(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｍｉＲ−９２に対するアンチセンス分子を有効成分とし、該アンチセンス分子を細胞に導入することにより、ｍｉＲ−９２の発現を減少させることを特徴とする、心筋梗塞または冠状動脈閉塞により生じた虚血という病的状態の治療剤。
【請求項２】
ｍｉＲ−９２に対するアンチセンス分子を有効成分として含む、心筋梗塞または冠状動脈閉塞により生じた虚血という病的状態の治療のための医薬組成物。
【請求項３】
アンチセンス分子が、配列番号１〜配列番号５のいずれか１つによる配列を有する分子とハイブリダイズする配列を含むアンチセンス分子であって、最大で３０ヌクレオチド長、又は１５〜２２ヌクレオチド長であるアンチセンス分子、又は配列番号６、配列番号８、若しくは配列番号１１による配列を有するアンチセンス分子である、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
心筋梗塞または冠状動脈閉塞により生じた虚血という病的状態を治療する医薬組成物を作製するためのｍｉＲ−９２に対するアンチセンス分子の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞におけるｍｉＲ−９２発現に影響を与える方法、特に血管新生、血管形成、若しくは血管修復を促進するか、又は腫瘍血管新生を阻害若しくは遮断する方法、及び疾患又は状態の治療のためのかかる方法の使用に関する。さらに、本発明は、細胞における血管新生、血管形成、若しくは血管修復を促進するか、又は腫瘍血管新生を阻害若しくは遮断する医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
内皮は血管の完全性及び機能性を維持する上で重要な役割を果たす。成体においては、新たな血管の成長は動脈形成、血管新生、又は脈管形成により起こる。動脈形成は側副血管の成長と定義されるが、血管新生は既存の血管からの新たな血管の成長であると理解される。血管新生において、静止内皮細胞は血管新生因子により活性化され、遊走を開始し、増殖して、管状構造体へと組織化する（非特許文献２）。脈管形成という用語は、当初は胚における血管芽細胞からの新規の（de novo）血管形成を説明するものであったが、現在は内皮前駆細胞又は他の成体幹細胞からの血管の形成も包含する（非特許文献１）。血管新生及び脈管形成は、虚血組織における血流の再構成において極めて重要な役割を果たす生理的発生過程であり、腫瘍の成長における基本的段階である。血管新生及び新血管形成の促進は、例えば虚血患者において考え得る治療戦略であることが確認されている。腫瘍血管新生において、これらの過程を制限することは腫瘍成長の抑制につながる。
【０００３】
ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、標的ｍＲＮＡの分解又は翻訳抑制によって、遺伝子発現を転写後レベルで制御する低分子非コードＲＮＡである（非特許文献３）。相補的ｍＲＮＡ配列と結合する低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）とは対照的に、ｍｉＲＮＡの標的への結合は相補的ＲＮＡで起こるだけでなく、熱力学的に有利なより複雑なＲＮＡ−ＲＮＡ構造を形成もする（非特許文献４）。この「不完全な」結合によって、或るｍｉＲＮＡ分子が異なるｍＲＮＡ分子へと結合することが可能となる。（単一の遺伝子又は成長因子を用いる単独療法とは対照的な）一連の遺伝子の制御は、それにより複雑な制御過程に影響を与えることができれば有利であり得る。これまで、ヒトゲノムにおいては４００種を超えるｍｉＲＮＡが同定されているが、これらのｍｉＲＮＡの大部分は、生理的過程及び発症過程における細胞機能との関連性が依然として明らかではない。現行の技術水準においては、ｍｉＲＮＡプロセシング酵素であるＤｉｃｅｒ及びＤｒｏｓｈａの下方制御は血管新生を妨げるとされているが（非特許文献５〜７）、内皮細胞の機能及び血管新生に影響を与える具体的なｍｉＲＮＡは、ほとんど記載されていない。ｍｉＲ−２２１及びｍｉＲ−２２２は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの内皮細胞の遊走、増殖、及び血管新生を、幹細胞因子受容体ｃ−ｋｉｔとの相互作用及びｅＮＯＳ発現の制御により間接的に遮断する（非特許文献６、８）。これに対し、ｌｅｔ７−ｆ及びｍｉＲ−２７ｂの発現はｉｎ  ｖｉｔｒｏ血管新生に寄与する（非特許文献７）。
【０００４】
現行の技術水準では、ｍｉＲＮＡクラスターであるｍｉＲ−１７−９２に強い腫瘍血管新生促進活性があると考えられている。ｍｉＲ−１７−９２クラスターは、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−１７−３ｐ、ｍｉＲ−１８ａ、ｍｉＲ−１９ａ、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−１９ｂ、及びｍｉＲ−９２−１から成る（非特許文献９）。このｍｉＲ−１７−９２クラスターは、Ｍｙｃ誘導腫瘍において上方制御され、個々のｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−１８及びｍｉＲ−１９）を、抗血管新生タンパク質の発現と特異的に相互作用する分子であると同定することができた。これらのｍｉＲＮＡの標的に関する具体的な評価により、ｍｉＲ−１８が結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）の発現を選択的に抑制し、ｍｉＲ−１９が強い血管新生阻害物質であるトロンボスポンジン−１（ＴＳＰ−１）と相互作用することが示された（非特許文献１０）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Carmeliet, P. (2000) Mechanisms of angiogenesis and arteriogenesis.Nat Med 6 (4), 389-395.
【非特許文献２】Adams, R.H. and Alitalo, K. (2007) Molecular regulation ofangiogenesis and lymphangiogenesis. Nat Rev Mol Cell Biol 8 (6), 464-478
【非特許文献３】Bartel, D.P. (2004) MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, andfunction. Cell 116 (2), 281-297
【非特許文献４】Hofacker, I.L. (2007) How microRNAs choose their targets. Nat Genet39 (10), 1191- 1192
【非特許文献５】Yang, W.J. et al. (2005) Dicer is required for embryonic angiogenesisduring mouse development. J Biol Chem 280 (10), 9330-9335
【非特許文献６】Suarez, Y. et al. (2007) Dicer dependent microRNAs regulate geneexpression and functions in human endothelial cells. Circ Res 100 (8),1164-1173
【非特許文献７】Kuehbacher, A. et al. (2007) Role of Dicer and Drosha forendothelial microRNA expression and angiogenesis. Circ Res 101 (1), 59-68
【非特許文献８】Poliseno, L. et al. (2006) MicroRNAs modulate the angiogenicproperties of HUVECs. Blood 108 (9), 3068-3071
【非特許文献９】Venturini, L. et al. (2007) Expression of the miR-17-92 polycistronin chronic myeloid leukemia (CML) CD34+ cells. Blood 109 (10), 4399-4405
