(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（１）で示されるペプチドフラグメントを吸着部位として有するポリペプチドを含有することを特徴とする、フォン・ウィルブランド因子又はフィブロネクチンに対する吸着剤。
―（Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）n―      （１）
（式（１）中、ｎは２〜９０００の整数である。）
【請求項２】
前記ポリペプチドの重量平均分子量が５７０〜７００万である、請求項１に記載の吸着剤。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の吸着剤を固定化した固相担体。
【請求項４】
試料溶液中のフォン・ウィルブランド因子又フィブロネクチンを精製する方法であって、
請求項１又は２に記載の吸着剤又は請求項３に記載の固相担体に、前記試料溶液を接触させて前記フォン・ウィルブランド因子又はフィブロネクチンを前記吸着剤に吸着させる吸着工程を含む方法。
【請求項５】
さらに前記吸着工程後の吸着剤又は固相担体に溶出剤を含む溶出液を接触させて前記フォン・ウィルブランド因子又はフィブロネクチンを溶出させる溶出工程を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記試料が血漿である、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項７】
前記溶出剤が、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ2、ＣａＣｌ2、Ｎａ2ＳＯ4、ＮａＢｒ、ＫＢｒ、酢酸ナトリウム、トリス塩酸塩、リン酸塩、グアニジン塩、アルギニンおよびその塩、並びに尿素から選ばれる、請求項５又は６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液凝固因子又は細胞接着因子に対する吸着剤及び精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質等の生体分子の精製方法として一般的にクロマトグラフィーが知られており、その具体例としては陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーがある。これらを組み合わせることで対象タンパク質を高度に精製することができるため、血液や血漿又は細胞等の培養液に含まれている、例えばバイオ医薬品となるエリスロポエチンや免疫グロブリン等の精製において、クロマトグラフィーは重要な技術となっている。特にアフィニティークロマトグラフィーは、他に比べて対象物質に対する選択性が非常に高いため、１回の操作で高度に精製することができ、短い操作時間で高い生産性を得られるものとして重要である。
【０００３】
アフィニティークロマトグラフィーは対象物質と相互作用を有するリガンドを利用して行われ、そのリガンドとしてタンパク質を用いる精製が行われることがある。例えば、プロテインＡ固定化充填剤により免疫グロブリンを精製して抗体医薬を製造したり、ゼラチン固定化充填剤によりフィブロネクチン等の血液成分等を精製したりすることが知られている。
【０００４】
タンパク質をリガンドとするアフィニティークロマトグラフィーは、高い選択性による効率の良い精製を可能とするが、アルカリ洗浄によるリガンドの変性や分解、タンパク質分解酵素によるリガンドの分解、又はリガンド自体の脆弱性に起因して、リガンドが劣化するという問題がある。
また、タンパク質をリガンドとするアフィニティークロマトグラフィーでは、そのリガンド材料に動物由来材料が混入する場合があり、その安全性の問題もある。すなわち、近年狂牛病等の人畜共通感染症への懸念から、例えばウシ由来のゼラチンをリガンドとして用いることは避けたいという需要があり、動物由来材料に替わるリガンド材料が求められている。
さらに、タンパク質をリガンドとするアフィニティークロマトグラフィーでは、リガンドと対象物質との高い親和性ゆえに、対象物質の回収条件が必ずしも温和なものとならない場合がある。例えば、前述のプロテインＡ固定化ゲルから免疫グロブリンを溶出させる場合に酸性条件（例えばｐＨ３）を要したり、ゼラチン固定化ゲルからフィブロネクチンを溶出させる場合に８Ｍ  尿素、１Ｍ  ＮａＢｒ又はアルギニン等を使用したりすることがある（非特許文献１）。このような厳しい溶出条件のもとでは、対象物質のタンパク質が変性するおそれや、溶出に使用する尿素やアルギニン等の試薬が高濃度でコストがかかる点や、溶出工程後に中和等の処理を要しそのコストや煩雑さが問題となる。
このように、タンパク質の精製においては、対象物質との高い親和性と劣化しにくさを有しつつ、温和な条件で、簡便な手順で、かつ安価で安全に、タンパク質を精製できるアフィニティーリガンドが求められている。
【０００５】
