(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の化学式２に記載される化合物、上記の化学式２に記載される化合物の薬学的に許容可能な塩、下記の化学式１に記載される化合物、および上記の化学式１に記載される化合物の薬学的に許容される塩からなる群より選択されるものを有効成分として含む、 卵巣顆粒細胞腫瘍の予防または治療用の薬学的組成物。
【化１】
0005973108.tif 000009
【化２】
0005973108.tif 000010
【請求項２】
上記の組成物は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３β（Ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ  ３−ｂｅｔａ；ＧＳＫ３ｂｅｔａ）を抑制することを特徴とする請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項３】
上記の組成物は、ＦＯＸＬ２（ｆｏｒｋｈｅａｄ  ｂｏｘ  Ｌ２）タンパク質の３３番目のアミノ酸であるセリン（ｓｅｒｉｎｅ）のリン酸化を抑制することを特徴とする請求項１または請求項２に記載の薬学的組成物。
【請求項４】
下記の化学式２に記載される化合物、上記の化学式２に記載される化合物の薬学的に許容可能な塩、下記の化学式１に記載される化合物、および上記の化学式１に記載される化合物の薬学的に許容可能な塩からなる群より選択されるものを有効成分として含む、卵巣顆粒細胞腫瘍の予防または改善用の健康機能食品の組成物。
【化１】
0005973108.tif 000011
【化２】
0005973108.tif 000012
【請求項５】
上記の組成物は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３β（Ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ  ３−ｂｅｔａ；ＧＳＫ３ｂｅｔａ）を抑制することを特徴とする請求項４に記載の健康機能食品の組成物。
【請求項６】
上記の組成物はＦＯＸＬ２（ｆｏｒｋｈｅａｄ  ｂｏｘ  Ｌ２）タンパク質の３３番目のアミノ酸であるセリン（ｓｅｒｉｎｅ）のリン酸化を抑制することを特徴とする、請求項４または請求項５に記載の健康機能食品の組成物。
【請求項７】
卵巣顆粒細胞腫瘍を予防または治療用薬剤の製造のための下記の化学式２に記載される化合物、上記の化学式２に記載される化合物の薬学的に許容可能な塩、下記の化学式１に記載される化合物、および上記の化学式１に記載される化合物の薬学的に許容可能な塩からなる群より選択される化合物を含む組成物の使用。
【化１】
0005973108.tif 000013
【化２】
0005973108.tif 000014
【請求項８】
上記の組成物は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３β（Ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ  ３−ｂｅｔａ；ＧＳＫ３ｂｅｔａ）を抑制することを特徴とする、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
上記の組成物は、ＦＯＸＬ２（ｆｏｒｋｈｅａｄ  ｂｏｘ  Ｌ２）タンパク質の３３番目のアミノ酸であるセリン（ｓｅｒｉｎｅ）のリン酸化を抑制することを特徴とする、請求項７または請求項８に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は卵巣顆粒細胞腫瘍の予防または治療用の薬学的組成物および健康機能性食品の組成物に関するものであり、より具体的にはグリコーゲンシンターゼキナーゼ３β抑制物質を有効成分として含む卵巣顆粒細胞腫瘍の予防または治療用の薬学的組成物および健康機能性食品の組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
２０代女性によく発病する疾患の中で代表的なもので、卵巣顆粒細胞腫瘍（ｇｒａｎｕｌｏｓａ  ｃｅｌｌ  ｔｕｍｏｒ；ＧＣＴ）と卵胞膜細胞腫瘍（ｔｈｅｃａ  ｃｅｌｌ  ｔｕｍｏｒ）がある。中でも、卵巣顆粒細胞腫瘍は、悪性卵巣性器索間質腫瘍（ｓｅｘｃｏｒｄ−ｓｔｒｏｍａｌ  ｔｕｍｏｒ、ＳＣＳＴ）の最も多い類型であり、エストロゲンを生産して初潮前の膣の出血前月経不順や閉経後の膣の出血などの症状があり、顆粒膜細胞腫の３／４が病気に属して、腫瘍の成長速度が遅く、再発も非常に遅くなり、無病期間が１０年以上である。
【０００３】
治療においては、子宮切除術または両側の卵管卵巣摘出術などのような手術療法、放射能療法、化学療法などがあるが、手術療法は出血、感染などの副作用や手術後の後遺症の問題があり、放射能療法は放射能の露出による深刻な副作用が発生することがあり、化学療法はその効果がまだ立証されていない問題点がある。卵巣顆粒細胞腫瘍は、全体の卵巣がんの５％以下であったり、２０代前に診断および治療する場合、９０％以上の患者が早期治療の可能性があるので、卵巣顆粒細胞腫瘍の予防、改善または治療に効果的な組成物に対する開発は非常に重要である。
【０００４】
一方、ＦＯＸＬ２はｗｉｎｇｅｄ−ｈｅｌｉｘ／ｆｏｒｋｈｅａｄ（ＦＨ）ドメイン伝写因子で知られていて、現在ＦＯＸＬ２に対する多様な研究が行われている。すなわち、２０１０年欧州分子生物研究所で主導した研究結果、著名な学術誌であるＣｅｌｌに発表した研究論文では、性別がひとえにＸＹ染色体によって決定されるという科学的事実を覆す研究結果を報告した。研究陣はｆｅｍａｌｅ  ｍｏｕｓｅのＦＯＸＬ２遺伝子をＫｎｏｃｋ−ｏｕｔしたマウスのｆｅｍａｌｅの卵巣が睾丸と同じ構造を有する組織に変わって、男性ホルモンであるテストステロンを分泌する結果を確認したし、このような過程で特に卵巣に存在する卵巣顆粒細胞が徐々に精子の成熟に関与するセルトリ細胞（ｓｅｒｔｏｌｉ  ｃｅｌｌ）に変化することを確認した。
【０００５】
