(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式
【化１】
0005916227.tif 000004
［式中、ＲはＦ，Ｃｌ及びＢｒの中から独立して選択され、ｎ＝４または５であり、Ｒ’はＣＯＯＨ，ＣＯＮＨ２，ＳＯ３Ｈ及びＣＯＯＲ”の中から選択され、Ｒ”＝Ｃ１-Ｃ５アルキル基である］
で表されるハロゲン化シアノケイ皮酸誘導体の、検体のＭＡＬＤＩ質量分析のためのマトリックスにおける使用。
【請求項２】
前記マトリックスが負イオンのＭＡＬＤＩ質量分析に用いられることを特徴とする請求項１記載の使用。
【請求項３】
ｎ＝５であることを特徴とする請求項１または２記載の使用。
【請求項４】
ＭＡＬＤＩ質量分析のための前記マトリックスが、α-シアノ-２,３,４,５,６-ペンタフロロケイ皮酸であることを特徴とする請求項１記載の使用。
【請求項５】
前記検体が、タンパク質、ペプチド、縮合核酸、脂質、ホスホリル化合物、糖質、医薬物質、代謝産物、合成及び天然の(コ)ポリマー及び無機化合物の中から選択されることを特徴とする請求項１から４いずれか１項記載の使用。
【請求項６】
前記マトリックスが前記検体と混合されることを特徴とする請求項１から５いずれか１項記載の使用。
【請求項７】
マトリックスに対する検体のモル混合比が１：１００から１：１０００００００００までであることを特徴とする請求項６記載の使用。
【請求項８】
請求項１記載のハロゲン化シアノケイ皮酸誘導体の内の少なくとも１つと、少なくとも１つの他のマトリックス材料との混合物が用いられることを特徴とする、請求項１から７いずれか１項記載の使用。
【請求項９】
前記他のマトリックス材料が、α-シアノ-４-ヒドロキシケイ皮酸、α-シアノ-２,４-ジフロロケイ皮酸、２,５-ジヒドロキシ安息香酸、シナピン酸、フェルラ酸、２-アザ-５-チオチミン、３-ヒドロキシピコリン酸及び４-クロロ-α-シアノケイ皮酸の中から選択されることを特徴とする請求項８記載の使用。
【請求項１０】
前記マトリックスが不活性フィラーと混合されることを特徴とする請求項１から９いずれか１項記載の使用。
【請求項１１】
前記マトリックスがイオン性液体として利用できることを特徴とする請求項１から１０いずれか１項記載の使用。
【請求項１２】
一般式
【化２】
0005916227.tif 000005
［式中、ＲはＦ，Ｃｌ及びＢｒの中から独立して選択され、ｎ＝４または５であり、Ｒ’はＣＯＯＨ，ＣＯＮＨ２，ＳＯ３Ｈ及びＣＯＯＲ”の中から選択され、Ｒ”＝Ｃ１-Ｃ５アルキル基である］
で表されるハロゲン化シアノケイ皮酸誘導体を含む、検体のＭＡＬＤＩ質量分析のためのマトリックス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は検体のＭＡＬＤＩ質量分析におけるマトリックスとしてのシアノケイ皮酸のハロゲン化誘導体の使用に関し、またそのようなマトリックスにも関する。
【背景技術】
【０００２】
ＭＡＬＤＩ(マトリックス支援レーザ脱離／イオン化)は、１９８０年代初期に開発された、様々な分子類のイオン化のための技術である。この方法は、分析されるべき検体の、共結晶化を用いる有機マトリックスへの導入に基づく。続く、レーザによる共結晶化試料の照射がマトリックスの吸収を介するエネルギーの入力をおこさせ、分析に必要な気相内の個々の分子の脱離及び分子凝集のために、また対応する単分子種への分子のフラグメンテーションのためにも、はたらく。さらに、レーザエネルギーがマトリックス及び検体の(光)イオン化をおこさせ、そのようにすることで、形成されたイオンを電磁場内で加速して質量及び電荷に依存する飛行時間を測定することによるそれぞれのイオンの分離検出を可能にする。マトリックスの圧倒的多数の分子の内に検体を導入することで検体の過大なフラグメンテーションが防止され、よってＭＡＬＤＩ法は、医薬物質、代謝産物またはペプチドのような小分子の検出に適するだけでなく、損なわれていない、タンパク質、オリゴヌクレオチドのような、大きく、熱的に不安定な生体分子の検出にも、あるいはまた、例えば合成ポリマーまたは巨大分子無機化合物の検出にも、特に良く適する。
