(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも2つのα-1→4結合D-グルコース単位をその非還元末端に含む多糖基質および/またはオリゴ糖基質を、(α1→4)グルコシド結合を切断し、新しい(α1→4)グルコシド結合および(α1→6)グルコシド結合を形成することができるα-グルカノトランスフェラーゼ酵素と接触させるステップを含む、２以上の連続する(α1→6)グルコシド結合および２以上の連続する(α1→4)グルコシド結合を有するグルコオリゴ糖の混合物を生成する方法であって、
前記α-グルカノトランスフェラーゼが、ラクトバチルス・ロイテリ121由来のGTFB、ラクトバチルス・ロイテリDSM 20016A由来のGTFDSM、および少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を示し、(α1→4)グルコシド結合を切断し、新しい(α1→4)結合および(α1→6)結合を形成する活性を有するそれらのホモログからなる群から選択される、方法。
【請求項２】
前記ホモログが、その番号付けがラクトバチルス・ロイテリ121のGTFB内の位置に相当する、Arg1013、Asp1015、Ala1017、Asn1019、Glu1053、Gly1054、Tyr1055、His1124、Asp1125、Gln1126、Arg1127、Lys1128、Asp1479、Ile1480、Met1482、Asn1483、及びGln1484から選択される保存アミノ酸残基の1つまたは複数を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ホモログが、その番号付けがラクトバチルス・ロイテリ121のGTFB内の位置に相当する、以下の保存領域配列の少なくとも１つを含む、請求項１又は２に記載の方法：
保存領域II：F1009DGFRVDAADNIDADVLDQ1027
保存領域III：H1048L(S/V)YNEGYHSGAA1060
保存領域IV：W1118SFVTNHDQRKN(L/V)I1131
保存領域I：G1473LKVQED(I/L)VMNQ1484。
【請求項４】
前記α-グルカノトランスフェラーゼが、(α1→6)分枝点、(α1→2)結合、および(α1→3)結合のいずれも導入しない、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記基質が、少なくとも4の重合度を有する、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記基質が、デンプン、ワキシースターチ、ハイアミロースデンプン、それらの誘導体、マルトオリゴ糖、アミロース、アミロペクチン、マルトデキストリン、(α1→4)グルカン、ロイテラン、またはそれらの組合せからなる群から選択される、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記デンプン、ワキシースターチ、ハイアミロースデンプン、またはデンプン誘導体が、ジャガイモ、トウモロコシ、タピオカ、エンドウマメ、リョクトウ、米、または小麦に由来する、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
前記デンプン誘導体が、デンプン、ワキシースターチ、またはハイアミロースデンプンをアミロマルターゼ/4-α-グルカノトランスフェラーゼまたはグリコーゲン分枝酵素で処理することによって生成される、請求項6または7に記載の方法。
【請求項９】
２以上の連続する(α1→6)グルコシド結合および２以上の連続する(α1→4)グルコシド結合を有する少なくとも1つのグルコオリゴ糖を、前記混合物から単離するステップをさらに含む、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
AとBとの間の結合が(α1→6)グルコシド結合であり、Aが2つ以上の連続する(α1→6)グルコシド結合を含み、Bが少なくとも2つの連続する(α1→4)結合グルコース残基を含む、一般式A-Bの直鎖状のグルコオリゴ糖もしくはグルコオリゴ糖部分、または一般式A-Bの異なる直鎖状のグルコオリゴ糖もしくはグルコオリゴ糖部分を含む混合物。
【請求項１１】
Aが、２以上の連続する(α1→4)グルコシド結合を含み、Aが、少なくとも4つのグルコース残基の重合度を有するマルトオリゴ糖を含む、請求項10に記載のグルコオリゴ糖またはグルコオリゴ糖混合物。
【請求項１２】
請求項10または11に記載のグルコオリゴ糖またはグルコオリゴ糖混合物を含む栄養組成物または化粧品組成物。
【請求項１３】
栄養添加物または化粧品添加物としての、請求項10または11に記載のグルコオリゴ糖またはグルコオリゴ糖混合物の使用。
【請求項１４】
請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法における、酵素の使用であって、
該酵素が、ラクトバチルス・ロイテリ121由来のGTFB、ラクトバチルス・ロイテリDSM 20016A由来のGTFDSM、および少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を示し、(α1→4)グルコシド結合を切断し、新しい(α1→4)結合および(α1→6)結合を形成する活性を有するそれらのホモログからなる群から選択される、使用。
【請求項１５】
乳製品、乳児または乳幼児用の調合乳、ベーカリー製品、菓子製品、シリアルバー、キャンディーバー、パスタ製品、ヌードル製品、液体飲料、スポーツ飲料、飲み物、およびアイスクリームからなる群から選択される、請求項12に記載の栄養組成物または化粧品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多糖およびオリゴ糖、ならびにそれらの栄養学的効果の分野に関する。特に、本発明は、プレバイオティック(prebiotic)オリゴ糖を含む食物繊維を調製する方法におけるα-グルカノトランスフェラーゼの適用に関し、その方法によって得ることができる新規のオリゴ糖に関する。
【背景技術】
【０００２】
用語「食物繊維」は、食物の植物細胞壁成分について記述するために、Hipsleyによって1953年に最初に使用された。今日、繊維に関し多くの定義が使用されているが、まだ、広く一般に認められた定義はない。一般に、繊維は、非消化性成分を有する炭水化物源に由来する。繊維は、2つのカテゴリーに通常は分類される。小麦ふすま、難消化性デンプン、ヘミセルロース、リグニン等の不溶性繊維、および可溶性繊維である。可溶性繊維は2つの下位区分にさらに分類される。すなわち、ポリデキストロース、イヌリン、およびオリゴ糖を含む短鎖長可溶性繊維、ならびにペクチン、ゴム(グアー、イナゴマメ、カラゲナン、キサンタン)およびβ-グルカン(例えば、カラスムギまたは大麦由来の)を含む長鎖長可溶性繊維である。
【０００３】
プレバイオティックは、ヒト酵素によって消化されないが、大腸の細菌叢によって発酵するので、食物繊維である。したがって、プレバイオティックは、バイオマスおよび排便の回数を増やし、それにより、便秘および大腸粘膜の健康に正の効果がある。プレバイオティック炭水化物は、天然に存在し、アスパラガス、チコリ、トマト、および小麦、ならびに母乳の天然成分を含む、多数の食物に見出すことができる。
【０００４】
プレバイオティックという用語は、GibsonおよびRoberfroidによって1995年に最初に定義された。しかし、最初の定義は、確認するのが困難であると判明し、それ以来、著者らはその概念をさらに発展させて、新しい定義「プレバイオティックとは、宿主の健全性および健康に便益を与える、胃腸内微生物叢の組成および/または活性の両方における特定の変化を可能にする、選択的に発酵した成分である」(Nutr Res Rev 2004; 17: 259〜275)を提案している。したがって、プレバイオティックと分類されるのに適格とされるには、成分は、(i)消化(胃液酸度、哺乳類酵素による加水分解、および胃腸吸収)に抵抗性であること、(ii)胃腸内微生物叢によって発酵すること、および(iii)健康および健全性と関連した腸内細菌の増殖および/または活性を選択的に刺激することが要求される。後者の基準は、食物繊維とプレバイオティックとを識別する主な特徴である。プレバイオティックは、結腸内微生物叢を変化させる能力があると一般には認識されており、糖分解性(炭水化物を発酵させること)の微生物を優勢にし、一方腐敗性(タンパク質を発酵させること)の微生物を減少させることによって、より健康的な組成および/または活性になるように促進する。
