(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
番号Ｉ−４３１２としてＣＮＣＭへ２０１０年５月１１日に寄託されたサッカロマイセス・セレビシエ株、番号Ｉ−４３１３としてＣＮＣＭへ２０１０年５月１１日に寄託されたサッカロマイセス・セレビシエ株、番号Ｉ−４４０９としてＣＮＣＭへ２０１０年１２月８日に寄託されたサッカロマイセス・セレビシエ株、および番号Ｉ−４４１０としてＣＮＣＭへ２０１０年１２月８日に寄託されたサッカロマイセス・セレビシエ株からなる群から選択される、サッカロマイセス・セレビシエ株。
【請求項２】
請求項１に記載の株の、弱酸の存在に対する適応化なしでの増殖によって得ることができるパン酵母。
【請求項３】
請求項２に記載のパン酵母を含有するパン生地。
【請求項４】
少なくとも１５％の糖（ベーカーズパーセンテージ）の存在による浸透圧の存在下、および弱有機酸タイプのカビ抑制剤の存在下の両方において発酵が行われる生地から選択されることを特徴とする、請求項３に記載のパン生地。
【請求項５】
弱有機酸タイプの前記カビ抑制剤は、プロピオン酸カルシウムの形態である、請求項４に記載のパン生地。
【請求項６】
請求項４または５のいずれか一項に記載のパン生地を用いることにより、焼成されたパン製品を調製するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
特許出願
本出願は、その内容が参照により組み込まれる、2011年2月18日に出願されたフランス出願番号FR1151354の優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、パン酵母を生産する能力があるサッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)株の分野、その調製方法、これらの株から生産されるパン酵母、それらを含有するパン生地、ならびにまたこれらの生地を用いて得ることができる、製パン方法およびパン製品に関する。より特に、本発明は、その最も一般的な態様において、浸透圧耐性であり、かつ弱有機酸に対する内因性抵抗性を示すパン酵母を生産する能力がある「工業用」サッカロマイセス・セレビシエ株に関する。
【背景技術】
【０００３】
先行技術
文献WO96/38538は、16%から25%まで(ベーカーズパーセンテージ)の高濃度の糖を含有する一塊の生地において好都合なガスを出す(CO2の生成)という点で浸透圧耐性の増加を示す改善されたS.セレビシエ由来の酵母を教示している。この文献は、弱有機酸などのカビ抑制剤の存在下におけるこれらの酵母の挙動に関しては触れていない。
【０００４】
文献US4318991は、弱有機酸、例えば、酢酸またはプロピオン酸などのカビ抑制物質の存在下においてさえもパン生地の高い発酵活性を有するパン酵母の生産のための方法を開示している。この方法は、特に酵母の増殖中、その繁殖の最終段階において、特にパン生地におけるプロピオン酸カルシウム(以下、Calproあるいはcppと表示する)の形態で存在する、前記酸に対して酵母を「適応させる」ために、そのような酸を加える工程を含む。その文献は、このようにして生産された酵母の、糖高含有量の生地における挙動を明記していない。
【０００５】
本出願人の名義の文献US4346115は、弱有機酸に対して抵抗性になったパン酵母を、浸透圧耐性株から、その増殖の最終サイクル中の糖蜜の不連続的添加により調製するための方法を記載する。
【０００６】
同じく本出願人の名義の別の文献EP1559322は、弱酸に対する適応化後、当業者によく知られた試験によればさらにより有効である酵母を生産するための株、およびカビ抑制剤の存在下において甘い生地で有効である商業用酵母を得るための、約20年間参照であった対照株を教示している。
【０００７】
酵母の増殖中の、例えばプロピオン酸カルシウムの形態の、弱酸に対する、上記で述べられた適応化はいくらかの費用がかかるという事実に加えて、弱酸はまた、酵母の発酵活性に、特に、甘い、または非常に甘い生地の存在下で、不利な影響を及ぼし得る。
【０００８】
甘い、または甘くないパン生地においてカビ抑制弱酸に対するパン酵母の抵抗性を、それらが由来する株を前記弱酸に対して適応させることにより、向上させることを目指したこれらの先行技術の好ましくない共通点は、それらが、酵母に、弱酸に対する一時的/一過性で、かつ非永久的な抵抗性のみを与える点である。適応化は、酵母細胞を、それらの成長相中、致死量以下の量の弱酸に曝すことにある。この事前曝露が、その後、適応化された細胞が、発酵条件下に置かれた場合、同じ弱酸の存在をより良く許容することを可能にする。場合によっては、所定の弱酸が、発酵相においてその後の別の弱酸の存在に関する適応化を与えることができる。これらの概念は、Ferreiraら(1997) International Journal of Food Microbiology 36、145〜153頁による論文において例証されている。弱酸に対する適応化の機構は、いくつかの研究の主題になっている。これらの研究の一部は、Piperら、(2001) Microbiology 147、2635〜2642頁による総説に挙げられている。適応化は、特定の膜ポンプを含むいくつかのタンパク質に関わる細胞機構に基づいていることがそこでわかる。これらの機構は非遺伝的で、本質的に一過性であり、それらの機構は、弱酸によって代表されるストレスに対する反応として細胞によって作動されるが、このストレスの非存在下で消失して終わる。前に適応化された細胞は、非適応化細胞状態に戻る。
