(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下：
ａ）キトサン溶液；および
ｂ）緩衝溶液、ここで該緩衝溶液は、炭酸アミノ糖溶液、リン酸アミノ糖溶液またはリン酸化アミノ糖溶液である；
を含む生体適合性熱ゲル化組成物であって、該組成物が生体適合性、等張であり、そして２５℃〜６０℃の温度範囲に加熱した際に、または８℃〜１℃の温度範囲に冷却した際にゲルを形成する、前記生体適合性熱ゲル化組成物。
【請求項２】
前記の組成物が６．５〜７．６のｐＨおよび１５℃〜２２℃の温度において液体である、請求項１に記載の生体適合性熱ゲル化組成物。
【請求項３】
前記の緩衝溶液が炭酸グルコサミン溶液、リン酸グルコサミン溶液またはグルコサミン−６−リン酸溶液である、請求項１または２に記載の生体適合性熱ゲル化組成物。
【請求項４】
前記の熱ゲル化組成物が６．７〜７．２のｐＨを有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の生体適合性熱ゲル化組成物。
【請求項５】
前記の熱ゲル化組成物が３７℃の温度まで加熱した際にゲルになる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の生体適合性熱ゲル化組成物。
【請求項６】
キトサンの濃度が０．１％から５．０％の範囲である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の生体適合性熱ゲル化組成物。
【請求項７】
炭酸グルコサミンの濃度が０．００２Ｍから０．１００Ｍの範囲である、請求項３に記載の生体適合性熱ゲル化組成物。
【請求項８】
キトサンの濃度が１．０％から３．０％の範囲である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の生体適合性熱ゲル化組成物。
【請求項９】
キトサンの炭酸グルコサミンに対する比率が１〜３である、請求項３または７に記載の生体適合性熱ゲル化組成物。
【請求項１０】
リン酸グルコサミンの濃度が０．００２Ｍから０．１００Ｍの範囲である、請求項６に記載の生体適合性熱ゲル化組成物。
【請求項１１】
キトサンのリン酸グルコサミンに対する比率が１〜３である、請求項６または１０に記載の生体適合性熱ゲル化組成物。
【請求項１２】
グルコサミン−６−リン酸の濃度が０．００２Ｍから０．１００Ｍの範囲である、請求項３に記載の生体適合性熱ゲル化組成物。
【請求項１３】
キトサンのグルコサミン−６−リン酸に対する比率が１〜３である、請求項３または１２に記載の生体適合性熱ゲル化組成物。
【請求項１４】
前記のキトサンが７０％〜１００％の範囲の脱アセチル化度（ＤＤＡ）および５０ｋＤａから１０００ｋＤａの範囲の分子量（Ｍｗ）を有する、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の生体適合性熱ゲル化組成物。
【請求項１５】
前記のキトサンが８０％〜９９％のＤＤＡおよび２００ｋＤａ〜５００ｋＤａのＭｗを有する、請求項１４に記載の生体適合性熱ゲル化組成物。
【請求項１６】
細胞、幹細胞、ペプチド、成長因子、ヒトの血液、血小板に富む血漿、ヌクレオチド類、骨、骨由来の物質、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、バイオガラス、セラミック、薬物およびイメージング剤からなる群から選択される少なくとも１種類の物質または化合物をさらに含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の生体適合性熱ゲル化組成物。
【請求項１７】
前記の組成物のモル浸透圧濃度が２７０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ〜３４０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇである、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の生体適合性熱ゲル化組成物。
【請求項１８】
前記の組成物が患者の中の組織欠損に注入され、次いで前記の組織欠損中でゲル化する、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の生体適合性熱ゲル化組成物。
【請求項１９】
前記の組成物を患者の中の組織欠損に注入する前に予めゲル化させる、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の生体適合性熱ゲル化組成物。
【請求項２０】
前記の組成物が哺乳類またはヒトの体内の組織または器官を完全にまたは部分的に処置する、修復する、再生する、取り替える、または置換するために投与される、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の生体適合性熱ゲル化組成物。
【請求項２１】
組織または器官が関節軟骨、線維軟骨、半月板、椎間板、骨組織、筋組織、神経および脊髄の軟組織、皮膚または真皮組織を含む、請求項２０に記載の生体適合性熱ゲル化組成物。
【請求項２２】
組成物が体の関節の機能を処置もしくは向上させるために、または軟骨欠損を修復するために関節内に（ｉｎｔｒａｒｔｉｃｕｌａｒ）注入される、請求項２０に記載の生体適合性熱ゲル化組成物。
【請求項２３】
前記の物質または化合物が１．０％〜４０．０％を構成する濃度のリン酸カルシウム粒子である、請求項１６に記載の生体適合性熱ゲル化組成物。
【請求項２４】
前記のリン酸カルシウム粒子が二相性リン酸カルシウム、リン酸四カルシウム、リン酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイト、リン酸二カルシウム、リン酸一カルシウム、非晶質リン酸カルシウム、リン酸八カルシウム、フッ素化リン酸カルシウム、ストロンタイド（ｓｔｒｏｎｔｉｅｄ）リン酸カルシウム、またはそれらの混合物である、請求項２３に記載の生体適合性熱ゲル化組成物。
【請求項２５】
前記の二相性リン酸カルシウム粒子が５０から１０００ミクロンの大きさである、請求項２４に記載の生体適合性熱ゲル化組成物。
【請求項２６】
前記の二相性リン酸カルシウムが以下：
ａ）２０％から８５％のリン酸三カルシウム；および
ｂ）８０％から１５％のヒドロキシアパタイト
を含む、請求項２４に記載の生体適合性熱ゲル化組成物。
【請求項２７】
前記の組成物は均一なゲルとして注入および投与される、請求項２３〜２６のいずれか１項に記載の生体適合性熱ゲル化組成物。
【請求項２８】
前記の均一なゲルが１分から３０分の硬化時間を有し、複合性の固体の足場になる、請求項２７に記載の生体適合性熱ゲル化組成物。
【請求項２９】
前記の組成物が追加で骨原性薬剤、骨誘導（ｏｓｔｅｏｉｎｄｕｃｔｉｖｅ）剤、骨形態形成タンパク質、サイトカイン類および成長因子からなる群から選択される生理活性薬剤を含む、請求項２３〜２８のいずれか１項に記載の生体適合性熱ゲル化組成物。
【請求項３０】
前記の組成物が、歯科、顎顔面、脊髄もしくは整形手術または外傷学的手順の過程の間に骨または骨性の（ｏｓｓｅｏｕｓ）欠損を処置、充填または修復するために投与される、請求項２３〜２９のいずれか１項に記載の生体適合性熱ゲル化組成物。
【請求項３１】
以下の工程：
ａ）キトサンを酸性溶液中で溶解させてキトサンの水溶液を得て；そして
ｂ）緩衝溶液を前記のキトサン水溶液に混合する、ここで該緩衝溶液は、炭酸アミノ糖溶液、リン酸アミノ糖溶液またはリン酸化アミノ糖溶液である；
を含む、キトサンの生体適合性熱ゲル化組成物を調製する方法であって、該組成物が生体適合性、等張であり、そして２５℃〜６０℃の温度範囲に加熱した際に、または８℃〜１℃の温度範囲に冷却した際にゲルを形成する、前記方法。