また、ＦＯＸＬ２が卵巣のどの細胞に発現するかと一緒にその発現の段階別の推移を調べた結果、ＦＯＸＬ２  ｍＲＮＡは発生段階から未成熟と成熟したマウスの卵巣ですべて発現して、特に小さいサイズまたは中間のサイズの卵胞に存在する未分化された顆粒細胞（ｇｒａｎｕｌｏｓａ  ｃｅｌｌ）に限定的に発現することを確認することで、ＦＯＸＬ２が卵胞の成長を調節する因子であることを報告した。
【０００６】
さらに、卵巣顆粒細胞腫瘍（ＧＣＴ）の発病と関連して、２００９年度６月Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ誌に発表された研究結果によれば、ｗｈｏｌｅ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ  ｐａｉｒｅｄ−ｅｎｄ  ＲＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇを通じて９７％のａｄｕｌｔ−ｔｙｐｅ  ＧＣＴ患者からＦＯＸＬ２という遺伝子にｐｏｉｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎ（４０２Ｃ−＞Ｇ）があることが報告された。これを通じて、ＦＯＸＬ２の単一、再発性体細胞突然変異（４０２Ｃ−＞Ｇ）が成人型ＧＣＴの発病起電で潜在的な調整者として判断されることができることが報告された（米国公開特許ＵＳ２０１１／０１９５０７０参考）。
【０００７】
本発明者はＦＯＸＬ２タンパク質の翻訳後の変形（ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）分析を通じて、ＦＯＸＬ２セリン（ｓｅｒｉｎｅ）３３残基のリン酸化を確認したと同時に、Ｃ１３４Ｗ突然変異を過発現する場合にも、Ｓ３３残基リン酸化の程度がＷＴ（ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ）より、さらにリン酸化されていることを確認して、ＧＳＫ３ｂｅｔａが特異的にＦＯＸＬ２Ｓ３３残基のリン酸化に関与されることを発見し、ＧＳＫ３ｂｅｔａ抑制物質が、卵巣顆粒細胞腫瘍を予防、治療または改善するために有用に用いることができることを見出し、これに基づいて本発明を完成することになった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は化学式１に記載される化合物、上記の化学式１に記載される化合物の薬学的に許容可能な塩、化学式２に記載される化合物、および上記の化学式２に記載される化合物の薬学的に許容可能な塩からなる群より選択されるものを有効成分として含む卵巣顆粒細胞腫瘍の予防または治療用の薬学的組成物を提供することをその目的とする。
【０００９】
また、本発明は化学式１に記載される化合物、上記の化学式１に記載される化合物の薬学的に許容可能な塩、化学式２に記載される化合物、および上記の化学式２に記載される化合物の薬学的に許容可能な塩からなる群より選択されるものを有効成分として含む卵巣顆粒細胞腫瘍の予防または改善用の健康機能食品の組成物を提供することを他の目的とする。
【００１０】
しかし、本発明が成し遂げようとする技術的課題は以上で言及した課題に制限されなく、言及されていない他の課題は以下の記載から当業者に明確に理解することができるだろう。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は下記の化学式１に記載される化合物、上記の化学式１に記載される化合物の薬学的に許容可能な塩、下記の化学式２に記載される化合物、および上記の化学式２に記載される化合物の薬学的に許容可能な塩からなる群より選択されるものを有効成分として含む卵巣顆粒細胞腫瘍の予防または治療用の薬学的組成物を提供する。
【化１】
0005973108.tif 000002
【化２】
0005973108.tif 000003
【００１２】
本発明の一具現例として、上記の組成物はグリコーゲンシンターゼキナーゼ３β（Ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ  ３−ｂｅｔａ；ＧＳＫ３ｂｅｔａ）を抑制することを特徴とする。
【００１３】
本発明の他の具現例として、上記の組成物はＦＯＸＬ２（ｆｏｒｋｈｅａｄ  ｂｏｘ  Ｌ２）タンパク質の３３番目のアミノ酸であるセリン（ｓｅｒｉｎｅ）のリン酸化を抑制することを特徴とする。
【００１４】
また、本発明は化学式１に記載される化合物、上記の化学式１に記載される化合物の薬学的に許容可能な塩、化学式２に記載される化合物、および上記の化学式２に記載される化合物の薬学的に許容可能な塩からなる群より選択されるものを有効成分として含む卵巣顆粒細胞腫瘍の予防または改善用の健康機能食品の組成物を提供する。
【００１５】
本発明の一具現例として、上記の組成物はグリコーゲンシンターゼキナーゼ３β（Ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ  ３−ｂｅｔａ；ＧＳＫ３ｂｅｔａ）を抑制することを特徴とする。
【００１６】
本発明の他の具現例として、上記の組成物はＦＯＸＬ２（ｆｏｒｋｈｅａｄ  ｂｏｘ  Ｌ２）タンパク質の３３番目のアミノ酸であるセリン（ｓｅｒｉｎｅ）のリン酸化を抑制することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１７】
本発明による組成物は化学式１に記載される化合物、上記の化学式１に記載される化合物の薬学的に許容可能な塩、下記の化学式２に記載される化合物、および上記の化学式２に記載される化合物の薬学的に許容可能な塩からなる群より選択されるものを有効成分として含むことにより、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３β（Ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ  ３−ｂｅｔａ；ＧＳＫ３ｂｅｔａ）を抑制して、これによって、ＦＯＸＬ２（ｆｏｒｋｈｅａｄ  ｂｏｘ  Ｌ２）タンパク質の３３番目のアミノ酸であるセリン（ｓｅｒｉｎｅ）のリン酸化を抑制する効果を有して、卵巣顆粒細胞腫瘍の予防または治療用の組成物として有用に用いることができる。これに加えて、健康機能食品の組成物としても有用に用いることができることで期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、ＦＯＸＬ２の非哺乳類と哺乳類の間のＳ３３残基の塩基配列保全分析の結果を示す図面である。
