(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
主要有効成分として、乳酸菌目の微生物若しくはそのフラグメントを含み、それは、病原微生物としての化膿連鎖球菌と共凝集する、化膿連鎖球菌に関連する皮膚、粘膜、及び口腔の疾患の処置、予防及び/又は治療用剤若しくは組成物であって、ここで、
該微生物が、ＤＳＭ２５９７２、ＤＳＭ２５９８７、ＤＳＭ２５９８８、ＤＳＭ２５９８９及びＤＳＭ２５９７３という番号でドイツ微生物細胞培養物コレクションに寄託された微生物を含む群から１以上選択されることを特徴とする、剤若しくは組成物。
【請求項２】
前記微生物がラクトバチルス属に属する、請求項１に記載の微生物若しくはそのフラグメントを含む剤若しくは組成物。
【請求項３】
生物学的処理、化学的処理又は物理的処理の後であっても前記病原微生物との共凝集能が現れる、請求項１又は２に記載の微生物若しくはそのフラグメントを含む剤若しくは組成物。
【請求項４】
前記病原微生物との共凝集能がおよそ３〜およそ８のｐＨで現れる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の微生物若しくはそのフラグメントを含む剤若しくは組成物。
【請求項５】
前記病原微生物の生物膜の形成を防ぐ能力を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の微生物若しくはそのフラグメントを含む剤若しくは組成物。
【請求項６】
化膿連鎖球菌によるフィブロネクチンの結合を妨げる能力を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の微生物若しくはそのフラグメントを含む剤若しくは組成物。
【請求項７】
皮膚又は粘膜の任意の片利共生微生物と共凝集しない能力を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の微生物若しくはそのフラグメントを含む剤若しくは組成物。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の少なくとも１つの微生物若しくはそのフラグメントを含む組成物。
【請求項９】
薬学上又は美容上許容可能な賦形剤又は補形薬を含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
固体、液体若しくは粘性体であるか、又はエアロゾルである、請求項８又は９に記載の組成物。
【請求項１１】
ペースト、軟質ゼラチンカプセル、硬質ゼラチンカプセル、粉末、顆粒、ビーズ、香錠、発泡錠、ロゼンジ、口腔錠、チュアブル錠、舌下錠、溶液、チンキ剤、エマルション、ジュース、濃縮液、シロップ、スプレー液、飲用アンプル、ゲル、洗口液、歯磨き粉、チューインガム、錠剤、コーティングピル又は糖菓の形態である、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
プロバイオティクス、防腐剤又は他の抗菌物質を含む、請求項８〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
医薬組成物、獣医組成物若しくは化粧品組成物又は栄養補助食品若しくは栄養補助食品組成物である、請求項８〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
酸化防止剤、ビタミン、補酵素、脂肪酸、アミノ酸及び補因子から選択される１つ又は複数の物質を更に含む、請求項８〜１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
１つ若しくは複数の増粘剤、１つ若しくは複数の甘味料、及び／又は１つ若しくは複数の人工甘味料を含む、請求項８〜１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記増粘剤が、セルロースエーテル、キサンタンガム、ゼラチン、高分散二酸化ケイ素、デンプン、アルギン酸塩、トラガカントゴム、寒天、アラビアゴム、ペクチンを含む群から選択される多糖類及びポリビニルエステルから選択され、前記甘味料が、グルコース、フルクトース、スクロース及びグルコースシロップ、ソルビトール、マンニトール、キシリトール及びマルチトール、サッカリン、シクラミン酸ナトリウム、アセスルファムＫ及び／又はアスパルテームを含む群から選択される、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
ビルダー物質、酵素、電解質、ｐＨ調整剤、増粘剤、防汚剤、蛍光増白剤、灰色化阻害剤、色移り阻害剤、整泡剤（foamregulators）及び／又は着色剤を更に含む、請求項８〜１６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
前記微生物が前記組成物中で生きている又は破壊した微生物として存在する、請求項８〜１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
前記微生物が、封入形態、噴霧乾燥形態及び／又は凍結乾燥形態で存在する、請求項８〜１８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
前記微生物が細胞可溶化物の形態で存在する、請求項８〜１９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２１】
前記微生物が、０．００１ｗｔ％〜２０ｗｔ％、又は０．００５ｗｔ％〜１０ｗｔ％、又は０．０１ｗｔ％〜５ｗｔ％の量で存在する、請求項８〜２０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
化膿連鎖球菌と共凝集する特性を有する乳酸菌を特定及び／又は選択する方法であって、
ａ．生物膜を形成する化膿連鎖球菌をインキュベーションする工程と、
ｂ．試験対象の乳酸菌を添加するとともに混合物をインキュベーションする工程であって、前記化膿連鎖球菌と調査対象の該乳酸菌との間で共凝集を起こす工程と、
ｃ．上清を除去することによって結合していない乳酸菌を分離するとともに、共凝集した乳酸菌に関して前記生物膜を測定する工程と、
を少なくとも含む、方法。
【請求項２３】
前記化膿連鎖球菌の生物膜の阻害を調査する工程であって、調査対象の前記乳酸菌を、生物膜を形成する前記化膿連鎖球菌のインキュベーション中に添加する工程、
を更に含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
試験対象の前記乳酸菌を添加していない対照と比較して、光学密度の測定を用いて結合していない細胞の除去後の生物膜の形成を定量化する工程、
を更に含む、請求項２２又は２３に記載の方法。
【請求項２５】
化膿連鎖球菌に関連する皮膚、粘膜、及び口腔の疾患の治療、予防及び／又は治療法用の調合薬、医療品又は化粧品の製造への請求項８〜２１のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項２６】
化膿連鎖球菌に関連する皮膚、粘膜、及び口腔の疾患の局所予防及び／又は局所治療用の調合薬、医療品又は化粧品の製造での使用である請求項２５に記載の使用。
【請求項２７】
前記組成物が１つ又は複数の香味物質を更に含む、請求項２５又は２６に記載の使用。
【請求項２８】
前記組成物が化膿連鎖球菌に関連する皮膚、粘膜、及び口腔の疾患、好ましくは口腔の化膿連鎖球菌に関連する疾患の局所予防及び／又は局所治療用途であり、かつ、前記組成物が、チュアブル化合物、チューインガム、糖菓、香錠、歯磨き粉、スプレー液又は洗口液の形態である、請求項２５〜２７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２９】
１つ又は複数の抗炎症物質及び／又は抗微生物物質が更に使用されて、調合薬、医療品又は化粧品の製造がされる、請求項２５〜２８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３０】
前記組成物が、溶媒、賦形剤、補形薬、充填剤、香味物質及び／又は芳香物質、及び／又は更なる成分と組み合わせて、調合薬、医療品又は化粧品の製造がされる、請求項２５〜２９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３１】
表面の処理用の清浄剤又は消毒剤への製造への請求項８〜２１のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項３２】
医療品及び／又は予防の分野において使用される製品の製造への請求項８〜２１のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項３３】
経口摂取、舌下摂取又は口腔摂取用の作用物質の製造への請求項８〜２１のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項３４】
口腔咽頭域内の炎症の局所治療に（for）又は上気道及び皮膚の感染に特異的な作用を有する抗菌添加剤の製造への請求項８〜２１のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項３５】
前記組成物が予防的に又は治癒的用組成物である、請求項２５〜３４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３６】
前記組成物が経口投与、舌下投与又は口腔投与用組成物である、請求項２５〜３５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３７】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の剤若しくは組成物又は請求項８〜２１のいずれか一項に組成物と、身体衛生用の機器若しくは装置、リンス及び／又はペーストとを含む衛生的な治療用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）と共凝集することができる、乳酸菌目の微生物若しくはそのアナログ、フラグメント、誘導株、変異株、又はそれらの組合せに関する。加えて本発明は、とりわけ身体衛生及び疾患治療に使用されるこれらの微生物を含有する組成物に関する。とりわけ本発明は、化膿連鎖球菌によって引き起こされ得る全ての疾患の治療及び／又は予防への新規な乳酸菌及び／又はそれを含有する組成物の使用に関する。
【０００２】
加えて、本明細書中に記載される発展は、口腔部及び咽喉部、すなわち口腔咽頭域内の炎症の予防及び局部治療、並びに上気道及び皮膚の感染に特異的な作用を有する抗微生物添加剤として使用することができる、ＧＲＡＳ微生物及び／又は乳酸菌の形態の革新的な生物学的製剤である。
【０００３】
さらに本発明は、例えばスプレー液、洗口液の形態での、又は喉飴若しくは錠剤、香錠、コーティングピル、エアロゾル、歯磨き粉、ジュース、シロップ又は食品添加剤としての、及び／又は栄養補助食品としての組成物又は医薬品又は医療品（口腔衛生）中での本発明による微生物、そのアナログ又はフラグメントの使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
大半の人は過去に咽喉痛又は扁桃炎（咽頭炎）の経験がある。これらの疾患には、ウイルス性のものと細菌性のものとがある。咽喉痛及び扁桃炎の症例のおよそ２０％〜３０％が細菌性のものである。いずれの症例であっても、これは化膿連鎖球菌による感染を伴うものである。化膿連鎖球菌は最も一般的なヒト病原性細菌の一つである。細菌性咽頭炎は飛沫感染によって拡散する。５歳〜１５歳の子供（Children and teenagers）はこの感染に最も罹患しやすい群であるが、人が密集した状態では高齢者にも感染のリスクがある（非特許文献１）。米国における化膿連鎖球菌（S. pyogenes）の感染数は、年間１０００万人と推定される（非特許文献２）。関連コストは米国において年間およそ１０億ドルにのぼると推定される（非特許文献３）。ドイツでの急性連鎖球菌咽頭炎の症例数は、年間１００万〜１５０万人と推定される。臨床的に明確な経路をとるのは一部の感染症のみであり、すなわち伝播性病原体の保菌者の方が多い。
【０００５】
化膿連鎖球菌（Ａ群連鎖球菌、ＧＡＳとも称される）は、長鎖を形成するグラム陽性球菌に属するヒト病原体である。多くの他の病原体と同様に、連鎖球菌もまた、複数の病原性因子を発現する能力を有する。化膿連鎖球菌の発病経路における第１ステップは、細菌の宿主細胞の表面への付着である。広く認められたモデルによると、付着は二段階で起こる：第１段階はヒト細胞の表面との弱い比較的非特異的な相互作用からなるものであり、その直後に高い親和性の組織特異的な相互作用が起こる（非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６）。早くは１９７６年には、Beachey et al.によって、初期付着を細菌レベルで媒介する分子としてリポテイコ酸（ＬＴＡ）が特定された。上皮レベルでは、フィブロネクチンがＬＴＡに対する受容体として特定されている（非特許文献７）。細菌表面上において少なくとも１１種の他の構造体が、付着の第２段階において上皮細胞との結合を与えるものとして特定されている。化膿連鎖球菌による発病の第２ステップは、細菌の上皮宿主細胞への浸潤である（非特許文献８）。LaPentaらによって、場合によってはサルモネラ菌又はリステリア菌等の従来の細胞内ヒト病原体よりも高い頻度でヒト上皮細胞がＧＡＳに感染する可能性があることが示唆されている。
【０００６】
病原性細菌は、宿主細胞内で高い複製能を有し、これにより急性感染が引き起こされ得る。休止状態での生存は、粘膜及び上皮の細菌感染の再発を引き起こす場合があり、このことにより、口腔咽頭粘膜の再発性感染を説明することができる。とりわけ口峡炎は小児においてＧＡＳにより引き起こされることが非常に多い再発性感染症である。
【０００７】
化膿連鎖球菌は、咽頭炎、猩紅熱、膿痂疹、蜂巣炎等の多くの急性疾患の病因因子である。壊疽性筋膜炎、筋炎及び連鎖球菌誘発性の毒素性ショック症候群等の浸潤性の毒素感染（toxigenic infections）、並びにリウマチ熱及び糸球体腎炎等の免疫媒介性後遺症の発症は全て、化膿連鎖球菌によって引き起こされる。
【０００８】
概して集団の５％〜１５％が、疾患の兆候を示さない（通常咽喉内での）この細菌の保因者であることが推定される。通常の微生物叢の構成要素として、化膿連鎖球菌は免疫系が弱まっている場合に感染を引き起こし得る。組織（例えば気道又は皮膚）への化膿連鎖球菌の定着の後に、咽喉のイガイガ感（scratchy throat）、咽喉痛及び嚥下困難等の関連症状を伴う疾患の発生が起こる。
