(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮下単回投与するために製剤化された0.5g〜70gの免疫グロブリン（IG）を含む第1液体組成物であって、
第1液体組成物中のIGのタンパク質濃度は5〜15%w/vであり、
第1液体組成物の量は50ml〜700mlである、
第1液体組成物、
および、
IGと組み合わせて皮下単回投与するために製剤化された可溶性ヒアルロニダーゼを含む第2液体組成物であって、
第2液体組成物は第1液体組成物とは分離して製剤化されており、
第2液体組成物の量は5〜30mlであり、
第2液体組成物は、単位(U)ヒアルロニダーゼ/グラム(g)IG比で10〜500U/gである量の可溶性ヒアルロニダーゼを含み、
第2液体組成物は、第1液体組成物の投与の前に第1液体組成物と同じ部位に投与されるためのものであり、それにより、同じIGで処置可能な疾患または病状の治療のために静脈内投与で投与されるのと同じ単回投与量のIGのバイオアベイラビリティの少なくとも90％まで、IGのバイオアベイラビリティを増大させる、
第2液体組成物
を含む、対象におけるIGで処置可能な疾患または病状の治療のために皮下投与されるIGのバイオアベイラビリティを増大させるためのキット。
【請求項２】
該第1および第2液体組成物が、二重チャンバー容器または互いに分離している単一容器に入っている請求項1記載のキット。
【請求項３】
該容器がシリンジ、チューブ、または瓶である請求項2記載のキット。
【請求項４】
該容器が、さらに注射用針を含む請求項3記載のキット。
【請求項５】
該可溶性ヒアルロニダーゼがPH20またはそのトランケート型である請求項1〜4のいずれかに記載のキット。
【請求項６】
PH20がヒツジ、ウシ、またはトランケートヒトPH20から選ばれる請求項5記載のキット。
【請求項７】
該トランケートヒトPH20が、配列番号4〜9のいずれかに記載のアミノ酸配列、または、配列番号4〜9のいずれかに記載のアミノ酸配列に少なくとも91％の配列同一性を示すアミノ酸配列を有するポリペプチドから選ばれる請求項6記載のキット。
【請求項８】
該可溶性ヒアルロニダーゼがrHuPH20である請求項1〜7のいずれかに記載のキット。
【請求項９】
IGがヒト血漿から精製される請求項1〜8のいずれかに記載のキット。
【請求項１０】
第1液体組成物の量が、100ml、150ml、200ml、300ml、400ml、500ml、600ml、または700mlである、請求項1〜9のいずれかに記載のキット。
【請求項１１】
第1液体組成物中のIGのタンパク質濃度が6〜15%w/vまたは8〜12%w/vである請求項1〜10のいずれかに記載のキット。
【請求項１２】
該タンパク質濃度が10%w/vである請求項11記載のキット。
【請求項１３】
第1液体組成物が、20〜30g、あるいは5g、10g、15g、20g、21g、22g、23g、24g、25g、26g、27g、28g、29g、30g、31g、32g、33g、34g、35g、36g、37g、38g、39g、または40gのIGを含む、請求項1〜12のいずれかに記載のキット。
【請求項１４】
第2液体組成物の量が、5ml、6ml、7ml、8ml、9ml、10ml、20mlまたは30mlである、請求項1〜13のいずれかに記載のキット。
【請求項１５】
第2液体組成物が、1,000単位〜10,000単位または5000単位〜7500単位である量の可溶性ヒアルロニダーゼを含む、請求項1〜14のいずれかに記載のキット。
【請求項１６】
第2液体組成物が、単位ヒアルロニダーゼ/グラムIG比で10U/g、20U/g、30U/g、40U/g、50U/g、60U/g、70U/g、80U/g、90U/g、100U/g、150U/g、200U/g、300U/g、400U/gまたは500U/gである量の可溶性ヒアルロニダーゼを含む、請求項1〜15のいずれかに記載のキット。
【請求項１７】
第1液体組成物が27〜61gまたは25.5〜61.2gのIGを含み、第2液体組成物が単位ヒアルロニダーゼ/グラムIG比で50U/gである量の可溶性ヒアルロニダーゼを含む、請求項1〜16のいずれかに記載のキット。
【請求項１８】
第1液体組成物および第2液体組成物が、1日1回、1週間に1回、2週間に1回、2〜3週間に1回、3〜4週間に1回、または1月に1回投与するための量で製剤化される請求項1〜17のいずれかに記載のキット。
【請求項１９】
該IGで処置可能な疾患または病状が以下から選ばれる請求項1〜18のいずれかに記載のキット：免疫不全；血液悪性腫瘍に続発する後天性低ガンマグロブリン血症；川崎病；慢性炎症性脱髄性多発神経障害(CIDP)；ギランバレー症候群；特発性血小板減少性紫斑病；炎症性筋疾患；ランバート・イートン（Lambert-Eaton）筋無力症候群；多巣性運動ニューロパシー；重症筋無力症；メルシュ・ヴォルトマン（Moersch-Woltmann）症候群；続発性低ガンマグロブリン血症(医原性免疫不全を含む)；特異抗体欠損症；急性播種性脳脊髄炎；ANCA陽性全身性壊死性血管炎；自己免疫性溶血性貧血；水疱性類天疱瘡；瘢痕性類天疱瘡；エバンス（Evans）症候群(免疫性血小板減少症を伴う自己免疫性溶血性貧血を含む)；胎児（Foeto）-妊婦/新生児同種免疫性血小板減少症(FMAIT/NAIT)；血球貪食症候群；ハイリスク同種造血幹細胞移植；IgMパラプロテイン血症性ニューロパシー；腎臓移植；多発性硬化症；眼球クローヌス・ミオクローヌス運動失調；落葉状天疱瘡；尋常性天疱瘡；輸血後紫斑病；中毒性表皮剥離症/スティーブンス・ジョンソン症候群(TEN/SJS)；毒素性ショック症候群；アルツハイマー病；全身性エリテマトーデス；多発性骨髄腫；敗血症；B細胞腫瘍；外傷；および細菌、ウイルス、または真菌感染症。
【請求項２０】
該IGで処置可能な疾患または病状が免疫不全であり、該免疫不全が以下から選ばれる請求項19に記載のキット：分類不能型免疫不全症(CVID)、先天性無ガンマグロブリン血症、ウィスコット・アルドリッチ症候群、重症複合免疫不全(SCID)、原発性低ガンマグロブリン血症、抗体欠損症を伴う原発性免疫不全疾患、X連鎖無ガンマグロブリン血症(XLA)、新生児低ガンマグロブリン血症、および抗体を伴わない傍腫瘍性小脳変性症。
【請求項２１】
該IGで処置可能な疾患または病状が、血液悪性腫瘍に続発する後天性低ガンマグロブリン血症であり、該血液悪性腫瘍が、慢性リンパ球性白血病(CLL)、多発性骨髄腫(MM)、および非ホジキンリンパ腫(NHL)から選ばれる請求項19に記載のキット。
【請求項２２】
該IGで処置可能な疾患または病状が炎症性筋疾患であり、該炎症性筋疾患が多発性筋炎、皮膚筋炎、および封入体筋炎から選ばれる請求項19に記載のキット。
【請求項２３】
該IGで処置可能な疾患または病状が、細菌、ウイルス、または真菌性病状であり、該細菌、ウイルス、または真菌が以下から選ばれる請求項19に記載のキット：ヘモフィルス・インフルエンザエ（Haemophilus influenzae）タイプB、シュードモナス・エルジノーサ（Pseudomonas aeruginosa）タイプAおよびB、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、B群連鎖球菌、肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）タイプ1、3、4、6、7、8、9、12、14、18、19、および23、アデノウイルスタイプ2および5、サイトメガロウイルス、エプスタイン・バー・ウイルスVCA、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス-1、単純ヘルペスウイルス-2、A型インフルエンザ、麻疹、パラインフルエンザ（Parainfluenza）タイプ1、2および3、ポリオ、水痘帯状疱疹ウイルス、アスペルギルス、およびカンジダ・アルビカンス（Candida albicans）。
【請求項２４】
対象のIGで処置可能な疾患または病状を治療するための医薬を製造するための、請求項1に記載の第1液体組成物および第2液体組成物の使用。
【請求項２５】
該IGで処置可能な疾患または病状が以下から選ばれる請求項24に記載の使用：免疫不全；血液悪性腫瘍に続発する後天性低ガンマグロブリン血症；川崎病；慢性炎症性脱髄性多発神経障害(CIDP)；ギランバレー症候群；特発性血小板減少性紫斑病；炎症性筋疾患；ランバート・イートン（Lambert-Eaton）筋無力症候群；多巣性運動ニューロパシー；重症筋無力症；メルシュ・ヴォルトマン（Moersch-Woltmann）症候群；続発性低ガンマグロブリン血症(医原性免疫不全を含む)；特異抗体欠損症；急性播種性脳脊髄炎；ANCA陽性全身性壊死性血管炎；自己免疫性溶血性貧血；水疱性類天疱瘡；瘢痕性類天疱瘡；エバンス（Evans）症候群(免疫性血小板減少症を伴う自己免疫性溶血性貧血を含む)；胎児（Foeto）-妊婦/新生児同種免疫性血小板減少症(FMAIT/NAIT)；血球貪食症候群；ハイリスク同種造血幹細胞移植；IgMパラプロテイン血症性ニューロパシー；腎臓移植；多発性硬化症；眼球クローヌス・ミオクローヌス運動失調；落葉状天疱瘡；尋常性天疱瘡；輸血後紫斑病；中毒性表皮剥離症/スティーブンス・ジョンソン症候群(TEN/SJS)；毒素性ショック症候群；アルツハイマー病；全身性エリテマトーデス；多発性骨髄腫；敗血症；B細胞腫瘍；外傷；および細菌、ウイルス、または真菌感染症。
【請求項２６】
該IGで処置可能な疾患または病状が免疫不全であり、該免疫不全が以下から選ばれる請求項25に記載の使用：分類不能型免疫不全症(CVID)、先天性無ガンマグロブリン血症、ウィスコット・アルドリッチ症候群、重症複合免疫不全(SCID)、原発性低ガンマグロブリン血症、抗体欠損症を伴う原発性免疫不全疾患、X連鎖無ガンマグロブリン血症(XLA)、新生児低ガンマグロブリン血症、および抗体を伴わない傍腫瘍性小脳変性症。
【請求項２７】
該IGで処置可能な疾患または病状が、血液悪性腫瘍に続発する後天性低ガンマグロブリン血症であり、該血液悪性腫瘍が、慢性リンパ球性白血病(CLL)、多発性骨髄腫(MM)、および非ホジキンリンパ腫(NHL)から選ばれる請求項25に記載の使用。
【請求項２８】
該IGで処置可能な疾患または病状が炎症性筋疾患であり、該炎症性筋疾患が多発性筋炎、皮膚筋炎、および封入体筋炎から選ばれる請求項25記載の使用。
【請求項２９】
該IGで処置可能な疾患または病状が、細菌、ウイルス、または真菌性病状であり、該細菌、ウイルス、または真菌が以下から選ばれる請求項25に記載の使用：ヘモフィルス・インフルエンザエ（Haemophilus influenzae）タイプB、シュードモナス・エルジノーサ（Pseudomonas aeruginosa）タイプAおよびB、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、B群連鎖球菌、肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）タイプ1、3、4、6、7、8、9、12、14、18、19、および23、アデノウイルスタイプ2および5、サイトメガロウイルス、エプスタイン・バー・ウイルスVCA、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス-1、単純ヘルペスウイルス-2、A型インフルエンザ、麻疹、パラインフルエンザ（Parainfluenza）タイプ1、2および3、ポリオ、水痘帯状疱疹ウイルス、アスペルギルス、およびカンジダ・アルビカンス（Candida albicans）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
(関連出願)
米国仮出願No.61/069,841(Richard Schiff、Heinz Leibl、およびGregory Frost；発明の名称「免疫グロブリンおよびヒアルロニダーゼを皮下投与するための組み合わせおよび方法」(2008年3月17日出願))の優先権の利益を主張する。許容されるならば、上記出願の内容は本明細書の一部を構成する。
【０００２】
本願は、米国仮出願No.61/069,841の優先権を主張する、本願と同日に出願された米国特許出願No.12/381,844(発明の名称「免疫グロブリンおよびヒアルロニダーゼを皮下投与するための組み合わせおよび方法」に関連する。許容されるならば、上記関連出願の内容は本明細書の一部を構成する。
(技術分野)
【０００３】
皮下投与用に製剤化された免疫グロブリン(IG)組成物および可溶性ヒアルロニダーゼ組成物を含む組み合わせ、組成物、およびキットを提供する。そのような製品は、IGで処置可能な疾患または病状の治療方法に用いることができる。投与計画が該IGで処置可能な疾患または病状を治療するための同じ用量の静脈内投与のためのものと実質的に同じである免疫グロブリンの皮下投与法も提供する。
【背景技術】
【０００４】
免疫グロブリンの静脈内(IV)投与(IVIG)は、免疫不全の個体の初期治療である。初期のIVIG製剤は重度の副作用を引き起こしたが、現在利用可能なIVIG製剤は、大多数の免疫不全患者が十分許容する。それにも関わらず、少ない割合の患者は、不快な、日常生活に支障をきたすことさえある反応、例えば、頭痛、疲労、および筋肉痛を持ち続ける。発熱および悪寒は、特に患者に併発感染症があるときに依然として問題である。該反応は、他のIVIG製剤を試み、またはアセトアミノフェン、ジフェンヒドラミン、およびコルチコステロイドを前投薬したにも関わらず持続することが多い。さらに、IV投与が必要であるため、患者のコンプライアンスの問題がある。
【０００５】
免疫グロブリンの皮下(SQ)投与は静脈内投与の代替手段である。IV注入に比べて、免疫グロブリンのSQ投与には種々の利点がある。例えば、該SQ投与は、全身反応の発生を減少させ、ときとして困難なIV接近手段を必要とせず、トラフ値を改善し、患者をより自立的にする。単一部位に大量に溶液を投与することは困難なため、一度に2〜5部位を使って、1週間に1または2回SQ注入する必要がある。したがって、1月に1回投与するIVIGと異なり、皮下投与は通常1週間に1回行われる。故に、免疫グロブリンの代替投与法が必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
(要約)
本発明は、免疫グロブリンを皮下投与し、IGで処置可能な疾患または病状を治療するための方法、組成物、組み合わせ、およびキットを提供する。IGで処置可能な疾患または病状を治療するために対象に水溶性ヒアルロニダーゼおよび免疫グロブリン(IG)を皮下投与することにより対象のIGで処置可能な疾患または病状を治療する方法を提供する。IGおよびヒアルロニダーゼの同時投与は、皮下投与されたIGのバイオアベイラビリティを増大し、特定の疾患または病状のための静脈内IG(IVIG)投与と実質的に同じ投与計画を用いたIGの皮下投与を可能にする。IGの投与は、投与量と投与頻度が同じ疾患または病状のためにIVを介して同量をIV(静脈内)投与するためのものと実質的に同じであるように行われる。IVを介した投与量は、特定疾患または病状のために予め決定することができるか、または知られている。典型的には、可溶性ヒアルロニダーゼ存在下の皮下投与用の投与速度はIV投与より速くすることができる。したがって、特定用量の投与回数を減らすことができる。投与速度は、例えばポンプによって調節するか、重力によることができる。
【０００７】
すなわち、可溶性ヒアルロニダーゼおよびIGで処置可能な疾患または病状を治療するのに有効な量の免疫グロブリン(IG)を対象に皮下投与することにより、該疾患または病状の治療が必要な対象のIGで処置可能な疾患または病状の治療方法を提供する。該投与は、(a)IGの量、および(b)対象にIGを連続投与する投与頻度が、対象に対する皮下IG投与の治療効果が同じ投与計画を用いて対象にIGを静脈内投与するのと少なくとも実質的に同等になるように選択される投与計画で行われる。
【０００８】
本発明が提供する例において、皮下投与されたIGのバイオアベイラビリティは、IV注射を介して投与された同じ用量のバイオアベイラビリティの少なくとも約90％である。投与した可溶性ヒアルロニダーゼの量は、わずか1月に1回投与される用量でIGを皮下投与するのに十分であり得る。別の例では、IGの投与はわずか1月に1回である。
【０００９】
本発明が提供する方法および使用において用いる可溶性ヒアルロニダーゼは、PH20またはそのトランケート型でありうる。例えば、該可溶性ヒアルロニダーゼは、ヒツジもしくはウシまたはトランケートヒトPH20でありうる。トランケートヒトPH20を本発明の方法および使用に用いる場合は、該トランケートヒトPH20は、配列番号4〜9のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドもしくはアレル変異体またはその他の変異体から選ぶことができる。ある例では、可溶性ヒアルロニダーゼはrHuPH20である。
【００１０】
本発明の方法および使用に用いる投与されるIGは、例えばアルコール分別によりヒト血漿から精製することができる。ある例では、該IGは、さらに化学修飾、ペプシン存在下または非存在下でpH4.0でインキュベーション、ポリエチレングリコール(PEG)沈殿、イオン交換クロマトグラフィ、酵素的開裂、溶媒洗浄処理、透析、または限外濾過の1またはそれ以上により精製される。本発明が提供する方法および使用は、IgG、IgA、およびIgMを含むIGを用いることができる。ある例ではIGは95%以上のIgGを含む。さらに、IgGはモノマーであり得る。タンパク質安定化賦形剤、例えばグリシン、マルトース、ポリオール、ヒト血清アルブミン、マンニトール、および非イオン性界面活性剤の1またはそれ以上を該IGに存在させることもできる。ある例において、IG製剤のpHは、4.2〜5.4、4.6〜5.1、もしくは4.8〜5.0、または約4.2〜5.4、4.6〜5.1、もしくは4.8〜5.0であり、タンパク質濃度はIG組成物の5〜15%w/v、6〜15%w/v、もしくは8〜12%w/v、または約5〜15%w/v、6〜15%w/v、もしくは8〜12%w/vである。ある例に置いて、IGのタンパク質濃度は10%w/vである。
【００１１】
本発明は、IGで処置可能な疾患または病状を治療するために可溶性ヒアルロニダーゼおよび免疫グロブリン(IG)を皮下投与し、該IGが、10ml/hr〜300ml/hrの速度、例えば、10ml/hr、20ml/hr、30ml/hr、40ml/hr、50ml/hr、60ml/hr、70ml/hr、80ml/hr、90ml/hr、100ml/hr、150ml/hr、200ml/hr、250ml/hr、および300ml/hrの速度、ならびに約10ml/hr、20ml/hr、30ml/hr、40ml/hr、50ml/hr、60ml/hr、70ml/hr、80ml/hr、90ml/hr、100ml/hr、150ml/hr、200ml/hr、250ml/hr、および300ml/hrの速度で投与されるIGで処置可能な疾患または病状を治療するための方法および使用を提供する。該速度は、ポンプまたは重力で調節することができる。ある例において、該IGおよびヒアルロニダーゼは、別個に、同時に、または間欠的に投与される。例えば、該ヒアルロニダーゼは、IG投与の前、例えばIG投与の0.5分、1分、2分、3分、4分、5分、6分、7分、8分、9分、10分、20分、または30分前に投与することができる。他の例では、該IGおよびヒアルロニダーゼは単一組成物中に存在する。さらなる例では、5グラム(g)、10g、15g、20g、21g、22g、23g、24g、25g、26g、27g、28g、29g、30g、31g、32g、33g、34g、35g、36g、37g、38g、39g、もしくは40g、または約5グラム(g)、10g、15g、20g、21g、22g、23g、24g、25g、26g、27g、28g、29g、30g、31g、32g、33g、34g、35g、36g、37g、38g、39g、もしくは40gのIGを投与し、ヒアルロニダーゼは、10U/グラム(g)、20U/g、30U/g、35U/g、40U/g、50U/g、60U/g、70U/g、80U/g、90U/g、100U/g、150U/g、もしくは300U/gの比(単位ヒアルロニダーゼ/グラムIG)で投与される。
【００１２】
可溶性ヒアルロニダーゼおよびIGを本発明の方法および使用を用いて投与し、例えば以下の疾患を治療することができる：免疫不全；血液悪性腫瘍に続発する後天性低ガンマグロブリン血症；川崎病；慢性炎症性脱髄性多発神経障害(CIDP)；ギランバレー症候群；特発性血小板減少性紫斑病；炎症性筋疾患；ランバート・イートン（Lambert-Eaton）筋無力症候群；多巣性運動ニューロパシー；重症筋無力症；メルシュ・ヴォルトマン（Moersch-Woltmann）症候群；続発性低ガンマグロブリン血症(医原性免疫不全を含む)；特異抗体欠損症；急性播種性脳脊髄炎；ANCA陽性全身性壊死性血管炎；自己免疫性溶血性貧血；水疱性類天疱瘡；瘢痕性類天疱瘡；エバンス（Evans）症候群(免疫性血小板減少症を伴う自己免疫性溶血性貧血を含む)；胎児（Foeto）-妊婦/新生児同種免疫性血小板減少症(FMAIT/NAIT)；血球貪食症候群；ハイリスク同種造血幹細胞移植；IgMパラプロテイン血症性ニューロパシー；腎臓移植；多発性硬化症；眼球クローヌス・ミオクローヌス運動失調；落葉状天疱瘡；尋常性天疱瘡；輸血後紫斑病；中毒性表皮剥離症/スティーブンス・ジョンソン症候群(TEN/SJS)；毒素性ショック症候群；アルツハイマー病；全身性エリテマトーデス；多発性骨髄腫；敗血症；B細胞腫瘍；外傷；および細菌、ウイルス、または真菌感染症。該IGおよびヒアルロニダーゼを投与して免疫不全を治療する場合は、該免疫不全は以下から選ぶことができる：分類不能型免疫不全症(CVID)、先天性無ガンマグロブリン血症、ウィスコット・アルドリッチ症候群、重症複合免疫不全(SCID)、原発性低ガンマグロブリン血症、抗体欠損症を伴う原発性免疫不全疾患、X連鎖無ガンマグロブリン血症(XLA)、乳児低ガンマグロブリン血症、および抗体を伴わない傍腫瘍性小脳変性症。
【００１３】
IGで処置可能な疾患または病状が血液悪性腫瘍に続発する後天性低ガンマグロブリン血症である場合は、該血液悪性腫瘍は、慢性リンパ球性白血病(CLL)、多発性骨髄腫(MM)、または非ホジキンリンパ腫(NHL)でありうる。IGで処置可能な疾患または病状が炎症性筋疾患である場合は、該炎症性筋疾患は、多発性筋炎、皮膚筋炎、または封入体筋炎でありうる。
【００１４】
ある場合には、可溶性ヒアルロニダーゼおよびIGは、細菌、ウイルス、または真菌性病状、例えば、ヘモフィルス・インフルエンザエ（Haemophilus influenzae）タイプB、シュードモナス・エルジノーサ（Pseudomonas aeruginosa）タイプAおよびB、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、B群連鎖球菌、肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)タイプ1、3、4、6、7、8、9、12、14、18、19、および23、アデノウイルスタイプ2および5、サイトメガロウイルス、エプスタイン・バー・ウイルス VCA、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス-1、単純ヘルペスウイルス-2、A型インフルエンザ、麻疹、パラインフルエンザ（Parainfluenza）タイプ1、2、および3、ポリオ、水痘帯状疱疹ウイルス、アスペルギルス、およびカンジダ・アルビカンス（Candida albicans）などを治療するために皮下投与される。
【００１５】
本発明は、わずか1月に1回の皮下単回投与用に製剤化されたIGを含む第1組成物、およびわずか1月に1回の単回投与用に製剤化された可溶性ヒアルロニダーゼを含む第2組成物を含む組成物の組み合わせを提供する。該組成物は、二重チャンバー容器または互いに分離している単一容器に存在しうる。ある例では、該ヒアルロニダーゼはIGの前に投与されるように容器中に位置している。該容器はシリンジ、チューブ、または瓶であり得、さらに注射針を含みうる。
【００１６】
本発明が適用する組成物の組み合わせは、PH20またはそのトランケート型を含みうる。例えば、ヒツジ、ウシ、またはトランケートヒトPH20、例えば配列番号4〜9のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドもしくはアレル変異体またはその他の変異体などを本発明の組成物の組み合わせ中に含むことができる。ある例では、該組み合わせ中の可溶性ヒアルロニダーゼはrHuPH20である。さらに、該組成物の組み合わせ中のIGは、ヒト血漿から精製することができ、凍結乾燥するか液体でありうる。
【００１７】
ある例では、該組成物の組み合わせ中の液体の量は、100ml、150ml、200ml、300ml、400ml、500ml、600ml、もしくは700ml、または約100ml、150ml、200ml、300ml、400ml、500ml、600ml、もしくは700mlである。該組成物の組み合わせ中のIGのタンパク質濃度は、IG組成物の5〜15%w/v、6〜15%w/v、もしくは8〜12%w/v、または約5〜15%w/v、6〜15%w/v、もしくは8〜12%w/v、例えば10%w/vでありうる。ある場合には、該組成物中のIGは、5グラム(g)、10g、15g、20g、21g、22g、23g、24g、25g、26g、27g、28g、29g、30g、31g、32g、33g、34g、35g、36g、37g、38g、39g、もしくは40g、または約5グラム(g)、10g、15g、20g、21g、22g、23g、24g、25g、26g、27g、28g、29g、30g、31g、32g、33g、34g、35g、36g、37g、38g、39g、もしくは40gである。該ヒアルロニダーゼは液体でありうる。ある場合には、該ヒアルロニダーゼ液の量は、1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml、7ml、8ml、9ml、10ml、20ml、もしくは30ml、または約1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml、7ml、8ml、9ml、10ml、20ml、もしくは30mlであり、該ヒアルロニダーゼは10単位〜500,000単位、100単位〜100,000単位、500単位〜50,000単位、1000単位〜10,000単位、5000単位〜7500単位、5000単位〜50,000単位、もしくは1,000単位〜10,000単位、または約10単位〜500,000単位、100単位〜100,000単位、500単位〜50,000単位、1000単位〜10,000単位、5000単位〜7500単位、5000単位〜50,000単位、もしくは1,000単位〜10,000単位である。
【００１８】
本発明は、1月に1回の単回投与用に製剤化された免疫グロブリン(IG)および可溶性ヒアルロニダーゼを含む組成物を提供する。該組成物中に含まれる可溶性ヒアルロニダーゼはPH20またはそのトランケート型でありうる。例えば、ヒツジ、ウシまたはトランケートヒトPH20、例えば、配列番号4〜9のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドもしくはアレル変異体またはその他の変異体を、本発明が提供する単回投与用に製剤化された組成物中に含むことができる。ある例では、該組成物中の可溶性ヒアルロニダーゼはrHuPH20である。該組成物中のIGは、ヒト血漿から精製することができ、液体でありうる。典型的な態様において、本発明が提供する単回投与用に製剤化された該組成物中のIGのタンパク質濃度は、IG組成物の5〜15%w/v、6〜15%w/v、もしくは8〜12%w/v、または約5〜15%w/v、6〜15%w/v、もしくは8〜12%w/v、例えば、10%w/vである。該組成物中のIGは、5グラム(g)、10g、15g、20g、21g、22g、23g、24g、25g、26g、27g、28g、29g、30g、31g、32g、33g、34g、35g、36g、37g、38g、39g、もしくは40g、または約5グラム(g)、10g、15g、20g、21g、22g、23g、24g、25g、26g、27g、28g、29g、30g、31g、32g、33g、34g、35g、36g、37g、38g、39g、もしくは40gであり、該ヒアルロニダーゼは、10単位〜500,000単位、100単位〜100,000単位、500単位〜50,000単位、1000単位〜10,000単位、5000単位〜7500単位、5000単位〜50,000単位、もしくは1,000単位〜10,000単位、または約10単位〜500,000単位、100単位〜100,000単位、500単位〜50,000単位、1000単位〜10,000単位、5000単位〜7500単位、5000単位〜50,000単位、もしくは1,000単位〜10,000単位である。該組成物中の液体の量は、100ml、150ml、200ml、300ml、400ml、500ml、600ml、もしくは700ml、または約100ml、150ml、200ml、300ml、400ml、500ml、600ml、もしくは700mlでありうる。
【００１９】
本発明は、わずか1月に1回の皮下単回投与用に製剤化されたIGを含む第1組成物、およびわずか1月に1回の単回投与用に製剤化された可溶性ヒアルロニダーゼを含む第2組成物を含む組成物の組み合わせを含むキットを提供する。本発明は、1月に1回の単回投与用に製剤化された免疫グロブリン(IG)および可溶性ヒアルロニダーゼを含む組成物も提供する。所望により、キットは指示書を含むことができる。
(詳細な説明)
概  要
【００２０】
A.  定義
B.  免疫グロブリン(IG)の皮下投与
C.  免疫グロブリン
D.  ヒアルロニダーゼ
可溶性ヒアルロニダーゼ
可溶性ヒトPH20
可溶性組み換えヒトPH20(rHuPH20)
E.  可溶性ヒアルロニダーゼをコードする核酸およびそのポリペプチドの製造方法
1.  ベクターおよび細胞
2.  発現
a.  原核細胞
b.  酵母細胞
c.  昆虫細胞
d.  哺乳動物細胞
e.  植物
3.  精製技術
F.  免疫グロブリンおよび可溶性ヒアルロニダーゼポリペプチドの製造、製剤、および投与
1.  製剤
凍結乾燥粉末
2.  用量および投与
G.  活性、バイオアベイラビリティ、および薬物動態の評価方法
1.  薬物動態および許容性(忍容性)
2.  生物活性
a.  免疫グロブリン
b.  ヒアルロニダーゼ
H.  治療的使用
1.  抗体欠損症を伴う原発性免疫不全
2.  血液悪性腫瘍に続発する後天性低ガンマグロブリン血症
3.  川崎病
4.  慢性炎症性脱髄性多発神経障害
5.  ギランバレー症候群
6.  特発性血小板減少性紫斑病
7.  炎症性筋疾患：多発性筋炎、皮膚筋炎、および封入体筋炎
8.  ランバート・イートン筋無力症候群
9.  多巣性運動ニューロパシー
10.  重症筋無力症
11.  メルシュ・ヴォルトマン症候群
12.  アルツハイマー病
13.  他の疾患および病状
I.  製品およびキット
J.  実施例
A.  定義
【００２１】
特記しない限り、本明細書で用いているすべての技術用語および科学用語は当業者が通常理解するのと同じ意味を持つ。本明細書に引用した全ての特許、特許出願、公開された出願、および公表文献、Genbank配列、データベース、ウェブサイト、および他の公表資料は、特記しない限り、本明細書の一部を構成する。本明細書に記載の用語に複数の定義がある場合は、この項の定義が優先する。URLや他のそのような識別子もしくはアドレスを参照する場合は、そのような識別子は変化しうるし、インターネット上の特定の情報は移り変わりうるが、同等の情報をインターネットを検索することにより見いだすことができる。その参照は、そのような情報の利用可能性と公衆への普及を証明する。
【００２２】