【０００９】
文献EP645094またはWO99/51746に記載されたものなどの他のはるかにより複雑な方法は、パン酵母を弱酸に対して内因性に抵抗性にするための、パン酵母を生産する能力がある株の遺伝子改変を教示している。
【００１０】
なおより有効である株を探索するその研究を続ける本出願人は、浸透圧耐性株の内部コレクションに由来した特定の株が、それが、通常の方法に従ってさらに雑種形成または変異された場合、これが、特に有効であり、かつ全く驚くべきことに、例えば、プロピオン酸カルシウム(Calproまたはcppと表示される)の形態の弱酸を含有する非常に甘い生地へそれが導入される前にいかなる適応化も必要としない、パン酵母を生産する能力がある株を提供するような、遺伝的形質を有することを言及している。
【００１１】
本発明の基盤を形成するのが、この発見である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】WO96/38538
【特許文献２】US4318991
【特許文献３】US4346115
【特許文献４】EP1559322
【特許文献５】EP645094
【特許文献６】WO99/51746
【特許文献７】US4318929
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ferreiraら(1997) International Journal of Food Microbiology 36、145〜153頁
【非特許文献１】Piperら、(2001) Microbiology 147、2635〜2642頁
【非特許文献２】「Journal of Institute of Brewing」LXV巻、1号、1959年1-2月
【非特許文献３】D. Burke、D. Dawson、およびT. Stearns、「Techniques and Protocols」21〜23章、「Methods in Yeast Genetics, A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual, 2000 Edition」、Cold Spring Harbor Laboratory Press (ISBN 0-87969-588-9)
【非特許文献４】G. ReedおよびT. W. Nagodawithana、「Yeast Technology」、第2版、1991、Van Nostrand Reinhold出版、ISBN 0-442-31892-8
【非特許文献５】A. Loiez、章「Production of baker's yeast by biotechnology」、Techniques de l'Ingenieur [Techniques for the Engineer]、Reference J6013、2003年3月10日
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
したがって、その最も一般的な態様において、本発明は、番号I-4341としてCNCM(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes [French National Collection of Microorganism Cultures]、Institut Curie、25 rue du docteur Roux、75724 Paris Cedex 15)へ2010年7月8日に寄託されたS.セレビシエの工業用株から、またはそのTyプロファイルを通して、および/もしくは量的形質座位マッピング(QTLマッピング)を通してそれに関連した工業用株から、浸透圧耐性および弱有機酸に対する内因性抵抗性を示すパン酵母を生産する能力があるS.セレビシエ株を調製するための方法に関する。
【００１５】
本出願人の知る限りでは、先行技術の高価および/または複雑な方法を不要にすると同時に、浸透圧耐性および弱酸に対する内因性抵抗性の両方をパン酵母に与える、パン酵母を生産するための方法が教示されるのは、これが初めてである。
【００１６】
本発明による方法の第1の変形において、調製方法は、前記工業用株の雑種形成の工程、および以下:
(i)少なくとも試験A5'、または試験A5およびA5'におけるBurrowsとHarrisonの発酵測定装置(fermentometer)で測定される発酵活性であって、選択される雑種が、そのガス放出が、番号I-4341としてCNCM[French National Collection of Microorganism Cultures]へ2010年7月8日に寄託されたS.セレビシエ株からなる対照株のものより少なくとも10%、好ましくは少なくとも15%〜25%多いようなものである、発酵活性;