【０００９】
さらに化膿連鎖球菌による感染は、下気道（中耳炎、副鼻腔炎、肺炎）又は血流への感染、並びに髄膜炎、並びに骨（骨髄炎）及び関節（関節炎）の感染の拡大により合併症を引き起こし得る。
【００１０】
定着の要因の１つは、細胞表面及び／又は粘膜表面への細菌付着である。細菌は細胞表面への結合を媒介する多様な付着因子（adhesins）（例えばＭタンパク質、フィブロネクチン結合タンパク質、ＬＴＡ、コラーゲン結合タンパク質）を有する。細胞表面との相互作用、すなわち結合が、宿主細胞での定着及び化膿連鎖球菌の発病における初期の役割を果たす。
【００１１】
したがって、予防及び治療への治療剤の早期使用は、総ＧＡＳ微生物数を減らし、化膿連鎖球菌の結合、すなわち浸潤を効果的に防ぐのに極めて重要である。
【００１２】
咽喉部における化膿連鎖球菌により引き起こされる症状を緩和することが可能である治療剤は従来技術において説明されている。
【００１３】
［従来技術］
急性疾患の標準治療は抗生物質の投与である。とりわけ１９８０年代半ばからのペニシリン耐性の出現の増加により、ここ数十年になって再び、この疾患が先進国において増加してきている（非特許文献９、非特許文献１０）。これまでに機能的なワクチンが開発されていないことから、予防法は存在していない。これは、使用される主な抗原の多様性、細菌細胞壁由来のＭタンパク質、及び他の抗原候補物質とヒトタンパク質との免疫学的交差反応性によるものである。
【００１４】
概して、抗生物質（通常ペニシリン又はエリスロマイシン）による治療が多大な副作用をもたらし得るにもかかわらず、ほとんどの患者で感染が再発する（subsides）ことが分かっている。
【００１５】
現在市販されている製剤は、場合によっては局部麻酔薬（リドカイン、ベンゾカイン）と混合する、ロゼンジ、錠剤、咽喉洗浄液及び咽喉スプレー液を本質的に含み、これらの製剤は咽喉部における症状を一時的に軽減するが、化膿連鎖球菌を破壊することはない。
【００１６】
一般に、乳酸菌は、多くの場合、乳酸に加えて抗菌物質を産出するため、病原体によって引き起こされる胃腸疾患を防ぐプロバイオティクス細菌として使用される。ラクトバチルス（乳酸菌）は、糖を乳酸に代謝させること（乳酸発酵）が可能であるグラム陽性の酸素耐性嫌気性菌である。乳酸菌には、ラクトバチルス科、アエロコッカス科、カルノバクテリウム科、エンテロコッカス科、ロイコノストック科及びストレプトコッカス科が含まれる。乳酸菌は非病原性であると考えられており、一般的に胃腸の微生物叢の改善及び胃腸症状の治療に対するプロバイオティクス細菌として使用されている。ラクトバチルスはとりわけ食品産業で重要とされ、「機能性食品」の領域で重要な役割を果たす。ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）種はかつて、ラクトバチルスに分類されていたが（ラクトバチルス・ビフィダム（Lactobacillus bifidum））、今日の理解では、この種は系統学的にはこの目に密接に関連するものではない。しかしながら、ビフィドバクテリウム・ビフィダムは代謝の観点では依然として乳酸菌として取り扱われている。また、乳酸菌は、乳製品を製造するのに乳酸菌を使用する食品産業において非常に重要であるが、有害菌（pests）として発生するおそれもある（例えば、ビール醸造所にて）。乳酸菌は非病原体に分類される。
【００１７】
多様な用途へのプロバイオティクス細菌の使用が従来技術において説明されている。例えば、特許文献１には、皮膚への皿洗いのマイナスの影響を低減する、皿洗い洗剤へのプロバイオティクス細菌の使用が開示されている。さらに、これらの細菌には皮膚に対する保護効果がある。
【００１８】
化粧用スキントリートメント剤におけるかかる微生物の使用は既に知られている。例えば、特許文献２には、ＵＶ放射によって引き起こされる皮膚損傷を抑制する、植物の細胞外マトリックス抽出物と組み合わせた、化粧用スキントリートメント剤におけるかかる微生物の使用が記載されている。しかしながら、この文献では、洗浄剤及び清浄剤におけるこれらの微生物の使用は開示されていない。
【００１９】
加えて、衛生清浄剤における或る特定のバチルス種の使用が知られている。このように、特許文献３には、衛生目的の清浄剤における病原体の繁殖を防ぎかつ有機質の汚れを分解することが示唆されているバチルス種の使用が記載されている。開示の使用は多くの場合、非活性化細菌を胞子の形態で含むものである。胞子は基質によって再活性化され、遺伝的欠陥のために繁殖することがないとされる。しかしながら、特許文献３の不利点は、細菌の繁殖及び／又は変異を完全には排除することができないために、依然として細菌が非制御的に繁殖する場合があるという残存リスクがあることである。
【００２０】
その一方、剤形がプロバイオティクス微生物の少なくとも１つの属を含有し、剤形及び／又は細菌に、セルロースエーテルを含有するコーティングが施される、プロバイオティクス細菌の経口剤形が、特許文献４に開示されている。
【００２１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験から、幾つかのラクトバチルス株がＧＡＳのヒト細胞株への結合を防ぐことが可能であることが分かっている。ラクトバチルス株は細胞上の表面構造に対してＧＡＳと競合し、それによってＧＡＳが宿主細胞へと侵入するのを防ぐ。化膿連鎖球菌の宿主細胞への付着が発病の第１段階であり、宿主細胞への浸潤プロセスは非常に迅速に起こるために、この方法はＧＡＳ感染症の治療には不利であると考えられる。細胞表面へと結合する前に化膿連鎖球菌の浮遊細胞の共凝集が起こり、免疫応答を誘導することができることが望ましい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２２】
【特許文献１】国際公開第２０１０／１３０５６３号
【特許文献２】米国特許第６，７９０，４３４号
【特許文献３】国際公開第９７／２５８６５号
【特許文献４】国際公開第２００５／１１７９２１号
【非特許文献】
【００２３】
【非特許文献１】Bisno 1995
【非特許文献２】Kilian 2002
【非特許文献３】Reid et al. 2001
【非特許文献４】Hasty et al. 1992
【非特許文献５】Courtney et al. 1999
【非特許文献６】Cunningham 2000
【非特許文献７】Simpson and Beachey 1983
【非特許文献８】LaPenta et al. 1994
【非特許文献９】Kaplan 1991
【非特許文献１０】Musser and Krause 1998
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２４】
本発明の目的は従来技術の欠点又は不利点を有しない化膿連鎖球菌による感染の治療及び予防用の作用物質及び組成物を提供することである。
【００２５】
この目的は独立請求項によって達成される。好ましい実施の形態は従属請求項から導かれる。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
第１の態様では、本発明は、乳酸菌目の微生物若しくはそのアナログ、フラグメント、誘導株、変異株、又はそれらの組合せであって、該微生物若しくはそのアナログ、フラグメント、誘導株、変異株、又はそれらの組合せが少なくとも１つの病原微生物と共凝集することができ、該病原微生物が化膿連鎖球菌であるようなものである、乳酸菌目の微生物若しくはそのアナログ、フラグメント、誘導株、変異株、又はそれらの組合せに関する。化膿連鎖球菌に結合する微生物に乳酸菌が利用可能であったことは全くもって驚くべきことであった。特に好ましい実施の形態においては、微生物若しくはそのアナログ、フラグメント、誘導株、変異株、又はそれらの組合せがラクトバチルス属に属する。
【００２７】
また、好ましい実施の形態において、微生物若しくはそのアナログ、フラグメント、誘導株、変異株、又はそれらの組合せに生物学的処理、化学的処理又は物理的処理の後であっても病原微生物との共凝集能が現れることは全くもって驚くべきことであった。病原微生物との共凝集能はおよそ３〜およそ８のｐＨでも現れる。微生物若しくはそのアナログ、フラグメント、誘導株、変異株、又はそれらの組合せが病原微生物の生物膜の形成を防ぐ能力を有することが好ましい。微生物若しくはそのアナログ、フラグメント、誘導株、変異株、又はそれらの組合せが、化膿連鎖球菌のフィブロネクチンへの結合を防ぐ能力を有することも好ましい。好ましい実施の形態において、微生物若しくはそのアナログ、フラグメント、誘導株、変異株、又はそれらの組合せは、皮膚又は粘膜の片利共生微生物と共凝集する能力を有しない。
【００２８】
この微生物が、ラクトバチルス・ラクチス（Lactobacillus lactis）、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillushelveticus）、ラクトバチルス・イエンセニイ（Lactobacillusjensenii）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）、ラクトバチルス・ブルガリクス（Lactobacillusbulgaricus）、ラクトバチルス・アミロボラス（Lactobacillusamylovorus）、ラクトバチルス・デルブリュッキイ（Lactobacillus delbrueckii）、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacilluscasei）、ラクトバチルス・クリスパータス（Lactobacilluscrispatus）、ラクトバチルス・ガゼリ（Lactobacillus gasseri）、ラクトバチルス・ジョンソニイ（Lactobacillusjohnsonii）、ラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillusparacasei）、ラクトバチルス・ペントーサス（Lactobacillus pentosus）、ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillusrhamnosus）、ラクトバチルス・クルバトス（Lactobacilluscurvatus）、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillusbrevis）、ラクトバチルス・ブフネリ（Lactobacillusbuchneri）、ラクトバチルス・フルクチボランス（Lactobacillus fructivorans）、ラクトバチルス・ヒルガルディ（Lactobacillushilgardii）、ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillusfermentum）、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ラクトバチルス・ビリデセンス（Lactobacillusviridescens）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、ラクトバチルス・イングルビエイ（Lactobacillusingluviei）、又はそれらのアナログ、誘導株、フラグメント若しくは変異株を含む群から選択されることが好ましい。
【００２９】
微生物は有利には、ＤＳＭ２５９７２、ＤＳＭ２５９８７、ＤＳＭ２５９８８、ＤＳＭ２５９８９及びＤＳＭ２５９７３という番号でドイツ微生物細胞培養物コレクションに寄託された微生物を含む群から選択される。
【００３０】
別の態様では、本発明は、少なくとも１つの微生物若しくはそのアナログ、フラグメント、誘導株、変異株、又はそれらの組合せを含む組成物に関する。組成物は、好ましくは薬学上又は美容上許容可能な賦形剤又は補形薬を含むことができる。組成物が固体、液体若しくは粘性体であるか、又はエアロゾルであることが好ましい。組成物はペースト、軟質ゼラチンカプセル、硬質ゼラチンカプセル、粉末、顆粒、ビーズ、香錠、発泡錠、ロゼンジ、口腔錠、チュアブル錠、舌下錠、溶液、チンキ剤、エマルション、ジュース、濃縮液、シロップ、スプレー液、飲用アンプル、ゲル、洗口液、歯磨き粉、チューインガム、錠剤、コーティングピル又は糖菓の形態であることが好ましい。
【００３１】
組成物は有利にはプロバイオティクス、防腐剤又は他の抗菌物質を含むことができ、及び／又は好ましくは酸化防止剤、ビタミン、補酵素、脂肪酸、アミノ酸及び補因子から選択される１つ又は複数の物質を更に含むこともできる。
【００３２】
本発明の好ましい実施の形態において、組成物は医薬組成物、獣医組成物若しくは化粧品組成物又は栄養補助食品若しくは栄養補助食品組成物である。組成物は１つ若しくは複数の増粘剤、１つ若しくは複数の甘味料、及び／又は１つ若しくは複数の人工甘味料を含むことが好ましく、増粘剤が、セルロースエーテル、キサンタンガム、ゼラチン、高分散二酸化ケイ素、デンプン、アルギン酸塩、トラガカントゴム、寒天、アラビアゴム、ペクチンを含む群から選択される多糖類及びポリビニルエステルから選択され、甘味料が、グルコース、フルクトース、スクロース及びグルコースシロップ、ソルビトール、マンニトール、キシリトール及びマルチトール、サッカリン、シクラミン酸ナトリウム、アセスルファムＫ及び／又はアスパルテームを含む群から選択されることが好ましい。
【００３３】
本発明の意味における好ましい医薬品は、口腔部、咽喉部又は頸部における咳、咽喉痛、感冒又は感染用の鼻うがい液、洗口液及びデンタルリンス；うがい液、鼻用スプレー液、口腔スプレー液、咽喉スプレー液、点鼻薬、点滴薬、チンキ剤、ジュース、又はシロップ、咽喉症状又は咽喉痛用の咽喉錠、糖菓、チュアブル糖菓、コーティングピル及び香錠、並びにエアロゾルを含む。
【００３４】
本発明の意味における好ましい医療品は、口腔部、頸部又は咽喉部における咳、咽喉痛、感冒又は感染用の鼻うがい液、洗口液及びデンタルリンス；うがい液、鼻用スプレー液、口腔スプレー液、咽喉スプレー液、点鼻薬、点滴薬、チンキ剤、ジュース、又はシロップ、咽喉症状又は咽喉痛用の咽喉錠、糖菓、チュアブル糖菓、コーティングピル及び香錠、並びにエアロゾルを含む。
【００３５】
本発明の意味における好ましい化粧品は、歯磨き粉、ローション、振盪合剤、粉末、洗鼻液、洗口液及び洗歯液、うがい液、鼻用スプレー液、口腔スプレー液、咽喉スプレー液、チューインガム、ヒドロゲル、クリーム、クレサ（cresa）、軟膏、脂性軟膏又は皮膚表面への塗布用のペーストを含む。
【００３６】
