(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ベクターにおいて注目の核酸フラグメントを相同組み換えによりすでに統合している形質転換酵母細胞の選択方法であって、前記方法が、
（ｉ）ポジティブ選択遺伝子、及び制限部位を構成する５’位の組み換え領域および３’位の組み換え領域を含む相同組み換えサイトを含むベクター、及び
前記ベクターの前記相同組み換えサイトに相同組み換えにより挿入される注目の前記核酸フラグメントであって、相同組み換えサイトの５’位の組み換え領域と同一のヌクレオチド配列を有する領域と、
３’位の組み換え領域と同一のヌクレオチド配列を有する領域とに隣接される前記核酸フラグメントを酵母細胞に接触させる工程、ならびに
（ｉｉ）前記酵母細胞を前記ベクターおよび前記注目の核酸フラグメントと共に形質転換する工程、
（ｉｉｉ）前記ポジティブ選択遺伝子を伴う前記ベクターを含む酵母細胞を選択する工程を含む方法であって、
ネガティブ選択遺伝子がベクター中の前記相同組み換えサイトの下流に更に存在し、前記相同組み換えサイトの上流に位置するプロモーターの制御下にあり、前記プロモーターおよびネガティブ選択遺伝子は、注目の核酸フラグメントの挿入前に前記ベクター中で作動可能に連結されており、かつ前記ネガティブ選択遺伝子が、相同組み換えによる注目の前記核酸フラグメントの挿入により前記プロモーターと作動可能に連結しなくなることを特徴とし、
（ｉｖ）前記方法が注目の核酸フラグメントを含む酵母細胞を前記ネガティブ選択遺伝子を用いて選択する工程をさらに含む方法。
【請求項２】
ポジティブ選択遺伝子、およびプロモーターを含むベクターに、
制限部位を構成する５’位の組み換え領域および３’位の組み換え領域を含む相同組み換えサイト、ならびに
前記相同組み換えサイトの下流のネガティブ選択遺伝子を含む、カセットの統合により本発明のベクターを得る事前工程をさらに含み、
前記カセットの相同組み換えサイトの下流にある前記ネガティブ選択遺伝子を、前記ベクター中に存在する前記プロモーターの制御下に配置し、前記プロモーターおよび前記ネガティブ選択遺伝子は得られたベクター中に作動可能に連結されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
注目する核酸フラグメントを合成するさらなる事前工程を含み、前記フラグメントは、工程（ｉ）のベクター上の相同組み換えサイトの５’位の領域と同一の配列および３’位の領域と同一の配列により隣接される、研究または製造するための核酸の配列を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ネガティブ選択遺伝子がＵＲＡ３遺伝子である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ネガティブ選択遺伝子発現を制御する前記プロモーターがＧＡＬ１プロモーターである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ネガティブ選択遺伝子のＵＲＡ３が、誘導性プロモーターの制御下にあり、および、
本発明の注目する核酸フラグメントの相同組み換えによる挿入が、少なくとも１２０塩基対により誘導性プロモーターからネガティブ選択遺伝子を分離する、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項７】
ネガティブ選択遺伝子発現を制御する前記プロモーターがＡＤＨ１プロモーターである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
ネガティブ選択遺伝子ＵＲＡ３がＡＤＨ−１プロモーターの制御下にあり、および、
本発明の注目する核酸フラグメントの相同組み換えによる挿入が、少なくとも１００塩基対により前記プロモーターからネガティブ選択遺伝子を分離する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
選択工程（ｉｉｉ）および（ｉｖ）が同時に実施される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、相同組み換えにより得られる予測される形質転換酵母細胞を簡単に選択するためのカセットおよび方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
酵母細胞、特にＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（サッカロマイセス・セレビシエ）は、技術的酵素のような化合物の場合の効率的な大量生産の要求と、医薬用タンパク質の場合の安全性および信頼性の基準の両方を満たすので、それらは組み換えタンパク質の製造において重要な生物である。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、広範囲で研究されており、そのため分子ツールおよびゲノムツールをその操作に利用でき、成功した工業用微生物である。
【０００３】
異なる技術は、発現ベクターを通して酵母細胞に注目のＤＮＡフラグメントを挿入するために用いられる。第一の方法はＤＮＡ修飾酵素（ＤＮＡ制限酵素およびＤＮＡライゲーション酵素）を通した周知のＤＮＡサブクローニングである。つまり、シャトルベクターにおいてＤＮＡフラグメントをサブクローンするため、マルチクローニングサイト（ＭＣＳ）は、一般的にプロモーターの３’位末端に存在する。このＭＣＳ  ＤＮＡは、ゲノム中にまれに見つかるエンドヌクレアーゼ（制限酵素として知られている）により認知されているヌクレオチド配列を含有する。両方の基質に存在する具体的な制限酵素を用いた伝統的な分子手順によって両方のＤＮＡ（サブクローンとシャトルベクター）の酵素による    消化の後（非特許文献１）、ライゲーションが起こり、プラスミドの繁殖がライゲーション生成物を用いた細菌形質転換の後に細菌中に得られる。最後の手順は、予測されるプラスミドを含む細菌形質転換体を選択するため、多くの個々の形質転換体のプラスミド成分（ＰＣＲまたは制限酵素のいずれかにより）を分析することにより達成される。予測されるプラスミドを含む一つの細菌形質転換体が選択された場合、プラスミド製造、抽出および精製は伝統的な技術を用いて行われる。この精製したプラスミドの数百ナノグラムは、酵母を形質添加するために用いられる。
【０００４】
シャトル酵母ベクターにおいてＤＮＡをサブクローンするより簡単な方法は、酵母で起こる相同組み換え現象をうまく利用する。この場合、発現ベクター中に配置された配列と同質である両サイドに含まれるＰＣＲ増幅ＤＮＡフラグメントは、一段階での酵母の同時形質転換に用いられる（シングルカットされた脱リン酸ベクターおよびＰＣＲ増幅ＤＮＡ）ので、プラスミドを増殖したとき、宿主としてのバクテリアを使う必要はない。
【０００５】
