(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
5'末端および3'末端を有する第1のオリゴヌクレオチド鎖、並びに5'末端および3'末端を有する第2のオリゴヌクレオチド鎖を含む単離された二本鎖核酸（dsNA）であって：
前記第1の鎖は、長さが31〜49ヌクレオチド残基であり、第1の鎖の5'末端にて第1のヌクレオチド（位置1）から開始して、前記第1の鎖の位置1〜23は、リボヌクレオチドであり；
前記第2の鎖は、長さが31〜53ヌクレオチド残基であり、かつ二重鎖を形成するために前記第1の鎖の位置1〜23のリボヌクレオチドと塩基対を形成する23の連続したリボヌクレオチドを含み；
前記第2の鎖は、1〜4ヌクレオチド3'オーバーハングを形成し；
前記第1の鎖の3'末端および前記第2の鎖の5'末端は、平滑末端を形成し；
前記第1の鎖の位置24〜3'末端ヌクレオチド残基の少なくとも1つは、前記第2の鎖のデオキシリボヌクレオチドと塩基対を形成するデオキシリボヌクレオチドであり；かつ
前記第2の鎖は、前記二本鎖核酸が哺乳動物細胞に導入されるときに、標的遺伝子発現を減少させるために前記第2の鎖長の少なくとも19リボヌクレオチドにて標的RNAに対して十分に相補的である、単離された二本鎖核酸（dsNA）。
【請求項２】
請求項1の単離された二本鎖核酸（dsNA）であって、前記第1の鎖の3'末端および前記第2の鎖の5'末端は、平滑末端を形成し、かつ前記第1の鎖の前記3'末端の最後および最後から2番目の残基、並びに前記第2の鎖の前記5'末端の最後および最後から2番目の残基は、1つまたは2つのミスマッチ塩基対を形成する、単離された二本鎖核酸（dsNA）。
【請求項３】
請求項1〜2のいずれか1項に記載の単離されたdsNAであって、前記第2の鎖のデオキシリボヌクレオチドと塩基対を形成する前記第1の鎖の位置24〜3'末端ヌクレオチド残基は、2以上、4以上、6以上、8以上、10以上、12以上、14以上、16以上、18以上および20以上ヌクレオチド残基からなる群より選択される量であり、任意に前記第2の鎖の前記デオキシリボヌクレオチドと塩基対を形成する前記第1の鎖の前記デオキシリボヌクレオチドは、連続したデオキシリボヌクレオチドである、単離されたdsNA。
【請求項４】
請求項1〜3のいずれか1項に記載の単離されたdsNAであって、前記第1の鎖の位置24〜27の2つ以上の連続したヌクレオチド残基は、前記第2の鎖のデオキシリボヌクレオチドと塩基対を形成するデオキシリボヌクレオチドであるか、または前記第1の鎖のそれぞれの位置24および25は、前記第2の鎖のデオキシリボヌクレオチドと塩基対を形成するデオキシリボヌクレオチドであるか、または前記第1のオリゴヌクレオチド鎖の位置24〜27のそれぞれのヌクレオチド残基は、前記第2の鎖のデオキシリボヌクレオチドと塩基対を形成するデオキシリボヌクレオチドである、単離されたdsNA。
【請求項５】
請求項1〜4のいずれか1項に記載の単離されたdsNAであって、
前記第1の鎖は、長さが31〜49ヌクレオチドであり、かつ前記第1のオリゴヌクレオチド鎖の位置24〜27のそれぞれのヌクレオチド残基は、前記第2の鎖のデオキシリボヌクレオチドと塩基対を形成するデオキシリボヌクレオチドであるか;または、
前記第1の鎖は、長さが31〜49ヌクレオチドであり、かつ前記第1のオリゴヌクレオチド鎖の位置24〜29のそれぞれのヌクレオチド残基は、前記第2の鎖のデオキシリボヌクレオチドと塩基対を形成するデオキシリボヌクレオチドであるか;または、
前記第1の鎖は、長さが31〜49ヌクレオチドであり、かつ前記第1のオリゴヌクレオチド鎖の位置24〜29のそれぞれのヌクレオチド残基は、前記第2の鎖のデオキシリボヌクレオチドと塩基対を形成するデオキシリボヌクレオチドであるか;または、
前記第1の鎖は、長さが33〜49ヌクレオチドであり、かつ前記第1のオリゴヌクレオチド鎖の位置24〜31のそれぞれのヌクレオチド残基は、前記第2の鎖のデオキシリボヌクレオチドと塩基対を形成するデオキシリボヌクレオチドであるか;または、
前記第1の鎖は、長さが31〜49ヌクレオチドであり、かつ前記第1のオリゴヌクレオチド鎖の位置24〜31のそれぞれのヌクレオチド残基は、前記第2の鎖のデオキシリボヌクレオチドと塩基対を形成するデオキシリボヌクレオチドであるか;または、
前記第1の鎖は、長さが35〜49ヌクレオチドであり、かつ前記第1のオリゴヌクレオチド鎖の位置24〜33のそれぞれのヌクレオチド残基は、前記第2の鎖のデオキシリボヌクレオチドと塩基対を形成するデオキシリボヌクレオチドであるか;または、
前記第1の鎖は、長さが33〜49ヌクレオチドであり、かつ前記第1のオリゴヌクレオチド鎖の位置24〜33のそれぞれのヌクレオチド残基は、前記第2の鎖のデオキシリボヌクレオチドと塩基対を形成するデオキシリボヌクレオチドであるか;または、
前記第1の鎖は、長さが37〜49ヌクレオチドであり、かつ前記第1のオリゴヌクレオチド鎖の位置24〜35のそれぞれのヌクレオチド残基は、前記第2の鎖のデオキシリボヌクレオチドと塩基対を形成するデオキシリボヌクレオチドであるか;または、
前記第1の鎖は、長さが35〜49ヌクレオチドであり、かつ前記第1のオリゴヌクレオチド鎖の位置24〜35のそれぞれのヌクレオチド残基は、前記第2の鎖のデオキシリボヌクレオチドと塩基対を形成するデオキシリボヌクレオチドであるか;または、
前記第1の鎖は、長さが39〜49ヌクレオチドであり、かつ前記第1のオリゴヌクレオチド鎖の位置24〜37のそれぞれのヌクレオチド残基は、前記第2の鎖のデオキシリボヌクレオチドと塩基対を形成するデオキシリボヌクレオチドであるか;または、
前記第1の鎖は、長さが37〜49のヌクレオチドであり、かつ前記第1のオリゴヌクレオチド鎖の位置24〜37のそれぞれのヌクレオチド残基は、前記第2の鎖のデオキシリボヌクレオチドと塩基対を形成するデオキシリボヌクレオチドである、単離されたdsNA。
【請求項６】
請求項1〜5のいずれか1項に記載の単離されたdsNAであって、前記第1の鎖の前記デオキシリボヌクレオチドと塩基対を形成する前記第2の鎖の前記デオキシリボヌクレオチドは、前記標的RNAに対して相補的でない、単離されたdsNA。
【請求項７】
請求項1〜6のいずれか1項に記載の単離されたdsNAであって、前記第2の鎖3'オーバーハングの前記ヌクレオチドは、修飾されたヌクレオチドを含み、および／または前記第1の鎖の位置24〜3'末端ヌクレオチド残基の少なくとも1つは、さらに修飾されたヌクレオチドを含み、任意に前記修飾されたヌクレオチド残基は、2'-O-メチル、2'-メトキシエトキシ、2'-フルオロ、2'-アリル、2'-O-［2-（メチルアミノ）-2-オキソエチル］、4'-チオ、4'-CH2-O-2'-ブリッジ、2-O-2'-ブリッジ4'-（CH2）、2'-LNA、2'-アミノおよび2'-O-（N-メチリカルバメートまたはこれらの組合せからなる群より選択される、単離されたdsNA。
【請求項８】
請求項1および3〜7のいずれか1項に記載の単離されたdsNAであって、前記第1の鎖の前記3'末端の最後および最後から2番目の残基はデオキシリボヌクレオチドであり、かつ前記第2の鎖の前記5'末端の最後および最後から2番目の残基は、リボヌクレオチドである、単離されたdsNA。
【請求項９】
請求項1〜8のいずれか1項に記載の単離されたdsNAであって、前記第2の鎖は、前記第1のオリゴヌクレオチド鎖の5'末端ヌクレオチド残基（位置1）に相補的である前記第2の鎖のヌクレオチド残基から開始して、前記第2の鎖の位置20〜5'末端残基まで全ての位置にて修飾されていないヌクレオチド残基を含むか；または前記第2の鎖の3'末端にて第1のヌクレオチド（位置1）から開始して、前記第2の鎖の3'末端から位置1、2および3は、修飾されたヌクレオチドであり；および／または前記第1の鎖の3'末端にて第1のヌクレオチド（位置1）から開始して、位置1、2および／または3は、デオキシリボヌクレオチドであり、および任意に前記第1の鎖は、前記第1の鎖の3'末端から位置1にてデオキシリボヌクレオチドを含むか、または前記第1の鎖は、前記第1の鎖の3'末端から位置1および2にてデオキシリボヌクレオチドを含む、単離されたdsNA。
【請求項１０】
請求項1〜9のいずれか1項に記載の単離されたdsNAであって、前記第2の、または第1のオリゴヌクレオチド鎖のヌクレオチドは、Dicer切断の向きを方向付ける修飾されたヌクレオチドで置換される、単離されたdsNA。
【請求項１１】
請求項1〜10のいずれか1項に記載の単離されたdsNAであって、第1の鎖が第2の鎖ヌクレオチド配列に対して少なくとも90%、95%または100%相補的であるヌクレオチド配列を有する、単離されたdsNA。
【請求項１２】
請求項1〜11のいずれか1項に記載の単離されたdsNAであって、前記第1の鎖の3'末端ヌクレオチド残基は、ヌクレオチド配列によって前記第2の鎖の5'末端ヌクレオチド残基に付着され、任意に前記第1の鎖の前記3'末端ヌクレオチド残基および前記第2の鎖の前記5'末端ヌクレオチド残基を付着する前記ヌクレオチド配列は、テトラループおよびヘアピンからなる群より選択される構造を含か；または任意に前記第1および第2の鎖は、化学的リンカーによって連結され、および任意に前記化学的リンカーは、前記第1の鎖の3'末端および前記第2の鎖の5'末端を連結する、単離されたdsNA。
【請求項１３】
請求項1〜12のいずれか1項に記載の単離されたdsNAであって、前記第2の鎖のデオキシリボヌクレオチドと塩基対を形成するデオキシリボヌクレオチドである前記第1の鎖の前記位置24〜3'末端ヌクレオチド残基の少なくとも1つは、修飾されていないデオキシリボヌクレオチドであり、および任意にさらに、前記第2の鎖の前記デオキシリボヌクレオチドの少なくとも1つは、修飾されていないデオキシリボヌクレオチドである、単離されたdsNA。
【請求項１４】
請求項1〜13のいずれか1項に記載の単離されたdsNAであって、前記第2のオリゴヌクレオチド鎖が、前記第1のオリゴヌクレオチド鎖の5'末端ヌクレオチド残基に対して相補的である前記第2の鎖のヌクレオチド残基から開始して、交互に修飾された、および修飾されていないヌクレオチド残基を含む、単離されたdsNA。
【請求項１５】
前記dsNAが哺乳動物細胞に導入されたときに標的遺伝子の発現を減少させるための医薬の製造における、請求項1〜13のいずれか1項に記載の単離されたdsNAの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、以下の出願に関し、かつこれらに対して米国特許法§119（e）下で優先権を主張する：2008年12月18日に出願の米国仮特許出願第61/138,946号；2009年4月2日に出願の米国仮特許出願第61/166,227号；2009年4月28日に出願の米国仮特許出願第61/173,505号；2009年4月28日に出願の米国仮特許出願第61/173,514号；2009年4月28日に出願の米国仮特許出願第61/173,521号；2009年4月28日に出願の米国仮特許出願第61/173,525号；2009年4月28日に出願の米国仮特許出願第61/173,532号；2009年4月28日に出願の米国仮特許出願第61/173,538号；2009年4月28日に出願の米国仮特許出願第61/173,544号；2009年4月28日に出願の米国仮特許出願第61/173,549号；2009年4月28日に出願の米国仮特許出願第61/173,554号；2009年4月28日に出願の米国仮特許出願第61/173,556号；2009年4月28日に出願の米国仮特許出願第61/173,558号；および2009年4月28日に出願の米国仮特許出願第61/173,563号。上記の出願の全ての教示は、参照により本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
本発明の背景
25〜35ヌクレオチドの鎖長を有する二本鎖RNA（dsRNA）薬剤は、哺乳動物細胞における標的遺伝子発現の有効な阻害剤として記述されている（Rossi et al.,米国特許公開第2005/0244858号および第2005/0277610号）。このような長さのdsRNA薬剤は、RNA干渉（RNAi）経路のDicer酵素によってプロセスされると考えられ、このような薬剤は「dicer基質siRNA」（「DsiRNA」）薬剤と呼ばれるようになっている。DsiRNA薬剤の一定の修飾された構造は、以前に記述されている（Rossi et al.,米国特許公開第2007/0265220号）。
【０００３】
強く、配列特異的な標的遺伝子サイレンシング有効性が、25〜35ヌクレオチド長dsRNA薬剤について同定されたが、増強されたインビトロおよびインビボでの有効性を有するDsiRNA薬剤の設計を含む、このような薬剤のデザインの改善に対する需要が存在する。
【発明の概要】
【０００４】
発明の簡単な要旨
本発明は、少なくとも部分的には、センス鎖の3'末端／5'末端のアンチセンス鎖にて、もしくは近くで、またはセンス鎖の5'末端／アンチセンス鎖の3'末端にて、もしくは近くのいずれかで、塩基対デオキシリボヌクレオチドを有する長さが27〜39ヌクレオチドの範囲の鎖長を有する二本鎖核酸薬剤が有効なRNA干渉薬剤であるという驚くべき発見に基づく。実際に、本発明は、Dicer酵素切断を介して生じる活性なsiRNAから切除されるDicer基質siRNA（「DsiRNAs」）の領域内の塩基対デオキシリボヌクレオチドの包含が有効な阻害性薬剤を生じることの実証に関する。DsiRNAのこの領域内の1つまたは複数の塩基対形成したデオキシリボヌクレオチドの包含は、このような修飾されたDsiRNA分子に対して、たとえば有効性の増強（能力の増強および／または効果の期間の改善を含む）、DNA-結合分子のための認識ドメインの提示およびDNA：DNA二重鎖領域と関連するその他の特質を含む一定の利点を与えることができる。実際に、このような二本鎖DNA：DNA-拡張DsiRNA薬剤は、特に対応する二本鎖RNA：DNA-またはRNA：RNA-拡張DsiRNA薬剤と比較した能力の改善を含む、増強された有効性を有することが証明された。
【０００５】
本発明の利点の中で、DNA拡張DsiRNA薬剤は、このような二本鎖DNA拡張ドメインを含まない対応する長さのdsRNA薬剤と比較して、二重鎖長さの増加が有効なRNA阻害性薬剤のままであるDsiRNAsの産生を可能にし、一方で、たとえば、さらなる官能基に対するDsiRNAsの付着、安定化する修飾（たとえば、PS-NA部分）の包含／パターン構成またはさらなる官能性を付加することおよび／もしくはたとえば、このような薬剤の薬物動態学、薬力学もしくは体内分布を増強することができる修飾のその他の形態のためのより大きな空間を提供するので、有効性の減少示さないという驚くべき発見。このようなdsDNA-拡張領域の効果は、dsDNA領域に固有の安定化活性から生じるようにはみえず、むしろ、好ましい切断産物もしくは切断産物の集団が産生され、および／またはより優勢となるように、特異的に局在化されたデオキシリボヌクレオチド残基（第1の鎖の突出したDicer切断部位の3'および対応して第2の鎖の突出したDicer切断部位5'に位置するか、または第1の鎖の突出したDicer切断部位の5'および対応して第2の鎖の突出したDicer切断部位の3'に位置する）がDicer切断を指揮する能力に起因するようにみえる。
【０００６】
したがって、一定の側面において、本発明は、先に述べたRNA阻害性薬剤よりも長い長さで（Dicer切断イベントの位置のより正確な指揮を介して）増強された有効性を有するRNA阻害性薬剤の設計が可能であり、これにより増強された有効性、送達、薬物動態学的、薬力学的および体内分布特性、並びにたとえば、首尾よく製剤化され、活性な薬物分子および／またはペイロードに付着され、別の活性な核酸分子に付着され、検出分子に付着され、（たとえば、複数の）安定化する修飾を有する能力の改善を有するdsRNA含有薬剤の産生が可能である。
【０００７】
一つの側面において、本発明は、5'末端および3'末端を有する第1のオリゴヌクレオチド鎖、並びに5'末端および3'末端を有する第2のオリゴヌクレオチド鎖を有する単離された二本鎖核酸（dsNA）であって、第1の鎖は、長さが27〜49ヌクレオチド残基であり、第1の鎖の5'末端にて第1のヌクレオチド（位置1）から開始し、第1の鎖の位置1〜23は、リボヌクレオチドであり；第2の鎖は、長さが27〜53ヌクレオチド残基であり、かつ二重鎖を形成するために第1の鎖の位置1〜23のリボヌクレオチドと塩基対を形成する23の連続したリボヌクレオチドを含み；第1の鎖の5'末端および第2の鎖の3'末端は、平滑末端または1〜4ヌクレオチドの3'オーバーハングを形成し；第1の鎖の3'末端および第2の鎖の5'末端は、平滑末端を形成し；第1の鎖の位置24〜3'末端ヌクレオチド残基の少なくとも1つは、第2の鎖のデオキシリボヌクレオチドと塩基対を形成するデオキシリボヌクレオチドであり；かつ第2の鎖は、第2の鎖長の少なくとも19リボヌクレオチドに沿って標的RNAに対して十分に相補的であり、二本鎖核酸が哺乳動物細胞に導入されるときに、標的遺伝子発現を減少させる、二本鎖核酸（dsNA）を提供する。
【０００８】
もう一つの側面において、本発明は、5'末端および3'末端を有する第1のオリゴヌクレオチド鎖、並びに5'末端および3'末端を有する第2のオリゴヌクレオチド鎖を有する単離された二本鎖核酸（dsNA）であって、第1の鎖は、長さが27〜53ヌクレオチド残基であり、
第1の鎖の5'末端にて第1のヌクレオチド（位置1）から開始し、第1の鎖の位置1〜23は、リボヌクレオチドであり；第2の鎖は、長さが27〜53ヌクレオチド残基であり、かつ二重鎖を形成するために第1の鎖の位置1〜23のリボヌクレオチドと塩基対を形成する23の連続したリボヌクレオチドを含み；第1の鎖の5'末端および第2の鎖形態の3'末端は、平滑末端または1〜4ヌクレオチド3'オーバーハングを形成し；第1の鎖の3'末端および第2の鎖の5'末端は、1〜4ヌクレオチド3'オーバーハングを形成し；第1の鎖の位置24〜3'末端ヌクレオチド残基の少なくとも1つは、第2のデオキシリボヌクレオチドと塩基対を形成するデオキシリボヌクレオチドであり；かつ第2の鎖は、第2の鎖長の少なくとも19リボヌクレオチドに沿って標的RNAに対して十分に相補的であり、二本鎖核酸が哺乳動物細胞に導入されるときに、標的遺伝子発現を減少させる、二本鎖核酸（dsNA）を提供する。
【０００９】
さらなる側面において、本発明は、5'末端および3'末端を有する第1のオリゴヌクレオチド鎖、並びに5'末端および3'末端を有する第2のオリゴヌクレオチド鎖を有する単離された二本鎖核酸（dsNA）であって、第1の鎖は、長さが27〜49ヌクレオチド残基であり、
第1の鎖の5'末端にて第1のヌクレオチド（位置1）から開始し、第1の鎖の位置1〜23は、リボヌクレオチドであり；第2の鎖は、長さが27〜53ヌクレオチド残基であり、かつ二重鎖を形成するために第1の鎖の位置1〜23のリボヌクレオチドと塩基対を形成する23の連続したリボヌクレオチドを含み；第1の鎖の5'末端および第2の鎖形態の3'末端は、平滑末端または1〜4ヌクレオチド3'オーバーハングを形成し；第1の鎖の3'末端および第2の鎖の5'末端は、平滑末端を形成し、かつ第1の鎖の3'末端の最後および最後から2番目の残基、並びに第2の鎖の5'末端の最後および最後から2番目の残基は、1つまたは2つのミスマッチ塩基対を形成し、第1の鎖の位置24〜3'末端ヌクレオチド残基の少なくとも1つは、第2のデオキシリボヌクレオチドと塩基対を形成するデオキシリボヌクレオチドであり；かつ第2の鎖は、第2の鎖長の少なくとも19リボヌクレオチドに沿って標的RNAに対して十分に相補的であり、二本鎖核酸が哺乳動物細胞に導入されるときに、標的遺伝子発現を減少させる、二本鎖核酸（dsNA）を提供する。
【００１０】
さらなる側面において、本発明は、5'末端および3'末端を有する第1のオリゴヌクレオチド鎖、並びに5'末端および3'末端を有する第2のオリゴヌクレオチド鎖を有する単離された二本鎖核酸（dsNA）であって、第1の鎖は、長さが27〜49ヌクレオチド残基であり、第1の鎖の5'末端にて第1のヌクレオチド（位置1）から開始し、第1の鎖の位置1〜23は、リボヌクレオチドであり；第2の鎖は、長さが27〜53ヌクレオチド残基であり、かつ二重鎖を形成するために第1の鎖の位置1〜23のリボヌクレオチドに対して十分に相補的である23の連続したリボヌクレオチドを含み；第1の鎖の5'末端および第2の鎖形態の3'末端は、平滑末端または1〜4ヌクレオチド3'オーバーハングを形成し；第1の鎖の3'末端および第2の鎖の5'末端は、平滑末端を形成し；第1の鎖の5'末端にて第1のヌクレオチド（位置1）から開始し、第1の鎖の位置1〜9は、第2の鎖とミスマッチを形成するヌクレオチドを含み；第1の鎖の位置24〜3'末端ヌクレオチド残基の少なくとも1つは、第2のデオキシリボヌクレオチドと塩基対を形成するデオキシリボヌクレオチドであり；かつ、第2の鎖は、第2の鎖長の少なくとも19リボヌクレオチドに沿って標的RNAに対して十分に相補的であり、二本鎖核酸が哺乳動物細胞に導入されるときに、標的遺伝子発現を減少させる、二本鎖核酸（dsNA）を提供する。
【００１１】
もう一つの側面において、本発明は、5'末端および3'末端を有する第1のオリゴヌクレオチド鎖、並びに5'末端および3'末端を有する第2のオリゴヌクレオチド鎖を有する単離された二本鎖核酸（dsNA）であって、第1の鎖は、長さが27〜53ヌクレオチド残基であり、第1の鎖の5'末端にて第1のヌクレオチド（位置1）から開始し、第1の鎖の位置1〜23は、リボヌクレオチドであり；第2の鎖は、長さが27〜53ヌクレオチド残基であり、かつ二重鎖を形成するために第1の鎖の位置1〜23のリボヌクレオチドに対して十分に相補的である23の連続したリボヌクレオチドを含み；第1の鎖の5'末端および第2の鎖の3'末端は、平滑末端または1〜4ヌクレオチド3'オーバーハングを形成し；第1の鎖の3'末端および第2の鎖の5'末端は、1〜4ヌクレオチド3'オーバーハングを形成し；第1の鎖の5'末端にて第1のヌクレオチド（位置1）から開始し、第1の鎖の位置1〜9は、第2の鎖とミスマッチを形成するヌクレオチドを含み；第1の鎖の位置24〜3'末端ヌクレオチド残基の少なくとも1つは、第2のデオキシリボヌクレオチドと塩基対を形成するデオキシリボヌクレオチドであり；かつ第2の鎖は、第2の鎖長の少なくとも19リボヌクレオチドに沿って標的RNAに対して十分に相補的であり、二本鎖核酸が哺乳動物細胞に導入されるときに、標的遺伝子発現を減少させる、二本鎖核酸（dsNA）を提供する。
【００１２】
さらなる側面において、本発明は、5'末端および3'末端を有する第1のオリゴヌクレオチド鎖、並びに5'末端および3'末端を有する第2のオリゴヌクレオチド鎖を有する単離された二本鎖核酸（dsNA）であって、第1の鎖は、長さが27〜49ヌクレオチド残基であり、第1の鎖の5'末端にて第1のヌクレオチド（位置1）から開始し、第1の鎖の位置1〜23は、リボヌクレオチドであり；第2の鎖は、長さが27〜53ヌクレオチド残基であり、かつ二重鎖を形成するために第1の鎖の位置1〜23のリボヌクレオチドに対して十分に相補的である23の連続したリボヌクレオチドを含み；第1の鎖の5'末端および第2の鎖の3'末端は、平滑末端または1〜4ヌクレオチド3'オーバーハングを形成し；第1の鎖および第2の鎖の5'末端の3'末端は、平滑末端を形成し、かつ第1の鎖の3'末端の最後および最後から2番目の残基、並びに第2の鎖の5'末端の最後および最後から2番目の残基は、1つまたは2つのミスマッチ塩基対を形成し、第1の鎖の5'末端にて第1のヌクレオチド（位置1）から開始し、第1の鎖の位置1〜9は、第2の鎖とミスマッチを形成するヌクレオチドを含み；第1の鎖の位置24〜3'末端ヌクレオチド残基の少なくとも1つは、第2のデオキシリボヌクレオチドと塩基対を形成するデオキシリボヌクレオチドであり；かつ第2の鎖は、第2の鎖長の少なくとも19リボヌクレオチドに沿って標的RNAに対して十分に相補的であり、二本鎖核酸が哺乳動物細胞に導入されるときに、標的遺伝子発現を減少させる、二本鎖核酸（dsNA）を提供する。
【００１３】
一つの態様において、第1の鎖の位置24〜3'末端ヌクレオチド残基の2以上、4以上、6以上、8以上、10以上、12以上、14以上、16以上、18または20以上のヌクレオチド残基は、第2の鎖のデオキシリボヌクレオチドと塩基対を形成するデオキシリボヌクレオチドである。任意に、第2の鎖のデオキシリボヌクレオチドと塩基対を形成する第1の鎖のデオキシリボヌクレオチドは、連続したデオキシリボヌクレオチドである。
【００１４】
一つの態様において、第1の鎖の位置24〜27の2つ以上の連続したヌクレオチド残基は、第2の鎖のデオキシリボヌクレオチドと塩基対を形成するデオキシリボヌクレオチドである。もう一つの態様において、第1の鎖の位置24および25のそれぞれは、第2の鎖のデオキシリボヌクレオチドと塩基対を形成するデオキシリボヌクレオチドである。
【００１５】
さらなる態様において、第1のオリゴヌクレオチド鎖の位置24〜27のそれぞれのヌクレオチド残基は、第2の鎖のデオキシリボヌクレオチドと塩基対を形成するデオキシリボヌクレオチドである。
【００１６】
もう一つの態様において、第1の鎖は、長さが29〜49ヌクレオチドである。任意に、第1のオリゴヌクレオチド鎖の位置24〜27のそれぞれのヌクレオチド残基は、第2の鎖のデオキシリボヌクレオチドと塩基対を形成するデオキシリボヌクレオチドである。
【００１７】
一つの態様において、第1の鎖は、長さが31〜49ヌクレオチドである。任意に、第1のオリゴヌクレオチド鎖の位置24〜29のそれぞれのヌクレオチド残基は、第2の鎖のデオキシリボヌクレオチドと塩基対を形成するデオキシリボヌクレオチドである。
【００１８】
さらなる態様において、第1の鎖は、長さが33〜49ヌクレオチドである。任意に、第1のオリゴヌクレオチド鎖の位置24〜31のそれぞれのヌクレオチド残基は、第2の鎖のデオキシリボヌクレオチドと塩基対を形成するデオキシリボヌクレオチドである。
【００１９】
もう一つの態様において、第1の鎖は、長さが35〜49ヌクレオチドである。任意に、第1のオリゴヌクレオチド鎖の位置24〜33のそれぞれのヌクレオチド残基は、第2の鎖のデオキシリボヌクレオチドと塩基対を形成するデオキシリボヌクレオチドである。
【００２０】
一定の態様において、第1の鎖は、長さが37〜49ヌクレオチドである。任意に、第1のオリゴヌクレオチド鎖の位置24〜35のそれぞれのヌクレオチド残基は、第2の鎖のデオキシリボヌクレオチドと塩基対を形成するデオキシリボヌクレオチドである。
【００２１】
一つの態様において、第1の鎖は、長さが39〜49ヌクレオチドである。任意に、第1のオリゴヌクレオチド鎖の位置24〜37のそれぞれのヌクレオチド残基は、第2の鎖のデオキシリボヌクレオチドと塩基対を形成するデオキシリボヌクレオチドである。
【００２２】
さらなる態様において、第1の鎖のデオキシリボヌクレオチドと塩基対を形成する第2の鎖のデオキシリボヌクレオチドは、標的RNAに対して相補的でない。
【００２３】
一定の態様において、第2の鎖は、長さが1〜4ヌクレオチドの3'オーバーハングを有する。関連した態様において、第2の鎖3'オーバーハングのヌクレオチドは、修飾されたヌクレオチドを含む。任意に、修飾されたヌクレオチド残基は、2'-O-メチル、2'-メトキシエトキシ、2'-フルオロ、2'-アリル、2'-O-［2-（メチルアミノ）-2-オキソエチル］、4'-チオ、4'-CH2-O-2'-ブリッジ、4'-（CH2）2-O-2'-ブリッジ、2'-LNA、2'-アミノまたは2'-O-（N-メチリカルバメート（methlycarbamate））である。
【００２４】
もう一つの態様において、第1の鎖の位置24〜3'末端ヌクレオチド残基の少なくとも1つは、2'-O-メチル、2'-メトキシエトキシ、2'-フルオロ、2'-アリル、2'-O-［2-（メチルアミノ）-2-オキソエチル］、4'-チオ、4'-CH2-O-2'-ブリッジ、2-O-2'-ブリッジ4'-（CH2）、2'-LNA、2'-アミノまたは2'-O-（N-メチリカルバメート（methlycarbamate））である修飾されたヌクレオチドをさらに有する。
【００２５】
一つの態様において、第1の鎖の3'末端の最後および最後から2番目の残基は、デオキシリボヌクレオチドであり、かつ第2の鎖の5'末端の最後および最後から2番目の残基は、リボヌクレオチドである。
【００２６】
もう一つの態様において、第2の鎖は、第1のオリゴヌクレオチド鎖の5'末端ヌクレオチド残基（位置1*）に相補的である第2の鎖のヌクレオチド残基から開始し、第2の鎖の位置20*〜5'末端残基の全ての位置にて修飾されていないヌクレオチド残基を含む。任意に、第1の鎖の3'末端にて第1のヌクレオチド（位置1*）から開始し、位置1*、2*および／または3*は、デオキシリボヌクレオチドである。
【００２７】
一つの態様において、第1の鎖は、第1の鎖の3'末端から位置1*にてデオキシリボヌクレオチドを有する。任意に、第1の鎖は、第1の鎖の3'末端から位置1*および2*にてデオキシリボヌクレオチドを有する。
【００２８】
もう一つの態様において、第2のヌクレオチドまたは第1のオリゴヌクレオチド鎖は、Dicer切断の向きを方向付ける修飾されたヌクレオチドで置換される。
【００２９】
さらなる態様において、第2の鎖の3'末端にて第1のヌクレオチド（位置1*）から開始し、第2の鎖の3'末端から位置1*、2*および3*は、修飾されたヌクレオチドである。
【００３０】
任意に、第1の鎖は、第2の鎖ヌクレオチド配列に対して少なくとも60%、70%、80%、90%、95%または100%相補的であるヌクレオチド配列を有する。
【００３１】
一定の態様において、第1の鎖の3'末端ヌクレオチド残基は、ヌクレオチド配列によって第2の鎖の5'末端ヌクレオチド残基に付着される。任意に、第1の鎖の3'末端ヌクレオチド残基および第2の鎖の5'末端ヌクレオチド残基を付着するヌクレオチド配列は、テトラループまたはヘアピン構造を含む。
【００３２】
一つの態様において、第1および第2の鎖は、化学的リンカーによって連結される。任意に、第1の鎖の3'末端および第2の鎖の5'末端は、化学的リンカーによって連結される。
【００３３】
一定の態様において、第2の鎖のデオキシリボヌクレオチドと塩基対を形成するデオキシリボヌクレオチドである第1の鎖の位置24〜3'末端ヌクレオチド残基の少なくとも1つは、修飾されていないデオキシリボヌクレオチドである。関連した態様において、第2の鎖のデオキシリボヌクレオチドと塩基対を形成するデオキシリボヌクレオチドである第1の鎖の位置24〜3'末端ヌクレオチド残基の少なくとも1つおよび第2の鎖のデオキシリボヌクレオチドの両方は、修飾されていないデオキシリボヌクレオチドである。
【００３４】
一つの態様において、第2のオリゴヌクレオチド鎖は、第1のオリゴヌクレオチド鎖の5'末端ヌクレオチド残基に相補的である第2の鎖のヌクレオチド残基から開始し、交互の修飾された、および修飾されていないヌクレオチド残基を交替させることを含む。
【００３５】
さらなる態様において、ミスマッチは、位置3〜9の任意の1つまたは複数にてDsiRNAに存在する。もう一つの態様において、ミスマッチは、位置1〜7の任意の1つまたは複数の位置にて存在する。さらなる態様において、ミスマッチは、位置3〜7の任意の1つまたは複数の位置にて存在する。任意に、ミスマッチは、位置6にて存在する。
【００３６】
もう一つの態様において、第1の鎖の5'末端にて第1のヌクレオチド（位置1）から開始し、第1の鎖の位置1〜9は、第2の鎖とミスマッチを形成する2つ以上のヌクレオチドを有する。任意に、位置2および6は、第2の鎖とミスマッチである。
【００３７】
さらなる側面において、本発明は、5'末端および3'末端を有する第1のオリゴヌクレオチド鎖、並びに5'末端および3'末端を有する第2のオリゴヌクレオチド鎖を有する単離された二本鎖核酸（dsNA）であって、第1の鎖は、長さが27〜49ヌクレオチド残基であり、第1の鎖の5'末端にて第1のヌクレオチド（位置1）から開始し、第1の鎖の位置1〜23は、リボヌクレオチドであり；第2の鎖は、長さが27〜53ヌクレオチド残基であり、かつ二重鎖を形成するために第1の鎖の位置1〜23のリボヌクレオチドに対して十分に相補的である23の連続したリボヌクレオチドを含み；第1の鎖の5'末端および第2の鎖形態の3'末端は、平滑末端または1〜4ヌクレオチド3'オーバーハングを形成し；第1の鎖の3'末端および第2の鎖の5'末端は、平滑末端を形成し；第1のオリゴヌクレオチド鎖の5'末端ヌクレオチド残基（位置1*）に相補的である第2の鎖のヌクレオチド残基から開始し、第2の鎖の5'方向における位置1*〜位置9*は、標的RNAの配列とミスマッチを形成するヌクレオチドを含み；第1の鎖の位置24〜3'末端ヌクレオチド残基の少なくとも1つは、第2のデオキシリボヌクレオチドと塩基対を形成するデオキシリボヌクレオチドであり；かつ第2の鎖は、第2の鎖長の少なくとも19リボヌクレオチドに沿って標的RNAに対して十分に相補的であり、二本鎖核酸が哺乳動物細胞に導入されるときに、標的遺伝子発現を減少させる、二本鎖核酸（dsNA）を提供する。
【００３８】
もう一つの側面において、本発明は、5'末端および3'末端を有する第1のオリゴヌクレオチド鎖、並びに5'末端および3'末端を有する第2のオリゴヌクレオチド鎖を有する単離された二本鎖核酸（dsNA）であって、第1の鎖は、長さが27〜53ヌクレオチド残基であり、第1の鎖の5'末端にて第1のヌクレオチド（位置1）から開始し、第1の鎖の位置1〜23は、リボヌクレオチドであり；第2の鎖は、長さが27〜53ヌクレオチド残基であり、かつ二重鎖を形成するために第1の鎖の位置1〜23のリボヌクレオチドに対して十分に相補的である23の連続したリボヌクレオチドを含み；第1の鎖の5'末端および第2の鎖形態の3'末端は、平滑末端または1〜4ヌクレオチド3'オーバーハングを形成し；第1の鎖の3'末端および第2の鎖の5'末端は、1〜4ヌクレオチド3'オーバーハングを形成し；第1のオリゴヌクレオチド鎖の5'末端ヌクレオチド残基（位置1*）に相補的である第2の鎖のヌクレオチド残基から開始し、第2の鎖の5'方向における位置1*〜位置9*は、標的RNAの配列とミスマッチを形成するヌクレオチドを含み；第1の鎖の位置24〜3'末端ヌクレオチド残基の少なくとも1つは、第2のデオキシリボヌクレオチドと塩基対を形成するデオキシリボヌクレオチドであり；かつ第2の鎖は、第2の鎖長の少なくとも19リボヌクレオチドに沿って標的RNAに対して十分に相補的であり、二本鎖核酸が哺乳動物細胞に導入されるときに、標的遺伝子発現を減少させる、二本鎖核酸（dsNA）を提供する。
【００３９】
さらなる側面において、本発明は、5'末端および3'末端を有する第1のオリゴヌクレオチド鎖、並びに5'末端および3'末端を有する第2のオリゴヌクレオチド鎖を有する単離された二本鎖核酸（dsNA）であって、第1の鎖は、長さが27〜49ヌクレオチド残基であり、第1の鎖の5'末端にて第1のヌクレオチド（位置1）から開始し、第1の鎖の位置1〜23は、リボヌクレオチドであり；第2の鎖は、長さが27〜53ヌクレオチド残基であり、かつ二重鎖を形成するために第1の鎖の位置1〜23のリボヌクレオチドに対して十分に相補的である23の連続したリボヌクレオチドを含み；第1の鎖の5'末端および第2の鎖形態の3'末端は、平滑末端または1〜4ヌクレオチド3'オーバーハングを形成し；第1の鎖の3'末端および第2の鎖の5'末端は、平滑末端を形成し、かつ第1の鎖の3'末端の最後および最後から2番目の残基および第2の鎖の5'末端の最後および最後から2番目の残基は、1つまたは2つのミスマッチ塩基対を形成し；第1のオリゴヌクレオチド鎖の5'末端ヌクレオチド残基（位置1*）に相補的である第2の鎖のヌクレオチド残基から開始し、第2の鎖の5'方向における位置1*〜位置9*は、標的RNAの配列とミスマッチを形成するヌクレオチドを含み；第1の鎖の位置24〜3'末端ヌクレオチド残基の少なくとも1つは、第2のデオキシリボヌクレオチドと塩基対を形成するデオキシリボヌクレオチドであり；かつ第2の鎖は、第2の鎖長の少なくとも19リボヌクレオチドに沿って標的RNAに対して十分に相補的であり、二本鎖核酸が哺乳動物細胞に導入されるときに、標的遺伝子発現を減少させる、二本鎖核酸（dsNA）を提供する。
【００４０】
一つの態様において、第2の鎖の3'オーバーハングのヌクレオチドは、標的RNAとミスマッチを形成する。
【００４１】
もう一つの側面において、本発明は、5'末端および3'末端を有する第1のオリゴヌクレオチド鎖、並びに5'末端および3'末端を有する第2のオリゴヌクレオチド鎖を有する単離された二本鎖核酸（dsNA）であって、第2の鎖は、長さが27〜53ヌクレオチド残基であり、第2の鎖の5'末端にて第1のヌクレオチド（位置1）から開始し、第2の鎖の位置1〜23は、リボヌクレオチドであり；第1の鎖は、長さが27〜49ヌクレオチド残基であり、かつ二重鎖を形成するために第2の鎖の位置1〜23のリボヌクレオチドと塩基対を形成する23の連続したリボヌクレオチドを含み；第1の鎖の3'末端および第2の鎖の5'末端は、平滑末端を形成し；第2の鎖の位置24〜3'末端ヌクレオチド残基の少なくとも1つは、第1のデオキシリボヌクレオチドと塩基対を形成するデオキシリボヌクレオチドであり；かつ第2の鎖は、第2の鎖長の少なくとも19リボヌクレオチドに沿って標的RNAに対して十分に相補的であり、二本鎖核酸が哺乳動物細胞に導入されるときに、標的遺伝子発現を減少させる、二本鎖核酸（dsNA）を提供する。
【００４２】
一つの側面において、本発明は、5'末端および3'末端を有する第1のオリゴヌクレオチド鎖、並びに5'末端および3'末端を有する第2のオリゴヌクレオチド鎖を有する単離された二本鎖核酸（dsNA）であって、第2の鎖は、長さが27〜53ヌクレオチド残基であり、第2の鎖の5'末端にて第1のヌクレオチド（位置1）から開始し、第2の鎖の位置1〜23は、リボヌクレオチドであり；第1の鎖は、長さが27〜53ヌクレオチド残基であり、かつ二重鎖を形成するために第2の鎖の位置1〜23のリボヌクレオチドと塩基対を形成する23の連続したリボヌクレオチドを含み；第1の鎖の3'末端および第2の鎖の5'末端は、1〜4ヌクレオチド3'オーバーハングを形成し；第2の鎖の位置24〜3'末端ヌクレオチド残基の少なくとも1つは、第1のデオキシリボヌクレオチドと塩基対を形成するデオキシリボヌクレオチドであり；かつ第2の鎖は、第2の鎖長の少なくとも19リボヌクレオチドに沿って標的RNAに対して十分に相補的であり、二本鎖核酸が哺乳動物細胞に導入されるときに、標的遺伝子発現を減少させる、二本鎖核酸（dsNA）を提供する。
【００４３】
さらなる側面において、本発明は、5'末端および3'末端を有する第1のオリゴヌクレオチド鎖、並びに5'末端および3'末端を有する第2のオリゴヌクレオチド鎖を有する単離された二本鎖核酸（dsNA）であって、第2の鎖は、長さが27〜53ヌクレオチド残基であり、第2の鎖の5'末端にて第1のヌクレオチド（位置1）から開始し、第2の鎖の位置1〜23は、リボヌクレオチドであり；第1の鎖は、長さが27〜49ヌクレオチド残基であり、かつ二重鎖を形成するために第2の鎖の位置1〜23のリボヌクレオチドと塩基対を形成する23の連続したリボヌクレオチドを含み；第1の鎖の3'末端および第2の鎖の5'末端は、平滑末端を形成し、かつ第1の鎖の3'末端の最後および最後から2番目の残基および第2の鎖の5'末端の最後および最後から2番目の残基は、1つまたは2つのミスマッチ塩基対を形成し；第2の鎖の位置24〜3'末端ヌクレオチド残基の少なくとも1つは、第1のデオキシリボヌクレオチドと塩基対を形成するデオキシリボヌクレオチドであり；かつ第2の鎖は、第2の鎖長の少なくとも19リボヌクレオチドに沿って標的RNAに対して十分に相補的であり、二本鎖核酸が哺乳動物細胞に導入されるときに、標的遺伝子発現を減少させる、二本鎖核酸（dsNA）を提供する。
【００４４】
一つの側面において、本発明は、5'末端および3'末端を有する第1のオリゴヌクレオチド鎖、並びに5'末端および3'末端を有する第2のオリゴヌクレオチド鎖を有する単離された二本鎖核酸（dsNA）であって、第2の鎖は、長さが27〜53ヌクレオチド残基であり、第2の鎖の5'末端にて第1のヌクレオチド（位置1）から開始し、第2の鎖の位置1〜23は、リボヌクレオチドであり、かつ第2の鎖の位置11〜21は、第1の鎖とミスマッチを形成するヌクレオチドを含み；第1の鎖は、長さが27〜49ヌクレオチド残基であり、かつ二重鎖を形成する第2の鎖の位置1〜23のリボヌクレオチドに対して十分に相補的である23の連続したリボヌクレオチドを含み；第1の鎖の3'末端および第2の鎖の5'末端は、平滑末端を形成し；第2の鎖の位置24〜3'末端ヌクレオチド残基の少なくとも1つは、第1のデオキシリボヌクレオチドと塩基対を形成するデオキシリボヌクレオチドであり；かつ第2の鎖は、第2の鎖長の少なくとも19リボヌクレオチドに沿って標的RNAに対して十分に相補的であり、二本鎖核酸が哺乳動物細胞に導入されるときに、標的遺伝子発現を減少させる、二本鎖核酸（dsNA）を提供する。
【００４５】
もう一つの側面において、本発明は、5'末端および3'末端を有する第1のオリゴヌクレオチド鎖、並びに5'末端および3'末端を有する第2のオリゴヌクレオチド鎖を有する単離された二本鎖核酸（dsNA）であって、第2の鎖は、長さが27〜53ヌクレオチド残基であり、第2の鎖の5'末端にて第1のヌクレオチド（位置1）から開始し、第2の鎖の位置1〜23は、リボヌクレオチドであり、かつ第2の鎖の位置11〜21は、第1の鎖とミスマッチを形成するヌクレオチドを含み；第1の鎖は、長さが27〜53ヌクレオチド残基であり、かつ二重鎖を形成するために第2の鎖の位置1〜23のリボヌクレオチドと塩基対を形成する23の連続したリボヌクレオチドを含み；第1の鎖の3'末端および第2の鎖の5'末端は、1〜4ヌクレオチド3'オーバーハングを形成し；第2の鎖の位置24〜3'末端ヌクレオチド残基の少なくとも1つは、第1のデオキシリボヌクレオチドと塩基対を形成するデオキシリボヌクレオチドであり；かつ第2の鎖は、第2の鎖長の少なくとも19リボヌクレオチドに沿って標的RNAに対して十分に相補的であり、二本鎖核酸が哺乳動物細胞に導入されるときに、標的遺伝子発現を減少させる、二本鎖核酸（dsNA）を提供する。
【００４６】
さらなる側面において、本発明は、5'末端および3'末端を有する第1のオリゴヌクレオチド鎖、並びに5'末端および3'末端を有する第2のオリゴヌクレオチド鎖を有する単離された二本鎖核酸（dsNA）であって、第2の鎖は、長さが27〜53ヌクレオチド残基であり、第2の鎖の5'末端にて第1のヌクレオチド（位置1）から開始し、第2の鎖の位置1〜23は、リボヌクレオチドであり、かつ第2の鎖の位置11〜21は、第1の鎖とミスマッチを形成するヌクレオチドを含み；第1の鎖は、長さが27〜49ヌクレオチド残基であり、かつ二重鎖を形成する第2の鎖の位置3〜23のリボヌクレオチドに対して十分に相補的である21の連続したリボヌクレオチドを含み；第1の鎖の3'末端および第2の鎖の5'末端は、平滑末端を形成し、かつ第1の鎖の3'末端の最後および最後から2番目の残基および第2の鎖の5'末端の最後および最後から2番目の残基は、1つまたは2つのミスマッチ塩基対を形成し；第2の鎖の位置24〜3'末端ヌクレオチド残基の少なくとも1つは、第1のデオキシリボヌクレオチドと塩基対を形成するデオキシリボヌクレオチドであり；かつ第2の鎖は、第2の鎖長の少なくとも19リボヌクレオチドに沿って標的RNAに対して十分に相補的であり、二本鎖核酸が哺乳動物細胞に導入されるときに、標的遺伝子発現を減少させる、二本鎖核酸（dsNA）を提供する。
【００４７】
一つの態様において、第2の鎖の位置24〜3'末端ヌクレオチド残基の2以上、4以上、6以上、8以上、10以上、12以上、14以上、16以上、18または20以上のヌクレオチド残基は、第1の鎖のデオキシリボヌクレオチドと塩基対を形成するデオキシリボヌクレオチドである。
【００４８】
もう一つの態様において、第1の鎖のデオキシリボヌクレオチドと塩基対を形成する第2の鎖のデオキシリボヌクレオチドは、連続したデオキシリボヌクレオチドである。任意に、第2の鎖の位置24〜27の2つ以上の連続したヌクレオチド残基は、第1の鎖のデオキシリボヌクレオチドと塩基対を形成するデオキシリボヌクレオチドである。
【００４９】
一つの態様において、DsiRNAの第2の鎖の位置24および25のそれぞれは、第1の鎖のデオキシリボヌクレオチドと塩基対を形成するデオキシリボヌクレオチドである。任意に、第2のオリゴヌクレオチド鎖の位置24〜27のそれぞれのヌクレオチド残基は、第1の鎖のデオキシリボヌクレオチドと塩基対を形成するデオキシリボヌクレオチドである。
【００５０】
一つの態様において、DsiRNAの第2の鎖は、長さが29〜53ヌクレオチドである。任意に、第2のオリゴヌクレオチド鎖の位置24〜27のそれぞれのヌクレオチド残基は、第1の鎖のデオキシリボヌクレオチドと塩基対を形成するデオキシリボヌクレオチドである。
【００５１】
もう一つの態様において、DsiRNAの第2の鎖は、長さが31〜53ヌクレオチドである。任意に、第2のオリゴヌクレオチド鎖の位置24〜29のそれぞれのヌクレオチド残基は、第1の鎖のデオキシリボヌクレオチドと塩基対を形成するデオキシリボヌクレオチドである。
【００５２】
さらなる態様において、DsiRNAの第2の鎖は、長さが33〜53ヌクレオチドである。任意に、第2のオリゴヌクレオチド鎖の位置24〜31のそれぞれのヌクレオチド残基は、第1の鎖のデオキシリボヌクレオチドと塩基対を形成するデオキシリボヌクレオチドである。
【００５３】
一定の態様において、DsiRNAの第2の鎖は、長さが35〜53ヌクレオチドである。任意に、第2のオリゴヌクレオチド鎖の位置24〜33のそれぞれのヌクレオチド残基は、第1の鎖のデオキシリボヌクレオチドと塩基対を形成するデオキシリボヌクレオチドである。
【００５４】
もう一つの態様において、DsiRNAの第2の鎖は、長さが37〜53ヌクレオチドである。任意に、第2のオリゴヌクレオチド鎖の位置24〜35のそれぞれのヌクレオチド残基は、第1の鎖のデオキシリボヌクレオチドと塩基対を形成するデオキシリボヌクレオチドである。
【００５５】
さらなる態様において、DsiRNAの第2の鎖は、長さが39〜53ヌクレオチドである。任意に、第2のオリゴヌクレオチド鎖の位置24〜37のそれぞれのヌクレオチド残基は、第1の鎖のデオキシリボヌクレオチドと塩基対を形成するデオキシリボヌクレオチドである。
【００５６】
一つの態様において、第2の鎖の位置24〜3'末端ヌクレオチド残基は、1〜25デオキシリボヌクレオチド残基の間を含み、第2の鎖のデオキシリボヌクレオチド残基のそれぞれは、第1の鎖のデオキシリボヌクレオチドと塩基対を形成する。
【００５７】
もう一つの態様において、第2の鎖は、第1の鎖の最も5'のDicer切断部位のすぐ3'に位置する第1のオリゴヌクレオチド鎖の残基に相補的である第2の鎖のヌクレオチド残基（位置1*）から開始して、第2の鎖の位置20*から5'末端残基の全てにて修飾されていないヌクレオチド残基を含む。
【００５８】
さらなる態様において、DsiRNAの第2の鎖の最も3'のDicer切断部位（位置A）のすぐ5'に位置するヌクレオチドから開始して、第2の鎖の5'方向における残基から位置A、BおよびCは、修飾されたヌクレオチドである。
【００５９】
もう一つの側面において、本発明は、5'末端および3'末端を有する第1のオリゴヌクレオチド鎖、並びに5'末端および3'末端を有する第2のオリゴヌクレオチド鎖を有する単離された二本鎖核酸（dsNA）であって、第2の鎖は、長さが27〜53ヌクレオチド残基であり、第2の鎖の5'末端にて第1のヌクレオチド（位置1）から開始し、第2の鎖の位置1〜23は、リボヌクレオチドであり；第1の鎖は、長さが27〜53ヌクレオチド残基であり、かつ二重鎖を形成するために第2の鎖の位置1〜23のリボヌクレオチドと塩基対を形成する23の連続したリボヌクレオチドを含み；第1の鎖の3'末端および第2の鎖の5'末端は、1〜4ヌクレオチド3'オーバーハングを形成し；第2の鎖の位置24〜3'末端ヌクレオチド残基の少なくとも1つは、第1のデオキシリボヌクレオチドと塩基対を形成するデオキシリボヌクレオチドであり；かつ第2の鎖は、第2の鎖長の少なくとも19リボヌクレオチドに沿って標的RNAに対して十分に相補的であり、二本鎖核酸が哺乳動物細胞に導入されるときに、標的遺伝子発現を減少させ、第2の鎖の位置11〜21は、標的RNAのヌクレオチドとミスマッチを形成するヌクレオチドを含む、二本鎖核酸（dsNA）を提供する。
【００６０】
一つの態様において、ミスマッチは、1つまたは複数の位置13〜21にて存在する。任意に、ミスマッチは、位置14にて存在する。
【００６１】
もう一つの態様において、第2の鎖の5'末端にて第1のヌクレオチド（位置1）から開始し、第2の鎖の位置11〜21は、第1の鎖とミスマッチを形成する2つ以上のヌクレオチドを有する。任意に、第2の鎖の位置14および18は、第1の鎖とミスマッチである。
【００６２】
本発明のもう一つの側面は、5'末端および3'末端を有する第1のオリゴヌクレオチド鎖、並びに5'末端および3'末端を有する第2のオリゴヌクレオチド鎖を有する単離された二本鎖核酸（dsNA）であって、第1の鎖は、長さが27〜49ヌクレオチド残基であり、第1の鎖の5'末端にて第1のヌクレオチド（位置1）から開始し、第1の鎖の位置1〜23は、リボヌクレオチドであり；第2の鎖は、長さが27〜53ヌクレオチド残基であり、かつ二重鎖を形成するために第1の鎖の位置1〜23のリボヌクレオチドと塩基対を形成する23の連続したリボヌクレオチドを含み；第1の鎖の5'末端および第2の鎖形態の3'末端は、平滑末端または1〜4ヌクレオチド3'オーバーハングを形成し；第1の鎖の3'末端および第2の鎖の5'末端は、平滑末端を形成し；第1の鎖の位置24〜3'末端ヌクレオチド残基の少なくとも1つは、第2のデオキシリボヌクレオチドと塩基対を形成するホスホロチオアート修飾されたヌクレオチド（PS-NA）であり；かつ第2の鎖は、第2の鎖長の少なくとも19リボヌクレオチドに沿って標的RNAに対して十分に相補的であり、二本鎖核酸が哺乳動物細胞に導入されるときに、標的遺伝子発現を減少させる、二本鎖核酸（dsNA）を提供する。
【００６３】
さらなる本発明の側面は、5'末端および3'末端を有する第1のオリゴヌクレオチド鎖、並びに5'末端および3'末端を有する第2のオリゴヌクレオチド鎖を有する単離された二本鎖核酸（dsNA）であって、第1の鎖は、長さが28〜53ヌクレオチド残基であり、第1の鎖の5'末端にて第1のヌクレオチド（位置1）から開始し、第1の鎖の位置1〜23は、リボヌクレオチドであり；第2の鎖は、長さが27〜53ヌクレオチド残基であり、かつ二重鎖を形成するために第1の鎖の位置1〜23のリボヌクレオチドと塩基対を形成する23の連続したリボヌクレオチドを含み；第1の鎖の5'末端および第2の鎖形態の3'末端は、平滑末端または1〜4ヌクレオチド3'オーバーハングを形成し；第1の鎖の3'末端および第2の鎖の5'末端は、1〜4ヌクレオチド3'オーバーハングを形成し；第1の鎖の位置24〜3'末端ヌクレオチド残基の少なくとも1つは、第2のデオキシリボヌクレオチドと塩基対を形成するホスホロチオアート修飾されたヌクレオチド（PS-NA）であり；かつ第2の鎖は、第2の鎖長の少なくとも19リボヌクレオチドに沿って標的RNAに対して十分に相補的であり、二本鎖核酸が哺乳動物細胞に導入されるときに、標的遺伝子発現を減少させる、二本鎖核酸（dsNA）を提供する。
【００６４】
本発明のさらなる側面は、5'末端および3'末端を有する第1のオリゴヌクレオチド鎖、並びに5'末端および3'末端を有する第2のオリゴヌクレオチド鎖を有する単離された二本鎖核酸（dsNA）であって、第1の鎖は、長さが27〜49ヌクレオチド残基であり、第1の鎖の5'末端にて第1のヌクレオチド（位置1）から開始し、第1の鎖の位置1〜23は、リボヌクレオチドであり；第2の鎖は、長さが27〜53ヌクレオチド残基であり、かつ二重鎖を形成するために第1の鎖の位置1〜23のリボヌクレオチドと塩基対を形成する23の連続したリボヌクレオチドを含み；第1の鎖の5'末端および第2の鎖形態の3'末端は、平滑末端または1〜4ヌクレオチド3'オーバーハングを形成し；第1の鎖の3'末端および第2の鎖の5'末端は、平滑末端を形成し、かつ第1の鎖の3'末端の最後および最後から2番目の残基および第2の鎖の5'末端の最後および最後から2番目の残基は、1つまたは2つのミスマッチ塩基対を形成し；第1の鎖の位置24〜3'末端ヌクレオチド残基の少なくとも1つは、第2のデオキシリボヌクレオチドと塩基対を形成するホスホロチオアート修飾されたヌクレオチド（PS-NA）であり；かつ第2の鎖は、第2の鎖長の少なくとも19リボヌクレオチドに沿って標的RNAに対して十分に相補的であり、二本鎖核酸が哺乳動物細胞に導入されるときに、標的遺伝子発現を減少させる、二本鎖核酸（dsNA）を提供する。
【００６５】
さらなる側面において、本発明は、5'末端および3'末端を有する第1のオリゴヌクレオチド鎖、並びに5'末端および3'末端を有する第2のオリゴヌクレオチド鎖を有する単離された二本鎖核酸（dsNA）であって、第1の鎖は、長さが27〜49ヌクレオチド残基であり、第1の鎖の5'末端にて第1のヌクレオチド（位置1）から開始し、第1の鎖の位置1〜23は、リボヌクレオチドであり；第2の鎖は、長さが27〜53ヌクレオチド残基であり、かつ二重鎖を形成するために第1の鎖の位置1〜23のリボヌクレオチドに対して十分に相補的である23の連続したリボヌクレオチドを含み；第1の鎖の5'末端および第2の鎖形態の3'末端は、平滑末端または1〜4ヌクレオチド3'オーバーハングを形成し；第1の鎖の3'末端および第2の鎖の5'末端は、平滑末端を形成し；第1の鎖の5'末端にて第1のヌクレオチド（位置1）から開始し、第1の鎖の位置1〜9は、第2の鎖とミスマッチを形成するヌクレオチドを含み；第1の鎖の位置24〜3'末端ヌクレオチド残基の少なくとも1つは、第2のデオキシリボヌクレオチドと塩基対を形成するホスホロチオアート修飾されたヌクレオチド（PS-NA）であり；かつ第2の鎖は、第2の鎖長の少なくとも19リボヌクレオチドに沿って標的RNAに対して十分に相補的であり、二本鎖核酸が哺乳動物細胞に導入されるときに、標的遺伝子発現を減少させる、二本鎖核酸（dsNA）を提供する。
【００６６】
さらなる本発明の側面は、5'末端および3'末端を有する第1のオリゴヌクレオチド鎖、並びに5'末端および3'末端を有する第2のオリゴヌクレオチド鎖を有する単離された二本鎖核酸（dsNA）であって、第1の鎖は、長さが27〜49ヌクレオチド残基であり、第1の鎖の5'末端にて第1のヌクレオチド（位置1）から開始し、第1の鎖の位置1〜23は、リボヌクレオチドであり；第2の鎖は、長さが27〜53ヌクレオチド残基であり、かつ二重鎖を形成するために第1の鎖の位置1〜23のリボヌクレオチドに対して十分に相補的である23の連続したリボヌクレオチドを含み；第1の鎖の5'末端および第2の鎖形態の3'末端は、平滑末端または1〜4ヌクレオチド3'オーバーハングを形成し；第1の鎖の3'末端および第2の鎖の5'末端は、平滑末端を形成し；第1のオリゴヌクレオチド鎖の5'末端ヌクレオチド残基（位置1*）に相補的である第2の鎖のヌクレオチド残基から開始し、第2の鎖の5'方向における位置1*〜位置9*は、標的RNAの配列とミスマッチを形成するヌクレオチドを含み；第1の鎖の位置24〜3'末端ヌクレオチド残基の少なくとも1つは、第2のデオキシリボヌクレオチドと塩基対を形成するホスホロチオアート修飾されたヌクレオチド（PS-NA）であり；かつ第2の鎖は、第2の鎖長の少なくとも19リボヌクレオチドに沿って標的RNAに対して十分に相補的であり、二本鎖核酸が哺乳動物細胞に導入されるときに、標的遺伝子発現を減少させる、二本鎖核酸（dsNA）を提供する。
【００６７】
一つの側面において、本発明は、5'末端および3'末端を有する第1のオリゴヌクレオチド鎖、並びに5'末端および3'末端を有する第2のオリゴヌクレオチド鎖を有する単離された二本鎖核酸（dsNA）であって、第1の鎖は、長さが27〜49ヌクレオチド残基であり、第1の鎖の5'末端にて第1のヌクレオチド（位置1）から開始し、第1の鎖の位置1〜23は、リボヌクレオチドであり；第2の鎖は、長さが27〜53ヌクレオチド残基であり、かつ二重鎖を形成するために第1の鎖の位置1〜23のリボヌクレオチドに対して十分に相補的である23の連続したリボヌクレオチドを含み；第1の鎖の5'末端および第2の鎖形態の3'末端は、平滑末端または1〜4ヌクレオチド3'オーバーハングを形成し；第1の鎖の3'末端および第2の鎖の5'末端は、平滑末端を形成し；第1の鎖の5'末端にて第1のヌクレオチド（位置1）から開始し、第1の鎖の位置1〜9は、第2の鎖とミスマッチを形成するヌクレオチドを含み；第2の鎖の少なくとも1つのヌクレオチドは、第1の鎖の位置24〜3'末端ヌクレオチド残基のデオキシリボヌクレオチドと塩基対を形成し、かつホスホロチオアート修飾されたヌクレオチド（PS-NA）であり；かつ第2の鎖は、第2の鎖長の少なくとも19リボヌクレオチドに沿って標的RNAに対して十分に相補的であり、二本鎖核酸が哺乳動物細胞に導入されるときに、標的遺伝子発現を減少させる、二本鎖核酸（dsNA）を提供する。
【００６８】