本明細書で用いている「免疫グロブリン(immunoglobulin)」、「免疫グロブリン(immune globulin)」、「ガンマグロブリン」は、成人ドナーのプール血漿から得た血漿タンパク質製剤を表す。IgG抗体が優性を占め、他の抗体のサブクラス、例えばIgAおよびIgMが存在する。治療的免疫グロブリンは、循環抗体のレシピエントの血清濃度を増加することにより受け身免疫をもたらすことができる。IgG抗体は、例えば細菌毒素と結合して中和し、病原体をオプソニン化し、補体を活性化し、病原性サイトカインを抑制し、サイトカインとそのレセプター、例えば、CD5、インターロイキン-1a(IL-1a)、インターロイキン 6(IL-6)、腫瘍壊死因子-アルファ(TNF-α)、およびT細胞レセプター、との相互作用により貪食することができる。治療的免疫グロブリンは自己抗体の活性を阻害することができる。免疫グロブリン製剤には、限定されるものではないが、静注用免疫グロブリン(IGIV)、免疫グロブリンIV、治療的免疫グロブリンも含まれる。免疫グロブリン製剤はよく知られており、商標名、例えば、BayGam(登録商標)、Gamimune(登録商標)N、Gammagard(登録商標)S/D、Gammar(登録商標)-P、Iveegam(登録商標)EN、Panglobulin(登録商標)、Polygam(登録商標)S/D、Sandoglobulin(登録商標)、Venoglobulin(登録商標)-I、Venoglobulin(登録商標)-S、WinRho(登録商標)SDFその他も含まれる。免疫グロブリン製剤はヒト血漿から得ることができ、また組み換え的に製造される。本明細書で用いているIGで処置可能な疾患または病状は免疫グロブリン製剤が用いられるあらゆる疾患または病状を表す。そのような疾患および病状には、限定されるものではないが、循環抗体の増加が改善につながる以下のようなあらゆる疾患が含まれる：免疫不全；血液悪性腫瘍に続発する後天性低ガンマグロブリン血症；川崎病；慢性炎症性脱髄性多発神経障害(CIDP)；ギランバレー症候群；特発性血小板減少性紫斑病；炎症性筋疾患；ランバート・イートン筋無力症候群；多巣性運動ニューロパシー；重症筋無力症；メルシュ・ヴォルトマン症候群；続発性低ガンマグロブリン血症(医原性免疫不全を含む)；特異抗体欠損症；急性播種性脳脊髄炎；ANCA陽性全身性壊死性血管炎；自己免疫性溶血性貧血；水疱性類天疱瘡；瘢痕性類天疱瘡；Evans症候群(免疫性血小板減少症を伴う自己免疫性溶血性貧血を含む)；胎児-妊婦/新生児同種免疫性血小板減少症(FMAIT/NAIT)；血球貪食症候群；ハイリスク同種造血幹細胞移植；IgMパラプロテイン血症性ニューロパシー；腎臓移植；多発性硬化症；眼球クローヌス・ミオクローヌス運動失調；落葉状天疱瘡；尋常性天疱瘡；輸血後紫斑病；中毒性表皮剥離症/スティーブンス・ジョンソン症候群(TEN/SJS)；毒素性ショック症候群；アルツハイマー病；全身性エリテマトーデス；多発性骨髄腫；敗血症；B細胞腫瘍；外傷；および細菌、ウイルス、または真菌感染症。
【００２３】
本明細書で用いている投与計画(投与レジメン)は、投与する免疫グロブリンの量および投与頻度を表す。該投与計画は治療する疾患または病状に応じるものであり、変化しうる。
【００２４】
本明細書で用いている「静脈内IG(IVIG)の投与計画と実質的に同じ」は、用量および/または頻度が特定疾患または病状を治療するのに有効な量、典型的にはIV用量または頻度の10％または約10％であるレジメンを表す。特定疾患または病状を治療するのに有効なIVIGの量は知られており、当業者が経験的に決定することができる。例えば、以下に例示するように、300mg/kg(すなわち、平均成人体重70kgに21グラムとする)〜600mg/kg(すなわち42グラム)が原発性免疫不全疾患を有する患者に投与するIVIGの典型的1月1回の用量である。したがって、ヒアルロニダーゼと組み合わせて投与する場合、IGは原発性免疫不全疾患を治療するために300mg/kg〜600mg/kg、または約300mg/kg〜600mg/kgの用量で皮下投与される。
【００２５】
本明細書で用いている投与頻度は、免疫グロブリンの連続投与間の時間を表す。例えば、頻度は1、2、3、4週間であり得るし、治療する特定疾患または病状に応じる。一般的には、頻度は少なくとも2または3週間に1回であり、典型的にはわずか1月に1回である。
【００２６】
本明細書で用いているヒアルロニダーゼは、ヒアルロン酸を分解する酵素を表す。ヒアルロニダーゼには、細菌ヒアルロニダーゼ(EC 4.2.99.1)、ヒル、他の寄生虫、および甲殻類由来ヒアルロニダーゼ(EC 3.2.1.36)、および哺乳動物型ヒアルロニダーゼ(EC 3.2.1.35)が含まれる。ヒアルロニダーゼには、限定されるものではないが、ネズミ、イヌ、ネコ、ウサギ、トリ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、魚、カエル、細菌、およびヒル、他の寄生虫、および甲殻類を含むあらゆる非ヒト起源のものも含まれる。典型的非ヒトヒアルロニダーゼには、乳牛由来ヒアルロニダーゼ(配列番号10および11)、スズメバチ由来ヒアルロニダーゼ(配列番号12および13)、ミツバチ由来ヒアルロニダーゼ(配列番号14)、クマンバチ由来ヒアルロニダーゼ(配列番号15)、アシナガバチ(paper wasp)由来ヒアルロニダーゼ(配列番号16)、マウス由来ヒアルロニダーゼ(配列番号17-19、32)、pig由来ヒアルロニダーゼ(配列番号20-21)、ラット由来ヒアルロニダーゼ(配列番号22-24、31)、ウサギ由来ヒアルロニダーゼ(配列番号25)、ヒツジ由来ヒアルロニダーゼ(配列番号26および27)、オランウータン由来ヒアルロニダーゼ(配列番号28)、カニクイザル由来ヒアルロニダーゼ(配列番号29)、モルモット(配列番号30)、黄色ブドウ球菌(配列番号33)、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)(配列番号34)、およびクロストリジウム・パーフリンジェンス(Clostridium perfringens)(配列番号35)が含まれる。ヒアルロニダーゼにはヒト起源のものも含まれる。典型的なヒトヒアルロニダーゼには、HYAL1(配列番号36)、HYAL2(配列番号37)、HYAL3(配列番号38)、HYAL4(配列番号39)、およびPH20(配列番号1)が含まれる。ヒアルロニダーゼには、ヒツジおよびウシ PH20、可溶性ヒトPH20、および可溶性rHuPH20を含む可溶性ヒアルロニダーゼも含まれる。
【００２７】
ヒアルロニダーゼには、前駆体ヒアルロニダーゼポリペプチドおよび成熟ヒアルロニダーゼポリペプチド(例えばシグナル配列が除去されているもの)、活性を有するそのトランケート型が含まれ、アレル変異体および種変異体、スプライス変異体をコードする変異体、および配列番号1および10〜39に記載の前駆体ポリペプチドまたはその成熟型と少なくとも40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくはそれ以上の配列同一性を有するポリペプチドを含む他の変異体が含まれる。例えば、ヒアルロニダーゼには、配列番号50〜51に記載のヒトPH20前駆体ポリペプチドも含まれる。ヒアルロニダーゼには、化学もしくは翻訳後修飾を含むもの、および化学もしくは翻訳後修飾を含まないものも含まれる。そのような修飾には、限定されるものではないが、PEG化、アルブミン化、グリコシル化、ファンネシル化、カルボキシル化、水酸化、リン酸化、および他の当該分野で知られたポリペプチド修飾が含まれる。
【００２８】
本明細書で用いている可溶性ヒアルロニダーゼは、生理学的条件下で可溶性であることを特徴とするポリペプチドを表す。可溶性ヒアルロニダーゼは、例えば37℃に温めたTriton X-114溶液の水性相に分配されることにより区別することができる(Bordier et al.、(1981)J. Biol. Chem.、256：1604-7)。膜固定、例えば脂質固定ヒアルロニダーゼは、界面活性剤豊富相に分配されるが、ホスホリパーゼC処理後は界面活性剤の少ない相または水性相に分配される。可溶性ヒアルロニダーゼには、ヒアルロニダーゼと膜との結合によって結合した1またはそれ以上の領域が除去または修飾されており、可溶性型が依然としてヒアルロニダーゼ活性を有する膜固定ヒアルロニダーゼが含まれる。可溶性ヒアルロニダーゼには、組換え可溶性ヒアルロニダーゼ、ならびに天然供給源、例えばヒツジまたは乳牛由来の試験抽出物中に含まれるかまたはそれから精製されるものが含まれる。そのような可溶性ヒアルロニダーゼの例には可溶性ヒトPH20がある。他の可溶性ヒアルロニダーゼにはヒツジ(配列番号27)およびウシ(配列番号11)PH20が含まれる。
【００２９】
本明細書で用いている可溶性ヒトPH20またはsHuPH20には、発現すると該ポリペプチドが可溶性になるようにC末端にグリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)結合部位のすべてまたは部分を欠く成熟ポリペプチドが含まれる。典型的なsHuPH20ポリペプチドには、配列番号4〜9および47〜48のいずれかに記載のアミノ酸配列を有する成熟ポリペプチドが含まれる。そのような典型的なsHuPH20ポリペプチドの前駆体ポリペプチドにはシグナル配列が含まれる。該前駆体の例には、それぞれアミノ酸1〜35位に35アミノ酸のシグナル配列を含む配列番号3および40〜46に記載のものがある。可溶性HuPH20ポリペプチドには、本明細書に記載の製造および精製法中またはその後に分解するものも含まれる。
【００３０】
本明細書で用いている可溶性組み換えヒトPH20(rHuPH20)とは、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞に組換え的に発現するヒトPH20の可溶性型をいう。可溶性rHuPH20は、シグナル配列を含む、配列番号49に記載の核酸によりコードされる。そのアレル変異体および他の可溶性変異体であるDNA分子も含まれる。可溶性rHuPH20をコードする核酸は、CHO細胞中に発現し、成熟ポリペプチドで分泌される。培養液中に産生されるので、該生成物が種々の存在度で配列番号4〜9の1またはそれ以上を含み得る種の混合物を含むようにC末端に多様性がある。配列番号50〜51に記載の前駆体ヒトPH20ポリペプチドに対応するものも含む、対応するアレル変異体および他の変異体も含まれる。他の変異体は、ヒアルロニダーゼ活性を保持し、可溶性である限り、配列番号4〜9および47〜48のいずれかと60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくはそれ以上の配列同一性を有しうる。
【００３１】
本明細書で用いている活性とは、完全長(完全)タンパク質と結合するポリペプチドまたはその部分の機能的活性(単数または複数)をいう。機能的活性には、限定されるものではないが、生物活性、触媒もしくは酵素活性、抗原性(抗ポリペプチド抗体と結合するポリペプチドの結合または競合能力)、免疫原性、多量体を形成する能力、および該ポリペプチドのレセプターまたはリガンドと特異的に結合する能力が含まれる。
【００３２】
本明細書で用いているヒアルロニダーゼ活性とは、ヒアルロン酸を開裂するヒアルロニダーゼの能力をいう。ヒアルロニダーゼ、例えば可溶性rHuPH20のヒアルロニダーゼ活性を測定するin vitroアッセイは当該分野で知られ、本明細書に記載されている。典型的なアッセイには、開裂していないヒアルロン酸が血清アルブミンと結合するときに形成される可溶性沈殿物を検出することにより間接的にヒアルロニダーゼによるヒアルロン酸の開裂を測定する下記(例えば実施例3に記載)の微量濁度アッセイが含まれる。
【００３３】
本明細書で用いている天然α-アミノ酸の残基は、ヒトのその同種mRNAコドンによる荷電tRNA分子の特異的認識によりタンパク質内に組み込まれる天然にみられる20α-アミノ酸の残基である。
【００３４】
本明細書で用いている核酸には、DNA、RNA、およびその類似体(ペプチド核酸(PNA)を含む)、およびその混合物が含まれる。核酸は一本鎖または二本鎖でありうる。例えば検出可能な標識、例えばフルオレセインまたは放射性標識で標識されていることがあるプローブまたはプライマーに言及するときは、一本鎖分子が予期される。そのような分子は、典型的には、その標的がライブラリーをプローブもしくはプライミングするために低コピー数(典型的には5以下、一般的には3以下)であるかまたは実質的にユニークであるような長さである。一般的に、プローブまたはプライマーは、目的とする遺伝子と相補的または同一の配列の少なくとも14、16、または30連続ヌクレオチドを含む。プローブおよびプライマーは、核酸の長さが10、20、30、50、100、もしくはそれ以上であり得る。
【００３５】
本明細書で用いているペプチドとは、長さが2〜40アミノ酸であるポリペプチドをいう。
【００３６】
本明細書で用いている、本発明が提供する種々のアミノ酸配列にみられるアミノ酸は、既知の3文字または1文字略号で特定される(表1)。種々の核酸断片にみられるヌクレオチドは、当該分野で通常用いられている標準的1文字表記で示される。
【００３７】
本明細書で用いている「アミノ酸」は、アミノ基とカルボン酸基を含む有機化合物である。ポリペプチドは、2またはそれ以上のアミノ酸を含む。本発明では、アミノ酸には、20の天然アミノ酸、非天然アミノ酸およびアミノ酸類似体(すなわち、α-炭素が側鎖を有するアミノ酸)が含まれる。
【００３８】
本明細書で用いている「アミノ酸残基」は、ポリペプチドのペプチド結合の化学的消化(加水分解)により形成されるアミノ酸を表す。本明細書に記載のアミノ酸残基は、「L」異性体型であると推定される。望む機能的特性が該ポリペプチドによって維持される限りあらゆるL-アミノ酸残基を「D」異性体型の残基(そう指定されている)で置換することができる。NH2は、ポリペプチドのアミノ末端に存在する遊離アミノ基を表す。COOHは、ポリペプチドのカルボキシル末端に存在する遊離カルボキシ基を表す。J. Biol. Chem.、243：3557-3559(1968)および37 C.F.R. §§ 1.821-1.822 に記載された標準的ポリペプチドの学術用語に沿って、アミノ酸残基の略号を表1に示す。
表1−対応表
【表１】
0005898286.tif 000002
【００３９】
式によって本明細書に記載の全てのアミノ酸残基配列はアミノ末端からカルボキシル末端の通常の方向に左から右の方向性を有する。さらに、用語「アミノ酸残基」は、対応表(表1)に記載のアミノ酸、ならびに修飾および異常アミノ酸、例えば37 C.F.R. §§ 1.821-1.822に記載のものを含むように広く定義され、本明細書の一部を構成する。さらに、アミノ酸残基配列の始めまたは終わりのダッシュは、1またはそれ以上のアミノ酸残基のさらなる配列、NH2のようなアミノ末端基、またはCOOHのようなカルボキシル基とのペプチド結合を表すことに注意すべきである。
【００４０】
本明細書で用いている「天然アミノ酸」は、ポリペプチドにみられる20のL-アミノ酸を表す。
【００４１】
本明細書で用いている「非天然アミノ酸」は、天然アミノ酸と同様の構造を有するが、構造的に修飾され、天然アミノ酸の構造および反応性とよく似ている有機化合物を表す。すなわち、非天然アミノ酸は、20の天然アミノ酸以外のアミノ酸もしくはアミノ酸の類似体を含み、限定されるものではないが、アミノ酸のD-イソステレオマーを含む。典型的な非天然アミノ酸は本明細書に記載されており、当業者に知られている。
【００４２】
本明細書で用いているDNA構築物は、天然にみられないような形で結合し、隣り合って並んだDNAの断片を含む一本鎖もしくは二本鎖の、直線状もしくは環状DNA分子である。DNA構築物は、ヒト操作の結果として存在し、操作分子のクローンおよび他のコピーを含む。
【００４３】
本明細書で用いているDNA断片は、特定の特性を有するより大きいDNA分子の部分である。例えば、特定のポリペプチドをコードするDNA断片は、5’から3’方向に読んだときに特定のポリペプチドのアミノ酸配列をコードするより大きいDNA分子の部分、例えばプラスミドまたはプラスミド断片である。
【００４４】
本明細書で用いている用語ポリヌクレオチドは、5’から3’末端に読んだデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド塩基の一本鎖または二本鎖ポリマーを意味する。ポリヌクレオチドには、RNAおよびDNAが含まれ、天然供給源から単離するか、in vitroで合成するか、または天然分子と合成分子の混合物から製造することができる。本明細書においてポリヌクレオチド分子の長さは、ヌクレオチド(「nt」と略す)または塩基対(「bp」と略す)単位で表す。用語ヌクレオチドは、文脈が認める一本鎖および二本鎖分子に用いる。該用語を二本鎖分子に適用する場合は、該用語は全長を表すのに用い、用語塩基対と同等であると理解されよう。二本鎖ポリヌクレオチドの2本鎖は長さがわずかに異なることがあり得、その末端はずれて配置されることがあり得ると認識されよう。すなわち、二本鎖ポリヌクレオチド分子内の全てのヌクレオチドが対合しないことがあり得る。
【００４５】
本明細書で用いている2つのタンパク質または核酸間の「類似性」は、タンパク質のアミノ酸配列または核酸のヌクレオチド配列間の関連性を表す。類似性は本明細書に含まれる残基および残基の配列の同一性および/または相同性の程度に基づき得る。タンパク質または核酸間の類似性の程度の評価方法は当業者に知られている。例えば、ある配列類似性の評価方法では、2つのアミノ酸またはヌクレオチド配列を配列間の最大レベルの同一性が得られるように1列に並べる。「同一性」とは、アミノ酸またはヌクレオチド配列が変化しない程度をいう。アミノ酸配列およびある程度はヌクレオチド配列のアラインメントは、アミノ酸(またはヌクレオチド)の保存的差異および/または頻繁な置換も考慮することができる。保存的差異は、関連する残基の物理化学的特性を保存する差異である。アラインメントは、全体的(全ての残基を含む配列の全長にわたって比較した配列のアラインメント)または局部的(ほとんど同様の領域(単数または複数)を含む配列の部分のアラインメント)であり得る。
【００４６】
「同一性」自体は、当該分野で認識された意味を有し、公表された技術を用いて計算することができる。(例えば、ComputationalMolecular Biology、Lesk、A.M.編、Oxford University Press、New York、1988；Biocomputing：Informatics and Genome Projects、Smith、D.W.編、Academic Press、New York、1993；Computer Analysis of Sequence Data、Part I、Griffin、A.M.およびGriffin、H.G.編、Humana Press、New Jersey、1994；Sequence Analysis inMolecular Biology、von Heinje、G.、Academic Press、1987；およびSequence Analysis Primer、Gribskov、M.およびDevereux、J.編、M Stockton Press、New York、1991参照)。2つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の同一性を測定する多くの方法があるが、用語「同一性」は、当業者によく知られている(Carillo、H. & Lipton、D.、SIAM J AppliedMath 48：1073(1988))。
【００４７】
本明細書で用いているホモローガス(核酸および/またはアミノ酸配列に関して)は、おおよそ25％に等しいかまたはそれ以上の配列相同性、典型的には25%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、もしくは95%に等しいかまたはそれ以上の配列相同性配列を意味し、必要であれば正確なパーセンテージを特定することができる。本発明において用語「相同性」および「同一性」は、特記しない限り互換性に用いることが多い。一般的に、相同性または同一性のパーセンテージを決定するためには最高の一致が得られるよう配列を並べる(例えば、ComputationalMolecular Biology、Lesk、A.M.編、Oxford University Press、New York、1988；Biocomputing：Informatics and Genome Projects、Smith、D.W.、ed.、Academic Press、New York、1993；Computer Analysis of Sequence Data、Part I、 Griffin、A.M.、およびGriffin、H.G.編、Humana Press、New Jersey、1994；Sequence Analysis inMolecular Biology、von Heinje、G.、Academic Press、1987；およびSequence Analysis Primer、Gribskov、M. およびDevereux、J.編、M Stockton Press、New York、1991；Carillo et al.(1988)SIAM J AppliedMath 48：1073参照)。配列相同性により、保存されたアミノ酸の数を標準的アラインメントアルゴリズムプログラムにより決定し、各供給者によって確立されたデフォルトギャップペナルティとともに用いることができる。実質的にホモローガスな核酸分子は、典型的には中程度のストリンジェンシーまたは高ストリンジェンシーで目的とする核酸の長さにわたりハイブリダイズするであろう。ハイブリダイズする核酸分子のコドンの代わりに縮重コドンを含む核酸分子も予期される。
【００４８】
あらゆる2つの分子が、少なくとも60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%の「同一」または「ホモローガス」であるヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を有するか否かは、Pearson et al.(1988)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85：2444に記載のデフォルトパラメーターを用い、「FASTA」プログラムのような既知のコンピューターアルゴリズムを用いて決定することができる(他のプログラムには、GCGプログラムパッケージ(Devereux、J.、et al.、nucleic acid Research 12(I)：387(1984))、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul、S.F.、et al.、JMolec Biol 215：403(1990))；Guide to Huge Computers、Martin J. Bishop編、Academic Press、San Diego、1994、およびCarillo et al.(1988)SIAM J AppliedMath 48：1073が含まれる)。例えば、National Center for Biotechnology InformationデータベースのBLAST機能を用いて同一性を決定することができる。他の市販されているかまたは公的に利用可能なプログラムには、DNAStar 「MegAlign」プログラム(Madison、WI)およびUniversity of Wisconsin Genetics Computer Group(UWG)「Gap」プログラム(Madison WI)が含まれる。タンパク質および/または核酸分子の相同性または同一性パーセントは、例えばGAPコンピュータープログラムを用いて配列情報を比較することにより決定することができる(例えば、Needleman et al.(1970)J.Mol. Biol. 48：443、Smith and Waterman((1981)により修正、Adv. Appl.Math. 2：482)。簡単には、GAPプログラムは、類似している整列させたシンボル(すなわちヌクレオチドまたはアミノ酸)の数を2つの配列の短い方の記号の総数で割ったものを類似性と定義する。GAPプログラムのデフォルトパラメーターには、(1)一変数比較マトリックス(同一に1の値を、非同一には0を含む)およびGribskov et al.(1986)Nucl. Acids Res. 14：6745の加重比較マトリックス(SchwartzおよびDayhoff編、ATLAS OF PROTEIN SEQUENCE AND STRUCTURE、National Biomedical Research Foundation、pp. 353-358(1979)に記載のごとく)；(2)各ギャップにつき3.0のペナルティ、および各ギャップの各シンボルにつきさらに0.10のペナルティ；および(3)エンドギャップにつきペナルティなしが含まれる。
【００４９】
したがって、本明細書で用いている用語「同一性」または「相同性」は、被験および参照ポリペプチドまたはポリヌクレオチド間の比較を表す。本明細書で用いている用語、少なくとも「〜と90%同一な」は、ポリペプチドの参照核酸またはアミノ酸に対して90〜99.99％の同一性を表す。90%もしくはそれ以上のレベルの同一性は、例示のためとすれば100アミノ酸の被験および参照ポリペプチド長を比較するという事実を示す。被験ポリペプチド中のアミノ酸のわずか10％(すなわち100のうち10)が参照ポリペプチドと異なる。同様の比較を被験および参照ポリヌクレオチド間で行うことができる。そのような違いは、ポリペプチドの全長にわたって無作為に分散する点突然変異として示すことができるか、または長さが許容される最大(例えば10/100アミノ酸差(約90％同一))まで変動する1またはそれ以上の位置に集めることができる。違いは核酸またはアミノ酸の置換、挿入、または欠失として定義される。約85〜90%の相同性または同一性のレベルで、結果はプログラムおよびギャップパラメーターのセットと独立しているべきであり、そのような高レベルの同一性は、しばしばソフトウエアを用いずに手作業のアラインメントにより容易に評価することができる。
【００５０】
本明細書で用いている配列のアラインメントは、相同性(類似性および/または同一性)を用いてヌクレオチドまたはアミノ酸の配列の対応する位置を整列させることをいう。典型的には、50％またはそれ以上の同一性により関連する2またはそれ以上の配列を整列させる。整列させた配列のセットとは、対応する位置で整列させた2またはそれ以上の配列をいい、ゲノムDNA配列と整列させたRNA、例えばEST、および他のcDNA由来の整列する配列を含むことができる。
【００５１】
本明細書で用いている「プライマー」は、適切な緩衝液中、適切な温度で、適切な条件下(例えば4つの異なるヌクレオシド三リン酸および重合剤、例えばDNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼまたは逆転写酵素の存在下)で鋳型指向DNA合成の開始点として働くことができる核酸分子を表す。ある核酸分子は「プローブ」および「プライマー」としての役割を果たすことができると認識されよう。しかしながら、プライマーは、伸長するために3’ヒドロキシル基を有する。プライマーは、例えばポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、逆転写酵素(RT)-PCR、RNA PCR、LCR、多重PCR、パンハンドルPCR、キャプチャーPCR、発現PCR、3'および5'RACE、in situ PCR、リガンド介在PCR、および他の増幅プロトコールを含む種々の方法に用いることができる。
【００５２】
本明細書で用いている「プライマー対」は、増幅する配列の5'末端とハイブリダイズする5'(上流)プライマー(例えばPCRによる)、および増幅する配列の3’末端の相補物とハイブリダイズする3'(下流)プライマーを含むプライマーのセットを表す。
【００５３】
本明細書で用いている「特異的にハイブリダイズする」は、核酸分子(例えばオリゴヌクレオチド)の標的核酸分子との相補的塩基対合によるアニーリングを表す。当業者は、特定分子の長さや組成のような特異的ハイブリダイゼーションに影響を及ぼすin vitroおよびin vivoパラメーターに精通している。さらに、in vitroハイブリダイゼーションに特に関連があるパラメーターには、アニーリングおよび洗浄温度、緩衝液組成、および塩濃度が含まれる。高ストリンジェンシーで非特異結合した核酸分子を除去するための典型的洗浄条件は、0.1×SSPE、0.1% SDS、65℃、および中等度のストリンジェンシーで0.2×SSPE、0.1% SDS、50℃である。同等のストリンジェンシー条件は当該分野で知られている。当業者は、核酸分子と特定の応用に適した標的核酸分子との特異的ハイブリダイゼーションを達成するためにこれらのパラメーターを容易に調整することができる。相補的は、2つのヌクレオチド配列に言及する場合、2つのヌクレオチド配列が典型的には反対のヌクレオチドと25%、15%、または5%以下のミスマッチでハイブリダイズすることができることを意味する。必要ならば、相補性のパーセンテージを特定する。典型的には、2つの分子を高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするように選択する。
【００５４】
本明細書で用いているある生成物と実質的に同一とは、目的とする特性が実質的に同一の生成物がある生成物の代わりに用いることができるように十分に不変であるように十分に同様であることを意味する。
【００５５】
本明細書で用いている用語「実質的に同一」または「同様」も、当業者が理解するように文脈によって変化すると理解される。
【００５６】
本明細書で用いているアレル変異体またはアレル変化は、同じ染色体の遺伝子座を占める遺伝子の2またはそれ以上の代替形態を表す。アレル変化は突然変異により天然に生じ、ポピュレーション内の表現形的多形性を生じうる。遺伝子突然変異は、サイレント(コードしたポリペプチドに変化なし)でありうるか、または変化したアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしうる。本明細書で用いている用語「アレル変異体」は、遺伝子のアレル変異体によりコードされるタンパク質も意味する。典型的には、遺伝子の参照型は、ポピュレーション由来のポリペプチドの野生型および/または優性型、または種の1つの参照メンバーをコードする。典型的には、種間および種中に変異体を含むアレル変異体は、典型的には同じ種由来の野生型および/または優性型と少なくとも80%、90%、またはそれ以上のアミノ酸同一性を有し、同一性の程度は遺伝子、ならびに比較が種間であるか種内であるかに左右される。一般的には、種内アレル変異体は、ポリペプチドの野生型および/または優性型と96%、97%、98%、99%、またはそれ以上の同一性を含む野生型および/または優性型との少なくとも約80%、85%、90%、95%、またはそれ以上の同一性を有する。本明細書においてアレル変異体に言及するときは、同じ種のメンバー内のタンパク質の変動を意味する。
【００５７】
本明細書で用いている「アレル」は、本明細書では「アレル変異体」と互換性に用い、遺伝子のまたはその部分の代替型を意味する。アレルは、ホモローガスな染色体の同じ遺伝子座または位置を占める。対象が遺伝子の2つの同じアレルを有するときは、該対象は該遺伝子またはアレルとホモ接合であるという。対象が遺伝子の2つの異なるアレルを有するときは、該対象は該遺伝子またはアレルとヘテロ接合であるという。特異遺伝子のアレルは、単一ヌクレオチドまたは種々のヌクレオチドにおいて互いに異なることがあり、ヌクレオチドの置換、欠失、および挿入を含みうる。遺伝子のアレルも突然変異を含む遺伝子の形でありうる。本明細書で用いている種変異体は、種々の哺乳動物種、例えばマウスおよびヒトを含む種々の種間のポリペプチドにおける変異体を表す。
【００５８】
本明細書で用いているスプライス変異体とは、1種類を超えるmRNAを生じるゲノムDNAの一次転写物の異なるプロセシングにより生じる変異体をいう。本明細書で用いている修飾は、ポリペプチドのアミノ酸配列の修飾に関するものであり、アミノ酸およびヌクレオチドのそれぞれ欠失、挿入、および置換が含まれる。ポリペプチドの修飾方法は、例えば組み換えDNA方法論により当業者に常套的なものである。
【００５９】
本明細書で用いている用語プロモーターは、RNAポリメラーゼの結合および転写開始をもたらすDNA配列を含む遺伝子の部分を意味する。プロモーター配列は、常にではないが通常、遺伝子の5’非コーディング領域にみいだされる。
【００６０】
本明細書で用いている単離または精製されたポリペプチドもしくはタンパク質またはその生物活性部分は、タンパク質を誘導する細胞部分や細胞もしくは組織由来の他の夾雑タンパク質を実質的に含まないか、または化学合成したときに化学物質の前駆体や他の化学物質を実質的に含まない。製剤は、純度を評価するために当業者が用いる標準的分析法、例えば薄層クロマトグラフィ(TLC)、ゲル電気泳動、および高速液体クロマトグラフィ(HPLC)によって検出される容易に検出可能な不純物がないか、またはさらに精製しても物質の物理化学特性、例えば酵素活性および生物活性に検出可能な変化がないほどに十分に純粋である場合に、不純物を実質的に含まないと決定することができる。実質的に化学的に純粋な化合物を生成するための化合物の精製方法は当業者に知られている。しかしながら、実質的に化学的に純粋な化合物は立体異性体の混合物であり得る。そのような場合、さらなる精製は化合物の特異活性を増加させるかもしれない。
【００６１】
用語細胞物質を実質的に含まないには、タンパク質が、単離または組み換え生成される細胞の細胞成分から分離しているタンパク質調製物が含まれる。ある態様において、用語細胞物質を実質的に含まないには、約30%(乾燥重量による)以下の非酵素タンパク質(本明細書では夾雑タンパク質ともいう)、一般的には約20%(乾燥重量による)以下の非酵素タンパク質、または約10%(乾燥重量による)以下の非酵素タンパク質、または約5%(乾燥重量による)以下の非酵素タンパク質を有する酵素タンパク質調製物が含まれる。酵素タンパク質が組み換え的に製造される場合は、培養液も実質的に含まない。すなわち、培養液は酵素タンパク質調製物の容量の20%、10%、もしくは5%以下、または約20%、10%、もしくは5%以下で存在する。
