(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における、標的腫瘍性幹細胞および標的腫瘍前駆細胞の少なくとも一方の細胞種の過度な細胞増殖または誤制御された細胞増殖を特徴とする神経腫瘍を治療するための医薬組成物であって、
前記医薬組成物は、白血病抑制因子（ＬＩＦ）調製物である作用薬を有効量で含有し、
前記作用薬の有効量は、標的腫瘍性幹細胞または標的腫瘍前駆細胞の集団の大きさ、クローン形成の指標、および増大速度のうち少なくとも１つを不可逆的に低下させることにより、標的腫瘍性幹細胞または標的腫瘍前駆細胞の過度な細胞増殖または誤制御された細胞増殖を抑制する量である、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は過度な細胞増殖または誤制御された細胞増殖を特徴とする疾病を治療する医薬の製造におけるＢＭＰ調製物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
本明細書におけるいかなる先行技術の引用も、その先行技術があらゆる国に共通の一般知識の一部を成すと認識するものでも何らかの形で示唆するものでもなく、またそのような認識や示唆とみなされるべきものでもない。本明細書に引用された参照文献はすべて、引用によってその全体が本願に明確に組み込まれる。
【０００３】
神経幹細胞
従来、幹細胞は、分化細胞が最も失われやすく、かつ頻繁に置き換わる必要のある組織、たとえば皮膚（非特許文献１）、腸管上皮（非特許文献２）および血液（非特許文献３）にのみあると考えられていた。確かに、成体幹細胞の最もよく知られている例は造血幹細胞（ＨＳＣ）であり、造血幹細胞は骨髄に見出され、動物の一生を通じてすべての種類の血液細胞の生成に根本的に関与している（非特許文献３〜５）。成人の中枢神経系（ＣＮＳ）では大量のニューロンが死ぬことはなく、かつ再生能はないと考えられたので、神経幹細胞は存在しそうもなく、かつ不必要に思われた。しかしながら、１９９２年に２つの独立したグループが、新しいニューロンを生じさせる能力を持った成体哺乳類ＣＮＳ内の前駆細胞の存在を実証することに成功した（非特許文献６および７）。
【０００４】
新しいニューロンの供給源は、成体哺乳類ＣＮＳの脳室の神経軸全体の内側を覆っている幹細胞であると同定された（非特許文献６）。他の組織で見つかった幹細胞のように、ＣＮＳの幹細胞（あるいは神経幹細胞（ＮＳＣ））は、増殖、大規模な自己複製、多数の子孫細胞の生成、多系列分化能というインビトロにおける決定的な幹細胞の特性（非特許文献８および非特許文献２）、ならびに損傷後の組織再生というインビボにおける特性を示すことが明らかになった。
【０００５】
幹細胞の役割のうちの１つは、分裂することと、多くの未分化細胞を増殖および生成する能力を備えた、より分化決定の進んだ前駆細胞を供給することである。究極的には、分化した子孫細胞を生じるのは前記のより分化決定の進んだ前駆細胞種の子孫細胞である。したがって幹細胞は、動物の寿命全体を通じて分裂する能力を備え、従って広範囲に及ぶ増殖能を備えた分化決定されていない細胞の、比較的活動性の低い貯蔵所と見なすことができる。一方、前駆細胞はより分化決定が進んでおり、より頻繁に分裂するが、時間とともに増殖能は制限される。発生中および成体のいずれにおいても、幹細胞および前駆細胞の増殖は細胞発生の基礎となる。
【０００６】
特定の形態学的特徴、分子的特徴、あるいは抗原性の特徴を欠いているため、幹細胞は機能上の基準に基づいて同定される。従って、幹細胞の制御についてインビトロで検討するためには、幹細胞の分裂を引き起こす組織培養法を開発しなければならない。しかしながらそのような方法はほとんどなく、神経系ではニューロスフェア法（Ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ  Ａｓｓａｙ）（ＮＡ）（非特許文献６）と呼ばれる培養法が、ＮＳＣをインビトロで同定し、増殖させ、かつ計数するために一般に使用される。簡潔に述べると、ＮＡは、胚から成人までのＣＮＳ組織を顕微解剖した後に、細胞間の接着を破壊し、単個細胞の浮遊液を生成させることを含む。細胞を、組織培養器において規定の無血清培地中で、少なくとも１つの増殖誘導性の成長因子（すなわち上皮成長因子［ＥＧＦ］、塩基性繊維芽
細胞成長因子［ｂＦＧＦ］など）の存在下で（典型的には低密度で）播種する。この条件下では、２〜５日以内に多能性ＮＳＣは分裂し、ニューロスフェアと呼ばれるクローン由来の未分化細胞集合体を生じる。増殖を誘導する因子が持続的に存在する状態では、ニューロスフェア中の細胞は分裂を続け、その結果ニューロスフェアを構成する細胞の数が増大し、従ってニューロスフェアが大きくなる。ニューロスフェアを回収し、破壊して単個細胞浮遊液とし、その細胞を再度培養液中に播種して新しいニューロスフェアを生成することができる。このようにしてＮＳＣを継代すると、成育可能なＣＮＳ前駆細胞が算術的に増加する。ＮＡ法により規定の条件でＮＳＣを単離および増殖させることが可能となり、この推定上の幹細胞の挙動を様々な実験条件下で研究することが可能である。ＮＡは哺乳類ＮＳＣを単離する標準的な方法となっており、神経系における幹細胞の細胞分子生物学を理解するために用いられる多くの分析法の中核を成している。
【０００７】
腫瘍の増大および増殖に寄与する幹細胞の特徴を備えた細胞の小集団から腫瘍が発生するという概念は、がん生物学の分野において目新しいことではない。この概念は１９７０年代の初めに提案され、存在頻度の低い腫瘍起源細胞が正常な造血幹細胞（ＨＳＣ）に似ていることが実証された急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）に関する研究で、実験的に確認された。これらの研究は、白血病幹細胞がＨＳＣの直接の子孫であるか、あるいはＨＳＣの特徴を獲得したより分化の進んだ細胞の生産物であることを示唆した。血液系以外の幹細胞の発見から、固形組織のがんにも幹細胞様の細胞が含まれている可能性が高まった。固形腫瘍中の腫瘍の起源となる幹細胞様の細胞の存在および単離は、ヒト乳がん組織において最初に実証され、その手法はＣＮＳの腫瘍にも適用されている。
【０００８】
最近、いくつかのグループから、ヒト神経膠腫組織由来の細胞が培養中にニューロスフェア状の細胞を生成する能力について報告され、ＣＮＳ腫瘍内のＮＳＣの存在が示唆されている。興味深いことに、蛍光活性化細胞選別法（ＦＡＣＳ）による「副集団（ｓｉｄｅ−ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）」細胞の単離に基づいて、確立されたＣ６神経膠腫細胞株に、生体内での悪性度を保持するニューロスフェア形成性の細胞の小集団が含まれていることが実証された。ガルリおよび共同研究者（非特許文献９）は、胚ＣＮＳおよび成体ＣＮＳ由来のＮＳＣとほぼ同一の機能特性を示す、ヒト多形膠芽腫（ＧＢＭ）由来の腫瘍神経幹細胞（ｔＮＳＣ）の単離、増殖および累代移植について報告した。これらのＧＢＭ由来ｔＮＳＣは、インビトロで重要な神経幹細胞の特徴を示す、プロミニン陽性の前駆細胞であり、安定した方法で増殖可能であり、かつ、累代移植−培養サイクル全体を通じて元の腫瘍誘発性を再現する。同時にこれらの研究は、ＣＮＳの腫瘍が腫瘍の発生および悪性度に関与する可能性のある幹細胞集団を含んでいる、という仮説を強く支持するものである。ｔＮＳＣは、ＣＤ１３３のｔＮＳＣ上での発現を利用したＦＡＣＳを用いて、他のＧＢＭ細胞から選別することができる（非特許文献１０）。
【０００９】
ＧＢＭは、平均生存時間９〜１２か月の、最も一般的な成人の悪性脳腫瘍である。大多数の患者は診断から２年までに死亡する。本質的に治癒することはなく、管理療法は一般に手術、放射線療法および化学療法の組合せに基づくものである。生存率は、遺伝子療法、抗血管形成療法、免疫療法および低分子伝達阻害剤のような新しい治療法の活発な探究が促進されてきた３０年以上の間、ほとんど変わらなかった。
【００１０】
ＬＩＦ
白血病抑制因子（ＬＩＦ）は、その誘導産物が多数の組織、恐らくはすべての組織に生じる可能性がある、多機能性の糖タンパク質サイトカインである。ＬＩＦはコリン作動性分化因子（ＣＤＦ）と呼ばれることもある。ＬＩＦは、低親和性のＬＩＦ特異的レセプタ（ＬＩＦＲ）と、インターロイキン６、オンコスタチンＭ、カルジオトロフィン−１および毛様体神経栄養因子のレセプタとしても使用されるｇｐｌ３０レセプタ鎖とで構成されたヘテロダイマーの細胞膜レセプタに結合することにより、反応性細胞に対して作用する
。ＬＩＦは、胚盤胞移植、ならびに海馬および嗅覚レセプタのニューロンの正常な発生に不可欠である。ＬＩＦは、胚性幹細胞の分化全能性を保持させるという重要な能力から、実験生物学において広範囲に使用されている。ＬＩＦは、血小板形成の刺激剤としての作用、いくつかの造血細胞の増殖、骨形成、脂肪細胞の脂質輸送、副腎皮質刺激ホルモン生産、ニューロンの生存および形成、筋衛星細胞の増殖、ならびに肝細胞による急性期産生などの多くの作用を有している（非特許文献１１）。
【００１１】
ＢＭＰ
骨形成タンパク質（ＢＭＰ）は、ＴＧＦｈスーパーファミリーのメンバーである（非特許文献１２）。２０を超えるメンバーが知られており、その配列ホモロジーに従ってサブグループに分けることができる（非特許文献１２および１３）。ＢＭＰは胚発生の間に重大な役割を果たす。例えば、ＢＭＰは原腸形成、神経新生、アポトーシスおよび造血に影響を及ぼす（総説として非特許文献１４を参照のこと）。ＢＭＰレセプタは以降ＢＭＰＲと称する。ヒト由来のＢＭＰＲにはＢＭＰＲ１ａ、ＢＭＰＲ１ｂおよびＢＭＰＲ２が含まれる。
【００１２】
本開示のとおり、ＬＩＦおよびＢＭＰが、前駆細胞および幹細胞の生存、自己複製、増殖および／または分化を制御し、特にがん組織中の増殖細胞の数を減少させうることがここで解明された。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】ヒュールスケン（Ｈｕｅｌｓｋｅｎ）ら、Ｃｅｌｌ  第１０５巻、ｐ．５３３−４５、２００１年
【非特許文献２】ポッテン（Ｐｏｔｔｅｎ）ら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  第１１０巻、ｐ．１００１−２０、１９９０年
【非特許文献３】モリソン（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ）ら、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  第１１巻、ｐ．３５−７１、１９９５年
【非特許文献４】ワイスマン（Ｗｅｉｓｓｍａｎ）、Ｃｅｌｌ  第１００巻、ｐ．１５７−６８、２０００年
【非特許文献５】ワイスマン（Ｗｅｉｓｓｍａｎ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  第２８７巻、ｐ．１４４２−６、２０００年
【非特許文献６】レノルズ（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ）およびワイス（Ｗｅｉｓｓ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  第２５５巻、ｐ．１７０７−１０、１９９２年
【非特許文献７】リチャーズ（Ｒｉｃｈａｒｄｓ）ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  第８９巻、ｐ．８５９１−５、１９９２年
【非特許文献８】ホール（Ｈａｌｌ）ら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  第１０６巻、ｐ．６１９−３３、１９８９年
【非特許文献９】ガルリ（Ｇａｌｌｉ）ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  第６４巻、ｐ．７０１１−７０２１、２００４年
【非特許文献１０】シン（Ｓｉｎｇｈ）ら、Ｎａｔｕｒｅ  第４３２巻、ｐ．３９６−４０１、２００４年
【非特許文献１１】総説としてメタカルフ（Ｍｅｔａｃａｌｆ）、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  第２１巻、ｐ．５−１４、２００３年
【非特許文献１２】フッドレス（Ｈｏｏｄｌｅｓｓ）ら、Ｃｅｌｌ  第８５巻、ｐ．４８９−５００、１９９６年
【非特許文献１３】ウォズニー（Ｗｏｚｎｅｙ）ら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ、追補１３、ｐ．１４９−１５６、１９９０年
【非特許文献１４】ノーエ（Ｎｏｈｅ）ら、Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  第１６巻、ｐ．２９１−２９９、２００４年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、対象における、腫瘍性幹細胞および腫瘍前駆細胞から選択された少なくとも一つの細胞種の過度な細胞増殖または誤制御された細胞増殖を特徴とする腫瘍を治療するための医薬組成物であって、白血病抑制因子（ＬＩＦ）調製物または白血病抑制因子レセプタ（ＬＩＦＲ）シグナル伝達活性化剤からなる群から選択される少なくとも１つの作用薬を含有する医薬組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
（発明の開示）  １つの態様では、本開示は、過度な細胞増殖または誤制御された細胞増殖を特徴とする疾病または障害を、治療または予防するための方法を提供する。該方法は、そのような過度な細胞増殖または誤制御された細胞増殖が生じていると思われる対象または組織に、治療上有効な量の白血病抑制因子（ＬＩＦ）調製物および少なくとも１つの骨形成タンパク質（ＢＭＰ）調製物のうち少なくともいずれか一方を投与することを含む。
【００１６】
別の態様では、本開示は、腫瘍の成長を低減する方法であって、治療上有効な量の白血病抑制因子（ＬＩＦ）調製物および骨形成タンパク質（ＢＭＰ）調製物のうち少なくともいずれか一方を前記腫瘍に投与することを含む方法を提供する。ヒト患者にＢＭＰ−４調製物を投与することにより、脳腫瘍（例えば多形膠芽腫）などのヒト患者の腫瘍の成長を低減する方法が含まれる。
【００１７】
さらなる態様では、本開示は、腫瘍中の腫瘍性幹細胞および腫瘍前駆細胞のうち少なくともいずれか一方の数を減少させる方法であって、該腫瘍をＬＩＦ調製物およびＢＭＰ調製物のうち少なくともいずれか一方と接触させることを含む方法を提供する。
【００１８】
別の態様では、本開示は、腫瘍性幹細胞または腫瘍前駆細胞中で、ＬＩＦレセプタ（ＬＩＦＲ）を介したシグナル伝達またはＢＭＰレセプタ（ＢＭＰＲ）を介したシグナル伝達をそれぞれ増大させることができる、ＬＩＦ調製物およびＢＭＰ調製物を提供する。
【００１９】
別の態様では、本開示は、腫瘍性幹細胞または腫瘍前駆細胞におけるＬＩＦレセプタ（ＬＩＦＲ）を介したシグナル伝達を増大させることができる、本明細書では以降「ＬＩＦＲシグナル伝達活性化剤」および「ＬＩＦレセプタシグナル伝達活性化剤」と称する作用薬を提供する。
【００２０】
別の態様では、本開示は、腫瘍におけるＬＩＦＲまたはＢＭＰＲを介したシグナル伝達を増大させることにより、前記腫瘍の成長を低減する方法を提供する。ＬＩＦＲを介したシグナル伝達は、例えば、ＬＩＦ調製物およびＬＩＦＲシグナル伝達活性化剤のうち少なくともいずれか一方を使用して活性化可能であり、ＢＭＰＲを介したシグナル伝達は、例えば、ＢＭＰ調製物およびＢＭＰＲシグナル伝達活性化剤のうち少なくともいずれか一方を使用して活性化可能である。
【００２１】
別の態様では、本開示は、ＬＩＦＲシグナル伝達活性化剤およびＢＭＰＲシグナル伝達活性化剤を同定するための方法を提供する。
別の態様では、本開示は、過度な細胞増殖または誤制御された細胞増殖を特徴とする疾病または障害を、治療または予防するための方法を提供する。該方法は、そのような過度な細胞増殖または誤制御された細胞増殖が生じていると思われる対象または組織に、治療上有効な量の、ＬＩＦＲシグナル伝達活性化剤およびＢＭＰＲシグナル伝達活性化剤のうち少なくともいずれか一方を投与することを含む。
【００２２】
別の態様では、本開示は、腫瘍中の腫瘍性幹細胞および腫瘍前駆細胞のうち少なくともいずれか一方の数を減少させる方法であって、該腫瘍を、ＬＩＦＲシグナル伝達活性化剤およびＢＭＰＲシグナル伝達活性化剤のうち少なくともいずれか一方と接触させることを含む方法を提供する。
【００２３】
別の態様では、本開示は、腫瘍の成長を低減する方法であって、前記腫瘍に治療上有効な量のＬＩＦＲシグナル伝達活性化剤およびＢＭＰＲシグナル伝達活性化剤のうち少なくともいずれか一方を投与することを含む方法を提供する。
【００２４】
別の態様では、本開示は、腫瘍性幹細胞または腫瘍前駆細胞が対称分裂を行う可能性を低減する方法であって、腫瘍性幹細胞または腫瘍前駆細胞を、ＬＩＦ調製物、ＢＭＰ調製物、ＢＭＰＲシグナル伝達活性化剤、およびＬＩＦＲシグナル伝達活性化剤から成る群から選択された少なくとも１つの作用薬と接触させることを含む方法を提供する。
【００２５】
別の態様では、本開示は、連続的に継代された神経幹細胞中の神経幹細胞の存在頻度および神経前駆細胞の存在頻度を低減する方法であって、神経幹細胞をＬＩＦ調製物およびＢＭＰ調製物のうち少なくともいずれか一方と接触させることを含む方法を提供する。
【００２６】
別の態様では、本開示は、ＬＩＦ調製物、ＢＭＰ調製物、ＢＭＰＲシグナル伝達活性化剤、およびＬＩＦＲシグナル伝達活性化剤から成る群から選択された少なくとも１つの作用薬を含有する医薬組成物を提供する。
【００２７】
さらなる態様では、腫瘍の治療のための医薬の製造におけるＢＭＰまたはＬＩＦ調製物の使用方法、たとえば脳腫瘍（例えば多形膠芽腫）の治療的処置および予防的処置のうち少なくともいずれか一方のための医薬の製造におけるＢＭＰ−４調製物の使用方法が開示される。
【００２８】
さらなる態様では、本開示は、腫瘍性幹細胞を含む腫瘍を治療するための方法であって、腫瘍性幹細胞を、腫瘍性幹細胞の分化を誘導する作用薬と接触させることを含む方法を提供する。適切な分化作用薬には、ＬＩＦ調製物、ＢＭＰ調製物、ＢＭＰＲシグナル伝達活性化剤、およびＬＩＦＲシグナル伝達活性化剤が含まれる。例えば、多形膠芽腫は、開示の方法に従って、腫瘍中の腫瘍性神経幹細胞（または、腫瘍の減量手術後の切除腔内残留物）を、腫瘍性神経幹細胞の分化を誘導するのに十分な量のＢＭＰ−４調製物と接触させることにより、治療可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１Ａ】ヒト神経幹細胞について、各継代の終了時における理論上の総細胞数を継代数に対してプロットした図。
【図１Ｂ】各継代の終了時における総細胞数の対数を継代数に対してプロットし、その線形対数プロットに最も良くフィットする傾向線を示す図。
【図２Ａ】ヒト神経幹細胞にＬＩＦを添加したものとしていないものについて、各継代の終了時における理論上の総細胞数を継代数に対してプロットした図。
【図２Ｂ】各継代の終了時における総細胞数の対数を継代数に対してプロットし、その線形対数プロットに最も良くフィットする傾向線を示す図。
【図２Ｃ】ＬＩＦの存在下における幹細胞および前駆細胞の存在頻度の低下を示すグラフ。
【図３Ａ】腫瘍細胞ニューロスフェアの２０×での位相差観察像を示す図。
【図３Ｂ】２つの異なるＧＢＭ細胞株について各分裂時の理論上の総細胞数を示す図。
【図４Ａ】連続的に継代したＧＢＭ腫瘍細胞について、各継代の終了時における理論上の総細胞数を継代数に対してプロットした図。
【図４Ｂ】各継代の終了時における総細胞数の対数を継代数に対してプロットし、その線形対数プロットに最も良くフィットする傾向線を示す図。
【図４Ｃ】腫瘍性幹細胞および腫瘍前駆細胞の存在頻度を示すグラフ。
【図５】連続的に継代したＧＢＭ腫瘍細胞について、神経コロニー形成細胞法（ＮＣＦＣＡ）で直径が次の範囲の大きさ：１，５００−２，０００μｍ；１，０００−１，５００μｍ；５００−１，０００μｍ；および＜５００μｍのコロニーを形成する細胞の、播種した細胞全体に対する割合（％）（ｙ軸）を示す図（主グラフ）。主グラフに挿入されたグラフは、直径が１，５００−２，０００μｍおよび１，０００−１，５００μｍの区分にあるコロニーを形成する細胞の、播種した細胞全体に対する割合（％）（ｙ軸）を、主グラフとは異なるｙ軸目盛りで示している。
【図６】ヒト初代腫瘍標本およびヒト腫瘍神経幹細胞株におけるＢＭＰＲ１ａ、ＢＭＰＲ１ｂおよびＢＭＰＲ２についてのリアルタイムＰＣＲの結果を示す図。
【図７】ＬＩＦまたはＢＭＰ−４で処理したＧＢＭ細胞株中の幹細胞および前駆細胞の割合（％）を示す図。
【図８】ＬＩＦ、ＢＭＰ−４、またはＬＩＦ＋ＢＭＰ−４で処理したＧＢＭ細胞株中の幹細胞および前駆細胞の割合（％）を示す図。
【図９】連続継代中持続的にＢＭＰ−２で処理したＧＢＭ細胞株、または１回の継代について一時的にＢＭＰ−２で処理したＧＢＭ細胞株（「ＢＭＰ後」）における幹細胞および前駆細胞の割合（％）を示す図。
【図１０】ヒトＧＢＭ由来の腫瘍性神経幹細胞の移植によって免疫不全マウスに引き起こされたＧＢＭを示す図（上側パネル）。ならびにヒト腫瘍性神経幹細胞をＢＭＰ−４またはＬＩＦで処理してから移植した場合はＧＢＭ形成が低減されることを示す図（下側パネル）。
【図１１】１１Ａ：急性単離したＧＢＭ細胞および培養したＧＢＭ細胞からの細胞について、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＢＭＰＲ２およびＢＭＰ−４の転写物レベルを示す図。１１Ｂ−Ｄ：単離直後のＧＢＭ細胞におけるＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１ＢおよびＢＭＰＲ２の免疫反応性を示す図。１１Ｅ−Ｇ：培養したＧＢＭ細胞におけるＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１ＢおよびＢＭＰＲ２の免疫反応性を示す図。１１Ｈ−Ｉ：ＧＢＭ細胞におけるリン酸化Ｓｍａｄ１，５，８の免疫反応性を示す図。１１Ｋ−Ｐ：ＧＢＭ細胞におけるＢＭＰ−４、Ｓｍａｄ１、リン酸化Ｓｍａｄ１，５，８およびＳｍａｄ４のウエスタンブロット解析を示す図。
【図１２Ａ】ＢＭＰ−４の存在下および非存在下におけるＧＢＭ培養物中の細胞死、アポトーシス、Ｋｉ６７免疫反応性およびＣＤ１３３免疫反応性の測定結果を示す図。
【図１２Ｂ】ＢＭＰ−４の存在下および非存在下におけるＧＢＭ細胞のクローン形成の指標を示す図。
【図１２Ｃ】ニューロスフェア分析法におけるＢＭＰ−４の存在下および非存在下でのＧＢＭ細胞の増殖を示す図。
【図１３Ａ】ＢＭＰ−４非存在下におけるＧＢＭ細胞を示す図。
【図１３Ｂ】ＢＭＰ−４とともに培養したＧＢＭ細胞を示す図。
【図１３Ｃ】ＧＦＡＰの免疫反応性（ＩＲ）を示す図（対照ＧＢＭ細胞）。
【図１３Ｄ】ＧＦＡＰの免疫反応性（ＩＲ）を示す図（ＢＭＰ−４処理したＧＢＭ細胞）。
【図１３Ｅ】βＩＩＩチューブリンのＩＲを示す図（対照ＧＢＭ細胞）。
【図１３Ｆ】βＩＩＩチューブリンのＩＲを示す図（ＢＭＰ−４処理したＧＢＭ細胞）。
【図１３Ｇ】ＧａｌＣのＩＲを示す図（対照ＧＢＭ細胞）。
【図１３Ｈ】ＧａｌＣのＩＲを示す図（ＢＭＰ−４処理したＧＢＭ細胞）。
