(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液又は組織における１−メチルアデノシンが、増加又は局在変化するかどうかを検出することを特徴とする虚血によるストレス状態を判定するための方法。
【請求項２】
血液における１−メチルアデノシンが、増加するかどうかを検出することを特徴とする放射線によるストレス状態を判定するための方法。
【請求項３】
細胞培養上清における１−メチルアデノシンが、増加するかどうかを検出することを特徴とする低酸素によるストレス状態を判定するための方法。
【請求項４】
検出が免疫学的測定法であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
免疫学的測定法がＥＬＩＳＡ法又は免疫染色法であることを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項６】
免疫学的測定法が受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２２１２０のハイブリドーマが産生する抗１−メチルアデノシンモノクローナル抗体を用いることを特徴とする請求項４又は５記載の方法。
【請求項７】
抗１−メチルアデノシンモノクローナル抗体を含むことを特徴とする虚血、低酸素、又は放射線によるストレス状態の検出キットであって、
血液又は組織における１−メチルアデノシンの増加を指標として、虚血によるストレス状態を判定するための、
細胞培養上清における１−メチルアデノシンの増加を指標として、低酸素によるストレス状態を判定するための、或いは
血液における１−メチルアデノシンの増加を指標として放射線によるストレス状態を判定するための
前記検出キット。
【請求項８】
受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２２１２０のハイブリドーマが産生する抗１−メチルアデノシンモノクローナル抗体を含むことを特徴とする請求項７記載のストレス状態の検出キット。
【請求項９】
以下の工程（Ａ）〜（Ｃ）を備えたことを特徴とする虚血によるストレスに起因する疾病の予防又は治療剤のスクリーニング方法。
（Ａ）虚血によるストレスを負荷する前後、若しくは虚血によるストレスを負荷している間の非ヒト動物に被検物質を投与する工程；
（Ｂ）工程（Ａ）の非ヒト動物から血液又は組織を採取し、血液又は組織中の１−メチルアデノシンを検出する工程；
（Ｃ）工程（Ｂ）で１−メチルアデノシンが増加しない、又は１−メチルアデノシンが細胞内局在変化しない場合、被検物質を虚血によるストレスに起因する疾病の予防又は治療の候補薬剤と評価する工程；
【請求項１０】
以下の工程（Ａ’）〜（Ｃ’）を備えたことを特徴とする放射線によるストレスに起因する疾病の予防又は治療剤のスクリーニング方法。
（Ａ’）放射線によるストレスを負荷する前後、若しくは放射線によるストレスを負荷している間の非ヒト動物に被検物質を投与する工程；
（Ｂ’）工程（Ａ’）の非ヒト動物から血液を採取し、血液中の１−メチルアデノシンを検出する工程；
（Ｃ’）工程（Ｂ’）で１−メチルアデノシンが増加しない場合、被検物質を放射線によるストレスに起因する疾病の予防又は治療の候補薬剤と評価する工程；
【請求項１１】
以下の工程（Ａ’’）〜（Ｃ’’）を備えたことを特徴とする低酸素によるストレスに起因する疾病の予防又は治療剤のスクリーニング方法。
（Ａ’’）低酸素によるストレスを負荷する前後、若しくは低酸素によるストレスを負荷している間の培養細胞に被検物質を投与する工程；
（Ｂ’’）工程（Ａ’’）の培養細胞から細胞培養上清を採取し、細胞培養上清中の１−メチルアデノシンを検出する工程；
（Ｃ’’）工程（Ｂ’’）で１−メチルアデノシンが増加しない場合、被検物質を低酸素によるストレスに起因する疾病の予防又は治療の候補薬剤と評価する工程；
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検体から１−メチルアデノシン、５−メチルシチジン及びシュードウリジンから選ばれる１又は２以上の修飾核酸を検出することによる細胞ストレス状態の判定方法や、抗１−メチルアデノシン抗体、抗５−メチルシチジン抗体又は抗シュードウリジン抗体を含むことを特徴とする細胞ストレス状態検出キットや、細胞ストレスに起因する疾病の予防又は治療剤のスクリーニング方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
虚血とは、組織や臓器への血液の流入が、減少あるいは途絶した状態をいい、脳梗塞、心筋梗塞、腎梗塞、腎血管性高血圧、炎症性大腸疾患、ミトコンドリア病、神経筋変性疾患、糖尿病などの様々な疾患で起こる。従来、この虚血の状態は、超音波や心電図、脳虚血シンチグラフィなどを用いて診断されてきたが、これらの方法には専用の高価で大掛かりな装置が必要であるという問題があった。また、部位及び疾患非特異的虚血マーカーとして、タンパク質、脂質、酵素、ホルモンなどの高分子物質を測定する方法が提案されているが、実用化に至っていない。そのため、組織の虚血を簡便に判定することができる方法が望まれていた。
【０００３】
小胞体（ＥＲ）ストレスとは、異常なタンパク質が、タンパク質合成の場である細胞内小器官（小胞体）の内部に蓄積する状態をいう。細胞が小胞体ストレスに応答できない場合にはアポトーシスが誘導されることが知られており、このアポトーシスが神経変性疾患や糖尿病などさまざまな疾患に関与することが明らかになりつつある（特許文献１）。また、虚血、小胞体ストレスのほか、ミトコンドリア障害、放射線障害、酸化ストレス、低酸素ストレスなどの細胞ストレスは、細胞機能の低下をもたらし、細胞の機能が回復しない場合はアポトーシスの誘導などにより細胞死を引き起こす。細胞ストレスによる影響を検知することができれば、いち早く体の不調を察知し自覚症状が現れる前に早期の治療を開始することができる。
【０００４】
アデノシンはプリンヌクレオシドの１つであるアデニンとリボースからなるヌクレオチドであり、１−メチルアデノシンは、アデノシンの１位がメチル化された化合物である。ヒトｔＲＮＡにおいて、５８番目のアデノシンは、４番目のループ（Ｔループ、ＴΨＣループともいう）のＬ字型の関節部（エルボーともいう）に存在し、メチル化された１−メチルアデノシンであることにより陽性の電荷をもちリボソームとの結合に関与すると考えられている（図１）。また、１−メチルアデノシンは、アポトーシスやオートファジーによっても、血液や尿中に排出されることが知られている。アポトーシスは、ミトコンドリア病、アルツハイマー病、その他組織の脱落や壊死を伴う疾患で認められ、オートファジーは、感染症、異常タンパク質蓄積を伴う神経変性疾患（アルツハイマー病、パーキンソン病、バッテン病など）、空胞化を伴う筋疾患（ダノン病など）、クローン病その他の自食作用を伴う疾患で認められる。さらに、血中１−メチルアデノシン濃度は、腎機能（ＧＦＲ；糸球体ろ過量）との相関性が高い傾向があり、腎不全の早期診断マーカーの一つとして開示されているが（特許文献２）、虚血との関係は全く不明である。
【０００５】
ウリジンはピリミジンヌクレオシドの１つであるウラシルとリボースからなるヌクレオシドであり、シュードウリジンはウリジンのＮ−グリコシド結合を解裂、ウラシル環を１８０度回転、そして新たなＣ１’−Ｃ５のＣ−Ｃ結合を形成する異性化反応によりシュードウリジン化される。シュードウリジンはＲＮＡ分子の高次構造安定化や分子認識機能を担っており、シュードウリジン合成酵素はＲＮＡ中の特定の位置にあるウリジンをシュードウリジン化することで、ＲＮＡの成熟化に寄与していると考えられている。シチジンはピリミジンヌクレオシドの１つであるシトシンとリボースからなるヌクレオチドであり、５−メチルシチジンは、シチジンの５位がメチル化された化合物である。
【０００６】
