(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号２，７，９のいずれかに記載のアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつミトコンドリア膜組織の形成能と共に、ミトコンドリアを異常な管状又は車軸状の形態に誘導する活性を有するタンパク質を有効成分として含む、ミトコンドリアの形態の制御又は調節剤。
【請求項２】
配列表の配列番号２，７，９のいずれかに記載のアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつミトコンドリア膜組織の形成能を有すると共に、ミトコンドリアを異常な管状又は車軸状の形態に誘導する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を有効成分として含むミトコンドリアの形態の制御又は調節剤。
【請求項３】
配列表の配列番号２，７，９のいずれかに記載のアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつミトコンドリア膜組織の形成能を有すると共に、ミトコンドリアを異常な管状又は車軸状の形態に誘導する活性を有するタンパク質の群から選ばれる１種又は２種以上のタンパク質が欠損若しくは過剰発現した細胞、又はこれらのタンパク質が添加された細胞であって、ミトコンドリアの形態に異常が生じている細胞に、試験物質を添加して、当該試験物質によるミトコンドリアの形態の変化を測定することからなる、ミトコンドリアの形態を正常化させるために活性な物質をスクリーニングする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ミトコンドリアの形態を制御又は調節する機能を有するタンパク質、及び当該タンパク質をコードする遺伝子に関する。また、本発明は、ミトコンドリアに存在するタンパク質、好ましくはミトコンドリア膜タンパク質を網羅的に精製し、単離することからなるミトコンドリアの形態を制御又は調節する機能を有する新規なタンパク質、及び当該タンパク質をコードする遺伝子に関する。さらに、本発明は、ミトコンドリアの形態を制御又は調節する機能を有するタンパク質が欠損又は過剰に存在して、ミトコンドリアの形態が異常になっている細胞を用いて、ミトコンドリアの形態を正常化させる活性を有する物質をスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ミトコンドリアは真核生物の細胞内小器官で、好気性原核細胞が原始の真核細胞に細胞内共生したものと考えられている。ミトコンドリアは、細胞核とは別に独自のＤＮＡを持ち、これはミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）と呼ばれている。ｍｔＤＮＡは動物では１６〜１８ｋｂと比較的一定しているが、原生動物では６〜７７ｋｂと極めて多様である。これまでに、７００種近く生物のｍｔＤＮＡの全塩基配列が解析されてきており、全てのｍｔＤＮＡに共通している遺伝子は、２つのｒＲＮＡと電子伝達系に関与している２つの遺伝子（ｃｏｂ、及びｃｏｘ１）であることが知られている。ヒトなどの哺乳動物のｍｔＤＮＡは、約１６．５ｋｂの環状２本鎖ＤＮＡであり、１細胞当たり数百〜数千コピー存在している。ｍｔＤＮＡは、核ＤＮＡとは異なり、ほぼ隙間なく遺伝子がコードされており、ヒトでは１３種類のタンパク質、２つのｒＲＮＡ、及び２２種のｔＲＮＡがコードされている。
ミトコンドリアは、哺乳動物では約１５００種のタンパク質によって構成されているといわれている。そのうちの１３種のタンパク質だけがｍｔＤＮＡにより産生されていることになるから、残りの約９９％のタンパク質は細胞核のＤＮＡにコードされていることになる。細胞質で合成されたタンパク質は、Ｎ末端に存在するミトコンドリア指向配列（ＭＴＳ）によりミトコンドリアに選別輸送される。このようなシグナル配列によりミトコンドリアのタンパク質を補足する方法も開発されている（特許文献１及び２参照）。
【０００３】
ミトコンドリアは、生命活動に必要なＡＴＰの大部分を産生する。また、アポトーシスの誘導および活性酸素の発生などの重要な機能を有する。これらの機能は、ミトコンドリア内膜上に存在する電子伝達系の働きによる。ミトコンドリア膜は、外膜と内膜の二つの膜から構成されるが、内膜はクリステという指状構造を有する。このクリステの形態はミトコンドリアのエネルギー状態によって異なり、休止状態に比較すると高エネルギー状態では膜間腔が広がりクリステの構造が密になることが知られており、ミトコンドリアの膜形態が電子伝達系の機能調節に密接に連関していると考えられる。これまで真核生物のミトコンドリアの形態が細胞の分化や病的状態により動的に変化することが観察されており、特に肝疾患や先天性筋ジストロフィー症、胃癌や骨髄腫、またミトコンドリアＤＮＡ異常に基づく拡張型心筋症などの病的状態で、ミトコンドリアの形態や分布が著しく変化し、巨大ミトコンドリアや環状または車軸状のミトコンドリア、環状や同心円状のクリステ構造を持つミトコンドリアなどを呈することが知られている（非特許文献１及び２参照）。このように、細胞機能とミトコンドリア形態が密接な連関を有することが考えられ、ミトコンドリアのＤＮＡ変異と関連性がない疾患でもミトコンドリアの形態異常が報告されている（非特許文献３、４及び５参照）。また、脳筋症（非特許文献６参照）や、アルツハイマー病やパーキンソン病（特許文献３及び４、並びに非特許文献７及び８参照）もミトコンドリアの異常と関連性がることや、さらにＩＩ型糖尿病は、少なくとも３２４３Ａ−Ｇの変異を有するミトコンドリアｔＲＮＡで生じること（非特許文献９参照）も報告されてきている。そして、このようなミトコンドリア性の各種の疾患を処置するための医薬組成物についても開発されてきている（特許文献５及び６参照）。
【０００４】
一方、高齢化社会における生活習慣病や老化関連疾患の占める重要度は大きい。ミトコンドリアの機能は生活習慣病や老化、各種神経疾患と密接に関係があることが知られている。例えば、ミトコンドリアはＡＴＰを産生し大量の酸素を消費するが、ミトコンドリアが消費する酸素の０．４〜４％はＡＴＰ産生に関連せず、活性酸素となることが知られている。ミトコンドリアで産生されたこの活性酸素が、細胞に障害を与え、細胞数を減少させ、細胞の機能低下や、個体の老化を促進すると考えられている。
また、癌や栄養障害などにおいては、ミトコンドリア形態の異常も報告されている。本発明によって明らかにされたタンパク質群をコードする遺伝子断片や、タンパク質を認識する抗体などを用いることにより、将来的には疾患の診断マーカーなどへの応用も期待される。また、これらのタンパク質は治療標的としても考えることができ、これらのタンパク質派生体は治療薬などへの応用も考えられる。
【０００５】
したがって、ミトコンドリアの機能を正常に保ち、当該機能をうまく制御することが、老化の防止だけでなく、個体の恒常性を維持して上で極めて重要となってくる。
しかしながら、ミトコンドリアには約１５００種のタンパク質が存在すると言われているが、どのような種類のタンパク質が存在し、それらのタンパク質がどのような機能を有し、どのような関連性を有しているのかと言うことは未だに解明されていない。また、ミトコンドリア膜の形態を調節する詳しい分子メカニズムや、ミトコンドリアの膜形態と機能の連関性に関しては未だ明らかにされていない。
ミトコンドリアが有する各種の機能を解明するために、近年において多くの検討がなされてきている。例えば、ミトコンドリア膜のイオン透過性に関するもの（特許文献７参照）、カスパーゼの活性化に関するもの（特許文献８参照）、タンパク質のミトコンドリアへの細胞内移動に関するもの（特許文献９参照）、ミトコンドリアＤＮＡを用いた遺伝子検出方法に関するもの（特許文献１０参照）などが報告されてきている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００１−２２４３８９号
【特許文献２】特開平１０−１４６２００号
【特許文献３】特開２００５−８２５２３号
【特許文献４】特開２００５−１５１８１０号
【特許文献５】特開２００２−５２３４３４号
【特許文献６】特開２００４−５３８３２６号
【特許文献７】特開２００４−１８９７３０号
【特許文献８】特開２００４−６７５３１号
【特許文献９】特開２００４−４１０６７号
【特許文献１０】特開２００３−１１６５７６号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Arbustini E, Diegoli M, et al., Am J Pathol. 1998 Nov;153(5):1501-10.
【非特許文献２】Nishino I, Kobayashi O, et al., Muscle Nerve. 1998 Jan;21(1):40-7.
【非特許文献３】Ann. NY Acad. Sci., 488, 65-81, 1986
【非特許文献４】Acta haemat. 68, 241-249, 1982.
【非特許文献５】Scand. J. Gastroenterol. 33, 975-981, 1998.
【非特許文献６】Goto, Y.; Nonaka, I.; et al., Nature 348: 651-653, 1990.
【非特許文献７】Lustbader,J.W., Cirilli,M., et al., Science 304 (5669), 448-452 (2004)
【非特許文献８】Shoffner, J. M., et al., Genomics 17: 171-184, 1993.
【非特許文献９】Ouweland, J. M. W.; Lemkes, H. H. P. J.; et al., Nature Genet. 1: 368-371,1992.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
このように個体の恒常性を維持して上でミトコンドリアの機能は極めて重要であり、ミトコンドリアの有する多種多様な機能を個別に解析する必要もあるが、ミトコンドリアの機能を担っているタンパク質を網羅的に同定・解析し、ミトコンドリア膜の形態を調節しかつミトコンドリアの機能を調節するタンパク質群の機能や相互の関連性を解明することが望まれている。
本発明は、ミトコンドリアの機能を担っているタンパク質を網羅的に同定・解析し、ミトコンドリア膜の形態を調節しかつミトコンドリアの機能を調節するタンパク質群の機能や相互の関連性を解明するための方法を提供し、また本発明の方法によって同定・解析された新規なタンパク質及びその用途を提供し、さらにミトコンドリアの機能を調整する方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、ミトコンドリアを簡便にかつ効率的に単離精製する方法を検討し、次いで、得られたミトコンドリア画分から、ミトコンドリアの膜画分とマトリックス画分を分離する方法を検討し、さらに得られた膜画分におけるタンパク質を、膜貫通ドメインを持つなどの膜に強固に結合する性質を持つタンパク質群と、膜に緩く結合するタンパク質群の二つのタンパク質群に分離する方法を検討した。この結果、本発明者は、大量培養したヒト培養細胞から、細胞破砕後、遠心分離法にて粗なミトコンドリア画分を分離し、この画分を比重密度勾配遠心法にて精製することにより、高純度のミトコンドリア画分を得ることができることを見出した。そして、この精製されたミトコンドリア画分を超音波破砕した後、遠心法にて膜画分とマトリックス画分に分離し、得られた膜画分をアルカリ液にて洗浄することにより、膜に緩く結合するタンパク質群の二つのタンパク質群を分離し、残された膜画分から、膜貫通ドメインを持つなどの膜に強固に結合する性質を持つタンパク質群を得ることができることを見出した。
そして、本発明者は、このミトコンドリアの膜に強固に結合するタンパク質群を可溶化し、二次元電気泳動法により、これらのタンパク質を網羅的に解析することができることを見出した。さらに、得られたタンパク質のスポットを分離し、これらのスポットを切り抜き、ゲル内消化後ペプチドを抽出し、質量分析法およびデータベース検索にてこれらのタンパク質を同定することに成功した。