【非特許文献１０】Dews, M. et al. (2006) Augmentation of tumor angiogenesis by aMyc-activated microRNA cluster. Nat Genet 38 (9), 1060-1065
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明によって、驚くべきことに、ｍｉＲ−９２が現行の技術水準において説明されているように血管新生を促進するものではなく、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの内皮細胞の遊走及び管腔形成（tube formation）、並びにｉｎ  ｖｉｖｏでの新血管形成を強く減少させることが見出された。ｍｉＲ−９２の阻害により新血管形成が減少する。したがって、ｍｉＲ−９２は、現行の技術水準においてこれまで説明されていたように血管新生促進活性を有するのではなく、抗血管新生活性を有するものである。
【０００７】
この抗血管新生活性は、血管新生及び内皮活性を調節する主要タンパク質、例えば内皮一酸化窒素合成酵素（ｅＮＯＳ）及びサーチュイン１（ＳＩＲＴ１）（共に出生後の内皮細胞の機能にとって極めて重要である）（文献１１〜１３）、並びにインテグリンα５（内皮細胞の運動性及びマトリックスとの相互作用を調節する）の阻害に関連する（文献１４）。ｍｉＲ−９２阻害物質によるｍｉＲ−９２の阻害は、内皮細胞の機能及び新血管形成を改善するための新たな治療戦略である。一方で、ｍｉＲ−９２の過剰発現が新血管形成を減少させることが見出された。
【０００８】
本発明は、ｍｉＲ−９２が、現行の技術水準においてこれまで説明されていたように血管新生促進活性を発揮するのではなく、抗血管新生生物活性を発揮するという知見に基づく。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
より具体的には、本発明は、特に血管新生及び／又は脈管形成との関連において、細胞におけるｍｉＲ−９２発現に影響を与える方法に関する。本発明によると、該方法は、
ａ）細胞を準備する工程、及び
ｂ１）ｍｉＲ−９２に対するアンチセンス分子を細胞に導入することにより、血管新生、血管形成、及び／又は血管修復を促進するよう、細胞におけるｍｉＲ−９２発現を減少させる工程、又は
ｂ２）発現可能なｍｉＲ−９２配列を含む構築物を細胞に導入することにより、腫瘍血管新生を阻害するよう、細胞におけるｍｉＲ−９２発現を増加させる工程を含む。ｍｉＲ−９２を細胞に導入することも可能である。好ましい実施の形態では、上記方法はｉｎ  ｖｉｔｒｏでの方法である。
【００１０】
細胞におけるｍｉＲ−９２発現を減少又は増加させるという表現は、ＲＴ−ＰＣＲすなわちリアルタイムＰＣＲを用いて行うことができるような、野生型細胞におけるｍｉＲ−９２発現との比較に基づく。発現の個々の変化はまた、細胞特性に対する変更したｍｉＲ−９２の発現レベルの機能的効果を用いて求めることができる。
【００１１】
アンチセンス分子は、ＲＮＡ（ここではｍｉＲ−９２）に対して本質的に逆相補的な配列を有し、且つｍｉＲ−９２とのハイブリダイゼーションによりｍｉＲ−９２の生物学的機能を阻害する一本鎖分子である。好ましくは、該分子はアンチセンスＲＮＡであり、任意で化学修飾を含んでいてもよい。
【００１２】
構築物はプラスミド、コスミド、ウイルス、又は前駆体ｍｉＲＮＡであり得るが、構築物は有利には、それに含まれる発現可能なｍｉＲ−９２配列を転写する手段、例えばｍｉＲ−９２配列と機能的に連結したプロモータを含む。
【００１３】
「ｍｉＲ−９２」という用語は、本明細書中で使用される場合、前駆分子（ｐｒｅ−９２ａ−１、ｐｒｅ−９２ａ−２、及びｐｒｅ−９２ｂ等）並びにプロセシングされた分子（ｍｉＲ−９２ａ及びｍｉＲ−９２ｂ等）の両方を包含する（配列番号１〜配列番号５による配列も参照されたい）。
【００１４】
分子又は構築物の導入は、物理的方法（例えばマイクロインジェクション又はエレクトロポレーション）、化学的方法（例えばリン酸カルシウム法又はリポフェクション）、又はウイルス法（ウイルスを用いる）のいずれかを用いて行なうことができる。
【００１５】
本発明の好ましい実施の形態では、細胞におけるｍｉＲ−９２発現に影響を与えることにより、細胞におけるタンパク質の発現が影響を受けるが、該タンパク質は、ｅＮＯＳ、ＳＩＲＴ１、インテグリンα５、インテグリンβ１、インテグリンαｖ、Ｓｐｒｏｕｔｙ２、ＴＩＭＰ  ４、Ｔｉｅ  ２、ＡＮＧ  ２、ＭＫＫ  ４、ＫＬＦ  ２、ＰＣＡＦ、ＥＤＧ  １、及びＲＡＰ  １Ｂの群から選択される。これらのタンパク質は全て、内皮細胞の機能の調節、動脈硬化予防（athero-protection）、及び／又は出生後新血管形成と関連する。ＳＩＲＴ１はさらに、加齢関連疾患と関連する。
【００１６】
細胞の準備には、単離形態（例えばクローン細胞株の細胞）での細胞の準備と、組織、器官、又は生体の一部である細胞の準備との両方が含まれる。
【００１７】
準備される細胞は一般に、任意の種類の細胞を含んでいてもよい。好ましくは、準備される細胞は血管細胞、造血細胞、心筋細胞、炎症細胞、及び／又は神経細胞である。どの場合も、前述の細胞の全ての前駆細胞及び幹細胞が含まれる。上記方法の好ましい実施の形態では、幹細胞はヒト胚性幹細胞ではない。さらに、準備される細胞は単離状態で存在していても、組織又は器官と結合していてもよい。一実施の形態では、方法はｉｎ  ｖｉｖｏでも行うことができる。
【００１８】
準備される細胞は、後生動物、特に哺乳動物（例えばマウス又はラット等の齧歯類）、サル、類人猿、ウシ、ブタ、イヌ、又はネコ、又は特に好ましくはヒトに由来する幹細胞（stems）であるのが好ましい。
【００１９】
ｍｉＲ−９２発現の減少
上記方法によって、細胞におけるｍｉＲ−９２発現が、野生型細胞におけるｍｉＲ−９２の正常発現と比較して減少する場合、発現の減少はアンチセンス分子、合成ｍｉＲ−９２阻害物質、及び転写因子阻害物質から成る群から選択される分子を提供することにより起こる。このｍｉＲ−９２発現の減少は、例えば組織における血管形成及び血管修復の増加をもたらす。
【００２０】
本発明による方法の一実施の形態では、アンチセンス分子は、ストリンジェントな条件下及びあまりストリンジェントでない条件下の両方で、配列番号１〜配列番号５のいずれか１つによるＲＮＡ分子とハイブリダイズする分子である。このことにより、アンチセンス分子はハイブリダイズした状態で、ｍｉＲ−９２と比較して「ミスマッチ」を示す可能性も含まれるが、それにもかかわらず、アンチセンス分子としての機能は除去されない。したがって、塩基ミスマッチ（複数可）にかかわらず、ｍｉＲ−９２の阻害又は分解は起こる。特に、アンチセンス分子は、最大で８０ヌクレオチド長、好ましくは最大で３０ヌクレオチド長、特に好ましくは１５〜２２ヌクレオチド長であり得る。特に未成熟ｍｉＲ−９２前駆体の阻害に関しては、アンチセンス分子は、最大で８０ヌクレオチド長、特に最大で３０ヌクレオチド長であり得る。かかるアンチセンス分子の最小の長さは、有利には１２ヌクレオチド長、好ましくは１５ヌクレオチド長である。
【００２１】
好ましい実施の形態では、アンチセンス分子は、配列番号１〜配列番号５のいずれか１つによる配列に対して逆相補的な配列を含む。このため、塩基ミスマッチ（複数可）は全く形成されず、効率的なｍｉＲ−９２の阻害がもたらされる。本発明の好ましい実施の形態では、アンチセンス分子は、配列番号６又は配列番号８による配列を有する分子である。アンチセンス分子が少なくとも１つの化学修飾、例えば少なくとも１つの２’−Ｏ−メチル基、コレステロール基、ホスホチオエート基、及び／又は２’−Ｏ−メトキシエチル−２’−フルオロ基を含むことが可能である。アンチセンス分子は、同様に又はさらにロックト核酸（locked nucleic acid）（ＬＮＡ）成分を含んでいてもよい。例えば、アンチセンス分子の非常に好ましい実施の形態は、化学修飾を有する配列番号６による配列を含む、以下の分子である：
ＣｔＡｔＧＧＣＣＧＧＧＡＣＡＡＧＵＧＣＡｔＡｔＵｔＡｔ−Ｃｈｏｌ  （配列番号９）
（大文字は２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを示し、下付きのｔ（「ｔ」）は隣接するヌクレオチド間のホスホチオエート結合を示し、「Ｃｈｏｌ」はコレステロール基を示す）
