(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテインＡのＢドメイン、プロテインＧのＣ２ドメイン、プロテインＧのＣ３ドメインの３種のドメインのみが結合されたタンパク質ドメインの前記プロテインＡのＢドメインが、大腸菌アルカリアルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）の１５３位のアミノ酸残基ＡｓｐをＧｌｙにより置換し、３３０位のアミノ酸残基ＡｓｐをＡｓｎにより置換した２重変異体Ｄ１５３Ｇ／Ｄ３３０Ｎ、大腸菌アルカリアルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）の１５３位のアミノ酸残基ＡｓｐをＨｉｓにより置換し、３３０位のアミノ酸残基ＡｓｐをＡｓｎにより置換した２重変異体Ｄ１５３Ｈ／Ｄ３３０Ｎ、または大腸菌アルカリアルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）の３２８位のアミノ酸残基ＬｙｓをＡｒｇにより置換し、３３０位のアミノ酸残基ＡｓｐをＡｓｎにより置換した２重変異体Ｋ３２８Ｒ／Ｄ３３０ＮのＣ末端側またはＮ末端側に融合されたものであることを特徴とするタンパク質検出用融合タンパク質。
【請求項２】
タンパク質の検出方法であって、
請求項１に記載のタンパク質検出用融合タンパク質と、対象物中に存在するタンパク質とを直接または間接的に結合させ、結合している前記タンパク質検出用融合タンパク質のアルカリホスファターゼ部分を標識部分として検出することを特徴とするタンパク質の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質検出用融合タンパク質およびタンパク質の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体試料中には種々のタンパク質が存在するが、特定のタンパク質を検出、定量するための方法として、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｌｉｎｋｅｄ  ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）等が知られている。
【０００３】
ＥＬＩＳＡは、試料中に含まれる抗原等の特定のタンパク質を、酵素標識した抗体を用い、抗原抗体反応を利用して定量的に検出する方法であり、免疫検査等において汎用されている手法の１つである。ＥＬＩＳＡには、直接吸着法、サンドイッチ法、競合法等が知られている。
【０００４】
例えば、固相の表面に吸着させた目的物質（抗原）に対する１次抗体を抗原抗体反応により結合させる。未反応の１次抗体を洗い流した後、酵素標識した標識２次抗体を添加して、再び抗原抗体反応により結合させる。ここで未反応の標識２次抗体を洗い流し、発色基質を添加すると、抗原の量に比例して発色反応が起こる。生成した発色物質の吸光度を吸光度計等により測定し、濃度既知の標準品を用いて作成した標準曲線から、抗原の量を定量することができる。
【０００５】
しかし、このような方法では、目的物質（抗原）に特異的に結合する１次抗体に対して特異的に結合する標識２次抗体が必要となり、複数種類の目的物質（抗原）を検出する場合、複数種類の１次抗体に対して、それぞれに特異的に結合する標識２次抗体を用意する必要があり、汎用性が低い。
【０００６】
従来、タンパク質検出用の酵素としてアルカリホスファターゼが知られ、その中ではＣＩＡＰ（Ｃａｌｆ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ  ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）が広く用いられている。ＣＩＡＰは牛小腸より精製したものが従来より広く使用されているが、近年、遺伝子組換えで作製したものも販売されている。しかし、前者は生産コストが高く、品質を安定させることが難しい。また、後者では生産コストを低減するために酵母等で発現生産を行っているが、過剰に糖鎖付加が生じ、バックグラウンド、粘性等が問題となる場合が多い。また、ＣＩＡＰは、高活性であるが、安定性、特に熱安定性が劣っており、長時間、活性を維持することは難しく、加熱が必要な遺伝子関連のアプリケーションに使用できない。さらに、希釈した場合にもその活性が低下することから、長時間、低濃度で用いる実際のアプリケーションで高活性という特性は十分に生かされていない。
【０００７】
ＢＡＰ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）は、安定性が高いが、ＣＩＡＰに比べるとその活性は数十分の一程度であり、活性が低いため、タンパク質検出にはほとんど用いられていない。
【０００８】
一方、標識２次抗体の代わりに、アルカリホスファターゼ等の酵素とプロテインＧとを化学反応で結合した酵素標識プロテインＧを用いる方法がある。プロテインＧは、連鎖球菌の細胞壁由来タンパク質で、ほとんどの哺乳動物のＩｇＧと結合する性質を持つ。このような酵素標識プロテインＧを用いれば多くの免疫種の１次抗体と結合可能であり、複数種類の目的物質（抗原）を検出する場合でも、それぞれに特異的に結合する抗体を用意しなくてもよく、汎用性が高い。
【０００９】
しかし、アルカリホスファターゼ等の酵素で標識した酵素標識プロテインＧを用いる方法は、検出感度が低いという問題があった。また、熱安定性が低いものもあり、取扱中に失活する場合があった。
【００１０】
非特許文献１には、プロテインＧ（ＳｐＧ）のＣ１ドメインをウミホタルルシフェラーゼのＮ末端に結合させた融合タンパク質を作製したが、抗体結合能はなかったこと、リンカーＧＧＧＧＳを両者間に挿入したものも同じ結果であったことが記載されている。
【００１１】
非特許文献２には、プロテインＧの遺伝子配列、アミノ酸配列、構造、各ドメインの機能等について記載されている。
【００１２】