【図２】図２は、ＦＯＸＬ２非リン酸化突然変異であるＳ３３Ａと過リン酸化突然変異であるＳ３３Ｄ突然変異をクローニングしてウェスタンブロッティング方法を用いてそれぞれのリン酸化程度を確認した結果を示す図面である。
【図３】図３は、ＧＰＳ２．１  ｐｈｏｓｐｈｏｐｌｏｔを用いてリン酸化に関与するＫｉｎａｓｅを予測した結果を示す図面である。
【図４】図４は、ＦＯＸＬ２Ｓ３３残基のリン酸化に関与するキナーゼの確認のためのウェスタンブロッティング分析結果を示す図面である。
【図５】図５は、ＧＳＫ３ｂｅｔａが特異的にＦＯＸＬ２Ｓ３３残基のリン酸化に関与するかどうかに関する確認をためのウェスタンブロッティング分析結果を示す図面である。
【図６】図６は、ＦＯＸＬ２の安定的な過発現およびＳ３３特異的ＧＳＫ３ｂｅｔａの効果の確認のためのウェスタンブロッティング分析結果を示す図面である。
【図７】図７は、ＧＳＫ３ｂｅｔａとＦＯＸＬ２タンパク質の結合ドメイン確認のための免疫沈降法の分析結果を示す図面である。
【図８】図８は、ＦＯＸＬ２Ｃ１３４Ｗ（ＧＣＴ）のＳ３３リン酸化程度の確認のためのウェスタンブロッティング分析結果を示す図面である。
【図９】図９は、ＦＯＸＬ２Ｃ１３４ＷとＳ３３残基の直接的リン酸化の関連性確認実験の結果を示す図面である。
【図１０】図１０は、ＦＯＸＬ２Ｃ１３４Ｗ突然変異とＷＴの間のＧＳＫ３ｂｅｔａの結合程度の確認のための免疫沈降法の分析結果を示す図面である。
【図１１】図１１は、ＧＳＫ３ｂｅｔａ抑制効果検証のためのルシフェラーゼ分析および細胞生存率の分析結果を示す図面である。
【図１２】図１２は、ＧＳＫ３ｂｅｔａ抑制効果検証のためのタンパク質安定度実験の結果を示す図面である。
【図１３】図１３は、ＧＳＫ３ｂｅｔａ抑制効果検証のための細胞成長率実験の結果を示す図面である。
【図１４】図１４は、卵巣顆粒細胞腫瘍に対するＧＳＫ３ｂｅｔａ抑制物質の効能検証結果を示す図面である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２０】
本発明は下記の化学式１に記載される、３−（２，４−ジクロロフェニル）−４−（１−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン  ｛３−（２，４−Ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−４−（１−ｍｅｔｈｙｌ−１Ｈ−ｉｎｄｏｌ−３−ｙｌ）−１Ｈ−ｐｙｒｒｏｌｅ−２，５−ｄｉｏｎｅ｝、上記の化学式１に記載される化合物の薬学的に許容可能な塩、化学式２に記載されるＮ−［（４−メトキシフェニル）メチル−Ｎ'−（５−ニトロ−チアゾール−２−イル）ウレア｛Ｎ−［（４−Ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）Ｍｅｔｈｙｌ］−Ｎ'−（５−ｎｉｔｒｏ−ｔｈｉａｚｏｌｅ−２−ｙｌ）ｕｒｅａ｝、および上記の化学式２に記載される化合物の薬学的に許容可能な塩からなる群より選択されるものを有効成分として含む卵巣顆粒細胞腫瘍の予防または治療用の薬学的組成物を提供する。
【化１】
0005973108.tif 000004
【化２】
0005973108.tif 000005
【００２１】
上記の化学式１および化学式２に記載される各化合物は公知された化学的な合成方法で製造したり、市販される試薬を購入して用いることができる。
【００２２】
本発明の一実施例によれば、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３β（Ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ  ３−ｂｅｔａ；ＧＳＫ３ｂｅｔａ）が特異的にＦＯＸＬ２Ｓ３３残基のリン酸化を調節するということを確認し（実施例４を参考）、また、化学式１または化学式２に記載される化合物を用いてＧＳＫ３ｂｅｔａを抑制する場合、ＦＯＸＬ２Ｓ３３残基のリン酸化が減って（実施例５を参考）、卵巣顆粒腫瘍細胞（ＧＣＴ）で多く発見されたＣ１３４Ｗ突然変異の細胞成長率が減少して（実施例９を参考）、卵巣顆粒腫瘍細胞から誘導された腫瘍のサイズが減ったことを確認した（実施例１０を参考）。
【００２３】
また、上記の化学式１または化学式２に記載される化合物は薬学的に許容可能な塩の形態で用いることができ、本発明で用いられる用語「薬学的に許容可能な塩」は化合物が投与される有機体に深刻な刺激を誘発せず、化合物の生物学的な活性と物性を損傷しない化合物の形態を意味する。
【００２４】
薬学的に許容可能な塩としては、薬学的に許容可能な遊離酸（ｆｒｅｅ  ａｃｉｄ）により形成された酸付加塩が有用である。酸付加塩は塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜硝酸、または亜リン酸のような無機酸類と脂肪族モノおよびジカルボン酸塩、フェニル−置換されたアルカノエート、ヒドロキシアルカノエートおよびアルカンチオエート、芳香族酸類、脂肪族および芳香族スルホン酸類などの非毒性有機酸から得る。これらの薬学的に無毒な塩類としては、硫酸、ピロ硫酸塩、重硫酸塩、亜硫酸塩、バイサルファイト、ニトレート、リン酸塩、モノハイドロゲンホスファート、ジハイドロゲンホスファート、メタホスファート、メタホスファート、ブロマイド、アイオダイド、フルオライド、アセテート、プロピオネート、デカノエート、カプリレート、アクリレート、ホルマート、イソブチレート、カプレート、ヘプタノエート、プロピオレート、オキサレート、マロネート、スクシネート、スベラート、セバカート、フマラート、マレアート、ブチン−１，４−ジオエート、ヘキサン−１，６−ジオエート、ベンゾエート、クロロベンゾエート、メチルベンゾエート、ジニトロベンゾエート、ヒドロキシベンゾエート、メトキシベンゾエート、フタラート、テレフタラート、ベンゼンスルホナート、トルエンスルホナート、クロロベンゼンスルホナート、キシレンスルホナート、フェニルアセテート、フェニルプロピオネート、フェニルブチレート、シトレート、ラクテート、β−ヒドロキシブチレート、グリコラート、マラート、タルトラート、メタンスルホナート、プロパンスルホナート、ナフタレン−１−スルホナート、ナフタレン−２−スルホナートまたはマンデルレートを含むが、これに制限されない。
