(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
酪農反芻動物により生成されるメタンの量を評価するための方法であり、当該方法は少なくとも、
前記反芻動物からの乳のサンプル中の、デノボ合成から得られる少なくとも１つの脂肪酸（ＡＧ）の重量を測定すること、及び
次式：ＣＨ４＝ａ*（デノボ  ＡＧ）＋ｙ*（ＢＨ  ＡＧ）＋ｚ：
により前記メタンの量を評価すること、
を含み、ここで、
−  「ＣＨ４」は、前記反芻動物によって乳１キログラム当たり又は１リットル当たり生成されるメタンのグラム数で表した量であり、
−  「デノボ  ＡＧ」は、乳１キログラム当たり又は１リットル当たりグラム数で表される、乳腺上皮細胞によって合成される１６以下の炭素原子を含む少なくとも１つの脂肪酸の前記サンプル中で測定された量であり、それ自体で又は少なくとも他のデノボ脂肪酸の測定された量と組み合わせて取得され；
−  「ＢＨ  ＡＧ」は、乳１キログラム当たり又は１リットル当たりグラム数で表される、反芻胃内での生体水素化から得られた少なくとも１つの脂肪酸、すなわち、反芻胃内での発酵の過程で少なくとも１つの水素化を経た１８の炭素原子を持つ少なくとも１つの脂肪酸の前記サンプル中の測定された量であり、それ自体で又は少なくとも反芻胃内での生体水素化から得られた他の脂肪酸の測定された量と組み合わせて取得され；
−  ａは、ｙがゼロである場合に−２から２、又はｙがゼロとは異なる場合には０．１から１０の間の数であり；
−  ｙは、ａがゼロではない場合に−１０から＋１０、又はａがゼロの場合には−５０から−０．１の間の数であり；
−  ａ及びｙは同時にゼロではなく；
−  ｚは−１００から＋１００の間の数である、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であり、「デノボ  ＡＧ」は次の定義：
（ａ）４から１４の炭素原子を持つ飽和脂肪酸（ＡＧＳ）の量；
（ｂ）４から１６の炭素原子を持つ飽和脂肪酸の量；
（ｃ）Ｃ１２及びＣ１４の飽和脂肪酸の量；
（ｄ）Ｃ４、Ｃ６、Ｃ８、Ｃ１０、Ｃ１２、Ｃ１４及びＣ１６の飽和脂肪酸の量であり、単独又はこれらのうち少なくとも２つの組み合わせで取得される、量；
から選択される、方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法であり、ｙがゼロであり、前記メタンの量が次の式：
ＣＨ４＝（１．０７±０．５）*Ｃ４からＣ１４の飽和脂肪酸の和＋（４．８±３）
によって与えられる、方法。
【請求項４】
請求項１又は２のいずれか一項に記載の方法であり、ｙがゼロではなく、「ＢＨ  ＡＧ」が次の定義：
（ａ）不飽和脂肪酸（ＡＧＩ）の全量；
（ｂ）少なくとも１８の炭素原子を含む不飽和脂肪酸（ＡＧＩ）の全量；
（ｃ）少なくとも１８の炭素原子を含む不飽和脂肪酸（ＡＧＩ）の全量、但しＣ１８：１ｎ−９、Ｃ１８：２ｎ−６及びＣ１８：３ｎ−３の不飽和脂肪酸を除く；
（ｄ）Ｃ１８の飽和脂肪酸（Ｃ１８：０）の量；
（ｅ）トランス脂肪酸又はその一部の量；
から選択される、方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法であり、前記メタンの量が以下の式：
ＣＨ４＝（１．１４±０．４）*Ｃ４からＣ１４の飽和脂肪酸の和−（０．０７±０．３）*［ＡＧＩ−（Ｃ１８：１ｎ−９＋Ｃ１８：２ｎ−６＋Ｃ１８：３ｎ−３）］＋（４．７±０．５）
によって与えられ、ここで、［ＡＧＩ−（Ｃ１８：１ｎ−９＋Ｃ１８：２ｎ−６＋Ｃ１８：３ｎ−３）］は、Ｃ１８：１ｎ−９、Ｃ１８：２ｎ−６及びＣ１８：３ｎ−３の酸を除く不飽和脂肪酸の全量を表す、方法。