しかしながら、相同組み換えは予測される形質転換体を１００％得ることを可能としない：この方法により得られる酵母形質転換体は空のベクター（相同組み換えが起こらなかったとき）または予測されるプラスミドのいずれも含む。発明者らは、全形質転換体のたったおよそ７０％が予測されるプラスミドを提供することを示す。全酵母形質転換体から選択するため、発明者らは、酵母ＤＮＡの精製および分析にいろいろな工程を含むこと、または酵母機能アッセイはいろいろな単一の酵母形質転換体になされなければならないことに注目する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ＪおよびＲｕｓｓｅｌ  Ｄ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、２００１年、第３版、ＣＳＨＬ出版
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、相同組み換えにより得られる注目の酵母形質転換体を容易に選択する新しいツールおよび方法の需要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、発現ベクターにおいて相同組み換えにより注目する核酸フラグメントを統合する形質転換酵母細胞を容易に選択する新しい方法およびカセットを開発した。方法およびカセットは、お金と時間の節約を可能とし、したがって、その方法およびカセットは予測される酵母を選択するためのＤＮＡの精製の工程を避け、一工程で予測される形質転換酵母細胞の選択を可能とする。
【０００９】
本発明は、相同組み換えによるベクターにおいて注目の核酸フラグメントをすでに統合している形質転換酵母細胞の選択方法に関し、その方法は、
（ｉ）ｏポジティブ選択遺伝子、
ｏ制限部位を構成する５’位および３’位の組み換え領域を含む相同組み換えサイト、を含むベクター、ならびに
ベクターの相同組み換えサイトに相同組み換えによる挿入において注目の核酸フラグメント、相同組み換えサイトの５’位および３’位の組み換え領域と実質的に同一の領域に隣接する核酸フラグメント、とを酵母細胞と接触させる工程、ならびに
（ｉｉ）上記酵母細胞を上記ベクターおよび上記注目の核酸フラグメントと共に形質転換する工程、
（ｉｉｉ）上記ポジティブ選択遺伝子を伴う上記ベクターを含む酵母細胞を選択する工程であって、
ネガティブ選択遺伝子はさらに上記相同組み換えサイトの下流にあるベクター中に、上記相同組み換えサイトの上流に位置するプロモーターの制御下で存在し、当該プロモーターおよびネガティブ選択遺伝子は、注目のＤＮＡフラグメントの挿入前に上記ベクター中で作動可能に連結されていることを特徴とする工程を含み、ならびに
（ｉｖ）上記方法は注目のＤＮＡフラグメントを含む酵母細胞を上記ネガティブ選択遺伝子を用いて選択する工程をさらに含む。
【００１０】
本発明は、
制限部位を構成する５’位および３’位の組み換え領域を含む相同組み換えサイトと
相同組み換えサイトの下流にあるネガティブ選択遺伝子と、を含むカセット、ならびに
複製起点、
ポジティブ選択がプロモーターの制御下にある、ポジティブ選択遺伝子、
制限部位を構成する５’位および３’位の組み換え領域を含む相同組み換えサイト、ならびに
相同組み換えサイトの下流にあるベクター中かつ上記相同組み換えサイトの上流に位置するプロモーターの制御下に存在し、プロモーターおよびネガティブ選択遺伝子は、注目のＤＮＡフラグメントの挿入前に上記ベクター中で作動可能に連結され、かつターミネータの制御下にあるネガティブ選択遺伝子、
を含むベクターに関する。
【００１１】
本発明は、本発明のベクターを得るための方法にも関し、その方法は本発明に係るカセットを、ベクター、好ましくは、ポジティブ選択遺伝子およびプロモーターを含むプラスミドに統合することを含み、
当該カセットの相同組み換えサイトの下流にある上記ネガティブ選択遺伝子を、上記ベクター中に存在する上記プロモーターの制御下に配置し、上記プロモーターおよび上記ネガティブ選択遺伝子は得られたベクター中に作動可能に連結されている方法、に関する。
【００１２】
本発明は、最終的に、
本発明に係るカセット、および
少なくとも一つの酵母細胞培地、
を含むキットを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
図面は本願明細書の部分を形成し、本発明の特定の態様をさらに実証するために包含される。本発明は、これらの図面の１以上を本願明細書に存在する特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて参照することにより、よりよく理解されるかもしれない。
【００１４】
【図１】ｐＲＳ３１６発現ベクターのプロモーターの領域の下流に挿入されうるカセットを作製する図面である。この構造の合理的な点は、ｕｒａ３  ＯＲＦが任意のシャトル酵母ベクターのｈｉｓ３、Ｌｅｕ２またはＴｒｐｌバージョンのプロモーターの制御下に配置されるカセットを作製することである。ｕｒａ３は、図１ａに示されるように、５’位の相同領域（ＲＨ５）、独特の制限部位および３’位の相同領域（ＲＨ３）によって先行されるだろう。この構造において、ｕｒａ３  ＯＲＦのプロモーターと開始コドンとの間の距離は、ｕｒａ３発現をもたらすが、ＵＲＡ３遺伝子がＲＨ５配列とＲＨ３配列との間のＤＮＡフラグメントの挿入に起因してプロモーターから離れて配置される場合、ｕｒａ３は発現されないだろう。５−ＦＯＡを用いた形質転換体のインキュベーションは、後にＵＲＡ３を発現する形質転換体の死と挿入されたＰＣＲ増幅フラグメントを伴うベクターを含む形質転換体の増殖をもたらすだろう（図１ｂ）。
【図２】５−ＦＯＡインキュベーションによりＨＩＶ−１プロテアーゼを含む酵母の組み換えの選択の図である。ｖｓ３ｇａｌ−ＲＨは、ＸｈｏＩで切断され、精製され、ＲＨｌ−５’配列およびＲＨｌ−３’配列の５’位および３’位の末端に存在するＨＩＶ−１プロテアーゼのＰＣＲ増幅配列と混合され、そしてＷ３０３酵母株を形質転換するために用いられる。形質転換体は、ヒスチジンおよび５−ＦＯＡを欠乏している最少培地に３０℃で２４時間増殖して最終濃度１ｍｇ／ｍＬとし、その後ヒスチジンを欠乏している最少培地中４８時間放置した。細胞は、滅菌水中、３回洗浄され、培地を含有するガラクト―ス中ＨＩＶ−１プロテアーゼの発現は試験された。酵母中ＨＩＶ−１プロテアーゼの発現は細胞死をもたらす（Ｂｌａｎｃｏら、２００３、国際特許出願２０１１／００７２４４号）。結果は、５−ＦＯＡインキュベーションを通して、ＤＮＡフラグメントはガラクトース（ＳＧａｌＲ−ｈｉｓ培地）中での細胞増殖の停止によって示されるようにベクターに挿入され、ＨＩＶ−１プロテアーゼ（ＩＰ）の具体的な阻害剤の添加により妨げられるが、作製されたＤＮＡカセットはクローンのみ選択するのに実際に効率的である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
（本発明の方法）
本発明の第一の目的は、相同組み換えによるベクターにおいて注目の核酸フラグメントをすでに統合している形質転換酵母細胞の選択方法に関し、当該方法は、