化学修飾を有する配列番号８による配列を含む、アンチセンス分子の非常に好ましい実施の形態は、以下の分子である：
ＡｔＣｔＡｔＧＧＣＣＧＧＧＡＣＡＡＧＵＧＣＡｔＡｔＵｔＡｔ−Ｃｈｏｌ  （配列番号１０）
（大文字は２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを示し、下付きのｔ（「ｔ」）は隣接するヌクレオチド間のホスホチオエート結合を示し、「Ｃｈｏｌ」はコレステロール基を示す）
２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドのみを含む、配列番号１１による配列を含むアンチセンス分子がさらに好ましい。
【００２２】
かかるアンチセンス分子を合成する方法は、当業者に既知である。
【００２３】
血管新生、血管形成、及び血管修復を促進する上述の類の方法は、疾患又は状態の治療に使用することができる。疾患又は状態（任意で病的状態）は、虚血（例えば心筋梗塞、慢性虚血性心疾患、末梢または冠状動脈閉塞、虚血性梗塞、脳卒中）、病的血管新生（例えば腫瘍血管新生、転移形成、糖尿病性網膜症、慢性炎症疾患）、関節硬化、関節硬化に対する二次疾患（急性冠症候群、心筋梗塞、脳卒中、心筋症）、又は（早期）老化若しくは加齢関連疾患、並びに神経変性疾患（例えばアルツハイマー病及びパーキンソン病）から成る群から選択される。
【００２４】
さらに、記載の方法は幹細胞又は前駆細胞（例えば血管新生促進細胞、器官特異的前駆細胞、骨髄由来細胞、又は循環前駆細胞）の治療に使用することができる。
【００２５】
したがって、上記方法は例えば、特に組織置換療法又は研究用の血管置換材料の作製のために、ｉｎ  ｖｉｖｏ及びｅｘ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏの両方で使用することができる。
【００２６】
ｍｉＲ−９２発現の増加
上記方法において、細胞、例えば内皮細胞におけるｍｉＲ−９２の発現が、野生型細胞におけるｍｉＲ−９２の正常発現と比較して増加する場合、これは例えば、発現可能なｍｉＲ−９２配列を含む構築物を細胞に導入して発現を増加させることによって起こり得る。本発明による方法の好ましい実施の形態では、ｍｉＲ−９２構築物は、配列番号１〜配列番号５のいずれか１つによる発現可能な配列を含むか、又はかかる配列をそれぞれ発現することができる。かかる構築物の有利な実施の形態は上記に記載している。代替的には、ｍｉＲ−９２を細胞に直接導入することもできる。
【００２７】
腫瘍血管新生を阻害する、後述される類の方法は、過剰の（overshooting）血管新生、望ましくない血管新生、腫瘍、及び慢性炎症から成る群から選択される疾患又は（病的）状態の治療に使用することができる。
【００２８】
医薬組成物
本発明はさらに、医薬組成物であって、ｍｉＲ−９２に対するアンチセンス分子、任意で合成の、阻害物質、及び／又は転写因子阻害物質の形態である、細胞におけるｍｉＲ−９２の活性又は発現を減少させる薬剤、又はｍｉＲ−９２を発現する構築物の形態である、細胞におけるｍｉＲ−９２発現を増加させる薬剤を含む、医薬組成物に関する。このため、構築物は、配列番号１〜配列番号５のいずれか１つによる発現可能な配列を含み得る。一実施の形態では、医薬組成物中に含まれるｍｉＲ−９２に対するアンチセンス分子は、配列番号６、配列番号８、又は配列番号１１による配列を含む。構築物又はアンチセンス分子のさらなる好ましい実施の形態については、上記の記載及び本明細書中に含まれる記載を参照されたい。
【００２９】
本発明はさらに、上述の医薬組成物を作製する方法に関する。
【００３０】
本発明による医薬組成物はそれぞれ、錠剤、糖衣錠、丸薬、粒剤（granulates）、エアロゾル、輸液、エマルション、懸濁液、溶液の形態で、又は埋め込み型医療機器（例えばステント）のコーティング材料中若しくは材料上に存在し得る。
【００３１】
本発明による薬剤又は医薬組成物の使用はそれぞれ、好適な既知の剤型を用いて行うことができる。
【００３２】
本発明による薬剤の使用では、薬剤は不活性、非毒性の薬学的に許容可能な担体又は溶媒を用いて既知の方法で、通常の剤型（例えば錠剤、糖衣錠、丸薬、粒剤、エアロゾル、エマルション、懸濁液、及び溶液）に変換することができる。この場合、混合物全体の約０．１ｗｔ％〜９５ｗｔ％、好ましくは約０．５ｗｔ％〜９０ｗｔ％の濃度といった、すなわち標的組織において必要とされる薬物濃度を達成するのに十分な量で、治療的に有効な化合物に関して治療的に有効な薬剤濃度が各々存在するものとする。
【００３３】
剤型は、例えば薬剤を、任意で乳化剤（emulgators）及び／又は分散剤を用いて、溶媒及び／又は担体で希釈すること（stretching）により作製されるが、その際、例えば水を希釈剤として使用する場合、任意で有機溶媒を助剤として使用してもよい。
【００３４】
助剤としてはさらに、例えば、水、非毒性溶媒、例えばパラフィン（例えば原油留分）、植物油（例えばラッカセイ油、ゴマ油）、アルコール（例えばエチルアルコール、グリセロール）、担体、例えば天然石粉（例えばカオリン、アルミナ、タルク、チョーク）、合成石粉（例えば高度に分散したケイ酸、シリカ）、糖（例えばスクロース、ラクトース、及びグルコース）、乳化剤（例えばポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテル）、分散剤（例えばリグニン、亜硫酸パルプ廃液、メチルセルロース、デンプン、及びポリビニルピロリドン）、及び滑剤（例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、ステアリン酸、及び硫酸ナトリウム）を挙げることができる。
【００３５】
投与は通常の方法、好ましくは経口的又は非経口的に、特に舌下又は静脈内で行なわれる。本発明による薬物を経口使用する場合、錠剤は当然ながら、前述の担体に加えて、添加物、例えばクエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、及びリン酸二カルシウム、並びに別の添加物、例えばデンプン（好ましくはジャガイモデンプン）、ゼラチン等を含有していてもよい。さらに、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、及びタルク等の滑剤を、錠剤を作製する際に使用してもよい。水性懸濁液の場合、上述の助剤に加えて、薬物に別の風味向上剤又は着色剤を混和してもよい。非経口的使用の場合には、好適な液体担体材料を用いた薬物の溶液を使用することができる。
【００３６】
治療又は予防する方法
本発明はまた、個体、特に患者を、ｍｉＲ−９２若しくはｍｉＲ−９２のアンタゴニスト（例えばアンチセンス分子若しくは転写因子阻害物質）、又は上記の記載若しくは本明細書中に含まれる記載に従う医薬組成物を用いて治療又は予防する方法に関する。かかる方法に関しては、１日当たり０．００１ｍｇ／ｋｇ体重〜２００ｍｇ／ｋｇ体重という量の薬物を投与することができる。
【００３７】
ｍｉＲ−９２に対するアンチセンス分子
本発明はまた、配列番号１〜配列番号５による配列を有する分子とハイブリダイズする配列を含む、ｍｉＲ−９２に対するアンチセンス分子に関するが、該分子は最大で８０個のヌクレオチド、特に１５個〜２２個のヌクレオチドを有するか、又はそれから成る。かかるアンチセンス分子は、少なくとも１２個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも１５個のヌクレオチドを含むのが有利である。ハイブリダイゼーションは、ストリンジェントな条件下又はあまりストリンジェントでない条件下で起こり得る。ハイブリダイゼーションを判定する方法は当業者に既知である。
【００３８】
かかる分子は任意で化学修飾を含んでいてもよい。上述の化学修飾のうち少なくとも１つを含む配列番号６、配列番号８、又は配列番号１１による分子が特に好ましい。化学修飾を含むアンチセンス分子としては、配列番号９及び配列番号１０による分子（それぞれ配列番号６又は配列番号８による分子に由来する）が好ましい。
【００３９】
本発明によると、かかる分子は血管新生、血管形成、及び血管修復を促進するために使用することができる。
【００４０】
本発明によると、ｍｉＲ−９２又は配列番号１〜配列番号５のいずれか１つによる配列を有する分子は、腫瘍血管新生を阻害するため、特に上述の医薬組成物を作製するために使用することができる。