本発明の意味における好ましい食品及び栄養補助食品は、発泡錠、ビタミン錠、ミネラル錠、微量元素錠、飲用粉末、飲料、ジュース、乳飲料、ヨーグルト、ミネラル水、無炭酸水、糖菓、チュアブル糖菓、チューインガム、ジュース若しくはシロップ、咽喉錠、コーティングピル及び香錠、並びにエアロゾルを含む。さらに、組成物はビルダー、酵素、電解質、ｐＨ調整剤、増粘剤、防汚剤、蛍光増白剤、灰色化阻害剤、色移り阻害剤、整泡剤及び／又は着色剤を含有していてもよい。
【００３７】
微生物は有利には、組成物中で生きている又は破壊した形態で存在することが好ましい。加えて、微生物は、好ましくは封入形態、噴霧乾燥形態及び／又は凍結乾燥形態で存在することができ、好ましくは細胞可溶化物の形態で存在することもできる。加えて、前記微生物が、組成物中に０．００１ｗｔ％〜２０ｗｔ％、好ましくは０．００５ｗｔ％〜１０ｗｔ％、特に好ましくは０．０１ｗｔ％〜５ｗｔ％の量（重量による量）で存在することが好ましい。
【００３８】
別の態様では、本発明は、化膿連鎖球菌と共凝集する特性を有する乳酸菌を特定及び／又は選択する方法であって、
ａ．生物膜を形成する病原微生物をインキュベーションする工程と、
ｂ．試験対象の乳酸菌を添加するとともにインキュベーションして混合物を形成する工程であって、病原微生物と調査対象の乳酸菌との間で共凝集を起こす工程と、
ｃ．上清を除去することによって結合していない乳酸菌を分離する工程と、
ｄ．共凝集した乳酸菌に関して生物膜を測定する工程と、
を少なくとも含む、方法に関する。
【００３９】
さらに本方法は、
病原微生物の生物膜の阻害を調査する工程であって、調査対象の乳酸菌を、生物膜を形成する病原微生物のインキュベーション中に添加する工程及び／又は好ましくは、
試験対象の乳酸菌を添加していない対照と比較して、光学密度を測定することによって、結合していない細胞の除去後の生物膜の形成を定量化する工程、
を更に含み得る。
【００４０】
加えて、本発明は、皮膚、粘膜及び口腔の微生物疾患の治療、予防及び／又は治療法用の調合薬、医療品又は化粧品の製造への組成物の使用に関する。
【００４１】
好ましい組成物は、皮膚、粘膜及び口腔の微生物疾患又は炎症性疾患の局所予防及び／又は局所治療に使用することもできる。組成物が口腔の微生物疾患の予防及び／又は治療に使用され、１つ又は複数の香味物質を更に含むことが好ましい。加えて、組成物が微生物疾患又は炎症性疾患、好ましくは口腔の微生物疾患又は炎症性疾患の局所予防及び／又は局所治療に使用され、組成物が、チュアブル物、チューインガム、糖菓、香錠、歯磨き粉、スプレー液又は洗口液の形態で使用されることが好ましい。
【００４２】
１つ又は複数の抗炎症物質又は抗微生物物質を組成物中で使用するのが有利であり得る。加えて、組成物を溶媒、賦形剤、補形薬、充填剤、香味物質、芳香物質及び／又は更なる成分と組み合わせて使用することが好ましい。好ましい実施の形態では、組成物を使用して、表面処理用の清浄剤又は消毒剤を調製することができる。組成物は医療品及び／又は予防の分野において使用される製品の製造に使用されるのも好ましい。組成物を使用して、経口摂取、舌下摂取、口腔摂取用の作用物質を調製することが好ましい。
【００４３】
好ましい実施の形態では、組成物を使用して、口腔咽頭域内での炎症の局所治療、並びに上気道及び皮膚の感染用の抗微生物添加剤を作製することができる。好ましい組成物はとりわけ予防的に又は治癒的に使用される。組成物を経口で、舌下に又は口腔に適用することが好ましい。
【００４４】
さらに本発明は、身体衛生機器若しくは器具、リンス及び／又はペーストに好ましい微生物又は好ましい組成物を含む衛生的な治療用キットに関する。キットは口腔部又は咽喉部での細菌感染症の治療に使用することができ、ここではとりわけ感染症は化膿連鎖球菌により引き起こされるか、又は少なくともこの種が感染症に関与している。
【００４５】
本発明は好ましくは、とりわけ乳児、幼児、小児、健常者、高齢者、免疫が抑制された人、単発性若しくは再発性の化膿連鎖球菌感染症の人及び／又は咽喉及び扁桃腺の細菌感染症（咽頭炎）の人の治療又は予防に使用される新規な乳酸菌、そのアナログ、変異株、誘導株又はフラグメント、及びそれらを含有する組成物に関する。本発明は驚くべきことに、動物にも使用することができる。
【００４６】
したがって、組成物を使用して、咽喉症状、咽喉痛、咽喉の発赤、並びに咽喉及び扁桃腺の化膿性炎症及び非化膿性炎症の治療又は予防に有益な調合薬を調製することが好ましい。ここでは、乳酸菌の投与が望ましい。好ましい組成物は、治癒的に又は予防的に、例えばプロバイオティクスとして使用することができる。
【００４７】
好ましい微生物、すなわちとりわけ乳酸菌の属に属する微生物、又はそのアナログ、誘導株、変異株若しくはフラグメントには、化膿連鎖球菌との共凝集能、化膿連鎖球菌との特異的な結合能がある。好ましい乳酸菌が、ストレプトコッカス・サリバリウス（Streptococcus salivarius）等の片利共生微生物との共凝集又は結合を起こさないことは全くもって驚くべきことであった。ストレプトコッカス・サリバリウスは健常者の咽喉部の粘膜に見られ、健常な微生物均衡に寄与することから、本発明に関してはその凝集は好ましいものではない。
【００４８】
換言すると、好ましい乳酸菌は病原性細菌である化膿連鎖球菌と特異的に共凝集する。これは従来技術で誘導することができるものではない。従来技術には、ヒト細胞株内での及び／又はヒト細胞株上での化膿連鎖球菌の浸潤及び複製を妨げる乳酸菌だけしか説明されていない。しかしながら、付着は細菌性発病に必須の第１段階であり、そのためこのアプローチは副作用なくしては使用することができなかった。これとは対照的に、好ましい乳酸菌は、化膿連鎖球菌の浮遊性細胞（例としてはＡＴＣＣ１２３４４及びＡＴＣＣ１９６１５というＤＳＭ番号の株が挙げられる）が宿主細胞に結合する前に、化膿連鎖球菌の浮遊性細胞と特異的に共凝集する。このため本発明は、従来技術に対して化膿連鎖球菌の上皮細胞への結合を低減する傾向にあることから、通例とは逸脱するものと見なすことができる。また、最初の段階で病原性細胞が上皮細胞と結合することができないように、乳酸菌が口腔内で病原性細胞と共凝集することができるという報告はなかった。これには、細胞凝集体が唾液とともに又は洗口液を用いて嚥下され、化膿連鎖球菌の細胞が胃腸管中で破壊されるという重要な利点もある。したがってこれは、例えば洗口液を吐き出すことが不快でかつ不便であると一般に認識されていることから、利用者に優しい適用でもある。これは好ましい使用に必要なものではない。
【００４９】
当業者は、健常な皮膚及び／又は粘膜には、細菌及び真菌等の微生物が密集していることを認識しており、これは片利共生及び／又は相利共生と呼ばれる。これらの微生物は、皮膚表面の自然構成要素であり、特に皮膚微生物叢という用語と総称される。自生（autochthonic）微生物叢という用語に含められる微生物は、病原微生物から皮膚自体及び全身を保護するための重要な必須条件であり、ミクロビオーム（microbiome）の一部である。この点において、好ましい乳酸菌は、皮膚微生物叢内で不均衡状態を起こさず、単に病原性細菌である化膿連鎖球菌と結合し、及び／又は化膿連鎖球菌と共凝集することが特に有利である。
【００５０】
最後になるが、本発明による微生物は化膿連鎖球菌のフィブロネクチンへの結合を防ぐことによって、細胞の浸潤が妨げられる。好ましい乳酸菌は化膿連鎖球菌と共凝集し、及び／又はこれらの細菌との付着特性を有することから、これによってとりわけ病原性因子のマスキング、ひいては不顕在化がもたらされ、次いで咽喉部での細菌数の低減及び／又は化膿連鎖球菌のフィブロネクチン及び／又は細胞への結合阻害が起こる。
【００５１】
本発明はとりわけ乳酸菌の群に関するものであるが、本願による教示には一貫性がある。特許請求の範囲に係る微生物には共通の特性又は効果がある。構造又は機能の共通性をまとめることで、化膿連鎖球菌との共凝集と、皮膚及び／又は粘膜の片利共生微生物との非結合と、化膿連鎖球菌のフィブロネクチンへの結合の阻止との機能的関係性が導かれる。また共通する特色は、特色の任意の総和を表すものではないが、特許請求の範囲に係る微生物の共通する特質（fingerprint）を構成するものであり、言い換えるならばこの特質によって有益には、これらの微生物がこの目的に適したものとなるともに、この目的に適したものであることが明らかになる。さらに、驚くべきことに本発明による微生物の驚くべき特性、すなわち化膿連鎖球菌との共凝集は、唾液中又は糖の存在下でも阻害されないことが見出されている。これは、とりわけ微生物及び組成物の好ましい使用部位が口腔内であり、一般的に共凝集プロセスは高い糖濃度によって阻害されることが従来技術から認識されていることから有益である。しかしながら試験によって、本発明による微生物、とりわけ乳酸菌は、高い糖濃度（例えば唾液中、並びに発泡錠、ビタミン錠、ミネラル錠、微量元素錠、飲用粉末、飲料、ジュース、乳飲料、ヨーグルト、糖菓、チュアブル糖菓、チューインガム、ジュース若しくはシロップ、咽喉錠、コーティングピル及びエアロゾル等の可能な剤形内で見られるようなもの）であっても化膿連鎖球菌と共凝集することから、このことは本発明による微生物、とりわけ乳酸菌には当てはまらないことが分かっている。
【００５２】
さらに、好ましい微生物は皮膚上でも使用することができ、そこでも該微生物が化膿連鎖球菌と共凝集することは驚くべきことであった。当業者は、化膿連鎖球菌が病原性創傷生物としても知られており、そのため好ましい微生物の共凝集能が口腔に限定されず、皮膚領域にも適用することができることが特に有利であることを認識している。
【００５３】
このため本発明は、とりわけ乳児、幼児、小児、健常者、高齢者、免疫が抑制された人、病理的皮膚変化（とりわけブドウ球菌性熱傷様皮膚症候群、伝染性膿痂疹、表在性毛嚢炎、膿痂疹化、皮膚膿瘍、フルンケル（せつ腫症）、癰（膿瘍）、蜂窩織炎、乾燥皮膚、皮膚掻痒、皮膚発赤、皮膚の刺激、極めて脂性の皮膚、座瘡、糖尿病足、褥瘡潰瘍、神経皮膚炎、急性リンパ節炎、毛巣洞（毛巣瘻、毛巣嚢胞、尾骨瘻、尾骨洞を含む）、皮膚及び皮下組織の他の局部感染（例えば、膿皮症、化膿性皮膚炎、敗血症性皮膚炎、膿瘍性皮膚炎）の人での治療又は予防に使用される、微生物、とりわけ乳酸菌、そのアナログ、変異株、誘導株又はフラグメント、及びこれらを含有する組成物にも関する。これらは、ヒト又は商用動物及びペットにおける様々な形態の皮膚炎及び湿疹（例えばアトピー性湿疹、脂漏性湿疹、おむつかぶれ若しくは皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、脂漏性皮膚炎、剥脱性皮膚炎、毒性接触皮膚炎、慢性単純性苔癬、痒疹、掻痒症及び他の形態の皮膚炎）、更に丘疹落屑性皮膚疾患（乾癬、類乾癬）、外皮付属器の疾患（例えば脱毛性毛包炎を含む瘢痕化を伴う脱毛症）、並びに皮膚及び皮下組織の他の疾患（例えば下腿潰瘍）、既往の皮膚損傷（例えば乾燥皮膚）、皮膚外傷（例えば疥癬、事故又は手術によるものを含む創傷）を治療するのにも使用することができる。
【００５４】
好ましい実施の形態において、本発明の意味における皮膚は、とりわけ外部から内部を隔てることを担う、ヒト又は動物の身体の外側器官であると理解される。好ましい実施の形態において、本発明の意味における皮膚領域には、皮膚の最上層、革質部若しくは真皮、又は皮下組織という構成要素が含まれる。また、皮膚の最上層（表皮）は、本発明によれば、上皮角質層（stratum corneum）（角質層）、淡明層（stratum lucidum）（透明層）、果粒層（stratum granulosum）（顆粒層）、有棘細胞層（stratumspinosum）（有棘層）及び／又は基底細胞層（stratum basale）（基底層）という層で構成される。この領域での細胞の各修飾は、本発明の意味においては皮膚領域における細胞修飾からなる。本発明によれば、皮膚領域の構成要素でもあり得る真皮（dermis）又は革質部は好ましくは、結合組織線維で構成され、栄養及び表皮のための支えを提供するものである。表皮との境界帯域における毛細血管系も本発明の意味では皮膚領域に属し、皮脂腺及び汗分泌腺（sudoriporous glands）すなわち汗腺（sweat glands）も同様である。本発明の意味における真皮は、乳頭層と網状層とに細分類することができる。加えて、本発明の意味における皮膚領域は、皮下組織（皮下）又は身体内部の組織中又はその上のいずれの領域、すなわちいずれの位置も、又はいずれの器官若しくは器官要素でもあり得る。周辺構造から器官を隔てる組織障壁は、本発明の意味における皮膚とすることができる。加えて、皮膚領域の発明概念には、髪、皮脂腺、立毛筋、爪、角、並びに汗分泌腺、とりわけエクリン汗分泌腺及びアポクリン汗分泌腺、また乳腺等の外皮付属器も含まれると理解される。任意の細胞修飾、とりわけ、正常状態から逸脱する細胞成長は、本発明による作用物質を用いて、好ましくは皮膚の外部領域に限定されることなく処理することができる。しかしながら、本発明の意味における皮膚領域には、足の指若しくは足裏の真皮等といった真皮、又はそれに関連する皮膚（meshed skin）及び皮膚付属器も含まれ得る。
【００５５】
好ましい組成物は、とりわけセッケン、ローション、粉末、合成洗剤、泡沫、スティック、エマルション、スプレー、クリーム、ゲル、シャンプー、液体セッケン又は消臭剤中に含めることができる。また、組成物を、とりわけ、洗浄剤、リンス剤、清浄剤又は消毒剤（例えば、セッケン、粉末、ペースト、溶液、エマルション、ローション）、掃除用及び／又は消毒用の布巾又はタオル、シャンプー、リンス、又は皮膚、髪及び／又は頭皮用の塗り薬、クリーム、軟膏、皮膚清浄用ローション及び／又はスキンケアローション、目、耳、口、鼻又は喉の中又はそれらの上に使用される溶液（例えば、滴剤、スプレー、リンス）として添加することができ、及び／又は、包帯又は創傷被覆材中に組み込んで病原微生物の形成を抑制し、病原微生物と結合させ、凝集体として病原微生物を除去し及び／又は病原微生物を阻害するか若しくは病原微生物を破壊することによって、病原微生物の数を低減させることができるプロバイオティクスとして使用することが好ましい。
【００５６】