（ｉ）ｏポジティブ選択遺伝子、
ｏ制限部位を構成する５’位および３’位の組み換え領域を含む相同組み換えサイト、
を含むベクター、ならびに
当該ベクターの相同組み換えサイトに相同組み換えによる挿入において注目の核酸フラグメント、相同組み換えサイトの５’位および３’位の組み換え領域と実質的に同一の領域に隣接する上記核酸フラグメント、とを酵母細胞と接触させる工程、ならびに
（ｉｉ）上記酵母細胞を上記ベクターおよび上記注目の核酸フラグメントと共に形質転換する工程、
（ｉｉｉ）上記ポジティブ選択遺伝子を伴う上記ベクターを含む酵母細胞を選択する工程、
を含み、
ネガティブ選択遺伝子はさらに上記相同組み換えサイトの下流にあるベクター中に、上記相同組み換えサイトの上流に位置するプロモーターの制御下で存在し、当該プロモーターおよびネガティブ選択遺伝子は、注目のＤＮＡフラグメントの挿入前に上記ベクター中で作動可能に連結されている、ならびに
（ｉｖ）上記方法は注目のＤＮＡフラグメントを含む酵母細胞を上記ネガティブ選択遺伝子を用いて選択する工程をさらに含む。
【００１６】
ベクター中の注目のＤＮＡフラグメントを統合しない形質転換酵母細胞は、上記プロモーターと未だ作動可能に連結されたネガティブ選択遺伝子の発現のせいで、工程（ｉｖ）で死に、
ベクター中の統合された注目のＤＮＡフラグメントを有する形質転換酵母細胞は、注目する核酸フラグメントが、上記ネガティブ選択遺伝子および上記プロモーターの間に挿入されるとき、そのプロモーターとさらには作動可能に連結しないネガティブ選択遺伝子の発現がないので、工程（ｉｖ）の後で生きている、
ことが、本発明の方法を用いてわかるはずである。
【００１７】
用語「形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」または「形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ）」は、宿主生物に、ＤＮＡフラグメント、プラスミドまたはベクターを転移することを言及する。ＤＮＡフラグメント、プラスミドまたはベクターなどを含有する宿主生物は、「組み換え（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）」生物または「形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ）」生物と呼ばれる。
【００１８】
本発明の方法において、形質転換生物は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ（カンジダ・アルビカンス）およびＣ．ｍａｌｔｏｓａ（カンジダ・マルトーサ）、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ（ハンゼヌラ・ポリモルファ）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ（クルイベロマイセス・フラギリス）およびＫ．ｌａｃｔｉｓ（クルイベロマイセス・ラクチス）、Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｉｌｌｅｒｉｍｏｎｄｉｉ（ピキア・ギリエルモンティー）およびＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ（ピキア・パストリス）、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ（シゾサッカロマイセス・ポムベ）、およびＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ（ヤローウィア・リポリティカ）である。好ましくは、形質転換酵母細胞は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどの酵母である。
【００１９】
用語「ベクター」または「プラスミド」は、細胞の中央代謝の部分でない遺伝子および、通常環状二本鎖ＤＮＡ分子の形態にある遺伝子をよく含む外因染色体を言及する。そのような成分は、任意の源由来の、自己複製配列、ゲノム統合配列、ファージまたはヌクレオチド配列、線状もしくは環状の一本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡであってよく、いくつかのヌクレオチド配列は、適切な３’位の非翻訳配列に沿って、選択された遺伝子産物のプロモーターフラグメントおよびＤＮＡ配列を細胞に導入することができる独特の構造に、結合または再結合されている。
【００２０】
したがって、本発明のベクターおよびプラスミドは、酵母中に機能的な複製起点を含む。用語「酵母中に機能的な複製起点」は、染色体から独立にベクターまたはプラスミドの複製を可能とする任意の核酸配列を言及する。一般的に、複製起点は以下の少なくとも一つ以上において機能的である：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓおよびＣ．ｍａｌｔｏｓａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓおよびＫ．ｌａｃｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｉｌｌｅｒｉｍｏｎｄｉｉおよびＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、およびＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ。好適な複製起点は、例えば、ａｒｓ１、セントロメア指向（ｏｒｉ）、および２μ指向を包含する。
【００２１】
一実施形態において、本発明の方法は、
ポジティブ選択遺伝子、および
プロモーター、
を含むベクターに、
制限部位を構成する５’位および３’位の組み換え領域を含む相同組み換えサイト、ならびに
当該相同組み換えサイトの下流のネガティブ選択遺伝子、を含む、カセットの統合により本発明のベクターを得る事前工程をさらに含み、
上記カセットの相同組み換えサイトの下流にある上記ネガティブ選択遺伝子を、上記ベクター中に存在する上記プロモーターの制御下に配置し、上記プロモーターおよび上記ネガティブ選択遺伝子は、得られたベクター中に作動可能に連結されている。
【００２２】
本発明において、用語「カセット」は、任意の手段により、例えば、酵素消化およびＤＮＡライゲーションにより、組み換え領域により、より具体的にはプラスミドへの相同組み換えにより統合する具体的な核酸配列を含む要素として考えられるべきである。
【００２３】
本願明細書で使用する場合、用語「プロモーター」は、当該プロモーターに作動可能に連結されている遺伝子またはコード配列の直接転写（したがって、発現）することができるＤＮＡ配列を言及する。
【００２４】