【００４１】
特に、本発明の好ましい実施の形態では、本発明は、ヒトをクローニングするプロセス、又はヒトの生殖細胞系遺伝的同一性を変更するプロセス、及び工業目的若しくは商業目的でのヒト胚の使用、又はヒト（man）若しくは動物に対するいかなる実質的な医学的利点もなしに動物に損害を引き起こす可能性がある、動物の遺伝的同一性を変更するプロセス、並びにかかるプロセスにより生じる動物に関するものではない。
【００４２】
本発明を実施例に基づきより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。実施例に記載される実験の結果を図面に示す。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】図１Ａ：内皮細胞（準備した細胞である）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ機能に対するｍｉＲ−９２の過剰発現の効果を示す図である。ｐｒｅ−ｍｉＲ−９２をトランスフェクトした内皮細胞におけるｍｉＲ−９２の過剰発現を示す。図１Ｂ：内皮細胞（準備した細胞である）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ機能に対するｍｉＲ−９２の過剰発現の効果を示す図である。スフェロイドにおける発芽（sprout）形成の阻害を示す。図１Ｃ：内皮細胞（準備した細胞である）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ機能に対するｍｉＲ−９２の過剰発現の効果を示す図である。「マトリゲルアッセイ」における発芽形成の阻害を示す。図１Ｄ：内皮細胞（準備した細胞である）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ機能に対するｍｉＲ−９２の過剰発現の効果を示す図である。生存率に対するｐｒｅ−ｍｉＲ−９２の効果を示す。図１Ｅ：内皮細胞（準備した細胞である）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ機能に対するｍｉＲ−９２の過剰発現の効果を示す図である。遊走に対するｐｒｅ−ｍｉＲ−９２の効果を示す。図１Ｆ：内皮細胞（準備した細胞である）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ機能に対するｍｉＲ−９２の過剰発現の効果を示す図である。接着に対するｐｒｅ−ｍｉＲ−９２の効果を示す。
【図２】図２Ａ：ｉｎ  ｖｉｖｏでの血管新生に対するｍｉＲ−９２の過剰発現の効果を示す図である。ｐｒｅ−ｍｉＲ−９２をトランスフェクトした内皮細胞におけるｍｉＲ−９２の過剰発現を示す。図２Ｂ：ｉｎ  ｖｉｖｏでの血管新生に対するｍｉＲ−９２の過剰発現の効果を示す図である。ｉｎ  ｖｉｖｏでの血管新生の阻害を示す。ＨＵＶＥＣに対照又はｐｒｅ−ｍｉＲ−９２をトランスフェクトし、１×１０６個の細胞をｉｎ  ｖｉｖｏ「マトリゲルプラグ」に埋め込んだ。Ｈ＆Ｅ切片における血管新生を判定した。図２Ｃ：ｉｎ  ｖｉｖｏでの血管新生に対するｍｉＲ−９２の過剰発現の効果を示す図である。ｉｎ  ｖｉｖｏでの血管新生の阻害を示す。ＨＵＶＥＣに対照又はｐｒｅ−ｍｉＲ−９２をトランスフェクトし、１×１０６個の細胞をｉｎ  ｖｉｖｏ「マトリゲルプラグ」に埋め込んだ。Ｈ＆Ｅ切片における血管新生を判定した。図２Ｄ：ｉｎ  ｖｉｖｏでの血管新生に対するｍｉＲ−９２の過剰発現の効果を示す図である。ｉｎ  ｖｉｖｏでの血管新生の阻害を示す。ＨＵＶＥＣに対照又はｐｒｅ−ｍｉＲ−９２をトランスフェクトし、１×１０６個の細胞をｉｎ  ｖｉｖｏ「マトリゲルプラグ」に埋め込んだ。ヘモグロビンを測定することにより灌流を判定した。
【図３−１】図３Ａ：ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでの血管新生に対するｍｉＲ−９２阻害の効果を示す図である。ｍｉＲ−９２を遮断する２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチドを用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ発芽の刺激を示す。図３Ｂ：ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでの血管新生に対するｍｉＲ−９２阻害の効果を示す図である。ｉｎ  ｖｉｖｏ新血管形成に対するアンタゴｍｉｒ（antagomir）の全身融合の効果を示す。実験計画を示す。
【図３−２】図３Ｃ：ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでの血管新生に対するｍｉＲ−９２阻害の効果を示す図である。ｉｎ  ｖｉｖｏ新血管形成に対するアンタゴｍｉｒの全身融合の効果を示す。種々の器官（心臓、大動脈、脾臓、肝臓）におけるｍｉＲ−９２の発現を示す。
【図３−３】図３Ｄ：ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでの血管新生に対するｍｉＲ−９２阻害の効果を示す図である。ｉｎ  ｖｉｖｏ新血管形成に対するアンタゴｍｉｒの全身融合の効果を示す。ヘモグロビン濃度の測定結果による灌流に対する効果を示す。図３Ｅ：ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでの血管新生に対するｍｉＲ−９２阻害の効果を示す図である。ｉｎ  ｖｉｖｏ新血管形成に対するアンタゴｍｉｒの全身融合の効果を示す。血管の形成を示す代表的な写真（Ｈ＆Ｅ染色）である。
【図４】図４Ａ：ｍｉＲ−９２標的分子の同定を示す図である。ｐｒｅ−ｍｉＲ−９２による処理後のＨＵＶＥＣの遺伝子発現プロファイルを示す。図４Ｂ：ｍｉＲ−９２標的分子の同定を示す図である。ウエスタンブロット法を用いた、ｐｒｅ−ｍｉＲ−９２のトランスフェクション後のＨＵＶＥＣにおけるタンパク質発現の異常調節の確認を示す。図４Ｃ：ｍｉＲ−９２標的分子の同定を示す図である。ウエスタンブロット法を用いた、ｐｒｅ−ｍｉＲ−９２のトランスフェクション後のＨＵＶＥＣにおけるタンパク質発現の異常調節の確認を示す。図４Ｄ：ｍｉＲ−９２標的分子の同定を示す図である。ＦＡＣＳを用いた、インテグリンの発現に対するｐｒｅ−ｍｉＲ−９２の効果の検出を示す。図４Ｅ：ｍｉＲ−９２標的分子の同定を示す図である。ＦＡＣＳを用いた、インテグリンの発現に対するｐｒｅ−ｍｉＲ−９２の効果の検出を示す。
【図５】図５Ａ：ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの血管新生に対するｍｉＲ−９２ａの効果を示す図である。ｐｒｅ−ｍｉＲ−９２をＨＵＶＥＣにおいて過剰発現させ、スフェロイドモデルにおいてｉｎ  ｖｉｔｒｏで血管新生を判定した。Ｎ＞３、＊：対照（Ｃｏ）に対してｐ＜０．０５。図５Ｂ：ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの血管新生に対するｍｉＲ−９２ａの効果を示す図である。ｐｒｅ−ｍｉＲ−９２をＨＵＶＥＣにおいて過剰発現させ、マトリゲルアッセイにおいてｉｎ  ｖｉｔｒｏで血管新生を判定した。Ｎ＞３、＊：対照（Ｃｏ）に対してｐ＜０．０５。図５Ｃ：ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの血管新生に対するｍｉＲ−９２ａの効果を示す図である。ｐｒｅ−ｍｉＲ−９２をＨＵＶＥＣにおいて過剰発現させ、スフェロイドモデル及びマトリゲルアッセイにおいてｉｎ  ｖｉｔｒｏで血管新生を判定した際の代表的な例を示す。図５Ｄ：ｉｎ  ｖｉｖｏでの血管新生に対するｍｉＲ−９２ａの効果を示す図である。ｐｒｅ−ｍｉＲ−９２ａ又は対照ｍｉｃｒｏＲＮＡ（Ｃｏ）をトランスフェクトしたＨＵＶＥＣをマトリゲルと混合し、ヌードマウスに移植した。血管形成を、移動した細胞を用いて判定した。Ｎ＞４、＊：対照（Ｃｏ）に対してｐ＜０．０５。図５Ｅ：ｉｎ  ｖｉｖｏでの血管新生に対するｍｉＲ−９２ａの効果を示す図である。ｐｒｅ−ｍｉＲ−９２ａ又は対照ｍｉｃｒｏＲＮＡ（Ｃｏ）をトランスフェクトしたＨＵＶＥＣをマトリゲルと混合し、ヌードマウスに移植した。血管形成を、レクチンを灌流した血管においてｉｎ  ｖｉｖｏで判定した。Ｎ＞４、＊：対照（Ｃｏ）に対してｐ＜０．０５。図５Ｆ：ｉｎ  ｖｉｖｏでの血管新生に対するｍｉＲ−９２ａの効果を示す図である。ｐｒｅ−ｍｉＲ−９２ａ又は対照ｍｉｃｒｏＲＮＡ（Ｃｏ）をトランスフェクトしたＨＵＶＥＣをマトリゲルと混合し、ヌードマウスに移植した。血管形成を、ヘモグロビン含量を求めることにより判定した。Ｎ＞４、＊：対照（Ｃｏ）に対してｐ＜０．０５。