【０００５】
プレバイオティック基準を満たす確立された非消化性炭水化物としては、フラクトオリゴ糖(FOS)、ガラクトオリゴ糖(GOS)、ラクツロース、イヌリン、およびポリデキストロースが挙げられる。
【０００６】
ポリデキストロースは、すべてのタイプのグリコシド結合を有する、ランダムに架橋されたグルコース単位からなる多糖である。ライテス(Litesse)ポリデキストロースは、グリコシド結合のユニークな配列により消化に抵抗性である。分子的に見ると、(α1→6)結合が優勢であるが、ポリマーの約13%は、ヒト小腸内の酵素によって加水分解され得る(α1→4)結合を有している。ライテスポリデキストロースは、結腸全体にわたって発酵し、遠位結腸中のプレバイオティック効果を媒介する上で特に効率が良い。ヒト介入研究により、ライテスポリデキストロースがビフィズス菌および乳酸桿菌の両方を用量依存的に強化することが実証されてきた。
【０００７】
デンプンは、エネルギー貯蔵手段して、緑色植物(クロロフィルを含有する植物)中に共通して見出される多糖である。デンプンは、数十億の食物成分市場の不可欠な部分を形成し、その複雑で強固な性質を特徴とする。デンプンは、幅広い工業的応用を有する不可欠な商品の理想的な例であり、この工業的応用には、紙およびボール紙の製造、発酵、バイオ燃料、生分解性のプラスチックおよび洗剤、バイオ農薬、界面活性剤、ポリウレタン、樹脂製品、結合剤、および溶剤が含まれる。しかし、デンプンおよびその誘導体に最大の市場を提供するのは食品産業である。
【０００８】
デンプンは、小腸内でグルコースへ完全に分解され血中に取り込まれるか、または消化を逃れた部分が大腸内に行き着き結腸内微生物叢の一般的な基質として働くかのいずれかである。デンプンおよびその誘導体それ自体は、特定の有益な結腸微生物叢を刺激しない。したがって、デンプンそれ自体は、プレバイオティック化合物ではない。この問題の部分的な解決策は、デンプンを二糖類であるマルトースへ分解し、次いでマルトースを、トランスグルコシダーゼ酵素を使用して2〜4の重合度を有する(α1→6)結合イソマルトオリゴ糖(IMO)に変換することである。しかし、これらのIMO生成物は、短すぎて小腸内で大半が分解されるため、結腸に到達しない。IMO生成物の結腸に到達する部分は、結腸の近位部において腸内微生物叢によって迅速に分解され、より有害なタンパク質分解細菌が存在する遠位部には到達しない。有益な細菌種、特にビフィズス菌を刺激することによって、これらの有害細菌を駆逐するためには、より長いイソマルトオリゴ糖が必要である。
【０００９】
これまでに、マルトオリゴ糖(MOS)およびデンプン(アミロース、アミロペクチン)の化学的修飾のために様々な方法が開発されてきた。最近になって、さらに様々なトランスグリコシラーゼ酵素(シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ、アミロマルターゼ、デンプン分枝酵素)がデンプン(アミロース、アミロペクチン)の修飾に使用されてきた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Nutr Res Rev 2004; 17: 259〜275
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、機能特性を変化させ、栄養学的価値を高めるために、デンプン、デンプン誘導体、および/または様々な鎖長のMOSの(酵素的)修飾のためのさらなる手段および方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
驚くべきことに、グリコシドヒドロラーゼファミリーGH70[http://www.cazy.org]のメンバーであり、GTFBタイプのグルカンスクラーゼであるα-グルカノトランスフェラーゼを使用することによって、これらの目的が満たされ得ることを見出した。グルカンスクラーゼ酵素はスクロースをα-グルカンの多糖およびオリゴ糖へ変換することを触媒するが、GTFBはスクロースと全く反応しないことが以前報告された(Kralj 2004)。GTFBが、(α1→4)結合グルコース残基を含む、マルトオリゴ糖(MOS)などのグルコオリゴ糖に対して高活性を示すことを本明細書において開示する。GTFBは、不均化タイプの反応を触媒し、1つの基質分子を短くし、別の基質分子を延長する。両方の生成物は、次の反応で再び基質になることができる。したがって、GTFB活性は、少なくともDP35までの一連の直鎖状グルコオリゴ糖を生じさせることができる。生成物の構造分析によって、GTFBが(α1→4)グルコシド結合を切断し、新しい(α1→4)結合および(α1→6)結合を形成することが明らかとなった。これは、この反応特異性および生成物特異性を有する酵素の最初の例である。したがって、この酵素を、(1→4)-α-D-グルカン:(1→4)(1→6)-α-D-グルカンα-D-グルカノトランスフェラーゼ、または、別名として、α-グルカノトランスフェラーゼと命名した。グルカンスクラーゼ酵素もMOSを使用するが、ドナー基質としてのスクロースの存在下でアクセプター基質としてのみ使用する。このことにより、例えば、デキストランスクラーゼの場合には、(α1→6)結合を介して結合した一連のグルコース単位で延長されたマルトースなどの様々なオリゴ糖の合成が起こる。しかし、グルカンスクラーゼの場合には、MOS基質中の(α1→4)結合は切断されず、MOSは単にアクセプター基質として使用される。この点が、スクロースに作用せず、その代わりにドナー基質およびアクセプター基質としてMOSを使用し、その(α1→4)結合を切断し、不均化タイプの反応を介して新しい(α1→6)結合および(α1→4)結合を導入するGFTB酵素との主な相違である。GTFBがデンプンまたはデンプン誘導体から合成することができる生成物は比較的長いイソマルトオリゴ糖(IMO)側鎖、特に、4以上の重合度を有するIMO側鎖を含有する。IMO-マルトデキストリン(IMO-MALT)の一部は、小腸内で分解されるが、その部分は未修飾デンプン/誘導体が摂取された場合に分解されることになる部分より少ない。この理由は、アミラーゼが作用するためには一定の長さの直鎖状(α1→4)結合グルコース残基が必要となるため、IMO部分に近接するマルトデキストリンのその部分が、腸内アミラーゼによって分解されることはないからである。したがって、IMO-MALTは、未修飾マルトデキストリンから生じるより少ないグルコースを小腸内で生成する、部分的に難消化性のデンプン誘導体とみなすことができる。このことは、有益であると考えられ、健康的なライフスタイルに寄与する(迅速に分解可能なデンプン/誘導体の過剰摂取と関連した肥満、II型糖尿病、心疾患および冠疾患を発症するリスクを軽減する)。未修飾の状態で結腸へと通過したIMO-MALT部分は、残りの微生物叢によってさらに分解されることになる。(α1→6)結合を含有するIMO-MALTのIMO部分は、有益なビフィズス菌に特異的な基質として作用し、IMO-MALTをプレバイオティック成分にすることができる。したが���て、IMO-MALTには少なくとも次の便益がある。
1.部分的に難消化性のマルトデキストリン/デンプンであり、グルコースの生成が少なく、それにより肥満およびII型糖尿病の予防に寄与する。
2.有益な腸内ビフィズス菌を刺激するプレバイオティック効果を有し、それにより腸の健康を促進する。
【００１３】
第1の実施形態では、本発明は、少なくとも2つの(α1→4)結合D-グルコース単位をその非還元末端に含む多糖基質および/またはオリゴ糖基質を、(α1→4)グルコシド結合を切断し、新しい(α1→4)グルコシド結合および(α1→6)グルコシド結合を形成することができるα-グルカノトランスフェラーゼ酵素と接触させるステップを含む、1つまたは複数の(α1→6)グルコシド結合および1つまたは複数の(α1→4)グルコシド結合を有するグルコオリゴ糖の混合物を生成する方法に関する。その代わりにまたはそれに加えて、α-グルカノトランスフェラーゼは、マルトシル単位、マルトトリオシル単位、またはマルトテトラオシル単位を、新しい(α1→6)グルコシド結合を介して基質に転移させることができる。
【００１４】