(ii)0.4%のプロピオン酸カルシウムの存在下で18%の糖(ベーカーズパーセンテージ)を含有する生地に対するノータイム法(No-Time Dough scheme)におけるホイロ時間であって、選択される雑種が、プロピオン酸カルシウムに対する適応化なしで増殖によってパン酵母を生産する能力があり、これが、番号I-4341としてCNCM[French National Collection of Microorganism Cultures]へ2010年7月8日に寄託されたS.セレビシエの工業用株から、前記株のプロピオン酸カルシウムの存在に対する適応化ありでの増殖により生産された対照パン酵母によって示されるホイロ時間の85%から105%の間、好ましくは95%から105%の間のホイロ時間を示す、ホイロ時間;
(iii)0.4%のプロピオン酸カルシウムの存在下で23%の糖(ベーカーズパーセンテージ)を含有する生地に対するノータイム法(No-Time Dough scheme)におけるホイロ時間であって、選択される雑種が、プロピオン酸カルシウムに対する適応化なしで増殖によってパン酵母を生産する能力があり、これが、番号I-4341としてCNCM[French National Collection of Microorganism Cultures]へ2010年7月8日に寄託されたS.セレビシエの工業用株から、前記株のプロピオン酸カルシウムの存在に対する適応化ありでの増殖により生産された対照パン酵母によって示されるホイロ時間の85%から105%の間、好ましくは95%から105%の間のホイロ時間を示す、ホイロ時間;
(iv)25%の糖(ベーカーズパーセンテージ)を含有する生地に対するノータイム法(No-Time Dough scheme)におけるホイロ時間であって、選択される雑種が、プロピオン酸カルシウムに対する適応化なしで増殖によってパン酵母を生産する能力があり、これが、番号I-4341としてCNCM[French National Collection of Microorganism Cultures]へ2010年7月8日に寄託されたS.セレビシエの工業用株から、前記株のプロピオン酸カルシウムの存在に対する適応化ありでの増殖により生産された対照パン酵母によって示されるホイロ時間の85%から105%の間、好ましくは95%から105%の間のホイロ時間を示す、ホイロ時間
からなる群から選択される、得られた雑種を選択する少なくとも1つの工程を含む。
【００１７】
本発明はまた、I-4341株由来の以下の雑種に関する:
-  番号I-4312としてCNCM [French National Collection of Microorganism Cultures]へ2010年5月11日に寄託されたサッカロマイセス・セレビシエ株
および
-  番号I-4313としてCNCM [French National Collection of Microorganism Cultures]へ2010年5月11日に寄託されたサッカロマイセス・セレビシエ株。
【００１８】
本発明の方法の第2の変形により、方法は、番号I-4341としてCNCM[French National Collection of Microorganism Cultures]へ2010年7月8日に寄託されたS.セレビシエの工業用株の、またはそのTyプロファイルを通して、および/もしくは量的形質座位マッピング(QTLマッピング)を通してそれに関連した株の変異誘発の工程、および以下:
(i)試験A5'におけるBurrowsとHarrisonの発酵測定装置で測定される発酵活性であって、選択される変異体が、そのガス放出が、番号I-4341としてCNCM[French National Collection of Microorganism Cultures]へ2010年7月8日に寄託されたS.セレビシエの工業用株からなる対照株のものより少なくとも5%〜20%多いようなものである、発酵活性;
(ii)0.4%のプロピオン酸カルシウムの存在下で15%の糖(ベーカーズパーセンテージ)を含有する生地に対するノータイム法(No-Time Dough scheme)におけるホイロ時間であって、選択される変異体が、プロピオン酸カルシウムに対する適応化なしで増殖によってパン酵母を生産する能力があり、これが、番号I-4341としてCNCM[French National Collection of Microorganism Cultures]へ2010年7月8日に寄託されたS.セレビシエの工業用株から、前記株のプロピオン酸カルシウムの存在に対する適応化ありでの増殖により生産された対照パン酵母によって示されるホイロ時間の95%から105%の間のホイロ時間を示す、ホイロ時間;
(iii)0.4%のプロピオン酸カルシウムの存在下で18%の糖(ベーカーズパーセンテージ)を含有する生地に対するノータイム法(No-Time Dough scheme)におけるホイロ時間であって、選択される変異体が、プロピオン酸カルシウムに対する適応化なしで増殖によってパン酵母を生産する能力があり、これが、番号I-4341としてCNCM[French National Collection of Microorganism Cultures]へ2010年7月8日に寄託されたS.セレビシエの工業用株から、前記株のプロピオン酸カルシウムの存在に対する適応化ありでの増殖により生産された対照パン酵母によって示されるホイロ時間の90%から105%の間のホイロ時間を示す、ホイロ時間;
