(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子工学により改変されて、以下からなる群から選択された酵素少なくとも１が、それぞれ以下に特定する、その野生型に比較して変更した活性を有する、ソホロリピッドを形成する細胞：
配列番号７のポリペプチド配列を有するか、又は、配列番号７に対しアミノ酸残基１０％までが欠失、挿入、置換又はこれら組み合わせによって変更されており、かつ、そのつどの参照配列  配列番号７を有する酵素の酵素活性のなお少なくとも９０％を有するポリペプチド配列を有する少なくとも１の酵素Ｅ1、その際、酵素Ｅ1のための酵素活性とは、Ｚ−９−オクタデセン酸を１７−ヒドロキシ−Ｚ−９−オクタデセン酸へと変換する能力が理解される、
配列番号８又は配列番号１１のポリペプチド配列を有するか、又は、配列番号８又は配列番号１１に対しアミノ酸残基１０％までが欠失、挿入、置換又はこれら組み合わせによって変更されており、かつ、そのつどの参照配列  配列番号８又は配列番号１１を有する酵素の酵素活性のなお少なくとも９０％を有するポリペプチド配列を有する少なくとも１の酵素Ｅ2、その際、酵素Ｅ2のための酵素活性とは、ＵＤＰ−グルコース及び１７−ヒドロキシ−Ｚ−９−オクタデセン酸を１７−（β−Ｄ−グルコピラノシル−オキシ）−Ｚ−９−オクタデセン酸へと変換する能力が理解される、
配列番号１１のポリペプチド配列を有するか、又は、配列番号１１に対しアミノ酸残基１０％までが欠失、挿入、置換又はこれら組み合わせによって変更されており、かつ、参照配列  配列番号１１を有する酵素の酵素活性のなお少なくとも９０％を有するポリペプチド配列を有する少なくとも１の酵素Ｅ3、その際、酵素Ｅ3のための酵素活性とは、１７−（β−Ｄ−グルコピラノシル−オキシ）−Ｚ−９−オクタデセン酸及びＵＤＰ−グルコースを１７−Ｌ−［（２′−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−オキシ］−Ｚ−９−オクタデセン酸へと変換する能力が理解される、
配列番号９のポリペプチド配列を有するか、又は、配列番号９に対しアミノ酸残基１０％までが欠失、挿入、置換又はこれら組み合わせによって変更されており、かつ、配列番号９を有する酵素の酵素活性のなお少なくとも９０％を有するポリペプチド配列を有する少なくとも１の酵素Ｅ4、その際、酵素Ｅ4のための酵素活性とは、１７−Ｌ−［（２′−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−オキシ］−Ｚ−９−オクタデセン酸−１′，４″−ラクトン及びアセチル−補酵素Ａを１７−Ｌ−［（２′−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−オキシ］−Ｚ−９−オクタデセン酸−１′，４″−ラクトン−モノアセタートへと、又は、１７−Ｌ−［（２′−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−オキシ］−Ｚ−９−オクタデセン酸−１′，４″−ラクトン−モノアセタート及びアセチル−補酵素Ａを１７−Ｌ−［（２′−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−オキシ］−Ｚ−９−オクタデセン酸−１′，４″−ラクトン−ジアセタートへと、又は１７−Ｌ−［（２′−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−オキシ］−Ｚ−９−オクタデセン酸−１′，４″−ラクトン及びアセチル−補酵素Ａを１７−Ｌ−［（２′−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−オキシ］−Ｚ−９−オクタデセン酸−１′，４″−ラクトン−ジアセタートへと変換する能力が理解される、
配列番号１０のポリペプチド配列を有するか、又は、配列番号１０に対しアミノ酸残基１０％までが欠失、挿入、置換又はこれら組み合わせによって変更されており、かつ、配列番号１０を有する酵素の酵素活性のなお少なくとも９０％を有するポリペプチド配列を有する少なくとも１の酵素Ｅ5、その際、酵素Ｅ5のための酵素活性とは、ソホロリピッドを細胞から周囲媒体へと移す能力が理解され、
以下の酵素組み合わせ：
Ｅ1Ｅ2、Ｅ1Ｅ3、Ｅ1Ｅ4、Ｅ1Ｅ5、Ｅ2Ｅ3、Ｅ2Ｅ4、Ｅ2Ｅ5、Ｅ3Ｅ4、Ｅ3Ｅ5、Ｅ4Ｅ5、Ｅ1Ｅ2Ｅ3、Ｅ1Ｅ2Ｅ4、Ｅ1Ｅ2Ｅ5、Ｅ1Ｅ3Ｅ4、Ｅ1Ｅ3Ｅ5、Ｅ1Ｅ4Ｅ5、Ｅ2Ｅ3Ｅ4、Ｅ2Ｅ4Ｅ5、Ｅ3Ｅ4Ｅ5、Ｅ1Ｅ2Ｅ3Ｅ4、Ｅ2Ｅ3Ｅ4Ｅ5、Ｅ1Ｅ3Ｅ4Ｅ5、Ｅ1Ｅ2Ｅ4Ｅ5、Ｅ1Ｅ2Ｅ3Ｅ5、Ｅ1Ｅ2Ｅ3Ｅ4及びＥ1Ｅ2Ｅ3Ｅ4Ｅ5
の増加した活性を有するか、
酵素Ｅ3の減少した活性、又は酵素Ｅ3の減少した活性と以下の酵素組み合わせ：
Ｅ1Ｅ2、Ｅ1Ｅ4、Ｅ1Ｅ5、Ｅ2Ｅ4、Ｅ2Ｅ5、Ｅ4Ｅ5、Ｅ1Ｅ2Ｅ4、Ｅ1Ｅ2Ｅ5、Ｅ1Ｅ4Ｅ5及びＥ1Ｅ2Ｅ4Ｅ5
の増加した活性を有するか、
酵素Ｅ4の減少した活性、又は酵素Ｅ4の減少した活性と以下の酵素組み合わせ：
Ｅ1Ｅ2、Ｅ1Ｅ3、Ｅ1Ｅ5、Ｅ2Ｅ3、Ｅ2Ｅ5、Ｅ3Ｅ5、Ｅ1Ｅ2Ｅ3、Ｅ1Ｅ2Ｅ5、Ｅ1Ｅ3Ｅ5及びＥ1Ｅ2Ｅ3Ｅ5
の増加した活性を有するか、又は
酵素Ｅ3及びＥ4の減少した活性、又は酵素Ｅ3及びＥ4の減少した活性と以下の酵素組み合わせ：
Ｅ1Ｅ2、Ｅ1Ｅ5、Ｅ2Ｅ5、Ｅ1Ｅ2Ｅ5
の増加した活性を有し、カンジダ（Candida）又はウイッカーハミーラ（Wickerhamiella）属である、前記細胞。
【請求項２】
少なくとも部分的にそのβ−酸化においてブロックされていることを特徴とする請求項１記載の細胞。
【請求項３】
次の方法工程
Ｉ）請求項１又は２記載の細胞を炭素源を含む培地と接触させる工程、
ＩＩ）細胞に前記炭素源からソホロリピッドを形成することを可能にさせる条件下で細胞を培養する工程、及び
ＩＩＩ）場合によって、この形成されたソホロリピッドを単離する工程
を含むソホロリピッドを製造する方法。
【請求項４】
以下の配列：
Ａ）配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６に記載の配列、
その際、配列番号３の配列は、ＵＤＰ−グルコース及び１７−ヒドロキシ−Ｚ−９−オクタデセン酸を１７−（β−Ｄ−グルコピラノシル−オキシ）−Ｚ−９−オクタデセン酸へと変換できるタンパク質をコードする、
その際、配列番号４の配列は、１７−Ｌ−［（２′−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−オキシ］−Ｚ−９−オクタデセン酸−１′，４″−ラクトン及びアセチル−補酵素Ａを１７−Ｌ−［（２′−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−オキシ］−Ｚ−９−オクタデセン酸−１′，４″−ラクトン−モノアセタートへと、又は、１７−Ｌ−［（２′−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−オキシ］−Ｚ−９−オクタデセン酸−１′，４″−ラクトン−モノアセタート及びアセチル−補酵素Ａを１７−Ｌ−［（２′−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−オキシ］−Ｚ−９−オクタデセン酸−１′，４″−ラクトン−ジアセタートへと、
又は１７−Ｌ−［（２′−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−オキシ］−Ｚ−９−オクタデセン酸−１′，４″−ラクトン及びアセチル−補酵素Ａを１７−Ｌ−［（２′−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−オキシ］−Ｚ−９−オクタデセン酸−１′，４″−ラクトン−ジアセタートへと変換できるタンパク質をコードする、
その際、配列番号５の配列は、ソホロリピッドを細胞から周囲媒体へと移すことができるタンパク質をコードする、
その際、配列番号６の配列は、ＵＤＰ−グルコース及び１７−ヒドロキシ−Ｚ−９−オクタデセン酸を１７−（β−Ｄ−グルコピラノシル−オキシ）−Ｚ−９−オクタデセン酸へと、又は１７−（β−Ｄ−グルコピラノシル−オキシ）−Ｚ−９−オクタデセン酸及びＵＤＰ−グルコースを１７−Ｌ−［（２′−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−オキシ］−Ｚ−９−オクタデセン酸へと変換できるタンパク質をコードする、
Ｂ）Ａ）に記載の配列の１から誘導され、かつ、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６に記載の配列によってコードされるタンパク質と同じタンパク質又はペプチドをコードする、イントロン不含配列、
Ｃ）配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質又はペプチドをコードする配列、
Ｄ）群Ａ）〜Ｃ）の１に記載の配列と少なくとも９０％同一である配列、ここで、前記配列は、相応する出発材料を相応する参照配列によりコードされるタンパク質について挙げた相応する生成物へと変換できるタンパク質をコードする、及び
Ｇ）群Ａ）〜Ｄ）の１に記載の配列に対する相補配列、
から選択されている単離ＤＮＡ。
【請求項５】
請求項４に定義される群Ａ）〜Ｄ）、Ｇ）の１に記載のＤＮＡ配列を含むベクター。
【請求項６】
細胞の形質転換のための請求項５記載のベクターの使用。
【請求項７】
請求項１又は２記載の細胞であって、請求項４記載の単離ＤＮＡ又は請求項５記載のベクターで形質転換されることを特徴とする細胞。
【請求項８】
配列番号８又は配列番号１１のポリペプチド配列を有するか、又は、配列番号８又は配列番号１１に対しアミノ酸残基１０％までが欠失、挿入、置換又はこれら組み合わせによって変更されており、かつ、そのつどの参照配列  配列番号８又は配列番号１１を有する酵素の酵素活性のなお少なくとも９０％を有するポリペプチド配列を有する酵素Ｅ2、その際、酵素Ｅ2のための酵素活性とは、ＵＤＰ−グルコース及び１７−ヒドロキシ−Ｚ−９−オクタデセン酸を１７−（β−Ｄ−グルコピラノシル−オキシ）−Ｚ−９−オクタデセン酸へと変換する能力が理解される、
配列番号１１のポリペプチド配列を有するか、又は、配列番号１１に対しアミノ酸残基１０％までが欠失、挿入、置換又はこれら組み合わせによって変更されており、かつ、参照配列  配列番号１１を有する酵素の酵素活性のなお少なくとも９０％を有するポリペプチド配列を有する酵素Ｅ3、その際、酵素Ｅ3のための酵素活性とは、１７−（β−Ｄ−グルコピラノシル−オキシ）−Ｚ−９−オクタデセン酸及びＵＤＰ−グルコースを１７−Ｌ−［（２′−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−オキシ］−Ｚ−９−オクタデセン酸へと変換する能力が理解される、
配列番号９のポリペプチド配列を有するか、又は、配列番号９に対しアミノ酸残基１０％までが欠失、挿入、置換又はこれら組み合わせによって変更されており、かつ、配列番号９を有する酵素の酵素活性のなお少なくとも９０％を有するポリペプチド配列を有する酵素Ｅ4、その際、酵素Ｅ4のための酵素活性とは、１７−Ｌ−［（２′−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−オキシ］−Ｚ−９−オクタデセン酸−１′，４″−ラクトン及びアセチル−補酵素Ａを１７−Ｌ−［（２′−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−オキシ］−Ｚ−９−オクタデセン酸−１′，４″−ラクトン−モノアセタートへと、又は、１７−Ｌ−［（２′−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−オキシ］−Ｚ−９−オクタデセン酸−１′，４″−ラクトン−モノアセタート及びアセチル−補酵素Ａを１７−Ｌ−［（２′−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−オキシ］−Ｚ−９−オクタデセン酸−１′，４″−ラクトン−ジアセタートへと、又は１７−Ｌ−［（２′−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−オキシ］−Ｚ−９−オクタデセン酸−１′，４″−ラクトン及びアセチル−補酵素Ａを１７−Ｌ−［（２′−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−オキシ］−Ｚ−９−オクタデセン酸−１′，４″−ラクトン−ジアセタートへと変換する能力が理解される、及び
配列番号１０のポリペプチド配列を有するか、又は、配列番号１０に対しアミノ酸残基１０％までが欠失、挿入、置換又はこれら組み合わせによって変更されており、かつ、配列番号１０を有する酵素の酵素活性のなお少なくとも９０％を有するポリペプチド配列を有する酵素Ｅ5、その際、酵素Ｅ5のための酵素活性とは、ソホロリピッドを細胞から周囲媒体へと移す能力が理解される、
からなる群から選択された単離ポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の技術分野
本発明の主題は、核酸、酵素及び細胞並びにソホロリピッドの製造のためのその使用とソホロリピッドの製造方法である。
【０００２】
背景技術
界面活性剤は、今日では石油化学原料を実質的に基礎として製造される。再生原料を基礎とする界面活性剤の利用は、石油化学原料の予想可能な不足、及び、再生原料を基礎とするか或いは生分解可能である生成物の増加する需要のために、重要な代替物である。
【０００３】
ソホロリピッドは、界面活性剤としての使用に必要とされる表面活性特性を有する。
【０００４】
この脂質は、今日では種々の酵母の野生型−単離物を用いて、特にカンジダ・ボンビコラ（Candida bombicola）を用いて製造される。
【０００５】
この生成物形成の性能パラメーター、例えば炭素収率、空時収率、生成物濃度、生成物−均質性（アセチル化度、脂肪酸種、ラクトン形ｖｓ．開鎖形）の改善は、従来はプロセス実施（ｐＨ値、酸素供給、培地組成、フィード戦略、窒素供給、温度、基質選択等）の最適化を介してのみ行われている。唯一の例外は、β−酸化を停止させるようにした、カンジダ・ボンビコラの遺伝子改変であり、このため、基質として供給されるトリグリセリド、脂肪酸、脂肪アルコール等はもはや炭素源として利用されず、すなわち、分解されることができない（Van Bogaert et al FEMS Yeast Res. 2009 Jun;9(4) : 610-7）。そして、基質の選択によって、生成物特性に影響を及ぼすために、ソホロリピッドの脂肪酸割合を狙いを定めて制御することが可能になることが望ましい。
【０００６】
ソホロリピッドのバイオテクノロジーによる製造の性能パラメーターの改善は、プロセス実施の最適化によっては制限されてしか可能でないので、細胞の遺伝子改変も行わなくてはならない。
【０００７】
これは、一方ではソホロリピッド合成に関与する酵素の強化を包含する：シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ、グリコシルトランスフェラーゼＩ、グリコシルトランスフェラーゼＩＩ、アセチルトランスフェラーゼ、ソホロリピッド−エキスポーター、生成物形成の性能パラメーター、例えば炭素収率、空時収率、生成物濃度、生成物均質性（アセチル化度、脂肪酸種）その他の改善の目的をもって。これは、他方ではソホロリピッド合成に関与するいくつか酵素の減弱を包含する：グリコシルトランスフェラーゼＩＩ、アセチルトランスフェラーゼ、生産されるソホロリピッドの構造及び特性の改変の目的をもって：グリコシルトランスフェラーゼＩＩ：モノグリコシル−ソホロリピッドの製造；アセチルトランスフェラーゼ：非アセチル化ソホロリピッドの生産。
【０００８】
ソホロリピッドは、大量に界面活性剤として清浄化適用、化粧品適用及び他の適用において使用されることが望ましい場合には、今日使用される界面活性剤との競争を開始しなくてはならない。これらは、バルク化学薬品であり、極めて低コストで製造できる。従って、ソホロリピッドは可能な限り低コストで製造されなくてはならない。このことは、プロセス最適化単独による性能パラメーターの最適化によっては可能でない。
【０００９】
従って、高い生成物収率を有するソホロリピッドの効率的生産に関して増加した需要が存在する。
【００１０】
従って、本発明の基礎となる課題は、特異的なソホロリピッドを簡易かつ大量に作成できる手段及び／又は方法を提供することである。
【００１１】
発明の詳細な説明
意外なことに、以下に記載の細胞、核酸、ポリペプチド及び方法は、前述の課題を解決できることが見出された。
【００１２】
本発明の主題は、従って、ソホロリピッド合成のために変更した酵素的構成（enzymatischen Ausstattung）を有する遺伝子工学により改変した細胞である。
【００１３】
本発明の更なる主題は、請求項１１及び１２に記載の新規核酸及びベクターである。
【００１４】
さらに、本発明の主題は、ソホロリピッド生合成において有用な新規酵素である。
【００１５】
本発明は、ソホロリピッド形成の性能パラメーター、例えば炭素収率及び空時収率が改善されているのみならず、例えばアセチル化度及び脂肪酸種に関する生成物−均質性もが改善されることができる、という利点を有する。
【００１６】
本発明の主題は、以下からなる群から選択された酵素少なくとも１のそれぞれ以下に特定するような活性をその野生型に比較して変更して有するように遺伝子工学により改変された、ソホロリピッドを形成できる細胞である：
配列番号７、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１又は配列番号６３、特に配列番号７のポリペプチド配列を有するか、又は、そのつどの参照配列  配列番号７、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１又は配列番号６３、特に配列番号７に対しアミノ酸残基２５％まで、好ましくは２０％まで、特に好ましくは１５％まで、とりわけ１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１％までが欠失、挿入、置換又はこれら組み合わせによって変更されており、かつ、そのつどの前記参照配列  配列番号７、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１又は配列番号６３を有する酵素の酵素活性のなお少なくとも５０％、好ましくは６５％、特に好ましくは８０％、とりわけ９０％超を有するポリペプチド配列を有する酵素Ｅ１、その際、酵素Ｅ１のための酵素活性とは、Ｚ−９−オクタデセン酸を１７−ヒドロキシ−Ｚ−９−オクタデセン酸へと変換する能力が理解される、
配列番号８又は配列番号１１のポリペプチド配列を有するか、又は、配列番号８又は配列番号１１に対しアミノ酸残基６０％まで、好ましくは２５％まで、特に好ましくは１５％まで、とりわけ１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１％までが欠失、挿入、置換又はこれら組み合わせによって変更されており、かつ、そのつどの参照配列  配列番号８又は配列番号１１を有する酵素の酵素活性のなお少なくとも５０％、好ましくは６５％、特に好ましくは８０％、とりわけ９０％超を有するポリペプチド配列を有する少なくとも１の酵素Ｅ２、その際、酵素Ｅ２のための酵素活性とは、ＵＤＰ−グルコース及び１７−ヒドロキシ−Ｚ−９−オクタデセン酸を１７−（β−Ｄ−グルコピラノシル−オキシ）−Ｚ−９−オクタデセン酸へと変換する能力が理解される、
配列番号１１のポリペプチド配列を有するか、又は、配列番号１１に対しアミノ酸残基６０％まで、好ましくは２５％まで、特に好ましくは１５％まで、とりわけ１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１％までが欠失、挿入、置換又はこれら組み合わせによって変更されており、かつ、参照配列  配列番号１１を有する酵素の酵素活性のなお少なくとも５０％、好ましくは６５％、特に好ましくは８０％、とりわけ９０％超を有するポリペプチド配列を有する少なくとも１の酵素Ｅ３、その際、酵素Ｅ３のための酵素活性とは、１７−（β−Ｄ−グルコピラノシル−オキシ）−Ｚ−９−オクタデセン酸及びＵＤＰ−グルコースを１７−Ｌ−［（２′−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−オキシ］−Ｚ−９−オクタデセン酸へと変換する能力が理解される、
配列番号９のポリペプチド配列を有するか、又は、配列番号９に対しアミノ酸残基５０％まで、好ましくは２５％まで、特に好ましくは１５％まで、とりわけ１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１％までが欠失、挿入、置換又はこれら組み合わせによって変更されており、かつ、配列番号９を有する酵素の酵素活性のなお少なくとも５０％、好ましくは６５％、特に好ましくは８０％、とりわけ９０％超を有するポリペプチド配列を有する少なくとも１の酵素Ｅ４、その際、酵素Ｅ４のための酵素活性とは、１７−Ｌ−［（２′−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−オキシ］−Ｚ−９−オクタデセン酸−１′，４″−ラクトン及びアセチル−補酵素Ａを１７−Ｌ−［（２′−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−オキシ］−Ｚ−９−オクタデセン酸−１′，４″−ラクトン−モノアセタートへと、又は、１７−Ｌ−［（２′−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−オキシ］−Ｚ−９−オクタデセン酸−１′，４″−ラクトン−モノアセタート及びアセチル−補酵素Ａを１７−Ｌ−［（２′−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−オキシ］−Ｚ−９−オクタデセン酸−１′，４″−ラクトン−ジアセタートへと、又は１７−Ｌ−［（２′−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−オキシ］−Ｚ−９−オクタデセン酸−１′，４″−ラクトン及びアセチル−補酵素Ａを１７−Ｌ−［（２′−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−オキシ］−Ｚ−９−オクタデセン酸−１′，４″−ラクトン−ジアセタートへと変換する能力が理解される（その際、第１のものが好ましい）、