【００１０】
即ち、本発明は、配列表の配列番号１〜１５のいずれかに記載のアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、ミトコンドリア膜組織の形成能を有するタンパク質に関する。より詳細には、本発明は、配列表の配列番号１〜１２のいずれかに記載のアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、ミトコンドリア膜組織の形成能を有するタンパク質に関する。
また、本発明は、配列表の配列番号１〜２２のいずれかに記載のアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、ミトコンドリア膜組織の形成能を有するタンパク質の群から選ばれる１種又は２種以上のタンパク質が欠損若しくは過剰発現した細胞、又はこれらのタンパク質が添加された細胞であって、ミトコンドリアの形態に異常が生じている細胞に、試験物質を添加して、当該試験物質によるミトコンドリアの形態の変化を測定することからなる、ミトコンドリアの形態を正常化させるために活性な物質をスクリーニングする方法に関する。
さらに、本発明は、配列表の配列番号１〜２２のいずれかに記載のアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、ミトコンドリア膜組織の形成能を有するタンパク質からなるミトコンドリア膜組織形成剤に関する。また、本発明は、配列表の配列番号１〜２２のいずれかに記載のアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、ミトコンドリア膜組織の形成能を有するタンパク質からなるミトコンドリア膜の形態調節剤に関する。さらに、本発明は、配列表の配列番号１〜１２のいずれかに記載のアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、ミトコンドリア膜組織の形成能を有するタンパク質、及び製薬上許容される担体を含有してなる医薬組成物に関する。
また、本発明は、配列表の配列番号２３〜４４のいずれかに記載の塩基配列、又はこれらの塩基配列のうちの連続した少なくとも２０塩基の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いて、ミトコンドリア膜組織を形成するタンパク質をコードする遺伝子を検出・同定する方法に関する。
さらに、本発明は、配列表の配列番号１〜１５のいずれかに記載のアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、ミトコンドリア膜組織の形成能を有するタンパク質に対する抗体に関する。
【００１１】
また、本発明は、培養細胞から、細胞破砕後、遠心分離法にて粗なミトコンドリア画分を分離し、この画分を比重密度勾配遠心法にて精製することにより、高純度のミトコンドリア画分を製造する方法に関する。より詳細には、本発明は、精製されたミトコンドリア画分を超音波破砕し、次いで遠心法にて膜画分とマトリックス画分に分離し、得られた膜画分をアルカリ液にて洗浄することにより、膜に緩く結合するタンパク質群の二つのタンパク質群を分離し、残された膜画分から、膜貫通ドメインを持つなどの膜に強固に結合する性質を持つタンパク質群を得ることからなるミトコンドリア膜組織を形成するタンパク質群を製造する方法に関する。さらに詳細には、本発明は、培養細胞から、細胞破砕後、遠心分離法にて粗なミトコンドリア画分を分離し、この画分を比重密度勾配遠心法にて精製することにより、高純度のミトコンドリア画分を得、次いで得られた精製されたミトコンドリア画分を超音波破砕し、次いで遠心法にて膜画分とマトリックス画分に分離し、得られた膜画分をアルカリ液にて洗浄することにより、膜に緩く結合するタンパク質群の二つのタンパク質群を分離し、残された膜画分から、膜貫通ドメインを持つなどの膜に強固に結合する性質を持つタンパク質群を得ることからなるミトコンドリア膜組織を形成するタンパク質群を製造する方法に関する。
また、本発明は、ミトコンドリア膜組織を形成するタンパク質群を含有する試料を、可溶化し、二次元電気泳動法により、これらのタンパク質群を網羅的に解析する方法に関する。
さらに、本発明は、ミトコンドリア膜組織を形成するタンパク質群を含有する試料を、可溶化し、二次元電気泳動法により、これらのタンパク質群の二次元電気泳動による泳動パターンを得、得られた泳動パターンを標準泳動パターンと比較することからなるミトコンドリア膜組織を形成するタンパク質群の異常を検出、同定する方法に関する。
【００１２】
本発明をより詳細に説明すれば、本発明は以下の（１）〜（２８）に記載のとおりである。
（１）配列表の配列番号１〜１５のいずれかに記載のアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、ミトコンドリア膜組織の形成能を有するタンパク質。
（２）配列表の配列番号１〜１２のいずれかに記載のアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、ミトコンドリア膜組織の形成能を有するタンパク質。
（３）タンパク質が、ミトコンドリアに局在するタンパク質である前記（１）又は（２）に記載のタンパク質。
（４）タンパク質が、ミトコンドリアの形態を制御又は調節する機能を有するものである前記（１）又は（２）に記載のタンパク質。
（５）タンパク質が、培養細胞を細胞破砕した後、遠心分離法にて粗なミトコンドリア画分を分離し、この画分を比重密度勾配遠心法にて精製し単離されたものである前記（１）又は（２）に記載のタンパク質。
（６）配列表の配列番号１〜２２のいずれかに記載のアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、ミトコンドリア膜組織の形成能を有するタンパク質の群から選ばれる１種又は２種以上のタンパク質が欠損若しくは過剰発現した細胞、又はこれらのタンパク質が添加された細胞であって、ミトコンドリアの形態に異常が生じている細胞に、試験物質を添加して、当該試験物質によるミトコンドリアの形態の変化を測定することからなる、ミトコンドリアの形態を正常化させるために活性な物質をスクリーニングする方法。
（７）タンパク質の群が、配列表の配列番号１〜１５のいずれかに記載のアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、ミトコンドリア膜組織の形成能を有するタンパク質の群である前記（６）に記載の方法。
（８）タンパク質の群が、配列表の配列番号１９〜２２のいずれかに記載のアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、ミトコンドリア膜組織の形成能を有するタンパク質の群である前記（６）に記載の方法。
（９）ミトコンドリアの形態の正常化が、ミトコンドリアの凝集の抑制である前記（６）〜（８）のいずれかに記載の方法。
（１０）配列表の配列番号１〜２２のいずれかに記載のアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、ミトコンドリア膜組織の形成能を有するタンパク質からなるミトコンドリア膜組織形成剤。
（１１）配列表の配列番号１〜２２のいずれかに記載のアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、ミトコンドリア膜組織の形成能を有するタンパク質からなるミトコンドリア膜の形態調節剤。
（１２）配列表の配列番号１〜１５、好ましくは配列番号１〜１２のいずれかに記載のアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、ミトコンドリア膜組織の形成能を有するタンパク質、及び製薬上許容される担体を含有してなる医薬組成物。
（１３）配列表の配列番号２３〜４４のいずれかに記載の塩基配列、又はこれらの塩基配列のうちの連続した少なくとも２０塩基の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いて、ミトコンドリア膜組織を形成するタンパク質をコードする遺伝子を検出・同定する方法。
（１４）配列表の配列番号１〜１５、好ましくは配列番号１〜１２のいずれかに記載のアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、ミトコンドリア膜組織の形成能を有するタンパク質に対する抗体。
（１５）抗体が、モノクローナル抗体である前記（１４）に記載の抗体。
【００１３】
（１６）培養細胞から、細胞破砕後、遠心分離法にて粗なミトコンドリア画分を分離し、この画分を比重密度勾配遠心法にて精製することにより、高純度のミトコンドリア画分を製造する方法。
（１７）培養細胞が、ヒト細胞である前記（１６）に記載の方法。
（１８）ヒト細胞が、ヒトＨｅＬａ細胞である前記（１７）に記載の方法。
（１９）精製されたミトコンドリア画分を超音波破砕し、次いで遠心法にて膜画分とマトリックス画分に分離し、得られた膜画分をアルカリ液にて洗浄することにより、膜に緩く結合するタンパク質群の二つのタンパク質群を分離し、残された膜画分から、膜貫通ドメインを持つなどの膜に強固に結合する性質を持つタンパク質群を得ることからなるミトコンドリア膜組織を形成するタンパク質群を製造する方法。
（２０）ミトコンドリア画分が、ヒト細胞由来のミトコンドリア画分である前記（１９）に記載の方法。
（２１）培養細胞から、細胞破砕後、遠心分離法にて粗なミトコンドリア画分を分離し、この画分を比重密度勾配遠心法にて精製することにより、高純度のミトコンドリア画分を得、次いで得られた精製されたミトコンドリア画分を超音波破砕し、次いで遠心法にて膜画分とマトリックス画分に分離し、得られた膜画分をアルカリ液にて洗浄することにより、膜に緩く結合するタンパク質群の二つのタンパク質群を分離し、残された膜画分から、膜貫通ドメインを持つなどの膜に強固に結合する性質を持つタンパク質群を得ることからなるミトコンドリア膜組織を形成するタンパク質群を製造する方法。
（２２）培養細胞が、ヒト細胞である前記（２１）に記載の方法。
（２３）ヒト細胞が、ヒトＨｅＬａ細胞である前記（２２）に記載の方法。
（２４）ミトコンドリア膜組織を形成するタンパク質群を含有する試料を、可溶化し、二次元電気泳動法により、これらのタンパク質群を網羅的に解析する方法。
（２５）ミトコンドリア膜組織を形成するタンパク質群を含有する試料が、請求項４〜９のいずれかに記載の方法により得られたものである前記（２４）に記載の方法。
（２６）ミトコンドリア膜組織を形成するタンパク質群を含有する試料を、可溶化し、二次元電気泳動法により、これらのタンパク質群の二次元電気泳動による泳動パターンを得、得られた泳動パターンを標準泳動パターンと比較することからなるミトコンドリア膜組織を形成するタンパク質群の異常を検出、同定する方法。
（２７）ミトコンドリア膜組織を形成するタンパク質群を含有する試料が、請求項４〜９のいずれかに記載の方法により得られたものである前記（２６）に記載の方法。
（２８）正常なミトコンドリアの機能を有する細胞から得られたミトコンドリア膜組織を形成するタンパク質群を含有する試料を、可溶化し、二次元電気泳動法により、これらのタンパク質群の二次元電気泳動による泳動パターン。
【００１４】
次に、本発明についてさらに詳細に説明する。
本発明における「ミトコンドリア」としては、ミトコンドリアを有している生物種からのものであればよく、動物であっても植物であってもよい。好ましいミトコンドリアとしては、ヒトミトコンドリアが挙げられる。ヒトミトコンドリアを対象にすることにより、ヒトの疾患や健康、老化などの予防や治療又は診断に応用することができる。
本発明における「ミトコンドリア膜組織」とは、ミトコンドリアの外膜及び／又は内膜に強固に結合する物質群、好ましくはタンパク質群をいう。典型的な「ミトコンドリア膜組織」を形成するタンパク質としては、少なくとも１個の膜貫通ドメインを持つタンパク質が挙げられる。例えば、外膜におけるミトコンドリア局在化シグナルを認識しているＴＯＭ４０複合体を形成するＴｏｍ４０，Ｔｏｍ５、Ｔｏｍ６、Ｔｏｍ７、Ｔｏｍ２２、また、内膜における膜透過装置を形成するＴＩＭ複合体を形成するＴｉｍ１７、Ｔｉｍ２２、Ｔｉｍ２３などの膜タンパク質が挙げられる。