(iv)0.4%のプロピオン酸カルシウムの存在下で23%の糖(ベーカーズパーセンテージ)を含有する生地に対するノータイム法(No-Time Dough scheme)におけるホイロ時間であって、選択される変異体が、プロピオン酸カルシウムに対する適応化なしで増殖によってパン酵母を生産する能力があり、これが、番号I-4341としてCNCM[French National Collection of Microorganism Cultures]へ2010年7月8日に寄託されたS.セレビシエの工業用株から、前記株のプロピオン酸カルシウムの存在に対する適応化ありでの増殖により生産された対照パン酵母によって示されるホイロ時間の90%から105%の間のホイロ時間を示す、ホイロ時間
からなる群から選択される、得られた変異体を選択する少なくとも1つの工程を含む。
【００１９】
本発明の対象はまた、番号I-4409およびI-4410としてCNCM[French National Collection of Microorganism Cultures]へ2010年12月8日に寄託されたサッカロマイセス・セレビシエ株である。
【００２０】
本発明の対象はまた、本発明による株、または本発明による方法を用いて得られた株の、弱酸の存在に対する適応化なしでの増殖によって得ることができるパン酵母である。
【００２１】
本出願人は、前記パン酵母が適応化ありで生産される場合、ホイロ時間の減少に関する利益が増幅されることに気づいた。
【００２２】
加えて、本発明の対象は、以下である:
-  本発明において特許請求されているパン酵母を含有するパン生地;
-  好ましくは、少なくとも15%の糖、好ましくは少なくとも18%の糖、より好ましくは少なくとも23%の糖、より好ましくは少なくとも25%の糖(ベーカーズパーセンテージ)の存在による浸透圧の存在下、および弱有機酸タイプの、好ましくはプロピオン酸カルシウムの形態のカビ抑制剤の存在下の両方において発酵が行われる生地から選択される、前記パン生地。
【００２３】
本発明の対象はまた、前記パン生地を用いることにより焼成されたパン製品を調製するための方法である。
【００２４】
本発明の対象はまた、前記調製方法を用いて得ることができるパン製品である。
【００２５】
他の特徴および利点は、本発明の例示的な実施形態を用いて、より詳細に以下に記載され、それらは単に例証として示され、限定するものではない。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明において、用語「浸透圧耐性パン酵母」は、以下の性質の少なくとも1つを有する酵母を意味するものである:
・35ユニット未満、好ましくは30ユニット未満、さらにより好ましくは20ユニット未満のインベルターゼ活性であって、インベルターゼユニットは、酵母の原形質分離なしに、30℃、4.7のpHで、1mgの酵母乾物あたり5分間での1マイクロモルの還元糖、すなわち1/2マイクロモルの転化糖の生成として定義される(特許US4318929において明記された試験)
・「Journal of Institute of Brewing」LXV巻、1号、1959年1-2月に記載され、特許EP1559322においてA5、A5'、A6、およびA6'として定義されている、BurrowsとHarrisonの発酵測定装置を用いた上記試験の少なくとも1つに合格する;
・適応化されたI-4341株と比較し、かつ常に、パン生地において0.4%プロピオン酸カルシウムおよび糖高含有量の存在下における、以下のパン製造試験の少なくとも1つに合格し、前記試験は、本発明において、NT15%+、NT18%+、NT23%+、NT25%+と呼ばれる:それらは、「ノータイム(No-Time Dough)」法、すなわち、生地の激しい混練と分割の間に事実上、一次発酵がなく、得られた生地片が35℃から40℃の間で型の中で発酵する、直接的方法におけるホイロ時間の測定に対応する。そのような方法において必須の発酵である、後の方の発酵は、「ホイロ」と呼ばれる。ホイロ時間は、パン生地が型において所定の高さ(生地をオーブンに入れるための生地の望ましい膨らみ(development)に対応する)に達するのに必要とされる時間として定義される。
【００２７】
好ましくは、本発明による浸透圧耐性酵母は、上記の試験に定義されている性質の少なくとも2つを有する。
【００２８】
本発明において、語句「例えばプロピオン酸カルシウムの形態で存在する、弱有機酸に対する酵母の内因性抵抗性」は、例えば、適応化によって誘発されないし、下記で教示されているような、酵母が由来する株の雑種形成または変異によること以外に前記酵母の遺伝子改変後にも獲得されない抵抗性を意味するものとする。
【００２９】
本発明において、用語「工業用株」は、「実験用」株とは違って、必ずしも一倍体または二倍体ではないが、その倍数性はより複合である場合が多い株を意味するものとする。
【００３０】
