(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記化学式２で表される構造を有することを特徴とする化合物：
【化１】
0005973571.tif 000007
【請求項２】
次の工程を含む化学式２で表される化合物の製造方法：
（ａ）留紅草属を水、アルコール、有機溶媒及びこれらの混合物からなる群より選択される溶媒で抽出して、留紅草属抽出物を製造する工程；
（ｂ）前記留紅草属抽出物に水を加えて懸濁し、ノルマルヘキサン、エチルアセテート及びブタノールで順次分画して水分画を得る工程；及び
（ｃ）前記水分画を分離及び精製して化学式２で表される化合物を取得する工程；
【化２】
0005973571.tif 000008
【請求項３】
前記留紅草属は丸葉留紅草であることを特徴とする請求項２に記載の製造方法。
【請求項４】
下記化学式２で表される化合物を含む、糖尿病または糖尿病合併症の予防または治療用医薬組成物：
【化３】
0005973571.tif 000009
【請求項５】
前記糖尿病合併症は高血糖症、高インシュリン血症、高中性脂肪血症、インシュリン抵抗、脂質代謝異常、空腹血糖障害、耐糖能異常、肥満、動脈硬化、微細血管症、腎臓疾患、心臓疾患、足部潰瘍、関節炎、骨粗しょう症、及び糖尿病により誘発される眼科疾患からなる群より選択されることを特徴とする請求項４に記載の糖尿病または糖尿病合併症の予防または治療用医薬組成物。
【請求項６】
前記糖尿病により誘発される眼科疾患は糖尿病性網膜症、白内障、黄斑変成症、外眼筋マヒ、紅彩毛様体炎、視神経炎、緑内障、網膜退行、眼底出血、屈折異常、結膜下出血及び硝子体出血からなる群より選択されることを特徴とする請求項５に記載の糖尿病または糖尿病合併症の予防または治療用医薬組成物。
【請求項７】
抗糖尿病化合物をさらに含むことを特徴とする請求項４〜６のいずれか一項に記載の糖尿病または糖尿病合併症の予防または治療用医薬組成物。
【請求項８】
前記抗糖尿病化合物はナテグリニド、レパグリニド、グリタゾン類、ズルホニルウレア系、メトホルミン、グリメピリド、チアゾリジンジオン系、ビグアナイド系、αグルコシダーゼ抑制剤であるアカルボース及びメグリチニド系のプランジンからなる群より選択されることを特徴とする請求項７に記載の糖尿病または糖尿病合併症の予防または治療用医薬組成物。
【請求項９】
下記化学式２で表される化合物を含む、糖尿病または糖尿病合併症の予防用健康機能食品：
【化４】
0005973571.tif 000010
【請求項１０】
前記糖尿病合併症は高血糖症、高インシュリン血症、高中性脂肪血症、インシュリン抵抗、脂質代謝異常、空腹血糖障害、耐糖能異常、肥満、動脈硬化、微細血管症、腎臓疾患、心臓疾患、足部潰瘍、関節炎、骨粗しょう症、及び糖尿病により誘発される眼科疾患からなる群より選択されることを特徴とする請求項９に記載の糖尿病または糖尿病合併症の予防用健康機能食品。
【請求項１１】
前記糖尿病により誘発される眼科疾患は糖尿病性網膜症、白内障、黄斑変成症、外眼筋マヒ、紅彩毛様体炎、視神経炎、緑内障、網膜退行、眼底出血、屈折異常、結膜下出血及び硝子体出血からなる群より選択されることを特徴とする請求項１０に記載の糖尿病または糖尿病合併症の予防用健康機能食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、留紅草属から分離した新規化合物およびこれを有効成分として含む組成物に関し、より詳細には、留紅草属から分離した新規化合物およびこれを有効成分として含む糖尿病予防または治療用組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病（diabetes）とは、インシュリンの分泌欠陥または、インシュリン作用の欠陥から起因した慢性高血糖症（hyperglycemia）の特徴を表す多重的病因の代謝障害のことをいい、血中の葡萄糖が異常に高い状態が長期間持続する場合、慢性的な代謝障害とこれに係る慢性的血管損傷で種々の合併症が発生する。
【０００３】
糖尿病は、代表的な成人性代謝疾患で、世界人口の約５％が苦しんでおり、それによる人命的、経済的損失は実に莫大なものである。糖尿病患者の多くは、経口用治療剤を服用しているが、現在まで安全な治療剤が開発されていないのが実情である。インシュリン抵抗性（insulin resistance）が、最も重要な原因として知られているが、正確な機序はいまだに確実ではなく、ただ遺伝的な素因と環境の複合的な原因が働くものと明らかになっている。糖尿病は、全世界的に３番目に深刻な病気で、２０１０年まで約２億５千万人の糖尿病患者が予想され、国内の場合にも継続的な増加が予想されている。国内死亡原因の第７番目であり、全体糖尿病患者の９０％以上を占めているインシュリン非依存性糖尿病（non-insulin dependent diabetes、ＮＩＤＤＭ）は、主に４０代以後に発病して、成人型糖尿病と呼ばれ、インシュリンを十分に生成させることができないか適切に利用できないことによって引き起こされる代謝障害である（DeFronzo RA et al., Diabetes Care, 15:318, 1992）。ＮＩＤＤＭの発病原因は、明らかになっていないが、西洋化された食生活及び生活方式等の環境的要因と肥満及び運動不足のような遺伝的な要因が全て働くものと考えられる。ＮＩＤＤＭは、普通食事療法及び運動療法で治療を先に試みて、この方法による治療効果が充分でない場合、一般に薬物が利用されるが、多くの場合、インシュリンが用いられる。インシュリンは、食事療法と経口血糖降下剤で血糖が調節されない患者に必要であるが、インシュリンは蛋白質であるため、消化管では加水分解されて、非活性化されるため、口腔では摂取できず、静脈や皮下内に注射しなければならない短所がある。
【０００４】
経口血糖降下剤は、細胞のインシュリンレセプターの感度を向上させて、すい臓を刺激してインシュリンの分泌を促すため、ＮＩＤＤＭ患者の血糖を調節するために用いられる。しかし、ＮＩＤＤＭの治療のための経口治療法は、低血糖症、吐き気、嘔吐、下痢、発疹などを起こせ、特に致命的な乳酸アシドーシスのような深刻な副作用を引き起こせる。この他にも経口血糖降下剤は、長期間使用時に心血管系障害や胃腸管及び肝の障害を誘発させるため、長時間の使用は推奨されない。このような欠点及び副作用があるため、現在の治療剤には満足できる効能を示すと共に安全性が高く副作用の側面においても安心できて、全ての糖尿病患者に適用できる薬物が殆どないため、糖尿病、特にＮＩＤＤＭを治療するためのより効率的な薬物の開発が切に求められている。
【０００５】
糖尿病にかかった後１０年が経つと、体内のほぼ全器官が損傷を受けて、合併症が誘発される。このような合併症中、急性合併症には低血糖症、ケトン酸血症、高浸透圧性非ケトン性高血糖症、高血糖性昏睡、及び糖尿病性ケトアシドーシス等が挙げられ、慢性合併症には糖尿病性網膜症、糖尿病性白内障、糖尿病性腎疾患、糖尿病性神経障害、心血管系合併症、及びウイルス感染等が挙げられる。慢性糖尿病性腎症は、血液透析治療及び末期腎不全の最も重要な原因になっており、糖尿病性白内障は、失明を招いて最終的には死に至る。
【０００６】