本発明における「ミトコンドリア膜組織形成剤」とは、前記した本発明の「ミトコンドリア膜組織」を形成するための物質、好ましくはタンパク質である。ミトコンドリア膜組織には既知及び未知の物質を含めて非常に多くの物質が存在しており、それらが単独で若しくは複合して、又は相互に関連して、ミトコンドリアのＡＴＰ産生やアポトーシスなどの多種多様な機能を発現させている。したがって、「ミトコンドリア膜組織」を正常に維持してゆくことは、個体の恒常性を維持して上で極めて重要なことである。本発明の「ミトコンドリア膜組織形成剤」は、正常なミトコンドリア膜組織において機能している物質、好ましくはタンパク質だけでなく、何等かの原因で欠損したり、又は機能不全となった異常なミトコンドリア膜組織を正常な状態に戻すために適用されるものを包含している。
本発明における「泳動パターン」とは、可溶化されたタンパク質群を二次元電気泳動にかけたときにできるこれらのタンパク質群によるスポットにより形成される二次元のスポットによる位置情報である。このような位置情報としては、写真や映像のような画像情報であってもよいし、Ｘ軸とＹ軸における数値情報であってもよい。したがって、本発明における「泳動パターン」は、目視可能な画像に限定されるものではなく、二次元電気泳動によって得られる位置情報であるということができる。
また、本発明の二次元電気泳動における展開方法としては、一次元が等電点電気泳動法で、二次元がＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による分子量の違いによる展開法が好ましいがこれに限定されるものではない。一次元目及び二次元目の展開方法としては各種の方法を採用することができる。例えば、複合体解析などによく用いられる未変性アクリルアミドゲルを用いた展開法なども採用することもできるが、等電点電気泳動法とＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による方法の組み合わせが再現性もよく好ましい。
本発明におけるその他の用語の意味は、当業者が通常使用している意味で用いられている。
【００１５】
次に、本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの具体例に限定されるものではない。
まず、大量培養したヒト培養細胞ＨｅＬａ細胞を破砕後、遠心分離法にて粗なミトコンドリア画分を分離した。この画分を比重密度勾配遠心法にて、高純度のミトコンドリア画分を精製した。このミトコンドリア画分を超音波破砕した後、遠心法にて膜画分とマトリックス画分に分離した。この膜画分には、膜貫通ドメインを持つなどの膜に強固に結合する性質を持つタンパク質群と、膜に緩く結合するタンパク質群の二つのタンパク質群が存在し、アルカリ液にて洗浄することにより、これらを分離した。このミトコンドリアの膜に強固に結合するタンパク質群を網羅的に解析するために、まずこれらのタンパク質を可溶化し、二次元電気泳動法にて２００以上のタンパク質のスポットを分離した。これらのスポットを切り抜き、ゲル内消化後ペプチドを抽出し、質量分析法にてこれらのタンパク質を同定した。同定されたタンパク質をペプチド配列ターゲッティング（Peptide sequence tagging）法を用いてデータベース検索を行ない、スポットのタンパク質をすべて同定した。２４７スポットを解析し、１７１種類のタンパク質を同定した。
上記の方法により網羅的に同定・解析されたタンパク質群には、ミトコンドリア膜の形態を調節しかつミトコンドリアの機能を調節するタンパク質が存在すると考えられる。
【００１６】
上記の方法により得られたミトコンドリアのマトリックス画分の二次元電気泳動を図１に示す。マトリックス画分と分離された膜画分の二次元電気泳動を図２に示す。そして、膜画分をアルカリ液にて洗浄して得られた膜に緩く結合するタンパク質群の二次元電気泳動を図３に示す。膜貫通ドメインを持つなどの膜に強固に結合する性質を持つタンパク質群の二次元電気泳動を図４に示す。図１〜図４の二次元電気泳動の写真の縦方向は分子量を示し、横方向は、ｐＨを示す。
これらの二次元電気泳動により展開されたパターン中にはリン酸化されたタンパク質や、各種のアイソフォームを含まれていた。
この方法により、ミトコンドリア膜組織を形成するタンパク質の２４７スポットを解析し、重複を除いた１７１種のタンパク質を同定した。これらの１７１種のタンパク質をミトコンドリアの機能に基づいて分類した結果を次の表１に示す。
【００１７】
【表１】
0005891561.tif 000002
【００１８】
これらの１７１種のタンパク質を同定した結果、特に、酵素や骨格・シャペロンやトランスポーターなど機能の同定されているタンパク質以外のタンパク質として、以下の２２種のタンパク質が得られていた。これらのタンパク質のアミノ酸配列を配列表の１〜２２にそれぞれ記載する。また、これらのタンパク質をコードしている塩基配列を配列表の２３〜４４にそれぞれ記載する。
得られたタンパク質のアミノ酸配列に基づいてデータベースを検索したところ、次のＡ〜Ｃの３群に分けることができた。
Ａ群：ゲノム研究においてその配列が推定されていたが、今までに単離され確認された
ことが無いタンパク質であって、その機能についても明らかにされていない
タンパク質。
配列番号１に記載のタンパク質：ＮＰ−０６０３３６（ＬＯＣ５４９６８）
hypothetical protein LOC54968
配列番号２に記載のタンパク質：ＮＰ−０７７０２７（ＬＯＣ７９１３５）
hypothetical protein LOC79135
配列番号３に記載のタンパク質：ＮＰ−００１００１６９２（ＦＬＪ４５１３９）
FLJ45139 protein
配列番号４に記載のタンパク質：ＮＰ−７７５９３２（ＬＯＣ２８５４９２）
hypothetical protein LOC285492
配列番号５に記載のタンパク質：ＮＰ−０７８９３７（ＬＯＣ７９７１４）
hypothetical protein LOC79714
配列番号６に記載のタンパク質：ＡＡＱ８９１５１（ＡＡＱ８９１５１）
HSAL5836
配列番号７に記載のタンパク質：ＮＰ−１１５７１６（ｃ６ｏｒｆ１２５）
chromosome 6 open reading frame 125
配列番号８に記載のタンパク質：ＢＡＣ０４４８６（ＢＡＣ０４４８６）
unnamed protein product
配列番号９に記載のタンパク質：ＮＰ−９５１０３２（Ｅ３−３ａ）
nuclear protein E3-3 isoform a 
配列番号１０に記載のタンパク質：ＮＰ−０６０２８２（ＣＨＣＨＤ３）
coiled-coil-helix-coiled-coil-helix domain 
containing 3; CHCHD3
配列番号１１に記載のタンパク質：ＮＰ−０５７０２６（ＣＧＩ−１２）
hypothetical protein LOC51001; CGI-12
配列番号１２に記載のタンパク質：Ｑ９Ｈ０７８（Ｑ９Ｈ０７８ＳＫＤ３）
suppressor of potassium transport defect 3; SKD3
配列番号１３に記載のタンパク質：ＮＰ−０６０３００（ＯＣＩＡ）
ovarian carcinoma immunoreactive antigen; OCIA
配列番号１４に記載のタンパク質：ＡＡＨ０１８３７（ＧＢＡＳ）
glioblastoma amplified sequence; GBAS
配列番号１５に記載のタンパク質：ＮＰ−１４９０６１（cat eye c5-2）
cat eye syndrome chromosome region, 
candidate 5 isoform 2 precursor
【００１９】
Ｂ群：機能の一部に関する知見はあるが、ミトコンドリアでの機能が明らかでない
タンパク質。
配列番号１６に記載のタンパク質：ＮＰ−００６３０８（ＢＡＳＰ１）
brain abundant, membrane attached signal protein 1
配列番号１７に記載のタンパク質：ＮＰ−００２０８３（ＧＲＳＦ１）
G-rich RNA sequence binding factor 1
Ｃ群：ミトコンドリアへの局在が明らかであり、機能の一部に関する知見はあるが、
ミトコンドリアの形態への影響に関する知見がないタンパク質。
配列番号１８に記載のタンパク質：ＮＰ−００２６２５（ＰＨＢ）
prohibitin; PHB
配列番号１９に記載のタンパク質：ＮＰ−０３８４７０（ＳＬＰ２）
stomatin-like protein 2; SLP2
配列番号２０に記載のタンパク質：ＮＰ−０５６１９５（ＣＧＩ−５１）
CGI-51 protein
配列番号２１に記載のタンパク質：ＮＰ−００６１０９（ＨＡＸ−１）
HS1 binding protein; HAX1
配列番号２２に記載のタンパク質：ＮＰ−００４４８４（ＨＡＤＨ２）
hydroxyacyl-Coenzyme A dehydrogenase, type II; HADH2
【００２０】
これらのタンパク質のうち、Ａ群に記載されている１５種のタンパク質は、ヒトゲノム解析により、遺伝子の塩基配列は知られることになったが、その機能はもとより、当該タンパク質がどこに存在し、どのような形態で存在しているのか、ということは全く知られておらず、しかもタンパク質自体は未だ人間が入手したことの無いものであり、本発明により初めて単離され、同定されたものである。したがって、これらのタンパク質は人類が初めて取得し、その作用を確認することができた新規なタンパク質である。
また、Ａ群の中の配列番号１３〜１５に記載のタンパク質は、ゲノム研究などにおいてその配列が推定されていたが、今までに単離され確認されたことが無いタンパク質ではあるが、ある種の疾患との関連性が推定されていたタンパク質である。しかし、これらのタンパク質自体も未だ人間が入手したことの無いものであり、本発明により初めて単離され、同定されたものである。したがって、これらのタンパク質は人類が初めて取得し、その作用を確認することができた新規なタンパク質である。例えば、配列番号１３のＮＰ−０６０３００と命名されているタンパク質は、卵巣癌のｃＤＮＡライブラリーから免疫スクリーニング法により染色体４ｐ１１に配座する遺伝子であるとされたものである（Biochem. Biophys. Res. Commun. 280 (1), 401-406 (2001)）。また、配列番号１４のＡＡＨ０１８３７と命名されたタンパク質は、ヒト及びマウスにおける全長が１５０００以上のｃＤＮＡの解析から推定されたものである（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (26), 16899-16903 (2002)）。さらに、配列番号１５のＮＰ−１４９０６１と命名されたタンパク質は、ヒトのネコ眼症候群（cat eye syndrome）のクリティカル領域及びマウスの保存されたシンテニー（synteny）の解析及び第２２染色体のセントロメア周辺における候補遺伝子の探索から推定されたものである（Genome Res. 11 (6), 1053-1070 (2001)）。
【００２１】
一方、Ｂ群及びＣ群に分類されているタンパク質は、いずれも単離・確認されて、その機能もある程度は明らかにされているものである。例えば、Ｂ群の配列番号１６に記載のＮＰ−００６３０８と命名されたタンパク質は、軸索末端におけるミリスチン酸でエステル化されるタンパク質であるＢＡＳＰ１ファミリーとして、その一次構造の解析と物理化学的性質の検討も報告され（Biochimie 79 (6), 373-384 (1997)）、このタンパク質は一過性のリン酸化サイト及びＰＥＳＴモチーフを有するに膜結合タンパク質である。また、配列番号１７に記載のＮＰ−００２０８３と命名されたタンパク質は、保存されたＧ−リッチエレメントに関連しているポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡ結合タンパク質であるＧＲＳＦ−１として報告され（Nucleic Acids Res. 22 (12), 2334-2343 (1994)）、このタンパク質は細胞質に局在し、スプライシングのされかたによるいくつかの変形が報告されているが、全長についての報告は未だなされていないものである。
