(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
イソプレンを生成するための改良された方法であって、
（ａ）イソプレンシンターゼポリペプチドをコードした異種核酸を有する細胞を、イソプレンの生成に適した培養条件下で培養する工程であって、前記細胞が、（ｉ）４０ｇ／Ｌよりも高い力価でイソプレンを生成するか、又は、（ｉｉ）イソプレン約５００ｍｇ／Ｌブロス／時間よりも高い平均のイソプレンの体積生産性を有するものである、工程と、
（ｂ）前記培養物の一部を取り出す工程と、
（ｃ）前記培養物の取り出した一部を膜フィルターを用いて濾過して透過液と保持成分とを生成する工程と、
（ｄ）前記保持成分を前記培養物に戻す工程と、
（ｅ）イソプレンを生成する工程と、を含み、
前記（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）工程を行った培養細胞が、前記（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）工程を行わずに培養した同じ細胞よりも（ｉ）より高い力価でイソプレンを生成するか、又は（ｉｉ）より高い平均のイソプレンの体積生産性を有する、方法。
【請求項２】
前記濾過する工程が、タンジェンシャルフロー濾過によるものである、請求項１に記載の改良された方法。
【請求項３】
前記細胞が、約５０ｇ／Ｌよりも高い力価でイソプレンを生成する、請求項１に記載の改良された方法。
【請求項４】
前記細胞が、イソプレン約１，０００ｍｇ／Ｌブロス／時間よりも高い平均の体積生産性を有する、請求項１に記載の改良された方法。
【請求項５】
同じ細胞培養又は別の細胞培養中に前記透過液を再循環させる工程を更に含み、再循環された透過液の存在下で培養された細胞は、再循環された透過液の非存在下で培養された同じ細胞よりも高い平均のイソプレンの比生産性を有する、請求項１に記載の改良された方法。
【請求項６】
前記細胞が、再循環された透過液の非存在下で培養された同じ細胞よりも約２倍高い平均のイソプレンの比生産性を有する、請求項５に記載の改良された方法。
【請求項７】
前記培養の一部が連続的に取り出される、請求項１に記載の改良された方法。
【請求項８】
前記培養の一部が非連続的に取り出される、請求項１に記載の改良された方法。
【請求項９】
前記イソプレンシンターゼポリペプチドが、植物のイソプレンシンターゼポリペプチドである、請求項１に記載の改良された方法。
【請求項１０】
前記細胞が、イソペンチル−二リン酸イソメラーゼ（ＩＤＩ）ポリペプチドをコードした核酸を更に有する、請求項１又は９に記載の改良された方法。
【請求項１１】
前記細胞が、ＤＸＳポリペプチドをコードした核酸を更に有する、請求項１０に記載の改良された方法。
【請求項１２】
前記細胞が、ＭＶＡ経路ポリペプチドをコードした核酸を更に有する、請求項１０に記載の改良された方法。
【請求項１３】
前記細胞が細菌細胞である、請求項９に記載の改良された方法。
【請求項１４】
前記細胞がグラム陽性細菌細胞またはグラム陰性細菌細胞である、請求項１３に記載の改良された方法。
【請求項１５】
前記細胞がバシラス・サブティリス（Bacillus subtilis）細胞、大腸菌（Escherichia coli）又はパントエア・シトレア（Pantoea citrea）細胞である、請求項１４に記載の改良された方法。
【請求項１６】
前記細胞が真菌細胞である、請求項９に記載の改良された方法。
【請求項１７】
前記細胞がトリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）細胞である、請求項１６に記載の改良された方法。
【請求項１８】
前記細胞が酵母細胞である、請求項１６に記載の改良された方法。
【請求項１９】
前記細胞がサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）またはヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）細胞である、請求項１８に記載の改良された方法。
【請求項２０】
イソプレンを生成するための改良された方法であって、
（ａ）イソプレンシンターゼポリペプチドをコードした異種核酸を有する細胞を、増殖培地が入った発酵装置中で、イソプレンの生成に適した培養条件下で培養する工程であって、前記細胞が、（ｉ）４０ｇ／Ｌよりも高い力価でイソプレンを生成するか、又は、（ｉｉ）イソプレン約５００ｍｇ／Ｌブロス／時間よりも高い平均のイソプレンの体積生産性を有するものである、工程と、
（ｂ）前記発酵装置から細胞培養物の一部を取り出す工程と、
（ｃ）前記細胞培養物の取り出した一部をフィルターに移す工程と、
（ｄ）前記細胞培養物の取り出した一部を膜フィルターを用いて濾過して、（ｉ）使用済み増殖培地を含む透過液と、（ｉｉ）細胞及び他の培養固形分を含む保持成分と、を生成する工程と、
（ｅ）前記保持成分を前記発酵装置に戻す工程と、
（ｆ）前記透過液を回収する工程と、
（ｇ）イソプレンを生成する工程と、を含み、
前記（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）工程を行った培養細胞が、前記（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）工程を行わずに培養した同じ細胞よりも（ｉ）より高い力価でイソプレンを生成するか、又は（ｉｉ）より高い平均のイソプレンの体積生産性を有する、方法。
【請求項２１】
前記発酵装置と前記フィルターとが、循環ループ及び循環ポンプによって接続される、請求項２０に記載の改良された方法。
【請求項２２】
前記透過液が、透過液回収出口及び透過液ポンプによって前記フィルターから回収され、透過液回収タンク内に貯蔵される、請求項２０に記載の改良された方法。
【請求項２３】
前記透過液回収タンクが、該タンク内の圧力を解放するための通気口を更に有する、請求項２２に記載の改良された方法。
【請求項２４】
前記循環ポンプ及び前記透過液ポンプがペリスタルティックポンプである、請求項２１又は２２のいずれか一項に記載の改良された方法。
【請求項２５】
前記フィルターが精密濾過フィルターである、請求項２１に記載の改良された方法。
【請求項２６】
前記フィルターが限外濾過フィルターである、請求項２１に記載の改良された方法。
【請求項２７】
前記精密濾過フィルターがタンジェンシャルフローフィルターである、請求項２５に記載の改良された方法。
【請求項２８】
前記タンジェンシャルフローフィルターが、約０．００５μｍ〜約１００μｍのフィルター孔径を有する、請求項２７に記載の改良された方法。
【請求項２９】
前記限外濾過フィルターがタンジェンシャルフローフィルターである、請求項２６に記載の改良された方法。
【請求項３０】
前記タンジェンシャルフローフィルターが、約１００，０００よりも大きい公称分画分子量（ＮＭＷＣ）を有する、請求項２８に記載の改良された方法。
【請求項３１】
（ｉ）前記フィルターの入口圧力（Ｐ入口）を入口圧力ゲージによって監視する工程と、（ｉｉ）前記フィルターの出口圧力（Ｐ出口）を出口圧力ゲージによって監視する工程と、（ｉｉｉ）前記透過液回収出口内の圧力（Ｐ透過液）を透過液圧力ゲージによって監視する工程と、（ｉｖ）前記フィルターの膜間圧力（ＴＭＰ）を測定する工程と、を更に含む、請求項２７又は２９のいずれかに記載の改良された方法。
【請求項３２】
前記フィルターの正のＴＭＰを維持する工程を更に含む、請求項３１に記載の改良された方法。
【請求項３３】
前記発酵装置が、イソプレン貯蔵タンクに接続されたイソプレン回収出口を更に有する、請求項３１に記載の改良された方法。
【請求項３４】
前記細胞が、約５０ｇ／Ｌよりも高い力価でイソプレンを生成する、請求項３１に記載の改良された方法。
【請求項３５】
前記細胞が、イソプレン約１，０００ｍｇ／Ｌブロス／時間よりも高い平均の体積生産性を有する、請求項３１に記載の改良された方法。
【請求項３６】
前記回収された透過液を滅菌する工程と、同じ発酵装置又は別の発酵装置中に前記透過液を再循環させる工程と、を更に含み、再循環された透過液の存在下で培養された細胞が、再循環された透過液の非存在下で培養された同じ細胞よりも高い平均のイソプレンの比生産性を有する、請求項３１に記載の改良された方法。
【請求項３７】
前記細胞が、再循環された透過液の非存在下で培養された同じ細胞よりも約２倍高い平均のイソプレンの比生産性を有する、請求項３６に記載の改良された方法。
【請求項３８】
前記細胞の生産性が約１０％高くなっている、請求項３６に記載の改良された方法。
【請求項３９】
前記培養の一部が連続的に取り出される、請求項２０に記載の改良された方法。
【請求項４０】
前記培養の一部が非連続的に取り出される、請求項２０に記載の改良された方法。
【請求項４１】
前記イソプレンシンターゼポリペプチドが、植物のイソプレンシンターゼポリペプチドである、請求項２０に記載の改良された方法。
【請求項４２】
前記細胞が、ＩＤＩポリペプチドをコードした核酸を更に有する、請求項２０又は４１に記載の改良された方法。
【請求項４３】
前記細胞が、ＤＸＳポリペプチドをコードした核酸を更に有する、請求項４２に記載の改良された方法。
【請求項４４】
前記細胞が、ＭＶＡ経路ポリペプチドをコードした核酸を更に有する、請求項４１に記載の改良された方法。
【請求項４５】
前記細胞が細菌細胞である、請求項４１に記載の改良された方法。
【請求項４６】
前記細胞がグラム陽性細菌細胞またはグラム陰性細菌細胞である、請求項４５に記載の改良された方法。
【請求項４７】
前記細胞がバシラス・サブティリス細胞、大腸菌、又はパントエア・シトレア細胞であるである、請求項４６に記載の改良された方法。
【請求項４８】
前記細胞が真菌細胞である、請求項４１に記載の改良された方法。
【請求項４９】
前記細胞がトリコデルマ・リーゼイ細胞である、請求項４８に記載の改良された方法。
【請求項５０】
前記細胞が酵母細胞である、請求項４８に記載の改良された方法。
【請求項５１】
前記細胞がサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）またはヤロウィア・リポリティカ細胞である、請求項５０に記載の改良された方法。
【請求項５２】
イソプレンを回収する工程を更に含む、請求項１又は２０に記載の改良された方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は、２００９年１２月２２日出願の米国特許仮出願第６１／２８９，３５２号に基づく優先権を主張するものであり、その開示内容を参照によりその全容にわたって本明細書に援用するものである。
【０００２】
（発明の分野）
本開示は、イソプレンを生成するための改良された方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
イソプレン（２−メチル−１，３−ブタジエン）は、広範な用途で使用されている重要な有機化合物である。例えば、イソプレンは、多くの化学組成物及びポリマーの合成における中間体又は開始物質として用いられている。イソプレンは、また、多くの植物及びヒトなどの動物によって自然に合成される重要な生物学的物質でもある。
【０００４】
産業用途で使用されているイソプレンは通常、石油又はナフサの熱分解の副生成物として生成するものか、あるいは石油化学製品のストリームから抽出されたものである。これは比較的コストのかかるエネルギー集約的なプロセスである。石油化学系製品の世界的な需要が常に高まりつつある中、イソプレンのコストは、長期的には大幅に上昇することが予想され、いずれにしてもその安定供給は制限されている。将来的な石油化学系の供給源からのイソプレンの供給は、予測されるニーズを満たすには充分なものとはいえず、かつてないほどの価格上昇が懸念されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、低コストかつ再生可能な、環境に優しい資源からイソプレンの供給源を得ることが求められている。
【０００６】
再生可能な資源からのイソプレンの生成に関して最近になって幾つかの進歩がなされている（例えば、国際特許出願公開第ＷＯ  ２００９／０７６６７６  Ａ２号を参照）。これらの方法は、安定的な商業用プロセスに対する要求を満たすうえで充分といえる速度、力価、及び純度でイソプレンを製造するものであるが、生物学的供給源からのイソプレンの生成にともなう運用コストを低減し、イソプレンの収率を高めるようなプロセスの改良が求められている。
【０００７】
本明細書において引用するすべての特許、特許出願、刊行物、文書、ヌクレオチド及びタンパク質配列のデータベースのアクセッション番号、それらが示す配列、並びに論文は、いずれも参照によりそれらの全容を本明細書に援用するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本明細書では、膜バイオリアクターを、バイオリアクター培養イソプレン生成細胞と組み合わせて操作する、生物学的材料からイソプレンを生成するための改良された方法を開示する。
【０００９】
一態様において、本明細書は、イソプレンを生成するための改良された方法であって、（ａ）イソプレンシンターゼポリペプチドをコードした異種核酸を有する細胞を、イソプレンの生成に適した培養条件下で培養する工程であって、細胞が、（ｉ）４０ｇ／Ｌよりも高い力価でイソプレンを生成するか、又は、（ｉｉ）イソプレン約５００ｍｇ／Ｌブロス／時間よりも高い平均のイソプレンの体積生産性を有するものである、工程と、（ｂ）培養の一部を取り出す工程と、（ｃ）培養の取り出した一部を濾過して透過液と保持成分とを生成する工程と、（ｄ）保持成分を培養に戻す工程と、（ｅ）イソプレンを生成する工程と、を含み、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）工程を行った培養細胞が、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）工程を行わずに培養した同じ細胞よりも（ｉ）より高い力価でイソプレンを生成するか、又は（ｉｉ）より高い平均のイソプレンの体積生産性を有する、方法を提供する。
【００１０】
別の態様では、本明細書は、イソプレンを生成するための改良された方法であって、（ａ）イソプレンシンターゼポリペプチドをコードした異種核酸を有する細胞を、イソプレンの生成に適した培養条件下で培養する工程であって、細胞が、（ｉ）４０ｇ／Ｌよりも高い力価でイソプレンを生成するか、又は、（ｉｉ）イソプレン約５００ｍｇ／Ｌブロス／時間よりも高い平均のイソプレンの体積生産性を有するものである、工程と、（ｂ）培養の一部を取り出す工程と、（ｃ）培養の取り出した一部を濾過して透過液と保持成分とを生成する工程と、（ｄ）保持成分を培養に戻す工程と、（ｅ）イソプレンを生成する工程と、（ｆ）イソプレンを回収する工程と、を含み、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）工程を行った培養細胞が、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）工程を行わずに培養した同じ細胞よりも（ｉ）より高い力価でイソプレンを生成するか、又は（ｉｉ）より高い平均のイソプレンの体積生産性を有する、方法を提供する。特定の態様では、濾過工程は、タンジェンシャルフロー濾過による。
【００１１】
特定の態様では、細胞は、約４０ｇ／Ｌよりも高い力価でイソプレンを生成する。特定の態様では、細胞は、約５０ｇ／Ｌよりも高い力価でイソプレンを生成する。特定の態様では、細胞は、約６０ｇ／Ｌよりも高い力価でイソプレンを生成する。特定の態様では、細胞は、約７０ｇ／Ｌよりも高い力価でイソプレンを生成する。特定の態様では、細胞は、約８０ｇ／Ｌよりも高い力価でイソプレンを生成する。特定の態様では、細胞は、約９０ｇ／Ｌよりも高い力価でイソプレンを生成する。特定の態様では、細胞は、約１００ｇ／Ｌよりも高い力価でイソプレンを生成する。特定の態様では、細胞は、約１１０ｇ／Ｌよりも高い力価でイソプレンを生成する。特定の態様では、細胞は、約１２０ｇ／Ｌよりも高い力価でイソプレンを生成する。特定の態様では、細胞は、約１３０ｇ／Ｌよりも高い力価でイソプレンを生成する。特定の態様では、細胞は、約１４０ｇ／Ｌよりも高い力価でイソプレンを生成する。特定の態様では、細胞は、約１５０ｇ／Ｌよりも高い力価でイソプレンを生成する。特定の態様では、細胞は、約１６０ｇ／Ｌよりも高い力価でイソプレンを生成する。特定の態様では、細胞は、約１７０ｇ／Ｌよりも高い力価でイソプレンを生成する。特定の態様では、細胞は、約１８０ｇ／Ｌよりも高い力価でイソプレンを生成する。特定の態様では、細胞は、約１９０ｇ／Ｌよりも高い力価でイソプレンを生成する。特定の態様では、細胞は、約２００ｇ／Ｌよりも高い力価でイソプレンを生成する。特定の態様では、細胞は、約４０ｇ／Ｌ〜約１００ｇ／Ｌの力価でイソプレンを生成する。特定の態様では、細胞は、約６０ｇ／Ｌ〜約１００ｇ／Ｌの力価でイソプレンを生成する。特定の態様では、細胞は、約６０ｇ／Ｌ〜約１２０ｇ／Ｌの力価でイソプレンを生成する。特定の態様では、細胞は、約４０ｇ／Ｌ〜約１５０ｇ／Ｌの力価でイソプレンを生成する。特定の態様では、細胞は、約４０ｇ／Ｌ〜約２００ｇ／Ｌの力価でイソプレンを生成する。特定の態様では、細胞は、約８０ｇ／Ｌ〜約１５０ｇ／Ｌの力価でイソプレンを生成する。特定の態様では、細胞は、約１００ｇ／Ｌ〜約１５０ｇ／Ｌの力価でイソプレンを生成する。特定の態様では、細胞は、約１００ｇ／Ｌ〜約１８０ｇ／Ｌの力価でイソプレンを生成する。特定の態様では、細胞は、約１００ｇ／Ｌ〜約２００ｇ／Ｌの力価でイソプレンを生成する。特定の態様では、細胞は、約１２０ｇ／Ｌ〜約２００ｇ／Ｌの力価でイソプレンを生成する。特定の態様では、細胞は、イソプレン約５００ｍｇ／Ｌブロス／時間よりも高い平均の体積生産性を有する。特定の態様では、細胞は、イソプレン約１，０００ｍｇ／Ｌブロス／時間よりも高い平均の体積生産性を有する。特定の態様では、細胞は、イソプレン約１，５００ｍｇ／Ｌブロス／時間よりも高い平均の体積生産性を有する。特定の態様では、細胞は、イソプレン約２，０００ｍｇ／Ｌブロス／時間よりも高い平均の体積生産性を有する。特定の態様では、細胞は、イソプレン約５００ｍｇ／Ｌブロス／時間〜約２，０００ｍｇ／Ｌブロス／時間の平均の体積生産性を有する。
【００１２】
特定の態様では、方法は、同じ細胞培養又は別の細胞培養中に透過液を再循環させる工程を更に含み、再循環された透過液の存在下で培養された細胞は、再循環された透過液の非存在下で培養された同じ細胞よりも高い平均のイソプレンの比生産性を有する。特定の態様では、細胞は、再循環された透過液の非存在下で培養された同じ細胞よりも約２倍高い平均のイソプレンの比生産性を有する。特定の態様では、細胞は、再循環された透過液の非存在下で培養された同じ細胞よりも約３倍高い平均のイソプレンの比生産性を有する。特定の態様では、培養の一部は連続的に取り出される。特定の態様では、培養の一部は非連続的に取り出される。
【００１３】
特定の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、植物のイソプレンシンターゼポリペプチドである。特定の態様では、細胞は、ＩＤＩポリペプチドをコードした異種核酸を更に有する。特定の態様では、細胞は、ＩＤＩポリペプチドをコードした内因性核酸の染色体コピーを更に有する。特定の態様では、細胞は、ＤＸＰ経路ポリペプチドをコードした異種核酸を更に有する。特定の態様では、細胞は、ＤＸＳポリペプチドをコードした異種核酸を更に有する。特定の態様では、細胞は、ＤＸＳポリペプチドをコードした内因性核酸の染色体コピーを更に有する。特定の態様では、細胞は、ＩＤＩポリペプチド、及びＤＸＳポリペプチド又はＤＸＰ経路ポリペプチドをコードした１つ以上の核酸を更に有する。特定の態様では、１つの核酸が、イソプレンシンターゼポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド、及びＤＸＳポリペプチド又はＤＸＰ経路ポリペプチドをコードする。特定の態様では、１つのプラスミドが、イソプレンシンターゼポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド、及びＤＸＳポリペプチドをコードする。特定の態様では、細胞は、ＭＶＡ経路ポリペプチドをコードした異種核酸を更に有する。特定の態様では、ＭＶＡ経路ポリペプチドはメバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）ポリペプチドである。特定の態様では、ＭＶＫポリペプチドは、メタノサルシナ（Methanosarcina）属に由来するポリペプチドである。特定の態様では、メタノサルシナは、メタノサルシナ・マゼイ（Methanosarcina mazei）である。
【００１４】
特定の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、プエラリア（Pueraria）属に由来する天然ポリペプチドである。特定の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、プエラリア・モンタナ（Pueraria montana）に由来する天然ポリペプチドである。特定の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、ヤマナラシ（Populus）属に由来する天然ポリペプチドである。特定の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、ギンドロ（Populus alba）に由来する天然ポリペプチドである。特定の態様では、細胞は、ＭＶＡ経路ポリペプチドをコードした異種核酸を更に有する。特定の態様では、ＭＶＡ経路ポリペプチドはメバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）である。特定の態様では、ＭＶＫは、メタノサルシナ属に由来するものである。特定の態様では、ＭＶＫは、メタノサルシナ・マゼイに由来するものである。特定の態様では、細胞は細菌細胞である。特定の態様では、細胞はグラム陽性細菌細胞である。特定の態様では、細胞はバシラス（Bacillus）細胞である。特定の態様では、細胞はバシラス・サブティリス（Bacillus subtilis）細胞である。特定の態様では、細胞はグラム陰性細菌細胞である。特定の態様では、細胞はエシェリキア（Escherichia）又はパントエア（Pantoea）細胞である。特定の態様では、細胞は大腸菌（Escherichia coli）又はパントエア・シトレア（Pantoea citrea）細胞である。特定の態様では、細胞は真菌細胞である。特定の態様では、細胞はトリコデルマ（Trichoderma）細胞である。特定の態様では、細胞はトリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）細胞である。特定の態様では、細胞は酵母細胞である。特定の態様では、細胞はヤロウィア（Yarrowia）細胞である。特定の態様では、細胞はヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）細胞である。
【００１５】
特定の態様では、細胞は、（ｉ）グルコースイソメラーゼプロモーター、並びに、メバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）をコードした核酸、ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）をコードした核酸、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＭＶＤ）をコードした核酸、及びイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＤＩ）をコードした核酸を含む、Ｓ．セレビシアエ（S．cerevisiae）に由来する下流ＭＶＡ経路をコードした統合された核酸と、（ｉｉ）ギンドロ（P．alba）イソプレンシンターゼをコードした核酸と、（ｉｉｉ）Ｍ．マゼイ（M．mazei）メバロン酸キナーゼをコードした核酸と、（ｉｖ）アセトアセチルＣｏＡシンターゼ（チオラーゼ）ポリペプチドをコードした核酸、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼポリペプチドをコードした核酸、及び３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼポリペプチドをコードした核酸を含む、エンテロコッカス・フィカリス（Enterococcus faecalis）に由来する上流ＭＶＡ経路をコードした核酸と、を有する。
【００１６】
別の態様では、本明細書は、イソプレンを生成するための改良された方法であって、（ａ）イソプレンシンターゼポリペプチドをコードした異種核酸を有する細胞を、増殖培地が入った発酵装置中で、イソプレンの生成に適した培養条件下で培養する工程であって、細胞が、（ｉ）４０ｇ／Ｌよりも高い力価でイソプレンを生成するか、又は、（ｉｉ）イソプレン約５００ｍｇ／Ｌブロス／時間よりも高い平均のイソプレンの体積生産性を有するものである、工程と、（ｂ）発酵装置から細胞培養の一部を取り出す工程と、（ｃ）細胞培養の取り出した一部をフィルターに移す工程と、（ｄ）細胞培養の取り出した一部を濾過して、（ｉ）使用済み増殖培地を含む透過液と、（ｉｉ）細胞及び他の培養固形分を含む保持成分と、を生成する工程と、（ｅ）保持成分を発酵装置に戻す工程と、（ｆ）透過液を回収する工程と、（ｇ）イソプレンを生成する工程と、を含み、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）工程を行った培養細胞が、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）工程を行わずに培養した同じ細胞よりも（ｉ）より高い力価でイソプレンを生成するか、又は（ｉｉ）より高い平均のイソプレンの体積生産性を有する、方法を提供する。
【００１７】
別の態様では、本明細書は、イソプレンを生成するための改良された方法であって、（ａ）イソプレンシンターゼポリペプチドをコードした異種核酸を有する細胞を、増殖培地が入った発酵装置中で、イソプレンの生成に適した培養条件下で培養する工程であって、細胞が、（ｉ）４０ｇ／Ｌよりも高い力価でイソプレンを生成するか、又は、（ｉｉ）イソプレン約５００ｍｇ／Ｌブロス／時間よりも高い平均のイソプレンの体積生産性を有するものである、工程と、（ｂ）発酵装置から細胞培養の一部を取り出す工程と、（ｃ）細胞培養の取り出した一部をフィルターに移す工程と、（ｄ）細胞培養の取り出した一部を濾過して、（ｉ）使用済み増殖培地を含む透過液と、（ｉｉ）細胞及び他の培養固形分を含む保持成分と、を生成する工程と、（ｅ）保持成分を発酵装置に戻す工程と、（ｆ）透過液を回収する工程と、（ｇ）イソプレンを生成する工程と、（ｈ）イソプレンを回収する工程と、を含み、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）工程を行った培養細胞が、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）工程を行わずに培養した同じ細胞よりも（ｉ）より高い力価でイソプレンを生成するか、又は（ｉｉ）より高い平均のイソプレンの体積生産性を有する、方法を提供する。
【００１８】
特定の態様では、発酵装置とフィルターとは、循環ループ及び循環ポンプによって接続される。特定の態様では、透過液は透過液回収出口及び透過液ポンプによりフィルターから回収され、透過液回収タンク内に貯蔵される。特定の態様では、透過液回収タンクはタンク内の圧力を解放するための通気口を更に有する。特定の態様では、循環ポンプ及び透過液ポンプはペリスタルティックポンプである。特定の態様では、フィルターは精密濾過フィルターである。特定の態様では、フィルターは限外濾過フィルターである。特定の態様では、精密濾過フィルターは、タンジェンシャルフローフィルターである。特定の態様では、タンジェンシャルフローフィルターは、約０．００５μｍ〜約１００μｍのフィルター孔径を有する。特定の態様では、タンジェンシャルフローフィルターは、約０．０５μｍ〜約１０μｍのフィルター孔径を有する。特定の態様では、限外濾過フィルターは、タンジェンシャルフローフィルターである。特定の態様では、タンジェンシャルフローフィルターは、約１００，０００よりも大きい公称分画分子量（ＮＭＷＣ）を有する。特定の態様では、タンジェンシャルフローフィルターは、約２５０，０００よりも大きいＮＭＷＣを有する。特定の態様では、タンジェンシャルフローフィルターは、５００，０００の公称分画分子量（ＮＭＷＣ）を有し、中空繊維膜を有するＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｘａｍｐｌｅｒ（商標）Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅである。
【００１９】
特定の態様では、方法は、（ｉ）フィルターの入口圧力（Ｐ入口）を入口圧力ゲージによって監視する工程と、（ｉｉ）フィルターの出口圧力（Ｐ出口）を出口圧力ゲージによって監視する工程と、（ｉｉｉ）透過液回収出口内の圧力（Ｐ透過液）を透過液圧力ゲージによって監視する工程と、（ｉｖ）フィルターの膜間圧力（ＴＭＰ）を測定する工程と、を更に含む。特定の態様では、方法は、フィルターの正のＴＭＰを維持する工程を更に含む。特定の態様では、発酵装置は、イソプレン貯蔵タンクに接続されたイソプレン回収出口を更に有する。
【００２０】