これまでに特許文献３、特許文献４、及び非特許文献１には抗１−メチルアデノシン抗体が、特許文献５には抗シュードウリジンモノクローナル抗体が、そして特許文献６には抗５−メチルシチジンモノクローナル抗体が開示されているが、これまで１−メチルアデノシン、シュードウリジン、５−メチルシチジンが細胞ストレス状態の早期マーカーとなることは全く明らかではなかった。また、特許文献７には小胞体ストレス誘導物質の濃度を段階的に変えて細胞の培養を行い、被検物質の有無によるＢｉＰ検出開始濃度の相違に基づいて当該被検物質の小胞体ストレスへの影響を評価する方法が開示されているが、細胞抽出液の試料を複数準備し、煩雑で技術的熟練を要する操作が必要であるなどの問題があった。また特許文献８にはヒトヘムオキシゲナーゼ−１と反応するモノクローナル抗体又はその可変領域からなる抗体結合部位を含む抗体フラグメントを用いて細胞又は組織におけるヒトヘムオキシゲナーゼ−１を検出することによる細胞又は組織におけるストレスの検出方法が開示されているが、タンパク質を検出対象とした場合は、検体中のタンパク質を安定に保つために検体に特別の処理を施す手間や、品質管理などに細心の注意を払う必要があるなどの問題があった。そこで、尿や血液を検体として検体中の安定な物質を容易に測定することによる、簡便で容易な細胞ストレス状態の検出方法が望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１１−０３７７２２号公報
【特許文献２】ＷＯ／２０１１／０２７５７３公開パンフレット
【特許文献３】特開昭６２−２９９７６６号公報
【特許文献４】特開平３−１５４８６７号公報
【特許文献５】特公平４−２１４７９号公報
【特許文献６】特表２００８−５０２３３２号公報
【特許文献７】特開２００８−１３１８９９号公報
【特許文献８】特開２００２−１１２７９１号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Masuda M., et al., Cancer, 72, 3571-3578 (1993)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明者らは、簡便に細胞ストレス状態を判定する方法や、細胞ストレス状態検出キットや、細胞ストレス状態の予防又は治療剤のスクリーニング方法を提供することを課題とした。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、抗１−メチルアデノシンモノクローナル抗体、抗シュードウリジンモノクローナル抗体、又は抗５−メチルシチジンモノクローナル抗体を用いて、組織切片の１−メチルアデノシン、５−メチルシチジン及びシュードウリジンから選ばれる１又は２以上の修飾核酸を検出することにより細胞ストレス状態を検出できることから、１−メチルアデノシン、５−メチルシチジン及びシュードウリジンを細胞ストレス状態の早期マーカーとして利用できることを見いだし、本研究を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は［１］（ａ）検体における１−メチルアデノシン、５−メチルシチジン及びシュードウリジンから選ばれる１又は２以上の修飾核酸を検出する工程；（ｂ）工程（ａ）で修飾核酸の増加又は局在変化があった場合、細胞ストレス状態と判定する工程；の工程（ａ）及び（ｂ）を備えたことを特徴とする細胞ストレス状態の判定方法や、［２］細胞ストレスが、虚血、低酸素、又は放射線によるストレスであることを特徴とする前記［１］記載の細胞ストレス状態の判定方法や、［３］検体が血液、尿、組織、培養細胞、又は細胞培養上清であることを特徴とする前記［１］又は［２］記載の細胞ストレス状態の判定方法や、［４］検出が免疫学的測定法であることを特徴とする前記［１］〜［３］のいずれかに記載の細胞ストレス状態の判定方法や、［５］免疫学的測定法がＥＬＩＳＡ法又は免疫染色法であることを特徴とする前記［４］記載の細胞ストレス状態の判定方法や、［６］免疫学的測定法が受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２２１２０のハイブリドーマが産生する抗１−メチルアデノシンモノクローナル抗体、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２２１２２のハイブリドーマが産生する抗５−メチルシチジンモノクローナル抗体、又は受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２２１２１のハイブリドーマが産生する抗シュードウリジンモノクローナル抗体を用いることを特徴とする前記［４］又は［５］記載の細胞ストレス状態の判定方法からなる。
【００１２】
また、本発明は［７］抗１−メチルアデノシンモノクローナル抗体、抗５−メチルシチジンモノクローナル抗体又は抗シュードウリジンモノクローナル抗体を含むことを特徴とする細胞ストレス状態の検出キットや、［８］受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２２１２０のハイブリドーマが産生する抗１−メチルアデノシンモノクローナル抗体、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２２１２２のハイブリドーマが産生する抗５−メチルシチジンモノクローナル抗体、又は受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２２１２１のハイブリドーマが産生する抗シュードウリジンモノクローナル抗体を含むことを特徴とする前記［７］記載の細胞トレス状態の検出キットや、［９］細胞ストレスが、虚血、低酸素、又は放射線によるストレスであることを特徴とする前記［８］記載の細胞ストレス状態の検出キットや、［１０］（Ａ）細胞ストレスを負荷する前後、若しくは細胞ストレスを負荷している間の非ヒト動物又は培養細胞に被検物質を投与する工程；（Ｂ）工程（Ａ）の非ヒト動物又は培養細胞から検体を採取し、検体中の１−メチルアデノシン、５−メチルシチジン及びシュードウリジンから選ばれる１又は２以上の修飾核酸を検出する工程；（Ｃ）工程（Ｂ）で修飾核酸が増加しない、又は修飾核酸が細胞内局在変化しない場合、被検物質を細胞ストレスに起因する疾病の予防又は治療の候補薬剤と評価する工程；の工程（Ａ）〜（Ｃ）を備えたことを特徴とする細胞ストレスに起因する疾病の予防又は治療剤のスクリーニング方法からなる。
【００１３】
さらに、本発明は［１１］抗１−メチルアデノシンモノクローナル抗体を産生する受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２２１２０のハイブリドーマや、［１２］抗５−メチルシチジンモノクローナル抗体を産生する受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２２１２２のハイブリドーマや、［１３］抗シュードウリジンモノクローナル抗体を産生する受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２２１２１のハイブリドーマからなる。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、検体における１−メチルアデノシン、５−メチルシチジン及びシュードウリジンから選ばれる１又は２以上の修飾核酸を検出することにより、細胞ストレス状態を判定することや、細胞ストレスに起因する疾病の予防又は治療剤のスクリーニングを行うことができる。また、抗１−メチルアデノシンモノクローナル抗体、抗５−メチルシチジンモノクローナル抗体又は抗シュードウリジンモノクローナル抗体を含む細胞ストレス状態の検出キットや、抗１−メチルアデノシンモノクローナル抗体を産生する受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２２１２０のハイブリドーマや、抗５−メチルシチジンモノクローナル抗体を産生する受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２２１２２のハイブリドーマや、抗シュードウリジンモノクローナル抗体を産生する受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２２１２１のハイブリドーマを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ｔＲＮＡと１−メチルアデノシンについて示す図である。
【図２】１−メチルアデノシン及びシュードウリジンの構造及び抗原提示部位、ならびに５−メチルシチジンの構造を示す図である。