【図１３Ｉ】対照ＧＢＭ細胞およびＢＭＰ−４処理したＧＢＭ細胞の、細胞蛍光測光法によるＧＦＡＰのＩＲについての解析を示す図。
【図１３Ｊ】対照ＧＢＭ細胞およびＢＭＰ−４処理したＧＢＭ細胞の、βＩＩＩチューブリンのＩＲについての解析を示す図。
【図１３Ｋ】対照ＧＢＭ細胞およびＢＭＰ−４処理したＧＢＭ細胞の、ＧａｌＣのＩＲについての解析を示す図。
【図１４Ａ】未処理のＧＢＭ細胞を注入したマウスにおける腫瘤を示す図。
【図１４Ｂ】ＢＭＰ−４処理したＧＢＭ細胞を注入したマウスには比較できるほどの腫瘤が存在しないことを示す図。
【図１４Ｃ】ＢＭＰ−４を欠いた対照ビーズで同時処理したマウスにおける腫瘍を示す図。
【図１４Ｄ】ＢＭＰ−４ビーズで同時処理したマウスには比較できるほどの腫瘍が存在しないことを示す図。
【図１４Ｅ】対照ビーズで後処理したマウスにおける腫瘍を示す図。
【図１４Ｆ】ＢＭＰ−４ビーズで後処理したマウスには比較できるほどの腫瘍が存在しないことを示す図。
【図１４Ｇ】マウスにおける未処理のＧＢＭ腫瘍の細胞形態を示す図。
【図１４Ｈ】マウスにおけるＢＭＰ−４処理したＧＢＭ腫瘍の細胞形態を示す図。
【図１４Ｊ】対照ビーズまたはＢＭＰ−４ビーズのいずれかを用いて、ＧＢＭ注入の前（左側パネル）、同時（中央パネル）および後（右側パネル）に処理したＧＢＭ注入マウスについて生存グラフを示す図。
【図１５】ＧＢＭ細胞の増殖に対する様々なＢＭＰの影響を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本開示について詳細に説明する前に、当然のことであるが、別途定めのないかぎり本開示内容は、変更可能なものである処方成分、製造法、投与計画などについて特定のものに限定されない。同様に当然のことであるが、本明細書中で使用される用語は、単に特別な実施形態を説明するためのものであり、限定を意図するものではない。
【００３１】
本明細書中で使用されるように、単数形の名詞は、文脈上そうでないことが明らかでないかぎり、複数形も含んでいることに留意すべきである。したがって、例えば、「作用薬」という場合には、単一の作用薬だけでなく２以上の作用薬を含んでおり；「幹細胞」という場合には、単一の幹細胞だけでなく２以上の幹細胞を含んでいる；などである。
【００３２】
本明細書中で使用されるように、「治療上有効な量」とは、過度な細胞増殖または誤制御された細胞増殖を特徴とする疾病または障害を、治療または管理するのに十分な治療薬の量、および好ましくは、原発がん組織、局所がん組織または転移がん組織を破壊、改変、制御、または除去するのに十分な量を指す。治療上有効な量は、過度な細胞増殖または誤制御された細胞増殖を特徴とする疾病または障害の発症を、遅延させるかまたは最小限にする、例えば、がんの蔓延または腫瘍の成長を遅延させるかまたは最小限にするのに十分な治療薬の量を指す場合もある。また治療上有効な量は、腫瘍またはがんの治療または管理において治療上の利点を提供する治療薬の量を指す場合もある。さらに、本開示の治療薬に関しての治療上有効な量とは、細胞過剰増殖性の疾病またはがんの治療または管理において治療上の利点を提供する、単独での、または他の療法との併用における治療薬の量を意味する。該用語は、治療法全体を改善する量、有害反応を低減もしくは回避する量、または別の治療薬の治療効果もしくは別の治療薬との相乗作用を増強する量を包含しうる。
【００３３】
用語「作用薬」、「化合物」、「活性作用薬」、「活性化合物」、「治療薬」、「薬理学的に活性な作用薬」、「医薬」、「活性体」および「薬物」は、所望の薬理学的かつ／または生理的な効果を引き起こす物質を指すために本明細書において互換的に使用される
。該用語は、本明細書に具体的に記載された活性作用薬の、医薬として許容可能かつ薬理学的に活性な有効成分、例えば限定するものではないが塩、エステル、アミド、プロドラッグ、活性代謝物、アナログおよびその他同種のものも包含する。用語「作用薬」、「化合物」、「活性作用薬」、「薬理学的に活性な作用薬」、「医薬」、「活性体」および「薬物」が用いられる場合、当然ながら同用語は、活性作用薬それ自身だけでなく、医薬として許容可能で、薬理学的に活性な塩、エステル、アミド、プロドラッグ、代謝産物、アナログなどを包含する。本開示の作用薬は、ペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質のような任意のタンパク質性分子であってもよいし、核酸分子のような非タンパク質分子であってもよく、天然または合成的に誘導された有機および無機の低分子ないし高分子であってよい。該作用薬は一般には血液脳関門を横断することが可能であり、あるいはＣＮＳへの直接投与に好適な場合もある。
【００３４】
本明細書において「治療」という場合、存在している疾病または症状の重症度の低減を意味する場合がある。用語「治療」は、疾病または症状の発症を防止する「予防的処置」を包含するとも解釈される。用語「治療」は、対象が完全に回復するまで治療されることを必ずしも示唆するものではない。同様に、「予防的処置」は、対象が最終的に疾病または症状を発症しないということを必ずしも意味するものではない。
【００３５】
本明細書において使用される場合、「幹細胞」は、（ａ）増殖が可能、（ｂ）長期間にわたる自己複製が可能で、（ｃ）多くの子孫を生成することができ、かつ（ｄ）その幹細胞が得られた組織のすべての種類の細胞を生じさせる能力を有する、未分化細胞を指す。
【００３６】
本明細書において使用されるように、「腫瘍性幹細胞」は腫瘍から得られた幹細胞である。腫瘍性幹細胞は、（ａ）増殖が可能、（ｂ）長期間にわたる自己複製が可能で、（ｃ）多くの子孫を生成することができ、かつ（ｄ）その腫瘍性幹細胞が得られた腫瘍のすべての種類の細胞を生じさせる能力を有する。本明細書において「ｔＮＳＣ」とも呼ばれる「腫瘍性神経幹細胞」は、ＣＮＳの腫瘍から得られた腫瘍性幹細胞を指す。
【００３７】
本明細書において使用される場合、「前駆細胞」は、（ａ）増殖が可能で、（ｂ）限定的な自己複製能力を有し、（ｃ）限られた数の子孫を生成することができ、かつ（ｄ）少なくとも１種類の子孫を生じさせる能力を有する、未分化細胞を指す。
【００３８】
本明細書において使用されるように、「腫瘍前駆細胞」は腫瘍から得られた前駆細胞である。腫瘍前駆細胞は、（ａ）増殖が可能で、（ｂ）限定的な自己複製能力を有し、（ｃ）限られた数の子孫を生成することができ、かつ（ｄ）その腫瘍前駆細胞が得られた腫瘍に見出される少なくとも１種類の細胞を生じさせる能力を有する。
【００３９】
ＬＩＦ調製物およびＢＭＰ調製物
１つの態様では、本開示は、過度な細胞増殖または誤制御された細胞増殖を特徴とする疾病または障害の治療または予防のための方法を提供する。該方法は、そのような過度な細胞増殖または誤制御された細胞増殖が生じていると思われる対象または組織に、治療上有効な量の白血病抑制因子（ＬＩＦ）調製物および少なくとも１つの骨形成タンパク質（ＢＭＰ）調製物のうち少なくともいずれか一方を投与することを含む。
【００４０】
好ましくは、過度の増殖を特徴とする障害は良性腫瘍または悪性腫瘍（がん）である。例えば、腫瘍は、脳腫瘍、例えば限定するものではないが聴神経腫、腺腫、星状細胞腫、若年性毛様細胞性星状細胞腫、脳幹部神経膠腫、脊索腫、脈絡叢、頭蓋咽頭腫、脳室上衣腫、神経節膠腫、神経節膠腫神経細胞、多形膠芽腫（ＧＢＭ）、神経膠腫、リンパ腫、髄芽細胞腫、髄膜腫、乏突起膠腫、視神経膠腫、下垂体部腫瘍、松果体部腫瘍、または松果体芽腫であってよい。好ましい実施形態では、脳腫瘍はＧＢＭである。
【００４１】
別の態様では、本開示は、腫瘍の成長を低減する方法であって、前記腫瘍に、治療上有効な量の白血病抑制因子（ＬＩＦ）調製物および少なくとも１つの骨形成タンパク質（ＢＭＰ）調製物のうち少なくともいずれか一方を投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、治療上有効な量のＢＭＰ−４調製物が、ＧＢＭの成長を低減するためにヒト患者のＧＢＭに投与される。
【００４２】
さらなる態様では、本開示は、腫瘍中の腫瘍性幹細胞および腫瘍前駆細胞のうち少なくともいずれか一方の数を減少させる方法であって、該腫瘍を、ＬＩＦ調製物およびＢＭＰ調製物のうち少なくともいずれか一方と接触させることを含む方法を提供する。理論または仮説によって限定されるものではないが、腫瘍へと投与された時、ＬＩＦ調製物およびＢＭＰ調製物はＬＩＦＲまたはＢＭＰＲを介したシグナル伝達の増大をもたらし、その結果次の腫瘍性幹細胞または腫瘍前駆細胞の特性、例えば限定するものではないが細胞の生存、自己複製、対称分裂、増殖、および／または分化についての特性のうちのいずれか１つ以上を調節するものと考えられる。理論または仮説によって限定されるものではないが、特に、ＬＩＦＲまたはＢＭＰＲを介したシグナル伝達が増大する結果、幹細胞および前駆細胞の増殖特性が低下し、特に増殖している幹細胞または前駆細胞による対称分裂の可能性が低下することによって該細胞の数が低下すると考えられる。従って、別の態様では、本開示は、腫瘍性幹細胞または腫瘍前駆細胞が対称分裂を行う可能性を低減する方法であって、腫瘍性幹細胞または腫瘍前駆細胞を、ＬＩＦ調製物およびＢＭＰ調製物のうち少なくともいずれか一方と接触させることを含む方法を提供する。
【００４３】
別の態様では、本開示は、腫瘍におけるＬＩＦＲまたはＢＭＰＲを介したシグナル伝達を増大させることにより、前記腫瘍の成長を低減する方法を提供する。ＬＩＦＲを介したシグナル伝達は、例えば、ＬＩＦ調製物およびＬＩＦＲシグナル伝達活性化剤のうち少なくともいずれか一方を使用して活性化可能であり（後述）、ＢＭＰＲを介したシグナル伝達は、例えば、ＢＭＰ調製物およびＢＭＰＲシグナル伝達活性化剤のうち少なくともいずれか一方を使用して活性化可能である（後述）。
【００４４】
従来の治療法を使用して腫瘍形成性の細胞を根絶することを目指した現在の治療は、細胞周期が急速に回転している細胞の除去を意図したものである。例えば、従来の化学療法薬は、分裂している細胞に対して最も有効性が高い。ｔＮＳＣは、対応するその非形質転換体と同じように細胞周期の回転が低頻度であるため、治療の毒性作用を免れ、治療後に腫瘍の増大を容易に再開しうる。成体幹細胞が本質的に寿命が長いこと、また本来薬剤抵抗性遺伝子および抗アポトーシス遺伝子を発現する能力を有することは、該細胞に対応する悪性の細胞においても見出される場合があり、腫瘍性幹細胞の根絶を目指した有効な治療戦略を開発する際の困難の度を増している。本明細書に開示された方法および組成物は、ｔＮＳＣ細胞を標的とすることにより上記の困難を克服する。理論または仮説によって制限を受けるものではないが、本明細書に開示の方法および組成物は、ｔＮＳＣに対する分化促進効果を有し（実施例に示すように、神経の分化マーカー、特に星状膠細胞の抗原のアップレギュレーションによって証明された）、したがって細胞生存率への影響やアポトーシス誘発を伴わずに幹細胞群を永続的に縮小させると考えられる。その結果（以下の実施例に示すように）、本開示の組成物（特にＧＢＭ治療用のＢＭＰ−４組成物）への一時的な曝露でも、ｔＮＳＣの腫瘍形成能が不可逆的に抑制される。
【００４５】
腫瘍細胞を死滅させようとするのではなく分化を誘導することは、がん治療への全く新しいアプローチである。したがって、別の態様では、本開示は、腫瘍性幹細胞を含む腫瘍を治療する方法であって、腫瘍性幹細胞を、腫瘍性幹細胞の分化を誘導する作用薬（ＢＭＰ調製物など）と接触させることを含む方法を提供する。１つのそのような実施形態では、多形膠芽腫のような脳腫瘍中の腫瘍性神経幹細胞を、該細胞の分化を誘導するためにＢ
ＭＰ−４と接触させる。
【００４６】
用語「ＬＩＦ調製物」および「ＢＭＰ調製物」には、ＬＩＦポリペプチドまたはＢＭＰポリペプチドであって、天然に、好ましくはヒトにおいて産生された、任意の翻訳後修飾を有するものまたは翻訳後修飾されていないものが含まれる。この用語は、ヒトＬＩＦの場合、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿００２３０９のｍＲＮＡによってコードされるポリペプチドを含んでいる。ヒトＢＭＰの場合、この用語は、ヒト遺伝子ＢＭＰ１、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８Ａ、ＢＭＰ８Ｂ、ＧＤＦ１０（ＢＭＰ−３ｂ）、ＧＤＦ１１（ＢＭＰ１１）、ＧＤＦ２（ＢＭＰ９）、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ１５によってコードされるＢＭＰポリペプチド、およびＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿００１７１９（ＢＭＰ７）；ＮＭ＿００１２０１（ＢＭＰ３）；ＮＭ＿００１２００（ＢＭＰ２）；ＮＭ＿００５４４８（ＢＭＰ１５）；ＮＭ＿００１７２０（ＢＭＰ８Ｂ）；ＮＭ＿０１４４８２（ＢＭＰ１０）；ＮＭ＿００６１３２（ＢＭＰ１−４）；ＮＭ＿００６１３１（ＢＭＰ１−５）；ＮＭ＿００６１３０（ＢＭＰ１−６）；ＮＭ＿００６１２９（ＢＭＰ１−３）：ＮＭ＿００６１２８（ＢＭＰ１−２）：ＮＭ＿００１７１８（ＢＭＰ６）；ＮＭ＿００１１９９（ＢＭＰ１−１）；ＮＭ＿１３０８５１（ＢＭＰ４−３）；ＮＭ＿１３０８５０（ＢＭＰ４−２）；ＮＭ＿００１２０２（ＢＭＰ４−１）；ＮＭ＿１８１８０９（ＢＭＰ８Ａ）；ＮＭ＿０２１０７３（ＢＭＰ５）のｍＲＮＡによってコードされるポリペプチドを含んでいる。ＢＭＰ−４ポリペプチドはＢＭＰ−２Ｂと呼ばれる場合もあることに留意されたい。
【００４７】
本開示の方法および組成物において使用される好ましいＢＭＰには、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７およびＢＭＰ−８ｂが挙げられる。特に、ＢＭＰ−４への曝露は、ヒトＧＢＭから単離された細胞の成熟を強化するとともに全体的な生存度およびアポトーシスには影響しないことが以下の実施例において示されている。このことから、ニューロンマーカーおよび神経膠マーカーのアップレギュレーションが引き起こされ、増殖能力の顕著な低下ももたらされる。ＢＭＰ−４への曝露は、一時的であっても、ＧＢＭ培養物中のＧＢＭ  ｔＮＳＣ集団（ＣＤ１３３＋のＧＢＭ細胞）を大幅に縮小し、ＧＢＭ細胞のコロニー形成の指標を大幅に低減し、ＧＢＭ  ｔＮＳＣの増大の速度論を劇的に低減することが以下の実施例において示されている。これらの効果は不可逆的であり、ヒトＧＢＭ細胞のインビボにおける腫瘍発生能力を消滅させる。
【００４８】
本明細書で使用される用語「ＬＩＦ調製物」または「ＢＭＰ調製物」はまた、ＬＩＦもしくはＢＭＰのポリペプチドもしくは糖ポリペプチドのフラグメントであって、本開示の分析法および治療方法において過度の細胞増殖を減弱する能力を少なくとも部分的に保持している、例えば、本開示の分析法または治療法において完全長ＬＩＦまたは完全長ＢＭＰの活性の１〜１００％を保持しているものも含む。そのようなフラグメントは、本開示の分析法または治療方法において完全長ＬＩＦまたは完全長ＢＭＰよりも高い活性を有していてもよい。そのようなフラグメントは、完全長タンパク質と比較して、アミノ末端またはカルボキシ末端、あるいは両末端から残基が欠失したひと続きのものであってもよい。フラグメントは、構造ドメインまたは機能ドメインを特徴とするもの、例えばαヘリックス領域およびαヘリックス形成領域、βシート領域およびβシート形成領域、ターン領域またはターン形成領域、コイル領域およびコイル形成領域、親水性領域、疎水性領域、両親媒性α領域、両親媒性β領域、フレキシブル領域、表面を形成する領域、および基質結合領域を含むフラグメントであってもよい。フラグメントは、ペプチド合成技術によって生産されたものでも、あるいは完全長のＬＩＦまたはＢＭＰポリペプチドの切断によって生じたものでもよい。フラグメントは、そのＮ末端、Ｃ末端、あるいはＮ末端およびＣ末端の両方が、他のポリペプチド配列に連結されることにより、融合タンパク質を形成する場合もある。
【００４９】
本明細書において使用される用語「ＬＩＦ調製物」または「ＢＭＰ調製物」はまた、ＬＩＦもしくはＢＭＰポリペプチド、または上述のようなそのフラグメントのアミノ酸配列と部分的に相同なアミノ酸配列を有し、かつ本開示の分析法および治療方法において過度の細胞増殖を減弱する能力を少なくとも部分的に保持しているポリペプチドまたは糖ポリペプチドも含む。相同体は、ＬＩＦもしくはＢＭＰまたはそのフラグメントと５０％、７０％、８０％、８０．６％、８３％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または９９．９％同一であってよい。
【００５０】
用語「ＬＩＦ調製物」または「ＢＭＰ調製物」はまた、ＬＩＦまたはＢＭＰの完全長ポリペプチドのバリアント、およびＬＩＰまたはＢＭＰのフラグメントのバリアントも含む。そのようなバリアントは、本開示の分析法および治療方法において過度の細胞増殖を減弱する能力を少なくとも部分的に保持している。バリアントは、当技術分野で既知の一般的な法則に従って活性に対する影響がほとんどないように選択された欠失、挿入、逆位、反復、および置換を含んでいてもよい。例えば、表現型の上では表に出ないアミノ酸置換を行う方法に関する手引きはボウイ（Ｂｏｗｉｅ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  第２４７巻、ｐ．１３０６−１３１０、１９９０年に提供されており、同文献はその全体が参照によって本願に組み込まれる。例えば、バリアントは部位特異的突然変異法またはアラニン走査突然変異法（分子中のすべての残基に単一アラニン変異を導入）（カニングハム（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ）およびウェルズ（Ｗｅｌｌｓ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  第２４４巻、ｐ．１０８１−１０８５、１９８９年）によって得ることができる。バリアントはまた、例えば、そのタンパク質配列またはペプチド配列中に１以上の非ペプチド結合を（ペプチド結合の代わりとして）含むアミノ酸置換を有していてもよい。バリアントはさらに、天然に存在するＬアミノ酸以外のアミノ酸残基、例えばＤアミノ酸または非天然もしくは合成アミノ酸、例えばＢアミノ酸もしくはｙアミノ酸、を含む置換を有していてもよい。バリアントはさらに、ポリペプチドに立体構造上の制約を課する架橋基を含んでいてもよい。バリアントはさらに、グリコシル化、アセチル化、リン酸化およびその他同種のものを含んでいてもよい。バリアントはまた、（ｉ）１以上の非保存アミノ酸残基による置換を含んでいてもよく、該置換アミノ酸残基は遺伝子コードによってコードされたアミノ酸残基であってもそうでなくてもよく、あるいは（ｉｉ）置換基を有する１以上のアミノ酸残基による置換を含んでいてもよく、あるいは（ｉｉｉ）成熟ポリペプチドが別の化合物と、例えばＬＩＦまたはＢＭＰ調製物の安定性および／または溶解度を増大させる化合物（例えばポリエチレングリコール）、あるいはＬＩＦまたはＢＭＰ調製物が特定の種類の細胞（腫瘍性神経幹細胞など）を標的とするための化合物、あるいはＬＩＦまたはＢＭＰ調製物が血液脳関門（ＢＢＢ）および／または血液腫瘍関門（ＢＴＢ；ｂｌｏｏｄ−ｔｕｍｏｒ  ｂａｒｒｉｅｒ）を横断可能とするための化合物、と融合していてもよく、あるいは（ｉｖ）該ポリペプチドと、付加アミノ酸もしくは付加ペプチドもしくは付加ポリペプチドと融合していてもよく、あるいは（ｖ）細胞毒性を有する作用薬、例えば毒素または放射活性化合物と融合していてもよく、あるいは（ｖｉ）画像化を目的として使用されるマーカー、例えば放射標識）と融合していてもよい。
【００５１】
本開示のＬＩＦ調製物およびＢＭＰ調製物は、任意の適切な方法で、例えば天然に存在するポリペプチドの単離により、組換え技術により、ポリペプチド合成技術により、あるいはこれらの方法の組合せにより、調製することができる。そのようなポリペプチドを調製する方法は、当技術分野ではよく了解されている。ＬＩＦ調製物またはＢＭＰ調製物は、融合タンパク質のようなより大きなタンパク質の形態であってもよい。分泌配列またはリーダー配列、プロ配列、ポリヒスチジン残基のような精製を支援する配列、あるいは組換え体生産中の安定性のための付加配列など、付加アミノ酸配列を備えていると有利な場合が多い。
【００５２】
本開示のＬＩＦ調製物およびＢＭＰ調製物は、単離された形態で提供されることが好ましく、十分に精製されることが好ましい。組換え法によって生成されたＬＩＦまたはＢＭＰ調製物は、本明細書に記載された技法または当技術分野で周知の他の方法、たとえばスミス（Ｓｍｉｔｈ）およびジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ）、Ｇｅｎｅ  第６７巻、ｐ．３１−４０、１９８８年に記載されているワンステップ法を用いて、十分に精製することが可能である。本開示のＬＩＦまたはＢＭＰの調製物はまた、天然、合成または組換えの供給源から、当技術分野で周知のプロトコールを用いて、例えば完全長のＬＩＦまたはＢＭＰに対して作製された本開示の抗体を使用して精製することもできる。
【００５３】
本開示のいくつかの実施形態では、内在する腫瘍性幹細胞および腫瘍前駆細胞がインビボで制御されるように、ＬＩＦ調製物およびＢＭＰ調製物のうち少なくともいずれか一方が対象に直接投与される場合がある。例えば、ＢＭＰ−４調製物はヒト患者体内のＧＢＭのような脳腫瘍に投与される場合がある。本開示の別の実施形態では、腫瘍性幹細胞および腫瘍前駆細胞に、本開示の作用薬をインビトロで接触させる場合がある。例えば、腫瘍性幹細胞と腫瘍前駆細胞とを含む単離された腫瘍に、本開示の作用薬をインビトロで接触させる場合がある。
【００５４】
ＬＩＦ調製物およびＢＭＰ調製物のうち少なくともいずれか一方を、ＬＩＦ調製物およびＢＭＰ調製物のうち少なくともいずれか一方を含む医薬組成物とともに、対象に、例えば対象者の腫瘍に投与する方法については、「投与および医薬組成物」と題した項で後述する。
【００５５】
ＬＩＦレセプタシグナル伝達活性化剤およびＢＭＰレセプタシグナル伝達活性化剤
別の態様の実施形態では、本開示は、本明細書中では以降「ＬＩＦＲシグナル伝達活性化剤」および「ＬＩＦレセプタシグナル伝達活性化剤」とも称する、腫瘍性幹細胞または腫瘍前駆細胞におけるＬＩＦレセプタ（ＬＩＦＲ）を介したシグナル伝達を増大させることのできる作用薬を提供する。本開示はまた、そのようなＬＩＦＲシグナル伝達活性化剤を同定するための方法、およびそのようなＬＩＦＲシグナル伝達活性化剤を含有する医薬組成物を提供する。本開示のＬＩＦＲシグナル伝達活性化剤は、ＬＩＦＲを直接活性化することにより幹細胞または前駆細胞におけるＬＩＦＲを介したシグナル伝達を増大させてもよいし（例えばアゴニスト）、あるいは間接的に、例えば腫瘍性幹細胞または腫瘍前駆細胞中で第２の分子もしくは化合物の発現または活性を増大させて（例えば、ＬＩＦ自体の発現を増大させて、あるいはＪＡＫまたはＳＴＡＴのようなＬＩＦＲを介したシグナル伝達の下流成分の活性または発現を増加させて）ひいては腫瘍性幹細胞または腫瘍前駆細胞におけるＬＩＦＲを介したシグナル伝達を増大させてもよい。
【００５６】