特定の態様では、細胞は、約４０ｇ／Ｌよりも高い力価でイソプレンを生成する。特定の態様では、細胞は、約５０ｇ／Ｌよりも高い力価でイソプレンを生成する。特定の態様では、細胞は、約６０ｇ／Ｌよりも高い力価でイソプレンを生成する。特定の態様では、細胞は、約７０ｇ／Ｌよりも高い力価でイソプレンを生成する。特定の態様では、細胞は、約８０ｇ／Ｌよりも高い力価でイソプレンを生成する。特定の態様では、細胞は、約９０ｇ／Ｌよりも高い力価でイソプレンを生成する。特定の態様では、細胞は、約１００ｇ／Ｌよりも高い力価でイソプレンを生成する。特定の態様では、細胞は、約１１０ｇ／Ｌよりも高い力価でイソプレンを生成する。特定の態様では、細胞は、約１２０ｇ／Ｌよりも高い力価でイソプレンを生成する。特定の態様では、細胞は、約１３０ｇ／Ｌよりも高い力価でイソプレンを生成する。特定の態様では、細胞は、約１４０ｇ／Ｌよりも高い力価でイソプレンを生成する。特定の態様では、細胞は、約１５０ｇ／Ｌよりも高い力価でイソプレンを生成する。特定の態様では、細胞は、約１６０ｇ／Ｌよりも高い力価でイソプレンを生成する。特定の態様では、細胞は、約１７０ｇ／Ｌよりも高い力価でイソプレンを生成する。特定の態様では、細胞は、約１８０ｇ／Ｌよりも高い力価でイソプレンを生成する。特定の態様では、細胞は、約１９０ｇ／Ｌよりも高い力価でイソプレンを生成する。特定の態様では、細胞は、約２００ｇ／Ｌよりも高い力価でイソプレンを生成する。特定の態様では、細胞は、約４０ｇ／Ｌ〜約１００ｇ／Ｌの力価でイソプレンを生成する。特定の態様では、細胞は、約６０ｇ／Ｌ〜約１００ｇ／Ｌの力価でイソプレンを生成する。特定の態様では、細胞は、約６０ｇ／Ｌ〜約１２０ｇ／Ｌの力価でイソプレンを生成する。特定の態様では、細胞は、約４０ｇ／Ｌ〜約１５０ｇ／Ｌの力価でイソプレンを生成する。特定の態様では、細胞は、約４０ｇ／Ｌ〜約２００ｇ／Ｌの力価でイソプレンを生成する。特定の態様では、細胞は、約８０ｇ／Ｌ〜約１５０ｇ／Ｌの力価でイソプレンを生成する。特定の態様では、細胞は、約１００ｇ／Ｌ〜約１５０ｇ／Ｌの力価でイソプレンを生成する。特定の態様では、細胞は、約１００ｇ／Ｌ〜約１８０ｇ／Ｌの力価でイソプレンを生成する。特定の態様では、細胞は、約１００ｇ／Ｌ〜約２００ｇ／Ｌの力価でイソプレンを生成する。特定の態様では、細胞は、約１２０ｇ／Ｌ〜約２００ｇ／Ｌの力価でイソプレンを生成する。特定の態様では、細胞は、イソプレン約５００ｍｇ／Ｌブロス／時間よりも高い平均の体積生産性を有する。特定の態様では、細胞は、イソプレン約１，０００ｍｇ／Ｌブロス／時間よりも高い平均の体積生産性を有する。特定の態様では、細胞は、イソプレン約１，５００ｍｇ／Ｌブロス／時間よりも高い平均の体積生産性を有する。特定の態様では、細胞は、イソプレン約２，０００ｍｇ／Ｌブロス／時間よりも高い平均の体積生産性を有する。特定の態様では、細胞は、イソプレン約５００ｍｇ／Ｌブロス／時間〜約２，０００ｍｇ／Ｌブロス／時間の平均の体積生産性を有する。
【００２１】
特定の態様では、方法は、回収された透過液を滅菌する工程と、同じ発酵装置又は別の発酵装置中に透過液を再循環させる工程と、を更に含み、再循環された透過液の存在下で培養された細胞は、再循環された透過液の非存在下で培養された同じ細胞よりも高い平均のイソプレンの比生産性を有する。特定の態様では、細胞は、再循環された透過液の非存在下で培養された同じ細胞よりも約２倍高い平均のイソプレンの比生産性を有する。特定の態様では、細胞は、再循環された透過液の非存在下で培養された同じ細胞よりも約３倍高い平均のイソプレンの比生産性を有する。特定の態様では、培養の一部は連続的に取り出される。特定の態様では、培養の一部は非連続的に取り出される。
【００２２】
特定の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、植物のイソプレンシンターゼポリペプチドである。特定の態様では、細胞は、ＩＤＩポリペプチドをコードした異種核酸を更に有する。特定の態様では、細胞は、ＩＤＩポリペプチドをコードした内因性核酸の染色体コピーを更に有する。特定の態様では、細胞は、ＤＸＳポリペプチドをコードした異種核酸を更に有する。特定の態様では、細胞は、ＤＸＳポリペプチドをコードした内因性核酸の染色体コピーを更に有する。特定の態様では、細胞は、ＩＤＩポリペプチド及びＤＸＳポリペプチドをコードした１つ以上の核酸を更に有する。特定の態様では、１つの核酸が、イソプレンシンターゼポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド、及びＤＸＳポリペプチドをコードする。特定の態様では、１つのプラスミドが、イソプレンシンターゼポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド、及びＤＸＳポリペプチドをコードする。特定の態様では、細胞は、ＭＶＡ経路ポリペプチドをコードした異種核酸を更に有する。特定の態様では、ＭＶＡ経路ポリペプチドはメバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）ポリペプチドである。特定の態様では、ＭＶＫポリペプチドは、メタノサルシナ属に由来するものである。特定の態様では、ＭＶＫは、メタノサルシナ・マゼイに由来するものである。特定の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、プエラリア属に由来する天然ポリペプチドである。特定の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、プエラリア・モンタナに由来する天然ポリペプチドである。特定の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、ヤマナラシ属に由来する天然ポリペプチドである。特定の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、ギンドロに由来する天然ポリペプチドである。特定の態様では、細胞は、ＭＶＡ経路ポリペプチドをコードした異種核酸を更に有する。特定の態様では、ＭＶＡ経路ポリペプチドはメバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）ポリペプチドである。特定の態様では、ＭＶＫポリペプチドは、メタノサルシナ属に由来するものである。特定の態様では、ＭＶＫポリペプチドは、メタノサルシナ・マゼイに由来するものである。特定の態様では、細胞は細菌細胞である。
【００２３】
特定の態様では、細胞はグラム陽性細菌細胞である。特定の態様では、細胞はバシラス細胞である。特定の態様では、細胞はバシラス・サブティリス細胞である。特定の態様では、細胞はグラム陰性細菌細胞である。特定の態様では、細胞はエシェリキア又はパントエア細胞である。特定の態様では、細胞は大腸菌又はパントエア・シトレア細胞である。特定の態様では、細胞は真菌細胞である。特定の態様では、細胞はトリコデルマ細胞である。特定の態様では、細胞はトリコデルマ・リーゼイ細胞である。特定の態様では、細胞は酵母細胞である。特定の態様では、細胞はヤロウィア細胞である。特定の態様では、細胞はヤロウィア・リポリティカ細胞である。
【００２４】
特定の態様では、細胞は、（ｉ）グルコースイソメラーゼプロモーター、並びに、メバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）をコードした核酸、ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）をコードした核酸、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＭＶＤ）をコードした核酸、及びイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＤＩ）をコードした核酸を含む、Ｓ．セレビシアエに由来する下流ＭＶＡ経路をコードした統合された核酸と、（ｉｉ）ギンドロイソプレンシンターゼをコードした核酸と、（ｉｉｉ）Ｍ．マゼイメバロン酸キナーゼをコードした核酸と、（ｉｖ）アセトアセチルＣｏＡシンターゼ（チオラーゼ）ポリペプチドをコードした核酸、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼポリペプチドをコードした核酸、及び３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼポリペプチドをコードした核酸を含む、エンテロコッカス・フィカリスに由来する上流ＭＶＡ経路をコードした核酸と、を有する。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１Ａ】イソプレンのＭＶＡ及びＤＸＰ代謝経路を示す図（Ｆ．Ｂｏｕｖｉｅｒら、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．４４：３５７〜４２９，２００５に基づく）。以下の説明には、当該経路の各ポリペプチドの代替名、及び示されるポリペプチドの活性を測定するためのアッセイを開示した参考文献が含まれる（これらの参考文献をいずれも参照によりその全容にわたって本明細書に援用する）。メバロン酸経路：ＡＡＣＴ；Ａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ，ＭｖａＥ，ＥＣ  ２．３．１．９．アッセイ：Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４：２１１６〜２１２２，２００２；ＨＭＧＳ；ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼ，ＭｖａＳ，ＥＣ  ２．３．３．１０．アッセイ：Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４：４０６５〜４０７０，２００２；ＨＭＧＲ；３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ，ＭｖａＥ，ＥＣ１．１．１．３４．アッセイ：Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４：２１１６〜２１２２，２００２；ＭＶＫ；メバロン酸キナーゼ，ＥＲＧ１２，ＥＣ  ２．７．１．３６．アッセイ：Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅｔ  １９：９〜１４，１９９１．ＰＭＫ；ホスホメバロン酸キナーゼ，ＥＲＧ８，ＥＣ  ２．７．４．２，アッセイ：Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１：６２０〜６３１，１９９１；ＤＰＭＤＣ；ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ，ＭＶＤ１，ＥＣ  ４．１．１．３３．アッセイ：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：１３３５５〜１３３６２，１９９４；ＩＤＩ；イソペンテニル−二リン酸Δ−イソメラーゼ，ＩＤＩ１，ＥＣ  ５．３．３．２．アッセイ：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１９１６９〜１９１７５，１９８９．ＤＸＰ経路：ＤＸＳ；１−デオキシキシルロース５−リン酸シンターゼ，ｄｘｓ，ＥＣ  ２．２．１．７．アッセイ：ＰＮＡＳ  ９４：１２８５７〜６２，１９９７；ＤＸＲ；１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸レダクトイソメラーゼ，ｄｘｒ，ＥＣ  ２．２．１．７．アッセイ：Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６９：４４４６〜４４５７，２００２；ＭＣＴ；４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールシンターゼ，ＩｓｐＤ，ＥＣ  ２．７．７．６０．アッセイ：ＰＮＡＳ  ９７：６４５１〜６４５６，２０００；ＣＭＫ；４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールキナーゼ，ＩｓｐＥ，ＥＣ  ２．７．１．１４８．アッセイ：ＰＮＡＳ  ９７：１０６２〜１０６７，２０００；ＭＣＳ；２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール−２，４−シクロ二リン酸シンターゼ，ＩｓｐＦ，ＥＣ４．６．１．１２．アッセイ：ＰＮＡＳ  ９６：１１７５８〜１１７６３，１９９９；ＨＤＳ；１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル４−二リン酸シンターゼ，ｉｓｐＧ，ＥＣ  １．１７．４．３．アッセイ：Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．７０：９１６８〜９１７４，２００５；ＨＤＲ；１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル４−二リン酸レダクターゼ，ＩｓｐＨ，ＥＣ  １．１７．１．２．アッセイ：ＪＡＣＳ  １２６：１２８４７〜１２８５５，２００４。
【図１Ｂ】古典的及び改変ＭＶＡ経路を示す図。１．アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ（ＡＡＣＴ）；２．ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ（ＨＭＧＳ）；３．ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧＲ）；４．メバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）；５．ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）；６．ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＭＶＤ又はＤＰＭＤＣ）；７．イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＤＩ）；８．ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＰＭＤＣ）；９．イソペンテニルリン酸キナーゼ（ＩＰＫ）．古典的ＭＶＡ経路が、反応１〜反応７まで反応５及び６を経由して進行するのに対して、改変ＭＶＡ経路は、反応８及び９を経由する。構造式中のＰ及びＰＰはそれぞれリン酸及びピロリン酸である。本図は、Ｋｏｇａ及びＭｏｒｉｉ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ７１：９７〜１２０，２００７より転載したものであり、当該文献をその全容において、特に改変ＭＶＡ経路の核酸及びポリペプチドに関して、参照により本明細書に援用するものである。改変ＭＶＡ経路は、例えばメタノサルシナ・マゼイなどの一部の古細菌生物に存在する。
【図２】プラスミドｐＥＴ２４  Ｐ．ａｌｂａ  ＨＧＳのマップ。
【図３Ａ】プラスミドｐＥＴ２４  Ｐ．ａｌｂａ  ＨＧＳのヌクレオチド配列（配列番号１）。
【図３Ｂ】プラスミドｐＥＴ２４  Ｐ．ａｌｂａ  ＨＧＳのヌクレオチド配列（配列番号１）。
【図４】プラスミドＥＷＬ２３０、及びＢｓｐＨＩとＮｃｏＩ部位との間の適合する粘着末端を構築するためのエンドヌクレアーゼ消化に用いられる制限部位を示す概略図。
【図５】プラスミドＥＷＬ２３０のマップ。
【図６Ａ】プラスミドＥＷＬ２３０のヌクレオチド配列（配列番号２）。
【図６Ｂ】プラスミドＥＷＬ２３０のヌクレオチド配列（配列番号２）。
【図７】プラスミドＥＷＬ２４４、及びＮｓｉＩとＰｓｔＩ部位との間の適合する粘着末端を構築するためのエンドヌクレアーゼ消化に用いられる制限部位を示す概略図。
【図８】プラスミドＥＷＬ２４４のマップ。
【図９Ａ】プラスミドＥＷＬ２４４のヌクレオチド配列（配列番号３）。
【図９Ｂ】プラスミドＥＷＬ２４４のヌクレオチド配列（配列番号３）。
【図１０Ａ】Ｍ．マゼイ古細菌の下流経路オペロンのマップ。
【図１０Ｂ】Ｍ．マゼイ古細菌の下流経路オペロンのヌクレオチド配列（配列番号４）。
【図１０Ｃ】Ｍ．マゼイ古細菌の下流経路オペロンのヌクレオチド配列（配列番号４）。
【図１１Ａ】ｐＥＴ２００Ｄ内のＭ．マゼイ古細菌下流に由来するＭＣＭ３７６−ＭＶＫのマップ。
【図１１Ｂ】ｐＥＴ２００Ｄ内のＭ．マゼイ古細菌下流に由来するＭＣＭ３７６−ＭＶＫのヌクレオチド配列（配列番号５）。
【図１１Ｃ】ｐＥＴ２００Ｄ内のＭ．マゼイ古細菌下流に由来するＭＣＭ３７６−ＭＶＫのヌクレオチド配列（配列番号５）。
【図１２】プラスミドｐＢＢＲＣＭＰＧＩ１．５−ｐｇｌのマップ。
【図１３Ａ】プラスミドｐＢＢＲＣＭＰＧＩ１．５−ｐｇｌのヌクレオチド配列（配列番号６）。
【図１３Ｂ】プラスミドｐＢＢＲＣＭＰＧＩ１．５−ｐｇｌのヌクレオチド配列（配列番号６）。
【図１４Ａ】Ｍ．マゼイメバロン酸キナーゼ、ギンドロイソプレンシンターゼ、及びｐｇｌ（ＲＨＭ１１１６０８−２）を発現し、１５Ｌスケールで流加培養中で増殖させた大腸菌株によるイソプレン生成のグラフ。グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクター内の光学密度の経時的変化を示す。
【図１４Ｂ】Ｍ．マゼイメバロン酸キナーゼ、ギンドロイソプレンシンターゼ、及びｐｇｌ（ＲＨＭ１１１６０８−２）を発現し、１５Ｌスケールで流加培養中で増殖させた大腸菌株によるイソプレン生成のグラフ。グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクター内のイソプレン力価の経時的変化を示す。力価は、発酵ブロス１Ｌ当たり生成されるイソプレンの量として定義される。イソプレンの計算方法：５９時間で生成されたイソプレンの累積量（ｇ）／５９時間後の発酵装置体積Ｌ［＝］ｇ／Ｌブロス。
【図１４Ｃ】Ｍ．マゼイメバロン酸キナーゼ、ギンドロイソプレンシンターゼ、及びｐｇｌ（ＲＨＭ１１１６０８−２）を発現し、１５Ｌスケールで流加培養中で増殖させた大腸菌株によるイソプレン生成のグラフ。グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクター内のイソプレン力価の経時的変化を示す。イソプレンの計算方法：ｔ＝０〜５９時間まで∫（瞬間的なイソプレン生成速度ｇ／Ｌ／ｈｒ）ｄｔ［＝］ｇ／Ｌブロス。
【図１４Ｄ】Ｍ．マゼイメバロン酸キナーゼ、ギンドロイソプレンシンターゼ、及びｐｇｌ（ＲＨＭ１１１６０８−２）を発現し、１５Ｌスケールで流加培養中で増殖させた大腸菌株によるイソプレン生成のグラフ。グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクターから生成されるイソプレンの総量の経時的変化を示す。
【図１４Ｅ】Ｍ．マゼイメバロン酸キナーゼ、ギンドロイソプレンシンターゼ、及びｐｇｌ（ＲＨＭ１１１６０８−２）を発現し、１５Ｌスケールで流加培養中で増殖させた大腸菌株によるイソプレン生成のグラフ。グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクター内の体積生産性を示す。
【図１４Ｆ】Ｍ．マゼイメバロン酸キナーゼ、ギンドロイソプレンシンターゼ、及びｐｇｌ（ＲＨＭ１１１６０８−２）を発現し、１５Ｌスケールで流加培養中で増殖させた大腸菌株によるイソプレン生成のグラフ。グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクター内の二酸化炭素放出速度（ＣＥＲ）、すなわち代謝活性プロファイルを示す。
【図１５】Ａ〜Ｂは１５Ｌバイオリアクター内の発酵からのオフガスの分析結果を示すグラフ。試料Ａは、６４．８時間後に採取したＲＭ１１１６０８−２株である。試料Ｂは、３４．５時間後に採取したＥＷＬ２５６株、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）、ｐＣＬ  Ｕｐｐｅｒ、ＣｍＲ−ｇｉ１．２−ｙＫＫＤｙＩ、ｐＴｒｃＡｌｂａ−ｍＭＶＫである。両方の試料でベースラインを上回る水素が検出されている（０．９５×１０−８ｔｏｒｒ（１．２７μＰａ））。
【図１６Ａ】代表的なイソプレン回収ユニットを示す図。
【図１６Ｂ】代表的なイソプレン吸着／凝縮装置を示す図。
【図１７】イソプレン生成物のＧＣ／ＦＩＤクロマトグラムを示す図。材料を測定したところ純度９９．７％であった。
【図１８Ａ】アルミナ（Ｂ）又はシリカ（Ｃ）による処理の前（Ａ）及び後のイソプレン試料のＧＣ／ＦＩＤクロマトグラム。イソプレンのピークはこれらのクロマトグラムには示されていない。
【図１８Ｂ】アルミナ（Ｂ）又はシリカ（Ｃ）による処理の前（Ａ）及び後のイソプレン試料のＧＣ／ＦＩＤクロマトグラム。イソプレンのピークはこれらのクロマトグラムには示されていない。
【図１８Ｃ】アルミナ（Ｂ）又はシリカ（Ｃ）による処理の前（Ａ）及び後のイソプレン試料のＧＣ／ＦＩＤクロマトグラム。イソプレンのピークはこれらのクロマトグラムには示されていない。
【図１９Ａ】ＰＴｒｃプロモーターの制御下にあるギンドロイソプレンシンターゼの短縮型（ＭＥＡ変異体）及びＭ．マゼイＭＶＫをコードしたプラスミドｐＤＷ３４のマップ。
【図１９Ｂ】プラスミドｐＤＷ３４の完全なヌクレオチド配列を示す（配列番号７）。
【図１９Ｃ】プラスミドｐＤＷ３４の完全なヌクレオチド配列を示す（配列番号７）。
【図１９Ｄ】プラスミドｐＤＷ３４の完全なヌクレオチド配列を示す（配列番号７）。
【図２０】大腸菌Ｋ１２  ＭＧ１６５５株のｐｇｌの遺伝子座周辺の染色体の構成を示す図。大腸菌Ｋ１２  ＭＧ１６５５に対して、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）において欠失させられ、ＣＭＰ２１５及びＣＭＰ２５８株において修復されている領域が括弧内に示されている。ｙｂｇＳ遺伝子の予測されるＯＲＦを丸で囲んで示している。順方向の矢印（→）は、ｇａｌＭＦプライマー（配列番号８）のアニーリング部位を示す。逆方向の矢印（←）は、ｇａｌＭＲプライマー（配列番号９）のアニーリング部位を示す。
【図２１】イソプレンガスを製造し、使用済み培地を含む透過液を回収するための１５Ｌスケールの発酵に使用されるＭＢＲシステムの図。ブロス循環ループが発酵装置のブロスをタンジェンシャルフロー膜フィルターに供給する。膜としてのＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｘａｍｐｌｅｒ（商標）Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ（５００，０００ＮＭＷＣ、繊維内径１ｍｍ、長さ６０ｃｍ、面積８５０平方ｃｍの中空繊維膜）は、高細胞密度の大腸菌ブロスに適していることから選択した。膜を含むブロス循環ループの保持体積はおおよそ２５０ｍＬであった。ループ要素を含むが循環ポンプは除いた装置の部分を、使用前にオートクレーブで滅菌した。循環ポンプ及び透過液ポンプは、ペリスタルティックチューブポンプとした。圧力ゲージを使用して膜の入口圧力Ｐ入口を測定することにより、膜の許容圧力（おおよそ２ｂａｒ（２００ｋＰａ））を上回らないようにした。図において定義されるＴＭＰは、透過を引き起こす力のおおよその尺度である。透過液を回収するためには正のＴＭＰが必要とされる。
【図２２】１５Ｌスケールの運転中のＭＢＲの操作パラメータを示す図。Ｐ入口及びＴＭＰは、主として循環ポンプの速度を変化させることによって操作した。例えば、循環ポンプの速度を約２０％低下させることによって５０時間でＰ入口を約２０％低下させることができる。ＴＭＰは、透過の間、約０．２ｂａｒ（２０ｋＰａ）で安定であった。膜カートリッジ内の流動力学特性のため、透過液の速度が０である場合にもＴＭＰが０になることはなかった。透過液の速度は、透過液ポンプの速度を調節することによって制御した。この例では約８ｋｇの透過液が回収された。
【図２３】ＭＢＲ発酵及び非ＭＢＲコントロールについての、１５Ｌスケールの発酵におけるリアクターのブロスの光学密度（ＯＤ）のプロット。ＭＢＲの運転中のＯＤが１９５から３０５に上昇したのに対して、非ＭＢＲコントロールのＯＤは同じ時間の間に１９５から１７５に低下した。ＯＤは、ブロス試料の５５０ｎｍの吸光度によって測定した。ＯＤが高いほど、細胞、細胞片、及び他の浮遊固形分の濃度が高いことを示す。発酵方法については実施例４で述べる。
【図２４】ＭＢＲ発酵及び非ＭＢＲコントロールについての、１５Ｌスケールの運転におけるイソプレンの比生産性のプロット。ＭＢＲでは、非ＭＢＲコントロールの比生産性と比較して、細胞の比生産性は変化しなかった。比生産性は、細胞量を基準としたイソプレン生成の速度である。ＭＢＲの運転と非ＭＢＲコントロールの運転との間の類似性は、ＭＢＲの運転が細胞の生理学的特性を大きく変化させなかったことを示唆するものである。発酵方法については実施例４で述べる。比生産性は、実施例４の式によって計算した。
【図２５】ＭＢＲ発酵及び非ＭＢＲコントロールについての、１５Ｌスケールの運転におけるイソプレンガスの力価のプロット。ＭＢＲでは、非ＭＢＲコントロールと比較して力価は約１６％増大した。力価が高いほど、リアクターの単位体積当たりより多くのイソプレンが生成することを意味し、これにより製造コストの低減につながる。発酵方法については実施例４で述べる。
【図２６】ＭＢＲ発酵及び非ＭＢＲコントロールについての、１５Ｌスケールの運転におけるイソプレンガスの総生成量のプロット。ＭＢＲでは、非ＭＢＲコントロールと比較して、同じ発酵時間におけるイソプレンガスの総生成量は約１７％増大した。発酵方法については実施例４で述べる。総イソプレン生成量の計算に用いた式については実施例４で述べる。
【図２７】ＭＢＲ発酵及び非ＭＢＲコントロールについての、１５Ｌスケールの運転におけるイソプレンの体積生産性のプロット。ＭＢＲの運転時の体積生産性は、同じ時間の長さにおける非ＭＢＲコントロールの体積生産性と比較してより高かった。体積生産性が高いほど、体積を基準としたイソプレンの生成速度がより高いことを意味し、これにより製造コストの低減につながる。発酵方法については実施例４で述べる。体積生産性は、実施例４の式によって計算した。
【図２８】１５Ｌスケールの発酵装置の運転におけるバイオリアクターのブロス重量のプロット。リアクター重量を維持するため、ＭＢＲの運転では膜透過液が抜き取られるのに対して、非ＭＢＲコントロールの運転においては、全ブロス（抜き取り液）が取り出される。この例では、ＭＢＲの運転で約８ｋｇの透過液が、非ＭＢＲコントロールで約７ｋｇの抜き取り液が回収された。発酵方法については実施例４で述べる。
【図２９】使用済み培地を添加することによる、流加培養におけるイソプレンガスの比生産性の増大のプロット。３０重量％の使用済み培地（透明化されたブロス上清液）を培地に添加することにより、増殖率は約２５％低下したにもかかわらず、イソプレンの比生産性は３倍以上に増大した。比生産性がより高いほど、単位細胞量につき単位時間当たり、より多くのイソプレンが生成されることを意味する。この結果は、使用済み培地を含むＭＢＲ透過液を使用することにより、細胞の比生産性を高めることができることを示唆するものであり、これにより製造コストが低減される。この実験方法については実施例５で述べる。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
膜バイオリアクター（ＭＢＲ）は、本来なら廃棄される選択されたブロス成分の再利用を発酵と組み合わせることによってイソプレンガスの発酵による生成量を高めることができる。ＭＢＲは、クロスフローフィルター又はタンジェンシャルフローフィルターなどの膜フィルターとともに使用される、イソプレン生成細胞を培養する液体発酵バイオリアクターを備えている。ＭＢＲは、発酵ブロスを濾過して非透過成分（フィルターの「保持成分」）をリアクターに戻すことにより、細胞の比生産性は維持しながら、細胞、細胞片、及び他のブロス固形分のリアクター濃度を効果的に高める。これにより、イソプレンの力価、総生成量、及び体積生成効率が大幅に高められ、資本コスト及び運営コストの低減につながる。
【００２７】
濾液（「透過液」）はリアクターには戻されず、ブロスの抜き取り液を回収する場合と同様に、リアクター体積が効果的に低減される。しかしながら、ブロスの抜き取りと異なり、回収される透過液は、通常の容器中での保存後に濾過によって容易に滅菌することが可能な透明な液体である。したがって、透過液は、栄養分及び／又は水の再利用源として容易に再使用することが可能であり、運営コストが更に低減される。可溶性の「使用済み培地」を含む透過液を同じか又は別の発酵に加えることによってイソプレン生成を促進することができる。
【００２８】
ＭＢＲは、他の文献に述べられる（例えば国際特許出願公開第ＷＯ  ２００９／０７６６７６号、米国特許出願第１２／３３５，０７１号（米国特許出願公開第２００９／０２０３１０２号）、国際特許出願公開第ＷＯ  ２０１０／００３００７号、米国特許出願公開第２０１０／００４８９６４号、国際特許出願公開第ＷＯ  ２００９／１３２２２０号、及び米国特許出願公開第２０１０／０００３７１６号を参照）、再生可能な資源からイソプレンを生成する方法の、潜在的に拡張性を有する、有利な態様の１つである。ＭＢＲを使用しない場合に可能なイソプレン力価と比較して大幅に高いイソプレン力価を与え、体積生産性を高めることに加え、ＭＢＲは、栄養分及び水の供給源として使用可能な透明な透過液を生成することにより、原材料の消費を低減し、プロセスの持続性を改善するものである。
【００２９】
したがって、一態様において、本明細書は、イソプレンを生成するための改良された方法であって、（ａ）イソプレンシンターゼポリペプチドをコードした異種核酸を有する細胞を、イソプレンの生成に適した培養条件下で培養する工程であって、細胞が、（ｉ）４０ｇ／Ｌよりも高い力価でイソプレンを生成するか、又は、（ｉｉ）イソプレン約５００ｍｇ／Ｌブロス／時間よりも高い平均のイソプレンの体積生産性を有するものである、工程と、（ｂ）培養の一部を取り出す工程と、（ｃ）培養の取り出した一部を濾過して透過液と保持成分とを生成する工程と、（ｄ）保持成分を培養に戻す工程と、（ｅ）イソプレンを生成する工程と、場合に応じて（ｆ）イソプレンを回収する工程と、を含み、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）工程を行った培養細胞が、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）工程を行わずに培養した同じ細胞よりも（ｉ）より高い力価でイソプレンを生成するか、又は（ｉｉ）より高い平均のイソプレンの体積生産性を有する、方法を提供する。
【００３０】
別の態様において、本明細書は、イソプレンを生成するための改良された方法であって、（ａ）イソプレンシンターゼポリペプチドをコードした異種核酸を有する細胞を、増殖培地が入った発酵装置中で、イソプレンの生成に適した培養条件下で培養する工程であって、細胞が、（ｉ）４０ｇ／Ｌよりも高い力価でイソプレンを生成するか、又は、（ｉｉ）イソプレン約５００ｍｇ／Ｌブロス／時間よりも高い平均のイソプレンの体積生産性を有するものである、工程と、（ｂ）発酵装置から細胞培養の一部を取り出す工程と、（ｃ）細胞培養の取り出した一部をフィルターに移す工程と、（ｄ）細胞培養の取り出した一部を濾過して、（ｉ）使用済み増殖培地を含む透過液と、（ｉｉ）細胞及び他の培養固形分を含む保持成分と、を生成する工程と、（ｅ）保持成分を発酵装置に戻す工程と、（ｆ）透過液を回収する工程と、（ｇ）イソプレンを生成する工程と、（ｈ）イソプレンを回収する工程と、を含み、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）工程を行った培養細胞が、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）工程を行わずに培養した同じ細胞よりも（ｉ）より高い力価でイソプレンを生成するか、又は（ｉｉ）より高い平均のイソプレンの体積生産性を有する、方法を提供する。