ところで、生体分子としてよく知られるコラーゲンは、Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ（Ｘ、Ｙは様々なアミノ酸で、ＸはＰｒｏ、ＹはＨｙｐである場合が多い）の繰り返しから成るポリペプチドが同じ向きに３本寄り集って形成された３重らせん構造を有するタンパク質の総称である。
天然コラーゲンは種々の生体分子と結合したり、血小板凝集能を有したりすることが知られている。これまでに天然コラーゲン中の特定のアミノ酸配列に対して特定のタンパク
質等の分子が結合したりすることが分かっている（非特許文献３）。このような知見を利用して特定の対象分子に結合するコラーゲン様ペプチドを創出する研究も行われており、例えばフォン・ウィルブランド因子等のコラーゲン結合分子と結合する特定のアミノ酸配列を有するコラーゲン様ペプチドが開示されている（非特許文献２）。
また、コラーゲン様ペプチドとして創出されたものとしてＰｒｏ−Ｘ−Ｇｌｙ（ＸはＰｒｏ又はＨｙｐ）の配列の繰り返し構造を有するポリペプチドがある。このポリペプチドは血小板凝集能を有することが分かっており（非特許文献４）、これを含む血小板凝集惹起物質が開示されている（特許文献１）。しかしながら、上記配列の繰り返し構造を有するポリペプチドフラグメントが、フィブロネクチンやフォン・ウィルブランド因子等と高い親和性で結合することは知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２００８／０７５５８９号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Affinity Chromatography Principles and Methods (Handbook from GE Healthcare) p.69
【非特許文献２】生化学第８２巻第６号，pp.474‐483，2010
【非特許文献３】THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY Vol. 277, No. 6, Issue of February 8, pp. 4223-4231, 2002
【非特許文献４】FEBS Letters 583 (2009) 81-87
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は上記の状況に鑑み、対象物質との高い親和性と劣化しにくさを有しつつ、温和な条件で、簡便な手順で、かつ安価で安全に、血液凝固因子や細胞接着因子を精製できる吸着剤、及び血液凝固因子や細胞接着因子の精製方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本願発明者らは、上記課題を解決するべく鋭意研究の末、血液凝固因子や細胞接着因子等が、Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙの配列の繰り返し構造からなるペプチドフラグメントを有するポリペプチドに高い親和性で吸着し、さらに塩濃度を上昇させる温和な方法で脱離する事を見出した。
すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］式（１）で示されるペプチドフラグメントを有するポリペプチドを含有することを特徴とする、血液凝固因子又は細胞接着因子に対する吸着剤（以降、本発明の吸着剤と記す）。
―（Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）n―      （１）
（式（１）中、ｎは２〜９０００の整数である。）
［２］前記血液凝固因子又は細胞接着因子が、フォン・ウィルブランド因子、フィブロネクチン、グリコプロテインＶＩ（ＧＰＶＩ）、インテグリン、ヒートショックプロテイン４７、およびビトロネクチンから選択される、［１］に記載の吸着剤。
［３］前記ポリペプチドの重量平均分子量が５７０〜７００万である、［１］又は［２］に記載の吸着剤。
［４］［１］〜［３］のいずれかに記載の吸着剤を固定化した固相担体。
［５］試料溶液中の血液凝固因子又は細胞接着因子を精製する方法であって、
［１］〜［３］のいずれかに記載の吸着剤又は［４］に記載の固相担体に、前記試料溶液を接触させて前記血液凝固因子又は細胞接着因子を前記吸着剤に吸着させる吸着工程を含む方法（以降、本発明の精製方法と記す）。
［６］さらに前記吸着工程後の吸着剤又は固相担体に溶出剤を含む溶出液を接触させて前記血液凝固因子又は細胞接着因子を溶出させる溶出工程を含む、［５］に記載の方法。
［７］前記血液凝固因子又は細胞接着因子が、フォン・ウィルブランド因子、フィブロネクチン、グリコプロテインＶＩ（ＧＰＶＩ）、インテグリン、ヒートショックプロテイン４７、およびビトロネクチンから選択される、［５］又は［６］に記載の方法。
［８］前記試料が血漿である、［５］〜［７］のいずれかに記載の方法。
［９］前記溶出剤が、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ2、ＣａＣｌ2、Ｎａ2ＳＯ4、ＮａＢｒ、ＫＢｒ、酢酸ナトリウム、トリス塩酸塩、リン酸塩、グアニジン塩、アルギニンおよびその塩、並びに尿素から選ばれる、［６］〜［８］のいずれかに記載の方法。       