配列番号１０のポリペプチド配列を有するか、又は、配列番号１０に対しアミノ酸残基４５％まで、好ましくは２５％まで、特に好ましくは１５％まで、とりわけ１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１％までが欠失、挿入、置換又はこれら組み合わせによって変更されており、かつ、配列番号１０を有する酵素の酵素活性のなお少なくとも５０％、好ましくは６５％、特に好ましくは８０％、とりわけ９０％超を有するポリペプチド配列を有する少なくとも１の酵素Ｅ５、その際、酵素Ｅ５のための酵素活性とは、ソホロリピッドを細胞から周囲媒体へと移す能力が理解される。
【００１７】
本発明と関連して「ソホロリピッド」との概念には、一般式（Ｉａ）及び（Ｉｂ）の化合物が理解される；
【化１】
0005936548.tif 000002
［式中、
Ｒ1＝Ｈ又はＣＯ−ＣＨ3、
Ｒ2＝Ｈ又はＣＯ−ＣＨ3、
Ｒ3＝非置換の又はヒドロキシ官能性で置換した、非分枝の、場合によって１〜３個の二重結合又は三重結合を含有する二価有機基であって、６〜３２個の炭素原子を含むもの、
Ｒ4＝Ｈ、ＣＨ3又は非置換の又はヒドロキシ官能性で置換した、非分枝の、場合によって１〜３個の二重結合又は三重結合を含有する一価有機基であって、２〜１０個の炭素原子を含むもの、及び
ｎ＝１又は０］。
【００１８】
細胞の「野生型」とは、本発明と関連して、好ましくは、前述の配列番号の酵素の活性を担う遺伝要素に対する遺伝子工学操作により本発明の細胞が生じる出発株が理解される。
【００１９】
「酵素の変更した活性」との概念は、好ましくは変更した細胞内活性を理解することができる。
【００２０】
所定のポリペプチドの特性及び機能の本質的変更を生じない、所定のポリペプチド配列のアミノ酸残基の変更は、当業者に知られている。そして、例えばいわゆる保存されたアミノ酸が相互に交換されることができる；このように適したアミノ酸置換の例は次のとおりである：Ｓｅｒに対しＡｌａ、Ｌｙｓに対しＡｒｇ、Ｇｌｎ又はＨｉｓに対しＡｓｎ、Ｇｌｕに対しＡｓｐ、Ｓｅｒに対しＣｙｓ、Ａｓｎに対しＧｌｎ、Ａｓｐに対しＧｌｕ、Ｐｒｏに対しＧｌｙ、Ａｓｎ又はＧｌｎに対しＨｉｓ、Ｌｅｕ又はＶａｌに対しＩｌｅ、Ｍｅｔ又はＶａｌに対しＬｅｕ、Ａｒｇ又はＧｌｎ又はＧｌｕに対しＬｙｓ、Ｌｅｕ又はＩｌｅに対しＭｅｔ、Ｍｅｔ又はＬｅｕ又はＴｙｒに対しＰｈｅ、Ｔｈｒに対しＳｅｒ、Ｓｅｒに対しＴｈｒ、Ｔｙｒに対しＴｒｐ、Ｔｒｐ又はＰｈｅに対しＴｙｒ、Ｉｌｅ又はＬｅｕに対しＶａｌ。同様に、例えばアミノ酸挿入又はアミノ酸欠失の形の、特にポリペプチドのＮ末端又はＣ末端での変更がしばしばポリペプチドの機能に対して本質的な影響を発揮しないことが知られている。
【００２１】
酵素Ｅ1の活性は、この活性を含む細胞を当業者に知られている様式で分解し、例えばボールミル、フレンチプレス又は超音波破砕機を用いて分解し、引き続き完全細胞、細胞破片及び分解助材、例えばガラス球を１３０００ｒｐｍかつ４℃での１０分間の遠心分離により分離することで決定されることができる。次に、生じる細胞不含の粗抽出物を用いて、生成物の引き続くＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ検出を用いた酵素アッセイを実施できる。代替的に、酵素を当業者に知られている様式でクロマトグラフィ法（例えば、ニッケル−ニトリロ三酢酸−アフィニティクロマトグラフィ、ストレプトアビジン−アフィニティクロマトグラフィ、ゲル濾過−クロマトグラフィ又はイオン交換クロマトグラフィ）により濃縮するか、又は均質性を達するまで精製することもできる。標準アッセイを全容積２００μｌの、２００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）、０．５ｍＭ  ＮＡＤＰＨ、０．５ｍＭ  ジチオトレイトール、３ｍＭ  グルコース６−ホスファート及び０．５Ｕ  グルコース６−ホスファート−デヒドロゲナーゼ及び５０μｌタンパク質粗抽出物（約１ｍｇの全タンパク質）又は精製したタンパク質であって溶液中のもの（１０μｇの精製タンパク質）中で実施できる。この反応を、ａ）５μｌの１０ｍＭエタノール性基質溶液（Ｚ−９−オクタデセン酸）又はｂ）０．１％のTriton X-100中の５μｌの１０ｍＭ基質溶液（Ｚ−９−オクタデセン酸）（これは前もってそれぞれ３０秒間の２回の超音波処理によって前処理されている）の添加で開始させ、３０分間３０℃でインキュベーションする。引き続き、この反応を２００μｌの酢酸エチルで抽出する。溶解していない成分を沈殿させ、ここで短期の遠心分離（１６１００ｇ、５分間）によって相分離させ、ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳを用いて酢酸エチル相を分析する。生成物の同定を相応する材料痕跡量（Massenspure）及びＭＳ2スペクトルの分析によって行う。
【００２２】
酵素Ｅ2の活性は、この活性を含む細胞を当業者に知られている様式で分解し、例えばボールミル、フレンチプレス又は超音波破砕機を用いて分解し、引き続き完全細胞、細胞破片及び分解助材、例えばガラス球を１３０００ｒｐｍかつ４℃で１０分間の遠心分離により分離することで決定されることができる。次に、生じる細胞不含の粗抽出物を用いて、生成物の引き続くＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ検出を用いた酵素アッセイを実施できる。代替的に、酵素を当業者に知られている様式でクロマトグラフィ法（例えば、ニッケル−ニトリロ三酢酸−アフィニティクロマトグラフィ、ストレプトアビジン−アフィニティクロマトグラフィ、ゲル濾過−クロマトグラフィ又はイオン交換クロマトグラフィ）により濃縮するか、又は均質性を達するまで精製することができる。標準アッセイは、１８５μｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０μｌの１２５ｍＭ  ＵＤＰグルコース及び５０μｌのタンパク質粗抽出物（約１ｍｇの全タンパク質）又は精製したタンパク質であって溶液中のもの（１０μｇの精製したタンパク質）からなってよい。この反応を、ａ）５μｌの１０ｍＭエタノール性基質溶液（例えば１８−ヒドロキシ−Ｚ−９−オクタデセン酸）又はｂ）０．１％のTriton X-100中の５μｌの１０ｍＭ基質溶液（例えば１８−ヒドロキシ−Ｚ−９−オクタデセン酸）（これは前もってそれぞれ３０秒間の２回の超音波処理によって前処理されている）の添加で開始させ、３０分間３０℃でインキュベーションする。引き続き、この反応を２００μｌの酢酸エチルで抽出する。溶解していない成分を沈殿させ、ここで短期の遠心分離（１６１００ｇ、５分間）によって相分離させ、ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳを用いて酢酸エチル相を分析する。生成物の同定を相応する材料痕跡量及びＭＳ2スペクトルの分析によって行う。このアッセイにおいて好ましくは１８−ヒドロキシ−Ｚ−９−オクタデセン酸を基質として使用し、というのも、これは市販されており、かつ、既に様々な箇所で、ソホロリピッド生合成の酵素が１８−ヒドロキシ−Ｚ−９−オクタデセン酸、１７−ヒドロキシ−Ｚ−９−オクタデセン酸も他の鎖長のヒドロキシ脂肪酸（飽和又は不飽和）及びω−又はω−１−炭素でヒドロキシル化したもの、例えばソホロリピッド生合成の経過においてここから発生するモノグルコシド及びジグルコシドも、基質として許容することが示されているからである。（Asmer, H.J., Lang, S., Wagner, F., Wray, V. (1988).Microbial production, structure elucidation and bioconversion of sophorose lipids. J. Am. Oil Chem. Soc. 65:1460-1466; Nunez, A., Ashby, R., Foglia, T.A. et al. (2001). Analysis and characterization of sophorolipids by liquid chromatography with atmospheric pressure chemical ionization. Chromatographia 53:673-677; Ashby, R.D., Solaiman, D.K., Foglia, T.A. (2008). Property control of sophorolipids: influence of fatty acid Substrate and blending. Biotechnology Letters 30 : 1093-1100）。
【００２３】
酵素Ｅ3の活性は、この活性を含む細胞を当業者に知られている様式で分解し、例えばボールミル、フレンチプレス又は超音波破砕機を用いて分解し、引き続き完全細胞、細胞破片及び分解助材、例えばガラス球を１３０００ｒｐｍかつ４℃で１０分間の遠心分離により分離することで決定されることができる。次に、生じる細胞不含の粗抽出物を用いて、生成物の引き続くＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ検出を用いた酵素アッセイを実施できる。代替的に、酵素を当業者に知られている様式でクロマトグラフィ法（例えば、ニッケル−ニトリロ三酢酸−アフィニティクロマトグラフィ、ストレプトアビジン−アフィニティクロマトグラフィ、ゲル濾過−クロマトグラフィ又はイオン交換クロマトグラフィ）により濃縮するか、又は均質性を達するまで精製することができる。標準アッセイは、１８５μｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０μｌの１２５ｍＭ  ＵＤＰグルコース及び５０μｌのタンパク質粗抽出物（約１ｍｇの全タンパク質）又は精製したタンパク質であって溶液中のもの（１０μｇの精製したタンパク質）からなってよい。この反応を、ａ）５μｌの１０ｍＭエタノール性基質溶液（例えば１８−（β−Ｄ−グルコピラノシル−オキシ）−Ｚ−９−オクタデセン酸）又はｂ）０．１％のTriton X-100中の５μｌの１０ｍＭ基質溶液（１８−（β−Ｄ−グルコピラノシル−オキシ）−Ｚ−９−オクタデセン酸）（これは前もってそれぞれ３０秒間の２回の超音波処理によって前処理されている）の添加で、又はｃ）酵素Ｅ2の活性測定のために記載の反応バッチの添加で開始させ、３０分間３０℃でインキュベーションする。引き続き、この反応を２００μｌ（基質添加、例えばａ）及びｂ）に記載のとおり）又は４００μｌ（基質添加、例えばｃ）に記載のとおり）の酢酸エチルで抽出する。溶解していない成分を沈殿させ、ここで短期の遠心分離（１６１００ｇ、５分間）によって相分離させ、ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳを用いて酢酸エチル相を分析する。生成物の同定を相応する材料痕跡量及びＭＳ2スペクトルの分析によって行う。このアッセイにおいて好ましくは１８−（β−Ｄ−グルコピラノシル−オキシ）−Ｚ−９−オクタデセン酸を基質として使用し、というのも、その前駆体分子１８−ヒドロキシ−Ｚ−９−オクタデセン酸は市販されており、かつ、既に様々な箇所で、ソホロリピッド生合成の酵素が１８−ヒドロキシ−Ｚ−９−オクタデセン酸、１７−ヒドロキシ−Ｚ−９−オクタデセン酸も他の鎖長のヒドロキシ脂肪酸（飽和又は不飽和）及びω−又はω−１−炭素でヒドロキシル化したもの、例えばソホロリピッド生合成の経過においてここから発生するモノグルコシド及びジグルコシド、も基質として許容することが示されているからである。
【００２４】
酵素Ｅ4の活性は、この活性を含む細胞を当業者に知られている様式で分解し、例えばボールミル、フレンチプレス又は超音波破砕機を用いて分解し、引き続き完全細胞、細胞破片及び分解助材、例えばガラス球を１３０００ｒｐｍかつ４℃で１０分間の遠心分離により分離することで決定されることができる。次に、生じる細胞不含の粗抽出物を用いて、生成物の引き続くＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ検出を用いた酵素アッセイを実施できる。代替的に、酵素を当業者に知られている様式でクロマトグラフィ法（例えば、ニッケル−ニトリロ三酢酸−アフィニティクロマトグラフィ、ストレプトアビジン−アフィニティクロマトグラフィ、ゲル濾過−クロマトグラフィ又はイオン交換クロマトグラフィ）により濃縮するか、又は均質性を達するまで精製することができる。標準アッセイは、１８５μｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２．５μｌの１００ｍＭ  アセチル補酵素Ａ及び５０μｌのタンパク質粗抽出物（約１ｍｇの全タンパク質）又は精製したタンパク質であって溶液中のもの（１０μｇの精製したタンパク質）からなってよい。この反応を、ａ）５μｌの１０ｍＭエタノール性基質溶液（化学的に脱アセチル化したソホロリピッド）又はｂ）０．１％のTriton X-100中の５μｌの１０ｍＭ基質溶液（化学的に脱アセチル化したソホロリピッド）（これは前もってそれぞれ３０秒間の２回の超音波処理によって前処理されている）の添加で、又はｃ）酵素Ｅ3の活性測定のために記載の反応バッチの添加（以下ではｃ）で記載の基質添加の種類、この後に３０分間３０℃でのインキュベーションが続く）で開始させ、３０分間３０℃でインキュベーションする。引き続き、この反応を２００μｌ（基質添加、例えばａ）及びｂ）に記載のとおり）又は６００μｌ（基質添加、例えばｃ）に記載のとおり）の酢酸エチルで抽出する。溶解していない成分を沈殿させ、ここで短期の遠心分離（１６１００ｇ、５分間）によって相分離させ、ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳを用いて酢酸エチル相を分析する。生成物の同定を相応する材料痕跡量及びＭＳ2スペクトルの分析によって行う。本発明により好ましいのは、酵素Ｅ4をソホロリピッドのラクトン形（ここでは参照活性のために選択）のみが基質として許容されるのでなく、同様に、一般に式（Ｉａ）中Ｒ1及びＲ2＝Ｈを有するソホロリピッドの酸型も、相応した箇所で少なくとも１回アセチル化できることである。
【００２５】
その野生型に比較した酵素Ｅ5の変更した活性は最も単純には、代わりに、細胞１個あたりの酵素Ｅ5の絶対量により決定されることができ、というのも、増強した存在が活性向上を、そして、減少した存在が活性低下を細胞に対して引き起こし、かつ、この関係は直接的に相互に依存していることを前提にできるからである。野生型に比較した酵素Ｅ5の変化した存在は、従来法を用いて決定できる。従って、タンパク質濃度は、検出すべきタンパク質に特異的な抗体を用いたウェスタンブロットハイブリダイゼーション（Sambrook et al., Molecular Cloning: a laboratory manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. USA, 1989)及び濃度決定のための相応するソフトウェアを用いた引き続く光学的評価(Lohaus及びMeyer (1989) Biospektrum, 5: 32-39; Lottspeich (1999), Angewandte Chemie 111: 2630-2647）によって分析できる。
【００２６】
本発明により好ましい細胞は、微生物、好ましくは細菌細胞、酵母細胞又は菌類細胞であり、その際、特に、カンジダ（Candida）及びウイッカーハミーラ（Wickerhamiella）属の子嚢菌類、特にカンジダ・ボンビコラ（Candida bombicola）、カンジダ・ボゴリエンシス（Candida bogoriensis）、カンジダ・バチステ（Candida batistae）、カンジダ・アピコラ（Candida apicola）及びウイッカーハミーラ・ドメルキー（Wickerhamiella domericqiae）が特に好ましい。
【００２７】
特に株カンジダ・ボンビコラATCC 22214、カンジダ・ボゴリエンシスNRRL Y-5980、カンジダ・バチステCBS 8550、カンジダ・アピコラIMET 42747及びウイッカーハミーラ・ドメルキーは特に適した細胞である。
【００２８】
ソホロリピッドは本発明の細胞によりグルコース及び脂肪酸から形成されるので、本発明の細胞がそのβ−酸化において少なくとも部分的にブロックされている場合にこれが好ましく、というのも、基質の流出が妨げられ、従って、より高い生成物濃度及び炭素収率が可能になるからである。β−酸化においてブロックされたカンジダ細胞は例えばWO03/100013に記載され、β−酸化ブロックされたカンジダ・ボンビコラ細胞はVan Bogaert et al FEMS Yeast Res. 2009 Jun; 9 (4) : 610-7に記載されている。
【００２９】
本発明により好ましい細胞において変更した酵素活性は好ましくは増加している。
【００３０】
以下の酵素組み合わせの増加した活性を有する細胞が本発明により好ましい：
Ｅ1Ｅ2、Ｅ1Ｅ3、Ｅ1Ｅ4、Ｅ1Ｅ5、Ｅ2Ｅ3、Ｅ2Ｅ4、Ｅ2Ｅ5、Ｅ3Ｅ4、Ｅ3Ｅ5、Ｅ4Ｅ5、Ｅ1Ｅ2Ｅ3、Ｅ1Ｅ2Ｅ4、Ｅ1Ｅ2Ｅ5、Ｅ1Ｅ3Ｅ4、Ｅ1Ｅ3Ｅ5、Ｅ1Ｅ4Ｅ5、Ｅ2Ｅ3Ｅ4、Ｅ2Ｅ4Ｅ5、Ｅ3Ｅ4Ｅ5、Ｅ1Ｅ2Ｅ3Ｅ4、Ｅ2Ｅ3Ｅ4Ｅ5、Ｅ1Ｅ3Ｅ4Ｅ5、Ｅ1Ｅ2Ｅ4Ｅ5、Ｅ1Ｅ2Ｅ3Ｅ5、Ｅ1Ｅ2Ｅ3Ｅ4及びＥ1Ｅ2Ｅ3Ｅ4Ｅ5、
このうち次の組み合わせ
Ｅ1Ｅ2、Ｅ1Ｅ3、Ｅ1Ｅ4、Ｅ1Ｅ5、Ｅ2Ｅ3、Ｅ2Ｅ4、Ｅ2Ｅ5、Ｅ3Ｅ4、Ｅ3Ｅ5、Ｅ4Ｅ5、Ｅ1Ｅ2Ｅ3、Ｅ1Ｅ2Ｅ4、Ｅ1Ｅ2Ｅ5、Ｅ1Ｅ3Ｅ4、Ｅ1Ｅ3Ｅ5、Ｅ1Ｅ4Ｅ5、Ｅ2Ｅ3Ｅ4、Ｅ2Ｅ4Ｅ5、Ｅ3Ｅ4Ｅ5及びＥ1Ｅ2Ｅ3Ｅ4Ｅ5、
特に
Ｅ1Ｅ2、Ｅ1Ｅ3、Ｅ1Ｅ4、Ｅ1Ｅ5、Ｅ2Ｅ3、Ｅ2Ｅ4、Ｅ2Ｅ5、Ｅ3Ｅ4、Ｅ3Ｅ5、Ｅ4Ｅ5及びＥ1Ｅ2Ｅ3Ｅ4Ｅ5が好ましい。
【００３１】
ｎ＝０を有する一般式（Ｉａ）のソホロリピッドの製造には可能な限り少ない酵素活性の酵素Ｅ3が細胞中に存在することが望ましい。従って、本発明の細胞の一定の実施態様においては酵素Ｅ3の変更した活性は減少した活性である。
【００３２】
この関連において本発明により、酵素Ｅ3の減少した活性を有し、かつ場合によって同時に少なくとも１の酵素Ｅ1、Ｅ2、Ｅ4及びＥ5の増加した活性を有する細胞が好ましく、特に、酵素Ｅ3の減少した活性の他に次の酵素組み合わせの増加した活性を有する：
Ｅ1Ｅ2、Ｅ1Ｅ4、Ｅ1Ｅ5、Ｅ2Ｅ4、Ｅ2Ｅ5、Ｅ4Ｅ5、Ｅ1Ｅ2Ｅ4、Ｅ1Ｅ2Ｅ5、Ｅ1Ｅ4Ｅ5及びＥ1Ｅ2Ｅ4Ｅ5、特に好ましくは
Ｅ1Ｅ2、Ｅ1Ｅ4、Ｅ1Ｅ5、Ｅ2Ｅ4、Ｅ2Ｅ5、Ｅ4Ｅ5及びＥ1Ｅ2Ｅ4Ｅ5。
【００３３】
この関連において、本発明の細胞は好ましくはカンジダ・ボンビコラ細胞、カンジダ・ボゴリエンシス細胞、カンジダ・バチステ細胞、カンジダ・アピコラ細胞又はウイッカーハミーラ・ドメルキー細胞である。
【００３４】
更に好ましくは、ここでは、配列番号６及び参照配列  配列番号６に対して少なくとも８０％、特に好ましくは少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９９％同一である配列からなる群から選択される核酸配列を含む遺伝子の改変により酵素活性の減少を達成する本発明の細胞であり、その際、前記改変は次のものを含むか、好ましくは次のものからなる群から選択されている：遺伝子中への外来ＤＮＡの挿入、遺伝子の少なくとも一部の欠失、遺伝子配列中の点突然変異、ＲＮＡ干渉（ｓｉＲＮａ）、アンチセンスＲＮＡ又は前記遺伝子に隣接する制御配列の改変（挿入、欠失又は点突然変異）。
【００３５】
このような細胞の製造に適した核酸は例えば配列番号１６を有するものであり、これは同様に本発明の主題である。
【００３６】
Ｒ1及びＲ2が同時にＨを有する一般式（Ｉａ）又は（Ｉｂ）のソホロリピッドの製造には可能な限り少ない酵素活性の酵素Ｅ4が細胞中に存在することが望ましい。従って、本発明の細胞の一定の実施態様においては酵素Ｅ4の変更した活性は減少した活性である。
【００３７】
この関連において本発明により、少なくとも１の酵素Ｅ4の減少した活性を有し、かつ場合によって同時に少なくとも１の酵素Ｅ1、Ｅ2、Ｅ3及びＥ5の増加した活性を有する細胞が好ましく、特に、酵素Ｅ4の減少した活性の他に次の酵素組み合わせの増加した活性を有する：
Ｅ1Ｅ2、Ｅ1Ｅ3、Ｅ1Ｅ5、Ｅ2Ｅ3、Ｅ2Ｅ5、Ｅ3Ｅ5、Ｅ1Ｅ2Ｅ3、Ｅ1Ｅ2Ｅ5、Ｅ1Ｅ3Ｅ5及びＥ1Ｅ2Ｅ3Ｅ5、特に好ましくは
Ｅ1Ｅ2、Ｅ1Ｅ3、Ｅ1Ｅ5、Ｅ2Ｅ3、Ｅ3Ｅ5、及びＥ1Ｅ2Ｅ3Ｅ5。
【００３８】
この関連において、本発明の細胞は好ましくはカンジダ・ボンビコラ細胞、カンジダ・ボゴリエンシス細胞、カンジダ・バチステ細胞、カンジダ・アピコラ細胞又はウイッカーハミーラ・ドメルキー細胞である。
【００３９】
更に好ましくは、ここでは、配列番号４及び配列番号４に対して少なくとも８０％、特に好ましくは少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９９％同一である配列からなる群から選択される核酸配列を含む遺伝子の改変により酵素活性の減少を達成する本発明の細胞であり、その際、前記改変は次のものを含むか、好ましくは次のものからなる群から選択されている：遺伝子中への外来ＤＮＡの挿入、遺伝子の少なくとも一部の欠失、遺伝子配列中の点突然変異、ＲＮＡ干渉（ｓｉＲＮａ）、アンチセンスＲＮＡ又は前記遺伝子に隣接する制御配列の改変（挿入、欠失又は点突然変異）。
【００４０】
このような細胞の製造に適した核酸は例えば配列番号１４を有するものであり、これは同様に本発明の主題である。
【００４１】
ｎ＝０及びＲ1＝Ｈを有する一般式（Ｉａ）のソホロリピッドの製造には可能な限り少ない酵素活性の酵素Ｅ3及びＥ4が細胞中に存在することが望ましい。従って、本発明の細胞の一定の実施態様においては酵素Ｅ3及びＥ4の変更した活性は減少した活性である。この関連において本発明により、そのつど少なくとも１の酵素Ｅ3及びＥ4の減少した活性を有し、かつ同時に少なくとも１の酵素Ｅ1、Ｅ2及びＥ5の増加した活性を有する細胞が好ましく、特に、そのつど少なくとも１の酵素Ｅ3及びＥ4の減少した活性の他に次の酵素組み合わせの増加した活性である：
