(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
外因性の遺伝エレメントを本質的に含まない人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞の集団を作製するための方法であって、該方法は、
（ａ）外部添加のＧＳＫ−３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、およびＴＧＦ−β受容体阻害剤を含むリプログラミング培地において体細胞およびその子孫細胞を培養し、それによってｉＰＳ細胞の集団を作製するステップ、ならびに
（ｂ）該外部添加のＧＳＫ−３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、およびＴＧＦ−β受容体阻害剤を本質的に含まない増殖培地を有する増殖条件において該ｉＰＳ細胞を培養するステップ
を含み、
該体細胞は、１つ以上のリプログラミング因子を発現する染色体外遺伝エレメントを含む、方法。
【請求項２】
前記リプログラミング培地は、フィーダー細胞を本質的に含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記リプログラミング培地は、マトリックス構成成分を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記マトリックス構成成分は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記体細胞は、ヒト細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記体細胞は、線維芽細胞、ケラチノサイト、造血細胞、間葉細胞、脂肪細胞、内皮細胞、神経細胞、筋細胞、乳房細胞、肝細胞、腎細胞、皮膚細胞、消化管細胞、卵丘細胞、腺細胞、または膵島細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記染色体外遺伝エレメントは、ＤＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記染色体外遺伝エレメントは、ＲＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記染色体外遺伝エレメントは、エピソームベクターとしてさらに定義される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記エピソームベクターは、細菌エレメントを本質的に含まない、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記エピソームベクターは、リプログラミング因子の発現のための複製開始点および１つ以上の発現カセットを含み、該発現カセットの１つ以上は、染色体外鋳型を複製するために複製開始点に結合するトランス作用因子をコードするヌクレオチド配列をさらに含み、そして／または前記体細胞は、そのようなトランス作用因子を発現する、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記複製開始点は、リンパ向性ヘルペスウイルスの複製開始点であり、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）のｏｒｉＰに対応する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記複製開始点は、ＥＢＶ、カポジ肉腫ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）、ヘルペスウイルスサイミリ（ＨＳ）、またはマレック病ウイルス（ＭＤＶ）の複製開始点である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記トランス作用性因子は、ＥＢＶ核抗原１（ＥＢＮＡ−１）である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記リプログラミング因子は、Ｓｏｘ、Ｏｃｔ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ−２８、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、形質転換を引き起こさないｍｙｃ変異体またはホモログ、およびＳＶ４０ＬＴから成る群から選択される１つ以上を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記リプログラミング因子は、形質転換を引き起こさないｍｙｃ変異体またはホモログを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記リプログラミング因子は、ＬＭＹＣ（ＮＭ＿００１０３３０８１）、Ｎ末端の４１アミノ酸が欠失したＭＹＣ（ｄＮ２ＭＹＣ）、またはアミノ酸１３６に変異を有するＭＹＣ（Ｗ１３６Ｅ）を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞は、少なくとも５日間、前記リプログラミング培地において培養される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞は、前記体細胞への前記染色体外遺伝エレメントの導入後の少なくとも約１日間〜５日間を含む期間、前記リプログラミング培地において培養される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞は、前記体細胞への前記染色体外遺伝エレメントの導入後の約１日間〜１５日間を含む期間、前記リプログラミング培地において培養される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記増殖培地は、既知組成培地である、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記増殖培地は、ＴｅＳＲ培地またはｍＴｅＳＲ培地である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ｉＰＳ細胞を選択するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記ｉＰＳ細胞は、１つ以上の胚細胞の特質に基づいて選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記リプログラミング培地は、外部添加のＬＩＦをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記リプログラミング培地は、外部添加のＲｈｏ関連キナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤またはミオシンＩＩ阻害剤をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＲＯＣＫ阻害剤は、ＨＡ−１００である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記リプログラミング培地は、外部添加の線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記リプログラミング培地は、既知組成培地である、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
前記既知組成培地は、ＴｅＳＲ培地、ヒト胚細胞培養培地、またはＮ２Ｂ２７培地である請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記リプログラミング培地は、外部添加のＦＧＦを有する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記リプログラミング培地は、外部添加のＴＧＦβを本質的に含まない、請求項２９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
本願は、２００９年１１月４日に出願された米国仮特許出願第６１／２５８，１２０号の優先権を主張し、この米国仮特許出願の全体の内容は、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（１．発明の分野）
本発明は、一般に、幹細胞の発生の分野に関する。特に、本発明は、多能性幹細胞の生成に関する。
【背景技術】
【０００３】
（２．先行技術の説明）
ヒト胚性幹（ＥＳ）細胞が有する無限の増殖能力および多能性潜在能力は、ヒトの体のすべての細胞型の前例がない入手方法を提供してきた。所望の遺伝的背景を有する患者体細胞から直接誘導されるヒト人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞は、ヒトＥＳ細胞のこれらの２つの重要な特性を共有し、これは、これらの細胞を、疾患モデル、薬剤スクリーニング、毒性試験、および移植療法のための優れた候補にした。ヒトｉＰＳ細胞の初めの誘導には、リプログラミング導入遺伝子を送達するためにゲノム組み込み型レトロウイルスまたはレンチウイルスベクターを使用した（Ｌｏｗｒｙら、２００８年；Ｐａｒｋら、２００８年；Ｔａｋａｈａｓｈｉら、２００７年；Ｙｕら、２００７年）。そのようなベクターは、ヒトｉＰＳ細胞およびそれらの誘導体の正常な機能に干渉する挿入変異および特異的な系列への分化に影響を及ぼし得る残存性の導入遺伝子発現をもたらし得る（Ｙｕら、２００７年）またはなお腫瘍形成をもたらし得る（Ｏｋｉｔａら、２００７年）。
【０００４】
外因性の遺伝エレメントがないｉＰＳ細胞は、繰り返しのプラスミドトランスフェクションを用いてマウス胚性線維芽細胞から（Ｏｋｉｔａら、２００８年）、非組み込み型アデノウイルスベクターを用いてマウス肝細胞およびヒト線維芽細胞から（Ｓｔａｄｔｆｅｌｄら、２００８年；ＺｈｏｕおよびＦｒｅｅｄ、２００９年）、ピギーバックトランスポゾンを用いて体細胞から（Ｗｏｌｔｊｅｎら、２００９年）、ｏｒｉＰ／ＥＢＮＡ−１ベースのエピソームベクター（Ｙｕら、２００９年）およびタンパク質形質導入を用いてヒト線維芽細胞から誘導された。これらの急速な進歩にもかかわらず、大きなハードルが、外因性の遺伝エレメントがない高品質のヒトｉＰＳ細胞を作製するあらゆる個々の技術の幅広い使用を妨げたままである。たとえば、外因性の遺伝エレメントがないヒトｉＰＳ細胞の生成を可能にする現在の技術（ピギーバックトランスポゾンアプローチ以外の）はすべて、非常に低いリプログラミング効率をもたらした。この低い効率は、様々な容易に入手可能なヒト体細胞型からならびに異なる遺伝的背景およびドナー年齢を有する細胞からｉＰＳ細胞を持続的に得ることを困難にする。ピギーバックトランスポゾンアプローチは、適切なリプログラミング効率を提供する。しかしながら、多くのドナー細胞系が関与する場合、ｉＰＳ細胞からのトランスポゾンの除去は、かなり重労働となり得る。
【０００５】
さらに、ヒトＥＳ細胞に対するヒトｉＰＳ細胞の高度な類似性にもかかわらず、ヒトｉＰＳ細胞の遺伝子発現／後成的な修飾および系列特異的な分化潜在能力の両方において、著しいクローン間の差異が存在する。特に、ヒトＥＳ細胞と比較して、ほとんどのヒトｉＰＳ細胞は、著しく低い神経分化潜在能力を示し、またマウスＥＳ細胞培養をルーチン的に支持するＬＩＦ（白血病抑制因子）に対して応答を示さない。さらに、高品質のヒトｉＰＳ細胞のための、好適で、容易にアッセイすることができるマーカーの不足により、高品質ヒトｉＰＳ細胞クローンの選択は、重労働で、時間がかかり得る。
【０００６】
人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）へのヒト体細胞の遺伝的リプログラミングは、移植療法のための、補充することができる細胞供給源を提供することができる。それらの将来性に応じるためには、ヒトｉＰＳＣは、理想的には、フィーダー細胞がない既知組成培地中で誘導および培養され、外因性のＤＮＡがないものであろう（フットプリントフリー（ｆｏｏｔｐｒｉｎｔ−ｆｒｅｅ））。現在、フットプリントフリーのヒトｉＰＳＣの生成のための単純で効率的なフィーダーなしの非ウイルス性の方法はない。以前は、導入遺伝子送達のためにエピソームベクターを使用することによるフットプリントフリーのヒトｉＰＳＣについての作業は、非能率的であり、フィーダー細胞を必要とした。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｌｏｗｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０５：２８８３，２００８
【非特許文献２】Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４５１：１４１，２００８
【非特許文献３】Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１３１：８６１，２００７
【非特許文献４】Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１８：１９１７，２００７．
【非特許文献５】Ｏｋｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４４８：３１３−３１７，２００７
【非特許文献６】Ｏｋｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２２：９４９−９５３，２００８
【非特許文献７】Ｓｔａｄｔｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２２：９４５−９４９，２００８
【非特許文献８】Ｚｈｏｕ  ａｎｄ  Ｆｒｅｅｄ，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，２００９  （Ａｈｅａｄ  ｏｆ  Ｅｐｕｂ  Ｐｒｉｎｔ）
【非特許文献９】Ｗｏｌｔｊｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４５８：７６６−７７０，２００９
【非特許文献１０】Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２４：７９７−８０１，２００９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
そのため、外因性の遺伝成分を本質的に含まない人工多能性幹細胞を調製する際の非効率または他の問題に取り組む必要性が残っている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の要旨
本発明の態様は、外因性のベクターエレメントを本質的に含まない人工多能性幹細胞を調製するための新規な方法を提供することによって当技術分野における主要な欠陥を克服し、したがって、ｉＰＳ細胞の適用の点から特有の利点を提供する。
【００１０】
さらに、小分子を使用して、本発明のある例示的な態様は、エピソームリプログラミング効率を大幅に改善し（＞７０倍；ＬＭＹＣなどのような形質転換欠損ＭＹＣを使用する場合、＞３００倍）、フットプリントフリーのヒトｉＰＳＣの誘導のための既知組成培地を使用して、フィーダーフリーのリプログラミング条件を確立した。これらの改善は、皮膚線維芽細胞およびおそらく他の多くの細胞型からのフットプリントフリーのヒトｉＰＳＣの日常的な誘導を可能にし、したがって、その技術を、ヒトｉＰＳＣの臨床グレードの作製に容易に適応可能にした。
【００１１】
したがって、第１の実施形態では、外因性のレトロウイルスエレメントを本質的に含まないｉＰＳ細胞の集団および外部添加のシグナル伝達阻害剤を含む培地を含む組成物が提供される。ある態様では、これらのｉＰＳ細胞は、外因性のベクターまたは遺伝エレメントが実質的になくてもよいまたは好ましくは本質的になくてもよい。たとえば、これらのｉＰＳ細胞は、１つ以上のヒト細胞から誘導されてもよい。さらなる態様では、集団の細胞は、ヒト患者などのような選択されたヒト個体のゲノムを含んでいてもよい。
【００１２】
ある態様では、ヒト細胞は、生きているヒト対象から直接得られる細胞である初代ヒト細胞であり、樹立または不死化細胞系の使用を除外してもよい。いくつかの実施形態は、最終分化ヒト細胞の使用を含んでいてもよい。初代ヒト細胞の非限定的な例は、線維芽細胞、ケラチノサイト、造血細胞、間葉細胞、脂肪細胞、内皮細胞、神経細胞、筋細胞、乳房細胞、肝細胞、腎細胞、皮膚細胞、消化管細胞、卵丘細胞（ｃｕｍｕｌｕｓ  ｃｅｌｌ）、腺細胞、または膵島細胞を含む。特に、初代ヒト細胞は、ＣＤ３４＋細胞などのような造血前駆細胞であってもよい。初代ヒト細胞は、血液試料、毛試料、皮膚試料、または当業者に公知の任意の供給源から得られてもよい。
【００１３】
シグナル伝達阻害剤は、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３（ＧＳＫ−３）阻害剤、マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ（ＭＥＫ）阻害剤、形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）受容体阻害剤、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、およびその組合せから成る群から選択される１つ以上であってもよい。特に、組成物は、細胞集団ならびにＧＳＫ−３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＴＧＦ−β受容体阻害剤、および任意選択でＬＩＦの組合せを含む。培地は、外部添加のＲＯＣＫ阻害剤またはミオシンＩＩ阻害剤をさらに含んでいてもよい。ＲＯＣＫ阻害剤は、ＨＡ−１００であってもよい。培地は、外部添加のＦＧＦをさらに含んでいてもよい。ある態様では、組成物は、既知組成培地をさらに含んでいてもよい。既知組成培地の非限定的な例は、ＴｅＳＲ培地、ヒト胚細胞培養培地、Ｎ２Ｂ２７培地、およびその派生物を含む。
【００１４】
組成物はまた、細胞集団の培養物を支持するためのフィーダー細胞に取って代わるためのマトリックス構成成分を含んでいてもよい。細胞接着のためのマトリックス構成成分は、幹細胞またはフィーダー細胞（使用される場合）を付着させるように意図される任意の物質とすることができる。マトリックス構成成分の非限定的な例は、コラーゲン、ゼラチン、ポリ−Ｌ−リシン、ポリ−Ｄ−リシン、ビトロネクチン、ラミニン、およびフィブロネクチンならびにその混合物、たとえばＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）および溶解細胞膜調製物を含む。
【００１５】
ある実施形態では、本発明は、ｉＰＳ細胞の集団を作製するための方法であって、ａ）１つ以上のリプログラミング因子を発現する染色体外遺伝エレメントを含む体細胞を得るステップと、ｂ）ＧＳＫ−３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、および／またはＴＧＦ−β受容体阻害剤などのような外部添加の１つ以上のシグナル伝達阻害剤を含むリプログラミング条件において体細胞および／またはその子孫細胞を培養し、それによってｉＰＳ細胞の集団を作製するステップとを含む方法に関する。ある態様では、リプログラミング培地は、ＧＳＫ−３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＴＧＦ−β受容体阻害剤、および任意選択でＬＩＦの組合せを含んでいてもよい。
【００１６】
さらなる態様では、リプログラミング条件は、照射マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）フィーダー細胞のようなフィーダー細胞が本質的になくてもよい。リプログラミング条件は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）などのようなマトリックス構成成分を含んでいてもよい。
【００１７】
体細胞は、初代ヒト細胞などのようなヒト細胞または初代細胞であってもよい。体細胞の例は、線維芽細胞、ケラチノサイト、造血細胞、間葉細胞、脂肪細胞、内皮細胞、神経細胞、筋細胞、乳房細胞、肝細胞、腎細胞、皮膚細胞、消化管細胞、卵丘細胞、腺細胞、膵島細胞を含むが、これらに限定されない。造血細胞は、造血前駆細胞（たとえばＣＤ３４＋細胞）、Ｔ細胞、Ｂ細胞、またはその組合せなどのような任意の血液細胞を含んでいてもよい。
【００１８】
ある態様では、染色体外遺伝エレメントは、エピソームベクターとしてさらに指定されてもよい。たとえば、エピソームベクターは、リプログラミング因子の発現のための複製開始点および１つ以上の発現カセットを含んでいてもよい。そのような１つ以上の発現カセットは、染色体外鋳型を複製するために複製開始点に結合するトランス作用因子をコードするヌクレオチド配列をさらに含んでいてもよい。その代わりに、体細胞は、そのようなトランス作用因子を発現してもよい。染色体外遺伝エレメントは、ＤＮＡまたはＲＮＡなどのような任意の遺伝物質または核酸であってもよい。
【００１９】
そのようなエピソームベクターは、細菌エレメントが本質的になくてもよい。細菌エレメントは、細菌複製起点、たとえばｐＵＣ複製開始点および細菌選択カセット、たとえばアンピシリン選択カセットなどのような、細菌におけるプラスミド増殖のために必要とされるベクターバックボーンの構成成分であってもよい。
【００２０】
例示的な実施形態では、複製開始点は、ＥＢＶのｏｒｉＰに対応するリンパ向性ヘルペスウイルスまたはガンマヘルペスウイルスの複製開始点などのような、リンパ向性ヘルペスウイルスもしくはガンマヘルペスウイルス、アデノウイルス、ＳＶ４０、ウシパピローマウイルス、または酵母の複製開始点であってもよい。さらなる態様では、リンパ向性ヘルペスウイルスは、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、カポジ肉腫ヘルペスウイルス（Ｋａｐｏｓｉ’ｓ  ｓａｒｃｒｏｍａ）（ＫＳＨＶ）、ヘルペスウイルスサイミリ（ＨＳ）、またはマレック病ウイルス（ＭＤＶ）であってもよい。
【００２１】
染色体外遺伝エレメントの複製および一過性の維持のために、トランス作用因子は、好ましくはＥＢＶのＯｒｉＰに対応する複製開始点の存在下における、ＥＢＶのＥＢＮＡ−１（ＥＢＶ核抗原１）の野生型タンパク質に対応するポリペプチドまたはその誘導体であってもよい。誘導体は、野生型ＥＢＮＡ−１と比較して、組み込まれた鋳型からの転写を活性化する能力を低下させ、したがって、染色体遺伝子を異所的に活性化して、発癌性の形質転換を引き起こす可能性を低下させてもよい。それに対し、誘導体は、誘導体が複製開始点に結合した後に、染色体外鋳型から、対応する野生型タンパク質の少なくとも５％、転写を活性化してもよい。
【００２２】
体細胞のリプログラミングについては、本発明の方法のある態様は、Ｓｏｘ、Ｏｃｔ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ−２８、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、およびＳＶ４０ＬＴから成る群から選択される１つ以上、たとえばＳｏｘ、Ｏｃｔ、Ｎａｎｏｇ、および任意選択でＬｉｎ−２８のセット、Ｓｏｘ、Ｏｃｔ、Ｋｌｆ４、および任意選択でｃ−Ｍｙｃのセット、またはこれらの６つの因子の組合せを含んでいてもよいリプログラミング因子を使用することを含んでいてもよい。ある態様では、ｃ−Ｍｙｃ発現の可能性のある毒性作用を低下させるために、ＳＶ４０ラージＴ遺伝子（ＳＶ４０ＬＴ）は、ｃ−Ｍｙｃと共に含まれていてもよい。リプログラミング効率をさらに改善するためのある態様では、形質転換が欠損したＭｙｃ変異体、バリアント、またはホモログが使用されてもよい。非限定的な例は、ＬＭＹＣ（ＮＭ＿００１０３３０８１）、Ｎ末端の４１アミノ酸が欠失したＭＹＣ（ｄＮ２ＭＹＣ）、またはアミノ酸１３６に変異を有するＭＹＣ（Ｗ１３６Ｅ）などのようなＭｙｃ癌原遺伝子ファミリーメンバーを含む（Ｎａｋａｇａｗａら２０１０年）。
【００２３】
ある態様では、細胞は、少なくとももしくは約１、２、３、４、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０日間またはその中で推論できる任意の範囲の間、上記に記載されるシグナル伝達阻害剤を含むリプログラミング培地を有するリプログラミング条件において培養されてもよい。リプログラミング条件は、体細胞への染色体外エレメントの導入後の少なくとも約１日間〜５日間を含む期間、続いてもよい。開始および終了時点は、導入後の１、２、３、４、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０日間またはその中で推論できる任意の範囲、たとえば、遺伝エレメントのトランスフェクション後の約１日間〜１５日間から選択されてもよい。
【００２４】
細胞は、リプログラミング後に、増殖培地を有する増殖条件に移されてもよい。増殖培地は、外部添加のＧＳＫ−３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、およびＴＧＦ−β受容体阻害剤が本質的になくてもよい。ある態様では、増殖培地は、シグナル伝達阻害剤および／またはＬＩＦの１つ以上を有していてもよい。ある態様では、この増殖条件、たとえば通常のＥＳ細胞培養培地またはＴｅＳＲ培地を使用することによって、ヒトＥＳ細胞に類似するヒトｉＰＳ細胞が、得られてもよい。
【００２５】
ある態様では、方法は、たとえば、ＥＳ細胞様の形態などのような１つ以上の胚細胞特質に基づいて、ｉＰＳ細胞を選択するステップをさらに含んでいてもよい。さらなる態様では、方法は、増殖培地において、選択されたｉＰＳ細胞を培養するステップを含んでいてもよい。
【００２６】
さらなる利点として、リプログラミング条件または増殖条件などのような、本明細書において記載される培養条件は、フィーダー細胞が本質的になくてもよい。フィーダーフリーの条件は、フィーダー細胞由来の変異性および副作用を低下させることによって産業上および治療用の適用を改善してもよい。たとえば、マトリックス構成成分は、フィーダー細胞の代わりに使用されてもよい。フィーダーフリーの条件においてエピソームのリプログラミングを増加させるために、シグナル伝達阻害剤および／またはＦＧＦは、リプログラミング培地に追加されてもよい。
【００２７】
多能性幹細胞のクローニング効率を増加させるために、リプログラミング培地、第１、または第２の増殖培地は、ＨＡ−１００またはブレビスタチンなどのようなＲｈｏ関連キナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤またはミオシンＩＩ阻害剤をさらに含んでいてもよい。さらに、エピソームのリプログラミングのためになるおよび／またはリプログラミングされた細胞の増殖を増強するために、いくつかの態様では、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）が、リプログラミング培地に追加されてもよい。外部添加のＦＧＦまたはシグナル伝達阻害剤は、少なくとも、約、もしくは多くとも０．１、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９０、１００、１５０、２００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも、約、もしくは多くとも０．０５、０．１、０．２、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．５、２、２．５、３、４、５、６、７、８、９、１０μＭまたはその中で推論できる任意の範囲またはエピソームのリプログラミングを改善するのに有効な任意の濃度の量であってもよい。特定の実施形態では、高濃度のＦＧＦ、たとえば約４０〜２００ｎｇ／ｍｌまたは特に約１００ｎｇ／ｍｌが使用されてもよい。
【００２８】
いくつかの態様では、ＴｅＳＲ培地、ヒト胚細胞培養培地、またはＮ２Ｂ２７培地などのようなリプログラミング培地または増殖培地は、既知組成培地でもよい。ある態様では、リプログラミング培地は、Ｎ２Ｂ２７培地などのように、ＴＧＦβを本質的に含まない培地であってもよい。増殖培地は、ＴｅＳＲ培地またはｍＴｅＳＲ培地であってもよい。
【００２９】
たとえば、ＧＳＫ−３阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０２１であってもよく、ＭＥＫ阻害剤は、ＰＤ０３２５９０１であってもよく、ＴＧＦ−β受容体阻害剤は、Ａ−８３−０１であってもよい。上記の方法に従って作製されるｉＰＳ細胞の集団もまた、提供されてもよい。
【００３０】
ある態様では、本発明の方法のための開始細胞は、少なくとももしくは約１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３細胞またはその中で推論できる任意の範囲を含んでいてもよい。開始細胞集団は、少なくとももしくは約１０、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８細胞／ｍｌまたはその中で推論できる任意の範囲の接種密度を有していてもよい。
【００３１】
本発明の方法および／または組成物と関連して議論される実施形態は、本明細書において記載される他の方法または組成物に関して使用されてもよい。したがって、ある方法または組成物に関する実施形態は、他の方法および本発明の組成物に同様に適用されてもよい。
【００３２】
本明細書において使用されるように、核酸に関しての用語「コードする」または「コードすること」は、本発明を当業者によって容易に理解し得るようにするために使用されるが、これらの用語は、それぞれ、「含む」または「含むこと」と区別なく使用されてもよい。
【００３３】
本明細書において使用されるように、「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」という指定は、１つ以上を意味してもよい。請求項（複数可）において本明細書において使用されるように、単語「含むこと」と共に使用される場合、単語「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」は、１つのまたは１つを超える、を意味してもよい。
【００３４】
請求項における用語「または」の使用は、選択肢のみを指すようにまたは選択肢が相互に排他的であることが明示的に示されない限り、「および／または」を意味するために使用されるが、本開示は選択肢のみならびに「および／または」を指す定義を支持する。本明細書において使用されるように、「他の」は、少なくとも第２のまたはそれ以上の、を意味してもよい。
【００３５】
本出願の全体にわたって、用語「約」は、値が、デバイス、値を決定するために利用される方法についての誤差の固有の差異または研究対象の間で存在する差異を含むことを示すために使用される。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
ｉＰＳ細胞の集団を作製するための方法であって、
ａ）１つ以上のリプログラミング因子を発現する染色体外遺伝エレメントを含む体細胞を得るステップと、
ｂ）外部添加のＧＳＫ−３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、およびＴＧＦ−β受容体阻害剤を含むリプログラミング条件において該体細胞およびその子孫細胞を培養し、それによってｉＰＳ細胞の集団を作製するステップと
