(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
構造Ｘ−Ｆｃ−Ｙ−ＮＰ−Ｚまたは構造Ｘ−ＮＰ−Ｙ−Ｆｃ−Ｚを含む単離されたポリペプチドを含む医薬組成物であって：
（ａ）前記ＸおよびＺがそれぞれ独立して不在であるか、少なくとも１個のアミノ酸のアミノ酸配列であり；
（ｂ）Ｙのアミノ酸配列が、
［（Ｇｌｙ）４（Ｓｅｒ）］ｎ（Ｇｌｙ）ｐまたは（Ｇｌｙ）ｐ［（Ｓｅｒ）（Ｇｌｙ）４］ｎ〔式中、ｎは１〜１０であり、かつｐは０であるかまたは０〜４である〕
を含み；
（ｃ）前記ＮＰが、配列番号１２６のアミノ酸６〜２２を含み、ここで配列番号１２６の位置１７に対応する前記ＮＰのアミノ酸がＬｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、またはＴｙｒであり；かつ
（ｄ）前記Ｆｃが免疫グロブリンの結晶性フラグメント領域を含む、
前記医薬組成物。
【請求項２】
前記ポリペプチドが、配列番号５７２、５５９〜５７１および５７３〜６０６のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記ポリペプチドが、配列番号５７２のアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
配列番号１２６の位置１７に対応する前記ＮＰのアミノ酸がＬｅｕまたはＰｈｅである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
配列番号１２６の位置１７に対応する前記ＮＰのアミノ酸がＬｅｕである、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記ＮＰが、配列番号１１９、１２０、１２２、１５７または１５８のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記Ｆｃが、配列番号４０１に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１および４〜６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記Ｆｃが、配列番号４０１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記Ｆｃが、配列番号４０１に対して少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記Ｆｃが、配列番号４０１で示されるアミノ酸配列を含む、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記Ｆｃが、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、およびヒンジ領域を含む、請求項１および４〜６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記Ｆｃが、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３およびＩｇＧ−４からなる群から選択される免疫グロブリンの全長定常ドメインである、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記ＮＰが、ＮＰＲ−Ａに対してよりもＮＰＲ−Ｂに対して選択性が高く、前記ＮＰに対するＥＣ５０（ＮＰＲ−Ａ）／ＥＣ５０（ＮＰＲ−Ｂ）比が、ｉｎ  ｖｉｖｏ薬動学的アッセイで決定したとき、少なくとも３０である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
Ｙが配列番号３１４で示されるアミノ酸配列を含む、請求項１および４〜１３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
Ｘ、Ｙ、またはＺが、骨ターゲッティング部分を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記骨ターゲッティング部分が、６個または１０個の連続した酸性残基を含む、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記連続した酸性残基がアスパラギン酸またはグルタミン酸残基である、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記骨ターゲッティング部分が、Ｄ１０、Ｄ６、Ｅ１０またはＥ６を含む、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
Ｘ、Ｙ、またはＺが、カテプシン切断配列を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記カテプシン切断配列がカテプシンＫ切断配列を含む、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
前記カテプシンＫ切断配列が、ＨＧＰＱＧ（配列番号３７４）またはＨＫＬＲＧ（配列番号３７５）である、請求項２０に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
前記ポリペプチドが、グリコシル化またはペグ化（pegylated）されている、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
被験体における、ＦＧＦＲ３の過剰活性化に関連付けられる障害、骨障害もしくは軟骨障害、または血管平滑筋障害の治療において使用するための、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
前記被験体がヒトである、請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
被験体において、ＦＧＦＲ３の過剰活性化に関連付けられる障害、骨障害もしくは軟骨障害、または血管平滑筋障害を治療するための医薬の製造のための、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の医薬組成物の使用。
【請求項２６】
前記被験体がヒトである、請求項２５に記載の使用。
【請求項２７】
Ｙのアミノ酸配列が［（Ｇｌｙ）４（Ｓｅｒ）］２を含む、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
Ｙのアミノ酸配列が［（Ｇｌｙ）４（Ｓｅｒ）］２を含む、請求項２５又は２６に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、軟骨無形成症などのＦＧＦＲ３の過剰活性化に関連付けられる障害、骨障害もしくは軟骨障害、または血管平滑筋障害を治療するための、あるいは骨を伸長させるための、方法、組成物、およびキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ナトリウム利尿ペプチドは、体内の塩および水の恒常性を変調し、こうして血圧のレギュレーターとして作用する。このファミリーに属するペプチドは、さまざまなアミノ酸配列を有し、体内の種々の組織により異なる機序で分泌される。これらのペプチドは、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、およびＣ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）を含む。これらのペプチドは、生理学的機能を変調すべく細胞内でシグナル伝達する３つのタイプのレセプターに結合する。ＡＮＰおよびＢＮＰは、ナトリウム利尿ペプチドレセプターＡ（ＮＰＲ−Ａ）（グアニリルシクラーゼＡ（ＧＣ−Ａ）としても知られる）に優先的に結合し、ＣＮＰは、ナトリウム利尿ペプチドレセプターＢ（ＮＰＲ−Ｂ）（グアニリルシクラーゼＢ（ＧＣ−Ｂ）としても知られる）に優先的に結合する。３つのペプチドはすべて、シグナリング機能およびペプチドクリアランス機能の両方を有するナトリウム利尿ペプチドレセプターＣ（ＮＰＲ−Ｃ）に対して類似の親和性を有する。ナトリウム利尿ペプチドのクリアランスはまた、膜結合中性エンドペプチダーゼ（ＮＥＰ）の作用によっても起こる。
【０００３】
ＮＰＲ−ＡまたはＮＰＲ−Ｂに結合するペプチドは、これらのレセプターの細胞内グアニリルシクラーゼドメインを活性化して、セカンドメッセンジャーｃＧＭＰを生成する。ｃＧＭＰは、細胞内の複数のシグナリング経路を活性化または阻害する。
【０００４】
長骨、肋骨、および椎骨の骨形成および長手方向骨成長は、骨の両端に位置する軟骨成長板の軟骨内骨化により起こる。骨成長の重要なレギュレーターの１つは、ＣＮＰであるが、これは、非常に低レベルで血液中を循環することから、骨に対してごくわずかの全身活性を有することが示唆される。骨芽細胞様細胞および軟骨細胞の初代培養を用いた研究では、そうではなく、ＣＮＰは、骨芽細胞および軟骨細胞の増殖および分化を調節すべくパラクリン／オートクリン因子として作用することが明らかにされた。ＣＮＰは、ＮＰＲ−Ｂグアニリルシクラーゼの活性化により軟骨細胞で細胞内メッセンジャーｃＧＭＰの生成を刺激し、骨の成長および発達に重要である。
【０００５】
ヒトでは、ＣＮＰは、最初に、一本鎖１２６アミノ酸プレプロポリペプチドとしてナトリウム利尿ペプチド前駆体Ｃ（ＮＰＰＣ）遺伝子から産生される。シグナルペプチドが除去されるとプロＣＮＰが得られ、エンドプロテアーゼフリンによりさらに切断されると活性５３アミノ酸ペプチド（ＣＮＰ５３）が生成され、これが分泌されて未知の酵素により再度切断されると成熟２２アミノ酸ペプチド（ＣＮＰ２２）が産生される。ＣＮＰ５３およびＣＮＰ２２は両方とも、ＮＰＲ−Ｂに同様に結合し、両方とも、用量依存的に同様にｃＧＭＰ生成を誘導する。
【０００６】
ＣＮＰ、そのコグネイトレセプター、または下流の細胞内エフェクター（ＰＫＧ）の遺伝子欠失を生じると、軟骨細胞の増殖および分化の低減に起因する重症骨格異形成症が起こる。ＣＮＰ欠失マウスでは、矮小発育症および早期死亡が起こる。出生時、このマウスは、骨長が約１０％低減しているが、出生後、成長遅滞がより重篤になり、マウスの７０％は、生後の最初の１００日間で死亡する。ＣＮＰの軟骨特異的過剰発現によりＣＮＰ欠損マウスの軟骨形成不全矮小発育症から部分的に救済されることから、ＣＮＰは、軟骨細胞への直接作用により骨成長を刺激することが示唆される。また、ＣＮＰに結合するナトリウム利尿ペプチド（ＮＰＲ）−Ｂレセプターの機能不活性化またはｃＧＭＰ作用を媒介するｃＧＭＰプロテインキナーゼＩＩをコードする遺伝子の機能不活性化によっても、矮小発育症が起こる。
【０００７】
骨格異形成症は、骨格成長が損なわれることにより特徴付けられる一群の遺伝障害である。多種多様な形態の骨格異形成症、たとえば、短肢矮小発育症は、有意な罹患率および死亡率を伴う。軟骨無形成症は、ヒトでは最も一般的な形態の短肢矮小発育症であり、全世界で２５０，０００人超が罹患している。軟骨無形成症は、ＦＧＦＲ３機能の増大を引き起こす繊維芽細胞増殖因子レセプター３（ＦＧＦＲ３）をコードする遺伝子の突然変異により引き起こされる。この突然変異は、多くの組織に影響を及ぼすが、最も顕著には、成長骨格の軟骨成長板に影響を及ぼして、さまざまな病変および合併症をもたらす。臨床表現型の重症度は、軟骨細胞のＦＧＦＲ３シグナリング経路を過剰活性化する突然変異能に関連付けられる。
【０００８】
ＮＰＲ−Ｂ活性化から生じるｃＧＭＰの細胞内産生は、ＦＧＦＲ３突然変異により過剰活性化されるＭＡＰキナーゼ経路を阻害することが知られている。したがって、骨格異形成症を治療すべくＮＰＲ−Ｂシグナリング経路を活性化可能なＣＮＰまたはＣＮＰ類似体の使用が検討されてきた。しかしながら、ＣＮＰの治療的使用の主な欠点は、その半減期がきわめて短いことである。さらに、文献、たとえば、Ｆａｒｎｕｍ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｎａｔ．Ｒｅｃ．Ａ  Ｄｉｓｃｏｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｅｖｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８８（１）：９１−１０３，２００６）の実験では、成長板への分子の進入能が分子量と共に有意に減少し、４０ｋＤａ以上の分子では、成長板への進入が不十分でありまたはまったく検出できないことが示されている。したがって、軟骨無形成症などの骨格異形成症に対するＣＮＰ系療法剤は、治療効果をもたせるべく十分な速度で成長板に進入できるように比較的小さい分子量を有する必要があると考えられてきた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、軟骨無形成症などのさまざまな障害を治療すべく相当な半減期ならびに他の有利な薬動学的および治療的な性質を有する治療用分子を開発する必要性が、当技術分野に存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明の概要
驚くべきことに、本発明に係るナトリウム利尿ペプチド含有ポリペプチド、たとえば、Ｆｃドメインを含むものが、軟骨無形成症などの障害の治療に治療上有効であることを見いだした。
【００１１】
したがって、第１の態様では、本発明は、被験体たとえばヒトにおいて、ＦＧＦＲ３の過剰活性化に関連付けられる障害、骨障害もしくは軟骨障害、または血管平滑筋障害を治療する方法であって、（ａ）構造Ｘ−Ｆｃ−Ｙ−ＮＰ−Ｚまたは構造Ｘ−ＮＰ−Ｙ−Ｆｃ−Ｚを含むポリペプチドと、（ｂ）薬学的に許容可能な賦形剤と、を含む治療上有効量の医薬組成物を被験体に投与することを含む方法を特徴とする。ここで、構造中、ＮＰは、ナトリウム利尿ペプチドレセプターＢ（ＮＰＲ−Ｂ）のアゴニストであるナトリウム利尿ペプチドであり、かつＸ、Ｙ、およびＺのそれぞれは、独立して、不在でありまたは少なくとも１個のアミノ酸のアミノ酸配列である。いくつかの実施形態では、それにより、被験体において、ＦＧＦＲ３の過剰活性化に関連付けられる障害、骨障害もしくは軟骨障害、または血管平滑筋障害が治療される。
【００１２】
第２の態様では、本発明は、被験体たとえばヒトにおいて骨を伸長させる方法であって、（ａ）構造Ｘ−Ｆｃ−Ｙ−ＮＰ−Ｚまたは構造Ｘ−ＮＰ−Ｙ−Ｆｃ−Ｚを含むポリペプチドと、（ｂ）薬学的に許容可能な賦形剤と、を含む治療上有効量の医薬組成物を被験体に投与することを含む方法を特徴とする。ここで、構造中、ＮＰは、ナトリウム利尿ペプチドレセプターＢ（ＮＰＲ−Ｂ）のアゴニストであるナトリウム利尿ペプチドであり、かつＸ、Ｙ、およびＺのそれぞれは、独立して、不在でありまたは少なくとも１個のアミノ酸のアミノ酸配列である。
【００１３】
以上の態様のいくつかの実施形態では、ポリペプチドは、構造Ｘ−Ｆｃ−Ｙ−ＮＰ−Ｚを含む。いくつかの実施形態では、ＮＰは、構造：［Ｎ末端伸長部］−［ショートセグメント］−［リングドメイン］−［Ｃ末端伸長部］を含む。ここで、構造中、リングドメインは、配列番号６、配列番号３０のアミノ酸１１〜２７、または配列番号９５で示されるアミノ酸配列を含み、かつＮ末端伸長部、ショートセグメント、およびＣ末端伸長部のそれぞれは、独立して、不在でありまたは少なくとも１個のアミノ酸のアミノ酸配列である。いくつかの実施形態では、リングドメインは、配列番号１２６のアミノ酸６〜２２を含む。いくつかの実施形態では、配列番号１２６の位置１７のアミノ酸は、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ａｌａ、またはＳｅｒである。いくつかの実施形態では、配列番号１２６の位置１７のアミノ酸は、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ｐｒｏ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、またはＬｙｓ、たとえば、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ｐｒｏ、またはＡｓｐ、たとえば、ＰｈｅまたはＬｅｕ、たとえば、Ｐｈｅ、たとえば、Ｌｅｕである。いくつかの実施形態では、リングドメインは、配列番号１２で示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ショートセグメントおよびリングドメインは、一緒になって、配列番号４または１３〜３０のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ショートセグメントのアミノ酸配列は、配列番号４のアミノ酸１〜５からなる。いくつかの実施形態では、ショートセグメントのアミノ酸配列は、配列番号４のアミノ酸１〜５、２〜５、３〜５、４〜５、もしくは５、配列番号１７のアミノ酸１〜１０、配列番号１９のアミノ酸１〜５、配列番号２０のアミノ酸１〜３、配列番号２１のアミノ酸１〜５、または配列番号２９のアミノ酸１〜６からなる。いくつかの実施形態では、ショートセグメントおよびリングドメインのアミノ酸配列は、一緒になって、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなる。いくつかの実施形態では、ショートセグメントおよびリングドメインのアミノ酸配列は、一緒になって、配列番号１１９〜１２２、１２６、または１５６〜１６１のいずれか１つで示されるアミノ酸配列からなる（たとえば、配列番号１２６中のＸは、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ｐｒｏ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、またはＬｙｓ、たとえば、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ｐｒｏ、またはＡｓｐ、たとえば、ＰｈｅまたはＬｅｕ、たとえば、Ｐｈｅ、たとえば、Ｌｅｕである）。いくつかの実施形態では、Ｎ末端伸長部のアミノ酸配列は、配列番号１１のアミノ酸１〜３１を含む。いくつかの実施形態では、Ｎ末端伸長部のアミノ酸配列は、配列番号１１のアミノ酸１７〜３１を含む。いくつかの実施形態では、Ｎ末端伸長部のアミノ酸配列は、ＫＧＡＮＫＫ（配列番号３１４）またはＫＧＡＮＱＫ（配列番号３１５）を含む。いくつかの実施形態では、Ｎ末端伸長部、ショートセグメント、およびリングドメインは、一緒になって、配列番号１１で示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｃ末端伸長部は、配列番号１１８、配列番号１１７で示されるアミノ酸配列、または配列番号１０１〜１１６のいずれか１つから選択されるアミノ酸２３〜３７を含む。いくつかの実施形態では、ＮＰのアミノ酸配列は、配列番号４からなる。いくつかの実施形態では、ＮＰのアミノ酸配列は、配列番号１１からなる。いくつかの実施形態では、ＮＰのアミノ酸配列は、配列番号３１〜９４のいずれか１つで示されるアミノ酸配列、または少なくともリングドメインを含むその断片からなる。
【００１４】
本明細書で説明した態様のいずれかでは、ＮＰのアミノ酸配列は、配列番号１２６のアミノ酸６〜２２を含み、かつ配列番号１２６の位置１７のアミノ酸は、Ｐｈｅである。
【００１５】
本明細書で説明した態様のいずれかでは、ＮＰのアミノ酸配列は、配列番号１２６のアミノ酸６〜２２を含み、かつ配列番号１２６の位置１７のアミノ酸は、Ｌｅｕである。
【００１６】
本明細書で説明した態様のいずれかでは、ＮＰのアミノ酸配列は、配列番号１２６のアミノ酸６〜２２を含み、かつ配列番号１２６の位置１７のアミノ酸は、Ｉｌｅである。
【００１７】
本明細書で説明した態様のいずれかでは、ＮＰのアミノ酸配列は、配列番号１２６のアミノ酸６〜２２を含み、かつ配列番号１２６の位置１７のアミノ酸は、Ｔｈｒである。
【００１８】
本明細書で説明した態様のいずれかでは、ＮＰのアミノ酸配列は、配列番号１２６のアミノ酸６〜２２を含み、かつ配列番号１２６の位置１７のアミノ酸は、Ｇｌｕである。
【００１９】
本明細書で説明した態様のいずれかでは、ＮＰのアミノ酸配列は、配列番号１２６のアミノ酸６〜２２を含み、かつ配列番号１２６の位置１７のアミノ酸は、Ａｒｇである。
【００２０】
本明細書で説明した態様のいずれかでは、ＮＰのアミノ酸配列は、配列番号１２６のアミノ酸６〜２２を含み、かつ配列番号１２６の位置１７のアミノ酸は、Ｔｙｒである。
【００２１】
本明細書で説明した態様のいずれかでは、ＮＰのアミノ酸配列は、配列番号１２６のアミノ酸６〜２２を含み、かつ配列番号１２６の位置１７のアミノ酸は、Ｃｙｓである。
【００２２】
本明細書で説明した態様のいずれかでは、ＮＰのアミノ酸配列は、配列番号１２６のアミノ酸６〜２２を含み、かつ配列番号１２６の位置１７のアミノ酸は、Ｐｒｏである。
【００２３】
本明細書で説明した態様のいずれかでは、ＮＰのアミノ酸配列は、配列番号１２６のアミノ酸６〜２２を含み、かつ配列番号１２６の位置１７のアミノ酸は、Ａｓｐである。
【００２４】
本明細書で説明した態様のいずれかでは、ＮＰのアミノ酸配列は、配列番号１２６のアミノ酸６〜２２を含み、かつ配列番号１２６の位置１７のアミノ酸は、Ｇｌｙである。
【００２５】
本明細書で説明した態様のいずれかでは、ＮＰのアミノ酸配列は、配列番号１２６のアミノ酸６〜２２を含み、かつ配列番号１２６の位置１７のアミノ酸は、Ａｌａである。
【００２６】
本明細書で説明した態様のいずれかでは、ＮＰのアミノ酸配列は、配列番号１２６のアミノ酸６〜２２を含み、かつ配列番号１２６の位置１７のアミノ酸は、Ｓｅｒである。
【００２７】
本明細書で説明した態様のいずれかでは、ＮＰのアミノ酸配列は、配列番号１２６のアミノ酸６〜２２を含み、かつ配列番号１２６の位置１７のアミノ酸は、Ｖａｌである。
【００２８】
本明細書で説明した態様のいずれかでは、ＮＰのアミノ酸配列は、配列番号１２６のアミノ酸６〜２２を含み、かつ配列番号１２６の位置１７のアミノ酸は、Ｔｒｐである。
【００２９】
本明細書で説明した態様のいずれかでは、ＮＰのアミノ酸配列は、配列番号１２６のアミノ酸６〜２２を含み、かつ配列番号１２６の位置１７のアミノ酸は、Ａｓｎである。
【００３０】
本明細書で説明した態様のいずれかでは、ＮＰのアミノ酸配列は、配列番号１２６のアミノ酸６〜２２を含み、かつ配列番号１２６の位置１７のアミノ酸は、Ｇｌｎである。
【００３１】
本明細書で説明した態様のいずれかでは、ＮＰのアミノ酸配列は、配列番号１２６のアミノ酸６〜２２を含み、かつ配列番号１２６の位置１７のアミノ酸は、Ｈｉｓである。
【００３２】
本明細書で説明した態様のいずれかでは、ＮＰのアミノ酸配列は、配列番号１２６のアミノ酸６〜２２を含み、かつ配列番号１２６の位置１７のアミノ酸は、Ｌｙｓである。
【００３３】
いくつかの実施形態では、ＮＰのアミノ酸配列は、配列番号１３〜２９、１００〜１１６、１１９〜１２５、１２７〜２３３、または１００１〜１１５５のいずれか１つで示されるアミノ酸配列からなる。
【００３４】
いくつかの実施形態では、ＮＰは、ＮＰＲ−Ａに対してよりもＮＰＲ−Ｂに対して選択性が高く、この場合、ｉｎ  ｖｉｖｏ薬動学的アッセイで決定されるＮＰのＥＣ５０（ＮＰＲ−Ａ）／ＥＣ５０（ＮＰＲ−Ｂ）比は、少なくとも３０である。
【００３５】
いくつかの実施形態では、Ｆｃは、ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとヒンジ領域とを含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃは、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３およびＩｇＧ−４からなる群から選択される免疫グロブリンの定常ドメインである。いくつかの実施形態では、Ｆｃは、配列番号４０１で示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、免疫グロブリンは、ＩｇＧ−１である。いくつかの実施形態では、Ｆｃのアミノ酸配列は、配列番号４０１に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、または配列番号４０１で示されるアミノ酸配列を含みもしくはそれからなる。
【００３６】
いくつかの実施形態では、Ｙは、高グリシン領域を含み、またはＹのアミノ酸配列は、１個以上のグリシンと１個以上のセリンとからなる。たとえば、Ｙのアミノ酸配列は、［（Ｇｌｙ）ｍ（Ｓｅｒ）］ｎ（Ｇｌｙ）ｐまたは（Ｇｌｙ）ｐ［（Ｓｅｒ）（Ｇｌｙ）ｍ］ｎ〔式中、ｍ、ｎ、およびｐのそれぞれは、独立して、０〜２０である〕を含みうる。いくつかの実施形態では、ｍは１〜６であり、ｎは１〜１０であり、かつｐは０〜４である。いくつかの実施形態では、ｍは４であり、かつｎは１〜６である。いくつかの実施形態では、ｍ、ｎ、およびｐの組合せは、表１の１行から選択され、またはＹのアミノ酸配列は、配列番号３０１〜３８９のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｙのアミノ酸配列は、［（Ｇｌｙ）ｍ（Ｓｅｒ）］ｎ（Ｇｌｙ）ｐもしくは（Ｇｌｙ）ｐ［（Ｓｅｒ）（Ｇｌｙ）ｍ］ｎ〔式中、ｍ、ｎ、およびｐの組合せは、表１の１行から選択される〕からなり、またはＹのアミノ酸配列は、配列番号３０１〜３８９のいずれか１つで示されるアミノ酸配列からなる。
【００３７】
いくつかの実施形態では、Ｘは不在であり、Ｚは不在であり、またはＸおよびＺは両方とも不在である。
【００３８】
いくつかの実施形態では、Ｘ、Ｙ、またはＺは、たとえば、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６個の連続した酸性残基、たとえば、アスパラギン酸またはグルタミン酸を含む、骨ターゲッティング部分を含む。いくつかの実施形態では、骨ターゲッティング部分は、Ｅ６、Ｅ７、Ｅ８、Ｅ９、Ｅ１０、Ｅ１１、Ｅ１２、Ｅ１３、Ｅ１４、Ｅ１５、Ｅ１６、Ｄ６、Ｄ７、Ｄ８、Ｄ９、Ｄ１０、Ｄ１１、Ｄ１２、Ｄ１３、Ｄ１４、Ｄ１５、もしくはＤ１６、たとえば、Ｅ６、Ｅ１０、Ｄ６、もしくはＤ１０を含み、またはそれらからなる。
【００３９】
いくつかの実施形態では、Ｘ、Ｙ、またはＺは、カテプシン（たとえばカテプシンＫ）切断配列を含む。いくつかの実施形態では、カテプシン切断配列は、ＨＧＰＱＧ（配列番号３７４）もしくはＨＫＬＲＧ（配列番号３７５）を含みまたはそれらからなる。
【００４０】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号５０１〜６０８のいずれか１つ、たとえば、配列番号５０２、配列番号５０４、配列番号５０６、配列番号５１２、配列番号５１４、配列番号５１６、配列番号５６０、配列番号５６２、配列番号５６４、配列番号５７２、配列番号５７４、配列番号５７６、配列番号５８４、配列番号５８６、配列番号５８８、配列番号５９６、配列番号５９８、配列番号６００、もしくは配列番号６０８で示されるアミノ酸配列を含みまたはそれらからなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、骨ターゲッティング部分、たとえば、Ｅ６、Ｅ７、Ｅ８、Ｅ９、Ｅ１０、Ｅ１１、Ｅ１２、Ｅ１３、Ｅ１４、Ｅ１５、Ｅ１６、Ｄ６、Ｄ７、Ｄ８、Ｄ９、Ｄ１０、Ｄ１１、Ｄ１２、Ｄ１３、Ｄ１４、Ｄ１５、またはＤ１６、たとえば、Ｅ６、Ｅ１０、Ｄ６、またはＤ１０を含む。
【００４１】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号５１２で示されるアミノ酸配列を含みまたはそれからなる。
【００４２】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号５５４で示されるアミノ酸配列を含みまたはそれからなる。
【００４３】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号５７２で示されるアミノ酸配列を含みまたはそれからなる。
【００４４】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号５７８で示されるアミノ酸配列を含みまたはそれからなる。
【００４５】
第３の態様では、本発明は、被験体たとえばヒトにおいて、ＦＧＦＲ３の過剰活性化に関連付けられる障害、骨障害もしくは軟骨障害、または血管平滑筋障害を治療する方法であって、（ａ）構造Ｖ−ＮＰ−Ｗを含むポリペプチドと、（ｂ）薬学的に許容可能な賦形剤と、を含む治療上有効量の医薬組成物を被験体に投与することを含む方法を特徴とする。ここで、構造中、ＮＰは、ナトリウム利尿ペプチドレセプターＢ（ＮＰＲ−Ｂ）のアゴニストであるナトリウム利尿ペプチドであり、ＶおよびＷのそれぞれは、独立して、不在でありもしくは少なくとも１個のアミノ酸のアミノ酸配列であり、かつＮＰは、配列番号１７〜２９、３１〜４０、４２〜９４、１０１〜１１６、１１９〜１２２、１２８〜１６１、もしくは１６３〜２３３のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含み、またはＶもしくはＷは、配列番号３０４〜３１３、３２２〜３３３、もしくは３３７〜３８９のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、それにより、被験体において、ＦＧＦＲ３の過剰活性化に関連付けられる障害、骨障害もしくは軟骨障害、または血管平滑筋障害が治療される。
【００４６】
第４の態様では、本発明は、被験体たとえばヒトにおいて骨を伸長させる方法であって、（ａ）構造Ｖ−ＮＰ−Ｗを含むポリペプチドと、（ｂ）薬学的に許容可能な賦形剤と、を含む治療上有効量の医薬組成物を被験体に投与することを含む方法を特徴とする。ここで、構造中、ＮＰは、ナトリウム利尿ペプチドレセプターＢ（ＮＰＲ−Ｂ）のアゴニストであるナトリウム利尿ペプチドであり、ＶおよびＷのそれぞれは、独立して、不在でありもしくは少なくとも１個のアミノ酸のアミノ酸配列であり、かつＮＰは、配列番号１７〜２９、３１〜４０、４２〜９４、１０１〜１１６、１１９〜１２２、１２８〜１６１、もしくは１６３〜２３３のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含み、またはＶもしくはＷは、配列番号３０４〜３１３、３２２〜３３３、もしくは３３７〜３８９のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含む。
【００４７】
第３および第４の態様のいくつかの実施形態では、本明細書で説明したＮＰまたはポリペプチドのいずれかは、本方法と組み合わせて使用可能である（たとえば、第１および第２の態様のいくつかの実施形態で説明したＮＰまたはポリペプチド）。いくつかの実施形態では、ＶまたはＷのアミノ酸配列は、［（Ｇｌｙ）ｍ（Ｓｅｒ）］ｎ（Ｇｌｙ）ｐまたは（Ｇｌｙ）ｐ［（Ｓｅｒ）（Ｇｌｙ）ｍ］ｎ〔式中、ｍ、ｎ、およびｐのそれぞれは、独立して、０〜２０である〕を含む。いくつかの実施形態では、ｍは４であり、かつｎは１〜６である。いくつかの実施形態では、Ｖは不在であり、Ｗは不在であり、またはＶおよびＷは両方とも不在である。いくつかの実施形態では、ＶまたはＷは、骨ターゲッティング部分、たとえば、Ｅ６、Ｅ７、Ｅ８、Ｅ９、Ｅ１０、Ｅ１１、Ｅ１２、Ｅ１３、Ｅ１４、Ｅ１５、Ｅ１６、Ｄ６、Ｄ７、Ｄ８、Ｄ９、Ｄ１０、Ｄ１１、Ｄ１２、Ｄ１３、Ｄ１４、Ｄ１５、またはＤ１６、たとえば、Ｅ６、Ｅ１０、Ｄ６、またはＤ１０を含む。いくつかの実施形態では、ＶまたはＷは、カテプシン（たとえばカテプシンＫ）切断配列、たとえば、ＨＧＰＱＧ（配列番号３７４）またはＨＫＬＲＧ（配列番号３７５）を含む。
【００４８】
第５の態様では、本発明は、被験体たとえばヒトにおいて、ＦＧＦＲ３の過剰活性化に関連付けられる障害、骨障害もしくは軟骨障害、または血管平滑筋障害を治療する方法であって、（ａ）構造Ｖ−ＮＰまたはＮＰ−Ｗを含むポリペプチドと、（ｂ）薬学的に許容可能な賦形剤と、を含む治療上有効量の医薬組成物を被験体に投与することを含む方法を特徴とする。ここで、構造中、ＮＰは、ナトリウム利尿ペプチドレセプターＢ（ＮＰＲ−Ｂ）のアゴニストであるナトリウム利尿ペプチドであり、かつＶおよびＷのそれぞれは、独立して、配列番号３０４〜３１３、３２２〜３３３、または３３７〜３８９のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、それにより、被験体において、ＦＧＦＲ３の過剰活性化に関連付けられる障害、骨障害もしくは軟骨障害、または血管平滑筋障害が治療される。
【００４９】
第６の態様では、本発明は、被験体たとえばヒトにおいて骨を伸長させる方法であって、（ａ）構造Ｖ−ＮＰまたはＮＰ−Ｗを含むポリペプチドと、（ｂ）薬学的に許容可能な賦形剤と、を含む治療上有効量の医薬組成物を被験体に投与することを含む方法を特徴とする。ここで、構造中、ＮＰは、ナトリウム利尿ペプチドレセプターＢ（ＮＰＲ−Ｂ）のアゴニストであるナトリウム利尿ペプチドであり、かつＶおよびＷのそれぞれは、独立して、配列番号３０４〜３１３、３２２〜３３３、または３３７〜３８９のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含む。
【００５０】
第５および第６の態様のいくつかの実施形態では、本明細書で説明したＮＰまたはポリペプチドのいずれかは、本方法と組み合わせて使用可能である（たとえば、第１および第２の態様のいくつかの実施形態で説明したＮＰまたはポリペプチド）。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、構造Ｖ−ＮＰを含む。いくつかの実施形態では、ＶまたはＷのアミノ酸配列は、［（Ｇｌｙ）ｍ（Ｓｅｒ）］ｎ（Ｇｌｙ）ｐまたは（Ｇｌｙ）ｐ［（Ｓｅｒ）（Ｇｌｙ）ｍ］ｎ〔式中、ｍ、ｎ、およびｐのそれぞれは、独立して、０〜２０である〕を含む。いくつかの実施形態では、ｍは４であり、かつｎは１〜６である。いくつかの実施形態では、ＶまたはＷは、骨ターゲッティング部分、たとえば、Ｅ６、Ｅ７、Ｅ８、Ｅ９、Ｅ１０、Ｅ１１、Ｅ１２、Ｅ１３、Ｅ１４、Ｅ１５、Ｅ１６、Ｄ６、Ｄ７、Ｄ８、Ｄ９、Ｄ１０、Ｄ１１、Ｄ１２、Ｄ１３、Ｄ１４、Ｄ１５、またはＤ１６、たとえば、Ｅ６、Ｅ１０、Ｄ６、またはＤ１０を含む。いくつかの実施形態では、ＶまたはＷは、カテプシン（たとえばカテプシンＫ）切断配列、たとえば、ＨＧＰＱＧ（配列番号３７４）またはＨＫＬＲＧ（配列番号３７５）を含む。
【００５１】
本明細書で説明した方法のいずれかのいくつかの実施形態では、ＶまたはＷは、配列番号３０４〜３１３、３２２〜３３３、または３３７〜３８９のいずれか１つで示されるアミノ酸配列からなる。
【００５２】
本明細書で説明した方法のいずれかのいくつかの実施形態では、ポリペプチドは、グリコシル化またはペグ化（pegylated）される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、ポリペプチドの二量体を含む。いくつかの実施形態では、薬学的に許容可能な賦形剤は、生理食塩水を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、凍結乾燥される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、皮下、静脈内、経口的、経鼻的、筋肉内、舌下、髄腔内、または皮内に投与される。
【００５３】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、毎日１回、２回、３回、または４回、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇの投与量で被験体に投与される。投与量は、毎日１回、２回、３回、または４回、たとえば、約５ｍｇ／ｋｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇ、たとえば、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇでありうる。いくつかの実施形態では、投与量は、毎日２回、約１０ｍｇ／ｋｇまたは約１００ｍｇ／ｋｇである。
【００５４】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、毎週１回または２回、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇの投与量で被験体に投与される。投与量は、毎週１回または２回、たとえば、約５ｍｇ／ｋｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇ、たとえば、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、たとえば、約２０ｍｇ／ｋｇ〜約４０ｍｇ／ｋｇでありうる。いくつかの実施形態では、投与量は、毎週１回または２回、約１０ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ、または約１００ｍｇ／ｋｇである。
【００５５】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、毎週１回または２回、約１０μｇ／ｋｇ〜約１，０００μｇ／ｋｇの投与量で被験体に投与される。投与量は、毎週１回または２回、たとえば、約２０μｇ／ｋｇ〜約８００μｇ／ｋｇ、たとえば、約３０μｇ／ｋｇ〜約６００μｇ／ｋｇ、たとえば、約５０μｇ／ｋｇ〜約５００μｇ／ｋｇ、たとえば、約１００μｇ／ｋｇ〜約４００μｇ／ｋｇ、たとえば、約２００μｇ／ｋｇ〜約３００μｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態では、投与量は、毎週１回または２回、約３０μｇ／ｋｇ、約１００μｇ／ｋｇ、約３００μｇ／ｋｇ、または約５００μｇ／ｋｇである。
【００５６】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、少なくとも１ヶ月間にわたり被験体に毎週１〜１４回投与されまたは毎日少なくとも１回投与される。好ましい実施形態では、医薬組成物は、少なくとも１ヶ月間にわたり被験体に毎週１回投与される。
【００５７】
本明細書で説明した方法のいずれかのいくつかの実施形態では、ＦＧＦＲ３の過剰活性化に関連付けられる障害は、骨障害または軟骨障害、たとえば、本明細書で説明したいずれかの骨格異形成症などである。本明細書で説明した方法のいずれかのいくつかの実施形態では、骨障害または軟骨障害は、骨格異形成症、たとえば、軟骨無形成症、ホモ接合軟骨無形成症、ヘテロ接合軟骨無形成症、軟骨無発生症、先端異骨症、遠位中位肢異形成症、骨形成不全症、屈曲肢異形成症、点状軟骨異形成症、近位肢型点状軟骨異形成症、鎖骨頭蓋異骨症、先天性大腿骨短縮症、頭蓋骨癒合症（たとえば、ムエンケ症候群、クルーゾン症候群、アペール症候群、ジャクソン・ワイス症候群、プファイファー症候群、またはクルーゾン皮膚骨格症候群）、指症、短指症、屈指症、多指症、合指症、捻曲性骨異形成症、矮小発育症、分節異常骨異形成症、内軟骨腫症、繊維軟骨形成症、繊維性骨異形成症、遺伝性多発性外骨腫症、軟骨低形成症、低ホスファターゼ症、低リン血症性くる病、ヤッフェ・リヒテンシュタイン症候群、クニースト骨異形成症、クニースト症候群、ランガー型中位肢異形成症、マルファン症候群、マッキューン・オルブライト症候群、小肢症、骨幹端異形成症、ヤンセン型骨幹端異形成症、変容性骨異形成症、モルキオ症候群、ニーベルゲルト型中位肢異形成症、神経繊維腫症（たとえば、１型、たとえば、骨病変併発型もしくは骨病変非併発型、２型、または神経鞘腫症）、骨関節炎、骨軟骨異形成症、骨形成不全症、周産期致死型骨形成不全症、骨化石症、骨斑紋症、末梢骨形成不全症、ラインハルト症候群、ロバーツ症候群、ロビノー症候群、短肋骨多指症候群、低身長症、先天性脊椎骨端異形成症、脊椎骨端骨幹端異形成症、または致死性骨異形成症である。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、成長遅滞、頭蓋変形、および歯科矯正学的欠陥からなる群から選択される軟骨無形成症表現型を治療すべく治療上有効量で投与される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、頸髄圧迫、脊柱管狭窄、水頭、慢性耳炎起因性聴力損失、心血管疾患、神経疾患、および肥満からなる群から選択される軟骨無形成症表現型を治療すべく治療上有効量で投与される。本明細書で説明した方法のいずれかのいくつかの実施形態では、ＦＧＦＲ３の過剰活性化に関連付けられる障害は、癌、たとえば、多発性骨髄腫、骨髄増殖性症候群、白血病、形質細胞白血病、リンパ腫、膠芽腫、前立腺癌、膀胱癌、または乳癌である。本明細書で説明した方法のいずれかのいくつかの実施形態では、血管平滑筋障害は、高血圧症、再狭窄症、動脈硬化症、急性非代償性心不全、鬱血性心不全、心性浮腫、腎性浮腫、肝性浮腫、急性腎不全、または慢性腎不全である。