【発明の効果】
【００１０】
本発明においては、化学合成されたポリペプチドを吸着剤として用いるため、天然コラーゲン等に比して洗浄液により劣化しにくく、タンパク質分解酵素に分解されにくく、また簡単な配列の繰り返しであるため容易に製造・入手することができ、さらに動物由来材料の使用に対する懸念事項を解消できる。また、本発明の吸着剤に対しては血液凝固因子や細胞接着因子を塩又は尿素の濃度の変化のみで吸脱着できるため、コストを抑え、血液凝固因子や細胞接着因子の変性を防ぐことができる。
したがって、本発明によれば、対象物質との高い親和性と劣化しにくさを有しつつ、温和な条件で、簡便な手順で、かつ安価で安全に、血液凝固因子や細胞接着因子を精製する方法が提供される。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明においては各種アミノ酸残基を次の略語で記述する。
Ａｌａ：Ｌ−アラニン残基
Ａｒｇ：Ｌ−アルギニン残基
Ａｓｎ：Ｌ−アスパラギン残基
Ａｓｐ：Ｌ−アスパラギン酸残基
Ｃｙｓ：Ｌ−システイン残基
Ｇｌｎ：Ｌ−グルタミン残基
Ｇｌｕ：Ｌ−グルタミン酸残基
Ｇｌｙ：グリシン残基
Ｈｉｓ：Ｌ−ヒスチジン残基
Ｈｙｐ：Ｌ−ヒドロキシプロリン残基
Ｉｌｅ：Ｌ−イソロイシン残基
Ｌｅｕ：Ｌ−ロイシン残基
Ｌｙｓ：Ｌ−リジン残基
Ｍｅｔ：Ｌ−メチオニン残基
Ｐｈｅ：Ｌ−フェニルアラニン残基
Ｐｒｏ：Ｌ−プロリン残基
Ｓａｒ：サルコシン残基
Ｓｅｒ：Ｌ−セリン残基
Ｔｈｒ：Ｌ−トレオニン残基
Ｔｒｐ：Ｌ−トリプトファン残基
Ｔｙｒ：Ｌ−チロシン残基
Ｖａｌ：Ｌ−バリン残基
なお、本明細書におけるペプチド鎖のアミノ酸配列は、定法に従い、Ｎ末端のアミノ酸残基を左側に、Ｃ末端のアミノ酸残基を右側に位置させて記載する。
【００１２】
＜１＞本発明の吸着剤
本発明の吸着剤に含有されるポリペプチドは、次式（１）で示されるペプチドフラグメ
ント（以降、ポリＰＨＧと記す）を有する。
―（Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）n―      （１）
ここでＨｙｐは、例えば４Ｈｙｐであり、trans−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンが好ましい。
【００１３】
また、式（１）中、繰り返し数ｎは２〜９０００の整数である。ｎがこの範囲であることにより、血液凝固因子等や細胞接着因子等と高い親和性で吸着することができる。ｎは、３重らせん構造形成によるリガンド安定性の観点から５〜１０００が好ましく、１０〜５００がより好ましい。
【００１４】
本発明の吸着剤に含有されるポリペプチドは、繰り返し数ｎが５以上で３重らせん構造をとり得る。血液凝固因子や細胞接着因子等との吸着作用が生じるために、ポリペプチドが３重らせん構造であることは必ずしも必要ではなく、ランダムコイル構造を有していてもよいが、ポリペプチドが３重らせん構造をとると前述のようにリガンドとしての安定性が向上する。３重らせん構造を形成しているポリペプチド鎖は、直線状または１以上の分岐を有していてもよい。分岐を有する場合、分岐点以降に３重らせん構造が形成されていてもよく、さらにその３重らせん構造の後ろに分岐を有していてもよい。
なお、ポリペプチドが３重らせん構造をとっているか否かは、ポリペプチド溶液について円二色性スペクトルを測定することにより確認することができる。具体的には、波長２２０〜２３０ｎｍに正のコットン効果、および波長１９５〜２０５ｎｍに負のコットン効果を示す場合、そのポリペプチドは３重らせん構造をとっていると考えられる。
また、本発明の吸着剤に含有されるポリペプチド鎖どうしは、互いに架橋されていてもよい。
【００１５】
本発明の吸着剤に含有されるポリペプチドの重量平均分子量は、特に限定されるものではないが、血液凝固因子や細胞接着因子との高親和性及び３重らせん構造の安定性の観点から５７０〜７００万が好ましく、２８５０〜３０万がより好ましい。
ここで、ポリペプチドの重量平均分子量は、例えば特開２００３-３２１５００号公報に記載されている、カラム：Superdex 200 HR 10/30（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社製）、流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ、溶離液：１５０ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．４））分子量標準としてGelFiltration LMW Calibration Kit及びGel Filtration HMW Calibration Kit（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社製）を使用したゲルパーミエーションクロマトグラフィーによる方法、あるいは、カラム：Superdex peptide PE 7.5/300（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社製）、流速：０．