(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料の調製および試料中の農薬の分析のための方法であって、
（ａ）  第１の溶媒を有するＨＩＬＩＣクロマトグラフィカラム（１４）への、第１の溶媒中に分解された試料の適用のステップと、
（ｂ）  前記試料に含まれる前記農薬の少なくとも大部分をＳＰＥ濃縮アセンブリ（２２）中で濃縮するステップと、
（ｃ）  選択された濃縮期間の後、弁アセンブリの切換により、前記ＳＰＥ濃縮アセンブリから第２の溶媒を有する第２のクロマトグラフィカラムを通して弁アセンブリの切換前とは反対方向に、前記ＳＰＥ濃縮アセンブリ中で濃縮された農薬を含む試料部分を流すステップと、
（ｄ）  前記第２のクロマトグラフィカラム中で分離された前記ＳＰＥ濃縮アセンブリで濃縮された農薬を含む前記試料部分を検出するステップとを含み、
前記第２の溶媒は、前記第１の溶媒よりも大きな極性および／または高い含水量を有する、方法。
【請求項２】
選択された濃縮期間の間に前記ＳＰＥ濃縮アセンブリ（２２）を通って流れる前記試料の流れの一部が直接に検出されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ポンプ（１２）は、前記弁アセンブリを第２の切換位置に切換えた後、前記ＨＩＬＩＣクロマトグラフィカラム（１４）を再生するおよび／または洗浄することを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＨＩＬＩＣクロマトグラフィカラム（１４）は、第２の切換位置では、質量分析計（３２）のポンプ（１８）を用いて、分析期間の一部の間に再生され、ガスクロマトグラフィのための農薬試料部分は、残余の分析期間の間に前記ＨＩＬＩＣクロマトグラフィカラム（１４）を用いて生成されることを特徴とする、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
ポンプ（１２）の前記第１の溶媒は、少なくとも９０体積％のアセトニトリル（ＡＣＮ）を備えることを特徴とする、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
ポンプ（１２）の前記第１の溶媒は、０から１０体積％の水を備え、アセトニトリルと水との総量が１００体積％以下であることを特徴とする、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
ポンプ（１２）の前記第１の溶媒は、５体積％の水を備えることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ポンプ（１８）の前記第２の溶媒は、少なくとも９０体積％の水を備えることを特徴とする、請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
ポンプ（１８）の前記第２の溶媒は、３から１０体積％のアセトニトリルおよび／またはＭｅＯＨを備え、アセトニトリルおよび／またはＭｅＯＨと水との総量が１００体積％以下であることを特徴とする、請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
ポンプ（１８）の前記第２の溶媒は、５体積％のアセトニトリルおよび／またはＭｅＯＨを備える、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
試料の調製および試料中の農薬の分析のための、請求項１から１０のいずれかに記載の方法を行なうためのアセンブリ（１０）であって、
（ａ）  第１の溶媒のための第１のポンプ（１２）を有するＨＩＬＩＣクロマトグラフィカラム（１４）と、
（ｂ）  ＳＰＥ濃縮アセンブリ（２２）と、
（ｃ）  前記第１の溶媒よりも大きな極性および／または高い含水量を有する第２の溶媒のための第２のポンプ（１８）を有する第２のクロマトグラフィカラム（２８）と、
