(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｍＲＮＡと、該ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質又はペプチドとの複合体を製造するための核酸リンカーであって、
５’末端にスペーサー部分と、
前記ｍＲＮＡの少なくとも一部の配列とハイブリダイズし得るポリヌクレオチド部分と、
前記タンパク質又はペプチドとの連結部分を３’末端に有するアーム部分とを備え、
前記スペーサー部分と前記ポリヌクレオチド部分と前記アーム部分とが一本鎖を形成してなり、
前記ポリヌクレオチド部分が光反応性塩基誘導体を含み、
前記スペーサー部分は５０塩基以上のオリゴヌクレオチドを有し、
前記光反応性塩基誘導体は３−Ｃｙａｎｏｖｉｎｙｌｃａｒｂａｚｏｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅであることを特徴とする核酸リンカー。
【請求項２】
前記スペーサー部分が５’末端に固相との結合部位を有する請求項１に記載の核酸リンカー。
【請求項３】
前記タンパク質又はペプチドとの連結部分は、前記アーム部分の末端にピューロマイシン、３’−Ｎ−アミノアシルピューロマイシンアミノヌクレオシド、又は３’−Ｎ−アミノアシルアデノシンアミノヌクレオシドが結合されてなる請求項１又は２に記載の核酸リンカー。
【請求項４】
更に、前記ポリヌクレオチド部分と、前記アーム部分の間から突出した３’末端を有する分岐鎖を有し、
該分岐鎖は、前記ｍＲＮＡの一部の配列とハイブリダイズして、該ｍＲＮＡを逆転写するプライマー配列を有する請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸リンカー。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸リンカーと、
該ｍＲＮＡの逆転写プライマーと、からなる核酸リンカー−逆転写プライマー複合体であって、
前記逆転写プライマーは、前記核酸リンカーのアーム部分の少なくとも一部の配列とハイブリダイズし得る配列を有する５’末端領域部分を含むことを特徴とする核酸リンカー−逆転写プライマー複合体。
【請求項６】
前記逆転写プライマーは、前記５’末端領域部分に３−Ｃｙａｎｏｖｉｎｙｌｃａｒｂａｚｏｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅを含む請求項５に記載の核酸リンカー−逆転写プライマー複合体。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸リンカーと、
前記ｍＲＮＡと、
該ｍＲＮＡの逆転写プライマーと、からなるｍＲＮＡ−核酸リンカー−逆転写プライマー複合体であって、
前記逆転写プライマーは、前記核酸リンカーのアーム部分の少なくとも一部の配列とハイブリダイズし得る配列を有する５’末端領域部分と、前記ｍＲＮＡの少なくとも一部の配列とハイブリダイズし得る配列を有する３’末端領域部分と、からなることを特徴とするｍＲＮＡ−核酸リンカー−逆転写プライマー複合体。
【請求項８】
前記逆転写プライマーは、前記５’末端領域部分に３−Ｃｙａｎｏｖｉｎｙｌｃａｒｂａｚｏｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅを含む請求項７に記載のｍＲＮＡ−核酸リンカー−逆転写プライマー複合体。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸リンカーが、固相上に固定化されてなることを特徴とする核酸リンカー固定化固相。
【請求項１０】
請求項５又は６に記載の核酸リンカー−逆転写プライマー複合体が、固相上に固定化されてなることを特徴とする核酸リンカー−逆転写プライマー複合体固定化固相。
【請求項１１】
ｍＲＮＡと、請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸リンカーと、前記ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質又はペプチドとの複合体が、固相上に固定化されてなることを特徴とするタンパク質又はペプチド固定化固相。
【請求項１２】
請求項７に記載のｍＲＮＡ−核酸リンカー−逆転写プライマー複合体と、前記ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質又はペプチドとの複合体であるｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質又はペプチド−逆転写プライマー複合体が、固相上に固定化されてなることを特徴とするタンパク質又はペプチド固定化固相。
【請求項１３】
請求項８に記載のｍＲＮＡ−核酸リンカー−逆転写プライマー複合体と、前記ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質又はペプチドとの複合体であるｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質又はペプチド−逆転写プライマー複合体が、固相上に固定化されてなることを特徴とするタンパク質又はペプチド固定化固相。
【請求項１４】
複数の核酸リンカーが固定化されたマイクロアレイであって、
前記核酸リンカーは請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸リンカーであることを特徴とするマイクロアレイ。
【請求項１５】
複数の核酸リンカー−逆転写プライマー複合体が固定化されたマイクロアレイであって、
前記核酸リンカー−逆転写プライマー複合体は請求項５又は６一項に記載の核酸リンカー−逆転写プライマー複合体であることを特徴とするマイクロアレイ。
【請求項１６】
複数のｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体が固定化されたマイクロアレイであって、
前記ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体は、請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸リンカーと、前記ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質又はペプチドとの複合体であることを特徴とするマイクロアレイ。
【請求項１７】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸リンカーが固定化された固相を用いて核酸を回収する核酸回収方法であって、
前記ｍＲＮＡと前記核酸リンカーとを光反応性塩基誘導体によって光架橋する工程Ａ１と、
前記ｍＲＮＡと前記核酸リンカーとの前記光架橋を光照射によって解離させる工程Ｂ１と、
を含むことを特徴とする核酸回収方法。
【請求項１８】
前記工程Ａ１は第一の波長帯域の光を照射することによって、核酸リンカーとｍＲＮＡを架橋する工程を有し、
前記工程Ｂ１は第二の波長帯域の光を照射して核酸リンカーからｍＲＮＡを解離する工程を有する請求項１７記載の核酸回収方法。
【請求項１９】
前記工程Ａ１は固相上の全てのスポットに光照射し、全てのスポット中の核酸リンカーとｍＲＮＡを架橋する工程を有し、
前記工程Ｂ１は固相上の特定のスポット中の核酸リンカーからｍＲＮＡを解離させる工程を有する請求項１７又は１８に記載の核酸回収方法。
【請求項２０】
前記工程Ａ１は固相上の特定のスポット以外のスポットに光照射し、特定のスポット以外のスポット中の核酸リンカーとｍＲＮＡを架橋する工程を有し、
工程Ｂ１は、固相上の特定のスポット中の核酸リンカーからｍＲＮＡを解離させる工程を有する請求項１７又は１８に記載の核酸回収方法。
【請求項２１】
第一の波長帯域は３４０ｎｍ〜３８０ｎｍであり、第二の波長帯域は２８０ｎｍ〜３４５ｎｍである請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の核酸回収方法。
【請求項２２】
請求項７に記載のｍＲＮＡ−核酸リンカー−逆転写プライマー複合体が固定化された固相を用いて核酸を回収する核酸回収方法であって、
前記ｍＲＮＡの逆転写プライマーと前記核酸リンカーとを光反応性塩基誘導体によって光架橋する工程Ａ２と、
前記逆転写プライマーと前記核酸リンカーとの前記光架橋を光照射によって解離させる工程Ｂ２と、
を含むことを特徴とする核酸回収方法。
【請求項２３】
前記工程Ａ２は前記ｍＲＮＡ−核酸リンカー−逆転写プライマー複合体を逆転写反応に供して前記逆転写プライマーの３’末端から前記ｍＲＮＡの相補鎖が伸長してなるｃＤＮＡを合成する工程を含む請求項２２に記載の核酸回収方法。
【請求項２４】
前記工程Ａ２は第一の波長帯域の光を照射することによって、核酸リンカーと逆転写プライマーを架橋する工程を有し、
前記工程Ｂ２は第二の波長帯域の光を照射して核酸リンカーからｃＤＮＡを解離する請求項２３に記載の核酸回収方法。
【請求項２５】
前記工程Ａ２は固相上の全てのスポットに光照射し、全てのスポット中の核酸リンカーとｍＲＮＡを架橋する工程を有し、
前記工程Ｂ２は固相上の特定のスポット中の核酸リンカーから逆転写プライマーを解離させる工程を有する請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の核酸回収方法。
【請求項２６】
前記工程Ａ２は固相上の特定のスポット以外のスポットに光照射し、特定のスポット以外のスポット中の核酸リンカーと逆転写プライマーを架橋する工程を有し、
前記工程Ｂ２は固相上の特定のスポット中の核酸リンカーから逆転写プライマーを解離させる工程を有する請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の核酸回収方法。
【請求項２７】
第一の波長帯域は３４０ｎｍ〜３８０ｎｍであり、第二の波長帯域は２８０ｎｍ〜３４５ｎｍである請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の核酸回収方法。
【請求項２８】
請求項９に記載の核酸リンカー固定化固相に、ｍＲＮＡを接触させ、前記ｍＲＮＡを前記核酸リンカーにハイブリダイズさせて固相上にｍＲＮＡ−核酸リンカー複合体を形成させる工程Ａ６と、
無細胞タンパク質翻訳系を用いて前記ｍＲＮＡからタンパク質又はペプチドを合成し、前記タンパク質又はペプチドのＣ末端を、前記タンパク質又はペプチドとの連結部分に結合させてｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質又はペプチド複合体を形成させる工程Ｂ６と、
更に、前記核酸リンカーのアーム部分の少なくとも一部の配列とハイブリダイズし得る配列を有し、３−Ｃｙａｎｏｖｉｎｙｌｃａｒｂａｚｏｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅを含む５’末端領域部分と、前記ｍＲＮＡの少なくとも一部の配列とハイブリダイズし得る配列を有する３’末端領域部分と、からなる逆転写プライマーを前記固相に接触させてｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質又はペプチド−逆転写プライマー複合体を形成させる工程Ｃ６と、
前記固相上の全てのスポットに第一の波長帯域の光を照射して、核酸リンカーとｍＲＮＡを架橋するとともに、核酸リンカーと逆転写プライマーを架橋する工程Ｄ６と、
前記ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質又はペプチド−逆転写プライマー複合体を逆転写反応に供して、前記逆転写プライマーの３’末端から相補鎖を伸長してなるｃＤＮＡを合成して、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質又はペプチド複合体を製造する工程Ｅ６と、
前記ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質又はペプチド複合体が固定された固相を機能性スクリーニングに供し、該固相上のスポットを特定する工程Ｆ６と、
機能性スクリーニングにより特定されたスポットに第二の波長帯域の光を照射して、特定されたスポット中のｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質又はペプチド複合体からｃＤＮＡを解離させる工程Ｇ６と、
解離したｃＤＮＡを回収してその塩基配列を解析する工程Ｈ６と、
を有することを特徴とする機能性タンパク質又は機能性ペプチドの同定方法。
【請求項２９】
請求項９に記載の核酸リンカー固定化固相に、ｍＲＮＡを接触させ、前記ｍＲＮＡを前記核酸リンカーにハイブリダイズさせて固相上にｍＲＮＡ−核酸リンカー複合体を形成させる工程Ａ７と、
無細胞タンパク質翻訳系を用いて前記ｍＲＮＡからタンパク質又はペプチドを合成し、前記タンパク質又はペプチドのＣ末端を、前記タンパク質又はペプチドとの連結部分に結合させてｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質又はペプチド複合体を形成させる工程Ｂ７と、
更に、前記核酸リンカーのアーム部分の少なくとも一部の配列とハイブリダイズし得る配列を有し、３−Ｃｙａｎｏｖｉｎｙｌｃａｒｂａｚｏｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅを含む５’末端領域部分と、前記ｍＲＮＡの少なくとも一部の配列とハイブリダイズし得る配列を有する３’末端領域部分と、からなる逆転写プライマーを前記固相に接触させてｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質又はペプチド−逆転写プライマー複合体を形成させる工程Ｃ７と、