２５ｍＬ／ｍｉｎ、溶離液：１５０ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．４））、分子量標準としてGel Filtration LMW Calibration Kit（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社製）とヒトインシュリン、グリシンを用いたゲルパーミエーションクロマトグラフィーによる方法により測定することができる。別の方法として、カラム：TSK-GEL6000PW XL-CP 8.0 x 300mm（東ソー製）、移動相２０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４・Ｈ3ＰＯ4（ｐＨ３．０）:ＭｅＯＨ=８：２、カラム温度４０℃、流速０．５ｍＬ/ｍｉｎ、検出はＵＶモニターによる２１５ｎｍ及び示差屈折系、分子量標準として分子量５００００から１６０００００のプルラン（昭和電工製）および分子量１１９０００００のデキストラン（Polymer Standards Service GmbH）によるＨＰＬＣゲルパーミエーションクロマトグラフィーにより測定できる。また、このＨＰＬＣゲルパーミエーションクロマトグラフィーの検出器にＷｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社のＤＡＷＮ  ＨＥＬＥＯＳ、Ｏｐｔｏｌａｂ  ｒＥＸを用いる事で、ゲル浸透クロマトグラフ/多角度レーザー光散乱検出器 (GPC-MALS)法としても測定する事ができる。本明細書においてポリペプチドの重量平均分子量は、これらの方法によって測定された値である。
【００１６】
本発明の吸着剤に含有されるポリペプチドは、ポリＰＨＧのみからなるものであっても
よいが、３重らせん構造の安定性を損なわず、また本発明の効果を損なわない範囲において、ポリＰＨＧの他にアミノ酸残基もしくはペプチドフラグメントまたはアルキレンを含んでもよい。
アミノ酸残基としては、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｈｙｐ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓａｒ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌから選択された少なくとも１種が挙げられる。ペプチドフラグメントとしては、前記アミノ酸残基の１種以上が複数個結合したペプチドが挙げられる。アルキレンとしては、直鎖状、分岐状のいずれでもよく、特に限定されるものではないが、具体的には炭素数１〜１８のアルキレンが挙げられ、実用的には炭素数２〜１２のアルキレンが好ましい。
本発明の吸着剤に含有されるポリペプチドは、ポリＰＨＧとポリＰＨＧの他のアミノ酸残基もしくはペプチドフラグメントまたはアルキレンを、重量比においてポリＰＨＧ：他のアミノ酸残基もしくはペプチドフラグメントまたはアルキレン他のペプチドフラグメント＝１：９９〜１００：０、好ましくは１０：９０〜１００：０の範囲で有する。
【００１７】
本発明の吸着剤に含有されるポリペプチドは、血液凝固因子や細胞接着因子の吸着を阻害しない限り、無機酸（塩酸、硫酸等）、有機酸（酢酸、乳酸、マレイン酸、シュウ酸、クエン酸等）、金属（ナトリウム、カリウム等）、有機塩基（トリメチルアミン、トリエチルアミン等）との塩であってもよい。本発明の吸着剤に含有されるポリペプチドの塩化合物は、単独または二種類以上の組合せであってもよい。
【００１８】
本発明の吸着剤は、本発明の効果を損なわない範囲であれば、ポリＰＨＧを有するポリペプチド以外の物質を含むものであってもよい。その他の物質は、保存性、取扱い易さ、活性の安定性等を考慮して選定すればよく、特に限定されるものではないが、例えば、後述のような保存溶媒を挙げることができる。
【００１９】
ポリＰＨＧを有するポリペプチドは、いずれの方法により得られたものであってもよい。
例えば、既知の固相合成法または液相合成法により取得したポリＰＨＧを構成するアミノ酸からなるペプチドオリゴマーを用いて、縮合反応を行う方法により好ましく取得できる。
【００２０】
上記ペプチドオリゴマーの縮合反応は、通常、溶媒中で行われる。溶媒は、原料となるペプチドオリゴマーを溶解（一部または全部を溶解）または懸濁可能なものであればよく、通常、水または有機溶剤が使用できる。具体的には、水、アミド類（ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、ヘキサメチルホスホロアミド等）、スルホキシド類（ジメチルスルホキシド等）、窒素含有環状化合物（Ｎ−メチルピロリドン、ピリジン等）、ニトリル類（アセトニトリル等）、エーテル類（ジオキサン、テトラヒドロフラン等）、アルコール類（メチルアルコール、エチルアルコール、プロピルアルコール等）、およびこれらの混合溶媒等である。これらの溶媒のうち、水、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドが好ましく使用される。