を含む方法。
（項目２）
前記リプログラミング条件は、フィーダー細胞を本質的に含まない、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記リプログラミング条件は、マトリックス構成成分を含む、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記マトリックス構成成分は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）を含む、項目３に記載の組成物。
（項目５）
前記体細胞は、ヒト細胞である、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記体細胞は、線維芽細胞、ケラチノサイト、造血細胞、間葉細胞、脂肪細胞、内皮細胞、神経細胞、筋細胞、乳房細胞、肝細胞、腎細胞、皮膚細胞、消化管細胞、卵丘細胞、腺細胞、または膵島細胞である、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記染色体外遺伝エレメントは、ＤＮＡを含む、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記染色体外遺伝エレメントは、ＲＮＡを含む、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記染色体外遺伝エレメントは、エピソームベクターとしてさらに定義される、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記エピソームベクターは、細菌エレメントを本質的に含まない、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記エピソームベクターは、リプログラミング因子の発現のための複製開始点および１つ以上の発現カセットを含み、該発現カセットの１つ以上は、染色体外鋳型を複製するために複製開始点に結合するトランス作用因子をコードするヌクレオチド配列をさらに含み、そして／または前記体細胞は、そのようなトランス作用因子を発現する、項目９に記載の方法。
（項目１２）
前記複製開始点は、リンパ向性ヘルペスウイルスの複製開始点であり、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）のｏｒｉＰに対応する、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記複製開始点は、ＥＢＶ、カポジ肉腫ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）、ヘルペスウイルスサイミリ（ＨＳ）、またはマレック病ウイルス（ＭＤＶ）の複製開始点である、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記トランス作用性因子は、ＥＢＶ核抗原１（ＥＢＮＡ−１）である、項目１１に記載の方法。
（項目１５）
前記リプログラミング因子は、Ｓｏｘ、Ｏｃｔ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ−２８、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、形質転換が欠損しているｍｙｃ変異体またはホモログ、およびＳＶ４０ＬＴから成る群から選択される１つ以上を含む、項目１に記載の方法。
（項目１６）
前記リプログラミング因子は、形質転換が欠損しているｍｙｃ変異体またはホモログを含む、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記リプログラミング因子は、ＬＭＹＣ（ＮＭ＿００１０３３０８１）、Ｎ末端の４１アミノ酸が欠失したＭＹＣ（ｄＮ２ＭＹＣ）、またはアミノ酸１３６に変異を有するＭＹＣ（Ｗ１３６Ｅ）を含む、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記細胞は、少なくとも５日間、前記リプログラミング条件において培養される、項目１に記載の方法。
（項目１９）
前記細胞は、前記体細胞への前記染色体外遺伝エレメントの導入後の少なくとも約１日間〜５日間を含む期間、前記リプログラミング条件において培養される、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記細胞は、前記体細胞への前記染色体外遺伝エレメントの導入後の約１日間〜１５日間を含む期間、前記リプログラミング条件において培養される、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
外部添加のＧＳＫ−３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、およびＴＧＦ−β受容体阻害剤を本質的に含まない増殖培地を有する増殖条件において前記ｉＰＳ細胞を培養するステップをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目２２）
前記増殖培地は、既知組成培地である、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記増殖培地は、ＴｅＳＲ培地またはｍＴｅＳＲ培地である、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記ｉＰＳ細胞を選択するステップをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目２５）
前記ｉＰＳ細胞は、１つ以上の胚細胞の特質に基づいて選択される、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記リプログラミング培地は、外部添加のＬＩＦをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目２７）
リプログラミング培地は、外部添加のＲｈｏ関連キナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤またはミオシンＩＩ阻害剤をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目２８）
前記ＲＯＣＫシグナル伝達阻害剤は、ＨＡ−１００である、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記リプログラミング培地は、外部添加の線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目３０）
前記リプログラミング培地は、既知組成培地である、項目１に記載の方法。
（項目３１）
前記既知組成培地は、ＴｅＳＲ培地、ヒト胚細胞培養培地、またはＮ２Ｂ２７培地である項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記リプログラミング培地は、外部添加のＦＧＦを有する、項目３０に記載の方法。
（項目３３）
前記リプログラミング培地は、外部添加のＴＧＦβを本質的に含まない、項目３０記載の方法。
（項目３４）
外因性の遺伝エレメントを本質的に含まない人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞の集団ならびに外部添加のグリコーゲン合成酵素キナーゼ３（ＧＳＫ−３）阻害剤、マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ（ＭＥＫ）阻害剤、および形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）受容体阻害剤を含む培地を含む組成物。
（項目３５）
前記培地は、既知組成培地である、項目３４に記載の組成物。
（項目３６）
マトリックス構成成分をさらに含む、項目３４に記載の組成物。
（項目３７）
前記マトリックス構成成分は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）を含む、項目３６に記載の組成物。
（項目３８）
前記培地は、外部添加のＬＩＦをさらに含む、項目３４に記載の組成物。
（項目３９）
前記培地は、外部添加のＨＡ−１００をさらに含む、項目３４に記載の組成物。
（項目４０）
前記培地は、外部添加のＦＧＦをさらに含む、項目３４に記載の組成物。
【００３６】
本発明の他の目的、特徴、および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、本発明の精神および範囲内の様々な変化および修飾が、この詳細な説明から当業者らに明らかになるので、詳細な説明および特定の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すが、例証のみのために提供されることが理解されたい。
【００３７】
以下の図面は、本明細書の一部を構成し、本発明のある態様をさらに示すために含まれる。本発明は、本明細書において提示される特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて、１つ以上のこれらの図面への参照によってより理解されてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】図１Ａ〜１Ｃは、小さな化学化合物を用いるヒト包皮線維芽細胞のエピソームリプログラミングの改善を示す図である。図１Ａ．エピソームリプログラミングベクター。ｐＥＦ：真核生物伸長因子１αプロモーター；ｐＣＭＶ：サイトメガロウイルス前初期プロモーター。導入遺伝子およびベクターの他の特徴は、示されるように異なる色によって示す。図１Ｂ．エピソームリプログラミング効率に対する化学化合物の異なる組合せの効果。ＦＦ培地：ヒト包皮線維芽細胞培養培地；ＣＭ：照射マウス胚性線維芽細胞フィーダー細胞を用いてあらかじめ調整したヒトＥＳ細胞培養培地。ｂＦＧＦは、１００ｎｇ／ｍｌ最終濃度で使用した。Ｂ：ＢＩＸ０１２９４（１μＭ）；Ｐ：ＰＤ０３２５９０１（０．５μＭ）；Ｃ：ＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ）；Ａ：Ａ−８３−０１（０．５μＭ）。合計：アルカリホスファターゼポジティブｉＰＳ細胞コロニーの合計数；ラージ：大きなサイズの好適な未分化アルカリホスファターゼポジティブｉＰＳ細胞コロニーの数。図１Ｃ．化学化合物の存在下においてエピソームリプログラミングによって得られた好適なｉＰＳ細胞コロニーの画像。左：明視野；右：アルカリホスファターゼ染色。
【図２】図２Ａ〜２Ｂは、小さな化学化合物を用いるヒト包皮線維芽細胞のエピソームリプログラミングの改善を示す図である。図２Ａ．エピソームリプログラミング効率に対するｂＦＧＦおよび化学化合物の異なる組合せの効果。ＦＦ培地：ヒト包皮線維芽細胞培養培地；ＣＭ：照射マウス胚性線維芽細胞フィーダー細胞を用いてあらかじめ調整したヒトＥＳ細胞培養培地。ｂＦＧＦは、１００ｎｇ／ｍｌ最終濃度で使用した。Ｈ：ＨＡ−１００（１０μＭ）；Ｂ：ＢＩＸ０１２９４（１μＭ）；Ｐ：ＰＤ０３２５９０１（０．５μＭ）；Ｃ：ＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ）；Ａ：Ａ−８３−０１（０．５μＭ）；Ｌ：ｈＬＩＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）。合計：アルカリホスファターゼポジティブｉＰＳ細胞コロニーの合計数；ラージ：大きなサイズの好適な未分化アルカリホスファターゼポジティブｉＰＳ細胞コロニーの数。図２Ｂ．エピソームリプログラミング効率に対する化学化合物処理のタイミング。ｂＦＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）およびＨＡ−１００（１０μＭ）を補足したＣＭを、リプログラミング培養において使用した。
【図３】図３Ａ〜３Ｄは、別個のｉＰＳ細胞が、化学化合物を用いて処理したエピソームリプログラミング培養から得ることができることを示す図である。図３Ａ．ＰＤ０３２５９０１（０．５μＭ）、ＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ）、Ａ−８３−０１（０．５μＭ）、およびｈＬＩＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）を補足したＣＭ（照射マウス胚性線維芽細胞フィーダー細胞を用いてあらかじめ調整したヒトＥＳ細胞培養培地）における５日間の培養後の分化ヒトＨ１  ＥＳ細胞（ｐ４４）および通常のヒトＥＳ細胞様のｉＰＳ細胞（ｐ２０、化学処理の非存在下においてエピソームリプログラミングによってヒト包皮線維芽細胞から誘導）の画像。図３Ｂ．ＰＤ０３２５９０１（０．５μＭ）、ＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ）、およびＡ−８３−０１（０．５μＭ）の存在下におけるエピソームリプログラミングを用いて４２歳の成人皮膚生検材料から誘導された通常のヒトＥＳ細胞様のｉＰＳ細胞の明視野画像。化学化合物は、コロニーピッキングの３日間前（ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ後の２３日目）に除去した。ｉＰＳ細胞コロニーは、採集し、化学化合物の非存在下においてｂＦＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）を補足したヒトＥＳ細胞培養培地において照射マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）フィーダー細胞上で増殖した。図３Ｃ．ＰＤ０３２５９０１（０．５μＭ）、ＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ）、Ａ−８３−０１（０．５μＭ）、およびｈＬＩＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下におけるエピソームリプログラミングを用いてヒト包皮線維芽細胞から誘導されたｉＰＳ（部分的にリプログラミングされたｉＰＳＣについてはｐｉＰＳＣ）細胞の中間段階の明視野画像。化学化合物は、リプログラミング培養の全体にわたって存在した。ｐｉＰＳ細胞コロニーは、採集し、ＰＤ０３２５９０１（０．５μＭ）、ＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ）、Ａ−８３−０１（０．５μＭ）、およびｈＬＩＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）を補足したＣＭにおいてＭＥＦフィーダー細胞上で増殖した。図３Ｄ．化学化合物の除去後の、ｂＦＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）を補足したヒトＥＳ細胞培養培地において培養されたｐｉＰＳ細胞由来のロゼット塊（神経分化）の明視野画像。
【図４】図４Ａ〜４Ｂは、化学化合物を補足した既知組成培地におけるエピソームリプログラミングを示す図である。図４Ａ．ＰＤ０３２５９０１（０．５μＭ）、ＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ）、Ａ−８３−０１（０．５μＭ）、およびｈＬＩＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下におけるエピソームリプログラミングに対する異なる培地の効果。ＦＦ培地：ヒト包皮線維芽細胞培養培地；ＣＭ：照射マウス胚性線維芽細胞フィーダー細胞を用いてあらかじめ調整したヒトＥＳ細胞培養培地。ｂＦＧＦは、１００ｎｇ／ｍｌ最終濃度で使用した。Ｈ：ＨＡ−１００（１０μＭ）；Ｂ：ＢＩＸ０１２９４（１μＭ）；Ｐ：ＰＤ０３２５９０１（０．５μＭ）；Ｃ：ＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ）；Ａ：Ａ−８３−０１（０．５μＭ）；Ｌ：ｈＬＩＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）。合計：アルカリホスファターゼポジティブｉＰＳ細胞コロニーの合計数；ラージ：大きなサイズの好適な未分化アルカリホスファターゼポジティブｉＰＳ細胞コロニーの数。図４Ｂ。通常のヒトＥＳ細胞様のｉＰＳ細胞およびｐｉＰＳ細胞の誘導のための３ステップリプログラミングプロセスの概略図。
【図５】図５Ａ〜５Ｃは、小分子を用いるエピソームリプログラミング効率の改善を示す図である。図５Ａ．エピソームリプログラミングに対するＰＤ０３２５９０１（Ｐ、０．５μＭ）、ＣＨＩＲ９９０２１（Ｃ、３μＭ）、Ａ−８３−０１（Ａ、０．５μＭ）、ｈＬＩＦ（Ｌ、１０００Ｕ／ｍｌ）、およびＨＡ−１００（Ｈ、１０μＭ）の効果。図５Ｂ  エピソームリプログラミングの改善のための小分子処理の一時的な必要。トランスフェクトされたヒト包皮線維芽細胞は、ＭＥＦフィーダー細胞に平板培養した。１００ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ（ＣＭ１００）および小分子を補足したＭＥＦ馴化ヒトＥＳＣ培地は、リプログラミングを支持するために使用した。アルカリホスファターゼポジティブｉＰＳＣコロニーは、トランスフェクション後の２２〜２３日目にカウントした。ｉＰＳＣコロニーの数は、約０．３３×１０６インプット細胞に由来した。示すデータは、平均±標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ．）とする（ｎ＝３）。図５Ｃ．小分子の存在下における、新しく誘導されたｉＰＳＣ（ｐ３）の分化。採集し、ＭＥＦフィーダー細胞上で小分子を補足したヒトＥＳＣ培地またはＭＥＦ馴化ヒトＥＳＣ培地において増殖した場合、小分子の継続的な存在により誘導されたｉＰＳＣは、広範囲な分化を示した。培養培地におけるｂＦＧＦの追加は、効果を有していなかった。黒色矢印：未分化ｉＰＳＣコロニー；白色矢印：分化コロニー。スケールバー：１００μｍ。
【図６−１】図６Ａ〜６Ｄは、エピソームリプログラミングのためのフィーダーフリー条件の開発を示す図である。図６Ａ．エピソームリプログラミングに対するＭＥＦフィーダー細胞、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）、および培養培地の効果。トランスフェクトヒト包皮線維芽細胞（ｐ６）は、ＭＥＦフィーダー細胞接種またはＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）コーティング１０ｃｍ皿に平板培養し、異なるリプログラミング培養条件にかけた。アルカリホスファターゼポジティブ（ＡＰ＋）コロニーは、トランスフェクション後の１８〜２１日目にカウントした。ＡＰ＋コロニーの数は、約０．３３×１０６インプット細胞に由来した。示すデータは、平均±ｓ．ｅ．ｍ．とする（ｎ＝３）。Ｎ２Ｂ２７：Ｎ−２およびＢ−２７を補足したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地；Ｎ２Ｂ２７−１００：１００ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦを補足したＮ２Ｂ２７培地。＊はｐｉＰＳＣを示す。図６Ｂ．試験２からのｐｉＰＳＣコロニーならびに試験１、３、および４からのヒトＥＳＣ様のｉＰＳＣコロニーの明視野画像。スケールバー：１００μｍ。図６Ｃ．ｐｉＰＳＣクローン１〜４（ｐ３）におけるＯＣＴ４およびＮＡＮＯＧ発現の定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析。合計：内因性および導入遺伝子発現。ヒトＨ１  ＥＳＣ（Ｈ１ＥＳＣ、ｐ３２）をコントロールとして使用した。示すデータは、平均±ｓ．ｅ．ｍ．とする（ｎ＝３）。図６Ｄ．既知組成培養培地を使用するフィーダーフリーエピソームリプログラミングのための小分子処理の一時的な必要条件。トランスフェクトヒト包皮線維芽細胞（ｐ７）は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）コーティング１０ｃｍ皿に平板培養した。ＰＣＡＬＨを補足したＮ２Ｂ２７−１００培地は、異なる期間、リプログラミングを支持するために使用し（段階２）、その後に増殖のためのｍＴｅＳＲ１を使用した。アルカリホスファターゼポジティブｉＰＳＣコロニーは、トランスフェクション後の２２日目にカウントした。ｉＰＳＣコロニーの数は、約０．３３×１０６インプット細胞に由来した。示すデータは、平均±ｓ．ｅ．ｍ．とする（ｎ＝３）。
【図６−２】図６Ａ〜６Ｄは、エピソームリプログラミングのためのフィーダーフリー条件の開発を示す図である。図６Ａ．エピソームリプログラミングに対するＭＥＦフィーダー細胞、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）、および培養培地の効果。トランスフェクトヒト包皮線維芽細胞（ｐ６）は、ＭＥＦフィーダー細胞接種またはＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）コーティング１０ｃｍ皿に平板培養し、異なるリプログラミング培養条件にかけた。アルカリホスファターゼポジティブ（ＡＰ＋）コロニーは、トランスフェクション後の１８〜２１日目にカウントした。ＡＰ＋コロニーの数は、約０．３３×１０６インプット細胞に由来した。示すデータは、平均±ｓ．ｅ．ｍ．とする（ｎ＝３）。Ｎ２Ｂ２７：Ｎ−２およびＢ−２７を補足したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地；Ｎ２Ｂ２７−１００：１００ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦを補足したＮ２Ｂ２７培地。＊はｐｉＰＳＣを示す。図６Ｂ．試験２からのｐｉＰＳＣコロニーならびに試験１、３、および４からのヒトＥＳＣ様のｉＰＳＣコロニーの明視野画像。スケールバー：１００μｍ。図６Ｃ．ｐｉＰＳＣクローン１〜４（ｐ３）におけるＯＣＴ４およびＮＡＮＯＧ発現の定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析。合計：内因性および導入遺伝子発現。ヒトＨ１  ＥＳＣ（Ｈ１ＥＳＣ、ｐ３２）をコントロールとして使用した。示すデータは、平均±ｓ．ｅ．ｍ．とする（ｎ＝３）。図６Ｄ．既知組成培養培地を使用するフィーダーフリーエピソームリプログラミングのための小分子処理の一時的な必要条件。トランスフェクトヒト包皮線維芽細胞（ｐ７）は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）コーティング１０ｃｍ皿に平板培養した。ＰＣＡＬＨを補足したＮ２Ｂ２７−１００培地は、異なる期間、リプログラミングを支持するために使用し（段階２）、その後に増殖のためのｍＴｅＳＲ１を使用した。アルカリホスファターゼポジティブｉＰＳＣコロニーは、トランスフェクション後の２２日目にカウントした。ｉＰＳＣコロニーの数は、約０．３３×１０６インプット細胞に由来した。示すデータは、平均±ｓ．ｅ．ｍ．とする（ｎ＝３）。
【図７】図７Ａ〜７Ｆは、既知組成培地を用いてフィーダーフリー条件下で誘導されたｉＰＳＣの特徴付けを示す図である。図７Ａ．ヒト成人皮膚線維芽細胞（ｉＰＳ（ＳＫ４６）クローン２）から誘導されたｉＰＳＣの明視野画像。スケールバー：１００μｍ。図７Ｂ．ｉＰＳ（ＳＫ４６）クローン２（ｐ１７）のＧ結合染色体分析。図７Ｃ．ｉＰＳＣにおけるリプログラミングベクターのＰＣＲ分析。Ｅ：エピソームＤＮＡ；Ｇ：ゲノムＤＮＡ；ＮＦ：新生児包皮線維芽細胞（ｐ５）；ｉＰＳＦ７クローン１〜３：新生児包皮線維芽細胞（ｐ２６）から誘導されたｉＰＳＣ；ＡＦ：成人皮膚線維芽細胞（ｐ６）；ｉＰＳ（ＳＫ４６）クローン１〜３：成人皮膚線維芽細胞（ｐ２２）から誘導されたｉＰＳＣ。ヒト包皮線維芽細胞（ｐ４）から誘導されたｐｉＰＳＣは、コントロールとして使用した。Ｔ−ＯＣＴ４：導入遺伝子ＯＣＴ４；Ｔ−ＳＯＸ２：導入遺伝子ＳＯＸ２；Ｔ−ＮＡＮＯＧ：導入遺伝子ＮＡＮＯＧ；Ｔ−ＬＩＮ２８：導入遺伝子ＬＩＮ２８；Ｔ−ｃ−ＭＹＣ：導入遺伝子ｃ−ＭＹＣ；Ｔ１−ＫＬＦ４：導入遺伝子ＫＬＦ４（１）；Ｔ２−ＫＬＦ４：導入遺伝子ＫＬＦ４（２）；Ｔ−ＳＶ４０ＬＴ：導入遺伝子ＳＶ４０ＬＴ；ＯＣＴ４：内因性ＯＣＴ４。３２のＰＣＲサイクルは、すべてのプライマーセットに使用した。図７Ｄ．ｉＰＳＣクローンにおける内因性ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、およびＬＩＮ２８発現の定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析。示すデータは、平均±ｓ．ｅ．ｍ．とする（ｎ＝３）。図７Ｅ．ｉＰＳＣクローンにおけるＯＣＴ４およびＮＡＮＯＧプロモーターのメチル化ステータスの重亜硫酸配列決定分析。白丸は、非メチル化を示し、黒丸は、メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを示す。図７Ｆ．ｉＰＳＣ（ＳＫ４６）クローン２の奇形腫切片のヘマトキシリンおよびエオシン染色。奇形腫は、すべてのｉＰＳＣクローンから得られた。左のパネル：神経組織（外胚葉）；中央のパネル：軟骨（中胚葉）；右のパネル：腸上皮（内胚葉）。スケールバー：１００μｍ。
【図８】図８Ａ〜８Ｃは、小分子の存在下における異なる体細胞型からのｉＰＳＣ誘導に対する異なるエピソームリプログラミングベクターの組合せの効果を示す図である。図８Ａ．エピソームベクターを用いるヒト包皮線維芽細胞のリプログラミング。トランスフェクトヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ、ｐ６）は、包皮線維芽細胞培養培地においてＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）コーティング１０ｃｍ皿に平板培養した。ＰＤ０３２５９０１（Ｐ、０．５μＭ）、ＣＨＩＲ９９０２１（Ｃ、３μＭ）、Ａ−８３−０１（Ａ、０．５μＭ）、ｈＬＩＦ（Ｌ、１０００Ｕ／ｍｌ）、およびＨＡ−１００（Ｈ、１０μＭ）（ＰＣＡＬＨ）を補足したＮ２Ｂ２７−１００培地は、トランスフェクション後の１日目および１３日目の間にリプログラミングを支持するために使用し、その後にトランスフェクション後の１４日目および２１日目の間にｍＴｅＳＲ１を使用した。ｉＰＳＣコロニーの数は、約０．３３×１０６インプット細胞に由来した。示すデータは、平均±標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ．）とする（ｎ＝３）。７Ｆ−１（ｐＥＰ４ＥＯ２ＳＣＫ２ＭＥＮ２ＬおよびｐＥＰ４ＥＯ２ＳＥＴ２Ｋ）；７Ｆ−２（ｐＥＰ４ＥＯ２ＳＥＮ２Ｋ、ｐＣＥＰ４−Ｍ２Ｌ、およびｐＥＰ４ＥＯ２ＳＥＴ２Ｋ）；５Ｆ（ｐＥＰ４ＥＯ２ＳＥＮ２ＬおよびｐＥＰ４ＥＯ２ＳＥＴ２Ｎ）。ベクター地図はすべて、図１２中に示す。図８Ｂ．エピソームベクターを用いる脂肪組織誘導幹細胞（ＡｄＳＣ）のリプログラミング。ＡｄＳＣ（Ｚｅｎｂｉｏ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｐａｒｋ、ＮＣ）は、ヒトコラーゲンＩ（１０ｃｍ皿当たり６０μｇ、ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．）およびフィブロネクチン（１０ｃｍ皿当たり１８μｇ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてコーティングした１０ｃｍ皿上で、１×Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補足したＭｅｓｅｎＣｕｌｔ（登録商標）−ＸＦ培養培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、ＢＣ、Ｖ５Ｚ  １Ｂ３、Ｃａｎａｄａ）において培養した。トランスフェクトＡｄＳＣ（ｐ９、プログラムＡ−３３を用いるＡｍａｘａ  ＶＰＥ−１００１）は、ＡｄＳＣ培養培地においてＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）コーティング１０ｃｍ皿に平板培養した。ＰＣＡＬＨを補足したＮ２Ｂ２７−１００培地は、トランスフェクション後の２日目および１３日目の間にリプログラミングを支持するために使用し、その後にトランスフェクション後の１３日目および２１日目の間にｍＴｅＳＲ１を使用した。ｉＰＳＣコロニーの数は、約０．３５×１０６インプット細胞に由来した。示すデータは、平均±標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ．）とする（ｎ＝２）。図８Ｃ．エピソームベクターを用いる臍帯血（ＣＢ）誘導ＣＤ３４＋細胞のリプログラミング。トランスフェクションに先立って、ＣＢ誘導ＣＤ３４＋細胞（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．）は、ＣＢ  ＣＤ３４＋細胞増殖培地：１×ＥｘＣｙｔｅ培地サプリメント（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）、１×Ｇｌｕｔａｍａｘ、２５０ｎｇ／ｍｌ  ＳＣＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ、ＮＪ）、２５０ｎｇ／ｍｌ  ＦＬＴ３Ｌ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、１００ｎｇ／ｍｌ  ＴＰＯ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、２０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、５０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−６（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、および１０ｎｇ／ｍｌ  ｓＩＬ６−Ｒ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を補足したＳｔｅｍＳｐａｎ  ＳＦＥＭ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．）において、フィブロネクチンコーティング６ウェルプレート上で４日間、培養した。トランスフェクトＣＢ細胞（プログラムＴ−１６を用いるＡｍａｘａ  ＶＰＡ−１００３）は、ＣＢ  ＣＤ３４＋細胞増殖培地におけるフィブロネクチン／Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）コーティング６ウェルプレートに平板培養した。ＰＣＡＬＨを補足したＮ２Ｂ２７−１００培地は、トランスフェクション後の２日目および１１日目の間にリプログラミングを支持するために使用し、その後にトランスフェクション後の１１日目および１７日目の間にｍＴｅＳＲ１を使用した。ｉＰＳＣコロニーの数は、約０．３３×１０６インプット細胞に由来した（４日間の培養後）。示すデータは、平均±標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ．）とする（ｎ＝３）。