【０００３】
ほとんどの場合、用いられる(ほとんどがＵＶレーザまたはＩＲレーザの)レーザ波長において十分に強い吸収能力を有する小有機分子がマトリックスとして用いられる。さらに、様々な他のマトリックス要件、例えば、マトリックスとの共結晶化を用いる検体のマトリックスへの十分な導入、マトリックス内の検体の分離、真空内安定性、検体適合溶剤内溶解可能性及び高検体感度が満たされなければならない。一般的なマトリックスは不安定陽子をカルボン酸または酸性水酸基として有する。最もよく知られたマトリックス化合物は、普通に用いられるα−シアノ-４-ヒドロキシケイ皮酸(ＣＩＣＡまたはＨＣＣＡ)である。ＭＡＬＤＩ-ＭＳに用いられる他のマトリックスは、例えば、４-クロロ-α-シアノケイ皮酸(ＣｌＣＣＡ)、シナピン酸(４-ヒドロキシ-３,５-ジメトキシケイ皮酸)、または２,５-ジヒドロキシ安息香酸(２,５-ＤＨＢ)である。それぞれの特定の構造にかかわらず、これらのマトリックスは実際上、特にタンパク質及び脂質のような生体巨大分子を含み、医薬物質、植物代謝物質等のような有機及び無機の検体も含む、とりわけて、大きい化合物及び小さい化合物も不揮発性化合物及び熱的に不安定な化合物も含む、ＭＡＬＤＩ-ＭＳによって分析することができる全ての物質に対して用いることができる。分析の現在の焦点はペプチドの分析にある。
【０００４】
ＭＡＬＤＩ質量分析におけるマトリックスとしての水酸基またはメトキシル基で置換したケイ皮酸の使用は、非特許文献１によって知られている。対応するα-ケイ皮酸の使用は特許文献１から得られる。特許文献２及び３は、α-シアノ-４-ヒドロキシケイ皮酸または３,５-ジメトキシ-４-ヒドロキシケイ皮酸の使用を説明している。ハロゲン化-α-シアノケイ皮酸の使用が特許文献４に説明され、ＭＡＬＤＩマトリックスとしてのＣｌＣＣＡの使用は非特許文献２によって知られている。さらに、特許文献５及び６は、α-シアノ-４-ヒドロキシケイ皮酸の検体結合誘導体またはポリマー結合誘導体に基づくＭＡＬＤＩマトリックスを開示している。
【０００５】
負イオンモードにおける脱離検体の高感度検出により質量スペクトル分析に対する様々な利点を得ることができる。例えば、正イオンモード及び負イオンモードの相補的測定により、例えば検体の酸性度のような、検体特性に関する追加情報が利用できるようになり、正イオンモードでは検出できない追加信号を用いることにより、例えばペプチド及びタンパク質の、高められたシーケンスカバレッジを達成することができ、あるいは負に荷電した検体フラグメントの分析により、フラグメント化過程における追加の構造情報を得ることができる。さらに、失われた塩基及び／または易脱プロトン化可能官能基の存在により、例えば、ホスホチロシン含有検体(非特許文献３)、硫酸化検体(非特許文献４)、小さな塩基性ジクロロアミン頭基を含む塩素酸化脂質(非特許文献５)または強酸ペプチド(非特許文献６)のような、様々な検体類のプロトン化だけを困難にすることができる。これには正イオンモードにおける感度低下がともない、また上述した追加情報に対する可能性に関して負イオンモードに対する高感度マトリックスが必要になる。
【０００６】
