に記載されているように、藻類を培養して所望の高総脂肪含有量（例えば、６７％以上の総脂肪）を含む藻類バイオマスを製造する方法を提供する。例えば、いくつかの実施形態では、本発明は、藻類を培養する方法であって、所望の高総脂肪含有量（例えば、６７％以上の総脂肪）を含む藻類バイオマスを製造するように、藻類を段階的に培養することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、藻類を培養するための段階的な工程は、貯蔵された藻類株を解凍すること、ならびに炭素源（例えば、糖（例えば、グルコース））、酵母抽出物および海塩を含む培地を含有する１Ｌ振盪フラスコに解凍された藻類を（例えば、無菌的に）追加することを含む。いくつかの実施形態では、炭素源は５０ｇ／Ｌの濃度で存在し、酵母抽出物は１０ｇ／Ｌの濃度で存在し、および／または海塩は４ｇ／Ｌの濃度で存在する。いくつかの実施形態では、藻類および培地を含有する１Ｌ振盪フラスコを３０℃に維持し、藻類が指数増殖期に入っているが、炭素源（例えば、糖（例えば、グルコース））を完全には使い果たしていないような時期まで（例えば、約１００〜４００ＲＰＭで）振盪する。本発明の実施形態の開発中に行った実験により、７２〜１４４時間の時期において、藻類は指数増殖に入っているが、炭素源（例えば、糖（例えば、グルコース））を完全には使い果たしていないことが判明した。したがって、いくつかの実施形態では、１Ｌ培養フラスコ中、炭素源（例えば、糖（例えば、グルコース））、酵母抽出物および海塩を含む培地、３０℃、約１００〜４００ＲＰＭ（例えば、２５０ＲＰＭ）で７２〜１４４時間培養された藻類は、（例えば、より大きい容器（例えば、４０、２７または１８Ｌの容器）に入っている）第１シード段階の培養液に接種するのに使用される。いくつかの実施形態では、第１シード段階において使用される培養培地は、炭素源（例えば、糖（例えば、グルコース））、酵母抽出物、硫酸マグネシウム、塩化カルシウムおよび／または塩化マグネシウムを含む。好ましい実施形態では、第１シード段階において使用される培養培地は、約５０ｇ／Ｌの炭素源（例えば、糖（例えば、グルコース））、約７．５ｇ／Ｌの酵母抽出物、約０．１５ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム、約０．１５ｇ／Ｌの塩化カルシウムおよび／または０．１５ｇ／Ｌの塩化マグネシウムを含む。いくつかの実施形態では、溶存酸素を約７〜１５％（例えば、８、９、１０、１１、１２、１３、１４％）に維持するように、気流および撹拌条件下、３０℃で第１シード段階の培養を行うが、より低いまたはより高い溶存酸素条件を用いてもよい。好ましい実施形態では、溶存酸素を約１０％に維持するように、気流および撹拌条件下、３０℃で第１シード段階の培養を行う。いくつかの実施形態では、藻類および培地を含有する第１シード段階の培養液を３０℃に維持し、藻類が指数増殖期に入り、少なくとも２０ｇ／Ｌの炭素源（例えば、糖（例えば、グルコース））が消費されたが、炭素源が完全には使い果たされていないような時期まで培養する。本発明の実施形態の開発中に行った実験により、第１シード段階の培養液の接種後２４〜４８時間の時期において、藻類は指数増殖に入っており、少なくとも２０ｇ／Ｌの炭素源（例えば、糖（例えば、グルコース））を消費しているが、炭素源（例えば、糖（例えば、グルコース））を完全には使い果たしていないことが判明した。いくつかの実施形態では、第１シード段階の培養において、炭素源（例えば、糖（例えば、グルコース））、酵母抽出物、硫酸マグネシウム、塩化カルシウムおよび塩化マグネシウムを含む培地中、３０℃で２４〜４８時間培養された藻類は、さらにより大きい容器（例えば、２０００Ｌの容器））に入っている第２シード段階の培養液に接種するのに使用される。いくつかの実施形態では、第２シード段階の培養において使用される培養培地は、炭素源（例えば、糖（例えば、グルコース））、酵母抽出物、硫酸マグネシウム、塩化カルシウムおよび／または塩化マグネシウムを含む。好ましい実施形態では、第２シード段階の培養において使用される培養培地は、約５０ｇ／Ｌの炭素源（例えば、糖（例えば、グルコース））、約７．５ｇ／Ｌの酵母抽出物、約０．１５ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム、約０．１５ｇ／Ｌの塩化カルシウムおよび／または０．１５ｇ／Ｌの塩化マグネシウムを含む。いくつかの実施形態では、溶存酸素を約７〜１５％（例えば、８、９、１０、１１、１２、１３、１４％）に維持するように、気流および撹拌条件下、３０℃で第２シード段階の培養を行うが、より低いまたはより高い溶存酸素条件を用いてもよい。好ましい実施形態では、溶存酸素を約１０％に維持するように、気流および撹拌条件下、３０℃で第２シード段階の培養を行う。いくつかの実施形態では、藻類および培地を含有する第２シード段階の培養液を３０℃に維持し、藻類が指数増殖期に入り、少なくとも２０ｇ／Ｌの炭素源（例えば、糖（例えば、グルコース））が消費されたが、炭素源が完全には使い果たされていないような時期まで培養する。本発明の実施形態の開発中に行った実験により、第２シード段階の培養液の接種後２４〜４８時間の時期において、藻類は指数増殖に入っており、少なくとも２０ｇ／Ｌの炭素源（例えば、糖（例えば、グルコース））を消費しているが、炭素源（例えば、糖（例えば、グルコース））を完全には使い果たしていないことが判明した。いくつかの実施形態では、第２シード段階の培養において、炭素源（例えば、糖（例えば、グルコース））、酵母抽出物、硫酸マグネシウム、塩化カルシウムおよび塩化マグネシウムを含む培地中、３０℃で２４〜４８時間培養された藻類は、藻類をさらに培養／発酵するのに使用される培地を含有する大規模容器（例えば、７０，０００Ｌ、１２０，０００Ｌ、２２０，０００Ｌまたはより大きい容器（例えば、主発酵槽））に接種するのに使用される。いくつかの実施形態では、第２シード段階の培養物を大規模容器（例えば、主発酵槽）に移す際に、大規模容器（例えば、主発酵槽）中に存在する培養培地（例えば、バッチ培地）は、炭素源（例えば、糖（例えば、グルコース））、酵母抽出物、硫酸マグネシウム、尿素、塩化カルシウム、塩化マグネシウムおよび／または一カリウムリン酸を含む。好ましい実施形態では、大規模（例えば、７０，０００Ｌ、１２０，０００Ｌ、２２０，０００Ｌまたはより大きい容器（例えば、主発酵槽））培養において使用される培養培地は、約５０ｇ／Ｌの炭素源（例えば、糖（例えば、グルコース））、約７．５ｇ／Ｌの酵母抽出物、約４．０ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム、約１ｇ／Ｌの尿素、約２ｇ／Ｌの塩化カルシウム、約２ｇ／Ｌの塩化マグネシウムおよび／または約０．２５ｇ／Ｌの一カリウムリン酸を含む。いくつかの実施形態では、溶存酸素を約７〜１５％（例えば、８、９、１０、１１、１２、１３、１４％）に維持するように、気流および撹拌条件下、３０℃で大規模培養を行うが、より低いまたはより高い溶存酸素条件を用いてもよい。好ましい実施形態では、溶存酸素を約１０％に維持するように、気流および撹拌条件下、３０℃で大規模培養を行う。好ましい実施形態では、一定期間（例えば、（例えば、フェドバッチ法を使用する）１日以上（例えば、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日またはそれ以上））にわたって、炭素源（例えば、糖（例えば、グルコース））を１０ｇ／Ｌに維持する。例えば、いくつかの実施形態では、所望量のグルコースが大規模容器中の藻類によって消費された後に（例えば、約２０〜３０ｇ／Ｌのグルコースが大規模容器中の藻類によって消費された後に（例えば、約３０ｇ／Ｌのグルコースが消費された後に））、グルコースおよびフェドバッチの供給を開始する。本発明の実施形態の開発中に行った実験により、フェドバッチ供給物を約３４時間にわたって追加するが、より短い（例えば、約３２、２８、２４、２０時間またはそれ以下）またはより長い（例えば、３６、３８、４２、４６、６０、７２、８４、９６、１０８、１２０、１３２、１４４、１５６、１６８時間またはそれ以上）期間を使用してもよいことが判明した。さらに好ましい実施形態では、フェドバッチ工程の完了時に、すべての栄養分が培地から除去／消費されるまで、藻類の培養を大規模容器で継続する。本発明の実施形態の開発中に行った実験により、栄養分は、フェドバッチ工程の停止約１２〜２４時間後に培地から枯渇することが判明した。いくつかの実施形態では、本明細書において記載されるように、大規模培養培地／ブロスから藻類バイオマスを回収して利用する。いくつかの実施形態では、大規模培養ブロスを遠心分離して、藻類バイオマスを得る。いくつかの実施形態では、遠心分離の前に大規模培養ブロスを冷やす。本発明を実施するために機序を理解する必要はなく、本発明は任意の特定の作用機序に限定されないが、いくつかの実施形態では、培養ブロスの冷却は、上昇したレベルの総脂肪（例えば、脂質／油）を含む藻類バイオマスの密度を増加させ、培養ブロスを冷却しない場合に達成されるよりも多くのバイオマスを回収することを可能にする（例えば、実施例３を参照のこと）。本発明は、遠心分離の前に大規模培養物を冷却する温度によって限定されない。いくつかの実施形態では、大規模培養物を０〜５０℃、５〜４０℃、５〜２５℃、５〜１５℃または５〜１０℃の温度に冷却する。
【００６４】
したがって、所望の脂肪含有量（例えば、６７％超の脂肪含有量）を含有する藻類バイオマスを生成するために、本発明は、藻類のバッチ培養モードおよびフェドバッチ培養モードの両方を（例えば、単独で、ならびに／または第１シード段階および／もしくは第２シード段階の後に）用いる。本発明は、バッチモードまたはフェドバッチモードのいずれかにおいて使用される培地中に存在する個々の成分によって限定されない。いくつかの実施形態では、主発酵槽（例えば、７０，０００Ｌ、１２０，０００Ｌ、２２０，０００Ｌの容器）の接種時において存在する培養培地は、窒素（Ｎ）：リン（Ｐ）：カリウム（Ｋ）の初期比が４６：１３：８．５である培地を含有する。好ましい実施形態では、Ｎ：Ｐ：Ｋの比は、バッチ培養モードおよびフェドバッチ培養モードで同じである。いくつかの実施形態では、マグネシウム（Ｍｇ）：カルシウム（Ｃａ）の比は、バッチモードおよびフェドバッチモードの両方において使用される培養培地では３：１である。別の実施形態では、塩化物（Ｃｌ２）：硫酸塩（ＳＯ４））の比は、バッチモードおよびフェドバッチモードの両方において使用される培養培地では１：１である。いくつかの実施形態では、主発酵槽（例えば、７０，０００Ｌ、１２０，０００Ｌ、２２０，０００Ｌの容器）の接種時における培地中の硫酸塩（ＳＯ４）：リン酸塩（ＰＯ４）の比は、１６：１である。いくつかの実施形態では、所望の脂肪含有量（例えば、６７％超の脂肪）を含有する藻類バイオマスを生成する（例えば、接種材料、第１シード段階、第２シード段階および主発酵槽の培養を含む）完全培養の終了時におけるバッチおよび供給された硫酸塩（ＳＯ４）：リン酸塩（ＰＯ４）の総比率は、５．３：１である。いくつかの実施形態では、主発酵槽（例えば、７０，０００Ｌ、１２０，０００Ｌ、２２０，０００Ｌの容器）の接種時における培地中の塩化物（Ｃｌ２）：リン酸塩（ＰＯ４）の比は、１６：１である。いくつかの実施形態では、所望の脂肪含有量（例えば、６７％超の脂肪）を含有する藻類バイオマスを生成する（例えば、接種材料、第１シード段階、第２シード段階および主発酵槽の培養を含む）完全培養の終了時におけるバッチおよび供給された塩化物（Ｃｌ２）：リン酸塩（ＰＯ４）の総比率は、５．３：１である。
【００６５】