このような糖尿病合併症を誘発する機序としては、大きく蛋白質の非酵素的な糖化反応（nonenzymatic glycation of protein）、及びポリオール経路（polyol pathway）等で説明されている。蛋白質の非酵素的な糖化反応（nonenzymatic glycation of protein）とは、蛋白質のリシン残基等のアミノ酸グループと還元糖が酵素作用なしに縮合反応、即ちメイラード反応が生じるもので、この反応の結果で最終糖化産物が生成される。蛋白質の非酵素的な糖化反応は、（１）蛋白質のリシン残基等のアミノ酸グループと還元糖のアルデヒドまたはケトンが酵素作用なしに求核付加反応を行って初期工程産物であるシッフ塩基（schiff base）を形成し、前記シッフ塩基と隣接したケトアミン付加物（ketoamine adduct）が互いに縮合して、可逆的なアマドリ（amadori）型の早期糖化産物が生成される工程と、（２）高血糖状態が持続して可逆的なアマドリ型の早期糖化産物が分解されず再配列（rearrangement）されて蛋白質と交差結合（cross-linking）して、非可逆的な最終糖化産物が生成される工程とで分けられる。
【０００７】
可逆的なアマドリ型の早期糖化産物とは異なり、最終糖化産物は、非可逆的な反応産物であるため、一旦生成されると血糖が正常に回復されても分解されず蛋白質生存期間の間組織に蓄積されて、組織の構造と機能を異常に変化させて、組織のあちこちに合併症を誘発させる（Vinson, J.A. et al., J. Nutritinal Biochemistry, 7: 559, 1996; Smith, P. R. et al., Eur. J. Biochem., 210:729, 1992）。
【０００８】
例えば、葡萄糖と多種の蛋白質が反応して生成された最終糖化産物の中一つである糖化アルブミンは、慢性糖尿病性腎症を起こす重要な要因として作用する。糖化アルブミンは、糖化が進行されない正常アルブミンに比べてさらに容易に腎糸球体細胞内に流入し、高濃度の葡萄糖は、メサンジウム細胞を刺激して細胞外基質（extracellular matrix）合成を増加させる。過度に流入した糖化アルブミンと増加した細胞外基質によって腎糸球体の繊維化が引き起こされる。このような機序で腎糸球体が損傷を受け続けることになって、血液透析または臓器移植等の極端な治療法を用いるほかはない段階に達することになる。また、慢性糖尿によって動脈壁ではコラーゲンが、腎糸球体では基底膜性蛋白質が最終糖化産物と結合されて組織に蓄積されることが報告された（Brownlee, M. et al., Sciences, 232:1629:1986）。
【０００９】
このように非酵素的蛋白質糖化反応によって基底膜、血漿アルブミン、水晶体蛋白質、フィブリン、コラーゲン等の蛋白質で糖化が起き、生成された最終糖化産物が組織の構造と機能を異常に変化させて、糖尿病性網膜症（diabetic retinopathy）、糖尿病性白内障（diabetic cataract）、糖尿病性腎症（diabetic nephropathy）、糖尿病性神経症（diabetic neuropathy）等の慢性糖尿病合併症を誘発させる（Yokozawa, T. et al., J. of Trad. Med., 18:107, 2001）。従って、糖尿病合併症の発病を遅らせたり予防または治療するためには、最終糖化産物の形成を抑制することが大変重要なことが明らかになった（Brownlee, M. et al., N. Engl. Med., 318:1315, 1988）。
【００１０】
また、最終糖化産物は、血管内皮細胞成長因子であるＶＥＧＦ  ｍＲＮＡと蛋白質を過発現して非増殖性または増殖性糖尿病性網膜症を誘発する。異常な新生血管形成または新生血管の病理的（pathogenic）成長は、多くの状態と係っている。このような状態は、糖尿病性網膜症、乾癬、滲出性または濡れ性（wet）加齢性黄斑変性症（ＡＲＭＤ）、リューマチ関節炎及びその他炎症性疾患、及び多くの癌を含む（Aiello et al., New Engl. J. Med, 331:1480, 1994; Peer et al. Lab. Invest., 72:638, 1995）。このような状態と係る病気にかかった組織または腫瘍でＶＥＧＦは異常な高水準で発現し、血管新生または血管透過性が増加している。特に、ＡＲＭＤは、臨床的に重要な血管新生疾患である。この疾患は、老人の片目または両目の脈絡膜で新生血管が形成されるのを特徴とし、先進工業国で失明の主要要因となっている。種々の治療法で用いられた抗−新生血管形成製剤は、単にＶＥＧＦまたはＶＥＧＦレセプターの化学量的減少を誘導でき、これら製剤の効果は、疾病にかかった組織で異常な高濃度で生成されたＶＥＧＦによって減少する（Lopez et al., Invest. Opththalmol. Vis. Sci., 37:855, 1996）。
【００１１】
そこで、本発明者等は、糖尿病及びそれによる合併症治療のための副作用が少ない天然生薬物質の探索に鋭意努力した結果、留紅草属から分離した新規化合物が糖尿モデルマウスで血糖、糖化血色素及び尿タンパク質などの糖尿指標を好転させる効果を示すことを確認して、本発明の完成に至った。
【発明の概要】
【００１２】
本発明の目的は、糖尿病及びそれによる合併症治療のための副作用が少ない天然生薬物質由来新規化合物を提供することである。
本発明の他の目的は、このような新規化合物を有効成分として含有する糖尿病及びその合併症予防または治療用医薬組成物または健康機能食品を提供することである。
【００１３】
前記目的を達成するために、本発明は下記化学式１で表わされる構造を有する化合物を提供する：
【化１】
0005973571.tif 000002
（ここで、Ｒ１及びＲ２は各々独立して、Ｈ，炭素数１乃至２０のアルキル基、炭素数６乃至３０のアリール基、炭素数１乃至２０のアリル基、炭素数６乃至３０のアリールアルキル基またはアシル基である）。
【００１４】
本発明はまた、（ａ）留紅草属を水、アルコール、有機溶媒及びこれらの混合物からなる群より選択される溶媒で抽出して、留紅草属抽出物を製造する工程；（ｂ）前記留紅草属抽出物に水を加えて懸濁し、ノルマルヘキサン、エチルアセテート及びブタノールで順次分画して水分画を得る工程；及び（ｃ）前記水分画を分離及び精製して化学式２で表わされる化合物の製造方法を提供する。
【化２】
0005973571.tif 000003
【００１５】
本発明はまた、化学式１で表される化合物；その塩；または化学式１で表される化合物またはその塩を含有する抽出物を有効成分として含む糖尿病または糖尿病合併症の予防または治療用医薬組成物を提供する。
【００１６】
本発明はまた、化学式１で表される化合物；その塩；または化学式１で表される化合物またはその塩を含有する抽出物を有効成分として含む糖尿病または糖尿病合併症の予防用健康機能食品を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】丸葉留紅草由来新規化合物のＨＰＬＣスペクトルである。
【図２】丸葉留紅草由来新規化合物のＬＣ−ＭＳスペクトルである。
【図３】丸葉留紅草由来新規化合物のＤ２Ｏを溶媒として使用したＨ−ＮＭＲスペクトルである。