【図３】抗１−メチルアデノシン抗体を用いて、虚血前（上段）、虚血解除直後（中央段）、再灌流１時間後（下段）の腎臓組織切片を染色した。皮質（左側）及び髄質外層（右側）を示す。矢印はｃＴＡＬ（cortical Thick Ascending Limb of Henle's Loop；皮質ヘンレループ上行脚肉厚部）を、白抜き矢印は糸球体を示す。
【図４】虚血処理をしていないラットの腎臓組織切片を、抗１−メチルアデノシン抗体（上から１及び２段目）、抗５−メチルシチジン抗体（上から３段目）、又は抗シュードウリジン抗体（上から４段目）を用いて染色した。髄質内層（左側）、髄質外層（中央）、及び皮質（右側）を示す。
【図５】虚血再灌流後１時間のラットの腎臓組織切片を、抗１−メチルアデノシン抗体（上から１及び２段目）、抗５−メチルシチジン抗体（上から３段目）、又は抗シュードウリジン抗体（上から４段目）を用いて染色した。髄質内層（左側）、髄質外層（中央）、及び皮質（右側）を示す。矢印は染色部位を示す。
【図６】虚血再灌流後８時間のラットの腎臓組織切片を、抗１−メチルアデノシン抗体（上から１段目）、抗５−メチルシチジン抗体（上から２段目）、又は抗シュードウリジン抗体（上から３段目）を用いて染色した。髄質内層（左側）、髄質外層（中央）、及び皮質（右側）を示す。矢印は染色部位を示す。
【図７】抗１−メチルアデノシン抗体を用いた虚血ラット腎臓ＴＡＬの免疫電子顕微鏡観察結果を示す。
【図８】ラット脳梗塞モデルの脳組織切片をＨＥ（ヘマトキシンエオシン）（上段）、抗１−メチルアデノシン抗体（中段）、又は抗５−メチルシチジン抗体（下段）を用いて染色した結果を示す。右上にラット脳における脳梗塞領域を模式図にて表し、虚血領域及び正常領域の境界部分（左から１及び２番目）、虚血領域（左から３番目）、正常領域（左から４番目）を示す。
【図９】腎臓虚血モデルブタの腎静脈血及び動脈血中の１−メチルアデノシン濃度を測定した結果を示す。グラフの縦軸は１−メチルアデノシン濃度（ｎｇ／ｍｌ）を表し、横軸は時間軸である。
【図１０】ヒト近位尿細管上皮細胞ＲＰＴＥＣ細胞の１−メチルアデノシン、ミトコンドリア、核の三重染色結果を示す。
【図１１】弓部置換術中の患者の腎静脈付近で採血した血液中の１−メチルアデノシン濃度を測定した結果を示す。グラフの縦軸は１−メチルアデノシン濃度（ｎｇ／ｍｌ）を表し、横軸は時間軸である。
【図１２】腎動脈拡張術後の患者の末梢血液中の１−メチルアデノシン濃度及びクレアチン値を測定した結果を示す。グラフの縦軸は１−メチルアデノシン濃度（ｎｇ／ｍｌ）を表し、横軸は時間軸である。
【図１３】弓部置換術中の患者から採取した血清サンプルを分子量（５０Ｋ、３０Ｋ及び１０Ｋ）で限外ろ過により分画し、ろ液中の１−メチルアデノシン濃度値を測定した結果を示す。「末梢」は末梢部から採取した血清サンプルを、「１」は腎静脈付近から採取した血清サンプルを表す。
【図１４】２０％酸素（Ｏ２）の通常培養（コントロール）又は１％酸素の低酸素負荷培養２４時間後の、細胞lysate又は培地中の１−メチルアデノシン濃度値を測定した結果を示す。
【図１５】Ｘ線照射（radiation）前後の末梢血リンパ球における１−メチルアデノシンの細胞内局在を、免疫蛍光染色法により観察した結果を示す。
【図１６】１−メチルアデノシンを検出することにより、生体における放射線障害の有無を検知することができることを示す図である。rad12hrはＸ線を照射したマウス、controlはＸ線を照射していないマウスを表す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明において「細胞ストレス」とは、細胞が環境から与えられる有害刺激（ストレッサー）をいい、かかる環境はインビトロでもインビボでもよく、「細胞ストレス状態」とは、細胞が細胞ストレスの負荷により悪影響を受けた状態をいう。例えば、遺伝子変異、ウイルス感染、炎症、有害化学物質などの細胞ストレスを受けると、細胞内に変性タンパク質が生成され、この変性タンパク質が小胞体に蓄積することで細胞に対して悪影響が及ぼされ、その結果として、小胞体ストレスと呼ばれる細胞ストレス状態に陥ることが知られている。また細胞が熱等の細胞ストレスにさらされた際には、分子シャペロンとして機能する熱ショックタンパク質の発現が上昇して、細胞を保護する機構が引き起こされることが知られている。以上のように、細胞が細胞ストレスを受けて細胞ストレス状態に陥ると、様々な細胞のストレス応答機構が引き起こされて細胞ストレスへの適応や細胞の機能回復がはかられるが、うまく対処しきれない場合には最終的にアポトーシスが誘導される。本発明における細胞ストレスとしては特に制限されず、インビトロでは細胞の置かれた培養条件等により細胞に与えられる有害刺激、インビボでは生体の変調などにより細胞に与えられる有害刺激を挙げることができ、物理的（圧力、温度、低酸素、放射線等）、化学的（薬物、酸化等）、生物的（細菌やウイルスの感染、小胞体ストレス等）な刺激を細胞ストレスに挙げることができる。これらの細胞ストレスは、１種類でも、２種類以上が組み合わされたものでもよく、具体的に細胞ストレスが全て特定され明らかになっていなくてもよい。また、生体内の組織や細胞がさらされる細胞ストレスには生体の疾患も挙げることができ、疾患に罹患した生体内の細胞は、疾患に起因する細胞ストレス状態にあることがある。本発明における細胞ストレスの起因となる疾患は特に制限されず、内因性疾患でも外因性疾患でもよく、梗塞など虚血が関与する疾患、ミトコンドリア病、アルツハイマー病、その他組織の脱落や壊死を伴う疾患などのアポトーシスが認められる疾患や、異常タンパク質蓄積を伴う神経変性疾患、空胞化を伴う筋疾患、クローン病その他の自食作用を伴う疾患などのオートファジーが認められる疾患、貧血、栄養失調、アレルギー症状など自己免疫応答疾患、白血病、がん、腎臓病、高血圧や高コレステロールなどの生活習慣病、糖尿病、細菌やウイルスの感染症等の疾患のほか、外傷や外科的処置等に起因する症状、放射線曝露による放射線障害や、低酸素による低酸素症などを挙げることができる。中でも、虚血、低酸素症、及び／又は放射線障害を好適に例示することができる。
【００１７】
本発明における虚血としては、動脈血量の減少による局所の貧血であればよく、内因的な疾患に起因するものでも、外科的手術等の際に人工的に引き起こされるものでもよい。すなわち、細胞ストレス状態を検出することにより、細胞ストレスの原因となっている疾患、例えば虚血が引き起こされる疾患の有無を検知、あるいは外科的手術等で人工的に引き起こした虚血の状態をモニターすることができる。また、本発明における低酸素症としては、低酸素にさらされることに起因する症状であればよく、低酸素としては生体又は細胞等の通常の生育環境の酸素濃度の、好ましくは１／２以下、更に好ましくは１／５以下、最も好ましくは１／１０以下の酸素濃度を挙げることができる。具体的には、哺乳類や鳥類等の大気中で生活する生物や、それら由来の細胞にとって、低酸素とは一般的な大気中の酸素濃度である２０％より低い酸素濃度であり、好ましくは０〜１０％、更に好ましくは０〜４％、最も好ましくは０〜２％の酸素濃度を挙げることができる。さらに、本発明における放射線障害としては、放射線にさらされることに起因する症状であればよく、放射線の種類やエネルギー量は特に制限されず、線種としてはアルファ線（α線）、ベータ線（β線）、ガンマ線（γ線）、エックス線（Ｘ線）、紫外線（ＵＶ）などを挙げることができ、いずれか１種のみ単独でも、２種以上の混合でもよく、また内部被曝や外部被曝いずれでもよい。例えば虚血や低酸素症、放射線障害が起こる可能性が予想される場合に細胞ストレス状態と判定された場合には、早期に予防及び／又は治療や、環境調査や原因の予防及び／又は改善の措置を講じることができる。
【００１８】
本発明における検体としては特に制限されず、生体から採取された組織や体液などの試料、人工培養細胞あるいはその培養液などを挙げることができ、血液、尿、組織切片、培養細胞、及び／又は細胞培養液を好適に例示することができる。血液を検体とする場合は、適宜血液凝固剤や防腐剤、防かび剤などを添加することや、赤血球や白血球、血漿などの特定の成分を除去することや、血清を用いることも、リンパ球など特定の成分のみを抽出することもできる。また、限外ろ過などにより試料中の成分を分子量により分画して検体とすることもできる。尿を検体とする場合は、適宜防腐剤、防かび剤などを添加してもよい。また組織を検体とする場合は、適宜固定処理などを施された組織切片とすることもできる。培養細胞は、株化された細胞株でもよく、生体から採取された血液や組織から採取した細胞の初代培養細胞などでもよい。検体の由来も特に制限されず、ヒト、サル、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウス、ハムスター、トリ等を挙げることができ、ヒト、マウスを好適に例示することができる。本発明の細胞ストレス状態の判定方法は微量サンプルから細胞ストレス状態を判定することができることから、検体採取のための生体への負担が少ないという利点があり、また体の小さいマウスなどの実験動物を用いた場合にも経時的に微量血液を採取し、細胞ストレス状態をモニターするために有効に利用することもできる。