【００６２】
本明細書で用いている用語化学物質前駆体または他の化学物質を実質的に含まないには、タンパク質の合成に関与する化学物質前駆体または他の化学物質から分離している酵素タンパク質の調製物が含まれる。該用語には、約30%(乾燥重量による)、20%、10%、5%、またはそれ以下の化学物質前駆体または非酵素化学物質もしくは成分を有する酵素タンパク質の調製物が含まれる。
【００６３】
例えば合成核酸分子または合成遺伝子または合成ペプチドについて本明細書で用いている合成は、組み換え法および/または化学合成法により生成される核酸分子またはポリペプチド分子を表す。
【００６４】
本明細書で用いている組み換えDNA法を用いることによる組み換え手段による製造(生成)は、クローンDNAによりコードされるタンパク質を発現させるためのよく知られた分子生物学的方法の使用を意味する。
【００６５】
本明細書で用いているベクター(またはプラスミド)は、ヘテロローガスな核酸をそれを発現または複製するために細胞内に導入するのに用いる分離した要素を表す。ベクターは、典型的にはエピソームのままであるが、遺伝子またはその部分がゲノムの染色体内に統合されるように設計することができる。人工染色体、例えば酵母人工染色体、および哺乳動物人工染色体であるベクターも予期される。そのようなビークルの選択および使用は当業者によく知られている。
【００６６】
本明細書で用いている発現ベクターには、DNA断片を発現させることができるプロモーター領域のような調節配列と作動可能なように連結したDNAを発現させることができるベクターが含まれる。そのようなさらなる断片は、プロモーターおよび終止配列を含むことができ、所望により、1またはそれ以上の複製起点、1またはそれ以上の選択可能マーカー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナルなどを含むことができる。発現ベクターは、一般的には、プラスミドまたはウイルスDNA由来であるか、またはその両方の要素を含むことができる。すなわち、発現ベクターは、適切な宿主細胞内に導入するとクローンしたDNAを発現させる組み換えDNAまたはRNA構築物、例えばプラスミド、ファージ、組み換えウイルス、または他のベクターを意味する。適切な発現ベクターは当業者によく知られており、真核細胞および/または原核細胞中で複製可能なものおよびエピソームのままであるもの、または宿主細胞ゲノム内で統合されるものが含まれる。
【００６７】
本明細書で用いているベクターには、「ウイルスベクター」または「ウイルス性ベクター」も含まれる。ウイルス性ベクターは、外来遺伝子を細胞内に伝達するために(ビークルまたはシャトルとして)外来遺伝子と作動可能に連結した操作されたウイルスである。
【００６８】
本明細書で用いている作動可能に(operablyまたはoperatively)連結したは、DNA断片に言及するとき、該断片が意図する目的のために協調して機能するように配列していること、例えば、転写がプロモーターを用いて開始し、ターミネーターまでコーディング断片全体に進行することを意味する。
【００６９】
本明細書で用いている用語評価するは、試料中に存在するプロテアーゼまたはそのドメインの活性の絶対値を得、また、該活性レベルを示す指数、比、パーセンテージ、視覚的または他の値を得る意味で定量的および定性的測定を含むものとする。評価は、直接または間接的であり得、もちろん、実際に検出される化学物質種は、タンパク分解産物自身である必要はなく、例えばその誘導体またはある種のさらなる物質であり得る。例えば、SDS-PAGEおよびクマシーブルーによるタンパク質染色による補体タンパク質の開裂産物の検出。
【００７０】
本明細書で用いている生物活性は、化合物のin vivo活性、または化合物、組成物、または他の混合物をin vivo投与すると生じる生理学的反応を表す。すなわち、生物活性は、そのような化合物、組成物、および混合物の治療効果、および医薬活性を含む。生物活性は、そのような活性を試験または使用するために設計したin vitro系において観察することができる。すなわち、本明細書においてプロテアーゼの生物活性は、ポリペプチドを加水分解する触媒活性である。
【００７１】
本明細書で用いている等価(同等)なは、2つの核酸配列に言及するとき、目的とする2つの配列が同じアミノ酸配列または等価なタンパク質をコードしていることを意味する。等価なを2つのタンパク質またはペプチドについて用いる場合は、2つのタンパク質またはペプチドが該タンパク質またはペプチドの活性または機能を実質的に変化させないアミノ酸置換のみを有する実質的に同じアミノ酸配列を有することを意味する。特性に言及する場合、等価なは、同じ程度で存在する必要はないが(例えば2つのペプチドは同じタイプの酵素活性が異なる割合を示しうる)、活性は通常実質的に同じである。
【００７２】
本明細書で用いている「調節する(modulate)」および「調節(modulation)」、または「変化させる」は、タンパク質のような分子の活性を変化させることをいう。典型的な活性には、限定されるものではないが、生物活性、例えば情報伝達が含まれる。調節には、活性の増加(すなわち、アゴニスト活性の上方調節)、活性の低下(例えば下方調節または阻害)または活性のあらゆる他の変化(例えば、周期性(periodicity)、頻度(frequency)、持続時間、動力学、または他のパラメーターの変化)を含みうる。調節は文脈に左右され得るし、典型的には調節は、示した状態、例えば野生型タンパク質、構成的状態のタンパク質、または示した細胞種または状態において発現するタンパク質と比較される。
【００７３】
本明細書で用いている組成物はあらゆる混合物を意味する。組成物は、溶液、サスペンジョン、液体、粉末、ペースト、水性、非水性またはそのあらゆる組み合わせであり得る。
【００７４】
本明細書で用いている組み合わせは、2またはそれ以上の要素間のあらゆる関連を表す。該組み合わせは、2またはそれ以上の分離した要素、例えば2つの組成物または2つのコレクションであり得、その混合物、例えば2またはそれ以上の要素またはそのあらゆる変化物の単一混合物であり得る。組み合わせのエレメントは一般的に機能的に関連(associatedまたはrelated)している。
【００７５】
本明細書で用いているキットは、所望により他の要素、例えばさらなる試薬、および該組み合わせまたはその要素を用いるための指示書を含む包装された組み合わせである。
【００７６】
本明細書で用いている「疾患または障害」は、限定されるものではないが、感染、後天的病状、遺伝的病状を含む原因または病状から生じる、確認できる症状を特徴とする生物の病的状態を表す。本発明が意図する疾患および病状は免疫グロブリンによって治療可能なものである。
【００７７】
本明細書で用いている疾患または病状を有する対象を「治療(処置)する」は、治療後に対象の症状が部分的もしくは完全に改善するか、または静止したままであることを意味する。例えば、治療には、予防、治療、および/または治癒が含まれる。予防は、潜在的疾患の予防、および/または症状の悪化もしくは疾患の進行の抑制が含まれる。治療は、本発明が提供する免疫グロブリン製剤および組成物のあらゆる医薬的使用も含む。
【００７８】
本明細書で用いている医薬活性物質は、限定されるものではないが、例えば、麻酔薬、血管収縮剤、分散剤、伝統的治療薬(低分子薬および治療的タンパク質を含む)を含むあらゆる治療薬もしくは生理活性物質を含む。
【００７９】
本明細書で用いている治療は、病状、障害もしくは疾患の症状、または他の兆候を改善するかもしくは有利に変化させるあらゆる方法を意味する。
【００８０】
本明細書で用いている治療効果は、対象を治療することにより生じる、疾患または病状の症状を変化、典型的には好転、または改善させるか、または疾患または病状を治癒させる効果を意味する。治療的有効量は、対象に投与した後に治療効果を生じる組成物、分子、または化合物の量を意味する。
【００８１】
本明細書で用いている用語「対象」は、哺乳動物を含む動物、例えばヒトを意味する。
【００８２】
本明細書で用いている患者はヒト対象を意味する。
【００８３】
本明細書で用いている医薬組成物または他の療法剤の投与のような治療による特定の疾患または障害の症状の改善は、永久的もしくは一時的、持続的もしくは一過性であるかにかかわらず、該組成物または療法剤の投与に起因または関連しうる症状のあらゆる緩和を意味する。
【００８４】
本明細書で用いている防止または予防は、疾患または病状が発現するリスクを減少させる方法を意味する。
【００８５】
本明細書で用いている「治療的有効量」または「治療的有効用量」は、治療効果を生じるのに少なくとも十分な薬剤、化合物、物質、または化合物含有組成物の量を意味する。したがって、該量は、疾患または病状の症状を予防、治癒、改善、抑制、もしくは部分的に抑制するのに必要な量である。
【００８６】
本明細書で用いている単位剤形は、当該分野で知られている個々に包装されたヒトおよび動物対象に適した物理的に分離した単位を意味する。
【００８７】
本明細書で用いている単用量製剤は、直接投与するための製剤を意味する。
【００８８】
本明細書で用いている「製品」は、製造販売される生成物である。本願全体に用いるこの用語は、包装品中に含まれるIGおよびヒアルロニダーゼ組成物を含むことを意図する。
【００８９】
本明細書で用いている液体は、流動可能なあらゆる組成物を意味する。すなわち、液体は、半固体、ペースト、溶液、水性混合物、ゲル、ローション、クリーム、および他のそのような組成物の形の組成物を含む。
【００９０】
本明細書で用いている「キット」は、本明細書に記載の組成物と、限定されるものではないが、活性化、投与、診断、および生物活性もしくは特性の評価を含む目的のための別の要素の組み合わせを意味する。キットは使用説明書を含むことがある。
【００９１】
本明細書で用いている細胞抽出物または溶解物は、溶解または破壊した細胞から製造した調製物または分画を表す。
【００９２】
本明細書で用いている動物には、あらゆる動物、限定されるものではないが、ヒト、ゴリラ、およびサルを含む霊長類；齧歯類、例えばマウスおよびラット：鳥類、例えばニワトリ；反芻動物、例えばヤギ、乳牛、シカ、ヒツジ；ヒツジ、例えばブタ、および他の動物が含まれる。非ヒト動物は、予期される動物としてヒトを除く。本発明が提供する酵素は、あらゆる供給源、動物、植物、原核生物、および真菌由来である。ほとんどの酵素は、哺乳動物起源を含む動物起源である。
【００９３】
本明細書で用いているコントロール(対照)は、試験パラメーターで処理されていない以外は被験試料と実質的に同じ試料を意味し、それが血漿試料である場合は関心が持たれる病状に罹患していない正常ボランティア由来でありうる。また、コントロールは内部コントロールでありうる。
【００９４】
本明細書で用いている単数形「a」、「an」および「the」は、特記しない限り複数への言及も含む。すなわち、例えば「細胞外ドメイン」(単数)を含む化合物(単数)への言及は、1または複数の細胞外ドメインを有する化合物(複数)を含む。
【００９５】
本明細書で用いている範囲および量は、特定値または範囲の「おおよそ(約)」で表すことができる。約には、正確な量も含まれる。従って、「約5塩基」は「約5塩基」と「5塩基」を意味する。
【００９６】
本明細書で用いている「所望の」または「所望により」は、その後の記載事象または状況が起きるか起きないこと、および該記載が該事象または状況が生じる場合と生じない場合を含むことを意味する。例えば、所望により置換された基は、その基が置換されていないかまたは置換されていることを意味する。本明細書で用いているあらゆる保護基、アミノ酸、および他の化合物の略号は、特記しない限り、その通常の使用、広く認められている略号、またはIUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature((1972)Biochem. 11：1726参照)に従う。
B. 免疫グロブリン(IG)の皮下投与
【００９７】
本発明は、免疫グロブリン(IG)を可溶性ヒアルロニダーゼと組み合わせて皮下投与することによりIGで処置可能な疾患および病状を治療する方法および使用を提供する。したがって、IGおよび可溶性ヒアルロニダーゼの組み合わせも提供する。細胞外マトリックス中のヒアルロン酸を分解するヒアルロニダーゼの能力によりヒアルロニダーゼは治療薬の皮下注入を促進する。免疫グロブリンは、IVIG療法という免疫不全の個体を治療するために静脈内投与により最初に与えられる治療薬である。ヒアルロニダーゼ存在下のIGのバイオアベイラビリティは、IVIG治療後のIGのバイオアベイラビリティの90％以上である。したがって、本発明が提供する方法および使用において、ヒアルロニダーゼとIGの組み合わせ療法は、IVIG処置と同様の用量および頻度で免疫グロブリンの皮下投与を可能にする。すなわち、例えば、本発明が提供する方法および使用において、IGを可溶性ヒアルロニダーゼ存在下で皮下投与するときは、特定の適応症に対する普及したIVIG用量で1月に1回投与することができる。さらに、ヒアルロニダーゼは皮膚のオープンフローチャンネルに作用するので注入速度を速めることができる。したがって、ヒアルロニダーゼと一緒に製剤化および/または一緒に投与するIGの皮下投与方法は、注入速度を増加させることによりIG療法の送達時間を減少させる。
【００９８】
欠陥抗体の形成は、大多数の原発性免疫不全(PID)疾患における最も一般的な異常であり、血清免疫グロブリンの減少に反映され、その結果、特に気道(sinopulmonary tract)の細菌感染への感受性の増加をもたらすことが最も多い。免疫グロブリンレベルの減少は、抗体の欠陥、例えばX連鎖無ガンマグロブリン血症、免疫グロブリン重鎖欠失、選択的免疫グロブリンG(IgG)サブクラス不全、分類不能型免疫不全、またはX連鎖高免疫グロブリンM症候群を有する個体にみられる。免疫グロブリンレベルの減少は、TおよびB細胞の欠陥による複合免疫不全、例えば限定されるものではないが、重症複合免疫不全またはWiskott Aldrich症候群(IUIS Scientific Committee、1999)にもみられる。
【００９９】
これらの疾患を有する個体は、感染症の重症度を減少させるかまたは抑える免疫グロブリン製剤による補充療法を必要とする。最初に免疫グロブリン補充療法は、筋肉内経路によって施されたが、患者の圧倒的大多数は、1981年に始まった静脈内(IV)経路で治療されてきた。現在、米国内の免疫グロブリン製剤の大多数は、IV投与用である。しかしながら、免疫グロブリン製剤は、より最近になって皮下投与用に開発された(Gardulf et al.(2006)Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol.、6：434-42；Gardulf et al.(2006)J Clin. Immunol.、26：177-85；Ochs et al.(2006)J Clin. Immunol.、26：265-73)。少なくとも1つの製品Vivaglobin(登録商標)は皮下投与用で承認されている。
【０１００】
現在用いられている免疫グロブリン製剤はすべて、IVIG製剤が5〜12％で製剤化されるのに比べて16％で製剤化される。IV製剤に対するより高濃度は、より少ない注入用量を可能にし、そのような製剤は静脈内注入することはできない。免疫グロブリン補充療法のそのような皮下方法は、全身副作用のリスクが低く、1月1回のIV注入(Gardulf et al.(1995)J Adv. Nurs.、21：917-27；Gardulf et al.(1993)Clin. Exp. Immunol.、92：200-4；Gardulf et al.(1991)Lancet、338：162-6)と比べてより高いトラフ血清IgG濃度をもたらすので、有効かつ安全であり、患者にも高く評価されると考えられる。
【０１０１】
皮下投与された免疫グロブリンのバイオアベイラビリティは、一般的には静脈内注入より低い。免疫グロブリンは血中で速やかに利用可能であり、3〜5日間かけて徐々に血管外コンパートメントと平衡化する(Schiff et al.(1986)J. Clin. Immunol.、6：256-64)。皮下投与された免疫グロブリンは、皮下スペースから血中に徐々に吸収され、同時に血管外コンパートメントと平衡化し、高IV急上昇(spike)がない。バイオアベイラビリティは十分に研究されていないが、ZLB-Behring製剤(すなわちVivaglobin(登録商標))の最近の臨床試験において、曲線下面積(AUC)を測定することにより決定され、免疫グロブリンの67％のみが吸収され、推奨用量はIV用量の137％であった(Ochs et al.(2006)J Clin. Immunol.、26：265-73)。2つの異なる経路および投与頻度についてAUCを比較することの技術的困難さにもかかわらず、ウサギにおける免疫グロブリンの皮下投与の研究は、皮下経路を介するとバイオアベイラビリティが低下することを示唆する。これは、毛細血管を通して容易に拡散できず、リンパ管を介して吸収される必要がある大分子タンパク質の吸収方法によるかもしれない(Supersaxo et al.(1990)Pharm. Res.、7：167-9)。
【０１０２】
IGの皮下投与に関連するバイオアベイラビリティの問題に加えて、SC投与の主な欠点は、各部位に少量しか注入することができず、1週間に1回または2週間に1回(隔週)ベースで複数部位に使用する必要があることである。一般的に、16％溶液を用いると1部位あたり約20mLを注入することができ、したがって、400mg/kg体重(BW)を投与する成人患者には少なくとも3部位/週または12部位/月が必要であろう。1週間に1回または2週間に1回投与は1月に1回のIV注入より良好なトラフ値を維持するというさらなる利点があるにもかかわらず、複数回針を挿入する必要があることは多くの患者にとって抑制となっている。
【０１０３】
SCスペースは、ゲル用物質、ヒアルロン酸で満たされたコラーゲンネットワークにより形成される。ヒアルロン酸は、半減期約5時間で置換し、組織を介する液の流れに対する抵抗性に大きく関与する。ヒアルロニダーゼはヒアルロン酸を一時的に消化し、皮下スペースへの注入を促進する。ヒアルロン酸は、24時間以内に修復され、観察しうる変化を残さない。すなわち、グリコサミノグリカンの分解を通して間質腔にチャンネルを開くヒアルロニダーゼの能力により、可溶性ヒアルロニダーゼの投与は分子の拡散を可能にし、そのような一緒に製剤化されるかまたは一緒に投与された分子のバイオアベイラビリティ、薬物動態および/または薬力学的特性を改善する。
【０１０４】
ある例では、ヒアルロニダーゼを皮下に一緒に投与したIGのバイオアベイラビリティは、IVIGのバイオアベイラビリティの70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%である。典型的には、該バイオアベイラビリティは90%以上である。さらに、可溶性ヒアルロニダーゼと一緒の投与は、単一皮下部位への大量の注入を可能にする。例えば、600mLまで、もしくはそれ以上の容量、例えば200ml、300ml、400ml、500,ml、600mlもしくはそれ以上のIGを1回に1部位に投与することができるか、または単回投与で1部位に投与することができる。すなわち、5〜12％で製剤化されたIG製剤を1月に1回のIVIG用量と等価な用量、例えば100mg/kg、200mg/kg、300mg/kg、400mg/kg、500mg/kg、600mg/kgもしくはそれ以上、または約100mg/kg、200mg/kg、300mg/kg、400mg/kg、500mg/kg、600mg/kgもしくはそれ以上で、可溶性ヒアルロニダーゼと一緒に皮下投与することができる。該用量は、単回用量として投与するか、または多用量に分けて、1日1回または1週間に1回、例えば1週間または2、3、もしくは4週間毎に1回投与することができる。したがって、可溶性ヒアルロニダーゼの存在下でIGを皮下投与することにより、IGの皮下投与に関連する1つまたはすべての検討事項および問題に対処する。すなわち、ヒアルロニダーゼの分散特性により可溶性ヒアルロニダーゼ存在下のIGの皮下投与は、IVIGのバイオアベイラビリティを維持しながら1月に1回のIVIG頻度でIVIG用量の投与を可能にする。
【０１０５】
以下の項は、本発明の組み合わせにおける典型的な免疫グロブリンおよび可溶性ヒアルロニダーゼ、その製造方法、およびIGで治療可能な疾患および病状を治療するためのそれらの使用方法について記載する。
C. 免疫グロブリン
【０１０６】
本発明は、可溶性ヒアルロニダーゼと組み合わせて皮下投与するために用いることができる免疫グロブリン(IG、ガンマグロブリンまたはIgGともいう)を提供する。IGは、補体活性を調節し、自己抗体産生を抑制し、マクロファージおよびBリンパ球上のFcレセプターを飽和もしくは遮断し、炎症メディエーター、例えばサイトカイン、ケモカイン、およびメタロプロテイナーゼの産生を抑制することにより免疫系を強化するように作用する。
【０１０７】
IGは、高等動物の血漿中にみいだされるタンパク質分画であり、種々の特異性を有する多くの抗体を含む。一般的には、IGはあらゆるイデオタイプ、例えばIgG、および種々のサブクラスIgA、IgM、IgD、IgEであり得る血清免疫グロブリンを含む。種々の免疫グロブリンまたはサブクラスは、例えば、血漿ドナーの抗原に対する暴露(例えばワクチン接種による)に応じて免疫グロブリン製剤間で異なりうる種々の濃度および特異性で存在しうる。しばしば、免疫グロブリンは血清中に通常みられる量で存在するが(表2参照)、精製工程を用いて特定の免疫グロブリンクラス(単数または複数)の比を変えることができる。典型的には、IG製剤は、90%、もしくはそれ以上のIgG、例えば、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくはそれ以上のIgGを含む。免疫グロブリンは、ポリクローナルまたはモノクローナルであり得る。典型的には、製剤には、高い割合のモノマーIgGと低IgA内容物を含む。
【表２】
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【０１０８】
免疫グロブリンは、ヒトまたは動物の血液から単離するか、または他の手段、例えば組み換えDNA技術またはハイブリドーマ技術により製造することができる。例えば、免疫グロブリンは、あらゆる適切な分別方法、例えばアルコール沈殿またはイオン交換分離を用いて組織、リンパ球ハイブリドーマ培養、血漿、もしくは血清、または組み換え細胞培養から得ることができる。一般的には、IGは、例えば、Cohnによって最初に使用され、Oncleyによって改良された(Cohn-Oncley法、例えばCohn et al.(1946)J. Am. Chem. Soc. 68：459-475；Oncley et al.(1949)J Am. Chem. Soc.、71：541-550参照)ようなアルコール分別により血漿から製造される。精製におけるアルコールの使用は、潜在的汚染ウイルスを不活性化することができる。Cohn-Oncley法は、補体を自由に固定する能力を有する抗体-抗原複合体として作用しうる高分子量型を生じる可能性がある変性および凝集タンパク質を生じ得る。
【０１０９】
そのような望ましくない効果を防ぐために、改良Cohn-Oncley法がIGの製造および精製のために開発された。種々のそのような手順は知られており、本発明においてIG製剤を使用するために適応させ、修飾することができる。当該分野で知られ、利用可能な詳細な方法によりIG製剤を製造することは当該分野の技術の範囲内である。典型的には、IGを、一次冷エタノール分別、ならびに化学修飾、ペプシン存在下または非存在下でpH4.0でインキュベーション、PEG沈殿、イオン交換クロマトグラフィ、酵素的開裂、溶媒洗浄処理および透析、ならびに限外濾過のあらゆる1またはそれ以上を含むことができる第2分別を用いて製造する。例えば、常套的技術、例えば超遠心もしくは排除クロマトグラフィによるIG凝集物の分離は、低い抗補体活性を有する生成物を得るのを可能にする。他のIG製造法には、限定されるものではないが、エチレングリコールポリマーによるヒト血漿を分画する方法(Polson et al.(1964)Biochim. Biophys. Acta.、82：463-475)；Cohn分別から分離された物質から出発する精製剤としてのポリエチレングリコール(PEG)の組み込み(分画IIまたはII＋III、例えば米国特許No. 4,093,606および4,165,370参照)；およびポリエチレングリコールを用いる他の同様な精製法(EP 0246579)が含まれる。さらに、酵素、例えばペプシン、プラスミン、固定化トリプシンによる処理、中等度の酸性pHでの処理、B-プロピオラクトン処理、ポリエチレングリコールを沈殿剤として用いる分別方法、および米国特許No.4,093,606、4,126,605、3,966,906、および4,124,576に記載の他の技術により低い抗補体活性を有するIGを含むための方法が記載されている。他の方法は、IG分子を還元剤で処理、アルコール化、アルキル化、およびスルホン化することによるIG分子の化学的および部分的修飾に基づく(例えば米国特許6,875,848)。イオン交換クロマトグラフィを用いて、IG製剤を得るために用いる出発物質から望ましくない夾雑物を除去することができる(例えば、米国特許No.3,869,436、EP 91300790、およびWO 94/29334参照)。EP0440483は、イオン交換クロマトグラフィおよび低酸pHでの透析に基づく生成物の静脈内用調製物を促進するのに有用な技術の組み合わせについて記載している。他の方法も当該分野で記載され、当業者に知られている(例えば、米国特許5,177,194および6,875,848参照)。
【０１１０】
IG製剤は、ウイルス負荷(ロード)を除去するよう処理すべきである。ウイルス負荷を減少させる2つの方法：ウイルス不活化およびウイルス分割もしくは除去がある。ウイルス不活化法の例には、限定されるものではないが、冷エタノール分別、加熱(殺菌)、溶媒/界面活性剤、および酸性環境(低pH)が含まれる。例えば、溶媒/界面活性剤法は、VSV(水疱性口内炎ウイルス)、シンドビス(Sindbis)ウイルス、HIV、HBV(B型肝炎ウイルス、およびHCV(C型肝炎ウイルス)に対する殺ウイルス作用を有することが証明されている。ウイルス分割もしくは除去の例には、限定されるものではないが、冷エタノール分別、相分配、もしくはPEG沈殿、アフィニティクロマトグラフィ、イオン交換もしくはゲル排除クロマトグラフィ、および濾過が含まれる。
【０１１１】
また、最終精製製剤は、過剰な凝集を避け、タンパク質を安定化させるように製造しなければならない。IG製剤の凝集は、凍結乾燥製剤を製造し、貯蔵時の安定性を改善し、使用前に希釈剤で再構成するためのすることにより最小限にすることができる。当該分野でよく知られているIG製剤の安定性を増大させる別の方法は、IG製剤にタンパク質安定化賦形剤を加えることである。既知の賦形剤には、限定されるものではないが、糖、ポリオール、アミノ酸、アミン、塩、ポリマー、および界面活性剤が含まれる。例えば、米国特許4,499,073は、pHおよびイオン強度の選択による安定化について記載しており、日本特許54020124は、筋肉内用製剤にアミノ酸を加えて保存安定性および安全性をもたらすことを開示し、JP 57031623およびJP 57128635は、筋肉内用製剤の長期安定性を達成する5〜15%IG製剤におけるアルギニンおよび/またはリジンおよびNaClの使用を開示し、JP 4346934は、低伝導度(mmho未満)、pH5.3〜5.7、および所望によりPEG、ヒト血清アルブミン、およびマンニトールを含む1またはそれ以上の安定化剤の使用を開示し、US 4,439,421は、抗補体発生に対して安定化させる親水性高分子、ポリオール、および他のタンパク質の添加を開示し、U.S. 5,945,098は、アミノ酸(0.1〜0.3Mグリシン)および非イオン性界面活性剤(ポリソルベートおよびPEG)を添加することによる等張溶液の安定化を開示し；US 4,186,192は、アミノ酸を含む種々の添加剤を開示し、WO 2005/049078は、マルトースおよびさらにグリシンを加えて0.1Mとする安定化を開示し、US 4,362,661は、5%IG製剤の安定化をもたらす中性および塩基性アミノ酸の使用を開示している。非常に低いイオン強度とpH4.25(米国特許No. 4,396,608)または弱酸性のpH5〜6(EP 0278422)を有する水性媒質中、炭水化物を用いて安定な液体製剤を製造することもできる。
【０１１２】
IG製剤のダイマー形成を調節することもできる。例えば、米国特許No. 5,871,736は、ダイマー形成に対して安定化させるための1またはそれ以上の両親媒性安定化剤を含むIG製剤、特に液体製剤を開示する。両親媒性安定化剤は、ニコチン酸およびその誘導体、特にニコチンアミドを主として非荷電の脂溶性側鎖を有する上記アミノ酸、例えば、フェニルアラニン、メチオニン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、およびバリンと共に含む。
【０１１３】
該製剤は、本明細書に記載しているような当該分野で知られている方法により製造することができる。しかしながら、一般的には、最終製剤のpHは、比較的高いが、酸性pH、すなわち、pH約4.2〜5.4の範囲、例えばpH4.6〜5.1の範囲に調整される。このpH範囲がIG製剤の保存を改善するのに特に有用である。
【０１１４】
一般的には、最終IG製剤は、約5〜25%w/v、一般的には6〜15%w/v、8〜12%w/v、および典型的には10%w/vのタンパク質濃度を有する。最終タンパク質濃度は、種々の因子、例えば投与経路、治療する患者、および治療する病状の種類に左右されるだろう。
【０１１５】
IV投与に使用するあらゆるIG製剤を皮下投与のために可溶性ヒアルロニダーゼと組み合わせて本発明が提供する方法に用いることができると本発明では予期される。製剤には凍結乾燥製剤および液体製剤が含まれる。免疫グロブリン(IVIG)は、Carimune(登録商標)NF、Flebogamma(登録商標)5%、Gammagard(登録商標)Liquid、Gammagard(登録商標)S/D、Gamunex(登録商標)、Iveegam(登録商標)EN、Octagam(登録商標)、およびPolygam(登録商標)S/Dとして市販品を利用できる。典型的には、そのような製剤はすべて冷アルコール分別法を用いるが、免疫グロブリンの単離および精製に種々の方法を用い、潜在的ウイルス汚染を減少させるために種々の方法を用いる。さらに、筋肉内または皮下投与用に現在製剤化されている他の製剤は、本発明が提供する組み合わせおよび方法において用いることができる。
【０１１６】
IG製剤の例には、正常血漿と同様のIgGサブクラスの分布を有する液体非修飾IgG製剤である静脈内用免疫グロブリン(ヒト)、10%(IVIG、10%、Gammagard(登録商標)液として市販、Baxter Healthcare Corporation)がある。該製剤は完全結晶化可能断片(Fc)およびFab領域を含む。該製剤は、IgGが少なくとも98%であり、IgAが濃度37μg/mLで存在し、IgMがほんの微量存在する100mg/mlのタンパク質を含む。該製剤は、生理学的浸透圧と同様の浸透圧を有し、糖、ナトリウム、または保存料は添加されていない。pH4.6〜5.1で安定化するためにグリシンを用いて製剤化する。製造方法には、改良Cohn-Oncley冷アルコール分別法、およびさらに弱陽イオン交換クロマトグラフィおよび弱陰イオン交換クロマトグラフィの使用による連続法による精製法を用いる。製造方法には、以下の3つの独立したウイルス不活化または除去工程も含まれる：溶媒/界面活性剤(S/D)処理、ナノ濾過、および低pHおよび上昇する温度でインキュベーション。
D.  ヒアルロニダーゼ
【０１１７】
本発明は、免疫グロブリンおよび可溶性ヒアルロニダーゼを含む組み合わせ、およびIG介在疾患および病状を治療するためにそのような皮下投与用の組み合わせの使用方法を提供する。ヒアルロニダーゼは、細胞外マトリックスの必須成分および間質障壁の主要成分であるヒアルロン酸を分解する酵素のファミリーである。ヒアルロン酸の加水分解を触媒することにより、ヒアルロニダーゼはヒアルロン酸の粘度を低下させることにより組織浸透性を増大させる。ヒアルロニダーゼそれ自体は、例えば展着剤もしくは分散剤として、その分散および送達を増大する他の物質、薬剤、およびタンパク質と共に用いられてきた。本発明が提供する組み合わせおよび方法中のヒアルロニダーゼの例は可溶性ヒアルロニダーゼである。
【０１１８】