【００２５】
本発明による、酸付加塩は通常の方法、例えば、化学式１または化学式２に記載される化合物を過量の酸水溶液の中に溶解させて、この塩を水混化性有機溶媒、例えば、メタノール、エタノール、アセトンまたはアセトニトリルを用いて沈殿させて製造することができる。同量の化学式１または化学式２に記載される化合物および水の中の酸またはアルコールを加熱して、続いて、この混合物を蒸発させて乾燥させたりまたは析出された塩を吸入・濾過させて製造することができる。
【００２６】
また、塩基を用いて、薬学的に許容可能な金属塩を作ることができる。アルカリ金属またはアルカリ土金属塩は、例えば、化合物を過量のアルカリ金属水酸化物またはアルカリ土金属水酸化物の溶液の中に溶解して、非溶解化合物塩を濾過して、濾液を蒸発、乾燥させて得る。この際に、金属塩としては、ナトリウム、カリウム、カルシウム塩を製造することが製薬上適合である。また、これに対応する銀塩はアルカリ金属またはアルカリ土金属塩を適当な銀塩（例、硝酸銀）と反応させて得た。
【００２７】
本発明で用いられる用語「予防」とは、本発明の組成物の投与により、卵巣顆粒細胞腫瘍を抑制させたり、発病を遅延させたりするすべての行為を意味する。
【００２８】
本発明で用いられる用語「治療」とは、本発明の組成物の投与により、卵巣顆粒細胞腫瘍による症状が好転されたり、有利に変更されるすべての行為を意味する。
【００２９】
本発明による上記の薬学的組成物を製剤化する場合、一般に用いられる充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を用いて製造される。
【００３０】
経口投与のための固形製剤には、錠剤、患剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、トローチ剤などが含まれて、このような固形製剤は一つ以上の本発明で表示される化合物に少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、澱粉、炭酸カルシウム、スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）またはラクトース（ｌａｃｔｏｓｅ）またはゼラチンなどを混ぜて助剤される。また、単純な賦形剤以外にマグネシウムステアレートタルク（ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  ｓｔｅａｒａｔｅ  ｔａｌｃ）などの潤滑剤も使用される。経口投与のための液状の製剤では、懸濁剤、内用液剤、乳剤またはシロップ剤などが該当するが、多く使われている単純希釈剤である水、流動パラフィン以外に様々な賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれることができる。
【００３１】
非経口投与のための製剤には滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁溶剤、乳剤、凍結乾燥製剤、座剤などが含まれる。
【００３２】
非水性溶剤、懸濁溶剤ではプロピレン・グリコール、ポリエチレン・グリコール、オリーブ・オイルのような植物性油、エチルオレエートのような注射可能なエステルなどが用いられる。座剤の基剤としてはウィテップゾール（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、ツイン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリナム、グリセロール、ゼラチンなどが用いることができる。
【００３３】
本発明の組成物は目的にする方法によって、経口投与したり、非経口投与（例えば、静脈内、皮下、腹腔内または局所に適用）できるし、投与量は患者の状態および体重、疾病の程度、薬物の形態、投与経路および時間により異なるが、当業者により適切に選択することができる。
【００３４】
本発明による組成物は薬学的に有効な量に投与する。本発明において、「薬学的に有効な量」は医学的に治療が適用可能な合理的な受益・危険の割合で疾患を治療するめに十分な量を意味して、有効容量の水準は患者の疾患の種類、重症度、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路および排出割合、治療の期間、同時に用いられる薬物を含む要素およびその他の医学分野によく知られている要素によって決定されることができる。本発明の組成物は個別治療剤で投与したり、他の治療剤と併用して投与することができて、従来の治療剤とは順次的また同時に投与できるし、単一または多重投与できる。上記の要素をすべて考慮して副作用なしに最小の量で最大の効果を得られる量を投与することが重要であって、これは当業者により容易に決定することができる。
【００３５】
具体的に、本発明による化合物の有効量は患者の年、性別、体重に応じて異なる場合があり、一般的には体重１ｋｇ当たり０．００１ないし１５０ｍｇ、望ましくは０．０１ないし１００ｍｇを毎日または隔日投与したり、１日１ないし３回に分けて投与することができる。しかし、投与経路、肥満の重症度、性別、体重、年齢などに応じて増減できるので、上記の投与量がどのような方法でも本発明の範囲を限定するものではない。
【００３６】
他の様態として、本発明の化学式１に記載される化合物、上記の化学式１に記載される化合物の薬学的に許容可能な塩、化学式２に記載される化合物、および上記の化学式２に記載される化合物の薬学的に許容可能な塩からなる群より選択されるものを有効成分として含む卵巣顆粒細胞腫瘍の予防または改善用の健康機能食品組成物を提供する。すなわち、本発明の組成物は、卵巣顆粒細胞腫瘍の予防または改善のために卵巣顆粒細胞腫瘍の発病段階以前または発病後、腫瘍の治療のための薬剤と同時にまたは別個として用いることができる。
【００３７】
本発明で用いられる用語「改善」とは、治療される状態と関連されるパラメーター、例えば、症状の程度を少なくとも減少させるすべての行為を意味する。
【００３８】