【００２１】
また、上記ペプチドオリゴマーの縮合反応は、脱水剤（脱水縮合剤、縮合助剤）の存在下で行うことが好ましい。脱水縮合剤と縮合助剤との存在下で反応させると、脱保護とアミノ酸結合とを繰返す煩雑な処理を経ることなく、二量化や環化を抑制しつつ円滑に縮合反応が進行する。
【００２２】
脱水縮合剤は、前記溶媒中で脱水縮合を効率よく行える限り特に限定されるものではなく、例えば、カルボジイミド系縮合剤（ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ＝ＷＳＣＩ）
、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩(ＷＳＣＩ・ＨＣｌ)、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）等）、フルオロホスフェート系縮合剤（Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート、ベンゾトリアゾール−１−イル−トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロリン化物塩（ＢＯＰ））等）、ジフェニルホスホリルアジド（ＤＰＰＡ）が例示できる。
これらの脱水縮合剤は単独で又は二種以上組み合わせて混合物として使用できる。好ましい脱水縮合剤は、カルボジイミド系縮合剤（例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩）である。
【００２３】
脱水縮合剤の使用量は、ペプチドフラグメントの総量１モルに対して、通常、水を含まない非水系溶媒を用いる場合０．７〜５モル、好ましくは０．８〜２．５モル、さらに好ましくは０．９〜２．３モル（例えば１〜２モル）の範囲である。水を含む溶媒（水系溶媒）においては、水による脱水縮合剤の失活があるので、脱水縮合剤の使用量は、ペプチドフラグメントの総量１モルに対して、通常、２〜５００モル、好ましくは５〜２５０モル、さらに好ましくは１０〜１２５モルの範囲である。
【００２４】
縮合助剤は、縮合反応を促進する限り特に制限されず、例えば、Ｎ−ヒドロキシ多価カルボン酸イミド類（例えば、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＨＯＮＳｕ）、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボン酸イミド（ＨＯＮＢ）等のＮ−ヒドロキシジカルボン酸イミド類）、Ｎ−ヒドロキシトリアゾール類（例えば、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）等のＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール類）、３−ヒドロキシ−４−オキソ−３，４−ジヒドロ−１，２，３−ベンゾトリアジン（ＨＯＯｂｔ）等のトリアジン類、２−ヒドロキシイミノ−２−シアノ酢酸エチルエステルが例示できる。
これらの縮合助剤も単独で又は二種以上組み合わせて使用できる。好ましい縮合助剤は、Ｎ−ヒドロキシジカルボン酸イミド類（ＨＯＮＳｕ等）、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール又はＮ−ヒドロキシベンゾトリアジン類（ＨＯＢｔ等）である。
【００２５】
縮合助剤の使用量は、溶媒の種類に関係なく、ペプチドフラグメントの総量１モルに対して、通常、０．５〜５モル、好ましくは０．７〜２モル、さらに好ましくは０．８〜１．５モルの範囲である。
【００２６】
脱水縮合剤と縮合助剤とは適当に組み合わせて使用することが好ましい。脱水縮合剤と縮合助剤との組合せとしては、例えば、ＤＣＣ−ＨＯＮＳｕ（ＨＯＢｔまたはＨＯＯＢｔ）、ＷＳＣＩ−ＨＯＮＳｕ（ＨＯＢｔ又はＨＯＯＢｔ）が挙げられる。
【００２７】
上記ペプチドオリゴマーの縮合反応においては、反応溶液のｐＨを調節してもよく、通常、反応溶液のｐＨは中性付近（ｐＨ＝６〜８程度）に調整される。ｐＨの調節は、通常、無機塩基（水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウムなど）、有機塩基、無機酸（塩酸など）や有機酸を用いて行うことができる。
また、縮合反応に関与しない塩基を反応溶液に添加してもよい。縮合反応に関与しない塩基としては、第三級アミン類、例えば、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミンなどのトリアルキルアミン類、Ｎ−メチルモルホリン、ピリジンなどの複素環式第三級アミン類などが例示できる。このような塩基の使用量は、通常、本ペプチドオリゴマーの総モル数の１〜２倍程度の範囲から選択できる。
【００２８】
以上のようにして得られたポリペプチドには、反応に用いた試薬が残存している。これ
は本発明の吸着剤の血液凝固因子又は細胞接着因子に対する吸着能に影響するため、除去することが好ましい。残存している試薬の除去は、透析法、カラム法、限外ろ過法等の既知の手法を用いることができる。