（ｄ）  検出器（３２）と、
（ｅ）  弁アセンブリの第１の切換位置（図１）で、試料の流れが前記ＨＩＬＩＣクロマトグラフィカラム（１４）から前記ＳＰＥ濃縮アセンブリ（２２）へ導かれるように形成された試料およびマトリックスの流れを制御するための弁アセンブリ（２０；２４）とを備え、第２の切換位置（図２）では、前記ＳＰＥ濃縮アセンブリ（２２）中で濃縮された前記試料は前記ＳＰＥ濃縮アセンブリ（２２）から前記第２のクロマトグラフィカラム（２８）を通って前記検出器（３２）へと前記第１の切換位置における方向とは反対方向に導かれる、アセンブリ。
【請求項１２】
前記第２のクロマトグラフィカラム（２８）はＨＰＬＣカラムまたはＧＣカラムであることを特徴とする、請求項１１に記載のアセンブリ。
【請求項１３】
前記第１の切換位置では、選択された濃縮時間の間に前記ＳＰＥ濃縮アセンブリ（２２）を通って流れる前記試料の流れの一部は前記検出器（３２）に直接に導かれることを特徴とする、請求項１１または１２のいずれかに記載のアセンブリ。
【請求項１４】
前記検出器（３２）は質量分析計であることを特徴とする、請求項１１から１３のいずれかに記載のアセンブリ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明は、試料の調製、およびクロマトグラフィによる試料中の農薬の分析のためのアセンブリに関する。農薬は、害虫または害獣から植物を保護するのに用いられる。それらは残留物の形態で食物連鎖に入ることがあるため、分析によって管理される法的しきい値が設定される。農薬の分析は、異なる試料マトリックス中の異なる試料について行なわれる。したがって、分析の目的は、マトリックスから試料中の農薬をできるだけ分離し、後で分析を行なうことである。高精度を達成し、試料の調製および分析を自動化し、かつ分析のための作業量および化学物質の消費を低減することが開発の目下の目的である。
【背景技術】
【０００２】
先行技術
刊行物である、フランス、エクスアンプロヴァンスでの２００３年５月のＭＧＰＲシンポジウムでのポスターの、M. Anastassiades, E. ScherbaumおよびD. Bertschによる「Validation of a Simple and Rapid Multiresidue Method (QuEChERS) and its Implementation in Routine Pesticide Analysis」は、ＧＣ−ＭＳＤまたはＬＣ−ＭＳによる農薬の機器分析のための試料調製のための簡略化された方法を開示する。当該方法は、さまざまな工程をより単純な工程で置き換える。ＭｇＳＯ4、ＮａＣｌおよびアセトニトリルなどのさまざまな化学物質を加え、試料調製のために振とうまたは遠心分離などの異なる調製工程を行なう。
【０００３】
Spechtによる食物中の植物保護剤の残留物を測定するための「Ｓ１９」として公知のマルチメソッドは、抽出および分配、ゲル浸透クロマトグラフィ（ＧＰＣ）、小型シリカゲルカラムを用いるクロマトグラフィ、ならびにさまざまな検出器を用いたその後のガスクロマトグラフィ検出を本質的に備える。
【０００４】
AlderによるChemElut法によると、均質化された試料は、単位含水量を調節した後にメタノールを用いて抽出され、遠心分離された抽出物は、後で液−液分配によって珪藻土で洗浄される。これにより、分析すべき農薬を干渉マトリックス成分から分離することができる。溶出に必要な比較的大量のジクロロメタンは後で低減され、残留物は、通常はメタノールである測定に好適な溶媒を用いて取られる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
すべての公知の方法は、通常手動で行なわれる方法ステップをコピーすることによる自動化を提供する。試料は異なる溶媒を用いて抽出される。抽出物を洗浄しかつ測定するには、実験室での多数の工程が必要である（液−液分配、ＳＰＥ、ＧＰＣ、…）。