本発明による上記の健康機能食品用の組成物はグリコーゲンシンターゼキナーゼ３β（Ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ  ３−ｂｅｔａ；ＧＳＫ３ｂｅｔａ）を抑制して、これにより、ＦＯＸＬ２（ｆｏｒｋｈｅａｄ  ｂｏｘ  Ｌ２）タンパク質の３３番目のアミノ酸であるセリン（ｓｅｒｉｎｅ）のリン酸化を抑制するので、卵巣顆粒細胞腫瘍の予防または改善を目的に食品、飲料などの健康補助食品に添加することができる。
【００３９】
上記の食品の種類には、特別に制限はない。上記の物質を添加することができる食品の例には、ドリンク剤、肉類、ソーセージ、パン、ビスケット、餅、チョコレート、キャンデー類、スナック類、お菓子類、ピザ、ラーメン、その他の麺類、ガム類、アイスクリーム類を含む酪農製品、各種のスープ、飲料水、アルコール飲料およびビタミン複合体、乳製品および乳加工製品等があり、通常的な意味での健康機能食品をすべて含む。
【００４０】
本発明の組成物は食品にそのまま添加したり、その他の食品または食品成分と一緒に用いることができ、通常的な方法により適切に使用できる。有効成分の混合量はその使用目的（予防または改善用）により適合に決定することができる。一般的に、食品または飲料の製造の際に、本発明の組成物は原料に対して１５重量％以下、望ましくは１０重量％以下の量で添加される。しかし、健康および衛生を目的にしたり、または健康調節を目的にする長期間の摂取の場合には上記の量は上記の範囲以下であってもよい。
【００４１】
本発明の健康飲料用の組成物は指示された割合で必須成分として、上記の化合物を含有する以外には、他の成分には特別な制限がなく、通常の飲料と一緒に様々な香味剤または天然炭水化物などを追加成分として含有することができる。上述した天然炭水化物の例は、モノサッカライド、例えば、ブドウ糖、果糖など；ジサッカライド、例えば、マルトース、スクロースなと；およびポリサッカライド、例えば、デキストリン、サイクロデキストリンなどのような通常的な糖、およびキシリトール、ソルビトール、エリトリトールなどの糖アルコールである。上述したもの以外の香味剤として天然香味剤（ソーマチン、ステビア抽出物（例えば、レバウジオシドＡ、グリチルリチンなど）および合成香味剤（サッカリン、アスパルテームなど）を有利に使用することができる。上記の天然炭水化物の割合は当業者の選択により適切に決定することができる。
【００４２】
上記の外に、本発明の健康機能食品用の組成物は様々な栄養剤、ビタミン、鉱物（電解質）、合成風味剤および天然風味剤などの風味剤、着色剤および重鎭剤（チーズ、チョコレートなど）、ペクチン酸およびその塩、アルギン酸およびその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に用いられる炭酸化剤などを含有することができる。その他に本発明の組成物は天然果物ジュース飲料および野菜飲料の製造のための果肉を含有することができる。このような成分は独立的にまたは組み合わせて用いることができる。このような、添加剤の割合はまた当業者により適切に選択することができる。
【００４３】
以下、本発明の理解を助けるための望ましい実施例を提示する。しかし、下記の実施例は本発明をより容易に理解するために提供されるものに過ぎなく、下記の実施例により本発明の内容が限定されるものではない。
【実施例】
【００４４】
実施例１．実験の準備
１−１．ＦＯＸＬ２突然変異のクローニング
様々なＦＯＸＬ２突然変異型をクローニングするために、下記の表１に記載されたプライマーを用いて再組合ＰＣＲを行った後、増幅されたＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩとＸｈｏＩ制限酵素を用いて、ｐＣＭＶ−Ｍｙｃベクトルにｌｉｇａｔｉｏｎ過程を経て、イー・コライ（Ｅ．  ｃｏｌｉ）に形質転換した。一方、ＦＯＸＬ２Ｃ１３４Ｗ＋Ｓ３３Ａ突然変異はＣ１３４Ｗ突然変異を鋳型でＳ３３Ａ正方向および逆方向プライマーを用いてクローニングした。
【表１】
0005973108.tif 000006
１−２．細胞の培養
本実施例の実験のためにＨｕｍａｎ  ｇｒａｎｕｌｏｓａ細胞（ＫＧＮ）を１０％ＦＢＳと１％ペニシリン−ストレプトマイシン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）が含有されたＤＭＥＭ／Ｆ１２ｍｅｄｉａに培養した。ＫＧＮ細胞はＹｏｓｉｈｉｒｏ  ＮｉｓｈｉとＴｏｓｈｉｈｉｋｏ  Ｙａｎａｓｅから提供を受けた。
【００４５】
１−３．細胞株（ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）の製作
ＦＯＸＬ２が安定的に細胞で発現するクローンを製作するために、ｐｃＤＮＡ６プラスミドにＦＯＸＬ２ＷＴ（ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ）、Ｓ３３Ｄ、Ｓ３３Ａ、Ｃ１３４Ｗのコンストラクト（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）をＥｃｏＲｌ、Ｘｈｏｌの制限酵素を用いてクローニングした。この後、１×１０７のＫＧＮ細胞に１０μｇのＤＮＡをトランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）した後、３〜４週間ブラストサイジン（ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ）で選別した。
【００４６】
１−４．細胞内のタンパク質の過発現のためのトランスフェクション
細胞でプラスミドを導入タンパク質を過発現するためにＫＧＮ細胞１×１０６当たり３μｇの導入しようとするプラスミドを導入して、このような導入のためにＩｎｖｉｔｒｏ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔであるＮｅｏｎ  ｅｌｅｃｔｒｏ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔを形質導入した。
【００４７】
実施例２．実験方法
２−１．ウェスタンブロッティング