グルコオリゴ糖生成物が直鎖状であること、または小腸内での酵素の攻撃に対して抵抗性にする、主として(α1→4)グルコシド結合および(α1→6)グルコシド結合からなる直鎖状の一続き/部分を含有することは、特に食物繊維としての用途にとって有利である。したがって、α-グルカノトランスフェラーゼは、(α1→6)分枝点、(α1→2)結合、および(α1→3)結合のいずれも導入しないことが好ましい。
【００１５】
特定の態様では、α-グルカノトランスフェラーゼ(GTFB)は、グルカンスクラーゼのGH70ファミリーの新メンバーであるか[http://www.cazy.org]、または上述のような特定の酵素活性および基質選択性を有するその機能的ホモログである。例えば、この酵素は、Table 2(表2)に示す酵素から、またはラクトバチルス・ロイテリ(Lactobacillus reuteri)121由来のGTFB、ラクトバチルス・ロイテリTMW 1.106由来のGTF106B、ラクトバチルス・ロイテリML1由来のGTML4およびラクトバチルス・ロイテリDSM 20016A由来のGTFDSM、ラクトバチルス・ファーメンタム(Lactobacillus fermentum)ATCC 14931由来のGTFからなる群から選択される。これらの酵素はすべて、タンパク質レベルおよび核酸レベルの両方で当技術分野において公知である。受託番号については、本明細書の下記の図2およびTable 2(表2)を特に参照されたい。もちろん、熱安定性、基質特異性、酵素活性などに関して望ましい特性を示す遺伝子改変変異体を含む、これら既知配列の自然または人工のホモログ(突然変異体)も使用することができる。一実施形態では、Table 2(表2)に載せたGTFB(様)酵素からのGTFB、または、好ましくは、ラクトバチルス・ロイテリ121(AAU08014)、ラクトバチルス・ロイテリTMW 1.106(ABP88725)由来のGTF106B、ラクトバチルス・ロイテリML1(AAU08003)由来のGTML4、ラクトバチルス・ロイテリDSM 20016A(ABQ83597)由来のGTFDSM、もしくはラクトバチルス・ファーメンタムATCC 14931(ZP_03945763)由来のGTFとのアミノ酸レベルでの配列同一性が少なくとも55%、好ましくは少なくとも60%、75%、例えば少なくとも80%、85%、または少なくとも90%であるGTFBホモログを使用する。例えば、ラクトバチルス・ロイテリ121由来のGTFBとのアミノ酸レベルでの配列同一性が少なくとも55%、好ましくは少なくとも60%、75%、例えば少なくとも80%、85%、または少なくとも90%であるGTFBホモログを使用する。
【００１６】
この酵素は、GTFBの触媒コアとのアミノ酸レベルでの配列同一性が少なくとも45%、より好ましくは少なくとも50%、または少なくとも60%であることが好ましい。この触媒コアは、L.ロイテリ121のGFTBのタンパク質配列:GenBank受託番号AAU08014(タンパク質コード)に見出される、連続したアミノ酸配列W790YRP....IVMNQ1484によって示される。
【００１７】
GTFBホモログは、その番号付けがラクトバチルス・ロイテリ121のGTFB内の位置:Arg1013;Asp1015;Ala1017;Asn1019;Glu1053,Gly1054,Tyr1055,His1124,Asp1125,Gln1126,Arg1127,Lys1128,Asp1479;Ile1480,Met1482,Asn1483,Gln1484に相当する、保存アミノ酸残基の1つまたは複数を含むことが好ましい。少なくとも触媒残基Asp1015、Glu1053およびAsp1125が存在することが好ましい。これらの残基のすべてが存在することがより好ましい。
【００１８】
4つの保存領域が、GTF酵素の触媒ドメイン内に同定されてきた。これまでのタンパク質工学研究により、保存配列領域IIIおよびIV(配列アライメントについて図1を参照されたい)に位置するアミノ酸残基が、形成されるグリコシド結合タイプに関する、GTF酵素の生成物特異性を制御することが実証されてきた(Hellmuthら  Biochemistry (2008); Kraljら(2005) Biochemistry 44、9206〜9216; Kraljら(2006) FEBS J. 273、3735〜3742)。さらに、領域Iおよび領域IIも、酵素活性および反応特異性に寄与するアミノ酸残基を含有する[Kraljら(2005);Swistowskaら(2007) FEBS Lett. 581、4036〜4042]。特定の態様では、この酵素は、その番号付けがGTFB内のアミノ酸位置に相当する次の共通配列(図1を参照されたい)の少なくとも1つを含む。
A)(保存領域II):F1009DGFRVDAADNIDADVLDQ1027
B)(保存領域III):H1048L(S/V)YNEGYHSGAA1060
C)(保存領域IV):W1118SFVTNHDQRKN(L/V)I1131
D)(保存領域I):G1473LKVQED(I/L)VMNQ1484
【００１９】
一実施形態では、この酵素は、本発明の方法を実施するために必要なユニークな「GTFB様」基質特異性および活性を得るために遺伝子改変された、グルカンスクラーゼ群からのGTFAメンバー、例えば、ラクトバチルス・ロイテリ121由来のGTFA(GenBank受託番号AX306822またはAY697435(GTF配列+フランキング配列a.o.GTFB+トランスポサーゼ)である。したがって、本発明はまた、Table 1(表1)の変異の少なくとも1つを含む、gtfAタイプのグルカンスクラーゼ酵素に属する遺伝子改変酵素に関し、前記酵素は、(α1→4)グルコシド結合を切断し、新しい(α1→4)グルコシド結合および(α1→6)グルコシド結合を形成することができ、(α1→4)結合D-グルコース単位を含む多糖基質および/またはオリゴ糖基質、特にマルトオリゴ糖に対する基質選択性を有する。Table 1(表1)に記載のものと等価な変異を他の生物からのGTFA酵素ホモログに導入することができることは、当業者ならば理解されよう。例えば、ラクトバチルス・ロイテリ180由来のGTF180、ラクトバチルス・ロイテリML1由来のGTFML1、ロイコノストック・メセンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)B512-F由来のDSRS、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)GS-5由来のGTFD(van Hijumら  2006も参照されたい)。Table 1(表1)から選択される多重変異が導入されることが好ましい。特定の実施形態では、Table 1(表1)に示す位置すべてを改変する。
【００２０】
Table 1(表1):GTFA様(グルカンスクラーゼ)酵素にGTFB様(α-グルカノトランスフェラーゼ)活性を導入するための変異
【００２１】
【表１】
0005916602.tif 000002
【００２２】
さらに、デンプン誘導体、好ましくは(部分的に)不消化性のデンプン誘導体を生成する方法における、(α1→4)グルコシド結合を切断し、新しい(α1→4)グルコシド結合および(α1→6)グルコシド結合を形成することができ、かつ/またはマルトシル、マルトトリオシル、もしくはマルトテトラオシル単位を転移させて、新しい(α1→6)グルコシド結合を形成することができる酵素の使用を提供する。一実施形態では、この酵素は、例えば、Table 2(表2)から選択される、あるいはラクトバチルス・ロイテリ121由来のGTFB、ラクトバチルス・ロイテリTMW 1.106由来のGTF106B、ラクトバチルス・ロイテリML1由来のGTML4、ラクトバチルス・ロイテリDSM 20016A由来のGTFDSM、もしくはラクトバチルス・ファーメンタムATCC 14931由来のGTF、または自然もしくは人工のそれらのホモログ(突然変異体)からなる群から選択される、GTFBタイプのグルカンスクラーゼである。この酵素がラクトバチルス・ロイテリ121由来のGTFBであることが好ましい。
【００２３】
当業者ならば、ルーチン実験によって本明細書において提供される方法を実施するのに適切な工程条件、例えば温度、インキュベーション時間、pH、酵素量などを決定することができよう。pH範囲4〜5、好ましくは4〜4.5を使用することができる。一実施形態では、少なくとも30℃、好ましくは37℃の温度を使用する。別の実施形態では、例えば、基質特性および/または無菌性を考慮して、酵素が十分に熱に安定であれば、少なくとも70℃のような高温で実施することが望ましい場合もある。反応混合物の乾燥物質含量は変えることができる。一実施形態では、乾燥物質含量は少なくとも10%、好ましくは少なくとも25%である。
