(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
リポソームの内液としてヘモグロビン溶液を含み、該リポソームの膜が、リン脂質、コレステロール、高級飽和脂肪酸およびポリエチレングリコール結合リン脂質の混合脂質で構成され、かつ該コレステロール／リン脂質のモル比が０.７〜１.０であり、前記混合脂質中のステアリン酸の含有率が２５〜３０モル％であり、膜構成脂質総量に対するポリエチレングリコール結合リン脂質の量が、０.８〜１.１モル％であるヘモグロビン含有リポソーム。
【請求項２】
前記リポソームの膜において、該ポリエチレングリコール結合リン脂質は前記膜の外表面に結合している請求項１に記載のヘモグロビン含有リポソーム。
【請求項３】
前記ヘモグロビン含有リポソームの平均粒子径が２００〜２５０ｎｍである請求項１または２に記載のヘモグロビン含有リポソーム。
【請求項４】
ヘモグロビン／前記混合脂質（質量比）が１.１〜１.６である請求項１〜３のいずれかに記載のヘモグロビン含有リポソーム。
【請求項５】
ゼータ電位が０ｍＶ以上である請求項１〜４のいずれかに記載のヘモグロビン含有リポソーム。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載のヘモグロビン含有リポソームの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特に、ヘモグロビンの高封入率を確保しかつ物理的安定性とともに生体内での安定性に優れるヘモグロビン含有リポソームおよびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
人工酸素運搬体の酸素運搬を担う物質として、赤血球由来のヘモグロビンを活用する方法が検討されて来たが、ヘモグロビン単体では、生体内での安定性に欠け、また、その毒性作用として様々な組織障害の原因となることが知られており、ヘモグロビンを化学的に修飾して安定化させた分子を用いる試みも続けられて来たが、これらの問題点を解決するには至っていない。
一方、ヘモグロビンをリポソーム内に封入した、ヘモグロビン含有リポソームは、ヘモグロビンが小胞体内に閉じ込められているという点で赤血球の構造を擬似化したものであり、ヘモグロビンの毒性作用の回避が可能と考えられ、人工酸素運搬体としての検討が行われてきた。【０００３】
ヘモグロビン含有リポソームについては、これまでにも、ヘモグロビンを高収率にリポソーム内に封入するための、膜成分の構成（特許文献１参照）、製造方法（特許文献２参照）が開示されているが、ヘモグロビンの高収率を維持しつつ、リポソームの生体内での安定性も確保し、ヘモグロビンを小胞体内に封入することによる、リポソーム化の意義を失わせないという条件の両立を達成し得るリポソーム膜の構成成分の量比と、平均粒子径や、ヘモグロビンと脂質の比率といった物理的化学的性質を組み合わせ、適切な設計とするための検討は十分ではなかった。【０００４】
ヘモグロビン含有リポソームを調製する場合、タンパク質であるヘモグロビンの変性を防ぎつつリポソーム内に封入するためには、低温条件下での乳化処理が必要である。リポソーム膜の構成材料として多用されるリン脂質は、生体膜成分との相同性、生体への親和性が高く、特に飽和脂肪酸から構成されるリン脂質は、安全に使用可能な物質として医薬品へ応用されているが、飽和リン脂質の場合、相転移温度が高く、低温でのリポソーム形成は難しい。【０００５】
一方、飽和リン脂質にコレステロールを配合することで、相転移温度の分布が変化し、さらに脂肪酸を配合することで、低温の乳化条件でも、ヘモグロビンをリポソーム内に取り込めることが明らかとなっているが、脂肪酸の量を増加させ過ぎると、リポソーム自体が不安定化することも開示されている（特許文献１参照）。【０００６】
そこで、ヘモグロビンの収率と、リポソームの安定性を両立する割合での配合が求められるが、リポソームとしての物理的な安定性は十分に高い条件でも、生体内では、生体成分との相互作用により、ヘモグロビンが漏出（リーク）する可能性がある。血中に遊離したヘモグロビンは少量であれば、血中のハプトグロビンと結合し、肝臓に運ばれて処理されるため、生体に悪影響を与える可能性は低いが、その処理量を超えた場合には、血中に遊離状態のヘモグロビンが存在することとなる。血中のハプトグロビンの量にはかなり幅があり、処理可能量を厳密に規定することは難しいが、前述の脂肪酸（ステアリン酸）の配合量比が３５モル％以上の場合の血漿中ヘモグロビン濃度は、この処理可能濃度域を越える可能性のある量と考えられる。ヘモグロビン濃度が、この処理可能量域を越えた場合、血漿中に遊離のヘモグロビンが存在することとなり、そのヘモグロビンは比較的容易に２量体へと解離し、解離した２量体は腎尿細管にてろ過され、尿中へ排泄されるが、ヘモグロビンが大量に漏出した場合には、腎尿細管に蓄積して毒性的影響を及ぼすことが知られている。さらに、ヘモグロビンは血管内皮細胞の間隙から、血管外に漏出し、血管内皮細胞が産生し、血管平滑筋細胞の緊張・弛緩状態を調節している因子である、一酸化窒素（ＮＯ）と容易に結合、トラップし、血管平滑細胞の収縮をさせると考えられている。ヘモグロビンを化学的に修飾したタイプの人工酸素運搬体で、副作用として問題となった、血管収縮や、心筋に対する影響には、この現象が関っていると考えられており、この現象を回避し得る点が、ヘモグロビンをカプセル化するというコンセプトの最も重要な点であり、カプセルからのヘモグロビンの漏出は、このコンセプト自体を危うくしかねないものである。【０００７】
また、特に脂肪酸の含有量を多くした場合には、脂肪酸の特性から、リポソームの表面荷電が陰性側に傾き、その結果、補体系の活性化が起こり易くなり、生体内でのリポソームの不安定化や、生体内寿命が短くなる等の問題が生ずるという課題がある。【０００８】