このようにＣ群に分類されているタンパク質は、ある程度の機能は既に報告されているが、しかし、これらの機能がミトコンドリア機能と関連していることは未だ報告されていない。
Ｃ群のタンパク質は、既にミトコンドリアへの局在が明らかにされてきており、機能の一部に関する知見は報告されていきているが、ミトコンドリアの形態に影響を与えるタンパク質であることは報告されていないタンパク質である。
【００２２】
これらのタンパク質のアミノ酸配列からそれらのドメイン構造を考察した結果を図５及び図６に示す。図５には配列番号１〜１２のタンパク質のドメイン構造を示し、図６は配列番号１３〜２３のタンパク質のドメイン構造を示しており、各図の左側の名称はそれぞれの配列番号のタンパク質の名称を示している。即ち、前記した配列番号の各タンパク質において、括弧内に示した名称で表示されている。図５及び図６の各ボックスの右側の数字は各タンパク質のアミノ酸数を示している。また、図５及び図６のボックスの長さはアミノ酸長の長さの概要を示し、各ボックスにおける片斜線の部分は弱いミトコンドリアターゲットシグナル（weak MTS）であることを示し、ハッチング部分はミトコンドリアターゲットシグナル（MTS）であることを示し、黒塗りつぶし部分（原図は青色）は強い膜貫通ドメイン（strong TM）であることを示し、灰色塗りつぶし部分（原図は水色）は弱い膜貫通ドメイン（weak TM）であることを示す。図５及び図６中の「ＣＣ」はコイルドコイルドドメインであることを示し、「ｍＴＥＲＦ」は、ミトコンドリア転写終止因子（mitochondrial transcription termination factor）の保存配列であることを示し、「ＡＮＫ  ｒｅｐ」は、アンキリン  リピート配列であることを示し、「ＡＴＰａｓｅ」は、ＡＴＰ分解酵素保存配列であることを示し、「ｍｙｒ」は、ミリスチル化部位保存配列であることを示し、「ＰＥＳＴ」は、タンパク質の分解シグナルであるＰＥＳＴ配列であることを示し、「ＲＲＭ」は、ＲＮＡ認識モチーフ配列であることを示し、「Ｂａｃ．Ｓｕｒｆａｃｅ  Ａｇ」は、バクテリア表面抗原（Bacterial surface antigen）の保存配列であることをそれぞれ示す。
【００２３】
これらのタンパク質の機能をさらに解明するために、Ａ群のタンパク質をコードしている遺伝子を単離し、これにＦＬＡＧタグを融合させた遺伝子を真核細胞の発現ベクターにサブクローニングした後、これを培養細胞に導入し、発現する遺伝子産物の局在性やミトコンドリア形態への影響等を免疫染色にて検討した。
このためにＡ群に属するタンパク質であるｃ６ｏｒｆ１２５（配列番号７）、Ｅ３−３ａ（配列番号９）、及びＬＯＣ７９１３５（配列番号２）をコードする遺伝子を、それぞれＦＬＡＧタグを付してＨｅＬａ細胞へ導入して発現させ、これをチトクロームＣに対する抗体（α−ｃｙｔ．ｃ）、及びタグ標識タンパク質（α−ＦＬＡＧ）を用いて二重染色による免疫染色を検討した。その結果を図７及び図８に示す。図７の左側の写真はそれぞれの細胞におけるミトコンドリアの顕微鏡写真である。左から２番目の写真は、チトクロームＣに対する抗体（α−ｃｙｔ．ｃ）により染色（赤色）したものを示し、左から３番目の写真は、タグ標識タンパク質（α−ＦＬＡＧ）で染色（緑色）したものを示し、右側の写真はこれらをマージしたものである。図８の写真は図７の拡大像を示している。
この結果、ｃ６ｏｒｆ１２５（配列番号７）、Ｅ３−３ａ（配列番号９）、及びＬＯＣ７９１３５（配列番号２）のタンパク質はいずれもミトコンドリアに局在しており、ｃ６ｏｒｆ１２５及びＥ３−３ａでは、ミトコンドリアは管状の形態となり、当該を管状の形態のトコンドリアの先端部に局在しており、これらのタンパク質はミトコンドリアの融合や分裂に関与するものであると考えられ、また、ＬＯＣ７９１３５ではミトコンドリアが車軸状の形態となり、このタンパク質はミトコンドリアを車軸状の形態に誘導する活性があることが示された。
【００２４】
また、Ａ群に属するタンパク質のうちのＬＯＣ７９７１４（配列番号５）、ＣＨＣＨＤ３（配列番号１０）、及びＯＣＩＡ（配列番号１３）について、同様に免疫染色にて検討した。その結果を図９に示す。図９の左側の写真はそれぞれの細胞におけるミトコンドリアの顕微鏡写真である。左から２番目の写真は、チトクロームＣに対する抗体（α−ｃｙｔ．ｃ）で染色（赤色）したものを示し、左から３番目の写真は、タグ標識タンパク質（α−ＦＬＡＧ）で染色（緑色）したものであり、右側の写真はこれらをマージしたものである。
この結果、ＬＯＣ７９７１４（配列番号５）、ＣＨＣＨＤ３（配列番号１０）、及びＯＣＩＡ（配列番号１３）のいずれのタンパク質もミトコンドリアに局在化しており、ＬＯＣ７９７１４及びＣＨＣＨＤ３では、ミトコンドリアが細胞核の近辺に凝集しており、これらのタンパク質はミトコンドリアを細胞内で凝集させる活性を有することが示された。
【００２５】
次に、Ｃ群に属するＰＨＢ（配列番号１８）、ＳＬＰ２（配列番号１９）、ＨＡＤＨ２（配列番号２２）、ＣＧＩ−５１（配列番号２０）、及びＨＡＸ−１（配列番号２１）の各タンパク質をコードする遺伝子について、同様のＦＬＡＧタグをしようして免疫染色を行なった。なお、ＰＨＢ、ＳＬＰ２、及びＨＡＤＨ２の免疫染色には、抗体としてチトクロームＣ抗体（cyt. C）に代えて、ミトコンドリア膜間腔（内膜と外膜の間）に局在するタンパク質ＯＰＡ１（OPTIC ATROPHY 1)に対する抗体（α−ＯＰＡ１）を用いた。この結果を図１０に示す。図１０の上の３段は、それぞれＰＨＢ、ＳＬＰ２、及びＨＡＤＨ２の結果を示し、これらはＯＰＡ１抗体（α−ＯＰＡ１）により緑色に染色され、α−ＦＬＡＧタグタンパク質により赤色に染色されている。図１０の下の２段はＣＧＩ−５１及びＨＡＸ−１の結果を示し、これらはチトクロームＣに対する抗体（α−ｃｙｔ．ｃ）により赤色に染色されており、タグ標識タンパク質（α−ＦＬＡＧ）により緑色に染色されている。また、図１０の左側の写真はそれぞれの細胞におけるミトコンドリアの顕微鏡写真である。左から２番目の写真は、ＯＰＡ１抗体（α−ＯＰＡ１）により染色（緑色）したもの（上３段）、又はチトクロームＣに対する抗体（α−ｃｙｔ．ｃ）により染色（赤色）したもの（下２段）を示し、左から３番目の写真は、タグ標識タンパク質（α−ＦＬＡＧ）で染色（赤色）したもの（上３段）、又はタグ標識タンパク質（α−ＦＬＡＧ）で染色（緑色）したもの（下２段）を示し、右側の写真はこれらをマージしたものである。これらの結果、本発明のＣ群に属するタンパク質のいずれも、ミトコンドリアの形態を凝集させる活性があることを示した。
【００２６】
次に、Ｃ群に属するＰＨＢ（配列番号１８）及びＳＬＰ２（配列番号１９）のタンパク質について、ミトコンドリア膜電位の変化について検討してみた。ＰＨＢ及びＳＬＰ２のそれぞれのカルボキシル末端にＦＬＡＧタグを融合させた融合タンパク質をコードする遺伝子をＨｅＬａ細胞に強制発現させ、これらの細胞におけるミトコンドリア膜電位を、ミトコンドリア膜電位に依存したミトコンドリア染色マーカーＲｈ１２３で検出した。その結果を図１１に示す。図１１の上段はＰＨＢの場合を示し、中段はＳＬＰ２の場合を示し、下段の−は遺伝子導入をしていない正常コントロールの細胞の場合を示す。図１１の左側の写真はミトコンドリア染色マーカーＲｈ１２３で染色（緑色）した場合を示し、右側は顕微鏡写真を示す。
これらの結果、ＳＬＰ２の過剰発現細胞ではミトコンドリアの膜電位の低下が認められなかったものの、ＰＨＢの過剰発現細胞ではミトコンドリアの膜電位の低下が認められた（図１１の上段の左側の写真中の矢印参照）。このことは、ＰＨＢタンパク質がミトコンドリアにおいて膜電位の調節に関わっている可能性を示しており、本発明におけるタンパク質の中には、ミトコンドリアの形態の制御だけでなく、ミトコンドリアの膜電位の制御に関連しているタンパク質が包含されていることが示された。
【００２７】
以上のように、本発明で示された２２種のタンパク質はミトコンドリアの形態の制御に関連しており、ミトコンドリアの膜組織を形成するための作用、及び／又はミトコンドリアの形態若しくはミトコンドリア膜の形態を調節・制御する作用を有しており、ミトコンドリアの形態の異常や、ミトコンドリア膜の形態の異常や、さらにミトコンドリアの膜構造の異常を修復させ正常化させるための試薬として有用となる。
したがって、本発明は、前記したＡ群に属する新規なタンパク質を提供するものである。本発明のこれらの１５種のタンパク質は、それぞれ配列表の配列番号１〜１５に記載されるアミノ酸配列を有するものであるが、当該アミノ酸配列は、ミトコンドリアの形態を制御又は調節することができる活性を有している範囲において、配列表に各々記載されている全アミノ酸配列における５０％以下の数のアミノ酸が他のアミノ酸に置換され、同じく１００％以下の数のアミノ酸が付加され、及び／又は、同じく５０％以下の数のアミノ酸が欠失してなるアミノ酸配列を有するものであってもよい。本発明のタンパク質としては、配列表の配列番号１〜１５に記載されているタンパク質、及び当該タンパク質と５０％以上、好ましくは７０％以上、又は８０％以上、より好ましくは９０％以上のアミノ酸配列における相同性を有するものであって、ミトコンドリアの形態を制御又は調節することができる活性を有しているタンパク質が包含される。
また、本発明は、前記したＡ〜Ｃ群に属するタンパク質の群から選ばれる１種又は２種以上のタンパク質からなるミトコンドリア膜組織形成剤、及びミトコンドリア膜の形態調節剤を提供するものである。
さらに、本発明は、前記したＡ〜Ｃ群に属する２２種のタンパク質の群から選ばれる１種又は２種以上のタンパク質が欠損若しくは過剰発現した細胞、又はこれらのタンパク質が添加された細胞であって、ミトコンドリアの形態に異常が生じている細胞に、試験物質を添加して、当該試験物質によるミトコンドリアの形態の変化を測定することからなる、ミトコンドリアの形態を正常化させるために活性な物質をスクリーニングする方法を提供するものである。
【００２８】
ミトコンドリアは、生体のエネルギー生産に関与しているだけではなく、活性酸素の供給や、アポトーシスにも強い関連性を有しており、拡張型心筋症、骨髄腫、胃癌、糖尿病などの各種の疾患だけでなく、栄養障害や加齢などにより形態変化を起こすことが知られている。このようなミトコンドリアの形態の変化に、本発明の２２種のタンパク質は強い関連性を有しており、これらのタンパク質によりミトコンドリアの形態を制御し、調節することも可能となる。
したがって、本発明のミトコンドリア膜組織形成剤、及びミトコンドリア膜の形態調節剤は、ミトコンドリアの形態異常に起因する各種の疾患や、栄養障害や加齢などによるミトコンドリアの形態の異常を修復するための有効成分として、ミトコンドリアの形態異常に起因する各種の疾患を治療・予防するための医薬組成物の成分として有用なだけでなく、栄養障害や加齢などによる体力の減退を予防・回復するための有効成分として有用である。本発明の医薬組成物は、前記した本発明のＡ〜Ｃ群に属するタンパク質の群から選ばれる１種又は２種以上のタンパク質、及び製薬上許容される担体を含有してなるものである。本発明の医薬組成物における有効成分としてのタンパク質は、タンパク質自体であってもよいが、必要により当該タンパク質に対する抗体、当該タンパク質をコードする遺伝子、頭蓋タンパク質の発現を抑制するためのアンチセンスなどであってもよい。
【００２９】
本発明の医薬組成物における「製薬上許容される担体」としては、賦形剤、希釈剤、増量剤、崩壊剤、安定剤、保存剤、緩衝剤、乳化剤、芳香剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤等が挙げられる。本発明の医薬組成物は、必要により、前記した製薬上許容される担体の一種以上を用いることにより、錠剤、散剤、顆粒剤、注射剤、液剤、カプセル剤、トローチ剤等の形態に製剤化することができる。本発明の医薬組成物は、経口又は非経口、好ましくは非経口投与される。非経口投与のための剤型としては、注射剤や粘膜投与剤などが挙げられる。