【００２４】
様々なオリゴ糖基質もしくはグルカン基質または基質混合物は、非還元末端に(α1→4)結合グルコース残基が含有される多糖またはオリゴ糖を含むかぎり、本発明による方法で使用することができる。前記非還元末端が3つ以上の連続する(α1→4)結合グルコース残基を含有することが好ましい。直鎖状基質が好ましい。したがって、さらに、その非還元末端に少なくとも2つの(α1→4)結合D-グルコース単位を含む、直鎖状の多糖基質および/またはオリゴ糖基質を、(α1→4)グルコシド結合を切断し、新しい(α1→4)グルコシド結合および(α1→6)グルコシド結合を形成することができるα-グルカノトランスフェラーゼ酵素と、例えばインキュベートすることによって接触させるステップを含む、1つまたは複数の(α1→6)グルコシド結合および1つまたは複数の(α1→4)グルコシド結合を有する直鎖状グルコオリゴ糖の混合物を生成する方法を提供する。
【００２５】
基質が、少なくとも4、好ましくは少なくとも5、より好ましくは少なくとも6の重合度を有する場合に、極めて良好な結果が観察される。基質は、例えば、天然デンプン、加工デンプン、デンプン誘導体、マルトオリゴ糖、アミロース、アミロペクチン、マルトデキストリン、(α1→4)グルカン、ロイテラン(reuteran)、またはそれらの組合せからなる群から選択される。本明細書において使用する用語「デンプン誘導体」は、物理的および/または(生)化学的手段によってなされた、1つまたは複数の修飾を受けた天然デンプンの生成物を指す。修飾には解重合、架橋、および置換が含まれる。デンプンまたはデンプン誘導体は、ジャガイモ、トウモロコシ、タピオカ、または小麦を含む様々な植物供給源に由来することができる。別の原料の中には、米、キャッサバ、クズウコン、リョクトウ、エンドウマメ、大麦、カラスムギ、ソバ、バナナ、モロコシ、およびレンズマメが含まれる。ジャガイモ、トウモロコシ、タピオカ、または小麦由来のデンプン(誘導体)が好ましい。
【００２６】
特定の態様では、本発明の方法はアミロマルターゼ(AMase)処理のデンプン(ATS)、好ましくはジャガイモデンプンを基質として使用する。ATSは、商品名Etenia(商標)でAVEBE(Veendam The Netherlands)から購入可能である。さらに特定の実施形態は、ロイテランスクラーゼ活性のα-グルカン生成物であり、(α1→4)結合および(α1→6)結合を含むロイテランを基質として使用する。さらに、ロイテランおよびマルトオリゴ糖(MOS)の混合物では、極めて良好な結果が得られる。さらに、デンプン、デンプン誘導体、マルトデキストリン、またはマルトオリゴ糖と、α-アミラーゼ、β-アミラーゼ、α-グルコシダーゼ、またはマルトース生成アミラーゼなど、α,1-4-O-グリコシド結合を分解する加水分解酵素を有するGTFB関連酵素またはGTFB関連酵素とのインキュベーションによって得ることができる生成物の処理を提供する。これによって、遅い消化性または非消化性のオリゴ糖/繊維が提供される。
【００２７】
本明細書において下記に例示されるように、典型的には、上記の本発明の方法により、1つまたは複数の連続する(α1→6)グルコシド結合および1つまたは複数、好ましくは2つ以上の連続する(α1→4)グルコシド結合を有する様々な直鎖状グルコオリゴ糖の混合物が得られる。多くの産業上の(例えば、栄養学的)適用のために、この混合物は本質的にそのまま使用することができ、さらに精製する必要はない。しかし、所望の場合には、混合物から1つまたは複数の個々のグルコオリゴ糖を単離すること、または取り出すことがもちろん可能である。この目的のために、当技術分野で公知の様々な方法、例えば、沈殿分別またはクロマトグラフィー技術を使用することができる。一実施形態では、本発明の方法は、サイズ排除クロマトグラフィーおよび/または陰イオン交換クロマトグラフィーに混合物を供するステップと、1つまたは複数の(α1→6)グルコシド結合および1つまたは複数の、好ましくは2以上の(α1→4)グルコシド結合を有する少なくとも1つのグルコオリゴ糖を単離するステップとを含む。
【００２８】
上述のように、本明細書に開示の酵素活性はユニークな構造を有するオリゴ糖を生じさせることができる。部分Aと部分Bとの間の結合が(α1→6)グルコシド結合であり、Bが少なくとも2つ、好ましくは少なくとも3つの連続する(α1→4)結合グルコース残基を含む、一般式A-Bの直鎖状(すなわち、非分枝)グルコオリゴ糖、そのような直鎖状部分を含むグルカン、または一般式A-Bの様々なグルコオリゴ糖/部分を含む混合物を提供する。(α1→6)グルコシド結合および(α1→4)グルコシド結合のみが存在することが好ましい。一般式A-Bの直鎖状部分は、いずれのタイプのグルカン(分枝していても、分枝していなくても)、例えばワキシーアミロペクチン(waxy amylopectin)にも結合させることができる。
【００２９】
一実施形態では、一般式A-Bの直鎖状(すなわち、非分枝)グルコオリゴ糖または一般式A-Bの異なるグルコオリゴ糖を含む混合物は、(i)部分Aと部分Bとの間の結合が(α1→6)グルコシド結合であり、(ii)部分Aが、2つ以上の連続する(α1→6)グルコシド結合を含み、好ましくは、Aが、少なくとも4つのグルコース残基の重合度を有するイソマルトオリゴ糖を含み、(iii)Bが少なくとも2つ、好ましくは少なくとも3つの連続する(α1→4)結合グルコース残基を含むことを特徴とする。例えば、A部分は一連の連続する(α1→6)結合グルコース残基からなり、B部分は一連の連続する(α1→4)結合グルコース残基からなる。
【００３０】
別の実施形態では、A部分は1つまたは複数の連続する(α1→4)グルコシド結合を含み、好ましくはAは、少なくとも4つの(α1→4)結合グルコース残基を有するマルトオリゴ糖を含む。したがって、一続きの(α1→4)結合残基は、(α1→6)結合を介して別の一続きの(α1→4)結合残基に結合させることができる。
【００３１】
様々な鎖長のオリゴ糖が提供される。一実施形態では、グルコオリゴ糖(部分)は、少なくとも7(DP≧7)、好ましくは少なくとも10(DP≧10)、より好ましくは少なくとも15、最大約50までの重合度(DP)を有する。最大30超の残基の長さを有するオリゴ糖が、MALDI-TOF-MS分析によって観察されている。通常は、混合物中のDP10〜DP35の高分子量生成物の相対量は、DP<10の生成物の量より少ない。典型的な混合物は、少なくとも5、好ましくは少なくとも6、例えば6〜15などの平均重合度を有する。
【００３２】
基質としてマルトオリゴ糖(例えば、DP7またはDP6)を使用する場合、一連の直鎖状グルコオリゴ糖が生成され、多くの場合、所与のDPの様々な構造が観察される。例えば、各構造が(α1→6)グルコシド結合および(α1→4)グルコシド結合の数に関して異なる、少なくとも4つのDP8構造が同定された。図6も参照されたい。概して言えば、(α1→4)グルコシド結合に対する(α1→6)グルコシド結合の比および構造多様性は、鎖長の増加と共に増加する。
【００３３】
一態様では、結合の少なくとも20%、好ましくは少なくとも25%は(α1→6)である。(α1→6)グルコシド結合と(α1→4)グルコシド結合の比は、通常、20:80から90:10の間の範囲にある。例えば、2つの連続する(α1→6)結合および4つの連続する(α1→4)結合を有する直鎖状DP7生成物;2つの連続する(α1→6)結合および5つの連続する(α1→4)結合を有する直鎖状DP8生成物;または3つの連続する(α1→6)結合および4つの連続する(α1→4)結合を有するDP8;5つの連続する(α1→6)結合および3つの連続する(α1→4)結合を有するDP9;4つの連続する(α1→6)結合および4つの連続する(α1→4)結合を有するDP9;5つの連続する(α1→6)結合および4つの連続する(α1→4)結合を有するDP10が提供される(図6を参照されたい)。
【００３４】
プレバイオティック繊維およびエネルギー源を消費者に提供する栄養学的成分としての適用のためには、オリゴ糖(混合物)は相当な量の(α1→6)グルコシド結合および(α1→4)グルコシド結合の両方を含むことが好ましい。したがって、一実施形態では、(α1→6)グルコシド結合と(α1→4)グルコシド結合の比は、30:70から70:30の間である。
【００３５】