【００３１】
一般的方法
本発明の実施においては、特に断らないかぎりにおいて、当業者の技能の範囲内に含まれる従来の分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、及び免疫学の技術を用いる。こうした技術は、以下の文献に詳細に説明されている。すなわち、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」，ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８７）；「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７、及びｐｅｒｉｏｄｉｃ  ｕｐｄａｔｅｓ）；「ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ」，（Ｍｕｌｌｉｓら編、１９９４）である。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．１９９４）、及びＭａｒｃｈ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ４ｔｈ  ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．１９９２）は、本願において使用する用語の多くについて一般的な指標を当業者に与えるものである。
【００３２】
バイオリアクター中の遺伝子操作された細胞培養は、例えば、国際特許出願公開第ＷＯ  ２００９／０７６６７６号、米国特許出願第１２／３３５，０７１号（米国特許出願公開第２００９／０２０３１０２号）、国際特許出願公開第ＷＯ  ２０１０／００３００７号、米国特許出願公開第２０１０／００４８９６４号、国際特許出願公開第ＷＯ  ２００９／１３２２２０号、及び米国特許出願公開第２０１０／０００３７１６号に述べられるように、より効率的に、より大量に、より高純度で、かつ／又は固有の不純物プロファイルにてイソプレンを生成するものである。
【００３３】
用語の定義
「イソプレン」なる用語は、２−メチル−１，３−ブタジエン（ＣＡＳ番号７８−７９−５）のことを指す。イソプレンは、３，３−ジメチルアリルピロリン酸（ＤＭＡＰＰ）からのピロリン酸の脱離による直接的かつ最終的な揮発性のＣ５炭化水素生成物でありうる。場合によっては、ＩＰＰ分子のＤＭＡＰＰ分子への結合又は重合が行われない場合もある。「イソプレン」なる用語は、本明細書において特に断らないかぎりは、その生成方法に限定されることを通常は意図していない。
【００３４】
本明細書において使用するところの「生物学的に生成されたイソプレン」又は「バイオイソプレン」とは、遺伝子操作された細胞培養、天然の微生物、植物又は動物によって生成されるもののような、任意の生物学的手段によって生成されたイソプレンのことである。バイオイソプレン組成物は、通常、石油化学系の原料から生成されるイソプレンと比較して含まれる炭化水素不純物が少なく、重合グレードとするのに必要な処理はしばしば最小で済む。バイオイソプレン組成物はまた、石油化学的に生成されたイソプレン組成物とは異なる不純物プロファイルを有している。
【００３５】
本明細書において使用するところの「透過液」なる用語は、増殖培地及び細胞が入った（すなわち培養細胞が入った）発酵装置又はバイオリアクターの内容物を、例えばクロスフロー濾過によって濾過することによって生成される濾液（すなわち使用済み増殖培地）のことを指す。細胞は、例えば、プロモーターと機能的に連結されたイソプレンシンターゼポリペプチド、ＤＸＳポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド、及び／又はＭＶＡ経路ポリペプチドをコードした１つ以上の異種核酸を含むものなどの、本明細書において述べられる代表的なイソプレン生成細胞又は細胞型のいずれのものであってもよい。
【００３６】
本明細書において使用するところの「保持成分」とは、増殖培地及び細胞が入った（すなわち培養細胞が入った）発酵装置又はバイオリアクターの内容物を、例えばクロスフロー濾過によって濾過した後にフィルター上に保持される固形分（すなわち細胞、破片、及び他の培養固形分）のことを指す。細胞は、例えば、プロモーターと機能的に連結されたイソプレンシンターゼポリペプチド、ＤＸＳポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド、及び／又はＭＶＡ経路ポリペプチドをコードした１つ以上の異種核酸を含むものなどの、本明細書において述べられる代表的なイソプレン生成細胞又は細胞型のいずれのものであってもよい。
【００３７】
本明細書において使用するところの「ポリペプチド」なる用語には、ポリペプチド、タンパク質、ペプチド、ポリペプチドのフラグメント、及び融合ポリペプチドが含まれる。
【００３８】
本明細書において使用するところの「単離ポリペプチド」とは、２、５、１０、２０、５０又はそれよりも多い異なるポリペプチドのライブラリーのようなポリペプチドのライブラリーの一部ではなく、自然界で混在する少なくとも１種類の成分から分離されたもののことである。単離ポリペプチドは、例えば、ポリペプチドをコードした組換え核酸を発現させることによって得ることができる。単離ポリペプチドは自然に存在しないポリペプチドであってもよい。
【００３９】
「異種ポリペプチド」とは、そのアミノ酸配列が、同じホスト細胞内で自然に発現される別のポリペプチドのアミノ酸配列と同一ではないポリペプチドのことを意味する。詳細には、異種ポリペプチドは、自然界で同じホスト細胞内に見出される野性型ポリペプチドと同一ではない。
【００４０】
本明細書において使用するところの「核酸」とは、一本鎖又は二本鎖の形で互いに共有結合された２つ以上のデオキシリボヌクレオチド及び／又はリボヌクレオチドのことを指す。
【００４１】
「組換え核酸」とは、対象とする核酸が由来する生物において自然に存在するゲノムにおいて、対象とする核酸に隣接する１つ以上の核酸（例えば遺伝子）を含まない、対象とする核酸のことを意味する。したがって、この用語には、例えば、ベクター中に、自己複製型のプラスミド若しくはウイルス中に、又は原核生物若しくは真核生物のゲノムＤＮＡ中に組み込まれるか、あるいは、他の配列とは独立した別の分子（例えばｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡフラグメント、又はＰＣＲ若しくは制限エンドヌクレアーゼによる消化によって生成するｃＤＮＡフラグメント）として存在する組換えＤＮＡが含まれる。場合によっては、組換え核酸は自然に存在しないポリペプチドをコードした核酸である。
【００４２】
「異種核酸」とは、その核酸配列が同じホスト細胞内に自然に見出される別の核酸の配列と同一ではない核酸のことを意味する。詳細には、異種核酸は、自然界で同じホスト細胞内に見出される野性型核酸と同一ではない。
【００４３】
本明細書において使用するところの「ベクター」とは、１つ以上の対象とする核酸をホスト細胞内に導入し、望ましくは発現させることが可能なコンストラクトのことを意味する。ベクターの例としては、これらに限定されるものではないが、プラスミド、ウイルスベクター、ＤＮＡ又はＲＮＡ発現ベクター、コスミド、及びファージベクターが挙げられる。
【００４４】
本明細書において使用するところの「発現調節配列」とは、対象とする核酸の転写を指示する核酸配列のことを意味する。発現調節配列は、構成的若しくは誘導性プロモーターなどのプロモーター、又はエンハンサーであってよい。「誘導性プロモーター」は、環境的な、又は発生における調節下で活性を有するプロモーターである。発現調節配列は、転写される核酸のセグメントと機能的に連結される。
【００４５】
「選択マーカー」又は「選択可能なマーカー」とは、導入された核酸又はベクターを有するホスト細胞の選択を容易にする、ホスト細胞中で発現可能な核酸のことを指す。選択可能なマーカーの例としては、これらに限定されるものではないが、抗生物質耐性核酸（例えば、カナマイシン、アンピシリン、カルベニシリン、ゲンタマイシン、ヒグロマイシン、フェロマイシン、ブレオマイシン、ネオマイシン又はクロラムフェニコール）、及び／又はホスト細胞に栄養的な利点などの代謝的な利点を与える核酸が挙げられる。代表的な栄養的選択マーカーとしては、当該技術分野においてａｍｄＳ、ａｒｇＢ及びｐｙｒ４として知られるマーカーが挙げられる。
【００４６】
本明細書において特に定義しないかぎり、本明細書で用いるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書において述べられるものと同様又は同等のあらゆる方法及び材料を本発明の実施において使用することができるが、好ましい方法及び材料については本明細書に述べる。したがって、以下に定義する用語は、明細書全体を参照することでより完全に記載される。引用される文献はすべて、その関連部分において、本明細書に参照によりその全容を援用するものである。しかしながら、いずれの文献の引用も、当該文献が本発明に対する先行技術であることを容認するものとして解釈されるべきではない。
【００４７】
本明細書において使用される単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」には、内容的に明らかに示されていないかぎり、複数の対象物が含まれる。
【００４８】
本明細書の全体を通じて与えられるすべての最大の数値的限定には、これよりも小さいすべての数値的限定が、あたかもこうしたより小さい数値的限定が本明細書に明確に記載されているものと同様に含まれるものとする。本明細書の全体を通じて与えられるすべての最小の数値的限定には、これよりも大きいすべての数値的限定が、あたかもこうしたより大きい数値的限定が本明細書に明確に記載されているものと同様に含まれる。本明細書の全体を通じて与えられるすべての数値的範囲には、これよりも狭い数値的範囲が、あたかもこうしたより狭い数値的範囲がすべて本明細書に明確に記載されているものと同様に含まれる。
【００４９】
バイオイソプレンの生成量を増大させるための方法
本明細書では、イソプレンを生成するための改良された方法を提供する。特定の態様では、改良された方法は、（ａ）イソプレンシンターゼをコードした異種核酸を有する細胞を、イソプレンの生成に適した培養条件下で培養する工程であって、細胞が、（ｉ）４０ｇ／Ｌよりも高い力価でイソプレンを生成するか、又は、（ｉｉ）イソプレン約５００ｍｇ／Ｌブロス／時間よりも高い平均の体積生産性を有するものである、工程と、（ｂ）培養の一部を取り出す工程と、（ｃ）培養の取り出した一部を濾過して透過液と保持成分とを生成する工程と、（ｄ）保持成分を培養に戻す工程と、（ｅ）イソプレンを生成する工程と、場合に応じて（ｆ）イソプレンを回収する工程と、を含み、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）工程を行った培養細胞が、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）工程を行わずに培養した同じ細胞よりも（ｉ）より高い力価でイソプレンを生成するか、又は（ｉｉ）より高い平均のイソプレンの体積生産性を有する。特定の態様では、細胞は発酵装置、バイオリアクター、又は商業的規模での細胞培養に適した他の容器中で培養される。特定の態様では、発酵装置、バイオリアクター、又は細胞培養容器は、ステンレス鋼、ガラス又は銅である。特定の態様では、発酵装置、バイオリアクター、又は細胞培養容器は、イソプレン貯蔵タンクに接続されたイソプレン回収出口を更に有する。特定の態様では、イソプレン回収出口は、イソプレン回収出口を通じたイソプレンの流れを制御するための弁を更に有する。
【００５０】
特定の態様では、改良された方法は、（ａ）イソプレンシンターゼをコードした異種核酸を有する細胞を、増殖培地が入った発酵装置中で、イソプレンの生成に適した培養条件下で培養する工程であって、細胞が、（ｉ）４０ｇ／Ｌよりも高い力価でイソプレンを生成するか、又は、（ｉｉ）イソプレン約５００ｍｇ／Ｌブロス／時間よりも高い平均の体積生産性を有するものである、工程と、（ｂ）発酵装置から細胞培養の一部を取り出す工程と、（ｃ）細胞培養の取り出した一部をフィルターに移す工程と、（ｄ）細胞培養の取り出した一部を濾過して、（ｉ）使用済み増殖培地を含む透過液と、（ｉｉ）細胞及び他の培養固形分を含む保持成分と、を生成する工程と、（ｅ）保持成分を発酵装置に戻す工程と、（ｆ）透過液を回収する工程と、（ｇ）イソプレンを生成する工程と、場合に応じて（ｈ）イソプレンを回収する工程と、を含み、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）工程を行った培養細胞が、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）工程を行わずに培養した同じ細胞よりも（ｉ）より高い力価でイソプレンを生成するか、又は（ｉｉ）より高い平均のイソプレンの体積生産性を有する。特定の態様では、細胞は発酵装置、バイオリアクター、又は商業的規模での細胞培養に適した他の容器中で培養される。特定の態様では、発酵装置、バイオリアクター、又は細胞培養容器は、ステンレス鋼、ガラス又は銅である。特定の態様では、発酵装置、バイオリアクター、又は細胞培養容器は、イソプレン貯蔵タンクに接続されたイソプレン回収出口を更に有する。特定の態様では、イソプレン回収出口は、イソプレン回収出口を通じたイソプレンの流れを制御するための弁を更に有する。特定の態様では、イソプレン回収出口は、本明細書において述べられる任意の適当な可撓性チューブ又は剛性チューブを有する。
【００５１】
特定の態様では、発酵装置、バイオリアクター、又は細胞培養容器は循環ループ及び循環ポンプによってフィルターと接続される。特定の態様では、循環ループは、循環ループを通じた物質の（すなわち、細胞培養の一部又は保持成分の）流れを制御するための１つ以上の弁を更に有する。一般的に、流速及び圧力を正確に調節又は制御する能力を有するあらゆる種類のポンプを本明細書において述べられる方法とともに使用することができる。特定の態様では、循環ポンプは、ペリスタルティックポンプ、往復動ポンプ、又はロータリーポンプなどの容積移送式ポンプを含む。特定の態様では、循環ポンプはペリスタルティックポンプである。特定の態様では、循環ポンプは、遠心ポンプ、渦巻ポンプ、軸流ポンプ、混合流ポンプ、又は重力ポンプなどの速度ポンプである。特定の態様では、循環ポンプは遠心ポンプである。
【００５２】
特定の態様では、循環ループは可撓性チューブを有する。特定の態様では、可撓性チューブは、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリウレタン（例えばＳｕｐｅｒｔｈａｎｅ（登録商標））、シリコーン（例えばＳｉｌｃｏｎ（登録商標））、熱可塑性ゴム（ＴＰＲ、例えばＳｕｐｒｅｎｅ（登録商標））、フルオロポリマー、ポリエチレン、ポリプロピレン（例えばＰｒｏｌｉｔｅ（登録商標））、ラテックス又は金属チューブである。特定の態様では、ＰＶＣチューブは、編組強化されたもの（例えばＮｙｌｏｂｒａｄｅ（登録商標））、鋼線強化されたもの（例えばＶａｒｄｅｘ（登録商標））、又は螺旋強化されたもの（例えばＮｅｗｆｌｅｘ（登録商標））である。特定の態様では、ポリウレタンチューブは編組強化されたものである（例えばＵｒｅｂｒａｄｅ（登録商標）Ｐｎｅｕｍａｔｉｃ）。特定の態様では、シリコーンチューブは、編組強化されたもの（例えばＳｉｌｂｒａｄｅ（登録商標））、白金硬化された医療グレードチューブ（例えばＳｉｌｃｏｎ（登録商標）Ｍｅｄ−Ｘ）、又はポリエステル及びワイア強化されたもの（例えばＳｉｌｖａｃ（登録商標））である。特定の態様では、フルオロポリマーチューブは、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ、例えばＣＯＮＴＥＦ（商標））、フッ素化エチレンプロピレン（ＦＥＰ、例えばＣｏｉｌｔｅｆ（商標））、ペルフルオロアルコキシ（ＰＦＡ、例えばＣｏｉｌｔｅｆ（商標））、エチレンテトラフルオロエチレン（ＥＴＦＥ）、エチレンクロロトリフルオロエチレン（ＥＣＴＦＥ）、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）ポリエーテルイミド（ＰＥＩ）、又はポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）である。特定の態様では、ポリエチレンチューブは、直鎖状低密度ポリエチレンチューブ（ＬＬＤＰＥ、例えばＺｅｌｉｔｅ（商標））である。
【００５３】
特定の態様では、循環ループは、剛性チューブ又はパイプを有する。特定の態様では、剛性チューブは金属である。特定の態様では、金属は炭素鋼、ステンレス鋼、亜鉛めっき鋼、銅、黄銅、若しくは他の任意の適当な金属又は合金である。特定の態様では、剛性チューブはプラスチックである。特定の態様では、プラスチックは、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、塩素化ポリ塩化ビニル（ＣＰＶＣ）、繊維強化プラスチック（ＦＲＰ）、強化ポリマーモルタル（ＲＰＭＰ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリエチレン（ＰＥ）、架橋高密度ポリエチレン（ＰＥＸ）、ポリブチレン（ＰＢ）、高密度ポリウレタン、アクリロニトリルブタジエンスチレン（ＡＢＳ）、又は他の任意の適当な材料である。
【００５４】
特定の態様では、透過液は透過液回収出口及び透過液ポンプによりフィルターから回収され、透過液回収タンク内に貯蔵される。特定の態様では、透過液回収出口は、透過液回収出口を通じた透過液の流れを制御するための弁を更に有する。特定の態様では、透過液回収出口は、本明細書において述べられる任意の適当な可撓性チューブ又は剛性チューブを有する。特定の態様では、透過液回収出口は、透過液回収出口内の圧力（Ｐ透過液）を監視するための透過液圧力ゲージを更に有する。一般的に、流速及び圧力を正確に調節又は制御する能力を有するあらゆる種類のポンプを本明細書において述べられる方法とともに使用することができる。特定の態様では、透過液ポンプは、ペリスタルティックポンプ、往復動ポンプ、又はロータリーポンプなどの容積移送式ポンプを含む。特定の態様では、透過液ポンプはペリスタルティックポンプである。特定の態様では、透過液ポンプは、遠心ポンプ、渦巻ポンプ、軸流ポンプ、混合流ポンプ、又は重力ポンプなどの速度ポンプである。特定の態様では、透過液ポンプは遠心ポンプである。特定の態様では、透過液回収タンクはタンク内の圧力を解放するための通気口を更に有する。
【００５５】
特定の態様では、改良された方法は、同じ細胞培養又は別の培養中に透過液を再循環させる工程を更に含む。透過液を再循環させることにより、所定の時間におけるイソプレンの生成量を増大させること、例えば、１Ｌのブロスにつき１時間当たりのイソプレンの生成量を増大させることが可能となる。したがって、一態様では、再循環された透過液の存在下で培養された細胞は、再循環された透過液の非存在下で培養された同じ細胞よりも高い平均のイソプレンの比生産性を有する。特定の態様では、細胞は、再循環された透過液の非存在下で培養された同じ細胞よりも約２倍高い平均のイソプレンの比生産性を有する。特定の態様では、細胞は、再循環された透過液の非存在下で培養された同じ細胞よりも約３倍高い平均のイソプレンの比生産性を有する。特定の態様では、透過液は同じ細胞培養又は別の細胞培養中に再循環される前に滅菌される。特定の態様では、透過液は濾過により滅菌される。特定の態様では、透過液はオートクレーブにより滅菌される。特定の態様では、透過液は紫外線又はγ線照射により滅菌される。特定の態様では、透過液は同じ細胞培養又は別の細胞培養中に再循環される前に滅菌されない。
【００５６】
この本明細書において述べられるシステムの利点の１つは、透過液の再循環又は廃棄の際に失われる所望の生成物（すなわちイソプレン）の量が最小に抑えられる点である。一態様では、循環が開始される前に発酵装置内で生成したイソプレンの少なくとも約５０％は、循環が完了した後に回収可能であり、したがって透過液の再循環又は廃棄の際に失われない。別の態様では、発酵装置内で生成したイソプレンの少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、少なくとも約９９．６％、少なくとも約９９．７％、少なくとも約９９．８％、又は少なくとも約９９．９％が回収可能であり、透過液中で失われない。
【００５７】
特定の態様では、循環ループは、フィルターの入口圧力（Ｐ入口）を監視するための入口圧力ゲージを更に有する。特定の態様では、循環ループは、フィルターの出口圧力（Ｐ出口）を監視するための出口ゲージを更に有する。特定の態様では、循環ループは、フィルターの入口圧力（Ｐ入口）を監視するための入口圧力ゲージ、及びフィルターの出口圧力（Ｐ出口）を監視するための出口ゲージを更に有する。特定の態様では、改良された方法は、（ｉ）フィルターの入口圧力（Ｐ入口）を入口圧力ゲージによって監視する工程と、（ｉｉ）フィルターの出口圧力（Ｐ出口）を出口圧力ゲージによって監視する工程と、（ｉｉｉ）透過液回収出口内の圧力（Ｐ透過液）を透過液圧力ゲージによって監視する工程を更に含むことによってフィルターの膜間圧力を測定する。
【００５８】
特定の態様では、濾過は精密濾過による。特定の態様では、精密濾過はクロスフロー濾過による。特定の態様では、濾過は限外濾過による。特定の態様では、限外濾過はクロスフロー濾過による。クロスフロー濾過では、濾過される溶液は、透過液側に対して正の膜間圧力（ＴＭＰ）で接線方向にフィルター膜を通過させられる。膜の孔径よりも小さい、材料の所定の割合が、濾液（すなわち透過液）として膜を通過するのに対して、溶液の残りの部分は保持成分として供給側に残る。クロスフロー濾過では、膜の両側のまとまった量の流体の接線方向の運動によって、フィルター表面上に残留する捕捉された粒子や固形分が剥離するため、クロスフローフィルターは汚れずに比較的高い固形分負荷で連続して動作することが可能である。更に、保持成分は、循環ループを介して発酵装置に戻すのに適した流動性のスラリーの形に維持される。特定の態様では、濾過は遠心分離又はスピン濾過による。特定の態様では、濾過は渦流濾過による。特定の態様では、濾過はハイドロサイクロンによる。本明細書において述べられる任意の態様において、濾過は精密濾過による。本明細書において述べられる任意の態様において、濾過は限外濾過による。
【００５９】
特定の態様では、濾過は精密濾過による。特定の態様では、精密濾過はクロスフロー濾過である。特定の態様では、クロスフロー濾過はタンジェンシャルフロー濾過である。特定の態様では、タンジェンシャルフローフィルターは、中空繊維膜、螺旋状濾過膜、管状膜、又はプレートフレーム膜からなる群から選択される膜の形態を有する。特定の態様では、タンジェンシャルフローフィルターは、中空繊維膜を有する。特定の態様では、中空繊維膜、螺旋状濾過膜、管状膜、又はプレートフレーム膜は、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜、ポリスルホン（ＰＳ）膜、二フッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）膜、ポリアリールスルホン膜、ポリアミド膜、ポリプロピレン膜、ポリエチレン膜、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）膜、酢酸セルロース膜、ポリアクリロニトリル膜、ビニルコポリマー膜、セルロース膜、再生セルロース膜、ポリカーボネート膜、セラミック膜、鋼膜、又はステンレス鋼膜を含む。
【００６０】
タンジェンシャルフロー膜などの限外濾過膜の孔径は、膜の材料及び用途に応じて変わりうる。本明細書において述べられる膜の形態及び膜の種類のいずれも、異なる範囲のフィルター孔径を有しうる。
【００６１】
特定の態様では、タンジェンシャルフローフィルターは、例えば、プロモーターと機能的に連結されたイソプレンシンターゼポリペプチド、ＤＸＳポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド、及び／又はＭＶＡ経路ポリペプチドをコードした１つ以上の異種核酸を有するものを含む、本明細書において述べられる代表的なイソプレン生成細胞又は細胞型のいずれかと使用するうえで適したフィルター孔径を有する。特定の態様では、タンジェンシャルフローフィルターは、約０．００５μｍ〜約１００μｍのフィルター孔径を有する。特定の態様では、タンジェンシャルフローフィルターは、約０．００５μｍ〜約５０μｍのフィルター孔径を有する。特定の態様では、タンジェンシャルフローフィルターは、約０．００５μｍ〜約１０μｍのフィルター孔径を有する。特定の態様では、タンジェンシャルフローフィルターは、約０．００５μｍ〜約５μｍのフィルター孔径を有する。特定の態様では、タンジェンシャルフローフィルターは、約０．００５μｍ〜約２μｍのフィルター孔径を有する。特定の態様では、タンジェンシャルフローフィルターは、約０．００５μｍ〜約１μｍのフィルター孔径を有する。特定の態様では、タンジェンシャルフローフィルターは、約０．０５μｍ〜約１００μｍのフィルター孔径を有する。特定の態様では、タンジェンシャルフローフィルターは、約０．０５μｍ〜約５０μｍのフィルター孔径を有する。特定の態様では、タンジェンシャルフローフィルターは、約０．０５μｍ〜約１０μｍのフィルター孔径を有する。特定の態様では、タンジェンシャルフローフィルターは、約０．０５μｍ〜約５μｍのフィルター孔径を有する。特定の態様では、タンジェンシャルフローフィルターは、約０．０５μｍ〜約２μｍのフィルター孔径を有する。特定の態様では、タンジェンシャルフローフィルターは、約０．０５μｍ〜約１μｍのフィルター孔径を有する。特定の態様では、タンジェンシャルフローフィルターは、約０．５μｍ〜約１００μｍのフィルター孔径を有する。特定の態様では、タンジェンシャルフローフィルターは、約０．５μｍ〜約５０μｍのフィルター孔径を有する。特定の態様では、タンジェンシャルフローフィルターは、約０．５μｍ〜約１０μｍのフィルター孔径を有する。特定の態様では、タンジェンシャルフローフィルターは、約０．５μｍ〜約５μｍのフィルター孔径を有する。特定の態様では、タンジェンシャルフローフィルターは、約０．５μｍ〜約２μｍのフィルター孔径を有する。特定の態様では、タンジェンシャルフローフィルターは、約０．５μｍ〜約１μｍのフィルター孔径を有する。特定の態様では、タンジェンシャルフローフィルターは、約１μｍ〜約１０μｍのフィルター孔径を有する。特定の態様では、タンジェンシャルフローフィルターは、約１μｍ〜約５０μｍのフィルター孔径を有する。特定の態様では、タンジェンシャルフローフィルターは、約１μｍ〜約１００μｍのフィルター孔径を有する。特定の態様では、タンジェンシャルフローフィルターは、約５μｍ〜約１０μｍのフィルター孔径を有する。特定の態様では、タンジェンシャルフローフィルターは、約５μｍ〜約５０μｍのフィルター孔径を有する。特定の態様では、タンジェンシャルフローフィ���ターは、約５μｍ〜約１００μｍのフィルター孔径を有する。特定の態様では、タンジェンシャルフローフィルターは、約０．０５μｍ〜約０．５μｍのフィルター孔径を有する。特定の態様では、タンジェンシャルフローフィルターは、約０．５μｍ〜約１μｍのフィルター孔径を有する。特定の態様では、タンジェンシャルフローフィルターは、約１μｍ〜約５μｍのフィルター孔径を有する。特定の態様では、タンジェンシャルフローフィルターは、約５μｍ〜約１０μｍのフィルター孔径を有する。特定の態様では、タンジェンシャルフローフィルターは、約１０μｍ〜約５０μｍのフィルター孔径を有する。特定の態様では、タンジェンシャルフローフィルターは、約１０μｍ〜約１００μｍのフィルター孔径を有する。
【００６２】
特定の態様では、濾過は限外濾過による。特定の態様では、限外濾過はクロスフロー濾過である。特定の態様では、クロスフロー濾過はタンジェンシャルフロー濾過である。特定の態様では、タンジェンシャルフローフィルターは、中空繊維膜、螺旋状濾過膜、管状膜、又はプレートフレーム膜からなる群から選択される膜の形態を有する。特定の態様では、タンジェンシャルフローフィルターは、中空繊維膜を有する。特定の態様では、中空繊維膜、螺旋状濾過膜、管状膜、又はプレートフレーム膜は、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜、ポリスルホン（ＰＳ）膜、二フッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）膜、ポリアリールスルホン膜、ポリアミド膜、ポリプロピレン膜、ポリエチレン膜、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）膜、酢酸セルロース膜、ポリアクリロニトリル膜、ビニルコポリマー膜、セルロース膜、再生セルロース膜、ポリカーボネート膜、セラミック膜、鋼膜、又はステンレス鋼膜を含む。
【００６３】
タンジェンシャルフロー膜のような限外濾過膜の公称分画分子量（ＮＭＷＣ）は、膜の材料及び用途に応じて変わりうる。本明細書において述べられる膜の形態及び膜の種類のいずれも、異なる範囲のＮＭＷＣを有しうる。
【００６４】