前記ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質又はペプチド−逆転写プライマー複合体を逆転写反応に供して、前記逆転写プライマーの３’末端から相補鎖が伸長してなるｃＤＮＡを合成して、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質又はペプチド複合体を製造する工程Ｄ７と、
前記ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質又はペプチド複合体が固定された固相を機能性スクリーニングに供し、該固相上のスポットを特定する工程Ｅ７と、
機能性スクリーニングにより特定されたスポット以外のスポットに第一の波長帯域の光を照射して、核酸リンカーとｃＤＮＡを架橋する工程Ｆ７と、
特定されたスポット中のｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質又はペプチド複合体からｃＤＮＡを解離させる工程Ｇ７と、
解離したｃＤＮＡを回収してその塩基配列を解析する工程Ｈ７と、
を有することを特徴とする機能性タンパク質又は機能性ペプチドの同定方法。
【請求項３０】
第一の波長帯域は３４０ｎｍ〜３８０ｎｍであり、第二の波長帯域は２８０ｎｍ〜３４５ｎｍである請求項２８又は２９に記載の機能性タンパク質又は機能性ペプチドの同定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸リンカー、核酸リンカー−逆転写プライマー複合体、ｍＲＮＡ−核酸リンカー−逆転写プライマー複合体、核酸リンカー固定化固相、核酸リンカー−逆転写プライマー複合体固定化固相、タンパク質又はペプチド固定化固相、マイクロアレイ、核酸回収方法、及び、機能性タンパク質又は機能性ペプチドの同定方法に関する。
本願は、２０１３年３月１３日に、日本に出願された特願２０１３−０５０９３６号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
新規機能性タンパク質は、医薬品、洗剤、食品加工、研究開発用試薬、臨床分析、さらにはバイオエネルギー、バイオセンサーなど様々なバイオ応用分野への貢献が期待されている。【０００３】
新規機能性タンパク質の取得に際しては、タンパク質の構造情報から人知によりデザインするタンパク質工学的手法が主流であった。しかし、より有用なタンパク質を取得するためには従来手法よりも効率的にスクリーニングする必要があり、タンパク質のランダムな分子構造改変と淘汰を繰り返す進化分子工学的手法が期待されている。【０００４】
進化分子工学的手法の一つであるｃＤＮＡディスプレイ法は、遺伝子型−表現型の対応付けの方法であり、核酸リンカーが、タンパク質（表現型）と、これをコードするｍＲＮＡと、逆転写したｃＤＮＡ（遺伝子型）と、を結ぶものである。ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−タンパク質連結体構造は、非常に安定であるため、該核酸リンカーを用いることにより、様々な環境下でスクリーニングを実施することが可能となった。【０００５】
ｃＤＮＡディスプレイ法は、タンパク質とこれをコードするポリヌクレオチドとを連結する核酸リンカー中に有するピューロマイシンに特徴を有している（特許文献１参照）。
ピューロマイシンは、アミノアシル−ｔＲＮＡの３’末端と類似する構造を有するタンパク質合成阻害剤であり、所定の条件下ではリボソーム上で伸長中のタンパク質のＣ末端に特異的に共有結合する。【０００６】
ｃＤＮＡディスプレイ法を用いた有用タンパク質のスクリーニング方法は、以下の一連の工程を有する。
先ず、ピューロマイシンを有する核酸リンカーとｍＲＮＡとを連結させ、無細胞翻訳系を用いてｍＲＮＡからタンパク質を合成し、合成されたタンパク質とこれをコードするｍＲＮＡとがピューロマイシンを介して結合している複合体（ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体）が生じる（非特許文献１参照）。
次いで、このｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体のライブラリーを製造した後、製造したｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を逆転写酵素により逆転写し、ｃＤＮＡを合成することにより、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体のライブラリーを製造する。
次いで、このｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体のライブラリーを用いて、所望の機能をもつタンパク質を選択し、選択したｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体中のｃＤＮＡの塩基配列を解析することによりタンパク質を同定する。逆転写のタイミングは、タンパク質を選択した後でもよい（非特許文献２参照）。【０００７】
上記ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体のライブラリーを基板上に固定したタンパク質アレイは、網羅的解析により、短期間で機能性タンパク質又は機能性ペプチドを取得するためのツールとして重要である。【０００８】
かかるタンパク質アレイを製造するための方法として、５’末端に光反応性塩基誘導体であるソラレンを有する核酸リンカー／逆転写酵素プライマー構築物を用いる方法が提案されている（特許文献２参照）。この方法は、核酸リンカーとｍＲＮＡを架橋して、核酸リンカー−ｍＲＮＡ間の結合を強固なものとして、ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質又はペプチド複合体の合成効率を上昇できる点で優れている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特許第４３１８７２１号公報
【特許文献２】特許第４８０３１５号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｎｅｍｏｔｏら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ、第４１４巻、第４０５〜４０８頁、１９９７年
【非特許文献２】Ｙａｍａｇｕｃｈｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．第３７巻、ｅ１０８頁、２００９年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかしながら、特許文献２では、固相上でｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を効率よく製造することについては何ら検討されておらず、固相上でｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質又はペプチド複合体を効率よく合成する核酸リンカーについては改良の余地があった。【００１２】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、固相上でｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質又はペプチド複合体を効率よく合成する核酸リンカー、該核酸リンカーを用いた核酸リンカー−逆転写プライマー複合体、ｍＲＮＡ−核酸リンカー−逆転写プライマー複合体、核酸リンカー固定化固相、核酸リンカー−逆転写プライマー複合体固定化固相、タンパク質又はペプチド固定化固相、マイクロアレイ、核酸回収方法、及び、機能性タンパク質又は機能性ペプチドの同定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは上記の課題を解決するため、鋭意研究を行った結果、スペーサー部分を有する核酸リンカーにより課題を解決できることを見出した。本発明の一実施態様は、下記（１）〜（１５）を提供するものである。
（１）本発明の一実施態様における核酸リンカーは、ｍＲＮＡと、該ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質又はペプチドとの複合体を製造するための核酸リンカーであって、５’末端にスペーサー部分と、前記ｍＲＮＡの少なくとも一部の配列とハイブリダイズし得るポリヌクレオチド部分と、前記タンパク質又はペプチドとの連結部分を３’末端に有するアーム部分とを備え、前記スペーサー部分と前記ポリヌクレオチド部分と前記アーム部分とが一本鎖を形成してなり、前記ポリヌクレオチド部分が光反応性塩基誘導体を含み、前記スペーサー部分は５０塩基以上のオリゴヌクレオチドを有し、前記光反応性塩基誘導体は３−Ｃｙａｎｏｖｉｎｙｌｃａｒｂａｚｏｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅであることを特徴とする。
【００１５】
（３）本発明の一実施態様における核酸リンカー−逆転写プライマー複合体は、先に記載の核酸リンカーと、該ｍＲＮＡの逆転写プライマーと、からなる核酸リンカー−逆転写プライマー複合体であって、前記逆転写プライマーは、前記核酸リンカーのアーム部分の少なくとも一部の配列とハイブリダイズし得る配列を有する５’末端領域部分を含むことを特徴とする。
（４）本発明の一実施態様におけるｍＲＮＡ−核酸リンカー−逆転写プライマー複合体は、先に記載の核酸リンカーと、前記ｍＲＮＡと、該ｍＲＮＡの逆転写プライマーと、からなるｍＲＮＡ−核酸リンカー−逆転写プライマー複合体であって、前記逆転写プライマーは、前記核酸リンカーのアーム部分の少なくとも一部の配列とハイブリダイズし得る配列を有する５’末端領域部分と、前記ｍＲＮＡの少なくとも一部の配列とハイブリダイズし得る配列を有する３’末端領域部分と、からなることを特徴とする。【００１６】
（５）本発明の一実施態様における核酸リンカー固定化固相は、先に記載の核酸リンカーが、固相上に固定化されてなることを特徴とする。
（６）本発明の一実施態様における核酸リンカー−逆転写プライマー複合体固定化固相は、先に記載の核酸リンカー−逆転写プライマー複合体が、固相上に固定化されてなることを特徴とする。
（７）本発明の一実施態様におけるタンパク質又はペプチド固定化固相は、ｍＲＮＡと、先に記載の核酸リンカーと、前記ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質又はペプチドとの複合体が、固相上に固定化されてなることを特徴とする。
（８）本発明の一実施態様におけるタンパク質又はペプチド固定化固相は、先に記載のｍＲＮＡ−核酸リンカー−逆転写プライマー複合体と、前記ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質又はペプチドとの複合体であるｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質又はペプチド−逆転写プライマー複合体が、固相上に固定化されてなることを特徴とする。【００１７】
（９）本発明の一実施態様におけるマイクロアレイは、複数の核酸リンカーが固定化されたマイクロアレイであって、前記核酸リンカーは先に記載の核酸リンカーであることを特徴とする。
（１０）本発明の一実施態様におけるマイクロアレイは、複数の核酸リンカー−逆転写プライマー複合体が固定化されたマイクロアレイであって、前記核酸リンカー−逆転写プライマー複合体は先に記載の核酸リンカー−逆転写プライマー複合体であることを特徴とする。
（１１）本発明の一実施態様におけるマイクロアレイは、複数のｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体が固定化されたマイクロアレイであって、前記ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体は、先に記載の核酸リンカーと、前記ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質又はペプチドとの複合体であることを特徴とする。
（１２）本発明の一実施態様における核酸回収方法は、先に記載の核酸リンカーが固定化された固相を用いて核酸を回収する核酸回収方法であって、前記ｍＲＮＡと前記核酸リンカーとを光反応性塩基誘導体によって光架橋する工程Ａ１と、前記ｍＲＮＡと前記核酸リンカーとの前記光架橋を光照射によって解離させる工程Ｂ１と、
を含むことを特徴とする。
（１３）本発明の一実施形態における核酸回収方法は、先に記載のｍＲＮＡ−核酸リンカー−逆転写プライマー複合体が固定化された固相を用いて核酸を回収する核酸回収方法であって、前記ｍＲＮＡの逆転写プライマーと前記核酸リンカーとを光反応性塩基誘導体によって光架橋する工程Ａ２と、前記逆転写プライマーと前記核酸リンカーとの前記光架橋を光照射によって解離させる工程Ｂ２と、を含むことを特徴とする。【００１８】