【００１９】
本発明において「修飾核酸を検出」とは、修飾核酸の有無を確認、修飾核酸を定量、又は修飾核酸を可視化することをいい、公知の方法を用いることができる。本発明における検出方法としては、検体における１−メチルアデノシン、５−メチルシチジン及びシュードウリジンから選ばれる１又は２以上の修飾核酸を検出することができる方法であれば特に制限されず、免疫学的測定法、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）法、ＣＥ（キャピラリー電気泳動）法、ＨＰＬＣ／ＭＳ（質量分析）法、ＣＥ／ＭＳ法、ＭＳ／ＭＳ法、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法などを挙げることができ、好ましくは免疫学的測定法を挙げることができる。また免疫学的測定法としては、これらの修飾核酸に特異的な抗体を用いて１−メチルアデノシン、５−メチルシチジン及びシュードウリジンから選ばれる１又は２以上の修飾核酸を検出することができる方法であればよく、ＥＬＩＳＡ法や免疫染色法、ウェスタンブロッティング法、フローサイトメトリー法、免疫沈降法、免疫電気泳動法などを挙げることができ、ＥＬＩＳＡ法や免疫染色法を好適に例示することができる。ＥＬＩＳＡ法としては直接吸着法、競合法、サンドイッチ法いずれを使用することもでき、中でも微量サンプルの検出に向いた競合法を好適に例示することができる。免疫染色法は、抗体を用いて目的分子を染色する方法であればよく、例えば、実体顕微鏡や位相差顕微鏡、共焦点蛍光顕微鏡、電子顕微鏡などを用いて観察し検出することができる。免疫組織染色においては組織切片の修飾核酸を、修飾核酸に対する標識された一次抗体を用いて、又は修飾核酸に対する一次抗体及び標識された二次抗体を用いて検出することもできる。一次抗体や二次抗体の標識としては、検出可能な標識物質であればよく、ＦＩＴＣやＣｙ３、Ｃｙ５、Rhodamine、Alexa fluor（登録商標、インビトロジェン社製）などの蛍光物質や、ペルオキシダーゼやアルカリホスファターゼなどの酵素、ビオチンなどのタンパク質、ＤＩＧ（ジゴキシゲニン）などのハプテン、金コロイド、放射性同位体元素などを挙げることができる。ペルオキシダーゼ標識は、ＤＡＢ（ジアミノベンジジ）法、ニッケルＤＡＢ法で検出することもでき、アルカリホスファターゼ標識はＮＢＴ／ＢＣＩＰ反応で検出することもできる。また、他にＴＳＡ法（tyramide signal amplification）やビオチン・アビジン反応を利用した増感法なども適宜組み合わせて使用することができる。
【００２０】
本発明における免疫学的測定法に用いられる抗体としては、修飾核酸である１−メチルアデノシン、５−メチルシチジン、又はシュードウリジンを特異的に認識できる抗体であればよく、例えばモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体等の抗体や、マウス、ラット、ブタ、ヤギ、ヒツジ等由来の抗体を挙げることができ、好ましくはマウスモノクローナル抗体である。中でも受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２２１２０のハイブリドーマ（ＡＭＡ−２）が産生する抗１−メチルアデノシンモノクローナル抗体、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２２１２２のハイブリドーマ（ＦＭＣ９）が産生する抗５−メチルシチジンモノクローナル抗体又は受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２２１２１のハイブリドーマ（ＡＰＵ−６）が産生する抗シュードウリジンモノクローナル抗体を好適に例示することができる。これらの抗体は、標識されていても、標識されていなくてもよく、標識物質としてはＦＩＴＣやＣｙ３、Ｃｙ５、Rhodamine、Alexa fluor（登録商標、インビトロジェン社製）などの蛍光物質や、ペルオキシダーゼやアルカリホスファターゼなどの酵素、ビオチンなどのタンパク質、ＤＩＧ（ジゴキシゲニン）などのハプテン、金コロイド、放射性同位体元素などを挙げることができる。
【００２１】
本発明の細胞ストレス状態の判定方法としては、
（ａ）検体における１−メチルアデノシン、５−メチルシチジン及びシュードウリジンから選ばれる１又は２以上の修飾核酸を検出する工程；
（ｂ）工程（ａ）で修飾核酸の増加又は局在変化があった場合、細胞ストレス状態と判定する工程；
の工程（ａ）及び（ｂ）を備えていれば特に制限されず、通常医師による診断行為は除かれる。また、実施の一形態として工程（ａ）及び（ｂ）を備えた細胞ストレス状態の診断のためのデータを収集する方法を例示することもできる。工程（ａ）において測定用検体及びコントロール検体における修飾核酸を検出して比較することもできるが、工程（ａ）において測定用検体の修飾核酸を検出し、別途標準的サンプル由来のコントロール検体の修飾核酸の検出結果から設定した、修飾核酸量の基準値又は修飾核酸の基準的な局在と比較してもよい。また、コントロール用サンプルや生体を別途用意してコントロール用検体を採取してもよいが、同一のサンプルや生体からコントロール検体及び測定用検体の２種以上の検体を採取することもでき、複数回にわけて生体の同じ部位から、あるいは、一度に又は複数回にわけて生体の異なる部位から、検体を採取する例を挙げることもできる。例えば、正常組織から採取された検体をコントロール検体とし、疾患組織から採取された検体を測定用検体として用いて、疾患組織の細胞ストレス状態を調べることもできる。ある臓器由来の検体と、別の臓器由来の検体を比較することで、特定の臓器の細胞ストレス状態を調べることもできる。また、治療前や治療開始時あるいはその直後に採取された検体をコントロール検体とし、治療の間、又はその後の１以上の時点において採取された検体を測定用検体として、治療効果の評価のためのデータを収集することができる。さらに手術前や検査前などに採取された検体をコントロール検体とし、手術や検査などの間、又は手術や検査後の１以上の時点において採取された検体を測定用検体として細胞ストレス状態を調べることにより、手術や検査が患者に与える影響をモニターする指標とすることもできる。細胞ストレス状態は疾患や障害の早期マーカーとして利用することができ、細胞ストレス状態を調べることにより症状が現れる前又は症状が重篤化する前に治療は予防を開始することも可能となる。
【００２２】
また、本発明の細胞ストレス状態の判定方法を用いて虚血を判定する方法としては、
（ａ１）検体における１−メチルアデノシン、５−メチルシチジン及びシュードウリジンから選ばれる１又は２以上の修飾核酸を検出する工程；
（ｂ１）工程（ａ１）で修飾核酸が増加した場合、虚血と判定する工程；
の工程（ａ１）及び（ｂ１）を備えていれば特に制限されず、通常医師による診断行為は除かれる。また、実施の一形態として工程（ａ１）及び（ｂ１）を備えた虚血の診断のためのデータを収集する方法を例示することもできる。検体としては、血液、尿、組織切片を用いる例を好適に例示することができ、中でも好ましくは組織切片の修飾核酸を染色する例、更に好ましくは血中の修飾核酸濃度を測定する例を挙げることができる。かかる虚血の診断のためのデータは、虚血を検出するためのデータや、虚血状態を評価するためのデータや、虚血を伴う外科的手術において生体の状態をモニターし評価するためのデータとして用いることができる他、例えばミトコンドリア病、アルツハイマー病、その他組織の脱落や壊死を伴う疾患などのアポトーシスが認められる疾患や、感染症、異常タンパク質蓄積を伴う神経変性疾患、空胞化を伴う筋疾患、クローン病その他の自食作用を伴う疾患などのオートファジーが認められる疾患の診断のためのデータとしても用いることができる。