一般的に、用語「作動可能に連結された」は、転写調節核酸が、転写が開始される態様のように任意のコード配列に関連して位置する、ことを意味する。本願明細書で使用する場合、これは、当該コード領域の発現を可能とする距離で、コード領域の５’位に、プロモーターは位置することを意味するだろう。プロモーターは、未変性の遺伝子から全体で得られ、または天然に見つかる異なるプロモーター由来の異なる要因から構成され、またはさらに合成ＤＮＡセグメントを含みさえするかもしれない。異なるプロモーターは異なる組織もしくは細胞型において、または異なる発展の段階で、または異なる環境条件に応答して、遺伝子の発現に向かわせるかもしれない。
【００２５】
異なる種類のプロモーターがある。本願明細書で使用する場合、プロモーターは誘導性プロモーターもしくは管理されたプロモーター（その活性は、生物的ファクターもしくは非生物的ファクターの存在または不存在により上昇制御または下方制御される）または構成的プロモーター（ほとんどの細胞型において、ほとんどの時間に遺伝子発現をもたらす）であるかもしれない。本発明において用いられるプロモーターは、強力プロモーター（高い遺伝子発現をもたらす）または弱いプロモーター（低い遺伝子発現をもたらす）であってよい（Ｍａｙａ，Ｄ，Ｑｕｉｎｔｅｒｏ，ＭＪ，Ｍｕｎｏｚ−Ｃｅｎｔｅｎｏ，Ｍ，Ｃｈａｖｅｚ，Ｓ，Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  ａｐｐｌｉｅｄ  ｇｅｎｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｉｎ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（サッカロマイセス・セレビシエにおける用いられる遺伝子の制御のためのシステム）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｌｅｔｔ、２００８年、第３０巻：９７９−９８７頁）。
【００２６】
本発明において用いられるプロモーターは、酵母細胞において機能的である。本発明において用いられうる酵母において機能的なプロモーターの例は、これらに限定されないが、ＧＡＬ１プロモーター（配列番号１）、ＡＤＨ１プロモーター（配列番号２）および強力ＧＰＤ（グリセルアルデヒド３Ｐ  ＤＨ）プロモーター（配列番号３）、を含む（Ｍａｙａら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ、２００８年、第３０巻：９７９−９８７頁）。
【００２７】
「選択遺伝子」（または「レポーター遺伝子」、「選択可能な遺伝子」）が、宿主細胞中に存在すること、すなわち発現において、遺伝子を意味することにより、選択可能な遺伝子を含有しない細胞から宿主は区別されることを可能としうる。選択可能な遺伝子は、ポジティブ選択遺伝子およびネガティブ選択遺伝子を包含している種々の異なる型に区別され得る。ある条件において特定の効果の原因となるのは、核酸またはタンパク質発現生成物であるかもしれない。基質、リガンドなどの追加成分は、選択可能な遺伝子に基づく選択または分類を可能とするためにさらに添加されてもよい。
【００２８】
本願明細書で使用する場合、本発明の選択遺伝子は開始コドンにより始まり、終止コドンにより停止し、プロモーター（遺伝子発現を可能とし、かつ制御する）により進行され、ターミネータにしたがって、機能化される。
【００２９】
「ポジティブ選択遺伝子」は、当該遺伝子を欠乏する細胞を殺しまたは成長を妨げる増殖条件下、ポジティブ選択遺伝子を発現する細胞の生存を可能とする核酸配列である。ポジティブ選択遺伝子の例は、抗生物質耐性遺伝子（ネオマイシン耐性遺伝子またはカナマイシン抵抗性遺伝子など）の発現を促進する核酸配列である。ネオマイシン耐性遺伝子を含有しない細胞はＧ４１８の適用により、選ばれ、ネオマイシン耐性遺伝子を発現する細胞はＧ４１８により危害を加えられない（ポジティブ選択）。
【００３０】
酵母中機能的な好ましいポジティブ選択遺伝子は、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、またはＴＲＰ１を包含する生存遺伝子である。ＡＬＧ７はツニカマイシンに対して増加した耐性を与え、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子は、銅イオン存在下で酵母を増殖できるようにするＧ４１８およびＣＵＰ１遺伝子に対する耐性を与える。
【００３１】
本発明において、ベクター中に存在するポジティブ選択遺伝子は、機能的な酵母プロモーターの制御下におかれている酵母中で機能的で古典的なポジティブ遺伝子の選択である。
【００３２】
好ましくは、当該ポジティブ選択遺伝子は、ＨＩＳ３遺伝子（配列番号４）である。酵母細胞を選択し、ゲノム中の機能的なＨＩＳ３遺伝子を欠乏し、本発明の方法の工程（ｉｉｉ）において、ベクターを避難させるために、培養された酵母細胞はヒスチジンを欠乏する培地に置かれる。Ｈｉｓ３遺伝子を発現する酵母細胞だけ、この培地において増殖しうる。
【００３３】
「ネガティブ選択遺伝子」は、通常適切な外因性試薬の利用において、当該ネガティブ選択遺伝子を発現する細胞を殺し、増殖を抑制またはさもなければ選択する核酸配列である。ネガティブ選択遺伝子の例は、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−ＴＫ）のチミジンキナーゼ遺伝子の発現を促進する核酸配列である。ＨＳＶ−ＴＫを発現する細胞は、ガンシクロビル（ネガティブ選択）の利用によって、それに対して選択され、それに対して遺伝子を発現しない細胞はガンシクロビルにより比較的危害を加えられない。用語はさらに定義され、そして、米国特許第５，４６４，７６４号（参照により本願明細書に援用したものとする）によってさらに説明される。ネガティブ選択遺伝子の別の実施例は、「ＵＲＡ」（オロチジン５’リン酸脱炭酸酵素遺伝子である。「ＵＲＡ３」は、出芽酵母Ｓ．Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（サッカロマイセス・セレビシエ）およびＫ．ｌａｃｔｉｓ（クルイベロマイセス・ラクチス）の「ＵＲＡ」遺伝子であり、「ＵＲＡ４」は、Ｓ．ｐｏｍｂｅ（シゾサッカロマイセス  ポムベ）の「ＵＲＡ」遺伝子である。本願明細書で使用する場合、用語「ＵＲＡ３遺伝子」は、ピリミジンリボヌクレオチドの合成およびウラシルまたはウリジンを欠いている培地中の細胞増殖の必要性に関する酵素をコードする遺伝子に関する。当該酵素は、５−フルオロオロチン酸（５−ＦＯＡ）の、細胞死の原因となる毒性化合物５−フルオロウラシルへと変換もする。ＵＲＡ３遺伝子は、ＤＮＡ形質転換、特に酵母ＤＮＡ形質転換のポジティブ選択遺伝子およびネガティブ選択遺伝として用いられうる。
【００３４】