【図４】丸葉留紅草由来新規化合物のＤ２Ｏを溶媒として使用したＣ−ＮＭＲスペクトルである。
【図５】丸葉留紅草由来新規化合物がヒト網膜色素上皮細胞株でＶＥＧＦ（vascular endothelial growth factor）蛋白質産生を阻害することを示したものである。
【図６】丸葉留紅草由来新規化合物がマウスすい臓β細胞株でインシュリン蛋白質産生を促すことを示したグラフである。
【図７】丸葉留紅草由来新規化合物のマウス水晶体の混濁度の減少効果を示したものである。
【図８】丸葉留紅草由来新規化合物の糖尿モデル動物における血糖抑制効果を示したものである。
【図９】丸葉留紅草由来新規化合物の糖負荷検査による、血糖減少効果を示したものである。
【図１０】丸葉留紅草由来新規化合物の糖尿モデル動物における糖化血色素抑制効果を示したものである。
【図１１】丸葉留紅草由来新規化合物による糖尿モデル動物のクレアチニンの尿排出が正常的であることを示したものである。
【図１２】丸葉留紅草由来新規化合物による糖尿モデル動物に肝毒性がないことを示したものである。
【図１３】丸葉留紅草由来新規化合物による糖尿モデル動物の肝機能に異常がないことを示したものである。
【図１４】丸葉留紅草由来新規化合物が糖尿モデル動物のベータ機能性を高めてインシュリン耐糖性の減少したことを示したものである。
【図１５】丸葉留紅草由来新規化合物の糖尿モデル動物のアディポネクチン発現を増加させる効果を示したものです。
【図１６】丸葉留紅草由来新規化合物の糖尿モデル動物のグルカゴン発現を減少させる効果を示したものである。
【図１７】丸葉留紅草由来新規化合物の糖尿モデル動物のＤＤＰ−ＩＶ活性抑制効果を示したものである。
【図１８】丸葉留紅草由来新規化合物の糖尿モデル動物のαグルコシダーゼ活性抑制効果を示したものです。
【図１９】丸葉留紅草由来新規化合物の糖尿モデル動物の腫瘍壞死因子アルファの発現を減少させる効果を示したものである。
【図２０】丸葉留紅草由来新規化合物の糖尿モデル動物の抗白内障効果を示したものである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
一観点において、本発明は下記化学式１で表わされる構造を有する化合物に関する：
【化３】
0005973571.tif 000004
（ここで、Ｒ１及びＲ２は各々独立して、Ｈ、炭素数１乃至２０のアルキル基、炭素数６乃至３０のアリール基、炭素数１乃至２０のアリル基、炭素数６乃至３０のアリールアルキル基またはアシル基である）。
【００１９】
好ましくは、前記化学式１で、Ｒ１及びＲ２は各々独立してＨまたは炭素数１乃至２０のアルキル基である。
【００２０】
より好ましくは、前記化学式１は化学式２で表わされる構造を有することができる。
【化４】
0005973571.tif 000005
【００２１】
また、前記化学式１の化合物は留紅草属、好ましくは丸葉留紅草から分離することができる。
【００２２】
本発明の実施例で使用された丸葉留紅草（Quamoclit angulata）は、ナス目ヒルガオ科ツル性一年草である。熱帯アメリカ原産であり、主に観賞用で栽培されており、ツルはアサガオのように生長しがら左に巻き上がる特徴がある。全草の長さは３ｍ前後である。葉はずれて葉袋が長くて心臓型円形をなす。葉先が尖って、下の部分の両側端が尖った角となる。花は８〜９月に咲き黄色を帯びた紅色であり、長い花茎の端に３〜５ヶずつ垂れ下がる。花はアサガオを縮小したような形を取っており、萼・雄蕊は、各々５ヶずつであり、雌蕊は１個である。実はさく果で丸く、９月に熟して萼が残る。留紅草と似ているが、葉が分かれない。
【００２３】
本発明の化学式２の構造を有する化合物は留紅草属から分離された新規化合物で、Ｃ４９Ｈ８８Ｏ２４の分子式を有して、化学式１の構造を有する樹脂配糖体の一種でベータＤ−フコピラノースなどの構造が連結されている。
【００２４】
本発明では化学式２の構造を有する化合物をＫＲＩＢＢ−ＢＨ−Ｐと命名した。前記新規化合物は微黄色の粉末でＬＣ−ＭＳにより分子イオンｍ／ｚ１０５９．４、９１６．４（１０５２．４−１４５）、７８６．９（９１６．４−１３６）、５１４．８（７８６．９−１３６）、３７８．９（５１４．８−１３６）、２３２．９（３７８．９−１４６）であり、これは分子式Ｃ４９Ｈ８８Ｏ２４と一致する。更に、１Ｄ−ＮＭＲ（Ｈ−ＮＭＲ，Ｃ−ＮＭＲ）を通じて明確なＮＭＲ配置を完成した。
【００２５】
本発明による新規化合物は公知の方法を使用して製造することができる。例えば、留紅草から水、アルコール、アルコール水溶液、有機溶媒またはこれらの混合物などの溶媒を利用して、抽出することができるし、好ましくは、水またはアルコールを利用して抽出でき、更に活性炭を利用して分離精製することができる。
【００２６】
前記化学式２で表わされる化合物の場合は次の方法で製造することができる。即ち、他の観点で、本発明は（ａ）留紅草属を水、アルコール、有機溶媒及びこれらの混合物からなる群より選択される溶媒で抽出して、留紅草属抽出物を製造する工程；（ｂ）前記留紅草属抽出物に水を加えて懸濁し、ノルマルヘキサン、エチルアセテート及びブタノールで順次分画して水分画を得る工程；及び（ｃ）前記水分画を分離及び精製して化学式２で表わされる化合物の製造方法に関する。
【００２７】
前記（ａ）工程で留紅草は乾燥して使用することが望ましく、留紅草属抽出物を活性炭が充填されたカラムを利用して１次分離・精製することが望ましい。（ｃ）工程の分離・精製方法は特別に制限されてないが、例えばクロマトグラフィを使用できる。
【００２８】
本発明の一様態では、次のような方法で丸葉留紅草から化学式２の化合物を製造した。破砕した丸葉留紅草を水、アルコール、有機溶媒、及びその混合溶液で構成された群から選択される溶媒を利用して、室温で超音波抽出機で２時間毎に１５分ずつ２〜３日抽出するか、または水を利用して５０℃で熱水抽出した。前記抽出された抽出物は、常温で真空回転濃縮機で減圧濃縮させた後、抽出された残渣を真空凍結乾燥機で乾燥した後、水で可溶化した丸葉留紅草抽出物を得た。
【００２９】
前記取得された丸葉留紅草抽出物は、活性炭が充填されたカラムに通過させて、丸葉留紅草の有効性分を吸着させ、活性炭が充填されたカラムを蒸溜水で洗浄して、非吸着成分を取り除いた。このように非吸着成分が取り除かれた活性炭充填カラムに１０〜５０％（ｖ／ｖ）エタノール等の有機溶媒を連続的または段階的に濃度を高めながら供給して、活性炭に吸着された丸葉留紅草の有効性分を溶出させて、分離精製した後、丸葉留紅草抽出物を取得した。このように精製された丸葉留紅草抽出物は、真空回転濃縮機を利用して常温で減圧濃縮し、前記濃縮された抽出物を真空凍結乾燥させた後、水で可溶化させて水に溶解した丸葉留紅草抽出物を取得した。
【００３０】
前記水に溶解した丸葉留紅草抽出物を、蒸留水を加えて懸濁し、ノルマルヘキサン（n-hexane）、エチルアセテート（ＥｔＯＡｃ）及びブタノール（ＢｕＯＨ）で順次、溶媒分画してノルマルヘキサン分画物、ＥｔＯＡｃ分画物、ＢｕＯＨ分画物及び水分画を各々得た。
【００３１】