以下の実施例２に記載されているように、本発明はまた、所望量の総脂肪および／またはその他の成分を含有する藻類バイオマス（例えば、（例えば、本明細書において記載される方法にしたがって生成された）乾燥藻類バイオマス）を含む組成物を提供する。例えば、いくつかの実施形態では、本発明は、約６７％超の総脂肪（例えば、約６８％超の総脂肪、約６９％超の総脂肪、約７０％超の総脂肪、約７１％超の総脂肪、約７２％超の総脂肪、約７３％超の総脂肪、約７４％超の総脂肪、約７５％超の総脂肪、約７６％超の総脂肪、約７７％超の総脂肪、約７８％超の総脂肪またはそれ以上の量の総脂肪）を含有する藻類バイオマス（例えば、乾燥バイオマス）を提供する。いくつかの実施形態では、（例えば、６７％超の総脂肪を含有する）藻類バイオマスを、バイオマスが５％未満の水分（例えば、４．５％未満の水分、４％未満の水分、３．５％未満の水分、３％未満の水分、２．５％未満の水分、２％未満の水分または１．５％未満の水分）を含有するように乾燥させる。いくつかの実施形態では、本発明の藻類バイオマス（例えば、５％未満の水分を含有する乾燥バイオマス）は、約１７０〜２５０ｍｇ／ｇ以上のドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）（例えば、約１７０〜１８０ｍｇ／ｇのＤＨＡ、約１８０〜１９０ｍｇ／ｇのＤＨＡ、約１９０〜２００ｍｇ／ｇのＤＨＡ、約２００〜２１０ｍｇ／ｇのＤＨＡ、約２１０〜２２０ｍｇ／ｇのＤＨＡ、約２２０〜２３０ｍｇ／ｇのＤＨＡ、約２３０〜２４０ｍｇ／ｇのＤＨＡ、約２４０〜２５０ｍｇ／ｇのＤＨＡまたは２５０ｍｇ／ｇ超のＤＨＡ）を含有する。いくつかの実施形態では、本発明の藻類バイオマス（例えば、５％未満の水分を含有する乾燥バイオマス）は、約１５０〜４００ｍｇ／ｇ以上のパルミチン酸（ＩＵＰＡＣ名称：ヘキサデカン酸（例えば、約１５０〜２００ｍｇ／ｇ、約２００〜２２５ｍｇ／ｇ、約２２５〜２５０ｍｇ／ｇ、約２５０〜２７５ｍｇ／ｇ、約２７５〜３００ｍｇ／ｇ、約３００〜３２５ｍｇ／ｇ、約３２５〜３５０ｍｇ／ｇ、約３５０〜３７５ｍｇ／ｇ、約３７５〜４００ｍｇ／ｇまたは４００ｍｇ／ｇ超））を含有する。いくつかの実施形態では、本発明の藻類バイオマス（例えば、５％未満の水分を含有する乾燥バイオマス）は、約３００〜６００ｍｇ／ｇ以上の総脂肪酸（例えば、約３００〜３５０ｍｇ／ｇ、約３５０〜４００ｍｇ／ｇ、約４００〜４５０ｍｇ／ｇ、約４５０〜５００ｍｇ／ｇ、約５００〜５５０ｍｇ／ｇ、約５５０〜６００ｍｇ／ｇまたは６００ｍｇ／ｇ超の脂肪酸））を含有する。いくつかの実施形態では、本発明の藻類バイオマス（例えば、５％未満の水分を含有する乾燥バイオマス）は、約１５％未満のタンパク質（例えば、約１４％未満のタンパク質、約１３％未満のタンパク質、約１２％未満のタンパク質、約１１％未満のタンパク質、約１０％未満のタンパク質、約９％未満のタンパク質または約８％未満のタンパク質）を含有する。
【００６６】
本発明は、本明細書において記載される方法および組成物において用いられる藻類の株または種によって限定されない。実際、限定されないが、スラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属の１種以上を含む様々な藻類が、本発明において使用される。いくつかの実施形態では、藻類は、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属の種である。いくつかの実施形態では、藻類は、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属の種である。いくつかの実施形態では、藻類は、クリプテコジニウム（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ）属の種である。いくつかの実施形態では、藻類は、スラウストキトリウム・ストリアツム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｔｒｉａｔｕｍ）、スラウストキトリウム・ロゼウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ）、スラウストキトリウム・アウレウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ａｕｒｅｕｍ）、クリプテコジニウム・コーニー（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ  ｃｏｈｎｉｉ）および／またはオーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属種である。好ましい実施形態では、シゾキトリウム・リマシナム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｌｉｍａｃｉｎｕｍ）が、本明細書において記載される方法および組成物において用いられる。本発明は、本明細書において開示される上昇したレベルの脂質を有する藻類バイオマスを生成するための方法によって製造された脂質の種類によって限定されない。いくつかの実施形態では、本発明の方法によって生成された脂質としては、限定されないが、ミリスチン酸、パルミチン酸、オレイン酸、リノール酸、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）およびステアリン酸が挙げられる。これらの脂質は、動物およびヒトの健康の両方において、心臓血管疾患および炎症性疾患などの種々の疾患の予防、ならびに子供の適切な脳発達および網膜視力のための乳児栄養に有用であったものである。
【００６７】
別の実施形態では、本発明は、藻類種（例えば、シゾキトリウム・リマシナム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｌｉｍａｃｉｎｕｍ））から、上昇したレベル（例えば、６７％超）の総脂肪を含有する藻類バイオマスを製造するための方法であって、（例えば、約５０ｇ／Ｌの炭素源（例えば、糖（例えば、グルコース））、約７．５ｇ／Ｌの酵母抽出物、約０．１５ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム、約０．１５ｇ／Ｌの塩化カルシウムおよび／または０．１５ｇ／Ｌの塩化マグネシウムを含む）培地を含む第１のフィードバッチ容器で藻類を培養すること、第１のフィードバッチ培養物を（例えば、約５０ｇ／Ｌの炭素源（例えば、糖（例えば、グルコース））、約７．５ｇ／Ｌの酵母抽出物、約０．１５ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム、約０．１５ｇ／Ｌの塩化カルシウムおよび／または０．１５ｇ／Ｌの塩化マグネシウムを含む）第２のシードバッチ培養培地に（例えば、無菌的に）移すこと、第２のシードバッチ培養物を、培地を含有する大規模培養容器（例えば、例えば約５０ｇ／Ｌの炭素源（例えば、糖（例えば、グルコース））、約７．５ｇ／Ｌの酵母抽出物、約４．０ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム、約１ｇ／Ｌの尿素、約２ｇ／Ｌの塩化カルシウム、約２ｇ／Ｌの塩化マグネシウムおよび／または約０．２５ｇ／Ｌの一カリウムリン酸を含む培地を含有する主発酵槽（例えば、７０，０００Ｌ、１２０，０００Ｌ、２２０，０００Ｌの容器））に（例えば、無菌的に）移すことを含み、フェドバッチ法を使用して大規模培養容器のグルコースレベルを１０ｇ／Ｌに維持し、すべての栄養分が培地から除去／消費された後のフェドバッチ工程の停止１２〜２４時間後に、大規模培養物から藻類細胞を回収する方法を提供する。
【００６８】
本発明の別の実施形態は、藻類種（例えば、シゾキトリウム・リマシナム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｌｉｍａｃｉｎｕｍ））から、上昇したレベル（例えば、６７％超）の総脂肪を含有する藻類バイオマスを製造するための方法であって、（例えば、各発酵段階（例えば、第１シード段階、第２シード段階および／またはバッチ培養（フェドバッチ）培養段階）の）培養培地が、炭素源（例えば、糖）、酵母抽出物、リン酸塩源（例えば、一カリウムリン酸、硫酸マグネシウムおよび／または硫酸亜鉛）、窒素源（例えば、尿素）、塩化マグネシウムおよび／または塩化カルシウムを含む方法を提供する。好ましい実施形態では、本発明は、藻類株から、上昇したレベル（例えば、６７％超）の総脂肪を含有する藻類バイオマスを製造するための方法であって、（例えば、各発酵段階（例えば、第１シード段階、第２シード段階および／またはバッチ培養（フェドバッチ）培養段階）の）培養培地が、糖、酵母抽出物、一カリウムリン酸、硫酸マグネシウム、硫酸亜鉛、尿素、塩化マグネシウムおよび／または塩化カルシウムを含む方法を提供する。しかしながら、本発明は、藻類を成長させる培養培地において用いられる栄養分の種類によって限定されない。いくつかの実施形態では、１つ以上の炭素源を培地に追加する。炭素源の例としては、限定されないが、炭水化物、例えばグルコース、フルクトース、キシロース、サッカロース、マルトース、または可溶性デンプン、ならびにオレイン酸、脂肪、例えば大豆油、糖蜜、グリセロール、マンニトールおよび酢酸ナトリウム、綿実粉、グリセロール、糖蜜およびトウモロコシ浸出液が挙げられる。いくつかの実施形態では、１つ以上の窒素源を培地に追加する。窒素源の例としては、限定されないが、中性の窒素源、例えばペプトン、酵母抽出物、麦芽抽出物、肉抽出物、カザミノ酸およびトウモロコシ浸出液、有機窒素源、例えばグルタミン酸ナトリウムおよび尿素、または無機窒素源、例えば酢酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウムおよび硫酸ナトリウムが挙げられる。いくつかの実施形態では、１つ以上のリン酸塩源を培地に追加する。リン酸塩源の例としては、限定されないが、リン酸カリウムおよびリン酸二水素カリウム、無機塩、例えば硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸亜鉛および硫酸銅が挙げられる。いくつかの実施形態では、塩化マグネシウム、塩化カルシウムおよび／またはビタミンを培養培地に含める。
【００６９】
本発明は、培養培地中のこれらの各成分の量（例えば、濃度）によって限定されない。いくつかの実施形態では、藻類の成長に有害ではない量が用いられる。好ましい実施形態では、各培地成分の量（例えば、濃度および／または比）は、（例えば、各発酵段階（例えば、第１シード段階、第２シード段階および／またはバッチ培養（フェドバッチ）培養段階）において）高脂肪含有量の藻類（例えば、６７％以上の脂肪含有量を含む藻類バイオマス）の形成を促進するレベルに設定する。いくつかの実施形態では、炭素源（例えば、糖）は、培地１リットルあたり約２０〜１２０グラムで培養培地中に存在する。その他の実施形態では、炭素源（例えば、糖）は、培地１リットルあたり約３０〜７０グラムで培養培地中に存在する。さらにその他の実施形態では、炭素源（例えば、糖）は、培地１リットルあたり約４０〜６０グラムで培養培地中に存在する。好ましい実施形態では、炭素源（例えば、糖）は、培地１リットルあたり約５０グラムで培養培地中に存在する。いくつかの実施形態では、尿素と一カリウムリン酸との比（尿素：ＫＨ２ＰＯ４）は、約５：０．１の間（例えば、約４．５：０．１；４：０．２５；３：０．２５；４：０．３；５：０．３；５：０．５；４：０．５；３：０．５；２：０．５；または１：０．５）であるが、より高いまたはより低い比を使用してもよい（例えば、１：１、１：２、１：３など）。好ましい実施形態では、培養培地中の尿素と一カリウムリン酸との比は、４：１である。いくつかの実施形態では、培養培地は、塩化ナトリウムを含有しない。その他の実施形態では、培養培地は、塩化ナトリウムを含有する。いくつかの実施形態では、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）：塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）の比は、１：１である。いくつかの実施形態では、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）：塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）の比は、１：２である。実際、限定されないが、１：１；１：１．１２５；１：１．５；１：１．７５；１：２；１：２．１２５；１：２．２５；１：２．５；２．５：１；２．２５：１；２．１２５：１；２：１；１．７５：１；１．５：１；１．２５：１または１．１２５：１を含む様々な硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）：塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）の比を使用してもよい。好ましい実施形態では、第１のシード培養培地中の硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）：塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）の比は、１：１である。別の好ましい実施形態では、第２のシード培養培地中の硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）：塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）の比は、１：１である。さらに別の好ましい実施形態では、大規模培養培地（例えば、本明細書において第３の培養培地とも称される主発酵槽（例えば、７０，０００Ｌ、１２０，０００Ｌ、２２０，０００Ｌの容器））中の硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）：塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）の比は、１：２である。
【００７０】