追加の態様では、本開示は、本明細書中では以降「ＢＭＰＲシグナル伝達活性化剤」および「ＢＭＰレセプタシグナル伝達活性化剤」とも称する、腫瘍性幹細胞または腫瘍前駆細胞におけるＢＭＰレセプタ（ＢＭＰＲ）を介したシグナル伝達を増大させることのできる作用薬を提供する。本開示はまた、そのようなＢＭＰＲシグナル伝達活性化剤を同定するための方法、およびそのようなＢＭＰＲシグナル伝達活性化剤を含有する医薬組成物を提供する。本開示のＢＭＰＲシグナル伝達活性化剤は、ＢＭＰＲを直接活性化することにより腫瘍性幹細胞または腫瘍前駆細胞におけるＢＭＰＲを介したシグナル伝達を増大させてもよいし（例えばアゴニスト）、あるいは間接的に、例えば腫瘍性幹細胞または腫瘍前駆細胞中で第２の分子もしくは化合物の発現または活性を増大させて（例えば、ＢＭＰ自体の発現を増大させて、あるいはＢＭＰＲを介したシグナル伝達の下流成分の活性または発現を増加させて）ひいては腫瘍性幹細胞または腫瘍前駆細胞におけるＢＭＰＲを介したシグナル伝達を増大させてもよい。
【００５７】
本明細書中で「ＬＩＦＲ」という場合、ＬＩＦＲのホモログ、パラログ、オーソログ、誘導体、フラグメントおよび機能的等価物など、ＬＩＦＲのすべての形態を指す。本明細書中で「ＢＭＰＲ」という場合、ＢＭＰＲのホモログ、パラログ、オーソログ、誘導体、フラグメントおよび機能的等価物など、ＢＭＰＲのすべての形態を指す。
【００５８】
本開示の文脈においては、ＬＩＦＲまたはＢＭＰＲを介したシグナル伝達の増大とは、ＬＩＦＲまたはＢＭＰＲを介したシグナル伝達の正常なレベルの１〜約１０００％の増大を意味する。別例として、ＬＩＦＲまたはＢＭＰＲのシグナル伝達活性化剤は、ＬＩＦＲまたはＢＭＰＲを介したシグナル伝達のレベルを、シグナル伝達が正常よりも低い場合に回復させることができる。
【００５９】
好ましくは、ＬＩＦＲまたはＢＭＰＲを介したシグナル伝達の増大により、腫瘍性幹細胞および腫瘍前駆細胞の特性のうちいずれか１つ以上、例えば限定されるものではないが生存、自己複製、増殖、対称分裂および分化のうち少なくともいずれかの特性が調節される。最も好ましくは、ＬＩＦＲまたはＢＭＰＲを介したシグナル伝達の増大は、腫瘍性幹細胞および腫瘍前駆細胞の分裂特性を変化させ、特に対称分裂の可能性の低減あるいは増殖している腫瘍性幹細胞および腫瘍前駆細胞によって示される細胞周期回転数の低減により、腫瘍性幹細胞および腫瘍前駆細胞の数の低下をもたらす。
【００６０】
本開示のＬＩＦＲおよびＢＭＰＲシグナル伝達活性化剤は、ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質のような任意のタンパク質性分子であってもよいし、非タンパク質性の分子であってもよい。ＬＩＦＲおよびＢＭＰＲシグナル伝達活性化剤の単離のための方法は本明細書において提供される。
【００６１】
本開示に関して、ミメティックはＬＩＦＲおよびＢＭＰＲシグナル伝達活性化剤の特に有用な一群である。該用語は、ミメティックが模倣する例えばＬＩＦなどの分子に対してある種の化学的類似性を有する物質であって、例えばＬＩＦＲのような標的とＬＩＦとの相互作用をアゴナイズする（模倣する）物質を指すように意図されている。ペプチドミメティックはミメティックの１種であり、タンパク質二次構造の構成要素を模倣するペプチド含有分子であってもよい（ジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ）ら、「Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｕｒｎ  Ｍｉｍｅｔｉｃｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｙ」、ペズート（Ｐｅｚｚｕｔｏ）ら編、チャップマン・アンド・ホール（Ｃｈａｐｍａｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ）、ニューヨーク、１９９３年）。ペプチドミメティックの使用の背景にある論理的根拠は、タンパク質のペプチド・バックボーンの存在が主として、分子の相互作用、たとえば抗体と抗原との相互作用、酵素と基質との相互作用または足場タンパク質の相互作用を促進するようにアミノ酸側鎖を正しい向きにするためにあるということである。したがってペプチドミメティックは、天然の分子に似た分子相互作用が可能なように設計される。
【００６２】
薬学的に活性な化合物を目指したミメティックの設計は、「リード」化合物に基づいた薬剤開発への既知のアプローチである。上記アプローチは、活性化合物の合成が困難であるか費用のかかる場合、あるいは特定の投与方法に適さない場合（例えば、ペプチドは消化管中のプロテアーゼによって急速に分解される傾向があるので経口組成物には不適当な活性作用薬である）、望ましいかもしれない。ミメティックの設計、合成および試験は、一般に、標的の特性に対して多数の分子をランダムにスクリーニングするのを回避するために使用される。ＢＭＰ−４のミメティック、例えばペプチドミメティックなどについて、本明細書中で具体的に検討する。
【００６３】
合理的薬物設計の目標は、対象とする生物学的に活性なポリペプチドまたは該ポリペプチドが相互作用する小分子の構造アナログを、例えばより高活性または安定な形態のポリ
ペプチドである薬物、あるいは例えばインビボでポリペプチドの機能を増強または妨害する薬物を作るために、作製することである（例えばホジスン（Ｈｏｄｇｓｏｎ）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  第９巻、ｐ．１９−２１、１９９１年を参照のこと）。１つの手法では、Ｘ線結晶解析、コンピュータモデリング、または最も典型的には手法の組み合わせによって、対象とするタンパク質の三次元構造を最初に決定する。ポリペプチドの構造に関する有用な情報は、相同タンパク質の構造に基づいたモデリングにより得られることもある。合理的薬物設計の一例は、ＨＩＶプロテアーゼインヒビターの開発である（エリクソン（Ｅｒｉｃｋｓｏｎ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  第２４９巻、ｐ．５２７−５３３、１９９０年）。
【００６４】
本開示のＬＩＦＲおよびＢＭＰＲシグナル伝達活性化剤がタンパク質性であれ非タンパク質性であれ、該活性化体が幹細胞または前駆細胞中でＬＩＦＲもしくはＢＭＰＲと相互作用し、かつ／またはＬＩＦＲもしくはＢＭＰＲを介したシグナル伝達を（直接的または間接的に）増大させる能力は、当業者に周知のいくつかのスクリーニング法によって評価することができる。該方法は、天然物ライブラリ、化学合成物ライブラリ、ならびにコンビナトリアルライブラリ、ファージディスプレイライブラリおよびインビトロトランスレーション系ライブラリのスクリーニングを含みうる。
【００６５】
ＬＩＦＲおよびＢＭＰＲに対して作製された抗体は、ＬＩＦおよびＢＭＰの活性構造をそれぞれ模倣するアゴニストとして特に有用であり得る。適切な抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、一価の抗体、二重特異性抗体、ヘテロ結合体抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化またはキメラ抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリによって生成されたフラグメント、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、および上記のうちいずれかのエピトープ結合フラグメントがある。本明細書で用いられる用語「抗体」は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち免疫学的に特異的に抗原に結合する抗原結合部位を含んでいる分子を指す。免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン分子の任意の種類（例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはサブクラスのものであってよい。さらに、用語「抗体」（Ａｂ）あるいは「モノクローナル抗体」（Ｍａｂ）は、完全な分子だけでなくタンパク質に特異的に結合することができる抗体フラグメント（例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメント）をも含むことを意味する。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは、完全な抗体のＦｃフラグメントを欠き、完全な抗体に比べて動物または植物の循環系からより急速に消滅し、完全な抗体よりも組織への非特異的な結合が小さい場合がある（ウォール（Ｗａｈｌ）ら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．第２４巻、ｐ．３１６−３２５、１９８３年）。抗体アゴニストを作製する方法は、例えば国際公開公報第９６／４０２８１号パンフレット；米国特許第５，８１１，０９７号；デング（Ｄｅｎｇ）ら、Ｂｌｏｏｄ  第９２巻（６）、ｐ．１９８１−１９８８（１９９８）；チェン（Ｃｈｅｎ）ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．第５８巻（１６）、ｐ．３６６８−３６７８（１９９８）；ハロップ（Ｈａｒｒｏｐ）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１６１巻（４）、ｐ．１７８６−１７９４（１９９８）；チュー（Ｚｈｕ）ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．第５８巻（１５）、ｐ．３２０９−３２１４（１９９８）；ユーン（Ｙｏｏｎ）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１６０巻（７）、ｐ．３１７０−３１７９（１９９８）；プラト（Ｐｒａｔ）ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．第１１１巻（Ｐｔ２）、ｐ．２３７−２４７（１９９８）；ピタール（Ｐｉｔａｒｄ）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  第２０５巻（２）、ｐ．１７７−１９０（１９９７）；リアウタール（Ｌｉａｕｔａｒｄ）ら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  第９巻（４）、ｐ．２３３−２４１（１９９７）；カールソン（Ｃａｒｌｓｏｎ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２７２巻（１７）、ｐ．１１２９５−１１３０１（１９９７）；タリーマン（Ｔａｒｙｍａｎ）ら、Ｎｅｕｒｏｎ  第１４巻（４）、ｐ．７５５−７６２（１９９５）；ミュラー（Ｍｕｌｌｅｒ）ら、Ｓｔｒｕｃｔｕ
ｒｅ  第６巻（９）、ｐ．１１５３−１１６７（１９９８）；バルツネク（Ｂａｒｔｕｎｅｋ）ら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  第８巻（１）、ｐ．１４−２０（１９９６）；ハーロー（Ｈａｒｌｏｗ）ら、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」（コールド・スプリング・ハーバー研究所出版社（第２版）、１９８８）；ハマーリング（Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ）ら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−ＣｅＩｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ」中のｐ．５６３−６８１（エルゼビア（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）、ニューヨーク、１９８１）（これらはすべて参照によって全体が本願に組み込まれる）。
【００６６】
核酸リガンド（「アプタマー」としても知られている）も、ＬＩＦおよびＢＭＰの活性構造をそれぞれ模倣するアゴニストとして特に有用な場合がある。例えば、アプタマーはＳＥＬＥＸ（指数関数的な富化によるリガンドの系統的進化（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ））法（ツエルク（Ｔｕｅｒｋ）およびゴールド（Ｇｏｌｄ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  第２４９巻、ｐ．５０５−５１０、１９９０年、この文献は参照によって全体が本願に組み込まれる）を使用して選択することができる。ＳＥＬＥＸ法では、大きな核酸分子ライブラリ（例えば１０１５個の異なる分子）を作製し、かつ／または標的分子（この場合はＢＭＰＲ、ＬＩＦＲまたはその一部分）でスクリーニングする。標的分子を、ヌクレオチド配列のライブラリとともに一定期間インキュベートする。その後、混合物中の非結合分子から標的アプタマー分子を物理的に単離するためにいくつかの方法を使用することが可能であり、非結合分子は廃棄することができる。その後、標的分子への親和性が最も高いアプタマーを精製して標的分子から分離し、標的分子に結合することができるアプタマーが十分に富化された新たなライブラリを作製するために、酵素を用いて増幅させることができる。その後、この富化されたライブラリを用いて、選択、分離および増幅の新しいサイクルを開始することができる。この選択、分離および増幅のプロセスを５〜１５サイクル行った後、ライブラリは、標的分子に強固に結合する少数のアプタマーに縮小される。その後、混合物中の個々の分子を単離し、該分子のヌクレオチド配列を決定し、該分子の結合親和性および結合特異性を測定して比較することができる。その後、単離されたアプタマーをさらに洗練して、標的への結合および／またはアプタマー構造に寄与しないあらゆるヌクレオチドを除去する（つまり、アプタマーを結合コアドメインまで切り詰める）ことができる。アプタマー技術の総説としては、例えばジャヤセナ（Ｊａｙａｓｅｎａ）、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．第４５巻、ｐ．１６２８−１６５０、１９９９年を参照のこと。同文献の教示内容は全て参照によって本願に組込まれる。
【００６７】
本質的にいかなる化学化合物もＬＩＦＲまたはＢＭＰＲシグナル伝達活性化剤の候補として使用することができる。ハイスループットスクリーニング法は、そのような候補活性化体の検出用として特に想定される。そのようなハイスループットスクリーニング法は、典型的には多数の潜在的な治療用化合物（例えばリガンドまたはモジュレータ化合物）を含んでいるコンビナトリアル化学ライブラリまたはペプチドライブラリを用意することを必要とする。その後、そのようなコンビナトリアル化学ライブラリまたはリガンドライブラリを１以上の分析法でスクリーニングして、所望の特徴的活性を示すライブラリ構成メンバー（例えば特定の化学種またはサブクラス）を同定する。このようにして同定された化合物は、従来のリード化合物として役立てることもできるし、それ自体を治療薬候補または実際の治療薬として使用することもできる。
【００６８】
コンビナトリアル化学ライブラリは、多くの化学ビルディングブロック（すなわちアミノ酸のような試薬）を組み合わせることにより、化学合成あるいは生物学的合成のいずれかによって生成された種々の化学化合物の集まりである。一例として、直鎖コンビナトリアルライブラリ、例えばポリペプチドまたはペプチドのライブラリは、化合物の所定の長さ（すなわちポリペプチド化合物またはペプチド化合物中のアミノ酸の数）について可能
なあらゆる方法で１セットの化学ビルディングブロックを組み合わせることにより形成される。化学ビルディングブロックをそのように組み合わせて混合することによって、何百万もの化学化合物を合成することができる。
【００６９】
コンビナトリアル化学ライブラリの作製およびスクリーニングは関連技術分野の技術者にはよく知られている。コンビナトリアルライブラリには、限定するものではないがペプチドライブラリが挙げられる（例えば米国特許第５，０１０，１７５号；フルカ（Ｆｕｒｋａ）、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔ．Ｒｅｓ．、第３７巻、ｐ．４８７−４９３、１９９１年；ならびにホートン（Ｈｏｕｇｈｔｏｎ）ら、Ｎａｔｕｒｅ  第３５４巻、ｐ．８４−８８、１９９１年）。多様な化学ライブラリを作製するためのその他の化学手法も使用することができる。多様な化学ライブラリの化学成分の非限定的な例としては、ペプチド（国際公開公報第９１／０１９７３５号パンフレット）、コード化されたペプチド（国際公開公報第９３／２０２４２号パンフレット）、ランダムなバイオオリゴマー（国際公開公報第９２／０００９１号パンフレット）、ベンゾジアゼピン（米国特許第５，２８８，５１４号）、ヒダントイン、ベンゾジアゼピンおよびジペプチドのようなダイバーソマー（ホッブズ（Ｈｏｂｂｓ）ら、１９９３年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  第９０巻、ｐ．６９０９−６９１３）、ビニル性ポリペプチド（ハギハラ（Ｈａｇｉｈａｒａ）ら、１９９２年、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、第１１４巻、ｐ．６５６８）、グルコース骨格を有する非ペプチド性のペプチドミメティック（ヒルシュマン（Ｈｉｒｓｃｈｍａｎｎ）ら、１９９２年、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、第１１４巻、ｐ．９２１７−９２１８）、小化合物のアナログ有機合成ライブラリ（ａｎａｌｏｇｏｕｓ  ｏｒｇａｎｉｃ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｓｍａｌｌ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ）（チェン（Ｃｈｅｎ）ら、１９９４年、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ、第１１６巻、ｐ．２６６１）、オリゴカルバメート（チョ（Ｃｈｏ）ら、１９９３年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  第２６１巻、ｐ．１３０３）かつ／またはペプチジルホスホネート（キャンベル（Ｃａｍｐｂｅｌｌ）ら、１９９４年、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ
第５９巻、ｐ．６５８）、核酸ライブラリ（いずれも上述のオースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）、バーガー（Ｂｅｒｇｅｒ）およびサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）の文献を参照のこと）、ペプチド核酸ライブラリ（米国特許第５，５３９，０８３号）、抗体ライブラリ（例えばヴォーン（Ｖａｕｇｈｎ）ら、１９９６年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  第１４巻（３）、ｐ．３０９−３１４）およびＰＣＴ／ＵＳ９６／１０２８７）、炭水化物ライブラリ（例えばリアン（Ｌｉａｎｇ）ら、１９９６年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２７４巻、ｐ．１５２０−１５２２および米国特許第５，５９３，８５３号）、有機小分子ライブラリ（例えばベンゾジアゼピン、Ｂａｕｍ  Ｃ＆ＥＮ、１９９３年１月１８日、ｐ．３３および米国特許第５，２８８，５１４号；イソプレノイド、米国特許第５，５６９，５８８号；チアゾリジノンおよびメタチアザノン、米国特許第５，５４９，９７４号）；ピロリジン、米国特許第５，５２５，７３５号および同第５，５１９，１３４号；モルホリノ化合物、米国特許第５，５０６，３３７号など）が挙げられる。
【００７０】
コンビナトリアルライブラリ作製用のデバイスは市販されている（例えば、米国ケンタッキー州ルイビル所在のアドバンスドケムテック（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｔｅｃｈ）の３５７ＭＰＳ、３９０ＭＰＳ；米国マサチューセッツ州ウォーバーン所在のレイニン（Ｒａｉｎｉｎ）のＳｙｍｐｈｏｎｙ（ＴＭ）；米国カリフォルニア州フォスターシティー所在のアプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の４３３Ａ；米国マサチューセッツ州ベッドフォード所在のミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の９０５０Ｐｌｕｓ）。さらに、多くのコンビナトリアルライブラリが市販されている（例えば、米国ニュージャージー州プリンストン所在のコムジェネックス（ＣｏｍＧｅｎｅｘ）；ロシア国モスクワ所在のアシネックス（Ａｓｉｎｅｘ）；米国ミズーリ州セントルイス所在のトリポス社（Ｔｒｉｐｏｓ，Ｉｎｃ．；ロシア国モスクワ所在のケムスター株式会社（ＣｈｅｍＳｔａｒ，Ｌｔｄ．）；米国ペンシルバニア州エクストン所在の３Ｄ
ファーマシューティカルズ（３Ｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）；米国メリーランド州コロンビア所在のマーテック・バイオサイエンシズ（Ｍａｒｔｅｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）など）。
【００７１】
ＬＩＦＲおよびＢＭＰＲシグナル伝達活性化剤の候補は、結合分析を使用して、ＬＩＦＲまたはＢＭＰＲに対する、またはＬＩＦＲもしくはＢＭＰＲシグナル伝達経路の下流成分に対する結合能力について最初にスクリーニングし、結合する活性化体候補を次いで機能分析でスクリーニングすることができる。適切な結合分析には、蛍光を用いるサーマルシフトアッセイ（米国ペンシルバニア州エクストン所在の３Ｄファーマシューティカルズ社（３−Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，  Ｉｎｃ．）、３ＤＰ）が挙げられる（パントリアノ（Ｐａｎｔｏｌｉａｎｏ）らの米国特許第６，０２０，１４１号および６，０３６，９２０号に記載；さらにＪ．ジマーマン（Ｊ．Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ）、２０００年、Ｇｅｎ．Ｅｎｇ．Ｎｅｗｓ  第２０巻（８）も参照のこと）。
【００７２】
ＬＩＦＲおよびＢＭＰＲシグナル伝達活性化剤の候補を機能に関してスクリーニングする方法の一例は、下記の工程：
（ｉ）  腫瘍性幹細胞または腫瘍前駆細胞のうち少なくともいずれか一方のサンプルを単離する工程；
（ｉｉ）  前記腫瘍性幹細胞または腫瘍前駆細胞のうち少なくともいずれか一方のアリコートを適切な容器に入れる工程；
（ｉｉｉ）  腫瘍性幹細胞または腫瘍前駆細胞のうち少なくともいずれか一方のアリコートを、特定の期間、特定の条件の下で候補作用薬に曝露する工程；ならびに