【００５８】
第７の態様では、本発明は、構造Ｘ−Ｆｃ−Ｙ−ＮＰ−Ｚまたは構造Ｘ−ＮＰ−Ｙ−Ｆｃ−Ｚを含む単離されたポリペプチドを特徴とする。ここで、構造中、ＮＰは、ナトリウム利尿ペプチドレセプターＢ（ＮＰＲ−Ｂ）のアゴニストであるナトリウム利尿ペプチドであり、かつ、（ｉ）ＮＰは、位置１７のアミノ酸がＭｅｔでない配列番号１２６のアミノ酸６〜２２を含み、かつＸ、Ｙ、およびＺのそれぞれは、独立して、不在でありもしくは少なくとも１個のアミノ酸のアミノ酸配列であるか、あるいは（ｉｉ）ＸおよびＺのそれぞれは、独立して、不在でありもしくは少なくとも１個のアミノ酸のアミノ酸配列であり、かつＹのアミノ酸配列は、［（Ｇｌｙ）４（Ｓｅｒ）］ｎ（Ｇｌｙ）ｐもしくは（Ｇｌｙ）ｐ［（Ｓｅｒ）（Ｇｌｙ）４］ｎ〔式中、ｎは１〜１０であり、かつｐは０〜４であり、もしくはｍ、ｎ、およびｐの組合せは、表１の１行から選択される〕を含み、またはＹのアミノ酸配列は、配列番号３０４〜３１３、３２２〜３３３、もしくは３３７〜３８９のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含むか、のいずれかである。
【００５９】
第７の態様のいくつかの実施形態では、ポリペプチドは、構造Ｘ−Ｆｃ−Ｙ−ＮＰ−Ｚを含む。
【００６０】
第７の態様のいくつかの実施形態では、（ｉ）ＮＰは、位置１７のアミノ酸がＭｅｔでない配列番号１２６のアミノ酸６〜２２を含み、かつＸ、Ｙ、およびＺのそれぞれは、独立して、不在でありまたは少なくとも１個のアミノ酸のアミノ酸配列である。いくつかの実施形態では、配列番号１２６の位置１７のアミノ酸は、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ａｌａ、またはＳｅｒである。いくつかの実施形態では、配列番号１２６の位置１７のアミノ酸は、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ｐｒｏ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、またはＬｙｓ、たとえば、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ｐｒｏ、またはＡｓｐ、たとえば、ＰｈｅまたはＬｅｕ、たとえば、Ｐｈｅ、たとえば、Ｌｅｕである。いくつかの実施形態では、ＮＰは、構造：［Ｎ末端伸長部］−［ショートセグメント］−［リングドメイン］−［Ｃ末端伸長部］を含む。ここで、構造中、前記リングドメインは、位置１７のアミノ酸がＭｅｔでない配列番号１２６のアミノ酸６〜２２を含み、かつ前記Ｎ末端伸長部、ショートセグメント、およびＣ末端伸長部のそれぞれは、独立して、不在でありまたは少なくとも１個のアミノ酸のアミノ酸配列である。いくつかの実施形態では、前記ＮＰのアミノ酸配列は、配列番号１１９〜１２５もしくは１５６〜２２０のいずれか１つで示されるアミノ酸配列（ここで、配列番号１２６を基準にした位置１７はＭｅｔでない）もしくは配列番号２２１〜２３３のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含みまたはそれからなる。
【００６１】
第７の態様のいくつかの実施形態では、（ｉｉ）ＸおよびＺのそれぞれは、独立して、不在でありまたは少なくとも１個のアミノ酸のアミノ酸配列であり、かつＹのアミノ酸配列は、［（Ｇｌｙ）４（Ｓｅｒ）］ｎ（Ｇｌｙ）ｐもしくは（Ｇｌｙ）ｐ［（Ｓｅｒ）（Ｇｌｙ）４］ｎ〔式中、ｎは１〜１０であり、かつｐは０〜４である〕を含み、またはＹのアミノ酸配列は、配列番号３０４〜３１３、３２２〜３３３、または３３７〜３８９のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＮＰは、構造：［Ｎ末端伸長部］−［ショートセグメント］−［リングドメイン］−［Ｃ末端伸長部］を含む。ここで、構造中、リングドメインは、配列番号６、配列番号３０のアミノ酸１１〜２７、または配列番号９５で示されるアミノ酸配列を含み、かつＮ末端伸長部、ショートセグメント、およびＣ末端伸長部のそれぞれは、独立して、不在でありまたは少なくとも１個のアミノ酸のアミノ酸配列である。いくつかの実施形態では、リングドメインは、配列番号１２６のアミノ酸６〜２２を含む。いくつかの実施形態では、配列番号１２６の位置１７のアミノ酸は、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ａｌａ、またはＳｅｒである。いくつかの実施形態では、配列番号１２６の位置１７のアミノ酸は、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ｐｒｏ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、またはＬｙｓ、たとえば、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ｐｒｏ、またはＡｓｐ、たとえば、ＰｈｅまたはＬｅｕ、たとえば、Ｐｈｅ、たとえば、Ｌｅｕである。いくつかの実施形態では、リングドメインは、配列番号１２で示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ショートセグメントおよびリングドメインは、一緒になって、配列番号４または１３〜３０のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ショートセグメントおよびリングドメインのアミノ酸配列は、一緒になって、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなる。いくつかの実施形態では、ショートセグメントおよびリングドメインのアミノ酸配列は、一緒になって、配列番号１１９〜１２２、１２６、または１５６〜１６１のいずれか１つで示されるアミノ酸配列からなる（たとえば、配列番号１２６中のＸは、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ｐｒｏ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、またはＬｙｓ、たとえば、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ｐｒｏ、またはＡｓｐ、たとえば、ＰｈｅまたはＬｅｕ、たとえば、Ｐｈｅ、たとえば、Ｌｅｕである）。いくつかの実施形態では、Ｎ末端伸長部、ショートセグメント、およびリングドメインは、一緒になって、配列番号１１で示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＮＰのアミノ酸配列は、配列番号４からなる。いくつかの実施形態では、ＮＰのアミノ酸配列は、配列番号１１からなる。いくつかの実施形態では、ＮＰのアミノ酸配列は、配列番号３１〜９４のいずれか１つで示されるアミノ酸配列、または少なくともリングドメインを含むその断片からなる。第７の態様のいくつかの実施形態では、ＮＰのアミノ酸配列は、配列番号１３〜２９、１００〜１１６、１１９〜１２５、１２７〜２３３、もしくは１００１〜１１５５のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含みまたはそれからなる。
【００６２】
第７の態様の実施形態のいずれかでは、ショートセグメントのアミノ酸配列は、配列番号４のアミノ酸１〜５からなる。いくつかの実施形態では、ショートセグメントのアミノ酸配列は、配列番号４のアミノ酸１〜５、２〜５、３〜５、４〜５、もしくは５、配列番号１７のアミノ酸１〜１０、配列番号１９のアミノ酸１〜５、配列番号２０のアミノ酸１〜３、配列番号２１のアミノ酸１〜５、または配列番号２９のアミノ酸１〜６からなる。いくつかの実施形態では、Ｎ末端伸長部のアミノ酸配列は、配列番号１１のアミノ酸１〜３１を含む。いくつかの実施形態では、Ｎ末端伸長部のアミノ酸配列は、配列番号１１のアミノ酸１７〜３１を含む。いくつかの実施形態では、Ｎ末端伸長部のアミノ酸配列は、ＫＧＡＮＫＫ（配列番号３１４）またはＫＧＡＮＱＫ（配列番号３１５）を含む。いくつかの実施形態では、Ｃ末端伸長部は、配列番号１１８、配列番号１１７で示されるアミノ酸配列、または配列番号１０１〜１１６のいずれか１つから選択されるアミノ酸２３〜３７を含む。
【００６３】
第７の態様の実施形態のいずれかでは、ＮＰは、ＮＰＲ−Ａに対してよりもＮＰＲ−Ｂに対して選択性が高く、この場合、ｉｎ  ｖｉｖｏ薬動学的アッセイで決定されるＮＰのＥＣ５０（ＮＰＲ−Ａ）／ＥＣ５０（ＮＰＲ−Ｂ）比は、少なくとも３０である。
【００６４】
第７の態様の実施形態のいずれかでは、Ｆｃは、ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとヒンジ領域とを含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃは、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３およびＩｇＧ−４からなる群から選択される免疫グロブリンの定常ドメインである。いくつかの実施形態では、Ｆｃは、配列番号４０１で示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、免疫グロブリンは、ＩｇＧ−１である。いくつかの実施形態では、Ｆｃのアミノ酸配列は、配列番号４０１に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、または配列番号４０１で示されるアミノ酸配列を含みもしくはそれからなる。
【００６５】
第７の態様の実施形態のいずれかでは、Ｙは、高グリシン領域を含み、またはＹのアミノ酸配列は、１個以上のグリシンと１個以上のセリンとからなる。たとえば、Ｙのアミノ酸配列は、［（Ｇｌｙ）ｍ（Ｓｅｒ）］ｎ（Ｇｌｙ）ｐまたは（Ｇｌｙ）ｐ［（Ｓｅｒ）（Ｇｌｙ）ｍ］ｎ〔式中、ｍ、ｎ、およびｐのそれぞれは、独立して、０〜２０である〕を含みうる。いくつかの実施形態では、ｍは０〜２０である（たとえば、ｍは、３〜６、３〜７、３〜８、３〜９、３〜１０、３〜１１、３〜１２、３〜１４、３〜１５、３〜１６、３〜１７、３〜１８、３〜１９、３〜２０、４〜６、４〜７、４〜８、４〜９、４〜１０、４〜１１、４〜１２、４〜１４、４〜１５、４〜１６、４〜１７、４〜１８、４〜１９、４〜２０、５〜６、５〜７、５〜８、５〜９、５〜１０、５〜１１、５〜１２、５〜１４、５〜１５、５〜１６、５〜１７、５〜１８、５〜１９、５〜２０、６〜７、６〜８、６〜９、６〜１０、６〜１１、６〜１２、６〜１４、６〜１５、６〜１６、６〜１７、６〜１８、６〜１９、６〜２０、７〜８、７〜９、７〜１０、７〜１１、７〜１２、７〜１４、７〜１５、７〜１６、７〜１７、７〜１８、７〜１９、７〜２０、８〜９、８〜１０、８〜１１、８〜１２、８〜１４、８〜１５、８〜１６、８〜１７、８〜１８、８〜１９、８〜２０、９〜１０、９〜１２、９〜１４、９〜１５、９〜１６、９〜１７、９〜１８、９〜１９、９〜２０、１０〜１１、１０〜１２、１０〜１４、１０〜１５、１０〜１６、１０〜１７、１０〜１８、１０〜１９、または１０〜２０である）。いくつかの実施形態では、ｍは４であり、かつｎは１〜６である。いくつかの実施形態では、ｍ、ｎ、およびｐの組合せは、表１の１行から選択され、またはＹのアミノ酸配列は、配列番号３０４〜３１３、３２２〜３３３、または３３７〜３８９のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｙのアミノ酸配列は、［（Ｇｌｙ）ｍ（Ｓｅｒ）］ｎ（Ｇｌｙ）ｐまたは（Ｇｌｙ）ｐ［（Ｓｅｒ）（Ｇｌｙ）ｍ］ｎ〔式中、ｍ、ｎ、およびｐの組合せは、表１の１行から選択される〕からなり、またはＹのアミノ酸配列は、配列番号３０４〜３１３、３２２〜３３３、または３３７〜３８９のいずれか１つで示されるアミノ酸配列からなる。
【００６６】
第７の態様のいくつかの実施形態では、Ｘは不在であり、Ｚは不在であり、またはＸおよびＺは両方とも不在である。
【００６７】
第７の態様のいくつかの実施形態では、Ｘ、Ｙ、またはＺは、たとえば、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６個の連続した酸性残基、たとえば、アスパラギン酸またはグルタミン酸を含む、骨ターゲッティング部分を含む。いくつかの実施形態では、骨ターゲッティング部分は、Ｅ６、Ｅ７、Ｅ８、Ｅ９、Ｅ１０、Ｅ１１、Ｅ１２、Ｅ１３、Ｅ１４、Ｅ１５、Ｅ１６、Ｄ６、Ｄ７、Ｄ８、Ｄ９、Ｄ１０、Ｄ１１、Ｄ１２、Ｄ１３、Ｄ１４、Ｄ１５、もしくはＤ１６、たとえば、Ｅ６、Ｅ１０、Ｄ６、もしくはＤ１０を含み、またはそれらからなる。
【００６８】
第７の態様のいくつかの実施形態では、Ｘ、Ｙ、またはＺは、カテプシン（たとえばカテプシンＫ）切断配列を含む。いくつかの実施形態では、カテプシン切断配列は、ＨＧＰＱＧ（配列番号３７４）もしくはＨＫＬＲＧ（配列番号３７５）を含みまたはそれらからなる。
【００６９】
第７の態様のいくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号５０１〜６０８のいずれか１つ、たとえば、配列番号５０２、配列番号５０４、配列番号５０６、配列番号５１２、配列番号５１４、配列番号５１６、配列番号５６０、配列番号５６２、配列番号５６４、配列番号５７２、配列番号５７４、配列番号５７６、配列番号５８４、配列番号５８６、配列番号５８８、配列番号５９６、配列番号５９８、配列番号６００、もしくは配列番号６０８で示されるアミノ酸配列を含みまたはそれらからなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、骨ターゲッティング部分、たとえば、Ｅ６、Ｅ７、Ｅ８、Ｅ９、Ｅ１０、Ｅ１１、Ｅ１２、Ｅ１３、Ｅ１４、Ｅ１５、Ｅ１６、Ｄ６、Ｄ７、Ｄ８、Ｄ９、Ｄ１０、Ｄ１１、Ｄ１２、Ｄ１３、Ｄ１４、Ｄ１５、またはＤ１６、たとえば、Ｅ６、Ｅ１０、Ｄ６、またはＤ１０を含む。
【００７０】
第７の態様のいくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号５１２で示されるアミノ酸配列を含みまたはそれからなる。
【００７１】
第７の態様のいくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号５５４で示されるアミノ酸配列を含みまたはそれからなる。
【００７２】
第７の態様のいくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号５７２で示されるアミノ酸配列を含みまたはそれからなる。
【００７３】
第７の態様のいくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号５７８で示されるアミノ酸配列を含みまたはそれからなる。
【００７４】
第７の態様のいくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号５６０で示されるアミノ酸配列を含みまたはそれからなる。
【００７５】
第７の態様のいくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号５６６で示されるアミノ酸配列を含みまたはそれからなる。
【００７６】
第７の態様のいくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号５３８で示されるアミノ酸配列を含みまたはそれからなる（たとえば、配列番号５３８中のＸは、任意のアミノ酸、たとえば、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ｐｒｏ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、またはＬｙｓ、たとえば、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ｐｒｏ、またはＡｓｐ、たとえば、ＰｈｅまたはＬｅｕ、たとえば、Ｐｈｅ、たとえば、Ｌｅｕでありうる）。
【００７７】
第８の態様では、本発明は、ポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号５０１〜６０８のいずれか１つ、たとえば、配列番号５０２、配列番号５０４、配列番号５０６、配列番号５１２、配列番号５１４、配列番号５１６、配列番号５６０、配列番号５６２、配列番号５６４、配列番号５７２、配列番号５７４、配列番号５７６、配列番号５８４、配列番号５８６、配列番号５８８、配列番号５９６、配列番号５９８、配列番号６００、もしくは配列番号６０８を含むまたはそれらからなる、単離されたポリペプチドを特徴とする。
【００７８】
第９の態様では、本発明は、構造Ｖ−ＮＰ−Ｗを含む単離されたポリペプチドを特徴とする。ここで、構造中、ＮＰは、ナトリウム利尿ペプチドレセプターＢ（ＮＰＲ−Ｂ）のアゴニストであるナトリウム利尿ペプチドであり、かつＶおよびＷのそれぞれは、独立して、不在でありもしくは少なくとも１個のアミノ酸のアミノ酸配列であり、かつＮＰは、配列番号１０１〜１１６、１１９〜１２２、１２８〜１６１、もしくは１６３〜２３３のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含み、またはＶもしくはＷは、配列番号３０４〜３１３、３２２〜３３３、もしくは３３７〜３８９のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含む。
【００７９】
第１０の態様では、本発明は、構造Ｖ−ＮＰまたはＮＰ−Ｗを含む単離されたポリペプチドを特徴とする。ここで、構造中、ＮＰは、ナトリウム利尿ペプチドレセプターＢ（ＮＰＲ−Ｂ）のアゴニストであるナトリウム利尿ペプチドであり、ＶおよびＷのそれぞれは、独立して、配列番号３０４〜３１３、３２２〜３３３、または３３７〜３８９のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含む。
【００８０】
第９および第１０の態様のいくつかの実施形態では、ポリペプチドは、構造Ｖ−ＮＰを含む。
【００８１】
第９および第１０の態様のいくつかの実施形態では、本明細書で説明したＮＰまたはポリペプチドのいずれかは、本方法と組み合わせて使用可能である（たとえば、第１、第２、および第７の態様のいくつかの実施形態で説明したＮＰまたはポリペプチド）。いくつかの実施形態では、ＶまたはＷのアミノ酸配列は、［（Ｇｌｙ）ｍ（Ｓｅｒ）］ｎ（Ｇｌｙ）ｐまたは（Ｇｌｙ）ｐ［（Ｓｅｒ）（Ｇｌｙ）ｍ］ｎ〔式中、ｍ、ｎ、およびｐのそれぞれは、独立して、０〜２０である〕を含む。いくつかの実施形態では、ｍは４であり、かつｎは１〜６である。いくつかの実施形態では、Ｖは不在であり、Ｗは不在であり、またはＶおよびＷは両方とも不在である。いくつかの実施形態では、ＶまたはＷは、骨ターゲッティング部分、たとえば、Ｅ６、Ｅ７、Ｅ８、Ｅ９、Ｅ１０、Ｅ１１、Ｅ１２、Ｅ１３、Ｅ１４、Ｅ１５、Ｅ１６、Ｄ６、Ｄ７、Ｄ８、Ｄ９、Ｄ１０、Ｄ１１、Ｄ１２、Ｄ１３、Ｄ１４、Ｄ１５、またはＤ１６、たとえば、Ｅ６、Ｅ１０、Ｄ６、またはＤ１０を含む。いくつかの実施形態では、ＶまたはＷは、カテプシン（たとえばカテプシンＫ）切断配列、たとえば、ＨＧＰＱＧ（配列番号３７４）またはＨＫＬＲＧ（配列番号３７５）を含む。
【００８２】
第７、第９、および第１０の態様のいくつかの実施形態では、ＮＰは、本明細書で説明したＮＰまたはポリペプチドのいずれか、たとえば、構造：［Ｎ末端伸長部］−［ショートセグメント］−［リングドメイン］−［Ｃ末端伸長部］を含むものを含む。ここで、構造中、リングドメインは、配列番号６、配列番号３０のアミノ酸１１〜２７、または配列番号９５で示されるアミノ酸配列を含み、Ｎ末端伸長部、ショートセグメント、およびＣ末端伸長部のそれぞれは、独立して、不在でありまたは少なくとも１個のアミノ酸のアミノ酸配列である。いくつかの実施形態では、リングドメインは、配列番号１２６のアミノ酸６〜２２を含む。他の実施形態では、配列番号１２６の位置１７のアミノ酸は、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ｐｒｏ、またはＡｓｐ、たとえば、ＰｈｅまたはＬｅｕ、たとえば、Ｐｈｅ、たとえば、Ｌｅｕである。いくつかの実施形態では、ショートセグメントおよびリングドメインのアミノ酸配列は、一緒になって、配列番号１１９〜１２２、１２６、または１５６〜１６１のいずれか１つで示されるアミノ酸配列からなる。いくつかの実施形態では、Ｎ末端伸長部のアミノ酸配列は、配列番号１１のアミノ酸１〜３１を含む。いくつかの実施形態では、Ｎ末端伸長部のアミノ酸配列は、配列番号１１のアミノ酸１７〜３１を含む。いくつかの実施形態では、Ｎ末端伸長部のアミノ酸配列は、ＫＧＡＮＫＫ（配列番号３１４）またはＫＧＡＮＱＫ（配列番号３１５）を含む。いくつかの実施形態では、Ｎ末端伸長部、ショートセグメント、およびリングドメインは、一緒になって、配列番号１１で示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｃ末端伸長部は、配列番号１１８、配列番号１１７で示されるアミノ酸配列、または配列番号１０１〜１１６のいずれか１つから選択されるアミノ酸２３〜３７を含む。いくつかの実施形態では、ＮＰのアミノ酸配列は、配列番号４からなる。いくつかの実施形態では、ＮＰのアミノ酸配列は、配列番号１１からなる。いくつかの実施形態では、ＮＰのアミノ酸配列は、配列番号３１〜９４のいずれか１つで示されるアミノ酸配列、または少なくともリングドメインを含むその断片からなる。
【００８３】
第７、第８、第９、および第１０の態様のいくつかの実施形態では、ポリペプチドは、グリコシル化またはペグ化される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、ポリペプチドの二量体を含む。
【００８４】
以上の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、本明細書で説明したポリペプチドのいずれかは、骨ターゲッティング部分、たとえば、Ｅ６、Ｅ７、Ｅ８、Ｅ９、Ｅ１０、Ｅ１１、Ｅ１２、Ｅ１３、Ｅ１４、Ｅ１５、Ｅ１６、Ｄ６、Ｄ７、Ｄ８、Ｄ９、Ｄ１０、Ｄ１１、Ｄ１２、Ｄ１３、Ｄ１４、Ｄ１５、またはＤ１６、たとえば、Ｅ６、Ｅ１０、Ｄ６、またはＤ１０を含みうる。
【００８５】
以上の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、本明細書で説明したポリペプチドのいずれかは、カテプシン（たとえばカテプシンＫ）切断配列、たとえば、ＨＧＰＱＧ（配列番号３７４）またはＨＫＬＲＧ（配列番号３７５）を含みうる。
【００８６】
以上の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、本明細書で説明したポリペプチドのいずれかは、対照（たとえば、ＣＮＰ２２、ＣＮＰ５３、または本明細書で説明した任意のポリペプチド、たとえば、国際公開第２０１０／１３５５４１号パンフレットまたは米国特許出願公開第２０１０−０３３１２５６号明細書に記載のペプチド）と比較して、（たとえば、中性エンドペプチダーゼ（ＮＥＰ）、インスリン分解酵素（ＩＤＥ）、またはｉｎ  ｖｉｖｏでナトリウム利尿ペプチドを切断する任意の他の酵素による）分解性が（たとえば、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％）低減されたポリペプチドを含みうる。
【００８７】
以上の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、本明細書で説明したポリペプチドは、対照（たとえば、本明細書で説明した任意のポリペプチド、たとえば、国際公開第２０１０／１３５５４１号パンフレットまたは米国特許出願公開第２０１０−０３３１２５６号明細書に記載のペプチド）と比較して、有効性が（たとえば、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約１００％、またはさらに多く）増大され、かつ／または用量依存的副作用が（たとえば、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％）低減される（たとえば、血圧低下が低減されるなど、有害な血行力学的作用が低減される）。
【００８８】
第１１の態様では、本発明は、（ａ）本明細書で説明した単離されたポリペプチドのいずれかと、（ｂ）薬学的に許容可能な賦形剤と、を含む医薬組成物を特徴とする。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、ＦＧＦＲ３の過剰活性化に関連付けられる障害、たとえば、骨障害または軟骨障害、たとえば、骨格異形成症、たとえば、本明細書で説明した骨格異形成症のいずれか、たとえば、軟骨無形成症、またはたとえば、頭蓋骨癒合症を治療すべく製剤化される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、骨障害または軟骨障害、たとえば、骨格異形成症、たとえば、本明細書で説明した骨格異形成症のいずれか、たとえば、軟骨無形成症、またはたとえば、頭蓋骨癒合症（たとえば、ムエンケ症候群、クルーゾン症候群、アペール症候群、ジャクソン・ワイス症候群、プファイファー症候群、またはクルーゾン皮膚骨格症候群）を治療すべく製剤化される。いくつかの実施形態では、ＦＧＦＲ３の過剰活性化に関連付けられる障害は、癌、たとえば、本明細書で説明した癌のいずれか、たとえば、多発性骨髄腫である。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、血管平滑筋障害、たとえば、本明細書で説明した血管平滑筋障害のいずれかを治療すべく製剤化される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、骨、たとえば、骨伸長が奏効すると思われる本明細書で説明した病態または障害のいずれかの骨を伸長させるべく製剤化される。
【００８９】
第１２の態様では、本発明は、被験体において、ＦＧＦＲ３の過剰活性化に関連付けられる障害、骨障害もしくは軟骨障害、または血管平滑筋障害を治療する方法であって、（ａ）本明細書で説明したポリペプチドのいずれかをコードする単離された核酸分子と、（ｂ）薬学的に許容可能な賦形剤と、を含む治療上有効量の医薬組成物を被験体に投与することを含む方法を特徴とする。いくつかの実施形態では、それにより、被験体において、ＦＧＦＲ３の過剰活性化に関連付けられる障害、骨障害もしくは軟骨障害、または血管平滑筋障害が治療される。
【００９０】
第１１および第１２の態様のいくつかの実施形態では、薬学的に許容可能な賦形剤は、生理食塩水を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、凍結乾燥される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、皮下、静脈内、経口的、経鼻的、筋肉内、舌下、髄腔内、または皮内に投与される。
【００９１】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、毎日１回、２回、３回、または４回、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇの投与量で被験体に投与される。投与量は、毎日１回、２回、３回、または４回、たとえば、約５ｍｇ／ｋｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇ、たとえば、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇでありうる。いくつかの実施形態では、投与量は、毎日２回、約１０ｍｇ／ｋｇまたは約１００ｍｇ／ｋｇである。
【００９２】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、毎週１回または２回、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇの投与量で被験体に投与される。投与量は、毎週１回または２回、たとえば、約５ｍｇ／ｋｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇ、たとえば、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、たとえば、約２０ｍｇ／ｋｇ〜約４０ｍｇ／ｋｇでありうる。いくつかの実施形態では、投与量は、毎週１回または２回、約１０ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ、または約１００ｍｇ／ｋｇである。
【００９３】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、毎週１回または２回、約１０μｇ／ｋｇ〜約１，０００μｇ／ｋｇの投与量で被験体に投与される。投与量は、毎週１回または２回、たとえば、約２０μｇ／ｋｇ〜約８００μｇ／ｋｇ、たとえば、約３０μｇ／ｋｇ〜約６００μｇ／ｋｇ、たとえば、約５０μｇ／ｋｇ〜約５００μｇ／ｋｇ、たとえば、約１００μｇ／ｋｇ〜約４００μｇ／ｋｇ、たとえば、約２００μｇ／ｋｇ〜約３００μｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態では、投与量は、毎週１回または２回、約３０μｇ／ｋｇ、約１００μｇ／ｋｇ、約３００μｇ／ｋｇ、または約５００μｇ／ｋｇである。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、少なくとも１ヶ月間にわたり被験体に毎週１〜１４回投与されまたは毎日少なくとも１回投与される。好ましい実施形態では、医薬組成物は、少なくとも１ヶ月間にわたり被験体に毎週１回投与される。
【００９４】
第１３の態様では、本発明は、被験体において骨を伸長させる方法であって、（ａ）本明細書で説明したポリペプチドのいずれかをコードする単離された核酸分子と、（ｂ）薬学的に許容可能な賦形剤と、を含む治療上有効量の医薬組成物を被験体に投与することを含む方法を特徴とする。
【００９５】
第１２および第１３の態様のいくつかの実施形態では、医薬組成物は、レンチウイルスベクターで被験体に投与される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、約０．１ｍｇ〜約１０ｍｇの単離された核酸の投与量で被験体に投与される。
【００９６】
第１４の態様では、本発明は、本明細書で説明したポリペプチドのいずれかをコードする単離された核酸分子を特徴とする。
【００９７】
第１５の態様では、本発明は、配列番号８０１〜８０６のいずれか１つで示される核酸配列を含む、または配列番号８０１〜８０６のいずれか１つによりコードされるポリペプチドをコードする核酸配列を含む、単離された核酸分子を特徴とする。
【００９８】
いくつかの実施形態では、本明細書で説明した単離された核酸分子のいずれかは、組換え発現ベクター、たとえば、核酸分子によりコードされるポリペプチドを発現可能なレンチウイルスベクターを含む。
【００９９】
第１６の態様では、本発明は、本明細書で説明した単離された核酸分子のいずれかでトランスフォームまたはトランスフェクトされた単離された組換え宿主細胞、たとえば、ＨＥＫ２９３細胞、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、またはＣＯＳ−７細胞を特徴とする。
【０１００】
第１７の態様では、本発明は、（ａ）本明細書で説明した単離された核酸分子のいずれかと、（ｂ）薬学的に許容可能な賦形剤と、を含む医薬組成物を特徴とする。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、ＦＧＦＲ３の過剰活性化に関連付けられる障害、たとえば、骨障害または軟骨障害、たとえば、骨格異形成症、たとえば、本明細書で説明した骨格異形成症のいずれか、たとえば、軟骨無形成症、またはたとえば、頭蓋骨癒合症を治療すべく製剤化される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、骨障害または軟骨障害、たとえば、骨格異形成症、たとえば、本明細書で説明した骨格異形成症のいずれか、たとえば、軟骨無形成症、またはたとえば、頭蓋骨癒合症（たとえば、ムエンケ症候群、クルーゾン症候群、アペール症候群、ジャクソン・ワイス症候群、プファイファー症候群、またはクルーゾン皮膚骨格症候群）を治療すべく製剤化される。いくつかの実施形態では、ＦＧＦＲ３の過剰活性化に関連付けられる障害は、癌、たとえば、本明細書で説明した癌のいずれか、たとえば、多発性骨髄腫である。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、血管平滑筋障害、たとえば、本明細書で説明した血管平滑筋障害のいずれかを治療すべく製剤化される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、骨、たとえば、骨伸長が奏効すると思われる本明細書で説明した病態または障害のいずれかの骨を伸長させるべく製剤化される。
【０１０１】
第１８の態様では、本発明は、ポリペプチドの発現を行うのに好適な条件下で培養培地中で本明細書で説明した宿主細胞のいずれかを培養することと、ポリペプチドを培養培地から回収することと、を含む、本明細書で説明したポリペプチドのいずれかを産生する方法を特徴とする。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＨＥＫ２９３細胞、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、またはＣＯＳ−７細胞である。
【０１０２】
第１９の態様では、本発明は、（ａ）本明細書で説明した医薬組成物のいずれかと、（ｂ）ＦＧＦＲ３の過剰活性化に関連付けられる障害、たとえば、本明細書で説明したＦＧＦＲ３の過剰活性化に関連付けられる障害のいずれか、たとえば、軟骨無形成症、骨障害もしくは軟骨障害、たとえば、本明細書で説明した任意の骨格異形成症、たとえば、頭蓋骨癒合症（たとえば、ムエンケ症候群、クルーゾン症候群、アペール症候群、ジャクソン・ワイス症候群、プファイファー症候群、もしくはクルーゾン皮膚骨格症候群）、または血管平滑筋障害、たとえば、本明細書で説明した血管平滑筋障害のいずれかを治療すべく医薬組成物を被験体に投与するための説明書と、を含むキットを特徴とする。
【０１０３】
第２０の態様では、本発明は、（ａ）本明細書で説明した医薬組成物のいずれかと、（ｂ）骨、たとえば、骨伸長が奏効すると思われる本明細書で説明した任意の病態または障害の骨を伸長させるべく被験体に医薬組成物を投与するための説明書と、を含むキットを特徴とする。
【０１０４】
第２１の態様では、本発明は、被験体たとえばヒトにおいて、ＦＧＦＲ３の過剰活性化に関連付けられる障害、骨障害もしくは軟骨障害、または血管平滑筋障害を治療する方法であって、（ａ）本明細書で説明した第７、第８、第９、もしくは第１０の態様に係るポリペプチドと、（ｂ）薬学的に許容可能な賦形剤と、を含む治療上有効量の医薬組成物、または本明細書で説明した第１１の態様に係る治療上有効量の医薬組成物を被験体に投与することを含む方法を特徴とする。いくつかの実施形態では、それにより、被験体において、ＦＧＦＲ３の過剰活性化に関連付けられる障害、骨障害もしくは軟骨障害、または血管平滑筋障害が治療される。
【０１０５】
第２２の態様では、本発明は、被験体たとえばヒトにおいて骨を伸長させる方法であって、（ａ）本明細書で説明した第７、第８、第９、もしくは第１０の態様に係るポリペプチドと、（ｂ）薬学的に許容可能な賦形剤と、を含む治療上有効量の医薬組成物、または本明細書で説明した第１１の態様に係る治療上有効量の医薬組成物を被験体に投与することを含む方法を特徴とする。
【０１０６】
第２３の態様では、本発明は、被験体たとえばヒトにおいて、ＦＧＦＲ３の過剰活性化に関連付けられる障害、骨障害もしくは軟骨障害、または血管平滑筋障害を治療する方法であって、（ａ）本明細書で説明した第１４もしくは第１５の態様に係る単離された核酸分子と、（ｂ）薬学的に許容可能な賦形剤と、を含む治療上有効量の医薬組成物、または本明細書で説明した第１７の態様に係る治療上有効量の医薬組成物を被験体に投与することを含む方法を特徴とする。いくつかの実施形態では、それにより、被験体において、ＦＧＦＲ３の過剰活性化に関連付けられる障害、骨障害もしくは軟骨障害、または血管平滑筋障害が治療される。
【０１０７】
第２４の態様では、本発明は、被験体たとえばヒトにおいて骨を伸長させる方法であって、（ａ）本明細書で説明した第１４もしくは第１５の態様に係る単離された核酸分子と、（ｂ）薬学的に許容可能な賦形剤と、を含む治療上有効量の医薬組成物、または本明細書で説明した第１７の態様に係る治療上有効量の医薬組成物を被験体に投与することを含む方法を特徴とする。
【０１０８】
第２３および第２４の態様のいくつかの実施形態では、医薬組成物は、レンチウイルスベクターで被験体に投与される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、約０．１ｍｇ〜約１０ｍｇの単離された核酸の投与量で被験体に投与される。
【０１０９】
本明細書で説明した実施形態のいずれかでは、ポリペプチドは、単離されていても単離されていなくてもよい。
【０１１０】
本明細書で用いられる場合、「約」という用語は、記載値の±１０％を意味する。
【０１１１】
ｉｎ  ｖｉｖｏ薬動学的アッセイとの関連では、「曲線下面積」または「ＡＵＣ」とは、動物における投与後の血清中濃度ｖｓ時間曲線下の面積を意味する。
【０１１２】
「骨障害または軟骨障害」とは、骨または軟骨の機能、構造、または成長に影響を及ぼす任意の障害、疾患、または他の異常を意味する。
【０１１３】
「骨ターゲッティング部分」とは、骨ターゲッティング部分が、単独使用で、少なくとも１０−６Ｍまたはそれよりも良好な（たとえば、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、またはそれよりも良好な）骨基質に対するｉｎ  ｖｉｖｏ結合親和性を有するように、骨基質に対する十分な親和性を有する６〜２０アミノ酸残基長のアミノ酸配列を意味する。
【０１１４】