また、リポソームに、出来る限り、効率良く物質を内封させるには、平均粒子径を大きくし、相対的にリポソーム膜を薄くする、すなわち、ヘモグロビンに対する脂質の量比を出来るだけ少なくすることが効果的であるが、一方で、粒子径を大きくすることは、生体内での細網内皮系への取り込みを促進し、血中での寿命を短くすることになる（非特許文献１〜２参照）。また、粒子径を大きくすることで、相対的に、内部水相に取り込ませる物質に対する、膜脂質成分の量比を相対的に小さくすることは、内部水相に存在する有効成分、すなわち、ヘモグロビン含有リポソームでは、ヘモグロビンがこれに該当するが、この有効成分を生体内投与する場合に、生体へのリポソーム膜脂質の負荷量を少なく出来るという点で安全性上のメリットもある。一方、低温下での乳化を可能とするような温度特性を有する脂質膜成分からなるリポソームにおいて、粒子径を大きく、相対的に膜を薄くすると、それだけ、リポソーム自体が物理的に脆弱で不安定となり易く、特に生体内においては、ヘモグロビンの漏出が起き易くなるという課題もある。【０００９】
また、リポソームについては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）結合リン脂質のような親水性高分子構造をリポソーム膜表面に導入することで、生体内での安定性を向上させ得ることが知られており（特許文献３参照）、ヘモグロビン含有リポソームについても、同様に、血漿中でのリポソームの凝集や、リポソームの投与に起因する生体反応を回避する手段として、ポリエチレングリコール結合リン脂質によりリポソーム膜表面を修飾する方法が開示されてきたが、前述の、高収率と生体内安定性を両立するための要件を考慮した中での検討は行われていなかった。【００１０】
上記リポソームによる補体系活性化や、細網内皮系への取り込み促進を防ぐ有効な手段として、ポリエチレングリコールのような親水性の高分子により、リポソームの膜を修飾する方法が知られており、ポリエチレングリコール結合リン脂質により、リポソーム膜表面のみを修飾する方法が開示されているが、前述の、高収率達成のため、脂肪酸の配合量を増加させたヘモグロビン含有リポソームにおいて、その膜表面の陰性荷電を、補体系の活性化が起き難いとされる中性状態とする（非特許文献３参照）ために必要な条件は知られていなかった。【００１１】
また、ポリエチレングリコール結合リン脂質のリポソーム膜表面への導入量については、添加量に依存して膜への導入量も増加するが、単純に添加量を多くすれば良いというものではなく、過剰な添加は、遊離状態のポリエチレングリコール結合リン脂質の割合を増加させることになる。ポリエチレングリコール結合リン脂質それ自体は両親媒性の性状による界面活性効果を持つ物質であり、高濃度に遊離状態で存在した場合には、リポソームらの内封物質の漏出をもたらすという報告や（非特許文献４参照）、また、ポリエチレングリコール結合リン脂質のリポソーム膜への導入量が、内封物質の漏出に影響する可能性を示す報告もあり（非特許文献５参照）、さらには、ポリエチレングリコール結合リン脂質添加量を増加させて行くと、製造工程におけるポリエチレングリコール結合リン脂質導入処理時に、リポソーム膜が不安定化し易いという問題も存在していた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】国際公開第０３／０１５７５３号
【特許文献２】特開２００５−２０５５号公報
【特許文献３】特開平２−１４９５１５号公報
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ishida O et al. Size-dependent exravasation and interstitial localization of polyethyleneglycol liposomes in solid tumor-bearing mice. Int J Pharmacol 1999; 190: 49-56
【非特許文献２】Awasthi VD et al. Circulation and biodistribution profiles of long-circulating PEG-liposomes of various size in rabbits. Int J Pharmacol  2003; 253: 121-132
【非特許文献３】Bradley AJ et al. Inhibition of liposome-induced complement activation by incorporated poly(ethylene glycol)-lipids. Arch Biochem Biophys  1998; 357(2) : 185-94
【非特許文献４】Kasbauer M et al.  Polymer induced fusion and leakage of small unilamellar phospholipid vesicles: effect of surface grafted polyethylene-glyucol in the presence of free PEG.  Chem Phys Lipids.  1997; 86(2): 153-159
【非特許文献５】Hashizaki K et al. Effects of poly (ethylen glycol) (PEG) chain length of PEG-lipid on the permeability of liposomal bilayer membranes.  Chem Parm Bull  2003; 51(7): 815-820
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