特定の態様では、タンジェンシャルフローフィルターは、例えば、プロモーターと機能的に連結されたイソプレンシンターゼポリペプチド、ＤＸＳポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド、ＤＸＰ経路ポリペプチド及び／又はＭＶＡ経路ポリペプチドをコードした１つ以上の異種核酸を有するものを含む、本明細書において述べられる代表的なイソプレン生成細胞又は細胞型のいずれかと使用するうえで適した公称分画分子量（ＮＭＷＣ）を有する。特定の態様では、タンジェンシャルフローフィルターは１０００〜７５０，０００のＮＭＷＣを有する。特定の態様では、タンジェンシャルフローフィルターは、１０００よりも大きいＮＭＷＣを有する。特定の態様では、タンジェンシャルフローフィルターは、５０００よりも大きいＮＭＷＣを有する。特定の態様では、タンジェンシャルフローフィルターは、１０，０００よりも大きいＮＭＷＣを有する。特定の態様では、タンジェンシャルフローフィルターは、１５，０００よりも大きいＮＭＷＣを有する。特定の態様では、タンジェンシャルフローフィルターは、２０，０００よりも大きいＮＭＷＣを有する。特定の態様では、タンジェンシャルフローフィルターは、２５，０００よりも大きいＮＭＷＣを有する。特定の態様では、タンジェンシャルフローフィルターは、５０，０００よりも大きいＮＭＷＣを有する。特定の態様では、タンジェンシャルフローフィルターは、７５，０００よりも大きいＮＭＷＣを有する。特定の態様では、タンジェンシャルフローフィルターは、１００，０００よりも大きいＮＭＷＣを有する。特定の態様では、タンジェンシャルフローフィルターは、１５０，０００よりも大きいＮＭＷＣを有する。特定の態様では、タンジェンシャルフローフィルターは、２００，０００よりも大きいＮＭＷＣを有する。特定の態様では、タンジェンシャルフローフィルターは、２５０，０００よりも大きいＮＭＷＣを有する。特定の態様では、タンジェンシャルフローフィルターは、３００，０００よりも大きいＮＭＷＣを有する。特定の態様では、タンジェンシャルフローフィルターは、３５０，０００よりも大きいＮＭＷＣを有する。特定の態様では、タンジェンシャルフローフィルターは、４００，０００よりも大きいＮＭＷＣを有する。特定の態様では、タンジェンシャルフローフィルターは、４５０，０００よりも大きいＮＭＷＣを有する。特定の態様では、タンジェンシャルフローフィルターは、５００，０００よりも大きいＮＭＷＣを有する。特定の態様では、タンジェンシャルフローフィルターは、６００，０００よりも大きいＮＭＷＣを有する。特定の態様では、タンジェンシャルフローフィルターは、７５０，０００よりも大きいＮＭＷＣを有する。
【００６５】
特定の態様では、タンジェンシャルフローフィルターは、１ｍｍの内径を有する中空繊維膜を備えた、公称分画分子量（ＮＭＷＣ）が５００，０００のＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｘａｍｐｌｅｒ（商標）Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃｏｒｐ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）である。特定の態様では、タンジェンシャルフローフィルターは、例えば、プロモーターと機能的に連結されたイソプレンシンターゼポリペプチド、ＤＸＳポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド、及び／又はＭＶＡ経路ポリペプチドをコードした１つ以上の異種核酸を有するものを含む、本明細書において述べられる代表的なイソプレン生成細胞又は細胞型のいずれかと使用するうえで適した公称分画分子量を有するフィルターを使用した、ＯＰＴＩＳＥＰ（登録商標）３０００フィルターモジュール（ＮＣＳＲＴ，Ｉｎｃ．，Ａｐｅｘ，ＮＣ）、ＯＰＴＩＳＥＰ（登録商標）７０００フィルターモジュール、又はＯＰＴＩＳＥＰ（登録商標）１１０００フィルターモジュールである。
【００６６】
特定の態様では、フィルターは、例えば、プロモーターと機能的に連結されたイソプレンシンターゼポリペプチド、ＤＸＳポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド、ＤＸＰ経路ポリペプチド及び／又はＭＶＡ経路ポリペプチドをコードした１つ以上の異種核酸を有するものを含む、本明細書において述べられる代表的なイソプレン生成細胞又は細胞型のいずれかと使用するうえで適した公称分画分子量（ＮＭＷＣ）を有するタンジェンシャルフローフィルターである。特定の態様では、タンジェンシャルフローフィルターは１０００〜７５０，０００のＮＭＷＣを有する。特定の態様では、タンジェンシャルフローフィルターは１０，０００〜７５０，０００のＮＭＷＣを有する。特定の態様では、タンジェンシャルフローフィルターは１００，０００〜７５０，０００のＮＭＷＣを有する。特定の態様では、タンジェンシャルフローフィルターは２５０，０００〜７５０，０００のＮＭＷＣを有する。特定の態様では、タンジェンシャルフローフィルターは、１０００よりも大きいＮＭＷＣを有する。特定の態様では、タンジェンシャルフローフィルターは、５０００よりも大きいＮＭＷＣを有する。特定の態様では、タンジェンシャルフローフィルターは、１０，０００よりも大きいＮＭＷＣを有する。特定の態様では、タンジェンシャルフローフィルターは、１５，０００よりも大きいＮＭＷＣを有する。特定の態様では、タンジェンシャルフローフィルターは、２０，０００よりも大きいＮＭＷＣを有する。特定の態様では、タンジェンシャルフローフィルターは、２５，０００よりも大きいＮＭＷＣを有する。特定の態様では、タンジェンシャルフローフィルターは、５０，０００よりも大きいＮＭＷＣを有する。特定の態様では、タンジェンシャルフローフィルターは、７５，０００よりも大きいＮＭＷＣを有する。特定の態様では、タンジェンシャルフローフィルターは、１００，０００よりも大きいＮＭＷＣを有する。特定の態様では、タンジェンシャルフローフィルターは、１５０，０００よりも大きいＮＭＷＣを有する。特定の態様では、タンジェンシャルフローフィルターは、２００，０００よりも大きいＮＭＷＣを有する。特定の態様では、タンジェンシャルフローフィルターは、２５０，０００よりも大きいＮＭＷＣを有する。特定の態様では、タンジェンシャルフローフィルターは、３００，０００よりも大きいＮＭＷＣを有する。特定の態様では、タンジェンシャルフローフィルターは、３５０，０００よりも大きいＮＭＷＣを有する。特定の態様では、タンジェンシャルフローフィルターは、４００，０００よりも大きいＮＭＷＣを有する。特定の態様では、タンジェンシャルフローフィルターは、４５０，０００よりも大きいＮＭＷＣを有する。特定の態様では、タンジェンシャルフローフィルターは、５００，０００よりも大きいＮＭＷＣを有する。特定の態様では、タンジェンシャルフローフィルターは、６００，０００よりも大きいＮＭＷＣを有する。特定の態様では、タンジェンシャルフローフィルターは、７５０，０００よりも大きいＮＭＷＣを有する。
【００６７】
特定の態様では、発酵装置、バイオリアクター、又は細胞培養容器は、循環ループ及び循環ポンプを有しておらず、濾過は浸漬型膜バイオリアクターによる。特定の態様では、浸漬型膜バイオリアクターは、発酵装置、バイオリアクター、又は細胞培養容器内で細胞培養中に浸漬された濾過モジュールを有する。特定の態様では、濾過モジュールはフィルターを有し、透過液側はフィルターのみを介して細胞培養と流体接触している。特定の態様では、フィルターは、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜、ポリスルホン（ＰＳ）膜、二フッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）膜、ポリアリールスルホン膜、ポリアミド膜、ポリプロピレン膜、ポリエチレン膜、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）膜、酢酸セルロース膜、ポリアクリロニトリル膜、ビニルコポリマー膜、セルロース膜、再生セルロース膜、ポリカーボネート膜、セラミック膜、鋼膜、又はステンレス鋼膜を含む。
【００６８】
特定の態様では、浸漬型膜バイオリアクター内のフィルターは、例えば、プロモーターと機能的に連結されたイソプレンシンターゼポリペプチド、ＤＸＳポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド、及び／又はＭＶＡ経路ポリペプチドをコードした１つ以上の異種核酸を有するものを含む、本明細書において述べられる代表的なイソプレン生成細胞又は細胞型のいずれかと使用するうえで適した公称分画分子量（ＮＭＷＣ）を有する限外濾過フィルターである。特定の態様では、フィルターは１０００〜７５０，０００のＮＭＷＣを有する。特定の態様では、フィルターは１０００よりも大きいＮＭＷＣを有する。特定の態様では、フィルターは５０００よりも大きいＮＭＷＣを有する。特定の態様では、フィルターは１０，０００よりも大きいＮＭＷＣを有する。特定の態様では、フィルターは１５，０００よりも大きいＮＭＷＣを有する。特定の態様では、フィルターは２０，０００よりも大きいＮＭＷＣを有する。特定の態様では、フィルターは２５，０００よりも大きいＮＭＷＣを有する。特定の態様では、フィルターは５０，０００よりも大きいＮＭＷＣを有する。特定の態様では、フィルターは７５，０００よりも大きいＮＭＷＣを有する。特定の態様では、フィルターは１００，０００よりも大きいＮＭＷＣを有する。特定の態様では、フィルターは１５０，０００よりも大きいＮＭＷＣを有する。特定の態様では、フィルターは２００，０００よりも大きいＮＭＷＣを有する。特定の態様では、フィルターは２５０，０００よりも大きいＮＭＷＣを有する。特定の態様では、フィルターは３００，０００よりも大きいＮＭＷＣを有する。特定の態様では、フィルターは３５０，０００よりも大きいＮＭＷＣを有する。特定の態様では、フィルターは４００，０００よりも大きいＮＭＷＣを有する。特定の態様では、フィルターは４５０，０００よりも大きいＮＭＷＣを有する。特定の態様では、フィルターは５００，０００よりも大きいＮＭＷＣを有する。特定の態様では、フィルターは６００，０００よりも大きいＮＭＷＣを有する。特定の態様では、フィルターは７５０，０００よりも大きいＮＭＷＣを有する。
【００６９】
特定の態様では、浸漬型膜バイオリアクター内のフィルターは、例えば、プロモーターと機能的に連結されたイソプレンシンターゼポリペプチド、ＤＸＳポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド、ＤＸＰ経路ポリペプチド及び／又はＭＶＡ経路ポリペプチドをコードした１つ以上の異種核酸を有するものを含む、本明細書において述べられる代表的なイソプレン生成細胞又は細胞型のいずれかと使用するうえで適したフィルター孔径を有する精密濾過フィルターである。特定の態様では、フィルターは約０．００５μｍ〜約１００μｍのフィルター孔径を有する。特定の態様では、フィルターは約０．００５μｍ〜約５０μｍのフィルター孔径を有する。特定の態様では、フィルターは約０．００５μｍ〜約１０μｍのフィルター孔径を有する。特定の態様では、フィルターは約０．００５μｍ〜約５μｍのフィルター孔径を有する。特定の態様では、フィルターは約０．００５μｍ〜約２μｍのフィルター孔径を有する。特定の態様では、フィルターは約０．００５μｍ〜約１μｍのフィルター孔径を有する。特定の態様では、フィルターは約０．０５μｍ〜約１００μｍのフィルター孔径を有する。特定の態様では、フィルターは約０．０５μｍ〜約５０μｍのフィルター孔径を有する。特定の態様では、フィルターは約０．０５μｍ〜約１０μｍのフィルター孔径を有する。特定の態様では、フィルターは約０．０５μｍ〜約５μｍのフィルター孔径を有する。特定の態様では、フィルターは約０．０５μｍ〜約２μｍのフィルター孔径を有する。特定の態様では、フィルターは約０．０５μｍ〜約１μｍのフィルター孔径を有する。特定の態様では、フィルターは約０．５μｍ〜約１００μｍのフィルター孔径を有する。特定の態様では、フィルターは約０．５μｍ〜約５０μｍのフィルター孔径を有する。特定の態様では、フィルターは約０．５μｍ〜約１０μｍのフィルター孔径を有する。特定の態様では、フィルターは約０．５μｍ〜約５μｍのフィルター孔径を有する。特定の態様では、タンジェンシャルフローフィルターは、約０．５μｍ〜約２μｍのフィルター孔径を有する。特定の態様では、フィルターは約０．５μｍ〜約１μｍのフィルター孔径を有する。特定の態様では、フィルターは約１μｍ〜約１０μｍのフィルター孔径を有する。特定の態様では、フィルターは約１μｍ〜約５０μｍのフィルター孔径を有する。特定の態様では、フィルターは約１μｍ〜約１００μｍのフィルター孔径を有する。特定の態様では、フィルターは約５μｍ〜約１０μｍのフィルター孔径を有する。特定の態様では、フィルターは約５μｍ〜約５０μｍのフィルター孔径を有する。特定の態様では、フィルターは約５μｍ〜約１００μｍのフィルター孔径を有する。特定の態様では、フィルターは約０．０５μｍ〜約０．５μｍのフィルター孔径を有する。特定の態様では、フィルターは約０．５μｍ〜約１μｍのフィルター孔径を有する。特定の態様では、フィルターは約１μｍ〜約５μｍのフィルター孔径を有する。特定の態様では、フィルターは約５μｍ〜約１０μｍのフィルター孔径を有する。特定の態様では、フィルターは約１０μｍ〜約５０μｍのフィルター孔径を有する。特定の態様では、フィルターは約１０μｍ〜約１００μｍのフィルター孔径を有する。
【００７０】
特定の態様では、濾過モジュールは、透過液回収出口及び透過液ポンプを更に有する。特定の態様では、濾過モジュールは、透過液回収タンクを更に有する。特定の態様では、透過液ポンプは、ペリスタルティックポンプ、往復動ポンプ、又はロータリーポンプなどの容積移送式ポンプを含む。特定の態様では、透過液ポンプはペリスタルティックポンプである。特定の態様では、透過液ポンプは、遠心ポンプ、渦巻ポンプ、軸流ポンプ、混合流ポンプ、又は重力ポンプなどの速度ポンプである。特定の態様では、透過液ポンプは遠心ポンプである。特定の態様では、透過液回収タンクはタンク内の圧力を解放するための通気口を更に有する。
【００７１】
特定の態様では、改良された方法は、以下のように計算される正の膜間圧力を維持する工程を更に含む。すなわち、ＴＭＰ＝（［Ｐ入口＋Ｐ出口］／２）−Ｐ透過液）特定の態様では、改良された方法は、ＴＭＰを逆転させる（すなわち、ＴＭＰを負にする）ことによりフィルターを掃除する工程を更に含む。ＴＭＰを逆転させることにより、透過液は濾過しようとする溶液中に逆流し、これによりフィルターを汚すすべての固形物を膜の表面から浮かせ、フィルター及び循環ループを通じた流れを改善する。ＴＭＰを逆転させるには、通常、膜の透過液側を加圧する必要がある。ＴＭＰの逆転は、その本来の強度のために損傷しにくいセラミック及び鋼製の膜フィルターについて、より一般的に適用される。透過液の加圧は、他の方法の中でも特に、透過液線を圧縮空気又は水に接続することによって実現することができる。螺旋型のポリマー膜においてＴＭＰを逆転させるための具体的な方法に関する代表的な教示については、例えば、Ｄａｎｉｓｃｏによる国際特許出願公開第ＷＯ  ２００９／０３５７００号を参照されたい。
【００７２】
特定の態様では、濾過ユニット内における滞留時間は２５秒であり、発酵ブロス中のグルコース濃度は３〜２５ｇ／Ｌである。特定の態様では、濾過ユニット内における滞留時間は１０秒であり、発酵ブロス中のグルコース濃度は１〜３ｇ／Ｌである。特定の態様では、濾過ユニット内における滞留時間は５〜６０秒であり、発酵ブロス中のグルコース濃度は０．２〜２５ｇ／Ｌである。
【００７３】
特定の態様では、培養の一部の取り出しは、培養が標的体積に達した時点で最初に開始する。特定の態様では、標的体積は経験的に求められる。特定の態様では、標的体積は、発酵装置、バイオリアクター、又は細胞培養容器の総体積の１／２（２分の１）、１／３（３分の１）、１／４（４分の１）、１／５（５分の１）、１／６（６分の１）、１／７（７分の１）、１／８（８分の１）、１／９（９分の１）、１／１０（１０分の１）、又はそれ未満である。特定の態様では、標的体積は、細胞を培養するために使用される発酵装置、バイオリアクター、又は細胞培養容器の作動容量である。特定の態様では、培養の一部の取り出しは、細胞培養の開始（すなわち発酵の開始）の５時間後、１０時間後、１５時間後、２０時間後、２５時間後、３０時間後、３５時間後、又はそれよりも後に最初に開始する。
【００７４】
循環ループの連続作動はエネルギーを消費し（圧力に抗した圧送）、細胞にストレスを与える。このため、濾過を遅延又は延期する、すなわち、使用済み培地を発酵の間の特定の時点において回収するか、あるいは連続的にではなく一定間隔で回収するという選択肢により、経済的な効果が得られ、発酵の結果が改善されうる。特定の態様では、培養の一部は、発酵装置、バイオリアクター、又は細胞培養容器から連続的に取り出される。特定の態様では、培養の一部は、１ｍＬ／分、５ｍＬ／分、１０ｍＬ／分、１５ｍＬ／分、２０ｍＬ／分、２５ｍＬ／分、３０ｍＬ／分、３５ｍＬ／分、４０ｍＬ／分、４５ｍＬ／分、５０ｍＬ／分、１００ｍＬ／分、２５０ｍＬ／分、５００ｍＬ／分、１０００ｍＬ／分、又はそれよりも大きな速度で連続的に取り出される。特定の態様では、培養の一部は、１ｍＬ／１５分、５ｍＬ／１５分、１０ｍＬ／１５分、１５ｍＬ／１５分、２０ｍＬ／１５分、２５ｍＬ／１５分、３０ｍＬ／１５分、３５ｍＬ／１５分、４０ｍＬ／１５分、４５ｍＬ／１５分、５０ｍＬ／１５分、１００ｍＬ／１５分、２５０ｍＬ／１５分、５００ｍＬ／１５分、１０００ｍＬ／１５分、又はそれよりも大きな速度で連続的に取り出される。特定の態様では、培養の一部は、１ｍＬ／３０分、５ｍＬ／３０分、１０ｍＬ／３０分、１５ｍＬ／３０分、２０ｍＬ／３０分、２５ｍＬ／３０分、３０ｍＬ／３０分、３５ｍＬ／３０分、４０ｍＬ／３０分、４５ｍＬ／３０分、５０ｍＬ／３０分、１００ｍＬ／３０分、２５０ｍＬ／３０分、５００ｍＬ／３０分、１０００ｍＬ／３０分、又はそれよりも大きな速度で連続的に取り出される。特定の態様では、培養の一部は、１ｍＬ／６０分、５ｍＬ／６０分、１０ｍＬ／６０分、１５ｍＬ／６０分、２０ｍＬ／６０分、２５ｍＬ／６０分、３０ｍＬ／６０分、３５ｍＬ／６０分、４０ｍＬ／６０分、４５ｍＬ／６０分、５０ｍＬ／６０分、１００ｍＬ／６０分、２５０ｍＬ／６０分、５００ｍＬ／６０分、１０００ｍＬ／６０分、又はそれよりも大きな速度で連続的に取り出される。特定の態様では、培養の一部は、１ｇ／分、２ｇ／分、３ｇ／分、４ｇ／分、５ｇ／分、６ｇ／分、７ｇ／分、８ｇ／分、９ｇ／分、１０ｇ／分、２０ｇ／分、３０ｇ／分、４０ｇ／分、５０ｇ／分、６０ｇ／分、７０ｇ／分、８０ｇ／分、９０ｇ／分、１００ｇ／分、又はそれよりも大きな速度で連続的に取り出される。特定の態様では、培養の一部は、１ｇ／１５分、２ｇ／１５分、３ｇ／１５分、４ｇ／１５分、５ｇ／１５分、６ｇ／１５分、７ｇ／１５分、８ｇ／１５分、９ｇ／１５分、１０ｇ／１５分、２０ｇ／１５分、３０ｇ／１５分、４０ｇ／１５分、５０ｇ／１５分、６０ｇ／１５分、７０ｇ／１５分、８０ｇ／１５分、９０ｇ／１５分、１００ｇ／１５分、又はそれよりも大きな速度で連続的に取り出される。特定の態様では、培養の一部は、１ｇ／３０分、２ｇ／３０分、３ｇ／３０分、４ｇ／３０分、５ｇ／３０分、６ｇ／３０分、７ｇ／３０分、８ｇ／３０分、９ｇ／３０分、１０ｇ／３０分、２０ｇ／３０分、３０ｇ／３０分、４０ｇ／３０分、５０ｇ／３０分、６０ｇ／３０分、７０ｇ／３０分、８０ｇ／３０分、９０ｇ／３０分、１００ｇ／３０分、又はそれよりも大きな速度で連続的に取り出される。特定の態様では、培養の一部は、１ｇ／６０分、２ｇ／６０分、３ｇ／６０分、４ｇ／６０分、５ｇ／６０分、６ｇ／６０分、７ｇ／６０分、８ｇ／６０分、９ｇ／６０分、１０ｇ／６０分、２０ｇ／６０分、３０ｇ／６０分、４０ｇ／６０分、５０ｇ／６０分、６０ｇ／６０分、７０ｇ／６０分、８０ｇ／６０分、９０ｇ／６０分、１００ｇ／６０分、又はそれよりも大きな速度で連続的に取り出される。特定の態様では、培養の一部は、０．２ｋｇ／分、０．４ｋｇ／分、０．６ｋｇ／分、０．８ｋｇ／分、１．０ｋｇ／分、１．２ｋｇ／分、１．４ｋｇ／分、１．６ｋｇ／分、１．８ｋｇ／分、２．０ｋｇ／分、３．０ｋｇ／分、４．０ｋｇ／分、５．０ｋｇ／分、又はそれよりも大きな速度で連続的に取り出される。特定の態様では、培養の一部は、０．２ｋｇ／１５分、０．４ｋｇ／１５分、０．６ｋｇ／１５分、０．８ｋｇ／１５分、１．０ｋｇ／１５分、１．２ｋｇ／１５分、１．４ｋｇ／１５分、１．６ｋｇ／１５分、１．８ｋｇ／１５分、２．０ｋｇ／１５分、３．０ｋｇ／１５分、４．０ｋｇ／１５分、５．０ｋｇ／１５分、又はそれよりも大きな速度で連続的に取り出される。特定の態様では、培養の一部は、０．２ｋｇ／３０分、０．４ｋｇ／３０分、０．６ｋｇ／３０分、０．８ｋｇ／３０分、１．０ｋｇ／３０分、１．２ｋｇ／３０分、１．４ｋｇ／３０分、１．６ｋｇ／３０分、１．８ｋｇ／３０分、２．０ｋｇ／３０分、３．０ｋｇ／３０分、４．０ｋｇ／３０分、５．０ｋｇ／３０分、又はそれよりも大きな速度で連続的に取り出される。特定の態様では、培養の一部は、０．２ｋｇ／６０分、０．４ｋｇ／６０分、０．６ｋｇ／６０分、０．８ｋｇ／６０分、１．０ｋｇ／６０分、１．２ｋｇ／６０分、１．４ｋｇ／６０分、１．６ｋｇ／６０分、１．８ｋｇ／６０分、２．０ｋｇ／６０分、３．０ｋｇ／６０分、４．０ｋｇ／６０分、５．０ｋｇ／６０分、又はそれよりも大きな速度で連続的に取り出される。
【００７５】
特定の態様では、培養の一部は、発酵装置、バイオリアクター、又は細胞培養容器から所望の時間間隔で非連続的に取り出される。特定の態様では、培養の一部は、発酵装置、バイオリアクター、又は細胞培養容器から、５分おき、１０分おき、１５分おき、２０分おき、２５分おき、３０分おき、３５分おき、４０分おき、４５分おき、５０分おき、５５分おき、６０分おき、又はそれよりも大きな間隔で取り出される。特定の態様では、それぞれの間隔において、１ｍＬ、５ｍＬ、１０ｍＬ、１５ｍＬ、２０ｍＬ、２５ｍＬ、３０ｍＬ、３５ｍＬ、４０ｍＬ、４５ｍＬ、５０ｍＬ、７５ｍＬ、１００ｍＬ、１２５ｍＬ、１５０ｍＬ、１７５ｍＬ、２００ｍＬ、２２５ｍＬ、２５０ｍＬ、又はそれよりも多くが培養から取り出される。特定の態様では、それぞれの間隔において、０．２ｋｇ、０．４ｋｇ、０．６ｋｇ、０．８ｋｇ、１．０ｋｇ、１．２ｋｇ、１．４ｋｇ、１．６ｋｇ、１．８ｋｇ、２．０ｋｇ、又はそれよりも多くが培養から取り出される。
【００７６】
特定の態様では、本明細書において述べられる改良された方法のいずれかによって培養される細胞は、プロモーターと機能的に連結されたイソプレンシンターゼポリペプチド、ＤＸＳポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド、ＤＸＰ経路ポリペプチド及び／又はＭＶＡ経路ポリペプチドをコードした１つ以上の異種核酸を有する、本明細書において述べられるイソプレン生成細胞のいずれかである。特定の態様では、イソプレンシンターゼをコードした異種核酸を有する細胞は、（ｉ）４０ｇ／Ｌよりも高い力価でイソプレンを生成するか、又は（ｉｉ）イソプレン約５００ｍｇ／Ｌブロス／時間よりも高い平均の体積生産性を有する。
【００７７】
特定の態様では、ＤＸＰ経路ポリペプチドは、ＤＸＳ（１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ）、ＤＸＲ（１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸リダクトイソメラーゼ）、ＭＣＴ（４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールシンターゼ）、ＣＭＫ（４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールキナーゼ）、ＭＣＳ（２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール−２，４−シクロ二リン酸シンターゼ）、ＨＤＳ（１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル−４−二リン酸シンターゼ）、ＨＤＲ（１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル−４−二リン酸レダクターゼ）、及びＩＤＩポリペプチドからなる群から選択される。
【００７８】
特定の態様では、ＭＶＡ経路ポリペプチドは、上流ＭＶＡ経路ポリペプチドである。特定の態様では、上流ＭＶＡ経路ポリペプチドは、（ｉ）アセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ（チオラーゼ）ポリペプチド、（ｉｉ）３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼポリペプチド、及び（ｉｉｉ）３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼポリペプチドからなる群から選択される。特定の態様では、上流ＭＶＡ経路ポリペプチドは、エンテロコッカス（Enterococcus）属に由来するものである。特定の態様では、上流ＭＶＡ経路ポリペプチドは、エンテロコッカス・フィカリスに由来するものである。特定の態様では、上流ＭＶＡ経路ポリペプチドは、エンテロコッカス・フィカリスに由来するアセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ（チオラーゼ）ポリペプチド、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼポリペプチド、及び３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼポリペプチドを含む。
【００７９】
特定の態様では、ＭＶＡ経路ポリペプチドは下流ＭＶＡ経路ポリペプチドである。特定の態様では、下流ＭＶＡ経路ポリペプチドは、（ｉ）メバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）、（ｉｉ）ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）、（ｉｉｉ）ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＭＶＤ）、及び（ｉｖ）イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＤＩ）からなる群から選択される。特定の態様では、下流ＭＶＡ経路ポリペプチドは、メタノサルシナ属に由来するものである。特定の態様では、下流ＭＶＡ経路ポリペプチドは、メタノサルシナ・マゼイに由来するものである。特定の態様では、下流ＭＶＡ経路ポリペプチドは、メタノサルシナ・マゼイに由来するＭＶＫポリペプチドを含む。特定の態様では、下流ＭＶＡ経路ポリペプチドは、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）に由来するＭＶＫポリペプチド、ＰＭＫポリペプチド、ＭＶＤポリペプチド、及びＩＤＩポリペプチドを含む。特定の態様では、下流ＭＶＡポリペプチドは、メタノサルシナ・マゼイに由来するＭＶＫポリペプチド、並びに、サッカロマイセス・セレビシエに由来するＭＶＫポリペプチド、ＰＭＫポリペプチド、ＭＶＤポリペプチド、及びＩＤＩポリペプチドを含む。
【００８０】
特定の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、プエラリア属に由来する天然ポリペプチドである。特定の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、プエラリア・モンタナに由来する天然ポリペプチドである。特定の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、ヤマナラシ属に由来する天然ポリペプチドである。特定の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、ギンドロに由来する天然ポリペプチドである。
【００８１】
特定の態様では、上流ＭＶＡ経路ポリペプチドは、エンテロコッカス・フィカリスに由来するアセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ（チオラーゼ）ポリペプチド、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼポリペプチド、及び３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼポリペプチドを含み、下流ＭＶＡ経路ポリペプチドは、メタノサルシナ・マゼイに由来するＭＶＫポリペプチド、並びに、サッカロマイセス・セレビシエに由来するＭＶＫポリペプチド、ＰＭＫポリペプチド、ＭＶＤポリペプチド、及びＩＤＩポリペプチドを含み、イソプレンシンターゼポリペプチドは、ギンドロに由来するものである。
【００８２】
特定の態様では、細胞は、約４０ｇ／Ｌよりも高い力価でイソプレンを生成する。特定の態様では、細胞は、約５０ｇ／Ｌよりも高い力価でイソプレンを生成する。特定の態様では、細胞は、約６０ｇ／Ｌよりも高い力価でイソプレンを生成する。特定の態様では、細胞は、約７０ｇ／Ｌよりも高い力価でイソプレンを生成する。特定の態様では、細胞は、約８０ｇ／Ｌよりも高い力価でイソプレンを生成する。特定の態様では、細胞は、約９０ｇ／Ｌよりも高い力価でイソプレンを生成する。特定の態様では、細胞は、約１００ｇ／Ｌよりも高い力価でイソプレンを生成する。特定の態様では、細胞は、約１１０ｇ／Ｌよりも高い力価でイソプレンを生成する。特定の態様では、細胞は、約１２０ｇ／Ｌよりも高い力価でイソプレンを生成する。特定の態様では、細胞は、約１３０ｇ／Ｌよりも高い力価でイソプレンを生成する。特定の態様では、細胞は、約１４０ｇ／Ｌよりも高い力価でイソプレンを生成する。特定の態様では、細胞は、約１５０ｇ／Ｌよりも高い力価でイソプレンを生成する。特定の態様では、細胞は、約１６０ｇ／Ｌよりも高い力価でイソプレンを生成する。特定の態様では、細胞は、約１７０ｇ／Ｌよりも高い力価でイソプレンを生成する。特定の態様では、細胞は、約１８０ｇ／Ｌよりも高い力価でイソプレンを生成する。特定の態様では、細胞は、約１９０ｇ／Ｌよりも高い力価でイソプレンを生成する。特定の態様では、細胞は、約２００ｇ／Ｌよりも高い力価でイソプレンを生成する。特定の態様では、細胞は、約４０ｇ／Ｌ〜約１００ｇ／Ｌの力価でイソプレンを生成する。特定の態様では、細胞は、約６０ｇ／Ｌ〜約１００ｇ／Ｌの力価でイソプレンを生成する。特定の態様では、細胞は、約６０ｇ／Ｌ〜約１２０ｇ／Ｌの力価でイソプレンを生成する。特定の態様では、細胞は、約４０ｇ／Ｌ〜約１５０ｇ／Ｌの力価でイソプレンを生成する。特定の態様では、細胞は、約４０ｇ／Ｌ〜約２００ｇ／Ｌの力価でイソプレンを生成する。特定の態様では、細胞は、約８０ｇ／Ｌ〜約１５０ｇ／Ｌの力価でイソプレンを生成する。特定の態様では、細胞は、約１００ｇ／Ｌ〜約１５０ｇ／Ｌの力価でイソプレンを生成する。特定の態様では、細胞は、約１００ｇ／Ｌ〜約１８０ｇ／Ｌの力価でイソプレンを生成する。特定の態様では、細胞は、約１００ｇ／Ｌ〜約２００ｇ／Ｌの力価でイソプレンを生成する。特定の態様では、細胞は、約１２０ｇ／Ｌ〜約２００ｇ／Ｌの力価でイソプレンを生成する。特定の態様では、細胞は、イソプレン５００ｍｇ／Ｌブロス／時間よりも高い平均の体積生産性を有する。特定の態様では、細胞は、イソプレン１，０００ｍｇ／Ｌブロス／時間よりも高い平均の体積生産性を有する。特定の態様では、細胞は、イソプレン１，５００ｍｇ／Ｌブロス／時間よりも高い平均の体積生産性を有する。特定の態様では、細胞は、イソプレン２，０００ｍｇ／Ｌブロス／時間よりも高い平均の体積生産性を有する。特定の態様では、細胞は、イソプレン約５００ｍｇ／Ｌブロス／時間〜約２，０００ｍｇ／Ｌブロス／時間の平均の体積生産性を有する。
