(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含む、胚以外の哺乳類の標的細胞において、インビボで、コード配列の発現を減少させる方法を実践する際に使用するためのキット：
（a）胚以外の哺乳類への投与のために薬学的に許容される輸送媒体において、標的細胞中のコード配列に特異的であるshRNAを含む薬学的調製物であって、該shRNAが、長さが100ヌクレオチドを超えず、かつ長さが20-29塩基対の二本鎖構造の領域を含む、前記薬学的調製物；および
（b）前記方法を実践するための説明書。
【請求項２】
脈管を有する胚以外の哺乳類の標的細胞において、インビボで、コード配列の発現を減少させるための薬学的組成物の製造における、核酸の使用であって、
該核酸がshRNAまたは該shRNAの転写鋳型であり、
該shRNAが、標的細胞中のコード配列に特異的であり、長さが100ヌクレオチドを超えず、かつ長さが20-29塩基対の二本鎖構造の領域を含み、かつ
該核酸が、裸の核酸としての該核酸および任意でRNアーゼ阻害剤を含む水性製剤中に存在し、かつ該脈管を有する胚以外の哺乳類への投与に適している、
前記使用。
【請求項３】
脈管を有する胚以外の哺乳類の標的細胞において、インビボで、コード配列の発現を減少させるための薬学的組成物の製造における、裸のリボ核酸の使用であって、
該裸のリボ核酸がshRNAであり、
該shRNAが、標的細胞中のコード配列に特異的であり、長さが100ヌクレオチドを超えず、かつ長さが20-29塩基対の二本鎖構造の領域を含み、かつ
該裸のリボ核酸が該胚以外の哺乳類への投与に適している、
前記使用。
【請求項４】
標的細胞が胚以外の哺乳類の肝臓中の肝細胞である、請求項2もしくは3記載の使用。
【請求項５】
RNアーゼ阻害剤の導入をさらに含む、請求項3記載の使用。
【請求項６】
前記胚以外の哺乳類への競合核酸の導入をさらに含む、請求項3記載の使用。
【請求項７】
競合核酸がデオキシリボ核酸である、請求項6記載の使用。
【請求項８】
競合核酸がリボ核酸である、請求項6記載の使用。
【請求項９】
shRNAが非経口投与を用いて投与される、請求項2もしくは3記載の使用。
【請求項１０】
shRNAが静脈内投与を用いて投与される、請求項2もしくは3記載の使用。
【請求項１１】
前記胚以外の哺乳類が成体哺乳類である、請求項2もしくは3記載の使用。
【請求項１２】
標的細胞が胚以外の哺乳類の肝臓中の肝細胞である、請求項１記載のキット。
【請求項１３】
shRNAが非経口投与を用いて投与される、請求項１記載のキット。
【請求項１４】
shRNAが静脈内投与を用いて投与される、請求項１記載のキット。
【請求項１５】
前記胚以外の哺乳類が成体哺乳類である、請求項１記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
米国法第35章119（e）項に従って、本出願は、その開示が参照として本明細書に組み入れられる、2001年7月23日に提出された米国特許仮出願第60/307,411号および2002年2月27日に提出された米国特許仮出願第60/360,664号の提出日に対する優先権を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明の分野はRNAiである。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
二本鎖RNAは、RNA干渉（RNAi）または転写後遺伝子沈黙化（PTGS）と呼ばれるプロセスを通して強力かつ特異的な遺伝子沈黙化を誘導する。RNAiは、沈黙化誘因物質と相同なメッセンジャーRNAを破壊する配列特異的多成分ヌクレアーゼであるRNA誘導沈黙化複合体（RISC）によって媒介される。RISCは、二本鎖RNA誘因物質に由来する短いRNA（約22ヌクレオチド）を含むことが知られている。
【０００４】
RNAiは、シー・エレガンス（C. elegans）、ショウジョウバエ、真菌、植物、および哺乳類細胞株さえも含む多数の系において機能喪失を調べるために選択される方法となった。大きいdsRNA（＞30 bp）はインターフェロン反応を誘発して、非特異的遺伝子沈黙化を引き起こすことから、ほとんどの哺乳類細胞株において遺伝子を特異的に沈黙化する場合には、小さい干渉RNA（siRNA）が用いられている。
【０００５】
今日まで、本発明の出願人の知る限り、胚以外の哺乳類生物へのRNAi技術の適用に成功したという報告はない。RNAiが胚以外の哺乳類生物において作用することが証明されれば、研究および治療応用を含むRNAi技術に関する多くの重要なさらなる適応が提供され、したがって非常に興味深い。
【０００６】
関連文献
国際公開公報第01/68836号（特許文献１）。同様に、Bernsteinら、RNA（2001）7：1509〜1521（非特許文献１）；Bernsteinら、Nature （2001）409：363〜366（非特許文献２）；Billyら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA（2001）98：14428〜33（非特許文献３）；Caplanら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA（2001）98：9742〜7（非特許文献４）；Carthewら、Curr. Opin. Cell Biol.（2001）13：244〜8（非特許文献５）；Elbashirら、Nature（2001）411：494〜498（非特許文献６）；Hammondら、Science（2001）293：1146〜50（非特許文献７）；Hammondら、Nat. Ref. Genet.（2001）2：110〜119（非特許文献８）；Hammondら、Nature（2000）404：293〜296（非特許文献９）；McCaffrreyら、Nature（2002）418：38〜39（非特許文献１０）；およびMaCaffreyら、Mol. Ther.（2002）5：676〜684（非特許文献１１）；Paddisonら、Genes Dev.（2002）16：948〜958（非特許文献１２）；Paddisonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA（2002）99：1443〜48（非特許文献１３）；Suiら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA（2002）99：5515〜20（非特許文献１４）も参照されたい。
【０００７】
関心対象の米国特許には、第5,985,847号（特許文献２）および第5,922,687号（特許文献３）が含まれる。同様に国際公開公報第11092号（特許文献４）も関心対象である。さらに関心対象の参考文献には：Acsadiら、New Biol.（1991年1月）3：71〜81（非特許文献１５）；Changら、J. Virol.（2001）75：3469〜3473（非特許文献１６）；Hickmanら、Hum. Gen. Ther.（1994）5：1477〜1483（非特許文献１７）；Liuら、Gene Ther.（1999）6：1258〜1266（非特許文献１８）；Wolffら、Science（1990）247：1465〜1468（非特許文献１９）；およびZhangら、Hum. Gene Ther.（1999）10：1735〜1737（非特許文献２０）；およびZhangら、Gene Ther.（1999）7：1344〜1349（非特許文献２１）が含まれる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開公報第01/68836号
【特許文献２】米国特許第5,985,847号
【特許文献３】米国特許第5,922,687号
【特許文献４】国際公開公報第11092号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Bernsteinら、RNA（2001）7：1509〜1521
【非特許文献２】Bernsteinら、Nature （2001）409：363〜366
【非特許文献３】Billyら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA（2001）98：14428〜33
【非特許文献４】Caplanら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA（2001）98：9742〜7
【非特許文献５】Carthewら、Curr. Opin. Cell Biol.（2001）13：244〜8
【非特許文献６】Elbashirら、Nature（2001）411：494〜498
【非特許文献７】Hammondら、Science（2001）293：1146〜50
【非特許文献８】Hammondら、Nat. Ref. Genet.（2001）2：110〜119
【非特許文献９】Hammondら、Nature（2000）404：293〜296
【非特許文献１０】McCaffrreyら、Nature（2002）418：38〜39
【非特許文献１１】MaCaffreyら、Mol. Ther.（2002）5：676〜684
【非特許文献１２】Paddisonら、Genes Dev.（2002）16：948〜958
【非特許文献１３】Paddisonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA（2002）99：1443〜48
【非特許文献１４】Suiら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA（2002）99：5515〜20
【非特許文献１５】Acsadiら、New Biol.（1991年1月）3：71〜81
【非特許文献１６】Changら、J. Virol.（2001）75：3469〜3473
【非特許文献１７】Hickmanら、Hum. Gen. Ther.（1994）5：1477〜1483
【非特許文献１８】Liuら、Gene Ther.（1999）6：1258〜1266
【非特許文献１９】Wolffら、Science（1990）247：1465〜1468
【非特許文献２０】Zhangら、Hum. Gene Ther.（1999）10：1735〜1737
【非特許文献２１】Zhangら、Gene Ther.（1999）7：1344〜1349
【発明の概要】
【００１０】
哺乳類においてコード配列の発現を調節する（例えば減少させる）方法および組成物を提供する。本発明の方法において、RNAi物質、例えば、干渉リボ核酸（siRNAもしくはshRNAのような）またはその転写鋳型、例えばshRNAをコードするDNAを、例えば流体力学投与プロトコールによって胚以外の哺乳類に投与する。同様に、本発明の方法において用いられるRNAi物質の薬学的調製物も提供される。本発明の方法および組成物は、学術的および治療的応用を含む、多様な異なる応用における用途を見出す。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】上記のRNAi実験において用いられる発現構築物を提供する。
【図２】成体マウスにおけるRNA干渉。図2A）ルシフェラーゼプラスミドpGL3-対照と、siRNAなし（左）、ルシフェラーゼsiRNA（中央）、または無関係なsiRNA（右）とを同時トランスフェクトしたマウスから放出された光の代表的な画像。グレースケールの参照画像（方向づけのため）上で重ねた放出光強度（赤が最も強く、青が最も弱い）を表す疑似カラー画像から、RNAiが成体哺乳類において機能することが示される。アニールした21量体siRNA（Dharmacon）40 μgを、pGL3-対照DNA 2 μgおよびRNasin（Promega）800単位と共にPBS 1.8 ml中でマウスの肝臓に5〜7秒間同時注射した。最初の注入の72時間後、マウスを麻酔して造影の15分前にルシフェリン3 mgを腹腔内投与した。図2B）siRNAデータの概要。ルシフェラーゼsiRNAを投与したマウスは、無処置対照より有意に少ない光を放出した。一元配置ANOVA分析を行った後にFisher検定を行った。無処置および無関係なsiRNA群は統計学的に類似であった。図2C）pShh1-Ff1（中央）は、無処置対照（左）と比較してマウスにおけるルシフェラーゼ発現を減少させたが、pShh1-Ff1revは、減少させなかった。pShh1-Ff1またはpShh1-rev 10 μgを、PBS 1.8 ml中でpLuc-NS5B 40 μgと同時注入した。図2D）pShh1データの定量。動物は、NIH動物飼育ガイドラインおよびスタンフォード大学ガイドラインに従って処置した。
【図３】上記の実験の章で行うモルフォリノホスホロアミデートアンチセンスHCV阻害アッセイ法において用いられる構築物の略図を示す。
【図４】アンチセンス阻害剤の機構に関する背景となる情報を示す。
【図５Ａ】本発明に従って行ったモルフォリノホスホロアミデートアンチセンスHCV阻害アッセイのグラフによる結果を示す。
【図５Ｂ】本発明に従って行ったモルフォリノホスホロアミデートアンチセンスHCV阻害アッセイのグラフによる結果を示す。
【図５Ｃ】本発明に従って行ったモルフォリノホスホロアミデートアンチセンスHCV阻害アッセイのグラフによる結果を示す。
【図５Ｄ】本発明に従って行ったモルフォリノホスホロアミデートアンチセンスHCV阻害アッセイのグラフによる結果を示す。