さらに好ましい実施形態では、培地を調製した後に、培地のｐＨを調整する必要はない。例えば、本発明の段階的な発酵工程において、藻類を成長させる培養培地のｐＨを調整する必要はない。本発明を実施するために機序を理解する必要はなく、本発明は任意の特定の作用機序に限定されないが、いくつかの実施形態では、本発明の段階的な発酵工程の滅菌条件および／または無菌条件は、発酵中に培養培地のｐＨを調整する必要性を打ち消す。いくつかの実施形態では、培養培地のｐＨは、４．０〜６．５である。本発明の段階的な発酵工程における藻類の培養は、１０〜４０℃、好ましくは１７〜３５℃、最も好ましくは約３０℃の温度で行ってもよい。培養は、通気−撹拌培養、振盪培養、静置培養などによって実施してもよい。好ましい実施形態では、溶存酸素を１０％にまたは１０％をわずかに超えて維持するような条件下で藻類を培養する。
【００７１】
いくつかの実施形態では、本発明は、上昇したレベル（例えば、６７％超）の総脂肪を含む藻類バイオマス（例えば、本明細書において記載される乾燥藻類バイオマス、ならびに／または本明細書において記載される方法および組成物にしたがって生成された乾燥藻類バイオマス）の全部または一部を含む食品、飼料、栄養または治療のサプリメントを提供する。例えば、いくつかの実施形態では、本発明は、上昇したレベル（例えば、６７％超）の総脂肪を含む噴霧乾燥藻類バイオマスを含む食品、飼料、栄養または治療のサプリメントを提供する。その他の実施形態では、本発明は、上昇したレベル（例えば、６７％超）の総脂肪を含む藻類バイオマスから抽出および／または単離された脂質を含む食品、飼料、栄養または治療のサプリメントを提供する。本発明は、上昇したレベル（例えば、６７％超）の総脂肪を含む藻類バイオマスから抽出および／または単離された脂質の種類によって限定されない。いくつかの実施形態では、脂質は、ミリスチン酸、パルミチン酸、オレイン酸、リノール酸、α−リノレン酸（ＡＬＡ）、ステアリドン酸（ＳＤＡ）、エイコサトリエン酸、エイコサテトラエン酸、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）、クルパノドン酸、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、テトラコサペンタエン酸および／またはテトラコサヘキサエン酸を含む。好ましい実施形態では、脂質は、ＤＨＡおよび／またはパルミチン酸を含む。
【００７２】
いくつかの実施形態では、本発明は、脂質（例えば、本明細書において開示される脂質（例えば、ドコサヘキサエン酸））を調製するための方法であって、（例えば、５０ｇ／Ｌの炭素源（例えば、糖（例えば、グルコース））、１０ｇ／Ｌの酵母抽出物および４ｇ／Ｌの海塩を含有する）第１の培養培地で藻類株（例えば、シゾキトリウム・リマシナム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｌｉｍａｃｉｎｕｍ））を培養すること、および培養物を２５〜３５℃の範囲の温度で約７２〜１４４時間の期間にわたってインキュベーションすること；培養物を（例えば、５０ｇ／Ｌの炭素源（例えば、糖（例えば、グルコース））、約７．５ｇ／Ｌの酵母抽出物、約０．１５ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム、約０．１５ｇ／Ｌの塩化カルシウムおよび／または０．１５ｇ／Ｌの塩化マグネシウムを含有する）第２の培養培地に移すこと、および培養物を２５〜３５℃の範囲の温度で約２４〜４８時間の期間にわたってインキュベーションすること；培養物を（例えば、５０ｇ／Ｌの炭素源（例えば、糖（例えば、グルコース））、約７．５ｇ／Ｌの酵母抽出物、約０．１５ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム、約０．１５ｇ／Ｌの塩化カルシウムおよび／または０．１５ｇ／Ｌの塩化マグネシウムを含有する）第３の培養培地に移すこと、および培養物を２５〜３５℃の範囲の温度で約２４〜４８時間の期間にわたってインキュベーションすること；培養物を（例えば、５０ｇ／Ｌの炭素源（例えば、糖（例えば、グルコース））、約７．５ｇ／Ｌの酵母抽出物、約４．０ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム、約１ｇ／Ｌの尿素、約２ｇ／Ｌの塩化カルシウム、約２ｇ／Ｌの塩化マグネシウムおよび／または約０．２５ｇ／Ｌの一カリウムリン酸を含有する）第４の培養培地に移すこと、および培養物を２５〜３５℃の範囲の温度（例えば、３０℃）で約２４〜１９２時間（例えば、約３６、約３８、約４２、約４６、約６０、約７２、約８４、約９６、約１０８、約１２０、約１３２、約１４４、約１５６、約１６８、約１８０または約１９２時間）の期間にわたってインキュベーションすること；培養物から細胞バイオマスを分離すること；ならびに、バイオマスから脂質を抽出することを含む方法を提供する。
【００７３】
いくつかの実施形態では、本明細書において記載されるように、種々の栄養培地を使用して適切な容量および１００ｍｌ〜数十万リットルの範囲の容器、フラスコまたは大きい発酵槽で、（例えば、藻類バイオマスを製造するために成長させた）藻類培養物を成長させる。
【００７４】
さらに別の態様では、脂質を含有する細胞バイオマスの分離は、遠心分離、ろ過および／もしくはフロキュレーション、または類似技術を使用してなされる。好ましい実施形態では、遠心分離を使用して、培養物から藻類バイオマスを得る。さらに好ましい実施形態では、（例えば、上昇したレベルの脂質を含有する細胞の回収を可能にするために）遠心分離は、細胞培養物を冷やした後に行われる。いくつかの実施形態では、得られた藻類バイオマスを噴霧乾燥して使用する（例えば、動物飼料またはバイオ燃料の製造において直接使用する）。
【００７５】
一実施形態では、藻類は、異なる藻類種（例えば、本明細書において記載される藻類種の１つ以上）の混合物である。いくつかの実施形態では、上昇したレベルの総脂肪を含有する藻類バイオマスから抽出された上昇したレベルの総脂肪および／または脂質を含有する藻類バイオマスに、その他の起源、例えば限定されないが、植物起源に由来する脂質（例えば、多価不飽和脂肪酸）を補充する。
【００７６】
いくつかの実施形態では、上昇したレベルの総脂肪を含有する藻類バイオマスは、約６０〜９０％（例えば、約６５〜９０％、約６６〜８９％、約６７〜８８％、約６８〜８７％、約６８〜８６％、約６９〜８５％または約７０〜８０％）の範囲の濃度（ｗ／ｗ）で脂質を含む。したがって、上昇したレベルの脂質を含有する藻類バイオマスは、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８％２、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％などの濃度で脂質を含み得る。一実施形態では、上昇したレベルの総脂肪を含有する藻類バイオマスは、少なくとも６７％の濃度で脂質を含む。
【００７７】
いくつかの実施形態では、ＤＨＡは、総脂質／脂肪酸の１％〜７５％の範囲で、本発明の藻類バイオマス組成物中に含まれる。したがって、ＤＨＡは、総脂肪酸量の１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％などで組成物中に提供され得る。その他の実施形態では、ＤＨＡは、総脂肪酸量の１％〜５％、１％〜１０％、１％〜１５％、１％〜２０％、１％〜２５％、１％〜３０％、５％〜１０％、５％〜１５％、５％〜２０％、５％〜２５％、５％〜３０％、１０％〜１５％、１０％〜２０％、１０％〜２５％、１０％〜３０％、１５％〜２０％、１５％〜２５％、１５％〜３０％、２０％〜２５％、２０％〜３０％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％、７０％〜７５％などの範囲で組成物中に含まれ得る。
【００７８】
いくつかの実施形態では、パルミチン酸は、総脂質／脂肪酸の１％〜７５％の範囲で、本発明の藻類バイオマス組成物中に含まれる。したがって、パルミチン酸は、総脂肪酸量の１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％などで組成物中に提供され得る。その他の実施形態では、パルミチン酸は、総脂肪酸量の１％〜５％、１％〜１０％、１％〜１５％、１％〜２０％、１％〜２５％、１％〜３０％、５％〜１０％、５％〜１５％、５％〜２０％、５％〜２５％、５％〜３０％、１０％〜１５％、１０％〜２０％、１０％〜２５％、１０％〜３０％、１５％〜２０％、１５％〜２５％、１５％〜３０％、２０％〜２５％、２０％〜３０％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％、７０％〜７５％などの範囲で組成物中に含まれ得る。
【００７９】
本発明の追加の実施形態は、動物飼料添加物を生産する方法を含む。したがって、本発明の一態様は、藻類（例えば、藻類バイオマス）に由来する脂質を含む動物飼料添加物を生産する方法であって、藻類を培養して、所望の上昇したレベルの総脂肪（例えば、６７％超の総脂肪）を含有する藻類バイオマスを製造すること；および、藻類バイオマスから藻類脂質を抽出して、藻類油を製造すること；および／または、藻類バイオマスから水を除去して、約５重量％〜１００重量％の固形分を有する藻類バイオマスを製造することを含み；動物飼料添加物が藻類に由来する脂質を含む方法である。いくつかの実施形態では、藻類から採取された脂肪酸は、短鎖、中間または長鎖のω−３脂肪酸である。さらなる実施形態では、藻類バイオマスから抽出された藻類脂質を、約５重量％〜１００重量％の固形分を有する藻類バイオマスと組み合わせる。
【００８０】
本発明の飼料添加物をその他の食品成分と組み合わせて、加工食品または飼料製品（例えば、動物および／またはヒトの飼料製品）を製造できる。このようなその他の食品成分としては、１つ以上の酵素サプリメント、ビタミン食品添加物およびミネラル食品添加物が挙げられる。得られた（組み合わせた）飼料添加物を、適切な量で穀物および植物タンパク質などのその他の食品成分と混合して、加工食品を形成してもよい。これらの成分を加工食品に加工することは、通常使用されている任意の加工器具を使用して実施され得る。本発明の飼料／食品添加物はそれ自体で、ビタミン、ミネラル、その他の飼料酵素、農業副産物（例えば、コムギの中等品またはトウモロコシグルテン粉）を加えて、またはそれらと組み合わせて、食品／飼料中のサプリメントとして使用され得る。
【００８１】
さらなる態様では、本発明は、ω−３脂肪酸の増加した組織含有量を有する動物および／またはヒトを製造する方法であって、藻類から採取された脂質／脂肪酸を含む飼料添加物であって、（ａ）培養された藻類バイオマスから抽出された藻類脂質、および／または（ｂ）培養された藻類に由来する藻類バイオマスをさらに含む飼料添加物を動物／ヒトに与えることを含み、水が藻類バイオマスから除去されて約５〜１００重量％の固形分を達成しており、動物／ヒトが、ω−３脂肪酸の増加した組織含有量を示す方法を提供する。本発明は、本発明の組成物から恩恵を受け得る任意の特定の哺乳動物（例えば、動物またはヒト）に限定されない。実際、本発明の動物としては、限定されないが、卵、肉、乳またはその他の産物がヒトまたはその他の動物によって消費される任意の動物が挙げられる。したがって、本発明の動物としては、限定されないが、魚、家禽（ニワトリ、シチメンチョウ、アヒルなど）、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、肉牛および乳牛が挙げられる。
【００８２】
いくつかの実施形態では、本発明は、治療有効量の本発明の組成物を被験体に投与することによって、それを必要とする被験体における哺乳動物の疾患を処置するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、処置される哺乳動物の疾患としては、限定されないが、心臓血管疾患、炎症性疾患および種々の癌性疾患が挙げられる。その他の実施形態では、処置されるべき心臓血管疾患としては、限定されないが、高トリグリセリド血症、冠動脈心疾患、卒中、急性心筋梗塞およびアテローム性動脈硬化症が挙げられる。さらなる実施形態では、処置されるべき炎症性疾患としては、限定されないが、喘息、関節炎、アレルギー性鼻炎、乾癬、アトピー性皮膚炎、炎症性腸疾患、クローン病およびアレルギー性鼻結膜炎が挙げられる。さらにさらなる実施形態では、処置されるべき癌性疾患としては、限定されないが、前立腺癌、乳癌および結腸癌が挙げられる。追加の実施形態では、処置されるべき哺乳動物の疾患としては、精神障害が挙げられる。精神障害としては、限定されないが、鬱病、双極性障害、統合失調症が挙げられる。加えて、本発明の組成物は、認知機能を維持および／または増強するのに使用され得る。
【００８３】