【図６】図６Ａ：ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの血管新生に対するｍｉＲ−９２ａ阻害の効果を示す図である。ｍｉＲ−９２ａを２’−Ｏ−メチルアンチセンスオリゴリボヌクレオチドの過剰発現により遮断し、血管新生をスフェロイドモデルにおいてｉｎ  ｖｉｔｒｏで判定した。Ｎ＞３、＊：対照オリゴヌクレオチド（２’ＯＭｅＧＦＰ）に対してｐ＜０．０５。図６Ｂ：ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの血管新生に対するｍｉＲ−９２ａ阻害の効果を示す図である。ｍｉＲ−９２ａを２’−Ｏ−メチルアンチセンスオリゴリボヌクレオチドの過剰発現により遮断し、血管新生をスフェロイドモデルにおいてｉｎ  ｖｉｔｒｏで判定した。Ｎ＞３、＊：対照オリゴヌクレオチド（Ｃｏ）に対してｐ＜０．０５。図６Ｃ：ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの血管新生に対するｍｉＲ−９２ａ阻害の効果を示す図である。ｍｉＲ−９２ａを、アンタゴｍｉｒ−９２ａとインキュベートすることにより阻害し、血管新生をスフェロイドモデルにおいてｉｎ  ｖｉｔｒｏで判定した。Ｎ＝５、＊：ＰＢＳ対照に対してｐ＜０．０５。
【図７−１】図７Ａ：マトリゲルモデルにおける、新たな血管の形成に対するアンタゴｍｉｒ−９２ａの効果を示す図である。アンタゴｍｉｒ−９２ａ、２つの異なる対照アンタゴｍｉｒ、又は溶媒ＰＢＳを１日目、３日目、５日目に静脈注射し（８ｍｇ／ｋｇ体重）、７日目にマトリゲルプラグを外植した。移動した細胞の数を求めた（Ｈ＆Ｅ）。Ｎ＞４、＊：ＰＢＳ又はアンタゴｍｉｒ対照（Ｃｏ）に対してｐ＜０．０５。図７Ｂ：マトリゲルモデルにおける、新たな血管の形成に対するアンタゴｍｉｒ−９２ａの効果を示す図である。アンタゴｍｉｒ−９２ａ、２つの異なる対照アンタゴｍｉｒ、又は溶媒ＰＢＳを１日目、３日目、５日目に静脈注射し（８ｍｇ／ｋｇ体重）、７日目にマトリゲルプラグを外植した。灌流したレクチン陽性血管の数を求めた。Ｎ＞４、＊：アンタゴｍｉｒ対照（Ｃｏ）に対してｐ＜０．０５。図７Ｃ：マトリゲルモデルにおける、新たな血管の形成に対するアンタゴｍｉｒ−９２ａの効果を示す図である。アンタゴｍｉｒ−９２ａ、２つの異なる対照アンタゴｍｉｒ、又は溶媒ＰＢＳを１日目、３日目、５日目に静脈注射し（８ｍｇ／ｋｇ体重）、７日目にマトリゲルプラグを外植した。ヘモグロビン含量を求めた。Ｎ＞４、＊：ＰＢＳに対してｐ＜０．０５。
【図７−２】図７Ｄ：後肢虚血モデルにおける、新たな血管の形成に対するアンタゴｍｉｒ−９２ａの効果を示す図である。アンタゴｍｉｒ−９２又は対照を、後肢虚血後０日目、２日目、４日目、７日目、９日目に静脈注射し、レーザードップラー法を用いて灌流を判定した。Ｎ＞３、対照（Ｃｏ）に対してｐ＜０．０５。図７Ｅ：後肢虚血モデルにおける、新たな血管の形成に対するアンタゴｍｉｒ−９２ａの効果を示す図である。アンタゴｍｉｒ−９２又は対照を、後肢虚血後０日目、２日目、４日目、７日目、９日目に静脈注射し、レーザードップラー法を用いて灌流を判定した。レーザードップラー法による画像化の例である。図７Ｆ：後肢虚血モデルにおける、新たな血管の形成に対するアンタゴｍｉｒ−９２ａの効果を示す図である。ｍｉＲ−９２ａ及び他の異なるｍｉｃｒｏＲＮＡの発現に対するアンタゴｍｉｒ−９２ａの特異性を示す。Ｎ＞３、対照（Ｃｏ）に対してｐ＜０．０５。
【図８−１】図８Ａ：心筋梗塞後の心機能に対するアンタゴｍｉｒ−９２ａの効果を示す図である。アンタゴｍｉｒ−９２ａ、対照アンタゴｍｉｒ（アンタゴｍｉｒ−対照）、又は溶媒ＰＢＳを、心筋梗塞の誘導後０日目、２日目、４日目、７日目、９日目に静脈注射し（８ｍｇ／ｋｇ体重）、１４日目にMillarのカテーテルを用いて心機能を判定した。心機能パラメータ（収縮性）の判定を示す。アンタゴｍｉｒ−９２ａで処理した動物は全て、アンタゴｍｉｒ−対照群及びＰＢＳ群と比較すると、より良好な心機能パラメータを示す。Ｎ＞５、＊：対照（Ｃｏ）に対してｐ＜０．０５。図８Ｂ：心筋梗塞後の心機能に対するアンタゴｍｉｒ−９２ａの効果を示す図である。アンタゴｍｉｒ−９２ａ、対照アンタゴｍｉｒ（アンタゴｍｉｒ−対照）、又は溶媒ＰＢＳを、心筋梗塞の誘導後０日目、２日目、４日目、７日目、９日目に静脈注射し（８ｍｇ／ｋｇ体重）、１４日目にMillarのカテーテルを用いて心機能を判定した。心機能パラメータ（圧力）の判定を示す。アンタゴｍｉｒ−９２ａで処理した動物は全て、アンタゴｍｉｒ−対照群及びＰＢＳ群と比較すると、より良好な心機能パラメータを示す。Ｎ＞５、＊：対照（Ｃｏ）に対してｐ＜０．０５。図８Ｃ：心筋梗塞後の心機能に対するアンタゴｍｉｒ−９２ａの効果を示す図である。アンタゴｍｉｒ−９２ａ、対照アンタゴｍｉｒ（アンタゴｍｉｒ−対照）、又は溶媒ＰＢＳを、心筋梗塞の誘導後０日目、２日目、４日目、７日目、９日目に静脈注射し（８ｍｇ／ｋｇ体重）、１４日目にMillarのカテーテルを用いて心機能を判定した。心機能パラメータ（弛緩定数）の判定を示す。アンタゴｍｉｒ−９２ａで処理した動物は全て、アンタゴｍｉｒ−対照群及びＰＢＳ群と比較すると、より良好な心機能パラメータを示す。Ｎ＞５、＊：対照（Ｃｏ）に対してｐ＜０．０５。
【図８−２】図８Ｄ：心筋梗塞後の心機能に対するアンタゴｍｉｒ−９２ａの効果を示す図である。アンタゴｍｉｒ−９２ａ処理後の心臓の種々の領域における毛細血管の有意な増加を示す。Ｎ＞５、＊：対照（Ｃｏ）に対してｐ＜０．０５。図８Ｅ：心筋梗塞後の心機能に対するアンタゴｍｉｒ−９２ａの効果を示す図である。アンタゴｍｉｒ−９２ａ処理群における梗塞及び線維化のサイズの減少を示す。Ｎ＞５、＊：対照（Ｃｏ）に対してｐ＜０．０５。
【図９】図９Ａ：ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの血管新生に対するｍｉＲ−１７−９２クラスターの個々の成員の効果を示す図である。スフェロイドアッセイにおける、血管新生に対する個々のｍｉｃｒｏＲＮＡの過剰発現の直接の効果を示す（Ｎ＞３、＊：ｐ＜０．０５）。図９Ｂ：ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの血管新生に対するｍｉＲ−１７−９２クラスターの個々の成員の効果を示す図である。内皮細胞の血管新生に対する、ｍｉＲ−１７又はｍｉＲ−１８をトランスフェクトした腫瘍細胞のパラクリン作用を示す。図に示すように、腫瘍細胞のトランスフェクション後、パラクリン因子の効果を試験するために上清を内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）に添加した。ｍｉＲ−１７の過剰発現により血管新生の増加がもたらされる。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００４４】
材料及び方法
細胞培養
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）をCambrexから購入し、ヒドロコルチゾン、ウシ脳抽出物、上皮成長因子、及び１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ；Gibco）を添加した内皮細胞用基礎培地（ＥＢＭ；Cambrex）中で３代目まで培養した。細胞をトリプシンを用いて剥離した後、６ｃｍ培養皿において少なくとも２４時間〜４８時間培養した。
【００４５】
トランスフェクション
ｍｉＲ−９２の阻害については、ＨＵＶＥＣを６０％〜７０％コンフルエントとなるまで培養した後、特定の阻害物質をトランスフェクトした。VBC Biotechにより合成された、ｍｉＲ−９２に対する２’−Ｏ−メチル−アンチセンスオリゴリボヌクレオチド（５’−ＣＡＧＧＣＣＧＧＧＡＣＡＡＧＵＧＣＡＡＵＡ−３’、配列番号１１）又はＧＦＰ（５’−ＡＡＧＧＣＡＡＧＣＵＧＡＣＣＣＵＧＡＡＧＵＵ−３’、配列番号７）の５０ｎｍｏｌ／ｌを、ＧｅｎｅＴｒａｎｓ  ＩＩ（登録商標）（MoBiTec）を用いて製造業者のプロトコルに従ってトランスフェクトした。ｍｉＲ−９２の過剰発現については、ＨＵＶＥＣを５０％コンフルエントとなるまで培養した。１０ｎｍｏｌ／ｌのｐｒｅ−ｍｉＲ−９２又は対照ｐｒｅ−ｍｉＲ（Ambion）を、リポフェクタミンＲＮＡｉ−ＭＡＸ（Invitrogen）を用いて製造業者のプロトコルに従ってトランスフェクトした。