本発明の医薬組成物の投与量は、患者の年齢、性別、体重及び症状、治療効果、投与方法、処理時間、あるいは該医薬組成物に含有される有効成分（前記したタンパクや、その抗体など）の種類などにより異なるが、通常成人一人当たり、有効成分の量として一回につき１μｇから１００ｍｇの範囲で投与される。
【００３０】
本発明のスクリーニング方法としては、次の（１）から（４）、
（１）前記したＡ〜Ｃ群に属する２２種のタンパク質の群から選ばれる１種又は２種以上のタンパク質が欠損若しくは過剰発現した細胞、又はこれらのタンパク質が添加された細胞を培養し、
（２）当該培養された細胞におけるミトコンドリアの形態に異常を生じさせ、
（３）ミトコンドリアの形態に異常が生じている細胞に、試験物質を添加して、
（４）当該試験物質による、当該細胞におけるミトコンドリアの形態の変化を観察・測定する、
ことからなるものである。
この方法における細胞としては、ヒトの細胞、サルの細胞、マウスの細胞、ラットの細胞などの動物細胞、大腸菌、酵母などの微生物細胞などを使用することができる。また、これらの細胞に目的タンパク質を過剰発現させる方法としては、１又は２以上のコピー数を有する遺伝子を用いて形質転換する方法が挙げられる。形質転換方法としては当業者によく知られている通常の手法を採用することができる。また、抗体を用いて目的のタンパク質の機能を障害させたり、遺伝子を欠損させて目的のタンパク質の発現を抑制することもできる。欠損させる方法としては、突然変異法やターゲッティング法などを採用することができる。さらに、細胞種によっては、培養系に目的のタンパク質を添加することにより、目的のタンパク質の過剰発現系と同種の状況を形成してもよい。
ミトコンドリアの形態の変化を観察・測定する方法としては、顕微鏡により観察する方法、目的のタンパク質の抗体による免疫染色法、タグタンパク質による方法、ＧＦＰなどの蛍光法などの各種の方法を採用することができる。
本発明のミトコンドリアの形態を正常化させるために活性な物質をスクリーニングする方法により、活性を有すると判定された物質は、ミトコンドリアの各種の機能障害に対する有効成分として有用な物質である。これらの有効性が確認された物質は、医薬の有効成分として、また化粧品や機能性食品における成分として有用である。
【００３１】
本発明の前記した各タンパク質に対する抗体を製造することもできる。したがって、本発明は、前記した本発明の２２種のタンパク質に対する抗体、好ましくは特異的抗体を提供するものである。
本発明のこれらの抗体は、公知の一般的な製造方法によって製造することができる。例えば、本発明のタンパク質又はその一部のアミノ酸配列からなるタンパク質を免疫原（抗原）として、必要に応じてフロイントアジュバント（Freund's Adjuvant）とともに、哺乳動物、好ましくは、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ニワトリ、ネコ、イヌ、ブタ、ヤギ、ウマあるいはウシ、より好ましくはマウス、ラット、ハムスター、モルモットまたはウサギに免疫することにより製造できる。ポリクローナル抗体は、当該免疫感作動物から得た血清から取得することができる。またモノクローナル抗体は、当該免疫感作動物から得た抗体産生細胞（脾臓、リンパ節、骨髄あるいは扁桃等、好ましくは脾臓のＢ細胞）と自己抗体産生能のない骨髄腫系細胞（ミエローマ細胞）からハイブリドーマを調製し、該ハイブリドーマをクローン化し、哺乳動物の免疫に用いた抗原に対して特異的親和性を示すモノクローナル抗体を産生するクローンを免疫学的測定法（ＥＬＩＳＡなど）により選択することによって製造することができる。
【発明の効果】
【００３２】
本発明は、ミトコンドリアの機能や形態を制御又は調節するタンパク質を網羅的に同定する手法を提供するものであり、本発明の方法によりミトコンドリアの形態を制御又は調節する機能を有するタンパク質を初めて単離し特定することが可能となった。したがって、本発明は、ミトコンドリアの形態を制御又は調節する機能を有する新規なタンパク質を提供するものであり、本発明によりミトコンドリアの形態を制御又は調製するためのミトコンドリア膜組織形成剤及びミトコンドリア膜の形態調節剤が提供される。本発明のミトコンドリア膜組織形成剤及びミトコンドリア膜の形態調節剤は、ミトコンドリアの形態を正常化させることにより、ミトコンドリアの機能を正常化させ、ミトコンドリアの異常に起因する各種の疾患の治療や予防を可能とするだけでなく、栄養障害や加齢に伴うミトコンドリアの機能の減退を回復し、また当該機能を維持することを可能とするものである。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１は、本発明の方法により得られたミトコンドリアのマトリックス画分の二次元電気泳動を示す図面に代わる写真である。
【図２】図２は、本発明の方法により得られたマトリックス画分と分離された膜画分の二次元電気泳動を示す図面に代わる写真である。
【図３】図３は、本発明の方法により得られた膜画分をアルカリ液にて洗浄して得られた膜に緩く結合するタンパク質群の二次元電気泳動を示す図面に代わる写真である。
【図４】図４は、本発明の方法により得られた膜貫通ドメインを持つなどの膜に強固に結合する性質を持つタンパク質群の二次元電気泳動を示す図面に代わる写真である。
【図５】図５は、本発明の配列番号１〜１２で示されるタンパク質のアミノ酸数とそれらのドメイン構造を模式的に示したものである。
【図６】図６は、本発明の配列番号１３〜２３で示されるタンパク質のアミノ酸数とそれらのドメイン構造を模式的に示したものである。
【図７】図７は、本発明のタンパク質であるｃ６ｏｒｆ１２５（配列番号７）、Ｅ３−３ａ（配列番号９）、及びＬＯＣ７９１３５（配列番号２）をコードする遺伝子を含有する遺伝子を、それぞれＨｅＬａ細胞へ導入して発現させたときの免疫染色の結果を示す図面に代わるカラー写真である。
【図８】図８は、本発明のタンパク質であるｃ６ｏｒｆ１２５（配列番号７）、Ｅ３−３ａ（配列番号９）、及びＬＯＣ７９１３５（配列番号２）をコードする遺伝子を含有する遺伝子を、それぞれＨｅＬａ細胞へ導入して発現させたときの免疫染色の結果を示す図面に代わるカラー写真である。
【図９】図９は、本発明のＡ群に属するタンパク質のうちのＬＯＣ７９７１４（配列番号５）、ＣＨＣＨＤ３（配列番号１０）、及びＯＣＩＡ（配列番号１３）をコードする遺伝子を含有する遺伝子を、それぞれＨｅＬａ細胞へ導入して発現させたときの免疫染色の結果を示す図面に代わるカラー写真である。
【図１０】図１０は、本発明のＣ群に属するＰＨＢ（配列番号１８）、ＳＬＰ２（配列番号１９）、ＨＡＤＨ２（配列番号２２）、ＣＧＩ−５１（配列番号２０）、及びＨＡＸ−１（配列番号２１）の各タンパク質をコードする遺伝子を含有する遺伝子を、それぞれＨｅＬａ細胞へ導入して発現させたときの免疫染色の結果を示す図面に代わるカラー写真である。
【図１１】図１１は、本発明のＣ群に属するＰＨＢ（配列番号１８）及びＳＬＰ２（配列番号１９）のタンパク質をコードする遺伝子を含有する遺伝子を、それぞれＨｅＬａ細胞へ導入して発現させたときの、これらの細胞におけるミトコンドリア膜電位を、ミトコンドリア膜電位に依存したミトコンドリア染色マーカーＲｈ１２３で検出した結果を示す図面に代わるカラー写真である。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００３５】
ミトコンドリア膜画分の単離と検定
ＤＭＥＭに１０％ＦＢＳを添加した培養液を用いて培養した５ｘ１０８から１ｘ１０９個のＨｅＬａ細胞をトリプシン処理した後に回収し、ＰＣＶ（packed cell volume）を測定した。細胞塊を１０ｘＰＣＶ量の低張液で懸濁したのち、ポッター型ホモゲナイザーでホモゲナイズした後、ショ糖液にて等張とした。これを高速冷却遠心機にて６００ｇで、１０分間、４℃にて遠心分離し、上清を細胞質画分とした。得られた細胞質画分を、さらに高速冷却遠心機にて１００００ｇで、１０分間、４℃にて遠心分離し、沈殿をミトコンドリア粗画分とした。この沈殿を、等張ショ糖液で懸濁後、密度勾配遠心法に用いた。密度勾配遠心は、ＯｐｔｉＰｒｅｐＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、その３５％及び１３％、並びに６％Ｐｅｒｃｏｌ（Ｄｉｆｃｏ社製）の段階的傾斜濃度（step gradient）を用いて、２００００ｒｐｍで、１６時間、４℃の遠心分離を施行した後、ミトコンドリアのバンドを得た。これを等張ショ糖液で洗浄し、純ミトコンドリア画分とした。
得られた純ミトコンドリア画分を超音波で破砕した後、冷却ミクロ遠心機にて１５０００ｒｐｍで、１０分遠心分離して非破砕ミトコンドリアを沈殿として取り除いた後、上清を卓上超遠心機にて１０００００ｒｐｍで、２０分、４℃にて遠心分離し、沈殿を粗なミトコンドリア膜画分（Ａ）とし、その上清をマトリックス画分（Ｂ）とした。粗な膜画分をアルカリ液にて処理したのち、この条件で超遠心分離を行い、沈殿をミトコンドリア膜に強固に結合するタンパク質群（Ｃ）とし、その上清をミトコンドリア膜に弱く結合するタンパク質群（Ｄ）とした。
これらの各ミトコンドリア画分の分画の可否を検討するために、それぞれの精製段階で二次元電気泳動にて検討した。二次元電気泳動は以下の方法で実施した。まず各々の画分約２００ｍｇのタンパク質をＴＣＡ沈殿法で精製し、７Ｍ尿素及び２Ｍチオ尿素を含むサンプル用緩衝液で可溶化した。これをｐＨ３−１０のレンジの非線形の等電点電気用ゲル（ImmobilineTM DryStrip pH3-10 NL: Amersham Biosciences）を用いて一次元電気泳動法を施行後、ヨードアセトアミドにてアルキル化処理して、二次元目の電気泳動に供した。二次元目の電気泳動は１０％または１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥを施行し、銀染色またはＣＢＢ染色にてタンパク質のスポットを検出した。
【００３６】
図１は粗なミトコンドリア膜画分（Ａ）を用いて、また図２はマトリックス画分（Ｂ）を用いて、前述の二次元電気泳動法を用いて展開した図である。二次元目には１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを施行し、銀染色にてタンパク質のスポットを検出した。その結果、図１と図２の二つのサンプルを比較すると、マトリックス画分には可溶性のタンパク質（例えばＨＳＰ６０：図１及び図２中の矢印参照）が多くみられ、超音波破細と超遠心法による分離はよく行なわれていることがわかった。
図３は、同様の方法でミトコンドリア膜に強固に結合するタンパク質群（Ｃ）について検討した結果であり、図４は同様にミトコンドリア膜に弱く結合するタンパク質群（Ｄ）について検討した結果である。なお、ゲルの染色はＣＢＢ染色法を用いた。その結果、膜タンパク質（例えばＡＴＰ合成酵素ｄサブユニット：図３及び図４中の矢印参照）は膜に強固に結合するタンパク質群（Ｃ）に多く見られることなどから、アルカリ洗浄法による精製はよく行なわれたことがわかった。
【実施例２】
【００３７】
ミトコンドリア膜に強固に結合するタンパク質群の２次元展開とタンパク質の網羅的同定
前記した実施例１で得られたミトコンドリア膜に強固に結合するタンパク質群（Ｃ）を網羅的に解析するために、この画分を改めて１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて二次元電気泳動法を行い、ＣＢＢ染色の染色性を高めてタンパク質を検出したところ、合計２４７スポットを検出した（図３参照）。
これらのスポットをすべて切り出し、トリプシンにてゲル中での消化（in gel digestion）を行った後、ペプチドを精製し、これをＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（ナノＬＣとしてＰａｒａｄｉｇｍ  ＭＳ−４と、ＭＳ／ＭＳとしてＦｉｎｉｇａｎ  ＬＴＱとを組み合わせて用いた。）にて分析し、ペプチド配列タギング（Peptide sequence tagging）法を用いてデータベース検索を行ない、各スポットのタンパク質をすべて同定した。２４７個のスポットを解析し、重複を排除して１７１種類のタンパク質を同定した。その結果を分類したものを表１に示した。以上の結果から、同定されたタンパク質がミトコンドリアタンパク質であり、実施例１に記載したミトコンドリアの精製標品の純度が高いことが示された。