前記の溶媒分画物を利用して、各々ＶＥＧＦ生成抑制実験を実施して、その中で最も優れた効能を見せる水分画物を、Ｃ１８逆相シリカゲルを固定相としてアセトニトリル−水混合溶媒（１：９→９：１  ｖ／ｖ）を移動相とするクロマトグラフィを実施して１０個の分画に分けて、そのうちの分画物ＡＣＮ２０［アセトニトリル水（２：８  ｖ／ｖ）で溶出］に対してＳｅｐｈａｄｅｘカラムクロマトグラフィ（５．０ｘ６５ｃｍ、ＭｅＯＨ）を実施して新規化合物を精製した。
【００３２】
本発明の１つの実施例において、丸葉留紅草由来の新規化合物ＫＲＩＢＢ−ＢＨ−Ｐが糖尿病マウスに注射された場合、血糖、糖化ヘモグロビン、及び尿中タンパク質の構成などの糖尿病の指標が改善されたことが示された。
【００３３】
本発明の一実施例では、糖尿病マウスに丸葉留紅草由来新規化合物ＫＲＩＢＢ−ＢＨ−Ｐを投与してマウスで肝毒性及び肝機能異常が無いことを証明し、本発明のＫＲＩＢＢ−ＢＨ−Ｐはｉｎ  ｖｉｖｏ適用時の安全性を確認した。
【００３４】
本発明の他の実施例では、糖尿病マウスに丸葉留紅草由来新規化合物ＫＲＩＢＢ−ＢＨ−Ｐを投与してマウスでアディポネクチンの数値が増加して、インシュリン抵抗性が改善されたことが確認されたし、糖尿病マウスで異常に増加するグルカゴン濃度が丸葉留紅草由来新規化合物ＫＲＩＢＢ−ＢＨ−Ｐを投与した群で正常化されることが確認できた。
【００３５】
また、他の観点で、化学式１で表される化合物；その塩；または化学式１で表される化合物またはその塩を含有する抽出物を有効成分として含む糖尿病または糖尿病合併症の予防または治療用医薬組成物及び健康機能食品に関する。
【００３６】
本発明において、前記化合物は、前記化学式１で、Ｒ１及びＲ２は各々独立してＨまたは炭素数１乃至２０のアルキル基であることが好ましく、前記化学式２の構造を有することが好ましい。
【００３７】
本発明において、前記組成物及び健康機能食品には留紅草の植物培養または組織培養によって得られた抽出物を追加に添加することができる。
【００３８】
本発明の新規化合物は糖尿病だけではなく、糖尿病による合併症を予防または治療する効能を有し、前記合併症は、特に限定されるものではないが高血糖症（hyperglycemia）、高インシュリン血症（hyperinsulinemia）、高中性脂肪血症（hypertriglyceridemia）、インシュリン抵抗（insulin resistance）、脂質代謝異常（dyslipidemia）、空腹血糖障害（impaired fasting glucose）、耐糖能異常（impaired glucose tolerance）、肥満、動脈硬化、微細血管症、腎臓疾患、心臓疾患、足部潰瘍、関節炎、骨粗しょう症、糖尿病性網膜症及びその以外の一つ以上の眼科疾患を例にあげられる。
または）
【００３９】
ここで、糖尿病は、第１型糖尿病、第２型糖尿病、若者に発生する成人型糖尿病、潜在性自己免疫性糖尿病、すい臓糖尿病等のあらゆる種類の糖尿病を含み、糖尿病合併症は前記の例以外にも糸球体硬化症、勃起不能、糖尿病性神経症、月経前症候群、血管再狭窄、潰瘍性大腸炎、冠状動脈疾患、高血圧、狭心症、心筋梗塞、脳卒中、皮膚及び結合組織疾患、代謝性酸症、及び損傷された耐糖能による症状等が含まれる。
【００４０】
また、前記眼科疾患は、糖尿病性網膜症以外にも、白内障、黄斑変成症、外眼筋マヒ、紅彩毛様体炎、視神経炎、緑内障、網膜退行、眼底出血、屈折異常、結膜下出血、及び硝子体出血等糖尿病によって誘発される全ての眼科疾患を意味する。
【００４１】
本発明による医薬組成物は留紅草から分離された新規化合物を必須成分とし、これを単独で含むが、一つ以上の薬学的に許容される担体、賦形剤または、希釈剤を含んで医薬組成物として提供される。
【００４２】
さらに本発明による医薬組成物は、従来知らされている糖尿病またはその合併症の治療物質と混合して提供されてもよい。即ち、本発明による医薬組成物は糖尿病またはその合併症の予防または治療効果を有する公知の化合物と共に投与することもできる。
【００４３】
これにより、本発明の糖尿病またはその合併症の予防または治療用医薬組成物は公知の抗糖尿化合物を更に含むことができる。このような抗糖尿化合物としてはナテグリニド、レパグリニド、グリタゾン類、ズルホニルウレア系、メトホルミン、グリメピリド、チアゾリジンジオン系、ビグアナイド系、αグルコシダーゼ抑制剤であるアカルボース、メグリチニド系のプランジンなどがあげられるが、これに限定されるものではない。
【００４４】
一方、本発明において、医薬組成物の投与経路はこれらに限定されるものではないが、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、硬膜内、心臓内、經皮内、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸管、局所、舌下または直腸が含まれる。
【００４５】
経口及び鼻腔投与が望ましい。本明細書において「非経口」は皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、滑液嚢内、胸骨内、硬膜内、病所内及び頭蓋骨内注射または注入技術を含む。
【００４６】
医薬組成物は滅菌注射用水性または油性懸濁液として、滅菌注射用製剤の形態でありうる。前記懸濁液は適当な分散剤または湿潤剤（例えば、ツイン８０）及び懸濁化剤を使用して本分野で公知の技術により調製される。滅菌注射用製剤はまた無毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒の中の滅菌注射溶液または懸濁液（例、１，３−ブタンジオル中の溶液）でありえる。許容されるビークル及び溶媒としてはマンニトール、水、リンゲル溶液及びアイソトニック塩化ナトリウム溶液がある。また、滅菌不揮発性オイルが通常的に溶媒または懸濁化媒質として使用される。このような目的のため、合成モノまたはジグリセリドを含み刺激性が低いいかなる不揮発性オイルも使用される。オレイン酸及びこれのグリセリド誘導体のような脂肪酸が薬学的に許容される天然オイル（例えば、オリーブ油または蓖麻子油）、特にこれらのポリオキシエチル化された物が注射剤に有用である。
【００４７】
医薬組成物はこれに限定されるものではないが、カプセル、精製及び水性懸濁液及び溶液を含み経口的に許容可能ないかなる形態として、経口投与できる。経口用製剤の場合、有用な希釈剤として乳糖及びトウモロコシ澱粉が含まれる。マグネシウムステアレートのような滑沢剤が典型的に添加される。カプセル形を経口投与する場合、有用な希釈剤としては乳糖及びトウモロコシ澱粉が含まれる。水性懸濁液が経口投与される場合、活性成分は油化剤及び懸濁化剤が配合される。必要な場合、甘味剤及び／または風味剤及び／または着色剤が添加される。
【００４８】
本発明による医薬組成物は直腸投与のための座剤の形態で投与できる。前記組成物は本発明の化合物を室温では固形であるが、直腸の温度では液状である適当な非刺激性の賦形剤と混合して製造できる。このような物質としては、これらに限定されるものではないが、ココアバター、蜜蝋及びポリエチレングリコールが含まれる。
【００４９】