本発明において、株の用語「Tyプロファイル」は、トランスポゾン(Ty)の移動に起因する遺伝子の「scar」に対応する標的配列に方向づけられたプライマーを用いるPCRによって得られる任意のプロファイルを意味するものとする。これらの配列の約100個のコピーがサッカロマイセス・セレビシエゲノム内に、より具体的には、tRNAをコードする遺伝子に近接した配列内に存在する。Tyエレメントのゲノム上での数および分布は、株によって異なり、株間のかなりの多型を示すことを可能にしている。この技術は、飼料のためのプロバイオティクス酵母の同定として標準DIN CEN/TS 15790(2009年3月)に記載されている。
【００３１】
本発明において、語句「量的形質座位マッピング(QTLマッピング)」は、より容易に同定可能な座位、マーカーに関連づけられた量的形質のバリエーションに関与する座位(染色体の領域)を位置づけることを可能にする遺伝子マップの構築からなる技術を意味するものとする。
【００３２】
本発明の関連において、選択試験において言及される全てのパーセンテージは、他に記載がない限り、当業者によく知られている「ベーカーズ」パーセンテージとして示される。これらのパーセンテージは、100%を表す小麦粉の重量に対して存在する材料(例えば、糖、プロピオン酸カルシウムなど)の重量パーセンテージを表す。
【００３３】
(実施例)
(実施例1)
雑種の調製
本発明の対象である、I-4312およびI-4313雑種株は、浸透圧耐性であり、および/または浸透圧耐性であり、かつカビ抑制剤として用いられる弱有機酸もしくはその塩の存在に対してあまり感受性が高くないとして選択された本出願人の内部コレクションの株(例えば、番号I-4341として2010年7月8日に、および番号I-4448として2011年2月9日に、Collection Nationale de Culture de Microorganismes[French National Collection of Microorganism Cultures] of the Institut Pasteur、25 rue du Docteur Roux、75724 Paris Cedex 15、Franceへ寄託されたものなど)のお互いとの系統的交雑によって作製される。
【００３４】
雑種形成プログラムは、D. Burke、D. Dawson、およびT. Stearnsによるマニュアル「Methods in Yeast Genetics, A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual, 2000 Edition」、Cold Spring Harbor Laboratory Press (ISBN 0-87969-588-9)の「Techniques and Protocols」21〜23章に記載されたものなどの通常の技術に従って実施される。
【００３５】
(実施例2)
実施例1の雑種からの本発明による酵母の調製
本発明によるパン酵母を生産するために、実施例1で得られた雑種株を、フラスコ内または発酵槽内の、公知であるが、弱酸を含まない培地での培養に置く。
【００３６】
フラスコ内において、D. Burke、D. Dawson、およびT. Stearnsによるマニュアル「Methods in Yeast Genetics, A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual, 2000 Edition」、Cold Spring Harbor Laboratory Press (ISBN 0-87969-588-9)の培地について当てられた付録Aに記載されているようなYPD培地を用いてもよい。
【００３７】
発酵槽内において、通常、培養条件は、酵母株の代謝が本質的に呼吸性であるように、および/または本質的にエタノール産生がないように設定される。
【００３８】
用語「本質的に」は、これらの条件が培養の全期間にわたって確認されるが、時々、これらの条件が、流加回分様式において、例えば、培養期間の1/4〜1/3の間の期間に相当する培養の最初の時間の間で、特に、流加回分様式における培養の最初の5時間、確認されない可能性があることを意味する。
【００３９】
語句「酵母株の代謝は本質的に呼吸性である」は、培養の全期間にわたって、炭素が酸化され、発酵せず、炭素の一部が一過性に発酵する可能性があることを意味する。
【００４０】
語句「本質的にエタノール産生がない」は、培養の終了時点におけるエタノール濃度が1%未満、好ましくは0.1%未満、より優先的には0.01%未満、より優先的には0.001%未満であることを意味する。
【００４１】
培養条件が、酵母の代謝が本質的に呼吸性であるように、および/または本質的にエタノール産生がないように設定されるために、所定の酵母株の培養についてのパラメータを調整する方法を当業者は知っている。
【００４２】
本発明による酵母株は、好気条件下の培地の存在中に置かれる。
【００４３】
好ましくは、本発明による酵母株は、酵母の生産に適した発酵槽内の培地の存在中に置かれる。発酵槽の容積は、2、3ミリリットルから数立方メートルまでの範囲であり得る。
【００４４】
発酵槽は、後に、リアクターとも呼ばれる。
【００４５】