本発明による組成物を上述の医薬品形態に組み込むことによって、本発明による組成物の利点をもう一段階改善することができたことは、全く驚くべきことであった。当業者は、本発明による組成物を賦形剤物質、例えば、エマルション、又は皮膚塗布用の他の製品、例えば、好ましくは含水物又は無水物であってもよく、本発明によれば水性形態を単一相系及び多相系に分類することができる液体形態等の中に導入するという他の配合概念に精通している。加えて、無水物又は含水物である半固体形態を使用してもよく、これもまた単一相系、及び水を含有する半固体形態も可能な多相系に分類することが可能である。親油性又は親水性である固体形態も使用することができるのが好ましい。かかる形態の例としては、上記で既に述べたそれらの形態に加えて、例えば、脂性軟膏、泡沫、粉末、スティック、ゲルクリーム、水分散ゲル、薄い（非粘性）エマルション、ローション、軟膏、スプレー及びクリームが挙げられる。ここで当業者は、かかる賦形剤物質をまず、皮膚上の感触に基づき、リッチ／高品質なものと、新鮮で軽いものとに区別することができ、次に、粘度の観点から低粘度のものと、高粘度のものとに区別することができ、ヒドロゲル若しくはハイドロクリーム、及び／又はＯ／Ｗ型エマルション若しくはＷ／Ｏ型エマルションは高粘度を有することを認識している。液体塗布形態を使用する場合、それらは、上記に説明したように、含水物系と無水物系とに細分類することができる。無水物系の中でも、無極性系、乳化剤を含まない極性系、及び乳化剤を含む極性系が特に好ましい。含水物系の中では、溶液及びマイクロエマルション等の単一相系が好ましく、多相系の中では、多重エマルションであるＷ／Ｏ型エマルション若しくはＯ／Ｗ型エマルションが好ましい。固体／液体系の中では、好ましい形態として、懸濁液、又は懸濁液系／エマルション系等の液体／固体／液体系が挙げられる。当業者は、かかる賦形剤を供給するための様々な可能性を認識している。Ｏ／Ｗ型エマルションでは、好ましい主な医薬物質には、Ｏ／Ｗ型乳化剤、Ｗ／Ｏ型乳化剤、親水性液体成分及び親油性液体成分が含まれる。Ｗ／Ｏ型エマルションでは、好ましい主な医薬物質には、Ｗ／Ｏ型乳化剤、Ｏ／Ｗ型乳化剤、液体及び半固体の親油性成分、ゲル形成剤、親水性液体成分及び／又は塩が含まれる。
【００５７】
好ましい半固体賦形剤物質の中では、含水物系及び無水物系が様々な用途に好ましい。無水物系は、乳化剤を含まない極性系又は無極性系、例えば、リポゲル、オレオゲル又はポリエチレングリコールゲルからなっていてもよく、及び／又は、Ｏ／Ｗ型吸収性基剤若しくはＷ／Ｏ型吸収性基剤における、乳化剤を含む無極性系からなっていてもよい。含水物系は好ましくは、ヒドロゲル若しくはマイクロエマルションゲル等の単一相系、又はＯ／Ｗ型クリーム、Ｗ／Ｏ型クリーム若しくは両親媒性系等の多相系からなっていてもよい。好ましい半固体製剤は、室温と皮膚温度との間の温度範囲で皮膚に塗布するために、又は粘膜に塗布するために、塗り広げることができる製剤であり、該製剤は局所的な効果を有するか、有効成分を輸送するか又は皮膚に対する軟化効果又は保護効果を有する。好ましい製剤としては、狭義の軟膏、クリーム、ゲル及び／又はペーストが挙げられる。軟膏、クリーム、ゲル及びペーストに加えて、オレオゲルも透明な半固体単一相系として使用することができる。当業者は、米国特許第６，１８７，３２３号又はAiache et al. 2001により、半固体系を配合するための様々な無水物化合物を認識しており、これらとしては、例えば、本発明によりバイオゲル（biogel）と称され得る、オレオゲル（oleogel）及びヒドロゲルの化合物が挙げられる。加えて、水分散ゲル又は様々な脂質は、本発明による賦形剤物質をもたらすのに使用することができる。脂質を使用する場合、有機ケイ素化合物及び有機炭素化合物を使用して、分散系に脂質相を供給することができ、ここで、有機炭素化合物は、例えば、非加水分解性脂質若しくは加水分解性脂質（グリセロール）又はワックスエステルを用いて供給することができる。かかる系の利点としては、皮膚の柔軟性の改善及び弾性の増大、並びに脂質組成物に応じて、物質の放出及び侵入を増大させる作用を有する能力が挙げられる。当業者は、例えば、時間パラメータ内における侵入を増大又は減少させるのに使用する必要のある脂質がどれかを知っているであろう。
【００５８】
付加的な好ましい賦形剤物質としては、例えば、水分散ゲル及び／又はマイクロカプセル、微小球（microspherules）若しくはペレット剤（マクロビーズ）が挙げられる。既述した賦形剤は、安定性を増大させて、皮膚への最低限の塗布時間を確保するのに役立つ。好ましい半固体単一相系は、親水性液体成分、とりわけ水及び（多価）アルコール、親水性ゲル形成物質、塩形成物質及びＷ／Ｏ型乳化剤、Ｏ／Ｗ型乳化剤、液体、半固体及び固体の親油性成分、並びに親油性ゲル形成物質及びビルダーという主な医薬物質を用いて調製することができる。当業者は、或る特定の効果を達成するためにこれらの物質をどのように組み合わせるべきかを知っているであろう。
【００５９】
また、当業者は、皮膚製品用の他の医薬製剤についても知っているであろう。本特許出願によれば、例えば、医薬化合物は全て、JDDG; 2007, 5:367-383においてDaniels及びKnieによる引例に開示されている。当業者は、種々の医薬製剤が、皮膚において種々の効果を有することを認識しており、生薬（galenical）組成物を種々の量で皮膚に塗布するであろう。JDDG; 2007,5:367-383の内容は、引用することにより特許出願による教示の開示内容の一部をなすものとする。本発明による好ましい製品としては、例えば、親油性若しくは親水性の溶液、親油性若しくは親水性のエマルション、親油性若しくは親水性の懸濁液、特別な液体製剤、疎水性若しくは親水性の軟膏、水乳化軟膏、親油性、親水性若しくは両親媒性のクリーム、ヒドロゲル、疎水性若しくは親水性のペースト、及び／又は粉末が挙げられる。
【００６０】
好ましい微生物、とりわけ乳酸菌は、ラクトバチルス・ラクチス、ラクトバチルス・ヘルベティカス、ラクトバチルス・イエンセニイ、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・ブルガリクス、ラクトバチルス・アミロボラス、ラクトバチルス・デルブリュッキイ、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・クリスパータス、ラクトバチルス・ガゼリ、ラクトバチルス・ジョンソニイ、ラクトバチルス・パラカゼイ、ラクトバチルス・ペントーサス、ラクトバチルス・ラムノサス、ラクトバチルス・クルバトス、ラクトバチルス・プランタルム、ラクトバチルス・ブレビス、ラクトバチルス・ブフネリ、ラクトバチルス・フルクチボランス、ラクトバチルス・ヒルガルディ、ラクトバチルス・ファーメンタム、ラクトバチルス・ロイテリ、ラクトバチルス・ビリデセンス、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、ラクトバチルス・イングルビエイ、又はそれらのアナログ、誘導株、フラグメント若しくは変異株を含む群から選択される。これらの微生物は、機能的関連性により互いに関連付けられ、本発明の画一的な概念を為すため、それらは特性及び／又は効果を共有している、すなわち、特に病原性細菌である化膿連鎖球菌と特異的に共凝集し、皮膚及び／又は粘膜の任意の片利共生微生物には結合せず、更に化膿連鎖球菌のフィブロネクチンへの結合を防ぎ、及び／又はフィブロネクチンに結合する化膿連鎖球菌細胞を破壊する。これらの乳酸菌としては、とりわけ、ＤＳＭ２５９７２、ＤＳＭ２５９８７、ＤＳＭ２５９８８、ＤＳＭ２５９８９、ＤＳＭ２５９７３というコード番号でドイツ微生物細胞培養物コレクションに寄託された微生物を含む群から選択される、微生物若しくはそのアナログ、フラグメント、誘導株、変異株、又はそれらの組合せが挙げられる。同一の有利な特性を有する乳酸菌の群を特定することができたことは全くもって驚くべきことであった。これらの特性を全て併せ持つ一方で、非病原性でもあるとともに、皮膚の自然微生物叢に何ら損傷も影響も生じさせない細菌、とりわけ乳酸菌はこれまでに説明されてこなかった。また、組成物又はその他のものとして好ましい乳酸菌を適用することにより、化膿連鎖球菌の宿主細胞への結合及び浸潤が妨げられることも見出された。この原因は、今までのところ知られていないが、更なる実験によって特定されるはずである。
【００６１】
好ましい微生物、とりわけ乳酸菌の別の驚くべき利点は、それらが予防的にも使用することができる点である。これは、乳酸菌及び／又はそれを含む組成物を、口腔及び咽喉の粘膜又は自生微生物叢を損傷させることなく予防的に（好ましくはロゼンジ又は糖菓の形態で）適用することができることを意味する。
【００６２】
好ましい実施の形態において、本発明の意味における皮膚及び／又は粘膜は、とりわけ、外部から内部を隔てることを担う、ヒト又は動物の身体の外側器官を指すものと理解される。好ましい実施の形態において、本発明の意味における皮膚領域には粘膜の構成要素が含まれる。
【００６３】
皮膚及び粘膜での乳酸菌の忍容性は、連鎖球菌の群の微生物による咽喉部での細菌による炎症、感染、疾患又は症状の治療の成功に必須のものである。好ましい組成物は、とりわけロゼンジ、糖菓若しくはコーティングピル、ジュース若しくはシロップ、リンス、スプレー液、又はエアロゾルの形態のプロバイオティクスとして導入され、主となる病原微生物の形成及び宿主細胞への結合を抑制し、これらの病原体と結合し、凝集体として取り除き、及び／又はこれらの病原体を阻害及び／又は破壊することにより、その数を低減させるものとする。
【００６４】
本発明による組成物は、糖菓、ロゼンジ又はコーティングピルとして使用することが好ましい。第１に、糖菓、ロゼンジ又はコーティングピルとして配合することで、（糖、代替糖、香料の添加を含む）殆どの場合で口当たりの良いレシピが可能となり、患者及び消費者において広く受け入れられるようになる。第２に、ロゼンジを舐める際にも分泌される唾液が粘膜を湿らせることで、咽喉痛又は扁桃炎の症状がある場合に、或る程度の緩和をもたらす。本発明による組成物は糖菓、ロゼンジ又はコーティングピルを舐めることで長時間にわたってゆっくりと放出され、このことは適用の側面において有利なものである。さらに、本発明による組成物を糖菓、ロゼンジ又はコーティングピル用の組成物に組み込むことは技術的に極めて簡単である。この点に関して、体温では活性があるが、熱処理後であっても好ましい能力、とりわけ化膿連鎖球菌との共凝集能を有するように７０℃〜９０℃での熱処理を耐えることができる微生物を利用可能にすることが可能であったことは全くもって驚くべきことであった。これはとりわけ、微生物が糖菓の製造後であっても共凝集能を有することが、糖菓の形態での微生物又は組成物の使用にとって有利であり、糖菓の製造の際に７０℃の温度が頻発することから有利なことである。このことは従来技術では知られていない。このため、好ましい微生物には、既知の微生物と全く異なる能力がある。加えて、微生物を含む組成物を有する糖菓は、口腔内でよりゆっくりと溶解することで、該糖菓がより良好かつより長期的な効果を示すことは驚くべきことであった。このことは本発明者らにとっても全くもって驚くべきことであった。さらに実験から、とりわけ微生物の徐放によって、口腔内の本質的に全ての化膿連鎖球菌細胞を共凝集することができることが分かっている。
【００６５】
当業者は、「体温」という用語に含まれるもの及びどのようにして体温を測定することができるかについて認識している。本明細書での体温は本質的に、ヒト及び動物に関するものである。当業者は、「糖菓」という用語にも精通しており、どの標準文献から糖菓の調製のための成分又は方法を探し出すのかも認識している。本発明は、単一の糖菓に限定されるものではなく、本発明では基本的に、当業者が精通している全ての糖菓を組み合わせることができる。糖菓及びその製造は、対応する自由にアクセス可能な技術文献、例えばCandy Ind. 27, 161 （1996）、H. Hoffmann, W. Mauch, W. Untze, Sugar and Sugar Products, 2ndedition,Behr's: Hamburg （2002）、R. Lees,B. Jackson, Sugar Confectionery and Chocolate Manufacture,Leonard Hill Books:Plymouth （1999）、FederalAssociation of the German Confectionery Industry （BDSI）, editors, Confectioner's Handbook,Molberg, Bonn （2001）、Handbookfor the Food Chemist, FoodLeader, Thieme, Stuttgart （1995）において当業者に開示されている。
【００６６】
多様な形状、味指向性、稠度及び色の糖菓が好ましい。糖菓は通常、一口サイズである。糖菓は固体、又は充填された形で（filled）、丸型、卵型、直方体型又は立方体型であり得る。残存水分含量に応じて、糖菓は硬質（硬質キャラメル）又は軟質で咀嚼可能なもの（軟質キャラメル）となる。添加剤に応じて、とりわけ咽喉糖菓と、咳用糖菓と、フルーツ糖菓と、キャラメル糖菓と、清涼糖菓とに分けられる。糖菓の効果及び味は、ハーブエキス、エッセンシャルオイル（例えばユーカリ）及びメントール等の有効成分を使用することで確定させることができる。フルーツ糖菓の場合、香味物質及び酸成分によって個々の味が生じ得る。天然の果汁エキス及び植物エキス又は食用色素を添加して、糖菓に色を付加することもできる。キャラメル糖菓は、とりわけコンデンスミルク、バター及びクリーム等の乳製品から調製される。様々な添加剤及び香料を添加することによって、ナッツ、アーモンド、蜂蜜、ココア、ココナッツ等の多様な味が可能となる。さらに、チュアブル糖菓、カットされた糖菓、エンボス加工された糖菓、キャスティングされた糖菓又はラミネート加工された糖菓が好ましい。有利なことに糖菓に、多様な成分、例えばビタミン、アミノ酸、オイル、ハーブ、脂質、様々な糖質若しくは代替糖、味増強剤及び／又は乳化剤を与えることができる。硬質糖菓には、とりわけスクロース及びグルコースが含まれ、硬質糖菓は、着香物質及び着味物質、着色物質、及び糖質の特性に影響を与える物質を使用して製造することが好ましい。残存水分含量が１％〜３％と低いことから、硬質キャラメルは硬く、また多くの場合で光沢／稠度を有する。硬質キャラメルは、糖ではなく甘味料及び代替糖を使用して作製することもできる。
【００６７】
軟質キャラメルは、とりわけ硬質キャラメルとは対照的に咀嚼可能な稠度を有し、バッチ式又は連続式の蒸解によって主成分としてスクロース、他のタイプの糖、甘味料及び／又は糖アルコール、並びにグルコースシロップから６％〜１０％の水分含量で作製される菓子製品群を指す。軟質キャラメルは好ましくは、添加剤として脂質、乳成分、増粘剤、乳化剤、着香物質及び着味物質を更に含有する。軟質キャラメルは、充填してまた充填することなく多種多様な形状及び色で作製することもできる。
【００６８】