Ｅ1Ｅ2、Ｅ1Ｅ5、Ｅ2Ｅ5、Ｅ1Ｅ2Ｅ5、
特に好ましくは
Ｅ1Ｅ2、Ｅ1Ｅ5及びＥ2Ｅ5。
【００４２】
この関連において、本発明の細胞は好ましくはカンジダ・ボンビコラ細胞、カンジダ・ボゴリエンシス細胞、カンジダ・バチステ細胞、カンジダ・アピコラ細胞又はウイッカーハミーラ・ドメルキー細胞である。
【００４３】
更に好ましくは、ここでは、配列番号４及び配列番号４に対して少なくとも８０％、特に好ましくは少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９９％同一である配列からなる群から選択される核酸配列を含む遺伝子
及び
配列番号６及び参照配列  配列番号６に対して少なくとも８０％、特に好ましくは少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９９％同一である配列からなる群から選択される核酸配列を含む遺伝子
の改変により酵素活性の減少を達成する本発明の細胞であり、
その際、前記改変は次のものを含む、好ましくは次のものからなる群から選択されている：
遺伝子中への外来ＤＮＡの挿入、遺伝子の少なくとも一部の欠失、遺伝子配列中の点突然変異、ＲＮＡ干渉（ｓｉＲＮａ）、アンチセンスＲＮＡ又は前記遺伝子に隣接する制御配列の改変（挿入、欠失又は点突然変異）。
【００４４】
このような細胞の製造に適した核酸は例えば配列番号１４及び１６を有するものである。
【００４５】
細胞中の酵素活性の増加のための次の実施態様は、酵素Ｅ1〜Ｅ5の活性の増加についても、同様に、その活性が場合によって高められていてよい以下挙げる酵素全てについても当てはまる。
【００４６】
原則的に、酵素活性の増加は、酵素をコードする１又は複数の遺伝子配列のコピー数を高めること、強力プロモーターを使用すること、遺伝子のコドン利用を変更すること、ｍＲＮＡ又は酵素の半値時間を様々な手法で高めること、遺伝子の発現の制御を改変すること、又は増加した活性を有する相応する酵素をコードする遺伝子若しくはアレルを利用すること、そして場合によってこれら処置を組み合わせること、により達成される。本発明により遺伝子工学により変更された細胞は、例えば形質転換、形質導入、コンジュゲーション、又はこの方法と、所望の遺伝子、この遺伝子のアレル又はその部分及びこの遺伝子の発現を可能にするプロモーターを含むベクターの組み合わせによる。非相同性発現は特に、細胞の染色体中への又は染色体外複製ベクター中への遺伝子又はアレルの組込によって達成される。
【００４７】
細胞中の酵素活性を高めるための手段に関する概要を、イソシトラートリアーゼ（Isocitratlyase）を例にとってEP0839211は挙げており、当該文献はここで参照として導入され、そして、細胞中の酵素活性の向上のための手段に関するその開示内容は本発明の開示の一部を構成する。
【００４８】
前述の及び以下に挙げる全ての酵素又は遺伝子の発現は、１次元及び２次元のタンパク質泳動分離及び相応する評価ソフトウェアを用いたタンパク質濃度の引き続く光学的同定を用いてゲル中で検出可能である。酵素活性の向上が相応する遺伝子の発現の向上のみを基礎とする場合には、酵素活性の向上の定量化は野生型と遺伝子工学により変更した細胞の間の１次元又は２次元のタンパク質分離の比較によって簡易に決定されることができる。コリネホルム細菌でのタンパク質ゲルの調製のための及びこのタンパク質の同定のための慣用法は、Hermann et al. (Electrophoresis , 22: 1712.23 (2001)が記載したやり方である。タンパク質濃度は、同様に、検出すべきタンパク質に特異的な抗体を用いたウェスタンブロットハイブリダイゼーション（Sambrook et al., Molecular Cloning: a laboratory manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. USA, 1989)及び濃度決定のための相応するソフトウェアを用いた引き続く光学的評価(Lohaus及びMeyer (1989) Biospektrum, 5: 32-39; Lottspeich (1999), Angewandte Chemie 111: 2630-2647）によって分析できる。ＤＮＡ結合性タンパク質の活性はＤＮＡバンドシフトアッセイ（ゲル遅延とも呼ばせる）を用いて測定されることができる（Wilson et al. (2001) Journal of Bacteriology, 183: 2151-2155）。他の遺伝子の発現に対するＤＮＡ結合性タンパク質の作用は、十分に記載される様々なリポーター遺伝子アッセイ方法により検出されることができる（Sambrook et al., Molecular Cloning: a laboratory manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. USA, 1989）。細胞内（特異的）酵素活性は、様々な記載の方法（Donahue et al. (2000) Journal of Bacteriology 182 (19): 5624-5627; Ray et al. (2000) Journal of Bacteriology 182 (8): 2277-2284; Freedberg et al. (1973) Journal of Bacteriology 115 (3) : 816-823）により決定されることができる。以下の実施態様において所定の酵素の活性の具体的な決定方法が挙げられていない場合には、酵素活性の増加の決定も酵素活性の減少の決定も好ましくはHermann et al., Electrophoresis , 22: 1712-23 (2001), Lohaus et al., Biospektrum 5 32-39 (1998), Lottspeich, Angewandte Chemie 111: 2630-2647 (1999)及びWilson et al., Journal of Bacteriology 183: 2151-2155 (2001)に記載の方法を用いて行われる。
【００４９】
酵素活性の向上が内在性遺伝子の突然変異によって実行される場合には、この種の突然変異は典型的な方法に応じて、指向しないで、例えばＵＶ照射によって又は突然変異作動性化学薬品によって、又は、遺伝子工学的方法を用いて指向させて、例えば１又は複数の欠失、１又は複数の挿入及び／又は１又は複数のヌクレオチド交換によって、生じさせられることができである。この突然変異によって改変した細胞が得られる。
【００５０】
酵素の特に好ましい突然変異は特に、もはやフィードバック阻害可能でないか又は野生型酵素に比較してフィードバック阻害性が少なくとも減少している酵素でもある。
【００５１】
酵素活性の向上が酵素の合成の向上により実行される場合には、例えば、相応する遺伝子のコピー数を高めるか、又はプロモーター領域及び制御領域又はリボソーム結合部位（構造遺伝子の上流にある）を突然変異する。同様に、前記構造遺伝子の上流に導入される発現カセットが作用する。更に、誘導可能なプロモーターによって、発現を任意の時間点で増加させることが可能である。更に、酵素遺伝子には制御配列もいわゆる「エンハンサー」も配置されていることができ、これはＲＮＡポリメラーゼ及びＤＮＡの間の改善された相互作用を介して同様に向上した遺伝子発現を引き起こす。ｍＲＮＡの寿命の延長のための処置により、同様に前記発現が改善される。更に、この酵素の分解の防止により、同様に前記酵素活性は増強される。遺伝子又は遺伝子コンストラクトは、この場合に、種々異なるコピー数を有するプラスミド中に存在するか又は染色体に組み込まれそして増幅される。又は、更に、この遺伝子の過剰発現は、この培地組成及び培養操作の変更により達成されてよい。当業者はこれに関するマニュアルを、特にMartin et al. (Bio/Technology 5, 137-146 (1987)), Guerrero et al.(Gene 138, 35-41 (1994)), Tsuchiya及びMorinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1988)), Eikmanns et al. (Gene 102, 93-98 (1991))、EP-A-0 472 869において、US 4,601,893において、Schwarzer及びPuehler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991)で、Reinscheid et al.(Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994))で、LaBarre et al.(Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993))で、WO-A-96/15246において、Malumbres et al.(Gene 134, 15-24 (1993)で、JP-A-10-229891において、Jensen及びHammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998))で、そして遺伝子学及び分子生物学の既知の教科書において見出す。前記した処置は突然変異と同様に遺伝子工学的に改変した細胞に導く。
【００５２】
それぞれの遺伝子の発現の向上には、例えばエピソームプラスミドが使用される。プラスミド又はベクターとして、原則的に当業者にこの目的のために使用される全ての実施態様が考慮される。この種のプラスミド及びベクターは、例えばNovagen, Promega, New England Biolabs, Clontech又はGibco BRL社のパンフレットから把握することができる。更なる好ましいプラスミド及びベクターは以下に見出されることができる：Glover, D. M. (1985), DNA cloning: a practical approach, Vol. I-III, IRL Press Ltd., Oxford; Rodriguez, R.L.及びDenhardt, D. T (eds) (1988), Vectors : a survey of molecular cloning vectors and their uses, 179-204, Butterworth, Stoneham; Goeddel, D. V. (1990), Systems for heterologous gene expression, Methods Enzymol. 185, 3-7; Sambrook, J.; Fritsch, E. F.及びManiatis, T. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York。
【００５３】
ベクター、例えば発現ベクター、遺伝子欠失カセット、遺伝子挿入カセット又は遺伝子過剰発現カセットは、増幅すべき遺伝子又は不活性化すべき遺伝子の部分を含み、引き続き、形質転換によって所望の株中へと移される。形質転換、特にエレクトロポレーション、酢酸リチウム媒介形質転換、凍結融解形質転換の方法は例えばGietz, R.D., Schiestl, R.H. (2007). Frozen competent yeast cells that can be transformed with high efficiency using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nat Protoc. 2:1-4; Suga, M., Hatakeyama, T. (2003). High-efficiency electroporation by freezing intact yeast cells with addition of calcium. Curr Genet. 43:206-211; Hubberstey, A.V., Wildeman, A.G. (1991).Transformation of Saccharomyces cerevisiae by use of frozen spheroplasts . Trends Genet. 7:41; Broeker, M. (1993). Rapid transformation of cryopreserved competent Schizosaccharomyces pombe cells. Biotechniques . 15:598 600; Gietz, R.D., Schiestl, R.H. (1989). High efficiency transformation of intact yeast cells using Single stranded nucleic acids as a carrier. Curr Genet. 16:339-346及び"Nonconventional yeast in biotechnology" (Hrsg. Klaus Wolf, Springer-Verlag Berlin, 1996)に記載されている。形質転換により、ベクター、特に遺伝子欠失カセット、遺伝子挿入カセット又は遺伝子発現カセットを、相同性又は非相同性の、好ましくは相同性の組み換えによって、「cross-over」結果を用いて所望の株の染色体中に組み込む。代替的に、ベクター、特に発現ベクターは、エピソーム的にも、すなわち、独立した複製単位として、所望の株の細胞中で複製する。全ての場合において、ベクター、例えば発現ベクター、遺伝子欠失カセット、遺伝子挿入カセット又は遺伝子過剰発現カセットが細胞分裂の際に娘細胞にも受け渡されることが保証されている。
【００５４】
前述し、かつ後述する説明で使用される書き方「その野生型に比較して増加した酵素Ｅxの活性」は、好ましくは常に少なくとも１．５倍、特に好ましくは少なくとも１０倍、更に好ましくは少なくとも１００倍、更により好ましくは少なくとも１０００倍、最も好ましくは少なくとも１００００倍だけ増加したそのつどの酵素Ｅxの活性を理解すべきである。更に、「その野生型に比較して増加した酵素Ｅxの活性」を有する本発明の細胞は特に、その野生型が酵素Ｅxの活性を有しないか又は少なくとも酵素Ｅxの検出可能な活性を有さず、この酵素Ｅxの検出可能な活性を酵素活性の向上（例えば過剰発現による）後に初めて示す細胞も含む。この関連において、「過剰発現」又は以下の説明で使用される書き方「発現の向上」との概念は、出発細胞、例えば野生型細胞が、発現を示さないか又は少なくとも検出可能な発現を示さず、かつ組み換え方法により初めて酵素Ｅxの検出可能な合成が誘発される場合をも含む。
【００５５】
使用される書き方「酵素Ｅxの減少した活性」は、相応して好ましくは、少なくとも０．５倍、特に好ましくは少なくとも０．１倍、さらに好ましくは少なくとも０．０１倍、さらにいっそう好ましくは少なくとも０．００１倍、最も好ましくは少なくとも０．０００１倍だけ減少した活性が理解される。「減少した活性」との書き方は、検出可能でない活性（「ゼロの活性」）も包含する。所定の酵素の活性の減少は、例えば、狙いを定めた突然変異によって又は所定の酵素の活性の減少のための当業者に知られている他の処置によって、行われることができる。
【００５６】
微生物中で酵素活性を減少させる方法は当業者に知られている。
【００５７】
特に分子生物学による技術はここで適当である。特別にカンジダのための、特に特殊な遺伝子の遮断のためのタンパク質発現の改変及び減少及びこれに不随する酵素活性減少のためのマニュアルを、当業者はWO91/006660及びWO03/100013に見出す。
【００５８】
本発明により好ましい細胞は、酵素活性の減少が、前述の核酸配列の１を含む遺伝子の改変により達成されることにより特徴付けられており、その際、前記改変は、遺伝子中への外来ＤＮＡの挿入、遺伝子の少なくとも一部の欠失、遺伝子配列中の点突然変異、ＲＮＡ干渉（ｓｉＲＮａ）、アンチセンスＲＮＡ又は前記遺伝子に隣接する制御配列の改変（挿入、欠失又は点突然変異）を含む群か、好ましくはこれらからなる群から選択されている。
【００５９】
外来ＤＮＡとは、この関連において、この遺伝子（この生物に対してでない）に対して「外来」性である全てのＤＮＡ配列を理解でき、すなわち、カンジダ・ボンビコラ内在性ＤＮＡ配列もこの関連において「外来ＤＮＡ」として機能する。
【００６０】
この関連において、遺伝子が選択マーカー遺伝子の挿入によって中断され、従って、外来ＤＮＡが選択マーカー遺伝子であることが特に好ましく、その際、好ましくは、この挿入は遺伝子座中への相同性組み換えによって行われている。
【００６１】
本発明により好ましい細胞は、少なくとも１の、以下に記載の本発明の核酸又は以下に記載の本発明のベクターが形質転換されていることによって特徴付けられている。
【００６２】
本発明の細胞は好ましくはソホロリピッドの製造に使用される。
【００６３】
従って、本発明の更なる主題は、一般式（Ｉａ）及び（Ｉｂ）の化合物：
［式中、
Ｒ1＝Ｈ又はＣＯ−ＣＨ3、
Ｒ2＝Ｈ又はＣＯ−ＣＨ3、
Ｒ3＝非置換の又はヒドロキシ官能性で置換した、非分枝の、場合によって１〜３個の二重結合又は三重結合を含有する二価有機基であって、６〜３２個、好ましくは７〜１９個の炭素原子を含むもの
Ｒ4＝Ｈ、ＣＨ3又は非置換の又はヒドロキシ官能性で置換した、非分枝の、場合によって１〜３個の二重結合又は三重結合を含有する一価有機基であって、２〜１０個の炭素原子を含むもの、及び
ｎ＝０又は１である］、
特に一般式（Ｉａ）及び（Ｉｂ）の次の化合物：
［式中、
Ｒ1＝Ｈ又はＣＯ−ＣＨ3、
Ｒ2＝Ｈ又はＣＯ−ＣＨ3、
Ｒ3＝非置換の又はヒドロキシ官能性で置換した、非分枝の、場合によって１〜３個の二重結合又は三重結合を含有する二価有機基であって、６〜３２個、好ましくは７〜１９個の炭素原子を含むもの
Ｒ4＝Ｈ、ＣＨ3又はＣ9Ｈ19、
ｎ＝０又は１である］、
特にとりわけ好ましくは一般式（Ｉａ）及び（Ｉｂ）の化合物：
［式中、
Ｒ1＝Ｈ又はＣＯ−ＣＨ3、
Ｒ2＝Ｈ又はＣＯ−ＣＨ3、
Ｒ3＝非置換の又はヒドロキシ官能性で置換した、非分枝の、場合によって１〜３個の二重結合又は三重結合を含有する二価有機基であって、６〜３２個、好ましくは７〜１９個の炭素原子を含むもの、とりわけＣ8Ｈ15＝Ｃ7Ｈ14
Ｒ4＝Ｈ、ＣＨ3又はＣ9Ｈ19、特にＨ又はＣＨ3、及び
ｎ＝１である］
の製造のための、本発明の細胞の使用である。
【００６４】
本発明の更なる一主題は、ソホロリピッド、好ましくは一般式（Ｉａ）及び（Ｉｂ）の化合物の製造方法
［式中、
Ｒ1＝Ｈ又はＣＯ−ＣＨ3、
Ｒ2＝Ｈ又はＣＯ−ＣＨ3、
Ｒ3＝非置換の又はヒドロキシ官能性で置換した、非分枝の、場合によって１〜３個の二重結合又は三重結合を含有する二価有機基であって、６〜３２個、好ましくは７〜１９個の炭素原子を含むもの
Ｒ4＝Ｈ、ＣＨ3又は非置換の又はヒドロキシ官能性で置換した、非分枝の、場合によって１〜３個の二重結合又は三重結合を含有する一価有機基であって２〜１０個の炭素原子を含むもの、及び
ｎ＝０又は１である］、
特に一般式（Ｉａ）及び（Ｉｂ）の次の化合物の製造方法：
［式中、
Ｒ1＝Ｈ又はＣＯ−ＣＨ3、
Ｒ2＝Ｈ又はＣＯ−ＣＨ3、
Ｒ3＝非置換の又はヒドロキシ官能性で置換した、非分枝の、場合によって１〜３個の二重結合又は三重結合を含有する二価有機基であって、６〜３２個、好ましくは７〜１９個の炭素原子を含むもの
Ｒ4＝Ｈ、ＣＨ3又はＣ9Ｈ19、及び
ｎ＝０又は１である］、
特にとりわけ好ましくは一般式（Ｉａ）及び（Ｉｂ）の化合物の製造方法：
［式中、
Ｒ1＝Ｈ又はＣＯ−ＣＨ3、
Ｒ2＝Ｈ又はＣＯ−ＣＨ3、
Ｒ3＝非置換の又はヒドロキシ官能性で置換した、非分枝の、場合によって１〜３個の二重結合又は三重結合を含有する二価有機基であって、６〜３２個、好ましくは７〜１９個の炭素原子を含むもの、とりわけＣ8Ｈ15＝Ｃ7Ｈ14
Ｒ4＝Ｈ、ＣＨ3又はＣ9Ｈ19、特にＨ又はＣＨ3、及び
ｎ＝１である］
であって、次の方法工程
Ｉ）本発明の細胞を炭素源を含む培地と接触させる工程、
ＩＩ）細胞に前記炭素源からソホロリピッドを形成することを可能にさせる条件下で、細胞を培養する工程、及び
ＩＩＩ）場合によって、この形成されたソホロリピッドを単離する工程
を含むものである。
【００６５】
本発明の、遺伝子工学により改変した細胞は、連続的に又は不連続的に、バッチ法（バッチ培養）で又はフェドバッチ法（流加培養法）で又は反復フェドバッチ法（繰り返し流加回分法）で、前述した生成物の製造の目的で栄養培地と接触させられ、従って培養されることができる。GB-A-1009370に記載されている半連続方法も考えることができる。既知の培養方法に関する要約は、Chmielによる教科書(Bioprozesstechnik 1. Einfuehrung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991))又はStorhasによる教科書(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994))に記載されている。
【００６６】
使用すべき培養培地は適したように、それぞれの株の要求を満足しなくてはならない。様々な酵母株の培養培地の説明は例えば"Nonconventional yeast in biotechnology" (Hrsg. Klaus Wolf, Springer-Verlag Berlin, 1996)に含まれている。
【００６７】
炭素源として、炭水化物、例えばグルコース、サッカロース、アラビノース、キシロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、糖蜜、デンプン、セルロース及び半セルロース、植物性及び動物性油脂、例えばダイズ油、アザミ油、ピーナッツ油、麻油、ジャトロファ油、ココナッツ脂、カボチャシード油、あまに油、トウモロコシ油、けし油、月見草油、オリーブ油、パームシード油、パーム油、ナタネ油、ゴマ油、ヒマワリ油、グレープシード油、クルミ油、コムギ胚芽油（Weizenkeimoel）及びヤシ脂、脂肪酸、例えばカプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、パルミトオレイン酸、ステアリン酸、アラキドン酸、ベヘン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、ガンマ−リノレン酸及びそのメチル−又はエチルエステル並びに脂肪酸混合物、モノ−、ジ−及びトリグリセリドであって前述の脂肪酸を有するもの、アルコール、例えばグリセリン、エタノール及びメタノール、炭化水素、例えばメタン、炭素含有ガス及びガス混合物、例えばＣＯ、ＣＯ2、合成ガス又は排ガス、アミノ酸、例えばＬ−グルタミン酸又はＬ−バリン又は有機酸、例えば酢酸が使用されることができる。これらの物質は単独で又は混合物として使用されてよい。