本願明細書で使用する場合、「ＵＲＡ３遺伝子」は、任意の酵母、好ましくはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ由来のＵＲＡ３遺伝子と、変異体を含み、そして上述で引用したＵＲＡ３活性を維持するＵＲＡ３の機能の保存的異型などを包含する。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＵＲＡ３遺伝子の配列の例は、配列番号５に与えられる。
【００３５】
本願明細書で使用する場合、「異型」または「機能の保存的異型」は、一つまたは種々のヌクレオチドの変更された核酸配列およびＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡアルゴリズムで測定して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％ヌクレオチドの同一性を有する核酸配列、ならびに比較される遺伝子の未変性または親遺伝子と同一の特性もしくは機能または実質的に同一の特性もしくは機能を有する核酸配列を包含する。
【００３６】
好ましくは、上記ネガティブ選択遺伝子はＵＲＡ３遺伝子である。本発明の方法の工程（ｉｖ）において注目する核酸フラグメントを含む酵母細胞を選択するために、酵母細胞は、５−ＦＯＡを含有する培地におかれる。
【００３７】
上記フラグメントを含まない細胞中、ＵＲＡ３遺伝子および本発明のベクターにおいてＵＲＡ３遺伝子発現を制御するプロモーターは作動可能に連結され、そしてＵＲＡ３は発現される。ＵＲＡ３遺伝子が発現されるとき、５−ＦＯＡは毒性の化合物に変換され、当該フラグメントを含まない酵母細胞は死ぬ。
【００３８】
上記フラグメントを含む細胞において、ＵＲＡ３遺伝子および上記プロモーターは当該フラグメントにより分離され、もはや本発明において作動可能に連結されない。したがって、ＵＲＡ３遺伝子は発現されず、そして５−ＦＯＡはこれらの細胞に毒性ではなく、生き続け成長し続ける。
【００３９】
実際、本発明に係るネガティブ選択遺伝子は、酵母中の機能的なプロモーターの制御下に置かれる。本発明のベクターにおいて、ネガティブ選択遺伝子は相同組み換えサイトにより当該プロモーターから分離され、当該プロモーターに作動可能に連結される（例えば、当該プロモーターに十分近くに存在し、当該プロモーターがネガティブ選択遺伝子の発現を制御することを可能とする）。
【００４０】
相同組み換えが起こったとき、注目する核酸フラグメントは、相同組み換えサイト、ここでは、プロモーターおよびネガティブ選択遺伝子との間に挿入される。その場合、プロモーターおよびネガティブ選択遺伝子は作動可能に連結されない（それらの同士の距離が重要すぎるせいで）。
【００４１】
発明者らは、「作動可能に連結された」の考えがプロモーターの種類に存在することを示した。
【００４２】
特定の実施形態において、本発明は、相同組み換えにより注目する核酸フラグメントを統合する形質転換酵母細胞を選択する方法に関し、
ネガティブ選択遺伝子は、強力プロモーター、好ましくはＧＰＤプロモーター、の制御下にあり、
本発明の注目する核酸フラグメントの相同組み換えによる挿入は、少なくとも２０００ｐｂ、特に少なくとも３０００ｐｂ、より具体的には少なくとも４０００ｐｂ、好ましくは少なくとも５０００ｐｂによりプロモーターからネガティブ選択遺伝子を分離する。
【００４３】
特定の実施形態において、本発明は、当該相同組み換えによるベクターにおいて注目の核酸フラグメントをすでに統合している形質転換酵母細胞の選択方法に関し、
ネガティブ選択遺伝子は、誘導性プロモーター（非誘導性の媒体中に漏れる）、好ましくはＧＡＬ−１プロモーターの制御下にあり、および
本発明の注目する核酸フラグメントの相同組み換えによる挿入は、そのプロモーターから、少なくとも１２０ｐｂ、特に少なくとも１５０ｐｂ、より具体的には少なくとも１８８ｐｂ、ネガティブ選択遺伝子を分離する。
【００４４】
特定の実施形態において、本発明は、相同組み換えにより注目する核酸フラグメントを統合する形質転換酵母細胞を選択する方法に関し、
ネガティブ選択遺伝子は、中間体プロモーター、好ましくはＡＤＨ１プロモーターの制御下にあり、および
本発明の注目する核酸フラグメントの相同組み換えによる挿入は、少なくとも１２０ｐｂ、特に少なくとも１５０ｐｂ、より具体的には少なくとも１６９ｐｂにより中間体プロモーターからネガティブ選択遺伝子を分離する。
【００４５】
本発明の一実施形態において、工程（ｉｉｉ）および（ｉｖ）の両方の選択は同時または分離して、好ましくは同時に実現されるかもしれない。
【００４６】
用語「相同組み換えサイト」は、相同組み換えにより、ベクターまたはシャトルベクターに注目する核酸フラグメントの導入を可能とするサイトを言及する。相同組み換えは、要するに、相同配列（すなわち、相補鎖のセット）の調製を自然発生的に生じうる鎖交換のプロセスである。技術分野で公知であるように、酵母は、相同組み換えで効果的である。Ｏｒｒ−  Ｗｅａｖｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９８１年、第７８巻：６３４５−６３５８頁；Ｍａ，ら、Ｇｅｎｅ、１９８７年、第５８巻：２０１−２１６；Ｐｅｔｅｒｍａｎｎ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１９９８年、第２６巻（９）：２２５２−２２５３頁（それぞれ、参照により本願明細書に援用したものとする）。相同組み換えを可能とする方法および条件は、技術分野で周知である。
【００４７】
したがって、一般に、相同組み換えサイトは、２つの異なった、一般的に連続的な領域を含有している。第一の領域（本願明細書において５’領域と称される）は、一般的に、注目する核酸フラグメントの側面に位置する５’領域と全く一致しており、ベクターに挿入される。第二の領域（本願明細書において３’領域と称される）は、一般的に、注目する核酸フラグメントの側面に位置する３’領域と全く一致しており、ベクターに挿入される。好ましくは、５’位および３’位の領域は、それぞれ１２個または１５個の核酸長さである。より好ましくは、５’位および３’位の領域は、それぞれ約２０個または３０個の核酸長さであり、より好ましくは少なくとも約５０個の核酸長さ、および最も好ましくは約６０個の核酸長さである。本発明において、相同組み換えサイトの配列は、ベクターが相同組み換えサイトの配列に対応する別の配列を含まないベクターに独特である任意の核酸配列および注目する核酸フラグメントを挿入する側面の領域と一致する核酸配列を言及する。
【００４８】
５’位および３’位の両方の相同組み換え領域の例は、実施例に示されている（それぞれ配列番号６および配列番号７または、それぞれ配列番号１６および配列番号１７）。
【００４９】
本願明細書で使用する場合、用語「注目する核酸フラグメント」は、相同組み換えサイトでベクターに挿入する任意の核酸を言及する。
【００５０】
本発明において、注目する核酸フラグメントは、本願明細書に提示されるベクターの相同組み換えサイトの５’位および３’位の領域と一致している（または実質的に一致している）。５’位および３’位の領域と隣接している。したがって、注目する核酸フラグメントがベクターに挿入されたとき、注目する核酸フラグメントを側面にする５’位および３’位の領域は、相同組み換えの間、相同組み換えサイトの５’位および３’位の領域を置換する。