【００２３】
さらに、本発明の細胞ストレス状態の判定方法を用いて低酸素症を判定する方法としては、
（ａ２）検体における１−メチルアデノシン、５−メチルシチジン及びシュードウリジンから選ばれる１又は２以上の修飾核酸を検出する工程；
（ｂ２）工程（ａ２）で修飾核酸が増加した場合、低酸素症と判定する工程；
の工程（ａ２）及び（ｂ２）を備えていれば特に制限されず、通常医師による診断行為は除かれる。また、実施の一形態として工程（ａ２）及び（ｂ２）を備えた低酸素症の診断のためのデータを収集する方法を例示することもできる。細胞外に放出された修飾核酸を検出する例を好適に例示することができ、検体としては細胞培養液や血液、尿を用いる例を挙げることができる。かかる低酸素症の診断のためのデータは、肺胞換気不全などによる呼吸の障害、一酸化炭素中毒などによる血液の酸素運搬量の減少、シアン化合物中毒低酸素脳症、呼吸中枢障害、神経筋障害、慢性閉塞性肺疾患などの低酸素症が関与する診断のためのデータとしても用いることができる。
【００２４】
本発明の細胞ストレス状態の判定方法を用いて放射線障害を判定する方法としては、
（ａ３）検体における１−メチルアデノシン、５−メチルシチジン及びシュードウリジンから選ばれる１又は２以上の修飾核酸を検出する工程；
（ｂ３）工程（ａ３）で修飾核酸が増加、又は修飾核酸の局在が変化した場合、放射線障害と判定する工程；
の工程（ａ３）及び（ｂ３）を備えていれば特に制限されず、通常医師による診断行為は除かれる。検体としては、血液や尿、血液や尿中に含まれる細胞、並びに組織切片を用いる例を好適に例示することができ、中でも末梢血より採取したリンパ球における修飾核酸の細胞内局在を免疫染色法により染色し、修飾核酸が凝集し、細胞膜へ移行することを観察する例、及び血中の修飾核酸濃度を測定する例を挙げることができる。また、実施の一形態として工程（ａ３）及び（ｂ３）を備えた放射線障害の診断のためのデータを収集する方法を例示することもできる。
【００２５】
本発明の細胞ストレス状態検出キットとしては、修飾核酸である１−メチルアデノシン、５−メチルシチジン、又はシュードウリジンを認識できる抗体、例えばモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体を備えたものであれば特に制限されず、モノクローナル抗体が好ましく、中でも受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２２１２０のハイブリドーマが産生する抗１−メチルアデノシンマウスモノクローナル抗体、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２２１２２のハイブリドーマが産生する抗５−メチルシチジンマウスモノクローナル抗体又は受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２２１２１のハイブリドーマが産生する抗シュードウリジンマウスモノクローナル抗体を好適に例示することができる。細胞ストレス状態の検出キットは、これら抗体の他に固定液や洗浄液、反応容器、検出試薬などを含んでもよい。また、本発明の細胞ストレス状態検出キットにおけるこれらの抗体は、標識されていても、標識されていなくてもよく、標識物質としてはＦＩＴＣやＣｙ３、Ｃｙ５、Rhodamine、Alexa fluor（登録商標、インビトロジェン社製）などの蛍光物質や、ペルオキシダーゼやアルカリホスファターゼなどの酵素、ビオチンなどのタンパク質、ＤＩＧ（ジゴキシゲニン）などのハプテン、金コロイド、放射性同位体元素などを挙げることができる。１−メチルアデノシンは、アポトーシスやオートファジーによっても血液や尿中に排出されることから、本発明の細胞ストレス状態検出キットや受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２２１２０のハイブリドーマが産生する抗１−メチルアデノシンモノクローナル抗体を用いて、虚血や放射線障害、低酸素症のほか、アポトーシスが認められるミトコンドリア病、アルツハイマー病、その他組織の脱落や壊死を伴う疾患や、オートファジーが認められる感染症、異常タンパク質蓄積を伴う神経変性疾患（アルツハイマー病、パーキンソン病、バッテン病など）、空胞化を伴う筋疾患（ダノン病など）、クローン病などの疾患を含む細胞ストレスの有無を検出することができる。
【００２６】
本発明の細胞ストレスに起因する疾病の予防又は治療剤のスクリーニング方法としては、
（Ａ）細胞ストレスを負荷する前後、若しくは細胞ストレスを負荷している間の非ヒト動物又は培養細胞に被検物質を投与する工程；
（Ｂ）工程（Ａ）の非ヒト動物又は培養細胞から検体を採取し、検体中の１−メチルアデノシン、５−メチルシチジン及びシュードウリジンから選ばれる１又は２以上の修飾核酸を検出する工程；
（Ｃ）工程（Ｂ）で修飾核酸が増加しない、又は修飾核酸が細胞内局在変化しない場合、被検物質を細胞ストレスに起因する疾病の予防又は治療の候補薬剤と評価する工程；
の工程（Ａ）〜（Ｃ）を備えていれば特に制限されず、他の工程を含んでもよく、細胞ストレスの種類や細胞ストレスを負荷する方法、細胞ストレスを負荷した後の回復時間の有無や長さなどは適宜選択することができる。工程（Ｂ）において測定用検体及びコントロール検体における修飾核酸を検出して比較することもできるが、工程（Ｂ）において測定用検体の修飾核酸を検出し、別途標準的サンプル由来のコントロール検体の修飾核酸の検出結果から設定した、修飾核酸量の基準値又は修飾核酸の基準的な局在と比較してもよい。また、コントロール用のサンプルや生体を別途用意してコントロール用検体を採取してもよいが、同一のサンプルや生体からコントロール検体及び測定用検体の２種以上の検体を採取することもでき、複数回にわけて生体の同じ部位から、あるいは、一度に又は複数回にわけて生体の異なる部位から、検体を採取する例を挙げることもできる。また、コントロール検体及び測定用検体は、生体中で同じ由来であることが好ましい。非ヒト動物を用いる場合、コントロール検体及び測定用検体は、生体中の同じ組織由来であることが好ましい。また、本発明における非ヒト動物としては、サル、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウス、ハムスター、トリ等を挙げることができ、ラット、マウスを好適に例示することができ、疾患モデル動物などを使用することもできる。非ヒト動物への被検物質の投与方法は適宜選択することができ、経口、注射、点滴、塗布などを挙げることができる。また培養細胞を用いる場合、培養細胞の由来する動物や臓器など、培養細胞の種類は特に制限されず、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＭＣＦ−７細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＰＣ１２細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＣＯＳ７細胞、ＣＨＯ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、Ｌ細胞、ＭＤＣＫ細胞、Ｓ２細胞、などの細胞株でも、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、初代培養細胞などでもよく、被検物質は培養液に添加する、あるいは被検物質がペプチドやタンパク質の場合、これらの発現ベクターを細胞内に導入することができる。被検物質は適宜選択することができ、化学物質、タンパク質、ペプチド、ステロイド等を挙げることができ、これらは合成や抽出等により作製しても市販品を購入することもでき、市販のライブラリーを使用することもできる。
【００２７】
本発明の細胞ストレスに起因する疾病の予防又は治療剤のスクリーニング方法を用いて、以下の工程（Ａ１）〜（Ｃ１）を備えた虚血の予防又は治療剤のスクリーニングを行うこともできる。
（Ａ１）虚血再灌流中、又は虚血再灌流前後の非ヒト動物に被検物質を投与する工程；
（Ｂ１）工程（Ａ１）の非ヒト動物から検体を採取し、検体中の１−メチルアデノシン、５−メチルシチジン及びシュードウリジンから選ばれる１又は２以上の修飾核酸を検出する工程；