非特許文献３には、ＢＡＰの特定の位置のアミノ酸残基を置換した２重変異体、例えば、Ｄ１５３Ｇ／Ｄ３３０Ｎ、Ｄ１５３Ｈ／Ｄ３３０Ｎ等が記載され、活性、安定性、至適ｐＨ、基質、金属イオンの親和性と活性について考察がされている。
【００１３】
特許文献１には、ＢＡＰの特定の位置のアミノ酸残基を置換した変異体Ｄ１５３Ｇ、Ｋ３２８Ｒおよび２重変異体Ｖ９９Ａ／Ｋ３２８Ｒについて記載され、サンドイッチＥＬＩＳＡ、競合法等の用途が記載されている。
【００１４】
特許文献２には、ＢＡＰの３２９位、３３０位、１５３／３２８位の変異体について記載され、抗原との融合タンパク質の作製と競合ＥＬＩＳＡを行ったことが記載されている。
【００１５】
特許文献３には、Ｋ３２８Ｒ等のＢＡＰの変異体について記載され、抗体に化学結合させてＥＬＩＳＡを行ったことが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】特許第３５６０９７２号公報
【特許文献２】特開平９−０９８７８０号公報
【特許文献３】特許第２６２０４１６号公報
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Engineering of functional chimeric protein G-Vargula luciferase, ANALYTICAL BIOCHEMISTRY, 249(2), pp.147-152(1997)
【非特許文献２】Expression and purification of a truncated recombinant streptococcal protein G, Biochem J．, 267(1), pp.171-177(1990)
【非特許文献３】Improving Escherichia coli Alkaline Phosphatase Efficacy by Additional Mutations inside and outside the Catalytic Pocket., Chembiochem., 2, pp.517-523, (2001)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明は、汎用性が高く、検出感度が高く、かつ安定性の高いタンパク質検出用融合タンパク質およびそれを用いたタンパク質の検出方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明は、プロテインＡのＢドメイン、プロテインＧのＣ２ドメイン、プロテインＧのＣ３ドメインの３種のドメインのみが結合されたタンパク質ドメインの前記プロテインＡのＢドメインが、大腸菌アルカリアルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）の１５３位のアミノ酸残基ＡｓｐをＧｌｙにより置換し、３３０位のアミノ酸残基ＡｓｐをＡｓｎにより置換した２重変異体Ｄ１５３Ｇ／Ｄ３３０Ｎ、大腸菌アルカリアルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）の１５３位のアミノ酸残基ＡｓｐをＨｉｓにより置換し、３３０位のアミノ酸残基ＡｓｐをＡｓｎにより置換した２重変異体Ｄ１５３Ｈ／Ｄ３３０Ｎ、または大腸菌アルカリアルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）の３２８位のアミノ酸残基ＬｙｓをＡｒｇにより置換し、３３０位のアミノ酸残基ＡｓｐをＡｓｎにより置換した２重変異体Ｋ３２８Ｒ／Ｄ３３０ＮのＣ末端側またはＮ末端側に融合されたものであるタンパク質検出用融合タンパク質である。
【００２１】
また、本発明は、タンパク質の検出方法であって、前記タンパク質検出用融合タンパク質と、対象物中に存在するタンパク質とを直接または間接的に結合させ、結合している前記タンパク質検出用融合タンパク質のアルカリホスファターゼ部分を標識部分として検出するタンパク質の検出方法である。
【発明の効果】
【００２２】
本発明では、プロテインＧのＣ１ドメイン、プロテインＧのＣ２ドメインおよびプロテインＧのＣ３ドメインのうち少なくとも１つを含むタンパク質ドメインと、大腸菌アルカリアルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）の２重変異体Ｄ１５３Ｇ／Ｄ３３０Ｎ、Ｄ１５３Ｈ／Ｄ３３０Ｎ、またはＫ３２８Ｒ／Ｄ３３０Ｎとを融合させることにより、汎用性が高く、検出感度が高く、かつ安定性の高いタンパク質検出用融合タンパク質およびそれを用いたタンパク質の検出方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】本実施形態に係るタンパク質検出用融合タンパク質の一例の構造を示す模式図である。
【図２】実施例１における、ｐＧ−Ｄ１５３Ｇ／Ｄ３３０Ｎ（ｐＧ結合部位：Ｎ末端）の発現量を示す図である（２ＳＬＮ培地、培養上清  ３ｍＬスケールで培養、３連制、矢印はｐＧ−Ｄ１５３Ｇ／Ｄ３３０Ｎの泳動位置を示す）。
【図３】実施例１における、ｐＧ−Ｄ１５３Ｇ／Ｄ３３０Ｎ（ｐＧ結合部位：Ｎ末端）の発現量を示す図である（ＴＭＮ培地、培養上清  ３ｍＬスケールで培養、３連制、矢印はｐＧ−Ｄ１５３Ｇ／Ｄ３３０Ｎの泳動位置を示す）。
【図４】実施例１における、ｐＧ−Ｄ１５３Ｈ／Ｄ３３０Ｎ（ｐＧ結合部位：Ｎ末端）の発現量を示す図である（２ＳＬＮ培地、培養上清  ３ｍＬスケールで培養、３連制、矢印はｐＧ−Ｄ１５３Ｈ／Ｄ３３０Ｎの泳動位置を示す）。
【図５】実施例１における、ｐＧ−Ｄ１５３Ｈ／Ｄ３３０Ｎ（ｐＧ結合部位：Ｎ末端）の発現量を示す図である（ＴＭＮ培地、培養上清  ３ｍＬスケールで培養、３連制、矢印はｐＧ−Ｄ１５３Ｈ／Ｄ３３０Ｎの泳動位置を示す）。
【図６】実施例１における、ｐＧ−Ｋ３２８Ｒ／Ｄ３３０Ｎ（ｐＧ結合部位：Ｎ末端）の発現量を示す図である（２ＳＬＮ培地、培養上清  ３ｍＬスケールで培養、３連制、矢印はｐＧ−Ｋ３２８Ｒ／Ｄ３３０Ｎの泳動位置を示す）。
【図７】実施例１における、ｐＧ−Ｋ３２８Ｒ／Ｄ３３０Ｎ（ｐＧ結合部位：Ｎ末端）の発現量を示す図である（ＴＭＮ培地、培養上清  ３ｍＬスケールで培養、３連制、矢印はｐＧ−Ｋ３２８Ｒ／Ｄ３３０Ｎの泳動位置を示す）。