本発明による医薬組成物の経口投与は目的とする治療が局所適用で接近が容易な部位または器官と関連がある場合、特に有用である。皮膚に局所的に適用する場合、医薬組成物は担体に懸濁または溶解された活性成分を含有する適当な軟膏として調製される。本発明の化合物を局所投与するための担体としてはこれらに限定されるものではないが、鉱油、流動パラピン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン化合物、油化ワックス及び水が含まれる。他の手段として、医薬組成物は担体に懸濁または溶解された活性化合物を含有した適当なローションまたはクリームに調製される。適当な担体としてはこれらに限定されるものではないが、鉱油、ソルビタンモノステアレート、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコール及び水が含まれる。本発明による医薬組成物はまた直腸座剤に適当な浣腸剤として下部腸管に局所適用できる。局所適用された経皮パッチも本発明に含まれる。
【００５０】
本発明による医薬組成物は鼻内エアロゾルまたは吸入により投与できる。前記組成物は薬学の分野において知られている技術により製造可能であり、ベンジルアルコールまたは他の適当な保存剤、生態利用率を増強させるための吸収促進剤、フルオロカーボン及び／またはその他本発明の分野で知られている可溶化剤または分散剤を使用して塩水中の溶液として製造することができる。
【００５１】
本発明による医薬組成物において、前記新規化合物は治療学的な有効量または予防学的な有効量で含有される。しかし、特定患者に対する特定有効量は使用される特定化合物の活性、年齢、体重、一般的な健康、性別、規定食、投与期間、投与経路、排出率、薬物配合及び予防または治療される特定疾患の重症を含む色々な要因により変えられる。本発明による医薬組成物は丸剤、糖衣錠、カプセル、液剤、ケル、シロップ、スラリ、懸濁剤に調製される。
【００５２】
本発明による医薬組成物が、魚類の皮下細胞に投与される場合、鰓嚢または消化管に投与できる。注射は筋肉組織内の筋肉細胞または他の細胞に注射できるし、腹腔内の内腸細胞にも注射することができる。
【００５３】
好ましい様態として、口腔内投与のための医薬組成物は固体状の賦形剤と共に活性成分を混合して製造できるし、精製または糖衣錠の形態で製造するために顆粒形態で製造することができる。適当な賦形剤としえは乳糖、蔗糖、マンニトール及びソルビトールのような糖の形態またはトウモロコシ、小麦粉、米、ジャガイモまたは他の植物からの澱粉、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロースまたナトリウムカルボキシメチルセルロースのようなセルロース、アラビアガム、トラガカントガムを含むガム類のようなカーボハイドレートまたはゼラチン、コラーゲンのようなタンパク質フィラーが使用できる。必要な場合、交差結合されたポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸またはアルギン酸ナトリウムのような各々の塩の形態の崩壊剤または溶解剤が添加できる。
【００５４】
好ましい様態として、非口腔内投与の場合、本発明の医薬組成物は水溶性溶液で製造することができる。好ましくは、ハンス溶液（Hank’s solution），リンゲル溶液また物理的に緩衝された塩水のような物理的に適切な緩衝溶液が使用される。水溶性注入（injection）懸濁液はナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールまたはデキストランのような懸濁液の粘度を増加させる基質が添加できる。ちなみに、活性成分の懸濁液は適当な油質の注入懸濁液として製造される。適当な親脂性溶媒または担体はゴマ油のような脂肪酸エステルを含む。複数陽イオン性非脂質アミノポリマー（polycationic amino polymer）も運搬体として使用できる。任意に、懸濁液は化合物の溶解度を増加させ、高濃度の溶液を製造するために、適当な安定化剤または薬剤が使用できる。
【００５５】
一方、本発明による留紅草由来新規化合物は糖尿病及びその合併症の予防または改善のための食品の形態で製造することができる。
【００５６】
本発明による、健康機能食品は食品組成物として、機能性食品（functional food）、栄養補助剤（nutritional supplement）、健康食品（health food）及び食品添加剤（food additives）等の全ての形態を含む。前記類型の健康機能食品は、当業界で公知の通常の方法により多様な形態で製造することができる。例えば、健康食品としては、本発明の留紅草由来新規化合物を茶、ジュース及びドリンク状で製造して飲用するようにしたり、顆粒化、カプセル化及び粉末化して摂取してもよい。また、機能性食品としては、飲料（アルコール性飲料含む）、果実及びその加工食品（例：果物缶詰め、瓶詰、ジャム、マーマレード等）、魚類、肉類及びその加工食品（例：ハム、ソーセージ、コンビーフ等）、パン類及び麺類（例：うどん、ザルソバ、ラーメン、スパゲッティ、マカロニ等）、果汁、各種ドリンク、クッキー、飴、乳製品（例：バター、チーズ等）、食用植物油脂、マーガリン、植物性蛋白質、レトルト食品、冷凍食品、各種調味料（例：味噌、醤油、ソース等）等に本発明の留紅草由来新規化合物を添加して製造してもよい。
【実施例】
【００５７】
以下、本発明を実施例を挙げて詳述する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないことは当業者において通常の知識を有する者にとって自明である。
【００５８】
実施例１：留紅草から新規化合物分離
済州（チェジュ）西帰浦（ソギポ）市安徳面西広里で採集された丸葉留紅草５１ｇを水を溶媒として５０℃で熱水抽出或は水、アルコール、有機溶媒及びそれらの混合溶液で構成された群から選択される溶媒を利用して、室温で音波抽出機で２時間毎に１５分ずつ２〜３日抽出した。抽出後、抽出物を真空回転濃縮器で常温で減圧濃縮した後、抽出された残渣を真空凍結乾燥器で乾燥した後、乾燥された丸葉留紅草抽出物を得た。前記濃縮液を水に懸濁して活性炭が装填されたカラムクロマトグラフィに通過させて、丸葉留紅草の有効成分を吸着させて、活性炭が装填されたカラムを蒸留水で洗浄して非吸着成分を除去した。前記非吸着成分が除去された活性炭装填カラムに１０〜５０（ｖ／ｖ）エタノールなどの有機溶媒を連続的または段階的に濃度を高めながら供給して活性炭に吸着された丸葉留紅草の有効成分を溶出させて、分離及び精製した後、丸葉留紅草抽出物を得た。前記分離及び精製された丸葉留紅草抽出物５ｇに水を加えて、丸葉留紅草抽出物の濃度が２０ｍｇ／ｍＬになるように溶解させた。この水抽出物を蒸留水に懸濁した後、ノルマルヘキサン（n-hexane）、エチルアセテート（ＥｔＯＡｃ）及びブタノール（ＢｕＯＨ）で順次分画して、ノルマルヘキサン分画、エチルアセテート分画、ブタノール分画及び水分画を各々得た。
【００５９】
前記それぞれの溶媒分画物のＶＥＧＦ抑制実験を実施し、その中で最も優れた効能を表す水分画を、Ｃ１８逆相シリカゲルを固定相としてアセトニトリル−水混合溶媒（１：９→９：１  ｖ／ｖ）を移動相とするクロマトグラフィを実施して１０個の分画に分けた。その中分画物ＡＣＮ２０［ＭｅＯＨ−水（１：９  ｖ／ｖ）に溶出］に対してＳｅｐｈａｄｅｘカラムクロマトグラフィ（５．０ｘ６５ｃｍ、ＭｅＯＨ）を実施して新規化合物を精製した（図１）。使用した条件及び結果は以下のとおりである：