【図５Ｅ】本発明に従って行ったモルフォリノホスホロアミデートアンチセンスHCV阻害アッセイのグラフによる結果を示す。
【図５Ｆ】本発明に従って行ったモルフォリノホスホロアミデートアンチセンスHCV阻害アッセイのグラフによる結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
定義
便宜上、明細書、実施例、および添付の請求の範囲において用いる特定の用語をここに集める。
【００１３】
本明細書において用いられるように、「ベクター」という用語は、それが結合しているもう一つの核酸を輸送することができる核酸分子を意味する。一つのタイプのベクターは、ゲノムに組み込まれたベクター、または「組み込み型ベクター」であり、これは宿主細胞の染色体DNAの中に組み込まれうる。もう一つのタイプのベクターは、エピソームベクター、すなわち適当な宿主、例えば真核または原核宿主細胞において染色体外複製を行うことができる核酸である。機能的に結合される遺伝子の発現を指示することができるベクターは、本明細書において「発現ベクター」と呼ぶ。本明細書において、「プラスミド」および「ベクター」は、本文が特に明記していない限り互換的に用いられる。
【００１４】
本明細書において用いられるように、「核酸」という用語は、デオキシリボ核酸（DNA）および適当であればリボ核酸（RNA）のようなポリヌクレオチドを意味する。この用語にはまた、記述の態様に適応可能であるように、一本鎖（センスまたはアンチセンス）および二本鎖ポリヌクレオチドが含まれると理解すべきである。
【００１５】
本明細書において用いられるように、「遺伝子」または「組み換え型遺伝子」という用語は、エキソンと（選択的に）イントロン配列の双方を含む、本発明のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む核酸を意味する。「組み換え型遺伝子」とは、選択的に染色体DNAに由来するイントロン配列を含んでもよい、そのような調節ポリペプチドをコードする核酸を意味する。「イントロン」という用語は、タンパク質に翻訳されないが、一般的にエキソンのあいだに認められる所定の遺伝子に存在するDNA配列を意味する。本明細書において用いられるように、「トランスフェクション」という用語は、核酸、例えば発現ベクターを核酸媒介遺伝子移入によってレシピエント細胞に導入することを意味する。
【００１６】
「タンパク質コード配列」または特定のポリペプチドもしくはペプチドを「コードする」配列は、適当な調節配列の制御下に置かれた場合にインビトロまたはインビボで転写されて（DNAの場合）、ポリペプチドに翻訳される（mRNAの場合）核酸配列である。コード配列の境界は、5'（アミノ）末端での開始コドンと3'（カルボキシ）末端での翻訳終了コドンによって定義される。コード配列には、原核または真核細胞mRNAからのcDNA、原核または真核細胞DNAからのゲノムDNA配列、および合成DNA配列までもが含まれうるがこれらに限定されない。転写終了配列は通常、コード配列の3'側に存在するであろう。
【００１７】
同様に、その文脈から明確である場合を除き、「コードする」とは、用語が典型的に用いられるように、ポリペプチドをコードするDNA配列のみならず、阻害アンチセンス分子へと転写されるDNA配列が含まれることを意味するであろう。
【００１８】
「機能喪失」という用語は、本発明のRNAi法によって阻害される遺伝子を指す場合、RNAi物質の非存在下でのレベルと比較して遺伝子の発現レベルの減少を指す。
【００１９】
遺伝子の配列に関する「発現」という用語は、遺伝子の転写を指し、適当であれば、得られたmRNA転写物のタンパク質への翻訳を指す。このように、本文から明確であるように、タンパク質コード配列の発現は、コード配列の転写および翻訳に帰因する。
【００２０】
「細胞」、「宿主細胞」、または「組み換え型宿主細胞」は、本明細書において互換的に用いられる用語である。そのような用語は、特定の本発明の細胞のみならず、そのような細胞の子孫または潜在的な子孫を指すと理解される。変異または環境の影響のいずれかにより、その後の世代に特定の改変が起こる可能性があるため、そのような子孫は実際には、親細胞と同一でない可能性があるが、それでもなお本明細書において用いられる用語の範囲内に含まれるであろう。
【００２１】
「組み換え型ウイルス」とは、例えば、異種核酸構築物の粒子への付加、または挿入によって遺伝的に変化しているウイルスを意味する。
【００２２】
本明細書において用いられるように、「形質導入」および「トランスフェクション」という用語は当技術分野において認識されており、核酸、例えば発現ベクターを核酸媒介遺伝子移入によってレシピエント細胞に導入することを意味する。本明細書において用いられるように、「形質転換」とは、外因性のDNAまたはRNAの細胞の取り込みの結果として細胞の遺伝子型が変化するプロセスを意味し、例えば形質転換細胞はdsRNA構築物を発現する。
【００２３】
「一過性のトランスフェクション」は、外因性のDNAまたはRNAがトランスフェクトした細胞のゲノムに組み入れられない、例えばエピソームDNAがmRNAに転写されてタンパク質に翻訳される場合を指す。
【００２４】
細胞は、核酸構築物が娘細胞によって遺伝されうる場合に、核酸構築物によって「安定にトランスフェクト」されている。
【００２５】
本明細書において用いられるように、「レポーター遺伝子構築物」は、少なくとも一つの転写調節配列に機能的に結合した「レポーター遺伝子」を含む核酸である。レポーター遺伝子の転写は、結合しているこれらの配列によって制御される。少なくとも一つまたは複数のこれらの制御配列の活性は、標的受容体タンパク質によって直接または間接的に調節されうる。例としての転写制御配列はプロモーター配列である。レポーター遺伝子には、細胞において異種発現されるプロモーター-レポーター遺伝子構築物が含まれることを意味する。
【００２６】
本明細書において用いられるように、「形質転換細胞」は、拘束されない増殖状態に自然変換した細胞、すなわちそれらが培養において無限分裂回数の増殖能を獲得したことを指す。形質転換細胞は、その増殖制御の喪失に関して新生物、未分化、または過形成のような用語によって特徴が示される可能性がある。本発明の目的に関して、「悪性哺乳類細胞の形質転換表現型」および「形質転換表現型」は、哺乳類細胞の細胞形質転換に関連した以下の任意の表現型形質を含むがこれらに限定されないことを意図する：細胞培養における持続的な増殖、半固体培地における増殖、または免疫不全もしくは同系動物における腫瘍形成増殖によって検出される、不死化、形態学的または増殖形質転換、および腫瘍形成性。
【００２７】
本明細書において用いられるように、「増殖する」および「増殖」は、細胞分裂を受ける細胞を意味する。
【００２８】
本明細書において用いられるように、「不死化細胞」は、化学、合成、および／または組み換え手段によって、細胞が培養における無限分裂回数増殖能を有するように変化している細胞を意味する。
【００２９】
細胞の「増殖状態」は、細胞の増殖速度および細胞の分化状態を指す。
【００３０】
「遺伝子発現の阻害」は、標的遺伝子からのタンパク質および／またはmRNA産物のレベルが存在しないこと（または認められないほど減少すること）を指す。「特異性」は、細胞の他の遺伝子に明白な影響を及ぼすことなく、標的遺伝子を阻害できることである。阻害の結果は、細胞もしくは生物の顕著な特性を調べることによって（下記の実施例において示すように）、またはRNA溶液ハイブリダイゼーション、ヌクレアーゼ保護、ノーザンハイブリダイゼーション、逆転写、マイクロアレイによる遺伝子発現のモニタリング、抗体結合、酵素結合免疫吸着アッセイ法（ELISA）、ウェスタンブロッティング、放射免疫アッセイ法（RIA）、他の免疫アッセイ法、および蛍光活性化細胞分析（FACS）のような生化学技術によって確認することができる。細胞株または生物全体におけるRNA媒介阻害の場合、遺伝子発現は、そのタンパク質産物が容易にアッセイされるレポーターまたは薬物耐性遺伝子を用いることによって簡便にアッセイされる。そのようなレポーター遺伝子には、アセトヒドロキシ酸シンターゼ（AHAS）、アルカリホスファターゼ（AP）、β-ガラクトシダーゼ（LacZ）、β-グルクロニダーゼ（GUS）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）、緑色蛍光タンパク質（GFP）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）、ルシフェラーゼ（Luc）、ノパリンシンターゼ（NOS）、オクトピンシンターゼ（OCS）、およびその誘導体が含まれ、アンピシリン、ブレオマイシン、クロラムフェニコール、ゲンタマイシン、ヒグロマイシン、カナマイシン、リンコマイシン、メソトレキセート、ホスフィノスリシン、ピューロマイシン、およびテトラサイクリンに対して抵抗性を付与する多数の選択マーカーが利用可能である。
【００３１】
アッセイ法に応じて、遺伝子発現量を定量することにより、本発明に従って処置していない細胞と比較して10％、33％、50％、90％、95％、または99％以上である阻害の程度を決定することができる。投与した活性物質の用量がより低く、そして活性物質の投与後の期間がより長ければ、より小さい分画の細胞に阻害が起こる可能性がある（例えば、標的細胞の少なくとも10％、20％、50％、75％、90％、または95％）。細胞における遺伝子発現の定量は、標的mRNAの蓄積または標的タンパク質の翻訳レベルで同様の量の阻害を示す可能性がある。例として、阻害効率は、細胞における遺伝子産物の量を評価することによって決定してもよい：mRNAを、阻害二本鎖RNAに関して用いられる領域の外側のヌクレオチド配列を有するハイブリダイゼーションプローブによって検出してもよく、または翻訳されたポリペプチドを、その領域のポリペプチド配列に対する抗体によって検出してもよい。
【００３２】
特定の態様の説明
哺乳類においてコード配列の発現を調節する（例えば減少させる）方法および組成物を提供する。本発明の方法において、RNAi物質、例えば干渉リボ核酸（siRNAまたはshRNAのような）またはその転写鋳型、例えばshRNAをコードするDNAの有効量を胚以外の哺乳類に、例えば流体力学プロトコールによって投与する。同様に、本発明の方法において用いられるRNAi物質薬学的調製物も提供される。本発明の方法および組成物は、学術的および治療的応用を含む、多様な異なる応用における用途を見出す。
【００３３】
本発明を詳しく説明する前に、本発明は、特定の態様の変更を行ってもよく、それらもなおも添付の請求の範囲内に含まれるため、下記の本発明の特定の態様に限定されないと理解すべきである。同様に、用いた用語は、特定の態様を説明する目的のためであって、制限的に解釈してはならないと理解すべきである。本発明の範囲は添付の請求の範囲によって確立されるであろう。
【００３４】
本明細書および添付の請求の範囲において、単数形「一つ」、「一つ（an）」、および「その」は本文が特に明記していない限り複数形が含まれる。特に明記していない限り、本明細書において用いた技術および化学用語は全て、本発明が属する当業者に一般的に理解される意味と同じ意味を有する。
【００３５】
値の範囲が提供される場合、特に明記していない限り、その範囲の上限と下限のあいだの、下限の単位の10分の1までのそれぞれの介在値、および他の任意の記述の値またはその記述の範囲における介在値が、本発明に含まれると理解すべきである。これらのより小さい範囲の上限および下限は、独立して小さい範囲に含まれてもよく、記述の範囲において特に除外された任意の限界に従って、同様に本発明に含まれる。記述範囲が限界の一つまたは双方を含む場合、それらの含まれる限界のいずれかまたは双方を除外する範囲も同様に本発明に含まれる。
【００３６】
特に明記していない限り、本明細書において用いた技術および科学用語は全て本発明が属する当業者に一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または同等の任意の方法、装置、および材料は、本発明の実践または試験において用いることができるが、代表的な方法、装置、および材料を記述する。
【００３７】
本明細書において言及した全ての刊行物は、本明細書に記述される本発明に関連して用いられる可能性がある、刊行物において記述されている成分を説明および開示する目的で参照として本明細書に組み入れられる。
【００３８】
胚以外の哺乳類におけるRNAi
先に要約したように、本発明は、胚以外の哺乳類においてRNAiを行う方法を提供する。本発明のこの局面をさらに記述するために、胚以外の哺乳類におけるRNAiの本方法を最初により詳細に説明してから、本発明が用いられる様々な代表的な応用のみならず、本発明の実践において用いられるキットについて論評する。
【００３９】
方法
上記のように、本発明の一つの局面は、胚以外の哺乳類宿主において標的遺伝子または複数の遺伝子の発現を調節するためにRNAiを用いる方法を提供する。多くの態様において、本発明は、胚以外の哺乳類宿主生物において一つまたは複数の標的遺伝子の発現を減少させる方法を提供する。発現を減少させるとは、標的遺伝子またはコード配列の発現レベルが、対照と比較して少なくとも約2倍、通常少なくとも約5倍、例えば10倍、15倍、20倍、50倍、100倍またはそれ以上減少するかまたは阻害されることを意味する。特定の態様において、標的遺伝子の発現は、標的遺伝子／コード配列の発現が有効に阻害される程度に減少する。標的遺伝子の発現を調節することは、コード配列、例えばゲノムDNA、mRNA等のポリペプチド、例えばタンパク質産物への転写／翻訳を変化させる、例えば減少させることを意味する。