【請求項６】
請求項１乃至５のいずれか一項に記載の方法であり、デノボ合成から得られる前記脂肪酸の量が、赤外分光法によって測定される、方法。
【請求項７】
請求項１乃至６のいずれか一項に記載の方法であり、
（ａ）参照サンプルとして知られるいくつかのサンプル乳を用いて繰り返され；
（ｂ）それぞれの参照サンプルの測定されたＣＨ４の量が、それぞれの赤外線吸収スペクトルと関連付けられ；
（ｃ）試験される新たなサンプルの赤外線吸収スペクトルが記録され；
（ｄ）前記スペクトルが前記参照サンプルのスペクトルと比較され；
（ｅ）前記新たなサンプルに関連付けられるＣＨ４の量が、前記新たなサンプルのスペクトルと前記参照サンプルのスペクトルとを比較することで導き出される；
方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法であり、ステップ（ｄ）で、前記比較が数学的統計学的モデルを用いて行われ、かつステップ（ｅ）で、ステップ（ｄ）のモデルで得られた評価式が用いられる、方法。
【請求項９】
デノボ合成から得られる前記脂肪酸の量が、中赤外線の赤外分光法によって測定される、請求項６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酪農反芻動物により生成されるメタンの量を評価する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
腸内メタン（ＣＨ４）は反芻動物においておくびによって放出されるガスである。メタンは、これらの動物の反芻胃（第１胃）内で飼料の発酵の際に形成され、これは前記動物に対するエネルギーの損失を表す。しかしメタンはまた、強力な温室効果ガスでもある。
【０００３】
地球規模では、畜産は温室効果ガスの全放出量の１８％に相当し得る（ＦＡＯ、２００６）。反芻動物の腸内発酵により放出されるＣＨ４は、地球全体の温室効果ガス放出量全体の３から５％を占めることが示される。
【０００４】
大気中ではその寿命は、（二酸化炭素の１００年と比較して）ほんの１２年であるが、前記腸内メタンの放出を低減するための技術を実現することは非常に興味深いことである。
【０００５】
反芻動物からの腸内メタン放出を削減することは、従って、経済問題と環境問題という２重の課題に一致する。
【０００６】
種々の技術が今後、反芻動物、特に酪農反芻動物からの腸内メタン放出を削減するために提案される。
【０００７】
しかし、これらの技術で有効な測定をすることは、ルーチン測定を可能にする簡単な方法が開発されていないという点でなお問題として残されている。
【０００８】
腸内メタン放出は反芻動物の発酵の特徴であるけれども、生成される乳１キログラム当たりのメタンの量は乳牛の生産性、摂取飼料の性質、反芻胃の生態系などに関して大きく変動する。
【０００９】
この点にかかる科学的文献によるデータは、乳１キログラム当たりの非常に広い範囲にわたる変動を示している。事実、約７から２５グラムのメタンが、生成される乳１キログラム当たり放出され得る。
【００１０】
前記乳の「メタンフットプリント」は、泌乳の際に１匹の乳牛により毎日放出され且つ一日当たり生産される乳のキログラム数で割り算されるメタンの量として定められる。これは、乳１キログラム当たりのメタン（ＣＨ４）のグラム数で表現される。
【００１１】
従って、信頼性のある方法で、乳１キログラム当たりのメタン放出量を、その乳の成分に関連させて評価でき、メタンフットプリント、言い換えると乳１キログラムの生成に対して放出されるメタンの量を低減及び最小化する畜産技術を見出しかつ促進することができるということは興味深いことである。
【００１２】