【００８３】
特定の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、植物のイソプレンシンターゼポリペプチドである。特定の態様では、細胞は、ＩＤＩポリペプチドをコードした異種核酸を更に有する。特定の態様では、細胞は、ＩＤＩポリペプチドをコードした内因性核酸の染色体コピーを更に有する。特定の態様では、細胞は、ＤＸＳポリペプチドをコードした異種核酸を更に有する。特定の態様では、細胞は、ＤＸＰ経路ポリペプチドをコードした異種核酸を更に有する。特定の態様では、細胞は、ＤＸＳポリペプチドをコードした内因性核酸の染色体コピーを更に有する。特定の態様では、細胞は、ＩＤＩポリペプチド、及びＤＸＳポリペプチド又はＤＸＰ経路ポリペプチドをコードした１つ以上の核酸を更に有する。特定の態様では、１つの核酸が、イソプレンシンターゼポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド、及びＤＸＳポリペプチド又はＤＸＰ経路ポリペプチドをコードする。特定の態様では、１つのプラスミドが、イソプレンシンターゼポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド、及びＤＸＳポリペプチド又はＤＸＰ経路ポリペプチドをコードする。特定の態様では、細胞は、ＭＶＡ経路ポリペプチドをコードした異種核酸を更に有する。特定の態様では、細胞は、ＭＶＡ経路ポリペプチドをコードした内因性核酸の染色体コピーを更に有する。特定の態様では、ＭＶＡ経路ポリペプチドはメバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）である。特定の態様では、ＭＶＫは、メタノサルシナ属に由来するポリペプチドである。特定の態様では、ＭＶＫは、メタノサルシナ・マゼイに由来するポリペプチドである。
【００８４】
特定の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、プエラリア属に由来する天然ポリペプチドである。特定の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、プエラリア・モンタナに由来する天然ポリペプチドである。特定の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、ヤマナラシ属に由来する天然ポリペプチドである。特定の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、ギンドロに由来する天然ポリペプチドである。特定の態様では、細胞は、ＭＶＡ経路ポリペプチドをコードした異種核酸を更に有する。特定の態様では、ＭＶＡ経路ポリペプチドはメバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）である。特定の態様では、ＭＶＫは、メタノサルシナ属に由来するポリペプチドである。特定の態様では、ＭＶＫは、メタノサルシナ・マゼイに由来するポリペプチドである。特定の態様では、細胞は細菌細胞である。特定の態様では、細胞はグラム陽性細菌細胞である。特定の態様では、細胞はバシラス細胞である。特定の態様では、細胞はバシラス・サブティリス細胞である。特定の態様では、細胞はグラム陰性細菌細胞である。特定の態様では、細胞はエシェリキア又はパントエア細胞である。特定の態様では、細胞は大腸菌又はパントエア・シトレア細胞である。特定の態様では、細胞は真菌細胞である。特定の態様では、細胞はトリコデルマ細胞である。特定の態様では、細胞はトリコデルマ・リーゼイ細胞である。特定の態様では、細胞は酵母細胞である。特定の態様では、細胞はヤロウィア細胞である。特定の態様では、細胞はヤロウィア・リポリティカ細胞である。
【００８５】
核酸を単離する代表的な方法
イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＤＸＰ経路ポリペプチド、ＭＶＡ経路ポリペプチド、ＰＧＬ、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟化因子及び／又は転写因子の核酸は、標準的な方法を用いて単離することが可能である。対象とする供給源生物（細菌ゲノムなど）から所望の核酸を得る方法は、一般的なものであり、分子生物学の技術分野では周知のものである（例えば国際特許出願公開第ＷＯ  ２００４／０３３６４６号及び当該明細書の引用文献を参照）。既知の配列のＰＣＲ増幅、核酸の合成、ゲノムライブラリーのスクリーニング、コスミドライブラリーのスクリーニングなどの標準的な核酸の単離方法については、国際特許出願公開第ＷＯ  ２００９／０７６６７６号、米国特許出願第１２／３３５，０７１号（米国特許出願公開第２００９／０２０３１０２号）、国際特許出願公開第ＷＯ  ２０１０／００３００７号、米国特許出願公開第２０１０／００４８９６４号、国際特許出願公開第ＷＯ  ２００９／１３２２２０号、及び米国特許出願公開第２０１０／０００３７１６号に述べられている。
【００８６】
代表的なプロモーター及びベクター
本明細書において述べられるイソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＤＸＰ経路ポリペプチド、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路ポリペプチド、ＰＧＬ、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟化因子及び／又は転写因子の核酸は、いずれも１つ以上のベクターに含ませることができる。したがって、本明細書では、本明細書において述べられるイソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＤＸＰ経路ポリペプチド、ＭＶＡ経路ポリペプチド、ＰＧＬ、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟化因子及び／又は転写因子のポリペプチドのいずれかをコードした１つ以上の核酸を有するベクターについても述べる。特定の態様では、ベクターは発現調節配列の制御下の核酸を有する。特定の態様では、発現調節配列は天然の発現調節配列である。特定の態様では、発現調節配列は非天然の発現調節配列である。特定の態様では、ベクターは選択マーカー又は選択可能なマーカーを有する。特定の態様では、イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＤＸＰ経路、ＭＶＡ経路、ＰＧＬ、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟化又は転写調節の核酸は、選択可能なマーカーなしで細胞の染色体に組み込まれる。
【００８７】
適当なベクターは、使用されるホスト細胞と適合性を有するものである。適当なベクターは、例えば細菌、ウイルス（バクテリオファージＴ７、又はＭ−１３由来ファージ）、コスミド、酵母、又は植物に由来するものであってよい。適当なベクターは、ホスト細胞中で、低、中、又は高コピー数で維持されうる。こうしたベクターを取得及び使用するためのプロトコールは、当業者には周知のものである（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，１９８９を参照）。本明細書において述べられる細胞及び方法と適合性を有する適当なベクターについては、国際特許出願公開第ＷＯ  ２００９／０７６６７６号、米国特許出願第１２／３３５，０７１号（米国特許出願公開第２００９／０２０３１０２号）、国際特許出願公開第ＷＯ  ２０１０／００３００７号、米国特許出願公開第２０１０／００４８９６４号、国際特許出願公開第ＷＯ  ２００９／１３２２２０号、及び米国特許出願公開第２０１０／０００３７１６号に述べられている。
【００８８】
プロモーターは、当該技術分野では周知のものである。ホスト細胞内で機能する任意のプロモーターを、イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＤＸＰ経路、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、ＰＧＬ、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟化因子及び／又は転写因子の核酸を、ホスト細胞内で発現させるために使用することができる。様々なホスト細胞内で、イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＤＸＰ経路、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、ＰＧＬ、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟化因子及び／又は転写因子の核酸の発現を誘導するうえで有用な開始調節領域又はプロモーターには多くのものがあり、当業者には周知のものである（例えば国際特許出願公開第ＷＯ  ２００４／０３３６４６号及び当該明細書の引用文献を参照）。グルコースイソメラーゼプロモーターなどの、これらの核酸を誘導可能な実質上すべてのプロモーターを使用することができる（例えば米国特許第７，１３２，５２７号及び当該明細書の引用文献を参照）。本明細書において述べられる細胞及び方法と適合性を有する適当なプロモーターについては、国際特許出願公開第ＷＯ  ２００９／０７６６７６号、米国特許出願第１２／３３５，０７１号（米国特許出願公開第２００９／０２０３１０２号）、国際特許出願公開第ＷＯ  ２０１０／００３００７号、米国特許出願公開第２０１０／００４８９６４号、国際特許出願公開第ＷＯ  ２００９／１３２２２０号、及び米国特許出願公開第２０１０／０００３７１６号に述べられている。
【００８９】
特定の態様では、発現ベクターはまた、ターミネーター配列を有する。ターミネーター調節領域は、ホスト細胞に自然に存在する様々な遺伝子に由来するものであってもよい。特定の態様では、ターミネーター配列及びプロモーター配列は同じ供給源に由来するものである。本明細書において述べられる細胞及び方法と適合性を有する適当なターミネーター配列は、いずれも参照により本明細書に援用するところの国際特許出願公開ＷＯ  ２００９／０７６６７６  Ａ２号、及び米国特許出願第１２／３３５，０７１号に述べられている。
【００９０】
イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＤＸＰ経路、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、ＰＧＬ、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟化因子及び／又は転写因子の核酸は、標準的な技術を用いて発現ベクターなどのベクターに組み込むことができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，１９８２）。本明細書において述べられる細胞及び方法と適合性を有する適当な技術については、国際特許出願公開第ＷＯ  ２００９／０７６６７６号、米国特許出願第１２／３３５，０７１号（米国特許出願公開第２００９／０２０３１０２号）、国際特許出願公開第ＷＯ  ２０１０／００３００７号、米国特許出願公開第２０１０／００４８９６４号、国際特許出願公開第ＷＯ  ２００９／１３２２２０号、及び米国特許出願公開第２０１０／０００３７１６号に述べられている。
【００９１】
特定の態様では、イソプレンシンターゼ、ＤＸＰ経路ポリペプチド、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路ポリペプチド、ＰＧＬ、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟化因子及び／又は転写因子の核酸は、天然細胞内で一般に見られるよりも大幅に高いレベルで過剰発現させることが望ましい場合がある。特定の態様では、イソプレンシンターゼ、ＤＸＰ経路ポリペプチド、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路ポリペプチド、ＰＧＬ、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟化因子又は転写因子のポリペプチドをコードした核酸は、天然細胞内で一般に見られるよりも大幅に低いレベルで過小発現させる（例えば突然変異、不活性化、又は欠失させる）ことが望ましい場合もある。本明細書において述べられる細胞及び方法と適合性を有するイソプレンシンターゼ、ＤＸＰ経路ポリペプチド、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路ポリペプチド、ＰＧＬ、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟化因子及び／又は転写因子の核酸を過剰又は過小に発現させるのに適した方法については、国際特許出願公開第ＷＯ  ２００９／０７６６７６号、米国特許出願第１２／３３５，０７１号（米国特許出願公開第２００９／０２０３１０２号）、国際特許出願公開第ＷＯ  ２０１０／００３００７号、米国特許出願公開第２０１０／００４８９６４号、国際特許出願公開第ＷＯ  ２００９／１３２２２０号、及び米国特許出願公開第２０１０／０００３７１６号に述べられている。
【００９２】
代表的な供給源生物
イソプレンシンターゼ、ＤＸＰ経路、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、ＰＧＬ、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟化因子及び／又は転写因子の核酸（及びこれらがコードするポリペプチド）は、イソプレンシンターゼ、ＤＸＰ経路、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、ＰＧＬ、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟化因子及び／又は転写因子の核酸を自然に含む任意の生物から得ることができる。上記に述べたように、イソプレンは、細菌、酵母、植物、及び動物などの様々な生物によって自然に生成される。生物は、イソプレンを生成するためのＭＶＡ経路、ＤＸＰ経路、又はＭＶＡ及びＤＸＰ経路の両方を有している（図１Ａ及び１Ｂ）。したがって、ＤＸＰ経路の核酸は、例えばＤＸＰ経路を有するか、又はＭＶＡ及びＤＸＰ経路の両方を有するあらゆる生物から得ることができる。ＩＤＩ及びイソプレンシンターゼの核酸は、例えばＭＶＡ経路、ＤＸＰ経路、又はＭＶＡ及びＤＸＰ経路の両方を有するあらゆる生物から得ることができる。ＭＶＡ経路の核酸は、例えばＭＶＡ経路を有するか、又はＭＶＡ及びＤＸＰ経路の両方を有するあらゆる生物から得ることができる。ヒドロゲナーゼの核酸は、例えば水素を酸化するか、又は水素イオンを還元するあらゆる生物から得ることができる。発酵副生成物の遺伝子は、例えば、解糖のような、酸素が制限された、すなわち嫌気的呼吸を行うあらゆる生物から得るか又は同定することができる。
【００９３】
イソプレンシンターゼ、ＤＸＰ経路、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、ＰＧＬ、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟化因子及び／又は転写因子の核酸の核酸配列は、細菌、真菌、植物、藻類、又はシアノバクテリアから単離することができる。代表的な供給源生物としては例えば、サッカロマイセス属の種（例えば、Ｓ．セレビシアエ）、又はヤロウィア属の種（例えば、ヤロウィア・リポリティカ）などの酵母、トリコデルマ属の種（例えばＴ．リーゼイ（T．reesei））などの他の真菌、バシラス属の種（例えば、Ｂ．サブティリス（B．subtilis））、エシェリキア属の種（例えば大腸菌（E．coli））、メタノサルシナ属の種（例えば、メタノサルシナ・マゼイ）、又はパントエア属の種（例えば、Ｐ．シトレア（P．citrea））などの細菌、クズ若しくはポプラ（例えば、ギンドロとヨーロッパヤマナラシとの雑種（Populus alba x tremula）ＣＡＣ３５６９６）又はヤマナラシ（例えば、アメリカヤマナラシ（Populus tremuloides））などの植物が挙げられる。代表的なホスト生物については、米国特許仮出願第６１／１８７，９５９号、国際特許出願公開第ＷＯ  ２００９／０７６６７６号、米国特許出願第１２／３３５，０７１号（米国特許出願公開第２００９／０２０３１０２号）、国際特許出願公開第ＷＯ  ２０１０／００３００７号、米国特許出願公開第２０１０／００４８９６４号、国際特許出願公開第ＷＯ  ２００９／１３２２２０号、及び米国特許出願公開第２０１０／０００３７１６号に述べられている。
【００９４】
代表的なホスト細胞
様々なホスト細胞を、イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＤＸＰ経路ポリペプチド、ＭＶＡ経路ポリペプチド、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟化因子及び／又は転写因子ポリペプチドを発現させ、本明細書において述べる方法でイソプレン及び水素を同時生成させる目的で使用することができる。代表的なホスト細胞としては、「代表的な供給源生物」の見出しで前項において列記した生物のいずれかに由来する細胞が挙げられる。ホスト細胞は、イソプレンを自然に生成する細胞であっても、イソプレンを自然には生成しない細胞であってもよい。特定の態様では、ホスト細胞はＤＸＰ経路を使用してイソプレンを自然に生成し、この経路を使用したイソプレンの生成を促進するためにイソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、及び／又はＩＤＩ核酸が加えられる。特定の態様では、ホスト細胞はＭＶＡ経路を使用してイソプレンを自然に生成し、この経路を使用したイソプレンの生成を促進するためにイソプレンシンターゼ及び／又は１つ以上のＭＶＡ経路の核酸が加えられる。特定の態様では、ホスト細胞はＤＸＰ経路を使用してイソプレンを自然に生成し、ＭＶＡ経路及びＤＸＰ経路の一部又は全体を使用してイソプレンを生成するために１つ以上のＭＶＡ経路の核酸が加えられる。特定の態様では、ホスト細胞は、ＤＸＰ及びＭＶＡ経路の両方を使用してイソプレンを自然に生成し、これらの経路の一方又は両方によるイソプレンの生成を促進するために１つ以上のイソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、又はＭＶＡ経路の核酸が加えられる。
【００９５】
ＤＸＰ及びＭＶＡ経路の両方を使用してイソプレンを自然に生成する細胞を含む、本明細書において述べられる方法との使用に適した様々な種類のホスト細胞が、国際特許出願公開第ＷＯ  ２００９／０７６６７６号、米国特許出願第１２／３３５，０７１号（米国特許出願公開第２００９／０２０３１０２号）、国際特許出願公開第ＷＯ  ２０１０／００３００７号、米国特許出願公開第２０１０／００４８９６４号、国際特許出願公開第ＷＯ  ２００９／１３２２２０号、及び米国特許出願公開第２０１０／０００３７１６号に述べられている。非限定的なホスト細胞としては、大腸菌、パントエア・シトレア、バシラス・サブティリス、ヤロウィア・リポリティカ、及びトリコデルマ・リーゼイが挙げられる。
【００９６】
代表的な形質転換方法
イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、ＰＧＬ、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟化因子及び／又は転写因子の核酸、又はこれらを含むベクターは、形質転換、エレクトロポレーション、核マイクロインジェクション、トランスダクション、トランスフェクション（例えばリポフェクション媒介若しくはＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、又は組換えファージウイルスを使用したトランスフェクション）、リン酸カルシウムＤＮＡ沈殿物とのインキュベーション、ＤＮＡコーティングした微粒子による高速ボンバードメント、及びプロトプラスト融合などの、ホスト細胞内にＤＮＡコンストラクト又はベクターを導入するための標準的な技術を使用してホスト細胞（例えば本明細書において述べられるような植物細胞、真菌細胞、酵母細胞、又は細菌細胞）内に挿入することができる。一般的な形質転換技法は、当該技術分野では周知のものである（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら（編）Ｃｈａｐｔｅｒ  ９，１９８７；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，１９８９；及びＣａｍｐｂｅｌｌら、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１６：５３〜５６，１９８９を参照）。導入された核酸は、染色体ＤＮＡに組み込まれるか、染色体外の複製配列として維持されうる。形質転換体は、当該技術分野では周知の任意の方法によって選択することができる。形質転換体の選択に適した方法については、米国特許仮出願第６１／１８７，９５９号、国際特許出願公開第ＷＯ  ２００９／０７６６７６号、米国特許出願第１２／３３５，０７１号（米国特許出願公開第２００９／０２０３１０２号）、国際特許出願公開第ＷＯ  ２０１０／００３００７号、米国特許出願公開第２０１０／００４８９６４号、国際特許出願公開第ＷＯ  ２００９／１３２２２０号、及び米国特許出願公開第２０１０／０００３７１６号に述べられている。
【００９７】
代表的な細胞培地
「培養中の細胞」とは、細胞が１回以上の細胞分裂を行うことを可能とする溶液（例えば細胞増殖培地）中の２つ以上の細胞のことを意味する。「培養中の細胞」には、植物組織に分化した細胞を有する生きた多細胞植物の一部をなす植物細胞は含まれない。様々な態様では、細胞培養は、少なくとも、又は約１０、２０、５０、１００、２００、５００、１，０００、５，０００、１０，０００、若しくはこれよりも多い細胞を含む。
【００９８】
任意の炭素源を使用してホスト細胞を培養することができる。「炭素源」なる用語は、ホスト細胞又は生物によって代謝されうる１つ以上の炭素含有化合物のことを指す。例えば、ホスト細胞を培養するために使用される細胞培地は、生存率を維持するか又はホスト細胞を増殖させるのに適した任意の炭素源を含みうる。
【００９９】
本明細書において述べられる方法に基づく、イソプレン生成細胞を培養するのに適した様々な炭素源については、いずれも参照によりその全容を本明細書に援用する国際特許出願公開第ＷＯ  ２００９／０７６６７６Ａ２号及び米国特許出願第１２／３３５，０７１号に述べられている。
【０１００】
特定の態様では、細胞を、生理学的塩類及び栄養素を含む標準培地中で培養する（例えば、Ｐｏｕｒｑｕｉｅ，Ｊ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ、Ａｕｂｅｒｔら編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．７１〜８６，１９８８及びＩｌｍｅｎら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３：１２９８〜１３０６，１９９７を参照）。代表的な増殖培地は、ルリア−ベルターニ（ＬＢ）ブロス、サブローデキストロース（ＳＤ）ブロス、又は酵素培地（ＹＭ）ブロスなどの一般的な商業的に調製された培地である。他の限定又は合成増殖培地を使用することも可能であり、特定のホスト細胞の増殖に適した培地は、微生物学又は発酵科学の当業者には周知のものである。
【０１０１】
細胞培地は、適当な炭素源以外に、適当なミネラル、塩類、補因子、バッファー、及び培養の増殖又はイソプレン生成の促進に適した当業者には周知の他の成分を含むことが望ましい（例えば、国際特許出願公開第ＷＯ  ２００４／０３３６４６号及び当該明細書の引用文献、並びに国際特許出願公開第ＷＯ  ９６／３５７９６号及び当該明細書の引用文献を参照）。イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、及び／又はＭＶＡ経路の核酸が誘導性プロモーターの制御下にあるような特定の態様では、誘導物質（例えば、糖、金属塩又は抗微生物剤など）を、イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＤＸＰ経路ポリペプチド及び／又はＭＶＡ経路ポリペプチドの発現を誘導するうえで有効な濃度で培地に加えることが望ましい。特定の態様では、細胞培地は、１つ以上のイソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＤＸＰ経路の核酸又はＭＶＡ経路の核酸を有するベクター上の抗生物質耐性核酸（カナマイシン耐性核酸など）に対応した抗生物質（カナマイシンなど）を有する。
【０１０２】
代表的な細胞培養条件
細菌培地の維持及び増殖に適した材料及び方法は、当該技術分野では周知のものである。代表的な技術は、Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  Ｇｅｒｈａｒｄｔら編、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９９４）又は、Ｂｒｏｃｋ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡに見ることができる。特定の態様では、細胞は、ホスト細胞内に挿入される核酸によってコードされた１つ以上のイソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＤＸＰ経路ポリペプチド及び／又はＭＶＡ経路ポリペプチドの発現を可能とする条件下で培地中で培養される。
【０１０３】
標準的な細胞培養条件が細胞の培養に適している（例えば、国際特許出願公開第ＷＯ  ２００４／０３３６４６号、及び当該明細書の引用文献を参照）。細胞は、適当な温度、混合気体、及びｐＨ（約２０℃〜約３７℃、約６％〜約８４％  ＣＯ２、及び約５〜約９のｐＨ）で増殖及び維持される。特定の態様では、細胞を適当な細胞培地中、３５℃で増殖させる。特定の態様では、例えば、培養は、振盪培養又は発酵装置中、適当な培地中で約２８℃で、所望の量のイソプレン及び水素の同時生成が実現されるまで培養される。特定の態様では、発酵のｐＨ範囲は、約ｐＨ  ５．０〜約ｐＨ  ９．０（約ｐＨ  ６．０〜約ｐＨ  ８．０、又は約６．５〜約７．０）である。反応は、ホスト細胞の要求条件に基づいて、好気的、無酸素的、又は嫌気的条件下で行うことができる。
【０１０４】
標準的な培養条件及び、回分発酵、流加発酵、又は連続発酵といった発酵の方式については、国際特許出願公開第ＷＯ  ２００９／０７６６７６号、米国特許出願第１２／３３５，０７１号（米国特許出願公開第２００９／０２０３１０２号）、国際特許出願公開第ＷＯ  ２０１０／００３００７号、米国特許出願公開第２０１０／００４８９６４号、国際特許出願公開第ＷＯ  ２００９／１３２２２０号、及び米国特許出願公開第２０１０／０００３７１６号に述べられている。回分発酵及び流加発酵は一般的かつ当該技術分野では周知のものであり、その例は、Ｂｒｏｃｋ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．に見ることができる。
【０１０５】
特定の態様では、構成的又はリーキー（leaky）なプロモーター（Ｔｒｃプロモーターなど）が使用され、プロモーターと機能的に連結されたイソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＤＸＰ経路の核酸、又はＭＶＡ経路の核酸の発現を誘導するために化合物（ＩＰＴＧなど）は添加されない。特定の態様では、プロモーターと機能的に連結されたイソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＤＸＰ経路の核酸、又はＭＶＡ経路の核酸の発現を誘導するために所定の化合物（ＩＰＴＧなど）が添加される。
【０１０６】
代表的なイソプレンシンターゼポリペプチド及び核酸
特定の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードした異種核酸が大腸菌細胞に含まれる。特定の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチド又は核酸は、マメ亜科などのマメ科に由来するものである。特定の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチド又は核酸は、プエラリア・モンタナ（クズ）（Ｓｈａｒｋｅｙら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １３７：７００〜７１２，２００５）、プエラリア・ロバタ（Pueraria lobata）、ポプラ（ギンドロ、ヨーロッパクロヤマナラシ（Populus nigra）、ハコヤナギ（Populus trichocarpa）、又はギンドロとヨーロッパヤマナラシとの雑種）（ＣＡＣ３５６９６）Ｍｉｌｌｅｒら、Ｐｌａｎｔａ  ２１３：４８３〜４８７，２００１）、ヤマナラシ（アメリカヤマナラシなど）Ｓｉｌｖｅｒら、ＪＢＣ  ２７０（２２）：１３０１０〜１３１６，１９９５）、又はヨーロッパナラ（Quercus robur）（Ｚｉｍｍｅｒら、国際特許出願公開第ＷＯ  ９８／０２５５０号）に由来するポリペプチド又は核酸である。特定の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチド又は核酸は、天然のイソプレンシンターゼポリペプチド又は核酸である。特定の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチド又は核酸は、天然のイソプレンシンターゼポリペプチド又は核酸ではない。代表的なイソプレンシンターゼポリペプチド及び核酸、並びにイソプレンシンターゼ活性を測定するための方法については、国際特許出願公開第ＷＯ  ２００９／０７６６７６号、米国特許出願第１２／３３５，０７１号（米国特許出願公開第２００９／０２０３１０２号）、国際特許出願公開第ＷＯ  ２０１０／００３００７号、米国特許出願公開第２０１０／００４８９６４号、国際特許出願公開第ＷＯ  ２００９／１３２２２０号、及び米国特許出願公開第２０１０／０００３７１６号により詳細に述べられている。
【０１０７】
代表的なＤＸＰ経路ポリペプチド及び核酸