「カテプシン切断配列」とは、３０℃以上（たとえば３７℃）で少なくとも１０３Ｍ−１ｓ−１（たとえば、１０４Ｍ−１ｓ−１、１０５Ｍ−１ｓ−１、１０６Ｍ−１ｓ−１、１０７Ｍ−１ｓ−１、または１０８Ｍ−１ｓ−１）のｋｃａｔ／ｋＭ速度定数でカテプシンにより切断可能な部位を有するアミノ酸配列を意味する。特定の実施形態では、カテプシン切断配列は、カテプシンＫに特異的である。例示的カテプシン切断配列は、Ｐ２−Ｐ１−Ｐ１’であり、この場合、酵素による切断は、Ｐ１−Ｐ１’ペプチド結合で起こるであろう。また、Ｐ２は、好ましくは、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅからなるが、Ｖａｌ、ノルロイシン、Ｍｅｔ、またはＡｌａからなることも可能であり、Ｐ１は、好ましくは、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎであるが、ノルロイシン、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、またはＴｈｒも可能であり、かつＰ１’は、任意のアミノ酸でありうるが、好ましくはＧｌｙである。このほかのカテプシン切断配列は、Ｃｈｏｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１（１８）：１２８２４−８３２，２００６（参照により本明細書に組み込まれる）に提供されている。
【０１１５】
「ＣＮＰ２２」とは、とくに異なる意味が明示的に示されていないかぎり、ヒトＣＮＰ２２（配列番号４）を意味する。
【０１１６】
「ＣＮＰ５３」とは、とくに異なる意味が明示的に示されていないかぎり、ヒトＣＮＰ５３（配列番号１１）を意味する。
【０１１７】
「ＦＧＦＲ３の過剰活性化に関連付けられる障害」とは、ＦＧＦＲ３の過剰活性化、たとえば、機能獲得ＦＧＦＲ３突然変異に由来する過剰活性化により引き起こされるまたはそれに関連付けられる任意の障害、疾患、または他の異常、障害を意味する。
【０１１８】
「有効性」とは、用量−応答アッセイにおける化合物のＥｍａｘ値を意味する。
【０１１９】
「Ｆｃ」とは、免疫グロブリン重鎖のＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む、免疫グロブリン、たとえば、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３またはＩｇＧ−４の結晶性フラグメント領域を意味する。Ｆｃはまた、Ｆａｂ領域とＦｃ領域とを連結するヒンジ領域の任意の部分をも含みうる。Ｆｃは、ヒトを含む任意の哺乳動物のものが可能であり、かつ（たとえばグリコシル化により）翻訳後修飾が可能である。例として、Ｆｃは、配列番号４０１で示されるアミノ酸配列を有するヒトＩｇＧ−１の結晶性フラグメント領域でありうるが、これに限定されるものではない。
【０１２０】
「断片」とは、好ましくは、参照の核酸分子またはポリペプチドの全長の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上を含有する、ポリペプチドまたは核酸分子の一部を意味する。断片は、たとえば、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００ヌクレオチド、もしくはそれ以上（核酸分子の全長まで）、または１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００アミノ酸、もしくはそれ以上（ポリペプチドの全長まで）を含有しうる。例示的ＮＰ断片は、少なくともコンセンサスリングドメイン、たとえば、配列番号６、３０、または９５で示されるものを有し、かつ追加のＮ末端部分および／またはＣ末端部分を含んでいてもよい。
【０１２１】
「同族体」とは、参照のアミノ酸配列または核酸配列に対して少なくとも５０％の同一性を呈するポリペプチドまたは核酸分子を意味する。そのような配列は、一般的には、参照配列に対して、アミノ酸レベルまたは核酸レベルで、少なくとも、たとえば、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性である。一般的には、ポリペプチドでは、比較配列の長さは、少なくとも５アミノ酸、たとえば、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００アミノ酸、またはそれ以上（ポリペプチドの全長まで）でありうる。核酸では、比較配列の長さは、一般的には、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００ヌクレオチド、またはそれ以上（核酸分子の全長まで）でありうる。配列同一性を決定する目的では、ＤＮＡ配列をＲＮＡ配列と比較した場合、チミンヌクレオチドは、ウラシルヌクレオチドと等価なものとみなされる。
【０１２２】
本明細書で用いられる場合、ポリペプチド配列または核酸配列が参照配列に対して「少なくともＸ％の配列同一性」を有するものとして参照されるとき、ポリペプチドまたは核酸のアミノ酸またはヌクレオチドの少なくともＸパーセントは、配列が最適にアライメントされたときに参照配列のものと同一であることを意味する。配列の最適アライメントは、当該技術の範囲内の種々の方法、たとえば、スミス・ウォーターマンアライメントアルゴリズム（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５−７，１９８１）およびＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０，１９９０）により、決定可能である。これらのおよび他のアライメントアルゴリズムは、公的に利用可能なコンピューターソフトウェア、たとえば、ＧｅｎｅＭａｔｃｈｅｒ  ＰｌｕｓＴＭ（Ｓｃｈｗａｒｚ  ａｎｄ  Ｄａｙｈｏｆ，Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．，Ｅｄ  ｐｐ  ３５３−３５８，１９７９）に組み込まれた「Ｂｅｓｔ  Ｆｉｔ」（Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ，４８２−４８９，１９８１）、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＢＬＡＳＴ−Ｐ、ＢＬＡＳＴ−Ｎ、ＢＬＡＳＴ−Ｘ、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２、ＣＬＵＳＴＡＬ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）などにより利用可能である。それに加えて、当業者であれば、比較される配列の長さ全体にわたる最適アライメントを達成するのに必要とされる任意のアルゴリズムを含めて、アライメントを評価するのに適切なパラメーターを決定することが可能である。
【０１２３】
「ハイブリダイズする」とは、種々のストリンジェンシー条件下で相補的ポリヌクレオチド間またはその一部分間で二本鎖分子を形成するように対合することを意味する。（たとえば、Ｗａｈｌ，Ｇ．Ｍ．ａｎｄ  Ｓ．Ｌ．Ｂｅｒｇｅｒ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：３９９、Ｋｉｍｍｅｌ，Ａ．Ｒ．（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：５０７を参照されたい）。たとえば、高ストリンジェンシー塩濃度は、通常、約７５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび７５ｍＭクエン酸三ナトリウムよりも低く、約５００ｍＭ  ＮａＣｌおよび５０ｍＭクエン酸三ナトリウムよりも低く、または約２５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび２５ｍＭクエン酸三ナトリウムよりも低いであろう。低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、有機溶媒たとえばホルムアミドの不在下で達成可能であり、一方、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、少なくとも約３５％のホルムアミドまたは少なくとも約５０％のホルムアミドの存在下で達成可能である。高ストリンジェンシー温度条件は、通常、少なくとも約３０℃、３７℃、または４２℃の温度を含むであろう。さまざまな追加のパラメーター、たとえば、ハイブリダイゼーションの時間、界面活性剤たとえばドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の濃度、および担体ＤＮＡの組込みまたは排除は、当業者に周知である。必要に応じてこれらの種々の条件を組み合わせることにより、種々のストリンジェンシーレベルが達成される。一実施形態では、ハイブリダイゼーションは、７５０ｍＭ  ＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸三ナトリウム、および１％ＳＤＳ中、３０℃で行われるであろう。代替実施形態では、ハイブリダイゼーションは、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭクエン酸三ナトリウム、１％ＳＤＳ、３５％ホルムアミド、および１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）中、３７℃で行われるであろう。さらなる代替実施形態では、ハイブリダイゼーションは、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２５ｍＭクエン酸三ナトリウム、１％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、および２００μｇ／ｍｌ  ｓｓＤＮＡ中、４２℃で行われるであろう。これらの条件の有用な変更は、当業者には自明であろう。
【０１２４】
ほとんどの用途では、ハイブリダイゼーションに続く洗浄工程もまた、ストリンジェンシーがさまざまであろう。洗浄ストリンジェンシー条件は、塩濃度によりおよび温度により規定可能である。以上のように、洗浄ストリンジェンシーは、塩濃度を低下させることによりまたは温度を上昇させることにより増大可能である。たとえば、洗浄工程の高ストリンジェンシー塩濃度は、たとえば、約３０ｍＭ  ＮａＣｌおよび３ｍＭクエン酸三ナトリウムよりも低くてもよいし、または約１５ｍＭ  ＮａＣｌおよび１．５ｍＭクエン酸三ナトリウムよりも低くてもよい。洗浄工程の高ストリンジェンシー温度条件は、通常、たとえば、少なくとも約２５℃、４２℃、または６８℃の温度を含むであろう。一実施形態では、洗浄工程は、３０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭクエン酸三ナトリウム、および０．１％ＳＤＳ中、２５℃で行われるであろう。代替実施形態では、洗浄工程は、１５ｍＭ  ＮａＣｌ、１．５ｍＭクエン酸三ナトリウム、および０．１％ＳＤＳ中、４２℃で行われるであろう。さらなる代替実施形態では、洗浄工程は、１５ｍＭ  ＮａＣｌ、１．５ｍＭクエン酸三ナトリウム、および０．１％ＳＤＳ中、６８℃で行われるであろう。これらの条件のさらなる変更は、当業者には自明であろう。ハイブリダイゼーション技術は、当業者に周知であり、たとえば、Ｂｅｎｔｏｎ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｓ（Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９６：１８０，１９７７）、Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｈｏｇｎｅｓｓ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ７２：３９６１，１９７５）、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００１）、Ｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ（Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９８７，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、およびＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載されている。
【０１２５】
「単離された」または「精製された」とは、他の天然に付随する成分から分離されたことを意味される。典型的には、化合物（たとえば、ポリペプチド、核酸、もしくは小分子）、因子、細胞、または他の成分は、タンパク質、抗体、天然に存在する有機分子、および天然に会合している他の成分が、重量基準で、少なくとも、たとえば、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、さらには９９％除去された場合、単離されたとみなされる。いくつかの場合には、成分は、重量基準で、少なくとも７５％、９０％、さらには９９％の純度である。単離された成分は、化学合成、天然源由来の因子の分離、または成分を天然に産生しない組換え宿主細胞内での成分の産生により、取得可能である。タンパク質および小分子は、当業者であれば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２０００）に記載の技術などの標準的技術を用いて精製可能である。成分は、たとえば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、カラムクロマトグラフィー、光学濃度、ＨＰＬＣ分析、またはウェスタン分析（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａ）を用いて測定したとき、好ましくは、少なくとも、たとえば、出発物質の２、５、または１０倍の純度である。例示的精製方法は、カラムクロマトグラフィー法、免疫沈降法、および磁気ビーズ免疫アフィニティー精製法である。
【０１２６】
「ナトリウム利尿ペプチドレセプターＢのアゴニストであるナトリウム利尿ペプチド（「ＮＰ」と略記される）」とは、本明細書で説明したナトリウム利尿ペプチド、たとえば、ヒトＣＮＰ２２（配列番号４）、または標準的ＮＰＲ−Ｂ活性化アッセイ、たとえば、本明細書で説明した膜アッセイまたは全細胞アッセイで測定したとき、ＣＮＰ２２の効力の少なくとも０．０００００１、０．０００００５、０．００００１、０．００００５、０．０００１、０．０００５、０．００１、０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．５、０．９、または１倍、かつその有効性の少なくとも１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９５％、さらには１００％を有して、ＮＰＲ−Ｂ、たとえば、ヒトＮＰＲ−Ｂをアゴナイズ可能な、その変異体を意味する。変異型ＮＰは、ＣＮＰ２２に対して１つ以上の置換、付加、または欠失を含んで、ＮＰＲ−Ｂをアゴナイズする能力を有しうる。本明細書で説明したＮＰは、ＮＰがＮＰＲ−Ｂをアゴナイズする能力を有するかぎり、共有結合または非共有結合された任意の他の配列または部分を含んでいてもよい。
【０１２７】
「核酸分子」とは、２個以上の共有結合された天然に存在するまたは修飾されたヌクレオチドの配列を有する分子、たとえば、ＲＮＡまたはＤＮＡを意味する。核酸分子は、たとえば、単一鎖または二本鎖であってもよく、かつ修飾型もしくは非修飾型のヌクレオチドまたはそれらの混合物もしくは組合せを含んでいてもよい。また、種々の塩、混合塩、および遊離酸形も含まれる。
【０１２８】
「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」という用語は、同義的に用いられ、翻訳後修飾（たとえば、グリコシル化またはリン酸化）の有無を問わず、本明細書で説明した天然に存在するまたは天然に存在しないポリペプチドまたはペプチドの全部または一部を構成する２個以上の天然または非天然アミノ酸の任意の鎖を意味する。
【０１２９】
本明細書で用いられる場合、天然アミノ酸とは、Ｌ配置を有する天然α−アミノ酸、たとえば、天然ポリペプチド中に通常存在するアミノ酸のことである。非天然アミノ酸とは、ポリペプチド中に通常存在しないアミノ酸、たとえば、Ｌ配置を有する天然α−アミノ酸のエピマー、すなわち、非天然Ｄ配置を有するアミノ酸、またはそれらの（Ｄ，Ｌ）−異性体混合物、あるいはそのようなアミノ酸の同族体、たとえば、β−アミノ酸、α，α−二置換アミノ酸、またはアミノ酸側鎖が１もしくは２個のメチレン基だけ短縮されたもしくは１０個の炭素原子まで延長されたα−アミノ酸、たとえば、直鎖中に５個から１０個まで（両端値を含む）の炭素原子を有するα−アミノアルカン酸、無置換もしくは置換芳香族（α−アリールもしくはα−アリール低級アルキル）、たとえば、置換フェニルアラニンもしくはフェニルグリシンを意味する。
【０１３０】
「薬学的に許容可能な担体」または「薬学的に許容可能な賦形剤」とは、一緒に投与される化合物の治療性を維持しながら治療患者に生理学的に許容可能な担体または賦形剤を意味する。例示的な薬学的に許容可能な担体物質の１つは、生理食塩水である。他の生理学的に許容可能な担体およびその製剤は、当業者に公知であり、たとえば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，（２０ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ），ｅｄ．Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ，２０００，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡに記載されている。
【０１３１】
「医薬組成物」とは、薬学的に許容可能な賦形剤と共に製剤化された本明細書で説明したポリペプチドまたは核酸分子を含有する、かつ被験体において疾患またはイベントを治療または予防すべく治療レジメンの一部として政府規制機関の承認を得て製造または販売される、組成物を意味する。医薬組成物は、たとえば、皮下投与に供すべく、静脈内投与に供すべく（たとえば、粒状塞栓を含まない無菌溶液としておよび静脈内使用に好適な溶媒系で）、経口投与に供すべく（たとえば、錠剤、カプセル剤、カプレット剤、ゲルキャップ剤、もしくはシロップ剤）、または本明細書で説明した任意の他の製剤、たとえば、ユニット製剤の形で、製剤化可能である。
【０１３２】
「骨格異形成症」とは、低身長症または矮小発育症により特徴付けられる骨障害または軟骨障害を意味する。
【０１３３】
「効力」とは、用量−応答アッセイにおける化合物のＥＣ５０値の逆数を意味する。化合物と対照との間またはアッセイと対照アッセイとの間で効力を比較する場合、低減された効力は、対照または対照アッセイのＥＣ５０値と比較して、増大されたＥＣ５０値を示し、増大された効力は、低減されたＥＣ５０値を示す。
【０１３４】
「低減された分解性」とは、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、６０、１２０、１８０、もしくは２４０分間またはそれ以上あるいはこれらの値の任意の２つの間の任意の範囲にわたり酵素に暴露した後、分解されたペプチドのパーセントが、分解された対照、たとえば、ＣＮＰ２２、ＣＮＰ５３、または本明細書で説明した任意のポリペプチド、たとえば、国際公開第２０１０／１３５５４１号パンフレットまたは米国特許出願公開第２０１０−０３３１２５６号明細書に記載のペプチドのパーセントと比較して、より低いことを意味する。分解されたペプチドのパーセントは、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％低くなりうる。この場合、分解されたペプチドのパーセントは、酵素（たとえば、中性エンドペプチダーゼ、インスリン分解酵素、およびｉｎ  ｖｉｖｏでナトリウム利尿ペプチドを切断する任意の他の酵素）に暴露した後、残存するペプチドのパーセントを測定してから残存するペプチドのこのパーセントを１００％から引き算して、分解されたペプチドのパーセントを直接的または間接的に測定することにより、決定可能である。分解されたペプチドまたは残存するペプチドのパーセントは、任意の有用な方法、たとえば、液体クロマトグラフィー法（たとえば、高性能液体クロマトグラフィー法（ＨＰＬＣ））、質量分析法（ＭＳ）、または組合せ分析技術（たとえば、ＬＣ−ＭＳ）により、測定可能である。
【０１３５】
「低減された用量依存的副作用」とは、対照（たとえば、本明細書で説明した任意のポリペプチド、たとえば、国際公開第２０１０／１３５５４１号パンフレットまたは米国特許出願公開第２０１０−０３３１２５６号明細書に記載のペプチド）と比較して、化合物の投与量の関数としての１つ以上の有害作用が低減されることを意味する。１つ以上の有害作用の低減は、有害作用を検出するのに有用な任意のアッセイにより決定したとき、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％でありうる。例示的有害作用は、血行力学的作用、たとえば、有害な低血圧作用を引き起こす血圧の低下、たとえば、収縮期動脈血圧、拡張期動脈血圧、または平均動脈血圧の低下を含み、そのような血行力学的作用を検出するアッセイは、血圧計または留置圧力トランスデューサーを含む。
【０１３６】
「ＮＰＲ−Ａに対してよりもＮＰＲ−Ｂに対して選択性が高い」とは、本明細書で説明したように、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ用量−応答アッセイで、たとえば、ｃＧＭＰ産生の測定で、少なくとも１．２５、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、７．５、１０、１２．５、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１２５、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１，０００、１，１００、１，２００、１，２５０、１，３００、１，４００、１，５００、１，７５０、２，０００、２，５００、３，０００、４，０００、５，０００、１０，０００、もしくはそれ以上またはこれらの値の任意の２つの間の任意の範囲であるＥＣ５０（ＮＰＲ−Ａ）／ＥＣ５０（ＮＰＲ−Ｂ）比を有することを意味する。他の選択肢としてまたは追加として、「ＮＰＲ−Ａに対してよりもＮＰＲ−Ｂに対して選択性が高い」という用語は、本明細書で説明したように、少なくとも１．１、１．２、１．２５、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．７５、１．８、１．９、２、２．２５、２．５、２．７５、３、３．５、４、４．５、５、７．５、１０、１２．５、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１２５、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１，０００、１，１００、１，２００、１，２５０、１，３００、１，４００、１，５００、１，７５０、２，０００、２，５００、３，０００、４，０００、５，０００、１０，０００、もしくはそれ以上またはこれらの値の任意の２つの間の任意の範囲であるＡＵＣ（ＮＰＲ−Ｂ）／ＡＵＣ（ＮＰＲ−Ａ）比を有することを意味する。
【０１３７】
「シグナルペプチド」または「シグナル配列」とは、ポリペプチドが分泌されるようにポリペプチドを細胞膜に方向付けるアミノ酸配列を意味する。他の選択肢として、シグナル配列は、ポリペプチドを細胞内区画またはオルガネラたとえばゴルジ装置に方向付け可能である。シグナル配列は、ポリペプチドを細胞の特定の領域にターゲッティングする既知の機能を有するペプチド配列との相同性または生物学的活性により同定可能である。当業者であれば、容易に利用可能なソフトウェア（たとえば、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒ，１７１０  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｖｅｎｕｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ  ５３７０５、ＢＬＡＳＴ、またはＰＩＬＥＵＰ／ＰＲＥＴＴＹＢＯＸプログラム）を用いて、シグナル配列を同定することが可能である。シグナル配列は、たとえば、配列番号５０１のアミノ酸１〜２５と実質的に同一のものでありうる。
【０１３８】
「被験体」とは、ヒトまたは非ヒト哺乳動物、たとえば、ウシ科動物、ウマ科動物、イヌ科動物、ヒツジ科動物、またはネコ科動物を含む哺乳動物を意味するが、これらに限定されるものではない。
【０１３９】
「治療上有効量」とは、ＦＧＦＲ３の過剰活性化に関連付けられる障害、骨障害もしくは軟骨障害（たとえば軟骨無形成症）、または血管平滑筋障害の任意の症状を実質的に治療、予防、遅延、抑制、または阻止するのに十分な、あるいは骨を実質的に伸長させるのに十分な、本明細書で説明したポリペプチドまたは核酸分子の量を意味する。本明細書で説明した組成物の治療上有効量は、治療される疾患の重症度、ならびに被験体の病態、体量、および全身状態に依存しうる。また、当業者であれば、そのような因子を考慮して、それを決定することが可能である。本明細書で説明した組成物の治療上有効量は、一定期間にわたり被験体に単回用量で投与可能であり、または複数回用量で投与可能である。
【０１４０】
「治療」（”ｔｒｅａｔｉｎｇ””ｔｒｅａｔ””ｔｒｅａｔｍｅｎｔ”）とは、たとえば、医薬組成物を投与することによる、ＦＧＦＲ３の過剰活性化に関連付けられる障害、骨障害もしくは軟骨障害（たとえば軟骨無形成症）、または血管平滑筋障害の治癒、寛解、安定化、可能性減少、または予防を目的とした患者の医療管理、あるいは骨の伸長を目的とした健常被験体の管理を意味する。この用語は、積極療法、すなわち、疾患、病態、障害、もしくはイベントの改善をとくに目指した治療、またはその治癒に関連付けられる治療を含み、さらには、原因療法、すなわち、関連する疾患、病態、障害、もしくはイベントの原因の除去を目指した治療をも含む。それに加えて、この用語は、待期療法、すなわち、疾患、病態、障害、またはイベントの治癒ではなく、症状の軽減を意図した治療、対症療法、すなわち、関連する疾患、病態、障害、またはイベントの全身症状に対処する治療、予防療法、すなわち、たとえば、まだ病気でないが、特定の疾患、病態、障害、またはイベントに罹患しやすい、さもなければその危険性のある患者において、関連する疾患、病態、障害、またはイベントの発生の最小化または部分的もしくは完全な抑制を目指した治療、および支持療法、すなわち、関連する疾患、病態、障害、またはイベントの改善を目指した他の特異療法を補足すべく利用される治療を含む。
【０１４１】
「血管平滑筋障害」とは、血管平滑筋の機能、構造、または成長に影響を及ぼす任意の障害、疾患、または他の異常を意味する。
【０１４２】
「ベクター」とは、ＤＮＡ断片の挿入またはクローニングが可能なＤＮＡ分子、通常、プラスミドまたはバクテリオファージに由来するものを意味する。組換えベクターは、１つ以上の特有の制限部位を含有するであろう。また、クローン化配列が複製できるように、規定の宿主生物または媒体生物において自律複製が可能でありうる。ベクターは、レシピエント細胞へのトランスフェクト時にＲＮＡが発現されるように、遺伝子領域またはコード領域に機能可能に連結されたプロモーターを含有する。
【０１４３】
本発明の他の特徴および利点は、詳細な説明からおよび特許請求の範囲から明らかであろう。
【０１４４】
多重配列アライメントを示す図中、「＊」は同一性を表し、「：」は保存置換を表し、かつ「．」は半保存置換を表す。
【図面の簡単な説明】
【０１４５】
【図１】図１は、ヒトＡＮＰ（配列番号１）、ヒトウロジラチン（配列番号２）、ヒトＢＮＰ（配列番号３）、ヒトＣＮＰ２２（配列番号４）、およびＤＮＰ（配列番号５）の多重配列アライメントである。各ナトリウム利尿ペプチドの１７アミノ酸リングドメインは、ボールド体で示され、四角で囲まれている。コンセンサス配列（配列番号６）は、下側に示されており、ここで、各Ｘは、任意のアミノ酸を表し、またはオプションとして配列番号１〜５のうちの１つの対応する位置の任意のアミノ酸を表す。
【図２】図２は、ヒトＣＮＰ５３（配列番号１１）、ヒトＣＮＰ２２、およびヒトＣＮＰ（リングドメインのみ）（配列番号１２）のアライメントである。
【図３】図３は、種々のＣＮＰ２２同族体の多重配列アライメントである。各ＮＰの１７アミノ酸リングドメインは、ボールド体で示され、四角で囲まれている。コンセンサス配列（配列番号３０）は、下側に示されており、ここで、リングドメイン内の各Ｘは、任意のアミノ酸を表し、またはオプションとして配列番号４および１３〜２９のうちの１つの対応する位置の任意のアミノ酸を表す。リングドメイン外の各Ｘは、任意のアミノ酸を表しもしくは不在であってもよく、またはオプションとして配列番号４および１３〜２９のうちの１つの対応する位置の任意のアミノ酸を表す。
【図４Ａ】図４Ａ〜４Ｇは、種々のＣＮＰ同族体の多重配列アライメントであり、いくつかの場合には、Ｎ末端のプレ配列およびプロ配列を含む。各ＮＰの１７アミノ酸リングドメインは、ボールド体で示され、四角で囲まれている。コンセンサス配列（配列番号９５）は、下側に示されており、ここで、各Ｘは、任意のアミノ酸を表し、またはオプションとして配列番号３１〜９４のうちの１つの対応する位置の任意のアミノ酸を表す。
【図４Ｂ】図４Ａ〜４Ｇは、種々のＣＮＰ同族体の多重配列アライメントであり、いくつかの場合には、Ｎ末端のプレ配列およびプロ配列を含む。各ＮＰの１７アミノ酸リングドメインは、ボールド体で示され、四角で囲まれている。コンセンサス配列（配列番号９５）は、下側に示されており、ここで、各Ｘは、任意のアミノ酸を表し、またはオプションとして配列番号３１〜９４のうちの１つの対応する位置の任意のアミノ酸を表す。
【図４Ｃ】図４Ａ〜４Ｇは、種々のＣＮＰ同族体の多重配列アライメントであり、いくつかの場合には、Ｎ末端のプレ配列およびプロ配列を含む。各ＮＰの１７アミノ酸リングドメインは、ボールド体で示され、四角で囲まれている。コンセンサス配列（配列番号９５）は、下側に示されており、ここで、各Ｘは、任意のアミノ酸を表し、またはオプションとして配列番号３１〜９４のうちの１つの対応する位置の任意のアミノ酸を表す。
【図４Ｄ】図４Ａ〜４Ｇは、種々のＣＮＰ同族体の多重配列アライメントであり、いくつかの場合には、Ｎ末端のプレ配列およびプロ配列を含む。各ＮＰの１７アミノ酸リングドメインは、ボールド体で示され、四角で囲まれている。コンセンサス配列（配列番号９５）は、下側に示されており、ここで、各Ｘは、任意のアミノ酸を表し、またはオプションとして配列番号３１〜９４のうちの１つの対応する位置の任意のアミノ酸を表す。
【図４Ｅ】図４Ａ〜４Ｇは、種々のＣＮＰ同族体の多重配列アライメントであり、いくつかの場合には、Ｎ末端のプレ配列およびプロ配列を含む。各ＮＰの１７アミノ酸リングドメインは、ボールド体で示され、四角で囲まれている。コンセンサス配列（配列番号９５）は、下側に示されており、ここで、各Ｘは、任意のアミノ酸を表し、またはオプションとして配列番号３１〜９４のうちの１つの対応する位置の任意のアミノ酸を表す。
【図４Ｆ】図４Ａ〜４Ｇは、種々のＣＮＰ同族体の多重配列アライメントであり、いくつかの場合には、Ｎ末端のプレ配列およびプロ配列を含む。各ＮＰの１７アミノ酸リングドメインは、ボールド体で示され、四角で囲まれている。コンセンサス配列（配列番号９５）は、下側に示されており、ここで、各Ｘは、任意のアミノ酸を表し、またはオプションとして配列番号３１〜９４のうちの１つの対応する位置の任意のアミノ酸を表す。
【図４Ｇ】図４Ａ〜４Ｇは、種々のＣＮＰ同族体の多重配列アライメントであり、いくつかの場合には、Ｎ末端のプレ配列およびプロ配列を含む。各ＮＰの１７アミノ酸リングドメインは、ボールド体で示され、四角で囲まれている。コンセンサス配列（配列番号９５）は、下側に示されており、ここで、各Ｘは、任意のアミノ酸を表し、またはオプションとして配列番号３１〜９４のうちの１つの対応する位置の任意のアミノ酸を表す。
【図５】図５は、オプションのＮ末端伸長部、オプションのショートセグメント、所要のリングドメイン、およびオプションのＣ末端伸長部を含む、本明細書で説明したナトリウム利尿ペプチドの構造の概略図である。
【図６】図６は、ヒトＩｇＧ−１由来の例示的Ｆｃのアミノ酸配列（配列番号４０１）のリストである。
【図７】図７Ａ〜７Ｅ、例示的なＦｃ−ＮＰ構築物またはＮＰ−Ｆｃ構築物の概略図である。図７Ａは、Ｆｃ−ＮＰ二量体を示している。図７Ｂは、ＮＰ−Ｆｃ二量体を示している。図７Ｃは、Ｆｃ：Ｆｃ−ＮＰ単量体−二量体ハイブリッドを示している。図７Ｄは、ＮＰ−Ｆｃ：Ｆｃ単量体−二量体ハイブリッドを示している。図７Ｅは、ＮＰ−Ｆｃ：Ｆｃ−ＮＰハイブリッド二量体を示している。
【図８Ａ】図８Ａは、タンパク質領域のまとめを提供する表と一緒になった、未成熟ＮＣ２  Ｓｔｒｅｐｔａｇ（「ＮＣ２ｓｔ」）融合タンパク質のアミノ酸配列（配列番号５０１）のリストである。翻訳時に切断されるＮ末端シグナル配列は、下線が付されている。種々のリンカー配列は、イタリック体で示されている。Ｆｃドメインは、ボールド体で示されている。ＣＮＰドメインは、灰色強調表示で示されている。
【図８Ｂ】図８Ｂは、シグナル配列無しのＮＣ２ｓｔ融合タンパク質のアミノ酸配列（配列番号５０２）のリストである。
【図８Ｃ】図８Ｃは、ＮＣ２ｓｔ融合タンパク質をコードする核酸配列（配列番号８０１）のリストである。
【図９】図９は、マウスへの静脈内投与後および皮下投与後のＮＣ２ｓｔのノンコンパートメント薬動学的パラメーターを解析するマウス試験の結果を示すグラフである。
【図１０】図１０は、ＥＣ５０、ＣＮＰを基準にしたＥＣ５０比、％有効性、および％ＡＵＣの平均値を示す表と一緒になった、ＣＮＰおよびＮＣ２ｓｔの１５回のＮＰＲ−Ｂ全細胞用量−応答アッセイの平均の結果を示すグラフである。また、５０％および１００％軟骨無形成症表現型修正を達成するのに必要なＣＮＰレベル（たとえば、Ｙａｓｏｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １５０：３１３８−３１４４，２００９（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）ならびに５０％および１００％軟骨無形成症表現型修正を達成すると予想される対応する予測血中ＮＣ２ｓｔ濃度レベルを示す表も示されている。
【図１１】図１１は、二回用量、すなわち、毎日２回１０ｍｇ／ｋｇおよび毎日２回１００ｍｇ／ｋｇでのＮＣ２ｓｔの用量レジメンシミュレーションを示すグラフである。
【図１２Ａ】図１２Ａ〜１２Ｈは、Ｆｇｆｒ３３６９／＋マウスにおける有効性試験の結果をまとめたものである。各図は、データの統計解析を示す対応する表と一緒になった、剖検後の種々の測定の結果を示す１つまたは２つのチャートを含む。図１２Ａは、剖検後の頭臀長測定の結果を示している。
【図１２Ｂ】図１２Ａ〜１２Ｈは、Ｆｇｆｒ３３６９／＋マウスにおける有効性試験の結果をまとめたものである。各図は、データの統計解析を示す対応する表と一緒になった、剖検後の種々の測定の結果を示す１つまたは２つのチャートを含む。図１２Ｂは、剖検後の脛骨長測定の結果を示している。
【図１２Ｃ】図１２Ａ〜１２Ｈは、Ｆｇｆｒ３３６９／＋マウスにおける有効性試験の結果をまとめたものである。各図は、データの統計解析を示す対応する表と一緒になった、剖検後の種々の測定の結果を示す１つまたは２つのチャートを含む。図１２Ｃは、剖検後の大腿骨長測定の結果を示している。
【図１２Ｄ】図１２Ａ〜１２Ｈは、Ｆｇｆｒ３３６９／＋マウスにおける有効性試験の結果をまとめたものである。各図は、データの統計解析を示す対応する表と一緒になった、剖検後の種々の測定の結果を示す１つまたは２つのチャートを含む。図１２Ｄは、剖検後の頸肛門測定の結果を示している。
【図１２Ｅ】図１２Ａ〜１２Ｈは、Ｆｇｆｒ３３６９／＋マウスにおける有効性試験の結果をまとめたものである。各図は、データの統計解析を示す対応する表と一緒になった、剖検後の種々の測定の結果を示す１つまたは２つのチャートを含む。図１２Ｅは、剖検後の頸椎長測定の結果を示している。
【図１２Ｆ】図１２Ａ〜１２Ｈは、Ｆｇｆｒ３３６９／＋マウスにおける有効性試験の結果をまとめたものである。各図は、データの統計解析を示す対応する表と一緒になった、剖検後の種々の測定の結果を示す１つまたは２つのチャートを含む。図１２Ｆは、剖検後の胸椎長測定の結果を示している。
【図１２Ｇ】図１２Ａ〜１２Ｈは、Ｆｇｆｒ３３６９／＋マウスにおける有効性試験の結果をまとめたものである。各図は、データの統計解析を示す対応する表と一緒になった、剖検後の種々の測定の結果を示す１つまたは２つのチャートを含む。図１２Ｇは、剖検後の腰椎長測定の結果を示している。
【図１２Ｈ】図１２Ａ〜１２Ｈは、Ｆｇｆｒ３３６９／＋マウスにおける有効性試験の結果をまとめたものである。各図は、データの統計解析を示す対応する表と一緒になった、剖検後の種々の測定の結果を示す１つまたは２つのチャートを含む。図１２Ｈは、剖検後の胸骨長測定の結果を示している。
【図１３】図１３は、ＮＣ２ｓｔでスパイクされた血清（左側）、ならびに媒体（Ｖｅ）投与マウス、野生型（ＷＴ）マウス、Ｔｘ１０投与マウス、およびＴｘ１００投与マウスに由来する血清（右側）を用いたｃＧＭＰアッセイの結果間の相関を示すチャートである。
【図１４】図１４は、Ｔｘ１０グループ（左側）およびＴｘ１００グループ（右側）のマウスの血液サンプル中に存在するＮＣ２ｓｔの活性濃度を示す一対のチャートである。
【図１５Ａ】図１５Ａは、シグナル配列有り（配列番号５０３）およびシグナル配列無し（配列番号５０４）の両方のＮＣ２Ｂアミノ酸配列、ならびにシグナル配列有り（配列番号６０７）およびシグナル配列無し（配列番号６０８）の両方のＤ１０タグ付きＤ１０−ＮＣ２アミノ酸配列のリストである。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、ＮＣ２Ｂをコードする核酸配列（配列番号８０２）のリストである。
【図１６Ａ】図１６Ａは、シグナル配列有り（それぞれ、配列番号５０５、５０７、および５０９）およびシグナル配列無し（それぞれ、配列番号５０６、５０８、および５１０）の両方の、ＮＣ２Ｂ−２２、ＮＣ２Ｂ−２８、およびＮＣ２Ｂ−３４のアミノ酸配列のリストである。シグナル配列は、下線が付されている。Ｆｃドメインは、ボールド体で示されている。リンカー配列は、イタリック体で示されている。ＣＮＰドメインは、灰色強調表示で示されている。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、ＮＣ２Ｂ−２２をコードする核酸配列（配列番号８０３）のリストである。
【図１６Ｃ】図１６Ｃは、ＮＣ２Ｂ−２８をコードする核酸配列（配列番号８０４）のリストである。
【図１６Ｄ】図１６Ｄは、ＮＣ２Ｂ−３４をコードする核酸配列（配列番号８０５）のリストである。
【図１７】図１７は、ＥＣ５０値を示す表と一緒になった、ＣＮＰ、ＮＣ２ｓｔ、ＮＣ２Ｂ−２２、ＮＣ２Ｂ−２８、およびＮＣ２Ｂ−３４のＮＰＲ−Ｂ全細胞用量−応答アッセイの結果を示すグラフである。
【図１８】図１８は、シグナル配列有り（それぞれ、配列番号５１１および５１３）およびシグナル配列無し（それぞれ、配列番号５１２および５１４）の両方のＮＣ２−ＫＧＡＮＫＫおよびＮＣ２−ＫＧＡＮＱＫのアミノ酸配列のリストである。シグナル配列は、下線が付されている。Ｆｃドメインは、ボールド体で示されている。リンカー配列は、イタリック体で示されている。ＣＮＰドメインは、灰色強調表示で示されている。
【図１９】図１９は、シグナル配列有り（配列番号５１５）およびシグナル配列無し（配列番号５１６）の両方のＮＣ２−ＣＮＰ５３ｍｕｔ２のアミノ酸配列のリストである。シグナル配列は、下線が付されている。Ｆｃドメインは、ボールド体で示されている。リンカー配列は、イタリック体で示されている。ＣＮＰドメインは、灰色強調表示で示されている。
【図２０】図２０は、シグナル配列有り（それぞれ、配列番号５１７および５１９）およびシグナル配列無し（それぞれ、配列番号５１８および５２０）の両方の、Ｆｃ−ＣＮＰ５３−Ａ（Ｆｃ−ＣＮＰ５３ｗｔとしても参照される）およびＦｃ−ＣＮＰ５３−ＡＡＡ（Ｆｃ−ＣＮＰ５３ｍｕｔとしても参照される）のアミノ酸配列のリストである。シグナル配列は、下線が付されている。Ｆｃドメインは、ボールド体で示されている。リンカー配列は、イタリック体で示されている。ＣＮＰドメインは、灰色強調表示で示されている。