科学的文献は、腸内メタンの放出を低減するために多くの可能な方法を記載している。
【００１３】
網羅されるものではないが、次の方法が留意され得る：
−  生産性（乳牛１頭１日当たり生産される乳のキログラム）の増加が、乳牛１頭１日当たりのメタンの放出量を増加させるが、しかし、乳１リットル当たりのメタンの量が減少する（前記用語「乳牛」はここでは、最も広く酪農反芻動物として飼育されていることから使用されている）；
−  反芻胃内で発酵されない食用油の摂取；
−  反芻胃のある微生物集団への毒物：抗生物質、エッセンシャルオイル、野菜抽出物、脂肪酸などの使用であり、メタンの経路を阻害してプロピオン酸塩経路による水素の使用を増加させる；
−  プロピオン酸塩前駆体（リンゴ酸塩、フマル酸塩など）の使用であり、これはまたメタン経路を阻害してプロピオン酸塩経路を優位にする；
−  前記方法の組み合わせ、などである。
【００１４】
これらの効果を説明する刊行物には測定方法として：
（ａ）インビトロ技術：これらは常にインビボを表すものではない、
（ｂ）短時間の実験期間でのインビボ技術：これらは前記効果が全期間で維持されることを保証するものではない、
の使用が開示される。
これらは常に実行が難しく実験的制限がある。
【００１５】
最も広く知られている方法は：
−  「カロリメトリックチャンバ」及び
−  「ＳＦ６方法」、即ち、おくびガスサンプル収集後に重量によるメタンの放出量を読み取り、インビボで動物の反芻胃内に導入されたパラメータ化拡散器から得られる既知量のＳＦ６ガスと比較する方法
である。
（ｃ）「レーザー検出装置」測定：最近の技術であり、シンシチュ（その場）でレーザー放射によりメタンの放出を測定できるが、入手可能な最初の刊行物（Ｃｈａｇｕｎｄａ等、２００９）からは高い信頼性が得られない。
（ｄ）摂取飼料の消化量又は性質から予測する：多くの式が異なる著者から提案されている。これらは正確なものではなく、定常的に測定可能ではないか又は一般には知られていない（例えば、乳牛の消化、飼料の発酵などの）多くの基準に依存している。
（ｅ）乳牛の生産性からの予測：乳牛がより多く乳を生産するほど、乳１キログラム当たりのメタンの放出量は低くなる。
【００１６】
生産性との関連付けは飼料摂取のタイプと関連付けされた違いを統合化せず、参考文献を注意深く読むと、メタンの放出が異なる摂取飼料で測定される場合に、同じ生産性レベルでも非常に大きな相違が見られる、ということが示される。
【００１７】
本発明者の仏国特許第０８５４２３０号明細書では、信頼性の高い簡単な方法が記載され、これは、乳牛の生産性と、反芻胃の脂肪酸、乳の脂肪酸及びメタンの間の化学量論的関係による前記反芻胃の発酵の方向とを一度及び同時に統合している。
【００１８】
最近の刊行物（Ｍａｒｔｉｎ  ２００８、Ｃｈｉｌｌｉａｒｄ  ２００９）ではこの関連付けが確認されている。
【００１９】
それにもかかわらず、この方法を実施するためには：
−  この乳牛の生産性を知ること、及び
−  前記乳の脂肪酸プロフィルを実施することが必要であり、これは：
−  前記乳の脂質の抽出、及び
−  ガス相クロマトグラフを要求する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２０】
【特許文献１】仏国特許第０８５４２３０号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
本発明は、これらの困難性を解消することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