もう一つの側面において、本発明は、5'末端および3'末端を有する第1のオリゴヌクレオチド鎖、並びに5'末端および3'末端を有する第2のオリゴヌクレオチド鎖を有する単離された二本鎖核酸（dsNA）であって、第1の鎖は、長さが27〜49ヌクレオチド残基であり、第1の鎖の5'末端にて第1のヌクレオチド（位置1）から開始し、第1の鎖の位置1〜23は、リボヌクレオチドであり；第2の鎖は、長さが27〜53ヌクレオチド残基であり、かつ二重鎖を形成するために第1の鎖の位置1〜23のリボヌクレオチドに対して十分に相補的である23の連続したリボヌクレオチドを含み；第1の鎖の5'末端および第2の鎖形態の3'末端は、平滑末端または1〜4ヌクレオチド3'オーバーハングを形成し；第1の鎖の3'末端および第2の鎖の5'末端は、平滑末端を形成し；第1のオリゴヌクレオチド鎖の5'末端ヌクレオチド残基（位置1*）に相補的である第2の鎖のヌクレオチド残基から開始し、第2の鎖の5'方向における位置1*〜位置9*は、標的RNAの配列とミスマッチを形成するヌクレオチドを含み；第2の鎖の少なくとも1つのヌクレオチドは、第1の鎖の位置24〜3'末端ヌクレオチド残基のデオキシリボヌクレオチドと塩基対を形成し、かつホスホロチオアート修飾されたヌクレオチド（PS-NA）であり；かつ第2の鎖は、第2の鎖長の少なくとも19リボヌクレオチドに沿って標的RNAに対して十分に相補的であり、二本鎖核酸が哺乳動物細胞に導入されるときに、標的遺伝子発現を減少させる、二本鎖核酸（dsNA）を提供する。
【００６９】
さらなる側面において、本発明は、5'末端および3'末端を有する第1のオリゴヌクレオチド鎖、並びに5'末端および3'末端を有する第2のオリゴヌクレオチド鎖を有する単離された二本鎖核酸（dsNA）であって、第1の鎖は、長さが27〜49ヌクレオチド残基であり、第1の鎖の5'末端にて第1のヌクレオチド（位置1）から開始し、第1の鎖の位置1〜23は、リボヌクレオチドであり；第2の鎖は、長さが27〜53ヌクレオチド残基であり、かつ二重鎖を形成するために第1の鎖の位置1〜23のリボヌクレオチドに対して十分に相補的である23の連続したリボヌクレオチドを含み；第1の鎖の5'末端および第2の鎖形態の3'末端は、平滑末端または1〜4ヌクレオチド3'オーバーハングを形成し；第1の鎖の3'末端および第2の鎖の5'末端は、平滑末端を形成し；第1の鎖の5'末端にて第1のヌクレオチド（位置1）から開始し、第1の鎖の位置1〜9は、第2の鎖とミスマッチを形成するヌクレオチドを含み；第1の鎖の位置24〜3'末端ヌクレオチド残基の少なくとも1つは、第2のホスホロチオアート修飾されたヌクレオチド（PS-NA）と塩基対を形成するデオキシリボヌクレオチドであり；かつ第2の鎖は、第2の鎖長の少なくとも19リボヌクレオチドに沿って標的RNAに対して十分に相補的であり、二本鎖核酸が哺乳動物細胞に導入されるときに、標的遺伝子発現を減少させる、二本鎖核酸（dsNA）を提供する。
【００７０】
さらなる側面において、本発明は、5'末端および3'末端を有する第1のオリゴヌクレオチド鎖、並びに5'末端および3'末端を有する第2のオリゴヌクレオチド鎖を有する単離された二本鎖核酸（dsNA）であって、第1の鎖は、長さが27〜49ヌクレオチド残基であり、第1の鎖の5'末端にて第1のヌクレオチド（位置1）から開始し、第1の鎖の位置1〜23は、リボヌクレオチドであり；第2の鎖は、長さが27〜53ヌクレオチド残基であり、かつ二重鎖を形成するために第1の鎖の位置1〜23のリボヌクレオチドに対して十分に相補的である23の連続したリボヌクレオチドを含み；第1の鎖の5'末端および第2の鎖形態の3'末端は、平滑末端または1〜4ヌクレオチド3'オーバーハングを形成し；第1の鎖の3'末端および第2の鎖の5'末端は、平滑末端を形成し；第1のオリゴヌクレオチド鎖の5'末端ヌクレオチド残基（位置1*）に相補的である第2の鎖のヌクレオチド残基から開始し、第2の鎖の5'方向における位置1*〜位置9*は、標的RNAの配列とミスマッチを形成するヌクレオチドを含み；第1の鎖の位置24〜3'末端ヌクレオチド残基の少なくとも1つは、第2のホスホロチオアート修飾されたヌクレオチド（PS-NA）と塩基対を形成するデオキシリボヌクレオチドであり；かつ第2の鎖は、第2の鎖長の少なくとも19リボヌクレオチドに沿って標的RNAに対して十分に相補的であり、二本鎖核酸が哺乳動物細胞に導入されるときに、標的遺伝子発現を減少させる、二本鎖核酸（dsNA）を提供する。
【００７１】
一つの側面において、本発明は、5'末端および3'末端を有する第1のオリゴヌクレオチド鎖、並びに5'末端および3'末端を有する第2のオリゴヌクレオチド鎖を有する単離された二本鎖核酸（dsNA）であって、第1の鎖は、長さが28〜53ヌクレオチド残基であり、第1の鎖の5'末端にて第1のヌクレオチド（位置1）から開始し、第1の鎖の位置1〜23は、リボヌクレオチドであり；第2の鎖は、長さが27〜53ヌクレオチド残基であり、かつ二重鎖を形成するために第1の鎖の位置1〜23のリボヌクレオチドに対して十分に相補的である23の連続したリボヌクレオチドを含み；第1の鎖の5'末端および第2の鎖形態の3'末端は、平滑末端または1〜4ヌクレオチド3'オーバーハングを形成し；第1の鎖の3'末端および第2の鎖の5'末端は、1〜4ヌクレオチド3'オーバーハングを形成し；第1の鎖の5'末端にて第1のヌクレオチド（位置1）から開始し、第1の鎖の位置1〜9は、第2の鎖とミスマッチを形成するヌクレオチドを含み；第1の鎖の位置24〜3'末端ヌクレオチド残基の少なくとも1つは、第2のデオキシリボヌクレオチドと塩基対を形成するホスホロチオアート修飾されたヌクレオチド（PS-NA）であり；かつ第2の鎖は、第2の鎖長の少なくとも19リボヌクレオチドに沿って標的RNAに対して十分に相補的であり、二本鎖核酸が哺乳動物細胞に導入されるときに、標的遺伝子発現を減少させる、二本鎖核酸（dsNA）を提供する。
【００７２】
もう一つの側面において、本発明は、5'末端および3'末端を有する第1のオリゴヌクレオチド鎖、並びに5'末端および3'末端を有する第2のオリゴヌクレオチド鎖を有する単離された二本鎖核酸（dsNA）であって、第1の鎖は、長さが28〜53ヌクレオチド残基であり、第1の鎖の5'末端にて第1のヌクレオチド（位置1）から開始し、第1の鎖の位置1〜23は、リボヌクレオチドであり；第2の鎖は、長さが27〜53ヌクレオチド残基であり、かつ二重鎖を形成するために第1の鎖の位置1〜23のリボヌクレオチドに対して十分に相補的である23の連続したリボヌクレオチドを含み；第1の鎖の5'末端および第2の鎖形態の3'末端は、平滑末端または1〜4ヌクレオチド3'オーバーハングを形成し；第1の鎖の3'末端および第2の鎖の5'末端は、1〜4ヌクレオチド3'オーバーハングを形成し；第1のオリゴヌクレオチド鎖の5'末端ヌクレオチド残基（位置1*）に相補的である第2の鎖のヌクレオチド残基から開始し、第2の鎖の5'方向における位置1*〜位置9*は、標的RNAの配列とミスマッチを形成するヌクレオチドを含み；第1の鎖の位置24〜3'末端ヌクレオチド残基の少なくとも1つは、第2のデオキシリボヌクレオチドと塩基対を形成するホスホロチオアート修飾されたヌクレオチド（PS-NA）であり；かつ第2の鎖は、第2の鎖長の少なくとも19リボヌクレオチドに沿って標的RNAに対して十分に相補的であり、二本鎖核酸が哺乳動物細胞に導入されるときに、標的遺伝子発現を減少させる、二本鎖核酸（dsNA）を提供する。
【００７３】
さらなる側面において、本発明は、5'末端および3'末端を有する第1のオリゴヌクレオチド鎖、並びに5'末端および3'末端を有する第2のオリゴヌクレオチド鎖を有する単離された二本鎖核酸（dsNA）であって、第1の鎖は、長さが28〜53ヌクレオチド残基であり、第1の鎖の5'末端にて第1のヌクレオチド（位置1）から開始し、第1の鎖の位置1〜23は、リボヌクレオチドであり；第2の鎖は、長さが27〜53ヌクレオチド残基であり、かつ二重鎖を形成するために第1の鎖の位置1〜23のリボヌクレオチドに対して十分に相補的である23の連続したリボヌクレオチドを含み；第1の鎖の5'末端および第2の鎖形態の3'末端は、平滑末端または1〜4ヌクレオチド3'オーバーハングを形成し；第1の鎖の3'末端および第2の鎖の5'末端は、1〜4ヌクレオチド3'オーバーハングを形成し；第1の鎖の5'末端にて第1のヌクレオチド（位置1）から開始し、第1の鎖の位置1〜9は、第2の鎖とミスマッチを形成するヌクレオチドを含み；第2の鎖の少なくとも1つのヌクレオチドは、第1の鎖の位置24〜3'末端ヌクレオチド残基のデオキシリボヌクレオチドと塩基対を形成し、かつホスホロチオアート修飾されたヌクレオチド（PS-NA）であり；かつ第2の鎖は、第2の鎖長の少なくとも19リボヌクレオチドに沿って標的RNAに対して十分に相補的であり、二本鎖核酸が哺乳動物細胞に導入されるときに、標的遺伝子発現を減少させる、二本鎖核酸（dsNA）を提供する。
【００７４】
さらなる側面において、本発明は、5'末端および3'末端を有する第1のオリゴヌクレオチド鎖、並びに5'末端および3'末端を有する第2のオリゴヌクレオチド鎖を有する単離された二本鎖核酸（dsNA）であって、第1の鎖は、長さが28〜53ヌクレオチド残基であり、第1の鎖の5'末端にて第1のヌクレオチド（位置1）から開始し、第1の鎖の位置1〜23は、リボヌクレオチドであり；第2の鎖は、長さが27〜53ヌクレオチド残基であり、かつ二重鎖を形成するために第1の鎖の位置1〜23のリボヌクレオチドに対して十分に相補的である23の連続したリボヌクレオチドを含み；第1の鎖の5'末端および第2の鎖形態の3'末端は、平滑末端または1〜4ヌクレオチド3'オーバーハングを形成し；第1の鎖の3'末端および第2の鎖の5'末端は、1〜4ヌクレオチド3'オーバーハングを形成し；第1のオリゴヌクレオチド鎖の5'末端ヌクレオチド残基（位置1*）に相補的である第2の鎖のヌクレオチド残基から開始し、第2の鎖の5'方向における位置1*〜位置9*は、標的RNAの配列とミスマッチを形成するヌクレオチドを含み；第2の鎖の少なくとも1つのヌクレオチドは、第1の鎖の位置24〜3'末端ヌクレオチド残基のデオキシリボヌクレオチドと塩基対を形成し、かつホスホロチオアート修飾されたヌクレオチド（PS-NA）であり；かつ第2の鎖は、第2の鎖長の少なくとも19リボヌクレオチドに沿って標的RNAに対して十分に相補的であり、二本鎖核酸が哺乳動物細胞に導入されるときに、標的遺伝子発現を減少させる、二本鎖核酸（dsNA）を提供する。
【００７５】
もう一つの側面において、本発明は、5'末端および3'末端を有する第1のオリゴヌクレオチド鎖、並びに5'末端および3'末端を有する第2のオリゴヌクレオチド鎖を有する単離された二本鎖核酸（dsNA）であって、第1の鎖は、長さが28〜53ヌクレオチド残基であり、第1の鎖の5'末端にて第1のヌクレオチド（位置1）から開始し、第1の鎖の位置1〜23は、リボヌクレオチドであり；第2の鎖は、長さが27〜53ヌクレオチド残基であり、かつ二重鎖を形成するために第1の鎖の位置1〜23のリボヌクレオチドに対して十分に相補的である23の連続したリボヌクレオチドを含み；第1の鎖の5'末端および第2の鎖形態の3'末端は、平滑末端または1〜4ヌクレオチド3'オーバーハングを形成し；第1の鎖の3'末端および第2の鎖の5'末端は、1〜4ヌクレオチド3'オーバーハングを形成し；第1の鎖の5'末端にて第1のヌクレオチド（位置1）から開始し、第1の鎖の位置1〜9は、第2の鎖とミスマッチを形成するヌクレオチドを含み；第1の鎖の位置24〜3'末端ヌクレオチド残基の少なくとも1つは、第2のホスホロチオアート修飾されたヌクレオチド（PS-NA）と塩基対を形成するデオキシリボヌクレオチドであり；第2の鎖は、第2の鎖長の少なくとも19リボヌクレオチドに沿って標的RNAに対して十分に相補的であり、二本鎖核酸が哺乳動物細胞に導入されるときに、標的遺伝子発現を減少させる、二本鎖核酸（dsNA）を提供する。
【００７６】
さらなる側面において、本発明は、5'末端および3'末端を有する第1のオリゴヌクレオチド鎖、並びに5'末端および3'末端を有する第2のオリゴヌクレオチド鎖を有する単離された二本鎖核酸（dsNA）であって、第1の鎖は、長さが28〜53ヌクレオチド残基であり、第1の鎖の5'末端にて第1のヌクレオチド（位置1）から開始し、第1の鎖の位置1〜23は、リボヌクレオチドであり；第2の鎖は、長さが27〜53ヌクレオチド残基であり、かつ二重鎖を形成するために第1の鎖の位置1〜23のリボヌクレオチドに対して十分に相補的である23の連続したリボヌクレオチドを含み；第1の鎖の5'末端および第2の鎖形態の3'末端は、平滑末端または1〜4ヌクレオチド3'オーバーハングを形成し；第1の鎖の3'末端および第2の鎖の5'末端は、1〜4ヌクレオチド3'オーバーハングを形成し；第1のオリゴヌクレオチド鎖の5'末端ヌクレオチド残基（位置1*）に相補的である第2の鎖のヌクレオチド残基から開始し、第2の鎖の5'方向における位置1*〜位置9*は、標的RNAの配列とミスマッチを形成するヌクレオチドを含み；第1の鎖の位置24〜3'末端ヌクレオチド残基の少なくとも1つは、第2のホスホロチオアート修飾されたヌクレオチド（PS-NA）と塩基対を形成するデオキシリボヌクレオチドであり；第2の鎖は、第2の鎖長の少なくとも19リボヌクレオチドに沿って標的RNAに対して十分に相補的であり、二本鎖核酸が哺乳動物細胞に導入されるときに、標的遺伝子発現を減少させる、二本鎖核酸（dsNA）を提供する。
【００７７】
本発明のもう一つの側面は、5'末端および3'末端を有する第1のオリゴヌクレオチド鎖、並びに5'末端および3'末端を有する第2のオリゴヌクレオチド鎖を有する単離された二本鎖核酸（dsNA）であって、第1の鎖は、長さが27〜49ヌクレオチド残基であり、第1の鎖の5'末端にて第1のヌクレオチド（位置1）から開始し、第1の鎖の位置1〜23は、リボヌクレオチドであり；第2の鎖は、長さが27〜53ヌクレオチド残基であり、かつ二重鎖を形成するために第1の鎖の位置1〜23のリボヌクレオチドに対して十分に相補的である23の連続したリボヌクレオチドを含み；第1の鎖の5'末端および第2の鎖形態の3'末端は、平滑末端または1〜4ヌクレオチド3'オーバーハングを形成し；第1の鎖の3'末端および第2の鎖の5'末端は、平滑末端を形成し、かつ第1の鎖の3'末端の最後および最後から2番目の残基および第2の鎖の5'末端の最後および最後から2番目の残基は、1つまたは2つのミスマッチ塩基対を形成し；第1の鎖の5'末端にて第1のヌクレオチド（位置1）から開始し、第1の鎖の位置1〜9は、第2の鎖とミスマッチを形成するヌクレオチドを含み；第1の鎖の位置24〜3'末端ヌクレオチド残基の少なくとも1つは、第2のデオキシリボヌクレオチドと塩基対を形成するホスホロチオアート修飾されたヌクレオチド（PS-NA）であり；かつ第2の鎖は、第2の鎖長の少なくとも19リボヌクレオチドに沿って標的RNAに対して十分に相補的であり、二本鎖核酸が哺乳動物細胞に導入されるときに、標的遺伝子発現を減少させる、二本鎖核酸（dsNA）を提供する。
【００７８】
さらなる本発明の側面は、5'末端および3'末端を有する第1のオリゴヌクレオチド鎖、並びに5'末端および3'末端を有する第2のオリゴヌクレオチド鎖を有する単離された二本鎖核酸（dsNA）であって、第1の鎖は、長さが27〜49ヌクレオチド残基であり、第1の鎖の5'末端にて第1のヌクレオチド（位置1）から開始し、第1の鎖の位置1〜23は、リボヌクレオチドであり；第2の鎖は、長さが27〜53ヌクレオチド残基であり、かつ二重鎖を形成するために第1の鎖の位置1〜23のリボヌクレオチドに対して十分に相補的である23の連続したリボヌクレオチドを含み；第1の鎖の5'末端および第2の鎖形態の3'末端は、平滑末端または1〜4ヌクレオチド3'オーバーハングを形成し；第1の鎖の3'末端および第2の鎖の5'末端は、平滑末端を形成し、かつ第1の鎖の3'末端の最後および最後から2番目の残基および第2の鎖の5'末端の最後および最後から2番目の残基は、1つまたは2つのミスマッチ塩基対を形成し；第1のオリゴヌクレオチド鎖の5'末端ヌクレオチド残基（位置1*）に相補的である第2の鎖のヌクレオチド残基から開始し、第2の鎖の5'方向における位置1*〜位置9*は、標的RNAの配列とミスマッチを形成するヌクレオチドを含み；第1の鎖の位置24〜3'末端ヌクレオチド残基の少なくとも1つは、第2のデオキシリボヌクレオチドと塩基対を形成するホスホロチオアート修飾されたヌクレオチド（PS-NA）であり；かつ第2の鎖は、第2の鎖長の少なくとも19リボヌクレオチドに沿って標的RNAに対して十分に相補的であり、二本鎖核酸が哺乳動物細胞に導入されるときに、標的遺伝子発現を減少させる、二本鎖核酸（dsNA）を提供する。
【００７９】
本発明のさらなる側面は、5'末端および3'末端を有する第1のオリゴヌクレオチド鎖、並びに5'末端および3'末端を有する第2のオリゴヌクレオチド鎖を有する単離された二本鎖核酸（dsNA）であって、第1の鎖は、長さが27〜49ヌクレオチド残基であり、第1の鎖の5'末端にて第1のヌクレオチド（位置1）から開始し、第1の鎖の位置1〜23は、リボヌクレオチドであり；第2の鎖は、長さが27〜53ヌクレオチド残基であり、かつ二重鎖を形成するために第1の鎖の位置1〜23のリボヌクレオチドに対して十分に相補的である23の連続したリボヌクレオチドを含み；第1の鎖の5'末端および第2の鎖形態の3'末端は、平滑末端または1〜4ヌクレオチド3'オーバーハングを形成し；第1の鎖の3'末端および第2の鎖の5'末端は、平滑末端を形成し、かつ第1の鎖の3'末端の最後および最後から2番目の残基および第2の鎖の5'末端の最後および最後から2番目の残基は、1つまたは2つのミスマッチ塩基対を形成し；第1の鎖の5'末端にて第1のヌクレオチド（位置1）から開始し、第1の鎖の位置1〜9は、第2の鎖とミスマッチを形成するヌクレオチドを含み；第2の鎖の少なくとも1つのヌクレオチドは、第1の鎖の位置24〜3'末端ヌクレオチド残基のデオキシリボヌクレオチドと塩基対を形成し、かつホスホロチオアート修飾されたヌクレオチド（PS-NA）であり；かつおよび第2の鎖は、第2の鎖長の少なくとも19リボヌクレオチドに沿って標的RNAに対して十分に相補的であり、二本鎖核酸が哺乳動物細胞に導入されるときに、標的遺伝子発現を減少させる、二本鎖核酸（dsNA）を提供する。
【００８０】
もう一つの側面において、本発明は、5'末端および3'末端を有する第1のオリゴヌクレオチド鎖、並びに5'末端および3'末端を有する第2のオリゴヌクレオチド鎖を有する単離された二本鎖核酸（dsNA）であって、第1の鎖は、長さが27〜49ヌクレオチド残基であり、第1の鎖の5'末端にて第1のヌクレオチド（位置1）から開始し、第1の鎖の位置1〜23は、リボヌクレオチドであり；第2の鎖は、長さが27〜53ヌクレオチド残基であり、かつ二重鎖を形成するために第1の鎖の位置1〜23のリボヌクレオチドに対して十分に相補的である23の連続したリボヌクレオチドを含み；第1の鎖の5'末端および第2の鎖形態の3'末端は、平滑末端または1〜4ヌクレオチド3'オーバーハングを形成し；第1の鎖の3'末端および第2の鎖の5'末端は、平滑末端を形成し、かつ第1の鎖の3'末端の最後および最後から2番目の残基および第2の鎖の5'末端の最後および最後から2番目の残基は、1つまたは2つのミスマッチ塩基対を形成し；第1のオリゴヌクレオチド鎖の5'末端ヌクレオチド残基（位置1*）に相補的である第2の鎖のヌクレオチド残基から開始し、第2の鎖の5'方向における位置1*〜位置9*は、標的RNAの配列とミスマッチを形成するヌクレオチドを含み；第2の鎖の少なくとも1つのヌクレオチドは、第1の鎖の位置24〜3'末端ヌクレオチド残基のデオキシリボヌクレオチドと塩基対を形成し、かつホスホロチオアート修飾されたヌクレオチド（PS-NA）であり；かつ第2の鎖は、第2の鎖長の少なくとも19リボヌクレオチドに沿って標的RNAに対して十分に相補的であり、二本鎖核酸が哺乳動物細胞に導入されるときに、標的遺伝子発現を減少させる、二本鎖核酸（dsNA）を提供する。
【００８１】
さらなる側面において、本発明は、5'末端および3'末端を有する第1のオリゴヌクレオチド鎖、並びに5'末端および3'末端を有する第2のオリゴヌクレオチド鎖を有する単離された二本鎖核酸（dsNA）であって、第1の鎖は、長さが27〜49ヌクレオチド残基であり、第1の鎖の5'末端にて第1のヌクレオチド（位置1）から開始し、第1の鎖の位置1〜23は、リボヌクレオチドであり；第2の鎖は、長さが27〜53ヌクレオチド残基であり、かつ二重鎖を形成するために第1の鎖の位置1〜23のリボヌクレオチドに対して十分に相補的である23の連続したリボヌクレオチドを含み；第1の鎖の5'末端および第2の鎖形態の3'末端は、平滑末端または1〜4ヌクレオチド3'オーバーハングを形成し；第1の鎖の3'末端および第2の鎖の5'末端は、平滑末端を形成し、かつ第1の鎖の3'末端の最後および最後から2番目の残基および第2の鎖の5'末端の最後および最後から2番目の残基は、1つまたは2つのミスマッチ塩基対を形成し；第1の鎖の5'末端にて第1のヌクレオチド（位置1）から開始し、第1の鎖の位置1〜9は、第2の鎖とミスマッチを形成するヌクレオチドを含み；第1の鎖の位置24〜3'末端ヌクレオチド残基の少なくとも1つは、第2のホスホロチオアート修飾されたヌクレオチド（PS-NA）と塩基対を形成するデオキシリボヌクレオチドであり；かつ第2の鎖は、第2の鎖長の少なくとも19リボヌクレオチドに沿って標的RNAに対して十分に相補的であり、二本鎖核酸が哺乳動物細胞に導入されるときに、標的遺伝子発現を減少させる、二本鎖核酸（dsNA）を提供する。
【００８２】
さらなる側面において、本発明は、5'末端および3'末端を有する第1のオリゴヌクレオチド鎖、並びに5'末端および3'末端を有する第2のオリゴヌクレオチド鎖を有する単離された二本鎖核酸（dsNA）であって、第1の鎖は、長さが27〜49ヌクレオチド残基であり、第1の鎖の5'末端にて第1のヌクレオチド（位置1）から開始し、第1の鎖の位置1〜23は、リボヌクレオチドであり；第2の鎖は、長さが27〜53ヌクレオチド残基であり、かつ二重鎖を形成するために第1の鎖の位置1〜23のリボヌクレオチドに対して十分に相補的である23の連続したリボヌクレオチドを含み；第1の鎖の5'末端および第2の鎖形態の3'末端は、平滑末端または1〜4ヌクレオチド3'オーバーハングを形成し；第1の鎖の3'末端および第2の鎖の5'末端は、平滑末端を形成し、かつ第1の鎖の3'末端の最後および最後から2番目の残基および第2の鎖の5'末端の最後および最後から2番目の残基は、1つまたは2つのミスマッチ塩基対を形成し；第1のオリゴヌクレオチド鎖の5'末端ヌクレオチド残基（位置1*）に相補的である第2の鎖のヌクレオチド残基から開始し、第2の鎖の5'方向における位置1*〜位置9*は、標的RNAの配列とミスマッチを形成するヌクレオチドを含み；第1の鎖の位置24〜3'末端ヌクレオチド残基の少なくとも1つは、第2のホスホロチオアート修飾されたヌクレオチド（PS-NA）と塩基対を形成するデオキシリボヌクレオチドであり；かつ第2の鎖は、第2の鎖長の少なくとも19リボヌクレオチドに沿って標的RNAに対して十分に相補的であり、二本鎖核酸が哺乳動物細胞に導入されるときに、標的遺伝子発現を減少させる、二本鎖核酸（dsNA）を提供する。
【００８３】
一つの態様において、第1の鎖の位置24〜3'末端ヌクレオチド残基の2つ以上のヌクレオチド残基は、第2の鎖のデオキシリボヌクレオチドと塩基対を形成するPS-NA残基である。
【００８４】
もう一つの態様において、第1の鎖PS-NA残基は、第2の鎖のPS-NAデオキシリボヌクレオチドと塩基対を形成する。
【００８５】
本発明のもう一つの側面は、5'末端および3'末端を有する第1のオリゴヌクレオチド鎖、並びに5'末端および3'末端を有する第2のオリゴヌクレオチド鎖を有する単離された二本鎖核酸（dsNA）であって、第2の鎖は、長さが27〜53ヌクレオチド残基であり、第2の鎖の5'末端にて第1のヌクレオチド（位置1）から開始し、第2の鎖の位置1〜23は、リボヌクレオチドであり；第1の鎖は、長さが27〜49ヌクレオチド残基であり、かつ二重鎖を形成するために第2の鎖の位置1〜23のリボヌクレオチドと塩基対を形成する23の連続したリボヌクレオチドを含み；第1の鎖の3'末端および第2の鎖の5'末端は、平滑末端を形成し；第2の鎖の位置24〜3'末端ヌクレオチド残基の少なくとも1つは、ホスホロチオアート修飾されたヌクレオチド（PS-NA）であり；かつ第2の鎖は、第2の鎖長の少なくとも19リボヌクレオチドに沿って標的RNAに対して十分に相補的であり、二本鎖核酸が哺乳動物細胞に導入されるときに、標的遺伝子発現を減少させる、二本鎖核酸（dsNA）を提供する。
【００８６】
一つの側面において、本発明は、5'末端および3'末端を有する第1のオリゴヌクレオチド鎖、並びに5'末端および3'末端を有する第2のオリゴヌクレオチド鎖を有する単離された二本鎖核酸（dsNA）であって、第2の鎖は、長さが27〜53ヌクレオチド残基であり、第2の鎖の5'末端にて第1のヌクレオチド（位置1）から開始し、第2の鎖の位置1〜23は、リボヌクレオチドであり；第1の鎖は、長さが27〜49ヌクレオチド残基であり、かつ二重鎖を形成するために第2の鎖の位置1〜23のリボヌクレオチドと塩基対を形成する23の連続したリボヌクレオチドを含み；第1の鎖の3'末端および第2の鎖の5'末端は、平滑末端を形成し；第2の鎖の位置24〜3'末端ヌクレオチド残基の少なくとも1つは、第1のホスホロチオアート修飾されたヌクレオチド（PS-NA）と塩基対を形成するデオキシリボヌクレオチドであり；かつ第2の鎖は、第2の鎖長の少なくとも19リボヌクレオチドに沿って標的RNAに対して十分に相補的であり、二本鎖核酸が哺乳動物細胞に導入されるときに、標的遺伝子発現を減少させる、二本鎖核酸（dsNA）を提供する。
【００８７】
もう一つの側面において、本発明は、5'末端および3'末端を有する第1のオリゴヌクレオチド鎖、並びに5'末端および3'末端を有する第2のオリゴヌクレオチド鎖を有する単離された二本鎖核酸（dsNA）であって、第2の鎖は、長さが27〜53ヌクレオチド残基であり、第2の鎖の5'末端にて第1のヌクレオチド（位置1）から開始し、第2の鎖の位置1〜23は、リボヌクレオチドであり；第1の鎖は、長さが27〜53ヌクレオチド残基であり、かつ二重鎖を形成する第2の鎖の位置1〜23のリボヌクレオチドに対して十分に相補的である23の連続したリボヌクレオチドを含み；第1の鎖の3'末端および第2の鎖の5'末端は、1〜4ヌクレオチド3'オーバーハングを形成し；第2の鎖の位置24〜3'末端ヌクレオチド残基の少なくとも1つは、ホスホロチオアート修飾されたヌクレオチド（PS-NA）であり；および第2の鎖は、第2の鎖長の少なくとも19リボヌクレオチドに沿って標的RNAに対して十分に相補的であり、二本鎖核酸が哺乳動物細胞に導入されるときに、標的遺伝子発現を減少させる、二本鎖核酸（dsNA）を提供する。
【００８８】
さらなる側面において、本発明は、5'末端および3'末端を有する第1のオリゴヌクレオチド鎖、並びに5'末端および3'末端を有する第2のオリゴヌクレオチド鎖を有する単離された二本鎖核酸（dsNA）であって、第2の鎖は、長さが27〜53ヌクレオチド残基であり、第2の鎖の5'末端にて第1のヌクレオチド（位置1）から開始し、第2の鎖の位置1〜23は、リボヌクレオチドであり；第1の鎖は、長さが27〜53ヌクレオチド残基であり、かつ二重鎖を形成する第2の鎖の位置1〜23のリボヌクレオチドに対して十分に相補的である23の連続したリボヌクレオチドを含み；第1の鎖の3'末端および第2の鎖の5'末端は、1〜4ヌクレオチド3'オーバーハングを形成し；第2の鎖の位置24〜3'末端ヌクレオチド残基の少なくとも1つは、第1のホスホロチオアート修飾されたヌクレオチド（PS-NA）と塩基対を形成するデオキシリボヌクレオチドであり；かつ第2の鎖は、第2の鎖長の少なくとも19リボヌクレオチドに沿って標的RNAに対して十分に相補的であり、二本鎖核酸が哺乳動物細胞に導入されるときに、標的遺伝子発現を減少させる、二本鎖核酸（dsNA）を提供する。
【００８９】
さらなる側面において、本発明は、5'末端および3'末端を有する第1のオリゴヌクレオチド鎖、並びに5'末端および3'末端を有する第2のオリゴヌクレオチド鎖を有する単離された二本鎖核酸（dsNA）であって、第2の鎖は、長さが27〜53ヌクレオチド残基であり、第2の鎖の5'末端にて第1のヌクレオチド（位置1）から開始し、第2の鎖の位置1〜23は、リボヌクレオチドであり；第1の鎖は、長さが27〜49ヌクレオチド残基であり、かつ二重鎖を形成するために第2の鎖の位置1〜23のリボヌクレオチドと塩基対を形成する23の連続したリボヌクレオチドを含み；第1の鎖の3'末端および第2の鎖の5'末端は、平滑末端を形成し、かつ第1の鎖の3'末端の最後および最後から2番目の残基および第2の鎖の5'末端の最後および最後から2番目の残基は、1つまたは2つのミスマッチ塩基対を形成し；第2の鎖の位置24〜3'末端ヌクレオチド残基の少なくとも1つは、ホスホロチオアート修飾されたヌクレオチド（PS-NA）であり；かつ第2の鎖は、第2の鎖長の少なくとも19リボヌクレオチドに沿って標的RNAに対して十分に相補的であり、二本鎖核酸が哺乳動物細胞に導入されるときに、標的遺伝子発現を減少させる、二本鎖核酸（dsNA）を提供する。
【００９０】
もう一つの側面において、本発明は、5'末端および3'末端を有する第1のオリゴヌクレオチド鎖、並びに5'末端および3'末端を有する第2のオリゴヌクレオチド鎖を有する単離された二本鎖核酸（dsNA）であって、第2の鎖は、長さが27〜53ヌクレオチド残基であり、第2の鎖の5'末端にて第1のヌクレオチド（位置1）から開始し、第2の鎖の位置1〜23は、リボヌクレオチドであり；第1の鎖は、長さが27〜49ヌクレオチド残基であり、かつ二重鎖を形成するために第2の鎖の位置1〜23のリボヌクレオチドと塩基対を形成する23の連続したリボヌクレオチドを含み；第1の鎖の3'末端および第2の鎖の5'末端は、平滑末端を形成し、かつ第1の鎖の3'末端の最後および最後から2番目の残基および第2の鎖の5'末端の最後および最後から2番目の残基は、1つまたは2つのミスマッチ塩基対を形成し；第2の鎖の位置24〜3'末端ヌクレオチド残基の少なくとも1つは、第1のホスホロチオアート修飾されたヌクレオチド（PS-NA）と塩基対を形成するデオキシリボヌクレオチドであり；かつ第2の鎖は、第2の鎖長の少なくとも19リボヌクレオチドに沿って標的RNAに対して十分に相補的であり、二本鎖核酸が哺乳動物細胞に導入されるときに、標的遺伝子発現を減少させる、二本鎖核酸（dsNA）を提供する。
【００９１】
本発明の一つの側面は、5'末端および3'末端を有する第1のオリゴヌクレオチド鎖、並びに5'末端および3'末端を有する第2のオリゴヌクレオチド鎖を有する単離された二本鎖核酸（dsNA）であって、第2の鎖は、長さが27〜53ヌクレオチド残基であり、第2の鎖の5'末端にて第1のヌクレオチド（位置1）から開始し、第2の鎖の位置1〜23は、リボヌクレオチドであり、かつ第2の鎖の位置11〜21は、第1の鎖とミスマッチを形成するヌクレオチドを含み；第1の鎖は、長さが27〜49ヌクレオチド残基であり、かつ二重鎖を形成する第2の鎖の位置1〜23のリボヌクレオチドに対して十分に相補的である23の連続したリボヌクレオチドを含み；第1の鎖の3'末端および第2の鎖の5'末端は、平滑末端を形成し；第2の鎖の位置24〜3'末端ヌクレオチド残基の少なくとも1つは、ホスホロチオアート修飾されたヌクレオチド（PS-NA）であり；かつ第2の鎖は、第2の鎖長の少なくとも19リボヌクレオチドに沿って標的RNAに対して十分に相補的であり、二本鎖核酸が哺乳動物細胞に導入されるときに、標的遺伝子発現を減少させる、二本鎖核酸（dsNA）を提供する。
【００９２】
本発明のもう一つの側面は、5'末端および3'末端を有する第1のオリゴヌクレオチド鎖、並びに5'末端および3'末端を有する第2のオリゴヌクレオチド鎖を有する単離された二本鎖核酸（dsNA）であって、第2の鎖は、長さが27〜53ヌクレオチド残基であり、第2の鎖の5'末端にて第1のヌクレオチド（位置1）から開始し、第2の鎖の位置1〜23は、リボヌクレオチドであり；第1の鎖は、長さが27〜49ヌクレオチド残基であり、かつ二重鎖を形成するために第2の鎖の位置1〜23のリボヌクレオチドと塩基対を形成する23の連続したリボヌクレオチドを含み；第1の鎖の3'末端および第2の鎖の5'末端は、平滑末端を形成し；第2の鎖の位置24〜3'末端ヌクレオチド残基の少なくとも1つは、ホスホロチオアート修飾されたヌクレオチド（PS-NA）であり；かつ第2の鎖は、第2の鎖長の少なくとも19リボヌクレオチドに沿って標的RNAに対して十分に相補的であり、二本鎖核酸が哺乳動物細胞に導入されるときに、標的遺伝子発現を減少させ、第2の鎖の位置11〜21は、標的RNAのヌクレオチドとミスマッチを形成するヌクレオチドを含む、二本鎖核酸（dsNA）を提供する。
【００９３】
さらなる本発明の側面は、5'末端および3'末端を有する第1のオリゴヌクレオチド鎖、並びに5'末端および3'末端を有する第2のオリゴヌクレオチド鎖を有する単離された二本鎖核酸（dsNA）であって、第2の鎖は、長さが27〜53ヌクレオチド残基であり、第2の鎖の5'末端にて第1のヌクレオチド（位置1）から開始し、第2の鎖の位置1〜23は、リボヌクレオチドであり、かつ第2の鎖の位置11〜21は、第1の鎖とミスマッチを形成するヌクレオチドを含み；第1の鎖は、長さが27〜49ヌクレオチド残基であり、かつ二重鎖を形成する第2の鎖の位置1〜23のリボヌクレオチドに対して十分に相補的である23の連続したリボヌクレオチドを含み；第1の鎖の3'末端および第2の鎖の5'末端は、平滑末端を形成し；第2の鎖の位置24〜3'末端ヌクレオチド残基の少なくとも1つは、第1のホスホロチオアート修飾されたヌクレオチド（PS-NA）と塩基対を形成するデオキシリボヌクレオチドであり；かつ第2の鎖は、第2の鎖長の少なくとも19リボヌクレオチドに沿って標的RNAに対して十分に相補的であり、二本鎖核酸が哺乳動物細胞に導入されるときに、標的遺伝子発現を減少させる、二本鎖核酸（dsNA）を提供する。
【００９４】
本発明のさらなる側面は、5'末端および3'末端を有する第1のオリゴヌクレオチド鎖、並びに5'末端および3'末端を有する第2のオリゴヌクレオチド鎖を有する単離された二本鎖核酸（dsNA）であって、第2の鎖は、長さが27〜53ヌクレオチド残基であり、第2の鎖の5'末端にて第1のヌクレオチド（位置1）から開始し、第2の鎖の位置1〜23は、リボヌクレオチドであり；第1の鎖は、長さが27〜49ヌクレオチド残基であり、かつ二重鎖を形成するために第2の鎖の位置1〜23のリボヌクレオチドと塩基対を形成する23の連続したリボヌクレオチドを含み；第1の鎖の3'末端および第2の鎖の5'末端は、平滑末端を形成し；第2の鎖の位置24〜3'末端ヌクレオチド残基の少なくとも1つは、第1のホスホロチオアート修飾されたヌクレオチド（PS-NA）と塩基対を形成するデオキシリボヌクレオチドであり；かつかつ第2の鎖は、第2の鎖長の少なくとも19リボヌクレオチドに沿って標的RNAに対して十分に相補的であり、二本鎖核酸が哺乳動物細胞に導入されるときに、標的遺伝子発現を減少させ、第2の鎖の位置11〜21は、第2の鎖の位置11〜21は、標的RNAのヌクレオチドとミスマッチを形成するヌクレオチドを含む、二本鎖核酸（dsNA）を提供する。
【００９５】
もう一つの側面において、本発明は、5'末端および3'末端を有する第1のオリゴヌクレオチド鎖、並びに5'末端および3'末端を有する第2のオリゴヌクレオチド鎖を有する単離された二本鎖核酸（dsNA）であって、第2の鎖は、長さが27〜53ヌクレオチド残基であり、第2の鎖の5'末端にて第1のヌクレオチド（位置1）から開始し、第2の鎖の位置1〜23は、リボヌクレオチドであり、かつ第2の鎖の位置11〜21は、第1の鎖とミスマッチを形成するヌクレオチドを含み；第1の鎖は、長さが27〜53ヌクレオチド残基であり、かつ二重鎖を形成する第2の鎖の位置1〜23のリボヌクレオチドに対して十分に相補的である23の連続したリボヌクレオチドを含み；第1の鎖の3'末端および第2の鎖の5'末端は、1〜4ヌクレオチド3'オーバーハングを形成し；第2の鎖の位置24〜3'末端ヌクレオチド残基の少なくとも1つは、ホスホロチオアート修飾されたヌクレオチド（PS-NA）であり；および第2の鎖は、第2の鎖長の少なくとも19リボヌクレオチドに沿って標的RNAに対して十分に相補的であり、二本鎖核酸が哺乳動物細胞に導入されるときに、標的遺伝子発現を減少させる、二本鎖核酸（dsNA）を提供する。
【００９６】
一つの側面において、本発明は、5'末端および3'末端を有する第1のオリゴヌクレオチド鎖、並びに5'末端および3'末端を有する第2のオリゴヌクレオチド鎖を有する単離された二本鎖核酸（dsNA）であって、第2の鎖は、長さが27〜53ヌクレオチド残基であり、第2の鎖の5'末端にて第1のヌクレオチド（位置1）から開始し、第2の鎖の位置1〜23は、リボヌクレオチドであり；第1の鎖は、長さが27〜53ヌクレオチド残基であり、かつ二重鎖を形成する第2の鎖の位置1〜23のリボヌクレオチドに対して十分に相補的である23の連続したリボヌクレオチドを含み；第1の鎖の3'末端および第2の鎖の5'末端は、1〜4ヌクレオチド3'オーバーハングを形成し；第2の鎖の位置24〜3'末端ヌクレオチド残基の少なくとも1つは、ホスホロチオアート修飾されたヌクレオチド（PS-NA）であり；かつ第2の鎖は、第2の鎖長の少なくとも19リボヌクレオチドに沿って標的RNAに対して十分に相補的であり、二本鎖核酸が哺乳動物細胞に導入されるときに、標的遺伝子発現を減少させ、第2の鎖の位置11〜21は、第2の鎖の位置11〜21は、標的RNAのヌクレオチドとミスマッチを形成するヌクレオチドを含む、二本鎖核酸（dsNA）を提供する。
【００９７】
さらなる側面において、本発明は、5'末端および3'末端を有する第1のオリゴヌクレオチド鎖、並びに5'末端および3'末端を有する第2のオリゴヌクレオチド鎖を有する単離された二本鎖核酸（dsNA）であって、第2の鎖は、長さが27〜53ヌクレオチド残基であり、第2の鎖の5'末端にて第1のヌクレオチド（位置1）から開始し、第2の鎖の位置1〜23は、リボヌクレオチドであり、かつ第2の鎖の位置11〜21は、第1の鎖とミスマッチを形成するヌクレオチドを含み；第1の鎖は、長さが27〜53ヌクレオチド残基であり、かつ二重鎖を形成する第2の鎖の位置1〜23のリボヌクレオチドに対して十分に相補的である23の連続したリボヌクレオチドを含み；第1の鎖の3'末端および第2の鎖の5'末端は、1〜4ヌクレオチド3'オーバーハングを形成し；第2の鎖の位置24〜3'末端ヌクレオチド残基の少なくとも1つは、第1のホスホロチオアート修飾されたヌクレオチド（PS-NA）と塩基対を形成するデオキシリボヌクレオチドであり；かつ第2の鎖は、第2の鎖長の少なくとも19リボヌクレオチドに沿って標的RNAに対して十分に相補的であり、二本鎖核酸が哺乳動物細胞に導入されるときに、標的遺伝子発現を減少させる、二本鎖核酸（dsNA）を提供する。
【００９８】
さらなる側面において、本発明は、5'末端および3'末端を有する第1のオリゴヌクレオチド鎖、並びに5'末端および3'末端を有する第2のオリゴヌクレオチド鎖を有する単離された二本鎖核酸（dsNA）であって、第2の鎖は、長さが27〜53ヌクレオチド残基であり、第2の鎖の5'末端にて第1のヌクレオチド（位置1）から開始し、第2の鎖の位置1〜23は、リボヌクレオチドであり；第1の鎖は、長さが27〜53ヌクレオチド残基であり、かつ二重鎖を形成する第2の鎖の位置1〜23のリボヌクレオチドに対して十分に相補的である23の連続したリボヌクレオチドを含み；第1の鎖の3'末端および第2の鎖の5'末端は、1〜4ヌクレオチド3'オーバーハングを形成し；第2の鎖の位置24〜3'末端ヌクレオチド残基の少なくとも1つは、第1のホスホロチオアート修飾されたヌクレオチド（PS-NA）と塩基対を形成するデオキシリボヌクレオチドであり；かつ第2の鎖は、第2の鎖長の少なくとも19リボヌクレオチドに沿って標的RNAに対して十分に相補的であり、二本鎖核酸が哺乳動物細胞に導入されるときに、標的遺伝子発現を減少させ、第2の鎖の位置11〜21は、第2の鎖の位置11〜21は、標的RNAのヌクレオチドとミスマッチを形成するヌクレオチドを含む、二本鎖核酸（dsNA）を提供する。
【００９９】
もう一つの側面において、本発明は、5'末端および3'末端を有する第1のオリゴヌクレオチド鎖、並びに5'末端および3'末端を有する第2のオリゴヌクレオチド鎖を有する単離された二本鎖核酸（dsNA）であって、第2の鎖は、長さが27〜53ヌクレオチド残基であり、第2の鎖の5'末端にて第1のヌクレオチド（位置1）から開始し、第2の鎖の位置1〜23は、リボヌクレオチドであり、かつ第2の鎖の位置11〜21は、第1の鎖とミスマッチを形成するヌクレオチドを含み；第1の鎖は、長さが27〜49ヌクレオチド残基であり、かつ二重鎖を形成する第2の鎖の位置3〜23のリボヌクレオチドに対して十分に相補的である21の連続したリボヌクレオチドを含み；第1の鎖の3'末端および第2の鎖の5'末端は、平滑末端を形成し、かつ第1の鎖の3'末端の最後および最後から2番目の残基および第2の鎖の5'末端の最後および最後から2番目の残基は、1つまたは2つのミスマッチ塩基対を形成し；第2の鎖の位置24〜3'末端ヌクレオチド残基の少なくとも1つは、ホスホロチオアート修飾されたヌクレオチド（PS-NA）であり；かつ第2の鎖は、第2の鎖長の少なくとも19リボヌクレオチドに沿って標的RNAに対して十分に相補的であり、二本鎖核酸が哺乳動物細胞に導入されるときに、標的遺伝子発現を減少させる、二本鎖核酸（dsNA）を提供する。
【０１００】
本発明のさらなる側面は、5'末端および3'末端を有する第1のオリゴヌクレオチド鎖、並びに5'末端および3'末端を有する第2のオリゴヌクレオチド鎖を有する単離された二本鎖核酸（dsNA）であって、第2の鎖は、長さが27〜53ヌクレオチド残基であり、第2の鎖の5'末端にて第1のヌクレオチド（位置1）から開始し、第2の鎖の位置1〜23は、リボヌクレオチドであり；第1の鎖は、長さが27〜49ヌクレオチド残基であり、かつ二重鎖を形成するために第2の鎖の位置3〜23のリボヌクレオチドと塩基対を形成する21の連続したリボヌクレオチドを含み；第1の鎖の3'末端および第2の鎖の5'末端は、平滑末端を形成し、かつ第1の鎖の3'末端の最後および最後から2番目の残基および第2の鎖の5'末端の最後および最後から2番目の残基は、1つまたは2つのミスマッチ塩基対を形成し；第2の鎖の位置24〜3'末端ヌクレオチド残基の少なくとも1つは、ホスホロチオアート修飾されたヌクレオチド（PS-NA）であり；かつ第2の鎖は、第2の鎖長の少なくとも19リボヌクレオチドに沿って標的RNAに対して十分に相補的であり、二本鎖核酸が哺乳動物細胞に導入されるときに、標的遺伝子発現を減少させ、第2の鎖の位置11〜21は、第2の鎖の位置11〜21は、標的RNAのヌクレオチドとミスマッチを形成するヌクレオチドを含む、二本鎖核酸（dsNA）を提供する。
【０１０１】
本発明の一つの側面は、5'末端および3'末端を有する第1のオリゴヌクレオチド鎖、並びに5'末端および3'末端を有する第2のオリゴヌクレオチド鎖を有する単離された二本鎖核酸（dsNA）であって、第2の鎖は、長さが27〜53ヌクレオチド残基であり、第2の鎖の5'末端にて第1のヌクレオチド（位置1）から開始し、第2の鎖の位置1〜23は、リボヌクレオチドであり、かつ第2の鎖の位置11〜21は、第1の鎖とミスマッチを形成するヌクレオチドを含み；第1の鎖は、長さが27〜49ヌクレオチド残基であり、かつ二重鎖を形成する第2の鎖の位置3〜23のリボヌクレオチドに対して十分に相補的である21の連続したリボヌクレオチドを含み；第1の鎖の3'末端および第2の鎖の5'末端は、平滑末端を形成し、かつ第1の鎖の3'末端の最後および最後から2番目の残基および第2の鎖の5'末端の最後および最後から2番目の残基は、1つまたは2つのミスマッチ塩基対を形成し；第2の鎖の位置24〜3'末端ヌクレオチド残基の少なくとも1つは、第1のホスホロチオアート修飾されたヌクレオチド（PS-NA）と塩基対を形成するデオキシリボヌクレオチドであり；かつ第2の鎖は、第2の鎖長の少なくとも19リボヌクレオチドに沿って標的RNAに対して十分に相補的であり、二本鎖核酸が哺乳動物細胞に導入されるときに、標的遺伝子発現を減少させる、二本鎖核酸（dsNA）を提供する。
【０１０２】
もう一つの側面において、本発明は、5'末端および3'末端を有する第1のオリゴヌクレオチド鎖、並びに5'末端および3'末端を有する第2のオリゴヌクレオチド鎖を有する単離された二本鎖核酸（dsNA）であって、第2の鎖は、長さが27〜53ヌクレオチド残基であり、第2の鎖の5'末端にて第1のヌクレオチド（位置1）から開始し、第2の鎖の位置1〜23は、リボヌクレオチドであり；第1の鎖は、長さが27〜49ヌクレオチド残基であり、かつ二重鎖を形成するために第2の鎖の位置3〜23のリボヌクレオチドと塩基対を形成する21の連続したリボヌクレオチドを含み；第1の鎖の3'末端および第2の鎖の5'末端は、平滑末端を形成し、かつ第1の鎖の3'末端の最後および最後から2番目の残基および第2の鎖の5'末端の最後および最後から2番目の残基は、1つまたは2つのミスマッチ塩基対を形成し；第2の鎖の位置24〜3'末端ヌクレオチド残基の少なくとも1つは、第1のホスホロチオアート修飾されたヌクレオチド（PS-NA）と塩基対を形成するデオキシリボヌクレオチドであり；かつ第2の鎖は、第2の鎖長の少なくとも19リボヌクレオチドに沿って標的RNAに対して十分に相補的であり、二本鎖核酸が哺乳動物細胞に導入されるときに、標的遺伝子発現を減少させ、第2の鎖の位置11〜21は、第2の鎖の位置11〜21は、標的RNAのヌクレオチドとミスマッチを形成するヌクレオチドを含む、二本鎖核酸（dsNA）を提供する。
【０１０３】
一つの態様において、第2の鎖の位置24〜3'末端ヌクレオチド残基の2つ以上のヌクレオチド残基は、ホスホロチオアート修飾されたヌクレオチド（PS-NAs）である。任意に、第2の鎖PS-NA残基は、第1の鎖のPS-NAデオキシリボヌクレオチドと塩基対を形成する。
【０１０４】
一つの態様において、dsNAは、全体で2つ以上の、3以上、4以上、5以上、6以上、7以上、8以上、9以上、10以上、11以上、12以上、13以上、14以上または15以上のPS-NA残基を有する。任意に、dsNAは、いずれか一方または両方の鎖に、2つ以上の、3以上、4以上、5以上、6以上、7以上、8以上、9以上、10以上、11以上、12以上、13以上、14以上もしくは15以上のPS-NAまたはその他の修飾された残基を有する。さらなる態様において、dsNAは、全体で16以上、17以上、18以上、19以上、20以上、21以上、22以上、23以上、24以上、25以上、26以上、27以上、28以上、29以上もしくは30以上のPS-NAまたはその他の修飾された残基を有する。
【０１０５】
もう一つの態様において、dsNAは、Dicerによって哺乳動物細胞において内因的に切断される。さらなる態様において、dsNAは、哺乳動物細胞において内因的に切断されて、標的遺伝子発現を減少させる、長さが19〜23ヌクレオチドの二本鎖核酸を産生する。さらなる態様において、単離されたdsNAは、ホスホナート、ホスホロチオアートまたはリン酸トリエステルホスフェートバックボーン修飾を有する。さらなる態様において、dsNAは、少なくとも10%、少なくとも50%または少なくとも80〜90%までインビトロでの哺乳動物細胞における標的遺伝子発現を減少させる。任意に、dsNAは、哺乳動物被験体における、または哺乳動物被験体の細胞もしくは組織における標的遺伝子発現を、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%または少なくとも95%以上まで減少させる。一定の態様において、阻害のこのようなレベルの期間は、一回または複数回の用量投与に続いて、哺乳動物の被験体、組織または細胞において、6時間、12時間、24時間、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日、14日以上である。
【０１０６】
一つの態様において、dsNAは、哺乳動物細胞に導入されたときに、デオキシリボヌクレオチド-デオキシリボヌクレオチド塩基対を有しない参照dsRNAと比較して、標的遺伝子発現を減少させる。
【０１０７】
もう一つの態様において、dsNAは、哺乳動物細胞に導入されたときに、1nM以下、200pM以下、100pM以下、50pM以下、20pM以下、10pM以下、5pM以下および1pM以下からなる群より選択される濃度にて細胞にトランスフェクトされたときに、少なくとも70%まで標的遺伝子発現を減少させる。
【０１０８】
さらなる態様において、dsNAのリボヌクレオチド残基の少なくとも50%は、修飾されていないリボヌクレオチドである。一定の態様において、第2の鎖のリボヌクレオチド残基の少なくとも50%は、修飾されていないリボヌクレオチドである。任意に、dsNAの全てのデオキシリボヌクレオチドの少なくとも50%は、修飾されていないデオキシリボヌクレオチドである。
【０１０９】
一つの態様において、第1の鎖は、第2の鎖ヌクレオチド配列に対して少なくとも80%、90%、95%または100%の相補的であるヌクレオチド配列を有する。
【０１１０】
一定の態様において、標的RNAは、KRASである。
【０１１１】
一つの側面において、本発明は、細胞における標的遺伝子の発現を減少させるための方法であって、参照dsRNAと比較して細胞における標的遺伝子の発現を減少させるのに有効な量で本明細書に記述したとおりの単離された二本鎖NA（dsNA）と細胞と接触することを含む方法を提供する。
【０１１２】
もう一つの側面において、本発明は、参照dsRNAと比較して動物の細胞における標的遺伝子の発現を減少させるのに有効な量で本明細書に記述したとおりの単離された二本鎖のNA（dsNA）で動物を処理することによって動物における標的遺伝子の発現を減少させるための方法を提供する。
【０１１３】
一つの態様において、dsNAは、適切な対照DsiRNAと比較して、増強された薬物動態、増強された薬力学、減少された毒性または増強された細胞内取り込みを有する。
【０１１４】
さらなる側面において、本発明は、参照dsRNAと比較して細胞における標的遺伝子の発現を減少させるのに有効な量で存在する、本明細書に記述された単離された二本鎖NA（dsNA）を含み、および薬学的に許容される担体をさらに含む、被験体の細胞における標的遺伝子の発現を減少させるための医薬組成物を提供する。
【０１１５】
本発明のもう一つの側面は、dsNAの化学的または酵素的合成を介して本明細書に記述したとおりの二本鎖NA（dsNA）を合成する方法を提供する。
【０１１６】
本発明のさらなる側面は、本明細書において記述されたdsNAおよびその使用のための説明書を含むキットを提供する。
【０１１７】
本発明のさらなる側面は、図30〜43Cいずれか1つに図示したような、単離された二本鎖核酸（dsNA）を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０１１８】
【図１】図1Aは、Dicer基質の阻害性RNA薬剤（「DsiRNA」）のプロセシングの略図を示す。タンパク質Dicerは、大きな長方形によって表され、DicerのPAZ（Piwi/Argonaute/Zwille）ドメインも示してある。PAZドメインは、ガイド（アンチセンス）鎖の3'末端における2塩基の突出および3'-OH（ヒドロキシル基）を結合し、dsRNA二重鎖のそれぞれの鎖は、別々のRNase IIIドメイン（黒い三角形）によって切断される。パッセンジャー（センス）鎖の3'末端における2塩基のDNAのRNAへの置換は、2塩基長いRNA/DNA二重鎖平滑末端を形成し、それはPAZに対する結合親和性を減少または除去する。DsiRNAの切断は、典型的にはそれぞれの末端にて2塩基の突出を有する19merの二重鎖を生じる。図1Bは、DsiRNAへの4塩基のDNA二重鎖の付加が、Dicer切断に対して明らかな阻害作用を有さなかったことを示す。抗HPRT DsiRNA（濃い黒いバーおよび矢印）のこの例に挿入される塩基は、HPRT標的配列に対して相補的ではなかった。
【図２】図2Aは、センス鎖のDicer切断部位の3'/アンチセンス鎖のDicer切断部位の5'に位置する二重鎖領域における塩基対形成したデオキシリボヌクレオチドを有するDsiRNA薬剤の強い有効性を示すヒストグラムデータを表す（「右に拡張したDsiRNA薬剤」）。DsiRNA二重鎖を、20nMの固定した濃度にてHela細胞にトランスフェクトし、HPRT発現レベルを24時間後に測定した。トランスフェクションは2連で行い、2連のそれぞれを、qPCRによってHPRT発現について3連でアッセイした。エラーバーは、標準誤差である。二重鎖1は、HPRTをターゲットして、Roze et al. NAR 2005に記載されているように突出するRNA/平滑2-DNA置換の25/27mer配置であった。HPRT標的領域に対して相補的でなかった塩基の挿入のため、その他の全ての二重鎖は、二重鎖1より長かった。挿入配列の長さは、2塩基（二重鎖2）から8塩基（二重鎖6、7および8）までの範囲であった。図2Bは、データが図2Aにおいて示される薬剤について、二重鎖番号、配列および化学的修飾パターンを示す。大文字=修飾されていないRNA、太字、下線= 2'-O-メチルRNA、小文字= DNA、太字の小文字=ホスホロチオアート修飾されたDNA（PS-DNA）。それぞれの二重鎖の一般的な記述および全体の配置を右に示してある。
【図３】図3Aおよび3Bは、DNA拡張DsiRNA薬剤が、対応するRNA拡張DsiRNA薬剤より低濃度にて有効だったことを示す。Hela細胞において評価されるHPRT mRNAレベルのノックダウンの有効性で、HPRTをターゲットする最適化した27/29merのDsiRNA二重鎖を、10.0ナノモル（nM）、1.0ナノモル（nM）および100ピコモル（100pMまたは0.1nM）の用量反応シリーズにおいて、修飾された二重鎖と比較した。示した二重鎖濃度は、実施例に記載されているようにトランスフェクション混合物および培養液におけるオリゴヌクレオチドの終濃度を表す。未処理の細胞におけるベースラインのHPRT発現を表す「C」バーと共に、二重鎖の情報をバー（1、2、3）の下に示してある。図3Bは、図3Aに示したこれらの二重鎖の配列および化学的修飾パターンを示す。大文字=修飾されていないRNA、太字、下線= 2'-O-メチルRNAおよび小文字= DNA。DsiRNA 1は、以前に報告された活性な25/27merのDsiRNA二重鎖の誘導体であったが（HPRT-1、Roze et al. NAR 2005、Collingwood et al. 2008、上記の図2Aをまた参照されたい）、それぞれの鎖において2つの塩基の挿入を含み、それはオリゴヌクレオチド二重鎖を27/29merまで拡張した（濃い黒いバーは、挿入された塩基対を意味する）。二重鎖2は、二重鎖1と配列が同一だったが、パッセンジャー鎖（センス配列）およびガイド鎖（アンチセンス配列）の両方の2つのさらなるヌクレオシドを含む2塩基対挿入（濃い黒いバー）をDNAとして合成した。したがって、以前報告されたパッセンジャー（センス）鎖の3'末端にて2塩基のDNA置換（Rose et al, 2005）とは対照的に、二重鎖2は、ガイド鎖の5'末端にて、4 DNA bp（塩基対）において終結した。二重鎖3（ミスマッチ（MM）対照）は、最適化したHPRT-1二重鎖に由来したが、矢印によって示されたミスマッチと共に合成された。それぞれの鎖の塩基組成と化学的修飾および塩基配列、並びに二重鎖3の末端における突出または平滑構造は、ターゲットされていない化学効果を制御するために、最適化したHPRT-1二重鎖に関して一定に保持した（下の図5を参照されたい）。
【図４】図4A〜4Dは、2〜8塩基対デオキシリボヌクレオシドによって拡張した修飾DsiRNA二重鎖が、対応するリボヌクレオシドが拡張DsiRNA薬剤より、HPRTがターゲットするmRNAレベルを減少させることに有効だったことを示す。図4Aは、1nMの修飾DsiRNA薬剤で処理した細胞の、HPRT標的遺伝子mRNAレベルを示す。図4Bは、100pMの修飾DsiRNA薬剤で処理した細胞の、HPRT標的遺伝子mRNAレベルを示す。図4Cは、10pMの修飾DsiRNA薬剤で処理した細胞の、HPRT標的遺伝子mRNAレベルを示す。図4Dは、図4A〜4Cに示したこれらの二重鎖の配列および化学的修飾パターンを示す。挿入配列（二重鎖の下の濃いバー）は、HPRT mRNA標的領域にマッチしなかった。大文字=修飾されていないRNA、太字、下線= 2'-O-メチルRNA、小文字= DNA、U=未処理の細胞。
【図５】図5Aは、100pMの固定濃度にて投与される、長さを増加させた一連の修飾した二重鎖についてのHPRT標的mRNAの阻害結果を示す。図5Bは、データが図5Aにおいて提示した薬剤の二重鎖番号、配列および化学的修飾パターンを示す。二重鎖1は、最適化した25/27mer DsiRNAであり、それはガイド（アンチセンス）鎖の3'末端における2塩基の突出およびパッセンジャー（センス）鎖の3'末端における2つのDNA置換および平滑末端の化学的修飾を含む（Collingwood et al. 2008）。HPRT mRNAに非相補な塩基は、RNA（二重鎖2〜5）またはDNA（二重鎖6〜9）として同時に2塩基挿入され、それは27/29mersから33/35mersに全二重鎖配置を増やした。大文字=修飾されていないRNA、太字、下線= 2'-O-メチルRNA、小文字= DNA、U =未処置の細胞。大文字=修飾されていないRNA、太字、下線= 2'-O-メチルRNA、小文字= DNA。