【図８】実施例１における、ｐＧ−Ｋ３２８Ｒ／Ｄ３３０Ｎ（ｐＧ結合部位：Ｃ末端）の発現量を示す図である（２ＳＬＮ培地、培養上清  ３ｍＬスケールで培養、３連制、矢印はｐＧ−Ｋ３２８Ｒ／Ｄ３３０Ｎの泳動位置を示す）。
【図９】実施例１における、ｐＧ−Ｋ３２８Ｒ／Ｄ３３０Ｎ（ｐＧ結合部位：Ｃ末端）の発現量を示す図である（ＴＭＮ培地、培養上清  ３ｍＬスケールで培養、３連制、矢印はｐＧ−Ｋ３２８Ｒ／Ｄ３３０Ｎの泳動位置を示す）。
【図１０】実施例２における、Ｎｉ−ＮＴＡカラムによる発現タンパク質（ｐＧ−Ｄ１５３Ｇ／Ｄ３３０Ｎ）の精製を示す図である（ベクター：ｐＢＩＣ４，ｐＢＩＣ７，ｐＢＩＣ８、培地：２ＳＬＮ、矢印はｐＧ−Ｄ１５３Ｇ／Ｄ３３０Ｎの泳動位置を示す）。
【図１１】実施例２における、Ｎｉ−ＮＴＡカラムによる発現タンパク質（ｐＧ−Ｄ１５３Ｇ／Ｄ３３０Ｎ）の精製を示す図である（ベクター：ｐＢＩＣ４，ｐＢＩＣ７，ｐＢＩＣ８、培地：ＴＭＮ、矢印はｐＧ−Ｄ１５３Ｇ／Ｄ３３０Ｎの泳動位置を示す）。
【図１２】実施例２における、Ｎｉ−ＮＴＡカラムによる発現タンパク質（ｐＧ−Ｄ１５３Ｈ／Ｄ３３０Ｎ）の精製を示す図である（ベクター：ｐＢＩＣ７，ｐＢＩＣ８、培地：２ＳＬＮ、矢印はｐＧ−Ｄ１５３Ｈ／Ｄ３３０Ｎの泳動位置を示す）。
【図１３】実施例２における、Ｎｉ−ＮＴＡカラムによる発現タンパク質（ｐＧ−Ｄ１５３Ｈ／Ｄ３３０Ｎ）の精製を示す図である（ベクター：ｐＢＩＣ７，ｐＢＩＣ８、培地：ＴＭＮ、矢印はｐＧ−Ｄ１５３Ｈ／Ｄ３３０Ｎの泳動位置を示す）。
【図１４】実施例２における、Ｎｉ−ＮＴＡカラムによる発現タンパク質（ｐＧ−Ｋ３２８Ｒ／Ｄ３３０Ｎ（ｐＧ結合部位：Ｎ末端））の精製を示す図である（ベクター：ｐＢＩＣ４，ｐＢＩＣ８、培地：２ＳＬＮ、矢印はｐＧ−Ｋ３２８Ｒ／Ｄ３３０Ｎの泳動位置を示す）。
【図１５】実施例２における、Ｎｉ−ＮＴＡカラムによる発現タンパク質（ｐＧ−Ｋ３２８Ｒ／Ｄ３３０Ｎ（ｐＧ結合部位：Ｎ末端））の精製を示す図である（ベクター：ｐＢＩＣ４，ｐＢＩＣ８、培地：ＴＭＮ、矢印はｐＧ−Ｋ３２８Ｒ／Ｄ３３０Ｎの泳動位置を示す）。
【図１６】実施例２における、Ｎｉ−ＮＴＡカラムによる発現タンパク質（ｐＧ−Ｋ３２８Ｒ／Ｄ３３０Ｎ（ｐＧ結合部位：Ｃ末端））の精製を示す図である（ベクター：ｐＢＩＣ２，ｐＢＩＣ３，ｐＢＩＣ１、培地：２ＳＬＮ、矢印はｐＧ−Ｋ３２８Ｒ／Ｄ３３０Ｎの泳動位置を示す）。
【図１７】実施例２における、Ｎｉ−ＮＴＡカラムによる発現タンパク質（ｐＧ−Ｋ３２８Ｒ／Ｄ３３０Ｎ（ｐＧ結合部位：Ｃ末端））の精製を示す図である（ベクター：ｐＢＩＣ１，ｐＢＩＣ３、培地：ＴＭＮ、矢印はｐＧ−Ｋ３２８Ｒ／Ｄ３３０Ｎの泳動位置を示す）。
【図１８】実施例３における、ｐＧ−Ｄ１５３Ｇ／Ｄ３３０ＮおよびｐＧ−Ｄ１５３Ｈ／Ｄ３３０Ｎ精製標品（Ｆｒ．１）のＡＬＰ活性を示す図である（４５℃測定、図中数値は、９連測定の平均値±標準偏差）。
【図１９】実施例３における、ｐＧ−Ｋ３２８Ｒ／Ｄ３３０Ｎ精製標品（Ｆｒ．１）のＡＬＰ活性を示す図である（４５℃測定、図中数値は、９連測定の平均値±標準偏差）。
【図２０】実施例３における、ｐＧ−Ｄ１５３Ｇ／Ｄ３３０Ｎ（ｐＧ結合部位：Ｎ末端）のウエスタンブロット結果を示す図である。
【図２１】実施例３における、ｐＧ−Ｄ１５３Ｈ／Ｄ３３０Ｎ（ｐＧ結合部位：Ｎ末端）のウエスタンブロット結果を示す図である。
【図２２】実施例３における、ｐＧ−Ｋ３２８Ｒ／Ｄ３３０Ｎ（ｐＧ結合部位：Ｎ末端）のウエスタンブロット結果を示す図である。
【図２３】実施例３における、ｐＧ−Ｋ３２８Ｒ／Ｄ３３０Ｎ（ｐＧ結合部位：Ｃ末端）のウエスタンブロット結果を示す図である。
【図２４】ｐＧ−ＢＡＰ変異体（Ｄ１５３Ｇ／Ｄ３３０Ｎ）のアミノ酸配列を示す図である。
【図２５】ｐＧ−ＢＡＰ変異体（Ｄ１５３Ｈ／Ｄ３３０Ｎ）のアミノ酸配列を示す図である。
【図２６】ｐＧ−ＢＡＰ変異体（Ｋ３２８Ｒ／Ｄ３３０Ｎ（ｐＧ結合部位：Ｎ末端））のアミノ酸配列を示す図である。
【図２７】ｐＧ−ＢＡＰ変異体（Ｋ３２８Ｒ／Ｄ３３０Ｎ（ｐＧ結合部位：Ｃ末端））のアミノ酸配列を示す図である。
【図２８】ｐＢＩＣベクターマップを示す図である（分泌シグナルの下流に直接目的遺伝子を挿入した。プロモータ：B.choshinensis由来Ｐ２２，Ｐ２タンパク質遺伝子５’配列、Ｒｅｐ：プラスミド自己複製関連タンパク質、Ｏｒｉ：プラスミド複製開始点、Ｎｍｒ：ネオマイシン耐性遺伝子）。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明の実施の形態について以下説明する。本実施形態は本発明を実施する一例であって、本発明は本実施形態に限定されるものではない。
【００２５】
本実施形態に係るタンパク質検出用融合タンパク質は、プロテインＧのＣ１ドメイン、プロテインＧのＣ２ドメインおよびプロテインＧのＣ３ドメインのうち少なくとも１つを含むタンパク質ドメインと、大腸菌アルカリアルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）の２重変異体Ｄ１５３Ｇ／Ｄ３３０Ｎ、Ｄ１５３Ｈ／Ｄ３３０Ｎ、またはＫ３２８Ｒ／Ｄ３３０Ｎとを融合したものである。
【００２６】
本発明者らは、検出対象であるタンパク質と直接または間接的に結合するタンパク質ドメインとして、プロテインＧに着目した。プロテインＧは、連鎖球菌の細胞壁由来タンパク質で、ほとんどの哺乳動物のＩｇＧと結合する性質を持つ。このプロテインＧをアルカリホスファターゼ標識し、標識２次抗体等に代わるものとして利用できないかを検討した。
【００２７】