本発明によるグルコオリゴ糖またはグルコオリゴ糖混合物は、特に栄養組成物および食物組成物において重要な産業的適用を有している。本発明によるグルコオリゴ糖またはグルコオリゴ糖(混合物)を含む(ヒトまたは動物の)食物製品が提供される。食物製品は、固形物、半固形、または液体の食物製品でもよい。食物製品は従来の栄養製品またはダイエット製品でもよい。食物製品は、インスタント食品でもよく、またはベイクオフ(bake-off)パン製品のように、摂取前にさらに処理することが必要な食物製品でもよい。典型的な製品としては、乳製品、乳児または乳幼児用の調合乳、ベーカリー製品、パスタ製品、ヌードル製品、菓子製品、液体飲料、スポーツ飲料、飲み物、およびアイスクリームが挙げられる。
【００３６】
さらなる実施形態は、本発明によるグルコオリゴ糖またはグルコオリゴ糖混合物の、食品添加物としての、例えばプレバイオティック繊維としての使用に関する。プレバイオティックは、乳製品からベーカリー、菓子、および飲み物の用途まで多数の食物に適用して使用することができる。プレバイオティックは、その化学的および物理的構造のため、高度に可溶である傾向があり、ボディー(body)、テキスチャー(texture)、および口腔感覚(mouth feel)を改善することが可能である。
【００３７】
別の有用な適用は、唾液アミラーゼおよび膵アミラーゼなどのα-アミラーゼタイプの酵素の阻害に関する。これらの酵素は、4〜6の範囲のDPを有する(α1→4)マルトオリゴ糖鎖に通常作用する。本発明のオリゴ糖中の(非加水分解性の)(α1→6)結合の存在により、酵素結合が起こるだけで、グルコースは放出されないと仮定される。このようなオリゴ糖の添加は、代謝(例えばデンプン代謝)の速度を低下させ、それによって食物製品のグリセミック指数(glycaemic index)(GI)を低下させる。したがって、本発明によるグルコオリゴ糖(混合物)は、食物製品のカロリー値および/またはグリセミック負荷(glyceamic load)を低下させるのに役立つこともできる。このようにして、グルコオリゴ糖(混合物)は、低GI食に寄与する。このことは、真性糖尿病および肥満を含む特定の代謝疾患においても、全般的なヒトの健康にとって特に興味深い。
【００３８】
さらなる実施形態では、グルコオリゴ糖(混合物)が、治療用途または化粧品用途において、特に正常な皮膚細菌叢を制御し、健康な皮膚を増進させるために使用できることが見出される。オリゴ糖は、好ましくは雑菌によって選択的に利用され得るという点でプロバイオティック(probiotic)効果をもたらすことができる。例えば、オリゴ糖は、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)およびコリネバクテリウム・ゼローシス(Corynebacterium xerosis)などのあまり望ましくない細菌の増殖と比較して、有益な皮膚細菌(例えばミクロコッカス・クリスチネ(Micrococcus kristinae)の増殖を促進することができる。本発明によるグルコオリゴ糖またはグルコオリゴ糖混合物、および適切な担体を含む化粧品組成物が提供される。さらに、パーソナルケアアイテムの中にグルコオリゴ糖(混合物)を使用することも可能であり、例えば、吸収性用品を着用している時に生じる臭いおよび皮膚炎(発疹)を軽減させることができる、使い捨ておむつ、生理用ナプキンなどの吸収性用品が挙げられる。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】(A)(推定上の)α-グルカノトランスフェラーゼ酵素、(B)DSREおよびDSRP、2つの触媒ドメイン(CD1およびCD2)を含有するグルカンスクラーゼ酵素、ならびに(C)乳酸菌のデキストラン-、ムタン-、アルテルナン-、およびロイテランスクラーゼ酵素の触媒ドメイン中の保存領域(II、III、IV、およびI)のアミノ酸配列[http://www.cazy.org]アライメントを示す図である。7つの厳密に保存されたアミノ酸残基(1〜7)は、グルカンスクラーゼ酵素の-1および+1サブサイトに重要な寄与をしており、α-グルカノトランスフェラーゼ酵素にも保存されている(L.ロイテリ121のGTFAおよびGTFBに対して下線およびグレースケールで示す)。アミノ酸の番号付け(イタリック体)は、L.ロイテリ180のGTF180によるものである。GTFBアミノ酸D1015(推定上の求核性残基)は太字で示す。
【図２】Pfamデータベースにおいて利用可能な、グリコシドヒドロラーゼファミリー70の108個のすべてのタンパク質配列の系統発生解析から得られたGTFB様タンパク質の系統樹を示す図である。このクラスター内の配列に関するさらなる詳細については、上記Table 2(表2)を参照されたい。
【図３】25mMスクロースまたは25mMマルトオリゴ糖と共に、50mM NaAc緩衝液pH4.7、1mM CaCl2中で13時間インキュベートされた90nM GTFBの反応生成物のTLC分析を示す図である。St=標準物質、Suc、スクロース;G1、グルコース;G2、マルトース;G3、マルトトリオース;G4、マルトテトラオース;G5、マルトペンタオース;G6、マルトヘキサオース;G7、マルトヘプタオース;Pol、ポリマー。
【図４】A)25mMマルトヘキサオースまたはB)25mMマルトヘプタオースと共に、50mM NaAc緩衝液pH 4.7、1mM CaCl2中で0、1、2、または8時間のいずれかの時間インキュベートされた90nM GTFBの反応生成物のダイオネクス(Dionex)分析を示す図である。
【図５】酵素なしで(パネルA)、または90nM GTFBと共に(パネルB)、ドナー基質としての0.25%アミロース-V(AMVと略す)のみと、またアクセプター基質としての25mMグルコース(G1)または25mMマルトース(G2)を加えたアミロース-Vと、25mM NaAc pH4.7、1mM CaCl2中で37℃にて一晩インキュベートされた基質試料のダイオネクス分析を示す図である。
【図６】GTFB(様)活性を有するマルトオリゴ糖DP7とのインキュベーションの生成物混合物中の様々なα-グルカンを示す概略図である。
【図７】マルトオリゴ糖DP7(100mM)とGTFB(250mM)とを120時間インキュベートした後の生成物混合物の1H NMRスペクトルを示す図である。
【図８】GTFBの可能な作用機構を示す図である。GTFBタイプの酵素の活性部位で起こる反応の順序を示す概略図である。GTFBタイプの酵素のドナーおよび(アクセプター)のサブサイトは、グルカンスクラーゼ酵素の利用可能な3D構造情報(1つのドナー(-1)サブサイトを含む)および本研究で得られたデータに基づいてマッピングされた。サブサイト-1および+1〜+6にG7が結合すると、α-1,4グリコシド結合の切断(G6の放出、灰色で示す)およびサブサイト-1での(推定上の)共有結合中間体の形成(灰色の線で示す)が起こる。使用したアクセプター基質に依存して、加水分解(水による)またはオリゴ糖アクセプターによるグリコシル転移(以下を参照されたい)。Lb.ロイテリ121 GTFB酵素はまた、マルトオリゴ糖との不均化反応を触媒する。例えば、マルトヘプタオース(G7)の2つの分子は、1つのG6分子と、8つのグルコース残基を含有するが、その非還元末端に新しく合成されたα-1,6グリコシド結合を有するG8生成物とに変換される。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００４０】
緒言
乳酸菌(LAB)のグルカンスクラーゼ(GS)(またはグルコシルトランスフェラーゼ; GTF)酵素(EC 2.4.1.5)は、(α1→6)[デキストラン、主としてロイコノストック属に見出される]グルコシド結合、(α1→3)、[ムタン、主としてストレプトコッカス属に見出される]グルコシド結合、交互の(α1→3)および(α1→6)[アルテルナン、ロイコノストック・メセンテロイデスにのみ報告がある]グコシド結合、(α1→4)[ロイテラン、ラクトバチルス・ロイテリ株由来のGTFAおよびGTFOによる]グルコシド結合を有する様々なα-グルカンを合成するためにスクロースを使用する{Monchois、1999; van Hijum、2006; Arguello-Morales、2000 ;Kralj、2002 ;Kralj、2005}。
【００４１】