高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）］分析（Ｓｈｉｍａｄｚｕモデル）
カラム：Ｃ１８逆相カラム
移動溶媒：９０％メタノール
流速：１ｍＬ／分
滞留時間：１．２９分
【００６０】
実施例２：留紅草由来新規化合物の構造確認
実施例１から分離した新規化合物は微黄色の粉末でＬＣ−ＭＳにより分子イオンｍ／ｚ１０５９．４、９１６．４（１０５２．４−１４５）、７８６．９（９１６．４−１３６）、５１４．８（７８６．９−１３６）、３７８．９（５１４．８−１３６）、２３２．９（３７８．９−１４６）を得ることができて（図２）、これは分子式Ｃ４９Ｈ８８Ｏ２４と一致する。
【００６１】
１Ｄ−ＮＭＲ（Ｈ−ＮＭＲ，Ｃ−ＮＭＲ）を通じて明確なＮＭＲ配置を完成した。
【００６２】
デューテリウム（Ｄ２Ｏ）で置換された水を溶媒とし、テトラメチルシラン（ＴＭＳ）を標準物質として測定したＨ−ＮＭＲ結果を図３に表した。
【００６３】
デューテリウム（Ｄ２Ｏ）で置換された水を溶媒とし、テトラメチルシラン（ＴＭＳ）を標準物質として測定したＣ−ＮＭＲ結果を図４に表した。
【００６４】
前記結果より実施例１から分離した丸葉留紅草由来新規化合物はＣ４９Ｈ８８Ｏ２４の分子式を有し、「化学式２」の構造を有する新規化合物であることを確認した。
【化５】
0005973571.tif 000006
【００６５】
前記化合物は配糖体の一種でベータＤ−フコピラノースに糖構造が連結されていて、ＫＲＩＢＢ−ＢＨ−Ｐと命名した。
【００６６】
実施例３：留紅草由来新規化合物のＶＥＧＦ抑制能確認
実施例１で製造された丸葉留紅草から分離した新規化合物の血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）の抑制能を確認するため、ヒト網膜色素上皮細胞株であるＡＲＰＥ１９細胞株に前記新規化合物を処理して、糖尿病性網膜症などの糖尿病合併症を誘発する血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）タンパク質の発現を確認した。
【００６７】
ＡＲＰＥ１９細胞株（ＡＴＣＣ、ＵＳＡ）は、ＤＭＥＭ；Ｆ１２培地に１０％ＦＢＳ（Fetal bovine serum）を添加して培養した。ＡＲＰＥ１９細胞株でＶＥＧＦの蛋白質の発現を誘導するために、６０Φプレートに１×１０５ｃｅｌｌ／プレート濃度で細胞を播種して、ＤＭＥＭ低グルコース培地に１０％ＦＢＳ無血清を添加して２４時間培養した後、ＤＭＥＭ  低グルコース培地に３０ｍＭのグルコースを添加した培養液に変えて、新規化合物ＫＲＩＢＢ−ＢＨ−Ｐの終濃度が０．５μｇ／ｍＬなるように添加した後、ＶＥＧＦ蛋白質産生を確認するために７２時間培養した。この時、対照群として５．５ｍＭグルコースを処理してＶＥＧＦが発現しない細胞自体を基準として、３０ｍＭのグルコースを処理した時ＶＥＧＦ発現程度を確認して、丸葉留紅草由来化合物のＶＥＧＦ発現抑制能を比較した。本実験に用いられる３０ｍＭのグルコース濃度は、各実験でＶＥＧＦの発現誘導を最適にする条件の濃度である。
【００６８】
前記方法で培養されたＡＲＰＥ１９細胞の培養液を取得して、ＶＥＧＦ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ、ＵＫ）を利用して分泌されるＶＥＧＦの量を測定した。
その結果、図５に示したように、新規化合物ＫＲＩＢＢ−ＢＨ−Ｐを処理した実験群でＶＥＧＦ発現が減少することを確認した。
【００６９】
実施例４：留紅草由来新規化合物のインスリン分泌促進確認
丸葉留紅草から分離した新規化合物ＫＲＩＢＢ−ＢＨ−Ｐのインスリン分泌促進能をマウス膵臓β細胞株であるＭｉｎ６細胞株において確認した。
【００７０】
Ｍｉｎ６（ＡＴＣＣ、ＵＳＡ）は、ＨＤＭＥＭ培地に１５％ＦＢＳ（fetal bovine serum）を添加して培養した。Ｍｉｎ６細胞株でインスリン発現を誘導するために、９６ｗｅｌｌプレートに１×１０４ｃｅｌｌ／プレート濃度で細胞を播種して、ＤＭＥＭ高グルコース培地に１５％ＦＢＳ無血清を添加して７２時間培養後、ＰＢＳ緩衝溶液で洗浄して、ＨＢＳＳ緩衝溶液に２時間培養後、２５ｍＭのグルコースを添加したＨＢＳＳ緩衝溶液に変えて、新規化合物ＫＲＩＢＢ−ＢＨ−Ｐを終濃度が０．５ｎｇ／ｍＬになるように添加した後、インスリン発現促進の可否を確認するために２時間培養した。この時、対照群として、５．５ｍＭのグルコースを処理してインスリン発現が誘導されない細胞自体のインスリン発現量を基準点とし、陽性対照群として、アミノグアニヂン１μＭ、アカボス１μＭ、グリメピリド１ｍＭとなるように添加した。陰性対照群として、２５ｍＭのグルコースを処理した時インスリンが発現される程度を確認して、丸葉留紅草由来新規化合物がインスリン発現を促進するかを比較分析した。前記方法で培養されたＭｉｎ６細胞の培養液を取得して、インスリンＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ、ＵＫ）を利用して分泌されるインスリン量を測定した。
【００７１】
その結果、図６に示したように、新規化合物ＫＲＩＢＢ−ＢＨ−Ｐが処理された膵臓β細胞株からインスリン発現が増加することが確認できた。
【００７２】
実施例５：マウスのレンズ培養実験
糖尿患者の場合には白内障が早く起きて、悪化も速く、視力が急速に低下する。糖尿病にかかると、水晶体が混濁する現象が促進される。そこで、レンズ培養実験を介して、糖尿病性白内障生成抑制効能を調べた。
【００７３】
マウスの眼球を摘出して、ヨード溶液に入れてしばらく消毒した後、レンズだけを摘出した。Ｍ１９９培地に入れて、細胞培養器で培養した。培地に２０ｍＭのキシロースを入れて培養すると、水晶体の混濁を誘発し、ＣＣＤカメラを利用して水晶体の混濁度を測定した。
【００７４】
その結果、図７に示したように、白内障誘発を抑制する物質として知らされたケルセチン（quercetin）を処理した陽性対照群よりも本発明による新規化合物ＫＲＩＢＢ−ＢＨ−Ｐ投与群で水晶体混濁度がさらに抑制されることが確認された。
【００７５】
実施例６：留紅草由来新規化合物の処理によるマウス糖尿指標分析
６−１：血糖分析
正常マウスと実際糖尿病マウスに丸葉留紅草由来新規化合物を処理することによって、糖尿指標の血糖、糖化血色素及び尿蛋白の変化を確認した。
【００７６】
６週齢のマウス（Ｍａｌｅ  Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ  ｍｏｕｓｅ、２０ｇ、中央実験動物、ソウル）と６週齢の糖尿病マウス（Ｍａｌｅ  Ｃ５７ＢＬ／Ｋｓ  ＤＢ／ＤＢ  ｍｏｕｓｅ、２０ｇ、中央実験動物、ソウル）を購入して、一定温度（２５℃）と湿度（５０％）下１週間適応させた後、実験に用いた。
マウスを各群当たり５匹にして、正常マウス対照群、糖尿病マウス対照群、糖尿病マウス薬物処理（グリメピリド、アカボス）処理群、丸葉留紅草由来新規化合物と薬物の併用処理群に分けて、丸葉留紅草由来新規化合物投与群の場合は各々０．１ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇの濃度で各群に経口投与して１２週間飼育した。各群のマウスは２週毎に血糖の変化を測定し、さらに、６週毎に尿を採取して、尿蛋白濃度を測定し、１２週間飼育した後、血液を採取して糖化血色素の濃度を測定した。