【００５１】
本願明細書で使用する場合、実質的な同一性は、挿入するＤＮＡフラグメントのベースと組み換え領域の約８０％、特に９０％、好ましくは９５％、より好ましくは９９％の同一性であるだろう。
【００５２】
本発明において、上記注目する核酸フラグメントは、タンパク質を製造するためにコードするまたはしない任意のＤＮＡ配列であってよい。例えば、当該フラグメントは、任意の外部または酵母タンパク質をコードする遺伝子でありまたは非コード核酸配列であってよい、好ましくは当該フラグメントは、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２逆転写酵素遺伝子配列、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２プロテアーゼ遺伝子配列、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２インテグラーゼ遺伝子配列、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２  ｇａｇ−ｐｏｌ前駆体遺伝子の全体または部分配列を含む群から選択される。
【００５３】
本発明の一実施形態において、相同組み換えによる注目する核酸フラグメントをすでに統合した形質転換酵母細胞において、方法は、注目する核酸フラグメントの合成のさらなる事前工程を含み、フラグメントは、ステップ（ｉ）のベクター上の相同組み換えサイトの５’位および３’位の領域と実質的に同一である配列に隣接するものを研究または製造する核酸配列を含む。
【００５４】
本願明細書で使用する場合、用語「制限部位」、または「制限認識部位」は、制限酵素により認識されているヌクレオチドの特定の配列を含有するＤＮＡ分子状に位置している。特定の制限酵素は、その認識部位または近くの部位の２つのヌクレオチド間の配列を切断するかもしれない。本発明において、制限部位は、本発明のベクターについて独特であり、ベクターは当該制限部位に対応する別の配列を含まない。任意の制限部位は、用いられるかもしれず、制限部位の例は、これらに限定されないが、ＮｏｔＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ、ＥｃｏＲＩ、ＮｃｏＩ、Ｓａｃｌ、Ｓａｉｌ、ＳｍａＩ、ＰｖｕＩＩ、ＳｃａＩを含む。本発明の制限部位は、本発明のベクターを相同組み換えのために線形化を可能とする。実際、相同組み換えは、シングルカットされた脱リン酸ベクターによって行われる。
【００５５】
（カセットおよび本発明のベクター）
本発明の第二の目的は、
制限部位を構成する５’位および３’位の組み換え領域を含む相同組み換えサイト、ならびに
当該相同組み換えサイトの下流に存在するネガティブ選択遺伝子を含むカセット、に関する。
【００５６】
本発明において、上記カセットは、ベクター、好ましくはプラスミドに挿入されるために用いられ、カセットのネガティブ選択遺伝子（当該カセットの上記相同組み換えサイト  の下流にある）を、ベクター、上記プロモーター、得られたベクター中に作動可能に連結された上記ネガティブ選択遺伝子のプロモーターの制御下に置くため、ポジティブ遺伝子の選択性およびプロモーターを含む。
【００５７】
得られたベクター（例えば、上記カセットが正確に挿入されているプラスミド）は、本発明の方法を行うために用いられる。
【００５８】
本発明において、ベクターは、複製起点を含み、ポジティブ選択遺伝子は、プロモーターの制御下にある。本発明の選択遺伝子のそれぞれは、ターミネータの制御下にもある。
【００５９】
本願明細書で使用する場合、用語「ターミネータ」または「転写ターミネータ」は、遺伝子の末端、または転写用のゲノムＤＮＡ上のオペロンをマークする核酸配列の領域である。ＡＤＨ１ターミネータ、ＳＴＥ２ターミネータ、ＣｙｃＥ１のような酵母細胞において機能的であるターミネータは技術分野で周知である。
【００６０】
本発明の第３の目的は、
複製起点、
ポジティブ選択がプロモーターの制御下にある、ポジティブ選択遺伝子、
制限部位を構成する５’位および３’位の組み換え領域を含む相同組み換えサイト、ならびに
相同組み換えサイトの下流にあるベクター中かつ上記相同組み換えサイトの上流に位置するプロモーターの制御下に存在し、プロモーターおよびネガティブ選択遺伝子は、注目のＤＮＡフラグメントの挿入前に上記ベクター中で作動可能に連結され、かつターミネータの制御下にあるネガティブ選択遺伝子、
を含むベクターに関する。
【００６１】
本発明において、ポジティブ選択遺伝子およびネガティブ選択遺伝子は、それぞれプロモーターとターミネータとの制御下にある。
【００６２】
本発明の一実施形態において、上記ベクターは、シャトルベクター（例えば、酵母および細菌細胞（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ（エシェリキア）大腸菌）の両方において増殖しうるように構成されているベクター）である。
【００６３】
したがって、本発明の特定の実施形態において、上記ベクターは、細菌性複製起点および細菌性ポジティブ遺伝子の選択（例えば、アンピシリン耐性遺伝子）をさらに含む。
【００６４】
本発明において、上記ベクターは、上記細胞に相同組み換えにより注目する核酸フラグメントを挿入するため、そして上記の選択方法により、発現ベクターの上記注目する核酸フラグメントを実際にかくまう形質転換酵母細胞を選択するために酵母細胞を形質転換するために用いられてもよい。
【００６５】
一実施形態において、本発明は、本発明のベクターを得るための方法に関し、当該方法は、
制限部位を構成する５’位および３’位の組み換え領域を含む相同組み換えサイトと、
当該相同組み換えサイトの下流のネガティブ選択遺伝子と、を含むカセットを
ポジティブ選択遺伝子およびプロモーターを含むベクターに統合し、
当該カセットの相同組み換えサイトの下流にある上記ネガティブ選択遺伝子を、上記ベクター中に存在する上記プロモーターの制御下に配置し、上記プロモーターおよび上記ネガティブ選択遺伝子は得られたベクター中に作動可能に連結されている。
【００６６】
カセットおよび本発明のベクターは、より詳細に上記されている。
【００６７】
（本発明のキット）
本発明の第４の目的は、本発明の方法を行うためのキットに関する
【００６８】
一実施形態において、本発明は、
本発明のカセット、
少なくとも一つの酵母細胞培地、
を含むキットに関する。
【００６９】
本発明において、上記キットは、上記カセットをベクターに挿入するためおよび酵母細胞を上記ベクターと注目する核酸フラグメントとを本発明の方法を行うために形質転換するために用いられる。
【００７０】
上記ベクターは、ポジティブ選択遺伝子およびプロモーターを含む任意の機能的なベクターであってよい。
【００７１】