発酵槽は、好ましくは、好気条件下での培養に適している。
【００４６】
酵母株は、好ましくは、流加回分様式および/または連続様式での培養に関連した培地の存在中に置かれる。
【００４７】
語句「流加回分様式での培養」または「流加培養」または「流加回分様式」は、本明細書では、徐々に培地を供給されるが、培地体積が取り除かれない発酵槽内での培養を意味する。そのような方法において、培養体積は、発酵槽内で変動する(および増加する)。流加回分様式での培養における供給流速は、一定または可変である。
【００４８】
流加培養の例は、参考書「Yeast Technology」、第2版、1991、G. ReedおよびT. W. Nagodawithana、Van Nostrand Reinhold出版、ISBN 0-442-31892-8に記載された条件下で実施される培養である。
【００４９】
培地は、組成物として、糖、および酵母の成長に必要とされる他の要素の混合物を含む。
【００５０】
酵母の成長に必要とされる他の要素は以下である:少なくとも1つの窒素源、少なくとも1つの硫黄源、少なくとも1つのリン源、少なくとも1つのビタミン源、および/または少なくとも1つのミネラル源。
【００５１】
これらの他の要素は、酵母の成長を制限する要因を構成しないように十分な量で供給される。
【００５２】
窒素源は、例えば、硫酸アンモニウム、水酸化アンモニウム、リン酸二アンモニウム、アンモニア、尿素、および/またはそれらの組み合わせの形態で供給される。
【００５３】
硫黄源は、例えば、硫酸アンモニウム、硫酸マグネシウム、硫酸、および/またはそれらの組み合わせの形態で供給される。
【００５４】
リン源は、例えば、リン酸、リン酸カリウム、リン酸二アンモニウム、リン酸一アンモニウム、および/またはそれらの組み合わせの形態で供給される。
【００５５】
ビタミン源は、例えば、糖蜜、酵母加水分解物、純粋なビタミンの溶液もしくは純粋なビタミン混合物の溶液、および/またはそれらの組み合わせの形態で供給される。
【００５６】
ビタミン源は、参照マニュアルに推奨されている量と少なくとも等しい量での全てのビタミンを酵母に供給する。いくつかのビタミン源は組み合わせることができる。
【００５７】
ミネラル源は、例えば、糖蜜、ミネラル塩の混合物、および/またはそれらの組み合わせの形態で供給される。
【００５８】
ミネラル源は、参照マニュアルに推奨されている量と少なくとも等しい量でのマクロ元素および微量元素の全てを酵母に供給する。いくつかのミネラル源は組み合わせることができる。
【００５９】
1つのおよび同一の物質が、いくつかの異なる要素を供給することができる。
【００６０】
パン酵母の発酵槽内生産のための条件は、2003年3月10日のReference J6013 Techniques de l'Ingenieur [Techniques for the Engineer]の章「Production of baker's yeast by biotechnology」にA. Loiezによって詳細に説明されている。
【００６１】
本発明による雑種の同じ培地が、それらが比較されるであろうI-4341参照株について用いられるが、同時に、前記参照株に関して、特許US4318991もしくはUS4346115に記載された技術による、またはこれらの2つの文献の組み合わされた教示による追加の「適応化」工程を行う。
【００６２】
パン酵母を調製するための方法は、以下にある一連の工程のうちの少なくとも最初の2工程を含む:
-  半好気条件下で、その後、好気条件下で純粋な株を増殖させる工程、
-  このようにして生産された酵母を、14%から25%までの乾物を含有する液状「クリーム酵母」、またはクリーム酵母が浸透性産物と混合される場合にはそれ以上の乾物を含有する液状クリーム酵母を提供するように、その培地から遠心分離によって分離する工程、
-  このようにして得られた液状クリーム酵母を、好ましくは減圧下の回転式フィルターで濾過し、26%から35%までの乾物を含有する脱水された新鮮な酵母を提供する工程、
-  このようにして得られた前記酵母を、その酵母を乾燥させることが意図されている場合には、新鮮な酵母ケーキの形態で、または約30%の乾物を含有する粉砕された新鮮な酵母の形態で、あるいは、粒子、好ましくは顆粒の形態であっても、混合する工程、
-  押し出しによって得られた酵母粒子の、控えめに、例えば流動化による、熱風の流れの中で乾燥させる工程、
-  市場に出す前に包装する工程。
【００６３】
(実施例3)
本発明による非適応化酵母と適応化対照株との有効性の比較
(実施例3.1)
試験の提示
3.1.1.  発酵測定装置試験
試験は、「Journal of Institute of Brewing」、LXV巻、1号、1959年1-2月に記載されたBurrowsとHarrisonの発酵測定装置を用いて実施され、以下のように定義される:
試験A5
酵母懸濁液は以下のように調製される:
1.  200mgの試験される酵母の乾物
2.  108g/lのNaClおよび16g/lの(NH4)2SO4を含有する5mlの溶液
3.   蒸留水で体積を20mlにする。
【００６４】