以下の3つの一般的なクラスのヒアルロニダーゼがある：哺乳動物ヒアルロニダーゼ、細菌ヒアルロニダーゼ、およびヒル、他の寄生虫、および甲殻類(crustacean)由来のヒアルロニダーゼ。哺乳動物型のヒアルロニダーゼ(EC 3.2.1.35)には、ヒアルロナンのβ1→4グリコシド結合を種々のオリゴ糖長、例えば四糖類および六糖類に加水分解するエンド-β-N-アセチル-ヘキソサミニダーゼがある。それらは加水分解活性とトランスグリコシダーゼ活性の両方を有し、ヒアルロナンおよびコンドロイチン硫酸(CS)、一般的にはC4-SおよびC6-Sを分解することができる。このタイプのヒアルロニダーゼには、限定されるものではないが、乳牛(ウシ)(配列番号10および11)、マウス(配列番号17〜19、32)、ブタ(配列番号20〜21)、ラット(配列番号22〜24、31)、ウサギ(配列番号25)、ヒツジ(ヒツジ)(配列番号26および27)、オランウータン(配列番号28)、カニクイザル(配列番号29)、モルモット(配列番号30)由来のヒアルロニダーゼ、およびヒトヒアルロニダーゼが含まれる。
【０１１９】
哺乳動物ヒアルロニダーゼは、さらに主として精巣抽出物にみられる中性で活性なもの、主として肝臓のような臓器にみられる酸で活性なものに細分することができる。典型的な中性で活性なヒアルロニダーゼには、限定されるものではないが、ヒツジ(配列番号27)、ウシ(配列番号11)、およびヒト(配列番号1)のような種々の種由来のPH20を含むPH20が含まれる。ヒトPH20(SPAM1または精子表面タンパク質PH20としても知られる)は、一般的にはグルコシルホスファチジルイノシトール(GPI)アンカーを介して細胞膜に固定される。ヒトPH20は、天然には精子-卵付着に関与し、ヒアルロン酸を消化することにより卵丘細胞の層に精子が侵入するのを助ける。PH20 mRNA転写物は、正常に翻訳されてN末端に35アミノ酸シグナル配列(アミノ酸残基1〜35位)を、C末端に19アミノ酸GPIアンカー(アミノ酸残基491〜509位)を含む509アミノ酸前駆体ポリペプチド(配列番号1)を生じる。したがって、成熟PH20は、配列番号2に示す474アミノ酸ポリペプチドである。ウシPH20は、553アミノ酸前駆体ポリペプチド(配列番号11)である。ウシPH20とヒトPH20とのアラインメントは、ウシポリペプチドにGPIアンカーがないためアミノ酸470から各カルボキシ末端までに複数のギャップが存在し、弱い相同性しか示さない(例えば、Frost GI(2007)Expert Opin. Drug. Deliv. 4：427-440参照)。実際に、明確なGPIアンカーはヒトを含むいかなる他のPH20種でも予測できない。すなわち、ヒツジおよびウシから生成されたPH20ポリペプチドは可溶性型として存在する。ウシPH20は、細胞膜に非常に緩く結合して存在するが、ホスホリパーゼ感受性アンカーを介して固定されない(Lalancette et al、Biol Reprod. 2001 Aug;65(2)：628-36.)。ウシヒアルロニダーゼのこの独特な特徴は、臨床使用用の抽出物としての可溶性ウシ精巣ヒアルロニダーゼ酵素の使用を可能にしている(Wydase(登録商標)、Hyalase(登録商標))。
【０１２０】
ヒトPH20(SPAM1ともいう)に加えて、以下の5つのヒアルロニダーゼ用遺伝子がヒトゲノムで同定されている：HYAL1、HYAL2、HYAL3、HYAL4、およびHYALP1。HYALP1は偽遺伝子であり、HYAL3(配列番号38)はあらゆる既知の基質に対しても酵素活性を有することは示されなかった。HYAL4(配列番号39に記載の前駆体ポリペプチド)はコンドロイチナーゼであり、ヒアルロナンに対する活性がほとんどない。HYAL1(配列番号36に記載の前駆体ポリペプチド)は、原型的酸活性酵素であり、PH20(配列番号1に記載の前駆体ポリペプチド)は、原型的中性活性酵素である。酸活性ヒアルロニダーゼ、例えばHYAL1およびHYAL2(配列番号37に記載の前駆体ポリペプチド)は、一般的には中性pH(すなわちpH7)で触媒活性がない。例えば、HYAL1は、pH4.5でin vitroで触媒活性がほとんどない(Frost et al.(1997)Anal. Biochemistry、251：263-269)。HYAL2は、in vitroでの特異活性が非常に低い。ヒアルロニダーゼ様酵素は、一般的にグリコシルホスファチジルイノシトールアンカー、例えばヒトHYAL2およびヒトPH20(Danilkovitch-Miagkova、et al.(2003)Proc Natl Acad Sci USA. 100(8)：4580-5)を介して血漿膜に固定されるもの、およびヒトHYAL1のような一般的に可溶性のもの(Frost et al、(1997)Biochem Biophys Res Commun. 236(1)：10-5)によっても特徴づけることができる。
【０１２１】
あるヒアルロニダーゼのN-およびO-結合グリコシル化を含むグリコシル化は、それらの触媒活性および安定性にとって非常に重要でありうる。糖タンパク質を修飾するグリカンのタイプの変化は、タンパク質の抗原性、構造的ホールディング、溶解性、および安定性に劇的な影響を与えうるが、ほとんどの酵素は、最適酵素活性にグリコシル化を必要とするとは考えられない。そのようなヒアルロニダーゼはこれに関してN-結合グリコシル化の除去がヒアルロニダーゼ活性のほぼ完全な不活化をもたらしうる点でユニークである。そのようなヒアルロニダーゼに関して、N-結合グリカンの存在が活性酵素を生じるために重要である。
【０１２２】
N-結合オリゴ糖は、そのすべてが-Asn-Xaa-Thr/Ser-配列(ここで、XaaはProではない)に含まれるAsn残基のアミド窒素を介して結合した(Man)3-GlcNAc-GlcNAc-コアを有する種々の主要タイプ(オリゴマンノース、複合体、ハイブリッド、硫酸化物)に分類される。-Asn-Xaa-Cys-部位のグリコシル化は、凝固プロテインCについて報告されている。ある場合には、ヒアルロニダーゼは、N-グリコシド結合とO-グリコシド結合の両方を含みうる。例えば、PH20は、O-結合オリゴ糖およびN-結合オリゴ糖を有する。
【０１２３】
配列番号1に例示したヒトPH20のN82、N166、N235、N254、N368、N393、N490に7個の潜在的N-結合グリコシル化がある。ジスルフィド結合がシステイン残基C60とC351の間およびC224とC238の間に形成され、コアヒアルロニダーゼドメインを形成する。しかしながら、中性酵素触媒活性にはカルボキシ末端にさらにシステインが必要であり、配列番号1のアミノ酸36〜464が最小の活性ヒトPH20 ヒアルロニダーゼドメインを含む。すなわち、N-結合グリコシル化部位N-490は適切なヒアルロニダーゼ活性には必要でない。
可溶性ヒアルロニダーゼ
【０１２４】
本発明の組み合わせおよび方法は可溶性ヒアルロニダーゼを提供する。可溶性ヒアルロニダーゼには、限定されるものではないが、Hyal1、ウシPH20およびヒツジPH20、そのアレル変異体、および他の変異体を含む、可溶性形で存在するあらゆるものが含まれる。可溶性ヒアルロニダーゼには、可溶性であるように修飾されたあらゆるヒアルロニダーゼが含まれる。例えば、通常GPIアンカーを介して膜に固定されているヒトPH20は、C末端のGPIアンカーの全てまたは部分をトランケーションおよび除去することにより可溶化することができる。可溶性ヒアルロニダーゼには、中性活性および酸活性ヒアルロニダーゼも含まれるが、中性活性ヒアルロニダーゼは本発明では皮下投与のための使用が予期される。
【０１２５】
すなわち、可溶性ヒアルロニダーゼの例には、あらゆる種由来のPH20、例えば、配列番号 1、2、11、25、27、30、および31のいずれかに示すものまたは該ヒアルロニダーゼが可溶性であり、ヒアルロニダーゼ活性を保持する限りC末端GPIアンカーの全てまたは部分を欠くそのトランケート形が含まれる。可溶性ヒアルロニダーゼには、配列番号 1、2、11、25、27、30、および31のいずれかのアレル変異体または他の変異体、またそのトランケート形が含まれる。アレル変異体および他の変異体には、配列番号 1、2、11、25、27、30、および31のいずれかと60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、もしくはそれ以上の配列同一性を有するポリペプチド、またはそのトランケート形が含まれる。典型的には、本発明の方法には可溶性ヒトPH20を用いる。他の動物由来のPH20を用いることができるが、そのような製剤は動物タンパク質であるので潜在的に免疫原性である。例えば、かなりの割合の患者が食物摂取に伴う前感作を示し、これらは動物タンパク質であるから全ての患者に二次感作のリスクがある。すなわち、非ヒト製剤は慢性使用には適さない。非ヒト製剤が望ましい場合は、本発明ではそのようなポリペプチドは免疫原性が減少するように製造することができると予期される。そのような修飾は当業者のレベルの範囲内である。本発明の方法に用いるPH20を含むヒアルロニダーゼは、組み換え的に製造するか、または天然供給源、例えば精巣抽出物から精製または部分精製することができる。
可溶性ヒトPH20
【０１２６】
可溶性ヒアルロニダーゼの例には可溶性ヒトPH20がある。可溶性形の組み換えヒトPH20を製造し、IG治療可能な疾患および病状を治療するために皮下投与用に免疫グロブリンと一緒に投与し、または一緒に製剤化するために本明細書に記載の方法に用いることができる。そのような可溶性形のPH20の製造は、出願No. 11/065,716および11/238,171、および下記実施例2〜6に記載されている。可溶性形には、限定されるものではないが、配列番号1に記載のアミノ酸配列のアミノ酸1〜アミノ酸347、372、394、413、430、447、467、477、478、479、480、481、482、および483を含むポリペプチドを生じるC末端にトランケーションを有するあらゆるものが含まれる。哺乳動物細胞に発現すると、35アミノ酸N末端シグナル配列はプロセシング中に開裂され、成熟形のタンパク質が分泌される。すなわち、成熟可溶性ポリペプチドには、配列番号1のアミノ酸 36〜347、372、394、413、430、447、467、477、478、479、480、481、482、および483が含まれる。アミノ酸477〜483位(配列番号1に記載の前駆体ポリペプチドに対応する)で終わる欠失突然変異は、完全長GPI固定形より高い分泌ヒアルロニダーゼ活性を示す。したがって、可溶性ヒアルロニダーゼの例には、例えば配列番号4〜9のいずれかに記載の長さ442、443、444、445、446、または447アミノ酸のもの、またはアレルもしくは種変異体またはその他の変異体がある。一般的には、グリコシル化はヒアルロニダーゼの触媒活性および安定性に重要であるので、可溶性形のPH20は、該ポリペプチドが確実に活性を保持するように正しいN-グリコシル化を促進するタンパク質発現系を用いて製造される。そのような細胞には、例えば、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞(例えばDG44 CHO 細胞)が含まれる。
組換え可溶性ヒトPH20(rHuPH20)
【０１２７】
組換え可溶性形のヒトPH20(可溶性rHuPH20)を生成し、本明細書に記載の方法を用いて製造および精製することができる。そのような可溶性形のrHuPH20の生成は、米国特許出願No. 11/065,716および11/238,171(米国特許公開公報No. US20050260186およびUS 20060104968として公開)および下記実施例2〜6に記載されている。そのようなポリペプチドの例には、配列番号3に記載のアミノ酸1〜482をコードする核酸分子から生じるものがある、翻訳後プロセシングは、35アミノ酸シグナル配列を除去し、447アミノ酸可溶性rHuPH20(配列番号4)の分泌をもたらす。得られた精製rHuPH20は、製造および精製時に培養液中に存在するペプチダーゼにより異種性(heterogenous)でありうる。典型的には、rHuPH20は、CHO細胞(例えばDG44 CHO細胞)のような活性を保持するために正しいN-グリコシル化を促進する細胞中で生成される。
E.  可溶性ヒアルロニダーゼをコードする核酸およびそのポリペプチドの製造方法
【０１２８】
本明細書に記載の可溶性ヒアルロニダーゼのポリペプチドは、タンパク質生成および組み換えタンパク質発現のための当該分野でよく知られた方法により得ることができる。目的とする遺伝子をコードする核酸を同定するための当業者に知られたあらゆる方法を用いることができる。当該分野で利用可能なあらゆる方法を用いて細胞または組織供給源のようなヒアルロニダーゼをコードする完全長(すなわち完全なコード領域を含む)cDNAまたはゲノムDNAクローンを得ることができる。修飾または変異体可溶性ヒアルロニダーゼは、例えば部位指向性突然変異誘発により野生型ポリペプチドから操作することができる。
【０１２９】
ポリペプチドは、核酸分子をクローニングおよび単離するための当該分野で知られたあらゆる利用可能な方法を用いてクローニングおよび単離することができる。そのような方法には、核酸のPCR増幅、ならびに核酸ハイブリダイゼーションスクリーニング、抗体に基づくスクリーニング、および活性に基づくスクリーニングを含むライブラリーのスクリーニングが含まれる。
【０１３０】
核酸の増幅方法を用いて、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)法を含む目的とするポリペプチドをコードする核酸分子を単離することができる。核酸を含む物質は、目的とするポリペプチドをコードする核酸分子を単離することができる出発物質として用いることができる。健康および/または罹患対象由来の例えば、DNAおよびmRNA調製物、細胞抽出物、組織抽出物、液体試料(例えば血液、血清、唾液)試料を増幅法に用いることができる。核酸ライブラリーも出発物質の供給源として用いることができる。目的とするポリペプチドを増幅するためのプライマーを設計することができる。例えば、プライマーは、目的とするポリペプチドを生成する発現した配列に基づいて設計することができる。プライマーはポリペプチドアミノ酸配列の逆翻訳(back-translation)に基づいて設計することができる。増幅により生じた核酸分子をシーケンシングし、目的とするポリペプチドをコードすることを確認することができる。
【０１３１】
さらなるヌクレオチド配列を、ベクター、例えばタンパク質発現ベクターもしくはコアタンパク質をコードするDNA配列を増幅するために設計されたベクター中に合成遺伝子をクローニングするための制限エンドヌクレアーゼ部位を含むリンカー配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子と連結することができる。さらに、機能的DNAエレメントを特定するさらなるヌクレオチド配列をポリペプチドをコードする核酸分子と作動可能なように連結させることができる。そのような配列の例には、限定されるものではないが、細胞内タンパク質発現を促進するように設計されたプロモーター配列、および分泌配列、例えばタンパク質分泌を促進するように設計されたヘテロローガスなシグナル配列が含まれる。そのような配列は当業者に知られている。さらなるヌクレオチド残基配列、例えばタンパク質結合領域を特定する塩基配列の酵素をコードする核酸分子と連結することができる。そのような領域には、限定されるものではないが、特定の標的細胞内への酵素の取り込みを促進するか、または合成遺伝子の生成物の薬物動態を変化させるタンパク質を促進またはコードする残基の配列が含まれる。例えば、酵素をPEG部分と連結することができる。
【０１３２】
さらに、タグまたは他の部分を、例えば、ポリペプチドの検出またはアフィニティ精製を助けるために加えることができる。さらに、さらなるヌクレオチド残基配列、例えばエピトープタグもしくは他の検出可能なマーカーを特定する塩基配列も酵素をコードする核酸分子と連結することができる。そのような配列の例には、Hisタグ(例えば、6xHis、HHHHHH；配列番号54)またはFlagタグ(DYKDDDDK；配列番号55)をコードする核酸配列が含まれる。
【０１３３】
次に、同定または単離された核酸を適切なクローニングベクターに挿入することができる。当該分野で知られた多くのベクター宿主系を用いることができる。あり得るベクターには、限定されるものではないが、プラスミドまたは修飾ウイルスが含まれるが、ベクター系は、用いる宿主細胞と適合性でなければならない。そのようなベクターには、限定されるものではないが、バクテリオファージ、例えばラムダ誘導体、またはプラスミド、例えばpCMV4、pBR322もしくはpUCプラスミド誘導体、またはBluescriptベクターが含まれる(Stratagene、La Jolla、CA)。他の発現ベクターには本明細書で例示しているHZ24発現ベクターがある。クローニングベクター内への挿入は、例えば相補的粘着末端を有するクローニングベクター内にDNA断片を結合することにより達成することができる。挿入は、TOPOクローニングベクター(INVITROGEN、Carlsbad、CA)を用いて行うことができる。DNAを断片化するのに用いる相補的制限部位がクローニングベクター中に存在しない場合は、DNA分子の末端を酵素的に修飾することができる。あるいはまた、あらゆる望ましい部位を、DNA末端上にヌクレオチド配列(リンカー)を結合することにより作製することができ、この結合したリンカーは制限エンドヌクレアーゼ認識配列をコードする特異的化学合成オリゴヌクレオチドを含むことができる。代替法において、開裂ベクターおよびタンパク質遺伝子は、ホモポリマーテーリングにより修飾することができる。組み換え分子は、多くの遺伝子配列のコピーが生じるように、例えば形質転換、トランスフェクション、感染、エレクトロポーレーション、およびソノポーレーションにより宿主細胞内に導入することができる。
【０１３４】
特定の態様において、単離したタンパク質遺伝子、cDNA、または合成DNA配列を組み込む組み換えDNA分子による宿主細胞の形質転換は、複数コピーの遺伝子の生成を可能にする。すなわち、形質転換体を増殖させ、形質転換体から組み換えDNA分子を単離し、必要であれば単離した組み換えDNAから挿入した遺伝子を回収することにより遺伝子を大量に得ることができる。
1. ベクターおよび細胞
【０１３５】
例えば本明細書に記載のあらゆる1またはそれ以上の目的とするタンパク質の組み換え発現のために、該タンパク質をコードするヌクレオチド配列のすべてまたは部分を含む核酸を適切な発現ベクター、すなわち、挿入タンパク質をコードする配列の転写および翻訳に必要なエレメントを含むベクター内に挿入することができる。必要な転写および翻訳シグナルを酵素遺伝子のための天然プロモーターおよび/またはそのフランキング領域により供給することもできる。
【０１３６】
酵素をコードする核酸を含むベクターも提供される。ベクターを含む細胞も提供される。該細胞には真核細胞と原核細胞が含まれ、ベクターには本発明に用いるのに適したあらゆるものがある。
【０１３７】
ベクターを含む原核細胞および真核細胞(内皮細胞を含む)が提供される。そのような細胞には、細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、古細菌(Archea)、植物細胞、昆虫細胞、および動物細胞が含まれる。該細胞を用い、上記細胞を、コードしたタンパク質が細胞により発現される条件下で増殖させ、発現タンパク質を回収することによりそのタンパク質を生成する。本発明の目的において、例えば該酵素を培地中に分泌させることができる。
【０１３８】
天然またはヘテロローガスなシグナル配列と結合した可溶性ヒアルロニダーゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列およびその複数コピーを含むベクターを提供する。該ベクターは、細胞内で酵素タンパク質が発現し、または酵素タンパク質が分泌タンパク質として発現されるように選択することができる。
【０１３９】
種々の宿主-ベクター系を用いてタンパク質をコードする配列を発現させることができる。これには、限定されるものではないが、ウイルス(例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、および他のウイルス)に感染した哺乳動物細胞系；ウイルス(例えばバクロウイルス)に感染した昆虫細胞；微生物、例えば酵母ベクターを含む酵母；またはバクテリオファージ、DNA、プラスミドDNA、またはコスミドDNAで形質転換された細菌が含まれる。ベクターの発現エレメントは強さと特異性が異なる。用いる宿主-ベクター系に応じて、多くの適切な転写および翻訳エレメントのいずれかを用いることができる。
【０１４０】
ベクター中にDNA断片を挿入するための当業者に知られたあらゆる方法を用いて、適切な転写/翻訳調節シグナルおよびタンパク質をコードする配列を含むキメラ遺伝子を含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、in vitro 組み換えDNAおよび合成技術ならびにvivo組換え(遺伝子組み換え)が含まれる。タンパク質またはドメイン、誘導体、断片またはその相同体をコードする核酸配列の発現は、遺伝子またはその断片が組み換えDNA分子で形質転換した宿主中で発現するように第2核酸配列により制御することができる。例えば、タンパク質の発現は、当該分野で知られたあらゆるプロモーター/エンハンサーにより調節することができる。具体的態様において、プロモーターは目的とするタンパク質の遺伝子に対して天然ではない。用いることができるプロモーターには、限定されるものではないが以下のものが含まれる：SV40早期プロモーター(Bernoist and Chambon、Nature 290：304-310(1981))、ラウス肉腫ウイルスの3'長末端反復中に含まれるプロモーター(Yamamoto et al. Cell 22：787-797(1980))、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター(Wagner et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78：1441-1445(1981))、メタロチオネイン遺伝子の調節配列(Brinster et al.、Nature 296：39-42(1982))；原核性発現ベクター、例えばβ-ラクタマーゼプロモーター(Jay et al.、(1981)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78：5543)、またはtacプロモーター(DeBoer et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80：21-25(1983))(「Useful Proteins from Recombinant Bacteria」：Scientific American中 242：79-94(1980)も参照のこと)；ノパリン合成酵素プロモーターを含む植物発現ベクター(Herrara-Estrella et al.、Nature 303：209-213(1984))、またはカリフラワーモザイクウイルス35S RNAプロモーター(Garder et al.、Nucleic Acids Res. 9：2871(1981))、および光合成酵素リブロースビスホスフェートカルボキシラーゼプロモーター(Herrera-Estrella et al.、Nature 310：115-120(1984))；酵母および他の真菌由来のプロモーターエレメント、例えばGal4プロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼプロモーター、アルカホスファターゼプロモーター、および組織特異性を有し、トランスジェニック動物に用いられる下記動物転写調節領域；膵腺房細胞中で活性なエラスターゼI遺伝子調節領域(Swift et al.、Cell 38：639-646(1984)；Ornitz et al.、Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50：399-409(1986)；MacDonald、Hepatology 7：425-515(1987))；膵β細胞中で活性なインスリン遺伝子調節領域(Hanahan et al.、Nature 315：115-122(1985))、リンパ様細胞中で活性な免疫グロブリン遺伝子調節領域(Grosschedl et al.、Cell 38：647-658(1984)；Adams et al.、Nature 318：533-538(1985)；Alexander et al.、Mol. Cell Biol. 7：1436-1444(1987))、精巣細胞、乳腺細胞、リンパ様細胞、および肥満細胞中で活性なマウス乳癌ウイルス調節領域(Leder et al.、Cell 45：485-495(1986))、肝臓中で活性なアルブミン遺伝子調節領域(Pinckert et al.、Genes and Devel. 1：268-276(1987))、α-フェトプロテイン遺伝子調節領域(Krumlauf et al.、Mol. Cell. Biol. 5：1639-1648(1985)；Hammer et al.、Science 235：53-58 1987))、肝臓中で活性なアルファ-1抗トリプシン遺伝子調節領域(Kelsey et al.、Genes and Devel. 1：161-171(1987))、ミエロイド細胞中で活性なベータグロビン遺伝子調節領域(Magram et al.、Nature 315：338-340(1985)；Kollias et al.、Cell 46：89-94(1986))、脳のオリゴデンドロサイト中で活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子調節領域(Readhead et al.、Cell 48：703-712(1987))、骨格筋中で活性なミオシン軽鎖-2遺伝子調節領域(Shani、Nature 314：283-286(1985))、および視床下部の性腺刺激ホルモン分泌細胞中で活性な性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子調節領域(Mason et al.、Science 234：1372-1378(1986))。
【０１４１】
具体的態様において、目的とするタンパク質、またはそのドメイン、断片、誘導体、または相同体をコードする核酸と作動可能なように連結したプロモーター、1またはそれ以上の複製起点、および所望により1またはそれ以上の選択可能マーカー(例えば抗生物質耐性遺伝子)を含むベクターを用いる。大腸菌(E.coli)細胞を形質転換するための典型的なプラスミドベクターには、例えばpQE発現ベクター(Qiagen、Valencia、CAから入手可能；この系を説明するQiagenが公表した論文も参照のこと)が含まれる。pQEベクターは、ファージT5プロモーター(大腸菌RNAポリメラーゼにより認識される)および大腸菌中で厳密に調節された高レベルの組み換えタンパク質発現をもたらす二重lacオペロン抑制モジュール、効率的な翻訳のための合成リボソーム結合部位(RBS II)、6XHis tagコーディング配列、t0およびT1転写終結因子、ColE1複製起点、およびアンピシリン耐性をもたらすベータラクタマーゼ遺伝子を有する。pQEベクターは、組み換えタンパク質のN-末端またはC-末端に6xHis tagを配置することができる。そのようなプラスミドにはpQE 32、pQE 30、およびpQE 31が含まれ、これらは3つすべての読み取り枠に対する複数のクローニング部位を提供し、N-末端6xHis標識タンパク質の発現をもたらす。大腸菌細胞の形質転換用の他の典型的なプラスミドベクターには、例えば、pET発現ベクター(米国特許4,952,496；NOVAGEN、Madison、WIから入手可能；該系を説明するNovagenが発表した論文も参照のこと)が含まれる。そのようなプラスミドには、T7lacプロモーター、T7終結因子、誘導性大腸菌lacオペレーター、およびlac抑制遺伝子を含むpET 11a；T7プロモーター、T7終結因子、および大腸菌ompT分泌シグナルを含むpET 12a-c；およびHisカラムで精製するのに用いるHis-Tag(登録商標)カラムおよびカラムで精製後に開裂を可能にするトロンビン開裂部位、T7-lacプロモーター領域、およびT7終結因子を含むpET 15bおよびpET19b(NOVAGEN、Madison、WI)が含まれる。
【０１４２】
哺乳動物細胞発現用のベクターの例にHZ24発現ベクターがある。HZ24発現ベクターはpCIベクター骨格(Promega)由来であった。該発現ベクターは、ベータラクタマーゼ耐性遺伝子をコードするDNA(AmpR)、F1複製起点、サイトメガロウイルス即初期エンハンサー/プロモーター領域(CMV)、およびSV40後期ポリアデニル化シグナル(SV40)を含む。該発現ベクターは、ECMVウイルス(Clontech)由来の内部リボソーム侵入部位およびマウスジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)遺伝子も有する。
2. 発現
【０１４３】
可溶性ヒアルロニダーゼポリペプチドは、in vivoおよびin vitro法を含む当業者に知られたあらゆる方法により製造することができる。目的とするタンパク質は、例えば投与および治療に必要なタンパク質の必要な量と形をもたらすのに適したあらゆる生物中で発現させることができる。発現宿主には、原核生物および真核生物、例えば、大腸菌、酵母、植物、昆虫細胞、ヒト細胞系を含む哺乳動物細胞、およびトランスジェニック動物が含まれる。発現宿主は、そのタンパク質発現レベルおよび発現したタンパク質上に存在する翻訳後修飾のタイプが異なりうる。発現宿主の選択はこれらおよび他の因子、例えば法的および安全性に関する考察、生産費用、および精製の必要性と方法に基づいて行うことができる。
【０１４４】
多くの発現ベクターが利用可能であり、当業者に知られており、タンパク質の発現に用いることができる。発現ベクターの選択は、宿主発現系の選択により影響されるだろう。一般的には、発現ベクターは、転写プロモーター、および所望によりエンハンサー、翻訳シグナル、および転写および翻訳終止シグナルを含むことができる。典型的には、適切な形質転換に用いる発現ベクターは、形質転換細胞の選択および維持を可能にする選択可能なマーカーを有する。ある場合には、複製起点を用いてベクターのコピー数を増幅することができる。
【０１４５】
可溶性ヒアルロニダーゼポリペプチドをタンパク質融合物として利用しまたは発現させることもできる。例えば、酵素融合物を、酵素にさらなる機能性を加えるために生成することができる。酵素融合タンパク質の例には、限定されるものではないが、シグナル配列、例えば局在化のためのタグ、例えば、his6タグ、もしくはmycタグ、または精製用タグ、例えば、GST融合物、およびタンパク質分泌および/または膜結合を指示する配列の融合物が含まれる。
a. 原核細胞
【０１４６】
原核生物、特に大腸菌は、大量のタンパク質の製造系を提供する。大腸菌の形質転換は、当業者によく知られた単純で迅速な技術である。大腸菌のための発現ベクターは、誘導性プロモーターを含むことができ、そのようなプロモーターは、高レベルのタンパク質発現を誘導し、宿主細胞にいくらかの毒性を示すタンパク質を発現させるのに有用である。誘導性プロモーターの例には、lacプロモーター、trpプロモーター、ハイブリッドtacプロモーター、T7およびSP6 RNAプロモーター、および温度調節λPLプロモーターが含まれる。
【０１４７】
本明細書に記載したようなタンパク質は、大腸菌の細胞質環境に発現することができる。細胞質は還元環境であり、ある分子では可溶性封入体の形成を生じ得る。還元剤、例えばジチオスレイトールおよびβ-メルカプトエタノール、および変性剤、例えばグアニジン-HClおよび尿素は、タンパク質を還元するのに用いることができる。代替法には、酸化環境およびシャペロニン様およびジスルフィドイソメラーゼを提供し、可溶性タンパク質を生成をもたらすことができる細菌のペリプラズム腔中のタンパク質の発現がある。典型的は、タンパク質をペリプラズムに導くリーダー配列を発現すべきタンパク質と融合させる。次に、リーダーはペリプラズムの内側にあるシグナルペプチダーゼにより除去される。ペリプラズム標的化リーダー配列の例には、ペクテートリアーゼ遺伝子由来のpelBリーダーおよびアルカリホスファターゼ遺伝子由来リーダーを含む。ある場合には、ペリプラズムでの発現は、発現タンパク質の培養液への漏出を可能にする。タンパク質の分泌は培養上清からの急速で簡単な精製を可能にする。分泌されないタンパク質は、浸透圧溶解によりペリプラズムから得ることができる。ペリプラズムでの発現と同様に、ある場合にはタンパク質は可溶性になることができ、変性および還元剤を用いて可溶性およびリホールディングを促進することができる。誘導および増殖温度は、発現レベルおよび溶解性に影響しうるし、典型的には25℃〜37℃の温度を用いる。典型的には、細菌は非グリコシル化タンパク質を生成する。すなわち、タンパク質が機能するためにグリコシル化を必要とする場合は、宿主細胞から精製した後にin vitroでグリコシル化を加えることができる。