【図２１Ａ】図２１Ａは、ＥＣ５０値、ＣＮＰを基準にしたＥＣ５０比、％有効性、および％ＡＵＣを示す表と一緒になった、ＮＰＲ−Ｂ膜アッセイでのＣＮＰ、Ｆｃ−ＣＮＰ５３−Ａ（Ｆｃ−ＣＮＰ５３ｗｔとしても参照される）、およびＦｃ−ＣＮＰ５３−ＡＡＡ（Ｆｃ−ＣＮＰ５３ｍｕｔとしても参照される）の一組の用量−応答曲線である。
【図２１Ｂ】図２１Ｂは、ＥＣ５０値、ＣＮＰに関するＥＣ５０比、％有効性、および％ＡＵＣを示す表と一緒になった、ＮＰＲ−Ｂ膜アッセイでのＣＮＰ、ＮＣ２ｓｔ、Ｆｃ−ＣＮＰ５３−Ａ、およびＦｃ−ＣＮＰ５３−ＡＡＡの一組の用量−応答曲線である。
【図２１Ｃ】図２１Ｃは、ＥＣ５０値、ＣＮＰに関するＥＣ５０比、％有効性、および％ＡＵＣを示している表と一緒になった、ＮＰＲ−Ｂ全細胞アッセイでのＣＮＰ、ＮＣ２ｓｔ、Ｆｃ−ＣＮＰ５３−Ａ、およびＦｃ−ＣＮＰ５３−ＡＡＡの一組の用量−応答曲線である。
【図２２】図２２は、種々のＮＰおよび同族体（ＣＤＮＰを含む）の多重配列アライメントである。四角で囲まれた領域は、ＮＰＲＡ結合ペプチド中のＤＮＰテールの最も保存された領域である。多くのＣＤＮＰ変異体の配列は、図の下半分に示され、ＤＮＰ  Ｃ末端テールのコンセンサス配列（配列番号１１８）もまた、示されている。コンセンサス配列中の各Ｘは、任意のアミノ酸を表し、またはオプションとして配列番号１００〜１１６のうちの１つの対応する位置の任意のアミノ酸を表す。
【図２３】図２３は、ＣＮＰ、ＣＤＮＰ、ＣＤＮＰ−Ｎ１、ＣＤＮＰ−Ｋ１、ＣＤＮＰ−Ｈ１、およびＣＤＮＰ−Ｇ１のＮＥＰ分解アッセイの結果を示すグラフである。
【図２４Ａ】図２４Ａは、ＮＰＲ−Ｂ膜アッセイで試験したときのＣＤＮＰおよびいくつかの変異体（ＣＤＮＰ−Ａ４、ＣＤＮＰ−Ａ５、ＣＤＮＰ−Ｓ３Ａ４、ＣＤＮＰ−Ａ４Ａ５、ＣＤＮＰ−Ｓ３Ａ５、およびＣＤＮＰ−Ｓ３Ａ４Ａ５）の一組の用量−応答曲線である。
【図２４Ｂ】図２４Ｂは、ＮＰＲ−Ｂ膜アッセイで試験したときのＣＤＮＰ（２回試験）、ＣＤＮＰ−Ｓ３Ａ４、およびＣＤＮＰ−Ｓ３Ａ４Ａ５の追加の一組の用量−応答曲線である。
【図２４Ｃ】図２４Ｃは、ＮＰＲ−Ａ膜アッセイで試験したときのＣＤＮＰおよびいくつかの変異体（ＣＤＮＰ−Ａ４、ＣＤＮＰ−Ａ５、ＣＤＮＰ−Ｓ３Ａ４、ＣＤＮＰ−Ａ４Ａ５、ＣＤＮＰ−Ｓ３Ａ５、およびＣＤＮＰ−Ｓ３Ａ４Ａ５）の一組の用量−応答曲線である。
【図２４Ｄ】図２４Ｄは、ＮＰＲ−Ａ膜アッセイで試験したときのＣＤＮＰ（２回試験）、ＣＤＮＰ−Ｓ３Ａ４、およびＣＤＮＰ−Ｓ３Ａ４Ａ５の追加の一組の用量−応答曲線である。
【図２５】図２５は、１８０分後の残存インタクト分子のパーセントを示す表と一緒になった、ＣＮＰおよび３つの変異体（ＣＤＮＰ−Ｓ３Ａ４Ａ５（ＣＤＮＰｓａａ）、ＣＤＮＰ−Ｓ３Ａ５（ＣＤＮＰｓｒａ）、およびＣＤＮＰ−Ｓ３Ａ４（ＣＤＮＰｓａｄ））のＮＥＰ分解アッセイの結果を示すグラフである。
【図２６Ａ】図２６Ａは、ＣＮＰ−１６ＡＡリンカー−Ｆｃ−Ｈｉｓ１０（ＮＣ１）（配列番号５２１）、ＣＮＰ−６ＡＡリンカー−Ｆｃ−Ｈｉｓ１０（ＮＣ３）（配列番号５２２）、ＣＮＰ−６ＡＡリンカー−Ｆｃ（配列番号５２３）、ＣＤＮＰ−Ｆｃ（配列番号５２４）、ＣＤＮＰ−Ａ１７ｓａａ−Ｆｃ（配列番号５２５）、およびＣＤＮＰ−Ａ１７ｓｒａ−Ｆｃ（配列番号５２６）のアミノ酸配列のリストである。ＣＮＰドメインは、灰色強調表示で示されている。リンカー配列は、イタリック体で示されている。Ｆｃドメインは、ボールド体で示されている。
【図２６Ｂ】図２６Ｂは、ＮＣ１の核酸配列（配列番号８０６）のリストである。
【図２７Ａ】図２７Ａは、ＥＣ５０値、ＣＮＰを基準にしたＥＣ５０比、％有効性、および％ＡＵＣを示す表と一緒になった、ＮＰＲ−Ｂ膜アッセイで試験したときのＣＮＰ、ＣＤＮＰ、およびＣＤＮＰ−Ｆｃの一組の用量−応答曲線である。
【図２７Ｂ】図２７Ｂは、ＥＣ５０値、ＣＮＰを基準にしたＥＣ５０比、％有効性、および％ＡＵＣを示す表と一緒になった、ＮＰＲ−Ｂ膜アッセイで試験したときのＣＮＰおよびＣＤＮＰ−Ｆｃの一組の用量−応答曲線である。
【図２７Ｃ】図２７Ｃは、ＥＣ５０値、ＡＮＰを基準にしたＥＣ５０比、％有効性、および％ＡＵＣを示す表と一緒になった、ＮＰＲ−Ａ膜アッセイで試験したときのＡＮＰ、ＣＮＰ、ＣＤＮＰ、およびＣＤＮＰ−Ｆｃの一組の用量−応答曲線である。
【図２８Ａ】図２８Ａは、ＥＣ５０値、ＣＮＰを基準にしたＥＣ５０比、％有効性、および％ＡＵＣを示す表と一緒になった、ＮＰＲ−Ｂ全細胞ｃＧＭＰアッセイで試験したときのＣＮＰ、ＣＤＮＰ−（Ａ１７）Ｓ３Ａ４Ａ５−Ｆｃ、およびＣＤＮＰ−（Ａ１７）Ｓ３Ａ５−Ｆｃの一組の用量−応答曲線である。
【図２８Ｂ】図２８Ｂは、ＥＣ５０値、ＡＮＰを基準にしたＥＣ５０比、％有効性、および％ＡＵＣを示す表と一緒になった、ＮＰＲ−Ａ全細胞ｃＧＭＰアッセイで試験したときのＡＮＰ、ＣＤＮＰ−（Ａ１７）Ｓ３Ａ４Ａ５−Ｆｃ、およびＣＤＮＰ−（Ａ１７）Ｓ３Ａ５−Ｆｃの一組の用量−応答曲線である。
【図２９】図２９は、コンセンサス配列（配列番号１２６）と一緒になった、ＣＮＰ２２の位置１７の突然変異をそれぞれ有する種々の点突然変異体（配列番号１１９〜１２５）のリストである。Ｘは、任意のアミノ酸を表し、またはオプションとして配列番号１１９〜１２５のうちの１つの対応する位置の任意のアミノ酸を表す。
【図３０】図３０は、ＥＣ５０値および％有効性値を示す表と一緒になった、ＮＰＲ−Ｂ全細胞ｃＧＭＰアッセイで試験したときのＣＮＰおよびいくつかの変異体（ＣＮＰ−Ｆ１７、ＣＮＰ−Ｌ１７、ＣＮＰ−Ｉ１７、ＣＮＰ−Ｔ１７、およびＣＮＰ−Ｖ１７）の一組の用量−応答曲線である。
【図３１】図３１は、いくつかのＣＮＰ変異体のアミノ酸配列のリストである。各変異体の１７アミノ酸リングドメインは、ボールド体で示されている。リンカー領域は、イタリック体で示されている。
【図３２Ａ】図３２Ａ〜３２Ｅは、追加のＣＮＰ変異体のアミノ酸配列のリストである。
【図３２Ｂ】図３２Ａ〜３２Ｅは、追加のＣＮＰ変異体のアミノ酸配列のリストである。
【図３２Ｃ】図３２Ａ〜３２Ｅは、追加のＣＮＰ変異体のアミノ酸配列のリストである。
【図３２Ｄ】図３２Ａ〜３２Ｅは、追加のＣＮＰ変異体のアミノ酸配列のリストである。
【図３２Ｅ】図３２Ａ〜３２Ｅは、追加のＣＮＰ変異体のアミノ酸配列のリストである。
【図３３Ａ】図３３Ａ〜３３Ｙは、野生型（ＣＤ−１）マウスにおける有効性試験の結果をまとめたものである。各図は、データの統計解析を示す対応する表と一緒になった、ｉｎ  ｖｉｖｏまたは剖検後の種々の測定の結果を示す１つまたは２つのチャートを含む。図３３Ａは、試験日数３６日間にわたるｉｎ  ｖｉｖｏ頭臀長測定の結果を示している。
【図３３Ｂ】図３３Ａ〜３３Ｙは、野生型（ＣＤ−１）マウスにおける有効性試験の結果をまとめたものである。各図は、データの統計解析を示す対応する表と一緒になった、ｉｎ  ｖｉｖｏまたは剖検後の種々の測定の結果を示す１つまたは２つのチャートを含む。図３３Ｂは、３６日目のｉｎ  ｖｉｖｏ頭臀長測定の結果を示している。
【図３３Ｃ】図３３Ａ〜３３Ｙは、野生型（ＣＤ−１）マウスにおける有効性試験の結果をまとめたものである。各図は、データの統計解析を示す対応する表と一緒になった、ｉｎ  ｖｉｖｏまたは剖検後の種々の測定の結果を示す１つまたは２つのチャートを含む。図３３Ｃは、試験日数３６日間にわたるｉｎ  ｖｉｖｏ平均尾長測定の結果を示している。
【図３３Ｄ】図３３Ａ〜３３Ｙは、野生型（ＣＤ−１）マウスにおける有効性試験の結果をまとめたものである。各図は、データの統計解析を示す対応する表と一緒になった、ｉｎ  ｖｉｖｏまたは剖検後の種々の測定の結果を示す１つまたは２つのチャートを含む。図３３Ｄは、３６日目のｉｎ  ｖｉｖｏ平均尾長測定の結果を示している。
【図３３Ｅ】図３３Ａ〜３３Ｙは、野生型（ＣＤ−１）マウスにおける有効性試験の結果をまとめたものである。各図は、データの統計解析を示す対応する表と一緒になった、ｉｎ  ｖｉｖｏまたは剖検後の種々の測定の結果を示す１つまたは２つのチャートを含む。図３３Ｅは、試験日数３６日間にわたるｉｎ  ｖｉｖｏ平均右脛骨長測定の結果を示している。
【図３３Ｆ】図３３Ａ〜３３Ｙは、野生型（ＣＤ−１）マウスにおける有効性試験の結果をまとめたものである。各図は、データの統計解析を示す対応する表と一緒になった、ｉｎ  ｖｉｖｏまたは剖検後の種々の測定の結果を示す１つまたは２つのチャートを含む。図３３Ｆは、３６日目のｉｎ  ｖｉｖｏ平均右脛骨長測定の結果を示している。
【図３３Ｇ】図３３Ａ〜３３Ｙは、野生型（ＣＤ−１）マウスにおける有効性試験の結果をまとめたものである。各図は、データの統計解析を示す対応する表と一緒になった、ｉｎ  ｖｉｖｏまたは剖検後の種々の測定の結果を示す１つまたは２つのチャートを含む。図３３Ｇは、試験日数３６日間にわたるｉｎ  ｖｉｖｏ平均体重測定の結果を示している。
【図３３Ｈ】図３３Ａ〜３３Ｙは、野生型（ＣＤ−１）マウスにおける有効性試験の結果をまとめたものである。各図は、データの統計解析を示す対応する表と一緒になった、ｉｎ  ｖｉｖｏまたは剖検後の種々の測定の結果を示す１つまたは２つのチャートを含む。図３３Ｈは、１日目および３６日目のｉｎ  ｖｉｖｏ平均体重測定の結果を示している。
【図３３Ｉ】図３３Ａ〜３３Ｙは、野生型（ＣＤ−１）マウスにおける有効性試験の結果をまとめたものである。各図は、データの統計解析を示す対応する表と一緒になった、ｉｎ  ｖｉｖｏまたは剖検後の種々の測定の結果を示す１つまたは２つのチャートを含む。図３３Ｉは、剖検後の左脛骨長測定の結果を示している。
【図３３Ｊ】図３３Ａ〜３３Ｙは、野生型（ＣＤ−１）マウスにおける有効性試験の結果をまとめたものである。各図は、データの統計解析を示す対応する表と一緒になった、ｉｎ  ｖｉｖｏまたは剖検後の種々の測定の結果を示す１つまたは２つのチャートを含む。図３３Ｊは、剖検後の左大腿骨長測定の結果を示している。
【図３３Ｋ】図３３Ａ〜３３Ｙは、野生型（ＣＤ−１）マウスにおける有効性試験の結果をまとめたものである。各図は、データの統計解析を示す対応する表と一緒になった、ｉｎ  ｖｉｖｏまたは剖検後の種々の測定の結果を示す１つまたは２つのチャートを含む。図３３Ｋは、剖検後の左尺骨長測定の結果を示している。
【図３３Ｌ】図３３Ａ〜３３Ｙは、野生型（ＣＤ−１）マウスにおける有効性試験の結果をまとめたものである。各図は、データの統計解析を示す対応する表と一緒になった、ｉｎ  ｖｉｖｏまたは剖検後の種々の測定の結果を示す１つまたは２つのチャートを含む。図３３Ｌは、剖検後の左上腕骨長測定の結果を示している。
【図３３Ｍ】図３３Ａ〜３３Ｙは、野生型（ＣＤ−１）マウスにおける有効性試験の結果をまとめたものである。各図は、データの統計解析を示す対応する表と一緒になった、ｉｎ  ｖｉｖｏまたは剖検後の種々の測定の結果を示す１つまたは２つのチャートを含む。図３３Ｍは、剖検後の鼻肛門長測定の結果を示している。
【図３３Ｎ】図３３Ａ〜３３Ｙは、野生型（ＣＤ−１）マウスにおける有効性試験の結果をまとめたものである。各図は、データの統計解析を示す対応する表と一緒になった、ｉｎ  ｖｉｖｏまたは剖検後の種々の測定の結果を示す１つまたは２つのチャートを含む。図３３Ｎは、剖検後の頭臀長（ＣＲＬ）測定と鼻肛門長測定との比を示している。
【図３３Ｏ】図３３Ａ〜３３Ｙは、野生型（ＣＤ−１）マウスにおける有効性試験の結果をまとめたものである。各図は、データの統計解析を示す対応する表と一緒になった、ｉｎ  ｖｉｖｏまたは剖検後の種々の測定の結果を示す１つまたは２つのチャートを含む。図３３Ｏは、剖検後の頸椎、胸椎、および腰椎（ＣＴＬ）の全長測定の結果を示している。
【図３３Ｐ】図３３Ａ〜３３Ｙは、野生型（ＣＤ−１）マウスにおける有効性試験の結果をまとめたものである。各図は、データの統計解析を示す対応する表と一緒になった、ｉｎ  ｖｉｖｏまたは剖検後の種々の測定の結果を示す１つまたは２つのチャートを含む。図３３Ｐは、剖検後の頸椎長測定の結果を示している。
【図３３Ｑ】図３３Ａ〜３３Ｙは、野生型（ＣＤ−１）マウスにおける有効性試験の結果をまとめたものである。各図は、データの統計解析を示す対応する表と一緒になった、ｉｎ  ｖｉｖｏまたは剖検後の種々の測定の結果を示す１つまたは２つのチャートを含む。図３３Ｑは、剖検後の胸椎長測定の結果を示している。
【図３３Ｒ】図３３Ａ〜３３Ｙは、野生型（ＣＤ−１）マウスにおける有効性試験の結果をまとめたものである。各図は、データの統計解析を示す対応する表と一緒になった、ｉｎ  ｖｉｖｏまたは剖検後の種々の測定の結果を示す１つまたは２つのチャートを含む。図３３Ｒは、剖検後の腰椎長測定の結果を示している。
【図３３Ｓ】図３３Ａ〜３３Ｙは、野生型（ＣＤ−１）マウスにおける有効性試験の結果をまとめたものである。各図は、データの統計解析を示す対応する表と一緒になった、ｉｎ  ｖｉｖｏまたは剖検後の種々の測定の結果を示す１つまたは２つのチャートを含む。図３３Ｓは、剖検後の胸骨長測定の結果を示している。
【図３３Ｔ】図３３Ａ〜３３Ｙは、野生型（ＣＤ−１）マウスにおける有効性試験の結果をまとめたものである。各図は、データの統計解析を示す対応する表と一緒になった、ｉｎ  ｖｉｖｏまたは剖検後の種々の測定の結果を示す１つまたは２つのチャートを含む。図３３Ｔは、剖検後の足および中足骨のラジオグラフを示している。
【図３３Ｕ】図３３Ａ〜３３Ｙは、野生型（ＣＤ−１）マウスにおける有効性試験の結果をまとめたものである。各図は、データの統計解析を示す対応する表と一緒になった、ｉｎ  ｖｉｖｏまたは剖検後の種々の測定の結果を示す１つまたは２つのチャートを含む。図３３Ｕは、剖検後の中足骨（第３指）長測定の結果を示している。
【図３３Ｖ】図３３Ａ〜３３Ｙは、野生型（ＣＤ−１）マウスにおける有効性試験の結果をまとめたものである。各図は、データの統計解析を示す対応する表と一緒になった、ｉｎ  ｖｉｖｏまたは剖検後の種々の測定の結果を示す１つまたは２つのチャートを含む。図３３Ｖは、剖検後の大後頭孔の高さおよび幅の測定の結果を示している。
【図３３Ｗ】図３３Ａ〜３３Ｙは、野生型（ＣＤ−１）マウスにおける有効性試験の結果をまとめたものである。各図は、データの統計解析を示す対応する表と一緒になった、ｉｎ  ｖｉｖｏまたは剖検後の種々の測定の結果を示す１つまたは２つのチャートを含む。図３３Ｗは、剖検後の大後頭孔幅測定と大後頭孔高さ測定との比を示している。
【図３３Ｘ】図３３Ａ〜３３Ｙは、野生型（ＣＤ−１）マウスにおける有効性試験の結果をまとめたものである。各図は、データの統計解析を示す対応する表と一緒になった、ｉｎ  ｖｉｖｏまたは剖検後の種々の測定の結果を示す１つまたは２つのチャートを含む。図３３Ｘは、剖検後の頭蓋円形度指数測定の結果を示している。
【図３３Ｙ】図３３Ａ〜３３Ｙは、野生型（ＣＤ−１）マウスにおける有効性試験の結果をまとめたものである。各図は、データの統計解析を示す対応する表と一緒になった、ｉｎ  ｖｉｖｏまたは剖検後の種々の測定の結果を示す１つまたは２つのチャートを含む。図３３Ｙは、剖検後の頭蓋中の後頭前頭距離測定の結果を示している。
【図３４】図３４は、ＣＮＰ２２（配列番号４）、ＣＮＰ−Ｌ１７（配列番号１２０）、ＣＮＰ−Ｆ１７（配列番号１１９）、ＣＮＰ−Ｔ１７（配列番号１２２）、Ｄ６−１４ＡＡリンカー−ＣＮＰ［Ｃ３］（配列番号１４７）、ＣＮＰ−１４ＡＡリンカー−Ｄ６［Ｃ４］（配列番号１４８）、ＣＮＰ−Ｎｔｅｒｍ２［Ｃ５］（配列番号１５０）、ＣＤＮＰ−Ｓ３Ａ４Ａ５Ｒ６［Ｃ１３］（配列番号１１５）、ＣＤＮＰ２９−Ｓ３Ａ４Ａ５Ｒ６［Ｃ１４］（配列番号１５１）、Ｃ１（Ｅ６）［ＢＣ１］（配列番号１２９）、Ｃ２（Ｅ６）［ＢＣ２］（配列番号１３０）、Ｃ３（Ｅ６）［ＢＣ３］（配列番号１３１）、Ｃ４（Ｅ６）［ＢＣ４］（配列番号１３２）、Ｃ５（Ｅ６）［ＢＣ５］（配列番号１３３）、Ｃ６（Ｅ６）［ＢＣ６］（配列番号１３４）、Ｃ７（Ｅ６）［ＢＣ７］（配列番号１３５）、Ｃ８（Ｅ６）［ＢＣ８］（配列番号１３６）、Ｃ９（Ｅ６）［ＢＣ９］（配列番号１３７）、Ｃ１０（Ｅ６）［ＢＣ１０］（配列番号１３８）、Ｃ１１（Ｅ６）［ＢＣ１１］（配列番号１３９）、ＰＧＣＮＰ３７（Ｅ６）（配列番号１２８）、ＫＡ１（配列番号１５２）、ＫＡ１（Ｅ６）（配列番号１５３）、ＫＢ１（配列番号１５４）、およびＫＢ１（Ｅ６）（配列番号１５５）のアミノ酸配列のリストである。各変異体の１７アミノ酸リングドメインは、ボールド体で示されている。リンカー配列は、イタリック体で示されている。カテプシン切断配列は、下線付きで示されている。
【図３５Ａ】図３５Ａは、ＣＮＰ２２、Ｄ６−１４ＡＡリンカー−ＣＮＰ［Ｃ３］、ＣＮＰ−１４ＡＡリンカー−Ｄ６［Ｃ４］、ＣＮＰ−Ｎｔｅｒｍ２［Ｃ５］、ＣＤＮＰ−Ｓ３Ａ４Ａ５Ｒ６［Ｃ１３］、ＣＤＮＰ２９−Ｓ３Ａ４Ａ５Ｒ６［Ｃ１４］、ＫＢ１（Ｅ６）、Ｃ２（Ｅ６）、およびＣ３（Ｅ６）のＮＥＰ分解アッセイの結果を示すグラフであり、これらの配列は、図３４に示されている。
【図３５Ｂ】図３５Ｂは、ＣＮＰ２２、ＫＡ１（Ｅ６）、Ｃ１（Ｅ６）、およびＣ４（Ｅ６）−Ｃ１１（Ｅ６）のＮＥＰ分解アッセイの結果を示すグラフであり、これらの配列は、図３４に示されている。
【図３６Ａ】図３６Ａは、ＣＮＰ２２、ＮＣ２−ＫＧＡＮＫＫ、ＮＣ２Ｂ−Ｌ１７、およびＮＣ２−ＫＧＡＮＫＫ−Ｌ１７（ＮＣ２−ＫＬ）のＮＥＰ分解アッセイの結果を示すグラフである。
【図３６Ｂ】図３６Ｂは、ＣＮＰ２２、ＮＣ２−ＫＧＡＮＫＫ、ＮＣ２Ｂ−Ｌ１７、およびＮＣ２−ＫＧＡＮＫＫ−Ｌ１７（ＮＣ２−ＫＬ）のＩＤＥ分解アッセイの結果を示すグラフである。
【図３７Ａ】図３７Ａは、ＥＣ５０値、ＣＮＰ２２を基準にしたＥＣ５０比、％有効性、およびＣＮＰ２２を基準にしたレスキュー比が併記されたレスキュー範囲を示す表と一緒になった、ＮＰＲ−Ｂ全細胞アッセイでのＮＣ２−ＣＮＰ５３ｍｕｔ２、ＮＣ２−ＫＧＡＮＫＫ、およびＮＣ２−ＫＧＡＮＱＫの一組の用量−応答曲線である。
【図３７Ｂ】図３７Ｂは、ＥＣ５０値、ＣＮＰ２２を基準にしたＥＣ５０比、％有効性、およびＣＮＰ２２を基準にしたレスキュー比が併記されたレスキュー範囲を示す表と一緒になった、ＮＰＲ−Ｂ全細胞アッセイでのＮＣ２ＢおよびＮＣ２Ｂ−Ｌ１７の一組の用量−応答曲線である。
【図３８】図３８は、ＣＮＰ２２を基準にした位置１７に点突然変異を有するＣＮＰ変異体のアミノ酸配列（配列番号１２６、１１９〜１２２、および１５６〜１７２）のリストである。配列番号１２６および１６２では、Ｘは、Ｆ、Ｌ、Ｉ、Ｔ、Ｅ、Ｒ、Ｙ、Ｃ、Ｐ、またはＤをはじめとする任意のアミノ酸でありうるが、これらに限定されるものではない。各変異体の１７アミノ酸リングドメインは、ボールド体で示されている。リンカー配列は、イタリック体で示されている。
【図３９Ａ】図３９Ａ〜３９Ｂは、ＣＮＰ２２を基準にした位置１７に点突然変異を有する追加のＣＮＰ変異体のアミノ酸配列（配列番号１７３〜２２０）のリストである。Ｘは、Ｆ、Ｌ、Ｉ、Ｔ、Ｅ、Ｒ、Ｙ、Ｃ、Ｐ、またはＤをはじめとする任意のアミノ酸でありうるが、これらに限定されるものではない。各変異体の１７アミノ酸リングドメインは、ボールド体で示されている。リンカー配列は、イタリック体で示されている。カテプシン切断配列は、下線付きで示されている。
【図３９Ｂ】図３９Ａ〜３９Ｂは、ＣＮＰ２２を基準にした位置１７に点突然変異を有する追加のＣＮＰ変異体のアミノ酸配列（配列番号１７３〜２２０）のリストである。Ｘは、Ｆ、Ｌ、Ｉ、Ｔ、Ｅ、Ｒ、Ｙ、Ｃ、Ｐ、またはＤをはじめとする任意のアミノ酸でありうるが、これらに限定されるものではない。各変異体の１７アミノ酸リングドメインは、ボールド体で示されている。リンカー配列は、イタリック体で示されている。カテプシン切断配列は、下線付きで示されている。
【図４０】図４０は、ＣＮＰ２２を基準にした位置１７に点突然変異を有するＣＮＰ変異体のアミノ酸配列（配列番号２２１〜２３３）のリストであるが、ここで、位置１７のメチオニンは、ロイシンで置換されている。各変異体の１７アミノ酸リングドメインは、ボールド体で示されている。リンカー配列は、イタリック体で示されている。カテプシン切断配列は、下線付きで示されている。
【図４１Ａ】図４１Ａ〜４１Ｅは、ＣＮＰ２２を基準にした位置１７に点突然変異を有する構築物のアミノ酸配列（配列番号５２７〜５５２）のリストである。Ｘは、Ｆ、Ｌ、Ｉ、Ｔ、Ｅ、Ｒ、Ｙ、Ｃ、Ｐ、またはＤをはじめとする任意のアミノ酸でありうるが、これらに限定されるものではない。シグナル配列は、下線が付されている。Ｆｃドメインは、ボールド体で示されている。リンカー配列は、イタリック体で示されている。ＣＮＰドメインは、灰色強調表示で示されている。
【図４１Ｂ】図４１Ａ〜４１Ｅは、ＣＮＰ２２を基準にした位置１７に点突然変異を有する構築物のアミノ酸配列（配列番号５２７〜５５２）のリストである。Ｘは、Ｆ、Ｌ、Ｉ、Ｔ、Ｅ、Ｒ、Ｙ、Ｃ、Ｐ、またはＤをはじめとする任意のアミノ酸でありうるが、これらに限定されるものではない。シグナル配列は、下線が付されている。Ｆｃドメインは、ボールド体で示されている。リンカー配列は、イタリック体で示されている。ＣＮＰドメインは、灰色強調表示で示されている。
【図４１Ｃ】図４１Ａ〜４１Ｅは、ＣＮＰ２２を基準にした位置１７に点突然変異を有する構築物のアミノ酸配列（配列番号５２７〜５５２）のリストである。Ｘは、Ｆ、Ｌ、Ｉ、Ｔ、Ｅ、Ｒ、Ｙ、Ｃ、Ｐ、またはＤをはじめとする任意のアミノ酸でありうるが、これらに限定されるものではない。シグナル配列は、下線が付されている。Ｆｃドメインは、ボールド体で示されている。リンカー配列は、イタリック体で示されている。ＣＮＰドメインは、灰色強調表示で示されている。
【図４１Ｄ】図４１Ａ〜４１Ｅは、ＣＮＰ２２を基準にした位置１７に点突然変異を有する構築物のアミノ酸配列（配列番号５２７〜５５２）のリストである。Ｘは、Ｆ、Ｌ、Ｉ、Ｔ、Ｅ、Ｒ、Ｙ、Ｃ、Ｐ、またはＤをはじめとする任意のアミノ酸でありうるが、これらに限定されるものではない。シグナル配列は、下線が付されている。Ｆｃドメインは、ボールド体で示されている。リンカー配列は、イタリック体で示されている。ＣＮＰドメインは、灰色強調表示で示されている。
【図４１Ｅ】図４１Ａ〜４１Ｅは、ＣＮＰ２２を基準にした位置１７に点突然変異を有する構築物のアミノ酸配列（配列番号５２７〜５５２）のリストである。Ｘは、Ｆ、Ｌ、Ｉ、Ｔ、Ｅ、Ｒ、Ｙ、Ｃ、Ｐ、またはＤをはじめとする任意のアミノ酸でありうるが、これらに限定されるものではない。シグナル配列は、下線が付されている。Ｆｃドメインは、ボールド体で示されている。リンカー配列は、イタリック体で示されている。ＣＮＰドメインは、灰色強調表示で示されている。
【図４２Ａ】図４２Ａ〜４２Ｊは、シグナル配列有りまたは無しのかつＮ末端にＤ１０骨ターゲッティング部分有りまたは無しのいずれかのＮＣ２変異体のアミノ酸配列（配列番号５１１〜５１６および５５３〜６０６）のリストである。シグナル配列は、下線が付されている。Ｆｃドメインは、ボールド体で示されている。リンカー配列は、イタリック体で示されている。ＣＮＰドメインは、灰色強調表示で示されている。
【図４２Ｂ】図４２Ａ〜４２Ｊは、シグナル配列有りまたは無しのかつＮ末端にＤ１０骨ターゲッティング部分有りまたは無しのいずれかのＮＣ２変異体のアミノ酸配列（配列番号５１１〜５１６および５５３〜６０６）のリストである。シグナル配列は、下線が付されている。Ｆｃドメインは、ボールド体で示されている。リンカー配列は、イタリック体で示されている。ＣＮＰドメインは、灰色強調表示で示されている。
【図４２Ｃ】図４２Ａ〜４２Ｊは、シグナル配列有りまたは無しのかつＮ末端にＤ１０骨ターゲッティング部分有りまたは無しのいずれかのＮＣ２変異体のアミノ酸配列（配列番号５１１〜５１６および５５３〜６０６）のリストである。シグナル配列は、下線が付されている。Ｆｃドメインは、ボールド体で示されている。リンカー配列は、イタリック体で示されている。ＣＮＰドメインは、灰色強調表示で示されている。
【図４２Ｄ】図４２Ａ〜４２Ｊは、シグナル配列有りまたは無しのかつＮ末端にＤ１０骨ターゲッティング部分有りまたは無しのいずれかのＮＣ２変異体のアミノ酸配列（配列番号５１１〜５１６および５５３〜６０６）のリストである。シグナル配列は、下線が付されている。Ｆｃドメインは、ボールド体で示されている。リンカー配列は、イタリック体で示されている。ＣＮＰドメインは、灰色強調表示で示されている。
【図４２Ｅ】図４２Ａ〜４２Ｊは、シグナル配列有りまたは無しのかつＮ末端にＤ１０骨ターゲッティング部分有りまたは無しのいずれかのＮＣ２変異体のアミノ酸配列（配列番号５１１〜５１６および５５３〜６０６）のリストである。シグナル配列は、下線が付されている。Ｆｃドメインは、ボールド体で示されている。リンカー配列は、イタリック体で示されている。ＣＮＰドメインは、灰色強調表示で示されている。
【図４２Ｆ】図４２Ａ〜４２Ｊは、シグナル配列有りまたは無しのかつＮ末端にＤ１０骨ターゲッティング部分有りまたは無しのいずれかのＮＣ２変異体のアミノ酸配列（配列番号５１１〜５１６および５５３〜６０６）のリストである。シグナル配列は、下線が付されている。Ｆｃドメインは、ボールド体で示されている。リンカー配列は、イタリック体で示されている。ＣＮＰドメインは、灰色強調表示で示されている。
【図４２Ｇ】図４２Ａ〜４２Ｊは、シグナル配列有りまたは無しのかつＮ末端にＤ１０骨ターゲッティング部分有りまたは無しのいずれかのＮＣ２変異体のアミノ酸配列（配列番号５１１〜５１６および５５３〜６０６）のリストである。シグナル配列は、下線が付されている。Ｆｃドメインは、ボールド体で示されている。リンカー配列は、イタリック体で示されている。ＣＮＰドメインは、灰色強調表示で示されている。
【図４２Ｈ】図４２Ａ〜４２Ｊは、シグナル配列有りまたは無しのかつＮ末端にＤ１０骨ターゲッティング部分有りまたは無しのいずれかのＮＣ２変異体のアミノ酸配列（配列番号５１１〜５１６および５５３〜６０６）のリストである。シグナル配列は、下線が付されている。Ｆｃドメインは、ボールド体で示されている。リンカー配列は、イタリック体で示されている。ＣＮＰドメインは、灰色強調表示で示されている。
【図４２Ｉ】図４２Ａ〜４２Ｊは、シグナル配列有りまたは無しのかつＮ末端にＤ１０骨ターゲッティング部分有りまたは無しのいずれかのＮＣ２変異体のアミノ酸配列（配列番号５１１〜５１６および５５３〜６０６）のリストである。シグナル配列は、下線が付されている。Ｆｃドメインは、ボールド体で示されている。リンカー配列は、イタリック体で示されている。ＣＮＰドメインは、灰色強調表示で示されている。
【図４２Ｊ】図４２Ａ〜４２Ｊは、シグナル配列有りまたは無しのかつＮ末端にＤ１０骨ターゲッティング部分有りまたは無しのいずれかのＮＣ２変異体のアミノ酸配列（配列番号５１１〜５１６および５５３〜６０６）のリストである。シグナル配列は、下線が付されている。Ｆｃドメインは、ボールド体で示されている。リンカー配列は、イタリック体で示されている。ＣＮＰドメインは、灰色強調表示で示されている。
【図４３】図４３Ａ〜４３Ｃは、注射３０分前に得られた平均ベースラインを基準にした、皮下投与２〜８時間後に観測された収縮期動脈血圧（Ａ）、拡張期動脈血圧（Ｂ）、および平均動脈血圧（Ｃ）の平均変化を提供することにより、ＮＣ２Ｂ血行力学的用量−応答効果を示している。解析は、１グループあたりｎ＝６でそれぞれ個別のマウスに対して連続注射日数５日間でプールされた平均テレメトリーデータに基づく。
【図４４Ａ】図４４Ａ〜４４Ｂは、野生型マウスにおけるＮＣ２Ｂの毎週投与レジメン試験の３６日目の結果を提供する。図４４Ａは、剖検後の鼻肛門長測定の結果を示している。
【図４４Ｂ】図４４Ａ〜４４Ｂは、野生型マウスにおけるＮＣ２Ｂの毎週投与レジメン試験の３６日目の結果を提供する。図４４Ｂは、剖検後の上腕骨（左側グラフ）および大腿骨（右側グラフ）の長さ測定の結果を示している。
【発明を実施するための形態】
【０１４６】
詳細な説明
本発明は、ナトリウム利尿ペプチド、たとえば、免疫グロブリンのＦｃドメインに融合されたナトリウム利尿ペプチドと、そのようなポリペプチドをコードする核酸分子と、ＦＧＦＲ３の過剰活性化に関連付けられる障害、骨障害もしくは軟骨障害（たとえば軟骨無形成症）、血管平滑筋障害を治療するための、さらには骨を伸長させるためのその使用と、を特徴とする。本発明のさらなる詳細は、以下に提供される。
【０１４７】
ＮＰ
ナトリウム利尿ペプチドレセプターＢ（「ＮＰＲ−Ｂ」）たとえばヒトＮＰＲ−Ｂのアゴニストである任意のナトリウム利尿ペプチドまたはその変異体を、本明細書で説明した方法および組成物のいずれかで使用することが可能である。
【０１４８】
本明細書で説明したナトリウム利尿ペプチドは、ＮＰＲ−Ｂをアゴナイズ可能なペプチドである。主にＮＰＲ−Ａをアゴナイズするナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰを含む）ならびに主にＮＰＲ−ＢをアゴナイズするＡＮＰおよびＢＮＰは、複数の生物学的過程で重要な役割を有する。種々のＮＰファミリーメンバーおよびコンセンサス配列の多重配列アライメントを、図１〜３および４Ａ〜４Ｇに示す。
【０１４９】
ＮＰＲ−Ｂをアゴナイズするうえでの本明細書で説明したＣＮＰ２２およびＣＮＰ５３ならびにそれらの変異体の主要な下流効果は、軟骨内骨化である。したがって、本明細書で説明したＮＰは、たとえば、ＦＧＦＲ３の過剰活性化に関連付けられる広範にわたる一連の障害および血管平滑筋障害を治療するのに有用である。
【０１５０】
ＮＰは、図５に示される模式的構造を含む。ここで、リングドメインは、必要であり、かつＮ末端伸長部、ショートセグメント、およびＣ末端伸長部のそれぞれは、オプションである。リングドメインは、１７アミノ酸長であり、ジスルフィド結合を形成するシステイン残基をリングドメインの各末端（位置１および１７）に有する。いくつかの実施形態では、リングドメインは、図１、３、または４Ａ〜４Ｇに示されるコンセンサス配列（それぞれ、配列番号６、配列番号３０のアミノ酸１１〜２７、または配列番号９５）の１つに該当するアミノ酸配列を有する。図１〜３および４Ａ〜４Ｇに示されるリングドメインのいずれかを、本明細書で説明したＮＰで使用することが可能である。
【０１５１】
ショートセグメントは、リングドメインのＮ末端のすぐ隣にある０〜１０アミノ酸長（たとえば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０アミノ酸長）のセグメントである。例示的ショートセグメントは、図１または図３の四角で囲まれた領域のＮ末端のすぐ隣に示されており、たとえば、配列番号４の残基１〜５、または図３および４Ａ〜４Ｇに示される種のいずれかの保存リングドメインのＮ末端のすぐ隣にある１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０アミノ酸である。いくつかの実施形態では、ショートセグメントは、図１、３、または４Ａ〜４Ｇに示される種のいずれかの保存リングドメインのＮ末端のすぐ隣にある５アミノ酸部分からなる。いくつかの実施形態では、ショートセグメントは、ＮＰＲ−Ａに対してよりもＮＰＲ−Ｂに対して増大された選択性を付与する。
【０１５２】
Ｎ末端伸長部は、ショートセグメント（ショートセグメントが存在する場合）またはリングドメイン（ショートセグメントが存在しない場合）のＮ末端のすぐ隣にある領域であり、かつ任意の長さ、たとえば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、またはそれ以上のアミノ酸でありうる。この領域は、ＣＮＰ２２には不在であるが、ＣＮＰ５３には存在する（配列番号１１の残基１〜３１）の中にある。例示的Ｎ末端伸長部は、図４Ａ〜４Ｇに示される種のいずれかの、たとえば５アミノ酸のショートセグメント（ショートセグメントが存在する場合）のＮ末端のすぐ隣にある、またはリングドメイン（ショートセグメントが存在しない場合）のＮ末端のすぐ隣にある、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２２５、２５０、またはそれ以上の残基である。いくつかの実施形態では、Ｎ末端伸長部は、ＮＰＲ−Ａに対してよりもＮＰＲ−Ｂに対して増大された選択性を提供する。
【０１５３】
Ｃ末端伸長部は、リングドメインのＣ末端のすぐ隣にある領域であり、かつ任意の長さ、たとえば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、またはそれ以上のアミノ酸でありうる。この領域は、ＣＮＰ２２およびＣＮＰ５３には不在であるが、ハイブリッドペプチドＣＤＮＰ（配列番号１００）には存在する。例示的Ｃ末端伸長部は、図１の四角で囲まれた領域のＣ末端のすぐ隣に示されており、たとえば、配列番号１のアミノ酸２４〜２８、配列番号２のアミノ酸２８〜３２、配列番号３のアミノ酸２７〜３２、または配列番号５のアミノ酸２４〜３８である。いくつかの実施形態では、Ｃ末端テールは、ＤＮＰ  Ｃ末端テール（配列番号１１７）、または１つ以上の付加、欠失、もしくは置換突然変異を有するその変異体（たとえば配列番号１１８）を含みまたはそれらからなる。たとえば、ＮＰのＣ末端テールは、図２２に示されるＤＮＰ  Ｃ末端テール突然変異のいずれかを含みうる。特定的には、ＤＮＰ  Ｃ末端テール（配列番号１１７）の残基１、３、４、５、６、および／または７は、たとえば、図２２に示される突然変異のいずれかのように、突然変異されたものでありうる。いくつかの実施形態では、Ｃ末端伸長部は、ＮＰＲ−Ａに対してよりもＮＰＲ−Ｂに対して増大された選択性を付与する。
【０１５４】
ＮＰは、オプションとして、任意の適切な１個以上のアミノ酸残基がグリコシル化されたものでありうる。
【０１５５】
それに加えて、ＮＰは、本明細書で説明したＮＰのいずれかに対して、またはリングドメイン、ショートセグメント、Ｃ末端伸長部、もしくはＮ末端伸長部の１つ以上に対して、少なくとも５０％（たとえば、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上）の配列同一性を有しうる。
【０１５６】
ＮＰは、本明細書で説明したＮＰのいずれか、またはリングドメイン、ショートセグメント、Ｃ末端伸長部、もしくはＮ末端伸長部の１つ以上に対して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の付加、欠失、または置換を有しうる。
【０１５７】
本明細書で説明したＮＰは、ＮＰがＮＰＲ−Ｂをアゴナイズする能力を有するかぎり、共有結合または非共有結合された任意の他の配列または部分を含んでいてもよい。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、本明細書で説明したＮＰは、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、または１２０アミノ酸長以下でありうる。さらに、いくつかの実施形態では、本明細書で説明したＮＰは、１．８、２．０、２．２、２．４、２．６、２．８、３．０、３．２、３．４、３．６、３．８、４．０、４．２、４．４、４．６、４．８、５．０、５．２、５．４、５．６、５．８、６．０、６．２、６．４、６．６、６．８、７．０、７．２、７．４、７．６、７．８、８．０、８．２、８．４、８．６、８．８、９．０、９．２、９．４、９．６、９．８、または１０．０キロダルトン（ｋＤａ）以下の分子量でありうる。
【０１５９】
本明細書で説明した組成物および方法で使用するのに好適なＮＰは、たとえば、米国特許第５，３５２，７７０号明細書、同第５，４３４，１３３号明細書、同第６，０２０，１６８号明細書、同第６，０３４，２３１号明細書、同第６，４０７，２１１号明細書、同第６，７４３，４２５号明細書、同第６，８１８，６１９号明細書、同第７，２７６，４８１号明細書、同第７，３８４，９１７号明細書、および同第７，７５４，８５２号明細書、米国特許出願公開第２００７−０１９７４３４号明細書、同２００８−０１８１９０３号明細書、同２００８−０３１２１４２号明細書、同２００９−０１７０７５６号明細書、同２０１０−００５５１５０号明細書、および同２０１０−０２９７０２１号明細書、国際公開第９４／２０５３４号パンフレット、同第０２／０４７８７１号パンフレット、同第２００４／０４７８７１号パンフレット、同第２００５／０９８４９０号パンフレット、同第２００８／１５４２２６号パンフレット、および同第２００９／０６７６３９号パンフレット、欧州特許第０４９７３６８号明細書および同第０４６６１７４号明細書、Ｆｕｒｕｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１８３：９６４−９６９（１９９２）、Ｔａｋａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｚｏｏｌ．Ｓｃｉ．，１１：４５１−４５４（１９９４）、Ｐｌａｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｏｘｉｃｏｎ．，３６（６）：８４７−８５７  （１９９８）、およびＩｎｏｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１００（１７）：１００７９−１００８４（２００３）（それらはいずれも、ナトリウム利尿ペプチドおよびその変異体のすべての式、構造、および配列を含めて、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載のものを含む。代替実施形態では、本節で参照されたＮＰは、本明細書で説明した組成物および方法から除外される。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、本明細書で説明したもしくは参照により本明細書に組み込まれるＮＰのいずれかを、Ｆｃドメインにもリンカーにも融合させずに、本明細書で説明した組成物および方法で使用することが可能であり、または他の選択肢として、Ｆｃドメインに融合させずに、本明細書で説明したリンカーのいずれかに融合させることが可能である。そのようなＮＰは、本明細書で説明した、ＦＧＦＲ３の過剰活性化に関連付けられる障害、たとえば、軟骨無形成症、または血管平滑筋障害を治療すべく使用可能である。
【０１６１】
他の実施形態では、本明細書で説明したまたは参照により本明細書に組み込まれるＮＰのいずれかは、ＣＮＰ２２を基準にした位置１７に点突然変異を含みうる。野生型ＣＮＰ２２は、ＣＮＰ２２を基準にした位置１７にメチオニンを有し、これは、ｉｎ  ｖｉｖｏで酸化可能であり、かつ／またはプロテアーゼにより分解されうるペプチドを提供可能である。本明細書で説明したように、ＣＮＰ２２を基準にした位置１７の点突然変異は、効力を保持しながら、低減された分解性を有するポリペプチドを提供可能である。ＣＮＰ２２を基準にした位置１７の例示的アミノ酸は、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ｐｒｏ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、またはＬｙｓ、たとえば、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ｐｒｏ、またはＡｓｐ、たとえば、ＰｈｅまたはＬｅｕ、たとえば、Ｌｅｕである。たとえば、ＣＮＰ２２を基準にした位置１７のアミノ酸は、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ｐｒｏ、およびＡｓｐ、たとえば、ＰｈｅまたはＬｅｕ、たとえば、Ｌｅｕでありうる。他の例では、ＣＮＰ２２を基準にした位置１７のアミノ酸は、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ａｌａ、またはＳｅｒでありうる。他の選択肢として、ＣＮＰ２２を基準にした位置１７の例示的アミノ酸は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、またはＬｙｓである。
【０１６２】