（１４）本発明の一実施態様における機能性タンパク質又は機能性ペプチドの同定方法は、先に記載の核酸リンカー固定化固相に、ｍＲＮＡを接触させ、前記ｍＲＮＡを前記核酸リンカーにハイブリダイズさせて固相上にｍＲＮＡ−核酸リンカー複合体を形成させる工程Ａ６と、無細胞タンパク質翻訳系を用いて前記ｍＲＮＡからタンパク質又はペプチドを合成し、前記タンパク質又はペプチドのＣ末端を、前記タンパク質又はペプチドとの連結部分に結合させてｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質又はペプチド複合体を形成させる工程Ｂ６と、更に、前記核酸リンカーのアーム部分の少なくとも一部の配列とハイブリダイズし得る配列を有し、３−Ｃｙａｎｏｖｉｎｙｌｃａｒｂａｚｏｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅを含む５’末端領域部分と、前記ｍＲＮＡの少なくとも一部の配列とハイブリダイズし得る配列を有する３’末端領域部分と、からなる逆転写プライマーを前記固相に接触させてｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質又はペプチド−逆転写プライマー複合体を形成させる工程Ｃ６と、前記固相上の全てのスポットに第一の波長帯域の光を照射して、核酸リンカーとｍＲＮＡを架橋するとともに、核酸リンカーと逆転写プライマーを架橋する工程Ｄ６と、前記ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質又はペプチド−逆転写プライマー複合体を逆転写反応に供して、前記逆転写プライマーの３’末端から相補鎖を伸長してなるｃＤＮＡを合成して、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質又はペプチド複合体を製造する工程Ｅ６と、前記ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質又はペプチド複合体が固定された固相を機能性スクリーニングに供し、該固相上のスポットを特定する工程Ｆ６と、機能性スクリーニングにより特定されたスポットに第二の波長帯域の光を照射して、特定されたスポット中のｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質又はペプチド複合体からｃＤＮＡを解離させる工程Ｇ６と、解離したｃＤＮＡを回収してその塩基配列を解析する工程Ｈ６と、を有することを特徴とする。【００１９】
（１５）本発明の一実施態様における機能性タンパク質又は機能性ペプチドの同定方法は、先に記載の核酸リンカー固定化固相に、ｍＲＮＡを接触させ、前記ｍＲＮＡを前記核酸リンカーにハイブリダイズさせて固相上にｍＲＮＡ−核酸リンカー複合体を形成させる工程Ａ７と、無細胞タンパク質翻訳系を用いて前記ｍＲＮＡからタンパク質又はペプチドを合成し、前記タンパク質又はペプチドのＣ末端を、前記タンパク質又はペプチドとの連結部分に結合させてｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質又はペプチド複合体を形成させる工程Ｂ７と、更に、前記核酸リンカーのアーム部分の少なくとも一部の配列とハイブリダイズし得る配列を有し、３−Ｃｙａｎｏｖｉｎｙｌｃａｒｂａｚｏｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅを含む５’末端領域部分と、前記ｍＲＮＡの少なくとも一部の配列とハイブリダイズし得る配列を有する３’末端領域部分と、からなる逆転写プライマーを前記固相に接触させてｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質又はペプチド−逆転写プライマー複合体を形成させる工程Ｃ７と、前記ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質又はペプチド−逆転写プライマー複合体を逆転写反応に供して、前記逆転写プライマーの３’末端から相補鎖が伸長してなるｃＤＮＡを合成して、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質又はペプチド複合体を製造する工程Ｄ７と、前記ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質又はペプチド複合体が固定された固相を機能性スクリーニングに供し、該固相上のスポットを特定する工程Ｅ７と、機能性スクリーニングにより特定されたスポット以外のスポットに第一の波長帯域の光を照射して、核酸リンカーとｃＤＮＡを架橋する工程Ｆ７と、特定されたスポット中のｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質又はペプチド複合体からｃＤＮＡを解離させる工程Ｇ７と、解離したｃＤＮＡを回収してその塩基配列を解析する工程Ｈ７と、を有することを特徴とする。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、固相上でｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質又はペプチド複合体を効率よく合成できる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明の核酸リンカーの一態様を示した図である。
【図２】本発明の核酸リンカーの一態様を示した図である。
【図３】本発明の核酸リンカー−逆転写プライマー複合体の一態様を示した図である。
【図４】本発明のｍＲＮＡ−核酸リンカー−逆転写プライマー複合体の一態様を示した図である。
【図５】本発明の核酸回収方法の一態様を示した図である。
【図６】本発明の核酸回収方法の一態様を示した図である。
【図７】本発明の核酸回収方法の一態様を示した図である。
【図８】本発明の核酸回収方法の一態様を示した図である。
【図９】本発明の機能性タンパク質又は機能性ペプチドの同定方法の一態様を示した図である。
【図１０】本発明の機能性タンパク質又は機能性ペプチドの同定方法の一態様を示した図である。
【図１１】実施例における電気泳動の結果である。
【図１２】実施例における電気泳動の結果である。
【図１３】実施例における蛍光イメージャーによる解析結果である。
【図１４】実施例におけるＣｙ３修飾ｍＲＮＡの定量結果である。
【図１５】実施例における蛍光イメージャーによる解析結果である。
【図１６】実施例における蛍光イメージャーによる解析結果である。
【図１７】実施例における蛍光イメージャーによる解析結果である。
【図１８】実施例における回収したＣｙ３修飾ＤＮＡの定量結果である。
【図１９】実施例における蛍光イメージャーによる解析結果である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
≪核酸リンカー≫［第１実施形態］
本実施形態の核酸リンカーは、ｍＲＮＡと、該ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質又はペプチドとの複合体を製造するための核酸リンカーである。本実施形態の核酸リンカーの構造について、図１を用いて説明する。
図１中、Ｐｕはピューロマイシン、ＡＴＣＧはＤＮＡ配列を示している。また、Ｓｐｃ１８はアーム部を構成するスペーサー（第１のスペーサー）を示している。
【００２３】
本実施形態の核酸リンカー２は、５’末端にスペーサー部分５１ｃと、スクリーニングすべきｍＲＮＡ２３の少なくとも一部の配列とハイブリダイズし得るポリヌクレオチド部分５１ａと、前記タンパク質又はペプチド３３との連結部分２ａを３’末端に有するアーム部分５１ｂとを備えている。そして、本実施形態の核酸リンカー２は、スペーサー部分５１ｃとポリヌクレオチド部分５１ａとアーム部分５１ｂとがこの順に一本鎖を形成してなる。
【００２４】
ポリヌクレオチド部分５１ａは、ＤＮＡであってもＰＮＡ（ポリヌクレオペプチド）などの核酸誘導体であってもよく、ヌクレアーゼ耐性が付与された修飾ＤＮＡが好ましい。
修飾ＤＮＡとしては、ホスホロチオエートなどのヌクレオシド間結合を有するＤＮＡ、２’−フルオロ、２’−Ｏ−アルキルなどの糖修飾を有するＤＮＡなど，当該技術分野において知られる修飾ＤＮＡのいずれを用いてもよい。
そして、ポリヌクレオチド部分５１ａは、光反応性塩基誘導体２ｂを含む。光反応性塩基誘導体２ｂは、所定の波長の光が照射されることにより、反応性が活性化され、核酸リンカー２とｍＲＮＡ２３を架橋可能な塩基誘導体を意味する。
光反応性塩基誘導体２ｂは、可逆的光連結性塩基を用いることが好ましい。可逆的光連結性塩基は、例えば、異なる波長帯域の光が照射されることによって、核酸リンカー２とｍＲＮＡ２３を可逆的に光連結及び光開裂する塩基を含む。可逆的光連結性塩基は、一例として、ソラーレン（ｐｓｏｒａｌｅｎ）を付加した塩基、３−Ｃｙａｎｏｖｉｎｙｌｃａｒｂａｚｏｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ（以下、ＣＮＶＫともいう。）が挙げられる。
なお、可逆的光連結性塩基は、短時間で効率よく架橋できることが良いため、ＣＮＶＫが好ましい。
光反応性塩基誘導体２ｂとしてＣＮＶＫを用いる場合、核酸リンカー２とｍＲＮＡ２３との複合体に、光連結する第一の波長帯域の光と光開裂する第二の波長帯域の光とを照射することで可逆的な架橋反応が可能である。第一の波長帯域は３４０ｎｍ以上の光である。一例として、３４０〜３８０ｎｍの波長帯域の光を照射することにより、ＣＮＶＫの５’側 に隣接するプリン塩基と塩基対を形成しているｍＲＮＡ２３中のピリミジン塩基を構成する原子とＣＮＶＫを構成する原子とが架橋構造を形成する。第二の波長帯域は３５０ｎｍ未満の光である。一例として、２８０〜３４５ｎｍの波長帯域の光を照射することにより、架橋は解除される。第一の波長帯域と第二の波長帯域は、波長帯域の一部が互いに重複していてもよいとする。
ＣＮＶＫを用いることで、所定の波長帯域の光を短時間（例えば３０秒）照射することで高い架橋効率が得られ、照射対象の核酸を損傷するおそれがない。また、ＣＮＶＫは、効率のよい可逆的な架橋反応が可能であるという点において優れている。
【００２５】
アーム部分５１ｂは、ｍＲＮＡ２３とタンパク質又はペプチドとの連結部分２ａとを所望の距離に保持するスペーサーとして機能する。アーム部５１ｂの５’末端は、ポリヌクレオチド部分５１aの３’末端と結合し、アーム部分５１ｂの３’末端はタンパク質連結部分２ａを有する。
【００２６】
３’末端を除くアーム部分５１ｂは、標識物質を用いて標識されてもよい。標識物質としては、例えば、蛍光色素、蛍光ビーズ、量子ドット、ビオチン、抗体、抗原、エネルギー吸収性物質、ラジオアイソトープ、化学発光体、酵素等が挙げられる。
蛍光色素としては、ＦＡＭ（カルボキシフルオレセイン）、ＪＯＥ（６−カルボキシ−４’,５’−ジクロロ２’,７’−ジメトキシフルオレセイン）、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）、ＴＥＴ（テトラクロロフルオレセイン）、ＨＥＸ（５'−ヘキサクロロ−フルオレセイン−ＣＥホスホロアミダイト）、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ａｌｅｘａ５６８、Ａｌｅｘａ６４７等が挙げられる。
【００２７】
アーム部５１ｂの３’末端にはタンパク質又はペプチド３３の連結部分２ａが存在する。タンパク質又はペプチド連結部分２ａとは、所定の条件下でリボソーム上の伸長中のタンパク質又はペプチド３３のＣ末端に特異的に結合する性質を有する構造を意味し、ピューロマイシンが代表的である。
ピューロマイシンは、アミノアシル−ｔＲＮＡの３’末端と類似する構造を有するタンパク質合成阻害剤である。タンパク質３３の連結部分２ａとしては、伸長中のタンパク質又はペプチド３３のＣ末端に特異的に結合する機能を有する限り、任意の物質を用いることができ、３’−Ｎ−アミノアシルピューロマイシンアミノヌクレオシド（ＰＡＮＳ−アミノ酸）、または３’−Ｎ−アミノアシルアデノシンアミノヌクレオシド（ＡＡＮＳ−アミノ酸）などのピューロマイシン誘導体を用いることができる。
ＰＡＮＳ−アミノ酸としては、アミノ酸部がグリシンのＰＡＮＳ−Ｇｌｙ、バリンのＰＡＮＳ−Ｖａｌ、アラニンのＰＡＮＳ−Ａｌａ、又はアミノ酸部が全ての各アミノ酸に対応するＰＡＮＳ−アミノ酸混合物を挙げることができる。
ＡＡＮＳ−アミノ酸としては、アミノ酸部がグリシンのＡＡＮＳ−Ｇｌｙ、バリンのＡＡＮＳ−Ｖａｌ、アラニンのＡＡＮＳ−Ａｌａ、又はアミノ酸部が全アミノ酸の各アミノ酸に対応するＡＡＮＳ−アミノ酸混合物を挙げることができる。
ピューロマイシン以外に好適に使用できるアミノアシルｔＲＮＡ３’末端アナログとしては、リボシチジルピューロマイシン（ｒＣｐＰｕｒ）、デオキシジルピューロマイシン（ｄＣｐＰｕｒ）、デオキシウリジルピューロマイシン（ｄＵｐＰｕｒ）などを挙げることができる。
【００２８】
アーム部５１ｂは、スペーサー（第１のスペーサー）として機能するものであれば、核酸や核酸誘導体から構成されていてもよく、ポリエチレングリコールなどの高分子から構成されていてもよい。アーム部５１ｂにはさらに、ピューロマイシンの安定性を高めるための修飾や、複合体の検出のための標識が付加されていてもよい。本実施形態の核酸リンカー２を、後述するｍＲＮＡ−核酸リンカー−逆転写プライマー−複合体に用いる場合には、アーム部分５１ｂは、逆転写プライマーと相補対を形成するための核酸や核酸誘導体を有することが好ましい。
【００２９】
本実施形態の核酸リンカー２は、５’末端にスペーサー部分５１ｃ（第２のスペーサー）を有する。本発明者は、固相上でｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を効率よく製造するためには、スペーサー部分５１ｃが必要であることを見出した。タンパク質又はペプチド３３の合成工程において、リボソームが固相に接触してタンパク質又はペプチド３３の合成が阻害されることを抑制するために、固相から所定の距離をおく必要があると考えられる。この理由のため、本実施形態の核酸リンカー２は、５’末端にスペーサー部分５１ｃ（第２のスペーサー）を有し、そのスペーサー部分は複数の塩基を有する。一例として、本実施形態のスペーサー部分は約５０塩基以上のオリゴヌクレオチドを有する。