（ｉｖ）  腫瘍性幹細胞または腫瘍前駆細胞のうち少なくともいずれか一方への形態学的、生理学的、および遺伝学的変化をスクリーニングする工程
を含む。
【００７３】
形態学的、生理学的、および遺伝学的変化には、生存、自己複製、増殖および分化のうち少なくともいずれかの状態に関するスクリーニングが含まれる。使用することができる分析法の一例は、参照により全体が本願に組込まれる米国特許出願第２００５／０１１２５４６号に記載の神経コロニー形成細胞法（Ｎｅｕｒａｌ  Ｃｏｌｏｎｙ  Ｆｏｒｍｉｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ａｓｓａｙ）（ＮＣＦＣＡ）である。ＮＣＦＣＡは、いずれも増殖力を有し浮遊培養法（ニューロスフェア分析法）で球体を形成するかまたはＮＣＦＣＡにおいてコロニーを形成することができる幹細胞と前駆細胞とを、区別することができる。簡潔に述べると、腫瘍から得られた初代細胞または培養細胞を、マイトジェンであるＦＧＦ２およびＥＧＦを含んだ無血清３Ｄコラーゲンマトリックスに播種する。この培養状態下では、増殖力を有する幹細胞および前駆細胞のみが分裂して輪郭の明確なコロニーを形成し、このコロニーの大きさを１〜４週後に計測することができる。コロニーの大きさの違いは元の細胞の増殖力と正に相関し、幹細胞および前駆細胞の存在頻度の計測値を提供する。この条件下では、直径２ｍｍを越えるコロニーだけが幹細胞に由来するものであり、直径２ｍｍ未満のものは前駆細胞に由来するものである。幹細胞および前駆細胞の、意味のある、かつ正確な計測値から、これら２種類の細胞の存在頻度を変化させる遺伝的・後成的な要素をスクリーニングすることが可能になる。
【００７４】
レセプタＬＩＦＲおよびＢＭＰＲのスクリーニングに使用可能な、生存、自己複製、増殖および分化のうち少なくともいずれかの分析法の別例は、以下のように実施される。最初に、参照により本願に組込まれるグリッティ（Ｇｒｉｔｔｉ）ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．（１９９６）第１６巻（３）、ｐ．１０９−１１００）に記載のように、分散させた多形膠芽腫腫瘍由来の細胞を、マイトジェンであるＦＧＦ２（繊維芽細胞成長因子２）およびＥＧＦ（上皮成長因子）を含んだ無血清培地中に播種する。この培養系は、初代腫瘍培養物から分化中の細胞／分化細胞を選択除去し、指数関数的に増殖拡大して初代ニュー
ロスフェアを形成できる腫瘍性幹細胞だけを残す。この初代ニューロスフェアを個々に分散させ、マイクロタイタープレート中ＥＧＦおよびＦＧＦ２の存在下、クローン化しうる密度で無血清培地中に再度播種することができる。ＬＩＦＲおよびＢＭＰＲシグナル伝達活性化剤の候補をマイクロタイタープレートの各ウェルに加え、該プレートを、未処置の細胞が十分に増殖可能な期間インキュベートする。インキュベーションを終えたらニューロスフェアを再び個々に分散させ、上記プロセスを、ＬＩＦＲおよびＢＭＰＲシグナル伝達活性化剤候補の存在下でさらに所定の継代数だけ繰り返すことができる。所定の継代数を終えたら、顕微鏡を使用してニューロスフェアの存在についてマイクロタイタープレートのウェルを検査し、ニューロスフェアの数および大きさを測定し、幹細胞および前駆細胞に対するＬＩＦＲまたはＢＭＰＲシグナル伝達活性化剤候補の作用の尺度を得る。各継代の終了時の幹細胞および前駆細胞の数を決定するために実施例１の数学的アルゴリズムを使用することができる。連続的に継代された未処置の細胞との比較により、ＬＩＦＲおよびＢＭＰＲシグナル伝達活性化剤候補（例えば幹細胞および前駆細胞の増殖特性を減弱化する作用薬）の同定が可能となる。その後、ＬＩＦＲおよびＢＭＰＲシグナル伝達活性化剤候補を、分化した細胞または分化中の細胞で分析し、その候補作用薬の作用が全般的な細胞毒性ではなく腫瘍性幹細胞に特異的かどうかを判断することができる。
【００７５】
ＬＩＦＲおよびＢＭＰＲのシグナル伝達活性化剤としては、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）分子、リボザイム、あるいはアンチセンスオリゴヌクレオチドも含まれうる。そのような分子は、ＬＩＦＲおよびＢＭＰＲシグナル伝達のインヒビターの発現を低減し、したがってＬＩＦＲおよびＢＭＰＲシグナル伝達を活性化する作用を有しうる。
【００７６】
本開示のＬＩＦＲおよびＢＭＰＲシグナル伝達活性化剤は、腫瘍性幹細胞または腫瘍前駆細胞におけるＬＩＦＲまたはＢＭＰＲを介したシグナル伝達を増大させるのに役立つ。従って、本開示は、腫瘍性幹細胞または腫瘍前駆細胞におけるＬＩＦＲまたはＢＭＰＲを介したシグナル伝達を増大させる方法であって、腫瘍性幹細胞または腫瘍前駆細胞を、ＬＩＦＲおよびＢＭＰＲのうち少なくともいずれか一方のシグナル伝達活性化剤と、腫瘍性幹細胞または腫瘍前駆細胞におけるＬＩＦＲまたはＢＭＰＲを介したシグナル伝達を増大させるのに十分な時間および条件の下で接触させることを含む方法を提供する。ＬＩＦＲおよびＢＭＰＲのうち少なくともいずれか一方のシグナル伝達活性化剤は、本明細書に開示されたようなＬＩＦ調製物およびＢＭＰ調製物のうち少なくともいずれか一方と組み合わせて使用されてもよい。
【００７７】
本開示はまた、過度な細胞増殖または誤制御された細胞増殖を特徴とする疾患または障害を治療または予防するための方法を提供する。該方法は、治療上有効な量の、ＬＩＦＲおよびＢＭＰＲのうち少なくともいずれか一方のシグナル伝達活性化剤を、そのような過度な細胞増殖または誤制御された細胞増殖が生じていると思われる対象または組織に投与することを含む。好ましくは、過度な細胞増殖を特徴とする障害は脳障害であり、より好ましくは脳腫瘍、例えば限定するものではないが聴神経腫、腺腫、星状細胞腫、若年性毛様細胞性星状細胞腫、脳幹部神経膠腫、脊索腫、脈絡叢、頭蓋咽頭腫、脳室上衣腫、神経節膠腫、神経節膠腫神経細胞、多形膠芽腫（ＧＢＭ）、神経膠腫、リンパ腫、髄芽細胞腫、髄膜腫、乏突起膠腫、視神経膠腫、下垂体部腫瘍、松果体部腫瘍、あるいは松果体芽腫である。ＬＩＦＲおよびＢＭＰＲのうち少なくともいずれか一方のシグナル伝達活性化剤は、本明細書に開示されたようなＬＩＦ調製物およびＢＭＰ調製物のうち少なくともいずれか一方と組み合わせて（同時にまたは時を異にして）投与することも可能である。
【００７８】
別の態様では、本開示は、腫瘍の成長を低減する方法であって、前記腫瘍に、治療上有効な量のＬＩＦＲシグナル伝達活性化剤およびＢＭＰＲシグナル伝達活性化剤のうち少なくともいずれか一方を投与することを含む方法、を提供する。
【００７９】
さらなる態様では、本開示は、腫瘍中の腫瘍性幹細胞および腫瘍前駆細胞のうち少なくともいずれか一方の数を減少させる方法であって、腫瘍を、ＬＩＦＲシグナル伝達活性化剤およびＢＭＰＲシグナル伝達活性化剤のうち少なくともいずれか一方と接触させることを含む方法を提供する。理論または仮説によって限定されるものではないが、腫瘍に投与される場合、ＬＩＦＲシグナル伝達活性化剤およびＢＭＰＲシグナル伝達活性化剤は、ＬＩＦまたはＢＭＰを介したシグナル伝達の増大をもたらし、その結果として腫瘍性幹細胞または腫瘍前駆細胞の次の特性、例えば限定するものではないが細胞の生存、自己複製、対称分裂、増殖または分化のうち少なくともいずれかの特性の１つ以上を調節すると考えられる。特に、ＬＩＦＲまたはＢＭＰＲを介したシグナル伝達の増大が幹細胞および前駆細胞の増殖特性を低下させ、特に増殖中の幹細胞または前駆細胞が示す対称分裂の可能性を低下させることによって該細胞の数が低減すると考えられる。従って、別の態様では、本開示は、腫瘍性幹細胞または腫瘍前駆細胞が対称分裂を行う可能性を低減する方法であって、腫瘍性幹細胞または腫瘍前駆細胞を、ＢＭＰＲシグナル伝達活性化剤およびＬＩＦＲシグナル伝達活性化剤のうち少なくともいずれか一方と接触させることを含む方法、を提供する。
【００８０】
本開示のいくつかの実施形態では、内在する腫瘍性幹細胞および腫瘍前駆細胞がインビボで制御されるように、ＬＩＦＲおよびＢＭＰＲのうち少なくともいずれか一方のシグナル伝達活性化剤が対象に直接投与されてもよい。本開示の代替実施形態では、腫瘍性幹細胞および腫瘍前駆細胞を、本開示の作用薬とインビトロで接触させる場合もある。
【００８１】
腫瘍などの対象に、ＬＩＦＲシグナル伝達活性化剤およびＢＭＰＲシグナル伝達活性化剤のうち少なくともいずれか一方を、ＬＩＦＲシグナル伝達活性化剤およびＢＭＰＲシグナル伝達活性化剤のうち少なくともいずれか一方を含む医薬組成物とともに投与する方法については、「投与および医薬組成物」と題した項で後述する。
【００８２】
投与および医薬組成物
上述のように、過度な細胞増殖または誤制御された細胞増殖を特徴とする疾病または障害を治療または予防するために、治療上有効な量のＬＩＦ調製物、ＢＭＰ調製物、ＬＩＦＲシグナル伝達活性化剤およびＢＭＰＲシグナル伝達活性化剤のうち少なくともいずれかを、とりわけ、対象または組織に投与することができる。例えば、一実施形態では、治療上有効な量のＢＭＰ−４調製物またはＢＭＰ−４ミメティックを、ＧＢＭに罹患しているヒト患者に投与する。上記の腫瘍およびがんに加えて、本明細書に開示された方法によって治療または予防され得るその他のがんには、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫および白血病が挙げられるがこれらに限定はされない。そのようながんのより具体的な例としては、扁平上皮がん、肺がん（小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺の腺癌および肺の扁平上皮癌を含む）、腹膜のがん、肝細胞がん、消化器がんもしくは胃がん（胃腸のがんを含む）、膵臓がん、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がん、膀胱がん、ヘパトーマ、乳がん、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜もしくは子宮の癌腫、唾液腺癌腫、腎臓がん、肝臓がん、前立腺がん、陰門がん、黒色腫、甲状腺がん、肝癌および様々なタイプの頭頸部がん、ならびにＢ細胞リンパ腫（例えば、低悪性度／濾胞性の非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ；中悪性度／濾胞性のＮＨＬ；中悪性度の播種性ＮＨＬ；高悪性度の免疫芽細胞性ＮＨＬ；高悪性度のリンパ芽球性ＮＨＬ；高悪性度のバーキット型（ｓｍａｌｌ  ｎｏｎ−ｃｌｅａｖｅｄ  ｃｅｌｌ）ＮＨＬ；巨大腫瘤病変ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；ＡＩＤＳ関連リンパ腫；およびヴァルデンストレームマクログロブリン血症）；慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；ヘアリー・セル白血病；慢性骨髄芽球白血病；ならびに、移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）がある。
【００８３】
一実施形態では、ＬＩＦ調製物、ＢＭＰ調製物、ＬＩＦＲシグナル伝達活性化剤および
ＢＭＰＲシグナル伝達活性化剤のうち少なくともいずれかを、医薬組成物の形態で対象に投与する。従って、別の態様では、本開示は、過度な細胞増殖または誤制御された細胞増殖を特徴とする疾病または障害の治療または予防に有用な医薬組成物を提供する。本開示の医薬組成物は、ＬＩＦ調製物、ＢＭＰ調製物、ＬＩＦＲシグナル伝達活性化剤およびＢＭＰＲシグナル伝達活性化剤から成る群から選択された少なくとも１つの作用薬を含有する。例えば、一実施形態では、治療上有効な量のＢＭＰ−４調製物を含む医薬組成物がＧＢＭの治療に提供される。別の実施形態では、治療上有効な量のＢＭＰ−２調製物を含む医薬組成物がＧＢＭの治療に提供される。別の実施形態では、治療上有効な量のＢＭＰ−５調製物を含む医薬組成物がＧＢＭの治療に提供される。別の実施形態では、治療上有効な量のＢＭＰ−６調製物を含む医薬組成物がＧＢＭの治療に提供される。別の実施形態では、治療上有効な量のＢＭＰ−７調製物を含む医薬組成物がＧＢＭの治療に提供される。別の実施形態では、治療上有効な量のＢＭＰ−８ｂ調製物を含む医薬組成物がＧＢＭの治療に提供される。
【００８４】
別の態様では、本開示は、過度な細胞増殖または誤制御された細胞増殖を特徴とする疾病または障害の治療または予防のための医薬の製造における、ＬＩＦ調製物、ＢＭＰ調製物、ＬＩＦＲシグナル伝達活性化剤、およびＢＭＰＲシグナル伝達活性化剤のうち少なくともいずれかの使用方法を開示する。例えば、多形膠芽腫の治療のための医薬の製造における、ＢＭＰ−４調製物またはＢＭＰ−４ミメティックの使用について、具体的に検討する。
【００８５】
本開示の医薬組成物は単一の作用薬を含んでいてもよいし、あるいは複数の前述の作用薬の任意の組み合わせ（例えばＬＩＦおよびＢＭＰ−４の組み合わせ）を含んでいてもよい。さらに、医薬組成物は、特定の種類の２以上の作用薬、例えば２つの異なるＬＩＦ調製物、または２つの異なるＢＭＰＲシグナル伝達活性化剤（例えばＢＭＰ−２およびＢＭＰ−４）を含んでいてもよい。
【００８６】
医薬組成物は少なくとも１つの医薬として許容可能な担体を含むことが好ましい。そのような医薬組成物では、ＬＩＦ調製物、ＢＭＰ調製物、ＬＩＦＲシグナル伝達活性化剤およびＢＭＰＲシグナル伝達活性化剤のうち少なくともいずれかが「活性化合物」を形成する。本明細書で使用されるように、「医薬として許容可能な担体」という言葉は、薬務行政に適合した溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌物質および抗真菌物質、等張剤および吸収遅延剤などを含んでいる。追加の活性化合物を組成物に組み入れることもできる。医薬組成物はその意図した投与経路に適合するように製剤化される。投与経路の例として、非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、経口（例えば吸入）、経皮（局所）、経粘膜、および直腸内投与が挙げられる。非経口、皮内、または皮下への適用に使用される溶液または懸濁物は、下記成分、すなわち、注射用蒸留水、生理食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたはその他の合成溶剤のような無菌の希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンのような抗菌物質；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムのような酸化防止剤；エチレンジアミン四酢酸のようなキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩のようなバッファ、ならびに塩化ナトリウムまたはデキストロースのような張度調整のための作用薬；を含むことができる。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムのような酸または塩基で調整することができる。非経口の調製物は、ガラス製またはプラスチック製のアンプル、ディスポーザブルシリンジまたは多人数用バイアル中に入れることができる。
【００８７】
過度な細胞増殖または誤制御された細胞増殖が生じていると思われる組織または細胞を、ＬＩＦ調製物、ＢＭＰ調製物、ＬＩＦＲシグナル伝達活性化剤およびＢＭＰＲシグナル伝達活性化剤のうち少なくともいずれかによりインビトロで治療する実施形態において、ＬＩＦ調製物、ＢＭＰ調製物、ＬＩＦＲシグナル伝達活性化剤およびＢＭＰＲシグナル伝
達活性化剤のうち少なくともいずれかは、医薬組成物の形態であってもよいし、そうでなくてもよいことに注意されたい。
【００８８】
本明細書において使用されるように対象とは、ヒトおよびヒト以外の霊長類（例えばゴリラ、マカク、マーモセット）、家畜動物（例えばヒツジ、畜牛、ウマ、ロバ、ブタ）、コンパニオン・アニマル（例えばイヌ、ネコ）、実験動物（例えばマウス、ウサギ、ラット、モルモット、ハムスター）、捕獲された野生動物（例えばキツネ、シカ）、および本開示の作用薬から利益を享受しうるその他の任意の生物を指す。ここで述べる作用薬から利益を享受し得る動物の種類に制限はない。本開示の中で最も好ましい対象はヒトである。ヒトかヒト以外の生物かどうかにかかわらず、対象を、患者、個体、動物、宿主またはレシピエントと称する場合がある。
【００８９】
注射可能な使用に適した医薬組成物には、無菌の水溶液（水に可溶な場合）または分散液、あるいは注射可能な無菌の溶液または分散液を即席に調製するための無菌の散剤が挙げられる。静脈内投与については、適切な担体として生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（ＴＭ）（米国ニュージャージー州パーシッパニー所在のバスフ（ＢＡＳＦ））またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。いずれの場合にも、組成物は無菌でなければならず、簡単にシリンジ操作ができる程度の流動性を有するべきである。組成物は製造および貯蔵の条件下で安定しているべきであり、細菌および真菌のような微生物の混入に対抗した状態に維持されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、多価アルコール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）およびこれらの適切な混合物を含んでいる溶媒または分散媒でありうる。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティング剤の使用により、分散液の場合は要求される粒度を維持することにより、また界面活性剤の使用により、維持することができる。微生物の活動の防止は、様々な抗菌性物質および抗真菌物質（例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなど）によって達成することができる。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば糖、多価アルコール例えばマンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムを含むことが望ましいだろう。注射可能な組成物の吸収の延長は、組成物中に吸収を遅延させる作用薬（例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）を含めることにより成される場合がある。
【００９０】
無菌注射剤溶液は、必要に応じて上に列挙された成分を１つまたは組み合わせて含有する適切な溶媒中に、必要な量の活性化合物を組み入れた後、ろ過滅菌することにより調製することができる。一般に、分散液は、基本の分散媒と、上に列挙された成分からの必要なその他の成分とを含んでいる無菌のビヒクルに、活性化合物を組み入れることにより調製される。無菌注射剤溶液を調製するための無菌の散剤の場合、好ましい調製法は、あらかじめろ過滅菌された、有効成分と任意の所望の付加成分との溶液から、有効成分および所望の付加成分の粉末を生じる、真空乾燥および凍結乾燥である。
【００９１】
経口組成物は一般に不活性の希釈剤または食用に適した担体を含んでいる。経口による治療投与の目的では、活性化合物を賦形剤と合わせて、錠剤、トローチ剤またはカプセル剤（例えばゼラチン・カプセル剤）の形態で使用することができる。経口組成物は、口内洗浄液として使用するための流動性の担体を用いて調製することもできる。薬学的に適した結着剤、または補助材のうち少なくともいずれか一方を、組成物の一部として含めることができる。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などは、次の成分、すなわち微結晶性セルロース、トラガカントゴムまたはゼラチンのような結合剤；デンプンまたはラクトースのような賦形剤、アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ（登録商標）またはトウモロコシデンプンのような崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムまたはＳｔｅｒｏｔｅｓ（登録商標）のような潤滑剤；コロイド状二酸化ケイ素のような流動促進剤；スクロースまたはサッカリンのような甘味料；あるいはペパーミント、サリチル酸メチルまたはオレンジ香味料のよ
うな香料、あるいは同様の性質の化合物のうちの任意のものを含むことができる。
【００９２】
吸入による投与については、化合物は、適切な噴射剤（例えば二酸化炭素のようなガス）の入った加圧容器またはディスペンサ、あるいは噴霧器から、エアゾルスプレーの形態で送達される。
【００９３】
経粘膜的手段または経皮的手段によって全身投与することも可能である。経粘膜投与または経皮投与の場合、浸透すべき障壁に適した浸透剤を製剤中に使用する。そのような浸透剤は当技術分野で一般に知られており、例えば、経粘膜投与については界面活性剤、胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、鼻内噴霧剤または坐剤の使用により遂行することができる。経皮投与については、活性化合物を、当技術分野で一般に知られているような軟膏剤、サルベ、ゲル剤あるいはクリーム剤に製剤化する。化合物を、直腸送達のために、坐剤（例えばココアバターおよび他のグリセリドのような従来の坐剤基剤を用いる）または停留浣腸剤の形態に調製することもできる。
【００９４】
一実施形態では、活性化合物は、植込剤およびマイクロカプセル化送達システムなどの制御放出製剤のように、化合物が身体から急速に消失するのを防ぐ担体を用いて調製される。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸のような生分解性で生体適合性のポリマーを使用することができる。そのような製剤を調製する方法は当業者には明白であろう。材料も、アルザコーポレイション（Ａｌｚａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）およびノバ・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド（Ｎｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，  Ｉｎｃ．）から商業的に入手することができる。リポソーム懸濁液（細胞特異抗原に対するモノクローナル抗体を用いて標的を感染細胞に設定したリポソームなど）も、医薬として許容可能な担体として使用することができる。これらは、例えば米国特許第４，５２２，８１１号に述べられているように、当業者に周知の方法によって調製することができる。
【００９５】
投与し易く、かつ投与量を均一にするために経口または非経口の組成物を投与量単位の形態に製剤化すると有利である。本明細書で使用される場合、投与量単位の形態とは、治療すべき対象についての単一量として適した物理的に個別の単位を指し；各々の単位は、所望の治療効果を生じるために計算された所定量の活性化合物を、必要な製薬担体とともに含んでいる。
【００９６】