【００７７】
その結果、血糖変化においては、図８に示したように、糖尿病マウス対照群は、正常マウス対照群と比較して血糖が上昇しているが、糖尿病マウスに薬物併用投与群と丸葉留紅草由来新規化合物を０．１ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇの濃度で経口投与した各群では有意な降下効果を示した。
【００７８】
６−２：糖負荷検査
経口糖負荷検査は５週齢のマウス（Ｍａｌｅ  Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、１９ｇ、コアテク、平沢（ピョンテク））を購入して、一定温度（２５℃）と湿度（５０％）下１週間適応させた後、実験に用いた。マウスを各群当たり５匹にし、対照群では一般飼料を餌にする一般食餌群、高脂肪飼料を餌にする高脂肪食餌群に分けて、２週間飼育した。高脂肪食餌飼育２週目に実験動物を１６時間絶食させた後、空腹時の血糖を測定し、試料は経口で２４時間、１６時間、８時間、４時間、２時間、1時間前投与し、以降３０分毎に血糖を測定した。
【００７９】
その結果、図９のように試料を経口投与して２４時間後が最も高い効能を示した。
【００８０】
６−３：糖化血色素（ＨｂＡ１ｃ）分析
糖尿病治療を受ける患者に発生する合併症を低減するためには、血糖数値を適切な水準に維持することが重要である。一時点で測定する血糖数値は、種々の要因によって変動が生じうることから、長期間の血糖調節推移を把握する目的で最も広く用いられる検査が、糖化血色素（ＨｂＡ１ｃ）である。糖化血色素は、赤血球に正常に存在する血色素に糖が結合した形態で血糖が高く維持された場合に糖化血色素数値も高くなる。糖化血色素は、２〜４ヶ月の間の平均血糖数値を反映するので、長期間の血糖調節程度を把握するのに役立つ。
【００８１】
丸葉留紅草由来新規化合物の糖化血色素に対する影響を確認するために、６週に一回ずつ正常マウス対照群、糖尿病マウス対照群及び丸葉留紅草由来新規化合物を０．１ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇの濃度で経口投与した群の血液を採取してＥＬＩＳＡキット（Ｃｕｓａｂｉｏ  ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｊａｐａｎ）を利用して測定した。
【００８２】
その結果、図１０に示したように、糖化血色素の数値で正常マウス対照群と比較して糖尿病マウスに丸葉留紅草由来新規化合物１０ｍｇ／ｍＬ濃度で経口投与した群で有意に降下効果を示した。
【００８３】
６−４：クレアチニン測定
糖尿病患者の場合、腎臓と心臓合併症が伴う場合が多い。糖尿病は体の老廃物をろ過して出す腎臓を損う。クレアチニン検査は血液中にあるクレアチニンの濃度を測定して腎臓の機能を評価することができる。クレアチニンはタンパク質が筋肉から使用された後、作られるクレアチン脱水物であって、極少量だけが血液に存在する。腎臓の機能が下がると、クレアチニンが排泄されない。各群の糖尿病マウスに１２週間経口投与したマウスの尿と血液を採取してＥＬＩＳＡキット（Ｅｘｏｃｅｌｌ、Ａｍｅｒｉｃａ）を利用して測定した。
【００８４】
その結果、図１１に示したように、併用投与群、丸葉留紅草由来新規化合物投与群から血液中のクレアチニン濃度は低くなる反面、尿のクレアチニンの濃度は高くなることが確認され、これはクレアチニン排泄が円滑に起こることを示すものである。
【００８５】
実施例７：留紅草由来新規化合物の処理による糖尿病マウスの肝毒性及び肝機能検査
７−１：アラニントランスアミナーゼ濃度分析
実施例５で使用したものと同一な６週齢のマウスと６週齢の糖尿病マウスを一定温度（２５℃）と湿度（５０％）下１週間適応させた後、肝毒性検査に用いた。
【００８６】
マウスを各群当たり５匹にして、正常マウス対照群、糖尿病マウス対照群、丸葉留紅草由来新規化合物を０．１ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇの濃度で経口投与した群に分けて、１２週間飼育した。１２週間飼育した後、血液を採取してアラニントランスアミナーゼ濃度を測定した。
【００８７】
アラニントランスアミナーゼは、アミノ酸の代謝酵素であり、診断及び経過観察の代表的な検査で活用される。アラニントランスアミナーゼの濃度が維持されたことは、肝の損傷がないことを示唆する。
【００８８】
丸葉留紅草由来新規化合物の肝臓に対する影響を確認するために、１２週間飼育した後、正常マウス対照群、糖尿病マウス対照群、丸葉留紅草由来新規化合物を０．１ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇの濃度で経口投与した群の血液を採取して、ＥＬＩＳＡキット（Ｃｕｓａｂｉｏ  ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｊａｐａｎ）を利用してアラニントランスアミナーゼ濃度変化を測定した。
【００８９】
その結果、図１２に示したように糖尿病マウスに丸葉留紅草由来新規化合物０．１ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇの濃度で経口投与した群が、正常マウス対照群と類似の数値を示して、この化合物による肝毒性がないと確認された。
【００９０】
７−２：ビリルビン分析
丸葉留紅草由来新規化合物を投与した群の肝機能異常有無を確認するため、前記実施例から採取された血液を利用してビリルビン数値をＥＬＩＳＡキット（Ｃｕｓａｂｉｏ  ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｊａｐａｎ）で測定した。ビリルビン数値の分析結果は図１３に示したように、丸葉留紅草由来新規化合物を投与した群のビリルビン数値は正常範囲の中に含まれる数値であった。したがって、本発明の組成物は肝機能の異常を誘発させない安全な組成物であることがわかる。
【００９１】
実施例８：留紅草由来新規化合物の処理による糖尿病マウスのインシュリン抵抗性及びβ細胞の機能性分析
実施例７の条件で飼育した糖尿病マウス群の空腹血液検査または糖負荷検査を通じてインシュリン感受性指数を計算した。
【００９２】
インシュリン感受性指数とはＨＯＭＡ（Homeostasis assessment）−ＩＲを使用してインシュリン感受性指数によってインシュリン抵抗性を評価し、ＨＯＭＡ−ｂｅｔａによってβ細胞の機能性を評価した。
【００９３】
その結果、図１４に示したように丸葉留紅草由来新規化合物投与群から有意な結果が表した。
ＨＯＭＡ−ＩＲ＝（Ｆａｓｉｔｉｎｇ  ｉｎｓｕｌｉｎ（μＩＵ／ｍＬ）×Ｆａｓｔｉｎｇ  ｇｌｕｃｏｓｅ（ｎｍｏｌ／Ｌ））／２２．５
ＨＯＭＡ−ｂｅｔａ＝２０×Ｆａｓｔｉｎｇ  ｉｎｓｕｌｉｎ（Ｕ／ｍＬ）／Ｆａｓｔｉｎｇ  ｇｌｕｃｏｓｅ（ｍｍｏｌ／Ｌ）−３．５
【００９４】
実施例９：留紅草由来新規化合物の処理による糖尿病マウスの血中アディポネクチン濃度分析