培養細胞を収去してＮＰ−４０（Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０）溶液を利用細胞でタンパク質を抽出した。抽出されたタンパク質の定量のためにＢｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ  ａｃｉｄ（ＢＣＡ）ＴＭ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙを実施した。定量されたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ方法を利用し、電気泳動してＰＶＤＦ（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ）ｍｅｍｂｒａｎｅにｔｒａｎｓｆｅｒして確認しようとするそれぞれ抗体を用いて培養した。その後、２次抗体を利用しＣｈｅｍＤｏｃ機械を用いて確認した。
【００４８】
２−２．免疫沈降法
細胞をサンプリングしてＮＰ−４０ｌｙｓｉｓバッファーにｌｙｓｉｓした後、タンパク質量を定量した。その後、沈降させたい特定のタンパク質の抗体とその対照群である抗体のｎｏｒｍａｌ  ＩｇＧを独立的に培養して抗体と結合するｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ａｇｒｏｓｅ  Ｇと一緒に培養した。培養されたサンプルとビード（ｂｅａｄ）をＮＰ−４０バッファーで３回洗浄（ｗａｓｈｉｎｇ）してウェスタンブロッティング方法を用いてサンプルをローディングした後、結合を見ようとする他のタンパク質の抗体でバンドを確認した。
【００４９】
２−３．ユビキチン化およびＳＵＭＯ化分析（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ＳＵＭＯｙｌａｔｉｏｎ）
過発現されたサンプルをプロテアソーム抑制剤であるＭＧ１３２を５０μＭで処理して培養した後、ＮＰ−４０バッファーでタンパク質をサンプリングした。その後、免疫沈降法を用いて過発現したタンパク質を沈殿した後、ウェスタンブロッティング方法を用いてサンプルをローディングしてユビキチン（Ｕｂｉｑｕｔｉｎｅ）アンチボディとＳＵＭＯアンチボディで培養の後、ｃｈｅｍｄｏｃ機械でバンドを確認した。
【００５０】
２−４．統計学的分析
各実験の際にｔｒｉｐｌｉｃａｔｅで３回繰り返し実施して、平均値および標準誤差を計算した。各実験で統計学的分析はＳＡＳ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＳＡＳ  Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅ  Ｇｕｉｄｅ、ＵＳＡ）を用いてＳｔｕｄｅｎｔ'ｓ  ｔ−ｔｅｓｔを通じて分析して、ｐ＜０．０５の場合、有意性があることと解釈した。
【００５１】
実施例３．ＦＯＸＬ２タンパク質のリン酸化分析
液体クロマトグラフィー（ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を用いて、ＦＯＸＬ２タンパク質の翻訳後の変形（ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を分析した結果、ＦＯＸＬ２の３３番目のアミノ酸であるセリン（ｓｅｒｉｎｅ）のリン酸化を確認することができた。
【００５２】
また、ＦＯＸＬ２セリン３３（Ｓ３３）残基の進化での重要性を確認するために、ＦＯＸＬ２種の間の塩基配列の系列分析を行って、その結果を図１に示した。
【００５３】
図１に示したように、哺乳類でセリン３３残基が保存的に位置することを確認することができた。
【００５４】
一方、ＦＯＸＬ２Ｓ３３残基のリン酸化に関連された実験を行うために、ＦＯＸＬ２非リン酸化突然変異であるＳ３３Ａと過リン酸化突然変異であるＳ３３Ｄ突然変異をクローニングしてそれぞれのリン酸化の程度をウェスタンブロッティング方法を用いて測定して、その結果を図２に示した。
【００５５】
図２に示すように、非リン酸化突然変異ではＦＯＸＬ２Ｓ３３残基のバンドが確認されていないし、過リン酸化突然変異はＷＴ（ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ）よりさらに濃いバンドを確認することで過リン酸化を確認することができた。
【００５６】
実施例４．ＦＯＸＬ２Ｓ３３残基のリン酸化に関与するキナーゼの予測および確認
４−１．ＦＯＸＬ２Ｓ３３残基のリン酸化に関与するキナーゼの予測
実施例３を通じて哺乳類で保存的に存在することを確認したＦＯＸＬ２Ｓ３３残基のリン酸化に関与するキナーゼ（ｋｉｎａｓｅ）を分析するために予測プログラムであるＧＰＳ２．１ｐｈｏｓｐｈｏｐｌｏｔを用いてリン酸化に関与するＫｉｎａｓｅを予測して、その結果を図３に示した。
【００５７】
図３に示したように、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３β（Ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ  ３−ｂｅｔａ；ＧＳＫ３ｂｅｔａ）は９．７５を示すことを確認することができた。したがって、上記の結果から、上記のキナーゼがＦＯＸＬ２Ｓ３３残基のリン酸化に関与できることを予測することができた。
【００５８】
４−２．ＦＯＸＬ２Ｓ３３残基のリン酸化に関与するキナーゼの確認
まず、実施例４−１により予測されたキナーゼとリン酸化に関与されることで知られた他のキナーゼの抑制剤（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）を購入して準備した。より具体的に、ＧＳＫ３ｂｅｔａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＳＢ２１６７６３）、ＲＳＫ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＳＬ０１０１）、ＥＲＫ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｕ０１２６）、ＪＮＫ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＳＰ６００１２５）およびＡＫＴ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＬＹ２９４００２）を準備した。その際に、ＧＳＫ３ｂｅｔａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒであるＳＢ２１６７６３は化学式１に記載される化合物を含む。