加えて、糖菓がビタミン又は他の補因子が或るチャンバ内に存在し、好ましい微生物又は組成物が１つ又は複数の更なるチャンバ内に存在するようなマルチチャンバシステムを備えることが有益であることも証明されている。このチャンバシステムによって、微生物を最適な時点で、また任意で様々な用量で放出させることが可能となる。ビタミン又は他の補因子は微生物の活性を促進することもできる。例えば、驚くべきことにクランベリーには生物膜の発生を抑える効果があり、そのためクランベリーは好ましい微生物に最適な補助物質であることが見出されている。試験によって、クランベリーの成分又は溶液が存在する場合に化膿連鎖球菌の共凝集が５０％より効率的になることが分かっている。
【００６９】
試験によって、好ましい乳酸菌、とりわけラクトバチルス細胞が化膿連鎖球菌細胞と接触することで共凝集体を形成することが分かっている。共凝集体の形成によって、化膿連鎖球菌が定着し、とりわけ咽喉部の細胞を浸潤するのが妨げられる。化膿連鎖球菌細胞が選択的に皮膚及び粘膜の上皮細胞へと結合することができなくなるように、化膿連鎖球菌細胞、とりわけその細胞表面は乳酸菌、とりわけラクトバチルス細胞によってマスキングされる。炎症反応は化膿連鎖球菌の皮膚及び粘膜の上皮細胞への結合の阻害によって妨げられる。極めて初期の段階で化膿連鎖球菌と共凝集し、それにより最初の段階から化膿連鎖球菌の上皮細胞への結合を防ぐ微生物を供給することが可能であることは全くもって驚くべきことであった。これは全くもって驚くべきことであり、従来技術では知られていない。このため、好ましい微生物は口腔内で既に化膿連鎖球菌と共凝集することができる。さらに、唾液中に存在する酵素又は他の因子によっては好ましい微生物が阻害されない、すなわち好ましい微生物の化膿連鎖球菌との共凝集能が阻害されないことは全くもって驚くべきことであった。
【００７０】
天然の唾液には、特に細菌に対する防御として作用し、とりわけグラム陽性細菌の細胞壁を直接攻撃することができる、リゾチーム等の抗微生物物質が含まれている。しかしながら、好ましい微生物は、天然の唾液が存在し、またその中に抗微生物物質が含まれていても、化膿連鎖球菌との特異的な共凝集が可能であるという特徴がある。これは全くもって驚くべきことであり、従来技術に対するかなりの利点である。
【００７１】
本発明の意味において、プロバイオティクス微生物は、ヒト及び／又は動物の身体に有利な効果を有する細胞を含む。好ましい組成物は、プロバイオティクス組成物として使用され、また、ヒト及び／又は動物の身体に有利な効果を有する乳酸菌を含有する。有利な効果とは、とりわけ頸部及び咽喉部の化膿連鎖球菌に起因する微生物数の低減にあり得る。特に、自生微生物叢内の化膿連鎖球菌等の望ましくない微生物を、プロバイオティクス微生物と望ましくない微生物との間接的な相互作用によって、とりわけプロバイオティクス微生物の発現産物による望ましくない微生物の代謝の阻害に基づく間接的な相互作用によって阻害することができる。試験によって、好ましい乳酸菌との共凝集後には病原性の化膿連鎖球菌微生物が成長を示さない、すなわち細胞塊は更に繁殖することなく、とりわけ細胞がマスキング及び／又は破壊されることが分かっている。
【００７２】
本発明の別の態様は、とりわけ乳酸菌の生物学的処理、化学的処理又は物理的処理によって生産され、驚くべきことに処理後であっても有利な特性を示す、本明細書に記載の乳酸菌のアナログ、変異株、誘導株若しくはアナログ、又はフラグメントに関する。乳酸菌は有利には、ラクトバチルス・ラクチス、ラクトバチルス・ヘルベティカス、ラクトバチルス・イエンセニイ、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・ブルガリクス、ラクトバチルス・アミロボラス、ラクトバチルス・デルブリュッキイ、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・クリスパータス、ラクトバチルス・ガゼリ、ラクトバチルス・ジョンソニイ、ラクトバチルス・パラカゼイ、ラクトバチルス・ペントーサス、ラクトバチルス・ラムノサス、ラクトバチルス・クルバトス、ラクトバチルス・プランタルム、ラクトバチルス・ブレビス、ラクトバチルス・ブフネリ、ラクトバチルス・フルクチボランス、ラクトバチルス・ヒルガルディ、ラクトバチルス・ファーメンタム、ラクトバチルス・ロイテリ、ラクトバチルス・ビリデセンス、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、ラクトバチルス・イングルビエイを含む群から選択され、好ましくはＤＳＭ２５９７２、ＤＳＭ２５９８７、ＤＳＭ２５９８８、ＤＳＭ２５９８９、ＤＳＭ２５９７３という番号でドイツ微生物細胞培養物コレクションに寄託された微生物を含む群から選択される。
【００７３】
さらに、乳酸菌、そのフラグメント、誘導株、変異株、アナログ又はそれらの組合せが、物理的、化学的及び／又は生物学的に破壊した後であっても有利な特性を有し得ることは驚くべきことであった。例えば、好ましい株、すなわちＤＳＭ２５９７２、ＤＳＭ２５９８７、ＤＳＭ２５９８８、ＤＳＭ２５９８９及びＤＳＭ２５９７３は、病原体との共凝集を起こし、病原体のフィブロネクチンとの結合を妨げ、更に７０℃での２０分間の熱処理又は超音波による処理後であっても片利共生微生物との結合を示さない。このため、乳酸菌、そのフラグメント、誘導株、変異株、アナログ又はそれらの組合せは有利には、組成物の好ましい実施の形態では破壊した形態で存在していてもよい。このようにして、組成物の安定性及び有用性を大幅に延ばすことができる。さらに、熱的破壊又は凍結乾燥によって、とりわけ生物学的、化学的又は物理的な破壊方法によって作製された組成物を、生微生物を使用することができない更なる適用範囲に使用することができ、アナログ又はフラグメントは、破壊又は噴霧乾燥後であっても化膿連鎖球菌の群から選択される病原微生物に特異的に結合する能力を有する。乳酸菌が生きている又は非生存（死滅）形態で組成物中に存在し、それにかかわらず病原微生物に特異的に結合し、及び／又は病原微生物と共凝集することは全くもって驚くべきことであった。
【００７４】
さらに本発明は、上記の病原微生物に特異的に結合する能力を有し、とりわけ食品、食品添加剤、動物飼料又は飲料として使用される、本発明による微生物又はそのアナログ若しくはフラグメント若しくは誘導株を含有する組成物にも関する。好ましい組成物には、化膿連鎖球菌の群の少なくとも１つの病原微生物に特異的に結合し、及び／又は該病原微生物と共凝集する能力を有する本発明による乳酸菌、又はそのアナログ、フラグメント、変異株若しくは誘導株が含まれ、組成物は感冒の治療又は（or）予防に使用される。
【００７５】
本発明による好ましい微生物は、乳酸菌属、すなわちグルコースの発酵によって乳酸を生成するグラム陽性細菌に代表される。一方で本発明による微生物は、化膿連鎖球菌の群から選択される少なくとも１つの病原微生物に特異的に結合する、すなわち該病原微生物と共凝集する能力を有することを特徴とする。この結合により、本発明による微生物と、特異的に結合する病原微生物との凝集体の形成が起こる。凝集体の形成により、後者、すなわち病原微生物は、例えば標的化する簡単な手法で凝集体を洗い流すことによって機械的に除去することができ、これはこれまでに知られる手段では不可能なことであった。
【００７６】
本発明の意味において、並びに通常微生物学及び衛生学、とりわけヒト微生物学及び身体衛生学の分野において、「特異的結合」又は「共凝集」という用語は、遺伝学的に異なるタイプの細胞に属する細胞同士の相互認識及び付着を指すものと理解される。本発明の意味において、共凝集はとりわけ、付着、相互作用、結合、特異的結合、親和性又は相互作用と理解され、とりわけ好ましい微生物の化膿連鎖球菌との集塊を形成する能力を指す。その細胞表面上で細菌は、細胞間の付着に使用される、他の細胞型への付着因子に対する受容体及び構造体を発現する。この付着は、病原性微生物及び片利共生微生物の定着に優れた役割を果たし、そのため付着への介入によって広範囲にわたる結果が生じ得る。本発明による微生物が化膿連鎖球菌の群の少なくとも１つの病原微生物に特異的に結合する、とりわけ該病原微生物と共凝集する能力を有することから、本発明による微生物と病原微生物との凝集体が形成される。得られる共凝集体は、例えば表面、皮膚、組織及び／又は幾つかの他の定着部位若しくは定着受容部を洗い流すことによって容易に除去することができ、そうすることで病原微生物数が確実に低減する。加えて、表面、皮膚、組織及び／又は他の定着部位若しくは定着受容部への最初の及び／又は再発する付着は、病原微生物の表面構造をマスキングすることによって阻止及び／又は低減される。細胞が互いに結合して凝集体を形成する場合に、このプロセスはとりわけ凝集と称される。１つの細胞種のみが凝集体の形成に関与する場合、そのプロセスは自発凝集（autoaggregation）又は自己凝集（self-aggregation）と称される。少なくとも２つの異なる細胞種が凝集体の形成に関与する場合、このプロセスはとりわけ共凝集として知られている。
【００７７】
本発明の意味において、「少なくとも１つの病原微生物の特異的結合」は、とりわけ、化膿連鎖球菌の群に由来する少なくとも１つの細菌に結合する、本発明による微生物の特性を指すものと理解される。
【００７８】
本発明による微生物の好ましい実施の形態によれば、本発明による微生物はまた、生物学的、化学的又は物理的な処理、例えば最低７０℃の熱処理の後であっても、少なくとも１つの病原微生物に対する特異的結合能が存在することを特徴とする。言い換えれば、病原性細菌、とりわけ化膿連鎖球菌との特異的な相互作用能又は結合能が影響を受けないことから、結合又は相互作用を構築することができるため、好ましい乳酸菌が好ましい組成物中に破壊された形態で存在し得ることが好ましい。
【００７９】
上述の熱処理及び／又は「熱処理に対する耐性」又は「熱安定性」は、７０℃以上の高温での少なくとも３０分間という或る特定の期間後であっても、化膿連鎖球菌の群から選択される少なくとも１つの病原微生物との特異的な結合を始めることが可能であるという細菌の特性を指すものと理解される。死滅した又は破壊された乳酸菌細胞は、該乳酸菌細胞が代謝活性を誘起することができないことから特に有利であり得る。とりわけ本発明の意味において、「死滅した」又は「破壊された」形態は、これらの形態の本発明による微生物に分裂能がなく、例えば該微生物は生体（live living）染料で染色されることがなく、代謝活性がなく、ＤＮＡ複製又はタンパク質生合成又は例えば代謝産物の分泌を示さないことを特徴とする。
【００８０】
乳酸菌の別の好ましい特性によれば、本発明による微生物は、上記の特性、すなわち、化膿連鎖球菌群から選択される少なくとも１つの病原微生物との特異的結合能に加えて熱安定性も特徴としてもよく、また本発明の微生物は、高温、好ましくは少なくともおよそ６０℃、より好ましくは少なくとも６５℃、更に好ましくは少なくとも７０℃における少なくとも２０分間、好ましくは２５分間、より好ましくは少なくともおよそ３０分間の処理に耐えることができるとともに、上記病原微生物の特異的結合の共凝集能に関しては変わらないままである。
【００８１】
組成物の好ましい実施の形態では、生きている若しくは破壊された乳酸菌、又はこれらの細菌の一部及びフラグメント、例えば酵素による又は機械的な切断産物（例えばフレンチプレス等）若しくは代謝産物は、依然として共凝集能及び／又はフィブロネクチンとの結合防止能を有することから好ましい。また、乳酸菌は、封入形態、噴霧乾燥形態及び／又は凍結乾燥形態で用いられる、すなわち、好ましい組成物中に封入形態、噴霧乾燥形態及び／又は凍結乾燥形態で存在することが好ましい。さらに、乳酸菌を消化細胞の形態で使用することが有利であり得る。
【００８２】
さらに、病原微生物への特異的結合に関する本発明による乳酸菌の能力がおよそ３〜８のｐＨにおいても持続する場合が好ましい。これは、乳酸菌が３〜８のｐＨの媒体中存在するとともに、化膿連鎖球菌との結合能を依然として有し得ることを意味する。好ましい乳酸菌は広範なｐＨ範囲で有利に使用することができ、及び／又は好ましい範囲内で好ましい特性を有する。このため好ましい乳酸菌は身体の様々な領域に普遍的に使用することができる。本発明による乳酸菌は驚くべきことに、とりわけ、およそ２５℃〜４２℃の広い温度範囲において、化膿連鎖球菌との共凝集特性を示す。それ故、「約」又は「およそ」といった用語によって特徴付けられる、本明細書において及び本発明において挙げられる範囲の記述全てにおいて、正確な数値範囲は、「約」又は「およそ（"approx." or "approximately"）」という表現を伴って示す必要はないが、その代わり、示される数に関する上下のほんの僅かな偏差も本発明の範囲内にあることは、当業者にとって明らかであろう。好ましくは挙げられる病原微生物への本発明による乳酸菌の結合は、これらの病原微生物の成長の阻害をもたらす。
【００８３】
病原微生物と本発明による乳酸菌との結合によって、凝集体が形成され、これをとりわけ好ましくは３００×ｇの遠心力で１０秒間遠心し、次いでとりわけ撹拌せずに室温での１０分間のインキュベーションによって沈殿物として存在させることができることは驚くべきことであった。
【００８４】
別の好ましい実施の形態によれば、本発明による乳酸菌は、とりわけ皮膚の微生物叢の至って凡庸な片利共生菌であるストレプトコッカス・サリバリウス等の片利共生的な口腔咽頭微生物叢に結合する能力を有しない。皮膚内又は皮膚上に存在する様々な微生物の相互作用下で、この菌種は、多くの哺乳動物の健常な皮膚微生物叢内に存在し、少なくとも健常な皮膚上ではそれらと微生物平衡状態にある。標的とされる目的のために、例えば凝集によるこの細菌に対する影響、ひいては身体衛生中に存在し得る他の微生物に対する影響は、本発明の範囲内において好ましいものではない。
【００８５】
好ましい実施の形態では、本発明は、乳酸菌、そのアナログ、フラグメント又は誘導株であって、好ましい実施の形態では該乳酸菌は、ａ）熱安定性若しくは生物学的処理及び／又は化学的処理及び／又は物理的処理後の安定性、又はｂ）化膿連鎖球菌の宿主細胞への付着を阻害する能力という特色の少なくとも１つを有する、アナログ、フラグメント、変異株、誘導株、又はそれらの組合せを有する、乳酸菌、そのアナログ、フラグメント又は誘導株に関する。本発明による乳酸菌が生物学的処理及び／又は化学的処理及び／又は物理的処理後であっても化膿連鎖球菌に特異的に結合することが可能であることは全くもって驚くべきことであった。
【００８６】
本発明による乳酸菌の別の特性は、化膿連鎖球菌の宿主細胞への結合の阻害能であり、これらの化膿連鎖球菌細胞は既に浮遊形態で存在し、特異的に共凝集した後、凝集体として洗い流される。これらの病原性細菌はこの共凝集に起因して、生体表面に定着／侵入しなくなるため、疾患を引き起こすこともなくなる。
【００８７】