【００４０】
本発明は、胚以外の哺乳類生物において標的遺伝子の発現を調節する方法を提供する。胚以外の哺乳類生物とは、胚ではない、すなわち胚の発達段階より後期の発達段階にある哺乳類生物または宿主を意味する。そのため、宿主生物は、胎児であってもよいが、一般的に生後の発達段階の宿主生物、例えば幼若体、成体等である。
【００４１】
本発明の実践にあたって、RNAi物質の有効量は、所望の様式で標的遺伝子の発現を調節するために、例えば標的細胞遺伝子発現の所望の減少を得るために、宿主生物に投与される。
【００４２】
RNAi物質とは、RNA干渉機構によって標的遺伝子の発現を調節する物質を意味する。本発明の一つの態様において用いられるRNAi物質は、小さいリボ核酸分子（本明細書において干渉リボ核酸とも呼ぶ）、すなわち二本鎖構造で存在するオリゴヌクレオチド、例えば互いにハイブリダイズする二つの異なるオリゴリボヌクレオチド、または二本鎖構造を生成するために小さいヘアピン形態をとる単一のリボオリゴヌクレオチドである。オリゴリボヌクレオチドとは、長さが約100ヌクレオチドを超えない、典型的に長さが約75ヌクレオチドを超えない、特定の態様において長さが約70ヌクレオチド未満であるリボ核酸を意味する。RNA物質が、互いにハイブリダイズする二つの異なるリボ核酸の二本鎖構造、例えばsiRNA（同時係属中の出願番号第60/377,704号に記述されるようなd-siRNA；その開示は参照として本明細書に組み入れられる）である場合、二本鎖構造の長さは典型的に約15〜30 bp、通常約15〜29 bpの範囲であり、長さが約20〜29 bpsの場合、例えば21 bp、22 bpは特定の態様において特に重要である。RNA物質がヘアピン形態で存在する単一のリボ核酸の二本鎖構造、すなわちshRNAである場合、ヘアピンのハイブリダイズ部分の長さは典型的にsiRNA型の物質に関して先に提供した長さと同じであるか、または4〜8ヌクレオチド長い。この態様のRNAi物質の重量は典型的に、約5,000ダルトンから約35,000ダルトンの範囲であり、多くの態様において少なくとも約10,000ダルトンであり、かつ約27,500ダルトン未満、しばしば約25,000ダルトン未満である。
【００４３】
特定の態様において、RNAi物質が干渉リボ核酸、例えば上記のsiRNAまたはshRNAである代わりに、RNAi物質は上記のような干渉リボ核酸、例えばshRNAをコードしてもよい。言い換えれば、RNAi物質は、干渉リボ核酸の転写鋳型であってもよい。これらの態様において、転写鋳型は典型的に干渉リボ核酸をコードするDNAまたはRNAである。DNAは、ベクター（多様な異なるベクターが当技術分野で既知であり、例えばプラスミドベクター、ウイルスベクター等）に存在してもよい。
【００４４】
RNAi物質は、用いるプロトコールが典型的に核酸投与プロトコールである場合、そのような異なる多くのプロトコールが当技術分野において既知である場合、任意の簡便なプロトコールを用いて胚以外の哺乳類宿主に投与することができる。以下の考察は、用いてもよい代表的な核酸投与プロトコールの論評を提供する。核酸は、ウイルス感染、マイクロインジェクション、または小胞の融合を含む任意の数の経路によって組織または宿主細胞に導入してもよい。Furthら（1992）、Anal Biochem 205：365〜368によって記述されるように、ジェット注射も同様に筋肉内投与のために用いてもよい。核酸は金微粒子にコーティングしてもよく、文献に記述されている粒子衝突装置または「遺伝子銃」によって皮内に輸送してもよく（例えば、Tangら（1992）Nature 356：152〜154）、金微粒子をDNAによってコーティングする場合、これを皮膚細胞に衝突させる。発現ベクターを用いて核酸を細胞に導入してもよい。そのようなベクターは一般的に、核酸配列の挿入を提供するために、プロモーター配列の近傍に存在する都合のよい制限部位を有する。転写開始領域、標的遺伝子またはその断片、および転写終了領域を含む転写カセットを調製してもよい。転写カセットは、多様なベクター、例えばプラスミド；レトロウイルス、例えばレンチウイルス；アデノウイルス等に導入してもよく、この場合、ベクターは細胞において一過性または安定に、通常少なくとも約1日、より通常は少なくとも約数日から数週間の期間、維持することができる。
【００４５】
例えば、RNAi物質は、標的遺伝子を含む宿主生物に直接摂取させるか、または注射することができる。物質は細胞（すなわち、細胞内）に直接導入してもよく、または腔、間質腔、生物の体循環へ細胞外に導入してもよく、経口等で導入してもよい。経口導入方法には、RNAを生物の食物と直接混合することが含まれる。核酸を導入する物理的方法には、細胞への直接注入、またはRNA溶液の生物への細胞外注入が含まれる。物質は、細胞あたり少なくとも１コピーを輸送することができる量で導入してもよい。物質のより高用量（例えば、細胞あたり少なくとも5、10、100、500、または1000コピー）は、より有効な阻害を生じる可能性があり、より低用量もまた特定の態様にとって有用となる可能性がある。
【００４６】
特定の態様において、流体力学核酸投与プロトコールを用いる。物質がリボ核酸である場合、下記に詳細に説明する流体工学リボ核酸投与プロトコールが、特に重要である。物質がデオキシリボ核酸である場合、Changら、J. Virol. （2001）75：3469〜3473；Liuら、Gene Ther. （1999）6：1258〜1266；Wolffら、Science（1990）247：1465〜1458；Zhangら、Hum Gene Ther.（1999）19：1735〜1737；およびZhangら、Gene Ther.（1999）7：1344〜1349において記述される流体工学デオキシリボ核酸投与プロトコールが重要である。
【００４７】
関心対象のさらなる核酸輸送プロトコールには、以下が含まれるがこれらに限定されない：関心対象の米国特許には、第5,985,847号および第5,922,687号（その開示が参照として本明細書に組み入れられる）；国際公開公報第11092号；Acsadiら、New Biol. （1991）3：71〜81；Hickmanら、Hum. Gen Ther.（1994）5：1477〜1483；およびWolffら、Science（1990）247：1465〜1468等が含まれる。
【００４８】
RNAi物質の特性に応じて、標的遺伝子発現の所望の調節を得ることができる任意の簡便な手段を用いて、宿主に活性物質（複数）を投与してもよい。このように、物質は治療応用のための多様な製剤に組み入れることができる。より詳しく述べると、本発明の物質は、適当であれば薬学的に許容される担体または希釈剤と組み合わせて薬学的組成物に調製することができ、錠剤、カプセル剤、粉剤、顆粒剤、軟膏、溶液、坐剤、注射剤、吸入剤およびエアロゾルのような固体、半固体、液体、またはガス状の調製物に調製してもよい。そのため、物質の投与は、経口、口腔内、直腸内、非経口、腹腔内、皮内、経皮、気管内投与を含む多様な方法で行うことができる。
【００４９】
薬学的投与剤形において、物質は単独または他の薬学的に活性な化合物と適当に会合させて、ならびに組み合わせて投与してもよい。以下の方法および賦形剤は単なる例であって決して制限的ではない。
【００５０】
経口調製物の場合、物質は単独または適当な添加剤、例えば乳糖、マンニトール、コーンスターチ、もしくはジャガイモデンプンのような通常の添加剤；結晶セルロース、セルロース誘導体、アカシア、コーンスターチ、もしくはゼラチンのような結合剤；コーンスターチ、ジャガイモデンプン、またはカルボキシメチルセルロースナトリウムのような崩壊剤；タルクもしくはステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤；ならびに望ましければ緩衝剤、湿潤剤、保存剤、および着香料と組み合わせて錠剤、粉剤、顆粒剤、カプセル剤を形成することができる。
【００５１】
物質は、植物油または他の類似の油、合成脂肪酸グリセリド、高級脂肪酸のエステルまたはポリエチレングリコールのような水性または非水性溶媒において；そして望ましければ溶解剤、等張剤、懸濁剤、乳化剤、安定化剤および保存剤のような通常の添加剤と共に、それらを溶解、懸濁、または乳化させることによって注射用調製物に調製することができる。
【００５２】
物質は、吸入によって投与されるエアロゾル調製物において利用することができる。本発明の化合物は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素等のような許容される加圧噴射剤に調製することができる。
【００５３】
さらに、物質は、乳化基剤または水性基剤のような多様な基剤と共に混合することによって坐剤に調製することができる。本発明の化合物は、坐剤によって直腸内投与することができる。坐剤には、体温で溶解するが室温では固化したままであるカカオバター、カルボワックスおよびポリエチレングリコールのような媒体が含まれうる。
【００５４】
それぞれの用量単位、例えば小さじ1杯、大さじ1杯、錠剤、または坐剤が、一つまたは複数の阻害剤を含む組成物の規定量を含む、シロップ剤、エリキシル剤、および懸濁剤のような経口または直腸投与のための単位投与剤形を提供してもよい。同様に、注射または静脈内投与のための単位投与剤形は、滅菌水、通常の生理食塩液、または他の薬学的に許容される担体中の溶液として組成物中に阻害剤（複数）を含んでもよい。
【００５５】
本明細書において用いられるように、「単位投与剤形」という用語は、それぞれの単位が薬学的に許容される希釈剤、単体、または溶媒に関連して所望の作用を生じるために十分な量で計算される、本発明の化合物の規定量を含む、ヒトおよび動物被験者のための単位用量として適した、物理的に個別の単位を指す。本発明の新規単位投与剤形の仕様は、用いる特定の化合物および得られる作用、ならびに宿主におけるそれぞれの化合物に関連した薬物動態に依存する。
【００５６】
溶媒、アジュバント、担体または希釈剤のような薬学的に許容される賦形剤は、公衆が容易に入手可能である。その上、pH調節および緩衝剤、等張性調節剤、安定化剤、湿潤剤等のような薬学的に許容される補助物質は、公衆が容易に入手可能である。
【００５７】
当業者は、用量レベルが特定の化合物、輸送媒体の特性等に応じて変化しうることを容易に認識するであろう。所定の化合物に関する好ましい用量は、多様な手段によって当業者によって容易に決定される。
【００５８】
上記に従ってRNAi物質の有効量を胚以外の哺乳類宿主に投与すると、上記のように、標的遺伝子（複数）発現の調節、例えば標的遺伝子（複数）発現の減少が起こる。
【００５９】
上記の方法は任意の哺乳類（関心対象の代表的な哺乳類には、有蹄類または蹄のある動物、例えばウシ、ヤギ、ブタ、ヒツジ等；齧歯類、例えばハムスター、マウス、ラット等；ウサギ類、例えばウサギ；霊長類、例えばサル、ヒヒ、ヒト等が含まれるがこれらに限定されない）において作用する。
【００６０】
上記の方法は、多様な異なる適用において有用であり、その代表的なタイプをこれから下記により詳細に説明する。
【００６１】
有用性
本発明の方法は、多様な異なる応用において用いられ、代表的な応用には学術的／研究応用および治療応用の双方が含まれる。これらのタイプの代表的な応用のそれぞれを下記により詳しく説明する。
【００６２】
学術的／研究応用
本発明の方法は、例えば哺乳類宿主における標的遺伝子／コード配列の機能を決定するために、哺乳類宿主において一つまたは複数の標的遺伝子（コード配列）の発現を調節することが望まれる多様な異なるタイプの学術的、研究応用における用途を見出す。本発明の方法は、哺乳類宿主において一つまたは複数の標的遺伝子／コード配列の発現を低下、減少、または阻害するために本発明の方法を用いる、「機能喪失」型のアッセイ法において特別な用途を見出す。
【００６３】
そのため、本発明の一つの代表的な有用性は、まだ機能がわかっていない標的遺伝子の活性を阻害するためにRNAi物質が本発明に従う哺乳類に投与される、胚以外の哺乳類における遺伝子機能を同定する方法としてである。従来の遺伝子スクリーニングによる、時間と労力のかかる変異体の単離の代わりに、本発明の方法を用いる機能的ゲノム学は、標的遺伝子活性の量を減少させ、かつ／または時期を変化させるためにRNAi物質を投与することによって、特徴が調べられていない遺伝子の機能を決定する。そのような方法は、医薬品の標的となる可能性があるか否かを決定するため、生後の発達および／または加齢に関与するシグナル伝達経路を決定するため等に用いることができる。哺乳類ゲノムに関する全配列を含む、ゲノム上の遺伝子源および発現遺伝子源からのヌクレオチド配列情報の獲得をより速やかにすることは、生きている哺乳類生物における遺伝子機能を決定するために本発明の方法を用いることと結びつけることができる。特定のコドン使用に対する異なる生物の嗜好性、関連する遺伝子産物の配列データベースの検索、遺伝形質の連鎖マップとヌクレオチド配列が由来する物理的マップとの相関、および人工知能法を用いて、そのような配列決定プロジェクトにおいて獲得されたヌクレオチド配列から推定のオープンリーディングフレームを定義してもよい。
【００６４】