ラクトバチルス・ロイテリ121は、大量の(α1→4)グルコシド結合を有するロイテラン生成物を合成するために、グルカンスクラーゼGTFAおよび基質としてスクロースを使用する。このgtfA遺伝子の上流に、gtfBと命名された別の推定上のグルカンスクラーゼ遺伝子が同定された。この遺伝子のクローニングおよび発現の後にこの酵素が基質としてのスクロースに活性を示さないことがこれまでに明らかとなっている。L.ロイテリML1のゲノムにも、gtfBホモログであるgtfML4の推定上の触媒ドメインおよびC末端ドメインが、ムタンスクラーゼをコードするgtfML1の上流に同定された{Kralj、2004}。L.ロイテリDSM 20016の最近解明されたゲノム配列でも、GTFBホモログを同定することができた(883アミノ酸中で73%の同一性、85%の類似性)。さらに、L.ロイテリTMW1.106もまた、GTFAホモログ(GTFA106)に加えてGTFBホモログ(GTFB106)を含有する。この酵素は、L.ロイテリ121由来のGTFBに対して、1383アミノ酸中で92%の同一性および95%の類似性を示した。しかし、GTF106Bは、GTFBとは対照的に、スクロースに対して低い(27時間のインキュベーション後に)加水分解活性を示した{Kaditzky、2008}。
【００４２】
GTFBがマルトオリゴ糖に対して不均化タイプおよび重合タイプの活性を有していることが本明細書において示される。この酵素は、基質としてマルトオリゴ糖((α1→4)グルコシド結合のみを含有する)を使用して、最大35の重合度(DP)のオリゴ糖を合成する。この伸長/重合プロセスの間に、多数の(α1→6)グルコシド結合(約32%)が最終生成物中に導入される。さらに、ドナーとして大きなアミロース基質(アミロース-V)、またアクセプターとしてより小さな糖(グルコース、マルトース)を用いて、5超のグルコース単位を含有する、(α1→4)グルコシド結合を介して結合したより大きな糖もまた合成されることを我々は示す。メチル化分析および1H NMRによる、マルトヘプタオースから合成された生成物の詳細な分析により、最大32%の(α1→6)グルコシド結合が最終生成物中に導入されることが判明した。GTFBの一次構造は、並べ替えられた(β/α)8バレルを含み、GH70酵素に類似しているが、その活性は、好ましい基質としてマルトオリゴ糖を使用するGH13α-アミラーゼタイプの酵素により類似している。
【００４３】
材料および方法
細菌株、プラスミド、培地、および増殖条件。エシェリキア・コリ(Escherichia coli)TOP 10(Invitrogen、Carlsbad、Calif.)を、クローニングのための宿主として使用した。プラスミドpET15b(Novagen、Madison、WI)を、E.コリBL21 Star(DE3)(Invitrogen)中の(変異)gtfB遺伝子の発現に使用した。E.コリ株は、LB培地中にて37℃で好気的に増殖させた{Ausubel、1987}。組換えプラスミドを含有するE.コリ株は、100μg ml-1アンピシリンと共に、LB培地中で培養した。寒天平板は、LB培地に1.5%の寒天を添加して作製した。
【００４４】
L.ロイテリ由来のGTFBのアミノ酸配列アライメント。GTFBならびに乳酸菌由来の公知のグルカンスクラーゼおよび推定上のα-グルカノトランスフェラーゼの多重アミノ酸配列アライメントは、MEGAバージョン4のClustalWインタフェース(www.megasoftware.net)を使用して、ギャップ開始ペナルティおよびギャップ伸張ペナルティをそれぞれ10および0.2として作製した。
【００４５】
分子技術。遺伝子クローニング、E.コリDNAの形質転換、DNA操作、およびアガロースゲル電気泳動の基本手順は、記載{Sambrook、1989}のとおりとした。制限エンドヌクレアーゼ消化およびT4DNAリガーゼによるライゲーションは、酵素供給業者(New England Biolabs、Beverly、MA; Roche Biochemicals、Basel、Switzerland)の推奨に従って実施した。プライマーは、Eurogentec、Seraing、Belgiumから入手した。配列決定は、GATC (Konstanz、Germany)によって実施した。DNAは、Pwo DNAポリメラーゼ(Roche Biochemicals)またはExpand High Fidelityポリメラーゼ(Fermentas)を使用して、DNA Thermal Cycler PTC-200 (MJ Research、Waltham、Massachusetts)にてPCRにより増幅した。E.コリのプラスミドDNAは、Wizard Plus SVプラスミド抽出キット(Sigma)を使用して単離した。
【００４６】
プラスミドの構築。適切なプライマーペアおよび鋳型DNAを使用して、C末端Hisタグを有する2つの異なる発現コンストラクトを作製した。すなわち、Lb.ロイテリ121由来のGTFAについて以前に記載された方法(以下を参照されたい){Kralj、2002}により、3つの別々のPCR反応を使用して構築した完全なGTFB(1587アミノ酸)、およびGTFBのN-末端切断変異体(N末端を欠く)可変領域(889アミノ酸)に対して構築した。
【００４７】
以後の突然変異誘発およびヌクレオチド配列決定を容易にするために、gtfBは3つの部分に分割してクローニングした。2つのPstI制限部位(1385bp、1751bp)の1番目を、メガプライマー法{Sarkar、1990}および次のプライマー:変異PstI制限部位(下線部、塩基の変化によるサイレント変異を太字で示す)を含有するBpstIfor 5'-GTAAGTCGTTACTCAGCAGATGCTAATGG-3'およびBpstI rev 5'-GGTCAGTAAATCCACCGTTATTAATTGG-3'を使用して改変した。その後のPCR反応において、増幅生成物(420bp)は、SalI(イタリック体)およびNcoI(太字)の制限部位を含有するBfor:5'-GCAATTGTCGACCATGGATACAAATACTGGTGATCAGCAAACTGAACA-GG-3'と共に(逆方向)プライマーとして使用した。得られた1700bpの生成物を、SalIおよびPstIにより消化し、pBluescript II SK+の対応する部位に連結し、pBSP1600を得た。増幅420bp生成物はまた、BamHI制限部位の70bp下流のBrevBamHI 5'-GGACTGTTATCACTATTATTATTTCCGGCC-3'と共に順方向プライマーとして使用した。得られた(約1500bp)生成物を、PstIおよびBamHIにより消化し、pBluescript II SK+の対応する部位に連結し、pBPB1000を得た。第3のフラグメントは、プライマーである、BamHI制限部位の200bp下流のBforBamHI 5'-CGCTATGTAATTGAACAGAGTATTGCTGC-3'ならびにXbaI(イタリック体)およびBglI(太字)と6xヒスチジンタグ(下線部)を含有するBRevHis 5'-CCTCCTTTCTAGATCTATTAGTGATGGTGATGGTGATGGTTGTTAAAGTTTAATGAAATTGCAGTTGG-3'を使用して得た。得られた2300bpの生成物を、BamHIおよびXbaIにより消化し、pBluescript II SK+の対応する部位に連結し、pBBX2300を得た。完全な遺伝子は、以下のように組み立てた。pBPB1000を、PstIおよびBamHIにより消化し、得られたフラグメントを、同じ制限酵素で制限処理されたpBSP1600に連結し、pBSB2600(第1および第2のフラグメントを含有する)を得た。続いて、プラスミドpBBX2300を、BamHIおよびSacII(プラスミド上に存在、XbaIの代わりに使用)により消化し、そのフラグメントをpBSB2600に連結し、完全長のgtfB遺伝子を含有するpBSS4900を得た。このプラスミドをNcoIおよびBglIIにより消化し、gtfB遺伝子をpET15bのNcoIおよびBamHIの部位に連結し、pET15B-GTFBを得た。
【００４８】
GTFBの発現および精製。(変異)GTFB {Kralj, 2004}を有するE.コリBL21star(DE3)の一晩培養物を、1/100に希釈した。細胞をOD600 0.4まで増殖させ、0.2mM IPTGで誘導した。増殖の4時間後に、細胞を遠心分離(10,000xgにて4℃、10分間)によって採取した。タンパク質を超音波処理によって抽出し、ラクトバチルス・ロイテリ121由来のGTFA(ロイテランスクラーゼ)に対して以前に記載されたように{Kralj、2004}、Ni-NTAおよび陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製した。ただし、陰イオン交換クロマトグラフィーについては、1mlのHi-trap(商標)Q HPカラムを使用する(Ge Healthcare)ように改変した。