これまで知られていたマトリックス化合物は、ほとんど排他的に、正に荷電したイオンの検出だけに適している。改善及び合理的アプローチのいずれもほとんどがこの極性における感度の最適化を目標にしている。したがって、分析目的にはほぼ圧倒的に正イオンモードが用いられる。対応する正イオン測定値に比較して、負イオンモードでの測定は検体信号強度の数桁に及ぶ減少を示すことが多く、したがって科学文献には散発的にしか見られない。負イオンモードにおける感度向上に関する数少ない既知のアプローチは、試料作成条件の変化及び／または、例えば、分解能を極端に下げることによって感度の向上が達成される(非特許文献７)、線形モードでの測定のような、デバイスパラメータの変化にほとんど限られている。
【０００７】
正に荷電したイオン及び負に荷電したイオンの検出及び検証感度に対するＭＡＬＤＩ質量分析の達成可能な感度は今のところ不十分であり、さらなる改善が必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許出願公開２００２/０１２２９８２Ａ１号明細書
【特許文献２】独国特許発明第１０１５８８９０Ａ１号明細書
【特許文献３】独国特許発明第１０３２２７０１Ａ１号明細書
【特許文献４】独国特許第１０２００７０４０２５１Ａ１号明細書
【特許文献５】米国特許出願公開２００６/００４０３３４Ａ１号明細書
【特許文献６】国際公開第２００６/１２４００３Ａ１号パンフレット
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】アール・シー・ビーヴィス(R. C. Bravis)及びビー・ティー・チェイト(B. T. Chait)，「タンパク質の紫外レーザ脱離質量分析のためのケイ皮酸誘導体(Cinnamic Acid Derivatives as Matrices for Ultraviolet Laser Desorption Mass Spectrometry of Proteins)」，Rapid Communication in Mass Spectrometry，１９８６年，第３巻，第１２号，ｐ.４３２〜４３５
【非特許文献２】ジャスコーヤ(Jaskolla)等，「４-クロロ-α-シアノケイ皮酸は先進の、合理的に設計されたＭＡＬＤＩマトリックスである(4-Chloro-α-cyanocinnamic acid is an advanced designed MALDI matrix)」，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，２００８年，第１０５巻，第３４号，ｐ.１２２００〜１２２０５
【非特許文献３】ベヌヴァルド(Bonewwald)等，「ホスホリル化チロシン含有ペプチドの合成及びキャラクタリゼーションに関する研究(Study on the synthesis and characterization of peptides containing phosphorylated tyrosine)」，Journal of Peptide Research，１９９９年，第５３巻，第２号，Ｐ．１６１〜１６９
【非特許文献４】ナベタニ(Nabetani)等，「添加リン酸一アンモニウムを含む正イオンモード及び負イオンモードを用いるマトリックス支援レーザ脱離／イオン化質量分析による酸性ペプチドの分析(Analysis of acidic peptides with a matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectroscopy using positive and negative ion modes with additive monoammonium phosphate)」，Proteomics，２００６年，第６巻，ｐ.４４５６〜４４６５