アディポネクチンは脂肪細胞から分泌され血液内に非常に豊富に存在し、肥満又は第２型糖尿病患者において減少していることが一貫して証明されている。また、低アディポネクチン血症は、動脈硬化疾患の新たな危険因子として注目されていて、糖尿病患者らの中でも特に、大血管合併症を伴っている患者においてアディポネクチン濃度が減少していた。即ち、アディポネクチンは抗肥満作用、抗糖尿作用、抗動脈硬化作用及び活性酸素生成の抑制作用などがある。実施例７の条件で飼育した糖尿病マウス群の血中アディポネクチンの濃度をＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ、Ｊａｐａｎ）で測定した。
【００９５】
その結果、図１５に示したように、糖尿マウス対照群ではアディポネクチンの発現が減少したが、その他の群、特に丸葉留紅草由来新規化合物投与群でインシュリン抵抗性の改善を表す数値であるアディポネクチンの発現が増加していることが確認された。
【００９６】
実施例１０：留紅草由来新規化合物の処理による糖尿病マウスのグルカゴン濃度分析
適当な血糖数値を維持することに中心的な役割をするものに、糖を除去するインシュリンだけではなく糖を増やすグルカゴンというホルモンもある。
【００９７】
第２型糖尿病患者において血糖が増加し、葡萄糖摂取に対するインシュリン分泌が遅延されグルカゴンが増加する。一般的に血漿グルカゴンに対するインシュリン比の減少は糖尿病悪化と関連していると知られている。したがって、実施例７の条件で飼育した糖尿病マウス群の血中グルカゴン濃度を確認した。
【００９８】
その結果、図１６に示したように、血漿グルカゴン濃度は糖尿対照群の場合、正常群に比べて有意に高かったが、本発明の化合物の投与に対照群より対照群に比べて顕著に低くなって薬物投与群よりもっと低かった。糖尿対照群の場合グルカゴンに対するインシュリンの比は正常群に比べて有意に低かった。従って、留紅草由来単一化合物投与によりグルカゴンの濃度に対するインシュリンの比が糖尿対照群に比べて顕著に増加し、留紅草由来単一化合物は糖尿病による異常なインシュリン及びグルカゴン濃度を正常化させて糖尿病の悪化を抑制できることがわかる。
【００９９】
実施例１１：留紅草由来新規化合物の処理による糖尿病マウスのジペプチルジペプチジルぺプチダーゼ４抑制効能分析
インクレティンにはＧＩＰ（glucose dependent insulinotropic peptide）とＧＬＰ−１（glucagon like peptide）の２種類があって、二つのホルモンすべてが小腸の上皮細胞層内の内分泌細胞（endocrine cell）で分泌され、小腸内血糖が増加し、膵臓β細胞を刺激してインシュリン分泌を促進し、α細胞からのグルカゴン分泌を抑制する。
【０１００】
したがって、インクレティンは経口で摂取されたブドウ糖の濃度に依存的に血糖を降下させ、低血糖を殆ど誘発しない。ＧＩＰとＧＬＰ−１両方ともセリンプロテアーゼ系であるジペプチジルぺプチダーゼ−４（ＤＰＰ−４）により早く分解される。このような事実を基にして実施例７の条件で飼育した糖尿病マウス群のＤＤＰ−４抑制効能を確認した。
【０１０１】
その結果、図１７に表したように、丸葉留紅草由来新規化合物投与群からＤＤＰ−４活性が抑制されることが確認できた。新たな糖尿病治療の標的として注目されているＤＤＰ−４の活性抑制を通じて血糖と糖化血色素の上昇を抑制し、糖尿病の予防または治療に優れた効果を有する。
【０１０２】
実施例１２：丸葉留紅草由来新規化合物で治療された糖尿病マウスのαグルコシダーゼ活性阻害率の測定
αグルコシダーゼ阻害剤は、腸粘膜に分布しているαグルコシダーゼの機能を阻害し、それによって増加した食後に血糖を減少させる。すなわち、αグルコシダーゼは多糖を単糖に分解する役割を有し、小腸での単糖の吸収を促進する。ここで、新規化合物はそのような役割を阻害し、そして単糖の吸収を抑制し、消化及び摂取した食物の炭水化物の吸収を遅らせ、食後の血糖及び血中のインシュリンの上昇を減少させ、糖尿病の治療効果を示す。αグルコシダーゼ阻害剤は、高インシュリン血症、又は低血糖症を誘導しないが、小腸におけるインシュリン分泌を促進し、グルカゴン分泌を阻害するグルカゴン様ペプチド−１の分泌を促進する。
【０１０３】
前記実施例７の条件で飼育した糖尿病マウス群のαグルコシダーゼ活性は、前記の記載に従って、測定した。
【０１０４】
その結果、図１８に示すように、本発明の新規化合物で処理された群のαグルコシダーゼ活性は抑制された。
【０１０５】
実施例１３：留紅草由来新規化合物の処理による糖尿病マウスの腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）
腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）は脂肪細胞から主に発現され、このサイトカインの上昇レベルは肥満及びインシュリン抵抗性と関連している。脂肪組織は腫瘍壊死因子−α、レジスチンとインターロイキン−６（ＩＬ−６）のようなサイトカインを生成するが、これらサイトカインはインシュリンの作用を抑制することが確認された。肥満人において交感神経活性が増加するがこれは脂肪分解を増加させ、筋肉の血流を減少させて（ブドウ糖の運搬）インシュリン作用に直接的な影響を与える。腫瘍壊死因子−αは血糖を高め、糖尿病を誘発させたり、血管に流れて炎症形成を防ぐ、コレステロールが蓄積することを抑制するアディポネクチンの分泌を抑制し血管内皮細胞のＮＦ−ｋＢ信号伝達を阻害し、大食細胞の貪食作用の活性を抑制する。
【０１０６】
このような事実を基にして、実施例７の条件で飼育した糖尿病マウス群のＴＮＦ−α濃度を測定した。その結果、図１９に示したように、丸葉留紅草由来新規化合物投与群からＴＮＦ−α濃度が減少することが確認できた。
【０１０７】
実施例１４：留紅草由来新規化合物の処理による糖尿病マウスの抗白内障効果
実施例７の条件で飼育した糖尿病マウス群から摘出した眼球から水晶体を分離してウェルプレートに移した後ＬＡＳ３０００イメージ分析装備で写真を撮った。混濁度は撮った写真をＬＡＳ３０００イメージ分析プログラムを用いて分析して水晶体の混濁度を測定した。
【０１０８】
その結果、図２０に示したように丸葉留紅草由来新規化合物投与群において混濁度が減少したことが確認できた。
【０１０９】
以上、本発明の内容の特定の部分を詳細に記述したが、当業界の通常の知識を有する者にとっては、このような具体的な記術は単に望ましい実施様態であるだけであり、これによって本発明の範囲が制限されないことは明らかである。従って、本発明の実質的な範囲は添付された請求の範囲及びその等価物によって定義される。
【産業上の利用可能性】
【０１１０】
本発明による留紅草属由来新規化合物は優れた血糖降下、インシュリン分泌促進、ＶＥＧＦか発現阻害などの効果を有していて、糖尿病及びこれによる各種合併症の予防または治療に効能を有するだけではなく、既存の糖尿病治療剤と併行投与する場合治療効果を促進することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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