【０００６】
時間のかかる試料調製を簡略化するため、高性能の検出器を利用可能である。自動化は以上で言及した先行技術と同様に実行される。
【０００７】
作業量が多いことおよび材料消費が多いことはすべての公知の方法について不利である。結果の精度および分析可能な農薬の数は、方法のうちあるものを用いた場合に限定されてしまう。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の開示
発明の目的は、試料の調製をより経済的にすること、ならびに作業量および材料消費を低減することである。本発明に従うと、この目的は、アセンブリであって、
（ａ）  本質的に無極性および／または低含水量溶媒のための第１のポンプを有する親水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＬＩＣ）クロマトグラフィカラムと、
（ｂ）  固相抽出（ＳＰＥ）濃縮アセンブリ（Anreicherungsanordnung; accumulation assembly）と、
（ｃ）  本質的に極性および／または高含水量溶媒のための第２のポンプを有する第２のクロマトグラフィカラムと、
（ｄ）  検出器と、
（ｅ）  弁アセンブリの第１の切換位置では試料の流れがＨＩＬＩＣクロマトグラフィカラムからＳＰＥ濃縮アセンブリへ導かれるように形成される試料およびマトリックスの流れを制御するための弁アセンブリとを備え、第２の切換位置では、ＳＰＥ濃縮アセンブリで濃縮された試料は、ＳＰＥ濃縮アセンブリから第２のクロマトグラフィカラムを通って検出器へと反対方向に導かれる、アセンブリを用いて達成される。
【０００９】
発明の好ましい変形例では、本質的に極性および／または高含水量溶媒は、弁アセンブリの第１の切換位置で、第２のクロマトグラフィカラムを通って反対方向に一気に流され、後で処分される。
【００１０】
本発明に従うアセンブリは、試料の調製および分析の完全な自動化を可能にする。未処理の抽出物が直接に洗浄される、すなわち干渉マトリックスが除去され、分析される。試料の抽出は、無極性および／または低含水量溶媒を用いたサンプリングの前に実行される。アセトニトリル（ＡＣＮ）が特に好適である。９５体積％のＡＣＮおよび５体積％の水の混合比が特に有利であることがわかっている。抽出物を測定に直接に用いることができる。抽出物の洗浄はＨＩＬＩＣクロマトグラフィカラムにおけるクロマトグラフィによって行なわれ、自動化される。
【００１１】
ＨＩＬＩＣカラムの使用は、干渉マトリックス成分から農薬を十分に分離することができるため、特に有利である。農薬はマトリックスよりも早く溶出し、ＳＰＥ濃縮アセンブリによって捕えられる。マトリックスはＨＩＬＩＣクロマトグラフィカラムの中に残留し、後の段階で溶出可能である。
【００１２】
自動化のための以前の試みに対して、いずれの既存の方法も模倣されず、新たなアセンブリを用いた新たな方法が適用されていることがわかる。液−液分配を行なう代わりに、ＨＩＬＩＣクロマトグラフィカラムを用いる。第２の分析クロマトグラフィカラムにおける第２の工程で農薬を分析しながら、ＨＩＬＩＣクロマトグラフィカラムを洗浄してもよい。
【００１３】
好ましくは、第２の分析クロマトグラフィカラムは逆相（ＲＰ）クロマトグラフィカラムとして運用される。驚くべきことに、ＨＩＬＩＣクロマトグラフィカラムをＲＰクロマトグラフィカラムと組合わせると、特に再現可能な結果を与え、農薬方法について検出限界および感度が良好となることがわかった。
【００１４】
発明に従うアセンブリは、手動での試料調製を行なうことなく、公知の古典的な方法の活性成分のスペクトルの検出を可能にする。ＳＰＥ濃縮アセンブリ中での濃縮は、大きな注入容積（Injectionsvolumina; injection volumina）を適用してもよいというさらなる利点を有する。これにより、検出限界および感度がさらに増大する。
【００１５】