表１で同定されたタンパク質の中で、新たにミトコンドリアの形態や機能の調節に関与する可能性のあるタンパク質に着目し、各々のタンパク質の生物学的情報の程度により以下の（Ａ）〜（Ｃ）の３群に分類した。
Ａ．機能が明らかにされていないタンパク質群。
Ｂ．機能の一部に関する知見はあるが、ミトコンドリアでの機能が明らかでないタンパ    ク質群。
Ｃ．ミトコンドリアへの局在が明らかであり、機能の一部に関する知見はあるが、ミト    コンドリアの形態への影響に関する知見がないタンパク質群。
【００３８】
これらのタンパク質の中のＡ群に属する１５種（Ａ−１〜Ａ−１５）、Ｂ群に属する２種（Ｂ−１〜Ｂ−２）、及びＣ群に属する５種（Ｃ−１〜Ｃ−５）の合計２２種のタンパク質について、同定した結果と一致するアミノ酸配列を有するものをデーターベースにより検索した結果を以下に示す。これらのタンパク質群の各タンパク質の検索結果に基づくアミノ酸配列と、その合致した部分アミノ酸配列（以下のアミノ酸配列中で下線が付されている部分。）を以下に示す。以下の表示では各アミノ酸はアミノ酸の１文字表記で示されている。
（１）タンパク質Ａ−１（配列番号１に記載のタンパク質）：
検索結果：ＮＰ＿０６０３３６    hypothetical protein LOC54968
ＡＡ’によるアミノ酸配列の一致率（protein coverage by AA's）：１０．００％
検索されたアミノ酸配列とその一致部分
ｍｌｆｌａｌｇｓｐｗ  ａｖｅｌｐｌｃｇｒｒ  ｔａｌｃａａａａｌｒ
1
ｇｐｒａｓｖｓｒａｓ  ｓｓｓｇｐｓｇｐｖａ  ｇｗｓｔｇｐｓｇａａ
31
ｒｌｌｒｒｐｇｒａｑ  ｉｐｖｙｗｅｇｙｖｒ  ｆｌｎｔｐｓｄｋｓｅ
61
ｄｇｒｌｉｙｔｇｎｍ  ａｒａｖｆｇｖｋｃｆ  ｓｙｓｔｓｌｉｇｌｔ
91
ｆｌｐｙｉｆｔｑｎｎ  ａｉｓｅｓｖｐｌｐｉ  ｑｉｉｆｙｇｉｍｇｓ
121
ｆｔｖｉｔｐｖｌｌｈ  ｆｉｔｋｇｙｖｉｒｌ  ｙｈｅａｔｔｄｔｙｋ
151
ａｉｔｙｎａｍｌａｅ  ｔｓｔｖｆｈｑｎｄｖ  ｋｉｐｄａｋｈｖｆｔ
181
ｔｆｙａｋｔｋｓｌｌ  ｖｎｐｖｌｆｐｎｒｅ  ｄｙｉｈｌｍｇｙｄｋ
211
ｅｅｆｉｌｙｍｅｅｔ  ｓｅｅｋｒｈｋｄｄｋ
241                                     260
（下線部分は、配列合致部分を示す。以下同じ。）
【００３９】
（２）タンパク質Ａ−２（配列番号２に記載のタンパク質）：
検索結果：ＮＰ＿０７７０２７    hypothetical protein LOC79135
ＡＡ’によるアミノ酸配列の一致率（protein coverage by AA's）：１３．１３％
検索されたアミノ酸配列とその一致部分
ｍｆｋｖｉｑｒｓｖｇ  ｐａｓｌｓｌｌｔｆｋ  ｖｙａａｐｋｋｄｓｐ
1
ｐｋｎｓｖｋｖｄｅｌ  ｓｌｙｓｖｐｅｇｑｓ  ｋｙｖｅｅａｒｓｑｌ
31
ｅｅｓｉｓｑｌｒｈｙ  ｃｅｐｙｔｔｗｃｑｅ  ｔｙｓｑｔｋｐｋｍｑ
61
ｓｌｖｑｗｇｌｄｓｙ  ｄｙｌｑｎａｐｐｇｆ  ｆｐｒｌｇｖｉｇｆａ
91
ｇｌｉｇｌｌｌａｒｇ  ｓｋｉｋｋｌｖｙｐｐ  ｇｆｍｇｌａａｓｌｙ
121
ｙｐｑｑａｉｖｆａｑ  ｖｓｇｅｒｌｙｄｗｇ  ｌｒｇｙｉｖｉｅｄｌ
151
ｗｋｅｎｆｑｋｐｇｎ  ｖｋｎｓｐｇｔｋ
181                                  198
【００４０】
（３）タンパク質Ａ−３（配列番号３に記載のタンパク質）：
検索結果：ＮＰ＿００１００１６９２    FLJ45139 protein
ＡＡ’によるアミノ酸配列の一致率（protein coverage by AA's）：  ４．４１％
検索されたアミノ酸配列とその一致部分
ｍｋｋｒｆｙｎａｋｔ  ｖｓｉｌｌｖｋｑｑｎ  ｎｗａｉｓｓｑｌｈｈ
1
ｑｌｍｐｎｌｅｓｉｗ  ｌｒｍｅｋｅｓｌｐｒ  ｓｌｎｆｄｈｈｇｉｙ
31
ｍｎｗｑｔｋｆｍｌｌ  ｌｋｔｖｓｉｐｒｓｑ  ａｉｆｔｑｐｇｌｇｓ
61
ｇｔｐｑｇｙｋｑｓｈ  ｓａｌｇｗａａｔｌｓ  ｃｗｇｋｄｇｓｒｑｌ
91
ｓｗｖｔａｇｓｓｆｈ  ｋｓｄｌｉｓ
121                              136
【００４１】
（４）タンパク質Ａ−４（配列番号４に記載のタンパク質）：
検索結果：ＮＰ＿７７５９３２    hypothetical protein LOC285492
ＡＡ’によるアミノ酸配列の一致率（protein coverage by AA's）：１０．８６％
検索されたアミノ酸配列とその一致部分
ｍｒｌｐｇａｐａｌｐ  ｄａｄｆｌｖｈｌｈｆ  ｌｖｑｔｓｗｆｉｃｎ
1
ｆｌｖｒｉｐｗａｓａ  ｌｐｄａｐａｌｌｖｉ  ｌｅｋｔｆｐｅｈａｔ
31
ｃｒｇｃｗｖｓｇｙｌ  ｃｗｔａｐｇｎｃｉｃ  ｓａｎｖｇｆｌｋｉｅ
61
ｎｔｙｒｑｉｈｈｔｈ  ｍｈｒｈｔｈｔｈｔｄ  ｋｓｉｔｈｔｃｔｄｔ
91
ｈｔｑｓｑｒｈｒｌｔ  ｓｒａｌｒｌｆｉｌｎ  ａｉｔｄｔｓｋｆｇａ
121
ａｖｆｆｙｖｙｃｌｆ  ａｄｓｖｙｋｆｆｐｆ  ｌｐｐｆｒ
151                                                  175
【００４２】
（５）タンパク質Ａ−５（配列番号５に記載のタンパク質）：
検索結果：ＮＰ＿０７８９３７    hypothetical protein LOC79714
ＡＡ’によるアミノ酸配列の一致率（protein coverage by AA's）：１３．１６％
検索されたアミノ酸配列とその一致部分
ｍｔｒｔｌｃｓｐｇｐ  ｓｑｐｇｅｋｒｐｅｅ  ｖａｌｇｌｈｈｒｌｐ
1
ａｌｇｒａｌｇｈｓｉ  ｑｑｒａｔｓｔａｋｔ  ｗｗｄｒｙｅｅｆｖｇ
31
ｌｎｅｖｒｅａｑｇｋ  ｖｔｅａｅｋｖｆｍｖ  ａｒｇｌｖｒｅａｒｅ
61
ｄｌｅｖｈｑａｋｌｋ  ｅｖｒｄｒｌｄｒｖｓ  ｒｅｄｓｑｙｌｅｌａ
91
ｔｌｅｈｒｍｌｑｅｅ  ｋｒｌｒｔａｙｌｒａ  ｅｄｓｅｒｅｋｆｓｌ
121
ｆｓａａｖｒｅｓｈｅ  ｋｅｒｔｒａｅｒｔｋ  ｎｗｓｌｉｇｓｖｌｇ
151
ａｌｉｇｖａｇｓｔｙ  ｖｎｒｖｒｌｑｅｌｋ  ａｌｌｌｅａｑｋｇｐ
181
ｖｓｌｑｅａｉｒｅｑ  ａｓｓｙｓｒｑｑｒｄ  ｌｈｎｌｍｖｄｌｒｇ
211
ｌｖｈａａｇｐｇｑｄ  ｓｇｓｑａｇｓｐｐｔ  ｒｄｒｄｖｄｖｌｓａ
241
ａｌｋｅｑｌｓｈｓｒ  ｑｖｈｓｃｌｅｇｌｒ  ｅｑｌｄｇｌｅｋｔｃ
271
ｓｑｍａｇｖｖｑｌｖ  ｋｓａａｈｐｇｌｖｅ  ｐａｄｇａｍｐｓｆｌ
301
ｌｅｑｇｓｍｉｌａｌ  ｓｄｔｅｑｒｌｅａｑ  ｖｎｒｎｔｉｙｓｔｌ
331
ｖｔｃｖｔｆｖａｔｌ  ｐｖｌｙｍｌｆｋａｓ
361                                      380
【００４３】
（６）タンパク質Ａ−６（配列番号６に記載のタンパク質）：
検索結果：ＡＡＱ８９１５１      ＨＳＡＬ５８３６
ＡＡ’によるアミノ酸配列の一致率（protein coverage by AA's）：３１．４６％
検索されたアミノ酸配列とその一致部分
ｍｈｓａｌａｔａｌｌ  ｌｌｉｐｌｌｌｌｒｒ  ｆｆｄｇｓａｌｒｅｇ
1
ｇｓｒｅｋｐｇｐｓｒ  ｒｒｗａｇｈｓｐｅｐ  ｗｒｓｐｔｌｒｓｇｐ
31
ｇｆｐｓｙｐｌｇｖｐ  ａｆｖｆｉｓｐｇｐｓ  ｐｓｑｗａｌｐｃｌ
61                                                          89
【００４４】
（７）タンパク質Ａ−７（配列番号７に記載のタンパク質）：
検索結果：ＮＰ＿１１５７１６    chromosome 6 open reading frame 125
ＡＡ’によるアミノ酸配列の一致率（protein coverage by AA's）：５３．１３％
検索されたアミノ酸配列とその一致部分
ｍａａｓｒｙｒｒｆｌ  ｋｌｃｅｅｗｐｖｄｅ  ｔｋｒｇｒｄｌｇａｙ
1
ｌｒｑｒｖａｑａｆｒ  ｅｇｅｎｔｑｖａｅｐ  ｅａｃｄｑｍｙｅｓｌ
31
ａｒｌｈｓｎｙｙｋｈ  ｋｙｐｒｐｒｄｔｓｆ  ｓｇｌｓｌｅｅｙｋｌ
61
ｉｌｓｔｄｔｌｅｅｌ  ｋｅｉｄｋｇｍｗｋｋ  ｌｑｅｋｆａｐｋｇｐ
91
ｅｅｄｈｋａ
121        126
【００４５】
（８）タンパク質Ａ−８（配列番号８に記載のタンパク質）：
検索結果：ＢＡＣ０４４８６    unnamed protein product
ＡＡ’によるアミノ酸配列の一致率（protein coverage by AA's）：１８．６０％
検索されたアミノ酸配列とその一致部分
ｍｋｓｋｌｐｐｐｓｇ  ｒｌｃｓｈｓｗｒｔｇ  ｓｇａａｐｇｇｓａｇ
1
ａａｅｇｆｆａｇｔｖ  ｑｑａａｒｄｋｔａｒ  ｑｒｐｍａｒｇｓｓｅ
31
ｐｅｓｐａａｒｒｆｓ  ｉｐｇｓｖｑｇｈｌｄ  ａｖｇｋｓｒｓｇｄｉ
61
ｇｓｓｌｒｖｅａｇｄ  ｋｒｔｑａｓｐｅｒｑ  ｐｈｃｇａｈｄａｑｇ
91
ｅｈｈｅａｑｅｉｇ
121              129
【００４６】
（９）タンパク質Ａ−９（配列番号９に記載のタンパク質）：
検索結果：ＮＰ＿９５１０３２    nuclear protein E3-3 isoform a
ＡＡ’によるアミノ酸配列の一致率（protein coverage by AA's）：３５．３３％
検索されたアミノ酸配列とその一致部分
ｍａｔａｌａｌｒｓｌ  ｙｒａｒｐｓｌｒｃｐ  ｐｖｅｌｐｗａｐｒｒ
1
ｇｈｒｌｓｐａｄｄｅ  ｌｙｑｒｔｒｉｓｌｌ  ｑｒｅａａｑａｍｙｉ
31
ｄｓｙｎｓｒｇｆｍｉ  ｎｇｎｒｖｌｇｐｃａ  ｌｌｐｈｓｖｖｑｗｎ
61
ｖｇｓｈｑｄｉｔｅｄ  ｓｆｓｌｆｗｌｌｅｐ  ｒｉｅｉｖｖｖｇｔｇ
91
ｄｒｔｅｒｌｑｓｑｖ  ｌｑａｍｒｑｒｇｉａ  ｖｅｖｑｄｔｐｎａｃ
121
ａｔｆｎｆｌｃｈｅｇ  ｒｖｔｇａａｌｉｐｐ  ｐｇｇｔｓｌｔｓｌｇ
151
ｑａａｑ
181    184
【００４７】
（１０）タンパク質Ａ−１０（配列番号１０に記載のタンパク質）：
検索結果：ＮＰ＿０６０２８２    coiled-coil-helix-coiled-coil-helix domain 
containing 3; CHCHD3
ＡＡ’によるアミノ酸配列の一致率（protein coverage by AA's）：３９．２１％
検索されたアミノ酸配列とその一致部分
ｍｇｇｔｔｓｔｒｒｖ  ｔｆｅａｄｅｎｅｎｉ  ｔｖｖｋｇｉｒｌｓｅ
1
ｎｖｉｄｒｍｋｅｓｓ  ｐｓｇｓｋｓｑｒｙｓ  ｇａｙｇａｓｖｓｄｅ
31
ｅｌｋｒｒｖａｅｅｌ  ａｌｅｑａｋｋｅｓｅ  ｄｑｋｒｌｋｑａｋｅ
61
ｌｄｒｅｒａａａｎｅ  ｑｌｔｒａｉｌｒｅｒ  ｉｃｓｅｅｅｒａｋａ
91
ｋｈｌａｒｑｌｅｅｋ  ｄｒｖｌｋｋｑｄａｆ  ｙｋｅｑｌａｒｌｅｅ
121
ｒｓｓｅｆｙｒｖｔｔ  ｅｑｙｑｋａａｅｅｖ  ｅａｋｆｋｒｙｅｓｈ
151  
ｐｖｃａｄｌｑａｋｉ  ｌｑｃｙｒｅｎｔｈｑ  ｔｌｋｃｓａｌａｔｑ
181
ｙｍｈｃｖｎｈａｋｑ  ｓｍｌｅｋｇｇ
211                                227
【００４８】
（１１）タンパク質Ａ−１１（配列番号１１に記載のタンパク質）：
検索結果：ＮＰ＿０５７０２６    hypothetical protein LOC51001 ; CGI-12
ＡＡ’によるアミノ酸配列の一致率（protein coverage by AA's）：４１．２５％
検索されたアミノ酸配列とその一致部分
ｍａｌｓａｑｑｉｐｒ  ｗｆｎｓｖｋｌｒｓｌ  ｉｎａａｑｌｔｋｒｆ
1
ｔｒｐａｒｔｌｌｈｇ  ｆｓａｑｐｑｉｓｓｄ  ｎｃｆｌｑｗｇｆｋｔ
31
ｙｒｔｓｓｌｗｎｓｓ  ｑｓｔｓｓｓｓｑｅｎ  ｎｓａｑｓｓｌｌｐｓ
61
ｍｎｅｑｓｑｋｔｑｎ  ｉｓｓｆｄｓｅｌｆｌ  ｅｅｌｄｅｌｐｐｌｓ
91
ｐｍｑｐｉｓｅｅｅａ  ｉｑｉｉａｄｐｐｌｐ  ｐａｓｆｔｌｒｄｙｖ
121
