(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療有効量の抗セラミド抗体又はその生物学的活性断片を含む、移植片対宿主病の予防又は治療剤。
【請求項２】
抗体がヒト化されている、請求項１に記載の剤。
【請求項３】
抗体が、モノクローナル抗体である、請求項１又は２に記載の剤。
【請求項４】
化合物が、患者が放射線を受ける前に投与されるか、又は患者が骨髄移植を受ける前に投与される、請求項１に記載の剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本願出願は、２００７年５月６日に出願された仮出願第６０／９１６，００７号の利益を主張しており、合衆国法典第３５巻第１１９条（ｅ）に基づいて、その全ての内容は、本明細書内に完全に説明されているかのように、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
政府の利益の提示
本発明は、国立衛生研究所の助成金ＣＡ８５７０４の下での政府の支援と共になされた。政府は本発明において特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
１．発明の分野
本発明は、ＧＩ症候群及び移植片対宿主病を治療及び予防する方法の分野におけるものである。
【０００４】
２．関連技術の説明
放射線療法は、依然として、様々な悪性細胞に対する最も効果的な治療法の一つである；しかしながら、骨髄、毛包、表皮及び消化管の正常細胞は、放射線誘導細胞死に対して極めて感受性であり、癌治療のための本治療法の効果的な利用を限定している。骨髄移植は進行性の癌を治療するための別の方法であるが、臓器移植は、宿主における種々の免疫応答をしばしば引き起こし、これは移植片の拒絶及び移植片対宿主病（以下、「ＧＶＨＤ」と言う）をもたらす。骨髄移植は、急性及び慢性白血病、骨髄腫、固形腫瘍（R. J. Jones, Curr Opin Oncol 3 (2), 234(1991); G. L. Phillips, Prog Clin Biol Res 354B, 171(1990)）、再生不良性貧血及び重症免疫不全症の（immunodeficiency's）（R. P. Gale, R. E. Champlin, S. A. Feigら、Ann Intern Med 95(4), 477(1981); G. M. Silber, J. A. Winkelstein, R. C. Moenら、Clin Immunol Immunopathol 44(3), 317(1987)）を含む、多くの悪性及び非悪性疾患を治療するために現在用いられている。移植の前に必要とされるコンディショニング（移植前処置）のレジメンは、患者の免疫系を除去又は抑制するのを目的としており、患者を腫瘍の再発又は感染症にかかりやすくする。最近の、非血縁且つＨＬＡ非同一のドナーの使用は、残念ながらＧｖＨＤの発生率を増加させた。ドナーの骨髄移植片からのＴ細胞の除去はＧｖＨＤを改善するが、このストラテジーは生着不全率を増加させ、治療に有益な移植片対腫瘍効果を顕著に減少させる。そのため、生存全体は改善しない。さらには、強力な前臨床データにも関わらず、コルチコステロイドにＴＮＦアンタゴニストを添加して炎症性サイトカインの作用を減少させることによりＧｖＨＤの転帰の改善を試みる、急性ＧｖＨＤケアの標準が提供する治療的有用性は限られている。したがって、臨床的に最適化され得るのであれば、ＧＩ症候群及びＧｖＨＤの発生率及び重症度を減少させるための代替的なストラテジーに対する緊急の必要性が存在している。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】ＡＳＭａｓｅ及びＢａｘ欠損は、Ｃ５７ＢＬ／６の腸粘膜を放射線誘導微小血管内皮アポトーシスから保護する。近位空腸検体を野生型（第２パネル）及びａｓｍａｓｅ−／−（第３パネル）及びＢａｘ−／−（第４パネル）Ｃ５７ＢＬ／６マウスから１５Ｇｙ  ＴＢＩの４時間後に採取し、非照射野生型マウスから採取した検体（第１パネル）と比較した。内皮細胞のアポトーシス核（赤、ＣＤ３１染色）は、絨毛粘膜固有層において、ＴＵＮＥＬ染色により、非アポトーシス核の青い染色と対照的に、濃縮又は断片化された茶色の核として同定された。矢印はアポトーシス内皮細胞を示す。
【図２】ＡＳＭａｓｅ欠損は、腸粘膜を放射性誘導微小血管内皮アポトーシス及び陰窩幹細胞致死から保護する。（Ａ）ＴＵＮＥＬ染色により評価した、０から１５Ｇｙ  ＴＢＩの４時間後の照射ａｓｍａｓｅ＋／＋及びａｓｍａｓｅ−／−マウスの絨毛固有層におけるアポトーシス細胞の頻度ヒストグラムである。アポトーシス細胞は、ポイントあたり２００の絨毛の粘膜固有層においてスコア化した。データは、２つの実験から得られた平均スコアを表す。（Ｂ）Ｃ３ＨｅＢ／ＦｅＪの近位空腸の横断面を照射前または照射後３．５日のいずれかに採取し、ヘマトキシリンで染色した。生存再生陰窩に典型的である、大きな好色素性陰窩は照射検体において見られ（中段及び下段パネル）、これは対照の非照射陰窩（上段パネル）と比較すると有意に拡大している。（Ｃ）１５Ｇｙ  ＴＢＩ後のａｓｍａｓｅ＋／＋及びａｓｍａｓｅ−／−Ｃ５７ＢＬ／６の剖検から採取した、Ｈ＆Ｅ染色した近位空腸及び大腿骨切片である。致死の日を記している。
【図３−１】Ｂａｘ欠損は、マウスの腸を放射線誘導内皮アポトーシス、陰窩致死及び致死性ＧＩ症候群から保護する。（Ａ）Ｃ５７Ｂｌ／６マウスを１５Ｇｙ  ＴＢＩ（Ａ）又は１３−１５Ｇｙ  ＴＢＩ（Ｂ）に曝露し、組織試料を採取し、図１及び２において記載するように処理した。示された各応答に関する２つの実験において、似たような結果を得た。データを、（Ａ）ポイントあたり２００の絨毛の固有層における平均アポトーシス細胞及び（Ｂ）４匹の各マウスについてスコア化した、１０−２０の周囲由来の平均±標準誤差の生存陰窩として報告した。（Ｃ）１２−１５Ｇｙ  ＴＢＩに曝露後、自家骨髄移植を受けている８−１２週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスの保険数理的な生存率カーブである。保険数理的な生存率は、積極限カプラン−マイヤー法［Kalpan, 1958 #47］により計算した。４−１０匹の動物を群ごとに照射した。データは、複数の実験に起因する照合した生存率の結果を表す。
【図３−２】Ｂａｘ欠損は、マウスの腸を放射線誘導内皮アポトーシス、陰窩致死及び致死性ＧＩ症候群から保護する。（Ａ）Ｃ５７Ｂｌ／６マウスを１５Ｇｙ  ＴＢＩ（Ａ）又は１３−１５Ｇｙ  ＴＢＩ（Ｂ）に曝露し、組織試料を採取し、図１及び２において記載するように処理した。示された各応答に関する２つの実験において、似たような結果を得た。データを、（Ａ）ポイントあたり２００の絨毛の固有層における平均アポトーシス細胞及び（Ｂ）４匹の各マウスについてスコア化した、１０−２０の周囲由来の平均±標準誤差の生存陰窩として報告した。（Ｃ）１２−１５Ｇｙ  ＴＢＩに曝露後、自家骨髄移植を受けている８−１２週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスの保険数理的な生存率カーブである。保険数理的な生存率は、積極限カプラン−マイヤー法［Kalpan, 1958 #47］により計算した。４−１０匹の動物を群ごとに照射した。データは、複数の実験に起因する照合した生存率の結果を表す。
【図４】セラミドの中和は、プラットフォーム生成を中和し、in vitroでの放射線誘導アポトーシスを弱める。（Ａ）１０Ｇｙ  ＩＲ１５分前の抗セラミドＭＩＤ１５Ｂ４（１μｇ／ｍｌ）とのＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞の予備培養は、プラットフォーム生成を弱めた。プラットフォームを、抗セラミドＭＩＤ１５Ｂ４（１：３０）及びＴｅｘａｓ−Ｒｅｄ結合抗マウスＩｇＭ（１：５００）で染色後の明視野顕微鏡検査により定量化した。（Ｂ）アポトーシスを、抗セラミドＭＩＤ１５Ｂ４（１μｇ／ｍｌ）での予備培養の有り又は無しで、Ｈｏｅｓｃｈｓｔビスベンズイミド染色後の核形態学的解析によりＪｕｒｋａｔ細胞において定量化した。最も少なくて１５０個の細胞由来のデータを、３つの独立した実験から得た。
【図５−１】セラミドの隔離は、Ｃ５７ＢＬ／６の腸粘膜を放射線誘導微小血管内皮アポトーシス、陰窩幹細胞死及び致死ＧＩ毒性から保護する。（Ａ）陰窩微小コロニーアッセイにより評価した陰窩生存率である。生存陰窩は、図４に示すように特定され、計数された。各線量レベルにおける生存画分の計算についてのデータを同時に照射された２−４匹の動物からまとめ、マウスごとに１０−２０の周囲をスコア化した。データは、平均±標準誤差として報告した。（Ｂ）ＴＵＮＥＬ染色により評価した、１５Ｇｙ  ＴＢＩの４時間後の照射ａｓｍａｓｅ＋／＋及びａｓｍａｓｅ−／−マウスの絨毛固有層におけるアポトーシス細胞の頻度ヒストグラムである。アポトーシス細胞を、ポイントあたり２００の絨毛の粘膜固有層においてスコア化した。データは、２つの実験から照合した平均スコアを表す。（Ｃ）抗セラミド又はＩｇＭを投与し、１５Ｇｙ  ＴＢＩに曝露した８−１２週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスの保険数理的な生存率カーブである。保険数理的な生存率を、積極限カプラン−マイヤー法［Kalpan, 1958 #47］により計算した。５−１０匹の動物を群ごとに照射した。似たようなデータが３つの実験において得られた。（Ｄ））１５Ｇｙ  ＴＢＩの１５分前の抗セラミドＭＩＤ１５Ｂ４（１００μｇ）とのＣ５７ＢＬ／６マウスの前処理は、対照ＩｇＭ処理と比較して内皮アポトーシスを弱めた。１５Ｇｙ照射後４時間で採取した小腸及び肺組織をＴＵＮＥＬにより染色した。アポトーシス細胞は茶色に染色した核により示される。データ（平均±標準誤差）は、２つの独立した実験の最も少なくて１５０個の絨毛から得た。
【図５−２】セラミドの隔離は、Ｃ５７ＢＬ／６の腸粘膜を放射線誘導微小血管内皮アポトーシス、陰窩幹細胞死及び致死ＧＩ毒性から保護する。（Ａ）陰窩微小コロニーアッセイにより評価した陰窩生存率である。生存陰窩は、図４に示すように特定され、計数された。各線量レベルにおける生存画分の計算についてのデータを同時に照射された２−４匹の動物からまとめ、マウスごとに１０−２０の周囲をスコア化した。データは、平均±標準誤差として報告した。（Ｂ）ＴＵＮＥＬ染色により評価した、１５Ｇｙ  ＴＢＩの４時間後の照射ａｓｍａｓｅ＋／＋及びａｓｍａｓｅ−／−マウスの絨毛固有層におけるアポトーシス細胞の頻度ヒストグラムである。アポトーシス細胞を、ポイントあたり２００の絨毛の粘膜固有層においてスコア化した。データは、２つの実験から照合した平均スコアを表す。（Ｃ）抗セラミド又はＩｇＭを投与し、１５Ｇｙ  ＴＢＩに曝露した８−１２週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスの保険数理的な生存率カーブである。保険数理的な生存率を、積極限カプラン−マイヤー法［Kalpan, 1958 #47］により計算した。５−１０匹の動物を群ごとに照射した。似たようなデータが３つの実験において得られた。（Ｄ））１５Ｇｙ  ＴＢＩの１５分前の抗セラミドＭＩＤ１５Ｂ４（１００μｇ）とのＣ５７ＢＬ／６マウスの前処理は、対照ＩｇＭ処理と比較して内皮アポトーシスを弱めた。１５Ｇｙ照射後４時間で採取した小腸及び肺組織をＴＵＮＥＬにより染色した。アポトーシス細胞は茶色に染色した核により示される。データ（平均±標準誤差）は、２つの独立した実験の最も少なくて１５０個の絨毛から得た。
【図６】ヒト化抗セラミドモノクローナル抗体を生成するために用いた戦略を示すフローチャート。
【図７】抗原（Ａｇ）の開発、スクリーニングのためのＥＬＩＳＡの検証。（挿入図）ＢＳＡ結合セラミドは、スフィンゴイド塩基にＢＳＡ結合Ｃ１６脂肪酸を合成することにより生成した。抗体スクリーニングのためのＡｇの検証はＥＬＩＳＡアッセイにより行い、該アッセイでは、減少する量のＡｇを、プレートに固定し、ブロッキング後に各ウェルを、抗セラミドＭＩＤ１５Ｂ４抗体（１：１００）、次に西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＭと共にインキュベートした。ＯＤを、（西洋ワサビペルオキシダーゼ）ＨＲＰ基質の投与後に６５０ｎｍで評価した。
【図８】ＢＳＡセラミドＥＬＩＳＡは、カポジ肉腫細胞での免疫後の上清＃３６７３における増大した結合活性を明らかにした。１：１００希釈でのＥＬＩＳＡにより免疫されたマウスから採取したプラズマ試料の結合は、試料＃３６７４に対して、試料＃３６７３によるセラミドのより高度な結合を明らかにした。結合活性は、抗体産生Ｂ細胞（ｓｎ７３−Ｉ−Ｃ６）の不死化後もとどまり、抗セラミド結合活性を伴うモノクローナル２Ａ２  ＩｇＭの単離を可能にする（非掲載）。
【図９】精製したモノクローナル２Ａ２抗体は、ＢＳＡセラミドに結合する。Ｅｌｉｓａは、２Ａ２マウスモノクローナルＩｇＭがＢＳＡセラミドに結合することを明らかにした。Ｅｌｉｓａは、図７にあるように行われ、対照ＩｇＭに対して、２Ａ２のより著しい結合能力を示す。２Ａ２は、ＭＩＤ１５Ｂ４マウスＩｇＭよりも５−１０倍効率悪くセラミドに結合する。
【図１０】２Ａ２は、in vitroでの、放射線誘導アポトーシスを中和する。８Ｇｙ  ＩＲ前１５分の抗セラミド２Ａ２（０−１００μｇ／ｍｌ）でのＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞の予備培養。抗セラミド抗体での予備培養の有り又は無しでの、Ｈｏｅｓｃｈｓｔビスベンズイミド染色後の、核形態学的解析により、アポトーシスをＪｕｒｋａｔ細胞において定量化した。データは、３つの独立した実験から得た最も少なくて１５０個の細胞由来である。
【図１１】２Ａ２は、in vivoでの１５Ｇｙ後の陰窩生存率を増強した。（Ａ）漸増用量の２Ａ２抗セラミド（０−７５０μｇ）でのＣ５７ＢＬ／６マウスの前処理は、１５Ｇｙ  ＴＢＩ後３．５日の陰窩生存率を改善する。（Ｂ）２Ａ２抗セラミド抗体は、１．２の線量修飾係数（ＤＭＦ）（過去の研究において、ＡＳＭａｓｅ欠損は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて、１．２のＤＭＦで陰窩生存率を増加させた）による８−１５Ｇｙ  全身照射後の陰窩生存率を増加させる。陰窩生存率は、図５ｃにあるようにして決定した。
【図１２】２Ａ２抗体は、１４−１７Ｇｙ  単一線量の放射線に曝露したＣ５７ＢＬ／６マウスの生存率を改善する。ＩＲ前１５分、７５０μｇ  ２Ａ２の有り又は無しでのＣ５７ＢＬ／６マウスを、１４−１７Ｇｙ  ＴＢＩで照射した。マウスは、ＩＲの１６時間内に、３×１０６自家骨髄細胞を注入された。生存率を、モニタリングし、カプラン−マイヤーパラメータを用いて表した。統計的有意性（ｐ＜０．０５）を、各線量において達成した。
【図１３】２Ａ２抗体は、in vivoでの放射線誘導ＧＩ死を弱め、ａｓｍａｓｅ−／−表現型を再現する。図１２において行った生存率の研究からの、瀕死の時に屠殺したマウスの剖検結果。近位空腸検体が９０％より多い陰窩−絨毛ユニットの露出を見せ、且つ陰窩の再生がない場合、ＧＩ死と判定した。脱灰した大腿骨切片が、造血因子の枯渇及び大量出血を示す場合、骨髄（ＢＭ）死と判定した。
【図１４】急性ＧｖＨＤの免疫病態生理を示す図解。
【図１５】宿主ＡＳＭａｓｅは、移植片対宿主に関連する疾病率及び死亡を制御する。致死に照射された（１１００ｃＧｙ）Ｃ５７ＢＬ／６ａｓｍａｓｅ＋／＋又はＣ５７ＢＬ／６ａｓｍａｓｅ−／−マウスは、脾臓Ｔ細胞（３ｘ１０６）の有り又は無しでのＬＰ  ＴＣＤ−ＢＭ細胞（５ｘ１０６）の静脈注射を受けた。カプラン−マイヤー生存率（Ａ）及び５つの臨床パラメータ（体重減少、猫背の姿勢、活動性低下、毛の波打ち現象（fur ruffling）及び皮膚病変）の週に一度の評価から導出される臨床的ＧｖＨＤスコア；１１７（Ｂ）を示しており、これは、２つの実験から集められた群ごとに６−８のＢＭ対照及び１３−１４のＢＭ＋Ｔ細胞レシピエントを示す。統計解析は次の通りである：（Ａ）□対■  ｐ＜０．００１、■対●  ｐ＜０．００１。（Ｂ）□対■  ｐ＜０．０５、■対●  ｐ＜０．０５。
【図１６−１】in vivoにおいて活性化された同種異系ＣＴＬは、ex vivoにおける効率的致死のために標的肝細胞ＡＳＭａｓｅを必要とする。実施例１に記載するように単離した肝細胞を、ＬＰ  ＢＭ＋Ｔ細胞の移植後１０−１４日に、致死的に照射された野生型Ｃ５７ＢＬ／６のレシピエントから採取した脾臓Ｔ細胞と共培養した。（Ａ）２ｘ１０６ＧｖＨ活性ＣＴＬを、０．５ｘ１０６野生型Ｃ５７ＢＬ／６又はＢ６．ＭＲＬ．ｌｐｒ（ＦａｓＲ−／−）肝細胞（左パネル）と共に、完全培地で１６時間共培養した。あるいは、ＤＭＳＯ又はコンカナマイシンＡで前処理した（１００ｎｇ／ｍｌ、３０分）ＧｖＨ活性化ＣＴＬを、０．５ｘ１０６野生型Ｃ５７ＢＬ／６肝細胞と共に、１６時間共培養した（右パネル）。アポトーシスを、固定後に核のビスベンズイミド染色により定量化した。（Ｂ）ａｓｍａｓｅ−／−肝細胞は、ＧｖＨ活性化ＣＴＬにより誘導されたアポトーシスに対して抵抗性である。ＣＴＬ共培養を、（Ａ）にあるように行い、アポトーシスをこの１６時間後に定量化した。（Ｃ）２ｘ１０６ＧｖＨ活性化Ｔ細胞と共に懸濁液中で１０分共培養後の、ａｓｍａｓｅ＋／＋（上段左パネル）及びａｓｍａｓｅ−／−（下段左パネル）のＣ５７ＢＬ／６肝細胞の代表的画像。肝細胞を、実施例１に記載するようにＤＡＰＩ及びＣｙ−３標識抗セラミドｍＡｂで固定し、染色した。矢印は、原形質膜の外層におけるセラミドリッチプラットフォーム生成を示す。留意すべきは、インキュベーション後、染色及びイメージング前に、細胞を５０ｘｇで４分、４℃で遠心分離した。したがって、肝細胞（大きな青い核）と共に分布しているＣＴＬ（小さな青い核）は、生物学的関連性を反映していない。（Ｄ）２ｘ１０６ＧｖＨ活性化ＣＴＬとインキュベーション後のａｓｍａｓｅ＋／＋及びａｓｍａｓｅ−／−肝細胞における、セラミドリッチプラットフォームの定量。０．５ｘ１０６肝細胞を、示した時間共培養し、上記のように固定し、染色した。（Ｅ）外因性Ｃ１６−セラミドは、標的細胞ＡＳＭａｓｅの必要性を回避し、ＧｖＨ活性化ＣＴＬ刺激ａｓｍａｓｅ−／−肝細胞にアポトーシスを付与する。アポトーシスを、（Ａ）にあるように定量化した。（Ｆ）ナイスタチンでの膜ＧＥＭの崩壊は、ＣＴＬ誘導肝細胞アポトーシスを阻害する。５０μｇ／ｍＬ  ナイスタチンで３０分間予備培養し、１％脂質フリーＦＢＳ含有ＲＰＭＩで再懸濁した、０．５ｘ１０６野生型肝細胞を、２ｘ１０６ＧｖＨ活性化Ｔ細胞と共培養し、アポトーシスを、（Ａ）にあるように定量化した。データ（平均±標準誤差）は、パネルＡ、Ｂ、Ｄ、Ｅ及びＦのそれぞれについての３つの独立した実験の３連の測定値を表す。
【図１６−２】in vivoにおいて活性化された同種異系ＣＴＬは、ex vivoにおける効率的致死のために標的肝細胞ＡＳＭａｓｅを必要とする。実施例１に記載するように単離した肝細胞を、ＬＰ  ＢＭ＋Ｔ細胞の移植後１０−１４日に、致死的に照射された野生型Ｃ５７ＢＬ／６のレシピエントから採取した脾臓Ｔ細胞と共培養した。（Ａ）２ｘ１０６ＧｖＨ活性ＣＴＬを、０．５ｘ１０６野生型Ｃ５７ＢＬ／６又はＢ６．ＭＲＬ．ｌｐｒ（ＦａｓＲ−／−）肝細胞（左パネル）と共に、完全培地で１６時間共培養した。あるいは、ＤＭＳＯ又はコンカナマイシンＡで前処理した（１００ｎｇ／ｍｌ、３０分）ＧｖＨ活性化ＣＴＬを、０．５ｘ１０６野生型Ｃ５７ＢＬ／６肝細胞と共に、１６時間共培養した（右パネル）。アポトーシスを、固定後に核のビスベンズイミド染色により定量化した。（Ｂ）ａｓｍａｓｅ−／−肝細胞は、ＧｖＨ活性化ＣＴＬにより誘導されたアポトーシスに対して抵抗性である。ＣＴＬ共培養を、（Ａ）にあるように行い、アポトーシスをこの１６時間後に定量化した。（Ｃ）２ｘ１０６ＧｖＨ活性化Ｔ細胞と共に懸濁液中で１０分共培養後の、ａｓｍａｓｅ＋／＋（上段左パネル）及びａｓｍａｓｅ−／−（下段左パネル）のＣ５７ＢＬ／６肝細胞の代表的画像。肝細胞を、実施例１に記載するようにＤＡＰＩ及びＣｙ−３標識抗セラミドｍＡｂで固定し、染色した。矢印は、原形質膜の外層におけるセラミドリッチプラットフォーム生成を示す。留意すべきは、インキュベーション後、染色及びイメージング前に、細胞を５０ｘｇで４分、４℃で遠心分離した。したがって、肝細胞（大きな青い核）と共に分布しているＣＴＬ（小さな青い核）は、生物学的関連性を反映していない。（Ｄ）２ｘ１０６ＧｖＨ活性化ＣＴＬとインキュベーション後のａｓｍａｓｅ＋／＋及びａｓｍａｓｅ−／−肝細胞における、セラミドリッチプラットフォームの定量。０．５ｘ１０６肝細胞を、示した時間共培養し、上記のように固定し、染色した。（Ｅ）外因性Ｃ１６−セラミドは、標的細胞ＡＳＭａｓｅの必要性を回避し、ＧｖＨ活性化ＣＴＬ刺激ａｓｍａｓｅ−／−肝細胞にアポトーシスを付与する。アポトーシスを、（Ａ）にあるように定量化した。（Ｆ）ナイスタチンでの膜ＧＥＭの崩壊は、ＣＴＬ誘導肝細胞アポトーシスを阻害する。５０μｇ／ｍＬ  ナイスタチンで３０分間予備培養し、１％脂質フリーＦＢＳ含有ＲＰＭＩで再懸濁した、０．５ｘ１０６野生型肝細胞を、２ｘ１０６ＧｖＨ活性化Ｔ細胞と共培養し、アポトーシスを、（Ａ）にあるように定量化した。データ（平均±標準誤差）は、パネルＡ、Ｂ、Ｄ、Ｅ及びＦのそれぞれについての３つの独立した実験の３連の測定値を表す。
【図１７】in vitroでの混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイの概略図。
【図１８】in vitroでの活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ）アッセイの概略図。
【図１９−１】in vitroでの活性化ＣＴＬは、効率的致死のために標的脾細胞ＡＳＭａｓｅを必要とする。（Ａ）２ｘ１０６照射された（２Ｇｙ）Ｃ５７ＢＬ／６脾細胞／ｍｌ培地で５日間in vitroで、活性化された、エフェクターＢａｌｂ／ｃ脾臓Ｔ細胞と２０分間２：１の標的：エフェクター比率で共培養した際の、ミトトラッカーレッド標識した、ｃｏｎＡ活性化（５ｍｇ／ｍｌで２４時間）標的Ｃ５７ＢＬ／６ａｓｍａｓｅ＋／＋及びＣ５７ＢＬ／６ａｓｍａｓｅ−／−脾細胞の表面に形成された、セラミドリッチプラットフォーム（矢印）の代表的画像。標的脾細胞を４％  リン酸緩衝ホルマリンで固定し、ＤＡＰＩ及びＦＩＴＣ標識抗セラミドｍＡｂで染色した。（Ｂ）クロム遊離アッセイにより測定した、エフェクターＢａｌｂ／ｃ脾臓Ｔ細胞との６時間の共培養後の、５１Ｃｒ標識標的Ｃ５７ＢＬ／６ａｓｍａｓｅ＋／＋及びＣ５７ＢＬ／６ａｓｍａｓｅ−／−脾細胞の溶解。（Ｃ）５００ｎＭ  Ｃ１６−セラミド又はＣ１６−ジヒドロセラミド（ＤＣｅｒ）の存在下での、（Ｂ）にあるような活性化エフェクターＢａｌｂ／ｃ脾臓Ｔ細胞に対する、５１Ｃｒ標識標的Ｃ５７ＢＬ／６ａｓｍａｓｅ−／−脾細胞の細胞溶解応答。（Ｄ）材料及び方法に記載のように１０ｎｇ／ｍｌ  抗ＣＤ３でのＡＩＣＤの誘導後４時間の、Ｃ５７ＢＬ／６ａｓｍａｓｅ＋／＋及びＣ５７ＢＬ／６ａｓｍａｓｅ−／−Ｃ５７ＢＬ／６脾臓Ｔ細胞の表面に形成された、セラミドリッチプラットフォーム（矢印）の代表的画像。細胞を、４％  リン酸緩衝ホルマリンで固定し、ＤＡＰＩ及びＦＩＴＣ標識抗セラミドｍＡｂで染色した。ＡＩＣＤは、ａｓｍａｓｅ＋／＋Ｔ細胞における平均蛍光強度による決定でセラミドシグナル全体における２．０±０．１倍の増加を誘導するが（未規定の対照に対してｐ＜０．００５）、ａｓｍａｓｅ−／−Ｔ細胞においては明らかではなく、パネル間での全体的な染色における差異を説明している。（Ｅ）（Ｄ）にあるようなＡＩＣＤ誘導後の、プラットフォームにおけるセラミド（上から２番目のパネル）及びＧＭ１（上から３番目のパネル）共局在化の共焦点顕微鏡検出。プラットフォームを、それぞれ抗セラミドＭＩＤ１５Ｂ４及びＦＩＴＣ結合コレラ毒素のＣｙ３抗マウスＩｇＭ検出を用いて同定した。（Ｆ）ＡＩＣＤアポトーシス同胞殺し（apoptotic fratricide）後のＣ５７ＢＬ／６ａｓｍａｓｅ＋／＋又はＣ５７ＢＬ／６ａｓｍａｓｅ−／−脾臓Ｔ細胞のアポトーシス応答を（Ｄ）にあるようにして誘導した。アポトーシスを、核ビスベンズイミド染色の１６時間後に定量した。（Ｇ）５００ｎＭ  Ｃ１６−セラミド又はＣ１６−ジヒドロセラミドの存在下で、（Ｄ）にあるようにＣ５７ＢＬ／６ａｓｍａｓｅ−／−脾臓Ｔ細胞において、ＡＩＣＤを開始した。アポトーシスを、核ビスベンズイミド染色の１６時間後に定量した。データ（平均±標準誤差）は、パネルＢ、Ｃ、Ｆ及びＧについての３つの独立した実験の３連の試料を表す。