【００４６】
アンタゴｍｉｒ戦略
本明細書中で使用される一本鎖ＲＮＡは、２１個〜２３個のヌクレオチドから成り、記載（１３）の通りVBC Biotechにより合成されるものであった。全ての動物モデルはＣ５７ＢＬ／６Ｊ背景に保持した。０日目に、８週齢のマウスに２つの「マトリゲル基底マトリックスプラグ」を腹部正中線に沿って皮下注射し、１日目、３日目、及び５日目に生理食塩水又はアンタゴｍｉｒ−９２を尾静脈注射した。アンタゴｍｉｒ−９２は、１回の注射につき０．２ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中８ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与した。組織及び「マトリゲルプラグ」を６日目に採取した。組織はＲＮＡ解析のために液体窒素中で凍結し、−８０℃で保存した。ヘモグロビン解析については、「マトリゲルプラグ」を７日後に取り出し、１３０μｌの脱イオン水中でホモジナイズした。遠心分離後、上清をＤｒａｂｋｉｎアッセイ（Sigma-Aldrich）において使用し、ヘモグロビン濃度を測定した。ヘモグロビンの原液を使用して検量線を作成した。結果は上清中の総タンパク質に対するものとして表した。第２の「マトリゲルプラグ」をＨ＆Ｅ染色を用いた浸潤細胞の定量化に使用した。
【００４７】
ウエスタンブロット解析
ウエスタンブロット解析については、ＨＵＶＥＣを２０分間氷上でＲＩＰＡ溶解バッファー（Sigma）に溶解した。２０．０００×ｇ（４℃）で１５分間の遠心分離の後、試料のタンパク質含量をブラッドフォード法に従って求めた。同量のタンパク質をＳＤＳポリアクリルアミドゲル上にロードし、ＰＶＤＦ膜又はニトロセルロース膜にブロットした。インテグリンα５に対する抗体（ウサギポリクローナル抗インテグリンα５抗体、１：２５０、Chemicon）、ＭＫＫ４に対する抗体（ウサギポリクローナル抗ＭＫＫ４、１：１．０００、cell signaling）、ｅＮＯＳに対する抗体（マウスモノクローナル抗ｅＮＯＳ、１：２．５００、BD）、ＳＩＲＴ１に対する抗体（ウサギポリクローナル抗ＳＩＲＴ１、１：１．０００、Upstate）、又はチューブリンに対する抗体（マウスモノクローナル抗チューブリン、１：１．５００、Dianova）を用いてウエスタンブロット法を行った。
【００４８】
ＲＴ−ＰＣＲ
ｍｉＲ−９２又はｐｒｅ−ｍｉＲ−９２に対する２’−Ｏ−メチルアンチセンスオリゴリボヌクレオチドをトランスフェクトしたＨＵＶＥＣにおける差次的ｍｉＲＮＡ発現を求めるために、トランスフェクションの２４時間後に、全ＲＮＡをＴＲＩｚｏｌ（Invitrogen）を用いて製造業者のプロトコルに従って単離した。ＲＴ−ＰＣＲを、ｍｉｒＶａｎａ（商標）ｑＲＴ−ＰＣＲ  ｍｉＲＮＡ検出キット（Ambion）、及びｈｓａ−ｍｉＲ−９２の増幅に特異的なプライマーセット（Ambion）を用いて行った（１サイクル：９５℃で３分間、２５サイクル：９５℃で１５秒間、６０℃で３０秒間）。
【００４９】
遊走アッセイ
内皮細胞の遊走を判定するために、ＨＵＶＥＣをトリプシンを用いて剥離し、遠心分離により採取して、０．１％ＢＳＡを含む５００μｌのＥＢＭ中に再懸濁し、計数して、２．５μｇ／ｌのフィブロネクチンをコーティングした改良Ｂｏｙｄｅｎチャンバ（チャンバ１つ当たり５×１０４個の細胞、細孔径８μｍ、BD Biosciences）の上部チャンバに入れた。チャンバを、０．１％ＢＳＡ及びヒト血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ、５０ｎｇ／ｍｌ）を含むＥＢＭを含有する２４ウェル培養皿に置いた。３７℃で５時間のインキュベーションの後、チャンバ上方の非遊走細胞を機械的に除去し、下方の残りの細胞を４％ホルムアルデヒドで固定した。定量化のために、細胞核を４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で染色した。チャンバ下方の遊走細胞を、無作為に選んだ５つの顕微鏡視野において手作業で計数した。
【００５０】
血管形成アッセイ
ＨＵＶＥＣ（７×１０４個）を、２００μｌの「マトリゲル基底膜マトリックス」（BD Biosciences）をコーティングした１２ウェルプレート（Greiner）において培養した。２４時間後に、形成された内皮細胞ネットワークを、無作為に選んだ５つの顕微鏡視野において、プログラムＫＳ３００  ３．０を用いるコンピュータ制御顕微鏡（Zeiss）を使用して定量化した。
【００５１】
スフェロイドに基づく血管新生アッセイ
規定の細胞数の内皮細胞スフェロイドを記載（文献２２、２３）の通り作製した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血管新生を、各々のスフェロイドから成長した発芽構造物（sprouted structures）の累積長をデジタル画像ソフトウェア（Axioplan、Zeiss）を用いて測定することにより判定したが、これにより各実験群及び実験につき１０個のスフェロイドを解析した。
【００５２】
ＭＴＴ生存率アッセイ
細胞の生存率を測定するために、（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムブロミド）を使用した（ＭＴＴアッセイ）。トランスフェクションの４８時間後に、０．５ｍｇ／ｍｌのＭＴＴを各ウェルに添加し、細胞を３７℃で４時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄し、室温で３０分間溶解バッファー（イソプロパノール中４０ｎｍｏｌ／ｌのＨＣｌ）を用いて溶解した。５５０ｎｍでの吸光度を測光法により測定した。
【００５３】
細胞−マトリックス接着
９６ウェル細胞培養プレートを、ＰＢＳ中の１μｇ／ｍｌの可溶性組換えヒトコラーゲン1（Roche，Mannheim，Germany）又は２．５μｇ／ｍｌのヒトフィブロネクチン（Roche，Mannheim，Germany）で４℃で一晩コーティングした後、加熱不活性化した（２時間、５６℃）３％（ｗ／ｖ）ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）と室温で１時間インキュベートした。ＨＵＶＥＣを２’，７’−ビス−（２−カルボキシエチル）−５−（及び−６）−カルボキシフルオレセインアセトキシメチルエステル（ＢＣＥＣＦ−ＡＭ）又はＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎ（Molecular Probes，Eugene，Oregon）で染色し、トリプシンを用いて剥離した後、０．０５％ＨＳＡを含むＥＢＭ中に再懸濁した。次いで、１ウェル当たり５００００個の細胞を、コーティングしたウェルにおいて、０．０５％ＨＳＡを含む１００μｌのＥＢＭ中に播種し、３７℃で６０分間インキュベートした。非接着細胞を温ＥＢＭを用いて洗い落とした後、接着細胞を蛍光プレートリーダー（Ｆｌｕｏｓｔａｔ、BMG Lab Technologies，Offenburg，Germany）を用いて３回定量化した。
【００５４】
フローサイトメトリー解析
透過化のために、ｐｒｅ−ｍｉＲ−９２又は対照をトランスフェクトしたＨＵＶＥＣを、トリプシンを用いて剥離し、４％ホルムアルデヒド中で１０分間固定し、０．１％トリトンＸ−１００で処理した。細胞（透過化処理したもの及び透過化処理していないもの）を１％ＢＳＡを用いて遮断し、インテグリンα５抗体（抗ＣＤ４９ｅ−ＦＩＴＣ  １：１０、Immunotech）又はインテグリンβ１抗体（抗ＣＤ２９−ＡＰＣ  １：２０、BD）を用いて染色した。細胞をＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩ装置（BD）を用いて解析した。
【００５５】
ｉｎ  ｖｉｖｏ「マトリゲルプラグ」アッセイ
このアッセイは記載（文献２４）の通り行ったが、以下の変更を加えた：