（Ｃ１）工程（Ｂ１）で修飾核酸が増加しない場合、被検物質を虚血の予防又は治療の候補薬剤と評価する工程；
の工程（Ａ１）〜（Ｃ１）を備えていれば特に制限されず、他の工程を含んでもよい。虚血を行う方法や、組織や、虚血時間や、虚血再灌流後の時間などは適宜選択することができる。検体としては、血液、尿、組織切片を好適に例示することができ、組織切片を染色する例や、血中の修飾核酸濃度を測定する例を挙げることができる。１−メチルアデノシンは、アポトーシスやオートファジーによっても血液や尿中に排出されることから、スクリーニングにより得られた虚血の予防又は治療の候補薬剤は、虚血が関与する疾患の他、例えばミトコンドリア病、アルツハイマー病、その他組織の脱落や壊死を伴う疾患などのアポトーシスが認められる疾患や、感染症、異常タンパク質蓄積を伴う神経変性疾患、空胞化を伴う筋疾患、クローン病その他の自食作用を伴う疾患などのオートファジーが認められる疾患の予防又は治療の候補薬剤と評価することもできる。
【００２８】
本発明の細胞ストレスに起因する疾病の予防又は治療剤のスクリーニング方法を用いて、以下の工程（Ａ２）〜（Ｃ２）を備えた低酸素症の予防又は治療剤のスクリーニングを行うこともできる。
（Ａ２）低酸素処理中、又は低酸素処理前後の培養細胞に被検物質を投与する工程；
（Ｂ２）工程（Ａ２）の培養細胞培養液を検体として採取し、検体中の１−メチルアデノシン、５−メチルシチジン及びシュードウリジンから選ばれる１又は２以上の修飾核酸を定量する工程；
（Ｃ２）工程（Ｂ２）で修飾核酸が増加しない場合、被検物質を低酸素症の予防又は治療の候補薬剤と評価する工程；
の工程（Ａ２）〜（Ｃ２）を備えていれば特に制限されず、他の工程を含んでもよく、培養細胞の種類や酸素濃度、低酸素処理を行う時間、低酸素処理後の回復時間の有無、その長さなどは適宜選択することができる。
【００２９】
本発明の細胞ストレスに起因する疾病の予防又は治療剤のスクリーニング方法を用いて、以下の工程（Ａ３）〜（Ｃ３）を備えた放射線障害の予防又は治療剤のスクリーニングを行うこともできる。
（Ａ３）放射線照射中、又は放射線照射前後の細胞又は非ヒト動物に被検物質を投与する工程；
（Ｂ３）工程（Ａ３）の細胞又は非ヒト動物から検体を採取し、検体中の１−メチルアデノシン、５−メチルシチジン及びシュードウリジンから選ばれる１又は２以上の修飾核酸を検出する工程；
（Ｃ３）工程（Ｂ３）で修飾核酸が局在変化しない又は増加しない場合、被検物質を放射線障害の予防又は治療の候補薬剤と評価する工程；
の工程（Ａ３）〜（Ｃ３）を備えていれば特に制限されず、他の工程を含んでもよく、検体を複数回採取して行うこともでき、放射線の種類や照射を行う強さや時間、回数、照射対象とする組織や、放射線照射後の回復時間の有無、その長さなどは適宜選択することができる。非ヒト動物を用いた例として、非ヒト動物から採取した末梢血中の修飾核酸濃度を測定する例や、かかる末梢血から採取したリンパ球における修飾核酸の細胞内局在を調べる例を挙げることができる。また、細胞としては、末梢血から採取したリンパ球や、培養細胞を用いてスクリーニングを行うこともできる。
【００３０】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【００３１】
〔腎臓虚血モデルラットの腎臓組織の染色〕
ラット（wister ８週齢（チャールズ社製））の両側腎動脈を１時間クランプして虚血し、その後クランプ解除して再灌流した。虚血処理なし、虚血解除直後、再灌流１時間後のラットをサクリファイスし、右腎臓を摘出した。腎臓を１０％ホルマリン浸漬により固定し、パラフィン標本を作製して、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２２１２０のハイブリドーマから産生された抗１−メチルアデノシン抗体（１：１００）を用いて免疫組織染色を行い、シンプルステインキット（ニチレイ社製）により発色させた（図３）。虚血解除直後及び再灌流１時間後において、特にｃＴＡＬ（cortical Thick Ascending Limb of Henle's Loop；皮質ヘンレループ上行脚肉厚部）が強く染色され、糸球体は染色されなかった。
【００３２】
また、同様にラットの両側腎動脈を１時間クランプして虚血し、その後クランプ解除して再灌流した。虚血処理なしラット（sham）、再灌流１時間後、再灌流３時間後、再灌流８時間後のラットをサクリファイスし右腎臓を摘出した。腎臓を１０％ホルマリン浸漬により固定しパラフィン標本を作製して、抗１−メチルアデノシン抗体（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２２１２０）（１：１００）、抗シュードウリジン抗体（受託番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２２１２１）（１：１００）又は抗５−メチルシチジン抗体（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２２１２２）（１：１００）を用いて免疫組織染色を行い、シンプルステインキット（ニチレイ社製）により発色させた。皮質の近位尿細管は虚血処理なしラットでも弱い非特異的な染色が観察された（図４）。再灌流１時間後では、抗１−メチルアデノシン抗体、抗シュードウリジン抗体、抗５−メチルシチジン抗体いずれを用いた場合も、髄質外層で主に染色が観察され、内層でも尿細管が染色され、皮質の染色陽性部分はｃＴＡＬであった（図５）。再灌流８時間後では、全体的に染色性が減少した。再灌流１時間後の皮質において観察された尿細管の部分（矢印）は、再灌流８時間後では細胞が菲薄化して染色性も落ち、細胞が死んだ可能性が考えられる（図６）。虚血に弱いとされる髄質外層部分が虚血により細胞傷害を起こし、再灌流１時間後においてはＲＮＡが分解され、変性ＲＮＡが産生されているのかもしれない。しかし、再灌流後８時間もたつと、すでに細胞は死んで、変性ＲＮＡは存在しない為に、染色が減った可能性が考えられる。また、再灌流１時間後のラットの腎臓ＴＡＬ（Thick Ascending Limb of Henle's Loop；ヘンレループ上行脚肉厚部）の抗１−メチルアデノシン抗体（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２２１２０）（１：１００）を用いた免疫電顕の結果を図７に示す。免疫電子顕微鏡法による観察でも、再潅流後の腎臓のＴＡＬにおいて１−メチルアデノシンが多量に存在することが示された。以上より、虚血処理によって組織切片において抗１−メチルアデノシン抗体、抗シュードウリジン抗体、抗５−メチルシチジン抗体による強い染色が得られることがわかり、これら１−メチルアデノシン、シュードウリジン、５−メチルシチジンは虚血マーカーとして利用できることが示された。
【実施例２】
【００３３】
〔脳梗塞モデルラットの脳組織の１−メチルアデノシン染色〕
中大脳動脈を１時間虚血し、脳梗塞を誘導した脳梗塞モデルラットを、１時間再灌流の後サクリファイスし、脳を摘出した。脳を１０％ホルマリン浸漬により固定しパラフィン標本を作製した。組織切片をＨＥ染色、あるいは、抗１−メチルアデノシン抗体（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２２１２０）（１：１００）又は抗５−メチルシチジン抗体（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２２１２２）（１：１００）を用い、シンプルステインキット（ニチレイ社製）により発色させて免疫組織染色を行った（図８）。虚血領域及び正常領域における染色を比較すると、１−メチルアデノシン及び５−メチルシチジンの染色は虚血領域の方が強いことが示され、脳における虚血も検出することができた。また、２時間虚血し、再灌流を行わなかった脳梗塞モデルラットを用いた場合も、同様の観察結果であった。
【実施例３】
【００３４】
〔腎臓虚血モデルブタの末梢動脈血液中の１−メチルアデノシン濃度〕