【図１９−２】in vitroでの活性化ＣＴＬは、効率的致死のために標的脾細胞ＡＳＭａｓｅを必要とする。（Ａ）２ｘ１０６照射された（２Ｇｙ）Ｃ５７ＢＬ／６脾細胞／ｍｌ培地で５日間in vitroで、活性化された、エフェクターＢａｌｂ／ｃ脾臓Ｔ細胞と２０分間２：１の標的：エフェクター比率で共培養した際の、ミトトラッカーレッド標識した、ｃｏｎＡ活性化（５ｍｇ／ｍｌで２４時間）標的Ｃ５７ＢＬ／６ａｓｍａｓｅ＋／＋及びＣ５７ＢＬ／６ａｓｍａｓｅ−／−脾細胞の表面に形成された、セラミドリッチプラットフォーム（矢印）の代表的画像。標的脾細胞を４％  リン酸緩衝ホルマリンで固定し、ＤＡＰＩ及びＦＩＴＣ標識抗セラミドｍＡｂで染色した。（Ｂ）クロム遊離アッセイにより測定した、エフェクターＢａｌｂ／ｃ脾臓Ｔ細胞との６時間の共培養後の、５１Ｃｒ標識標的Ｃ５７ＢＬ／６ａｓｍａｓｅ＋／＋及びＣ５７ＢＬ／６ａｓｍａｓｅ−／−脾細胞の溶解。（Ｃ）５００ｎＭ  Ｃ１６−セラミド又はＣ１６−ジヒドロセラミド（ＤＣｅｒ）の存在下での、（Ｂ）にあるような活性化エフェクターＢａｌｂ／ｃ脾臓Ｔ細胞に対する、５１Ｃｒ標識標的Ｃ５７ＢＬ／６ａｓｍａｓｅ−／−脾細胞の細胞溶解応答。（Ｄ）材料及び方法に記載のように１０ｎｇ／ｍｌ  抗ＣＤ３でのＡＩＣＤの誘導後４時間の、Ｃ５７ＢＬ／６ａｓｍａｓｅ＋／＋及びＣ５７ＢＬ／６ａｓｍａｓｅ−／−Ｃ５７ＢＬ／６脾臓Ｔ細胞の表面に形成された、セラミドリッチプラットフォーム（矢印）の代表的画像。細胞を、４％  リン酸緩衝ホルマリンで固定し、ＤＡＰＩ及びＦＩＴＣ標識抗セラミドｍＡｂで染色した。ＡＩＣＤは、ａｓｍａｓｅ＋／＋Ｔ細胞における平均蛍光強度による決定でセラミドシグナル全体における２．０±０．１倍の増加を誘導するが（未規定の対照に対してｐ＜０．００５）、ａｓｍａｓｅ−／−Ｔ細胞においては明らかではなく、パネル間での全体的な染色における差異を説明している。（Ｅ）（Ｄ）にあるようなＡＩＣＤ誘導後の、プラットフォームにおけるセラミド（上から２番目のパネル）及びＧＭ１（上から３番目のパネル）共局在化の共焦点顕微鏡検出。プラットフォームを、それぞれ抗セラミドＭＩＤ１５Ｂ４及びＦＩＴＣ結合コレラ毒素のＣｙ３抗マウスＩｇＭ検出を用いて同定した。（Ｆ）ＡＩＣＤアポトーシス同胞殺し（apoptotic fratricide）後のＣ５７ＢＬ／６ａｓｍａｓｅ＋／＋又はＣ５７ＢＬ／６ａｓｍａｓｅ−／−脾臓Ｔ細胞のアポトーシス応答を（Ｄ）にあるようにして誘導した。アポトーシスを、核ビスベンズイミド染色の１６時間後に定量した。（Ｇ）５００ｎＭ  Ｃ１６−セラミド又はＣ１６−ジヒドロセラミドの存在下で、（Ｄ）にあるようにＣ５７ＢＬ／６ａｓｍａｓｅ−／−脾臓Ｔ細胞において、ＡＩＣＤを開始した。アポトーシスを、核ビスベンズイミド染色の１６時間後に定量した。データ（平均±標準誤差）は、パネルＢ、Ｃ、Ｆ及びＧについての３つの独立した実験の３連の試料を表す。
【図２０】２Ａ２抗体は、in vivoでの急性ＧｖＨＤに影響を及ぼし、ａｓｍａｓｅ−／−表現型を部分的に再現する。図１４に記載のような、ＬＰ  ＢＭ及びＴ細胞の移植後のカプラン−マイヤー生存率解析。２Ａ２抗体を受けている群は、１１００ｃＧｙ分割線量ＴＢＩの前半の１５分前に、７５０μｇの抗体を受けた。
【図２１】２Ａ２抗体は、急性ＧｖＨＤに関連する血清サイトカインストームを弱める。図１５からの実験的急性ＧｖＨＤをわずらっているマウスから、ＢＭＴ７日後に血清を採取した。血清インターフェロンγを、製造者のプロトコル（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）にしたがって、ＥＬＩＳＡにより定量化した。
【図２２−１】宿主ＡＳＭａｓｅは、移植片対宿主標的臓器障害及びアポトーシスを決定する。Ｃ５７ＢＬ／６ａｓｍａｓｅ＋／＋又はＣ５７ＢＬ／６ａｓｍａｓｅ−／−マウスに移植を行い、病理組織学的解析のためにその２１日後に屠殺した。（Ａ）代表的な５μＭ  Ｈ＆Ｅ染色した肝臓切片であり、これは、ａｓｍａｓｅ−／−の同腹子と比較して、自家Ｔ細胞を受けたａｓｍａｓｅ＋／＋宿主における、リンパ球浸潤の増加、門脈領域の膨張及び内皮炎を示している。（Ｂ）近位空腸陰窩及び絨毛の代表的な５μＭ  ＴＵＮＥＬ染色切片は、固有層及び陰窩のアポトーシスを示す。矢印は、（Ｃ）及び（Ｄ）においてそれぞれ定量化された、非アポトーシス核の青い染色と対照的な、凝縮又は断片化された茶色の核を含む細胞を示す。絨毛固有層におけるアポトーシス細胞の頻度ヒストグラム（Ｃ）は、２つの実験から集められた、ポイントあたり１５０の絨毛からのデータを示す。陰窩アポトーシス（Ｄ）を、ポイントあたり２００の陰窩においてスコア化し、２つの実験から集められた平均±標準誤差を表す。（Ｅ）Ｃ５７ＢＬ／６レシピエント宿主は、上記のような骨髄移植、あるいはＢ１０．ＢＲ（Ｈ２ｋ）ドナー由来の０．５ｘ１０６Ｔ細胞の有り又は無しでの１０ｘ１０６ＴＣＤ−ＢＭ細胞を受けた。皮膚（舌及び耳）を、骨髄移植後１４日（Ｂ１０．ＢＲレシピエント）又は２１日（ＬＰ）に採取し、ＧｖＨＤスコアは、Ｈ＆Ｅ染色切片での盲検方式での評価で、表皮１ｍｍごとの異常角化及びアポトーシス角化細胞の数（平均±標準誤差）により決定した。データは、３つの独立した実験から集められた、群ごと４−１４匹のマウスを表す。
【図２２−２】宿主ＡＳＭａｓｅは、移植片対宿主標的臓器障害及びアポトーシスを決定する。Ｃ５７ＢＬ／６ａｓｍａｓｅ＋／＋又はＣ５７ＢＬ／６ａｓｍａｓｅ−／−マウスに移植を行い、病理組織学的解析のためにその２１日後に屠殺した。（Ａ）代表的な５μＭ  Ｈ＆Ｅ染色した肝臓切片であり、これは、ａｓｍａｓｅ−／−の同腹子と比較して、自家Ｔ細胞を受けたａｓｍａｓｅ＋／＋宿主における、リンパ球浸潤の増加、門脈領域の膨張及び内皮炎を示している。（Ｂ）近位空腸陰窩及び絨毛の代表的な５μＭ  ＴＵＮＥＬ染色切片は、固有層及び陰窩のアポトーシスを示す。矢印は、（Ｃ）及び（Ｄ）においてそれぞれ定量化された、非アポトーシス核の青い染色と対照的な、凝縮又は断片化された茶色の核を含む細胞を示す。絨毛固有層におけるアポトーシス細胞の頻度ヒストグラム（Ｃ）は、２つの実験から集められた、ポイントあたり１５０の絨毛からのデータを示す。陰窩アポトーシス（Ｄ）を、ポイントあたり２００の陰窩においてスコア化し、２つの実験から集められた平均±標準誤差を表す。（Ｅ）Ｃ５７ＢＬ／６レシピエント宿主は、上記のような骨髄移植、あるいはＢ１０．ＢＲ（Ｈ２ｋ）ドナー由来の０．５ｘ１０６Ｔ細胞の有り又は無しでの１０ｘ１０６ＴＣＤ−ＢＭ細胞を受けた。皮膚（舌及び耳）を、骨髄移植後１４日（Ｂ１０．ＢＲレシピエント）又は２１日（ＬＰ）に採取し、ＧｖＨＤスコアは、Ｈ＆Ｅ染色切片での盲検方式での評価で、表皮１ｍｍごとの異常角化及びアポトーシス角化細胞の数（平均±標準誤差）により決定した。データは、３つの独立した実験から集められた、群ごと４−１４匹のマウスを表す。
【図２３】ドナーのＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖は、ａｓｍａｓｅ−／−宿主において損なわれた。（Ａ）Ｃ５７ＢＬ／６ａｓｍａｓｅ＋／＋及びＣ５７ＢＬ／６ａｓｍａｓｅ−／−レシピエントは、実施例１に記載のように、ＬＰ／Ｊドナー由来の１５−２０６ＣＦＳＥ染色脾臓ＣＤ３＋Ｔ細胞を注入された。脾臓を、その７２時間後に採取し、マルチカラーフローサイトメトリーを行った。ＣＦＳＥが「高い」（平均蛍光値＞１０３である細胞）及び「低い」（平均蛍光値＜１０３）ＣＤ４＋及びＣＤ８＋集団のパーセンテージは、２つの独立した実験のうち代表する１つから示された。（Ｂ）実施例１に記載される、ＬＰ／Ｊ  ＢＭ及びＴ細胞注入後１４日にＣ５７ＢＬ／６  ａｓｍａｓｅ＋／＋及びＣ５７ＢＬ／６  ａｓｍａｓｅ−／−レシピエントから採取したＬｙ９．１＋ドナーのＬＰ／Ｊ  Ｔ細胞のフローサイトメトリー解析。データ（平均±標準誤差）は、２つの独立した実験の４−１２の測定値を表す。
【図２４】Ｔ細胞増殖能は、ａｓｍａｓｅ−／−宿主においてインタクトなままである。同系（ＬＰ）もしくは自家（Ｂａｌｂ／ｃ）脾細胞又はマイトジェン（ＣｏｎＡ）に応えて、ドナーのＬＰ  ＢＭ及びＴ細胞のＣ５７ＢＬ／６ａｓｍａｓｅ＋／＋又はＣ５７ＢＬ／６ａｓｍａｓｅ−／−レシピエントから採取した脾臓Ｔ細胞の増殖を測定するチミジン取り込みアッセイ。データ（平均±標準誤差）は、３つの独立した実験からの３連の測定値を表す。
【図２５】１Ｈ４、５Ｈ９及び１５Ｄ９ハイブリドーマ細胞系を、６回のサブクローニング後に確立した。ハイブリドーマ上清は、Ｊｕｒｋａｔ細胞アポトーシス阻害アッセイにおいて検査され、用量依存的であり、かつ２Ａ２と同程度の保護効果を示した。３つの抗体のアイソタイプを確立した。１５Ｄ９  ｍＡｂは、ＩｇＭ、κである。１Ｈ４及び５Ｈ９  ｍＡｂは、ｍＩｇＧ３、κである。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
略語リスト
ＡＳＭａｓｅ  −  酸性スフィンゴミエリナーゼ
ＢＭＴ  −  骨髄移植
ＣＴＬ  −  細胞傷害性Ｔリンパ球
ＥＲＫ  −  細胞外シグナル関連キナーゼ
ＦＡＤＤ  −  Ｆａｓ関連デスドメイン
ＦｃＲγＩＩ  −  ＦｃレセプターγＩＩ
ＦＩＴＣ  −  フルオレセインイソチオシアネート
ＧＶＨＤ  −  移植片対宿主病
ＧＶＴ  −  移植片対腫瘍
ＩＬ  −  インターロイキン
ＪＮＫ  −  ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ
ｍＨＡｇ  −  副組織適合（histocompatability）抗原
ＭＨＣ  −  主要組織適合（histocompatability）複合体
ＭＬＲ  −  混合リンパ球反応
ＳＤＳ-ＰＡＧＥ  −  ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
ＴＣＲ  −  Ｔ細胞レセプター
ＴＮＦ  −  腫瘍壊死因子
ＴＵＮＥＬ  −  末端ｄＵＴＰニック末端標識
【０００７】
詳細な説明
我々は、抗セラミド抗体の投与が、放射線誘導ＧＩ症候群、移植片対宿主病、炎症性疾患及び自己免疫疾患（本明細書内に列挙された疾患）を含む、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）誘導死及び内皮微小血管（microvasculture）への損傷により介在される数々の疾患を治療及び予防する事を発見した。我々はまた、新規抗セラミドモノクローナル抗体２Ａ２及び以下に記載されるその他のものを発見し、これらは、列挙された疾患を治療又は予防するための、好ましくはヒト化形態での治療用途を有する。本発明の他の実施形態は、１以上のスタチン；又はイミプラミンもしくは他のＡＳＭａｓｅ阻害剤又はＢａｘ阻害剤と共に抗セラミド抗体を投与することにより、上に列挙された疾患を治療又は予防する併用療法を対象とする。さらに、他の実施形態は、ＡＳＭａｓｅ、Ｂａｘ及びＢａｋの発現を低下させるか、さもなければ列挙した疾患のいずれかの症状を低減又は改善する量のアンチセンスヌクレオチド又は低分子干渉ＲＮＡを投与することを含む。最後に、特定の実施形態は、抗セラミド抗体及び１以上のスタチン又はイミプラミンを含む、列挙された疾患を治療又は予防における治療的使用のための組成物を対象とする。
【０００８】
細胞外セラミドは放射線誘導アポトーシスに必要である
【０００９】
脂質ラフトは、スフィンゴ脂質と共に密集したコレステロールからなるはっきりした原形質膜ミクロドメインであり、特定のスフィンゴミエリンにおいて、液体無秩序（liquid-disordered）のバルク原形質膜内に液体秩序（liquid-ordered）ドメインを作る。ラフトは、周囲の膜とはタンパク質及び脂質組成が異なり、多数のグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）−アンカータンパク質、Ｓｒｃファミリーの二重にアシル化されたチロシンキナーゼ及び膜貫通タンパク質を含む、シグナル分子を収容する。さらに、ラフトは、抗原に遭遇した際のＢ細胞レセプター（ＢＣＲ）を含め多数のレセプターが、活性化の際に内又は外に移行する部位としての役割を果たす。最近の証拠は、これらの移行の事象が、多数のシグナル伝達カスケードのために極めて重要であることを示している。
【００１０】
古典的には細胞膜の構成成分として見なされていたスフィンゴ脂質は、１，２−ジアシルグリセロールが、スフィンゴミエリンのセラミドへの加水分解を促進するという実証によりシグナル伝達の重要な調節因子であり得ることが発見された５。ＧＨ３下垂体細胞においてセラミドを産生する酸性スフィンゴミエリナーゼ（ＡＳＭａｓｅ）の活性を同定することにより、これらの研究は、セカンドメッセンジャーとしてのセラミドの役割の可能性を導入した。この役割は、外因性セラミドの添加によるin vitroでの調節されたタンパク質リン酸化反応事象及びキナーゼ活性の同定により支持された（R. N. Kolesnick及びM. R. Hemer, J Biol Chem 265(31), 18803(1990), S. Mathias, K. A. Dressler、並びにR. N. Kolesnic, Proc Natl Acad Sci U S A 88(22), 10009(1991)）。最終的に、腫瘍壊死因子レセプター（ＴＮＦＲ）活性の無細胞系におけるセラミド産生との結合、セラミド産生の阻害によるＴＮＦ−α介在性シグナル伝達の拮抗作用、並びにセラミド産生を欠いた細胞におけるＴＮＦ−αシグナル伝達の外因性セラミドによる再現は、正規の脂質セカンドメッセンジャーとしてのセラミドを確立した（K. A. Dressler, S. Mathias及びR. N. Kolesnick, Science 255(5052), 1715(1992）。
【００１１】
酸性スフィンゴミエリナーゼ（ＡＳＭａｓｅ）は、リソソーム型及び分泌型の２つの形態で存在する、スフィンゴミエリン特異的ホスフォリパーゼＣ（スフィンゴミエリンホスフォジエステラーゼ）であり；これは、多くの細胞型において、迅速なストレス応答を開始させる（R. Kolesnick, Mol Chem Neuropathol 21 (2-3), 287(1994); J. Lozano, S. Menendez, A. Morales ら、J Biol Chem 276(1), 442(2001); Y. Morita, G. I. Perez, F. Parisら、Nat Med 6(10), 1109(2000); F. Paris, Z. Fuks, A. Kangら、Science 293(5528), 293(2001); Santana, L. A. Pena, A. Haimovitz-Friedmanら、Cell 86(2), 189(1996)）。我々の最近の研究は、セラミドリッチプラットフォーム内への原形質膜の脂質ラフトのクラスタリングが、ＡＳＭａｓｅを活性化することができる刺激を増幅することを示した。Grassmeら、J Biol Chem. 2001, 276:20589（これは、参照によって本明細書内に組み込まれる）。これらの研究において、我々は、in vitro及びin vivoにおいて、ＣＤ９５に誘導されてＡＳＭａｓｅが原形質膜外表面へ移行すると放出される、細胞外に配向されたセラミドが、スフィンゴ脂質リッチ膜ラフトにおけるＣＤ９５のクラスタリングを可能にし、並びにＪｅｒｋａｔ細胞におけるアポトーシスを誘導することを示した。ＡＳＭａｓｅの欠損、ラフトの破壊又は表面セラミドの中和は、ＣＤ９５のクラスタリング及びアポトーシスを妨げたが、天然セラミドは、ＡＳＭａｓｅ欠損細胞をレスキューした。データは、セラミドによるＣＤ９５介在性クラスタリングが、シグナル伝達及びアポトーシス細胞死についての必要条件であることを示した。Ｊｕｒｋａｔ細胞は、ヒトＴ細胞白血病細胞株である。
【００１２】
セラミドが、いくつかの細胞型におけるＦａｓ誘導アポトーシスのために必要であることが他の者らによって示されている。我々は、アポトーシス応答開始の際のＵＶ−Ｃ誘導セラミド産生の必要条件を調べた。ＵＶ−Ｃは、１００−２８０ｎｍの波長帯における紫外放射線を意味する。これらの研究において、ＡＳＭａｓｅ活性を阻害するためにイミプラミンが用いられた。５０ｍＭ  イミプラミンでの３０分間のＪｕｒｋａｔ細胞の前処理は、ベースラインのＡＳＭａｓｅ活性を低下させ、刺激後１分でのＵＶ−Ｃ及びＦａｓ誘導ＡＳＭａｓｅの活性化並びに２分でのセラミド産生を無効にし、かつ、刺激後４時間でのアポトーシスを弱めた。これらのデータは、ＡＳＭａｓｅ活性が、最適なＦａｓ又はＵＶ−Ｃ誘導のアポトーシスに不可欠であることを示しているが、この応答におけるセラミドそれ自体の役割を明確にしてはいない。Grassmeら、J Biol Chem. 2001, 276:20589（これは、参照によって本明細書内に組み込まれる）。
【００１３】
セラミドは、分化、増殖及び成長停止において重要な役割を有するが、セラミドに関する最も顕著な役割は、プログラム細胞死の誘導においてである。外因性Ｃ８セラミド及びスフィンゴミエリナーゼは、ＨＬ６０ヒト白血病細胞におけるＴＮＦ−α誘導ＤＮＡ断片化及びクローン原性の低下をミミックし、セラミドがアポトーシスシグナル伝達の必須成分であることを示した（K. A. Dressler, S. Mathias及びR. N. Kolesnic, Science 255(5052), 1715(1992）。電離放射線（ＩＲ）は、セラミドへのスフィンゴミエリンの加水分解を促進し、外因性セラミドは、放射線誘導セラミド産生及びアポトーシスのホルボールエステル介在性の阻害を回避することができた（A. Haimovits-Friedman, C. C. Kan, D. Ehleiterら、J Exp Med 180(2), 525(1994)）。ＡＳＭａｓｅ活性における遺伝的欠損を特徴とする遺伝病である、ニーマン・ピック患者由来のリンパ芽球は、遺伝学的モデルにおいて、ＡＳＭａｓｅ介在性のセラミド産生が放射線誘導アポトーシスに必要であることを証明し、ＡＳＭａｓｅ欠損マウスの開発は、セラミドについての細胞型特異的な役割の同定を可能にした（J. Lozano, S. Menendez, A. Moralesら、J Biol Chem 276(1), 442(2001); P. Santana, L. A. Pena, A. Haimovitz-Freidmanら、Cell 86(2), 189(1996)）。セラミド産生はその後、多数のサイトカイン、ウイルス／病原体、環境ストレス、及び化学療法誘導アポトーシス事象のための必要条件として同定されてきた。Verheij Mら。Requirement for ceramide-initiated SAPK/JNK signaling in stress-induced apoptosis。Nature. 1996 Mar 7; 380(6569): 75-9; Riethmuller Jら。Membrane rafts in host-pathogen interactinons、Biochim Biophys Acta. 2006 Dec: 1758(12): 2139-47（これらは参照によって本明細書内に取り込まれる）。
【００１４】
その後、新たに出てきた多数の証拠は、細菌及び病原体の内在化、並びに放射線及び化学療法誘導アポトーシスに対するシグナル伝達の部位として、セラミド介在性のラフトのクラスタリングを認識した。D. A. Brown及びE. London, Annu Rev Cell Dev Biol 14, 111 (1998): J. C. Fanzo, M. P. Lynch, H. Phee ら、Cancer Biol Ther 2 (4), 392 (2003); S. Lacour, A. Hammann, S . Grazideら、Cancer Res 64 (1O), 3593 (2004); Semac, C. Palomba, K. Kulangaraら、Cancer Res 63 (2), 534 (2003; A. B. Abdel Shakor, K. Kwiatkowska、及び A. Sobota, J Biol Chem 279 (35) 36778 (2004); H. Grassme, V. Jendrossek, J. Bockら、J Zmmunol 168 (1), 298 (2002); M. S. Cragg, S. M. Morgan, H. T. Chanら、Blood 101 (3), 1045 (2003);6 D. Scheel-Toellner, K. Wang, L. K. Assi ら、Biochem Soc Trans 32 (Pt 5), 679 (2004).; D. Delmas, C. Rebe, S. Lacourら、J Biol Chem 278 (42), 41482 (2003).;及び C. Bezombes, S. Grazide, C. Garret ら、Blood 104 (4), 1166 (2004)。
【００１５】
これに関連して、セラミドリッチプラットフォームは、Ｊｕｒｋａｔ細胞（Zhang及びKolesnick、未発表結果）及びウシ大動脈内皮細胞（Stancevic及びKolesnick、未発表結果）におけるＩＲ誘導アポトーシス、ＪＹ  Ｂ細胞におけるＣＤ４０誘導ＩＬ−１２分泌及びｃ−Ｊｕｎキナーゼリン酸化反応、緑膿菌（P. aeruginosa）の内在化及び肺における自然免疫応答の活性化、Ｄａｕｄｉ及びＲＬリンパ腫細胞におけるリツキシマブ誘導ＣＤ２０クラスタリング及びＥＲＫリン酸化反応、Ｕ９３７ヒト単球細胞におけるＦｃＲγＩＩクラスタリング及びリン酸化反応、並びに、ＨＴ２９ヒト結腸癌細胞及び好中球におけるレスベラトロル、シスプラチン、及び活性酸素種誘導アポトーシスのためのシグナルを送る。ＡＳＭａｓｅの移行及び活性化の下流の効果についての更なる研究にも関わらず、ＡＳＭａｓｅシグナル伝達を開始させるカプセース（capsase）非依存の経路があることを我々が示すまで、原形質外膜上へのその移行を介在する起因事象についてはほとんど分かっていなかった。J.A. Rotolo ら、J. Biol. Chem. Vol 280, No. 29, Issue of July 15,26425-34 (2005)（これは、参照によって本明細書内に組み込まれる）。
【００１６】
異なる区画においてセラミドを作るための経路が細胞内には多数ある点を強調しておくことは、重要である。細胞表面においてＡＳＭａｓｅによってラフト内で産生されるセラミドは、細胞内部のセラミドとは異なる。以下に示す結果は、ＡＳＭａｓｅ産生細胞表面セラミドが、内皮微小血管への損傷（ＧＩ症候群の顕著な特徴）を経て、放射線誘導ＧＩ症候群を引き起こすことに関与することを初めて示すものである。我々はさらに、ＡＳＭａｓｅ産生セラミドが、Ｔ細胞介在性の死によって引き起こされるＧＶＨＤに必要であることを示す。したがって、ＡＳＭａｓｅ産生セラミドは、内皮微小血管損傷及びＴ細胞介在性の死の両方に必要である。我々はさらに、in vivoでの抗セラミド抗体の投与による、ＡＳＭａｓｅにより産生されるセラミドの阻害又は隔離は、放射線誘導損傷を低減し、並びにＧＩ症候群及びＧｖＨＤを治療又は予防するために訴えられ（be sued to）得ることを発見した。本発明の特定の実施形態は、（例えば、イミプラミンもしくはアンチセンス核酸で）ＡＳＭａｓｅを阻害すること又は（例えば、抗セラミド抗体単独もしくはスタチンと共に）細胞表面セラミドを不活性化することにより、ＧＶＨＤ及びＧＩ症候群並びに自己免疫疾患を含む他のＴ細胞介在性の疾患を治療又は予防する薬理学的方法を対象にする。
【００１７】
致死的ＧＩ症候群の治療及び予防
【００１８】
小腸の幹細胞を収容する腸コロニー形成区画は、リーベルキューンの陰窩の底から４−９の位置にあり、腸多能性幹細胞及び、本明細書内では幹細胞クロノゲン（clonogens）と呼ばれる未確定の前駆細胞クロノゲンからなる。この群の細胞は、絶え間なく増殖及び分化し、腸細胞の生理学的損失及び絨毛の先端から分化した他の上皮細胞を補充し、したがって、粘膜の解剖学的及び機能的完全性を維持する。この区画の完全な除去は、陰窩−絨毛ユニットを恒久的に破壊するために必要であるようであるが、たとえ陰窩ごとに１つであったとしても、生存している幹細胞クロノゲンは、完全に機能的な陰窩を再生可能である。
【００１９】
放射線は、胃腸微小血管及び増殖性陰窩幹細胞の両方を標的にする。絨毛における微小管内皮のアポトーシスは、照射の４時間後に生じるＧＩ症候群の初期病変を呈する。内皮アポトーシスは、病変を亜致死から致死の陰窩クロノゲンに変換し、再生陰窩の減少をもたらし、ＧＩ毒性を促進する。［３Ｈ］ＴｄＲ及びＢｒｄＵｒｄによる免疫組織学的及び標識研究は、陰窩幹細胞クロノゲンの死が放射線曝露後すぐには起こらないことを明らかにした。むしろ、最も早く検出可能な応答は、放射線誘導ＤＮＡ二本鎖切断（ｄｓｄ）によりシグナルされているらしい、Ｓ期後期チェックポイント及び核分裂停止を経る進行における一時的な線量依存的遅延である。哺乳類細胞において、ＤＮＡ二本鎖切断は、ＤＮＡ損傷の認識及び修復の経路、並びに細胞周期チェックポイント活性の協調的な制御を活性化する。腸幹細胞の核分裂停止は、この経路における制御された事象を表すように思われる。この考えと一致して、腸の周囲あたりの陰窩数における有意な変化はこのステージでは見られないが、陰窩の大きさは、陰窩通過の継続的な通常の移動及び分化した細胞の陰窩から絨毛の上皮層への通常の移動によって徐々に減少する。３６−４８時間での核分裂活性の再開は、陰窩幹細胞クロノゲンの迅速な枯渇及び周囲あたりの陰窩数の減少に関連する。幹細胞枯渇の機序は、完全には確立されていない。