また、本発明者らは、検出感度および安定性に関与する酵素標識としてのアルカリホスファターゼとして、大腸菌アルカリアルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）の１５３位または３２８位のアミノ酸残基が活性に関与し、３３０位のアミノ酸残基が安定性に関与することに着目し、大腸菌アルカリアルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）の２重変異体Ｄ１５３Ｇ／Ｄ３３０Ｎ、Ｄ１５３Ｈ／Ｄ３３０Ｎ、およびＫ３２８Ｒ／Ｄ３３０Ｎを選択した。ＢＡＰの２重変異体であるＤ１５３Ｇ／Ｄ３３０ＮおよびＤ１５３Ｈ／Ｄ３３０Ｎは従来からよく用いられているＣＩＡＰに比べて安定性が高く、ＢＡＰ（Ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ）に比べて高活性である。
【００２８】
ここで、ＢＡＰの２重変異体Ｄ１５３Ｇ／Ｄ３３０Ｎは、ＢＡＰの１５３位のアミノ酸残基ＡｓｐをＧｌｙにより置換し、３３０位のアミノ酸残基ＡｓｐをＡｓｎにより置換したものであり、Ｄ１５３Ｈ／Ｄ３３０Ｎは、ＢＡＰの１５３位のアミノ酸残基ＡｓｐをＨｉｓにより置換し、３３０位のアミノ酸残基ＡｓｐをＡｓｎにより置換したものであり、Ｋ３２８Ｒ／Ｄ３３０Ｎは、ＢＡＰの３２８位のアミノ酸残基ＬｙｓをＡｒｇにより置換し、３３０位のアミノ酸残基ＡｓｐをＡｓｎにより置換したものである。
【００２９】
本発明者らが鋭意検討したところ、プロテインＧのＣ１ドメイン、プロテインＧのＣ２ドメインおよびプロテインＧのＣ３ドメインのうち少なくとも１つを含むタンパク質ドメインと、ＢＡＰの２重変異体Ｄ１５３Ｇ／Ｄ３３０Ｎ、Ｄ１５３Ｈ／Ｄ３３０Ｎ、またはＫ３２８Ｒ／Ｄ３３０Ｎとを融合させることにより、汎用性が高く、検出感度が高く、かつ安定性の高いタンパク質検出用融合タンパク質が得られることを見出した。
【００３０】
タンパク質ドメインとしては、プロテインＧのＩｇＧ結合ドメインであるＣ１ドメイン、Ｃ２ドメインおよびＣ３ドメインのうち少なくとも１つを含むものであればよく、特に制限はないが、抗体から脱離しにくい等の点から、プロテインＧのＣ２ドメインおよびプロテインＧのＣ３ドメインが連結されているものを含むことが好ましい。また、プロテインＧの抗体等に対する反応性が向上する等の点から、プロテインＡのＥドメイン、プロテインＡのＤドメイン、プロテインＡのＡドメイン、プロテインＡのＢドメイン、プロテインＡのＣドメインのうち少なくとも１つを含むことが好ましく、プロテインＡのＢドメインを含むことがより好ましい。特に、プロテインＡのＢドメイン、プロテインＧのＣ２ドメインおよびプロテインＧのＣ３ドメインが結合されたものであることが好ましい。
【００３１】
融合型アルカリホスファターゼのＣ末端側にプロテインＧのＣ２ドメインを融合させたものでもよいし、Ｎ末端側に融合させたものでもよい。発現の安定性等の点から、融合型アルカリホスファターゼのＮ末端側にプロテインＧのＣ２ドメインを融合させたものであることが好ましい。
【００３２】
本実施形態に係るタンパク質検出用融合タンパク質は、６個程度の連続するヒスチジン（Ｈｉｓ）残基からなるタグペプチドの一種であるＨｉｓタグ等のタグを有していてもよい。
【００３３】
図１に、本実施形態に係るタンパク質検出用融合タンパク質の一例の構造を模式的に示す。本実施形態に係るタンパク質検出用融合タンパク質は、例えば、ＢＡＰの２重変異体Ｄ１５３Ｇ／Ｄ３３０Ｎ、Ｄ１５３Ｈ／Ｄ３３０Ｎ、またはＫ３２８Ｒ／Ｄ３３０ＮのＮ末端側に、プロテインＡのＢドメイン、プロテインＧのＣ２ドメインおよびプロテインＧのＣ３ドメインが結合され、ＢＡＰの２重変異体のＣ末端側にＨｉｓタグが付加されたもの、ＢＡＰの２重変異体Ｄ１５３Ｇ／Ｄ３３０Ｎ、Ｄ１５３Ｈ／Ｄ３３０Ｎ、またはＫ３２８Ｒ／Ｄ３３０ＮのＣ末端側に、プロテインＡのＢドメイン、プロテインＧのＣ２ドメインおよびプロテインＧのＣ３ドメインが結合され、プロテインＧドメインのＣ末端側にＨｉｓタグが付加されたものである。
【００３４】
本実施形態に係るタンパク質検出用融合タンパク質は、遺伝子工学的手法により、プロテインＧのＣ１ドメイン、プロテインＧのＣ２ドメインおよびプロテインＧのＣ３ドメインのうち少なくとも１つを含むタンパク質ドメインと、ＢＡＰの２重変異体Ｄ１５３Ｇ／Ｄ３３０Ｎ、Ｄ１５３Ｈ／Ｄ３３０Ｎ、またはＫ３２８Ｒ／Ｄ３３０Ｎとを融合した融合タンパク質として発現させて得ることができる。また、その際、プロテインＧドメインまたはＢＡＰの２重変異体のＮ末端側またはＣ末端側にＨｉｓタグ等のタグを付与してもよい。
【００３５】
融合タンパク質の精製は、Ｎ末端またはＣ末端に付加した精製用ペプチドタグ（例えば、（Ｈｉｓ）６−ｔａｇ（ヘキサヒスチジンタグ））を利用し、ゲル濾過クロマトグラフィ、固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィ等により行うことができる。
【００３６】
融合タンパク質のアミノ酸配列の確認は当該タンパク質をコードするプラスミドベクターの遺伝子配列をＤＮＡシーケンサにて確認することができる。融合タンパク質の精製の確認は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ等で行うことができる。
【００３７】
本実施形態に係るタンパク質検出用融合タンパク質によれば、ほぼ全ての動物種の１次抗体を検出可能である。本実施形態に係るタンパク質検出用融合タンパク質の検出感度は、従来の標識プロテインＧより高く、安定性も高い。また、従来の標識２次抗体と検出感度は同等以上であり、汎用性が高い。本実施形態に係るタンパク質検出用融合タンパク質を用いれば多くの免疫種の（１次）抗体と結合可能であり、免疫種ごとに２次抗体を用意しなくてもよく、汎用性が高い。
【００３８】
このタンパク質検出用融合タンパク質は、バクテリア由来のタンパク質であり、翻訳後修飾の問題がなく、微生物の発現系で作製することができる。また、分泌発現系を利用すれば効率よく生産することができる。動物由来のものを抽出、精製したり、動物由来のものを動物細胞で発現生産する場合に比べて安価に製造することができる。
【００３９】
動物由来のＣＩＡＰ等には糖鎖が含まれている。糖鎖は測定容器、メンブレン等に吸着する原因の１つであると言われており、高いバックグラウンドを生じることがある。しかし、ＢＡＰの２重変異体は、高バックグラウンドの原因となる糖鎖修飾が存在しないため、動物由来酵素でみられるバックグラウンドおよび高粘性によるハンドリングの問題等が生じにくい。