【請求項３２】
キトサンを１５℃〜２２℃の温度で溶解させる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記の組成物が６．７〜７．２のｐＨを有する液体状態である、請求項３１または３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記の組成物が３０〜５０℃の温度範囲に加熱した際にゲルを形成する、請求項３１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記の組成物が８℃〜１℃の温度範囲に冷却した際にゲルを形成する、請求項３１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記の緩衝溶液が炭酸グルコサミン溶液、リン酸グルコサミン溶液またはグルコサミン−６−リン酸溶液である、請求項３１〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記の熱ゲル化組成物が３７℃まで加熱した際にゲルになる、請求項３１〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
キトサンの濃度が０．１％から５．０％の範囲である、請求項３１〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
炭酸グルコサミンの濃度が０．００２Ｍから０．１００Ｍの範囲である、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
キトサンの濃度が１．０％から３．０％の範囲である、請求項３１〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
キトサンの炭酸グルコサミンに対する比率が１〜３である、請求項３６または３９に記載の方法。
【請求項４２】
リン酸グルコサミンの濃度が０．００２Ｍから０．１００Ｍの範囲である、請求項３６に記載の方法。
【請求項４３】
キトサンのリン酸グルコサミンに対する比率が１〜３である、請求項３６または４２に記載の方法。
【請求項４４】
グルコサミン−６−リン酸の濃度が０．００２Ｍから０．１００Ｍの範囲である、請求項３６に記載の方法。
【請求項４５】
キトサンのグルコサミン−６−リン酸に対する比率が１〜３である、請求項３６または４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記のキトサンが７０％〜１００％の範囲の脱アセチル化度（ＤＤＡ）および５０ｋＤａから１０００ｋＤａの範囲の分子量（Ｍｗ）を有する、請求項３１〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
前記のキトサンが８０％〜９９％のＤＤＡおよび２００ｋＤａ〜５００ｋＤａのＭｗを有する、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記の組成物のモル浸透圧濃度が２７０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ〜３４０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇである、請求項３１〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
それを必要とする対象に物質または化合物を送達するために用いる、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の熱ゲル化組成物であって、
ａ）前記熱ゲル化組成物を前記物質または化合物と混合し；そして
ｂ）前記混合された組成物および物質または化合物は該対象に投与される；
前記熱ゲル化組成物。
【請求項５０】
前記の物質または化合物が、細胞、幹細胞、ペプチド、成長因子、ヒトの血液、血小板に富む血漿、ヌクレオチド類、骨および骨由来の物質、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、バイオガラスおよびセラミック、薬物ならびにイメージング剤からなる群から選択される、請求項４９に記載の熱ゲル化組成物。
【請求項５１】
哺乳類またはヒトの体内の組織または器官を処置する、修復する、再生する、取り替える、または置換するために用いる、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５２】
前記組成物が哺乳類またはヒトの体内に注入され、次いでゲル化する、請求項５１に記載の組成物。
【請求項５３】
前記の組成物を哺乳類またはヒトの体内に注入する前に予めゲル化させる、請求項５１に記載の組成物。
【請求項５４】
前記組織または器官が関節軟骨、線維軟骨、半月板、椎間板、骨組織、筋組織、神経および脊髄の軟組織、皮膚または真皮組織を含む、請求項５１〜５３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５５】
前記組成物が体の関節の機能を処置もしくは向上させるために、または軟骨欠損を修復するために関節内に（ｉｎｔｒａｒｔｉｃｕｌａｒ）注入される、請求項５１〜５４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５６】
哺乳類またはヒトの体内の組織または器官を処置する、修復する、再生する、取り替える、または置換するために用いる医薬の製造における、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項５７】
前記組成物が注入のために配合され、次いで哺乳類またはヒトの体内でゲル化する、請求項５６に記載の使用。
【請求項５８】
前記の組成物を哺乳類またはヒトの体内に注入する前に予めゲル化させるために配合する、請求項５６に記載の使用。
【請求項５９】
前記組織または器官が関節軟骨、線維軟骨、半月板、椎間板、骨組織、筋組織、神経および脊髄の軟組織、皮膚または真皮組織を含む、請求項５６〜５８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６０】
前記組成物が体の関節の機能を処置もしくは向上させるため、または軟骨欠損を修復するための関節内（ｉｎｔｒａｒｔｉｃｕｌａｒ）注入のために配合される、請求項５６〜５９のいずれか１項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
[0001]  この出願は、２０１０年８月２７日に出願された米国仮出願一連番号６１／３７７，５９２および２０１１年２月１８日に出願された米国仮出願一連番号６１／４４４，６４６からの優先権を主張し、それの明細書を本明細書に援用する。
【０００２】
[0002]  本記述は、炭酸アミノ糖緩衝溶液、リン酸アミノ糖緩衝溶液またはリン酸化アミノ糖緩衝溶液により中和されたキトサン溶液に関する。
【発明の概要】
【０００３】
[0003]  ヒドロゲルは継続的に生体医学的適用、例えば組織工学および療法の送達のための生体材料として増大した注目を得ている。さらに、生体内原位置形成型（ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｆｏｒｍｉｎｇ）ヒドロゲルまたは温度によりそれらの粘度を増大させる特定の能力（熱感受性とも呼ばれる）を示すヒドロゲルは、細胞および生理活性化合物、例えば薬物をゲル化の前にその前駆体溶液と容易に混合して均一に装填された（ｌｏａｄｅｄ）ゲルを与えることができるため、予め形成されたヒドロゲルよりも好ましい。加えて、生体内原位置ゲル化は適用を容易にし、最小限に侵襲的な外科手術および複雑な形状の損傷の空洞を十分に満たすことを可能にする。