さらに、本明細書で説明した組成物および方法には、本明細書で説明したＮＰおよび融合ポリペプチドのいずれかをコードする核酸分子、ならびに本明細書で説明したＮＰまたは融合ポリペプチドのいずれかをコードする核酸分子の少なくとも一部に、たとえば、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、さらには１００％に高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸分子が含まれる。
【０１６３】
結晶性フラグメント領域（Ｆｃ）断片
本発明に係る融合ポリペプチドは、Ｆｃ（免疫グロブリンの結晶性フラグメント領域）などのＮ末端ドメインまたはＣ末端ドメインを含みうる。免疫グロブリン分子は、当技術分野で周知の構造を有する。それは、２本の軽鎖（それぞれ約２３ｋＤ）と、鎖間ジスルフィド結合により連結された２本の重鎖（それぞれ約５０〜７０ｋＤ）と、を含む。免疫グロブリンは、タンパク質分解により（たとえば、パパイン切断により）、Ｆａｂ（軽鎖と重鎖のＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインとを含有する）とＦｃ（隣接配列と一緒に重鎖のＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含有する）とに容易に切断される。切断は、典型的には、Ｆａｂ領域とＦｃ領域とを連結するフレキシブルヒンジ領域で起こる。たとえば、パパインは、２本の重鎖を連結するジスルフィド結合の直前のヒンジ領域を切断する。
【０１６４】
本明細書で説明した有用なＦｃフラグメントは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはＩｇＥ、およびそれらの種々のサブクラス（たとえば、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３、ＩｇＧ−４、ＩｇＡ−１、ＩｇＡ−２）を含めて、任意の哺乳動物（たとえばヒト）から採取される任意の免疫グロブリン分子のＦｃフラグメントを含む。本発明に係るＦｃフラグメントは、たとえば、重鎖のＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインならびにヒンジ領域の任意の部分を含みうる。さらに、Ｆｃ領域は、オプションとして、任意の適切な１個以上のアミノ酸残基、たとえば、当業者に公知の種々のアミノ酸残基がグリコシル化されていてもよい。いくつかの実施形態では、Ｆｃフラグメントは、ヒトＩｇＧ−１のものである。特定の実施形態では、融合ポリペプチドのＦｃフラグメントは、配列番号４０１で示されるアミノ酸配列を有し、または配列番号４０１（図６）に対して少なくとも５０％（たとえば、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上）の配列同一性を有する。
【０１６５】
いくつかの実施形態では、たとえば、国際公開第２００５／００７８０９号パンフレット（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるように、工学操作された（たとえば、天然に存在しない）Ｆｃ領域を本発明に係る組成物および方法で利用することが可能である。
【０１６６】
本明細書で説明したＦｃフラグメントは、本明細書で説明したＦｃフラグメントのいずれかに対して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、５０、またはそれ以上の付加、欠失、または置換を有しうる。
【０１６７】
リンカー
本明細書で説明した融合タンパク質は、ＦｃフラグメントとＮＰとの間にペプチドリンカー領域を含みうる。リンカー領域は、ＮＰが生物学的活性を維持する、たとえば、立体障害を受けない、任意の配列および長さでありうる。例示的リンカー長は、１〜２００アミノ酸、たとえば、１〜５、６〜１０、１１〜１５、１６〜２０、２１〜２５、２６〜３０、３１〜３５、３６〜４０、４１〜４５、４６〜５０、５１〜５５、５６〜６０、６１〜６５、６６〜７０、７１〜７５、７６〜８０、８１〜８５、８６〜９０、９１〜９５、９６〜１００、１０１〜１１０、１１１〜１２０、１２１〜１３０、１３１〜１４０、１４１〜１５０、１５１〜１６０、１６１〜１７０、１８１〜１９０、または１９１〜２００アミノ酸である。さらなる例示的リンカー長は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００アミノ酸である。さらなる例示的リンカー長は、１４〜１８、２０〜２４、２６〜３０、３２〜３６、３８〜４２、および４４〜４８アミノ酸である。
【０１６８】
いくつかの実施形態では、リンカーは、フレキシブル部分、たとえば、有意な固定された二次構造や三次構造をとらない領域を含みまたはそれからなる。例示的フレキシブルリンカーは、高グリシンリンカー、たとえば、少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、さらには１００％のグリシン残基を含有するリンカーである。リンカーはまた、たとえば、セリン残基を含有しうる。いくつかの場合には、リンカーのアミノ酸配列は、グリシン残基およびセリン残基のみからなる。
【０１６９】
いくつかの場合には、リンカー配列のアミノ酸配列は、式［（Ｇｌｙ）ｍ（Ｓｅｒ）］ｎ（Ｇｌｙ）ｐ〔式中、ｍ、ｎ、およびｐのそれぞれは、独立して、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０である〕で表される配列を含みまたはそれからなる。いくつかの実施形態では、ｍ＝１、２、３、４、５、または６、ｎ＝１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０、かつｐ＝０、１、２、３、または４である。他の選択肢として、リンカー配列は、式（Ｇｌｙ）ｐ［（Ｓｅｒ）（Ｇｌｙ）ｍ］ｎ〔式中、ｍ、ｎ、およびｐのそれぞれは、独立して、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０である〕で表される配列を含みまたはそれからなる。いくつかの実施形態では、ｍ＝１、２、３、４、５、または６、ｎ＝１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０、かつｐ＝０、１、２、３、または４である。
【０１７０】
以上の２つの式のいずれに対しても、ｍ、ｎ、およびｐの値の例示的組合せを表１に列挙する。
【０１７１】
【表１】
0006055779.tif 000002
【０１７２】
いくつかの実施形態では、リンカーのアミノ酸配列は、表２の配列を含みまたはそれらからなる。
【０１７３】
【表２】
0006055779.tif 000003
0006055779.tif 000004
【０１７４】
いくつかの実施形態では、リンカーは、以上で説明した［（Ｇｌｙ）ｍ（Ｓｅｒ）］ｎ（Ｇｌｙ）ｐまたは（Ｇｌｙ）ｐ［（Ｓｅｒ）（Ｇｌｙ）ｍ］ｎリンカーと、それに続く配列番号３１４〜３２１の１つ、たとえば、配列番号３１４、３１５、または３２１の１つと、を含みまたはそれらからなりうる。
【０１７５】
他の実施形態では、リンカーは、ＮＰの全部または断片を含みまたはそれらからなりうる。たとえば、ＣＮＰ２２のＮ末端にあるヒトＣＮＰ５３の３１アミノ酸部分またはその同族体もしくは変異体（たとえば、配列番号３２０の残基４〜３４）は、リンカーとして使用可能である。この３１アミノ酸領域の同族体は、たとえば、図４Ａ〜４Ｇなどの配列アライメントを調べて、ヒトＣＮＰ５３のＮ末端３１アミノ酸に対応する領域を同定することにより、同定可能である。他の好適なリンカーはまた、たとえば、オプションとしてリングドメインを除いて、図４Ａ〜４Ｇに示されるＮＰの任意の部分、または図４Ａ〜４Ｇに示されていない任意の他のＮＰもしくはＮＰの領域を選択することにより、同定可能である。たとえば、ＤＮＰ（配列番号１１７）のＣ末端伸長部またはその断片もしくは変異体は、リンカーとして使用可能である。
【０１７６】
リンカーは、オプションとして、任意の適切な１個以上のアミノ酸残基がグリコシル化されていてもよい。
【０１７７】
それに加えて、リンカーは、本明細書で説明したリンカーのいずれかに対して、少なくとも５０％（たとえば、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上）の配列同一性を有しうる。それに加えて、リンカーは、本明細書で説明したリンカーのいずれかに対して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の付加、欠失、または置換を有しうる。
【０１７８】
本明細書で説明したリンカーは、共有結合または非共有結合された任意の他の配列または部分を含みうる。
【０１７９】
いくつかの実施形態では、リンカーは不在である。つまり、介在残基無しでＦｃフラグメントとＮＰとが直接融合一体化される。
【０１８０】
本開示によれば、特定のＦｃ−ＮＰまたはＮＰ−Ｆｃ融合タンパク質は、１）リンカーを有していないか、または２）ＮＰの一部に対応するリンカーを有するか、のいずれかであるとみなしうることに留意されたい。たとえば、ＣＮＰ５３に直接融合されたＦｃは、ＮＰがＣＮＰ５３であるとき、リンカーを有していないか、またはＮＰがＣＮＰ２２であるとき、３１アミノ酸リンカーを有するか、のいずれかであるとみなしうる。
【０１８１】
融合ポリペプチド
本明細書で説明したＮＰ、リンカー、およびＦｃ領域のいずれかを、構造Ｘ−Ｆｃ−Ｙ−ＮＰ−Ｚまたは構造Ｘ−ＮＰ−Ｙ−Ｆｃ−Ｚ〔式中、Ｘ、Ｙ（リンカー領域）、およびＺのそれぞれは、不在でありまたは少なくとも１個のアミノ酸のアミノ酸配列である〕を含む融合ポリペプチド、たとえば、組換え融合ポリペプチドの形で、組み合わせることが可能である。
【０１８２】
図７Ａ〜７Ｅは、本明細書で説明した融合ポリペプチドのいくつかの可能な模式的構造を示している。Ｆｃ−ＮＰホモ二量体またはＮＰ−Ｆｃホモ二量体は、たとえば、Ｆｃにより形成されるジスルフィド結合により、形成可能である（それぞれ、図７Ａおよび７Ｂ）。ＮＰ−Ｆｃ融合ポリペプチドまたはＦｃ−ＮＰ融合ポリペプチドが遊離Ｆｃドメインに連結されている代替的単量体−二量体ハイブリッドが可能である（それぞれ、図７Ｃおよび７Ｄ）。さらに、図７Ｅに示されるように、ＮＰ−Ｆｃ単量体は、Ｆｃ−ＮＰ単量体に連結可能である。これらの構成は、網羅的であることが意図されているわけではなく、単に例示的であるにすぎない。
【０１８３】
Ｘは、１個以上（たとえば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０個、またはそれ以上）の追加のアミノ酸をポリペプチドのＮ末端に含んでいてもよく、かつＺは、独立して、１個以上（たとえば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０個、またはそれ以上）の追加のアミノ酸をポリペプチドのＣ末端に含んでいてもよい。
【０１８４】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、骨ターゲッティング部分、たとえば、一連の連続したＡｓｐ残基またはＧｌｕ残基、たとえば、Ｅ６、Ｅ７、Ｅ８、Ｅ９、Ｅ１０、Ｅ１１、Ｅ１２、Ｅ１３、Ｅ１４、Ｅ１５、Ｅ１６、Ｄ６、Ｄ７、Ｄ８、Ｄ９、Ｄ１０、Ｄ１１、Ｄ１２、Ｄ１３、Ｄ１４、Ｄ１５、またはＤ１６を有する部分を含む。骨ターゲッティング部分は、存在するのであれば、融合ポリペプチドの任意の位置、たとえば、Ｎ末端もしくはＣ末端またはその近傍ならびに／あるいはリンカー領域に位置しうる。たとえば、Ｘ、Ｙ、および／またはＺのいずれか１つは、骨ターゲッティング部分を含みうる。
【０１８５】
いくつかの場合には、使用されるクローニング戦略の結果として、１個以上のアミノ酸が、融合ポリペプチド中に、たとえば、Ｘ、Ｙ、またはＺ内に導入される。いくつかの実施形態では、任意のそのような追加のアミノ酸は、本発明に係るポリペプチド中に組み込まれる場合、宿主細胞のエンドプロテアーゼの切断部位を提供しない。設計配列が宿主細胞のエンドプロテアーゼにより切断される可能性は、たとえば、Ｉｋｅｚａｗａ（Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．２５：４０９−４１７，２００２）（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるように、予測か可能である。
【０１８６】
本発明に係るポリペプチドはまた、グリコシル化（たとえば、マンノシル化および本明細書で考察される他の形態のグリコシル化）、アセチル化、アミド化、ブロック化、ホルミル化、γ−カルボキシグルタミン酸ヒドロキシル化、メチル化、ユビキチン化、リン酸化、ピロリドンカルボン酸修飾、硫酸化などの１つ以上の翻訳後修飾を有する任意のポリペプチドを含む。人工修飾たとえばペグ化もまた、実施可能である。
【０１８７】
特定の実施形態では、本発明に係る融合ポリペプチドは、たとえば、Ｆｃフラグメントのヒンジ領域に位置する２つのジスルフィド結合を介して、二量体の形に会合される。
【０１８８】
いくつかの実施形態では、本発明に係る融合ポリペプチドは、ｉｎ  ｖｉｖｏでＣＮＰ２２の少なくとも、たとえば、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、５、６、７、８、９、１０、１２．５、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，５００、２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、７，５００、１０，０００、１５，０００、２０，０００、２５，０００、３０，０００、４０，０００、または５０，０００倍の半減期を有する。
【０１８９】
分泌を促進するために、Ｎ末端シグナル配列、たとえば、配列番号５０１のアミノ酸１〜２５または当技術分野で公知の任意の他のシグナル配列をもたせて、任意のＮＰ融合タンパク質を発現させることが可能である。そのような配列は、一般的には、共翻訳的に切断されて、タンパク質の成熟体の分泌をもたらす。
【０１９０】
本明細書で説明した融合ポリペプチドは、本明細書で説明した融合ポリペプチドのいずれか、たとえば、配列番号５０１〜６０８に対して、少なくとも５０％（たとえば、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上）の配列同一性を有しうる。それに加えて、本明細書で説明した融合ポリペプチドは、本明細書で説明した融合ポリペプチドのいずれかに対して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、５０、またはそれ以上の付加、欠失、または置換を有しうる。さらに、いくつかの実施形態では、本明細書で説明した融合ポリペプチドは、本明細書で説明したポリペプチドたとえば融合ポリペプチドのいずれかをコードする核酸分子の少なくとも一部に、たとえば、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、さらには１００％に高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸分子によりコード可能である。
【０１９１】
核酸およびポリペプチドの産生
本発明に係る核酸およびポリペプチドは、当技術分野で公知の任意の方法により産生可能である。典型的には、所望の融合タンパク質をコードする核酸は、分子クローニング法を用いて生成され、一般的には、プラスミドやウイルスなどのベクター内に配置される。ベクターは、融合タンパク質の発現に適した宿主細胞内に核酸をトランスフォームすべく使用される。代表的な方法は、たとえば、Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８９）に開示されている。多くの細胞型を適切な宿主細胞として使用可能であるが、適切な翻訳後修飾を付与可能であることから、哺乳動物細胞が好ましい。たとえば、以下の実施例でより詳細に説明されるように、本発明に係る融合タンパク質を発現すべく、ヒト胚性腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞を宿主として使用した。
【０１９２】
本発明に係るポリペプチドは、宿主細胞内でポリペプチドの発現を行うのに好適な任意の条件下で産生可能である。そのような条件は、緩衝剤、重炭酸塩、および／またはＨＥＰＥＳ、塩化物イオン、リン酸イオン、カルシウムイオン、ナトリウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、鉄イオンのようなイオン、単糖のような炭素源、アミノ酸、場合により脂質、ヌクレオチド、ビタミン、ならびにインスリンのような増殖因子などの成分を用いて調製された培地、２〜４ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび５％ウシ胎仔血清が追加された、α−ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ハムＦ１２、およびＩＭＤＭのような通常の市販の培地、２〜４ｍＭ  Ｌ−グルタミンが追加された、ＨｙｃｌｏｎｅＴＭ  ＳＦＭ４ＣＨＯ、Ｓｉｇｍａ  ＣＨＯ  ＤＨＦＲ−、Ｃａｍｂｒｅｘ  ＰＯＷＥＲＴＭ  ＣＨＯ  ＣＤのような通常の市販の動物性タンパク質非含有培地の適切な選択を含む。これらの培地は、望ましくは、選択圧を維持して安定なタンパク質産物発現を可能にすべく、チミジン、ヒポキサンチン、およびＬ−グリシンを用いずに調製される。
【０１９３】
本発明に係るポリペプチドおよび核酸の産生のさらなる詳細は、実施例に示される。
【０１９４】
治療用途
本明細書で説明したポリペプチドおよび核酸分子は、たとえば、ＦＧＦＲ３の過剰活性化に関連付けられる障害（たとえば、骨障害および軟骨障害、たとえば、軟骨無形成症、もしくは癌、たとえば、多発性骨髄腫）、または血管平滑筋障害、または骨障害もしくは軟骨障害、たとえば、ＦＧＦＲ３の過剰活性化に関連付けられない障害の分野で、多種多様な治療用途を有しうる。それに加えて、本明細書で説明したポリペプチドおよび核酸分子は、骨の伸長が奏効すると思われる任意の病態または障害に使用可能である。
【０１９５】
ＦＧＦＲ３の過剰活性化に関連付けられる障害
ＦＧＦＲ３の過剰活性化により引き起こされるまたはそれに関連付けられる、たとえば、機能獲得ＦＧＦＲ３突然変異に由来する、任意の障害、疾患、または他の異常は、本明細書で説明した組成物および方法を用いて治療可能である。これらの障害、疾患、および他の異常は、それぞれ以下でより詳細に説明される骨障害または軟骨障害および癌を含むが、これらに限定されるものではない。
【０１９６】
ＦＧＦＲ３の過剰活性化に関連付けられる骨障害または軟骨障害
骨または軟骨の機能、構造、または成長に影響を及ぼす任意の障害、疾患、または他の異常、たとえば、骨格異形成症は、本明細書で説明した組成物および方法を用いて治療可能である。特定的には、障害は、ＦＧＦＲ３の過剰活性化に関連付けられる骨格異形成症、たとえば、発達遅延および表皮肥厚を併発する重症軟骨無形成症を含めて、軟骨無形成症など、ムエンケ症候群（ムエンケ冠状頭蓋骨癒合症）、クルーゾン皮膚骨格症候群、軟骨低形成症、Ｉ型致死性骨異形成症、ならびにＩＩ型致死性骨異形成症でありうる。本発明に係る組成物および方法はまた、ＦＧＦＲ３の過剰活性化に関連付けられない骨障害または軟骨障害を治療すべく使用可能であり、これらの障害は、以下でより詳細に説明される。
【０１９７】
癌
本明細書で説明した組成物および方法を用いて、ＦＧＦＲ３の過剰活性化により引き起こされるまたはそれに関連付けられる任意の癌を治療することが可能である。これらの癌は、たとえば、多発性骨髄腫、骨髄増殖性症候群、白血病（たとえば、形質細胞白血病）、リンパ腫、膠芽腫、前立腺癌、膀胱癌、および乳癌を含む。
【０１９８】
骨障害または軟骨障害
本明細書で説明したポリペプチドおよび核酸分子は、骨または軟骨の機能、構造、または成長に影響を及ぼす任意の障害、疾患、または他の異常を治療すべく使用可能である。これらの骨障害または軟骨障害は、ＦＧＦＲ３の過剰活性化に関連付けられるが、必ずしもそうである必要はない。
【０１９９】
骨格異形成症は、低身長または矮小発育により特徴付けられる骨障害または軟骨障害である。骨格異形成症は、典型的には、先天性であり、低身長のほかに、多くの異常、たとえば、短肢および短体幹、内反膝、動揺性歩行、頭蓋奇形、たとえば、大頭、クローバー葉頭蓋、頭蓋骨癒合（頭蓋骨の早期融合）、もしくはウォルム骨（頭蓋骨間の異常糸状結合）、手および足の異常、たとえば、多指（余分の指）、「ヒッチハイカー」母指、ならびに異常な指の爪および足の爪、または胸部異常、たとえば、洋ナシ形胸部もしくは細状胸郭を含みうる。また、骨格異形成症を有する者には、非骨格異常、たとえば、先天白内障、近視、口蓋裂、もしくは難聴などの眼、口、および耳の異常、水頭、孔脳、水無脳、もしくは脳梁欠損などの脳奇形、心房中隔欠損、動脈管開存、もしくは大血管転位などの心臓欠陥、発達遅延、または精神遅滞も存在しうる。ＦＧＦＲ３の過剰活性化に関連付けられる骨格異形成症は、軟骨無形成症を含む。
【０２００】
骨格異形成症は、軟骨無形成症（たとえば、ホモ接合またはヘテロ接合軟骨無形成症）、軟骨無発生症、先端異骨症、遠位中位肢異形成症、骨形成不全症、屈曲肢異形成症、点状軟骨異形成症（たとえば、近位肢型点状軟骨異形成症）、鎖骨頭蓋異骨症、先天性大腿骨短縮症、指症（たとえば、短指症、屈指症、多指症、または合指症）、捻曲性骨異形成症、矮小発育症、分節異常骨異形成症、内軟骨腫症、繊維軟骨形成症、繊維性骨異形成症、遺伝性多発性外骨腫症、軟骨低形成症、低ホスファターゼ症、低リン血症性くる病、ヤッフェ・リヒテンシュタイン症候群、クニースト骨異形成症、クニースト症候群、ランガー型中位肢異形成症、マルファン症候群、マッキューン・オルブライト症候群、小肢症、骨幹端異形成症（たとえば、ヤンセン型骨幹端異形成症）、変容性骨異形成症、モルキオ症候群、ニーベルゲルト型中位肢異形成症、神経繊維腫症（たとえば、１型、たとえば、骨病変併発型もしくは骨病変非併発型、２型、または神経鞘腫症）、骨関節炎、骨軟骨異形成症、骨形成不全症（たとえば、周産期致死型骨形成不全症）、骨化石症、骨斑紋症、末梢骨形成不全症、ラインハルト症候群、ロバーツ症候群、ロビノー症候群、短肋骨多指症候群、低身長症、先天性脊椎骨端異形成症、脊椎骨端骨幹端異形成症または致死性骨異形成症を含む。
【０２０１】
特定的には、いくつかの形態の頭蓋骨癒合症は、ＭＡＰＫ経路の活性化を引き起こす繊維芽細胞増殖因子レセプター（たとえば、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、またはＦＧＦＲ３の１つ以上）の１つの突然変異の結果である。このことは、たとえば、ムエンケ症候群（ムエンケ冠状頭蓋骨癒合症）、クルーゾン症候群、アペール症候群、ジャクソン・ワイス症候群、プファイファー症候群、およびクルーゾン皮膚骨格症候群の場合にあてはまる。ＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１／２）の活性化を予防可能な作用剤は、動物モデルで頭蓋骨癒合症を予防可能であるという遺伝的および生化学的証拠が科学文献に存在する。特定的には、ＥＲＫ１／２の活性化を予防するＭＥＫ１／２阻害剤（たとえば、Ｕ０１２６）の使用により、アペール症候群の動物モデルで頭蓋骨癒合症を予防可能である（Ｓｈｕｋｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３９：１１４５，２００７）。したがって、ＭＡＰキナーゼ経路の活性化を予防可能な本発明に係る化合物は、これらの形態の頭蓋骨癒合症を治療すべく使用可能である。
【０２０２】
軟骨無形成症
軟骨無形成症は、ヒトにおいて矮小発育症の最も一般的な原因となる常染色体優性骨格異形成症である。その発生頻度は、生児出生２０，０００例中約１例である。骨格病変は、成長遅延（平均成人身長１２３〜１３１ｃｍ（４フィート１／２インチ〜４フィート３・１／２インチ））、頭蓋変形、および歯科矯正学的欠陥を含む。骨外性病変は、頸髄圧迫（たとえば、中枢性無呼吸または発作が原因で、死の危険を伴う）、脊柱管狭窄（たとえば、下肢痛および腰痛）、水頭（たとえば、脳シャント手術を必要とするもの）、慢性耳炎起因性聴力損失、心血管疾患、神経疾患、より高頻度の偶発症候、および肥満を含む。
【０２０３】
乳児は、出生時に診断されることが多い。ホモ接合型は、通常、致死的であるが、ヘテロ接合型と診断された者は、正常者よりも平均で１５年間短い余命を有する。
【０２０４】
本明細書で説明した組成物および方法を用いて、ヘテロ接合もしくはホモ接合軟骨無形成症またはその病変もしくは表現型のいずれかを治療することが可能である。いずれの型の治療も、患者の生涯のできるだけ早い時期に、たとえば、出生直後に、さらには子宮内で、開始可能であり、このことは、典型的にはかなり重篤で治療しなければ致死的であることが多いホモ接合型の治療にとくに重要である。
【０２０５】
血管平滑筋障害
本明細書で説明したポリペプチドおよび核酸分子は、血管平滑筋の機能、構造、または成長に影響を及ぼす任意の障害、疾患、または他の異常を治療すべく使用可能である。例示的血管平滑筋障害は、高血圧症、再狭窄症、動脈硬化症、急性非代償性心不全、鬱血性心不全、心性浮腫、腎性浮腫、肝性浮腫、急性腎不全、および慢性腎不全である。
【０２０６】
骨の伸長に適した病態
骨の伸長が奏効すると思われる任意の病態、障害、疾患、または他の異常は、本明細書で説明した組成物および方法を用いて治療可能である。これらの病態、障害、疾患、および他の異常は、骨折、腎障害もしくは腎不全、粗食、ビタミン欠乏症、またはホルモン欠乏症に起因する不十分なまたは損なわれた骨成長を含むが、これらに限定されるものではない。また、本明細書で説明した組成物および方法を用いて、たとえば、美容目的で、健常被験体、たとえば、骨または軟骨に関連付けられるいかなる病態、障害、疾患、または他の異常もない被験体を治療することが可能である。
【０２０７】
骨格異形成症はまた、長骨の短縮分節にも関連付けられる。例示的骨格異形成症は、近位肢短縮症（または肢の近位分節、たとえば、上腕骨または大腿骨の短縮）、たとえば、軟骨無形成症、骨形成不全症、先天性大腿骨短縮症、捻曲性骨異形成症、軟骨低形成症、ヤンセン型骨幹端異形成症、近位肢型点状軟骨異形成症、先天性脊椎骨端異形成症、および致死性骨異形成症、中位肢短縮症（または肢の中位分節、たとえば、橈骨、尺骨、脛骨、または腓骨の短縮）、たとえば、ランガー型およびニーベルゲルト型の中位肢異形成症、ロビノー症候群、およびラインハルト症候群、先端異骨症および末梢骨形成不全症などの遠位肢短縮症（または肢の遠位分節、たとえば、中手骨または指骨の短縮）、遠位中位肢短縮症（または肢の中位分節および遠位分節、たとえば、前腕および手の短縮）、たとえば、遠位中位肢異形成症、小肢症（または全肢の短縮）、たとえば、軟骨無発生症、繊維軟骨形成症、分節異常骨異形成症、クニースト骨異形成症、およびロバーツ症候群、または短体幹症、たとえば、ディグヴー・メキオー・クローセン疾患、クニースト症候群、変容性骨異形成症、モルキオ症候群、脊椎骨端骨幹端異形成症、および先天性脊椎骨端異形成症に関連付けられるものを含む。
【０２０８】
製剤
製剤は、投与経路さらには他の治療目標に依存するであろう。本明細書で説明したポリペプチドおよび核酸分子は、当技術分野で公知の任意の経路により、たとえば、皮下（たとえば、皮下注射により）、静脈内、経口的、経鼻的、筋肉内、舌下、髄腔内、または皮内に投与可能である。例として、本発明に係る医薬組成物は、液体剤、溶液剤、サスペンジョン剤、丸剤、カプセル剤、錠剤、ゲルキャップ剤、粉末剤、ゲル剤、軟膏剤、クリーム剤、ネブラ剤、ミスト剤、アトマイズ蒸気剤、エアロゾル剤、またはフィトソーム剤の形態をとりうる。
【０２０９】
本発明のいくつかの実施形態では、本発明に係る組成物は、皮下投与可能である。比較的非侵襲性でありかつ望ましい薬動学的プロファイルを呈するので、皮下投与は有利である。好適な量は、当業者に公知であり、典型的には、５ｍＬ以下（たとえば、４ｍＬ、３．５ｍＬ、３ｍＬ、２．７ｍＬ、２．５ｍＬ、２．３ｍＬ、２．２ｍＬ、２．１ｍＬ、２．０ｍＬ、１．９ｍＬ、１．８ｍＬ、１．７ｍＬ、１．５ｍＬ、１．３ｍＬ、１．０ｍＬ、０．７ｍＬ、０．５ｍＬ、０．３ｍＬ、０．１ｍＬ、０．０５ｍＬ、０．０１ｍＬ、またはそれ以下）である。典型的には、本発明に係る組成物は、皮下投与に供する場合１ｍｇ／ｍＬ〜５００ｍｇ／ｍＬ（たとえば、１０ｍｇ／ｍＬ〜３００ｍｇ／ｍＬ、２０ｍｇ／ｍＬ〜１２０ｍｇ／ｍＬ、４０ｍｇ／ｍＬ〜２００ｍｇ／ｍＬ、３０ｍｇ／ｍＬ〜１５０ｍｇ／ｍＬ、４０ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ〜８０ｍｇ／ｍＬ、または６０ｍｇ／ｍＬ〜７０ｍｇ／ｍＬ）の濃度で製剤化可能である。経口投与に供する場合、錠剤またはカプセル剤は、結合剤、充填剤、潤滑剤、崩壊剤、または湿潤剤などの薬学的に許容可能な賦形剤と共に従来の手段により調製可能である。錠剤は、当技術分野で公知の方法によりコーティング可能である。経口投与に供される液状製剤は、たとえば、溶液剤、シロップ剤、またはサスペンジョン剤の形態をとることが可能であり、または使用前に生理食塩水もしくは他の好適な液状媒体を用いて構成すべく乾燥製剤として提供可能である。経口投与に供される本発明に係る組成物はまた、必要に応じて、懸濁化剤、乳化剤、非水性媒体、保存剤、緩衝塩、風味剤、着色剤、および甘味剤などの薬学的に許容可能な賦形剤を含有可能である。経口投与に供される製剤はまた、好適には、活性成分の制御放出を行うべく製剤化可能である。
【０２１０】
さらに、強酸性胃液との長時間接触には耐えるが、弱酸性または中性の腸内環境では溶解するように、腸溶コーティングを本発明に係る錠剤で使用することが可能である。そのように限定されるものではないが、本発明に係る医薬組成物の腸溶コーティングでは、セルロースアセテートフタレート、ＥｕｄｒａｇｉｔＴＭ、およびヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート（ＨＰＭＣＰ）を使用することが可能である。一般に使用されるセルロースアセテートフタレート濃度は、コア重量の０．５〜９．０％である。可塑剤の添加により、このコーティング材料の耐水性が向上し、そのような可塑剤を用いた製剤は、セルロースアセテートフタレートが単独で使用された場合よりも効果的である。セルロースアセテートフタレートは、アセチル化モノグリセリド、ブチルフタリルブチルグリコレート、ジブチルタルトレート、ジエチルフタレート、ジメチルフタレート、エチルフタリルエチルグリコレート、グリセリン、プロピレングリコール、トリアセチン、トリアセチンシトレート、およびトリプロピオニンをはじめとする多くの可塑剤と相溶可能である。また、薬剤制御放出製剤では、エチルセルロースなどの他のコーティング剤と組み合わせて使用される。
【０２１１】
本発明に係る化合物は、薬学的に許容可能な無菌の水性または非水性の溶媒、サスペンジョン、またはエマルジョンと組み合わせて、投与可能である。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、魚油、および注射可能な有機エステルである。水性担体は、水溶液、水アルコール溶液、エマルジョン、またはサスペンジョン、たとえば、生理食塩水、および緩衝化医療用非経口媒体、たとえば、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース溶液、デキストロース＋塩化ナトリウム溶液、ラクトース含有リンゲル溶液、または固定油を含む。静脈内投与媒体は、流体・栄養補液、電解質補液、たとえば、リンゲルデキストロース系補液などを含みうる。
【０２１２】
いくつかの実施形態では、本発明に係る医薬組成物は、制御放出系で送達可能である。いくつかの実施形態では、ポリ乳酸、ポリオルトエステル、架橋両親媒性ブロックコポリマーおよびヒドロゲル、ポリヒドロキシ酪酸、ならびにポリジヒドロピランをはじめとする高分子材料を使用することが可能である（Ｓｍｏｌｅｎ  ａｎｄ  Ｂａｌｌ，Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，１９８４，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｒａｎａｄｅ  ａｎｄ  Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ，Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ｓｅｒｉｅｓ，２００３，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，ＣＲＲＣ  Ｐｒｅｓｓをも参照されたい）。他の実施形態では、ポンプを使用することが可能である（Ｓａｕｄｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４）。
【０２１３】
本発明に係る組成物は、希釈剤として適切な賦形剤溶液（たとえばスクロース溶液）を用いて、凍結乾燥粉末の形態で製剤化可能である。
【０２１４】
さらに、ＦＧＦＲ３の過剰活性化に関連付けられる障害、たとえば、軟骨無形成症、骨障害もしくは軟骨障害、または血管平滑筋障害を有する者、または骨伸長が奏効すると思われる者から、細胞を単離し、本発明に係る核酸でトランスフォームし、そして罹患者（たとえば、皮下注射または静脈内注射）に再導入することが可能である。他の選択肢として、たとえば注射により、核酸を罹患者に直接投与することが可能である。また、特定の細胞型にターゲッティングされるように設計可能であるかつさまざまな経路を介して投与されるように工学操作可能であるリポソームなどの媒体を介して、核酸を送達することも可能である。
【０２１５】
本発明に係る組成物はまた、たとえば軟骨無形成症表現型を修正すべく、少なくとも１つの他の活性成分と組み合わせて使用することも可能である。
【０２１６】
遺伝子療法
本明細書で説明したポリペプチドはまた、タンパク質をコードする外因性核酸が対象の組織に送達されてｉｎ  ｖｉｖｏで発現される遺伝子療法を介して、有利に送達可能である。遺伝子療法は、たとえば、Ｖｅｒｍｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ  ３８９：２３９−２４２，１９９７）、  Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １７：Ｓ６７−Ｓ６８，２００９）、およびＹａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．２６：１３５−１４２，２０１１）（それらはいずれも参照により本明細書に組み込まれる）で考察されている。ウイルスおよび非ウイルスの両方のベクター系を使用することが可能である。ベクターは、たとえば、複製起点と、オプションとして、ウイルスポリペプチドをコードする核酸を発現させるためのプロモーターと、オプションとして、プロモーターのレギュレーターと、を備えた、プラスミドベクター、人工染色体ベクター（たとえば、細菌、哺乳動物、または酵母の人工染色体）、ウイルスベクター、またはファージベクターでありうる。ベクターは、１つ以上の選択性マーカー遺伝子、たとえば、細菌プラスミドの場合にはアンピシリン耐性もしくはカナマイシン耐性の遺伝子、または菌類ベクター用の耐性遺伝子を含有しうる。ベクターは、たとえば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、もしくはウイルスポリペプチドを産生するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで使用可能であり、またはたとえば、ベクターによりコードされるウイルスポリペプチドを産生するために、宿主細胞たとえば哺乳動物宿主細胞をトランスフェクトもしくはトランスフォームすべく使用可能である。ベクターはまた、ｉｎ  ｖｉｖｏで、たとえば、ワクチン接種法または遺伝子療法で使用すべく適合化可能である。
【０２１７】
好適なウイルスベクターの例は、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルスを含む）、アルファウイルス、ポックスウイルス（たとえばカナリアポックス）、およびワクシニアウイルスに基づく系を含む。これらのウイルスを用いた遺伝子移入技術は、当技術分野で公知である。たとえば、レトロウイルスベクターは、本発明に係る核酸を宿主ゲノム中に安定に組み込むべく使用可能である。これとは対照的に、複製欠損アデノウイルスベクターは、エピソーム性を維持するので、一過性発現を可能にする。昆虫細胞中（たとえば、バキュロウイルスベクター）、ヒト細胞中、酵母中、または細菌中で発現を駆動可能なベクターは、たとえば、サブユニットワクチンでまたはイムノアッセイで使用するために、本発明に係る核酸によりコードされるウイルスポリペプチドを多量に産生すべく利用可能にする。有用な遺伝子療法は、タンパク質産生細胞としての肝細胞に対象の核酸をターゲッティングすべくアデノウイルスベクターを使用する、国際公開第０６／０６０６４１号パンフレット、米国特許第７，１７９，９０３号明細書、および国際公開第０１／３６６２０号パンフレット（それらはいずれも参照により本明細書に組み込まれる）に記載のものを含む。
【０２１８】
さらなる例では、複製欠損サルアデノウイルスベクターを生ベクターとして使用することが可能である。このウイルスは、Ｅ１欠失を含有し、Ｅ１遺伝子でトランスフォームされた細胞系で増殖させることが可能である。この複製欠損サルアデノウイルスベクターの例は、米国特許第６，０８３，７１６号明細書および国際公開第０３／０４６１２４号パンフレット（それらはいずれも参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。このベクターは、コードウイルスポリペプチドが発現されうるように、本発明に係る核酸を挿入すべく操作可能である。
【０２１９】
プロモーターおよび他の発現調節シグナルは、発現が設計される宿主細胞に適合しうるように選択可能である。たとえば、哺乳動物プロモーターは、カドミウムなどの重金属に応答して誘導可能なメタロチオネインプロモーターおよびβ−アクチンプロモーターを含む。ウイルスプロモーター、たとえば、ＳＶ４０ラージＴ抗原プロモーター、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期（１Ｅ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲプロモーター、アデノウイルスプロモーター、またはＨＰＶプロモーター、特定的には、ＨＰＶ上流調節領域（ＵＲＲ）を使用することが可能である。すべてのこれらのプロモーター、さらには追加のプロモーターは、当技術分野で十分に説明されている。
【０２２０】
本明細書で説明した核酸分子はまた、非ウイルスに基づく系を用いて投与することも可能である。たとえば、これらの投与系は、マイクロスフェアカプセル化、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、ナノ粒子、およびリポソームに基づく系を含む。また、非ウイルスに基づく系は、「裸の」ポリヌクレオチドの送達を促進する技術（たとえば、電気穿孔、「遺伝子銃」送達、およびポリヌクレオチドの導入に使用された種々の他の技術）も含む。
【０２２１】
導入されたポリヌクレオチドは、安定的または一過的に宿主細胞内に維持可能である。安定な維持は、典型的には、導入されたポリヌクレオチドが、宿主細胞に適合可能な複製起点を含有するか、あるいは染色体外レプリコン（たとえばプラスミド）または核染色体もしくはミトコンドリア染色体などの宿主細胞のレプリコン中に組み込まれるか、のいずれかを必要とする。
【０２２２】
投与量