【００２９】
また、ポリペプチドの安定性および取扱いの容易さから考えると、反応溶媒を保存溶媒に置換することが好ましい。反応溶媒から目的とする保存溶媒への置換は、透析法においては目的とする保存溶媒を透析外液として使用することにより、カラム法においては目的とする保存溶媒を移動相として用いることにより置換することができる。
保存溶媒としては、得られた有効成分ポリペプチドの物理的性質等の変化を抑えられるものであれば特に限定されない。例えば、水、生理食塩水、弱酸から弱アルカリに緩衝能を有するバッファーを挙げることができる。ただし、血液凝固因子や細胞接着因子に影響を与える物質を含有しないことが好ましい。
【００３０】
本発明の吸着剤は、血液凝固因子や細胞接着因子を高い親和性で吸着することができる。前記血液凝固因子や細胞接着因子のうちフォン・ウィルブランド因子（以降、ｖＷＦと記す）、フィブロネクチン（以降、ＦＮと記す）、グリコプロテインＶＩ（以降、ＧＰＶＩと記す）、インテグリン、ヒートショックプロテイン４７、ビトロネクチンが特に吸着剤への親和性が高いため好ましい。
本発明の吸着剤は、血液等のタンパク質の混合物から血液凝固因子や細胞接着因子を精製あるいは除去したり、菌体や酵母等で製造した組換えタンパク質を精製したりできるため、目的とする血液凝固因子や細胞接着因子の精製や製造に好適に使用できる。
【００３１】
本発明の吸着剤は、固相担体に固定化する態様とすることができる。このような固相担体の材料としては、特に限定されず、セルロース系、ポリマー系、シリカ系、アガロース系等既知のものを用いることができる。また、その形態もビーズ、プレート、繊維等、特に限定されない。
固定化は、固相担体に対して本発明の吸着剤を共有結合で固定することが、操作中の吸着剤の脱離を防ぐ観点から好ましい。共有結合による固定化は、例えば、上記固相担体の表面にエステル基、アルデヒド基、エポキシ基等の反応性基を導入し、本発明の吸着剤に含有されるポリペプチドのアミノ基や水酸基とのカップリング反応を固相担体表面で行う一般的な公知の方法により行うことができる。なお、表面に反応性基が導入された固相担体は市販のものが種々存在するので、これらを好適に利用できる。固相担体へのポリペプチドの固定化量は、本発明の効果を妨げない限りにおいて任意に設定することができる。
このような固定化固相担体は、例えばタンパク質精製キット等に含めて、後述する血液凝固因子又は細胞接着因子の精製方法に好適に用いることができる。
【００３２】
＜２＞本発明の精製方法
本発明の精製方法は、本発明の吸着剤又は本発明の吸着剤を固定化した固相担体に、前記試料溶液を接触させて前記血液凝固因子又は細胞接着因子を前記吸着剤に吸着させる吸着工程を含む。また、さらなる態様では、さらに前記吸着工程後の吸着剤又は固相担体に溶出剤を含む溶出液を接触させて前記血液凝固因子又は細胞接着因子を溶出させる溶出工程を含む。
本発明の精製方法では、試料溶液中の血液凝固因子又は細胞接着因子を精製することができる。特に、前記血液凝固因子又は細胞接着因子のうち、ｖＷＦ、ＦＮ、ＧＰＶＩ、インテグリン、ヒートショックプロテイン４７、ビトロネクチンを好ましく精製対象とすることができる。
また、前記試料としては、特に限定されないが、全血、血漿、細胞等の培養液、細胞抽出液、血清、体液、組み替え細胞の生産物等が挙げられ、特に血漿が好ましい。全血や血漿等の生体由来の試料の場合は、いずれの動物のものでも構わないが、ヒトのものに好ましく適用できる。
本発明の精製方法は、血液等のタンパク質の混合物からの血液凝固因子や細胞接着因子の精製あるいは除去や、菌体や酵母等で製造した組換えタンパク質の精製に適用できるため、目的とする血液凝固因子や細胞接着因子の精製や製造に好適に使用できる。
以下に、本発明の精製方法の各工程について説明する。
【００３３】
本発明の精製方法における吸着工程において、試料溶液は通常には０．０１〜０．５Ｍの塩又は尿素を含む。０．０１Ｍより低い濃度では、血液凝固因子や細胞接着因子の安定性が損なわれ、また０．５Ｍより高い濃度では、血液凝固因子や細胞接着因子の吸着剤への吸着が阻害されてしまうからである。なお、塩の種類としては、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ2、ＣａＣｌ2、Ｎａ2ＳＯ4、ＮａＢｒ、ＫＢｒ、酢酸ナトリウム、トリス塩酸塩、リン酸塩、グアニジン塩、アルギニンおよびその塩等が挙げられ、特に限定されず、２種類以上の塩あるいは塩と尿素とを組み合わせて用いてもよい。試料は、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸、グッドの緩衝塩等公知の緩衝液で希釈することにより調整することができ、そのｐＨは血液凝固因子又は細胞接着因子の安定性を損なわない範囲、例えば４〜９に調整する。