【０００４】
[0004]  キトサンは、キチン（ポリ（Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン）とも呼ばれる）の部分的〜実質的なアルカリＮ−脱アセチル化により得られるアミノ多糖類であり、それは甲殻類、例えばエビ、カニおよびロブスターの殻の外骨格中にある天然起源の生体高分子である。キトサンは遊離アミン（−ＮＨ２）基を含有し、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン単位およびＤ−グルコサミン単位の比率により特性付けることができ、それは完全にアセチル化されたポリマーであるキチンの脱アセチル化度（ＤＤＡ）として表される。キトサンの特性、例えば溶解度および粘度は、脱アセチル化された単量体の百分率を表す脱アセチル化度（ＤＤＡ）および分子量（Ｍｗ）による影響を受ける。
【０００５】
[0005]  キトサンは、様々な配合物において、単独および他の構成要素と共に、皮膚、角膜および硬組織の修復を刺激することが、多くの報告において提案されてきた（米国特許第４，５７２，９０６号；第４，９５６，３５０号；第５，８９４，０７０号；第５，９０２，７９８号；第６，１２４，２７３号；およびＷＯ９８／２２１１４）。創傷修復プロセスに関して有益であるものとして最も一般的に言及されるキトサンの特性は、それの生分解性、接着性、脱水の防止、および細菌の侵入に対する防壁としてである。キトサンの興味深い止血可能性は、移植および創傷部位において出血を低減するためのそれの直接適用にもつながってきた（米国特許第４，５３２，１３４号）。いくつかの研究はキトサンの止血能力はそれの赤血球を凝集させる能力にのみ由来すると主張し、一方で他の研究は、それのポリカチオン性アミン特性は血小板をトロンビンを放出して古典的な凝血カスケードを開始するように活性化することができ、そうしてフィブリノーゲンおよび精製された自己由来血小板との組み合わせでの止血薬としてのそれの使用につながると信じている（米国特許第５，７７３，０３３号）。
【０００６】
[0006]  キトサンがしばしば示す１つの技術的な困難は生理的ｐＨおよびイオン強度における低い溶解度であり、それによりそれの溶液状態での使用が制限される。従って、典型的には、キトサンの溶解は３．０から５．６の範囲のｐＨを有する酸性水溶液中でのアミン基のプロトン化により達成される。そのようなキトサン溶液は６．２付近のｐＨまで可溶性のままであり、ここでそのアミン基の中和が鎖間の静電反発力を低減し、水素結合、疎水性相互作用およびファンデルワールス相互作用の引力が６．３〜６．４付近のｐＨにおいてポリマーの沈殿を引き起こすことを可能にする。ポリオール−ホスフェート二塩基性塩（すなわちグリセロール−ホスフェート）のキトサンの水溶液への混合は、沈殿を回避しながらその溶液のｐＨを上げることができる。これらの特定の塩類の存在下では、実質的な濃度（０．５〜３％）および高分子量（数百ｋＤａより大きい分子量）のキトサン溶液が、低温または室温で、長い期間の間、６．８〜７．２の生理的に許容できる中性領域中のｐＨで、液体のままである。この側面は、キトサンと細胞の、それらの生存能力を維持する様式での混合を容易にする。追加の重要な特性は、そのようなキトサン／ポリオール−ホスフェート（Ｃ／ＰＰ）水溶液は適切な温度に加熱した際に凝固またはゲル化することであり、それはその混合されたキトサン／細胞溶液を体の部位の中に注入することを可能にし、そこで例えば皮下の空間において軟骨結節を形成することができる。
【０００７】
[0007]  キトサンはこのように、創傷の治癒、薬物の吸収、および組織の再構成を促進することができる生分解性、生体適合性、抗細菌性および止血性生体高分子として認識されている。上記で言及した固有の特性のため、キトサンは数多くの化粧的および医薬的適用においても広く探求されてきた。従って、キトサンの大きな可能性を考慮すると、より広い範囲の生体医学的適用に関してなお非常に有望であると考えられる既知の熱感受性キトサンヒドロゲルの特性を向上させる継続的な必要性が存在する。
【０００８】
[0008]  米国特許第６，３４４，４８８号は、７０から９５％の範囲の脱アセチル化度を有する市販のキトサンを、特にβ−グリセロリン酸（β−ＧＰ）により例示される、ポリオール類もしくは糖類のモノホスフェート二塩基性塩類、リン酸化ポリオール類またはリン酸化糖類で中和することにより調製された、ｐＨ依存性の温度制御されるキトサン組成物を開示している。その独特の特性のため、その熱ゲル化（ｔｈｅｒｍｏｇｅｌｌｉｎｇ）キトサン−ＧＰ系は重要な生体医学的関心を生じさせてきた。しかし、体温における速いゲル化を達成するためには、そしてそのヒドロゲルのその投与後の急速な排除を避けるためには、特に７０〜８５％のＤＤＡを有するキトサンに関して高濃度のβ−ＧＰが必要であった(Chenite et al., 2000, Biomaterials, 21: 2155-2161;およびChenite et al., 2001, Carbohydrate Polymers, 46: 39-47)。これは結果として生理的細胞外液のモル浸透圧濃度の２倍より大きい非常に高いモル浸透圧濃度をもたらした(Crompton et al., 2007, Biomaterials, 28: 441-449;およびHoemann et al., 2005, Osteoarthritis Cartilage, 13: 318-329)。理想的には、そのヒドロゲルは細胞外液と等張であるべきであり；そのモル浸透圧濃度は約３００ｍＯｓｍであるべきである。そのモル浸透圧濃度は、インビトロまたはインビボのどちらにおいても、そのヒドロゲルの細胞との生体適合性を制御する非常に重要な要素である。
【０００９】
[0009]  さらに、特に等張組成物に関してキトサン−ＧＰ系のゲル化特性を向上させる試みにおいて、米国特許出願公開第２００９／０２０２４３０号はグリオキサールの化学的架橋剤としての添加を提案した。別の記述において、血餅を向上および安定化する試みにおいて、キトサン−ＧＰ系の特定の組成物が血液と組み合わせられてきた（米国特許第７，１４８，２０９号および米国特許出願公開第２０１０／０１７８３５５号）。
【００１０】
[0010]  米国特許出願第２００９／０２７０５１４号および第２０１０／０１１３６１８号は、β−ＧＰの代わりにそれぞれ（ＮＨ４）２ＨＰＯ４溶液またはＮａＯＨ溶液を用いることによる熱ゲル化キトサン溶液の調製を記述した。しかし、リン酸アンモニウム塩類または米国特許出願第２００９／０２７０５１４号において開示されているような有機塩基由来の全ての塩類の使用は、たとえそれらが通常は等張の熱ゲル化キトサン溶液をもたらす濃度であっても、細胞および生体組織に有害である、または損傷を与え得る可能性がある。米国特許出願第２０１０／０１１３６１８号は、３０から６０％の範囲の脱アセチル化度（ＤＤＡ）を有する再アセチル化されたキトサンに限定されていた。さらに、そのＮａＯＨ溶液は事前に高濃度の１，３−プロパンジオールと共に添加されており、それは細胞および生体組織に対して潜在的に毒性である可能性のある有機試薬である。１，３−プロパンジオールの代わりに多糖類またはポリオール類を用いることにより提供されるわずかな向上にも関わらず、米国特許出願第２００９／０００４２３０号において開示されているように、その毒性の問題は未解決のままであり、従ってその系は細胞、繊細なタンパク質または生体組織に適したマトリックスではあり得ない。
【００１１】