そのような化合物の毒性および治療上の有効性は、例えばＬＤ５０（集団の５０％が死亡する用量）およびＥＤ５０（集団の５０％に治療上有効な用量）を決定するための、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手法により決定することができる。毒性作用および治療効果の間の用量比が治療係数であり、治療係数はＬＤ５０／ＥＤ５０比として表すことができる。高い治療係数を示す化合物が好ましい。毒性副作用を示す化合物を使用することは可能であるが、非感染細胞が損傷する可能性を最小限にすることによって副作用を低減するために、そのような化合物の標的を罹患組織の部位に設定する送達システムを設計するように配慮すべきである。
【００９７】
細胞培養分析および動物実験から得られたデータを、ヒトで用いる用量範囲を策定するのに使用することができる。そのような化合物の用量は、毒性をほとんどまたは全く伴わないＥＤ５０を含めた血中濃度範囲にあることが好ましい。用量は、この範囲内で、使用される剤形および利用される投与経路に依存して変わりうる。本開示の方法において使用される任意の化合物について、治療上有効な用量は、最初に細胞培養分析から推測することができる。用量は、細胞培養で決定されるようなＩＣ５０（すなわち症状の最大限の抑制を２分の１達成する試験化合物の濃度）を含む血漿中濃度範囲を達成するように動物モデルで策定することができる。そのような情報は、ヒトでの有用な用量をより正確に決定
するために使用することができる。血漿中濃度は、例えば高速液体クロマトグラフィによって測定することができる。
【００９８】
本明細書において定義される場合、治療上有効な量のタンパク質またはポリペプチド（すなわち有効な用量）は、体重１ｋｇあたり約０．００１〜３０ｍｇ、好ましくは体重１ｋｇあたり約０．０１〜２５ｍｇ、より好ましくは体重１ｋｇあたり約０．１〜２０ｍｇ、より一層好ましくは体重１ｋｇあたり約１〜１０ｍｇ、２〜９ｍｇ、３〜８ｍｇ、４〜７ｍｇ、または５〜６ｍｇの範囲にありうる。タンパク質またはポリペプチドを、１週間に１回として、約１〜１０週間、好ましくは約２〜８週間、より好ましくは約３〜７週間、より一層好ましくは約４、５または６週間投与することができる。当業者には当然のことであるが、一定の要因、例えば限定するものではないが疾病または障害の重症度、以前の治療、対象の全体的な健康状態および／または対象の年齢、ならびにその他の疾病の存在などが、対象を有効に治療するのに必要な用量および時期に影響しうる。さらに、治療上有効な量のタンパク質、ポリペプチドまたは抗体を用いた対象の治療は、単回治療を含むものでもよいが、好ましくは一連の複数の治療を含むこともできる。
【００９９】
本開示の実施形態において、脳の増殖性障害、例えばＧＢＭが治療される場合、血液脳関門（ＢＢＢ）および血液腫瘍関門（ＢＴＢ）のうち少なくともいずれか一方を乗り越えるために、医薬組成物および投与方法のうち少なくともいずれか一方を調整することが望ましい。ＢＢＢを越えて医薬組成物を送達する方法は、当技術分野で周知である。例えば、参照により全体が本願に組込まれる、ミスラ（Ｍｉｓｒａ）ら、２００３年、Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  第６巻、ｐ．２５２−２７３を参照のこと。適切な方法としては、限定するものではないが、脳内移植、脳室内（ＩＣＶ）注入、またはＣＥＤ（ｃｏｎｖｅｃｔｉｏｎ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）法のような経頭蓋的脳内薬物送達法が挙げられる。脳内移植は、例えば、ＬＩＦ調製物、ＢＭＰ調製物、ＬＩＦＲシグナル伝達活性化剤およびＢＭＰＲシグナル伝達活性化剤のうち少なくともいずれかを含浸させた、ポリマー製ビーズ（ヘパリンアクリルビーズなど）またはポリマー製ウエハ（ポリフェプロサン（ｐｏｌｉｆｅｐｒｏｓａｎ）２０など）を使用して実行可能である。例えば、脳内移植は、ＢＭＰ−４を装荷したヘパリンアクリルビーズを腫瘍内または切除腔内に定位的に注入することにより実行可能である。
【０１００】
本開示の医薬組成物、例えばＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７またはＢＭＰ−８ｂ調製物（またはこれらの組み合わせ）を含有する医薬組成物を、上記の方法を使用して未切除の腫瘍に投与してもよいし、あるいは、医薬組成物を腫瘍切除後に切除腔に投与してもよい。いくつかの実施形態では、医薬組成物を最初に腫瘍内に投与し、次に、腫瘍切除後に術後投与する。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、ＬＩＦ調製物、ＢＭＰ調製物、ＬＩＦＲシグナル伝達活性化剤およびＢＭＰＲシグナル伝達活性化剤のうち少なくともいずれかが、血液脳関門（ＢＢＢ）レセプタ仲介輸送（ＲＭＴ）システムの構成分子上の外表面エピトープと結合することができる分子と会合している。この方法では、ＬＩＦ調製物、ＢＭＰ調製物、ＬＩＦＲシグナル伝達活性化剤およびＢＭＰＲシグナル伝達活性化剤のうち少なくともいずれかは、内在性のＲＭＴシステムを使用してＢＢＢを越えて輸送されうる。例えば、ＬＩＦまたはＢＭＰの調製物をトランスフェリンレセプタ（ＴｆＲ）に対するモノクローナル抗体（ＯＸ２６など）と結合させて、該結合体の膜透過輸送を可能にする。例えば、参照により全体が本願に組み込まれるパルドリッジ（Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ）、Ｎｅｕｒｏｒｘ  第２巻（１）、ｐ．３−１４（２００５）を参照されたい。例えばＯＸ２６との結合によってナノ粒子がＢＢＢを超えるようにすることも可能であり、そのようなナノ粒子を、ＬＩＦ調製物、ＢＭＰ調製物、ＬＩＦＲシグナル伝達活性化剤およびＢＭＰＲシグナル伝達活性化剤のうち少なくともいずれかと結合させてもよい。例えば、参照により全体が本願に組
み込まれるオリヴィエ（Ｏｌｉｖｉｅｒ）ら、Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．（２００２）第１９巻（８）、ｐ．１１３７−４３を参照されたい。さらに、例えばＯＸ２６に結合させたリポソームを用いて、カプセル封入されたＬＩＦ調製物、ＢＭＰ調製物、ＬＩＦＲシグナル伝達活性化剤およびＢＭＰＲシグナル伝達活性化剤のうち少なくともいずれかを、ＢＢＢを越えて送達させることもできる。参照により全体が本願に組み込まれるヒュイラー（Ｈｕｗｙｌｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．（１９９６）第９３巻（２４）、ｐ．１４１６４−９を参照されたい。さらに、ＢＢＢおよびＢＴＢを破壊する作用薬および処置法を用いて、ＬＩＦ調製物、ＢＭＰ調製物、ＬＩＦＲシグナル伝達活性化剤またはＢＭＰＲシグナル伝達活性化剤のうち少なくともいずれかを、ＢＢＢまたはＢＴＢに通過させることもできる。例えば、血管作用薬ブラジキニンの頸動脈内注入は、脳腫瘍毛細血管の透過性を選択的に増大させることができる。参照により全体が本願に組み込まれるマツカド（Ｍａｔｓｕｋａｄｏ）ら、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．（１９９８）第７９２巻（１）、ｐ．１０−５を参照されたい。
【０１０２】
一実施形態では、ＬＩＦおよびＢＭＰ調製物、またはポリペプチド性およびペプチド性のＬＩＦＲもしくはＢＭＰＲシグナル伝達活性化剤、または、ＬＩＦＲもしくはＢＭＰシグナル伝達活性化剤であるリボザイム、ＲＮＡｉ分子およびアンチセンス分子、をコードする核酸分子をベクターに挿入し、遺伝子療法ベクターとして使用する。遺伝子療法ベクターは、例えば静脈注射、局所投与（米国特許第５，３２８，４７０号を参照）、または定位注入（例えば、いずれも参照により全体が本願に組み込まれるチェン（Ｃｈｅｎ）ら（１９９４）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  第９１巻、ｐ．３０５４−３０５７；ボーグ（Ｖｏｇｅｓ）ら（２００３）、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．第５４巻、ｐ．４７９−４８７を参照）によって対象に送達することができる。遺伝子療法ベクターの医薬品製剤は、許容可能な希釈剤中またはカプセル材料（ベクターを含むリポソームなど）中に入った遺伝子療法ベクターを含むものでもよいし、あるいは遺伝子送達手段が埋め込まれた遅延放出マトリックスからなるものでもよい。別例として、完全な遺伝子送達ベクターが組換え細胞からそのまま生産される、例えばレトロウイルス・ベクターの場合、医薬品製剤は、遺伝子送達システムを生産する１以上の細胞を含むことができる。一実施形態では、ＬＩＦおよびＢＭＰ調製物をコードする、またはポリペプチド性およびペプチド性のＬＩＦＲもしくはＢＭＰＲシグナル伝達活性化剤をコードする核酸分子は、参照により全体が本願に組み込まれるコンシグリオ（Ｃｏｎｓｉｇｌｉｏ）ら、Ｐｒｏｃ
Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、２００４年１０月１２日、第１０１巻（４１）、ｐ．１４８３５−１４８４０に述べられているように、レンチウイルスベクターによって哺乳類のがん性神経幹細胞に導入される。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、本開示による単一の活性化合物、例えば単一のＬＩＦ調製物または単一のＢＭＰ調製物が投与される。他の実施形態では、複数の活性化合物、例えば２つの異なるＬＩＦ調製物；またはＬＩＦ調製物とＢＭＰ調製物；またはＢＭＰＲシグナル伝達活性化剤と２つの異なるＢＭＰ調製物、が同時投与される。さらに、本開示の活性化合物は、化学療法剤、放射線増感剤、放射線治療薬などのような他の薬剤と同時投与されることもある。本明細書で「同時投与」という場合、同一の製剤として、または２つの異なる製剤として、同一経路または異なる経路で同時に投与すること、あるいは同一経路または異なる経路で連続的に投与することを意味する。本明細書で「連続的に」投与するという場合、２種類の作用薬および／または医薬組成物の投与の間の時差が、数秒、数分、数時間または数日であることを意味する。作用薬および／または医薬組成物の同時投与は任意の順序で行われうる。
【０１０４】
本明細書に開示された治療方法および医薬組成物は、他の治療、たとえば化学療法（カルマスティン、シスプラチン、パクリタクセル、テモゾロミド、ＰＣＶ（プロカルバジン、ロムスチンおよびビンクリスチン）およびＩＬ１３−ＰＥ３８ＱＱＲなど）、放射線治
療薬（放射標識抗体または放射標識核酸リガンドなど）を用いた治療、放射線療法、および手術（腫瘍の切除／減量手術など）などと併用されてもよい。例えば、ＢＭＰ−４調製物を、ＧＢＭ治療用の腫瘍切除手術および放射線治療後の化学療法剤とともに同時投与してもよい。これらの付加的な治療は、本明細書に開示された方法による治療の前、治療中、または治療後のうちいずれにおいても使用できる。
【０１０５】
実施例
本開示について、以下の非限定的な実施例によりさらに説明する。実施例１９−２３については、列挙された結果を得るために使用されたプロトコールが実施例２４−２９に提示されていることに注意されたい。
【０１０６】
実施例１：ヒト胎児神経幹細胞の連続継代および数学的モデル化に基づく幹細胞と前駆細胞の存在頻度の分析
連続的に継代されたニューロスフェア培養物中に存在する神経幹細胞の数および神経前駆細胞の数を計算するためにアルゴリズムを導き出した。このアルゴリズムにために、すべての細胞を以下の３つのカテゴリーに分類する。
【０１０７】
１．幹細胞は、（ａ）増殖が可能、（ｂ）長期間にわたる自己複製が可能、（ｃ）多くの子孫を生じることが可能で、かつ（ｄ）その幹細胞が得られた組織のすべての種類の細胞を生じる能力を有する、未分化細胞として定義する。
【０１０８】
２．前駆細胞は、（ａ）増殖が可能で、（ｂ）限定的な自己複製能力を有し、（ｃ）限られた数の子孫を生じることが可能で、かつ（ｄ）少なくとも１種類の子孫を生じる能力を有する、未分化細胞として定義する。
【０１０９】
３．分化細胞は、増殖能力が限定されているかまたは増殖能力がなく、細胞系統特異的マーカーおよび成熟した機能特性のいずれをも発現している細胞として定義する。
用語「幹細胞」およびＮＳＣは本明細書中で互換的に使用されることがある。同様に、用語「前駆細胞」およびＮＰＣも本明細書中で互換的に使用されることがある。このアルゴリズムについて説明する際に、以下のいくつかの仮定が為される。
【０１１０】
１．ニューロスフェアは、幹細胞、前駆細胞および分化細胞で構成される。
２．すべてのニューロスフェアは単一の幹細胞または単一の前駆細胞のいずれかから成長する。
【０１１１】
３．幹細胞の寿命は無限であり、前駆細胞の寿命は有限である。有限の寿命を継代数ｌと定義する。
４．幹細胞は常にニューロスフェアを形成可能であり、前駆細胞はその寿命の終わりに達していなければニューロスフェアを形成する。
【０１１２】
５．各ニューロスフェアは、合計ｃ個の細胞を有し、これらの細胞は２つの可能な組成のうちの１つである。可能な組成とは、
ａ．単一の幹細胞に由来する各ニューロスフェアにおいて、組成は幹細胞ｓ個、前駆細胞ｐ個、残りは分化細胞であり；
ｂ．単一の前駆細胞に由来する各ニューロスフェアにおいて、組成は前駆細胞ｐ個と残りの分化細胞である。
【０１１３】
継代数ｎにおける細胞の総数Ｔｎを表すアルゴリズムを導き出した。実験の初めに、幹細胞由来のニューロスフェアを個々に分散させる、すなわち、幹細胞がｓ個、前駆細胞がｐ個、および分化細胞がｃ−ｓ−ｐ個存在する。この幹細胞および前駆細胞を増殖させて
、合計ｓ＋ｐ個のニューロスフェアになるように成長させ、分化細胞は死滅する。その結果、最初の継代の時点Ｔ１での総細胞数は、ニューロスフェアの総数と各ニューロスフェア中の細胞数との積：
【０１１４】
【数１】
0005891068.tif 000002
【０１１５】
で与えられる。
上記方程式の第２の等式は興味深い。というのも、ｓｃは幹細胞由来のニューロスフェア中の総細胞数を表し、ｐｃは前駆細胞由来のニューロスフェア中の総細胞数を表しているからである。
【０１１６】
前駆細胞が２世代生きると仮定し、ここでこれらのニューロスフェアを個々に分散させる。最初の継代では、幹細胞由来のｓ個のニューロスフェアが存在し、その各々がｓ個の幹細胞、ｐ個の前駆細胞およびｃ−ｓ−ｐ個の分化細胞を含むはずである。同様に、最初の継代では、前駆細胞由来のｐ個のニューロスフェアが存在し、今度はその各々がｐ個の前駆細胞およびｃ−ｐ個の分化細胞を含む。ここで、新たに個々に分散させたこれらの細胞は、死滅する分化細胞以外はその細胞独自のニューロスフェアへと成長することになる。その結果、２番目の継代の時点Ｔ２での総細胞数は、
【０１１７】
【数２】
0005891068.tif 000003
【０１１８】
【数３】
0005891068.tif 000004
【０１１９】
で与えられる。
等式の右辺の第１のカラムは、幹細胞由来のニューロスフェアを表す項を含んでいる。第２のカラムは、前駆細胞由来のニューロスフェアを表している。
【０１２０】
Ｔ２の方程式中の第２の等式は、総細胞数を展開式で表すものである。ｓ2ｃ項は、幹
細胞由来のニューロスフェア中の、次世代で幹細胞由来のニューロスフェアになる細胞の総数を示す。第２項ｓｐｃは、幹細胞由来のニューロスフェア中の、次世代で前駆細胞由来のニューロスフェアになる細胞の総数を示す。最後の項ｐ2ｃは、その寿命に依存して
前駆細胞由来のニューロスフェアになるかまたは死滅する、前駆細胞由来のニューロスフェアを表す。
【０１２１】
ここでこれらの細胞を継代して第３の世代を生じさせる。この世代の総細胞数は、前駆細胞の寿命に左右される。寿命がわずか２世代であれば、前駆細胞由来の前駆細胞は新しいニューロスフェアを生成せずにここで死滅することになる。この仮定の下では、３番目の継代の時点Ｔ３における総細胞数は、
【０１２２】
【数４】
0005891068.tif 000005
【０１２３】
【数５】
0005891068.tif 000006
【０１２４】
【数６】
0005891068.tif 000007
【０１２５】
で与えられる。
同様に、４番目の継代の時点における総細胞数を決定することができる。これらの方程式を書き直すと、
【０１２６】
【数７】
0005891068.tif 000008
【０１２７】
【数８】
0005891068.tif 000009
【０１２８】
【数９】
0005891068.tif 000010
【０１２９】
【数１０】
0005891068.tif 000011
【０１３０】
となる。
したがって、導き出すと、ｎ番目の継代における総細胞数は、
【０１３１】
【数１１】
0005891068.tif 000012
【０１３２】
で与えられることになる。
この方程式は前駆細胞の寿命が２世代であるという仮定に基づいていることを繰り返しておかなければならない。
【０１３３】
前駆細胞の寿命が２世代より長い場合、３番目の継代の時点Ｔ３における総細胞数は、
【０１３４】
【数１２】
0005891068.tif 000013
【０１３５】
【数１３】
0005891068.tif 000014
【０１３６】
【数１４】
0005891068.tif 000015
【０１３７】
で与えられる。
前駆細胞の寿命が３世代である場合、第４世代までの総細胞数は、
【０１３８】
【数１５】
0005891068.tif 000016
【０１３９】
【数１６】
0005891068.tif 000017
【０１４０】
【数１７】
0005891068.tif 000018
【０１４１】
【数１８】
0005891068.tif 000019
【０１４２】
で与えられる。
したがって、この特定の仮定を用いて導き出すと、ｎ番目の継代における総細胞数は、
【０１４３】
【数１９】
0005891068.tif 000020
【０１４４】
で与えられる。
一般に、同様の論拠によって、前駆細胞の寿命がｌ世代である場合のｎ番目の継代の時点における総細胞数は、
【０１４５】
【数２０】
0005891068.tif 000021
【０１４６】
【数２１】
0005891068.tif 000022
【０１４７】
で与えられる。
上記方程式中の総和については単純化がよく知られている。
【０１４８】
【数２２】
0005891068.tif 000023
【０１４９】
従ってＴｎを表す式は、
【０１５０】
【数２３】
0005891068.tif 000024
【０１５１】
【数２４】
0005891068.tif 000025
【０１５２】
に単純化される。
所与の種類の細胞について、ｐ、ｓ、ｃ、およびｌは一定であるため、角括弧内の項を定数に置き換えて、
【０１５３】
【数２５】
0005891068.tif 000026
【０１５４】
および
【０１５５】
【数２６】
0005891068.tif 000027
【０１５６】
とすることができる。
この方程式は、式（２５）の対数をとることにより一次式で表して
【０１５７】
【数２７】
0005891068.tif 000028
【０１５８】
とすることができる。
方程式（２７）を検討すると、この直線の傾きはｌｏｇ  ｓで、ｙ切片はｌｏｇ  Ｂである。実験上の観点から見ると、このことは、総細胞数の対数を継代数に対してプロットすると、このプロットの傾きを調べることによりニューロスフェア中の幹細胞の数を計算することができ、ｙ切片を調べることにより前駆細胞の数を計算することができる、ということを意味する。このプロットを構築する場合、継代数が前駆細胞の寿命より大きいときのデータポイントのみを含めるように注意しなければならない。前駆細胞の寿命は、ｌ≧ｎの場合に所与の継代とその前の継代とにおける総細胞数の比率は一定（（Ｔｎ＋１／Ｔｎ）＝ｓ）であるが、ｌ＜ｎの場合はこの比率は一定ではないことに注意して計算される。従ってｌ＝ｎ＋１であり、ここでｎは上記の比率がｓと等しくならない最大の整数である。この手法はノイズの多いデータを処理するのに適している場合がある。
【０１５９】
注意すべき重要なことは、最初のｌ−１継代まで、すなわち（１，ｌｏｇＴ１），・・・，（ｌ−１，ｌｏｇＴｌ−１）は、直線にのらないことである。このことは方程式（２３）および（２４）を調べればわかる。
【０１６０】
方程式（２７）から、ニューロスフェア中の前駆細胞の数ｐは、直線の傾きには影響しないことがわかる。傾きが変わる場合、これは幹細胞の数が変わることを意味するはずで
ある。傾きが０である場合、つまり、直線が水平の場合、ニューロスフェア中には幹細胞が１つだけ存在し、従って、各継代における細胞の総数は増大しない。
【０１６１】
ニューロスフェアの成長条件が変わる場合、例えば成長因子がＥＧＦのみからＥＧＦ＋ＦＧＦのみに変わる場合、直線の傾きは依然としてニューロスフェア中の幹細胞の数によってのみ決定される。この主張の証拠は、本項の残りの部分で述べる。
【０１６２】
ｒ番目の継代後に条件が変わり、生じる幹細胞の数がｑに、前駆細胞の数がｗに、前駆細胞の寿命がｍ世代に変わると仮定する（便宜上、ｍ≦ｌとするがｍ＞ｌの場合も同じである）。ｒ＋ｌ回の継代後の総細胞数は、
【０１６３】
【数２８】
0005891068.tif 000029
【０１６４】
で与えられる。
ｒ＋ｍ−１回の継代後には、総数は
【０１６５】
【数２９】
0005891068.tif 000030
【０１６６】
であり、ｒ＋ｍ回の継代後には、総数は
【０１６７】
【数３０】
0005891068.tif 000031
【０１６８】
である。
導き出すと、ｒ＋Ｎ回の継代後の総細胞数は、
【０１６９】
【数３１】
0005891068.tif 000032
【０１７０】
【数３２】
0005891068.tif 000033
【０１７１】
となり、ここで
【０１７２】
【数３３】
0005891068.tif 000034
【０１７３】
である。
線形化すると、
【０１７４】
【数３４】
0005891068.tif 000035
【０１７５】
である。
したがって、上述のように、条件の変更後この直線の傾きは幹細胞の数によってのみ影響されることが分かる。
【０１７６】
上記のアルゴリズムに基づいて、幹細胞および前駆細胞の存在頻度を以下の工程、すなわち
１．  ニューロスフェア分析法において細胞を連続的に継代し、各継代で生成された細胞の総数を、その前の継代の総細胞数と、現在の継代で生成された細胞における増加倍数とを乗じることに基づいてプロットする工程；
２．  各継代で生成された細胞の総数の対数をとることにより、対数増殖カーブを線形化する工程；
３．  最も良くフィットする直線を計算し、次いで直線式（ｙ＝ｍｘ＋ｂ）を用いて直線の傾きとｙ切片を計算し、次には上記の式を使用して幹細胞の数と前駆細胞の数とを明らかにする工程
から計算することができる。
【０１７７】
実施例２：ヒト胎児神経幹細胞の連続継代および数学的モデル化に基づく幹細胞と前駆細胞の存在頻度の分析