ｄｈｓｅｔｌｑｋｌｖ  ｌｌｇｖｄｌｓｋｉｅ  ｋｈｐｅａａｎｌｌｌ
151
ｒｌｄｆｅｋｄｉｋｑ  ｍｌｌｆｌｋｄｖｇｉ  ｅｄｎｑｌｇａｆｌｔ
181
ｋｎｈａｉｆｓｅｄｌ  ｅｎｌｋｔｒｖａｙｌ  ｈｓｋｎｆｓｋａｄｖ
211
ａｑｍｖｒｋａｐｆｌ  ｌｎｆｓｖｅｒｌｄｎ  ｒｌｇｆｆｑｋｅｌｅ
241
ｌｓｖｋｋｔｒｄｌｖ  ｖｒｌｐｒｌｌｔｇｓ  ｌｅｐｖｋｅｎｍｋｖ
271
ｙｒｌｅｌｇｆｋｈｎ  ｅｉｑｈｍｉｔｒｉｐ  ｋｍｌｔａｎｋｍｋｌ
301
ｔｅｔｆｄｆｖｈｎｖ  ｍｓｉｐｈｈｉｉｖｋ  ｆｐｑｖｆｎｔｒｌｆ
331
ｋｖｋｅｒｈｌｆｌｔ  ｙｌｇｒａｑｙｄｐａ  ｋｐｎｙｉｓｌｄｋｌ
361
ｖｓｉｐｄｅｉｆｃｅ  ｅｉａｋａｓｖｑｄｆ  ｅｋｆｌｋｔｌ
391                                                      417
【００４９】
（１２）タンパク質Ａ−１２（配列番号１２に記載のタンパク質）：
検索結果：Ｑ９Ｈ０７８        suppressor of potassium transport defect 3; SKD3
ＡＡ’によるアミノ酸配列の一致率（protein coverage by AA's）：３０．４１％
検索されたアミノ酸配列とその一致部分
ＭＬＧＳＬＶＬＲＲＫ  ＡＬＡＰＲＬＬＬＲＬ  ＬＲＳＰＴＬＲＧＨＧ
1
ＧＡＳＧＲＮＶＴＴＧ  ＳＬＧＥＰＱＷＬＲＶ  ＡＴＧＧＲＰＧＴＳＰ
31
ＡＬＦＳＧＲＧＡＡＴ  ＧＧＲＱＧＧＲＦＤＴ  ＫＣＬＡＡＡＴＷＧＲ
61
ＬＰＧＰＥＥＴＬＰＧ  ＱＤＳＷＮＧＶＰＳＲ  ＡＧＬＧＭＣＡＬＡＡ
91
ＡＬＶＶＨＣＹＳＫＳ  ＰＳＮＫＤＡＡＬＬＥ  ＡＡＲＡＮＮＭＱＥＶ
121
ＳＲＬＬＳＥＧＡＤＶ  ＮＡＫＨＲＬＧＷＴＡ  ＬＭＶＡＡＩＮＲＮＮ
151
ＳＶＶＱＶＬＬＡＡＧ  ＡＤＰＮＬＧＤＤＦＳ  ＳＶＹＫＴＡＫＥＱＧ
181
ＩＨＳＬＥＤＧＧＱＤ  ＧＡＳＲＨＩＴＮＱＷ  ＴＳＡＬＥＦＲＲＷＬ
211
ＧＬＰＡＧＶＬＩＴＲ  ＥＤＤＦＮＮＲＬＮＮ  ＲＡＳＦＫＧＣＴＡＬ
241
ＨＹＡＶＬＡＤＤＹＲ  ＴＶＫＥＬＬＤＧＧＡ  ＮＰＬＱＲＮＥＭＧＨ
271
ＴＰＬＤＹＡＲＥＧＥ  ＶＭＫＬＬＲＴＳＥＡ  ＫＹＱＥＫＱＲＫＲＥ
301
ＡＥＥＲＲＲＦＰＬＥ  ＱＲＬＫＥＨＩＩＧＱ  ＥＳＡＩＡＴＶＧＡＡ
331
ＩＲＲＫＥＮＧＷＹＤ  ＥＥＨＰＬＶＦＬＦＬ  ＧＳＳＧＩＧＫＴＥＬ
361
ＡＫＱＴＡＫＹＭＨＫ  ＤＡＫＫＧＦＩＲＬＤ  ＭＳＥＦＱＥＲＨＥＶ
391
ＡＫＦＩＧＳＰＰＧＹ  ＶＧＨＥＥＧＧＱＬＴ  ＫＫＬＫＱＣＰＮＡＶ
421
ＶＬＦＤＥＶＤＫＡＨ  ＰＤＶＬＴＩＭＬＱＬ  ＦＤＥＧＲＬＴＤＧＫ
451
ＧＫＴＩＤＣＫＤＡＩ  ＦＩＭＴＳＮＶＡＳＤ  ＥＩＡＱＨＡＬＱＬＲ
481
ＱＥＡＬＥＭＳＲＮＲ  ＩＡＥＮＬＧＤＶＱＩ  ＳＤＫＩＴＩＳＫＮＦ
511
ＫＥＮＶＩＲＰＩＬＫ  ＡＨＦＲＲＤＥＦＬＧ  ＲＩＮＥＩＶＹＦＬＰ
541
ＦＣＨＳＥＬＩＱＬＶ  ＮＫＥＬＮＦＷＡＫＲ  ＡＫＱＲＨＮＩＴＬＬ
571
ＷＤＲＥＶＡＤＶＬＶ  ＤＧＹＮＶＨＹＧＡＲ  ＳＩＫＨＥＶＥＲＲＶ
601
ＶＮＱＬＡＡＡＹＥＱ  ＤＬＬＰＧＧＣＴＬＲ  ＩＴＶＥＤＳＤＫＱＬ
631
ＬＫＳＰＥＬＰＳＰＱ  ＡＥＫＲＬＰＫＬＲＬ  ＥＩＩＤＫＤＳＫＴＲ
661
ＲＬＤＩＲＡＰＬＨＰ  ＥＫＶＣＮＴＩ
691                                707
【００５０】
（１３）タンパク質Ａ−１３（配列番号１３に記載のタンパク質）：
検索結果：ＮＰ＿０６０３００    ovarian carcinoma immunoreactive antigen; OCIA
ＡＡ’によるアミノ酸配列の一致率（protein coverage by AA's）：１３．４７％
検索されたアミノ酸配列とその一致部分
ｍｎｇｒａｄｆｒｅｐ  ｎａｅｖｐｒｐｉｐｈ  ｉｇｐｄｙｉｐｔｅｅ
1
ｅｒｒｖｆａｅｃｎｄ  ｅｓｆｗｆｒｓｖｐｌ  ａａｔｓｍｌｉｔｑｇ
31
ｌｉｓｋｇｉｌｓｓｈ  ｐｋｙｇｓｉｐｋｌｉ  ｌａｃｉｍｇｙｆａｇ
61
ｋｌｓｙｖｋｔｃｑｅ  ｋｆｋｋｌｅｎｓｐｌ  ｇｅａｌｒｓｇｑａｒ
91
ｒｓｓｐｐｇｈｙｙｑ  ｋｓｋｙｄｓｓｖｓｇ  ｑｓｓｆｖｔｓｐａａ
121
ｄｎｉｅｍｌｐｈｙｅ  ｐｉｐｆｓｓｓｍｎｅ  ｓａｐｔｇｉｔｄｈｉ
151
ｖｑｇｐｄｐｎｌｅｅ  ｓｐｋｒｋｎｉｔｙｅ  ｅｌｒｎｋｎｒｅｓｙ
181
ｅｖｓｌｔｑｋｔｄｐ  ｓｖｒｐｍｈｅｒｖｐ  ｋｋｅｖｋｖｎｋｙｇ
211
ｄｔｗｄｅ
241      245
【００５１】
（１４）タンパク質Ａ−１４（配列番号１４に記載のタンパク質）：
検索結果：ＡＡＨ０１８３７    glioblastoma amplified sequence; GBAS
ＡＡ’によるアミノ酸配列の一致率（protein coverage by AA's）：  ９．４４％
検索されたアミノ酸配列とその一致部分
ｍａａｒｖｌｒａｒｇ  ａａｗａｇｇｌｌｑｒ  ａａｐｃｓｌｌｐｒｌ
1
ｒｔｗｔｓｓｓｎｒｓ  ｒｅｄｓｗｌｋｓｌｆ  ｖｒｋｖｄｐｒｋｄａ
31
ｈｓｎｌｌａｋｋｅｔ  ｓｎｌｙｋｌｑｆｈｎ  ｖｋｐｅｃｌｅａｙｎ
61
ｋｉｃｑｅｖｌｐｋｉ  ｈｅｄｋｈｙｐｃｔｌ  ｖｇｔｗｎｔｗｙｇｅ
91
ｑｄｑａｖｈｌｗｒｙ  ｅｇｇｙｐａｌｔｅｖ  ｍｎｋｌｒｅｎｋｅｆ
121
ｌｅｆｒｋａｒｓｄｍ  ｌｌｓｒｋｎｑｌｌｌ  ｅｆｓｆｗｎｅｐｖｐ
151
ｒｓｇｐｎｉｙｅｌｒ  ｓｙｑｌｒｐｇｔｍｉ  ｅｗｇｎｙｗａｒａｉ
181
ｒｆｒｑｄｇｎｅａｖ  ｇｇｆｆｓｑｉｇｑｌ  ｙｍｖｈｈｌｗａｙｒ
211
ｄｌｑｔｒｅｄｉｒｎ  ａａｗｈｋｈｇｗｅｅ  ｌｖｙｙｔｖｐｌｉｑ
241
ｅｍｅｓｒｉｍｉｐｌ  ｋｔｓｐｌｑ
271                              286
【００５２】
（１５）タンパク質Ａ−１５（配列番号１５に記載のタンパク質）：
検索結果：ＮＰ＿１４９０６１    cat eye syndrome chromosome region, 
candidate 5 isoform 2 precursor
ＡＡ’によるアミノ酸配列の一致率（protein coverage by AA's）：  ３．８７％
検索されたアミノ酸配列とその一致部分
ｍａａｗｇｃｖａａｌ  ｇａａｒｇｌｃｗｒａ  ａｒａａａｇｌｑｇｒ
1
ｐａｒｒｃｙａｖｇｐ  ａｑｓｐｐｔｆｇｆｌ  ｌｄｉｄｇｖｌｖｒｇ
31
ｈｒｖｉｐａａｌｋａ  ｆｒｒｌｖｎｓｑｇｑ  ｌｒｖｐｖｖｆｖｔｎ
61
ａｇｎｉｌｑｈｓｋａ  ｑｅｌｓａｌｌｇｃｅ  ｖｄａｄｑｖｉｌｓｈ
91
ｓｐｍｋｌｆｓｅｙｈ  ｅｋｒｍｌｖｓｇｑｇ  ｐｖｍｅｎａｑｇｌｇ
121
ｆｒｎｖｖｔｖｄｅｌ  ｒｍａｆｐｌｌｄｍｖ  ｄｌｅｒｒｌｋｔｔｐ
151
ｌｐｒｎｄｆｐｒｉｅ  ｇｖｌｌｌｇｅｐｖｒ  ｗｅｔｓｌｑｌｉｍｄ
181
ｖｌｌｓｎｇｓｐｇａ  ｇｌａｔｐｐｙｐｈｌ  ｐｖｌａｓｎｍｄｌｌ
211
ｗｍａｅａｋｍｐｒｆ  ｇｈｇｔｆｌｌｃｌｅ  ｔｉｙｑｋｖｔｇｋｅ
241
ｌｒｙｅｇｌｍｇｋｐ  ｓｉｌｔｙｑｙａｅｄ  ｌｉｒｒｑａｅｒｒｇ
271
ｗａａｐｉｒｋｌｙａ  ｖｇｄｎｐｍｓｄｖｙ  ｇａｎｌｆｈｑｙｌｑ
301
ｋａｔｈｄｇａｐｅｌ  ｇａｇｇｔｒｑｑｑｐ  ｓａｓｑｓｃｉｓｉｌ
331
ｖｃｔｇｖｙｎｐｒｎ  ｐｑｓｔｅｐｖｌｇｇ  ｇｅｐｐｆｈｇｈｒｄ
361
ｌｃｆｓｐｇｌｍｅａ  ｓｈｖｖｎｄｖｎｅａ  ｖｑｌｖｆｒｋｅｇｗ
391
ａｌｅ
421  423
【００５３】
（１６）タンパク質Ｂ−１（配列番号１６に記載のタンパク質）：
検索結果：ＮＰ＿００６３０８    brain abundant, membrane attached 
signal protein 1
ＡＡ’によるアミノ酸配列の一致率（protein coverage by AA's）：７６．２１％
検索されたアミノ酸配列とその一致部分
ｍｇｇｋｌｓｋｋｋｋ  ｇｙｎｖｎｄｅｋａｋ  ｅｋｄｋｋａｅｇａａ
1
ｔｅｅｅｇｔｐｋｅｓ  ｅｐｑａａａｅｐａｅ  ａｋｅｇｋｅｋｐｄｑ
31
ｄａｅｇｋａｅｅｋｅ  ｇｅｋｄａａａａｋｅ  ｅａｐｋａｅｐｅｋｔ
61
ｅｇａａｅａｋａｅｐ  ｐｋａｐｅｑｅｑａａ  ｐｇｐａａｇｇｅａｐ
91
ｋａａｅａａａａｐａ  ｅｓａａｐａａｇｅｅ  ｐｓｋｅｅｇｅｐｋｋ
121
ｔｅａｐａａｐａａｑ  ｅｔｋｓｄｇａｐａｓ  ｄｓｋｐｇｓｓｅａａ
151
ｐｓｓｋｅｔｐａａｔ  ｅａｐｓｓｔｐｋａｑ  ｇｐａａｓａｅｅｐｋ
181
ｐｖｅａｐａａｎｓｄ  ｑｔｖｔｖｋｅ
211                                227
【００５４】
（１７）タンパク質Ｂ−２（配列番号１７に記載のタンパク質）：
検索結果：ＮＰ＿００２０８３    G-rich RNA sequence binding factor 1
ＡＡ’によるアミノ酸配列の一致率（protein coverage by AA's）：１３．９２％
検索されたアミノ酸配列とその一致部分
ｍａｇｔｒｗｖｌｇａ  ｌｌｒｇｃｇｃｎｃｓ  ｓｃｒｒｔｇａａｃｌ
1
ｐｆｙｓａａｓｙｐａ  ｌｒａｓｌｌｐｑｓｌ  ａａａａａｖｐｔｒｓ
31
ｙｓｑｅｓｋｔｔｙｌ  ｅｄｌｐｐｐｐｅｙｅ  ｌａｐｓｋｌｅｅｅｖ
61
ｄｄｖｆｌｉｒａｑｇ  ｌｐｗｓｃｔｍｅｄｖ  ｌｎｆｆｓｄｃｒｉｒ
91
ｎｇｅｎｇｉｈｆｌｌ  ｎｒｄｇｋｒｒｇｄａ  ｌｉｅｍｅｓｅｑｄｖ
121
ｑｋａｌｅｋｈｒｍｙ  ｍｇｑｒｙｖｅｖｙｅ  ｉｎｎｅｄｖｄａｌｍ
151
ｋｓｌｑｖｋｓｓｐｖ  ｖｎｄｇｖｖｒｌｒｇ  ｌｐｙｓｃｎｅｋｄｉ
181
ｖｄｆｆａｇｌｎｉｖ  ｄｉｔｆｖｍｄｙｒｇ  ｒｒｋｔｇｅａｙｖｑ
211
ｆｅｅｐｅｍａｎｑａ  ｌｌｋｈｒｅｅｉｇｎ  ｒｙｉｅｉｆｐｓｒｒ
241
ｎｅｖｒｔｈｖｇｓｙ  ｋｇｋｋｉａｓｆｐｔ  ａｋｙｉｔｅｐｅｍｖ
271
ｆｅｅｈｅｖｎｅｄｉ  ｑｐｍｔａｆｅｓｅｋ  ｅｉｅｌｐｋｅｖｐｅ
301
ｋｌｐｅａａｄｆｇｔ  ｔｓｓｌｈｆｖｈｍｒ  ｇｌｐｆｑａｎａｑｄ
331
ｉｉｎｆｆａｐｌｋｐ  ｖｒｉｔｍｅｙｓｓｓ  ｇｋａｔｇｅａｄｖｈ
361
ｆｅｔｈｅｄａｖａａ  ｍｌｋｄｒｓｈｖｈｈ  ｒｙｉｅｌｆｌｎｓｃ
391
ｐｋｇｋ
421    424
【００５５】
（１８）タンパク質Ｃ−１（配列番号１８に記載のタンパク質）：
検索結果：ＮＰ＿００２６２５    prohibitin; PHB
ＡＡ’によるアミノ酸配列の一致率（protein coverage by AA's）：２９．０４％
検索されたアミノ酸配列とその一致部分
ｍａａｋｖｆｅｓｉｇ  ｋｆｇｌａｌａｖａｇ  ｇｖｖｎｓａｌｙｎｖ
1
ｄａｇｈｒａｖｉｆｄ  ｒｆｒｇｖｑｄｉｖｖ  ｇｅｇｔｈｆｌｉｐｗ
31
ｖｑｋｐｉｉｆｄｃｒ  ｓｒｐｒｎｖｐｖｉｔ  ｇｓｋｄｌｑｎｖｎｉ
61
ｔｌｒｉｌｆｒｐｖａ  ｓｑｌｐｒｉｆｔｓｉ  ｇｅｄｙｄｅｒｖｌｐ
91
ｓｉｔｔｅｉｌｋｓｖ  ｖａｒｆｄａｇｅｌｉ  ｔｑｒｅｌｖｓｒｑｖ
121
ｓｄｄｌｔｅｒａａｔ  ｆｇｌｉｌｄｄｖｓｌ  ｔｈｌｔｆｇｋｅｆｔ
151
ｅａｖｅａｋｑｖａｑ  ｑｅａｅｒａｒｆｖｖ  ｅｋａｅｑｑｋｋａａ
181
ｉｉｓａｅｇｄｓｋａ  ａｅｌｉａｎｓｌａｔ  ａｇｄｇｌｉｅｌｒｋ
211
ｌｅａａｅｄｉａｙｑ  ｌｓｒｓｒｎｉｔｙｌ  ｐａｇｑｓｖｌｌｑｌ
241
ｐｑ
271272
【００５６】
（１９）タンパク質Ｃ−２（配列番号１９に記載のタンパク質）：
検索結果：ＮＰ＿０３８４７０    stomatin-like protein 2; SLP2
ＡＡ’によるアミノ酸配列の一致率（protein coverage by AA's）：４１．０１％
検索されたアミノ酸配列とその一致部分
ｍｌａｒａａｒｇｔｇ  ａｌｌｌｒｇｓｌｌａ  ｓｇｒａｐｒｒａｓｓ
1
ｇｌｐｒｎｔｖｖｌｆ  ｖｐｑｑｅａｗｖｖｅ  ｒｍｇｒｆｈｒｉｌｅ
31
ｐｇｌｎｉｌｉｐｖｌ  ｄｒｉｒｙｖｑｓｌｋ  ｅｉｖｉｎｖｐｅｑｓ
61
ａｖｔｌｄｎｖｔｌｑ  ｉｄｇｖｌｙｌｒｉｍ  ｄｐｙｋａｓｙｇｖｅ
91