ここで本発明の意味において、「化膿連鎖球菌の宿主細胞（口腔咽頭細胞）への結合を阻害する」という語句は、とりわけ化膿連鎖球菌が口腔咽頭細胞に結合することができなくなるように、化膿連鎖球菌と相互作用する、すなわち化膿連鎖球菌に結合する、又はそれ以外の方法で化膿連鎖球菌に影響を与えるという本発明による乳酸菌の特性を指すものとして理解される。
【００８８】
したがって好ましい実施の形態では、本発明による微生物は、上述の特性、すなわち生物学的処理、化学的処理及び／又は物理的処理に対する耐性、耐熱性、化膿連鎖球菌との特異的結合能、化膿連鎖球菌との共凝集能の少なくとも１つを有し得る。特性の好ましい組合せとしては、例えば２つ又は３つの特性、すなわち例えば生物学的処理、化学的処理及び／又は物理的処理に対する耐性、耐熱性及び化膿連鎖球菌との結合能、又は生物学的処理、化学的処理及び／又は物理的処理に対する耐性、耐熱性及び化膿連鎖球菌の口腔咽頭細胞への結合の阻害が挙げられる。
【００８９】
本事例では、既に述べられるように、「乳酸菌属に属する微生物」という表現も、本明細書に記載される本発明による微生物の特徴及び／又は特色又は特性を依然として有するそれらの誘導株、変異株、アナログ又はフラグメントを含むと理解される。本発明による乳酸菌は、ラクトバチルス・パラカゼイ亜種パラカゼイ種、ラクトバチルス・プランタルム種、ラクトバチルス・クリスパータス種及びラクトバチルス・イングルビエイ種の細菌であることが好ましい。
【００９０】
したがって、乳酸菌属に属する上述の微生物の「変異株又は誘導株」、とりわけ本願の一部としてＤＳＭＺコレクションによる寄託を受けたラクトバチルス種の変異株又は誘導株は、本事例において本発明による乳酸菌、とりわけＤＳＭＺによる寄託を受けたものと同じ株について特許請求の範囲に記載されるものと同じ特徴を有する。この特徴は少なくとも、化膿連鎖球菌の群から選択される少なくとも１つの病原微生物との特異的な結合能、共凝集能を指すものと考えられる。加えて、以下の特色：（ｉ）生物学的処理、化学的処理及び／又は物理的処理、とりわけ少なくとも３０分間の７０℃を超える熱処理に対する特異的結合能の耐性；（ｉｉ）ストレプトコッカス・サリバリウスと結合しないこと；（ｉｉｉ）化膿連鎖球菌との特異的結合能；（ｉｖ）化膿連鎖球菌の口腔咽頭細胞への結合阻害能；（ｖ）ｐＨ３〜８における特異的結合の存在；（ｖｉ）天然の唾液中での特異的結合能の少なくとも１つを有することが好ましい。このような好ましい誘導株は、例えば遺伝子操作によって生産することができる。本発明の意味において、「遺伝子操作によって生産される」という用語はとりわけ、組換えＤＮＡ技術によって遺伝子修飾を引き起こして遺伝子を修飾し得るように、遺伝子操作分野におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでの核酸の修飾について当業者が精通しているあらゆる方法を含む。
【００９１】
したがって、本発明はとりわけ、本発明による乳酸菌の特性を依然として有する、本発明による乳酸菌のフラグメントも含む。本発明の意味において、「フラグメント」はとりわけ、本発明による微生物の細胞成分、及び好ましくは細胞膜の一部である。当業者は、従来技術から細胞膜画分を得る方法に適切に精通していると考えられる。
【００９２】
本発明による微生物は好ましくは単離形態又は精製形態であり、ここで、「単離」という用語はとりわけ、乳酸菌がその培地（例えばその天然培地を含む）に由来することを意味する。「精製」という用語は絶対純度に制限されるものではない。
【００９３】
生存可能な形態の本発明による微生物に加えて、本発明による微生物の破壊された形態も本発明の範囲内に含まれることが好ましい。好適な破壊方法（例えば生物学的、化学的又は物理的な破壊方法）に当業者は十分精通している。しかしながら、本事例では、凍結乾燥形態の微生物を使用してもよい。凍結乾燥細胞は、液体培地又は固体培地中での好適な培養後に再度、成長させることができる。このことが新規性及び進歩性に関するものであることは全くもって驚くべきことであった。従来技術には、例えば胞子を含む表面のクリーニング溶液が含まれるが、細菌は、胞子が対応する基質に接触すると再び活性化する。このことは好ましい微生物及び組成物に必要なものではない。さらに、好ましい微生物は活性があり、すなわち化膿連鎖球菌と共凝集し、上記した他の特性も有するが、代謝活性を有しておらず、微生物学の当業者にとって「死滅（dead）」しているものと見なされる。このため該微生物はもはや成長、分裂、複製又は代謝産物の分泌が不可能であることから、その使用範囲が大幅に拡大する。
【００９４】
また、「破壊された形態」又は「死滅形態」及び「誘導株」又は「アナログ」又は「変異株」という用語は、本事例において、本発明による微生物の細胞上清及び／又は発酵上清、溶解産物、画分又は抽出物を含み、これらの溶解産物、画分又は抽出物は好ましくは、乳酸菌の特性を有し、「溶解産物」（及び「抽出物」という用語）はとりわけ、本発明による微生物の細胞の水性媒体中における溶液又は懸濁液を指し、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、ペプチド、脂質、炭水化物等及び細胞破片（cell detritus）等の巨大分子を含む。また好ましくは溶解産物が細胞壁又は細胞壁構成要素を含む。溶解産物を生産する方法は、当業者に十分に既知であり、例えば、「フレンチプレス」又は酵素溶解、ガラスビーズ若しくは鉄ビーズを用いたボールミルの使用を含む。細胞は、酵素による方法、物理的又は化学的な方法によって開裂することができる。酵素による細胞溶解の例としては、個々の酵素並びに酵素カクテル、例えば、プロテアーゼ、プロテイナーゼＫ、リパーゼ、グリコシダーゼを挙げることができ；化学的溶解は、イオノフォア、ＳＤＳ等の洗浄剤、酸又は塩基によって誘起することができ；また物理的方法は、フレンチプレス等の高圧、浸透圧、温度、すなわち高温と低温とを交互に切り替えることによって実施することができる。さらに、化学的方法、物理的方法及び酵素による方法は当然のことながら併用してもよい。本発明による微生物の「破壊された形態」又は「死滅形態」及び「誘導株」又は「アナログ」又は「変異株」は好ましくは、上述の株と同様の特性を有する。「破壊された形態」又は「死滅形態」及び「誘導株」又は「アナログ」は好ましくはもはや全く代謝活性を有しない。本発明による微生物のアナログは、溶解産物又はフラグメントの形態である。本発明による微生物のフラグメントは、細胞膜、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、ペプチド、脂質、炭水化物等の巨大分子、及び細胞破片等の細胞の一部である。変異株及び／又は遺伝子組換え変異株、又は誘導株は、例えば、組換えＤＮＡ技術（クローニング、シーケンシング、組換え核酸の形質転換）、並びに例えば紫外線放射による物理的な変異誘発によって遺伝子組換えが行われるが、エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）等の化学薬品によっても遺伝子組換えが行われる。陽性特性の変更は選択することができる。遺伝子が組換えられた変異株は、本発明による微生物の細胞を含有し、その細菌染色体及び／又はプラスミド中に組換え核酸を含む。また、点突然変異に起因する修飾は、発現／転写／翻訳、並びに直接的な遺伝子操作を何ら行わない自然突然変異に作用を及ぼすことができる。アナログ又はフラグメントは、本発明による微生物の、熱によって破壊された（死滅）形態又は凍結乾燥形態であってもよく、これらは、それらの発明特性を保持するか又は例えば表面積を増大させることによって改善させる。凍結乾燥（フリーズドライ）後であっても、細胞は環境によっては依然生存可能であり得る。これらの細胞は、種々の温度における特別な貯蔵プロセスにより不活化された状態であってもよい。死滅細胞は、例えば、無傷の又は破裂した細胞膜を有していてもよいが、死滅細胞は、如何なる代謝活性も有するこ��ができない。不活化細胞を得る方法は、それらをガラスビーズで処理すること、例えば、細胞とガラスビーズとの間の剪断力の作用によって細胞が破裂することを含み得る。フレンチプレス、高圧均質化、ボールミル又は凍結融解プロセス及び加圧滅菌等の他の物理的方法も、細胞の破壊を引き起こし、本発明による微生物のフラグメント、並びにＵＶ照射、自己溶解プロセス、又は種々の温度における特別な貯蔵プロセスをもたらす。
【００９５】
本発明による特性を有する乳酸菌属に属する微生物であれば、例えば本明細書の下記の試験に基づき、当業者によって試験及び検証することができる。本発明の意味において、「ラクトバチルス細胞」という用語は、乳酸菌又はラクトバチルスを含むものとして使用することができ、また、乳酸の発酵に、糖質、とりわけグルコース及びラクトースを必要とするとともに、通常エムデンマイヤーホフ生合成経路を利用する微生物を含む。ラクトバチルス細胞は、乳酸菌科に分類学的に分類される。それらは、グラム陽性で非胞子形成性かつ一般的に静止性のものである。ラクトバチルス細胞は嫌気性であるが、ヘミン（シトクロム、カタラーゼ）を含有しないものの酸素耐性である（Schleifer et al., System. Appl. Microb. 18, 461-467 （1995）、又はLudwiq et al., System. Appl.Microb.15, 487-501 （1992））。ラクトバチルス細胞及び／又はその細胞種は、糖質の利用パターンに基づき、とりわけＡＰＩ試験（Biomerieux社製）を用いて求めることができる。本発明によれば、これらはとりわけ、同種発酵性の乳酸発酵又は異種発酵性の乳酸発酵に好適な細胞種を含む。またかかるラクトバチルス細胞は好ましくは、ラクトバチルス・ラクチス、ラクトバチルス・ヘルベティカス、ラクトバチルス・イエンセニイ、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・ブルガリクス、ラクトバチルス・アミロボラス、ラクトバチルス・デルブリュッキイ、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・クリスパータス、ラクトバチルス・ガゼリ、ラクトバチルス・ジョンソニイ、ラクトバチルス・パラカゼイ、ラクトバチルス・ペントーサス、ラクトバチルス・ラムノサス、ラクトバチルス・クルバトス及びラクトバチルス・プランタルム（全て同種発酵性）、またラクトバチルス・ブレビス、ラクトバチルス・ブフネリ、ラクトバチルス・フルクチボランス、ラクトバチルス・ヒルガルディ、ラクトバチルス・ファーメンタム、ラクトバチルス・ロイテリ、ラクトバチルス・ビリデセンス、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、及びラクトバチルス・イングルビエイ（全て異種発酵性）を含む群から選択される。例として好適であり、出願人が寄託を受けたラクトバチルス細胞には、ラクトバチルス・パラカゼイ亜種パラカゼイ（ＤＳＭ２５９７２）、ラクトバチルス・クリスパータス（ＤＳＭ２５９８７、ＤＳＭ２５９８８）、ラクトバチルス・プランタルム（ＤＳＭ２５９８９）、ラクトバチルス・イングルビエイ（ＤＳＭ２５９７３）が含まれ、それら全てが本発明にとって好ましい。
【００９６】
本発明の好ましい実施の形態において、本発明による微生物は、各々ドイツ微生物細胞培養物コレクション（ＤＳＭＺ）（所在Braunschweig）により寄託番号ＤＳＭ２５９７２、ＤＳＭ２５９８７、ＤＳＭ２５９８８、ＤＳＭ２５９８９、ＤＳＭ２５９７３として寄託された、ラクトバチルス・パラカゼイ亜種パラカゼイ、ラクトバチルス・クリスパータス、ラクトバチルス・プランタルム、ラクトバチルス・イングルビエイから選択される。上述のＤＳＭＺの寄託は、特許手続上の寄託を目的として、微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約に従って為されたものである。
【００９７】
上述のように、本発明は、微生物、好ましくは生きている微生物又はそのアナログ、変異株、誘導株若しくはフラグメントと、好ましくは、美容上許容可能な賦形剤若しくは補形薬、薬学上許容可能な賦形剤若しくは補形薬、又は皮膚科学上許容可能な賦形剤若しくは補形薬の少なくとも１つから選択される、少なくとも１つの賦形剤又は補形薬とを含有する組成物にも関する。
【００９８】
本発明の意味において、「組成物」という用語はとりわけ、本発明による少なくとも１つの微生物、又はそれらのフラグメント、誘導株、アナログ若しくは変異株と、任意に、賦形剤若しくは補形薬等の他の成分、又は任意に他の有効成分及び塩とを有する任意の組成物を含むと理解される。美容上、薬学上又は皮膚科学上許容可能な補形薬、賦形剤又は添加剤は、有効成分又は組成物、すなわち、本事例では少なくとも１つの微生物、又はそれらのアナログ若しくは誘導株若しくは変異株若しくはフラグメントを美容上又は薬学上使用するか、投与するか又は効果的に適用するために、美容分野、薬学分野又は歯科分野で一般的な任意の物質を含むと理解される。
【００９９】
本発明及び特許請求の範囲の意味において、「粘膜（"mucosa" or"mucous membrane"）」という用語は、腺分泌物によって保湿される中空器官の内壁の（lining）内層を指すものとして理解される。とりわけこれは口腔及び鼻腔の粘膜、結合組織、胃腸管の粘膜、並びに化学分野の粘膜を指す。
【０１００】
「炎症性疾患」は、本明細書及び本特許請求の範囲内において、皮膚、粘膜又は口腔に関与する急性、亜急性、慢性の再発する（relaxing）疾患状態、又は慢性の持続する疾患状態を伴う疾患を指すものとして理解される。炎症性疾患は臨床的に、発赤、腫脹、疼痛、掻痒、滲出、水疱形成（vesiculation）、過角化、過鱗状化（hypersquamation）、糜爛、潰瘍及び他の物質欠乏及び疥癬、小水疱、並びに他の発疹を特徴とする。組織学的には炎症細胞は真皮及び／又は表皮に見ることができる。本発明及び本特許請求の範囲の意味において、「炎症性疾患」又は「炎症状態」は、とりわけ例えば（限定するものではないが）湿疹、アトピー性湿疹、脂漏性湿疹、アレルギー性接触湿疹若しくは毒性接触湿疹）、乾癬及び他の過角化性炎症、急性及び慢性の創傷、痒疹性皮膚疾患、並びに扁平紅色苔癬、肉芽腫性皮膚及び錯乾癬性の（parapsoriatic）皮膚の変化等の珍しい炎症、並びに皮膚兆候を伴う大きな自己免疫疾患群等の疾患及び病態を指すものとして理解される。「予防法（prophylaxis）」又は「予防（prevention）」という用語は、本明細書及び特許請求の範囲ではあらゆるタイプの予防、すなわち健常な利用者及び／又は患者の予防的治療と、皮膚、粘膜若しくは口腔の微生物疾患に罹りやすい利用者及び／又は患者又は炎症性疾患に罹りやすい利用者及び／又は患者（いわゆる「素因」がある人）の予防的治療との両方を含むものとして理解される。さらに予防は、皮膚、粘膜若しくは口腔の微生物疾患又は炎症性疾患に過去に１度でも罹患したことがあり、例えば本明細書及び特許請求の範囲に提示された治療等の有効な治療によって該疾患を克服した利用者及び／又は患者の予防的治療（いわゆる「再発予防」）を含むものとしても理解される。さらに本明細書及び特許請求の意味において予防は、刺激を起こしやすい皮膚の化粧品による処置並びに治癒的及び修復的な処置を含むものとしても理解される。