（１）リポソームの脂質膜の構成要素として、リン脂質とコレステロールの組み合わせは汎用的に用いられており、コレステロールは、不飽和脂肪酸リン脂質に対しては膜の透過性や流動性を低下させ、リポソーム膜を安定化するという特性を有する一方、飽和脂肪酸リン脂質に対しては、相転移を消失させ膜の流動性を高めるとされている。この特性は、ヘモグロビンのような蛋白質を低温下で乳化時する際の、内封物質のリポソーム内への取込を容易にし、リポソーム化に際しての内封効率を高めると考えられる。すなわち、特に、熱に弱い物質の低温度下でのリポソーム化に際しては有利となる。事実、リン脂質に対し、コレステロールを添加することにより、膜成分物質の相転移温度以下の温度にてヘモグロビンをリポソーム内に取り込ませる方法（特公平５−６４９２６）、リン脂質に、重量比で１０〜５０％（モル比で２１〜１００％）のコレステロールを添加し、リポソーム化を行なうヘモグロビン含有リポソーム並びにその製造方法（特開平２−２９５９１７）が開示されているが、コレステロールの配合量と、ヘモグロビンの収率との関係に関する検討は十分に行なわれていなかった。【００１５】
（２）また、リポソーム形成時には、リポソームどうしの凝集や融合といった現象が起こり易く、リポソーム調製時の不安定要因となっている。これに対して、負電荷をもつ物質を、リポソーム膜の構成要素として添加することにより、その静電的反発力からこれらの現象を抑制することが可能であることが開示されている（特開平１−１８０２４５）。また、負電荷物質として脂肪酸を利用した場合、コレステロールの場合と同様、リン脂質やコレステロールに対して、ある程度以上の量比の脂肪酸を添加した場合、リポソーム内への物質の取込効率が大幅に向上することも示されている一方で、脂肪酸の添加量が多くなり過ぎると、リポソーム膜は不安定化し、封入したヘモグロビンの漏れ出しが多くなることから、最適域が存在することも開示されている（特許文献１参照）。しかしながら、ここで、開示されているリポソームの安定性に関する情報は、あくまで、in vitroでの物理的な安定性に関するものであり、医薬品として使用する場合、その安全性、有効性の面から本質的に重要な、生体内での安定性については十分な検討が行われていなかった。【００１６】
（３）リポソームは脂質２重膜に包まれた小胞体であり、単層の膜に包まれた（ユニラメラ）の方が複数の膜に包まれた（マルチラメラ）リポソームより、内部の水相の容積比率が大きく、単位脂質量当りの内封物質の封入効率は高くなる。さらに、同じ膜厚であれば、リポソームの粒子径が大きい方が、相対的に、脂質膜に対する、内水相の空間率は高くなり、内封物のキャリアとしては、効率の良いものとなり得る。一方、膜の枚数が少ない、あるいは、リポソームの粒子径が大きく、膜厚が相対的に薄いものでは、リポソームから、内封物質の漏れ出しが起こり易くなる。さらに、リポソームの粒子径が２５０〜３００ｎｍを越えるくらいから、急激に細網内皮系への取込が増加することが知られており（Klibanov AL et al.  Activity of amphipathic poly(ethylene glycol) 5000 to prolong the circulation time of liposomes depends on the liposome size and is unfavorable for i mmnoliposome binding to target. Biochem Biophys Acta  1991; 1062: 142-148； Litzinger DC et al.  Effect of liposome size on the circulation time and intraorgan distribution of amphipathic poly(ethylene glycol)-conjugating liposomes.  Biochem Biophys Acta  1994; 1190: 99-107）生体内での安定性の観点からは、リポソームの粒子径は前述のレベル以下に抑えることが必要となる。
また、平均粒子径に対して、ヘモグロビン／脂質の重量には相関関係が存在することが判っており、ヘモグロビン及び脂質の仕込み量から算出されるヘモグロビンの理論収率は、平均粒子径２５０ｎｍの場合に対して、２００ｎｍでは前者の７０％程度まで低下する。【００１７】
（４）脂肪酸の添加は前述のように、リポソーム膜に荷電を付与することとなり、製造過程でのリポソームの凝集を防ぐことに寄与するが、一方で、リポソーム膜の荷電が陰性に傾いている場合、補体系の活性化が起こり易くなり、生体内でリポソームが不安定化する、あるいは、異物反応から、細網内皮系による取り込みが増強されることに繋がると考えられる。また、生体内では、血液中のタンパク質の結合や、異物処理細胞、器官への取り込みにさらされることとなるが、ポリエチレングリコール結合リン脂質のような親水性高分子物質によりリポソーム膜表面を修飾することにより、生体内でのリポソームの凝集や、異物としての処理が抑制され、生体内での安定性が向上することが開示されている（特公平７−２０８５７、特開平４−５２４２、特開平３−２１８３０９参照）。
しかしながら、ＰＥＧ結合リン脂質の修飾条件を、前述のリポソームの表面荷電と、生体反応との関係から詳細に検討し、最適域を見出す検討は十分に行なわれて来なかった。さらに、ＰＥＧ結合リン脂質は多く加えれば良いというものではなく、過剰な添加は、遊離状態のＰＥＧ結合リン脂質を増やし、結果として、その界面活性効果により、リポソームの不安定化を招来する可能性が想定されていたが、実際に、過剰添加とならず、かつ、十分な修飾効果を示す添加量については明らかにされていなかった。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明者らは、上記（１）について検討を行った。本発明におけるリポソーム膜構成脂質には、天然あるいは合成の脂質が利用可能であるが、リン脂質としては、特に、水素添加リン脂質が好適に使用される。該リン脂質に等モル比附近の量のコレステロールを添加した場合に、ヘモグロビン並びに膜脂質成分の収率は良好となり、等モル比以上添加すると、むしろ、リポソーム調製時のヘモグロビン並びに脂質の収率は低下することを見出した。【００１９】