いくつかの実施形態では、本発明は、上昇したレベルの総脂肪（例えば、６７％超の総脂肪）を含有する藻類バイオマスによって提供され、および／または前記藻類バイオマスから得られた脂質組成物の治療有効量を被験体に投与することによって、それを必要とする被験体における哺乳動物の疾患を処置する方法を提供する。処置から恩恵を受けると思われ得る被験体としては、限定されないが、鳥類および哺乳動物の被験体が挙げられる。本発明の哺乳動物としては、限定されないが、イヌ、ネコ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ブタ、齧歯類（例えば、ラットおよびマウス）、ウサギ、霊長類（非ヒト霊長類を含む）、ヒトなど、および子宮内の哺乳動物が挙げられる。本発明にしたがって処置されることを必要とする任意の哺乳動物被験体が適切である。本発明の哺乳動物としては、限定されないが、イヌ、ネコ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ブタ、齧歯類（例えば、ラットおよびマウス）、ウサギ、霊長類（非ヒト霊長類を含む）、ヒトなど、および子宮内の哺乳動物が挙げられる。本発明のいくつかの実施形態によれば、哺乳動物は、非ヒト哺乳動物である。いくつかの実施形態では、哺乳動物は、ヒト被験体である。両性および任意の発達段階（例えば、新生児、乳児、若年者、青年、成人）の哺乳動物被験体が、本発明にしたがって処置され得る。本発明の例示的な鳥類としては、ニワトリ、アヒル、シチメンチョウ、ガチョウ、ウズラ、キジ、走禽類（例えば、ダチョウ）、飼育されている鳥（例えば、オウムおよびカナリヤ）および卵内の鳥が挙げられる。
【００８４】
藻類
本明細書において記載される方法を使用して、上昇したレベルの総脂肪、または上昇したレベルの総脂肪を含有する藻類バイオマスを産生できる任意の藻類が、本発明の方法、組成物、食事サプリメント、バイオ燃料および／もしくはバイオ燃料前駆体、ならびに／または飼料添加物において使用され得る。したがって、いくつかの実施形態では、本発明の藻類は、スラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、渦鞭毛藻綱（Ｄｉｎｏｐｈｙｃｅａｅ）、クリプト藻綱（Ｃｒｙｐｔｏｐｈｙｃｅａｅ）、トレボウクシア藻綱（Ｔｒｅｂｏｕｘｉｏｐｈｙｃｅａｅ）、ピングイオ藻綱（Ｐｉｎｇｕｉｏｐｈｙｃｅａｅ）およびそれらの組み合わせから選択される。その他の実施形態では、本発明の藻類は、スラウストキトリウム・ストリアツム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｔｒｉａｔｕｍ）、スラウストキトリウム・ロゼウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ）、スラウストキトリウム・アウレウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ａｕｒｅｕｍ）、クリプテコジニウム・コーニー（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ  ｃｏｈｎｉｉ）、パリエトクロリス（Ｐａｒｉｅｔｏｃｈｌｏｒｉｓ）属種、ロドモナス（Ｒｈｏｄｏｍｏｎａｓ）属種、クリプトモナス（Ｃｒｙｐｔｏｍｏｎａｓ）属種、パリエトクロリス（Ｐａｒｉｅｔｏｃｈｌｏｒｉｓ）属種、ヘミセブニス（Ｈｅｍｉｓｅｂｎｉｓ）属種；ポルフィリジウム（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ）属種、グロッソマスティックス（Ｇｌｏｓｓｏｍａｓｔｉｘ）属種およびそれらの組み合わせから選択される。さらなる実施形態では、本発明の藻類は、パリエトクロリス・インシス（Ｐａｒｉｅｔｏｃｈｌｏｒｉｓ  ｉｎｃｉｓｅ）、ロドモナス・サリナ（Ｒｈｏｄｏｍｏｎａｓ  ｓａｌｉｎａ）、ヘミセルミス・ブルネセンス（Ｈｅｍｉｓｅｌｍｉｓ  ｂｒｕｎｅｓｃｅｎｓ）、ポルフィリジウム・クルエンタム（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ  ｃｒｕｅｎｔｕｍ）およびグロッソマスティックス・チリソプラスタ（Ｇｌｏｓｓｏｍａｓｔｉｘ  ｃｈｒｙｓｏｐｌａｓｔａ）ならびにそれらの組み合わせから選択される。さらにさらなる実施形態では、本発明の藻類は、シゾキトリウム・リマシナム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｌｉｍａｃｉｎｕｍ）である。
【００８５】
本発明のいくつかの実施形態では、藻類は、異なる藻類種の混合物である。その他の実施形態では、藻類は、単一の藻類種である。本発明のいくつかの実施形態では、藻類脂質／脂肪酸は、藻類油として提供される。その他の実施形態では、藻類脂質／脂肪酸は、藻類バイオマス（例えば、乾燥（例えば、粉末）バイオマス）として提供される。
【００８６】
さらに、本発明の藻類としては、限定されないが、野生型、突然変異体（天然または誘導されたもの）または遺伝子操作された藻類が挙げられる。好ましい実施形態では、本発明の方法、組成物、食事サプリメント、バイオ燃料もしくはバイオ燃料前駆体、および／または飼料添加物において使用される藻類は、遺伝子改変されていない生物である。本明細書において使用される「遺伝子改変された変異体」および「遺伝子改変された生物」という用語は、所望の結果が達成されるようにその通常（例えば、天然に存在する野生型）の形態から改変（例えば、突然変異、変化）されたゲノムを有する藻類株を指す。
【００８７】
加えて、本発明の藻類としては、野生型藻類の細胞と比較して厚みが減少した細胞壁であって、藻類の脂質画分の抽出性および／またはバイオアベイラビリティを改善する（例えば、藻類の易消化性および藻類バイオマスの細胞からの藻類脂質／脂肪酸の易抽出性を改善する）厚みが減少した細胞壁を持つ細胞を有する藻類が挙げられる。野生型藻類の細胞と比較して厚みが減少した細胞壁を持つ細胞を有する藻類は天然に存在するものでもよいし、突然変異したものでもよいし、および／または野生型の株と比較して厚みが減少した細胞壁を有するように遺伝子改変されたものでもよい。したがって、本発明の一実施形態では、藻類は、野生型藻類と比較して厚みが減少した細胞壁であって、藻類の脂質画分の抽出性および／またはバイオアベイラビリティを改善する厚みが減少した細胞壁を有する藻類である。減少した細胞壁を有する藻類を製造する方法としては、国際公開第２００６／１０７７３６Ａ１号パンフレット（これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に見られる方法が挙げられる。したがって、藻類は、限定されないが、化学薬剤または放射線を含む当業者に公知の突然変異原で突然変異誘発され得る。特定の実施形態では、化学的な突然変異原としては、限定されないが、メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）、メタンスルホン酸メチル（ＭＭＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−ニトロソウレア（ＥＮＵ）、トリエチルメラミン（ＴＥＭ）、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソウレア（ＭＮＵ）、プロカルバジン、クロラムブシル、シクロホスファミド、硫酸ジエチル、アクリルアミドモノマー、メルファラン、ナイトロジェンマスタード、ビンクリスチン、ジメチルニトロソアミン、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、ニトロソグアニジン、２−アミノプリン、７，１２ジメチル−ベンズ（ａ）アントラセン（ＤＭＢＡ）、エチレンオキシド、ヘキサメチルホスホラミド、ブスルファン、ジエポキシアルカン類（ジエポキシオクタン（ＤＥＯ）、ジエポキシブタン（ＢＥＢ）など）、２−メトキシ−６−クロロ−９（３−（エチル−２−クロロ−ｏ−エチルアミノプロピルアミノ（ｅｔｈｙｐａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌａｍｉｎｏ））アクリジン二塩酸塩（ＩＣＲ−１７０）、ホルムアルデヒドなどが挙げられる。放射線突然変異誘発の方法としては、限定されないが、ｘ線、ガンマ線照射、紫外線などが挙げられる。
【００８８】
細胞壁突然変異体は、界面活性剤感受性の増加に基づいて、または細胞壁の厚みの変化を顕微鏡観察することによって（例えば、国際公開第２００６／１０７７３６Ａ１号パンフレットを参照のこと）、または細胞壁の厚みの減少もしくは細胞壁の完全性の低下を検出するための当技術分野において公知の任意のその他の方法によって選択され得る。
【００８９】
実施例１〜実施例３に記載されている技術にしたがって、本発明の藻類を培養し得る。
【００９０】
したがって、いくつかの実施形態では、１０℃〜３５℃の範囲の温度で藻類を培養する。したがって、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃などの温度で藻類を培養し得る。その他の実施形態では、２０℃〜３５℃の範囲で藻類を成長させ得るが、より冷たい（例えば、２０℃未満）およびより温かい（例えば、３５℃超）ものを使用してもよい。好ましい実施形態では、約３０℃で藻類を成長させる。
【００９１】
いくつかの実施形態では、培養後に藻類を回収する。いくつかの実施形態では、藻類の回収は、限定されないが、遠心分離、フロキュレーションまたはろ過を含む当業者に公知の通常の手順を使用して実施される。好ましい実施形態では、回収前に藻類培養物を冷却し、それにより、上昇したレベルの総脂肪を含有する藻類細胞をうまく回収することを可能にする。次いで、回収された藻類細胞または藻類バイオマスは脂質／脂肪酸源として直接使用することもできるし、脂質／脂肪酸を含む藻類油を得るために抽出することもできる。藻類バイオマスが直接使用されるべきものであるいくつかの実施形態では、藻類バイオマスから水を除去して、約５〜１００重量パーセントの固形分を達成する。追加の実施形態では、直接使用されるべき藻類バイオマスは、細胞内の藻類油の抽出性および／またはバイオアベイラビリティを高めるために少なくとも部分的に破壊されている細胞壁をさらに含む藻類細胞から構成される。藻類細胞の破壊は、限定されないが、沸騰水による細胞処理を含む公知技術にしたがって、または機械的破壊、例えば粉砕、微粉砕、超音波処理もしくはフレンチプレス、または当業者に公知の任意のその他の方法によって実施され得る。
【００９２】
藻類バイオマスを直接使用する場合、藻類バイオマスから水を除去して、約５〜１００％の固形分を達成する。したがって、いくつかの実施形態では、藻類バイオマスから水を除去して、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％などの固形分を達成する。追加の実施形態では、藻類バイオマスから水を除去して、約５％〜５０％、５％〜６０％、５％〜７０％、５％〜８０％、５％〜９０％、５％〜９５％、１０％〜３０％、１０％〜４０％、１０％〜５０％、１０％〜６０％、１０％〜６５％、１０％〜７０％、１０％〜７５％、１０％〜８０％、１０％〜８５％、１０％〜９０％、１０％〜９５％、１０％〜１００％、１５％〜４０％、１５％〜５０％、１５％〜６０％、１５％〜６５％、１５％〜７０％、１５％〜７５％、１５％〜８０％、１５％〜８５％、１５％〜９０％、１５％〜９５％、１５％〜１００％、２０％〜５０％、２０％〜６０％、２０％〜６５％、２０％〜７０％、２０％〜７５％、２０％〜８０％、２０％〜８５％、２０％〜９０％、２０％〜９５％、２０％〜１００％、２５％〜５０％、２５％〜６０％、２５％〜７０％、２５％〜７５％、２５％〜８０％、２５％〜８５％、２５％〜９０％、２５％〜９５％、２５％〜１００％、３０％〜５０％、３０％〜６０％、３０％〜７０％、３０％〜７５％、３０％〜８０％、３０％〜８５％、３０％〜９０％、３０％〜９５％、４５％〜１００％、５０％〜７０％、５０％〜７５％、５０％〜８０％、５０％〜８５％、５０％〜９０％、５０％〜９５％、５０％〜１００％、５５％〜７５％、５５％〜８０％、５５％〜８５％、５５％〜９０％、５５％〜９５％、５５％〜１００％、６０％〜７５％、６０％〜８０％、６０％〜８５％、６０％〜９０％、６０％〜９５％、６０％〜１００％、７０％〜８０％、７０％〜８５％、７０％〜９０％、７０％〜９５％、７０％〜１００％、７５％〜８５％、７５％〜９０％、７５％〜９５％、７５％〜１００％、８０％〜８５％、８０％〜９０％、８０％〜９５％、８０％〜１００％、８５％〜９０％、８５％〜９５％、８５％〜１００％、９０％〜９５％、９５％〜１００％などの範囲の固形分を達成する。
【００９３】