【図６】図6は、dsRNA二重鎖配列内にミスマッチ残基（G：U）を含む「25/27merのDsiRNA」薬剤（上部）および例示的な「左に拡張した」DsiRNA薬剤（下の）の構造および突出したDicerが媒介するプロセシングを示す。大文字= RNA残基；小文字= DNA残基。
【図７】図7は、一連のDNAが拡張した二重鎖の構造を示し、5塩基対のDNA配列で右または左の交互に拡張した二重鎖を描いた。示したとおり、拡張DsiRNA薬剤の両方のタイプ内にミスマッチを導入し、Dicer切断後の第2の鎖の突出した5'末端RNA残基である第2の鎖の位置1から3'方向に進行してこのようなミスマッチの番号付けする。
【図８】図8は、図7に示した右および左に拡張した薬剤の阻害活性を試験する最初のラウンドの結果を示す。右対左に拡張した親分子、位置14にてミスマッチを有する右対左に拡張した薬剤、位置16にてミスマッチを有する右対左に拡張した薬剤、並びに位置14および18にてミスマッチを有する右対左に拡張した薬剤の間の比較について、左に拡張した薬剤は、驚くべきことに対応する右に拡張した薬剤より、遺伝子サイレンシングにおいて有効であることが観察された。（100pMのそれぞれの示された二重鎖を、全てのこのような実験について、Hela細胞にトランスフェクトし、残りのKRAS標的mRNAの%を24時間にて評価した。）
【図９】図9は、図7に示した薬剤で行った2回目の実験の結果を示し、左に拡張した薬剤が、右に拡張した薬剤より、左に拡張した薬剤を選ぶこのようなバイアスを示すことが最初に観察された4例のうちの3つにおいて、再現的に有効な標的mRNAサイレンシング薬剤であったことを示す。拡張されていない25/27mer DsiRNAについての阻害の結果も示してある（「Opt」25／27mer）。
【図１０】図10は、HPRTの標的mRNAをサイレンスするようにデザインした一連のDsiRNA薬剤の構造および細胞培養におけるこのような薬剤の阻害の有効性を示す。大文字は、リボヌクレオチドを示す；小文字は、デオキシリボヌクレオチドを示す；太字の小文字は、ホスホロチオアート（PS-NAs）を示す；太字で下線を引いた大文字は、2'-O-メチル修飾のヌクレオチドを示す；薬剤DP1065P/DP1067Gの太字の大文字は、DsiRNA薬剤のアンチセンス鎖の「シード」領域配列内のミスマッチのヌクレオチド（センス鎖に関して）の部位を示す。
【図１１】図11は、ホスホロチオアート修飾した「右に拡張した」DsiRNAsが標的HPRT1遺伝子の阻害の有効性を保持することを示し、またパッセンジャー鎖に拡張した残基が、標的遺伝子阻害活性を保持する一方で、ガイド鎖に拡張した残基よりもよくホスホロチオアート修飾を許容するかもしれないことを示す。また、インビトロでのDicer切断アッセイ（左のレーン=未処理；右のレーン= Dicer酵素処理した）を全ての拡張DsiRNAsについて示してある。大文字は、リボヌクレオチドを示す；小文字は、デオキシリボヌクレオチドを示し、一方で、太字の小文字は、ホスホロチオアート修飾されたデオキシリボヌクレオチドを示す。
【図１２】図12は、対照およびKRAS転写物内の「KRAS-200」部位をターゲットする本発明の「右に拡張した」DsiRNAsの構造を示す。大文字は、リボヌクレオチドを示す；小文字はデオキシリボヌクレオチドを示す。
【図１３】図13は、インビトロでの、図12のDsiRNA構造について観察されたKRAS阻害の有効性を示す。
【図１４】図14は、対照およびKRAS転写物中の「KRAS-909」部位をターゲットする本発明の「右に拡張した」DsiRNAsの構造を示す。大文字は、リボヌクレオチドを示す；小文字はデオキシリボヌクレオチドを示す。
【図１５】図15は、インビトロにおいて図14のDsiRNA構造について観察されたKRAS阻害の有効性を示す。
【図１６】図16は、対照およびKRAS転写物内の「KRAS-249」部位をターゲットする本発明の「右に拡張した」DsiRNAsの構造を示し、このようなDsiRNAsの修飾パターンを含む。大文字は、リボヌクレオチドを示す；小文字は、デオキシリボヌクレオチドを示し、一方で、太字の小文字は、ホスホロチオアート修飾されたデオキシリボヌクレオチドを示す。下線を引いた大文字は、2'-O-メチル修飾リボヌクレオチドを示す。
【図１７】図17は、対照およびKRAS転写物内の「KRAS-516」部位をターゲットする本発明の「右に拡張した」DsiRNAsの構造を示し、このようなDsiRNAsの修飾パターンを含む。大文字は、リボヌクレオチドを示す；小文字は、デオキシリボヌクレオチドを示し、一方で、太字の小文字は、ホスホロチオアート修飾されたデオキシリボヌクレオチドを示す。下線を引いた大文字は、2'-O-メチル修飾リボヌクレオチドを示す。
【図１８】図18は、対照およびKRAS転写物内の「KRAS-909」部位をターゲットする本発明の「右に拡張した」DsiRNAsの構造を示し、このようなDsiRNAsの修飾パターンを含む。大文字は、リボヌクレオチドを示す；小文字は、デオキシリボヌクレオチドを示し、一方で、太字の小文字は、ホスホロチオアート修飾されたデオキシリボヌクレオチドを示す。下線を引いた大文字は、2'-O-メチル修飾リボヌクレオチドを示す。
【図１９】図19は、図16-18の「右に拡張した」DsiRNAsについて得られた、インビトロでのKRAS阻害の有効性の結果を示す。結果は、0.1nM濃度にて示したDsiRNAsと接触したHela細胞において得られ、RNAiMAX（商標）処理の24時間後にアッセイした。大文字は、リボヌクレオチドを示す；小文字は、デオキシリボヌクレオチドを示し、一方で、太字の小文字は、ホスホロチオアート修飾されたデオキシリボヌクレオチドを示す。
【図２０】図20は、ミスマッチ残基の寛容性について評価した25/27merの「KRAS-249」部位をターゲットするDsiRNAsの構造を示す。黒矢印は、突出したDicer酵素切断部位を示し、一方で、白矢印は、示されるパッセンジャー鎖のDsiRNA配列に対応する標的鎖配列内の、突出したAgo2切断部位を示す。大文字は、リボヌクレオチドを示す；小文字は、デオキシリボヌクレオチドを示す。太字の大文字は、ガイド鎖の標的ミスマッチ残基の部位（および適切な場合、パッセンジャー鎖の相補残基）を示し、このような標的ミスマッチの残基は、DsiRNAのデザインの間に、ガイドとパッセンジャー鎖との間の個々の残基を「反転させる」ことによって得られる。DP1301P/DP1302Gの二重鎖内の水平ブラケットは、この二重鎖の「シード領域」を示す（全てのその他のDsiRNA構造のシード領域は、同じ垂直に整列した位置に存在する）。
【図２１】図21は、図20のDsiRNAsについて得られた、インビトロでのKRAS阻害の有効性の結果を示す。結果は、0.1nM濃度にて示したDsiRNAsと接触したHela細胞において得られ、RNAiMAX（商標）処理の24時間後にアッセイした。
【図２２】図22は、修飾されていない25/27merの「KRAS-249」部位をターゲットするDsiRNA（「K249」）、この25/27merの2'-O-メチル-修飾型（「KRAS-249M」）およびこの修飾されたDsiRNAのDNA拡張型（「K249D」として図16に示した「K249DNA」；「5%のGlu」= 5%のグルコース対照）についての、肝臓組織における、単一用量（10mg/kg）のインビボKRAS阻害の有効性結果を示す。
【図２３】図23は、修飾されていない25/27merの「KRAS-249」部位をターゲットするDsiRNA（「K249」）、この25/27merの2'-O-メチル-修飾型（「KRAS-249M」）およびこの修飾されたDsiRNAのDNA拡張型（「K249D」として図16に示した「K249DNA」；「5%のGlu」= 5%のグルコース対照）についての、腎臓組織における、単一用量（10mg/kg）のインビボKRAS阻害の有効性結果を示す。
【図２４】図24は、修飾されていない25/27merの「KRAS-249」部位をターゲットするDsiRNA（「K249」）、この25/27merの2'-O-メチル-修飾型（「KRAS-249M」）およびこの修飾されたDsiRNAのDNA拡張型（「K249D」として図16に示した「K249DNA」；「5%のGlu」= 5%のグルコース対照）についての、脾臓組織における、単一用量（10mg/kg）のインビボKRAS阻害の有効性結果を示す。
【図２５】図25は、修飾されていない25/27merの「KRAS-249」部位をターゲットするDsiRNA（「K249」）、この25/27merの2'-O-メチル-修飾型（「KRAS-249M」）およびこの修飾されたDsiRNAのDNA拡張型（「K249D」として図16に示した「K249DNA」；「5%のGlu」= 5%のグルコース対照）についての、リンパ節組織における、単一用量（10mg/kg）のインビボKRAS阻害の有効性結果を示す。
【図２６】図26は、25/27merの「KRAS-249」部位をターゲットするDsiRNAの2'-O-メチル-修飾型（「KRAS-249M」）およびこの修飾されたDsiRNAのDNA拡張型（図16に示した「K249D」）についての、肝臓組織における、複数用量（2mg/kg、合計4回の投与、それぞれの投与で3日間のインターバル）のインビボKRAS阻害の有効性結果を示す。
【図２７】図27は、25/27merの「KRAS-249」部位をターゲットするDsiRNAの2'-O-メチル-修飾型（「KRAS-249M」）およびこの修飾されたDsiRNAのDNA拡張型（図16に示した「K249D」）についての、肺組織における、複数用量（2mg/kg、合計4回の投与、それぞれの投与で3日間のインターバル）のインビボKRAS阻害の有効性結果を示す。
【図２８】図28は、25/27merの「KRAS-249」部位をターゲットするDsiRNAの2'-O-メチル-修飾型（「KRAS-249M」）およびこの修飾されたDsiRNAのDNA拡張型（図16に示した「K249D」）についての、脾臓組織における、複数用量（2mg/kg、合計4回の投与、それぞれの投与で3日間のインターバル）のインビボKRAS阻害の有効性結果を示す。
【図２９】図29は、25/27merの「KRAS-249」部位をターゲットするDsiRNAの2'-O-メチル-修飾型（「KRAS-249M」）およびこの修飾されたDsiRNAのDNA拡張型（図16に示した「K249D」）についての、腎臓組織における、複数用量（2mg/kg、合計4回の投与、それぞれの投与で3日間のインターバル）のインビボKRAS阻害の有効性結果を示す。
【図３０】図30は、第1の鎖の3'末端と第2の鎖の5'末端との間に平滑末端を形成する「右に拡張した」DsiRNA薬剤の例示的な構造を示す。大文字は、リボヌクレオチドを示す；小文字は、デオキシリボヌクレオチドを意味する；白三角形は、標的RNA内のAgo2切断部位に対応する第1の鎖（ここではセンス鎖）の配列内の部位を示す；黒三角形は、Dicer切断の突出部位を示す；および［#］は、少なくとも1つのデオキシリボヌクレオチド-デオキシリボヌクレオチド塩基対を含む長さの4〜16以上の塩基対の二重鎖領域を示す。（代わりの態様において、［#］は、少なくとも4デオキシリボヌクレオチドを含む長さの4〜16以上の塩基対の二重鎖領域を示すが、デオキシリボヌクレオチド-デオキシリボヌクレオチド塩基対を有することは必要とされない）。また、ヌクレオチド位置の番号付けも示してある。
【図３１】図31は、第2の鎖の5'末端に関して第1の鎖の3'末端突出を有する「右に拡張した」DsiRNA薬剤の例示的な構造を示す。大文字は、リボヌクレオチドを示す；小文字は、デオキシリボヌクレオチドを意味する；白三角形は、標的RNA内のAgo2切断部位に対応する第1の鎖（ここではセンス鎖）の配列内の部位を示す；黒三角形は、Dicer切断の突出部位を示す；および［#］は、少なくとも1つのデオキシリボヌクレオチド-デオキシリボヌクレオチド塩基対を含む長さの4〜16以上の塩基対の二重鎖領域を示す。（代わりの態様において、［#］は、少なくとも4デオキシリボヌクレオチドを含む長さの4〜16以上の塩基対の二重鎖領域を示すが、デオキシリボヌクレオチド-デオキシリボヌクレオチド塩基対を有することは必要とされない）。また、ヌクレオチド位置の番号付けも示してある。
【図３２】図32は、第1の鎖の3'末端および第2の鎖の対応する5'末端の端の削れを形成する「右に拡張した」DsiRNA薬剤の例示的な構造を示す。大文字は、リボヌクレオチドを示す；小文字は、デオキシリボヌクレオチドを意味する；白三角形は、標的RNA内のAgo2切断部位に対応する第1の鎖（ここではセンス鎖）の配列内の部位を示す；黒三角形は、Dicer切断の突出部位を示す；および［#］は、少なくとも1つのデオキシリボヌクレオチド-デオキシリボヌクレオチド塩基対を含む長さの4〜16以上の塩基対の二重鎖領域を示す。（代わりの態様において、［#］は、少なくとも4デオキシリボヌクレオチドを含む長さの4〜16以上の塩基対の二重鎖領域を示すが、デオキシリボヌクレオチド-デオキシリボヌクレオチド塩基対を有することは必要とされない）。また、ヌクレオチド位置の番号付けも示してある。
【図３３】図33は、第1の鎖の3'末端と第2の鎖の5'末端との間に平滑末端を形成し、またDicer切断の後の干渉薬剤内に保持されるように突出したアンチセンス鎖配列内にミスマッチの残基を有する「右に拡張した」DsiRNA薬剤の例示的な構造を示す。大文字は、リボヌクレオチドを示す；小文字は、デオキシリボヌクレオチドを意味する；白三角形は、標的RNA内のAgo2切断部位に対応する第1の鎖（ここではセンス鎖）の配列内の部位を示す；黒三角形は、Dicer切断の突出部位を示す；および［#］は、少なくとも1つのデオキシリボヌクレオチド-デオキシリボヌクレオチド塩基対を含む長さの4〜16以上の塩基対の二重鎖領域を示す。（代わりの態様において、［#］は、少なくとも4デオキシリボヌクレオチドを含む長さの4〜16以上の塩基対の二重鎖領域を示すが、デオキシリボヌクレオチド-デオキシリボヌクレオチド塩基対を有することは必要とされない）。また、アンチセンス鎖の種およびミスマッチ領域、並びにそれぞれの鎖のヌクレオチド位置の番号付けを示してある。下の薬剤の下線を引いたアンチセンス残基は、DsiRNA薬剤のセンス鎖と塩基対を形成するヌクレオチドを示すが、標的RNAとミスマッチを形成するように突出している。
【図３４】図34は、第2の鎖の5'末端に関して第1の鎖の3'末端突出を有し、またDicer切断の後の干渉薬剤内に保持されるように突出したアンチセンス鎖配列内にミスマッチの残基を有する「右に拡張した」DsiRNA薬剤の例示的な構造を示す。大文字は、リボヌクレオチドを示す；小文字は、デオキシリボヌクレオチドを意味する；白三角形は、標的RNA内のAgo2切断部位に対応する第1の鎖（ここではセンス鎖）の配列内の部位を示す；黒三角形は、Dicer切断の突出部位を示す；および［#］は、少なくとも1つのデオキシリボヌクレオチド-デオキシリボヌクレオチド塩基対を含む長さの4〜16以上の塩基対の二重鎖領域を示す。（代わりの態様において、［#］は、少なくとも4デオキシリボヌクレオチドを含む長さの4〜16以上の塩基対の二重鎖領域を示すが、デオキシリボヌクレオチド-デオキシリボヌクレオチド塩基対を有することは必要とされない）。また、アンチセンス鎖の種およびミスマッチ領域、並びにそれぞれの鎖のヌクレオチド位置の番号付けを示してある。下の薬剤の下線を引いたアンチセンス残基は、DsiRNA薬剤のセンス鎖と塩基対を形成するヌクレオチドを示すが、標的RNAとミスマッチを形成するように突出している。
【図３５】図35は、第1の鎖の3'末端および第2の鎖の対応する5'末端の端の削れを形成し、またDicer切断の後の干渉薬剤内に保持されるように突出したアンチセンス鎖配列内にミスマッチの残基を有する「右に拡張した」DsiRNA薬剤の例示的な構造を示す。大文字は、リボヌクレオチドを示す；小文字は、デオキシリボヌクレオチドを意味する；白三角形は、標的RNA内のAgo2切断部位に対応する第1の鎖（ここではセンス鎖）の配列内の部位を示す；黒三角形は、Dicer切断の突出部位を示す；および［#］は、少なくとも1つのデオキシリボヌクレオチド-デオキシリボヌクレオチド塩基対を含む長さの4〜16以上の塩基対の二重鎖領域を示す。（代わりの態様において、［#］は、少なくとも4デオキシリボヌクレオチドを含む長さの4〜16以上の塩基対の二重鎖領域を示すが、デオキシリボヌクレオチド-デオキシリボヌクレオチド塩基対を有することは必要とされない）。また、アンチセンス鎖の種およびミスマッチ領域、並びにそれぞれの鎖のヌクレオチド位置の番号付けを示してある。下の薬剤の下線を引いたアンチセンス残基は、DsiRNA薬剤のセンス鎖と塩基対を形成するヌクレオチドを示すが、標的RNAとミスマッチを形成するように突出している。
【図３６】図36は、第1の鎖の3'末端と第2の鎖の5'末端との間に平滑末端を形成する「左に拡張した」DsiRNA薬剤の例示的な構造を示す。大文字は、リボヌクレオチドを示す；小文字は、デオキシリボヌクレオチドを意味する；白三角形は、標的RNA内のAgo2切断部位に対応する第1の鎖（ここではセンス鎖）の配列内の部位を示す；黒三角形は、Dicer切断の突出部位を示す；および［#］は、少なくとも1つのデオキシリボヌクレオチド-デオキシリボヌクレオチド塩基対を含む長さの4〜16以上の塩基対の二重鎖領域を示す。（代わりの態様において、［#］は、少なくとも4デオキシリボヌクレオチドを含む長さの4〜16以上の塩基対の二重鎖領域を示すが、デオキシリボヌクレオチド-デオキシリボヌクレオチド塩基対を有することは必要とされない）。また、ヌクレオチド位置の番号付けも示してある。
【図３７】図37は、第2の鎖の5'末端に関して第1の鎖の3'末端突出を有する「左に拡張した」DsiRNA薬剤の例示的な構造を示す。大文字は、リボヌクレオチドを示す；小文字は、デオキシリボヌクレオチドを意味する；白三角形は、標的RNA内のAgo2切断部位に対応する第1の鎖（ここではセンス鎖）の配列内の部位を示す；黒三角形は、Dicer切断の突出部位を示す；および［#］は、少なくとも1つのデオキシリボヌクレオチド-デオキシリボヌクレオチド塩基対を含む長さの4〜16以上の塩基対の二重鎖領域を示す。（代わりの態様において、［#］は、少なくとも4デオキシリボヌクレオチドを含む長さの4〜16以上の塩基対の二重鎖領域を示すが、デオキシリボヌクレオチド-デオキシリボヌクレオチド塩基対を有することは必要とされない）。また、ヌクレオチド位置の番号付けも示してある。
【図３８】図38は、第1の鎖の3'末端および第2の鎖の対応する5'末端の端の削れを形成する「左に拡張した」DsiRNA薬剤の例示的な構造を示す。大文字は、リボヌクレオチドを示す；小文字は、デオキシリボヌクレオチドを意味する；白三角形は、標的RNA内のAgo2切断部位に対応する第1の鎖（ここではセンス鎖）の配列内の部位を示す；黒三角形は、Dicer切断の突出部位を示す；および［#］は、少なくとも1つのデオキシリボヌクレオチド-デオキシリボヌクレオチド塩基対を含む長さの4〜16以上の塩基対の二重鎖領域を示す。（代わりの態様において、［#］は、少なくとも4デオキシリボヌクレオチドを含む長さの4〜16以上の塩基対の二重鎖領域を示すが、デオキシリボヌクレオチド-デオキシリボヌクレオチド塩基対を有することは必要とされない）。また、ヌクレオチド位置の番号付けも示してある。
【図３９】図39は、第1の鎖の3'末端と第2の鎖の5'末端との間に平滑末端を形成し、またDicer切断の後の干渉薬剤内に保持されるように突出したアンチセンス鎖配列内にミスマッチの残基を有する「左に拡張した」DsiRNA薬剤の例示的な構造を示す。大文字は、リボヌクレオチドを示す；小文字は、デオキシリボヌクレオチドを意味する；白三角形は、標的RNA内のAgo2切断部位に対応する第1の鎖（ここではセンス鎖）の配列内の部位を示す；黒三角形は、Dicer切断の突出部位を示す；および［#］は、少なくとも1つのデオキシリボヌクレオチド-デオキシリボヌクレオチド塩基対を含む長さの4〜16以上の塩基対の二重鎖領域を示す。（代わりの態様において、［#］は、少なくとも4デオキシリボヌクレオチドを含む長さの4〜16以上の塩基対の二重鎖領域を示すが、デオキシリボヌクレオチド-デオキシリボヌクレオチド塩基対を有することは必要とされない）。また、アンチセンス鎖の種およびミスマッチ領域、並びにそれぞれの鎖のヌクレオチド位置の番号付けを示してある。下の薬剤の下線を引いたアンチセンス残基は、DsiRNA薬剤のセンス鎖と塩基対を形成するヌクレオチドを示すが、標的RNAとミスマッチを形成するように突出している。
【図４０】図40は、第2の鎖の5'末端に関して第1の鎖の3'末端突出を有し、またDicer切断の後の干渉薬剤内に保持されるように突出したアンチセンス鎖配列内にミスマッチの残基を有する「左に拡張した」DsiRNA薬剤の例示的な構造を示す。大文字は、リボヌクレオチドを示す；小文字は、デオキシリボヌクレオチドを意味する；白三角形は、標的RNA内のAgo2切断部位に対応する第1の鎖（ここではセンス鎖）の配列内の部位を示す；黒三角形は、Dicer切断の突出部位を示す；および［#］は、少なくとも1つのデオキシリボヌクレオチド-デオキシリボヌクレオチド塩基対を含む長さの4〜16以上の塩基対の二重鎖領域を示す。（代わりの態様において、［#］は、少なくとも4デオキシリボヌクレオチドを含む長さの4〜16以上の塩基対の二重鎖領域を示すが、デオキシリボヌクレオチド-デオキシリボヌクレオチド塩基対を有することは必要とされない）。また、アンチセンス鎖の種およびミスマッチ領域、並びにそれぞれの鎖のヌクレオチド位置の番号付けを示してある。下の薬剤の下線を引いたアンチセンス残基は、DsiRNA薬剤のセンス鎖と塩基対を形成するヌクレオチドを示すが、標的RNAとミスマッチを形成するように突出している。
【図４１】図41は、第1の鎖の3'末端および第2の鎖の対応する5'末端の端の削れを形成し、またDicer切断の後の干渉薬剤内に保持されるように突出したアンチセンス鎖配列内にミスマッチの残基を有する「左に拡張した」DsiRNA薬剤の例示的な構造を示す。大文字は、リボヌクレオチドを示す；小文字は、デオキシリボヌクレオチドを意味する；白三角形は、標的RNA内のAgo2切断部位に対応する第1の鎖（ここではセンス鎖）の配列内の部位を示す；黒三角形は、Dicer切断の突出部位を示す；および［#］は、少なくとも1つのデオキシリボヌクレオチド-デオキシリボヌクレオチド塩基対を含む長さの4〜16以上の塩基対の二重鎖領域を示す。（代わりの態様において、［#］は、少なくとも4デオキシリボヌクレオチドを含む長さの4〜16以上の塩基対の二重鎖領域を示すが、デオキシリボヌクレオチド-デオキシリボヌクレオチド塩基対を有することは必要とされない）。また、アンチセンス鎖の種およびミスマッチ領域、並びにそれぞれの鎖のヌクレオチド位置の番号付けを示してある。下の薬剤の下線を引いたアンチセンス残基は、DsiRNA薬剤のセンス鎖と塩基対を形成するヌクレオチドを示すが、標的RNAとミスマッチを形成するように突出している。
【図４２Ａ】図42Aは、「右に拡張した」DsiRNA薬剤の例示的な構造を示す。大文字は、リボヌクレオチドを示す；小文字は、デオキシリボヌクレオチドを意味する；白三角形は、標的RNA内のAgo2切断部位に対応する上部鎖（ここではセンス鎖）の配列内の部位を示す；黒三角形は、Dicer切断の突出部位を示す；およびヌクレオチド位置の番号付けは、また示してある。
【図４２Ｂ】図42Bは、「右に拡張した」DsiRNA薬剤の例示的な構造を示す。大文字は、リボヌクレオチドを示す；小文字は、デオキシリボヌクレオチドを意味する；白三角形は、標的RNA内のAgo2切断部位に対応する上部鎖（ここではセンス鎖）の配列内の部位を示す；黒三角形は、Dicer切断の突出部位を示す；およびヌクレオチド位置の番号付けは、また示してある。
【図４２Ｃ】図42Cは、「右に拡張した」DsiRNA薬剤の例示的な構造を示す。大文字は、リボヌクレオチドを示す；小文字は、デオキシリボヌクレオチドを意味する；白三角形は、標的RNA内のAgo2切断部位に対応する上部鎖（ここではセンス鎖）の配列内の部位を示す；黒三角形は、Dicer切断の突出部位を示す；およびヌクレオチド位置の番号付けは、また示してある。
【図４３Ａ】図43Aは、「左に拡張した」DsiRNA薬剤の例示的な構造を示す。大文字は、リボヌクレオチドを示す；小文字は、デオキシリボヌクレオチドを意味する；白三角形は、標的RNA内のAgo2切断部位に対応する上部鎖（ここではセンス鎖）の配列内の部位を示す；黒三角形は、Dicer切断の突出部位を示す；およびヌクレオチド位置の番号付けは、また示してある。
【図４３Ｂ】図43Bは、「左に拡張した」DsiRNA薬剤の例示的な構造を示す。大文字は、リボヌクレオチドを示す；小文字は、デオキシリボヌクレオチドを意味する；白三角形は、標的RNA内のAgo2切断部位に対応する上部鎖（ここではセンス鎖）の配列内の部位を示す；黒三角形は、Dicer切断の突出部位を示す；およびヌクレオチド位置の番号付けは、また示してある。
【図４３Ｃ】図43Cは、「左に拡張した」DsiRNA薬剤の例示的な構造を示す。大文字は、リボヌクレオチドを示す；小文字は、デオキシリボヌクレオチドを意味する；白三角形は、標的RNA内のAgo2切断部位に対応する上部鎖（ここではセンス鎖）の配列内の部位を示す；黒三角形は、Dicer切断の突出部位を示す；およびヌクレオチド位置の番号付けは、また示してある。
【発明を実施するための形態】
【０１１９】
詳細な説明
本発明は、細胞における標的遺伝子の発現を減少させるのに有効な量の単離された二本鎖核酸（dsNA）と細胞を接触させることを含む、細胞における標的遺伝子の発現を減少させるための組成物および方法を提供する。本発明のdsNAsは、dsNA分子内のDicer酵素切断の部位に向けるようにデザインされたデオキシリボヌクレオチドのパターン（大部分の態様において、パターンは、少なくとも1つのデオキシリボヌクレオチド-デオキシリボヌクレオチド塩基対を含む）を有する。本発明のdsNA分子のデオキシリボヌクレオチドパターンは、Dicer切断を介して切除して、デオキシリボヌクレオチドパターン（たとえば、大部分の態様において、デオキシリボヌクレオチドパターンは、1つまたは複数のデオキシリボヌクレオチド-デオキシリボヌクレオチド塩基対を含む）をもはや含まない活性なsiRNA薬剤を産生することができるdsNAの領域内に位置する。驚くべきことに、本明細書において証明されるように、DNA：DNA拡張Dicer-基質siRNAs（DsiRNAs）は、対応するRNA：DNA-またはRNA：RNA拡張DsiRNAsよりも有効なRNA阻害性薬剤であった。
【０１２０】
DsiRNA薬剤の第1の鎖の5'末端および第2の鎖の対応する3'末端に位置するDNA：DNA拡張を含むDsiRNAs（第2の鎖は、RNAi薬剤（標的RNAに対するアンチセンス）のガイド鎖配列として役に立つ標的RNA配列の十分な領域に対して相補的である）は、有効な、および多くの例において増強された、阻害性薬剤であり続けたという発見は、また驚くべきであった。
【０１２１】
DNA拡張DsiRNA薬剤は、二重鎖長増大として有効性の減少を示さないという驚くべき発見は、このような二本鎖DNA拡張ドメインを含まない対応する長さのdsRNA薬剤と比較して、二重鎖長さの増加が有効なRNA阻害性薬剤のままであるDsiRNAsの産生を可能にし、一方で、たとえば、さらなる官能基に対するDsiRNAsの付着、安定化する修飾（たとえば、PS-NA部分）の包含／パターン構成またはさらなる官能性を付加することおよび／もしくはたとえば、このような薬剤の薬物動態学、薬力学もしくは体内分布を増強することができる修飾のその他の形態のためのより大きな空間を提供することができる。
【０１２２】
dsNA二重鎖を含むDsiRNAを長くし、一方で類似の長さのdsRNA二重鎖より高いレベルにてポスト-DicerプロセスsiRNA薬剤の活性を保持する新発見の能力によって提供される利点は、拡張DsiRNA薬剤の二本鎖DNA：DNA領域の全てのヌクレオチドの完全なホスホロチオアート（PS）修飾は、完全にサイレンシング活性を無くしたことを示す本明細書に示した結果（図2Aおよび2Bの二重鎖#8を参照されたい）によっ強調される。RNAサイレンシング活性における対応する減少を観察することないDsiRNA薬剤を拡張する能力により、たとえば、このような修飾されたヌクレオチドがこのような間隔が可能ではない（直列型の一連、たとえば、タンデムPSまたは2'-O-メチル修飾に存在するときに、一定の修飾と関連する阻害作用の点から見て）場合に達成することができるよりも、修飾されたなおもRNAサイレンシング活性を保持したままで単一の分子内により多くのヌクレオチドを包含させることができる。同様に、このようなDsiRNAを含む薬剤により長い二重鎖拡張を含むと共に、RNA阻害機能を保持する能力により、より密接な配置で存在するときにこのような官能基がRNAサイレンシング活性を妨げる能力のため他では可能性でないだろう、このような薬剤に一定の官能基を付着させることができる。
【０１２３】
定義
特に定義されない限り、本明細書において使用される全ての専門用語および科学用語は、本発明が属する当業者によって共通に理解される意味を有する。以下の言及は、本発明において使用される用語の多くの一般的な定義を当業者に提供する：Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994);The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988);The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991);and Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)。本明細書に使用される、以下の用語は、特に明記しない限り、以下のこれらに対して与えた意味を有する。
【０１２４】
本明細書に使用される、「核酸」という用語は、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドおよび一本鎖もしくは二本鎖の形態のその重合体をいう。本用語は、合成の、天然に存在する、および天然に存在しない、参照核酸と類似の結合特性を有し、並びに参照ヌクレオチドと類似の様式で代謝される、公知のヌクレオチド類似体、または修飾されたバックボーン残基もしくは結合を含む核酸を包含する。このような類似体の例は、ホスホロチオアート、ホスホロアミダート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、2-O-メチルリボヌクレオチド、ペプチド-核酸（PNA）を含むが、限定されない。
【０１２５】
本明細書に使用される「ヌクレオチド」は、天然の塩基（標準的）および当該技術分野において周知の修飾塩基をもつものを含むように、当該技術分野において認識されるように使用される。このような塩基は、一般にヌクレオチド糖部分の1'位に位置する。ヌクレオチドは、一般に塩基、糖およびホスフェート基を含む。ヌクレオチドは、糖、ホスフェートおよび／または塩基部分にて修飾されていないか、または修飾されていることができる（また、交換可能にヌクレオチド類似体、修飾ヌクレオチド、非自然のヌクレオチド、非標準ヌクレオチドおよびその他といわれる；をたとえば、UsmanおよびMcSwiggen、上記；Eckstein、et al., 国際PCT公開番号WO 92/07065；Usman et al、国際 PCT公開番号WO 93/15187；UhlmanおよびPeyman、上記を参照されたい、すべてが、本明細書において参照により本明細書に援用される）。Limbach., et al、Nucleic Acids Res. 22：2183、1994によって概説されるように、当該技術分野において公知の修飾された核酸塩基のいくつかの例がある。核酸分子に導入されることができる塩基修飾の非限定的な例のいくつかには、ヒポキサンチン、プリン、ピリジン-4-オン、ピリジン-2-オン、フェニル、プソイドウラシル、2,4,6-トリメトキシベンゼン、3-メチルウラシル、ジヒドロウリジン、ナフチル、アミノフェニルで、5-アルキルシチジン（たとえば、5-メチルシチジン）、5-アルキルウリジン（たとえば、リボチミジン）で、5-ハロウリジン（たとえば、5-ブロモウリジン）または6-アザピリミジンもしくは6-アルキルピリミジン（たとえば6-メチルウリジン）、プロピンおよびその他（Burgin、et al., Biochemistry 35：14090、1996；UhlmanおよびPeyman、上記）を含む。この側面おける「修飾塩基」は、1’位置におけるアデニン、グアニン、シトシンおよびウラシル以外のヌクレオチド塩基またはこれらの均等物を意味する。
【０１２６】
本明細書に使用される、「二本鎖核酸」または「dsNA」は、二重鎖を形成する2つのオリゴヌクレオチド鎖を含む分子である。dsNAは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、修飾されたヌクレオチドおよびその組み合わせを含んでいてもよい。本発明の二本鎖NAsは、RNA干渉経路におけるタンパク質およびタンパク質複合体、たとえばDicerおよびRISCのための基質である。本発明のdsNAの1つの形態の例示的な構造は、図1Aに示してあり、このような構造は、特徴的に、Dicer基質siRNA（DsiRNA）として機能することができる領域にRNA二重鎖および少なくとも1つのデオキシリボヌクレオチドを含むDNA二重鎖を含み、これは、DsiRNA／DNA薬剤の第1の鎖の突出したDicer切断部位の位置3'に位置し、かつDsiRNA／DNA薬剤の第2の鎖の突出したDicer切断部位の位置5'に位置する第2の鎖の同種のデオキシリボヌクレオチドと塩基対を形成する。代わりの態様において、本発明は、特徴的に、Dicer基質siRNA（DsiRNA）として機能することができる領域内にRNA二重鎖およびDsiRNA／DNA薬剤の第1の鎖の突出したDicer切断部位の位置5'にて位置し、かつDsiRNA／DNA薬剤の第2の鎖の突出したDicer切断部位の位置3'にて位置する第2の鎖の同種のデオキシリボヌクレオチドと塩基対を形成する少なくとも1つのデオキシリボヌクレオチドを含むDNA二重鎖（たとえば、図6の「左に拡張された」DsiRNA薬剤を参照されたい）を含む構造を提供する。
【０１２７】
一定の態様において、本発明のDsiRNAsは、突出したDicer酵素切断部位にすぐ隣接した部位にてデオキシリボヌクレオチド残基を有することができる。たとえば、図12において示した第2、第4および第6のDsiRNAsにおいて、デオキシリボヌクレオチドは、位置22（位置1として第1の鎖の5'末端残基にて始まる）および位置22の部位3'（たとえば、23、24、25、その他）にて見つけることができる。対応して、デオキシリボヌクレオチドは、また第1の鎖の位置20に相補的であるヌクレオチドにて始まる第2の鎖上に、更に、このヌクレオチドの5'方向において位置する第2の鎖上の位置にて見いだすことができる。したがって、本発明の一定の有効なDsiRNAsは、このようなDsiRNAsの第1の鎖、第2の鎖および／または両方の鎖内に、デオキシリボヌクレオチドの導入の開始の前に、19の二重リボヌクレオチドのみを有する。本発明のDsiRNAsの突出したDicer酵素切断部位とすぐ隣接するデオキシリボヌクレオチドの配置に関する前述の記載は、本発明の「右に拡張された」DsiRNAsを明確に想定するが、デオキシリボヌクレオチドの平行した配置は、本発明の「左に拡張された」DsiRNAs内で行うことができる（たとえば、デオキシリボヌクレオチドは、「左に拡張された」DsiRNAs内で突出したDicer酵素切断部位にすぐ隣接して配置することができる−たとえば、このような「左に拡張された」DsiRNAのセンス鎖上の最も5'の突出したDicer切断部位のセンス鎖上のすぐ5'および／またははこのような「左に拡張された」DsiRNAのアンチセンス鎖上の最も3'の突出したDicer切断部位のアンチセンス鎖上のすぐ3'）。
【０１２８】
本明細書に使用される、「二重鎖」は、2つの一本鎖核酸の相互作用によって形成される二重螺旋構造をいう。本発明によれば、二重鎖は、センスおよびアンチセンスであるか、または標的およびアンチセンスである第1および第2の鎖を含んでいてもよい。二重鎖は、典型的には、互いに関して逆平行の向きにされた2つの一本鎖核酸の間の対をなす塩基の水素結合、すなわち「塩基対形成」によって形成される。二重鎖における塩基対形成は、一般にワトソン‐クリック型塩基対によって生じ、たとえば、グアニン（G）は、DNAおよびRNAにおいてシトシン（C）と塩基対を形成し、アデニン（A）は、DNAにおけるチミン（T）と塩基対を形成し、かつアデニン（A）はRNAにおけるウラシル（U）と塩基対を形成する（したがって、グアニンデオキシリボヌクレオチドの同種のヌクレオチドは、シトシンデオキシリボヌクレオチドであり、かつ逆もまた同じである）。塩基対を形成することができる条件は、生理的または生物学的に関連した条件を含む（たとえば、細胞内：pH 7.2、140mMカリウムイオン；細胞外pH 7.4、145mMナトリウムイオン）。さらにまた、二重鎖は、隣接するヌクレオチド間のスタッキング相互作用によって安定化される。本明細書に使用される、二重鎖は、塩基対形成によって、もしくはスタッキング相互作用によって確立され、または維持されてもよい。二重鎖は、実質的に相補的または完全に相補的であろう2つの相補核酸鎖によって形成される（下記を参照されたい）。
【０１２９】
「相補的」または「相補性」は、核酸が従来のワトソン‐クリックまたはフーグスティーン型塩基対形成のいずれかによって、もう一つの核酸配列と水素結合を形成することができることを意味する。本開示の核酸分子に関して、その相補配列との、核酸分子のための結合自由エネルギーは、核酸の関連した機能、たとえば、RNAi活性を進行させることができるために十分である。核酸分子のための結合自由エネルギーの判定は、当該技術分野において周知である（たとえば、Turner, et al., CSH Symp. Quant. Biol. LII, pp. 123-133, 1987; Frier, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 83:9373-9377, 1986; Turner, et al., J. Am. Chem. Soc. 109:3783-3785, 1987を参照されたい）。パーセント相補性は、第2の核酸配列と水素結合（たとえば、ワトソン‐クリック型塩基対）を形成することができる核酸分子における隣接する残基の割合を示す（たとえば、第1のオリゴヌクレオチドにおける合計10ヌクレオチドのうちの5、6、7、8、9または10ヌクレオチドが10ヌクレオチドを有する第2の核酸配列と塩基対形成することは、それぞれ50%、、60%、70%、80%、90%および100%の相補を表す）。パーセント相補性が少なくとも一定の割合であることを決定するために、第2の核酸配列と水素結合（たとえば、ワトソン‐クリック型塩基対）を形成することができる核酸分子における隣接する残基の割合を算出し、最も近い整数に丸められる（たとえば、第1のオリゴヌクレオチドにおける合計23ヌクレオチドのうちの12、13、14、15、16または17ヌクレオチドが23ヌクレオチドを有する第2の核酸配列と塩基対形成することは、それぞれ52%、57%、61%、65%、70%および74%を示し；およびそれぞれ、少なくとも50%、50%、60%、60%、70%および70%の相補性を有する）。本明細書に使用される、「実質的に相補的な」とは、これらが生物学的条件下でハイブリダイズすることができるような鎖の間の相補性をいう。実質的に相補的な配列は、60%、70%、80%、90%、95%またはさらに100%の相補性を有する。加えて、2つの鎖がこれらのヌクレオチド配列を調べることによって生物学的条件下でハイブリダイズすることができるかどうかを決定する技術は、当該技術分野において周知である。
【０１３０】
本発明の薬剤の第1および第2の鎖（アンチセンスおよびセンスオリゴヌクレオチド）は、完全に相補的であることは必要とされない。一つの態様において、アンチセンス鎖のRNA配列は、1つまたは複数のミスマッチまたは塩基類似体で修飾されたヌクレオチドを含む。ある具体例では、このようなミスマッチは、アンチセンス鎖のRNA配列の3'領域内に（たとえば、標的RNA内の突出したArgonaute2（Ago2）切断部位の5'に位置する標的RNA配列に対して相補的であるアンチセンス鎖のRNA配列内に-たとえば、このようなミスマッチを含む領域の例示的な位置の例証については、図6を参照されたい）で生じる。一つの側面において、約2つのミスマッチまたは塩基類似体で修飾されたヌクレオチドは、標的RNA配列がハイブリダイズするときに、標的RNA配列の突出したAgo2切断部位のアンチセンス鎖の3'であるアンチセンス鎖のRNA配列内に組み込まれる。
【０１３１】
（特に、センスの3'末端残基／siRNAsのアンチセンス領域の5'末端残基にて、もしくは近くにおける）ミスマッチまたは減少した熱力学的安定性の使用は、RISC内へのアンチセンス鎖の移行を促進し、または好都合であることが提唱されており（Schwarz et al., 2003；Khvorova et al., 2003）、これは、おそらくRISCへのsiRNAの移行と共に生じるいくらかの律速巻戻しに影響を及ぼすことによる。したがって、活性な21mer siRNA二重鎖を選択するために、末端塩基組成が設計アルゴリズムに含まれてきた（Ui-Tei et al., 2004；Reynolds et al., 2004）。
【０１３２】
一定の態様において、ミスマッチ（または塩基類似体で修飾されたヌクレオチド）は、Dicer切断に続いて形成されるように突出したsiRNAのセンス鎖の予測される3'末端にて、もしくは近くで、親DsiRNA（任意に右または左に拡張されたDsiRNA薬剤）内に位置することができる。このような態様において、ミスマッチ（群）を含む小さな末端配列は、アンチセンス鎖（3'-オーバーハングの部分となる）と対不形成のままにされるか、または最終的な21mer siRNAから完全に切断されるだろう。このような態様において、元の（非dicerプロセス）薬剤におけるミスマッチは、RISCの最終的なRNA成分においてミスマッチとして残ることはない。Dicer基質のセンス鎖の3'末端におけるセグメントの塩基ミスマッチまたは不安定化は、おそらくDicerによるプロセシングを促進することによって、RNAiにおける合成の鎖の能力を改善したことが分かっている（Collingwood et al., 2008）。
【０１３３】
一部の態様において、1つまたは複数のミスマッチは、標的mRNA内の予測されるAgo2切断部位の5’に位置する標的mRNAの領域とハイブリダイズするDsiRNA薬剤のアンチセンス鎖の領域内の位置にて本発明のDsiRNA薬剤（任意に右または左に拡張されたDsiRNA薬剤）内に位置する（たとえば、図7の薬剤内のミスマッチの位置を参照されたい）。任意に、2つ以上のミスマッチは、標的RNAの突出したAgo2切断部位の5’に位置する標的RNAの配列にハイブリダイズするこの相対的にアンチセンス鎖の3'領域内の本発明の右または左に拡張されたDsiRNA薬剤内に位置する（標的RNA切断が生じた）。本発明のDsiRNA薬剤内のこのようなミスマッチの包含により、このような薬剤が天然に存在するmiRNAのものに似ている阻害作用を及ぼすことができ、任意に天然に存在するmiRNA標的RNAに対してだけでなく（たとえば、標的転写物の3'UTR領域）、天然に存在するアンタゴニストmiRNAが存在することが知られていないRNA配列に対しても向けることができる。たとえば、miRNAに似ている、および／またはmiRNAとして機能ようにデザインされているミスマッチ塩基対を有する本発明のDsiRNAsは、天然に存在するmiRNAによってターゲットされないかもしれない遺伝子／転写物内の繰返し配列をターゲットするように合成することができる（たとえば、ノッチタンパク質内のリピート配列をターゲットすることができ、この場合、ノッチ内の個々のリピートは、核酸レベルにて互いに異なることができる（たとえば、縮重である）が、miRNA機構を介して効率的にターゲットすることができ、これはミスマッチ（群）を可能にし、さらまた、対応する、完璧なマッチsiRNA薬剤よりも不特定な阻害作用を可能とする）。このような態様において、標的RNA切断は、ミスマッチを含むDsiRNA薬剤が阻害作用を及ぼすために必要であっても、またはなくてもよい。
【０１３４】
一つの態様において、本発明の二本鎖核酸分子は、マイクロRNA（miRNA）を含む、またはとして機能する。「マイクロRNA」または「miRNA」とは、mRNA切断、翻訳の抑制／阻害または異質染色性サイレンシングのいずれかによって標的メッセンジャーRNAの発現を調節する小さな二本鎖のRNAを意味する。（たとえばAmbros, 2004, Nature, 431, 350-355; Bartel, 2004, Cell, 116, 281-297; Cullen, 2004, Virus Research., 102, 3-9; He et al., 2004, Nat. Rev. Genet., 5, 522-531; and Ying et al., 2004, Gene, 342, 25-28を参照されたい）。一つの態様において、本発明のマイクロRNAは、センス鎖（たとえば、第1の鎖）もしくはセンス領域とアンチセンス鎖（たとえば、第2の鎖）もしくはmiRNA分子のアンチセンス領域との間またはアンチセンス鎖もしくはmiRNAのアンチセンス領域と対応する標的核酸分子（たとえば、標的mRNA）との間に部分的な相補性（すなわち、100%未満の相補性）を有する。たとえば、部分的な相補性は、二本鎖核酸分子構造内に種々のミスマッチまたは非塩基対ヌクレオチド（たとえば、1、2、3、4、5もしくはより多くのミスマッチまたはヌクレオチドバルジなどの非基対形成ヌクレオチド）を含むことができ、これは、バルジ、ループまたはオーバーハングを生じて、センス鎖もしくはセンス領域とmiRNAのアンチセンス鎖もしくはアンチセンス領域との間またはmiRNAのアンチセンス鎖もしくはアンチセンス領域と対応する標的核酸分子との間に生じる。
【０１３５】
多数の塩基にわたって塩基対を形成する一本鎖の核酸は、「ハイブリダイズする」と言われる。ハイブリダイゼーションは、典型的には生理的または生物学的に関連した条件下（たとえば、細胞内：pH 7.2、140mMカリウムイオン；細胞外pH 7.4、145mMナトリウムイオン）で決定される。ハイブリダイゼーション条件は、一般に単価カチオンおよび生物学的に許容される緩衝液を含み、および二価カチオン、錯体アニオン、たとえばグルコン酸カリウムからのグルコナート、スクロースなどの非荷電化学種および試料における水の活性を減少させる不活性な重合体、たとえばPEGを含んでいても、または含まなくてもよい。このような条件は、塩基対を形成することができる条件を含む。
【０１３６】
ハイブリダイゼーションは、二重鎖を形成する一本鎖核酸を解離させるために必要とされる温度、すなわち（融解温度；Tm）によって測定される。ハイブリダイゼーション条件は、また、塩基対を形成することができる条件である。種々のストリンジェンシーの条件を、ハイブリダイゼーションを決定するために使用することができる（たとえば、Wahl, G. M. and S. L. Berger (1987) Methods Enzymol. 152: 399; Kimmel, A. R. (1987) Methods Enzymol. 152: 507を参照されたい）。ストリンジェントな温度条件は、通常少なくとも約30℃、より好ましくは、少なくとも約37℃および最も好ましくは少なくとも約42℃の温度を含むだろう。長さが50未満の塩基対であることが予想されるハイブリッドのためのハイブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの融解温度（Tm）よりも5〜10℃低いべきであり、Tmは、以下の方程式にしたがって決定される。長さが18塩基対未満のハイブリッドについては、Tm（℃）=2（A+T塩基の#）+4（G+C塩基の#）。長さが18〜49塩基対の間のハイブリッドについては、Tm（℃）=81.5+16.6（log 10［Na+］）+0.41（% G+C）-（600／N）、式中Nは、ハイブリッドにおける塩基の数であり、および［Na+］は、ハイブリダイゼーション緩衝液におけるナトリウムイオンの濃度（1×SSCについての［Na+］=0.165 M）である。たとえば、ハイブリダイゼーション決定緩衝液は、表1に示してある。
【０１３７】
【表１】
0005855463.tif 000002
【０１３８】
ハイブリダイゼーション条件上の有用なバリエーションは、当業者に容易に明らかだろう。ハイブリダイゼーション技術は、当業者に周知であり、たとえば、Benton and Davis (Science 196:180, 1977); Grunstein and Hogness (Proc. Natl. Acad. Sci., USA 72:3961, 1975); Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, New York, 2001); Berger and Kimmel (Antisense to Molecular Cloning Techniques, 1987, Academic Press, New York); and Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkにおいて記述されている。
【０１３９】
本明細書に使用される、「オリゴヌクレオチド鎖」は、一本鎖核酸分子である。オリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、修飾されたヌクレオチド（たとえば、2'修飾、をもつヌクレオチド合成塩基類似体、その他）またはその組み合わせを含んでいてもよい。このような修飾されたオリゴヌクレオチドは、たとえば細胞の取り込みの増強およびヌクレアーゼの存在下における安定性の増加などの特性のため、天然の形態以上に好ましいであろう。
【０１４０】
本発明の一定のdsNAsは、キメラdsNAsである。「キメラdsNAs」または「キメラ」は、本発明の状況において、それぞれが少なくとも1つのヌクレオチドで構成される2つ以上の化学的に異なる領域を含むdsNAsである。これらのdsNAsは、典型的には、主にDicer基質siRNA（「DsiRNA」）分子を形成するリボヌクレオチド（任意に、修飾されたリボヌクレオチドを含む）を含む少なくとも1つの領域を含む。このDsiRNA領域は、1つまたは複数の有益な特性（たとえば、増加した有効性、たとえば、増加した能力および／またはDsiRNA活性の期間、認識ドメインまたは特異的位置にキメラdsNAをターゲットする手段としての機能、たとえば、培養において細胞に、または被験体に投与されたとき、官能基、ペイロード、検出／検出可能部分の付着の改善のための拡張領域として機能すること、より望ましい修飾および／またはこのような修飾の間隔の改善を可能にする拡張領域として機能する、その他など）を与える塩基対形成したデオキシリボヌクレオチド（「dsDNA領域」）を含む第2の領域に共有結合で付着される。塩基対形成したデオキシリボヌクレオチドを含むこの第2の領域は、また修飾された、もしくは合成のヌクレオチドおよび／または修飾された、または合成のデオキシリボヌクレオチドを含んでいてもよい。
【０１４１】
本明細書に使用される、「リボヌクレオチド」という用語は、自然の、および合成の、修飾されていない、および修飾されたリボヌクレオチドを包含する。修飾は、糖部分に、塩基部分に、および／またはオリゴヌクレオチドにおけるリボヌクレオチド間の結合に対する変更を含む。本明細書に使用される「リボヌクレオチド」という用語は、特に、2’リボース環に単一のプロトン基を有するヌクレオチドデオキシリボヌクレオチドを除外する。
【０１４２】
本明細書に使用される、「デオキシリボヌクレオチド」という用語は、自然の、および合成の、修飾されていない、および修飾されたデオキシリボヌクレオチドを包含する。修飾は、糖部分に、塩基部分に、および／またはオリゴヌクレオチドにおけるデオキシリボヌクレオチド間の結合に対する変更を含む。本明細書に使用される、また「デオキシリボヌクレオチド」という用語は、dsNA薬剤のDicer切断を可能にしない修飾されたリボヌクレオチド、たとえば、2'-O-メチルリボヌクレオチド、ホスホロチオアート修飾されたリボヌクレオチド残基、その他を含み、これらは、このような残基の結合にてDicer切断を生じるさせることができない。
【０１４３】
本明細書に使用される、「PS-NA」という用語は、ホスホロチオアート修飾されたヌクレオチド残基をいう。したがって、「PS-NA」という用語は、ホスホロチオアート修飾リボヌクレオチド（「PS-RNA」）およびホスホロチオアート修飾デオキシリボヌクレオチド（「PS-DNA」）を包含する。
【０１４４】
一定の態様において、本発明のキメラDsiRNA／DNA薬剤は、その中の全てのヌクレオチドの少なくとも50%が修飾されていないリボヌクレオチドである、長さが少なくとも23ヌクレオチドの少なくとも1つの二重鎖領域を含む。本明細書に使用される、「修飾されていないリボヌクレオチド」という用語は、リボース糖の2’位置にてヒドロキシル（-OH）基を有するリボヌクレオチドをいう。
【０１４５】
一定の態様に存在する発明のキメラDsiRNA／DNA薬剤は、、長さが少なくとも2塩基対ヌクレオチドの長さを有し、長さが少なくとも2つの塩基対ヌクレオチドのこの領域内の全てのヌクレオチドの少なくとも50%は、修飾されていないデオキシリボヌクレオチドである、第1の鎖上の突出したDicer切断部位の3'および第2の鎖上の突出したDicer切断部位の5'に位置する、少なくとも1つの領域を含む。本明細書に使用される、「修飾されていないデオキシリボヌクレオチド」という用語は、リボース糖の2’位置にて単一のプロトンを有するリボヌクレオチドをいう。
【０１４６】
本明細書に使用される、「アンチセンス鎖」は、標的RNAのものに対して相補的な配列を有する一本鎖核酸分子をいう。アンチセンス鎖が塩基類似体での修飾ヌクレオチドを含むとき、それは、必ずしもその全ての長さにわたって相補的であると必要はないが、少なくとも標的RNAとハイブリダイズしなければならない。
【０１４７】
本明細書に使用される、「センス鎖」は、アンチセンス鎖のものに対して相補的な配列を有する一本鎖核酸分子をいう。アンチセンス鎖が塩基類似体での修飾ヌクレオチドを含むとき、センス鎖は、アンチセンス鎖の全ての長さにわたって相補的である必要はないが、ア少なくともンチセンス鎖と二重鎖形成しなければならない。
【０１４８】
本明細書に使用される、「ガイド鎖」は、RNA干渉を生じるように標的RNAのものと十分に相補的な配列を有する、dsRNAまたはdsRNA含有分子の一本鎖核酸分子をいう。DicerによるdsRNAまたはdsRNA含有分子の切断の後、ガイド鎖の断片は、RISCと会合したままで、RISC複合体の成分として標的RNAに結合し、およびRISCによる標的RNAの切断を促進する。本明細書に使用されるガイド鎖は、必ずしも連続的な一本鎖核酸にをいうというわけではなく、好ましくはDicerによって切断される部位にて不連続を含んでいてもよい。ガイド鎖は、アンチセンス鎖である。
【０１４９】
本明細書に使用される、「標的RNA」は、ターゲットされた切断または立体化学的妨害物などのアンチセンス鎖によって導かれる調整を受けるであろうRNAをいう。標的RNAは、たとえばゲノムウイルスRNA、mRNA、前mRNAまたは非コードRNAであることができる。好ましい標的は、ApoB、Bcl2、Hif-lalpha、SurvivinまたはHa. ras、KrasもしくはN-rasなどのp21 rasなどの、疾患関連タンパク質をコードするmRNAなどの、mRNAである。
【０１５０】
本明細書に使用される、「パッセンジャー鎖」は、ガイド鎖のものに対して相補的である配列を有するdsRNAまたはdsRNA含有分子のオリゴヌクレオチド鎖をいう。本明細書に使用される、パッセンジャー鎖は、必ずしも連続的な一本鎖核酸をいうというわけではなく、好ましくはDicerによって切断される部位にて不連続を含んでいてもよい。パッセンジャー鎖は、センス鎖である。
【０１５１】
本明細書に使用される「Dicer」は、dsRNAまたはdsRNA含有分子、たとえば、二本鎖RNA（dsRNA）またはプレ-マイクロRNA（miRNA））を、通常3'末端に2塩基オーバーハングをもつ約19〜25ヌクレオチド長の二本鎖核酸断片に切断するRNase IIIファミリーのエンドリボヌクレアーゼをいう。本発明のdsNAsに関して、本発明のdsNAのdsRNA領域によって形成される二重鎖は、Dicerによって認識され、かつ二重鎖の少なくとも1つの鎖においてDicer基質である。Dicerは、RNA干渉経路における第1の工程を触媒し、結果的に標的RNAの分解を生じる。ヒトDicerのタンパク質配列は、参照により本明細書に援用されるアクセッション番号NP_085124の下でNCBIデータベースにて提供される。
【０１５２】