【００４０】
酵素部分はＢＡＰに比べて高活性であり、ＣＩＡＰに比べると安定性に優れており、高温にもある程度耐性を有していることから、温度処理の必要な遺伝子検出（ハイブリダイゼーション）等における感度向上にも応用することができる。また、既存のｐＧ−ＣＩＡＰに比べて高感度でタンパク質を検出することができる可能性がある。
【００４１】
＜タンパク質の検出方法＞
本実施形態に係るタンパク質の検出方法は、前記タンパク質検出用融合タンパク質と、対象物中に存在するタンパク質とを直接または間接的に結合させ、結合しているタンパク質検出用融合タンパク質のアルカリホスファターゼ部分を標識部分として検出する方法である。
【００４２】
本実施形態に係るタンパク質検出用融合タンパク質およびタンパク質の検出方法は、例えば、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降、免疫組織化学（免疫染色）等の基礎研究分野や、病理検査分野等に利用することができる。
【実施例】
【００４３】
以下、実施例および比較例を挙げ、本発明をより具体的に詳細に説明するが、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。なお、下記実施例中、室温とは２０〜２５℃である。
【００４４】
［実施例１］
Brevibacillus発現ベクターにｐＧ−ＢＡＰ変異体の遺伝子断片を挿入し、発現ベクターの構築を行った。発現ベクターを構築できたものについては、形質転換および所定期間培養を実施し、培養上清と菌体を分離後、培養上清に含まれる目的タンパク質の生産量を確認した。
【００４５】
＜材料および試験方法＞
１．発現ベクター（プラスミド）
Brevibacillusを用いた分泌発現では、目的タンパク質ごとに最適なタンパク質の合成速度および分泌シグナルが異なる可能性が示唆されている。そこで、２種のプロモータ（ｐＢＩＣ１，ｐＢＩＣ２，ｐＢＩＣ３，ｐＢＩＣ４：Ｐ２２プロモータ（配列番号９）、ｐＢＩＣ５，ｐＢＩＣ６，ｐＢＩＣ７，ｐＢＩＣ８：Ｐ２プロモータ（配列番号１０））および４種の分泌シグナル（ｐＢＩＣ１，ｐＢＩＣ５：配列番号１１、ｐＢＩＣ２，ｐＢＩＣ６：配列番号１２、ｐＢＩＣ３，ｐＢＩＣ７：配列番号１３、ｐＢＩＣ４，ｐＢＩＣ８：配列番号１４）を組合せた、合計８種の発現用ベクターを使用した（図２８参照）。
使用ベクター：ｐＢＩＣ１〜ｐＢＩＣ８［ヒゲタ醤油（株）提供］
【００４６】
２．発現ベクター構築
ｐＧ−ＢＡＰ変異体の遺伝子断片（ｐＧ−Ｄ１５３Ｇ／Ｄ３３０Ｎ、ｐＧ−Ｄ１５３Ｈ／Ｄ３３０ＮおよびｐＧ−Ｋ３２８Ｒ／Ｄ３３０Ｎ）の発現用ベクターへの挿入には、酵素処理を必要としない簡便なプラスミド構築法であるＢＩＣ法（Brevibacillus In vivo Cloning）を利用した。ＢＩＣ法では、目的タンパク質をコードする遺伝子の両端に、直鎖上の発現ベクターの両末端と相同な１５ｂｐの配列を付加したＤＮＡをベクターと混合してコンピテントセルに導入する。菌体内で相同配列の組み換え反応が生じ、発現プラスミドが形成される。８種のベクターのうち、ベクター構築が可能であり、目的タンパク質発現用のベクターを取得できたものについては、下記の発現試験を実施した。
【００４７】
３．分泌発現用宿主
Brevibacillus choshinensis  ＨＰＤ３１−ＳＰ３株［ヒゲタ醤油（株）提供］
【００４８】
４．Brevibacillusの形質転換（ＤＮＡ導入）
Brevibacillus choshinensis  ＨＰＤ３１−ＳＰ３株をＭＴ培地（２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を添加したＴＭ培地（表１参照））で３７℃にて対数増殖期まで振盪培養し、遠心分離によって集菌した。次いで、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に懸濁し、遠心分離により集菌後、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）に再懸濁し、３７℃で６０分間振盪した。振盪した懸濁液５００μＬの遠心分離を行って集菌し、２ｎｇ／μＬの発現ベクターＤＮＡ溶液５μＬと０．５Ｍ  ＮａＳＯ３／７０ｍＭ  リン酸バッファ（ｐＨ６．３）５０μＬの混合液を加え、懸濁して５分間静置後、４０％  ＰＥＧ６０００／７０ｍＭ  リン酸バッファ（ｐＨ６．３）を１５０μＬ添加して、ボルテックスにより撹拌、懸濁した。
【００４９】
【表１】
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【００５０】
５．形質転換体の選抜
形質転換を行った菌体は、遠心分離により集菌し、１ｍＬのＴＭ培地に懸濁し、３７℃で６０分間振盪した。次いで、ＴＭＮ（ＴＭ培地に５０μｇ／ｍＬのネオマイシンを添加した寒天培地）に塗抹して、３７℃、３０時間培養し、形質転換体を選抜した。
【００５１】
６．形質転換体の培養
３ｍＬのＴＭＮ培地、および２ＳＬＮ培地（２ＳＬ培地（表２参照）に５０μｇ／ｍＬのネオマイシンを添加）を１６ｍｍ径の試験管に分注し、前項で選抜したシングルコロニーを植菌した。３０℃、１２０ｒｐｍの条件で４８時間振盪培養を行った。
【００５２】
【表２】
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【００５３】
７．菌体と培養上清の分離
遠心分離（５０００ｇ、５分間）を行って、菌体と培養上清を分離した。培養上清は０．２２μｍのろ過滅菌用フィルタを通して、菌体を除去した。
【００５４】
８．発現確認
培養上清に等量の２×サンプルバッファを添加し、１００℃で５分間変性した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供して、各サンプル中の生産タンパク質のサイズ確認、および発現生産量の推定、比較を行った。
【００５５】