b. 酵母細胞
【０１４８】
酵母、例えばサッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、ヤロウイア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)、クルイベロミセス・ラクチス(Kluyveromyces lactis)、およびピキア・パストリス(Pichia pastorisは、本明細書に記載のようなタンパク質を製造するのに用いることができるよく知られた酵母発現宿主である。酵母は、エピソーム複製ベクターを用いるか、またはホモローガスな組み換えによる安定な染色体統合により形質転換することができる。典型的には、誘導性プロモーターを用いて遺伝子発現を調節する。そのようなプロモーターの例には、GAL1、GAL7、およびGAL5mならびにメタロチオネインプロモーター、例えばCUP1、AOX1または他のピキア属、または他の酵母プロモーターが含まれる。発現ベクターは、形質転換DNAの選択および維持のために選択可能なマーカー、例えばLEU2、TRP1、HIS3、およびURA3を含むことが多い。酵母に発現したタンパク質はしばしば可溶性である。シャペロニン、例えばBip、とタンパク質ジスルフィドイソメラーゼの共発現は、発現レベルと可溶性を改善することができる。さらに、酵母に発現したタンパク質は、分泌シグナルペプチド融合、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ由来の酵母接合型アルファ因子分泌シグナル、および酵母細胞表面タンパク質、例えばAga2p接合吸着レセプター、またはアルクラ・アデニニボランス(Arxula adeninivorans)グルコアミラーゼとの融合を用いる分泌を指向することができる。発現ポリペプチドは分泌経路から抜け出るので、Kex-2プロテアーゼのようなプロテアーゼ開裂部位を操作し、該発現ポリペプチドから融合配列を取り出すことができる。酵母は、Asn-X-Ser/Thrモチーフでグリコシル化することもできる。
c. 昆虫細胞
【０１４９】
特にバクロウイルス発現を用いる昆虫細胞は、ポリペプチド、例えばヒアルロニダーゼポリペプチドを発現させるのに有用である。昆虫細胞は、高レベルのタンパク質を発現し、高等真核細胞によって使用されるほとんどの翻訳後修飾を行うことができる。バクロウイルスは、安全性を改善し、真核性発現の制御不安を減少させる制限的宿主範囲を有する。典型的発現ベクターは、高レベル発現用のプロモーター、例えばバクロウイルスのポリヘドリンプロモーターを用いる。一般に用いられるバクロウイルス系には、バクロウイルス、例えば、オートグラファ・カリフォルニカ(Autographa californica)核多角体病ウイルス(AcNPV)、およびカイコ(Bombyx mori)核多角体病ウイルス(BmNPV)、および昆虫細胞系、例えばヨトウガ(Spodoptera frugiperda)由来Sf9、シューダレチア・ユニパンクタ(Pseudaletia unipuncta)(A7S)、およびダナウス・プレクシップス(Danaus plexippus)(DpN1)が含まれる。高レベルで発現させるために、発現する分子のヌクレオチド配列を該ウイルスのポリヘドリン開始コドンのすぐ下流に融合させる。哺乳動物分泌シグナルは、昆虫細胞中で正確にプロセシングされ、これを用いて培養液中に発現タンパク質を分泌させることができる。さらに、細胞系シューダレチア・ユニパンクタ(A7S)およびダナウス・プレクシップス(DpN1)は、哺乳動物細胞系と同様のグリコシル化パターンを有するタンパク質を生成する。
【０１５０】
昆虫細胞における代替発現系は安定に形質転換された細胞を用いることである。細胞系、例えば、Schneider 2(S2)およびKc 細胞(キイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster))およびC7 細胞(ヒトスジシマカ(Aedes albopictus))を発現に用いることができる。ドロソフィラ(Drosophila)メタロチオネインプロモーターを用いてカドミウムまたは銅を用いる重金属誘導存在下で高レベルの発現を誘導することができる。発現ベクターは、典型的には選択可能なマーカー、例えばネオマイシンおよびヒグロマイシンを用いて維持することができる。
d.  哺乳動物細胞
【０１５１】
哺乳動物発現系を用いて、可溶性ヒアルロニダーゼポリペプチドを含むタンパク質を発現させることができる。発現構築物を、ウイルス感染(例えばアデノウイルス)によるか、または直接DNA伝達(例えばリポソーム、リン酸カルシウム、DEAEデキストラン)、およびエレクトロポーレーションおよびマイクロインジェクションにより哺乳動物細胞に伝達することができる。典型的には、哺乳動物細胞用の発現ベクターは、mRNAキャップ部位、TATAボックス、翻訳開始配列(Kozakコンセンサス配列)、およびポリアデニル化エレメントを含む。IRESエレメントを加え、選択可能マーカーのような別の遺伝子と2シストロン性発現を可能にすることもできる。そのようなベクターは、しばしば高レベル発現用の転写プロモーターエンハンサー、例えばSV40プロモーターエンハンサー、ヒトサイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、およびラウス肉腫ウイルス(RSV)の長末端反復配列を含む。これらプロモーターエンハンサーは多くの細胞種において活性である。組織および細胞型プロモーターおよびエンハンサー領域を発現に用いることもできる。典型的なプロモーター/エンハンサー領域には、限定されるものではないが、エラスターゼI、インスリン、免疫グロブリン、マウス乳癌ウイルス、アルブミン、アルファフェトプロテイン、アルファ1抗トリプシン、ベータグロビン、ミエリン塩基性タンパク質、ミオシン軽鎖2、および性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子コントロールのような遺伝子由来のものが含まれる。選択可能マーカーを用いて発現構築物を有する細胞を選択し、維持することができる。選択可能マーカー遺伝子の例には、限定されるものではないが、ヒグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ、アデノシンデアミナーゼ、キサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)、およびチミジンキナーゼが含まれる。例えば、発現をメトトレキセート存在下で行い、DHFR遺伝子を発現する細胞のみを選択することができる。細胞表面情報伝達分子、例えばTCR-ζおよびFcεRI-γとの融合は細胞表面上で活性状態のタンパク質の発現を指示することができる。
【０１５２】
多くの細胞系は、マウス、ラット、ヒト、サル、ニワトリ、およびハムスター細胞を含む哺乳動物での発現に利用可能である。典型的な細胞系には、限定されるものではないが、CHO、Balb/3T3、HeLa、MT2、マウスNS0(非分泌)および他のミエローマ細胞系、ハイブリドーマおよびヘテロハイブリドーマ細胞系、リンパ球、繊維芽細胞、Sp2/0、COS、NIH3T3、HEK293、293S、2B8、およびHKB 細胞が含まれる。細胞培養液からの分泌タンパク質の精製を促進する無血清培地と適合する細胞系も利用可能である。例には、CHO-S 細胞(Invitrogen、Carlsbad、CA、カタログ#11619-012)および無血清EBNA-1細胞系(Pham et al.、(2003)Biotechnol. Bioeng. 84：332-42)が含まれる。最大発現を最適化する特別培地中で増殖するように適合した細胞系も利用可能である。例えば、DG44 CHO細胞は、既知組成の動物生成物不含培地中、懸濁培養中で増殖するよう適合している。
e. 植物
【０１５３】
トランスジェニック植物細胞および植物を用いて、本明細書に記載したようなタンパク質を発現させることができる。典型的には、発現構築物は、直接DNA伝達、例えば微粒子銃、およびプロトプラスト中へのPEG介在伝達、およびアグロバクテリウム介在形質転換を用いて植物に伝達される。発現ベクターには、プロモーターおよびエンハンサー配列、転写終結エレメント、および翻訳調節エレメントを含むことができる。発現ベクターおよび形質転換技術は、通常、双子葉宿主、例えばシロイヌナズナおよびタバコ、および単子葉宿主、例えばトウモロコシおよびコメに分けられる。発現に用いる植物プロモーターの例には、カリフラワーモザイクウイルスプロモーター、ノパリンシンターゼプロモーター、リボースビスホスフェートカルボキシラーゼプロモーター、およびユビキチンおよびUBQ3プロモーターが含まれる。選択可能マーカー、例えばヒグロマイシン、ホスホマンノースイソメラーゼ、およびネオマイシンホスホトランスフェラーゼもしばしば用いられ、形質転換細胞の選択および維持を促進する。細胞は凝集するか(カルス組織)または植物全体に再生するので、形質転換植物細胞を培養中で維持することができる。トランスジェニック植物細胞には、ヒアルロニダーゼポリペプチドを産生するよう操作された藻類も含まれうる。植物は哺乳動物細胞と異なるグリコシル化パターンを有するので、これはこれら宿主中で産生されるタンパク質の選択に影響を及ぼしうる。
3.  精製技術
【０１５４】
宿主細胞からの可溶性ヒアルロニダーゼポリペプチドまたは他のタンパク質を含むポリペプチドの精製方法は、選択する宿主細胞と発現系に依存するであろう。分泌される分子については、タンパク質は一般的に細胞を除去した後に培養液から精製される。細胞内発現については、細胞を溶解し、タンパク質を抽出物から精製することができる。発現にトランスジェニック生物、例えばトランスジェニック植物および動物を用いるときは、組織または器官を出発物質に用いて溶解細胞抽出物を作製することができる。さらに、トランスジェニック動物での生成には、回収することができる乳または卵中のポリペプチドの生成が含まれ、必要であれば、タンパク質を抽出し、さらに当該分野で標準的な方法を用いて精製することができる。
【０１５５】
タンパク質、例えば可溶性ヒアルロニダーゼポリペプチドは、限定されるものではないが、SDS-PAGE、サイズ分画およびサイズ排除クロマトグラフィ、硫酸アンモニウム沈殿、およびイオン交換クロマトグラフィ(例えば陰イオン交換)を含む当該分野で知られた標準的タンパク質精製技術を用いて精製することができる。アフィニティ精製技術を用いて精製の効率と純度を改善することもできる。例えば、ヒアルロニダーゼ酵素と結合する抗体、レセプター、および他の分子をアフィニティ精製に用いることができる。発現構築物は、タンパク質に対する親和性タグ、例えばmycエピトープ、GST融合、またはHis6を加えて操作し、それぞれmyc抗体、グルタチオン樹脂、およびNi-樹脂を用いてアフィニティ精製することができる。純度はゲル電気泳動、および染色および分光光度法を含む当該分野で知られたあらゆる方法により評価することができる。
F.  免疫グロブリンおよび可溶性ヒアルロニダーゼポリペプチドの製造、製剤化、および投与
【０１５６】
本発明は皮下投与用の免疫グロブリンおよび可溶性ヒアルロニダーゼの医薬組成物を提供する。可溶性ヒアルロニダーゼ、例えばPH20、の医薬組成物の製剤化は当該分野で知られている(例えば、米国特許出願公開公報No. US20040268425、US20050260186、およびUS20060104968参照)。可溶性ヒアルロニダーゼは、免疫グロブリンの医薬製剤と一緒に製剤化するかまたは一緒に投与され、免疫グロブリンのバイオアベイラビリティを増加させることにより体内の目的とする部位への免疫グロブリンの送達を増加させる。例えば、IGのヒアルロニダーゼとの一緒の投与または一緒の製剤化は、血流への到達を増加し、より急速な浸透により投与後の分解を減少させることにより薬剤の吸収の程度および/または速度、すなわちバイオアベイラビリティを改善することができる。吸収性とバイオアベイラビリティの増加は、例えばヒアルロナンの分解を伴う流れに対する障害の減少を伴う用量の注射に関連した静水圧を適用することにより投与後の間質の流れと恐らく結合輸送(connective transport)を加速することにより達成することができる。すなわち、可溶性ヒアルロニダーゼを用い、常套的皮下投与方法に比べて皮下投与後の免疫グロブリン濃度の上昇および/またはより急速な上昇が達成され、例えば所定用量に対するより強力および/またはより急速な応答を得ることができる。あるいはまた、可溶性ヒアルロニダーゼを用いて、低用量の投与されたIGで所定の反応を達成することができる。注射もしくは注入部位またはその近くのバルク液流を増加させる可溶性ヒアルロニダーゼの能力は、関連する薬理学的送達の他の局面も改善することができる。例えば、バルク液流の増加は、注射した液体の容量を注射部位からより速やかに分散させる(注射の潜在的痛みまたは他の副作用を減少させる)のを助けることができる。これは、より高用量の投与を可能にする皮下注入にとって特に重要である。バイオアベイラビリティの増加に加え、IGと可溶性ヒアルロニダーゼの一緒の投与または一緒の処方は、常套的静脈内投与経路に比べてより安全もしくはそれ以上に好都合な投与経路を提供する。
【０１５７】
すなわち、バイオアベイラビリティの増加により免疫グロブリンは現在の静脈内(IVIG)製剤を製造し投与するための用量と頻度で皮下投与することができる。IGの現在の皮下投与用製剤に対する利点は、一緒に投与または一緒に製剤化されるヒアルロニダーゼ/IGがより好ましい投与計画、例えば投与頻度の減少をもたらすことができることである。より少ない投与頻度または低用量により、毒性に関連する副作用を減らすことができる。一般的には、皮下IG療法の薬物動態および/または薬力学が改善される。さらに、IGの皮下投与も現在の静脈内注入より利点がある。例えば、皮下注入は、熟練した看護士ではなく患者や家族による注入を可能にし、IGが常套的IVIG療法の5〜10時間に比べて1〜3時間で注入されるより高速での注入が達成され、機能的静脈が必要でなく、さらに、注入に関連する副作用、例えば、血栓症、頭痛、静脈血栓症、および悪心がなく、副作用事象の可能性も低く、注入を家やどこででも行うことができる。
【０１５８】
該組成物は凍結乾燥形または液体形で製剤化することができる。該組成物を凍結乾燥形で提供する場合は、使用直前に適切な緩衝液、例えば無菌生理食塩水溶液で再構成することができる。該組成物は一緒にまたは別個に提供することができる。本発明の目的において、典型的にはそのような組成物は別個に提供される。可溶性ヒアルロニダーゼおよびIGは一緒、連続的、または間欠的に投与するための別個の組成物として包装することができる。該組み合わせはキットとして包装することができる。
1.  製剤
【０１５９】
該化合物を皮下投与に適したあらゆる適切な医薬製剤、例えば溶液剤、サスペンジョン剤、粉末剤、または持続放出製剤に製剤化することができる。典型的には、該化合物は当該分野でよく知られた技術および方法を用いて医薬組成物に製剤化される(例えば、Ansel Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms、第4版、1985、126参照)。医薬的に許容される組成物は、動物およびヒトに使用するための一般的に認められている薬局方に従って作製された規制機関または他の機関の承認により製造される。該製剤は投与方法に適合すべきである。
【０１６０】
医薬組成物は、担体、例えば希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはヒアルロニダーゼまたはIGとともに投与するビークルを含むことができる。適切な医薬的担体の例は、「Remington's Pharmaceutical Sciences」E. W.Martinに記載されている。そのような組成物は、一般的には精製された形または部分精製された形の治療的有効量の化合物を患者に適切に投与するための形をもたらすための適切な量の担体と共に含むだろう。そのような医薬的担体は、無菌の液体、例えば水および油(石油、動物、植物、または合成起源のもの、例えばピーナッツ油、ダイズ油、鉱油、およびゴマ油を含む)でありうる。水は、医薬組成物を静脈内に投与するときの典型的な担体である。生理食塩水溶液および水性デキストロースおよびグリセロール溶液も特に注射可能溶液のための液体担体として用いることができる。組成物は活性成分と共に希釈剤、例えばラクトース、ショ糖、第二リン酸カルシウム、またはカルボキシメチルセルロース；潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、およびタルク；および結合剤、例えばデンプン、中性ゴム、例えばアカシアゼラチンゴム、グルコース、糖蜜、ポリビニルピロリドン、セルロース、およびそれらの誘導体、ポビドン、クロスポビドン、および当該分野で知られた他のそのような結合剤を含むことができる。適切な医薬的賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、ショ糖、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、およびエタノールが含まれる。所望により組成物は少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはpH緩衝剤、例えばアセテート、クエン酸ナトリウム、クロロデキストリン誘導体、ソルビタンラウリン酸モノエステル(ソルビタンラウリン酸モノエステル)、トリエタノールアミン酢酸ナトリウム、オレイン酸トリエタノールアミン、および他のそうような薬剤を含むこともできる。
【０１６１】
医薬的、治療的に活性な化合物およびその誘導体は、典型的には単位剤形または多剤形で製剤化され、投与される。各単位用量は、望む治療効果をもたらすのに十分な予め決定された量の治療的活性化合物を、必要な医薬的担体、ビークル、または希釈剤と共に含む。単位剤形の例には、アンプル、シリンジ、および個々に包装された錠剤またはカプセル剤が含まれる。多剤形は、分離した単位剤形で投与するために単一容器中に包装された複数の同じ単位剤形である。多剤形の例には、バイアル、錠剤もしくはカプセル剤の瓶、またはパイントもしくはガロン瓶が含まれる。したがって、多剤形は、包装で分離していない複数の単位用量である。一般的には、0.005%〜100%の範囲の活性成分を無毒性担体で製造されたバランスと共に含む剤形または組成物を製造することができる。
【０１６２】
典型的には、本発明が提供する組成物は、皮下投与により投与するために製剤化されるが、他の投与経路、例えば筋肉内、静脈内、皮内、病変内、腹腔内注射、硬膜外、経鼻、経口、経膣、経直腸、局所(topicalおよびlocal)、経耳、吸入、バッカル(例えば舌下)、および経皮投与、またはあらゆる経路を含む当業者に知られたあらゆる経路が予期される。そのような経路に適した製剤は当業者に知られている。投与は治療部位に応じて局所的(topicalまたはlocal)、または全身的でありうる。治療が必要な領域への局所投与は、例えば、限定されるものではないが、外科手術時の局所注入、例えば外科手術後の創傷被覆材と併用する局所適用、注射、カテーテル、坐剤、またはインプラントにより達成することができる。組成物は、連続的、間欠的に、または同じ組成物で他の生物活性剤と共に投与することもできる。投与には制御放出製剤および用具制御放出(例えばポンプによる)を含む制御放出系も含まれうる。
【０１６３】
あらゆる症例において最も適した経路は、種々の因子、例えば、特定の組成物を用いる疾患の性質、疾患の進行、疾患の重症度に依存する。本発明の目的において、ヒアルロニダーゼを皮膚または組織の間質に達するように投与し、間質腔で分解し、次いで免疫グロブリンを送達することが望ましい。すなわち、例えば皮下投与法による皮膚下への直接投与が予期される。すなわち、ある例において、局所投与は、例えばシリンジまたは注射針のような注射用具を含む他の製品から注射により達成することができる。別の例において、局所投与は注入によって達成することができ、これはポンプまたは他の同様の用具を用いて促進することができる。他の投与方法も予期される。医薬組成物は各投与経路に適した剤形で製剤化することができる。一般的に注射または注入を特徴とする皮下投与が本発明において予期される。注射物質は液体溶液もしくはサスペンジョン、注射前に液体中で溶解もしくは懸濁するのに適した固形、またはエマルジョンとして通常の形に製造することができる。適切な賦形剤には、例えば水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、またはエタノールがある。医薬組成物は、他の少量の無毒性補助物質、例えば湿潤剤もしくは乳化剤、pH緩衝剤、安定化剤、溶解促進剤、および他のそのような物質、例えば酢酸ナトリウム、ソルビタンラウリン酸モノエステル、オレイン酸トリエタノールアミン、およびシクロデキストリンを含むことがある。一定レベルの用量を維持する徐放性もしくは持続放出系のインプラント(埋め込み物)(例えば米国特許No. 3,710,795参照)も本発明において予期される。そのような組成物に含まれる活性化合物のパーセンテージは、その特定の性質および化合物の活性、ならびに対象の要求に大きく依存する。
【０１６４】
注射物質は、局所および全身投与用に設計される。本発明の目的において、局所投与は、罹患した間質に直接投与するために望ましい。非経口投与用の製剤には、注射準備ができている無菌溶液、無菌乾燥可溶性製品、例えば使用直前に溶媒と混合する準備ができている凍結乾燥粉末(皮下錠)、注射用無菌サスペンジョン、使用直前にビークルと混合する準備ができている可溶性生成物中の無菌乾燥物、および無菌エマルジョンが含まれる。溶液は水性または非水性でありうる。静脈内に投与する場合、適切な担体には、生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水(PBS)、および増粘剤および可溶化剤、例えばグルコース、ポリエチレングリコール、およびポリプロピレングリコール、およびその混合物が含まれる。
【０１６５】
非経口投与用製剤に用いる医薬的に許容される担体には、水性ビークル、非水性ビークル、抗菌剤、等張化剤、緩衝剤、抗酸化剤、局所麻酔剤、懸濁化剤および分散剤、乳化剤、金属イオン封鎖剤もしくはキレート剤、および他の医薬的に許容される物質が含まれる。水性ビークルの例には、塩化ナトリウム注(Injection)、リンゲル注、等張デキストロース注、無菌水注、デキストロースおよび乳酸化リンゲル注が含まれる。非水性非経口投与用ビークルには、植物起源の固定油、綿実油、コーン油、ゴマ油、およびピーナッツ油が含まれる。静菌または静真菌濃度の抗菌剤を、フェノールもしくはクレゾール、水銀剤、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルおよびプロピルp−ヒドロキシ安息香酸エステル、チメロサール、塩化ベンザルコニウム、および塩化ベンゼトニウムを含む多用量容器に包装された非経口投与用製剤に加えることができる。等張化剤には塩化ナトリウムおよびデキストロースが含まれる。緩衝剤にはリン酸塩とクエン酸塩が含まれる。抗酸化剤には重硫酸ナトリウムが含まれる。局所麻酔剤には塩酸プロカインが含まれる。懸濁化剤および分散剤には、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、およびポリビニルピロリドンが含まれる。乳化剤にはポリソルベート80(TWEEN 80)が含まれる。金属イオン封鎖剤もしくは金属イオンのキレート剤にはEDTAが含まれる。医薬的担体には、水混和性ビークル用のエチルアルコール、ポリエチレングリコール、およびプロピレングリコール、ならびにpH調整用の水酸化ナトリウム、塩酸、クエン酸、もしくは乳酸が含まれる。
【０１６６】
医薬活性化合物の濃度は、注射が目的とする薬理効果を生じる有効量を提供するように調整する。正確な用量は、当該分野で知られているように患者または動物の年齢、体重、および状態に依存する。単位用量非経口投与用製剤はアンプル、バイアル、または注射針付きシリンジに包装される。医薬活性化合物を含む液体溶液または再構成粉末調製物の容量は、治療する疾患および包装のために選んだ特定の製品に応じる。非経口投与用のすべての製剤は、当該分野で知られ、実施されているように無菌でなければならない。
【０１６７】
ある例において、医薬製剤は、液体形、例えば溶液剤、シロップ、またはサスペンジョンであり得る。液体形で提供する場合、医薬製剤は使用前に治療的有効濃度に希釈する濃縮製剤として提供することができる。そのような液体製剤は、医薬的に許容される添加剤、例えば懸濁化剤(例えばソルビトールシロップ、セルロース誘導体、または水素添加食用油)、乳化剤(例えばレシチンもしくはアカシア)、非水性ビークル(例えばアーモンド油、油状エーテル、もしくは分画植物油)、および保存料(例えばメチルもしくはプロピル-p-ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸)を用いる常套的手段により製造することができる。別の例において、医薬製剤は、使用前に水または他の適切なビークルで再構成するために凍結乾燥形で存在しうる。
【０１６８】
投与方法は、選択した化合物の、分解過程、例えばタンパク質分解性分解、および抗原および免疫原性反応を介する免疫学的介入への暴露を減少させるために用いることができる。そのような方法の例には、治療部位への局所投与が含まれる。治療薬のPEG化は、タンパク質分解に対する抵抗性を増大し、血漿中の半減期を増加し、抗原性および免疫原性を減少させることが報告されている。PEG化方法論の例は当該分野で知られている(例えば、Lu and Felix、Int. J. Peptide Protein Res.、43：127-138、1994；Lu and Felix、Peptide Res.、6：142-6、1993；Feli×et al.、Int. J. Peptide Res.、46 ：253-64、1995；Benhar et al.、J. Biol. Chem.、269：13398-404、1994；Brumeanu et al.、J Immunol.、154：3088-95、1995参照； Caliceti et al.(2003)Adv. Drug Deliv. Rev. 55(10)：1261-77、およびMolineux(2003)Pharmacotherapy 23(8 Pt 2)：3S-8Sも参照のこと)。PEG化は、in vivo核酸分子の送達に用いることもできる。例えば、アデノウイルスのPEG化は安定性と遺伝子伝達を増大させることができる(例えば、Cheng et al.(2003)Pharm. Res. 20(9)：1444-51参照)。
凍結乾燥粉末
【０１６９】
本発明において、溶液、エマルジョン、および他の混合物として投与するために再構成することができる凍結乾燥粉末が興味がもたれる。凍結乾燥粉末を再構成し、固体またはゲルとして製剤化することもできる。
【０１７０】
無菌凍結乾燥粉末は活性化合物を緩衝溶液に溶解することにより製造される。緩衝溶液は、安定性を改善する賦形剤、または粉末もしくは粉末から製造された再構成溶液の他の医薬成分を含みうる。次に、該溶液の無菌濾過、次いで当業者に知られた標準条件下の凍結乾燥により目的とする製剤を得る。簡単には、凍結乾燥粉末は、賦形剤、例えばデキストロース、ソルビトール、フルクトース、コーンシロップ、キシリトール、グリセリン、グルコース、ショ糖、または他の適切な物質を、適切な緩衝液、例えばクエン酸塩、リン酸ナトリウムもしくはリン酸カリウム、または当業者に知られた他のそのような緩衝剤に溶解することにより製造される。次に、選択した酵素を得られた混合物に加え、溶解するまで撹拌する。得られた混合物を無菌濾過もしくは無菌処理して微粒子を除去して確実に無菌とし、次いでバイアルに分配して凍結乾燥する。各バイアルは、単用量または多用量の化合物を含む。凍結乾燥粉末を適切な条件下、例えば約4℃〜室温で保存することができる。この凍結乾燥粉末の緩衝溶液による再構成は非経口投与に用いる製剤を提供する。
2.  用量および投与
【０１７１】
本発明が提供する可溶性ヒアルロニダーゼは、IGと組み合わせて典型的には単回投与用の医薬組成物として製剤化することができる。選択した可溶性ヒアルロニダーゼは、治療する患者に対する望ましくない副作用なしにIGの医薬的に有用な効果をもたらすのに十分な量で含まれる。治療的有効濃度は、例えば本明細書に記載のもしくは当該分野で知られたアッセイを用い、知られたin vitroおよびin vivo系で該ポリペプチドを試験することにより実験的に決定し(例えば、Taliani et al.(1996)Anal. Biochem.、240：60-67；Filocamo et al.(1997)J Virology、71：1417-1427；Sudo et al.(1996)Antiviral Res. 32：9-18；Buffard et al.(1995)Virology、209：52-59；Bianchi et al.(1996)Anal. Biochem.、237：239-244；Hamatake et al.(1996)Intervirology 39：249-258；Steinkuhler et al.(1998)Biochem.、37：8899-8905；D’Souza et al.(1995)J Gen. Virol.、76：1729-1736；Takeshita et al.(1997)Anal. Biochem.、247：242-246；see also e.g、Shimizu et al.(1994)J. Virol. 68：8406-8408；Mizutani et al.(1996)J. Virol. 70：7219-7223；Mizutani et al.(1996)Biochem. Biophys. Res. Commun.、227：822-826；Lu et al.(1996)Proc. Natl. Acad. Sci(USA)、93：1412-1417；Hahm et al.、(1996)Virology、226：318-326；Ito et al.(1996)J. Gen. Virol.、77：1043-1054；Mizutani et al.(1995)Biochem. Biophys. Res. Commun.、212：906-911；Cho et al.(1997)J. Virol.Meth. 65：201-207参照)、次いでそれからヒトの用量を推定することができる。
【０１７２】
典型的には治療的有効量は可溶性ヒアルロニダーゼ500単位〜100,000単位または約500単位〜100,000単位である。例えば、可溶性ヒアルロニダーゼは、500単位、1000単位、2000単位、5000単位、10,000単位、30,000単位、40,000単位、50,000単位、60,000単位、70,000単位、80,000単位、90,000単位、100,000単位、もしくはそれ以上、または約500単位、1000単位、2000単位、5000単位、10,000単位、30,000単位、40,000単位,、50,000単位、60,000単位、70,000単位、80,000単位、90,000単位、100,000単位、もしくはそれ以上を皮下投与することができる。ある例では、用量は、投与するIG比として規定することができる。例えば、ヒアルロニダーゼは、10U/g(IG)〜500U/g、もしくはそれ以上、例えば、10U/g、20U/g、30U/g、40U/g、50U/g、60U/g、70U/g、80U/g、90U/g、100U/g、150U/g、200U/g、300U/g、400U/g、500U/g、もしくはそれ以上、または約10U/g、20U/g、30U/g、40U/g、50U/g、60U/g、70U/g、80U/g、90U/g、100U/g、150U/g、200U/g、300U/g、400U/g、500U/g、もしくはそれ以上で投与することができる。典型的には、本発明で予期されるヒアルロニダーゼの注射または注入容量は、0.5ml、1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml、7ml、8ml、9ml、10ml、15ml、20ml、30ml、40ml、50ml、もしくはそれ以上、または約0.5ml、1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml、7ml、8ml、9ml、10ml、15ml、20ml、30ml、40ml、50ml、もしくはそれ以上である。ヒアルロニダーゼは、50U/ml、100U/ml、150U/ml、200U/ml、400U/ml、もしくは500U/ml、または約50U/ml、100U/ml、150U/ml、200U/ml、400U/ml、もしくは500U/ml、のストック溶液として供給するか、または使用前に有効濃度に希釈するかまたは直接使用するために、例えば、1000U/ml、1500単位/ml、2000U/ml、4000U/ml、もしくは5000U/ml、または約1000U/ml、1500単位/ml、2000U/ml、4000U/ml、もしくは5000U/mlのより濃縮された形で供給することができる。可溶性ヒアルロニダーゼは液体または凍結乾燥製剤として供給することができる。凍結乾燥製剤は、大単位用量の可溶性ヒアルロニダーゼの保存にとって理想的である。