【００６８】
特に好ましくは炭水化物の使用であり、特に単糖、オリゴ糖又は多糖の使用であり、これは炭素源として例えばUS 6,01,494及びUS 6,136,576に記載され、並びに、炭化水素、特にアルカン、アルケン及びアルキン並びにここから誘導されるモノカルボン酸及びこのモノカルボン酸から誘導されるモノ−、ジ−及びトリグリセリド、並びにグリセリン及びアセタートの使用である。特にとりわけ好ましくは、グリセリンとカプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、パルミトオレイン酸、ステアリン酸、アラキドン酸、ベヘン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸及び／又はγ−リノレン酸とのエステル化生成物を含むモノ−、ジ−及びトリグリセリドである。
【００６９】
窒素源として、有機窒素含有化合物、例えばペプトン、酵母エキス、肉エキス、麦芽エキス、コーンスティープリカー、大豆粉及び尿素、又は無機化合物、例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウム、アンモニア、水酸化アンモニウム又はアンモニア水が使用できる。前記窒素源は、単独で又は混合物として使用できる。
【００７０】
リン源として、リン酸、リン酸二水素カリウム又はリン酸水素二カリウム又はこの相応するナトリウム含有塩が使用できる。前記培養培地は更に、金属塩、例えば硫酸マグネシウム又は硫酸鉄を含有することが必要であり、これらは成長に必要である。
【００７１】
最後に、必須栄養成長物質、例えばアミノ酸及びビタミンを上述の物質に加えて使用できる。培養培地にはその上適した前駆物質が添加されることができる。上述の使用物質は、１回のバッチの形で培養物に添加するか、適した方法で、この培養の間に供給できる。前記培養物のｐＨ調節のために、塩基性化合物、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア又はアンモニア水、又は酸性化合物、例えばリン酸又は硫酸を適した方法で使用する。泡発生の調節のために、消泡剤、例えば脂肪酸ポリグリコールエステルが使用できる。プラスミドの安定性の維持のために、前記培地に、選択的に作用する適した物質、例えば抗生物質を添加できる。好気的条件を維持するために、酸素又は酸素含有混合物、例えば空気を前記培養物に導入する。
【００７２】
培養物の温度は通常は２０℃超、好ましくは２５℃超であり、そして４０℃超であってもよく、その際、好ましくは９５℃、特に好ましくは９０℃、最も好ましくは８０℃の培養温度を超えない。
【００７３】
本発明の方法の工程ＩＩＩ）において、細胞により形成されるソホロリピッドは場合によって細胞及び／又は栄養培地から単離されることができ、その際、単離には複雑な組成物から低分子量物質を単離するための当業者に知られている全ての方法が考慮され、例えば濾過、抽出、吸着（クロマトグラフィ）又は結晶化である。ソホロリピッドの後処理は、通常は生成物流に依存して行われる。水不溶性のラクトン形で存在するソホロリピッドの場合には、以下のやり方が適している：水相からのラクトン形の生成物の分離を遠心分離によって行う。
【００７４】
さらに、この生成物相は、バイオマス及び様々な不純物、例えば油、脂肪酸及び他の栄養培地成分の残分を含む。油残分は、例えば適した溶媒を用いた、好ましくは有機溶媒を用いた抽出により分離されることができる。好ましくは溶媒としてアルカン、例えばｎ−ヘキサンである。水相からの生成物の分離は、例えば適したエステルを用いて、例えば酢酸エチルを用いて行うことができる。前述の抽出工程は任意の順序で実施できる。
【００７５】
代替的に、栄養培地からのソホロリピッドの精製は、水溶性の開放酸型へのラクトン形の移行によって行うことができる。例えば、開放酸型への移行は、加水分解、好ましくはアルカリ性加水分解を用いて行われる。引き続き、この開放鎖状ソホロリピッドは、場合によって形成される酸を溶液中で分離するために、水性酸、好ましくは水性硫酸中で溶解される。生成物の更なる精製を抽出を用いて行う。ここで、好ましくは溶媒、特に有機溶媒が使用される。好ましくは溶媒としてｎ−ペンタノールである。溶媒の除去のために例えば蒸留を行う。
【００７６】
引き続き、凍結乾燥した生成物を、例えばクロマトグラフィ法を用いて更に精製できる。例示的に、この箇所では、適した溶媒を用いた沈殿、適した溶媒を用いた抽出、複合体化、例えばシクロデキストリン又はシクロデキストリン誘導体を用いた複合体化、結晶化、クロマトグラフィ法を用いた精製又は単離、又はソホロリピッドを容易に分離可能な誘導体に移行することが挙げられる。
【００７７】
本発明の方法で製造したソホロリピッドは、好ましくは清浄化剤において、化粧品又は医薬品調製物において、並びに植物保護調製物において使用される。
【００７８】
従って、本発明の更なる主題は、化粧用、皮膚用又は医薬用調製物の、植物保護調製物の並びにケア剤及び清浄化剤及び界面活性剤濃縮物の製造のための本発明の方法で得られるソホロリピッドの使用である。
【００７９】
「ケア剤」との概念には、ここでは、その本来の形で対象物を得るか、外部影響の作用（例えば時間、光、温度、圧力、汚染、当該対象物と接触する他の反応性化合物との化学反応）、例えば老化、汚染、材料疲労、退色を減少するか又は回避するか、又はそれどころか対象物の所望の好ましい特性を改善さえもする、という目的を満たす調製物が理解される。後者の観点については、例えば改善された髪光沢又は観察される対象物のより大きな弾性が挙げられる。
【００８０】
「植物保護調製物」とは、その手入れの仕方に応じて歴然と植物保護に使用される調製物が理解される；このことは特に、除草剤、殺菌剤、殺虫剤、殺ダニ剤、殺線虫剤、鳥被害に対する保護物質、植物栄養物質及び土壌構造改善剤の類からの少なくとも１の化合物が調製物中に含まれている場合である。
【００８１】
本発明により好ましくは本発明の方法で製造したソホロリピッドを、家庭、工業のために、特に硬質表面、皮革又はテキスタイルのために、ケア剤及び清浄化剤において使用する。
【００８２】
前記課題の解決には、次の配列から選択されている単離ＤＮＡが寄与する：
Ａ１ａ）  配列番号２、配列番号５２又は配列番号５４、特に配列番号２に応じた配列、その際、この配列は、Ｚ−９−オクタデセン酸を１７−ヒドロキシ−Ｚ−９−オクタデセン酸へと変換できるタンパク質をコードする、
Ｂ１ａ）  Ａ１ａ）に応じた配列の１から誘導され、かつ、配列番号２、配列番号５２又は配列番号５４、特に配列番号２に応じた配列と同じタンパク質又はペプチドをコードするイントロン不含配列、
Ｃ１ａ）  配列番号７、配列番号５３又は配列番号５５、特に配列番号７に応じたアミノ酸配列を含み、かつ、好ましくは、Ｚ−９−オクタデセン酸を１７−ヒドロキシ−Ｚ−９−オクタデセン酸へと変換できるタンパク質又はペプチドをコードする配列、
Ｄ１ａ）  群Ａ１ａ）〜Ｃ１ａ）の１に応じた配列、特に好ましくは群Ａ１ａ）に応じた配列と、少なくとも８０％、特に好ましくは少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９９％同一である配列、その際、この配列は好ましくは、Ｚ−９−オクタデセン酸を１７−ヒドロキシ−Ｚ−９−オクタデセン酸へと変換できるタンパク質又はペプチドをコードする、
Ｅ１ａ）  群Ａ１ａ）〜Ｄ１ａ）の１に応じた配列、特に好ましくは群Ａ１ａ）に応じた配列の対ストランドと、ハイブリダイゼーションするか又は遺伝暗号の縮重を考慮してハイブリダイゼーションするだろう配列、その際、この配列は好ましくは、Ｚ−９−オクタデセン酸を１７−ヒドロキシ−Ｚ−９−オクタデセン酸へと変換できるタンパク質又はペプチドをコードする、
Ｆ１ａ）  少なくとも１の塩基、好ましくは少なくとも２の塩基、更に好ましくは少なくとも５の塩基、最も好ましくは少なくとも１０の塩基の、しかし、好ましくは１００を超えない塩基、特に好ましくは５０を超えない塩基、最も好ましくは２５を超えない塩基の置換、付加、逆位及び／又は欠失により得られる、群Ａ１ａ）〜Ｅ１ａ）の１に応じた、特に好ましくは群Ａ１ａ）に応じた配列の誘導体、その際、この誘導体は好ましくは、Ｚ−９−オクタデセン酸を１７−ヒドロキシ−Ｚ−９−オクタデセン酸へと変換できるタンパク質又はペプチドをコードする、及び
Ｇ１ａ）  群Ａ１ａ）〜Ｆ１ａ）の１、特に好ましくは群Ａ１ａ）に応じた配列に対する相補配列。
【００８３】
前記課題の解決には、次の配列から選択されている単離ＤＮＡが更に寄与する：
Ａ１ｂ）  配列番号５６、配列番号５８又は配列番号６０に応じた配列、その際、この配列は、Ｚ−９−オクタデセン酸を１７−ヒドロキシ−Ｚ−９−オクタデセン酸へと変換できるタンパク質をコードする、
Ｂ１ｂ）  Ａ１ｂ）に応じた配列から誘導され、かつ、配列番号５６、配列番号５８又は配列番号６０に応じた配列と同じタンパク質又はペプチドをコードするイントロン不含配列、
Ｃ１ｂ）  配列番号５７、配列番号５９又は配列番号６１に応じたアミノ酸配列を含み、かつ好ましくは、Ｚ−９−オクタデセン酸を１７−ヒドロキシ−Ｚ−９−オクタデセン酸へと変換できるタンパク質又はペプチドをコードする配列、
Ｄ１ｂ）  群Ａ１ｂ）〜Ｃ１ｂ）の１に応じた配列、特に好ましくは群Ａ１ｂ）に応じた配列と、少なくとも８０％、特に好ましくは少なくとも８６％、更に好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９９％同一である配列、その際、この配列は好ましくは、Ｚ−９−オクタデセン酸を１７−ヒドロキシ−Ｚ−９−オクタデセン酸へと変換できるタンパク質又はペプチドをコードする、
Ｅ１ｂ）  群Ａ１ｂ）〜Ｄ１ｂ）の１に応じた配列、特に好ましくは群Ａ１ｂ）に応じた配列の対ストランドと、ハイブリダイゼーションするか又は遺伝暗号の縮重を考慮してハイブリダイゼーションするだろう配列、その際、この配列は好ましくは、Ｚ−９−オクタデセン酸を１７−ヒドロキシ−Ｚ−９−オクタデセン酸へと変換できるタンパク質又はペプチドをコードする、
Ｆ１ｂ）  少なくとも１の塩基、好ましくは少なくとも２の塩基、更に好ましくは少なくとも５の塩基、最も好ましくは少なくとも１０の塩基の、しかし、好ましくは１００を超えない塩基、特に好ましくは５０を超えない塩基、最も好ましくは２５を超えない塩基の置換、付加、逆位及び／又は欠失により得られる、群Ａ１ｂ）〜Ｅ１ｂ）の１に応じた、特に好ましくは群Ａ１ｂ）に応じた配列の誘導体、その際、この誘導体は好ましくは、Ｚ−９−オクタデセン酸を１７−ヒドロキシ−Ｚ−９−オクタデセン酸へと変換できるタンパク質又はペプチドをコードする、及び
Ｇ１ｂ）  群Ａ１ｂ）〜Ｆ１ｂ）の１、特に好ましくは群Ａ１ｂ）に応じた配列に対する相補配列。
【００８４】
前記課題の解決には、次の配列から選択されている単離ＤＮＡが更に寄与する：
Ａ１ｃ）  配列番号６２に応じた配列、その際、この配列は、Ｚ−９−オクタデセン酸を１７−ヒドロキシ−Ｚ−９−オクタデセン酸へと変換できるタンパク質をコードする、
Ｂ１ｃ）  Ａ１ｃ）に応じた配列から誘導され、かつ、配列番号６２に応じた配列と同じタンパク質又はペプチドをコードするイントロン不含配列、
Ｃ１ｃ）  配列番号６３に応じたアミノ酸配列を含み、かつ好ましくは、Ｚ−９−オクタデセン酸を１７−ヒドロキシ−Ｚ−９−オクタデセン酸へと変換できるタンパク質又はペプチドをコードする配列、
Ｄ１ｃ）  群Ａ１ｃ）〜Ｃ１ｃ）の１に応じた配列、特に好ましくは群Ａ１ｃ）に応じた配列と、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも８５％、更に好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９９％同一である配列、その際、この配列は好ましくは、Ｚ−９−オクタデセン酸を１７−ヒドロキシ−Ｚ−９−オクタデセン酸へと変換できるタンパク質又はペプチドをコードする、
Ｅ１ｃ）  群Ａ１ｃ）〜Ｄ１ｃ）の１に応じた配列、特に好ましくは群Ａ１ｃ）に応じた配列の対ストランドと、ハイブリダイゼーションするか又は遺伝暗号の縮重を考慮してハイブリダイゼーションするだろう配列、その際、この配列は好ましくは、Ｚ−９−オクタデセン酸を１７−ヒドロキシ−Ｚ−９−オクタデセン酸へと変換できるタンパク質又はペプチドをコードする、
Ｆ１ｃ）  少なくとも１の塩基、好ましくは少なくとも２の塩基、更に好ましくは少なくとも５の塩基、最も好ましくは少なくとも１０の塩基の、しかし、好ましくは１００を超えない塩基、特に好ましくは５０を超えない塩基、最も好ましくは２５を超えない塩基の置換、付加、逆位及び／又は欠失により得られる、群Ａ１ｃ）〜Ｅ１ｃ）の１に応じた、特に好ましくは群Ａ１ｃ）に応じた配列の誘導体、その際、この誘導体は好ましくは、Ｚ−９−オクタデセン酸を１７−ヒドロキシ−Ｚ−９−オクタデセン酸へと変換できるタンパク質又はペプチドをコードする、及び
Ｇ１ｃ）  群Ａ１ｃ）〜Ｆ１ｃ）の１、特に好ましくは群Ａ１ｃ）に応じた配列に対する相補配列。
【００８５】
本発明の更なる主題は、次の配列から選択されている単離ＤＮＡである：
Ａ２）  配列番号３に応じた配列、その際、この配列は、ＵＤＰ−グルコース及び１７−ヒドロキシ−Ｚ−９−オクタデセン酸を１７−（β−Ｄ−グルコピラノシル−オキシ）−Ｚ−９−オクタデセン酸へと変換できるタンパク質をコードする、
Ｂ２）  Ａ２）に応じた配列から誘導され、かつ、配列番号３に応じた配列と同じタンパク質又はペプチドをコードするイントロン不含配列、
Ｃ２）  配列番号８に応じたアミノ酸配列を含み、かつ好ましくは、ＵＤＰグルコース及び１７−ヒドロキシ−Ｚ−９−オクタデセン酸を１７−（β−Ｄ−グルコピラノシル−オキシ）−Ｚ−９−オクタデセン酸へと変換できるタンパク質又はペプチドをコードする配列、
Ｄ２）  群Ａ２）〜Ｃ２）の１に応じた配列、特に好ましくは群Ａ２）に応じた配列と、少なくとも８０％、特に好ましくは少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９９％同一である配列、その際、この配列は好ましくは、ＵＤＰグルコース及び１７−ヒドロキシ−Ｚ−９−オクタデセン酸を１７−（β−Ｄ−グルコピラノシル−オキシ）−Ｚ−９−オクタデセン酸へと変換できるタンパク質又はペプチドをコードする、
Ｅ２）  群Ａ２）〜Ｄ２）の１に応じた配列、特に好ましくは群Ａ２）に応じた配列の対ストランドと、ハイブリダイゼーションするか又は遺伝暗号の縮重を考慮してハイブリダイゼーションするだろう配列、その際、この配列は好ましくは、ＵＤＰグルコース及び１７−ヒドロキシ−Ｚ−９−オクタデセン酸を１７−（β−Ｄ−グルコピラノシル−オキシ）−Ｚ−９−オクタデセン酸へと変換できるタンパク質又はペプチドをコードする、
Ｆ２）  少なくとも１の塩基、好ましくは少なくとも２の塩基、更に好ましくは少なくとも５の塩基、最も好ましくは少なくとも１０の塩基の、しかし、好ましくは１００を超えない塩基、特に好ましくは５０を超えない塩基、最も好ましくは２５を超えない塩基の置換、付加、逆位及び／又は欠失により得られる、群Ａ２）〜Ｅ２）の１に応じた、特に好ましくは群Ａ２）に応じた配列の誘導体、その際、この誘導体は好ましくは、ＵＤＰグルコース及び１７−ヒドロキシ−Ｚ−９−オクタデセン酸を１７−（β−Ｄ−グルコピラノシル−オキシ）−Ｚ−９−オクタデセン酸へと変換できるタンパク質又はペプチドをコードする、及び
Ｇ２）  群Ａ２）〜Ｆ２）の１、特に好ましくは群Ａ２）に応じた配列に対する相補配列。
【００８６】
本発明の更なる一主題は、次の配列から選択されている単離ＤＮＡである：
Ａ３）  配列番号４に応じた配列、その際、この配列は、
１７−Ｌ−［（２′−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−オキシ］−Ｚ−９−オクタデセン酸−１′，４″−ラクトン及びアセチル−補酵素Ａを１７−Ｌ−［（２′−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−オキシ］−Ｚ−９−オクタデセン酸−１′，４″−ラクトン−モノアセタートへと、
又は、１７−Ｌ−［（２′−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−オキシ］−Ｚ−９−オクタデセン酸−１′，４″−ラクトン−モノアセタート及びアセチル−補酵素Ａを１７−Ｌ−［（２′−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−オキシ］−Ｚ−９−オクタデセン酸−１′，４″−ラクトン−ジアセタートへと、
又は１７−Ｌ−［（２′−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−オキシ］−Ｚ−９−オクタデセン酸−１′，４″−ラクトン及びアセチル−補酵素Ａを１７−Ｌ−［（２′−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−オキシ］−Ｚ−９−オクタデセン酸−１′，４″−ラクトン−ジアセタートへと変換できるタンパク質をコードし、その際、第１のものが好ましい、
Ｂ３）  Ａ３）に応じた配列の１から誘導され、かつ、配列番号４に応じた配列と同じタンパク質又はペプチドをコードするイントロン不含配列、
Ｃ３）  配列番号９に応じたアミノ酸配列を含み、好ましくは、
１７−Ｌ−［（２′−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−オキシ］−Ｚ−９−オクタデセン酸−１′，４″−ラクトン及びアセチル−補酵素Ａを１７−Ｌ−［（２′−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−オキシ］−Ｚ−９−オクタデセン酸−１′，４″−ラクトン−モノアセタートへと、
又は、１７−Ｌ−［（２′−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−オキシ］−Ｚ−９−オクタデセン酸−１′，４″−ラクトン−モノアセタート及びアセチル−補酵素Ａを１７−Ｌ−［（２′−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−オキシ］−Ｚ−９−オクタデセン酸−１′，４″−ラクトン−ジアセタートへと、
又は１７−Ｌ−［（２′−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−オキシ］−Ｚ−９−オクタデセン酸−１′，４″−ラクトン及びアセチル−補酵素Ａを１７−Ｌ−［（２′−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−オキシ］−Ｚ−９−オクタデセン酸−１′，４″−ラクトン−ジアセタートへと変換できるタンパク質又はペプチドをコードする配列、その際、第１のものが好ましい、
Ｄ３）  群Ａ３）〜Ｄ３）の１に応じた、特に好ましくは群Ａ３）に応じた配列と少なくとも８０％、特に好ましくは少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９９％同一である配列、その際、この配列は、好ましくは
１７−Ｌ−［（２′−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−オキシ］−Ｚ−９−オクタデセン酸−１′，４″−ラクトン及びアセチル−補酵素Ａを１７−Ｌ−［（２′−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−オキシ］−Ｚ−９−オクタデセン酸−１′，４″−ラクトン−モノアセタートへと、
又は１７−Ｌ−［（２′−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−オキシ］−Ｚ−９−オクタデセン酸−１′，４″−ラクトン−モノアセタート及びアセチル−補酵素Ａを１７−Ｌ−［（２′−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−オキシ］−Ｚ−９−オクタデセン酸−１′，４″−ラクトン−ジアセタートへと、
又は１７−Ｌ−［（２′−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−オキシ］−Ｚ−９−オクタデセン酸−１′，４″−ラクトン及びアセチル−補酵素Ａを１７−Ｌ−［（２′−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−オキシ］−Ｚ−９−オクタデセン酸−１′，４″−ラクトン−ジアセタートへと変換できるタンパク質又はペプチドをコードし、その際、第１のものが好ましい、
Ｅ３）  群Ａ３）〜Ｄ３）の１に応じた、特に好ましくは群Ａ３）に応じた配列の対ストランドと、ハイブリダイゼーションするか又は遺伝暗号の縮重を考慮してハイブリダイゼーションするだろう配列、その際、この配列は、好ましくは、
１７−Ｌ−［（２′−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−オキシ］−Ｚ−９−オクタデセン酸−１′，４″−ラクトン及びアセチル−補酵素Ａを１７−Ｌ−［（２′−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−オキシ］−Ｚ−９−オクタデセン酸−１′，４″−ラクトン−モノアセタートへと、
又は、１７−Ｌ−［（２′−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−オキシ］−Ｚ−９−オクタデセン酸−１′，４″−ラクトン−モノアセタート及びアセチル−補酵素Ａを１７−Ｌ−［（２′−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−オキシ］−Ｚ−９−オクタデセン酸−１′，４″−ラクトン−ジアセタートへと、