【非特許文献５】ジャスコーヤ等，「新マトリックスＣｌＣＣＡがＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ ＭＳによるホスファチジルエタノールアミンクロラミンの検出を可能にする(The new matrix ClCCA allows the detection of phosphatidylethanolamine chloramines」，Journal of the American Society for Mass Spectrometry，２００９年，第２０巻．ｐ.８６７〜８７４
【非特許文献６】ジェイ・ジャイ-ヌクナン(J. Jai-nhuknan)及びシー・ジェイ・キャサディ(C.J. Cassady)，「酸性アミノ酸残渣含有ペプチドの負イオン源後壊変飛行時間質量分析(Negative ion postsource decay time-of-flight mass spectrometry of peptides containing acidic amino acid residues)」，Analytical Chemistry，１９９８年，第７０巻，第２４号，ｐ.５１２２〜５１２８
【非特許文献７】ジャネク(Janek)等，「正イオン及び負イオンマトリックス支援レーザ脱離／イオン化質量分析法によるホスホペプチド分析(Phosphopeptide analysis by positive and negative ion matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry)」，Rapid Communication in Mass spectrometry，２００１年，第１５巻，ｐ.１５９３〜１５９９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の課題は、正イオンモード及び負イオンモードの感度をかなり高めることにより様々な検体、とりわけ、調べられているペプチド類のほとんどに対する現状技術の欠点を少なくともある程度克服する化合物を、マトリックス構造の最適化によって提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題は、検体のＭＡＬＤＩ質量分析のためのマトリックスにおける、一般式が、
【化１】
0005916227.tif 000002
【００１２】
のハロゲン化シアノケイ皮酸誘導体、及び／または４-ブロモ-α-シアノケイ皮酸、及び／またはα-シアノ-２,４-ジクロロケイ皮酸の使用により、解決される。式中、ＲはＦ，Ｃｌ及びＢｒの中から独立に選ばれ、ｎ＝３，４または５である。Ｒ’はＣＯＯＨ，ＣＯＮＨ２，ＳＯ３Ｈ及びＣＯＯＲ”の中から選ばれ、Ｒ”＝Ｃ１-Ｃ５アルキル基である。
【００１３】
本発明にしたがえば、ハロゲン化シアノケイ皮酸誘導体のシス異性体及びトランス異性体のいずれをも用いることができる。ハロゲン化シアノケイ皮酸誘導体の構造異性体も用いることができる。
【００１４】
フェニル環には３つないし４つのハロゲン置換基しか利用できないから、残りのフェニル置換基は水素である。上に示した構造式は、様々なシアノケイ皮酸誘導体の、可能な全ての立体異性体(シス／トランス異性体)及び構造異性体(位置異性体)を含むべきである。したがって、例えば、フェニル環の位置２，３及び４において置換されているシアノケイ皮酸誘導体は、位置４，５及び６において同じ置換基により置換されているシアノケイ皮酸誘導体シアノケイ皮酸誘導体に相当すべきである。可能な置換基としてのＦ，Ｃｌ及びＢｒの選択は相互に完全に独立であり、それぞれのＲは別々に選ぶことができる。
【００１５】
特に好ましい実施形態において、ＲはＦ，Ｃｌ及びＢｒから選ばれ、ｎ＝５及びＲ’＝ＣＯＯＨである。好ましい化合物の例は、α-シアノ-２,３,４,５,６-ペンタフルオロケイ皮酸、α-シアノ-２,３,４,５,６-ペンタクロロケイ皮酸及びα-シアノ-２,３,４,５,６-ペンタブロモケイ皮酸である。
【００１６】