両側腎動脈を１時間虚血した、ブタの腎臓虚血モデルにおいて、虚血前、再灌流直後、再灌流１５分後、再灌流１時間後、再灌流２時間後に末梢動脈及び腎静脈から血液を採取した。採取した血液中の１−メチルアデノシンを濃度は、ＥＬＩＳＡ（競合法）によって以下の方法で測定した。ＰＢＳに溶解した１−メチルアデノシン−ＢＳＡコンジュゲート（０．１２５ｎｇ／ｍｌをウェルあたり５０μｌ）を４℃で一晩固相化した後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳ  １００μｌを加え３７℃でブロッキングを行った。１時間後、希釈系列（１、５、１０、５０、１００、５００ｎｇ／ｍｌ）で調製した１−メチルアデノシン標準液と抗１−メチルアデノシン抗体（受託番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２２１２０）０．０２μｇ／ｍｌを２５μｌずつ添加し、４℃で１時間反応させた。各ウェルを０．０５％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで５回洗浄し、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで１：５００に希釈したＡＬＰ rabbit anti-mouse ＩｇＧ Ｆｃを５０μｌずつ添加し４℃で１時間反応させた。先と同様の方法で洗浄した後、基質（パラニトロフェニルフォスフェートを１ｍｇ／ｍｌの濃度で１Ｍジエタノールアミン緩衝液ｐＨ９．８に溶解）を加え１５分間反応させ、４０５ｎｍにおける吸光度を測定して検量線を作成した。同様に、採取した血液の血清（アミコンウルトラ−４（１０，０００ＮＭＷＬ）を用いて遠心限外ろ過し、得られたろ液をさらに２倍、４倍、８倍に希釈したもの）を測定し、検量線から１−メチルアデノシン量を算出した。結果を図９に示す。動脈血の１−メチルアデノシン濃度は再灌流後２時間で虚血前の約５倍の値に上昇した。また、どの時点においても、常に腎静脈血中における１−メチルアデノシン濃度は動脈血中における１−メチルアデノシン濃度より高く、これは血中の増加した１−メチルアデノシンは腎由来であるという解釈と矛盾しない結果である。したがって、末梢動脈から採取した血液中の１−メチルアデノシン濃度を測定することにより、腎臓などの臓器における虚血を検出することができることが示された。
【実施例４】
【００３５】
〔ヒト近位尿細管上皮細胞ＲＰＴＥＣ細胞の１−メチルアデノシン染色〕
虚血再灌流によって、ミトコンドリアが傷害を受けることが知られている。そこで、ミトコンドリアが豊富に存在する近位尿細管の培養細胞における、１−メチルアデノシンの細胞内局在について調べた。初代培養細胞である、ヒト近位尿細管上皮細胞ＲＰＴＥＣ細胞はタカラ社より入手し、１０％ＦＢＳ（インビトロジェン社製）を添加したＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地（インビトロジェン社製）を用いて、３７℃、５％ＣＯ２下で維持した。ＲＰＴＥＣ細胞は、３０万個／ウェルで１２ウェルチャンバー上に撒き、２４時間後に４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳで固定し、洗浄し、１％ＢＳＡ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳでブロッキングした。抗１−メチルアデノシン抗体を用いて１−メチルアデノシンを、Mitotracker（商標登録）deep red（インビトロジェン社製）を用いてミトコンドリアを、ＤＡＰＩ（インビトロジェン社製）を用いて核を染色し、洗浄、マウントした後、共焦点顕微鏡（ＬＳＭ５、Zeiss社製）で観察した（図１０）。１−メチルアデノシンとミトコンドリアは共局在を示すことが確認された。
【実施例５】
【００３６】
〔弓部置換術中の腎静脈付近血液中の１−メチルアデノシン濃度〕
心臓病患者のヒト弓部置換術中に、虚血前open distal手術前（かつ人工心肺ポンプ開始前）の患者の末梢及び腎静脈付近から虚血状態にある血清試料２００μｌを採取した。心臓病患者の弓部置換術中に腎静脈付近の血液を採取し、１−メチルアデノシン濃度を測定した。人工心肺ポンプの開始から、弓部大動脈遮断による虚血、遠位側開放下血管吻合術、再灌流２時間後までの計７時点において腎静脈付近の血液を採取した。前記と同様にＥＬＩＳＡ（競合法）によって血中１−メチルアデノシン濃度を測定した結果を図１１に示す。手術及び再灌流２時間後において、手術開始前の３倍以上の高い１−メチルアデノシン濃度が測定された。１−メチルアデノシンの測定により、手術中の虚血状態をリアルタイムでモニターすることもできることが示された。
【実施例６】
【００３７】
〔ヒト腎動脈狭窄症の治療経過における末消血液中の１−メチルアデノシン濃度〕
腎動脈狭窄症患者の末消血液を腎動脈拡張術前後の計５時点において採取し、血液中の１−メチルアデノシン濃度を測定した。血中１−メチルアデノシン濃度の測定は前記と同様にＥＬＩＳＡ（競合法）によって行った。また、腎臓の機能マーカーの一つ、クレアチンの値も同サンプルからＬＣ−ＭＳを用いて測定した。結果を図１２に示す。血液中の１−メチルアデノシン濃度は腎梗塞後に増加し続けたのに対し、クレアチンの値は、腎梗塞前後で変化が見られなかった。したがって、従来腎臓機能のマーカーとして使用されているクレアチンよりも、１−メチルアデノシンを検出する本発明の細胞ストレスの判定方法は、腎臓の状態を精度よく反映することができることが示された。
【実施例７】
【００３８】
〔弓部置換術中の末梢血液中の１−メチルアデノシンの検出〕
心臓病患者のヒト弓部置換術中に、虚血前open distal手術前（かつ人工心肺ポンプ開始前）の患者の末梢血及びカテーテル血から血清試料２００μｌを調整した。この血清試料を１×ＰＢＳにて２倍希釈し、遠心限外ろ過装置（アミコンウルトラ（Amicon Ultra）−４遠心式フィルターユニット（Millipore社製）：分画分子量１０，０００（ＵＦＣ８０１００８）、分画分子量３０，０００（ＵＦＣ８０３００８）、分画分子量５０，０００（ＵＦＣ８０５００８））にそれぞれ添加し、マイクロ冷却遠心機（KUBOTA3700、久保田商事社製）を用いて、４℃、７，５００×ｇ（６，８３０ｒｐｍ）で９０分間遠心分離を行った。得られたろ液（約３２０μｌ）中の１−メチルアデノシン量をＥＬＩＳＡにて測定した結果を図１３に示す。
【００３９】
図１３中、「末梢」は腕から採取した末梢血サンプルを示し、「１」は腎静脈にカテーテルを挿入し採取した血清サンプルを示す。図１３中の血清、１０Ｋ、３０Ｋ、５０Ｋはそれぞれ、限外ろ過しない血清、分画分子量１０，０００の限外ろ液、分画分子量３０，０００の限外ろ液、分画分子量５０，０００の限外ろ液を表す。１−メチルアデノシンは細胞内ではフリーのヌクレオシドとして存在するか、あるいはｔＲＮＡに含まれて存在する。ｔＲＮＡの分子量は約２５，０００であるので、完全な形であればｔＲＮＡは５０Ｋ（５０，０００）の限外ろ液に回収されるが、３０Ｋ（３０，０００）と１０Ｋ（１０，０００）ではろ過されない。またｔＲＮＡが分解途中であれば、５０Ｋ及び３０Ｋ限外ろ液に回収され、１０Ｋではろ過されない。さらに分解が進み、オリゴヌクレオシドまで分解されると、オリゴヌクレオシドは１０Ｋ限外ろ液に回収される。したがって、限外ろ過装置の分画分子量を変え異なる分子量の限外ろ液を得ることによって、様々な状態の１−メチルアデノシンを回収することができる。図１３では、血清並びに、１０Ｋ、３０Ｋ及び５０Ｋの限外ろ液の全サンプルにおいて１−メチルアデノシンが測定されたことから、本発明の抗体を用いてフリーの１−メチルアデノシン、分解過程にあるｔＲＮＡ（１−メチルアデノシンを含む）もあわせて検出することができることが示された。さらに、図１３に示されるとおり、ｔＲＮＡに含まれる（５０Ｋの限外ろ液の検出される）１−メチルアデノシンがフリーの（１０Ｋの限外ろ液の検出される）１−メチルアデノシンよりも多いことから、１−メチルアデノシンしか検出することができない従来の質量分析装置を用いた系よりも、抗体を用いた本発明の方法は、感度よく血清中の１−メチルアデノシンを検出することができ有用であることが示された。
【００４０】