又は、１７−Ｌ−［（２′−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−オキシ］−Ｚ−９−オクタデセン酸−１′，４″−ラクトン及びアセチル−補酵素Ａを１７−Ｌ−［（２′−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−オキシ］−Ｚ−９−オクタデセン酸−１′，４″−ラクトン−ジアセタートへと変換できるタンパク質又はペプチドをコードし、その際、第１のものが好ましい、
Ｆ３）  少なくとも１の塩基、好ましくは少なくとも２の塩基、更に好ましくは少なくとも５の塩基、最も好ましくは少なくとも１０の塩基の、しかし、好ましくは１００を超えない塩基、特に好ましくは５０を超えない塩基、最も好ましくは２５を超えない塩基の置換、付加、逆位及び／又は欠失により得られる、群Ａ３）〜Ｅ３）の１に応じた、特に好ましくは群Ａ３）に応じた配列の誘導体、その際、この誘導体は好ましくは、
１７−Ｌ−［（２′−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−オキシ］−Ｚ−９−オクタデセン酸−１′，４″−ラクトン及びアセチル−補酵素Ａを１７−Ｌ−［（２′−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−オキシ］−Ｚ−９−オクタデセン酸−１′，４″−ラクトン−モノアセタートへと、
又は、１７−Ｌ−［（２′−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−オキシ］−Ｚ−９−オクタデセン酸−１′，４″−ラクトン−モノアセタート及びアセチル−補酵素Ａを１７−Ｌ−［（２′−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−オキシ］−Ｚ−９−オクタデセン酸−１′，４″−ラクトン−ジアセタートへと、
又は、１７−Ｌ−［（２′−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−オキシ］−Ｚ−９−オクタデセン酸−１′，４″−ラクトン及びアセチル−補酵素Ａを１７−Ｌ−［（２′−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−オキシ］−Ｚ−９−オクタデセン酸−１′，４″−ラクトン−ジアセタートへと変換できるタンパク質又はペプチドをコードし、その際、第１のものが好ましい、
及び
Ｇ３）  群Ａ３）〜Ｆ３）の１、特に好ましくは群Ａ３）に応じた配列に対する相補配列。
【００８７】
本発明の更なる一主題は、次の配列から選択されている単離ＤＮＡである：
Ａ４）  配列番号５に応じた配列、その際、この配列は、ソホロリピッドを細胞から周囲媒体へと移すことができるタンパク質をコードする、
Ｂ４）  Ａ４）に応じた配列から誘導され、かつ、配列番号５に応じた配列と同じタンパク質又はペプチドをコードするイントロン不含配列、
Ｃ４）  配列番号１０に応じたアミノ酸配列を含み、かつ好ましくは、ソホロリピッドを細胞から周囲媒体へと移行できるタンパク質又はペプチドをコードする配列、
Ｄ４）  群Ａ４）〜Ｃ４）の１に応じた配列、特に好ましくは群Ａ４）に応じた配列と、少なくとも８０％、特に好ましくは少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９９％同一である配列、その際、この配列は好ましくは、ソホロリピッドを細胞から周囲媒体へと移行できるタンパク質又はペプチドをコードする、
Ｅ４）  群Ａ４）〜Ｄ４）の１に応じた配列、特に好ましくは群Ａ１ａ）に応じた配列の対ストランドと、ハイブリダイゼーションするか又は遺伝暗号の縮重を考慮してハイブリダイゼーションするだろう配列、その際、この配列は好ましくは、ソホロリピッドを細胞から周囲媒体へと移行できるタンパク質又はペプチドをコードする、
Ｆ４）  少なくとも１の塩基、好ましくは少なくとも２の塩基、更に好ましくは少なくとも５の塩基、最も好ましくは少なくとも１０の塩基の、しかし、好ましくは１００を超えない塩基、特に好ましくは５０を超えない塩基、最も好ましくは２５を超えない塩基の置換、付加、逆位及び／又は欠失により得られる、群Ａ４）〜Ｅ４）の１に応じた、特に好ましくは群Ａ４）に応じた配列の誘導体、その際、この誘導体は好ましくは、ソホロリピッドを細胞から周囲媒体へと移行できるタンパク質又はペプチドをコードする、及び
Ｇ４）  群Ａ４）〜Ｆ４）の１、特に好ましくは群Ａ４）に応じた配列に対する相補配列。
【００８８】
本発明の更なる一主題は、次の配列から選択されている単離ＤＮＡである：
Ａ５）  配列番号６に応じた配列、その際、この配列は、
ＵＤＰ−グルコース及び１７−ヒドロキシ−Ｚ−９−オクタデセン酸を１７−（β−Ｄ−グルコピラノシル−オキシ）−Ｚ−９−オクタデセン酸へと、又は
１７−（β−Ｄ−グルコピラノシル−オキシ）−Ｚ−９−オクタデセン酸及びＵＤＰ−グルコースを１７−Ｌ−［（２′−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−オキシ］−Ｚ−９−オクタデセン酸へと変換できるタンパク質をコードし、その際後者のものが好ましい、
Ｂ５）  Ａ５）に応じた配列から誘導され、かつ、配列番号６に応じた配列と同じタンパク質又はペプチドをコードするイントロン不含配列、
Ｃ５）  配列番号１１に応じたアミノ酸配列を含み、かつ、好ましくは、
ＵＤＰ−グルコース及び１７−ヒドロキシ−Ｚ−９−オクタデセン酸を１７−（β−Ｄ−グルコピラノシル−オキシ）−Ｚ−９−オクタデセン酸へと、又は
１７−（β−Ｄ−グルコピラノシル−オキシ）−Ｚ−９−オクタデセン酸及びＵＤＰ−グルコースを１７−Ｌ−［（２′−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−オキシ］−Ｚ−９−オクタデセン酸へと変換できるタンパク質又はペプチドをコードする配列、その際、後者のものが好ましい、
Ｄ５）  群Ａ５）〜Ｃ５）の１に応じた配列、特に好ましくは群Ａ５）に応じた配列と、少なくとも８０％、特に好ましくは少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９９％同一である配列、その際、この配列は好ましくは、ＵＤＰグルコース及び１７−ヒドロキシ−Ｚ−９−オクタデセン酸を１７−（β−Ｄ−グルコピラノシル−オキシ）−Ｚ−９−オクタデセン酸へと、１７−（β−Ｄ−グルコピラノシル−オキシ）−Ｚ−９−オクタデセン酸及びＵＤＰグルコースを１７−Ｌ−［（２′−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−オキシ］−Ｚ−９−オクタデセン酸へと変換できるタンパク質又はペプチドをコードする、その際後者のものが好ましい、
Ｅ５）  群Ａ５）〜Ｄ５）の１に応じた配列、特に好ましくは群Ａ５）に応じた配列の対ストランドと、ハイブリダイゼーションするか又は遺伝暗号の縮重を考慮してハイブリダイゼーションするだろう配列、その際、この配列は好ましくは、ＵＤＰグルコース及び１７−ヒドロキシ−Ｚ−９−オクタデセン酸を１７−（β−Ｄ−グルコピラノシル−オキシ）−Ｚ−９−オクタデセン酸へと、又は１７−（β−Ｄ−グルコピラノシル−オキシ）−Ｚ−９−オクタデセン酸及びＵＤＰグルコースを１７−Ｌ−［（２′−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−オキシ］−Ｚ−９−オクタデセン酸へと変換できるタンパク質又はペプチドをコードする、その際後者のものが好ましい、
Ｆ５）  少なくとも１の塩基、好ましくは少なくとも２の塩基、更に好ましくは少なくとも５の塩基、最も好ましくは少なくとも１０の塩基の、しかし、好ましくは１００を超えない塩基、特に好ましくは５０を超えない塩基、最も好ましくは２５を超えない塩基の置換、付加、逆位及び／又は欠失により得られる、群Ａ５）〜Ｅ５）の１に応じた、特に好ましくは群Ａ５）に応じた配列の誘導体、その際、この誘導体は好ましくは、
ＵＤＰグルコース及び１７−ヒドロキシ−Ｚ−９−オクタデセン酸を１７−（β−Ｄ−グルコピラノシル−オキシ）−Ｚ−９−オクタデセン酸へと、又は
１７−（β−Ｄ−グルコピラノシル−オキシ）−Ｚ−９−オクタデセン酸及びＵＤＰグルコースを１７−Ｌ−［（２′−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−オキシ］−Ｚ−９−オクタデセン酸へと変換できるタンパク質又はペプチドをコードする、その際後者のものが好ましい、及び
Ｇ５）  群Ａ５）〜Ｆ５）の１、特に好ましくは群Ａ５）に応じた配列に対する相補配列。
【００８９】
「ヌクレオチド同一性」又は「アミノ酸同一性」はここでは既知の方法で決定される。一般に、特殊な要求を考慮した、アルゴリズムを用いた特殊なコンピュータープログラムが使用される。
【００９０】
同一性の決定のための好ましい方法はまず、比較すべき配列の間の最大の一致度を明らかにする。この同一性の決定のためのコンピュータープログラムは、ＧＡＰを含めたＧＣＧプログラムパケットを含むが、これに限定されない（Deveroy, J. et al., Nucleic Acid Research 12 (1984), 387頁, Genetics Computer Group University of Wisconsin, Medicine (Wi), 及びBLASTP, BLASTN及びFASTA (Altschul, S. et al., Journal of Molecular Biology 215 (1990), 403-410頁.BLASTプログラムはNational Center For Biotechnology Information (NCBI)及び他の供給源から得られる(BLAST Handbuch, Altschul S. et al., NCBI NLM NIH Bethesda ND 22894; Altschul S. et al.、前記の通り）。
【００９１】
既知のSmith-Watermanアルゴリズムは同様にヌクレオチド同一性の決定のために使用できる。
【００９２】
「ヌクレオチド同一性」の決定のための好ましいパラメーターは、BLASTN-Programms (Altschul, S. et al., Journal of Molecular Biology 215 (1990), 403-410頁の使用下で得られる：
Expect Threshold: 10
Word size: 28
Match Score: 1
Mismatch Score: -2
Gap costs: Linear。
前述のパラメーターは、ヌクレオチド配列比較におけるデフォルトパラメーターである。
このＧＡＰプログラムは同様に、前述のパラメーターと一緒の使用に適している。
【００９３】
「アミノ酸同一性」の決定のための好ましいパラメーターは、BLASTP-Programms (Altschul, S. et al., Journal of Molecular Biology 215 (1990), 403-410頁の使用下で得られる：
Expect Threshold: 10
Word size: 3
Matrix: BLOSUM62
Gap costs: Existence: 11; Extension: 1
Compositional adjustments: Conditional compositional score matrix adjustment。
前述のパラメーターはアミノ酸配列比較におけるデフォルトパラメーターである。
このＧＡＰプログラムは同様に、前述のパラメーターと一緒の使用に適している。
【００９４】
前記アルゴリズムに応じた８０％の同一性は本発明との関連において８０％の同一性を意味する。このことはより高い同一性にも当てはまる。
【００９５】
「配列の対ストランドと、ハイブリダイゼーションするか又は遺伝暗号の縮重を考慮してハイブリダイゼーションするだろう配列」との特徴は、好ましくはストリンジェントな条件下で、参照配列の対ストランドとハイブリダイゼーションするか、又は遺伝暗号の縮重を考慮してハイブリダイゼーションするだろう配列を示す。例えばハイブリダイゼーションは６８℃で２×ＳＳＣ中で又はBoehringer社(Mannheim)のDigoxigenin-Labelling-Kitsのプロトコルに応じて実施できる。好ましいハイブリダイゼーション条件は、例えば６５℃で一晩７％ＳＤＳ、１％ＢＳＡ、１ｍＭＥＤＴＡ、２５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）中でのインキュベーション及び６５℃で２×ＳＳＣ；０．１％ＳＤＳでの後続の洗浄である。
【００９６】
選択肢Ｆ１ａ）、Ｆ１ｂ）、Ｆ１ｂ）、Ｆ１ｃ）、Ｆ２、Ｆ３）、Ｆ４）又はＦ５）に応じた、群Ａ１ａ）〜Ｅ１ａ）、Ａ１ｂ）〜Ｅ１ｂ）、Ａ１ｃ）〜Ｅ１ｃ）、Ａ２）〜Ｅ２）、Ａ３）〜Ｅ３）、Ａ４）〜Ｅ４）及びＡ５）〜Ｅ５）の１の配列の１又は複数の塩基の置換、付加、逆位及び／又は欠失によって得られることができる本発明による単離されたＤＮＡの誘導体には、特に、これらがコードするタンパク質中で保存アミノ酸交換、例えばアラニンに対するグリシン又はグルタミン酸に対するアスパラギン酸の交換を生じる配列が属する。このような機能中性（funktionsneutral）突然変異は、センス突然変異（sense mutations）と呼ばれ、このポリペプチドの活性の根本的な変更を生じない。さらに、ポリペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端での変更はその機能を本質的に損なわないか又は安定化すらできることが知られており、その結果、これに応じて、この配列の３′末端又は５′末端で本発明の核酸塩基と結合しているＤＮＡ配列も本発明に包含されている。当業者は、それらの説明を、とりわけＢｅｎ−Ｂａｓｓａｔ他（Journal of Bacteriology 169:751-757 (1987)）で、Ｏ’Ｒｅｇａｎ他（Gene 77:237-251 (1989）で、Ｓａｈｉｎ−Ｔｏｔｈ他（Protein Sciences 3:240-247 (1994)）で、Ｈｏｃｈｕｌｉ他（Bio/Technology 6:1321-1325 (1988)）で、かつ遺伝学と分子生物学の公知の教科書において見出す。
【００９７】
冒頭部で挙げた課題の解決には、更に、ベクター、好ましくは発現ベクター、遺伝子欠失カセット、遺伝子挿入カセット又は遺伝子過剰発現カセットであって、ＤＮＡと、前記で定義したような群Ａ１ａ）〜Ｇ１ａ）、Ａ１ｂ）〜Ｇ１ｂ）、Ａ１ｃ）〜Ｇ１ｃ）、Ａ２）〜Ｇ２）、Ａ３）〜Ｇ３）、Ａ４）〜Ｇ４）及びＡ５）〜Ｇ５）の１に応じた配列とを含むものが寄与する。ベクターとしては、当業者に知られている全てのベクターが考慮され、これは通常は宿主細胞中へのＤＮＡの送入に使用される。このベクターは自立複製してもよく、というのも、ベクターは複製起点、例えば２μプラスミドのもの又はＡＲＳ（自立複製配列）を有するか、又は染色体へと組み込むからである（非複製性プラスミド）。ベクターとは、鎖状ＤＮＡ断片も理解され、これは複製起点を全く有さず、例えば遺伝子欠失カセット、遺伝子挿入カセット又は遺伝子過剰発現カセットである。遺伝子欠失カセットは、通常は選択マーカー及びＤＮＡ断片からなり、これは欠失すべき領域に隣接している。
【００９８】
遺伝子挿入カセットは、通常はマーカー及び不活性化すべき遺伝子の断片からなり、遺伝子過剰発現カセットは、通常はマーカー、過剰発現すべき遺伝子並びに遺伝子の発現に関連する制御領域、例えばプロモーター及びターミネーターからなる。好ましいベクターは、プラスミド及びカセット、例えば大腸菌（E. coli）−酵母−シャトル−プラスミドを含む群から選択されており、特に好ましくは発現ベクター、遺伝子欠失カセット、遺伝子挿入カセット又は遺伝子過剰発現カセット、特に以下記載の遺伝子欠失カセットであって配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５並びに配列番号１６を有するもの並びに発現カセットであって配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３及び配列番号７４を有するものである。
【００９９】
本発明のベクターの好ましい一実施態様によれば、群Ａ１）〜Ｆ５）の１に応じた配列を有するＤＮＡは、構成的又は制御可能なプロモーターの制御下にあり、これは微生物の細胞、好ましくは細菌細胞、酵母細胞又は菌類細胞、特に好ましくは酵母細胞、最も好ましくはカンジダ・ボンビコラ細胞、カンジダ・ボゴリエンシス細胞、カンジダ・バチステ細胞、カンジダ・アピコラ細胞又はウイッカーハミーラ・ドメルキー細胞中のこのＤＮＡ配列によりコードされるポリペプチドの発現に適している。このような構成的プロモーターのための例は、例えばＴＳＣ３プロモーター、ＥＮＯ１プロモーター、ＦＢＡ１プロモーター、ＧＰＤプロモーター、ＧＰＭプロモーター、ＦＢＡ１プロモーター、ＩＣＬ１プロモーター又はＡＣＴ１プロモーターである。このような制御可能なプロモーターの例は、例えばＧＡＬ１プロモーター、ＧＡＬ２プロモーター、ＧＡＬ７プロモーター、ＭＥＬ１プロモーター、ＧＡＬ１０プロモーター、ＳＢＧ１プロモーター、ＳＢＧ２プロモーター、ＳＢＧ３プロモーター、ＳＢＧ４プロモーター、ＳＢＧ５プロモーター又はＭＡＬ２プロモーターである。
【０１００】
本発明のベクターは、プロモーターの他に好ましくはリボソーム結合部位並びにターミネーターを含むことが望ましい。この場合に、本発明のＤＮＡが、プロモーター、リボソーム結合部位及びターミネーターを含むベクターの発現カセット中へと組み込まれていることが特に好ましい。前述の構造的要素の他に、ベクターは更に当業者に知られている選択マーカー遺伝子を含んでよい。
【０１０１】
本発明により好ましいベクターは、実施例に記載の核酸、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、IntEx-CbSBG1（配列番号７０）、IntEx-CbSBG2（配列番号７１）、IntEx-CbSBG3（配列番号７２）、IntEx-CbSBG4（配列番号７３）及びIntEx-CbSBG5（配列番号７４）である。
【０１０２】
新規酵素Ｅ1〜Ｅ5が前記課題の解決に寄与する。
【０１０３】
したがって、本発明の更なる主題は、次のものからなる群から選択されている単離ポリペプチドである：
配列番号７、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１又は配列番号６３、特に配列番号７のポリペプチド配列を有するか、又は、そのつどの参照配列  配列番号７、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１又は配列番号６３、特に配列番号７に対しアミノ酸残基２５％までが、好ましくは２０％までが、特に好ましくは１５％までが、特に１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１％までが欠失、挿入、置換又はこれら組み合わせによって変更されており、かつ、そのつどの前記参照配列を有する酵素の酵素活性のなお少なくとも５０％、好ましくは６５％、特に好ましくは８０％、とりわけ９０％超を有するポリペプチド配列を有する酵素Ｅ1、その際、酵素Ｅ1の酵素活性とは、Ｚ−９−オクタデセン酸を１７−ヒドロキシ−Ｚ−９−オクタデセン酸へと変換する能力が理解される、
配列番号８又は配列番号１１のポリペプチド配列を有するか、又は、配列番号８又は配列番号１１に対しアミノ酸残基６０％まで、好ましくは２５％まで、特に好ましくは１５％まで、とりわけ１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１％までが欠失、挿入、置換又はこれら組み合わせによって変更されており、かつ、そのつどの参照配列  配列番号８又は配列番号１１を有する酵素の酵素活性のなお少なくとも５０％、好ましくは６５％、特に好ましくは８０％、とりわけ９０％超を有するポリペプチド配列を有する酵素Ｅ2、その際、酵素Ｅ2の酵素活性とは、ＵＤＰ−グルコース及び１７−ヒドロキシ−Ｚ−９−オクタデセン酸を１７−（β−Ｄ−グルコピラノシル−オキシ）−Ｚ−９−オクタデセン酸へと変換する能力が理解される、
配列番号１１のポリペプチド配列を有するか、又は、配列番号１１に対しアミノ酸残基６０％まで、好ましくは２５％まで、特に好ましくは１５％まで、とりわけ１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１％までが欠失、挿入、置換又はこれら組み合わせによって変更されており、かつ、そのつどの参照配列  配列番号１１を有する酵素の酵素活性のなお少なくとも５０％、好ましくは６５％、特に好ましくは８０％、とりわけ９０％超を有するポリペプチド配列を有する酵素Ｅ3、その際、酵素Ｅ3の酵素活性とは、１７−（β−Ｄ−グルコピラノシル−オキシ）−Ｚ−９−オクタデセン酸及びＵＤＰ−グルコースを１７−Ｌ−［（２′−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−オキシ］−Ｚ−９−オクタデセン酸へと変換する能力が理解される、
配列番号９のポリペプチド配列を有するか、又は、配列番号９に対しアミノ酸残基５０％まで、好ましくは２５％まで、特に好ましくは１５％まで、とりわけ１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１％までが欠失、挿入、置換又はこれら組み合わせによって変更されており、かつ、配列番号９を有する酵素の酵素活性のなお少なくとも５０％、好ましくは６５％、特に好ましくは８０％、とりわけ９０％超を有するポリペプチド配列を有する酵素Ｅ4、その際、酵素Ｅ4の酵素活性とは、
１７−Ｌ−［（２′−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−オキシ］−Ｚ−９−オクタデセン酸−１′，４″−ラクトン及びアセチル−補酵素Ａを１７−Ｌ−［（２′−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−オキシ］−Ｚ−９−オクタデセン酸−１′，４″−ラクトン−モノアセタートへと、