【０１７３】
本発明が提供する免疫グロブリン製剤は、単用量または多用量使用のための医薬組成物として製剤化することができる。一般的には、IG製剤は、現在の静脈内(IVIG)製剤が特定のIGで処置可能な疾患または病状のために製造および投与される投与計画(用量および頻度)を達成するように医薬組成物に製剤化される。当業者は、特定疾患または病状のIVIG投与のための投与方法に精通している。例えば、下記H項は、特定の疾患または病状のIVIG投与のための典型的なIGの投与計画(用量および頻度)を提供する。他の投与方法は当業者によく知られている。ある例では、投与頻度は、連日もしくは隔日、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10日、もしくはそれ以上にわたり投与される時間間隔にわたり1日1回でありうる。他の例では、投与方法は、毎週、例えば、1週間に1回、2週間に1回、3週間に1回、4週間に1回、5週間に1回、6週間に1回もしくはそれ以上に1回である。典型的には、免疫グロブリンは、1月に1回の用量を提供するのに十分な量で単回投与するために製剤化されるが、複数回投与のためにより少ない量で提供することができる。例えば、IG製剤の1月に1回の用量は、1日1回、1週間に1回、2週間に1回、または1月に1回投与することができる。投与方法は、数ヶ月間または数年間続けることができる。IG製剤は、本明細書の他の箇所に記載したように凍結乾燥形もしくは液体形で提供することができる。
【０１７４】
免疫グロブリンは治療的有効量で提供される。治療的有効濃度は、本明細書に記載のアッセイのような既知のin vitroおよびin vivo系を用いて化合物を試験することにより実験的に決定することができる。該組成物中の選択した免疫グロブリンの濃度は、該複合物の吸収、不活化、および分泌速度、該複合物の物理化学特性、投与スケジュール、および投与量、ならびに当業者に知られた他の因子に依存する。例えば、正確な用量および治療の継続期間は、治療する組織に応じ、既知の試験プロトコールを用いて実験的に、またはin vivoまたはin vitro試験データから推定することができよう。また、濃度および投与用量は、治療する個体の年齢に応じて変化しうることに注意すべきである。さらに、あらゆる特定の対象に対して、具体的投与方法は個々の要求、および該製剤を投与するかもしくは投与を監督するヒトの専門的判断に従って経時的に調節すべきであり、本明細書に記載の濃度範囲は典型的であるというだけであり、本発明の範囲を限定するものではない。疾患または病状、例えばIGで処置可能な疾患または病状を治療するために投与された選択した免疫グロブリン製剤の量は標準的臨床技術により決定することができる。さらに、in vitroアッセイおよび動物モデルは最大用量範囲を確認するのを助けるために用いることができる。
【０１７５】
したがって、実験的に決定することができる正しい用量は、特定の免疫グロブリン調製物、可溶性ヒアルロニダーゼを用いる投与計画および投与スケジュール、投与経路、治療する疾患のタイプ、および疾患の重症度に依存しうる。一般的には、IG製剤は、IG組成物が5〜15%w/v、6〜15%w/v、もしくは8〜12%w/v、または約5〜15%w/v、6〜15%w/v、もしくは8〜12%w/v、例えば、10%w/vであるタンパク質濃度を有する。例えば、IGは、治療する特定の適応症について1月に1回のIV用量に等しい用量の皮下投与を可能にする量で提供される。特定の1月に1回のIV用量は、治療する疾患と相関し、変化しうる。IGの皮下投与のための典型的な用量範囲は、1グラム(g)、5g、10g、20g、30g、40g、50g、60g、70g、80g、90g、100g、もしくは200g、または約1グラム(g)、5g、10g、20g、30g、40g、50g、60g、70g、80g、90g、100g、もしくは200gである。その特定用量および製剤は、適応症と個体に依存する。例えば、50mg/kg体重(BW)、100mg/kg BW、200mg/kg BW、300mg/kg BW、400mg/kg BW、500mg/kg BW、600mg/kg BW、もしくはそれ以上の用量で投与することができる。必要であれば実験的に用量を決定することができる。そのような用量を達成するための皮下投与するIG製剤の用量は、50ml、100ml、200ml、300ml、400ml、500ml、600ml、700ml、もしくはそれ以上、または約50ml、100ml、200ml、300ml、400ml、500ml、600ml、700ml、もしくはそれ以上でありうる。例えば、本明細書に記載の適応症のための10%液体IG製剤(100mg/ml)を、50ml〜700mlの容量で投与し、用量0.5g〜70g IGを達成することができる。
【０１７６】
大容量を投与する場合の投与は典型的には注入による。対象に、0.5ml/kg/BW/h、1ml/kg/BW/h、2ml/kg/BW/h、3ml/kg/BW/h、4ml/kg/BW/h、もしくは5ml/kg/BW/h、または約0.5ml/kg/BW/h、1ml/kg/BW/h、2ml/kg/BW/h、3ml/kg/BW/h、4ml/kg/BW/h、もしくは5ml/kg/BW/hの注入速度で投与することができる。注入速度は、実験的に決定することができ、典型的には、対象の許容性と相関する。注入中に副作用が生じる場合は、注入速度を副作用が生じる速度のわずかに下の速度まで遅らせることができる。副作用が速度の低下に応じて解決したら、注入速度を医師の裁量で徐々に増加させることができる。皮下IG注入は、比重、ポンプ注入、または全20〜30グラム用量の注射により促進することができる。一般的には、注入には静脈内注入ポンプを用いることができる。IGは、5ml/h、10ml/h、30ml/h、60ml/h、120ml/h、240ml/h、もしくは300ml/h、または約5ml/h、10ml/h、30ml/h、60ml/h、120ml/h、240ml/h、もしくは300ml/hの速度で注入することができる。注入速度は、注入を患者が許容するかぎり、治療経過中に増加させることができる。一般的には、注入投与時間は、0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h、3h、4h、もしくはそれ以上、または約0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h、3h、4h、もしくはそれ以上である。一緒に製剤化し、および/またはヒアルロニダーゼと一緒に投与するIGの皮下投与により達成される高速の注入速度により、注入回数は常套的IVIG療法より有意に少ない。注入時間が望ましい限界を超える場合は、第2注入部位を医師と患者の裁量で開始することができる。第2部位は、典型的には開始部位から少なくとも10cmで始めることができる。
【０１７７】
注入技術は当業者に知られており、治療する医師の技術の範囲内である。一般的には、適切な用量のIGを標準的IVバッグにプールすることができる。例えば、末端近くにYポートを有する非ベント型注入セットを用いることができる。24ゲージ皮下注入針を対象の選択した部位に挿入することができるが、注入する液の容量のため、腹部、二番目に大腿が推奨される。ヒアルロニダーゼおよびIGは同じYポート装置に供給される。重力またはポンプで注入するために他の製品も本発明に用いることもできる、これには、限定されるものではないが、チューブ、ボトル、シリンジ、または他の容器が含まれる。可溶性ヒアルロニダーゼはIG製剤と連続的、間欠的、または同時に投与することができる。一般的には、ヒアルロニダーゼをIG製剤を投与する前に投与し、間質腔でヒアルロニダーゼがヒアルロン酸を分解するのを可能にする。例えば、可溶性ヒアルロニダーゼはIG製剤の投与前1分、2分、3分、4分、5分、6分、7分、8分、9分、10分、20分、または30分に投与される。ある例では、ヒアルロニダーゼを免疫グロブリン製剤と一緒に投与する。当業者が理解するであろうように、同時投与の望ましい近接性は、特定組織環境における該薬剤の有効半減期および治療する具体的疾患に大部分が依存し、適切なモデル、例えば適切な動物モデルに種々の時間で該薬剤を投与したときの効果を試験することにより容易に最適化することができる。ある状況において、ヒアルロニダーゼを投与する最適タイミングは60分間以上であろう。
【０１７８】
一般的には、IG注入前に可溶性ヒアルロニダーゼを、0.2ml/min、0.5ml/min、1ml/min. 2ml/min、5ml/min、10ml/min、もしくはそれ以上または約0.2ml/min、0.5ml/min、1ml/min、2ml/min、5ml/min、10ml/min、もしくはそれ以上の速度で注射する。例えば、可溶性ヒアルロニダーゼは、次にIGを注入するのに用いるのと同じYポートから注射することができる。上記のように、投与する可溶性ヒアルロニダーゼの容量は、必要な用量と相関するが、利用可能な可溶性ヒアルロニダーゼストック製剤の濃度に応じて変化することができる。例えば、可溶性ヒアルロニダーゼは約50mlを超える容量では投与されず、典型的には5〜30mLの容量で投与されることが本発明において予期される。シリンジポンプを医師の裁量で高容量に対して用いることができる。
【０１７９】
注入が許容性でない(例えば注入が中等度〜重度の局所反応を引き起こす)場合は、第2注入部位は対象が全用量を投与されるように出発することができる。
【０１８０】
IG製剤は、一度に投与するか、一定時間間隔で投与するように多くの小用量に分けることができる。選択したIG製剤は、治療期間中、例えば数時間、数日、数週間、または数ヶ月にわたり、1またはそれ以上の用量で投与することができる。ある場合には、連続投与が有用である。正確な用量および一連の投与は、適応症と患者の許容性に依存すると理解される。
【０１８１】
正確な用量および治療期間は、治療する疾患に応じ、既知の試験プロトコールを用いて実験的に、またはin vivoまたはin vitroデータから外挿することにより決定することができると理解される。濃度および用量値も改善すべき病状の重症度に応じて変化しうることに注意すべきである。さらに、あらゆる特定の対象について特定の投与計画を個体の要求および該組成物の投与を行うかもしくは監督する人の専門的判断に従って経時的に調節すべきであり、本明細書に記載の濃度範囲は単に例示的であり、組成物およびそれを含む組み合わせの使用または範囲を限定するものではないと理解すべきである。該組成物は、1時間に1回、1日1回、1週間に1回、1月に1回、1年に1回、または1回投与することができる。一般的には、投与計画は毒性を制限するように選択される。担当医師は、毒性、または骨髄、肝臓もしくは腎臓、または他の組織の機能不全により治療を中止、中断、またはより低用量に調整する時およびその方法がわかることに注意すべきである。反対に、担当医者は臨床反応が適切でない場合は治療をより高レベルに調節する(毒性作用を排除する)時およびその方法も解るであろう。
G.  活性、バイオアベイラビリティ、および薬物動態の評価方法
【０１８２】
免疫グロブリン単独または可溶性ヒアルロニダーゼとの組み合わせのin vitroおよびin vivo活性を評価するアッセイを用いることができる。そのようなアッセイには、皮下投与した免疫グロブリンの、バイオアベイラビリティおよび許容性を含む薬物動態特性を評価するものが含まれる。免疫グロブリンおよびヒアルロニダーゼの両方の生物活性も当該分野でよく知られたアッセイを用いて評価することができる。そのようなアッセイを用いて、例えば治療のための、免疫グロブリンおよびヒアルロニダーゼの適切な用量および投与頻度を決定することができる。
1. 薬物動態および許容性
【０１８３】
薬物動態および許容性試験、例えば下記実施例1に記載のものは、動物モデルを用いて行うか、または臨床試験で患者に対して行うことができる。動物モデルには、限定されるものではないが、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、モルモット、および非ヒト霊長類モデル、例えばカニクイザルまたはアカゲザルが含まれる。ある例において、薬物動態および許容性試験は健康動物を用いて行われる。他の例において、該試験は免疫グロブリンを用いる治療が考慮される疾患の動物モデル、例えば下記のあらゆる疾患および病状の動物モデルを用いて行われる。
【０１８４】
皮下投与された免疫グロブリンの薬物動態は、投与後の、最大(ピーク)血漿免疫グロブリン濃度(Cmax)、ピーク時間(すなわち、最大血漿免疫グロブリン濃度が生じる時；Tmax)、最小血漿免疫グロブリン濃度(すなわち、免疫グロブリンの用量間の最小血漿濃度；Cmin)、排除半減期(T1/2)、および曲線下面積(すなわち、時間対血漿免疫グロブリン濃度をプロッティングすることにより生じる曲線下面積；AUC)のようなパラメーターを測定することにより評価することができる。皮下投与された免疫グロブリンの絶対バイオアベイラビリティは、皮下送達後の免疫グロブリンの曲線下面積(AUCsc)を静脈内送達後の免疫グロブリンのAUC(AUCiv)と比較することにより決定される。絶対バイオアベイラビリティ(F)は、式：F =([AUC]sc×dosesc)/([AUC]iv×doseiv)を用いて計算することができる。皮下投与後の血漿中の免疫グロブリン濃度は血液試料中の免疫グロブリン濃度を評価するのに適した当該分野で知られたあらゆる方法を用いて測定することができる。典型的な方法には、例えばELISAおよび比濁法が含まれる。
【０１８５】
薬物動態試験においてある範囲の用量および種々の投与頻度で投与し、用量中の免疫グロブリンおよび/またはヒアルロニダーゼの濃度を増加もしくは減少させたときの影響を評価することができる。皮下投与された免疫グロブリンの薬物動態特性、例えばバイオアベイラビリティもヒアルロニダーゼと一緒に投与するかまたはしないで評価することができる。例えば、イヌ、例えばビーグルに、免疫グロブリンを単独またはヒアルロニダーゼと組み合わせて皮下投与することができる。免疫グロブリンの静脈内用量を別の群のビーグルに投与することもできる。次に、血液試料を種々の時点でとり、血漿中の免疫グロブリンを例えば比濁法により測定する。次に、AUGを測定し、ヒアルロニダーゼと共にまたは単独で皮下投与された免疫グロブリンのバイオアベイラビリティを測定することができる。そのような試験を行って、皮下投与された免疫グロブリンの薬物動態特性、例えばバイオアベイラビリティに対するヒアルロニダーゼの併用投与の効果を評価することができる。
【０１８６】
安全性および許容性を評価する試験も当該分野で知られており、本発明において用いることができる。ヒアルロニダーゼを併用投与するかまたはせずに免疫グロブリンを皮下投与した後のあらゆる副作用の発現をモニターすることができる。副作用には、限定されるものではないが、注射部位反応、例えば水腫もしくは腫脹、頭痛、発熱、疲労、悪寒、顔面紅潮、眩暈、じんま疹、喘鳴もしくは胸部圧迫感、悪心、嘔吐、悪寒、背痛、胸痛、筋痙攣、発作もしくは痙攣、血圧変化、およびアナフィラキシーまたは重度の過敏反応が含まれる。典型的には、安全性および許容性試験においてある範囲の用量および種々の投与頻度で投与を行い、用量中の免疫グロブリンおよび/またはヒアルロニダーゼの濃度を増加または減少させる影響を評価する。
2.  生物活性
a.  免疫グロブリン
【０１８７】
治療剤として作用する免疫グロブリンの能力をin vitroまたはin vivoで評価することができる。例えば、in vitroアッセイを行って免疫グロブリンのウイルスまたは細菌の感染性を中和する能力を評価することができる(Hiemstra et al.、(1994)J Lab ClinMed 123：241-6)。他のin vitroアッセイを用いて免疫グロブリンの他の生物活性を評価することができる。例えば、補体活性生成物と相互作用し、それを調節し、イデオタイプ抗体と結合し、マクロファージ上のFcレセプターと結合し、サイトカイン、ケモカイン、およびメタロプロテイナーゼを含む種々の炎症性メディエーターを抑制する免疫グロブリンの能力は、限定されるものではないが、ELISA、ウエスタンブロット、ノーザンブロット、およびマーカー発現を評価するフローサイトメトリーを含む当該分野で知られたあらゆる方法を用いて評価することができる。末梢血単核細胞上のケモカインレセプターの発現に対する免疫グロブリンの影響をフローサイトメトリーを用いて評価することができる(Trebst et al.、(2006)Eur J Neurology)。別の例において、マクロファージにおけるメタロプロテイナーゼの発現に対する免疫グロブリンの影響をノーザンブロット分析を用いて評価することができる(Shapiro et al.、(2002)Cancer 95：2032-2037)。
【０１８８】
動物モデルを用いるin vivo試験を行って免疫グロブリンの治療的活性を評価することもできる。免疫グロブリンを1またはそれ以上の微生物に感染した動物モデルに投与し、感染の進行に対する効果を、例えば微生物数を測定するかもしくは病状のマーカーとして重量を測定することにより評価することができる。免疫グロブリンの治療効果は、免疫グロブリンを用いて治療することが考慮される疾患および病状の動物モデルを用いて評価することもできる。そのような動物モデルは当該分野で知られており、限定されるものではないが、X連鎖無ガンマグロブリン血症(XLA)、SCID、ウィスコット・アルドリッチ症候群、川崎病、ギランバレー症候群、ITP、多発性筋炎、ランバート・イートン筋無力症候群、重症筋無力症、およびメルシュ・ヴォルトマン症候群の小動物モデルが含まれる(Czitrom et al(1985)J Immunol 134：2276-2280、Ellmeier et al.、(2000)J ExpMed. 192：1611-1624、Ohno(2006)Drug Discovery Today：DiseaseModels 3：83-89、Oyaizu et al(1988)J ExpMed 2017-2022、Hansen et al.、(2002)Blood 100：2087-2093、Strongwater et al.、(1984)Arthritis Rheum. 27：433-42、Kim et al.(1998)Annals NY Acad Sci 841：670-676、Christadoss et al.(2000)94：75-87、Sommer et al.、(2005)Lancet 365：1406-1411、米国特許No.7309810)。
b. ヒアルロニダーゼ
【０１８９】
ヒアルロニダーゼ活性は、当該分野でよく知られた方法を用いて評価することができる。ある例において、活性は、微量濁度アッセイを用いて評価される。これはヒアルロン酸が血清アルブミンと結合したときに可溶性沈殿物が形成されることに基づく。該活性は、一定期間(例えば10分間)ヒアルロン酸ナトリウム(ヒアルロン酸)とヒアルロニダーゼをインキュベーションし、次いで非消化ヒアルロン酸ナトリウムを酸性化血清アルブミンを加えて沈殿させることにより測定される。得られる試料の濁度を、さらなる発現期間後640nmで測定する。ヒアルロン酸ナトリウム基質に対するヒアルロニダーゼ活性から生じる濁度の減少は、ヒアルロニダーゼの酵素活性の尺度である。別の例において、ヒアルロニダーゼ活性は、ヒアルロニダーゼとインキュベーションした後に残存するビオチン化ヒアルロン酸を測定するマイクロタイターアッセイを用いて測定する(例えば、Frost and Stern(1997)Anal. Biochem. 251：263-269、米国特許公開公報No. 20050260186参照)。ヒアルロン酸のグルクロン酸残基上の遊離カルボキシル基をビオチン化し、ビオチン化ヒアルロン酸基質をマイクロタイタープレートと共有結合させる。ヒアルロニダーゼとインキュベーションした後、残ったビオチン化ヒアルロン酸基質をビオチンパーオキシダーゼ反応を用いて検出し、活性が解っているヒアルロニダーゼ標準品との反応後に得られたものと比較する。ヒアルロニダーゼ活性を測定する他のアッセイも当該分野で知られており、本発明の方法に用いることができる(例えば、Delpech et al.、(1995)Anal. Biochem. 229：35-41；Takahashi et al.、(2003)Anal. Biochem. 322：257-263参照)。
【０１９０】
展着剤もしくは分散剤として作用するヒアルロニダーゼの能力も評価することができる。例えば、トリパンブルー色素を、ヌードマウスの各側の側部皮膚内にヒアルロニダーゼと共にまたは無しで皮下注射することができる。次に色素面積を、例えばマイクロキャリパーで測定し、展着剤として作用するヒアルロニダーゼの能力を決定する(米国特許No. 20060104968)。
H.  治療的使用
【０１９１】
本明細書に記載の方法免疫グロブリンを用いるあらゆる病状の治療に用いることができる。免疫グロブリン(IG)をヒアルロニダーゼと一緒に皮下投与して免疫グロブリンで治療可能なあらゆる病状を治療することができる。この項ではIGの典型的な治療的使用を示す。下記治療的使用は例示的であって、本明細書に記載の方法の応用を限定するものではない。治療的使用には、限定されるものではないが、種々の免疫学的、血液学的、神経学タンパク質系、炎症性、皮膚科的、および/または感染性疾患および病状のための免疫グロブリン補充療法および免疫修飾療法が含まれる。ある例において、免疫グロブリンを投与して、例えば感染性疾患に暴露した可能性がある(例えば、事故で注射針を刺した傷)健康な患者の免疫応答を増強する。そのような疾患または病状を確認することは治療する医師の技術の範囲内である。
【０１９２】
免疫グロブリンは、ヒアルロニダーゼと一緒に、該疾患および病状の治療に用いる他の薬剤と組み合わせて皮下投与することができる。例えば、投与することができる他の薬剤は、限定されるものではないが、抗体、化学療法剤、ステロイド系抗炎症剤、非ステロイド系抗炎症剤、および他の免疫修飾剤、例えばサイトカイン、ケモカイン、および成長因子が含まれる。
【０１９３】
必要であれば、特定の用量および持続期間、および治療プロトコールを実験的に決定するか外挿することができる。例えば、静脈内投与される免疫グロブリンの典型的な用量を適切な用量を決定するための出発点として用いることができる。用量レベルは、種々の因子、例えば個体の体重、一般的健康状態、年齢、用いる特定化合物の活性、性別、食事、投与時間、排泄速度、薬剤の組み合わせ、疾患の重症度と経過、および患者の疾患に対する素因、ならびに治療する医師の判断に基づいて決定することができる。一般的には、免疫グロブリンの用量は、100mg/kg体重(すなわち、100mg/kg BW)〜2g/kg BWまたは約100mg/kg体重(100mg/kg BW)〜2g/kg BWであり、ヒアルロニダーゼの用量は、10U/g〜500U/g免疫グロブリンもしくはそれ以上、または約10U/g〜500U/g免疫グロブリンもしくはそれ以上、例えば、10U/g、20U/g、30U/g、40U/g、50U/g、60U/g、70U/g、80U/g、90U/g、100U/g、150U/g、200U/g、300U/g、400U/g、500U/g、もしくはそれ以上、または約10U/g、20U/g、30U/g、40U/g、50U/g、60U/g、70U/g、80U/g、90U/g、100U/g、150U/g、200U/g、300U/g、400U/g、500U/g、もしくはそれ以上である。投与量は治療する適応症およびおそらく許容される副作用に応じる。用量は、各疾患の認められたモデルを用いて実験的に決定することができる。
【０１９４】
患者の病状が改善したら、免疫グロブリンの維持用量を必要であればヒアルロニダーゼと組み合わせて皮下投与し、用量、剤形、または投与頻度、またはその組み合わせを修飾することができる。ある例では、対象は、疾患の症状が再発したら長期間の間欠的治療を要求することができる。
1.  抗体欠損症を伴う原発性免疫不全
【０１９５】
免疫グロブリンを用いて抗体欠損症を伴う原発性免疫不全を治療することができる。原発性免疫不全は、免疫系の1またはそれ以上のタンパク質の欠損を特徴とする多くの障害を含む。典型的には、原発性免疫不全は遺伝的障害であり、多くは防御抗体産生の不全により発現する。すなわち、免疫グロブリンをそのような疾患のみられる患者に免疫グロブリン補充療法として投与することができる。典型的な原発性免疫不全には、限定されるものではないが、分類不能型免疫不全症(CVID)、先天性無ガンマグロブリン血症、ウィスコット・アルドリッチ症候群、重症複合免疫不全(SCID)、原発性低ガンマグロブリン血症、抗体欠損症を伴う原発性免疫不全疾患、X連鎖無ガンマグロブリン血症(XLA)、乳児低ガンマグロブリン血症、および抗体を伴わない傍腫瘍性小脳変性症が含まれる。免疫グロブリンは、ヒアルロニダーゼと組み合わせて、免疫グロブリンの静脈内投与に用いる用量と同様の用量で抗体欠損症を伴う原発性免疫不全の患者に投与することができる。典型的な用量には、例えば4週間間隔での100mg/kg BW〜800mg/kg BW免疫グロブリンが含まれる。用量は臨床反応に応じて投与頻度同様に増加または減少させることができる。
2. 血液悪性腫瘍に続発する後天性低ガンマグロブリン血症
【０１９６】
血液悪性腫瘍に続発する後天性低ガンマグロブリン血症、例えば、慢性リンパ球性白血病(CLL)、多発性骨髄腫(MM)、非ホジキンリンパ腫(NHL)& 他の関連悪性腫瘍、および造血幹細胞移植後の患者は、細菌感染に感受性である。低ガンマグロブリン血症は、Bリンパ球の欠乏およびそれによって生じる低血中抗体レベルにより生じ、CLL、MM、NHL、およびその結果白血球関連免疫機能不全および治療関連免疫抑制の両方がある化合物に生じうる。液性免疫の欠乏は、主に、特に被包性微生物によるこれらの患者の感染症関連罹患率および死亡率のリスク増加に関与する。例えば、肺炎連鎖球菌、ヘモフィルス・インフルエンザエ、および黄色ブドウ球菌、並びにレジオネラ属(Legionella)、およびノカルジア属(Nocardia spp.)は、しばしばCLLの患者に肺炎を引き起こす細菌病原体である。ニューモシスチス・カリニ(Pneumocystis carinii)、真菌、ウイルス、およびミコバクテリアなどの日和見感染もみられる。これらの患者における疾患の数および重症度は、免疫グロブリンの投与により顕著に減少させることができる(Griffiths et al.、(1989)Blood 73：366-368、Chapel et al.(1994)Lancet 343：1059-1063)。したがって、そのような患者は、免疫グロブリンを、再発感染症を防ぐために本明細書に記載の方法を用いてヒアルロニダーゼと組み合わせて皮下投与することができる。典型的な用量には、血液悪性腫瘍に続発する後天性低ガンマグロブリン血症の患者に免疫グロブリンを静脈内投与するのに用いる用量が含まれる。例えば、約400mg/kg BW免疫グロブリンとヒアルロニダーゼの組み合わせを3〜4週間ごとに皮下投与することができる。さらなる例において、さらなる用量400mg/kg BWを患者血清IgGが4g/L未満である治療の第1月に投与することができる。投与する免疫グロブリンの量および投与頻度は適切に増加または減少させることができる。
3.  川崎病
【０１９７】
川崎病は、しばしば冠状動脈を侵す子供および年少乳児の急性熱性多臓器疾患である。川崎病は、リンパ節症候群、皮膚粘膜リンパ節疾患、乳児結節性動脈周囲炎(infantile polyarteritis)、および川崎症候群としても知られ、皮膚および粘膜、リンパ節、血管壁、および心臓を含む多くの臓器を冒す、あまりよく解っていない自己限定性血管炎である。冠動脈動脈瘤は、回復期の疾患の第2週から生じうる。該病状の原因はよく解っていないが、特徴的血管炎は、未知の抗原に対するT細胞およびマクロファージの活性化、サイトカインの分泌、ポリクローナルB細胞活性化、および内皮細胞および平滑筋細胞に対する自己抗体の形成を特徴とする免疫応答から生じる証拠がある。遺伝的に感受性のある個体では、1またはそれ以上の、恐らくスーパー抗原活性を有する未分類の一般的感染物質が疾患を引き起こすかもしれない。川崎病の初期に投与された免疫グロブリンは冠動脈病変を予防しうる。川崎病に関連する進行中の炎症を有する患者に対する免疫グロブリンのヒアルロニダーゼと組み合わせた皮下投与は症状を改善しうる。典型的な用量には、川崎病の患者に免疫グロブリンを静脈内投与するのに用いる用量が含まれる。例えば、川崎病の患者に約1〜2g/kg患者体重の免疫グロブリンを投与することができる。これに400mg/kg BWの4用量を4日間連続で投与することができる。別の例では、1g/kg BW免疫グロブリンを10時間かけて単用量として投与する。投与する免疫グロブリンの量は適宜増加または減少させることができる。
4.  慢性炎症性脱髄性多発神経障害
【０１９８】
慢性炎症性脱髄性多発神経障害(CIDP)は、脚および腕の進行性虚弱および感覚機能不全を特鏡とする神経障害である。該障害は、慢性再発性多発ニューロパシーと呼ばれることがあり、末梢神経のミエリン鞘に対する損傷によって引き起こされる。該障害はあらゆる年齢および両性に生じうるが、CIDPは青年に、また女性より男性により一般的である。該疾患は、刺痛(うずき)、もしくは無感覚(つま先と指に始まる)、腕および脚の脆弱化、深部腱反射の消失(反射消失)、疲労、および知覚異常を含む症状を示す。CIDPは、ギランバレー症候群と密接な関連があり、該急性疾患の慢性対応疾患であると考えられる。具体的な診断試験はないが、特徴的臨床所見および検査所見が該疾患を他の免疫関連神経病理学的症候群と区別するのを助ける。免疫グロブリンによる治療が症状を減少させることが研究で示されている(van Schaik et al.、(2002)Lancet Neurol. 1：497-498)。すなわち、CIDPを示す患者に本明細書に記載の方法を用いて、免疫グロブリンをヒアルロニダーゼと一緒に皮下投与することができる。典型的な用量には、CIDP患者に免疫グロブリンを静脈内投与するときに用いる用量が含まれる。ある例では、CIDP患者に、約2g/kg BWの免疫グロブリンをヒアルロニダーゼと組み合わせて皮下投与する。これは、例えば、400mg/kg BWの5用量を5日間連続で投与することができる。投与する免疫グロブリンの量は適宜増加または減少させることができる。
5.  ギランバレー症候群
ギランバレー症候群は、末梢神経の炎症性脱髄を伴う神経学的自己免疫障害である。第1症状には、程度の異なる脚の虚弱および刺痛感が含まれ、これが腕や上体に広がり得る。この症状は、筋肉が全く使えなくなり、患者がほぼ全身麻痺となり、生命を脅かす上体になるまで激しさが増しうる。
【０１９９】
一般的に、回復は大多数の患者において良好または完全であるが、持続的な身体障害が患者の約20％に生じ、4〜15％が死亡すると報告されている。ギランバレー症候群は、呼吸器または消化器ウイルス感染の症状の後、数日または数週間で生じうる。例えば、外科手術またはワクチン接種は該症状を引き起こしうる。該障害は数時間または数日の経過で発現するか、または3〜4週間かかることがある。神経伝導速度(NCV)試験は、医師に診断を助ける手掛かりを与えることができる。ある例では、ギランバレー症候群症候群の脳脊髄液は通常、正常対象よりタンパク質を多く含むので脊椎穿刺を診断に用いることができる。ギランバレー症候群の治癒は知られていないが、免疫グロブリンによる治療は疾患の重症度を軽減し、回復を促進することができる。免疫グロブリンは、ヒアルロニダーゼと組み合わせて患者に適切な用量、例えば、ギランバレー症候群の患者に免疫グロブリンを静脈内投与するのに用いる用量と同様の用量で皮下投与することができる。例えば、ギランバレー症候群の患者に約2g/kg BWの免疫グロブリンをヒアルロニダーゼと組み合わせて皮下投与することができる。これは、例えば、400mg/kg BWの5用量を5日間連続投与することができる。投与する免疫グロブリンの量は、例えば疾患の重症度、治療に対する臨床的反応に応じて増加または減少させることができ、これは当業者が容易に評価することができる。
6.  特発性血小板減少性紫斑病
【０２００】
特発性血小板減少性紫斑病(ITP)は、原発性免疫性血小板減少性紫斑病および自己免疫性血小板減少性紫斑病としても知られ、抗血小板抗体による血小板の生存期間の短縮によって生じる血小板数の減少(血小板減少症)がある。血小板数が非常に低い(例えば<30×109/L)時は、皮膚(紫斑病)と粘膜に出血が生じうる。ITP患者における骨髄での血小板の生成(巨核球形成)は、形態学的に正常である。場合により、血小板表面上の糖タンパク質と結合する抗体に関連する血小板機能のさらなる機能障害がある。ITPは、慢性型と急性型が存在しうる。ITP成人患者の約80％が慢性型疾患を有する。慢性ITPの発生率が最も高いのは15〜50歳の女性であるが、加齢と共に発生率が増加することを示唆する報告がある。ITPはHIV患者に比較的一般的にみられる。ITPは感染症のあらゆる段階でみられるが、その有病率はHIV病の進行につれて増加する。