上記の懸濁液の15ml(すなわち、150mgの酵母乾物)を、30℃の温度で15分間、平衡させる。あらかじめ30℃で一晩平衡化した20gの小麦粉と4gのショ糖の混合物を、この懸濁液に加える。混合物全体を、35秒間、ホモジナイズする。
【００６５】
形成された生地を、30℃に置かれた密閉容器内でインキュベートする。(760mmHgにおけるmlで表される)ガス放出を、120分間の全時間(この時間は調整することができる)にわたって記録する。
【００６６】
試験A5'
以下を除いて、A5と同一のプロトコール:
1.  16%(w/v)のプロピオン酸カルシウム(calpro)での500μlの溶液を、35秒間の混合段階の直前に、小麦粉+糖混合物の上に加える。
【００６７】
試験A5''
以下を除いて、A5と同一のプロトコール:
1.  16%(w/v)のプロピオン酸カルシウムでの1mlの溶液を、35秒間の混合段階の直前に、小麦粉+糖混合物の上に加える。
【００６８】
試験A6
以下を除いて、PS4gと同一のプロトコール:
1.  酵母懸濁液を、(200mgの代わりに)400mgの乾物で調製し、そのことにより、試験に用いられる酵母乾物の量を300mgにすることができる。
2.  小麦粉+糖混合物は、(20gの代わりに)25gの小麦粉と(4gの代わりに)6.5gのショ糖で構成される。
【００６９】
試験A51およびA51'(プロピオン酸カルシウムを含む)
新鮮な酵母について
酵母懸濁液は以下のように調製される:
1.  400mgの試験される酵母の乾物
2.  新鮮な酵母によって供給される水(典型的には、圧縮された酵母の重量の70%)を考慮しながら、6.8mlの水の総体積に達するのに必要とされる体積の蒸留水と混合する。
3.  30℃で22分間、平衡させる。
4.  73.6g/kgのNaClを含有する4.5mlの溶液を加え、ホモジナイズする。
【００７０】
20gの小麦粉および3gのショ糖を上記懸濁液に加える。全体を35秒間、混合する。
【００７１】
(760mmHgにおけるmlで表される)ガス放出を、120分間の全時間(この時間は調整することができる)にわたって記録する。測定を、プロトコールの始まりから36分後に開始する。
【００７２】
このプロトコールは、プロピオン酸カルシウムの存在を含む変形として存する。この場合、酵母懸濁液の調製の工程4において、73.6g/kgのNaClを含有する溶液はまた、17.4g/kgのプロピオン酸カルシウムを含有する。
【００７３】
乾燥酵母について
20gの小麦粉、3gのショ糖、および400mgの試験される酵母の乾物を混合する。30℃で12分間、平衡させる。
【００７４】
6.8mlの蒸留水、および73.6g/kgのNaClを含有する4.5mlの溶液を加え、35秒間、ホモジナイズする。
【００７５】
蒸留水の添加から36分後、1回目と同じ2回目のホモジナイゼーションを行う。
【００７６】
(760mmHgにおけるmlで表される)ガス放出を、120分間の全時間(この時間は調整することができる)にわたって記録する。測定を、プロトコールの始まりから60分後に開始する。
【００７７】
試験A61およびA61'(プロピオン酸カルシウムを含む)
新鮮な酵母について
酵母懸濁液は以下のように調製される:
1.  700mgの試験される酵母の乾物
2.  新鮮な酵母によって供給される水(典型的には、圧縮された酵母の重量の70%)を考慮しながら、7.5mlの水の総体積に達するのに必要とされる体積の蒸留水と混合する。
3.  30℃で22分間、平衡させる。
4.  73.6g/kgのNaClを含有する5.75mlの溶液を加え、ホモジナイズする。
【００７８】
25gの小麦粉および6.5gのショ糖を上記懸濁液に加える。
【００７９】
全体を35秒間、混合する。
【００８０】
(760mmHgにおけるmlで表される)ガス放出を、120分間の全時間(この時間は調整することができる)にわたって記録する。測定を、プロトコールの始まりから36分後に開始する。
【００８１】
このプロトコールは、プロピオン酸カルシウムの存在を含む変形として存する。この場合、酵母懸濁液の調製の工程4において、73.6g/kgのNaClを含有する溶液はまた、17.4g/kgのプロピオン酸カルシウムを含有する。
【００８２】
乾燥酵母について
25gの小麦粉、6.5gのショ糖、および700mgの試験される酵母の乾物を混合する。30℃で12分間、平衡させる。
【００８３】
7.5mlの蒸留水、および73.6g/kgのNaClを含有する5.75mlの溶液を加え、35秒間、ホモジナイズする。
【００８４】
蒸留水の添加から36分後、1回目と同じ2回目のホモジナイゼーションを行う。
【００８５】
(760mmHgにおけるmlで表される)ガス放出を、120分間の全時間(この時間は調整することができる)にわたって記録する。測定を、プロトコールの始まりから60分後に開始する。
【００８６】
3.1.2.  製パン試験、4つのレシピを試験する:
-  15重量%(ベーカーズパーセンテージ)のショ糖および0.4重量%(ベーカーズパーセンテージ)のプロピオン酸カルシウムを含有するレシピPT1;
-  18重量%(ベーカーズパーセンテージ)のショ糖および0.4重量%(ベーカーズパーセンテージ)のプロピオン酸カルシウムを含有するレシピPT2;