【００３０】
また、スペーサー部分５１ｃが５’末端に固相との結合部位を有することが好ましい。
固相結合部位／固相結合部位を認識する固相上の固相結合部位認識部位の組み合わせとしては、アビジン−ビオチン結合を利用する方法の他、核酸リンカー２をアミノ基、ホルミル基、ＳＨ基、などの官能基で修飾し、固相をアミノ基、ホルミル基、エポキシ基などを有するシランカップリング剤で表面処理したものを利用する方法や、金-チオール結合を利用する方法などを用いることができ、金-チオール結合を利用した方法が好ましい。
【００３１】
本実施形態の核酸リンカー２は、一本鎖という単純な構造を有しているため、従来の核酸リンカーと比較して容易に製造できる。このため、この核酸リンカーを用いてペプチド又はタンパク質を迅速かつ簡単に調製できる。
更に、本実施形態の核酸リンカー２は、スペーサー部分５１ｃを有するため、固相上でのタンパク質又はペプチド３３の合成に適している。
更に、本実施形態の核酸リンカー２は、光反応性塩基誘導体２ｂを含むため、ｍＲＮＡ２３との複合体を安定化でき、効率よくタンパク質又はペプチド３３を合成できる。
【００３２】
［第２実施形態］
本実施形態の核酸リンカー１２の構造について、図２を用いて説明する。
図２において、図１の核酸リンカー２の模式図に示されたものと同じ構成要素には、同一の符号を付して説明を省略する。
【００３３】
本実施形態の核酸リンカー１２は、第１実施形態と同様に、５’末端にスペーサー部分５１ｃと、スクリーニングすべきｍＲＮＡ２３の少なくとも一部の配列とハイブリダイズし得るポリヌクレオチド部分５１ａと、前記タンパク質又はペプチド３３との連結部分２ａを３’末端に有するアーム部分５１ｂとを備えている。そして、本実施形態の核酸リンカー１２は、スペーサー部分５１ｃとポリヌクレオチド部分５１ａとアーム部分５１ｂとがこの順に一本鎖を形成してなる。更に、本実施形態の核酸リンカー１２は、ポリヌクレオチド部分５１ａと、アーム部分５１ｂの間から突出した３’末端を有する分岐鎖５１ｄを有する。分岐鎖５１ｄは、ｍＲＮＡ２３の一部の配列とハイブリダイズして、ｍＲＮＡ２３を逆転写するプライマー配列を有する。
分岐鎖５１ｄは、分岐鎖５１ｄの３’末端から数塩基５’側の位置で一本鎖ポリヌクレオチド部５１ａと結合し、Ｔ字型の構造を形成している。逆転写の際に分岐鎖５１ｄの３’末端がプライマーとして機能する。
本実施形態の核酸リンカー１２によれば、分岐鎖５１ｄを有するため、第１実施形態の効果に加えて、スクリーニングする目的のタンパク質をコードするｍＲＮＡを逆転写して生成されるｃＤＮＡが得られる。
【００３４】
≪核酸リンカー−逆転写プライマー複合体≫［第１実施形態］
本実施形態の核酸リンカー−逆転写プライマー複合体５２は、核酸リンカー２と、ｍＲＮＡの逆転写プライマー４４と、からなる複合体である。本実施形態の核酸リンカー−逆転写プライマー複合体５２（以下、複合体５２ともいう。）の構造について、図３を用いて説明する。図３において、図１の核酸リンカー２の模式図に示されたものと同じ構成要素には、同一の符号を付して説明を省略する。
【００３５】
逆転写プライマー４４は、核酸リンカー２のアーム部分５１ｂの少なくとも一部の配列とハイブリダイズし得る配列を有する５’末端領域部分４４ａを含む。
【００３６】
本実施形態の複合体５２を構成する核酸リンカー２は、核酸リンカーの第１実施形態として上述したものと同様の構成である。本実施形態の複合体５２において、核酸リンカー２のアーム部分５１ｂは、逆転写プライマーと相補対を形成するための核酸や核酸誘導体を有することが好ましい。
【００３７】
逆転写プライマー４４は、５’末端領域４４ａを介して、核酸リンカー２のアーム部分５１ｂと相補対を形成する。
複合体５２を安定化する観点から、逆転写プライマー４４は、５’末端領域部分４４ａが光反応性塩基誘導体４４ｂを含むことが好ましい。光反応性塩基誘導体４４ｂは、可逆的光連結性塩基を用いることが好ましい。本実施形態においては、短時間で効率のよい可逆的な架橋反応が可能である点から、光反応性塩基誘導体４４ｂは、ＣＮＶＫを用いている。
【００３８】
≪ｍＲＮＡ−核酸リンカー−逆転写プライマー複合体≫［第１実施形態］
本実施形態のｍＲＮＡ−核酸リンカー−逆転写プライマー複合体６２は、核酸リンカー２と、ｍＲＮＡ６３と、ｍＲＮＡ６３の逆転写プライマー５４と、からなる複合体である。本実施形態のｍＲＮＡ−核酸リンカー−逆転写プライマー複合体６２（以下、複合体６２ともいう。）の構造について、図４を用いて説明する。図４において、図１及び図３の核酸リンカー２の模式図に示されたものと同じ構成要素には、同一の符号を付して説明を省略する。
【００３９】
逆転写プライマー５４は、核酸リンカー２のアーム部分５１ｂの少なくとも一部の配列とハイブリダイズし得る配列を有する５’末端領域部分５４ａと、ｍＲＮＡ６３の少なくとも一部の配列とハイブリダイズし得る配列を有する３’末端領域部分５４ｂと、からなる。
【００４０】
逆転写プライマー５４は、５’末端領域５４ａを介して、核酸リンカー２のアーム部分５１ｂと相補対を形成する。また、逆転写プライマー５４は、３’末端領域５４ｂを介して、ｍＲＮＡ６３と相補対を形成する。
核酸リンカー２は、ポリヌクレオチド部分５１ａを介してｍＲＮＡ６３と相補対を形成し、アーム部分５１ｂを介して逆転写プライマー５４と相補対を形成している。
このように、本実施形態の複合体６２は、逆転写プライマー５４、核酸リンカー２、及び、ｍＲＮＡ６３の３本の核酸鎖が相互に二本鎖を形成することによって、３つの二本鎖核酸が１ヶ所で交差した構造を形成している。また、本実施形態の複合体６２は、逆転写プライマー５４、核酸リンカー２、及び、ｍＲＮＡ６３の３本の核酸鎖が相互に二本鎖を形成することによって、３つの二本鎖核酸が１つの共通領域を基点に互いに異なる方向に伸びた構造を形成している。
【００４１】
複合体６２を安定化する観点から、逆転写プライマー５４は、５’末端領域部分５４ａが光反応性塩基誘導体５４ｃを含むことが好ましい。光反応性塩基誘導体５４ｃは、可逆的光連結性塩基を用いることが好ましい。本実施形態においては、短時間で効率のよい可逆的な架橋反応が可能である点から、光反応性塩基誘導体５４ｃは、ＣＮＶＫを用いている。
【００４２】
本実施形態の複合体６２は、上述した核酸リンカーの第１実施形態と同様の効果を奏し、ペプチド又はタンパク質を迅速かつ簡単に効率よく合成できる。
また、本実施形態の複合体６２は、上述した核酸リンカーの第２実施形態と同様の効果を奏し、スクリーニングすべきタンパク質をコードするｍＲＮＡを逆転写してなるｃＤＮＡを得ることができる。
更に、本実施形態の複合体６２は、後述するようにスクリーニングすべきタンパク質又はペプチドをコードする核酸を回収する方法に好適に用いられる。
【００４３】
≪核酸リンカー固定化固相≫
本実施形態の核酸リンカー固定化固相は、上述した実施形態の核酸リンカーが、固相上に固定化されてなるものである。固相としては、基板又は担体が挙げられる。以下、好ましい実施形態について説明する。
【００４４】
［第１実施形態］
本実施形態の核酸リンカー固定化固相は、上述した実施形態の核酸リンカーが、基板上に固定化されてなるものである。
用いられる基板としては、ガラス基板、シリコン基板、プラスチック基板、金属基板等が挙げられる。上述したように本実施形態の核酸リンカーは、スペーサー部分を有している。該スペーサー部分が５’末端に固相との結合部位を有することが好ましく、その固相結合部位と、基板に結合させた固相結合部位認識部位との結合を利用して、核酸リンカーが基板上に固定化される。
このような固相結合部位／固相結合部位認識部位の組み合わせとしては、上述したように、金-チオール結合を利用した組合せが好ましい。かかる観点から、基板としては金基板が好ましい。
【００４５】
基板として金基板を用いる場合、先ず、該金基板をＳＰＭ洗浄（硫酸過酸化水素水洗浄）し、酸化作用を利用して、該金基板上の有機物を除去することが好ましい。次いで、該金基板上に５’末端に固相との結合部位であるチオールを有する核酸リンカーを滴下し、室温で２０〜２４時間密閉空間内で反応させた後、還元剤を用いてこの金基板上の金-チオール結合以外の反応をブロックすることが好ましい。
用いる還元剤としては、６−メルカプト−１−ヘキサノールが好ましい。かかるブロッキング処理により、核酸リンカーが効率よくスポットされた金基板が得られる。
【００４６】
［第２実施形態］
本実施形態の核酸リンカー固定化固相は、上述した実施形態の核酸リンカーが、ビーズ担体上に固定化されてなるものである。
用いられるビーズ担体としては、磁気ビーズ、金ナノ粒子、アガロースビーズ、プラスチックビーズ等が挙げられ、磁性を利用したハンドリングが容易であることから磁気ビーズであることが好ましい。核酸リンカー固定化ビーズを用いて、複数の反応槽が配設されたビーズ配置用基板中の反応槽に配列させることにより、核酸リンカー固定化アレイを構成することができる。核酸リンカーの固定化には、上述した、アビジン−ビオチン結合を利用する方法の他、核酸リンカーをアミノ基、ホルミル基、ＳＨ基、などの官能基で修飾し、ビーズ担体をアミノ基、ホルミル基、エポキシ基などを有するシランカップリング剤で表面処理したものを利用する方法が挙げられ、特に、アビジン−ビオチン結合を利用した方法が好ましい。
【００４７】
≪核酸リンカー−逆転写プライマー複合体固定化固相≫［第１実施形態］
本実施形態の核酸リンカー−逆転写プライマー複合体固定化固相は、上述した第１実施形態の核酸リンカー−逆転写プライマー−複合体が、固相上に固定化されてなるものである。固相としては、≪核酸リンカー固定化固相≫と同様に、基板又は担体が挙げられる。
【００４８】
≪タンパク質又はペプチド固定化固相≫［第１実施形態］
本実施形態のタンパク質又はペプチド固定化固相は、ｍＲＮＡ２３と、上述した第１実施形態の核酸リンカー２と、前記ｍＲＮＡ２３によりコードされるタンパク質又はペプチド３３との複合体が、固相上に固定化されてなる（図１参照）。固相としては、≪核酸リンカー固定化固相≫と同様に、基板又は担体が挙げられる。
【００４９】
本実施形態のタンパク質又はペプチド固定化固相は、核酸リンカー２が固相上に固定化されてなる上述した核酸リンカー固定化固相を用いて製造される。
即ち、本実施形態のタンパク質又はペプチド固定化固相の製造方法は、（ａ）本実施形態の核酸リンカー固定化固相に、ｍＲＮＡ２３を接触させ、ｍＲＮＡ２３を核酸リンカー２にハイブリダイズさせて固相上にｍＲＮＡ２３−核酸リンカー２複合体を形成させる工程と、（ｂ）前記工程（ａ）の後、固相上のｍＲＮＡ２３−核酸リンカー２複合体に第一の波長帯域の光を照射して、核酸リンカー２とｍＲＮＡ２３を架橋する工程と、（ｃ）前記工程（ｂ）の後、無細胞タンパク質翻訳系を用いてｍＲＮＡ２３からタンパク質又はペプチド３３を合成し、タンパク質又はペプチド３３のＣ末端と核酸リンカー２のタンパク質又はペプチドとの連結部分２ａとを結合させて、ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体を固相上に作製する工程と、を有する。
以下、各工程について説明する。
【００５０】
工程（ａ）において、ｍＲＮＡ２３を核酸リンカー２にハイブリダイズさせる。まず、工程（ａ）に用いられるｍＲＮＡの調製について説明する。
ｍＲＮＡ２３は、スクリーニングすべきタンパク質又はペプチドをコードするＤＮＡを調製し、ＲＮＡポリメラーゼにより転写させることにより得られる。ＲＮＡポリメラーゼとしては、例えばＴ７ＲＮＡポリメラーゼが挙げられる。
前記ＤＮＡとしては、任意のＤＮＡまたはＤＮＡライブラリーを利用することができる。例えば、サンプル組織から得たｃＤＮＡライブラリー、配列をランダムに合成したＤＮＡライブラリー、配列の一部を変異させたＤＮＡライブラリーなどを用いることができる。
作製されるタンパク質又はペプチドを精製しやすいように、ＰＣＲ等で予めＤＮＡの末端に該ポリヒスチジンやＦＬＡＧ等のタグをコードする塩基配列を付加しておくことが好ましい。また、転写効率を高めるために、ＰＣＲ等で予めＤＮＡの５’末端にＴ７プロモーター配列を付加しておくことが好ましく、翻訳効率を高めるために、ＰＣＲ等で予めＤＮＡの５’末端にオメガ配列を付加しておくことが好ましい。
【００５１】
次にｍＲＮＡ２３の３’末端領域と核酸リンカー２の５’末端領域とをハイブリダイズさせる。例えば、９０℃まで加熱し、ｍＲＮＡ２３を変性させた後、１時間かけて２５℃まで冷却することによりｍＲＮＡ２３が核酸リンカー２に確実にハイブリダイズされる。
【００５２】
次に工程（ｂ）において、前記工程（ａ）の後、固相上のｍＲＮＡ２３−核酸リンカー２複合体に第一の波長帯域の光を照射して、核酸リンカー２とｍＲＮＡ２３を架橋する。
第一の波長帯域は、３４０ｎｍ以上の光である。一例として、３４０〜３８０ｎｍの波長帯域の光を照射する。照射時間は、照射されることによる核酸の損傷を抑制する観点から短い時間がよく、５秒〜６０秒が好ましい。また、照射時間は、１０秒〜５０秒がより好ましく、２０秒〜４０秒が特に好ましい。例えば、３６５ｎｍの光を３０秒間照射することにより、ｍＲＮＡ２３と核酸リンカー２の全モル数中、６０％以上のｍＲＮＡ２３−核酸リンカー２複合体の形成率が得られる。
架橋反応を行う際に用いるバッファーとしては、特に限定されず、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー等が挙げられる。該バッファー中の塩としては、１００ｍＭ〜１ＭのＮａＣｌが好ましく、２００ｍＭ〜６００ｍＭのＮａＣｌがより好ましい。また、例えば、バッファー中の塩が２００ｍＭのＮａＣｌであることにより、８０％以上のｍＲＮＡ２３−核酸リンカー２複合体の形成率が得られる。