【０１０１】
組成物は、本発明による微生物又はそのアナログ、変異株、誘導株若しくはフラグメントの１つだけではなく、本発明による微生物の混合物、又はアナログ、誘導株、変異株若しくはフラグメントの混合物、又は本発明による微生物とそのフラグメント、誘導株、変異株若しくはアナログとの混合物も含有し得ることが好ましい。
【０１０２】
組成物は好ましくは、固体又は液体又は粘性体又はエアロゾルであってもよく、例えば粉末、錠剤、溶液、顆粒、懸濁液、エマルション、カプセル、ペースト、ゲル、スプレー液等の形態、すなわち投与に適した任意の形態で使用することができる。組成物が更なるプロバイオティクス、防腐剤又は他の抗菌物質と、好ましくは任意であるが、サッカリド及び防腐剤、香料、甘味料、ビタミン、ミネラル、芳香剤等とを含むことも好ましい。欧州特許出願公開第２１３３４１４号には、好ましい組成物に使用される多くの成分が挙げられており、これらは本公報にはっきりと言及されている。さらに、充填剤、流量制御剤、レオロジー改質剤、軟化剤、安定化剤、又は反応性架橋モノマー、例えばメタクリレートが、好ましい組成物中に存在し得る。これに関しては、組成物がＥＤＴＡ、マグネシウム、カルシウム、ＳＤＳ若しくはそれらの塩、又は類似の塩等の物質を含有することが好ましい。これらの物質が初めに、化膿連鎖球菌による生物膜の形成を阻害するだけでなく、好ましい微生物の共凝集能を促進することは全くもって驚くべきことであった。本発明による組成物は、とりわけ身体衛生、治療及び予防に使用され、本発明による少なくとも１つの微生物、又はその誘導株、変異株、フラグメント若しくはアナログを含有する。
【０１０３】
プロバイオティクスとして、すなわち経口摂取することができる、生きている微生物を含有し、プロバイオティクスを摂取する人及び／又はプロバイオティクスが投与される人に対する健康増進効果を有する製剤として組成物を使用することが好ましい。かかる製剤は、食品若しくは食品添加剤又は動物飼料若しくは飼料添加剤又は薬剤であり得る。本発明によれば、組成物は、ヒトだけでなくあらゆる商用動物及びペット、すなわちイヌ、ネコ、ウマ、ラクダ、タカ等に使用することができる。微生物及び／又はそれを含有する組成物を様々な方法で使用して、これを達成することができる。例えば、この組成物をチュアブル棒、板ガム、動物用スナック、動物飼料、ペレット、齧ったり舐めたりする商品又は動物用玩具等に適用することが好ましい。とりわけ微生物又は組成物を、動物及びヒトの咽喉部でとりわけ化膿連鎖球菌により引き起こされる細菌感染症の治療及び／又は予防に使用することが好ましい。
【０１０４】
本発明による組成物に使用される投与量及び投与自体は、特定の使用及び特定の患者、とりわけ年齢、体重、全身状態等によって様々であり、この組成物を使用する当業者の能力及び評価の範囲内である。
【０１０５】
本発明による組成物は化粧品、医療品又は医薬品とすることができる。組成物は、０．００１ｗｔ％〜２０ｗｔ％、好ましくは０．００５ｗｔ％〜１０ｗｔ％、特に好ましくは０．０１ｗｔ％〜５ｗｔ％の量で乳酸菌を含有することが好ましい。とりわけ０．００１ｗｔ％〜２０ｗｔ％の量を使用することで、組成物（composition）がより長期間有用となる、すなわち安定性を維持するようになることは全くもって驚くべきことであった。乳酸菌が０．００５ｗｔ％〜１０ｗｔ％の量で使用される場合、これによって、組成物のレオロジー特性にプラスの効果が得られるとともに、粘性が低く、そのため皮膚上でより良好に分散するか又は口腔により容易に導入される組成物がもたらされることは驚くべきことであった。０．０１ｗｔ％〜５ｗｔ％の量での乳酸菌の使用によって驚くべきことに、互いにより良好に結合する組成物の構成要素がもたらされ、作業時間を短縮して均質な組成物を供給することができ、それにより生産コストが削減される。しかしながら、本明細書に明記したものとは異なる他の量も特定の用途に使用することができるは自明のことである。本発明による乳酸菌がヒトの唾液中で極めて高い共凝集活性を有することは特に驚くべきことであった。生じた化膿連鎖球菌との凝集体は、極めて良好な安定性を有し、そのため洗い流すか、又は嚥下することによって非常に良好かつ効率的に除去することができる。
【０１０６】
驚くべきことに共凝集効率は、補因子（ＥＤＴＡ、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２、ＳＤＳ）の存在下で大幅に増大することができる。とりわけＥＤＴＡが本発明による乳酸菌と化膿連鎖球菌との共凝集に強いプラスの効果を有することは絶対に予期することができないものであった。更に上述のように、好ましい実施の形態によれば、組成物及び／又は微生物を咽喉及び扁桃腺の感染症の予防及び治療の分野に使用することで、上述の病原微生物と共凝集し、すなわち上述の病原微生物に結合させることができる。この共凝集体（coaggregate）は、嚥下する若しくは洗い流すことによって容易に除去することができ、及び／又はとりわけ懸濁液の場合は洗い流すことができ、それにより有利に病原体数の低減が達成される。乳酸菌及び／又はそれを含有する組成物をこの目的のために多様な方法で使用することができる。例えば、これらをスプレー液、うがい液又は洗口液中で、ロゼンジ若しくは咽喉錠、香錠、コーティングピル、エアロゾル、歯磨き粉、ジュース、シロップとして、又は食品中の添加剤として及び／又は栄養補助食品として使用することができる。そのため、本発明は、身体衛生及び医療品及び予防法の分野で使用され、かつ本発明による乳酸菌を含有するあらゆる製品にも関する。したがって上記の実施の形態は、哺乳動物の治療、治療法及び予防の分野で考慮されるものである。したがって微生物及び／又はそれを含有する組成物は様々な方法で使用することができる。
【０１０７】
とりわけ本発明による組成物及び／又は本発明による微生物を使用して、咽喉症状、萎縮性乾燥咽頭炎（Pharyngitisatrophicans et sicca）、乾燥性咽頭炎、外側口峡炎（Angina lateralis）、化膿連鎖球菌によって引き起こされる扁桃炎の治療又は予防用の調合薬を作製することができることが好ましい（preferable）。本発明による微生物及びそれを含有する組成物は、これらの疾患を有利に治療及び／又は予防することができる作用物質を提供する。微生物及び／又はそれを含有する組成物は、人間医学及び獣医学の両方に、とりわけ先に示したようにイヌ、ネコ、ウマ、ラクダ及びタカに使用することができる。本発明による組成物及び／又は微生物、若しくはそのフラグメント、誘導株若しくは変異株を、とりわけ食品添加剤、衛生製品及び／又は微生物を含有する衛生製品として、若しくは医薬製剤として使用することができる。
【０１０８】
本発明は、本発明による特性を有するラクトバチルス属の種の微生物を特定及び／又は選択する方法であって、少なくともａ）フィブロネクチンに結合する化膿連鎖球菌から選択される病原微生物の集団をインキュベーションする工程と、ｂ）調査対象のラクトバチルス属の微生物を添加するとともに集団をインキュベーションする工程であって、病原微生物と調査対象のラクトバチルス属の微生物との間で特異的な結合を形成する工程と、ｃ）上清を除去することによって結合していないラクトバチルス属の微生物を分離する工程と、ｄ）結合及び凝集したラクトバチルス属の微生物に関してフィブロネクチンの結合を測定する工程とを含む、方法にも関する。
【０１０９】
好ましい実施の形態では、本発明による方法は、化膿連鎖球菌のフィブロネクチンへの結合の阻止を調査する工程も含む。ここでは調査対象のラクトバチルス属の微生物を、フィブロネクチンに結合する蛍光標識した病原微生物のインキュベーション中に添加する。結合していない細胞を除去した後、フィブロネクチンとの結合の特異的な定量化は、試験対象の微生物を添加することによって蛍光を対照と比較して測定することで行うのが好ましい。
【０１１０】
上述の特色及び以下にこれから記載する特色は、特定の組合せで使用することができるのみならず、本発明の範囲を超えない範囲内では単独でも使用することができることは自明である。
【０１１１】
更なる利点は添付の図面及びこれに関して行われる実験、並びに例示的な実施形態から導かれるものである。実験は全ての好ましい乳酸菌を用いて行われるが、ここでは幾つかの実験だけを示している。当業者は実施例を基に本発明を再現することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１１２】
【図１】本発明によるものでなく、化膿連鎖球菌に結合することができない付加的なラクトバチルス株（ラクトバチルス種１及びラクトバチルス種２）と比較するための、結合していない細胞を３回洗浄した後の、化膿連鎖球菌により形成される生物膜に対する、本発明による微生物の例示的な一実施形態（ＤＳＭ２５９７２、ＤＳＭ２５９８９、ＤＳＭ２５９７３）の特異的結合及び／又は凝集（結合アッセイ）；蛍光測定（Ｅｘ４８５ｎｍ／Ｅｍ５３５ｎｍ）に基づく、９６ウェルマイクロタイタープレートにおける、ＣＦＤＡにより標識された本発明によるラクトバチルス株の、化膿連鎖球菌の生物膜への結合及び／又は凝集の特異的定量を示す図である。当業者は、このようにして好ましい微生物をとりわけ口腔咽頭域内で生じる細菌感染の治療に特に使用することができることを知っているであろう。
【図２】写真記録システムにおける２４ウェル規模の共凝集バッチ内での本発明による微生物の例示的な実施形態（ＤＳＭ２５９７２、ＤＳＭ２５９８７、ＤＳＭ２５９８８、ＤＳＭ２５９８９及びＤＳＭ２５９７３）と化膿連鎖球菌との特異的結合、並びに本発明によるラクトバチルス株及び化膿連鎖球菌標的株（どちらも単独）の肉眼による対照図（２４ウェルマイクロタイタープレートの写真）である。白色沈殿物が共凝集（及びそれに伴う沈殿）によって形成される。そのため集塊から、とりわけ化膿連鎖球菌が咽喉の上皮細胞と結合することができないという結果になる。患者の試験によって、細菌感染を好ましい微生物を用いて防ぐ又は低減することができることが分かった。
【図３】共凝集後の本発明による微生物の例示的な実施形態（ＤＳＭ２５９８７及びＤＳＭ２５９７３）と化膿連鎖球菌細胞との特異的結合、並びに本発明によるラクトバチルス株単独及び化膿連鎖球菌単独の顕微鏡による代表図である。顕微鏡による撮像（位相差、倍率１０００倍）によって、共凝集体を大きな細胞塊として見ることができる。
【図４】写真記録システムにおけるヒト唾液中での本発明による微生物の例示的な実施形態（ＤＳＭ２５９７２、ＤＳＭ２５９８７、ＤＳＭ２５９８８、ＤＳＭ２５９８９及びＤＳＭ２５９７３）と化膿連鎖球菌細胞との特異的結合（共凝集）、並びに本発明によるラクトバチルス株単独及び化膿連鎖球菌単独の肉眼による対照図（２４ウェルマイクロタイタープレートの写真）である。白色沈殿物が共凝集（及びそれに伴う沈殿）によって形成される。好ましい微生物は唾液中で既に化膿連鎖球菌と結合しており、とりわけ唾液中で共凝集しており、そのため化膿連鎖球菌の上皮細胞への結合が妨げられることは驚くべきことであった。さらに好ましい微生物が唾液中に存在する酵素によってその好ましい能力を失うことがなかったことは驚くべきことであった。そのため、好ましい微生物は、とりわけ糖菓等の経口適用剤に使用するのが有利である。
【図５】ＰＢＳで洗浄したラクトバチルス懸濁液（生存）及び熱処理によって破壊したラクトバチルス懸濁液（死滅）との３７℃での２時間のインキュベーション後の化膿連鎖球菌ＡＴＣＣ１９６１５株のフィブロネクチンへの結合の阻止に対する本発明による微生物の例示的な実施形態（ＤＳＭ２５９７２、ＤＳＭ２５９８７、ＤＳＭ２５９８８、ＤＳＭ２５９８９及びＤＳＭ２５９７３）の影響を示す図である。特異的定量化はＣＦＤＡで標識した化膿連鎖球菌と、フィブロネクチンをコーティングした９６ウェルマイクロタイタープレートとの結合である。図５は化膿連鎖球菌の結合（％）で示され、１００％はラクトバチルス懸濁液を添加しない化膿連鎖球菌（ＡＴＣＣ１９６１５）単独のフィブロネクチンをコーティングしたマイクロタイタープレートへの結合を表すものである。好ましい微生物が咽喉での化膿連鎖球菌の上皮細胞への結合を防ぎ、それによって細菌感染が妨げられることが見出されている。
【図６】（ＰＢＳで洗浄したラクトバチルス懸濁液（生存）及び熱処理によって破壊したラクトバチルス懸濁液（死滅）との）３７℃での２時間のインキュベーション後の化膿連鎖球菌（ＡＴＣＣ１２３４４株）のフィブロネクチンへの結合に対する本発明による微生物の１つの例示的な実施形態（ＤＳＭ２５９７２、ＤＳＭ２５９８７、ＤＳＭ２５９８８、ＤＳＭ２５９８９及びＤＳＭ２５９７３）の影響を示す図である。図６はＣＦＤＡで標識した化膿連鎖球菌とフィブロネクチンをコーティングした９６ウェルマイクロタイタープレートとの結合の特異的定量化を示す。図６は化膿連鎖球菌の結合（％）で示され、１００％はラクトバチルス懸濁液を添加しない化膿連鎖球菌単独のフィブロネクチンをコーティングしたマイクロタイタープレートへの結合を表すものである。
【図７】写真記録システムにおけるＰＢＳバッファー中での本発明による微生物の１つの例示的な実施形態（ＤＳＭ２５９７２、ＤＳＭ２５９８７、ＤＳＭ２５９８８、ＤＳＭ２５９８９及びＤＳＭ２５９７３）と化膿連鎖球菌との共凝集、並びに本発明によるラクトバチルス株単独及び化膿連鎖球菌単独の肉眼による代表図（２４ウェルマイクロタイタープレートの写真）である。白色沈殿物が共凝集（及びそれに伴う沈殿）によって形成される。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【０１１３】
実施例１
本発明による微生物の特定及び選択に関して、ラクトバチルス株バンクからの様々な菌株を、４段階スクリーニングプロセスによって試験した。この４段階スクリーニングプロセスでは、初めに、標的病原微生物である化膿連鎖球菌（以後「標的微生物」とも称される）に結合する能力に関してスクリーニングし（結合アッセイ）、次に、第１の工程で特定された菌株を、マイクロタイタープレートスケールにおける共凝集アッセイにおいて試験し、各標的微生物との共凝集を、双眼実体顕微鏡を用いて定性的に測定した。本発明の意味において、「共凝集（co-aggregation）」という用語は「共凝集（coaggregation）」という用語と同義で用いられる。さらに、共凝集の強度及び標的微生物への結合の安定性、並びにフィブロネクチンとの結合防止能を調査して、最終的には、本発明により特定される例示的な微生物（ラクトバチルス）を導く。