【図９】図９は、小分子の存在下における形質転換欠損ＭＹＣを用いるエピソームリプログラミングの改善を示す図である。エピソームベクターの組合せ７Ｆ−２をｉＰＳＣ誘導に使用した。ベクターｐＣＥＰ４−Ｍ２Ｌにおけるｃ−Ｍｙｃは、形質転換欠損ＭＹＣ：ＬＭＹＣ（ＮＭ＿００１０３３０８１）、Ｎ末端の４１アミノ酸が欠失したＭＹＣ（ｄＮ２ＭＹＣ）、またはアミノ酸１３６に変異を有するＭＹＣ（Ｗ１３６Ｅ）と交換した（Ｎａｋａｇａｗａら、２０１０年）。トランスフェクトヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ、ｐ９）は、包皮線維芽細胞培養培地においてＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）コーティング１０ｃｍ皿に平板培養した。ＰＤ０３２５９０１（Ｐ、０．５μＭ）、ＣＨＩＲ９９０２１（Ｃ、３μＭ）、Ａ−８３−０１（Ａ、０．５μＭ）、ｈＬＩＦ（Ｌ、１０００Ｕ／ｍｌ）、およびＨＡ−１００（Ｈ、１０μＭ）（ＰＣＡＬＨ）を補足したＮ２Ｂ２７−１００培地は、トランスフェクション後の２日目および１３日目の間にリプログラミングを支持するために使用し、その後にトランスフェクション後の１４日目および２０日目の間にｍＴｅＳＲ１を使用した。ｉＰＳＣコロニーの数は、約０．３３×１０６インプット細胞に由来した。示すデータは、平均±標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ．）とする（ｎ＝３）。
【図１０Ａ】図１０Ａ〜１０Ｃは、エピソームリプログラミングのためのフィーダーフリー条件の開発を示す図である。図１０Ａ．ｐｉＰＳＣ（ｐ６）におけるヒトＥＳＣ特異的細胞表面マーカー（ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、およびＴｒａ−１−８１）ならびに線維芽細胞マーカーＣＤ４４のフローサイトメトリー発現分析。白：アイソタイプコントロール；黒：抗原染色。図１０Ｂ．ｐｉＰＳＣ（ｐ７）から単離されたエピソームＤＮＡにおけるリプログラミングベクターのＰＣＲ分析。レーン１：導入遺伝子ＯＣＴ４（Ｔ−ＯＣＴ４）；レーン２：導入遺伝子ＮＡＮＯＧ（Ｔ−ＮＡＮＯＧ）；レーン３：導入遺伝子ＫＬＦ４（１）（Ｔ１−ＫＬＦ４）；レーン４：導入遺伝子ＫＬＦ４（２）（Ｔ２−ＫＬＦ４）；レーン５：導入遺伝子ＳＶ４０ＬＴ（Ｔ−ＳＶ４０ＬＴ）；レーン６：導入遺伝子ＳＯＸ２（Ｔ−ＳＯＸ２）；レーン７：導入遺伝子ＬＩＮ２８（Ｔ−ＬＩＮ２８）；レーン８：導入遺伝子ｃ−ＭＹＣ（Ｔ−ｃ−ＭＹＣ）；レーン９：内因性ＯＣＴ４（ＯＣＴ４）。図１０Ｃ．ｍＴｅＳＲ１を使用するフィーダーフリーエピソームリプログラミングのための小分子処理の一時的な必要条件。トランスフェクトヒト包皮線維芽細胞（ｐ７）は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）コーティング１０ｃｍ皿に平板培養した。小分子（ＰＣＡＬＨ）を補足したｍＴｅＳＲ１は、異なる期間、リプログラミングを支持するために使用し（段階２）、その後に増殖のために小分子なしのｍＴｅＳＲ１を使用した。アルカリホスファターゼポジティブｉＰＳＣコロニーは、トランスフェクション後の２２日目にカウントした。ｉＰＳＣコロニーの数は、約０．３３×１０６インプット細胞に由来した。示すデータは、平均±ｓ．ｅ．ｍ．とする（ｎ＝３）。
【図１０Ｂ】図１０Ａ〜１０Ｃは、エピソームリプログラミングのためのフィーダーフリー条件の開発を示す図である。図１０Ａ．ｐｉＰＳＣ（ｐ６）におけるヒトＥＳＣ特異的細胞表面マーカー（ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、およびＴｒａ−１−８１）ならびに線維芽細胞マーカーＣＤ４４のフローサイトメトリー発現分析。白：アイソタイプコントロール；黒：抗原染色。図１０Ｂ．ｐｉＰＳＣ（ｐ７）から単離されたエピソームＤＮＡにおけるリプログラミングベクターのＰＣＲ分析。レーン１：導入遺伝子ＯＣＴ４（Ｔ−ＯＣＴ４）；レーン２：導入遺伝子ＮＡＮＯＧ（Ｔ−ＮＡＮＯＧ）；レーン３：導入遺伝子ＫＬＦ４（１）（Ｔ１−ＫＬＦ４）；レーン４：導入遺伝子ＫＬＦ４（２）（Ｔ２−ＫＬＦ４）；レーン５：導入遺伝子ＳＶ４０ＬＴ（Ｔ−ＳＶ４０ＬＴ）；レーン６：導入遺伝子ＳＯＸ２（Ｔ−ＳＯＸ２）；レーン７：導入遺伝子ＬＩＮ２８（Ｔ−ＬＩＮ２８）；レーン８：導入遺伝子ｃ−ＭＹＣ（Ｔ−ｃ−ＭＹＣ）；レーン９：内因性ＯＣＴ４（ＯＣＴ４）。図１０Ｃ．ｍＴｅＳＲ１を使用するフィーダーフリーエピソームリプログラミングのための小分子処理の一時的な必要条件。トランスフェクトヒト包皮線維芽細胞（ｐ７）は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）コーティング１０ｃｍ皿に平板培養した。小分子（ＰＣＡＬＨ）を補足したｍＴｅＳＲ１は、異なる期間、リプログラミングを支持するために使用し（段階２）、その後に増殖のために小分子なしのｍＴｅＳＲ１を使用した。アルカリホスファターゼポジティブｉＰＳＣコロニーは、トランスフェクション後の２２日目にカウントした。ｉＰＳＣコロニーの数は、約０．３３×１０６インプット細胞に由来した。示すデータは、平均±ｓ．ｅ．ｍ．とする（ｎ＝３）。
【図１０Ｃ】図１０Ａ〜１０Ｃは、エピソームリプログラミングのためのフィーダーフリー条件の開発を示す図である。図１０Ａ．ｐｉＰＳＣ（ｐ６）におけるヒトＥＳＣ特異的細胞表面マーカー（ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、およびＴｒａ−１−８１）ならびに線維芽細胞マーカーＣＤ４４のフローサイトメトリー発現分析。白：アイソタイプコントロール；黒：抗原染色。図１０Ｂ．ｐｉＰＳＣ（ｐ７）から単離されたエピソームＤＮＡにおけるリプログラミングベクターのＰＣＲ分析。レーン１：導入遺伝子ＯＣＴ４（Ｔ−ＯＣＴ４）；レーン２：導入遺伝子ＮＡＮＯＧ（Ｔ−ＮＡＮＯＧ）；レーン３：導入遺伝子ＫＬＦ４（１）（Ｔ１−ＫＬＦ４）；レーン４：導入遺伝子ＫＬＦ４（２）（Ｔ２−ＫＬＦ４）；レーン５：導入遺伝子ＳＶ４０ＬＴ（Ｔ−ＳＶ４０ＬＴ）；レーン６：導入遺伝子ＳＯＸ２（Ｔ−ＳＯＸ２）；レーン７：導入遺伝子ＬＩＮ２８（Ｔ−ＬＩＮ２８）；レーン８：導入遺伝子ｃ−ＭＹＣ（Ｔ−ｃ−ＭＹＣ）；レーン９：内因性ＯＣＴ４（ＯＣＴ４）。図１０Ｃ．ｍＴｅＳＲ１を使用するフィーダーフリーエピソームリプログラミングのための小分子処理の一時的な必要条件。トランスフェクトヒト包皮線維芽細胞（ｐ７）は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）コーティング１０ｃｍ皿に平板培養した。小分子（ＰＣＡＬＨ）を補足したｍＴｅＳＲ１は、異なる期間、リプログラミングを支持するために使用し（段階２）、その後に増殖のために小分子なしのｍＴｅＳＲ１を使用した。アルカリホスファターゼポジティブｉＰＳＣコロニーは、トランスフェクション後の２２日目にカウントした。ｉＰＳＣコロニーの数は、約０．３３×１０６インプット細胞に由来した。示すデータは、平均±ｓ．ｅ．ｍ．とする（ｎ＝３）。
【図１１】図１１Ａ〜１１Ｅは、既知組成培地を用いてフィーダーフリー条件下で誘導されたｉＰＳＣの特徴付けを示す図である。図１１Ａ．ヒト包皮線維芽細胞から誘導されたｉＰＳＣの明視野画像（ｉＰＳＦ７クローン１）。スケールバー：１００μｍ。図１１Ｂ．ｉＰＳＦ７クローン１（ｐ１８）のＧ結合染色体分析。図１１Ｃ．ｉＰＳＣクローンにおける導入遺伝子発現のＲＴ−ＰＣＲ分析。ＮＦ：新生児包皮線維芽細胞（ｐ５）；ｉＰＳＦ７クローン１〜３：新生児包皮線維芽細胞（ｐ２６）から誘導されたｉＰＳＣ；ＡＦ：成人皮膚線維芽細胞（ｐ６）；ｉＰＳ（ＳＫ４６）クローン１〜３：成人皮膚線維芽細胞（ｐ２２）から誘導されたｉＰＳＣ。ヒト包皮線維芽細胞から誘導されたＨ１ＥＳＣ（ｐ３２）およびｐｉＰＳＣ（ｐ４）は、コントロールとして使用した。Ｔ−ＯＣＴ４：導入遺伝子ＯＣＴ４；Ｔ−ＳＯＸ２：導入遺伝子ＳＯＸ２；Ｔ−ＮＡＮＯＧ：導入遺伝子ＮＡＮＯＧ；Ｔ−ＬＩＮ２８：導入遺伝子ＬＩＮ２８；Ｔ−ｃ−ＭＹＣ：導入遺伝子ｃ−ＭＹＣ；Ｔ１−ＫＬＦ４：導入遺伝子ＫＬＦ４（１）；Ｔ２−ＫＬＦ４：導入遺伝子ＫＬＦ４（２）；Ｔ−ＳＶ４０ＬＴ：導入遺伝子ＳＶ４０ＬＴ；ＯＣＴ４：内因性ＯＣＴ４；ＧＡＰＤＨ：内因性コントロール。Ｔ−ＯＣＴ４（３０のサイクル）を除いて、３２のＰＣＲサイクルをすべてのプライマーセットに使用した。図１１Ｄ．ヒトＥＳＣ特異的細胞表面マーカー（ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、およびＴｒａ−１−８１）ならびに線維芽細胞に豊富なマーカーＣＤ４４のフローサイトメトリー発現分析。白：アイソタイプコントロール；黒：抗原染色。図１１Ｅ．ｉＰＳＦ７クローン１の奇形腫切片のヘマトキシリンおよびエオシン染色。上部のパネル：神経組織（外胚葉）；中央のパネル：軟骨（中胚葉）；下部のパネル：腸上皮（内胚葉）。スケールバー：１００μｍ。
【図１２】図１２は、ピソームリプログラミングベクターを示す図である。エピソームリプログラミングベクターの遺伝成分の詳述。ｐＥＦ：真核生物伸長因子１αプロモーター；ｐＣＭＶ：サイトメガロウイルス前初期プロモーター；ＩＲＥＳ２：配列内リボソーム進入部位；ＳＶ４０  ｐＡ：サル空胞ウイルス４０ポリアデニル化シグナル；ｏｒｉＰ：ＥＢＶ複製起点；ＥＢＮＡ−１：ＥＢＶ核抗原１；Ａｍｐ：アンピシリン細菌抵抗性選択カセット；ｐＵＣ開始点：細菌複製起点；Ｏｃｔ４：ｏｃｔａｍｅｒ４転写因子；Ｓｏｘ２：Ｓｏｘ２転写因子；ｃ−Ｍｙｃ：ｃ−Ｍｙｃ転写因子；Ｋｌｆ４：Ｋｒｅｕｐｐｅｌ様因子転写修飾因子；ＳＶ４０ＬＴ：ＳＶ４０ラージＴ遺伝子；Ｎａｎｏｇ：ＮＡＮＯＧ転写因子；Ｌｉｎ２８：Ｌｉｎ２８  ｍＲＮＡ結合タンパク質。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
例示的な実施形態の説明
Ｉ．導入
本発明は、ＧＳＫ−３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、およびＴＧＦ−β受容体阻害剤の存在下において、リプログラミングされた細胞を培養することによってエピソームリプログラミング効率および反応速度を改善するために細胞内シグナル伝達の阻害剤が使用されてもよいという驚くべき発見に部分的に基づく。ＭＥＫ阻害剤およびＴＧＦ−β受容体阻害剤を含む化学反応混液を使用することによって、ヒト線維芽細胞のレトロウイルスリプログラミングが改善されたことが報告された（Ｌｉｎら、２００９年）が、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）リプログラミングは、レトロウイルスベクターエレメントのゲノム組み込みおよび組み込まれたベクターエレメントの持続的な導入遺伝子発現について、エピソームのリプログラミングとは基本的に異なる。たとえば、実施例において示されるように、これらの３つの阻害剤の組合せの存在下におけるエピソームのリプログラミングは、ベースラインを超える最小限の増強しか有していないＭＥＫ阻害剤およびＴＧＦ−β受容体阻害剤の存在下における効率と比較して、予想外に高度なリプログラミング効率をもたらした。
【００４０】
本発明のある態様の実施におけるエピソームベクターの使用は、ゲノムの中に組み込まれるベクターに対して、いくつかの利点を有する。第１に、その使用は、ＤＮＡへのランダムな組み込みの結果として起こる適切でない表現型の改変の原因を低下させる。第２に、エピソームは、腫瘍形成を導き得る挿入変異誘発の可能性を低下させる。第３に、エピソームベクターの複製は、外因性ベクターエレメントの段階的な損失をもたらすことができ、これにより、最小限の外因性遺伝子修飾を有する細胞を残す。しかしながら、低いリプログラミング効率は、体細胞のリプログラミングにおけるエピソームベクターの使用に打ち勝ち、これは、本発明のある態様によって検討することができた。
【００４１】
さらなる態様では、改善された産業上および臨床上の適用を有するｉＰＳ細胞を作製するための方法が、開発された。方法は、外因性の遺伝エレメントを本質的に含まないｉＰＳ細胞を作製するためにフィーダーフリーの条件を使用することを含んでいてもよく、そのため、外因性の遺伝エレメントの残存または変異原性作用およびフィーダー細胞の変異性または望まれない効果によってもたらされる問題を回避してもよい。
【００４２】
さらに、ｉＰＳ細胞集団の作製のための組成物および方法における進歩もまた、下記に記載される。
【００４３】
ＩＩ．定義
本明細書において使用される「初代細胞」は、ある細胞系に樹立されていないまたは固定されていない、生きている生物またはその子孫から直接得られる細胞を指す。「ヒト初代細胞」は、生きているヒト対象から得られる初代細胞を指す。
【００４４】
「胚性幹（ＥＳ）細胞」は、初期胚から誘導される多能性幹細胞である。ＥＳ細胞は、１９８１年に最初に樹立され、これはまた、１９８９年以来、ノックアウトマウスの作製に適用されてきた。１９９８年に、ヒトＥＳ細胞が樹立され、これは、現在、再生医療のために利用可能になってきている。
【００４５】
一般にｉＰＳ細胞またはｉＰＳＣと略される「人工多能性幹細胞」は、リプログラミングによって、非多能性細胞、典型的に、成体の体細胞または線維芽細胞、造血細胞、ミオサイト、ニューロン、表皮細胞、もしくはその他同種のものなどのような最終分化細胞から人工的に調製される、多能性幹細胞のタイプを指す。
【００４６】
「多能性」は、１つ以上の組織もしくは器官または好ましくは、３つの胚葉：内胚葉（内部の胃内層、胃腸管、肺）、中胚葉（筋肉、骨、血液、泌尿生殖器）、もしくは外胚葉（表皮組織および神経系）のいずれかを構成するすべての細胞に分化するための潜在能力を有する幹細胞を指す。本明細書において使用される「多能性幹細胞」は、３つの胚葉のいずれかから誘導される細胞に分化することができる細胞、たとえば、全能性細胞、胚性幹細胞、または人工多能性細胞の直接的な子孫を指す。
【００４７】
本明細書において使用されるように、用語「体細胞」は、次世代にそのＤＮＡを直接伝達しない、卵子、精子、またはその他同種のものなどのような生殖細胞以外の任意の細胞を指す。典型的に、体細胞は、多能性が限られているまたは多能性がない。本明細書において使用される体細胞は、天然に存在してもよいまたは遺伝子改変されてもよい。
【００４８】
「リプログラミング」は、リプログラミングなしの同じ条件下で有するよりも、培養またはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて少なくとも１つの新しい細胞型の子孫を形成するための測定可能な程度に増加した性能を細胞に与えるプロセスである。特に、リプログラミングは、多能性潜在能力を体細胞に与えるプロセスである。これは、十分な増殖後に、本質的に、そのような子孫がリプログラミング前に形成することができなかった場合に、新しい細胞型の表現型の特質を有する子孫の測定可能な割合が、他の場合には、新しい細胞型の特質を有する割合が、リプログラミング前よりも測定可能な程度に多いことを意味する。ある条件下で、新しい細胞型の特質を有する子孫の割合は、望ましい順に、少なくとも約０．０５％、０．１％、０．５％、１％、５％、２５％以上であってもよい。
【００４９】
細胞は、それらが１０％未満のエレメント（複数可）を有する場合、本明細書において使用されるように、外因性の遺伝エレメントまたはベクターエレメントが「実質的になく」、それらが１％未満のエレメント（複数可）を有する場合、外因性の遺伝エレメントまたはベクターエレメントが「本質的にない」。しかしながら、全細胞集団の０．５％未満または０．１％未満が、外因性の遺伝エレメントまたはベクターエレメントを含む細胞集団がさらに望ましい。培地が、当業者に公知の従来の検出方法を使用して検出可能なレベルよりも低いこれらの試薬のレベルを有する場合、培地は、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ阻害剤、ＴＧＦ−β受容体阻害剤、ＬＩＦなどのようなある種の試薬が「本質的にない」。
【００５０】
用語「外因性」は、細胞もしくは生物におけるタンパク質、遺伝子、核酸、ポリヌクレオチド、遺伝エレメント、もしくはベクターエレメントに関して使用される場合、人工的もしくは自然の手段によって細胞もしくは生物の中に導入されたタンパク質、遺伝子、核酸、ポリヌクレオチド、遺伝エレメント、もしくはベクターエレメントを指すまたは細胞に関して、単離され、続いて、人工的なもしくは自然の手段によって他の細胞もしくは生物に導入された細胞を指す。外因性の核酸は、異なる生物もしくは細胞由来のものであってもよいまたはそれは、生物もしくは細胞内で自然に生じる核酸の１つ以上のさらなるコピーであってもよい。外因性の細胞は、異なる生物由来のものであってもよいまたはそれは、同じ生物由来のものであってもよい。非限定的な例として、外因性の核酸は、自然の細胞とは異なる染色体上の位置にあるまたは他の場合には、それが自然界において見つけられるものとは異なる核酸配列が側面に位置する。
【００５１】
「複製起点」（「ｏｒｉ」）または「複製開始点」は、細胞中のプラスミド中に存在する場合、プラスミド中の連結された配列を維持することができる、たとえばリンパ向性ヘルペスウイルス中のＤＮＡ配列および／またはＤＮＡ合成が開始される場所の部位もしくはその近くの部位である。ＥＢＶについてのｏｒｉは、ＦＲ配列（３０ｂｐリピートの２０の不完全なコピー）および好ましくはＤＳ配列を含むが、しかしながら、ＥＢＶにおける他の部位がＥＢＮＡ−１に結合する、たとえば、Ｒｅｐ＊配列は、複製起点としてＤＳと置換することができる（ＫｉｒｃｈｍａｉｅｒおよびＳｕｇｄｅｎ、１９９８年）。したがって、ＥＢＶの複製開始点は、核酸改変を介した、ＦＲ、ＤＳ、もしくはＲｅｐ＊配列または任意の機能的に等価な配列またはそれらに由来する合成的な組合せを含む。たとえば、本発明はまた、Ｌｉｎｄｎｅｒら（２００８年）において特に記載されるように、個々のエレメントの挿入または変異によってなどのように、ＥＢＶの遺伝的に操作された複製開始点を使用してもよい。
【００５２】
「リンパ向性」ヘルペスウイルスは、リンパ芽球（たとえばヒトＢリンパ芽球）または他の細胞型において複製し、その自然の生活環の少なくとも一部の間、染色体外で複製するヘルペスウイルスである。宿主に感染した後に、これらのウイルスは、プラスミドとしてウイルスゲノムを維持することによって潜在的に宿主に感染する。単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）は、「リンパ向性」ヘルペスウイルスではない。例示的なリンパ指向性ヘルペスウイルスは、ＥＢＶ、カポジ肉腫ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）、ヘルペスウイルスサイミリ（ＨＳ）、およびマレック病ウイルス（ＭＤＶ）を含むが、これらに限定されない。
【００５３】
「ベクター」または「構築物」（時に遺伝子送達または遺伝子移入「ビヒクル」と呼ばれる）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて宿主細胞に送達されることとなるポリヌクレオチドを含む高分子または分子の複合体を指す。
【００５４】
「プラスミド」は、一般的なタイプのベクターであり、染色体ＤＮＡとは無関係に複製することができる、染色体ＤＮＡと別々の染色体外ＤＮＡ分子である。ある場合には、プラスミドは、環状で二重鎖をしている。
【００５５】
本明細書において使用される「鋳型」は、複製開始点を含有するＤＮＡまたはＲＮＡの分子である。「組み込まれた鋳型」は、細胞のゲノムにおいて安定して維持される、たとえば、その細胞の染色体の中に組み込まれた鋳型である。「染色体外鋳型」は、細胞において維持され、安定して維持されるが、染色体の中に組み込まれない鋳型である。
【００５６】
「発現構築物」または「発現カセット」によって、転写を指示することができる核酸分子を意味する。発現構築物は、少なくとも、プロモーターまたはプロモーターに機能的に等価な構造を含む。エンハンサーおよび／または転写終結シグナルなどのようなさらなるエレメントもまた、含まれていてもよい。核酸分子は、ＤＮＡまたはＲＮＡであってもよい。
【００５７】
用語「に対応する」は、ポリヌクレオチド配列が、参照ポリヌクレオチド配列のすべてもしくは一部分と相同性である（つまり同一であり、厳密ではないが進化的に関連する）またはポリペプチド配列が、参照ポリペプチド配列と同一であるということを意味するために本明細書において使用される。対比して、用語「に相補的な」は、相補的配列が、参照ポリヌクレオチド配列のすべてまたは一部分と相同性であることを意味するために本明細書において使用される。例証のために、ヌクレオチド配列「ＴＡＴＡＣ」は、参照配列「ＴＡＴＡＣ」に対応し、参照配列「ＧＴＡＴＡ」に対して相補的である。
【００５８】
ＩＩＩ．ｉＰＳ細胞
人工多能性幹細胞は、一般にｉＰＳ細胞またはｉＰＳＣと略され、非多能性細胞、典型的に、成体の体細胞から人工的に誘導される多能性幹細胞のタイプである。人工多能性幹細胞は、ある種の幹細胞遺伝子およびタンパク質の発現、クロマチンメチル化パターン、倍加時間、胚様体形成、奇形腫形成、生存可能なキメラ形成、ならびに潜在能および分化可能性（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｂｉｌｉｔｙ）の点からなどのように、多くの点において、胚性幹細胞などのような自然の多能性幹細胞と同一ではなくても、類似していると考えられるが、自然の多能性幹細胞とのそれらの関係の詳細な程度は、なお評価され続けている。
【００５９】
胚性起源以外のヒト組織から誘導される人工多能性細胞の生成は、胚および胚組織の実験用の使用に関する倫理的な問題を緩和するのに望まれる。人工多能性細胞の治療用の適用の将来性が、喧伝されている。医療用の適用は、いくつかを挙げると、アルツハイマー病、糖尿病、および脊椎損傷のための治療を含む。他の適用は、疾患モデリングおよび医薬品スクリーニングを含む。
【００６０】
ＩＰＳ細胞は、マウス細胞から２００６年に（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、２００６年）およびヒト細胞から２００７年に（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、２００７年；Ｙｕら、２００７年）、最初に作製された。これは、研究者が、研究において重要であり、論争の的になっている胚の使用を伴うことなく治療用の適用を可能性として有する多能性幹細胞を得ることを可能にし得るので、それは、幹細胞研究における重要な進歩として引き合いに出されてきた。マウスまたはヒト組織由来の人工多能性細胞（ｉＰＳ細胞）を生成するための第１の成功した実証は、転写因子の特異的なセットを発現するレトロウイルスベクターの使用を含んだ。Ｊａｍｅｓ  ＴｈｏｍｓｏｎおよびＳｈｉｎｙａ  Ｙａｍａｎａｋａの研究室における研究は、マウスまたはヒト線維芽細胞へのレトロウイルスベクターによる特異的な転写因子の導入が、それらの細胞を未分化多能性幹細胞にリプログラミングするのに十分であることを実証した。Ｔｈｏｍｓｏｎが使用した因子は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、およびＬｉｎ２８を含む。Ｙａｍａｎａｋａが使用した因子は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃ−Ｍｙｃを含む。どちらかの遺伝子セットを介してのリプログラミングは、宿主細胞ゲノムへの組み込みおよび転写因子の発現によって達成される。Ｏｃｔ４およびＳｏｘ２は、リプログラミングのために必要とされる本質的な転写因子であるように思われる。リプログラミングの効率は、低く、開始細胞集団の０．０１〜０．０２％の範囲の頻度である。
【００６１】
本発明のある実施形態では、現在のリプログラミング方法を改善するために、染色体外遺伝エレメントを有する体細胞にリプログラミング因子を導入し、その後に続いて、上記に記載される１つ以上のシグナル伝達阻害剤を含むリプログラミング培地において培養することによる、体細胞をリプログラミングする方法が開示される。これらの細胞の子孫は、下記に記載される様々な態様において胚性幹細胞と同一になり得るが、外因性の遺伝エレメントを本質的に含まない。
【００６２】
本来の胚性幹細胞（ＥＳ細胞）は、胚盤胞、初期の胚の内部細胞塊から誘導される多能性幹細胞である。ＥＳ細胞は、２つの特有の特性：それらの多能性およびそれら自体を無限に自己再生するそれらの能力によって区別される。ＥＳ細胞は、多能性である、すなわち、それらは、３つの一次胚葉のすべて：外胚葉、内胚葉、および中胚葉の誘導体に分化することができる。さらに、胚性幹細胞は、特定されている条件下で、無限に自己増殖することができる。胚性幹細胞が、継続的な研究または臨床上の使用のためにそれら自体を無限の数、生み出すことができるので、これは、研究および再生医療の両方のための有用なツールとしてそれらを利用することを可能にする。
【００６３】
しかしながら、マウスおよびヒトＥＳ細胞の間に顕著な差異がある。ヒトＥＳ細胞は、Ｊａｍｅｓ  Ｔｈｏｍｓｏｎによって発見されたとき、それらの潜在能およびそれらの培養条件がマウスＥＳ細胞と異なることが分かり、これは、ＬＩＦ（マウスＥＳ細胞の培養において必要とされるエレメント）に対して全く応答しないことによって顕著であり、これは、ヒトＥＳ細胞における不活性白血病抑制因子経路に起因する。既存のヒトＩＰＳ細胞は、これらの点においてヒトＥＳ細胞に類似し、そのため、それらは、ヒトＥＳ細胞様のｉＰＳ細胞と称することができる。
【００６４】
ＩＶ．リプログラミングのための染色体外遺伝エレメント
ヒト体細胞からの多能性幹細胞の誘導は、遺伝子をリプログラミングするために異所性の発現のためにレトロウイルスまたはレンチウイルスベクターを使用して達成されてきた。モロニーマウス白血病ウイルスなどのような組換えレトロウイルスは、安定した方法において宿主ゲノムの中に組み込まれる能力を有する。組換えレトロウイルスは、宿主ゲノムへの組み込みを可能にするリバーストランスクリプターゼを含有する。レンチウイルスは、レトロウイルスのサブクラスである。レンチウイルスは、非分裂および分裂細胞のゲノムに組み込まれる能力のおかげでベクターとして広く適応されている。ウイルスが細胞に入ったとき、ＲＮＡの形態をしたウイルスゲノムが逆転写されて、ＤＮＡを産生し、ＤＮＡは、次いで、ウイルスインテグラーゼ酵素によってランダムな位置でゲノムの中に挿入される。そのため、リプログラミングの成功のための現在の技術は、組み込みベースのウイルスアプローチに依存している。
【００６５】
しかしながら、現在の技術を用いても、標的指向性の組み込みはなお、ルーチン的なものではなく（Ｂｏｄｅら、２０００年）、従来の代替のランダム組み込みは、人工多能性幹細胞における予測不能の結果を伴う挿入変異誘発を導き得る。同じ理由で、導入遺伝子の発現は、組み込み部位のクロマチンの状況に依存しているので、コントロールすることができない（Ｂａｅｒら、２０００年）。高レベルの発現は、好都合なゲノム遺伝子座でのみ達成することができるが、高度に発現される部位へのその組み込みが人工多能性幹細胞の重大な細胞の機能に干渉する危険性が存在する。
【００６６】
さらに、ＤＮＡメチル化が伴うプロセスにおいて導入遺伝子をダウンレギュレートすることによって作動する、外来性ＤＮＡに対する細胞の防御メカニズムの存在を立証する証拠が増加している（Ｂｉｎｇｈａｍ、１９９７年、Ｇａｒｒｉｃｋら、１９９８年）。さらに、ウイルスの構成成分は、他の因子と作用して、細胞を形質転換し得る。多くのウイルス遺伝子由来の継続的な発現が伴って、細胞内のウイルスゲノムの少なくとも一部の残存により、細胞形質転換が引き起こされ得る。これらの遺伝子は、細胞のシグナル伝達経路に干渉し、細胞の実際の表現型の変化を引き起こし、細胞分裂の増加を示す形質転換細胞を導き得、これは、ウイルスにとって好都合となる。
【００６７】
そのため、ある実施形態では、本発明は、以前の方法において使用されるレトロウイルスまたはレンチウイルスベクターエレメント由来のなどのような外因性の遺伝エレメントを本質的に含まない人工多能性幹細胞を生成するための新規な方法を開発する。本発明におけるこれらの方法は、最適なリプログラミング効率および反応速度を達成するために、細胞シグナル伝達阻害剤の存在下においてリプログラミングされた細胞を培養することと組み合わせて、染色体外で複製するベクターまたはエピソームとして複製することができるベクターを使用する（参照によって本明細書において組み込まれるＵ．Ｓ．出願第１２／４７８，１５４号を参照されたい）。
【００６８】
アデノウイルス、サル空胞ウイルス４０（ＳＶ４０）、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）、または出芽酵母ＡＲＳ（自己複製配列）含有プラスミドなどのような多くのＤＮＡウイルスは、哺乳動物細胞において染色体外で複製する。これらのエピソームプラスミドは、組み込み型ベクターと関連するすべての不都合（Ｂｏｄｅら、２００１年）を本質的に含まない。エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）を含むリンパ向性ヘルペスウイルスベースの系もまた、染色体外で複製し、リプログラミング遺伝子を体細胞に送達するのを助けてもよい。
【００６９】
たとえば、本発明において使用されるエピソームベクターベースのアプローチは、詳細に下記に記載されるように、臨床設定における扱いやすさを損なうことなく、ＥＢＶエレメントベースの系の複製の成功および維持のために必要な強いエレメントを抽出する。有用なＥＢＶエレメントは、ＯｒｉＰおよびＥＢＮＡ−１またはそれらのバリアントもしくは機能的な等価物である。この系のさらなる利点は、これらの外因性のエレメントが細胞の中に導入された後に時間と共に失われ、これらのエレメントを本質的に含まない自立したｉＰＳ細胞が導かれるであろうということである。
【００７０】
Ａ．エプスタインバーウイルス
ヒトヘルペスウイルス４（ＨＨＶ−４）と呼ばれるエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）は、ヘルペスファミリー（単純ヘルペスウイルスおよびサイトメガロウイルスを含む）のウイルスであり、ヒトにおいて最も一般的なウイルスの１つである。ＥＢＶは、そのゲノムを染色体外で維持し、効率的な複製および維持のために宿主細胞機構と共同で作用し（ＬｉｎｄｎｅｒおよびＳｕｇｄｅｎ、２００７年）、細胞分裂の間の細胞内でのその複製およびその保持のために２つの本質的な特徴にもっぱら依存する（Ｙａｔｅｓら  １９８５年；Ｙａｔｅｓら  １９８４年）。一般にｏｒｉＰと呼ばれる１つのエレメントは、シスで存在し、複製起点として役立つ。他の因子、ＥＢＮＡ−１は、プラスミドＤＮＡの複製および維持を促進するためにｏｒｉＰ内の配列に結合することによってトランスで機能する。非限定的な例として、本発明のある態様は、これらの２つの特徴を抽出し、従来のプラスミドに対して、これらの遺伝子の複製および発現の保持を促進するために、体細胞をリプログラミングするのに必要な遺伝子を往復させるためのベクターと関連してそれらを使用する。
【００７１】
Ｂ．複製開始点
ある態様では、ＥＢＶの複製開始点、ＯｒｉＰが使用されてもよい。ＯｒｉＰは、ＤＮＡ複製が開始する部位にありまたはその近くにあり、ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｒｅｐｅａｔｓ（ＦＲ）およびｄｙａｄ  ｓｙｍｍｅｔｒｙ（ＤＳ）として公知の、およそ１キロ塩基対離れた２つのシス作用性配列から構成される。