代表的なＤＸＰ経路ポリペプチドとしては、これらに限定されるものではないが、以下のポリペプチドが挙げられる。すなわち、ＤＸＳポリペプチド、ＤＸＲポリペプチド、ＭＣＴポリペプチド、ＣＭＫポリペプチド、ＭＣＳポリペプチド、ＨＤＳポリペプチド、ＨＤＲポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド、及び、１種、２種、又はそれ以上のＤＸＰ経路ポリペプチドの活性を有するポリペプチド（例えば融合ポリペプチド）。詳細には、ＤＸＰ経路ポリペプチドとしては、ＤＸＰ経路ポリペプチドの少なくとも１つの活性を有するポリペプチド、ポリペプチドのフラグメント、ペプチド、及び融合ポリペプチドが挙げられる。代表的なＤＸＰ経路の核酸としては、ポリペプチド、ポリペプチドのフラグメント、ペプチド、又はＤＸＰ経路ポリペプチドの少なくとも１つの活性を有する融合ポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。代表的なＤＸＰ経路ポリペプチド及び核酸としては、本明細書において述べられる供給源生物のいずれかに由来する天然ポリペプチド及び核酸、並びに本明細書において述べられる供給源生物のいずれかの突然変異ポリペプチド及び核酸が挙げられる。
【０１０８】
代表的なＤＸＳポリペプチドとしては、ＤＸＳ経路ポリペプチドの少なくとも１つの活性を有するポリペプチド、ポリペプチドのフラグメント、ペプチド、及び融合ポリペプチドが挙げられる。あるポリペプチドがＤＸＳポリペプチド活性を有するか否かは、標準的な方法（本明細書において述べられるものなど）を使用して、インビトロ、細胞抽出物中、又はインビボでピルビン酸とＤ−グリセルアルデヒド−３−リン酸を１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸に変換するそのポリペプチドの能力を測定することによって判定することが可能である。代表的なＤＸＳポリペプチド及び核酸、並びにＤＸＳ活性を測定するための方法については、国際特許出願公開第ＷＯ  ２００９／０７６６７６号、米国特許出願第１２／３３５，０７１号（米国特許出願公開第２００９／０２０３１０２号）、国際特許出願公開第ＷＯ  ２０１０／００３００７号、米国特許出願公開第２０１０／００４８９６４号、国際特許出願公開第ＷＯ  ２００９／１３２２２０号、及び米国特許出願公開第２０１０／０００３７１６号により詳細に述べられている。
【０１０９】
詳細には、ＤＸＳポリペプチドは、ピルビン酸とＤ−グリセルアルデヒド−３−リン酸を１−デオキシ−ｄ−キシルロース−５−リン酸（ＤＸＰ）に変換する。あるポリペプチドがＤＸＳポリペプチド活性を有するか否かは、標準的な方法を使用して、インビトロ、細胞抽出物中、又はインビボでピルビン酸とＤ−グリセルアルデヒド−３−リン酸を変換するそのポリペプチドの能力を測定することによって判定することが可能である。
【０１１０】
ＤＸＲポリペプチドは、１−デオキシ−ｄ−キシルロース−５−リン酸（ＤＸＰ）を、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール４−リン酸（ＭＥＰ）に変換する。あるポリペプチドがＤＸＲポリペプチド活性を有するか否かは、標準的な方法を使用して、インビトロ、細胞抽出物中、又はインビボでＤＸＰを変換するそのポリペプチドの能力を測定することによって判定することが可能である。
【０１１１】
ＭＣＴポリペプチドは、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール４−リン酸（ＭＥＰ）を、４−（シチジン５’−ジホスホ）−２−メチル−Ｄ−エリスリトール（ＣＤＰ−ＭＥ）に変換する。あるポリペプチドがＭＣＴポリペプチド活性を有するか否かは、標準的な方法を使用して、インビトロ、細胞抽出物中、又はインビボでＭＥＰを変換するそのポリペプチドの能力を測定することによって判定することが可能である。
【０１１２】
ＣＭＫポリペプチドは、４−（シチジン５’−ジホスホ）−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール（ＣＤＰ−ＭＥ）を、２−ホスホ−４−（シチジン５’−ジホスホ）−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール（ＣＤＰ−ＭＥＰ）に変換する。あるポリペプチドがＣＭＫポリペプチド活性を有するか否かは、標準的な方法を使用して、インビトロ、細胞抽出物中、又はインビボでＣＤＰ−ＭＥを変換するそのポリペプチドの能力を測定することによって判定することが可能である。
【０１１３】
ＭＣＳポリペプチドは、２−ホスホ−４−（シチジン５’−ジホスホ）−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール（ＣＤＰ−ＭＥＰ）を、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２，４−シクロ二リン酸（ＭＥ−ＣＰＰ又はｃＭＥＰＰ）に変換する。あるポリペプチドがＭＣＳポリペプチド活性を有するか否かは、標準的な方法を使用して、インビトロ、細胞抽出物中、又はインビボでＣＤＰ−ＭＥＰを変換するそのポリペプチドの能力を測定することによって判定することが可能である。
【０１１４】
ＨＤＳポリペプチドは、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２，４−シクロ二リン酸（ＭＥ−ＣＰＰ又はｃＭＥＰＰ）を、（Ｅ）−４−ヒドロキシ−３−メチルブト−２−エン−１−イル二リン酸（ＨＭＢＰＰ又はＨＤＭＡＰＰ）に変換する。あるポリペプチドがＨＤＳポリペプチド活性を有するか否かは、標準的な方法を使用して、インビトロ、細胞抽出物中、又はインビボでＭＥ−ＣＰＰ又はｃＭＥＰＰを変換するそのポリペプチドの能力を測定することによって判定することが可能である。
【０１１５】
ＨＤＲポリペプチドは、（Ｅ）−４−ヒドロキシ−３−メチルブト−２−エン−１−イル二リン酸（ＨＭＢＰＰ又はＨＤＭＡＰＰ）を、イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）とジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）に変換する。あるポリペプチドがＨＤＲポリペプチド活性を有するか否かは、標準的な方法を使用して、インビトロ、細胞抽出物中、又はインビボでＨＭＢＰＰ又はＨＤＭＡＰＰを変換するそのポリペプチドの能力を測定することによって判定することが可能である。
【０１１６】
ＩＤＩポリペプチドは、イソペンテニル二リン酸をジメチルアリル二リン酸に変換する。あるポリペプチドがＩＤＩポリペプチド活性を有するか否かは、標準的な方法を使用して、インビトロ、細胞抽出物中、又はインビボでイソペンテニル二リン酸を変換するそのポリペプチドの能力を測定することによって判定することが可能である。
【０１１７】
代表的なＩＤＩポリペプチド及び核酸
イソペンテニル二リン酸イソメラーゼポリペプチド（イソペンテニル−二リン酸Δ−イソメラーゼ、すなわちＩＤＩ）は、イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）とジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）との相互変換を触媒する（例えばＩＰＰをＤＭＡＰＰに変換する、及び／又はＤＭＡＰＰをＩＰＰに変換する）。代表的なＩＤＩポリペプチドとしては、ＩＤＩ経路ポリペプチドの少なくとも１つの活性を有するポリペプチド、ポリペプチドのフラグメント、ペプチド、及び融合ポリペプチドが挙げられる。あるポリペプチドがＩＤＩポリペプチド活性を有するか否かは、標準的な方法（本明細書において述べられるものなど）を使用して、インビトロ、細胞抽出物中、又はインビボでＩＰＰとＤＭＡＰＰとを相互変換するそのポリペプチドの能力を測定することによって判定することが可能である。代表的なＩＤＩポリペプチド及び核酸、並びにＩＤＩ活性を測定するための方法については、国際特許出願公開第ＷＯ  ２００９／０７６６７６号、米国特許出願第１２／３３５，０７１号（米国特許出願公開第２００９／０２０３１０２号）、国際特許出願公開第ＷＯ  ２０１０／００３００７号、米国特許出願公開第２０１０／００４８９６４号、国際特許出願公開第ＷＯ  ２００９／１３２２２０号、及び米国特許出願公開第２０１０／０００３７１６号により詳細に述べられている。
【０１１８】
代表的なＭＶＡ経路ポリペプチド及び核酸
代表的なＭＶＡ経路ポリペプチドとしては、アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ（ＡＡ−ＣｏＡチオラーゼ）ポリペプチド、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼ（ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ）ポリペプチド、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ）ポリペプチド、メバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）ポリペプチド、ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）ポリペプチド、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＭＶＤ）ポリペプチド、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＰＭＤＣ）ポリペプチド、イソペンテニルリン酸キナーゼ（ＩＰＫ）ポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド、及び、２種以上のＭＶＡ経路ポリペプチドの活性を有するポリペプチド（例えば融合ポリペプチド）が挙げられる。詳細には、ＭＶＡ経路ポリペプチドとしては、ＭＶＡ経路ポリペプチドの少なくとも１つの活性を有するポリペプチド、ポリペプチドのフラグメント、ペプチド、及び融合ポリペプチドが挙げられる。代表的なＭＶＡ経路ポリペプチド及び核酸、並びにＩＤＩ活性を測定するための方法については、国際特許出願公開第ＷＯ  ２００９／０７６６７６号、米国特許出願第１２／３３５，０７１号（米国特許出願公開第２００９／０２０３１０２号）、国際特許出願公開第ＷＯ  ２０１０／００３００７号、米国特許出願公開第２０１０／００４８９６４号、国際特許出願公開第ＷＯ  ２００９／１３２２２０号、及び米国特許出願公開第２０１０／０００３７１６号により詳細に述べられている。
【０１１９】
特定の態様では、細胞は、ＡＡ−ＣｏＡチオラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ、及びＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの核酸を含む上流ＭＶＡ経路を有する。特定の態様では、細胞は、ＭＶＫ、ＰＭＫ、ＭＶＤ、及びＩＤＩの核酸を含む下流ＭＶＡ経路を有する。特定の態様では、細胞は、ＡＡ−ＣｏＡチオラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、ＭＶＫ、ＰＭＫ、ＭＶＤ、及びＩＤＩの核酸を含むＭＶＡ経路全体を有する。特定の態様では、細胞は、ＡＡ−ＣｏＡチオラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、ＭＶＫ、ＰＭＤＣ、ＩＰＫ、及びＩＤＩの核酸を含むＭＶＡ経路全体を有する。
【０１２０】
本明細書において述べられる改良された方法は、イソプレン及び水素などの副生成物を生成するために用いることもできる。代表的なヒドロゲナーゼのポリペプチド及び核酸、発酵副生成物の生成に関連する遺伝子のポリペプチド及び核酸、並びに水素の再取り込みに関連する遺伝子のポリペプチド及び核酸を、本明細書において述べられる組成物及び方法とともに使用することもできる。こうしたポリペプチド及び核酸については、米国特許仮出願第６１／１４１，６５２号、米国特許仮出願第６１／１８７，９３４号、米国特許出願公開第２０１０／０１９６９８８号、国際特許出願公開第ＷＯ  ２０１０／０７８４５７号、国際特許出願公開第ＷＯ  ２００９／０７６６７６号、米国特許出願第１２／３３５，０７１号（米国特許出願公開第２００９／０２０３１０２号）、国際特許出願公開第ＷＯ  ２０１０／００３００７号、米国特許出願公開第２０１０／００４８９６４号、国際特許出願公開第ＷＯ  ２００９／１３２２２０号、及び米国特許出願公開第２０１０／０００３７１６号に述べられている。
【０１２１】
再生可能な資源から生成されるイソプレン組成物
再生可能な資源から生成されるイソプレン組成物（例えばバイオイソプレン）は、バイオイソプレンが、アルコール、アルデヒド、ケトンなどの、石油系イソプレン中に存在しないか又は大幅に低い濃度で存在する他の生体副生成物（生物学的供給源に由来する、及び／又は、バイオイソプレンとともに得られる生物学的プロセスと関連した化合物）とともに生成される点において石油系イソプレン組成物とは区別される。生体副生成物としては、これらに限定されるものではないが、エタノール、アセトン、メタノール、アセトアルデヒド、メタクロレイン、メチルビニルケトン、２−メチル−２−ビニルオキシラン、ｃｉｓ−及びｔｒａｎｓ−３−メチル−１，３−ペンタジエン、Ｃ５プレニルアルコール（３−メチル−３−ブテン−１−オール、又は３−メチル−２−ブテン−１−オール）、２−ヘプタノン、６−メチル−５−ヘプテン−２−オン、２，４，５−トリメチルピリジン、２，３，５−トリメチルピラジン、シトロネラール、メタンチオール、酢酸メチル、１−プロパノール、ジアセチル、２−ブタノン、２−メチル−３−ブテン−２−オール、酢酸エチル、２−メチル−１−プロパノール、３−メチル−１−ブタナール、３−メチル−２−ブタノン、１−ブタノール、２−ペンタノン、３−メチル−１−ブタノール、イソ酪酸エチル、３−メチル−２−ブテナール、酢酸ブチル、酢酸３−メチルブチル、酢酸３−メチル−３−ブテン−１−イル、酢酸３−メチル−２−ブテン−１−イル、３−ヘキセン−１−オール、酢酸３−ヘキセン−１−イル、リモネン、ゲラニオール（ｔｒａｎｓ−３，７−ジメチル−２，６−オクタジエン−１−オール）、シトロネロール（３，７−ジメチル−６−オクテン−１−オール）、（Ｅ）−３，７−ジメチル−１，３，６−オクタトリエン、（Ｚ）−３，７−ジメチル−１，３，６−オクタトリエン、２，３−シクロヘプテノールピリジン、又は直鎖状イソプレンポリマー（複数のイソプレン単位の重合によって得られる直鎖状イソプレンダイマー又は直鎖状イソプレントリマーなど）が挙げられる。バイオイソプレンに由来する生成物は、１つ以上の生体副生成物又は副生成物のいずれかに由来する化合物を含む。更に、バイオイソプレンに由来する生成物は、後の化学変換においてこれらの副生成物から生成される化合物を含みうる。このような化合物の例としては、イソプレンへの求ジエン体のディールス・アルダー環化付加反応、又はイソプレンの酸化から誘導されるものが挙げられる。
【０１２２】
特定の副生成物又は不純物を含む再生可能な資源から生成されるイソプレン組成物については、米国特許仮出願第６１／１８７，９５９号、米国特許出願第１２／８１８，０９０号、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１０／０３９０８８号、国際特許出願公開第ＷＯ  ２００９／０７６６７６号、米国特許出願第１２／３３５，０７１号（米国特許出願公開第２００９／０２０３１０２号）、国際特許出願公開第ＷＯ  ２０１０／００３００７号、米国特許出願公開第２０１０／００４８９６４号、国際特許出願公開第ＷＯ  ２００９／１３２２２０号、及び米国特許出願公開第２０１０／０００３７１６号により詳細に述べられている。
【０１２３】
代表的な精製方法
特定の態様では、本明細書において述べられる方法のいずれも、イソプレンを回収する工程を更に含む。イソプレンを生成及び回収するための効率的な方法の更なる例が、米国特許仮出願第６１／１８７，９５９号及び同第６１／１８７，９３４号、国際特許出願公開第ＷＯ  ２００９／０７６６７６号、米国特許出願第１２／３３５，０７１号（米国特許出願公開第２００９／０２０３１０２号）、国際特許出願公開第ＷＯ  ２０１０／００３００７号、米国特許出願公開第２０１０／００４８９６４号、国際特許出願公開第ＷＯ  ２００９／１３２２２０号、及び米国特許出願公開第２０１０／０００３７１６号に述べられている。イソプレン及び水素などの副生成物を生成及び回収するための効率的な方法の更なる例が、米国特許仮出願第６１／１４１，６５２号、同第６１／１８７，９３４号、及び同第６１／１８７，９５９号、並びに国際特許出願公開第ＷＯ  ２００９／０７６６７６号、米国特許出願第１２／３３５，０７１号（米国特許出願公開第２００９／０２０３１０２号）、国際特許出願公開第ＷＯ  ２０１０／００３００７号、米国特許出願公開第２０１０／００４８９６４号、国際特許出願公開第ＷＯ  ２００９／１３２２２０号、及び米国特許出願公開第２０１０／０００３７１６号に述べられている。更に、回収は、米国特許出願第１２／９６９，４４０号に述べられるように吸収ストリッピングによって行うこともできる。
【０１２４】
他の技術
本明細書において述べられる方法による細胞内でのイソプレンの生成量は、米国特許仮出願第６１／１８７，９５９号、米国特許出願第１２／４９６，５７３号、国際特許出願公開第ＷＯ  ２００９／０７６６７６号、米国特許出願第１２／３３５，０７１号（米国特許出願公開第２００９／０２０３１０２号）、国際特許出願公開第ＷＯ  ２０１０／００３００７号、米国特許出願公開第２０１０／００４８９６４号、国際特許出願公開第ＷＯ  ２００９／１３２２２０号、及び米国特許出願公開第２０１０／０００３７１６号に述べられるように、イソプレン生成を細胞増殖から分離することによって増大させることができる。本明細書において述べられる方法による、細胞内でイソプレンを生成する方法の安全性は、米国特許仮出願第６１／１８７，９５９号、米国特許出願第１２／４９６，５７３号、国際特許出願公開第ＷＯ  ２００９／０７６６７６号、米国特許出願第１２／３３５，０７１号（米国特許出願公開第２００９／０２０３１０２号）、国際特許出願公開第ＷＯ  ２０１０／００３００７号、米国特許出願公開第２０１０／００４８９６４号、国際特許出願公開第ＷＯ  ２００９／１３２２２０号、及び米国特許出願公開第２０１０／０００３７１６号に述べられるように、安全な操作範囲内でイソプレンを生成することによって高めることができる。本明細書において述べられるイソプレンを生成するための改良された方法によって実現されるような、高いイソプレン力価における細胞生存率は、米国特許仮出願第６１／１８７，９５９号、国際特許出願公開第ＷＯ  ２００９／０７６６７６号、米国特許出願第１２／３３５，０７１号（米国特許出願公開第２００９／０２０３１０２号）、国際特許出願公開第ＷＯ  ２０１０／００３００７号、米国特許出願公開第２０１０／００４８９６４号、国際特許出願公開第ＷＯ  ２００９／１３２２２０号、及び米国特許出願公開第２０１０／０００３７１６号に述べられるようにして高めることができる。
【０１２５】
イソプレンを生成及び回収するための効率的な方法の更なる例が、米国特許仮出願第６１／１８７，９５９号、国際特許出願公開第ＷＯ  ２００９／０７６６７６号、米国特許出願第１２／３３５，０７１号（米国特許出願公開第２００９／０２０３１０２号）、国際特許出願公開第ＷＯ  ２０１０／００３００７号、米国特許出願公開第２０１０／００４８９６４号、国際特許出願公開第ＷＯ  ２００９／１３２２２０号、米国特許出願公開第２０１０／０００３７１６号、及び米国特許出願第１２／９６９，４４０号に述べられている。イソプレン及び水素などの副生成物を生成及び回収するための効率的な方法の更なる例が、米国特許仮出願第６１／１４１，６５２号、米国特許仮出願第６１／１８７，９３４号、米国特許出願公開第２０１０／０１９６９７７号、及び国際特許出願公開第ＷＯ  ２０１０／０７８４５７号に述べられている。
【０１２６】
以下の実施例を参照することによって更に本発明の理解が深められる。なお、実施例は説明を目的として与えられるものであって、限定を意図するものではない。
【実施例】
【０１２７】
実施例１：Ｓ．セレビシアエのｇｉ１．２ＫＫＤｙＩオペロン、ギンドロイソプレンシンターゼ、Ｍ．マゼイのメバロン酸キナーゼ、ｐＣＬ  Ｕｐｐｅｒ  ＭＶＡ（Ｅ．フィカリス（E．faecalis）のｍｖａＥ及びｍｖａＳ）、及びｙｂｈＥ（ｐｇｌ）を発現する大腸菌株の構築
（ｉ）ＥＷＬ２０１株（ＢＬ２１，Ｃｍ−ＧＩ１．２−ＫＫＤｙＩ）の構築
大腸菌ＢＬ２１（Ｎｏｖａｇｅｎ  ｂｒａｎｄ，ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）をレシピエント株とし、ＭＣＭ３３１  Ｐ１ライセートにより形質導入した（ライセートは、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．に述べられる方法にしたがって調製した）。ＭＣＭ３３１細胞は、Ｓ．セレビシアエのメバロン酸キナーゼ、メバロン酸リン酸キナーゼ、メバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼ、及びＩＰＰイソメラーゼをコードした染色体コンストラクトｇｉ１．２ＫＫＤｙＩ（すなわち、Ｓ．セレビシアエに由来するｇｉ１．２−ＫＫＤｙＩオペロン）を有する。形質導入体は、細胞をＬＡｇａｒ及び２０μｇ／μＬのクロラムフェニコール上に播くことによって選択した。各プレートを３０℃で一晩インキュベートした。形質導入体を分析したところ、コントロールプレート（復帰変異については水＋細胞のコントロールプレート、ライセートの汚染については水＋Ｐ１ライセートのコントロールプレート）上にコロニーは示されなかった。
【０１２８】
４つの形質導入体を選び、５ｍＬのＬブロス＋２０μｇ／μＬのクロラムフェニコールに接種するのに用いた。培養を２００ｒｐｍで振盪しながら３０℃で一晩増殖させた。ＰＣＲ分析用の各形質導入体のゲノムＤＮＡ調製物を調製するため、１．５ｍＬの一晩細胞培養物を遠心した。この細胞ペレットを４００μＬの再懸濁バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ７．５）に再懸濁し、４μＬのＲＮａｓｅ、ＤＮａｓｅフリー（Ｒｏｃｈｅ）を加えた。各チューブを３７℃で３０分間インキュベートした後、４μＬの１０％  ＳＤＳ及び４μＬの１０ｍｇ／ｍＬプロテイナーゼＫ保存溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を加えた。各チューブを３７℃で１時間インキュベートした。この細胞ライセートを２ｍＬ  Ｐｈａｓｅ  Ｌｏｃｋ  Ｌｉｇｈｔ  Ｇｅｌチューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）に移し、各２００μＬの飽和フェノールｐＨ  ７．９（Ａｍｂｉｏｎ  Ｉｎｃ．）及びクロロフォルムを加えた。各チューブをよく混合し、５分間微小遠心した。４００μＬのクロロフォルムで２回目の抽出を行い、水相を新しいエッペンドルフチューブに移した。１ｍＬの１００％エタノールを添加し、５分間遠心することによりゲノムＤＮＡを沈殿させた。このゲノムＤＮＡのペレットを１ｍＬの７０％エタノールで洗浄した。エタノールを除去し、ゲノムＤＮＡのペレットを大まかに風乾した。このゲノムＤＮＡのペレットを２００μＬのＴＥで再懸濁した。
【０１２９】
Ｐｆｕ  Ｕｌｔｒａ  ＩＩ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）及びテンプレートとしての２００ｎｇ／μＬのゲノムＤＮＡを使用して、製造者のプロトコールにしたがって異なる２組のＰＣＲ反応チューブを調製した。１組目については、形質導入体がａｔｔＴｎ７遺伝子座に首尾よく確実に組み込まれるようにプライマーとしてＭＣＭ１３０及びＧＢ  Ｃｍ−Ｒｅｖ（表１）を使用した。１組目のＰＣＲパラメータは、９５℃で２分間（最初のサイクルのみ）、９５℃で２５秒間、５５℃で２５秒間、７２℃で２５秒間（ステップ２〜４を２８サイクル繰り返す）、７２℃で１分間とした。２組目については、ｇｉ１．２−ＫＫＤｙＩオペロンが適切に確実に組み込まれるようにプライマーとしてＭＶＤ  Ｆｏｒ及びＭＶＤ  Ｒｅｖ（表１）を使用した。２組目のＰＣＲパラメータは、９５℃で２分間（最初のサイクルのみ）、９５℃で２５秒間、５５℃で２５秒間、７２℃で１０秒間（ステップ２〜４を２８サイクル繰り返す）、７２℃で１分間とした。ＰＣＲ増幅物を１．２％  Ｅ−ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．）上で分析したところ、４つの形質導入体のクローンがいずれも正しいものであることが示された。１つを選び、ＥＷＬ２０１株と命名した。
【０１３０】
（ｉｉ）ＥＷＬ２０４株（ＢＬ２１，ｌｏｏｐｏｕｔ−ＧＩ１．２−ＫＫＤｙＩ）の構築
Ｄａｔｓｅｎｋｏ及びＷａｎｎｅｒ（２０００）により述べられるように、プラスミドｐＣＰ２０を使用してＥＷＬ２０１株からクロラムフェニコールマーカーをループアウトした（Ｄａｔｓｅｎｋｏら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９７：６６４０〜６６４５，２０００）。ＰＣＲ生成物を使用して大腸菌Ｋ−１２の染色体遺伝子を１ステップで不活性化した（Ｄａｔｓｅｎｋｏら、ＰＮＡＳ  ９７：６６４０〜６６４５，２０００）。ＥＷＬ２０１細胞をＬブロス中で対数増殖期中期まで増殖させた後、氷冷した滅菌水で３回洗った。細胞懸濁液の５０μＬのアリコートを１μＬのｐＣＰ２０と混合し、細胞懸濁混合物をＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｉｎｃ．）を使用して２ｍｍキュベット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．）中、２．５Ｖ及び２５μＦｄでエレクトロポレーションした。１ｍＬのＬＢを細胞に直ちに加えてから、金属キャップを有する１４ｍＬポリプロピレンチューブ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）に移した。細胞を３０℃で１時間増殖させることによって回復させた。Ｌアガー＋２０μｇ／μＬクロラムフェニコール＋５０μｇ／μＬカルベニシリン上で形質転換体を選択し、３０℃で一晩インキュベートした。翌日、１つのクローンを１０ｍＬのＬブロス＋５０μｇ／μＬカルベニシリン中、３０℃で対数増殖期初期まで増殖させた。次いで増殖培地の温度を４２℃に２時間シフトさせた。連続希釈を行い、次いで細胞をＬＡプレート（抗生物質による選択なし）上に播き、３０℃で一晩インキュベートした。翌日、２０のコロニーを選び、Ｌアガー（抗生物質無添加）及びＬＡ＋２０μｇ／μＬクロラムフェニコールのプレート上にパッチした。次いで各プレートを３０℃で一晩インキュベートした。ＬＡプレート上では増殖したがＬＡ＋２０μｇ／μＬクロラムフェニコールのプレート上では増殖できなかった細胞は、クロラムフェニコールマーカーがループアウトしたものと考えられた（１つを選び、ＥＷＬ２０４株と命名した）。
【０１３１】
（ｉｉｉ）プラスミドｐＥＷＬ２３０（ｐＴｒｃ  Ｐ．ａｌｂａ）の構築
ギンドロイソプレンシンターゼ（Ｐ．ａｌｂａ  ＨＧＳ）をコードした合成遺伝子の生成を、大腸菌で発現させるためのコドン最適化法に基づいてＤＮＡ２．０  Ｉｎｃ．（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）に外注した。合成遺伝子をプラスミドｐＥＴ２４ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ  ｂｒａｎｄ，ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）にカスタムクローニングし、凍結乾燥したものを与えた（図２、３Ａ〜Ｂ、配列番号１）。
【０１３２】
製造者のプロトコールにしたがって、テンプレートとしてのｐＥＴ２４  Ｐ．ａｌｂａ  ＨＧＳ、プライマーＭＣＭ１８２及びＭＣＭ１９２、及びＨｅｒｃｕｌａｓｅ  ＩＩ  Ｆｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用してＰＣＲ反応を行ってギンドロイソプレンシンターゼ（Ｐ．ａｌｂａ  ＨＧＳ）遺伝子を増幅した。ＰＣＲ条件は以下の通りとした。すなわち、９５℃で２分間（最初のサイクルのみ）、９５℃で２５秒間、５５℃で２０秒間、７２℃で１分間を２５サイクル繰り返し、最後の延長を７２℃で３分間。ギンドロイソプレンシンターゼのＰＣＲ生成物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．）を使用して精製した。
【０１３３】