また上記（２）について、特に、ヘモグロビン含有リポソームの場合、リポソーム化する、すなわち、脂質の小胞体内にヘモグロビンを封入して用いることの利点は、ヘモグロビンが単体で血中に遊離状態で存在した場合に起こる、ヘモグロビンによってもたらされる毒性や不都合な生体反応を防ぐことにある。従って、生体内で容易にヘモグロビンが漏れ出してしまうことは、リポソーム化することの基本的なコンセプト自体を危うくし、安全性面での問題が生ずる可能性が大きくなることとなる。そこで、脂肪酸の添加量と、ヘモグロビンの取り込みの度合い（封入率）並びに、生体内でのヘモグロビンの漏出を指標として、リン脂質、コレステロール、並びに脂肪酸を合わせた、リポソーム膜構成脂質の総量（総モル数）に対する最適なモル比について鋭意検討を行い、総脂質量に対して、モル比で２５〜３０％の脂肪酸量が、前述の、要件を両立させ得る条件として適切であることを明らかにした。このとき、脂肪酸としては、高級飽和脂肪酸が好適に使用され、特に、リン脂質として、アシル鎖長Ｃ１８のリン脂質を用いる場合には、炭素数が等しい、ステアリン酸が好適に使用される。【００２０】
上記（３）平均粒子径並びにヘモグロビンと脂質の量比について、生体内安定性を大幅に損なうことなく、可能な限りヘモグロビンを効率良くリポソーム内に取り込みつつ、ヘモグロビンの漏れ出しを抑え、生体内安定性を確保することを検討した結果、平均粒子径は少なくとも２００以上とし、一方２５０ｎｍを超えない範囲で設定し、ヘモグロビン／脂質の重量比が１.０〜２.０、好ましくは１.１〜１.６の範囲となるよう、リポソームの調製を行なうことで、この目的が達成出来ることを見出した。【００２１】
さらに、（４）ポリエチレングリコール結合リン脂質添加量について、ヘモグロビン含有リポソームリポソーム製剤に関して、その表面荷電を中性化し、補体系活性化を極小化するＰＥＧ結合リン脂質の修飾条件を検討した。前述の条件を満たし、遊離ＰＥＧ結合リン脂質を増加させない限度量は、膜構成脂質の総量に対して、ＰＥＧ結合リン脂質量はモル比として０.８〜１.１モル％であることを見出した。【００２２】
上記から、以下の本発明が提供される。
本発明は、リポソームの内液としてヘモグロビン溶液を含み、該リポソームの膜が、リン脂質、コレステロールおよび高級飽和脂肪酸の混合脂質で構成され、かつ該コレステロール／リン脂質のモル比が０.７〜１.０であり、前記混合脂質中のステアリン酸の含有率が２５〜３０モル％であるヘモグロビン含有リポソームを提供する。【００２３】
上記ヘモグロビン含有リポソームの平均粒子径は、好ましくは２００〜２５０ｎｍである。【００２４】
上記ヘモグロビン含有リポソームにおけるヘモグロビン／前記混合脂質（質量比）は１.０〜２.０であり、好ましくは１.１〜１.６である。【００２５】
本発明の好ましいヘモグロビン含有リポソームの態様は、上記リポソームの膜が、膜構成脂質総量に対して０.８モル％以上のポリエチレングリコール結合リン脂質をさらに含み、該ポリエチレングリコール結合リン脂質は膜の外表面に結合している。
この態様のヘモグロビン含有リポソームは、ゼータ電位が０ｍＶ以上である。
また、この態様において、膜構成脂質総量に対するポリエチレングリコール結合リン脂質の量が、０.８〜１.１モル％で特定される。【００２６】
本発明は、上記のようなヘモグロビン含有リポソームの製造方法も提供することができる。
【発明の効果】
【００２７】
本発明によれば、人工酸素運搬体としてのヘモグロビン含有リポソームを、高いヘモグロビンの収率にて調製することが出来、かつ、生体内でのヘモグロビンの漏出が抑えられ、安定に血中に存在し、安全に使用し得る該製剤およびその製法を提供し得る。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】リポソーム膜を構成する混合脂質の各組成に対するヘモグロビン含有リポソームの物理的な安定性を示す図である。
【図２】リポソーム膜を構成する混合脂質の各組成に対するヘモグロビン含有リポソームの生体内での安定性を示す図である。
【図３】ヘモグロビン含有リポソームの平均粒子径とヘモグロビン／脂質比の関係を示す図である。
【図４】ヘモグロビン含有リポソームへのＰＥＧ添加量と導入量の関係を示す図である。
【図５】ヘモグロビン含有リポソームへのＰＥＧ添加量とゼータ電位の関係を示す図である。
【図６】ヘモグロビン含有リポソームによるヒト血漿中での補体系活性化とゼータ電位の関係を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
以下に本発明の実施の形態を具体的に説明する。
リポソームは、リン脂質二重膜からなり、脂質の疎水性基と親水性基との極性に基づいて生ずる膜により外界から隔てられた空間を形成する構造を有する閉鎖小胞（リポソームカプセル）の水性分散液である。膜を隔てて閉鎖小胞内外の水相は、それぞれ内液、外液と称される。ヘモグロビン含有リポソームは、リポソームカプセル内にヘモグロビンを取り込んだ、すなわち内液としてヘモグロビン溶液を封入したリポソーム製剤である。
【００３０】
本発明において、リポソームの膜は、リン脂質、コレステロールおよび高級飽和脂肪酸の混合脂質で構成される。