単純な代表的なアッセイ法は、発現された配列タグ（EST）から利用できる部分配列に従って遺伝子発現を阻害する。増殖、発達、代謝、疾患抵抗性、または他の生物学的プロセスにおける機能的変化は、EST遺伝子産物の正常な役割を示すであろう。標的遺伝子の機能は、遺伝子活性が阻害された場合にそれが哺乳類に及ぼす影響からアッセイすることができる。
【００６５】
生物の特徴がRFLPまたはQTL分析を通して多形性に遺伝子連鎖されることが決定されれば、本発明を用いて、その遺伝子多形がその特徴に直接関与する可能性があるか否かに関する洞察を得ることができる。例えば、遺伝子多形を定義する断片またはそのような遺伝子多形の近傍の配列を、RNAi物質を産生するために用いることができ、次にその物質を哺乳類に投与して、特徴の変化が阻害と関連するか否かを決定することができる。
【００６６】
本発明は、本質的な遺伝子の阻害を可能にするために有用である。そのような遺伝子は、特定の発達段階または細胞区画に限って生物の生存能力にとって必要であるかも知れない。条件的変異の機能的同等物は、それが生存能力にとって必要でない時間または場所で標的遺伝子の活性を阻害することによって産生してもよい。本発明は、標的ゲノムに永続的な変異を導入することなく、特定の発達時期および生物の部位にRNAi物質を付加することを可能にする。
【００６７】
選択的スプライシングが、特徴的なエキソンの使用によって区別することができる転写物ファミリーを産生する状況では、本発明は、ファミリーメンバーの機能を特異的に阻害するかまたは区別するために、適当なエキソンを介した阻害を標的とすることができる。例えば、選択的にスプライシングされう膜貫通ドメインを含むホルモンは、膜結合型および分泌型の双方で発現される可能性がある。膜貫通ドメインの前で翻訳を終了するナンセンス変異を単離する代わりに、膜貫通ドメインを含むエキソンを標的にし、それによって膜結合ホルモンの発現を阻害することによって、分泌型ホルモンのみを有する機能的結果を本発明に従って決定することができる。
【００６８】
治療応用
本発明の方法はまた、例えば哺乳類全体またはその一部、例えば組織、臓器等において一つまたは複数の標的遺伝子を調節することが望まれる多様な治療応用における用途を見出す。そのような方法において、RNAi活性物質の有効量を宿主哺乳類に投与する。有効量とは、標的遺伝子（複数）の発現を望ましく調節するために十分な用量を意味する。上記のように、このタイプの応用の多くの態様において、本発明の方法は、所望の治療転帰を得るために、宿主において一つまたは複数の標的遺伝子の発現を減少／阻害するために用いられる。
【００６９】
治療される病態の特性に応じて、標的遺伝子は、細胞に由来する遺伝子、内因性遺伝子、病的に変異した遺伝子、例えば癌を引き起こす遺伝子、トランスジーン、またはその感染後に細胞に存在する病原体の遺伝子であってもよい。特定の標的遺伝子および輸送されるRNAi物質の用量に応じて、技法は、標的遺伝子の部分的または完全な機能喪失を提供してもよい。注射した材料の用量がより低く、そしてRNAi物質の投与後の時間がより長ければ、より小さい分画の細胞に阻害が起こる可能性がある。
【００７０】
本発明の方法は、哺乳類宿主における標的遺伝子発現の調節が望まれる多数の異なる病態の治療において用いられる。治療とは、宿主に罹患する病態に関連した症状が少なくとも改善することを意味し、改善は、パラメータ、例えば治療すべき病態に関連した症状の程度が少なくとも減少することを意味するために広い意味で用いられる。そのため、治療には、宿主がもはや病態を有しないように、または病態の特徴を示す症状を少なくとも有しないように、病態または少なくともそれに関連する症状が完全に阻害される、例えば発生が防止されるか、または停止する、例えば終了する状況が含まれる。
【００７１】
多様な宿主が本発明の方法に従って治療可能である。一般的にそのような宿主は、「哺乳類」または「哺乳動物」であり、これらの用語は、広く肉食目（例えば、イヌおよびネコ）、齧歯目（例えば、マウス、モルモット、およびラット）ならびに霊長目（例えば、ヒト、チンパンジー、およびサル）を含む、哺乳類に含まれる生物を記述するために用いられる。多くの態様において、宿主はヒトであろう。
【００７２】
本発明は、任意の特定のタイプの標的遺伝子またはヌクレオチド配列の調節に限定されない。関心対象の標的遺伝子の代表的なクラスには以下が含まれるがこれらに限定されない：発生上の遺伝子（例えば、接着分子、サイクリンキナーゼ阻害剤、サイトカイン／リンフォカインおよびその受容体、増殖／分化因子およびその受容体、神経伝達物質およびその受容体）；腫瘍遺伝子（例えば、
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）；腫瘍抑制遺伝子（例えば、APC、BRCA1、BRCA2、MADH4、MCC、NF1、NF2、RB1、TP53、およびWTI）；ならびに酵素（例えば、ACCシンターゼおよびオキシダーゼ、ACPデサチュラーゼおよびヒドロキシラーゼ、ADP-グルコースピロホスホリラーゼ、ATPアーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アミラーゼ、およびアミログルコシダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、カルコンシンターゼ、キチナーゼ、シクロオキシゲナーゼ、デカルボキシラーゼ、デキストリナーゼ、DNAおよびRNAポリメラーゼ、ガラクトシダーゼ、グルカナーゼ、グルコースオキシダーゼ、顆粒結合デンプンシンターゼ、GTPアーゼ、ヘリカーゼ、ヘミセルラーゼ、インテグラーゼ、イヌリナーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、キナーゼ、ラクターゼ、UPアーゼ、リポキシゲナーゼ、ライソザイム、ノパリンシンターゼ、オクトピンシンターゼ、ペクチンエステラーゼ、ペルオキシダーゼ、ホスファターゼ、ホスホリパーゼ、ホスホリラーゼ、フィターゼ、植物生長調節シンターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテナーゼ、およびペプチダーゼ、プラナーゼ、リコンビナーゼ、逆転写酵素、RUBISCO、トポイソメラーゼ、およびキシラナーゼ）；ケモカイン（例えば、CXCR4、CCR5）、テロメラーゼのRNA成分、血管内皮増殖因子（VEGF）、VEGF受容体、腫瘍壊死因子、核因子κB、転写因子、細胞接着分子、インスリン様増殖因子、形質転換成長因子βファミリーメンバー、細胞表面受容体、RNA結合タンパク質（例えば、小さい核小体RNA、RNA輸送因子、翻訳因子、テロメラーゼ逆転写酵素）等。
【００７３】
キット
上記の方法の一つまたは複数を実践するための試薬およびそのキットも同様に提供される。本発明の試薬およびそのキットは、大きく変化してもよい。典型的に、キットは少なくとも上記のようにRNAi物質を含む。
【００７４】
上記の成分の他に、本発明のキットは本発明の方法を実践するための説明書をさらに含むであろう。これらの説明書は、多様な形で本発明のキットに存在してもよく、その一つまたは複数がキットに存在してもよい。これらの説明書が存在しうる一つの形は、キットのパッケージ、添付文書等における、適した媒体または基材、例えば情報が印刷されている紙片または複数の紙片上の、印刷情報としてである。さらにもう一つの手段は、情報が記録されているコンピューター読み取り可能な媒体、例えばディスケット、CD等であろう。存在しうるさらにもう一つの手段は、隔たったサイトで情報にアクセスするために、インターネットを通して用いられる可能性があるウェブサイトのアドレスである。任意の簡便な手段がキットに存在してもよい。
【００７５】
裸のRNAの流体力学投与
本発明によって、裸の核酸、例えばリボ核酸、デオキシリボ核酸、または化学改変された核酸（モルフォリノ、ペプチド核酸、メチルホスホネート、ホスホロチオエート、または2'-Oメチルオリゴヌクレオチドを含むがこれらに限定されない）を脈管を有する（vascularized）生物、例えば哺乳類の標的細胞にインビボで導入するための方法および組成物が提供される。本発明のこれらの方法は、便宜上「流体力学」法と呼ぶ。
【００７６】
本発明の方法の一つの態様において、裸の核酸およびRNアーゼ阻害剤の水性製剤を生物の脈管系に投与する。多くの態様において、水性製剤には同様に競合リボ核酸、例えば非キャップ化非ポリアデニル化リボ核酸が含まれる。さらに他の態様において、RNA分子に転写されうるDNAと候補調節物質との同時輸送は、RNアーゼ阻害剤または競合リボ核酸を含まずに行われ、この場合調節物質とDNAとは、単一の組成物として輸送してもしなくてもよい。本発明の方法は、研究および治療応用の双方を含む異なる多様な応用において用いられ、特に、肝細胞へのリボ核酸のインビボ輸送に用いるため、例えば核酸の肝臓標的化インビボ輸送のために特に適している。
【００７７】
本発明のこの局面をさらに記述するために、本発明の方法を最初に説明した後、本発明の方法が用いられる代表的な応用および本発明の方法を実践するために用いられるキットの説明を行う。
【００７８】
方法
先に要約したように、本発明の方法は脈管を有する多細胞生物に存在する標的細胞に、核酸、例えばリボ核酸をインビボで導入する方法を提供する。インビボ導入とは、本発明において、核酸が導入される標的細胞が、多細胞生物に存在する細胞であること、すなわち多細胞生物から分離された、例えば除去された細胞ではないことを意味する。そのため、本発明の方法は、細胞が由来する多細胞生物から分離された、例えば培養された細胞または複数の細胞に核酸が導入される、インビトロ核酸移入プロトコールとは異なる。言い換えれば、本発明の方法はインビトロ核酸移入法ではない。
【００７９】
核酸の導入とは、核酸、例えばデオキシリボ核酸（DNA）、リボ核酸（RNA）、または天然に存在しない核酸類似体を標的細胞の細胞質に挿入することを意味する。言い換えれば、核酸は、標的細胞の外側から細胞膜を超えて標的細胞の内部に移動する。
【００８０】
脈管を有する多細胞生物とは、脈管系を含む多細胞生物を意味する。関心対象の多細胞生物には植物および動物が含まれ、動物は、特に例えば心臓の鼓動に反応して血液が流れる静脈および動脈系で構成される脈管系を有する脊椎動物が特に重要である。関心対象の動物は、多くの態様において哺乳類である。関心対象の哺乳類には；齧歯類、例えばマウス、ラット；家畜、例えばブタ、ウマ、ウシ等；ペット、例えばイヌ、ネコ；および霊長類、例えばヒトが含まれる。特定の態様において、多細胞生物はヒトである。他の態様において、多細胞生物はヒト以外の哺乳類、例えばマウス、ラット等のような齧歯類である。
【００８１】
先に述べたように、本発明の方法は、最も広い意味において、宿主の標的細胞に核酸を導入するために適している。本明細書において用いられる「核酸」という用語は、ヌクレオチド、例えばデオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドからなるポリマー、または天然に存在する二つの核酸と類似の、配列特異的な様式で、天然に存在する核酸とハイブリダイズすることができる、合成的に産生される化合物（例えば、米国特許第5,948,902号およびそこに引用されている文献に記載されるPNA）を意味する。本明細書において用いられる「リボ核酸」および「RNA」という用語は、リボヌクレオチドで構成されるポリマーを意味する。本明細書において用いられる「デオキシリボ核酸」および「DNA」という用語は、デオキシリボヌクレオチドからなるポリマーを意味する。
【００８２】
本発明の方法は、多細胞生物の標的細胞へのリボ核酸の輸送に用いるために特に適している。そのため、リボ核酸の輸送に関して方法をさらに説明する。しかし、以下のプロトコールも同様に他の核酸、例えばDNA（プラスミドDNAのような）の輸送に用いるために適している。
【００８３】
本発明の方法を実践する場合、リボ核酸が裸のリボ核酸として存在するリボ核酸の水性組成物を、多細胞生物または宿主の脈管系に投与する。多くの態様において、裸のRNA水性組成物または製剤を宿主の静脈に投与する、すなわち裸のRNA調製物を静脈内投与する。特定の態様において、裸のRNA調製物は高圧注射によって宿主に静脈内投与される。高圧注射とは、水性製剤が、一般的に少なくとも約20 mmHg、通常少なくとも約30 mmHgである上昇させた圧で静脈内に導入されることを意味する。多くの態様において、上昇させた圧は、約10 mmHg〜50 mmHgの範囲であり、40 mmHg〜50 mmHgがしばしば好ましい。上記の方法のように、高圧下で水性製剤を投与する方法は、上記の関連文献の章に記載の参考文献に記載される。
【００８４】
上記のように、本発明の方法によって標的細胞に導入されるRNAまたはDNAは、裸のRNAとして水性製剤に存在する。「裸」とは、標的細胞への流入を促進するように作用することができる如何なる輸送媒体も含まないことを意味する。例えば、本発明の方法において輸送される裸のRNAまたはDNAは、リポソーム製剤、荷電脂質または沈殿物質のようなトランスフェクションを促進する如何なる材料も含まず、例えば、それらはコロイド材料（リポソーム調製物を含む）と複合体を形成しない。さらに、本発明の裸のRNAは、標的細胞ゲノムにRNAの組み込みを引き起こすベクターに含まれない、すなわち、それらは遺伝情報を有するウイルス配列または粒子を含まない。
【００８５】