【０２０１】
免疫グロブリンを用いてITP患者を治療することができることが研究により示された(Godeau et al.(1993)Blood 82(5)：1415-21、Godeau et al.(1999)Br J Haematol 1999;107(4)：716-9)。免疫グロブリンは、ITP患者を治療するために、ヒアルロニダーゼと組み合わせて、免疫グロブリンの静脈内投与に用いる用量と同様の用量を患者に皮下投与することができる。例えば、ITP患者は、ヒアルロニダーゼと組み合わせて、約1〜2g /kgの免疫グロブリンを皮下投与することができる。これは数日間にわたり投与するか、または単用量で投与することができる。ある例では、400mg/kg BWの免疫グロブリンの5用量を連日投与する。別の例では、血小板数と臨床反応に応じて、1g/kg BWを1〜2日間連日で投与する。投与する免疫グロブリンの量および投与頻度は、例えば当業者が容易に評価可能な血小板数と臨床反応に応じて増加または減少させることができる。
7.  炎症性筋疾患：多発性筋炎、皮膚筋炎、および封入体筋炎 
【０２０２】
炎症性筋疾患は、骨格筋組織の炎症と変性を伴う筋疾患のグループである。この障害は後天性であり、すべて顕著な筋肉の衰弱を示し、筋肉内に炎症反応が存在する。皮膚筋炎(DM)は、まぶた、頬、および鼻梁、および背中もしくは上胸部、肘、膝、および指関節の、まばら、浅黒い、赤みを帯びた、または薄紫色の発疹として生じる独特な発疹により最も容易に認識される炎症性筋疾患である。ある患者では、皮下に石灰化結節または硬化した瘤ができる。発疹は筋肉の衰弱に先立つことが多く、典型的には数週間にわたり発現するが、数ヶ月間または数日間発現することもある。皮膚筋炎は、幼児期から成人期まであらゆる年齢に生じ、男性より女性により一般的である。DM患者の約1/3が燕下困難を訴える。一般的には、筋肉痛と圧痛はDM患者の25％未満に生じるが、DMの子供の50％以上が筋肉痛と圧痛を訴える。
【０２０３】
多発性筋炎(PM)は、皮膚筋炎の特徴的発疹を示さず、筋肉の衰弱の発生は、通常、DMより徐々に進行する。存在する多くのPM患者は燕下困難を示す。ある場合には、該患者は筋不全により呼吸困難も示す。1/3ものPM患者に筋肉痛がある。該疾患は男性より女性の方がより多く罹患し、20歳以下のヒトの罹患は希であるが、幼児期や乳児の多発性筋炎の症例が報告されている。
【０２０４】
封入体筋炎(IBM)は多発性筋炎と非常によく似ている。IBMにおける筋衰弱の発症は、通常、非常に徐々であり、数ヶ月間または数年間にわたって生じる。近位筋および遠位筋の両方が罹患する点がPMと異なり、PMでは、一般的に近位筋のみが罹患する。典型的な所見には、手関節屈筋群と手指屈筋の衰弱が含まれる。前腕の萎縮が該疾患の特徴であり、大腿四頭筋の萎縮は他の筋肉の衰弱と程度は異なるが一般的である。IBMにおける筋衰弱に罹患した患者の約半数が燕下困難である。IBMの症状は、通常50歳以後に始まるが、除外できる年齢群はない。IBMは、女性より男性により頻繁に生じる。IBMの10症例中約1例が遺伝性である。
【０２０５】
免疫グロブリンの投与がこれら炎症性筋疾患の患者に有益でありうることが研究により示されている。免疫グロブリンは、筋強度を改善し、炎症を減少させ、疾患の進行と重症度を減少させることができる(Dalakas et al.(1993)N Engl JMed 329(27)：1993-2000；Dalakas et al.(2001)Neurology 56(3)：323-7、 Dalakas(2004)Pharmacol Ther 102(3)：177-93、 Walter et al.(2000)J Neurol 247(1)：22-8)。免疫グロブリンは、DM、PM、またはIBMの患者に、免疫グロブリンを静脈内投与するのに用いる用量と同様の用量をヒアルロニダーゼと組み合わせて皮下投与することができる。例えば、2g/kg BWの免疫グロブリンを、典型的には、数日間、例えば400mg/kg BWの5用量を連日投与することができる。
8.  ランバート・イートン筋無力症候群
【０２０６】
ランバート・イートン筋無力症候群(LEMS)は、神経筋伝達の希な自己免疫障害であり、最初に肺癌と関連して、次いで新生物が検出されない症例で臨床的に認識された。LEMSの患者は、シナプス前神経筋接合部異常を有する。該疾患は、運動後に強さが増す近位筋衰弱、軽度の動眼神経兆候、深部腱反射の低下、および自律神経機能障害(ドライマウス、便秘、勃起不全)を臨床的特徴とする。LEMS患者に対する、ヒアルロニダーゼと組み合わせた免疫グロブリンの皮下投与は症状を改善することができる。典型的な用量には、LEMS患者に対する免疫グロブリンの静脈内投与に用いるものが含まれる。例えば、LEMS患者に2g/kgBWの免疫グロブリンを数用量投与することができる。例えば、400mg/kg BW 免疫グロブリンの5用量を5日間連続で投与することができる。投与する免疫グロブリンの量は適宜増加または減少させることができる。
9.  多巣性運動ニューロパシー
【０２０７】
伝導ブロックがある多巣性運動ニューロパシー(MMN)は、徐々に進行する衰弱、線維束性攣縮、および痙攣を伴い、顕著な感覚障害を伴わない後天性免疫性脱髄性ニューロパシーである。診断前の疾患の持続時間は、数ヶ月から15年以上の範囲である。MMNの正確な原因は不明である。組織病理学的および電気診断的研究は、脱髄と軸索損傷両方を示す。運動神経が主として罹患するが、知覚神経にも軽度の脱髄がみられる。さらに、免疫修飾治療および免疫抑制治療の効果は、MMNの免疫的性質を裏付ける。該疾患における抗GM1抗体の役割は解っていないが、その存在はMMNの診断マーカーとして用いることができる。
【０２０８】
MMN患者に対するヒアルロニダーゼと組み合わせた免疫グロブリンの皮下投与は、症状を改善することができる。典型的な用量には、MMN患者に対する免疫グロブリンの静脈内投与に用いる用量が含まれる。例えば、MMN患者に2g/kg患者BWの免疫グロブリンを数用量にわたり投与することができる。例えば、400mg/kg BWの免疫グロブリンの5用量を5日間連続で投与することができる。別の例では、1g/kg BWを2日間連続投与することができる。ある患者は維持療法を受けることがあり、これには、例えば、400mg/kg BW〜2g/kg BWの用量を2〜6週間毎に投与することが含まれ得る。投与する免疫グロブリンの量は患者の反応を考慮して適宜増減することができる。
10.  重症筋無力症
【０２０９】
重症筋無力症(MG)は、程度の異なる身体の骨格筋の衰弱を特徴とする慢性自己免疫性神経筋疾患である。該疾患には、神経筋接合部のアセチルコリンレセプター(AChR)または筋特異的チロシンキナーゼ(MuSK)に対する抗体の存在が関連するが、ある患者は抗体陰性である。MGの臨床的特徴には、随意筋、具体的には眼瞼挙筋、眼球外、延髄、手足、および呼吸器の筋肉の変動的衰弱と易疲労感が含まれる。通常、患者は、片側または両側のまぶたの下垂(眼瞼下垂)、複視(diplopia)、燕下困難(dysphagia)、および近位筋衰弱を示す。呼吸筋の衰弱は、重症症例または急性重症再燃(筋無力症クリーゼ)における呼吸器不全を生じうる。
重症筋無力症は、すべての民族群および両性に生じる。該疾患は、最も一般的には40歳以下の若い成人女性と60歳以上の高齢男性が罹患するが、あらゆる年齢で生じうる。ある場合には、症状を減少させるために胸腺摘出が行われる。
【０２１０】
免疫グロブリンは、例えば、中等度〜重症のMG患者に対し、典型的には他の治療が無効または重度の副作用を生じるときに維持療法として用いることができ、胸腺切除前、または該疾患の急性再燃(筋無力症クリーゼ)時に投与することもできる。免疫グロブリンは、本明細書に記載の方法を用いて重症筋無力症の患者に、ヒアルロニダーゼと組み合わせて皮下投与することができる。典型的な用量には、MG患者に免疫グロブリンを静脈内投与するのに用いる用量が含まれる。例えば、MG患者に維持療法として400mg/kg BW〜2g/kg BWの用量を4〜6週間毎に投与することができる。胸腺切除前または筋無力症クリーゼ時に、1〜2g/kg BWを数用量で、例えば、400mg/kg BWの5用量を5日間連続で投与することができる。別の例において、1g/kg BWは2日間連続で投与することができる。
11.メルシュ・ヴォルトマン症候群
【０２１１】
メルシュ・ヴォルトマン症候群は、全身硬直症候群またはスティフマン症候群としても知られる自己免疫疾患の特徴を有する希な神経学的障害である。患者は筋肉の硬直と多重一過性痙攣に関連する症状を示す。筋硬直は、体軸筋、主として腹部および胸腰部、ならびに四肢近位筋に広がる。典型的には、体幹主動筋および拮抗筋の同時収縮は、脊柱前弯過度のボード様出現をもたらす。低頻度の呼吸筋の障害は、呼吸困難および顔面筋肉障害(マスク様顔)をもたらす。免疫グロブリンによる治療は、メルシュ・ヴォルトマン症候群の患者における硬直の減少と感受性スコアの増加をもたらすことができる(Dalakas et al.(2001)N Engl JMed 345(26)：1870-6)。免疫グロブリンは、本明細書に記載の方法を用いてメルシュ・ヴォルトマン症候群の患者にヒアルロニダーゼと組み合わせて皮下投与することができる。典型的な用量には、メルシュ・ヴォルトマン症候群の患者に免疫グロブリンを静脈内投与するのに用いる用量が含まれる。例えば、免疫グロブリンは400mg/kg BWの用量を5日間連続で投与することができる。ある患者は維持療法を受けることができ、これには、例えば、1〜2g/kg BWの免疫グロブリンを4〜6週間ごとに投与することが含まれうる。投与する免疫グロブリンの量は、適宜増減することができる。
12.  アルツハイマー病
【０２１２】
アルツハイマー病の治療には、静脈内免疫グロブリンによる治療が含まれる(例えば、Dodel et al.(2004)J Neurol Neurosurg. Psychiatry、75：1472-4；Solomon et al.(2007)Curr. Opin.Mol. Ther.、9：79-85；Relkin et al.(2008)Neurobiol Aging参照)。IGには、アルツハイマー病患者の脳中のプラークの中心的成分であるベータアミロイド(AB)と結合する抗体が含まれる。すなわち、IGは、脳からのABのクリアランスを促進し、脳組織に対するABの毒性作用をブロックするのを助けることができる。したがって、免疫グロブリンは、本明細書に記載の方法を用い、アルツハイマー病患者にヒアルロニダーゼと組み合わせて皮下投与することができる。治療する対象には、軽度、中等度、または進行したアルツハイマー病を有する患者が含まれる。治療する患者の同定は治療する医師の技術水準の範囲内である。免疫グロブリンはヒアルロニダーゼと組み合わせて1週間に1回、2週間に1回、または1月に1回投与することができる。治療は数ヶ月または数年にわたり継続することができる。IGは、200mg/kg BW〜2g/kg BWの用量で1週間に1回もしくは2週間に1回、一般的には少なくとも200mg/kg〜2g/kg BWを少なくとも1月に1回投与することができる。免疫グロブリンによる治療は患者の抗アミロイドベータ抗体レベルを治療前のレベルに比べて増加させることができる。
13.  他の疾患および病状
【０２１３】
臨床データは、免疫グロブリンを多くの病状の治療に用いることができることを示す。ある場合には、免疫グロブリンを一次治療に用いることができるが、別の場合には、標準療法が無効か、耐え難くなるか、または禁忌である場合に第2選択療法として投与される。そのような疾患または病状を同定することは治療する医師の技術の範囲内である。この例には、限定されるものではないが、続発性低ガンマグロブリン血症(医原性免疫不全を含む)；特異抗体欠損症；急性播種性脳脊髄炎；ANCA陽性全身性壊死性血管炎；自己免疫性溶血性貧血；水疱性類天疱瘡；瘢痕性類天疱瘡；エバンス症候群(免疫性血小板減少症を伴う自己免疫性溶血性貧血を含む)；胎児-妊婦/新生児同種免疫性血小板減少症(FMAIT/NAIT)；アルツハイマー病、血球貪食症候群；ハイリスク同種造血幹細胞移植；IgMパラプロテイン血症性ニューロパシー；腎臓移植；多発性硬化症；眼球クローヌス・ミオクローヌス運動失調；落葉状天疱瘡；尋常性天疱瘡；輸血後紫斑病；中毒性表皮剥離症/スティーブンス・ジョンソン症候群(TEN/SJS)；毒素性ショック症候群；全身性エリテマトーデス；多発性骨髄腫；敗血症；骨髄移植、B細胞腫瘍；および外傷が含まれる。免疫グロブリンは、限定されるものではないが以下のものを含む多くの細菌、ウイルス、および真菌感染に対する抗菌活性を有することも示されている：ヘモフィルス・インフルエンザエタイプB、シュードモナス・エルジノーサタイプAおよびB、黄色ブドウ球菌、B群連鎖球菌、肺炎連鎖球菌タイプ1、3、4、6、7、8、9、12、14、18、19、および23、アデノウイルスタイプ2および5、サイトメガロウイルス、エプスタイン・バー・ウイルス VCA、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス-1、単純ヘルペスウイルス-2、A型インフルエンザ、麻疹、パラインフルエンザタイプ1、2、および3、ポリオ、水痘帯状疱疹ウイルス、アスペルギルス、およびカンジダ・アルビカンス。すなわち、免疫グロブリンは、ヒアルロニダーゼと組み合わせて細菌、ウイルス、および真菌感染症の患者に患者の免疫系を増強し、疾患を治療するために皮下投与することができる。ある例において、抗体または他の抗生物質も投与される。
I.  製品およびキット
【０２１４】
免疫グロブリンおよび可溶性ヒアルロニダーゼを一緒にまたは別個に提供する医薬組成物は、包装物質、IGで処置可能な疾患または病状を治療するのに有効な医薬組成物、および該組成物および組み合わせがIGで治療可能な疾患および病状を治療するのに有用であることを示す標識を含む製品として包装することができる。該製品の例には、単チャンバーおよび二チャンバー容器を含む容器がある。該容器には、限定されるものではないが、チューブ、瓶、およびシリンジが含まれる。該容器はさらに皮下投与用の注射針を含むことができる。
【０２１５】
本発明が提供する製品は包装物質を含む。医薬製剤を包装するための包装物質が当業者によく知られている。例えば、米国特許No. 5,323,907、5,033,252、および5,052,558参照(これらの内容は本明細書の一部を構成する。医薬包装物質の例には、限定されるものではないが、ブリスターパック、瓶、チューブ、吸入器、ポンプ、バッグ、バイアル、容器、シリンジ、瓶、および選択した製剤および意図する投与および治療方法に適したあらゆる包装物質が含まれる。本発明が提供する多様な化合物および組成物の製剤は、IGで処置可能なあらゆる疾患または病状のための種々の治療方法として予期される。
【０２１６】
一緒にもしくは別々に供給される免疫グロブリンおよび可溶性ヒアルロニダーゼの組成物はキットとして提供することもできる。キットは、本明細書に記載の医薬組成物と投与用の用具を含むことができる。例えば、該組成物は投与用器具、例えばシリンジ、吸入器、投与カップ、ドロッパー、またはアプリケーターを用いて供給することができる。キットは、所望により、用量、投与計画、および投与法の指示書を含む適用のための指示書を含むことができる。キットは、本明細書に記載の医薬組成物と診断用器具を含むこともできる。例えば、そのようなキットはIGの濃度、量、または活性を測定するための器具も含むことができる。
【発明を実施するための形態】
【０２１７】
J.  実施例
以下の実施例は例示のためだけに記載するものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【０２１８】
可溶性組み換えヒトPH20(rHuPH20)は、免疫グロブリン(IG)の皮下投与とバイオアベイラビリティを支援する。
免疫グロブリン(IG)の皮下(SQ)投与は、静脈内(IV)投与に比べてバイオアベイラビリティの低下をもたらす。ある研究報告によれば、IV投与に比べて63%のバイオアベイラビリティであり、等価なバイオアベイラビリティ、すなわち時間濃度曲線下面積(AUC)を達成するにはIVの137％のSQ用量が必要であった(Ochs et al.(2006)J Clin. Immunol.、26：265-273)。すなわち、可溶性組み換えヒトPH20(rHuPH20)存在下のIG(GAMMAGARD LIQUID(GGL)、Baxter Biosciences)の皮下投与が、SQ投与によるIGのバイオアベイラビリティを増加させ、用量の増加を不要にするか否かを決定するための実験を行った。実験は以下の評価を行うために計画した：
1)皮下(SQ)経路による単一部位へのGGLの1月1回投与を許容する対象の能力；2)GGLの1月1回と投与を許容する(薬剤の軽度のわずかな局所副作用)のに必要なrHuPH20/g GGLの用量；3)SC投与に必要な時間、および3)GGL IV対SQの曲線下面積(AUG)により測定したバイオアベイラビリティの比較。
【０２１９】
簡単には、安定した用量の静脈内ガンマグロブリン(IVIG)を投与されていた11名の成人免疫不全患者を試験に登録した。すべての患者は、試験前に受けたのと同じIVIG 1月1回投与を受け続けた。皮下投与に関して、患者に、600mg/kg体重までのGGLを4週間ごとにIV投与し、4週IV用量の1/4の用量で単一部位にSQ注射を開始し、1週用量を許容するのに必要なrHuPH20の用量を決定する。次に、rHuPH20の用量を減らし、患者は、GGLを2、3、および最終的には完全4週用量を投与され、GGL SQの1月に1回の注入を許容するのに必要な最小rHuPH20を決定した。
【０２２０】
最初の注入は、150UのrHuPH20/グラムGGLを用いて行った。rHuPH20は、濃度150U/mLまたは1500U/mlを1〜2mL/分で24ゲージのSQ注射針を用いて投与し、次いでGGLを注入した。1500U/ml rHuPH20を用いるときは以下のごとく希釈した：a)必要な濃縮(1500U/ml)rHuPH20溶液の容量が1.5mlまたはそれ以下であった場合は、注射用の通常の生理食塩水を用いて1：10に希釈した；b)必要な濃縮(1500U/ml)rHuPH20溶液の容量が1.5mL以上、15mL以下であった場合は、注射用の通常の生理食塩水を用いて15Lに希釈した；c)必要な濃縮(1500U/ml)rHuPH20溶液の容量が15mLもしくはそれ以上であった場合は無希釈で用いた。
【０２２１】
rHuPH20の注入直後(および5分間以内)、GGLを同じ24ゲージのSQ注射針を用いて4週容量の1/4(すなわち、1週間用量)の用量で出発し、4週用量の1/4を単一部位に投与するのに必要なrHuPH20の量を決定した。各患者について、注入を許容したか否かを決定する評価を行い、注入が3時間未満の注入を完結することができないかまたは2以上の投与部位が必要な中等度または重度の局所反応がある場合は注入は許容されないとみなした。GGLの1週間に1回投与が許容された場合は、1/2用量(2週用量)を100U/g GGLのrHuPH20を用いて投与し、rHuPH20の用量をさらに66U/g GGL、次いで50U/g GGLに減少させた。rHuPH20の投与を1g GGL当たりに基づいて反復し、単一部位へのGGLの全4週用量が許容されるまでGGLの量を増加した。rHuPH20の量はいかなる点でも許容されなければ、該用量が許容されるまでGGLの1週間に1回投与を次の間隔で反復し、rHuPH20の量を増加させた。対象がrHuPH20用量の2連続増加(すなわち、GGLの異なる用量で3回試みた)を許容しない場合は、先に許容された用量を最大耐量と決定した。
【０２２２】
最初の4名の患者は許容性のみ評価し、残りの7名の患者はIV注入を受け、次いでIV注入とそれに続くSQ注入を比較する薬物動態(PK)試験を行った。SQ注入については、GGLの1月1回用量を投与した後、同じ1月1回用量を反復し、PK試験を行ってT1/2、Tmax、およびAUCを評価した。AUC(SQ)がAUC(IV)の90%以内にない場合は、rHuPH20の用量を次の注入時に4倍に増加し、PK評価を繰り返した。
【０２２３】
11名の患者のうち10名には、25.5〜61.2グラムのGGL(255〜612ml)の1月1回用量を単一SQ部位に120〜300ml/時の速度で投与した。11番目の患者は局所の不快感を示し1週間注入後に中止した。最初の患者(39001)については、初期注入を重力により行ったが、その速度はrHuPH20の用量を150から300U/g GGLに増加したにも関わらず許容されなかった。したがって、全ての続く注入はIV蠕動ポンプ(peristaltic pump)を用いて行った。残りの9名の患者では、rHuPH20濃度の増加または反復投与を必要とせずにGGLの1月1回用量が達成された。すなわち、rHuPH20の用量を減少させることを試みた9名の患者すべてで試験を完了し、50U/g GGLを用いる注入を許容することができた。50U/g GGLが投与しうる最小rHuPH20であるかを決定するため、25U/g GGLの用量を2名の患者に試みたが成功せず、1名は不快感を示し、もう1名は許容性の低下を示し、2部位への投与を求めた。すなわち、GGL SQの1月1回用量の投与を可能にするrHuPH20の最小量は50U/g GGLであった。結果を下記表3に要約する。結果は、最初の2名を除く全ての患者が300ml/hrまでの速度で、注入時間1.64 h(270ml)〜3.55 h(537ml)で注入されたことを示す。投与速度は、主として用いるポンプのタイプによって限定される。IVポンプは急速な注入速度で警告音が鳴ることが多かった。ある注入は徐々であり、あるものは軽度の注入部位痛により中断された。両注入とも再開し、完結した。
【表３】
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1.  許容性評価
【０２２４】
対象のSQ注入に対する許容性について評価した。ほとんどの注入は、軽度の注入関連反応とのみ関連した(表4)。ほとんどの一般的な軽度の反応は注入部位の紅斑、痛み、腫脹、熱感、および掻痒であった。中等度の注入部位反応には、3例の痛み、1例のそれぞれ掻痒、腫脹、および熱感が含まれた。重度の反応は報告されなかった。該注入の10においてrHuPH20注入時に一過性の火照り(burning)を訴え、5は1名の患者に生じた。
【表４】
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【０２２５】
注入に関連する可能性があるかまたは恐らく関連すると思われる全身有害事象を表5に示す。3つは中等度であり、重症はみられなかった。軽度の胸部痛の発現のみが注入の中断と関連があったが、注入は完結し、続く注入も良く許容された。表6は、有害事象による中断なしに完結した皮下注入の割合を示す。
【０２２６】
1つの重症有害事象であるアナフィラキシー反応が試験療法と無関係に1名の患者に生じた。以前に抗生物質に対するアレルギー反応の病歴がある患者は、GGL/rHuPH20を注入した翌日に抗生物質を投与され、その後、アナフィラキシーが発現した。この患者は完全に回復し、成功裏に試験を完了することができた。
【０２２７】
PID患者のこの臨床試験中に細菌感染は記録されなかった。ウイルス感染の報告が9例あり、すべて試験療法とは無関係とみなされた(2例がウイルス性胃腸炎、1例がヘルペス性角膜炎、2例が副鼻腔炎、1例が結膜炎、および3例(1名の患者)がインフルエンザ様疾患。
【表５】
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【表６】
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2.  薬物動態評価
【０２２８】
薬物動態(PK)分析を血清IgGレベルについて行った。本試験のPK評価相(phase)に登録された7名の患者において、50UのrHuPH20/グラムGGLを用いて単一部位に27〜61グラムのGGLの1月1回用量が達成された(表3参照)。PK試験をGGLの第2の1月1回用量注入を受けた後に行った。血清試料を注入前、注入後1時間、注入後1、2、3、4、5、7、14、21、および28日(28日が予定されている場合)に採取した。7名の患者の薬物動態パラメーターを表7に示す。結果は、7名の患者のうち5名がAUC(IV)の90％以内のAUC(SQ)であったことを示す。比が90％未満の2名の患者において用量を増加するかまたはrHuPH20を4倍にしてもバイオアベイラビリティはさらに改善しなかった。
【表７】
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【表８】
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3.  結果のまとめ
【０２２９】
GGLの注入前の注射によるrHuPH20の使用は、本試験において300mL/hまでの注入速度で単回皮下部位に600mLものGGLを注入することを可能にした。該速度は、主として使用する、IVが浸潤し圧が増大したときにアラームを発し、止まるように設計されたIVポンプにより制限された。ポンプの停止は速度が300mL/hに近づくまで起きないが、ポンプを再始動する必要により注入時間が増加した。皮下投与では圧アラームは必要ないので、停止の問題はアラームなしにより高圧を生じることができるポンプに交換することにより排除すべきである。
【０２３０】
ほとんどの注入は、いくらかの腫脹、発赤、または時に痛みや掻痒と関連があるが、一部を除いて軽度であった。6の中等度の反応のうちの2つがrHuPH20を最小有効用量を見いだすために減少させた注入においてみられ、rHuPH20用量50U/g GGLが11名の対象のうち10名に許容された。以前に皮下注入を受けていない1名の対象は、下腹部に不快感を示し最初の1週投与後に中止した。全ての他の注入は軽度の反応にも関わらず完結し、97％の注入が中断なしに完結した。ほとんどの反応はクールパックで治療され、ほんのわずかだけがアセトアミノフェンやジフェンヒドラミンを必要とした。
【０２３１】
rHuPH20と組み合わせて皮下投与したGGLの平均バイオアベイラビリティは、IV投与後のGGLのバイオアベイラビリティの92％であった。本試験は、rHuPH20によってもたらされた拡散の増加がGGLの吸収を改善したことを示唆する。本試験においてGGLの1月1回皮下投与により達成されるトラフ値はIV投与により達成されるものと同一である。すなわち、皮下投与によるGGLの投与頻度をIV投与に対して増加させる必要がなく、rHuPH20と組み合わせたGGLの皮下投与は単一SQ部位のみを必要とし、300mLまでの注入速度を達成することができる。
【０２３２】
結論として、rHuPH20は、成人免疫不全対象群において、GGLの全1月1回用量を1部位に300mL/hまでの速度で投与するのを促進する。該組み合わせのバイオアベイラビリティは、時間対IgG濃度曲線のAUCに基づいてIVバイオアベイラビリティの92％であった。これは、rHuPH20が皮下投与したGGLの吸収を改善することを示唆する。ほとんどの局所的副作用は軽度であり、注入の減速や中断を生じなかった。
【実施例２】
【０２３３】
可溶性rHuPH20発現細胞系の生成
HZ24プラスミド(配列番号52に記載)を用いてチャイニーズハムスター卵巣(CHO細胞)をトランスフェクトした(例えば、出願No. 10,795,095、11/065,716、および11/238,171参照)。可溶性rHuPH20を発現するためのHZ24プラスミドベクターは、pCIベクター骨格(Promega)、ヒアルロニダーゼのアミノ酸1〜482をコードするDNA(配列番号49)、ECMVウイルス(Clontech)由来の内部リボソーム侵入部位(IRES)、およびマウスジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)遺伝子を含む。pCIベクター骨格は、ベータラクタマーゼ耐性遺伝子(AmpR)をコードするDNA、f1複製起点、サイトメガロウイルス即初期エンハンサー/プロモーター領域(CMV)、キメライントロン、およびSV40後期ポリアデニル化シグナル(SV40)も含む。可溶性rHuPH20構築物をコードするDNAは、ヒトPH20の天然35アミノ酸シグナル配列の1位アミノ酸のメチオニンをコードするDNAの前にNheI部位とKozakコンセンサス配列と、配列番号1に示すヒトPH20ヒアルロニダーゼのアミノ酸482位に対応するチロシンをコードするDNAの後に終止コドン、次いでBamHI制限部位を含む。したがって、構築物pCI-PH20-IRES-DHFR-SV40pa(HZ24)は、内部リボソーム侵入部位(IRES)により分離したヒトPH20のアミノ酸1〜482(配列番号3に示す)およびマウスジヒドロ葉酸還元酵素のアミノ酸1〜186(配列番号53に示す)をコードするCMVプロモーターにより誘導される単一mRNA種を生じる。
【０２３４】
4mMグルタミンおよび18mL/L Plurionic F68/L(Gibco)添加DHFR(-)細胞用GIBCO変法CD-CHO培地中で増殖させた非トランスフェクトDG44 CHO細胞0.5x106細胞/mlをトランスフェクションのために振盪フラスコ中に接種した。細胞を加湿インキュベーター中5％CO2下37℃で120rpmで振盪させながら増殖させた。対数増殖期の非トランスフェクトDG44 CHO細胞のトランスフェクション前の生存率を試験した。
【０２３５】
6x107生細胞の非トランスフェクトDG44 CHO細胞培養をペレットとし、0.7mLの2xトランスフェクション緩衝液(2×HeBS：40mM Hepes、pH7.0、274mM NaCl、10mM KCl、1.4mM Na2HPO4、12mMデキストロース)に2×107細胞の密度で再浮遊させた。再浮遊した細胞の各部分標本に、0.09mL(250μg)の線状HZ24プラスミド(Cla I(New England Biolabs)で一夜消化して線状化した)を加え、細胞/DNA溶液を室温で0.4cmギャップBTX(Gentronics)エレクトロポーレーションキュベットに移した。陰性コントロールエレクトロポーレーションを細胞と混合した非プラスミドDNAを用いて行った。細胞/プラスミド混合物を330Vおよび960μFまたは350Vおよび960μFのコンデンサ放電によりエレクトロポーレーションした。
【０２３６】
エレクトロポーレーション後に細胞をキュベットから取り出して4mMグルタミンおよび18mL/L Plurionic F68/L(Gibco)添加DHFR(-)細胞用変法CD-CHO培地5mLに移し、加湿インキュベーター中5％CO2下37℃で2日間選択せずに6ウェル組織培養プレートのウェル中で増殖させた。
【０２３７】
エレクトロポーレーションの2日後に0.5mLの組織培養液を各ウェルから取り出し、実施例3に記載の微量濁度アッセイを用いてヒアルロニダーゼ活性の存在を試験した。
【表９】
0005898286.tif 000010
【０２３８】
トランスフェクション2(350V)から得た細胞を組織培養ウェルから回収し、カウントし、1×104〜2×104生細胞/mLに希釈した。細胞浮遊液の0.1mL部分標本を5つの96ウェル丸底組織培養プレートの各ウェルに移した。4mM GlutaMAX(登録商標)-1添加物(GIBCO(登録商標)、Invitrogen Corporation)を含み、ヒポキサンチンおよびチミジン添加物を含まないCD-CHO培地(GIBCO)100μLを細胞を含むウェルに加えた(最終容量0.2mL)。
【０２３９】
メトトレキセート非存在下で増殖した5プレートから10クローンを同定した。
【表１０】
0005898286.tif 000011
【０２４０】
6個のHZ24クローンを培養中で拡大培養し、単細胞浮遊液として振盪フラスコ中に移した。クローン3D3、3E5、2G8、2D9、1E11、および4D10を、二次元無限希釈法を用いて96ウェル丸底組織培養プレートに播き、上端左手ウェルの5000細胞から出発し、プレートの下に向かって1：2に希釈し、プレートを横切って1：3に希釈した。希釈したクローンを500非トランスフェクトDG44 CHO細胞/ウェルのバックグラウンド中で増殖させ、培養に開始日に必要な成長因子を得た。サブクローンあたり10プレートとし、5プレートは50nMメトトレキセートを含む、5プレートはメトトレキセートを含まなかった。
【０２４１】
クローン3D3は24個の目視できるサブクローンを生じた(非メトトレキセート処理から13、50nMメトトレキセート処理から11)。顕著なヒアルロニダーゼ活性が24サブクローンの8個由来の上清に測定され(>50単位/mL)、これら8サブクローンをT-25組織培養フラスコ中で増殖させた。メトトレキセート処理プロトコールから単離したクローンを50nMメトトレキセート存在下で培養した。クローン3D35Mをさらに500nMメトトレキセート中で拡大培養し、振盪フラスコ中で1,000単位/ml以上を産生するクローンを生じた(クローン3D35M；またはGen1 3D35M)。次に、3D35M細胞のマスター細胞バンク(MCB)を調製した。