【０１１４】
結合アッセイ
選択されたラクトバチルス株の結合活性の定量化を可能にする結合アッセイを構築し、それにより９６ウェルプレートでのラクトバチルス株の病原微生物への結合の定量的検出が可能になる。ラクトバチルス細胞の標的微生物への結合活性は共凝集活性及び／又は共凝集能に相当する。これは実験によって試験した。これに関して、図２はラクトバチルスＤＳＭ２５９７２、ＤＳＭ２５９８７、ＤＳＭ２５９８８、ＤＳＭ２５９８９及びＤＳＭ２５９７３と、化膿連鎖球菌ＡＴＣＣ１９６１５との共凝集の例を示すものである。
【０１１５】
測定方法は、本発明による株の生物膜内で結合した標的株への特異的結合に基づくものである。規定量の本発明による株を蛍光色素（ＣＦＤＡ溶液、Invitrogen）で標識し、アッセイのために生物膜に結合した規定量の標的微生物と混合した。標的株上に結合した本発明による株の持続性を、数回の洗浄後に蛍光光度計を用いて測定する。
【０１１６】
これらの試験を行うために、標的微生物である化膿連鎖球菌を標準的なプロトコルに従って培養した。この株を５％  ＣＯ２雰囲気での３７℃の好気条件下でＴＨＹ（トッドヒューウィットブロス）培地中で培養した。ラクトバチルス株をＭＲＳ培地中、３７℃で（at）嫌気的に培養した（deMan et al. （1960）"A mediumfor the cultivation of Lactobacilli," J. Appl. Bact. 23 （130-135）を参照されたい）。標的微生物の処理のために、細胞を中間（average）指数増殖期で５〜６時間培養した後、回収し、次いでＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ  ７．４）で３回洗浄し、ＰＢＳに溶解した。そのようにして、１００μＬの懸濁液を９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに入れた。５％  ＣＯ２での３７℃での１６時間のインキュベーション中に、生物膜が標的微生物によって形成される。インキュベーション後、結合していない細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ  ７．４）で３回洗浄することによって取り除いた。ラクトバチルス株の処理のために、ラクトバチルス株を２４時間の培養後に回収し、次いでＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳ中に入れ、ＣＦＤＡ溶液（Invitrogen）を添加することによって蛍光標識した。結合アッセイを行うために、１ウェル当たり１００μＬの蛍光標識したラクトバチルス懸濁液を生物膜に結合した標的株に添加した。ラクトバチルス懸濁液を添加しない対照バッチを並行して行った。インキュベータ内における３７℃での１時間のインキュベーション後、ＰＢＳで３回洗浄することで結合していない細胞を分離した。各洗浄工程後、蛍光を蛍光プレート型光度計（Ｅｍ  ４８５ｎｍ／Ｅｘ  ５３５ｎｍ）で測定した。ラクトバチルス細胞のない対照と比較した上でのラクトバチルス株を含むバッチでの蛍光（Ｅｍ  ４８５ｎｍ／Ｅｘ  ５３５ｎｍ）の増大は、生物膜に結合したラクトバチルス細胞の量に相当するものであった。ラクトバチルス細胞の結合後に測定された蛍光は結合強度に相当するものであった。この値が高ければ、標識したラクトバチルス細胞と生物膜に結合した標的株との結合がより良好であり、試験したラクトバチルス細胞の結合活性がより大きくなる。
【０１１７】
これらの実験から、結合していない細胞を取り除いた後の結合アッセイにおける標的微生物である化膿連鎖球菌に関しては、本発明によるラクトバチルス株によって、３回の洗浄後の標識したラクトバチルス細胞と、生物膜に結合した標的株との結合に起因して、最大１７倍の蛍光の増大がもたらされたことが示された。図１に、本発明による微生物の例としてのラクトバチルスＤＳＭ２５９７２、ＤＳＭ２５９８９及びＤＳＭ２５９７３と化膿連鎖球菌との結合アッセイの結果を示す。比較のため、図１には、標的微生物に特異的に結合することができない本発明によるものではないラクトバチルス株（ラクトバチルス種１及びラクトバチルス種２）に関するデータも示している。好ましい微生物は、化膿連鎖球菌と特異的に共凝集することから、ヒト及び動物での細菌感染症を防ぐことが可能であり、及び／又は細菌感染症の治療に使用されることが見出されている。このようにして、化膿連鎖球菌の上皮細胞への結合が妨げられる一方で、化膿連鎖球菌による生物膜の形成が妨げられるか、又は既に形成された生物膜を溶解若しくは崩壊させる。
【０１１８】
実施例２
共凝集アッセイ
１．０ｍＬの体積及び／又は２４ウェルプレートにおける以下の検証を用いて、選択したラクトバチルス株の共凝集活性を説明する。
【０１１９】
本方法では、ラクトバチルス及び標的株の共凝集挙動を別々に検討し、最後に、混合物中で一緒にしたラクトバチルスと標的株との共凝集を検討する。この分析は、２４ウェルプレートの写真を用いて肉眼で、及び顕微鏡を用いて行った。これらの試験を行うために、標的微生物である化膿連鎖球菌を標準的なプロトコルに従って培養した。この株を５％  ＣＯ２雰囲気での３７℃の好気条件下でＴＨＹ（トッドヒューウィットブロス）培地中で培養した。ラクトバチルス株をＭＲＳ培地中、３７℃で嫌気的に培養した（de Man et al. （1960）"A medium for the cultivation oflactobacilli," J. Appl. Bact. 23 （130-135）を参照されたい）。標的微生物の処理のために、細胞を中間指数増殖期で５〜６時間培養した後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ  ７．４）で２回洗浄し、ＯＤ６００を４に調整した。ラクトバチルス株の処理のために、ラクトバチルス株を１６時間の培養後に回収し、ＰＢＳで２回洗浄した後、ＰＢＳの体積中に入れることで、ＯＤ６００を４に調整した。共凝集アッセイを行うために、２４ウェルプレートにおいて１ウェル当たり５００μＬの一部の標的微生物懸濁液を５００μＬのラクトバチルス懸濁液と合わせた。５００μＬの標的微生物＋５００μＬのＰＢＳ、又は５００μＬの各ラクトバチルス懸濁液＋５００μＬのＰＢＳ（対照１）を含む対照バッチを並行して試験した。デスクトップ型撹拌器での２５℃での１０分のインキュベーション後、バッチを写真記録システムを用いて肉眼で観察し、さらに顕微鏡で観察した。破壊したラクトバチルス細胞の共凝集能の分析のために、初めにラクトバチルス細胞を７０℃の水浴中で３０分間の熱処理によって破壊した後、共凝集アッセイに使用した。
【０１２０】
これらの実験から、選択されたラクトバチルス株は、標的微生物である化膿連鎖球菌と共凝集し、それによってウェル内において不規則な凝縮した及び／又は粒状の領域として肉眼で視認可能な混合物の塊化（clumping）（凝集体）を観察することが可能であることが分かった。標的株及び／又は本発明によるラクトバチルス株を別々に含有するウェルでは塊化又は凝集体の形成は存在しない。ウェルにおける細胞懸濁液は均質なままである。図２に、選択されたラクトバチルス株（生きているもの及び破壊したものの両方）と標的微生物である化膿連鎖球菌との共凝集バッチにおける肉眼による結果を示す。顕微鏡による観察では、本発明によるラクトバチルス株の全てで標的微生物に対する明確な親和性が存在し、そのことから共凝集の顕微鏡による観察での異なる凝集サイズが得られた。図３に、例えば本発明によるラクトバチルス株ＤＳＭ２５９８７及びＤＳＭ２５９７３と、標的微生物である化膿連鎖球菌との共凝集バッチにおける顕微鏡による結果を示す。好ましい微生物は、とりわけ患者又は動物において化膿連鎖球菌によって引き起こされ、及び／又は化膿連鎖球菌が関与する細菌感染症を予防する又は細菌感染症に対抗することが可能である。
【０１２１】
実施例３
ヒト唾液中の共凝集
ヒトの天然唾液中の本発明によるラクトバチルス株の共凝集能を調査するために、本発明によるラクトバチルス株を実施例２に記載のように１６時間の培養後に回収し、ＰＢＳで２回洗浄して、ヒト唾液中に入れた。唾液は予め数人から回収しており、混合して、８０００×ｇで２０分間の遠心分離により粒子から分離した。標的微生物を実施例２に記載のように処理し、これもＰＢＳで２回洗浄した後、ヒト唾液中に入れた。共凝集アッセイを行うために、２４ウェルプレートにおいて５００μＬの一部の標的微生物の唾液懸濁液を１ウェル当たり５００μＬのラクトバチルス唾液懸濁液と合わせた。５００μＬの標的微生物＋５００μＬの唾液、又は５００μＬの各ラクトバチルス懸濁液＋５００μＬの唾液（対照１）を含む対照バッチを並行して試験した。デスクトップ型撹拌器での２５℃での１０分のインキュベーション後、バッチを写真記録システムを用いて肉眼で観察し、さらに顕微鏡で観察した。
【０１２２】
試験から、天然の唾液中の本発明によるラクトバチルス株が、標的微生物である化膿連鎖球菌と特異的に共凝集することが可能であることが分かった。このことは、口腔咽頭域内での本発明によるラクトバチルス株の適用の最良な前提条件を与えるものである。この好ましい微生物を、例えば糖菓として経口投与して、細菌感染症の軽減又は更には完全な治療をもたらすことができる。図４に、ヒトの天然の唾液中での本発明によるラクトバチルス株と、標的微生物である化膿連鎖球菌との共凝集の肉眼による結果を示す。
【０１２３】
実施例４
フィブロネクチンへの結合の阻止
標的病原微生物である化膿連鎖球菌（ＡＴＣＣ１９６１５）のフィブロネクチンへの結合に対する本発明によるラクトバチルス株の効果を調査するために、フィブロネクチンをコーティングした９６ウェルプレートにおける蛍光標識した標的微生物の結合の定量的検出を可能にする結合アッセイを構築した。本発明によるラクトバチルス株をＣＦＤＡで標識した標的微生物に結合開始時に直接添加し、３７℃で２時間インキュベートした。結合していない細胞を取り除き、ＰＢＳで２回洗浄した後、結合した標的微生物細胞の特異的定量化を、蛍光プレート型光度計でＥｍ  ４８５ｎｍ／Ｅｘ  ５３５ｎｍの蛍光を測定することによって行った。これらの試験を行うために、標的株と本発明によるラクトバチルス株とを標準的プロトコルに従って培養した。ラクトバチルス株の処理のために、培養後、ラクトバチルス株をＰＢＳで２回洗浄した後、ＰＢＳ中に入れた。ＰＢＳで洗浄後、ラクトバチルス株の一部を７０℃で３０分間の低温殺菌によって破壊した。標的株の処理のために、標的株を定常状態の増殖期に達するまで１６時間培養した後、回収し、ＣＦＤＡを添加することで蛍光標識して、ＯＤ６００ｎｍを３．０に調整した。結合アッセイを行うために、ラクトバチルス細胞を蛍光標識した標的微生物に結合開始時に直接添加し、３７℃で２時間微好気性条件下でインキュベートした。ラクトバチルス懸濁液を添加しない対照バッチを並行して行った。浮遊細胞を取り除き、生物膜内に見られる細胞を洗浄した後、結合した標的微生物細胞の特異的定量化を、ラクトバチルス細胞の存在下及び非存在下での蛍光測定によって行った。ラクトバチルスの非存在下での標的微生物の対照と比較した上での蛍光の低減は、標的微生物である化膿連鎖球菌と、フィブロネクチンをコーティングしたマイクロタイタープレートとの結合の強度に相関するものであった。この低減は生物膜形成の阻害率で表される。図５に、フィブロネクチンへの結合、すなわち化膿連鎖球菌ＡＴＣＣ１９６１５の阻害におけるラクトバチルス株ＤＳＭ２５９７２、ＤＳＭ２５９８７、ＤＳＭ２５９８８、ＤＳＭ２５９８９及びＤＳＭ２５９７３（これらの株は本発明による微生物の例として試験された）で得られた結果を示す。実験から、これによって、生きている及び破壊された両方の形態の上記で挙げられた本発明によるラクトバチルス株に起因して標的微生物のフィブロネクチンへの結合の阻害がもたらされることが分かっている。そのためこのことによって、本発明によるラクトバチルス株が化膿連鎖球菌の宿主細胞への結合を防ぐことが可能であることが示される。さらに、同じ属及び種の更なる微生物による実験を行うことで、本発明によるラクトバチルス株の結合特性及び／又は凝集特性の特異性と、同じ属及び種の標的微生物に応じたフィブロネクチンへの結合を防ぐ能力とが示される。この目的のためにそれらの中で化膿連鎖球菌ＡＴＣＣ１２３４４が選択された。標的微生物である化膿連鎖球菌ＡＴＣＣ１２３４４のフィブロネクチンへの結合に対する効果を調査するために、本発明によるラクトバチルス株と標的微生物とを上記の標準的条件下で培養した後、処理し、アッセイに使用した。
【０１２４】
試験から、同じ種及び属の他の微生物も、本発明によるラクトバチルス株によって凝集することができ、さらに本発明によるラクトバチルス株は他の標的微生物がフィブロネクチンに結合するのを防ぐことが分かっている。図６に、本発明による微生物の例としてのラクトバチルス株ＤＳＭ２５９７２、ＤＳＭ２５９８７、ＤＳＭ２５９８８、ＤＳＭ２５９８９及びＤＳＭ２５９７３による化膿連鎖球菌（ＡＴＣＣ１２３４４株）のフィブロネクチンへの結合の阻止の結果を示す。好ましい微生物のヒト又は動物への投与を用いることで、細菌感染症を予防又は治療することができ、化膿連鎖球菌と同じ属及び種の更なる微生物も感染症に関与し得ることは全くもって驚くべきことであった。
【０１２５】
実施例５
ストレプトコッカス・サリバリウスの共凝集
共凝集アッセイにおいて本発明によるラクトバチルス株と、ストレプトコッカス・サリバリウスとを標準的な条件に従って培養し、ＰＢＳで３回洗浄し、ヒト唾液中で使用した。結果によって、ストレプトコッカス・サリバリウスは本発明によるラクトバチルス株によっては共凝集しないことが示唆される（図７）。このため、ここでは例としてストレプトコッカス・サリバリウスが挙げられる片利共生株は、ラクトバチルス株によっては共凝集せず、自然環境から取り除かれる可能性を排除することができる。これによって、とりわけ好ましい乳酸菌が細菌感染症に対して特異的な作用を有することが示唆される。
【０１２６】
参考文献
（S.＝頁；und＝及び；Hrsg.＝編；Kapitel＝章）
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【図１】
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【図５】
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【図６】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図７】
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