リン脂質は、生体膜の主要構成成分であり、分子内に長鎖アルキル基から構成される疎水性基とリン酸基より構成される親水性基のグループを持つ両親媒性物質である。リン脂質は、上記構造のリポソームを形成しうるものであれば、天然または合成のいずれのものでも使用可能であり、たとえば、ホスファチジルコリン（レシチンと称することもある）、ホスファチジルエタノールアミン（略称ＰＥ）、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、さらにスフィンゴミエリンなどのスフィンゴリン脂質、カルジオリピンなどの天然あるいは合成のリン脂質もしくはこれらの誘導体、糖類を結合させた誘導体（糖脂質）およびこれらの水素添加物（飽和リン脂質）などを挙げることができる。
これらのうちでも、飽和リン脂質が好ましく、その具体例として、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、スフィンゴミエリンなどの水素添加物、およびこれらの混合物が挙げられる。特に、これらが卵黄あるいは大豆由来であって、水素添加率が５０％以上のものが好ましい。
【００３１】
本発明において、コレステロールは、上記リン脂質１モルに対し、０.７〜１.０モルの量で存在する。
【００３２】
高級飽和脂肪酸としては、炭素数１２〜１８の直鎖をもつものが挙げられ、具体的には、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸などが挙げられる。特に、ステアリン酸が好ましい。
本発明において、高級飽和脂肪酸の含有量は、混合脂質すなわちリン脂質、コレステロールおよび高級飽和脂肪酸の総量に対し、２５〜３０モル％である。
【００３３】
このように、特にヘモグロビンを内封するリポソームにおいて、リポソームの膜が、コレステロール／リン脂質（モル比）が０.７〜１.０でかつ高級飽和脂肪酸の含有率が２５〜３０モル％という限定された混合脂質で構成されることにより、製造時のヘモグロビン収率および脂質収率ならびにヘモグロビンの高い封入率（ヘモグロビン／脂質比）を確保しつつ、内液にヘモグロビンを高濃度に含有していてもリポソーム膜の強度が保たれ、物理的安定性とともに生体内投与時に内液漏出などを生じにくいリポソーム（膜）安定性を得ることができる。
【００３４】
本発明では、リポソームの膜が、ＰＥＧ結合リン脂質で修飾されているのが好ましい態様である。ＰＥＧの分子量は、特に限定されないが、通常、重量平均分子量が５００〜１０,０００程度である。ＰＥＧ結合リン脂質のリン脂質は、上記リポソーム膜構成成分と同様のリン脂質を挙げることもでき、特に限定されないが、ＰＥＧ結合リン脂質として、典型的には、入手容易なポリエチレングリコール結合ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ-ＤＳＰＥ）などが挙げられる。
【００３５】
本発明では、ＰＥＧ結合リン脂質を、膜構成脂質総量に対して０.８モル％以上の量で含む。
本発明では、このＰＥＧ結合リン脂質は、リポソーム膜の外表面に結合している。リポソーム膜の外表面のみをＰＥＧ結合リン脂質で修飾すれば、リポソーム（カプセル）の膜の外表面から外液側のみにＰＥＧ鎖が延在する構造となる。
【００３６】
なお、ＰＥＧ結合リン脂質によるリポソームの表面修飾は、生体内投与時のリポソーム表面への蛋白吸着抑制効果が知られており、リポソームの血漿中での凝集防止効果および血中滞留性を長引かせる効果をもたらすことが知られている。
本発明では、このような公知の効果に加え、特に、リポソームの表面電位を中性ないしプラスとするために、上記に特定される従来よりも多量のＰＥＧ結合リン脂質を導入する。ＰＥＧ結合リン脂質の導入量が、膜構成脂質総量に対して０.８モル％以上であると、リポソーム製剤のゼータ電位が０ｍＶ以上となり、すなわちリポソームの表面電位が中性ないしプラスとなる。この場合、荷電物質としての脂肪酸を多く含むリポソーム製剤であっても、生体内でのリポソーム膜の強度が保たれるとともに、生体内での補体系の活性化を回避することができる。
【００３７】
なお、上記ＰＥＧ結合リン脂質の量の上限は、後述する製造例で説明するとおり、多量に使用しても導入効率が低下する製造効率の観点から、膜構成脂質総量に対し１.１モル％が好ましい。
【００３８】
ヘモグロビン含有リポソームは、リン脂質を含む膜成分からリポソーム（分散液）を調製する常法により、膜成分として上記で特定される混合脂質を用い、内液としてヘモグロビン溶液を取込ませることにより調製することができる。
ヘモグロビン溶液は、たとえば特開２００６−１０４０６９号公報の段落［００３２］〜［００３８］などに記載される方法に準じて調製することができ、その記載を引用することで、本明細書に記載されているものとして説明を省略することができる。
ヘモグロビン原料が天然血液である場合には、赤血球膜（ストローマ）の破壊すなわち溶血後、ストローマおよび血液型物質などの赤血球細胞基質を分離除去し、ストローマフリーヘモグロビン（ＳＦＨ）とした後、精製、濃縮などの処理を行って、リポソーム製剤化に適切な安全で高純度のストローマフリーヘモグロビン溶液を調製する。
【００３９】
天然由来のヘモグロビン溶液は、公知のろ過方法を適用して無菌性を保証するとともに、ウイルス除去・不活化して安全性を保証する。ウイルスの除去または不活化方法は、ヘモグロビンたんぱく質を実質上変性させない方法であれば公知の方法を広く利用することができる。たとえば限外ろ過膜あるいはウイルス除去膜によるウイルス除去処理、加熱処理、マイクロウエーブ照射による短時間熱処理、紫外線照射処理、ジメチルメチレンブルーなどの光増感物質を利用する光増感作用を利用した処理、ＳＤ（ソルベント・デタージェント法などの不活化処理がある。より詳しくは、ヘモグロビン溶液の６５℃以上で１０時間の加熱もしくはソルベント・デタージェント法によるウイルス不活化処理、分画分子量が１０〜３０万程度の限外ろ過膜あるいはウイルス除去膜（旭化成社  プラノバ、メルクミリポア社  バイアソルブ等）によるウイルス除去処理が好ましく行われる。
【００４０】