【００７２】
ＦＲは、３０ｂｐリピートの２１の不完全なコピーから構成され、２０の高親和性ＥＢＮＡ−１結合部位を含有する。ＦＲにＥＢＮＡ−１が結合すると、ＦＲは、共に、１０ｋｂも離れたシスのプロモーターの転写エンハンサーとして働き（ＲｅｉｓｍａｎおよびＳｕｇｄｅｎ、１９８６年；Ｙａｔｅｓ、１９８８年；ＳｕｇｄｅｎおよびＷａｒｒｅｎ、１９８９年；ＷｙｓｏｋｅｎｓｋｉおよびＹａｔｅｓ、１９８９年；ＧａｈｎおよびＳｕｇｄｅｎ、１９９５年；ＫｅｎｎｅｄｙおよびＳｕｇｄｅｎ、２００３年；Ａｌｔｍａｎｎら、２００６年）、ＦＲ含有プラスミドの核内係留および正確な維持に寄与する（Ｌａｎｇｌｅ−Ｒｏｕａｕｌｔら、１９９８年；ＫｉｒｃｈｍａｉｅｒおよびＳｕｇｄｅｎ、１９９５年；Ｗａｎｇら、２００６年；ＮａｎｂｏおよびＳｕｇｄｅｎ、２００７年）。ｏｒｉＰプラスミドの効率的な分配もまた、おそらくＦＲに起因する。ウイルスは、ＦＲにおける２０のＥＢＮＡ−１結合部位を維持するように進化してきたが、効率的なプラスミド維持は、これらの部位の７つのみを必要とし、合計１２のＥＢＮＡ−１−結合部位を有する、ＤＳの３つのコピーのポリマーによって再構成することができる（ＷｙｓｏｋｅｎｓｋｉおよびＹａｔｅｓ、１９８９年）。
【００７３】
ｄｙａｄ  ｓｙｍｍｅｔｒｙエレメント（ＤＳ）は、ＥＢＮＡ−１の存在下におけるＤＮＡ合成の開始に十分であり（Ａｉｙａｒら、１９９８年；Ｙａｔｅｓら、２０００年）、開始は、ＤＳでまたはその近くで起こる（ＧａｈｎおよびＳｃｈｉｌｄｋｒａｕｔ、１９８９年；Ｎｉｌｌｅｒら、１９９５年）。２Ｄゲル電気泳動によって観察されるように、ＦＲにＥＢＮＡ−１が結合すると、ＦＲが複製フォークバリアとして機能するので、ウイルスＤＮＡ合成の停止は、ＦＲで起こると考えられる（ＧａｈｎおよびＳｃｈｉｌｄｋｒａｕｔ、１９８９年；Ｅｒｍａｋｏｖａら、１９９６年；Ｗａｎｇら、２００６年）。ＤＳからのＤＮＡ合成の開始は、細胞周期当たり１回まで許可され（Ａｄａｍｓ、１９８７年；ＹａｔｅｓおよびＧｕａｎ、１９９１年）、細胞複製系の構成成分によって調節される（Ｃｈａｕｄｈｕｒｉら、２００１年；Ｒｉｔｚｉら、２００３年；Ｄｈａｒら、２００１年；Ｓｃｈｅｐｅｒｓら、２００１年；Ｚｈｏｕら、２００５年；Ｊｕｌｉｅｎら、２００４年）。ＦＲにおいて見つけられるものよりも低い親和性を有するにもかかわらず、ＤＳは、４つのＥＢＮＡ−１結合部位を含有する（Ｒｅｉｓｍａｎら、１９８５年）。ＤＳのトポロジーは、４つの結合部位が２対の部位として配置され、それぞれの対の間に２１ｂｐの中心間距離および２つの非対内部結合部位の間に３３ｂｐの中心間距離を有するようなものである（Ｂａｅｒら、１９８４年；Ｒａｗｌｉｎｓら、１９８５年）。
【００７４】
ＤＳ内のエレメントの機能的な役割は、Ｒｅｐ＊と称されるＥＢＶのゲノムの他の領域に関する研究によって確認されており、ＤＳと非効率的に置換することができるエレメントとして同定された（ＫｉｒｃｈｍａｉｅｒおよびＳｕｇｄｅｎ、１９９８年）。Ｒｅｐ＊を８回重合することにより、複製のその支持においてＤＳと同じくらい効率的なエレメントがもたらされた（Ｗａｎｇら、２００６年）。Ｒｅｐ＊の生化学的な分析により、その複製の機能にとって決定的な２１ｂｐの中心間距離を有する１対のＥＢＮＡ−１結合部位が同定された（同書）。ポリマー中のすべてのフランキング配列がラムダファージに由来する配列と交換された後でさえ、複製機能が保持されたので、Ｒｅｐ＊の最小限のレプリケーターは、対のＥＢＮＡ−１結合部位であることが分かった。ＤＳおよびＲｅｐ＊の比較は、共通のメカニズムを明らかにした：これらのレプリケーターは、ＥＢＮＡ−１によって曲げられ、ＥＢＮＡ−１が結合した１対の適切に間隔を置かれた部位を介して、細胞複製機構を動員することによってＤＮＡ合成の開始を支持する。
【００７５】
ＥＢＶに関係がない哺乳動物細胞において複製し、ある点で、ＥＢＶのＲａｊｉ株内の開始のゾーンに類似するように思われる他の染色体外の許可されたプラスミドがある。Ｈａｎｓ  Ｌｉｐｐｓおよび彼の同僚は、「核骨格／マトリックス付着領域」（Ｓ／ＭＡＲ）および強い転写ユニットを含有するプラスミドを開発し、研究した（Ｐｉｅｃｈａｃｚｅｋら、１９９９年；Ｊｅｎｋｅら、２００４年）。それらのＳ／ＭＡＲは、ヒトインターフェロン−ベータ遺伝子に由来し、Ａ／Ｔリッチであり、それが核マトリックスに随伴することおよび低イオン強度においてまたはスーパーコイルＤＮＡに埋め込まれた場合にそれが優先的に巻き戻されることによって操作的に定義された（Ｂｏｄｅら、１９９２年）。これらのプラスミドは、半保存的に複製し、ＯＲＣタンパク質に結合し、それらのＤＮＡの全体にわたってＤＮＡ合成の開始を有効にランダムに支持する（Ｓｃｈａａｒｓｃｈｍｉｄｔら、２００４年）。これらのプラスミドは、薬剤選択を伴うことなく、増殖するハムスターおよびヒト細胞において効率的に維持され、ブタ胚の中に導入された場合、胎児動物のほとんどの組織においてＧＦＰの発現を支持することができる（Ｍａｎｚｉｎｉら、２００６年）。
【００７６】
Ｃ．トランス作用因子
トランス作用因子の特定の例は、エプスタイン−バー核抗原１（ＥＢＮＡ−１）とすることができ、これは、それぞれの細胞分裂の間に、細胞染色体と無関係であるが、それと協力する複製および娘細胞へのＥＢＶベースのベクターの正確な分配を促進するために、ｏｒｉＰのＦＲおよびＤＳまたはＲｅｐ＊に結合するＤＮＡ結合タンパク質である。
【００７７】
ＥＢＮＡ−１の６４１のアミノ酸（ＡＡ）は、変異および欠失分析によって、その様々な機能と関連するドメインに分類された。ＡＡ４０−８９およびＡＡ３２９−３７８の間の２つの領域は、ＥＢＮＡ−１が結合した場合にシスまたはトランスで２つのＤＮＡエレメントを連結することができ、したがって、連結領域１および２（ＬＲ１、ＬＲ２）と称された（ＭｉｄｄｌｅｔｏｎおよびＳｕｇｄｅｎ、１９９２年；ＦｒａｐｐｉｅｒおよびＯ’Ｄｏｎｎｅｌｌ、１９９１年；Ｓｕら、１９９１年；Ｍａｃｋｅｙら、１９９５年）。ＧＦＰへのＥＢＮＡ−１のこれらのドメインの融合は、有系分裂染色体にＧＦＰを向かわせる（Ｍａｒｅｃｈａｌら、１９９９年；Ｋａｎｄａら、２００１年）。ＬＲ１およびＬＲ２は、複製にとって機能的に余分であり、どちらか１つの欠失は、ＤＮＡ複製を支持することができるＥＢＮＡ−１の誘導体をもたらす（ＭａｃｋｅｙおよびＳｕｇｄｅｎ、１９９９年；Ｓｅａｒｓら、２００４年）。ＬＲ１およびＬＲ２は、アルギニンおよびグリシン残基が豊富であり、Ａ／ＴリッチＤＮＡに結合するＡＴフックモチーフに似ている（ＡｒａｖｉｎｄおよびＬａｎｄｓｍａｎ、１９９８年）、（Ｓｅａｒｓら、２００４年）。ＥＢＮＡ−１のＬＲ１およびＬＲ２のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける分析は、Ａ／ＴリッチＤＮＡに結合するそれらの能力を実証した（Ｓｅａｒｓら、２００４年）。１つのそのようなＡＴフックを含有するＬＲ１がＥＢＮＡ−１のＤＮＡ結合ドメインおよび二量体化ドメインに融合された場合、野生型ＥＢＮＡ−１ほど効率的ではないにもかかわらず、ｏｒｉＰプラスミドのＤＮＡ複製に十分であることが分かった（同書）。
【００７８】
しかしながら、ＬＲ１およびＬＲ２は、異なる。ＬＲ１のＣ末端半分は、Ｎ末端半分の繰り返しＡｒｇ−Ｇｌｙ以外のアミノ酸から構成され、特有の領域１（ＵＲ１）と称される。ＵＲ１は、ＥＢＮＡ−１が、ＦＲを含有する、トランスフェクトされ、組み込まれたレポーターＤＮＡから効率的に転写を活性化するのに必要である（Ｗｕら、２００２年；ＫｅｎｎｅｄｙおよびＳｕｇｄｅｎ、２００３年；Ａｌｔｍａｎｎら、２００６年）。ＵＲ１はまた、ＥＢＶが感染したＢ細胞の効率的な形質転換にとって不可欠である。このドメインを欠くＥＢＮＡ−１の誘導体が、ウイルス全体と関連して野生型タンパク質に取って代わる場合、これらの誘導体ウイルスは、野生型ウイルスの形質転換能力の０．１％を有する（Ａｌｔｍａｎｎら、２００６年）。
【００７９】
ＬＲ２は、ｏｒｉＰ複製のＥＢＮＡ−１の支持に必要とされない（Ｓｈｉｒｅら、１９９９年；ＭａｃｋｅｙおよびＳｕｇｄｅｎ、１９９９年；Ｓｅａｒｓら、２００４年）。さらに、ＥＢＮＡ−１のＮ末端半分は、ＨＭＧＡ１ａなどのようなＡＴフックモチーフを含有する細胞タンパク質と交換することができ、なお複製機能を保持することができる（Ｈｕｎｇら、２００１年；Ｓｅａｒｓら、２００３年；Ａｌｔｍａｎｎら、２００６年）。これらの発見は、ヒト細胞においてｏｒｉＰの維持に必要とされるのは、おそらく、ＬＲ１およびＬＲ２のＡＴフック活性であることを示す。
【００８０】
第３のＥＢＮＡ−１の残基（ＡＡ９１−３２８）は、プロテオソーム分解および提示を阻害することによって宿主免疫応答を回避するＥＢＮＡ−１の能力に関係するグリシン−グリシン−アラニン（ＧＧＡ）リピートから成る（Ｌｅｖｉｔｓｋａｙａら、１９９５年；Ｌｅｖｉｔｓｋａｙａら、１９９７年）。これらのリピートはまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＥＢＮＡ−１の翻訳を阻害することが分かっている（Ｙｉｎら、２００３年）。しかしながら、このドメインの多くの欠失は、細胞培養におけるＥＢＮＡ−１の機能に対して明らかな効果を有しておらず、このドメインが果たす役割を解明するのを困難にしている。
【００８１】
核移行シグナル（ＮＬＳ）は、ＡＡ３７９−３８６によってコードされ、これはまた、細胞核輸入機構と関連する（Ｋｉｍら、１９９７年；Ｆｉｓｃｈｅｒら、１９９７年）。ＬＲ１およびＬＲ２のＡｒｇ−Ｇｌｙリッチ領域内の配列はまた、それらの高度に塩基性の含有率によりＮＬＳとして機能し得る。
【００８２】
最後に、Ｃ末端（ＡＡ４５８−６０７）は、ＥＢＮＡ−１の部分的に重なるＤＮＡ結合ドメインおよび二量体化ドメインをコードする。ＤＮＡに結合したこれらのドメインの構造は、Ｘ線結晶解析によって解明されており、パピローマウイルスのＥ２タンパク質のＤＮＡ結合ドメインに類似することが分かった（Ｈｅｇｄｅら、１９９２年；Ｋｉｍら、２０００年；Ｂｏｃｈｋａｒｅｖら、１９９６年）。
【００８３】
本発明の特定の実施形態では、リプログラミングベクターは、ｏｒｉＰおよび細胞分裂の間のプラスミド複製およびその適切な維持を支持する能力がある一種のＥＢＮＡ−１をコードする短縮配列の両方を含有するであろう。アミノ末端の３分の１の野生型ＥＢＮＡ−１内の高頻度反復配列および様々な細胞において毒性を示した２５アミノ酸領域の除去は、ｏｒｉＰと関連するＥＢＮＡ−１のトランス作用性機能にとって不要である（Ｙａｔｅｓら  １９８５年；Ｋｅｎｎｅｄｙら  ２００３年）。そのため、一実施形態では、このエピソームベクターベースの系内のｏｒｉＰと一緒に、ｄｅｌｔａＵＲ１として公知のＥＢＮＡ−１の短縮形態を使用することができる。
【００８４】
ある態様では、本発明において使用されてもよいＥＢＮＡ−１の誘導体は、対応する野生型ポリペプチドと比較して、改変されたアミノ酸配列を有するポリペプチドである。結果として生じる誘導体が所望の特性を有する限り、たとえば、ｏｒｉＰに対応するｏｒｉを含有するＤＮＡを二量体化させ、結合し、核に局所化し、細胞毒性ではなく、染色体外からの転写を活性化するが、組み込まれた鋳型からの転写を実質的に活性化しない限り、改変は、ＥＢＮＡ−１におけるＬＲ１（残基約４０〜約８９）の特有の領域（残基約６５〜約８９）に対応する領域において少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失、挿入、または置換を含み、ＥＢＮＡ−１の他の残基に対応する領域、たとえば、約残基１〜約残基４０、残基約９０〜約３２８（「Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ」リピート領域）、残基約３２９〜約３７７（ＬＲ２）、残基約３７９〜約３８６（ＮＬＳ）、残基約４５１〜約６０８（ＤＮＡ結合および二量体化）、または残基約６０９〜約６４１において１つ以上のアミノ酸残基の欠失および挿入および／または置換を含んでいてもよい。
【００８５】
Ｄ．残留物なしの特徴
重要なことには、ｏｒｉＰベースのエピソームベクターの複製および維持は、不完全であり、それが細胞の中に導入される最初の２週間以内に細胞から急に（細胞分裂当たり２５％）失われるが、プラスミドを保持する細胞は、それをそれほど頻繁に失わない（細胞分裂当たり３％）（ＬｅｉｇｈｔおよびＳｕｇｄｅｎ、２００１年；ＮａｎｂｏおよびＳｕｇｄｅｎ、２００７年）。一度、プラスミドを持つ細胞についての選択を除いたら、プラスミドは、結果として生じる娘細胞内にその前者の存在のフットプリントを残すことなく、それらがすべてある期間にわたって排除されるまで、それぞれの細胞分裂の間に失われるであろう。本発明のある態様は、ｉＰＳ細胞を生成するための遺伝子を送達するための現在のウイルス関連アプローチに対する代わりとして、ｏｒｉＰベースの系のこのフットプリントレスの特徴を使用する。他の染色体外ベクターもまた、宿主細胞の複製および増殖の間に失われるであろうし、これらもまた、本発明において利用することができる。
【００８６】
Ｅ．リプログラミング因子
ｉＰＳ細胞の生成では、誘導に使用される遺伝子が決定的である。以下の因子またはその組合せは、本発明において開示されるベクター系において使用することができる。ある態様では、ＳｏｘおよびＯｃｔ（好ましくはＯｃｔ３／４）をコードする核酸は、リプログラミングベクターの中に含まれるであろう。たとえば、リプログラミングベクターは、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、および任意選択でＬｉｎ−２８をコードする発現カセットまたはＳｏｘ２、Ｏｃｔ４、Ｋｌｆ４、および任意選択でｃ−ｍｙｃをコードする発現カセットを含んでいてもよい。これらのリプログラミング因子をコードする核酸は、同じ発現カセット、異なる発現カセット、同じリプログラミングベクター、または異なるリプログラミングベクターにおいて含まれてもよい。
【００８７】
Ｏｃｔ−３／４ならびにＳｏｘ遺伝子ファミリーのある種のメンバー（Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３、およびＳｏｘ１５）が、不在だと誘導を不可能にする、誘導プロセスに関与する決定的な転写調節因子として同定された。しかしながら、Ｋｌｆファミリー（Ｋｌｆ１、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ４、およびＫｌｆ５）、Ｍｙｃファミリー（Ｃ−ｍｙｃ、Ｌ−ｍｙｃ、およびＮ−ｍｙｃ）、Ｎａｎｏｇ、ならびにＬＩＮ２８のある種のメンバーを含むさらなる遺伝子が、誘導効率を増加させると同定された。
【００８８】
Ｏｃｔ−３／４（Ｐｏｕ５ｆ１）は、八量体（「Ｏｃｔ」）転写因子のファミリーの１つであり、多能性を維持する際に決定的な役割を果たす。割球および胚性幹細胞などのようなＯｃｔ−３／４＋細胞におけるＯｃｔ−３／４の不在により、自発的な栄養膜分化が導かれ、したがって、Ｏｃｔ−３／４の存在により、胚性幹細胞の多能性および分化潜在能力が生じる。Ｏｃｔ−３／４の類縁体、Ｏｃｔ１およびＯｃｔ６を含む「Ｏｃｔ」ファミリーにおける様々な他の遺伝子は、誘導を誘発しない。
【００８９】
遺伝子のＳｏｘファミリーは、Ｏｃｔ−３／４に類似して、多能性の維持と関連するが、それは、多能性幹細胞において排他的に発現されるＯｃｔ−３／４とは対照的に多分化能（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）および単能性幹細胞と関連する。Ｓｏｘ２は、Ｔａｋａｈａｓｈｉら（２００６年）、Ｗｅｒｎｉｇら（２００７年）、およびＹｕら（２００７年）によって誘導に使用された初めの遺伝子であったが、Ｓｏｘファミリーにおける他の遺伝子は、誘導プロセスにおいて同様に作用することが分かった。Ｓｏｘ１は、Ｓｏｘ２と類似する効率によりｉＰＳ細胞をもたらし、効率は減少するが、遺伝子Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５、およびＳｏｘ１８もまた、ｉＰＳ細胞を生成する。
【００９０】
Ｎａｎｏｇは、未分化胚性幹細胞の自己再生と決定的に関連する転写因子である。ヒトでは、このタンパク質は、ＮＡＮＯＧ遺伝子によってコードされる。Ｎａｎｏｇは、胚性幹細胞（ＥＳＣ）において発現される遺伝子であり、多能性を維持する重要な因子であると考えられる。ＮＡＮＯＧは、ＥＳＣの独自性を樹立するためにＯｃｔ４（ＰＯＵ５Ｆ１）およびＳｏｘ２などのような他の因子と協力して機能すると考えられる。
【００９１】
ＬＩＮ２８は、分化および増殖と関連する、胚性幹細胞および胚性癌腫細胞において発現されるｍＲＮＡ結合タンパク質である。Ｙｕら（２００７年）は、ＬＩＮ２８が、不可欠ではないが、ｉＰＳ生成における因子であることを実証した。
【００９２】
遺伝子のＫｌｆファミリーのＫｌｆ４は、最初に、Ｔａｋａｈａｓｈｉら（２００６年）によって同定され、マウスｉＰＳ細胞の生成のための因子としてＷｅｒｎｉｇら（２００７年）によって確認され、Ｔａｋａｈａｓｈｉら（２００７年）によってヒトｉＰＳ細胞の生成のための因子として示された。しかしながら、Ｙｕら（２００７年）は、Ｋｌｆ４が、ヒトｉＰＳ細胞の生成にとって不可欠ではないことを報告した。Ｋｌｆ２およびＫｌｆ４は、ｉＰＳ細胞を生成することができる因子であると分かり、効率は低下するが、関係する遺伝子Ｋｌｆ１およびＫｌｆ５も同様であった。
【００９３】
遺伝子のＭｙｃファミリーは、癌に関係する癌原遺伝子である。Ｔａｋａｈａｓｈｉら（２００６年）およびＷｅｒｎｉｇら（２００７年）は、ｃ−ｍｙｃが、マウスｉＰＳ細胞の生成に関係する因子であることを実証し、Ｙａｍａｎａｋａらは、それが、ヒトｉＰＳ細胞の生成に関係する因子であることを実証した。しかしながら、Ｙｕら（２００７年）およびＴａｋａｈａｓｈｉら（２００７年）は、ｃ−ｍｙｃが、ヒトｉＰＳ細胞の生成にとって不必要であることを報告した。ｃ−ｍｙｃ誘導ｉＰＳ細胞を移植したマウスの２５％が、致死的な奇形腫を発症したので、ｉＰＳ細胞の誘導における遺伝子の「ｍｙｃ」ファミリーの使用は、臨床上の療法として、ｉＰＳ細胞の不測の事態のために問題がある。Ｎ−ｍｙｃおよびＬ−ｍｙｃは、同様の効率により、ｃ−ｍｙｃの代わりに多能性を誘導することが同定された。ある態様では、細胞の形質転換が低下している変異体などのようなＭｙｃ変異体、バリアント、ホモログ、または誘導体が、使用されてもよい。例として、ＬＭＹＣ（ＮＭ＿００１０３３０８１）、Ｎ末端の４１アミノ酸が欠失したＭＹＣ（ｄＮ２ＭＹＣ）、またはアミノ酸位置１３６に変異を有するＭＹＣ（たとえばＷ１３６Ｅ）を含む。
【００９４】
Ｖ．細胞シグナル伝達阻害剤
本発明のある態様では、リプログラミングプロセスの少なくとも一部の間に、細胞は、シグナル伝達カスケードに関与するシグナルトランスデューサーを阻害する１つ以上のシグナル伝達阻害剤の存在下において、たとえば、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ＴＧＦ−β受容体阻害剤、ＭＥＫ阻害剤およびＧＳＫ３阻害剤の両方、ＧＳＫ３阻害剤およびＴＧＦ−β受容体阻害剤の両方、ＭＥＫ阻害剤およびＴＧＦ−β受容体阻害剤の両方、３つの阻害剤すべての組合せ、または、これらの同じ経路内の他のシグナルトランスデューサーの阻害剤の存在において維持されてもよい。ある態様では、ＨＡ−１００などのようなＲＯＣＫ阻害剤またはブレビスタチンなどのようなミオシンＩＩ阻害剤は、リプログラミングされた細胞および結果として生じるｉＰＳ細胞のクローン増殖を促進するために使用されてもよい。馴化ヒトＥＳ細胞培養培地などのような特定のリプログラミング培地または無血清限定Ｎ２Ｂ２７培地（ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ  ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｎ２Ｂ２７  ｍｅｄｉｕｍ）などのような既知組成培地（ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ）と組み合わせた高濃度のＦＧＦもまた、リプログラミング効率を増加させるために使用されてもよい。
【００９５】
ある実施形態では、染色体外遺伝エレメントによって、１つ以上のリプログラミング因子（たとえば本明細書において記載される２つまたは３つ以上の）で細胞に形質導入することに加えて、細胞は、ＭＥＫ阻害剤、ＴＧＦ−β受容体阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、および任意選択でＬＩＦを含むリプログラミング培地を用いて処理され、それにより、リプログラミング効率および反応速度を改善し、初代リプログラミング培養におけるｉＰＳ細胞の同定を促進し、したがってｉＰＳ細胞クローン性を保つような利点が伴う。
【００９６】
これらの態様および実施形態では、同じシグナル伝達経路（たとえばＥＲＫ１またはＥＲＫ２カスケード）のシグナル伝達構成成分を阻害する他のシグナル伝達阻害剤が、望まれる場合、ＭＥＫ阻害剤と置換されてもよいことが理解されるであろう。これは、ＦＧＦ受容体を通してのＭＡＰＫ経路の上流の刺激の阻害を特に含んでいてもよい（Ｙｉｎｇ、２００８年）。同様に、ＧＳＫ３阻害剤は、望まれる場合、インスリン合成およびＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達などのようなＧＳＫ３関連シグナル伝達経路の他の阻害剤と置換されてもよく、ＬＩＦは、望まれる場合、Ｓｔａｔ３またはｇｐ１３０シグナル伝達の他の活性化因子と置換されてもよい。
【００９７】
そのようなシグナル伝達阻害剤、たとえばＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ＴＧＦ−β受容体阻害剤は、少なくとももしくは約０．０２、０．０５、０．１、０．２、０．５、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、１５０、２００、５００〜約１０００μＭまたはその中で推論できる任意の範囲の有効濃度で使用されてもよい。
【００９８】
阻害剤は、従来の手段によって当業者らによってまたは従来の供給源から提供されてもよいまたは得られてもよい（ＷＯ２００７１１３５０５もまた参照されたい）。
【００９９】
Ａ．グリコーゲン合成酵素キナーゼ３阻害剤
グリコーゲン合成酵素キナーゼ３（ＧＳＫ−３）は、特定の細胞基質におけるあるセリンおよびトレオニンアミノ酸上へのリン酸分子の追加を媒介するセリン／トレオニンプロテインキナーゼである。ＧＳＫ−３によるこれらの他のタンパク質のリン酸化は、普通、標的タンパク質（「基質」とも呼ばれる）を阻害する。述べられるように、ＧＳＫ−３は、グリコーゲン合成酵素をリン酸化し、したがって不活性化することが公知である。それはまた、損傷ＤＮＡおよびＷｎｔシグナル伝達に対する細胞の応答のコントロールに関係する。ＧＳＫ−３はまた、Ｈｅｄｇｅｈｏｇ（Ｈｈ）経路においてＣｉをもリン酸化し、タンパク質分解のためにそれを不活性形態に向ける。グリコーゲン合成酵素に加えて、ＧＳＫ−３は、他の多くの基質を有する。しかしながら、ＧＳＫ−３は、それが、普通、基質を最初にリン酸化するために「プライミングキナーゼ」を必要とするという点で、キナーゼの中で珍しい。
【０１００】
ＧＳＫ−３リン酸化の結果は、普通、基質の阻害である。たとえば、ＧＳＫ−３が、もう１つのその基質、転写因子のＮＦＡＴファミリーをリン酸化する場合、これらの転写因子は、核に移行することができず、そのため、阻害される。発生の間の組織パターンニングを確立するのに必要とされるＷｎｔシグナル伝達経路におけるその重要な役割に加えて、ＧＳＫ−３はまた、骨格筋肥大などのような設定において誘導されるタンパク質合成にとっても決定的である。ＮＦＡＴキナーゼとしてのその役割もまた、それを、分化および細胞増殖の両方の重要な調節因子にする。
【０１０１】
ＧＳＫ３阻害は、１つ以上のＧＳＫ３酵素の阻害を指してもよい。ＧＳＫ３酵素のファミリーは、周知であり、多くのバリアントが記載されている（たとえばＳｃｈａｆｆｅｒら、２００３を参照されたい）。特定の実施形態では、ＧＳＫ３−βが、阻害される。ＧＳＫ３−α阻害剤もまた、適しており、ある態様では、本発明で使用される阻害剤は、ＧＳＫ３−αおよびＧＳＫ３−βの両方を阻害する。
【０１０２】
ＧＳＫ３の阻害剤は、ＧＳＫ３に結合する抗体、ＧＳＫ３のドミナントネガティブバリアント、ならびにＧＳＫ３を標的とするｓｉＲＮＡおよびアンチセンス核酸を含むことができる。ＧＳＫ３阻害剤の例は、Ｂｅｎｎｅｔｔら（２００２年）およびＲｉｎｇら（２００３年）において記載される。
【０１０３】
ＧＳＫ３阻害剤の特定の例は、Ｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ、ｌ−Ａｚａｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ、ＣＨＩＲ９９０２１、ＣＨＩＲ９８０１４、ＡＲ−Ａ０１４４１８（たとえばＧｏｕｌｄら、２００４年を参照されたい）、ＣＴ  ９９０２１（たとえばＷａｇｍａｎ、２００４年を参照されたい）、ＣＴ  ２００２６（Ｗａｇｍａｎ、前掲を参照されたい）、ＳＢ４１５２８６、ＳＢ２１６７６３（たとえばＭａｒｔｉｎら、２００５年を参照されたい）、ＡＲ−Ａ０１４４１８（たとえばＮｏｂｌｅら、２００５年を参照されたい）、ｌｉｔｈｉｕｍ（たとえばＧｏｕｌｄら、２００３年を参照されたい）、ＳＢ  ４１５２８６（たとえばＦｒａｍｅら、２００１年を参照されたい）、およびＴＤＺＤ−８（たとえばＣｈｉｎら、２００５年を参照されたい）を含むが、これらに限定されない。Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍから入手可能な、さらなる例示的なＧＳＫ３阻害剤は（たとえば、参照によって本明細書において組み込まれるＤａｌｔｏｎら、ＷＯ２００８／０９４５９７を参照されたい）、ＢＩＯ（２’Ｚ，３’£）−６−ブロモムジルブム−３’−オキシム（ＧＳＫ３阻害剤ＩＸ）；ＢＩＯ−アセトキシム（２’Ｚ，３’Ｅ）−６−ブロモインジルビン−３’−アセトキシム（ＧＳＫ３阻害剤Ｘ）；（５−メチル−ｌＨ−ピラゾール−３−イル）−（２−フェニルキナゾリン−４−イル）アミン（ＧＳＫ３阻害剤ＸＩＩＩ）；ピリドカルバゾール−シクロペンタジエニルルテニウム複合体（ＧＳＫ３阻害剤ＸＶ）；ＴＤＺＤ−８  ４−ベンジル−２−メチル−ｌ，２，４−チアジアゾリジン−３，５−ジオン（ＧＳＫ３ベータ阻害剤Ｉ）；２−チオ（３−ヨードベンジル）−５−（ｌ−ピリジル）−［ｌ，３，４］−オキサジアゾール（ＧＳＫ３ベータ阻害剤ＩＩ）；ＯＴＤＺＴ  ２，４−ジベンジル−５−オキソチアジアゾリジン−３−チオン（ＧＳＫ３ベータ阻害剤ＩＩＩ）；アルファ−４−ジブロモアセトフェノン（ＧＳＫ３ベータ阻害剤ＶＩＩ）；ＡＲ−ＡＯ  １４４１８  Ｎ−（４−メトキシベンジル）−Ｎ’−（５−ニトロ−ｌ，３−チアゾール−２−イル）尿素（ＧＳＫ−３ベータ阻害剤ＶＩＩＩ）；３−（ｌ−（３−ヒドロキシプロピル）−ｌＨ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル］−４−ピラジン−２−イル−ピロール−２，５−ジオン（ＧＳＫ−３ベータ阻害剤ＸＩ）；ＴＷＳｌ  １９ピロロピリミジン化合物（ＧＳＫ３ベータ阻害剤ＸＩＩ）；Ｌ８０３  Ｈ−ＫＥＡＰＰ  ＡＰＰＱＳｐＰ−ＮＨ２またはそのミリストイル化形態（ＧＳＫ３ベータ阻害剤ＸＩＩＩ）；２−クロロ−ｌ−（４，５−ジブロモ−チオフェン−２−イル）−エタノン（ＧＳＫ３ベータ阻害剤ＶＩ）；ＡＲ−ＡＯ１４４−１８；ＳＢ２１６７６３；およびＳＢ４１５２８６を含むが、これらに限定されない。
【０１０４】
ＧＳＫ３阻害剤は、たとえば、Ｗｎｔ／β−カテニン経路を活性化することができる。多くのβ−カテニン下流遺伝子は、多能性遺伝子ネットワークを同時制御する。たとえば、ＧＳＫ阻害剤は、ｃＭｙｃ発現を活性化し、そのタンパク質安定性および転写活性を増強する。したがって、いくつかの実施形態では、ＧＳＫ３阻害剤は、細胞における内因性のＭｙｃポリペプチド発現を刺激するために使用され、それによって、Ｍｙｃ発現が多能性を誘導する必要性を排除することができる。
【０１０５】
さらにＧＳＫ３−βの活性部位の構造は、特徴付けられており、特異的および非特異的な阻害剤と相互作用する重要な残基が同定されている（Ｂｅｒｔｒａｎｄら、２００３年）。この構造の特徴付けは、さらなるＧＳＫ阻害剤が容易に同定されるのを可能にする。
【０１０６】
本明細書において使用される阻害剤は、好ましくは、キナーゼを標的とすることに特異的である。ある実施形態の阻害剤は、ＧＳＫ３−βおよびＧＳＫ３−αに特異的であり、ｅｒｋ２を実質的に阻害せず、ｃｄｃ２を実質的に阻害しない。好ましくは、阻害剤は、マウスｅｒｋ２および／またはヒトｃｄｃ２を超えて、ヒトＧＳＫ３に対して、ＩＣ５０値の比として測定される、少なくとも１００倍、より好ましくは少なくとも２００倍、好ましくは少なくとも４００倍の選択性を有し、ＧＳＫ３  ＩＣ５０値への言及は、ヒトＧＳＫ３−βおよびＧＳＫ３−αについての平均値を指す。好適な結果が、ＧＳＫ３に特異的なＣＨＩＲ９９０２１により得られた。ＣＨＩＲ９９０２１の使用に適した濃度は、０．０１〜１００、好ましくは０．１〜２０、より好ましくは０．３〜１０マイクロモルの範囲である。
【０１０７】
Ｂ．ＭＥＫ阻害剤
マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ（ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼもしくはＭＥＫ）またはＭＡＰＫカスケードのようなその関係するシグナル伝達経路の阻害剤を含むＭＥＫ阻害剤が、本発明のある態様において使用されてもよい。マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ（ｓｉｃ）は、マイトジェン活性化プロテインキナーゼをリン酸化するキナーゼ酵素である。マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼはまた、ＭＡＰ２Ｋとしても知られている。細胞外刺激は、ＭＡＰキナーゼ、ＭＡＰキナーゼキナーゼ（ＭＥＫ、ＭＫＫ、ＭＥＫＫ、またはＭＡＰ２Ｋ）、およびＭＡＰキナーゼキナーゼキナーゼ（ＭＫＫＫまたはＭＡＰ３Ｋ）から構成されるシグナル伝達カスケード（「ＭＡＰＫカスケード」）を介してＭＡＰキナーゼの活性化を導く。
【０１０８】
本明細書におけるＭＥＫ阻害剤は、一般のＭＥＫ阻害剤を指す。したがって、ＭＥＫ阻害剤は、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２、およびＭＥＫ５を含むプロテインキナーゼのＭＥＫファミリーのメンバーの任意の阻害剤を指す。ＭＥＫ１、ＭＥＫ２、およびＭＥＫ５阻害剤もまた、言及される。当技術分野において既に公知の適したＭＥＫ阻害剤は、ＭＥＫ１阻害剤ＰＤ１８４３５２およびＰＤ９８０５９、ＭＥＫ１およびＭＥＫ２の阻害剤Ｕ０１２６およびＳＬ３２７、ならびにＤａｖｉｅｓら（２０００年）において議論されるものを含む。
【０１０９】
特に、ＰＤ１８４３５２およびＰＤ０３２５９０１は、他の公知のＭＥＫ阻害剤と比較した場合、高度の特異性および潜在能を有することが分かった（Ｂａｉｎら、２００７年）。他のＭＥＫ阻害剤およびＭＥＫ阻害剤のクラスは、Ｚｈａｎｇら（２０００年）において記載される。
【０１１０】