本発明によって輸送してもよい裸のRNAは、その意図とする目的、例えばそれらがコードするタンパク質等に応じて、長さが多様に変化してもよい。一般的に、裸のRNAは長さが少なくとも約10 nt、通常は長さが少なくとも約30 nt、およびより通常は長さが少なくとも約35 ntであり、裸のRNAは長さが20,000 ntまたはそれ以上であってもよいが、一般的に長さが約10,000 ntを超えず、通常は、長さが約6,000 ntを超えないと考えられる。上記のように裸のRNAがRNAi物質である特定の態様において、RNAの長さは、約10 nt〜50 nt、しばしば約10 nt〜40 nt、およびよりしばしば20 nt〜25 nt、例えば21 ntまたは22 ntなどの15 nt〜25 ntを含む、約15 nt〜30 ntである。
【００８６】
本発明の方法に従って標的細胞に導入してもよい裸のRNAはタンパク質をコードしてもしなくてもよく、すなわち標的細胞への導入時にタンパク質に翻訳されてもされなくてもよい。裸のRNAが標的細胞への導入後にタンパク質に翻訳されうる態様において、裸のRNAはキャップ化されてもされなくてもよく、それはIRESドメイン等を含んでもよい。しかし、本態様の多くの特定のプロトコールにおいて、裸のRNAはキャップ化されている。さらに、これらの態様におけるRNAには一般的に、少なくともポリアデニル化シグナルが含まれ、多くの態様において、ポリアデニル化されており、ポリA尾部は存在する場合、一般的に長さが約10個〜300個、通常約30個〜50個である。裸のRNAに関するさらなる説明を下記に提供する。
【００８７】
上記のように、裸のRNAの水性製剤は、宿主に血管内、通常静脈内投与される。本発明の方法において用いられる水性製剤において、裸のRNAの有効量を水性輸送媒体と配合する。有効量は、標的細胞に所望の輸送量を提供するために、例えば所望のタンパク質発現量のような所望の転帰を提供するために十分である量を意味する。多くの態様において、水性製剤に存在する裸のRNAの量は少なくとも約5 μg、通常は少なくとも約10 μg、およびより通常は少なくとも約20 μgであってもよく、量は10 mgまたはそれ以上の量であってもよいが、一般的に約1 mgを超えず、通常は約200 μgを超えない。
【００８８】
関心対象の水性輸送媒体には：水、生理食塩液、および緩衝媒体が含まれる。関心対象の特定の溶媒には：塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液、リン酸緩衝生理食塩液等が含まれる。水性輸送媒体にはさらに、保存剤および他の添加剤、例えば抗菌剤、抗酸化剤、キレート化剤、不活性ガス、栄養補給剤、電解質補給剤、マグネシウム、カルシウムおよびマンガンのような二価陽イオンが含まれてもよい。多くの態様において特別な関心対象は、偽生理的である緩衝塩溶液の使用である。
【００８９】
本発明の方法の特定の態様の特徴は、裸のRNAがRNアーゼ阻害剤と組み合わせて多細胞生物の脈管系に導入される点である。RNアーゼ阻害剤は、多細胞生物におけるRNアーゼ活性の活性を、完全には不活化しないが少なくとも減少させる化合物または物質を意味する。多くの態様において、RNアーゼ阻害剤は、RNアーゼのタンパク質阻害剤であり、この場合ヒトの胎盤RNアーゼ阻害剤が特に重要である。タンパク質RNアーゼ阻害剤は、天然起源から精製してもよく、または例えば組み換え技術によって合成的に産生してもよい。ヒト胎盤RNアーゼ阻害剤は、異なる多様な販売元から多様な異なる商品名で得てもよく、代表的な販売元には；プロメガ社（Promega Inc.）、ストラタジーン社（Stratagene Inc.）、フィッシャーサイエンティフィック社（Fisher Scientific Inc.）等が含まれる。
【００９０】
RNアーゼ阻害剤は、特定の態様において、水性の裸のRNA組成物とは異なる組成物で宿主に投与してもよいが、多くの態様において、RNアーゼ阻害剤は、裸のRNAの水性組成物に存在する。水性組成物に存在するRNアーゼ阻害剤の量は、裸のRNAの所望の取り込みを提供するために十分である。RNアーゼ阻害剤がタンパク質阻害剤である場合、本発明の方法を実践する際に多細胞生物に導入される水性組成物中の阻害剤の濃度は、約4〜4,000単位の範囲であってもよく、通常は約400〜4,000単位、およびより通常は約400〜1,500単位であってもよい。
【００９１】
特定の態様において、裸のRNAまたはRNアーゼ阻害剤は、競合RNAと共に投与される。競合RNAはRNアーゼ活性の競合的阻害剤として作用することができるRNAを意味する。多くの態様において、競合RNAはキャップ化されず、ポリアデニル化されない。キャップ化されないとは、競合RNAが真核細胞メッセンジャーRNAの5'末端に認められるキャップ構造を欠損すること、すなわちそれが5' 7メチルGを欠損することを意味する。ポリアデニル化されないとは、競合RNAがその3'末端において、真核細胞メッセンジャーRNAにおいて認められるポリA尾部またはポリアデニル化ドメインを欠損することを意味する。競合RNAの長さは異なってもよいが、一般的に少なくとも約70 nt、通常少なくとも約200 nt、およびより通常少なくとも約1,500 ntであり、長さは10,000 ntまたはそれ以上であってもよいが、一般的に約3,500 ntを超えず、通常約1,500 ntを超えない。水性組成物中の競合RNAの濃度は、裸のRNAの所望の保護（例えば、RNアーゼによる結合の競合によって）を提供するために十分であり、多くの態様において、約10 μg/ml〜10 mg/ml、通常約20 μg/ml〜200 μg/ml、およびより通常約40 μg/ml〜150 μg/mlの範囲である。
【００９２】
本発明の方法によって、投与されたRNAの標的細胞（複数）の細胞質への非常に効率的な移入が起こる。本発明の方法は、肝臓または肝細胞および肝臓の非実質細胞の細胞質にRNAを移入するために特に適している。そのため、多くの態様において、本発明の方法は、高レベルの核酸、例えばRNAの肝細胞または肝組織への移入を得るインビボの方法である。
【００９３】
本発明の方法によって標的細胞に導入される核酸は、標的細胞の内部では短命である。核酸の特定の性質に応じて、本発明の方法による導入後の核酸の半減期は一般的に約30秒〜10日、通常は約1分〜24時間の範囲であり、より通常は約5分〜10時間の範囲である。そのため核酸が、関心対象のタンパク質をコードするRNAである場合、本発明の方法による導入後のタンパク質発現は一過性であり、典型的に約1分〜3日間の範囲の期間、通常約5分〜24時間持続する。そのため、本発明の方法の多くの態様において、本発明の方法は、タンパク質発現がRNAの寿命に等しい、導入遺伝子から一過性のタンパク質発現を提供する方法である。それにもかかわらず、発現されたタンパク質は、特定のタンパク質の性質に応じて、より長い寿命を有する可能性がある。
【００９４】
有用性
本発明の方法は、標的細胞への裸の核酸の効率的なインビボ移入が望まれる、多様な異なる応用における用途を見出す。本発明の方法が用いられる応用には、治療的および研究応用の双方が含まれる。関心対象の治療応用には、遺伝子治療応用、ワクチン接種応用等が含まれる。関心対象の研究応用には、特定の病態、例えばRNAウイルス感染症の動物モデルの作製、遺伝子機能を解明するために表現型に関する遺伝子発現を観察すること等が含まれる。本発明の方法が用いられる他の応用には、アンチセンス、リボザイムおよびキメラ形成（chimeraplasty）（すなわち、RNA/DNAキメラによる遺伝子の修復）（例えば、Yoonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA（1996）93(5)：2071〜6；Cole-Straussら、Science（1996）273（5280）：1386〜9；およびZhuら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA（1999）96(15)：8768〜73を参照されたい）治療法のみならず、干渉RNA（細胞に存在することにより類似のRNAの翻訳を防止するRNA）（例えば、Wiannyら、Nat. Cell Biol.（2000）2(2)：70〜5；およびSiQunら、Nature（1998）391：806〜811を参照されたい）治療法の開発が含まれる。
【００９５】
本発明の方法が用いられる一つのタイプの応用は、例えば標的細胞からの、関心対象のポリペプチド、例えばタンパク質の合成においてであり、特にポリペプチドの一過性の発現である。そのような応用において、関心対象のポリペプチドをコードする核酸を、必要かつ／または望ましい発現成分、例えば5'キャップ構造、IRESドメイン、ポリAシグナルまたはポリA尾部等と組み合わせて、ポリペプチド発現のための発現宿主としての役割を有する標的細胞が存在する多細胞生物にインビボ投与によって標的細胞に導入する。例えば、本発明の方法によって投与される裸の核酸がRNAである場合、RNAは、標的細胞の細胞質においてRNAに含まれる配列によってコードされるタンパク質に翻訳されうるRNAである。RNAはキャップ化されてもされなくてもよく、キャップ化されない場合、一般的にIRES配列を含む。RNAはまた一般的にポリA尾部をさらに含み、ポリA尾部の長さは典型的に約10 nt〜300 nt、通常は約30 nt〜50 ntである。インビボ投与およびその後の標的細胞への導入後、多細胞生物、およびそこに存在する標的細胞は、移入されたRNAによってコードされるタンパク質の発現にとって十分な条件で維持される。次に、発現されたタンパク質を回収して、望ましければ任意の都合のよいプロトコールを用いて精製する。
【００９６】
そのため、本発明の方法は、多細胞生物において関心対象のタンパク質の量を少なくとも増強する手段を提供する。「少なくとも増強する」という用語には、本発明の方法を実践する前に、タンパク質の特定の初期量が存在する多細胞生物において、タンパク質の量を増加させる方法が用いられる状況が含まれる。「少なくとも増強する」という用語にはまた、本発明の方法を実践する前に多細胞生物が実質的に如何なるタンパク質も含まない状況が含まれる。本発明の方法が、多細胞生物に存在するタンパク質の量を少なくとも増強するために用いられる場合、それらは薬学的調製物の応用および治療的応用を含む多様な異なる応用において用いられ、後者を下記により詳細に説明する。
【００９７】
本発明の方法が用いられる治療的応用には、宿主生物における治療タンパク質レベルを増強するために本発明の方法が用いられる遺伝子治療応用、および宿主にワクチン接種する（または他の方法によって輸送されるワクチンを開発する）ために本発明の方法が用いられるワクチン接種応用が含まれる。DNAに基づく発現プロトコールとは異なり、本発明のRNAに基づく発現プロトコールは、真核細胞遺伝子に共通して関連するプロモーター、エンハンサー、リプレッサーおよび他の調節要素を用いる必要がなく複雑でない。本発明の方法は、標的細胞に流入すると宿主において必要な増強されたタンパク質レベルを提供する、広く多様な治療的核酸を輸送するために用いてもよい。関心対象の治療的核酸には、遺伝的欠損に基づく疾患状態の原因となる遺伝子などの欠損遺伝子を、標的宿主細胞において、これらの欠損遺伝子によって宿主に提供されると想定される産物をコードすることによって置換する核酸；癌の治療において治療的に有用な核酸等が含まれる。そのレベルが本発明の方法の実践によって増強する可能性がある遺伝子欠損疾患状態に関係する代表的な産物には、第VIII因子、第IX因子、β-グロビン、低密度タンパク質受容体、アデノシンデアミナーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、グルコセレブロシダーゼ、嚢胞性線維症膜貫通調節物質、α-アンチトリプシン、CD-18、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギノスクシネートシンターゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、分岐鎖α-ケト酸デヒドロゲナーゼ、フマリルアセトアセテートヒドロラーゼ、グルコース-6-ホスファターゼ、α-L-フコシダーゼ、β-グルクロニダーゼ、α-L-イデュロニダーゼ（iduronidase）、ガラクトース-1-ホスフェートウリジルトランスフェラーゼ等が含まれるがこれらに限定されない。本発明の方法によって輸送してもよい癌治療核酸には：適当な因子をコードすることによってリンパ球の抗腫瘍活性を増強する核酸、その発現産物が腫瘍細胞の免疫原性を増強する核酸、腫瘍サプレッサーをコードする核酸、毒素コード核酸、自殺因子コード核酸、多剤耐性産物コード核酸、リボザイム、DNAリボザイム、DNA/RNAキメラ、干渉RNAおよびアンチセンス配列等が含まれる。
【００９８】
上記のように、本発明の方法の重要な特徴は、本発明の方法をインビボ遺伝子治療応用のために用いてもよい点である。インビボ遺伝子治療応用とは、治療遺伝子の発現が望まれる標的細胞または複数の細胞が、本発明を実践する前に宿主から除去されないことを意味する。対照的に、裸の核酸組成物が多細胞生物に直接投与されて標的細胞によって取り込まれ、その後コードされた産物の発現が起こる。
【００９９】
上記のように、本発明の方法が用いられるもう一つの治療応用は、宿主のワクチン接種（と共に他の方法によって輸送されるワクチンの開発）である。これらの方法において、本発明の方法によって宿主に投与される裸の核酸、例えばRNAは、標的細胞にRNAが流入すると、発現されて所望の免疫応答を誘発するために分泌される所望の免疫原をコードする。裸の核酸が用いられ、本発明の裸の核酸輸送方法が用いられるワクチン接種法は、その開示が参照として本明細書に組み入れられる、国際公開公報第90/11092号にさらに記述される。