[0011]  弱塩基であるＮａＨＣＯ３のような重炭酸塩の溶液を用いて沈殿を一切生じさせずにキトサン溶液のｐＨを６．５付近に上げることができるが、結果として得られた溶液は０〜５０℃の範囲の温度において均一なヒドロゲルになることができないことも周知である。実際は、最近の研究(Liu et al., 2011, Int. J. Pharm., 414: 6-15)により報告されているように、その溶液の表面において起こる、ＣＯ２の放出により引き起こされる偽ゲル化（ｐｓｅｕｄｏ−ｇｅｌａｔｉｏｎ）が観察され得る。そのような場合、試料全体のゲル化を達成するためには、溶液をかき乱してゲル化していない溶液をその試料の底部から表面に移動させる必要がある。これは不均一なヒドロゲルをもたらす。
【００１２】
[0012]  従って、細胞および生体組織に対して毒性ではない、よりよい生体適合性特性を有する向上した熱ゲル化キトサン溶液を提供する必要性がまだ存在する。
発明の概要
[0013]  本記述に従って、ここでキトサンおよび緩衝溶液を含む生体適合性熱ゲル化組成物が提供される。
【００１３】
[0014]  １態様において、その組成物は６．５〜７．６のｐＨおよび約１５℃〜約２２℃の温度において液体であり、約２５〜約６０℃の温度範囲に加熱した際にゲルを形成する。
【００１４】
[0015]  本明細書で開示する組成物は、約８℃〜約１℃の温度、およそ４℃の温度に冷却した際にもゲルを形成することができる。
[0016]  本明細書において、以下の工程を含む、キトサンの熱ゲル化組成物を調製する方法も提供する：キトサンを酸性溶液中で溶解させてキトサンの水溶液を得て；緩衝溶液をそのキトサン水溶液に混合して、本明細書で記述したようなキトサンの熱ゲル化組成物を得る。
【００１５】
[0017]  １態様において、その温度はその調製の間１５℃〜２２℃（室温の範囲）で維持される。
[0018]  本開示に従って、以下の工程を含む、それを必要とする対象に物質または化合物を送達するための方法も提供する：本明細書で記述した熱ゲル化組成物をその物質または化合物と混合し；その混合された組成物および物質および／または化合物をその対象に投与する。
【００１６】
[0019]  本明細書で記述した組成物を投与する工程を含む、哺乳類またはヒトの体内の組織または器官を処置する、修復する、再生する、取り替える、または置換する方法も提供する。
【００１７】
[0020]  哺乳類またはヒトの体内の組織または器官を処置する、修復する、再生する、取り替える、または置換するための本明細書で記述した組成物の使用も提供する。
[0021]  好ましい態様において、その緩衝溶液は炭酸アミノ糖溶液、リン酸アミノ糖溶液またはリン酸化アミノ糖溶液である。
【００１８】
[0022]  別の態様において、その緩衝溶液は炭酸グルコサミン溶液、リン酸グルコサミン溶液またはグルコサミン−６−リン酸溶液である。
[0023]  本明細書で記述した熱ゲル化組成物は、６．７〜７．２のｐＨを有することができる。
【００１９】
[0024]  別の態様において、その熱ゲル化組成物は、１５℃〜２２℃の温度において液体状態である。
[0025]  さらなる態様において、その熱ゲル化組成物は３７℃の温度まで加熱した際に、または約４℃の温度に冷却した際にゲルになる。
【００２０】
[0026]  キトサンの濃度は、０．１％から５．０％、または１．０％から約３．０％の範囲であることができ；炭酸グルコサミン、リン酸グルコサミンまたはグルコサミン−６−リン酸の濃度は、０．００２Ｍから０．１００Ｍの範囲であることができる。
【００２１】
[0027]  好ましい態様において、キトサンの炭酸グルコサミンに対する比率、キトサンのリン酸グルコサミンに対する比率、および／またはキトサンのグルコサミン−６−リン酸に対する比率は、おおよそ１〜３である。この比率とその熱ゲル化組成物のｐＨおよびゲル化温度の間には直接的な関係が存在する。
【００２２】
[0028]  別の態様において、そのキトサンは７０％〜１００％の範囲の脱アセチル化度（ＤＤＡ）および５０ｋＤａから１０００ｋＤａの範囲の分子量（Ｍｗ）；好ましくは８０％〜９９％のＤＤＡおよび２００ｋＤａ〜５００ｋＤａのＭｗを有する。
【００２３】
[0029]  別の態様において、その熱ゲル化組成物はさらに、例えば細胞、幹細胞、ペプチド、成長因子、ヒトの血液、血小板に富む血漿、ヌクレオチド類、薬物および／またはイメージング剤のような（それらに限定されない）少なくとも１種類の物質または化合物を含むことができる。
【００２４】
[0030]  別の態様において、前記の組成物のモル浸透圧濃度は２７０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ〜３４０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇである。
[0031]  別の態様において、その組成物は患者の中の組織欠損（ｔｉｓｓｕｅ  ｄｅｆｅｃｔ）に注入され、次いでその組織欠損中でゲル化する。
【００２５】
[0032]  代わりの態様において、その組成物を患者の中の組織欠損に注入する前に予めゲル化させる。
[0033]  さらなる態様において、その組成物は、哺乳類またはヒトの体内の組織または器官を完全にまたは部分的に処置する、修復する、再生する、取り替える、または置換するために投与される。
【００２６】
[0034]  別の態様において、その組成物は体の関節の機能を処置もしくは向上させるために、または軟骨欠損を修復するために関節内に（ｉｎｔｒａｒｔｉｃｕｌａｒ）注入される。
【００２７】
[0035]  別の態様において、その物質または化合物は１．０％〜４０．０％を構成する濃度のリン酸カルシウム粒子である。
[0036]  そのリン酸カルシウム粒子は、二相性リン酸カルシウム、リン酸四カルシウム、リン酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイト、リン酸二カルシウム、リン酸一カルシウム、非晶質リン酸カルシウム、リン酸八カルシウム、フッ素化リン酸カルシウム、ストロンタイド（ｓｔｒｏｎｔｉｅｄ）リン酸カルシウム、またはそれらの混合物であることができる。
【００２８】
[0037]  特に、その二相性リン酸カルシウム粒子は５０から１０００ミクロンの大きさである。
[0038]  さらに詳細には、その二相性リン酸カルシウムは２０％から８５％のリン酸三カルシウム；および８０％から１５％のヒドロキシアパタイトを含む。
【００２９】
[0039]  さらなる態様において、その組成物は均一なゲルとして注入または投与される。
[0040]  特に、その均一なゲルは１分から３０分の硬化時間を有し、複合性の固体の足場（ｓｃａｆｆｏｌｄ）になる。
【００３０】
[0041]  このように本発明の性質を一般的に記述してきたが、ここで添付の図面への参照を行うことにする。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】[0042]  図１は、本明細書で記述したような約６．７のｐＨ値を有する熱ゲル化組成物（キトサンＤＤＡ＝９８％）の、温度による弾性モジュラスおよび粘性モジュラス（ｖｉｓｃｏｕｓ  ｍｏｄｕｌｕｓ）の発生（ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）を示す。
【図２】[0043]  図２は、二重熱ゲル化を経ている本明細書で記述したような熱ゲル化組成物を示す。この典型的な画像は、炭酸グルコサミン緩衝溶液またはリン酸グルコサミン緩衝溶液のどちらかで中和したキトサン溶液（ＤＤＡ＝８０％または９８％）に関して得られた二重熱ゲル化を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
[0044]  炭酸アミノ糖緩衝溶液により、リン酸アミノ糖緩衝溶液により、またはリン酸化アミノ糖緩衝溶液により中和されたキトサン水溶液が提供される。結果として得られた熱ゲル化キトサン組成物は非常に生体適合性、等張であり、体温に加熱した際に急速にゲルになる能力を有する。好ましい態様において、そのキトサン溶液は、炭酸アミノ糖緩衝溶液、リン酸グルコサミン緩衝溶液、または二塩基性グルコサミン−６−リン酸緩衝溶液のいずれかにより中和されている。