又は、１７−Ｌ−［（２′−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−オキシ］−Ｚ−９−オクタデセン酸−１′，４″−ラクトン−モノアセタート及びアセチル−補酵素Ａを１７−Ｌ−［（２′−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−オキシ］−Ｚ−９−オクタデセン酸−１′，４″−ラクトン−ジアセタートへと、
又は１７−Ｌ−［（２′−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−オキシ］−Ｚ−９−オクタデセン酸−１′，４″−ラクトン及びアセチル−補酵素Ａを１７−Ｌ−［（２′−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−オキシ］−Ｚ−９−オクタデセン酸−１′，４″−ラクトン−ジアセタートへと変換する能力が理解される、その際、第１のものが好ましい、
及び
配列番号１０のポリペプチド配列を有するか、又は、配列番号１０に対しアミノ酸残基４５％まで、好ましくは２５％まで、特に好ましくは１５％まで、とりわけ１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１％までが欠失、挿入、置換又はこれら組み合わせによって変更されており、かつ、配列番号１０を有する酵素の酵素活性のなお少なくとも５０％、好ましくは６５％、特に好ましくは８０％、とりわけ９０％超を有するポリペプチド配列を有する酵素Ｅ5、その際、酵素Ｅ5の酵素活性とは、ソホロリピッドを細胞から周囲媒体へと移す能力が理解される。
【０１０４】
以下に記載の実施例においては、本発明は例示的に記載され、この場合に、その適用範囲が全体的な発明の詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかである本発明は実施例に挙げられた実施形態が限定されることはない。
【０１０５】
以下の図面は実施例の一部である。
【図面の簡単な説明】
【０１０６】
【図１】図１は、１７−Ｌ−［（６′−Ｏ−アセチル−２′−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−６″−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−オキシ］−Ｚ−９−オクタデセン酸−４″−Ｏ−ラクトンのための正確な材料痕跡量（Massenpur）を示す図である。
【図２】図２は、１７−Ｌ−［（２′−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−オキシ］−Ｚ−９−オクタデセン酸−４″−Ｏ−ラクトンのための正確な材料痕跡量を示す図である。
【０１０７】
実施例：
実施例１：カンジダ・ボンビコラATCC 22214のウラシル栄養要求性突然変異体の作成
カンジダ・ボンビコラATCC 22214のウラシル栄養要求性突然変異体を以前に記載の通り作成した（van Bogaert et al. Yeast. 2007. 24 (3):201-8）。この株をＣ．ボンビコラATCC 22214 ura-と称呼した。
【０１０８】
実施例２：カンジダ・ボンビコラATCC 22214中のソホロリピッド生合成に関与する酵素の構造遺伝子の不活性化
ソホロリピッド生合成に関与する酵素を同定できるようにするために、まずカンジダ・ボンビコラATCC 22214のゲノムをGLS Flexチタン技術を用いて配列決定した。カンジダ・ボンビコラATCC 22214の遺伝子情報の調査では、５つの遺伝子（配列番号０１）のクラスターが同定され、そのコード領域（配列番号０２、配列番号０３、配列番号０４、配列番号０５、配列番号０６）は遺伝子産物（配列番号０７、配列番号０８、配列番号０９、配列番号１０、配列番号１１）をコードする。
【０１０９】
この５つの遺伝子をSBG1（配列番号０２）、SBG2（配列番号０３）、SBG3（配列番号０４）、SBG4（配列番号０５）及びSBG5（配列番号０６）（ＳＢＧはソホロリピッド生合成遺伝子）と称呼した。
【０１１０】
これらは以下タンパク質をコードする：Sbg1p（配列番号０７）、Sbg2p（配列番号０８）、Sbg3p（配列番号０９）、Sbg4p（配列番号１０）及びSbg5p（配列番号１１）。
【０１１１】
表１：Sbg1p、Sbg2p、Sbg3p、Sbg4p及びSbg5p並びにソホロリピッド生合成及び輸送におけるその機能
【表１】
0005936548.tif 000003
【０１１２】
遺伝子SBG1、SBG2、SBG3、SBG4及びSBG5を個々に不活性化し、この相応する突然変異体のフェノタイプをソホロリピッド生合成に関して特性決定する。Ｃ．ボンビコラATCC 22214中の相応する突然変異体の構築には、まず欠失カセットをGeneArt AG（Regensburg）により合成する。この欠失カセット（配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６）は以前記載された、Ｃ．ボンビコラATCC 22214のオロチジン−５−ホスファート−デカルボキシラーゼをコードする遺伝子CbURA3からなり（van Bogaert et al. Yeast. 2007. 24 (3) : 201-8）、これはそのつど約１０００ｂｐの不活性化すべき遺伝子に隣接する領域により上流及び下流で隣接される。この隣接領域及び遺伝子CbURA3の間にはそのつどloxP遺伝子座が導入され、これは場合によってCbURA3の欠失を、リコンビナーゼCreをコードする遺伝子の一過的導入及びその機能的発現により可能にする（概要に関しては、Kuehn & Torres. Methods Mol Biol. 2002. 180:175-204を参照）。この場合に、表２中の記載に応じて個々の欠失カセットが構築されている：
【０１１３】
表２：Ｃ．ボンビコラATCC 22214の、Sbg1p、Sbg2p、Sbg3p、Sbg4Ｐ及びSbg5Ｐをコードする構造遺伝子のための欠失カセットの構造
【表２】
0005936548.tif 000004
【０１１４】
Ｃ．ボンビコラATCC 22214 ura-の引き続く形質転換のための欠失カセットを十分な量で提供するために、これをＰＣＲで増幅する。この場合に次のオリゴヌクレオチドを使用する：
0005936548.tif 000005
【０１１５】
以下パラメーターをＰＣＲのために使用する：１×：初期変性、９８℃、３分；２５×：変性、９８℃、０：１０分、アニーリング、６０℃、０：３０分；エロンゲーション、７２℃、２：００分；１×：末端エロンゲーション、７２℃、１０分。増幅には、New England Biolabs (Frankfurt)のPhusionTM High-Fidelity Master Mixを製造者の推奨に相応して使用する。ＰＣＲ産物をQIAquick PCR-Purification Kit (Qiagen, Hilden)を用いて製造者の指示に応じて精製する。ＰＣＲの実施、アガロース電気泳動を用いたＰＣＲの成功した増幅の検証、ＤＮＡのエチジウムブロミド染色、ＰＣＲ断片サイズの測定、ＰＣＲ産物の精製及びＤＮＡ濃度測定を当業者に知られている様式で行う。
【０１１６】
Ｃ．ボンビコラATCC 22214 ura-の形質転換を、以前に記載されたように行う (van Bogaert et al. Yeast. 2008. 25:273-278); van Bogaert et al. FEMS Yeast Res. 2009. 9:610-617)。
【０１１７】
CbSBGl(配列番号１２）、CbSBG2（配列番号１３）、CbSBG3（配列番号１４）、CbSBG4（配列番号１５）及びCbSBG5（配列番号１６）のための欠失カセットを用いた形質転換後の、Ｃ．ボンビコラATCC 22214 ura-形質転換体中の遺伝子SBG1、SBG2、SBG3、SBG4及びSBG5の欠失を検証するために、そのつど５つの形質転換体及びＣ．ボンビコラATCC 22214 ura-によってそのつどの遺伝子座をコロニーＰＣＲにより増幅する。この場合に次のオリゴヌクレオチドを使用する：
0005936548.tif 000006
【０１１８】
以下パラメーターをＰＣＲのために使用する：１×：初期変性、９４℃、３分；２５×：変性、９４℃、１：００分、アニーリング、６０℃、１：００分；エロンゲーション、７２℃、５：００分；１×：末端エロンゲーション、７２℃、１０分。増幅には、QIAGEN (Hilden)のTaq PCR Master Mix Kitを製造者の推奨に相応して使用する。そのつど１０μｌのＰＣＲ反応を引き続き０．８％のアガロースゲルで分離する。ＰＣＲの実施、アガロースゲル電気泳動、ＤＮＡのエチジウムブロミド染色及びＰＣＲ断片サイズの測定を当業者に知られている様式で行う。
【０１１９】
相応する遺伝子座の増幅の場合に表３に挙げられるＰＣＲ断片サイズが発生するものである：
表３：成功した欠失又は野生型シチュエーションの場合に染色体性SBG1−、SBG2−、SBG3−、SBG4−及びSBG5−遺伝子座の増幅の際に予期されるＰＣＲ断片サイズ
【表３】
0005936548.tif 000007
【０１２０】
Ｃ．ボンビコラATCC 22214 ura-からのCbSBGl-、CbSBG2−、CbSBG3−、CbSBG4−又はCbSBG5−遺伝子座の増幅の際に野生型シチュエーションの存在で予期すべき断片サイズ約３．７ｋｂｐ、３．５ｋｂｐ、２．８ｋｂｐ、５．９ｋｂｐ又は３．４ｋｂｐのみが達成される。
【０１２１】
CbSBG1のための欠失カセットの形質転換後の形質転換体からのＳＢＧｌ遺伝子座の増幅では、CbSBG1の成功した染色体性欠失後に予期すべき断片サイズ約４．２ｋｂｐのみが達成される。CbSBG2のための欠失カセットの形質転換後の形質転換体からのＳＢＧ２遺伝子座の増幅では、CbSBG2の成功した染色体性欠失後に予期すべき断片サイズ約４．２ｋｂｐのみが達成される。CbSBG3のための欠失カセットの形質転換後の形質転換体からのＳＢＧ３遺伝子座の増幅では、CbSBG3の成功した染色体性欠失後に予期すべき断片サイズ約４．２ｋｂｐのみが達成される。CbSBG4のための欠失カセットの形質転換後の形質転換体からのＳＢＧ４遺伝子座の増幅では、CbSBG4の成功した染色性欠失後に予期すべき断片サイズ約４．２ｋｂｐのみが達成される。CbSBG5のための欠失カセットの形質転換後の形質転換体からのＳＢＧ５遺伝子座の増幅では、CbSBG5の成功した染色体性欠失後に予期すべき断片サイズ約４．２ｋｂｐのみが達成される。従って、全ての５つの場合に、遺伝子ＣｂＳＢＧｌ、ＣｂＳＢＧ２、ＣｂＳＢＧ３、ＣｂＳＢＧ４又はＣｂＳＢＧ５が染色体欠失されたクローンが同定できる。相応する株は、以下、Ｃ．ボンビコラATCC 22214 sbg1、Ｃ．ボンビコラATCC 22214 sbg2、Ｃ．ボンビコラATCC 22214 sbg3、Ｃ．ボンビコラATCC 22214 sbg4又はＣ．ボンビコラATCC 22214 sbg5と呼ばれる。
【０１２２】
実施例３：Ｃ．ボンビコラATCC 22214、Ｃ．ボンビコラATCC 22214 sbg1、Ｃ．ボンビコラATCC 22214 sbg2、Ｃ．ボンビコラATCC 22214 sbg3、Ｃ．ボンビコラATCC 22214 sbg4及びＣ．ボンビコラATCC 22214 sbg5によるソホロリピッド形成の特性決定
株Ｃ．ボンビコラATCC 22214、Ｃ．ボンビコラATCC 22214 sbg1、Ｃ．ボンビコラATCC 22214 sbg2、Ｃ．ボンビコラATCC 22214 sbg3、Ｃ．ボンビコラATCC 22214 sbg4及びＣ．ボンビコラATCC 22214 sbg5の繁殖（Propagierung）をＹＰＤ寒天プレート上で行う。ソホロリピッドの生産には、以下でＳＬ生産培地と呼ばれる培地が使用される。これは、０．１％  ＫＨ2ＰＯ4、０．５％  ＭｇＳＯ4×７Ｈ2Ｏ、０．０１％  ＦｅＣｌ3、０．０１％  ＮａＣｌ、０．０１％  ウラシル、０．４％  酵母エキス、０．１％  尿素、１０．５％  ナタネ油及び１０％  グルコースからなる。このｐＨ値を４．５に調節し、この培地を続いてオートクレーブ（１２１℃、２０分）を用いて滅菌する。培養の間のｐＨ値の調節は必要でない。
【０１２３】
振盪フラスコ中のソホロリピッド生産の検査のために、まず予備培養物を適用する。このために、新規にＹＰＤ寒天プレート上に塗布する株のイノキュレート用エーゼを使用し、かつ１０ｍｌのＹＰＤ培地を１００ｍｌのエルレンマイヤーフラスコ中で接種する。この培養を３０℃及び２００ｒｐｍで一晩行う。この予備培養物を、１００ｍｌのＳＬ培地を１０００ｍｌのエルレンマイヤーフラスコ中に接種するために以下使用する（開始ＯＤ600  ０．２）。この培養物を２００ｒｐｍ及び３０℃で７日間培養し、毎日２ｍｌのブイヨンの試料を取り出し、その際、試料採取前にこの培養培地の十分な混合について厳密に注意した。
【０１２４】
後続のクロマトグラフィ分析のための試料前処理を以下のように行う：容積式ピペット（Combitip）を用いて２ｍｌの反応容器中に８００μｌのアセトンを装入し、この反応容器を蒸発を最小限にするためにすぐに閉鎖する。この後に２００μｌのブイヨンを添加する。ブイヨン／アセトン混合物のボルテックス処理後に、これらを１分間１３０００ｒｐｍで遠心分離し、この上清８００μｌをＨＰＬＣ容器中に移す。
【０１２５】
ソホロリピッド又はオレイン酸の検出及び定量化のために、Evaporative Light Scattering Detektor (ELSD)を利用する。当初の測定をAgilent Technologies 1200系列(Santa Clara, california)及びZorbax SB-C8 Rapid Resolutionカラム（４．６×１５０ｍｍ、３．５μｍ、Agilent）を用いて実施する。この注入容積は５μｌであり、この方法の通液時間は２０分である。移動相としてＨ2Ｏ及び０．１％ＴＦＡ（三フッ化酢酸、溶液Ａ）及びメタノール（溶液Ｂ）を使用する。このカラム温度は４０℃である。検出器としてＥＬＳＤ（検出温度６０℃）及びＤＡＤ（ダイオードアレー、２１０ｎｍ）を使用した。この方法で使用される勾配は表４に挙げてある。
【０１２６】
表４：移動相の使用される勾配プロファイルについてのソホロリピッドのＨＰＬＣベースの定量化の説明
【表４】
0005936548.tif 000008
【０１２７】
Ｃ．ボンビコラATCC 22214がソホロリピッドを生産する一方で、株Ｃ．ボンビコラATCC 22214 sbg1、Ｃ．ボンビコラATCC 22214 sbg2及びＣ．ボンビコラATCC 22214 sbg4ではソホロリピッド形成を検出可能でない。このことは、この遺伝子がソホロリピッド形成に関与しており、かつ、この場合に上述の機能を満たすことを一義的に示す。この株Ｃ．ボンビコラATCC 22214 sbg3及びＣ．ボンビコラATCC 22214 sbg5は、ソホロリピッドを形成でき、しかし、これらはＨＰＬＣ分析において変更した維持時間を示す。
【０１２８】
ＬＣ−ＭＣ2によって、Ｃ．ボンビコラATCC 22214 sbg3によって形成されるソホロリピッドが、Ｃ．ボンビコラATCC 22214によって形成されるソホロリピッドとは対照的に、Ｒ1＝Ｈ及びＲ2＝Ｈである一般式（Ｉａ）及び（Ｉｂ）の化合物のみに相応することが検出できる。
【０１２９】
このことは、Sbg3pの機能をソホロリピッド生合成においてアセチルトランスフェラーゼ（Ｅ4）として裏付ける。
【０１３０】
ＬＣ−ＭＣによって、同様に、Ｃ．ボンビコラATCC 22214 sbg5によって形成されるソホロリピッドが、Ｃ．ボンビコラATCC 22214によって形成されるソホロリピッドとは対照的に、ｎ＝０である一般式（Ｉａ）の化合物のみに相応することが検出できる。
【０１３１】
このことは、Sbg5pの機能をソホロリピッド生合成においてグリコシルトランスフェラーゼＩＩ（Ｅ3）として裏付ける。
【０１３２】
実施例４：ソホロリピッド生合成に関与する酵素を過剰生産するカンジダ・ボンビコラATCC 22214株の構築
ソホロリピッド生合成に関与する酵素を過剰発現するカンジダ・ボンビコラATCC 22214株の構築を可能にするには、まず、GeneArt AGによって組込／過剰発現カセットが合成される（配列番号７５）。
【０１３３】
この組込／過剰発現カセットは表５に挙げられる成分を含む：
表５：カンジダ・ボンビコラATCC 22214のために開発すべき組込／過剰発現カセット中に存在するモジュール及び重要な制限切断部位に関する概要
【表５】
0005936548.tif 000009
【０１３４】
この組込／過剰発現カセットは、Ｃ．ボンビコラATCC 22214 TSC3遺伝子のプロモーター領域とターミネーター領域の間のNdel及びFselを介して開始コドンから停止コドンまでの任意の構造遺伝子の挿入を可能にし、前記遺伝子はグリセルアルデヒド−３−リン酸−デヒドロゲナーゼをコードする（van Bogaert et al. ; 2008）。グリセルアルデヒド−３−リン酸−デヒドロゲナーゼは、種々の酵母中で高アバンダントタンパク質であり、このため、このようにして挿入される遺伝子の強力発現が達成できることを前提とすることができる。選択マーカーとして、Ｃ．ボンビコラATCC 22214 URA3遺伝子を選択し、このため、この組込／過剰発現カセットはＣ．ボンビコラATCC 22214のウラシル栄養要求株の形質転換のためにだけ利用できる。その作製並びにＣ．ボンビコラATCC 22214 URA3遺伝子は既に以前に記載されている（van Bogaert et al., 2007; van Bogaert et al., 2008）。この５′−及び３′末端のＤＮＡ断片は、Ｃ．ボンビコラATCC 22214 LEU2遺伝子座（配列番号３７）にこのカセットの挿入を可能にし、その際、LEU2遺伝子が不活性化される。LEU2は、Ｃ．ボンビコラATCC 22214中の唯一のイソプロピルマラート−デヒドロゲナーゼをコードする。このイソプロピルマラート−デヒドロゲナーゼはロイシン生合成の本質的成分であるので、組込／過剰発現カセットの正確な組込を用いた形質転換体がそのロイシン栄養要求性を介して同定されることができる。多様な唯一かつ余分な認識配列（NotI, PciI, AseSI, MluI, SbfI）が、組込／過剰発現カセットの個々のモジュールの交換を可能にする。このカセットはGeneArt AGにより専売ベクターpMA中にクローニングされ、これは前記した切断部位を含まず、このため、この切断部位は全ての範囲で利用できる。
【０１３５】
遺伝子CbSBG1、CbSBG3及びCbSBG5を記載の組込／過剰発現カセット中に挿入するためには、これがＣ．ボンビコラATCC 22214の染色体性ＤＮＡからＰＣＲによって増幅され、かつ同時に、使用されるオリゴヌクレオチドを介して開始コドンの上流にNdeI切断部位が、そして、停止コドンの下流にFsel切断部位が導入される。記載の組込／過剰発現カセット中への遺伝子CbSBG2及びCbSBG4の挿入には、これはまず、コードタンパク質のアミノ酸配列を変更することなく、この配列を内部Fsel及びNotl切断部位（CbSBG2）又はNdel切断部位（CbSBG4）を除去するように増幅すべく、GeneArt AG (Regensburg)によりｄｅ  ｎｏｖｏ合成される。引き続き、GeneArt AG (Regensburg)によって既に作成された改変された遺伝子CbSBG2mod及びCbSBG4modをＰＣＲにより増幅し、かつ同時に、使用されるオリゴヌクレオチドを介して開始コドンの上流にNdeI切断部位が、そして、停止コドンの下流にFsel切断部位が導入される。この場合に次のオリゴヌクレオチドを使用する：
0005936548.tif 000010
【０１３６】
以下パラメーターをＰＣＲのために使用する：１×：初期変性、９８℃、３分；２５×：変性、９８℃、０：１０分、アニーリング、６０℃、０：３０分；エロンゲーション、７２℃、２：００分；１×：末端エロンゲーション、７２℃、１０分。増幅には、New England Biolabs (Frankfurt)のPhusionTM High-Fidelity Master Mixを製造者の推奨に相応して使用する。そのつど１０μｌのＰＣＲ反応を引き続き０．８％のアガロースゲルで分離する。ＰＲＣの実施、アガロースゲル電気泳動、ＤＮＡのエチジウムブロミド染色及びＰＣＲ断片サイズの測定を当業者に知られている様式で行う。全ての場合に、予期されるサイズのＰＣＲ断片を増幅できる。これはCbSBG1については１６４６ｂｐ、CbSBG2については１４２１ｂｐ、CbSBG3については８０９ｂｐ、CbSBG4については３９２９ｂｐ、そしてCbSBG5については１３２８ｂｐである。ＰＣＲ産物をNdel及びFselを用いて制限エンドヌクレアーゼの製造者（New England Biolabs; Frankfurt/Main）の推奨に応じて消化させ、Ndel及びFselで切断させたベクターpMA-ExCat（配列番号６４）中にライゲーションさせる。ライゲーション並びに化学的にコンピテントな大腸菌（E. coli）DH5a細胞（New England Biolabs; Frankfurt/Main）の形質転換は当業者に知られているように行われる。pMA-ExCat中へのCbSBG1−、CbSBG2−、CbSBG3−、CbSBG4−又はCbSBG5−断片の正確な挿入をNdel及びFselを用いた制限により検証し、かつ確認する。得られるベクターをpMA_ExCat-CbSBG1（配列番号６５）、pMA_ExCat-CbSBG2（配列番号６６）、pMA_ExCat-CbSBG3（配列番号６７）、pMA_ExCat-CbSBG4（配列番号６８）及びpMA_ExCat-CbSBG5（配列番号６９）と称呼する。
【０１３７】
Ｃ．ボンビコラATCC 22214 ura-の引き続く形質転換のために個々の組込／過剰発現カセット並びに制御カセットExCatを十分な量で提供するために、これをＰＣＲで増幅する。この場合に次のオリゴヌクレオチドを使用する：
0005936548.tif 000011
【０１３８】
このＰＣＲ産物をQIAquick PCR-Purification Kit (Qiagen, Hilden)を用いて製造者の指示に応じて精製する。ＰＣＲの実施、アガロース電気泳動を用いたＰＣＲの成功した増幅の検証、ＤＮＡのエチジウムブロミド染色、ＰＣＲ断片サイズの測定、ＰＣＲ産物の精製及びＤＮＡ濃度測定を当業者に知られている様式で行う。
【０１３９】