【実施例３】
【０２４２】
可溶性rHuPH20のヒアルロニダーゼ活性の測定
細胞培養、精製分画、および精製溶液のような試料中の可溶性rHuPH20のヒアルロニダーゼ活性を、ヒアルロン酸が血清アルブミンと結合したときの不溶性沈殿物の形成に基づき比濁分析を用いて測定した。可溶性rHuPH20をヒアルロン酸ナトリウム(ヒアルロン酸)と一定期間(10分間)インキュベーションし、次いで酸性化血清アルブミンを加えて未消化のヒアルロン酸ナトリウムを沈殿させることに活性を測定する。得られた試料の濁度を30分間の発色期後640nmで測定した。ヒアルロン酸ナトリウム基質に対する酵素活性から得られた濁度の低下は、可溶性rHuPH20ヒアルロニダーゼ活性の測定値である。該方法は、可溶性rHuPH20アッセイの操作参照標準の希釈物を用いて得られる較正曲線を用いて行い、試料の活性測定はこの較正曲線に対してなされる。
【０２４３】
試料の希釈は酵素希釈溶液を用いて調製する。希釈溶液は、33.0±0.05mgの加水分解ゼラチンを25.0mLの50mM PIPES反応緩衝液(140mM NaCl、50mM PIPES、pH5.5)および25.0mLのSWFIに溶解し、0.2mLの25% Buminate溶液を混合物中で希釈し、30秒間渦巻き撹拌することにより調製する。これは、必要になるまで氷上で保存し、2時間以内に用いた。試料を、推定1〜2U/mLに希釈した。一般的には、最大希釈/工程は1：100を超えず、最初の希釈にための初期試料サイズは20μL未満ではない。アッセイを行うために必要な最小試料容量は以下の通りである：製造過程の試料、FPLC分画：80μL；組織培養上清：1mL；濃縮物質80μL；精製または最終工程の物質：80μL。希釈は、低タンパク質結合96ウェルプレート中でトリプリケートで行い、各希釈の30μLをOptiluxブラック/透明底プレート(BD BioSciences)に移した。
【０２４４】
濃度2.5U/mLの既知可溶性rHuPH20希釈液を酵素希釈溶液を用いて調製し、標準曲線を作製し、Optiluxプレートにトリプリケートで加えた。希釈液は、0U/mL、0.25U/mL、0.5U/mL、1.0U/mL、1.5U/mL、2.0U/mL、および2.5U/mLを含んだ。60μLの酵素希釈溶液を含む「試薬ブランク」ウェルを陰性コントロールとしてプレートに含めた。次に、プレートを被い、加熱ブロック上で37℃で5分間温めた。被いを除去しプレートを10秒間振盪させた。振盪後、プレートを加熱ブロックに戻し、MULTIDROP 384 Liquid Handling Device(液体走査装置)を20.0mLのSWFI中、温0.25mg/mLヒアルロン酸ナトリウム溶液(100mgのヒアルロン酸ナトリウム(LifeCore Biomedical)を溶解して調製した)で満たした。これを、2〜8℃で2〜4時間もしくは完全に溶解するまで、静かに回転および/または振動させて混合した。反応プレートをMULTIDROP 384に移し、スタートキーを押して30μLのヒアルロン酸ナトリウムを各ウェルに分注して反応を開始した。次に、プレートをMULTIDROP 384から取り出し、10秒間振盪させ、次いでプレートカバーを交換した加熱ブロックに移した。プレートを37℃で10分間インキュベーションした。
【０２４５】
MULTIDROP 384を調製し、該機械を血清操作溶液で満たし、容量設定を240μLに変えて反応を止めた。(75mLの500mM酢酸緩衝溶液中の25mLの血清ストック溶液[1容量のウマ血清(Sigma)を9容量の500mM 酢酸緩衝液溶液で希釈し、pHをヒアルロン酸で3.1に調整する])。プレートを加熱ブロックから除去し、MULTIDROP 384上に置き、240μLの血清操作溶液をウェルに分注した。プレートを除去し、プレートリーダー上で10秒間振盪させた。さらに15分後、試料の濁度を640nmで測定し、各試料のヒアルロニダーゼ活性(U/mL)を標準曲線に当てはめて決定した。
【０２４６】
比活性(単位/mg)は、ヒアルロニダーゼ活性(U/ml)をタンパク質濃度(mg/mL)で割って計算した。
【実施例４】
【０２４７】
Gen1 ヒトsPH20の生成と精製
A.  5Lバイオリアクタープロセス
3D35Mのバイアルを解凍し、100nMメトトレキセートおよびGlutaMAX(登録商標)-1(Invitrogen)を添加したCD-CHO培地(Invitrogen、Carlsbad Calif.)中、1Lスピナーフラスコを経て振盪フラスコから拡大培養した。細胞をスピナーフラスコから5Lバイオリアクター(Braun)に4×105生細胞/mLの接種密度で移した。パラメーターは温度の設定値37℃、pH7.2(出発設定値)であり、希釈酸素設定値25%、および空気の重層は0〜100cc/minであった。168時間で、250mlのフィード#1培地(50g/Lグルコース添加CD CHO)を加えた。216時間で、250mlのフィード#2培地(50g/Lグルコースおよび10mM酪酸ナトリウム含有CD CHO)を加え、264時間で、250mlのフィード#2培地を加えた。このプロセスは、最大細胞密度6×106細胞/mlで1600単位/mLの最終生産性をもたらした。酪酸ナトリウムの添加は最終生成段階における可溶性rHuPH20の産生を顕著に増強した。
【０２４８】
3D35Mクローンから得た順化培地は、深層濾過および10mM Hepes pH7.0へのタンジェンシャルフロー透析により浄化した。次に、可溶性rHuPH20を、Qセファロース(Pharmacia)イオン交換連続クロマトグラフィ、フェニルセファロース(Pharmacia)疎水性相互作用クロマトグラフィ、ボロン酸フェニル(Prometics)、およびヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ(Biorad、Richmond、CA)により精製した。
【０２４９】
Qセファロースと結合した可溶性rHuPH20を同じ緩衝液中400mM NaClで溶出した。溶出物を2M硫酸アンモニウムで希釈して最終濃度500mMリン酸アンモニウムとし、フェニルセファロース(低sub)カラムに通し、次いで同じ条件下でボロン酸フェニル樹脂と結合させた。可溶性rHuPH20を、硫酸アンモニウムを含まない50mMビシン中pH9.0で洗浄後、ヘペスpH6.9中のフェニルセファロース樹脂から溶出させた。溶出液を、5mMリン酸カリウムおよび1mM CaCl2中のpH6.9のセラミックヒドロキシアパタイト樹脂にロードし、0.1mM CaCl2添加80mMリン酸カリウム、pH7.4で溶出した。
【０２５０】
得られた精製可溶性rHuPH20は、USP参照標準を用いる微量濁度アッセイ(実施例16)により65,000 USP単位/mgタンパク質以上の比活性を有した。精製sPH20は、0.1% TFA/H2O〜0.1% TFA/90%アセトニトリル/10% H20間の勾配でPharmacia 5RPCスチレンジビニルベンゼンカラムから24〜26分間で単一ピークとして溶出され、PNGASE-Fで処理すると還元されて明確な51kDaのバンドになるSDS電気泳動による単一の広い61kDaバンドとして分解された。
B.  100Lバイオリアクター細胞培養中の上流細胞培養の拡大培養(エクスパンジョン)プロセス
【０２５１】
スケールアッププロセスを用い、3D35M細胞の4つの異なるバイアルから別々に可溶性rHuPH20を精製し、sHuPH20の4つの分離したバッチ；HUA0406C、HUA0410C、HUA0415C、およびHUA0420Cを製造した。各バイアルを別個に125Lバイオリアクターにより拡大培養および培養し、次いでカラムクロマトグラフィを用いて精製した。該プロセスを通して試料を得、酵素収量のようなパラメーターを評価した。下記プロセスの説明は、バイオリアクターの出発およびフィード培地容量、伝達細胞密度、および洗浄および溶出容量のようなものについて典型的な説明を記載している。正確な数は各バッチでわずかに異なり、表11〜18に詳述している。
【０２５２】
3D35M細胞の4つのバイアルを37℃の水浴中で解凍し、100nMメトトレキセートおよび40mL/L GlutaMAXを含むCD CHOを加え、細胞を遠心した。細胞を20mL新鮮培地を含む125mL振盪フラスコに再浮遊させ、37℃、7％CO2インキュベーター中においた。細胞を125mL振盪フラスコ中で40mLまで拡大培養した。細胞密度が1.5〜2.5×106細胞/mLに達したら、培養を100mL培養容量の125mLスピナーフラスコ中で拡大培養した。フラスコを37℃、7% CO2でインキュベーションした。細胞密度が1.5〜2.5×106細胞/mLに達したら、培養を200mL培養容量の250mLスピナーフラスコ中で拡大培養し、37℃、7% CO2でインキュベーションした。細胞密度が1.5〜2.5×106 細胞/mLに達したら、培養を800mL培養容量の1Lスピナーフラスコ中で拡大培養し、37℃、7% CO2でインキュベーションした。細胞密度が1.5〜2.5×106 細胞/mLに達したら、培養を5L培養容量の6Lスピナーフラスコ中で拡大培養し、37℃、7% CO2でインキュベーションした。細胞密度が1.5〜2.5×106 細胞/mLに達したら、培養を20L培養容量の36Lスピナーフラスコ中で拡大培養し、37℃、7% CO2でインキュベーションした。
【０２５３】
125Lリアクターを121℃、20PSIの蒸気で滅菌し、65LのCD CHO培地を加えた。使用前に、リアクターの汚染をチェックした。36Lスピナーフラスコ中の細胞密度が1.8〜2.5×106 細胞/mLに達したら、20L細胞培養を36Lスピナーフラスコから125Lバイオリアクター(Braun)に移し、最終容量85Lおよび接種密度約4×105細胞/mLを得た。パラメーターは、温度設定値37℃；pH：7.2；溶存酸素：25%±10%；インぺラ速度50rpm；容器(Vessel)圧3psi；空気スパージ1L/min；空気重層：1L/minであった。細胞数、pH確認、培地分析、タンパク質生成、および保持(retention)について、リアクターを1日1回サンプリングした。操作期間中栄養フィードを加えた。第6日に、3.4Lのフィード#1培地(CD CHO＋50g/Lグルコース＋40mL/L GlutaMAX(登録商標)-1)を加え、培養温度を36.5℃に変えた。第9日に、3.5Lのフィード#2(CD CHO＋50g/Lグルコース＋40mL/L GlutaMAX(登録商標)-1＋1.1g/L酪酸ナトリウム)を加え、培養温度を36℃に変えた。第11日に、3.7Lのフィード#3(CD CHO＋50g/Lグルコース＋40mL/L GlutaMAX(登録商標)-1＋1.1g/L酪酸ナトリウム)を加え、培養温度を35.5℃に変えた。14日目または細胞の生存率が50％以下に下がった時にリアクターから収集した。該プロセスは最大細胞密度8×106細胞/mLで酵素活性1600単位/mlの可溶性rHuPH20の産生をもたらした。収集時に、マイコプラズマ、バイオバーデン、エンドトキシン、およびウイルス(in vitroおよびin vivo)、ウイルス粒子の透過型電子顕微鏡検査(TEM)、および酵素活性のために培養をサンプリングした。
【０２５４】
100Lバイオリアクター細胞培養収集物を、一連のポリエーテルスルホン媒体(Sartorius)を有するディスポーザブルカプセルフィルターを通して濾過した：最初に8.0μmの深さのカプセル、0.65μmの深さのカプセル、0.22μmカプセルを通し、最後に0.22μm Sartopore 2000cm2フィルターを通し、100L無菌保存バッグに入れた。培養を、Spiral Polyethersulfone(スパイラルポリエーテルスルホン)30kDaMWCOフィルター(Millipore)を備えた2つのTFFで10×に濃縮し、次いで10mM HEPES、25mM Na2SO4、pH7.0による緩衝液交換で6×に濃縮して0.22μm最終フィルターを通し、20L無菌保存バッグに入れた。表11は、細胞培養、収集物、濃度、および緩衝液交換工程に関するモニターデータを示す。
【表１１】
0005898286.tif 000012
【０２５５】
Qセファロース(Pharmacia)イオン交換カラム(3L樹脂、高さ＝20cm、直径＝14cm)を調製した。pH、伝導度、エンドトキシン(LAL)アッセイについて検討するために洗浄試料を回収した。カラムを、5カラム容量の10mM Tris、20mM Na2SO4、pH7.5で平衡化した。濃縮し、透析した収集物をQカラムに流速100cm/hrでロードした。カラムを、5カラム容量の10mM Tris、20mM Na2SO4、pH7.5、および10mM Hepes、50mM NaCl、pH7.0で洗浄した。タンパク質を10mM Hepes、400mM NaCl、pH7.0で溶出し、0.22μm最終フィルターで濾過して無菌バッグに入れた。
【０２５６】
次に、フェニルセファロース(Pharmacia)疎水性相互作用クロマトグラフィを行った。フェニルセファロース(PS)カラム(9.1 L樹脂、高さ＝29cm、直径＝20cm)を作製した。該カラムを5カラム容量の5mMリン酸カリウム、0.5M硫酸アンモニウム、0.1mM CaCl2、pH7.0で平衡化した。上記タンパク質溶出物に、2M 硫酸アンモニウム、1M リン酸カリウム、および1M CaCl2ストック溶液をそれぞれ最終濃度5mM、0.5M、および0.1mMで加えた。タンパク質をPSカラムに流速100cm/hrでロードした。5mMリン酸カリウム、0.5M硫酸アンモニウム、および0.1mM CaCl2 pH7.0を100cm/hrで加えた。フロースルーを0.22μm最終フィルターに通し、無菌バッグに入れた。
【０２５７】
PS精製タンパク質を、5カラム容量の5mMリン酸カリウム、0.5M硫酸アンモニウムで平衡化したアミノフェニルボロン酸カラム(ProMedics)(6.3L樹脂、高さ＝20cm、直径＝20cm)にロードした。タンパク質を該カラムに流速100cm/hrで通し、次いで、カラムを5mMリン酸カリウム、0.5M硫酸アンモニウム、pH7.0で洗浄した。次に、カラムを、20mMビシン、100mM NaCl、pH9.0で洗浄し、タンパク質を50mM Hepes、100mM NaCl pH6.9で溶出し、無菌フィルターを通して20L無菌バッグに入れた。溶出液のバイオバーデン、タンパク質濃度、および酵素活性を試験した。
【０２５８】
ヒドロキシアパタイト(HAP)カラム(BioRad)(1.6L樹脂、高さ＝10cm、直径＝14cm)を、5mM リン酸カリウム、100mM NaCl、0.1mM CaCl2 pH7.0で平衡化した。洗浄試料を回収し、pH、伝導度、およびエンドトキシン(LALアッセイ)について試験した。アミノフェニルボロン酸精製タンパク質にリン酸カリウムおよびCaCl2を添加して最終濃度5mMリン酸カリウムおよび0.1mM CaCl2とし、HAPカラムに流速100cm/hrでロードした。カラムを5mMリン酸カリウム pH7.0、100mM NaCl、0.1mM CaCl2、次いで10mMリン酸カリウム pH7.0、100mM NaCl、0.1mM CaCl2 pHで洗浄した。タンパク質を70mM リン酸カリウム pH7.0で溶出し、0.22μmフィルターで濾過して5L無菌保存バッグに入れた。溶出液のバイオバーデン、タンパク質濃度、および酵素活性を試験した。
【０２５９】
次に、HAP精製タンパク質を加圧タンクを介して20nMウイルス除去フィルターに注入した。タンパク質をDV20加圧タンクおよびフィルター(Pall Corporation)に加え、次いで20nmポアのUltipor DV20フィルター(Pall Corporation)を通して無菌20L保存バッグに入れた。濾液のタンパク質濃度、酵素活性、オリゴ糖、単糖類、およびシアル酸プロフィール、およびプロセス関連不純物について試験した。次に、濾液中のタンパク質を10kD分子量カットオフ(MWCO)Sartocon Sliceタンジェンシャルフロー濾過(TFF)システム(Sartorius)を用いて1mg/mLに濃縮した。フィルターを最初にHepes/生理食塩水溶液(10mM Hepes、130mM NaCl、pH7.0)で洗浄して調製し、pHおよび伝導度用に浸透物をサンプリングした。濃縮後、濃縮タンパク質をサンプリングし、タンパク質濃度と酵素活性を試験した。6×緩衝剤交換を濃縮タンパク質について実施し、最終緩衝液、10mM Hepes、130mM NaCl、pH7.0、に入れた。濃縮タンパク質を0.22μmフィルターに通して20L無菌保存バッグに入れた。タンパク質濃度、酵素活性、遊離スルフヒドリル基、オリゴ糖プロフィールおよびオスモル濃度用にタンパク質をサンプリングした。
【０２６０】
表12〜18は、各3D35M細胞ロットについて上記精製工程のそれぞれに関連するモニタリングデータを提供する。
【表１２】
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【０２６１】
【表１３】
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【０２６２】
【表１４】
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【０２６３】
【表１５】
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【０２６４】
【表１６】
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【０２６５】
【表１７】
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【０２６６】
【表１８】
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【０２６７】
精製および濃縮可溶性rHuPH20タンパク質を5mLおよび1mL充填容量の無菌バイアルに無菌充填した。該タンパク質を0.22μmフィルターに通し、オペレーターが遠隔操作するポンプを用い、重量計測値を用いてバイアルに充填した。バイアルをストッパーで閉じ、波形キャップでしっかり固定した。密閉したバイアルは、異物粒子を目視検査し、次いでラベルを貼った。ラベルを貼った後、バイアルを1分間以内で液体窒素に浸漬して瞬間凍結し、<15℃(-20±5℃)で保存した。
【実施例５】
【０２６８】
可溶性ヒトPH20(rHuPH20)含有Gen2細胞の産生
実施例2に記載のGen1 3D35M細胞系はより高レベルのメトトレキセートに適合し、2世代(Gen2)クローンを生成した。3D35M細胞を樹立メトトレキセート含有培地から4mM GlutaMAX-1(登録商標)および1.0μMメトトレキセートを含むCD CHO培地に接種した。細胞を、37℃の7%CO2加湿インキュベーター中46日間にわたり9回増殖および継代して高レベルのメトトレキセートに適合させた。増幅した細胞ポピュレーションを、2.0μMメトトレキセート含有培地を含む96ウェル組織培養プレート中で限界希釈してクローニングした。約4週間後、クローンを同定し、クローン3E10Bを拡大培養用に選んだ。3E10B細胞を4mM GlutaMAX-1(登録商標)および2.0μMメトトレキセート含有CD CHO培地中で増殖させ、20回継代した。3E10B細胞系のマスター細胞バンク(MCB)を作製し、凍結し、その後の研究に用いた。
【０２６９】
3E10B 細胞を4mM GlutaMAX-1(登録商標)および4.0μMメトトレキセート含有CD CHO培地中で培養することにより該細胞系の増幅を続けた。12回継代後、細胞を調査細胞バンク(RCB)としてバイアル中で凍結させた。RCBの1バイアルを解凍し、8.0μMメトトレキセート含有培地中で培養した。5日後、培地中のメトトレキセート濃度を16.0μMに、次いで18日後に20.0μMに増加させた。20.0μMメトトレキセート含有培地中で8代継代した細胞を4mM GlutaMAX-1(登録商標)および20.0μMメトトレキセート含有CD CHO培地を含む96ウェル組織培養プレート中で限界希釈してクローンした。クローンを5〜6週間後に同定し、クローン2B2を、20.0μMメトトレキセート含有培地中で拡大培養するために選択した。11代継代後、2B2細胞を調査細胞バンク(RCB)用にバイアル中で凍結させた。
【０２７０】
得られた2B2細胞はジヒドロ葉酸還元酵素欠損(dhfr-)DG44 CHO細胞であり、可溶性組み換えヒトPH20(rHuPH20)を発現する。可溶性PH20は2B2細胞中に約206コピー/細胞のコピー数で存在する。rHuPH20-特異的プローブを用いるSpe I-、Xba I-、およびBamH I/Hind III消化ゲノム2B2細胞DNAのサザンブロット分析は、以下の制限消化プロフィールを示した：Spe I消化DNAで〜7.7 kbの1つの主要ハイブリダイズバンドと4つのマイナーなハイブリダイズバンド(〜13.9、〜6.6、〜5.7、および〜4.6 kb)；Xba I消化DNAで〜5.0 kbの1つの主要ハイブリダイズバンドと2つのマイナーなハイブリダイズバンド(〜13.9および〜6.5 kb)；およびBamH I/Hind III消化2B2DNAを用いて観察される〜1.4kbの1つのハイブリダイズバンド。mRNA転写物の配列分析は、誘導されたcDNA(配列番号56)が、予期されたシトシン(C)の代わりにチミジン(T)が観察された1131位の1塩基対の違いを除いて参考配列(配列番号49)と同一であった。これはアミノ酸配列に影響しないサイレント突然変異である。
【実施例６】
【０２７１】
A.  300Lバイオリアクター細胞培養中のGen2可溶性rHuPH20の生成
HZ24-2B2のバイアルを解凍し、20μMメトトレキセートおよびGlutaMAX-1(登録商標)(Invitrogen)添加CD-CHO培地(Invitrogen、Carlsbad、CA)中、振盪フラスコから36Lスピナーフラスコに拡大培養した。簡単には、細胞のバイアルを37℃の水浴中で解凍し、培地を加えて細胞を遠心した。細胞を20mLの新鮮培地を入れた125mL振盪フラスコに再浮遊させ、37℃、7% CO2インキュベーター中に置いた。細胞を、125mL振盪フラスコ中で40mLまで拡大培養した。細胞密度が1.5×106 細胞/mL以上に達したら、培養を100mL培養容量の125mLスピナーフラスコ中で拡大培養した。フラスコを37℃、7% CO2でインキュベーションした。細胞密度が1.5×106 細胞/mL以上に達したら、培養を200mL培養容量の250mLスピナーフラスコ中で拡大培養した。フラスコを37℃、7% CO2でインキュベーションした。細胞密度が1.5×106 細胞/mL以上に達したら、培養を800mL培養容量の1Lスピナーフラスコ中で拡大培養し、37℃、7% CO2でインキュベーションした。細胞密度が1.5×106 細胞/mL以上に達したら、培養を5000mL培養容量の6Lスピナーフラスコ中で拡大培養し、37℃、7% CO2でインキュベーションした。細胞密度が1.5×106 細胞/mL以上に達したら、培養を32L培養容量の36Lスピナーフラスコ中で拡大培養し、37℃、7% CO2でインキュベーションした。
【０２７２】
400Lリアクターを滅菌し、230mLのCD-CHO培地を加えた。使用前に、リアクターの汚染をチェックした。約30Lの細胞を36Lスピナーフラスコから接種密度4.0×105生細胞/mlおよび総容量260Lの400Lバイオリアクター(Braun)に移した。パラメーターは、温度設定値37℃；インペラ速度40〜55RPM；容器圧：3psi；空気スパージ0.5〜1.5 L/Min.；空気重層：3L/minであった。細胞数、pH確認、培地分析、タンパク質産生、および保持のためにリアクターを1日1回サンプリングした。また、操作中、栄養フィードを加えた。120hrs で(第5日に)、10.4Lのフィード#1培地(4×CD-CHO＋33g/Lグルコース＋160mL/L Glutamax-1(登録商標)＋83mL/Lイーストレート(Yeastolate)＋33mg/L rHuインスリン)を加えた。168時間で(第7日に)、10.8Lのフィード#2(2×CD-CHO＋33g/Lグルコース＋80mL/L Glutamax-1(登録商標)＋167mL/L Yeastolate＋0.92g/L酪酸ナトリウム)を加え、培養温度を36.5℃に変えた。216時間で(第9日に)、10.8Lのフィード#3(1×CD-CHO＋50g/Lグルコース＋50mL/L Glutamax-1(登録商標)＋250mL/L Yeastolate＋1.80g/L酪酸ナトリウム)を加え、培養温度を36℃に変えた。264時間で(第11日に)、10.8Lのフィード#4(1×CD-CHO＋33g/Lグルコース＋33mL/L Glutamax-1(登録商標)＋250mL/L Yeastolate＋0.92g/L酪酸ナトリウム)を加え、培養温度を35.5℃に変えた。フィード培地の添加により、生成の最終段階における可溶性rHuPH20生成の劇的な増強がみられた。14または15日に、または細胞の生存率が40％以下に落ちた時にリアクターを収集した。該プロセスは、最大細胞密度12×106細胞/mLで17,000単位/mLの最終生産性をもたらした。収集時に、マイコプラズマ、バイオバーデン、エンドトキシン、ウイルス(in vitroおよびin vivo)、透過型電子顕微鏡検査(TEM)、および酵素活性のために培養をサンプリングした。
【０２７３】
培養を、それぞれが4〜8μmのグレードの珪藻土層および1.4〜1.1μmのグレードの珪藻土層、次にセルロース膜を含む4つのMillistak濾過システムモジュール(Millipore)、次いで0.4〜0.11μmのグレードの珪藻土層、および<0.1μmのグレードの珪藻土層、次にセルロース膜、次いで0.22μm最終フィルターを含む第2の単一Millistak濾過システム(Millipore)を並列して蠕動ポンプにより注入し、容量350Lの無菌1回使用フレキシブルバッグに入れた。収集した細胞培養液に10mM EDTAおよび10mM Trisを添加しpH7.5とした。培養を、4つのSartoslice TFF 30kDa分子量カットオフ(MWCO)ポリエーテルスルホン(PES)フィルター(Sartorious)を用いるタンジェンシャルフロー濾過(TFF)装置で10×濃縮し、次いで10mM Tris、20mM Na2SO4、pH7.5で10×緩衝液交換し、0.22μm最終フィルターに通して50L無菌保存バッグに入れた。
【０２７４】
濃縮し透析した収集物のウイルスを不活化した。ウイルス不活化前に、10% Triton X-100、3%トリ(n-ブチル)ホスフェート(TNBP)の溶液を調製した。濃縮し透析した収集物を36Lガラス反応容器中で1時間、1% Triton X-100、0.3% TNBPに暴露し、その直後にQカラムで精製した。
B.  Gen2可溶性rHuPH20の精製
【０２７５】
Qセファロース(Pharmacia)イオン交換カラム(9L樹脂、H= 29cm、D= 20cm)を調製した。pH測定、伝導度、およびエンドトキシン)LAL)アッセイ用に洗浄試料を収集した。カラムを5カラム容量の10mM Tris、20mM Na2SO4、pH7.5で平衡化した。ウイルス不活化後、濃縮透析収集物を流速100cm/hrでQカラムにロードした。カラムを5カラム容量の10mM Tris、20mM Na2SO4、pH7.5、および10mM Hepes、50mM NaCl、pH7.0で洗浄した。タンパク質を10mM Hepes、400mM NaCl、pH7.0で溶出し、0.22μm最終フィルターに通して無菌バッグに入れた。溶出溶液のバイオバーデン、タンパク質濃度、およびヒアルロニダーゼ活性を試験した。A280吸光度を交換の開始および終了時に得た。
【０２７６】
次に、フェニルセファロース(Pharmacia)疎水性相互作用クロマトグラフィを行った。フェニルセファロース(PS)カラム(19〜21L樹脂、H=29cm、D= 30cm)を調製した。洗浄液を回収し、pH、伝導度、およびエンドトキシン(LALアッセイ)用にサンプリングした。カラムを5カラム容量の5mMリン酸カリウム、0.5M硫酸アンモニウム、0.1mM CaCl2、pH7.0で平衡化した。Qセファロースカラムからのタンパク質溶出液に2M硫酸アンモニウム、1Mリン酸カリウム、および1M CaCl2ストック溶液を添加し、それぞれ最終濃度5mM、0.5M、および0.1mMとした。タンパク質をPSカラムに流速100cm/hrでロードし、カラムフロースルーを回収した。カラムを5mMリン酸カリウム、0.5M硫酸アンモニウム、および0.1mM CaCl2 pH7.0で100cm/hrにて洗浄し、洗浄物を回収したフロースルーに加えた。カラム洗浄物と混合したフロースルーを0.22μm最終フィルターに通し、無菌バッグに入れた。バイオバーデン、タンパク質濃度、および酵素活性用にフロースルーをサンプリングした。
【０２７７】
アミノフェニルボロン酸カラム(Promtics)を調製した。洗浄液をpH、伝導度、およびエンドトキシン(LALアッセイ)用にサンプリングした。カラムを5カラム容量の5mM リン酸カリウム、0.5M 硫酸アンモニウムで平衡化した。精製タンパク質を含むPSフロースルーを流速100cm/hrでアミノフェニルボロン酸カラムにロードした。カラムを5mMリン酸カリウム、0.5M 硫酸アンモニウム、pH7.0で洗浄した。カラムを、20mMビシン、0.5M硫酸アンモニウム、pH9.0で洗浄した。カラムを20mMビシン、100mM塩化ナトリウム、pH9.0で洗浄した。タンパク質を50mM Hepes、100mM NaCl、pH6.9で溶出し、無菌フィルターを通して無菌バッグに入れた。溶出した試料のバイオバーデン、タンパク質濃度、および酵素活性を試験した。
【０２７８】
ヒドロキシアパタイト(HAP)カラム(Biorad)を調製した。洗浄物を回収し、pH、伝導度、およびエンドトキシン(LALアッセイ)について試験した。カラムを5mMリン酸カリウム、100mM NaCl、0.1mM CaCl2、pH7.0で平衡化した。アミノフェニルボロン酸で精製したタンパク質に5mMリン酸カリウムおよび0.1mM CaCl2(最終濃度)を加え、HAPカラムに流速100cm/hrでロードした。カラムを5mM リン酸カリウム、pH7、100mM NaCl、0.1mM CaCl2で洗浄した。次に、カラムを10mM リン酸カリウム、pH7、100mM NaCl、0.1mM CaCl2で洗浄した。タンパク質を70mMリン酸カリウム、pH7.0で溶出し、0.22μm無菌フィルターに通して無菌バッグに入れた。溶出試料のバイオバーデン、タンパク質濃度、および酵素活性を試験した。
【０２７９】
次に、HAP精製タンパク質をウイルス除去フィルターに通した。最初に、滅菌Virosartフィルター(Sartorius)を2Lの70mMリン酸カリウム、pH7.0で洗浄して調製した。使用前に、濾過した緩衝液のpHおよび伝導度用にサンプリングした。HAP精製タンパク質を蠕動ポンプで20nMウイルス除去フィルターに通した。70mMリン酸カリウム、pH7.0中の濾過タンパク質を0.22μm最終フィルターに通し、無菌バッグに入れた。ウイルス濾過試料のタンパク質濃度、酵素活性、オリゴ糖、単糖、およびシアル酸プロフィールを試験した。試料のプロセス関連不純物も試験した。
【０２８０】
次に、濾液中のタンパク質を10kD分子量カットオフ(MWCO)Sartocon Sliceタンジェンシャルフロー濾過(TFF)システム(Sartorius)を用いて10mg/mLに濃縮した。最初に、フィルターを10mM ヒスチジン、130mM NaCl、pH6.0で洗浄して調製し、浸透物をpHおよび伝導度用にサンプリングした。濃縮後、濃縮タンパク質をサンプリングし、タンパク質濃度および酵素活性を試験した。濃縮タンパク質を6×緩衝液交換した(最終緩衝液：10mMヒスチジン、130mM NaCl、pH6.0)。緩衝液交換後、濃縮タンパク質を0.22μmフィルターに通し、20L無菌保存バッグに入れた。タンパク質をサンプリングし、タンパク質濃度、酵素活性、遊離スルフヒドリル基、オリゴ糖プロフィール、およびオスモル濃度を試験した。
【０２８１】
次に、無菌濾過バルクタンパク質を無菌的に30mL無菌テフロンバイアル(Nalgene)に20mL分注した。次に、バイアルを瞬間凍結し、-20±5℃で保存した。
C.  Gen1可溶性rHuPH20およびGen2可溶性rHuPH20の生成および精製の比較
【０２８２】
300Lバイオリアクター細胞培養におけるGen2可溶性rHuPH20の生成および精製は、100Lバイオリアクター細胞培養におけるGen1可溶性rHuPH20の生成および精製に比べてプロトコールにいくらか違いがあった(実施例4.Bに記載)。表19に、単純なスケールアップ変化に加えて、これらの方法間の典型的な違いを示す。
【表１９−１】
0005898286.tif 000020
【表１９−２】
0005898286.tif 000021
【０２８３】
修飾は当業者に明らかであるから、本発明は特許請求の範囲のみに限定されるものではない。
【配列表】
0005898286000001.app