従って、本発明は、酪農反芻動物により生成されるメタンの量を評価するための方法を提案し、前記方法は、前記反芻動物からの乳のサンプル中の、デノボ合成から得られる、少なくとも１つの脂肪酸（ＡＧ）の重量を測定すること、及び、次式：ＣＨ４＝ａ*（デノボ  ＡＧ）＋ｙ*（ＢＨ  ＡＧ）＋ｚによりメタンの量を評価すること、を少なくとも含むことを特徴とし、ここで、
−  「ＣＨ４」は前記反芻動物による乳１キログラム当たり又は１リットル当たり生成されるメタンのグラム数で表した量であり、
−  「デノボ  ＡＧ」とは、乳１キログラム当たり又は１リットル当たりグラム数で表される、少なくとも前記脂肪酸の前記サンプル中の測定された量であり、それ自体で又は少なくとも他のデノボ脂肪酸の測定された量と組み合わせて取得され；
−  「ＢＨ  ＡＧ」とは、乳１キログラム当たり又は１リットル当たりグラム数で表される、反芻胃内での生体水素化から得られた少なくとも１つの脂肪酸の前記サンプル中の測定された量であり、それ自体で又は少なくとも反芻胃内での生体水素化から得られた他の脂肪酸の測定された量と組み合わせて取得され；
−  ａは、ｙがゼロである場合−２から２、又はｙがゼロとは異なる場合には０．１から１０の間の数であり；
−  ｙは、ａがゼロではない場合には−１０から＋１０、又はａがゼロの場合には−５０から−０．１の間の数であり；
−  ａ及びｙは同時にゼロではなく；
−  ｚは−１００から＋１００の間の数を含む。
【００２３】
この方法により、前記反芻動物の生産性に縛られることなく、シンプルな乳のサンプルを分析することでＣＨ４の量を決定することが可能となる。
【００２４】
さらに他の有利なかつ非限定的な特徴により：
−  「デノボ  ＡＧ」が次の定義：
（ａ）４から１４の炭素原子を持つ飽和脂肪酸（ＡＧＳ）の量；
（ｂ）４から１６の炭素原子を持つ飽和脂肪酸の量；
（ｃ）Ｃ１２及びＣ１４の飽和脂肪酸の量；
（ｄ）Ｃ４、Ｃ６、Ｃ８、Ｃ１０、Ｃ１２、Ｃ１４及びＣ１６の飽和脂肪酸の量であり、単独又はこれらのうち少なくとも２つの組み合わせで取得される、量；
から選択される。
−  前記メタン量は次の式：
ＣＨ４＝（１．０７±０．５）*Ｃ４からＣ１４の飽和脂肪酸の和＋（４．８±３）によって与えられる。
−  「ＢＨ  ＡＧ」は次の定義：
（ａ）不飽和脂肪酸（ＡＧＩ）の全量；
（ｂ）少なくとも１８の炭素原子を含む不飽和脂肪酸（ＡＧＩ）の全量；
（ｃ）少なくとも１８の炭素原子を含む不飽和脂肪酸（ＡＧＩ）の全量、但し、Ｃ１８：１ｎ−９、Ｃ１８：２ｎ−６及びＣ１８：３ｎ−３の不飽和脂肪酸を除く；
（ｄ）Ｃ１８の飽和脂肪酸（Ｃ１８：０）の量；
（ｅ）トランス脂肪酸又はその一部の量；
から選択される。
−  前記メタンの量は以下の式で与えられる：
ＣＨ４＝（１．１４±０．４）*Ｃ４からＣ１４の飽和脂肪酸の和−（０．０７±０．３）*［ＡＧＩ−（Ｃ１８：１ｎ−９＋Ｃ１８：２ｎ−６＋Ｃ１８：３ｎ−３）］＋（４．７±０．５）、ここで、［ＡＧＩ−（Ｃ１８：１ｎ−９＋Ｃ１８：２ｎ−６＋Ｃ１８：３ｎ−３）］は、Ｃ１８：１ｎ−９、Ｃ１８：２ｎ−６及びＣ１８：３ｎ−３の酸を除く不飽和脂肪酸の全量を表している。
−  デノボ合成から得られる前記脂肪酸の量は、赤外分光法で、優先的には中赤外線において測定する。
（ａ）前記方法は参照乳として知られるいくつかのサンプル乳を用いて繰り返される；
（ｂ）それぞれの参照サンプルの測定されたＣＨ４の量が、それぞれの赤外線吸収スペクトルと関連付けられる；
（ｃ）試験される新たなサンプルの赤外線吸収スペクトルが記録される；
（ｄ）前記スペクトルが前記参照サンプルのスペクトルと比較される；
（ｅ）前記新たなサンプルに関連付けられるＣＨ４の量を、そのスペクトルを参照サンプルのスペクトルと比較することで導き出す。