得られる組込／過剰発現カセットは名称IntEx-CbSBG1（配列番号７０）、IntExCbSBG2（配列番号７１）、IntExCbSBG3（配列番号７２）、IntExCbSBG4（配列番号７３）及びIntExCbSBG5（配列番号７４）を得る。同様に、制御カセットExCat（配列番号７５）が得られる。
【０１４０】
Ｃ．ボンビコラATCC 22214 ura-の形質転換を、以前に記載されたように行う (van Bogaert et al. Yeast. 2008. 25:273-278); van Bogaert et al. FEMS Yeast Res. 2009. 9:610-617)。
【０１４１】
Ｃ．ボンビコラATCC 22214 ura-のLEU2遺伝子座中への過剰発現CbSBG1、CbSBG2、CbSBG3、CbSBG4及びCbSBG5のための組込／過剰発現カセット並びに制御カセットExCatの挿入を検証するために、そのつど５つの形質転換体（CbSBG1、CbSBG2、CbSBG3、CbSBG4及びCbSBG5のための組込／過剰発現カセット並びに制御カセットExCatの形質転換後）及びＣ．ボンビコラATCC 22214 ura-のうちLEU2遺伝子座をコロニーＰＣＲにより増幅する。この場合に次のオリゴヌクレオチドを使用する：
0005936548.tif 000012
【０１４２】
以下パラメーターをＰＣＲのために使用する：１×：初期変性、９４℃、３分；２５×：変性、９４℃、１：００分、アニーリング、６０℃、１：００分；エロンゲーション、７２℃、５：００分；１×：末端エロンゲーション、７２℃、１０分。増幅には、QIAGEN (Hilden)のTaq PCR Master Mix Kitを製造者の推奨に相応して使用する。そのつど１０μｌのＰＣＲ反応を引き続き０．８％のアガロースゲルで分離する。ＰＲＣの実施、アガロースゲル電気泳動、ＤＮＡのエチジウムブロミド染色及びＰＣＲ断片サイズの測定を当業者に知られている様式で行う。
【０１４３】
相応する遺伝子座の増幅の場合に表６に挙げられるＰＣＲ断片サイズが発生するものである：
表６：染色体性Ｃ．ボンビコラLEU2遺伝子座中へのSBG1-、SBG2-、SBG3-、SBG4-及びSBG5発現カセット並びに制御カセットExCatの相同性組み換え後の染色体性LEU2遺伝子座の増幅の際に又は非相同性組込の際に予期すべきＰＣＲ断片サイズ
【表６】
0005936548.tif 000013
【０１４４】
Ｃ．ボンビコラATCC 22214 ura-からのLEU2遺伝子座の増幅の際に野生型シチュエーションの存在の場合に予期すべきサイズ２．２ｋｂｐを有する断片のみが達成される。
【０１４５】
CbSBG1、CbSBG2 mod、CbSBG3、CbSBG4 mod及びCbSBG5の過剰発現のための組込／過剰発現カセットを用いた形質転換後のＣ．ボンビコラATCC 22214形質転換体からのLEU2遺伝子座の増幅の際には、組込／過剰発現カセットIntExCbSBG1（配列番号７０）、IntExCbSBG2（配列番号７１）、IntExCbSBG3（配列番号７２）、IntEx-CbSBG4（配列番号７３）及びIntExCbSBG5（配列番号７４）の成功した染色体性組込の際に予期すべき断片サイズ約５．５ｋｂｐ、５．２ｋｂｐ、４．６ｋｂｐ、７．７ｋｂｐ又は５．１ｋｂｐのみが達成される。
【０１４６】
従って、全ての５つの場合に、遺伝子CbSBG1、CbSBG2、CbSBG3、CbSBG4又はCbSBG5がＣ．ボンビコラATCC 22214 TSC3プロモーターの制御下にもたらされるクローンが同定でき、この結果、その過剰発現が推測できる。
【０１４７】
相応する株は、以下、Ｃ．ボンビコラATCC 22214 PTsc3-SBG1-TTSC3、Ｃ．ボンビコラATCC 22214 PTsc3-SBG2-TTSC3、Ｃ．ボンビコラ 22214 PTsc3-SBG3-TTSC3、Ｃ．ボンビコラATCC 22214 PTsc3-SBG4-TTSC3及びＣ．ボンビコラATCC 22214 PTsc3-SBG5-TTSC3と呼ばれる。
【０１４８】
例５：Ｃ．ボンビコラATCC 22214 ExCat、Ｃ．ボンビコラATCC 22214 PTsc3-SBG1-TTSC3、Ｃ．ボンビコラATCC 22214 PTsc3-SBG2-TTSC3、Ｃ．ボンビコラ ATCC 22214 PTsc3-SBG3-TTSC3、Ｃ．ボンビコラATCC 22214 PTsc3-SBG4-TTSC3及びＣ．ボンビコラATCC 22214 PTsc3-SBG5-TTSC3によるソホロリピッド形成の特性決定
ＹＰＤ寒天プレート上で株Ｃ．ボンビコラATCC 22214 ExCat、Ｃ．ボンビコラATCC 22214 PTsc3-SBG1-TTSC3、Ｃ．ボンビコラATCC 22214 PTsc3-SBG2-TTSC3、Ｃ．ボンビコラATCC 22214 PTsc3-SBG3-TTSC3、Ｃ．ボンビコラATCC 22214 PTsc3-SBG4-TTSC3及びＣ．ボンビコラATCC 22214 PTsc3-SBG5-TTSC3の増殖を行う。ソホロリピッドの生産には、以下でＳＬ生産培地と呼ばれる培地が使用される。これは、０．１％  ＫＨ2ＰＯ4、０．５％  ＭｇＳＯ4×７Ｈ2Ｏ、０．０１％  ＦｅＣｌ3、０．０１％  ＮａＣｌ、０．０１％  ウラシル、０．４％  酵母エキス、０．１％  尿素、１０．５％  ナタネ油及び１０％  グルコースからなる。このｐＨ値を４．５に調節し、この培地を続いてオートクレーブ（１２１℃、２０分）を用いて滅菌する。培養の間のｐＨ値の調節は必要でない。
【０１４９】
振盪フラスコ中のソホロリピッド生産の検査のためにまず予備培養物を適用する。このために、新規にＹＰＤ寒天プレート上に塗布する株のイノキュレート用エーゼを使用し、かつ１０ｍｌのＹＰＤ培地を１００ｍｌのエルレンマイヤーフラスコ中で接種する。この培養を３０℃及び２００ｒｐｍで一晩行う。この予備培養物を、１００ｍｌのＳＬ培地を１０００ｍｌのエルレンマイヤーフラスコ中に接種するために以下使用する（開始ＯＤ600  ０．２）。この培養物を２００ｒｐｍ及び３０℃で７日間培養し、毎日２ｍｌのブイヨンの試料を取り出し、その際、試料採取前にこの培養培地の十分な混合について厳密に注意した。
【０１５０】
後続のクロマトグラフィ分析のための試料前処理を以下のように行う：容積式ピペット（Combitip）を用いて２ｍｌの反応容器中に８００μｌのアセトンを装入し、この反応容器を蒸発を最小限にするためにすぐに閉鎖する。この後に２００μｌのブイヨンを添加する。ブイヨン／アセトン混合物のボルテックス処理後に、これらを１分間１３０００ｒｐｍで遠心分離し、この上清８００μｌをＨＰＬＣ容器中に移す。
【０１５１】
ソホロリピッド又はオレイン酸の検出及び定量化のために、Evaporative Light Scattering Detektor (ELSD)を利用する。当初の測定をAgilent Technologies 1200系列(Santa Clara, california)及びZorbax SB-C8 Rapid Resolutionカラム(４．６×１５０ｍｍ、３．５μｍ、Agilent)を用いて実施する。この注入容積は５μｌであり、この方法の通液時間は２０分である。移動相としてＨ2Ｏ及び０．１％ＴＦＡ（三フッ化酢酸、溶液Ａ）及びメタノール（溶液Ｂ）を使用する。このカラム温度は４０℃である。検出器としてＥＬＳＤ（検出温度６０℃）及びＤＡＤ（ダイオードアレー、２１０ｎｍ）を使用した。この方法で使用される勾配は表３に挙げてある。
【０１５２】
コントロール株Ｃ．ボンビコラATCC 22214 ExCatと同様に全ての株はソホロリピッドを生産する。しかし、株Ｃ．ボンビコラATCC 22214 PTsc3-SBG1-TTSC3、Ｃ．ボンビコラATCC 22214 PTsc3-SBG2-TTSC3、Ｃ．ボンビコラ ATCC 22214 PTsc3-SBG3-TTSC3、Ｃ．ボンビコラATCC 22214 PTsc3-SBG4-TTSC3及びＣ．ボンビコラATCC 22214 PTsc3-SBG5-TTSC3は、Ｃ．ボンビコラATCC 22214 ExCatに対してソホロリピッド形成の高められた空時収率を有する。Ｃ．ボンビコラATCC 22214 ExCatが選択された条件下で約２ｍｇのソホロリピッドを１リットル、時間及びＯＤ600あたりで生産する一方で、このパラメーターは株Ｃ．ボンビコラATCC 22214 PTsc3-SBG1-TTSC3、Ｃ．ボンビコラATCC 22214 PTsc3-SBG2-TTSC3、Ｃ．ボンビコラ PTsc3-SBG3-TTSC3、Ｃ．ボンビコラATCC 22214 PTsc3-SBG4-TTSC3及びＣ．ボンビコラATCC 22214 PTsc3-SBG5-TTSC3では２．５ｍｇ〜６ｍｇである。従って、酵素CbSBG1、CbSBG2、CbSBG3、CbSBG4及びCbSBG5の増強がＣ．ボンビコラATCC 22214中でソホロリピッド形成の増加を生じることが示されることができる。
【０１５３】
実施例６：Ｎ末端Ｈｉｓタグを有するカンジダ・ボンビコラ遺伝子SBG2の過剰発現のためのベクターpTZ_E02_His-GlcTrI
大腸菌中のカンジダ・ボンビコラ ATCC22214遺伝子SBG2（配列番号０３）の過剰発現のために、プラスミドpTZ_E02_His-GlcTrIを構築した。カンジダ・ボンビコラ ATCC22214からの染色体性ＤＮＡを、製造者の指示に応じたRoche Diagnostics (Mannheim)の"ExpandTM High Fidelity"-PCR-Kitを用いたＰＣＲのための鋳型として使用した。SBG2遺伝子をオリゴヌクレオチド1373_GlcTrI_BsmBI_His_fp（配列番号７６）及び1373_GlcTrI_AscI_rp（配列番号７７）を用いて染色体性ＤＮＡから増幅し（"PCR protocols. A guide to methods and applications" , 1990, Academic Press）、この過程で５′−末端に６倍のＮ末端ヒスチジンタグを取り付けた。更に、切断部位BsmBI及びAscIを導入した。このために以下オリゴヌクレオチドを使用した：
0005936548.tif 000014
【０１５４】
このＰＣＲ産物（１４３５ｂｐ）をQIAquick PCR-Purification Kits (Qiagen, Hilden)を用いて製造者の指示に応じて精製し、BsmBI及びAsclで切断し、引き続き同様にして切断した、Trenzyme GmbH, Konstanz社の発現ベクターpTZ_E02 (pET24dベースベクター；Merck Chemicals, Darmstadt)中にライゲーションした。生じるプラスミドpTZ_E02_His-GlcTrI（配列番号７８）は６７００塩基対のサイズである。このライゲーション並びに化学的にコンピテントな大腸菌（E. coli）DH5a細胞（Gibco-BRL, Karlsruhe）の形質転換は当業者に知られているように行われた。このインサートの信頼性をＤＮＡ配列分析により検証した。
【０１５５】
プラスミドpTZ_E02_His-GlcTrIを形質転換を用いて大腸菌BL21（DE3）及び大腸菌Rosetta（DE3）の株（両者Merck Chemicals, Darmstadt）中に導入した。生じる株を大腸菌BL21(DE3) /pTZ_E02_His-GlcTrl及び大腸菌Rosetta (DE3) /pTZ_E02_His-GlcTrIと呼んだ。
【０１５６】
実施例７：Ｎ末端Ｈｉｓタグを有するカンジダ・ボンビコラ遺伝子SBG5の過剰発現のためのベクターpTZ_E02_His-GlcTrII
大腸菌中のカンジダ・ボンビコラ ATCC22214遺伝子SBG5（配列番号０６）の過剰発現のために、プラスミドpTZ_E02_His-GlcTrIIを構築した。カンジダ・ボンビコラATCC22214からの染色体性ＤＮＡを、製造者の指示に応じてRoche Diagnostics (Mannheim)の"ExpandTM High Fidelity"-PCR-Kitを用いたＰＣＲのための鋳型として使用した。SBG5遺伝子をオリゴヌクレオチド1373_GlcTrII_BsmBI_His_fp（配列番号７９）及び1373_GlcTrII_AscI_rp（配列番号８０）を用いて染色体性ＤＮＡから増幅し（"PCR protocols. A guide to methods and applications" , 1990, Academic Press）、この過程で５′−末端に６倍のＮ末端ヒスチジンタグを取り付けた。更に、切断部位BsmBI及びAscIを導入した。このために以下オリゴヌクレオチドを使用した：
0005936548.tif 000015
【０１５７】
このＰＣＲ産物（１３４２ｂｐ）をQIAquick PCR-Purification Kits (Qiagen, Hilden)を用いて製造者の指示に応じて精製し、BsmBI及びAsclで切断し、引き続き同様にして切断した、Trenzyme GmbH, Konstanz社の発現ベクターpTZ_E02 (pET24dベースベクター；Merck Chemicals, Darmstadt) にライゲーションした。生じるプラスミドpTZ_E02_His-GlcTrII（配列番号８１）は６６０７塩基対のサイズである。ライゲーション並びに化学的にコンピテントな大腸菌（E. coli）DH5a細胞（Gibco-BRL, Karlsruhe）の形質転換は当業者に知られているように行われた。このインサートの信頼性をＤＮＡ配列分析により検証した。
【０１５８】
プラスミドpTZ_E02_His-GlcTrIIを形質転換を用いて株大腸菌BL21（DE3）及び大腸菌Rosetta（DE3）（両者Merck Chemicals, Darmstadt）中に導入した。生じる株を大腸菌BL21(DE3) /pTZ_E02_His-GlcTrlI及び大腸菌Rosetta (DE3) /pTZ_E02_His-GlcTrIIと呼んだ。
【０１５９】
実施例８：Ｎ末端Ｈｉｓタグを有するカンジダ・ボンビコラ遺伝子SBG3の過剰発現のためのベクターpTZ_E02_His-AcTr
大腸菌中のカンジダ・ボンビコラ ATCC22214遺伝子SBG3（配列番号０４）の過剰発現のために、プラスミドpTZ_E02_His-AcTrを構築した。カンジダ・ボンビコラ ATCC22214からの染色体性ＤＮＡを、製造者の記載に応じてRoche Diagnostics (Mannheim)の"ExpandTM High Fidelity"-PCR-Kitを用いたＰＣＲのための鋳型として使用した。SBG3遺伝子をオリゴヌクレオチド1373_AcTr_BsmBI_His_fp（配列番号８２）及び1373_AcTr_AscI_rp（配列番号８３）を用いて染色体性ＤＮＡから増幅し（"PCR protocols. A guide to methods and applications" , 1990, Academic Press）、この過程で５′−末端に６倍のＮ末端ヒスチジンタグを取り付けた。更に、切断部位BsmBI及びAscIを導入した。このために以下オリゴヌクレオチドを使用した：
0005936548.tif 000016
【０１６０】
このＰＣＲ産物（８２３ｂｐ）をQIAquick PCR-Purification Kits (Qiagen, Hilden)を用いて製造者の指示に応じて精製し、BsmBI及びAsclで切断し、引き続き同様にして切断した、Trenzyme GmbH, Konstanz社の発現ベクターpTZ_E02 (pET24dベースベクター；Merck Chemicals, Darmstadt) にライゲーションした。生じるプラスミドpTZ_E02_His-AcTr（配列番号８４）は６０８８塩基対のサイズである。ライゲーション並びに化学的にコンピテントな大腸菌（E. coli）DH5a細胞（Gibco-BRL, Karlsruhe）の形質転換は当業者に知られているように行われた。このインサートの信頼性をＤＮＡ配列分析により検証した。
【０１６１】
プラスミドpTZ_E02_His-AcTrを形質転換を用いて株大腸菌BL21（DE3）及び大腸菌Rosetta（DE3）（両者Merck Chemicals, Darmstadt）中に導入した。生じる株を大腸菌BL21(DE3) /pTZ_E02_His-AcTr及び大腸菌Rosetta (DE3) /pTZ_E02_His-AcTrと呼んだ。
【０１６２】
実施例９：ソホロリピッド生合成に関与する酵素SBG2、SBG3及びSBG5の非相同性発現
項目１−３で構築した大腸菌株の個々のコロニーごとに、まず８時間５ｍｌのＬＢ培地（１０ｇ／ｌ  トリプトン、５ｇ／ｌ  酵母エキス、１０ｇ／ｌ  ＮａＣｌ）中で５０μｇ／ｍｇのカナマイシンを用いて３７℃及び１７５ｒｐｍで培養した。引き続き、１００ｍｌのＬＢ培地を５００ｍｌの振盪フラスコ中で第１の予備培養物を用いて接種し、一晩３７℃で１７５ｒｐｍで培養した。翌朝に、この第２の予備培養物を、０．１の開始ＯＤ600を有する１ｌのＬＢ培地を接種するために利用した（５ｌ  振盪フラスコ）。全ての培養物を３７℃及び１７５ｒｐｍでインキュベーションした。培養物の成長をみかけ光学密度（ＯＤ600）をもとに追跡した。約０．３のＯＤ600の達成時に培養温度３７℃を２０℃に低下させた。０Ｄ600０．６ではそのつどの目的遺伝子の発現を０．５ｍＭ  ＩＰＴＧ（終濃度）の添加により誘導した。全培養工程の間に相応する抗生物質を添加した（カナマイシン５０μｇ／ｍｌ）。
【０１６３】
ＩＰＴＧ添加前にも誘導２４時間後にも試料を分析のために取り出した。この細胞をBugbuster (Merck Chemicals, Darmstadt)を用いて製造者の指示に応じて分解し、溶解性及び非溶解性タンパク質を相互に分離する。比較可能な量の細胞エキスをＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分離し、このゲルを引き続きコロイド状クーマシーを用いて染色する。全３つの、組み換えにより製造したヒスタグ化タンパク質Sbg2p、Sbg3p及びSbg5pについては、細胞エキスの溶解性分画中で過剰生産が検出できた。
【０１６４】
実施例１０：ソホロリピッド生合成に関与する酵素Sbg2p、Sbg3p及びSbg5pの精製
遺伝子発現の誘導２４時間後に細胞を遠心分離（８０００ｇ、２０分、４℃）を用いて回収した。１ｌの培養物は約５ｇの湿潤バイオマスを生じた。この細胞ペレットを１００ｍｌの緩衝液Ａ（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．８、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  イミダゾール）中で再懸濁し、これは付加的にプロテアーゼ阻害剤（Roche, 注文Nr. 11 873 580 001）を含有する。この再懸濁した細胞を６回の継代を通過させてMicrofluidizerによって分解した。更なる遠心分離工程（１００００ｇ、２０分、４℃）後に、溶解性タンパク質分画を得るために、この上清を濾過した（孔径：０．４５μｍ）。この目的タンパク質をＨｉｓタグアフィニティクロマトグラフィカラム（GE, HisTrap FF 1 ml カラム、注文Nr. 17-5319-01）により精製した。この流速は１ｍ／分であった。リニア溶出０〜１００％を緩衝液Ｂ（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．８，５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５００ｍＭ  イミダゾール）を用いて行った。この場合に、カラム容積２０倍の緩衝液Ｂを使用し、２ｍｌの分画を集めた。タンパク質を有する溶出分画をプールし、濾過ユニットを用いて濃縮した（Amicon Ultra-15, NMWL 10 kDa Centricons, Millipore、注文Nr. UFC901024）。引き続き、そのつどのタンパク質分画をSephadex25（PD-10カラム、GE、注文Nr. 17-0851-01）を用いたゲル濾過を用いて最終的な緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．８、５０ｍＭ  ＮａＣｌ）へと緩衝液交換した（umpuffern）。タンパク質精製をSDS-PAGEを用いて検証した。１ｌの培養物から３．３ｍｇのSbg2p（タンパク質濃度１．０μｇ／μｌ）、７．３ｍｇのSbg5p（タンパク質濃度２．２μｇ／μｌ）及び６．９ｍｇのSbg3p（タンパク質濃度２．１μｇ／μｌ）に精製した。
【０１６５】
実施例１１：ソホロリピッド生合成に関与する酵素Sbg2p、Sbg3p及びSbg5pの特性決定
ソホロリピッド生合成に関与する酵素Sbg2p、Sbg3p及びSbg5pの機能を検出するために、３つの精製した酵素Sbg2p、Sbg3p及びSbg5pをそのつど個々に並びに全ての可能性のある組み合わせにおいて酵素アッセイを実施した。この実施を全容積３５０μｌにおいて以下のスキームに応じて行った：
【０１６６】
表７：酵素アッセイバッチの組成（μｌ）
【表７】
0005936548.tif 000017
【０１６７】
この反応を１４μｌの１３．４ｍＭのエタノール性基質溶液（１８−ヒドロキシ−Ｚ−９−オクタデセン酸）の添加により開始させ、６時間３０℃で振盪下（６００ｒｐｍ）でインキュベーションした。引き続きこの反応を１．４ｍｌのアセトンの添加により停止させた。未溶解成分を遠心分離（１６１００ｇ、５分、ＲＴ）で沈殿させた。この上清を引き続き新規容器中に移し、真空蒸発器（２５℃）を用いて当初の反応容積（３５０μｌ）に濃縮した。この試料をＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳを用いて分析し、この生成物の同定を相応する材料痕跡及びＭＳスペクトルの分析により行った。
【０１６８】
発生した生成物の同定のために５μｌのＵＰＬＣ設備Accela (Thermo Scientific, Dreieich)中に注入した。検査すべき物質を半ＵＰＬＣカラム"Pursuit XRs ULTRA (C8, 2.8μm, 2.1 x 100 mm) (Varian, Darmstadt)を用いて分析した。この分離を２５分以内のうちに移動相Ａ１（Ｈ2Ｏ、０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ）及び移動相Ｂ1（メタノール、０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ）からなる勾配を用いて、流速０．３ｍｌ／分で４０℃で行った。この勾配の時間経過は表８中に示されている。