精製後のヘモグロビン溶液は、通常４０〜５０％の濃度でリポソームカプセル内に取り込むことが望ましく、この濃度とするための濃縮には、分画分子量３万程度の限外ろ過フィルターを用いた限外濃縮などを使用することができる。
【００４１】
また、ヘモグロビン溶液には、ヘモグロビンの酸化抑制を目的とする物質を含ませることができる。また、2,3-ジフォスフォグリセレート（2,3-ＤＰＧ）、ピリドキサールリン酸、イノシトールヘキサリン酸（ＩＰ６）などのリン酸化合物をアロステリックエフェクターとして添加してもよい。
【００４２】
ヘモグロビン溶液のリポソームカプセル内への取込みは、常法にしたがえばよいが、たとえば膜成分の混合脂質を水和させ、ヘモグロビン溶液と高速撹拌機で撹拌すればリポソームカプセルの分散した懸濁液を得ることができる。この懸濁液を遠心分離あるいは、膜ろ過処理して、リポソーム内に取込まれなかったヘモグロビン溶液を除去した後、生理食塩水などの等張液を外液としてヘモグロビン含有リポソーム分散液を得る。
【００４３】
ヘモグロビン含有リポソームは、赤血球より小さい平均粒子径が好ましい。通常、フィルター処理により平均粒子径２００〜２５０ｎｍに調整される。
また、分画分子量３０万の限外濾過による循環濾過システムを用いて、生理食塩水による加水濃縮操作で、リポソームに取り込まれなかったヘモグロビンなどを除去し、かつ所望濃度に濃縮することができる。
本発明では、上記特定の混合脂質のリポソーム膜によって、このような平均粒子径２００〜２５０ｎｍのヘモグロビン含有リポソームにおいて、ヘモグロビン／脂質（質量比）が１.１〜１.６の比率を実現できることを確認している。
【００４４】
このようにヘモグロビン含有リポソームを調製した後、ＰＥＧ結合リン脂質を上記特定量となる量で添加すれば、本発明の好ましい形態である外表面がＰＥＧ結合リン脂質で修飾されたヘモグロビン含有リポソームを得ることができる。
【実施例】
【００４５】
以下に、本発明の実施例を示す。これら例は、本発明を具体的に説明するためのものであって、本発明の範囲はこれら実施例の記載によって限定されるものではない。
使用した材料を以下に示す。
ヘモグロビン溶液（ヘモグロビン濃度４０ｗ／ｖ％以上）：ヒト濃厚赤血球製剤より、赤血球を溶血させ、抽出、精製し、イノシトールヘキサリン酸（ＩＰ６）をヘモグロビン（Ｈｂ）に対して等モル添加して調製された。
水素添加ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）：（Lipoid KG 社）
コレステロール：（Solvay pharmaceuticals B.V. 社）
ステアリン酸：（日本精化社）
ポリエチレングリコール結合リン脂質：ＰＥＧ5000−ＤＳＰＥ（ポリエチレングリコール−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン，ＰＥＧの重量平均分子量５０００，日本油脂社）【００４６】
（製造例１）
（１）混合脂質の調製
ＨＳＰＣ（分子量７９０）、コレステロール（分子量３８７）およびステアリン酸（分子量２８４）を、表１に示す各量で秤量し、所定量のｔ−ＢｕＯＨに加温溶解後、凍結乾燥によりｔ−ＢｕＯＨを除去して、表１に示す所定配合比（モル比）の混合脂質（１）〜（６）を調製した。【００４７】
（２）ヘモグロビン含有リポソームの調製
上記混合脂質の約７７ｇに、それぞれ注射用水約７７ｍＬを加え、脂質を加温、膨潤させた。これに、ヘモグロビン溶液約５５０ｇを加え、良く混和した後、高速撹拌型の装置を用いて、混和物を冷却しつつ、１０〜４５℃の範囲で、断続的な乳化によって乳化物を調製した。
乳化物を生理食塩水で希釈し、フィルター処理した。すなわち、孔径０.４５μｍのクロスフローフィルターと、同孔径のデッドエンドフィルターとにより、粗大粒子を除去して平均粒子径を適切な範囲に制御した。更に、分画分子量３０万の限外濾過による循環濾過システムを用いて、生理食塩水による加水濃縮操作で、リポソームに取り込まれなかったヘモグロビン及びＩＰ６を除去、濃縮し、ヘモグロビン含有リポソームの生理食塩水懸濁液（内液：ヘモグロビン溶液、外液：生理食塩水）を得た。
（３）表面修飾
次に、この懸濁液に、最終的に、ヘモグロビン濃度が６ｗ／ｖ％で、ＰＥＧ5000−ＤＳＰＥ濃度が０.１５ｗ／ｖ％となるよう算出された必要量のＰＥＧ5000−ＤＳＰＥを添加し、加温して、リポソーム膜の外表面にＰＥＧ5000−ＤＳＰＥを導入してヘモグロビン含有リポソーム（以下、製剤とも記す）を得た。【００４８】
＜分析＞
上記で調製された各製剤の物理的化学的特性値を表２に示す。また、それらの測定方法を以下に示す。
〔平均粒子径の測定〕
製剤検体を生理食塩水で希釈し、光散乱回折式粒度分布計（ベックマンコールターＬＳ２３０）によりリポソームの平均粒径を測定した。【００４９】
〔シアンメトへモグロビン法によるヘモグロビン濃度の分析〕
製剤検体に、シアンメトヘモグロビン法用の発色試液を加え、液体窒素中で急速冷却して一旦凍結した後、流水中で融解し、所定量の水を加え、さらに、氷冷下で、ジメチルスルホキシドを加えて振り混ぜ放置後、水を加えて正確に容量を合わせて試料溶液とした。
別に、各種所定濃度のヘモグロビン溶液に発色試液を加え、ジメチルスルホキシドを加えて振り混ぜ、標準溶液を調製した。
発色試液の所定の希釈液を対照とし、試料溶液及び標準溶液について波長５４０ｎｍにおける吸光度を測定し、試料溶液及び標準溶液との吸光度比から、検体のヘモグロビン濃度を算出した。【００５０】
製剤（２）〜（５）については、外液中に残存するヘモグロビン濃度（外液ヘモグロビン濃度）を測定した。外液の試料溶液は、製剤を超遠心分離（５０,０００ｘｇ×１２０分）した上清を用いた。【００５１】
〔膜組成の分析〕
製剤検体に、所定量の内標準溶液、さらにクロロホルムを加えて激しく振り混ぜ、遠心分離（３,０００ｒｐｍ×１０分間）した。上澄液を０.２０μｍのメンブランフィルターでろ過して試料溶液とした。