【０１００】
上記のように、本発明の方法はまた、様々な研究応用における用途を見出す。本発明の方法が用いられる一つの研究応用は、RNAウイルス感染症の動物モデルを作製する場合であり、この場合関心対象のRNAウイルスには、HCV、HIV、A型インフルエンザ、A型肝炎、ポリオウイルス、エンテロウイルス、ライノウイルス、アフタウイルス等が含まれる。そのような動物モデルを作製するために、レポータードメイン、例えば検出可能な産物（ルシフェラーゼ、蛍光タンパク質等）をコードするドメインに機能的に結合させた、関心対象のRNAウイルスからの一つまたは複数の調節要素等を含む構築物をまず提供する。または、そのようなRNA構築物にインビボで転写されうるDNA構築物を用いてもよい。次に、これらの構築物を本発明の方法に従って宿主、例えばマウスに投与して、対応するRNAウイルスによる感染症の動物モデルを作製する。そのため、本発明の方法によって作製されたRNAウイルスの動物モデルも同様に提供される。RNAウイルス動物モデルを作製するための代表的なプロトコールを下記の実験の章に提供する。
【０１０１】
本発明はまた、先により詳しく記述し、下記の実験の章でより詳しく記述するsiRNAおよびshRNAを含む、RNAi治療および／または研究物質の輸送に用いられる。
【０１０２】
そのような動物モデルを用いて、候補となる調節物質、例えば、増強または阻害物質をスクリーニングする方法も提供される。異なる多様なタイプの候補物質を本発明に従ってスクリーニングしてもよい。候補物質は多数の化学クラスを含み、典型的にそれらは有機分子であるが、好ましくは分子量が50ダルトンより大きく、約2,500ダルトン未満である低分子有機化合物である。候補物質は、タンパク質との構造的相互作用、特に水素結合にとって必要である官能基を含み、典型的に少なくとも一つのアミン、カルボニル、ヒドロキシル、またはカルボキシル基を含み、好ましくは少なくとも二つの官能化学基を含む。候補物質はしばしば、一つまたは複数の上記の官能基によって置換された環状炭素または複素環構造および／または芳香環もしくは多芳香環構造を含む。候補物質は同様に、ペプチド、糖質、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン誘導体、構造的類似体またはその組み合わせを含む生体分子の中にも認められる。
【０１０３】
特定の態様において特に重要であるのはアンチセンス核酸である。アンチセンス試薬は、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ODN）、特に無処置の核酸からの化学改変を有する合成ODN、またはRNAのようなアンチセンス分子を発現する核酸構築物であってもよい。アンチセンス配列は、標的遺伝子のmRNAに対して相補的であり、標的遺伝子産物の発現を阻害する。アンチセンス分子は、様々な機構により、例えばRNアーゼHの活性化または立体的妨害により、翻訳に利用できるmRNAの量を減少させることによって、遺伝子発現を阻害する。アンチセンス分子の一つまたは組み合わせを投与してもよく、組み合わせは多数の異なる配列を含んでもよい。
【０１０４】
アンチセンス分子は、転写開始が、アンチセンス鎖がRNA分子として産生されるように方向づけられた適当なベクターにおいて、標的遺伝子配列の全てまたは一部の発現によって産生してもよい。または、アンチセンス分子は合成オリゴヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチドは一般的に、長さが少なくとも約7ヌクレオチド、通常は少なくとも約12ヌクレオチド、より通常は少なくとも約16ヌクレオチドであり、長さは約500ヌクレオチドを超えない、通常は約50ヌクレオチドを超えない、より通常は約35ヌクレオチドを超えず、長さは、阻害効率、特異性（交叉反応性がないことを含む）等によって支配される。長さが7〜8塩基の短いオリゴヌクレオチドが、遺伝子発現の強くかつ選択的な阻害剤となりうることが判明している（Wagnerら（1996）、Nature Biotechnol. 14：840〜844）。
【０１０５】
内因性のセンス鎖mRNA配列の特異的領域または複数の特異的領域は、アンチセンス配列によって相補的となるように選択される。オリゴヌクレオチドに関する特異的配列の選択は、いくつかの候補配列をインビトロまたは動物モデルにおいて標的遺伝子発現の阻害に関してアッセイする経験的な方法を用いてもよい。配列の組み合わせも同様に用いてもよく、この場合mRNA配列のいくつかの領域がアンチセンス相補性のために選択される。
【０１０６】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、当技術分野で公知の方法によって化学合成してもよい（Wagnerら（1993）、上記、およびMilliganら、上記を参照されたい）。好ましいオリゴヌクレオチドは、細胞内安定性および結合親和性を増加させるために、本来のホスホジエステル構造から化学改変されている。そのような多くの改変が文献において記述されており、これらは骨格、糖または複素環基礎骨格の化学を変化させる。
【０１０７】
骨格の化学における有用な変更は、ホスホロジアミデート結合、メチルホスホネートホスホロチオエート；非架橋酸素がいずれも硫黄で置換されているホスホロジチオエート；ホスホロアミダイト；アルキルホスホトリエステルおよびボラノホスフェートである。アキラルホスフェート誘導体には、3'-O-5'-S-ホスホロチオエート、3'-S-5'-O-ホスホロチオエート、3'-CH2-5'-O-ホスホネートおよび3'-NH-5'-O-ホスホロアミデートが含まれる。ペプチド核酸は、リボースホスホジエステル骨格全体をペプチド結合に置換する。安定性および親和性を増加させるために、糖の改変も同様に用いてもよい。一つの例は、モルフォリンによるリボース糖の置換である。基本骨格が天然のβ-アノマーとは逆転しているデオキシリボースのα-アノマーを用いてもよい。リボース糖の2'-OHは、2'-O-メチルまたは2'-O-アリル糖を形成するように改変してもよく、これは親和性を含まずに分解に対する抵抗性を提供する。複素環基礎骨格の改変は適切な塩基対形成を維持しなければならない。いくつかの有用な置換には、デオキシチミジンの代わりにデオキシウリジン；デオキシシチジンの代わりに5-メチル-2'-デオキシシチジンおよび5-ブロモ-2'-デオキシシチジンを用いることが含まれる。5-プロピニル-2'-デオキシウリジンおよび5-プロピニル-2'-デオキシシチジンを、それぞれデオキシチミジンおよびデオキシシチジンの代わりに用いると、親和性および生物活性を増加させることが示されている。
【０１０８】
候補物質は、合成または天然の化合物のライブラリを含む多様な起源から得られる。例えば、幅広い有機化合物および生体分子のランダム合成および計画的合成を行うために、ランダム化オリゴヌクレオチドおよびオリゴペプチドの発現を含む様々な手段が利用可能である。または、細菌、真菌、植物、および動物抽出物の形での天然化合物のライブラリも利用可能、または容易に産生される。さらに、天然または合成によって産生されたライブラリおよび化合物は、通常の化学、物理、および生化学手段によって容易に改変され、組み合わせライブラリを作製するために用いてもよい。公知の薬理学的物質に、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化等のような計画的またはランダム化学改変を行って、構造類似体を作製してもよい。
【０１０９】
そのようなスクリーニングアッセイ法において、核酸構築物（例えば、上記のRNAまたはDNA構築物）および候補物質を宿主動物に投与して、構築物の活性に及ぼす候補物質の影響を観察して、認められた作用を候補化合物の調節活性に相関させる。候補物質および核酸構築物を、同じまたは異なる時期に本発明の方法に従って宿主に投与してもよく、特定の好ましい態様において、二つの成分を宿主に同時に、例えば単一の液体組成物の形で投与してもよい。代表的なスクリーニングアッセイ法を下記の実験の章に提供する。
【０１１０】
本発明が用いられるもう一つの研究応用は、遺伝子機能の解明である。特定の遺伝子配列を有するRNAを本発明の方法によって導入して、生物の表現型に及ぼす遺伝子の影響を観察する。遺伝子機能の研究応用のために本発明の方法を用いる利益には、遺伝子調節要素に関係なく遺伝子を発現可能であることが含まれる。本発明の方法が用いられる他の研究応用には、リボザイムおよびアンチセンス有効性に関する研究；RNA代謝に関する研究等が含まれるが、これらに限定されない。
【０１１１】
キット
標的細胞、例えば肝細胞にインビボで核酸を輸送する本発明の方法を実践するために用いられるキットも、本発明によって提供される。本発明のキットには一般的に、標的細胞に導入されることが望まれる裸の核酸およびRNアーゼ阻害剤とが含まれる。本発明のキットはさらに、水性輸送媒体、例えば緩衝生理食塩液等をさらに含んでもよい。さらに、キットは上記のような競合RNAを含んでもよい。本発明のキットにおいて、上記の成分は宿主に輸送するために単一の水性組成物に配合してもよく、または異なるもしくは個別の組成物として、例えば異なる容器において個別であってもよい。選択的に、キットは、宿主に水性組成物を輸送するための血管内輸送手段、例えばシリンジ等をさらに含んでもよく、輸送手段は水性組成物を予め充填してもしなくてもよい。レポーター遺伝子がインビボでDNAから転写される場合、RNアーゼ阻害剤および競合RNAは必要でない。
【０１１２】
上記の成分の他に、本発明のキットはさらに、本発明の方法を実践するための説明書を含むであろう。これらの説明書は、多様な形で本発明のキットに存在してもよく、その一つまたは複数がキットに存在してもよい。これらの説明書が存在しうる一つの形は、キットのパッケージ、添付文書等における、適した媒体または基材上の、例えば情報が印刷されている紙片または複数の紙片上の、印刷情報としてである。さらにもう一つの手段は、情報が記録されているコンピューター読み取り可能な媒体、例えばディスケット、CD等であろう。存在しうるさらにもう一つの手段は、隔たったサイトで情報にアクセスするために、インターネットによって用いられる可能性があるウェブサイトアドレスである。任意の簡便な手段がキットに存在してもよい。
【０１１３】
以下の実施例は本発明を説明するためであって、本発明を制限するために提供するのではない。
【実施例】
【０１１４】
実験
1．哺乳類におけるRNAi
A．本発明者らは、ルシフェラーゼmRNAを発現するプラスミド（pCMVGL3）2 μgを、以下の処方に沿って、PBS 1.8 ml、RNasin 1200単位、および競合RNA 40 μgと共に混合して同時輸送した：
1）（1群、RNAなし）無処置対照としてPBS 1.8 ml；
2）（2群、アンチセンスRNA）：配列
0006055164.tif 000003
（デオキシチミジレート残基をdTで示し、残りのヌクレオチドはリボヌクレオチドである）を有するアンチセンス方向の21量体RNA/DNAキメラ20 μgと混合したPBS 1.8 ml；または
3）（3群、RNAi）配列
0006055164.tif 000004
を有するそのセンス相補鎖20 μgにアニーリングした上記のアンチセンス21量体20 μgと混合したPBS 1.8 ml。
【０１１５】
オリゴヌクレオチドは、アデノシン三燐酸およびT4ポリヌクレオチドキナーゼを用いてキナーゼ処理した。それぞれの製剤（1〜3）は、5週齢の雌性Balb/cマウスへの高圧尾静脈注射によって試験した。注射の5時間、72時間、および96時間後に、ルシフェラーゼ発現の結果として放出された光を上記のように測定した。この実験の結果を下記の表に要約する。数値は相対光単位として表記した。
0006055164.tif 000005
【０１１６】
上記の結果は、RNAi（3群）が成体哺乳類の肝臓においてルシフェラーゼRNAの破壊を引き起こしたことを証明する。この破壊によって、RNAなしまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド単独を投与した動物と比較して、ルシフェラーゼ活性の結果として放出された光が減少した。われわれの知る限り、これは、RNAiが成体哺乳類において有効であることの最初の証明である。本発明の方法は、RNAiが哺乳類において機能する機構を研究するモデル系を提供する。これは同様に、RNAiに基づく治療の開発および最適化にとって有用である。さらに、発現プラスミドを調節物質と共に同時輸送する必要がない。同様に、内因性遺伝子を標的化する調節物質を輸送することができる。
【０１１７】
B．ここでは、本発明者らは、RNAiが成体哺乳類における遺伝子発現を抑制できるか否かを試験する。本発明者らは、小さい合成干渉RNA（siRNA）がインビボで遺伝子発現の強力な阻害剤であることを発見した。さらに、小さいヘアピンRNA（shRNA）も同様に有効である。特に、これらのRNAi物質は、合成RNAとして、またはDNA発現構築物からインビボで転写されたRNAのいずれかとして輸送することができる。これらの研究は、RNAiが治療ツールとして開発されうることを示し、通常の遺伝子治療戦略と共に用いることができることを証明している。
【０１１８】
1．siRNA