-  23重量%(ベーカーズパーセンテージ)のショ糖および0.4重量%(ベーカーズパーセンテージ)のプロピオン酸カルシウムを含有するレシピPT3;
-  25重量%(ベーカーズパーセンテージ)のショ糖および0.4重量%(ベーカーズパーセンテージ)のプロピオン酸カルシウムを含有するレシピPT4。
【００８７】
試験1〜4において、一方では、評価される株について得られた乾燥酵母と、他方では、対照株「C」について得られた乾燥酵母との間のホイロ時間の差を、所定の製パン方法において、所定のレシピを用いて、測定する。有効性は、試験される株と対照株とのパーセンテージ差として測定される。マイナスの差は、対照株のものより高い有効性に該当する。
【００８８】
試験に用いられ、ベーカーズパーセンテージで表されたレシピは、以下の表に示されている。この表はまた、用いられる様々なプロトコールの詳細を含む。
【００８９】
【表１】
0005898237.tif 000002
【００９０】
手順の詳細
試験PT1〜PT4における上記の様々なレシピに適用される試験プロトコールは以下である:
1.  様々な材料を計り分ける。
2.  周囲温度および小麦粉の温度を測定する。
3.  レシピ1と4について27℃+/-0.5℃、レシピ2について28℃、およびレシピ3について29℃での生地温度が得られるように水の温度を調整する。
4.  Hobart A200(登録商標)混練機のMac Duffy(登録商標)ボウル内に材料を入れ、そのジャケットは、22.5℃(レシピ1および4)または23.5℃(レシピ2)または24.5℃(レシピ3)の水であらかじめ温度調節されている。
5.  乾燥材料を第1速で1分間、混合する。
6.  混練の流れは、用いられるレシピによって異なる:
-  レシピ1および4:
-  油脂を乾燥予備混合後に混ぜ込む
-  注水する
-  ブレンドを、第1速で5分間、行う(L5)
-  生じた生成物を5分間、放置する(R5)
-  混練を、第2速で4分間、行う(H4)
-  レシピ2
-  注水を乾燥予備混合後に行う
-  ブレンドを、第1速で1分間、行う(L1)
-  生じた生成物を、油脂の添加のために1分間、放置する(+MG1)
-  ブレンドを、第1速で1分間、行う(L1)
-  混練を、第2速で4分間、行う(H4)
-  レシピ3
-  注水を乾燥予備混合後に行う
-  ブレンドを、第1速で1分間、行う(L1)
-  生じた生成物を、油脂の添加のために1分間、放置する(+MG1)
-  ブレンドを、第1速で1分間、行う(L1)
-  混練を、第2速で5分30秒間、行う(H5.5)。
7.  混練の終了時点で得られた生地の温度を確認する。
8.  23℃で10分間(レシピ1、3、および4)または15分間(レシピ2)、バルク発酵
9.  320gの1片に分割する。
10.  ゆるく丸め、カバーリングする。
11.  10分間(レシピ1、3、および4)または30分間(レシピ2)、放置する。
12.  生地を成形する。
13.  320gの生地片を型(寸法:型の底面185×75mm;型の上部200×90mm;型の高さ75mm)に入れる。
14.  35℃で90%相対湿度のStericult(登録商標)インキュベーター内におけるホイロ時間を決定する。ホイロ時間は、インキュベーター内の型の設置から、生地が型において85mmの高さに達する瞬間の間に経過した時間である。
15.  Reed(登録商標)トレーオーブン内、190℃で21分間、焼成する。
【００９１】
(実施例3.2):結果
【００９２】
【表２】
0005898237.tif 000003
【００９３】
【表３】
0005898237.tif 000004
【００９４】
【表４】
0005898237.tif 000005
【００９５】
結論:本発明による非適応化酵母は、適応化対照酵母と比較して実質的に同一に、またはさらにより良く挙動し、番号I-4341として寄託された、本出願人の内部コレクションで入手可能な最良の浸透圧耐性株の1つと弱酸に対してあまり感受性が高くない商業用株との交雑によって生産される。
【００９６】
工業用株を雑種形成することにより2つの親の既存の利点を蓄積し、特に、その上、それらの2つの親のガス放出値を15%〜25%、上回ることは、全く予測できなかったため、これらの結果は驚くべきことである。
【００９７】
したがって、本発明は、より低コストでパン酵母を生産する能力があり、同時に、非常に甘いパン生地において、かつプロピオン酸カルシウムなどのカビ抑制剤の存在下で、有効である雑種を提供する。
【００９８】
(実施例4)
I-4409およびI-4410変異体の調製
I-4341株を、紫外線照射への曝露による変異誘発に供した。変異体集団を、フラスコ内での生産後、試験A5およびA5'において評価した。I-4409株およびI-4410株をこの集団から最初に選択した。
【００９９】
(実施例5)
実施例4の変異体からの酵母の調製(実施例2に同じ)
【０１００】
(実施例6)
対照酵母との有効性の比較
【０１０１】
【表５】
0005898237.tif 000006
【０１０２】
【表６】
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