【００３３】
[0045]  本記述は、炭酸グルコサミン、リン酸グルコサミンの、および／またはグルコサミン−６−リン酸の緩衝溶液により中和された熱ゲル化キトサンヒドロゲルの調製を開示する。炭酸グルコサミンおよびリン酸グルコサミンは塩であり、ここでその陽イオンは正に荷電したグルコサミン以外に存在せず、それはキトサン自体の中の繰り返し単位である。グルコサミンまたはグルコサミン−６−リン酸はどちらもヒトの組織および関節中に豊富にあり、その熱ゲル化キトサン溶液の生体適合性および生理活性を向上させる。
【００３４】
[0046]  本明細書で記述した熱ゲル化キトサン溶液は中性であり、非常に生体適合性であり、薬物、タンパク質および成長因子の制御および延長された送達のための注射可能なヒドロゲル、注射可能な充填剤、注射可能な複合材としての、組織接着剤および創傷被覆材としての、ならびに組織工学の適用のための足場としての幅広い生体医学的適用において用いることができる。
【００３５】
[0047]  本明細書において、体温の近くまで加熱した際に熱ゲル化を経ることができる、生理的ｐＨを有するキトサン溶液の調製を記述する。１観点において、その熱ゲル化または熱硬化性キトサン溶液は、適切な量の炭酸グルコサミン溶液またはリン酸グルコサミン溶液を室温、好ましくは１５〜２２℃において強い撹拌の下でキトサン溶液に混合することにより調製される。結果として得られた溶液は、６．２〜７．２のｐＨにおいてさえも、室温で液体のままであり、３７℃またはそれ以上に加熱した際にヒドロゲルになることが分かっている。ゲル化が起こるのに必要な時間は主に最終的な溶液の温度およびｐＨに依存することが分かっており、それは今度は“緩衝溶液”と呼ばれるリン酸水素グルコサミン溶液の量およびキトサン溶液の濃度に依存する。１観点において、効率的な熱ゲル化キトサン溶液の最終的なｐＨは少なくとも約６．７であるべきである。別の態様において、その熱ゲル化キトサン溶液は８〜１℃の温度に冷却した際にもヒドロゲルを形成することができる。
【００３６】
[0048]  本明細書で記述した熱ゲル化キトサン組成物は、炭酸グルコサミンまたはリン酸グルコサミンを緩衝溶液として用いているため、細胞、繊細なタンパク質および生体組織と非常に生体適合性であり、グルコサミンの長所が保存されている。グルコサミンはグルコースおよびアミノ酸であるグルタミンから天然に合成されるアミノ糖である。それはヒトの関節中に豊富であり、そこでそれは糖脂質、糖タンパク質、グリコサミノグリカン類、ヒアルロネートおよびプロテオグリカン類が含まれる様々な化合物の生化学的合成のための重要な前駆体である。それらの化合物は全て軟骨および他の関節の構成要素中に存在し、そこでそれらは関節の弾力性および潤滑に関して重要な役割を果たしている。
【００３７】
[0049]  年齢と共に、変換酵素グルコサミンシンセターゼのより低いレベルのため、体は徐々にそのグルコースおよびグルタミンをグルコサミンに変換する能力を失う。この徐々の減少は、変性関節疾患、例えば骨関節炎（ＯＡ）に寄与している主な要因の１つであることが示唆されてきた。臨床グループ試験および患者による主張は、ある期間にわたってグルコサミンを毎日補うことはＯＡの患者に有益な作用を有する可能性があるという事実を支持している。見たところ、グルコサミンはインビボでグルコサミノグリカンの生合成を刺激することにより軟骨の弾力性を向上させるように作用している可能性がある。
【００３８】
[0050]  甲殻類、例えばエビ、カニおよびロブスターの殻の外骨格は通常商業的なグルコサミンの源であり、それはキトサンのモノマー単位への破壊または分解により得られる。
【００３９】
[0051]  臨床試験および患者による主張は、ある期間にわたってグルコサミンを毎日補うことはＯＡの患者に有益な作用を有し得るという事実を支持している。安全性の観点から、ヒトでの試験は一貫してグルコサミンの投与はグルコースもしくはインスリンの血漿レベル、インスリン感受性またはグルコース酸化に影響を及ぼさなかったと報告してきた(Scroggie et al., 2003, Archives of Internal Medicine, 163: 1587-1590 ; Pouwels et al., 2001, J. Clin. Endocrinol. Metab., 86: 2099-2103;およびMonauni et al., 2000, Diabetes, 49: 926-935)。これは、グルコサミンは２型糖尿病の患者においてさえも血中グルコース代謝に有意な影響を有しなかったことを示している。
【００４０】
[0052]  Andersonおよび共同研究者らは３０００人を超える患者に関して記録された臨床試験のデータを再調査し、グルコサミンの経口投与は骨関節炎の痛みの処置において中程度に〜非常に有効であり、血液、尿または便のパラメーターに悪影響を有しないと述べた(Anderson et al., 2005, Food and Chemical Toxicology, 43: 187-201)。さらに、その再調査は、２０近い動物の試験において報告されたように、ラット、マウス、ウサギ、イヌおよびウマに経口投与された非常に高い用量のグルコサミンについての結果を要約している。そのＬＤ５０はラットに関して５０００ｍｇ／ｋｇならびにマウスおよびウサギに関して８０００ｍｇ／ｋｇを超えると概算された。その調査は、３００から２１４９ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の高い用量でのグルコサミンの摂取はラット、ウサギまたはイヌにおいて血中グルコースレベルに影響を有さないことも示した。さらに、変形性膝関節症を有する５４人の外来患者において、０．９％ＮａＣｌのプラセボと比較した関節内グルコサミンの有効性および許容度を評価する目的で二重盲検式臨床試験を実施した。それぞれの患者は、連続する５週間の間１週につき１回の関節内注射を受けた。関節の痛み、能動的および受動的可動性、腫脹、ならびに全身性および局所性の不耐性症状を、処置の開始前、および最後の注射の４週間後に記録した。グルコサミンは痛みをプラセボが低減したよりも有意に大きい程度まで低減し、結果として有意により痛みのない患者をもたらした。関節の屈曲の角度はグルコサミン処置の後に実質的に増大した。能動的可動性は両方の処置で増大し、グルコサミンの投与後により有利な傾向があった。膝の腫脹はグルコサミンの後に有意に減少しなかったが、それはプラセボの後に（有意にではないが）悪化した。処置の間および後に局所性または全身性の不耐性症状はなかった。
【００４１】
[0053]  グルコサミンの投与は、結果として副作用をもたらさずに関節症の患者の回復を速め、関節の機能を部分的に修復することができた。加えて、臨床での回復は処置が終わった後に衰えず、少なくとも翌月の間は続いた。従って、グルコサミン療法は骨関節症の管理において選ばれた場所を与えられるに値することが示された(Vajaradul et al., 1981, Clin Ther., 3:336-343)。キトサンはＧＲＡＳ（食品医薬品局合格証（Ｇｅｎｅｒａｌｌｙ  Ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  Ａｓ  Ｓａｆｅ））に登録されている。キトサン組成物および材料は、インビトロならびにインビボで、動物およびヒトの両方において、広範に分析されてきた。インビトロでは、キトサン組成物はＣａｃｏ−２細胞、ＨＴ２９−Ｈ、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ（ヒトリンパ芽球性白血病）、およびＬ１３２（ヒト胎児肺細胞）、ＭＣＦ７およびＣＯＳ７細胞を含む様々な細胞株を用いて試験されてきた(Kean et al., 2010, Advanced Drug Delivery Reviews, 62: 3-11; Richardson et al., 1999, Int. J. Pharm., 178: 231-243; Schipper et al., 1996, Pharm. Res., 13: 1686-1692; Schipper et al., 1999, Eur. J. Pharm. Sci., 8: 335-343;およびZhang, et al., 2008, Biomaterials, 29: 1233-1241)。