任意の量の本発明に係る医薬組成物を被験体に投与することが可能である。投与量は、投与形態および被験体の年齢をはじめとする多くの因子に依存するであろう。典型的には、単回用量に含有される本発明に係る組成物の量は、有意な毒性を誘導することなく、ＦＧＦＲ３の過剰活性化に関連付けられる障害、骨障害もしくは軟骨障害、または血管平滑筋障害を治療するのに、または骨を伸長させるのに、有効な量であろう。たとえば、本明細書で説明したポリペプチドは、たとえば、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜５００ｍｇ／ｋｇ（たとえば、０．０５ｍｇ／ｋｇ〜５００ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ〜５００ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ〜２５ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇ、もしくは２．０ｍｇ／ｋｇ〜３．０ｍｇ／ｋｇ）、または１μｇ／ｋｇ〜１，０００μｇ／ｋｇ（たとえば、５μｇ／ｋｇ〜１，０００μｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜７５０μｇ／ｋｇ、５μｇ／ｋｇ〜７５０μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ〜７５０μｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜５００μｇ／ｋｇ、５μｇ／ｋｇ〜５００μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ〜５００μｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜１００μｇ／ｋｇ、５μｇ／ｋｇ〜１００μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ〜１００μｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜５０μｇ／ｋｇ、５μｇ／ｋｇ〜５０μｇ／ｋｇ、もしくは１０μｇ／ｋｇ〜５０μｇ／ｋｇ）の範囲内の個別用量で被験体に投与可能である。例示的用量は、たとえば、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、２、２．５、５、１０、２０、２５、５０、１００、１２５、１５０、２００、２５０、もしくは５００ｍｇ／ｋｇ、または１、２、２．５、５、１０、２０、２５、５０、１００、１２５、１５０、２００、２５０、５００、７５０、９００、もしくは１，０００μｇ／ｋｇを含む。本明細書に挙げられたすべての投与量または範囲に対して、「約」という用語は、これらの投与量を記載値または範囲終点の±１０％だけ変更すべく使用可能である。
【０２２３】
用量は、たとえば、１時間に１回、２時間に１回、毎日１回、２日に１回、毎週２回、毎週３回、毎週４回、毎週５回、毎週６回、毎週１回、２週間に１回、毎月１回、２ヶ月に１回、または毎年１回投与可能である。他の選択肢として、用量は、たとえば、毎日２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、または１２回投与可能である。特定の好ましい実施形態では、投与レジメンは、毎週１回である。投与レジメンの継続期間は、たとえば、日数、週数、または月数で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０、さらには被験体の残りの寿命でありうる。投与の量、頻度、および継続期間は、疾患の程度や被験体からのさまざまなパラメーターなどの通常の因子に基づいて、臨床医により適合化されるであろう。
【０２２４】
本発明に係る核酸は、本明細書で説明した処方に従って遺伝子療法に好適な投与量で患者に投与可能である。投与される核酸の量は、核酸の長さおよび性質、使用されるベクター（たとえば、ウイルスまたは非ウイルス）、コードされるポリペプチドの活性、賦形剤の存在、投与の経路および方法、ならびに被験体の全身状態および適応能力をはじめとする当業者に公知のいくつかの因子に依存するであろう。例示的な投与量および投与経路は、たとえば、Ｍｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｉｓｒ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．Ｊ．９：１４３−１４６，２００７、勃起不全を治療すべくプラスミド中のヒトｃＤＮＡを０．５ｍｇ〜７．５ｍｇで陰茎内注射することが記載されている）、Ｐｏｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １１８：５８−６５，２００８、重症肢虚血を治療すべく肝細胞増殖因子プラスミドを０．４ｍｇ〜４．０ｍｇで筋肉内注射することが記載されている）、Ｗａｄｄｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（ＡＪＲ  Ａｍ．Ｊ．Ｒｏｅｎｔｇｅｎｏｌ．１６９：６３−６７，１９９７、黒色腫を治療すべくＭＨＣ抗原をコードするプラスミドＤＮＡを０．０１ｍｇ〜０．２５ｍｇでＣＴガイド下腫瘍内注射することが記載されている）、Ｋａｓｔｒｕｐ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．４５：９８２−９８８，２００５、重症狭心症を治療すべくＶＥＧＦプラスミドを０．５ｍｇで心筋内注射することが記載されている）、およびＲｏｍｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．（Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．１５：１０６５−１０７６，２００４、デュシェンヌ／ベッカー筋ジストロフィーを治療すべくプラスミドを０．２ｍｇ〜０．６ｍｇで筋肉内注射することが記載されている）（それらはいずれも参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０２２５】
特定の実施形態では、本発明に係る核酸は、たとえば、０．０１ｍｇ〜１００ｍｇ（たとえば、０．０５ｍｇ〜５０ｍｇ、０．１ｍｇ〜１０ｍｇ、０．３ｍｇ〜３ｍｇ、または約１ｍｇ）の範囲内の核酸用量で被験体に投与可能である。核酸の投与可能な全量は、その濃度に依存するであろう。また、たとえば、１μＬ〜１０ｍＬ（たとえば、１０μＬ〜１ｍＬ、５０μＬ〜５００μＬ、７０μＬ〜２００μＬ、９０μＬ〜１５０μＬ、または１００μＬ〜１２０μＬ）の範囲内でありうる。
【０２２６】
核酸は、たとえば、１時間に１回、２時間に１回、毎日１回、２日に１回、毎週２回、毎週３回、毎週４回、毎週５回、毎週６回、毎週１回、２週間に１回、毎月１回、２ヶ月に１回、または毎年１回投与可能である。他の選択肢として、核酸は、たとえば、毎日２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、または１２回投与可能である。投与レジメンの継続期間は、たとえば、日数、週数、または月数で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０、さらには被験体の残りの寿命でありうる。
【０２２７】
実際の用量は、各被験体に特有の臨床因子に基づいて、主治医または栄養士により注意深く選択調整すべきであるので、これらは、ガイドラインである。最適な反復用量は、当技術分野で公知の方法により決定されるであろう。また、以上に示された被験体の年齢などの因子および他の臨床関連因子により影響されるであろう。それに加えて、被験体は、他の疾患または病態に対する投薬を受けることも可能である。他の投薬は、本発明に係るポリペプチドまたは核酸が被験体に投与される期間にわたり継続されるが、そのような場合、有害な副作用を起こすかを調べるために、低用量から始めることが推奨される。
【実施例】
【０２２８】
以下に提供される実施例は、本発明を例示することを意図したものであり、それを限定しようとするものではない。
【０２２９】
実施例１．ＮＣ２  Ｓｔｒｅｐｔａｇのクローニング、産生、および精製
Ｆｃ−ＣＮＰ融合タンパク質を図８Ａおよび８Ｂに示されるように設計した。「ＮＣ２  Ｓｔｒｅｐｔａｇ」または「ＮＣ２ｓｔ」と称されるこのタンパク質は、発現時に切断される２５アミノ酸Ｎ末端シグナル配列を有する。成熟タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へ、次のドメイン構造、すなわち、短いリンカー配列によりフランキングされたＳｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩ配列（精製促進用）、ＴＥＶプロテアーゼ切断配列、それに続く短いリンカー、ヒトＩｇＧ−１のＦｃドメイン、１６アミノ酸高グリシンリンカー、およびＣＮＰ２２を有する。
【０２３０】
ＮＣ２ｓｔのコード配列を化学合成し（図８Ｃ、配列番号８０１）、当技術分野で公知の標準的技術を用いて小さいクローニングプラスミドに挿入した。次いで、ＮＣ２ｓｔのコード配列を哺乳動物発現ベクターに挿入し、所有権付きＨＥＫ２９３細胞系（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，  ＮＲＣＣ，  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｇｒｏｕｐ，  Ｍｏｎｔｒｅａｌ）に一過性トランスフェクトした。ＮＣ２ｓｔを培養培地中に７日間分泌させた後、培養上清を採取した。
【０２３１】
ＮＣ２ｓｔタンパク質を含有する培養上清を接線流濾過により１０倍に濃縮し、無菌条件で０．４５μｍ膜で濾過し、そして４℃に維持した。濃縮採取物を０．２２μｍ膜で無菌濾過した後、１８０ｍＬ  Ｓｔｒｅｐｔａｃｔｉｎカラム（ＩＢＡ  ＧｍｂＨ）上に充填した。Ｕｎｉｃｏｒｎ制御ソフトウェアを利用して、ＡＫＴＡ  ＦＰＬＣシステムで精製を行った。最初に、Ｓｔｒｅｐｔａｃｔｉｎカラムを５ＣＶの１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０と平衡化させ、次いで、５分間の接触時間を用いて濃縮採取物を充填し、そしてカラムを６ＣＶの１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０で洗浄した。各溶出分画間で２分間休止することにより、１０×０．５ＣＶの１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２．５ｍＭデスチオビオチン、ｐＨ８．０で段階的にＮＣ２ｓｔタンパク質を溶出させた。次いで、溶出液を透析し、濃縮し、そして２５ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４中に製剤化した。
【０２３２】
他の選択肢として、ＣＮＰ−ＦｃまたはＦｃ−ＣＮＰタンパク質をプロテインＡ収着剤（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ，  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した。最初に、１８０ｍＬカラムを５カラム体積（ＣＶ）のＥＱ緩衝液（５０ｍＭ  ＮａＰＯ４、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）と平衡化させた。約２．４ｇ／ＬのＦｃ−ＣＮＰを含有する約１Ｌの採取媒体をカラムに充填した後、３ＣＶのＥＱ緩衝液、４ＣＶのＷａｓｈ２緩衝液（１００ｍＭクエン酸ナトリウム、１．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．０）、および３ＣＶのＷａｓｈ３緩衝液（１００ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ６．０）でカラムを洗浄した。次いで、３ＣＶの溶出緩衝液（１００ｍＭクエン酸ナトリウム、０．１Ｍ  Ｌ−アルギニン、ｐＨ３．５）を用いて、溶出体積の６７％の中和緩衝液（１．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ７．６）を含有する適切な容器内にタンパク質を溶出させた。最後に、精製タンパク質を濃縮し、そして１０ｋＤａカットオフＶｉｖａｓｐｉｎユニット（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＶＳ２０２２）またはＴＦＦ  １０ｋＤａ  Ｋｖｉｃｋ  Ｌａｂ  ＳＣＵユニット（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、リン酸緩衝液（２５ｍＭ  ＮａＰＯ４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で透析した。ＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｒｕｂｙ染色４〜１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．）およびサイズ排除ＨＰＬＣによる評価で、精製手順の全収率は約８０％であり、純度は９５％を超えた。精製タンパク質調製物は、４〜６℃で貯蔵され、数ヶ月間わたり安定性を維持した。
【０２３３】
実施例２．全細胞グアニリルシクラーゼアッセイ
Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ−２０００ＣＤを用いて、半集密７５ｃｍ２フラスコ中のＨＥＫ２９３Ｓ細胞を、適切なレセプターたとえばヒトＮＰＲ−ＢまたはＮＰＲ−Ａをコードする３０μｇのプラスミドＤＮＡでトランスフェクトした。他の選択肢として、ヒトＮＰＲ−ＢまたはＮＰＲ−Ａのいずれかを発現する安定ポリクローナルＨＥＫ２９３Ｓ細胞系を使用した。トランスフェクションの２４時間後、細胞をトリプシン処理して１×１０５細胞／ウェルで４８ウェルプレート中にプレーティングする。プレーティングの２４時間後、グアニリルシクラーゼアッセイを行う。最初に、無血清ＤＭＥＭ培地を用いて３７℃で細胞を３０分間インキュベートする。次いで、１ｍＭ  ＩＢＭＸおよび０．５％ＢＳＡが追加された無血清ＤＭＥＭ中で、参照タンパク質または試験タンパク質の濃度を増加させてまたは増加させずに、３０分間〜１時間にわたり３７℃で三重試験方式でインキュベートする。ＣＮＰは、ＮＰＲ−Ｂに対する好適な参照として機能し、一方、ＡＮＰは、ＮＰＲ−Ａに対する好適な参照である。最後に、細胞を氷冷ＰＢＳで洗浄し、そしてＣａｔｃｈｐｏｉｎｔ  ｃＧＭＰキット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｅｖｉｃｅｓ）の溶解緩衝液中に可溶化させる。Ｃａｔｃｈｐｏｉｎｔ  ｃＧＭＰキットを用いて、溶解物中のｃＧＭＰの濃度を決定する。四パラメーターロジスティック式で非線形回帰を用いて、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ５ソフトウェアで用量−応答曲線を解析する。
【０２３４】
実施例３．膜グアニリルシクラーゼアッセイ
ＮＰＲ−ＢまたはＮＰＲ−Ａのいずれかを発現するＨＥＫ２９３細胞を用いて、次のように粗膜調製物を調製する。ＴＨ緩衝液（５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４、１０％グリセロール、プロテアーゼ阻害剤錠剤（Ｒｏｃｈｅカタログ番号１１６９７４９８００１、３５ｍＬの緩衝液に対して１錠）、５０ｍＭフッ化ナトリウム、１０ｍＭピロリン酸ナトリウム、２５ｍＭグリセロール２−リン酸）中に細胞を再懸濁し、ポリトロンホモジナイザーを用いてホモジナイズする。３８，０００ｇで３０分間遠心分離した後、細胞を再度ホモジナイズし、この洗浄手順をさらに２回繰り返す。次いで、粗膜ペレットをＦＢ緩衝液（５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２５０ｍＭスクロース、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．４、１０％グリセロール、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅカタログ番号１１８７３５８０００１、および２５ｍＬの緩衝液に対して１錠）、５０ｍＭフッ化ナトリウム、２５ｍＭグリセロール２−リン酸）中でホモジナイズし、１．５ｍＬエッペンドルフチューブ中に２００μＬで分注し、そして液体窒素中で迅速に凍結し、その後、−８０℃で貯蔵する。次いで、１ｍＭ  ＧＴＰ、１ｍＭ  ＡＴＰ、１０ｍＭテオフィリン、２ｍＭ  ＩＢＭＸ、１００Ｕ／ｍＬのクレアチンキナーゼ、１０ｍＭクレアチンリン酸、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含有する１００μＬの緩衝液Ａ（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７，５）中の１０μｇの粗調製物に対して漸増濃度のアゴニストペプチドまたはタンパク質を１．２ｍＬのディープウェルプレート中に添加することにより、膜を用いてｃＧＭＰ用量−応答曲線を作成する。プレートを３７℃の水浴中で１５〜２０分間インキュベートした後、５００μＬの氷冷１１０ｍＭ酢酸亜鉛を各ウェルに添加し、プレートを氷上に配置する。５００μＬの１１０ｍＭ炭酸ナトリウムを各ウェルに添加した後、プレートシェーカー上でプレートを６００ｒｐｍで２分間アジテートする。各ウェルの内容物を１．５ｍＬエッペンドルフチューブに移して、２０，０００ｇで５分間遠心分離する。上清を新しい１．５ｍＬエッペンドルフチューブに移す。Ｃａｔｃｈｐｏｉｎｔ  ｃＧＭＰキットを用いて、ｃＧＭＰ濃度を決定する。四パラメーターロジスティック式で非線形回帰を用いて、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ５ソフトウェアで用量−応答曲線を解析する。
【０２３５】
一般的には、ＮＰＲ−Ｂに対する膜アッセイでは、対応する全細胞アッセイよりもかなり高い（効能の低い）ＥＣ５０値が得られるので、一般的には、全細胞アッセイでの絶対ＥＣ５０測定値を膜アッセイでの絶対ＥＣ５０測定値と比較すべきでないことに留意されたい。アッセイタイプ間で結果を比較する場合、絶対ＥＣ５０値を比較するよりも、試験化合物と対照化合物との相対ＥＣ５０比を比較するほうが有益である。
【０２３６】
実施例４．Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＩＶ投与またはＳＣ投与ＮＣ２ｓｔのｉｎ  ｖｉｖｏ薬動学的試験
目的
この試験の目的は、マウスへの静脈内投与後および皮下投与後のＮＣ２ｓｔのノンコンパートメント薬動学的パラメーターの決定およびその皮下生物学的利用能の算出であった。
【０２３７】
実験計画
ＮＣ２ｓｔを５．７９ｍｇ／ｍＬの濃度で２５ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中に製剤化した。以下の表３に記載されるように、動物は、単回ＩＶまたはＳＣ用量（２０ｍｇ／ｋｇ）としてＮＣ２ｓｔの投与を受けた。
【０２３８】
【表３】
0006055779.tif 000005
【０２３９】
注射は７：００〜１０：１５ＡＭの間にスケジュールされた。各マウスの肩甲部に試験品を皮下注射し、または各マウスを齧歯動物保定器で固定して尾静脈を介して静脈内ボーラスとして試験品を注射した。投与量を３．４５ｍＬ／ｋｇに設定した。動物に一回用量のみの投与を行った後、予定された血液採取および屠殺を行った。個別体重を評価した後、予定された試験品注射を行った。また、投与される試験品の量は、体重測定に基づいた。
【０２４０】
血液採取
さまざまな時点でイソフルラン麻酔下で頸静脈を介して、血液サンプル（０．１〜０．１２  ｍＬ）を採取した。最後の時点でイソフルラン麻酔下で心臓穿刺により、血液サンプルを採取した。
【０２４１】
血液サンプルをＭｉｃｒｏｖｅｔｔｅ２００Ｚ／ゲルチューブ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ、血清／ゲル凝固アクチベーター、＃２０．１２９１）中に採取し、室温で３０〜６０分間インキュベートし、そして２〜８℃で５分間にわたり１０，０００×ｇで遠心分離した。次いで、血清を新しい０．５ｍＬチューブ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ、＃７２．６９９）中に移し、液体窒素中でスナップ凍結し、そして分析まで−８０℃で貯蔵した。
【０２４２】
血清中の試験品濃度
ＣＮＰ２２蛍光ＥＩＡキット（Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、カタログ番号ＦＥＫ−０１２−０３）を用いて、血清サンプル中のＮＣ２ｓｔの存在を評価した。血清中にスパイクされた製剤化ＮＣ２ｓｔタンパク質は、標準として機能した。ＥＩＡにより測定された濃度から薬動学的プロファイルを導出した。
【０２４３】
最終手順
最後のサンプルの採取後、イソフルラン麻酔下で両側開胸により動物を屠殺した。
【０２４４】
ノンコンパートメント薬動学的解析
ノンコンパートメント解析（ＮＣＡ）を用いて、試験化合物の薬動学的パラメーターを算出した。ＷｉｎＮｏｎｌｉｎＴＭ  Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅ  Ｅｄｉｔｉｏｎバージョン５．２．１２を用いて、試験化合物のすべての測定された血清中濃度対時間プロファイルを処理した。血管外投与に対してはＮＣＡモデル２００またはＩＶボーラス投与に対してはモデル２０１を選択し、両方のモデルでスパースサンプリング解析モジュールを使用した。
【０２４５】
次のノンコンパートメントＰＫパラメーターを算出した。
・線形台形（線形補間）を用いて算出される時間ゼロから最後までの検出可能濃度の曲線下面積（ＡＵＣｌａｓｔ）、
・ＡＵＣｌａｓｔ＋Ｃｌａｓｔ／λｚ（式中、λｚ＝血清中濃度対時間曲線の最終相の傾き）として算出される時間ゼロから無限大までの曲線下面積（ＡＵＣ∞）、
・最大観測血清中濃度（Ｃｍａｘ）、最大血清中濃度の時間（Ｔｍａｘ）、
・最終排出半減期（０．６９３／λｚとして算出されるＴ１／２）、
・全身クリアランス（ＣＬ）は、用量／ＡＵＣ∞として算出し、かつ
・全分布量（Ｖｓｓ）は、ＣＬ×ＭＲＴ（式中、ＭＲＴは平均滞留時間である）を用いて計算した。
【０２４６】
経路間の絶対生物学的利用能（Ｆ％）は、次式：［ＡＵＣ∞（ｓｃ）／用量（ｓｃ）］／［ＡＵＣ∞（ｉｖ）／用量（ｉｖ）］×１００を用いて算出した。
【０２４７】
公称時間を算出に使用し、かつ投与開始を基準にして時間を設定した。公称用量をＣＬの計算に使用した。
【０２４８】
結果
ＩＶ投与後およびＳＣ投与後の雄マウスにおけるＮＣ２ｓｔの平均（±ＳＣ）血清中濃度を図９に示す。
【０２４９】
雄マウス血清中のＮＣ２ｓｔのノンコンパートメント薬動学的パラメーターを表４にまとめる。
【０２５０】
【表４】
0006055779.tif 000006
【０２５１】
・雄マウスにおいて、２０ｍｇ／ｋｇ（３２０ｎｍｏｌ／Ｌ）のＮＣ２ｓｔのＩＶ投与後、暴露ＰＫパラメーターＡＵＣ∞は２８，５６３ｎｍｏｌ・ｈ／Ｌであり、かつＣｍａｘは２，０９９ｎｍｏｌ／Ｌであり、
・雄マウスにおいて、２０ｍｇ／ｋｇ（３２０ｎｍｏｌ／Ｌ）のＮＣ２ｓｔのＳＣ投与後、暴露ＰＫパラメーターＡＵＣ∞は１９，５９２ｎｍｏｌ・ｈ／Ｌであり、かつＣｍａｘは７９８ｎｍｏｌ／Ｌであり、
・雄マウスにおいて、ＳＣ投与後、推定生物学的利用率（％Ｆ）は６８．５％であり、かつ
・推定ＳＣ半減期は１４．３時間であり、静脈内ＣＮＰ２２の約３４０倍に増加した。
【０２５２】
要約すると、ＮＣ２ｓｔは、大幅に増大された半減期、高いＡＵＣ値、およびＳＣ投与経路を介する高い生物学的利用能を含めて、非常に有利な薬動学的性質を有することが確認された。
【０２５３】
実施例５．Ｆｇｆｒ３３６９／＋マウスにおけるＡＣＨ骨表現型のレスキューに関するＮＣ２ｓｔの皮下投与の有効性の評価
目的
この試験は、疾患のマウスモデルＦｇｆｒ３３６９／＋マウスにおいて軟骨無形成症骨格障害のレスキューに関するＮＣ２  Ｓｔｒｅｐｔａｇ（ＮＣ２ｓｔ）の毎日１回皮下（ＳＣ）投与の効果を評価すべく設計した。
【０２５４】
試験品および対照品
試験品：２５ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４中に製剤化されたＮＣ２ｓｔ。
対照品：媒体、２５ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４。
【０２５５】
試験系
マウス繊維芽細胞増殖因子レセプター３（Ｆｇｆｒ３）遺伝子の位置３６９のアミノ酸置換（ＧｌｙからＣｙｓへ）により、Ｆｇｆｒ３３６９／＋マウスを作製した（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０４（１１）：１５１７−１５２５，１９９９）。マウスＦｇｆｒ３遺伝子中の置換３６９（Ｇｌｙ３６９Ｃｙｓ）は、ヒト軟骨無形成症を模倣する特徴を有する矮小発育症を引き起こす。Ｆｇｆｒ３３６９／＋マウスは、軟骨内骨成長の遅延および頭蓋底軟骨結合の早期閉鎖に起因する大頭および短縮肢を呈する。突然変異型マウスは、組織崩壊成長板、二次骨化中心の遅延形成、および低減骨密度を示した。したがって、Ｆｇｆｒ３３６９／＋マウスは、軟骨無形成症の治療を評価する非臨床試験の適切なモデルである。
【０２５６】
用量レベルおよび投与間隔の選択の理論的根拠
一組のＮＰＲ−Ｂ全細胞用量−応答アッセイで決定されたＣＮＰ２２およびＮＣ２ｓｔの相対生物学的活性に基づいて（図１０）、ＡＣＨ表現型の５０％および＞１００％の逆転を達成する標的化ＮＣ２ｓｔ濃度は、それぞれ、３４５（±９５Ｓ．Ｄ．）ｎＭおよび１２１４（±４４６Ｓ．Ｄ．）ｎＭであろうと予測された。成体マウスにおける単回用量薬動学的試験から得られたＮＣ２ｓｔ薬動学的データのＷｉｎＮｏｎｌｉｎシミュレーションに基づいて（図１１）、毎日２回ＳＣ投与される１０ｍｇ／ｋｇの用量は、＞５０％の逆転を達成するであろう。毎日２回の１００ｍｇ／ｋｇは、１００％超の逆転を達成するのに十分であろう。
【０２５７】
実験計画
試験は、オープンラベル並行ランダム化対照試験であった。治療は、オープンラベルであり、表５は、治療グループの詳細を提供する。
【０２５８】
【表５】
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【０２５９】
約８：００〜１０：００ＡＭおよび８：００〜１０：００ＰＭで毎日２回、注射を予定した。投与量を４ｍｌ／ｋｇに設定した。各マウスに投与される実際の量を算出し、ＡＭ注射前に測定された各動物のその日の体重に基づいて調整した。生後３日目から６３日齢までのＦｇｆｒ３３６９／＋動物の肩甲骨または腰部に媒体またはＮＣ２ｓｔを毎日２回ＳＣ注射した。
【０２６０】
試験評価項目のまとめを表６に示す。
【０２６１】
【表６】
0006055779.tif 000008
【０２６２】
実験手順
死亡率検査を毎日行って、試験記録に書き留めた。動物を毎日検査した。存在するのであれば、臨床徴候を試験記録に書き留めた。
【０２６３】
剖検時（６４日目）、最後の投与の１３〜１８時間後、イソフルラン麻酔下で心臓穿刺により血液サンプルを採取した。血液サンプルをＭｉｃｒｏｖｅｔｔｅ５００Ｚ／ゲルチューブ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ、血清／ゲル凝固アクチベーター、＃２０．１３４４）中に採取し、室温で３０〜６０分間インキュベートし、そして２〜８℃で５分間にわたり１０，０００×ｇで遠心分離した。次いで、１００μｌの血清を０．５ｍＬチューブ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ、＃７２．６９９）中に移し、残りの部分を第２のチューブ中で移した。２つのチューブを液体窒素中で凍結し、解析まで−８０℃で貯蔵した。
【０２６４】
イソフルラン麻酔下で両側開胸により動物を安楽死させて、肉眼病理検査を行った。すべての肉眼病理検査所見を試験記録に記録した。
【０２６５】
ＣＮＰ２２蛍光ＥＩＡキット（Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、カタログ番号ＦＥＫ−０１２−０３）およびサイクリックＧＭＰ蛍光アッセイキット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、カタログ番号Ｒ８０７５）を用いて、それぞれ、血清サンプル中のＮＣ２ｓｔの濃度および生物学的活性を評価した。
【０２６６】
ＦａｘｉｔｒｏｎモデルＭＸ−２０ＤＣ４を用いて、全身、胸郭、および頭蓋のｅｘ  ｖｉｖｏラジオグラフを、一定の条件（２６ｋＶ、１０秒間、それぞれ、１倍、３倍、および３倍の倍率）下で取得した。ソフトウェアＩｍａｇｅ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｊａｖａ（ＩｍａｇｅＪ）を用いて、盲検化方式ですべての動物のラジオグラフィー画像上で骨測定を行った。
【０２６７】
骨サンプルの過剰組織を清浄化し（擦取しなかった）、骨サンプルを固定した。カリパスを用いて、大腿骨および脛骨の長さを測定した。
【０２６８】
結果
実験結果を図１２Ａ〜１２Ｈに示し、以下の表７にまとめる。
【０２６９】
【表７】
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【０２７０】
それに加えて、図１３は、以上で説明したｃＧＭＰアッセイを用いて血液サンプル中に存在するＮＣ２ｓｔの活性濃度を決定できるように、ＮＣ２ｓｔでスパイクされた血清（左側）ならびに媒体（Ｖｅ）投与マウス、野生型（ＷＴ）マウス、Ｔｘ−１０投与（Ｔｘ１０）マウス、およびＴｘ−１００投与（Ｔｘ１００）マウスに由来する血清（右側）を用いたｃＧＭＰアッセイの結果を示している。図１４のチャートおよび表は、Ｔｘ１０グループ（左側）およびＴｘ１００グループ（右側）のマウスの血液サンプル中に存在するＮＣ２ｓｔの活性濃度を示しており、Ｔｘ１０グループの平均血清中ＮＣ２ｓｔレベルは、ＡＣＨ表現型の５０％逆転の予測閾値を上回り、一方、Ｔｘ１００グループの平均血清中ＮＣ２ｓｔレベルは、軟骨無形成症表現型の１００％逆転の予測閾値の約３倍であることが実証される。
【０２７１】
まとめると、これらの結果から、ＮＣ２ｓｔなどのＦｃ−ＮＰ融合体は、疾患の重症マウスモデルで軟骨無形成症表現型を逆転可能であることが実証される。
【０２７２】
実施例６．ＮＣ２ｓｔの修飾
ＮＣ２ｓｔは、ＦｃドメインのＮ末端にある配列の脱離（たとえば、図１５Ａ〜１５Ｂに示されるＮＣ２Ｂが得られる）、骨ターゲッティング部分の付加（たとえば、図１５Ａに示されるＤ１０−ＮＣ２が得られる）、およびＦｃとＣＮＰ２２との間のリンカーの長さの変化（たとえば、ＮＣ２Ｂ−２２（ＮＣ２−２２としても参照される）、ＮＣ２Ｂ−２８（ＮＣ２−２８としても参照される）、および図１６Ａ〜１６Ｄに示されるＮＣ２Ｂ−３４（ＮＣ２−３４としても参照される））をはじめとするいくつかの点で、変更可能である。一組の実験で、ＮＰＲ−Ｂ用量−応答全細胞アッセイにより、ＮＣ２ｓｔ、ＮＣ２Ｂ−２２、ＮＣ２Ｂ−２８、およびＮＣ２Ｂ−３４を試験した。この実験の結果を図１７に示す。他の例示的ＮＣ２ｓｔ変異体を図１８（ＮＣ２−ＫＧＡＮＫＫおよびＮＣ２−ＫＧＡＮＱＫ）および図１９（ＮＣ２−ＣＮＰ５３ｍｕｔ２）に示す。
【０２７３】
実施例７．Ｆｃ−ＣＮＰ５３構築物
この一組の実験で、短いＧｌｙ３リンカー領域を有するＣＮＰ５３の変異体にＮ末端Ｆｃドメインを融合した２つの構築物を調製した。これらの融合ポリペプチドを解析する代替法では、リンカー領域は、Ｇｌｙ３およびそれに続くＣＮＰ５３のアミノ酸１〜３１（またはその変異体）であり、このように考えると、リンカー領域は、ＦｃドメインをＣＮＰ２２に結合し、３４アミノ酸長である。
【０２７４】
Ｆｃ−ＣＮＰ５３−Ａ（「Ｆｃ−ＣＮＰ５３ｗｔ」としても参照される）（配列番号５１７（シグナル配列有り）および配列番号５１８（シグナル配列無し）、図２０）では、ＣＮＰ２２の位置１７に対応するＣＮＰ５３の位置４８は、アラニンに突然変異させた。Ｆｃ−ＣＮＰ５３−ＡＡＡ（「Ｆｃ−ＣＮＰ５３ｍｕｔ」としても参照される）（配列番号５１９（シグナル配列有り）および配列番号５２０（シグナル配列無し）、図２０）は、タンパク質分解切断の可能性を減少させるべくＣＮＰ５３の残基３０および３１、すなわち、ＣＮＰ２２の直前の２つの残基をアラニンに突然変異させたこと以外は、Ｆｃ−ＣＮＰ５３−Ａと同一の配列を有する。これらの２つの構築物を、ＮＣ２ｓｔと共に、２つのＮＰＲ−Ｂ膜アッセイおよび１つのＮＰＲ−Ｂ全細胞アッセイで試験した。
【０２７５】
第１の膜アッセイでは、Ｆｃ−ＣＮＰ５３−Ａは、ＣＮＰの２倍超の効力およびＣＮＰよりもわずかに良好な有効性を示し、一方、Ｆｃ−ＣＮＰ５３−ＡＡＡは、ＣＮＰの１／１．５の効力およびＣＮＰの約２／３の有効性を有していた（図２１Ａ）。第２の膜アッセイでは、Ｆｃ−ＣＮＰ５３−Ａは、ＣＮＰの１／１．３の効力および同程度の有効性を有し、一方、Ｆｃ−ＣＮＰ５３−ＡＡＡは、ＣＮＰの１／３．３の効力および同程度の有効性を有していた。第２のアッセイでのＮＣ２ｓｔの効力は、ＣＮＰの１／１９であり、一方、有効性は、ＣＮＰの６１％であった（図２１Ｂ）。
【０２７６】
全細胞アッセイでは、Ｆｃ−ＣＮＰ５３−Ａは、ＣＮＰの１／５．４の効力および同程度の有効性を有し、一方、Ｆｃ−ＣＮＰ５３−ＡＡＡは、ＣＮＰの１／１４の効力および７４％の有効性を有していた。ＮＣ２ｓｔの効力は、ＣＮＰの１／８３であり、一方、有効性は、ＣＮＰの８４％であった（図２１Ｃ）。
【０２７７】
まとめると、これらの結果から、ＣＮＰ５３の最初の３１アミノ酸を含むようにＦｃ−ＣＮＰ２２融合体のリンカー領域を修飾すると、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ膜アッセイおよび全細胞アッセイでＮＣ２ｓｔよりもさらに大きい効力および有効性を有する構築物が得られることが示される。
【０２７８】
実施例８．ＣＤＮＰ変異体
ＣＤＮＰ（配列番号１００、図２２）は、ＤＮＰのＣ末端テールに融合されたＣＮＰ２２からなるハイブリッドＮＰである。このＮＰは、ＮＰＲ−Ｂをアゴナイズするが、ＮＰＲ−Ａとの有意な交差反応性を有する。ＮＰＲ−ＢのためのＣＤＮＰの選択性を増大させるために、ＣＤＮＰのテール残基のいくつかで突然変異を行った。
【０２７９】
第１の一組のＣＤＮＰ実験では、ＮＥＰ分解に対する感受性を評価すべく、いくつかのＣＤＮＰ変異体を試験した。試験された変異体は、図２２に示されるＣＤＮＰ−Ｎ１（配列番号１０１）、ＣＤＮＰ−Ｇ１（配列番号１０２）、ＣＤＮＰ−Ｈ１（配列番号１０３）、およびＣＤＮＰ−Ｋ１（配列番号１０４）（数字は、ＤＮＰテール（配列番号１１７）を基準にした突然変異の位置を意味する）であり、対照としてＣＤＮＰおよびＣＮＰ２２が含まれていた。ＮＥＰ分解アッセイでは、１．２５ｎｇ／μＬの精製中性エンドペプチダーゼ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  ｒｅｓｅａｒｃｈ）を含有する全量５００μＬの緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．５、１００ｍＭ  ＮａＣｌ）中、３７℃で、１２５μＭのペプチドをインキュベートした。０分、１０分、３０分、６０分、１２０分、および２４０分の時間で、７０μＬをチューブから採取し、ドライヒートブロック上、１００℃で、１０分間熱不活性化した。次いで、アリコートを氷上に配置し、または−２０℃で貯蔵した。２０，０００×ｇで５分間遠心分離した後、６５μＬの上清をＨＰＬＣチューブに移し、２×２０μＬを逆相ＨＰＬＣ中に注入して解析に供した（Ａｇｉｌｅｎｔ  ＸＤＢ−Ｃ１８）。
【０２８０】
試験された変異体のそれぞれは、ＣＮＰ２２と比較して、ＮＥＰに対する有意に低減された感受性（すなわち、増大された耐性）を呈し、ＣＤＮＰ、ＣＤＮＰ−Ｎ１、ＣＤＮＰ−Ｇ１、およびＣＤＮＰ−Ｈ１はすべて、同程度のＮＥＰ感受性を有していた。ＣＤＮＰ−Ｋ１は、ＮＥＰに対する感受性が他のＣＤＮＰ変異体よりもわずかに高かったが、依然としてＣＮＰ２２よりもかなり低い感受性であった。結果を図２３に示す。これは、ＣＮＰ２２単独よりもＮＥＰ分解に対して実質的に耐性があるＣＤＮＰ（それは）を、ＮＥＰ耐性の実質的損失を伴うことなく、改変可能であることを示している。
【０２８１】
実施例９．テール位置３、４、および５のＣＤＮＰ変異体
図２２に示されるように、１７アミノ酸リングに続くＣ末端伸長部の残基３〜５は、ナトリウム利尿ペプチドのタイプおよび種にわたり有意な保存度を示すので、これらの残基は、ＮＰＲ−Ａアゴニスト活性に重要な役割を果たすと思われる。これら残基の１つ以上を突然変異させると、ＣＮＰ２２がＣ末端テールを完全に欠如しているので、ＮＰＲ−Ｂアゴニスト活性を有意に損なうことなく、低減されたＮＰＲ−Ａアゴニスト活性をもたらすことが可能であった。
【０２８２】
この一組の実験では、ＮＰＲ−Ｂに対する向上した選択性を有するＣＤＮＰ変異体を同定するために、ＤＮＰテールの位置３、４、および／または５に突然変異を導入した。次のＣＤＮＰ変異体、すなわち、ＣＤＮＰ−Ａ４（配列番号１０７）、ＣＤＮＰ−Ａ５（配列番号１０８）、ＣＤＮＰ−Ｓ３Ａ４（配列番号１０９）、ＣＤＮＰ−Ａ４Ａ５（配列番号１１０）、ＣＤＮＰ−Ｓ３Ａ５（配列番号１１１）、またＣＤＮＰ−Ｓ３Ａ４Ａ５（配列番号１１３）を試験した。結果を図２４Ａ〜２４Ｄおよび以下の表８〜１０に示す。実験は、同一条件下で行った。膜効力アッセイは、迅速かつ便利であり、同一の実験でペプチドとＣＮＰまたはＣＤＮＰとの比較が可能である。
【０２８３】
【表８】
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【０２８４】
【表９】
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【０２８５】
【表１０】
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【０２８６】
以上の表に示されるように、ＣＤＮＰは、２５ｎＭのＥＣ５０値を有してＮＰＲ−Ｂを活性化し、一方、７３ｎＭのＥＣ５０値（ＮＰＲ−Ｂに対する選択性の３倍）を有してＮＰＲ−Ａを活性化した。
【０２８７】
Ｃ１２（ＣＤＮＰ−ＳＡＤ）は、ＮＰＲ−Ｂに対する選択性が約８３倍であり、ＣＤＮＰと比較して２８倍の選択性ゲイン倍率であった。ＮＰＲ−Ｂ選択性有効性ゲインは、２７％であった。
【０２８８】
Ｃ１１（ＣＤＮＰ−ＳＲＡ）は、ＮＰＲ−Ｂに対する選択性が約３．６倍であり、ＣＤＮＰと比較して１．２倍の選択性ゲイン倍率であった。ＮＰＲ−Ｂ選択性有効性ゲインは、８２％であった。
【０２８９】
Ｃ１０（ＣＤＮＰ−ＳＡＡ）は、ＮＰＲ−Ｂに対する選択性が約４５倍であり、ＣＤＮＰと比較して１５倍の選択性ゲイン倍率であった。ＮＰＲ−Ｂ選択性有効性ゲインは、６９％であった。
【０２９０】
それに加えて、ＮＥＰ分解に対する感受性を評価すべく、ＣＤＮＰおよびＣＮＰ２２を対照として含めて、ＣＤＮＰ−Ｓ３Ａ４、ＣＤＮＰ−Ｓ３Ａ、５およびＣＤＮＰ−Ｓ３Ａ４Ａ５を試験した。図２５に示されるように、ＣＤＮＰ−Ｓ３Ａ４（ＣＤＮＰｓａｄ）およびＣＤＮＰ−Ｓ３Ａ５（ＣＤＮＰｓｒａ）は、同程度のＮＥＰ感受性を有し、一方、ＣＤＮＰ−Ｓ３Ａ４Ａ５（ＣＤＮＰｓａｄ）は、ＣＤＮＰよりもＮＥＰに対するわずかに高い感受性を有する。試験された変異体はすべて、ＣＮＰ２２よりもＮＥＰに対する感受性がかなり低かった。
【０２９１】
要約すると、これらの結果から、たとえば、ＣＤＮＰのＣ末端テールの位置３〜５のＬＲＤ残基を突然変異させることにより、ＣＤＮＰのＮＰＲ−Ｂ／ＮＰＲ−Ａ選択性を増大可能であることが実証される。Ｓ３Ａ４突然変異は、効力に及ぼす効果が最も劇的であり、一方、Ｓ３Ａ５突然変異は、有効性に及ぼす効果が最も顕著であった。それに加えて、ＣＤＮＰ中のこれらの残基を修飾しても、ＮＥＰ分解に対する感受性は有意に増大しなかった。