＜結果＞
１．菌体内および培養上清における発現確認
・ｐＧ−Ｄ１５３Ｇ／Ｄ３３０Ｎ（ｐＧ結合部位：Ｎ末端）
ｐＧ−Ｄ１５３Ｇ／Ｄ３３０Ｎについては、ベクター２種類およびシグナルペプチド４種類の計８種類の組合せのうち、発現プラスミドの取得が可能であった４種類について発現試験を実施した。２ＳＬＮ培地（培養上清）の場合は、ｐＢＩＣ４、ｐＢＩＣ７およびｐＢＩＣ８で高いレベルの発現量が認められ、連制間の差異もほとんどなく、安定的な発現がなされていることが示唆された。ＴＭＮ培地でも発現量が２ＳＬＮ培地より多くなること以外は、同様の傾向であったが、ｐＢＩＣ６では、両培地とも目的タンパク質は、ほとんど生産されていないことがわかった（図２，３）。ｐＧ−Ｄ１５３Ｇ／Ｄ３３０Ｎのアミノ酸配列を図２４および配列番号１に、ＤＮＡ配列を配列番号２に示す。
【００５６】
・ｐＧ−Ｄ１５３Ｈ／Ｄ３３０Ｎ（ｐＧ結合部位：Ｎ末端）
５種類の発現ベクターを取得したｐＧ−Ｄ１５３Ｈ／Ｄ３３０Ｎの場合は２ＳＬＮおよびＴＭＮ両培地で高発現が認められたものは、ｐＢＩＣ７およびｐＢＩＣ８であり、ＴＭＮ培地の方が発現量が多い傾向であった。連制間のばらつきも認められないことから、安定した発現を示す可能性が示唆された。ｐＢＩＣ１、ｐＢＩＣ５およびｐＢＩＣ６においては、ほとんどｐＧ−Ｄ１５３Ｈ／Ｄ３３０Ｎの発現は認められなかった（図４，５）。ｐＧ−Ｄ１５３Ｈ／Ｄ３３０Ｎのアミノ酸配列を図２５および配列番号３に、ＤＮＡ配列を配列番号４に示す。
【００５７】
なお、ｐＧ−Ｄ１５３Ｇ／Ｄ３３０Ｎ、ｐＧ−Ｄ１５３Ｈ／Ｄ３３０Ｎ双方とも発現量の多いものは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのバンド強度から、ｇ／Ｌレベルの生産量が期待された。
【００５８】
・ｐＧ−Ｋ３２８Ｒ／Ｄ３３０Ｎ（ｐＧ結合部位：Ｎ末端）
ｐＧ−Ｋ３２８Ｒ／Ｄ３３０Ｎ（ｐＧ結合部位：Ｎ末端）の場合は、取得した４種の発現ベクターのうち、目的タンパク質が生産されていたのはｐＢＩＣ４およびｐＢＩＣ８であった。いずれも連制間のバラツキは小さく、安定な発現を示しており、培地別にみると、ｐＢＩＣ８ではＴＭＮ培地で発現量が若干多い傾向が認められた（図６，７）。ｐＧ−Ｋ３２８Ｒ／Ｄ３３０Ｎ（ｐＧ結合部位：Ｎ末端）のアミノ酸配列を図２６および配列番号５に、ＤＮＡ配列を配列番号６に示す。
【００５９】
・ｐＧ−Ｋ３２８Ｒ／Ｄ３３０Ｎ（ｐＧ結合部位：Ｃ末端）
Ｃ末端にｐＧを結合したＫ３２８Ｒ／Ｄ３３０Ｎの場合、得られた発現ベクター３種（ｐＢＩＣ１、ｐＢＩＣ２、ｐＢＩＣ３）のうち、２ＳＬＮ培地では、すべてのベクターで目的タンパク質の生産が認められたが、ＴＭＮ培地では、ｐＢＩＣ２の生産量が著しく少ない結果が得られた。ｐＧをＮ末端に結合したものとＣ末端結合したものを比べると、生産が認められたものについては、目的タンパク質バンドの強度に大きな差があるとは考えられない。しかし、Ｃ末端結合のものは、３連制の試験で同等に生産されたものがなく、Ｎ末端結合のものに比べるとタンパク質発現に安定性を欠く可能性が示唆された（図８，９）。ｐＧ−Ｋ３２８Ｒ／Ｄ３３０Ｎ（ｐＧ結合部位：Ｃ末端）のアミノ酸配列を図２７および配列番号７に、ＤＮＡ配列を配列番号８に示す。
【００６０】
［実施例２］
ブレビバチルスにて発現させたＢＡＰ変異体には、上述のようにヒスチジンタグ（Ｈ６  ｔａｇ）がＣ末端に付加されており、Ｎｉ−ＮＴＡカラムを用いて、比較的簡便に精製を行うことができる。本実施例においては、培養上清から精製標品を取得した。
【００６１】
＜材料および試験方法＞
１．目的タンパク質の精製
Ｎｉ−ＮＴＡカラムの一種であるＨｉｓ  ＳｐｉｎＴｒａｐ  Ｋｉｔ（２８−９３２１−７１／ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて簡易精製を行った。精製操作は、添付の取扱説明書に準じたが、３００〜６００μＬの培養上清を用い、カラム結合時の培養上清のイミダゾール濃度、そして結合（洗浄）バッファの同濃度は４０ｍＭ、溶出バッファの同濃度は５００ｍＭとした。また、培養上清をカラムに添加後、洗浄を３回行い、酵素溶出を２回実施して、溶出画分をそれぞれフラクション１，２（Ｆｒ．１、Ｆｒ．２）とした。
【００６２】
２．脱塩および濃縮
精製された変異体酵素液には、高濃度のイミダゾールが含有しているが、予備検討の結果、酵素活性に悪影響を及ぼすことが判明したので、イミダゾールを除去するために脱塩し、保存バッファ（下記）への溶媒交換を実施した。この操作には、ゲルろ過法（Ｚｅｂａ  Ｄｅｓａｌｔ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎｓ、８９８９０／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、または限外ろ過法（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｆｉｌｔｅｒｓ、１０Ｋ  ｍｅｍｂｒａｎｅ、ＵＦＣ５０１０２４／Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いた。溶媒交換した精製標品は、限外ろ過（同上）により４〜５倍程度、濃縮を行い、４℃で保存した。
【００６３】
保存バッファ：１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０μＭ  ＺｎＣｌ２
【００６４】
３．純度確認およびタンパク質定量
得られた精製標品は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により純度を確認した。ゲルは、ミニプロティアン（登録商標）  ＴＧＸ（商標）プレキャストゲル（４５６−１０３６／Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用した。電気泳動後のゲルは、純水で洗浄し、ＣＢＢ染色（Ｑｕｉｃｋ−ＣＢＢ  ＰＬＵＳ、１７８−００５５１／和光純薬）によりタンパク質バンドを可視化した。
【００６５】