【００４２】
[0054]  インビボでは、キトサン組成物および材料は、様々な動物モデルにおいて、そしていくつかの投与経路により試験されてきた。キトサンはマウスモデル（免疫原性）、ラットモデル、モルモットモデル、およびウサギモデル（亜急性毒性）において安全に試験されてきた。マウスにおける急性毒性試験ではキトサンの“有意な毒性作用”は言及されておらず、ウサギおよびモルモットではそれぞれ眼または皮膚への刺激はなかった。同じ試験において、キトサンが発熱性ではないことも結論付けられた。ラットの鼻粘膜の０．５％（ｗ／ｖ）キトサン溶液への１時間にわたる曝露は、粘膜細胞の形態に対照と比較して有意な変化を引き起こさなかった。ほとんどの研究から、キトサンは最小限の毒性作用を示すようであると報告されており、これは薬物送達における安全な材料としてのそれの選択を正当化する。キトサン／ｂ−グリセロリン酸系は、インビトロで、動物モデルおよびヒトにおいてインビボで研究されており、安全かつ非毒性のプロフィールを示してきた(Hirano et al., 1991, Agric. Biol. Chem., 55: 2623-2625; Ono et al., 2000, J. Biomed. Mater. Res., 49: 289-295; Azad et al., 2004, J. Biomed. Mater. Res. B Appl. Biomater., 69: 216-222; Ishihara et al., 2001, Wound Repair Regen., 9: 513-52;およびIllum et al., 1994, Pharm. Res., 11: 1186-1189)。
【００４３】
[0055]  ヒトにおいて、乏しい外科的見通しを有する患者における肝細胞癌の処置に関するキトサン−１６６ホルミウム錯体の経皮注射を含む第２相臨床試験は、安全かつ有効な結果を報告した。長期の安定な血液透析処置を受けている８０人の腎不全を有する患者に対してキトサンの作用が研究された。その患者は、１週間の対照処置期間の後に試験された。半分は３０個のキトサンの錠剤（４５ｍｇキトサン／錠剤）を１日３回与えられた。キトサンの摂取は有効に総血清コレステロールレベルを低減させ（１０．１４＋／−４．４０から５．８２＋／−２．１９ｍＭ）、血清ヘモグロビンレベルを増大させた（５８．２＋／−１２．１から６８＋／−９．０ｇＬ−１）。その処置期間の間、臨床的に問題のある症状は観察されなかった。その結果は、キトサンは腎不全の患者に関する有効な処置である可能性があることを示唆しているが、その作用の機序はさらに研究されるべきである。
【００４４】
[0056]  キトサンはまた、整形手術後の患者においてモルヒネを送達するために鼻内投与され、静脈内（ＩＶ）モルヒネに対する安全かつより侵襲性の低い代替手段を与えることが示された。ゲンタマイシン装填キトサン棒の薬物送達システム（ＤＤＳ）に関する臨床および薬物動態試験が、それの有効性を評価し、それの臨床適用に関するさらなるデータを与える目的で実施された。１８（１８）の慢性骨髄炎の症例を、用意された骨の空洞中へのゲンタマイシン装填キトサン棒の埋め込みを伴う外科的壊死部切除により処置した。その１８の症例の全てを、２４．８ヶ月間（６〜３４ヶ月の範囲で）追跡し、１６人の患者は最初の治療を受け、一切再発しなかった。従って、ゲンタマイシン装填キトサンＤＤＳは、その薬物キャリヤーを除去するための第２の手術を実施する必要のない、慢性骨髄炎の処置のための単純かつ有効な方法であると結論付けることができた。
【００４５】
[0057]  中国では、１２人の患者において、キトサンが肘関節解離術後の肘の接着を安全に予防または低減することが観察された。それは再度ヒトにおいて膝蓋骨手術後の膝の接着を予防するために研究された(Kim et al., 2006, Clin. Cancer Res., 12: 543-548; Jing et al., 1997, J Pharm Pharmacol., 49(7): 721-723; Stoker et al., 2008, Pain Med., 9: 3-12;およびChen et al., 1998, Chinese Journal of Reparative and Reconstructive Surgery, 12: 355-358)。
【００４６】
[0058]  キトサン組成物または材料と関係する、薬物送達または医療用インプラント目的に関するいくつかの臨床試験が米国において進行中（募集中）であり、または終了している。キトサン材料は、困難な自発性の鼻出血の管理のために、およびその鼻粘膜への治癒作用を評価するために、歯の外科的手順における使用のための包帯の止血の安全性および有効性を研究するために、診断的経皮的冠動脈造影後の、血管アクセス部位の出血をよりよく制御するためおよび止血までの時間を低減するための手での圧迫への補助としてのキトサンパッドを試験するために、手術室および入院患者病棟設定における慢性創傷の安全で有効なデブリードマンとしての、そして創傷の細菌の再コロニー形成を最小限にするためのキトサン組成物を研究するために、糖尿病性腎症の足部潰瘍の創傷修復のためにキトサン組成物を用いることの療法的利益を研究するために、糖尿病性腎症の足部潰瘍の処置におけるキトサン組成物の有効性を従来の処置に対して比較するために、眼球乾燥症候群と関係する症状を低減するための新規キトサン誘導体を研究するために、ならびに膝における損傷した軟骨のキトサン組成物による処置が微細破壊のみと比較した場合に軟骨修復組織の量および質を高めるかどうかを研究するために、臨床で患者において試験されており、または試験されてきた。さらに、キトサン材料は、キトサン（４０ｋＤａの分子量を有する短鎖キトサン）が穏やか〜中程度に高いコレステロールレベル（薬物）を有する患者におけるＬＤＬ−コレステロールレベルの低減において安全かつ有効であるかどうかを決定するために、ならびにキトサンアジュバント／賦形剤を含むノーウォークＶＬＰワクチンの２種類の投与レベルの安全性および免疫原性を比較するために、臨床で患者において試験されており、または試験されてきた。
【００４７】
[0059]  本明細書において、天然起源のグルコサミン−６−リン酸を溶液または固体の形態で用いることによるキトサンの高度に生体適合性の熱ゲル化溶液の調製も開示する。グルコサミン−６−リン酸はグルコサミンの天然の生合成につながる経路における中間生成物であり、全ての窒素含有糖類の生化学的前駆体として認識されており(Roseman, 2001, J. Biol. Chem., 276: 41527-41542)、それは生物学的認識に関係する糖タンパク質およびオリゴ糖類の重要な構成要素である。具体的には、グルコサミン−６−リン酸はフルクトース−６−リン酸およびグルタミンからヘキソサミン生合成経路の最初の段階として合成される(Ghosh et al., 1960, J. Biol. Chem., 235: 1265-1273)。この経路の最終生成物はヌクレオチド糖であるウリジン二リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃであり、次いでそれはグリコサミノグリカン類（ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｉｇｌｙｃａｎｓ）、プロテオグリカン類および糖脂質を作るために用いられる。