【００２０】
ＧＩ幹細胞クロノゲンの死亡率は、放射線曝露から３．５日後に生存している陰窩の数により最もよく評価され、これは、線量の増加に従って指数関数的に減少する（C. S. Potten及びM. Loeffler, Development 110 (4), 1001 (1990), H. R. Withers, Cancer 28 (I), 75 (1971)及びJ. G. Maj, F. Paris, A. Haimovitz-Friedmanら、Cancer Res 63, 4338 (2003)）。生存幹細胞を含む陰窩は加速度的に増殖し、腸粘膜が正常な構造を取り戻すまで分裂又は出芽して新しい陰窩を産生する典型的な再生陰窩を生じる。いくつかのマウスモデルにおけるＴＢＩ実験は、８−１２Ｇｙに曝露後の生存陰窩幹細胞の数が、通常、粘膜の完全な回復を支持するのに十分であることを実証した。しかしながら、より高い線量では、とても大きな幹細胞クロノゲン損失が、陰窩−絨毛系のほぼ完全な崩壊、粘膜露出及びＧＩ症候群による動物の死を引き起こし得る。ＧＩ死を誘導するための閾値線量及び５０％のＧＩ致死率を与えるＴＢＩ線量（ＬＤ５０）は、系統特異的であるように思われる。ＴＢＩに曝露したＣ５７ＢＬ／６マウスの剖検研究は、１４Ｇｙに曝露したマウスの２５％及び１５Ｇｙに曝露したマウスの１００％が、６．８±０．９９日でＧＩ症候群のため死亡し、１４と１５Ｇｙの間がＧＩ死のＬＤ５０であると予測された。これに対して、報告されたＬＤ５０／６（６日目のＬＤ５０、ＧＩ死に対する代わりのマーカーとしての役割を果たす）は、ＢＡＬＢ／ｃマウスについて８．８±０．７２Ｇｙ、ＢＤＦ１マウスについて１１．７±０．２２Ｇｙ、Ｃ３Ｈ／Ｈｅマウスについて１２．５±０．１Ｇｙ、Ｃ３Ｈ／ＳＰＦマウスについて１４．９Ｇｙ（９５％の信頼限界で１３．９−１６．０Ｇｙ）、及びＢ６ＣＦ１マウスについて１６．４±１．２Ｇｙであり、ＧＩ症候群による死に対するマウスの感受性における、系統特異的スペクトルを示す。骨髄及び肺といった、放射線に対する他の臓器の感受性における系統変動もまた、報告されている。
【００２１】
古典的に、電離放射線（ＩＲ）は、ゲノムＤＮＡへの直接の損傷によりゲノムの不安定性を引き起こすことで細胞を殺し、その結果生殖細胞の死をもたらすと考えられた。Haimovitz-Friedmanらは、無核系において、アポトーシスシグナル伝達が、ＩＲと細胞膜との相互作用により代わりに発生し得ることを実証した。我々による、本明細書に記載したこれらの研究の拡大は、セラミド介在性のラフトクラスタリングが、ＩＲ誘導アポトーシス及びクローン原性細胞の死に関与することを明らかにした。胃腸（ＧＩ）粘膜のクローン原性区画が、ＧＩ損傷誘導の際の照射のための特異的かつ直接的な標的であることは、長い間受け入れられてきた。
【００２２】
我々の初期研究の一部において、我々は、Ｊｕｒｋａｔ細胞においてナイスタチンによって誘導されたコレステロール枯渇と組み合わせて抗セラミドモノクローナル抗体によりセラミド中和を誘導することにより、いずれかの物質のみを用いて得られるよりも、ＵＶ−Ｃ（５−５０Ｊ／ｍ２）の紫外線照射及びin vitroでの抗Ｆａｓ（１−５０ｎｇ／ｍｌ  ＣＨ−１１）誘導アポトーシスに対するより強い保護が得られたことを示した。H. Grassme, H. Schwarz及び E. Gulbins, Biochem Biophys Res Commun 284 (4), 1016 (2001)（これは、参照によって本明細書内に組み込まれる）。これらの研究において、我々は、ナイスタチンとの併用での抗セラミド抗体とのＪｕｒｋａｔ細胞の予備培養が、５０Ｊ／ｍ２  ＵＶ−Ｃ又は５０ｎｇ／ｍｌ  抗Ｆａｓ刺激後１分でのラフトクラスタリングを阻害したことを示した。さらに、抗セラミドとナイスタチンとの併用処理によるラフトクラスタリングの阻害は、刺激後４時間でのＵＶ−Ｃ（５−５０Ｊ／ｍ２）及び抗Ｆａｓ（１−５０ｎｇ／ｍｌ  ＣＨ−１１）誘導アポトーシスを弱め（図２ｄ）、５０Ｊ／ｍ２  ＵＶ−Ｃ又は５０ｎｇ  抗Ｆａｓでの刺激後７日で、細胞生存率をそれぞれ２．４６及び２．４２倍増強した。重要なことには、我々はまた、抗セラミド及びナイスタチン前処理が、５−５０Ｊ／ｍ２  ＵＶ−Ｃ又は抗Ｆａｓ刺激後のビヒクル対照と比較して、クローン原性細胞の生存率における約１ｌｏｇの増加を生み出したことを観察した。単一ヒット多標的モデルによるこれらのクローン原性生存データのプロットは、抗セラミド及びナイスタチンでの前処理が用量応答曲線のＤ０を、１．６±０．７Ｊ／ｍ２から３．６±１．１Ｊ／ｍ２へ増加させたことを明らかにし、これは、１０％の生存レベルでの２．３２の線量修正値と共に、再現的な様式のＵＶ誘導細胞死に対する有意な（ｐ＜０．０５）保護を示す。総合すると、これらの結果は、Ｊｕｒｋａｔ細胞の表面でのセラミド介在性のラフトクラスタリングがＵＶ−Ｃにより誘導されるアポトーシスの膜透過型シグナル伝達に必須であること、及びそのような保護はクローン原性生存の改善により明らかなように、生物学的に意義があることを示した。
【００２３】
単一線量照射後の陰窩幹細胞クロノゲンの死亡率と、腸微小血管系の内皮におけるＡＳＭａｓｅ介在性アポトーシスの初期の波との間の条件的なつながりについての証拠がある。放射線は、原形質膜の外側の層におけるグリコスフィンゴ脂質及びコレステロールリッチなラフト内への分泌非リソソーム形態のＡＳＭａｓｅの迅速な移動を誘導し（E. Gulbins 及びR. Kolesnick, Oncogene 22 (45) 7070 (2003)、そこでセラミドが迅速に産生され、膜透過型のアポトーシスシグナルの伝達が連係されている。内皮細胞は、体内の他の細胞と比較して、分泌型ＡＳＭａｓｅに２０倍富んでおり、この細胞型は、in vitro及びin vivoでの放射線誘導アポトーシスに特に感受性である。ＳＶ１２９／Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＡＳＭａｓｅの遺伝子不活性化、又は全身照射（ＴＢＩ）前の内皮細胞生存因子ｂＦＧＦでのＣ５７ＢＬ／６マウスの静脈注射処理は、腸微小血管系の放射線誘導内皮アポトーシスを弱め、陰窩幹細胞クロノゲンを保存し、ＧＩ症候群による死亡からマウスを保護した（F. Paris, Z. Fuks, A. Kangら、 Science 293 (5528), 293 (2001)）。陰窩上皮細胞ではなく腸内皮細胞が照射の前又は後にｂＦＧＦレセプター転写物を発現することから、血管機能障害は放射線誘導ＧＩ損傷にとって重要であるように思われる。
【００２４】
ＡＳＭａｓｅ欠損及びＢａｘ欠損は、放射線損傷及びＧＩ症候群から保護する
【００２５】
本項は、ａｓｍａｓｅ−／−マウス及びＢａｘ−／−マウスの両方が全身照射（ＴＢＩ）の４時間以内に起こる内皮アポトーシスに抵抗性であることを示す我々の実験を説明する。これは、陰窩クロノゲンにより被った亜致死病変の修復、陰窩−絨毛系の再生、及び致死性ＧＩ症候群の無効化を可能にする。ＧＩ症候群のよく特徴付けられたパラメータは、この系をセラミド標的医薬品の研究のための理想的なモデルにする。以下に、我々は、抗セラミド抗体がａｓｍａｓｅ−／−遺伝子型に類似したレベルまで微小血管アポトーシスを弱め、クローン原性陰窩幹細胞生存及びＧＩ再生を促進することを示す。抗セラミドは、１５Ｇｙ  ＴＢＩ及び同系ＢＭＴを受けたマウスの６０％を保護し、微小血管保護には生物学的意義があることを実証した。
【００２６】
先行研究は、Ｃ５７ＢＬ／６マウス系統及びそのＳＶ１２９／Ｃ５７ＢＬ／６ハイブリッドのＧＩ放射線応答における内皮幹細胞クロノゲンの関連を明らかにした。さらに、これらの研究は、ＳＶ１２９／Ｃ５７ＢＬ／６ハイブリッド系統におけるＧＩ放射線応答でのＡＳＭａｓｅの役割を特徴付けた。F. Parisら、上記を参照。ＡＳＭａｓｅの遺伝子不活性化が、放射線に対する腸応答において血管成分からＣ５７ＢＬ／６を保護するかどうかを調べるために、放射線に対するＳＶ１２９／Ｃ５７ＢＬ／６マウスの腸応答を特徴付けるいくつかの特徴を、ａｓｍａｓｅ＋／＋及びａｓｍａｓｅ−／−のＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて評価した。この系統でのａｓｍａｓｅ＋／＋及びａｓｍａｓｅ−／−遺伝子型における放射線に対する内皮応答のパターンの典型的な組織学的例を示す（図１）。ＳＶ１２９／Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける公表された観察と一致して、野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、１５Ｇｙ  ＴＢＩから４時間後に、大規模な内皮アポトーシスを示し（絨毛固有層における１２のアポトーシス内皮核；図１第２パネル）、ａｓｍａｓｅ−／−及びＢａｘ−／−検体においては、それぞれ３つのアポトーシス核に減少させた（図１、それぞれ第３及び第４パネル）。非照射の対照ａｓｍａｓｅ＋／＋（図１、第１パネル）、ａｓｍａｓｅ−／−又はＢａｘ−／−（非掲載）の固有層においては、たまにのみ（１−３）アポトーシス核が観察された。内皮細胞アポトーシスは、１５Ｇｙへの曝露から早ければ３時間で野生型粘膜において検出され、４時間で最大に到達した（非掲載）。図２Ａは、漸増した線量のＴＢＩへの曝露から４時間後のＣ５７ＢＬ／６マウスの腸固有層におけるアポトーシス核の頻度ヒストグラムを表示している。最大の効果は１５Ｇｙでのａｓｍａｓｅ＋／＋粘膜において観察され、対照非照射マウスにおいて観察された３以下のアポトーシス核／絨毛（ｐ＜０．００１；ｎ＝各データポイントのために計数した２動物由来の２００の絨毛）と比較して、９２％の絨毛が３より多くのアポトーシス核／絨毛を示し、５２％が大規模なアポトーシス（１０より多くのアポトーシス核／絨毛）を示した。ＡＳＭａｓｅ欠損は、アポトーシス応答全体（３より多くのアポトーシス核／絨毛）を３８％にまで、並びに大規模なアポトーシスの頻度を総絨毛の２０％にまで有意に低減させた（それぞれ、野生型同腹子と比較してｐ＜０．００１；ｎ＝各データポイントのために計数した２動物由来の２００の絨毛）。したがって、アポトーシス応答のピークの出現は、ＳＶ１２９／Ｃ５７ＢＬ／６系統よりも１時間遅く起こったが、Ｃ５７ＢＬ／６系統における、放射線誘導内皮細胞アポトーシスの速度及び線量依存性、並びにＡＳＭａｓｅの必要性は、ＳＶ１２９／Ｃ５７ＢＬ／６マウス系統１におけるものと定性的及び定量的に類似していた。
【００２７】
ＳＶ１２９／Ｃ５７ＢＬ／６マウスについて報告されたように（J. G. Maj, F. Paris, A. Haimovitz-Friedmanら、Cancer Res 63, 4338 (2003)）、内皮アポトーシスは、ＴＢＩ後の陰窩幹細胞クロノゲンの生存と密接に相関した。図２ｂは、１５Ｇｙ  ＴＢＩに曝露後３．５日でのＣ５７ＢＬ／６マウスの近位空腸の典型的な横断面を示す。非照射の場合、この系統における陰窩／腸周囲の数は１５５±１．１だった。１５Ｇｙに曝露後、示したＣ５７ＢＬ／６ａｓｍａｓｅ＋／＋マウス由来の検体は、Ｃ５７ＢＬ／６ａｓｍａｓｅ−／−同腹子から得られた検体における２７と比較して、生存再生陰窩を３つしか含まなかった。ＡＳＭａｓｅ欠損は、１０−１５Ｇｙの範囲内の各線量において、陰窩生存比率を有意に増加させた（ｐ＜０．０５）。１５Ｇｙ  ＴＢＩに曝露後３．５日の野生型マウスは、機能的な近位空腸陰窩をほぼ完全に枯渇している（図２ｂ、中段パネル）。暗紫染色された、再生、過色素性陰窩の発現の増加により明らかなように、ＡＳＭａｓｅの遺伝子不活性化は、陰窩生存率を増強した（図２ｂ、下段パネル）。１０％の陰窩生存率の等効果を与えるために必要な線量（Ｄ１０）は、野生型に対しては１４．６±０．９Ｇｙ、ＡＳＭａｓｅ欠損マウスに対しては１６．８±１．８Ｇｙであり（ｐ＜０．０１）、ａｓｍａｓｅ−／−遺伝子型については１．１５±０．１４の線量修正係数（ＤＭＦ）を示した。この値は、ｂＦＧＦによる照射Ｃ５７ＢＬ／６陰窩幹細胞クロノゲンの保護について報告されたＤＭＦとは大きくは異なっていなかった７。
【００２８】
ＡＳＭａｓｅ欠損により与えられた幹細胞クロノゲン保護もまた、１５Ｇｙ  ＴＢＩ後のＧＩ症候群によるＣ５７ＢＬ／６マウスの死に対する保護に翻訳され、これは、ハイブリッドＳＶ１２９／Ｃ５７ＢＬ／６ａｓｍａｓｅ−／−マウスについて報告されたもの１と類似した。ｐ５３欠損Ｃ５７ＢＬ／６マウスが放射線損傷から保護されなかったのに対して（データ非掲載）、Ｃ５７ＢＬ／６ａｓｍａｓｅ＋／＋マウスはＴＢＩから５−６（平均５．３±０．２）日後に死亡した（非掲載）。剖検は、骨髄への一部分の損傷のみ（正常な造血組織の島と混じった、出血の部位及び造血因子の枯渇の部位；それぞれ図２ｃ中段左及び右パネル）を伴う、ＧＩ症候群に典型的な腸損傷（ほとんど全ての陰窩及び絨毛の大規模な露出）を明らかにした。胸腺及びリンパ組織、並びに直接の死因とは思われない種々の臓器における時折の微小腫瘍又は局所出血を除いて、他の臓器に損傷は見られなかった。これに対して、Ｃ５７ＢＬ／６ａｓｍａｓｅ−／−マウスは、７．７５±０．１２日で死亡した（Ｃ５７ＢＬ／６ａｓｍａｓｅ＋／＋マウスと比較した場合、ｐ＜０．００１）。剖検は骨髄死の典型的な特徴を明らかにした（造血因子の完全な枯渇を伴う、大規模な出血及びマトリックスの大規模な壊死；図２ｃ、右下パネル）。さらに、Ｃ５７ＢＬ／６ａｓｍａｓｅ＋／＋マウスにおける陰窩／絨毛ネットワークの完全な崩壊とは対照的に、Ｃ５７ＢＬ／６ａｓｍａｓｅ−／−同腹子の腸粘膜は、腸表面のほとんどを覆う増殖性、好色素性の陰窩を伴う大規模な再生活性を示した（図２ｃ、左下パネル）。
【００２９】
Ｂａｘ欠損は、放射線損傷及びＧＩ症候群からのａｓｍａｓｅ−／−保護を表現型模写する
【００３０】
放射線により誘導され且つＡＳＭａｓｅにより調節される、内皮細胞アポトーシス以外の事象が放射線損傷幹細胞クロノゲンの致死率に影響を与え得るという可能性を排除するためである。幼若マウスの卵母細胞における腫瘍内皮において野生型ＡＳＭａｓｅを発現し、ａｓｍａｓｅ−／−放射線表現型をミミックするアポトーシス耐性Ｂａｘ欠損Ｃ５７ＢＬ／６マウスを用いた実験を行った。Ｂａｘ及びＢａｋは、原型的なプロアポトーシスのＢｃｌ−２マルチドメインタンパク質である。二重欠損（Ｂａｘ−／−及びＢａｋ−／−突然変異の劣性ホモ接合体）は、アポトーシス刺激に対する抵抗性を与えるために必要であると以前には考えられていた。Ｂａｋ欠損マウスについてのデータは掲載していない。
【００３１】
これらの実験で用いられた野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｂａｘ＋／＋系統は、検出可能なベースラインの内皮細胞アポトーシスを示さず、１５Ｇｙ  ＴＢＩへの曝露後に、４時間でピークとなる時間依存的な増加を被った（非掲載）。絨毛の８５％が、１５Ｇｙの４時間後に、３より多い内皮アポトーシス核／絨毛を含み、３８％が大規模な（１０より多いアポトーシス核／絨毛）アポトーシス応答を示した（図３）。Ｂａｘ欠損は、放射線誘導アポトーシス応答全体を４５％まで（ｐ＜０．０５）、並びに大規模なアポトーシスの頻度を絨毛の１２％まで（ｐ＜０．００１；ｎ＝各データポイントのために計数した２動物由来の２００の絨毛）有意に低下させ、既に報告されたＣ５７ＢＬ／６及びＳＶ１２９／Ｃ５７ＢＬ／６におけるａｓｍａｓｅ−／−放射線応答表現型を再現した。Ｂａｘ欠損による内皮アポトーシスの減弱は、１３、１４及び１５Ｇｙ  ＴＢＩに曝露後の陰窩クロノゲンを保護した（図３ｂ）。通説では生存陰窩幹細胞の指標である、１３、１４及び１５Ｇｙ  ＴＢＩ後３．５日での野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける生存陰窩は、非照射の腸周囲における１５２±３から、それぞれ、２０．５±１．３、１０．８±０．６及び２．３±０．３に減少した（それぞれ１３．４±０．９％、７．０±０．４％及び１．４７±０．２％の生存率、ｎ＝ポイントあたりそれぞれ４動物由来の１０−２０の周囲）。Ｂａｘ欠損は、野生型対照に比べて１３、１４及び１５Ｇｙ  ＴＢＩ後の生存陰窩の数を、それぞれ４２．３．７±２．０、２７．６±１．６及び１８．２±１．３に増加させた（それぞれ２７．８±１．４％、１８．２±１．１％及び１２．０±０．９％の生存率、野生型Ｃ５７ＢＬ／６に対してｐ＜０．００１、図３ｂ）。１３−１５Ｇｙ後のＣ５７ＢＬ／６Ｂａｘ−／−マウスにおける生存陰窩の率は、１２Ｇｙ単独で処理した野生型Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおける粘膜の回復の支持及びＧＩ死の予防に必要と報告された８．５±０．１％の生存陰窩６２、７１を上回った。これらのデータは、放射線曝露後の内皮アポトーシスと陰窩幹細胞クロノゲンの生存率との間の関連性という概念と一致する。J.A. Rotolo,ら、Int. J. Radiation Oncology Biol. Phys.., Vol. 70, No. 3, 804-815(2008)（これは、参照によって本明細書内に組み込まれる）。
【００３２】
Ｂａｘ欠損により提供された幹細胞クロノゲン保護は、ＳＶ１２９／Ｃ５７ＢＬ／６マウスについて報告された１と同様、ＧＩ症候群によるマウス死に対する保護と関連があった。自家骨髄移植（ＢＭＴ）は、１３Ｇｙ  ＴＢＩに曝露したＣ５７Ｂｌ／６Ｂａｘ＋／＋及びＣ５７Ｂｌ／６Ｂａｘ−／−マウスの１００％をＢＭ死から保護した（図３Ｃ）。これらのＴＢＩ線量に曝露されたがＢＭＴを受けなかった対照動物は、完全に修復（１２Ｇｙ）又はほぼ完全に修復した（１３Ｇｙ）ＧＩ粘膜と共に、ＢＭ死に陥った（表１）。表１はＢａｘの遺伝子不活性化又は抗セラミド抗体によるセラミドの薬理学的拮抗作用が、致死性ＧＩ症候群を阻害することを示す。全身照射したＢａｘ＋／＋又はＢａｘ−／−遺伝子型Ｃ５７ＢＬ／６マウス及び抗セラミド抗体又は無関連のＩｇＭ対照を投与されたＣ５７ＢＬ／６マウスの剖検は、Ｂａｘ及びセラミドシグナル伝達が、致死性ＧＩ症候群に必要であることを明らかにした。ＢＭ及びＧＩ死亡率は、Ｈ＆Ｅ染色した近位空腸及び大腿骨の５μｍ切片の組織学的試験により評価された。ＧＩ死は、絨毛及び陰窩の完全な露出により特徴付けられ、並びにＢＭ死は、ＢＭ窩洞及び大量出血による造血因子の枯渇により特徴付けられた。＊は、ＢＭ形成不全並びにＢＭ死及びＧＩ死の混合の促進を示す。
【００３３】
【表１】
0005924863.tif 000002
【００３４】
ＧＩ症候群による死への転換は、１４Ｇｙ  ＴＢＩでのＣ５７Ｂｌ／６Ｂａｘ＋／＋マウスにおいて生じ、ＢＭＴ非処理マウスの９０％が、７．７±０．８日でこの様式の死に陥った（図５ｃ；表１）。したがって、野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスコロニーに関するこれまでに報告されたデータと比較して、Ｂａｘ−／−遺伝子型を包含するＣ５７ＢＬ／６亜株は、約１ＧｙのＧＩ放射線感受性増加を示した（F. Paris, Z. Fuks, A. Kangら Science 293 (5528), 293 (2001)）。Ｂａｘ欠損は、１４Ｇｙ  ＴＢＩ後のＧＩ死から保護し（図５ｃ、表１）、剖検は、腸粘膜の再生の進行及びＢＭ死の典型的な変化を示す腸表面のほとんどを覆う増殖性、好色素性の陰窩を示した。これらの発見は、上で報告したＣ５７Ｂｌ／６Ｂａｘ−／−マウスにおける陰窩幹細胞クロノゲン生存率のレベルに一致し（図３ｂ）、腸粘膜の再生の観察は、恐らくこれらのマウスの生存の延長に関係し（８．４±０．５日；表１）、これは粘膜回復の開始を可能にしたと推定される。自家ＢＭＴは、１４Ｇｙ  ＴＢＩに曝露したＣ５７Ｂｌ／６Ｂａｘ−／−マウスの６０％を恒久的にレスキューしたが（図３ｃ；ｐ＜０．０５）、残りの動物は、移植に失敗したり、骨髄形成不全に陥った（表１）。線量を１５Ｇｙ  ＴＢＩに上げた場合、Ｃ５７Ｂｌ／６Ｂａｘ＋／＋マウスは、剖検が証明するところでは、混合ＧＩ及びＢＭ死との混合により５．５±０．４日で死亡し（表１）、胃腸粘膜の回復の成功ために必要とされるような、十分な数の生存陰窩が利用可能であるように思われたにも関わらず（図３ｂ）、Ｂａｘ欠損は、当該動物をレスキューしなかった。後者の現象は、粘膜再生が明らかになる前に起こる、不確定の理由に起因した、ＢＭ形成不全及びＢＭ死の進行の加速に由来すると思われる。この概念と一致して、１５Ｇｙ  ＴＢＩで処置したＣ５７Ｂｌ／６Ｂａｘ−／−マウスへの自家ＢＭＴは、マウスの生存を９．０±０．０日に延長し（図３ｃ；ｐ＜０．０５）、また、移植のレベルはＢＭマトリックス壊死及び造血因子の完全な欠失からマウスをレスキューするには十分でなかったが（表１及び非掲載）、腸粘膜は、活発に再生する陰窩の複数の領域を示した。これらのデータは、Ｂａｘ欠損がＡＳＭａｓｅ欠損によりもたらされたＧＩ致死性に対する保護をミミックすることを示す。留意すべきは、Ｂａｘ及びＢａｋ欠損は、陰窩位置４−５における、ｐ５３介在性の上皮アポトーシスに影響を与えなかったことである。さらに、Ｂａｘ及びＢａｋは、腸微小血管系において機能的に重複しない。さらなるサポートは、J.A. Rotoloら、Int. J. Radiation Oncology Biol. Phys..,Vol. 70, No. 3, 804-815(2008)（これは、参照によって本明細書内に組み込まれる）に見られ得る。
【００３５】
本発明の特定の実施形態は、患者における標的タンパク質ＡＳＭａｓｅ又はＢａｋ又はＢａｘの内因性発現を阻害するアンチセンスヌクレオチド又はｓｉＲＮＡを投与することにより、該対象における放射線損傷又はＧＩ症候群（及び以下で議論される他の列挙された疾患）を治療又は予防する方法を対象にする。他の実施形態は、疾患の１以上の症状を改善する量のイミプラミンを投与することにより、放射線疾患又はＧＩ症候群を治療又は予防するための方法を対象にする。例えば、ＡＳＭａｓｅを阻害するアンチセンス又はイミプラミンの治療量は、処理前のレベルと比較して、ヒト（又は哺乳類）対象由来の生物学的試料におけるＡＳＭａｓｅの活性又は発現を低減する量としてルーチンの実験により決定され得る。
【００３６】
各アンチセンスヌクレオチドは、アンチセンス核酸の少なくとも一部、典型的に８−５０の連続したヌクレオチド）が、標的ＡＳＭａｓｅ、Ｂａｘ又はＢａｋをコードする遺伝子又はｍＲＮＡと相補的であり、かつ特異的にハイブリダイズするものである。ＡＳＭａｓｅのＧｅｎＢａｎｋ登録番号は、ＮＰ＿０００５３４であり、配列番号：１として本明細書内に組み込まれる。ＢａｘのＧｅｎＢａｎｋ登録番号は、ＮＰ＿００４３１５．１であり、配列番号：２として本明細書内に組み込まれる。ＢａｋのＧｅｎＢａｎｋ登録番号は、ＮＰ＿００１１７９．１であり、配列番号：３として本明細書内に組み込まれる。以下に記載されるように、当業者は、ＡＳＭａｓｅ、Ｂａｘ又はＢａｋの発現を低減させるために、標的遺伝子又はｍＲＮＡそれぞれの転写又は翻訳のいずれかを妨害するための様々なアンチセンスヌクレオチド及びｓｉＲＮＡを設計することが出来る。列挙された疾患を治療又は予防するために、本発明において治療的に用いられるアンチセンス核酸としては、ｃＤＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ及び低分子干渉ＲＮＡが挙げられ、これらは、各遺伝子又はｍＲＮＡに対する特異的ハイブリダイゼーションが可能である標的タンパク質をコードする標的遺伝子又はｍＲＮＡに十分相補的であり、したがって処理前のレベルと比較して動物における標的タンパク質の発現を低減する。
【００３７】
特定の実施形態において、ヒトＡＳＭａｓｅ登録番号ＮＭ０００５４３に関するｃＤＮＡ配列である配列番号：２；又はヒトＢａｘ登録番号ＮＭ１３８７６１に関するｃＤＮＡ配列である配列番号：４；又はヒトＢａｋ登録番号ＮＭ００１１８８に関するｃＤＮＡ配列である配列番号：５に特異的にハイブリダイズする、治療量の長さ８−５０ヌクレオチドのアンチセンス核酸を投与することにより、列挙された疾患は治療又は予防される。別の実施形態において、アンチセンスは、各遺伝子、ＡＳＭａｓｅ  配列番号：７、Ｂａｘ  配列番号：８、又はＢａｋ  配列番号：９の転写を阻害する、各ゲノムＤＮＡの様々な領域を対象にする。患者は、ＡＳＭａｓｅ（タンパク質配列  配列番号：１）もしくはＢａｘ（タンパク質配列  配列番号：３）；又はＢａｋ（タンパク質配列  配列番号：５）の発現を低減するために、同日又は異なる日に投与される、単一の製剤又は異なる製剤中のこれらのアンチセンス核酸の組み合わせにより治療され得るであろう。あるいは、治療は、１以上の標的タンパク質ＡＳＭａｓｅ、Ｂａｘ又はＢａｋの発現を低減させるために適切なｓｉＲＮＡを投与することにより達成され得るであろう。アンチセンス技術に関するさらなる詳細は、以下に説明する。
【００３８】