【００５３】
更に、架橋反応後、架橋されずに残ったｍＲＮＡを取り除く観点から、固相を洗浄することが好ましい。洗浄方法としては、特に限定されず、従来公知の方法が挙げられるが、例えば８Ｍの尿素含有バッファーを用いて、架橋されていないｍＲＮＡを変性させて取り除く方法が好ましい。
【００５４】
次に工程（ｃ）において、前記工程（ｂ）の後、無細胞タンパク質翻訳系を用いて前記ｍＲＮＡ２３からタンパク質又はペプチド３３を合成する。
【００５５】
無細胞タンパク質翻訳系とは、適当な細胞から抽出されたタンパク質合成能を有する成分からなるタンパク質翻訳系であり、この系にはリボゾーム、翻訳開始因子、翻訳伸長因子、解離因子、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素等、翻訳に必要な要素が含まれている。このようなタンパク質翻訳系として、大腸菌抽出液、ウサギ網状赤血球抽出液、小麦胚芽抽出液等が挙げられ、ｍＲＮＡの分解を抑制する観点から、本実施形態においては、ウサギ網状赤血球抽出液が好ましい。
更に、翻訳に必要な要素が独立に精製された因子のみからなる再構成型無細胞タンパク質合成系が挙げられる。再構成型無細胞タンパク質合成系は、従来の細胞抽出液を使用する場合よりもヌクレアーゼやプロテアーゼの混入を容易に防ぐことができるため、翻訳効率を高めることができる。
【００５６】
このような系を用いることにより、固相上にｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体が製造される。
【００５７】
［第２実施形態］
本実施形態のタンパク質又はペプチド固定化固相は、ｍＲＮＡ２３と、上述した核酸リンカー１２と、ｍＲＮＡ２３によりコードされるタンパク質又はペプチド３３との複合体が、固相上に固定化されてなる（図２参照）。固相としては、≪核酸リンカー固定化固相≫と同様に、基板又は担体が挙げられる。
本実施形態のタンパク質又はペプチド固定化固相は、核酸リンカー１２を用いる以外は、第１実施形態のタンパク質又はペプチド固定化固相と同様であるため、その説明を省略する。
【００５８】
［第３実施形態］
本実施形態のタンパク質又はペプチド固定化固相は、上述したｍＲＮＡ６３−核酸リンカー２−逆転写プライマー５４−複合体と、ｍＲＮＡ６３によりコードされるタンパク質又はペプチド７３との複合体であるｍＲＮＡ２３−核酸リンカー２−タンパク質又はペプチド７３−逆転写プライマー５４−複合体が、固相上に固定化されてなる（図４参照）。
固相としては、≪核酸リンカー固定化固相≫と同様に、基板又は担体が挙げられる。
複合体６２を安定化する観点から、逆転写プライマー５４は、５’末端領域部分５４ａが光反応性塩基誘導体５４ｃを含むことが好ましい。光反応性塩基誘導体５４ｃは、可逆的光連結性塩基を用いることが好ましい。本実施形態においては、短時間で効率のよい可逆的な架橋反応が可能である点から、光反応性塩基誘導体５４ｃは、ＣＮＶＫを用いている。本実施形態のタンパク質又はペプチド固定化固相の製造方法は、（ａ’）本実施形態の核酸リンカー固定化固相に、ｍＲＮＡ６３及び逆転写プライマー５４を接触させて逆転写プライマー５４、核酸リンカー２、及び、ｍＲＮＡ６３の３本の核酸鎖が相互に二本鎖を形成することにより、固相上にｍＲＮＡ６３−核酸リンカー２−逆転写プライマー５４複合体を形成させる工程と、（ｂ’） 前記工程（ａ’）の後、固相上のｍＲＮＡ６３−核酸リンカー２−逆転写プライマー５４複合体に第一の波長帯域の光を照射して、核酸リンカー２とｍＲＮＡ６３を架橋するとともに、核酸リンカー２と逆転写プライマー５４を架橋する工程と、（ｃ’）前記工程（ｂ’）の後、無細胞タンパク質翻訳系を用いてｍＲＮＡ６３からタンパク質又はペプチド７３を合成し、タンパク質又はペプチド７３のＣ末端と核酸リンカー２のタンパク質又はペプチドとの連結部分２ａとを結合させて、ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質又はペプチド−逆転写プライマー複合体を固相上に作製する工程と、を有する。
以下、各工程について説明する。
【００５９】
工程（ａ’）において、ｍＲＮＡ６３及び逆転写プライマー５４を核酸リンカー２にハイブリダイズさせる。核酸リンカーに各分子がハイブリダイズする順序は特に限定されず、ｍＲＮＡ６３−核酸リンカー２複合体が形成された後に、逆転写プライマー５４を系に添加して、ｍＲＮＡ６３−核酸リンカー２−逆転写プライマー５４複合体を形成させてもよく、核酸リンカー２−逆転写プライマー５４複合体が形成された後に、ｍＲＮＡ６３を系に添加して、ｍＲＮＡ６３−核酸リンカー２−逆転写プライマー５４複合体を形成させてもよい。また、予めｍＲＮＡ６３−逆転写プライマー５４複合体を形成させたものを系に添加してｍＲＮＡ６３−核酸リンカー２−逆転写プライマー５４複合体を形成させてもよい。
【００６０】
次に工程（ｂ’）において、前記工程（ａ’）の後、固相上のｍＲＮＡ６３−核酸リンカー２−逆転写プライマー５４に第一の波長帯域の光を照射して、核酸リンカー２とｍＲＮＡ６３を架橋するとともに、核酸リンカー２と逆転写プライマー５４を架橋する。第一の波長帯域の光としては、３４０ｎｍ以上の光である。一例として、３４０〜３８０ｎｍの波長帯域の光を照射する。照射時間は、照射されることによる核酸の損傷を抑制する観点から短い時間がよく、５秒〜６０秒が好ましい。また、照射時間は、１０秒〜５０秒がより好ましく、２０秒〜４０秒が特に好ましい。ｍＲＮＡ６３−核酸リンカー２−逆転写プライマー５４複合体中の二箇所を架橋することにより、３つの二本鎖核酸が１ヶ所で交差した構造がより安定化される。
【００６１】
次に工程（ｃ’）において、前記工程（ｂ’）の後、無細胞タンパク質翻訳系を用いて前記ｍＲＮＡ６３からタンパク質又はペプチド３３を合成する。工程（ｃ’）において、作成される複合体がｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質又はペプチド−逆転写プライマー複合体以外は、前記工程（ｃ）と同様であるため、説明を省略する。
【００６２】
≪マイクロアレイ≫
本実施形態のマイクロアレイは、複数の核酸リンカー、複数の核酸リンカー−逆転写プライマー複合体、又は複数のｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体が固定化されたものである。核酸リンカー、核酸リンカー−逆転写プライマー複合体、及びｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体については、各実施形態において上述しているため、その説明を省略する。
【００６３】
≪核酸回収方法１≫
本実施形態の核酸回収方法は、本実施形態の核酸リンカーが固定化された固相を用いて核酸を回収する核酸回収方法であって、前記ｍＲＮＡと前記核酸リンカーとを光反応性塩基誘導体によって光架橋する工程Ａ１と、前記ｍＲＮＡと前記核酸リンカーとの前記光架橋を光照射によって解離させる工程Ｂ１と、を含む。
前記工程Ａ１は第一の波長帯域の光を照射することによって、核酸リンカーとｍＲＮＡを架橋する工程を有することが好ましい。
また、前記工程Ｂ１は第二の波長帯域の光を照射して核酸リンカーからｍＲＮＡを解離する工程を有することが好ましい。
以下、好ましい実施形態について説明する。
【００６４】
［第１実施形態］
本実施形態の核酸回収方法は、
第１実施形態又は第２実施形態の核酸リンカーが固定化された固相上の全てのスポットに第一の波長帯域の光を照射して、全てのスポット中の核酸リンカーとｍＲＮＡを架橋する工程Ａ１ａと、
固相上の特定のスポットに第二の波長帯域帯の光を照射して、特定のスポット中の核酸リンカーからｍＲＮＡを解離させる工程Ｂ１ａと、を有する（図５参照。）。
【００６５】
本実施形態の核酸回収方法は、核酸リンカーが含有する光反応性塩基誘導体を利用したものである。上述したように、該光反応性塩基誘導体に照射する光の波長帯域により、架橋反応の制御が可能となる。可逆的光反応を利用して核酸の架橋と解離を行うため、光反応性塩基誘導体として可逆的光連結性塩基を用いることが好ましい。特に、厳密かつ高効率の制御が可能となることから、光反応性塩基誘導体としてはＣＮＶＫが好ましい。
【００６６】
工程Ａ１ａは、≪タンパク質又はペプチド固定化固相≫の第１実施形態における工程（ｂ）に相当する。第一の波長帯域は３４０ｎｍ以上の光であり、一例として、３４０〜３８０ｎｍの光が挙げられる。照射時間は、照射されることによる核酸の損傷を抑制する観点から短い時間がよく、５秒〜６０秒が好ましい。また、照射時間は、１０秒〜５０秒がより好ましく、２０秒〜４０秒が特に好ましい。該工程Ａ１ａにより、全てのスポット中の核酸リンカーとｍＲＮＡが架橋される。架橋反応により、例えば、固相を尿素含有バッファーを用いて洗浄したとしても、核酸リンカー−ｍＲＮＡ複合体の形成は維持される。
【００６７】
工程Ｂ１ａにおいて、工程Ａ１ａにおいて形成された架橋を第一の波長帯域とは異なる第二の波長帯域の光照射により解除する。第二の波長帯域は３５０ｎｍ未満の光であり、一例として、２８０〜３４５ｎｍの光が挙げられる。また、照射時間としては、照射されることによる核酸の損傷を抑制する観点から短い方がよく、１秒〜３００秒が好ましい。
また、工程Ｂ１ａにおいて、第二の波長帯域の光を固相上の特定のスポットに選択的に照射する。光を選択的に照射する方法としては、マスクを用いる方法等、アレイ作製において用いられる方法が適用される。架橋を解除されたｍＲＮＡは、熱処理や尿素含有バッファーによる溶出等、定法により核酸リンカーから解離する。本実施形態の核酸回収方法によれば、第二の波長帯域の光照射によって解離したｍＲＮＡを選択的に回収することができる。
【００６８】
［第２実施形態］
本実施形態の核酸回収方法は、
第１実施形態又は第２実施形態の核酸リンカーが固定化された固相上の特定のスポット以外のスポットに第一の波長帯域（３４０ｎｍ以上。一例として、３４０〜３８０ｎｍ）の光を照射して、特定のスポット以外のスポット中の核酸リンカーとｍＲＮＡを架橋する工程Ａ１ｂと、
固相上の特定のスポット中の核酸リンカーからｍＲＮＡを解離させる工程Ｂ１ｂと、を有する（図６参照。）。
【００６９】
本実施形態においては、工程Ａ１ｂにおいて、第一の波長帯域の光を固相上の特定のスポット以外のスポットに選択的に照射して、核酸リンカーとｍＲＮＡを架橋する。次いで、工程Ｂ１ｂにおいて、第一の波長帯域の光が照射されていないスポット中の核酸リンカーからｍＲＮＡを解離させる。解離方法は、第１実施形態と同様である。本実施形態の核酸回収方法によれば、第一の波長帯域の光照射がされなかったｍＲＮＡを選択的に回収することができる。
【００７０】
≪核酸回収方法２≫
本実施形態の核酸回収方法は、第１実施形態のｍＲＮＡ−核酸リンカー−逆転写プライマー複合体が固定化された固相を用いて核酸を回収する核酸回収方法であって、
前記ｍＲＮＡの逆転写プライマーと前記核酸リンカーとを光反応性塩基誘導体によって光架橋する工程Ａ２と、
前記逆転写プライマーと前記核酸リンカーとの前記光架橋を光照射によって解離させる工程Ｂ２と、を含む。
【００７１】
前記工程Ａ２は前記ｍＲＮＡ−核酸リンカー−逆転写プライマー複合体を逆転写反応に供して前記逆転写プライマーの３’末端から前記ｍＲＮＡの相補鎖が伸長してなるｃＤＮＡを合成する工程を含むことが好ましい。逆転写に用いられる逆転写酵素としては、従来公知のものが用いられ、例えば、Ｍｏｌｏｎｅｙ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ由来の逆転写酵素等が挙げられる。  
逆転写されたｃＤＮＡはｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質又はペプチド複合体中のｍＲＮＡとハイブリッドを形成する。ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質又はペプチド複合体中のｍＲＮＡは、アプタマーとして、他の分子と非特異的に相互作用する可能性が高いため、このようなｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質又はペプチド複合体を作製しておくことが好ましい。  
また、タンパク質又はペプチドをコードするｃＤＮＡを解析するためには、この複合体の作製が必須である。
【００７２】
ｃＤＮＡは、核酸リンカーにハイブリダイズした逆転写プライマーの３’末端から相補鎖が伸長して合成されたものである。従って、本実施形態においては、ｃＤＮＡが核酸リンカーと一体となっておらず別個に存在する。合成されたｃＤＮＡは、核酸リンカーから分離可能であるため、本実施形態の核酸回収方法は、ｃＤＮＡの回収方法に適している。
以下、核酸回収方法の好ましい実施形態について説明する。
【００７３】
［第１実施形態］ 本実施形態の核酸回収方法は、
前記工程Ａ２は固相上の全てのスポットに光照射し、全てのスポット中の核酸リンカーとｍＲＮＡを架橋する工程を有し、 前記工程Ｂ２は固相上の特定のスポット中の核酸リンカーから逆転写プライマーを解離させる工程を有する。
【００７４】
図７に示すように、具体的には、本実施形態の核酸回収方法は、
ｍＲＮＡ−核酸リンカー−逆転写プライマー複合体固定化固相上の全てのスポットに第一の波長帯域の光を照射して、核酸リンカーとｍＲＮＡを架橋し、核酸リンカーと逆転写プライマーを架橋する工程Ａ３と、