虚血などにより細胞死の過程では、細胞が壊れてｔＲＮＡも細胞外に漏れ出すため、血中ｔＲＮＡ量を検出することにより、アポトーシスや細胞ストレス状態を検出することができると考えられる。抗体を用いた本発明の方法では、フリーの１−メチルアデノシンだけでなく分解前及び分解過程にあるｔＲＮＡ（１−メチルアデノシンを含む）もあわせて検出することができるため、フリーの１−メチルアデノシンしか検出することができない質量分析装置を用いた測定方法よりも、高感度に精度よく細胞死を検出することができ、有用性が高い。すなわち、虚血や細胞ストレス状態がひどいほど血清中に多量のｔＲＮＡが検出されると考えられ、フリーの１−メチルアデノシン量（１０Ｋの限外ろ液中）と比較してフリー及びｔＲＮＡ中の１−メチルアデノシン量（５０Ｋの限外ろ液中）が、健常人（平常時）よりも有意に高い場合、アポトーシスや細胞ストレス状態にあると判定することができる。
【実施例８】
【００４１】
〔ＭＤＣＫ細胞１％Ｏ２低酸素負荷の検出〕
６well dishにＭＤＣＫ細胞（イヌ尿細管由来培養細胞）を２５万個／well撒き、１２時間後に細胞が５０％コンフルエントとなった時点でＰＢＳで１回洗浄した後、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ２ｍｌ培地にて、２０％Ｏ２の通常培養（コントロール）又は１％Ｏ２の低酸素負荷培養を２４時間行い、コントロール及び１％Ｏ２どちらも９５％コンフルエント状態にした。その後に、以下の方法で培地（上清）、細胞を回収し、細胞及び培地における１−メチルアデノシン量を測定した。
【００４２】
（Cell lysateの作製）
３wellをＰＢＳで２回洗浄後、トリプシン／ＥＤＴＡ処理により細胞を剥がして回収し、細胞数を計測した。コントロール及び１％Ｏ２の低酸素負荷サンプルいずれも１０５万−１１０万／wellであった。次に１，０００ｇ×５分間の遠心操作の後上清を除去し、lysis buffer５００μｌで細胞を可溶化し、Bioruptor（東湘電機株式会社製）を用いて超音波破砕（Ｈ×５分間）し、１，０００ｇ×５分間の遠心操作の後、上清をcell lysateとして回収し、−８０℃で保存した。
Lysis buffer組成
１％          TritonX-100 
５０ｍＭ      Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．６
１５０ｍＭ    ＮａＣｌ 
０．０２％    Sodium azide
Protease inhibitor（Roche社製：Complete mini EDTA free）
ＶＲＣ（Vanadyl-ribonucleotide complex）  １０ｍＭ
【００４３】
（total ＲＮＡの抽出）
３wellをＰＢＳで２回洗浄後、TriPure Isolation Reagent（Roche社製）２ｍｌ／wellを添加し、１ｍｌずつ１．５ｍｌエッペンチューブに分注した。かかるエッペンチューブにクロロホルムを２００μｌ加え、vortexにより撹拌し、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心操作を行った。遠心操作後の水層５００μｌを別のチューブに移し、２−プロパノール５００μｌで沈殿させ、７０％エタノールで２回リンスし、ＲＮａｓｅ freeの蒸留水２００μｌで溶解させ、分光光度計Nanodrop（商標登録、株式会社エル・エム・エス社製）でＲＮＡ濃度を測定し、−８０℃保存した。コントロールサンプルのＲＮＡ濃度は８０．８ｎｇ／μｌ、８７．４ｎｇ／μｌ、８５．８ｎｇ／μｌであり、１％Ｏ２低酸素サンプルのＲＮＡ濃度は７５．０ｎｇ／μｌ、７２．４ｎｇ／μｌ、７１．４ｎｇ／μｌであった。前記と同様にＥＬＩＳＡ（競合法）によってlysate及び上清中の１−メチルアデノシン濃度を測定した。測定値を、前記ＲＮＡ濃度により補正した結果を図１４に示す。その結果、１％Ｏ２の低酸素負荷によって細胞lysate中の１−メチルアデノシン濃度は変化しないが、培地中の１−メチルアデノシン濃度が有意に増加することが示された。したがって、１−メチルアデノシンを検出することにより、低酸素負荷による細胞ストレスも検知できることが示された。
【実施例９】
【００４４】
〔末梢血リンパ球における放射線障害の検出〕
ヒト末梢血リンパ球を以下の方法で採取し、１−メチルアデノシンを染色して観察した。
（末梢血からのリンパ球の採取）
空腹時に被検者よりヘパリン採血管を用いて血液を１０ｍｌ採取した。Ficoll（ベクトン社製）１０ｍｌ（等量）を入れた５０ｃｃチューブに、Ficollの液面が乱れないように注射器から血液をゆっくり移し、液面を乱さないように室温で１，５００ｒｐｍ×３０分間遠心操作を行った。次に、ピペットで上から血清とＰＢＬ層を回収し、等量のＰＢＳを加えて１，２００ｒｐｍ×１０分間遠心操作を行った。上清を吸引し、沈殿をＰＢＳ５ｍｌに懸濁し、１，５００ｒｐｍ×５分間遠心操作を行う一連の操作を２回行い、沈殿を１０％ＦＣＳ（ウシ胎仔血清）を含むＲＰＭＩ、２ｍｌに懸濁した。このＰＢＬ１×１０７個／２ｍｌとなったリンパ細胞を２４穴プレート（コートなし）に分注し、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。
【００４５】
（リンパ球の１−メチルアデノシン染色標本の作成）
前記末梢血リンパ球に、Ｘ線装置ソフテックス（ソフテックス株式会社）を用いて２８７ｒａｄを１０分間、約３，０００ｒａｄ照射した。その後、３７℃、５％ＣＯ２で培養し、経時的にリンパ球８０μｌ（４×１０５個）を１．５ｍｌチューブに移し標本用サンプルとして採取した。かかる標本用サンプルを２，０００ｒｐｍ×５分間遠心操作を行い、上清を捨てＰＢＳ２００μｌで洗浄操作を２回繰り返し、細胞をＰＢＳ２０μｌに懸濁してコートスライド上にのせてスメア標本を作製し、４％ＰＦＡ（パラホルムアルデヒド）で固定処理を行った。前記４％ＰＦＡ固定スメア標本を、TritonX-100  ０．２％を含むＰＢＳで室温２分間の可溶化処理を行った後、３％ＮＧＳ（通常ヤギ血清）を含むＴＢＳ−Ｔで室温１０分間のブロッキング処理を行った。受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２２１２０のハイブリドーマが産生する抗１−メチルアデノシン抗体（１ｍｇ／ｍｌ）を３％ＮＧＳを含むＴＢＳ−Ｔで１：１００に希釈した１次抗体を用いて室温１時間の１次抗体反応を行い、次にAlexa Fluor（商標）488 anti-mouse ＩｇＧ（インビトロジェン社製）を３％ＮＧＳ ＴＢＳ−Ｔで１：５００に希釈した２次抗体を用いて室温１時間の２次抗体反応を行った後、標本を封入し、蛍光顕微鏡で観察した。その結果を図１５に示す。
【００４６】
その結果、Ｘ線照射前の末梢血リンパ球においては１−メチルアデノシンは細胞質に分布しているが、Ｘ線照射後は１−メチルアデノシンの染色部分が、細胞膜辺縁に変化し、また細胞内部においても粒状の凝集した局在に変化することが確認された。また、Ｘ線照射後に細胞が壊れてゆく細胞形態の変化が見られ、Ｘ線照射によるミトコンドリアの障害が起こっていると考えられた。したがって、１−メチルアデノシンを検出することにより、放射線障害の検知も行うことができることが示された。
【００４７】
〔放射線照射マウスにおける放射線障害の検出〕
マウス（C57BL/6）（ｎ＝３）に、Ｘ線装置ソフテックス（ソフテックス株式会社）を用いて、Ｘ線１０Ｇｙを照射した。照射後、採血し、血液中の１−メチルアデノシン濃度を前記と同様にＥＬＩＳＡ法で測定した。血液中の１−メチルアデノシン濃度の平均値の結果を図１６に示す。図１６中、controlは、Ｘ線を照射していないマウスの血液中１−メチルアデノシン濃度を示す。rad12hrは、Ｘ線照射１２時間後のマウスの血液中１−メチルアデノシン濃度を示す。Ｘ線を照射したマウス（rad12hr）は、Ｘ線を照射していないマウス（control）と比較して、血液中の１−メチルアデノシン濃度が約１．４倍高いことが示された。したがって、実験動物等の生体においても、１−メチルアデノシンを検出することにより、放射線による影響や放射線障害の検知を行うことができることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
本発明は、血液検査や尿検査、組織検査の分野に好適に利用することができる。また、虚血に関連する疾患に関する医療・研究分野や、アポトーシス、オートファジー、低酸素や放射線への暴露などの検出に関する医療・研究分野にも好適に利用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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