【０２９２】
実施例１０．ＮＰ−Ｆｃ融合体
Ｎ末端ＮＰドメインとＣ末端Ｆｃドメインとを有する融合ポリペプチドを構築することが可能である。いくつかの例は、図２６Ａに示されており、ＣＮＰ−１６ＡＡリンカー−Ｆｃ−Ｈｉｓ１０（ＮＣ１）（配列番号５２１）、ＣＮＰ−６ＡＡリンカー−Ｆｃ−Ｈｉｓ１０（ＮＣ３）（配列番号５２２）、ＣＮＰ−６ＡＡリンカー−Ｆｃ（配列番号５２３）、ＣＤＮＰとＦｃ部分との間にリンカーをまったく有していないＣＤＮＰ−Ｆｃ（配列番号５２４）、ＣＮＰ２２領域の位置１７でのアラニンへの突然変異と、ＤＮＰテール領域中の突然変異Ｓ３、Ａ４、およびＡ５と、を有するＣＤＮＰ−Ａ１７ｓａａ−Ｆｃ（配列番号５２５）、またはＣＮＰ２２領域の位置１７でのアラニンへの突然変異と、ＤＮＰテール領域中の突然変異Ｓ３およびＡ５と、を有するＣＤＮＰ−Ａ１７ｓｒａ−Ｆｃ（配列番号５２６）を含む。
【０２９３】
一組の実験で、ＣＤＮＰおよびＣＮＰ２２と比較してＣＤＮＰ−Ｆｃの相対効力および相対有効性を決定すべく、用量−応答ＮＰＲ−Ｂ膜アッセイを行った。第１の一組の実験では、図２７Ａに示されるように、ＣＤＮＰは、ＣＮＰ２２の１／５．５の効力であり、ＣＮＰ２２の有効性の５６％を有していた。ＣＤＮＰ−Ｆｃは、ＣＮＰ２２のわずか１／２．６の効力であり、ＣＮＰ２２の有効性の２４．５％を有していた。第２の一組の実験では、図２７Ｂに示されるように、ＣＤＮＰ−Ｆｃは、１／２２の効力であり、ＣＮＰ２２の有効性の５１％を有することが確認された。
【０２９４】
ＮＰＲ−Ａをアゴナイズする相対効力および相対有効性を決定すべく、ＣＤＮＰ−Ｆｃをさらにアッセイした。図２７Ｃに示されるように、ＣＤＮＰ−Ｆｃは、ＡＮＰの１／１２６の効力であり、その有効性の５５％を有していた。これらの実験から、ＣＤＮＰ−Ｆｃは、いくらかのＮＰＲ−Ａアゴナイズ活性を維持することが実証される。
【０２９５】
次いで、ＮＰＲ−ＢおよびＮＰＲ−Ａのそれぞれをアゴナイズする相対効力および相対有効性を決定すべく、それぞれ対照としてＣＮＰおよびＡＮＰを用いて、全細胞ＮＰＲ−ＢおよびＮＰＲ−Ａアッセイで、ＣＤＮＰ−Ａ１７ｓａａ−ＦｃおよびＣＤＮＰ−Ａ１７ｓｒａ−Ｆｃを試験した。図２８Ａおよび２８Ｂに示されるように、ＣＤＮＰ−Ａ１７ｓａａ−ＦｃおよびＣＤＮＰ−Ａ１７ｓｒａ−Ｆｃは、それぞれＣＮＰ２２の１／２，７２１および１／９４１の効力ならびにそれぞれ６８％および１１５％の有効性を有して、ＮＰＲ−Ｂをアゴナイズした。しかしながら、これらの構築物の効力は、ＮＰＲ−ＡアッセイではＡＮＰと比較して検出できないほど小さかった。したがって、これらの構築物は、ＣＤＮＰ−ＦｃではＮＰＲ−Ｂに対するかなり改良された選択性を示した。
【０２９６】
実施例１１．位置１７のＣＮＰ２２の点突然変異体
この一組の実験では、ＣＮＰ２２の位置１７に突然変異を導入して、この位置の野生型残基メチオニンを、効力や有効性を実質的に低減することなく、酸化に対する感受性の低い残基と、置き換えることが可能であるか、を調べた。残基１７は、ＣＮＰ２２中のそれほど保存されない位置の１つであり、天然に存在する同族体は、限定されるものではないが、この位置にＰｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、またはＳｅｒを有する（たとえば、図３を参照されたい）。したがって、次のＣＮＰ２２変異体、すなわち、ＣＮＰ−Ｆ１７（配列番号１１９）、ＣＮＰ−Ｌ１７（配列番号１２０）、ＣＮＰ−Ｉ１７（配列番号１２１）、ＣＮＰ−Ｔ１７（配列番号１２２）、ＣＮＰ−Ｖ１７（配列番号１２３）、ＣＮＰ−Ａ１７（配列番号１２４）、ＣＮＰ−Ｓ１７（配列番号１２５）、ＣＮＰ−Ｅ１７（配列番号１５６）、ＣＮＰ−Ｒ１７（配列番号１５７）、およびＣＮＰ−Ｙ１７（配列番号１５８）を調製した。ここで、コンセンサス配列は、配列番号１２６（ここで、Ｘは、限定されるものではないが、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ｐｒｏ、Ａｓｐ、Ｖａｌ、Ａｌａ、またはＳｅｒをはじめとする任意のアミノ酸でありうる）（図２９）に示される。
【０２９７】
図３０に示されるように、種々の変異体をアッセイした。変異体ＣＮＰ−Ｒ１７およびＣＮＰ−Ｙ１７は、改良された効力を示し、ＣＮＰ−Ｆ１７、ＣＮＰ−Ｌ１７、およびＣＮＰ−Ｔ１７は、ＣＮＰ２２と同程度の効力を呈した。したがって、これらの結果から、ＣＮＰ２２分子は、同程度の効力を保持しながら、酸化感受性メチオニン残基を排除すべく、１７部分で修飾可能であることが実証される。
【０２９８】
実施例１２．ＣＮＰ２２変異体および骨ターゲッティングＮＰ
たとえば、ＮＥＰもしくはＩＤＥ分解に耐性がありかつ適正な効力を維持するように、および／またはＮ末端もしくはＣ末端に骨ターゲッティング部分を含むように、ＣＮＰ２２の変異体を設計することが可能である。例示的分子を図３１（配列番号１２７〜１５０）に示す。たとえば、骨ターゲッティング部分を欠如しているまたは異なる骨ターゲッティング部分を含有する、図３１に示されるまたは他の形で本明細書に記載される分子の変異体もまた、利用可能である。たとえば、Ｅ６、Ｅ７、Ｅ８、Ｅ９、Ｅ１０、Ｅ１１、Ｅ１２、Ｅ１３、Ｅ１４、Ｅ１５、Ｅ１６、Ｄ６、Ｄ７、Ｄ８、Ｄ９、Ｄ１０、Ｄ１１、Ｄ１２、Ｄ１３、Ｄ１４、Ｄ１５、またはＤ１６のいずれかを、骨ターゲッティング部分として使用することが可能である。リンカー、たとえば、フレキシブルリンカーは、骨ターゲッティング部分とＮＰとの間に組込み可能である。それに加えて、図３１に示される分子のいずれかは、骨ターゲッティング部分有りまたは無しで、Ｆｃドメインに融合可能であり、オプションとして、本明細書に開示されるように、ＦｃとＮＰとの間にリンカー領域をさらに含有可能である。それに加えて、図３１にイタリック体で示された領域は、本明細書に開示されるＮＰのいずれかに対して、Ｎ末端伸長部、Ｃ末端伸長部、および／またはリンカーとして使用可能である。
【０２９９】
実施例１３．さらなるＣＮＰ変異体
たとえば、ＮＥＰもしくはＩＤＥ分解に耐性がありかつ適正な効力を維持するように、および／またはＮ末端もしくはＣ末端に骨ターゲッティング部分を含むように、ＣＮＰのさらなる変異体を設計することが可能である。例示的分子を図３２Ａ〜３２Ｅ（配列番号１００１〜１１５５）に示す。たとえば、骨ターゲッティング部分を含む、図３２Ａ〜３２Ｅに示されるまたは他の形で本明細書に記載される分子の変異体もまた、利用可能である。たとえば、Ｅ６、Ｅ７、Ｅ８、Ｅ９、Ｅ１０、Ｅ１１、Ｅ１２、Ｅ１３、Ｅ１４、Ｅ１５、Ｅ１６、Ｄ６、Ｄ７、Ｄ８、Ｄ９、Ｄ１０、Ｄ１１、Ｄ１２、Ｄ１３、Ｄ１４、Ｄ１５、またはＤ１６のいずれかを、骨ターゲッティング部分として使用することが可能である。リンカー、たとえば、フレキシブルリンカーは、骨ターゲッティング部分とＮＰとの間に組込み可能である。それに加えて、図３２Ａ〜３２Ｅに示される分子のいずれかは、骨ターゲッティング部分有りまたは無しで、Ｆｃドメインに融合可能であり、オプションとして、本明細書に開示されるように、ＦｃとＮＰとの間にリンカー領域をさらに含有可能である。
【０３００】
実施例１４．野生型（ＣＤ−１）マウスにおける骨成長に関するＮＣ２ｓｔの毎日１回のボーラス皮下注射の評価
目的
さまざまな用量のＮＣ２ｓｔと骨の薬理学的応答との関係を評価すべく、試験を設計した。野生型（ＷＴ、ＣＤ−１）マウスにおいて骨成長に及ぼすＮＣ２ｓｔ（たとえば、実施例１に記載の配列番号５０２）の用量増加の影響を測定することにより、関係を評価した。野生型マウスおよびＦｇｆｒ３３６９／＋（ＡＣＨ）マウスの骨成長応答を比較した。
【０３０１】
試験品
試験品：２５ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４中に製剤化されたＮＣ２ｓｔ。
対照品：媒体、２５ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４。
【０３０２】
試験系
ＣＤ−１マウスは、薬力学的試験で使用するための標準的齧歯動物種である。簡潔に述べると、１３〜１６日間養育された雌仔を連れた養母を取得した。２１日齢で、仔を離乳させ、体重に基づいてランダム化して治療グループに入れた。
【０３０３】
実験計画
以下の表１１に記載されるように、肩甲間部への皮下注射として動物にＮＣ２ｓｔの投与を行った。
【０３０４】
【表１１】
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【０３０５】
ＣＤ−１マウスを３週齢で連続３５日間にわたり指定用量で治療し、続いて、最後の注射の２４時間後、剖検を行った。試験評価項目のまとめを表１２に示す。
【０３０６】
【表１２】
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【０３０７】
実験手順
死亡率検査を毎日行って、試験記録に書き留めた。動物を毎日検査した。存在するのであれば、臨床徴候を試験記録に書き留めた。
【０３０８】
イソフルラン麻酔下で両側開胸により動物を安楽死させて、肉眼病理検査を行った。すべての肉眼病理検査所見を試験記録に記録した。
【０３０９】
ＦａｘｉｔｒｏｎモデルＭＸ−２０ＤＣ４を用いて、全身、胸郭、および頭蓋のｅｘ  ｖｉｖｏラジオグラフを、一定の条件（２６ｋＶ、１０秒間、それぞれ、１倍、３倍、および３倍の倍率）下で取得した。ソフトウェアＩｍａｇｅ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｊａｖａ（ＩｍａｇｅＪ）を用いて、盲検化方式ですべての動物のラジオグラフィー画像上で骨測定を行った。
【０３１０】
骨サンプルの過剰組織を清浄化し（擦取しなかった）、骨サンプルを固定した。カリパスを用いて、大腿骨および脛骨の長さを測定した。
【０３１１】
結果
実験結果を図３３Ａ〜３３Ｙに示し、以下の表１３にまとめる（３６日目の結果）。
【０３１２】
【表１３】
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【０３１３】
ｉｎ  ｖｉｖｏ測定では、ＮＣ２ｓｔ治療マウスは、媒体と比較して、用量依存的に有意に長い頭臀長、尾長、および脛骨長を示した。頭臀長および尾長のいずれでも、Ｔｘ−３０およびＴｘ−１００による２週間の治療後、有意差を達成した。脛骨長は、２週間（Ｔｘ−１００）または４週間（Ｔｘ−３０）の治療後、対媒体で有意差を生じた。
【０３１４】
５週間の治療後、ＮＣ２ｓｔ治療マウスで長骨の用量依存的伸長が観測された。Ｔｘ−１００グループでは、大腿骨（１０％）、脛骨（７％）、尺骨、および上腕骨（６％）で、有意な骨成長が観測された。それに加えて、Ｔｘ−１０、Ｔｘ−３０、およびＴｘ−１００で治療したマウスでは、体長（鼻肛門）は、統計的により長く、それぞれ、７％、９％、および１３％増加を達成した。すべての用量で、脊椎分節（頸椎胸椎腰椎）長は、統計的により長かった（Ｔｘ−１０での頸椎長を除く）。中足骨（第３指）長は、用量依存的にすべての用量で統計的に増大された。頭蓋円形度は、用量依存的に低減され、後頭前頭距離は、Ｔｘ−１００で統計的に増大された。胸骨長は、用量依存的にすべての用量で統計的に増大された。
【０３１５】
野生型ＣＤ−１マウス（表１３）および軟骨無形成症マウスモデル（表７）で、ＮＣ２ｓｔによる治療データを提供する。これらの結果から、Ｆｃ−ＮＰ融合体は、野生型マウスおよび重症疾患マウスモデルの両方で、有効性を提供することが示される。まとめると、これらの結果から、ＮＣ２ｓｔなどのＦｃ−ＮＰ融合体は、用量依存的に骨成長および骨伸長を促進可能であることが実証される本明細書で説明した方法を用いて、健常マウス（たとえば、骨を伸長させるために）および疾患マウスモデルで、ＮＰポリペプチドおよびＦｃ−ＮＰ融合体の有効性を評価することが可能である（たとえば、１０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、または１００ｍｇ／ｋｇの用量で）。
【０３１６】
実施例１５．ＣＮＰ変異体の安定性
多数のＣＮＰ変異体を合成して、ｉｎ  ｖｉｖｏの公知ＣＮＰ分解経路である中性エンドペプチダーゼ（ＮＥＰ）によるペプチダーゼ分解に対するそれらの感受性を試験した。試験されたＣＮＰ変異体の配列を図３４に提供し、以下で説明する。
【０３１７】
次の条件下で行われた実験により、ＮＥＰ分解を調べた。一般的には、１．２５ｎｇ／μＬのＮＥＰを含有する全量５００μＬの緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．５、１００ｍＭ  ＮａＣｌ）中、３７℃で、１００μＭのペプチドをインキュベートした。種々の時点（０分、３０分、６０分、１２０分、および２４０分）で、チューブから７０μＬを採取し、ドライヒートブロック上、１００℃で、１０分間熱不活性化させた。１４，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、７０μＬの上清をＨＰＬＣチューブに移し、２×２０μＬをＲＰ−ＨＰＬＣ中に注入して解析に供した（Ａｇｉｌｅｎｔ  ＸＤＢ−Ｃ１８）。ＣＮＰ変異体に対応するピークの曲線下面積を測定して、対照を基準にした％としてプロットした。
【０３１８】
第１の一組の実験では、ＮＥＰ分解に対する感受性を評価すべく、種々のＣＮＰ変異体を試験した。試験された変異体は、ＣＮＰ２２（配列番号４）、Ｄ６−１４ＡＡリンカー−ＣＮＰ［Ｃ３］（配列番号１４７）およびＣＮＰ−１４ＡＡリンカー−Ｄ６［Ｃ４］（配列番号１４８）を含むＤ６骨ターゲッティング部分を有するＣＮＰ変異体、ＣＮＰ−Ｎｔｅｒｍ２［Ｃ５］（配列番号１５０）、ＣＤＮＰ−Ｓ３Ａ４Ａ５Ｒ６［Ｃ１３］（配列番号１１５）、ＣＤＮＰ２９−Ｓ３Ａ４Ａ５Ｒ６［Ｃ１４］（配列番号１５１）、Ｃ２（Ｅ６）［ＢＣ２］（配列番号１３０）、およびＣ３（Ｅ６）［ＢＣ３］（配列番号１３１）を含むＣＤＮＰ由来変異体、ならびにＫＢ１（Ｅ６）（配列番号１５５）を含む一般的カテプシン切断配列を有するＣＮＰ変異体であり、図３４に示されるとおりである。結果を図３５Ａおよび表１４に示す。
【０３１９】
全体的に、これらの結果から、Ｃ４ペプチドは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＮＥＰ分解に対する感受性を示すことが示される。それにもかかわらず、それらは、ＮＥＰと共に２４０分間インキュベートした後、Ｃ４の７５％は、依然としてインタクトであったので、ＣＮＰ２２よりも耐性がある。
【０３２０】
【表１４】
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【０３２１】
第２の一組の実験では、ＮＥＰ分解に対する感受性を評価すべく、Ｅ６骨ターゲッティング部分を有する種々のＣＮＰ変異体を試験した。試験された変異体は、対照としてＣＮＰ２２（配列番号４）、ＫＡ１（Ｅ６）（配列番号１５３）を含む特異的カテプシンＫ切断配列を有するＣＮＰ変異体、ならびにＣ１（Ｅ６）およびＣ４（Ｅ６）〜Ｃ１１（Ｅ６）［ＢＣ１およびＢＣ４〜ＢＣ１１］（配列番号１２９および１３２〜１３９）を含む、Ｅ６骨ターゲッティング部分と（Ｇｌｙ）ｐ［（Ｓｅｒ）（Ｇｌｙ）ｍ］ｎリンカーとを有するＣＮＰ変異体であり、図３４に示されるとおりである。結果を図３５Ｂおよび表１５に示す。これらの結果から、このアッセイの条件下では、試験されたＣＮＰ変異体はすべて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＮＥＰ分解に対して十分に耐性があることが示される。
【０３２２】
【表１５】
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【０３２３】
実施例１６．ＣＮＰ変異体の効力
効力を決定すべく、ＮＰＲ−Ｂ全細胞用量応答アッセイでｃＧＭＰを生成する能力に関してペプチドを試験した。以上の実施例２で説明したように、全細胞ｃＧＭＰアッセイを用いて、骨ターゲッティング部分を有する種々のペプチドの効力を試験した。これらの結果を表１６に示す。レスキュー比は、２．４ｎＭのＣＮＰ２２（低値）および１４ｎＭのＣＮＰ２２（高値）と同一のレベルでｃＧＭＰを産生するのに必要なアゴニスト濃度として定義される。
【０３２４】
【表１６】
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【０３２５】
これらの結果からわかるように、効力は、Ｅ６部分とＣＮＰとの間にカテプシン切断部位を導入することにより向上した。たとえば、ＫＡ１（Ｅ６）およびＫＢ１（Ｅ６）は、他の試験されたペプチドよりも効力がある。ここで、ＫＡ１（Ｅ６）は、特異的カテプシンＫ切断部位を有し、ＫＢ１（Ｅ６）は、一般的カテプシン切断部位を有する。ＫＧＡＮＫＫ配列またはその変異体）を組み込むことにより、効力を向上させることが可能である。
【０３２６】
実施例１７．ＮＣ２ｓｔ変異体の安定性および効力
安定性および効力を保持しながら、本明細書および実施例６で説明したように、ＮＣ２ｓｔ変異体にいくつかの点で変更を加えることが可能である。ＣＮＰの天然に存在する同族体は、細胞環境中で中性エンドペプチダーゼ酵素（ＮＥＰ）およびインスリン分解酵素（ＩＤＥ）により切断される。これらの酵素の１つにより分解されると、細胞内ｃＧＭＰを増加させるナトリウム利尿ペプチドの能力が不活性化される可能性がある。したがって、ＮＥＰまたはＩＤＥへの暴露後のｃＧＭＰ生成を調べることにより、種々のＮＣ２ｓｔ変異体（ＦｃＣＮＰ融合タンパク質）の安定性を試験した。
【０３２７】
ＮＥＰまたはＩＤＥを用いて、安定性に関して、ＣＮＰ２２を対照として提供して、次の変異体、すなわち、ＮＣ２−ＫＧＡＮＫＫ（配列番号５１２）、ＮＣ２Ｂ−Ｌ１７（ＸがＬである配列番号５３０）、およびＮＣ２−ＫＧＡＮＫＫ−Ｌ１７（配列番号５７２、ＮＣ２−ＫＬ）を試験した。
【０３２８】
ＣＮＰ２２と比較して融合タンパク質の安定性を評価すべく、中性エンドペプチダーゼ酵素（ＮＥＰ）アッセイおよびインスリン分解酵素（ＩＤＥ）アッセイの両方で、次のプロトコルを使用した。ＮＥＰアッセイでは、エッペンドルフチューブ内のアッセイ緩衝液（２５ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）中で、１．２５ｎｇ／μＬの精製ＮＥＰ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）と共に、等モル量の融合タンパク質（６０μＭ）およびＣＮＰ２２（１２０μＭ）を３７℃で０、３０、または１２０分間インキュベートした。ＩＤＥアッセイでは、エッペンドルフチューブ内のアッセイ緩衝液（２５ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）中で、３ｎｇ／μＬの精製ＩＤＥ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）と共に、等モル量の融合タンパク質（６０μＭ）およびＣＮＰ２２（１２０μＭ）を３７℃で０、３０、または１２０分間インキュベートした。インキュベーション後、チューブを氷上に配置した。次いで、ＮＰＲＢ活性化を介してサイクリックＧＭＰ産生を活性化する能力に関して、サンプルを試験した。ヒトＮＰＲＢレセプターを安定に発現するＨＥＫ２９３細胞を、各サンプルの同等効力用量のＣＮＰ２２、ＮＣ２−ＫＧＡＮＫＫ、もしくはＮＣ２−ＫＬ（１０ｎＭ）またはＮＣ２Ｂ−Ｌ１７（３００ｎＭ）と共に、４０分間インキュベートした。ｃＧＭＰ  ＨＴＲＦアッセイ（Ｃｉｓｂｉｏ  ｂｉｏａｓｓａｙｓ）を用いて、ｃＧＭＰ産生を測定した。アッセイは、三重試験方式で行った。また、すべての対照サンプルの測定ｃＧＭＰ値は、類似していた。
【０３２９】
ＮＥＰでは図３６Ａに示されるように、精製ＮＥＰと共にＣＮＰ２２を３０分間および１２０分間インキュベートしたところ、ｃＧＭＰを生成する能力は、それぞれ、５０％および８７％低減された。これとは対照的に、ＮＣ２−ＫＧＡＮＫＫおよびＮＣ２−ＫＬは、ＮＥＰと共に２時間インキュベートした場合でさえも、依然として同程度のレベルのｃＧＭＰを生成した。ＮＣ２Ｂ−Ｌ１７は、ＮＥＰと共にインキュベートすることによりわずかに影響を受け、ｃＧＭＰを生成する能力を２５％低減した。
【０３３０】
ＩＤＥでは図３６Ｂに示されるように、精製ＩＤＥと共にＣＮＰ２２を３０分間および１２０分間インキュベートしたところ、ｃＧＭＰを生成する能力は、それぞれ、６４％および９９％低減された。これとは対照的に、３つのＦｃＣＮＰ融合タンパク質はすべて、ＩＤＥと共に２時間インキュベートした場合でさえも、依然として同程度のレベルのｃＧＭＰを生成した。
【０３３１】
まとめると、分解試験のこれらのデータから、ＦｃＣＮＰタンパク質は、ＮＥＰおよびＩＤＥに対する貧基質であることが示唆され、少なくとも部分的には、なぜこれらの融合タンパク質が、ＣＮＰ２２と比較してｉｎ  ｖｉｖｏで大幅に増大された半減期を有するかを説明しうる。
【０３３２】
以上の実施例２で説明したように、全細胞ｃＧＭＰアッセイを用いて、図１８に示されるＮＣ２ｓｔ変異体（シグナル配列無しのＮＣ２−ＫＧＡＮＫＫ（配列番号５１２）およびＮＣ２−ＫＧＡＮＱＫ（配列番号５１４））の効力を試験した。図３７Ａに提供されるように、その結果から、ＮＣ２−ＣＮＰ５３ｍｕｔ２、ＮＣ２−ＫＧＡＮＫＫ、およびＮＣ２−ＫＧＡＮＱＫは、ＮＣ２Ｂ（図１５Ａに示される配列番号５０４）と比較して改良された効力を有することが示される。特定的には、ＮＣ２−ＫＧＡＮＫＫは、図３７Ａに提供されるすべてのタンパク質のうちで最も効力がある。
【０３３３】
ＣＮＰ２２の位置１７に点突然変異を組み込むことにより、ＮＣ２ｓｔ変異体に変更を加えることも可能である。以上の実施例２で説明したように、全細胞ｃＧＭＰアッセイを用いて、図４１Ａに示されるＣＮＰ２２の位置１７にロイシンを有する変異型ＮＣ２ｓｔ（シグナル配列無しのＮＣ２Ｂ−Ｌ１７（ＸがＬである配列番号５３０））の効力を試験した。図３７Ｂに提供されるように、その結果から、ＣＮＰ２２の位置１７のロイシンをメチオニンで置換しても、ＮＣ２Ｂと比較して、ＮＰＲ−Ｂ活性化の効力は、有意に低減されないことが示される。
【０３３４】
ＮＣ２Ｂ（配列番号５０４）、骨ターゲッティング部分を有するペプチド、すなわち、Ｄ１０−ＮＣ２（配列番号６０８）、ＣＮＰ２２の位置１７に点突然変異を有するＮＣ２Ｂペプチド、すなわち、ＮＣ２Ｂ−Ｌ１７、ＮＣ２Ｂ−Ｆ１７、ＮＣ２Ｂ−Ｉ１７、およびＮＣ２Ｂ−Ｔ１７（それぞれ、ＸがＬ、Ｆ、Ｉ、またはＴである配列番号５３０）、変異体ＮＣ２−ＫＧＡＮＫＫおよびＮＣ２−ＫＧＡＮＱＫ（それぞれ、配列番号５１２および５１４）、ならびにＮＣ２−ＣＮＰ５３ｍｕｔ２（配列番号５１６）を含むシグナル配列無しのＮＣ２ｓｔ変異体のさらなるデータを、以下の表１７に提供する。レスキュー比は、２．４ｎＭのＣＮＰ２２（低値）および１４ｎＭのＣＮＰ２２（高値）と同一のレベルでｃＧＭＰを産生するのに必要なアゴニスト濃度として定義される。「レスキュー範囲」中のＸは、アゴニストがより少ないｃＧＭＰを産生したので、アゴニストが１４ｎＭのＣＮＰ２２に類似したｃＧＭＰ産生を誘導可能である用量を決定できないことを示している。
【０３３５】
【表１７】
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【０３３６】
したがって、本明細書で説明した配列のいずれかは、本明細書に開示されたＮＰのいずれかに対するＮ末端伸長部、Ｃ末端伸長部、および／もしくはリンカーとして、ＫＧＡＮＫＫ（配列番号３１４）もしくはその変異体（たとえば、ＫＧＡＮＱＫ（配列番号３１５）、ＫＧＡＮＫＱ（配列番号３１６）、ＫＧＡＮＱＱ（配列番号３１７）、ＱＧＡＮＫＫ（配列番号３１８）、ＱＧＡＮＱＫ（配列番号３１９）、ＱＧＡＮＫＱ（配列番号３２０）、もしくはＱＧＡＮＱＱ（配列番号３２１））を含むように、一連の連続したＡｓｐ残基もしくはＧｌｕ残基、たとえば、Ｅ６、Ｅ７、Ｅ８、Ｅ９、Ｅ１０、Ｅ１１、Ｅ１２、Ｅ１３、Ｅ１４、Ｅ１５、Ｅ１６、Ｄ６、Ｄ７、Ｄ８、Ｄ９、Ｄ１０、Ｄ１１、Ｄ１２、Ｄ１３、Ｄ１４、Ｄ１５、もしくはＤ１６などの骨ターゲッティング部分を含むように、ＧＧＧＤＬＱＶＤＴＱＳＱＡＡＷＡＱＬＬ  ＱＥＨＰＮＡＱＱＹＫＧＡＮＫＫ（配列番号３３０）もしくはその断片を含むリンカーを含むように、および／またはＣＮＰ２２の位置１７の点突然変異、たとえば、メチオニンからフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トレオニン、システイン、プロリン、もしくはアスパラギン酸への位置１７の突然変異を含むように、修飾可能である。
【０３３７】
実施例１８．位置１７のＣＮＰ２２の例示的点突然変異
ＣＮＰ２２を基準にした位置１７に点突然変異を有するＣＮＰ２２の変異体またはそれを含有するポリペプチドを設計することが可能である。本明細書で、たとえば、実施例１１および１５で説明したように、この突然変異は、効力や有効性を実質的に低減させることなく、酸化および／またはＮＥＰ切断による分解に対する安定性を付与することが可能である。さらなる修飾は、骨ターゲッティング部分を有する変異体、および骨ターゲッティング部分と、骨ターゲッティング部分とＮＰとの間のリンカーたとえばフレキシブルリンカーと、の両方を有する変異体を含む。例示的な骨ターゲッティング部分およびリンカーは、本明細書に記載されている。
【０３３８】
位置１７に点突然変異を有する例示的ＣＮＰ変異体を図３８に示す（配列番号１２６、１１９〜１２２、および１５６〜１７２）。ここで、配列番号１２６または１６２中のＸは、任意のアミノ酸、たとえば、Ｆ、Ｌ、Ｉ、Ｔ、Ｅ、Ｒ、Ｙ、Ｃ、Ｐ、またはＤでありうる。たとえば、図３８に示される配列のいずれかの一実施形態では、Ｘはフェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）である。図３８に示される配列のいずれかの一実施形態では、Ｘはロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）である。図３８に示される配列のいずれかの一実施形態では、Ｘはイソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）である。図３８に示される配列のいずれかの一実施形態では、Ｘはトレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）である。図３８に示される配列のいずれかの一実施形態では、Ｘはグルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）である。図３８に示される配列のいずれかの一実施形態では、Ｘはアルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）である。図３８に示される配列のいずれかの一実施形態では、Ｘはチロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）である。図３８に示される配列のいずれかの一実施形態では、Ｘはシステイン（Ｃｙｓ、Ｃ）である。図３８に示される配列のいずれかの一実施形態では、Ｘはプロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）である。図３８に示される配列のいずれかの一実施形態では、Ｘはアスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）である。図３８に示される配列のいずれかの一実施形態では、Ｘはグリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）である。図３８に示される配列のいずれかの一実施形態では、Ｘはアラニン（Ａｌａ、Ａ）である。図３８に示される配列のいずれかの一実施形態では、Ｘはセリン（Ｓｅｒ、Ｓ）である。図３８に示される配列のいずれかの一実施形態では、Ｘはバリン（Ｖａｌ、Ｖ）である。図３８に示される配列のいずれかの一実施形態では、Ｘはトリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）である。図３８に示される配列のいずれかの一実施形態では、Ｘはアスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）である。図３８に示される配列のいずれかの一実施形態では、Ｘはグルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）である。図３８に示される配列のいずれかの一実施形態では、Ｘはヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）である。図３８に示される配列のいずれかの一実施形態では、Ｘはリシン（Ｌｙｓ、Ｋ）である。
【０３３９】
たとえば、骨ターゲッティング部分を欠如しているまたは異なる骨ターゲッティング部分を含有する、図３８に示されるまたは他の形で本明細書に記載される分子の変異体もまた、利用可能である。たとえば、Ｅ６、Ｅ７、Ｅ８、Ｅ９、Ｅ１０、Ｅ１１、Ｅ１２、Ｅ１３、Ｅ１４、Ｅ１５、Ｅ１６、Ｄ６、Ｄ７、Ｄ８、Ｄ９、Ｄ１０、Ｄ１１、Ｄ１２、Ｄ１３、Ｄ１４、Ｄ１５、またはＤ１６のいずれかを、骨ターゲッティング部分として使用することが可能である。リンカー、たとえば、フレキシブルリンカーは、骨ターゲッティング部分とＮＰとの間に組込み可能である。たとえば、図３９Ａ〜３９Ｂは、リンカーを有するまたは骨ターゲッティング部分とリンカーとの両方を有する変異体を提供する。ここで、配列番号１７３〜２１０のいずれか１つ中のＸは、任意のアミノ酸、たとえば、Ｆ、Ｌ、Ｉ、Ｔ、Ｅ、Ｒ、Ｙ、Ｃ、Ｐ、またはＤでありうる。たとえば、リンカーを有するまたは骨ターゲッティング部分とリンカーとの両方を有する図３９Ａ〜３９Ｂに示される配列のいずれかの一実施形態では、Ｘはフェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）である。リンカーを有するまたは骨ターゲッティング部分とリンカーとの両方を有する図３９Ａ〜３９Ｂに示される配列のいずれかの一実施形態では、Ｘはロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）である。リンカーを有するまたは骨ターゲッティング部分とリンカーとの両方を有する図３９Ａ〜３９Ｂに示される配列のいずれかの一実施形態では、Ｘはイソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）である。リンカーを有するまたは骨ターゲッティング部分とリンカーとの両方を有する図３９Ａ〜３９Ｂに示される配列のいずれかの一実施形態では、Ｘはトレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）である。リンカーを有するまたは骨ターゲッティング部分とリンカーとの両方を有する図３９Ａ〜３９Ｂに示される配列のいずれかの一実施形態では、Ｘはグルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）である。リンカーを有するまたは骨ターゲッティング部分とリンカーとの両方を有する図３９Ａ〜３９Ｂに示される配列のいずれかの一実施形態では、Ｘはアルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）である。リンカーを有するまたは骨ターゲッティング部分とリンカーとの両方を有する図３９Ａ〜３９Ｂに示される配列のいずれかの一実施形態では、Ｘはチロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）である。図３９Ａ〜３９Ｂに示される配列のいずれかの一実施形態では、Ｘはシステイン（Ｃｙｓ、Ｃ）である。リンカーを有するまたは骨ターゲッティング部分とリンカーとの両方を有する図３９Ａ〜３９Ｂに示される配列のいずれかの一実施形態では、Ｘはプロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）である。リンカーを有するまたは骨ターゲッティング部分とリンカーとの両方を有する図３９Ａ〜３９Ｂに示される配列のいずれかの一実施形態では、Ｘはアスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）である。リンカーを有するまたは骨ターゲッティング部分とリンカーとの両方を有する図３９Ａ〜３９Ｂに示される配列のいずれかの一実施形態では、Ｘはグリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）である。リンカーを有するまたは骨ターゲッティング部分とリンカーとの両方を有する図３９Ａ〜３９Ｂに示される配列のいずれかの一実施形態では、Ｘはアラニン（Ａｌａ、Ａ）である。リンカーを有するまたは骨ターゲッティング部分とリンカーとの両方を有する図３９Ａ〜３９Ｂに示される配列のいずれかの一実施形態では、Ｘはセリン（Ｓｅｒ、Ｓ）である。リンカーを有するまたは骨ターゲッティング部分とリンカーとの両方を有する図３９Ａ〜３９Ｂに示される配列のいずれかの一実施形態では、Ｘはバリン（Ｖａｌ、Ｖ）である。リンカーを有するまたは骨ターゲッティング部分とリンカーとの両方を有する図３９Ａ〜３９Ｂに示される配列のいずれかの一実施形態では、Ｘはトリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）である。リンカーを有するまたは骨ターゲッティング部分とリンカーとの両方を有する図３９Ａ〜３９Ｂに示される配列のいずれかの一実施形態では、Ｘはアスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）である。リンカーを有するまたは骨ターゲッティング部分とリンカーとの両方を有する図３９Ａ〜３９Ｂに示される配列のいずれかの一実施形態では、Ｘはグルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）である。リンカーを有するまたは骨ターゲッティング部分とリンカーとの両方を有する図３９Ａ〜３９Ｂに示される配列のいずれかの一実施形態では、Ｘはヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）である。リンカーを有するまたは骨ターゲッティング部分とリンカーとの両方を有する図３９Ａ〜３９Ｂに示される配列のいずれかの一実施形態では、Ｘはリシン（Ｌｙｓ、Ｋ）である。
【０３４０】
それに加えて、図４０は、配列番号１８６〜１９８中のＸがロイシンである特定の変異体のアミノ酸配列を提供し、配列番号２２１〜２３３の配列を提供する。
【０３４１】
図３８、３９Ａ〜３９Ｂ、および４０に示される分子のいずれかは、骨ターゲッティング部分有りまたは無しで、Ｆｃドメインに融合可能であり、オプションとして、本明細書に開示されるように、ＦｃとＮＰとの間にリンカー領域をさらに含有可能である。たとえば、Ｍ１７Ｘ突然変異を有する変異型ＣＮＰをＦｃドメインに融合することが可能であり、たとえば、図４１Ａ〜４１Ｅに示されるように、Ｘは、任意のアミノ酸、たとえば、Ｆ、Ｌ、Ｉ、Ｔ、Ｅ、Ｒ、Ｙ、Ｃ、Ｐ、またはＤでありうる。たとえば、図４１Ａ〜４１Ｅに示される配列のいずれかの一実施形態では、Ｘはフェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）である。図４１Ａ〜４１Ｅに示される配列のいずれかの一実施形態では、Ｘはロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）である。図４１Ａ〜４１Ｅに示される配列のいずれかの一実施形態では、Ｘはイソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）である。図４１Ａ〜４１Ｅに示される配列のいずれかの一実施形態では、Ｘはトレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）である。図４１Ａ〜４１Ｅに示される配列のいずれかの一実施形態では、Ｘはグルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）である。図４１Ａ〜４１Ｅに示される配列のいずれかの一実施形態では、Ｘはアルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）である。図４１Ａ〜４１Ｅに示される配列のいずれかの一実施形態では、Ｘはチロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）である。図４１Ａ〜４１Ｅに示される配列のいずれかの一実施形態では、Ｘはシステイン（Ｃｙｓ、Ｃ）である。図４１Ａ〜４１Ｅに示される配列のいずれかの一実施形態では、Ｘはプロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）である。図４１Ａ〜４１Ｅに示される配列のいずれかの一実施形態では、Ｘはアスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）である。図４１Ａ〜４１Ｅに示される配列のいずれかの一実施形態では、Ｘはグリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）である。図４１Ａ〜４１Ｅに示される配列のいずれかの一実施形態では、Ｘはアラニン（Ａｌａ、Ａ）である。図４１Ａ〜４１Ｅに示される配列のいずれかの一実施形態では、Ｘはセリン（Ｓｅｒ、Ｓ）である。図４１Ａ〜４１Ｅに示される配列のいずれかの一実施形態では、Ｘはバリン（Ｖａｌ、Ｖ）である。図４１Ａ〜４１Ｅに示される配列のいずれかの一実施形態では、Ｘはトリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）である。図４１Ａ〜４１Ｅに示される配列のいずれかの一実施形態では、Ｘはアスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）である。図４１Ａ〜４１Ｅに示される配列のいずれかの一実施形態では、Ｘはグルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）である。図４１Ａ〜４１Ｅに示される配列のいずれかの一実施形態では、Ｘはヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）である。図４１Ａ〜４１Ｅに示される配列のいずれかの一実施形態では、Ｘはリシン（Ｌｙｓ、Ｋ）である。
【０３４２】