前記ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質又はペプチド−逆転写プライマー複合体を逆転写反応に供して、前記逆転写プライマーの３’末端から相補鎖が伸長してなるｃＤＮＡを合成して、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質又はペプチド複合体を製造する工程Ｂ３と、
前記ｍＲＮＡを前記ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質又はペプチド複合体から解離させ、ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質又はペプチド複合体を製造する工程Ｃ３と、
タンパク質又はペプチド固定化固相上の特定のスポットに第二の波長帯域の光を照射して、特定のスポット中のｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質又はペプチド複合体からｃＤＮＡを解離させる工程Ｄ３と、を有する。
【００７５】
工程Ａ３において、第一の波長帯域の光は、３４０ｎｍ以上の光であり、一例として３４０〜３８０ｎｍの光が挙げられる。また、照射時間としては、照射されることによる核酸の損傷を抑制する観点から短い方がよく、５秒〜６０秒が好ましく、１０秒〜５０秒がより好ましく、２０秒〜４０秒が特に好ましい。該工程Ａ３により、全てのスポット中の核酸リンカーとｍＲＮＡが架橋される。
【００７６】
工程Ｂ３は、上述した逆転写反応により、ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質又はペプチド−逆転写プライマー複合体からｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質又はペプチド複合体を製造する工程である。
工程Ａ３と工程Ｂ３の順序は特に限定されず、架橋反応→逆転写反応の順でも、逆転写反応→架橋反応の順でもよい。
【００７７】
工程Ｃ３において、ｍＲＮＡを前記ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質又はペプチド複合体から解離させる。ｃＤＮＡを回収するためには、先ず、相補鎖を形成しているｍＲＮＡを解離させる必要があるからである。解離方法としては、特に限定されず、熱や変性剤による解離方法や、ＲＮＡ分解酵素やアルカリ溶液を用いたｍＲＮＡの分解による解離方法が挙げられる。
【００７８】
工程Ｄ３において、工程Ａ３において形成された架橋を第一の波長帯域とは異なる第二の波長帯域の光照射により解除する。第二の波長帯域の光は、３５０ｎｍ未満の光であり、一例として２８０〜３４５ｎｍの光が挙げられる。また、照射時間としては、照射されることによる核酸の損傷を抑制する観点から短い方がよく、１秒〜３００秒が好ましい。
また、工程Ｄ３において、第二の波長帯域の光を固相上の特定のスポットに選択的に照射する。光を選択的に照射する方法としては、マスクを用いる方法等、アレイ作製において用いられる方法が適用される。架橋を解除されたｃＤＮＡは、熱処理や尿素含有バッファーによる溶出等、定法により核酸リンカーから解離する。本実施形態の核酸回収方法によれば、第二の波長帯域の光照射によって解離したｃＤＮＡを選択的に回収することができる。
【００７９】
［第２実施形態］ 本実施形態の核酸回収方法は、
前記工程Ａ２は固相上の特定のスポット以外のスポットに光照射し、特定のスポット以外のスポット中の核酸リンカーと逆転写プライマーを架橋する工程を有し、
前記工程Ｂ２は固相上の特定のスポット中の核酸リンカーから逆転写プライマーを解離させる工程を有する。
【００８０】
図８に示すように、具体的には、本実施形態の核酸回収方法は、
ｍＲＮＡ−核酸リンカー−逆転写プライマー複合体を逆転写反応に供して、前記逆転写プライマーの３’末端から相補鎖が伸長してなるｃＤＮＡを合成して、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー複合体を製造する工程Ａ５と、
ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー複合体中の前記ｍＲＮＡを前記ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー複合体から解離させ、ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質又はペプチド複合体を製造する工程Ｂ５と、
固相上の特定のスポット以外のスポットに第一の波長帯域の光を照射して、特定のスポット以外のスポット中の核酸リンカーとｃＤＮＡを架橋する工程Ｃ５と、
特定のスポット中のｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質又はペプチド複合体からｃＤＮＡを解離させる工程Ｄ５と、を有する。
【００８１】
工程Ａ５〜Ｃ５は、第１実施形態の各工程と同じであるため記載を省略する。工程Ｂ５と工程Ｃ５の順序は特に限定されず、ＲＮＡ解離反応→架橋反応の順でも、架橋反応→ＲＮＡ解離反応の順でもよい。
本実施形態においては、工程Ｃ５において、第一の波長帯域の光を固相上の特定のスポット以外のスポットに選択的に照射して、核酸リンカーとｃＤＮＡを架橋する。次いで、工程Ｄ５において、第一の波長帯域の光が照射されていないスポット中の核酸リンカーからｃＤＮＡを解離させる。解離方法は、第１実施形態と同様である。本実施形態の核酸回収方法によれば、第一の波長帯域の光照射がされなかったｍＲＮＡを選択的に回収することができる。
【００８２】
≪機能性タンパク質の同定方法≫［第１実施形態］
図９に示すように、本実施形態の機能性タンパク質の同定方法は、
本実施形態の核酸リンカー固定化固相に、ｍＲＮＡを接触させ、前記ｍＲＮＡを前記核酸リンカーにハイブリダイズさせて固相上にｍＲＮＡ−核酸リンカー複合体を形成させる工程Ａ６と、
無細胞タンパク質翻訳系を用いて前記ｍＲＮＡからタンパク質又はペプチドを合成し、前記タンパク質又はペプチドのＣ末端を、前記タンパク質又はペプチドとの連結部分に結合させてｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質又はペプチド複合体を形成させる工程Ｂ６と、
更に、前記核酸リンカーのアーム部分の少なくとも一部の配列とハイブリダイズし得る配列を有し、３−Ｃｙａｎｏｖｉｎｙｌｃａｒｂａｚｏｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅを含む５’末端領域部分と、前記ｍＲＮＡの少なくとも一部の配列とハイブリダイズし得る配列を有する３’末端領域部分と、からなる逆転写プライマーを前記固相に接触させてｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質又はペプチド−逆転写プライマー複合体を形成させる工程Ｃ６と、
前記固相上の全てのスポットに第一の波長帯域の光を照射して、核酸リンカーとｍＲＮＡを架橋するとともに、核酸リンカーと逆転写プライマーを架橋する工程Ｄ６と、
前記ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質又はペプチド−逆転写プライマー複合体を逆転写反応に供して、前記逆転写プライマーの３’末端から相補鎖を伸長してなるｃＤＮＡを合成して、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質又はペプチド複合体を製造する工程Ｅ６と、
前記ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質又はペプチド複合体が固定された固相を機能性スクリーニングに供し、該固相上のスポットを特定する工程Ｆ６と、
機能性スクリーニングにより特定されたスポットに第二の波長帯域の光を照射して、特定されたスポット中のｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質又はペプチド複合体からｃＤＮＡを解離させる工程Ｇ６と、
解離したｃＤＮＡを回収してその塩基配列を解析する工程Ｈ６と、を有する。
以下、本実施形態の機能性タンパク質の同定方法について詳細に説明するが、上述した工程と同様の工程については、その記載を省略する。
【００８３】
工程Ｆ６における機能性スクリーニングは、固相上の多数のスポットから所望のタンパク質を有するスポットを特定するためのものであれば特に限定されない。
例えば、スクリーニング対象のタンパク質が酵素である場合、機能性スクリーニングとしては、酵素活性測定系が挙げられる。具体的な手法としては、固相上のスポット位置に対応するような微小凹部を有するマイクロ凹版を用意し、マイクロ凹版の微小凹部内にタンパク質の活性を測定するために必要な溶液（酵素活性測定系）を予め充填し、固相とマイクロ凹版を重ね合わせて酵素反応を生じさせることで、固相上のタンパク質の活性を測定する手法が挙げられる。
【００８４】
また、酵素活性の測定法としては、従来公知の方法が用いられ、例えば、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ法）、エバネッセント場分子イメージング法、蛍光イメージングアナライズ法、固相酵素免疫検定法（Ｅｎｚｙｍｅ Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ））、蛍光偏光解消法、蛍光相関分光法、表面プラズモン共鳴法等が挙げられる。
【００８５】
本実施形態の機能性タンパク質の同定方法は、工程Ｆ６と工程Ｇ６の間に、ｍＲＮＡを前記ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質又はペプチド複合体から解離させる工程Ｉ６を有していてもよい。ｃＤＮＡを回収するためには、先ず、相補鎖を形成しているｍＲＮＡを解離させる必要があるからである。解離方法としては、特に限定されず、熱や変性剤による解離方法や、ＲＮＡ分解酵素やアルカリ溶液を用いたｍＲＮＡの分解による解離方法が挙げられる。
【００８６】
工程Ｇ６において、工程Ｄ６において形成された架橋を第一の波長帯域とは異なる第二の波長帯域の光照射により解除する。本実施形態の機能性タンパク質の同定方法によれば、第二の波長帯域の光照射によって解離したｃＤＮＡを選択的に回収することができる。
工程Ｈ６において、解離したｃＤＮＡを回収する。回収方法としては特に限定されず、熱処理や尿素含有バッファーによる溶出等、従来公知の方法が挙げられる。次いで、回収されたｃＤＮＡの塩基配列を解析することにより、所望の機能を有するタンパク質又はペプチドをコードするＤＮＡを同定することができる。
【００８７】
［第２実施形態］
図１０に示すように、本実施形態の機能性タンパク質の同定方法は、
本実施形態の核酸リンカー固定化固相に、ｍＲＮＡを接触させ、前記ｍＲＮＡを前記核酸リンカーにハイブリダイズさせて固相上にｍＲＮＡ−核酸リンカー複合体を形成させる工程Ａ７と、
無細胞タンパク質翻訳系を用いて前記ｍＲＮＡからタンパク質又はペプチドを合成し、前記タンパク質又はペプチドのＣ末端を、前記タンパク質又はペプチドとの連結部分に結合させてｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質又はペプチド複合体を形成させる工程Ｂ７と、
更に、前記核酸リンカーのアーム部分の少なくとも一部の配列とハイブリダイズし得る配列を有し、３−Ｃｙａｎｏｖｉｎｙｌｃａｒｂａｚｏｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅを含む５’末端領域部分と、前記ｍＲＮＡの少なくとも一部の配列とハイブリダイズし得る配列を有する３’末端領域部分と、からなる逆転写プライマーを前記固相に接触させてｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質又はペプチド−逆転写プライマー複合体を形成させる工程Ｃ７と、
前記ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質又はペプチド−逆転写プライマー複合体を逆転写反応に供して、前記逆転写プライマーの３’末端から相補鎖が伸長してなるｃＤＮＡを合成して、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質又はペプチド複合体を製造する工程Ｄ７と、
前記ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質又はペプチド複合体が固定された固相を機能性スクリーニングに供し、該固相上のスポットを特定する工程Ｅ７と、
機能性スクリーニングにより特定されたスポット以外のスポットに第一の波長帯域の光を照射して、核酸リンカーとｃＤＮＡを架橋する工程Ｆ７と、
特定されたスポット中のｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質又はペプチド複合体からｃＤＮＡを解離させる工程Ｇ７と、
解離したｃＤＮＡを回収してその塩基配列を解析する工程Ｈ７と、を有する
以下、本実施形態の機能性タンパク質の同定方法について詳細に説明するが、上述した工程と同様の工程については、その記載を省略する。
【００８８】
本実施形態の機能性タンパク質の同定方法は、工程Ｅ７と工程Ｆ７の間に、ｍＲＮＡをｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質又はペプチド複合体から解離させる工程Ｉ７を有していてもよい。ｃＤＮＡを回収するためには、先ず、相補鎖を形成しているｍＲＮＡを解離させる必要があるからである。解離方法としては、特に限定されず、熱や変性剤による解離方法や、ＲＮＡ分解酵素やアルカリ溶液を用いたｍＲＮＡの分解による解離方法が挙げられる。