特定の実施形態において、上記キットは、
本発明のベクター中に存在するネガティブ選択遺伝子および／またはポジティブ選択遺伝子による選択を可能とする選択的な媒体または化合物をさらに含んでもよい。
【００７２】
別の特定の実施形態において、上記キットは、
５’位および３’位の相同組み換え領域と同一または実質的に同一の核酸フラグメント配列、をさらに含んでもよい。
【００７３】
一実施形態において、本発明は、
上で定義されたとおりの本発明に係るベクター、および
少なくとも一つの酵母細胞培地、
を含むキットに関する。
【００７４】
特定の実施形態において、上記キットは、
本発明のベクター中に存在するネガティブ選択遺伝子および／またはポジティブ選択遺伝子による選択を可能とする選択的な媒体または化合物、をさらに含んでもよい。
【００７５】
別の特定の実施形態において、上記キットは、
５’位および３’位の相同組み換え領域と同一または実質的に同一の核酸フラグメント配列、をさらに含んでもよい。
【００７６】
別の実施形態において、本発明のキットは、酵母細胞、好ましくはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ酵母細胞をさらに含む。
【００７７】
本願明細書で使用する場合、用語「キット」は、物質を含むための任意の送達システムを言及する。反応分析との関連で、送達システムなどは、反応試薬（例えば、適当な容器におけるオリゴヌクレオチド、酵素など）の貯蔵、輸送、または配達を可能とするシステム、および／または、別の一つの場所からの支持材（例えば、バッファー、分析を行うための記載されている装置）を包含する。例えば、キットは、対応する反応試薬および／または支持材を含有する１以上の封入物（例えば、箱）を包含する。本願明細書で使用する場合、用語「断片化されたキット」は、全キットの補助成分をそれぞれ含有する２以上の独立した容器を含む送達システムを言及する。容器は、意図する受容体に共にまたは独立に含まれてよい。例えば、第一容器は、分析において使用するための酵素を含有してよく、第二容器はオリゴヌクレオチドを含有する。用語「断片化されたキット」は、限定されないが、連邦食品・医薬品・化粧品法のセクション５２０（ｅ）で定義されている分析物特異的試薬（ＡＳＲ’ｓ）を含有するキットを包含することを意図する。実際、各容器がそれぞれ全キットの補助成分を含有する２以上の独立した容器を含む任意の送達システムは、用語「断片化されキット」に包含される。対照的に、「結合キット」は、単一の容器における反応分析の全成分を含有する送達システムを言及する。用語「キット」は、断片化されたキットと結合キットとの両方を包含する。
【００７８】
現在のキットも、現在の方法を直ちに容易に実施するため、試薬、緩衝液、ハイブリダイゼーション培地、核酸、プライマー、ヌクレオチド、プローブ、分子量マーカー、酵素、固体支持体、データベース、分散様式を計算するためのコンピュータープログラムおよび／または使い捨て実験室装置（マルチウェルプレートなど）を１以上包含しうる。現在のキットに包含されうる酵素は、ヌクレオチドポリメラーゼなどを包含する。固体支持体は、  ビーズなどを包含しうるが、分子量マーカーはコンジュゲーブル（ｃｏｎｊｕｇａｂｌｅ）マーカー（例えば、ビオチンおよびストレプトアビジンなど）を包含しうる。
【００７９】
一実施形態において、キットは、本願明細書に記載される方法を行う装置から生成される。装置は、有形的表現媒体（紙上に印刷された、コンピューター可読媒体など）を通して理解できる形態に提供されうる。
【実施例】
【００８０】
以下の実施例は、本発明を成しおよび実施するいくつかの好ましい形態を開示する。しかしながら、実施例は、例示目的だけであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【００８１】
実施例１：変性ｐＲＳ発現ベクターの下流のＧＡＬプロモーター領域への「自滅的なカセット」の挿入
プライマー５ＳａｃＵｒａ（配列番号８）および３ＵｒａＳａｃ（配列番号９）を用いるＰＣＲにより増幅されたＵＲＡ３のためのコード領域は、３７℃で１時間ＳａｃＩにより消費され、ＳａｃＩによっても消費されるｐＲＳベクターの変性バージョンにＧＡＬ１プロモータの制御下クローンされる。新しく作製されたカセット、ＧＡＬ１プロモーターの下流に位置し、以下の配列を含有する。
ＲＨｌ５’（配列番号６）
固有のＸｈｏＩ制限酵素サイト
ＲＨｌ３’（配列番号７）
ＵＲＡ３  ＯＲＦ
【００８２】
この構造において、ＵＲＡ３遺伝子の開始コドンは、ＧＡＬ１プロモーターの下流末端に配置された８８ｂｐである。この新しく作製された発現ベクターのｖｓ３ｇａｌ−ＲＨにおいて、ＧＡＬ１プロモーターとＵＲＡ３  ＯＲＦの開始コドンとの距離は、ｐＲＳ    骨格のＨＩＳ３バージョンにおけるこのプロモーターの「リークしやすい」特徴に起因して、グルコース培地においてさえ、ＵＲＡ３発現をもたらす（表１）。
【００８３】
【表１】
0005973563.tif 000002
【００８４】
この新しく製造されるベクターは、ＸｈｏＩを伴ったシングルカットであり、精製され、ＲＨｌ−５’配列およびＲＨｌ−３’配列の５’位および３’位の末端で存在するＨＩＶ−Ｉプロテアーゼの配列を増幅させた配列ＰＣＲと混合され、Ｗ３０３酵母株を形質転換するために用いられる。
【００８５】
形質転換体は、ヒスチジンおよび５−ＦＯＡを欠乏する最少培地において２４時間３０℃で１ｍｇ／ｍＬの最終濃度に増殖し、その後ヒスチジンを欠乏する最少培地中４８時間残される。細胞は、滅菌水中３回洗浄され、そして、培地を含有するガラクトース中、ＨＩＶ−１プロテアーゼの発現を試験した。
【００８６】
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（サッカロマイセス・セレビシエ）中のＨＩＶ−１プロテアーゼの発現が細胞死を誘導することは以前報告されている。図２は、ＰＣＲ増幅されたウイルスプロテアーゼ遺伝子を伴ったまたは伴っていない線形のｖｓ３ｇａｌ−ＲＨベクターを用いて形質転換されたＷ３０３の細胞増殖を示す。示された結果の分析は、作製されたＤＮＡカセットは実際選択において、５−ＦＯＡインキュベーションを通して、ＤＮＡフラグメントがベクターに挿入されているクローンのみ選択するのに実際効率的である（図２）ことを明確に示す。
【００８７】
ＵＲＡ３開始コドンがＧＡＬ１プロモーター（任意のＤＮＡフラグメントの不存在下での８８ｂｐの長さプラス挿入されたフラグメントの存在下での１００ｂｐの長さ）の下流末端に約１８８ｂｐ以下の距離で配置されたとき、作製されたカセットの「自殺特性（ｓｕｉｃｉｄｅ  ｃｈａｒａｃｔｅｒ）」は、効果的であることを、ｖｓ３ｇａｌ−ＲＨベクターでなされた実験は示している。
【００８８】
【表２】
0005973563.tif 000003
【００８９】