Dicer「切断」は、以下の通りに決定される（たとえば、Collingwood et al., Oligonucleotides 18：187-200（2008）を参照されたい）。Dicer切断アッセイにおいて、RNA二重鎖（100pmol）を20μLの20mM Tris pH 8.0、200mM NaCl、2.5mM MgCl2中で、組換えヒトDicer（Stratagene、La Jolla、CA）の1単位の有無において、37℃にて18〜24時間インキュベートする。試料をPerforma SR 96ウェルプレート（Edge Biosystems、Gaithersburg、MD）を使用して脱塩する。Dicerでの二重鎖RNAの前処置および後処理のエレクトロスプレー-イオン化液体のクロマトグラフィー質量分光法（ESI-LCMS）は、ThermoFinnigan TSQ7000、Xcaliburデータシステム、ProMassデータ処理ソフトウェアおよびParadigm MS4 HPLC（Michrom BioResources、Auburn、CA）からなるOligo HTCSシステムを使用してなされる（Novatia、Princeton、NJ；Hail et al., 2004）。このアッセイにおいて、Dicer切断は、Dicer基質dsRNAの少なくとも5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%またはさらに100%（すなわち、本明細書において記述したように任意に拡張された、25〜35bp dsRNA、好ましくは26〜30bp dsRNA）がより短いdsRNA（たとえば、19〜23bp dsRNA、好ましくは21〜23 bp dsRNA）に切断される場合に生じる。
【０１５３】
本明細書に使用される、「Dicer切断部位」は、DicerがdsRNAを切断する部位（たとえば、本発明のdsNAのdsRNA領域）をいう。Dicerは、典型的にはdsRNAのセンスおよびアンチセンス鎖を切断する2つのRNase IIIドメインを含む。RNase IIIドメインとPAZドメインとの間の平均距離は、それが生じる短い二本鎖核酸断片の長さを決定し、かつこの距離は、変更することができる（Macrae I, et al. (2006). "Structural basis for double-stranded RNA processing by Dicer". Science 311 (5758): 195-8.）。図1Aに示したように、Dicerは、アンチセンス鎖の3'末端から除去される21と22番目のヌクレオチド間の部位にて、およびセンス鎖の5'末端から除去される21と22番目のヌクレオチド間の対応する部位にて、2ヌクレオチド3'オーバーハングを有するアンチセンス鎖を有する本発明の一定の二本鎖核酸を切断するように突出している。図1Aにおいて示したものとは異なるdsNA分子についての突出した、および／または般に行なわれるDicer切断部位は、Macrae et al.において記述したものを含む、当該技術分野で認識される方法を介して同じように同定してもよい。図1Aにおいて示したDicer切断イベントは、21ヌクレオチドsiRNAを生じるが、dsNA（たとえば、DsiRNA）のDicer切断は、長さが19〜23ヌクレオチドのDicerでプロセスされたsiRNA長さの生成を生じ得ることに留意されたい。実際に、後で更に詳細に記述される本発明の一つの側面において、二本鎖DNA領域は、典型的には好ましくない19mer siRNAの一般に行なわれるDicer切除を指揮する目的のためにdsNA内に含まれる。
【０１５４】
本明細書に使用される「オーバーハング」は、dsNAの5’末端または3’末端のいずれかにて2または4つの遊離末端を有する二重鎖の状況において、不対のヌクレオチドをいう。一定の態様において、オーバーハングは、アンチセンス鎖またはセンス鎖上の3'または5'オーバーハングである。
【０１５５】
本明細書に使用される、「標的」は、発現または活性が調整される任意の核酸配列をいう。詳細な態様において、標的は、RISC複合体においてアンチセンス鎖である一本鎖核酸に対して二重鎖を形成するRNAをいう。アンチセンス鎖に対する標的RNAのハイブリダイゼーションにより、RISC複合体によるプロセシングを生じる。結果的に、RNAまたはRNA、たとえばmRNAによってコードされるタンパク質の発現が減少される。
【０１５６】
本明細書に使用される、「RNAプロセシング」という用語は、後で更に詳細に記述される（以下の「RNAプロセシング」の節を参照されたい）、siRNA、miRNAまたはRNase H経路の成分（たとえば、Drosha、Dicer、Argonaute2またはその他のRISCエンドリボヌクレアーゼ）およびRNaseH）によって行われるプロセシング活性をいう。本用語は、RNAの5'キャッピングおよび非RISCまたは非RNase Hによって媒介されるプロセスを経たRNAの分解の転写後のプロセスから明確に区別される。RNAのこのような「分解」は、いくつかの形態、たとえば脱アデニル化（3’ポリ（A）テールの除去）および／またはいくつかのエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼ（たとえば、RNase III、RNase P、RNase T1、RNase A（1、2、3、4／5）、オリゴヌクレオチダーゼ、その他）のいずれかによるRNAの本体の一部または全体のヌクレアーゼ分解）をとり得る。
【０１５７】
本明細書に使用される、「参照」は、標準または対照を意味する。当業者にとって明らかであるように、適切な参照は、1つのエレメントだけが1つのエレメントの効果を決定するために変化される場合である。
【０１５８】
本明細書に使用される、「修飾ヌクレオチド」は、ヌクレオシド、核酸塩基、ペントース環またはホスフェート基に対する1つまたは複数の修飾を有するヌクレオチドをいう。たとえば、修飾ヌクレオチドは、アデノシン一リン酸、グアノシン一リン酸、ウリジンリン酸およびシチジン一リン酸を含むリボヌクレオチド、並びにデオキシアデノシンモノホスフェート、デオキシグアノシンモノホスフェート、デオキシチミジンモノホスフェートおよびデオキシシチジンモノホスフェートを含むデオキシリボヌクレオチドを除外する。修飾は、メチルトランスフェラーゼなどのヌクレオチドを修飾する酵素による修飾によって生じる天然に存在するものを含む。修飾ヌクレオチドは、また合成の、または天然に存在しないヌクレオチドを含む。ヌクレオチドにおける合成の、または天然に存在しない修飾は、2'修飾、たとえば、2'-メトキシエトキシ、2'-フルオロ、2'-アリル、2'-O-［2-（メチルアミノ）-2-オキソエチル］、4'-チオ、4'-CH2-O-2'-ブリッジ、4'-（CH2）2-O-2'-ブリッジ、2'-LNAおよび2'-O-（N-メチルカルバミン酸塩）または塩基類似体を含むものを含む。本開示のために記述される2'修飾ヌクレオチドに関連して、「アミノ」は、修飾することができる、または修飾されていなことができる2'-NH2または2'-O-NH2を意味する。このような修飾された基は、たとえば、Eckstein et al.,米国特許第5,672,695号およびMatulic-Adamic et al.,米国特許第6,248,878号に記述される。
【０１５９】
「インビトロで」という用語は、たとえば、精製された試薬または抽出物、たとえば細胞抽出物を含むその技術分野で認識される手段を有する。「インビボ」という用語は、また、たとえば、生細胞、たとえば、不死化された細胞、一次細胞、株化細胞および／または微生物における細胞を含むその技術分野で認識される手段を有する。
【０１６０】
本開示の核酸分子に関して、修飾は、dsNA鎖上においてパターンで存在してもよい。本明細書に使用される、「交互の位置」は、1つおきのヌクレオチドが修飾されたヌクレオチドであるか、またはdsNA鎖の定義された長にわたって全ての修飾されたヌクレオチドの間で、修飾されていないヌクレオチド（たとえば、修飾されていないリボヌクレオチド）があるパターンをいう。（たとえば、5'-MNMNMN-3’；3'-MNMNMN-5'；式中、Mは、修飾されたヌクレオチドであり、かつNは、修飾されていないヌクレオチドである）。修飾パターンは、本明細書において記述した位置番号づけ慣例のいずれかにしたがって5'または3'末端のいずれかにて第1のヌクレオチド位置から始まる（一定の態様において、位置1は、本発明のDsiRNA薬剤の突出したDicer切断イベント後の鎖の末端残基に関して命名され；したがって、位置1は、本発明のプレプロセス薬剤の3'末端または5'末端残基を必ずしも構成しない）。交互の位置における修飾ヌクレオチドのパターンは、鎖の全長にわたってもよいが、一定の態様において、それぞれ、少なくとも2、3、4、5、6または7つの修飾されたヌクレオチドを含む、少なくとも4、6、8、10、12、14ヌクレオチドを含む。本明細書に使用される、「交互の位置」は、2つの連続した修飾されたヌクレオチドがdsNA鎖の定義された長さにわたって2つの連続した修飾されていないヌクレオチドによって分離されるパターンをいう。（たとえば、5'-MMNNMMNNMMNN-3’；3'-MMNNMMNNMMNN-5'；式中、Mは、修飾されたヌクレオチドであり、かつNは、修飾されていないヌクレオチドである）。修飾パターンは、本明細書において記述した位置番号づけ慣例のいずれかにしたがって5'または3'末端のいずれかにて第1のヌクレオチド位置から始まる。交互位置における修飾ヌクレオチドのパターンは、鎖の全長にわっていてもよいが、好ましくは、それぞれ、少なくとも4、6、8、10、12または14修飾されたヌクレオチドを含む、少なくとも8、12、16、20、24、28ヌクレオチドを含む。上記の修飾パターンは、例示的であり、本発明の範囲に対する制限として意図されないことが強調される。
【０１６１】
本明細書に使用される、「塩基類似体」は、核酸二重鎖に組み込むことができる修飾されたヌクレオチドにおけるヌクレオチド糖部分の1’位置（または核酸二重鎖に組み込むことができるヌクレオチド糖部分置換における同等の位置）に位置する複素環式部分をいう。本発明のdsNAsにおいて、塩基類似体は、一般に、共通の塩基グアニン（G）、シトシン（C）、アデニン（A）、チミン（T）およびウラシル（U）を除くプリンまたはピリミジン塩基のいずれかである。塩基類似体は、dsRNAにおけるその他の塩基または塩基類似体と二重鎖形成することができる。塩基類似体は、本発明の化合物および方法において有用なもの、たとえば、Bennerに対する米国特許第5,432,272号および第6,001,983号、並びにManoharanに対する米国特許公開番号20080213891に開示されたものを含み、これらは、本明細書において参照により援用される。塩基の非限定的な例は、ヒポキサンチン（I）（キサンチン（X）、3β-D-リボフラノシル-（2,6-ジアミノピリミジン）（K）、3-β-D-リボフラノシル-（1-メチルピラゾロ［4,3-d］ピリミジン-5,7（4H,6H）-ジオン）（P）、イソシトシン（イソC）、イソグアニン（イソG）、1-β-D-リボフラノシル-（5-ニトロインドール）、1-β-D-リボフラノシル-（3-ニトロピロール）、5-ブロモウラシル、2-アミノプリン、4-チオ-dT、7-（2-チエニル）-イミダゾ［4,5-b］ピリジン（Ds）およびピロール-2-カルバルデヒド（Pa））2-アミノ-6-（2-チエニル）プリン（S）、2-オキソピリジン（Y）、ジフルオロトリル、4-フルオロ-6-メチルベンズイミダゾール、4-メチルベンズイミダゾール、3-メチルイソカルボスチリリル、5-メチルイソカルボスチリリルおよび3-メチル-7-プロピニルイソカルボスチリリル（7-アザインドリル）を含むアザ6-メチル-7-インドリル、イミジゾピリジニル、9-メチル-イミジゾピリジニル、ピロロピリジニル、イソカルボスチリリル、7-プロピニルイソカルボスチリリル、アザプロピニル-7-インドリル、2,4,5-トリメチルフェニル、4-メチルインドリル、ジメチル4,6-インドリル、フェニル、ナフタレニル、アントラセニル、フェナントラセニル、ピレニル、スチリベンジル、テトラセニル、ペンタセニル、およびこれらの構造的誘導体（Schweitzer et al., J. Org. Chem., 59:7238-7242 (1994); Berger et al., Nucleic Acids Research, 28(15):2911-2914 (2000); Moran et al., J. Am. Chem. Soc., 119:2056-2057 (1997); Morales et al., J. Am. Chem. Soc., 121:2323-2324 (1999); Guckian et al., J. Am. Chem. Soc., 118:8182-8183 (1996); Morales et al., J. Am. Chem. Soc., 122(6):1001-1007 (2000); McMinn et al., J. Am. Chem. Soc., 121:11585-11586 (1999); Guckian et al., J. Org. Chem., 63:9652-9656 (1998); Moran et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 94:10506-10511 (1997); Das et al., J. Chem. Soc., Perkin Trans., 1:197-206 (2002); Shibata et al., J. Chem. Soc., Perkin Trans., 1: 1605-1611 (2001); Wu et al., J. Am. Chem. Soc., 122(32):7621-7632 (2000); O'Neill et al., J. Org. Chem., 67:5869-5875 (2002); Chaudhuri et al., J. Am. Chem. Soc., 117:10434-10442 (1995); and U.S. Pat. No. 6,218,108.）。塩基類似体は、またユニバーサル塩基でもよい。
【０１６２】
本明細書に使用される、「ユニバーサル塩基」は、核酸二重鎖に存在するときに、二重螺旋構造（たとえば、ホスフェートバックボーンの構造）を変化させることのなく複数の塩基のタイプの反対側に位置することができる、修飾されたヌクレオチドにおけるヌクレオチド糖部分の1’位置またはヌクレオチド糖部分置換における同等の位置に位置する複素環式部分をいう。加えて、ユニバーサル塩基は、それが標的核酸に対する二重鎖にある一本鎖核酸においてその能力を破壊しない。ユニバーサル塩基を含む一本鎖核酸が標的核に二重鎖形成する能力は、当業者に明らかな方法（たとえば、UV吸光度、円偏光二色性、ゲルシフト、一本鎖ヌクレアーゼ感受性、その他）によってアッセイすることができる。加えて、二重鎖形成が観察される条件、たとえば、融解温度（Tm）は、核酸二重鎖の安定性と相関するので、温度を、二重鎖安定性または形成を決定するために変化させてもよい。標的核酸に対して正確に相補的である参照一本鎖核酸と比較して、ユニバーサル塩基を含む一本鎖核酸は、相補核酸で形成される二重鎖よりも低いTmを有する標的核酸と二重鎖を形成する。しかし、ユニバーサル塩基が単一のミスマッチを生じるように塩基で置換された参照一本鎖核酸と比較して、ユニバーサル塩基を含む一本鎖核酸は、ミスマッチの塩基を有する核酸と形成される二重鎖よりも高いTmを有する標的核酸よ二重鎖を形成する。
【０１６３】
いくつかのユニバーサル塩基は、塩基対形成条件下で、ユニバーサル塩基と塩基グアニン（G）、シトシン（C）、アデニン（A）、チミン（T）およびウラシル（U）のすべてとの間で水素結合を形成することによって塩基対形成することができる。ユニバーサル塩基は、1つの単一の相補塩基だけと塩基対を形成する塩基ではない。二重鎖において、ユニバーサル塩基は、二重鎖の反対側の鎖上の、それと反対側のG、C、A、TおよびUのそれぞれと、水素結合なし、1つの水素結合または複数の水素結合を形成してもよい。好ましくは、ユニバーサル塩基は、特性は、二重鎖の反対側の鎖上のそれと反対側の塩基と相互作用する。二重鎖において、ユニバーサル塩基間の塩基対形成は、ホスフェートバックボーンの二重螺旋構造を変化させずに生じる。ユニバーサル塩基は、またスタッキング相互作用によって同じ核酸鎖上の隣接するヌクレオチドの塩基と相互作用してもよい。このようなスタッキング相互作用は、特にユニバーサル塩基が二重鎖の逆の鎖上のそれと反対側に位置する塩基と任意の水素結合を形成しない状況において、二重鎖を安定化する。ユニバーサル結合ヌクレオチドの非限定的な例は、イノシン、1-β-D-リボフラノシル-5-ニトロインドールおよび／または1-β-D-リボフラノシル-3-ニトロピロールを含む（Quay et al.に対する米国特許出願公開番号20070254362；Van Aerschot et al., An acyclic 5-nitroindazole nucleoside analogue as ambiguous nucleoside.  Nucleic Acids Res. 1995 Nov 11; 23 (21):4363-70; Loakes et al., 3-Nitropyrrole and 5-nitroindole as universal bases in primers for DNA sequencing and PCR.  Nucleic Acids Res. 1995 Jul 11;23(13):2361-6; Loakes and Brown, 5-Nitroindole as an universal base analogue.  Nucleic Acids Res. 1994 Oct 11;22(20):4039-43）。
【０１６４】
本明細書に使用される、「ループ」は、特定の一本鎖ヌクレオチド領域に隣接する相補領域が、相補領域間の一本鎖ヌクレオチド領域が二重鎖形成またはワトソン‐クリック型塩基対から除外される方法でハイブリダイズする、核酸の単一鎖によって形成される構造をいう。ループは、任意の長さの一本鎖ヌクレオチド領域である。ループの例は、ヘアピン、ステムループまたは拡張されたループなどの構造に存在する不対ヌクレオチドを含む。
【０１６５】
本明細書に使用される、dsRNAの状況における「拡張ループ」は、一本鎖ループおよび加えてループに隣接する1、2、3、4、5、6または20までの塩基対または二重鎖をいう。拡張されたループにおいて、5'側でループに隣接するヌクレオチドは、3'側でループに隣接するヌクレオチドと二重鎖形成する。拡張されたループは、ヘアピンまたはステムループを形成してもよい。
【０１６６】
本明細書に使用される、dsRNAの状況における「テトラループ」は、隣接するワトソン-クリックハイブリダイズしたヌクレオチドの安定性に寄与する安定な二次構造を形成する4つのヌクレオチドからなるループ（一本鎖領域）をいう。理論に限定されないが、テトラループは、スタッキング相互作用によって隣接するワトソン-クリック塩基対を安定化し得る。加えて、テトラループにおける4ヌクレオチド内の相互作用は、非ワトソン‐クリック型塩基対、スタッキング相互作用、水素結合および接触相互作用を含むが、限定されない（Cheong et al., Nature 1990 Aug 16;346(6285):680-2; Heus and Pardi, Science 1991 Jul 12;253(5016):191-4）。テトラループは、4つのランダムな塩基からなる単純なモデルループ配列から予想されるよりも高い、隣接する二重鎖の融解温度（Tm）の増大を与える。たとえば、テトラループは、長さが少なくとも2塩基対の二重鎖を含むヘアピンに対して、10mM NaHPO4において少なくとも55℃の融解温度を与えることができる。テトラループは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、修飾されたヌクレオチドおよびその組み合わせを含んでいてもよい。RNAテトラループの例は、テトラループのUNCGファミリー（たとえば、UUCG）、テトラループのGNRAファミリー（たとえば、GAAA）およびCUUGテトラループを含む。（Woese et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1990 Nov;87(21):8467-71; Antao et al., Nucleic Acids Res. 1991 Nov 11;19(21):5901-5）。DNAテトラループの例は、テトラループのd（GNNA）ファミリー（たとえば、d（GTTA）、テトラループのd（GNRA））ファミリー、テトラループのd（GNAB）ファミリー、テトラループのd（CNNG）ファミリー、テトラループのd（TNCG）ファミリー（たとえば、d（TTCG））を含む。（Nakano et al. Biochemistry, 41 (48), 14281 -14292, 2002.; SHINJI et al. Nippon Kagakkai Koen Yokoshu VOL.78th; NO.2; PAGE.731 (2000).）。
【０１６７】
本明細書に使用される、「増加する」または「増強する」とは、アッセイにおいて参照と比較して少なくとも5%までポジティブに変化させることを意味する。変化は、アッセイにおいて参照と比較して5%、10%、25%、30%、50%、75%またはさらに100%までであってもよい。「Dicer切断を増強する」とは、DicerによるdsRNAまたはdsRNA含有分子の量のプロセシングにより、より多くのDicer切断されたdsRNA産物を生成し、Dicer切断反応は、この開示のインビボの、またはインビトロでのアッセイにおける同じ量の参照dsRNAまたはdsRNA含有分子のプロセシングと比較してより急速に生じるか、またはDicer切断が（たとえば、本明細書において記述したDNA残基の包含によって）dsNA内の特異的な、好ましい部位にて切断するように、および／もしくはより高く優勢に切断産物の好ましい集団を産生するように、向けられることが意味される。一つの態様において、dsNA分子の増強された、または増加されたDicer切断は、適切な参照dsNA分子で観察されるもののレベルを上回る。もう一つの態様において、dsNA分子の増強された、または増加されたDicer切断は、不活性または減弱された分子で観察されるもののレベルを上回る。
【０１６８】
本明細書に使用される、「減少させる」とは、アッセイにおいて参照と比較して少なくとも5%までネガティブに変化させることを意味する。変化は、アッセイにおいて参照と比較して5%、10%、25%、30%、50%、75%またはさらに100%までであってもよい。「発現を減少させる」とは、遺伝子の発現、または1つもしくは複数のタンパク質もしくはタンパク質サブユニットをコードするRNA分子または同等のRNA分子のレベル、または標的遺伝子によってコードされる1つもしくは複数のタンパク質もしくはタンパク質サブユニットのレベルまたは活性がこの開示のインビボまたはインビトロでのアッセイにおいて核酸分子（たとえば、dsRNA分子またはdsRNA含有分子）の非存在下において観察されてものを下回って減少されることを意味される。一つの態様において、dsNA分子での阻害、ダウンレギュレーションまたは減少は、不活性または減弱された分子の存在下において観察されるレベルを下回る。もう一つの態様において、dsNA分子での阻害、ダウンレギュレーションまたは減少は、たとえば、スクランブルされた配列をもつか、またはミスマッチをもつdsNA分子の存在下において観察されるレベルを下回る。もう一つの態様において、本開示の核酸分子での遺伝子発現の阻害、ダウンレギュレーションまたは減少は、その非存在におけるよりも核酸分子の存在下において優れている。
【０１６９】
本明細書に使用される、「細胞」は、原核生物の（たとえば、細菌）および真核生物（たとえば、哺乳動物または植物）の両方の細胞を含むことが意味される。細胞は、体細胞のたは生殖系列起源でもよく、全能性または多能性でもよく、および分裂してもいても、または分裂していなくてもよい。細胞は、また生殖子もしくは胚、幹細胞または完全に分化した細胞に由来することもでき、または以下を含むことができる。したがって、「細胞」という用語は、その通常の生物学的意味を保持することが意味され、たとえばトリ、植物、並びにたとえばヒト、ウシ、ヒツジ、類人猿、サル、ブタ、イヌおよびネコを含む哺乳動物などの任意の生物に存在し得る。一定の側面内で、「細胞」という用語は、本開示の1つまたは複数の単離されたdsNA分子を含むヒト細胞などの哺乳動物細胞を具体的にいう。特定の側面において、細胞はdsRNAまたはdsRNA含有分子をプロセスして、標的核酸のRNA干渉を生じ、およびRNAiのために必要とされるタンパク質およびタンパク質複合体、たとえばDicerおよびRISCを含む。
【０１７０】
本明細書に使用される、「動物」は、哺乳動物、特にヒトを含む、多細胞の、真核生物を意味さする。本発明の方法は、一般に、哺乳動物、特にヒトを含む、その必要のある被験体（たとえば、動物、ヒト）に対して、本明細書における式の構造の薬剤などの、本明細書における薬剤の有効量の投与を含む。このような治療は、疾患またはその症候を罹患し、有し、に感受性であり、またはリスクのある被験体、特にヒトに対して適切に投与されるだろう。
【０１７１】
「薬学的に許容される担体」とは、これらの所望の活性のために最も適した物理的な位置における本開示の核酸分子の有効な分布が可能な組成物または製剤を意味する。本発明は、真核細胞における標的遺伝子の発現を減少させることができる、同じ薬剤内に二重鎖RNA（「dsRNA」）二重鎖およびDNA含有拡張領域−大部分の態様において、dsDNA二重鎖−を含む組成物、並びにこれらを調製するための方法に向けられる。dsRNA領域の鎖の一方は、標的遺伝子から転写されるRNAの破壊を指揮することができる約15から約22ヌクレオチドの範囲である長さを有するヌクレオチド配列の領域を含む。このような薬剤のdsDNA二重鎖領域は、必ずしも標的RNAに対して相補的であるというわけではなく、したがって、このような例において、標的RNAの破壊を指揮することができるヌクレオチド配列の領域の標的RNAハイブリダイゼーションを増強しない。本発明の二本鎖NAsは、第1および第2の鎖を連結する、化学的に連結された鎖を有することができ、または任意に、テトラループを含む拡張されたループを有することもできる。一部の態様において、テトラループを含む拡張ループは、センス鎖の3'末端にて、アンチセンス鎖の5'末端にて、または両方にある。
【０１７２】
一つの態様において、本発明のdsNAは、長さ18〜30nts（たとえば、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29および30 nts）を含む二重鎖RNA二重鎖領域を含む。
【０１７３】
本発明のDsiRNA／dsDNA薬剤は、このようなdsDNA領域を欠いているDsiRNAsと比較して、このような薬剤の以下の特性を増強することができる：インビトロでの有効性（たとえば、作用強度および効果の期間）、インビボの有効性（たとえば、作用強度、効果の期間、薬物動態、薬力学、細胞内取り込み、毒性の減少）。一定の態様において、本発明のdsDNA領域（またはこれらの断片）は、アプタマーまたはこれらの断片；非配列選択的または配列特異的様式のいずれかでdsDNAに結合することができる天然または外因的に導入された部分のための結合部位（たとえば、「デコイ」結合部位）（たとえば、本発明の薬剤のdsDNA拡張領域は、1つまたは複数の転写因子認識配列を含むようにデザインすることができ、および／またはdsDNA拡張領域は、配列特異的認識ドメインをプローブ、マーカー、その他に提供することができる）などのさらなる薬剤を任意に提供することができる。
【０１７４】
本明細書に使用される、「薬物動態」という用語は、薬物が体によって吸収され、分配され、代謝され、および除去されるプロセスをいう。本発明の一定の態様において、適切な対照DsiRNAに対して、DsiRNA／dsDNA薬剤の増強された薬物動態は、このような薬剤の吸収および／または分布を増加されること、および／またはこのような薬剤を投与した被験体からこのようなDsiRNA／dsDNA薬剤の代謝または除去を遅らせることをいう。
【０１７５】
本明細書に使用される、「薬力学」という用語は、生きた生物に対する薬物の作用または効果をいう。本発明の一定の態様において、適切な対照DsiRNAに対して、DsiRNA／dsDNA薬剤の増強された薬力学は、適切な対照DsiRNAと比較して、このような薬剤が投与された被験体に対して、DsiRNA／dsDNA薬剤の作用または効果が増加されること（たとえば、より強力またはより延長されること）をいう。
【０１７６】
本明細書に使用される、「安定化」という用語は、選択された環境（たとえば、細胞または生物において）における薬剤の持続が増強された状態をいう。一定の態様において、本発明のDsiRNA／dsDNAキメラ薬剤は、適切な対照DsiRNAsと比較して、増強された安定性を示す。このような増強された安定性は、分解酵素（たとえば、ヌクレアーゼ）またはその他の薬剤に対するこのような薬剤の耐性の増強によって達成することができる。
【０１７７】
DsiRNA設計／合成
25〜約30ヌクレオチド（DsiRNAs）のより長いdsRNA種は、19〜23mer siRNA薬剤と比較して、作用強度および作用の期間に関して、予想外に有効なRNA阻害性の結果を生じることを以前に示した。dsRNAプロセシングメカニズムの根底にある理論によって高速されることは望まないが、より長いdsRNA種が、細胞の原形質においてDicer酵素のための基質としての役割を果たすと考えられる。本発明のdsNAをより短いセグメントに切断することに加えて、Dicerは、標的遺伝子の、またはに由来する細胞質RNAの破壊を担うRISC複合体への、切断されたdsNAに由来する一本鎖の切断産物の、組み込みを促進すると考えられる。以前の研究（Rossi et al.,米国特許出願番号第2007/0265220号）は、DicerによるdsRNA種（具体的には、DsiRNA薬剤）の切断性がdsRNA種の作用強度および作用の期間の増加に対応することを示した。本発明は、少なくとも部分的には、Dicer切断の部位に向けるRNA阻害性薬剤の設計を提供し、その結果、このようなそのDicer切断産物の好ましい種がこれにより産生される。
【０１７８】
DsiRNAプロセシングのモデルは、図1Aに示してある。簡潔には、Dicer酵素は、DsiRNA薬剤に結合して、位置19〜23ヌクレオチドにてDsiRNAの切断を生じ、Dicer PAZドメインが結合したDsiRNA薬剤のアンチセンス鎖の3'オーバーハング配列から除去される。このDicer切断イベントにより、以前にパッセンジャー（センス）鎖の3'末端およびガイド（アンチセンス）鎖の5'末端に位置したこれらの二重核酸の切除を生じる。（典型的には、図1Aに示したDsiRNAの切断は、それぞれの末端にて2-塩基オーバーハングをもつ19mer二重鎖を生じる。）今回、図1Aにおいてモデル化したように、このDicer切断イベントにより、RISC成分として標的mRNAの配列特異的阻害を指揮することができる21〜23ヌクレオチドガイド（アンチセンス）鎖を生じる。
【０１７９】
本発明のDsiRNA薬剤の第1および第2のオリゴヌクレオチドは、完全に相補的であることは必要とされない。実際に、一つの態様において、センス鎖の3'末端は、1つまたは複数のミスマッチを含む。一つの側面において、約2つのミスマッチがセンス鎖の3'末端に組み込まれる。もう一つの態様において、本発明のDsiRNAは、2つのRNAオリゴヌクレオチドを含む二本鎖のRNA分子であり、そのそそれぞれが、長さが27〜35ヌクレオチドの範囲のヌクレオチドの同一の数であり、かつ互いにアニールされたときに、平滑末端を有し、かつセンス鎖の3'末端（アンチセンス鎖の5'末端）で2つのヌクレオチドミスマッチを有する。ミスマッチまたは減少した熱力学的安定性の（具体的には、3'-センス／5'-アンチセンス位置における）使用は、RISCへのアンチセンス鎖の移行を促進し、または選ぶことが提唱され（Schwarz et al., 2003；Khvorova et al., 2003）、おそらく、いくつかの律速巻戻しに工程に影響を及ぼすことによる。したがって、末端塩基組成物は、活性な21mer siRNA二重鎖を選択するために、設計アルゴリズムに含まれた（Ui-Tei et al., 2004；Reynolds et al., 2004）。この態様のdsRNA領域のDicer切断では、ミスマッチを含む小さな末端配列は、アンチセンス鎖と不対のままであるか（3'-オーバーハングの部分になる）、または最終的に21mer siRNAから完全に切断されるかのいずれかだろう。したがって、「ミスマッチ」のこれらの特異的形態は、RISCの最終的なRNA成分においてミスマッチとして残り続けることはない。Dicer基質のセンス鎖の3'末端ににおけるセグメントの塩基ミスマッチまたは不安定化がRNAiにおける合成二重鎖の能力を改善したという発見は、おそらくDicerによるプロセシングを促進することにより、25〜30mer dsRNAの設計および使用を記述する過去の研究の驚くべき知見であった（本明細書において、「DsiRNAs」とも名付けた；Rossi et al.,米国特許出願番号2005/0277610、2005/0244858および2007/0265220）。それぞれのパッセンジャーまたはガイド鎖の最も3'dicer切断部位の3'であると予測される、パッセンジャー（センス）鎖またはガイド（アンチセンス）鎖位置のいずれかにおいて塩基対形成したデオキシリボヌクレオチドを有するDsiRNAsは、少なくともRNA-RNA二重鎖拡張DsiRNA薬剤と同程度に有効であることは、今回同度に驚くべきである。このような薬剤は、また、ミスマッチを有していてもよく、このようなミスマッチは、DsiRNA薬剤のセンス鎖の配列（実際の、またはそれとの突出したハイブリダイぜーション）に関して、または標的RNA配列に関して、いずれかのアンチセンス鎖によって形成されてシーケンスしてもよい。
ミスマッチを有する薬剤の例示的なミスマッチの、または揺らぎのある塩基対は、G：A、C：A、C：U、G：G、A：A、C：C、U：U、I：A、I：UおよびI：Cである。このような薬剤の塩基対強度は、また、たとえばグアニンおよびアデニンヌクレオチドの2-アミノ-または2,6-ジアミノ修飾を含む、このような薬剤のヌクレオチドの修飾を介して少なくすることができる。
【０１８０】
DsiRNA薬剤組成物の例示的な構造
一つの側面において、本発明は、突出したセンス鎖Dicer切断部位の3'および対応して突出したアンチセンス鎖Dicer切断部位の5'に位置する二本鎖核酸（dsNA）の領域内に1つまたは複数の塩基対形成したデオキシリボヌクレオチドを有するRNA干渉（RNAi）ための組成物を提供する。本発明の組成物は、前駆体分子であるdsNAを含み、すなわち、本発明のdsNAは、活性な小さな干渉核酸（siRNA）を生じるようにインビボてプロセスされる。dsNAは、Dicerによって活性なsiRNAにプロセスされ、これがRISCに組み込まれる。
【０１８１】
一定の態様において、本発明のDsiRNA薬剤は、以下の例示的な構造のいずれかを有することができる：
このような態様において、DsiRNAは、以下を含む：
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*DNDD-3'
3'-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*DNXX-5'
式中、「X]=RNA、「Y」は、任意に2'-O-メチルRNA単量体である0〜10RNA単量体で構成される随意のオーバーハングドメインであり−一定の態様において、「Y」は、任意に2'-O-メチルRNA単量体である1〜4RNA単量体で構成されるオーバーハングドメインであり、「D」=DNAおよび「N」=1〜50以上、しかし任意に1〜15または任意に1〜8である。「N*」=0〜15以上、しかし任意に0、1、2、3、4、5または6である。一つの態様において、上の鎖は、センス鎖であり、かつ下の鎖は、アンチセンス鎖である。あるいは、下の鎖は、センス鎖であり、かつ上の鎖は、アンチセンス鎖である。
【０１８２】
関連した態様において、DsiRNAは、以下を含む：
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*DNDD-3'
3'-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*DNDD-5'
式中、「X」=RNA、「Y」は、任意に2'-O-メチルRNA単量体である0〜10RNA単量体で構成される随意のオーバーハングドメインであり−一定の態様において、「Y」は、任意に2'-O-メチルRNA単量体である1〜4RNA単量体で構成されるオーバーハングドメインであり、「D」=DNAおよび「N」=1〜50以上、しかし、任意に1〜15または任意に1〜8である。
「N*」=0〜15以上、しかし任意に0、1、2、3、4、5または6である。一つの態様において、上の鎖は、センス鎖であり、かつ下の鎖は、アンチセンス鎖である。あるいは、下の鎖は、センス鎖であり、かつ上の鎖は、アンチセンス鎖である。
【０１８３】
別の態様において、DsiRNAは、以下を含む：
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*DNDD-3'
3’-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*DNZZ-5’
式中、「X」=RNA、「X」=2'-O-メチルRNA、「Y」は、任意に2'-O-メチルRNA単量体である0〜10RNA単量体で構成される随意のオーバーハングドメインであり−一定の態様において、「Y」は、任意に2'-O-メチルRNA単量体である1〜4RNA単量体で構成されるオーバーハングドメインであり、「D」=DNA、「Z」=DNAまたはRNAおよび「N」=1〜50以上、しかし、任意に1〜15または任意に1〜8である。）。
「N*」=0〜15以上、しかし任意に0、1、2、3、4、5または6である。。
一つの態様において、上の鎖は、センス鎖であり、かつ下の鎖は、アンチセンス鎖である。あるいは、下の鎖は、センス鎖であり、かつ下の鎖は、アンチセンス鎖であり、ここで上記の模型図に示した下の鎖よりもむしろ、上の鎖は、上の鎖に沿って交互の残基に位置した2'-O-メチルRNA単量体をもつ。
【０１８４】
別の態様において、DsiRNAは、以下を含む：
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*DNDD-3'
3’-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*DNZZ-5’
式中、「X」=RNA、「X」=2'-O-メチルRNA、「Y」は、任意に2'-O-メチルRNA単量体である0〜10RNA単量体で構成される随意のオーバーハングドメインであり−一定の態様において、「Y」は、任意に2'-O-メチルRNA単量体である1〜4RNA単量体で構成されるオーバーハングドメインであり、「D」=DNA、「Z」=DNAまたはRNAおよび「N」=1〜50以上、しかし、任意に1〜15または任意に1〜8である。「N*」=0〜15以上、しかし任意に0、1、2、3、4、5または6である。一つの態様において、上の鎖は、センス鎖であり、かつ下の鎖は、アンチセンス鎖である。あるいは、下の鎖は、センス鎖であり、かつ下の鎖は、アンチセンス鎖であり、ここで上記の模型図に示した下の鎖よりもむしろ、上の鎖は、上の鎖に沿って交互の残基に位置した2'-O-メチルRNA単量体をもつ。
【０１８５】
もう一つの態様において、DsiRNAは、以下を含む：
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*[X1/D1]NDD-3'
3’-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*[X2/D2]NZZ-5’
式中、「X」=RNA、「Y」は、任意に2'-O-メチルRNA単量体である0〜10RNA単量体で構成される随意のオーバーハングドメインであり−一定の態様において、「Y」は、任意に2'-O-メチルRNA単量体である1〜4RNA単量体で構成されるオーバーハングドメインであり、「D」=DNA、「Z」=DNAまたはRNAおよび「N」=1〜50以上、しかし任意に1〜15または任意に1〜8であり、式中、少なくとも1つのD1Nは、上の鎖に存在し、および下の鎖の対応するD2Nと塩基対を形成する。任意に、D1NおよびD1N+1は、対応するD2NおよびD2N+1と塩基対を形成し；D1N、D1N+1およびD1N+2は、対応するD2N、D1N+1およびD1N+2と塩基対を形成し、その他である。「N*」=0〜15以上、しかし任意に0、1、2、3、4、5または6である。一つの態様において、上の鎖は、センス鎖であり、かつ下の鎖は、アンチセンス鎖である。あるいは、下の鎖は、センス鎖であり、かつ下の鎖は、アンチセンス鎖であり、ここで上記の模式図に示した下の鎖よりもむしろ、上の鎖は、上の鎖に沿って交互の残基に位置した2'-O-メチルRNA単量体をもつ。
【０１８６】
上に示した構造のいずれかにおいて、センス鎖またはアンチセンス鎖の5'末端は、任意にホスフェート基を含む。
【０１８７】
もう一つの態様において、DNA：DNA拡張DsiRNAは、Dicer切断に向ける役割を果たす1〜3のミスマッチの残基を有する同等の長さを有する鎖を含む（具体的には、DsiRNAの第1の鎖上の位置1、2または3の1つまたは複数は、3'末端残基から数えるときに、第1および第2の鎖が互いにアニールされるときに第2の鎖上の5'末端領域の対応する残基とミスマッチである）。例示的な2つの末端ミスマッチの残基をもつDNA：DNA拡張DsiRNA薬剤を示してある：
【０１８８】
【化１】
0005855463.tif 000003
式中、「X」=RNA、「M」=鎖がアニールしたときに他の相補鎖の対応する「M」残基と塩基対形成（水素結合）をしない核酸残基（RNA、DNAまたは非自然または修飾された核酸）、「D」=DNAおよび「N」=1〜50以上、しかし任意に1〜15または任意に1〜8である。「N*」=0〜15以上、しかし任意に0、1、2、3、4、5または6である。このような薬剤の残基のいずれも、任意に-2'-O-メチルRNA単量体であることができ、上の非対称の薬剤について示したように、下の（第2の）鎖の3'末端残基から始まる2'-O-メチルRNA単量体を交互の配置を、また上の「平滑／端の削れた」DsiRNA薬剤にも使用することができる。一つの態様において、上の鎖（第1の鎖）は、センス鎖であり、かつ下の鎖（第2の鎖）は、アンチセンス鎖である。あるいは、下の鎖は、センス鎖であり、かつ上の鎖は、アンチセンス鎖である。非対称／オーバーハング薬剤について上に示したものに匹敵する修飾およびDNA：DNA拡張パターンは、またこのような「平滑／端の削れた」薬剤にも組み込むことができる。
【０１８９】
一つの態様において、長さが拡張されたDsiRNA薬剤は、Dicer切断の特異的方向を介して機能するようにモデル化された部位に位置したデオキシリボヌクレオチドを含むものを提供し、これはさらに、dsNA構造において塩基対形成したデオキシリボヌクレオチドの存在を必要としない。このような分子のための例示的な構造を示してある：
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXDDXX-3'
3’-YXXXXXXXXXXXXXXXXXDDXXXX-5’
式中、「X」=RNA、「Y」は、任意に2'-O-メチルRNA単量体である0〜10RNA単量体で構成される随意のオーバーハングドメインであり-一定の態様において、「Y」は、任意に2'-O-メチルRNA単量体および「D」=DNAである1〜4RNA単量体で構成されるオーバーハングドメインである。一つの態様において、上の鎖は、センス鎖であり、かつ下の鎖は、アンチセンス鎖である。あるいは、下の鎖は、センス鎖であり、かつ上の鎖は、アンチセンス鎖である。上の構造は、Dicerにその主なプロセシング後形態として最小の21mer二重鎖を切断させるこようにモデル化される。上の構造の下の鎖がアンチセンス鎖である態様において、アンチセンス鎖の5'末端の最後および最後から2番目の残基における2つのデオキシリボヌクレオチド残基の位置は、オフターゲット効果を減少させる可能性が高い（以前の研究では、オフターゲット効果を減少させるためにアンチセンス鎖の5'末端から少なくとも最後から2番目の位置の2'-O-メチル修飾を示した；たとえば、US 2007/0223427を参照されたい）。
【０１９０】
一つの態様において、DsiRNAは、以下を含む：
5'-DNXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*Y-3'
3’-DNXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*-5’
式中、「X」=RNA、「Y」は、任意に2'-O-メチルRNA単量体である0〜10RNA単量体で構成される随意のオーバーハングドメインであり−一定の態様において、「Y」は、任意に2'-O-メチルRNA単量体である1〜4RNA単量体で構成されるオーバーハングドメインであり、「D」=DNAおよび「N」=1〜50以上、しかし任意に1〜15または任意に1〜8である。「N*」=0〜15以上、しかし任意に0、1、2、3、4、5または6である。一つの態様において、上の鎖は、センス鎖であり、かつ下の鎖は、アンチセンス鎖である。あるいは、下の鎖は、センス鎖であり、かつ上の鎖は、アンチセンス鎖である。
【０１９１】
関連した態様において、DsiRNAは、以下を含む：
5'-DNXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*DD-3'
3’-DNXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*XX-5’
式中、「X」=RNA、任意に2'-O-メチルRNA単量体「D」=DNA、「N」=1〜50以上、しかし任意に1〜15または任意に1〜8である。「N*」=0〜15以上、しかし任意に0、1、2、3、4、5または6である。一つの態様において、上の鎖は、センス鎖であり、かつ下の鎖は、アンチセンス鎖である。あるいは、下の鎖は、センス鎖であり、かつ上の鎖は、アンチセンス鎖である。
【０１９２】
別の態様において、DsiRNAは、以下を含む：
5'-DNXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*DD-3'
3’-DNXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*ZZ-5’
式中、「X」=RNA、任意に2'-O-メチルRNA単量体「D」=DNA、「N」=1〜50以上、しかし任意に1〜15または任意に1〜8である。「N*」=0〜15以上、しかし任意に0、1、2、3、4、5または6である。「Z」=DNAまたはRNA。一つの態様において、上の鎖は、センス鎖であり、かつ下の鎖は、アンチセンス鎖である。あるいは、下の鎖は、センス鎖であり、かつ下の鎖は、アンチセンス鎖であり、ここで上記の模式図に示した下の鎖よりもむしろ、上の鎖は、上の鎖に沿って交互の残基に位置した2’-O-メチルRNA単量体をもつ。
【０１９３】
別の態様において、DsiRNAは、以下を含む：
5'-DNZZXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*DD-3'
3’-DNXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*ZZ-5’
式中、「X」=RNA、「X」=2'-O-メチル RNA、「D」=DNA、「Z」=DNAまたはRNAおよび「N」=1〜50以上、しかし、任意に1〜15または任意に1〜8である。「N*」=0〜15以上、しかし任意に0、1、2、3、4、5または6である。一つの態様において、上の鎖は、センス鎖であり、かつ下の鎖は、アンチセンス鎖である。あるいは、下の鎖は、センス鎖であり、かつ下の鎖は、アンチセンス鎖であり、ここで上記の模式図に示した下の鎖よりもむしろ、上の鎖は、上の鎖に沿って交互の残基に位置した2’-O-メチルRNA単量体をもつ。
【０１９４】
別の態様において、DsiRNAは、以下を含む：
5'-DNZZXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*Y-3'
3’-DNXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*-5’
式中、「X」=RNA、「X」=2'-O-メチル RNA、「D」=DNA、「Z」=DNAまたはRNAおよび「N」=1〜50以上、しかし、任意に1〜15または任意に1〜8である。「N*」=0〜15以上、しかし任意に0、1、2、3、4、5または6である。「Y」は、任意に2'-O-メチルRNA単量体である0〜10RNA単量体で構成される随意のオーバーハングドメインであり−一定の態様において、「Y」は、任意に2'-O-メチルRNA単量体である1〜4RNA単量体で構成されるオーバーハングドメインである。一つの態様において、上の鎖は、センス鎖であり、かつ下の鎖は、アンチセンス鎖である。あるいは、下の鎖は、センス鎖であり、かつ下の鎖は、アンチセンス鎖であり、ここで上記の模式図に示した下の鎖よりもむしろ、上の鎖は、上の鎖に沿って交互の残基に位置した2’-O-メチルRNA単量体をもつ。
【０１９５】
もう一つの態様において、DsiRNAは、以下を含む：
5'-[X1/D1]NXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*DD-3'
3’-[X2/D2]NXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*ZZ-5’
式中、「X」=RNA、「D」=DNA、「Z」=DNAまたはRNAおよび、「N」=1〜50以上、しかし任意に1〜15または任意に1〜8であり、式中、少なくとも1つのD1Nは、上の鎖に存在し、および下の鎖の対応するD2Nと塩基対を形成する。任意に、D1NおよびD1N+1は、対応するD2NおよびD2N+1と塩基対を形成し；D1N、D1N+1およびD1N+2は、対応するD2N、D1N+1およびD1N+2と塩基対を形成し、その他である。「N*」=0〜15以上、しかし任意に0、1、2、3、4、5または6である。一つの態様において、上の鎖は、センス鎖であり、かつ下の鎖は、アンチセンス鎖である。あるいは、下の鎖は、センス鎖であり、かつ下の鎖は、アンチセンス鎖であり、ここで上記の模式図に示した下の鎖よりもむしろ、上の鎖は、上の鎖に沿って交互の残基に位置した2’-O-メチルRNA単量体をもつ。
【０１９６】
関連した態様において、DsiRNAは、以下を含む：
5'-[X1/D1]NXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*Y-3'
3’-[X2/D2]NXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*-5’
式中、「X」=RNA（「D」=DNA、「Y」は、任意に2'-O-メチルRNA単量体である0〜10RNA単量体で構成される随意のオーバーハングドメインであり−一定の態様において、「Y」は、任意に2'-O-メチルRNA単量体である1〜4RNA単量体で構成されるオーバーハングドメインであり、および「N」=1〜50以上、しかし任意に1〜15または任意に1〜8であり、式中、少なくとも1つのD1Nは、上の鎖に存在し、および下の鎖の対応するD2Nと塩基対を形成する。任意に、D1NおよびD1N+1は、対応するD2NおよびD2N+1と塩基対を形成し；D1N、D1N+1およびD1N+2は、対応するD2N、D1N+1およびD1N+2と塩基対を形成し、その他である。「N*」=0〜15以上、しかし任意に0、1、2、3、4、5または6である。一つの態様において、上の鎖は、センス鎖であり、かつ下の鎖は、アンチセンス鎖である。あるいは、下の鎖は、センス鎖であり、かつ下の鎖は、アンチセンス鎖であり、ここで上記の模式図に示した下の鎖よりもむしろ、上の鎖は、上の鎖に沿って交互の残基に位置した2’-O-メチルRNA単量体をもつ。
【０１９７】
上に示した構造のいずれかにおいて、センス鎖またはアンチセンス鎖の5'末端は、任意にホスフェート基を含む。
【０１９８】
もう一つの態様において、DNA：DNA拡張DsiRNAは、Dicer切断に向ける役割を果たす1〜3のミスマッチの残基を有する同等の長さを有する鎖を含む（具体的には、DsiRNAの第1の鎖上の位置1、2または3の1つまたは複数は、3'末端残基から数えるときに、第1および第2の鎖が互いにアニールされるときに第2の鎖上の5'末端領域の対応する残基とミスマッチである）。例示的な2つの末端ミスマッチの残基をもつDNA：DNA拡張DsiRNA薬剤を示してある：
【０１９９】
【化２】
0005855463.tif 000004
式中、「X」=RNA、「M」=鎖がアニールしたときに他の相補鎖の対応する「M」残基と塩基対形成（水素結合）をしない核酸残基（RNA、DNAまたは非自然または修飾された核酸）、「D」=DNAおよび「N」=1〜50以上、しかし任意に1〜15または任意に1〜8である。「N*」=0〜15以上、しかし任意に0、1、2、3、4、5または6である。このような薬剤の残基のいずれも、任意に-2'-O-メチルRNA単量体であることができ、上の非対称の薬剤について示したように、下の（第2の）鎖の3'末端残基から始まる2'-O-メチルRNA単量体を交互の配置を、また上の「平滑／端の削れた」DsiRNA薬剤にも使用することができる。一つの態様において、上の鎖（第1の鎖）は、センス鎖であり、かつ下の鎖（第2の鎖）は、アンチセンス鎖である。あるいは、下の鎖は、センス鎖であり、かつ上の鎖は、アンチセンス鎖である。非対称／オーバーハング薬剤について上に示したものに匹敵する修飾およびDNA：DNA拡張パターンは、またこのような「平滑／端の削れた」薬剤にも組み込むことができる。
【０２００】
もう一つの態様において、長さが拡張されたDsiRNA薬剤は、Dicer切断の特異的方向を介して機能するようにモデル化された部位に位置したデオキシリボヌクレオチドを含むものを提供し、これはさらに、dsNA構造において塩基対形成したデオキシリボヌクレオチドの存在を必要としない。このような分子のための例示的な構造を示してある：
5'-XXDDXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*Y-3'
3’-DDXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*-5’
または
5'-XDXDXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*Y-3'
3’-DXDXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*-5’
式中、「X」=RNA、「Y」は、任意に2'-O-メチルRNA単量体である0〜10RNA単量体で構成される随意のオーバーハングドメインであり-一定の態様において、「Y」は、任意に2'-O-メチルRNA単量体および「D」=DNAである1〜4RNA単量体で構成されるオーバーハングドメインである。「N*」=0〜15以上、しかし任意に0、1、2、3、4、5または6である。一つの態様において、上の鎖は、センス鎖であり、かつ下の鎖は、アンチセンス鎖である。あるいは、下の鎖は、センス鎖であり、かつ上の鎖は、アンチセンス鎖である。上の構造は、Dicerにその主なプロセシング後形態として最小の21mer二重鎖を切断させるこようにモデル化される。
【０２０１】
上の構造の下の鎖がアンチセンス鎖である態様において、アンチセンス鎖の5'末端の最後および最後から2番目の残基における2つのデオキシリボヌクレオチド残基の位置は、オフターゲット効果を減少させる可能性が高い（以前の研究では、オフターゲット効果を減少させるためにアンチセンス鎖の5'末端から少なくとも最後から2番目の位置の2'-O-メチル修飾を示した；たとえば、US 2007/0223427を参照されたい）。
【０２０２】
本発明の拡張DsiRNAsは、広範な修飾パターン（たとえば、拡張DsiRNA薬剤内の2'-O-メチルRNAパターン）を有することができる。本発明の拡張DsiRNAsの第2の鎖のパターンの一定の好ましい修飾を下に示してあり、-なお、下記の構造の多くは、非拡張DsiRNAsの修飾を示す一方、当業者であれば、示された修飾パターンが本明細書において他に記述されたあらゆる拡張DsiRNA構造にも容易に適用されることを認識するだろう。
【０２０３】
一つの態様において、DsiRNAは、以下を含む：
5'-pXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3’-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXp-5’
式中、「X」=RNA、「p」=ホスフェート基、「Y」は、任意に2'-O-メチルRNA単量体Aである1〜4RNA単量体で構成されるオーバーハングドメインであり、および「D」=DN）。一つの態様において、上の鎖は、センス鎖であり、かつ下の鎖は、アンチセンス鎖である。あるいは、下の鎖は、センス鎖であり、かつ上の鎖は、アンチセンス鎖である。
【０２０４】
もう一つの態様において、DsiRNAは、以下を含む：