本発明の目的のための、化合物の治療有効量は、所望の生物学的又は治療的効果を達成する量、即ち、治療又は予防されている列挙した疾患の１以上の症状を予防、減少又は改善する量である。アンチセンス又はｓｉＲＮＡの有効治療量の決定のための開始点は、対象から採取された生物学的試料における標的タンパク質ＡＳＭａｓｅ、又はＢａｘもしくはＢａｋの発現を低減する量である。イミプラミンの治療量は、同様に決定され得る。
【００３９】
抗セラミド抗体によるＩＲ誘導疾患及びＧＩ症候群の治療及び予防
【００４０】
我々は、抗セラミド抗体によるセラミドの隔離がセラミド介在性ラフトクラスタリングを阻害し、それによってアポトーシスを弱め、並びにクローン原性生存率を改善することを示すＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞におけるin vitroでの研究を行った（図４）。放射線誘導アポトーシスに対する抗セラミドのin vivoでの作用を決定するために、１００μｇの市販のマウス抗セラミド抗体ＭＩＤ  １５Ｂ４又はアイソタイプ対照ＩｇＭを、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに１５Ｇｙ  ＴＢＩの３０分前に静脈投与した。抗セラミド注入は、１５Ｇｙから４時間後の内皮アポトーシスを無効にし、大規模なアポトーシス（１０より多いアポトーシス細胞／絨毛）の出現を、ＩｇＭ処理対象における５６．９％から１３．７％に減少させ（図５Ｂ及びＤ）、ＡＳＭａｓｅの遺伝子不活性化により与えられる保護を薬理学的に再現した（１４．９％）。これらの発見は、内皮の抗セラミド介在性の保護が、ＧＩ幹細胞致死率に影響を与え、これによって動物の全体的な生存を増強することを示した。内皮アポトーシスの拮抗作用は、陰窩幹細胞クロノゲンの生存を増進し、これは、１５Ｇｙ照射後３．５日の生存陰窩の出現の増加により実証される。抗セラミドは、ａｓｍａｓｅ−／−表現型を薬理学的に再現して、内皮アポトーシスを弱めるため、我々は陰窩生存に対する影響を試験した。１５Ｇｙ  ＴＢＩ前の抗セラミドでのＣ５７ＢＬ／６マウスの前処理は、１５Ｇｙ  ＴＢＩ前に無関連のＩｇＭで処理した同腹子により示された９．３ｘ１０−３生存率に対して、１  ｌｏｇの保護を上回る１．３ｘ１０−１の陰窩生存率をもたらした（図５Ａ）。無関連のＩｇＭ抗体は、非処理Ｃ５７ＢＬ／６対照と比較して陰窩生存率に影響を与えなかった。抗セラミド抗体は、ＡＳＭａｓｅの遺伝的阻害と同様のレベル（１．２ｘ１０−１）まで陰窩生存を増加させ、セラミドシグナル伝達の薬理学的阻害が、in vivoでの陰窩クロノゲン致死率に対してＡＳＭａｓｅの遺伝子不活性化により与えられる保護をミミックすることを実証した。留意すべきは、Ｂａｘ及びＢａｋ欠損は、陰窩位置４−５におけるｐ５３介在性の上皮アポトーシスに影響を与えなかったことである。さらに、Ｂａｘ及びＢａｋは、腸微小血管系において機能的に重複しない。さらなるサポートは、J.A. Rotoloら、Int. J. Radiation Oncology Biol. Phys.., Vol. 70, No. 3, 804-815(2008)（これは、参照によって本明細書内に組み込まれる）において見いだされ得る。
【００４１】
抗セラミド投与がａｓｍａｓｅ−／−表現型を再現し、１５Ｇｙ後の動物生存率を増加させるかどうかを評価するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを５０−１００μｇ  抗セラミド抗体又は無関連のＩｇＭ対照で前処理し、１５Ｇｙ  ＴＢＩに供した。照射の１６時間以内に、マウスに３ｘ１０６自家骨髄細胞を静脈内投与した。これまでに公開されたデータと一致して、１５Ｇｙは、ＩｇＭ処理したマウスのＣ５７ＢＬ／６対照において７日までに１００％致死であった。抗セラミド抗体は、照射後１２０日で６０％の生存率をもたらす１００μｇ  抗セラミド前処理で線量依存的に生存率を増加させた（図５Ｃ）。これらの知見は、１５Ｇｙ後に自家ＢＭＴを投与されたａｓｍａｓｅ−／−マウスの生存率と密接に相関する（F. Paris, Z. Fuks, A. Kang ら、Science 293 (5528), 293 (2001)）。剖検は、対照ＩｇＭを受けたマウスが、骨髄への部分的損傷のみを伴う、完全に露出した陰窩及び絨毛を含む、大規模な腸損傷で死亡したことを明らかにした（非掲載）。これらの発見は、ＧＩ症候群による死と一致する。反対に、抗セラミド前処理後に死亡したマウスの剖検は、大規模な出血及びほぼ完全な造血因子の枯渇を含む骨髄死の典型的特徴を明らかにした（非掲載）。これらのマウスは、腸表面のほとんどを覆う、増殖性、好色素性陰窩を含む、再生状態にある腸粘膜を示した。図５Ｄは、ＴＵＮＥＬによって染色された１５Ｇｙ照射後４時間に採取された小腸の顕微鏡写真を示す。アポトーシス細胞は、茶色に染色された核によって表される。データ（平均±標準誤差）は、２つの独立した実験由来の最も少なくて１５０の絨毛から得られた。これらのデータは、抗セラミド抗体が、in vivoでのセラミドシグナル伝達を効果的に中和し、ａｓｍａｓｅ−／−表現型を薬理学的に再現し、並びに放射線誘導疾患及びＧＩ症候群から保護することを実証している。
【００４２】
アポトーシスにおける細胞外セラミドの役割に関するこの証拠に基づいて、本発明の特定の実施形態は、治療量の１以上の抗セラミド抗体又はそれらの生物学的活性断片を、好ましくはヒト化形態で投与することにより放射線誘導疾患及びＧＩ症候群を治療又は予防する方法を対象にする。これらの抗体は、ポリクローナル又はモノクローナルであり得る。好ましい実施形態において、抗セラミド抗体は、モノクローナル２Ａ２抗体又は以下に記載する生物学的活性断片で、好ましくはヒト化形態である。我々が発見した、２Ａ２  ＩｇＭと呼ばれる新規の効果的なモノクローナル抗セラミド抗体を、以下に詳しく記載する。上に記載した先行研究は、スタチン（ナイスタチン）もまた、in vitroモデルにおけるアポトーシスの低減に有益な効果を有したことを示した。したがって、特定の他の実施形態は、ＧＩ症候群を治療又は予防するために単独又は組み合わせて投与される、治療量の抗セラミド抗体又はそれらの生物学的活性断片、及び１以上のスタチンを投与することを含む。併用療法のための本明細書内に記載される治療剤は、同日又は連日に投与され得る。
【００４３】
スタチンは、血中のコレステロール及び特定の脂質の量を低下させる剤の群のいずれかを含む。スタチンは、コレステロール形成を助ける重要な酵素を阻害する。スタチンは２つの群に分けられる：発酵由来及び合成。スタチンとしては、アルファベット順に（商標名は色々な国によって異なる）：
【表２】
0005924863.tif 000003
【００４４】
ＬＤＬ低下有効性は、剤の間で変化する。セリバスタチンは最も効能があり、続いて（有効性が低下する順に）ロスバスタチン、アトルバスタチン、シムバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチンである。
【００４５】
２Ａ２抗セラミドモノクローナルＩｇＭ抗体
【００４６】
強力なin vivo活性を有する新規抗セラミド抗体を作成するために用いた戦略のフローチャートを図６に示す。抗体を作成するために、我々はまず予防接種された宿主から強い抗体応答を生み出すのに十分な免疫原性である抗原の開発を必要とした。スフィンゴイド塩基上にＢＳＡ結合Ｃ１６脂肪酸を合成することにより、ＢＳＡ結合セラミドを合成した。図７）挿入図。抗体スクリーニングのための抗原の検証は、ＥＬＩＳＡアッセイにより行い、これはプレートに固定された抗原の量を減少させた。各ウェルをブロックした後、次いで、Ａｘｘｏｒａ  ＬＬＣ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡより市販の抗セラミドＭＩＤ１５Ｂ４抗体（１：１００）続いて、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＭと共にプレートをインキュベートした。ＨＲＰ基質の投与後、ＯＤを６５０ｎｍで評価した。ＢＳＡセラミドＥＬＩＳＡは、カポジ肉腫細胞での免疫後の上清＃３６７３における結合活性の増大を明らかにした。図８。免疫したマウスから採取された血漿試料の１：１００希尺でのＥＬＩＳＡによる結合は、試料＃３６７３対＃３６７４によるセラミドのより強い結合を明らかにした。結合活性は、抗体産生Ｂ細胞（ｓｎ７３−Ｉ−Ｃ６）の固定化後も保たれ、抗セラミド結合活性を伴うモノクローナル２Ａ２  ＩｇＭの単離を可能にした（非掲載）。カルポジ（Karposi）免疫は、一群の抗体産生Ｂ細胞の形成をもたらす強い免疫応答を生み出すことを意図されていた。これらのＢ細胞から産生されたハイブリドーマ由来の抗体含有上清は、次いで、ＢＳＡセラミドＥＬＩＳＡに対して検査された。アッセイにおいて陽性と試験された上清を単離し、これが最終的にクローン２Ａ２の精製をもたらす。さらなる詳細は、実施例４に説明される。
【００４７】
精製モノクローナル２Ａ２抗体は、上清＃３６７３から単離された。Ｅｌｉｓａは、２Ａ２マウスモノクローナルＩｇＭがＢＳＡセラミドに結合することを明らかにした。図９。Ｅｌｉｓａは、対照ＩｇＭに対する２Ａ２のより大きな結合能力を有意に示した。我々は、２Ａ２抗体がin vivoで働くこと及び、我々が臨床用途のためにこれをヒト化できたことを示す。抗体及びその他をヒト化する方法は、実施例１に説明される。
【００４８】
in vitroでの市販の抗体を用いた我々の初期の観察と一致して、精製２Ａ２抗体は、in vitroでの放射線誘導アポトーシスを中和した。２Ａ２モノクローナル抗セラミド抗体（２５−１００μｇ／ｍＬ）とのＪｕｒｋａｔ細胞の予備培養は、８Ｇｙ誘導アポトーシスを阻害した。図１０；図４Ｂにおけるように定量化した。アポトーシス阻害の計算は、８Ｇｙ前の無処理Ｊｕｒｋａｔ細胞の平均アポトーシスに対して行われた。Ｃ１６セラミドでのマウスの免疫により産生された、他の抗セラミド抗体１Ｈ４、１５Ｄ９及び５Ｈ９は、当該技術分野に公知の技術を用いてヒト化され得、並びに、ＧＩ症候群、及び同様にＧｖＨＤ、自己免疫疾患及び以下で議論される炎症の治療又は予防について本発明の範囲内となる。
【００４９】
次の一連の実験において、我々は、２Ａ２がin vivoでの１５Ｇｙ後の陰窩生存率を高めたことを示した。増加用量の２Ａ２抗セラミド（０−７５０μｇ）でのＣ５７ＢＬ／６マウスの前処理は、１５Ｇｙ  ＴＢＩ後の重要な３．５日の時点での陰窩生存率を改善した。図１１（Ａ）。２Ａ２抗セラミド抗体は、８−１５Ｇｙ全身照射後の陰窩生存率を１．２の線量修飾係数（ＤＭＦ）で増加させた。図１１（Ｂ）。陰窩生存率を図５Ｃにあるように測定した。我々の動物実験において、我々はマウス３５ｇあたり７５０μｇの抗体を用いた。この標的タンパク質は抗体に接近しやすいため、活性化Ｔ細胞の表面上のセラミドの配置は、抗体療法を用いて列挙された疾患のいずれかを治療又は予防するために特に重要である。
【００５０】
他の実験において、我々は、抗２Ａ２抗体もまた、１４−１７Ｇｙ単一線量放射線に曝露したＣ５７ＢＬ／６マウスの生存率を改善したことを発見した。図１２。Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、ＩＲの１５分前に７５０μｇ  ２Ａ２の有り又は無しで、１４−１７Ｇｙ  ＴＢＩで照射された。マウスは、ＩＲの１６時間以内に、３ｘ１０６自家骨髄細胞を注入された。生存をモニターし、カプラン−マイヤーパラメータを介して表した。統計的有意性（ｐ＜０．０５）は、各線量において達成された。
【００５１】
曝露の範囲に渡って、我々は、２Ａ２抗体がin vivoでの放射線誘導ＧＩ死を弱め、ａｓｍａｓｅ−／−表現型を再現することを見出した。図１３において行われた生存率研究で瀕死になった時に屠殺されたマウスの剖検結果。近位空腸検体が９０％より多くの陰窩−絨毛ユニットの露出を見せ、並びに陰窩の再生がない場合にＧＩ死と判定した。脱灰大腿骨部分が造血因子の枯渇及び大量出血を示す場合に骨髄（ＢＭ）死と判定した。
【００５２】
これらの結果は、好ましくはヒト化形態での２Ａ２抗体自身、又はその断片もしくは変異体を対象とした本発明の実施形態をサポートする。別の好ましい実施形態において、ヒト２Ａ２抗体又はその断片は、放射線損傷又はＧＩ症候群を治療又は予防するために治療有効量で投与される。抗体が本明細書内で用いられる場合、これはまた、以下に記載されるように抗体断片又は変異体を包含することを意味する。特定の他の実施形態は、抗セラミド抗体、好ましくはヒト化、さらに好ましくは２Ａ２、並びに循環コレステロールレベルを減少させ、それによって抗セラミド抗体の効果を増加させる量のスタチンを含む組成物を対象とする。別の実施形態は、イミプラミン並びに、単独又は抗セラミド抗体及び／もしくはスタチンとの組み合わせのいずれかで、抗精神病薬剤として現在用いられるＡＳＭａｓｅ阻害剤を投与することによる、放射線損傷又はＧＩ症候群の治療又は予防を対象とする。別の実施形態は、２Ａ２抗体及びイミプラミン、又はＡＳＭａｓｅもしくはＢａｋを標的とするアンチセンスもしくはｓｉＲＮＡを含む組成物である。
【００５３】
ルーチンの実験により、使用されるヒト化モノクローナル抗セラミド抗体の治療有効量が決定されるであろう。治療的に投与され得る抗セラミド抗体の量は、約１ｕｇから１００ｕｇ／ｍｌに及ぶ。この量は、典型的に変動し、並びに典型的には対象において約１μｇ／ｍｌと約１０μｇ／ｍｌとの間の血清治療剤のレベルを達成するために十分な量であり得る。本発明の文脈において、抗セラミド抗体は、セラミドがアポトーシスを阻害するのを防ぐ中和抗体の一種である。
【００５４】
以下に記載するように、我々はまた、２Ａ２抗体がＧｖＨＤを低減することによりＢＭＴ後の生存率を改善し、並びにＧｖＨＤと共に見られる典型的なサイトカインストームを低減させることを発見した。
【００５５】
我々は、ＢＳＡセラミドで免疫されたマウスにおいて作られた他のモノクローナル抗体は、Ｊｕｒｋａｔ細胞アポトーシス阻害アッセイにおいて検査された場合、線量依存的で有り、且つ２Ａ２に匹敵する保護作用を示すこと免疫を発見した。３つの抗体のアイソタイプは確立されている。１５Ｄ９  ｍＡｂは、ＩｇＭ、κである。１Ｈ４及び５Ｈ９  ｍＡｂはｍＩｇＧ３、κである。図２５。
【００５６】
本発明の特定の実施形態は、放射線誘導疾患又はＧＩ症候群、及び同様に以下に示されるようにＧｖＨＤ、他の自己免疫疾患及び炎症を治療するための治療的使用のための、好ましくはヒト化されたモノクローナル抗体１５Ｄ９、１Ｈ４及び５Ｈ９並びにそれらの断片又は変異体を対象とする。他の実施形態は、これらのモノクローナル抗体、断片又は変異体を好ましくはヒト化形態で、並びに任意的にアロス（alos）イミプラミンもしくはスタチン又は両方を包含する医薬組成物を対象にする。
【００５７】
我々の発見の一つは、実施例４に記載されるようなカルポシ（Karposi）肉腫細胞による宿主マウスの免疫が、例えば２Ａ２抗体で示されるように、劇的な治療作用を伴う効果的な抗セラミドモノクローナル抗体を産生したことである。我々は、免疫のためにＫＳ細胞を選択したが、それは、セラミドリッチであることを我々が示した活性化内皮をＫＳ細胞が再現するからである。純粋なセラミド抗原だけでなく、活性化細胞で免疫したために、我々が作成したモノクローナルは、セラミド以外の他のタンパク質と交差反応し得る。本出願では、交差反応とは、モノクローナルがセラミド以外の他のタンパク質又はタンパク質複合体と反応し得ることを意味する。例えば、これらのモノクローナル抗体が反応する（即ち、親和性を有する）セラミド上のエピトープは、他の細胞表面タンパク質と共有され得る。あるいは、他のタンパク質は、抗原部位において類似の構造を有し得るか、あるいは、該エピトープは、セラミドを提示する複合体の一部であり得る。したがって、本発明の特定の他の実施形態は、セラミドと交差反応するモノクローナル抗体を広く対象にし、ここで該抗体は、全細胞での宿主の免疫によって得られる。断片を含むヒト化モノクローナルが、好ましい実施形態である。免疫グロブリンのサブタイプは任意のサブタイプであり得、ＩｇＧ、ＩｇＭが好ましいが、ＩｇＡ、ＩｇＥ等もまた効果的であり得る。
【００５８】
移植片対宿主病及び自己免疫疾患の治療及び予防
【００５９】
以下に示す結果は、ＡＳＭａｓｅ産生セラミドがＧＶＨＤに必要であることを初めて示し、したがって、特定の実施形態は、（例えばイミプラミン又はアンチセンス核酸での）ＡＳＭａｓｅの阻害により、ＧＶＨＤを治療又は予防するためあるいは、（例えば抗セラミド抗体で）この細胞表面セラミドを不活性化するための薬理学的方法を対象にする。
【００６０】
自己免疫疾患は、自己抗原に対する持続的な適応免疫応答である。Ｔ細胞と、ほとんどの細胞型において発現される細胞表面分子である組織主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子及び／又は副組織適合抗原（ｍＨＡＧ）との間の不適合性に起因してＴ細胞は自己抗原を異物として認識する。自己抗原に対する活性化Ｔ細胞は、直接的（細胞傷害性Ｔ細胞、ＣＴＬ経由）又は間接的（自己反応性Ｂ細胞に対するＴ細胞の助けによる抗体産生経由）に組織損傷及び慢性炎症を与える。造血幹細胞移植の主な合併症である急性移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）は、免疫除去された（immunoablated）宿主に注入されたアロ反応性ドナーＴ細胞の分化及び活性化に起因する特有の自己免疫様疾患である。急性ＧｖＨＤにおいて、ドナーＴ細胞による宿主のアロ抗原の認識（メジャー又はマイナーミスマッチ）は、宿主組織に対する初期損傷及びＩ型サイトカイン（ＩＮＦ−γ及びＩＬ−２）産生を含む適応免疫応答を開始させる。これが、ＣＴＬクローンの増殖及び活性化をもたらし、それが炎症性サイトカイン（ＴＮＦ−α及びＩＬ−１β）から成るマクロファージ依存性「サイトカインストーム」の発生と共に（D. A. Wall及び K. C. Sheehan, Transplantation 57 (2), 273 (1994); G. R. Hill, W. Krenger、及びJ. L. Ferrara, Cytokines Cell Mol Ther 3 (4), 257 (1997); J. L. Ferrara, Bone Marrow Transplant 21 Suppl 3, S13 (1998)）、選ばれた一連の標的細胞におけるアポトーシスを誘導し（A. C. Gilliam, D. Whitaker-Menezes, R. Korngold ら、J Invest Dematol 107 (3), 377 (1996)）、並びに関連する標的臓器（肝臓、腸及び皮膚）に結果として損傷を与えるD. A. Wall、上記を参照; G. F. Murphy, D. Whitaker, J. Sprentら、Am J Pathol 138 (4), 983 (1991)）。急性ＧｖＨＤの一般的な症状としては、深刻な体重減少、下痢、肝疾患、発疹及び黄疸が挙げられる。図１４は、ＧｖＨＤの免疫病理学の図解である。
【００６１】
多くの種類の白血病及びリンパ腫の治療に用いられる、高用量化学療法及び高線量放射線は、さらに分裂している骨髄細胞幹細胞を迅速に殺し、免疫除去及びそれに必然的に伴われる造血因子の再構成をもたらす。骨髄移植（ＢＭＴ）は、これらの患者における免疫再構成のための一般的且つ効果的治療法であり、並びに無形成性貧血及び重症複合免疫不全を含む免疫疾患の治療であり、骨髄移植（ＢＭＴ）では、骨髄幹細胞の注入が、赤血球、Ｔ及び／又はＢ細胞の欠損を矯正し得る。ＧｖＨＤはＢＭＴに関連する主な合併症であり、血縁ドナーからのＭＨＣが一致するＢＭＴの３０％、単一のＭＨＣが不一致のＢＭＴの５０％及び２つのＭＨＣが不一致のＢＭＴの７０％、並びに非血縁ドナーを用いる場合にはより高く起こる８６。大規模な研究にも関わらず、よい治療法がない。急性ＧｖＨＤは典型的にＢＭＴの３ヶ月以内に発症し、その間、腸、皮膚及び肝臓を含む特定の臓器が細胞傷害性Ｔ細胞の標的となる。これまで、ＧｖＨＤを制御するために利用できる臨床的意義のある戦略方法は、同種移植片からのＴ細胞枯渇又はドナーＴ細胞増殖及び活性化を制御することを目的とした非特異的免疫抑制に限られており、既に免疫不全である患者における感染又は腫瘍再発の可能性を増加させる試みに限られている。
【００６２】
薬理学的及び遺伝的手段は、細胞レベルでのＣＴＬ誘導アポトーシス細胞死のいくつかの重要なメディエーターの同定を可能にした。急性ＧｖＨＤの間の肝臓、腸及び皮膚アポトーシスは、パーフォリン／グランザイム介在性細胞溶解からの最少の寄与を伴う、Ｆａｓ−Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）（H. Kuwahara, Y. Tani, Y. Ogawaら、Clin Immunol 99 (3), 340 (2001); C. Schmaltz, 0. Alpdogan, K. J. Horndasch ら、Blood 97 (9), 2886 (2001); K. Hattori, T. Hirano, H. Miyajimaら、Blood 91 (11), 4051 (1998)）及びＴＮＦ−ＴＮＦＲ経路を介したの宿主組織のＣＴＬの攻撃を介して主に介在される。ＴＮＦスーパーファミリーレセプターシグナル伝達の阻害は、概して、マウス同種異系ＢＭＴのメジャー及びマイナーミスマッチモデルにおいて急性ＧｖＨＤ関連死亡率を弱め、それはドナーＴ細胞ＦａｓリガンドもしくはＴＮＦ−αの遺伝子不活性化、又はこれらの同種レセプターであるＣＤ９５／Ｆａｓ及びＴＮＦＲの抗体介在性中和のいずれかによるものであった。これらの研究は、急性ＧｖＨＤの発症におけるドナーＣＴＬ機能におけるデスレセプターシグナル伝達の不可欠な役割を確立し、ＴＮＦスーパーファミリーシグナル伝達の無差別阻害がＧｖＨ関連病変からの強い保護を提供する可能性があることを示唆した。
【００６３】
多くの最近の研究は、自己免疫性の肝臓及びＧＩ毒性における及びそのセカンドメッセンジャーであるセラミドの役割を同定している。ＡＳＭａｓｅの遺伝子不活性化は、フィトヘマグルチン(phytohemagglutin) （ＰＨＡ）誘導Ｆａｓ依存性自己免疫性肝炎の自己免疫マウスモデルを無効にし、その際リンパ球におけるＦａｓＬの誘導がＦａｓを発現する肝細胞の選択的殺傷及び抗ＣＤ４抗体によるＨＩＶレセプターｇｐ１２０の活性化をもたらし、ＣＤ４＋Ｔ細胞の枯渇が、これらの細胞におけるＦａｓ及びＦａｓＬのアップレギュレーションによって起こる。さらに、証拠は、細胞膜の原形質外（exoplasmic）層におけるセラミド産生が、虚血再かん流傷害の過程（L. Llacuna, M. Mari, C. Garcia-Ruizら、Hepatology 44 (3), 561 (2006)）並びに肝硬変９３及び放射線誘導ＧＩ毒性につながるＴＮＦ誘導肝細胞アポトーシスの過程（これらの疾患単位について標準化された動物モデルを用いることが既に議論されている）において急激に起こることを示す。
【００６４】
造血幹細胞移植の主な合併症である急性ＧｖＨＤは、宿主組織に対するドナーの細胞溶解性Ｔ細胞の攻撃により介在される明確な自己免疫様疾患である。ＣＴＬ介在性の組織損傷における標的細胞のＡＳＭａｓｅ及びセラミドの寄与並びに急性ＧｖＨＤの間の死亡率を評価するため、ＬＰ／Ｊ  ドナー（Ｈ−２ｂ）のＣ５７ＢＬ／６レシピエント（Ｈ−２ｂ）への副組織適合性（minor histocompatability）不適合同種異系ＢＭ移植モデルを選択した。ａｓｍａｓｅ＋／＋又はａｓｍａｓｅ−／−バックグラウンドの致死性照射Ｃ５７ＢＬ／６宿主は、５ｘ１０６のＴ細胞枯渇した（ＴＣＤ）ＬＰ／Ｊ  ＢＭ細胞を受け、ＧｖＨＤを同種移植片に対して３ｘ１０６のＬＰ／Ｊドナー脾臓Ｔ細胞を加えることにより誘導した。ドナーＬＰ／Ｊ  ＢＭ及びＴ細胞の移植は、カプラン−マイヤー生存率（図１５Ａ）、及び臨床的ＧｖＨＤスコア（図１５Ｂ）カーブによる決定で、ａｓｍａｓｅ−／−レシピエントにおける作用を低減したが、全てのレシピエントにおいてＧｖＨＤの進行を誘導した。ＧｖＨＤ生存率は、ＢＭ及びＴ細胞のａｓｍａｓｅ＋／＋レシピエントにおける２８．６％からａｓｍａｓｅ−／−レシピエントにおける８４．６％まで増加し（ｐ＜０．００５）、ａｓｍａｓｅ−／−レシピエントでは９０日を通じて一貫して低い臨床スコアを伴い（図１５Ｂ及び非掲載）、ａｓｍａｓｅ−／−レシピエントにおけるＧｖＨＤの減弱を示した。これらの結果は、マイナーＭＨＣ不一致の同種異系ＢＭＴモデルでの急性ＧｖＨＤ誘導死亡率におけるＡＳＭａｓｅの役割を同定する。
【００６５】
ＧｖＨ誘導の死亡は、回腸、肝臓及び皮膚を含む臓器を選択する損傷に関与する。実施例２は、ＡＳＭａｓｅがＧｖＨＤ標的臓器損傷及びアポトーシスに必要であることを示す実験を記載する。実施例２における実験は、ＡＳＭａｓｅ欠損が、概してＧｖＨＤ関連臓器損傷を保護し、肝臓及び小腸においてそれぞれ、スコアを１０．２±０．５及び７±０．１減少させることを示す（表１、それぞれａｓｍａｓｅ＋／＋同腹子に対して肝臓及び腸についてｐ＜０．００５）。ＡＳＭａｓｅ欠損はまた、マイナー抗原不適合同種異系ＢＭＴ後の皮膚角化細胞アポトーシスから宿主を保護した。さらに、ＧｖＨＤ関連臓器損傷は、目立った腸及び皮膚アポトーシスと関連することが示された。これらのデータは、ＧｖＨＤ関連標的臓器損傷及びアポトーシスの有意な減衰を明らかにしており、マイナー及びメジャー抗原差異の両方にわたって、野生型同腹子と比較してａｓｍａｓｅ−／−宿主におけるＧｖＨＤの疾病及び死亡に対する保護と密接に関連している。