【００８９】
本実施形態においては、工程Ｆ７において、第一の波長帯域の光を固相上の特定のスポット以外のスポットに選択的に照射して、核酸リンカーとｃＤＮＡを架橋する。次いで、工程Ｇ７において、第一の波長帯域の光が照射されていないスポット中の核酸リンカーからｃＤＮＡを解離させる。解離方法は、第１実施形態と同様である。本実施形態の機能性タンパク質の同定方法によれば、第一の波長帯域の光照射がされなかったｃＤＮＡを選択的に回収し、回収されたｃＤＮＡの塩基配列を解析することにより、所望の機能を有するタンパク質又はペプチドをコードするＤＮＡを同定することができる。
【００９０】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００９１】
［光架橋核酸リンカーの合成］
以下に示す材料をつくばオリゴサービス株式会社に委託し、自動核酸合成装置を使用して、ホスホロアミダイト法に従って合成した。
（１）光架橋核酸リンカー１［配列：５’ − （ＨＯ−Ｃ６Ｈ１２−ＳＳ−Ｃ６Ｈ１２）−Ｘ１−（ＣＮＶＫ）−Ｘ２−（ｓｐｃ１８）−（ｓｐｃ１８）−（ｓｐｃ１８）−ＣＣ−（Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）−３’］
Ｘ１は以下の配列を表す。
ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＣＡ（配列番号１：５４ｍｅｒ）
Ｘ２は以下の配列を表す。
ＣＣＧＴＧＴＡＧＴＡＧＴＣＧＣ（配列番号２：１５ｍｅｒ）【００９２】
（２）光架橋核酸リンカー２［配列：５’ − （ＨＯ−Ｃ６Ｈ１２−ＳＳ−Ｃ６Ｈ１２）−Ｘ３−（ＣＮＶＫ）−Ｘ４−（ｓｐｃ１８）−（ｓｐｃ１８）−（ｓｐｃ１８）−ＣＣ−（Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）−３’］
Ｘ３は以下の配列を表す。
ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＡＧＡＴＣＡＣＴＣＧＧＴＣＧＡ（配列番号３：６７ｍｅｒ）
Ｘ４は以下の配列を表す。
ＧＴＡＧＡＣＣＧＧＴＣＴＣＧ（配列番号４：１４ｍｅｒ）【００９３】
（３）逆転写プライマー１［配列：５’ −Ｘ５−[ＣＮＶＫ]−Ｘ６−３’］
Ｘ５は以下の配列を表す。
ＣＧＡＧＡ（配列番号５：５ｍｅｒ）
Ｘ６は以下の配列を表す。
ＣＧＧＴＧＡＣＧＡＴＧＣＣＴ（配列番号６：１４ｍｅｒ）【００９４】
ここで、（ＨＯ−Ｃ６Ｈ１２−ＳＳ−Ｃ６Ｈ１２）は、（１−Ｏ−Ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌ−ｈｅｘｙｌ−ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ，１’−[（２−ｃｙａｎｏｅｔｈｙｌ)−(Ｎ，Ｎ−ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌ）]−ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ)を用いて合成したものを表す（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製、商品名：Ｔｈｉｏｌ−Ｍｏｄｉｆｉｅｒ  Ｃ６  Ｓ−Ｓ）。
（ＣＮＶＫ）は、（３−Ｃｙａｎｏｖｉｎｙｌｃａｒｂａｚｏｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ，１’−[（２−ｃｙａｎｏｅｔｈｙｌ)−(Ｎ，Ｎ−ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌ）]−ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ)を用いて合成したものを表す。
（ｓｐｃ１８）は、１８−Ｏ−Ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌｈｅｘａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ，１−[(２−ｃｙａｎｏｅｔｈｙｌ)−(Ｎ，Ｎ−ｄｉｉｓｏｐｒｏｐyｌ)]−ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅを用いて合成したものを表す（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製、商品名：Ｓｐａｃｅｒ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ  １８）。
（Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）は、５'-Ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌ−Ｎ-ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｙｌ−ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ，２'-ｓｕｃｃｉｎｏｙｌ−ｌｏｎｇ  ｃｈａｉｎ  ａｌｋｙｌａｍｉｎｏ−ＣＰＧ用いて合成したものを表す（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製、商品名：Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ−ＣＰＧ）。【００９５】
［ｍＲＮＡの合成］
５’上流からＴ７プロモーター配列と翻訳促進配列、Ｏｃｔ１ ＰＯＵ特異的ドメインをコードする配列（以下、ＰＤＯとよぶ）、スペーサー領域及び光架橋リンカー１との相補鎖領域を有する２本鎖ＤＮＡ配列（ＤＮＡ１、配列番号７：３８９ｂｐ）、もしくは光架橋リンカー２、３との相補鎖領域を有する２本鎖ＤＮＡ配列（ＤＮＡ２、配列番号８：４０１ｂｐ）をＰＣＲにより増幅した。
ＰＣＲにより得られたＤＮＡからＴ７  ＲｉｂｏＭＡＸ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｌａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  ＲＮＡ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社製）を用いて、添付のプロトコールに従って５−３０ｐｍｏｌ／μｌのｍＲＮＡを合成した（ＲＮＡ１、配列番号９：３５９ｍｅｒ、ＲＮＡ２、配列番号１０：３７１ｍｅｒ）。なお、ｍＲＮＡ合成反応中にＣｙ３−ＵＴＰもしくはＣｙ５−ＵＴＰ（どちらもＧＥヘルスケア社製）を添加することで、Ｃｙ３もしくはＣｙ５修飾したｍＲＮＡを作製した。【００９６】
［液相における光架橋リンカーとｍＲＮＡの光架橋］（１）光架橋リンカー１の還元
１００μＭの光架橋リンカー１  ２μｌを１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ  ９．０）３８μｌと混合し、１ＭＤＴＴを１０μｌ加え、室温で１時間反応させ、前記光架橋リンカー１の５’側にあるジスルフィド基をチオール基に還元した。その後、２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ  ７．２）で平衡化したマイクロバイオスピン６カラム（バイオラッド社製）を用いて、過剰なＤＴＴを除去した。【００９７】
（２）前記還元済み光架橋リンカー１のテトラメチルローダミン修飾 前記還元済み光架橋リンカー１  ６０μｌを、ＤＭＳＯに溶解した１ｍＭのテトラメチルローダミン−５−マレイミド（和光純薬社製）５μｌと混合し、よく撹拌しながら室温で６０分間反応させた。その後、エタノール沈殿を行って、反応物を沈殿させ、未反応のテトラメチルローダミン−５−マレイミドを除去した。沈殿物を２００μｌの７０％エタノールにて洗浄した後、２０μｌのヌクレアーゼフリー水に溶解した。【００９８】
（３）前記テトラローダミン修飾した光架橋リンカー１とｍＲＮＡの光架橋 前記テトラローダミン修飾光架橋リンカー１  ５ｐｍｏｌとｍＲＮＡ１５ｐｍｏｌとを、１０μｌの５０ｍＭＴｒｉs−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．５）／２Ｍ  ＮａＣｌ中で混合し、９０℃で３０秒熱変性させた後、１３分間かけて１０℃まで徐冷することで、ハイブリダイズさせた後、３６５ｎｍの紫外線（２１０ｍＷ／ｃｍ２）を３０秒間照射した。
紫外線照射サンプルおよび照射前サンプルを８Ｍ尿素５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、蛍光イメージャー（Ｔｙｐｈｏｏｎ９４１０、ＧＥヘルスケア社製）でテトラメチルローダミンの蛍光を観察（励起波長：５３３ｎｍ、蛍光フィルター：５８０ＢＰ３０）した後、ＳｙｂｒＧｏｌｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で染色し、蛍光イメージャーで観察した（励起波長：４８８ｎｍ、蛍光フィルター：５２０ＢＰ４０）。
結果を図１１に示す。レーン１は  １００ｂｐ  ＤＮＡ  ｌａｄｄｅｒ（プロメガ社製）、レーン２は紫外線照射前のサンプル、レーン３は紫外線照射後のサンプルである。左図はＳｙｂｒＧｏｌｄ染色の蛍光、右図はテトラメチルローダミン蛍光を観察したものである。レーン２、３より、紫外線照射によってｍＲＮＡにテトラメチルローダミン修飾光架橋リンカー１が光架橋して分子量が増加していることが確認された。【００９９】
[ウサギ網状赤血球由来無細胞翻訳系を用いたｍＲＮＡとタンパク質の連結] 上記のように合成した、光架橋核酸リンカー１とｍＲＮＡの光架橋物（光架橋物１）を用いてウサギ網状赤血球由来の無細胞翻訳系を用いて翻訳反応を行った。１ｐｍｏｌの光架橋物１と０．６μｌの２０ｘ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｍｉｘ（ライフテクノロジーズ社製）と、８．５μｌのウサギ網状赤血球の細胞溶解液であるＲａｂｂｉｔ  Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓａｔｅ（ライフテクノロジーズ社製）、および０．２５μｌのＦｌｕｏｒｏｔｅｃｔ（プロメガ社製）に、ヌクレアーゼフリー水を加えて混合し、１２．５μｌの混合液とした。
この混合液を３０℃にて２０分間反応させた後、５μｌの３Ｍ  塩化カリウム溶液と１．５μｌの１Ｍ  塩化マグネシウム溶液を加え、混合した。この混合液を更に３７℃で３０分間反応させ、ＰＤＯ遺伝子のポリペプチド鎖を合成し、光架橋物１−タンパク質複合体を形成させた。反応産物を８Ｍ尿素含有ＳＤＳ−６％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて分離し、光架橋物１のテトラメチルローダミンの蛍光シグナルと、タンパク質中に取り込まれたＦｌｕｏｒｏｔｅｃｔの蛍光シグナルを蛍光イメージャーを用いて検出した。【０１００】
[小麦胚芽由来無細胞翻訳系を用いたｍＲＮＡとタンパク質の連結] 前述のように合成した、光架橋物１を用いて小麦胚芽由来の無細胞翻訳系を用いて翻訳反応を行った。１ｐｍｏｌの光架橋物１、０．５μｌのＡｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（プロメガ社製）、６．２５μｌの小麦胚芽抽出液であるＷｈｅａｔ  Ｇｅｒｍ  Ｅｘｔｒａｃｔ（プロメガ社製）、０．３μｌのＦｌｕｏｒｏｔｅｃｔ（プロメガ社製）、１．０μｌの酢酸カリウム、０．２μｌのＳＵＰＥＲａｓｅ・Ｉｎ（２０Ｕ／μｌ，ライフテクノロジーズ社製）および０．２μｌのＲＮａｓｉｎ  Ｐｌｕｓ  ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（プロメガ社製）にヌクレアーゼフリー水を加えて混合し、１３μｌの混合液とした。
この混合液を２５℃にて２０分間反応させ、ＰＤＯ遺伝子のポリペプチド鎖を合成し、光架橋物１−タンパク質複合体を形成させた。反応産物を８Ｍ尿素含有ＳＤＳ−６％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて分離し、光架橋物１のテトラメチルローダミンの蛍光シグナルと、タンパク質中に取り込まれたＦｌｕｏｒｏｔｅｃｔの蛍光シグナルを蛍光イメージャーを用いて検出した。【０１０１】
[液相におけるｍＲＮＡとタンパク質の連結実験結果] 上述したウサギ網状赤血球由来無細胞翻訳系および小麦胚芽由来無細胞翻訳系を用いた、ｍＲＮＡとタンパク質の連結実験の結果を図１２に示す。レーン１はｍＲＮＡと光架橋リンカー１の光架橋物（光架橋物１）、レーン２はウサギ網状赤血球由来無細胞翻訳系を用いた翻訳産物、レーン３は小麦胚芽由来無細胞翻訳系を用いた翻訳産物、レーン４は光架橋物１およびＦｌｕｏｒｏｔｅｃｔを未添加のウサギ網状赤血球由来無細胞翻訳系反応物、レーン５は、光架橋物１およびＦｌｕｏｒｏｔｅｃｔを未添加の小麦胚芽由来無細胞翻訳系反応物である。左図は光架橋物１のテトラメチルローダミンの蛍光を検出したもの、右図はタンパク質に取り込まれたＦｌｕｏｒｏｔｅｃｔの蛍光を検出したもの（励起波長：４８８ｎｍ、蛍光フィルター：５２０ＢＰ４０）である。