5'-pXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3’-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXp-5’
式中、「X」=RNA、「p」=ホスフェート基、「X」=2'-O-メチルRNA、「Y」は、任意に2'-O-メチルRNA単量体である1〜4RNA単量体で構成されるオーバーハングドメインであり、下線を引いた残基は、2'-O-メチルRNA単量体であり、および「D」=DNA。上の鎖は、センス鎖であり、かつ下の鎖は、アンチセンス鎖である。
【０２０５】
もう一つの態様において、DsiRNAは、以下を含む：
5'-pXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3’-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXp-5’
式中、「X」=RNA、「p」=ホスフェート基、「X」=2'-O-メチルRNA、「Y」は、任意に2'-O-メチルRNA単量体である1〜4RNA単量体で構成されるオーバーハングドメインであり、下線を引いた残基は、2’-O-メチルRNA単量体であり、および「D」=DNA。上の鎖は、センス鎖であり、かつ下の鎖は、アンチセンス鎖である。
【０２０６】
さらなる態様において、DsiRNAは、以下を含む：
5'-pXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3’-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXp-5’
式中、「X」=RNA、「p」=ホスフェート基、「X」=2'-O-メチルRNA、「Y」は、任意に2'-O-メチルRNA単量体である1〜4RNA単量体で構成されるオーバーハングドメインであり、下線を引いた残基は、2’-O-メチルRNA単量体であり、および「D」=DNA。上の鎖は、センス鎖であり、かつ下の鎖は、アンチセンス鎖である。
【０２０７】
一つの態様において、DsiRNAは、以下を含む：
5'-pXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3’-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXp-5’
式中、「X」=RNA、「p」=ホスフェート基、「X」=2'-O-メチルRNAおよび「D」=DNA。上の鎖は、センス鎖であり、かつ下の鎖は、アンチセンス鎖である。
【０２０８】
さらなる態様において、DsiRNAは、以下を含む：
5'-pXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3’-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXp-5’
式中、「X」=RNA、「p」=ホスフェート基、「X」=2'-O-メチルRNA、「Y」は、任意に2'-O-メチルRNA単量体である1〜4RNA単量体で構成されるオーバーハングドメインであり、下線を引いた残基は、2’-O-メチルRNA単量体であり、および「D」=DNA。上の鎖は、センス鎖であり、かつ下の鎖は、アンチセンス鎖である。
【０２０９】
一つの態様において、DsiRNAは、以下を含む：
5'-pXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3’-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXp-5’
式中、「X」=RNA、「p」=ホスフェート基、「X」=2'-O-メチルRNAおよび「D」=DNA。上の鎖は、センス鎖であり、かつ下の鎖は、アンチセンス鎖である。
【０２１０】
その他の態様において、DsiRNAは、以下を含む：
5'-pXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3’-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXp-5’
式中、「X」=RNA、「p」=ホスフェート基、「X」=2'-O-メチルRNA、「Y」は、任意に2'-O-メチルRNA単量体である1〜4RNA単量体で構成されるオーバーハングドメインであり、下線を引いた残基は、2’-O-メチルRNA単量体であり、および「D」=DNA。上の鎖は、センス鎖であり、かつ下の鎖は、アンチセンス鎖である。
【０２１１】
一つの態様において、DsiRNAは、以下を含む：
5'-pXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3’-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXp-5’
式中、「X」=RNA、「p」=ホスフェート基、「X」=2'-O-メチルRNAおよび「D」=DNA。上の鎖は、センス鎖であり、かつ下の鎖は、アンチセンス鎖である。
【０２１２】
さらなる態様において、DsiRNAは、以下を含む：
5'-pXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3’-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXp-5’
式中、「X」=RNA、「p」=ホスフェート基、「X」=2'-O-メチルRNA、「Y」は、任意に2'-O-メチルRNA単量体である1〜4RNA単量体で構成されるオーバーハングドメインであり、下線を引いた残基は、2’-O-メチルRNA単量体であり、および「D」=DNA。上の鎖は、センス鎖であり、かつ下の鎖は、アンチセンス鎖である。
【０２１３】
一つの態様において、DsiRNAは、以下を含む：
5'-pXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3’-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXp-5’
式中、「X」=RNA、「p」=ホスフェート基、「X」=2'-O-メチルRNAおよび「D」=DNA。上の鎖は、センス鎖であり、かつ下の鎖は、アンチセンス鎖である。
【０２１４】
さらなる態様において、DsiRNAは、以下を含む：
5'-pXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3’-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXp-5’
式中、「X」=RNA、「p」=ホスフェート基、「X」=2'-O-メチルRNA、「Y」は、任意に2'-O-メチルRNA単量体である1〜4RNA単量体で構成されるオーバーハングドメインであり、下線を引いた残基は、2’-O-メチルRNA単量体であり、および「D」=DNA。上の鎖は、センス鎖であり、かつ下の鎖は、アンチセンス鎖である。
【０２１５】
一つの態様において、DsiRNAは、以下を含む：
5'-pXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3’-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXp-5’
式中、「X」=RNA、「p」=ホスフェート基、「X」=2'-O-メチルRNAおよび「D」=DNA。上の鎖は、センス鎖であり、かつ下の鎖は、アンチセンス鎖である。
【０２１６】
その他の態様において、DsiRNAは、以下を含む：
5'-pXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3’-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXp-5’
式中、「X」=RNA、「p」=ホスフェート基、「X」=2'-O-メチルRNA、「Y」は、任意に2'-O-メチルRNA単量体である1〜4RNA単量体で構成されるオーバーハングドメインであり、下線を引いた残基は、2’-O-メチルRNA単量体であり、および「D」=DNA。上の鎖は、センス鎖であり、かつ下の鎖は、アンチセンス鎖である。
【０２１７】
一つの態様において、DsiRNAは、以下を含む：
5'-pXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3’-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXp-5’
式中、「X」=RNA、「p」=ホスフェート基、「X」=2'-O-メチルRNAおよび「D」=DNA。上の鎖は、センス鎖であり、かつ下の鎖は、アンチセンス鎖である。
【０２１８】
一定のさらなる態様において、DsiRNAは、以下を含む：
5'-pXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3’-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXp-5’
式中、「X」=RNA、「p」=ホスフェート基、「X」=2'-O-メチルRNA、「Y」は、任意に2'-O-メチルRNA単量体である1〜4RNA単量体で構成されるオーバーハングドメインであり、下線を引いた残基は、2’-O-メチルRNA単量体であり、および「D」=DNA。上の鎖は、センス鎖であり、かつ下の鎖は、アンチセンス鎖である。
【０２１９】
一つの態様において、DsiRNAは、以下を含む：
5'-pXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3’-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXp-5’
式中、「X」=RNA、「p」=ホスフェート基、「X」=2'-O-メチルRNAおよび「D」=DNA。上の鎖は、センス鎖であり、かつ下の鎖は、アンチセンス鎖である。
【０２２０】
さらなる態様において、DsiRNAは、以下を含む：
5'-pXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3’-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXp-5’
式中、「X」=RNA、「p」=ホスフェート基、「X」=2'-O-メチルRNA、「Y」は、任意に2'-O-メチルRNA単量体である1〜4RNA単量体で構成されるオーバーハングドメインであり、下線を引いた残基は、2’-O-メチルRNA単量体であり、および「D」=DNA。上の鎖は、センス鎖であり、かつ下の鎖は、アンチセンス鎖である。
【０２２１】
一つの態様において、DsiRNAは、以下を含む：
5'-pXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3’-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXp-5’
式中、「X」=RNA、「p」=ホスフェート基、「X」=2'-O-メチルRNAおよび「D」=DNA。上の鎖は、センス鎖であり、かつ下の鎖は、アンチセンス鎖である。
【０２２２】
さらなる態様において、DsiRNAは、以下を含む：
5'-pXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3’-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXp-5’
式中、「X」=RNA、「p」=ホスフェート基、「X」=2'-O-メチルRNA、「Y」は、任意に2'-O-メチルRNA単量体である1〜4RNA単量体で構成されるオーバーハングドメインであり、下線を引いた残基は、2’-O-メチルRNA単量体であり、および「D」=DNA。上の鎖は、センス鎖であり、かつ下の鎖は、アンチセンス鎖である。
【０２２３】
一つの態様において、DsiRNAは、以下を含む：
5'-pXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3’-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXp-5’
式中、「X」=RNA、「p」=ホスフェート基、「X」=2'-O-メチルRNAおよび「D」=DNA。上の鎖は、センス鎖であり、かつ下の鎖は、アンチセンス鎖である。
【０２２４】
もう一つの態様において、DsiRNAは、Dicer切断に向ける役割を果たす1〜3のミスマッチの残基を有する同等の長さを有する鎖を含む（具体的には、DsiRNAの第1の鎖上の位置1、2または3の1つまたは複数は、3'末端残基から数えるときに、第1および第2の鎖が互いにアニールされるときに第2の鎖上の5'末端領域の対応する残基とミスマッチである）。例示的な2つの末端ミスマッチの残基をもつ27mer DsiRNA薬剤を示してある：
【０２２５】
【化３】
0005855463.tif 000005
式中、「X」=RNA、「p」=ホスフェート基、「M」=鎖がアニールしたときに他の相補鎖の対応する「M」残基と塩基対形成（水素結合）をしない核酸残基（RNA、DNAまたは非自然または修飾された核酸）。このような薬剤の残基のいずれも、任意に-2'-O-メチルRNA単量体であることができ、上の非対称の薬剤について示したように、下の（第2の）鎖の3'末端残基から始まる2'-O-メチルRNA単量体を交互の配置を、また上の「平滑／端の削れた」DsiRNA薬剤にも使用することができる。一つの態様において、上の鎖は、センス鎖であり、かつ下の鎖は、アンチセンス鎖である。あるいは、下の鎖は、センス鎖であり、かつ上の鎖は、アンチセンス鎖である。
【０２２６】
本明細書に使用される「DsiRNAmm」は、DsiRNAのセンスおよびアンチセンス鎖によって形成される二重鎖の1、2、3または4つのミスマッチ塩基対を含む「ミスマッチ寛容な領域」を有するDisRNAをい、このようなミスマッチは、にも嘘をついているDsiRNAのいずれの末端の2つの末端塩基対の間にある（およびしたがって、含んでいない）位置にて、DsiRNA内に位置する。ミスマッチ塩基対は、対応する標的核酸の突出したAgo2切断部位の位置に関して本明細書において定義される「ミスマッチ寛容な領域」内に位置する。ミスマッチ寛容な領域は、標的鎖の突出したAgo2切断部位「の上流」に位置する。この文脈における「上流」は、DsiRNAmm二重鎖の最も5'部分と理解され、5'とは、DsiRNA二重鎖のセンス鎖の向きをいう。したがって、ミスマッチ寛容な領域は、標的核酸の突出したAgo2切断部位に対応するセンス（パッセンジャー）鎖上の塩基の上流であり（図14を参照されたい）；あるいは、DsiRNAmmのアンチセンス（ガイド）鎖をいうときに、ミスマッチ寛容な領域は、また、標的核酸の突出したAgo2切断部位に対して相補的である塩基の下流に位置する、すなわち、DsiRNAmmのアンチセンス鎖の最も3'部分（この場合、アンチセンス鎖の位置1がアンチセンス鎖の5'末端ヌクレオチドである、図20を参照されたい）とも記述することができる。
【０２２７】
一つの態様において、たとえば図33にて図示したように、二重鎖のセンス鎖の5'末端にて始まるヌクレオチドから番号をつけたときに、ミスマッチ寛容な領域は、塩基対3〜9の間に位置し、および含む。したがって、本発明のDsiRNAmmは、右側拡張DsiRNAのセンス鎖の位置3、4、5、6、7、8または9のいずれか1つにて単一のミスマッチ塩基対を有する（位置1がセンス鎖の5'末端ヌクレオチドであり、および位置9がセンス鎖配列に対応する標的RNA配列の突出したAgo2切断部位のすぐ5'であるセンス鎖のヌクレオチド残基である場合）。一定の態様において、センス鎖の位置3、4、5、6、7、8または9のいずれかにてミスマッチ塩基対ヌクレオチドを有するDsiRNAmmについては、アンチセンス鎖の対応するミスマッチ塩基対ヌクレオチドは、DsiRNAmmセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するだけでなく、DsiRNAmm標的RNA配列とミスマッチ塩基対も形成する（したがって、アンチセンス鎖配列とセンス鎖配列との間の相補性は、DsiRNAmm内のミスマッチ塩基対にて破壊され、かつ相補性は、DsiRNAmmのアンチセンス鎖配列と標的RNA配列との間でも同じように破壊される）。代わりの態様において、DsiRNAmmのアンチセンスのミスマッチ塩基対ヌクレオチドは、DsiRNAmmのセンス鎖配列の対応するヌクレオチドとのみミスマッチ塩基対を形成し、それでもその対応する標的RNA配列ヌクレオチドと塩基対形成する（したがって、アンチセンス鎖配列とセンス鎖配列との間の相補性は、DsiRNAmm内のミスマッチ塩基対にて破壊され、それでも、相補性は、DsiRNAmmのアンチセンス鎖配列と標的RNA配列との間で維持される）。
【０２２８】
上記の通りにミスマッチ寛容な領域（ミスマッチ領域）内に単一のミスマッチ塩基対を有する本発明のDsiRNAmm（たとえば、センス鎖の位置3、4、5、6、7、8または9いずれか1つにてミスマッチのヌクレオチド残基を有するDsiRNAmm）は、1、2または3つのさらなるミスマッチ塩基対をさらに含むことができる。好ましい態様において、DsiRNAmmのこれらの1、2または3つのさらなるミスマッチ塩基対は、センス鎖の位置3、4、5、6、7、8および／または9にて（およびアンチセンス鎖の対応する残基にて）生じる。1つのさらなるミスマッチ塩基対がDsiRNAmm内に存在する一つの態様において、センス鎖の2つのミスマッチ塩基対は、たとえば、センス鎖の位置4および位置6の両方のヌクレオチドにて生じることができる（また、ミスマッチは、アンチセンス鎖の対応するヌクレオチド残基にて生じる）。
【０２２９】
2つのミスマッチ塩基対を有するDsiRNAmm薬剤において、ミスマッチは、連続的に生じることができる（たとえば、センス鎖ヌクレオチド配列に沿った連続した位置にて）。あるいは、アンチセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するセンス鎖のヌクレオチドは、アンチセンス鎖配列と塩基対を形成するヌクレオチドによって散在させることができる（たとえば、位置4および5においてではなく、位置3および6にてミスマッチのヌクレオチドを有するDsiRNAmmについては、センス鎖位置3および6のミスマッチの残基は、アンチセンス鎖の対応する残基とマッチした塩基対を形成する2つのヌクレオチドによって散在される）。たとえば、対応するアンチセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するセンス鎖の2つの残基（センス鎖のミスマッチ寛容な領域内に位置する）は、これらのミスマッチ塩基対の間に位置するゼロ、1、2、3、4または5つのマッチした塩基対で生じることができる。
【０２３０】
3つのミスマッチ塩基対を有する一定のDsiRNAmm薬剤については、ミスマッチは、連続的に生じることができる（たとえば、センス鎖ヌクレオチド配列に沿って三連で）。あるいは、アンチセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するセンス鎖のヌクレオチドは、アンチセンス鎖とマッチした塩基対を形成するヌクレオチドによって散在させることができる（たとえば、位置5、6および7においてではなく、位置3、4および8にてミスマッチのヌクレオチドを有するDsiRNAmmについては、センス鎖位置3および4のミスマッチの残基は、互いに隣接し、一方で、センス鎖位置4および8のミスマッチの残基は、アンチセンス鎖の対応する残基とマッチした塩基対を形成する3つのヌクレオチドによって散在される）。たとえば、対応するアンチセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するセンス鎖の3つの残基（センス鎖のミスマッチ寛容な領域内に位置する）は、これらのミスマッチ塩基対のいずれか2つの間に位置するゼロ、1、2、3または4つのマッチした塩基対で生じることができる。
【０２３１】
4つのミスマッチ塩基対を有する一定のDsiRNAmm薬剤については、ミスマッチは、連続的に生じることができる（たとえば、センス鎖ヌクレオチド配列に沿って四連で）。あるいは、アンチセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するセンス鎖のヌクレオチドは、アンチセンス鎖配列とマッチした塩基対を形成するヌクレオチドによって散在させることができる（たとえば、位置4および6においてではなく、位置3、5、7および8にてミスマッチのヌクレオチドを有するDsiRNAmmについて、センス鎖位置7および8のミスマッチの残基は、互いに隣接し、一方で、センス鎖位置3および5のミスマッチの残基は、アンチセンス鎖の対応する残基とマッチされた塩基対を形成する1つのヌクレオチドによって散在され-同様に、センス鎖位置5および7のミスマッチの残基は、アンチセンス鎖の対応する残基とマッチした塩基対を形成する1つのヌクレオチドによって散在される）。たとえば、対応するアンチセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するセンス鎖の4つの残基（センス鎖のミスマッチ寛容な領域内に位置する）は、これらのミスマッチ塩基対のいずれか2つの間に位置するゼロ、1、2または3つのマッチした塩基対で生じることができる。
【０２３２】
もう一つの態様において、たとえば図39にて図示するように、本発明のDsiRNAmmは、左側拡張DsiRNAのアンチセンス鎖の13、14、15、16、17、18、19、20または21のいずれか1つにて単一のミスマッチ塩基対ヌクレオチドを有するミスマッチ寛容な領域を含む（位置1は、アンチセンス鎖の5'末端ヌクレオチドでありかつ、位置13は、アンチセンス鎖配列と十分に相補的な標的RNA配列の突出したAgo2切断部位のアンチセンス鎖においてすぐ3'（下流）であるアンチセンス鎖のヌクレオチド残基である。）。一定の態様において、DsiRNAmmのセンス鎖に関してアンチセンス鎖の位置13、14、15、16、17、18、19、20または21のいずれかにてミスマッチ塩基対ヌクレオチドを有するDsiRNAmmについては、アンチセンス鎖のミスマッチ塩基対ヌクレオチドは、DsiRNAmmセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するだけでなく、DsiRNAmm標的RNA配列とミスマッチ塩基対も形成する（したがって、アンチセンス鎖配列とセンス鎖配列との間の相補性は、DsiRNAmm内でミスマッチ塩基対にて破壊され、かつ相補性は、DsiRNAmmのアンチセンス鎖配列と標的RNA配列との間でも同じように破壊される）。代わりの態様において、DsiRNAmmのアンチセンス鎖のミスマッチ塩基対ヌクレオチドは、DsiRNAmmのセンス鎖配列の対応するヌクレオチドとミスマッチ塩基対を形成するだけであり、それでも、その対応する標的RNA配列ヌクレオチドと塩基対形成する（したがって、アンチセンス鎖配列とセンス鎖配列との間の相補性は、DsiRNAmm内でミスマッチ塩基対にて破壊され、それでも、相補性は、DsiRNAmmのアンチセンス鎖配列と標的RNA配列との間で維持される）。
【０２３３】
上記の通りに、ミスマッチ寛容な領域内に単一のミスマッチ塩基対を有する本発明のDsiRNAmm（たとえば、アンチセンス鎖の位置13、14、15、16、17、18、19、20または21にてミスマッチのヌクレオチド残基を有するDsiRNAmm）は、1、2または3つのさらなるミスマッチ塩基対をさらに含むことができる。好ましい態様において、DsiRNAmmのこれらの1、2または3つのさらなるミスマッチ塩基対は、アンチセンス鎖の位置13、14、15、16、17、18、19、20および／または21にて（およびセンス鎖の対応する残基にて）にて生じる。1つのさらなるミスマッチ塩基対がDsiRNAmm内に存在する一つの態様において、アンチセンス鎖の2つのミスマッチ塩基対は、たとえば、アンチセンス鎖の位置14位および位置18の両方のヌクレオチドにて生じることができる（ミスマッチは、またセンス鎖の対応するヌクレオチド残基にて生じる）。
【０２３４】
2つのミスマッチ塩基対を有するDsiRNAmm薬剤において、ミスマッチは、連続的に生じることができる（たとえば、アンチセンス鎖ヌクレオチド配列に沿って連続した位置にて）。あるいは、センス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖のヌクレオチドは、センス鎖配列と塩基対を形成するヌクレオチドによって散在させることができる（たとえば、位置14および15においてではなく、位置13および16にてミスマッチのヌクレオチドを有するDsiRNAmmについては、アンチセンス鎖位置13および16のミスマッチの残基は、センス鎖の対応する残基とマッチした塩基対を形成する2つのヌクレオチドによって散在される）。たとえば、対応するセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖の2つの残基（センス鎖のミスマッチ寛容な領域内に位置する）は、これらのミスマッチ塩基対の間に位置するゼロ、1、2、3、4、5、6または7つのマッチした塩基対で生じることができる。
【０２３５】
3つのミスマッチ塩基対を有する一定のDsiRNAmm薬剤については、ミスマッチは、連続的に生じることができる（たとえば、アンチセンス鎖ヌクレオチド配列に沿った三連で）。あるいは、センス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖のヌクレオチドは、センス鎖配列とマッチした塩基対を形成するヌクレオチドによって散在させることができる（たとえば、位置15、16および17においてではなく、位置13、14および18にてミスマッチのヌクレオチドを有するDsiRNAmmについては、アンチセンス鎖位置13および14のミスマッチの残基は、互いに隣接し、一方で、アンチセンス鎖位置14および18のミスマッチの残基は、センス鎖の対応する残基とマッチした塩基対を形成する3つのヌクレオチドによって散在される）。たとえば、対応するセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖の3つの残基（アンチセンス鎖のミスマッチ寛容な領域内に位置する）は、これらのミスマッチ塩基対のいずれか2つの間に位置したゼロ、1、2、3、4、5または6つのマッチした塩基対で生じることができる。
【０２３６】
4つのミスマッチ塩基対を有する一定のDsiRNAmm薬剤については、ミスマッチは、連続的に生じることができる（たとえば、アンチセンス鎖ヌクレオチド配列に沿った四連で）。あるいは、センス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖のヌクレオチドは、センス鎖配列とマッチした塩基対を形成するヌクレオチドによって散在させることができる（たとえば、位置14および16においてではなく、位置13、15、17および18にてミスマッチのヌクレオチドを有するDsiRNAmmについて、アンチセンス鎖位置17および18のミスマッチの残基は、互いに隣接し、一方でアンチセンス鎖位置13および15のミスマッチの残基は、センス鎖の対応する残基とマッチした塩基対を形成する1つのヌクレオチドによって散在され-同様に、アンチセンス鎖位置15および17のミスマッチの残基は、またセンス鎖の対応する残基とマッチした塩基対を形成する1つのヌクレオチドによって散在される）。たとえば、対応するセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖の4つの残基（アンチセンス鎖のミスマッチ寛容な領域内に位置する）は、これらのミスマッチ塩基対のいずれか2つの間に位置するゼロ、1、2、3、4または5つのマッチした塩基対で生じることができる。
【０２３７】
さらなる態様において、たとえば図40にて図示するように、本発明のDsiRNAmmは、左側拡張DsiRNAのアンチセンス鎖の位置11、12、13、14、15、16、17、18または19のいずれか1つのにて単一のミスマッチ塩基対ヌクレオチドを有する（位置1は、アンチセンス鎖の5'末端ヌクレオチドであり、かつ位置11は、アンチセンス鎖配列と十分に相補的な標的RNA配列の突出したAgo2切断部位のアンチセンス鎖においてすぐ3'（下流）であるアンチセンス鎖のヌクレオチド残基である）。一定の態様において、DsiRNAmmのセンス鎖に関してアンチセンス鎖の位置11、12、13、14、15、16、17、18または19のいずれかにてミスマッチ塩基対ヌクレオチドを有するDsiRNAmmについては、アンチセンス鎖のミスマッチ塩基対ヌクレオチドは、DsiRNAmmセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するだけでなく、DsiRNAmm標的RNA配列ともミスマッチ塩基対も形成する（したがって、アンチセンス鎖配列とセンス鎖配列との間の相補性は、DsiRNAmm内でミスマッチ塩基対にて破壊され、かつ相補性は、DsiRNAmmのアンチセンス鎖配列と標的RNA配列との間でも同じように破壊される）。代わりの態様において、DsiRNAmmのアンチセンス鎖のミスマッチ塩基対ヌクレオチドは、DsiRNAmmのセンス鎖配列の対応するヌクレオチドとミスマッチ塩基対を形成するだけであり、それでも、この同じアンチセンス鎖ヌクレオチドは、その対応する標的RNA配列ヌクレオチドと塩基対形成する（したがって、アンチセンス鎖配列とセンス鎖配列との間の相補性は、siRNAmm内でミスマッチ塩基対にて破壊され、それでも、相補性は、DsiRNAmmのアンチセンス鎖配列と標的RNA配列との間で維持される）。
【０２３８】
上記の通りに、ミスマッチ寛容な領域内に単一のミスマッチ塩基対を有する本発明のDsiRNAmm（たとえば、アンチセンス鎖の位置11、12、13、14、15、16、17、18または19にてミスマッチのヌクレオチド残基を有するDsiRNAmm）は、1、2または3つのさらなるミスマッチ塩基対をさらに含むことができる。好ましい態様において、DsiRNAmmのこれらの1、2または3つのさらなるミスマッチ塩基対は、アンチセンス鎖の位置11、12、13、14、15、16、17、18および／または19にて（およびセンス鎖の対応する残基にて）生じる。1つのさらなるミスマッチ塩基対がDsiRNAmm内で存在する一つの態様において、アンチセンス鎖の2つのミスマッチ塩基対は、たとえば、アンチセンス鎖の位置14および位置18両方のヌクレオチドにて生じることができる（ミスマッチは、またセンス鎖の対応するヌクレオチド残基にて生じる）。
【０２３９】
2つのミスマッチ塩基対を有するDsiRNAmm薬剤において、ミスマッチは、連続的に生じることができる（たとえば、アンチセンス鎖ヌクレオチド配列に沿った連続した位置にて）。あるいは、センス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖のヌクレオチドは、
センス鎖配列と塩基対を形成するヌクレオチドによって散在させることができる（たとえば、位置13および14においてではなく、位置12および15にてミスマッチのヌクレオチドを有するDsiRNAmmについては、アンチセンス鎖位置12および15のミスマッチの残基は、センス鎖の対応する残基とマッチした塩基対を形成する2つのヌクレオチドによって散在される）。たとえば、対応するセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖の2つの残基（センス鎖のミスマッチ寛容な領域内に位置する）は、これらのミスマッチ塩基対の間に位置するゼロ、1、2、3、4、5、6または7つのマッチした塩基対で生じることができる。
【０２４０】
3つのミスマッチ塩基対を有する一定のDsiRNAmm薬剤については、ミスマッチは、連続的に生じることができる（たとえば、アンチセンス鎖ヌクレオチド配列に沿った三連で）。あるいは、センス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖のヌクレオチドは、センス鎖配列とマッチした塩基対を形成するヌクレオチドによって散在させることができる（たとえば、位置15、16および17においてではなく、位置13、14および18にてミスマッチのヌクレオチドを有するDsiRNAmmについては、アンチセンス鎖位置13および14のミスマッチの残基は、互いと隣接し、一方で、アンチセンス鎖位置14および18のミスマッチの残基は、センス鎖の対応する残基とマッチした塩基対を形成する3つのヌクレオチドによって散在される）。たとえば、対応するセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖の3つの残基（アンチセンス鎖のミスマッチ寛容な領域内に位置する）は、これらのミスマッチ塩基対のいずれか2つの間に位置したゼロ、1、2、3、4、5または6つのマッチした塩基対で生じることができる。
【０２４１】
4つのミスマッチ塩基対を有する一定のDsiRNAmm薬剤については、ミスマッチは、連続的に生じることができる（たとえば、アンチセンス鎖ヌクレオチド配列に沿った四連で）。あるいは、センス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖のヌクレオチドは、センス鎖配列とマッチした塩基対を形成するヌクレオチドによって散在させることができる（たとえば、位置14および16においてではなく、位置13、15、17および18にてミスマッチのヌクレオチドを有するDsiRNAmmについては、アンチセンス鎖位置17および18のミスマッチの残基は、互いに隣接し、かつ一方で、アンチセンス鎖位置13および15のミスマッチの残基は、センス鎖の対応する残基とマッチした塩基対を形成する1つのヌクレオチドによって散在され-同様に、アンチセンス鎖位置15および17のミスマッチの残基は、またセンス鎖の対応する残基とマッチした塩基対を形成する1つのヌクレオチドによって散在される）。たとえば、対応するセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖の4つの残基（アンチセンス鎖のミスマッチ寛容な領域内に位置する）は、これらのミスマッチ塩基対のいずれか2つの間に位置するゼロ、1、2、3、4または5マッチした塩基対で生じることができる。
【０２４２】
さらなる態様において、たとえば図41に図示したように、本発明のDsiRNAmmは、左側拡張DsiRNAのアンチセンス鎖の位置15、16、17、18、19、20、21、22または23のいずれか1つにて単一のミスマッチ塩基対ヌクレオチドを有する（位置1は、アンチセンス鎖の5'末端ヌクレオチドであり、かつ位置15は、アンチセンス鎖配列と十分に相補的な標的RNA配列の突出したAgo2切断部位のアンチセンス鎖においてアンチセンス鎖のすぐ3'（下流）であるヌクレオチド残基である）。一定の態様において、DsiRNAmmのセンス鎖に関してアンチセンス鎖の位置15、16、17、18、19、20、21、22または23のいずれかにてミスマッチ塩基対ヌクレオチドを有するDsiRNAmmについては、アンチセンス鎖のミスマッチ塩基対ヌクレオチドは、DsiRNAmmセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するだけでなく、DsiRNAmm標的RNA配列ともミスマッチ塩基対を形成する（したがって、アンチセンス鎖配列とセンス鎖配列との間の相補性は、DsiRNAmm内でミスマッチ塩基対にて破壊され、かつ相補性は、DsiRNAmmのアンチセンス鎖配列と標的RNA配列との間も同じように破壊される）。代わりの態様において、DsiRNAmmのアンチセンス鎖のミスマッチ塩基対ヌクレオチドは、DsiRNAmmのセンス鎖配列の対応するヌクレオチドとミスマッチ塩基対を形成するだけであり、それでも、この同じアンチセンス鎖ヌクレオチドは、その対応する標的RNA配列ヌクレオチドと塩基対形成する（したがって、アンチセンス鎖配列とセンス鎖配列との間の相補性は、DsiRNAmm内でミスマッチ塩基対にて破壊され、それでも、相補性は、DsiRNAmmのアンチセンス鎖配列と標的RNA配列との間で維持される）。
【０２４３】
上記の通りに、ミスマッチ寛容な領域内に単一のミスマッチ塩基対を有する本発明のDsiRNAmm（たとえば、アンチセンス鎖の位置15、16、17、18、19、20、21、22または23にてミスマッチのヌクレオチド残基を有するDsiRNAmm）は、1、2または3つのさらなるミスマッチ塩基対をさらに含むことができる。好ましい態様において、DsiRNAmmのこれらの1、2または3つのさらなるミスマッチ塩基対は、アンチセンス鎖の位置15、16、17、18、19、20、21、22および／または23にて（およびセンス鎖の対応する残基にて）生じる。1つのさらなるミスマッチ塩基対がDsiRNAmm内で存在する一つの態様において、アンチセンス鎖の2つのミスマッチ塩基対は、たとえば、アンチセンス鎖の位置16および位置20両方のヌクレオチドにて生じることができる（ミスマッチは、またセンス鎖の対応するヌクレオチド残基にて生じる）。
【０２４４】
2つのミスマッチ塩基対を有するDsiRNAmm薬剤において、ミスマッチは、連続的に生じることができる（たとえば、アンチセンス鎖ヌクレオチド配列に沿った連続した位置にて）。あるいは、センス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖のヌクレオチドは、センス鎖配列と塩基対を形成するヌクレオチドによって散在させることができる（たとえば、位置17、18および19においてではなく、位置16および20にてミスマッチのヌクレオチドを有するDsiRNAmmについては、アンチセンス鎖位置16および20のミスマッチの残基は、センス鎖の対応する残基とマッチした塩基対を形成する3つのヌクレオチドによって散在される）。たとえば、対応するセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖の2つの残基（センス鎖のミスマッチ寛容な領域内に位置する）は、これらのミスマッチ塩基対の間に位置するゼロ、1、2、3、4、5、6または7つのマッチした塩基対で生じることができる。
【０２４５】
3つのミスマッチ塩基対を有する一定のDsiRNAmm薬剤については、ミスマッチは、連続的に生じることができる（たとえば、アンチセンス鎖ヌクレオチド配列に沿った三連で）。あるいは、センス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖のヌクレオチドは、センス鎖配列とマッチした塩基対を形成するヌクレオチドによって散在させることができる（たとえば、位置18、19および20においてではなく、位置16、17および21にてミスマッチのヌクレオチドを有するDsiRNAmmについては、アンチセンス鎖位置16および17のミスマッチの残基は、互いに隣接し、一方で、アンチセンス鎖位置17および21のミスマッチの残基は、センス鎖の対応する残基とマッチした塩基対を形成する3つのヌクレオチドによって散在される）。たとえば、対応するセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖の3つの残基（アンチセンス鎖のミスマッチ寛容な領域内に位置する）は、これらのミスマッチ塩基対のいずれか2つの間に位置したゼロ、1、2、3、4、5または6つのマッチした塩基対で生じることができる。
【０２４６】
4つのミスマッチ塩基対を有する一定のDsiRNAmm薬剤については、ミスマッチは、連続的に生じることができる（たとえば、アンチセンス鎖ヌクレオチド配列に沿った四連で）。あるいは、センス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖のヌクレオチドは、センス鎖配列とマッチした塩基対を形成するヌクレオチドによって散在させることができる（たとえば、位置18および20においてではなく、位置17、19、21および22にてミスマッチのヌクレオチドを有するDsiRNAmmについては、アンチセンス鎖位置21および22のミスマッチの残基は、互いに隣接し、一方で、アンチセンス鎖位置17および19のミスマッチの残基は、センス鎖の対応する残基とマッチした塩基対を形成する1つのヌクレオチドによって散在され-同様に、アンチセンス鎖位置19および21のミスマッチの残基は、またセンス鎖の対応する残基とマッチした塩基対を形成する1つのヌクレオチドによって散在される）。たとえば、対応するセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖の4つの残基（アンチセンス鎖のミスマッチ寛容な領域内に位置する）は、これらのミスマッチ塩基対のいずれか2つの間に位置するゼロ、1、2、3、4または5つのマッチした塩基対で生じることができる。
【０２４７】
明快さの理由で、上記のDsiRNAmm薬剤内のミスマッチのヌクレオチド残基の位置は、DsiRNAmmのセンスまたはアンチセンス鎖の5'末端残基に関して番号をつけてある。図20、21および22において例証される異なる左に拡張DsiRNAmm薬剤について言及したように、アンチセンス鎖のミスマッチ寛容な領域（ミスマッチ領域）内に位置する位置の番号付けは、アンチセンス鎖の5'末端の付近の変異により、突出したAgo2切断部位に移動することができる。したがって、アンチセンス鎖またはセンス鎖のずれかの中の好ましいミスマッチ部位の位置は、また突出したAgo切断部位2に対するこのようなミスマッチの近接を許容できると同定することができる。したがって、一つの好ましい態様において、DsiRNAmmのセンス鎖のミスマッチヌクレオチドの位置は、対応する標的RNA配列の突出したAgo2切断部位のすぐ5'（上流）に位置するセンス鎖のヌクレオチド残基である。他の好ましい態様において、DsiRNAmmのセンス鎖のミスマッチヌクレオチドは、突出したAgo2切断部位の2ヌクレオチド5'（上流）、突出したAgo2切断部位の3ヌクレオチド5'（上流）、突出したAgo2切断部位の4ヌクレオチド5'（上流）、突出したAgo2切断部位の5ヌクレオチド5'（上流）、突出したAgo2切断部位の6ヌクレオチド5（上流）、突出したAgo2切断部位の7ヌクレオチド5'（上流）、突出したAgo2切断部位の8ヌクレオチド5'（上流）または突出したAgo2切断部位の9ヌクレオチド5'（上流）に位置するセンス鎖のヌクレオチド残基に位置する。
【０２４８】
例示的な単一のミスマッチ含む25／27mer DsiRNAs（DsiRNAmm）は、以下の構造を含む（このようなミスマッチを含む構造は、また本明細書において示したその他の例示的なDsiRNA構造に、組み込まれてもよい）。
【０２４９】
【化４】
0005855463.tif 000006
式中、「X」=RNA（「D」=DNA、「p」=ホスフェート基、「M」=鎖がアニールされたときに、その相補鎖の対応する「M」残基と塩基対形成（水素結合）をしない核酸残基（RNA、DNAまたは非自然または修飾された核酸）。このような薬剤の残基のいずれも、任意に2'-O-メチルRNA単量体であることができ−示したように、下の（第2）鎖の3'末端残基から始まる2'-O-メチルRNA単量体の交互の位置を、また上記のDsiRNAmm薬剤に使用することができる。
上記のミスマッチ構造については、上の鎖は、センス鎖であり、かつ下の鎖は、アンチセンス鎖である。
【０２５０】
一定の態様において、本発明のDsiRNAは、DsiRNAの2つの鎖内のミスマッチ塩基対として必ずしも存在するというわけではない標的RNA配列に関して存在するミスマッチを含むことができ-したがって、DsiRNAは、DsiRNAの第1と第2との鎖の間に完全な相補性を有することができるが、さらに標的RNAに関して、ミスマッチの残基を有することができる（これは、一定の態様において、有効性および／または能力および／または効果の期間を促進するのに有利であろう）。ミスマッチがアンチセンス鎖と標的RNA配列との間に生じる一定の態様において、ミスマッチの位置は、標的領域の突出したAgo2切断部位の5'に位置するセンス鎖の配列に対応する位置にてアンチセンス鎖内に位置し-たとえば、標的配列の突出したAgo2切断部位に対して相補的であるアンチセンス残基の3’に対してアンチセンス鎖内に位置したアンチセンス残基である（このような領域は、たとえば、「ミスマッチ領域」として図33内に示してあり、これは、このようなDsiRNAsの突出した「シード領域」とは異なっている）。
【０２５１】
標的配列に関して単一のミスマッチの残基を有する例示的な25／27mer DsiRNAsは、以下の好ましい構造を含む。
標的RNA配列：5'-. . AXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX . . .-3'
DsiRNAmmセンス鎖：5'-pXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
DsiRNAmmアンチセンス鎖：3'-EXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXp-5'
標的RNA配列：5'-. . XAXXXXXXXXXXXXXXXXXXX . . .-3'
DsiRNAmmセンス鎖：5'-pXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
DsiRNAmmアンチセンス鎖：3'-XEXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXp-5'
標的RNA配列：5'-. . . AXXXXXXXXXXXXXXXXXX . . .-3'
DsiRNAmmセンス鎖：5'-pBXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
DsiRNAmmアンチセンス鎖：3'-XXEXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXp-5'
標的RNA配列：5'-. . . XAXXXXXXXXXXXXXXXXX . . .-3'
DsiRNAmmセンス鎖：5'-pXBXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
DsiRNAmmアンチセンス鎖：3'-XXXEXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXp-5'
標的RNA配列：5'-. . . XXAXXXXXXXXXXXXXXXX . . .-3'
DsiRNAmmセンス鎖：5'-pXXBXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
DsiRNAmmアンチセンス鎖：3'-XXXXEXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXp-5'
標的RNA配列：5'-. . . XXXAXXXXXXXXXXXXXXX . . .-3'
DsiRNAmmセンス鎖：5'-pXXXBXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
DsiRNAmmアンチセンス鎖：3'-XXXXXEXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXp-5'
標的RNA配列：5'-. . . XXXXAXXXXXXXXXXXXXX . . .-3'
DsiRNAmmセンス鎖：5'-pXXXXBXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
DsiRNAmmアンチセンス鎖：3'-XXXXXXEXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXp-5'
標的RNA配列：5'-. . . XXXXXAXXXXXXXXXXXXX . . .-3'
DsiRNAmmセンス鎖：5'-pXXXXXBXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
DsiRNAmmアンチセンス鎖：3'-XXXXXXXEXXXXXXXXXXXXXXXXXXXp-5'
標的RNA配列：5'-. . . XXXXXXAXXXXXXXXXXXX . . .-3'
DsiRNAmmセンス鎖：5'-pXXXXXXBXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
DsiRNAmmアンチセンス鎖：3'-XXXXXXXXEXXXXXXXXXXXXXXXXXXp-5'
標的RNA配列：5'-. . . XXXXXXXAXXXXXXXXXXX . . .-3'
DsiRNAmmセンス鎖：5'-pXXXXXXXBXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
DsiRNAmmアンチセンス鎖：3'-XXXXXXXXXEXXXXXXXXXXXXXXXXXp-5'
標的RNA配列：5'-. . . XXXXXXXXAXXXXXXXXXX . . .-3'
DsiRNAmmセンス鎖：5'-pXXXXXXXXBXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
DsiRNAmmアンチセンス鎖：3'-XXXXXXXXXXEXXXXXXXXXXXXXXXXp-5'
式中、「X」=RNA（「D」=DNA、「p」=ホスフェート基、「E」=鎖がアニールされるときに他の相補（標的）鎖の対応する「A」RNA残基と塩基対形成（水素結合）をせず、さらに任意に、対応する「B」残基（「B」残基は、またRNA、DNAまたは非自然または修飾された核酸である）と塩基対形成をする核酸残基（RNA、DNAまたは非自然または修飾された核酸）。このような薬剤の残基のいずれも、任意に2'-O-メチルRNA単量体であることができ−たとえば、上に示したように、下の（第2）鎖の3'末端残基から始まる2'-O-メチルRNA単量体の交互の位置、または、2'-O-メチルのその他のパターンおよび／または本明細書において記述したその他の修飾を、また上記のDsiRNA薬剤に使用することができる。
【０２５２】
上で例示した構造に加えて、本発明のDsiRNAsは、また標的RNA配列とさらなるミスマッチを形成する1、2または3つのさらなる残基を有することができる。このようなミスマッチは、連続することができ、または標的RNA配列とマッチした塩基対を形成するヌクレオチドによって散在させることができる。マッチした塩基対を形成するヌクレオチドによって散在される場合、ミスマッチの残基は、このようなミスマッチ形成残基の間に1、2、3、4、5、6、7またはさらに8塩基対形成したヌクレオチド間隔にて単一の鎖内で互いに離れて間隔を置くことができる。
【０２５３】
上記のDsiRNAmm薬剤に関しては、標的RNA配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖ヌクレオチドのためのDsiRNAs内の好ましい位置（さらに、対応するセンス鎖ヌクレオチドとミスマッチを形成しても、または形成はしなくてもよい）は、DsiRNAの突出したAgo2切断部位に対して相補的であるアンチセンス鎖配列の3’（下流）に位置するアンチセンス鎖領域内にある（たとえば、図39において、「ミスマッチ領域」とラベルしたアンチセンス鎖の領域は、ミスマッチ形成残基のための好ましく、および図39に示した薬剤についてアンチセンス鎖の位置13〜21にて位置する）。したがって、一つの好ましい態様において、DsiRNAmmのアンチセンス鎖のミスマッチヌクレオチドの（標的RNA配列に関する）位置は、対応する標的RNA配列の突出したAgo2切断部位のアンチセンス鎖配列内のすぐ3'（下流）に位置するアンチセンス鎖のヌクレオチド残基である。他の好ましい態様において、DsiRNAmmのアンチセンス鎖のミスマッチヌクレオチドは（標的RNA配列に関して）、突出したAgo2切断部位の2ヌクレオチド3'（下流）、対応する突出したAgo2切断部位の3ヌクレオチド3'（下流）、対応する突出したAgo2切断部位の4ヌクレオチド3'（下流）、対応する突出したAgo2切断部位の5ヌクレオチド3'（下流）、対応する突出したAgo2切断部位の6ヌクレオチド3'（下流）、突出したAgo2切断部位の7ヌクレオチド3'（下流）、突出したAgo2切断部位の8ヌクレオチド3'（下流）または突出したAgo2切断部位9ヌクレオチド3'（下流）に位置するアンチセンス鎖のヌクレオチド残基に位置する。
【０２５４】
2つのミスマッチを形成するアンチセンス鎖のヌクレオチドを有するDsiRNA薬剤において（ミスマッチ形成ヌクレオチドが、標的RNA配列に関して形成されるミスマッチである場合）、ミスマッチは、連続的に生じることができる（たとえば、アンチセンス鎖ヌクレオチド配列に沿った連続した位置にて）。あるいは、標的RNA配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖のヌクレオチドは、標的RNA配列と塩基対を形成するヌクレオチドによって散在させることができる（たとえば、位置14および15においてではなく、位置13および16（図39に示した構造のアンチセンス鎖の5'末端（位置1）から始まる）にてミスマッチ形成ヌクレオチドを有するDsiRNAについては、センス鎖位置13および16のミスマッチの残基は、標的RNA配列の対応する残基とマッチした塩基対を形成する2つのヌクレオチドによって散在される。たとえば、対応する標的RNA配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖の2つの残基（アンチセンス鎖のミスマッチ寛容な領域内に位置する）は、（標的RNA配列に関して）これらのミスマッチ形成塩基対の間に位置するゼロ、1、2、3、4または5つのマッチした塩基対で生じることができる。
【０２５５】
3つのミスマッチ形成塩基対（標的RNA配列に関するミスマッチ-成形）を有する一定のDsiRNAsについては、ミスマッチ形成ヌクレオチドは、連続的に生じることができる（たとえば、アンチセンス鎖ヌクレオチド配列に沿った三連で）。あるいは、標的RNA配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖のヌクレオチドは、標的RNA配列とマッチした塩基対を形成するヌクレオチドによって散在させることができる（たとえば、位置15、16および17においてではなく、位置13、14および18にてミスマッチのヌクレオチドを有するDsiRNAについては、アンチセンス鎖位置13および14のミスマッチ形成残基は、互いに隣接し、一方で、アンチセンス鎖位置14および18のミスマッチ形成残基は、標的RNAの対応する残基とマッチした塩基対を形成する3つのヌクレオチドによって散在される）。たとえば、対応する標的RNA配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖の3つの残基（アンチセンス鎖のミスマッチ寛容な領域内に位置する）は、これらのミスマッチ形成塩基対のいずれか2つの間に位置するゼロ、1、2、3または4つのマッチした塩基対で生じることができる。
【０２５６】
4つのミスマッチ形成塩基対（標的RNA配列に関するミスマッチ-成形）を有する一定のDsiRNAsについては、ミスマッチ形成ヌクレオチドは、連続的に生じることができる（たとえば、センス鎖ヌクレオチド配列に沿った四連で）。あるいは、標的RNA配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖のヌクレオチドは、標的RNA配列とマッチした塩基対を形成するヌクレオチドによって散在させることができる（たとえば、位置14および16においてではなく、位置13、15、17および18にてミスマッチ-成形ヌクレオチドを有するDsiRNAについては、アンチセンス鎖位置17および18のミスマッチ-成形作業残基は、互いに隣接し、一方で、アンチセンス鎖位置13および15のミスマッチ形成残基は、標的RNA配列の対応する残基とマッチした塩基対を形成する1つのヌクレオチドによって散在され−同様に、アンチセンス鎖位置15および17のミスマッチ形成残基は、また標的RNA配列の対応する残基とマッチした塩基対を形成する1つのヌクレオチドによって散在される）。たとえば、対応する標的RNA配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖の4つの残基（アンチセンス鎖のミスマッチ寛容な領域内に位置する）は、これらのミスマッチ形成塩基対のいずれか2つの間に位置するゼロ、1、2または3つのマッチした塩基対で生じることができる。
【０２５７】
上記のDsiRNAmmおよびその他のDsiRNA構造は、DsiRNAmmおよびDsiRNA薬剤の一定の構造を例証するために記述される。上記のDsiRNAmmおよびDsiRNA構造の設計は、たとえば、下に示したとおり（たとえば、図14〜16および20〜22に示したようなミスマッチを含むDsiRNAmm薬剤の設計を含む）、DNA拡張された（「DNAハンドル」）DsiRNA薬剤のDsiRNAmm形態を産生するために適応することができる。上で例証されるように、DsiRNAのアンチセンス鎖と標的配列との間に単一のミスマッチ（または2、3または4つのミスマッチ）を有するが、DsiRNAのセンスとアンチセンス鎖配列との間に任意に完全な相補性を保持することができるDsiRNAsを、またデザインすることができる。