ＨＵＶＥＣにｐｒｅ−ｍｉＲ−９２又は上述の対照をトランスフェクトした。トランスフェクションの１８時間後、細胞を「細胞トラッカー（cell tracker）ＣＭ−Ｄｉｌ」（Invitrogen）で標識し、剥離し、洗浄して、計数した。１×１０６個の細胞を３０μｌのＰＢＳ中に再懸濁し、１５単位のヘパリン（Sigma-Aldrich）を含有する「マトリゲル基底膜マトリックス」（BDBiosciences）５００μｌと混合した。細胞−マトリゲル混合物を、６週齢〜８週齢の雌無胸腺ヌードマウス（Harlan）に腹部正中線に沿って皮下注射した。ヘモグロビン解析及びＨ＆Ｅ染色を上述のように行った。
【００５６】
アフィメトリクスｍＲＮＡプロファイリング
ＨＵＶＥＣにｐｒｅ−ｍｉＲ−９２又は対照をトランスフェクトした。全ＲＮＡを４８時間後に単離し、遺伝子発現プロファイルをアフィメトリクス遺伝子チップ発現（Affymetrix-gene-chip-expression）アッセイを用いて測定した。
【００５７】
結果
ｐｒｅ−ｍｉＲ−９２はｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏにおいて内皮細胞の機能を遮断する
内皮細胞に対するｍｉＲ−９２の効果を試験するために、ＨＵＶＥＣにｍｉＲ−９２の前駆体であるｐｒｅ−ｍｉＲ−９２をトランスフェクトし、このトランスフェクションの影響を種々のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて判定した。効率的なｍｉＲ−９２の過剰発現が初めにＲＴ−ＰＣＲを用いて検出された（図１Ａ）。ｍｉＲ−９２過剰発現は、スフェロイドアッセイにおいて血管構造の形成を有意に遮断し（図１Ｂ）、マトリゲルにおける血管ネットワークの形成を阻害した（図１Ｃ）が、このことからｍｉＲ−９２が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの血管新生の負の調節因子であることが示される。ｍｉＲ−９２の起こり得る毒性作用を検出するために、細胞生存率を測定した。その際、ｐｒｅ−ｍｉＲ−９２のトランスフェクションの後、非トランスフェクト細胞と比較して有意な差は検出することができなかった（図１Ｄ）。内皮細胞の遊走は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞の血管新生活性にとって非常に重要な意味があるため、さらに基本条件下でのＨＵＶＥＣの遊走を、ＶＥＧＦに対する反応として判定した。ｐｒｅ−ｍｉＲ−９２は、遊走（図１Ｅ）及び細胞のフィブロネクチンへの接着（図１Ｆ）を減少させた。したがって、ｐｒｅ−ｍｉＲ−９２は直接的な毒性作用は示さないが、血管新生に必要とされる内皮細胞の反応を遮断する。さらに、ｉｎ  ｖｉｖｏでの血管新生に対するｐｒｅ−ｍｉＲ−９２の効果を判定した。これに関しては、ｐｒｅ−ｍｉＲ−９２をトランスフェクトしたＨＵＶＥＣを、ｉｎ  ｖｉｖｏで「マトリゲルプラグ」に埋め込み、ヌードマウスに注射した。阻害の効率は、埋め込んだ細胞の亜画分において各々調節されていた（図２Ａ）。図２Ｂの代表的な写真及び図２Ｃの定量化において示されるように、ｐｒｅ−ｍｉＲ−９２はｉｎ  ｖｉｖｏで血管の成長を効率的に遮断する。また、外植した「マトリゲルプラグ」におけるヘモグロビン濃度の測定により示されるように、灌流が有意に減少した（図２Ｂ）。
【００５８】
ｍｉＲ−９２の阻害はｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏにおいて血管新生を増加させる
ｍｉＲ−９２の阻害が血管成長の刺激を引き起こすか否かについてさらに試験した。ｍｉＲ−９２を２’−Ｏ−メチルアンチセンスオリゴリボヌクレオチド（Ｏ−メチル−ｍｉＲ−９２）により阻害し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの血管構造の形成をスフェロイドアッセイを用いて判定した。Ｏ−メチル−ｍｉＲ−９２によりｉｎ  ｖｉｔｒｏでの発芽形成が増加し（図３Ａ）、これによりｍｉＲ−９２の阻害が、血管新生を改善するための新たな治療戦略であり得ることが示された。この仮説について試験するために、ｍｉＲ−９２を、特異的ｍｉＲＮＡと比較して相補的配列を有する一本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドである、いわゆる「アンタゴｍｉｒ」を用いて全身的に阻害した。化学修飾により安定性が増大し、コレステロール抱合により細胞への取り込みが改善した（文献１５）。ｍｉＲ−９２に対するアンタゴｍｉｒを、図３Ｂに示されるように３日投与した。アンタゴｍｉｒの全身投与により、ｉｎ  ｖｉｖｏで血管成長及び「マトリゲルプラグ」の灌流が改善した（図３Ｃ／図３Ｄ）。結果として、ｍｉＲ−９２の阻害により、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで内皮細胞の機能が増大し、ｉｎ  ｖｉｖｏで血管成長が改善する。
【００５９】
ｍｉＲ−９２標的遺伝子の同定
ｍｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡの分解又は翻訳抑制により標的遺伝子を調節する。ｍｉＲ−９２の過剰発現に応じて分解される標的ｍＲＮＡを決定するために、５４６８１個の遺伝子を含むアフィメトリクスｍＲＮＡ遺伝子発現アレイ（ＨＧ−Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ  ２）を用いたチップ解析を行った。制御されるｍＲＮＡを解析することにより、ｅＮＯＳ、ＳＩＲＴ１、インテグリン、及びアンジオポエチン−２等の成長因子を含む、内皮機能を調節する種々の鍵酵素が同定された（図４Ａ）。下方制御された遺伝子の一部に対し、コンピュータによる潜在的ｍｉＲ−９２標的の解析が可能であった（表１）。画面上の結果を確認するために、個々の遺伝子のタンパク質発現をウエスタンブロット法又はＦＡＣＳ解析を用いて検出した。予測された結果と一致して、ｅＮＯＳ、ＳＩＲＴ１、及びインテグリンα５のタンパク質発現は、ｐｒｅ−ｍｉＲ−９２により有意に抑制された（図４Ｂ〜図４Ｅ）。
【００６０】
【表１】
0005898843.tif 000002
【００６１】
結果として、ｍｉＲ−９２は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏで強い抗血管新生効果を示し、内皮細胞の機能に対して悪影響を与える。これに一致して、アンタゴｍｉｒの全身注入によりｍｉＲ−９２を遮断することで、ｉｎ  ｖｉｖｏで血管成長の改善がもたらされる。この結果は、記載される（文献１０）ようなｍｉＲ−１７−９２クラスターの血管新生促進活性とは対照的であるため、驚くべきものである。
【００６２】
本発明のデータにより、ｍｉＲ−９２が、内皮細胞生物学において主要な役割を果たすことが知られる種々のタンパク質の発現に影響を与えることが示される。マイクロアレイを用いて同定された遺伝子のうち、特にｅＮＯＳ、ＳＩＲＴ１、及びインテグリンα５のタンパク質レベルでの下方制御を確認することができた。これらのタンパク質を欠損するマウスは、血管機能障害及び／又は出生後新血管形成能力の障害を示す。
【００６３】
ｅＮＯＳは、血管反応性の維持において或る役割を果たし、内皮細胞のアポトーシスを遮断する（文献１６）。ヒストン脱アセチル化酵素ＳＩＲＴ１は、モデル生物において寿命を延長し、哺乳動物において新血管形成及び血管成熟を調節する（文献１３、１７）。インテグリンの異常調節は、細胞マトリックスとの相互作用に対し悪影響を有し、したがって抗アポトーシスシグナル伝達及び細胞遊走を害する可能性がある（文献１４、１８）。成長因子アンジオポエチン−２、その受容体Ｔｉｅ２、及びＴＩＭＰ４等のプロテアーゼ阻害物質は、血管成熟を調節する（文献１９、２０）。したがって、ｍｉＲ−９２は内皮細胞の機能を種々のレベルで調節する一連の遺伝子と相互作用する。血管成長、血管成熟、及び血管の機能維持の複雑なプロセスには、一連の遺伝子の細かく調整された制御が必要とされることが知られているため、種々のエフェクターに影響を与えるｍｉＲ−９２の能力は、ｍｉＲＮＡに基づく治療戦略の利点をもたらし、単一の成長因子又は単一の遺伝子に基づく虚血疾患の治療の治療能力の限界を克服する上で役立つ。
【００６４】