別の好ましい実施形態において、ＲはＦ，Ｃｌ及びＢｒから選ばれ、ｎ＝４及びＲ’＝ＣＯＯＨである。ここで好ましい化合物は、α-シアノ-２,３,４,５-テトラフルオロケイ皮酸、α-シアノ-２,３,４,５-テトラクロロケイ皮酸及びα-シアノ-２,３,４,５-テトラブロモケイ皮酸である。
【００１７】
さらに、シアノケイ皮酸誘導体は、好ましくは、α-シアノ-２,３,５,６-テトラフルオロケイ皮酸、α-シアノ-２,３,５,６-テトラクロロケイ皮酸及びα-シアノ-２,３,５,６-テトラブロモケイ皮酸の中から選ぶことができる。
【００１８】
さらに、α-シアノ-２,４,５,６-テトラフルオロケイ皮酸、α-シアノ-２,４,５,６-テトラクロロケイ皮酸及びα-シアノ-２,４,５,６-テトラブロモケイ皮酸の中から選ばれる、シアノケイ皮酸誘導体も好ましい。
【００１９】
好ましくは、ＲがＦ，Ｃｌ及びＢｒから選ばれ、ｎ＝３及びＲ’＝ＣＯＯＨである実施形態も提供される。好ましい化合物の例は、α-シアノ-２,３,４トリフロロケイ皮酸、α-シアノ-２,３,４トリクロロケイ皮酸、α-シアノ-２,３,４トリブロモケイ皮酸、α-シアノ-２,３,５トリフロロケイ皮酸、α-シアノ-２,３,５トリクロロケイ皮酸、α-シアノ-２,３,５トリブロモケイ皮酸、α-シアノ-２,３,６トリフロロケイ皮酸、α-シアノ-２,３,６トリクロロケイ皮酸、α-シアノ-２,３,６トリブロモケイ皮酸、α-シアノ-２,４,５トリフロロケイ皮酸、α-シアノ-２,４,５トリクロロケイ皮酸、α-シアノ-２,４,５トリブロモケイ皮酸、α-シアノ-２,４,６トリフロロケイ皮酸、α-シアノ-２,４,６トリクロロケイ皮酸、α-シアノ-２,４,６トリブロモケイ皮酸、α-シアノ-３,４,５トリフロロケイ皮酸、α-シアノ-３,４,５トリクロロケイ皮酸、及びα-シアノ-３,４,５トリブロモケイ皮酸である。
【００２０】
他にも、特に好ましく用いられるα-ケイ皮酸は、４-ブロモ-α-シアノケイ皮酸及び／またはα-シアノ-２,４-ジクロロケイ皮酸である。
【００２１】
上記のマトリックスは負イオンＭＡＬＤＩ質量分析に用いられることが好ましい。
【００２２】
ｎ＝５であることが特に好ましい。
【００２３】
一実施形態において、検体は、タンパク質、ペプチド、縮合核酸、脂質、ホスホリル化合物、糖質、医薬物質、代謝産物、合成及び天然の(コ)ポリマー、及び無機化合物の中から選ぶことができる。検体の例は、とりわけ、ホスホペプチドまたはリン脂質、デンドリマー及び縮合核酸、例えば、ＤＮＡ，ＲＮＡ，ｓｉＲＮＡ，ｍｉＲＮＡである。
【００２４】
好ましくは、マトリックスが検体と混合される実施形態も提供される。
【００２５】
マトリックスに対する検体の分子混合比は、１：１００から１：０００００００００とすることができ、１：１００００であることが好ましい。
【００２６】
上記化学式に属するハロゲン化シアノケイ皮酸誘導体の混合物も用いることができる。
【００２７】
本発明にしたがえば、上記ハロゲン化シアノケイ皮酸誘導体の内の少なくとも１つの、少なくとも１つの別のマトリックス材料との混合物が、用いるに最も好ましい。
【００２８】
好ましくは、別のマトリックス材料は、α-シアノ-４-ヒドロキシケイ皮酸、α-シアノ-２,４-ジフロロケイ皮酸、２,５-ジヒドロキシ安息香酸、シナピン酸、フェルラ酸、２-アザ-５-チオチミン、３-ヒドロキシピコリン酸、及び４-クロロ-α-ケイ皮酸の中から選ぶことができる。
【００２９】
本発明にしたがって別のマトリックス材料との混合物が用いられる場合、別のマトリックス材料は、マトリックス材料の総重量に対して、１０〜９０重量％、好ましくは２０〜５０重量％の比で用いられる。
【００３０】
別の好ましい実施形態において、マトリックス材料は不活性フィラーと混合される。
【００３１】
マトリックス材料はイオン性液体としても利用することができる。
【００３２】