１００ｂｐ長さのＤＮＡフラグメントの挿入は、ｖｓ３ｇａｌ−ＲＨベクターの５−ＦＯＡ致死率を抑制する。Ｗ３０３酵母株は、線形化され、かつ脱リン酸化されたｖｓ３ｇａｌ−ＲＨベクターおよびベクターの相同組み換えサイトの５’および３’組み換え領域に同一の領域に隣接するＤＮＡフラグメントを用いて形質転換された。得られた形質転換体は、二日間５−ＦＯＡの存在下または不存在下の異なる選択的な媒体における増殖のため試験された。少なくとも１００ｐｂ長さのＤＮＡフラグメントを含むプラスミドは５−ＦＯＡ耐性を与える。
【００９０】
実施例２：ｐ４１５ＡＤＨ１発現ベクターのＡＤＨ１プロモーター領域の下流への「自滅的なカセット」の挿入
【００９１】
ｐ４１５ＡＤＨベクター（Ｍｕｍｂｅｒｇ，Ｄ．，Ｍｕｌｌｅｒ，Ｒ，Ｆｕｎｋ，Ｍ．Ｇｅｎｅ．１９９５年、第１５６巻：１１９−１２２頁．Ｙｅａｓｔ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄｓ（異なる遺伝的背景において異種のタンパク質の制御された発現用の酵母ベクター））を、そのマルチクローニングサイトに配置されている制限酵素ＸｈｏＩを用いて切断し、そしてＵＲＡ３遺伝子のＯＲＦ領域をその位置に挿入した。本発明の目的のカセットは、以下の配列：
５’位の相同組み換え領域ＲＨ５ｐ４ｘｘ（配列番号１６），
独特の制限酵素サイト，
３’位の相同組み換え領域ＲＨ３ｐ４ｘｘ（配列番号１７），
ＵＲＡ３  ＯＲＦ
を包含する。
【００９２】
このカセットにおいて、ＵＲＡ３遺伝子の開始コドンは、ＡＤＨ１プロモーターの末端の６９ｂｐの下流に位置している。ＵＲＡ−酵母細胞はこのベクター（ｖｓ５ＡＤＨ−ＲＨ）を用いて形質転換され、ＵＲＡ３遺伝子はウラシルを欠乏する最少合成培地で増殖した形質転換体として発現する。
【００９３】
我々は、約６７０ｂｐのＴＲＰ１遺伝子のＯＲＦ領域をサブクローニングすることにより、得られた発現ベクターの「自殺特性」を試験した。下流のＡＤＨ１プロモーターおよび上流のＵＲＡ３遺伝子は以下のとおりである：
栄養要求性マーカーＴＲＰ１のためのコード領域は、プライマー（配列番号１０および配列番号ｌ１）を用いるＰＣＲにより増殖された。
【００９４】
新たな選択性マーカーを含むフラグメントは、その後、ＣＢ０１８またはＷ３０３酵母株における相同組み換えによりｖｓ５ＡＤＨ−ＲＨベクター（制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（ヒンディースリー）により線形化した）に組み込まれている。
【００９５】
ＵＲＡ−、ＴＲＰ−酵母細胞がこのプラスミドを用いて形質転換されるとき、ＵＲＡ３遺伝子は、その形質転換体はウラシルを欠乏している最少合成培地において増殖しないので発現されなかったが、ＴＲＰ１遺伝子は発現し、その形質転換体は、トリプトファンを欠乏している最少合成培地において増殖した。
【００９６】
ＵＲＡ３遺伝子ではなく、新たなプラスミドの発現されたＴＲＰ１を含み、ＡＤＨ１プロモーターの３’位の末端から６７５ｂｐの距離はＵＲＡ３遺伝子は発現されないようにすることを暗に示す（表３）。
【００９７】
ＵＲＡ３開始コドンがＡＤＨ１プロモーターの末端の約１６９ｂｐ下流のより小さい距離にあるとき、ｖｓ５ＡＤＨ−ＲＨベクター上で行われる実験は作製された新しいカセットの「自殺特性」は効果的であることを示している。
【００９８】
【表３】
0005973563.tif 000004
【００９９】
表３．１００ｂｐ長さのＤＮＡフラグメントの挿入はｖｓ５ＡＤＨ−ＲＨベクターの５−ＦＯＡ致死率を抑制する。Ｗ３０３酵母株を、直線化し、かつ脱リン酸化したｖｓＳＡＤＨ−ＲＨベクターと形質転換し、ＤＮＡフラグメントはベクターの相同組み換えサイトの５’位および３’位の組み換え領域に一致している領域に隣接する。ＤＮＡフラグメントはＴＲＰ１遺伝子の全長ＯＲＦであり、またはそのＯＲＦのより小さいフラグメントであった。得られた形質転換体を、２日間、５−ＦＯＡの存在下または不存在下で、異なる選択媒体中での増殖を試験し。少なくとも１００ｐｂ長さのＤＮＡフラグメントを含むプラスミドは５−ＦＯＡ耐性を与えた。
【０１００】
実施例３：ｐ４２４ＧＰＤ発現ベクターのＧＰＤプロモーター領域の下流に実施例２で作製された「自滅的なカセット」の挿入
【０１０１】
実施例２で作製された「自滅的なカセット」は、制限酵素ＳａｃｌおよびＫｐｎｌを用いて、ｖｓ５ＡＤＨ−ＲＨベクターから切除された。純粋なＳａｃｌ−Ｋｐｎｌ    カセットは、同じ酵素で前もって切断してｖｓ４ＧＰＤ−ＲＨベクターになるｐ４２４ＧＰＤベクターに挿入された（Ｍｕｍｂｅｒｇ，Ｄ．，Ｍｕｌｌｅｒ，Ｒ，Ｆｕｎｋ，Ｍ．、Ｇｅｎｅ．、１９９５年、第１５６巻：１１９−１２２頁．Ｙｅａｓｔ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄｓ（異なる遺伝的背景にある異種タンパク質の制御される発現のための酵母ベクター））。
【０１０２】
ＵＲＡ−酵母細胞は、このベクター（ｖｓ４ＧＰＤ−ＲＨ）と形質転換されるとき、形質転換体はウラシルを欠乏する最少合成培地上で増殖するので、ＵＲＡ３遺伝子が発現される。
【０１０３】
我々は、下流のＧＰＤプロモーターおよび上流のＵＲＡ３遺伝子の約６６０ｂｐのＨＩＳ３遺伝子のＯＲＦ領域を、以下のとおりにサブクローニングすることにより得られる発現ベクターの「自殺特性」を試験した：栄養要求性のマーカーＨＩＳ３のコード領域はプライマー（配列番号１２および配列番号１３）用いてＰＣＲにより増幅された。
【０１０４】
新たな選択可能なマーカーを含むフラグメントは、その後、Ｗ３０３酵母株中の相同組み換えにより、（制限酵素ＥｃｏＲＩにより線形化した）ｖｓ４ＧＰＤ−ＲＨベクターに組み込まれた。
【０１０５】
ＵＲＡ−、ＨＩＳ−酵母細胞がこのプラスミドで形質転換されたとき、形質転換体がウラシルおよびヒスチジンを欠乏する最少合成培地において増殖するので、ＵＲＡ３およびＨＩＳ３遺伝子は発現する。
【０１０６】
その後、我々は、下流のＧＰＤプロモーターおよび上流のＵＲＡ３遺伝子の約１０９５ｂｐのＬＥＵ２遺伝子のＯＲＦ領域を、以下のとおりにサブクローニングすることにより、得られる発現ベクターの「自殺特性」を試験した：
栄養要求性のマーカーＬＥＵ２のコード領域をプライマー（配列番号１４および配列番号１５）を用いるＰＣＲにより増幅した。
【０１０７】
新たな選択可能なマーカーを含むフラグメントは、その後、ＣＢ０１８またはＷ３０３酵母株における相同組み換えによりｖｓ４ＧＰＤ−ＲＨベクター（制限酵素ＥｃｏＲＩにより線形化されている）に組み込んだ。
【０１０８】
ＵＲＡ−、ＬＥＵ−酵母細胞を、このプラスミドを用いて形質転換したとき、ＵＲＡ３およびＬＥＵ２遺伝子の形質転換体は、ウラシルおよびロイシンを欠乏する最少合成培地上で増殖するので、ＵＲＡ３およびＬＥＵ２遺伝子は発現する。
【図１】
0005973563.tif 000005
【図２】
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【配列表】
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