結果として、ｍｉＲ−９２に影響を与えることは、内皮細胞の機能の調節のための新たな治療戦略となる。アンタゴｍｉｒの全身使用は、本明細書中に示されるように、ｍｉＲＮＡ機能に影響を与える上で特に好適である。アンタゴｍｉｒによるｍｉＲ−９２の阻害は、血管成長を増加させ、新血管形成及び血管修復の改善に寄与する。動脈硬化予防効果が知られている遺伝子（例えばｅＮＯＳ）に関して、ｍｉＲ−９２の遮断は抗アテローム性動脈硬化治療において有用である。ＳＩＲＴ１はまた、神経変性疾患（例えばパーキンソン病）において神経を保護する役割に寄与するため（文献２５）、この疾患状況においてもｍｉＲ−９２のアンタゴｍｉｒを首尾よく使用することができる。これに対し、ｍｉＲ−９２の過剰発現は、血管成長を強く減少させるため、例えば腫瘍血管新生を遮断する上で有用である。
【００６５】
引用文献
１     Carmeliet,P. (2000) Mechanisms of angiogenesis and arteriogenesis. Nat Med 6 (4),389-395. 
２     Adams,R.H. and Alitalo, K. (2007) Molecular regulation of angiogenesis and lymphangiogenesis.Nat Rev Mol Cell Biol 8 (6), 464-478 3 Bartel, D.P. (2004) MicroRNAs: genomics,biogenesis, mechanism, and function. Cell 116 (2), 281-297 
４     Hofacker,I.L. (2007) How microRNAs choose their targets. Nat Genet 39 (10), 1191- 1192 
５     Yang,W.J. et al. (2005) Dicer is required for embryonic angiogenesis during mouse development.J Biol Chem 280 (10), 9330-9335 
６     Suarez,Y. et al. (2007) Dicer dependent microRNAs regulate gene expression and functionsin human endothelial cells. Circ Res 100 (8), 1164-1173 
７     Kuehbacher,A. et al. (2007) Role of Dicer and Drosha for endothelial microRNA expressionand angiogenesis. Circ Res 101 (1), 59-68 
８     Poliseno,L. et al. (2006) MicroRNAs modulate the angiogenic properties of HUVECs. Blood108 (9), 3068-3071 
９     Venturini,L. et al. (2007) Expression of the miR-17-92 polycistron in chronic myeloid leukemia(CML) CD34+ cells. Blood 109 (10), 4399-4405 
１０   Dews,M. et al. (2006) Augmentation of tumor angiogenesis by a Myc-activated microRNAcluster. Nat Genet 38 (9), 1060-1065 
１１   Murohara,T. et al. (1998) Nitric oxide synthase modulates angiogenesis in response totissue ischemia. J Clin Invest 101 (11), 2567-2578 
１２   Aicher,A. et al. (2003) Essential role of endothelial nitric oxide synthase formobilization of stem and progenitor cells. Nat Med 9 (11), 1370-1376 
１３   Potente,M. et al. (2007) SIRT1 controls endothelial angiogenic functions duringvascular growth. Genes Dev 21 (20), 2644-2658 
１４   Kim,S. et al. (2000) Regulation of integrin alpha vbeta 3-mediated endothelial cellmigration and angiogenesis by integrin alpha5beta1 and protein kinase A. J BiolChem 275 (43), 33920-33928. 
１５   Krutzfeldt,J. et al. (2005) Silencing of microRNAs in vivo with 'antagomirs'. Nature 438(7068), 685-689 
１６   Dimmeler,S. and Zeiher, A.M. (1999) Nitric oxide - an endothelial cell survival factor.Cell Death Differ 6, 964-968 
１７   Imai,S. et al. (2000) Transcriptional silencing and longevity protein Sir2 is an NADdependent histone deacetylase. Nature 403 (6771), 795-800. 
１８   Zhang,Z. et al. (1995) The alpha 5 beta 1 integrin supports survival of cells on fibronectinand up-regulates Bcl-2 expression. Proc Natl Acad Sci U S A 92 (13), 6161-6165 
１９   Asahara,T. et al. (1998) Tie2 receptor ligands, Angiopoietin-1 and Angiopoietin-2,modulate VEGF-induced postnatal neovascularization. Circ Res 83, 233-240 
２０   Sang,Q.X. (1998) Complex role of matrix metalloproteinases in angiogenesis. Cell Res8 (3), 171-177 
２１   Care,A. et al. (2007) MicroRNA-133 controls cardiac hypertrophy. Nat Med 13 (5),613-618 
２２   Korff,T. and Augustin, H.G. (1998) Integration of endothelial cells in multicellularspheroids prevents apoptosis and induces differentiation. J Cell Biol 143 (5),1341-1352
２３   Diehl,F. et al. (2007) The histone methyltransferase MLL is an upstream regulator ofendothelial cell sprout formation. Blood 109 (4), 1472-1478
２４  Potente, M.et al. (2005) Involvement of FoxO transcription factors in angiogenesis andpostnatal neovascularization. J Clin Invest 115(9), 2382-2392.
２５   Dillin, A. andKelly, J.W. (2007) The yin-yang of sirtuins. Science 317 (5837), 461-462
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【配列表】
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