次いでギンドロイソプレンシンターゼのＰＣＲ生成物を、１μＬのＢｓｐＨＩエンドヌクレアーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）及び２μＬの１０Ｘ  ＮＥＢバッファー４を含む２０μＬの反応液中で消化した。反応液を３７℃で２時間インキュベートした。次いでＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキットを使用して消化されたＰＣＲフラグメントを精製した。２回目の制限酵素による消化を、１μＬのＰｓｔＩエンドヌクレアーゼ（Ｒｏｃｈｅ）及び２μＬの１０×バッファーＨを含む２０μＬの反応液中で行った。反応液を３７℃で２時間インキュベートした。次いでＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキットを使用して消化されたＰＣＲフラグメントを精製した。プラスミドｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．）を、１μＬのＮｃｏＩエンドヌクレアーゼ（Ｒｏｃｈｅ）、１μＬのＰｓｔＩエンドヌクレアーゼ、及び２μＬの１０ＸバッファーＨを含む２０μＬの反応液中で消化した。反応液を３７℃で２時間インキュベートした。消化されたｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂベクターを１．２％  Ｅ−ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．）を使用してゲル精製し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して抽出した（図４）。ＢｓｐＨＩ及びＮｃｏＩ部位の適合する粘着末端を用い、５μＬのギンドロイソプレンシンターゼインサート、２μＬのｐＴｒｃベクター、１μＬのＴ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、２μＬの１０Ｘリガーゼバッファー、及び１０μＬのｄｄＨ２Ｏを含む２０μＬのライゲーション反応液を調製した。このライゲーション混合物を室温で４０分間インキュベートした。０．０２５μｍのニトロセルロース膜フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）をペトリ皿内のｄｄＨ２Ｏに浮かべ、ライゲーション混合物を室温で３０分間、ニトロセルロース膜フィルター上に静かに置くことによってライゲーション混合物を脱塩した。ＭＣＭ４４６細胞（第２項を参照）をＬＢ中で対数増殖期中期まで増殖させた後、氷冷した滅菌水で３回洗った。細胞懸濁液の５０μＬのアリコートを、５μＬの脱塩したｐＴｒｃ  Ｐ．ａｌｂａ  ＨＧＳライゲーションミックスと混合した。この細胞懸濁混合物を、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒを使用して２ｍｍキュベット中、２．５Ｖ及び２５μＦｄでエレクトロポレーションした。１ｍＬのＬＢを細胞に直ちに加えてから、金属キャップを有する１４ｍＬポリプロピレンチューブ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）に移した。細胞を３０℃で２時間増殖させることによって回復させた。Ｌアガー＋５０μｇ／μＬカルベニシリン＋１０ｍＭメバロン酸上で形質転換体を選択し、３０℃でインキュベートした。翌日、６つの形質転換体を選び、５ｍＬのＬブロス＋５０μｇ／μＬカルベニシリンのチューブ内で一晩、３０℃で増殖させた。ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してこの一晩培養物でプラスミド調製を行った。プラスミドの増殖におけるＢＬ２１細胞の使用のため、高品質のプラスミドＤＮＡを得るために標準的な製造者のプロトコールに、スピンカラムをＰＢバッファーで５回及びＰ���バッファーで３回洗浄するという改変を組み込んだ。プラスミドを、２０μＬの反応液中、ＰｓｔＩで消化して適正なサイズの直鎖状フラグメントとした。６つのプラスミドはいずれも適正なサイズであり、Ｑｕｉｎｔａｒａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ）に送付してプライマーＭＣＭ６５、ＭＣＭ６６、ＥＬ１０００（表１）により配列決定した。ＤＮＡの配列決定の結果、６つのプラスミドはいずれも正しいものであることが示された。１つのプラスミドを選び、プラスミドＥＷＬ２３０と命名した（図５、６Ａ〜Ｂ、配列番号２）。
【０１３４】
ｉｖ）プラスミドｐＥＷＬ２４４（ｐＴｒｃ  Ｐ．ａｌｂａ−ｍＭＶＫ）の構築
製造者のプロトコールにしたがって、テンプレートとしてのＭＣＭ３７６（下記第（ｖ）項を参照）、プライマーＭＣＭ１６５及びＭＣＭ１７７（表１参照）、及びＰｆｕ  Ｕｌｔｒａ  ＩＩ  Ｆｕｓｉｏｎ  ＤＮＡ  ポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用してＰＣＲ反応を行ってメタノサルシナ・マゼイ（Ｍ．マゼイ）のＭＶＫ遺伝子を増幅した。ＰＣＲ条件は以下の通りとした。すなわち、９５℃で２分間（最初のサイクルのみ）、９５℃で２５秒間、５５℃で２５秒間、７２℃で１８秒間を２８サイクル繰り返し、最後の延長を７２℃で１分間。Ｍ．マゼイＭＶＫのＰＣＲ生成物をＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．）を使用して精製した。
【０１３５】
次いでＭ．マゼイＭＶＫのＰＣＲ生成物を、８μＬのＰＣＲ生成物、２μＬのＰｍｅＩエンドヌクレアーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、４μＬの１０Ｘ  ＮＥＢバッファー４、４μＬの１０Ｘ  ＮＥＢ  ＢＳＡ、及び２２μＬのｄｄＨ２Ｏを含む４０μＬの反応液中で消化した。反応液を３７℃で３時間インキュベートした。次いでＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキットを使用して消化されたＰＣＲフラグメントを精製した。２回目の制限酵素による消化を、２μＬのＮｓｉＩエンドヌクレアーゼ（Ｒｏｃｈｅ）、４．７μＬの１０ＸバッファーＨ、及び４０μＬのＰｍｅＩ消化したＭ．マゼイＭＶＫのフラグメントを含む４７μＬの反応液中で行った。反応液を３７℃で３時間インキュベートした。次いで消化されたＰＣＲフラグメントを１．２％  Ｅ−ゲルを使用してゲル精製し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキットを使用して抽出した。プラスミドＥＷＬ２３０を、１０μＬのプラスミド、２μＬのＰｍｅＩエンドヌクレアーゼ、４μＬの１０Ｘ  ＮＥＢバッファー４、４μＬの１０Ｘ  ＮＥＢ  ＢＳＡ、及び２０μＬのｄｄＨ２Ｏを含む４０μＬの反応液中で消化した。反応液を３７℃で３時間インキュベートした。次いでＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキットを使用して消化されたＰＣＲフラグメントを精製した。２回目の制限酵素による消化を、２μＬのＰｓｔＩエンドヌクレアーゼ、４．７μＬの１０ＸバッファーＨ、及び４０μＬのＰｍｅＩ消化したＥＷＬ２３０の直鎖状フラグメントを含む４７μＬの反応液中で行った。反応液を３７℃で３時間インキュベートした。次いで消化されたＰＣＲフラグメントを１．２％  Ｅ−ゲルを使用してゲル精製し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキットを使用して抽出した（図７）。ＮｓｉＩ及びＰｓｔＩ部位の適合する粘着末端を用い、８μＬのＭ．マゼイＭＶＫインサート、３μＬのＥＷＬ２３０プラスミド、１μＬのＴ４  ＤＮＡリガーゼ、２μＬの１０Ｘリガーゼバッファー、及び６μＬのｄｄＨ２Ｏを含む２０μＬのライゲーション反応液を調製した。ライゲーション混合物を１６℃で一晩インキュベートした。翌日、０．０２５μｍのニトロセルロース膜フィルターをペトリ皿内のｄｄＨ２Ｏに浮かべ、ライゲーション混合物を室温で３０分間、ニトロセルロース膜フィルター上に静かに置くことによってライゲーション混合物を脱塩した。ＭＣＭ４４６細胞をＬＢ中で対数増殖期中期まで増殖させた後、氷冷した滅菌水で３回洗った。細胞懸濁液の５０μＬのアリコートを、５μＬの脱塩したｐＴｒｃ  Ｐ．ａｌｂａ−ｍＭＶＫライゲーションミックスと混合した。この細胞懸濁混合物を、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒを使用して２ｍｍキュベット中、２．５Ｖ及び２５μＦｄでエレクトロポレーションした。１ｍＬのＬＢを細胞に直ちに加えてから、金属キャップを有する１４ｍＬポリプロピレンチューブに細胞を移した。細胞を３０℃で２時間増殖させることによって回復させた。ＬＡ＋５０μｇ／μＬカルベニシリン＋５ｍＭメバロン酸のプレート上で形質転換体を選択し、３０℃でインキュベートした。翌日、６つの形質転換体を選び、５ｍＬのＬＢ＋５０μｇ／μＬカルベニシリンのチューブ内で一晩、３０℃で増殖させた。ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキットを使用してこの一晩培養物でプラスミド調製を行った。プラスミドの増殖におけるＢＬ２１細胞の使用のため、高品質のプラスミドＤＮＡを得るために標準的な製造者のプロトコールに、スピンカラムをＰＢバッファーで５回及びＰＥバッファーで３回洗浄するという改変を組み込んだ。プラスミドを、２０μＬの反応液中、ＰｓｔＩで消化して適正なサイズの直鎖状フラグメントとした。６つのプラスミドのうちの３つは適正なサイズであり、Ｑｕｉｎｔａｒａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓに送付してプライマーＭＣＭ６５、ＭＣＭ６６、ＥＬ１０００、ＥＬ１００３、及びＥＬ１００６（表１）により配列決定した。ＤＮＡの配列決定の結果、３つのプラスミドはいずれも正しいものであることが示された。１つを選び、プラスミドＥＷＬ２４４と命名した（図８及び９Ａ〜Ｂ、配列番号３）。
【０１３６】
ｖ）ｐＥＴ２００ＤにＭ．マゼイ古細菌下流配列を組み込んだプラスミドＭＣＭ３７６−ＭＶＫの構築
Ｍ．マゼイ古細菌の下流経路オペロン（図１０Ａ〜Ｃ、配列番号４）から、ＭＶＫのＯＲＦを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｐｌａｔｉｎｕｍ  ＨｉＦｉ  ＰＣＲミックスを使用し、プライマーＭＣＭ１６１及びＭＣＭ１６２（表１）を使用してＰＣＲ増幅した。４５μＬのＰＣＲミックスを、１μＬのテンプレート、１０μＭの各１μＬずつのプライマー、及び２μＬの水と合わせた。反応サイクルを以下のようにして行った。すなわち、９４℃で２：００分間；９４℃で０：３０分間、５５℃で０：３０分間、及び６８℃で１：１５分間を３０サイクル；次いで７２℃で７：００分間、及び４℃で冷却するまで。３μＬのこのＰＣＲ反応液を、製造者のプロトコールにしたがってＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｐＥＴ２００Ｄプラスミドにライゲートした。３μＬのこのライゲーション液をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＴＯＰ１０細胞に導入し、形質転換体をＬＡ／ｋａｎ５０上で選択した。形質転換体からプラスミドを単離し、インサートを配列決定してＭＣＭ３７６を得た（図１１Ａ〜Ｃ）。
【０１３７】
ｖｉ）ＥＷＬ２５１株（ＢＬ２１（ＤＥ３），Ｃｍ−ＧＩ１．２−ＫＫＤｙＩ，ｐＴｒｃ  Ｐ．ａｌｂａ−ｍＭＶＫ）の構築
ＭＣＭ３３１細胞（Ｓ．セレビシアエのメバロン酸キナーゼ、メバロン酸リン酸キナーゼ、メバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼ、及びＩＰＰイソメラーゼをコードした染色体コンストラクトｇｉ１．２ＫＫＤｙＩを有する）をＬＢ中で対数増殖期中期まで増殖させた後、氷冷した滅菌水で３回洗った。５０μＬの細胞懸濁液を１μＬのプラスミドＥＷＬ２４４と混合した。この細胞懸濁混合物を、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒを使用して２ｍｍキュベット中、２．５Ｖ及び２５μＦｄでエレクトロポレーションした。１ｍＬのＬＢを細胞に直ちに加えてから、金属キャップを有する１４ｍＬポリプロピレンチューブに細胞を移した。細胞を３０℃で２時間増殖させることによって回復させた。ＬＡ＋５０μｇ／μＬカルベニシリン＋５ｍＭメバロン酸のプレート上で形質転換体を選択し、３７℃でインキュベートした。１つのコロニーを選択し、ＥＷＬ２５１株と命名した。
【０１３８】
ｖｉｉ）ＥＷＬ２５６株（ＢＬ２１（ＤＥ３），Ｃｍ−ＧＩ１．２−ＫＫＤｙＩ，ｐＴｒｃ  Ｐ．ａｌｂａ−ｍＭＶＫ，ｐＣＬ  Ｕｐｐｅｒ  ＭＶＡ）の構築
ＥＷＬ２５１細胞をＬＢ中で対数増殖期中期まで増殖させた後、氷冷した滅菌水で３回洗った。５０μＬの細胞懸濁液を１μＬのプラスミドＭＣＭ８２（Ｅ．フィカリスのｍｖａＥ及びｍｖａＳをコードしたｐＣＬ  ＰｔｒｃＵｐｐｅｒＰａｔｈｗａｙ（「ｐＣＬ  Ｕｐｐｅｒ  ＭＶＡ」としても知られる）を含む）と混合した。プラスミドｐＣＬ  Ｐｔｒｃ  Ｕｐｐｅｒ  Ｐａｔｈｗａｙは、いずれも参照によりその全容にわたって本願に援用する国際特許出願公開第ＷＯ  ２００９／０７６６７６Ａ２号及び米国特許出願第１２／３３５，０７１号の実施例８に述べられるようにして構築した。この細胞懸濁混合物を、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒを使用して２ｍｍキュベット中、２．５Ｖ及び２５μＦｄでエレクトロポレーションした。１ｍＬのＬＢを細胞に直ちに加えた。次いで細胞を金属キャップを有する１４ｍＬポリプロピレンチューブに移した。細胞を３０℃で２時間増殖させることによって回復させた。ＬＡ＋５０μｇ／μＬカルベニシリン＋５０μｇ／μＬスペクチノマイシンのプレート上で形質転換体を選択し、３７℃でインキュベートした。１つのコロニーを選択し、ＥＷＬ２５６株と命名した。
【表１】
0005855576.tif 000002
【０１３９】
ｖｉｉｉ）ＲＭ１１１６０８−２株（Ｃｍ−ＧＩ１．２−ＫＫＤｙＩ，ｐＴｒｃ  Ｐ．ａｌｂａ−ｍＭＶＫ，ｐＣＬ  Ｕｐｐｅｒ  ＭＶＡ，ｐＢＢＲＣＭＰＧＩ１．５−ｐｇｌ）の構築
複製プラスミドｐＢＢＲ１ＭＣＳ５（ゲンタマイシン）上でｙｂｈＥ遺伝子（大腸菌６−ホスホグルコノラクトナーゼをコードする）を構成的に発現する、イソプレンを生成する大腸菌のＢＬ２１株（ＥＷＬ２５６）を構築した（ルイジアナ州立大学Ｋ．Ｐｅｔｅｒｓｏｎ博士より入手）。
【０１４０】
ＦＲＴに基づいた組換えカセット、及びＲｅｄ／Ｅｔにより媒介される挿入及び抗生物質マーカーループアウト用のプラスミドをＧｅｎｅ  Ｂｒｉｄｇｅｓ  ＧｍｂＨ（Ｇｅｒｍａｎｙ）より入手した。これらの材料を使用する手順は、Ｇｅｎｅ  Ｂｒｉｄｇｅｓのプロトコールにしたがって行った。プライマーＰｇｌ−Ｆ（配列番号２５）及びＰｇｌＧＩ１．５−Ｒ（配列番号２６）を使用し、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ  ＩＩ  Ｆｕｓｉｏｎキットを製造者のプロトコールにしたがって使用してＦＲＴ−ｇｂ２−Ｃｍ−ＦＲＴのテンプレートから耐性カセットを増幅した。ＰＣＲ反応液（最終体積５０μＬ）は以下を含むものとした。すなわち、５μＬバッファー、１μＬテンプレートＤＮＡ（Ｇｅｎｅ  Ｂｒｉｄｇｅｓから得たＦＲＴ−ｇｂ２−Ｃｍ−Ｆ）、１０ｐｍｏｌの各プライマー、及び１．５μＬの２５ｍＭ  ｄＮＴＰミックスをｄＨ２Ｏで５０μＬとしたもの。反応サイクルを以下のようにして行った。すなわち、１×２分間、９５℃、次いで（９５℃で３０秒間、６３℃で３０秒間、７２℃で３分間）を３０サイクル。
【０１４１】
得られたＰＣＲ生成物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製し、ｐＲｅｄ−ＥＴリコンビナーゼ含有プラスミドを有するエレクトロコンピテントなＭＧ１６５５細胞内に以下のようにしてエレクトロポレーションした。ＭＧ１６５５細胞を、５ｍＬのＬブロス中、３０℃でＯＤ６００＝約０．６となるまで増殖させることによりエレクトロポレーション用に調製した。４％アラビノースを添加することにより細胞にリコンビナーゼの発現を誘導し、３０℃で３０分間増殖させた後、３７℃で３０分間増殖させた。１．５ｍＬのこの細胞のアリコートを、氷冷ｄＨ２Ｏ中で３〜４回洗った。最終的な細胞ペレットを４０μＬの氷冷ｄＨ２Ｏに再懸濁し、２〜５μＬのＰＣＲ生成物を加えた。Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｉｎｃ．）内で１ｍｍ間隔のキュベット中、１．３ｋＶでエレクトロポレーションを行った。細胞を３０℃で１〜２時間回復させ、クロラムフェニコール（５μｇ／ｍＬ）を含むＬアガー上に播いた。５つの形質転換体を、挿入部位に隣接したプライマー（２つのプライマーの組：ｐｇｌ及び４９  ｒｅｖ及び３’ＥｃｏＲＶ−ｐｇｌｓｔｏｐ；Ｂｏｔｔｏｍ  Ｐｇｂ２及びＴｏｐ  ＧＢ’ｓ  ＣＭＰ（９４６））を使用したＰＣＲ及び配列決定により分析した。正しい形質転換体を選択し、この株をＭＧ１６５５  ＧＩ１．５−ｐｇｌ：：ＣＭＰと命名した。
【０１４２】
ＭＧ１６５５  ＧＩ１．５−ｐｇｌ：：ＣＭＰの染色体ＤＮＡをテンプレートとして用いてＦＲＴ−ＣＭＰ−ＦＲＴ−ＧＩ１．５−ｙｂｈＥコンストラクトを含むＰＣＲフラグメントを生成した。このコンストラクトを以下のようにしてｐＢＢＲ１ＭＣＳ５（ゲンタマイシン）内にクローニングした。このフラグメント（ここではＣＭＰ−ＧＩ１．５−ｐｇｌと呼ぶ）を、５’末端側のプライマーＰｇｌｃｏｎｆｉｒｍ−Ｆ（配列番号２７）及び３’末端側のプライマー３’ＥｃｏＲＶ−ｐｇｌｓｔｏｐ（配列番号２８）を用いて増幅した。得られたフラグメントをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＴＯＰＯ−Ｂｌｕｎｔクローニングキットを製造者の推奨するところにしたがって使用してプラスミドベクターｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯ内にクローニングした。ＣＭＰ−ＧＩ１．５−ｐｇｌフラグメントを有するＮｓｉＩフラグメントを、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ５（ゲンタマイシン）のＰｓｔＩ部位にクローニングした。５μＬのＣＭＰ−ＧＩ１．５−ｐｇｌインサート、２μＬのｐＢＢＲ１ＭＣＳ５（ゲンタマイシン）ベクター、１μＬのＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、２μＬの１０Ｘリガーゼバッファー、及び１０μＬのｄｄＨ２Ｏを含む２０μＬのライゲーション反応液を調製した。ライゲーション混合物を、室温で４０分間インキュベートした後、２〜４μＬを上記に開示したパラメータを用いてエレクトロコンピテントなＴｏｐ１０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内にエレクトロポレーションした。１０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール及び５μｇ／ｍＬのゲンタマイシンを含むＬアガー上で形質転換体を選択した。選択されたクローンの配列を、上記に述べたプライマーのうちの幾つか、及びＳｅｑｕｅｔｅｃｈ，ＣＡにより提供されるインハウスのＴ３及びＲｅｖｅｒｓｅプライマーを使用して決定した。このプラスミドをｐＢＢＲＣＭＰＧＩ１．５−ｐｇｌと命名した（図１２、１３Ａ〜Ｂ、及び配列番号６）。
【０１４３】
プラスミドｐＢＢＲＣＭＰＧＩ１．５−ｐｇｌを、本明細書において述べるようにしてＥＷＬ２５６内にエレクトロポレーションし、形質転換体をクロラムフェニコール（１０μｇ／ｍＬ）、ゲンタマイシン（５μｇ／ｍＬ）、スペクチノマイシン（５０μｇ／ｍＬ）、及びカルベニシリン（５０μｇ／ｍＬ）を含むＬアガー上に播いた。１つの形質転換体を選択し、ＲＭ１１１６０８−２株と命名した。
【０１４４】
プライマー：
Ｐｇｌ−Ｆ
５’−ＡＣＣＧＣＣＡＡＡＡＧＣＧＡＣＴＡＡＴＴＴＴＡＧＣＴＧＴＴＡＣＡＧＴＣＡＧＴＴＧＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧＣＧＧＣＣＧＣ−３’（配列番号２５）
ＰｇｌＧＩ１．５−Ｒ
５’−ＧＣＴＧＧＣＧＡＴＡＴＡＡＡＣＴＧＴＴＴＧＣＴＴＣＡＴＧＡＡＴＧＣＴＣＣＴＴＴＧＧＧＴＴＡＣＣＴＣＣＧＧＧＡＡＡＣＧＣＧＧＴＴＧＡＴＴＴＧＴＴＴＡＧＴＧＧＴＴＧＡＡＴＴＡＴＴＴＧＣＴＣＡＧＧＡＴＧＴＧＧＣＡＴＡＧＴＣＡＡＧＧＧＣＧＴＧＡＣＧＧＣＴＣＧＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＴＣＧＡＧ−３’（配列番号２６）
３’ＥｃｏＲＶ−ｐｇｌｓｔｏｐ：
５’−ＣＴＴ  ＧＡＴ  ＡＴＣ  ＴＴＡ  ＧＴＧ  ＴＧＣ  ＧＴＴ  ＡＡＣ  ＣＡＣ  ＣＡＣ（配列番号２８）
ｐｇｌ＋４９  ｒｅｖ：ＣＧＴＧＡＡＴＴＴＧＣＴＧＧＣＴＣＴＣＡＧ（配列番号２９）
Ｂｏｔｔｏｍ  Ｐｇｂ２：ＧＧＴＴＴＡＧＴＴＣＣＴＣＡＣＣＴＴＧＴＣ（配列番号３０）
Ｔｏｐ  ＧＢ’ｓ  ＣＭＰ（９４６）：ＡＣＴＧＡＡＡＣＧＴＴＴＴＣＡＴＣＧＣＴＣ  （配列番号３１）
Ｐｇｌｃｏｎｆｉｒｍ−Ｆ
５’−ＡＣＣＧＣＣＡＡＡＡＧＣＧＡＣＴＡＡＴＴＴＴＡＧＣＴ−３’（配列番号２７）
実施例２：大腸菌内でのｙｂｈＥ（ｐｇｌ）の構成的発現によるイソプレン生成の改良
この実施例では、野生型のレベルでｙｂｈＥを発現するコントロール株（すなわちＥＷＬ２５６）と比較した、大腸菌ｙｂｈＥ（ｐｇｌ）を構成的に発現する株におけるイソプレンの生成を示す。遺伝子ｙｂｈＥ（ｐｇｌ）は、異種細胞で発現されたタンパク質の翻訳後グルコニル化を抑制し、生成物の溶解度及び収率を高める一方で更にペントースリン酸経路を通じてバイオマス収率及び流量を高める大腸菌６−ホスホグルコノラクトナーゼをコードしている（Ａｏｎら、Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ７４（４）：９５０〜９５８，２００８）。
【０１４５】
ｉ）小規模分析
培地の組成（発酵培地１Ｌ当たり）：Ｋ２ＨＰＯ４  １３．６ｇ、ＫＨ２ＰＯ４  １３．６ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ２ｇ、クエン酸一水和物２ｇ、クエン酸鉄アンモニウム０．３ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４  ３．２ｇ、酵母エキス１ｇ、１０００Ｘ微量金属溶液１ｍＬ。すべての成分を加え合わせ、ｄｉＨ２Ｏに溶解した。ｐＨを水酸化アンモニウム（３０％）で６．８に調整し、一定の体積とした。培地を０．２２μｍフィルターでフィルター滅菌した。滅菌及びｐＨ調整後にグルコース５．０ｇ及び抗生物質を加えた。
【０１４６】
１０００Ｘ微量金属溶液（発酵培地１Ｌ当たり）：クエン酸・Ｈ２Ｏ  ４０ｇ、ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ  ３０ｇ、ＮａＣｌ  １０ｇ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  １ｇ、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ  １ｇ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  １ｇ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ  １００ｍｇ、Ｈ３ＢＯ３  １００ｍｇ、ＮａＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ  １００ｍｇ。各成分を１成分ずつｄｉＨ２Ｏに溶解する。ｐＨをＨＣｌ／ＮａＯＨで３．０に調整した後、溶液を一定体積とし、０．２２μｍフィルターでフィルター滅菌する。
【０１４７】
（ａ）実験手順
ＭｉｃｒｏＲｅａｃｔｏｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．によるＣｅｌｌｅｒａｔｏｒ（商標）内で上記の株を増殖させることによってイソプレン生成を分析した。２４ウェルのそれぞれの作業容量は４．５ｍＬであった。温度を３０℃に維持し、ｐＨの設定を７．０とし、酸素流の設定を２０ｓｃｃｍとし、攪拌速度を８００ｒｐｍとした。凍結容器から取り出した大腸菌株の接種物をＬＢブロスアガープレート（抗生物質を添加したもの）上にストリークし、３０℃でインキュベートした。シングルコロニーを抗生物質を添加した培地中に接種し、一晩増殖させた。細菌を、抗生物質を添加した４．５ｍＬの培地に、５５０ｎｍで測定した光学密度が０．０５となるまで希釈した。
【０１４８】
イソプレンのオフガス分析を、ガスクロマトグラフ−マススペクトロメータ（ＧＣ−ＭＳ）（Ａｇｉｌｅｎｔ）ヘッドスペースアッセイを用いて行った。以下のようにして試料を調製した。１００μＬの全ブロスを密封したＧＣ容器に入れ、３０℃で３０分間の一定時間にわたってインキュベートした。７０℃で５分間のインキュベーションによる熱殺菌処理の後、試料をＧＣに導入した。
【０１４９】
測定の間にマイクロプレートリーダー（Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ）を使用して波長５５０ｎｍにおける光学密度（ＯＤ）を得た。イソプレン濃度（μｇ／Ｌ）をＯＤの測定値及び時間（時）で割ることによって比生産性を得た。
【０１５０】
ＥＷＬ２５６及びＲＭ１１１６０８−２の２種類の株について、２００及び４００μＭのＩＰＴＧ誘導レベルで評価を行った。各試料を、イソプレン生成量及び細胞増殖（ＯＤ５５０）について誘導の１、２．５、４．７５、及び８時間後に分析した。各試料について２重に行った。
【０１５１】
（ｂ）結果
この実施例では、２つの異なるＩＰＴＧの濃度において、ｙｂｈＥ（ｐｇｌ）を発現する株のイソプレンの比生産性がコントロール株と比較して２〜３倍に劇的に上昇することが実証された。
【０１５２】
ｉｉ）Ｃｍ−ＧＩ１．２−ＫＫＤｙＩ、Ｍ．マゼイのメバロン酸キナーゼ、ギンドロイソプレンシンターゼ、及びｙｂｈＥ（ｐｇｌ）（ＲＭ１１１６０８−２）を発現し、１５Ｌスケールで流加培養で増殖させた大腸菌からのイソプレン発酵
培地の組成（発酵培地１Ｌ当たり）：Ｋ２ＨＰＯ４  ７．５ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ２ｇ、クエン酸一水和物２ｇ、クエン酸鉄アンモニウム０．３ｇ、酵母エキス０．５ｇ、１０００Ｘ改変微量金属溶液１ｍＬ。すべての成分を加え合わせ、ｄｉＨ２Ｏに溶解した。この溶液をオートクレーブで滅菌した。ｐＨを水酸化アンモニウム（３０％）で７．０に調整し、所定の体積とした。滅菌処理及びｐＨ調整後にグルコース１０ｇ、チアミン・ＨＣｌ  ０．１ｇ、及び抗生物質を添加した。
【０１５３】
１０００Ｘ改変微量金属溶液：クエン酸・Ｈ２Ｏ  ４０ｇ、ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ  ３０ｇ、ＮａＣｌ  １０ｇ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  １ｇ、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ  １ｇ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  １ｇ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ  １００ｍｇ、Ｈ３ＢＯ３  １００ｍｇ、ＮａＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ  １００ｍｇ。各成分を１成分ずつＤｉ  Ｈ２Ｏに溶解し、ｐＨをＨＣｌ／ＮａＯＨにより３．０に調整した後、一定の体積とし、０．２２μｍフィルターによりフィルター滅菌する。
【０１５４】
上流メバロン酸（ＭＶＡ）経路（ｐＣＬ  Ｕｐｐｅｒ）、統合された下流ＭＶＡ経路（ｇｉ１．２ＫＫＤｙＩ）を有し、Ｍ．マゼイ由来のメバロン酸キナーゼ及びギンドロ由来のイソプレンシンターゼを高発現し（ｐＴｒｃＡｌｂａ−ｍＭＶＫ）、大腸菌ｐｇｌを高発現（ｐＢＢＲ−ｐｇｌ）するＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌細胞を用い、１５Ｌバイオリアクターで発酵を行った。この実施例は、望ましい発酵ｐＨ  ７．０及び温度３４℃においてグルコースからのイソプレン生成を観測する目的で行った。大腸菌株の凍結容器を解凍し、トリプトン−酵母エキス培地中に接種した。５５０ｎｍで測定したＯＤが１．０となるまで接種物が増殖した後、５００ｍＬを１５Ｌバイオリアクターへの接種に使用して初期体積を５Ｌとした。
【０１５５】
細胞が静止期に達するまでグルコースを指数関数的速度で供給した。この後、代謝要求量を満たす量までグルコース供給量を低減させた。４０時間（５９時間）の発酵中にバイオリアクターに供給されたグルコースの総量は、３．１ｋｇ（５９時間で４．２ｋｇ）であった。ＩＰＴＧを添加することによって誘導を行った。５５０ｎｍでの光学密度（ＯＤ５５０）の値が４となった時点でＩＰＴＧの濃度を１１０μＭとした。ＯＤ５５０が１５０に達した時点でＩＰＴＧ濃度を１９２μＭに上昇させた。時間に対するバイオリアクター内のＯＤ５５０プロファイルを図１４Ａに示す。バイオリアクターからのオフガス中のイソプレン濃度を、Ｈｉｄｅｎ質量分析器を使用して測定した。イソプレンの力価は、発酵過程において４０時間における最大値３３．２ｇ／Ｌにまで増大した（５９時間では４８．６ｇ／Ｌ）（図１４Ｂ）。イソプレンの力価は、発酵過程において４０時間における最大値４０．０ｇ／Ｌにまで増大した（５９時間では６０．５ｇ／Ｌ）（図１４Ｃ）。４０時間（５９時間）の発酵の間に生成したイソプレンの総量は２８１．３ｇ（５９時間では４５１．０ｇ）であり、生成の経時的変化を図１４Ｄに示す。体積生産性の経時的変化を図１４Ｅに示したが、この図は０〜４０時間の間に１．０ｇ／Ｌ／時の平均速度が維持されたことを示している（１９〜５９時間の間では１．４ｇ／Ｌ／時）。ＣＥＲで測定した代謝活性プロファイルを図１４Ｆに示す。発酵中にイソプレンの生成に利用された炭素のモル収率は４０時間で１９．６％であった（５９時間で２３．６％）。グルコースからのイソプレンの重量収率（％）は４０時間で８．９％であった（５９時間で１０．７％）。
【０１５６】
実施例３：再生可能な資源から生成されたイソプレンの回収
活性炭への吸着による発酵オフガス流からのイソプレンの除去、及びこれに続く、液体バイオイソプレンを与えるオフラインでの蒸気脱着及び凝縮を行う２工程の操作で４つの１５Ｌスケールの発酵のセットからイソプレンを回収した（図１６Ａ及び１６Ｂ）。４つの発酵装置によって生成されたイソプレンの総量は１１５０ｇ（１６．９ｍｏｌ）であり、そのうち９５３ｇ（１４ｍｏｌ、８３％）がカーボンフィルターによって吸着された。蒸気脱着／凝縮工程の後、回収された液体イソプレンの量は８１０ｇであり、７０％の全体の回収収率に相当した。回収されたイソプレンを不純物の存在について分析した。
【０１５７】
再生可能な資源から生成されたイソプレン液の分析及び不純物プロファイル
回収されたバイオイソプレン液を、ＧＣ／ＭＳ及びガスクロマトグラフィー／水素炎イオン化検出法（ＧＣ／ＦＩＤ）によって分析して不純物の性状及び濃度を調べた。生成物を測定したところ純度＞９９．５％であり、幾つかの主要な不純物以外にも多くの微量成分を含んでいた。ＧＣ／ＦＩＤクロマトグラムを図１７に示し、不純物の典型的な濃度を表２に示す。不純物プロファイルは、このスケールで生成された他のバイオイソプレンバッチと同様であった。
【表２】
0005855576.tif 000003
【０１５８】
再生可能な資源から生成されたイソプレンの吸着剤処理による精製
吸着剤は、炭化水素原料から微量不純物を除去するために産業界で広く用いられている。適当な吸着剤としては、ゼオライト、アルミナ、及びシリカ系材料が挙げられる。イソプレンはシリカゲルに通すことによりほぼ精製することが可能であり、アルミナではより低い精製度で精製される。図１８は、アルミナ（Ｂ）又はシリカ（Ｃ）による処理の前（Ａ）及び後のイソプレン試料のＧＣ／ＦＩＤクロマトグラムを示す。ＢＡＳＦより販売されるＳｅｌｅｘｓｏｒｂ（商標）吸着剤製品は、再生可能な資源から生成されるイソプレンから極性不純物を除去するために選択される吸着剤の１つである。詳細には、Ｓｅｌｅｘｓｏｒｂ  ＣＤ及びＣＤＸ製品が、イソプレン及びブタジエン原料から極性不純物を除去するうえでその有用性が証明されていることから好ましい。