吸着工程においては、試料溶液を本発明の吸着剤に接触させることにより、血液凝固因子又は細胞接着因子を吸着剤に吸着させるが、これは本発明の吸着剤を固定化した固相担体を用いれば、操作を容易に行うことができる。例えば、そのような固定化担体を充填したカラムに試料溶液を通過させてもよく、その場合は吸着が十分に行われるように、試料溶液の通過速度や通過回数を適宜調整することができる。また、固定化担体を入れた容器（容器自体が固定化担体であってもよい）に試料溶液を入れ、吸着に十分な時間おいた後（溶液の攪拌はあってもなくてもよい）、試料溶液の除去等により固定化担体を回収してもよい。
吸着工程後は、必要に応じて、洗浄液、例えば濃度０．０１〜０．５Ｍの塩又は尿素を含む緩衝液等で洗浄して、吸着剤に非特異吸着した分子や未吸着の分子を取り除いてもよい。
また、吸着工程は、特に限定されないが、２〜３７℃の温度において行うことが好ましく、吸着剤やタンパク質の変性を防ぐ観点から４〜２５℃がより好ましい。
【００３４】
本発明の精製方法における溶出工程において、用いる溶出液は溶出剤を含み、該溶出剤の濃度は通常には０．５〜１Ｍである。０．５Ｍより低い濃度では、血液凝固因子又は細胞接着因子を吸着剤から脱離させにくく、また１Ｍより高い濃度では、溶出効率が頭打ちになるだけでなく、血液凝固因子又は細胞接着因子の安定性が損なわれるからである。なお、溶出剤の種類としては、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ2、ＣａＣｌ2、Ｎａ2ＳＯ4、ＮａＢｒ、ＫＢｒ、酢酸ナトリウム、トリス塩酸塩、リン酸塩、グアニジン塩、アルギニンおよびその塩、尿素等が挙げられ、特に限定されず、２種類以上の溶出剤を組み合わせて用いてもよい。また溶出液のｐＨは血液凝固因子又は細胞接着因子の安定性を損なわない範囲、例えば４〜９に調整すればよい。
本発明の精製方法においては、吸着工程で用いた溶液よりも溶出液の塩又は尿素の濃度を上昇させるという簡便な手段で、吸着剤に吸着している血液凝固因子又は細胞接着因子を溶出・回収することができる。これは、従来のアフィニティークロマトグラフィーに比べて、各段に温和な条件での精製を可能とするものであり、血液凝固因子又は細胞接着因子やリガンドとなるポリＰＨＧを有するポリペプチドを劣化させるおそれがない。また、高価な試薬を大量に使用することもないため、非常に効率が良い。
溶出工程も前記吸着工程同様に、固定化した固相担体を用いれば、操作を容易に行うことができる。すなわち、吸着工程後の固定化担体を充填したカラムに溶出液を通過させてもよく、その場合溶出が十分に行われるように、溶出液の通過速度や通過回数を適宜調整することができる。また、吸着工程後の固定化担体を入れた容器（容器自体が固定化担体であってもよい）に溶出液を入れ、溶出に十分な時間おいた後（溶液の攪拌はあってもなくてもよい）、溶出液を回収してもよい。
また、溶出工程は、特に限定されないが、４〜２５℃の温度において行うことが好ましい。
【実施例】
【００３５】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３６】
≪リガンドの固定化≫
本発明の吸着剤であるポリＰＨＧ含有ポリペプチド又は比較のためのコラーゲンを、アフィニティーリガンドとしてゲル担体に公知の方法で固定化した。
＜実施例１＞
セルファインホルミル（ＪＮＣ（株）製）を５０ｍＭ炭酸ナトリウムで洗浄し、吸引ろ過して得られた洗浄ゲル４．３ｇを２００ｍＬの三角フラスコに入れ、さらに０．５重量％のポリＰＨＧ含有ポリペプチド水溶液を１６ｇ、５０ｍＭ炭酸ナトリウムを６．４ｍＬ、水９．６ｍＬを加えて、よく混合したのち、４０℃で２時間振盪した。水素化ホウ素ナトリウム５０ｍｇ/ｍＬ水溶液０．７ｍＬを加えて、更に４０℃で２時間振盪した。反応終了後、反応スラリーを吸引ろ過してゲルを回収した。ゲルに残存する未反応物などを除くために、５０ｍＭ炭酸ナトリウム、塩酸水溶液（ｐＨ３）、純水で洗浄、吸引ろ過してポリＰＨＧ固定化ゲルを得た。
洗浄液中の残存ポリＰＨＧ含有ポリペプチド量を定量し、反応に用いたポリＰＨＧ含有ポリペプチドとの差から、固定化されたポリＰＨＧ含有ポリペプチドの量を算出した。洗浄液中のポリＰＨＧ含有ポリペプチド量は、２１０ｎｍの吸光度から濃度を測定して算出した。
ここで用いたポリＰＨＧ含有ポリペプチドは、式（１）で示されるペプチドフラグメントのみで構成された重量平均分子量が約５００万のポリペプチドであり、以降の実施例・比較例においても同様である。
【００３７】
＜比較例１＞
セルファインホルミル（ＪＮＣ（株）製）を５０ｍＭ炭酸ナトリウムで洗浄し、吸引ろ過して得られた洗浄ゲル４．３ｇを２００ｍＬの三角フラスコに入れ、さらブタ皮膚精製コラーゲン溶液１％（日本ハム（株）製）を８ｇ、５０ｍＭ炭酸ナトリウム２４ｍＬを加えて、よく混合したのち、４０℃で２時間振盪した。水素化ホウ素ナトリウム５０ｍｇ/ｍＬ水溶液０．７ｍＬを加えて、更に４０℃で２時間振盪した。反応終了後、反応スラリーを吸引ろ過してゲルを回収した。ゲルに残存する未反応物などを除くために、５０ｍＭ炭酸ナトリウム、塩酸水溶液（ｐＨ３）、純水で洗浄、吸引ろ過してコラーゲン固定化ゲルを得た。