濃縮された成分は、逆流置換法を用いて、初期勾配を有する第２の分析カラムに移される。同時に、マトリックスはＨＩＬＩＣクロマトグラフィカラムから溶出され、カラムは次の分析のために調整される。使い捨てのものは洗浄に必要ない。これは環境を保護し、方法およびアセンブリを特に経済的にする。
【００１６】
発明の好ましい実施形態は、分析の当初は少なくとも９０体積％の水を備える、ポンプの高含水量および／または極性溶媒を用いる。さらに、ポンプの高含水量および／または極性溶媒は、３から１０体積％、好ましくは５体積％のアセトニトリルおよび／またはＭｅＯＨを備えてもよい。そのような溶媒を用いると、濃縮した農薬は、逆流置換法によりＳＰＥ濃縮アセンブリから第２の分析クロマトグラフィカラムに流される。
【００１７】
第２のクロマトグラフィカラムは高速液体（ＨＰＬＣ）カラムであってもよい。しかしながら、これはガスクロマトグラフィ（ＧＣ）カラムであってもよい。次に、溶出はＳＰＥ濃縮アセンブリ中でオフラインで行なわれる。溶出物はＧＣカラムで分析される。換言すると、ＨＩＬＩＣクロマトグラフィカラムおよびＳＰＥ濃縮アセンブリは、ＧＣカラムのための試料調製のために働く。そのような使用により、ＳＰＥ濃縮アセンブリからの濃縮された試料は酢酸エチルおよび／またはアセトンなどの溶媒を用いて容器の中に一気に流され、ＧＣカラムを用いて分析される。
【００１８】
発明の特に好ましい変形例では、選択された濃縮時間の間、第１の切換位置で、ＳＰＥ濃縮アセンブリを通って流れる試料の流れの一部が検出器に直接に導かれる。それらは、特に、濃縮不可能な極性農薬である。それらは直接に検出器へと流され、測定される。同時にマトリックスが分離される。質量分析計が検出器として特に好適である。
【００１９】
記載のアセンブリは、
（ａ）  本質的に無極性および／または低含水量溶媒を有するＨＩＬＩＣクロマトグラフィカラムへの、本質的に無極性および／または低含水量溶媒中に分解される（gelosten; resolved）試料の適用のステップと、
（ｂ）  試料に含まれる農薬の少なくとも大部分をＳＰＥ濃縮アセンブリ中で濃縮するステップと、
（ｃ）  選択された濃縮期間の後、弁アセンブリの切換により、ＳＰＥ濃縮アセンブリから本質的に極性および／または高含水量溶媒を有する第２のクロマトグラフィカラムを通って反対方向に、ＳＰＥ濃縮アセンブリ中で濃縮された農薬を含む試料の一部を流すステップと、
（ｄ）  第２のクロマトグラフィカラムで分離された試料の一部を検出するステップとによって特に十分に動作可能である。
【００２０】
選択された濃縮期間の間にＳＰＥ濃縮アセンブリを通って流れる試料の流れの一部は好ましくは直接に検出される。
【００２１】
方法は、第２の切換位置で、質量分析計のポンプを用いて、ＨＩＬＩＣクロマトグラフィカラムが分析期間の一部の間に再生成されれば、かつガスクロマトグラフィのための農薬試料部分が残余の分析期間の間にカラムを用いて生成されれば、特に有利である。
【００２２】
発明のさらなる変形例は従属クレームの主題である。添付の図面を参照して好ましい実施形態を以下により詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】第１の切換位置の、試料調製および農薬の分析のためのアセンブリの概略図である。
【図２】第２の切換位置の、図１のアセンブリの図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
実施形態の説明
図１および図２は、全般的に番号１０で示される、試料中の農薬の自動分析のためのアセンブリを示す。アセンブリは、オーブン１６中のＨＩＬＩＣクロマトグラフィカラム１４へ、当初は５体積％の水および９５体積％のＡＣＮからなる溶媒をポンプ注入するグラジエントポンプ１２を備える。アセンブリは、当初は５体積％のＡＣＮおよび／またはＭｅＯＨならびに９５体積％の水からなる溶媒を弁２０にポンプ注入する別のグラジエントポンプ１８を備える。