ＭＥＫの阻害剤は、ＭＥＫに対する抗体、そのドミナントネガティブバリアント、ならびにその発現を抑制するｓｉＲＮＡおよびアンチセンス核酸を含むことができる。ＭＥＫ阻害剤の特定の例は、ＰＤ０３２５９０１（たとえばＲｉｎｅｈａｒｔら、２００４年を参照されたい）、ＰＤ９８０５９（たとえばＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから入手可能）、Ｕ０１２６（たとえばＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから入手可能）、ＳＬ３２７（たとえばＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手可能）、ＡＲＲＹ−１６２（たとえばＡｒｒａｙ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａから入手可能）、ＰＤ１８４１６１（たとえばＫｌｅｉｎら、２００６を参照されたい）、ＰＤ１８４３５２（ＣＩ−１０４０）（たとえばＭａｔｔｉｎｇｌｙら、２００６年を参照されたい）、スニチニブ（たとえば、参照によって本明細書において組み込まれるＶｏｓｓら、ＵＳ２００８００４２８７を参照されたい）、ソラフェニブ（Ｖｏｓｓ  前掲を参照されたい）、バンデタニブ（Ｖｏｓｓ  前掲を参照されたい）、パゾパニブ（たとえばＶｏｓｓ  前掲を参照されたい）、アキシチニブ（Ｖｏｓｓ  前掲を参照されたい）、およびＰＴＫ７８７（Ｖｏｓｓ  前掲を参照されたい）を含むが、これらに限定されない。
【０１１１】
現在、いくつかのＭＥＫ阻害剤は、臨床試験の評価を受けている。ＣＩ−１０４０は、癌のためのフェーズＩおよびＩＩの臨床試験において評価された（たとえばＲｉｎｅｈａｒｔら、２００４年を参照されたい）。臨床試験において評価されている他のＭＥＫ阻害剤は、ＰＤ  １８４３５２（たとえばＥｎｇｌｉｓｈら、２００２年を参照されたい）、ＢＡＹ  ４３−９００６（たとえばＣｈｏｗら、２００１年を参照されたい）、ＰＤ−３２５９０１（さらにＰＤ０３２５９０１）、ＧＳＫｌ  １２０２１２、ＡＲＲＹ−４３８１６２、ＲＤＥＡｌ  １９、ＡＺＤ６２４４（さらにＡＲＲＹ−１４２８８６またはＡＲＲＹ−８８６）、ＲＯ５１２６７６６、ＸＬ５１８、およびＡＺＤ８３３０（さらにＡＲＲＹ−７０４）を含む。
【０１１２】
ＭＥＫの阻害はまた、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を使用して好都合に達成することもできる。典型的に、ＭＥＫ遺伝子のすべてまたは一部に相補的な二重鎖ＲＮＡ分子は、多能性細胞の中に導入され、したがって、ＭＥＫコードｍＲＮＡ分子の特異的な分解を促進する。この転写後メカニズムは、標的ＭＥＫ遺伝子の発現の低下または消失をもたらす。ＲＮＡｉを使用してＭＥＫ阻害を達成するための適した技術およびプロトコールは、公知である。
【０１１３】
ＧＳＫ３阻害剤およびＭＥＫ阻害剤を含むキナーゼ阻害剤を同定するための多くのアッセイが、公知である。たとえば、Ｄａｖｉｅｓら（２０００年）は、キナーゼが、ペプチド基質および放射標識ＡＴＰの存在下においてインキュベートされるキナーゼアッセイを記載する。キナーゼによる基質のリン酸化は、基質への標識の組み込みをもたらす。それぞれの反応の一定分量は、ホスホセルロース紙上に固定され、遊離ＡＴＰを除去するためにリン酸中で洗浄される。次いで、インキュベーション後の基質の活性は、測定され、キナーゼ活性の指標を提供する。候補キナーゼ阻害剤の存在下および非存在下における相対的なキナーゼ活性は、そのようなアッセイを使用して容易に決定することができる。Ｄｏｗｎｅｙら（１９９６年）はまた、キナーゼ阻害剤を同定するために使用することができるキナーゼ活性のためのアッセイを記載する。
【０１１４】
Ｃ．ＴＧＦ−β受容体阻害剤
ＴＧＦ−β受容体阻害剤は、一般に、ＴＧＦシグナル伝達の任意の阻害剤またはＴＧＦ−β受容体（たとえばＡＬＫ５）阻害剤に特異的な阻害剤を含んでいてもよく、これらは、ＴＧＦベータ受容体（たとえばＡＬＫ５）に対する抗体、そのドミナントネガティブバリアント、ならびにその発現を抑制するｓｉＲＮＡおよびアンチセンス核酸を含むことができる。例示的なＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ５阻害剤は、ＳＢ４３１５４２（たとえばＩｎｍａｎら、２００２年を参照されたい）、３−（６−メチル−２−ピリジニル）−Ｎ−フェニル−４−（４−キノリニル）−ｌＨ−ピラゾール−１−カルボチオアミドとしても公知であるＡ−８３−０１、（たとえばＴｏｊｏら、２００５年を参照されたい、たとえばＴｏｉｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから市販で入手可能である）；２−（３−（６−メチルピリジン−２−イル）−ｌＨ−ピラゾール−４−イル）−ｌ，５−ナフチリジン、Ｗｎｔ３ａ／ＢＩＯ（たとえば、参照によって本明細書において組み込まれるＤａｌｔｏｎら、ＷＯ２００８／０９４５９７を参照されたい）、ＢＭＰ４（Ｄａｌｔｏｎ、前掲を参照されたい）、ＧＷ７８８３８８（−（４−［３−（ピリジン−２−イル）−ｌＨ−ピラゾール−４−イル］ピリドム−２−イル｝−Ｎ−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）ベンズアミド）（たとえばＧｅｌｌｉｂｅｒｔら、２００６年を参照されたい）、ＳＭ１６（たとえばＳｕｚｕｋｉら、２００７を参照されたい）、ＩＮ−１１３０（３−（（５−（６−メチルピリジン−２−イル）−４−（キノキサリン−６−イル）−ｌＨ−イミダゾール−２−イル）メチル）ベンズアミド）（たとえばＫｉｍら、２００８年を参照されたい）、ＧＷ６６０４（２−フェニル−４−（３−ピリジン−２−イル−ｌＨ−ピラゾール−４−イル）ピリジン）（たとえばｄｅ  Ｇｏｕｖｉｌｌｅら、２００６年を参照されたい）、ＳＢ−５０５１２４（２−（５−ベンゾ［ｌ，３］ジオキソール−５−イル−２−ｔｅｒｔ−ブチル−３Ｈ−イミダゾール−４−イル）−６−メチルピリジンハイドロクロライド）（たとえばＤａＣｏｓｔａら、２００４年を参照されたい）、およびピリミジン誘導体（たとえば、参照によって本明細書において組み込まれるＳｔｉｅｆｌら、ＷＯ２００８／００６５８３において列挙されるものを参照されたい）を含むが、これらに限定されない。
【０１１５】
さらに、「ＡＬＫ５阻害剤」は、非特異的キナーゼ阻害剤を包含するようには意図されないが、「ＡＬＫ５阻害剤」は、たとえばＳＢ−４３１５４２などのような、ＡＬＫ５に加えてＡＬＫ４および／またはＡＬＫ７を阻害する阻害剤を包含することを理解されたい（たとえばＩｎｍａｎら、２００２年を参照されたい）。本発明の範囲を限定することを意図するものではないが、ＡＬＫ５阻害剤は、間葉系から上皮への転換／移行（ＭＥＴ）プロセスに影響を与えると考えられる。ＴＧＦβ／アクチビン経路は、上皮から間葉系への移行（ＥＭＴ）のための駆動体である。発明者は、ＴＧＦβ／アクチビン経路の阻害が、ＭＥＴ（つまりリプログラミング）プロセスを促進することができることを企図する。
【０１１６】
ＴＧＦβ／アクチビン経路の阻害は，同様の効果を有するであろうということが考えられる。したがって、ＴＧＦβ／アクチビン経路の任意の阻害剤（たとえば上流または下流の）を、本明細書において記載されるＴＧＦ−β／ＡＬＫ５阻害剤と組み合わせてまたはその代わりに使用することができる。例示的なＴＧＦβ／アクチビン経路阻害剤は、ＴＧＦベータ受容体阻害剤、ＳＭＡＤ  ２／３リン酸化の阻害剤、ＳＭＡＤ  ２／３およびＳＭＡＤ  ４の相互作用の阻害剤、ならびにＳＭＡＤ  ６およびＳＭＡＤ  ７の活性化因子／アゴニストを含むが、これらに限定されない。さらに、本明細書において記載される分類は、単に構成上の目的のためのものであり、当業者は、化合物が経路内の１つ以上の段階に影響を与えることができることを知っているであろう、また、したがって、化合物は、１つを超える定義されたカテゴリーにおいて機能してもよい。
【０１１７】
ＴＧＦベータ受容体阻害剤は、ＴＧＦベータ受容体に対する抗体、そのドミナントネガティブバリアント、およびそれを標的とするｓｉＲＮＡまたはアンチセンス核酸を含むことができる。阻害剤の特定の例は、ＳＵ５４１６；（２−（５−ベンゾ［ｌ，３］ジオキソール−５−イル−２−ｔｅｒｔ−ブチル−３Ｈ−イミダゾール−４−イル）−６−メチルピリジンハイドロクロライド（ＳＢ−５０５１２４）；ｌｅｒｄｅｌｉｍｕｍｂ（ＣＡＴ−１５２）；ｍｅｔｅｌｉｍｕｍａｂ（ＣＡＴ−１９２）；ＧＣ−１００８；ＩＤｌ  １；ＡＰ−１２００９；ＡＰ−１１０１４；ＬＹ５５０４１０；ＬＹ５８０２７６；ＬＹ３６４９４７；ＬＹ２１０９７６１；ＳＢ−５０５１２４；ＳＢ−４３１５４２；ＳＤ−２０８；ＳＭ１６；ＮＰＣ−３０３４５；Ｋｉ２６８９４；ＳＢ−２０３５８０；ＳＤ−０９３；Ｇｌｅｅｖｅｃ；３，５，７，２’，４’−ペンタヒドロキシフラボン（ｐｅｎｔａｈｙｄｒｏｘｙｆｉａｖｏｎｅ）（Ｍｏｒｉｎ）；アクチビン−Ｍ１０８Ａ；Ｐ１４４；可溶性ＴＢＲ２−Ｆｃ；およびＴＧＦベータ受容体を標的とするアンチセンストランスフェクト腫瘍細胞（たとえばＷｒｚｅｓｉｎｓｋｉら、２００７年；Ｋａｍｉｎｓｋａら、２００５年；およびＣｈａｎｇら、２００７年を参照されたい）を含むが、これらに限定されない。
【０１１８】
Ｄ．ＲＯＣＫ阻害剤およびミオシンＩＩ  ＡＴＰアーゼ阻害剤
多能性幹細胞、特にヒトＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞は、細胞の脱離および解離に際してアポトーシスを受けやすく、細胞の脱離および解離は、クローンの単離または増殖および分化誘導にとって重要である。最近、ＲＯＣＫ関連シグナル伝達経路のための阻害剤であるＲｈｏ関連キナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤、たとえばＲｈｏ特異的阻害剤、ＲＯＣＫ特異的阻害剤、またはミオシンＩＩ特異的阻害剤などのような小さなクラスの分子は、解離した多能性幹細胞のクローンの効率および生存を増加させることが分かった。本発明のある態様では、ＲＯＣＫ阻害剤は、多能性幹細胞の培養および継代そして／または幹細胞の分化のために使用されてもよい。そのため、ＲＯＣＫ阻害剤は、接着培養液または浮遊培養液などのような、多能性幹細胞が成長する、解離する、凝集物を形成する、または分化を受ける任意の細胞培養培地中に存在することができる。本明細書においてその他に述べられない限り、ブレビスタチンなどのようなミオシンＩＩ阻害剤は、ＲＯＣＫ阻害剤の実験的な使用のために代用することができる。
【０１１９】
ＲＯＣＫシグナル伝達経路は、ＲｈｏファミリーＧＴＰアーゼ；Ｒｈｏの下流の主要なエフェクターキナーゼであるＲＯＣＫ；ＲＯＣＫの下流の主なエフェクターであるミオシンＩＩ（Ｈａｒｂら、２００８年）；および任意の中間、上流、または下流のシグナルプロセッサーを含んでいてもよい。ＲＯＣＫは、ミオシン制御軽鎖（ＭＲＬＣ）の脱リン酸化を通してミオシン機能を負に調節するＲＯＣＫの主な下流の標的の１つであるミオシンホスファターゼ標的サブユニット１（ＭＹＰＴ１）をリン酸化し、不活性化し得る。
【０１２０】
ＲＯＣＫは、Ｒｈｏについての標的タンパク質として果たすセリン／トレオニンキナーゼである（この３つのアイソフォームが存在する−−ＲｈｏＡ、ＲｈｏＢ、およびＲｈｏＣ）。これらのキナーゼは、ＲｈｏＡ誘導性のストレスファイバーの形成および局所的な接着の媒介物質として最初に特徴付けられた。２つのＲＯＣＫアイソフォーム−ＲＯＣＫ１（ＲＯＫβとも呼ばれるｐ１６０ＲＯＣＫ）およびＲＯＣＫ２（ＲＯＫα）−は、Ｒｈｏ結合ドメインを含有するコイルドコイルドメインが後続するＮ末端キナーゼドメインおよびプレクストリン相同ドメイン（ＰＨ）から構成される。両方のＲＯＣＫは、細胞骨格調節因子であり、ストレスファイバー形成、平滑筋収縮、細胞接着、膜ラフリング、および細胞運動性に対するＲｈｏＡの効果を媒介する。ＲＯＣＫは、ミオシンＩＩ、ミオシン軽鎖（ＭＬＣ）、ＭＬＣホスファターゼ（ＭＬＣＰ）、およびホスファターゼテンシンホモログ（ＰＴＥＮ）などのような下流の分子を標的とすることによって、それらの生物学的活性を働かせてもよい。
【０１２１】
ＲＯＣＫ阻害剤の非限定的な例は、ＨＡ−１００、Ｙ−２７６３２、Ｈ−１１５２、ファスジル（ＨＡ１０７７とも呼ばれる）、Ｙ−３０１４１（米国特許第５，４７８，８３８号において記載される）、Ｗｆ−５３６、ＨＡ−１０７７、ヒドロキシル−ＨＡ−１０７７、ＧＳＫ２６９９６２Ａ、ＳＢ−７７２０７７−Ｂ、およびその誘導体、ならびにＲＯＣＫに対するアンチセンス核酸、ＲＮＡ干渉を誘導する核酸（たとえばｓｉＲＮＡ）、競合性ペプチド、アンタゴニストペプチド、阻害性抗体、抗体−ＳｃＦＶ断片、ドミナントネガティブバリアント、およびその発現ベクターを含む。さらに、他の低分子化合物がＲＯＣＫ阻害剤として公知であるので、そのような化合物またはその誘導体もまた、実施形態において使用することができる（たとえば、参照によってこれによって組み込まれる米国特許出願公開第２００５０２０９２６１号、第２００５０１９２３０４号、第２００４００１４７５５号、第２００４０００２５０８号、第２００４０００２５０７号、第２００３０１２５３４４号、および第２００３００８７９１９号ならびに国際特許出願公開第２００３／０６２２２７号、第２００３／０５９９１３号、第２００３／０６２２２５号、第２００２／０７６９７６号、および第２００４／０３９７９６号を参照されたい）。本発明のある態様では、１つまたは２つ以上のＲＯＣＫ阻害剤の組合せもまた、使用することができる。
【０１２２】
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｃ３細胞外酵素などのようなＲｈｏ特異的阻害剤および／またはミオシンＩＩ特異的阻害剤もまた、本発明のある態様においてＲＯＣＫ阻害剤として使用されてもよい。
【０１２３】
ＶＩ．リプログラミングされた細胞の培養
開始細胞および目的のリプログラミングされた細胞は、一般に、培養培地および培養条件について異なる必要条件を有する。細胞のリプログラミングが起こることをも可能にしながらこれを可能にするために、開始細胞の成長に適することが公知の培地の存在下においておよび培養条件下で、リプログラミング因子の導入後に、培養の少なくとも１つの初期段階を実行することは普通である。血清を有するフィーダー上での、リプログラミング培地の存在下におけるおよび多能性細胞に適することが公知の条件下でのまたは既知組成培地もしくはフィーダーフリーの条件を使用する培養の続く期間が、これに続く。適したフィーダーは、それらがリプログラミングされている細胞の成長を押しのけないように典型的に不活性化された初代または不死化線維芽細胞系を含む。リプログラミングのための十分な時間の後に、リプログラミングされた細胞は、増殖培地において、ｉＰＳ細胞の選択の前またはその後に、ｉＰＳ細胞の増殖のためにさらに培養されてもよい。そのような増殖培地は、上記に記載される１つ以上のシグナル伝達阻害剤を含むまたはこれらの阻害剤を本質的に含まない培養培地を含んでいてもよい。
【０１２４】
培養の初期段階は、好ましくは６日間までの、より好ましくは４日間までの、特に、下記に記載される実施形態では、３日間以下の、特に１日間までまたは約１日間の期間の間である。１つ以上のシグナル伝達阻害剤を含むリプログラミング培地における培養の続く段階は、適宜、少なくとももしくは約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３日間またはその中で推論できる任意の範囲の期間の間であり、７０日間までの、好ましくは５６日間まで、またはｉＰＳ細胞の検出までの期間の間とすることができる。リプログラミングヒト細胞を生成するために使用される下記に記載される特定の実施形態では、培養の初期段階は、約１日間の期間の間であり、続く段階は、ＭＥＫ阻害剤、ＴＧＦ−β受容体阻害剤、およびＧＳＫ３阻害剤を含むリプログラミング培地の存在下におけるリプログラミング条件における培養による約９〜２８日間の間とした。リプログラミング条件は、フィーダー細胞が本質的になくてもよい。さらなる態様では、リプログラミング培地は、既知組成培地であってもよい。リプログラミングを改善するために、リプログラミング培地は、高濃度のＦＧＦをさらに含んでいてもよく、ＴＧＦβが本質的になくてもよい。
【０１２５】
ＭＥＫ阻害剤、ＴＧＦ−β受容体阻害剤、およびＧＳＫ３阻害剤の組合せは、リプログラミング効率の増加およびリプログラミング時間の短縮を含めて、リプログラミングプロセスを促進し得る。ＬＩＦは、ｇｐ１３０シグナル伝達の活性化因子の例であり、他は、可溶性ＩＬ−６受容体と結合するＩＬ−６であり、細胞がリプログラミングされつつあるとき、細胞の成長および生存を促進する。リプログラミングの間に、細胞は、ＬＩＦの存在下において培養されてもよく、ＬＩＦの使用は、本発明のある態様においてリプログラミングされた細胞が細胞生存およびクローン形成能を改善するのを助けてもよい。
【０１２６】
Ａ．一般の幹細胞培養条件
本発明による培養条件は、使用される培地および幹細胞に依存して、適切に決定されるであろう。本発明のある態様による培地は、ＴｅＳＲ、ＢＭＥ、ＢＧＪｂ、ＣＭＲＬ  １０６６、Ｇｌａｓｇｏｗ  ＭＥＭ、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ＭＥＭ  Ｚｉｎｃ  Ｏｐｔｉｏｎ、ＩＭＤＭ、Ｍｅｄｉｕｍ  １９９、Ｅａｇｌｅ  ＭＥＭ、αＭＥＭ、ＤＭＥＭ、Ｈａｍ、ＲＰＭＩ  １６４０、およびＦｉｓｃｈｅｒの培地ならびにその任意の組合せのいずれかなどのような、その基本培地として、動物細胞を培養するために使用される培地を使用して調製することができるが、培地は、動物細胞を培養するためにそれを使用することができる限り、その培地に特に限定されない。
【０１２７】
本発明による培地は、血清含有または無血清培地とすることができる。無血清培地は、未処理または未精製血清を有していない培地を指し、したがって、精製血液由来構成成分または動物組織由来構成成分（増殖因子など）を有する培地を含むことができる。異種性の動物由来構成成分による混入を予防する側面から、血清は、幹細胞（複数可）と同じ動物に由来することができる。
【０１２８】
本発明による培地は、血清に対する任意の代替物を含有していてもよいまたは含有していなくてもよい。血清に対する代替物は、アルブミンを適切に含有する物質（脂質が豊富なアルブミン、組換えアルブミンなどのようなアルブミン代用物、植物デンプン、デキストラン、およびタンパク加水分解物など）、トランスフェリン（または他の鉄輸送体）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、２−メルカプトエタノール、３’−チオグリセロール（ｔｈｉｏｌｇｉｙｃｅｒｏｌ）、またはそれに対する等価物を含むことができる。たとえば、血清に対する代替物は、国際特許出願公開第９８／３０６７９号において開示される方法によって調製することができる。その代わりに、任意の市販で入手可能な物質は、さらなる利便性のために使用することができる。市販で入手可能な物質は、ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）、Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ−ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｌｉｐｉｄ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ（Ｇｉｂｃｏ）、およびＧｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ）を含む。
【０１２９】
本発明の培地はまた、脂肪酸または脂質、アミノ酸（非必須アミノ酸など）、ビタミン（複数可）、増殖因子、サイトカイン、抗酸化物質、２−メルカプトエタノール、ピルビン酸、緩衝剤、および無機塩類を含有することができる。たとえば、２−メルカプトエタノールの濃度は、たとえば、約０．０５〜１．０ｍＭ、特に約０．１〜０．５ｍＭとすることができるが、濃度が幹細胞を培養するのに適切な限り、濃度は、特にそれに限定されない。
【０１３０】
幹細胞（複数可）を培養するために使用される培養容器は、それが幹細胞をその中で培養することができる限り、フラスコ、組織培養用のフラスコ、皿、ペトリ皿、組織培養用の皿、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マルチプレート、マルチウェルプレート、マイクロスライド、チャンバースライド、チューブ、トレー、ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）チャンバー、培養袋、およびローラーボトルを含むことができるが、特にこれらに限定されない。幹細胞は、培養の必要性に依存して、少なくとももしくは約０．２、０．５、１、２、５、１０、２０、３０、４０、５０ｍｌ、１００ｍｌ、１５０ｍｌ、２００ｍｌ、２５０ｍｌ、３００ｍｌ、３５０ｍｌ、４００ｍｌ、４５０ｍｌ、５００ｍｌ、５５０ｍｌ、６００ｍｌ、８００ｍｌ、１０００ｍｌ、１５００ｍｌまたはその中で推論できる任意の範囲の容量において培養されてもよい。ある実施形態では、培養容器は、バイオリアクターであってもよく、これは、生物学的に活性な環境を支持する任意のデバイスまたはシステムを指してもよい。バイオリアクターは、少なくとももしくは約２、４、５、６、８、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、５００リットル、１、２、４、６、８、１０、１５立方メートルまたはその中で推論できる任意の範囲の容量を有していてもよい。
【０１３１】
培養容器は、細胞接着性または非接着性とすることができ、目的に依存して選択することができる。細胞接着性培養容器は、容器表面の細胞への接着性を改善するために細胞外マトリックス（ＥＣＭ）などのような細胞接着のための基質のいずれかを用いてコーティングすることができる。細胞接着のための基質は、幹細胞またはフィーダー細胞（使用される場合）を付着させるように意図される任意の物質とすることができる。細胞接着のための基質は、コラーゲン、ゼラチン、ポリ−Ｌ−リシン、ポリ−Ｄ−リシン、ビトロネクチン、ラミニン、およびフィブロネクチンならびにその混合物、たとえばＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）および溶解細胞膜調製物を含む（Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａら、２００５年）。
【０１３２】
他の培養条件は、適切に決定することができる。たとえば、培養温度は、約３０〜４０℃、たとえば、少なくともまたは約３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９℃とすることができるが、これらに特に限定されない。ＣＯ２濃度は、約１〜１０％、たとえば約２〜５％またはその中で推論できる任意の範囲とすることができる。酸素分圧は、少なくとももしくは約１、５、８、１０、２０％またはその中で推論できる任意の範囲とすることができる。
【０１３３】
たとえば、ある態様における本発明の方法は、幹細胞の接着培養に使用することができる。この場合、細胞は、フィーダー細胞の存在下において培養することができる。フィーダー細胞が本発明の方法において使用される場合には、胎児線維芽細胞などのような間質細胞は、フィーダー細胞として使用することができる（たとえばＨｏｇａｎら、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９９４年）；Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（１９９３年）；Ｍａｒｔｉｎ（１９８１年）；ｖａｎｓおよびＫａｕｆｍａｎ（１９８１年）；Ｊａｉｎｃｈｉｌｌら、（１９６９年）；Ｎａｋａｎｏら（１９９６年）；Ｋｏｄａｍａら（１９８２年）；ならびに国際特許出願公開第０１／０８８１００号および第２００５／０８０５５４号を参照されたい）。
【０１３４】
ある態様における本発明の方法はまた、キャリヤー上での浮遊培養（Ｆｅｒｎａｎｄｅｓら、２００４年）またはゲル／生体高分子カプセル化（米国特許出願公開第２００７／０１１６６８０号）を含む、幹細胞の浮遊培養に使用することができる。幹細胞の浮遊培養という用語は、幹細胞が、培地中で、培養容器またはフィーダー細胞（使用される場合）に関して非接着性の条件下で培養されることを意味する。幹細胞の浮遊培養は、幹細胞の解離培養および幹細胞の凝集浮遊培養を含む。幹細胞の解離培養という用語は、浮遊した幹細胞が、培養され、幹細胞の解離培養が、単細胞の幹細胞の培養または複数の幹細胞（たとえば約２〜４００の細胞）から構成される小細胞凝集物の培養を含むことを意味する。前述の解離培養が継続される場合、培養され、解離した細胞は、幹細胞のより大きな凝集物を形成し、その後、凝集浮遊培養を実行することができる。凝集浮遊培養は、胚子様培養法（Ｋｅｌｌｅｒら、１９９５年を参照されたい）およびＳＦＥＢ法（Ｗａｔａｎａｂｅら、２００５年；国際特許出願公開第２００５／１２３９０２号を参照されたい）を含む。
【０１３５】
Ｂ．多能性幹細胞の培養
培養条件に依存して、多能性幹細胞は、分化細胞または未分化の細胞のコロニーを産生することができる。用語「分化する」は、発生経路に沿った細胞の進行を意味する。用語「分化した」は、他の細胞と比較した、発生経路に沿った細胞の進行を説明する相対的な用語である。たとえば、多能性細胞は、体のあらゆる細胞を誘発することができるが、造血細胞などのようなより分化した細胞は、より少ない細胞型を誘発するであろう。
【０１３６】
多能性幹細胞の培養物は、集団における幹細胞およびそれらの誘導体の実質的な割合が、未分化の細胞の形態学的特質を示す場合、「未分化の」として記載され、胚または成体の起源の分化した細胞をそれらと明確に区別する。未分化のＥＳまたはｉＰＳ細胞は、当業者らによって認識され、高度な核／細胞質比および顕著な核小体を有する細胞のコロニーにおいて二次元の顕微鏡視野に典型的に現れる。未分化の細胞のコロニーは、分化した隣りの細胞を有することができることが理解される。
【０１３７】
ＥＳ細胞は、血清およびフィーダー層、典型的にマウス胚性線維芽細胞の存在下において細胞を培養することによって、未分化の状態で維持することができる。未分化の状態において幹細胞を維持する他の方法もまた、公知である。たとえば、マウスＥＳ細胞は、フィーダー層を伴わないでＬＩＦの存在下において培養することによって、未分化の状態で維持することができる。しかしながら、マウスＥＳ細胞と異なり、先在するヒトＥＳ細胞は、ＬＩＦに応答しない。ヒトＥＳ細胞は、塩基性線維芽細胞増殖因子の存在下において線維芽細胞のフィーダー層上でＥＳ細胞を培養することによって（Ａｍｉｔら、２０００年）またはフィーダー層を伴わないでかつ線維芽細胞条件培地および塩基性線維芽細胞増殖因子の存在下においてＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）もしくはラミニンなどのようなタンパク質マトリックス上で培養することによって（Ｘｕら、２００１年；米国特許第６，８３３，２６９号）、未分化の状態で維持することができる。
【０１３８】
ＥＳ細胞を調製し、培養するための方法は、すべて参照によって本明細書において組み込まれるｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：  Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ（１９８７年）；Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｕｓｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（１９９３年）；Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（１９９３年）；Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｕｓｅｓ  ｏｆ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ  ｆｏｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９８年）を含む、細胞生物学、組織培養、および発生学における標準的な教科書および概説において見つけることができる。組織培養において一般に使用される標準的な方法は、Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（１９８７年）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（１９８７年）；およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８７年＆１９９５年）において記載されている。
【０１３９】
体細胞に、リプログラミング因子を導入したまたは接触させた後に、これらの細胞は、多能性および未分化の状態を維持するのに十分な培地において培養されてもよい。本発明において生成される人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞の培養は、参照によってこれによって組み込まれる米国特許出願公開第２００７０２３８１７０号および米国特許出願公開第２００３０２１１６０３号および米国特許出願公開第２００８０１７１３８５号において記載されるように、霊長動物多能性幹細胞、特に胚性幹細胞を培養するために開発された様々な培地および技術を使用することができる。当業者に公知であろう、多能性幹細胞の培養および維持のためのさらなる方法は、本発明と共に使用されてもよいことが十分に理解される。
【０１４０】
ある実施形態では、定義されていない条件が、使用されてもよい；たとえば、多能性細胞は、未分化の状態に幹細胞を維持するために、線維芽細胞フィーダー細胞または線維芽細胞フィーダー細胞に曝露された培地上で培養されてもよい。
【０１４１】
代わりに、多能性細胞は、ＴｅＳＲ培地などのような定義されるフィーダー非依存性の培養系を使用して培養され、本質的に未分化の状態で維持されてもよい（Ｌｕｄｗｉｇら、２００６ａ；Ｌｕｄｗｉｇら、２００６ｂ）。フィーダー非依存性の培養系および培地は、多能性細胞を培養し、維持するために使用されてもよい。これらのアプローチは、誘導ヒトｉＰＳ細胞およびヒト胚性幹細胞が、マウス線維芽細胞「フィーダー層」の必要性を伴わないで本質的に未分化の状態で残ることを可能にする。本明細書において記載されるように、様々な修飾は、所望されるとおり、費用を下げるためにこれらの方法になされてもよい。
【０１４２】
様々なマトリックス構成成分は、ヒト多能性幹細胞を培養し、維持するのに使用されてもよい。たとえば、組合せのＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）、コラーゲンＩＶ、フィブロネクチン、ラミニン、およびビトロネクチンは、それらの全体が参照によって組み込まれるＬｕｄｗｉｇら（２００６ａ；２００６ｂ）において記載されるように、多能性細胞成長のための固体担体を提供する手段として培養表面をコーティングするために使用されてもよい。特に、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）は、ヒト多能性幹細胞の細胞培養および維持のための基質を提供するために使用されてもよい。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）は、マウス腫瘍細胞によって分泌されるゼラチン状のタンパク質混合物であり、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、ＵＳＡ）から市販で入手可能である。この混合物は、多くの組織において見つけられる複雑な細胞外環境に類似しており、細胞培養のための基質として細胞生物学者によって使用される。