【００６６】
実施例３に記載した追加実験は、ＡＳＭａｓｅ欠損が、一般にＧｖＨＤ及び炎症に関連するサイトカインストームを弱め、それによって、炎症から宿主を保護することを示す。実験は、ＡＳＭａｓｅ不活性化が、同種異系ＢＭ及びＴ細胞のレシピエントにおける急性ＧｖＨＤでのＴｈ１／Ｔｈ２サイトカインプロファイル及びＣＤ８＋Ｔ細胞増殖を弱めることを示した。我々のデータは、ａｓｍａｓｅ−／−宿主におけるin vivoでのＣＤ８＋ＣＴＬ増殖の不全、及びＧｖＨＤを有するこれらのＢＭＴレシピエントにおける血清炎症性サイトカインレベルの減弱に対する生物学的に関連する結果を示した。したがって、in vivoデータは、ＧｖＨに関連する疾病率、死亡及び標的臓器損傷におけるＡＳＭａｓｅの役割を確認する。宿主のＡＳＭａｓｅ欠損の影響は、Ｔ細胞殺傷の不活性化によってではなく、主に全身性因子（即ち、サイトカイン、循環するＴ細胞の数）の変換によって、ＧｖＨＤの病態生理学に作用する。
【００６７】
抗セラミド抗体の投与は、ＧｖＨＤを予防する
【００６８】
膜プラットフォーム内へのセラミド介在性ラフトクラスタリングが肝細胞の細胞溶解Ｔ細胞（ＣＴＬ）誘導アポトーシスの必須成分であるかどうかを判定するために、我々は、ラフトクラスタリングを薬理学的に阻害し、in vitroにおける同種活性化（alloactivated）ＣＴＬ誘導肝細胞アポトーシスにおける影響を試験した。ＡＳＭａｓｅ欠損が、ＣＴＬ誘導アポトーシスに対する抵抗性を直接標的細胞に与えるかどうかを調べるために、活性ＧｖＨＤ及びナイーブＣ５７ＢＬ／６肝細胞を示すマウスから新たに単離された同種活性化脾臓ＣＴＬエフェクターを用いて２細胞ex vivoモデルにおいて、ＧｖＨＤ介在性の標的細胞融解を脱構築(deconstructed)した。本アッセイにおける標的細胞として肝細胞を選択したが、それは、肝細胞がＧｖＨＤの重要な標的であり、アポトーシスのためにスフィンゴミエリン経路を利用するためである。我々のアッセイ条件下では、０．５ｘ１０６の肝細胞を、ＬＰ／Ｊ  ＢＭ＋Ｔ細胞→Ｂ６レシピエントから単離した０−２ｘ１０６の同種活性脾臓Ｔ細胞と共培養した。共培養は、核の形態変化によって検出されたように、１６時間で４．７±０．７％ベースラインから３３．８±１．９％への肝細胞アポトーシスの増加を誘導した（図１６Ａ）。多くのin vivo研究からのデータと一致して、機能的Ｆａｓレセプターを欠くＢ６．ＭＲＬ．ｌｐｒ肝細胞は、この様式のＣＴＬ誘導アポトーシスに対して抵抗性であり（図１６Ａ、左パネル）、一方、１００ｎｇ／ｍｌ  ＣＭＡとの２時間のインキュベーションによる、顆粒エキソサイトーシス介在性細胞溶解経路の選択的阻害は、肝細胞アポトーシスに対する効果を有しなかった（図１６Ａ、右パネル）。これらの研究は、本モデルにおけるＣＴＬ介在性肝細胞アポトーシスが、パーフォリン／グランザイムシグナル伝達ではなくＦａｓシグナル伝達を必要とすることを示す。先行研究は、Ｆａｓレベルはａｓｍａｓｅ−／−肝細胞において変わらないことを示したが、それにも関わらず、ａｓｍａｓｅ−／−肝細胞は、ex vivoでのＧｖＨＤモデルにおいて同種異系エフェクターＴ細胞の０．１−２ｘ１０６からの全用量で（図１６Ｂ）、且つ４−４８時間からの全ての時間で（データ非掲載）、アポトーシスに抵抗性であった。
【００６９】
Ｆａｓ介在性アポトーシスデスレセプターの活性化は、いくつかの細胞系では、セラミドリッチプラットフォームの生成を必要とする一方で、ＧｖＨＤのex vivoモデルにおいて、ＣＴＬ誘導プラットフォーム生成をａｓｍａｓｅ＋／＋及びａｓｍａｓｅ−／−肝細胞において評価した。同種活性化Ｔ細胞は、共培養後１０分で標的肝細胞表面におけるセラミドリッチプラットフォームの迅速な生成を誘導した（図１６Ｃ）。プラットフォームの生成は、１分以内で増加し、１０分でピークを迎え、６０分間を超えて持続した（図１６Ｄ）。この系でのアポトーシスに必要とされるＦａｓを、共焦点顕微鏡法による決定で、セラミドリッチプラットフォーム内に濃縮した。反対に、ａｓｍａｓｅ−／−肝細胞は、セラミドリッチプラットフォームの形成（図１６Ｃ、及び図１６Ｄにおいて定量化されている）、並びにその中でのＦａｓの濃縮に対して完全に抵抗性であり、肝細胞におけるＣＴＬ誘導プラットフォーム生成がＡＳＭａｓｅ依存性であることを実証した。それに付随して、ＣＴＬは、ａｓｍａｓｅ＋／＋肝細胞における１ピクセル当りの平均蛍光強度による決定で、セラミドシグナルの全体として１．５±０．１倍の全体としての増加を誘導した（刺激していない対照と比較してｐ＜０．００５）、これはａｓｍａｓｅ−／−肝細胞では起こらず、図１６Ｃの下パネルに対する上パネルにおけるセラミド染色の強度の差異を説明する。
【００７０】
肝細胞アポトーシスが特にセラミド依存性であり、ＡＳＭａｓｅ欠損の結果でないことを実証するため、我々は、ex vivoでのＧｖＨＤアッセイにおいて、アポトーシス濃度未満の外因性Ｃ１６セラミド（５００ｎＭまで）を、ａｓｍａｓｅ−／−肝細胞に添加した。低用量の長鎖天然セラミドによる、ヒトａｓｍａｓｅ−／−リンパ球におけるプラットフォーム生成の回復に一致して、亜致死用量の外因性Ｃ１６セラミド（２００ｎＭ以下）は、ＣＴＬ処理ａｓｍａｓｅ−／−肝細胞において４６．３±１．３％の細胞までプラットフォーム形成を回復させ、ＡＳＭａｓｅ介在性セラミド生成はプラットフォーム形成を促進することを実証した。Ｃ１６セラミドは、ａｓｍａｓｅ−／−肝細胞に対するＣＴＬ誘導アポトーシスをほぼ完全に回復し（図１６Ｅ）、標的細胞ＡＳＭａｓｅの必要性を回避する。反対に、Ｃ１６セラミドの生物学的不活性アナログであるＣ１６ジヒドロセラミドは、ＣＴＬ誘導プラットフォーム生成（非掲載）又は肝細胞アポトーシス（図１６Ｅ）を回復しなかった。これらのデータは、ex vivoでのＣＴＬ誘導肝細胞アポトーシスが、効率的な細胞死誘導のために標的細胞のセラミド生成を必要とすることを明らかに実証し、これはａｓｍａｓｅ−／−マウスにおいて観察された急性ＧｖＨＤからのin vivoでの保護と一致する。さらに、コレステロールキレート剤ナイスタチンを用いたスフィンゴミエリン濃縮の部位である細胞表面ラフトの薬理学的崩壊は、ＣＴＬ誘導性のセラミドリッチプラットフォームの生成を無効化し（非掲載）、並びに２ｘ１０６の同種活性化ＣＴＬ誘導肝細胞アポトーシスを完全に阻害した（図１６Ｆ）。外因性Ｃ１６セラミドは、コレステロールキレート化を克服することができず（図１６Ｆ）、セラミドリッチプラットフォームの形成は、シグナル伝達のためにアポトーシス機構が予め集合するための場所として働き得る、機能的ラフトを必要とすることを示唆した。
【００７１】
Ｔ細胞誘導溶解における標的細胞ＡＳＭａｓｅの遺伝的役割を示すために、我々はＴ細胞機能についての２つの標準化されたアッセイを用いた；ＭＬＲ感作ＣＴＬ誘導脾細胞溶解（図１７）及びin vitroでのＴ細胞の活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ）（図１８）。標的細胞のＡＳＭａｓｅの役割を、in vitroでの活性化ＭＬＲにおいて評価し、ここで、ａｓｍａｓｅ＋／＋又をａｓｍａｓｅ−／−遺伝子型のＣ５７ＢＬ／６脾細胞標的細胞をマイトジェンで４８時間刺激し、洗浄し、クロム標識した。次いで、これらの細胞を、照射Ｃ５７ＢＬ／６脾細胞との培養により５日間活性化させた、エフェクターＢａｌｂ／ｃ脾細胞と共培養した。クロム放出を定量化し、％融解を算出した。ａｓｍａｓｅ−／−標的細胞を溶解するためのin vitro活性化脾細胞の能力を試験するために、Ｂａｌｂ／ｃエフェクターＴ細胞を５ｘ１０６照射（２Ｇｙ）Ｃ５７ＢＬ／６脾細胞と共に５日間培養することより活性化した。標的ａｓｍａｓｅ＋／＋又はａｓｍａｓｅ−／−のＣ５７ＢＬ／６脾細胞を４８時間、１０ｍｇ／ｍｌ  ｃｏｎＡで刺激することにより調製し、５１Ｃｒで標識してＣＴＬ介在性クロム放出を評価した。洗浄した脾細胞を増加する比率の活性化エフェクターＢａｌｂ／ｃＴ細胞と共培養し、５１Ｃｒ放出をその６時間後に定量化した。図１９Ａ。
【００７２】
Ｔ細胞誘導溶解におけるプラットフォーム生成における標的細胞ＡＳＭａｓｅの果たす潜在的遺伝的役割を評価するために、我々は、Ｔ細胞介在性の細胞溶解についての、２つの標準化されたアッセイ、ＭＬＲ感作ＣＴＬ誘導脾細胞溶解、及びＴ細胞のin vitroでのＡＩＣＤを試験した。in vitroでの活性化脾細胞溶解アッセイのために、５ｘ１０６の照射（２Ｇｙ）したＣ５７ＢＬ／６脾細胞との５日間の培養により、ＢＡＬＢ／ｃエフェクターＴ細胞を刺激し、その後、４８時間の１０□ｇ／ｍｌ  ｃｏｎＡでの刺激により調製したａｓｍａｓｅ＋／＋又はａｓｍａｓｅ−／−標的Ｃ５７ＢＬ／６脾細胞と共培養した。検出のためにミトトラッカーレッドで標識したａｓｍａｓｅ＋／＋標的脾細胞とのエフェクターＴ細胞の共培養は、標的細胞上でのセラミドリッチプラットフォームの迅速な生成をもたらした。共培養の５分以内で、標的ａｓｍａｓｅ＋／＋脾細胞上のプラットフォームの出現は、４．７±２．１から２５．８±６．６％に増加した（ｐ＜０．０１；図１９Ａ）。Ｆａｓは、これらのセラミドリッチプラットフォーム内に共局在した（データ非掲載）。プラットフォーム生成は、ａｓｍａｓｅ−／−脾細胞にはなく、刺激後１０分での集団のわずか５．９±３．５％で見られた。さらに、ＭＬＲ感作ＣＴＬは、５０：１のエフェクター：標的の割合において４３．２±６．５％のａｓｍａｓｅ＋／＋脾細胞溶解を誘導し（図１９Ｂ）、５１Ｃｒ放出アッセイによる定量で、ａｓｍａｓｅ−／−標的細胞における溶解を７．３±２．５％まで弱めた。亜致死の外因性の５００ｎＭ  Ｃ１６セラミドは、プラットフォーム生成及びａｓｍａｓｅ−／−標的脾細胞のＣＴＬ誘導溶解の両方を回復したが、一方で、Ｃ１６ジヒドロセラミドは、両方の事象において作用しなかった（非掲載及び図１９Ｃ）。これらのデータは、ｃｏｎＡブラストのin vitro 感作ＣＴＬ溶解が、ＡＳＭａｓｅに依存して標的細胞のプラットフォーム生成を活性化すること、並びにプラットフォームがこれらのモデルにおける標的細胞の効率的な溶解に必要であることを示す。
【００７３】
ＡＩＣＤにおける標的細胞のＡＳＭａｓｅの役割を明らかにするために、ａｓｍａｓｅ＋／＋、ａｓｍａｓｅ−／−又はＭＲＬ．ｌｐｒ（ＦａｓＲ−／−）Ｔ細胞を１０μｇ／ｍｌ  ＣｏｎＡで２４時間刺激し、洗浄し、２０Ｕ／ｍｌ  ｒＩＬ−２含有培地中に２４時間静置し、そして最終的に、２０Ｕ／ｍｌ  ｒＩＬ−２及び増加する濃度のプレート結合抗ＣＤ３  ｍＡｂを含有する培地中で再刺激することにより、ＡＩＣＤを開始させた。抗ＣＤ３  ｍＡｂによるＡＩＣＤ誘導は、刺激後４時間でセラミドリッチプラットフォーム生成を与え（図１９Ｄ）、ａｓｍａｓｅ−／−Ｔ細胞の集団の５．１±１．０％と比較して、ａｓｍａｓｅ＋／＋Ｔ細胞の２６．４±１．６％において明らかであった（ｐ＜０．００５）。共焦点解析は、ａｓｍａｓｅ＋／＋Ｔ細胞におけるセラミドリッチプラットフォーム内のスフィンゴ脂質ＧＭ１（図１９Ｅ）及びＦａｓの共局在化を明らかにした。
【００７４】
ＡＩＣＤに対するプラットフォーム生成の影響を特徴付けるために、ａｓｍａｓｅ＋／＋及びａｓｍａｓｅ−／−Ｔ細胞を、ＡＩＣＤを被るように誘導し、その１６時間後アポトーシスを定量化した。ａｓｍａｓｅ＋／＋Ｔ細胞におけるアポトーシスは抗ＣＤ３  ｍＡｂ用量依存的であり、誘導の１６時間後にアポトーシスは３２．９±５．２％に達した（図１９Ｆ）。反対に、アポトーシスはＭＲＬ．ｌｐｒ（ＦａｓＲ−／−）Ｔ細胞では無効化され（図１９Ｆ）、この系におけるＦａｓ／ＦａｓＬ相互作用についての必要性が確認された。ａｓｍａｓｅ−／−Ｔ細胞は、ａｓｍａｓｅ＋／＋Ｔ細胞と同様に良く抗ＣＤ３  ｍＡｂにより増殖するように誘導され、腫瘍細胞の溶解においてａｓｍａｓｅ＋／＋Ｔ細胞と同様に効果的であったが、ａｓｍａｓｅ−／−Ｔ細胞は、in vitroにおいてＡＩＣＤ誘導アポトーシスに対するほぼ完全な抵抗性を示した。ａｓｍａｓｅ−／−脾細胞は、最大１０ｎｇ／ｍｌ  抗ＣＤ３に対する応答において、バックグラウンド（８．８％）を上回る検出可能なアポトーシスを被らなかった（１０ｎｇ／ｍｌ  抗ＣＤ３においてａｓｍａｓｅ＋／＋に対してｐ＜０．０５；図１９Ｆ）。これは、Ｆａｓ及びＦａｓＬの通常のアップレギュレーションに関わらず起こった（非掲載）。Ｃ１６ジヒドロセラミド(C16-dihydoceramide)はそうではなかったが、天然の長鎖Ｃ１６セラミドは、プラットフォーム生成（非掲載）及びＡＩＣＤを被るように刺激されたａｓｍａｓｅ−／−Ｔ細胞のアポトーシスを完全に回復した（図１９Ｇ）。これらのデータは、標的細胞のＡＳＭａｓｅ介在性のセラミドリッチプラットフォームの形成が、抗原不一致及び競合的（fratricidic）な両方の設定におけるＴ細胞誘導アポトーシスに必要であるという説得力のある証拠を提供する。
【００７５】
抗セラミド抗体でのＧｖＨＤの治療及び予防
【００７６】
次に、我々は、同種異系骨髄及びＴ細胞移植後の生存率に対する２Ａ２抗セラミド抗体ＩｇＭでの治療の効果に注目した（図２０）。図１５に記載のＣ５７ＢＬ／６レシピエント（Ｈ−２ｂ）モデルへの同一のＬＰ／Ｊドナー（Ｈ−２ｂ）を用いて、我々は、２Ａ２抗体治療がin vivoにおける急性移植片対宿主病の客観的兆候を有意に低減させ、ａｓｍａｓｅ−／−表現型を部分的に再現することを実証する。Ｃ５７ＢＬ／６ａｓｍａｓｅ＋／＋又はＣ５７ＢＬ／６ａｓｍａｓｅ−／−を、分割線量の１１００ｃＧｙ  ＴＢＩで致死的に照射した。２Ａ２抗体を受けたＣ５７ＢＬ／６ａｓｍａｓｅ＋／＋群は、分割線量ＴＢＩの前半の１５分前に７５０μｇの抗体を受けた。その後、全てのマウスに、脾臓Ｔ細胞（３ｘ１０６）と共にマイナー抗原不適合であるＬＰ  ＴＣＤ−ＢＭ細胞（５ｘ１０６）を静脈内注射した。生存率を毎日モニタリングし、結果をカプラン−マイヤー生存率解析により表した。２Ａ２の投与は、移植後１００日の動物生存率を１２．５％から６０％に増加させた（図２０）。
【００７７】
ＧｖＨＤのサイトカインストーム発生においてＡＳＭａｓｅが果たす役割を鑑みて、次に、我々は、この有害反応を弱めるための２Ａ２抗体の能力を研究した。上に記載したように解析された群に由来する、ＢＭＴ後７日目の野生型、ａｓｍａｓｅ−／−及び２Ａ２処理動物から血清を採取した（図２１）。血清インターフェロンγを、製造者のプロトコル（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）にしたがって、ＥＬＩＳＡにより定量化した。我々の結果は、２Ａ２  ｍＡｂで処理したＷＴマウスが、ＡＳＭａｓｅ欠損マウスと同様に、約２５％の血清インターフェロンγの減少を伴う応答をしたことを示す。
【００７８】
これらの結果は、ＧｖＨＤ及び炎症性サイトカインの増加に関連する他のＴ細胞介在性の自己免疫疾患が、治療量の抗セラミド抗体、好ましくは２Ａ２抗セラミドモノクローナルＩｇＭ又は本明細書内に記載するようなそれらの生物学的活性断片を投与することにより治療され得ることを示す。我々のin vivoでの結果は、ナイスタチンもまたex vivoでのＴ細胞の細胞溶解を減少させ、ＧｖＨＤ及び自己免疫疾患が１以上のスタチンを、好ましくは２Ａ２といったヒト化抗セラミド抗体と共に投与することにより治療又は予防されるという特定の実施形態を支持することを示した。他の実施形態は、１以上のスタチン及び１以上の抗セラミド抗体の新しい組成物を対象にする。ＧＩ症候群の治療に関して、ルーチンの実験により、使用すべきヒト化モノクローナル抗セラミド抗体の有効量が決定されるであろう。治療的に投与され得る抗セラミド抗体の量は、約１ｕｇから１００ｕｇ／ｍｌに及ぶ。この量は、典型的に変動し、並びに対象において典型的には約１μｇ／ｍｌと約１０μｇ／ｍｌの間の血清治療剤レベルを達成するために十分な量であり得る。
【００７９】
本研究は、電離放射線後のＧＩの微小血管アポトーシス及び免疫標的上のＣＴＬによる溶解攻撃の両方において重要な段階としての標的細胞の原形質膜の原形質外層におけるセラミドリッチ膜プラットフォームの形成を明らかにする。刺激の数秒以内で形成されるこれらの構造は、かなり大きくしばしば直径３ミクロンに達するため、共焦点又は標準顕微鏡によって容易に検出される。我々は、例えばＡＳＭａｓｅ又はＢａｘの阻害及び抗セラミド抗体の投与による、プラットフォームの遺伝子的又は薬理的破壊が、in vivo及びin vitroでの放射線誘導細胞死並びにＣＴＬ誘導細胞死の３つの異なる細胞モデルにおけるＣＴＬ介在性の死を妨げることを示した。モノクローナル抗セラミド抗体での治療は、胃腸の放射線毒性における病態生理学的応答の複数の側面を劇的に低減させ、並びにＧｖＨＤのメジャー及びマイナーミスマッチモデルを標準化した。
【００８０】
要約
【００８１】
本研究は、微小血管内皮アポトーシスと幹細胞クロノゲン致死率との間のつながりは、マウスの腸に対する放射線損傷の誘導に関する一般的な機序であるとする新しい証拠を提供する。Ｂａｘ欠損マウスは、照射された陰窩幹細胞クロノゲンの運命に影響を与えるのは、ＡＳＭａｓｅシグナル伝達により制御された他の事象よりはむしろ、内皮アポトーシス応答である証拠を提供する。ＡＳＭａｓｅを阻害し得る薬理学的利用可能性（イミプラミン、アンチセンス核酸又はｓｉＲＮＡ）は、高線量腹部照射を必要とする患者において、腫瘍細胞殺傷に影響を与えず、ＧＩ毒性を選択的に中和する可能性を伴う、価値ある治療法である。別の価値ある治療法は、突発的放射線曝露又は大規模な放射線事故に対する応答の初期の、ラフトクラスタリング及びＧＩアポトーシスを中和するための抗セラミド抗体のようなセラミド標的薬物療法の利用である。現在治療の選択肢がない、放射線曝露後の致死性ＧＩ毒性は、世界情勢の現在の状態に代わって、国立衛生研究所の主要な関心事である。
【００８２】
我々がここに示した結果が示すように、セラミドリッチプラットフォームは、in vivoでのＴ細胞介在性自己免疫症候群に必要である。ＡＳＭａｓｅは急性Ｔ細胞介在性の自己攻撃的肝疾患のモデルである、フィトヘマグリチン（phytohemagglutin）（ＰＨＡ）誘導肝炎における肝細胞アポトーシスを制御することが示されている（S. Kirschnek, F. Paris, M. Wellerら、J Biol Chem 275(35), 27316 (2000)）。ＰＨＡは、リンパ球でのＦａｓＬ誘導を刺激し、肝臓へのそれらの移動の際に、肝細胞はアポトーシスにより殺され、肝炎を促す（K. Seino, N. Kayagaki, K. Takedaら、Gastroenterology 113(4), 1315(1997)）。リンパ球ＦａｓＬの正常アップレギュレーションにもかかわらず、ＡＳＭａｓｅ欠損は、アポトーシスから肝細胞を保護した。ＣＤ４活性化Ｔ細胞誘導細胞溶解におけるＡＳＭａｓｅの役割が報告されている（Z. Q. Wang, A. Dudhane, T. Orlikowskyら、Eur J Immunol 24(7), 1549(1994)）。ＨＩＶレセプター分子ｇｐ１２０又はアゴニストの抗ＣＤ４抗体によるＣＤ４活性化は、Ｆａｓ／ＦａｓＬ系を活性化し、アポトーシスを開始させる一方、ＡＳＭａｓｅにおけるＣＤ４＋Ｔ細胞欠損は、抗ＣＤ４抗体のin vivoでの接種においてアポトーシスを遂げることができなかった（S. Kirschnek, F. Paris, M. Wellerら、J Biol Chem 275(35), 27316(2000)）。我々はここに、ＡＳＭａｓｅ産生セラミドがサイトカイン介在性Ｔ細胞誘導アポトーシス、及びＧＩ症候群の病理学の根底にある内皮微小血管のアポトーシスの阻止において普遍的に必要であることを示してきた）。我々はまた、抗セラミド抗体でのＡＳＭａｓｅ産生セラミドの阻害は、血清炎症性サイトカインの発現を減少させることも示した。したがって、Ｆａｓ／ＦａｓＬ及びＴＮＦ／ＴＮＦＲ相互関作用を含むＴＮＦスーパーファミリーレセプターシグナル伝達を介して働く任意の疾患は、ＡＳＭａｓｅ産生セラミドに結合する治療量の抗体を投与することにより、又はＡＳＭａｓｅもしくはＢａｘの阻害により治療又は予防され得る。
【００８３】
本明細書内に記載される実験は、宿主ＡＳＭａｓｅの活性化及びセラミドリッチプラットフォームの形成が急性ＧｖＨＤを起こさせることにおける重要な事象であることを初めて示す。我々は、不適合自己活性ＣＴＬがａｓｍａｓｅ−／−マウスへの骨髄移植片に加えられた場合の、ＧｖＨＤを進めるために必要なステップである、Ｉ型サイトカイン産生及びＣＴＬクローン性増殖における著しい減少により、これを示した。異なる病因にも関わらず、ＧＩ症候群と同様、ＧｖＨＤは、抗セラミド抗体による治療及びＡＳＭａｓｅ又はＢａｘ発現の阻害に対して応答した。
【００８４】
セラミドリッチプラットフォームの不活性化の利点は、ＴＮＦ、ＩＬ−１及びＴＲＡＩＬを含むがこれに限定されない他の炎症性サイトカインは同様に、膜貫通型シグナル伝達のためにＡＳＭａｓｅを用いるので、Ｆａｓ介在性の生物学的作用に限定されない。したがって、ＡＳＭａｓｅ産生セラミドリッチプラットフォームは、ＧｖＨＤ及び病態生理を引き起すために複数のサイトカインを利用する他の免疫疾患のための無差別の標的を示す。
【００８５】
抗体
【００８６】
「抗体」は、インタクトな免疫グロブリン又は特異的結合のためにインタクトな抗体と競合するその抗原結合部分を言う。抗原結合部分は、組換えＤＮＡ技術又はインタクトな抗体の酵素的もしくは化学的切断により産生されてもよい。抗原結合部分としては、とりわけ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）ｓｕｂ．２、Ｆｖ、ｄＡｂ及び相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、キメラ抗体、二重特異性抗体並びにポリペプチドへの特異的抗原結合を与えるのに十分である免疫グロブリンの少なくとも一部分を含むポリペプチドが挙げられる。
【００８７】
「免疫グロブリン」は、四量体分子である。天然に生じる免疫グロブリンにおいて、各四量体は、ポリペプチド鎖の２つの同一の対からなり、各対は１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）及び１つの「重」鎖（約５０−７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、抗原認識に主に関与する約１００から１１０又はそれより多くのアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、エフェクター機能に主に関与する定常領域を規定する。ヒト軽鎖は、κ及びλ軽鎖に分類されている。重鎖は、μ、δ、γ、α又はεに分類され、それぞれ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥとしての抗体のアイソタイプを規定する。軽鎖及び重鎖のうち、可変及び定常領域は、約１２以上のアミノ酸の「Ｊ」領域により結合され、重鎖はまた、約１０以上(10 more)のアミノ酸の「Ｄ」領域を含む。一般には、Fundamental Immunology Ch. 7（Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)）（全ての目的のために参照によってその全体が組み込まれる）を参照されたい。各軽／重鎖対の可変領域は、インタクトな免疫グロブリンが２つの結合部位を有するように抗体結合部位を形成する。免疫グロブリン鎖は、相補的決定領域又はＣＤＲとも呼ばれる、３つの超可変領域によって結合された比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）の同一の一般的構造を示す。各対の２つの鎖由来のＣＤＲは、フレームワーク領域により整列し、特異的エピトープへの結合を可能にする。Ｎ末端からＣ末端へ、軽鎖及び重鎖の両方は、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４を含む。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interestの定義（国立衛生研究所、Bethesda, Md. (1987及び1991)）又はChothia & Lesk J. Mol. Biol. 196:901 917 (1987); Chothia ら、Nature 342:878 883 (1989)に従う。
【００８８】