本発明者らは、裸のRNAの効率的な輸送を行うために、既存の流体力学トランスフェクション法（J. Chang、L.J. Sigal、A. Lerro、J. Taylor、J. Virol. 75：3469〜73（2001））を改変した。ホタルのルシフェラーゼに由来するsiRNAまたは無関係なsiRNAのいずれかを、ルシフェラーゼ発現プラスミド（図1に構築物の説明）と共に同時注射した。ルシフェラーゼ発現を、生きている動物において、ルシフェラーゼ基質（4）の注射後の定量的全身造影を用いてモニターしたところ、注射したレポータープラスミドの量およびトランスフェクション後の時間に依存的であった（データは示していない）。代表的な動物を図2Aに示す。これらの結果の定量を図2Bに示す。
【０１１９】
それぞれの実験において、同時注射したヒトα-1アンチトリプシン（hAAT）（S.R. Yantら、Nat. Genet. 25：35〜41（2000））をコードするプラスミドの血清測定値を内部対照としてトランスフェクション効率を標準化して、非特異的翻訳阻害をモニターした。74時間での血清hAATレベルの平均値は、動物のそれぞれの群において類似であった。
【０１２０】
本発明者らの結果は、成体マウスにおいてルシフェラーゼ発現がsiRNAによって特異的に阻害されることを示している（p＜0.0115）；無関係なsiRNAは作用を示さなかった（p＜0.864）。異なる11回の実験において、ルシフェラーゼsiRNAはルシフェラーゼ発現（放出光）を平均で81％（±2.2％）減少させた。
【０１２１】
2．shRNA
ホタルのルシフェラーゼまたはウミシイタケのルシフェラーゼを標的とする短いヘアピンRNA（shRNA）を、T7ポリメラーゼインビトロランオフ（runoff）転写によって合成した。これらのインビトロで転写されたRNAをpGL3-対照DNAと共に同時トランスフェクトすると、培養におけるホタルのルシフェラーゼ発現が減少した（Paddisonら、Genes Dev. 16(8)：948〜58（2002））。これらのヘアピンRNAがマウスにおいて機能的であるか否かを試験するために、本発明者らは、インビトロで転写されたルシフェラーゼshRNA（または対照としてウミシイタケのshRNA）40 μg、pGL3-対照DNA 2 μg、pThAAT 2 μg、RNasin 800単位およびPBS 1.8 mlをマウスに流体力学的にトランスフェクトした。ホタルのルシフェラーゼshRNAを投与した72時間後にマウスから放出された光は、無処置対照と比較して平均で95％（±1.4％）減少した。ウミシイタケのshRNAを投与したマウスから放出された光はごくわずかに減少したに過ぎなかった。意外にも、T7転写鋳型DNAとT7タンパク質を発現するプラスミドとの同時トランスフェクションによって、培養またはマウスにおけるルシフェラーゼレポーター活性の如何なる減少も起こらなかった（データは示していない）。
【０１２２】
ホタルのルシフェラーゼshRNA配列（5'から3'）
0006055164.tif 000006
【０１２３】
ウミシイタケのルシフェラーゼshRNA配列（5'から3'）
0006055164.tif 000007
【０１２４】
上記の結果は、短いインビトロ転写されたヘアピンが同様にインビボでのルシフェラーゼ発現を減少させたことを示している。
【０１２５】
3．結論
上記のデータは、成体マウスにおける遺伝子発現を下方調節できることを証明している。
【０１２６】
C．C型肝炎ウイルス（HCV）は、世界で40人に1人に感染するRNAウイルスであり、西欧社会において肝移植の最も一般的な基礎原因である。RNAiをヒト病原体に対して向けることができるか否かを決定するために、マウス肝臓においてHCV RNAを標的とする能力に関していくつかのsiRNAを試験した。本発明者らは、HCV配列をルシフェラーゼRNAに融合させたレポーター戦略を用いて、RNAiをインビボでの同時トランスフェクションによってモニターした。HCV内部リボソーム進入部位およびコアタンパク質コード領域を標的とするsiRNAは、ルシフェラーゼ発現を阻害することができなかった。対照的に、キメラHCV NS5Bタンパク質-ルシフェラーゼ融合RNAのNS5B領域を標的とするsiRNAは、ルシフェラーゼ発現を75％（±6.8％）減少させた。これらの結果は、重要なヒト病原体を標的とするためにRNAiを治療的に用いる有用性を示している。
【０１２７】
D．これらのデータから、siRNAはマウスにおいて機能的であることは明白である。遺伝子抑制を誘導するために等しく有効である機能的shRNAは、RNAポリメラーゼIIIプロモーターを用いてDNA鋳型からインビボで発現させることができる（Paddisonら、提出）。同起源のshRNA（pShh1-Ff1）の発現は、ルシフェラーゼ発現の98％（±0.6％）までの抑制を誘導し、3回の独立した実験において平均で92.8％（±3.39％）抑制した（図2Cおよび2D）。空のshRNA発現ベクターは、作用を示さなかった（データは示していない）。さらに、shRNAインサートの方向を逆転させる（pShh1-Ff1rev）と、RNAポリメラーゼIIIによる終結が変化したことおよび不適切に構築されたshRNAがその後産生されたことにより、沈黙化が消失した（Paddisonら、提出）。これらのデータは、プラスミドコードshRNAが成体マウスにおいて強力かつ特異的RNAi反応を誘導できることを示している。さらに、本発明のRNAi輸送法は、遺伝子移入ベクターの開発においてなされた有意な進歩を利用するように作製することができることを証明している。
【０１２８】
既存の遺伝子治療戦略は、治療的結果を得るために外因性のタンパク質の異所発現に大きく依存している。その発見以来、RNAiは、疾患関連遺伝子を沈黙化する手段を提供することによって、これらの機能獲得アプローチを補完する見込みを有する。併せて考慮すると、本発明者らの結果は、小さいヘアピンRNAの発現を導くDNA構築物を用いて、成体哺乳類においてRNAiが誘導されうることを示している。これらの結果は、本発明が広範囲の疾患に治療的RNAiを適用するためのウイルスおよび非ウイルス輸送系を提供することを示している。
【０１２９】
II．裸のRNAの流体力学輸送
A．緒言
特に明記していない限り、全ての実験において、RNAおよびDNAをRNasinの表記の量に加えて、PBSの最終容積を1.4〜1.8 mlとした。この溶液をマウスの尾静脈に4〜5秒間注射した。これらの実験において用いたRNAは全て、mMessage Machineキットを用いて合成して、RNeasyキット（いずれもキアゲン社（Qiagen Inc.）製）を用いて精製した。しかし、RNAを精製する必要はなく、同様に役立つはずである他の精製法が存在する。本明細書に一覧で示した全ての実験において用いたRNasinは、特に明記していなければヒト胎盤から精製した天然のRNasin（プロメガ社（Promega Inc.）から購入）であった。ルシフェラーゼ試料に関しては、表記の時間において、マウスにルシフェリン（1.5 μg/g体重）を腹腔内投与して、マウスから放出された光を測定した。バックグラウンドは〜2×102相対光単位である。ヒト第IX因子試料は酵素結合免疫アッセイ法を用いて分析した。
【０１３０】
B．裸のRNAの流体力学輸送
ルシフェラーゼタンパク質をコードするRNAを以下と共に、生きているマウスに注射した：
1）RNアーゼ阻害剤なし；または
2）RNアーゼ阻害剤（RNasinと呼ぶ）。
【０１３１】
全てのRNA試料はまた、RNアーゼ活性の競合的阻害剤として含まれる非キャップ化非ポリアデニル化RNA（競合RNA）を含んだ。それぞれの試料における総RNAを、競合RNAと共に全体で80 μgとなるように調節した。原核細胞プロモーターの制御下でルシフェラーゼタンパク質を発現する陰性対照（下記）DNAも同様に注射した。3時間および6時間で、マウスにルシフェリン（ルシフェラーゼ酵素の基質）の腹腔内注射を行い、マウスから放出された光を測定した。
【０１３２】
結果を表1に要約した。
【０１３３】
【表１】
0006055164.tif 000008
【０１３４】
上記の結果は以下であることを示す：
・注射したRNAは生きているマウスの肝臓にトランスフェクトされた。
・ポリA尾部（ポリA RNA）を有するキャップ化ポリアデニル化RNAは、キャップ化されたポリアデニル化RNAが強いルシフェラーゼシグナルを生じることから、マウス肝臓において翻訳されている。
・ポリAシグナルを有するキャップ化RNA（ポリAシグナルRNA）は、マウス肝臓において翻訳されるが、シグナルはポリA尾部を有するRNAについて認められたシグナルより約100倍低い。
本明細書において記述された全ての実験において用いたRNAは、DNAプラスミドの細菌プロモーターから転写された。このプロモーターは、哺乳類細胞において効率的に機能しないはずである。DNA鋳型はDNアーゼを用いて転写後に除去したが、認められたシグナルがDNAの混入の結果となりうる懸念が常にある。これを制御するために、転写において用いた物と同等の鋳型DNAの量を注射した。シグナルがDNAの混入によるものであれば、この試料はシグナルを生じるはずである。しかし、DNA対照からはシグナルが認められない。
【０１３５】
同様に、RNアーゼ阻害剤（RNasinと呼ぶ）を添加すると、用いた用量でシグナルが20倍増加したことから、RNasinの添加が血清ヌクレアーゼによる分解からRNAを保護し、したがって認められるシグナルを増加させることが判明した。
【０１３６】
上記から、以下の結論を得る。裸のRNAの流体力学輸送によって、生きているマウスの肝臓へのRNAの高レベルの移入が起こる。さらに、キャップ化してポリアデニル化したRNAは、ポリアデニル化シグナルを有するがポリA尾部を有しないRNAより良好に作用するが、双方のRNAがシグナルを生じた。RNアーゼ阻害剤を添加するとRNAを分解から保護し、それによってより高いルシフェラーゼシグナルが得られた。最後に、注射したRNAについて認められたシグナルはDNAの混入によるものではない。
【０１３７】
C．系の改良
ルシフェラーゼタンパク質をコードするRNAを、1）高用量もしくは低用量の天然もしくは組み換え型RNasinと共に、または2）RNAを破壊してシグナルを消失させるはずであるRNアーゼT1の処置（陰性対照）後に、生きているマウスに注射した。RNA試料は全て、注射されたRNAの全量が80 μgとなるように非キャップ化非ポリアデニル化競合RNAを含んだ。原核細胞プロモーターの制御下でルシフェラーゼタンパク質を発現する対照DNAも同様に、表記の対照反応において注射した。3時間および6時間目に、マウスにルシフェリンの腹腔内注射を行い、マウスから放出された光を測定した。この実験は主に、第一の実験の結果を確認するためであり、どのパラメータが重要であるかを試験するためのものである。6時間の時点で、RNAを注射したマウス1匹を屠殺して、臓器を摘出し、どの臓器がルシフェラーゼを発現するかを調べた。
【０１３８】
結果を表2に要約する。
【０１３９】
【表２】
0006055164.tif 000009
【０１４０】
上記の結果は以下を証明している：
・RNasinの用量を増加させるとルシフェラーゼ活性レベルが増加することから、RNasinの投与は認められる発現レベルを変化させる。
・天然および組み換え型RNasinはいずれもRNAを保護する。
・RNAがRNアーゼによって破壊されるとシグナルは消失し、RNAがシグナルに関与していることを示す（陰性対照）。
・転写に用いたものと同等の鋳型DNAの量をDNアーゼ処置を行わずに注射すると、シグナルを認めず、シグナルはDNA混入によるものではないことを証明する。
・肝臓が唯一のルシフェラーゼ発現部位である。
【０１４１】
上記から、以下の結論を得る。RNasinの投与は発現レベルに影響を及ぼす。組み換え型および天然のRNasinはいずれも注射したRNAを保護した。鋳型DNAを注射した場合、またはRNAをRNアーゼによって破壊した場合にはシグナルを認めず、シグナルがDNAの混入の結果ではないことを示している。最後に、肝臓が唯一のルシフェラーゼ発現部位である。
【０１４２】
D．競合RNAは活性を増強する。
キャップ化されかつポリアデニル化されたルシフェラーゼRNA 20 μgのルシフェラーゼ活性を測定した。四つの条件を実験1および2に記載の条件と類似の実験において調べた。
1）RNasin 400単位＋競合RNA；
2）競合RNAを含まないRNasin 40単位；
3）競合RNAを含まないRNasin 800単位；
4）競合RNAを含まないRNasin 1200単位。
3時間、6時間および9時間に、マウスにルシフェリンの腹腔内注射を行い、マウスから放出された光を測定した。
【０１４３】
結果を表3に要約する。
【０１４４】
【表３】
0006055164.tif 000010
【０１４５】
上記の結果は以下を証明する：
・RNasinの用量を増加するとルシフェラーゼ活性が増加したことから、RNasinはルシフェラーゼ活性を変化させる。最高用量（RNasin 1200単位）は調べた全ての時間において最高の活性を示した。
・競合RNAの存在によってルシフェラーゼ活性が増強されたことから、競合RNAを添加すると測定されたルシフェラーゼ活性が増強した。この作用は、RNasinの保護作用と相乗的であった。
【０１４６】
上記の結果から、以下の結論を得る。競合RNAの添加によってルシフェラーゼシグナルは増加する。さらに、RNasinの用量を増加すると、ルシフェラーゼ活性レベルが増加する。
【０１４７】