Ｃ．細胞継代
本発明のある態様は、幹細胞を解離させるステップをさらに含むことができる。幹細胞解離は、任意の公知の手順を使用して実行することができる。これらの手順は、キレート剤（ＥＤＴＡなど）、酵素（トリプシン、コラゲナーゼなど）、またはその他同種のものを用いる処理および機械的な解離（ピペット操作など）などのような操作を含む。幹細胞（複数可）は、解離後におよび／または前にＲＯＣＫ阻害剤を用いて処理することができる。たとえば、幹細胞（複数可）は、解離後にのみ処理することができる。
【０１４３】
多能性幹細胞培養のいくつかのさらなる実施形態では、一度、培養容器が一杯になったら、コロニーは、解離に適した任意の方法によって、凝集細胞またはさらに単細胞に分割されてもよく、これらの細胞は、次いで、継代のために新しい培養容器の中に配置される。細胞継代は、長期間、培養条件下で、細胞を生きたまま、成長し続けるよう保つのを可能にする技術である。細胞は、普通、約７０％〜１００％コンフルエントになった場合に、継代されるであろう。
【０１４４】
単細胞継代が後続する多能性幹細胞の単細胞の解離は、細胞増殖、細胞選別、および分化のための定義される接種を促進し、かつ培養手順およびクローン増殖の自動化を可能にするようないくつかの利点を伴って、本方法において使用されてもよい。たとえば、単細胞からクローン誘導可能な子孫細胞は、遺伝子構造が均質であり得、かつ／または細胞周期が同調したものであり得、これは、標的指向性の分化を増加させ得る。単細胞継代のための例示的な方法は、参照によって本明細書において組み込まれる米国特許出願第２００８０１７１３８５号において記載されるとおりであってもよい。
【０１４５】
ある実施形態では、多能性幹細胞は、個々の単細胞に解離されたものでも、個々の単細胞と２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上の細胞を含む小さな細胞塊との組合せに解離されたものでもよい。解離は、機械力またはクエン酸ナトリウム（ＮａＣｉｔｒａｔｅ）などのような細胞解離剤もしくは酵素、たとえばトリプシン、トリプシン−ＥＤＴＡ、ＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ、もしくはその他同種のものによって達成され得る。
【０１４６】
多能性幹細胞の供給源および増殖の必要性に依存して、解離させた細胞は、少なくとももしくは約１：２、１：４、１：５、１：６、１：８、１：１０、１：２０、１：４０、１：５０、１：１００、１：１５０、１：２００またはその中で推論できる任意の範囲などのような分割比で、新しい培養容器に個々にまたは小さな塊で移されてもよい。浮遊細胞系分割比は、培養細胞浮遊液の容量に基づいて決められてもよい。継代間隔は、少なくとももしくは約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０日間またはその中で推論できる任意の範囲毎であってもよい。たとえば、異なる酵素による継代プロトコールについての達成可能な分割比は、３〜７日間毎に１：２、４〜７日間毎に１：３、およびおよそ７日間毎に１：５〜１：１０、７日間毎に１：５０〜１：１００であってもよい。高分割比が使用される場合、継代間隔は、過度の自発的な分化または細胞死による細胞損失を伴うことなく、少なくとも１２〜１４日間または任意の期間まで延長されてもよい。
【０１４７】
ある態様では、単細胞継代は、上記に記載されるＲＯＣＫ阻害剤などのような、クローニング効率および細胞生存を増加させるのに有効な小分子の存在下であってもよい。そのようなＲＯＣＫ阻害剤、たとえばＹ−２７６３２、ＨＡ−１０７７、Ｈ−１１５２、またはブレビスタチンは、有効濃度、たとえば、少なくとももしくは約０．０２、０．０５、０．１、０．２、０．５、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０〜約１００μＭまたはその中で推論できる任意の範囲で使用されてもよい。
【０１４８】
ＶＩＩ．ｉＰＳ細胞の選択
本発明のある態様では、１つ以上の染色体外遺伝エレメントが体細胞の中に導入された後に、細胞は、増殖のために培養されてもよく、（トランスフェクトされた細胞を濃縮するために、ポジティブ選択マーカーまたはスクリーニング可能なマーカーのようなベクターエレメントの存在について任意選択で選択されてもよく）、これらの遺伝エレメントは、これらの細胞においてリプログラミング因子を発現し、複製し、細胞分裂と共に分割するであろう。これらの発現されたリプログラミング因子は、体細胞ゲノムをリプログラミングして、自立多能性状態を確立し、その間にまたはベクターの存在についてのポジティブ選択を除いた後に、外因性の遺伝エレメントは、徐々に失われるであろう。これらの人工多能性幹細胞は、それらが、多能性胚性幹細胞と実質的に同一であると予想されるので、胚性幹細胞の特質に基づいて、これらの体細胞から誘導された子孫から選択することができる。さらなるネガティブセレクションステップは、リプログラミングベクターＤＮＡの不在を試験するまたは選択マーカーを使用することによって、外因性の遺伝エレメントを本質的に含まないｉＰＳ細胞についての選択を速めるまたは助けるために利用することができる。
【０１４９】
Ａ．胚性幹細胞の特質についての選択
従来の研究からの生成に成功したｉＰＳＣは、以下の点において、自然に単離された多能性幹細胞（マウスおよびヒト胚性幹細胞、それぞれｍＥＳＣおよびｈＥＳＣなど）に著しく類似し、したがって、自然に単離された多能性幹細胞に対するｉＰＳＣの同一性、確実性、および多能性を確認した。したがって、本発明において開示される方法から生成される人工多能性幹細胞は、１つ以上の以下の胚性幹細胞の特質に基づいて選択することができる。
【０１５０】
ｉ．細胞の生物学的特性
形態：ｉＰＳＣは、ＥＳＣに形態学的に類似する。細胞はそれぞれ、円形、大きな核小体、およびわずかな細胞質を有していてもよい。ｉＰＳＣのコロニーもまた、ＥＳＣに類似し得る。ヒトｉＰＳＣは、ｈＥＳＣに類似する鋭い縁の平らな、しっかりと詰まったコロニーを形成し、マウスｉＰＳＣは、ｍＥＳＣに類似するコロニー、ｈＥＳＣよりも平らではなく、より凝集したコロニーを形成する。ある実施形態では、本方法は、大きなヒトｉＰＳ細胞を生成してもよく、これらは、少なくとももしくは約１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５ｍｍまたはその中で推論できる任意の範囲の直径を有していてもよく、非ｉＰＳ細胞から容易に認識できてもよい。
【０１５１】
成長特性：幹細胞がそれらの定義の一部として自己再生しなければならないので、倍加時間および有系分裂活性は、ＥＳＣの基本となる。ｉＰＳＣは、有系分裂活性となり得、活動的に自己再生することができ、増殖することができ、ＥＳＣと等しい速度で分裂することができる。
【０１５２】
幹細胞マーカー：ｉＰＳＣは、ＥＳＣ上に発現される細胞表面抗原マーカーを発現してもよい。ヒトｉＰＳＣは、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＴＲＡ−２−４９／６Ｅ、およびＮａｎｏｇを含むが、これらに限定されない、ｈＥＳＣに特異的なマーカーを発現した。マウスｉＰＳＣは、ｍＥＳＣに類似して、ＳＳＥＡ−１を発現したが、ＳＳＥＡ−３もＳＳＥＡ−４も発現しなかった。
【０１５３】
幹細胞遺伝子：ｉＰＳＣは、Ｏｃｔ−３／４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、ＧＤＦ３、ＲＥＸ１、ＦＧＦ４、ＥＳＧ１、ＤＰＰＡ２、ＤＰＰＡ４、およびｈＴＥＲＴを含む、未分化のＥＳＣにおいて発現される遺伝子を発現してもよい。
【０１５４】
テロメラーゼ活性：テロメラーゼは、約５０回の細胞分裂というＨａｙｆｌｉｃｋ限界によって制限されない細胞分裂を保持するのに必要である。ヒトＥＳＣは、自己再生および増殖を保持するために高度なテロメラーゼ活性を発現し、ｉＰＳＣもまた、高度なテロメラーゼ活性を示し、テロメラーゼタンパク質複合体における必要な構成成分であるｈＴＥＲＴ（ヒトテロメラーゼリバーストランスクリプターゼ）を発現する。
【０１５５】
多能性：ｉＰＳＣは、完全に分化した組織への、ＥＳＣに類似する方法での分化が可能であろう。
【０１５６】
神経分化：ｉＰＳＣは、ニューロンに分化し、βＩＩＩチューブリン、チロシンヒドロキシラーゼ、ＡＡＤＣ、ＤＡＴ、ＣｈＡＴ、ＬＭＸ１Ｂ、およびＭＡＰ２を発現することができる。カテコールアミン関連酵素の存在は、ｉＰＳＣが、ｈＥＳＣのように、ドーパミン作動性ニューロンに分化可能であり得ることを示してもよい。幹細胞関連遺伝子は、分化後にダウンレギュレートされるであろう。
【０１５７】
心臓分化：ｉＰＳＣは、自発的に鼓動し始めた心筋細胞に分化することができた。心筋細胞は、ＴｎＴｃ、ＭＥＦ２Ｃ、ＭＹＬ２Ａ、ＭＹＨＣβ、およびＮＫＸ２．５を発現した。幹細胞関連遺伝子は、分化後にダウンレギュレートされるであろう。
【０１５８】
奇形腫形成：免疫不全マウスの中に注射されたｉＰＳＣは、９週間などのような一定の時間後に奇形腫を自発的に形成し得る。奇形腫は、３つの胚葉、内胚葉、中胚葉、および外胚葉から誘導された組織を含有する複数の系列の腫瘍である；これは、典型的に１つの細胞型のみである他の腫瘍と異なる。奇形腫形成は、多能性についてのランドマーク試験である。
【０１５９】
胚様体：培養中のヒトＥＳＣは、「胚様体」と称されるボール様で胚様の構造を自発的に形成し、これらは、有系分裂活性で、分化しているｈＥＳＣのコアおよび３つの胚葉すべてから完全に分化した細胞の周辺から成る。ｉＰＳＣもまた、胚様体を形成し、周辺の分化細胞を有していてもよい。
【０１６０】
胚盤胞注射：ヒトＥＳＣは、胚盤胞の内部細胞塊（胚結節）内に自然に存在し、胚盤胞のシェル（栄養膜）が胚外組織に分化する間に、胚結節において、胚に分化する。くぼんだ栄養膜は、生きている胚を形成することができず、したがって、胚結節内の胚性幹細胞が分化し、胚を形成することが必要である。レシピエントメスに移される胚盤胞を生成するためにマイクロピペットによって栄養膜の中に注射されるｉＰＳＣは、キメラ生マウスの子：１０％〜９０で、それらの体全体にわたって組み込まれたｉＰＳＣ誘導体およびキメラ現象を有するマウスをもたらしてもよい。
ｉｉ．後成的なリプログラミング
プロモーター脱メチル化：メチル化は、ＤＮＡ塩基に対するメチル基の移入、典型的に、ＣｐＧ部位（近接するシトシン／グアニン配列）におけるシトシン分子に対するメチル基の移入である。遺伝子の広範囲のメチル化は、発現タンパク質の活性を妨げるまたは発現に干渉する酵素を動員することによって、発現に干渉する。したがって、遺伝子のメチル化は、転写を妨げることによって有効にそれをサイレンシングする。Ｏｃｔ−３／４、Ｒｅｘ１、およびＮａｎｏｇを含む、多能性関連遺伝子のプロモーターは、ｉＰＳＣにおいて脱メチル化され、ｉＰＳＣにおいて、それらのプロモーター活性ならびに多能性関連遺伝子の活性促進および発現を示してもよい。
【０１６１】
ヒストン脱メチル化：ヒストンは、様々なクロマチン関連の修飾を通してそれらの活性を引き起こすことができるＤＮＡ配列に構造上局所化する圧縮タンパク質である。Ｏｃｔ−３／４、Ｓｏｘ２、およびＮａｎｏｇと関連するＨ３ヒストンは、Ｏｃｔ−３／４、Ｓｏｘ２、およびＮａｎｏｇの発現を活性化するために脱メチル化されてもよい。
【０１６２】
Ｂ．残留物なしの特徴についての選択
本発明におけるｏｒｉＰベースのベクターなどのようなリプログラミングベクターは、染色体外で複製し、数代後に宿主細胞においてその存在を失わせることができる。しかしながら、外因性のベクターエレメントを本質的に含まない子孫細胞についてのさらなる選択ステップは、このプロセスを容易にしてもよい。たとえば、子孫細胞の試料は、当技術分野において公知の外因性のベクターエレメントの存在または損失を試験するために抽出されてもよい（ＬｅｉｇｈｔおよびＳｕｇｄｅｎ、２００１年）。
【０１６３】
リプログラミングベクターは、選択マーカーを本質的に含まない子孫細胞を選択するために、そのような選択マーカー、特に、チミジンキナーゼをコードする遺伝子などのようなネガティブセレクションマーカーをさらに含んでいてもよい。ヒト単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ１型遺伝子（ＨＳＶｔｋ）は、哺乳動物細胞における条件致死マーカーとして作用する。ＨＳＶｔｋにコードされる酵素は、ある種のヌクレオシドアナログ（たとえばガンシクロビル、抗ヘルペス剤）をリン酸化し、したがって、それらを、毒性のＤＮＡ複製阻害剤に変換することができる。代替のまたは補足のアプローチは、ＲＴ−ＰＣＲ、ＰＣＲ、ＦＩＳＨ（蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）、遺伝子アレイ、またはハイブリダイゼーション（たとえばサザンブロット）などのような従来の方法を使用して、子孫細胞における外因性の遺伝エレメントの不在を試験することである。
【０１６４】
ＶＩＩＩ．ベクター構築および送達
ある実施形態では、リプログラミングベクターは、細胞においてリプログラミング因子を発現するために、上記に記載されるこれらのリプログラミング因子をコードする核酸配列に加えて、さらなるエレメントを含むように構築することができる。これらの方法の１つの特徴は、染色体外複製ベクターの使用であり、これは、宿主細胞ゲノムの中に組み込まれないであろう、また、多数の複製の間に失われてもよい。これらのベクターの構成成分および送達の方法の詳細については、下記に開示される。
【０１６５】
Ａ．ベクター
プラスミドもしくはリポソームベースの染色体外ベクター、たとえばｏｒｉＰベースのベクターおよび／またはＥＢＮＡ−１の誘導体をコードするベクターの使用は、ＤＮＡの大きな断片が細胞に導入され、染色体外で維持され、細胞周期当たり１回複製され、娘細胞に効率的に分割し、免疫応答を実質的に誘発しないことを可能にする。特に、ｏｒｉＰベースの発現ベクターの複製を担うウイルスタンパク質であるＥＢＮＡ−１は、それが、ＭＨＣクラスＩ分子上のその抗原の提示に必要とされる処理を迂回するための効率的なメカニズムを発達させたので、細胞性免疫応答を誘発しない（Ｌｅｖｉｔｓｋａｙａら、１９９７年）。さらに、ＥＢＮＡ−１は、クローニング遺伝子の発現を増強するために、トランスで作用し、いくつかの細胞系において、１００倍まで、クローニング遺伝子の発現を誘導することができる（Ｌａｎｇｌｅ−Ｒｏｕａｕｌｔら、１９９８年；Ｅｖａｎｓら、１９９７年）。最後に、そのようなｏｒｉＰベースの発現ベクターの製造は、低費用である。
【０１６６】
他の染色体外ベクターは、他のリンパ向性ヘルペスウイルスベースのベクターを含む。リンパ向性ヘルペスウイルスは、リンパ芽球（たとえばヒトＢリンパ芽球）において複製し、その自然の生活環の一部の間、プラスミドになるヘルペスウイルスである。単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）は、「リンパ向性」ヘルペスウイルスではない。例示的なリンパ向性ヘルペスウイルスは、ＥＢＶ、カポジ肉腫ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）；ヘルペスウイルスサイミリ（ＨＳ）、およびマレック病ウイルス（ＭＤＶ）を含むが、これらに限定されない。さらに、酵母ＡＲＳ、アデノウイルス、ＳＶ４０、またはＢＰＶなどのようなエピソームベースのベクターの他の供給源が、企図される。
【０１６７】
当業者は、標準的な組換え技術を通してベクターを構築するのに十分に備えられているであろう（たとえば、共に参照によって本明細書において組み込まれるＭａｎｉａｔｉｓら、１９８８年およびＡｕｓｕｂｅｌら、１９９４年を参照されたい）。
【０１６８】
ベクターはまた、遺伝子送達および／もしくは遺伝子発現をさらに調整するまたは他の場合には、標的細胞に有利な特性を提供する他の構成成分または機能性をも含むことができる。他のそのような構成成分は、たとえば、細胞への結合またはターゲティングに影響を及ぼす構成成分（細胞型または組織特異的な結合を媒介する構成成分を含む）；細胞によるベクター核酸の取り込みに影響を及ぼす構成成分；取り込み後に細胞内のポリヌクレオチドの局所化に影響を及ぼす構成成分（核局所化を媒介する作用物質など）；およびポリヌクレオチドの発現に影響を及ぼす構成成分を含む。
【０１６９】
そのような構成成分はまた、ベクターによって送達される核酸を取り込み、発現している細胞を検出するまたは選択するために使用することができる検出可能なおよび／または選択マーカーなどのようなマーカーを含んでいてもよい。そのような構成成分は、ベクターの自然の特徴として提供することができる（結合および取り込みを媒介する構成成分もしくは機能性を有する、ある種のウイルスベクターの使用など）またはベクターは、そのような機能性をもたらすように改変することができる。種々様々のそのようなベクターは、当技術分野において公知で、一般に入手可能である。ベクターが宿主細胞において維持される場合、ベクターは、自律性の構造物として、有糸分裂の間に細胞によって安定して複製され、宿主細胞のゲノム内に組み込まれるまたは宿主細胞の核もしくは細胞質中に維持される。
【０１７０】
Ｂ．調節エレメント
ベクター中に含まれる真核生物発現カセットは、好ましくは、コード配列に操作可能に連結された真核生物転写プロモータータンパク質、介在配列を含むスプライスシグナル、および転写終結／ポリアデニル化配列を含有する（５’から３’方向に）。
ｉ．プロモーター／エンハンサー
「プロモーター」は、転写の開始および速度がコントロールされる核酸配列の領域であるコントロール配列である。プロモーターは、核酸配列の特異的な転写を開始するために、ＲＮＡポリメラーゼおよび他の転写因子などのような調節タンパク質および分子が、結合してもよい遺伝エレメントを含有していてもよい。語句「作動可能に位置する」、「作動可能に連結された」、「コントロール下の」、および「転写コントロール下の」は、プロモーターが、その配列の転写開始および／または発現をコントロールするために、核酸配列に関して適正な機能的な場所にあるおよび／または方向づけをされていることを意味する。
【０１７１】
本発明のＥＢＮＡ−１コードベクターにおいて使用するのに適したプロモーターは、ＥＢＮＡ−１タンパク質をコードする発現カセットの発現を指示して、十分な定常状態のレベルのＥＢＮＡ−１タンパク質をもたらし、ＥＢＶ  ｏｒｉＰ−含有ベクターを安定して維持するものである。プロモーターはまた、リプログラミング因子をコードする発現カセットの効率的な発現のために使用されてもよい。
【０１７２】
プロモーターは、一般に、ＲＮＡ合成のための開始部位を位置づけるために機能する配列を含む。この最もよく知られている例は、ＴＡＴＡボックスであるが、たとえば哺乳動物末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ遺伝子についてのプロモーターおよびＳＶ４０後期遺伝子についてのプロモーターなどのようなＴＡＴＡボックスを欠くいくつかのプロモーターでは、開始の場所を固定するのを助けるために開始部位それ自体を覆う孤立性のエレメントである。さらなるプロモーターエレメントは、転写開始の頻度を調節する。典型的に、これらは、開始部位の３０〜１１０ｂｐ上流の領域に位置するが、多くのプロモーターは、同様に、開始部位の下流の機能エレメントを含有することが示されている。プロモーター「のコントロール下の」コード配列をもたらすために、転写リーディングフレームの転写開始部位の５’端を、選ばれたプロモーターの「下流に」（つまり、３’に）位置づける。「上流の」プロモーターは、ＤＮＡの転写を刺激し、コードＲＮＡの発現を促進する。
【０１７３】
プロモーターエレメントの間の間隔は、しばしば可動性であり、エレメントが互いに反転するまたは移動する場合、プロモーター機能は保たれる。ｔｋプロモーターでは、プロモーターエレメントの間の間隔は、５０ｂｐの間隔まで増加させることができ、それを超えると活性が下がり始める。プロモーターに依存して、個々のエレメントは、転写を活性化するために、協力的にまたは非依存的に機能することができるように思われる。プロモーターは、「エンハンサー」と共に使用されてもよくまたは使用されなくてもよく、これは、核酸配列の転写活性化に関与するシス作用性調節配列を指す。
【０１７４】
プロモーターは、コードセグメントおよび／またはエキソンの上流に位置する５’非コード配列を単離することによって得られるかもしれないので、核酸配列と自然に関連するものである。そのようなプロモーターは、「内因性」と呼ぶことができる。同様に、エンハンサーは、その配列の下流または上流に位置する核酸配列と自然に関連するものであってもよい。その代わりに、ある種の利点は、その自然環境において核酸配列と通常関連しないプロモーターを指す組換えまたは異種プロモーターのコントロール下にコード核酸セグメントを位置づけることによって、獲得されるであろう。組換えまたは異種エンハンサーはまた、その自然環境において核酸配列と通常関連しないエンハンサーを指す。そのようなプロモーターまたはエンハンサーは、他の遺伝子のプロモーターまたはエンハンサーならびに他のウイルスまたは原核もしくは真核細胞から単離されたプロモーターまたはエンハンサーならびに「天然に存在しない」、つまり、異なる転写調節領域の異なるエレメントおよび／または発現を改変する変異を含有するプロモーターまたはエンハンサーを含んでいてもよい。たとえば、組換えＤＮＡ構築において最も一般に使用されるプロモーターは、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトース、およびトリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系を含む。プロモーターおよびエンハンサーの核酸配列を合成的に産生することに加えて、配列は、本明細書において開示される組成物に関連して、組換えクローニングおよび／またはＰＣＲ（商標）を含む核酸増幅技術を使用して産生されてもよい（それぞれ参照によって本明細書において組み込まれる米国特許第４，６８３，２０２号および第５，９２８，９０６号を参照されたい）。さらに、ミトコンドリア、葉緑体、およびその他同種のものなどのような非核細胞小器官内の配列の転写および／または発現を指示するコントロール配列を同様に利用することができることが企図される。
【０１７５】
当然ながら、発現のために選ばれた細胞小器官、細胞型、組織、器官、または生物におけるＤＮＡセグメントの発現を有効に指示するプロモーターおよび／またはエンハンサーを利用することが重要であろう。分子生物学の当業者らは、一般に、タンパク質発現のためのプロモーター、エンハンサー、および細胞型の組合せの使用を知っている（たとえば、参照によって本明細書において組み込まれるＳａｍｂｒｏｏｋら  １９８９年を参照されたい）。利用されるプロモーターは、組換えタンパク質および／またはペプチドの大規模生産において有利であるなどのように、導入されたＤＮＡセグメントの高レベルの発現を指示するのに適切な条件下で、恒常的、組織特異的、誘導性、および／または有用であってもよい。プロモーターは、異種または内因性のものであってもよい。
【０１７６】
さらに、任意のプロモーター／エンハンサーの組合せ（たとえば、Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  Ｄａｔａ  Ｂａｓｅ  ＥＰＤＢ、Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂ  ａｔ  ｅｐｄ．ｉｓｂ−ｓｉｂ．ｃｈ／）もまた、発現を駆動するために使用することができる。Ｔ３、Ｔ７、またはＳＰ６細胞質発現系の使用は、他の可能な実施形態である。真核細胞は、送達複合体の一部としてまたはさらなる遺伝子発現構築物として適切な細菌ポリメラーゼが提供される場合、ある種の細菌プロモーターからの細胞質転写を支持することができる。
【０１７７】
プロモーターの非限定的な例は、ＳＶ４０初期にまたは後期プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター、ニワトリ肉腫ウイルス（ＲＳＶ）初期プロモーターなどのような初期または後期ウイルスプロモーター；たとえば、ベータアクチンプロモーター（Ｎｇ、１９８９年、Ｑｕｉｔｓｃｈｅら、１９８９年）、ＧＡＤＰＨプロモーター（Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、１９８８年、Ｅｒｃｏｌａｎｉら、１９８８年）、メタロチオネインプロモーター（Ｋａｒｉｎら、１９８９年；Ｒｉｃｈａｒｄｓら、１９８４年）などのような真核細胞プロモーター；ならびに環状ＡＭＰ応答エレメントプロモーター（ｃｒｅ）、血清応答エレメントプロモーター（ｓｒｅ）、ホルボールエステルプロモーター（ＴＰＡ）、および最小限のＴＡＴＡボックスの近くの応答エレメントプロモーター（ｔｒｅ）などのような連鎖状応答エレメントプロモーターを含む。ヒト成長ホルモンプロモーター配列（たとえば、Ｇｅｎｂａｎｋ、受入番号Ｘ０５２４４に記載されるヒト成長ホルモンの最小限のプロモーター、ヌクレオチド２８３〜３４１）またはマウス乳癌プロモーター（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＡＴＣＣ  ４５００７から入手可能）を使用することもまた、可能である。特定の例は、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターとすることができる。
【０１７８】
ｉｉ．開始シグナルおよび内部リボソーム結合部位
特異的な開始シグナルもまた、コード配列の効率的な翻訳のために必要とされてもよい。これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドンまたは近接する配列を含む。ＡＴＧ開始コドンを含む外因性翻訳コントロールシグナルが提供される必要があってもよい。当業者はこれを容易に決定し、必要なシグナルを提供することができるであろう。開始コドンは、挿入物全体の翻訳を確実にするために、所望のコード配列のリーディングフレームとインフレームでなければならないことは周知である。外因性翻訳コントロールシグナルおよび開始コドンは、自然または合成のものであってもよい。発現の効率は、適切な転写エンハンサーの包含によって増強されてもよい。
【０１７９】
本発明のある実施形態では、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）エレメントの使用は、多重遺伝子または多シストロン性メッセージを生成するために使用されてもよい。ＩＲＥＳエレメントは、５’メチル化キャップ依存性の翻訳のリボソームスキャニングモデルを迂回し、内部の部位で翻訳を始めることができる（ＰｅｌｌｅｔｉｅｒおよびＳｏｎｅｎｂｅｒｇ、１９８８年）。ピコルナウイルスファミリーの２つのメンバー（ポリオおよび脳心筋炎）由来のＩＲＥＳエレメントが、記載されており（ＰｅｌｌｅｔｉｅｒおよびＳｏｎｅｎｂｅｒｇ、１９８８年）、そのうえ、哺乳動物メッセージ由来のＩＲＥＳ（ＭａｃｅｊａｋおよびＳａｒｎｏｗ、１９９１年）も記載されている。ＩＲＥＳエレメントは、異種オープンリーディングフレームに連結することができる。複数のオープンリーディングフレームは、共に転写することができ、ＩＲＥＳによってそれぞれ分離され、多シストロン性メッセージを生成することができる。ＩＲＥＳエレメントによって、オープンリーディングフレームはそれぞれ、効率的な翻訳のためにリボソームに到達できる。複数の遺伝子は、単一のメッセージを転写するために単一のプロモーター／エンハンサーを使用して効率的に発現することができる（参照によって本明細書において組み込まれる米国特許第５，９２５，５６５号および第５，９３５，８１９号を参照されたい）。
ｉｉｉ．マルチクローニング部位
ベクターは、マルチクローニング部位（ＭＣＳ）を含むことができ、これは、複数の制限酵素部位を含有する核酸領域であり、これらのいずれも、ベクターを消化するための標準的な組換え技術と共に使用することができる（たとえば、参照によって本明細書において組み込まれるＣａｒｂｏｎｅｌｌｉら、１９９９年、Ｌｅｖｅｎｓｏｎら、１９９８年、およびＣｏｃｅａ、１９９７年を参照されたい）。「制限酵素消化」は、核酸分子中の特異的な場所でのみ機能する酵素を用いる核酸分子の触媒性の切断を指す。これらの制限酵素の多くは、市販で入手可能である。そのような酵素の使用は、当業者らによって広く理解されている。しばしば、ベクターは、外因性の配列がベクターにライゲーションされるのを可能にするために、ＭＣＳ内を切断する制限酵素を使用して、直線化されるまたは断片化される。「ライゲーション」は、２つの核酸断片の間にホスホジエステル結合を形成するプロセスを指し、これらは、互いに隣接していてもよいまたは隣接していなくてもよい。制限酵素およびライゲーション反応に関する技術は、組換え技術の当業者らに周知である。
【０１８０】
ｉｖ．スプライシング部位
ほとんどの転写真核生物ＲＮＡ分子は、一次転写物からイントロンを除去するためにＲＮＡスプライシングを受けるであろう。ゲノム真核生物配列を含有するベクターは、タンパク質発現のための転写の適切な処理を確実にするために、ドナーおよび／またはアクセプタースプライシング部位を必要としてもよい（たとえば、参照によって本明細書において組み込まれるＣｈａｎｄｌｅｒら、１９９７年を参照されたい）。
【０１８１】
ｖ．終結シグナル
本発明のベクターまたは構築物は、一般に、少なくとも１つの終結シグナルを含むであろう。「終結シグナル」または「ターミネーター」は、ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ転写の特異的な終結に関与するＤＮＡ配列から構成される。したがって、ある実施形態では、ＲＮＡ転写物の産生を終了する終結シグナルが企図される。ターミネーターは、望ましいメッセージレベルを達成するためにｉｎ  ｖｉｖｏにおいて必要であってもよい。
【０１８２】
真核生物系では、ターミネーター領域はまた、ポリアデニル化部位を曝露するように、新しい転写物の部位特異的な切断を可能にする特異的なＤＮＡ配列を含んでいてもよい。これは、約２００のＡ残基（ポリＡ）のストレッチを転写物の３’端に追加するように、特殊化した内因性のポリメラーゼにシグナル伝達する。このポリＡテイルを用いて修飾されたＲＮＡ分子は、より安定しているように思われ、より効率的に翻訳される。したがって、真核生物に関する他の実施形態では、そのターミネーターが、ＲＮＡの切断のためのシグナルを含むことが好まれ、ターミネーターシグナルが、メッセージのポリアデニル化を促進することがより好まれる。ターミネーターおよび／またはポリアデニル化部位エレメントは、メッセージレベルを増強し、かつカセットから他の配列へのリードスルーを最小限にするように果たすことができる。
【０１８３】
本発明において使用するために企図されるターミネーターは、たとえば、たとえばウシ成長ホルモンターミネーターなどのような遺伝子の終結配列またはたとえばＳＶ４０ターミネーターなどのようなウイルス終結配列を含むが、これらに限定されない、本明細書において記載されるまたは当業者に公知の転写の任意の公知のターミネーターを含む。ある実施形態では、終結シグナルは、配列切断によるなどのように、転写可能なまたは翻訳可能な配列の欠如であってもよい。