【化１】
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【００５９】
ＦＯＸＬ２ＷＴ（ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ）がＫＧＮ細胞で過発現されている状態でそれぞれのキナーゼ抑制剤１０μＭを用いて細胞処理して、１８時間培養の後、細胞をサンプリングしてウェスタンブロッティング方法を行ってリン酸化変化を測定した。この際に、配列番号２１のアミノ酸からなるペプチドに特異的に結合する抗体を用いてリン酸化の変化を測定して、その結果を図４に示した。
【００６０】
図４に示したように、ＧＳＫ３ｂｅｔａ抑制剤を処理した時、ＦＯＸＬ２Ｓ３３残基のリン酸化が減ることを確認することができた。したがって、上記の結果から、ＧＳＫ３ｂｅｔａがＦＯＸＬ２Ｓ３３残基のリン酸化に関与することが分かった。
【００６１】
実施例５．ＦＯＸＬ２のＳ３３残基のリン酸化を特異的に調節するＧＳＫ３ｂｅｔａの役割の確認
ＧＳＫ３ｂｅｔａによるＦＯＸＬ２Ｓ３３残基の抑制効果がＧＳＫ３ｂｅｔａ特異的な効果であるかを確認するために他のＧＳＫ３ｂｅｔａ抑制剤であるＡＲ−Ａ０１４４１８とＴＷＳ１１１９の抑制剤１０μＭをＦＯＸＬ２ＷＴが過発現された細胞に処理して、細胞をサンプリングしてウェスタンブロッティング方法を行った。この際に、ＡＲ−Ａ０１４４１８は化学式２に記載される化合物を含む。
【化２】
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【００６２】
さらに、ＧＳＫ３ｂｅｔａ特異的なｓｉＲＮＡを処理してＧＳＫ３ｂｅｔａがノックダウン（ｋｎｏｃｋ−ｄｏｗｎ）された時、ＦＯＸＬ２Ｓ３３残基のリン酸化の変化をウェスタンブロッティング方法を用いて確認して、その結果を図５に示した。
【００６３】
図５に示したように、ＧＳＫ３ｂｅｔａ抑制剤を用いた場合に、ＦＯＸＬ２Ｓ３３残基のリン酸化が減ることが確認できた。
【００６４】
追加的に、ＦＯＸＬ２のＳ３３残基のリン酸化を調節するＧＳＫ３ｂｅｔａの効果を確認するために、ヒト卵巣顆粒細胞の中の一つであるＫＧＮ細胞にＦＯＸＬ２が安定的に過発現する細胞を製作した。ＦＯＸＬ２ＷＴ、Ｓ３３Ｄ、Ｓ３３ＡとＣ１３４Ｗが安定的に発現する細胞にＧＳＫ３ｂｅｔａ  １０ｎＭを処理してＦＯＸＬ２のリン酸化程度をウェスタンブロッティング方法を用いて測定して、その結果を図６に示した。
【００６５】
図６に示したように、ＦＯＸＬ２の安定的な発現細胞ラインでもＧＳＫ３ｂｅｔａがＦＯＸＬ２Ｓ３３残基のリン酸化を調節することが確認できた。
【００６６】
したがって、上記の結果からＧＳＫ３ｂｅｔａが特異的にＦＯＸＬ２Ｓ３３残基をリン酸化することが分かった。
【００６７】
実施例６．ＧＳＫ３ｂｅｔａとＦＯＸＬ２タンパク質の結合ドメインの確認
リン酸化のためにＧＳＫ３ｂｅｔａがＦＯＸＬ２に直接的に結合するかを確認するために卵巣顆粒細胞であるＫＧＮ細胞をサンプリングして、免疫沈降法を用いてＦＯＸＬ２とＧＳＫ３ｂｅｔａタンパク質の結合を確認した。また、二つのタンパク質の結合ドメインを確認するためにＦＯＸＬ２の欠損突然変異タンパク質（１−９４ａ．ａ、１−２１８ａ．ａ、２１８−３７６ａ．ａ．  ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｆｏｒｋｈｅａｄ  ｄｏｍａｉｎ）との結合を免疫沈降法を用いて確認して、その結果を図７に示した。
【００６８】
図７に示したように、ＦＯＸＬ２とＧＳＫ３ｂｅｔａタンパク質が直接的に結合して、ドメインの中のＮ−ｔｅｒｍｉｎａｌドメインと結合することを確認することができた。
【００６９】
実施例７．  卵巣顆粒腫瘍細胞（ＧＣＴ）でリン酸化の程度の確認
ＦＯＸＬ２のＳ３３残基のリン酸化に伴うＦＯＸＬ２によって誘発される疾病との関係を調べるために下記のような実験を行った。
【００７０】
すなわち、実施例１により製作されたＦＯＸＬ２の突然変異を過発現して、ＦＯＸＬ２Ｓ３３残基のリン酸化の程度をウェスタンブロッティング方法を用いて確認して、その結果を図８に示した。
【００７１】
図８に示したように、最近９７％のＧＣＴ患者から発見されるものと報告されたＣ１３４Ｗ突然変異を過発現する場合に、Ｓ３３残基のリン酸化の程度がＷＴ（ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ）よりさらにリン酸化されていることが確認できた。
【００７２】
追加的に、ＦＯＸＬ２Ｃ１３４Ｗ突然変異とＳ３３残基のリン酸化関係を調べるために、実施例２−３の方法を通じてユビキチン化およびＳＵＭＯ化様相を確認して、その結果を図９に示した。
【００７３】
図９に示したように、ＦＯＸＬ２Ｃ１３４Ｗ突然変異が、ユビキチン化が増加して、ＳＵＭＯ化が減少することが確認できた。ただし、Ｃ１３４ＷにＳ３３Ａ突然変異があるサンプルではそのような変化を確認することができなかった。
【００７４】
上記の結果から、ＦＯＸＬ２Ｃ１３４Ｗ突然変異の過−リン酸化はＳ３３残基と直接的に関連があることを確認することができた。
【００７５】
実施例８．ＦＯＸＬ２Ｃ１３４Ｗ突然変異とＷＴの間のＧＳＫ３ｂｅｔａの結合程度の確認
ＧＣＴ誘発突然変異であるＦＯＸＬ２Ｃ１３４Ｗタンパク質とＧＳＫ３ｂｅｔａとの関係を確認するために、免疫沈降法を用いてＦＯＸＬ２Ｃ１３４Ｗ突然変異とＷＴの間のＧＳＫ３ｂｅｔａ結合の程度を確認して、その結果を図１０に示した。
【００７６】
図１０に示したように、ＷＴよりＣ１３４Ｗ突然変異がさらに多くＧＳＫ３ｂｅｔａと結合することを確認することができた。
【００７７】
実施例９．ＧＳＫ３ｂｅｔａ抑制の効果の検証
９−１．ルシフェラーゼ分析および細胞生存率の分析