実施例１の数理モデルを、連続的に継代したヒト胎児神経幹細胞に適用した。ヒト胎児神経幹細胞を、参照により全体が本願に組み込まれるベスコビ（Ｖｅｓｃｏｖｉ）ら、１９９９年、Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．第１５６巻、ｐ．７１−８３に記載されているような従来の技術（すなわち、細胞を、その前の継代由来の細胞の一部を用いて、かつマイトジェンであるＥＧＦおよびＦＧＦ２を補足した無血清培地を用いて、各継代につきクローン化しうる密度で播種する）を使用して、連続的に継代した。各継代の終了時に、細胞を個々に分散させて単個細胞浮遊液とし、この単個細胞浮遊液の細胞を計数し、トリパンブルー排除法によって生細胞および死細胞の数を計数することにより、総細胞数を決定した。各継代終了時の理論上の総細胞数（継代の終了時に計数された総細胞数と、計数されたその細胞を生成させるために播種された継代直前の細胞の一部との関数である）を継代数に対してプロットして（図１Ａ）成長曲線を得た。各継代の終了時の総細胞数の対数も継代数に対してプロットした（図１Ｂ）。線形の対数プロットについて最もフィットする傾向線を作成し（図１Ｂ）、直線式（ｙ＝ｍｘ＋ｂ）を用いて傾きとｙ切片とを決定した。その後、幹細胞および前駆細胞の存在頻度を、実施例１の方程式（２６）および（２７）によって計算した（ｎ＝１、ｌ＝ｎ＋１＝２、ｃ＝１０００とした；これらの値は以降全ての実施例でも使用）。幹細胞の存在頻度は細胞集団全体の０．２４％であると算出され、前駆細胞の存在頻度は細胞集団全体の１．１５％であると算出された。
【０１７８】
実施例３：神経コロニー形成細胞法におけるヒト胎児神経幹細胞の幹細胞および前駆細胞の存在頻度の分析
神経コロニー形成細胞法（ＮＣＦＣＡ）は、神経コロニーの大きさの分析に基づいて幹細胞および前駆細胞の存在頻度を決定するために使用することができる。ＮＣＦＣＡは、参照によってその全体が本願に組み込まれる２００５年５月２６日に公開された米国特許出願番号第２００５／０１１２５４６号に述べられている。簡潔に述べると、ＮＣＦＣＡは、軟寒天培地、好ましくはコラーゲンベースまたはメチルセルロースベース（ＩＭＤＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、マッコイ（ＭｃＫｏｙ’ｓ）、イスコフ（Ｉｓｃｏｖｅｓ））の軟寒天培地中に神経細胞を浮遊させることにより行なわれる。軟寒天培地は、神経細胞を培養するために使用されるのと同じ適切な培地（例えばＮｅｕｒｏｃｕｌｔ（ＴＭ）［ステムセルテクノロジーズ社（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．］無血清培地でサイトカインを含まずＮｅｕｒｏｃｕｌｔ（ＴＭ）増殖サプリメントとＥＧＦを含むもの）にコラーゲンまたはメチルセルロースを加えて成るものでよい。培地は血清を含まないことが好ましい。軟寒天培地中の細胞は、データの統計学的解析に十分な数のコロニーを生じる濃度（例えば３５ｍｍの培養ディッシュ当たりの細胞数が１，０００〜２５，０００個、好ましくは２，５００〜７，５００個）に播種する。形成されるコロニーは、単一の細胞すなわち神経幹細胞または前駆細胞いずれかから生じる。このコロニーを、コロニー間の大きさおよび差異が識別可能になるまで（例えば約１０〜３０日）培養し、次にコロニーを計数し、かつスコアリング用ディッシュのグリッドを使用してコロニーの大きさを推定する。単一の神経幹細胞から生成されたコロニーは時間とともに大きく成長し続けるが、神経前駆細胞から生成されたコロニーは成長力に限界があり、従って時間とともに大きく成長し続けることはない。コロニーの大きさから、増殖力の高いＮＳＣ（ＨＰＰ−ＮＳＣ）、増殖力の低いＮＳＣ（ＬＰＰ−ＮＳＣ）、および神経前駆細胞が区別される。したがって、生成されたコロニーの大きさは、そのコロニーが神経幹細胞から生成したか神経前駆細胞から生成したか、さらにはそのＮＳＣの増殖力が高いか低いかの指標となりうる。特に、（ディッシュ上の他のコロニーに比べて）より大きなコロニーは、増殖力の高い神経幹細胞を示し、中型のコロニーは増殖力の低い神経前駆細胞を示し、より小さなコロニーは神経前駆細胞を示す。「より大きなコロニー」または「より小さなコロニー」の実際の直径は、コロニーを培養する時間の長さなど多くの要因によって変化する。例えば、細胞２，５００個／ディッシュで１４〜２８日間培養した後、コロニーを直径に基づいて４つのカテゴリー、すなわち（１）＞２．０ｍｍ、（２）１−２ｍｍ、（３）０．５−１ｍｍおよび（４）＜０．５ｍｍのうちの１つに分類した。したがって、コロニーを少なくとも１４日間培養すると仮定すると、直径が２．０ｍｍを超えると神経幹細胞から生成されたコロニーを示す。ＮＣＦＣＡにおいて細胞の種類は、その細胞種が形成する形態に基づいて区別することもできる。波状のコロニーは、神経幹細胞によって生成され、周囲が滑らかなコロニーは神経前駆細胞によって生成される。ＮＣＦＣＡを行なうためのキ��トはステムセルテクノロジーズ社から市販で入手可能である。
【０１７９】
ヒト胎児神経幹細胞に関する幹細胞および前駆細胞の存在頻度を、ＮＣＦＣＡにおいて細胞をプレート培養することにより計算した。継代数１２の胎児神経幹細胞の子孫を個々に分散させて単個細胞浮遊液とし、細胞密度を２０００個／ｍｌとして２０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦおよび１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦとともにプレート培養した。細胞を軟寒天培地において３週間培養した後、コロニーの存在頻度および大きさを計算した。プレート培養した全細胞の２％未満が幹細胞の特性を示すコロニーを形成した。したがって、実施例２における数学的分析法からの結果はＮＣＦＣＡの結果と一致している。
【０１８０】
実施例４：白血病抑制因子（ＬＩＦ）は、連続的に継代されたヒト胎児神経幹細胞における幹細胞および前駆細胞の存在頻度を低下させる
連続的に継代されたヒト胎児神経幹細胞を、実施例２のような通常の増殖条件（マイトジェンＦＧＦ２およびＥＧＦを含む）で、２０ｎｇ／ｍｌのヒトＬＩＦを添加したものと
添加していないものについて培養した。いずれの群についても成長曲線を作成し（図２Ａ）、各継代の終了時に生成された細胞の理論上の総数の対数をとることにより均等目盛に変換し（実施例２を参照）、最も良くフィットする傾向線に基づいて傾きおよびｙ切片を決定した（図２Ｂ）。実施例１の方法による幹細胞および前駆細胞の存在頻度の分析から、ＬＩＦ存在下では幹細胞の存在頻度が４８％、前駆細胞の存在頻度が１８％低下することが明らかとなった（図２Ｃ；ｙ軸は対照の値に対する割合（％）を表す）。従って、ＬＩＦは連続的に継代されたヒト神経幹細胞中の神経幹細胞および神経前駆細胞の存在頻度を低下させるために使用することができる。
【０１８１】
実施例５：骨形成タンパク質２（ＢＭＰ−２）は、連続的に継代されたヒト胎児神経幹細胞における幹細胞および前駆細胞の存在頻度を低下させる
連続的に継代されたヒト胎児神経幹細胞を、実施例２のような通常の増殖条件（マイトジェンＦＧＦ２およびＥＧＦを含む）で、２０ｎｇ／ｍｌのヒトＢＭＰ−２タンパク質を添加したものと添加していないものについて培養した。いずれの群についても成長曲線を作成し、各継代の終了時に生成された細胞の理論上の総数の対数をとることにより均等目盛に変換し、最も良くフィットする傾向線に基づいて傾きおよびｙ切片を決定した。実施例１の方法による幹細胞および前駆細胞の存在頻度を分析すると、ＢＭＰ−２が存在するといずれの種類の細胞においても低下することが明らかとなった。従って、ＢＭＰは連続的に継代されたヒト神経幹細胞中の神経幹細胞の存在頻度および神経前駆細胞の存在頻度を低下させるために使用することができる。
【０１８２】
実施例６：連続的に継代された多形膠芽腫（ＧＢＭ）由来の細胞は幹細胞の重要な特徴を示す
ヒトＧＢＭには、神経幹細胞が生体条件外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）で増殖できるように調整された条件下で増殖する、腫瘍性神経幹細胞（ｔＮＳＣ）が含まれている。参照によって全体が本願に組み込まれるガルリ（Ｇａｌｌｉ）ら、２００４年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  第６４巻、ｐ．７０１１−７０２１を参照されたい。ｔＮＳＣは、上述のガルリ（Ｇａｌｌｉ）らの文献（２００４年）および参照によって全体が本願に組み込まれるベスコビ（Ｖｅｓｃｏｖｉ）ら、Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．第１５６巻、ｐ．７１−８３、１９９９年の方法に従って腫瘍サンプルから単離することができる。簡潔に述べると、ｔＮＳＣを単離するには、最初に、腫瘍サンプルを、０７．ｍｇ／ｍＬのオボムコイドを含んでいるダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）／Ｆ１２の中で粉砕して個々に分離する。細胞を遠心分離によって回収し、成長因子を含まず化学的組成の明らかなＮＳ−Ａ培地（カナダ国ブリティッシュコロンビア州バンクーバー所在のステムセルテクノロジーズ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））に２ｍＭグルタミン、０．６％グルコース、９．６ｇｍ／ｍＬプトレッシン、６．３ｎｇ／ｍＬプロゲステロン、５．２ｎｇ／ｍＬ亜セレン酸ナトリウム、０．０２５ｍｇ／ｍＬインシュリン、０．１ｍｇ／ｍＬトランスフェリンを含めたものに再浮遊させる。その後、生細胞を、化学的組成の明らかな同じＮＳ−Ａ培地に２０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦおよび２０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ２を加えた中に、細胞密度を２，５００−５，０００個／ｃｍ2として２５ｃｍ2組織培養フラスコ中に播種する。必要ならば培地を２４−４８時間ごとに新鮮な培地に交換する。播種の５〜２０日後に、参照によって全体が本願に組み込まれるレノルズ（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ）およびワイス（Ｗｅｉｓｓ）、１９９２年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  第２５５巻、ｐ．１７０７−１７１０によって記述されるように、正常な神経幹細胞によってインビトロで形成される古典的なニューロスフェアに似た腫瘍細胞のニューロスフェアを観察することができる（図３Ａを参照：図３Ａは２０倍の位相差観察像である）。腫瘍細胞のニューロスフェアを個々に分散させて同じ条件下で連続的に再継代すると、ｔＮＳＣは新しい腫瘍細胞ニューロスフェアを構築する。ｔＮＳＣは、培養下で安定的に自己複製して増殖する（２つの異なるＧＢＭ細胞株について各分裂における理論上の総細胞数を示す図３Ｂを参照されたい）。ｔＮＳＣの子孫は分化条件下でニューロン、乏突起膠細胞および星状細胞を生じるの
で、ｔＮＳＣはインビトロにおいて多能性である。例えば、抗β−チューブリン抗体、抗グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）抗体（ＧＦＡＰは星状膠細胞への分化のマーカーである）、および抗ガラクトセレブロシド（ＧａｌＣ）抗体による、分化した子孫の染色が観察された（ＧａｌＣは乏突起膠細胞のマーカーである）。
【０１８３】
免疫不全マウスの脳へ移植すると、ｔＮＳＣは、ちょうど典型的なヒトＧＢＭと同じように、星状膠細胞特異的マーカーとの免疫反応性を備えたＧＢＭを生じる。これらの腫瘍そのものを取り出してｔＮＳＣを再培養すると、次世代のｔＮＳＣは免疫不全マウスの脳内に移植されるとＧＢＭを再生成する。したがって、ヒトのｔＮＳＣはインビボでは単能性で、インビトロでは多能性であり、クローンのレベルに至るまで腫瘍の基となる細胞として働く可能性があり、連続的な再移植の後でさえヒトの疾病の重要な特徴に非常によく似た腫瘍をマウスにおいて創り出すことができる。したがって、ヒトのｔＮＳＣは、ヒトＧＢＭの増殖および再発に関係するように思われる。
【０１８４】
実施例７：腫瘍性幹細胞および腫瘍前駆細胞の存在頻度を計算するための連続的に継代されたＧＢＭ腫瘍細胞の数学的モデル化の使用
幹細胞および前駆細胞の存在頻度を、実施例１の分析法を使用して３つのＧＢＭ細胞株について測定した。これらの細胞株は、３人の異なる患者の腫瘍（Ｃ．ベスタ神経学研究所（Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃ．  Ｂｅｓｔａ）から入手し、世界保健機構（ＷＨＯ）のガイドラインによって分類した腫瘍）に由来するものである。腫瘍細胞を実施例６の方法を使用して連続的に継代し、生成された細胞の理論上の総数を、各細胞株（６２７、９１３、１０２２）について継代ごとにプロットした（図４Ａを参照）。各継代の終了時に生成された細胞の理論上の総数の対数を計算し、最も良くフィットする傾向線に基づいて傾きおよびｙ切片を計算した（図４Ｂを参照）。幹細胞および前駆細胞の数についての度数は実施例１の方法を使用して計算した。腫瘍性幹細胞の存在頻度は細胞全体の０．４４％であり、腫瘍前駆細胞の存在頻度は細胞全体の１．５６％であった（図４Ｃに３つのＧＢＭ細胞株各々について示した）。
【０１８５】
実施例８：神経コロニー形成細胞法（ＮＣＦＣＡ）における、ＧＢＭ腫瘍性幹細胞由来の子孫細胞からの腫瘍性幹細胞および腫瘍前駆細胞の存在頻度の算出
継代数１５のＧＢＭ細胞を、実施例３に記載のように神経コロニー形成細胞法（ＮＣＦＣＡ）でプレート培養した。培養物に毎週新鮮な培地を供給し、３週後にコロニーの直径を測定した。この分析法では、最も大きなコロニーだけが、軟寒天培地からの抽出およびサブクローニングの後で幹細胞の特性を示す。播種した細胞全体の０．２５％〜０．６５％が大きなコロニーを形成した。図５の主グラフを参照すると、播種した細胞全体に対する、直径が１，５００−２，０００μｍ；１，０００−１，５００μｍ；５００−１，０００μｍ；および＜５００μｍのコロニーを形成するものの割合（％）（ｙ軸）を示している。図５の主グラフに挿入されたグラフは、播種した細胞全体に対する、直径が１，５００−２，０００μｍおよび１，０００−１，５００μｍの区分のコロニーを形成するものの割合（％）（ｙ軸）を、主グラフとは異なるｙ軸目盛りで示している。したがって、ＮＣＦＣＡおよび実施例７の数学的分析から、ＧＢＭ腫瘍細胞株中の腫瘍性幹細胞について同様の存在頻度が得られる。
【０１８６】
実施例９：初代腫瘍サンプルおよびｔＮＳＣにおけるすべての種類のＢＭＰレセプタの存在
３種のＢＭＰレセプタ（ＢＭＰＲ１ａ、ＢＭＰＲ１ｂおよびＢＭＰＲ２）の発現を、以下のものについてリアルタイムＰＣＲで測定した。
【０１８７】
１．  初代ヒト脳腫瘍標本：未分化星細胞腫（ＡＡ０３１２１７）；膠芽腫（ＧＢＭ０５０２０３、ＧＢＭ０４０１１４、ＧＢＭ０４０２０２、ＧＢＭ０５０２０７、ＧＢＭ０
５０２０８）；および胚芽異形成性神経上皮新生物（ＮＮＤ０４０１１５）；
２．  正常なヒト胎児神経幹細胞（ｆＮＳＣ）；および
３．  実施例６の方法によって調製されたヒト膠芽腫の腫瘍性神経幹細胞（ｔＮＳＣ）の細胞株（ＧＢＭ０１０６２７、ＧＢＭ０２０９１３、ＧＢＭ０２１０２２）。
【０１８８】
以下の方法を用いた。最初に、ＴＲＩｚｏｌ試薬（米国メリーランド州ロックヴィル所在のライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））を使用してｆＮＳＣ、ｔＮＳＣｓ、および初代腫瘍サンプルから全ＲＮＡを単離し、次に、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＲｎａｓｅＨ逆転写酵素（米国メリーランド州ロックヴィル所在のライフ・テクノロジーズ）を使用して逆転写した。鋳型として使用したｃＤＮＡはすべて、ハウスキーピング遺伝子としてグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）および陽性対照としてＭＣＦ−７細胞株を使用して、あらかじめ標準化されたものとした。その後、各ＢＭＰレセプタ特異的プライマーを使用し、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ（登録商標）ＳＹＢＲ（登録商標）グリーンＱＰＣＲコア試薬キット（米国カリフォルニア州ラ・ホーヤ所在のストラタジーン（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ））を使用して、定量的リアルタイムＰＣＲ反応を３連で実施した。ＳＹＢＲグリーン色素はあらゆるＰＣＲ生成物に結合するため、配列特異的プローブを使用する必要がない。Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  ＳＹＢＲグリーンのマスターミックスは、ＵＮＧによるコンタミネーション除去プロトコールに使用するｄＵＴＰを含んでいる。使用したプライマー配列は以下のとおり、すなわち
プライマー配列×逆転写（ＲＴ）ＰＣＲ
ｈＢＭＰＲ−１Ａ  Ｆｗ：５’−ＡＡＴＧＧＡＧＴＡＡＣＣＴＴＡＧＣＡＣＣＡＧＡＧ−３’
ｈＢＭＰＲ−１Ａ  Ｒｗ：５’−ＡＧＣＴＧＡＧＴＣＣＡＧＧＡＡＣＣＴＧＴＡＣ−３’
ｈＢＭＰＲ−１Ｂ  Ｆｗ：５’−ＧＧＴＴＧＣＣＴＧＴＧＧＴＣＡＣＴＴＣＴＧＧ−３’
ｈＢＭＰＲ−１Ｂ  Ｒｗ：５’−ＴＡＧＴＣＴＧＴＧＡＴＴＡＧＧＴＡＣＡＡＣＴＧＧ−３’
ｈＢＭＰＲ−２  Ｆｗ：５’−ＴＣＡＧＡＴＡＴＡＴＧＧＣＡＣＣＡＧＡＡＧＴＧ−３’
ｈＢＭＰＲ−２  Ｒｗ：５’−ＧＴＧＧＡＧＡＧＧＣＴＧＧＴＧＡＣＡＣＴＴＧ−３’
プライマー配列×リアルタイムＰＣＲ
ｈＢＭＰＲ１ａ  Ｆｗ：５’−ｃａｇｇｔｔｃｃｔｇｇａｃｔｃａｇｃｔｃ−３’
ｈＢＭＰＲ１ａ  Ｒｗ：５’−ｃｔｔｔｃｃｔｔｇｇｇｔｇｃｃａｔａａａ−３’
ｈＢＭＰＲ１ｂ  Ｆｗ：５’−ａａａｇｇｔｃｇｃｔａｔｇｇｇｇａａｇｔ−３’
ｈＢＭＰＲ１ｂ  Ｒｗ：５’−ｇｃａｇｃａａｔｇａａａｃｃｃａａａａｔ−３’  ｈＢＭＰＲ２  Ｆｗ：５’−ｇｃｔａａａａｔｔｔｇｇｃａｇｃａａｇｃ−３’
ｈＢＭＰＲ２  Ｒｗ：５’−ｃｔｔｇｇｇｃｃｃｔａｔｇｔｇｔｃａｃｔ−３’
である。
【０１８９】
蛍光性の発光をリアルタイムで記録した（Ｃｈｒｏｍｏ４（ＴＭ）４色リアルタイムＰＣＲ検出器、ＭＪリサーチ（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、バイオラッド（ＢＩＯ−ＲＡＤ）、米国）。遺伝子発現の解析は、相対的な定量法の比較Ｃｔ法（ヒグチ（Ｈｉｇｕｃｈｉ）ら）を使用して完了した。各遺伝子について、相対的なＲＮＡ量を２つの内在性の対照すなわちＧＡＰＤＨおよび１８ｓ  ｒＲＮＡに対して標準化した。３連実験のそれぞれを標準化し、平均の相対量（ＲＱ）を各遺伝子について報告する。平均で何倍変化したかを、３連実験の標準偏差および９５％信頼区間と共に計算した。
【０１９０】
図６に結果を示す。この結果は、悪性度の異なる様々な腫瘍が特有のＢＭＰＲ発現プロファイルを有することを示している。したがって腫瘍のＢＭＰＲ発現プロファイルは、腫
瘍の特徴を解析し、腫瘍の悪性度を予測するための診断法において使用することができる。
【０１９１】
実施例１０：白血病抑制因子（ＬＩＦ）およびＢＭＰは、連続的に継代されたヒトＧＢＭ細胞株における幹細胞の存在頻度を低減する
３人の異なる患者から得られたＧＢＭ腫瘍細胞を、ＬＩＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）またはＢＭＰ−４（２０ｎｇ／ｍｌ）のいずれかを含むかまたは含まないコントロール培地（マイトジェンＥＧＦ＋ＦＧＦ２を含む；実施例６を参照のこと）の中で連続的に継代した。実施例１の方法を使用した幹細胞および前駆細胞の存在頻度の分析から、ＬＩＦまたはＢＭＰ−４の添加により腫瘍性幹細胞の数が著しく減少し（統計的有意性  ｐ＜０．０１）、ＢＭＰ−４の添加により腫瘍前駆細胞の数が著しく減少する（統計的有意性  ｐ＜０．０５）が、ＬＩＦを添加しても腫瘍前駆細胞集団の存在頻度は有意には変化しないことが明らかとなった。これらの結果は、ＢＭＰ分子が腫瘍性幹細胞および腫瘍前駆細胞の増殖を低減し、ＬＩＦは腫瘍性幹細胞の数を選択的に低減し腫瘍前駆細胞群に対しては影響しないことを示している。図７は、結果をグラフで（未処置対照の値に対する割合（％）として）表している。これらの結果は、ＬＩＦおよびＢＭＰがそれぞれ、マイトジェンＥＧＦおよびＦＧＦ２の存在下であってもｔＮＳＣの増殖を低減するのに有効であることを示している。これは、ＬＩＦおよびＢＭＰのうち少なくともいずれか一方による処置がヒトの脳腫瘍の治療に有効となることを示している。
【０１９２】
実施例１１：ＬＩＦおよびＢＭＰ−２を連続的に継代されたＧＢＭ由来の細胞に適用すると、幹細胞および前駆細胞の存在頻度が低下する
コントロール培地（マイトジェンＥＧＦ＋ＦＧＦ２を含む；実施例６を参照のこと）中で連続的に継代したＧＢＭ細胞（実施例６を参照）を、ＬＩＦ、ＢＭＰ−２またはＢＭＰ−２＋ＬＩＦの組み合わせで処理した。連続的に継代した対照のＧＢＭ細胞は、どちらのタンパク質による処理も行わなかった。幹細胞および前駆細胞の存在頻度を計算するために実施例１の方法を使用して成長曲線を比較した。データから、ＬＩＦおよびＢＭＰ−２を一緒に使用すると、単独で使用した時よりも腫瘍性幹細胞および腫瘍前駆細胞の存在頻度が大きく低下することが明らかである。図８は、結果をグラフで示すものである（ｙ軸は、未処理対照の値に対する割合（％）を表す）。これらの結果は、ＬＩＦおよびＢＭＰ−２の同時投与が、マイトジェンＥＧＦおよびＦＧＦ２の存在下であってもｔＮＳＣの増殖を低減するのに有効であること、またＬＩＦおよびＢＭＰ−２の同時投与はヒトの脳腫瘍を治療するのに有効であろうことを示している。
【０１９３】
実施例１２：培養したＧＢＭ細胞をＢＭＰ−２で一時的に処理すると幹細胞および前駆細胞の存在頻度が永続的に低下する  ３人の異なる患者から得られたＧＢＭ腫瘍細胞を、コントロール培地（ＥＧＦ＋ＦＧＦ２を含む；実施例６を参照のこと）中、ＢＭＰ−２（２０ｎｇ／ｍｌ）を添加するか（図９に「ＢＭＰ」と示す）または１回の継代時にＢＭＰ−２に一時的に曝露して（図９に「ＢＭＰ後」と示す）、連続的に継代した。実施例１の方法を使用した腫瘍性幹細胞および腫瘍前駆細胞の存在頻度の分析から、いずれのＢＭＰ処理群においても腫瘍性幹細胞および腫瘍前駆細胞の数が著しく減少することが明らかになった。これらの結果は、ＢＭＰ−２に一時的に曝露すると、マイトジェンＥＧＦおよびＦＧＦ２の存在下であっても腫瘍性幹細胞および腫瘍前駆細胞の存在頻度が永続的に低下することを示している。これらの結果は、ＢＭＰ−２治療がヒトの脳腫瘍の増殖に永続的効果を有すると思われることを示している。
【０１９４】
実施例１３：ＬＩＦおよびＢＭＰを用いた事前処理後の培養ＧＢＭ細胞における腫瘍形成性の低下
免疫不全マウスの脳（腹側外側の線条体）に、ヒトＧＢＭ由来の腫瘍性神経幹細胞１００，０００個を定位注入により移植した。腫瘍性神経幹細胞はマウスにおいてＧＢＭを発
症させた。これらのＧＢＭ病変は、正常組織とは明白に区別される、核が過剰に存在する広範な領域として明らかになった（図１０の上側パネルを参照）。同じ腫瘍性神経幹細胞を移植に先立って１００ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ−４または１００ｎｇ／ｍＬのＬＩＦで４８時間前処理すると、腫瘍の形成は著しく（ほぼ８０％）低減され、核が過剰に存在する領域は検出困難なものが多い（図１０の下側パネルを参照）。これらの結果は、ＢＭＰおよびＬＩＦのうち少なくともいずれか一方による治療がヒト脳腫瘍の治療に有効であることをさらに示すものである。補足例については、実施例２２も参照されたい。