ｖｉ．ポリアデニル化シグナル
発現、特に真核生物の発現では、典型的に、転写物の適切なポリアデニル化を引き起こすためのポリアデニル化シグナルを含むであろう。ポリアデニル化シグナルの性質は、本発明の実施の成功に重大であると考えられず、任意のそのような配列が利用されてもよい。好ましい実施形態は、様々な標的細胞において十分に機能するのに好都合であり、そのことが公知であるＳＶ４０ポリアデニル化シグナルまたはウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルを含む。ポリアデニル化は、転写物の安定性を増加させてもよいまたは細胞質輸送を促進してもよい。
【０１８４】
ｖｉｉ．複製起点
宿主細胞においてベクターを増殖させるために、ベクターは、複製が開始される特異的な核酸配列である、１つ以上の複製起点部位（多くの場合、「ｏｒｉ」と称される）、たとえば、上記に記載されるＥＢＶのｏｒｉＰに対応する核酸配列を含有していてもよい。その代わりに、上記に記載される他の染色体外で複製するウイルスの複製開始点または自己複製配列（ＡＲＳ）を利用することができる。
ｖｉｉｉ．選択マーカーおよびスクリーニング可能なマーカー
本発明のある実施形態では、本発明の核酸構築物を含有する細胞は、発現ベクター中にマーカーを含むことによって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて同定されてもよい。そのようなマーカーは、細胞に同定可能な変化を与え、発現ベクターを含有する細胞の容易な同定を可能にするであろう。一般に、選択マーカーは、選択を可能にする特性を与えるものである。ポジティブ選択マーカーは、マーカーの存在がその選択を可能にするものであるが、ネガティブ選択マーカーは、その存在がその選択を妨げるものである。ポジティブ選択マーカーの例は、薬剤抵抗性マーカーである。
【０１８５】
普通、薬剤選択マーカーの包含は、形質転換体のクローニングおよび同定を援助し、たとえば、ネオマイシン、ブラストサイジン、ピューロマイシン、ヒグロマイシン、ＤＨＦＲ、ＧＰＴ、ｚｅｏｃｉｎ、およびヒスチジノールに対する抵抗性を与える遺伝子は、有用な選択マーカーである。条件の実行に基づく形質転換体の識別を可能にする表現型を与えるマーカーに加えて、その基準が比色分析であるＧＦＰなどのようなスクリーニング可能なマーカーを含む他のタイプのマーカーもまた、企図される。その代わりに、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ｔｋ）またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）などのようなネガティブ選択マーカーとしてスクリーニング可能な酵素が、利用されてもよい。当業者はまた、おそらくＦＡＣＳ分析と共に、免疫マーカーを利用する方法をも知っているであろう。マーカーが遺伝子産物をコードする核酸と同時に発現されることができる限り、使用されるマーカーは、重要であると考えられない。さらに、選択およびスクリーニング可能なマーカーの例は、当業者に周知である。
【０１８６】
Ｃ．ベクター送達
本発明を用いる体細胞へのリプログラミングベクターの導入は、本明細書において記載されるようにまたは当業者に公知であるように、細胞の形質転換のために、任意の核酸送達に適した方法を使用してもよい。そのような方法は、ｅｘ  ｖｉｖｏトランスフェクションによって（Ｗｉｌｓｏｎら、１９８９年、Ｎａｂｅｌら、１９８９年）；マイクロインジェクション（ＨａｒｌａｎｄおよびＷｅｉｎｔｒａｕｂ、１９８５年；参照によって本明細書において組み込まれる米国特許第５，７８９，２１５号）を含む注射によって（それぞれ参照によって本明細書において組み込まれる米国特許第５，９９４，６２４号、第５，９８１，２７４号、第５，９４５，１００号、第５，７８０，４４８号、第５，７３６，５２４号、第５，７０２，９３２号、第５，６５６，６１０号、第５，５８９，４６６号、および第５，５８０，８５９号）；エレクトロポレーションによって（参照によって本明細書において組み込まれる米国特許第５，３８４，２５３号；Ｔｕｒ−Ｋａｓｐａら、１９８６年；Ｐｏｔｔｅｒら、１９８４年）；リン酸カルシウム沈殿によって（ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ  Ｄｅｒ  Ｅｂ、１９７３年；ＣｈｅｎおよびＯｋａｙａｍａ、１９８７年；Ｒｉｐｐｅら、１９９０年）；ポリエチレングリコールが後続するＤＥＡＥデキストランの使用によって（Ｇｏｐａｌ、１９８５年）；直接的な音波ローディングによって（Ｆｅｃｈｈｅｉｍｅｒら、１９８７年）；リポソーム媒介性のトランスフェクションによって（ＮｉｃｏｌａｕおよびＳｅｎｅ、１９８２年；Ｆｒａｌｅｙら、１９７９年；Ｎｉｃｏｌａｕら、１９８７年；Ｗｏｎｇら、１９８０年；Ｋａｎｅｄａら、１９８９年；Ｋａｔｏら、１９９１年）ならびに受容体媒介性のトランスフェクション（ＷｕおよびＷｕ、１９８７年；ＷｕおよびＷｕ、１９８８年）によって；微粒子銃によって（それぞれ、参照によって本明細書において組み込まれるＰＣＴ出願ＷＯ９４／０９６９９および９５／０６１２８；米国特許第５，６１０，０４２号；第５，３２２，７８３号  第５，５６３，０５５号、第５，５５０，３１８号、第５，５３８，８７７号、および第５，５３８，８８０号）；炭化ケイ素繊維を用いる撹拌によって（それぞれ参照によって本明細書において組み込まれるＫａｅｐｐｌｅｒら、１９９０年；米国特許第５，３０２，５２３号および第５，４６４，７６５号）；乾燥／阻害媒介性のＤＮＡ取り込み（Ｐｏｔｒｙｋｕｓら、１９８５年）によって、ならびにそのような方法の任意の組合せなどのように、ＤＮＡの直接的な送達を含むが、これらに限定されない。これらの技術などのような技術の適用を通して、細胞小器官（複数可）、細胞（複数可）、組織（複数可）、または生物（複数可）は、安定してまたは一時的に形質転換されてもよい。
【０１８７】
ｉ．リポソーム媒介性のトランスフェクション
本発明のある実施形態では、核酸は、たとえばリポソームなどのような脂質複合体中に封入されてもよい。リポソームは、リン脂質二重層膜および内部水性媒体によって特徴付けられる小胞性の構造物である。多重膜リポソームは、水性媒体によって分離される複数の脂質層を有する。多重膜リポソームは、リン脂質が過剰な水溶液中に懸濁される場合、自発的に形成される。脂質成分は、閉鎖した構造物の形成の前に自己再配列を受けて、脂質二分子膜の間に水および溶解した溶質を封入する（ＧｈｏｓｈおよびＢａｃｈｈａｗａｔ、１９９１年）。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）またはＳｕｐｅｒｆｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ）と複合体を形成した核酸もまた、企図される。使用されるリポソームの量は、リポソームの性質および使用される細胞次第で変動してもよく、たとえば、１〜１０百万の細胞当たり約５〜約２０μｇベクターＤＮＡが企図されてもよい。
【０１８８】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける外来性ＤＮＡのリポソーム媒介性の核酸送達および発現は、非常に成功してきた（ＮｉｃｏｌａｕおよびＳｅｎｅ、１９８２年；Ｆｒａｌｅｙら、１９７９年；Ｎｉｃｏｌａｕら、１９８７年）。培養ニワトリ胚、ＨｅＬａ、および肝癌細胞における外来性ＤＮＡのリポソーム媒介性の送達および発現の実現可能性もまた示された（Ｗｏｎｇら、１９８０年）。
【０１８９】
本発明のある実施形態では、リポソームは、赤血球凝集ウイルス（ＨＶＪ）と複合体を形成させてもよい。これは、細胞膜との融合を促進し、かつリポソームカプセル化ＤＮＡの細胞侵入を促進することが示された（Ｋａｎｅｄａら、１９８９年）。他の実施形態では、リポソームは、核非ヒストン染色体タンパク質（ＨＭＧ−１）と複合体を形成させてもよいまたはそれと共に利用されてもよい（Ｋａｔｏら、１９９１年）。さらなる実施形態では、リポソームは、ＨＶＪおよびＨＭＧ−１の両方と複合体を形成させてもよいまたはそれらと共に利用されてもよい。他の実施形態では、送達ビヒクルは、リガンドおよびリポソームを含んでいてもよい。
【０１９０】
ｉｉ．エレクトロポレーション
本発明のある実施形態では、核酸は、エレクトロポレーションを介して、細胞小器官、細胞、組織、または生物の中に導入される。エレクトロポレーションは、細胞およびＤＮＡの懸濁液の高電圧放電への曝露を含む。レシピエント細胞は、機械的な傷によって形質転換に対してより感受性にすることができる。さらに、使用されるベクターの量は、使用される細胞の性質次第で変動してもよく、たとえば、１〜１０百万の細胞当たり約５〜約２０μｇベクターＤＮＡが企図されてもよい。
【０１９１】
エレクトロポレーションを使用する真核細胞のトランスフェクションは、かなり成功してきた。マウス前Ｂリンパ球は、ヒトカッパ免疫グロブリン遺伝子をトランスフェクトされ（Ｐｏｔｔｅｒら、１９８４年）、ラット肝細胞は、このようにしてクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子をトランスフェクトされた（Ｔｕｒ−Ｋａｓｐａら、１９８６年）。
【０１９２】
ｉｉｉ．リン酸カルシウム
本発明の他の実施形態では、核酸は、リン酸カルシウム沈殿を使用して、細胞に導入される。ヒトＫＢ株細胞は、この技術を使用して、アデノウイルス５  ＤＮＡ（ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ  Ｄｅｒ  Ｅｂ、１９７３年）がトランスフェクトされた。さらに、このようにして、マウスＬ（Ａ９）、マウスＣ１２７、ＣＨＯ、ＣＶ−１、ＢＨＫ、ＮＩＨ３Ｔ３、およびＨｅＬａ細胞は、ネオマイシンマーカー遺伝子がトランスフェクトされ（ＣｈｅｎおよびＯｋａｙａｍａ、１９８７年）、ラット肝細胞は、様々なマーカー遺伝子がトランスフェクトされた（Ｒｉｐｐｅら、１９９０年）。
【０１９３】
ｉｖ．ＤＥＡＥ−デキストラン
他の実施形態では、核酸は、ポリエチレングリコールが後続するＤＥＡＥ−デキストランを使用して、細胞の中に送達される。このようにして、レポータープラスミドは、マウス骨髄腫細胞および赤白血病細胞の中に導入された（Ｇｏｐａｌ、１９８５年）。
【０１９４】
ｖ．超音波処理ローディング
本発明のさらなる実施形態は、直接的な音波ローディングによる核酸の導入を含む。ＬＴＫ−線維芽細胞は、音波処理ローディングによってチミジンキナーゼ遺伝子がトランスフェクトされた（Ｆｅｃｈｈｅｉｍｅｒら、１９８７年）。
【０１９５】
ｖｉ．受容体媒介性のトランスフェクション
さらに、核酸は、受容体媒介性の送達ビヒクルを介して目的の細胞に送達されてもよい。これらは、標的細胞において起こるであろう受容体媒介性のエンドサイトーシスによる高分子の選択的な取り込みを利用する。様々な受容体の細胞型に特異的な分布を考慮して、この送達方法は、本発明に他の特異性を追加する。
【０１９６】
ある種の受容体媒介性の遺伝子ターゲティングビヒクルは、細胞受容体特異的リガンドおよび核酸結合剤を含む。他のものは、送達されることとなる核酸が作動可能に付着された細胞受容体特異的リガンドを含む。いくつかのリガンドは、受容体媒介性の遺伝子移入（ＷｕおよびＷｕ、１９８７年；Ｗａｇｎｅｒら、１９９０年；Ｐｅｒａｌｅｓら、１９９４年；Ｍｙｅｒｓ、ＥＰＯ０２７３０８５）のために使用され、これは、技術の実施可能性を確立する。他の哺乳動物細胞型と関連する特異的な送達が記載されている（ＷｕおよびＷｕ、１９９３年；参照によって本明細書において組み込まれる）。本発明のある態様では、リガンドは、標的細胞集団上に特異的に発現される受容体に対応するように選ばれるであろう。
【０１９７】
他の実施形態では、細胞特異的核酸ターゲティングビヒクルの核酸送達ビヒクル構成成分は、リポソームと結合する特異的な結合リガンドを含んでいてもよい。送達されることとなる核酸（複数可）は、リポソーム内に収容され、特異的な結合リガンドは、リポソーム膜の中に機能的に組み込まれる。リポソームは、したがって、標的細胞の受容体（複数可）に特異的に結合し、細胞に内容物を送達するであろう。そのような系は、たとえば、上皮増殖因子（ＥＧＦ）を、ＥＧＦ受容体のアップレギュレーションを示す細胞への核酸の受容体媒介性の送達において使用する系を使用して、機能的であることが示された。
【０１９８】
さらなる実施形態では、標的送達ビヒクルの核酸送達ビヒクル構成成分は、リポソームそれ自体であってもよく、リポソームは、細胞特異的な結合を指示する１つ以上の脂質または糖タンパク質を好ましくは含むであろう。たとえば、ラクトシル−セラミド、ガラクトース末端アシアロガングリオシド（ａｓｉａｌｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ）は、リポソームの中に組み込まれ、肝細胞によるインスリン遺伝子の取り込みの増加が観察された（Ｎｉｃｏｌａｕら、１９８７年）。本発明の組織特異的形質転換構築物は、同様の方法において標的細胞の中に特異的に送達することができることが企図される。
ｖｉｉ  微粒子銃
微粒子銃技術は、少なくとも１つの細胞小器官、細胞、組織、または生物の中に核酸を導入するために使用することができる（米国特許第５，５５０，３１８号；米国特許第５，５３８，８８０号；米国特許第５，６１０，０４２号；およびＰＣＴ出願ＷＯ９４／０９６９９；それぞれ、参照によって本明細書において組み込まれる）。この方法は、ＤＮＡをコーティングする微粒子を高速度まで加速し、それらが細胞膜を貫通し、かつそれらを死滅させることなく細胞に入ることを可能にする能力に依存する（Ｋｌｅｉｎら、１９８７年）。当技術分野において公知の種々様々の微粒子銃技術があり、これらの多くは、本発明に適用可能である。
【０１９９】
この微粒子銃では、１つ以上の粒子は、少なくとも１つの核酸を用いてコーティングされ、発射力によって細胞の中に送達されてもよい。小さな粒子を加速するためのいくつかのデバイスが開発されている。１つのそのようなデバイスは、電流を生成するために高圧放電に依存し、これにより、さらには、原動力がもたらされる（Ｙａｎｇら、１９９０年）。使用される微粒子は、タングステンもしくは金の粒子またはビーズなどのような生物学的に不活性の物質から成った。例示的な粒子は、タングステン、白金、および好ましくは金から構成されるものを含む。いくつかの実例では、金属粒子上へのＤＮＡ沈殿は、微粒子銃を使用するレシピエント細胞へのＤＮＡ送達に必要ではないであろうということが企図される。しかしながら、粒子は、ＤＮＡを用いてコーティングされるのではなく、ＤＮＡを含有していてもよいことが企図される。ＤＮＡコーティングされた粒子は、粒子銃を介して、ＤＮＡ送達のレベルを増加させてもよいが、それら自体、必要ではない。
【０２００】
衝撃のために、懸濁液中の細胞は、フィルターまたは固体培養培地上で濃縮される。その代わりに、未成熟の胚または他の標的細胞は、固体培養培地上に配置されてもよい。衝撃を与えられることとなる細胞は、微粒子を止めるプレートより下の適切な距離に置かれる。
【実施例】
【０２０１】
ＩＸ．実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すために含まれる。続く実施例において開示される技術は、本発明の実施において十分に機能するように、発明者によって発見された技術を示し、したがって、その実施のための好ましいモードを構成すると考えることができることが、当業者らによって十分に理解されるはずである。しかしながら、当業者らは、本開示を考慮して、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、多くの変化が、開示される特定の実施形態において成され、同様のまたは類似する結果をなお得ることができることを十分に理解するはずである。
【０２０２】
（実施例１）
小さな化学化合物を用いるヒト包皮線維芽細胞のエピソームリプログラミング
ｉＰＳ細胞誘導に影響を与える公知の化学化合物のスクリーニングを通して、発明者らは、ヒト包皮線維芽細胞のエピソームリプログラミング効率を著しく改善したいくつかの化合物を同定した。ＢＩＸ０１２９４（Ｂ）は、Ｇ９ａヒストンメチルトランスフェラーゼの選択的阻害剤である。ＢａｙＫ８６４４と組み合わせて、それは、Ｏｃｔ４およびＫｌｆ４のみが形質導入されたマウス胚性線維芽細胞のリプログラミングを可能にすることができた小分子として最初に同定された（Ｓｈｉら、２００８年）。ＰＤ０３２５９０１（Ｐ）は、マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ（ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼまたはＭＥＫ）の阻害剤である。ＣＨＩＲ９９０２１（Ｃ）は、ＧＳＫ３βの最も選択的な阻害剤であり、一方、Ａ−８３−０１（Ａ）は、ＴＧＦ−βＩ型受容体ＡＬＫ５、アクチビン／Ｎｏｄａｌ受容体ＡＬＫ４、およびｎｏｄａｌ受容体ＡＬＫ７の強力な阻害剤である。ＰＤ０３２５９０１およびＣＨＩＲ９９０２１の組合せ（２ｉ）は、不応性株からのマウスＥＳ細胞の効率的な誘導を可能にした（Ｙｉｎｇら、２００８年）。２ｉ条件において、重要でないが、マウスＥＳ細胞培養に決まって使用される白血病抑制因子（ＬＩＦ）は、マウスＥＳ細胞のクローン形成能および誘導を促進した（Ｙｉｎｇら、２００８年）。この２ｉ／ＬＩＦ条件は、マウス神経幹細胞の真の多能性へのリプログラミングを促進することが示された（Ｓｉｌｖａら、２００８年）。興味深いことに、真のラットＥＳ細胞は、この２ｉ／ＬＩＦ条件において初期胚から直ちに誘導することができたが（Ｂｕｅｈｒら、２００８年；Ｌｉら、２００８年）、Ａ−８３−０１の追加は、ラットｉＰＳ細胞の長期的な培養を保持するために必要とされることが示された（Ｌｉら、２００９年）。ＰＤ０３２５９０１、ＣＨＩＲ９９０２１、Ａ−８３−０１、およびＬＩＦの組合せもまた、レンチウイルス媒介性のリプログラミング培養由来の異型マウスＥＳ細胞様ヒトｉＰＳ細胞を選択し、安定化することができることが示された（Ｌｉら、２００９年）が、リプログラミング、特にエピソームリプログラミングに対するこれらの阻害剤の組合せの効果は、立証されていない。
【０２０３】
細胞培養のために、ヒトＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞は、２０％ノックアウト血清リプレーサー、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、１ｍＭ  Ｇｌｕｔａｍａｘ（すべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡから）、０．１ｍＭ  β−メルカプトエタノール、および１００ｎｇ／ｍｌゼブラフィッシュ塩基性線維芽細胞増殖因子（ｚｂＦＧＦ）を補足したＤＭＥＭ／Ｆ１２培養培地において照射マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）上で維持した（Ａｍｉｔら、２０００年；Ｌｕｄｗｉｇら、２００６ａ；Ｔｈｏｍｓｏｎら、１９９８年）。馴化培地を用いる、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）上でのフィーダーフリーの培養は、１００ｎｇ／ｍｌ  ｚｂＦＧＦを用いる以外は先に記載される（Ｘｕら、２００１年）ように実行した。ヒト新生児包皮線維芽細胞（Ｃａｔ＃  ＣＲＬ−２０９７（商標）、ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）および４２歳の皮膚生検材料由来の成人線維芽細胞は、１０％限定ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、２ｍＭ  Ｇｌｕｔａｍａｘ（すべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから）、０．１ｍＭ  β−メルカプトエタノール、および４ｎｇ／ｍｌ  ｚｂＦＧＦを補足したＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において培養した。ｍＴｅＳＲ（商標）１は、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．（Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｃａｎａｄａ）から得た。Ｎ２Ｂ２７培地は、以下のように調製した：１×Ｎ２サプリメント、１×Ｂ−２７サプリメント、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、１ｍＭ  Ｇｌｕｔａｍａｘ（すべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから）、０．１ｍＭ  β−メルカプトエタノールを補足したＤＭＥＭ／Ｆ１２培養培地。
【０２０４】
ヒト体細胞、ヒト包皮線維芽細胞のエピソームリプログラミングのために、エピソームベクター（図１Ａ、７．３μｇのｐＥＰ４ＥＯ２ＳＣＫ２ＭＥＮ２Ｌおよび３．２μｇのｐＥＰ４ＥＯ２ＳＥＴ２Ｋ）（Ｙｕら、２００９年）は、ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ（プログラムＵ−２０を用いるＮＨＤＦ−ＶＰＤ−１００１、Ａｍａｘａ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を介して１×１０６細胞の中にコトランスフェクトした。それぞれのｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎからのトランスフェクト包皮線維芽細胞は、線維芽細胞培養培地において３×１０ｃｍ  ＭＥＦ接種皿に直接平板培養した。成人皮膚線維芽細胞については、７．３μｇのｐＥＰ４ＥＯ２ＳＣＫ２ＭＥＮ２Ｌおよび６．４μｇのｐＥＰ４ＥＯ２ＳＥＴ２Ｋは、ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ（プログラムＵ−２０を用いるＮＨＤＦ−ＶＰＤ−１００１、Ａｍａｘａ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を介して１×１０６細胞の中にコトランスフェクトした。それぞれのｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎからのトランスフェクト成人皮膚線維芽細胞は、より低い細胞生存のために、線維芽細胞培養培地において１×１０ｃｍ  ＭＥＦ接種皿に直接平板培養した。翌日、線維芽細胞培養培地は、ｚｂＦＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）を補足したまたはなしの、以下の化合物：Ｈ−ＨＡ−１００（１０μＭ）；Ｂ−ＢＩＸ０１２９４（１μＭ）；Ｐ−ＰＤ０３２５９０１（０．５μＭ）；Ｃ−ＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ）；Ａ−Ａ−８３−０１（０．５μＭ）およびＬ−ｈＬＩＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）ありのまたはなしの新鮮な線維芽細胞培養培地または様々なリプログラミング培地（たとえば、ＭＥＦ−ＣＭを用いてあらかじめ調整したヒトＥＳ細胞培養培地、ヒトＥＳ細胞培養培地、ｍＴｅＳＲ（商標）１、Ｎ２Ｂ２７）と交換した。ヒトＥＳ細胞様のｉＰＳ細胞を得るために、リプログラミング培地は、トランスフェクション後の１３〜２０日目に、１００ｎｇ／ｍｌ  ｚｂＦＧＦまたはｍＴｅＳＲ（商標）１を補足したＣＭと交換した。別個のタイプのｉＰＳ（部分的にリプログラミングされたｉＰＳＣについてはｐｉＰＳＣ）細胞を得るために、リプログラミング培地は、ＰＣＡＬを補足したＣＭまたはＮ２Ｂ２７培地と交換した。アルカリホスファターゼ染色（Ｃａｔ＃  ＳＣＲ００４、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）は、リプログラミング効率をチェックするために、トランスフェクション後の１８日目および２４日目の間に実行した。
【０２０５】
ＢＩＸ０１２９４は、それだけで、エピソームベクターによるリプログラミングを改善することができ（図１Ａ）、ＰＤ０３２５９０１、ＣＨＩＲ９９０２１、およびＡ−８３−０１の組合せにおける利益を示さなかったまたはわずかに示したのみであった（図１Ｂおよび２Ａ）。ＰＤ０３２５９０１およびＣＨＩＲ９９０２１のみが十分であったマウス神経幹細胞リプログラミング（Ｓｉｌｖａら、２００８年）と異なり、３つすべての化学化合物（ＰＤ０３２５９０１、ＣＨＩＲ９９０２１、およびＡ−８３−０１）が、最善のリプログラミング効率を達成するために必要とされた（図１Ｂ）。得られたｉＰＳ細胞コロニーは、３つすべての化学化合物の存在下において非ｉＰＳ細胞コロニーと容易に識別可能になり得る（図１Ｃ）。これは、ピッキングおよび増殖の間のｉＰＳ細胞クローン性の維持、初代リプログラミング培養の継代が、非ｉＰＳ細胞からｉＰＳ細胞を同定するために必要とされた以前のプロトコール（Ｙｕら、２００９年）からの大きな改善を可能にするであろう。ＨＡ−１００は、ヒトＥＳ細胞クローニング効率を改善することが示された。ＨＡ−１００は、実験のサブセットに含めた。ヒトＬＩＦ（ｈＬＩＦ、またはＬ）の追加は、ＰＤ０３２５９０１、ＣＨＩＲ９９０２１、およびＡ−８３−０１を用いるエピソームリプログラミングをさらに促進した（図２Ａ）。さらに、ＬＩＦを追加すると、ｉＰＳ細胞の最初の出現が、およそ３〜４日早くなり（トランスフェクション後、約１４日目）、より多くの大きなｉＰＳ細胞コロニーが存在した（図２Ａ）。
【０２０６】
ＰＤ０３２５９０１が、ｂＦＧＦシグナル伝達の下流の標的であるＭＥＫ活性を効率的に阻害するので、リプログラミングに対するｂＦＧＦの効果もまた、検査した。図２Ａにおいて示されるように、高濃度のｂＦＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）は、この特定のリプログラミング条件下で有利であった。この効果は、高度なｂＦＧＦレベルの非ＭＥＫ媒介性の効果に起因した可能性が最も高い。高度なｂＦＧＦレベルの効果は、特定のリプログラミング培養培地に依存するように思われた。たとえば、ｂＦＧＦは、馴化ヒトＥＳ細胞培養培地（ＣＭ）および無血清限定Ｎ２Ｂ２７培地が使用された場合、有益な効果を示した（図２Ａおよび４Ａ）が、無馴化ヒトＥＳ細胞培養培地が試験された場合、逆効果が観察された（図４Ａ）。図２Ｂにおいて示されるように、化学化合物の早期の追加は、リプログラミング効率を増加させ、より長い化学処理が、最善のリプログラミング効率を達成するために必要とされた。
【０２０７】
ヒトＥＳ細胞およびヒトＥＳ細胞様のｉＰＳ細胞の増殖は、移植後のマウス胚盤葉上層から誘導されるマウスＥｐｉＳＣに類似して、ＦＧＦおよびＴＧＦβ／アクチビンシグナル伝達経路の活性化を必要とする。ＰＤ０３２５９０１は、ＦＧＦシグナル伝達の下流の標的であるＭＥＫを阻害し、Ａ−８３−０１は、ＴＧＦβ／アクチビンシグナル伝達を阻害する。両方の薬剤がリプログラミングを増加させたという観察は、むしろ驚くべきことであった。図３Ａにおいて示されるように、ヒトＥＳ細胞およびヒトＥＳ細胞様のｉＰＳ細胞の両方は、リプログラミング化学カクテル（ＰＤ０３２５９０１、ＣＨＩＲ９９０２１、Ａ−８３−０１、およびｈＬＩＦ）の存在下において効率的な分化を受けた。化学カクテルの存在下において誘導されたｉＰＳ細胞の同一性を確認するために、ｉＰＳ細胞は、通常のヒトＥＳ細胞培養条件における増殖のために採集した。初めの試験は、未分化細胞の小さな塊を有する多くの分化コロニーをもたらし、これは、ほとんどのコロニーが未分化のままであった、化学カクテルの非存在下において誘導されたｉＰＳ細胞とは非常に異なっていた。この結果は、化学カクテルの存在下において誘導されたほとんどのｉＰＳ細胞が通常のヒトＥＳ細胞様のｉＰＳ細胞とは異なっていたことを示唆する。
【０２０８】
化学カクテルの存在下において、ｉＰＳ細胞は、採集し、マウス胚性線維芽細胞フィーダー上で増殖することができ（図３Ｃ）、多くの分化を伴うが、培養最適化の必要性を示唆する。通常のヒトＥＳ細胞培養条件下でこれらのｉＰＳ細胞を培養することによる化学カクテルの除去は、著しい分化をもたらし、これらの多くは、ロゼット構造物を形成し（図３Ｄ）、これらの細胞が、以前に誘導されたほとんどのヒトｉＰＳ細胞とは対照的に、効率的なｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける神経分化が可能であることを示唆する。ｈＬＩＦがリプログラミングを改善したというこれらのデータおよび観察は、このタイプのヒトｉＰＳ細胞が、通常のヒトＥＳ細胞様のｉＰＳ細胞とは異なることを示唆し、リプログラミング細胞の中間段階であることがその後、分かった。
【０２０９】
化学的に誘導されたｉＰＳ細胞を採集し、通常のヒトＥＳ細胞培養条件下で増殖した場合の小さな未分化細胞塊の存在は、通常のヒトＥＳ細胞様のｉＰＳ細胞もまた、化学処理したリプログラミング培養から誘導することができる可能性を高めた。実際に、化学カクテルが、最低１０日間の処理後にリプログラミング培養から除去された場合、通常のヒトＥＳ細胞様のｉＰＳ細胞は、通常のヒトＥＳ細胞培養条件下で直ちに増殖した（図３Ｂ）。これらのｉＰＳ細胞の起源は、興味深い問題のままである。これらのｉＰＳ細胞は、先在する通常のヒトＥＳ細胞様のｉＰＳ細胞から増殖することができるまたはそれらは、ｐｉＰＳ細胞が、通常のヒトＥＳ細胞培養条件下で通常のヒトＥＳ細胞様のｉＰＳ細胞を直ちに誘発することができるので、ｐｉＰＳ細胞から誘導することができる。
【０２１０】
ヒト体細胞のリプログラミングは、一般に、ＭＥＦを用いてあらかじめ調整したヒトＥＳ細胞培養培地（ＣＭ）を用いてＭＥＦフィーダー上で実行した。ＭＥＦの品質は、異なるバッチの間に著しく変動し、これは、リプログラミング効率の一貫性に非常に影響を与える。また、ＭＥＦおよびＣＭの調製は、かなり重労働となり得る。さらに、ＭＥＦフィーダーおよびＣＭの両方は、種々様々の細胞型の成長を支持し、これらは、リプログラミングの間の非ｉＰＳ細胞の増殖がリプログラミングに負に影響を与え得るので、リプログラミング効率に対する著しい制限をもたらす。この問題を克服するために、異なる培地を試験した。図４Ａにおいて示されるように、ＴｅＳＲ、ｂＦＧＦサプリメントなしの無馴化ヒトＥＳ細胞培養培地、およびＮ２Ｂ２７培地は、ｂＦＧＦを補足したＣＭよりも高い、強いエピソームリプログラミングを支持した。
【０２１１】
さらに、異なるリプログラミング培地（ステップ２、図４Ｂ）は、異なる効率で、２つのタイプのｉＰＳ細胞を誘発した。どのリプログラミング培地を使用したかに依存して、２つのタイプのｉＰＳ細胞を得る効率は、図４Ａにおいて示されるように異なった。たとえば、ｈＥＳＣ培地（＋ＰＣＡＬＨ）をリプログラミングにおいて使用した場合、ヒトＥＳ細胞様のｉＰＳ細胞は、ＣＭ＋ｂＦＧＦまたはＴｅＳＲ増殖培地を使用して、リプログラミング培養から直ちに得ることができ、Ｎ２Ｂ２７＋ＰＣＡＬ増殖培地を使用した場合、ｐｉＰＳ細胞を得ることができる。しかしながら、Ｎ２Ｂ２７培地（＋ＰＣＡＬＨ）をリプログラミング培地として使用した場合、ヒトＥＳ細胞様のｉＰＳ細胞を得ることができないまたはめったに得ることができない。
【０２１２】