【０１５９】
実施例４：膜バイオリアクターシステムを使用したイソプレンガスの生成量の増加
Ｉ．大腸菌ＣＭＰ２３４株の構築
Ｐ１形質導入によれば、最大で１００ｋｂのＤＮＡを細菌株の間で移動させることが可能である（Ｔｈｏｍａｓｏｎら、２００７）。大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）における１７，２５７ｂｐの欠失を、Ｐ１形質導入を用いて大腸菌Ｋ１２ＭＧ１６５５から大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）へと細菌染色体の小片を移動させることによって置き換えた。
【０１６０】
組換えられた細菌染色体を有するコロニーを特定するため、異なる選択可能なマーカーを用いた２つの方法を用いた。第１に、出願人らは、その欠失が菌株に悪影響を与えないような、導入しようとする１７，２５７ｂｐの配列に近い遺伝子に抗生物質マーカーを挿入した。その抗生物質マーカーを含む菌株は、マーカーと同時に形質導入される１７，２５７ｂｐの細菌染色体の小片を有している可能性が高い。この場合では、出願人らは、カナマイシン耐性遺伝子（「ｋａｎＲ」）をコードした遺伝子を、１２６のアミノ酸からなる機能が不明なタンパク質をコードしているｙｂｇＳ遺伝子に挿入した。第２に、ガラクトースの利用に関与している多くの遺伝子が、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質導入しようとする１７，２５７ｂｐの小片内においてｐｇｌの近くに位置することが知られていることから、大腸菌Ｋ１２ＭＧ１６５５（大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）において欠失させられた１７，２５７ｂｐの配列を有する）から得られたＰ１ライセートによって形質導入し、０．４％（ｗ／ｖ）ガラクトースを含むＭ９培地（６ｇ／Ｌ  Ｎａ２ＨＰＯ４、３ｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、０．５ｇ／Ｌ  ＮＨ４Ｃｌ、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４）中で単離されたコロニーは、この１７，２５７ｂｐの細菌染色体の小片を含んでいる可能性が高い。
【０１６１】
プライマーＭＣＭ１２０（配列番号３２）及びＭＣＭ２２４（配列番号３３）を使用し、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ（商標）ＩＩ  Ｆｕｓｉｏｎキット（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を製造者のプロトコールにしたがって使用してＧｅｎｅＢｒｉｄｇｅｓ  ＦＲＴ−ｇｂ２−Ｃｍ−ＦＲＴテンプレートからクロラムフェニコール耐性（「ＣｍＲ」）カセットを増幅した。以下のようにして４つの５０μＬのＰＣＲ反応サイクルを行った。すなわち、９５℃／２分間；９５℃／２０秒間、５５℃／２０秒間、７２℃／１分間を３０サイクル；及び７２℃／３分間。この後、各反応液を４℃に冷却した。４つの反応液をプールし、Ｑｉａｇｅｎ  ＰＣＲカラムに製造者のプロトコールにしたがって導入し、６０μＬの溶出バッファー（「ＥＢ」）により５５℃で溶出させた。
【０１６２】
標準的な手順を用いてプラスミドｐＲｅｄＥＴ−カルベニシリンＲ（ＧｅｎｅＢｒｉｄｇｅｓ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ＭＣＭ４４６株（ＣｍＲ，ｇｉ１．６ｍＫＫＤｙＩ  Ａ１−３）内にエレクトロポレーションした。ＳＯＣ培地中、３０℃で１時間振盪した後、ＬＢ＋５０μｇ／ｍＬカルベニシリン（「ＬＢ／ｃａｒｂ５０」）プレート上、３０℃で一晩選択することによって形質転換体を回収した。カルベニシリン耐性コロニーをＭＣＭ５０８株として凍結した。
【０１６３】
ＭＣＭ５０８株を、５ｍＬのＬＢ／ｃａｒｂ５０中、３０℃で新鮮なストリークから約０．５のＯＤ６００となるまで増殖させた。この時点で４０ｍＭのＬ−アラビノースを加え、培養を３７℃で１．５時間インキュベートした。次いで遠心分離により細胞を収穫し、３μＬの上記に述べた精製したアンプリコンでエレクトロポレーションした後、５００μＬのＳＯＣ培地中、３７℃で１．５〜３時間回復させた。形質転換体をＬＢ＋１０μｇ／ｍＬカナマイシン（ＬＢ／ｋａｎ１０）プレート上、３７℃で選択した。
【０１６４】
標的遺伝子座におけるアンプリコンの組換えを、プライマーＧＢ−ＤＷ（配列番号３４）及びＭＣＭ２０８（配列番号３５）を用いたＰＣＲによって確認した。得られたアンプリコンを配列決定して下記に示す配列を有する４つのクローンを特定した。４つのカルベニシリン感受性クローンをＭＣＭ５１８〜ＭＣＭ５２１株として凍結した。
【０１６５】
ＭＣＭ５１８〜ＭＣＭ５２１株をＬＢ／ｋａｎ１０上に再びストリークし、３７℃で一晩増殖させた。ＭＣＭ５１８〜ＭＣＭ５２１株のコロニーを選び、ＬＢ／ｋａｎ１０中、３７℃で培養し、プラスミドｐＣＰ２０により電気的に形質転換した。プラスミドｐＣＰ２０は、酵母Ｆｌｐリコンビナーゼ、クロラムフェニコール、及びアンピシリン耐性遺伝子をコードし、ホスト細胞に温度感受性の複製能を与えるものである（Ｃｈｅｒｅｐａｎｏｖ，Ｐ．Ｐ．ら、Ｇｅｎｅ  １５８（１）：９〜１４（１９９５））。細胞を５００μＬのＳＯＣ培地中、３０℃で１時間振盪することによって回復させた。形質転換体を、ＬＢ／ｃａｒｂ５０プレート上、３０℃で一晩選択した。翌朝、各プレートからのコロニーを、ＬＢ／ｃａｒｂ５０培地中、３０℃で目視にて濁りが分かるまで増殖させた。この後、培養を３７℃に少なくとも３時間シフトさせた。細胞をこの培養からＬＢプレート上にストリークし、３７℃で一晩増殖させた。
【０１６６】
翌日、各コロニーをＬＢ、ＬＢ／ｃａｒｂ５０及びＬＢ／ｋａｎ１０にパッチした。カルベニシリン及びカナマイシンの両方に対して感受性を示したクローン（すなわちｃａｒｂ５０及びｋａｎ１０上で増殖できなかったもの）を液体ＬＢ中で培養し、ＭＣＭ５２８〜ＭＣＭ５３１株として凍結した。
【表３】
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【表４】
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【０１６７】
ＭＣＭ５１８〜ＭＣＭ５２１株の染色体に組み込まれたアセンブリは、バクテリオファージ（λ）に由来する新たなＰＬプロモーター及びｍＭＶＫ  ＯＲＦのごく最初の部分を含み、Ｇｅｎｅ  ＢｒｉｄｇｅｓのＦＲＴ−ｇｂ２−Ｃｍ−ＦＲＴカセットからの配列を有してプロモーター／ｍＭＶＫアセンブリの上流に組み込まれており、更にｍＭＶＫ  ＯＲＦの残りの部分に続くＭＣＭ５０８株由来の下流ＭＶＡ経路のインテグロンの残りの部分を含んでいる。
【０１６８】
ＭＣＭ５１８に組み込まれたプロモーター／ｍＭＶＫ配列（配列番号３６）：
ａａａｇａｃｃｇａｃｃａａｇｃｇａｃｇｔｃｔｇａｇａｇｃｔｃｃｃｔｇｇｃｇａａｔｔｃｇｇｔａｃｃａａｔａａａａｇａｇｃｔｔｔａｔｔｔｔｃａｔｇａｔｃｔｇｔｇｔｇｔｔｇｇｔｔｔｔｔｇｔｇｔｇｃｇｇｃｇｃｇｇａａｇｔｔｃｃｔａｔｔｃｔｃｔａｇａａａｇｔａｔａｇｇａａｃｔｔｃｃｔｃｇａｇｃｃｃｔａｔａｇｔｇａｇｔｃｇｔａｔｔａａａｔｔｃａｔａｔａａａａａａｃａｔａｃａｇａｔａａｃｃａｔｃｔｇｃｇｇｔｇａｔａａａｔｔａｔｃｔｃｔｇｇｃｇｇｔｇｔｔｇａｃａｔａａａｔａｃｃａｃｔｇｇｃｇｇｔｇａｔａｃｔｇａｇｃａｃａｔｃａｇｃａｇｇａｃｇｃａｃｔｇａｃｃａｃｃａｔｇａａｇｇｔｇｃａａａｇｇａｇｇｔａａａａａａａｃａｔｇｇｔａｔｃｃｔｇｔｔｃｔｇｃｇｃｃｇｇｇｔａａｇａｔｔｔａｃｃｔｇｔｔｃｇｇｔｇａａｃａｃｇｃｃｇｔａｇｔｔｔａｔｇｇｃｇａａａｃｔｇｃａａｔｔｇｃｇｔｇｔｇｃｇｇｔｇｇａａｃｔｇｃｇｔａｃｃｃｇｔｇｔｔｃｇｃｇｃｇｇａａｃｔｃａａｔｇａｃｔｃｔａｔｃａｃｔａｔｔｃａｇａｇｃ
ＭＣＭ５１９に組み込まれたプロモーター／ｍＭＶＫ配列（配列番号３７）：
ａａａｇａｃｃｇａｃｃａａｇｃｇａｃｇｔｃｔｇａｇａｇｃｔｃｃｃｔｇｇｃｇａａｔｔｃｇｇｔａｃｃａａｔａａａａｇａｇｃｔｔｔａｔｔｔｔｃａｔｇａｔｃｔｇｔｇｔｇｔｔｇｇｔｔｔｔｔｇｔｇｔｇｃｇｇｃｇｃｇｇａａｇｔｔｃｃｔａｔｔｃｔｃｔａｇａａａｇｔａｔａｇｇａａｃｔｔｃｃｔｃｇａｇｃｃｃｔａｔａｇｔｇａｇｔｃｇｔａｔｔａａａｔｔｃａｔａｔａａａａａａｃａｔａｃａｇａｔａａｃｃａｔｃｔｇｃｇｇｔｇａｔａａａｔｔａｔｃｔｃｔｇｇｃｇｇｔｇｔｔｇａｃｃｔａａａｔａｃｃａｃｔｇｇｃｇｇｔｇａｔａｃｔｇａｇｃａｃａｔｃａｇｃａｇｇａｃｇｃａｃｔｇａｃｃａｃｃａｔｇａａｇｇｔｇｃａａａｇｇａｇｇｔａａａａａａａｃａｔｇｇｔａｔｃｃｔｇｔｔｃｔｇｃｇｃｃｇｇｇｔａａｇａｔｔｔａｃｃｔｇｔｔｃｇｇｔｇａａｃａｃｇｃｃｇｔａｇｔｔｔａｔｇｇｃｇａａａｃｔｇｃａａｔｔｇｃｇｔｇｔｇｃｇｇｔｇｇａａｃｔｇｃｇｔａｃｃｃｇｔｇｔｔｃｇｃｇｃｇｇａａｃｔｃａａｔｇａｃｔｃｔａｔｃａｃｔａｔｔｃａｇａｇｃ
ＭＣＭ５２０に組み込まれたプロモーター／ｍＭＶＫ配列（配列番号３８）：
ａａａｇａｃｃｇａｃｃａａｇｃｇａｃｇｔｃｔｇａｇａｇｃｔｃｃｃｔｇｇｃｇａａｔｔｃｇｇｔａｃｃａａｔａａａａｇａｇｃｔｔｔａｔｔｔｔｃａｔｇａｔｃｔｇｔｇｔｇｔｔｇｇｔｔｔｔｔｇｔｇｔｇｃｇｇｃｇｃｇｇａａｇｔｔｃｃｔａｔｔｃｔｃｔａｇａａａｇｔａｔａｇｇａａｃｔｔｃｃｔｃｇａｇｃｃｃｔａｔａｇｔｇａｇｔｃｇｔａｔｔａａａｔｔｃａｔａｔａａａａａａｃａｔａｃａｇａｔａａｃｃａｔｃｔｇｃｇｇｔｇａｔａａａｔｔａｔｃｔｃｔｇｇｃｇｇｔｇｔｔｇａｃｃｔａａａｔａｃｃａｃｔｇｇｃｇｇｔｇａｔａｃｔｇａｇｃａｃａｔｃａｇｃａｇｇａｃｇｃａｃｔｇａｃｃａｃｃａｔｇａａｇｇｔｇｃａａａｇｇｔａａａａａａａｃａｔｇｇｔａｔｃｃｔｇｔｔｃｔｇｃｇｃｃｇｇｇｔａａｇａｔｔｔａｃｃｔｇｔｔｃｇｇｔｇａａｃａｃｇｃｃｇｔａｇｔｔｔａｔｇｇｃｇａａａｃｔｇｃａａｔｔｇｃｇｔｇｔｇｃｇｇｔｇｇａａｃｔｇｃｇｔａｃｃｃｇｔｇｔｔｃｇｃｇｃｇｇａａｃｔｃａａｔｇａｃｔｃｔａｔｃａｃｔａｔｔｃａｇａｇｃ
ＭＣＭ５２１に組み込まれたプロモーター／ｍＭＶＫ配列（配列番号３９）：
ａａａｇａｃｃｇａｃｃａａｇｃｇａｃｇｔｃｔｇａｇａｇｃｔｃｃｃｔｇｇｃｇａａｔｔｃｇｇｔａｃｃａａｔａａａａｇａｇｃｔｔｔａｔｔｔｔｃａｔｇａｔｃｔｇｔｇｔｇｔｔｇｇｔｔｔｔｔｇｔｇｔｇｃｇｇｃｇｃｇｇａａｇｔｔｃｃｔａｔｔｃｔｃｔａｇａａａｇｔａｔａｇｇａａｃｔｔｃｃｔｃｇａｇｃｃｃｔａｔａｇｔｇａｇｔｃｇｔａｔｔａａａｔｔｃａｔａｔａａａａａａｃａｔａｃａｇａｔａａｃｃａｔｃｔｇｃｇｇｔｇａｔａａａｔｔａｔｃｔｃｔｇｇｃｇｇｔｇｔｔｇａｃｇｔａａａｔａｃｃａｃｔｇｇｃｇｇｔｇａｔａｃｔｇａｇｃａｃａｔｃａｇｃａｇｇａｃｇｃａｃｔｇａｃｃａｃｃａｔｇａａｇｇｔｇｃａａａｇｇａｇｇｔａａａａａａａｃａｔｇｇｔａｔｃｃｔｇｔｔｃｔｇｃｇｃｃｇｇｇｔａａｇａｔｔｔａｃｃｔｇｔｔｃｇｇｔｇａａｃａｃｇｃｃｇｔａｇｔｔｔａｔｇｇｃｇａａａｃｔｇｃａａｔｔｇｃｇｔｇｔｇｃｇｇｔｇｇａａｃｔｇｃｇｔａｃｃｃｇｔｇｔｔｃｇｃｇｃｇｇａａｃｔｃａａｔｇａｃｔｃｔａｔｃａｃｔａｔｔｃａｇａｇｃ
次に、ＰＴｒｃプロモーターの制御下にあるギンドロイソプレンシンターゼの短縮型（ＭＥＡ変異体）を有するイソプレン生成大腸菌株である大腸菌ＤＷ１９９株を構築した。
【０１６９】
短縮型のギンドロイソプレンシンターゼ（ＩｓｐＳ）を有するプラスミドは、テンプレートとしてのｐＥＷＬ２４４（ｐＴｒｃ−Ｐ．ａｌｂａ（ＭＥＡ）−ｍＭＶＫとも呼ばれる（その構築については参照により本願にその全容を援用するところの米国特許出願第１２／３３５，０７１号の実施例１０に述べられている。））からＱｕｉｋｃｈａｎｇｅ（商標）（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）ＰＣＲ突然変異誘発キット（mutagenesis）によって構築した。ＰＣＲ反応液は以下の成分を含むものであった。すなわち、１μＬのｐＥＷＬ２４４（ｐＴｒｃ  Ｐ．ａｌｂａ−ｍＭＶＫをコードしたもの）、５μＬの１０Ｘ  ＰｆｕＵｌｔｒａ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙバッファー、１μＬの１００ｍＭ  ｄＮＴＰ、１μＬの５０μＭ  ＱＣ  ＥＷＬ２４４  ＭＥＡ  Ｆプライマー（配列番号４０）、１μＬの５０μＭ  ＱＣ  ＥＷＬ２４４  ＭＥＡ  Ｒプライマー（配列番号４１）、２μＬのＤＭＳＯ、１μＬのＰｆｕＵｌｔｒａ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙポリメラーゼ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、及び３９μＬのｄｉＨ２Ｏ。ＰＣＲ反応サイクルを以下のようにして行った。すなわち、９５℃／１分間；及び９５℃／３０秒間、５５℃／１分間、６８℃／７．３分間を１８サイクル。次いでこの反応液を４℃まで冷ました。
【０１７０】
このＰＣＲ生成物をＥ−ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用したゲル電気泳動によって可視化した後、１μＬのＤｐｎＩ制限エンドヌクレアーゼ（Ｒｏｃｈｅ，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）により３７℃で３時間処理した。次いで１０μＬのＰＣＲ生成物を、微小透析膜（ＭｉｌｌｉＰｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を使用して脱塩し、標準的な分子生物学の方法を用いてエレクトロコンピテントな大腸菌ＭＣＭ５３１株（上記のようにして調製したもの）に形質転換した。細胞を１ｍＬのＬＢ培地中、３０℃で１．５時間回復させ、５０μｇ／ｍＬのカルベニシリン及び５ｍＭのメバロン酸を含むＬＢアガープレート上に播いてから３７℃で一晩インキュベートした。翌日、陽性のコロニー（ＤＷ１９５株、下記参照）を選択して増殖、プラスミド精製（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）し、下記に示すプライマーを用いたＤＮＡ配列決定（Ｑｕｉｎｔａｒａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ）によって確認した。最終的なプラスミドであるｐＤＷ３４（図１９Ａ〜Ｄ；配列番号１５６）は、Ｐ．ａｌｂａ  ＩｓｐＳの短縮型をコードするオープンリーディングフレームを有していることが確認された。
【０１７１】
ｐＤＷ３４及びＭＣＭ８２（その構築については参照により本願にその全容を援用するところの米国特許出願第１２／３３５，０７１号の実施例８に述べられている）をエレクトロコンピテントなＭＣＭ５３１（上記のように調製したもの）内に形質転換することによってＤＷ１９９株が生成された。細胞を１ｍＬのＬＢ培地中、３７℃で１時間回復させ、５０μｇ／ｍＬのスペクチノマイシン及び５０μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含むＬＢアガープレート上に播いてから３７℃で一晩インキュベートした。翌日、ＤＷ１９９株の抗生物質耐性コロニーを更なる実験用に選択した。
【表５】
0005855576.tif 000006
【表６】
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【０１７２】
この実施例では、大腸菌ＣＭＰ２１５、ＣＭＰ２５８及びＣＭＰ２３４株の構築について述べる。これらの菌株はいずれも、大腸菌ＭＧ１６５５のゲノムＤＮＡを有するＰ１ファージにより形質導入し、ＭＧ１６５５には存在するがＢＬ２１及びＢＬ２１（ＤＥ３）には存在しない１７，２５７ｂｐの小片の組換えについて選択されたＢＬ２１に由来するものである。
【０１７３】
Ｋｅｉｏコレクション（Ｂａｂａら、２００６）より入手したカナマイシン耐性遺伝子（「ＫａｎＲ」）でｙｂｇＳ遺伝子を置換した（すなわち、ｙｂｇＳ：：ＫａｎＲ突然変異）ＪＷ０７３６株からＰ１ライセートを調製した。このライセートを使用してＭＣＭ５３１株（上記に述べたもの）に感染させ、ＣＭＰ２１５株を作出した。ＣＭＰ２１５の遺伝子型は、プライマーｇａｌＭ  Ｒ（５’−ＧＴＣ  ＡＧＧ  ＣＴＧ  ＧＡＡ  ＴＡＣ  ＴＣＴ  ＴＣＧ−３’；配列番号９）及びｇａｌＭ  Ｆ（５’−ＧＡＣ  ＧＣＴ  ＴＴＣ  ＧＣＣ  ＡＡＧ  ＴＣＡ  ＧＧ−３’；配列番号８）を使用したＰＣＲによって確認した。これらのプライマーは、図２０に示されるようにｇａｌＭ遺伝子にアニールするが、１７，２５７ｂｐが欠失した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の染色体ＤＮＡからのＰＣＲ生成物のみを生成する。
【０１７４】
Ｐ１形質導入後のこの１７，２５７ｂｐのフラグメントの挿入を、以下のプロトコールによるＰＣＲによって確認した。１つの細菌コロニーを３０μＬのＨ２Ｏ中で攪拌し、９５℃に５分間加熱した。得られた溶液を遠心沈降させ、２μＬの上清を以下のＰＣＲ反応においてテンプレートとして使用した。すなわち、２μＬのコロニーＨ２Ｏ溶液、５μＬのＨｅｒｃｕｌａｓｅ（登録商標）バッファー、１μＬの１００ｍＭ  ｄＮＴＰ、１μＬの１０μＭ順方向プライマー、１μの１０μＭ逆方向プライマー、０．５μのＨｅｒｃｕｌａｓｅ（登録商標）Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、及び３９．５μＬのｄｉＨ２Ｏ。ＰＣＲ反応サイクルは、ＰＣＲ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｈｙｂａｉｄ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ，ＭＡ）で以下のようにして行った。すなわち、９５℃／２分間；９５℃／３０秒間、５２℃／３０秒間、７２℃／６０秒間を３０サイクル；及び７２℃／７分間。次いでこの反応液を４℃まで冷ました。５２℃のアニーリング温度は、プライマーペアの低いＴｍよりも３℃低い温度である。得られたＰＣＲフラグメントのサイズは、プレキャストした０．８％  Ｅ−ゲル（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）上でＤＮＡ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｒｋｅｒ  Ｘ（７５〜１２，２１６ｂｐ）（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）をサイズマーカーとして使用して測定した。形質導入の成功は、ＣＭＰ２１５株がガラクトース上で増殖可能であったことによっても確認された。
【０１７５】
別の方法として、大腸菌ＭＧ１６５５のライセートを使用してＭＣＭ５３１株（上記に述べたもの）に形質導入した。０．４％（ｗ／ｖ）ガラクトースを添加したＭ９培地上で選択したコロニーをＣＭＰ２５８と命名した。ｐｇｌを含む１７，２５７ｂｐの領域の存在を、基本的には上記に述べたようにしてプライマーｇａｌＭ  Ｒ（配列番号９）及びｇａｌＭ  Ｆ（配列番号８）を使用したＰＣＲによって確認した。
【０１７６】
ＣＭＰ２１５株を、ｍｖａＥ及びｍｖａＳを発現するプラスミドｐＣＬＰｔｒｃＵｐｐｅｒＰａｔｈｗａｙ（参照により本願にその全容を援用するところの米国特許出願第１２／３３５，０７１号の実施例８に述べられるようにして調製したもの）及びプラスミドｐＤＷ３４（上記に述べたような、短縮型のギンドロイソプレンシンターゼ及びＭ．マゼイメバロン酸キナーゼを有するもの）をエレクトロポレーションすることによって同時形質転換した。形質転換体を、５０μｇ／ｍＬカルベニシリン＋５０μｇ／ｍＬスペクチノマイシンを含むＬＢアガープレート上で選択した。１つのコロニーを選び、ＣＭＰ２３４と命名した。
【０１７７】
ＩＩ．ＭＢＲを使用した発酵はイソプレン生成を増大させる
イソプレンの生成量の増大：膜バイオリアクターシステムでの大腸菌株ＣＭＰ２３４による１５Ｌ流加発酵。大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ＣＭＰ２３４株（上記に述べたようにして構築したもの）は、Ｍ．マゼイメバロン酸キナーゼ及びギンドロイソプレンシンターゼを過剰発現し、大腸菌Ｋ１２  ＭＧ１６５５株に由来する６−ホスホグルコノラクトナーゼ（ＰＧＬ）の挿入されたコピーを有している。イソプレンは、膜バイオリアクター（ＭＢＲ）内で１５Ｌスケールで最小培地中で流加培養で増殖させたＣＭＰ２３４細胞により生成された。
【０１７８】
培地の組成（１Ｌ当たり）：７．５ｇのＫ２ＨＰＯ４、２ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２ｇのクエン酸一水和物、０．３ｇのクエン酸鉄アンモニウム、０．５ｇの酵母エキス、及び１ｍＬの１０００Ｘ改変微量金属溶液（下記に組成を示す）を蒸留脱イオン水（ｄｉＨ２Ｏ）に同時に溶解し、１２３℃で２０分間加熱滅菌した。ｐＨを２８％水酸化アンモニウムで７．０に調整し、滅菌水で最終体積とした。滅菌処理及びｐＨ調整後に１０ｇのグルコース、８ｍＬのビタミン溶液（下記に組成を示す）、及び適当な抗生物質を加えた。
【０１７９】
１０００Ｘ改変微量金属溶液（１Ｌ当たり）：４０ｇのクエン酸・Ｈ２Ｏ、３０ｇのＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ、１０ｇのＮａＣｌ、１ｇのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１ｇのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、１ｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１００ｍｇのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、１００ｍｇのＨ３ＢＯ３、及び１００ｍｇのＮａＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏを１成分ずつｄｉＨ２Ｏに溶解した。ｐＨをＨＣｌ／ＮａＯＨにより３．０に調整し、溶液を最終体積とし、０．２２μｍフィルターを使用して滅菌した。
【０１８０】
ビタミン溶液（１Ｌ当たり）：１ｇの塩酸チアミン、１ｇのＤ−（＋）−ビオチン、１ｇのニコチン酸、４．８ｇのＤ−パントテン酸、及び４．０ｇの塩酸ピリドキシンを１成分ずつｄｉＨ２Ｏに溶解した。ｐＨをＨＣｌ／ＮａＯＨにより３．０に調整し、溶液を最終体積とし、０．２２μｍフィルターで滅菌した。
【０１８１】
マクロ塩溶液（１Ｌ当たり）：２９６ｇのＭｇＳＯ４・７Ｏ、２９６ｇのクエン酸一水和物、及び４９．６ｇのクエン酸鉄アンモニウムを同時に水に溶解し、最終体積とし、０．２２μｍフィルターで滅菌した。
【０１８２】
グルコース供給溶液（１ｋｇ当たり）：０．５７ｋｇのグルコース、０．３８ｋｇのｄｉＨ２Ｏ、７．５ｇのＫ２ＨＰＯ４、及び１０ｇの１００％  Ｆｏａｍｂｌａｓｔを互いに混合し、オートクレーブで滅菌した。５．６ｍＬのマクロ塩溶液、０．８ｍＬの１０００Ｘ改変微量金属溶液、及び６．７ｍＬのビタミン溶液を、溶液が２５℃に冷めた後に加えた。
【０１８３】
上流メバロン酸（ＭＶＡ）経路（ｐＣＬ  Ｕｐｐｅｒ）、統合された下流ＭＶＡ経路（ＰＬ．２ｍＫＫＤｙＩ）、Ｍ．マゼイ由来のメバロン酸キナーゼ、及びギンドロ由来の短縮型イソプレンシンターゼ（ｐＴｒｃＡｌｂａ（ＭＥＡ）ｍＭＶＫ（ｐＤＷ３４））を発現し、修復された染色体ｐｇｌ遺伝子（ｔ  ｙｂｇＳ：：Ｋａｎ）を有する大腸菌ＢＬ２１細胞（菌株名ＣＭＰ２３４）により、１５Ｌバイオリアクター中で発酵を行った。
【０１８４】
この実施例は、別の「非ＭＢＲ」無膜型リアクターをコントロールとして用い、ＭＢＲ内の望ましい発酵ｐＨ  ７．０及び温度３４℃でグルコースからのイソプレンの生成を観測する目的で行った。大腸菌ＢＬ２１  ＣＭＰ２３４株の凍結容器を解凍し、各リアクターについてトリプトン−酵母エキス培地中に接種した。５５０ｎｍで測定した光学密度（ＯＤ）が１．０となるまで接種材料が増殖した後、５００ｍＬを用いて１５Ｌリアクターに接種し、初期発酵槽体積を５Ｌとした。
【０１８５】
図２１は、大腸菌株ＣＭＰ２３４を増殖させる１５Ｌバイオリアクターを備えたタンジェンシャルフローフィルター装置を有する膜バイオリアクターを示す。図２２は、１５Ｌスケールの発酵運転中のＭＢＲの操作パラメータを示す。
【０１８６】
供給溶液は、６．４ｇ／分の最大供給速度に達するまで指数関数的速度で加えた。次いで、代謝要求量を満たすように６．４ｇ／分以下の速度でグルコースを供給した。８８時間の発酵中にＭＢＲリアクターに供給されたグルコースの総量は、非ＭＢＲコントロールリアクターに供給されたグルコースが８．４ｋｇであったのに対して、９．２ｋｇであった。タンパク質発現の誘導は、イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加することにより達成された。ＩＰＴＧ濃度を、ＯＤが５に達した時点で１１０μＭとし、ＯＤが１００に達した時点で２００μＭに上昇させた。
【０１８７】
透明化された発酵ブロス（透過液）を、ＭＢＲ（図２１）を使用して、発酵３０時間後から開始して、リアクター重量を９．７ｋｇに維持するのに必要な量だけ除去した（図２８、８８時間の発酵中７．８ｋｇの透過液が除去された）。細胞を含んだ全ブロスを、非ＭＢＲコントロールリアクターから、発酵３０時間後から開始して、リアクター重量を９．７ｋｇに維持するのに必要な量だけ除去した（図２８、８８時間の発酵中６．６ｋｇの全ブロスが除去された）。ＭＢＲリアクター及び非ＭＢＲリアクター内の時間に対するＯＤプロファイルを図２３に示す。
【０１８８】
リアクターのオフガス中のイソプレン濃度をＨｉｄｅｎ質量分析器を使用して測定した。発酵中のイソプレン力価は、ＭＢＲでは８８時間後の１００．５ｇ／Ｌに、非ＭＢＲコントロールでは８４．３ｇ／Ｌに上昇した（図２５）。８８時間の発酵中に生成した総イソプレンは、非ＭＢＲコントロールでは７２１．０ｇであったのに対して、ＭＢＲでは８４３．９ｇであった。生成量の経時的変化を図２６に示す。比生産性の経時的変化は、両方のリアクターで極めて似通ったプロファイルを示しており、ＭＢＲは細胞の生理学的性質を大きく変化させなかったようである（図２４）。発酵中のグルコース炭素からのイソプレンのモル収率は、非ＭＢＲコントロールでは８８時間後に１８．８％であったのに対して、ＭＢＲでは８８時間後に２０．１％であった。グルコースからのイソプレンの重量収率（％）は、非ＭＢＲコントロールでは８８時間後に８．７％であったのに対して、ＭＢＲでは８８時間後に９．３％であった。
【０１８９】
イソプレン生成速度、イソプレン力価、総イソプレン量、体積生産性、及び比生産性を以下の式に基づいて計算した。
【数１】
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【０１９０】
式中、
【表７】
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【０１９１】
であり、積分は台形公式によって推定することができる。
【０１９２】
実施例５：ＭＢＲから再循環される透過液は、イソプレンの比生産性を向上させる。
【０１９３】
ＭＢＲからの透過液の再循環。ＭＶＡ経路（Ｅ．フィカリス由来の上流ＭＶＡ経路及びＳ．セレビシアエ由来の統合された下流ＭＶＡ経路＋Ｍ．マゼイ由来のＭＶＫ）及びイソプレンシンターゼ（ギンドロ由来）を有する、イソプレン生成大腸菌ＤＷ２０２株（ＤＷ１９９株（上記に述べたようにして生成されたもの）＋ｐＢＢＲ  ｇｉ１．５−ｐｇｌ（上記に述べたようにして生成されたもの））の１５Ｌスケールの発酵からの培地を、接種３８時間後にバイオリアクターから単離した。上記に述べたようにして１５Ｌスケールの発酵を行った。細胞塊を遠心分離により速やかに除去した。残りの培地（透過液に相当する）を５０，０００ｒｐｍ、４℃で３０分間、超遠心し、すべての固形分を確実に除去した。得られた透明化された使用済み培地を、新鮮なＴＭ３最小培地中に０〜３０％の範囲の濃度に希釈した。
【０１９４】
大腸菌ＭＣＭ５９７株（ギンドロイソプレンシンターゼの短縮型（ＭＥＡ変異体）、大腸菌ＤＸＳ、及びＳ．セレビシアエのＩＤＩを発現する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（参照により本願にその全容を援用するところの米国特許出願第１２／３３５，０７１号の実施例７に述べられるようにして調製したもの）を一晩増殖させ、上記培地に接種した。ＭＣＭ５９７株におけるタンパク質発現を２００μＭ  ＩＰＴＧにより誘導し、誘導された菌株を微小発酵槽中で３０℃で増殖させた。培養の増殖（すなわち細胞塊形成）後、プレートリーダーを使用して６００ｎｍの光学密度を測定した。イソプレンの生成後、接種４時間後に採取した１００μＬのヘッドスペース試料のＧＣ分析を行った。イソプレン生成量を光学密度で割ることによって比生産性を計算した。
【０１９５】
培地に３０％（ｗ／ｗ）の使用済み培地（すなわち透過液）を添加することによって、増殖率が約２５％低くなったにもかかわらず、イソプレンの比生産性が３倍以上高くなった（図２９）。比生産性がより高いほど、単位細胞量につき単位時間当たり、より多くのイソプレンが生成されることを意味する。この結果は、使用済み培地を含むＭＢＲ透過液を使用することによって、イソプレン生成細胞の比生産性を向上させることが可能であることを示唆するものであり、これにより製造コストを低減させることが可能である。
【０１９６】
本明細書において示される見出しは、明細書全体を参照することによって把握可能な発明の様々な態様を限定するものではない。
【０１９７】
上記の発明は、理解を明確にする目的で実例及び例示としてある程度詳細に説明したものであるが、本発明に対しては、付属の特許請求の範囲の趣旨及び範囲から逸脱することなく特定の変更及び改変を行うことが可能である点は、本発明の教示に照らすことで当業者には直ちに明らかとなるであろう。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【図１４Ｆ】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【配列表】
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