いくつかの実施形態では、バイオマスの藻類細胞を破壊または溶解し、藻類脂質を抽出する。藻類細胞を通常の技術にしたがって湿式抽出または乾式抽出して、脂質／脂肪酸を含有する組成物を製造し得る。藻類細胞の破壊または溶解は、限定されないが、沸騰水による細胞処理を含む通常の技術にしたがって、または機械的破壊、例えば粉砕、微粉砕、超音波処理もしくはフレンチプレス、または任意のその他の公知の方法によって行われ得る。溶解細胞からの脂質／脂肪酸の抽出は、公知の藻類およびその他の生物を用いて使用される標準的な手順であって、限定されないが、細胞溶解後に固体相から液体相を分離すること、溶媒の追加によって液体相中の脂質／脂肪酸を抽出すること、溶媒を蒸発させること、および溶解細胞の液体相から得られた脂質／脂肪酸を回収することを含む標準的な手順に従う。
【００９４】
本発明は、抽出に使用される任意の特定の溶媒に限定されない。溶媒としては、限定されないが、ヘキサン、クロロホルム、エタノール、メタノール、イソプロパノール、ジエチルエーテル、ジオキサン、イソプロピルエーテル、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン、石油エーテルおよびそれらの組み合わせが挙げられる。
【００９５】
いくつかの実施形態では、本発明の藻類バイオマスに由来する脂質／脂肪酸は、（例えば、本明細書において記載される方法、組成物、バイオ燃料、食品製品、食事サプリメント、飼料添加物またはその他の組成物において使用するために）遊離脂肪酸、コレステロールエステル、塩エステル、脂肪酸エステル、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、ジアシルグリセロール、モノグリセロール、スフィンゴリン脂質、スフィンゴ糖脂質またはそれらの任意の組み合わせの形態で提供され得る。
【００９６】
藻類バイオマスを調製するための方法
いくつかの実施形態では、本発明は、上昇したレベルの総脂肪（例えば、６７％超の脂質）を含む藻類バイオマスを調製するための方法であって、上昇したレベルの総脂肪（例えば、６７％超の脂質）を含む藻類バイオマスを提供するのに十分な培養条件下で藻類を培養することを含み、藻類の対数増殖期終了時に藻類バイオマスを回収する方法を提供する（例えば、実施例１および実施例２を参照のこと）。本明細書において使用される「対数増殖期」という用語は、藻類細胞の数が指数関数的に増加することを特徴とする培養段階を指す。一般に、培養系では、接種の後に、誘導期、指数または「対数増殖期」、負の増殖加速期およびプラトーまたは「定常期」を含む特徴的な成長パターンがある。例えば、対数増殖期では、藻類の成長が続くにつれて、細胞は細胞分裂の最大速度に達し得、細胞数は時間との関係で対数的に増加する。対数期開始後の期間内に、細胞分裂の速度は低下し始め得、細胞の一部は死に始め得る。これは、線が徐々に横ばいになって成長曲線に反映される。最終的には、細胞死の速度は細胞分裂の速度と本質的に同等になり、総生存数は一定期間にわたって同じ状態であり続け得る。これは定常期またはプラトー期として公知であり、成長曲線上では、傾きがゼロに近づいている横ばいの線として表される。好ましい実施形態では、（例えば、培養液中の汚染微生物（例えば、酵母、細菌、ウイルスなど）の混入および／または成長を防止するために）無菌条件下で藻類バイオマスを培養する。
【００９７】
いくつかの実施形態では、培養条件は、藻類が、上昇したレベルの総脂肪（例えば、ｗ／ｗ基準で６７％超）を産生するのに十分なものである。培養条件は、藻類を成長させ、それにより上昇したレベルの総脂肪（例えば、ｗ／ｗ基準で６７％超）を含む藻類バイオマスを提供するのに適切な培養培地を含む。適切な培養培地は、本明細書において記載される。培地は、塩、ビタミン、ミネラル、金属およびその他の栄養分も含み得る。好ましくは、培養条件は、上昇したレベルの総脂肪を含む藻類バイオマスを生成する条件下で藻類が成長するのに適切な量の栄養分および温度を提供するのに十分なものである。
【００９８】
いくつかの実施形態では、培養は、総脂肪量を増加させるのに適切な時間にわたって栄養分（例えば、窒素、リン）を制限することを含む。例えば、培養液をある種の栄養分について欠乏させることもできるし、特定の栄養分を含まない別個の培養培地（例えば、無リン培地もしくは無窒素培地、またはより低レベルの栄養分を含有する培養培地）に移すこともできる。いくつかの実施形態では、培養培地は、栄養分が、指数増殖のより遅い時期であってその他の栄養分の枯渇前に枯渇することになるように、初期量の栄養分を含有する。いくつかの実施形態では、培養は、培養中に栄養分（例えば、窒素、リン）を制限することを含まない。いくつかの実施形態では、単一の藻類バイオマスの培養は、２種類以上の培地で連続的に行われる。いくつかの実施形態では、単一の藻類バイオマスの培養は、３種類以上の培地で連続的に行われる。同様に、単一の藻類バイオマスの培養は２つ以上の容器で行われてもよく、この場合には第１の容器を使用して次の容器に接種し、前記次の容器を使用してさらに別の次の容器に接種するなどする。本発明を実施するために機序を理解する必要はなく、本発明は任意の特定の作用機序に限定されないが、いくつかの実施形態では、複数の種類の培地を含有する複数の容器で単一の藻類バイオマスを連続的に培養することは、単一の容器および／または成長培地で成長させた（例えば、同じ藻類種の）藻類バイオマスの成長と比較してバイオマスの総脂肪含有量が上昇するような形で、藻類バイオマスが成長することを可能にする。
【００９９】
藻類の培養は、藻類を培養して藻類バイオマスを提供するのに適切な通常のバイオリアクタで実施され得る。例えば、限定されないが、バッチ、フェドバッチ、細胞リサイクルおよび連続発酵を含む方法によって、藻類を培養し得る。好ましい実施形態では、フェドバッチ法で藻類を培養する。
【０１００】
本発明は、培養培地からの藻類の回収について任意の特定の様式または方法に限定されない。培養培地から藻類細胞を回収するために、様々な方法が使用され得る。一実施形態では、回収は、分離によって、例えばろ過（例えば、ベルトろ過、回転円筒型ろ過）および／または遠心分離によって、培養培地から藻類バイオマスを回収することを含む。次いで、所望により、回収された藻類細胞を非酸化雰囲気ガス（例えば、ＣＯ２、Ｎ２）下で、洗浄、凍結、リョフィリゼーション、噴霧乾燥、および／または保存して、Ｏ２の存在を減少または排除できる。場合により、限定されないが、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロキノン（ＴＢＨＱ）、エトキシキン、β−カロチン、ビタミンＥおよびビタミンＣを含む合成および／または天然の抗酸化剤を、回収された細胞に追加することもできる。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、本発明は、上昇したレベルの総脂肪を含む藻類バイオマスを調製するための方法であって、上昇したレベルの総脂肪を含む藻類バイオマスを提供するのに十分な培養条件下で藻類を培養すること、および藻類バイオマスを回収することを含む方法を提供する。
【０１０２】
微細藻類バイオマス
いくつかの実施形態では、本発明は、（例えば、バイオ燃料の製造において、および／または食品もしくは飼料製品として使用するための）藻類バイオマスならびに／またはその画分および／もしくは抽出物を提供する。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、藻類バイオマスは、バイオマス乾燥重量の少なくとも１０％、例示的にはバイオマス乾燥重量の約１０％〜約５０％、約１０％〜約４０％、約１０％〜約３０％、約１０％〜約２０％のω−３脂肪酸含有量を含む。一実施形態では、藻類バイオマスは、本発明の方法にしたがって調製される。例えば、いくつかの実施形態では、藻類バイオマスは、上昇した総脂肪レベル（例えば、６７％ｗ／ｗ超）を含む藻類バイオマスを提供するのに十分な培養条件下で藻類を培養することを含む方法であって、負の増殖加速期（ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｏｎ  ｐｈａｓｅ）または定常期に藻類バイオマスを回収する方法によって調製される。別の実施形態では、指数対数増殖期に培養物から藻類バイオマスを回収する。
【０１０４】
藻類バイオマスから調製された脂質組成物
いくつかの実施形態では、本発明は、上昇したレベルの総脂肪を含有するための条件下で成長させた藻類バイオマスから脂質／脂肪酸抽出物（例えば、脂質／脂肪酸組成物）を調製するための方法であって、上昇した総脂肪含有量（例えば、バイオマスの６７％超の総脂肪含有量）を有する藻類バイオマスを提供するのに十分な培養条件下で培養された藻類バイオマスから脂質を得ることを含み、藻類の負の増殖加速期または定常期に藻類バイオマスを回収する方法を提供する。別の実施形態では、藻類の対数増殖期に藻類バイオマスを回収する。
【０１０５】
本発明の藻類バイオマスから脂質組成物を得るための方法としては、限定されないが、抽出、加熱、圧力、鹸化、超音波処理、凍結、粉砕、イオン交換、クロマトグラフィー、膜分離、電気透析、逆浸透、蒸留、化学的誘導体化、結晶化などが挙げられる。例えば、藻類脂質は、限定されないが、溶媒（限定されないが、エタノール、酢酸エチル、イソプロピルアルコール、メタノール、酢酸エチル、ヘキサン、塩化メチレン、メタノール、石油、クロロホルムなどを含む）による抽出、または加圧液体炭化水素、例えばブタン、ペンタン、プロパンもしくはその他のもの（共溶媒の有無にかかわらず）、または超臨界流体抽出（共溶媒の有無にかかわらず）を含む任意の適切な方法によって、藻類細胞から抽出され得る。場合により、抽出された脂質／脂肪酸油を減圧下で蒸発させて、溶媒を減少または除去し、および／または濃縮脂質物質の試料を製造する。その他の実施形態では、（例えば、バイオ燃料またはバイオ燃料前駆体として使用するために）細胞を破壊または溶解して、例えば油の形態の脂質組成物を得る。いくつかの実施形態では、抽出された油を精製に供する。本発明は、精製の種類によって限定されない。いくつかの実施形態では、抽出された油を化学的に精製する。いくつかの実施形態では、抽出された油を物理的に精製する。いくつかの実施形態では、抽出された油を化学的および物理的に精製する。（例えば、藻類細胞の総脂肪含有量を（例えば、６７％超に）上昇させるための条件下で成長させた藻類バイオマスから）抽出された油は、任意の通常の精製方法を使用して精製してもよい。精製方法は、抽出された脂質／脂肪酸／油から一部または全部の不純物を除去し得る。いくつかの実施形態では、精製方法は、抽出された脂質／脂肪酸／油を脱ガム、漂白、ろ過、脱臭および／または研磨する１つ以上の工程を含む。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、抽出された脂質組成物に含まれる脂質／脂肪酸／油は、例えば、尿素付加、分留、カラムクロマトグラフィー、および／または超臨界流体分画などの方法を用いて、脂質を加水分解して脂質画分に濃縮することによって濃縮する。
【０１０７】
したがって、一実施形態では、本発明の藻類バイオマスから脂質組成物を得る工程は、バイオマスから脂質組成物を抽出することを含む。別の実施形態では、本発明の藻類バイオマスから脂質組成物を得る工程は、バイオマスを極性溶媒と接触させることを含む。
【０１０８】
例えば、いくつかの実施形態では、脂質および／または脂肪酸を抽出するのに十分であるが、溶媒に不溶の化合物を抽出するのには十分ではない抽出条件下で溶媒を使用して、藻類バイオマスから脂質／脂肪酸／油を抽出して、脂質組成物を提供する。一実施形態では、本発明の藻類バイオマスから脂質／脂肪酸組成物を抽出し、脂質／脂肪酸および溶媒を含有する画分から、細胞の残骸および／または沈殿した不溶性化合物を分離する。別の実施形態では、この方法は、ろ過、遠心分離および／またはそれらの組み合わせなどの分離方法を使用して、細胞の残骸および沈殿した化合物を分離することをさらに含む。いくつかの実施形態では、細胞の残骸および／または沈殿した不溶性化合物（例えば、溶媒に不溶の藻類バイオマスの部分（例えば、タンパク質、繊維など））を回収して（例えば、食品または飼料製品において）利用する。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、溶媒は、極性溶媒である。極性溶媒の例としては、限定されないが、エタノール、酢酸エチル、イソプロピルアルコール、メタノール、酢酸エチルおよびそれらの混合物が挙げられる。一実施形態では、極性溶媒は、エタノールである。溶媒による脂質組成物の抽出は、様々な方法で行われ得る。例えば、抽出は、バッチ法、連続方法、連続向流方法であり得る。連続向流方法では、微細藻類と接触している溶媒が油を溶媒に浸出させ、次第に多くの溶媒−油画分を提供する。抽出後、当技術分野において公知の方法を使用して、溶媒を除去し得る。例えば、蒸留、回転蒸発、もしくは上昇薄膜蒸発器および蒸気ストリッパー、または任意の適切な脱溶媒器が、溶媒を除去するのに使用され得る。
【０１１０】