さらに、本発明にしたがえば、検体のＭＡＬＤＩ質量分析のための、一般式が、
【化２】
0005916227.tif 000003
【００３３】
のハロゲン化シアノケイ皮酸誘導体を含み、及び／または４-ブロモ-α-シアノケイ皮酸及び／またはα-シアノ-２,４-ジクロロケイ皮酸を含むマトリックスも提供される。式中、ＲはＦ，Ｃｌ及びＢｒの中から独立に選ばれ、ｎ＝３，４または５であって、Ｒ’はＣＯＯＨ，ＣＯＮＨ２，ＳＯ３Ｈ及びＣＯＯＲ”の中から選ばれ、Ｒ”＝Ｃ１-Ｃ５アルキル基である。
【００３４】
好ましい実施形態において、マトリックスはイオン性液体として利用できる。イオン性液体の作成のため、マトリックスは、例えば、ピリジン、ジエチルアミンまたは３-アミノキノリンのような、プロトン化可能塩基と混合することができ、よってイオン性マトリックス溶液が形成され、この溶液は検体溶液と混合されるかまたは試験されるべき表面上のフィルムとして塗布される。
【００３５】
別の実施形態において、マトリックスは蒸気圧が低い溶剤、例えばグリセリンに溶解させることができ、次いで溶解された検体と混合するかまたは試験されるべき表面上のフィルムとして塗布される。
【００３６】
ＭＡＬＤＩ質量分析を実施するため、好ましくは、ＩＲレーザ、Ｎｄ；ＹＡＧレーザまたは窒素レーザのようなＵＶレーザを、また、可調色素レーザまたは可調光パラメトリック発振(ＯＰＯ)レーザ及び３０８ｎｍＸｅＣｌエキシマーレーザのような、中ＵＶ域または遠ＵＶ域で発光するレーザも、エネルギー入力として用いられる。
【００３７】
意外にも、ＭＡＬＤＩ質量分析におけるマトリックスへの複数のハロゲン化α-シアノケイ皮酸誘導体の使用において、正イオン及び負イオン、好ましくは負イオンに対する検出及び検出感度がかなり改善され得ることが、本発明によって確立された。誘導体の使用により、負イオンモードにおいて従来のマトリックスより明らかに高い検体信号強度及び感度が得られる。
【００３８】
好ましい実施形態にしたがうマトリックス混合物の使用により、結晶化及びマトリックス結晶への検体化合物の導入に関する特性の最適化が、また検体のさらに高効率のイオン化の達成が可能になる。
【００３９】
いずれかの与えられる理論に束縛されることは好まないが、上記利点は、電子求引性であり、軽く分極可能でもある、置換基の選択に基づき、芳香族化合物におけるハロゲン置換基の正確な位置及び数には無関係に存在すると考えられる。
【００４０】
本発明にしたがって提供されるハロゲン化α-シアノ経皮酸誘導体の使用により、以下の利点、
非常に活性な電子求引性ハロゲンの顕著なＩ効果の結果、二次イオン化過程中のマトリックスカルボアニオンの高負電荷密度の形成が抑えられ、したがってそのようなカルボアニオンの安定性が高められる、
中性マトリックス内で、電子求引性置換基がそれぞれのマトリックス-π系の負電荷密度を減少させ、よってマトリックスまたは金属基板の光イオン化中に自由になり、負に荷電もしている、電子が他の中性マトリックス分子による吸収に対する低い反発力に打ち勝たなければならず、この結果、より高い電子親和度及び捕獲確率がそれぞれ得られる、
ハロゲン置換基による誘導体形成を介して電気親和度が高くなると、反応性カルボアニオンの形成のための内部エネルギーが大きくなる、
ことが達成され得ると考えられる。
【００４１】
本発明のさらなる特徴及び利点は、添付図面に関わる、以下の好ましい実施形態の詳細な説明から得られる。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１ａ−１】図１ａ−１は、ＣＨＣＡで得られた、βカゼイントリプシン消化物の、負イオンモードで記録された質量スペクトルの一区画を示す。
【図１ａ−２】図１ａ−２は、図１ａ−１の対応する検体フラグメントに関する拡大図を示す。