ｄｐｅｙａｖｔｑｌａ  ｑｔｔｍｒｓｅｌｇｋ  ｌｓｌｄｋｖｆｒｅｒ
121
ｅｓｌｎａｓｉｖｄａ  ｉｎｑａａｄｃｗｇｉ  ｒｃｌｒｙｅｉｋｄｉ
151
ｈｖｐｐｒｖｋｅｓｍ  ｑｍｑｖｅａｅｒｒｋ  ｒａｔｖｌｅｓｅｇｔ
181
ｒｅｓａｉｎｖａｅｇ  ｋｋｑａｑｉｌａｓｅ  ａｅｋａｅｑｉｎｑａ
211
ａｇｅａｓａｖｌａｋ  ａｋａｋａｅａｉｒｉ  ｌａａａｌｔｑｈｎｇ
241
ｄａａａｓｌｔｖａｅ  ｑｙｖｓａｆｓｋｌａ  ｋｄｓｎｔｉｌｌｐｓ
271
ｎｐｇｄｖｔｓｍｖａ  ｑａｍｇｖｙｇａｌｔ  ｋａｐｖｐｇｔｐｄｓ
301
ｌｓｓｇｓｓｒｄｖｑ  ｇｔｄａｓｌｄｅｅｌ  ｄｒｖｋｍｓ
331                                                    356
【００５７】
（２０）タンパク質Ｃ−３（配列番号２０に記載のタンパク質）：
検索結果：ＮＰ＿０５６１９５    CGI-51 protein
ＡＡ’によるアミノ酸配列の一致率（protein coverage by AA's）：  ９．３８％
検索されたアミノ酸配列とその一致部分
ｍｇｔｖｈａｒｓｌｅ  ｐｌｐｓｓｇｐｄｆｇ  ｇｌｇｅｅａｅｆｖｅ
1
ｖｅｐｅａｋｑｅｉｌ  ｅｎｋｄｖｖｖｑｈｖ  ｈｆｄｇｌｇｒｔｋｄ
31
ｄｉｉｉｃｅｉｇｄｖ  ｆｋａｋｎｌｉｅｖｍ  ｒｋｓｈｅａｒｅｋｌ
61
ｌｒｌｇｉｆｒｑｖｄ  ｖｌｉｄｔｃｑｇｄｄ  ａｌｐｎｇｌｄｖｔｆ
91
ｅｖｔｅｌｒｒｌｔｇ  ｓｙｎｔｍｖｇｎｎｅ  ｇｓｍｖｌｇｌｋｌｐ
121
ｎｌｌｇｒａｅｋｖｔ  ｆｑｆｓｙｇｔｋｅｔ  ｓｙｇｌｓｆｆｋｐｒ
151
ｐｇｎｆｅｒｎｆｓｖ  ｎｌｙｋｖｔｇｑｆｐ  ｗｓｓｌｒｅｔｄｒｇ
181
ｍｓａｅｙｓｆｐｉｗ  ｋｔｓｈｔｖｋｗｅｇ  ｖｗｒｅｌｇｃｌｓｒ
211
ｔａｓｆａｖｒｋｅｓ  ｇｈｓｌｋｓｓｌｓｈ  ａｍｖｉｄｓｒｎｓｓ
241
ｉｌｐｒｒｇａｌｌｋ  ｖｎｑｅｌａｇｙｔｇ  ｇｄｖｓｆｉｋｅｄｆ
271
ｅｌｑｌｎｋｑｌｉｆ  ｄｓｖｆｓａｓｆｗｇ  ｇｍｌｖｐｉｇｄｋｐ
301
ｓｓｉａｄｒｆｙｌｇ  ｇｐｔｓｖｒｇｆｓｍ  ｈｓｉｇｐｑｓｅｇｄ
331
ｙｌｇｇｅａｙｗａｇ  ｇｌｈｌｙｔｐｌｐｆ  ｒｐｇｑｇｇｆｇｅｌ
361
ｆｒｔｈｆｆｌｎａｇ  ｎｌｃｎｌｎｙｇｅｇ  ｐｋａｈｉｒｋｌａｅ
391
ｃｉｒｗｓｙｇａｇｉ  ｖｌｒｌｇｎｉａｒｌ  ｅｌｎｙｃｖｐｍｇｖ
421
ｑｔｇｄｒｉｃｄｇｖ  ｑｆｇａｇｉｒｆｌ
451                                    469
【００５８】
（２１）タンパク質Ｃ−４（配列番号２１に記載のタンパク質）：
検索結果：ＮＰ＿００６１０９    HS1 binding protein; HAX1
ＡＡ’によるアミノ酸配列の一致率（protein coverage by AA's）：１８．６４％
検索されたアミノ酸配列とその一致部分
ｍｓｌｆｄｌｆｒｇｆ  ｆｇｆｐｇｐｒｓｈｒ  ｄｐｆｆｇｇｍｔｒｄ
1
ｅｄｄｄｅｅｅｅｅｅ  ｇｇｓｗｇｒｇｎｐｒ  ｆｈｓｐｑｈｐｐｅｅ
31
ｆｇｆｇｆｓｆｓｐｇ  ｇｇｉｒｆｈｄｎｆｇ  ｆｄｄｌｖｒｄｆｎｓ
61
ｉｆｓｄｍｇａｗｔｌ  ｐｓｈｐｐｅｌｐｇｐ  ｅｓｅｔｐｇｅｒｌｒ
91
ｅｇｑｔｌｒｄｓｍｌ  ｋｙｐｄｓｈｑｐｒｉ  ｆｇｇｖｌｅｓｄａｒ
121
ｓｅｓｐｑｐａｐｄｗ  ｇｓｑｒｐｆｈｒｆｄ  ｄｖｗｐｍｄｐｈｐｒ
151
ｔｒｅｄｎｄｌｄｓｑ  ｖｓｑｅｇｌｇｐｖｌ  ｑｐｑｐｋｓｙｆｋｓ
181
ｉｓｖｔｋｉｔｋｐｄ  ｇｉｖｅｅｒｒｔｖｖ  ｄｓｅｇｒｔｅｔｔｖ
211
ｔｒｈｅａｄｓｓｐｒ  ｇｄｐｅｓｐｒｐｐａ  ｌｄｄａｆｓｉｌｄｌ
241
ｆｌｇｒｗｆｒｓｒ
271              279
【００５９】
（２２）タンパク質Ｃ−５（配列番号２２に記載のタンパク質）：
検索結果：ＮＰ＿００４４８４    hydroxyacyl-Coenzyme A dehydrogenase, 
type II; HADH2
ＡＡ’によるアミノ酸配列の一致率（protein coverage by AA's）：４６．３６％
検索されたアミノ酸配列とその一致部分
ｍａａａｃｒｓｖｋｇ  ｌｖａｖｉｔｇｇａｓ  ｇｌｇｌａｔａｅｒｌ
1
ｖｇｑｇａｓａｖｌｌ  ｄｌｐｎｓｇｇｅａｑ  ａｋｋｌｇｎｎｃｖｆ
31
ａｐａｄｖｔｓｅｋｄ  ｖｑｔａｌａｌａｋｇ  ｋｆｇｒｖｄｖａｖｎ
61
ｃａｇｉａｖａｓｋｔ  ｙｎｌｋｋｇｑｔｈｔ  ｌｅｄｆｑｒｖｌｄｖ
91
ｎｌｍｇｔｆｎｖｉｒ  ｌｖａｇｅｍｇｑｎｅ  ｐｄｑｇｇｑｒｇｖｉ
121
ｉｎｔａｓｖａａｆｅ  ｇｑｖｇｑａａｙｓａ  ｓｋｇｇｉｖｇｍｔｌ
151
ｐｉａｒｄｌａｐｉｇ  ｉｒｖｍｔｉａｐｇｌ  ｆｇｔｐｌｌｔｓｌｐ
181
ｅｋｖｃｎｆｌａｓｑ  ｖｐｆｐｓｒｌｇｄｐ  ａｅｙａｈｌｖｑａｉ
211
ｉｅｎｐｆｌｎｇｅｖ  ｉｒｌｄｇａｉｒｍｑ  ｐ
241                                          261
【００６０】
これらのタンパク質の中のＡ群に属する１５種（Ａ−１〜Ａ−１５）、Ｂ群に属する２種（Ｂ−１〜Ｂ−２）、及びＣ群に属する５種（Ｃ−１〜Ｃ−５）の合計２２種のタンパク質についての検索結果に基づいたアミノ酸配列を配列表の配列番号１〜２２に示し、その塩基配列を配列番号２３〜４４に示す。
これらのタンパク質のドメイン構成を、それぞれのタンパク質についてＳＩＢ（Swiss Institute of Bioinformatics）のプロテオミクスサーバーであるＥｘＰＡＳｙ（Expert Protein Analysis System）にアクセスして、各種の予測ツールでドメイン構成を予測した。この結果を図５及び図６に示す。これらの結果から、同定された多くのタンパク質が予測上のミトコンドリア標的シグナル（ＭＴＳ）や膜貫通ドメインなどを持つタンパク質であることが明らかとなった。
【実施例３】
【００６１】
ミトコンドリア膜タンパク質群のｃＤＮＡの単離と細胞への過剰発現によるミトコンドリアへの効果の検討
実施例１及び２において単離され同定されたタンパク質群のそれぞれのｃＤＮＡをＰＣＲ法により単離し、当該タンパク質のカルボキシル末端にＦＬＡＧタグなどのタグタンパク質を融合させるような融合タンパク質をコードする遺伝子を構築し、これを動物細胞用発現ベクターに挿入したプラスミドを作製した。これらの遺伝子をＨｅＬａ細胞に導入し、発現させた。これらの発現細胞を免疫細胞染色法にて、タグ標識タンパク質とミトコンドリアのタンパク質としてチトクロームＣ（ｃｙｔ．  Ｃ）に対する抗体を用いて、二重染色を行なった。これを共焦点レーザー顕微鏡で観察した。
結果を図７に示す。この結果の拡大図を図８に示す。この結果、ｃ６ｏｒｆ１２５およびＥ３−３ａは、管状の形態をもつミトコンドリアの先端部に位置し、ミトコンドリアの融合や分裂に関与する可能性がある。また、ＬＯＣ７９１３５はミトコンドリアが車軸状の形態をとるように誘導する活性があることが示された。
また、タンパク質としてＬＯＣ７９７１４、ＯＣＩＡ、及びＣＨＣＨＤ３を同様に行った結果を図９に示す。この結果、ＯＣＩＡおよびＣＨＣＨＤ３のタンパク質はミトコンドリアに局在すること、ＬＯＣ７９７１４およびＣＨＣＨＤ３は、ミトコンドリアを凝集させる活性が存在することが示された。
【実施例４】
【００６２】
タンパク質として、ＰＨＢ、ＳＬＰ２、及びＨＡＤＨ２、並びにＣＧＩ−５１、及びＨＡＸ−１を用いて、実施例３と同様の免疫染色を行なった。なお、ＰＨＢ、ＳＬＰ２、及びＨＡＤＨ２については、ミトコンドリアのマーカーとしてｃｙｔ．Ｃに代えてＯＰＡ１の抗体を用いた。
この結果を図１０に示す。この結果、いずれのタンパク質も、ミトコンドリアの形態を凝集させる活性があることが示された。
【実施例５】
【００６３】
ミトコンドリアの膜電位に与える影響について
Ｃ群に属するタンパク質であるＰＨＢ及びＳＬＰ２のカルボキシル末端にＦＬＡＧタグを融合させた融合タンパク質をコードする遺伝子をＨｅＬａ細胞に強制発現させ、ミトコンドリア膜電位に依存したミトコンドリア染色マーカーＲｈ１２３でミトコンドリアの膜電位を検出した。
結果を図１１に示す。その結果、ＳＬＰ２の過剰発現細胞ではミトコンドリアの膜電位の低下が認められなかったものの、ＰＨＢの過剰発現細胞ではミトコンドリアの膜電位の低下が認められた（図１１の矢印）。このことは、ＰＨＢタンパク質がミトコンドリアにおいて膜電位の調節に関わっている可能性を示している。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明は、ミトコンドリアの形態を制御又は調節することができる機能を有する新規なタンパク質及び、当該タンパク質を用いたミトコンドリア膜組織形成剤及びミトコンドリア膜の形態調節剤を提供するものであり、ミトコンドリアの形態の異常に起因する各種の疾患の治療剤や予防剤などの医薬組成物だけでなく、ミトコンドリアの形態や機能を維持するための化粧品や機能性食品などの材料として産業上の利用可能性を有するものである。
【配列表フリーテキスト】
【００６５】
配列番号１：ＮＰ−０６０３３６のアミノ酸配列。
配列番号２：ＮＰ−０７７０２７のアミノ酸配列。
配列番号３：ＮＰ−００１００１６９２のアミノ酸配列。
配列番号４：ＮＰ−７７５９３２のアミノ酸配列。
配列番号５：ＮＰ−０７８９３７のアミノ酸配列。
配列番号６：ＡＡＱ８９１５１のアミノ酸配列。
配列番号７：ＮＰ−１１５７１６のアミノ酸配列。
配列番号８：ＢＡＣ０４４８６のアミノ酸配列。
配列番号９：ＮＰ−９５１０３２のアミノ酸配列。
配列番号１０：ＮＰ−０６０２８２のアミノ酸配列。
配列番号１１：ＮＰ−０５７０２６のアミノ酸配列。
配列番号１２：Ｑ９Ｈ０７８のアミノ酸配列。
配列番号１３：ＮＰ−０６０３００のアミノ酸配列。
配列番号１４：ＡＡＨ０１８３７のアミノ酸配列。
配列番号１５：ＮＰ−１４９０６１のアミノ酸配列。
配列番号１６：ＮＰ−００６３０８のアミノ酸配列。
配列番号１７：ＮＰ−００２０８３のアミノ酸配列。
配列番号１８：ＮＰ−００２６２５のアミノ酸配列。
配列番号１９：ＮＰ−０３８４７０のアミノ酸配列。
配列番号２０：ＮＰ−０５６１９５のアミノ酸配列。
配列番号２１：ＮＰ−００６１０９のアミノ酸配列。
配列番号２２：ＮＰ−００４４８４のアミノ酸配列。
配列番号２３：ＮＰ−０６０３３６の塩基配列。
配列番号２４：ＮＰ−０７７０２７の塩基配列。
配列番号２５：ＮＰ−００１００１６９２の塩基配列。
配列番号２６：ＮＰ−７７５９３２の塩基配列。
配列番号２７：ＮＰ−０７８９３７の塩基配列。
配列番号２８：ＡＡＱ８９１５１の塩基配列。
配列番号２９：ＮＰ−１１５７１６の塩基配列。
配列番号３０：ＢＡＣ０４４８６の塩基配列。
配列番号３１：ＮＰ−９５１０３２の塩基配列。
配列番号３２：ＮＰ−０６０２８２の塩基配列。
配列番号３３：ＮＰ−０５７０２６の塩基配列。
配列番号３４：Ｑ９Ｈ０７８の塩基配列。
配列番号３５：ＮＰ−０６０３００の塩基配列。
配列番号３６：ＡＡＨ０１８３７の塩基配列
配列番号３７：ＮＰ−１４９０６１の塩基配列。
配列番号３８：ＮＰ−００６３０８の塩基配列。
配列番号３９：ＮＰ−００２０８３の塩基配列。
配列番号４０：ＮＰ−００２６２５の塩基配列。
配列番号４１：ＮＰ−０３８４７０の塩基配列。
配列番号４２：ＮＰ−０５６１９５の塩基配列。
配列番号４３：ＮＰ−００６１０９の塩基配列。
配列番号４４：ＮＰ−００４４８４の塩基配列。
【図１】
0005891561.tif 000003
【図２】
0005891561.tif 000004
【図３】
0005891561.tif 000005
【図４】
0005891561.tif 000006
【図５】
0005891561.tif 000007
【図６】
0005891561.tif 000008
【図７】
0005891561.tif 000009
【図８】
0005891561.tif 000010
【図９】
0005891561.tif 000011
【図１０】
0005891561.tif 000012
【図１１】
0005891561.tif 000013
【配列表】
0005891561000001.app