一実施形態では、抽出された脂質／脂肪酸を吸収工程（例えば、漂白）に曝露して、存在し得る１つ以上の望ましくない化合物、例えば色素体および／またはホスファチドなどを除去する。いくつかの実施形態では、吸収工程は、脂質／脂肪酸抽出物を漂白物質（例えば、中性の土（例えば、自然粘土またはフーラ土）、酸活性化土、活性炭、活性粘土、ケイ酸塩および／またはそれらの組み合わせ）と接触させることを含む漂白工程である。本発明は、用いられる漂白物質の量によって限定されない。
【０１１１】
一実施形態では、抽出された脂質／脂肪酸を脱ガム工程に曝露する。脱ガム方法は当技術分野において公知であり、例えば、水脱ガム、酸脱ガム、酵素脱ガムおよび膜脱ガムが挙げられる。いくつかの実施形態では、（例えば、吸収工程の後に）脂質／脂肪酸抽出物組成物中に存在し得るガムおよび／またはクロロフィル型化合物を沈殿させるのに有効な量の酸性水溶液混合物と脂質／脂肪酸抽出物を接触させることを含む脱ガムに脂質／脂肪酸抽出物を供する。本発明は、用いられる酸性水溶液の種類または量によって限定されない。一実施形態では、酸性水溶液混合物は、硫酸および／またはリン酸を含む。別の実施形態では、等量の酸性水溶液を脂質組成物と混合する。好ましい実施形態では、油と混合する場合、酸性水溶液は、酸性ｐＨを提供するのに十分な量である。酸との混合後に形成される沈殿物は、例えば、遠心分離および／またはろ過（例えば、膜ろ過）を使用して、脂質組成物から除去され得る。いくつかの実施形態では、脱ガムされた脂質／脂肪酸抽出物組成物を（例えば、組成物の含水量を減少させるために）乾燥に供する。本発明は、乾燥条件（例えば、時間、温度および／または真空条件）によって限定されない。本明細書において記載されるように、いくつかの実施形態では、乾燥された脂質／脂肪酸組成物の含水量は、約１０％ｗ／ｗ未満（例えば、約９、８、７、６、５、４、３、２、１、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、０．１、０．０５または０．０１％ｗ／ｗ未満）である。
【０１１２】
脂質組成物
いくつかの実施形態では、本発明は、本発明の藻類バイオマスから調製された脂質組成物を提供する。いくつかの実施形態では、脂質組成物は、本発明の方法にしたがって調製される。例えば、いくつかの実施形態では、脂質組成物は、スラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属の藻類に由来する藻類バイオマスまたはその一部／画分である。いくつかの実施形態では、藻類バイオマスは、渦鞭毛藻綱（Ｄｉｎｏｐｈｙｃｅａｅ）、クリプト藻綱（Ｃｒｙｐｔｏｐｈｙｃｅａｅ）、トレボウクシア藻綱（Ｔｒｅｂｏｕｘｉｏｐｈｙｃｅａｅ）、ピングイオ藻綱（Ｐｉｎｇｕｉｏｐｈｙｃｅａｅ）属および／またはそれらの組み合わせから選択される藻類を含む。その他の実施形態では、藻類バイオマスは、スラウストキトリウム・ストリアツム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｔｒｉａｔｕｍ）、スラウストキトリウム・ロゼウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ）、スラウストキトリウム・アウレウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ａｕｒｅｕｍ）、クリプテコジニウム・コーニー（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ  ｃｏｈｎｉｉ）、パリエトクロリス（Ｐａｒｉｅｔｏｃｈｌｏｒｉｓ）属種、ロドモナス（Ｒｈｏｄｏｍｏｎａｓ）属種、クリプトモナス（Ｃｒｙｐｔｏｍｏｎａｓ）属種、パリエトクロリス（Ｐａｒｉｅｔｏｃｈｌｏｒｉｓ）属種、ヘミセブニス（Ｈｅｍｉｓｅｂｎｉｓ）属種；ポルフィリジウム（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ）属種、グロッソマスティックス（Ｇｌｏｓｓｏｍａｓｔｉｘ）属種および／またはそれらの組み合わせから選択される藻類を含む。さらなる実施形態では、藻類バイオマスは、パリエトクロリス・インシス（Ｐａｒｉｅｔｏｃｈｌｏｒｉｓ  ｉｎｃｉｓｅ）、ロドモナス・サリナ（Ｒｈｏｄｏｍｏｎａｓ  ｓａｌｉｎａ）、ヘミセルミス・ブルネセンス（Ｈｅｍｉｓｅｌｍｉｓ  ｂｒｕｎｅｓｃｅｎｓ）、ポルフィリジウム・クルエンタム（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ  ｃｒｕｅｎｔｕｍ）およびグロッソマスティックス・チリソプラスタ（Ｇｌｏｓｓｏｍａｓｔｉｘ  ｃｈｒｙｓｏｐｌａｓｔａ）ならびにそれらの組み合わせから選択される藻類を含む。好ましい実施形態では、藻類バイオマスは、シゾキトリウム・リマシナム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｌｉｍａｃｉｎｕｍ）を含む。
【０１１３】
食品製品および動物飼料添加物
いくつかの実施形態では、全細胞藻類バイオマス、その画分および／または抽出物は、（例えば、哺乳動物による消費（例えば、ヒトまたは動物の消費））のために、または（例えば、食品の脂質含有量および／または栄養成分を増加させるための）食品添加物として使用される。例えば、いくつかの実施形態では、動物飼料（例えば、ウシ飼料、酪農飼料、水産養殖飼料、家禽飼料など）として使用する場合、本発明の藻類バイオマスによって産生される脂質／脂肪酸を食品製品（例えば、動物飼料）に組み込む。いくつかの実施形態では、全細胞藻類バイオマス、その画分および／または抽出物は、薬学的または栄養学的な目的で、および／または工業用途に使用される。
【０１１４】
全細胞藻類バイオマス、その画分および／または抽出物は、特定の適用または用途に適切な様々な形態／組成物のいずれか１つで提供され得る。いくつかの実施形態では、全細胞藻類バイオマス、その画分および／または抽出物が提供される。別の実施形態では、全細胞藻類バイオマス、その画分および／または抽出物は、粉末形態で、または液体形態の遊離油（例えば、脂質組成物またはその画分または濃縮物）として提供される。全細胞藻類バイオマス、その画分および／または抽出物は、ヒトおよび／または動物の消費に使用され得る。例えば、いくつかの実施形態では、全細胞藻類バイオマス、その画分および／または抽出物は、飼料、食事サプリメント、食品、医薬製剤、乳製品および／または調整粉乳として提供されるか、またはこれらに組み込まれる。
【０１１５】
例えば、一実施形態では、全細胞藻類バイオマス、その画分および／または抽出物を乾燥（例えば、噴霧乾燥、トンネル乾燥、真空乾燥）させ、肉および／または産物がヒトまたは動物（例えば、愛玩動物、家畜）によって消費される任意の動物または水産養殖の生物（例えば、魚、エビ、カニ、ロブスタなど）用の飼料または食品サプリメントとして使用する。別の実施形態では、全細胞藻類バイオマス、その画分および／または抽出物を乾燥脱水剤（例えば、粉砕トウモロコシなどの粉砕穀物）と混合する。
【０１１６】
本明細書において記載される組成物は、完全な食品製品として、食品製品の成分として、食事サプリメントとしてまたは食事サプリメントの一部として、飼料添加物として使用してもよいし、液体、半固体または固体のいずれかの形態でもよい。加えて、本発明の組成物は、医薬組成物の形態であり得る。本発明の組成物、食事サプリメント、食品製品、乳児用食品製品、飼料添加物および／または医薬組成物は、個体の健康を増進するための方法において用いられ得る。組成物は、液体、半固体または固体の形態であり得る。例えば、組成物は、錠剤、ゲルパック、カプセル剤、ゼラチンカプセル剤、味付きの飲料、このような飲料に再構成できる粉末、調理用油、サラダ油またはドレッシング、ソース、シロップ、マヨネーズ、マーガリンなどとして投与され得る。さらに、本発明の食品製品、食事サプリメントなどとしては、限定されないが、乳製品、乳児用食品、調整粉乳、飲み物、バー、粉末、食品のトッピング、飲料、シリアル、アイスクリーム、飴、スナックミックス、焼いた食品製品および揚げた食品製品が挙げられ得る。本発明の飲み物としては、限定されないが、エネルギー飲料、栄養補助飲料、スムージ、スポーツ飲料、オレンジジュースおよびその他のフルーツ飲料が挙げられる。本発明のバーとしては、限定されないが、調理済みの食べ物、栄養バー、スナックバーおよびエネルギーバー、押し出しバーなどが挙げられる。本発明の乳製品としては、限定されないが、ヨーグルト、ヨーグルト飲料、チーズおよび乳が挙げられる。経口投与を目的とする組成物は、食事サプリメントまたは医薬調製物を製造するための任意の公知の方法によって調製してもよく、栄養学的または薬学的に好ましい調製物を提供するために、このような組成物は、味を改善する物質、例えば甘味剤または香味剤、安定剤、乳化剤、着色剤および保存剤からなる群より選択される少なくとも１つの添加物を含み得る。任意の生理学的に許容される供給源に由来するビタミン、ミネラルおよび微量元素も、本発明の組成物に含まれ得る。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物は、本発明の組成物を治療有効量で含む。本発明の組成物は、公知の調剤技術にしたがって投与用に製剤化され得る。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（９ｔｈ  Ｅｄ．１９９５）を参照のこと。本発明の医薬組成物の製造では、脂質組成物（その生理学的に許容される塩を含む）は、典型的には、とりわけ、許容される担体と混合される。担体は、製剤中の任意のその他の成分と適合するものであり、被験体に有害であってはならない。
【０１１８】
バイオ燃料
藻類からバイオ燃料を生産するための既存技術の多くは、市場において、有意義な割合の石油ディーゼルに取って代わるのに必要とされる規模で稼動する場合、高価で非効率であり、維持できない。藻類を回収して加工するためのエネルギーの供給と支出は、過小評価されることが多い。従来法で藻類からバイオディーゼルを製造するためには、典型的には、水中濃度約０．２ｇ／Ｌの培養物から藻類を回収する。次いで、回収された藻類を脱水して藻類濃度を増加させ、固形物約１５％の藻類ペーストを形成させる。次いで、水を蒸発させることによって、このペーストを完全に乾燥させる。次いで、ヘキサンなどの有機溶媒を用いて乾燥藻類から油を抽出し、蒸留によって藻類油から有機溶媒を除去する。藻類からバイオディーゼルを生成するためのこの従来方法は、法外に高価である。
【０１１９】
例えば、藻類が自然水域で成長する場合、水の容量を考慮すると、藻類バイオマスは比較的希薄である。１ガロンの油を製造するためには、約２０，０００〜４０，０００ガロンの水の処理を必要とする。このような大容量の水を輸送および処理するエネルギーコストは高い。例として、質量の２５％を脂質として有する藻類を２５ｇ／ｍ２／日で製造できる場合、油を２，５００ガロン／エーカ／年で製造することができるであろう。この例では、２，５００ガロンの油を製造するためには、５０００万ガロンの水を処理しなければならない。水を中央集積脱水施設にポンピングする標準的な手法は、全く非常にエネルギーを大量消費し、法外な費用がかかる。例として、２０００万ｇａｌ／年を製造した比較的小さい藻類油施設は、油製品に含まれるエネルギーよりも多くのエネルギーを消費して、水を池から中央施設にポンピングする結果、エネルギー収支が正味で負になるであろう。
【０１２０】
したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、上昇したレベルの総脂肪を含有するための条件下で成長させた藻類バイオマスから藻類バイオマスおよび／または脂質／脂肪酸抽出物（例えば、脂質／脂肪酸組成物）を調製するための方法であって、上昇した総脂肪含有量（例えば、バイオマスの６７％超の総脂肪含有量）を有する藻類バイオマスを提供するのに十分な培養条件下で培養された藻類バイオマスから脂質を得ることを含み、藻類の負の増殖加速期または定常期に藻類バイオマスを回収する方法を提供する。別の実施形態では、藻類の対数増殖期に藻類バイオマスを回収する。本発明の藻類バイオマスから脂質組成物を得るための方法は、本明細書において記載される。
【０１２１】
したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、本発明の方法にしたがって生成された藻類培養物および／または藻類バイオマスに由来する脂質、炭化水素またはその両方を含むバイオ燃料原料またはバイオ燃料を提供する。いくつかの実施形態では、脂質またはそれを含む藻類組成物は、極性にしたがって中性脂質および極性脂質に細分される。主な中性脂質は、トリグリセリドならびに遊離飽和脂肪酸および遊離不飽和脂肪酸である。主な極性脂質は、糖脂質およびリン脂質などのアシル脂質である。いくつかの実施形態では、本発明の脂質および炭化水素を含む組成物は、組成物中に存在する脂肪酸および／または炭化水素の種類および相対量によって説明および区別される。いくつかの実施形態では、本発明の藻類組成物中に存在する炭化水素はほとんどが直鎖状アルカンおよびアルケンであり、最大３６個の炭素原子を有するパラフィンなどを含み得る。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、本発明は、液体燃料を生産する方法であって、本明細書において記載される藻類培養物および／もしくは藻類バイオマスまたはそれらの脂質画分に由来する脂質を処理することを含む方法を提供する。藻類に由来するバイオ燃料原料の処理によって生産される本発明の製品は、限定されないが、ディーゼル、バイオディーゼル、灯油、ジェット燃料、ガソリン、ＪＰ−１、ＪＰ−４、ＪＰ−５、ＪＰ−６、ＪＰ−７、ＪＰ−８、耐熱性ジェット推進薬（ＪＰＴＳ：Ｊｅｔ  Ｐｒｏｐｅｌｌａｎｔ  Ｔｈｅｒｍａｌｌｙ  Ｓｔａｂｌｅ）、フィッシャー・トロプシュ液、エタノール含有輸送燃料を含むアルコール系燃料、セルロースバイオマス系輸送燃料を含むその他のバイオマス系液体燃料を含む様々な液体燃料に組み込むこともできるし、使用することもできる。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、藻類油中のトリアシルグリセリドは、例えば、塩基触媒エステル交換法を使用することによって、脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ：ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｍｅｔｈｙｌ  ｅｓｔｅｒｓまたはバイオディーゼル）に変換される（概要については、例えば、Ｋ．Ｓｈａｉｎｅ  Ｔｙｓｏｎ，Ｊｏｓｅｐｈ  Ｂｏｚｅｌｌ，Ｒｏｂｅｒｔ  Ｗａｌｌａｃｅ，Ｅｕｇｅｎｅ  Ｐｅｔｅｒｓｅｎ，ａｎｄ  Ｌｕｃ  Ｍｏｅｎｓ，“Ｂｉｏｍａｓｓ  Ｏｉｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｎｅｅｄｓ  ａｎｄ  Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ”，ＮＲＥＬ／ＴＰ−５１０−３４７９６，Ｊｕｎｅ  ２００４（これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。いくつかの実施形態では、ＮａＯＨの存在下、６０℃でトリアシルグリセリドをメタノールと２時間反応させて、脂肪酸メチルエステル（バイオディーゼル）およびグリセロールを生成する。さらなる実施形態では、バイオディーゼルおよびグリセロール副産物は不混和性であり、典型的には、デカントまたは遠心分離した後に洗浄および精製することによって終了段階で分離される。遊離脂肪酸（ＦＦＡ：ｆｒｅｅ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ）はトリグリセリドの天然加水分解産物であり、トリアシルグリセリドおよび水を反応させることによって形成される。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、遊離脂肪酸の生成を好ましくは１％未満に制限するために、当技術分野において公知の技術によって、藻類油を急速かつ実質的に乾燥させるための工程をさらに含む。本発明の別の実施形態では、この方法は、当技術分野において公知の技術によって、遊離脂肪酸を変換または除去するための工程をさらに含み得る。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、藻類油中のトリアシルグリセリドは、酸触媒エステル交換、酵素触媒エステル交換または超臨界メタノールエステル交換によって、脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ：ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｍｅｔｈｙｌ  ｅｓｔｅｒｓまたはバイオディーゼル）に変換される。超臨界メタノールエステル交換は、触媒を必要としない（例えば、Ｋｕｓｄｉａｎａ，Ｄ．ａｎｄ  Ｓａｋａ，Ｓ．，“Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｗａｔｅｒ  ｏｎ  ｂｉｏｄｉｅｓｅｌ  ｆｕｅｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｓｕｐｅｒｃｒｉｔｉｃａｌ  ｍｅｔｈａｎｏｌ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，”Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９１（２００４），２８９−２９５；Ｋｕｓｄｉａｎａ，Ｄ．ａｎｄ  Ｓａｋａ，Ｓ．，“Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒａｐｅｓｅｅｄ  ｏｉｌ  ｔｏ  ｂｉｏｄｉｅｓｅｌ  ｆｕｅｌ  ａｓ  ｔｒｅａｔｅｄ  ｉｎ  ｓｕｐｅｒｃｒｉｔｉｃａｌ  ｍｅｔｈａｎｏｌ，”Ｆｕｅｌ  ８０（２００１），６９３−６９８；Ｓａｋａ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｋｕｓｄｉａｎａ，Ｄ．，“Ｂｉｏｄｉｅｓｅｌ  ｆｕｅｌ  ｆｒｏｍ  ｒａｐｅｓｅｅｄ  ｏｉｌ  ａｓ  ｐｒｅｐａｒｅｄ  ｉｎ  ｓｕｐｅｒｃｒｉｔｉｃａｌ  ｍｅｔｈａｎｏｌ，”Ｆｕｅｌ  ８０（２００１），２２５−２３１を参照のこと）。超臨界メタノール中の反応は、反応時間を２時間〜５分間減少させる。加えて、塩基触媒ＮａＯＨがないことにより、終了段階の精製が非常に単純化され、原料コストが削減され、遊離脂肪酸に由来する石けんの問題が取り除かれる。問題というよりもむしろ、遊離脂肪酸は有用な原料になり、以下のように超臨界メタノール中でバイオディーゼルに変換される。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、トリアシルグリセリドを水素で還元して、パラフィン、プロパン、二酸化炭素および水、グリーンディーゼルとして一般に公知の生成物を生成する。パラフィンは異性化してディーゼルを製造することもできるし、ディーゼルと直接混合することもできる。いくつかの実施形態では、通常の塩基触媒エステル交換を超える水素化の利点がある。例えば、水素化法（水素化分解とも称される）は熱化学的なものであるので、生化学的な方法と比較して、不純物の供給について非常にロバストである（例えば、水素化分解は、遊離脂肪酸および水に対して比較的非感受性である）。遊離脂肪酸はパラフィンに容易に変換され、水はこの方法の全体的な熱効率を単に減少させるが、化学反応を有意に変化させない。別の非限定的な例では、パラフィン生成物は純粋な炭化水素であるので、石油系炭化水素と区別不可能である。１５％低いエネルギー含有量を有し、寒い気候で凍結し得るバイオディーゼルとは異なり、グリーンディーゼルは、石油系ディーゼルと同様のエネルギー含有量および流量特性（例えば、粘度）を有する。種々の実施形態では、本発明の方法は、液体燃料、例えばジェット燃料、ディーゼル、灯油、ガソリン、ＪＰ−１、ＪＰ−４、ＪＰ−５、ＪＰ−６、ＪＰ−７、ＪＰ−８およびＪＰＴＳを製造するための当技術分野において周知の水素化分解工程および異性化工程を包含する。
【実施例】
【０１２６】
実験
以下の実施例は、本発明のある種の好ましい実施形態および態様を実証およびさらに説明するために提供するものであり、その範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【実施例１】
【０１２７】
高脂肪藻類バイオマスの成長
従属栄養性藻類の製造方法、特に、高脂肪／脂質レベルを含有する藻類バイオマスを生成するための藻類を培養する方法を特性決定および確立するために、本発明の実施形態の開発中に実験を行った。一連の従来の従属栄養性藻類製造研究を実施し、バッチでランした。
【０１２８】
シゾキトリウム・リマシナム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｌｉｍａｃｉｎｕｍ）の培養物を得て、１．５ｍＬクライオバイアルに−８０℃で保管した。各実験について、クライオバイアルを解凍し、培地を有する１．０Ｌ振盪フラスコに無菌的に追加することによって、工程を開始した。１Ｌフラスコ中の培地は、５０ｇ／Ｌの糖、１０ｇ／Ｌの酵母抽出物および４ｇ／Ｌの海塩を含有していた。３〜６日経過した振盪フラスコの培養液３リットルを使用して、培地を含有する２５０Ｌ容器に接種し、２４〜４８時間成長させ、次いで主容器（１７，０００〜２８，０００Ｌ）に移し、バッチ法として３６〜７２時間ランした。バッチランの温度は、２５〜３０℃に維持した。このシステムの正確な制御手段がなかったので、温度範囲が広くなった。シード（２５０Ｌ）およびバッチ（１７，０００〜２８，０００Ｌ）ランにおいて使用した培地は、以下のとおりであった：
【表１Ａ】
0006055469.tif 000003
【０１２９】
バッチ培養の藻類バイオマスの総脂肪含有量は、ガスクロマトグラフィー（ＡＯＡＣ  ｇｒａｖｉｍｅｔｒｉｃ  ｍｅｔｈｏｄ  ９２２．０６を参照のこと）、酸加水分解（Ｔｏｔａｌ  Ｆａｔ  ｂｙ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ  Ａｎｋｏｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｍｅｔｈｏｄ  １，０２−１０−０９を参照のこと）および高温溶媒抽出（Ａｎｋｏｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｍｅｔｈｏｄ  ２，０１−３０−０９およびＡＯＣＳ  Ｍｅｔｈｏｄ  ５−０４を参照のこと）によって決定した。簡潔に言えば、発酵ブロスの通常の分析手順は、以下のとおりであった：ブロス試料を遠心分離によって濃縮した。デカントした後に試料を２４時間凍結乾燥した結果、水分は１パーセント未満になった。試料の重量を量ってから酸加水分解し、洗浄し、オーブンで乾燥させた。この後、石油エーテルを用いて温度勾配条件下で抽出工程を行った。加水分解および抽出の工程は、自動機器を用いて行った。さらに乾燥させた後、質量損失に基づいて結果を決定した。
【０１３０】
以下の表１Ｂに示されているように、２５〜３０℃の温度範囲のバッチ製造で達成された総脂肪／脂質レベル（ｗ／ｗ）は、８〜３８％であった。
【表１Ｂ】
0006055469.tif 000004
【０１３１】
これらの量は少なすぎて価値がないと考えられたので、脂肪／脂質レベルの量を増加させようと努力し、培養した藻類中に産生される脂質のレベルを増加させようと努力して追加実験を行った。
【０１３２】
本発明の実施形態の開発において、培地中の構成成分および／またはその量もしくは比の変化が、異なる藻類の成長特性を提供できるかを決定するために、実験を行った。加えて、藻類培養系のスケールアップが、藻類の成長特性を変化させるかを決定するために、実験を行った。特に、培養した藻類によって産生される脂質のレベルを増加させようとして、ＭｇＳＯ４、尿素、ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２およびＫＨ２ＰＯ４の量および比を改変した。
【０１３３】
１０Ｌのバッチ容量でもたらされた発酵の結果を以下に示す：
【表２】
0006055469.tif 000005
【表３】
0006055469.tif 000006
【表４】
0006055469.tif 000007
【０１３４】
本発明の実施形態の開発中に行ったこれらの実験により、培地内に存在する基質の一定の量／比が、藻類の成長特性（例えば、達成された総バイオマス、ならびにバイオマスそれ自体の中の脂肪量および／またはその他の成分の含有量）に直接影響を与えたことが示された。次いで、１０Ｌのランで高脂肪含有量のバイオマスを提供したパラメータを用いて、それらが高脂肪含有量のバイオマスの大規模製造に効果的であるかを決定した。
【実施例２】
【０１３５】
高脂肪藻類バイオマスの大規模製造