−  優先的には、ステップ（ｄ）で、前記比較を数学的統計学的モデルを用いて行い、かつステップ（ｅ）で、ステップ（ｄ）のモデルで得られた評価式を用いて行う。
【００２５】
本発明の他の特徴及び利点は以下の詳細な記載を参照することで明らかとなる。
【００２６】
本願を通じて次の表現は以下のように定義される。
−  「デノボ脂質生成」：乳腺上皮細胞による脂肪酸合成；
−  「デノボ脂肪酸」：乳腺上皮細胞によって合成される、１６以下の炭素原子を含む脂肪酸；
−  「ＢＨ脂肪酸」又は「反芻胃内での生体水素化から得られる脂肪酸」：反芻胃内での発酵の過程で少なくとも１つの水素化を経た１８の炭素原子を持つ脂肪酸。
これらはゼロ、１又はそれ以上の不飽和性を持つ。
【００２７】
最後に、「組み合わせる」という用語は、加える、差し引く、掛け合わす又は割ることを意味する。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
［１］：  メタン及びＡＧＶ（揮発性脂肪酸）関係−反芻胃とメタン生成
反芻胃中でのＡＧＶの生成とメタンの生成との関連付けは知られており、多年研究されている。
【００２９】
従って、反芻胃中での酢酸塩及び酪酸塩の生成は水素を放出し、従ってメタン生成に有利であり、一方でプロピオン酸塩の生成は水素の使用を可能にし、従ってメタン生成を抑制するということが示されてきた。このことは次の式：
１グルコース（Ｃ６）は、２ピルビン酸塩（Ｃ３）［＋４Ｈ］を与え、
１ピルビン酸塩（Ｃ３）＋Ｈ２Ｏ＝１酢酸塩＋ＣＯ２［＋２Ｈ］であり、及び
１ピルビン酸塩＝１プロピオン酸塩（Ｃ３）［−４Ｈ］
で表される。
【００３０】
従って、予想式がＭｏｓｓら（２０００）の刊行物に従って開発され、ＣＨ４の生成がＡＧＶの生成から予想される。従って、反芻胃での発酵がＣ２（酢酸塩）及びＣ４（酪酸塩）をより生成すると、ＣＨ４の生成がより多くなる。
【００３１】
逆に、反芻胃での発酵がＣ３（プロピオン酸塩）をより生成すると、ＣＨ４の生成はより少なくなる。
【００３２】
これに続く合成式は次のようである。（Ｍｏｓｓの式）：
［ＣＨ４］＝０．４５［酢酸塩］＋０．４０［酪酸塩］−０．２７５［プロピオン酸塩］、ここで、［ｘ］＝ｘの量を全ＡＧＶに対する％で表す。
【００３３】
前記デノボ脂質生成とメタン生成との関連付けはここで現れる、というのはＣ２とＣ４は乳頭で合成されるデノボ脂肪酸（デノボ  ＡＧ）の前駆体だからである。
【００３４】
反芻胃の発酵によりＣ２及びＣ４がより多く生成されるほど、前記乳の脂肪酸のデノボ合成に利用可能な基質がより多く存在することとなる。
【００３５】
［２］：  乳頭及び脂質生成
反芻胃内での発酵から得られるＣ２及びＣ４のＡＧＶはその後、乳腺上皮細胞によって取り込まれデノボＡＧ合成の基質として供される。
【００３６】
ＡＧＶ基質の利用可能性が、これらの合成を制限する要因である場合には（これは極めて普通である）、腸内ＣＨ４の放出と、前記乳中のデノボ合成から得られたＡＧの排泄には、厳正な比例関係があり、以下の表に示される。
0005916741.tif 000002
乳腺内皮細胞におけるデノボＡＧの合成は、上記の開発されたＭｏｓｓ式が示唆するように、「メタンフットプリント」で反芻胃内での発酵から得られたＣ２とＣ４の基質からほとんど生じる。
【００３７】
その後、次の偶数飽和脂肪酸の合成で終了する：Ｃ４：０、Ｃ６：０、Ｃ８：０、Ｃ１０：０、Ｃ１２：０、Ｃ１４：０、１６：０。
【００３８】
しかし留意すべきことは、第２相において、前記デノボ合成から得られた前記飽和ＡＧ（ＡＧＳ）が不飽和化される、ということである。
【００３９】