Ｆａｂ断片は、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨＩドメインからなる一価の断片である；Ｆ（ａｂ’）．ｓｕｂ．２断片は、ヒンジ領域のジスルフィド結合により結合された２つのＦａｂ断片を含む二価の断片である；Ｆｄ断片は、ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなる；Ｆｖ断片は、抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインからなる；並びにｄＡｂ断片（Wardら、Nature 341:544 546, 1989）は、ＶＨドメインからなる。単鎖抗体（ｓｃＦｖ）は、ＶＬ及びＶＨ領域が対になって、これらを単一タンパク質鎖とすることを可能にする合成リンカーを介して、一価分子を形成する抗体である（Birdら、Science 242:423 426, 1988 及びHuston ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 855879 5883, 1988）。二重特異性抗体は二価の二重特異性の抗体であり、ＶＨ及びＶＬドメインが単一ポリペプチド鎖上に発現されるが、同一鎖上の２つのドメインの間でペアになるのを可能にするには短かすぎるリンカーを用いることにより、当該ドメインが別の鎖の相補的ドメインと対にならざるを得ず、２つの抗原結合部位を作る（例えばHolliger, P., ら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444 6448, 1993,及びPoljak, R. J.ら、Structure 2: 1121 1123, 1994を参照）。１以上のＣＤＲが、共有又は非共有結合的のいずれかで分子内に組み込まれてそれをイムノアドヘシンとしてもよい。イムノアドヘシンは、大きなポリペプチド鎖の一部としてＣＤＲを組み込んでもよく、ＣＤＲを別のポリペプチド鎖に共有結合的に結合してもよく、もしくは、ＣＤＲを非共有結合的に組み込んでもよい。ＣＤＲは、イムノアドヘシンが、目的の特定の抗原に特異的に結合するのを可能にする。
【００８９】
抗体は、１以上の結合部位を有し得る。１より多くの結合部位がある場合、結合部位は、互いに同一でもよく、又は異なっていてもよい。例えば、天然に生じる免疫グロブリンは、２つの同一の結合部位を有し、単鎖抗体又はＦａｂ断片は１つの結合部位を有する一方、「二重特異的」又は「二機能性」抗体は、２つの異なる結合部位を有する。
【００９０】
「単離された抗体」は、（１）自然の状態においてそれに付随する、他の天然に伴われる抗体を含む天然に伴われる成分を伴っていない、（２）同種由来の他のタンパク質を含まない、（３）異種由来の細胞により発現される、又は（４）天然には生じない、抗体である。
【００９１】
用語「ヒト抗体」は、ヒト免疫グロブリン配列由来の１以上の可変及び定常領域を有する全ての抗体を含む。好ましい実施形態において、全ての可変及び定常ドメインは、ヒト免疫グロブリン配列由来（完全ヒト抗体）である。これらの抗体は、以下に記載するように、様々な方法において調製され得る。
【００９２】
ヒト化抗体は、非ヒト種由来の抗体であり、重鎖及び軽鎖のフレームワークドメイン及び定常ドメインの特定のアミノ酸が、ヒトにおける免疫応答を妨げるか又は無効にするように変異されたものである。あるいは、ヒト化抗体は、ヒト抗体由来の定常ドメインを非ヒト種の可変ドメインに融合させることにより作成され得る。ヒト化抗体の作成方法の例は、参照によって本明細書内に組み込まれる、米国特許第６，０５４，２９７号、第５，８８６，１５２号及び第５，８７７，２９３号に見られ得る。
【００９３】
用語「キメラ抗体」は、１つの抗体由来の１以上の領域及び１以上の他の抗体由来の１以上の領域を含む抗体を言う。
【００９４】
抗体の断片又はアナログは、本明細書の教示に従って当業者によって容易に作製され得る。断片又はアナログの好ましいアミノ及びカルボキシ末端は、機能的ドメインの境界付近に生じる。構造的及び機能的ドメインは、ヌクレオチド及び／又はアミノ酸配列データと公的又は私的な配列データベースとの比較によって同定され得る。好ましくは、コンピュータでの比較方法が、公知の構造及び／又は機能の他のタンパク質で生じる配列モチーフ又は予測されるタンパク質構造ドメインの同定に用いられる。公知の３次元構造に折りたたまれたタンパク質配列を同定するための方法は、公知である。Bowie ら、Science 253:164 (1991)。
【００９５】
低分子干渉ＲＮＡ
【００９６】
低分子干渉ＲＮＡもまた、それぞれの発現を低減又は阻害し、それによりアポトーシスを阻害するために、その少なくとも一部がＡＳＭａｓｅ又はＢａｘをコードするｍＲＮＡに相補的且つ特異的にハイブリダイズするｓｉＲＮＡを投与することにより、対象におけるＧｖＨＤ、ＧＩ症候群、炎症及び自己免疫疾患を含む放射線誘導疾患を治療又は予防するため治療的に用いられ得る。
【００９７】
米国特許出願第20040023390（参照によって本明細書内に組み込まれる）は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として公知のプロセスによって、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が、多くの生物体において配列特異的な転写後遺伝子サイレンシングを誘導し得ることを教示する。しかしながら、哺乳類細胞において、３０塩基対又はそれより長いｄｓＲＮＡは、タンパク質合成の終了及びアポトーシスを介する細胞死すらも引き起こす、配列非特異的応答を誘導し得る。最近の研究は、ＲＮＡ断片がＲＮＡｉの配列特異的メディエーターであることを示す（Elbashirら、2001）。これらの低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）による遺伝子発現の干渉が、線虫（C. elegans）、ショウジョウバエ、植物において及びマウス胚幹細胞、卵母細胞及び初期胚において遺伝子をサイレンシングするための天然に起こる戦略方法として現在認識されている（Cogoniら、1994; Baulcombe, 1996; Kennerdell, 1998; Timmons, 1998; Waterhouseら、1998; Wianny 及びZernicka-Goetz, 2000; Yangら、2001; Svobodaら、2000）。
【００９８】
哺乳類細胞培養において、ｓｉＲＮＡ介在性遺伝子発現の減少が、合成ＲＮＡ核酸を伴う細胞をトランスフェクトすることにより達成されている（Caplanら、2001; Elbashirら、2001）。本明細書に完全に説明されたように、参照によってその内容全てが本明細書内に組み込まれる、出願第20040023390号は、対象の遺伝子を標的にした低分子干渉ＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡ）をコードする核酸配列に作動可能に連結されたｐｏｌ  ＩＩプロモーターを包含する発現カセットを含有するウイルスベクターを用いる方法を提供する。
【００９９】
本明細書内で用いられる場合ＲＮＡｉは、ＲＮＡ干渉のプロセスである。典型的なｍＲＮＡは、約５０００コピーのタンパク質を産生する。ＲＮＡｉは、ｍＲＮＡにより作成されたタンパク質コピーの数に干渉するか又は有意に減少させるプロセスである。例えば、二本鎖の短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子は、干渉されるべき標的ｍＲＮＡのタンパク質コードヌクレオチド配列と相補的且つ適合するように作製されている。細胞内輸送後、ｓｉＲＮＡ分子はＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に随伴される。ｓｉＲＮＡ随伴ＲＩＳＣは、標的ｍＲＮＡ（ＡＳＭａｓｅ又はＢａｘをコードするｍＲＮＡ等）と塩基対合相互作用を介して結合し、これを分解する。ＲＩＳＣは、標的とされたｍＲＮＡの更なるコピーを依然として分解することができる。短いヘアピンＲＮＡ及びより長いＲＮＡ分子などのＲＮＡの他の形態が用いられ得る。より長い分子は、例えばアポトーシスを引き起こして、インターフェロン応答を誘導することにより、細胞死を引き起こす。３０ヌクレオチドより長いｄｓＲＮＡはＲＮＡ転写物の非特異的分解及び宿主細胞の全体的な停止をもたらす防御機序を活性化するため、細胞死は哺乳類においてＲＮＡｉを達成するための大きな障害であった。哺乳類細胞における遺伝子特異的抑制を介在するために約２０から約２９ヌクレオチドのｓｉＲＮＡを利用することで、この障害を克服されたようである。これらのｓｉＲＮＡは、遺伝子抑制を引き起こすのに十分な長さであるが、インターフェロン応答を誘導する長さではない。
【０１００】
本発明は、特定の実施形態への言及と共に先行する詳述において記載されている。しかしながら、本発明のより広範な精神及び範囲を逸脱することなく、様々な改変及び変更が、実施形態に対して行われ得ることは明らかであろう。本明細書及び図面は、限定的意味ではなく寧ろ例示的意味において見なされるべきである。
【０１０１】
アンチセンス核酸
【０１０２】
本明細書内で用いられる場合、用語「核酸」は、ＲＮＡ及びｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ及び合成（例、化学合成）ＤＮＡを含むＤＮＡの両方をいう。核酸は、二本鎖又は一本鎖（即ち、センス又はアンチセンス一本鎖）であり得る。本明細書内で用いられる場合、「単離された核酸」は、哺乳類ゲノムにおける核酸の片側又は両側に通常隣接する核酸（例、ＡＲＰＫＤ遺伝子に隣接する核酸）を含む、哺乳類ゲノム中に存在する別の核酸分子から分離された核酸をいう。天然に生じない配列は、天然には見出されず且つ天然に生じるゲノムにおいて直に接する配列を有さないため、核酸について本明細書内で用いられる用語「単離された」はまた、任意の天然に生じない核酸配列を含む。
【０１０３】
単離された核酸は、天然に生じるゲノムにおいてそのＤＮＡ分子に直に接して通常見出される核酸配列の一つが除去されているか又は存在しないのであれば、例えばＤＮＡ分子であり得る。したがって、単離された核酸としては、限定されないが、他の配列から独立した分離分子として存在するＤＮＡ分子（例、化学的に合成された核酸又はＰＣＲもしくは制限エンドヌクレアーゼ処理により生成されたｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ断片）並びにベクター、自己複製プラスミド、ウイルス（例、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルスもしくはヘルペスウイルス）又は原核細胞もしくは真核細胞のゲノムＤＮＡ内に組み込まれているＤＮＡが挙げられる。さらに単離された核酸は、ハイブリッド又は融合核酸の一部であるＤＮＡ分子等の改変核酸を含み得る。例えば、ｃＤＮＡライブラリ又はゲノムＤＮＡ制限消化を包含するゲル薄片内の何百から何百万の他の核酸の中に存在する核酸は、単離された核酸と考えられない。
【０１０４】
本発明の他の実施形態は、ＡＳＭａｓｅもしくはＢａｘもしくはＢａｋ又はそれらの生物学的活性断片もしくは変異体の発現を阻害するための、アンチセンス核酸（ＤＮＡもしくはＲＮＡのいずれか）又は低分子干渉ＲＮＡの使用を対象にする。アンチセンス核酸は、アンチセンスＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ又は低分子干渉ＲＮＡであり得る。ＡＳＭａｓｅもしくはＢａｘもしくはＢａｋの公知の配列に基づいて、発現を止めるために各々の遺伝子もしくはｍＲＮＡに十分にハイブリダイズするアンチセンスのＤＮＡもしくはＲＮＡは、当該技術分野において公知の方法を用いて容易に設計及び作製され得る。
【０１０５】
本発明において用いるための単離されたアンチセンス又はｓｉＲＮＡ核酸分子は、標的（配列番号：１として特定されるＡＳＭａｓｅをコードする遺伝子（完全ゲノムＤＮＡ）、配列番号：２として特定されるヒトＢａｘをコードする遺伝子、又は配列番号：３として特定されるヒトＢａｋをコードする遺伝子）のための遺伝子又はｍＲＮＡ配列の相補体である核酸分子を含む。所与のヌクレオチド配列に相補的な核酸分子は、該所与のヌクレオチドとハイブリダイズして安定な二本鎖を形成し得る、該所与のヌクレオチド配列に十分相補的であるものである。
【０１０６】
アンチセンス核酸分子は、即ちタンパク質をコードするセンス核酸に相補的である（例、二本鎖ＤＮＡ分子のコード鎖（もしくはｃＤＮＡ）に相補的であるか、又はｍＲＮＡ配列と相補的である）分子である。したがって、アンチセンス核酸はセンス核酸と水素結合し得る。アンチセンス核酸は、ＡＳＭａｓｅ、ＢａｋもしくはＢａｘのコード鎖全体、又はその一部のみ（例、タンパク質コード領域（又はオープンリーディングフレーム）の全てもしくは一部）に相補的であり得る。アンチセンス核酸分子は、ＡＳＭａｓｅ、ＢａｋまたはＢａｘをコードするヌクレオチド配列のコード鎖の非コード領域に対してアンチセンスであり得る。非コード領域（「５’及び３’非翻訳領域」）は、コード領域に隣接し、アミノ酸に翻訳されない５’及び３’の配列である。
【０１０７】
本明細書に開示される、ＡＳＭａｓｅをコードするコード鎖配列（ｃＤＮＡ配列番号：２、ゲノムＤＮＡ配列番号：７、Ｂａｘ  ｃＤＮＡ配列番号：３、ゲノムＤＮＡ配列番号：８又はＢａｋ  ｃＤＮＡ配列番号：５、ゲノムＤＮＡ配列番号：９を考慮して、本発明のアンチセンス核酸を、ワトソンとクリックの塩基対合のルールにしたがって設計することができる。アンチセンス核酸分子は、ＡＳＭａｓｅ、Ｂａｋ又はＢａｘ  ｍＲＮＡのコード領域全体と相補的であり得るが、より好ましくは、ＡＳＭａｓｅ、Ｂａｋ又はＢａｘ  ｍＲＮＡのコード又は非コード領域の一部のみにアンチセンスであるオリゴヌクレオチドである。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＡＳＭａｓｅ、Ｂａｋ又はＢａｘの翻訳開始部位の周りの領域に相補的であり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５又は５０ヌクレオチドの長さであり得る。本発明のアンチセンス核酸は、当該技術分野において公知の手順を用いた化学合成及び酵素的ライゲーション反応を用いて構築され得る。例えば、アンチセンス核酸（例、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然に生じるヌクレオチド又は、分子の生物学的安定性を増加するようにもしくはアンチセンスとセンス核酸との間に形成される二本鎖の物理的安定性を増加するように設計された様々な改変ヌクレオチド(例えば、ホスホロチオエート誘導体及びアクリジン置換ヌクレオチドが用いられ得る)を用いて化学的に合成され得る。アンチセンス核酸を生成するために用いられ得る、改変ヌクレオチドの例としては、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ホドウラシル（hodouracil）、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−ソウリジン（thouridine）、５−カルボキシメチルアミノメチ−イルウラシル（5-carboxymethylaminometh-yluracil）、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メトニルシトシン（metnylcytosine）、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテン−イルアデニン（2-methylthio-N6-isopenten- yladenine）、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、シュードウラシル、キュエオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−スロウラシル（2-thlouracil）、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−シクシ酢酸（cxyacetic acid）（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボシキプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、及び２，６−ジアミノプリン等が挙げられる。あるいは、アンチセンス核酸は、アンチセンスの向きに核酸がサブクローニング���れている（即ち、以下の小節にさらに記載される、挿入された核酸から転写されたＲＮＡが、目的の標的核酸に対してアンチセンスの向きであるだろう）発現ベクターを用いて生物学的に作成され得る。
【０１０８】
本発明のアンチセンス核酸分子は、典型的には、対象に投与されるか、又は細胞性ｍＲＮＡ及び／もしくは目的のタンパク質をコードするゲノムＤＮＡとハイブリダイズするかもしくは結合し、それによって、例えば転写及び／もしくは翻訳を阻害することにより該タンパク質の発現を阻害するようにin situで生成される。ハイブリダイゼーションは、安定な二本鎖を形成する従来のヌクレオチド相補性によるものであってもよく、又は、例えば、ＤＮＡ二本鎖と結合するアンチセンス核酸分子の場合、ダブルへリックスの主溝内での特異的相互作用を介したものであってもよい。本発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の例は、組織部位における直接接種を含む。あるいは、アンチセンス核酸分子は、選択された細胞を標的にするために改変され得、次いで全身に投与され得る。例えば、アンチセンス分子は、全身投与のために、例えば、アンチセンス核酸分子を、細胞表面レセプターもしくは抗原に結合するペプチド又は抗体に連結することにより、選択された細胞表面に発現したレセプター又は抗原に特異的に結合するように改変され得る。アンチセンス核酸分子はまた、本明細書に記載されるベクターを用いて細胞に送達され得る。アンチセンス分子の十分な細胞内濃度を達成するため、アンチセンス核酸分子は、強いｐｏｌ  ＩＩ又はｐｏｌ  ＩＩＩポリメラーゼの制御下に置かれたベクターコンストラクトが好ましい。
【０１０９】
本発明のアンチセンス核酸分子は、α−アノマー核酸分子であり得る。α−アノマー核酸分子は、通常のβ−ユニットとは対照的に、鎖が互いに並行して走る特有の二本鎖ハイブリッドを相補的なＲＮＡと形成する（Gaultierら、(1987) Nucleic Acids. Res. 15:6625-6641）。アンチセンス核酸分子はまた、２’−ｏ−メチルリボヌクレオチド（Inoueら、(1987) Nucleic Acids Res. 15:6131-6148）又はキメラＲＮＡ−ＤＮＡアナログ（Inoueら、(1987) FEBS Lett. 215:327-330）を包含し得る。アンチセンス技術に関する上記論文に記載される全ての方法は、参照によって本明細書内に組み込まれる。
【０１１０】
本発明はまた、リボザイムを包含する。リボザイムは、相補的領域を有する一本鎖核酸(ｍＲＮＡなど)を切断することができるリボヌクレアーゼ活性を伴う触媒ＲＮＡ分子である。したがって、リボザイム（例、ハンマーヘッドリボザイム（Haselhoff及びGerlach (1988) Nature 334:585-591に記載される））は、ＡＳＭａｓｅ、Ｂａｋ又はＢａｘ転写物を触媒的に切断することにより、ＡＳＭａｓｅ、Ｂａｋ又はＢａｘの翻訳を阻害するために用いられ得る。ＡＳＭａｓｅ、Ｂａｋ又はＢａｘコード核酸に特異性を有するリボザイムは、本明細書内に開示されるＡＳＭａｓｅ、Ｂａｋ又はＢａｘｃＤＮＡのヌクレオチド配列に基づいて設計され得る。例えば、活性部位のヌクレオチド配列が、ＡＳＭａｓｅ、Ｂａｋ又はＢａｘをコードするｍＲＮＡにおいて切断されるヌクレオチド配列に相補的であるテトラヒメナのＬ−１９  ＩＶＳ  ＲＮＡの誘導体が、構築され得る。例えば、Cechら、米国特許第４，９８７，０７１号；及びCechら、米国特許第５，１１６，７４２号を参照されたい。あるいは、ＡＳＭａｓｅ、Ｂａｋ又はＢａｘ  ｍＲＮＡは、ＲＮＡ分子のプールから特異的リボヌクレアーゼ活性を有する触媒ＲＮＡを選択するために用いられ得る。例えば、参照によって本明細書内に組み込まれる、Bartel及びSzostak (1993) Science 261:1411-1418を参照されたい。
【０１１１】
本明細書内で用いられる場合、用語「核酸」は、ＲＮＡ及びｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ及び合成（例、化学合成）ＤＮＡを含むＤＮＡの両方をいう。核酸は、二本鎖又は一本鎖（即ち、センス又はアンチセンス一本鎖）であり得る。本明細書内で用いられる場合、「単離された核酸」は、哺乳類ゲノムにおける核酸の片側又は両側に通常隣接する核酸（例、ＡＲＰＫＤ遺伝子に隣接する核酸）を含む、哺乳類ゲノム中に存在する別の核酸分子から分離された核酸をいう。天然に生じない配列は、天然には見出されず且つ天然に生じるゲノムにおいて直に接する配列を有さないため、核酸について本明細書内で用いられる用語「単離された」はまた、任意の天然に生じない核酸配列を含む。
【０１１２】
単離された核酸は、天然に生じるゲノムにおいてそのＤＮＡ分子に直に接して通常見出される核酸配列の一つが除去されているか又は存在しないのであれば、例えばＤＮＡ分子であり得る。したがって、単離された核酸としては、限定されないが、他の配列から独立した分離分子として存在するＤＮＡ分子（例、化学的に合成された核酸又はＰＣＲもしくは制限エンドヌクレアーゼ処理により生成されたｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ断片）並びにベクター、自己複製プラスミド、ウイルス（例、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルスもしくはヘルペスウイルス）又は原核細胞もしくは真核細胞のゲノムＤＮＡ内に組み込まれているＤＮＡが挙げられる。さらに単離された核酸は、ハイブリッド又は融合核酸の一部であるＤＮＡ分子等の改変核酸を含み得る。例えば、ｃＤＮＡライブラリ又はゲノムＤＮＡ制限消化を包含するゲル薄片内の何百から何百万の他の核酸の中に存在する核酸は、単離された核酸と考えられない。
【０１１３】
医薬組成物
【０１１４】
本発明はまた、任意で１以上のスタチン又はイミプラミンと共に製剤処方される、２Ａ２ヒト化モノクローナル抗体の医薬組成物及び製剤を含む。投与される本発明のアンチセンス核酸及び低分子干渉ＲＮＡを含む他の医薬組成物は、ＡＳＭａｓｅ又はＢａｋ又はＢａｘ発現を低減する。
【０１１５】
本発明の医薬組成物は、対象における列挙した疾患：ＧＶＨＤ、ＧＩ症候群、炎症及び自己免疫疾患を含む放射線誘導疾患を予防又は治療するのに十分な量の治療剤（抗セラミド抗体、酵素阻害剤、アンチセンス核酸及びｓｉＲＮＡ）を包含する。これらの医薬組成物は、対象においてＧＶＨＤ、ＧＩ症候群、炎症及び自己免疫疾患を含む放射線誘導疾患の予防又は治療の必要がある対象への投与に好適である。対象は、好ましくはヒトであるが、非ヒトでもあり得る。好適な対象は、列挙した疾患の１つである疑いがある、であると診断された、又は発症の危険性がある個体であり得る。治療組成物は、例えば、結合剤、充填剤、担体、保存剤、安定剤、乳化剤、緩衝剤及び賦形剤、例えば医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等として通常使用される添加剤等を含有してもよい。これらの組成物は典型的に、１％−９５％の活性成分、好ましくは２％−７０％の活性成分を含有する。
【０１１６】
本発明の抗体及びアンチセンスヌクレオチド並びに酵素阻害剤又はスタチンはまた、相溶性があり、生理的に許容できる希釈剤又は賦形剤と混合され得る。好適な希釈剤及び賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール等、並びにこれらの組み合わせである。さらに、必要であれば、該組成物は、湿潤又は乳化剤、安定化又はｐＨ緩衝剤等の少量の補助物質を含有してもよい。
【０１１７】
いくつかの実施形態において、本願発明の治療組成物は、水溶液もしくは懸濁液として、スプレーとして又は固形でのいずれかで調製される。経口製剤としては、通常、結合剤、充填剤、担体、保存剤、安定剤、乳化剤、緩衝剤及び賦形剤、例えば医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等として通常使用される添加剤等が挙げられる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル、徐放性製剤又は粉末の形態をとり、典型的には１％−９５％の活性成分、好ましくは２％−７０％を含有する。本発明の治療組成物を送達するのに有用な経口組成物の一例は、米国特許第５，６４３，６０２号に記載される（参照によって本明細書内に組み込まれる）。
【０１１８】