【０２５８】
下に例証したDsiRNA薬剤は、またこれらの二本鎖および／または標的RNA整列構造内に挿入／欠失（in/del）構造を有することができる点にさらに留意されたい。したがって、本発明のDsiRNAsは、たとえば、標的RNA配列と比較してアンチセンス鎖配列および／またはセンス鎖配列と比較してアンチセンス鎖配列のin/delバリエーションを有するようにデザインすることができ、このようなin/delヌクレオチドの配置のための好ましい位置は、ミスマッチのおよび／またはミスマッチ形成塩基対の位置について上に記述した位置に対応する。
【０２５９】
一定の態様において、上記の構造のいずれかの「D」残基は、少なくとも1つのPS-DNAまたはPS-RNAを含む。任意に、上記の構造のいずれかの「D」残基は、Dicer切断を阻害する少なくとも1つの修飾されたヌクレオチドを含む。
【０２６０】
上記の「DNA拡張された」DsiRNA薬剤は、「左に拡張した」たは「右に拡張した」のいずれかに分類することができるが、単一の薬剤（たとえば、コアdsRNA構造を囲んでいる両方のフランクは、dsDNA拡張である）内に左および右の両方の拡張DNA含有配列を含むDsiRNA薬剤は、また「右に拡張された」および「左に拡張された」薬剤について本明細書において記述したものに類似の様式で産生すること、および使用することができる。
【０２６１】
一部の態様において、本発明のDsiRNAは、DNA：DNA拡張DsiRNA薬剤のセンスおよびアンチセンス鎖を連結する結鎖部分またはドメインをさらに含む。任意に、このような結鎖部分ドメインは、センス鎖の3'末端およびアンチセンス鎖の5'末端を連結する。結鎖部分は、オリゴメチルエンジオールリンカー、オリゴエチレングリコールリンカーまたはその他の当業者に認識されるリンカー部分などの化学的（非ヌクレオチド）リンカーでもよい。あるいは、リンカーは、任意に拡張されたループおよび／またはテトラループを含む、ヌクレオチドリンカーであることができる。
【０２６２】
一つの態様において、DsiRNA薬剤は、27塩基対長を有するセンス鎖、2塩基3'-オーバーハングをもつ29ヌクレオチド長を有するアンチセンス鎖（およびしたがって、DsiRNA薬剤は、センス鎖の3'末端／アンチセンス鎖の5'末端にて、平滑末端を有する）をもつ、並びにセンス鎖の位置24および25に位置するデオキシリボヌクレオチド（センス鎖の5'にて位置1からの番号付け）およびアンチセンス鎖の同種のデオキシリボヌクレオチドと対形成したそれぞれの塩基をもつ、非対称の構造を有する。もう一つの態様において、このDsiRNA薬剤は、センス鎖の3'末端にて2つのデオキシリボヌクレオチドをさらに含む非対称構造を有する。
【０２６３】
もう一つの態様において、DsiRNA薬剤は、30ヌクレオチド長を有するセンス鎖、センス鎖の3'末端に位置する2つのヌクレオチド3'オーバーハングをもつ28ヌクレオチド長を有するアンチセンス鎖をもつ、非対称構造を有する。このDsiRNA薬剤のアンチセンス鎖の3'末端およびセンス鎖の5'末端は平滑末端を形成し、センス鎖の5'末端にて位置1から始まって、位置1〜5は、アンチセンス鎖の3'末端領域の同種のデオキシリボヌクレオチドと二重鎖を形成するようにハイブリダイズするデオキシリボヌクレオチドである。任意に、アンチセンス鎖の5'末端にて位置1から始まって、アンチセンス鎖の位置11〜21（一定の態様において、位置13〜21）は、センス鎖の対応するヌクレオチドと、またはアンチセンス鎖および標的RNA配列がハイブリダイズして二重鎖を形成するときに標的RNA配列の対応するヌクレオチドと、またはセンス鎖および標的RNA配列の両方のいずれかとミスマッチ塩基対を形成する1つまたは複数のヌクレオチドを有する。任意に、センス鎖の5'末端の最後および最後から2番目のヌクレオチド、並びにアンチセンス鎖の3'末端の最後および最後から2番目のヌクレオチドは、1つまたは複数のホスホロチオアートを含む（任意に、センス鎖の5'末端およびアンチセンス鎖の3'末端の両方の最後および最後から2番目の残基を構成する2つのアンチセンス鎖デオキシリボヌクレオチド、2つのセンス鎖デオキシリボヌクレオチドまたは全ての4デオキシリボヌクレオチドは、ホスホロチオアートを有する）。
【０２６４】
DsiRNAsの修飾
二重鎖RNA（「dsRNA」）の効果を阻害する1つの主要な要因は、ヌクレアーゼによるdsRNA（たとえば、siRNAsおよびDsiRNAs）の分解である。3'-エキソヌクレアーゼは、血清に存在する一次ヌクレアーゼ活性であり、かつアンチセンスDNAオリゴヌクレオチドの3'末端の修飾は、分解を防止するために重要である（Eder et al., 1991）。RNase-Tファミリーヌクレアーゼは、siRNAsの制御および分解に関与する3'から5'エキソヌクレアーゼ活性を有する、いわゆるERI-1として同定された（Kennedy et al., 2004；Hong et al., 2005）。この遺伝子は、マウスにおけるThex1（NM__02067）またはヒトにおけるTHEX1（NM__153332）としても知られ、ヒストンmRNAの分解に関与し；これは、またsiRNAsにおける3'-オーバーハングの分解を媒介するが、二重鎖RNAを分解しない（Yang et al., 2006）。したがって、本発明のDsiRNAsを含む、dsRNAの3'末端を安定化により、安定性を改善するだろうと予想することは、合理的である。
【０２６５】
XRN1（NM__019001）は、P-体にある5'から3'エキソヌクレアーゼであり、miRNAによってターゲットされるmRNAの分解において関係しており（Rehwinkel et al., 2005）、またsiRNAによって指揮されるような、内部切断によって開始される分解を完了する役割を果たしているだろう。XRN2（NM __012255）は、核RNAプロセシングに関与する異なる5'〜3'エキソヌクレアーゼである。現在siRNAsおよびmiRNAの分解またはプロセシングに関係しないが、これらは、両方ともRNAを分解することができる公知のヌクレアーゼであり、また考慮することが重要であろう。
【０２６６】
RNase Aは、RNAを分解する哺乳類における主要なエンドヌクレアーゼ活性である。これは、ssRNAに特異的であり、ピリミジン塩基の3'末端にて切断する。RNase A切断に対応するSiRNA分解産物は、血清におけるインキュベーションの後、質量分析によって検出することができる（Turner et al., 2007）。3'-オーバーハングは、RNase分解に対するsiRNAsの感受性を増強する。血清からのRNase Aの枯渇は、siRNAsの分解を減少させ；この分解は、いくつかの配列優先度を示し、末端にポリA／U配列を有する配列に対しては劣る（Haupenthal et al., 2006）。これは、二重鎖のより低い安定性領域が「呼吸し」、および一過性にRNase Aによる分解を利用できる一本鎖の種を提供し得る可能性がを示唆する。siRNA阻害剤を血清に添加することができ、siRNAの長寿命および能力を改善することができる（Haupenthal et al., 2007）。
【０２６７】
21mersでは、ホスホロチオアートまたはボラノホスフェート修飾は、ヌクレオシド間ホスフェート結合を直接的に安定化する。ボラノホスフェート修飾RNAは、高度にヌクレアーゼ耐性で、サイレンシング薬剤として強力なであり、および比較的無毒である。ボラノホスフェート修飾RNAは、標準的な化学的合成法を使用して製造することができず、その代わりにインビトロでの転写（IVT）によって作製される（Hall et al., 2004およびHall et al., 2006）。RNAサイレンシング活性を保持するRNA二重鎖内においてこのような修飾を使用する能力は、制限され得るにもかかわらず、ホスホロチオアート（PS）修飾は、任意の所望の位置にてRNA二重鎖において容易に配置することができ、標準的な化学的合成法を使用して作製することができる。図2に存在する明細書に示したとおり（二重鎖#8）、同種の直列型の一連のPS修飾されたデオキシリボヌクレオチド残基と塩基対形成する直列型の一連の配置で複数のPS修飾されたデオキシリボヌクレオチド残基の包含することにより、さもなければこれらの残基に存在する修飾されていないデオキシリボヌクレオチドのみで活性だった薬剤のRNAサイレンシング活性を無くした。PS部分は、RNA阻害活性を保持するためにRNA二重鎖を含む薬剤内に含まれたときに、より大きな間隔を必要とする可能性が高いので、本明細書に記述したものなどの拡張DsiRNAsは、単一のDsiRNA薬剤内に、このような拡張が使用されなかったさもなければ利用できるだろうより多くのPS修飾（PS-DNAまたはPS-RNA）を含む手段を提供することができる。しかし、PS修飾は、用量依存的毒性を示し、そして大部分の研究者は、siRNAsにおける限られた組み込みを推奨したきたし、歴史的には、ヌクレアーゼからの保護が最も重要である場合、3'末端を選択することに注意されたい（Harborth et al., 2003；ChiuおよびRana（2003）；Braasch et al., 2003；Amarzguioui et al., 2003）。より広範なPS修飾は、強力なRNAi活性と適合し得るが；しかし、糖修飾（たとえば、2'-O-メチルRNA）の使用が優れているであろう（Choung et al., 2006）。
【０２６８】
多様な置換をリボースの2'-位置にて置くことができ、これは、一般に二重鎖安定性（Tm）を増加させ、かつヌクレアーゼ耐性を非常に改善することができる。2'-O-メチルRNAは、哺乳動物リボソームRNAおよび転移RNAにおいて見いだされる天然に存在する修飾である。siRNAsにおける2'-O-メチル修飾は、公知であるが、二重鎖内の修飾された塩基の正確な位置は、能力を保持するために重要であり、かつRNAの2'-O-メチルRNAでの完全な置換は、siRNAを不活性化するだろう。たとえば、交互に2'-O-メチル塩基を使用するパターンは、修飾されていないRNAと銅との能力を有することができ、かつ血清において全く安定である（Choung et al., 2006；Czauderna et al., 2003）。
【０２６９】
また、2'-フルオロ（2'-F）修飾は、dsRNA（たとえば、siRNAおよびDsiRNA）機能と適合性であり；これは、最も一般的には、ピリミジン部位に置かれ（試薬コストおよび利用能のため）、プリン位置における2'-O-メチル修飾と組み合わせることができ；2'-Fプリンを利用でき、また使用することができる。この種の重く修飾された二重鎖は、インビトロにおけるRNAiの強力なトリガーであり得る（Allerson et al., 2005；Prakash et al., 2005；KraynackおよびBaker（2006）、インビボで使用したときに、性能を改善すること、および作用の期間を拡張することができる（Morrissey et al., 2005a；Morrissey et al., 2005b）。高度に強力な、交互に2'-Fおよび2'-O-Me塩基を含むヌクレアーゼ安定な、平滑19mer二重鎖がAllersonによって教示されている。この設計では、交互の2'-O-Me残基が、Czaudernaによって使用されるものと同一のパターンで位置するが、残りのRNA残基は、2'-F修飾された塩基に変換される。Morrisseyによって使用される高度に強力な、ヌクレアーゼ耐性のsiRNAは、インビボで高度に強力な、ヌクレアーゼ耐性のsiRNAを使用した。2'-O-Me RNAおよび2'-F RNAに加えて、この二重鎖は、DNA、RNA、反転された無塩基残基および3'末端PSヌクレオシド間結合を含む。広範な修飾は、一定の利益を有するが、二重鎖のより限定された修飾も、またインビボの性能を改善することができ、より単純であり、かつ製造コストが低い。Soutschek et al.（2004）は、インビボで二重鎖を使用して、大部分が2つの2'-O-Me RNA塩基および限定された3'末端PSヌクレオシド間結合をもつRNAであった。
【０２７０】
ロックド核酸（LNA）は、dsRNA（たとえば、siRNAおよびDsiRNA）を安定化するために使用することができる2'-修飾の異なる種類である。能力を保持するLNA組み込みのパターンは、2'-O-メチルまたは2'-F塩基よりも制限されるので、限定された修飾が好ましい（Braasch et al., 2003；Grunweller et al., 2003；Elmen et al., 2005）。限定された組み込みでさえ、LNA修飾の使用は、インビボでのdsRNA性能を改善することができ、またオフターゲット効果プロフィールを変化させ、または改善し得る（Mook et al., 2007）。
【０２７１】
細胞または生きている動物に導入された合成核酸は、「外来である」と認識され、免疫応答をトリガー得る。免疫刺激は、オフターゲット効果の主要なクラスを構成し、これは、実験結果を劇的に変え、およびさらに細胞死を引き起こし得る。生得的な免疫系は、これらの反応を媒介するDNAおよびRNAと特異的に相互作用する受容体分子のコレクションを含み、その幾つかは、原形質に位置し、およびその幾つかは、エンドソームにある（MarquesおよびWilliam、2005；Schlee et al., 2006）。カチオン脂質またはリポソームによるsiRNAsの送達は、細胞質およびエンドソームの両方のコンパートメントにsiRNAを曝露して、インビトロでおよびインビボで1型インターフェロン（IFN）反応をトリガーするリスクを最大にする（Morrissey et al., 2005b；SioudおよびSorensen（2003）；Sioud、2005；腫et al., 2005）。細胞内で転写されたRNAは、あまり免疫原性がなく（Robbins et al., 2006）、脂質に基づいた方法を使用してを送達されたときに免疫原性である合成RNAは、機械的手段によって細胞に導入されたときに、インビボでさえ、免疫刺激を避けることができる（Heidel et al., 2004）。しかし、脂質に基づいた送達方法は、便利で、有効で、かつ広く使用されている。全ての細胞タイプが存在し、免疫応答を発生するリスクが最高の場合、免疫応答を防止するためのいくつかの一般的なストラテジーが、特にインビボの適用のために必要である。化学修飾RNAの使用は、これらの問題のほとんどまたはさらに全てを解決し得る。
【０２７２】
一定の配列モチーフは、その他よりも明らかに免疫原性であるが、一般の生得的な免疫系の受容体は、一定の塩基修飾の有無を区別するように見え、これは、原核生物のRNAにおいてよりも哺乳動物RNAにおいてより共通に見いだされるる。たとえば、プソイドウリジン、N6-メチル-Aおよび2'-O-メチル改質塩基は、「自己」として認識され、合成RNAにおけるこれらの残基の包含は、免疫検出を避けるのを補助することができる（Kariko et al., 2005）。修飾されていないRNAとして強く免疫賦活性である配列の広範な2'-修飾は、マウスに静脈内に投与されたときに、免疫応答を遮断することができる（Morrissey et al., 2005b）。しかし、広範な修飾は、免疫検出を逃れるために必要ではなく、siRNA二重鎖の単一の鎖におけるわずか2つの2'-O-メチル塩基の置換は、インビトロおよびインビボの両方における1型IFN反応を遮断するために十分であり得るし；修飾UおよびG塩基が最も有効である（Judge et al., 2006）。さらなる利益として、2'-O-メチル塩基の選択的な組み込みは、オフターゲット効果の大きさを減少させることができる（Jackson et al., 2006）。したがって、2'-O-メチル塩基の使用は、免疫応答を遮断する手段としてインビボでの適用が意図される全てのdsRNAについて考慮されるべきであり、ヌクレアーゼ安定性を改善し、かつオフターゲット効果の可能性を減少させるさらなる利益を有する。
【０２７３】
細胞死は、免疫刺激により生じ得るが、細胞生存度を評価することは、IFN反応の誘導をモニターするための適切な方法ではない。IFN反応は、細胞死を伴わずに存在し得るし、細胞死は、IFNトリガリングの非存在下での標的ノックダウンにより生じ得る（たとえば、ターゲットされた遺伝子が細胞生存にとって必須である場合）。関連したサイトカインは、培養液において直接測定することができ、このようなアッセイをルーチンで行うようにする様々な市販のキットが存在する。多数の異なる免疫エフェクター分子を測定することができるが、スクリーニング目的のためには、通常、トランスフェクションの後4および24時間におけるIFN-α、TNF-αおよびIL-6のレベルを試験することで十分である。カチオン性脂質は、任意の核酸積荷の非存在下で一定の細胞における免疫応答をトリガーし得るので、「トランスフェクション試薬飲みの対照」を含むことが重要である。IFN経路誘導のために対照を含めることを、細胞培養研究のために考慮するべきである。IFN反応をトリガーするリスクが最高である、インビボで核酸を投与するときはいつでも、免疫刺激について試験することが必須である。
【０２７４】
修飾により、DsiRNA薬剤がDicerのための基質として役に立つのを妨げない限り、修飾を本発明のDsiRNA薬剤に含めることができる。実際に、本発明の1つの驚くべき発見は、塩基対デオキシリボヌクレオチドを前述したDsiRNA分子に付着することができ、RNAi有効性および期間の増強を生じるということであり、ただし、このようなその拡張は、Dicerプロセシングを妨げない拡張分子の領域において行われる（たとえば、センス鎖のDicer切断部位の3'／アンチセンス鎖のDicer切断部位の5'）ことを条件とする。一つの態様において、DsiRNA薬剤のDicerプロセシングを増強する1つまたは複数の修飾が行われる。第2の態様において、より有効なRNAi生成を生じる1つまたは複数の修飾が行われる。第3の態様において、より大きなRNAi効果を支持する1つまたは複数の修飾が行われる。第4の態様において、細胞に送達されるそれぞれのDsiRNA薬剤分子当たりより大きな能力を生じる1つまたは複数の修飾が行われる。修飾は、3'末端領域、5'末端領域において、3'末端および5'末端領域の両方において、またはいくつかの例において、配列内の種々の位置において組み込むことができる。上で言及した制限に留意して、任意の修飾の数および組み合わせをDsiRNA薬剤に組み込むことができる。複数の修飾が存在する場合、これらは同じでも、または異なってもよい。塩基、糖部分、ホスフェートバックボーンおよびこれらの組み合わせに対する修飾が想定される。いずれの5'末端をリン酸化することもできる。
【０２７５】
ホスフェートバックボーンについて想定される修飾の例は、メチルホスホナート、ホスホロチオアートおよびアルキルホスホトリエステルなどのホスホトリエステル修飾等を含むホスホナートを含む。糖部分について想定される修飾の例は、2'-O-メチル、2'-フルオロ、アミノおよびデオキシ修飾などの2'-アルキルピリミジン等を含む（たとえば、Amarzguioui et al., 2003を参照されたい）。塩基群について想定される修飾の例は、無塩基糖、2-O-アルキル修飾されたピリミジン、4‐チオウラシル、5-ブロモウラシル、5-ヨードウラシルおよび5-（3-アミノアリル）-ウラシル等を含む。ロックド核酸またはLNAのものも組み込むことができる。多くのその他の修飾が公知であり、上記の基準を満たす限り、使用することができる。修飾の例は、米国特許第5,684,143号、第5,858,988号および第6,291,438号においておよび米国公開特許出願番号2004/0203145A1においても開示される。その他の修飾は、Herdewijn（2000）、Eckstein（2000）、Rusckowski et al.（2000）、Stein et al.（2001）；Vorobjev et al.（2001）において開示される。
【０２７６】
想定される1つまたは複数の修飾は、いずれの鎖にも組み込むことができる。DsiRNA薬剤における修飾の配置は、DsiRNA薬剤の特徴に非常に影響を及ぼし得るし、より優れた能力および安定性を与えること、毒性を減少させること、Dicerプロセシングを増強すること、および免疫応答を最小化することを含む。一つの態様において、アンチセンス鎖もしくはセンス鎖または両方の鎖は、1つまたは複数の2'-O-メチル修飾されたヌクレオチドを有する。もう一つの態様において、アンチセンス鎖は、2'-O-メチル修飾ヌクレオチドを含む。もう一つの態様において、アンチセンススタンドは、2'-O-メチル修飾されたヌクレオチドで構成される3'オーバーハングを含む。アンチセンス鎖は、また、さらなる2'-O-メチル修飾されたヌクレオチドを含むことができる。
【０２７７】
本発明の一定の態様において、DsiRNA薬剤は、Dicerによるそのプロセシングを増強する1つまたは複数の特性を有する。これらの態様にしたがって、DsiRNA薬剤は、Dicerによってプロセスされて活性なsiRNAおよび以下の特性の少なくとも1つを生じるように、十分な長さを有する：（i）たとえば、DsiRNA薬剤は、非対称であるアンチセンス鎖上の3'オーバーハングを有し、および（ii）DsiRNA薬剤は、Dicer結合の向きおよび活性なsiRNAへのdsRNA領域のプロセシングを方向付けるために、センス鎖上に修飾された3'末端を有する。このような態様において、Dicer酵素切断の突出した部位に対して3'であるセンス鎖の領域およびDicer酵素切断の突出した部位の5'であるアンチセンス鎖の対応する領域における1つまたは複数の塩基対形成したデオキシリボヌクレオチドの存在は、Dicer酵素切断の適切な方向性のためにこのような分子を正しい位置に置くためにも役に立ち得る。
【０２７８】
一定の態様において、dsDNA領域の長さ（またはDNA：DNA塩基対を含む領域の長さ）は、1〜50塩基対、任意に2〜30塩基対、好ましくは2〜20の塩基対およびより好ましくは、2〜15塩基対である。したがって、本発明のDNA：DNA拡張DsiRNAは、長さが1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50またはより多くの（たとえば、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60またはより多くの）塩基対であるdsDNA領域を有してもよい。
【０２７９】
一部の態様において、dsNAにおいて最も長い鎖は、29〜43ヌクレオチドを含む。一つの態様において、DsiRNA薬剤は、センス鎖の3'末端およびアンチセンス鎖の5'末端が平滑末端を形成し、かつアンチセンス鎖の3'末端は、センス鎖の5'末端に突出するように、非対称である。一定の態様において、アンチセンス鎖の3'オーバーハングは、1〜10ヌクレオチドであり、および任意に1〜4ヌクレオチド、たとえば2ヌクレオチドである。センスおよびアンチセンス鎖は、また5'ホスフェートを有してもよい。
【０２８０】
一定の態様において、塩基対形成したデオキシリボヌクレオチド残基を含む本発明のDsiRNAのセンス鎖は、26ヌクレオチド〜39以上のヌクレオチドの間（たとえば、センス鎖は、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50またはより多くのの合計長を有する（たとえば、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60またはより多くの）ヌクレオチドの長さを有する）。一定の態様において、センス鎖の長さは、26ヌクレオチド〜39ヌクレオチドの間、任意に27〜35ヌクレオチドの間または任意に27および33ヌクレオチドの間の長さである。関連した態様において、アンチセンス鎖は、27〜43以上のヌクレオチド（たとえば、センス鎖は、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50またはより多くのの長さを有する（たとえば、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60またはより多くの）ヌクレオチドの長さを有する）。一定のこのような態様において、アンチセンス鎖は、長さが27〜43ヌクレオチドの間、または長さが27〜39ヌクレオチドの間、または長さが27〜35ヌクレオチドの間、または長さが28〜37ヌクレオチドの間、または任意に長さが29〜35ヌクレオチドの間の長さを有する。
【０２８１】
一定の態様において、Dicer酵素切断の突出した部位の3'であるセンス鎖の領域における、およびDicer酵素の突出した部位の5'であるアンチセンス鎖の対応する領域における1つまたは複数の塩基対形成したデオキシリボヌクレオチドの存在は、このような分子のDicer酵素切断を指揮するように役に立ち得る。本発明の一定の例証された薬剤は、センス鎖の5'末端にて位置1から計数するときに位置24またはより3'に位置するセンス鎖デオキシリボヌクレオチド、およびアンチセンス鎖の同種のデオキシリボヌクレオチドと塩基対形成するセンス鎖のデオキシリボヌクレオチドのこの位置24またはより3'を有するを有するが、いくつかの態様において、たとえば、センス鎖の位置20におけるデオキシリボヌクレオチド残基の包含を介して、より短い産物、たとえば19merまたは20merを切断するようにDicerを指揮することも可能性ある。このような位置20デオキシリボヌクレオチド塩基は、アンチセンス鎖の対応するデオキシリボヌクレオチドと対形成し、これにより、最も優勢なDicer産物として19merのDicerを媒介した切除を指揮する（アンチセンス鎖は、また、さらにアンチセンス鎖のDicer切断を指揮するために、このような態様におけるセンス鎖の位置20デオキシリボヌクレオチド残基と塩基対を形成するアンチセンス残基のすぐ3'に1つまたは2つのデオキシリボヌクレオチド残基を含むことができることに注意されたい）。このような態様において、二本鎖DNA領域（これは、Dicer切断を遮断する修飾核酸を含む）は、通常は好ましくないDicer切断産物の長さであるものを産生ようにDicer切断を指揮するために、1つのまたは2つの塩基対を超える長さ（たとえば、3〜5またはより多くの塩基対）を一般に有するだろう。位置21にて存在するセンス鎖の第1のデオキシリボヌクレオチド残基の位置で（センス鎖の5'末端にて位置1からセンス鎖を調査するときに）、20mer siRNAsのDicer切除を指揮するために、平行アプローチを採用することもできる。
【０２８２】
一定の態様において、DsiRNA薬剤のセンス鎖は、センス鎖の3'末端に位置する適切な修飾因子によってDicerプロセシングについて修飾され、すなわち、DsiRNA薬剤は、センス鎖修飾を介してDicer結合およびプロセシングの向きを方向付けるようにデザインされる。適切な修飾因子は、デオキシリボヌクレオチド、ジデオキシリボヌクレオチド、アシクロヌクレオチド等などのヌクレオチドおよび蛍光分子等などの立体障害型分子を含む。アシクロヌクレオチドは、2-ヒドロキシエトキシメチル基を通常dNMPsに存在する2'-デオキシリボフラノシル糖と置換する。その他のヌクレオチド修飾因子は、3'-デオキシアデノシン（コルジセピン）、3'-アジド-3'-デオキシチミジン（AZT）、2',3-ジデオキシイノシン（ddI）、2',3-ジデオキシ-3'-チアシチジン（3TC）、2',3-ジデヒドロ-2',3-ジデオキシチミジン（d4T）、並びに3'-アジド-3'-デオキシチミジン（AZT）、2',3-ジデオキシ-3'-チアシチジン（3TC）および2',3-ジデヒドロ-2',3-ジデオキシチミジン（d4T）のモノホスフェートヌクレオチドを含むことができる。一つの態様において、デオキシリボヌクレオチドは、修飾因子として使用される。ヌクレオチド修飾因子が利用されるとき、1〜3ヌクレオチド修飾因子または2ヌクレオチド修飾因子が、センス鎖の3'末端上のリボヌクレオチドの代わりに置換される。立体障害型分子が利用されるとき、これらは、アンチセンス鎖の3'末端にてリボヌクレオチドに付着される。したがって、鎖の長さは、修飾因子の組み込みにより変化しない。もう一つの態様において、本発明は、アンチセンス鎖のDicerプロセシングの向きを方向付けるために、DsiRNA薬剤における2つのDNA塩基を置換することを想定する。本発明のさらなる態様において、2つの末端DNA塩基は、センス鎖のセンス鎖の3'末端およびアンチセンス鎖の5'末端で二重鎖の平滑末端を形成する3'末端上の2つのリボヌクレオチドの代わりに置換され、2-ヌクレオチドRNAオーバーハングは、アンチセンス鎖の3'末端上に位置する。これは、平滑末端上のDNAおよび突出末端上のRNA塩基と非対称の構成である。本発明の一定の態様において、センス鎖の3'末端の最後から2番目および最後の位置の修飾されたヌクレオチド（たとえば、デオキシリボヌクレオチド）は、アンチセンス鎖の対応する修飾ヌクレオチド（たとえば、デオキシリボヌクレオチド）（任意に、センス鎖3'末端／アンチセンス鎖の5'末端にて平滑末端を有する本発明のDsiRNA薬剤におけるアンチセンス鎖の5'末端の最後から2番目および最後の残基）と塩基対形成する。
【０２８３】
本発明のDsiRNA薬剤のセンスおよびアンチセンス鎖は、細胞の原形質において見いだされる条件などの生物学的条件下でアニール化される。加えて、DsiRNA薬剤の、特にアンチセンス鎖の、配列の1つの領域は、少なくとも19ヌクレオチドの配列長さを有し、これらのヌクレオチドは、アンチセンス鎖の3'末端に隣接した21ヌクレオチド領域にあり、および標的遺伝子から産生されるRNAのヌクレオチド配列に対して、このような標的RNAとアニーリングし、および／またはレベルを減少するほど十分に相補的である。
【０２８４】
本発明のDsiRNA薬剤は、センス鎖の突出したDicer切断部位の3'およびアンチセンス鎖の突出したDicer切断部位の5'に位置するセンスおよびアンチセンス鎖の任意の位置に位置する1つまたは複数のデオキシリボヌクレオチド塩基対を有してもよい。一定の態様において、センス鎖（センス鎖の5'末端にて位置1から始まる）の位置24〜27の1、2、3または4つ全てが、デオキシリボヌクレオチドであり、そのそれぞれのデオキシリボヌクレオチドが、アンチセンス鎖の対応するデオキシリボヌクレオチドと塩基対を形成する。一定の態様において、アンチセンス鎖の5'領域のデオキシリボヌクレオチド（たとえば、所与のDsiRNA分子について突出したDicer切断部位の5'に位置したアンチセンス鎖の領域）は、DsiRNA薬剤が向けられる標的RNAに対して相補的でない。関連した態様において、DsiRNA薬剤の突出したDicer切断部位の5'に位置するアンチセンス鎖の全ての領域は、DsiRNA薬剤が向けられる標的RNAに対して相補的でない。一定の態様において、アンチセンス鎖のデオキシリボヌクレオチドまたはDsiRNA薬剤の突出したDicer切断部位の5'に位置すアンチセンス鎖の全ての領域は、アンチセンス鎖がアンチセンス鎖と標的RNAとの間のアニーリングが可能な十分な条件下で標的RNAにアニールされるときに標的RNAに対するDsiRNAのアンチセンス鎖のアニーリングを増強するほど、標的RNAに対して十分に相補的でない（たとえば、DNA拡張領域を欠いている「コア」アンチセンス鎖配列は、同じ「コア」アンチセンス鎖配列もDNA拡張領域の配列で拡張したので、標的RNAに同程度によくアニール化される）。
【０２８５】
DsiRNA薬剤は、また、以下のさらなる特性の1つまたは複数を有してもよい：（a）アンチセンス鎖は、典型的な21merから右または左に変化を有する、（b）鎖は、完全に相補的でなくてもよく、すなわち、鎖は、単純なミスマッチ対形成を含んでいてもよく、および（c）ロックド核酸などの塩基修飾がセンス鎖の5'末端に含まれてもよい。「典型的な」21mer siRNAは、従来の技術を使用してデザインされる。1つの技術において、様々な部位を平行して、または試薬の1つのが有効だろうことが望まれる同じ標的に特異的ないくつかの異なるsiRNA二重鎖特異的を含むプールにおいて、共通に試験する（Ji et al., 2003）。その他の技術は、活性なRNAiエフェクター分子を得る可能性を増加させるために、設計則およびアルゴリズムを使用する（Schwarz et al., 2003；Khvorova et al., 2003；Ui-Tei et al., 2004；Reynolds et al., 2004；Krol et al., 2004；Yuan et al., 2004；Boese et al., 2005）。siRNAの高スループット選択も開発されている（米国公開特許出願番号2005/0042641A1）。潜在的な標的部位は、また、二次構造予測によって解析することができる（Heale et al., 2005）。次いで、この21merを使用して、21merの5'末端上の3〜9個のさらなるヌクレオチドを含むように右シフトをデザインする。これらのさらなるヌクレオチドの配列は、任意の配列を有してもよい。一つの態様において、付加されるリボヌクレオチドは、標的遺伝子の配列に基づいている。本態様においてさえ、標的配列とアンチセンスsiRNAとの間の完全な相補性は、必要とされない。
【０２８６】
本発明のDsiRNA薬剤の第1および第2のオリゴヌクレオチドは、完全に相補的であることは必要とされない。これらは、生物学的条件下でアニールするように、および標的配列と十分に相補的なsiRNAを産生するDicerのための基質を提供するように、実質的に相補的であることを必要とするだけである。ロックド核酸（またはLNAのもの）は、当業者に周知である（Elman et al., 2005；Kurreck et al., 2002；Crinelli et al., 2002；BraaschおよびCorey（2001）；Bondensgaard et al., 2000；Wahlestedt et al., 2000）。一つの態様において、LNAは、センス鎖の5'末端にて組み込まれる。もう一つの態様において、LNAは、アンチセンス鎖上の3'オーバーハングを含むようにデザインされた二重鎖におけるセンス鎖の5'末端にて組み込まれる。
【０２８７】
一定の態様において、本発明のDsiRNA薬剤は、センス鎖が27塩基対長を有し、かつアンチセンス鎖が2塩基3'-オーバーハングをもつ29塩基対の長さを有する、非対称構造を有する。このような薬剤は、1〜4デオキシリボヌクレオチドの間の、センス鎖の3'末端領域（具体的には、突出したDicer切断部位の3'領域）を任意に有してもよく、その少なくとも1つは、アンチセンス鎖の5'末端領域（具体的には、突出したDicer切断部位の5'領域）の同種のデオキシリボヌクレオチドと塩基対を形成する。その他の態様において、センス鎖は、28塩基対の長さを有し、かつアンチセンス鎖は、2塩基3'-オーバーハングをもつ30塩基対の長さを有する。このような薬剤は、1〜5デオキシリボヌクレオチドの間の、センス鎖の3'末端領域（具体的には、突出したDicer切断部位の3'領域）のを任意に有してもよく、その少なくとも1つはアンチセンス鎖の5'末端領域（具体的には、突出したDicer切断部位の5'領域）の同種のデオキシリボヌクレオチドと塩基対を形成する。さらなる態様において、センス鎖は、29塩基対の長さを有し、かつアンチセンス鎖は、2塩基3'-オーバーハングをもつ31塩基対の長さを有する。このような薬剤は、1〜6デオキシリボヌクレオチドの間の、センス鎖の3'末端領域（具体的には、突出したDicer切断部位の3'領域）を任意に有し、その少なくとも1つは、アンチセンス鎖の5'末端領域（具体的には、突出したDicer切断部位の5'領域）の同種のデオキシリボヌクレオチドと塩基対を形成する。さらなる態様において、センス鎖は、30塩基対の長さを有し、かつアンチセンス鎖は、2塩基3'-オーバーハングをもつ32塩基対の長さを有する。このような薬剤は、1〜7デオキシリボヌクレオチドの間の、センス鎖の3'末端領域（具体的には、突出したDicer切断部位の3'領域）を任意に有し、その少なくとも1つは、アンチセンス鎖の5'末端領域（具体的には、突出したDicer切断部位の5'領域）の同種のデオキシリボヌクレオチドと塩基対を形成する。その他の態様において、センス鎖は、31塩基対の長さを有し、かつアンチセンス鎖は、2塩基3'-オーバーハングをもつ33塩基対の長さを有する。このような薬剤は、1〜8のデオキシリボヌクレオチドの間の、センス鎖の3'末端領域（具体的には、突出したDicer切断部位の3'領域）を任意に有し、その少なくとも1つは、アンチセンス鎖の5'末端領域（具体的には、突出したDicer切断部位の5'領域）の同種のデオキシリボヌクレオチドと塩基対を形成する。さらなる態様において、センス鎖は、32塩基対の長さを有し、かつアンチセンス鎖は2塩基3'-オーバーハングをもつ34塩基対の長さを有する。このような薬剤は、1〜9デオキシリボヌクレオチドの間の、センス鎖の3'末端領域（具体的には、突出したDicer切断部位の3'領域）を任意に有し、その少なくとも1つは、アンチセンス鎖の5'末端領域（具体的には、突出したDicer切断部位の5'領域）の同種のデオキシリボヌクレオチドと塩基対を形成する。一定のさらなる態様において、センス鎖は、33塩基対の長さを有し、かつアンチセンス鎖は、2塩基3'-オーバーハングをもつ35塩基対の長さを有する。このような薬剤は、1〜10デオキシリボヌクレオチドの間の、センス鎖の3'末端領域（具体的には、突出したDicer切断部位の3'領域）を任意に有し、その少なくとも1つは、アンチセンス鎖の5'末端領域（具体的には、突出したDicer切断部位の5'領域）の同種のデオキシリボヌクレオチドと塩基対を形成する。さらに他の態様において、これらのDsiRNA薬剤のいずれもが、リボヌクレオチドのうちの2つの代わりにセンス鎖の3'末端にて2つのデオキシリボヌクレオチドをさらに含む非対称構造を有し；任意に、これらの2つのデオキシリボヌクレオチドは、アンチセンス鎖の同種のデオキシリボヌクレオチドと塩基対を形成する。
【０２８８】
2つの別々のオリゴヌクレオチドを含む一定のDsiRNA薬剤構成を、第3の構造によって連結することができる。第3の構造は、DsiRNA薬剤に対するDicer活性を遮断しないだろうし、標的遺伝子から転写されるRNAの定方向破壊を妨げないだろう。一つの態様において、第3の構造は、化学的連結基でもよい。多くの適切な化学的連結基が当該技術分野において公知であり、使用することができる。あるいは、第3の構造は、dsNA組成物を構成する2つのオリゴヌクレオチドのアニーリングによりヘアピン構造が生じるような様式で、DsiRNA薬剤の2つのオリゴヌクレオチドを連結するオリゴヌクレオチドでもよい。ヘアピン構造は、DsiRNA薬剤に対するDicer活性を遮断しないだろうし、標的RNAの定方向破壊を妨げないだろう。
【０２８９】
一定の態様において、本発明のDsiRNA薬剤は、Dicerによるそのプロセシングを増強するいくつかの特性を有する。このような態様にしたがって、DsiRNA薬剤は、DicerによってプロセスされてsiRNAおよび以下の特性の少なくとも1つを生じるように、十分な長さを有する：（i）DsiRNA薬剤は、非対称であり、たとえば、センス鎖上に3'オーバーハングを有し、かつ（ii）DsiRNA薬剤は、Dicer結合の向きおよびdsRNA領域の活性なsiRNAへのプロセシングを方向付けるように、アンチセンス鎖上に修飾された3'末端を有する。これらの態様にしたがって、DsiRNA薬剤において最も長い鎖は、25〜43ヌクレオチドを含む。一つの態様において、センス鎖は、25〜39ヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖は、26-43ヌクレオチドを含む。生じるdsNAは、センス鎖の3'末端にオーバーハングを有することができる。オーバーハングは、2ヌクレオチドなど、1〜4ヌクレオチドである。アンチセンスまたはセンス鎖は、また5'ホスフェートを有してもよい。
【０２９０】
一定の態様において、DsiRNA薬剤のセンス鎖は、センス鎖の3'末端に位置する適切な修飾因子によってDicerプロセシングのために修飾され、すなわち、DsiRNA薬剤は、Dicer結合およびプロセシングの向きを方向付けるようにデザインされている。適切な修飾因子は、デオキシリボヌクレオチド、ジデオキシリボヌクレオチド、アシクロヌクレオチド等などのヌクレオチドおよび蛍光分子等などの立体障害型分子を含む。アシクロヌクレオチドは、2-ヒドロキシエトキシメチル基を通常dNMPsに存在する2'-デオキシリボフラノシル糖と置換する。その他のヌクレオチド修飾因子は、3'-デオキシアデノシン（コルジセピン）、3'-アジド-3'-デオキシチミジン（AZT）、2',3-ジデオキシイノシン（ddI）、2',3-ジデオキシ-3'-チアシチジン（3TC）、2',3-ジデヒドロ-2',3-ジデオキシチミジン（d4T）、並びに3'-アジド-3'-デオキシチミジン（AZT）、2',3-ジデオキシ-3'-チアシチジン（3TC）および2',3-ジデヒドロ-2',3-ジデオキシチミジン（d4T）のモノホスフェートヌクレオチドを含むことができる。一つの態様において、デオキシリボヌクレオチドは、修飾因子として使用される。ヌクレオチド修飾因子が利用されるとき、1〜3ヌクレオチド修飾因子または2ヌクレオチド修飾因子が、センス鎖の3'末端上のリボヌクレオチドの代わりに置換される。立体障害型分子が利用されるとき、これらは、アンチセンス鎖の3'末端にてリボヌクレオチドに付着される。したがって、鎖の長さは、修飾因子の組み込みにより変化しない。もう一つの態様において、本発明は、アンチセンス鎖のDicerプロセシングの向きを方向付けるために、DsiRNA薬剤における2つのDNA塩基を置換することを想定する。本発明のさらなる態様において、2つの末端DNA塩基は、センス鎖のセンス鎖の3'末端およびアンチセンス鎖の5'末端で二重鎖の平滑末端を形成する3'末端上の2つのリボヌクレオチドの代わりに置換され、2-ヌクレオチドRNAオーバーハングは、アンチセンス鎖の3'末端上に位置する。これは、平滑末端上のDNAおよび突出末端上のRNA塩基と非対称の構成である。
【０２９１】
一定のその他の態様において、DsiRNA薬剤のアンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の3'末端に位置する適切な修飾因子によってDicerプロセシングのために修飾され、すなわち、DsiRNA薬剤は、Dicer結合およびプロセシングの向きを方向付けるようにデザインされている。アシクロヌクレオチドは、2-ヒドロキシエトキシメチル基を通常dNMPsに存在する2'-デオキシリボフラノシル糖と置換する。その他のヌクレオチド修飾因子は、3'-デオキシアデノシン（コルジセピン）、3'-アジド-3'-デオキシチミジン（AZT）、2',3-ジデオキシイノシン（ddI）、2',3-ジデオキシ-3'-チアシチジン（3TC）、2',3-ジデヒドロ-2',3-ジデオキシチミジン（d4T）、並びに3'-アジド-3'-デオキシチミジン（AZT）、2',3-ジデオキシ-3'-チアシチジン（3TC）および2',3-ジデヒドロ-2',3-ジデオキシチミジン（d4T）のモノホスフェートヌクレオチドを含むことができる。一つの態様において、デオキシリボヌクレオチドは、修飾因子として使用される。ヌクレオチド修飾因子が利用されるとき、1〜3ヌクレオチド修飾因子または2ヌクレオチド修飾因子が、センス鎖の3'末端上のリボヌクレオチドの代わりに置換される。立体障害型分子が利用されるとき、これらは、アンチセンス鎖の3'末端にてリボヌクレオチドに付着される。したがって、鎖の長さは、修飾因子の組み込みにより変化しない。もう一つの態様において、本発明は、アンチセンス鎖のDicerプロセシングの向きを方向付けるために、DsiRNA薬剤における2つのDNA塩基を置換することを想定する。本発明のさらなる態様において、2つの末端DNA塩基は、センス鎖のセンス鎖の3'末端およびアンチセンス鎖の5'末端で二重鎖の平滑末端を形成する3'末端上の2つのリボヌクレオチドの代わりに置換され、2-ヌクレオチドRNAオーバーハングは、アンチセンス鎖の3'末端上に位置する。これは、また平滑末端上のDNAおよび突出末端上のRNA塩基と非対称の構成である。
【０２９２】
センスおよびアンチセンス鎖は、細胞の原形質において見いだされる条件などの生物学的条件下でアニール化される。加えて、DsiRNA薬剤の、特にアンチセンス鎖の、配列の1つの領域は、少なくとも19ヌクレオチドの配列長さを有し、これらのヌクレオチドは、アンチセンス鎖の3'末端に隣接し、およびRNA干渉を指揮するほど、標的RNAのヌクレオチド配列に十分に相補的である。
【０２９３】
加えて、DsiRNA薬剤構造は、Dicerの切断により産生されるオリゴヌクレオチドセグメントが遺伝子発現を阻害するのに最も有効であるオリゴヌクレオチドの部分であるだろうことを保証するように最適化することができる。たとえば、本発明の一つの態様において、遺伝子発現を阻害するだろうことが予想される21〜22bpセグメントがアンチセンス鎖の3'末端に位置する、27〜35bpオリゴヌクレオチドのDsiRNA薬剤構造が合成される。アンチセンス鎖の5'末端に位置する残りの塩基は、Dicerによって切断されるだろうし、廃棄されるだろう。この切断された部分は、相同的（すなわち、標的配列の配列に基づいた）または非相同的であること、および核酸鎖を拡張するために付加することができる。驚くべきことに本発明において同定されたように、このような拡張は、塩基対形成したDNA残基で行うことができ（二本鎖DNA：DNA拡張）、対応する二重鎖RNA：RNA拡張DsiRNA薬剤よりも改善された有効性または効果の期間を有する拡張DsiRNA薬剤を生じる。
【０２９４】
US 2007/0265220は、27mer DsiRNAsが、化学的修飾の非存在でさえ、相当する21mer siRNA組成物を上回る血清における改良された安定性を示すことを開示する。米国2007/0265220において、および本実施例において詳述されたパターンの、アンチセンス鎖における2'-O-メチルRNAの包含などのDsiRNA薬剤の修飾は、5'ホスフェートの付加と対にしたときに、DsiRNA薬剤の安定性を改善することができる。合成RNA二重鎖における全ての鎖に対する5'-ホスフェートの付加は、ヌクレアーゼ安定性の程度いくらかの制限させるための、安価かつ生理的な方法であろう。
【０２９５】
本発明のDsiRNA薬剤の化学的修飾パターンは、このような薬剤の有効性を増強するようにデザインされている。したがって、このような修飾は、DsiRNA薬剤の能力を減少させることを回避するように；DsiRNA薬剤のDicerプロセシングを妨げることを回避するように；DsiRNA薬剤の生物学的液体における安定性を改善する（ヌクレアーゼ感受性を減少させる）ように；または生得的な免疫系による検出を遮断し、もしくは避けるようにデザインされている。このような修飾は、また毒性になるのを回避し、および本発明の本DsiRNA薬剤を製造する際のコストまたは容易さへの影響を増大させるのを回避しするようにデザインされている。
【０２９６】
RNAプロセシング
siRNA
siRNAによって媒介されるRNAiのプロセスは、細胞における長いdsRNA分子の存在下でトリガーされる。RNAiの開始工程の間に、これらのdsRNA分子は、2つのRNase III様のドメインを含む酵素の保存されたファミリーであるDicerによって21〜23ヌクレオチド（nt）低分子干渉RNA二重鎖（siRNAs）に切断される（Bernstein et al. 2001；Elbashir et al. 2001）。。siRNAsは、19〜21塩基対の二重鎖領域およびそれぞれの鎖上の2つのヌクレオチド3'オーバーハングによって特徴づけられる。RNAiのエフェクター工程の間に、siRNAsは、RNA誘導サイレンシング複合体（RISC）と呼ばれる多量体タンパク質複合体に組み込まれ、これらが、分解のための完全に相補的なmRNA基質を選択するためのイドとしての役割を果たす。分解は、siRNAに対して相補的な領域内のmRNAのヌクレオチド鎖切断によって開始される。より正確に言うと、mRNAは、ガイドするsiRNAの5'末端から位置10ヌクレオチドにて切断される（Elbashir et al. 2001 Genes and Dev. 15：188-200；Nykanen et al. 2001 Cell 107：309〜321；Martinez et al. 2002 Cell 110：563-574）。この切断の担うエンドヌクレアーゼは、Argonaute2として同定された（Ago2；Liu et al. Science、305：1437-41）。
【０２９７】
miRNA
大部分のヒトmiRNA（70%）-およびおそらくその他の哺乳類の大部分のmiRNA-は、イントロンおよび／またはエキソンから転写され、およそ30%は、遺伝子間領域に位置する（Rodriguez et al., Genome Res. 2004、14（10A）、1902-1910）。ヒトおよび動物において、miRNAは、通常、RNAポリメラーゼIIによって（Farh et al. Science 2005、310（5755）、1817-1821）、およびいくつかの場合においてpol IIIによって転写される（Borchert et al. Nat. Struct. Mol. Biol. 2006, 13(12), 1097-1101）。一定のウイルスのコードされたmiRNAは、RNAポリメラーゼIIIによって転写され（Pfeffer et al. Nat. Methods 2005, 2(4), 269-276; Andersson et al. J. Virol. 2005, 79(15), 9556-9565）、いくつかは、ウイルスの遺伝子のオープンリーディングフレームに位置する（Pfeffer et al. Nat. Methods 2005, 2(4), 269-276; Samols et al. J. Virol. 2005, 79(14), 9301-9305）。miRNA転写は、大きなモノシストロン性、双シストロン性または多シストロン性の一次転写物（pri-miRNA）の産生を生じる。単一のpri-miRNAは、長さがおよそ200ヌクレオチド（nt）から数キロベース（kb）までの範囲であろうし、5'7-メチルグアノシン（m7）キャップおよび3'ポリ（A）テールの両方を有し得る。特徴的には、成熟したmiRNA配列は、pri-miRNA内の不完全なステム-ループ配列の領域に局在化される（Cullen、Mol., Cell 2004、16（6）、861-865）。
【０２９８】
核におけるmiRNA成熟の第1の工程は、RNase III Drosha-DGCR8核マイクロプロセッサ複合体によるpri-miRNAの認識および切断であり、これにより、5'末端にてモノホスフェートおよび3'末端にてヒドロキシル基をもつ2ntオーバーハングをもつpre-miRNAと呼ばれる、〜70 ntのヘアピンを含む前駆体分子を放出する（Cai et al. RNA 2004、10（12）、1957〜1966；Lee et al. Nature 2003、425（6956）、415-419；Kim Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2005、6（5）、376-385）。次の工程は、担体タンパク質であるExportin-5による核から原形質へのpre-miRNAの核輸送である（Yi et al. Genes. Dev. 2003、17（24）、3011-3016、Bohnsack et al. RNA 2004、10（2）、185-191）。Exportin-5およびその補因子RanのGTP結合した形態は、共に、pre-miRNAの特徴である2ヌクレオチド3'オーバーハングおよび隣接するステムを認識し、および結合する（Basyuk et al. Nucl. Acids Res. 2003、31（22）、6593〜6597、Zamore Mol. Cell. 2001, 8（6）, 1158-1160）。原形質において、GTP加水分解により、pre-miRNAの放出を生じ、次いでこれが細胞エンドヌクレアーゼIII酵素Dicerによって処理される（Bohnsack et al.）。Dicerは、RNA干渉（RNAi）を媒介するsiRNAsを産生する際のその役割について、最初に認識された。Dicerは、その補因子TRBP（トランス活性化領域結合タンパク質；Chendrimata et al. Nature 2005、436（7051）、740-744）およびPACT（インターフェロン誘導性二重鎖-RNA依存的プロテインキナーゼ活性化因子；Lee et al. EMBO J. 2006、25（3）、522-532）と協力して作用する。これらの酵素は、pre-miRNAヘアピンの塩基にて3'の2ヌクレオチドオーバーハングにて結合して、末端ループを除去して、5'モノホスフェート、3'の2ヌクレオチドオーバーハングおよび3'ヒドロキシル基を有する両末端もつおよそ21ntのmiRNA二重鎖中間体をもたらす。次いで、その5末端がエネルギー的にあまり安定でないmiRNAガイド鎖は、RISC（RNA誘導サイレンシング複合体）に組み込むために選択され、一方で、「パッセンジャー」鎖は、放出されて、分解される（Maniataki et al. Genes. Dev. 2005, 19（24）, 2979-2990；Hammond et al. Nature 2000、404（6775）、293-296）。RISCの組成は、完全に定義されないままであるが、重要な成分は、Argonaute（Ago）タンパク質ファミリーのメンバーである（Maniataki et al.；Meister et al. Mol. Cell. 2004, 15（2）, 185-197）。
【０２９９】
次いで、成熟したmiRNAは、RISCを相補的mRNA種に向ける。標的mRNAがRISCを備えたmiRNAに対して完全な相補性を有する場合、mRNAは、切断され、分解されるだろう（Zeng et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2003、100（17）、9779-9784；Hutvagner et al. Science 2002、297（55 89）、2056-2060）。しかし、哺乳動物細胞において最も共通の状況として、miRNAは、不完全な相補性をもつmRNAをターゲットして、これらの翻訳を抑制し、対応するタンパク質の発現の減少を生じる（Yekta et al. Science 2004、304（5670）、594-596；Olsen et al. Dev. Biol. 1999、216（2）、671-680）。miRNAの5'領域、特にシード領域と呼ばれるmiRNAの（5'末端にて位置1から始めて）ヌクレオチド2〜7または8におけるmiRNAと標的配列との間のマッチはmiRNAターゲティングにとって本質的に重要であり、このシードマッチは、またmiRNAターゲティングのコンピュータ予測においても広く使用される重要な原理になった（Lewis et al. Cell 2005、120（1）、15-20；Brennecke et al. PLoS Biol. 2005、3、e85）。miRNA-mRNA二重鎖のmiRNA制御は、主に3'UTRにおける複数の相補部位を介して媒介されるが、これには、多くの例外がある。miRNAは、また5'UTRおよび／またはmRNAのコード領域にも結合し得るし、類似の結果を生じる（Lytle et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2007、104（23）、9667-9672）。
【０３００】
RNase H
RNase Hは、DNA／RNA二重鎖におけるRNAの3'-OP結合を切断して、3'-ヒドロキシルおよび5'-ホスフェート末端産物を産生するリボヌクレアーゼである。RNase Hは、非特異的エンドヌクレアーゼであり、酵素結合した二価の金属イオンによって補助される加水分解機構を介してRNAの切断を触媒する。RNase Hファミリーのメンバーは、アルケーおよび原核生物から真核細胞までのほとんど全ての微生物において見いだされている。DNA合成の間に、RNase Hは、岡崎フラグメントの産生をプライミングする役割を担うRNAプライマーを切断すると考えられているが；しかし、RNase H酵素は、さらに一般的に、十分な長さの任意のDNARNAハイブリッド配列（たとえば、典型的には、哺乳類における長さが4以上の塩基対のDNA：RNAハイブリッド配列を切断するために使用され得る。
【０３０１】
MicroRNAおよびMicroRNA様治療薬
MicroRNAs（miRNA）は、鋳型転写物の3'UTRに対する結合によって作用し、これにより、古典的なRNA干渉に関連があるが、異なる機構によって鋳型転写物によってコードされるタンパク質の発現を阻害することが記述されている。特に、miRNAは、その安定性を減少させることによるのではなく、むしろ標的転写物の翻訳を減少することによって作用すると考えられる。天然に存在するmiRNAは、典型的には長さがおよそ22ntである。これらは、およそ70ntの長さの低分子一時的RNA（small temporal RNAs：stRNAs）として公知のより大きな前駆体に由来すると考えられる。
【０３０２】