従って、一方では前記二重関係（Ｃ２＋Ｃ４）とＣＨ４（メタン）を用い、及び乳頭における飽和デノボＡＧの合成の前駆体として（Ｃ２＋Ｃ４）を用いて、前記合成されたデノボＡＧの量から放出されるメタンの量を予想することは魅力的であるように見える。
【００４０】
乳の脂質はまた、偶数ＡＧＶ基質を用いるデノボ合成から得られる奇数飽和ＡＧを（メタンの影響を有して）含むが、またＣ３から得られるものも含み、そのメタン生成に対する影響はない。従って、奇数ＡＧについて、乳中のこれらの重量とこれらの「メタンフットプリント」との関連性はより低くなる。
【００４１】
しかし、ある偶数飽和ＡＧは外因性起源を持ち得るものであり、特にＣ１６：０はこれ自体、乳の全ＡＧのほとんど１／３であり、種々の起源から派生し、例えば脂肪組織又は外因性植物油（例えばパーム油）などの保存領域の動員から派生する。
【００４２】
従って、乳１キログラム当たりのメタンフィンガープリントと、ＡＧの重量との信頼性のある関係を確立するためには、第１に必要なことは、乳１キログラム当たりのデノボの重量の信頼性のある測定を利用可能にする、ということである。
【００４３】
［３］：  乳中に存在するデノボＡＧの量の評価
合成メカニズムは次に、乳頭における偶数飽和ＡＧのエステル化であり、これは多くの共同経路を含む。
【００４４】
また、乳中の偶数飽和ＡＧ間の強い関係を見出すことが論理的である。次の表（Ｍｏａｔｅら、２００７）は、この主題に対する刊行されたメタ分析後の乳中の偶数Ｃ４からＣ１６の飽和ＡＧ間の統計的関係を与える。
0005916741.tif 000003
これらのＡＧの全てがお互いに相当な割合で合成経路によって関連付けられており、乳中でのこれらのレベルはお互いに関連している、ということが明らかである。
【００４５】
脂肪酸Ｃ１６：０は、より短い鎖長の他の偶数ＡＧよりも、短鎖長及び中間的鎖長を持つＡＧＳとより弱い関係があるように見えるが、これは部分的に外因性起源によると考えられる。
【００４６】
脂肪酸Ｃ４：０はまた、他の「デノボ」ＡＧとの関連性が弱いように見えるが、これは他のＡＧとは異なる合成経路及び（乳のトリグリセリドに対する）エステル化経路によるものと考えられ、分析困難性によるものとも考えられる。
【００４７】
従って、Ｃ２及びＣ４基質として、前記ＡＧのそれぞれの和又は組み合わせを用いてノボ合成のマーカーとして使用することと同等であるように思われる。
【００４８】
優先的な方法では、（外因性起源であり得る）Ｃ１６：０を除いて、全ての短鎖長又は中間的鎖長のＡＧ（Ｃ４：０からＣ１４：０）の重量による和が最も信頼性のある関係であるように思われる。
【００４９】
しかしながら、それのみで、又は、いかなる前記ＡＧの少なくとも２つの和又は組み合わせで取得されたいかなる偶数Ｃ４からＣ１６のＡＧも、多かれ少なかれ、デノボ合成について、従って反芻胃内でのメタン生成について、Ｃ２及びＣ４基質の使用の信頼性のある評価を与える。
【００５０】
従って、乳１キログラム当たり、又は乳１リットル当たりグラム数で表される、放出されたＣＨ４の量を決定するために、次の式、
ＣＨ４（ｇ／ｋｇ）＝ａ*デノボＡＧ＋ｚ
が使用され、ここでデノボＡＧは重量（ｇ／ｋｇ乳）であり、式中、ａは−２から＋２の間の数、及びｚは−１００から＋１００の間の数である。
【００５１】
前記デノボＡＧは、優先的に、乳中の４から１４の炭素原子の飽和ＡＧ（ＡＧＳ）含有量により評価され得る。
【００５２】
この式は、乳腺の不飽和化の過程後、４から１６の炭素原子のモノ不飽和ＡＧの合成のために使用されるＣ２及びＣ４基質の量を過小評価するが、しかし奇数飽和ＡＧにおけるＣ２及びＣ４の共有をやや過大評価する。
【００５３】