【０１９５】
実施例１４：ＬＩＦおよびＢＭＰ−２処理後の乳癌組織における腫瘍性幹細胞の存在頻度の分析
腫瘍切除のために生検を受ける患者から同意のもとに腫瘍標本を入手し、１：１コラゲナーゼ／ヒアルロニダーゼ溶液中３７℃にて１時間酵素消化してから４０μｍフィルタで濾過し、細胞を、マイトジェンＥＧＦおよびＦＧＦ２（２０ｎｇ／ｍｌ）を含んだ無血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２ホルモン混合物（ＮｅｕｒｏＣｕｌｔ（登録商標）、ステムセルテクノロジーズ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））中にクローン化しうる密度で播種した。３−５日後、クローンから生じた細胞塊が懸濁浮遊しているのが観察される。これらの細胞を回収し、酵素的に個々に分散させ、新鮮な増殖培地に再度播種する。このようにして４−７日ごとに継代した細胞は、生成される総細胞数が幾何学的に増加する。
【０１９６】
連続的に継代した乳房腫瘍由来の幹細胞を、ＬＩＦおよびＢＭＰ−２のうち少なくともいずれか一方に曝露し、対照の培養物と比較する。神経コロニー形成細胞法において乳房性球状細胞塊（ｍａｍｍａｒｙ  ｓｐｈｅｒｅ）を分散させた細胞を播種し、実施例１の数学的モデルを用いて一連の成長曲線を分析することにより、処理群および対照群の腫瘍性幹細胞および腫瘍前駆細胞の存在頻度を分析する。
【０１９７】
実施例１５：ＬＩＦおよびＢＭＰ−２処理後の前立腺癌組織における腫瘍性幹細胞の存在頻度の分析
リンパ節転移から前立腺がん細胞を入手し、５％の血清と幹細胞マイトジェンＥＧＦおよびＦＧＦ２とを添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２ホルモン混合物（ステムセルテクノロジーズ）で培養する。クローンから生じた球状塊をトリプシン処理してから連続的に継代し、継代した細胞（未処理のもの、またはＬＩＦおよびＢＭＰ−２のうち少なくともいずれか一方で処理したもの）由来の増殖データを用いて、実施例１の数学的モデルを用いて腫瘍性幹細胞および腫瘍前駆細胞の存在頻度を計算する。
【０１９８】
実施例１６；ＬＩＦおよびＢＭＰ−２処理後の黒色腫組織における腫瘍性幹細胞の存在頻度の分析
切除された腫瘍から黒色腫細胞を得て、哺乳類の皮膚から多能性幹細胞を培養するために使用された方法（参照により全体が本願に組み込まれるトマ（Ｔｏｍａ）ら、Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２００１年９月、第３巻（９）、ｐ．７７８−８４を参照のこと）に従って幹細胞を単離する。簡潔に述べると、組織を小片（＜２ｍｍ）に切断し、ＨＥＭで洗浄し、０．１トリプシンで３７℃にて３０分間消化する。サンプルをＰＢＳですすぎ、機械的に分散させて単個細胞浮遊液とし、４０ｕｍ細胞ストレーナでろ過し、ヌンク（Ｎｕｎｃ）のＴ−８０組織培養フラスコ中で１ｍｌ当たり細胞５０，０００個の密度で播種する。増殖培地は、幹細胞マイトジェンＥＧＦおよびＦＧＦ２を添加したホルモン混合物含有無血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２（ステムセルテクノロジーズ）である。７−１０回の分裂の後、クローンから生じた細胞塊が培養物中に確認される。これらのメラノスフェアを回収し、分散させて単個細胞浮遊液とし、幹細胞マイトジェンを含む新鮮な培地を使用して、再度播種する。このように継代した培養物をＬＩＦまたはＢＭＰ−２で処理し、経時的に生成された細胞の総数を対数目盛でプロットする。治療群および対照群の腫瘍性幹細胞
および腫瘍前駆細胞の存在頻度を、実施例１の数学的モデルを使用して分析する。
【０１９９】
実施例１７：腫瘍切除後のＣＥＤ法によるＬＩＦ投与を用いた再発性多形膠芽腫の治療
再発性多形膠芽腫の患者を選出する。腫瘍切除に続いて、切除腔を囲んでいる脳実質に、２〜３個のカテーテルを、脳溝または脳室内に入らないように画像誘導を使用して配置する。該カテーテルを通して、７２ｍＬのヒトＬＩＦ（１μｇ／ｍＬ）を、シリンジ・ポンプを使用して９６時間かけて注入する。
【０２００】
実施例１８：ポリマービーズを用いたＢＭＰ−４投与による再発性多形膠芽腫の治療
再発性多形膠芽腫の患者を選出する。腫瘍切除に続いて、ＢＭＰ−４で飽和させたポリアクリル酸ビーズ（１週間以上ＢＭＰ−４を放出する）を切除部位に埋め込む。
【０２０１】
実施例１９：ＧＢＭ標本由来の細胞におけるＢＭＰＲの発現
ＧＢＭ組織由来の細胞におけるＢＭＰおよびそのレセプタ（ＢＭＰＲ）の転写物およびタンパク質の発現を、ＧＢＭ組織由来のＣＤ１３３＋ｔＮＳＣ集団について評価した（シン（Ｓｉｎｇｈ）、Ｓ．Ｋ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  第４３２巻、ｐ．３９６−４０１、２００４年）。下記のインビトロのデータは、１つの代表的なＧＢＭ標本由来の細胞から得たデータを例証するものであるが、同等の結果は別の４つのサンプルでも得られている。該サンプルは選別されたＣＤ１３３＋細胞または非選別細胞を含み、該細胞はＧＢＭから急性単離したものであるかまたはマイトジェンとともに短時間培養した後（培養した細胞）であるかのいずれかである（ガルリ（Ｇａｌｌｉ）ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  第６４巻、ｐ．７０１１−２１、２００４年；シン（Ｓｉｎｇｈ）、Ｓ．Ｋ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  第４３２巻、ｐ．３９６−４０１、２００４年）。ＢＭＰＲの３つのサブタイプ（ＢＭＰＲ１Ａ、−１Ｂ、−２）およびＢＭＰのすべての転写物が、急性単離したＧＢＭ細胞および培養したＧＢＭ細胞のいずれにおいても見出された。図１１Ａを参照すると、同図においてレーン１は陰性対照、レーン２は急性単離したＧＢＭのＣＤ１３３＋細胞、レーン３は培養したＧＢＭのＣＤ１３３＋細胞、レーン４は陽性対照のＭＣＦ７細胞である。さらに、同系統のレセプタおよびＢＭＰ−４タンパク質がいずれの集団においても、ＣＤ１３３＋画分およびＣＤ１３３−画分のいずれにおいても見出された。図１１Ｂ−Ｇを参照すると、単離直後（図１１Ｂ−Ｄ）および培養した（図１１Ｅ−Ｇ）ＣＤ１３３＋ＧＢＭ細胞における記載のタンパク質の免疫蛍光が示されている。
【０２０２】
最も有効なリガンドのうちの１つであるＢＭＰ−４を飽和濃度（１００ｎｇ／ｍｌ）で添加した後にＳｍａｄ１−５−８のリン酸化が観察されたので、ＢＭＰＲは機能性を有しており、一方ｐ３８ＭＡＰＫ経路の活性化は検出されなかった。図１１Ｈ−Ｊを参照すると、ＧＢＭ細胞における、記載の時間（分）での、レセプタに活性化されたＳｍａｄタンパク質のリン酸化および核移行を示す（抗リン酸化Ｓｍａｄ１，５，８）。
【０２０３】
図１１Ｋ−Ｐは、記載のタンパク質のウエスタンブロット解析を示す。図１１Ｋは、急性単離した（左側のレーン）、および培養した（右側のレーン）ＣＤ１３３＋ＧＢＭ細胞におけるＢＭＰ−４タンパク質を示す。図１１Ｌは、ＢＭＰ−４処理した培養細胞でＳｍａｄ１のレベルは変化しなかったことを示している（左側のレーンが対照、右側のレーンがＢＭＰ−４処理）。図１１Ｍ−Ｎは、単離直後の細胞（図１１Ｍ）および培養した細胞（図１１Ｎ）におけるＢＭＰ−４存在下でのＳｍａｄ１，５，８のリン酸化の増大を示している（左側のレーンが対照、右側のレーンがＢＭＰ−４処理）。図１１Ｏ−Ｐは、培養したＧＢＭ細胞（図１１Ｏ）および急性単離したＧＢＭ細胞（図１１Ｐ）におけるＢＭＰ−４処理後のＳｍａｄ４発現の増大を示している（左側のレーンが対照；右側のレーンがＢＭＰ−４処理）。
【０２０４】
この結果は、Ｓｍａｄ１，５，８複合体もまたＧＢＭの治療に有用な治療標的であり得
ることを示すものでもある。例えば、該複合体のリン酸化を増大させる治療薬はｔＮＳＣに対してＢＭＰ−４と同じ効果を有するであろう。本開示の他の箇所に開示したスクリーニング法は、そのような治療薬を得るために使用されてもよい。
【０２０５】
実施例２０：ＧＢＭのｔＮＳＣに対するＢＭＰ−４曝露の作用に関する検討
ＧＢＭから単離された細胞に対するＢＭＰ−４の作用の性質について検討した。他の細胞系（ハラハン（Ｈａｌｌａｈａｎ）ら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ  第９巻、ｐ．１０３３−８、２００３年；ズザルテ−ルイ（Ｚｕｚａｒｔｅ−Ｌｕｉｓ）およびヒューレ（Ｈｕｒｌｅ）、Ｓｅｍｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  第１６巻、ｐ．２６１−９、２００５年；フルスカ（Ｈｒｕｓｋａ）ら、Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ  第９７巻、ｐ．１０５−１４、２００５年）、例えば髄芽細胞腫（グラハム（Ｇｒａｈａｍ）ら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  第８巻、ｐ．７６−８３、１９９６年）などとは異なり、ＢＭＰ−４は細胞死（ヨウ化プロピジウム排除法により測定）またはアポトーシス（ＴＵＮＥＬ法により測定）を生じなかったが、マイトジェンに応答するＧＢＭ細胞の増殖を著しく低減した（Ｋｉ６７免疫蛍光法により測定）。図１２Ａは、ＧＢＭ培養物におけるＢＭＰ−４の作用をグラフで示している（白抜きのカラムは対照の培養物、暗色のカラムはＢＭＰ−４処理物；平均＋ＳＥ、ｎ＝３；＊ｐ、０．００５；ＰＩ＝ヨウ化プロピジウム）。
【０２０６】
増殖に対する他のＢＭＰの作用も分析した。図１５を参照すると、ＧＢＭ細胞の増殖に対する他のＢＭＰ（１００ｎｇ／ｍｌ）の作用が示されている。ＢＭＰ−２、−４、−５、−６、−７、−８ｂは細胞増殖を抑制するが、ＢＭＰ１、−３および−３ｂは、ＴＧＦβ１、２およびＴＧＦβ１，２（ＴＧＦβアゴニストのキメラポリペプチド）と同様に効果がないようであった（すべて１００ｎｇ／ｍｌ）。＊ＢＭＰと対照、ｐ＜０．００５、平均±ＳＥ、ｎ＝３、両側スチューデントｔ検定；＊＊ＢＭＰ４と対照、ｐ＜０．００１、平均±ＳＥ、ｎ＝３、両側スチューデントｔ検定。したがって、ＢＭＰ−２、−４、−５、−６、−７、−８ｂも、特にＧＢＭの治療のための本開示の方法および組成物に有用であろう。
【０２０７】
ＢＭＰ−４の抗増殖作用は、ＢＭＰ−４に応答してＧ０／Ｇ１期のＧＢＭ細胞の数が著しく増加し、Ｓ期の細胞の割合（％）が減少することを示した細胞周期分析によって確証された。ＧＢＭ細胞に見出されるＴＧＦβ（ケルマン（Ｋｊｅｌｌｍａｎ）ら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  第８９巻、ｐ．２５１−８、２０００年）は、ＢＭＰのシグナル伝達経路とオーバーラップするシグナル伝達経路を用いて（カナリ（Ｃａｎａｌｉｓ）ら、Ｅｎｄｏｃｒ  Ｒｅｖ  第２巻、ｐ．２１８−３５、２００３年；ゴレステーン（Ｇｏｌｅｓｔａｎｅｈ）ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  第２４巻、ｐ．５７２２−３０、２００５年）、促進性の作用または反促進性の作用を誘発する（ジェニングス（Ｊｅｎｎｉｎｇｓ）ら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｏｎｃｏｌ  第３６巻、ｐ．１２３−４０（１９９８））が、ＢＭＰ４とは異なり、本明細書に記載のＢＭＰ４作用の特異性の基礎をなすＧＢＭ細胞の増殖への影響は示さなかった。
【０２０８】
古典的な２つの分析法、すなわち１つはクローン形成の指標を測定し、従ってクローンを形成するニューロン前駆体の割合（％）を計測する分析法（グリッティ（Ｇｒｉｔｔｉ）ら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  第１６巻、ｐ．１０９１−１００、１９９６年；レノルズ（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ）ら、Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  第１７５巻、ｐ．１−１３、１９９６年）ならびに第２には増殖速度論データに基づいてＮＳＣ集団の大きさの増大を測定する分析法（ガルリ（Ｇａｌｌｉ）ら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  第１２９巻、ｐ．１６３３−４４、２００２年；レノルズ（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ）ら、Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  第２巻、ｐ．３３３−６、２００５年）により、ＢＭＰ−４の細胞増殖抑制作用がＧＢＭ細胞中のｔＮＳＣ集団に影響を与えたことが確認された。ＢＭＰ−４に４８時間曝露すると、ＧＢＭ細胞におけるクローン形成の指標（播種した細胞の合計に対する形成クローンの割合（
％））はインビトロで７０％を超えて低減された（図１２Ｂを参照すると、急性単離したＧＢＭ細胞および培養したＧＢＭ細胞の両方についての、対照群およびＢＭＰ−４処理群に関するクローン形成の指標がグラフで示されている；平均±ＳＥ、ｎ＝３；＊はｐ＜０．００５）。さらに、初代腫瘍標本からの単離直後にＧＢＭ細胞をＢＭＰ−４に曝露すると、同細胞が培養時に増殖する能力が消失し、一方、既にインビトロで増殖中のＧＢＭ細胞にＢＭＰ４を添加すると同細胞の成長速度が大きく低下した。ニューロスフェア分析法を使用してインビトロでのＧＢＭ細胞の増殖をグラフに示す図１２Ｃを参照すると、急性単離したＧＢＭ組織からの細胞はＢＭＰ−４の存在下では連続的に二次培養できなかったことが明らかである（黒い点線に黒塗り三角形）。図１２Ｃはまた、同じ条件下で短時間増殖させた後（菱形）、急性単離した同じ組織に由来する細胞をＢＭＰ−４で処理しても、成長曲線の傾きが著しく小さくなった（正方形）ことも示している。同様の結果は、ＢＭＰ−４で処理したヒト胎児ＮＳＣについても見られ（図１２Ｃ参照、黒い星印（対照）と黒丸（ＢＭＰ−４））、ヒト神経膠腫細胞株Ｕ８７（ＢＭＰＲを持たない）は影響を受けなかった（図１２Ｃを参照、白抜き三角形（対照）とバツ印（ＢＭＰ−４））。
【０２０９】
細胞蛍光測光法から、ＢＭＰ４処理の結果、急性単離したＧＢＭ細胞および培養したＧＢＭ細胞のいずれにおいても、ＣＤ１３３＋集団の大きさがほとんど半分になること（図１２Ａを参照）が示された。これらのデータはともに、ＢＭＰ−４がＧＢＭ細胞のｔＮＳＣ集団を標的とすることができることを示している。
【０２１０】
ＧＢＭ細胞をＢＭＰ−４に曝露すると、インビトロで明らかな形態学的変化が生じた。マイトジェン単独で増殖させた細胞に比べ、さらにＢＭＰ４を与えられた細胞はより分化の進んだ（扁平、濃密な様相、複雑な突起を有する）形態を呈した。対照の細胞を示す図１３Ａ、およびＢＭＰ−４に４８時間曝露した後の細胞を示す図１３Ｂを参照されたい。これに応じて、星状膠細胞のマーカーの発現（ＧＦＡＰ免疫反応性［ＩＲ］）のかなりの増加と一緒に、それほど大きくはないがニューロンのマーカー（βＩＩＩチューブリンおよびＭＡＰ５）または乏突起膠細胞のマーカー（ＧａｌＣ）に関する標識の増大が観察された。図１３Ｃ−Ｈを参照されたい。具体的には、図１３Ｃ（対照）および図１３Ｄ（ＢＭＰ−４）はＧＦＡＰ−ＩＲを示し；図１３Ｅ（対照）および図１３Ｆ（ＢＭＰ−４）は、βＩＩＩチューブリン−ＩＲを示し；図１３Ｇ（対照）および図１３Ｈ（ＢＭＰ−４）はＧａｌＣ−ＩＲを示す。
【０２１１】
特定の分化マーカーを発現している細胞の数を数えることによるＢＭＰ４の作用の定量化は、増殖している未分化のＧＢＭ培養物中および同細胞内でニューロンの抗原および神経膠の抗原が異常に発現しているという、正常な神経幹細胞では観察されない２つの現象のため、困難であった。したがって、細胞蛍光測光法を用いて蛍光信号強度を計測し、同方法により、対照に比べてＢＭＰ−４で処理した培養物ではＧＦＡＰ−ＩＲが２倍以上増大すること（図１３Ｉを参照）、そして同様に、ただし顕著ではないがβＩＩＩチューブリン（図１３Ｊ）およびＧａｌＣ（図１３Ｋ）の免疫反応性が増大することが見出された（ＭＥＦＬ＝フルオレセイン１分子相当の蛍光量；ＭＥＦＥ＝フィコエリスリン１分子相当の蛍光量）。
【０２１２】
理論または仮説によって制限されるものではないが、ここで述べるＢＭＰ−４の作用は、それ自体ｔＮＳＣである２つの同一の娘細胞を生じる対称分裂の回数の減少によるものであるか、あるいはｔＮＳＣ群の一部が分化してもはや幹細胞の特性を保持することができないことによるものと考えられる。要するにこのことは、ＢＭＰ−４が細胞分裂促進性の刺激を無効にして、ｔＮＳＣに、より成熟した腫瘍形成性の低い表現型を獲得させることができることを示唆している。ＢＭＰ−４はヒトＥＳ細胞に対し、幹細胞集団および増殖速度を増大させる抗分化作用を有するので、上記の結果は予想外である。
【０２１３】
実施例２１：ＢＭＰ−４はＧＢＳＣの腫瘍形成能を抑制し、インビボに送達可能である
急性単離したＣＤ１３３＋ＧＢＭ細胞および培養されたＣＤ１３３＋ＧＢＭ細胞の両方を、培養下で４８時間ＢＭＰ−４に曝露した後、免疫不全のｓｃｉｄ／ｂｇマウスの片側の線条体へ注入した（３×１０５個の生細胞）。腫瘍の形成および増大を、同一の条件下だがＢＭＰ−４を伴わずに維持されたＧＢＭ細胞を与えた対照動物のものと比較した。
【０２１４】
未処理のＧＢＭ細胞を与えた動物はすべて、注入された側に確立した腫瘤を生じた（図１４Ａを参照）。この腫瘤は、膠芽腫の特徴、たとえば顕著な核異型性、異常な神経膠成分の発現、広範囲な新血管新生および高い有系分裂活動（ガルリ（Ｇａｌｌｉ）ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  第６４巻、ｐ．７０１１−２１、２００４年）を示し、側脳室、第三脳室および第四脳室に侵入した。これに対し、ＢＭＰ４で処理した細胞は侵襲性の腫瘍を形成せず、小さくて範囲の定まった病変を形成し、該病変は注入部位に制限され、分裂指数が低く、脳室への侵入を示さなかった（図１４Ｂを参照）。注入後３〜４か月の間に対照の動物はすべて死亡したが、予めＢＭＰ−４処理した細胞を与えたほぼすべてのマウスは生き残った（図１４Ｊを参照。同図は前処理（左側パネル）、同時処理（中心パネル）、および後処理（右側パネル）した例における生存をグラフで示している（ログランク検定、それぞれｐ＜０．００１、ｐ＜０．００１、およびｐ＜０．００５）。同じ結果は、ＢＭＰ−４処理したＧＢＭ培養物からの残りのＣＤ１３３＋画分をＦＡＣＳで精製し、その腫瘍形成性を、対照のＧＢＭ細胞から精製した同数のＣＤ１３３＋細胞（動物１匹あたり１．５×１０５個のＣＤ１３３＋細胞）の腫瘍形成性と比較した場合にも観察された。さらに、従来示されるように（ガルリ（Ｇａｌｌｉ）ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  第６４巻、ｐ．７０１１−２１、２００４年；シン（Ｓｉｎｇｈ）ら、Ｎａｔｕｒｅ  第４３２巻、ｐ．３９６−４０１、２００４年）、急性単離した対照ＧＢＭ細胞を与えたマウスの脳からＣＤ１３３＋ｔＮＳＣを再培養することは常に可能であった（平均のクローン形成頻度：９．０±１．３％［ｎ＝２、移植後９０日］）。これらは、ｓｃｉｄ／ｂｇマウスの脳に再び脳内移植されると大きな二次腫瘍を生じさせた。反対に、上記のことは、最初の移植においてＢＭＰ−４で前処理したＧＢＭ細胞を与えた動物では不可能であり、また同じマウスの一次腫瘍から急性単離した細胞３×１０５個を直接注入しても二次腫瘍を確立することは不可能であった。
【０２１５】
総合すると、これらの所見は、ＢＭＰ−４への一時的な曝露であっても、ＧＢＭのｔＮＳＣ集団を激減させ、ＧＢＭ細胞のインビボにおける腫瘍発生能力を顕著に低下させることを実証するものである。さらに実施例１３を参照されたい。
【０２１６】
実施例２２：ＢＭＰ−４のインビボ送達により脳内腫瘍の確立および増大が防止される
次に、脳内腫瘍の確立および増大を防止する治療法としての、ＢＭＰ−４のインビボ送達について評価した。ＧＢＭを移植する際、細胞と同時（同時処理例）または１０日後（後処理例）に、ビヒクル（対照）またはＢＭＰ−４で飽和させたポリアクリル酸ビーズ（１週間以上ＢＭＰ−４を放出）を、細胞移植部位に注入した。双方の処理群における組織学的な一連の再構成から、ＢＭＰ−４処理した動物では対照に対して腫瘤の最大増量が著しく減少することが明らかになった。具体的には、すべての実験設定において、対照のビーズを与えた動物は大きな悪性腫瘍を生じ（図１４Ｃ（培養したＧＢＭ細胞、注入後４週間、同時処理例）；図１４Ｅ（単離直後のＧＢＭ細胞、細胞注入後３０日、後処理例））かつすぐに死亡した（図１４Ｊ）が、ＢＭＰ４放出ビーズを注入したマウスでは小さく制限された病変が見られ（図１４Ｄ（培養したＧＢＭ細胞、注入後４週間、同時処理例）；図１４Ｆ（単離直後のＧＢＭ細胞、細胞注入後３０日、後処理例）；そして有意に長く生存した（図１４Ｊ）。対照の腫瘍は、多形態性で、新生物形成性の高い要素を、反応性の染色質および悪性の高い浸潤性の細胞と共に含んでいた（図１４Ｇ）。反対に、ＢＭＰ−４処理した動物は、新生物形成性の低い細胞、多数の高度に分化した要素および多数のマクロファージを含む病変を示した（図１４Ｈ）。分裂指数は、ＢＭＰ−４処理した動物に
対して対照で有意に高かった（同時処理：対照の３．８±０．２に対しＢＭＰ−４では０．２０±０．１；ｐ＜０．０１。後処理：対照の４．３±０．３に対しＢＭＰ−４では０．７±０．３；ｐ＜０．０５。平均±ＳＥ、ｎ＝４、両側スチューデントｔ検定）。インビボにおける免疫蛍光法から、対照の腫瘍およびＢＭＰ４処理した腫瘍のいずれにおいても、星状細胞およびネスチン陽性細胞は存在するが、乏突起膠細胞やニューロン細胞は存在しないことが明らかとなった。
【０２１７】
これらの結果は、ＢＭＰ−４を放出するか、そうでなければＢＭＰ−４を送達するデバイスの脳内移植が、ヒトにおけるＧＢＭの治療に有効と思われることを示唆している。
実施例２３：ＢＭＰ−４抗体中和実験
実施例１９は、内在性のＢＭＰ４および他のＢＭＰがＧＢＭ細胞中に見出されることを示している。先の実施例で示された所見と一致して、抗ＢＭＰ４中和抗体はｔＮＳＣの増殖を増大させる。これは、内在性のＢＭＰはインビボで生理的にＧＢＭ細胞に作用しうるが、その影響は腫瘍の成長を停止させるのには不十分であることを示唆している。この現象の背景にあるメカニズム、例えば腫瘍中に内在性ＢＭＰアンタゴニストが存在する可能性について検討することは（カナリ（Ｃａｎａｌｉｓ）ら、Ｅｎｄｏｃｒ  Ｒｅｖ  第２巻、ｐ．２１８−３５、２００３年）、ＧＢＭ治療のための別の戦略を指し示し得る。さらに、ＢＭＰ、ＢＭＰの同系統レセプタおよびＢＭＰに関連する細胞内の伝達メカニズム、特にＳｍａｄ経路は、ＧＢＭの確立および増殖の主因である細胞に対してより特異的に照準を定める治療法の有望な標的として浮上する。