3'UTR内に（または標的転写物におけるその他の場所、たとえば、ノッチまたはノッチファミリーの転写物の、たとえば繰り返されたエレメントにおいて）結合し、および翻訳を阻害する、siRNAsなどの、およびより具体的にはmiRNAなどの干渉薬剤は、siRNA／鋳型（miRNA／鋳型）二重鎖における多数のミスマッチを許容し得るし、特に二重鎖の中心領域内のミスマッチを許容し得る。実際に、インビトロにおける翻訳を阻害することが示されたmiRNAのように、天然に存在するstRNAsは、このようなミスマッチを頻繁に示すので、いくつかのミスマッチが望ましく、または必要とされ得るという証拠がある（Zeng et al., Molecular Cell、9：1-20）。たとえば、標的転写物とハイブリダイズしたときに、このようなmiRNAは、頻繁に、ミスマッチの領域によって分離された完全に相補的な2つのひと配列を含む。このようなハイブリダイズした複合体は、ヌクレオチド対を含む完全な相補性の（二重鎖部分）および少なくとも単一のミスマッチ塩基対の2つの領域を一般に含み、これは、たとえば、G：A、G：U、G：G、A：A、A：C、U：U、U：C、C：C、G：-A：-、U：-、C：-などであってもよい。このようなミスマッチのヌクレオチドは、特に直列型で存在する場合（たとえば、2、3または4ヌクレオチドのミスマッチの領域）、このようなバルジのいずれかに隣接しての位置する二重鎖部分を分離するバルジを形成し得る。様々な構造は、可能である。たとえば、miRNAは、複数の非同一（ミスマッチ）の領域を含んでいてもよい。非同一（ミスマッチ）の領域は、標的およびmiRNAの両方が対を形成しないヌクレオチドを含むという意味で、対称形である必要はない。たとえば、1つの鎖だけが対を形成しないヌクレオチドを含む構造が記述されている（Zeng et al.,図33）。典型的には、miRNA薬剤内の完全な相補性のひと配列は、長さが少なくとも5ヌクレオチド、たとえば長さが6、7またはそれ以上のヌクレオチドであるが、一方でミスマッチの領域は、たとえば、長さが1、2、3、または4ヌクレオチドでもよい。
【０３０３】
一般に、任意の特定のsiRNAは：（i）標的転写物の安定性が減少され、かつsiRNAと標的との間の完全な相補性が頻繁に好まれる「古典的な」siRNA経路を介して、および更に（ii）標的転写物の翻訳が阻害される「代わりの」経路（一般に、動物におけるmiRNA経路として特徴づけられる）によって、両方で遺伝子発現を阻害するように機能し得る。一般に、単一の転写物が,それが古典的な、および代わりの経路のための標的として役に立つことができる領域を含むことができるかもしれないが、機構（i）を介して特定のsiRNAによってターゲットされる転写物は、機構（ii）を介してターゲットされる転写物とは異なるだろう。（「古典的な」および「代わりの」という用語は、単に便宜のために使用され、一般に、動物細胞におけるこのような機構の発見の歴史的タイミングを反映すると考えられるが、重要性、有効性またはいずれの機構のその他の特色を反映しない点に留意されたい）。siRNA設計の1つの共通の目標は、機構（i）を介して、優れた特異性で単一の転写物をターゲットし、一方で、機械シム（ii）を介して潜在的に誘発されるこれらの効果を含むオフターゲット効果を最小にすることであった。しかし、天然に存在するmiRNAの活性を模倣する目的のため、または対応するmiRNAが現在公知でない標的RNAに対して向けられた薬剤を作製することのいずれかのために、このようなミスマッチに寛容な、および実際は、おそらく増強されるこのようなミスマッチを含むDsiRNA薬剤（たとえば、DsiRNAmm薬剤）の阻害性および／または治療的有効性／能力により、設計によってミスマッチ残基を有するRNA干渉薬剤を提供することが本発明の目標の一つである。
【０３０４】
ミスマッチのヌクレオチドのためのmiRNA薬剤の寛容性（および実際は、細胞における上記の機構（ii）の存在および天然の使用）は、機構（i）を介して作用する完全に相補的なsiRNAsの「古典的な」使用に対して有利であり、および／またはこれにより拡張されるに様式でのmiRNAの使用を示唆する。miRNAは、天然に存在する分子であるので、治療的薬剤としてmiRNAに適用する際に異なる利点がある可能性がある。miRNAは、数億年のこれらの機能の進化の「微調整」からも利益を得る。したがって、配列特異的「オフターゲット」効果は、天然に存在するmiRNAで、または天然に存在するmiRNAを模倣するようにデザインされた本発明の一定の合成DsiRNAs（たとえば、DsiRNAmm薬剤）での拡張により、問題とならないはずである。加えて、miRNAは、遺伝子の群の発現を調整するように進化してきて、駆動のアップレギュレーションおよびダウンレギュレーションの両方を操縦し（一定の例において、複数の標的RNAに無差別に作用する単一のmiRNAで、細胞内で同時に両方の機能を行う）、複雑な細胞機能を正確に調整することができる。天然に存在するmiRNAのこのような置換は、正常な増殖、アポプトーシス、細胞周期および1つまたは複数のmiRNAのダウンレギュレーションによって影響を受けるその他の細胞の機能を回復する試みにおいて、合成miRNAまたはmiRNA擬態（たとえば、一定のDsiRNAmms）を病気にかかった組織に導入することを含むことができる。一定の例において、これらのmiRNAで調節される経路の再活性化により、有意な治療的反応を生じた（たとえば、心肥大での1つの研究において、miRNA発現カセットのアデノウイルスを媒介した送達によるmiR-133の過剰発現は、アゴニストで誘導される心肥大から動物を保護したが、相反的に、アンタゴミア（antagomirs）による野生型マウスにおけるmiR-133の減少は、肥大マーカーの増大を生じさせた（Care et al. Nat. Med. 13：613〜618）。
【０３０５】
現在まで、600を超えるmiRNAがヒトゲノム内でコードされることが同定されており、このようなmiRNAは、核および原形質におけるタンパク質の組み合わせによって発現され、およびプロセスされる。miRNAは、脊椎動物内で高度に保存されており、全ての哺乳動物遺伝子のおよそ2%を含む。それぞれのmiRNAが複数の、たとえば、2、3、4、5、6、7、8、9またはさらに数十から何百もの異なる遺伝子の発現十を調節するようなので、miRNAは、「マスタースイッチ」として機能して、効率的に複数の細胞経路およびプロセスを調節し、および連繋することができる。複数の遺伝子の発現を連繋することにより、miRNAは、胚発生、免疫、炎症、並びに細胞の成長および増殖において重要な役割を果たす。
【０３０６】
発現および昨日研究は、特異的miRNAの発現の変化が多様なヒト疾患に重要であることを示唆する。あがってきた証拠は、疾患細胞および組織への特異的miRNAの導入により、好ましい治療的反応を誘導することができることを示す（Pappas et al., Expert Opin Ther Targets. 12: 115-27）。miRNA療法の将来性は、腫瘍抑制因子としての一定のmiRNAの明らかな役割のため、おそらく癌において最も大きい。癌のためのmiRNAに基づいた治療のための理論的根拠は、たとえば、少なくとも部分的には、以下の観察によって支持される：
（1）miRNAは、正常組織と比較したときに、病気にかかった組織において、変化さしたレベルにて頻繁に誤って調節され、および発現される。多数の研究は、これらの対応する正常組織と比較して、癌組織において変化したmiRNAのレベルを示していた。たいてい、発現の変化は、特定のmiRNAの発現の増加または減少を引き起こす遺伝的な突然変異の結果である。独特のmiRNA発現サインを有する疾患は、診断および予後マーカーとして利用することができ、本発明のDsiRNA（たとえば、DsiRNAmm）薬剤でターゲットすることができる。
【０３０７】
（2）誤って調節されたmiRNAは、癌遺伝子または腫瘍抑制因子として機能することによって、癌発症に寄与する。癌遺伝子は、その過剰発現または不適当な活性化が腫瘍形成を引き起こす遺伝子として定義される。腫瘍抑制因子は、細胞が癌性になることからを維持するために必要とされる遺伝子であり；腫瘍抑制因子のダウンレギュレーションまたは不活性化は、癌の共通の誘導因子である。このようなターゲティングは、特定の癌に対して分子基盤に特異的に作用することができるので、両タイプの遺伝子が好ましい薬物標的となる。発癌性miRNAの例は、miR-155およびmiR-17〜92であり；let-7は、腫瘍抑制性miRNAの例である。
【０３０８】
（3）miRNAの投与は、前臨床動物試験において、腫瘍成長を遮断し、または減少させることによって、治療的反応を誘導する。科学文献は、miRNA機能を修復することにより、インビトロにおける、更に動物モデルにおける癌細胞の成長を防止することができ、または減少させることができることを証明する概念実証研究を提供する。十分に特徴づけられた例は、乳癌および肺癌のためのモデルにおけるlet-7の抗腫瘍活性である。let-7を模倣するように設計されている本発明のDsiRNAs（たとえば、DsiRNAmms）は、このような癌をターゲットするために使用することができ、治療的リード化合物（たとえば、前臨床動物モデルにおいて腫瘍量を減少させることができる薬剤）をスクリーニングするために、対応する天然に存在するmiRNAが公知でない（たとえば、ノッチまたはその他の転写物内のリピート）標的RNAに対して向けられる新たなDsiRNA（たとえば、DsiRNAmm）薬剤を産生するために、本明細書において記述したDsiRNA設計パラメーターを使用することも可能である。
【０３０９】
（4）所与のmiRNAは、複数の細胞経路を制御し、したがって優れた治療的活性を有し得る。これらの生物学に基づくと、miRNAは、ゲノムの「マスタースイッチ」として機能して、複数の遺伝子産物を調節し、および複数の経路を連繋することができる。miRNAによって調節される遺伝子は、従来の癌遺伝子および腫瘍抑制因子をコードする遺伝子を含み、これらの多くは、医薬品工業による薬物標的として個々に追跡されている。したがって、miRNA治療は、複数の疾患および／または癌関連遺伝子をターゲティングすることによってsiRNAsおよびリード化合物のその他の形態より優れた活性を有し得る。miRNAの誤った制御が腫瘍形成のプロセスの初期のイベントであることが多いという観察を考慮すると、失われたmiRNAを置換するmiRNA治療は、最適な療法であろう。
【０３１０】
（5）miRNAは、天然の分子であり、およびしたがって、あまり特異的な副作用を誘導しにくい。何百万年の進化も、miRNAの調節ネットワークを発達させるするのを助け、標的メッセンジャーRNAとmiRNAの相互作用を微調整した。したがって、miRNAおよびmiRNA誘導体（たとえば、天然に存在するmiRNAを模倣するようにデザインされたDsiRNAs）は、適当な状況において適用されたときに、もしあってもほとんど配列特異的「オフターゲット」効果を有さないだろう。
【０３１１】
siRNAsおよびmiRNAの物理的な特徴は、類似している。したがって、siRNAs（たとえば、本発明のDsiRNAs）を送達するのに有効である技術は、同様に、合成miRNA（たとえば、本発明の一定のDsiRNAmms）を送達するのにも有効である。
【０３１２】
DsiRNA薬剤の抱合および送達
一定の態様において、本発明は、疾患または障害を有する、または発症するリスクのある被験体を治療するための方法に関する。このような態様において、DsiRNAは、疾患または障害を制御するための新規な治療的薬剤として作用しうる。本方法は、患者（たとえば、ヒト）に対して本発明の医薬組成物を投与することを含み、その結果、標的RNAの発現、レベルおよび／または活性が減少される。標的RNAによってコードされるポリペプチドの発現、レベルおよび／または活性は、また本発明のDsiRNAによって減少させられるかもしれない。
【０３１３】
疾患または障害の治療において、DsiRNAは、疾患または障害を示す、もしくはに関連した細胞または組織と接触させることができる。たとえば、標的RNA配列の全てまたは一部と実質的に同一のDsiRNAを、病気にかかった、疾患に関連した、もしくは感染した細胞と、インビボもしくはインビトロで接触させても、または導入してもよい。同様に、標的RNA配列の全てまたは一部と実質的に同一のDsiRNAを、疾患または障害を有する、または発症するリスクのある被験体に直接投与してもよい。
【０３１４】
本発明のDsiRNA薬剤の治療的な使用は、複数の異なるDsiRNA薬剤配列を含むDsiRNA薬剤の製剤の使用を含み得る。たとえば2以上、3以上、4以上、5以上、その他の今回記述した薬剤を組み合わせて、たとえば、1つまたは複数の標的RNA（類）の複数の異なる領域をターゲットする製剤を作製することができる。、本発明のDsiRNA薬剤は、またDsiRNA薬剤の鎖が標的RNAの2つ以上の領域を独立してターゲットするように構築してもよい。標的核酸分子の1つ以上の領域をターゲットする多機能性DsiRNA分子の使用により、RNAレベルおよび発現の強力な阻害をもたらすことが予想される。たとえば、本発明の単一の多機能性DsiRNA構築物は、標的核酸分子の保存された領域および可変領域をターゲットすることができ、これにより、単一の標的遺伝子によってコードされる、たとえばウイルスの異なる株変異体またはスプライスバリアントのダウンレギュレーションまたは阻害が可能となる。
【０３１５】
本発明のDsiRNA薬剤は、別の部分（たとえば、ペプチドなどの非核酸部分）、有機化合物（たとえば、色素、コレステロールまたはその他同種のもの）に抱合すること（たとえば、そのセンスまたはアンチセンス鎖のその5'または3'末端にて）または抱合しないことができる。このようにしてDsiRNA薬剤を修飾することにより、対応する複合していないDsiRNA薬剤と比較して、生じるDsiRNA薬剤誘導体の細胞の取り込みを改善し、または細胞のターゲティング活性を増強し得るし、細胞におけるDsiRNA薬剤誘導体を追跡するために有用であり得るし、または対応する抱合していないDsiRNA薬剤と比較して、DsiRNA薬剤誘導体の安定性を改善し得る。
【０３１６】
DsiRNA活性を評価するためのRNAiインビトロアッセイ
無細胞系におけるRNAiを再現するインビトロアッセイを、DsiRNA構築物を評価するために、任意に使用することができる。たとえば、このようなアッセイは、標的RNAに対して向けられたDsiRNA薬剤で使用するために適応されたTuschl et al., 1999, Genes and Development, 13, 3191-3197 and Zamore et al., 2000, Cell, 101, 25-33によって記述されたシステムを含む。合胞性胞胚葉に由来するショウジョウバエ（Drosophila）抽出物が、インビトロでのRNAi活性を再構成するために使用される。標的RNAは、T7 RNAポリメラーゼを使用する適切なプラスミドからのインビトロでの転写を介して、または化学的合成を介して産生する。センスおよびアンチセンスDsiRNA鎖（たとえば各々20μM）を緩衝液（100mM酢酸カリウム、30mM HEPES-KOH、pH 7.4、2mM酢酸マグネシウムなど）において、90℃にて1分間、続いて37℃にて1時間のインキュベーションによってアニールさせ、次いで溶解緩衝液（たとえば、100mM酢酸カリウム、pH 7.4にて30mM HEPES-KOH、2mM酢酸マグネシウム）で希釈させる。アニーリングは、TBE緩衝液におけるアガロースゲルでのゲル電気泳動によってモニターすることができ、臭化エチジウムで染色することができる。ショウジョウバエ（Drosophila）可溶化液は、脱塩素化して溶解化した発酵させたモラセス寒天上に収集したOregon Rハエからの0〜2時間齢胚を使用して調製する。可溶化液を遠心分離して、上清を単離する。アッセイは、50%の可溶化液［vol／vol］、RNA（10〜50pM終濃度）および10%［vol／vol］の溶解緩衝液含むDsiRNA（10nM終濃度）を含む反応混合物を含む。また、反応混合物は、また10mMクレアチンリン酸、10μg／mlのクレアチンホスホキナーゼ、100um GTP、100μM UTP、100μM CTP、500μM ATP、5mM DTT、0.1U／μL RNasin（Promega）および100μMのそれぞれのアミノ酸も含む。酢酸カリウムの終濃度は、100mMに調整する。反応は、氷上で予め組み立てて、RNAを添加する前に25℃にて10分間事前に沈殿させ、次いでさらに25℃にて60分間インキュベートする。反応を4容積の1.25×Passive Lysis Buffer（Promega）でクエンチする。標的RNA切断は、RT-PCR解析または当該技術分野において公知のその他の方法によってアッセイして、反応からDsiRNAを省いた対照反応と比較する。
【０３１７】
あるいは、アッセイのための内部標識された標的RNAは、［α-32P］CTPの存在下においてインビトロでの転写によって調製して、スピンクロマトグラフィーによってG50セファデックスカラム上で通過し、さらに精製することなく標的RNAとして使用する。任意に、標的RNAは、T4ポリヌクレオチドキナーゼ酵素を使用して、5'-32P末端標識させる。アッセイは、上記の通りに行い、標的RNAおよびRNAiによって産生される特異的RNA切断産物をゲルのオートラジオグラフで視覚化する。切断の割合は、DsiRNAおよびアッセイによって産生される切断産物のない対照反応からの無処置の対照RNAまたはRNAを示すバンドの、PHOSPHOR IMAGER（登録商標）（オートラジオグラフィー）定量化によって決定する
核酸、ベクターおよび宿主細胞を導入する方法
本発明のDsiRNA薬剤は、細胞の中に（すなわち、細胞内に）直接導入してもよいく；または細胞外に空洞、間隙内に、微生物の循環内に導入し、経口的に導入してもよく、または核酸を含む溶液に細胞もしくは微生物を浸すことによって導入してもよい。血管または脈管外循環、血液またはリンパ系および脳脊髄液は、核酸を導入してもよい部位である。
【０３１８】
本発明のDsiRNA薬剤は、核酸を含む溶液注射、核酸によって覆われた粒子による照射、核酸の溶液に細胞もしくは微生物を浸漬すること、または核酸の存在下における細胞膜エレクトロポレーションを含む当該技術分野において公知の核酸送達方法を使用して導入することができる。脂質を媒介した担体輸送、化学的担体輸送およびリン酸カルシウムなどのカチオン性リポソームトランスフェクション等などの、核酸を細胞に導入するために当該技術分野において公知のその他の方法を使用してもよい。核酸は、以下の活性の1つまたは複数を行うその他の成分と共に導入してもよい：細胞による核酸取り込みを増強する、またはその他の標的RNAの阻害を増大する。
【０３１９】
標的RNAを有する細胞は、生殖系列または体細胞から、全能性または多能性、分裂してもいても、または分裂していなくても、甲状腺実質または上皮、不死化され、または形質転換されても、またはその他でもよい。細胞は、幹細胞または分化した細胞でもよい。分化した細胞タイプは、脂肪細胞、線維芽細胞、筋細胞、心筋細胞、内皮、ニューロン、グリア、血球、骨髄巨核球、リンパ球、マクロファージ、好中球、好酸球、塩基好性、肥満細胞、白血球、顆粒球、ケラチノサイト、軟骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、肝細胞および内分泌または外分泌腺の細胞を含む。
【０３２０】
特定の標的RNA配列および送達されるDsiRNA薬剤材料の用量に応じて、このプロセスは、標的RNAに対して部分的または完全な機能喪失をもたらし得る。ターゲットされた細胞の少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%もしくは99%以上のRNAレベルもしくは発現（RNA発現またはコードされるポリペプチド発現）の減少または喪失は、例示される。標的RNAレベルまたは発現の阻害とは、RNAまたはRNAコードされるタンパク質のレベルの非存在（または観察可能な減少）をいう。特異性とは、その他の細胞の遺伝子に対して明らかな効果を伴わずに標的RNAを阻害する能力をいう。阻害の結果は、細胞または微生物の外部特性の検査によって（下記の実施例に示したとおり）、またはRNA溶液ハイブリダイゼーション、ヌクレアーゼ保護、ノーザンハイブリダイゼーション、逆転写、マイクロアレイでの遺伝子発現モニタリング、抗体結合、酵素結合免疫吸着検定法（ELISA）、ウェスタンブロッティング、放射免疫アッセイ（RIA）、その他の免疫アッセイおよび蛍光標示式細胞分取器[（FACS）などの生化学的な技術によって確認することができる。本発明のDsiRNA薬剤による標的RNA配列の阻害は、また、インビボまたはインビトロのいずれかで、癌治療については腫瘍サイズなどの測定可能な表現型、ウイルス感染疾患についてはウイルスの負荷／力価、その他により、このようなDsiRNA薬剤の投与の効果に基づいて測定することができる。ウイルス感染疾患については、ウイルスの負荷または力価の減少は、細胞、組織または被験体に対する本発明のDsiRNA薬剤の投与を介して達成することができる、たとえば50%、60%、70%、80%、90%、95%または99%以上の減少を含むことができ、たいてい対数条件、たとえばウイルスの負荷または力価の10倍、100倍、1000倍、105倍、106倍、107倍の減で測定される。
【０３２１】
株化細胞または微生物全体におけるRNAによって媒介される阻害については、そのタンパク質産物が容易にアッセイされるリポーターまたは薬物耐性遺伝子の発現を測定することができる。このようなリポーター遺伝子は、アセトヒドロキシ酸シンターゼ（AHAS）、アルカリホスファターゼ（AP）、βガラクトシダーゼ（LacZ）、βグルコロニダーゼ（GUS）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）、緑色蛍光タンパク質（GFP）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）、ルシフェラーゼ（Luc）、ノパリンシンターゼ（NOS）、オクトピンシンターゼ（OCS）およびその誘導体を含む。アンピシリン、ブレオマイシン、クロラムフェニコール、ゲンタマイシン（gentarnycin）、ハイグロマイシン、カナマイシン、リンコマイシン、メトトレキセート、フォスフィノスリシン、ピューロマイシンおよびテトラサイクリンに対する耐性を与える複数の選択可能なマーカーを利用できる。アッセイに応じて、遺伝子発現の量の定量化により、本発明にしたがって治療されない細胞と比較して、10%、33%、50%、90%、95%または99%より優れた阻害の程度を決定することができる。
【０３２２】
より低用量の注射される材料およびRNAサイレンシング薬剤の投与の後により長時間、より小さな細胞の画分（たとえば、ターゲットされた細胞の少なくとも10%、20%、50%、75%、90%または95%）における阻害を生じ得る。細胞における遺伝子発現の定量化は、標的RNAの蓄積または標的タンパク質の翻訳のレベルにて、類似の阻害の量を示し得る。一例として、阻害の効率は、細胞における遺伝子産物の量を評価することによって決定され得るし；RNAは、阻害性DsiRNAのために使用した領域の外側のヌクレオチド配列を有するハイブリダイゼーションプローブで検出してもよく、または翻訳されたポリペプチドは、その領域のポリペプチド配列に対して生じる抗体で検出してもよい。
【０３２３】
DsiRNA薬剤は、細胞あたり少なくとも1コピーの送達が可能な量で導入してもよい。高用量の材料（たとえば、細胞あたりの少なくとも5、10、100、500または1000コピー）は、より有効な阻害を生じ得るし；低用量は、また特異的適用のために有用であり得る。
【０３２４】
RNA干渉に基づいた療法
公知のとおり、RNAi法は、広く多様な生物における広く多様な遺伝子に適用でき、開示された組成物および方法をこれらの状況のそれぞれにおいて利用することができる。開示された組成物および方法によってターゲットすることができる遺伝子の例は、細胞に対して天然である遺伝子である内因性遺伝子または通常細胞に対して天然でない遺伝子を含む。限定されないが、これらの遺伝子は、癌遺伝子、サイトカイン遺伝子、イディオタイプ（Id）タンパク質遺伝子、プリオン遺伝子、脈管形成を誘導する分子を発現する遺伝子、細胞接着因子のための遺伝子、細胞表面受容体、転移に関与するタンパク質、プロテアーゼ、アポプトーシス遺伝子、細胞サイクル制御遺伝子、EGFおよびEGF受容体を発現する遺伝子、MDR1遺伝子などの多剤耐性遺伝子を含む。
【０３２５】
より具体的には、本発明の標的mRNAは、細胞タンパク質（たとえば、核、細胞質、膜貫通または膜会合タンパク質）のアミノ酸配列を特定することができる。もう一つの態様において、本発明の標的mRNAは、細胞外タンパク質（たとえば、細胞外マトリックスタンパク質または分泌タンパク質）のアミノ酸配列を特定することができる。本明細書に使用される、タンパク質の「アミノ酸配列を特定する」というフレーズは、mRNA配列が遺伝子暗号の規則にしたがってアミノ酸配列に翻訳されることを意味する。タンパク質の以下のクラスを説明の便宜上挙げてある：発生タンパク質（たとえば（細胞接着因子、サイクリンキナーゼ阻害剤、Wntファミリーメンバー、Paxファミリーメンバー、Wingedヘリックスファミリーメンバー、Hoxファミリーメンバー、サイトカイン／リンフォカインおよびこれらの受容体、成長／分化因子およびこれらの受容体、神経伝達物質およびこれらの受容体）；癌遺伝子でコードされるタンパク質（たとえば、ABLI、BCLI、BCL2、BCL6、CBFA2、CBL、CSFIR、ERBA、ERBB、EBRB2、ETSI、ETSI、ETV6、FGR、FOS、FYN、HCR、HRAS、JUN、KRAS、LCK、LYN、MDM2、MLL、MYB、MYC、MYCLI、MYCN、NRAS、PIM I、PML、RET、SRC、TALI、TCL3およびYES）；腫瘍抑制因子タンパク質（たとえば、APC、BRCA1、BRCA2、MADH4、MCC、NF I、NF2、RB I、TP53およびWTI）；および酵素（たとえば、ACCシンターゼおよびオキシダーゼ、ACPデサチュラーゼおよび水酸化酵素、ADPグルコースピロホリラーゼ、ATPase、アルコールデヒドロゲナーゼ、アミラーゼ、アミルグルコシダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、カルコンシンターゼ、キチナーゼ、シクロオキシゲナーゼ、デカルボキシラーゼ、デキストリイナーゼ（dextriinases）、DNAおよびRNAポリメラーゼ、ガラクトシダーゼ、グルカナーゼ、グルコースオキシダーゼ、顆粒結合したデンプンシンターゼ、GTPase、ヘリカーゼ、ヘミセルラーゼ（hernicellulases）、インテグラーゼ、イヌリナーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、キナーゼ、ラクターゼ、リパーゼ、リポオキシゲナーゼ、リゾチーム、ノパリンシンターゼ、オクトピンシンターゼ、ペクチンエステラーゼ、ペルオキシダーゼ、ホスファターゼ、ホスホリパーゼ、ホスホリラーゼ、フィターゼ、植物生長調節剤シンターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテイナーゼおよびペプチダーゼ、プラナーゼ（pullanases）、リコンビナーゼ、逆転写酵素、RUBISCOs、トポイソメラーゼおよびキシラナーゼ）。
【０３２６】
一つの側面において、本発明の標的mRNA分子は、病的状態と関連するタンパク質のアミノ酸配列を特定する。たとえば、タンパク質は、病原体関連タンパク質（たとえば、宿主の免疫抑制、病原体の複製、病原体の伝達または感染の維持に関与するウイルスタンパク質）または宿主への病原体の侵入、病原体もしくは宿主による薬物代謝、病原体ゲノムの複製もしくは組込み、宿主における感染の確立もしくは伝播、または病原体の次世代の構築を促進する宿主タンパク質であってもよい。病原体は、フラビウイルス、ピコルナウイルス、ラブドウイルス、フィロウイルス、レンチウイルスを含むレトロウイルスなどのRNAウイルスまたはアデノウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、細胞拡大ウイルス、ヘパドナウイルスもしくはその他などのDNAウイルスを含む。さらなる病原体は、細菌、真菌、蠕虫、住血吸虫およびトリパノゾームを含む。その他の種類の病原体は、哺乳動物転置因子を含み得る。あるいは、タンパク質は、腫瘍関連タンパク質または自己免疫疾患関連タンパク質でもよい。
【０３２７】
標的遺伝子は、任意の微生物に由来しても、または含まれてもよい。微生物は、植物、動物、原虫、細菌、ウイルスまたは真菌でもよい。たとえば、参照によって本明細書に援用される米国特許第6,506,559合を参照されたい。
【０３２８】
医薬組成物
一定の態様において、本発明は、本発明のDsiRNA薬剤を含む医薬組成物を提供する。DsiRNA薬剤試料は、それが存在する場合に、試料の十分な部分が細胞に入って遺伝子サイレンシングを誘導するためにることができる任意の手段によって適切に製剤化すること、および細胞の環境に導入することができる。dsNAのための多くの製剤が当該技術分野において公知であり、dsNAが作用することができるようにそれが標的細胞に入ることができる限り使用することができる。たとえば、米国公開特許出願番号2004/0203145 A1および2005/0054598 A1を参照されたい。たとえば、本発明のDsiRNA薬剤は、ホスフェート緩衝生理食塩溶液、リポソーム、ミセル者構造およびカプシドなどの緩衝溶液中に製剤化することができる。カチオン脂質を伴うDsiRNA薬剤の製剤は、細胞へのDsiRNA薬剤のトランスフェクションを促進するために使用することができる。たとえば、リポフェクチン（米国特許第5,705,188）、カチオン性グリセロール誘導体およびポリリジン（公開されたPCT国際出願WO 97/30731）などのポリカチオン性分子などのカチオン脂質を使用することができる。適切な脂質は、オリゴフェクトアミン（Oligofectamine）、リポフェクトアミン（Lipofectamine）（Life Technologies）、NC388（Ribozyme Pharmaceuticals, Inc., Boulder、Colo.）またはFuGene 6（Roche）を含み、これらのすべては、製造業者の説明書にしたがって使用することができる。
【０３２９】
このような組成物は、典型的には核酸分子および薬学的に許容される担体を含む。本明細書に使用される、「薬学的に許容される担体」の言葉は、医薬品投与で適合性である生理食塩水、溶媒、分散培地、コーティング、抗菌および抗真菌薬、等張薬および吸収を遅延させる薬剤等を含む。補助活性化合物は、また組成物に組み込むことができる。
【０３３０】
医薬組成物は、その意図された投与の経路に適合性であるように製剤化される。投与経路の例は、非経口投与薬、たとえば、静脈内、皮内、皮下、経口（たとえば、吸入）、経皮（局所的）、経粘膜、および直腸投与を含む。非経口的、皮内もしくは皮下適用のために使用される溶液または懸濁液は、以下の成分を含むことができる：注射用蒸留水、生理食塩水溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたはその他の合成溶媒などの無菌の希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌物質；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミンなどの四酢酸キレート化剤；アセテート、シトラートまたはホスフェートなどの緩衝液および塩化ナトリウムまたはブドウ糖などの張性の調整のための薬剤。pHは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基で調整することができる。非経口製剤は、ガラスもしくはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジまたは多回投与バイアルに封入することができる。
【０３３１】
注射可能な使用のために適した医薬組成物は、無菌の水性溶液（水溶性の場合）または分散液および無菌の注射可能な溶液または分散液の即時調製のための無菌の粉末を含む。静脈内の投与については、適切な担体は、生理食塩水、静菌性水、Cremophor EL.TM.（BASF、Parsippany、N.J.）またはリン酸緩衝食塩水（PBS）を含む。全ての場合において、組成物は、無菌でなければならないし、簡単な注射可能性（syringability）である程度に液体であるべきである。これは、製造条件および貯蔵下で安定であるべきであり、細菌および真菌などの微生物の混入作用に対して保存されなければならない。担体は、たとえば、水、エタノール、ポリオール（たとえば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体のポリエチレングリコール等）およびこれらの適切な混合物を含む溶媒または分散媒であることができる。適当な流動性は、たとえば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散の場合必要とされる粒径の維持によって、および表面活性物質の使用によって維持することができる。微生物の作用の予防は、種々の抗細菌性および抗真菌薬薬剤、たとえば、パラベン、クロロブタノール、石炭酸、アスコルビン酸、チメロサール等によって達成することができる。多くの場合に、組成物における等張薬、たとえばメニトール（manitol）、ソルビトール、塩化ナトリウムなどの糖、多価アルコールを含むことが好ましいだろう。注射可能な組成物の長期にわたる吸収は、組成物における吸収を遅延させる薬剤、たとえばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含むことによって行うことができる。
【０３３２】
無菌の注射可能な溶液は、必要に応じて濾過滅菌後に、上で列挙した成分の1つまたは組み合わせで、適切な溶媒において必要とされる量で活性化合物を組み込むことによって調製することができる。一般に、分散材は、活性化合物を無菌の媒体に組み込むことによって調製され、これには、基本的分散媒および上記で列挙したものからの必要とされるその他の成分を含む。無菌の注射可能な溶液の調製のための無菌の粉末の場合、好ましい調製法は、減圧乾燥および凍結乾燥であり、これにより、以前に滅菌濾過された溶液から活性成分プラス任意のさらなる所望の成分の粉末を生じる。
【０３３３】
経口組成物は、一般に不活性な希釈剤または食用の担体を含む。経口治療的投与の目的のためには、活性化合物は、賦形剤と共に組み込むことができ、錠剤、トローチまたはカプセル、たとえばゼラチンカプセルの形態で使用することができる。経口組成物は、また含嗽薬として液体担体を使用して調製することができる。薬学的に適合性の結合剤および／または補助材料は、組成物の一部として含めることができる。錠剤、丸剤、カプセル、トローチ等は、以下の成分または類似の天然の化合物のいずれかを含むことができる：微晶質セルロース、トラガカントゴムまたはゼラチンなどの結合剤；デンプンまたはラクトース、崩壊剤（たとえばアルギン酸）、Primogelまたはトウモロコシデンプンなどの賦形剤；ステアリン酸マグネシウムまたはステローツ（Sterotes）などの潤滑剤；コロイド性二酸化ケイ素などの流動促進剤（glidant）；スクロースまたはサッカリンなどの甘味料薬剤；またはハッカ、サリチル酸メチルまたはオレンジ香味料などの香味薬。
【０３３４】
吸入による投与のためには、化合物は、エアゾール噴霧の形態で、適当な高圧ガス、たとえば二酸化炭素を含む加圧容器またはディスペンサーまたはネブライザーから送達される。このような方法は、米国特許第6,468,798号に記述されたものを含む。
【０３３５】
また、全身投与は、経粘膜または経皮手段によることができる。経粘膜または経皮的投与のためには、浸透するバリアに対して適当な透過剤を製剤中に使用する。このような浸透剤は、一般に当該技術分野において公知であり、およびたとえば、経粘膜投与のために、洗浄剤、胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体含む。経粘膜投与は、鼻内噴霧または坐薬を使用することによって達成することができる。経皮投与のためには、活性化合物を当該技術分野において一般に公知の軟膏、膏薬、ゲルまたはクリームに製剤化する。
【０３３６】
また、化合物は、直腸送達のための坐薬（たとえば、カカオ脂およびその他のグリセリドなどの従来の座薬基剤と共に）または保持浣腸の形態で調製することができる。化合物は、またMcCaffrey et al.（2002）、Nature、418（6893）、38-9（流体力学的なトランスフェクション）；Xia et al.（2002）、Nature Biotechnol., 20（10）、1006-10（ウイルスを媒介した送達）；またはPutnam (1996), Am. J. Health Syst. Pharm. 53(2), 151-160, erratum at Am. J. Health Syst. Pharm. 53(3), 325 (1996)に記述された方法を含むが、限定されない、当該技術分野において公知のトランスフェクションまたは感染を使用する方法によって投与することができる。
【０３３７】
また、化合物は、DNAワクチンなどの核酸薬剤の投与に適した任意の方法によって投与することができる。これらの方法は、遺伝子銃、バイオ注射器および皮膚パッチ、並びに針のない方法（たとえば米国特許第6,194,389号に開示された微小粒子DNAワクチン技術および米国特許第6,168,587号に開示したようが粉末形態ワクチンでの哺乳動物の経皮の針なしワクチン接種を含む。加えて、とりわけ、Hamajima et al.（1998） Clin .Immunol. Immunopathol., 88（2）、205-10に記載されているように、鼻腔内送達も可能である。リポソーム（たとえば、米国特許第6,472,375号に記載されているとおり）およびマイクロカプセル化も使用することができる。また、生物分解可能なターゲット可能な微小粒子送達系を使用することができる（たとえば、米国特許第6,471,996号に記載されているとおり）。
【０３３８】
一つの態様において、活性化合物は、インプラントおよびマイクロカプセルに入れられた送達系を含む制御された放出製剤などの、体からの迅速除去から化合物を保護するだろう担体と共に調製される。たとえばエチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸等の生物分解性の、生物学的適合性を有するポリマーを使用することができる。このような製剤は、標準的な技術を使用して調製することができる。材料は、またAlza CorporationおよびNova Pharmaceuticals, Inc.から商業的に得ることができる。また、リポソーム型懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体で感染細胞にターゲットされるリポソームを含む）を薬学的に許容される担体として使用することができる。これらは、当業者に公知の方法にしたがって調製することができる（たとえば、米国特許第4,522,811号に記載されているとおり）。
【０３３９】
このような化合物の毒性および治療有効性は、たとえば、LD50（集団の50%にとって致命的な用量）およびED50（集団の50%において治療的に有効な用量）を決定するための、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順によって決定することができる。毒性および治療効果の用量比は、治療指数であり、LD50とED50との比として表すことができる。高い治療インデックスを示す化合物が好ましい。毒性の副作用を示す化合物を使用してもよいが、非感染細胞への潜在的損傷を最小化し、およびこれにより、副作用を減少させるために、感染した組織の部位にこのような化合物をターゲットする送達系をデザインすように注意するべきである。
【０３４０】
細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータを使用して、ヒトに使用するための投薬量の範囲を製剤化する際に使用することができる。このような化合物の投薬量は、好ましくはほとんど毒性がないED50を含む循環濃度の範囲内である。投薬量は、使用される投薬形態および利用される投与の経路に応じて、この範囲内で変更してもよい。本発明の方法において使用される任意の化合物については、治療的に有効な用量は、初めに細胞培養アッセイから見積もることができる。用量は、細胞培養において決定されるように、IC50を含む循環血漿濃度範囲（すなわち、症候の半分最大阻害を達成する試験化合物の濃度）を達成するように動物モデルにおいて処方してもよい。このような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために使用することができる。血漿におけるレベルは、たとえば高性能液体クロマトグラフィーによって測定してもよい。
【０３４１】
本明細書で定義されるように、核酸分子の治療上有効な量（すなわち、有効な投薬量）は、選択される核酸に依存する。たとえば、DsiRNA薬剤をコードするプラスミドが選択される場合、およそ1pg〜1000mgの範囲の単一用量量を投与してもよい；一部の態様において、10、30、100もしくは1000 pgまたは10、30、100もしくは1000 ngまたは10、30、100もしくは1000 μgまたは10、30、100または1000 mgを投与してもよい。一部の態様において、1〜5gの組成物を投与することができる。組成物は、日当たり1回または複数回〜週当たり1回または複数回投与することができ；一日おきに、一回を含む。当業者であれば、疾患または障害の重症度、以前の治療、被験体の一般的な健康および／または年齢、並びにその他の存在する疾患を含むが、限定されない、一定の要因が被験体を効率的に治療するために必要とされる投薬量およびタイミングに影響を与えうることを認識するだろう。その上、タンパク質、ポリペプチドまたは抗体の治療上有効な量での被験体の治療は、単一の治療を含むことができ、または好ましくは、一連の治療を含むことができる。
【０３４２】
DsiRNA薬剤を細胞の環境に導入する方法は、細胞のタイプおよびその環境の構成に依存するだろうことを認識することができる。たとえば、細胞が液体内で見いだされるときに、1つの好ましい製剤は、リポフェクトアミン中などの脂質製剤であり、かつDsiRNA薬剤は、細胞の液体環境に直接添加することができる。脂質製剤は、また静脈内、筋肉内もしくは腹腔内注射によるか、または経口によるか、または吸入もしくは当該技術分野において公知であるその他の方法などによって動物に投与することができる。製剤が哺乳類およびより具体的にはヒトなどの動物に対する投与に適するとき、製剤は、また薬学的に許容される。オリゴヌクレオチドを投与するための薬学的に許容される製剤は、公知であり、使用することができる。一部の場合には、卵母細胞での研究と同様に、緩衝液または生理食塩水溶液中にDsiRNA薬剤を製剤化して、細胞に製剤化したDsiRNA薬剤を直接注射することが好ましいであろう。DsiRNA薬剤二重鎖の直接注射を行ってもよい。dsNA（たとえば、DsiRNA薬剤）を導入する適切な方法については、米国公開特許出願番号2004/0203145 A1を参照されたい。
【０３４３】
DsiRNA薬剤の適切な量を導入しなければならないし、これらの量は、標準的な方法を使用して経験的に決定することができる。典型的には、細胞の環境における個々のDsiRNA薬剤種の有効な濃度は、約50ナノモル以下、10ナノモル以下であるか、または約1ナノモル以下の濃度を使用することができる組成物。もう一つの態様において、方法は約200ピコモル以下の濃度を使用し、さらに約50ピコモル以下、約20ピコモル以下、約10ピコモル以下、約5ピコモル以下の濃度を多くの環境において使用することができる。
【０３４４】
本方法は、その中で細胞が生きることができる任意の細胞外マトリックスへのDsiRNA薬剤組成物の添加によって実施することができ、ただしDsiRNA薬剤組成物は、DsiRNA薬剤の十分な量が細胞に入ってその効果を及ぼすことができるように製剤化される。たとえば、本方法は、液体培養もしくは細胞成長培地などの液体において、組織外植体において、または哺乳類および特にヒトなどの動物を含む生物全体において存在する細胞で使用するために受け入れられる。
【０３４５】
標的RNAのレベルまたは活性は、現在当該技術分野において公知の、または後で開発される任意の適切な方法によって決定することができる。標的RNAおよび／または標的RNAの発現を測定するために使用される方法は、標的RNAの性質に依存することができることを認識することができる。たとえば、標的RNAがタンパク質をコードする場合、「発現」という用語は、標的RNAに由来するタンパク質またはRNA／転写物をいうことができる。このような場合には、標的RNAの発現は、標的RNAに対応するRNAの量またはそのタンパク質の量を測定することによって測定することによって決定することができる。タンパク質は、染色または免疫ブロットなどのタンパク質アッセイ法によって、またはタンパク質が測定することができる反応を触媒する場合、反応速度を測定することによって測定することができる。全てのこのような方法は、当該技術分野において公知であり、および使用することができる。標的RNAレベルが測定される場合、RNAレベルを検出するための任意の当該技術分野で認識される方法を使用することができる（たとえば、RT-PCR、ノーザンブロッティング、その他）。本発明のDsiRNA薬剤でウイルスRNAをターゲットする際に、また、インビトロまたはインビボのいずれかの、被験体、組織における、細胞における、または細胞抽出物における標的ウイルスのレベルの減少におけるDsiRNA薬剤の有効性の測定を使用して、標的ウイルスRNAレベルの減少の程度を決定することができることがまた予想される。上記の測定のいずれも、細胞、細胞抽出物、組織、組織抽出物または任意のその他の適切な供与源材料で行うことができる。
【０３４６】
標的RNAの発現が減少されたかどうかの決定は、RNAレベルの変化を確実に検出することができる任意の適切な方法によることができる。典型的には、決定は、そのDsiRNA薬剤の少なくとも一部が原形質に入るように消化されていないDsiRNAを細胞の環境に導入すること、および次いで標的RNAのレベルを測定することによって行われる。同じ測定を同一の未処置の細胞で行って、それぞれの測定から得られる結果を比較する。
【０３４７】
DsiRNA薬剤は、DsiRNA薬剤の薬理学的に有効な量および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物として製剤化することができる。薬理学的にまたは治療的に有効な量は、意図された薬理学的、治療的または予防的結果を生じるために有効なDsiRNA薬剤のその量をいう。「薬理学的に有効な量」および「治療上有効な量」または単に「有効量」という句は、意図された薬理学的、治療的または予防的結果を生じるのに有効なRNAのその量をいう。たとえば、疾患または障害と関連する測定可能なパラメーターの2少なくとも0%の減少があるときに、所与の臨床的治療が有効であるとみなされる場合、その疾患または障害の治療のための薬物の治療上有効な量は、少なくともそのパラメーターの20%の減少を遂行するために必要な量である。
【０３４８】
本発明の適切に製剤化された医薬組成物は、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、経皮、気道（エアロゾル）、経直腸、経膣および局所的（頬側および舌下を含む）投与を含む非経口的経路によってなどの当該技術分野において公知の任意の手段によって投与することができる。一部の態様において、医薬組成物は、静脈内または内部非経口的注入もしくは注射によって投与される。
【０３４９】
一般に、dsNAの適切な投薬量単位は、日当たりのレシピエントのキログラム体重量当たり0.001〜0.25ミリグラムの範囲または日当たりのキログラム体重量当たり0.01〜20マイクログラムの範囲または日当たりのキログラム体重量当たり0.01〜10マイクログラムの範囲または日当たりのキログラム体重量当たり0.10〜5マイクログラムの範囲または日当たりのキログラム体重量当たり0.1〜2.5マイクログラムの範囲であるだろう。dsNAを含む医薬組成物は、1日1回投与することができる。しかし、治療的薬剤は、また1日の全体にわたって適切な間隔にて投与される2、3、4、5、6回以上のサブ用量を含む投薬量単位で投薬してもよい。その場合、それぞれのサブ用量に含まれるdsNAは、合計で1日の投薬量単位を達成するために、対応してより少なくなければならない。投薬量単位は、たとえば、数日の期間にわたってdsNAの持続性および一貫した放出を提供する従来の持効性製剤を使用して、数日にわたって単一用量のために調合することができる。持効性製剤は、当該技術分野において周知である。本態様において、投薬量単位は、対応する複数の1日量を含む。製剤に関係なく、医薬組成物は、治療される動物またはヒトにおける標的遺伝子の発現を阻害するために十分な量のdsNAを含まなければならない。組成物は、dsNAの複数の単位の合計が共に十分な用量を含むような方法で調合することができる。
【０３５０】
ヒトのために適した投薬量範囲を製剤化するために、細胞培養アッセイおよび動物試験からデータを得ることができる。本発明の組成物の投薬量は、ほとんど毒性がないED50（公知の方法の決定にしたがって）を含む循環濃度の範囲内にある。投薬量は、使用される投薬形態および利用される投与の経路に応じて、この範囲内で変更してもよい。本発明の方法において使用される任意の化合物については、治療的に有効な用量は、初めに細胞培養アッセイから見積もることができる。用量は、細胞培養において決定されるように、IC50を含む循環血漿濃度範囲（すなわち、症候の半分最大阻害を達成する試験化合物の濃度）を達成するように動物モデルにおいて処方してもよい。このような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために使用することができる。血漿におけるdsNAのレベルは、標準的な方法によって、たとえば、高性能液体クロマトグラフィーによって測定してもよい。
【０３５１】
医薬組成物は、投与のための説明書と共に、キット、容器、パックまたはディスペンサーに含めることができる。
【０３５２】
治療の方法
本発明は、全体的にあるいは部分的に、標的RNAの発現またはこのような標的RNAの存在によって（たとえば、ウイルス感染、ウイルスゲノムの標的RNAの存在、カプシド、宿主細胞成分、その他の状況において）生じる疾患または障害のリスクのある（または感受性の）被験体を治療する予防的および治療的な方法の両方を提供する。
【０３５３】
本明細書に使用される「治療」または「治療すること」は、疾患または障害、疾患または障害の症候または疾患への素因を治癒し、治し、軽減し、解放し、変化させ、直し、寛解させ、改善し、または影響を及ぼすための目的で、患者に対する治療的薬剤（たとえば、DsiRNA薬剤またはベクターまたはこれをコードする導入遺伝子）の適用もしくは投与または疾患もしくは障害、疾患もしくは障害の症候または疾患もしくは障害への素因を有する患者から単離された組織もしくは株化細胞に対するの治療的薬剤の適用もしくは投与として定義される。
【０３５４】
一つの側面において、本発明は、治療的薬剤（たとえば、DsiRNA薬剤またはベクターまたはこれを導コードする入遺伝子）を被験体に投与することにより、被験体において、上記の通りの疾患または障害を予防するための方法を提供する。疾患のリスクのある被験体は、たとえば、本明細書において記述されるような、診断もしくは予後のアッセイのいずれかまたは組み合わせによって同定することができる。予防的薬剤の投与は、たとえば、被験体におけるウイルス粒子の検出または疾患もしくは障害に特徴的な症候の出現の前に行うことができ、その結果、疾患または障害は、防止され、またはあるいは、その進行が遅れる。
【０３５５】
本発明のもう一つの側面は、被験体を治療的に処置する、すなわち、疾患または障害の症候の発病を変化させる方法に属する。これらの方法は、インビトロで（たとえば、DsiRNA薬剤と共に細胞を培養することによって）、またはあるいは、インビボで（たとえば、被験体にDsiRNA薬剤を投与することによって）行うことができる。
【０３５６】
予防的および治療的な処置の方法に関して、このような治療は、薬理ゲノミクスの分野から得られる知識に基づいて、特異的に目的に合わせてもよく、または改変してもよい。本明細書に使用される「薬理ゲノミクス」は、臨床開発における、および市場での薬物に対する遺伝子シーケンシング、統計遺伝学および遺伝子発現解析などのゲノム科学技術の適用をいう。より具体的には、本用語は、患者の遺伝子がどのように彼または彼女の薬物に対する反応を決定するか（たとえば、患者の「薬物反応表現型」または「薬物反応遺伝子型」）の研究をいう。したがって、本発明のもう一つの側面は、その個体の薬物反応遺伝子型にしたがって、本発明の標的RNA分子または標的RNAモジュレーターのいずれかでの個体の予防的または治療的な処置に合わせるための方法を提供する。薬理ゲノミクスにより、臨床医または医師が治療から最も利益を得るだろう患者に対して予防的または治療的な処置をターゲットすること、および毒性のある薬物に関連した副作用を経験するだろう患者の治療を回避することができる。
【０３５７】
治療的薬剤は、適切な動物モデルにおいて試験することができる。たとえば、本明細書において記述したDsiRNA薬剤（または発現ベクターまたはこれをコードする導入遺伝子）を動物モデルにおいて使用して、前記薬剤での治療の有効性、毒性または副作用を決定することができる。あるいは、治療的薬剤を動物モデルにおいて使用して、このような薬剤の作用機構を決定することができる。たとえば、薬剤を動物モデルにおいて使用して、このような薬剤での治療の有効性、毒性または副作用を決定することができる。あるいは、薬剤を動物モデルにおいて使用して、このような薬剤の作用機構を決定することができる。
【０３５８】
本発明の実施には、特に明記しない限り、化学、分子生物学、細菌学、組換えDNA、遺伝学、免疫学、細胞生物学、細胞培養およびトランスジェニック生物学の従来の技術を使用し、これらは、当該技術分野の技術内である。たとえば、Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.); Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, 2nd Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.); Sambrook and Russell, 2001, Molecular Cloning, 3rd Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.); Ausubel et al., 1992), Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, including periodic updates); Glover, 1985, DNA Cloning (IRL Press, Oxford); Anand, 1992; Guthrie and Fink, 1991; Harlow and Lane, 1988, Antibodies, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.); Jakoby and Pastan, 1979; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155 (Wu et al. eds.), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986); Riott, Essential Immunology, 6th Edition, Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1988; Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986); Westerfield, M., The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio), (4th Ed., Univ. of Oregon Press, Eugene, 2000)を参照されたい。
【０３５９】
他に定義されない限り、本明細書において使用される全ての専門用語および科学用語は、共通に、本発明が属する当業者によって理解するのと同じ意味を有する。本明細書において記述したものに類似のまたは均等な方法および材料は、本発明の実施または試験において使用することができるが、適切な方法および材料は、後述する。本明細書において言及される全ての刊行物、特許出願、特許およびその他の参照文献は、これらの全体が参照により援用される。矛盾する場合には、定義を含む本明細書が優先するだろう。加えて、材料、方法および実施例は、例証のみであり、限定することは意図されない。
【実施例】
【０３６０】
本発明は、以下の実施例を参照することにより記述され、これらは実例として提供してあり、いずれの様式に本発明を限定することも意図されない。当該技術分野において周知の標準的技術またはいかに具体的に記述した技術を利用した。
【０３６１】
実施例1-方法
オリゴヌクレオチド合成、インビトロでの使用