局所投与等の他の投与の方法に対して好適であるさらなる製剤としては、軟膏、チンキ剤、クリーム、ローション、経皮貼布剤及び坐薬が挙げられる。軟膏及びクリームについて、従来の結合剤、担体及び賦形剤を含んでもよく、例えば、ポリアルキレングリコール又はトリグリセリドである。局所送達方法の一例は、米国特許第５，８３４，０１６号（参照によって本明細書内に組み込まれる）に記載される。他のリポソーム送達方法もまた使用されてもよい（いずれも参照によって本明細書内に組み込まれる、米国特許第５，８５１，５４８号及び第５，７１１，９６４号を参照されたい）。
【０１１９】
製剤はまた、治療される特定の兆候に必要である１より多くの活性化合物を含有してもよく、好ましくは、互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を伴うものである。このような分子は、好ましくは、意図した目的に効果がある量で組み合わせて存在する。例えば、２Ａ２抗体はスタチン又はイミプラミンと共に処方され得るであろう。
【０１２０】
徐放製剤もまた調製され得る。徐放製剤の好適な例は、抗体又は断片を含有する固体疎水性ポリマーの半透明性マトリックス、ナイスタチン、イミプラミン又はそれらの組み合わせを含み、ここで該マトリックスは、例えば、フィルム又はマイクロカプセルの造形品の形態である。徐放性マトリックスの例としては、これに限定されないが、ポリエステル、ヒドロゲル（例、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）又はポリ（ビニルアルコール）、ポリラクチド、Ｌ−グルタミン酸とｙエチル−Ｌ−グルタミン酸（y ethyl-L-glutamate）の共重合体、非分解性エチレン酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（乳酸−グリコール酸共重合体及び酢酸ロイプロリドからなる注射可能なミクロスフェア）等の分解性乳酸−グリコール酸共重合体、並びにポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン酢酸ビニル及び乳酸−グリコール酸等のポリマーは、１００日を越える分子の放出が可能であり、特定のヒドロゲルは、より短期間タンパク質を放出する。
【０１２１】
本願発明の抗体及びアンチセンス又はｓｉＲＮＡは、非経口、皮下、局所、腹腔内、肺内、及び鼻腔内並びに病巣内投与（例、局所的免疫抑制治療）を含む、任意の好適な方法により投与され得る。非経口注入としては、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、又は皮下投与が挙げられる。さらに、好適な投与としては、特に抗体の用量の低下を伴う、脈内注入が含まれる。好ましくは、投与は注射により与えられ、最も好ましくは投与が短いか又は慢性的かに部分的に依存して静脈内又は皮下注射により与えられる。
【０１２２】
疾患の予防又は治療について、抗体の適切な用量は、治療される疾患の種類、重症度及び疾患の経過、薬剤が予防又は治療目的で投与されるかどうか、薬歴、患者の病歴及び新薬（２Ａ２抗体等）に対する応答及び主治医の判断に依存するだろう。抗体及びヌクレオチド又は他の薬剤（イミプラミン及びスタチン）は１回又は一連の治療に渡って患者に好適に投与される。
【０１２３】
上述したように、治療的に投与されるべき抗セラミド抗体の量は、約１ｕｇから１００ｕｇ／ｍｌに及ぶ。この量は典型的に変動し、対象において典型的には約１μｇ／ｍｌと約１０μｇ／ｍｌの間の血清治療剤レベルを達成するのに十分な量であり得る。本発明の治療剤は、１以上の分かれた投与により又は連続的注入により投与され得る。数日又はそれより長きに渡る繰り返し投与について、条件に応じて、治療は症状が十分に低減又は除去されるまで続けられる。本治療の進展は、従来の技術及びアッセイにより容易にモニタリングされ、治療効果を達成するための用量を調節するために用いられてもよい。
【０１２４】
治療的用途のためのアンチセンス核酸又はｓｉＲＮＡの候補用量は、ヒト又は動物からの生物学的試料における標的タンパク質の発現を低減する量を見つけることにより初めに決定され得る。
【０１２５】
以上の詳述において、本発明をその特定の実施形態について説明してきた。しかしながら、本発明のより広範な精神及び範囲を逸脱することなく、様々な改変及び変更が、これらに対して行われることは明らかであろう。したがって、本明細書及び図面は、限定的意味ではなく寧ろ例示的意味において見なされるべきである。
【実施例】
【０１２６】
実施例１：材料及び方法
細胞培養及び刺激
【０１２７】
野生型（クローンＥ６−１）、カスパーゼ８−／−（クローンＩ９．２）及びＦＡＤＤ−／−（クローンＩ２．１）Ｊｕｒｋａｔ  Ｔリンパ球はＡＴＣＣ（Rockville、MD）から得た。細胞を５％  ＣＯ２インキュベーター内、３７℃で１０％  熱不活性化ウシ胎仔血清及び１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ7.4）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム、１００μＭ  非必須アミノ酸、１００単位／ｍｌ  ペニシリン及び１００μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシンを添加した、ＲＰＭＩ１６４０培地中で増殖した。ＵＶ−Ｃ又は抗Ｆａｓでの刺激の前に、細胞を新鮮培地で再懸濁し、４時間順化させた。次いで、別段記載しない限り、５０ｎｇ／ｍｌ  抗ＦａｓＣＨ−１１活性抗体（Upstate Biotechnology, Lake Placid NY）又はＦＢ−ＵＶＸＬ−１０００クロスリンカー（Fisher Biotech, Pittsburgh PA）を用いて５０ジュール／ｍ２  ＵＶ−Ｃで、Ｊｕｒｋａｔ細胞を処理した。プラットフォーム研究のために、均一なレセプターの関与を保証するためにＪｕｒｋａｔ細胞をＣＨ−１１と共に４℃で２０分間培養し、刺激を開始させるために３７℃に温めた。
【０１２８】
示した場合には、細胞を１０μＭ  ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ（Calbiochem, La Jolla CA）、３０μｇ／ｍｌ  ナイスタチン（Sigma-Aldrich, Milwaukee WI）、５０μＭ  イミプラミン（Sigma-Aldrich）又は１μｇ／ｍｌ  マウスモノクローナル抗セラミド抗体ＭＩＤ１５Ｂ４（Alexis Biochemicals, San Diego CA）と共に予備培養した。ナイスタチン、イミプラミン及び抗セラミド研究を０．５％  脂質フリーウシ胎仔血清（HyClone, Logan UT）含有ＲＰＭＩ中で行った。各研究において、生存率を評価するために、細胞のアリコートをトリパンブルーで染色した。
【０１２９】
マウスと骨髄移植（ＢＭＴ）
【０１３０】
Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ、Ｃ３ＨｅＢ／ＦｅＪ、ＬＰ／Ｊ（“ＬＰ”、Ｈ−２ｂ）、Ｂ１０．ＢＲ（“Ｂ１０”、Ｈ−２ｋ）及びＢ６．ＭＲＬ．ｌｐｒ雌マウス、８−１２週齢をＪａｃｋｓｏｎ研究所（Bar Harbor, ME）から購入した。ＳＶ１２９／Ｃ５７ＢＬ／６ａｓｍａｓｅ−／−及びＣ５７ＢＬ／６Ｂａｘ−／−マウスを、前述の我々のコロニーで交配し、遺伝子型を同定した［Horinouchi, 1995 #171; Knudson, 1995 #173］。初めに、野生型Ｃ５７ＢＬ／６雌と雄ＳＶ１２９／Ｃ５７ＢＬ／６ａｓｍａｓｅ−／−マウスを交配することにより、Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドへのａｓｍａｓｅ−／−遺伝子型戻し交雑を行った。続いて、ａｓｍａｓｅ＋／−遺伝子型の雄Ｆ１マウスをＣ５７ＢＬ／６の雌と交配した。次に、純粋Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドにおけるａｓｍａｓｅ＋／−遺伝子型を得るために、雄のａｓｍａｓｅ＋／−後代と野生型Ｃ５７ＢＬ／６の雌マウスとの交配プロトコルを、１０世代続けた。戻し交配が確立されたら、Ｃ５７ＢＬ／６ａｓｍａｓｅ＋／＋マウスを異種交配させて、実験的動物を得た。ＢＭＴ実験において用いた雄及び雌宿主は８−１２週齢であった。ＢＭＴプロトコルは、Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Institutional Animal Care and Use Committeeにより承認された。マウスをMemorial Sloan-Kettering Cancer Centerの病原体のない施設内の殺菌したマイクロアイソレーターケージ内に収容し、通常の食事及びオートクレーブした高塩素消毒飲料水（ｐＨ３．０）を与えた。この施設は、アメリカの実験動物管理評価認定協会により承認され、農務省及び保健社会福祉省、国立衛生研究所の規則及び基準にしたがって維持される。
【０１３１】
骨髄（ＢＭ）細胞を大腿骨及び頸骨から無菌で除去した。ドナーの髄質は、抗Ｔｈｙ−１．２抗体及び低ＴＯＸ−Ｍウサギ補体を用いて枯渇させたＴ細胞であった（Cedarlane Laboratories, Hornby, Canada）。ナイロンウールカラムを通じた精製により脾臓Ｔ細胞を採取した。細胞（脾臓Ｔ細胞の有り又は無しでの５ｘ１０６ＢＭ細胞）をＤｕｌｂｅｃｃｏの改変必須培地に再懸濁し、０日目において、投与の間３時間の分割用量で、尾静脈注入により１１００ｃＧｙ全身照射（１３７Ｃｓソース）を受けた致死照射されたレシピエントに移植した。
【０１３２】
リンパ球及び骨髄採集のための細胞培養培地は、１０％  熱不活性化ウシ胎仔血清、１００単位／ｍｌ  ペニシリン、１００μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシン、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン及び５０μＭ  ２−メルカプトエタノールを添加した、ＲＰＭＩ１６４０からなる。抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２  Ｆｃ  ブロック（２．４Ｇ２）、蛍光クロム標識ＣＤ３（１４５−２Ｃｌｌ）、ＣＤ４（ＲＭ４−５）、ＣＤ８（５３−６．７）、ＣＤ６２Ｌ（ＭＥＬ−１４）、及びＬｙ−９．１(３０Ｃ７)抗体をPharmingen（San Diego, CA）から入手した。塩化アンモニウム赤血球細胞（ＲＢＣ）溶解バッファ、コンカナバリンＡ（ｃｏｎＡ）及びコンカナマイシンＡ(ＣＭＡ)をＳｉｇｍａ（St. Louis, MO）から入手した。
【０１３３】
ex vivoでの肝細胞培養
【０１３４】
Ｋｌａｕｎｉｇ９４により記載される方法にしたがって門脈の挿管及びin situでの逆行性コラゲナーゼかん流により、肝細胞を単離した。つまり、肝臓を２０ｍＬ  バッファ１（グルコース＋０．１ｍＭ  ＥＧＴＡを含むＫｒｅｂｓリンガー）、続いて２５ｍＬ  バッファ２［５０００ユニットコラゲナーゼＩ型（Ｓｉｇｍａ）を含む０．２ｍＭ  ＣａＣｌ２含有グルコースを含むＫｒｅｂｓリンガー］で、７ｍｌ／分の速さで蠕動ポンプ（Rainin Instrument LLC. Woburn, MA）によってかん流した。かん流した肝臓を切除し、バッファ２中で細分化し、１００μＭ細胞ストレーナーを通じて濾過し、５０ｘｇで２度洗浄し、並びに１０％  ウシ胎仔血清含有ＲＰＭＩ１６４０完全培地に再懸濁した。生存率は、通常９０％より高かった。
【０１３５】
アポトーシス定量
【０１３６】
２つの異なる技術によって、アポトーシスをin vitroで評価した。製造者の説明書（Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis IN）にしたがって、０．１％トリトンＸ−１００及び０．１％クエン酸ナトリウムにより、４℃、５分で透過処理した細胞についてＴＵＮＥＬ染色を行った。あるいは、刺激した細胞を２％  パラホルムアルデヒドで固定し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、１００μｌの２４μｇ／ｍｌ  ビスベンズイミド三塩酸塩溶液（Hoechst #33258; Sigma-Aldrich, Milwaukee WI）で１０分間染色した。核の周辺に沿ったクロマチンの凝縮(condensation)、セグメント化、凝縮(compaction)又はアポトーシス小体の出現を含む核アポトーシスの生態学的変化を、前述のようにして、Axiovert S-100 Zeiss蛍光顕微鏡を用いて定量化した３３。ポイントあたり最も少なくて２００個の細胞を試験した。
【０１３７】
記載されているようにして［Paris, 2001 #7］、ＴＵＮＥＬ染色後に、アポトーシスを小f腸の固有層の内皮においてin vivoで定量化した。既に公開されたようにして［Paris, 2001 #7］、内皮細胞表面マーカーＣＤ３１（PharMingenカタログＮｏ．１９５１Ｄ）に対する抗体を用いた免疫染色により、内皮細胞を同定した。
【０１３８】
完全培地に３０分間静置し、記載するようにして、ＬＰ／Ｊドナー骨髄及びＴ細胞の移植後２―３週間でＣ５７ＢＬ／６マウスから単離した１μｇ／ｍＬ抗Ｆａｓ  Ｊｏ２抗体（Pharmingen）又は０−２ｘ１０６の脾臓Ｔ細胞と共に、１６時間、３７℃、５％  ＣＯ２下で刺激した０．５ｘ１０６の肝細胞において肝細胞アポトーシスを定量化した。いくつかの研究において、肝細胞をナイスタチン（５０μｇ／ｍＬ、Sigma-Aldrich, Milwaukee WI）で３０分間前処理し、ＲＰＭＩで洗浄し、刺激前に１％  脂質フリーＦＢＳが添加されたＲＰＭＩに再懸濁した。
【０１３９】
クローン原性アッセイ
【０１４０】
ＵＶ−Ｃ又は抗ＦａｓＣＨ−１１処理後のＪｕｒｋａｔ細胞のコロニー形成を、既述９５のようにして、軟寒天クローニングアッセイを用いて評価した。つまり、細胞をナイスタチン及び抗セラミドｍＡｂ、又はビヒクル及び対照ＩｇＭと共に、ＲＰＭＩ＋０．５％  脂質フリーウシ胎仔血清中で予備培養し、並びに漸増用量のＵＶ−Ｃ又は抗Ｆａｓで４時間刺激した。その後、細胞を２０％  ＦＢＳ、２０ｍＭ  Ｌ−グルタミン及び４０％  メチルセルロース培地含有ＲＰＭＩ培地に懸濁し、３連で塗布した。培養の１４−１６日後、プレートを倒立顕微鏡により解析し、２０より多い細胞の凝集体をコロニーとしてスコア化した。各条件についてのコロニー形成を、非処理対照細胞について得られた値に対して算出した。コロニー生存曲線を、ＦＩＴソフトウェアプログラム９６の変更を用いて最小二乗回帰分析により算出した。該プログラムは、線量−生存率データの各セットに対する重み付けした加重最小二乗を繰り返すことにより曲線をフィットさせ、生存曲線パラメータの共変量及び対応する信頼領域を見積もり、並びに生存曲線をプロットする。これはまた、Ｄ０（放射線感受性レベルを示す、カーブの指数部分における傾きの逆数）及びＮナンバー（肩の大きさの指標）といった曲線パラメータを導き出す。
【０１４１】
プラットフォーム検出
【０１４２】
前述のようにして、プラットフォームを検出した。つまり、１ｘ１０６Ｊｕｒｋａｔ細胞をＵＶ−Ｃ又はα−Ｆａｓで刺激し、２％  パラホルムアルデヒドで示した時間固定し、１％  ウシ胎仔血清含有ＰＢＳでブロックし、次いでＰＢＳで洗浄した。細胞を、ラフト局在脂質ＧＭ１について、ＦＩＴＣ結合コレラ毒素β−サブユニット（２μｇ／ｍｌ；Sigma-Aldrich）で、４５分間、４℃で染色し、０．１％  トリトンＸ−１００含有ＰＢＳで２度洗浄し、蛍光封入剤（Dako, Carpenteria CA）にマウントした。ＳＰＯＴデジタルカメラを備えたAxiovert S-100 Zeiss蛍光顕微鏡を用いて蛍光を検出した。プラットフォームを包含する細胞即ち蛍光が細胞表面の１５％未満に凝縮した細胞のパーセンテージを、ポイントあたり１５０−２５０個の細胞を計数することにより測定した。あるいは、マウスモノクローナル抗セラミド抗体ＭＩＤ  １５Ｂ４  ＩｇＭ（１：５０希釈、Alexis Biochemicals）、マウスモノクローナル抗Ｆａｓ  ＣＨ−１１  ＩｇＭ（１：５００希釈、Upstate Biotechnology）又はポリクローナルウサギ抗ＡＳＭａｓｅ抗体１５９８（１：１００希釈）を用いてプラットフォームを同定し、それぞれＣｙ３結合抗マウス又は抗ウサギＩｇＭ（１：５００希釈、Roche Molecular Biochemicals）を用いて検出した。ウサギポリクローナル抗ＣＤ４６（１：１０００希釈、Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz CA）をネガティブ対照として用いた。いくつかの研究において、Ｌｅｉｃａ  ＴＣＳ  ＳＰＺ直立共焦点顕微鏡を用いて、共焦点画像を得た。あるいは、０．５ｘ１０６肝細胞をＣＴＬで示した時間の間刺激し、プラットフォーム形成を記載したようにして評価した。
【０１４３】
ウサギポリクローナル抗ＡＳＭａｓｅ抗体＃１５９８を全長ＦＬＡＧタグ化ヒトＡＳＭａｓｅタンパク質に対して産生した。抗血清をＢＩＯ−ＲＡＤ  Ｔゲルカラムを通じて精製して、１００ｎｇの精製組換えヒトＡＳＭａｓｅ又は２５μｇのＪｕｒｋａｔ細胞溶解液由来のＡＳＭａｓｅに対して、１００ｎｇ／μｌの濃度での免疫ブロットアッセイにより特異的免疫反応性を示すＩｇＧ分画を得た。２００μｇ／μｌの濃度で、＃１５９８は、１００ｎｇの精製ＡＳＭａｓｅ由来のＡＳＭａｓｅ活性を定量的に免疫沈降し、並びに２００ｎｇ／μｌの濃度で、フローサイトメトリー又は共焦点免疫蛍光顕微鏡によりＡＳＭａｓｅの細胞表面発現を検出する。
【０１４４】
ジアシルグリセロールキナーゼアッセイ（ＤＧＫ）
【０１４５】
ＵＶ−Ｃ又はＣＨ−１１で刺激したＪｕｒｋａｔ細胞を、３７℃で示した時間の間インキュベートした。２ｍｌのクロロホルム：メタノール：ＨＣｌ（１００：１００：１、ｖ／ｖ／ｖ）の添加により刺激を終了し、記載されたようにして９７、セラミドをジアシルグリセロールキナーゼアッセイにより定量化した。
【０１４６】
ウエスタンブロット解析
【０１４７】
ＵＶ−Ｃ又はＣＨ−１１で刺激したＪｕｒｋａｔ細胞を、３７℃で示した時間の間インキュベートした。氷冷ＰＢＳで刺激を終了し、細胞をＲＩＰＡバッファ（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ(ｐＨ７．４)、０．１％  ＳＤＳ、０．５％  デオキシコール酸ナトリウム、１％  トリトンＸ−１００、１００ｍＭ  ＮａＣ１、１０ｍＭ  ＮａＦ、１０ｍＭ  Ｎａ２Ｐ２Ｏ７、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ及び１０μｇ／ｍｌずつのアプロトニン及びロイペプチン）に溶解した。試料を１４０００ｇで遠心分離し、上清を４Ｘ  ＳＤＳサンプルバッファに添加した。溶解液を１０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離し、ニトロセルロース膜に移した。カスパーゼ３（BD PharMingen, San Diego CA）、カスパーゼ８（BD PharMingen）又はカスパーゼ９（Cell Signaling Technology, Beverly MA）に対するウサギポリクローナル抗体を用いて、カスパーゼ切断を検出した。マウスモノクローナル抗カスパーゼ８（clone 1-1-37; Upstate Biotechnology）又は抗ＦＡＤＤ（BD PharMingen）抗体をそれぞれ用いて、カスパーゼ８及びＦＡＤＤ発現レベルを検出した。
【０１４８】
フローサイトメトリー解析
【０１４９】
ＦＡＣＳにより表面ＡＳＭａｓｅを検出するために、５０Ｊ／ｍ２  ＵＶ−Ｃ又は５０ｎｇ／ｍｌ  ＣＨ−１１で、３７℃で、Ｊｕｒｋａｔ細胞を刺激した。最大ＡＳＭａｓｅ転移の時間である１分後に、氷冷洗浄バッファ（１％  ＦＣＳ及び０．１％  ＮａＮ３含有ＰＢＳ）の添加により刺激を終了し、アイソタイプ対照ウサギＩｇＧ（２０μｇ／ｍｌ）を添加した同一のバッファを用いて２０分間、氷上で細胞をブロックした。細胞を再洗浄し、ＰＢＳ中で１μｇ／ｍｌのポリクローナル抗ＡＳＭａｓｅ１５９８抗体と共に４５分間インキュベートし、続いて洗浄し、Ｃｙ３結合抗ウサギＩｇＧと共にインキュベートした。１００００個の細胞を、ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーター（Becton Dickinson, Franklin Lakes NJ）を用いて解析した。
【０１５０】
採取した脾細胞を洗浄し、ＣＤ１６／ＣＤ３２ＦｃＲブロックと共に、氷上で１５分間インキュベートし、その後一次抗体と共に４５分間インキュベートし、洗浄し、ＦＡＣＳバッファ（ＰＢＳ＋２％ＢＳＡ＋０．１％ＮａＮ３）に再懸濁し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（Becton Dickinson）を備えたＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーターで解析した。ＣＦＳＥ染色のために、ＲＢＣ溶解ＬＰ／Ｊ又はＢ１０．ＢＲ脾細胞を抗ＣＤ３マイクロビーズ（Miltenyi, Auburn, CA）を用いて製造者の取扱説明書のように陽性選択し、２．５μＭ  カルボキシフルオレセイン  ジアセテート  スクシンイミジル  エステル（ＣＦＳＥ）中で染色し、並びに１５−２０ｘ１０６の染色細胞を、ａｓｍａｓｅ＋／＋又はａｓｍａｓｅ−／−バックグラウンドのいずれかの同種異系（Ｂ６）レシピエントに移植した。これらの動物由来の脾細胞をその後７２時間で採取し、表面抗原に対する蛍光クロム結合抗体で染色し、ＦＡＣＳ解析を上記のように行った。
【０１５１】
ＡＳＭａｓｅ活性アッセイ
【０１５２】
蛍光ベースの高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）アッセイ９８を用いてＡＳＭａｓｅ活性を測定した。つまり、５ｘ１０６のＪｕｒｋａｔ細胞を、５０Ｊ／ｍ２  ＵＶ−Ｃ又は５０ｎｇ／ｍｌ  ＣＨ−１１で、３７℃で刺激し、示した時間氷冷ＰＢＳで洗浄し、氷上でＮＰ−４０バッファ（１５０ｍＭ  ＮａＣ１、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１０％  グリセロール、１％  ＮＰ−４０、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、ＰＭＳＦを添加した０．１Ｍ  ＤＴＴ、ロイペプチン及びプロテアーゼ阻害剤カクテル）に溶解した。アッセイバッファ［５００μＭ  ＢＯＤＩＰＹ−Ｃ１２スフィンゴミエリン（Molecular Probes, Eugene OR）、０．１ｍＭ  ＺｎＣ１２、０．１Ｍ  酢酸ナトリウムｐＨ５．０及び０．６％トリトンＸ−１００］中で等量の溶解液を６０分間、３７℃でインキュベートすることによりＡＳＭａｓｅ活性を測定した。その後、エタノールでの１０Ｘ希釈により反応を停止し、２０ｘ４ｍｍの逆相Ａｑｕａｓｉｌ  Ｃ１８カラム（Keystone Scientific, Bellefonte PA）を備えたＷＩＰＳ  ７１２（Waters Corp., Milford MA）オートサンプラーにより５μｌのアッセイ混合物をサンプリングした。１．２ｍｌ／分の流速で、９５％  ＭｅＯＨでの定組成溶離により０．４−０．５分以内に、ＢＯＤＩＰＹ−Ｃ１２セラミドである反応産物を基質から特異的に分離した。それぞれ５０５及び５４０ｎｍの励起及び発光波長に設定したWaters 474 (Waters Corp.)蛍光検出器を用いて、蛍光を定量化した。既知量のＢＯＤＩＰＹ−Ｃ１２セラミドの標準について確立された標準曲線から導出される回帰式を用いて、生成産物の量を算出した。あるいは、記載されたようにして１４、［１４Ｃメチルコリン］スフィンゴミエリン（Amersham Biosciences, Piscataway, NJ）を基質として用いる放射酵素アッセイにより、ＡＳＭａｓｅ活性を定量化した。つまり、５０Ｊ／ｍ２  ＵＶ−Ｃ又は５０ｎｇ／ｍｌ  ＣＨ−１１刺激後に、示した時間０．２％  トリトンＸ−１００含有ＰＢＳにＪｕｒｋａｔ細胞を溶解した。基質の存在下で、０．１ｍＭ  ＺｎＣｌ２、１ｍＭ  ＥＤＴＡ及び０．１％  トリトンＸ−１００を添加した２５０ｍＭ  酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０中で、ポスト核上清を活性についてアッセイした。１時間後、ＣＨＣｌ３:ＭｅＯＨ：１Ｎ  ＨＣ１（１００：１００：1、ｖ／ｖ／ｖ）で反応を終了し、シンチレーションカウンターにより産物を定量した。両方のアッセイが、ＵＶ−Ｃ又はＦａｓ刺激後に同一の明らかな倍増を生じたために、これらのデータを照合した。しかしながら、ミカエリスメンテン動態解析による決定では、ＢＯＤＩＰＹ−Ｃ１２スフィンゴミエリンは、より非効率的に触媒され、より低いＶｍａｘをもたした。したがって、放射酵素アッセイから導出された基準ＡＳＭａｓｅ特異的活性を、本文書を通じて示している。
【０１５３】
放射線及び組織調製
【０１５４】