【００４９】
(i)pHおよび温度の最適条件。pHおよび温度の最適条件は、一晩インキュベーション後の、25mMマルトテトラオースから合成されたオリゴ糖および多糖の量をTLC上で定性的に測定することにより決定した(データは図示せず)。
【００５０】
(ii)マルトオリゴ糖および他の糖から合成される生成物。単一基質のインキュベーション。90nM GTFB、および25mMのスクロース(Acros)、ラフィノース(Sigma)、ツラノース(Sigma)、パラチノース(Sigma)、パノース(Sigma)、0.25%アミロース-V(Avebe、Foxhol、The Netherlands)、0.25%アミロペクチン、25mMイソマルトペンタオース、イソマルトヘキサオース(Sigma)、様々な重合度(G2〜G7)を有するマルトオリゴ糖を、25mM NaAc pH4.7、1mM CaCl2中で37℃にて一晩別々にインキュベートし、TLCによって分析した。長時間をかけてG6およびG7から合成された生成物は、TLCおよびHPAECによって分析した。
【００５１】
アクセプター/ドナーの研究。90nM GTFBならびに25mMのグルコースおよび様々な重合度(G2〜G7)を有するマルトオリゴ糖を、0.25%アミロース-Vと共に、25mM NaAc pH4.7、1mM CaCl2中で37℃にて一晩インキュベートし、TLCによって分析した。
【００５２】
(i)G7から生成したオリゴ糖および多糖の特徴づけ。精製されたGTFB酵素調製物(90nM)を、酵素アッセイの上述の条件を使用して、150mM G7(Sigma)と共に、7日間インキュベートした。精製された組換えGTFBによって生成されたオリゴ糖および多糖は、96%エタノールよる沈殿によって分離した(より大きな糖生成物のほとんどは沈殿する){van Geel-Schutten、1999}。
【００５３】
(ii)メチル化分析。オリゴ糖および多糖は、ヨウ化メチルおよびジメシルナトリウム(CH3SOCH2--Na+)を使用して、DMSO中にて室温で完全メチル化した{Kralj、2004}。
【００５４】
結果
GTFBのアライメント
GTFBは、様々なラクトバシラス属の中で同定された一群のホモログ酵素の最初の代表的なものである。この新規の酵素群のメンバーと他のグルカンスクラーゼとのアライメントは、類似性を示したが、いくつかの特徴的な相違も示した。グルカンスクラーゼに存在する3つの触媒残基(D1024、E1061、およびD1133、他に指示がなければ、L.ロイテリ121 GTFAの番号付けを全体を通して使用する)は、α-グルカノトランスフェラーゼの群にも存在する(D1015、E1053、およびD1125、L.ロイテリ121 GTFBの番号付け)。しかし、グルカンスクラーゼの領域I、II、III、およびIVにある多数の保存アミノ酸残基が、α-グルカノトランスフェラーゼ群の酵素には存在しない(図1)。領域II(推定上の求核性残基を包含する)では、保存V1025(GTFAおよびGTFOではPro)が、α-グルカノトランスフェラーゼではアラニンに置換されている。領域IIIでは、推定上の酸/塩基触媒E1061の下流の領域は、グルカンスクラーゼとα-グルカノトランスフェラーゼとの間で完全に異なっている。
【００５５】
しかし、グルカンスクラーゼの領域I、II、III、およびIVにある多数の保存アミノ酸残基が、α-グルカノトランスフェラー群の酵素には存在しない(図1)。領域II(推定上の求核性残基を包含する)では、保存P1025(GTFAおよびGTFOではPro、大部分のGTFではVal)が、α-グルカノトランスフェラーゼではアラニンに置換されている。領域IIIでは、推定上の酸/塩基触媒E1061の下流の領域は、グルカンスクラーゼとα-グルカノトランスフェラーゼとの間で完全に異なっている。保存トリプトファン1063は、α-グルカノトランスフェラーゼではチロシン残基に置換されている(図1)。領域IVでは、GTFBホモログは、Q1137残基の位置の直ぐ上流にギャップを含有しており、保存グルタミンの位置にはリシン残基が存在する。
【００５６】
GTFBホモログ
遺伝子およびタンパク質の配列データバンクの検索により、GTFBと同じ触媒活性を有する可能性のあるいくつかの配列が判明した。この情報は、グリコシドヒドロラーゼファミリー70のメンバーすべて(2010年4月27日のPfamデータベースにおいて利用可能な108配列)の系統樹に基づいている。さらに、この系統樹はPfamサーバから利用可能である。図2を参照されたい。
【００５７】
Table 2(表2).アライメントおよび系統樹から明らかである、GTFBとの明確な類似性を有する、Pfamデータベース(http://pfam.sanger.ac.uk)からのグリコシドヒドロラーゼファミリー70の配列。9番がGTFBであり、番号が図2の系統樹でみられる順番に従っていることに留意されたい。
【００５８】
【表２】
0005916602.tif 000003
【００５９】
9つのGTFB様配列のうち、ラクトバチルス・ロイテリDSM 20016(表中の5番)由来の推定上のデキストランスクラーゼは、エシェリキア・コリでクローニングして発現させた。組換えタンパク質は、アフィニティクロマトグラフィーおよび陰イオン交換クロマトグラフィーを組み合わせて精製した。精製されたタンパク質は、マルトオリゴ糖とインキュベートすると、GTFB様活性を示した。ラクトバチルス・ロイテリDSM 20016由来の推定上のデキストランスクラーゼは、スクロースに対する活性を示さなかったが、その代わりに、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、およびマルトヘプタオースを基質として使用し、長短の生成物をはしご状に生成した。生成物のプロトンNMR分析により、GTFBインキュベーションにおいてもみられたように、α-1,6-グリコシド結合が導入されることが実証された。さらに、ラクトバチルス・ロイテリDSM 20016由来の推定上のデキストランスクラーゼは、Sigma-Aldrichの可溶性ジャガイモデンプン中のα-1,6-グリコシド結合のパーセンテージも増大させた。
【００６０】
GTFBのクローニングおよび発現
完全長GTFB、N末端切断バージョン、および推定上の求核性GFTB突然変異体を構築し、に発現させるのに成功した。完全長GFTBおよびN末端切断変異体の両方が、TLCによる測定においてマルトオリゴ糖に対して明確な活性を示した(データを示さず)。構築された切断GTFBバージョン(GTFB-ΔN)は、完全長GTFBほど効率的に発現しなかったので、実験はすべて完全長GTFBを使用して実施した。E.コリ自体から出現するいかなるバックグラウンド活性も除外するために、空のpET15bプラスミドを精製した。Hisタグ精製の後にはすでに、マルトオリゴ糖(G2〜G7)に対する活性は検出されなかった(データを示さず)。さらに、精製された完全長D1015N(推定上の)求核性突然変異体は、マルトオリゴ糖(G2〜G7;データを示さず)に対する活性を示さなかった。
【００６１】
酵素の特徴
TLCによって定性的に決定した、基質としてマルトテトラオースを使用したときのGTFBの至適活性は、温度30〜37℃およびpH4〜5においてであった(データを示さず)。様々な温度およびpH緩衝液の組合せにより、温度37℃およびpH4.7において至適活性があることが示され、その後のすべてのアッセイでその条件を使用した。
【００６２】
ドナー基質