特に好ましい方法では、この量は式：
ＣＨ４（ｇ／ｋｇ）＝１．０７*Ｃ４からＣ１４のＡＧＳの和＋４．８
で評価される。
【００５４】
ここでＣ４からＣ１６のＡＧＳの和が乳１キログラム当たりのグラム数で表現されている。
【００５５】
しかし、Ｃ４からＣ１４のＡＧＳの和の代わりに、次の変数を含む他の式を用いることも可能である：
−  全てのＡＧＳの和：これはしかし精度が低いパラメータであり、というのは前記ＡＧＳはまた外因性ＡＧ及び反芻胃内での生体水素化から得られるＣ１８：０を含むからである。
−  ４から１６の炭素原子の飽和ＡＧの和：常には既知でないＣ１６：０の一部が、しかし、外因性起源である。
−  Ｃ１２：０及びＣ１４：０の和。
−  Ｃ４：０、Ｃ６：０、Ｃ８：０、Ｃ１０：０、Ｃ１２：０、Ｃ１４：０、Ｃ１６：０の単独又は少なくとも２つの組み合わせ。
【００５６】
［４］  精度の増加
本発明による方法は、前記のようにメタン生成と脂質生成との間の関連付けを十分考慮するものである。
【００５７】
しかし、メタンの放出の変化はここでは、メタン合成の経路とプロピオン酸塩合成の経路との間の水素の分配／競合へ関連付けされている。
【００５８】
また、メタン生成及びプロピオン酸塩生成以外の経路も水素利用について存在する。ほとんどは重要でないが、反芻胃での嫌気性発酵で生成される水素代謝物はまた、飼料摂取された多不飽和ＡＧの水素化反応でも使用され得る。
【００５９】
従って、前記式はまた次のように表現される：
ＣＨ４（ｇ／ｋｇ）＝ａ*デノボＡＧ＋ｙＢＨ  ＡＧ*＋ｚ
*ＢＨ  ＡＧは、反芻胃内での生体水素化から得られたＡＧであり：ここで式中、
−  ａは、ｙがゼロの場合に−２から２の間の数、又はｙがゼロではない場合には０．１から１０の間の数であり；
−  ｙは、ａがゼロと異なる場合に−１０から＋１０の間の数、又は、ａがゼロの場合には−５０から−０．１の間の数であり；
−  ａとｙとは同時にゼロとなることはなく；
−  ｚは−１００から＋１００の間の数である。
【００６０】
生体水素化から得られるＡＧは、１８以上で、外因性起源のものより少ない炭素原子を持つ全ＡＧの和を表す。
【００６１】
これは：
−  ステアリン酸（Ｃ１８：０）を含むが、これはまた外因性起源であり得る；
−  Ｃ１８：０の乳頭における不飽和化から得られる場合にオレイン酸（Ｃ１８：１ｎ−９）を含むが、しかしこれはまた外因性起源である得る；
−  外因性起源のリノール酸（Ｃ１８：２ｎ−６）及びアルファリノール酸（Ｃ１８：３ｎ−３）を除く２以上の不飽和を持つ全てのＡＧを含む。
−  Ｃ２０：４ｎ−６、Ｃ２０：５ｎ−３、Ｃ２２：６ｎ−３又はより長い鎖長のＡＧを除外することも得策である。
【００６２】
水素を用いた競合によるメタン放出の減少への（前記デノボＡＧから懸念される反芻胃内での発酵へのオイルの一般的効果とは異なる）これらの特定の寄与は完全には無視できない。
【００６３】
実施例
−  ３６０ｇの食餌性Ｃ１８：１ｎ−９（飼料摂取の２％）は、反芻胃内で８５％水素化され、乳１キログラムあたり０．４ｇのＣＨ４の合成（ＣＨ４放出の約２％）に必要な水素を「消費」する。
−  ３６０ｇの食餌性Ｃ１８：２ｎ−６は、反芻胃内で８５％水素化され、乳１キログラムあたり０．７ｇのＣＨ４の合成（約４％）に必要な水素を「消費」する。
−  ３６０ｇの食餌性Ｃ１８：３ｎ−３は、反芻胃内で８５％水素化され、乳１キログラムあたり１．１ｇのＣＨ４の合成（約６％）に必要な水素を「消費」する。
【００６４】
生体水素化から得られるＡＧの性質は複雑である。
【００６５】
１８以上の炭素元素を有するＡＧのうち、Ｃ１８：１ｎ−９などは、内因性（Ｃ１８：０で水素化、その後Ｃ１８：１ｎ−９で不飽和化）又は（例えばなたね油等の）外因性の起源を持つ。