【００４８】
[0060]  本明細書において、あらゆるリン酸化アミノ糖は本明細書の上記で記述したように用いることができると考えられる。さらに、その内容を本明細書に援用する、ポリオール類および糖類のモノホスフェート（リン酸化ポリオール類および糖類）の使用を教示している米国特許第６，３４４，４８８号とは逆に、あらゆる当業者は本開示が糖類および／またはポリオール類とは異なるアミノ糖の使用に向けられているという区別をするであろう。
【００４９】
[0061]  糖はいくつかの炭水化物、例えば単糖、二糖、またはオリゴ糖を指す。単糖（Ｍｏｎｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ）は“単糖（ｓｉｍｐｌｅ  ｓｕｇａｒｓ）”とも呼ばれ、式ＣｎＨ２ｎＯｎを有し、ここでｎは３〜７である。分子式Ｃ６Ｈ１２Ｏ６を有するグルコースは最も重要な単糖である。その炭水化物は実際にはまさにアルドースと呼ばれるポリヒドロキシアルデヒドまたはケトースと呼ばれるポリヒドロキシケトンであり、一方でポリオール類は単に多数のヒドロキシル基を含有するアルコール類である。当技術で、例えば米国特許第６，３４４，４８８号で記述されたキトサン組成物は、単糖である糖類、例えばモノホスフェート二塩基性糖類、モノサルフェート糖類および一カルボン酸糖類を含んでいた。
【００５０】
[0062]  本明細書に含まれるようなアミノ糖は、ヒドロキシル基がアミン基で置換されている糖である。アミン含有糖類の誘導体、例えばＮ−アセチルグルコサミンは、正式にはアミンを含有しないが、それもアミノ糖類と考えられる。
【００５１】
[0063]  リン酸化は、ホスフェート（ＰＯ４）基のタンパク質、糖または他の有機分子への化学的付加である。本明細書で用いられる際、グルコサミン−６−リン酸は６番目の炭素上でリン酸化されたグルコサミンを指す。
【００５２】
[0064]  本明細書で用いられる際、“炭酸アミノ糖溶液”または“リン酸アミノ糖溶液”は、正に荷電したアミノ糖（＋ＮＨ３−糖）を、負に荷電したＣＯ３２−およびＰＯ４３−の釣り合いを取るのに必要な対イオンの中に、総電荷がゼロであるように含有する溶液を指す。
【００５３】
[0065]  本明細書で用いられる際、“リン酸化アミノ糖溶液”は、負に荷電したイオンがアミノ−糖−ホスフェート（アミノ−糖−Ｏ−ＰＯ３２−）である溶液を指す。
[0066]  用語“ゲル化（ｇｅｌａｔｉｎｇ）温度”は、約２５℃から約７０℃、好ましくは３７℃から約６０℃の範囲のあらゆる温度、より好ましくはおよそ生理的温度または３７℃の温度を意味することを意図している。
【００５４】
[0067]  表現“生体内原位置ゲル化”は、本明細書において、本明細書で教示するような液体キトサン溶液の、哺乳類またはヒトの環境、例えばあらゆる組織（筋肉、骨、靭帯、軟骨）および器官の特定の部位内への注入後のゲルの形成を指す。生体内原位置ゲル化は組織欠損または体腔の完全かつ正確な充填を可能にする。そのキトサン混合物のゲル化は、生理的温度により誘導される。
【００５５】
[0068]  本明細書で教示するようなキトサンゲルは、薬物送達システムに理想的な材料である。固体微粒子または水溶性添加物がゲル化の前に組み込まれるそのような生体内原位置ゲル様形成ビヒクルは、処置または診断すべき体の部位に局所的に、直接投与することができる。抗細菌剤、抗真菌剤、ステロイド系または非ステロイド系抗炎症剤、抗癌剤、抗線維症剤、抗ウイルス剤、抗緑内障（ａｎｔｉ−ｇｌｕｃｏｍａ）剤、縮瞳薬および抗コリン剤（ａｎｔｉ−ｃｈｏｌｉｎｅｒｇｉｅｓ）、抗精神病剤、抗ヒスタミン剤およびうっ血除去剤、麻酔剤（ａｎｅｓｔｈｅｓｉｃ）ならびに抗寄生虫剤を、その組成物およびゲル内に組み込むことができる。類似の様式で、ポリペプチド類または生きていない（ｎｏｎ−ｌｉｖｉｎｇ）医薬を、回復、再建または再生目的でその組成物またはゲル内に組み込むことができる。
【００５６】
[0069]  本開示は、その範囲を限定することではなく態様を説明するために与えられている以下の実施例への参照により、より容易に理解されるであろう。
【実施例】
【００５７】
実施例Ｉ
キトサン−緩衝溶液の混合物の調製
１．キトサン溶液の調製
[0070]  キトサン溶液（２．００％ｗ／ｖ）を、中程度の分子量を有する医療用グレードのキトサンをＨＣｌの水溶液中で溶解することにより調製した。溶液中のキトサンのプロトン化の程度と呼ばれる、キトサンのアミノ基（ＮＨ２）と比較したＨＣｌの比率は、７０％で維持された。その溶液を、オートクレーブを１２１℃で３０分間用いて滅菌した。冷却した後、オートクレーブのプロセスにより引き起こされた水の喪失を、制御された無菌環境下で滅菌水を添加することにより補った。次いでその溶液を金属のフリット（ｆｒｉｔ）を通して無菌的に濾過し、５．０ｍＬの分割量（ａｌｉｑｕｏｔｓ）で分配し、４℃で保管した。約３ｍＬの余分の分割量を用いてそのキトサン溶液のｐＨを測定した。約８０％および９８％のＤＤＡを有するキトサンを用いて調製された１００ｍＬの溶液の特徴を、表１において要約する。
【００５８】
【表１】
0005898682.tif 000002
【００５９】
２．緩衝溶液の調製
[0071]  炭酸グルコサミンの緩衝溶液を、グルコサミン塩酸塩および炭酸ナトリウムを水中で同時に一緒に溶解する（ｃｏ−ｄｉｓｓｏｌｖｉｎｇ）ことにより得て、一方でリン酸グルコサミンの緩衝溶液を、グルコサミン塩酸塩および三塩基性リン酸カリウムを同時に溶解することにより調製した。５０ｍＬのそれぞれの緩衝溶液の調製のために用いられた塩の量を、表２において要約する。概して、その緩衝溶液のｐＨは、炭酸グルコサミンに関して７．６０〜８．００およびリン酸グルコサミンに関して８．１０〜８．５０で維持される。
【００６０】
[0072]  長期安定性のため、炭酸グルコサミンおよびリン酸グルコサミンの緩衝溶液は非常に低い温度、−２０℃より下の温度、好ましくは−８０℃で保管されるべきである。これは、分解を引き起こすことが疑われており、褐色の呈色により明らかになる、０℃より上の温度で保管した場合のその緩衝溶液の、起こりそうなメイラード様の反応を防ぐ、または止めることができる。技術的に、この問題を解決するために、その炭酸グルコサミンおよびリン酸グルコサミンの緩衝溶液は、それぞれある量の２倍の濃度の塩化グルコサミンの溶液を同じ量の２倍の濃度の炭酸塩の溶液と混合することにより、またはある量の２倍の濃度のグルコサミンの溶液を同じ量の２倍の濃度のリン酸塩の溶液と混合することにより、使用時に調製することができる。これらの溶液、すなわち、別々に調製された塩化グルコサミン溶液、炭酸塩溶液またはリン酸塩溶液は、４℃で少なくとも６ヶ月以上の期間保管することができる。この温度では、分解はグルコサミン塩酸塩の酸性水溶液中では起こらず、一方で炭酸塩またはリン酸塩の水溶液はかなり安定である。
【００６１】
【表２】
0005898682.tif 000003
【００６２】
３．炭酸グルコサミンを用いる熱ゲル化溶液の調製
Ｉ．キトサンＤＤＡ＝８０％
[0073]  その熱ゲル化溶液を、５．００ｍＬのキトサン溶液を０．５６ｍＬの炭酸グルコサミン緩衝溶液と、温度を約１５℃で維持しながら強く混合することにより調製した。次いで、結果として得られた約６．８２のｐＨを有する溶液を試験管の中に注ぎ、３７℃で保温し、そこでそれはおおよそ１０分以内にゲル化した。
【００６３】