ＴＢＩは、１３７Ｃｓソースを操作するShepherd Mark-I unit (Model 68, SN643)を用いて供給された。線量率は、２．１２Ｇｙ／分であった。小腸試料を採取するために、高炭酸ガス窒息によりマウスを屠殺し、２．５ｃｍの近位空腸断片をトライツ靱帯から２ｃｍで採取した。組織試料を４％  中性緩衝ホルムアルデヒド中で終夜のインキュベーションにより固定し、パラフィンブロックに包埋した。放射線に対する腸組織応答を評価するために、完全な空腸周囲の横断切片（５μｍ厚）を、パラフィンブロックからのミクロトーム法により採取し、ポリリシン処理したスライドに接着し、９０℃で１０分間及び６０℃で５分間加熱することにより脱パラフィンし、続いて５分間、２度キシレン洗浄し、標準プロトコルにしたがって、ヘマトキシリン及びエオシンで染色した。ＴＢＩ後の死亡原因を決定するため、動物死の６０分以内に剖検を行うか、又は末期の場合、末期の呼吸パターンを示す動物を高炭酸ガス窒息により屠殺した。組織検体を全ての動物から採取し、ホルムアルデヒド中で固定し、ヘマトキシリンで染色した。
【０１５５】
陰窩微小コロニー生存アッセイ
【０１５６】
Withers及びElkind９９により記載されるように、微小コロニー生存アッセイを行った。つまり、照射後３．５日のマウスを高炭酸ガス窒息により屠殺し、小腸の試料を採取し、上述のように組織学的染色のために調製した。生存陰窩を、１０以上の隣接した好色素性非パネート細胞、少なくとも１つのパネート細胞及び内腔を包含するとして定義した。腸の横断切片の周囲を１つのユニットとして用いた。生存陰窩の数を、各周囲について計数した。１０−２０周囲をマウスごとにスコア化し、各データ点を作成するために２−４匹のマウスを用いた。データを平均±標準誤差として報告した。
【０１５７】
ＧＶＨＤの評価
【０１５８】
生存率を毎日モニタリングし、５つの臨床パラメータ（体重減少、猫背の姿勢、活動性低下、毛の波打ち現象（fur ruffling）及び皮膚病変）について、０から２のスケールで、コード化したケージ内の耳タグをした動物を個別に毎週スコア化した。Ｃｏｏｋｅら１００により記載されるように、５つの基準スコア（０−１０）の合計により、臨床ＧＶＨＤスコアを作成した。１０％  ホルマリン緩衝リン酸保存し、パラフィン包埋し、且つヘマトキシリン／エオシン染色した５μＭ  組織学的切片について、盲検方式で、腸（回腸末端及び上行結腸）、肝臓及び皮膚（舌及び耳）についてのＧＶＨＤ標的臓器病理を、半定量的な採点系で、１つの個体により評価した（肝臓及び腸病理についてJ.M.C.、皮膚病理について G.F.M.）。つまり、記載されたように腸及び肝臓をＧＶＨＤに関連する１９から２２の異なるパラメータについてスコア化し１０１、並びに、公開されたように異常角化及びアポトーシス細胞の数について皮膚を評価した１０２。記載されたようにして、ホルマリン保存し、パラフィン包埋し、ＴＵＮＥＬ染色及びヘマトキシリン／エオシン対比染色した切片について、絨毛及び陰窩細胞アポトーシスをスコア化した１８、６２。
【０１５９】
ＥＬＩＳＡ
【０１６０】
血清ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＮＦ−γ及びＴＮＦ−αレベルについての酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を、製造者の取扱説明書（R&D, Minneapolis, MN）にしたがって行った。
【０１６１】
活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ）アッセイ
【０１６２】
採取した脾細胞をナイロンウール通過によりＴリンパ球について枯渇し、フローサイトメトリーによるＦＩＴＣ−ＣＤ３  ｍＡｂ染色に基づいて９０％を超える純度をもたらした。既述のようにして、ＡＩＣＤを誘導した１０３。つまり、Ｔ細胞をＲＰＭＩ１６４０＋１０％  ＦＣＳ中で、２ｘ１０６／ｍＬでインキュベートし、１０μｇ／ｍｌ  ＣｏｎＡ（Sigma, St. Loius, MO）で４８時間プライムした。次いで、細胞を洗浄し、２０Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−２（R&D Systems）含有培地に２４時間静置した。最終的に、細胞を洗浄し、２０Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−２及び増加量の抗ＣＤ３  ｍＡｂ（０−１０μｇ／ｍｌ）含有培地に２４時間再懸濁した。その後、細胞を固定し、２５μｌの２４μｇ／ｍｌ  ビスベンズイミド三塩酸塩溶液（Hoechst #33258; Sigma-Aldrich, Milwaukee WI）で染色し、蛍光顕微鏡により、上記のように、アポトーシスを定量化した。
【０１６３】
混合リンパ球反応（ＭＬＲ）
【０１６４】
２ｘ１０６の照射（２０００ｒａｄ）Ｃ５７ＢＬ／６脾細胞とのＲＰＭＩ１６４０＋１０％  ＦＣＳ中での５日間のインキュベーションにより、Ｂａｌｂ／ｃ脾細胞をin vitroで活性化した。ＭＬＲの２日前、ａｓｍａｓｅ＋／＋又はａｓｍａｓｅ−／−脾細胞を、１０μｇ／ｍＬ  ｃｏｎＡで４８時間活性化し、４５分間１μＣｉ／ｍＬ  Ｎａ２５１ＣｒＯ４で、３７℃及び５％  ＣＯ２で標識し、ＲＰＩＭ１６４０＋１０％  ＦＢＳで洗浄し、並びに活性化Ｂａｌｂ／ｃ脾細胞と、完全培地中で、２４時間３７℃で共培養した。補正した溶解％＝１００ｘ（試料５１Ｃｒ放出−対照５１Ｃｒ放出）／（最大５１Ｃｒ放出−対照５１Ｃｒ放出）という式を用いて、ガンマカウンター（Cobra, Meriden, CT）により上清中への５１Ｃｒ放出を計数することによって、標的細胞溶解を定量化した。
【０１６５】
統計
【０１６６】
動物の保険数理上の生存率を積極限カプラン−マイヤー法１０４により算出し、生存率における差異の統計学的有意性をマンテルログランク検定１０５により算出した。陰窩生存率カーブを、ＦＩＴソフトウェアプログラム９６の変更を用いて最小二乗回帰解析により算出した。該プログラムは、線量−生存率データの各セットに対する重み付けした加重最小二乗を繰り返すことにより曲線をフィットさせ、生存曲線パラメータの共変量及び対応する信頼領域を見積もり、並びに生存曲線をプロットする。これはまた、Ｄ０（放射線感受性レベルを示す、カーブの指数部分における傾きの逆数）及びＮナンバー（肩の大きさを測定する）といった曲線パラメータを導き出す。ＧＶＤＨスコア、胸腺細胞及び脾細胞数並びに増殖アッセイの統計学的解析を、ノンパラメトリックな対応のないマンホイットニーＵ検定を用いて行った。９５％の確信度推定を伴うスチューデントのｔ検定を、他の全ての解析に用いた。
【０１６７】
実施例２
ＧＶＨＤにおけるＡＳＭＡＳＥの役割
【０１６８】
３ｘ１０６Ｔ細胞が有り又は無しでの骨髄の移植後２１日のａｓｍａｓｅ＋／＋及びａｓｍａｓｅ−／−レシピエントから小腸、肝臓及び皮膚を採取した。ヘマトキシリン＆エオシン染色した肝臓切片は、ａｓｍａｓｅ＋／＋レシピエントと比較して、ａｓｍａｓｅ−／−ではより目立たない、リンパ球浸潤（図２２Ａ、矢印）、門脈域浸潤、内皮炎（図２２Ａ、右パネル）及び肝臓構造喪失により特徴付けられる、肝臓ＧｖＨＤを示した。同様に、絨毛の鈍化、固有層炎症、陰窩幹細胞喪失及び崩壊並びに粘膜の萎縮を含む腸ＧｖＨＤは、ａｓｍａｓｅ−／−レシピエントにおいてより目立たなかった（図２２Ｂ、矢印はアポトーシス細胞を示す）。半定量的組織学的解析は、同種異系骨髄及びＴ細胞のａｓｍａｓｅ＋／＋レシピエントが、肝臓（表１、１５．７±１．５対８．３±２．７、ｐ＜０．０５）及び小腸（表２、１０．７±１．１対３．５±０．５、ｐ＜０．０１）においてＢＭのみ受けた同腹子よりも有意に高くスコア化されたことを明らかにした。ＡＳＭａｓｅ欠損は、ＧｖＨＤ関連臓器損傷を大きく保護し、肝臓及び小腸において、それぞれ、１０．２±０．５及び７±０．１までスコアを低下させた（表２、ａｓｍａｓｅ＋／＋同腹子に対して肝臓及び腸についてそれぞれｐ＜０．００５）。
【０１６９】
ＧｖＨＤ関連臓器損傷は、腸及び皮膚の顕著なアポトーシスに関連する。ＴＵＮＥＬ染色した回腸切片は、ＢＭ及びＴ細胞のａｓｍａｓｅ＋／＋レシピエントの固有層（図２２Ｃ）及び陰窩上皮（図２２Ｄ）の内部のアポトーシス細胞の顕著な増加を明らかにした。同系異種Ｔ細胞のａｓｍａｓｅ＋／＋レシピエントは、絨毛の８８．４％における大規模なアポトーシス（４より多くのアポトーシス細胞／絨毛）を示し、これは、ａｓｍａｓｅ−／−レシピエントにおいて２５．４％に減少し（図２２Ｃ、ｐ＜０．０５）、並びに３．８±０．４の陰窩ごとのアポトーシス内皮細胞は、ａｓｍａｓｅ−／−レシピエントにおいて０．９５±０．２に弱まった（図２２Ｄ、ｐ＜０．０５）。さらに、ＡＳＭａｓｅ欠損は、マイナー抗原ミスマッチ同種異系ＢＭＴ後の皮膚角化細胞アポトーシスから宿主を保護した（図２２Ｅ）。同系異種Ｔ細胞は、ａｓｍａｓｅ＋／＋上皮の８．２±２．１アポトーシス細胞／ｍｍと比較して、ａｓｍａｓｅ−／−上皮における５．１±０．９アポトーシス細胞／ｍｍを誘導した(ｐ＜０．０５)。これらのデータは、ＡＳＭａｓｅ組織が、ＧｖＨ関連アポトーシス及び臓器損傷に対して抵抗性であることを実証し、標的臓器損傷及びアポトーシスを決定することで、ＡＳＭａｓｅがＧＶＨ誘導罹患率及び死亡率を制御することを示した。ＧｖＨＤにおける宿主ＡＳＭａｓｅの具体的役割を確かめるために、Ｃ５７ＢＬ／６レシピエント（Ｈ−２ｂ）への、Ｂ１０．ＢＲドナー（Ｈ−２ｋ）の主要組織適合性不適合同種異系ＢＭ移植モデルを選択した。ＡＳＭａｓｅ＋／＋又はＡＳＭａｓｅ−／−バックグラウンドの致死性照射Ｃ５７ＢＬ／６宿主は、１０ｘ１０６Ｔ細胞枯渇（ＴＣＤ）Ｂ１０．ＢＲ  ＢＭ細胞を受け、並びに、同種移植片に対する０．５ｘ１０６Ｂ１０．ＢＲドナー脾臓Ｔ細胞の添加によりＧｖＨＤを誘導した。マイナーミスマッチモデルと一致して、ＢＭ及びＴ細胞の移植後１４日でのａｓｍａｓｅ＋／＋同腹子と比較してａｓｍａｓｅ−／−宿主において、有意に少ない標的臓器損傷を観察した（表１、ａｓｍａｓｅ−／−宿主における７．４±０．９に対するａｓｍａｓｅ＋／＋における１６．３±１．１の肝臓病理スコア、ｐ＜０．０５及びａｓｍａｓｅ−／−宿主における３．５±０．４に対するａｓｍａｓｅ＋／＋における１０．０±０．８の小腸病理スコア、ｐ＜０．０５）。これらのデータは、陰窩上皮アポトーシスの低下（ａｓｍａｓｅ−／−宿主における１５．８±３．７％に対する野生型におけるアポトーシス細胞含有陰窩の５９．３±３．８％、ｐ＜０．０５、非掲載）、並びに肝臓リンパ球浸潤、内皮炎、及び肝臓構造の全体的な崩壊の減少（非掲載）と一致する。さらに、角化細胞アポトーシスは野生型宿主において顕著であり、１１．２±１．２アポトーシス細胞／ｍｍ２上皮のアポトーシス指標に達し、これはａｓｍａｓｅ−／−宿主において３．２±１．７まで著しく減衰した（図２２Ｅ、ｐ＜０．０１）。しかしながら、カプラン−マイヤー生存率は、遅発性（ＢＭＴ後２１日以降）骨髄形成不全のため、このメジャーミスマッチモデルにおいて決定され得ず、Ｂ１０．ＢＲ系統における遺伝的シフトの検出が認められ、Ｊａｃｋｓｏｎ研究所ウェブサイ��に記載された。総合すると、これらのデータは、ＧｖＨＤ関連標的臓器損傷及びアポトーシスの有意な減衰を明らかにし、マイナー及びメジャー抗原不一致の両方に渡って、野生型同腹子と比較して、ａｓｍａｓｅ−／−宿主における、ＧｖＨＤ罹患率及び死亡に対する保護と密接に相関する。
【０１７０】
【表３】
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【０１７１】
【表４】
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【０１７２】
実施例３
ＡＳＭａｓｅ欠損は炎症を防ぐ
【０１７３】
次に、我々は、宿主ＡＳＭａｓｅ不活性化は、急性ＧｖＨＤにおけるＴｈ１／Ｔｈ２サイトカインプロファイル及びＣＤ８＋Ｔ細胞増殖を弱めることを示す実験を行った。初期ＣＴＬ介在性アポトーシス組織損傷は、ＣＤ４＋Ｔｈ１サイトカイン分泌を必要とするフィードフォワード応答及び結果として生じる、急性ＧｖＨＤを進行させる同種反応性（alloreactive）ＣＤ８＋クローン性増殖を伝播し、それに炎症性サイトカインストームが続く。ＧｖＨＤの際の血清サイトカインレベル対するＡＳＭａｓｅの影響を評価するために、脾臓Ｔ細胞の有り又は無しでのＬＰ  ＢＭの移植後７及び１４日に、血清Ｔｈ１サイトカインＩＬ−２及びＩＦＮ−γ並びにＴｈ２サイトカインＩＬ−１β及びＴＮＦ−αを定量化した。マイナーミスマッチモデルにおいて、自己移植片へのＴ細胞の添加は、ＢＭ対照レシピエントと比較して、７日目に、ＩＬ−２及びＩＦＮ−γを、それぞれ１５．７±４．１から３０．３±２．８及び３．７±１．０から１０９．９±１８．９ｐｇ／ｍｌ血清に増加した（それぞれ、ｐ＜０．０５）（表３）。同様に、ＢＭ対照レシピエントと比較して、７日目に、Ｔｈ２サイトカインＩＬ−１β及びＴＮＦ−αは、それぞれ、６．８±１．９から１３．４±１．１及び２．３±１．２から２４．３±７．０ｐｇ／ｍｌ血清に増加した（それぞれ、ｐ＜０．０５）（表３）。宿主ＡＳＭａｓｅの遺伝子不活性化は、７日目に、血清ＩＬ−２及びＩＦＮ−γを、それぞれ１９．１±２．０及び３２．８±１２．４ｐｇ／ｍｌ血清に、（ａｓｍａｓｅ＋／＋宿主に対してｐ＜０．０５）並びにＩＬ−１β及びＴＮＦ−αを、それぞれ２．９±１．２及び１７．３±３．０ｐｇ／ｍｌ血清に（ａｓｍａｓｅ＋／＋宿主に対してｐ＜０．０５且つ有意でない）減少させた（表３）。血清サイトカインの減衰は、Ｃ５７ＢＬ／６宿主へのドナーＢ１０．ＢＲ  ＢＭ及びＴ細胞のメジャーミスマッチモデルに渡って保存され（表２、ａｓｍａｓｅ＋／＋対ａｓｍａｓｅ−／−宿主における１１９．１±１４．２対６３．３±１０．８ｐｇ／ｍｌのＩＦＮ−γ  ｐ＜０．０５、ａｓｍａｓｅ＋／＋対ａｓｍａｓｅ−／−宿主における１３６．８±１１．５対６３．７±９．０ｐｇ／ｍｌのＴＮＦ−α、ｐ＜０．００５）、ＡＳＭａｓｅ欠損は、同系異種ＢＭ及びＴ細胞のレシピエントにおける血清サイトカイン産生を通常弱めたことを実証した。
【０１７４】
血清サイトカインレベルの増加は、Ｔ細胞増殖に直接影響する１１１。ＢＭ及びＴ細胞のａｓｍａｓｅ−／−レシピエントにおける血清サイトカインの減衰が、ドナーＴ細胞増殖に影響を与えるかどうかを評価するために、ＬＰ／Ｊ（Ｈ−２ｂ、マイナーＭＨＣ不適合）又はＢ１０．ＢＲ（Ｈ−２ｋ、メジャーＭＨＣ不適合）ドナー由来のカルボキシフルオレセイン  スクシンイミジル  エステル（ＣＦＳＥ）標識Ｔ細胞（１０−２０ｘ１０６）をａｓｍａｓｅ＋／＋又はａｓｍａｓｅ−／−バックグラウンドの致死照射Ｃ５７ＢＬ／６宿主内に注入した。ＬＰ及びＢ１０．ＢＲのＣＤ４＋Ｔ細胞のin vivoでの増殖は、ａｓｍａｓｅ＋／＋同腹子と比較して、ａｓｍａｓｅ−／−において統計的に差異がない（図２３Ａ  上段パネル及びＢ１０．ＢＲについては非掲載）一方で、ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖は、マイナー（図１２Ａ）及びメジャーＭＨＣ（非掲載）不一致モデルの両方に渡って有意に損なわれた。注入３日後、ＣＤ８＋細胞の増殖は、ａｓｍａｓｅ−／−宿主から回収した集団の２６．４％と比較して、ａｓｍａｓｅ＋／＋宿主における全ドナーＬＰ  ＣＤ８＋Ｔ細胞集団の５４．１％を占めた（図２３Ａ下段パネル、ｐ＜０．００５）。同様に、ａｓｍａｓｅ＋／＋宿主における全ての集団の８１．５％からａｓｍａｓｅ−／−宿主における６７．１％にまで、増殖ドナーＢ１０．ＢＲ  ＣＤ８＋細胞は減少した（非掲載、ｐ＜０．００５）。さらに、増殖の減弱は、ＢＭ及び３ｘ１０６Ｔ細胞の注入から１４日後においてａｓｍａｓｅ＋／＋レシピエントにおける１．６９±０．２８ｘ１０６細胞からａｓｍａｓｅ−／−レシピエントにおける０．５５±０．２８ｘ１０６まで、脾臓ドナーＬＰ／Ｊ  ＣＤ８＋Ｔ細胞の有意な減少をもたらした（図２３Ｂ、ｐ＜０．００１）。
【０１７５】
in vivoで増殖を損なったにも関わらず、ＬＰ／Ｊ  ＴＣＤ−ＢＭ及びＴ細胞と共に同種移植したａｓｍａｓｅ−／−又はａｓｍａｓｅ＋／＋宿主由来の脾臓Ｔ細胞は、ｃｏｎＡでチャレンジした場合にex vivoで同様の特異的増殖応答を提示するため、Ｔ細胞増殖能力は、ａｓｍａｓｅ−／−宿主内への移植においてインタクトなままであった（図２４）。Ｔ細胞増殖能力は、ａｓｍａｓｅ−／−宿主への移植においてインタクトなままである。同系（ＬＰ）又は同種異系（Ｂａｌｂ／ｃ）脾細胞又はマイトジェン（ＣｏｎＡ）に対する応答におけるドナーＬＰ  ＢＭ及びＴ細胞のＣ５７ＢＬ／６ａｓｍａｓｅ＋／＋又はＣ５７ＢＬ／６ａｓｍａｓｅ−／−レシピエントから採取した脾臓Ｔ細胞の増殖を測定するチミジン取り込みアッセイ。データ（平均±標準誤差）は、３つの独立した実験から得られる３連の測定値を示す。
【０１７６】
さらに、増殖は、照射した第三者のＴ細胞チャレンジに対する応答においてインタクトであり（Ｂａｌｂ／ｃ）、照射ＬＰ／Ｊ  Ｔ細胞に対する応答はなかったため（図２３）、ＬＰ／Ｊ  ＢＭ＋Ｔ細胞を伴う移植後２１日でのａｓｍａｓｅ＋／＋及びａｓｍａｓｅ−／−宿主由来Ｔ細胞のex vivoにおける同種活性は似ていた。これらのデータは、ａｓｍａｓｅ−／−宿主におけるin vivoでのＣＤ８＋ＣＴＬ増殖の欠損を実証し、並びに、これらのＢＭＴレシピエントにおいて、血清炎症性サイトカインレベルの減衰への生物学的意義のある結果を示す。
【０１７７】
実施例４
２Ａ２抗体の作成方法
ハイブリドーマ作製
【０１７８】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスをカポジ肉腫細胞で８回免疫付与し、ＥＬＩＳＡによる評価のために血清を採取した。あるいは、マウスをＢＳＡ結合Ｃ１６セラミドで免疫した。ＥＬＩＳＡによってセラミド結合について血清を試験し、陽性と評価された動物を屠殺した。末梢リンパ節を採取し、浸漬してＢ細胞を放出させた。Ｓｐ２／０骨髄腫細胞を用いてＰＥＧ介在性融合を精製Ｂ細胞で行い、該融合をＨＡＴ添加ＤＭＥＭ含有培地プレートに播種した。その後、５日目にハイブリドーマを与え、１０日目に上清を採取し、ＥＬＩＳＡによりセラミド結合について試験した。上清がセラミドと結合するが、ＢＳＡ又はＣ１６ジヒドロセラミドには結合しない場合のみ、クローンは陽性であると決定した。陽性クローンをＨＴ添加ＤＭＥＭ中で増殖し、限定希釈法によりサブクローニングし、ＥＬＩＳＡにより再評価した。
【０１７９】
ＥＬＩＳＡアッセイ
【０１８０】
抗原（ＢＳＡ結合Ｃ１６セラミド、ＢＳＡ結合Ｃ１６ジヒドロセラミド又はＢＳＡ）を、終夜４℃でのインキュベーションにより、ＮＵＮＣ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ免疫プレート上に吸収させた（absorped）。非結合抗原を、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）により洗浄し、プレートを５％  ミルク含有ＰＢＳで飽和した。ハイブリドーマ上清又は一次抗体インキュベーションを室温で２時間行った。ＰＢＳ＋０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄後、二次抗体インキュベーション（ＨＲＰ結合抗マウス抗体）を室温で２時間行った。さらに３回洗浄後、３，３’，５，５’テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を用いて抗体結合を検出し、酸性溶液を用いて停止し、吸光度を４５０ｎｍで定量化した。
【０１８１】
抗体精製
【０１８２】
ハイブリドーマ由来の組織培養上清を滅菌濾過し、予め洗浄したタンパク質Ｇと１時間４℃で混合した。タンパク質Ｇを採取し、１０倍量のＰＢＳで洗浄した。抗体を５０ｍＭ  クエン酸、１４０ｍＭ  ＮａＣＬ、ｐＨ２．７で溶出した。抗体含有画分をＴｒｉｓにより中和し、透析し、抗体をカラムアフィニティーにより精製した。ＮａＣＬ勾配を用いて抗体を溶出した。抗体を２５ｍＭ  リン酸塩、１００ｍＭ  ＮａＣＬ、ｐＨ５．８に対して透析し、１ｍｇ／ｍｌに分割し、−２０℃で保管した。
【０１８３】
２Ａ２抗体作成方法
モノクローナル抗体の産生
【０１８４】
５匹の８週齢雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを、ＩＰを介して０．５ｍｌのカポジ肉腫細胞（４ｘ１０７／ｍｌ）で免疫した。動物を、週に１度、３回免疫した。最後の免疫の後１週間で、マウスを出血し、抗血清における抗体応答をＦＡＣＳ解析により評価した。ハイブリドーマ調製のために１匹のマウスを選んだ。細胞融合前３日間、ＫＳ細胞の追加免疫を受けた。ポリエチレングリコール（ＭＷ  １５００）を用いて、ＫＳ細胞で免疫したＢＡＬＢ／ｃマウス由来の脾細胞をマウス骨髄腫細胞（Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３、ＡＴＣＣ）と４：１の割合で融合した。融合後、細胞を９６ウェルプレートに１ｘ１０５細胞／ウェルで、２０％ウシ胎仔血清、１０％  ハイブリドーマ添加物（Ｓｉｇｍａ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌ  ペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌ  ストレプトマイシン、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ及び１ｘヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン（Ｓｉｇｍａ）含有ＲＰＭＩ１６４０選択培地に播種し、培養した。ＫＳ細胞におけるＦＡＣＳ解析及び市販のタンパク質混合物(アネキシンＶ、セラミドＢＳＡ及びＡＰＡ)を用いるＥＬＩＳＡによりハイブリドーマ上清を選択した。選ばれたハイブリドーマを限定希釈法により４回サブクローニングし、アネキシンＶ塗布プレート上でＥＬＩＳＡにより検査した。条件培地を安定ハイブリドーマ培養物から採取した。ｍＡｂのＩｇクラスをマウスｍＡｂアイソタイピングキット（Santa Cruz）で決定した。ｍＡｂの免疫グロブリンクラスを，マウスｍＡｂアイソタイプキットを用いて決定した。アネキシンＶに結合する２Ａ２  ｍＡｂ（ｍＩｇＭ）は、ＥＬＩＳＡにより確認されたセラミドに対する弱い交差結合活性を有する。
【０１８５】
抗体ヒト化。マウス２Ａ２抗体の重（ＶＨ）及び軽（ＶＬ）鎖の両方に対する可変領域を得るために、一般的な分子クローニング技術（ＲＴ−ＰＣＲ又は５’−ＲＡＣＥ）を用いた。キメラ２Ａ２抗体を作成し、マウス両親と同等の結合特性を確認する。相補性決定領域（ＣＤＲ）移植を用いることによりキメラ２Ａ２抗体をヒト化する。一連のヒト生殖細胞系遺伝子由来のヒトフレームワーク配列を、マウス２Ａ２抗体のＣＤＲに対するヒト抗体のＣＤＲの類似性に基づいて選択する。抗体親和性及び生産量を改善するために、抗体の可変領域のフレームワーク領域における重要な残基を交換することにより、抗原結合ループの構造を微調整するために、抗体をさらに操作する。
【図３−１】
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【図３−２】
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【図５−１】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６−１】
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【図１７】
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【図１８】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２３】
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【図２４】
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【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５−２】
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【図１６−２】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図２２−１】
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【図２２−２】
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【図２５】
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【配列表】
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