洗浄液中の残存コラーゲン量を定量し、反応に用いたコラーゲンとの差から、固定化されたコラーゲンの量を算出した。洗浄液中のコラーゲン量は、２１０ｎｍの吸光度から濃度を測定して算出した。
【００３８】
＜実施例２＞
Ｓｈｏｄｅｘ  ＢＩＯＡＣＴ  ｇｅｌ  ＥＰＯシリーズ（昭和電工（株）製）を乾燥重量で２．７ｇを量り、３０ｍＬの０．２５重量％のポリＰＨＧ含有ポリペプチド、５０ｍＭ炭酸ナトリウム溶液に加え、４０℃で一夜振盪し反応させた。反応終了後、反応スラリーを吸引ろ過してゲルを回収した。ゲルに残存する未反応物などを除くために、５０ｍＭ炭酸ナトリウム、塩酸水溶液（ｐＨ３）、純水で洗浄、吸引ろ過してポリＰＨＧ固定化ゲルを得た。
洗浄液中の残存ポリＰＨＧ含有ポリペプチド量を定量し、反応に用いたポリＰＨＧ含有ポリペプチドとの差から、固定化されたポリＰＨＧ含有ポリペプチドの量を算出した。洗浄液中のポリＰＨＧ含有ポリペプチド量は、２１０ｎｍの吸光度から濃度を測定して算出
した。
【００３９】
＜実施例３＞
反応温度を４０℃から４℃に変えた以外は、実施例２と同様にした。
【００４０】
＜比較例２＞
Ｓｈｏｄｅｘ  ＢＩＯＡＣＴ  ｇｅｌ  ＥＰＯシリーズ（昭和電工（株）製）を乾燥重量で２．７ｇを量り、３０ｍＬの０．２５重量％に希釈したブタ皮膚精製コラーゲン溶液（日本ハム（株）製）、５０ｍＭ炭酸ナトリウム溶液に加え、４０℃で一夜振盪し反応させた。反応終了後、反応スラリーを吸引ろ過してゲルを回収した。ゲルに残存する未反応物などを除くために、５０ｍＭ炭酸ナトリウム、塩酸水溶液（ｐＨ３）、純水で洗浄、吸引ろ過してコラーゲン固定化ゲルを得た。
洗浄液中の残存コラーゲン量を定量し、反応に用いたコラーゲンとの差から、固定化されたコラーゲンの量を算出した。洗浄液中のコラーゲン量は、２１０ｎｍの吸光度から濃度を測定して算出した。
【００４１】
＜比較例３＞
反応温度を４０℃から４℃に変えた以外は、比較例２と同様にした。
【００４２】
表１に上記実施例１〜３及び比較例１〜３のゲル担体へのリガンド固定化量を示す。
【００４３】
【表１】
0006024101.tif 000002
【００４４】
≪血漿成分の吸着溶出実験１≫
実施例１及び比較例１の固定化ゲル担体並びにゲル担体の原料である６重量％セルロース粒子（ＪＮＣ（株）製）各１ｍＬを、ポリプロピレン製のカラムに充填した。１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５（ＴＢ）を５ｍＬ以上通液して平衡化した後、ＴＢで１０倍に希釈したＰｌａｓｍａ，ｈｕｍａｎ（Ｓｉｇｍａ／Ｐ９５２３−５ＭＬ）５ｍＬをカラムへ流した（１回）。その後、ＴＢを５ｍＬ流して、吸着していない血漿成分を洗い流した（１回）。これらのカラム出口からの液は合わせて素通り・洗浄液として回収した。洗浄終了後に、１Ｍ  ＮａＣｌを含んだＴＢを５ｍＬカラムに流し（１回）、そのカラム出口からの液は、溶出液として回収した。以上の操作は全て室温下（２５℃）で行った。
素通り・洗浄液及び溶出液それぞれに含まれるＦＮ及びｖＷＦの各量をＥＬＩＳＡによって測定した。
【００４５】
表２にＦＮの吸着及び溶出結果を、表３にｖＷＦの吸着及び溶出結果を示す。
本発明の吸着剤は血漿中のＦＮ及びｖＷＦを効率よく吸着し、また１Ｍ  ＮａＣｌを含む溶出液により容易に吸着したＦＮ及びｖＷＦを回収することができた。特にｖＷＦはコ
ラーゲンに比べて吸着剤への吸着量が多く、本発明の吸着剤がｖＷＦへの親和性が高いことがわかった。また、特にＦＮは吸着剤への吸着量はコラーゲンと同程度であるものの、塩濃度を上昇させるだけの簡便な溶出操作のみで容易に回収できることがわかった。
【００４６】
【表２】
0006024101.tif 000003
【００４７】
【表３】
0006024101.tif 000004
【００４８】
≪血漿成分の吸着溶出実験２≫
溶出液を０．７Ｍアルギニン及び０．３ＭＮａＣｌを含んだＴＢに変更した以外は、前記吸着溶出実験１と同様に行った。素通り・洗浄液及び溶出液それぞれに含まれるＦＮ量をＥＬＩＳＡによって測定した。
【００４９】
表４にＦＮの吸着及び溶出結果を示す。
表２及び表４より、ＦＮの吸着量は実施例１と比較例１とで同程度であるが、その溶出条件において本発明の吸着剤が有利であることがわかった。すなわち、比較例１（コラーゲン）では１Ｍ  ＮａＣlの条件では吸着したＦＮの３４．４％しか溶出できず、０．７Ｍ  アルギニン及び０．３Ｍ  ＮａＣｌの条件で９９．２％溶出できた。それに対し、実施例１では、アルギニンを用いずとも１Ｍ  ＮａＣlの温和な条件で吸着したＦＮの１００％の回収が可能であった。
【００５０】
【表４】
0006024101.tif 000005
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明によれば、対象物質との高い親和性と劣化しにくさを有しつつ、温和な条件で、簡便な手順で、かつ安価で安全に、血漿のような複雑なタンパク質の混合物からであっても血液凝固因子や細胞接着因子を回収又は除去することができる。これは、血液凝固因子
や細胞接着因子の精製やそれを用いたバイオ医薬品の製造に適用できるので、産業上非常に有用である。