[0074]  第２の実験において、５．００ｍＬのキトサン溶液を０．５０ｍＬの炭酸グルコサミン溶液と、温度を約１５℃で維持しながら強い撹拌の下で混合した。結果として得られた約６．７５のｐＨ値を有する溶液は、４５℃で２０分以内にゲル化した。
【００６４】
ＩＩ．キトサンＤＤＡ＝９８％
[0075]  その熱ゲル化溶液を、５．００ｍＬのキトサン溶液を０．５０ｍＬの炭酸グルコサミン緩衝溶液と、温度を約１５℃で維持しながら強く混合することにより調製した。次いで、結果として得られた約６．８のｐＨを有する溶液を試験管の中に注ぎ、３７℃で保温し、そこでそれはおおよそ１分以内にゲル化した。
【００６５】
[0076]  第２の実験において、５．０ｍＬのキトサン溶液を０．４０ｍＬの炭酸グルコサミン溶液と、温度を約１５℃で維持しながら強い撹拌の下で混合した。結果として得られた約６．７のｐＨ値を有する溶液は、４５℃で２０分以内にゲル化した。後者の溶液の弾性モジュラス（Ｇ’）および粘性モジュラス（Ｇ’’）の温度依存性を図１において示す。
【００６６】
４．リン酸グルコサミンを用いる熱ゲル化溶液の調製
Ｉ．キトサンＤＤＡ＝８０％
[0077]  その熱ゲル化溶液を、５．００ｍＬのキトサン溶液を０．６０ｍＬのリン酸グルコサミン溶液と、温度を約１５℃で維持しながら強い撹拌の下で混合することにより調製した。次いで、結果として得られた約７．０２のｐＨを有する溶液を試験管の中に注ぎ、３７℃で保温し、そこでそれは約７分以内にゲル化した。
【００６７】
[0078]  第２の実験において、５．００ｍＬのキトサン溶液を０．５０ｍＬのリン酸グルコサミン溶液と、温度を約１５℃で維持しながら強い撹拌の下で混合した。結果として得られた約６．８１のｐＨ値を有する溶液は、４５℃で３０分以内にゲル化した。
【００６８】
[0079]  しかし、本明細書で開示した熱ゲル化組成物は、グルコサミン塩酸塩溶液を用いることによっても遊離グルコサミン溶液を用いることによっても得ることはできない。０．５５Ｍグルコサミン塩酸塩溶液に関して測定された３．１１のｐＨはキトサン溶液のｐＨよりもはるかに低いため、その混合物のｐＨは５．５０の値を超えない。そのような混合物は０から８０℃の温度範囲全体で液体のままである。対照的に、７．７１〜８．０３のｐＨを有する遊離グルコサミン溶液の使用はその混合物のｐＨを上げるが、６．２〜６．４のｐＨ値に達したらすぐにキトサンの実質的な沈殿が生じた。
【００６９】
[0080]  Ｎａ２ＣＯ３の溶液も本明細書で開示した熱ゲル化組成物を調製するために用いることはできない。キトサン溶液に添加した際、そのような炭酸塩溶液（０．３７３Ｍ）の比較的強いアルカリ度（ｐＨ約１１．５）が瞬時のキトサンの沈殿を引き起こす。次いで、グルタミン酸およびピルビン酸のような有機酸が含まれるがそれらに限定されない酸が、炭酸塩溶液のアルカリ度を和らげ、そうして本明細書で開示した熱ゲル化組成物のための緩衝溶液を提供するために用いられてきた。しかし、これらの緩衝溶液は炭酸グルコサミンおよび緩衝溶液よりも有効でないことが分かっている。表３は、７．６５および７．８５のｐＨ値を有するグルタミン酸−炭酸塩溶液の調製に必要な量を示す。５．００ｍＬのキトサン溶液（ＤＤＡ＝９８％）の０．５０ｍＬの溶液１との、および０．５０ｍＬの溶液２との混合の結果得られる組成物は、それぞれ６．３１および６．５６のｐＨ値を有していた。
【００７０】
【表３】
0005898682.tif 000004
【００７１】
実施例ＩＩ
グルコサミン−６−リン酸を用いるキトサンの熱ゲル化溶液の調製
[0081]  キトサン溶液（約２．０％ｗ／ｖ）を、上記で実施例Ｉで記述したように調製した。その熱ゲル化溶液を、５．０ｍＬの冷蔵されたキトサン溶液を０．５ｍＬの冷蔵されたグルコサミン−６−リン酸二ナトリウム塩溶液（１Ｍ）と、氷浴中で（約４℃）、強い撹拌の下で混合することにより調製した。次いで結果として得られた約７．０のｐＨを有する溶液を氷浴から取り出し、３７℃に置き、そこでそれは１５分以内にゲル化した。
【００７２】
実施例ＩＩＩ
二重熱ゲル化組成物を用いた療法手順
[0082]  本明細書で開示した組成物は、特に筋骨格組織、例えば（それらの少数のみの名前を挙げる）関節の軟骨、線維軟骨および骨に対する、最小限に侵襲性の療法手順のために用いることができる。本明細書で記述した組成物は関節軟骨の損傷を処置するのに特に適しており、関節軟骨の欠損を患う患者において臨床で適用されてきた。この組成物は、整形外科の専門医により、臨床プロトコルの下で、そしてカナダ保健省からの特別アクセスプログラム（Ｓｐｅｃｉａｌ  Ａｃｃｅｓｓ  Ｐｒｏｇｒａｍ）（ＳＡＰ）の下で、膝軟骨の損傷、膝関節痛および関節の機能性の低下を患う患者の膝関節における関節軟骨の欠損を処置するために適用されてきた。
【００７３】
[0083]  １８から７０歳の年齢の合計９人の患者は完全な膝靭帯の構造を有し、１区画の症候性の軟骨病変を患っており、その軟骨病変は磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）により調べられ、カナダで処置されてきた。全ての患者を関節鏡を用いて非接着性の関節軟骨のデブリードマンにより処置し、その組成物を関節鏡を用いて投与してその軟骨欠損を充填し、覆った。その組成物で処置された軟骨欠損は、３ｃｍ×３ｃｍの表面積までであった。その組成物は主に関節の軟骨欠損を充填するように作用し、その関節において損傷した軟骨表面に新しい表面を付ける。患者の膝に投与された組成物は、安全、非毒性、かつ調製および投与するのが容易であることが証明されている。手術後８〜９ヶ月の追跡調査により、その組成物で処置した全ての患者が手術後３〜６ヶ月において始まる明らかなプラスの臨床成績を示し、そのようなプラスの臨床成績は主に有意に低減した膝関節痛ならびに向上した膝関節の機能性および全体的な患者の活動レベルにあった。ＷＯＭＡＣ型採点法および質問表を用いて臨床評価を実施した。関節軟骨の損傷の処置に関して提案されたその組成物は、膝および他の関節に関する体の関節における、特に股関節および足関節における軟骨欠損を処置するために用いることができる。
【００７４】
[0084]  本明細書で記述した組成物による処置は、膝の関節鏡検査の過程の間に実施される。それは洗浄およびデブリードマンと一緒に行われ、骨髄刺激技法（微細破壊）に付随させることができる。その組成物は、関節軟骨損傷上に直接適用することができる。
【００７５】
[0085]  本明細書で記述した組成物は、膝の関節鏡検査手順の過程の間に容易に、かつ迅速に調製される。さらに、それは注射液として投与することができるため、それは好都合に関節鏡検査を通して非常に容易に投与され、それは関節鏡検査手順の所要時間を著しく伸ばさない。
【００７６】
[0086]  本明細書で記述した組成物を用いた関節軟骨損傷の処置は、膝関節痛を低減し、膝関節の機能を向上させ、そうして高められた関節の機能性および全体的な活動レベルを処置された患者に提供した。これらの有益な作用は、関節鏡検査後３ヶ月の時点ですぐに現れるはずである。この処置は、関節軟骨損傷のより侵襲性で費用のかかる人工関節処置を後に回す（ｐｏｓｔｐｏｎｅ）ことができる。
【００７７】
[0087]  本記述はその具体的な態様に関連して記述されてきたが、さらなる修正が可能であり、この出願は概してその開示の原理に従うその開示のあらゆる変形、使用、または適合を含み、その開示が属する技術分野内の既知または慣習的な実施の範囲内に入るような、ならびに上記で述べた、および添付の特許請求の範囲において下記の通りである本質的な特徴に適用することができるような本開示からの逸脱が含まれることが意図されていることは理解されるであろう。
【図１】
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【図２】
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