【００６６】
［ＡＧＩ−（Ｃ１８：１ｎ−９）−（Ｃ１８：２ｎ−６）−（Ｃ１８：３ｎ−３）］の値は、具体的に水素化から得られるＡＧの量のよい指標である。
【００６７】
従って、前記式は有利には次のように表される。
ＣＨ４（ｇ／ｋｇ）＝１．１４*（Ｃ４からＣ１４のＡＧＳの和）−０．０７*［ＡＧＩ−（Ｃ１８：１ｎ−９＋Ｃ１８：２ｎ−６＋Ｃ１８：３ｎ−３）］＋４．７
また、ＡＧＩ−（Ｃ１８：１ｎ−９＋Ｃ１８：２ｎ−６＋Ｃ１８：３ｎ−３）の代わりに、変数として次の生体水素化の指標：
−  ＡＧＩの和；
−  Ｃ１８：０；
−  トランスＡＧ又はその中のいくつかの和；
が含まれる他の式を使用することも可能である。
【００６８】
前記のとおり、従来技術では、直接、迅速にかつ容易に判断を実施することができない。現在最も正確な予想には、少なくとも乳中の脂質含有量及び牛の生産性を知ることが必要であり、この２つの因子は常には知り得ない。
【００６９】
本発明の方法は、（もはや３つの最小の基準でもない）１つの基準、すなわち、１キログラム当たりグラムで表された乳中の１つ又は複数の脂肪酸の含有量から、乳１キログラム当たりのメタンの放出量を評価することを可能にする。
【００７０】
［５］  本方法の実施
ここ数年、赤外分光法による、１キログラム（又は１リットル）当たりの乳中のグラムでのＡＧの迅速測定技術が開発されてきている。
【００７１】
乳サンプルのデータベースから、これはそれぞれの乳サンプルについて、赤外線分析によって得られた光吸収スペクトルと、参考分析（ガス相クロマトグラフィーなど）によって得られた（１リットル当たりグラムで表される）ＡＧ中の成分との関連付けに本質がある。式（又は較正）を利用する数学的及び統計学的方法により、前記測定の信頼性のレベルが満足できるものとなる瞬間から、事前に決定された評価式を用いて、赤外線分析による全ての乳サンプルのＡＧを式により評価することが可能となる。
【００７２】
乳のＡＧとメタンの放出との化学量論的関連付けが知られているため、乳の「メタンフットプリント」を評価するために１キログラム（又は１リットル）当たりグラム数での乳中のＡＧの直接の読み出しを使用することは魅力的である。
【００７３】
牛の生産性又は乳の全脂質量を知ることはもはや必要ではない。
【００７４】
赤外分光法、より正確には中赤外線を用いることで、乳１キログラム（又は１リットル）当たりのグラム数で直接、液体乳サンプルのＡＧ含有量を測定することが可能となる。
【００７５】
この方法の精度は、最近の刊行物に示されるようにますます信頼性が高くなってきている（Ｓｏｙｅｕｒｔら、２０１０）。
【００７６】
この技術的進歩は本発明をいとも簡単に実施することを可能にする。
【００７７】
従って、脂質の抽出及びガス相クロマトグラフィーの実行はもはや必要なく、乳の全脂質含有量も牛の生産性も知る必要はない。
【００７８】
本発明によれば、乳のそれぞれ１キログラムのメタンフットプリントの測定は、いつでも通常測定（ルーチン）で実施することが可能となる。
【００７９】
乳の赤外線スペクトル分析により、単独で又は組合せて取得してＡＧを、次いでこれらのＡＧからＣＨ４を連続的に測定する代わりに、赤外線スペクトル分析からＣＨ４を直接推定することも想定され得る。
【００８０】
事実、デノボＡＧの量は、少なくとも、現在では中赤外線で非常によく決定されており、具体的に、識別される吸収スペクトルバンド、及びその光吸収に対応する波長に関連付けされている。従って、乳のＡＧの測定を行うことなく、同じスペクトルバンドを用いることで、スペクトル分析から乳サンプルのＣＨ４を直接決定することが可能である。