別に、ＨＳＰＣ、コレステロール、ステアリン酸およびＰＥＧ5000−ＤＳＰＥの各標準品を精密に秤量し、クロロホルムを加えて溶かし、さらに、内標準溶液と所定量の生理食塩液を加え、標準溶液とした。
試料溶液及び標準溶液について、酢酸ナトリウム／酢酸を移動相とした逆相ＨＰＬＣを実施し、示差屈折計により検出される、試料溶液の内標準物質のピーク面積に対する各成分のピーク面積の比より、各成分量を算出した。【００５２】
なお、上記分析で求めたステアリン酸の組成（モル％）は、ＨＳＰＣ、コレステロール、ステアリン酸の膜構成脂質総量に対する割合であり、ＰＥＧ5000−ＤＳＰＥの組成（モル％）の場合も、同様に膜構成脂質総量に対する割合である。【００５３】
〔ヘモグロビン収率〕
製造例の方法により得られた製剤中のヘモグロビン量を、リポソ−ム化処理前の処理液中のヘモグロビン量で除した数値に１００を掛けた値を、ヘモグロビン収率とした。【００５４】
〔脂質収率〕
製造例の方法により得られた製剤中の脂質量を、リポソ−ム化処理前の処理液中の脂質量で除した数値に１００を掛けた値を脂質収率とした。【００５５】
〔ヘモグロビン／脂質（質量比）〕
製造例の方法により得られた製剤中のヘモグロビン濃度を脂質濃度で除した数値をヘモグロビン／脂質とした。【００５６】
【表１】
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【表２】
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【００５７】
表２に示すとおり、ヘモグロビン収率および脂質収率は、いずれも、リン脂質／ステアリン酸＝１／１（モル比）一定の場合には、コレステロールのモル比が１以下の場合（製剤（１），（４））ほぼ同等であるのに対し、１より大きい製剤（６）では、大幅な低下が見られた。一方、リン脂質／コレステロール＝１／１（モル比）一定の場合（製剤（２）〜（５））には、これらの収率はステアリン酸の量が増加するほど増加した。
また、ヘモグロビン／脂質の比は、リン脂質／ステアリン酸＝１／１（モル比）一定の場合には、コレステロール量の増加に伴い小さくなる傾向が見られるのに対し、リン脂質／コレステロール＝１／１（モル比）一定の場合には、ステアリン酸の量が増加するほど増加した。【００５８】
（試験例１）シェアストレスによるヘモグロビン漏出試験
リポソームの物理的な安定性の評価として、フィルターを循環通過させる評価法にて検討を行った。この試験では、リポソームの物理的強度の指標として、圧力をかけて、メンブレンフィルターを循環通過させた際のリポソームから漏出したヘモグロビン量を以下のとおり測定した。
上記で調製された製剤（２）〜（５）を、各４０ｍＬ、リザーバーとして用いる各プラスチック容器に入れ、３７℃にて加温し、ペリスタリックポンプに取り付けたチューブを介して、２６ｍｍ径のディスクフィルター（孔径５.０μｍ，膜面積５.３ｍ２，酢酸セルロース膜：ザルトリウス社製）に４時間循環通過させた。
循環を終了させて循環回路中の液を回収後、リザーバー中の液を超遠心処理（３０,０００ｘｇ×６０分）し、リポソームを沈降させた後、遠心上清中のヘモグロビン濃度を、前述のシアンメトへモグロビン法にて定量した。
この定量値から、表１中に示す外液ヘモグロビン濃度の値を差し引いた値をヘモグロビン漏出量とした。
次いで、製剤のヘモグロビン濃度から、外液ヘモグロビン濃度を引いた値を、リポソーム内ヘモグロビン濃度とし、この濃度に対するヘモグロビン漏出量の比率をヘモグロビン漏出率とした。結果を図１に示す。【００５９】
（試験例２）生体内でのリポソーム（膜）安定性評価
ヘモグロビン含有リポソームをラット静脈内投与時のラット血中に漏出したヒトヘモグロビン濃度の検討を行なった。
ＳＤラット（体重２８３.０〜３１７.８ｇ）に、ヘモグロビン含有リポソーム２０ｍＬ／ｋｇを、尾静脈よりシリンジポンプを使い、２ｍＬ／ｋｇ／分の投与速度にて投与した。投与終了５分後にエーテル麻酔下で開腹し、腹大動脈からヘパリン加採血（ヘパリン終濃度５〜１０Ｕ／ｍＬ）を行なった。全血の遠心分離（３,０００ｒｐｍ×１０分）上清を、さらに超遠心分離（５０,０００ｘｇ×１２０分）し得た上清中のヒトヘモグロビン濃度を測定した。【００６０】
検体中のヒトヘモグロビン濃度は、逆相ＨＰＬＣグラジェント法を用い、分離定量を行なった。すなわち、０.１％トリフルオロ酢酸水溶液／０.１％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液を移動相とした、逆相ＨＰＬＣにおいて、ヒトヘモグロビンの標品により、ヘモグロビンの構成タンパク質部分である、グロビンのピーク面積値から検量線を作成し、検体のグロビンのピーク面積から、ヒトヘモグロビンとしての定量値を算出した。結果を図２に示す。【００６１】
上記試験例１では、物理的な力によるヘモグロビンの漏出は、ステアリン酸の含有量が３３モル％までの製剤（製剤（２）〜（４））に比べ、それ以上の製剤（５）では急激な増加が見られた（図１）。
一方、生体内でのリポソーム安定性評価（試験例２）では、ステアリン酸含有量が２６モル％まで（製剤（２），（３））は、ヘモグロビンの血漿中への漏出は低く抑えられていたが、３３モル％の製剤（４）のヘモグロビンの漏出は、１３モル％の製剤（２）の３.５倍程度に増加し、４１モル％の製剤（５）では、さらにその約２倍にまで増加した（図２）。
以上のように、ステアリン酸の含有量比については、膜の総脂質量に対して、少なくとも４１モル％程度までは、多いほど、リポソームを調製する際の、ヘモグロビンの収率が良い結果となったが、生体内での安定性を考慮すると、３０％程度までの範囲が好ましいという結果であった。【００６２】
（製造例２）