これは、リプログラミング培地（ステップ２、図４Ｂ）および増殖培地（ステップ３、図４Ｂ）の組合せが、おそらく、リプログラミング培養におけるｉＰＳ細胞の不均一性のレベルに影響を与えるであろうということを示唆する。それぞれのｉＰＳ細胞型の誘導に最適な培地の組合せは、ｉＰＳ細胞のクローン間の差異を最小限にするために選択することができる。
【０２１３】
（実施例２）
小分子を用いるフィーダーフリーエピソームリプログラミング
ヒトｉＰＳＣは、ヒト胚性幹細胞（ＥＳＣ）に類似して、無限の増殖が可能であり、体のすべての細胞型に分化するための潜在能力を有する。これらの細胞は、したがって、基本的な生物学、疾患モデリング、薬剤開発、および移植療法における適用を有する。リプログラミング因子の決定されたセットの発現によって、ｉＰＳＣは、異なる種の多くの細胞型から生成された（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、２００７年；Ｙｕら、２００７年；ＴａｋａｈａｓｈｉおよびＹａｍａｎａｋａ、２００６年；Ｌｉｕら、２００８年；Ｅｓｔｅｂａｎら、２００９年；Ｌｏｈら、２００９年；Ｓｕｎら、２００９年；Ｓｈｉｍａｄａら、２０１０年）。ｉＰＳＣ生成のための初めの方法は、ゲノム組み込み型レトロウイルスまたはレンチウイルスベクターを利用した（Ｙｕら、２００７年；ＴａｋａｈａｓｈｉおよびＹａｍａｎａｋａ、２００６年）。これらのアプローチは、腫瘍形成性の挿入変異をもたらし得、ｉＰＳＣ分化の間の導入遺伝子発現の残留または再活性化は、ｉＰＳＣ誘導体の系列選択および機能性に影響を与え得た（Ｙｕら、２００７年；Ｏｋｉｔａら、２００７年）。これらの問題を克服するために、リプログラミング因子（プラスミド、小環状ＤＮＡ、非組み込み型アデノウイルスベクター、およびタンパク質）を用いる繰り返しの処理、トランスポゾン、ならびにＲＮＡウイルスベクター（Ｏｋｉｔａら、２００８年；Ｓｔａｄｔｆｅｌｄら、２００８年；Ｆｕｓａｋｉら、２００９年；Ｋａｊｉら、２００９年；Ｗｏｌｔｊｅｎら、２００９年；Ｚｈｏｕら、２００９年；Ｊｉａら、２０１０年）を含む様々な方法が、フットプリントフリーのｉＰＳＣを誘導するために開発された。しかしながら、これらの方法は、以下の１つ以上の制限を受ける：容認できない低リプログラミング効率；ｉＰＳＣからのリプログラミング因子の重労働な除去；ウイルスパッケージ細胞またはフィーダー細胞の必要。したがって、多くのヒトドナー試料からのフットプリントフリーのｉＰＳＣのルーチン的な誘導および最終的に、臨床グレードのヒトｉＰＳＣの誘導を可能にするための単純で効率的なフィーダーフリーの方法を開発するための必要性がある。
【０２１４】
フットプリントフリーのヒトｉＰＳＣは、リプログラミング遺伝子（ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８、ｃ−ＭＹＣ、ＫＬＦ４、およびＳＶ４０ＬＴ）を送達するためにｏｒｉＰ／ＥＢＮＡ−１（エプスタイン−バー核抗原−１）エピソームベクターを使用して、先に生成された（Ｙｕら、２００９年）。他の方法と比較して、このアプローチは、いくつかの利点を有する。第１に、ｏｒｉＰ／ＥＢＮＡ−１ベクターは、幅広い宿主細胞の範囲を有し、多くのヒト細胞型へのこの方法の適用を可能にする。第２に、それは、ウイルスパッケージングを必要としない。第３に、リプログラミング因子を用いる繰り返しの処理が必要とされない。ヒトｉＰＳＣの誘導には、エピソームベクターの１回のトランスフェクションで十分である。さらに、より高度なトランスフェクション効率は、ベクターＤＮＡのｏｒｉＰ／ＥＢＮＡ−１媒介性の核移入および保持によりこれらのベクターを用いて達成することができる（ＭｉｄｄｌｅｔｏｎおよびＳｕｇｄｅｎ、１９９４年）。第４に、ｏｒｉＰ／ＥＢＮＡ−１ベクターは、細胞周期当たりに１回複製し、一般に、細胞当たり低コピー数で存在し、したがって、ＤＮＡ再配列およびゲノム組み込みを最小限にする（ＹａｔｅｓおよびＧｕａｎ、１９９１年）。最後に、ヒトｉＰＳＣからのエピソームベクターの除去は、ｉＰＳＣにおけるＥＢＮＡ−１発現を駆動するウイルスのプロモーターのサイレンシングおよびｏｒｉＰ／ＥＢＮＡ−１エピソーム状態の固有の不安定性により、さらなる操作を伴わないで単純な細胞培養によって達成することができ、安定して確立されたエピソームは、ベクター合成および分割における欠損により、細胞世代当たり約５％の率で細胞から失われる（Ｎａｎｂｏら、２００７年）。これらの利点にもかかわらず、発明者らの最初のｏｒｉＰ／ＥＢＮＡ−１エピソームアプローチは、低リプログラミング効率を示し（約１×１０６のインプットヒト包皮線維芽細胞から約３つのｉＰＳＣコロニー）、マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）フィーダー細胞を使用したが、これは、この方法の産業上および治療上の適用を深刻に制限する。
【０２１５】
これらの制限を克服するために、発明者らは、最初に、エピソームリプログラミング効率の改善のために小分子をスクリーニングした。ｏｒｉＰ／ＥＢＮＡ−１ベクターは、トランスフェクト細胞の１〜１０％のみにおいて、安定したエピソームを確立することができる（ＬｅｉｇｈｔおよびＳｕｇｄｅｎ、２００１年）。トランスフェクション後の最初の２週間の間、トランスフェクト細胞は、細胞世代当たり＞２５％でｏｒｉＰ／ＥＢＮＡ−１ベクターを失い、これには、おそらくＤＮＡメチル化を通して媒介される導入遺伝子サイレンシングが伴う（Ｋａｍｅｄａら、２００６年）。ベクター損失または導入遺伝子サイレンシングによる、トランスフェクション後の最初の２週間の間の導入遺伝子発現の損失は、主として、低エピソームリプログラミング効率の原因となる。したがって、リプログラミングプロセスを速めるまたは導入遺伝子サイレンシングを低下させるまたは安定したエピソーム確立の効率を増加させることができる小分子が、リプログラミングを改善することが予想される。リプログラミングを促進することが先に示された小分子を試験することによって、発明者らは、ＭＥＫ阻害剤ＰＤ０３２５９０１、ＧＳＫ３β阻害剤ＣＨＩＲ９９０２１、およびＴＧＦ−β／アクチビン／Ｎｏｄａｌ受容体阻害剤Ａ−８３−０１の追加によりエピソームリプログラミング効率を大幅に増強することができることを発見した（図５Ａ）。以前の研究は、ＴＧＦ−βシグナル伝達阻害剤が、ＭＥＫ阻害剤ＰＤ０３２５９０１と共に、ウイルスのリプログラミング効率の＞１００倍の増加をもたらしたことを示した（Ｌｉｎら、２００９年）。図１ａにおいて示されるように、ＴＧＦ−βシグナル伝達阻害剤Ａ−８３−０１は、単独でまたはＭＥＫ阻害剤ＰＤ０３２５９０１と共に、エピソームリプログラミングに対して最小限の効果を有した。３つの阻害剤ＰＤ０３２５９０１、ＣＨＩＲ９９０２１、およびＡ−８３−０１すべてが、リプログラミング効率の最大の増加を達成するために必要とされた。ヒト白血病抑制因子（ｈＬＩＦ）は、エピソームリプログラミング効率を著しく改善しなかったが、リプログラミング中間体の増殖を増加させた。ＲＯＣＫ阻害剤ＨＡ−１００は、それだけで最小限の効果を有したが、ＰＤ０３２５９０１、ＣＨＩＲ９９０２１、Ａ−８３−０１、およびｈＬＩＦの存在下においてエピソームリプログラミング効率をさらに増加させた。ＨＡ−１００の効果は、それを、類似する機能を有する他の阻害剤、たとえばＨ−１１５２およびブレビスタチンと交換することができなかったので、個別化されたヒトｉＰＳＣの細胞生存を促進する際にその機能を通して媒介されなかったかもしれない（Ｗａｔａｎａｂｅら、２００７年；Ｃｈｅｎら、２０１０年）。エピソームリプログラミング効率の増加は、小分子処理の期間と相関した（図５Ｂ）。トランスフェクション後の１日目および５日目の間の処理は、特に、それらの最大の効果にとって重要であるように思われた。
【０２１６】
ヒトＥＳＣは、マウス胚盤葉上層誘導幹細胞（ＥｐｉＳＣ）と類似する遺伝子発現および培養必要条件を示し、初期の胚盤胞段階から誘導されたマウスＥＳＣと異なる。以前の研究は、あらかじめこれらの阻害剤に曝露されなかったリプログラミング培養物からのマウスＥＳＣ様のヒトｉＰＳＣを増殖するためのＰＤ０３２５９０１、ＣＨＩＲ９９０２１、Ａ−８３−０１、およびｈＬＩＦの能力を示した（Ｌｉら、２００９年）。これらのマウスＥＳＣ様のヒトｉＰＳＣは、これらの小分子の除去後に直ちに分化した。ヒトＥＳＣは、これに反して、これらの小分子の存在下において速やかに分化した。驚いたことに、小分子の継続的な存在下において得られるヒトエピソームｉＰＳＣは、ヒトＥＳＣについての条件下（小分子なし）で最小限の分化と共に好適な増殖を示したが、採集され、それらの誘導に使用した同じ条件において、つまり小分子の存在下において増殖した場合、広範囲な分化を受け（図５Ｃ）、これらのｉＰＳＣが、おそらく、マウスＥＳＣではなくヒトＥＳＣに類似する多能性状態にあることを示唆する。外見的には相いれない結果は、小分子の存在下におけるヒトＥＳＣ様の多能性状態の生成を可能にするかもしれないリプログラミングに使用したＭＥＦ馴化ヒトＥＳＣ培地における、小分子の有効性を軽減した活性の存在によって説明することができるかもしれない（たとえばｂＦＧＦおよびＴＧＦ−βシグナル伝達に対するリガンド）。
【０２１７】
ヒトＥＳＣ培地において使用されるＫｎｏｃｋＯｕｔ（商標）血清代替品が、リプログラミングに干渉するかもしれない未知の因子を含有するので、小分子を軽減する活性を欠く培養培地を使用することによって、発明者らがマウスＥＳＣ様のｉＰＳＣを効率的に生成することができるかどうかを知るために、また、特定されたリプログラミング条件を同定するために、エピソームリプログラミングを支持することができる限定培地を見つけるために実験を設定した。特に、限定Ｎ２Ｂ２７培地を試験し、これは、単純な配合を有し、サイトカインを補足した場合に、ヒトＥＳＣの増殖を支持することができた（Ｌｉｕら、２００６年）。図６Ａにおいて示されるように、小分子を補足したＮ２Ｂ２７培地は、約６倍高い数の、アルカリホスファターゼ（ヒト多能性幹細胞マーカー）についてポジティブ染色されたコロニーを誘発した（試験２対試験１）。これらのコロニー（部分的にリプログラミングされたｉＰＳＣについてはｐｉＰＳＣ）は、マウスＥＳＣ様のドーム形の形態を有し、これは、ヒトＥＳＣ様のｉＰＳＣコロニーの典型的な平らな形態と異なる（図６Ｂ）。それらは、採集し、小分子を補足したＮ２Ｂ２７培地において７回以上の継代の間、増殖することができた。しかしながら、これらの細胞のフローサイトメトリー分析は、ヒト多能性幹細胞に特異的な抗原（ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、およびＴｒａ−１−８１）の発現を検出しなかったが、線維芽細胞マーカーＣＤ４４の発現が存在した（図１０Ａ）。定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析もまた、ヒト多能性幹細胞についての２つの本質的なマーカーである内因性のＯＣＴ４およびＮＡＮＯＧのいかなる発現をも検出しなかった（図６Ｃ）。これらの結果は、コロニーが、ＭＥＦ馴化ヒトＥＳＣ培地を用いて誘導されたものとしてのヒトＥＳＣ様のｉＰＳＣ（試験１）またはＰＤ０３２５９０１、ＣＨＩＲ９９０２１、およびＬＩＦの存在下においてウイルスにより誘導されたものとしてのマウスＥＳＣ様のｉＰＳＣではなく、部分的にリプログラミングされたｉＰＳＣであることを示唆し、したがって、ｉＰＳＣの多能性状態に対するリプログラミング培養条件の重要な影響を示した（Ｈａｎｎａら、２０１０年；Ｂｕｅｃｋｅｒら、２０１０年）。興味深いことに、ｐｉＰＳＣは、小分子を補足したＮ２Ｂ２７培地における複数回の継代後にさえ、豊富なエピソームベクターを含有し、高レベルの導入遺伝子発現を維持し（図６Ｃおよび図１０Ｂ）、エピソームベクターおよび導入遺伝子発現の保持への小分子の可能性の高い関与を示唆した。小分子の除去は、限定ヒトＥＳＣ培地ｍＴｅＳＲ１におけるｐｉＰＳＣの２週間の培養後に、広範囲な分化の中に、ヒトＥＳＣ様のｉＰＳＣのところどころの出現を導いた。したがって、現在のリプログラミング条件は、マウスＥＳＣ様のヒトエピソームのｉＰＳＣをもたらさなかったが、Ｎ２Ｂ２７培地におけるヒトＥＳＣ様のｉＰＳＣの誘導を可能にするためにリプログラミングプロトコールにおいて修飾を成すことができるかもしれない。
【０２１８】
この目的のために、発明者らは、リプログラミングプロセスを３つの段階：トランスフェクション（段階１）、リプログラミング（段階２）、および増殖（段階３）に分割し、ｍＴｅＳＲ１を使用した（図６Ａ）。小分子を補足したＮ２Ｂ２７培地をリプログラミングを支持するために段階２で使用した場合、ヒトＥＳＣ様のｉＰＳＣへのｐｉＰＳＣのまれな変換のみを観察することができ、ｍＴｅＳＲ１における増殖の間の導入遺伝子発現が、ほとんどのｐｉＰＳＣにおける内因性の多能性遺伝子の発現を再活性化するのに不十分であったことを示唆した。したがって、発明者らは、小分子を補足したＮ２Ｂ２７培地中へのさらなるサイトカインの追加によって、エピソームリプログラミングを改善することが可能であるかどうかを検査した（段階２）。ヒトＥＳＣの増殖に関係する因子のうちで、ｂＦＧＦおよびＴＧＦ−β／アクチビン／Ｎｏｄａｌシグナル伝達は、特に重要である。Ａ−８３−０１によるＴＧＦ−β／アクチビン／Ｎｏｄａｌシグナル伝達の阻害がリプログラミングを促進したので（図５Ａ）、発明者らは、エピソームリプログラミングに対するｂＦＧＦの効果を試験した。実際に、Ｎ２Ｂ２７培地への高濃度ｂＦＧＦの追加は、ヒトＥＳＣ様のｉＰＳＣコロニーの適切な数をもたらした（試験３）（図６Ａ）。この結果は、高濃度ｂＦＧＦがＭＥＫに加えて複数の経路を通してヒトＥＳＣ増殖を支持したという以前の観察と一致した。重要なことには、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）は、さらに高度なリプログラミング効率でＭＥＦフィーダー細胞に取って代わることができた（試験４）（図６Ａ）。時間的経過実験は、小分子処理の最適期間についての必要条件を示した（図６Ｄ）。驚くほどのことではないが、段階２での、Ｎ２Ｂ２７培地のＴＧＦ−β含有ｍＴｅＳＲ１との置換は、エピソームリプログラミング効率を著しく減少させた（図１０Ｃ）。したがって、小分子および限定培地を使用して、発明者らは、著しく改善された効率により、フィーダーフリーエピソームリプログラミング方法を確立した（１×１０６インプットヒト包皮線維芽細胞から＞２２０のｉＰＳＣコロニー、＞７０倍の増加）（図６Ｄ）。
【０２１９】
新しく開発されたフィーダーフリーリプログラミング条件を用いて、発明者らは、成人皮膚線維芽細胞からのヒトＥＳＣ様のｉＰＳＣの誘導に成功した。採集し、ｍＴｅＳＲ１において増殖した場合、これらのｉＰＳＣは、典型的なヒトＥＳＣ形態（たとえば密度の高いコロニー、高度な核−細胞質比、および顕著な核小体）を示し、正常な核型を有した（図７Ａ〜７Ｆおよび図１１Ａ〜１１Ｅ）。ほとんどのｉＰＳＣコロニーは、導入遺伝子発現もゲノム組み込みも示さず、ＰＣＲおよびＲＴ−ＰＣＲ分析によって示されるように複数回の継代（＞１４）後にエピソームベクターを完全に失った（図７Ｃおよび図１１Ｃ）。それらのｉＰＳＣコロニーは、典型的なヒトＥＳＣ特異的抗原（ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、およびＴｒａ−１−８１）を発現し、線維芽細胞マーカーＣＤ４４の発現をダウンレギュレートし（図１１Ｄ）、内因性多能性遺伝子（ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、およびＬＩＮ２８）の発現を再活性化した（図７Ｄ）。ＯＣＴ４およびＮＡＮＯＧの両方のプロモーターは、ヒトＥＳＣに類似してならびに親の線維芽細胞およびｐｉＰＳＣとは対照的に、これらのｉＰＳＣにおいて脱メチル化された（図７Ｅ）。免疫無防備状態のマウスに注射した場合、それらのマウスは、３つの胚葉すべての誘導体から成る奇形腫を形成し、これらのｉＰＳＣの多能性を示した（図７Ｆおよび図１１Ｅ）。
【０２２０】
フィーダーフリーエピソームリプログラミングに対する小分子の効果は、細胞型特異的でないが、異なる体細胞型に適用される（図８Ａ〜８Ｃ）。さらに、このデータは、それぞれの細胞型に最適なリプログラミング効率を達成するための、エピソームベクターの正しい組合せ（異なるリプログラミング導入遺伝子の組合せおよび異なる導入遺伝子の発現レベル）を同定する重要性を示す。
【０２２１】
エピソームリプログラミング効率の著しい改善は、形質転換欠損ＭＹＣにより達成され（図９）、たとえば、ＬＭＹＣは、１×１０６インプットヒト包皮線維芽細胞当たり、約１０００のｉＰＳＣコロニーをもたらした。
【０２２２】
要約すると、遺伝学的および化学的アプローチの組合せを使用して、発明者らは、非ウイルスフィーダーフリーエピソームリプログラミング方法の確立に成功し、効率が非常に改善された。この方法は、線維芽細胞を用いて開発されたが、脂肪組織および末梢血などのような生きているヒトドナーから容易に得られる組織の細胞型に適用可能である。異なる細胞型が、リプログラミング因子の特異的な組合せおよび発現レベルについての選択性を有するように思われるので、最適な効率のために異なるエピソームリプログラミングベクターを試験することが必要であるかもしれない。さらなる特徴は、リプログラミング効率をさらに改善するためにエピソームベクターの中に導入することができる。たとえば、現在のエピソームベクターは、細菌の増殖に必要なエレメントを有し、これは、導入遺伝子サイレンシングの一因となる公知の多くのＣｐＧ島を含有する（Ｃｈｅｎら、２００４年）。小環状ｏｒｉＰ／ＥＢＮＡ−１エピソームベクターを産生するために部位特異的組換えを使用して細菌ベクター構成成分を除去することによって導入遺伝子サイレンシングを最小限にすることが可能である。しかしながら、新しい方法は、多数のヒトドナー試料からのフットプリントフリーのｉＰＳＣのルーチン的な誘導に十分に単純で、効率的であり、ドナー細胞付着およびｉＰＳＣ増殖を支持する限定マトリックス（ｄｅｆｉｎｅｄ  ｍａｔｒｉｘ）を用いると、この方法は、臨床グレードのヒトｉＰＳＣの産生に容易に適応することができる。
【０２２３】
細胞培養．ヒトＥＳＣおよびｉＰＳＣは、２０％ＫｎｏｃｋＯｕｔ（商標）血清代替品、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、１ｍＭ  ＧｌｕｔａＭＡＸ（すべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡから）、０．１ｍＭ  β−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、および１００ｎｇ／ｍｌゼブラフィッシュ塩基性線維芽細胞増殖因子（ｚｂＦＧＦ）を補足したＤＭＥＭ／Ｆ１２培養培地において照射ＭＥＦ上で維持した（Ｙｕら、２００９年）。ＭＥＦ馴化ヒトＥＳＣ培地は、先に記載されるように調製した（Ｘｕら、２００１年）。ヒト新生児包皮線維芽細胞（Ｃａｔ＃  ＣＲＬ−２０９７（商標）、ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＭＡ）および成人皮膚線維芽細胞（Ｃａｔ＃  ＣＲＬ−２１０６（商標）、ＡＴＣＣ）は、１０％熱不活性化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｌｏａｎ、ＵＴ）、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、１ｍＭ  ＧｌｕｔａＭＡＸ、０．１ｍＭ  β−メルカプトエタノール、および４ｎｇ／ｍｌ  ｚｂＦＧＦを補足したＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において培養した。
【０２２４】
ｍＴｅＳＲ（商標）１（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、ＢＣ、Ｃａｎａｄａ）におけるＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）上でのヒトＥＳＣおよびｉＰＳＣのフィーダーフリー培養は、継代手順における修飾と共に、先に記載されるように実行した（Ｌｕｄｗｉｇら、２００６ｃ）。手短かに言えば、ＥＤＴＡ分解方法を利用した。ヒトＥＳＣおよびｉＰＳＣがコンフルエンスに達した場合、細胞は、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋なしのＰＢＳを用いて１回洗浄し、３７℃で８分間、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡと共にインキュベートした（２ｍｌ／６ウェルプレートのウェル）。インキュベーション後に、ＥＤＴＡ溶液を除去し、新鮮なｍＴｅＳＲ１（２ｍｌ／６ウェルプレートのウェル）を、細胞脱離のためにそれぞれのウェルに滴下して追加した。ほとんどの細胞は、緩やかな振盪によりプレートから離れた。次いで、解離した細胞は、ｍＴｅＳＲ１を用いてあらかじめ充填した新たに調製したＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）プレートの中に直ちに等分した。細胞付着および生存を改善するために、ＲＯＣＫ阻害剤ＨＡ−１００（１０μＭ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）を、継代の間に１日間、ｍＴｅＳＲ１に追加した。この方法を用いて、ヒトＥＳＣおよびｉＰＳＣは、最適な増殖のために１：８の分割比で３〜４日毎に継代した。
【０２２５】
ヒト線維芽細胞のリプログラミング．ヒトＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８、ｃ−ＭＹＣ、ＫＬＦ４、およびＳＶ４０ＬＴ導入遺伝子のための発現カセットを含有するエピソームリプログラミングベクターは、先に記載されている（Ｙｕら、２００９年）。特に、ベクターｐＥＰ４ＥＯ２ＳＣＫ２ＭＥＮ２ＬおよびｐＥＰ４ＥＯ２ＳＥＴ２Ｋ（組合せ４）は、リプログラミング最適化のために使用した。約７．３μｇのベクターｐＥＰ４ＥＯ２ＳＣＫ２ＭＥＮ２Ｌおよび３．２μｇのｐＥＰ４ＥＯ２ＳＥＴ２Ｋは、ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ（Ｕ−２０プログラムを用いるＮＨＤＦ−ＶＰＤ−１００１、Ａｍａｘａ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ  ）を介してヒト新生児包皮線維芽細胞の中にコトランスフェクトした。トランスフェクト線維芽細胞（ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ当たり約１．０×１０６細胞）は、線維芽細胞培養培地において、３×１０ｃｍ  ＭＥＦ接種皿または３×１０ｃｍ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）コーティング皿に直接平板培養した。トランスフェクション後の翌日、線維芽細胞培地は、１００ｎｇ／ｍｌ  ｚｂＦＧＦ（ＣＭ１００）を補足したＭＥＦ馴化ヒトＥＳＣ培地または合成Ｎ２Ｂ２７培地（Ｎ２Ｂ２７）もしくは１００ｎｇ／ｍｌ  ｚｂＦＧＦを補足したＮ２Ｂ２７培地（Ｎ２Ｂ２７−１００）またはｍＴｅＳＲ１と交換した。Ｎ２Ｂ２７培地は、Ｎ−２サプリメント（１×、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｂ−２７サプリメント（１×、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、１ｍＭ  ＧｌｕｔａＭＡＸ、および０．１ｍＭ  β−メルカプトエタノールを補足したＤＭＥＭ／Ｆ１２培養培地から成る。加える場合、小分子ＰＤ０３２５９０１（Ｐ、０．５μＭ）、ＣＨＩＲ９９０２１（Ｃ、３μＭ）、Ａ−８３−０１（Ａ、０．５μＭ）（すべてＳｔｅｍｇｅｎｔ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから）、ｈＬＩＦ（Ｌ、１０００Ｕ／ｍｌ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）、およびＨＡ−１００（Ｈ、１０μＭ）は、リプログラミング培養に追加した。培養培地は、２日毎にリフレッシュした。アルカリホスファターゼ染色（Ｃａｔ＃  ＳＣＲ００４、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）は、ｉＰＳＣの同定を促進するためにリプログラミング実験のサブセットにおいて実行した。限定培養培地を使用するヒト成人皮膚線維芽細胞のフィーダーフリーエピソームリプログラミングは、プロトコールにおける最小限の変化を伴って、包皮線維芽細胞と同様に実行し、トランスフェクト成人線維芽細胞は、ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ後に、より低い細胞生存により、３枚の代わりに１枚の１０ｃｍ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）皿に平板培養した。フィーダーフリー条件下で誘導されたｉＰＳＣを特徴付けるために、典型的なｉＰＳＣ形態を有するコロニーは、ｍＴｅＳＲ１におけるＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）コーティング１２ウェルプレート上に直接採集した。ＥＤＴＡ分解方法は、継代の間の分化細胞の持ち越し汚染を最小限にしながらｉＰＳＣ増殖を促進するために利用した。エピソームリプログラミングベクターの完全な損失は、ヒト包皮線維芽細胞および成人皮膚線維芽細胞の両方から誘導されたすべてのｉＰＳＣクローンについて１４継代のあたりで一般に達成された���
【０２２６】
ＲＴ−ＰＣＲ発現分析、エピソームベクターのＰＣＲ分析、重亜硫酸配列決定分析、フローサイトメトリー分析、および核型分析。ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、フローサイトメトリー分析は、先に記載されるように実行した（Ｙｕら、２００７年；Ｙｕら、２００９年）。ＯＣＴ４およびＮＡＮＯＧのプロモーターのメチル化ステータスは、ＭｅｔｈｙｌＣｏｄｅ（商標）Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて重亜硫酸配列決定を使用して分析した（Ｙｕら、２００９年）。プライマーはすべて表１中のものとし、抗体は、表２中のものとした。標準的なＧ結合染色体分析は、Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｌａｂ  ａｔ  ＷｉＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）で実行した。
【０２２７】
表１．ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、および重亜硫酸配列決定ＰＣＲ用のプライマー
【０２２８】
【表１−１】
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【０２２９】
【表１−２】
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表２．フローサイトメトリー分析用の抗体
【０２３０】
【表２】
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奇形腫形成．フィーダーフリー条件下で誘導されたヒトｉＰＳＣのｉｎ  ｖｉｖｏにおける発生多能性を検査するために、ｍＴｅＳＲ１におけるＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）上で成長させたｉＰＳＣは、１回の継代のためにＭＥＦフィーダー細胞に移した。細胞は、コラゲナーゼ処理を用いて収集し、６週齢の免疫無防備状態のＳＣＩＤベージュマウスの後ろ足の筋肉の中に注射した（マウス当たり５０〜８０％コンフルエンスのおよそ１枚の１０ｃｍ皿）（Ｈａｒｌａｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）。６〜８週間後に、奇形腫を解剖し、１０％ホルマリン（Ｆｉｓｈｅｒ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）中で固定した。試料は、パラフィン中に包埋し、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ＭｃＡｒｄｌｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ−Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩにおいてヘマトキシリンおよびエオシン染色を用いて処理した。
【０２３１】
本明細書において開示され、主張される方法はすべて、本開示を考慮して、不必要な実験作業を伴わないで成され、かつ実行することができる。本発明の組成物および方法は、好ましい実施形態の点から記載されるが、本発明の概念、精神、および範囲から逸脱することなく、本明細書において記載される方法、ステップ、または方法のステップの順序において変更が適用されてもよいことは、当業者らに明らかであろう。特に、化学的にまた生理学的に関係するある種の作用物質は、本明細書において記載される作用物質と置換されてもよく、そのうえ、同じまたは類似する結果が達成されることが明らかであろう。当業者らに明らかなすべてのそのような類似する代用物および修飾は、添付の請求項によって定義されるように、本発明の精神、範囲、および概念内にあると考えられる。
【０２３２】
参考文献
以下の参考文献は、それらが、本明細書において記載されるものに対して補足的な、例示的な手順のまたは他の詳細を提供する程度まで、参照によって本明細書において明確に組み込まれる。
【０２３３】
【数１】
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【０２３４】
【数２】
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【０２３５】
【数３】
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【０２３６】
【数４】
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【０２３７】
【数５】
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【０２３８】
【数６】
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【０２３９】
【数７】
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【０２４０】
【数８】
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【０２４１】
【数９】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ｃ】
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【図１２】
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【配列表】
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