【図１ｂ】図１ｂは、ＣＨＣＡとα-シアノ-２,３,４,５,６-ペンタフルオロケイ皮酸(ペンタ-ＦＣＣＡ)を１：４で混合したマトリックスを用いて得られた、βカゼイントリプシン消化物の、負イオンモードで記録された質量スペクトルの対応する区画を示す。
【図２】図２は、ＣＨＣＡを用いて、また本発明にしたがって適用されたマトリックスを含む様々な三元マトリックス系も用いて、負イオンモードで記録された６つのβカゼイントリプシン消化物フラグメントの、それぞれのｍ/ｚ比で表された、絶対信号強度の図を示す。
【図３】図３は、図２において分析された全てのペプチドの平均信号対雑音(Ｓ/Ｎ)比を、用いられたマトリックスまたはマトリックス混合物の関数として示し、Ｓ/Ｎ比はＣＨＣＡに基づいて規格化されている。
【図４】図４は、本発明にしたがって適用されたマトリックスの使用の下で負イオンモードで得られた、様々な従来のマトリックス及びマトリックス混合物のＳ/Ｎ比の図を示し、標準較正ペプチド混合物を検体として用い、表示測定値は１０回の独立した個々の測定による平均値を表す。図における均等な表示のため、個々の検体のＳ/Ｎ比は一定の係数でスケールを調節してある。
【図５】図５は、負イオンモードで得られ、様々なマトリックス及びマトリックスを用いて測定された、様々なホスホペプチドの強度の図を示し、独立な５つの測定値からの平均値が適用され、それぞれのペプチドシーケンスにしたがって横座標に与えられており、より明確にするため、いくつかのホスホペプチドの強度は全てのマトリックスに対して一定の係数によってスケールを調節してある。
【図６】図６は、様々なマトリックスまたはマトリックス混合物を用いることにより、負イオンモードで得られた様々なホスホペプチドの強度の図を示し、それぞれの平均化後に標準ＣＨＣＡで得られた信号強度を１に規格化しである。
【図７ａ】図７ａは、様々なホスホペプチドの検出のため、マトリックスとしてＣＨＣＡを用いて負イオンモードで得られた質量スペクトルを示す。
【図７ｂ】図７ｂは、様々なホスホペプチドの検出のため、マトリックスとして４-ブロモ-α-シアノケイ皮酸(ＢｒＣＣＡ)と４-クロロ-α-シアノケイ皮酸(ＣｌＣＣＡ)を２：８の比で用いて負イオンモードで得られた質量スペクトルを示す。
【図７ｃ】図７ｃは、様々なホスホペプチドの検出のため、マトリックスとしてα-シアノ-２,４-ジクロロケイ皮酸(ジＣｌＣＣＡ)とＣｌＣＣＡを１：１の比で用いて負イオンモードで得られた質量スペクトルを示す。
【図８ａ−１】図８ａ−１は正イオンモードにおける様々なペプチドのフラグメンテーションを示す。
【図８ａ−２】図８ａ−２は正イオンモードにおける様々なペプチドのフラグメンテーションを示す。
【図８ｂ−１】図８ｂ−１は正イオンモードにおける様々なペプチドのフラグメンテーションを示す。
【図８ｂ−２】図８ｂ−２は正イオンモードにおける様々なペプチドのフラグメンテーションを示す。
【図８ｃ−１】図８ｃ−１は正イオンモードにおける様々なペプチドのフラグメンテーションを示す。
【図８ｃ−２】図８ｃ−２は正イオンモードにおける様々なペプチドのフラグメンテーションを示す。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
置換α-シアノケイ皮酸誘導体の合成
本発明にしたがって用いられるハロゲン化シアノケイ皮酸誘導体は、例えば、クネベナーゲル縮合に基づく置換アルデヒドのシアノケイ皮酸(誘導体)との縮合を用いて得ることができる。これに必要な置換ベンズアルデヒドは、ペンタハロゲン誘導体の場合、対応するハロゲン化トルオール誘導体から三酸化イオウによる酸化によって得ることができる。
【００４４】
２,３,４,５,６-ペンタブロモベンズアルデヒドの選出に対する実施形態例