ＨＳＰＣ（３，１４９ｇ） 、コレステロール（１，５４３ｇ）及びステアリン酸（８０９ ｇ）とを、夫々秤量し、所定量のエタノール中に加温溶解した。さらに、減圧下で加温し、エタノールを留去して、ＨＳＰＣ、コレステロール、ステアリン酸からなる各成分比率の脂質の混合体を調製した。
さらに、この脂質混合体４.０ｋｇに対して、注射用水４.０ｋｇを加え、脂質を加温、膨潤させ、次いで、ヒト濃厚赤血球製剤からヘモグロビンを抽出、精製し、イノシトールヘキサリン酸をヘモグロビンに対して等モル添加したヘモグロビン溶液（ヘモグロビン濃度４０ｗ／ｖ％以上）２９.５ｋｇを加え、良く混和し、ヘモグロビンと脂質の混合物を得た。
その後、この量比にて調製されたヘモグロビンと脂質の混合物を、高速攪拌型の装置を用いて、乳化温度を１０〜４５℃の範囲に制御するため、冷却しつつ、断続的攪拌乳化を行った。なお、乳化時攪拌条件を調節して複数の製剤を調製した。
乳化処理後、乳化物に生理食塩水１００ｋｇ添加して希釈し、孔径０.４５μｍのクロスフローフィルターと、同孔径のデッドエンドフィルターにより、粗大粒子を除去し、更に、分画分子量３０万の限外ろ過システムにより、生理食塩水による加水濃縮操作でリポソームに含有できなかったヘモグロビンおよびＩＰ６を除去、濃縮しヘモグロビン含有リポソームの生理食塩水による懸濁液を得た。得られた懸濁液の膜構成脂質総量に対して０.９モル％となるようにポリエチレングリコール結合リン脂質を生理食塩水に溶解し、懸濁液に添加し加温処理した。
以上のように調製された、ヘモグロビン含有リポソームについて、試験例１と同様の方法により、ヘモグロビン量並びに、各脂質成分の含量、平均粒子径を測定し、へグロビン／脂質の量比を算出した。
その結果、平均粒子径と、ヘモグロビン／脂質比の間には、図３に示されるように、高い相関性が認められた。即ち、リポソームの平均粒子径は２００〜２５０ｎｍの範囲内とした場合、ヘモグロビン／脂質比は１.１〜１.６の範囲となった（図３）。【００６３】
（製造例３）
製造例１に記載の方法にて製剤（３）と同じ膜脂質成分比を持つヘモグロビン含有リポソームを調製し、当該製剤の表面修飾において、ＰＥＧ5000−ＤＳＰＥ添加量を、膜構成脂質総量に対し０.１〜１.８（モル比）の範囲で変え、製造例１と同様にして、リポソーム表面をＰＥＧ5000−ＤＳＰＥで修飾した。
各添加量に対する導入量を測定し、ＰＥＧ5000−ＤＳＰＥの導入効率と、リポソームの荷電状態（ゼータ電位）並びに、血漿と接触させた際のリポソームによる補体系活性化を検討した。
〔ＰＥＧ導入量〕
製剤検体を超遠心用遠心分離（５０,０００ｘｇ×１２０分、１０℃）し、上清（結合しなかったＰＥＧ5000−ＤＳＰＥを含む）を廃棄し、生理食塩液を加えて懸濁し均一な状態にした。
この懸濁液について、前記〔膜成分の分析〕と同様にして、ＰＥＧ5000−ＤＳＰＥの導入量（モル％）を定量した（ＰＥＧ導入量と略記する）。【００６４】
結果を図４に示す。ＰＥＧ導入量は、添加量があるレベルまでは直線的相関関係で増加したが、添加量が１.２モル％を超えた領域では、その傾きが小さくなった。すなわち、傾きが小さい領域では、添加量が増加するほど、遊離のＰＥＧ結合リン脂質（ＰＥＧ5000−ＤＳＰＥ）量が増加することを意味している。この両直線の交点は、ＰＥＧ5000−ＤＳＰＥ添加量１.１モル％に相当し、この添加量が、遊離のＰＥＧ5000−ＤＳＰＥ量を増やすことなく、導入量を高められる限界であることが確認された。【００６５】
（試験例３）
製造例３で得られたＰＥＧ導入量の異なる各ヘモグロビン含有リポソームの表面荷電を以下のとおり測定した。結果を図５に示す。
製剤検体を、リン酸緩衝化生理食塩水（１３７ｍＭのＮａＣｌ、２.７ｍＭのＫＣｌ及び１０ｍＭリン酸緩衝液，ｐＨ７.４）にてヘモグロビン濃度として０.０６％に希釈し、ゼータサイザー（マルバーン社，Zetasizer ３０００ＨＳ）にてゼータ電位を測定した。結果を図５に示す。
図５に示されるとおり、ゼータ電位は、ＰＥＧ導入量が増えるに従い中性に近づき、０.８モル％以上で、ゼータ電位はほぼゼロとなった。【００６６】
（試験例４）
ヘモグロビン含有リポソームの生体反応の評価指標として、ヒト血漿での補体系活性を以下のとおり検討した。
ヒト正中肘静脈より採血（ヘパリンを終濃度として５Ｕ／ｍＬ添加）した血液を遠心分離（３，０００ｒｐｍ×１５分）し、得られた遠心上清（血漿）に、所定の比率にて、ＰＥＧ導入量の異なるヘモグロビン含有リポソームを混和し、３７℃にて３０分間インキュベーションした。インキュベーション終了後、氷冷にて血漿を急速冷却し、当該血漿に、補体系の反応停止液としてＥＤＴＡ・フサン（鳥居薬品）混合溶液を添加し凍結保存した。この検体について、Ｈｕｍａｎ Ｃ３ａ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔによりＣ３ａ濃度を測定した。
各ＰＥＧ導入量の製剤について、試験例３で測定されたゼータ電位に対するＣ３ａ濃度を図６に示す。
図６に示されるとおり、ゼータ電位と補体系の活性化の関係は逆相関を示し、補体系の活性化は、ゼータ電位が中性に近づくにつれ低下した。【００６７】
（試験例５）
ヘモグロビン含有リポソームについて、生体内でのヘモグロビンの漏出に対する、ＰＥＧ5000−ＤＳＰＥ挿入量の影響についても評価した。
製造例３と同様にして得たＰＥＧ導入量０.３モル％と０.９モル％の各ヘモグロビン含有リポソームを、ラットに静脈内投与し、試験例２と同様にして、ラット血中のヒトヘモグロビン濃度を測定した。結果を表３に示す。
ＰＥＧ導入量が０.９モル％では、ヘモグロビンの漏出が抑制される結果を得た。【００６８】
【表３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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