上記実施例１に記載されている従属栄養性藻類バイオマスを生成する最初の試みでは、酵母発酵法に基づく手順を用いた。製造施設（Ｎｉｃｈｏｌａｓｖｉｌｌｅ，ＫＹ）の制限、および温度が２５〜３０℃でしか制御できないという理由により、この工程はバッチで行った。このシステムの正確な制御手段がなかったので、温度範囲が広くなった。上記表１に示されているように、Ｎｉｃｈｏｌａｓｖｉｌｌｅ，ＫＹのプラントで達成された脂肪レベルは、８〜３８％の範囲であった。しかしながら、上記のように、本発明の実施形態の開発中に追加実験を行ったところ、従属栄養性藻類バイオマスの製造において、藻類の成長およびバイオマス生成／特性を変化させるのに用いることができる一定の基質比／量を特定した。発酵時の培地（例えば、ＭｇＳＯ４、尿素、ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２およびＫＨ２ＰＯ４）のレベルおよび比を改変することにより、藻類の成長が変化し、特性が有意に異なるバイオマス（例えば、有意に高い脂肪含有量のバイオマス）が生成されると判明および特性決定した。下記のように、この方法（高脂肪含有量の藻類バイオマス（例えば、６７％超の脂肪含有量）を生成するのに有効であると特定した比／量の基質を含有する培地を含む）をさらに試験し、大規模でおよびフェドバッチとしてもランした（それにより、ランにおいて窒素、リン、カリウムおよび炭素の量を改変および制御することが可能になる）。
【０１３６】
シゾキトリウム・リマシナム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｌｉｍａｃｉｎｕｍ）の培養物を得て、１．５ｍＬクライオバイアルに−８０℃で保管した。各培養について、クライオバイアルを解凍し、培地を含む１．０Ｌ振盪フラスコに無菌的に追加した。１Ｌフラスコ中の培地は、表５に示されている成分を含有していた：
【表５】
0006055469.tif 000008
【０１３７】
培地中にシゾキトリウム・リマシナム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｌｉｍａｃｉｎｕｍ）を含有する振盪フラスコの温度を３０℃に維持し、藻類が対数／指数増殖期に入っているが、培地中のグルコースが枯渇する前であるような時期（通常、７２〜１４４時間）まで２５０ＲＰＭで振盪した。
【０１３８】
次いで、１Ｌ培養フラスコの内容物を、滅菌コネクタ（これは、より大きい容器（４０Ｌまたは２７Ｌまたは１８Ｌの容器）に接続するのに使用した）を備える２．０Ｌ無菌ボトルに無菌的に移した。このように、１Ｌ培養フラスコの培養物を接種材料として使用し、以下の表６に記載されている培地を含有するシード容器（４０Ｌまたは２７Ｌまたは１８Ｌのいずれか）に無菌的に追加した：
【表６】
0006055469.tif 000009
【０１３９】
少なくとも２０ｇ／Ｌのグルコースが消費されるまで、溶存酸素を１０％以上に維持するように、気流および撹拌条件下、３０℃で第１シード段階（４０／１８／２７Ｌ）を行った。滅菌条件下で成長させる際に、ｐＨの制御は必要なかった。むしろ、ｐＨは、発酵工程全体を通して正常範囲内にあった。藻類の成長が対数／指数増殖期内であり、グルコースが培地から枯渇していないが、少なくとも２０ｇ／Ｌのグルコースが消費された場合（一般に、これは約２４〜４８時間に起こった）に、第１シード段階（４０／１８／２７Ｌ）が完了したとみなした。第１シード段階の培養のために、より大きい容器（４０００／２０００Ｌ）を準備した（例えば、滅菌条件下でそれを培地で満たして３０℃にした）。
【０１４０】
第１のシード培養が完了したら、第１シード段階（４０／１８／２７Ｌ）の培養容器の内容物を、以下の表７に記載されている少なくとも２，０００Ｌの培地を有する容器に移した：
【表７】
0006055469.tif 000010
【０１４１】
少なくとも２０ｇ／Ｌのグルコースが消費されるまで、溶存酸素を１０％以上に維持するように、気流および撹拌条件下、３０℃でこの第２シード段階（４０００／２０００Ｌ）の培養を行った。滅菌条件下で成長させる際に、ｐＨの制御は必要なかった。むしろ、ｐＨは、発酵工程全体を通して正常範囲内にあった。藻類の成長が対数／指数増殖期内であり、グルコースが培地から枯渇していないが、少なくとも２０ｇ／Ｌのグルコース消費された場合（一般に、これは約２４〜４８時間に起こった）に、第２シード段階（４０００／２０００Ｌ）が完了したとみなした。
【０１４２】
第２のシード（４０００／２０００Ｌ）培養が完了したら、第２のシード培養の内容物を、以下の表８に記載されているように、３０℃の滅菌培地を含む容量範囲７０，０００Ｌ〜２２０，０００Ｌの第３の培養容器に無菌的に移した：
【表８】
0006055469.tif 000011
【０１４３】
第３の培養容器（７０，０００Ｌ〜２２０，０００Ｌの容器）中に存在する藻類によって３０ｇ／Ｌのグルコースが消費された場合に、グルコースおよびフェドバッチの供給を開始した。第３の培養容器（７０，０００Ｌ〜２２０，０００Ｌの容器）における藻類の大規模培養では、グルコースを１０ｇ／Ｌに維持した。以下の表９に記載されているように、フェドバッチ法に使用した供給物は、以下のものを含有していた：
【表９】
0006055469.tif 000012
【０１４４】
フェドバッチ供給物は、３４時間の期間にわたって追加した。本発明を実施するために機序を理解する必要はなく、本発明は任意の特定の作用機序に限定されないが、いくつかの実施形態では、（第３の培養容器中に存在する藻類によって３０ｇ／Ｌのグルコースが消費される場合では）供給の開始に約２０時間を要したという観察結果に基づいて、この期間を特定した。次いで、すべての栄養分が培地から除去（消費）されるようにするために、（例えば、対数時間約５４に）供給を停止した。藻類バイオマスの回収は、指数増殖の終了（一般に、これは対数時間６６〜７６に起こる）時に行った。
【０１４５】
１５〜３０％の固形分を達成するための条件下で培養ブロスをスラッジ除去遠心分離し、濃縮物を噴霧乾燥して水を除去して、最終含水率を５％未満にした。
【０１４６】
数回の独立した大規模培養の結果を図１および以下の表１０〜表１２に示す：
【表１０】
0006055469.tif 000013
【０１４７】
総脂肪（飽和脂肪および不飽和脂肪）含有量；水分、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）含有量、パルミチン酸含有量、粗タンパク質含有量および灰分の分析を含め、各大規模フェドバッチ培養から生成したバイオマスを特性決定した（例えば、脂肪含有量および／水分−ＡＯＣＳ  Ａｍ  ５−０４‘Ｒａｐｉｄ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｉｌ／Ｆａｔ  Ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ  Ｈｉｇｈ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  Ｓｏｌｖｅｎｔ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ’ｖ．３／３１／１０；ＤＨＡ／パルミチン酸−ＡＯＣＳ  Ｍｅｔｈｏｄ  Ｃｅ  １ｂ−８９およびＡＯＡＣ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ９９１．３９；タンパク質−ＡＯＡＣ  ９９０．０３；灰分−ＡＯＡＣ  ９４２．０５で容量調整したバイオマス（ｇ／Ｌ）−Ｓｔｏｎｅ，ｅｔ．ａｌ．Ｄｒｙ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｂｉｏｍａｓｓ  ａｎｄ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｖａｒｉａｂｌｉｔｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．Ｖｏｌ  ６：２０７−２１２を参照のこと）。
【表１１】
0006055469.tif 000014
【表１２】
0006055469.tif 000015
【０１４８】
加えて、バイオマスの脂肪酸プロファイルを特性決定した。図２に示されているように、生成した各藻類バイオマスの脂肪酸プロファイルは、バイオマスの総脂肪含有量に関係なく高度に類似／一致している。分析したすべての試料の集合プロファイルを考慮した複合的な脂肪酸プロファイルを図３に示す。
【０１４９】
各藻類バイオマスについて、グリセリドプロファイルも決定した。バイオマスの総グリセリド含有量のうち、約４〜８％がジグリセリドであり、１％未満がグリセロールであり、約３〜７％がモノグリセリドであり、約８４〜８８％がトリグリセリドであった。
【実施例３】
【０１５０】
バイオマスの回収
本発明の実施形態の開発中に行った実験により、バイオマスの総脂肪レベルの増加が、藻類バイオマスの遠心分離に関する重大な問題を引き起こしたことが判明した。遠心分離後のバイオマス内容物の回収率は、総バイオマス重量のわずか約４５〜８５％の範囲であった。これについては、例えば、以下の表１３に示す：
【表１３】
0006055469.tif 000016
【０１５１】
回収の問題は、バイオマス中の低密度脂質／油の量の増加に起因することが判明した。したがって、この問題に対処しようと努力して、本発明の実施形態で実験を行った。
【０１５２】
バイオマスの回収率を高める能力を発揮した一方策は、遠心分離の前に、藻類バイオマスを含む培養物を冷却することであった。本発明を実施するために機序を理解する必要はなく、本発明は任意の特定の作用機序に限定されないが、いくつかの実施形態では、培養物の冷却は脂質／油の密度を増加させ、より多くのバイオマスの回収を可能にした。
【０１５３】
遠心分離の前にバイオマスを冷却する効果を決定するために、実験を行った。
【０１５４】
ラボ試験１：２ガロンのブロスを回収し、７〜８℃で１６時間以上保管した。８個の５０ｍｌ遠心管を回収し、水浴に入れて、以下の表１４に記載されている目標温度に達した。すべての試料は、５０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。
【表１４】
0006055469.tif 000017
【０１５５】
ラボ試験２：新たなブロス試料を回収し、１０〜３０℃の温度範囲にわたって試験した。それらは、試験１のように一晩冷蔵しなかった。すべての試料を氷水浴に入れて目標温度にした。試料は、５０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。
【表１５】
0006055469.tif 000018
【０１５６】
実施例２および図１に記載されているように、大規模製造において、回収（遠心分離）前のバイオマスの冷却は、バイオマスの総回収率の有意な増加につながる。複数の大規模なランが約９５％の総回収率で完了した。
【０１５７】
上記明細書において記述されているすべての刊行物および特許は、参照により本明細書に組み込まれる。記載されている本発明の組成物および方法についての種々の修正および変形は、本発明の範囲および精神を逸脱することなく当業者に明らかである。具体的な好ましい実施形態に関連して本発明を説明したが、特許請求の範囲に記載されている本発明は、このような具体的な実施形態に不当に限定されるべきでないと理解するべきである。実際、本発明を実施するために記載されている形態についての種々の修正は当業者に明らかであり、本発明の範囲内であると意図する。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図１−６】
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【図１−７】
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【図１−８】
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【図１−９】
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【図１−１０】
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【図１−１１】
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【図１−１２】
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【図１−１３】
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【図１−１４】
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【図２−１】
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【図２−２】
0006055469.tif 000034
【図２−３】
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【図２−４】
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【図２−５】
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【図３】
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