【００２５】
図１に示す切換位置では、ＨＩＬＩＣクロマトグラフィカラム１４の出口は、弁２０を介してＳＰＥ濃縮アセンブリ２２に接続される。本実施形態のＳＰＥ濃縮アセンブリは短いＣ８カラムである。ＳＰＥ濃縮カラム（図示せず）の前に水を加えることにより、溶出物の極性が上昇して農薬を濃縮することができる。
【００２６】
ＳＰＥ濃縮アセンブリの出口はオーブン２６中の別の弁２４を介してＬＣ−ＭＳ検出器３２の試料容量に接続される。オーブン２６の中にＲＰ−ＨＰＬＣカラム（Ｃ１８カラム）２８が設けられる。図１に示す切換位置では、ポンプ１８からの溶媒の流れは、弁２４を通ってＨＰＬＣカラムに流れる。ＨＰＬＣカラム２８の出口は弁２０を介して廃棄場所（Entsorgung; waste）３０に接続される。
【００２７】
図２は図１と同じアセンブリを示す。しかしながら、弁２０および２４は異なる位置に切換わっている。溶媒は、グラジエントポンプ１２により、ＨＩＬＩＣカラムを通り、弁２０を通って廃棄場所３０に流れている。これにより、ＨＩＬＩＣカラムが洗浄され、次の分析のために準備される。
【００２８】
高含水量溶媒は、グラジエントポンプ１８により、弁２４を通ってＳＰＥ濃縮アセンブリ２２へ流される。次にこれは、ＳＰＥ濃縮アセンブリ２２を通って弁２０へ反対方向に、図１のように流れる。弁２０は、農薬を含む試料が弁２０を通って分析用ＨＰＬＣカラム２８へ流れる位置へ切換えられる。ＨＰＬＣカラム２８の出口は弁２４を介してＬＣ−ＭＳ検出器３２に接続される。
【００２９】
アセンブリは以下のように動作する。
方法は、５マイクロリットルの未処理抽出溶液の注入で始まる。弁２０および２４の第１の切換位置では、９５：５の比率のＡＣＮおよび水に溶解された、分析すべき農薬を含む試料（未処理の抽出物）がポンプ１２によってＨＩＬＩＣクロマトグラフィカラム１４を通して流される。そこで、農薬を無関係の干渉マトリックスの主要部から分離する。マトリックスは主にＨＩＬＩＣクロマトグラフィカラム１４の中に残る。農薬の大部分は、約１から４分後に早期に溶出する。マトリックスの大部分は、その段階では依然としてＨＩＬＩＣカラム中に存在する。残余の試料部分はＳＰＥ濃縮アセンブリ２２へ流れる。そこで、農薬が濃縮する。農薬、特に低分子極性農薬のごく一部は、ＳＰＥ濃縮アセンブリ２２の中に残らず、この濃縮期間（図１）の間にＳＰＥ濃縮アセンブリ２２を通って直接に検出器３２へ流れる。これにより、この切換位置では、それらは既に検出される。
【００３０】
約４分後、ＨＩＬＩＣ中のマトリックスは分析すべき農薬から十分に分離される。次に弁２０および２４を、図２の状況が得られるように切換える。この切換位置では、ＳＰＥ濃縮アセンブリ中で濃縮された農薬は、ＳＰＥ濃縮アセンブリ２２から、９５体積％の水および５体積％のＡＣＮという高含水量溶媒を含んで、ＨＰＬＣカラム２８へと反対方向に流される。グラジエントポンプ２は、逆転された流れの原則に従ってＳＰＥ濃縮アセンブリから分析ＨＰＬＣカラムへ成分を溶出する。本質的にマトリックスを含まない農薬がその中で分離され、検出器３２によって検出される。これは、ＨＰＬＣカラム２８での分離のために用いられる勾配によって実行される。高含水量から開始して、溶出パワー（Elutionskraft; elution power）は、メタノールおよび／またはＡＣＮの含有量を増やすことによってゆっくりと増大される。同時に、ＨＩＬＩＣクロマトグラフィカラム１４はグラジエントポンプ１２を用いて再生成されるかまたは洗浄される。
【００３１】
図示しない別の実施形態では、マトリックスから分離される試料をＨＰＬＣカラムに流す代わりに、ＧＣ分析を行なう。次に、まずＳＰＥ濃縮アセンブリによって別個の容器の中に試料を一気に流す。そのように調製した試料は、ガスクロマトグラフィにより公知の態様で分析可能である。
【図１】
0005855100.tif 000002
【図２】
0005855100.tif 000003