タンパク質定量は、Ｍｉｃｒｏ  ＢＣＡ法（ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ、２３２２７／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によった。所定量の精製標品と検出試薬を等量混合後、６０℃で１時間処理し、冷却した後、ＯＤ５６２を測定した。標準タンパク質としてＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ）を用いて検量線を作成し、タンパク質含量を求めた。
【００６６】
＜結果＞
１．  Ｎｉ−ＮＴＡカラムによる精製
・ｐＧ−Ｄ１５３Ｇ／Ｄ３３０Ｎ（ｐＧ結合部位：Ｎ末端）
発現試験において発現量の多かったｐＧ−Ｄ１５３Ｇ／Ｄ３３０Ｎにおけるベクターおよび培地の組合せについて培養上清からＮｉ−ＮＴＡカラムを用いて簡易精製を行った（図１０，１１）。供試したいずれの組合せ（ｐＢＩＣ４、ｐＢＩＣ７、ｐＢＩＣ８）も精製画分においては、夾雑タンパク質がほぼ除去されており、高純度の精製標品を得ることが可能であった。
【００６７】
・ｐＧ−Ｄ１５３Ｈ／Ｄ３３０Ｎ
ｐＧ−Ｄ１５３Ｈ／Ｄ３３０Ｎの場合も２ＳＬＮ培地およびＴＭＮ培地双方において、ｐＢＩＣ７およびｐＢＩＣ８の組合せで高純度の標品を精製することが可能であった。また、精製標品の分子量についても、ｐＧ−Ｄ１５３Ｇ／Ｄ３３０Ｎと同様の結果であった（図１２，１３）。
【００６８】
・ｐＧ−Ｋ３２８Ｒ／Ｄ３３０Ｎ（ｐＧ結合部位：Ｎ末端）
２ＳＬＮ培地を用いた場合、ｐＢＩＣ４についてはＮｉ−ＮＴＡカラムによる精製が可能であり、純度の高い精製標品を得ることができた。しかしｐＢＩＣ８については、カラム未結合画分に少量しかタンパク質が存在せず、その後のカラム洗浄においても同様であった。高濃度のイミダゾールを有する溶出バッファを用いてもほとんど出てこないことから、Ｎｉ−ＮＴＡカラムにタンパク質が強固に吸着されており回収不能となった可能性が示唆された（図１４）。ＴＭＮ培地の場合は、ｐＢＩＣ４、ｐＢＩＣ８双方とも目的タンパク質を精製することが可能であった（図１５）。２ＳＬＮ培地を用いた場合のみｐＢＩＣ８がカラムに吸着する原因は、現状では不明である。
【００６９】
・ｐＧ−Ｋ３２８Ｒ／Ｄ３３０Ｎ（ｐＧ結合部位：Ｃ末端）
ｐＧ−Ｋ３２８Ｒ／Ｄ３３０Ｎ（ｐＧ結合位置：Ｃ末端）についても、同様にタンパク質発現量が認められたものについて簡易精製を実施した（図１６，１７）。２ＳＬＮ培地では、ｐＢＩＣ１、ｐＢＩＣ２およびｐＢＩＣ３、また、ＴＭＮ培地では、ｐＢＩＣ１、ｐＢＩＣ３で精製標品を得ることができた。
【００７０】
［実施例３］
精製した各標品の酵素部分、および抗体結合タンパク質部分が実際に機能するか確認し、タンパク質検出試薬として利用できるか検討を行うために、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性測定とウエスタンブロットにおける検出感度の比較を市販の試薬を対照として実施した。
【００７１】
＜材料および試験方法＞
１．ＡＬＰ活性測定
酵素標品を酵素希釈バッファで所定濃度に希釈し、９６穴マイクロプレートの各ウェルに５μＬ加えた。次いで、基質（ｐ−ＮＰＰ：ｐ−ニトロフェニルホスフェート、１４９−０２３４２／和光純薬）溶液を９５μＬ添加し、基質の脱リン酸化により生じる吸光度変化（ＯＤ４１０）をマイクロプレートリーダー（ＳＨ−９０００Ｌａｂ／コロナ電気）を用いて、２０〜３０ｓｅｃごとに１８回測定した。測定温度は、４５℃とした。酵素の比活性（μｍｏｌ  ｐ−ＮＰ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ／ｓｅｃ）は、既知濃度の酵素産物（ｐ−ＮＰ：ｐ−ニトロフェノール、２９９−５８６４１／和光純薬）の検量線を利用して求めた。なお、酵素の希釈、および基質、酵素産物の溶解、希釈には、下記のバッファを使用し、基質溶液のｐ−ＮＰＰ濃度は、１ｍＭとした。比較対照としては、ウシ小腸由来のＡＬＰであるＣＩＡＰを酵母発現させたもの（ＡＰ  ｈｉｇｈｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｒｅｃ．  ＥＩＡ  Ｇｒａｄｅ，ＣＲ，０３  ５３５  ４５２／Ｒｏｃｈｅ）、およびＰＬＡＰ（Ｐｌａｃｅｎｔａｌ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ、Ｐ３８９５／Ｓｉｇｍａ）を使用した。
【００７２】
酵素希釈バッファ：１００ｍＭ  ＤＥＡ−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２
基質、酵素産物希釈、溶解バッファ：１Ｍ  ＤＥＡ−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２
【００７３】
２．ウエスタンブロットによる検出感度検討
抗原には、血清タンパク質であるヒト由来のＴｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ／６１６４１９）を使用した。２×サンプルバッファで１０ｎｇ〜３ｐｇ／１５μＬとなるように希釈列を作製し、１レーンあたり１５μＬロードして、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。同じ希釈列のＴｒａｎｓｆｅｒｒｉｎが転写されたＨｙｂｏｎｄ  Ｐ（ＰＶＤＦ）メンブレンを作製し、抗原抗体反応後、検出感度を比較した。詳しい手順および比較対照に用いた試薬を以下に示す。
【００７４】
サンプルバッファ（２×）：６２．５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、２％  ＳＤＳ、２５％  グリセロール、０．０１％  ＢＰＢ（Ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ  ｂｌｕｅ、０２９−０２９１２／Ｗａｋｏ）、１０％  メルカプトエタノール（Ｍ３１４８／Ｓｉｇｍａ）