ＦＯＸＬ２のリン酸化を調節するＧＳＫ３ｂｅｔａの抑制による効果を検証するためにＦＯＸＬ２ターゲット遺伝子であるＴＮＦＲ１、ＦＡＳ、Ｃａｓｐａｓｅ８およびｐ２１タンパク質のルシフェラーゼ分析および細胞生存率分析を行った。
【００７８】
より具体的に、ルシフェラーゼ分析はＫＧＮを６ｗｅｌｌにｗｅｌｌ当たり４×１０５の細胞に１７０ｎｇのｐＣＭＶ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅプラスミドＤＮＡ、３００ｎｇのＴＮＦＲ１、ＦＡＳ、Ｃａｓｐａｓｅ８、ｐ２１のリポーターＤＮＡ、ＦＯＸＬ２または突然変異タンパク質プラスミドをＭｉｃｒｏｐｏｒａｔｏｒ  ＭＰ−１００を利用トランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）して、２０時間培養の後、プロメガで提供するＬｕｃｉｆｅｒａｓｅキットを用いて吸光度をＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ１４２０カウンターで測定して、その結果を図１１に示した。
【００７９】
また、細胞生存率分析は、ＫＧＮ細胞を９６ｗｅｌｌに２×１０４個で特定タンパク質を発現するプラスミドを過発現の後、培養した。その後、プロメガで提供するＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ  ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙキットを用いてＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ１４２０カウンターで細胞生存率を測定して、その結果を図１１に示した。
【００８０】
図１１に示したように、ＧＳＫ３ｂｅｔａが阻害されない時、ＦＯＸＬ２のリン酸化が阻害されて、これによってＴＮＦＲ１、ＦＡＳ、Ｃａｓｐａｓｅ８、ｐ２１（発現度が高い時、細胞生存率を減少させて、ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈを増加させた）プロモーターが活性化されることで、細胞生存率が減少することを確認することができる。
【００８１】
９−２．タンパク質安定度の実験
特定プロモーターＴＮＦＲ１、ＦＡＳ、Ｃａｓｐａｓｅ８、ｐ２１の活性を誘導して細胞生存率を減少させる効果がＦＯＸＬ２のＳ３３残基リン酸化によりＦＯＸＬ２タンパク質安定度を調節して誘導するかどうかを確認するために、ＦＯＸＬ２タンパク質が過発現された細胞にＧＳＫ３ｂｅｔａ抑制剤（ＳＢ２１６７６３）を処理して発現の後、タンパク質合成抑制剤であるＣｙｃｌｏｈｅｘａｍｉｄｅを１０μｇ処理して０、６、１２、２４時間単位でサンプリングしてウェスタンブロッティングを行って、その結果を図１２に示した。
【００８２】
図１２に示したように、ＧＳＫ３ｂｅｔａが抑制される際に、タンパク質の安定度が増加することを確認することができた。
【００８３】
９−３．細胞成長率の実験
ＦＯＸＬ２タンパク質が過発現された細胞にＧＳＫ３ｂｅｔａ抑制剤（ＡＲ−Ａ０１４４１８）を処理した後、時間による細胞成長率を測定して、その結果を図１３に示した。
【００８４】
図１３に示したように、ＧＳＫ３ｂｅｔａが阻害されない時、ＦＯＸＬ２のリン酸化が阻害されて細胞成長率が減少することを確認することができ、特にＧＣＴで多く発見されたＣ１３４Ｗ突然変異の細胞成長率が確実に減少することを確認することができた。
【００８５】
実施例１０．卵巣顆粒腫瘍細胞に対するＧＳＫ３ｂｅｔａ抑制物質の効能の検証
卵巣顆粒細胞腫瘍でのＧＳＫ３ｂｅｔａ抑制物質の効能を検証するために下記のような実験を行った。
【００８６】
６週齢の成熟した雄ＢＡＬＢ／ｃ−ｎｕマウスを（株）中央実験動物から購入して中央大学校実験動物研究支援センター内で１週間飼育室および実験室の環境に適応させて一般症状がないことを確認して、実験に使用した。５匹をｐｏｌｙｃａｒｂｏｎａｔｅ収容して、実験動物用の固形飼料と飲料水を自由に供給した。飼育実験室環境で温度、湿度、換気の回数、照明の時間、照度を一定に誘導して、すべての実験は中央大学校動物実験倫理委員会規定に立脚して実施した。
【００８７】
ＦＯＸＬ２が安定的に発現するＫＧＮ細胞をマウスに３×１０７ずつ皮下注射をして
腫瘍を誘導した。インジェクション３週の後、ＧＳＫ３ｂｅｔａ抑制剤（ＡＲ−Ａ０１４４１８）を腫瘍が誘導された部分に直接２ｍｇ／ｋｇ単位で２週の間１０回注射して腫瘍のサイズを測定して、その結果を図１４に示した。
【００８８】
図１４に示したように、卵巣顆粒腫瘍細胞から誘導された腫瘍のサイズが、ＧＳＫ３ｂｅｔａ抑制剤を投与したグループで確実に減ることを確認することができた。
【００８９】
また、実質的にｉｎ  ｖｉｖｏでＧＳＫ３ｂｅｔａ抑制物質が卵巣顆粒細胞の腫瘍の生成を抑制することができることをヌードマウスモデルで確認した。
【００９０】
上記の結果から、ＧＳＫ３ｂｅｔａ抑制物質は卵巣顆粒細胞腫瘍の予防または治療に優秀な効果があることを分かることができた。
【００９１】
前述した本発明の説明は例示のためのものであり、本発明が属する技術分野の通常の知識を有するものは、本発明の技術的思想や必須的な特徴を変形しなくて、他の具体的な形態に容易に変形ができることを理解することができるだろう。したがって、以上で技術した実施例はすべての面で例示的なものであり、限定的なものではないと理解すべきである。
【産業上の利用可能性】
【００９２】
本発明による組成物は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３β（Ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ  ３−ｂｅｔａ；ＧＳＫ３ｂｅｔａ）を抑制してＦＯＸＬ２（ｆｏｒｋｈｅａｄ  ｂｏｘ  Ｌ２）タンパク質の３３番目のアミノ酸であるセリン（ｓｅｒｉｎｅ）のリン酸化を抑制する効果を有して、卵巣顆粒細胞腫瘍の予防または治療用の組成物として有用に用いることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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