標準的な方法にしたがって、個々のRNA鎖を合成し、HPLCで精製した（Integrated DNA Technologies、Coralville、Iowa）。全てのオリゴヌクレオチドは、HPLC解析による化学的純度および質量分析解析による全長鎖の純度に基づいて品質管理してリリースした。二重鎖RNAのDsiRNAsは、それぞれの鎖の同等の量を混合し、RNA緩衝液（IDT）において100℃に手短に加熱して、次いで混合物を室温に冷却させることにより、使用直前に調製した。
【０３６２】
オリゴヌクレオチド合成、インビボの使用
標準的な方法にしたがって、個々のRNA鎖を合成し、HPLCで精製した（OligoFactory、Holliston、MA）。全てのオリゴヌクレオチドは、HPLC解析による化学的純度および質量分析解析による全長鎖の純度に基づいて品質管理してリリースした。二重鎖RNAのDsiRNAsは、それぞれの鎖の等モル量を混合し、RNA緩衝液（IDT）において100℃に手短に加熱して、次いで混合物を室温に冷却させることにより、使用直前に調製した。
【０３６３】
細胞培養およびRNAトランスフェクション
Hela細胞をATCCから得て、5%のCO2下で37℃にて、10%のウシ胎児血清（HyClone）を補充したダルベッコの修飾イーグル培地（HyClone）において維持した。図2のRNAトランスフェクションについては、Hela細胞を2mLの最終的な容積において4x105細胞/ウェルの密度にて6穴プレートに一晩播種した。24時間後に、Oligofectamine（商標）（Invitrogen）を使用し、製造業者の説明書にしたがって、20nMの終濃度に特定するように、細胞をDsiRNA二重鎖でトランスフェクトした。簡潔には、8μLのそれぞれのDsiRNAの5μM保存液を、200μLのOpti-MEM（登録商標）I（Invitrogen）と混合した。別々のチューブに、12μLのOligofectamine（商標）を48μL のOpti-MEM（登録商標）Iと混合した。室温（RT）にて5分インキュベーションした後、DsiRNAおよびOligofectamine（商標）の一定分量を合わせて、穏やかに撹拌し、RTにて20分間さらにインキュベートしてDsiRNA：Oligofectamine（商標）複合体（トランスフェクション混合物）を形成させた。最後に、培養液を加えて、それぞれのトランスフェクション混合物を2mLの最終的な容積にした。6時間のインキュベーションの後、それぞれのウェルにおけるトランスフェクション/培養液を新鮮な培養液に置換し、細胞をさらに18時間インキュベートした。
【０３６４】
図3-5のRNAトランスフェクションについては、Lipofectamine（商標）RNAiMAX（Invitrogen）を使用し、製造業者の説明書にしたがって、0.1nMの終濃度にて示されるように、Hela細胞をDsiRNAsでトランスフェクトした。簡潔には、2.5μLのそれぞれのDsiRNAの0.02μMの保存液を、46.5μLのOpti-MEM I（Invitrogen）および1μLのLipofectamine（商標）RNAiMAXと混合した。生じる50μLの混合物を12ウェルプレートの個々のウェルに添加して、RTにて20分間インキュベートし、DsiRNA：Lipofectamine（商標）RNAiMAX複合体を形成させた。一方、Hela細胞をトリプシン処理して、367細胞/mLの終濃度にて、培地において再懸濁した。最後に、450μLの細胞懸濁液をそれぞれのウェル（最終的な容積500μL）に添加し、プレートを24時間インキュベーターに置いた。
【０３６５】
RNA単離および解析、インビトロの実施例
細胞を2mLのPBSで一度洗浄し、総RNAをRNeasy Mini Kit（商標）（Qiagen）を使用して抽出して、30μLの最終的な容積において溶出した。1μgの総RNAを、製造業者の説明書にしたがって、Transcriptor 1st Strand cDNA Kit（商標）（Roche）およびランダムなヘキサマーを用いて逆転写した。生じるcDNAの1/30（0.66μL）を、3.33μLのH2Oおよび1μLのヒト遺伝子HPRT-1（アクセッション番号NM_000194）およびSFRS9（アクセッション番号NM_003769）遺伝子に特異的な2セットのプライマーおよびプローブを含む3μM混合物と共に、5μLのiQ（商標）Multiplex Powermix（Bio-Rad）と混合した：
Hu HPRTフォワードプライマーF517 GACTTTGCTTTCCTTGGTCAG 
Hu HPRTリバースプライマーR591 GGCTTATATCCAACACTTCGTGGG
Hu HPRTプローブ P554 Cy5-ATGGTCAAGGTCGCAAGCTTGCTGGT-IBFQ
Hu SFRS9フォワードプライマーF569 TGTGCAGAAGGATGGAGT 
Hu SFRS9リバースプライマーR712 CTGGTGCTTCTCTCAGGATA 
Hu SFRS9プローブP644 HEX-TGGAATATGCCCTGCGTAAACTGGA-IBFQ。
【０３６６】
インビボの試料調製および注射
DsiRNAは、製造業者のプロトコルにしたがって、Invivofectamine（商標）中に製剤化した（Invitrogen、Carlsbad、CA）。簡潔には、N/グループのマウスおよび使用するマウスの体重量を決定し、次いで処理されるマウスのそれぞれのグループに必要なDsiRNAの量を算出した。1mlのIVF-oligoは、10mg/kgの投薬量にて25g/マウスの4匹のマウスに十分であった。1mgのDsiRNAを、1mlのInvivofectamine（商標）に添加して、ローテーターで30分間、RTにて混合した。14mlの5%グルコースを、製剤化いたIVF-DsiRNAを希釈するために使用して、50kDaの分子重量をカットオフする回転コンセントレータ（Amicon）に適用した。IVF-DsiRNAの容積が1ml未満になるまで、回転コンセントレータを4℃にて&#12316;2時間、4000rpmにて回転した。回収したIVF-DsiRNAを、1mlの5%グルコースに希釈して、動物注射のために準備した。
【０３６７】
動物への注射および組織の収集
動物を、ケタミン/キシラジンで腹腔内注射によって、外科的麻酔に供した。それぞれのマウスを、注射の前に体重測定した。製剤化いたIVF-DsiRNAを、100μl/10gの体重量にて静脈注射した。24時間後に、マウスを、CO2吸入によって屠殺した。解析のための組織を収集して、2mlのRNAlater（商標）（Qiagen）を含むチューブに置き、4℃一晩のインキュベーションの前に30分間RTにて回転した。組織は、使用まで-80℃にてその後貯蔵した。
【０３６８】
組織RNA調製および定量化
約50〜100mgの組織を、Tissue Lyser（商標）（Qiagen）上にて1mlのQIAzol（商標）（Qiagen）中でホモジナイズした。次いで総RNAを、製造業者のプロトコルにしたがって単離した。簡潔には、0.2mlのクロロホルム（Sigma-Aldrich）をQIAzol（商標）可溶化液に添加して、ボルテックスすることによって、勢いよく混合した。4℃にて15分間、14,000rpmにて遠心した後、水相を収集して、0.5mlのイソプロパノールと混合した。10分間、14,000rpmにてさらに遠心の後、RNAペレットを75%のエタノールで一度洗浄して、短時間乾燥した。単離したRNAを、100μlのRNaseを含まない水に再懸濁して、製造業者のプロトコルにしたがってRNeasy（商標） total RNA preparation kit（Qiagen）またはSV 96 total RNA IsolationSystem（Promega）によるクリーンアップに供した。
【０３６９】
一本鎖cDNA合成、インビトロの実施例
1μgの総RNAを、製造業者の説明書にしたがって、Transcriptor 1st Strand cDNA Kit（商標）（Roche）およびオリゴdTを使用して逆転写した。生じるcDNAの1/40（0.66μL）を、3.33μLの水および1μLのマウス遺伝子HPRT-1（アクセッション番号NM_013556）およびKRAS（アクセッション番号NM_021284）遺伝子に特異的な2セットのプライマーおよびプローブを含む3μM混合物と共に、5μLのIQ Multiplex Powermix（Bio-Rad）と混合した：
Mm HPRTフォワードプライマーF576 CAAACTTTGCTTTCCCTGGT 
Mm HPRTリバースプライマーR664 CAACAAAGTCTGGCCTGTATC
Mm HPRTプローブP616 Cy5-TGGTTAAGGTTGCAAGCTTGCTGGTG-IBFQ
Mm KRASフォワードプライマーF275 CTTTGTGGATGAGTACGACC 
Mm KRASリバースプライマーR390 CACTGTACTCCTCTTGACCT 
Mm KRASプローブP297 FAM-ACGATAGAGGACTCCTACAGGAAACAAGT-IBFQ。
【０３７０】
定量的RT-PCR
C1000 Thermalサイクラー（Bio-Rad）を備えたCFX96 Real-time systemを、増幅反応のために使用した。PCR条件は、以下の通りだった： 95℃、3分間；次いで、95℃、10秒；55℃、1分間を40サイクル繰り返し。それぞれの試料を、三連で試験した。HPRTの実施例については、相対的なHPRT mRNAレベルをSFRS9 mRNAレベルで規準化し、トランスフェクション試薬プラス対照のミスマッチ二重鎖で処理したか、または未処理の対照試料において得られたmRNAレベルと比較した。KRASの実施例については、相対的なKRAS mRNAレベルをHPRT-1 mRNAレベルで規準化し、5%グルコースで処理したマウスからの対照試料において得られたmRNAレベルと比較した。データは、Bio-Rad CFX Manager version1.0（インビトロ実施例）または1.5（インビボ実施例）ソフトウェアを使用して解析した。
【０３７１】
実施例2-DNA二重鎖拡張を有するDsiRNA薬剤の有効性
DNA二重鎖拡張を有するDsiRNA薬剤を、配列特異的な標的mRNA阻害の有効性について調べた。具体的には、RNA拡張、DNA拡張、または混合DNAおよびRNA拡張構造を有するHPRT-標的DsiRNA二重鎖を、20nMの固定した濃度にてHela細胞にトランスフェクトし、HPRT発現レベルを24時間後に測定した（図2Aおよび2B）。トランスフェクションを二連で行い、それぞれの二連を、qPCRによってHPRT発現について三連でアッセイした。これらの条件（20nM二重鎖、オリゴフェクトアミンによるトランスフェクション）下で、HPRT遺伝子発現は、二重鎖1〜6によって、30〜50%に減少した。二重鎖6は、ガイド（アンチセンス）鎖の5'末端にて始まっている10bp（塩基対）の領域を形成したDNA置換を含み、33/35merの最終的な長さの配置となった。二重鎖7は、長さおよび配列において二重鎖6と同一だったが、図2Bにおいて示した位置において4つのDNAヌクレオシド修飾だけを含んだ。驚くべきことに、二重鎖7は、二重鎖6より著しく少なくHPRT発現を減少させ、それは、DicerがDNA塩基間の拡張されたRNA領域を認識し、siRNAsの代替物種へと二重鎖を切断することを示唆した。DsiRNA（二重鎖8）のDNA：DNA拡張領域のホスホロチオアート修飾が、DNA拡張DsiRNA薬剤のRNA阻害活性を無くすことができたことも、また観察された。二重鎖8薬剤の活性は、未修飾のDNA部分とPS-DNA部分の十分な置換によって回復することができる可能性が高い。実際に、このような二重鎖に未修飾のDNA残基をこのように「加えて戻す（add-back）」ことは、本発明の利点を強調する−本発明の薬剤は、なおもRNA阻害活性を保持すると共に、非拡張薬剤より多くの修飾を有するように作製することができ、これは、タンデムおよび/または密接に間隔のあいた修飾残基の存在を生じさせることができるという問題の観点において、重要な発展である（ここで、直列型の塩基対形成したPS-DNAが二重鎖8において存在する場合、RNA阻害活性は、完全に無くなる）。
【０３７２】
実施例3-27/29mer二重鎖の用量反応比較
減少した濃度でのDNA二重鎖の拡張DsiRNAの有効性を試験するために、Hela細胞におけるHPRT mRNAレベルのノックダウンのための、10.0ナノモル（nM）、1.0ナノモル（nM）および100ピコモル（100pMまたは0.1nM）濃度での一連の用量反応実験において、HPRTをターゲットする修飾した二重鎖を、最適化した27/29mer二重鎖と比較した。二重鎖DsiRNA 1は、活性のあるものとして以前に報告された25/27merのDsiRNA二重鎖の誘導体であった（HPRT-1、Roze et al. NAR 2005、Collingwood et al. 2008）；しかし、本二重鎖（#1）は、オリゴヌクレオチド二重鎖を27/29merまで拡張したそれぞれの鎖において2塩基の挿入を含んだ。二重鎖2は二重鎖1と配列が同じだったが、ガイド鎖（アンチセンス配列）の2塩基対挿入および2つのさらなるヌクレオシドをDNAとして合成した。したがって、パッセンジャー（センス）鎖の3'末端にて2塩基のDNA置換が以前報告されているのに対し（Rose et al, 2005）、二重鎖2は、ガイド鎖の5'末端にて4つのDNA bp（塩基対）で終了した。二重鎖3（MM対照）は、最適化したHPRT-1二重鎖に由来したが、標的RNA配列に関してミスマッチを有して合成した。それぞれの鎖の塩基組成および化学修飾、並びに配列および二重鎖3の末端における突出または平滑構造は、ターゲットされない化学効果（図5を参照されたい）を制御するために、最適化したHPRT-1二重鎖に関して一定に保持された。未処理の細胞におけるベースラインのHPRT発現をまた測定した（図3Aの「C」）。
【０３７３】
二重鎖1および2の推定のDicerプロセシング産物は、互いに、および図2Bに示した二重鎖のDicerプロセシング産物と同一だった（図1Aを参照されたい）。10nMおよび1nMトランスフェクション濃度にて、二重鎖1および2の両方は、少なくとも95%までHPRT RNAレベルを減少させ、これは、二重鎖2の末端での二本鎖DNAの付加が、Dicer結合、並びにHPRT mRNAに対するRISC活性をロードし、および指揮するための構造への二重鎖のプロセシングを妨げなかったことを示唆した。100pMにて、二重鎖2は、90%までHPRT発現を減少させ、およそ75%までHPRTを減少させた二重鎖1より2倍を超える活性に思われた。
【０３７４】
実施例4-2、6および8つのDNA塩基対が拡張した二重鎖の比較
拡張した二重鎖RNAの対応する長さを有するDsiRNA薬剤と比較して、このようなDNA二重鎖が拡張DsiRNAの有効性および/または効果の期間をなお増強する一方で、DsiRNA薬剤に導入されるかもしれない二本鎖DNA拡張の長さを調査するために、一連の二本鎖の核酸を産生し、2塩基対、6塩基対および8塩基対拡張で試験した（このような拡張のわずかな長さは、また、センス鎖の3'末端の最後から2番目および最後のデオキシリボヌクレオチド残基を含み、それはアンチセンス鎖の5'末端の同種のデオキシリボヌクレオチド残基と塩基対を形成し、結果として図4A〜4Dの「DNA 4bp」二重鎖#4、「DNA 8bp」二重鎖#5および「DNA 10bp」二重鎖#6を生じる）。2塩基対のDNA：RNA二本鎖領域および6塩基対のRNA：RNA二本鎖領域（図4A〜4D参照されたい）を含む拡張を含む33/35merの二重鎖3による遺伝子発現の阻害は、二重鎖1（2塩基対のRNA：RNAの二本鎖拡張を有する27/29mer）および二重鎖2（6塩基対のRNA：RNAの二本鎖拡張を有する31/33mer）に比較して減少し、これは、RNA二重鎖長を増加させることがRNAi活性を低下させたという以前の報告と一致した。特に、RNA：RNA拡張した二重鎖1、2および3は全て、二本鎖DNA：DNA拡張を有した対応する二重鎖4、5および6に比較して減少した活性を示した。RNA挿入/DNAシリーズとDNAシリーズとぼ間の、活性における最も大きな相違は、100pMにて観察されたが、10pMにてなおも検出可能であった（図4Bおよび4C）。
【０３７５】
図4にて比較される二重鎖は、1）それが生じる場合Dicer-基質二重鎖の乱交雑なプロセシングの負の効果を増強し、2）HPRT mRNAのRNase Hが媒介する切断の可能性をなくすようにデザインされていた。図4Bに示したガイド（アンチセンス）鎖の3'末端で開始して、正準の19〜23塩基長のRNA鎖を生じなかった方法でプロセスされた二重鎖は、HPRT標的mRNAレベルにおけるRISCが媒介する減少を指揮する可能性がないだろう。長いRNA二重鎖（たとえば、図4Dの二重鎖3）の乱交雑なプロセシングは、シード領域にミスマッチを含んだガイド鎖を産するだろうし、したがって、標的に対するRISC活性を減少させる。乱交雑プロセシングは、またパッセンジャー（センス）オリゴヌクレオチドをロードするRISCを生じさせることができた。二重鎖3は、より低い濃度にてより短いRNA種より著しく低い活性であり、より活性のないsiRNA種へとプロセスされる可能性が高かった。
【０３７６】
DNAを含む長い二重鎖（たとえば、図4Dの二重鎖6）が、差動的に分解され、および/または誤ってプロセスされた場合、10塩基までのアンチセンスDNAを含む一本鎖オリゴヌクレオチドが生じ得る。理論的には、このDNA部分は、RNase Hを活性化して相補的な標的mRNAを切断することができる。二重鎖4、5および6のDNA部分は、HPRT mRNAにマッチせず、したがって、HPRT mRNAにおいて観察された減少の原因とはなりえなかった。細胞取り込み、Dicerによるプロセシングより前の、またはRISCへのロードの前の二重鎖の差動的分解は、また、HPRTの減少において観察された相違を生じさせうる。二重鎖3は、この効果を制御する2つのDNAヌクレオシドの内部置換を含んだ（パッセンジャー鎖の3'末端から計数して塩基9および10）。DNA置換が、ヌクレアーゼ分解に対して二重鎖を単に安定化することによって二重鎖活性を増加させる場合、二重鎖3は、二重鎖1または2より安定であるはずであり、潜在的に二重鎖4と同程度安定であるはずだった。その代わりに、二重鎖3は、二重鎖1、2および4より効率的に、HPRT標的mRNAレベルを減少させず、二重鎖DNA：DNA領域が導入されたときに見られた増強効果が、単にヌクレアーゼ分解に対する増強された耐性に起因していないことを示す。類似の理論的根拠によって、DNA塩基対が試験した二重鎖の有意な安定化を生じさせた場合、DNA塩基対長の増加により、二重鎖4〜6全体の次第に増強された活性を生じるはずであった。しかし、このような次第に増加するDNA長は、二重鎖活性を増加させなかった。
【０３７７】
上記の結果からみて、2〜10塩基対の二重鎖DNA：DNAが拡張した領域を有するDsiRNA薬剤（この場合、このような拡張が、予測されDicer切断部位の3'であるセンス鎖の領域および予測されたDicer切断部位の5'であるアンチセンス鎖の対応する領域に位置した）は、有効で、ある場合は増強したRNA阻害性薬剤を構成すると結論づけた。
【０３７８】
実施例5-低濃度での二本鎖DNA：DNAが拡張した二重鎖の増強された有効性
一連の長さを増加した修飾二重鎖を、100pMの固定した濃度にて、HPRT mRNA発現の減少について評価した。図5Aおよび5Bの二重鎖1は、化学的修飾、ガイド（アンチセンス）鎖の3'末端における2塩基の突出および2つのDNA置換、並びにパッセンジャー（センス）鎖の3'末端における平滑末端を含む最適化された25/27merのDicer基質であった（Collingwood et al. 2008）。HPRT mRNAに非相補的塩基は、RNA（二重鎖2〜5）またはDNA（二重鎖6〜9；図5Aおよび5Bを参照されたい）として、時として2塩基挿入され、27/29mersから33/35mersに全体の二重鎖配置が増加した。
【０３７９】
二重鎖1は、RNA塩基対の付加によって拡張した任意のその他の「最適化した」二重鎖（二重鎖2〜5；図5A）より、HPRT mRNAレベルを減少させることにおいてより有効であり、それは、より長い二重鎖が1つまたは複数のより活性のないガイド種にプロセスされる可能性が高いという概念を支持している。DNA塩基対の付加によって拡張した全ての二重鎖（二重鎖6&#12316;9；図5A）は、二重鎖2&#12316;5よりも著しく活性であり、二重鎖1に対する活性とほぼ同等であった。
【０３８０】
二重鎖6〜9は、HPRT mRNA減少のこれらの程度において区別がつかなかった。したがって、DNA塩基対領域は、RNAi活性を増加させたヌクレアーゼ耐性の特性に影響を及ぼしていなかった（二重鎖2〜5を互いに、および二重鎖1と比較する）。驚くべきことに、またDNA部分の長さを増加させることは、HPRTの減少に負に影響を与えなかった。全てのDNA二重鎖は、同等の活性を有して、相当するRNAに基づいた二重鎖よりも優れた活性を有した。これらの結果は、二重鎖2〜5のDNA挿入が、最適化した二重鎖1からプロセスされた正準のガイド鎖の産生にDicer活性を限定することを示した。
【０３８１】
実施例6-ミスマッチを有するDsiRNA薬剤を含む、左に拡張DsiRNA薬剤の有効性（「DsiRNAmms」）
有効なDsiRNA薬剤が、また、上記に記載した「右に拡張した」DsiRNA薬剤と反対の（「反転した」）向きにおいて、DNA：DNA拡張を有することができるかどうか調べるために、「左に拡張した」DsiRNA薬剤を合成して、上記の方法を介して阻害の有効性について試験した。このような「左に拡張した」DsiRNA薬剤（本件の場合、図7で示すような、センス鎖の5'末端領域とアンチセンス鎖の3'末端領域との間に形成される5塩基対のDNA：DNA拡張を有する30/28mer薬剤）を、対応する28/30merの「右に拡張した」DsiRNA薬剤と直接比較して、標的RNAの阻害の有効性について試験した。驚くべきことに、「左に拡張した」薬剤は、KRAS標的mRNAレベルのこれらの阻害において、「右に拡張した」薬剤より強力であることが観察された。また、驚いたことは、ミスマッチ残基を、両方の「左に拡張した」および「右に拡張した」DNA：DNA拡張DsiRNA薬剤に、このような薬剤の阻害有効性を保持したまま、その他でなく一定の位置にて導入することができるという事実であった。具体的には、DNA：DNA拡張「DsiRNAmm」薬剤（本明細書に使用される、「DsiRNAmm薬剤」という用語は、いずれの鎖のいずれの末端の2つの末端ヌクレオチド残基以外の位置に位置する1つまたは複数のミスマッチ塩基対を含むDsiRNA薬剤を示す）を、以下の位置にてミスマッチ塩基対を有するように合成した：12単独、14単独、16単独、14と18共に、および12と16共に（突出したDicer切断後のDsiRNAmm薬剤の5'末端アンチセンス残基を位置1として始める）。図8および9に示したように、位置14単独、位置16単独、並びに位置14および18の両方にミスマッチ残基を有するDsiRNAmm薬剤は、全て有効な阻害性薬剤であった。驚くべきことに、両方の「親」DsiRNAsおよびDsiRNAmmsの左に拡張した形態は、親のDsiRNA薬剤について、およびアンチセンス鎖の位置14単独、位置16単独、並びに位置14および18の両方にミスマッチ残基を有するDsiRNAmm薬剤について、右に拡張した形態よりも優れた阻害有効性（Hela細胞における100pMのトランスフェクションレベルにて）を有することが最初に同定された（位置は、突出したDicer切断後のDsiRNAまたはDsiRNAmm薬剤の5'末端アンチセンス残基を位置1として始めて3'方向において（5'から3'を意味）番号付けされるとき）。アンチセンス鎖の位置14および18の両方にミスマッチ残基を有するDsiRNAmm薬剤を除いては、右に拡張DsiRNAまたはDsiRNAmm薬剤と比較して、左に拡張したものに最初に観察された100pMでのより優れた有効性は、再生可能だった（図9）。
【０３８２】
実施例7-有効なDsiRNA薬剤内のホスホロチオアート修飾およびDNA残基の位置
本発明のDNA：DNA拡張配列が、DsiRNA薬剤の阻害の有効性を保持しながら、有利な修飾が配置されることにより、DsiRNA薬剤内に余分の残基を提供するかどうか試験するために、複数のホスホロチオアート修飾した塩基を有するDsiRNA薬剤の強さを調べた。ホスホロチオアート修飾されたsiRNA薬剤の以前の研究は、複数のホスホロチオアートが存在するときに、このような薬剤が細胞に対して細胞毒性でありえることを明らかにし（Amarzguioui et al. Nucleic Acids Research、31：589-595）、アンチセンス鎖の5'末端で、又はその近くで、ホスホロチオアート修飾を有するいくつかのsiRNA薬剤は、減少した阻害活性を有することが観察された。図10に示したように、DsiRNA薬剤の「DNA 6bp（2PS）」および「DNA 6bp（4PS）」は、同様な標的mRNA（HPRT）の阻害有効性を示し、これらの分子のDNAが拡張した二重鎖領域が、これらの分子の標的RNAの阻害の有効性に対する有害な影響なしに、広範囲に修飾されうることを証明する。
【０３８３】
本発明の「右に拡張した」DsiRNA薬剤中のアンチセンス鎖の突出した5'Dicer切断部位での、またはその近くのデオキシリボヌクレオチドのパターン構成を、また調べた。図10に示したように、アンチセンス鎖の5'末端からDicer切断後のアンチセンス鎖の5'末端ヌクレオチドに隣接した位置に対して、あらゆる方向に拡張するアンチセンス鎖デオキシリボヌクレオチドを有するDsiRNA薬剤（薬剤DP1055P/DP1057GおよびDP1058P/DP1060G参照されたい）は、有効なRNA干渉薬剤であった。アンチセンス鎖の5'末端領域内のデオキシリボヌクレオチド包含のその終結は、センス鎖内の最も3'のDicer切断部位のアンチセンス鎖内の5'位置に生じるはずであると以前に考えられたので、DP1055P/DP1057GおよびDP1058P/DP1060GのDsiRNA薬剤についての結果は、予想外であった（薬剤DP1055P/DP1056GおよびDP1058P/DP1059Gを参照されたい）。また、図10に示したように、左に拡張DsiRNA薬剤は、有効な阻害性薬剤であることが観察され、一方で、このDsiRNA薬剤のアンチセンス鎖の「シード」領域内のU：Gミスマッチの包含が、阻害活性の控え目な減弱レベルを生じさせることが観察された。
【０３８４】
本発明の「右に拡張した」DsiRNA薬剤のホスホロチオアート修飾の鎖加重のパターンの効果も調べた。「右に拡張した」DsiRNA薬剤、「DNA 6bp（2PS）」および「DNA 6bp（4PS）」のホスホロチオアート修飾オリゴヌクレオチド鎖を再構築して、図11に示したDP1061P/DP1064GおよびDP1062G/DP1063PのDsiRNA薬剤を作製した。驚くべきことにそれはパッセンジャー鎖に4つのホスホロチオアート修飾したデオキシリボヌクレオチドおよび対応するガイド鎖残基に2つのホスホロチオアート修飾したデオキシリボヌクレオチドが存在する、DP1062G/DP1063Pの二重鎖が、「DNA 6bp（2PS）」と同等、あるいはよりよく実行したが、ガイド鎖に4つのホスホロチオアート修飾したデオキシリボヌクレオチドおよび対応するパッセンジャー鎖残基に2つのホスホロチオアート修飾したデオキシリボヌクレオチドを有するDP1061P/DP1064G二重鎖は、有効な阻害性の分子ではなかった。このような結果は、本発明のDsiRNAsの拡張した領域については、ガイド鎖に比べてパッセンジャー鎖にこのような修飾を加重するホスホロチオアート修飾パターンが、反対に加重したパターンに比べて、最大の有効性を保持するかもしれないことを示唆する。
【０３８５】
実施例8-5、10および12のDNAまたはRNA塩基対によって拡張した二重鎖の比較
DsiRNAsの構造的な拡張の影響をさらに調査するために、KRAS転写物をターゲットする「右に拡張した」DsiRNAsのいくつかのシリーズを産生し、インビトロにおける標的のノックダウン有効性について評価した。図12は、KRAS転写物内の「KRAS-200」部位をターゲットする「右に拡張した」DsiRNAsの一連の構造を示す。図12の第1の二重鎖（対応するデータ図13の「DP1174P/DP1175G」または二重鎖「01」）は、パッセンジャー鎖の最後および最後から2番目の3'末端残基にだけデオキシリボヌクレオチドを有する25/27merのDsiRNAである。図12の第2の二重鎖（対応するデータ図13の「DP1200P/DP1201G」または二重鎖「02」）は、パッセンジャー鎖の突出したDicer切断部位の3'に位置する全てのパッセンジャー鎖残基にて、および示されたガイド鎖の突出したDicer切断部位5'に位置する全てのガイド鎖残基にてデオキシリボヌクレオチドを有する25/27merのDsiRNAである。図12の第3の二重鎖（対応するデータ図13の「DP1202P/DP1203G」または二重鎖「03」）は、示すように（図12の第3の二重鎖の箱の領域）、「DP1174P/DP1175G」二重鎖と比べて、5塩基対のリボヌクレオチド配列の挿入を有する30/32merのDsiRNAである。図12の第4の二重鎖（対応するデータ図13の「DP1204P/DP1205G」または二重鎖「04」）は、示すように（図12の第4の二重鎖の箱の領域）、「DP1200P/DP1201G」二重鎖と比べて、5塩基対のリボヌクレオチド配列の挿入を有する30/32merのDsiRNAである。図12の第5の二重鎖（対応するデータ図13の「DP1206P/DP1207G」または二重鎖「05」）は、示すように（図12の第5の二重鎖の箱の領域）、「DP1174P/DP1175G」二重鎖と比べて、10塩基対のリボヌクレオチド配列の挿入を有する35/37merのDsiRNAである。図12の第6の二重鎖（対応するデータ図13の「DP1208P/DP1209G」または二重鎖「06」）は、示すように（図12の第6の二重鎖の箱の領域）、「DP1200P/DP1201G」二重鎖と比べて、10塩基対のリボヌクレオチド配列の挿入を有する35/37merのDsiRNAである。
【０３８６】
図13は、KRAS標的遺伝子の阻害の有効性が、図12に示したKRAS-200部位の標的DsiRNAsについて生ずることを示す。図13に示したように、長さが5またはさらに10塩基対のRNA二重鎖またはDNA二重鎖の拡張を有するDsiRNAsは、インビトロで強い阻害の有効性を保持した（図13の実験は、Hela細胞において行われ、RNAiMAXを使用して、二連で、24時間、0.1nM DsiRNAでの処理を含んだ；「13」および「14」は、RNAiMAXのみを使用して得た、および未処理の細胞について得られた結果にそれぞれ対応する；複数の実験を、KRASおよびHPRT1レベルの両方を評価するために行った）。
【０３８７】
図14は、KRAS転写物中の「KRAS-909」部位をターゲットする一連の「右に拡張した」DsiRNAsの構造を示す。図14の第1の二重鎖（「DP1188P/DP1189G」）は、パッセンジャー鎖の最後および最後から2番目の3'末端残基にだけデオキシリボヌクレオチドを有する25/27merのDsiRNAである。図14の2番目の二重鎖（「DP1210P/DP1211G」）は、パッセンジャー鎖の突出したDicer切断部位の3'に位置する全てのパッセンジャー鎖残基にて、および示されたガイド鎖の突出したDicer切断部位の5'に位置する全てのガイド鎖残基にてデオキシリボヌクレオチドを有する25/27merのDsiRNAである。図14の第3の二重鎖（「DP1212P/DP1213G」）は、示すように（図14の第3の二重鎖の箱の領域）、「DP1188P/DP1189G」二重鎖と比べて、5塩基対のリボヌクレオチド配列の挿入を有する30/32merのDsiRNAである。図14の第4の二重鎖（「DP1214P/DP1215G」）は、示すように（図14の第4の二重鎖の箱の領域）、「DP1210P/DP1211G」二重鎖と比べて、5塩基対のリボヌクレオチド配列の挿入を有する30/32merのDsiRNAである。図14の第5の二重鎖（「DP1216P/DP1217G」）は、示すように（図14の第5の二重鎖の箱の領域）、「DP1188P/DP1189G」二重鎖と比べて、10塩基対のリボヌクレオチド配列の挿入を有する35/37merのDsiRNAである。図14の第6の二重鎖（「DP1218P/DP1219G」）は、示すように（図14の第6の二重鎖の箱の領域）、「DP1210P/DP1211G」二重鎖と比べて、10塩基対のリボヌクレオチド配列の挿入を有する35/37merのDsiRNAである。
【０３８８】
図15は、KRAS標的遺伝子の阻害の有効性が、図14に示したKRAS-909部位の標的DsiRNAsについて生ずることを示す。図15に示したように、25/27merのDsiRNAsである「1188P/1189G」および30/32merの「1212P/1213G」は、調べたその他のDsiRNAsよりも標的RNAの阻害の有効性がわずかにより優れており、一方、長さが5またはさらに10塩基対のRNA二重鎖またはDNA二重鎖の拡張を有するDsiRNAsは、インビトロで強い阻害の有効性を保持した（図13の実験、はHela細胞において行われ、RNAiMAXを使用して、二連で、24時間、0.1nM DsiRNAでの処理を含んだ；複数の実験をKRASおよびHPRT1レベルの両方を評価するために行った）。
【０３８９】
実施例9-「拡張した」DsiRNAs内の多数のホスホロチオアート修飾の効果
図10は、DsiRNA分子のデオキシリボヌクレオチド拡張が、ホスホロチオアート修飾されたDsiRNAの標的転写阻害の有効性にほとんど影響を与えずにホスホロチオアート修飾が行われうる表面を提供することができることを証明する。図16-18は、ホスホロチオアート修飾のさらに広範なレベルを、拡張した（ここでは「右に拡張した」）DsiRNAsの中で許容することができるかどうかを試験する目的のために合成したDsiRNA分子を示す。具体的には、図16は、一連の「KRAS-249」部位を標的とするDsiRNAsを示し、そこでは：
-第1の二重鎖（「K249M」）は、パッセンジャー鎖の3'末端にて最後から2番目および最後の残基だけにデオキシリボヌクレオチドを有する25/27merであり、ホスホロチオアート修飾を有さず、かつ示すように2'-O-メチル修飾のパターンを有する（下線の残基は、2-O-メチル修飾された残基を示す）。
【０３９０】
-第2の二重鎖（「K249D」）は、パッセンジャー鎖の3'末端/ガイド鎖の5'末端にて位置する合計8つのデオキシリボヌクレオチド塩基対を有する31/33merであり、ホスホロチオアート修飾を有さず、かつ示すように2'-O-メチル修飾のパターンを有する。
【０３９１】
-3および4二重鎖（「K249DNA8」および「K249DNA8p」）は、示される突出したDicer切断部位の3'に位置する全てのパッセンジャー鎖残基にて、および示される突出したDicer切断部位の5'に位置するガイド鎖の全ての残基にてデオキシリボヌクレオチドを全面的に有する33/35mersである。2'-O-メチル修飾パターンは、上で記述した「K249D」DsiRNAに使用されるのと同じであった。第4の二重鎖（「K249DNA8p」）は、パッセンジャー鎖の3'末端/ガイド鎖の5'末端を含む8塩基対の全てのヌクレオチドにてホスホロチオアート修飾を有する。
【０３９２】
-5および6二重鎖（「K249DNA12」および「K249DNA12p」）は、示される突出したDicer切断部位の3'に位置する全てのパッセンジャー鎖残基にて、および示される突出したDicer切断部位の5'に位置するガイド鎖の全ての残基にてデオキシリボヌクレオチドを全面的に有する37/39mersである。2'-O-メチル修飾パターンは、上で記述した「K249D」DsiRNAに使用されるのと同じであった。第6の二重鎖（「K249DNA12p」）は、パッセンジャー鎖の3'末端/ガイド鎖の5'末端を含む12塩基対の全てのヌクレオチドにてホスホロチオアート修飾を有する。
【０３９３】
図17は、一連の「KRAS-516」部位を標的とするDsiRNAsを示し、そこでは：
-第1および第2の二重鎖（「K516DNA8」および「K516DNA8p」）は、示される突出したDicer切断部位の3'に位置する全てのパッセンジャー鎖残基にて、および示される突出したDicer切断部位の5'に位置するガイド鎖の全ての残基にてデオキシリボヌクレオチドを全面的に有する33/35mersである。2'-O-メチル修飾ヌクレオチドは、下線を引いた残基として示してある。第2の二重鎖（「K516DNA8p」）は、パッセンジャー鎖の3'末端/ガイド鎖の5'末端を含む8塩基対の全てのヌクレオチドにてホスホロチオアート修飾を有する。特に、K249の4塩基対のデオキシリボヌクレオチド配列をこれらの拡張DsiRNAsに導入した（「K249」として標識された箱の領域を参照されたい）。
【０３９４】
-3および4二重鎖（「K516DNA12」および「K516DNA12p」）は、示される突出したDicer切断部位の3'に位置する全てのパッセンジャー鎖残基にて、および示される突出したDicer切断部位の5'に位置するガイド鎖の全ての残基にてデオキシリボヌクレオチドを全面的に有する37/39mersである。2'-O-メチル修飾パターンは、上で記述した「K516DNA8」および「K516DNA8p」DsiRNAsに使用されるのと同じであった。第4の二重鎖（「K516DNA12p」）は、パッセンジャー鎖の3'末端/ガイド鎖の5'末端を含む12塩基対の全てのヌクレオチドにてホスホロチオアート修飾を有する。「K516DNA8」および「K516DNA8p」DsiRNAsに関しては、K249の4塩基対のデオキシリボヌクレオチド配列をこれらの拡張DsiRNAsに導入した（「K249」として標識された箱の領域を参照されたい）。
【０３９５】
図18は、一連の「KRAS-909」部位を標的とするDsiRNAsを示し、そこでは：
-第1および第2の二重鎖（「K909DNA8」および「K909DNA8p」）は、示される突出したDicer切断部位の3'に位置する全てのパッセンジャー鎖残基にて、および示される突出したDicer切断部位の5'に位置するガイド鎖の全ての残基にてデオキシリボヌクレオチドを全面的に有する33/35mersである。2'-O-メチル修飾ヌクレオチドは、下線を引いた残基として示してある。第2の二重鎖（「K909DNA8p」）は、パッセンジャー鎖の3'末端/ガイド鎖の5'末端を含む8塩基対の全てのヌクレオチドにてホスホロチオアート修飾を有する。K249の4塩基対のデオキシリボヌクレオチド配列を、また、これらの拡張DsiRNAsに導入した（「K249」として標識された箱の領域を参照されたい）。
【０３９６】
-3および4二重鎖（「K909DNA12」および「K909DNA12p」）は、示される突出したDicer切断部位の3'に位置する全てのパッセンジャー鎖残基にて、および示される突出したDicer切断部位の5'に位置するガイド鎖の全ての残基にてデオキシリボヌクレオチドを全面的に有する37/39mersである。2'-O-メチル修飾パターンは、上で記述した「K909DNA8」および「K909DNA8p」DsiRNAsに使用されるのと同じであった。第4の二重鎖（「K909DNA12p」）は、パッセンジャー鎖の3'末端/ガイド鎖の5'末端を含む12塩基対の全てのヌクレオチドにてホスホロチオアート修飾を有する。「K909DNA8」および「K909DNA8p」DsiRNAsに関しては、K249の4塩基対のデオキシリボヌクレオチド配列をこれらの拡張DsiRNAsに導入した（「K249」として標識された箱の領域を参照されたい）。
【０３９７】
図16〜18に示した拡張DsiRNAsを、インビトロでKRASを標的とする転写物阻害の有効性について試験した。このような実験からのデータを図19に示した。驚くべきことに、33/35merおよび37/39merのDNA拡張DsiRNAsの両方が有意な阻害の有効性を示した（図19におけるKRAS-249、516および909の標的部位のそれぞれについて「DNA8」および「DNA12」の結果を参照）；しかし、これらのDsiRNAs のDNAが拡張した領域の広範なホスホロチオアート修飾-拡張した領域の両方の鎖に位置する-は、阻害の有効性を減少させた（KRAS-249、516および909の標的部位のそれぞれについて「DNA8」および「DNA12」の結果を参照）。したがって、両方の鎖のホスホロチオアート修飾を有する2つまたは4つもの連続したDNA塩基対のパターンは、DNAが拡張DsiRNAの有効性に対してほとんど影響を及ぼさないことが観察された場合であっても（図10を参照されたい）、図19は、本発明の「拡張した」DsiRNAs内の8または12個の連続したホスホロチオアート修飾されたデオキシリボヌクレオチド塩基対の挿入（両方の鎖における修飾ホスホロチオアート）が、このような「拡張した」DsiRNAsの阻害の有効性を減少させ得ることを示している。
【０３９８】
上記の結果にもかかわらず、本発明の拡張DsiRNAsの二本鎖の拡張領域の1つだけの鎖におけるホスホロチオアート修飾の位置により、有効性の有意な喪失なしでホスホロチオアートのより長い進行の導入を可能にすることが示されたことに注意されたい。たとえば、拡張DsiRNAの拡張領域の1つだけの鎖に15もの連続したホスホロチオアート修飾を含むことにより、このような修飾された拡張DsiRNAの有効性の有意な喪失なしで許容されることを示した（データ示さず）。したがって、図19の結果が、本発明の拡張DsiRNAsの両方の鎖においてホスホロチオアート修飾の長い域を含むことの影響を示す場合であっても、概して、本発明のDsiRNAsのDNAを含む拡張領域は、広範な有利な修飾（本発明の拡張DsiRNAsの安定性、送達、有効性および/または能力を増強することができる、たとえばホスホロチオアート、2'-O-メチルまたはその他の修飾）を、たとえば、本発明の拡張DsiRNAsの阻害の有効性に負に影響を与えずに導入することができる構造を提供することを証明した。
【０３９９】
実施例10-DsiRNAsの非シード領域内のミスマッチの位置および数の相対効果
上記の実施例6において、本発明の拡張DsiRNAs内のミスマッチの導入により、標的配列に対して完全に相補的である配列を有するDsiRNAsのものと類似の阻害の有効性を有する、拡張した「DsiRNAmm」薬剤を作製することができることが証明された。特に、図7〜9において、調べられた非シード領域のミスマッチの位置の中で、最も有効性に影響を与えたミスマッチ位置（「位置12」）は、また、標的鎖配列の突出したAgo2切断部位の最も近くに位置する位置であったことが観察された。これらの結果に加えて、突出したAgo2切断部位から実質的に除去された非シード領域位置に25/27mer DsiRNA内の配列ミスマッチを導入する効果を調べた。図20は、1つまたは複数のミスマッチ残基を導入する影響を評価するために合成した一連の25/27mer DsiRNAsの構造を示し（図20のDsiRNAmm分子については、ミスマッチは標的配列とだけ関連し、対応するDsiRNAパッセンジャー鎖の配列残基に関しては関連しなかった点に留意し；「標的ミスマッチ」のヌクレオチドまたは残基が、本発明の目的のために、標的ヌクレオチド配列に関してミスマッチを形成するが、対応するDsiRNAパッセンジャー鎖の配列ヌクレオチドに関して必ずしもミスマッチでないガイド鎖ヌクレオチドとして定義されることにさらに留意されたい）、このようなミスマッチは、ガイド鎖の3'末端から始まる、またはパッセンジャー鎖の5'末端残基に対して相補的であるガイド鎖の位置から始まる。図21に示したように、試験した25/27mer DsiRNAのガイド鎖の3'末端領域は、驚くべきことに、1つまたは複数の標的ミスマッチのヌクレオチドの導入を許容した。実際に、試験したDsiRNAのガイド鎖の3'末端から始まって1〜3の間の標的ミスマッチのヌクレオチドの導入は、標的阻害有効性に統計的に有意な影響を誘発しなかったが（二重鎖DP1301P/DP1303G、DP1301P/DP1304GおよびDP1305P/DP1306Gを参照されたい）、一方で、試験したDsiRNAのガイド鎖の3'末端から始まって4、5またはさらに6個の標的ミスマッチのヌクレオチドの導入により、有意な阻害活性を保持するDsiRNAが生じた（二重鎖DP1307P/DP1308G、DP1309P/DP1310GおよびDP1311P/DP1312Gを参照されたい）。DsiRNAのパッセンジャー鎖の5'末端残基に相補的であるガイド鎖位置から始まるガイド鎖内の標的ミスマッチの残基の導入により、ガイド鎖の3'末端から始まっている標的ミスマッチのヌクレオチドの導入について観察されたものと一致した結果が生じた。特に、DsiRNAのパッセンジャー鎖の5'末端残基に相補的であるガイド鎖位置から始まる1〜4の間の標的ミスマッチのヌクレオチドの導入は、ガイド鎖の3'末端から始まっている3〜6の間の標的ミスマッチのヌクレオチドの導入について観察されたものとおよそ同じ程度に、DsiRNA阻害性の有効性に影響を与えた（標的ミスマッチのヌクレオチドに対して、3'末端ガイド鎖配列の最後および最後から2番目のヌクレオチド-並びにDsiRNAパッセンジャー鎖の5'末端残基に相補的なガイド鎖の位置-について観察された寛容性と一致した）。
【０４００】
実施例11-DsiRNA薬剤のインビボの有効性、単一用量の結果
DNA二重鎖拡張を有するDsiRNA薬剤を、配列特異的な標的mRNA阻害のインビボの有効性について調べた。具体的には、図20の未修飾のKRAS標的DsiRNA「K249」（「DP1301P/DP1302G」二重鎖）、2'-O-メチル修飾したKRAS標的DsiRNA「K249M」（図16の第1の二重鎖）および2'-O-メチル修飾した「右に拡張した」KRAS標的DsiRNA「K249D」（図16の第2の二重鎖；図22-25において「K249DNA」として示した）をInvivofectamine（商標）中に製剤化し、10mg/kgにてCD1マウスへ静脈注射した。肝臓、腎臓、脾臓およびリンパ節組織におけるKRASの発現を、KRAS発現を評価するために三連で行ったリアルタイムPCR（RT-PCR）で、注射後24時間で測定した（それぞれ図22〜25；それぞれの棒は、処理グループ当たり4匹のマウスについて得られた結果を示す）。これらの条件下で、「右に拡張した」DsiRNA「K249DNA」は、調べた全ての組織において、統計的に有意なレベルのKRAS標的遺伝子阻害を示した。このような「K249DNA」で処理した組織において観察される特異的KRAS阻害率レベルおよびこれらの観察と関連するp値は、以下の通りだった：肝臓（55%〜87%、平均71%、p=0.010）、脾臓（92%〜98%、平均94%、P＜0.001）、腎臓（19%〜53%、平均35%、P=0.009）およびリンパ節（47%〜81%、平均59%、P=0.001）。したがって、本発明の拡張DsiRNAsのインビボの有効性は、多くの組織型に渡って証明された。
【０４０１】
実施例12- DsiRNA薬剤のインビボの有効性、複数用量の結果
DNA二重鎖拡張を有するDsiRNA薬剤を、実施例11のものよりも低い投薬量にて、繰り返し用量プロトコルにおいて、配列特異的な標的mRNA阻害のインビボの有効性について調べた。具体的には、2'-O-メチル修飾したKRAS標的DsiRNA「K249M」（図16の第1の二重鎖）および2'-O-メチル修飾した「K249D」（図16の第2の二重鎖）をInvivofectamine（商標）中に製剤化し、合計4用量がそれぞれのマウスに投与されるまで、3日毎に2mg/kgにてCD1マウスへ静脈注射した。肝臓、肺、脾臓および腎臓組織におけるKRASの発現を、KRAS発現を評価するために三連で行ったリアルタイムPCR（RT-PCR）で、最後の注射後24時間で測定した（それぞれ図26〜29；それぞれの棒は、処理グループ当たり4匹のマウスについて得られた結果を示す）。これらの条件下で、KRASレベルにおける統計的に有意な減少は、「右に拡張した」DsiRNA「K249D」を投与したマウスの肝臓および脾臓組織において観察された。このような「K249DNA」で処理した組織において観察される特異的KRAS阻害率レベルおよびこれらの観察と関連するp値は、以下の通りだった：肝臓（46%〜90%、平均78%、p=0.002）、脾臓（36%〜80%、平均62%、P=0.004）、腎臓（0%、平均0%、P=0.814**）および肺（17%〜38%、平均26%、P=0.065**）。したがって、多回用量（低用量）処方計画における本発明の拡張DsiRNAsのインビボの有効性は、肝臓および脾臓組織において証明された。
【０４０２】
実施例13-DsiRNA薬剤のインビボの有効性のさらなる評価
インビボにおいて特異的標的遺伝子の遺伝子発現を減少させるという、本発明の拡張Dicer基質薬剤の能力のさらなる実証を、マウスまたはその他の哺乳動物被験体に対する本発明のDsiRNAsの投与を介して、全身的に（たとえば、静脈または腹腔内注射によって）、または組織への直接注射（たとえば、目、脊髄/脳/中枢神経系その他への注射）を介して、いずれかで行う。別の標的RNAレベルの測定を標的細胞にて行い（たとえば、肝臓および/または腎臓細胞におけるRNAレベルを、マウスの注射の後にアッセイする；眼の細胞は、被験体の眼の注射の後にアッセイする；または脊髄/脳/中枢神経系細胞は、同じ被験体の直接注射の後にアッセイする）、標準的な方法（たとえば、Trizol調製（グアニジウムチオシアナート-石炭酸-クロロホルム）後のqRT-PCR）によって行う。
【０４０３】
このようなさらなるインビボ実験において、適切な対照（たとえば、媒体のみの対照、ランダム化された二重鎖対照、異なる標的RNA対照に向けられる二重鎖、その他）と比較して、本発明の拡張Dicer基質薬剤を投与するときに、RNAレベルにおける統計的に有意な減少が観察される場合、本発明の拡張Dicer基質薬剤（たとえば、左に拡張した、または右に拡張DsiRNA）は、有効なインビボの薬剤であると考えることができる。一般に、このような比較に割り当てられるp値（たとえば、片側独立T検定を介して生成する）が0.05未満である場合、本発明の拡張Dicer基質薬剤（たとえば、左に拡張した、または右に拡張DsiRNA薬剤）は、有効なRNA干渉薬剤であると考えられる。あるいは、本発明の拡張Dicer基質薬剤を有効なRNA干渉薬剤と分類するp値閾値は、より厳しいフィルタリングを提供し、より強い相違を同定し、および/または複数の仮説検定を調整するなどのために、たとえば0.01、0.001、その他に設定することができる。絶対活性のレベルの限界を、また、有効および効果的でない拡張Dicer基質薬剤間を区別するために設定することができる。たとえば、一定の態様において、本発明の有効な拡張Dicer基質薬剤は、適切な対照と比較して、組織または細胞における標的RNAレベルにおいてインビボで標的RNAレベルの統計的に有意な減少を示すだけでなく、たとえば、少なくともおよそ10%の減少、およそ15%の減少、少なくともおよそ20%の減少、およそ25%の減少、およそ30%の減少などを発揮するものである。本発明の拡張Dicer基質薬剤（たとえば、左に拡張および右に拡張DsiRNA薬剤）のさらなるインビボの有効性試験は、これにより行われる。
【０４０４】
明細書において言及した全ての特許および刊行物は、本発明が属する当業者の技術のレベルを指し示す。本開示において引用した全ての参照文献は、それぞれの参照文献が参照により個々にその全体が援用されたのと同様に参照により援用される。
【０４０５】
当業者であれば、本発明が目的を実行し、言及される目標および利点、並びにその中に固有のものを得るのに十分に適することを容易に認識するだろう。好ましい態様の現在の代表として本明細書に記述された方法および組成物は、例示的であり、本発明の範囲についての限界として意図されない。その中の変化およびその他の用途が当業者に生じるだろうし、それは、本発明の精神内に包含され、請求項の範囲によって定義される。
【０４０６】
様々な置換および改変を本発明の範囲内で、本明細書に開示された本発明に行うことができることが、当業者には容易に明らかだろう。したがって、このようなさらなる態様は、本発明および以下の特許請求項の範囲内である。本発明は、RNAi活性を媒介するために改善された活性をもつ核酸構築物を産生することに向けた本明細書に記述された化学的修飾の種々の組み合わせおよび／または置換を試験することを当業者に教示する。このような改善された活性は、改善された安定性、生物学的利用能の改善、および／またはRNAiを媒介する細胞反応の活性の改善を含み得る。従って、本明細書に記述された具体的態様は、限定でなく、当業者であれば、本明細書に記述された改変の特異的な組み合わせが改良されたRNAi活性をもつDsiRNA分子を同定することに向けて過度の実験なしで試験することができることを容易に認識することができる。
【０４０７】
本明細書に適切に実例として記述された本発明は、本明細書に具体的に開示されない任意の要素または要素類、限定または限定類なく実施することができる。したがって、たとえば、本明細書におけるそれぞれの例において、「含む」、「本質的にからなる」および「からなる」という用語のいずれも、その他の2つの用語のいずれと置き換えてもよい。使用された用語および表現は、記述の用語として使用され、限定ではなく、このような用語および表現の使用において、示され、および記載された特色、またはその一部の任意の均等物を除外することは意図されないが、、種々の改変が特許請求の発明の範囲内で可能であることが認識される。したがって、本発明は、好ましい態様によって具体的に開示したが、本明細書に開示される概念の随意の特色、改変およびバリエーションが当業者によって使用されてもよいこと、およびこのような改変およびバリエーションは、明細書および添付の特許請求の範囲によって定義されるとおり、本発明の範囲内であるものと考えられることを理解すべきである。
【０４０８】
加えて、本発明の特色または側面は、マーカッシュ群または変形例のその他の群に関して記述されており、当業者であれば、本発明が、またマーカッシュ群またはその他の群のメンバーの任意の個々メンバーまたはサブグループに関して、これにより記述されることを認識するであろう。
【０４０９】
「ある」および「該」、並びに本明細書に記述される状況における（特に、以下の特許請求の範囲の状況における）同様の指示物は、他に本発明において記述されるか、または状況によって明らかに否定されない限り、単数および複数の両方を包含するものと解釈される。「含む」、「有する」、「含む」および「含む」は、特に明記しない限り、制限のない用語として解釈される（すなわち、「含むが、限定されない」ことを意味する）ものと解釈される。本明細書におけるある値の範囲の説明は、特に明記しない限り、範囲内に入るそれぞれ値について個々に言及するのを簡略する方法として役に立つことを単に意図し、それぞれの別々の値は、それがあたかも本明細書に詳述されるかのように、本明細書内に組み込まれる。本明細書に記述された全ての方法は、本明細書において特に明記しない限り、または状況によって明らかに否定することができない限り、任意の適切な順位で行うことができるか。本明細書に提供されるすべての例または例示的な言語（たとえば、「などの」）の使用は、他に請求されない限り、単に本発明をよりよく解釈することのみを意図し、本発明の範囲に対して限定を与えるというわけではない。明細書における言語は、本発明の実施に必須なものとして任意の請求されていない要素を示すものとして解釈されるべきでない。
【０４１０】
本発明を実施するための発明者が知っている最良の形態を含む本発明の態様が、本明細書に記述されている。これらの態様の変異は、前述の記述を読み込むと、即座に当業者に明らかになるであろう。本発明者らは、当業者がこのようバリエーションを適宜使用することを予想し、本発明者らは、本発明について、本明細書に具体的に記述されたもの以外のその他のものが実施されることを意図する。従って、本発明は、準拠法によって可能にされるように、本願明細書に添付の特許請求の範囲に詳述された主題の全ての改変および均等物を含む。その上、その全ての可能なバリエーションの上記の要素のいずれの組み合わせも、本明細書において特に明記しない限り、または状況によって明らかに否定されない限り、本発明によって包含される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２Ａ】
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【図４２Ｂ】
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【図４２Ｃ】
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【図４３Ａ】
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【図４３Ｂ】
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【図４３Ｃ】
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【図２４】
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【図２５】
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【配列表】
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