【０１６９】
表８：ＨＰＬＣ勾配経過
【表８】
0005936548.tif 000018
【０１７０】
この検出をＤＡＤ検出器を用いて波長範囲２００〜６００ｎｍにおいて並びに質量選択的に高解像度ＦＴ−ＩＣＲ質量分析機ＬＴＱ−ＦＴ（Thermo Scientific, Dreieich）を用いてスキャン範囲ｍ／ｚ１００〜１０００において行った。このイオン化をＥＳＩ（electrospray ionization）を用いて行った。正確な質量及び化学的実験式をＦＴ−ＩＣＲ質量分析機を用いて、解像度Ｒ＝１０００００及び質量正確度≦２ｐｐｍで算出した。
【０１７１】
コントロール反応として、基質ＵＤＰグルコース、アセチルＣｏＡ及び１８−ヒドロキシ−Ｚ−９−オクタデセン酸のみを含むが、酵素を含まないバッチを使用した（表７参照）。この試料において、ＭＳを用いて基質１８−ヒドロキシ−Ｚ−９−オクタデセン酸（Ｃ18Ｈ34Ｏ3、２９８，２５０２ｇ／ｍｏｌ）のみを検出できた。
【０１７２】
バッチ２（表７参照）は基質の他に１０５μｇのSbg3pを含有した。この試料において、バッチ１におけるのと同様に１８−ヒドロキシ−Ｚ−９−オクタデセン酸のみを検出できた。
【０１７３】
バッチ３（表７参照）は基質の他に１００μｇのSbg2pを含有した。基質１８−ヒドロキシ−Ｚ−９−オクタデセン酸の他に１８（β−Ｄ−グルコピラノシル−オキシ）−Ｚ−９−オクタデセン酸（実験式、Ｃ24Ｈ44Ｏ8；分子量、４６０，３０３１ｇ／ｍｏｌ）を検出した。このことは、Sbg2pがＵＤＰグルコース及び１８−ヒドロキシ−Ｚ−９−オクタデセン酸を１８（β−Ｄ−グルコピラノシル−オキシ）−Ｚ−９−オクタデセン酸へと変換可能であることを裏付ける。
【０１７４】
バッチ４（表７参照）は基質の他に更に１１０μｇのSbg5pを含有した。基質１８−ヒドロキシ−Ｚ−９−オクタデセン酸の他に１８−（β−Ｄ−グルコピラノシル−オキシ）−Ｚ−９−オクタデセン酸及び１８−Ｌ［（２′−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−オキシ］−Ｚ−９−オクタデセン酸（実験式、Ｃ30Ｈ54Ｏ13；分子量６２２，３５５９ｇ／ｍｏｌ）を検出した。このことは、Sbg5pがＵＤＰグルコース及び１８−ヒドロキシ−Ｚ−９−オクタデセン酸を１８−（β−Ｄ−グルコピラノシル−オキシ）−Ｚ−９−オクタデセン酸へと、更に１８−Ｌ［（２′−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−オキシ］−Ｚ−９−オクタデセン酸へと変換可能であることを裏付ける。
【０１７５】
バッチ５（表７参照）は基質の他に更に１００μｇのSbg2p及び１０５μｇのSbg3pを含有した。基質１８−ヒドロキシ−Ｚ−９−オクタデセン酸の他に１８−（β−Ｄ−グルコピラノシル−オキシ）−Ｚ−９−オクタデセン酸及び１８−（６−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシル−オキシ）−Ｚ−９−オクタデセン酸（実験式、Ｃ26Ｈ46Ｏ9；分子量５０２．３１３６ｇ／ｍｏｌ）を検出した。このことは、既にバッチ３中で示したように、Sbg2pがＵＤＰグルコース及び１８−ヒドロキシ−Ｚ−９−オクタデセン酸を１８−（β−Ｄ−グルコピラノシル−オキシ）−Ｚ−９−オクタデセン酸へと変換可能であることを確認し、さらに、Sbg3pが１８−（β−Ｄ−グルコピラノシル−オキシ）−Ｚ−９−オクタデセン酸をアセチルＣｏＡの存在下で１８（６−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシル−オキシ）−Ｚ−９−オクタデセン酸へアセチル化できることを裏付ける。
【０１７６】
バッチ６（表７参照）は基質の他に更に１１０μｇのSbg5p及び１０５μｇのSbg3pを含有した。基質１８−ヒドロキシ−Ｚ−９−オクタデセン酸の他に１８−（β−Ｄ−グルコピラノシル−オキシ）−Ｚ−９−オクタデセン酸、１８−（６−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシル−オキシ）−Ｚ−９−オクタデセン酸、１８−Ｌ［（２′−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−オキシ］−Ｚ−９−オクタデセン酸、１８−Ｌ［（６′−Ｏ−アセチル−２′−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−オキシ］−Ｚ−９−オクタデセン酸（実験式Ｃ32Ｈ56Ｏ14；分子量６６４，３６６５ｇ／ｍｏｌ）及び１８−Ｌ［（６′−Ｏ−アセチル−２′−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−６″Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−オキシ］−Ｚ−９−オクタデセン酸（実験式Ｃ34Ｈ58Ｏ15；分子量７０６，３７７０ｇ／ｍｏｌ）を検出した。このことは、既にバッチ４で示したように、Sbg5pがＵＤＰグルコース及び１８−ヒドロキシ−Ｚ−９−オクタデセン酸を１８（β−Ｄ−グルコピラノシル−オキシ）−Ｚ−９−オクタデセン酸へと、更に１８−Ｌ［（２′−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−オキシ］−Ｚ−９−オクタデセン酸へと変換できることを確認し、さらに、形成された生成物がアセチルＣｏＡの存在下でSbg3pにより１８−Ｌ［（６′−Ｏ−アセチル−２′−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−オキシ］−Ｚ−９−オクタデセン酸及び／又は１８−Ｌ［（２′−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−６″−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−オキシ］−Ｚ−９−オクタデセン酸並びに１８−Ｌ［（６′−Ｏ−アセチル−２′−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−６″−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−オキシ］−Ｚ−９−オクタデセン酸へとアセチル化できることを裏付ける。
【０１７７】
バッチ７（表７参照）は基質の他に更に１００μｇのSbg2p及び１１０μｇのSbg5pを含有した。基質１８−ヒドロキシ−Ｚ−９−オクタデセン酸の他に１８−（β−Ｄ−グルコピラノシル−オキシ）−Ｚ−９−オクタデセン酸及び１８−Ｌ［（２′−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−オキシ］−Ｚ−９−オクタデセン酸が検出された。このことは、Sbg2p及びSbg5pがバッチ中でＵＤＰグルコース及び１８−ヒドロキシ−Ｚ−９−オクタデセン酸を１８−（β−Ｄ−グルコピラノシル−オキシ）−Ｚ−９−オクタデセン酸へと、そして更に１８−Ｌ［（２′−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−オキシ］−Ｚ−９−オクタデセン酸へと変換可能であることを裏付ける。
【０１７８】
バッチ８（表７参照）は基質の他に更に１００μｇのSbg2p、１０５μｇのSbg3p及び１１０μｇのSbg5pを含有した。基質１８−ヒドロキシ−Ｚ−９−オクタデセン酸の他に１８−（β−Ｄ−グルコピラノシル−オキシ）−Ｚ−９−オクタデセン酸、１８−（６−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシル−オキシ）−Ｚ−９−オクタデセン酸、１８−Ｌ−［（２′−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−オキシ］−Ｚ−９−オクタデセン酸、１８−Ｌ−［（６′−Ｏ−アセチル−２′−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−オキシ］−Ｚ−９−オクタデセン酸及び１８−Ｌ−［（６′−Ｏ−アセチル−２′−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−６″−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−オキシ］−Ｚ−９−オクタデセン酸を検出した。このことは、既にバッチ７において示したように、Sbg2p及びSbg5pが一緒にＵＤＰグルコース及び１８−ヒドロキシ−Ｚ−９−オクタデセン酸を１８−（β−Ｄ−グルコピラノシル−オキシ）−Ｚ−９−オクタデセン酸へと、更に１８−Ｌ−［（２′−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−オキシ］−Ｚ−９−オクタデセン酸へと変換できることを確認し、かつ同様に既にバッチ５及び６において示したように、形成された生成物がアセチルＣｏＡの存在下でSbg3pにより１８−Ｌ−［（６′−Ｏ−アセチル−２′−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−オキシ］−Ｚ−９−オクタデセン酸及び／又は１８−Ｌ−［（２′−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−６″−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−オキシ］−Ｚ−９−オクタデセン酸並びに１８−Ｌ−［（６′−Ｏ−アセチル−２′−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−６″−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−オキシ］−Ｚ−９−オクタデセン酸へとアセチル化できることを裏付ける。
【０１７９】
実施例１２：カンジダ・ボンビコラATCC 22214中のアセチルトランスフェラーゼ（SBG3）の不活性化のための代わりの経路
遺伝子SBG3を代わりの経路で個々に不活性化し、この相応する突然変異体のフェノタイプをソホロリピッド生合成に関して特性決定した。Ｃ．ボンビコラATCC 22214中の相応する突然変異体の構築のために、まずCbSBG3のための欠失カセットをGeneArt AG (Regensburg)により合成した（配列番号１４；実施例２参照のこと）。引き続き、Trenzyme GmbH (Konstanz)でＣ．ボンビコラATCC 22214のオロチジン−５−ホスファート−デカルボキシラーゼをコードする遺伝子CbURA3 (van Bogaert et al. Yeast. 2007. 24(3):201-8)をヒグロマイシン耐性カセットにより交換した。このために、ベクターp-Col-5（配列番号８５）のＤＮＡのヒグロマイシンカセットを以下のオリゴヌクレオチドを用いて増幅した：
0005936548.tif 000019
【０１８０】
以下パラメーターをＰＣＲのために使用した：１×：初期変性、９８℃、３分；２５×：変性、９８℃、０：１０分、アニーリング、６０℃、０：３０分；エロンゲーション、７２℃、２：００分；１×：末端エロンゲーション、７２℃、１０分。増幅には、New England Biolabs (Frankfurt)のPhusionTM High-Fidelity Master Mixを製造者の推奨に相応して使用した。ＰＣＲ産物をQIAquick PCR-Purification Kit (Qiagen, Hilden)を用いて製造者の指示に応じて精製した。得られるＰＣＲ産物は１８３１ｂｐのサイズを有した。ＰＣＲの実施、アガロース電気泳動を用いたＰＣＲの成功した増幅の検証、ＤＮＡのエチジウムブロミド染色、ＰＣＲ断片サイズの測定、ＰＣＲ産物の精製及びＤＮＡ濃度測定を当業者に知られている様式で行った。ヒグロマイシンカセットをベクターpCR4_AcTr_URA（配列番号８８）中にクローニングし、この中でベクターを制限エンドヌクレアーゼBglII及びPmllで線形化した。このインサートを制限エンドヌクレアーゼEcoRV及びBglIIで引き続くライゲーションのために前処理した。ライゲーション及び大腸菌DH5α細胞中の引き続く形質転換を、当業者に知られている様式で行った。このインサートの信頼性をＤＮＡ配列分析により検証した。
【０１８１】
生じたプラスミドはpCR4_AcTr_HygR（配列番号８９）と呼ばれ、８５７８ｂｐのサイズである。
【０１８２】
欠失カセットCbSbg3-hyg（配列番号９０）は、クレブシエラ・ニューモニエ  ヒグロマイシン耐性遺伝子（hph）からなり、これはヒグロマイシンＢホスファターゼをコードする（Gritz L及びDavies J 1983 Plasmid-encoded hygromycin B resistance: the sequence of hygromycin B phosphotransferase gene and its expression in Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae . Gene 25 (2-3) : 179-188）。この耐性遺伝子のためのプロモーターとは、構成的ハイブリッドプロモーターhp4dである（Madzak et al. 2000, Strong hybrid promotors and integrative expression/secretion vectors for quasi-constitutive expression of heterologous proteins in the yeast Yarrowia lipolytica. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2, 207 216）。この耐性遺伝子は、XPR2遺伝子のターミネーターによって隣接され、これはＹ，リポリティカからの細胞外プロテアーゼをコードする（Nicaud et al. 1989a. Cloning, sequencing and amplification of the alkaline extracellular protease (XPR2) gene of the yeast Yarrowia lipolytica . J. Biotechnol. 12, 285 298）。上流及び下流には、不活性化すべき遺伝子の隣合う領域の約１０００ｂｐの耐性遺伝子が隣接する。
【０１８３】
この隣接領域及びhph遺伝子の間にはそのつどloxP遺伝子座が導入され、これは場合によってhph遺伝子の欠失を、リコンビナーゼCreをコードする遺伝子の一時的な導入及びその機能的発現により可能にする（概要に関しては、Kuehn & Torres. Methods Mol Biol. 2002. 180:175-204を参照）。この欠失カセットは以下の表９中の記載に相応して構築されている：
【０１８４】
表９：Ｃ．ボンビコラATCC 22214のSbg3pをコードする構造遺伝子のための欠失カセットの構造
【表９】
0005936548.tif 000020
【０１８５】
Ｃ．ボンビコラATCC 22214の引き続く形質転換のための欠失カセットを十分な量で提供するために、これをＰＣＲで増幅した。この場合に次のオリゴヌクレオチドを使用した：
0005936548.tif 000021
【０１８６】
以下パラメーターをＰＣＲのために使用した：１×：初期変性、９８℃、３分；２５×：変性、９８℃、０：１０分、アニーリング、６０℃、０：３０分；エロンゲーション、７２℃、２：００分；１×：末端エロンゲーション、７２℃、１０分。増幅には、New England Biolabs (Frankfurt)のPhusionTM High-Fidelity Master Mixを製造者の推奨に相応して使用した。ＰＣＲ産物をQIAquick PCR-Purification Kit (Qiagen, Hilden)を用いて製造者の指示に応じて精製した。ＰＣＲの実施、アガロース電気泳動を用いたＰＣＲの成功した増幅の検証、ＤＮＡのエチジウムブロミド染色、ＰＣＲ断片サイズの測定、ＰＣＲ産物の精製及びＤＮＡ濃度測定を当業者に知られている様式で行った。
【０１８７】
Ｃ．ボンビコラATCC 22214の形質転換を、以前記載したように行った（van Bogaert et al. Yeast. 2008. 25:273-278); van Bogaert et al. FEMS Yeast Res. 2009. 9:610-617）。
【０１８８】
Ｃ．ボンビコラATCC 22214形質転換体中の遺伝子SBG3の欠失をCbSBG3のための欠失カセット（配列番号９０）を用いた形質転換後に検証するために、そのつど５つの形質転換体及びＣ．ボンビコラATCC 22214のうちそのつどの遺伝子座をコロニーＰＣＲで増幅した。この場合に次のオリゴヌクレオチドを使用した：
0005936548.tif 000022
【０１８９】
以下パラメーターをＰＣＲのために使用した：１×：初期変性、９４℃、３分；２５×：変性、９４℃、１：００分、アニーリング、６０℃、１：００分；エロンゲーション、７２℃、５：００分；１×：末端エロンゲーション、７２℃、１０分。増幅には、QIAGEN (Hilden)のTaq PCR Master Mix Kitを製造者の推奨に相応して使用する。そのつど１０μｌのＰＣＲ反応を引き続き０．８％のアガロースゲルで分離した。ＰＲＣの実施、アガロースゲル電気泳動、ＤＮＡのエチジウムブロミド染色及びＰＣＲ断片サイズの測定を当業者に知られている様式で行った。
【０１９０】
Ｃ．ボンビコラATCC 22214からのCbSBG3遺伝子座の増幅の際に野生型シチュエーション存在の場合に予期すべき断片サイズ２８３９ｂｐのみが算出された。
【０１９１】
ＳＢＧ３遺伝子座の増幅では欠失カセットCbSBG3-hygの形質転換後の形質転換体から、CbSBG3の成功した染色体性欠失後に予期すべき断片サイズ４６９３ｂｐのみが達成された。
【０１９２】
従って、遺伝子CbSBG3が染色体欠失されたクローンが同定できた。相応する株は更にＣ．ボンビコラATCC 22214 sbg3-hygと称呼した。
【０１９３】
実施例１３：Ｃ．ボンビコラATCC 22214 sbg3-hygによるソホロリピッド形成の特性決定
株Ｃ．ボンビコラATCC 22214及びＣ．ボンビコラATCC 22214 sbg3-hygの増殖をＹＰＤ寒天プレート上で行った。ソホロリピッドの生産には、以下でＳＬ生産培地と呼ばれる培地が使用された。これは、０．１％  ＫＨ2ＰＯ4、０．５％  ＭｇＳＯ4×７Ｈ2Ｏ、０．０１％  ＦｅＣｌ3、０．０１％  ＮａＣｌ、０．４％  酵母エキス、０．１％  尿素、１０．５％  ナタネ油及び１０％  グルコースからなる。このｐＨ値を４．５に調節し、この培地を続いてオートクレーブ（１２１℃、２０分）を用いて滅菌した。培養の間のｐＨ値の調節は必要でない。
【０１９４】
振盪フラスコ中のソホロリピッド生産の検査のためにまず予備培養物を適用した。このために、新規にＹＰＤ寒天プレート上に塗布する株のイノキュレート用エーゼを使用し、かつ１０ｍｌのＹＰＤ培地を１００ｍｌのエルレンマイヤーフラスコ中で接種した。この培養を３０℃及び２００ｒｐｍで一晩行った。この予備培養物を、１００ｍｌのＳＬ培地を１０００ｍｌのエルレンマイヤーフラスコ中に接種するために以下使用した（開始ＯＤ600  ０．２）。この培養物を２００ｒｐｍ及び３０℃で７日間培養し、毎日２ｍｌのブイヨンの試料を取り出し、その際、試料採取前にこの培養培地の十分な混合について厳密に注意した。
【０１９５】
後続のクロマトグラフィ分析のための試料前処理を以下のように行った：容積式ピペット（Combitip）を用いて２ｍｌの反応容器中に８００μｌのアセトンを装入し、この反応容器を蒸発を最小限にするためにすぐに閉鎖した。この後に２００μｌのブイヨンを添加した。ブイヨン／アセトン混合物のボルテックス処理後に、これらを１分間１３０００ｒｐｍで遠心分離し、この上清８００μｌをＨＰＬＣ容器中に移した。
【０１９６】
ソホロリピッド又はオレイン酸の検出及び定量化のために、Evaporative Light Scattering Detektor (ELSD)を利用した。当初の測定をAgilent Technologies 1200系列(Santa Clara, california)及びZorbax SB-C8 Rapid Resolutionカラム(４．６×１５０ｍｍ、３．５μｍ、Agilent)を用いて実施した。この注入容積は５μｌであり、この方法の通液時間は２０分であった。移動相としてＨ2Ｏ及び０．１％ＴＦＡ（三フッ化酢酸、溶液Ａ）及びメタノール（溶液Ｂ）を使用した。このカラム温度は４０℃であった。検出器としてＥＬＳＤ（検出温度６０℃）及びＤＡＤ（ダイオードアレー、２１０ｎｍ）を使用した。この方法で使用される勾配は以下の表１０に挙げてある。
【０１９７】
表１０：ソホロリピッドのＨＰＬＣベースの定量化のために使用すべき、移動相の勾配プロファイルの説明
【表１０】
0005936548.tif 000023
【０１９８】
この分析は、Ｃ．ボンビコラATCC 22214及びＣ．ボンビコラATCC 22214 sbg3-hygがソホロリピッドを生産することを示した。
【０１９９】
ＬＣ−ＭＳ2を用いて、Ｃ．ボンビコラATCC 22214 sbg3-hygにより形成したソホロリピッドが、Ｃ．ボンビコラATCC 22214により形成したソホロリピッドとは対照的に、一般式（Ｉａ）及び（Ｉｂ）の化合物［式中、Ｒ1＝Ｈ及びＲ2＝Ｈ（図１及び２参照）］のみに相応すること、そして、この化合物の濃度がＣ．ボンビコラATCC 22214と比較して１０倍高められて存在すること、を検出した。このことはSbg3pの機能をソホロリピッド生合成においてアセチルトランスフェラーゼ（Ｅ4）として裏付ける。
【図１】
0005936548.tif 000024
【図２】
0005936548.tif 000025
【配列表】
0005936548000001.app