この泳動結果より、ウサギ網状赤血球由来無細胞翻訳系を用いた反応では、光架橋物１より高分子量側に、テトラメチルローダミンおよびＦｌｕｏｒｏｔｅｃｔの蛍光シグナルを示す光架橋物１−タンパク質複合体のバンドを確認できた。また、小麦胚芽由来無細胞翻訳系を用いた反応では、反応過程においてｍＲＮＡの分解が確認され、複合体の形成が僅かであった。この結果から、光架橋核酸リンカー１を用いたｍＲＮＡ−タンパク質複合体形成反応ではウサギ網状赤血球由来の無細胞翻訳系を用いることが好ましいことが確認された。【０１０２】
[金薄膜基板上への光架橋リンカー１の固定] 金薄膜基板を酸溶液（Ｈ２ＳＯ４：Ｈ２Ｏ２＝１：１)に浸し、２００℃で１５分間洗浄した後、超純水で１０分間リンスし、窒素ガスで乾燥した。
その後、１×ＰＢＳに溶解した１μＭの還元済み光架橋リンカー１を金薄膜基板上に滴下し、室温で２４時間、密閉反応溶液中で反応させた。
その後、金薄膜基板を１０ｍｌの１×ＰＢＳに溶解した１ｍＭの６−ｍｅｒｃａｐｔｏ−１−ｈｅｘａｎｏｌ溶液に浸漬し、室温で１時間反応させた後、１×ＰＢＳ/０．２％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０溶液中で３０分間超音波洗浄し、１０００ｒｐｍで３秒間、３０００ｒｐｍで２０秒間の条件でスピンドライヤーを用いて乾燥した。【０１０３】
[金薄膜基板上でのｍＲＮＡの光架橋] 光架橋リンカー１を固定した金薄膜基板上全面に０．０２％のＳＤＳを含む３×ＳＳＣ  ５０μｌに溶解した１μＭのＣｙ３修飾ｍＲＮＡ１を滴下後、３０℃で２時間、密閉容器中で反応させることで、光架橋リンカー１にｍＲＮＡ１をハイブリダイズさせた後、３×ＳＳＣ溶液で５分間、０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ溶液で５分間、および０．１×ＳＳＣ溶液で５分間洗浄することで、未反応のｍＲＮＡを洗い流した。
その後、金薄膜基板上に３６５ｎｍの紫外線（２１０ｍＷ／ｃｍ２）を１、５、１０、２０、３０、４５、６０、９０秒間スポット照射した。
その後、８Ｍ尿素溶液で洗浄することにより光架橋リンカー１とｍＲＮＡ１のハイブリダイズを剥がし、光架橋していないｍＲＮＡを洗い流し、金薄膜基板上に残留している光架橋されたＣｙ３修飾ｍＲＮＡを蛍光イメージャーで観察した（励起波長：５３２ｎｍ、蛍光フィルター：５８０ＢＰ３０）。
結果を図１３に示す。左から、紫外線照射スポット・照射時間対応図、紫外線照射前、紫外線照射後、尿素洗浄後のＣｙ３蛍光像である。この結果より、紫外線を照射したスポットのみＣｙ３修飾ｍＲＮＡが残留し、光架橋が行われていることを確認した。また、残留Ｃｙ３修飾ｍＲＮＡ量を定量したところ、照射時間に応じて光架橋度が上がることが確認できた（図１４）。【０１０４】
[金薄膜基板上へのタンパク質固定化] 光架橋リンカー１を固定した金薄膜基板上に３×ＳＳＣに溶解した１μＭのＣｙ５修飾ｍＲＮＡ１、０．５μＭのＣｙ５修飾ｍＲＮＡ１と０．５μＭの無修飾ｍＲＮＡ１の混合液、０．２５μＭのＣｙ５修飾ｍＲＮＡ１と０．２５μＭの無修飾ｍＲＮＡ１の混合液、１μＭの無修飾ｍＲＮＡ１を５μｌずつスポットした後、３０℃で２時間、密閉容器中で反応させ、３×ＳＳＣ溶液で５分間、０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ溶液で５分間、および０．１×ＳＳＣ溶液で５分間洗浄した。その後、金薄膜基板全体に３６５ｎｍの紫外線（２１０ｍＷ／ｃｍ２）を３０秒間照射し、金薄膜基板を蛍光イメージャーで観察した。
次に、洗浄液（８０ｍＭ酢酸カリウム、０．５ｍＭ酢酸マグネシウム）で洗浄した後、Ｆｌｕｏｒｏｔｅｃｔ（プロメガ社製）を添加した５０μｌのウサギ網状赤血球由来無細胞翻訳系（ライフテクノロジーズ社製）を滴下し、３０℃で２０分間、密閉容器中で反応させた。その後、２５μｌの高塩濃度溶液（３Ｍ塩化カリウム、１Ｍ塩化マグネシウム）を添加し、３７℃で９０分間、密閉容器中で反応させた後、洗浄液（７９０ｍＭ塩化カリウム、７９ｍＭ塩化マグネシウム、５２ｍＭ酢酸カリウム、０．３２Ｍ酢酸マグネシウム）で洗浄し、金薄膜基板を蛍光イメージャー（Ｔｙｐｈｏｏｎ９４１０、ＧＥヘルスケア社製）で観察しＣｙ５修飾ｍＲＮＡ１の蛍光（励起波長：６３３ｎｍ、蛍光フィルター：６７０ＢＰ３０）、およびタンパク質に取り込まれたＦｌｕｏｒｏｔｅｃｔの蛍光を確認した。
その後、マグネシウム非含有洗浄液（７９０ｍＭ塩化カリウム、５２ｍＭ酢酸カリウム、）で洗浄し、上記と同様に金薄膜基板を蛍光イメージャー（Ｔｙｐｈｏｏｎ９４１０、ＧＥヘルスケア社製）で観察した。
結果を図１５に示す。この結果より、翻訳後、Ｆｌｕｏｒｏｔｅｃｔが取り込まれたタンパク質がｍＲＮＡ１と同じスポット上に存在していることが分かる。また、マグネシウム非含有洗浄液で洗浄すると、Ｆｌｕｏｒｏｔｅｃｔの蛍光強度が大幅に減少するが、これは、ｍＲＮＡ上に存在するポリソームを介して結合していたタンパク質が、マグネシウム非含有洗浄液によってポリソームが洗い流された結果、Ｆｌｕｏｒｏｔｅｃｔを取り込んだタンパク質も同時に洗い流された為と考えられる。そして、マグネシウム非含有洗浄液による洗浄後も金薄膜基板上に残留しているＦｌｕｏｒｏｔｅｃｔ修飾タンパク質が、光架橋リンカー１を介してｍＲＮＡ１に結合しているタンパク質であると考えられ、光架橋リンカー１を用いて、タンパク質を基板上に固定化できることが確認できた。【０１０５】
[基板上での逆転写] 光架橋リンカー２を固定した金薄膜基板上に、３×ＳＳＣに溶解した１μＭのＣｙ５修飾ｍＲＮＡ２および１μＭの逆転写プライマー１の混合液を５μｌずつ４箇所に滴下し、３０℃で２時間、密閉容器中で反応させ、３×ＳＳＣ溶液で５分間、０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ溶液で５分間、および０．１×ＳＳＣ溶液で５分間洗浄した。
次に、金薄膜基板全面に３６５ｎｍの紫外線（２１０ｍＷ／ｃｍ２）を３０秒間照射した後、Ｃｙ３−ｄＣＴＰ（ＧＥヘルスケア社製）を添加したＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ逆転写反応液（インビトロジェン社製）を金薄膜基板上全面に５０μｌ滴下し、４２℃で１時間、密閉容器中で反応させた後、３×ＳＳＣ溶液で５分間、０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ溶液で５分間、および０．１×ＳＳＣ溶液で５分間洗浄し、金薄膜基板を蛍光イメージャー（Ｔｙｐｈｏｏｎ９４１０、ＧＥヘルスケア社製）で観察し、Ｃｙ５修飾ｍＲＮＡ２および、逆転写反応中にｃＤＮＡに取り込まれたＣｙ３の蛍光を確認した。
結果を図１６に示す。この結果より、逆転写反応後に、Ｃｙ３修飾されたｃＤＮＡが基板上で合成されていることが確認できる。【０１０６】
[基板上からのｃＤＮＡ回収１] 逆転写反応を行った金薄膜基板上に、５０μｌの４ｍＭの塩化マグネシウムを含む１×ＰＢＳに溶解した１００ｕｎｉｔのリボヌクレアーゼＨ（タカラバイオ社製）を滴下し、３０℃で１５分間、密閉容器中で反応させた後、リボヌクレアーゼＨによるＣｙ５修飾ｍＲＮＡの分解を、蛍光イメージャーで確認した。
結果を図１７に示す。この結果より、Ｃｙ３修飾されたｃＤＮＡは残留しているが、Ｃｙ５修飾されたｍＲＮＡが分解され消失していることが確認できる。
次に、基板上全面に５０μｌの８Ｍ尿素溶液を滴下し、Ｃｙ３修飾ｃＤＮＡ固定化スポットのうち２箇所に３１２ｎｍの紫外線（１０ｍＷ／ｃｍ２）を１８０秒間照射した後、基板上の溶液を全て回収した。
溶液回収後の金薄膜基板を蛍光イメージャーで観察し、３１２ｎｍの紫外線を照射したスポットからＣｙ３修飾ｃＤＮＡが遊離していることを確認した。
光開裂によって遊離したＣｙ３修飾ｃＤＮＡが溶解していると考えられる回収溶液をエタノール沈殿で濃縮後、回収溶液中に含まれるｃＤＮＡ量を、リアルタイムＰＣＲを用いて解析した結果、回収ＤＮＡ量は、約１６０００分子であった。なお、３１２ｎｍの紫外線を照射せずに回収したサンプルも同様に定量したところ、ＤＮＡの増幅は見られたがＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＩによるリアルタイムＰＣＲ実験系での定量範囲未満であった。（図１８参照。）。以上のことから、３１２ｎｍの紫外線照射に依存した基板上からのＤＮＡ回収を確認できた。リアルタイムＰＣＲ装置としてライトサイクラー４８０（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）、リアルタイムＰＣＲ試薬としてライトサイクラー４８０ＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎＩ  マスター（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）、プライマーとして、(５’−ＧＡＣＣＴＴＧＡＧＧＡＧＣＴＴＧＡＧＣＡＧ−３’)、および(５’−ＡＴＡＧＣＧＡＧＣＣＣＡＡＣＡＴＣＡＣＣ−３’)を用いた。【０１０７】
[基板上からのｃＤＮＡ回収２] 光架橋リンカー２を固定した金薄膜基板上に３×ＳＳＣに溶解した０．５μＭのＣｙ５修飾ｍＲＮＡ１と０．５μＭの無修飾ｍＲＮＡ１の混合液を５μｌずつ４箇所にスポットした後、３０℃で２時間、密閉容器中で反応させ、３×ＳＳＣ溶液で５分間、０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ溶液で５分間、および０．１×ＳＳＣ溶液で５分間洗浄した。その後、金薄膜基板全体に３６５ｎｍの紫外線（２１０ｍＷ／ｃｍ２）を０．１ｘＳＳＣ溶液中で３０秒間照射し、金薄膜基板を蛍光イメージャーで観察した（図１９参照。）。
次に、５０μｌの２μＭの光架橋リンカー３とＣｙ３−ｄＣＴＰ（ＧＥヘルスケア社製）を添加したＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ逆転写反応液（インビトロジェン社製）を金薄膜基板上全面に５０μｌ滴下し、３０℃で３０分、４２℃で１時間、密閉容器中で反応させた後、３×ＳＳＣ溶液で５分間、０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ溶液で５分間、および０．１×ＳＳＣ溶液で５分間洗浄し、金薄膜基板を蛍光イメージャーで観察し、Ｃｙ５修飾ｍＲＮＡおよび、逆転写反応中にｃＤＮＡに取り込まれたＣｙ３の蛍光を確認した（図１９参照。）。その後、金薄膜基板の一部に３６５ｎｍの紫外線（２１０ｍＷ／ｃｍ２）を３０秒間照射した。
次に、逆転写反応を行った金薄膜基板上に、５０μｌの４ｍＭの塩化マグネシウムを含む１×ＰＢＳに溶解した１００ｕｎｉｔのリボヌクレアーゼＨ（タカラバイオ社製）を滴下し、３０℃で１５分間、４０℃で５分間密閉容器中で反応させた後、基板上の溶液を全て回収した。リボヌクレアーゼＨによるｍＲＮＡの分解とｃＤＮＡの遊離を蛍光イメージャーで確認した（図１９参照。）。
溶液回収後の金薄膜基板を蛍光イメージャーで観察し、２回目の３６５ｎｍの紫外線を照射していないスポットからＣｙ３修飾ｃＤＮＡが遊離していることを確認した。【０１０８】
以上の結果から、本実施形態の核酸リンカーによれば、固相上でｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質又はペプチド複合体を効率よく合成するできることが明らかである。
また、本実施形態の核酸回収方法によれば、固相上の特定領域から核酸回収を効率よく行うことができることが明らかである。
【産業上の利用可能性】
【０１０９】
固相上でｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質又はペプチド複合体を効率よく合成するできる核酸リンカーを提供することができる。
【符号の説明】
【０１１０】
２，１２    核酸リンカー
２ａ    連結部分
２３，６３    ｍＲＮＡ
３３，７３    タンパク質又はペプチド
４４，５４    逆転写プライマー
４４ａ, ５４ａ    ５’末端領域部分
４４ｂ，５４ｃ    光反応性塩基誘導体
５１ａ    ポリヌクレオチド部分
５１ｂ    アーム部分
５１ｃ    スペーサー部分
５１ｄ    分岐鎖
５４ｂ    ３’末端領域部分
６２    複合体
【図１】
0006020865.tif 000002
【図２】
0006020865.tif 000003
【図３】
0006020865.tif 000004
【図４】
0006020865.tif 000005
【図５】
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【図６】
0006020865.tif 000007
【図７】
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【図８】
0006020865.tif 000009
【図９】
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【図１０】
0006020865.tif 000011
【図１４】
0006020865.tif 000012
【図１８】
0006020865.tif 000013
【図１１】
0006020865.tif 000014
【図１２】
0006020865.tif 000015
【図１３】
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【図１５】
0006020865.tif 000017
【図１６】
0006020865.tif 000018
【図１７】
0006020865.tif 000019
【図１９】
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【配列表】
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