GTFBがドナー基質としてスクロースを使用することができないことがすでに示されていたので{Kralj、2004}、様々なスクロースアナログ(ツラノース、パラチノース)およびラフィノースを活性に関してテストした。我々は、これらの基質のいずれに対する活性も検出することができなかった(データを示さず)。さらに、活性はイソマルトオリゴ糖(IG5およびIG6)基質に対しても観察されなかった(データを示さず)。部分精製されたロイテラン(GTFA)加水分解物に由来するオリゴ糖またはパノースに対する活性も検出されなかった(データを示さず)。しかし、直鎖状のマルトオリゴ糖に対しては、明確な活性が短時間インキュベーション後にすでに観察された。特に重合度4以上のマルトオリゴ糖においては、様々なオリゴ糖が合成された(図3)。6以上のDPからは、オリゴ糖に加えて、より大きな高分子物質も蓄積し始めた。アミロース-V(Avebe、Foxhol、The Netherlands)に対しても、低い活性(主としてG1およびG2の放出)が観察された(図5)。マルトース単独に対しては、事実上活性は観察されなかった。しかし、アミロース-Vをグルコースまたはマルトースと同時にインキュベートしたときには、一連のオリゴ糖が合成された(図5)。ドナーとしてアミロース-V、アクセプターとしてグルコースを使用すると、アミロース-V単独のインキュベーションと比較して、多数のマルトースが合成され、(α1→4)を合成する能力が示された。アミロース-V単独においては、事実上G3は放出されなかった。アミロース-Vをアクセプターとしてのマルトースと共にインキュベートすると、パノースおよびG3が明確に得られ、パノース((α1→6)を合成する能力を示す)に加えてマルトトリオースも合成するGFTBの能力が示され、(α1→4)グルコシド結合を合成するこの酵素の能力が実証された。
【００６３】
G6およびG7に関する、時間経過による生成物の特徴づけ
G6に関して検出できる第1の反応生成物はG1(グルコース)およびG5(マルトペンタオース)であった(図4)。さらに、G7に関しては、放出された第1の生成物はG1(グルコース)およびG6(マルトヘキサオース)であった。G6に関しては、時間経過の後半で、G2、G3、およびG4など他のマルトオリゴ糖も出現した。G7およびG8の隣に未知の糖も同定され、この糖は、(α1→4)グルコシド結合に加えて、保持時間のシフトによって示される他の結合も含有しているにちがいない。
【００６４】
マルトヘプタオースをGTFBと共に120時間インキュベートした後に、全生成物混合物の1D 1H-NMRスペクトル(図7)が、δH-1〜4.96のブロードなシグナルによって、新しく形成された(α1→6)結合の存在を示した。(α1→4)シグナルはδH-1〜5.39に存在する。120時間のインキュベーション後に、(α1→4):(α1→6)の比は、生成物混合物中において67:33である。生成物混合物のMALDI-TOF MSの分析により、DP2から最大DP35の範囲(m/z 365〜m/z 5711、[M+Na]+)にある化合物の存在が明らかとなった。
【００６５】
MOS DP7を組換えGFTBと共にインキュベートして得られた反応混合物において、DP2〜DP10の範囲にある様々な17個の構造(図6)をNMR分光法によって詳細に解明することができた。解明された構造は、形成された化合物の総数の一部だけを構成する。多糖を含めて、より多くの高分子量生成物が存在する。DP7より小さなオリゴ糖は、基質[(α1→4)のみを含有する生成物]に対するGTFBの加水分解活性、および形成されたオリゴ糖[(α1→4)および(α1→6)を含有する生成物]に対する加水分解活性から生じているにちがいないことは明らかである。6-置換された還元末端グルコース残基を有する構造が見出されなかったことに留意されたい。これまでに、連続する(α1→4)結合グルコース残基が伸長する(α1→6)結合グルコース残基を有する構造(DP8)は1つのみ見出された。他の場合では、(連続する)(α1→6)の伸長のみが生じていた。オリゴ糖はすべて還元末端に4-置換されたグルコース残基を有している。しかし、全生成物混合物の1D 1H NMRスペクトル(図7)において、微量の末端還元-(1→)-D-Glc単位が見出されたが(δ5.240のH-1αおよびδ4.669のH-16)、この単位は解明された構造には見出されなかった。
【００６６】
したがって、組換えGTFBは、(α1→4)結合のみの切断を触媒し、新しい(α1→4)結合および(α1→6)結合の形成を開始する。このようにして、単糖から多糖(DP>30)に至るまで多くの生成物が形成される。形成されたDP7-およびDP8-オリゴ糖(-アルジトール)について明確に示されるように、単一分子量の生成物に対して様々な構造が可能である。さらに、(α1→4)結合に対する(α1→6)結合の量は、鎖長の増加と共に、最大50:50まで増加することが観察された。4、6-、および他のタイプの分枝点は導入されない。組換えGTFB酵素が、遊離マルトオリゴ糖およびその還元体(マルトオリゴ糖-アルジトール)に対して類似の活性を示したという事実より、非還元末端伸長メカニズムが実証される。
【００６７】
上記の結果から引き出すことができる重要な結論は以下のものである。
- 6-置換された還元末端グルコース残基を有する構造は見出されなかった。
- GTFBは、(α1→4)結合のみの切断を触媒し、新しい(α1→4)結合および(α1→6)結合の形成を開始する。
- (α1→4)結合に対する(α1→6)結合の量は、鎖長の増加と共に、最大50:50まで増加する。
- 4、6-、および他のタイプの分枝点は導入されない。
- GTFBは非還元末端伸長メカニズムを有する。
【００６８】
タンパク質工学によるGTFAへのGTFB様活性の導入。
保存配列領域IIIおよびIV(配列アライメントについては図1を参照されたい)に位置するアミノ酸残基は、形成されるグリコシド結合タイプに関する、GTF酵素の生成物特異性を制御することがこれまでのタンパク質工学研究により実証されてきた。また、領域Iおよび領域IIは、酵素活性および反応特異性に寄与するアミノ酸残基を含有している。保存配列領域のアミノ酸残基は、GTF酵素のアクセプター基質結合領域の一部を形成する。基質としてスクロースを使用する重合反応では、これらの残基は、スクロースのグルコース(サブサイト-1)およびフルクトース(サブサイト+1)の部分と相互作用する。GTFBが基質としてマルトヘプタオース(および他のマルトオリゴ糖)を利用する場合には、グルコース部分はGTFB酵素中のアクセプターサブサイトで相互作用することになる。したがって、従来のGTFと比較してユニークなGTFBの基質特異性は、アクセプターサブサイトにおける相違によって決定されている可能性が高い。そこで、従来のGTFA酵素にGTFB様活性を導入するために、領域I、II、IIIおよびIVに位置する、アクセプターサブサイトの残基を置換して、GTFB酵素の配列に類似させることが考えられる。
【００６９】
さらに、GTF180の3D構造(Vujicic、博士論文University of Groningen)から、GTFの反応特異性の相互転換にとっておそらく重要なサブサイト-1および+1で相互作用するいくつかの追加の残基が示される。981のL→V変異は、Leu981がスクロースのフルクトシル部分とファンデルワールス相互作用する、GTF180の3D構造でみられる相互作用に基づいている。GTFBでは、この位置は、他のα-グルカノトランスフェラーゼであるGTFDSM、GTF106B、GTFML4においてと同様にバリン残基で占められている。1463のD→R、T、またはMの変異は、アスパラギン酸残基の置換を目的としたものであり、この残基は、グルカンスクラーゼに高度に保存されているが、GTFBおよびその関連酵素では保存されておらず、GTF180 3D構造においてサブサイト-1でグルコース部分と相互作用する。
【００７０】
さらに、GTF酵素の反応特異性を改変させる強い効果を得るために、いかようにも変異を組み合わせてもよい。提案する変異は以下の通りである。
領域I
位置W1510:W→I/L
位置P1512:P→
位置D1513:D→N
領域II
位置1026:P→A
領域III
位置1062:D→G
位置1063:W→Y
位置1064:N→H
位置1062〜1064 DWN→GYH
領域IV
位置1134:N→Q
位置1135:N→R
位置1136:S→この残基欠失
位置1134〜1136:NNS→QR
位置1137:Q→K
3D構造
位置981:L→V
位置1414:N→L
位置1463:D→R、TまたはM
(参考文献)
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0005916602.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図１】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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