E．内部リボソーム進入部位を用いるルシフェラーゼのキャップ非依存的翻訳
真核細胞において、RNAのタンパク質への翻訳は、キャップ依存的およびキャップ非依存的翻訳と呼ばれる二つの異なる機構によって起こる。キャップ非依存的翻訳は、内部リボソーム進入部位（IRES）と呼ばれる5'非翻訳領域を必要とする。C型肝炎ウイルス（HCV）、ポリオウイルスおよびA型肝炎ウイルスのようないくつかのRNAウイルスは、キャップ非依存的翻訳を行うためにIRES配列を利用する。本発明者らは当初、抗HCV治療を研究するための小動物モデル系を作製するために用いることができるであろうと考えて、本明細書に記述したRNAトランスフェクション法を開発した。IRES RNAのトランスフェクションも同様に、効率的なIRES機能にとって必要な配列要素を調べるために設計された変異誘発試験のために用いることができるであろう。
【０１４８】
1．実験および結果の説明
RNA HCVlucは、5'末端にHCV IRES、およびルシフェラーゼ遺伝子の後にポリA尾部を有する。HCVluc 40 μg＋競合RNA 40 μg＋RNasin 20 μlをマウスの尾静脈に注射した。3時間および6時間後、マウスにルシフェリンを腹腔内注射して、マウスから放出される光を測定した。結果：HCV IRESは、注射したHCVルシフェラーゼRNA融合体の翻訳を促進することができた。結果の定量を表4に要約する。
【０１４９】
【表４】
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【０１５０】
F．hFIX RNAを注射に応じて、測定可能な血清中濃度のヒト第IX因子（hFIX）タンパク質が産生され、分泌されうる。
ヒト第IXタンパク質は、血友病の患者では産生されない血液凝固タンパク質である。血清中のこのタンパク質レベルは、酵素結合イムノアッセイ（ELISA）によって容易に測定することができる。本発明者らは、二つの理由からこのタンパク質を発現させることを選択した：
1）hFIXは治療関連タンパク質である。hFIXの一過性の発現は臨床的に重要ではないが、慢性的な発現を必要としない他のいくつかのタイプの治療タンパク質を一過性に発現させることが望ましいであろう。
2）hFIXはヒトタンパク質であり、したがってマウスにおいて免疫応答を誘発することができる。
【０１５１】
RNA注射の一つの応用は、ワクチンの開発および試験である。hFIXの注射によるhFIXに対する免疫応答は、RNAをワクチンとして用いる原理の証明を示すであろう。
【０１５２】
1．実験および結果の概要：
キャップ化され、かつポリアデニル化されたhFIX RNA 40 μg＋競合RNA 40 μg＋RNasin 800単位をマウス1匹の尾静脈に注射した。結果：40 ng/ml血清がELISAによって6時間目に検出された。この量のhFIXは、ELISAアッセイ法の有意な範囲内である。
【０１５３】
G．HCVマウスモデルを作製するためのHCVゲノムRNAの流体力学的輸送
1群6匹のマウス2群に以下を注射した：
1）90 FL HCVと呼ばれる（何らかの非キャップ化RNAを同様に含む）キャップ化HCVの完全長ゲノムRNA 50 μg＋キャップ化されかつポリアデニル化されたhFIX RNA 40 μg＋RNasin 400単位；または
2）触媒的に不活性にするレプリカーゼ遺伝子に変異を有する完全長の非感染性HCVゲノムRNA（101 FL HCVと呼ばれる）＋キャップ化およびポリアデニル化hFIX RNA 40 μg＋RNasin 400単位。
【０１５４】
HCV RNAを作製するための転写鋳型は、Charles Riceおよびワシントン大学から得た。注射の6時間後、マウスから採血してhFIXレベルを測定して注射効率を標準化する。注射したHCV RNAは急速に分解すると予想される。数日後に検出された如何なるRNAもウイルス複製の際に新たに合成されたRNAである可能性がある。これらのマウスの肝臓におけるHCV RNAレベルを測定するために、定量的リアルタイムPCR法が開発されている。ウイルスの複製が起こると、注射の数週間後に測定した場合、90 FL HCVを注射したマウスにおけるHCV RNAレベルは、101 FL HCVを注射したマウスのレベルより高いであろう。組織学的アッセイ法も同様にHCVタンパク質の合成に関してアッセイするために開発されている。異なる三つの陽性転帰が起こる可能性がある：1）RNAは肝臓に入るが翻訳されず複製されない、2）RNAは肝臓に入り翻訳されるが複製されない、3）RNAは肝臓に入り、翻訳されて複製される。三つの転帰は全て有用なモデル系である。1、2または3が起こる場合、この系を用いて、HCV RNAに対して向けられるリボザイムを試験することができるであろう（下記の実験9を参照されたい）。2または3が起これば、この系は、HCV翻訳、複製および感染の阻害剤を試験するために用いることができるであろう。
【０１５５】
このRNAの注射によって、HCVに関するウイルス複製サイクルは起こらなかった。しかし、別の研究グループはデルタ型肝炎複製サイクルを開始するために類似の方法を用いた。Chang J.、Sigal L.J.、Lerro A.、Taylor J.、J. Virol. 75(7)：3469〜73（2001）。
【０１５６】
H．リボザイムによるHCV RNAのインビボ切断
HCVのIRESを標的とするDNAザイムは化学合成されている。本発明者らはこれらのリボザイムを流体力学的にマウスに注射して、それらが肝臓において注射したHCV RNAレベルを減少させることができるか否かを評価した。IRESを標的とするDNAザイム5 nmolを、HCV IRESの後にホタルのルシフェラーゼコード配列、その後にアデノシン30個が続く配列からなるRNA 20 μgと同時注射した。DNAザイムの配列は、
0006055164.tif 000012
であった。標的RNAと共にDNAザイムを投与したマウスは、6時間で標的RNAのみを投与したマウスより95％少ない光を放出した。結論：本発明者らは、このDNAザイムがHCV IRESからの翻訳を、おそらくIRES RNA配列を切断することによって、阻害しうることを証明した。合成リボザイムを同様に類似の方法論を用いて試験したところ、無効であることが判明した。
【０１５７】
I．本実験は、キャップ化およびポリアデニル化RNAを1回注射した後のルシフェラーゼ発現の経時的変化を調べることである。以下の条件を満たせば、本発明者らは、発現されたタンパク質の分解速度を計算するためにデータの一次指数関数的減衰適合（等式1に記述）を用いることができる。このデータを単純な一次指数関数的減衰に適合させるためには、mRNAの半減期はタンパク質の半減期より有意に短くなければならない（少なくとも5〜10倍少ない）。この条件を満たさない場合、mRNAの半減期を考慮に入れたより複雑な数学的関係を用いることができる。この問題に対するもう一つの解決策は、mRNAを非キャップ化にする、または競合RNAを省略することによって、mRNAの半減期を減少させることである。
【０１５８】
所定の時間でのタンパク質の量（またはタンパク質からのシグナル）をA、第一の時点でのタンパク質（またはシグナル）の量をA0、減衰速度定数をk、および最初の測定後の時間をtと定義すると、等式は以下の形となるであろう：
A＝A0 exp(-kt)    （等式1）
【０１５９】
1．実験の説明：
1群6匹のマウス4群に、キャップ化したポリアデニル化ルシフェラーゼRNA 20 μg＋非キャップ化競合RNA 60 μg＋RNasin 800単位を注射した。3時間、6時間、9時間または24時間で、マウスにルシフェリンを腹腔内投与（1.5μg/g体重）してマウスから放出された光を測定した。
【０１６０】
結果を下記の表に提供する：
0006055164.tif 000013
相対光単位を時間に対してプロットして、得られた曲線を等式1に適合させる。この分析により、見かけの分解速度定数は0.297 時間-1である。
【０１６１】
タンパク質の半減期を測定する最も一般的な方法は以下の通りである。一つのアプローチにおいては、タンパク質を精製し、時に標識する（例えば、放射活性ヨウ素によって）。精製タンパク質を注射して、異なる時間に動物から試料を採取し、所定の時間で残っているタンパク質の量を時間に対してプロットすると、曲線は等式1のような等式に適合する。本発明者らの方法の長所は、タンパク質のインビトロ合成または精製を必要としない点である。
【０１６２】
J．本発明者らは、ルシフェラーゼと呼ばれるタンパク質の翻訳を制御するHCV RNAの調節領域を含むRNA（本明細書においてHCV luc RNAと呼ぶ）を構築した。本発明者らはまた、それらが細胞に入ると類似のRNAを発現するDNA発現プラスミド（本明細書においてHCV luc DNAと呼ばれる）も構築した。これらの構築物の図に関しては図3を参照されたい。
【０１６３】
HCV luc RNAまたはHCV luc DNAのいずれかがマウスにトランスフェクトされると、それらは肝臓に入り、HCV luc RNAまたはHCV luc DNAから転写されたRNAがルシフェラーゼタンパク質に翻訳される。様々な時間において、ルシフェラーゼタンパク質の基質、ルシフェリンをマウスに注射する。酵素ルシフェラーゼはルシフェリンを消費して、そのプロセスにおいて光を生成する。マウスから放出された光の量は、試料採取時に存在するルシフェラーゼタンパク質の量と比例する。
【０１６４】
本発明者らは、モルフォリノオリゴとして知られるタイプの短い合成オリゴヌクレオチドを合成した。本発明者らは、モルフォリノオリゴ1 nmolをHCV luc RNA 10 μgまたはHCV luc DNA 1 μgと混合した。モルフォリノオリゴは、ジーンツールズ（Gene Tools、LLCコーバリス、オレゴン州）が製造し、配列
0006055164.tif 000014
を有する。次に混合物に緩衝液1.8 mlを加えて、本発明者らのこれまでの出願に記述されるようにマウスの尾静脈に高圧下で注射する。対照として、阻害剤を含まない混合物を他のマウスに注射する。阻害剤の存在下では、放出光は90％以上減少する。本発明者らは、この知見から、注射したRNAの翻訳または注射したDNAから産生されたRNAの翻訳が、アンチセンス機構によって阻害剤によって阻害されると結論する。RNAを注射した場合、細胞におけるRNAの安定性が限られているために、本発明者らはこの阻害を約24時間追跡できたに過ぎなかった。DNAを注射した場合、本発明者らは、翻訳を約8日間モニターすることができる。翻訳の阻害は、本発明者らがこの系において翻訳を測定することができる全ての期間持続した。
【０１６５】
K．
実験A
対照群：HCV IRESおよびルシフェラーゼレポーター配列を含むRNAをマウスに注射し、それらは、このRNAがルシフェラーゼタンパク質に翻訳されると発光する。
【０１６６】
試験群：阻害剤をRNAと共に同時注射する。いずれも同じ細胞に移動する。阻害は、対照群と比較した活性（発光）として表記する。
【０１６７】
実験B
標的RNAをコードするDNAを阻害剤と共に注射したことを除いては実験Aと同じ。DNAはマウス肝細胞の核に移動して、転写されて標的RNAを生じる。このRNAは細胞の細胞質に移動してそこで阻害剤と相互作用する。
【０１６８】
これらの実験において用いた構築物を図4に提供する。アンチセンスおよびDNAザイム阻害剤によるこれらの実験の結果を図5A〜5Fに提供する。
【０１６９】
阻害剤およびRNA/DNAを同時投与する上記のスクリーニングプロトコールは、薬物輸送の問題を薬物有効性の問題と区別できることから、重要な長所を提供する。
【０１７０】
上記の結果および考察から、本発明の方法および組成物が、多様な異なる学術的および治療応用のために用いることができる、胚以外の哺乳類生物においてRNAi物質を用いる実現可能な方法を、本発明が提供することは明らかである。さらに、本発明の方法は、標的細胞に核酸を移入する改善された方法を提供する。特に、本発明は、ウイルスベクターを用いない裸の核酸移入に関する非常に効率的なインビボ法を提供し、したがって、核酸移入に関する先行技術の方法に対して多くの長所を提供する。そのため本発明は、当技術分野に有意な貢献をする。
【０１７１】
本明細書において引用した全ての刊行物および特許出願は、それぞれの個々の刊行物または特許出願が特にかつ個々に参照として本明細書に組み入れられることが示されているかのように、参照として本明細書に組み入れられる。如何なる刊行物の引用も、提出日以前にその開示がなされたためであり、先行発明に基づきそのような刊行物に先立つ権利が本発明には与えられないことを自認したと解釈すべきではない。
【０１７２】
前述の本発明は、理解を明快にする目的で説明および実施例によって幾分詳細に記述してきたが、添付の特許請求の範囲の趣旨および範囲から逸脱することなく特定の変更および改変を本発明に行ってもよいことは、本発明の教示に照らして当業者に容易に明らかであると考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
0006055164.tif 000021
【図５Ｄ】
0006055164.tif 000022
【図５Ｅ】
0006055164.tif 000023
【図５Ｆ】
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【配列表】
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