いくつかの実施形態では、配列は配列番号５３０であり、かつＸは本明細書で説明した任意のアミノ酸である。一実施形態では、配列は配列番号５３０であり、かつＸはフェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）である。一実施形態では、配列は配列番号５３０であり、かつＸはロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）である。一実施形態では、配列は配列番号５３０であり、かつＸはイソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）である。一実施形態では、配列は配列番号５３０であり、かつＸはトレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）である。一実施形態では、配列は配列番号５３０であり、かつＸはグルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）である。一実施形態では、配列は配列番号５３０であり、かつＸはアルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）である。一実施形態では、配列は配列番号５３０であり、かつＸはチロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）である。一実施形態では、配列は配列番号５３０であり、かつＸはシステイン（Ｃｙｓ、Ｃ）である。一実施形態では、配列は配列番号５３０であり、かつＸはプロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）である。一実施形態では、配列は配列番号５３０であり、かつＸはアスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）である。一実施形態では、配列は配列番号５３０であり、かつＸはグリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）である。一実施形態では、配列は配列番号５３０であり、かつＸはアラニン（Ａｌａ、Ａ）である。一実施形態では、配列は配列番号５３０であり、かつＸはセリン（Ｓｅｒ、Ｓ）である。一実施形態では、配列は配列番号５３０であり、かつＸはバリン（Ｖａｌ、Ｖ）である。一実施形態では、配列は配列番号５３０であり、かつＸはトリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）である。一実施形態では、配列は配列番号５３０であり、かつＸはアスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）である。一実施形態では、配列は配列番号５３０であり、かつＸはグルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）である。一実施形態では、配列は配列番号５３０であり、かつＸはヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）である。一実施形態では、配列は配列番号５３０であり、かつＸはリシン（Ｌｙｓ、Ｋ）である。
【０３４３】
実施例１９．例示的ＮＣ２Ｂ変異体
点突然変異、たとえば、ＣＮＰ２２を基準にした位置１７の点突然変異を有すること、骨ターゲッティング部分を有すること、および／または修飾もしくは改変されたリンカー領域を有することを含めて、いくつかの点でＮＣ２Ｂに変更を加えることが可能である。例示的変異体を以下に提供する。
【０３４４】
図４２Ａに示されるようにおよび以上の実施例６に記載されるように、変異体は、ＮＣ２Ｂと比較して修飾または改変されたリンカー領域を有するものを含む（図１５Ａ〜１５Ｂに示されるとおり）。それに加えて、変異体はまた、骨ターゲッティング部分たとえばＤ１０部分を有する任意の配列を含み、例示的配列は、図４２Ｂに提供される（配列番号５５３〜５５８）。それに加えて、図３８、３９Ａ〜３９Ｂ、および４０にイタリック体で示された領域は、本明細書に開示されたＮＰのいずれかに対してＮ末端伸長部、Ｃ末端伸長部、および／またはリンカーとして使用可能である（たとえば、配列番号５１１〜５１６および５５３〜５５８）。配列番号５１１〜５１６および５５３〜５５８のいずれかは、本明細書に記載の任意の病態の治療方法で使用可能である。特定の実施形態では、配列番号５１１〜５１６および５５３〜５５８の１つ以上は、軟骨無形成症の治療方法で使用される。
【０３４５】
図４２Ｃに示されるように、配列番号５３７〜５４２でＣＮＰ２２を基準にした位置１７をフェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）で置換すると、配列番号５５９〜５６４の配列が提供される。図４２Ｄに示されるように、Ｎ末端にＤ１０骨ターゲッティング部分を含むようにこれらの配列をさらに修飾して、配列番号５６５〜５７０の配列を提供することが可能である。それに加えて、図３８、３９Ａ〜３９Ｂ、および４０にイタリック体で示された領域は、本明細書に開示されたＮＰのいずれかに対してＮ末端伸長部、Ｃ末端伸長部、および／またはリンカーとして使用可能である（たとえば、配列番号５５９〜５７０）。配列番号５５９〜５７０のいずれかは、本明細書に記載の任意の病態の治療方法で使用可能である。特定の実施形態では、配列番号５５９〜５７０の１つ以上は、軟骨無形成症の治療方法で使用される。
【０３４６】
図４２Ｅに示されるように、配列番号５３７〜５４２でＣＮＰ２２を基準にした位置１７をロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）で置換すると、配列番号５７１〜５７６の配列が提供される。図４２Ｆに示されるように、Ｎ末端にＤ１０骨ターゲッティング部分を含むようにこれらの配列をさらに修飾して、配列番号５７７〜５８２の配列を提供することが可能である。それに加えて、図３８、３９Ａ〜３９Ｂ、および４０にイタリック体で示された領域は、本明細書に開示されたＮＰのいずれかに対してＮ末端伸長部、Ｃ末端伸長部、および／またはリンカーとして使用可能である（たとえば、配列番号５７１〜５８２）。配列番号５７１〜５８２のいずれかは、本明細書に記載の任意の病態の治療方法で使用可能である。特定の実施形態では、配列番号５７１〜５８２の１つ以上は、軟骨無形成症の治療方法で使用される。
【０３４７】
図４２Ｇに示されるように、配列番号５３７〜５４２でＣＮＰ２２を基準にした位置１７をアルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）で置換すると、配列番号５８３〜５８８の配列が提供される。図４２Ｈに示されるように、Ｎ末端にＤ１０骨ターゲッティング部分を含むようにこれらの配列をさらに修飾して、配列番号５８９〜５９４の配列を提供することが可能である。それに加えて、図３８、３９Ａ〜３９Ｂ、および４０にイタリック体で示された領域は、本明細書に開示されたＮＰのいずれかに対してＮ末端伸長部、Ｃ末端伸長部、および／またはリンカーとして使用可能である（たとえば、配列番号５８３〜５９４）。配列番号５８３〜５９４のいずれかは、本明細書に記載の任意の病態の治療方法で使用可能である。特定の実施形態では、配列番号５８３〜５９４の１つ以上は、軟骨無形成症の治療方法で使用される。
【０３４８】
図４２Ｉに示されるように、配列番号５３７〜５４２でＣＮＰ２２を基準にした位置１７をチロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）で置換すると、配列番号５９５〜６００の配列が提供される。図４２Ｊに示されるように、Ｎ末端にＤ１０骨ターゲッティング部分を含むようにこれらの配列をさらに修飾して、は配列番号６０１〜６０６の配列を提供することが可能である。それに加えて、図３８、３９Ａ〜３９Ｂ、および４０にイタリック体で示された領域は、本明細書に開示されたＮＰのいずれかに対してＮ末端伸長部、Ｃ末端伸長部、および／またはリンカーとして使用可能である（たとえば、配列番号５９５〜６０６）。
配列番号５９５〜６０６のいずれかは、本明細書に記載の任意の病態の治療方法で使用可能である。特定の実施形態では、配列番号５９５〜６０６の１つ以上は、軟骨無形成症の治療方法で使用される。
【０３４９】
実施例２０．マウスにおける動脈血圧に及ぼすＮＣ２Ｂの影響
融合タンパク質の副作用の可能性を調べるために、我々は、テレメトリー測定覚醒野生型マウスにおいて、ＮＣ２Ｂの皮下（ＳＣ）投与の前後の収縮期動脈血圧、拡張期動脈血圧、および平均動脈血圧に及ぼすＮＣ２Ｂの血行力学的影響を評価した。
【０３５０】
用量は、０〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲内であり、ｉｎ  ｖｉｖｏでの骨成長に及ぼす影響に基づいて選択した。１２〜１３週齢の６匹の雄ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを各治療グループに組み込んだ。ＮＣ２Ｂ投与は、非麻酔マウスにおいて連続５日間にわたり１日１回皮下に行った。左頸動脈に配置された外科的留置圧力トランスデューサーを介して、動脈血圧を取得した。各マウスに対して、毎日１回注射３０分前の動脈血圧の平均を参照として記録し、他の時点での値から引き算して血行力学的応答を得た。各注射日の個別解析後、累積効果や相加効果の徴候はまったく観測されず、いかなる習慣性や耐性も観測されなかったので、テレメトリーデータ解析は、各個別マウスで連続注射５日間にわたる平均変化に基づいた。
【０３５１】
図４３Ａ〜４３Ｃに示されるように、ＮＣ２Ｂは、ＳＣ注射時、血行力学的作用を誘導して用量−応答関係を呈した。これらの血圧降下作用は、ＳＣ投与後、すべての試験用量で、限定的であり許容可能な血行力学的範囲内にあると考えられる。したがって、血圧低下をはじめとする有害な血行力学的作用などの用量依存的副作用の可能性に関して、本明細書で説明した配列のいずれかをアッセイし、対照（たとえば、本明細書で説明したいずれか）と比較して、そのような副作用を最小限に抑えるべくまたはこれらの副作用を低減すべく、投与量範囲（たとえば、本明細書で説明したいずれか）内で投与することが可能である。
【０３５２】
実施例２１．野生型（ＣＤ−１）マウスにおける骨成長に関するＮＣ２Ｂの毎週１回のボーラス皮下注射の評価
目的
野生型（ＷＴ）マウスにおいて骨成長に関するＮＣ２Ｂの毎週１回の皮下（ＳＣ）投与の影響を評価すべく、試験を設計した。
【０３５３】
試験品
試験品：２５ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４中に製剤化されたＮＣ２Ｂ。
対照品：媒体、２５ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４。
【０３５４】
試験系
ＣＤ−１マウスは、薬力学的試験で使用するための標準的齧歯動物種であり、このマウスは、以上の実施例１４で説明されている。
【０３５５】
実験計画
以下の表１８に記載されるように、肩甲間部への皮下注射として動物にＮＣ２Ｂの投与を行った。
【０３５６】
【表１８】
0006055779.tif 000021
【０３５７】
ＣＤ−１マウスを３週齢で連続３５日間にわたり指定用量で治療し、続いて、最後の注射の２４時間後、剖検を行った。
【０３５８】
実験手順
実験は、以上の実施例１４で説明したように行った。
【０３５９】
結果
実験結果を図４４Ａ〜４４Ｂに示し、以下の表１９にまとめる（３６日目の結果）。表１９のデータは、とくに断りのないかぎり、剖検時にカリパスを用いて取得した。
【０３６０】
【表１９】
0006055779.tif 000022
【０３６１】
ＮＣ２Ｂの毎日１回および毎週１回の治療レジメンは両方とも、野生型マウスにおいて、３５日間の治療期間後、ほとんどすべての骨長（身体中心部および四肢）の強健な成長を誘導した。表１３および１９に示されるように、毎日１回３０ｍｇ／ｋｇのＮＣ２ｓｔおよびＮＣ２Ｂは、マウスにおいて骨成長に関する類似の有効性を有する。これらのデータから、毎週１回の投与レジメンは、Ｆｃ−ＣＮＰ融合タンパク質が有意な骨成長を誘導するのに十分であることが確認される。
【０３６２】
参考文献
１．    Ｐｏｔｔｅｒ，  Ｌ．Ｒ．，  Ｓ．  Ａｂｂｅｙ−Ｈｏｓｃｈ，  ａｎｄ  Ｄ．Ｍ．  Ｄｉｃｋｅｙ，  Ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ，  ｔｈｅｉｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，  ａｎｄ  ｃｙｃｌｉｃ  ｇｕａｎｏｓｉｎｅ  ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．  Ｅｎｄｏｃｒ  Ｒｅｖ，  ２００６．  ２７（１）：  ｐ．  ４７−７２．
２．    Ｈａｇｉｗａｒａ，  Ｈ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｕｔｏｃｒｉｎｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒａｔ  ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，  ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−Ｂ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，  １９９４．  ２６９（１４）：  ｐ．  １０７２９−３３．
３．    Ｈａｇｉｗａｒａ，  Ｈ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ｃＧＭＰ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ＡＮＰ  ａｎｄ  ＣＮＰ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ．  Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，  １９９６．  ２７０（５  Ｐｔ  １）：  ｐ．  Ｃ１３１１−８．
４．    Ｓｕｄａ，  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃ−ｔｙｐｅ  ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｓ  ａｎ  ａｕｔｏｃｒｉｎｅ／ｐａｒａｃｒｉｎｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ．  Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｂｏｎｅ  ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｓｔｅｍ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ，  １９９６．  ２２３（１）：  ｐ．  １−６．
５．    Ｙａｓｏｄａ，  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｄｏｃｈｏｎｄｒａｌ  ｏｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ．  Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃ−ｔｙｐｅ  ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ／ｇｕａｎｙｌｙｌ  ｃｙｃｌａｓｅ−Ｂ  ｐａｔｈｗａｙ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，  １９９８．  ２７３（１９）：  ｐ．  １１６９５−７００．
６．    Ｍｅｒｉｃｑ，  Ｖ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｅｔａｌ  ｒａｔ  ｂｏｎｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｂｙ  Ｃ−ｔｙｐｅ  ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  ｃＧＭＰ．  Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｒｅｓ，  ２０００．  ４７（２）：  ｐ．  １８９−９３．
７．    Ｄａｇｇｕｂａｔｉ，  Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ，  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ，  ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ  Ｙ，  ａｔｒｉａｌ，  ｂｒａｉｎ，  ａｎｄ  Ｃ−ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  ｐｒｏｈｏｒｍｏｎｅ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｃｏｍｐａｒｅｄ  ａｓ  ｅａｒｌｙ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ  ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ．  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ，  １９９７．  ３６（２）：  ｐ．  ２４６−５５．
８．    Ｋａｌｒａ，  Ｐ．Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｃ−ｔｙｐｅ  ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｉｎ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ．  Ｅｕｒ  Ｈｅａｒｔ  Ｊ，  ２００１．  ２２（１２）：  ｐ．  ９９７−１００７．
９．    Ｐｆｅｉｆｅｒ，  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｄｅｆｅｃｔｓ  ａｎｄ  ｄｗａｒｆｉｓｍ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｌａｃｋｉｎｇ  ｃＧＭＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ＩＩ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  １９９６．  ２７４（５２９５）：  ｐ．  ２０８２−６．
１０．    Ｙａｓｏｄａ，  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＣＮＰ  ｉｎ  ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ  ｒｅｓｃｕｅｓ  ａｃｈｏｎｄｒｏｐｌａｓｉａ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ａ  ＭＡＰＫ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐａｔｈｗａｙ．  Ｎａｔ  Ｍｅｄ，  ２００４．  １０（１）：  ｐ．  ８０−６．
１１．    Ｃｈｕｓｈｏ，  Ｈ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｗａｒｆｉｓｍ  ａｎｄ  ｅａｒｌｙ  ｄｅａｔｈ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｌａｃｋｉｎｇ  Ｃ−ｔｙｐｅ  ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，  ２００１．  ９８（７）：  ｐ．  ４０１６−２１．
１２．    Ｙｏｄｅｒ，  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｒｅｄｕｃｅｄ  ａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｃ−ｔｙｐｅ  ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ  （ＣＮＰ）  ｔｏ  ａｃｔｉｖａｔｅ  ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｂ  （ＮＰＲ−Ｂ）  ｃａｕｓｅｓ  ｄｗａｒｆｉｓｍ  ｉｎ  ｌｂａｂ−／−  ｍｉｃｅ．  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，  ２００８．  ２９（９）：  ｐ．  １５７５−１５８１．
１３．    Ｂｏｃｃｉａｒｄｉ，  Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃ−ｔｙｐｅ  ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ  （ＣＮＰ）  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｏｖｅｒｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｂｏｎｅ  ａｎｏｍａｌｉｅｓ  ｉｎ  ａｎ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｗｉｔｈ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｔ（２；７）  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ．  Ｈｕｍ  Ｍｕｔａｔ，  ２００７．  ２８（７）：  ｐ．  ７２４−３１．
１４．    Ｔａｍｕｒａ，  Ｎ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｕａｎｙｌｙｌ  ｃｙｃｌａｓｅ  Ｂ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎ  ｅｎｄｏｃｈｏｎｄｒａｌ  ｏｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｆｅｍａｌｅ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ｏｒｇａｎｓ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，  ２００４．  １０１（４９）：  ｐ．  １７３００−５．
１５．    Ｔｓｕｊｉ，  Ｔ．  ａｎｄ  Ｔ．  Ｋｕｎｉｅｄａ，  Ａ  ｌｏｓｓ−ｏｆ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２  （Ｎｐｒ２）  ｇｅｎｅ  ｉｓ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ  ｆｏｒ  ｄｉｓｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｔｅ  ｄｗａｒｆｉｓｍ  ｉｎ  ｃｎ／ｃｎ  ｍｏｕｓｅ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，  ２００５．  ２８０（１４）：  ｐ．  １４２８８−９２．
１６．    Ｍｉｙａｚａｗａ，  Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｙｃｌｉｃ  ＧＭＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ＩＩ  ｐｌａｙｓ  ａ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  Ｃ−ｔｙｐｅ  ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｅｎｄｏｃｈｏｎｄｒａｌ  ｏｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，  ２００２．  １４３（９）：  ｐ．  ３６０４−１０．
１７．    Ｔｅｉｘｅｉｒａ，  Ｃ．，  Ｈ．  Ａｇｏｓｔｏｎ，  ａｎｄ  Ｆ．  Ｂｅｉｅｒ，  Ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ，  Ｃ−ｔｙｐｅ  ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  ｃＧＭＰ  ａｓ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ  ｏｆ  ｅｎｄｏｃｈｏｎｄｒａｌ  ｏｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ．  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ２００８．  ３１９（２）：  ｐ．  １７１−１７８．
１８．    Ｈｏｒｔｏｎ，  Ｗ．Ａ．，  Ｊ．Ｇ．  Ｈａｌｌ，  ａｎｄ  Ｊ．Ｔ．  Ｈｅｃｈｔ，  Ａｃｈｏｎｄｒｏｐｌａｓｉａ．  Ｌａｎｃｅｔ，  ２００７．  ３７０（９５８２）：  ｐ．  １６２−７２．
１９．    Ｎａｋａｏ，  Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｅ  ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ａｌｐｈａ−ｈｕｍａｎ  ａｔｒｉａｌ  ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｉｎ  ｈｅａｌｔｈｙ  ｓｕｂｊｅｃｔｓ．  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，  １９８６．  ３１（１）：  ｐ．  １０１−３．
２０．    Ｂｒｅｎｎｅｒ，  Ｂ．Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉｖｅｒｓｅ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ａｔｒｉａｌ  ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｖ，  １９９０．  ７０（３）：  ｐ．  ６６５−９９．
２１．    Ｆａｒｎｕｍ，  Ｃ．Ｅ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎａｔｅｄ  ｄｅｘｔｒａｎｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｍｕｒｉｎｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｐｌａｔｅ：  Ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｒｅｅ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｒｏｕｔｅｓ  ｂｙ  ｍｕｌｔｉｐｈｏｔｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ．  Ｔｈｅ  Ａｎａｔｏｍｉｃａｌ  Ｒｅｃｏｒｄ  Ｐａｒｔ  Ａ：  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｉｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，  Ｃｅｌｌｕｌａｒ，  ａｎｄ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ２００６．  ２８８Ａ（１）：  ｐ．  ９１−１０３．
２２．    Ｗｉｌｌｉａｍｓ，  Ｒ．Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｏｌｕｔｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｉｎ  ｇｒｏｗｔｈ  ｐｌａｔｅ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ：  Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ，  ２００７．  ９３：  １０３９−１０５０．
２３．    Ｃｈｅｎ，  Ｌ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｌｙ３６９Ｃｙｓ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ＦＧＦＲ３  ｃａｕｓｅｓ  ａｃｈｏｎｄｒｏｐｌａｓｉａ  ｂｙ  ａｆｆｅｃｔｉｎｇ  ｂｏｔｈ  ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｏｓｔｅｏｇｅｎｅｓｉｓ，  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ，  １９９９．  １０４（１１）：  １５１７−１５２５．
２４．    Ｙａｓｏｄａ，  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃ−Ｔｙｐｅ  Ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｓ  ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  Ｓｋｅｌｅｔａｌ  Ｄｙｓｐｌａｓｉａｓ，  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，  ２００９．  １５０（７）：  ３１３８−３１４４．
【０３６３】
他の実施形態
本明細書に挙げた出版物、特許出願、および特許はすべて、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本発明を特定の実施形態との関連で説明してきたが、さらなる変更が可能であることは理解されよう。したがって、本出願は、当業界内で公知または慣用の規範に該当する本開示からの逸脱を含めて、本発明の原理に一般に従う本発明の任意の変形形態、使用形態、または適応形態を包含するとみなされる。
【図１】
0006055779.tif 000023
【図２】
0006055779.tif 000024
【図３】
0006055779.tif 000025
【図４Ａ】
0006055779.tif 000026
【図４Ｂ】
0006055779.tif 000027
【図４Ｃ】
0006055779.tif 000028
【図４Ｄ】
0006055779.tif 000029
【図４Ｅ】
0006055779.tif 000030
【図４Ｆ】
0006055779.tif 000031
【図４Ｇ】
0006055779.tif 000032
【図５】
0006055779.tif 000033
【図６】
0006055779.tif 000034
【図７】
0006055779.tif 000035
【図８Ａ】
0006055779.tif 000036
【図８Ｂ】
0006055779.tif 000037
【図８Ｃ】
0006055779.tif 000038
【図９】
0006055779.tif 000039
【図１０】
0006055779.tif 000040
【図１１】
0006055779.tif 000041
【図１２Ａ】
0006055779.tif 000042
【図１２Ｂ】
0006055779.tif 000043
【図１２Ｃ】
0006055779.tif 000044
【図１２Ｄ】
0006055779.tif 000045
【図１２Ｅ】
0006055779.tif 000046
【図１２Ｆ】
0006055779.tif 000047
【図１２Ｇ】
0006055779.tif 000048
【図１２Ｈ】
0006055779.tif 000049
【図１３】
0006055779.tif 000050
【図１４】
0006055779.tif 000051
【図１５Ａ】
0006055779.tif 000052
【図１５Ｂ】
0006055779.tif 000053
【図１６Ａ】
0006055779.tif 000054
【図１６Ｂ】
0006055779.tif 000055
【図１６Ｃ】
0006055779.tif 000056
【図１６Ｄ】
0006055779.tif 000057
【図１７】
0006055779.tif 000058
【図１８】
0006055779.tif 000059
【図１９】
0006055779.tif 000060
【図２０】
0006055779.tif 000061
【図２１Ａ】
0006055779.tif 000062
【図２１Ｂ】
0006055779.tif 000063
【図２１Ｃ】
0006055779.tif 000064
【図２２】
0006055779.tif 000065
【図２３】
0006055779.tif 000066
【図２４Ａ】
0006055779.tif 000067
【図２４Ｂ】
0006055779.tif 000068
【図２４Ｃ】
0006055779.tif 000069
【図２４Ｄ】
0006055779.tif 000070
【図２５】
0006055779.tif 000071
【図２６Ａ】
0006055779.tif 000072
【図２６Ｂ】
0006055779.tif 000073
【図２７Ａ】
0006055779.tif 000074
【図２７Ｂ】
0006055779.tif 000075
【図２７Ｃ】
0006055779.tif 000076
【図２８Ａ】
0006055779.tif 000077
【図２８Ｂ】
0006055779.tif 000078
【図２９】
0006055779.tif 000079
【図３０】
0006055779.tif 000080
【図３１】
0006055779.tif 000081
【図３２Ａ】
0006055779.tif 000082
【図３２Ｂ】
0006055779.tif 000083
【図３２Ｃ】
0006055779.tif 000084
【図３２Ｄ】
0006055779.tif 000085
【図３２Ｅ】
0006055779.tif 000086
【図３３Ａ】
0006055779.tif 000087
【図３３Ｂ】
0006055779.tif 000088
【図３３Ｃ】
0006055779.tif 000089
【図３３Ｄ】
0006055779.tif 000090
【図３３Ｅ】
0006055779.tif 000091
【図３３Ｆ】
0006055779.tif 000092
【図３３Ｇ】
0006055779.tif 000093
【図３３Ｈ】
0006055779.tif 000094
【図３３Ｉ】
0006055779.tif 000095
【図３３Ｊ】
0006055779.tif 000096
【図３３Ｋ】
0006055779.tif 000097
【図３３Ｌ】
0006055779.tif 000098
【図３３Ｍ】
0006055779.tif 000099
【図３３Ｎ】
0006055779.tif 000100
【図３３Ｏ】
0006055779.tif 000101
【図３３Ｐ】
0006055779.tif 000102
【図３３Ｑ】
0006055779.tif 000103
【図３３Ｒ】
0006055779.tif 000104
【図３３Ｓ】
0006055779.tif 000105
【図３３Ｔ】
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【図３３Ｕ】
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【図３３Ｖ】
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【図３３Ｗ】
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【図３３Ｘ】
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【図３３Ｙ】
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【図３４】
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【図３５Ａ】
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【図３５Ｂ】
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【図３６Ａ】
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【図３６Ｂ】
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【図３７Ａ】
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【図３７Ｂ】
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【図３８】
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【図３９Ａ】
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【図３９Ｂ】
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【図４０】
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【図４１Ａ】
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【図４１Ｂ】
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【図４１Ｃ】
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【図４１Ｄ】
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【図４１Ｅ】
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【図４２Ａ】
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【図４２Ｂ】
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【図４２Ｃ】
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【図４２Ｄ】
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【図４２Ｅ】
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【図４２Ｆ】
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【図４２Ｇ】
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【図４２Ｈ】
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【図４２Ｉ】
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【図４２Ｊ】
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【図４３】
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【図４４Ａ】
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【図４４Ｂ】
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【配列表】
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