【０２１８】
実施例２４：初代培養、培養増殖、クローニングおよび細胞株の確立
ＧＢＭ細胞は、ガルリ（Ｇａｌｌｉ）ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００４）第６４巻、ｐ．７０１１−７０２１に記述されるように腫瘍サンプルを処理して得た。急性単離した細胞を、ＣＤ１３３への免疫反応性について選別し（以下を参照）、ＮｅｕｒｏＣｕｌｔ（登録商標）ＮＳ−Ａ無血清培地（ステムセルテクノロジーズ）中で最終密度を１ｃｍ2あたり細胞２５００個として２５ｃｍ2組織培養フラスコに播種した。培養増殖、クローン形成の分析および集団の解析は、ガルリ（Ｇａｌｌｉ）ら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  第１２９巻、ｐ．１６３３−４４（２００２）にすでに記載されているのと同一の条件を使用して実施した。急性単離したＣＤ１３３＋ＧＢＭ細胞のＢＭＰ４による前処理については、これらの細胞を、同じ培地でマイトジェンを欠くもの（対照）または１００ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４を含むものの中で、移植に先立って４８時間プレート培養した。
【０２１９】
実施例２５：免疫細胞化学  ２．５×１０４個／ｃｍ2のＧＢＭ細胞を、ＦＧＦ２／Ｅ
ＧＦの存在下でＭａｔｒｉｇ
ｅｌ（ＴＭ）コーティングされたガラス製カバーガラス上に播種し、ＢＭＰ４（１００ｎｇ／ｍｌ）で４８時間処理した。その後、細胞を洗浄し、４％のパラホルムアルデヒド中で固定した（１０分）。ガルリ（Ｇａｌｌｉ）ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００４）第６４巻、ｐ．７０１１−７０２１に記述されるようにして、神経抗原（ＧＦＡＰ、ダコ・コーポレーション（Ｄａｋｏ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）；Ｔｕｊ１、バブコ（Ｂａｂｃｏ）；Ｇａｌｃ、ケミコン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ））について多重免疫蛍光法を実施した。Ｋｉ６７染色（１：１０００、英国ニューカースル所在のノボカストラ（ＮｏｖｏＣａｓｔｒａ））により、増殖している細胞を検出した。
【０２２０】
４％パラホルムアルデヒド中で固定した後、ＢＭＰＲ−１Ａ、−１Ｂおよび−２について、製造業者の指示書に従って免疫染色した（１：５０  Ｒ＆Ｄシステムズ）。リン酸化Ｓｍａｄ１について染色する場合（１：１００  米国マサチューセッツ州ベヴァリー所在のセルシグナリング（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ））、細胞をＢＭＰ−４（１００ｎｇ／ｍｌ）で様々な時間（５分〜２時間）処理した。適切なアイソタイプ対照または陰性
対照を、これらの手順全体にわたって常に含めた。オリジナルのＴＵＮＥＬ法に、ガブリエリ（Ｇａｖｒｉｅｌｉ）ら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  第１１９巻、ｐ．４９３−５０１（１９９２）によるジゴキシゲニンに基づいた変更を加えて、フルオレセイン−ｄＵＴＰ  ＴＵＮＥＬ法（Ｉｎ  Ｓｉｔｕ細胞死検出キット、フルオレセイン、ロッシュ・アプライドサイエンス（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ））を使用してアポトーシスの細胞を検出した。簡潔に述べると、１２ｍｍのカバーガラス上で増殖させた細胞を、４％パラホルムアルデヒド中で室温にて１０分間固定し、次にＰＢＳですすいだ。その後、細胞を氷中で２分間透過処理してからＴＵＮＥＬ反応液５０ｕｌで標識し、パラフィルムカバーガラス下の湿潤チャンバ内で３７℃にて１時間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、スライドを、ＤＡＰＩを含んだＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（ＴＭ）にマウントし、蛍光顕微鏡法で調べた。ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色については、細胞を４％パラホルムアルデヒド中で室温にて１０分固定し、ＰＢＳですすぎ、ＰＩ（１ｕｇ／ｍｌ）とともに室温で５分間インキュベートした。洗浄後、カバーガラスをＤＡＰＩ含有Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（ＴＭ）にマウントし、蛍光顕微鏡法で調べた。ＰＩ排除法により生細胞を示した。実施例１９の分析法については、サンプルを各試験条件につき６連で実施した。
【０２２１】
実施例２６：従来型ＰＣＲおよびリアルタイムＰＣＲ
全ＲＮＡを、ＴＲＩｚｏｌ試薬（米国メリーランド州ロックヴィル所在のライフ・テクノロジーズ）を使用して培養ＧＢＭ細胞および急性単離したＧＢＭ細胞から単離し、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＲＮＡｓｅＨ逆転写酵素（ライフ・テクノロジーズ）を使用して逆転写した。従来型のＰＣＲ反応で鋳型として使用したｃＤＮＡの量は、グリセリンアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）に関して標準化した。ＭＣＦ−７細胞株をＢＭＰＲに関する陽性対照として使用した。ＰＣＲ生成物は、臭化エチジウムで染色したアガロース（１％）ゲル中での電気泳動によって視覚化した。
【０２２２】
定量的ＲＴ−ＰＣＲ反応は、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ（登録商標）ＳＹＢＲ（登録商標）グリーンＱＰＣＲコア試薬キット（米国カリフォルニア州ラ・ホーヤ所在のストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））を用いて３連で実施した。ＳＹＢＲグリーン色素はあらゆるＰＣＲ生成物に結合し、したがって配列特異的プローブを使用する必要がない。蛍光性の発光をリアルタイムで記録した（Ｃｈｒｏｍｏ４（ＴＭ）４色リアルタイムＰＣＲ検出器、ＭＪリサーチ（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、バイオラッド（ＢＩＯ−ＲＡＤ））。遺伝子発現の解析は、相対的な定量法の比較Ｃｔ法を使用して完了した。相対的なＲＮＡ量を２つの内在性の対照すなわちＧＡＰＤＨおよび１８ＳリボソームＲＮＡ（１８Ｓ  ｒＲＮＡ）に対して標準化した。
【０２２３】
従来型ＰＣＲについては、次のプライマー、すなわち、ＢＭＰ４、順方向：５’−ｃｔｔｃａｇｔｃｔｇｇｇｇａｇｇａｇ−３’、逆方向：５’−ｇａｔｇａｇｇｔｇｃｃｃａｇｇｃａｃ−３’；ＢＭＰＲ１Ａ、順方向：５’−ａａｔｇｇａｇｔａａｃｃｔｔａｇｃａｃｃａｇａｇ−３’、逆方向：５’−ａｇｃｔｇａｇｔｃｃａｇｇａａｃｃｔｇｔａｃ−３’；ＢＭＰＲ１Ｂ、順方向：５’−ｇｇｔｔｇｃｃｔｇｔｇｇｔｃａｃｔｔｃｔｇｇ−３’、逆方向：５’−ｔａｇｔｃｔｇｔｇａｔｔａｇｇｔａｃａａｃｔｇｇ−３’；ＢＭＰＲ２、順方向：５’−ｔｃａｇａｔａｔａｔｇｇｃａｃｃａｇａａｇｔｇ−３’、逆方向：５’−ｇｔｇｇａｇａｇｇｃｔｇｇｔｇａｃａｃｔｔｇ−３’；ＧＡＰＤＨ、順方向：５’−ｃｇｇａｇｔｃａａｃｇｇａｔｔｔｇｇｔｃｇｔａｔ−３’、逆方向：５’−ａｇｃｃｔｔｃｔｃｃａｔｇｇｔｇｇｔｇａａｇａｃ−３’を使用した。ＰＣＲ増幅条件は、５６℃でプライマーをアニーリングする３５サイクルで構成されるものとした。
【０２２４】
ＲＴ−ＰＣＲについては、次のプライマー、すなわち、ＢＭＰＲ１Ａ、順方向：５’−ｃａｇｇｔｔｃｃｔｇｇａｃｔｃａｇｃｔｃ−３’、逆方向：５’−ｃｔｔｔｃｃｔｔｇ
ｇｇｔｇｃｃａｔａａａ−３’；ＢＭＰＲ１Ｂ、順方向：５’−ａａａｇｇｔｃｇｃｔａｔｇｇｇｇａａｇｔ−３’、逆方向：５’−ｇｃａｇｃａａｔｇａａａｃｃｃａａａａｔ−３’；ＢＭＰＲ２、順方向：５’−ｇｃｔａａａａｔｔｔｇｇｃａｇｃａａｇｃ−３’、逆方向：５’−ｃｔｔｇｇｇｃｃｃｔａｔｇｔｇｔｃａｃｔ−３’；ＧＡＰＤＨ：従来型ＰＣＲについて記載したのと同じプライマーを使用；１８Ｓ  ｒＲＮＡ、順方向：５’−ａｇｔｃｃｃｔｇｃｃｃｔｔｔｇｔａｃａｃａ−３’、逆方向：５’−ｇａｔｃｃｇａｇｇｇｃｃｔｃａｃｔａａａｃ−３’を使用した。プライマーの特異性は、解離曲線分析（Ｏｐｔｉｃｏｎ（登録商標）２およびＣｈｒｏｍｏ４（ＴＭ）リアルタイム・システム・ソフトウェア、ＭＪリサーチ（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ））により、ＰＣＲを実施するごとに確認した。ＲＴ−ＰＣＲ増幅条件は、５６℃でプライマーをアニーリングする４０サイクルで構成されるものとした。
【０２２５】
実施例２７：ウェスタンブロッティング
培養ＧＢＭ細胞および急性単離されたＧＢＭ細胞を冷ＰＢＳで洗浄し、５００μｌの１×サンプル・バッファー（６２．５ｍＭトリスＨＣｌ、２５℃でｐＨ６．８；２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ；１０％グリセロール；５０ｍＭ  ＤＴＴ；０．０１％（ｗ／ｖ）ブロモフェノールブルー）で溶解することにより、タンパク質を採取した。サンプルを氷中でインキュベートし、−２０℃で保存した。アリコートを５分間沸騰させ、氷中でインキュベートし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（１０ｃｍ×１０ｃｍ）に２０μｌ／レーンとして載せた。その後、タンパク質をニトロセルロース・メンブレンに転写した。メンブレンを、ＴＢＳ中５％粉乳／０．１％トゥイーンで室温にて１時間ブロッキング処理し、１５ｍｌのＴＢＳ／０．１％トゥイーンで３回洗浄した。その後、ブロットを、ＴＢＳ中５％粉乳／０．１％トゥイーンの中で、抗Ｓｍａｄ１−５−８抗体（１：１０００；セルシグナリング（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ））、抗リン酸化Ｓｍａｄ１−５−８抗体（１：１０００；セルシグナリング）、抗Ｓｍａｄ４抗体（１：２００；サンタクルーズ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ））、抗ＢＭＰ４抗体（１：４００、ケミコン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ））とともにインキュベートした。すべてのブロットについて、メンブレンを１５ｍｌのＴＢＳ／０．１％トゥイーンで３回洗浄し、次いでホースラディッシュ結合型の適切な二次抗体（１：１０００、アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））とともに、ＴＢＳ中５％粉乳／０．１％トゥイーンの中で室温にて１時間インキュベートした。バンドを化学発光（ＥＣＬ；アマシャム）によって視覚化した。
【０２２６】
実施例２８：フローサイトメトリー
ｐ３８およびＳｍａｄ１−５−８のリン酸化状態を決定するために、細胞調製物を遠心分離し、０．５ｍｌのＰＢＳおよび０．５ｍｌの４％パラホルムアルデヒド中に３７℃で１０分間再浮遊させた。その後、あらかじめ冷却したＧＢＭ細胞を優しく攪拌しながら同細胞に氷冷１００％メタノールをゆっくり添加して、終濃度９０％のメタノールとすることにより、細胞を透過処理した。４℃で３０分間のインキュベーションおよび遠心分離に続いて、細胞をＰＢＳ中０．５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、シグマ）３ｍｌで２回洗浄し、１５０ｕｌのＰＢＳに再浮遊させ、室温で１０分間インキュベートした。インキュベーション後、１：５０希釈の抗リン酸化Ｓｍａｄ１−５−８ウサギポリクローナル抗体（セルシグナリング）または１：５０希釈のリン酸化ｐ３８  ＭＡＰキナーゼ・ウサギポリクローナル抗体（セルシグナリング）に対し、暗所にて室温で１時間曝露した。十分に洗浄した後、１：８００希釈のヤギ抗ウサギＩｇ  ＦＩＴＣ標識抗体（ＢＤ、ファーミンゲン（ＢＤ，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ））を添加し、各チューブを暗所にて室温で３０分間インキュベートした。ＰＢＳ中０．５％ＢＳＡ（シグマ）３ｍｌで２回洗浄した後、細胞を０．５ｍｌのＰＢＳに再浮遊させ、フローサイトメトリーによって分析した。自己蛍光およびアイソタイプの対照について、上記の分析法すべてについて常に実施した。
【０２２７】
細胞周期分析については、１サンプルあたり１００万個の培養ＧＢＭ細胞および急性単
離したＧＢＭ細胞を、ＢＭＰ４（１００ｎｇ／ｍｌ）で指定の時間処理した。その後、ＧＢＭ細胞を、氷冷ＰＢＳおよび１００％エタノールの等容量混合物に再浮遊させ、氷中で３０分間インキュベートした。遠心分離した後、細胞ペレットをＰＢＳで３回洗浄し、５分間遠心分離した。その後、ＧＢＭ細胞を、ＲＮＡｓｅ（１２．５ｕｇ／ｍｌ；シグマ）およびヨウ化プロピジウム（３ｕｇ／ｍｌ；シグマ）を含んだ１ｍｌのＰＢＳ中で暗所にて一晩インキュベートし、フローサイトメトリーによって分析した。
【０２２８】
ＣＤ１３３発現の定量化については、生細胞を区別するために７−アミノアクチノマイシンＤ（７ＡＡＤ）を使用して二重染色フローサイトメトリーを実施した。ＰＢＳで洗浄した後、ＧＢＭ細胞を７ＡＡＤ標識バッファ（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％ＢＳＡおよび０．００４％サポニンを含む０．１Ｍリン酸−クエン酸バッファ、ｐＨ６．０）中に再浮遊させた後、トバ（Ｔｏｂａ）ら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  第１８２巻、ｐ．１９３−２０７（１９９５）に記述されるように７ＡＡＤを終濃度２０ｕＭとなるように添加した。５〜７分の７ＡＡＤインキュベーションに続いて、ＧＢＭ細胞をＣＤ１３３／１（ＣＤ１３３）−ＰＥ結合型モノクローナル抗体（１：４０、ミルテニーバイオテク（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ））とともに４℃で３０分間インキュベートし、１ｍｌの増殖培地で洗浄した。その後、細胞を５００×ｇで５分間遠心分離し、０．５ｍｌの増殖培地中に再浮遊させ、フローサイトメトリーで分析した。同じ分析を、さらにＣＤ１３３／２（２９３Ｃ３）−ＰＥ結合型モノクローナル抗体を用いて実施し、同一の結果を得た。
【０２２９】
ＧＢＭ細胞の選別（ＭｏＦｌｏ（ＴＭ）高速セルソーター、ダコサイトメーション（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ））は、同じ希釈率のＣＤ１３３／１（ＣＤ１３３）−ＰＥ結合型抗体およびＣＤ１３３／２（２９３Ｃ３）−ＰＥ結合型抗体を使用して実施した。シン（Ｓｉｎｇｈ）らの文献（Ｎａｔｕｒｅ（２００４）第４３２巻、ｐ．３９６−４０１）に記述されているように、選別した細胞を、同じ抗体を使用してＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＴＭ）装置（ＢＤバイオサイエンシズ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））を用いたフローサイトメトリーによって純度分析した。純度はＣＤ１３３陽性および陰性のフラクションのいずれについても少なくとも８７％であった。
【０２３０】
グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、βＩＩＩチューブリンおよびガラクトセレブロシドＣ（ＧａｌＣ、「ＧＣ」と称されることもある）の定量化については、３．０−３．４ｕｍのレインボーキャリブレーション粒子混合物（８ピーク）（ＢＤバイオサイエンシズ）をキャリブレーションに使用し、細胞の標識強度を、フィコエリスリン１分子相当の蛍光量（ＭＥＰＥ）またはフルオレセイン１分子相当の蛍光量（ＭＥＦＬ）として表した。簡潔に述べると、細胞内染色については、細胞を、０．５ｍｌのＣｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（ＴＭ）溶液（ＢＤバイオサイエンシズ）中で室温にて２０分間透過処理した。細胞を２ｍｌのＢＤ  Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ（ＴＭ）１×（ＢＤバイオサイエンシズ）で洗浄し、室温で１０分間インキュベートした。遠心分離した後、該細胞を、適切な一次抗体混合物を含んだ０．２ｍｌのＢＤ  Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ（ＴＭ）１×（ＢＤバイオサイエンシズ）中に再浮遊させた。膜抗原については、細胞を０．２ｍｌの増殖培地中に再浮遊させ、次いで以下の一次抗体、すなわち１：４００の抗ＧＦＡＰポリクローナル抗体（ダコ・コーポレーション）、抗βＩＩＩチューブリンモノクローナル抗体（バブコ）、および抗ｇａｌＣモノクローナル抗体（ケミコン）、とともに４℃で３０分間インキュベートした。その後、細胞を洗浄し、４℃で３０分間二次抗体に曝露した。細胞内の抗原の場合には、二次抗体は１：８００のヤギ抗ウサギＩｇ  ＦＩＴＣ標識抗体またはヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｒ−ＰＥ標識抗体（ＢＤファーミンゲン）であり、膜抗原については、１：１０００のＦＩＴＣ結合型Ｆ（ａｂ’）２ヤギ抗マウスＩｇＭまたはＦＩＴＣ結合型ヤギ抗マウスＩｇＭ（ジャクソン・イムノリサーチ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ））を使用した。十分に洗浄した後、細胞を再浮遊させてフローサイトメト
リーによって分析した。
【０２３１】
上記のすべての分析法について、分析は、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ（ＴＭ）ソフトウェア（ＢＤバイオサイエンシズ）を使用してフローサイトメトリー（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、ＢＤバイオサイエンシズ）によって実施した。バックグラウンドの蛍光は、特異的一次抗体を特異的アイソタイプ対照で代用することにより概算した。自己蛍光の計測も、各試験条件について常に実施した。
【０２３２】
実施例２９：同所注入および免疫組織化学による腫瘍形成性の評価
腫瘍形成性は、コントロール条件の下で、または１００ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ−４をさらに追加した条件で４８時間培養したＧＢＭ細胞の同所移植によって測定した。移植に先立って、細胞を洗浄しＰＢＳ中に再浮遊させた（１０８個／ｍｌ）。３マイクロリットルを、ガルリ（Ｇａｌｌｉ）ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００４）第６４巻、ｐ．７０１１−７０２１にすでに記載されているようにして免疫不全マウスの右側線条体に定位的に注入した。ポリマーを用いたＢＭＰ−４の送達は、ＢＭＰ−４を装荷したヘパリン・アクリル樹脂ビーズ（動物１匹あたり１００個のビーズ；シグマ・アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ））を使用して実施した。移植に先立って、ＰＢＳ単独または０．６５μｇ／μｌのＢＭＰ４を含むＰＢＳ中でビーズを３７℃にて１時間インキュベートし、そしてＰＢＳで２×３回徹底的にすすいでから移植した。ヘマトキシリン−エオジン染色および免疫組織化学分析を、ガルリ（Ｇａｌｌｉ）ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００４）第６４巻、ｐ．７０１１−７０２１にすでに記載されているようにして処理した、パラフィン包埋した４ｕｍ厚のミクロトーム切片について実施した。
【０２３３】
期間中（Ｘ軸）の生存者の累積的な見込み（Ｙ軸）の下方傾斜プロットは、ソフトウェアＭｅｄＣａｌｃ（ベルギー国所在のマリアケルク（Ｍａｒｉａｋｅｒｋｅ））を使用して実施した。生存の有意差はログランク検定によって測定した。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
0005891068.tif 000039
【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
0005891068.tif 000041
【図３Ｂ】
0005891068.tif 000042
【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
0005891068.tif 000044
【図４Ｃ】
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【図５】
0005891068.tif 000046
【図６】
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【図７】
0005891068.tif 000048
【図８】
0005891068.tif 000049
【図９】
0005891068.tif 000050
【図１０】
0005891068.tif 000051
【図１１】
0005891068.tif 000052
【図１２Ａ】
0005891068.tif 000053
【図１２Ｂ】
0005891068.tif 000054
【図１２Ｃ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１３Ｆ】
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【図１３Ｇ】
0005891068.tif 000062
【図１３Ｈ】
0005891068.tif 000063
【図１３Ｉ】
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【図１３Ｊ】
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【図１３Ｋ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【図１４Ｆ】
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【図１４Ｇ】
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【図１４Ｈ】
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【図１４Ｊ】
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【図１５】
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