【００７５】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（２００Ｖ  定電圧条件、３０ｍｉｎ）
ゲル：ミニプロティアンＴＧＸゲル１０％（Ｂｉｏ−Ｒａｄ／４５６−１０３５）
泳動バッファ：２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１９２ｍＭ  グリシン、０．１％  ＳＤＳ
↓
ブロッティング（２００ｍＡ  定電流条件、４０ｍｉｎ）
メンブレン：Ｈｙｂｏｎｄ  Ｐメンブレン（ＧＥヘルスケア／ＲＰＮ２０２０Ｆ）
転写バッファ：２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１９２ｍＭ  グリシン、２０％メタノール
↓
メンブレン洗浄（ＴＢＳ、３ｍｉｎ  ×２回）
ＴＢＳ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．６８ｍＭ  ＫＣｌ）
↓
ブロッキング（５％  Ｓｋｉｍ  Ｍｉｌｋ  Ｐｏｗｄｅｒ（１９８−１０６０５／Ｗａｋｏ）／ＴＢＳＴ、室温、撹拌、６０ｍｉｎ）
ＴＢＳＴ（０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０／ＴＢＳ）
↓
メンブレン洗浄（ＴＢＳＴ、５ｍｉｎ×３回）
↓
１次抗体反応（室温、撹拌、６０ｍｉｎ）
抗体：Ｒａｂｂｉｔ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＤＡＫＯ／Ａ００６１）  １／２，０００希釈  （４．３μｇ／ｍＬ  ＴＢＳＴ）
↓
メンブレン洗浄（ＴＢＳＴ、５ｍｉｎ×４回）
↓
ｐＧ−アルカリホスファターゼ反応（室温、撹拌、６０ｍｉｎ）
ｐＧ−ＢＡＰ変異体精製標品、Ｆｒ．１を使用
処理濃度：０．５μｇ／ｍＬ  ＴＢＳＴ
↓
メンブレン洗浄（ＴＢＳＴ、５ｍｉｎ×４回）
↓
発光検出
７，２００ｓｅｃまで１５０ｓｅｃ毎に画像取得。
測定器：Ｃｈｅｍｉｄｏｃ  ＸＲＳ＋（１７０−８２６５Ｊ１ＰＣ／Ｂｉｏ−Ｒａｄ）
発光基質：ＣＤＰ−Ｓｔａｒ  Ｒｅａｄｙ−ｔｏ−ｕｓｅ（Ｒｏｃｈｅ／１２０４１６７７００１）
【００７６】
比較対照試薬
ｐＧ−ＣＩＡＰ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ、ＰＧ００−０５／Ｒｏｃｋｌａｎｄ）
【００７７】
＜結果＞
１．ＡＬＰ活性
図１８には、ｐＧ−Ｄ１５３Ｇ／Ｄ３３０ＮおよびｐＧ−Ｄ１５３Ｈ／Ｄ３３０Ｎ（いずれもｐＧ結合位置：Ｎ末端）のＡＬＰ活性測定結果を示す。測定値のばらつきが若干、大きいが、ｐＧ−Ｄ１５３Ｇ／Ｄ３３０Ｎの比活性は、３５０〜４５０μｍｏｌ  ｐ−ＮＰ／ｍｇ  ｐｒｏｔ．／ｍｉｎであり、ＴＭＮ培地の方が比活性は、若干高い傾向にあった。
【００７８】
一方、ｐＧ−Ｄ１５３Ｈ／Ｄ３３０Ｎの比活性は、５０μｍｏｌ  ｐ−ＮＰ／ｍｇ  ｐｒｏｔ．／ｍｉｎ程度でｐＧ−Ｄ１５３Ｇ／Ｄ３３０Ｎに比べるとその値は大幅に低いものであった。
【００７９】
図１９には、ｐＧ−Ｋ３２８Ｒ／Ｄ３３０Ｎ（ｐＧ結合部位：Ｎ末端およびＣ末端）の活性測定結果を示す。Ｎ末端結合のものに若干、活性値の大小が認められるが、Ｎ末端、Ｃ末端ともその比活性は２００μｍｏｌ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍｉｎ程度であり、両者の間に大きな差はないものと考えられた。
【００８０】
以上の結果から、作製したｐＧ−ＢＡＰ変異体のＡＬＰ活性を高い方から示すと以下の通りであった。
ｐＧ−Ｄ１５３Ｇ／Ｄ３３０Ｎ＞ｐＧ−Ｋ３２８Ｒ／Ｄ３３０Ｎ＞ｐＧ−Ｄ１５３Ｈ／Ｄ３３０Ｎ
【００８１】
２．ウエスタンブロットによる検出感度
精製標品（Ｆｒ．１）を用いたウエスタンブロットを行い、発光検出を行った結果を図２０〜２３に示す。ｐＧ−Ｄ１５３Ｇ／Ｄ３３０Ｎは、ｐＢＩＣ８（２ＳＬＮ培地）を除いて３〜１０ｐｇのＴｒａｎｓｆｅｒｒｉｎを検出することが可能であった。対照のｐＧ−ＣＩＡＰは、１００ｐｇ程度であることから、ｐＧ−Ｄ１５３Ｇ／Ｄ３３０Ｎの検出感度は、１０〜３０倍高い可能性が示唆された（図２０）。一方、ｐＧ−Ｄ１５３Ｈ／Ｄ３３０Ｎの検出感度は、３０〜１００ｐｇであり、市販のｐＧ−ＣＩＡＰと大きな差はなく、その低い酵素活性が検出感度に反映されているものと考えられた（図２１）。ｐＧ−Ｋ３２８Ｒ／Ｄ３３０Ｎの場合は、ｐＧ−Ｄ１５３Ｇ／Ｄ３３０Ｎより若干、劣るが、ｐＧをＮ末端、Ｃ末端に結合したもの双方とも１０ｐｇ程度の検出感度であり、対照のｐＧ−ＣＩＡＰより１０倍程度高い可能性が示唆された（図２２，２３）。
【００８２】
以上の結果より、ブレビバチルスで分泌発現された目的タンパク質は抗体結合活性、ＡＬＰ活性を保持していることが明らかとなった。また、ウエスタンブロットという実際のアプリケーションにおいて、今回、供試したｐＧ−Ｄ１５３Ｇ／Ｄ３３０ＮおよびｐＧ−Ｋ３２８Ｒ／Ｄ３３０Ｎは、市販の既存品に比べ、高い検出感度を示すことから、タンパク質検出試薬として有用であることが判明した。
【００８３】
Ｋ３２８Ｒ／Ｄ３３０Ｎでは、Ｎ末端と、Ｃ末端でＡＬＰ活性、ウエスタンブロット双方とも性能差はほとんどなかった。
【００８４】
Ｄ１５３Ｇ／Ｄ３３０Ｎ、Ｄ１５３Ｈ／Ｄ３３０Ｎでは、ｐＧの結合部位はＮ末端しか検討していないが、これらの変異部位はリン酸、Ｍｇ２＋およびＺｎ２＋の結合部位近傍であり、ｐＧの結合部位をＣ末端とした場合も立体構造変化によってｐＧの抗体結合活性が阻害されるとは考えにくく、性能面では同等の結果が得られる可能性が高い。
【００８５】
Ｋ３２８Ｒ／Ｄ３３０Ｎにおいては、発現生産の安定性はＮ末端のものが優れていた。Ｃ末端にｐＧが結合したものは宿主内でベクターが安定して保持されにくいことが一因と考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【配列表】
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