１０.１ｇ(０.０２モル)の２,３,４,５,６-ペンタブロモトルオールを８０ｇの三酸化イオウに溶解させ、水を抜きながら還流で２４時間フラッシする。反応終了後、余剰の三酸化イオウを減圧下で分離する。形成されたジオキソニウム成分は２００ｍｌの氷に加えることで加水分解されてアルデヒドになる。７５℃までの短時間加熱及び引き続く冷却の後、アルデヒドは濾過され、蒸留水で中性ｐＨ値にされて、乾燥される。クロロベンゼンからの再結晶化により、８.４ｇ(０．０１７モル)の２,３,４,５,６-ペンタブロモベンズアルデヒドがクリーム色のピンとして得られる。収率：理論値の８４％。
【００４５】
２,３,４,５-テトラブロモ-α-シアノケイ皮酸の選出に対する実施形態例
１５ｇの２,３,４,５-テトラブロモベンズアルデヒド(分子量＝４２１.１ｇ/モル，１当量，３.５６ミリモル)を、３０ｍｌの無水トルオール内の３１７.７ｍｇのシアノ酢酸(分子量＝８５.１ｇ/モル，１.０５当量，３.７４ミリモル)及び７.８ｍｇのピペリジニウムアセタートにより、還流で１.５時間フラッシする。水セパレータが縮合水の分離のためにはたらく。室温までの冷却後、生成物は濾過され、大量の冷水が注がれる。原生成物はメタノール／水混合物から繰返し再結晶化される。濾過抽出及び真空乾燥後、１.６５ｇのα-シアノ-２,３,４,５-テトラブロモケイ皮酸が得られる。収率：理論値の９５％。
【００４６】
α-シアノ-２,３,４,５,６-ペンタフルオロケイ皮酸の選出に対する実施形態例
１当量のシアノ酢酸(ｎ＝１２.９５ミリモル，ｍ＝１.１０ｇ)、０.９当量の２,３,４,５,６-ペンタフロロベンズアルデヒド(分子量＝１９６.０７ｇ/モル，ｎ＝１１.６６ミリモル，ｍ＝２.２８７ｇ)及び０.０１２ａｑのピペリジニウムアセタート(ｎ＝０.１５６ミリモル，ｍ＝２２.５５ｍｇ)を、十分な量のトルオール内で３時間還流でフラッシする。４０℃への冷却後、淡黄色の結晶が濾過抽出され、冷水が注がれる。メタノール／水からの再結晶化により、黄色のオイルが得られ、このオイルが分離され、冷ＨＰＬＣ水が注がれ、ここで結晶化がおこる。この結晶のメタノール内の溶解及び２倍の量の冷水を加えることによる沈殿が、生成物を結晶形態で直接に沈殿させる。収率：理論値の６２％。
【００４７】
反応終了後の冷却中に結晶化しない生成物があれば、その生成物は結晶化が始めるまで真空下で濃縮され、残渣に冷水が注がれる。例えば、生成物の溶解度が低下する温度より融点が低い、α-シアノ-２,３,４,５,６-ペンタフルオロケイ皮酸のような成分をともなうオイルアウトを防止するため、そのような場合は、透明なメタノール溶液に十分な量の冷ＨＰＬＣ水を迅速に加えることで誘導体が沈殿する。例えば、２,３,６-トリクロロ-α-シアノケイ皮酸または２,３,４,５-テトラクロロ-α-シアノケイ皮酸のような、いくつかの誘導体は、トルエンへの溶解度が小さい黄色オイルへのエネルギー入力が強すぎる場合、二量重合し、これが低温で結晶化する。これらの成分を選出するため、触媒部分を０.０３％まで増やし、反応時間を１時間に抑える。完全な転換はＤＣを用いて検査することができる。５０℃への冷却後、トルオール相はオイル上の副生成物から分離され、さらに冷却することで所望の生成物が沈殿する。再結晶化には二量重合及び収率低下もともなうから、原生成物をメタノールに迅速に溶解させ、十分な量の冷水を加えることで迅速に沈殿させる。
【００４８】
シアノ経皮酸誘導体は、ＭＡＬＤＩ質量分析に適する試料を作成するために普通に用いられる方法を提供することで、検体と混合することができる。
【００４９】
混合のための方法の例は、例えば、ドライドドロップレット(dried droplet)法である。マトリックス及び検体は次いで溶解され、(予備混合により)同時に、または順次に、いずれかの所望の表面に塗布される。検体化合物を含むマトリックスの結晶化は溶剤の蒸発によっておこる。
【００５０】
さらに、マトリックスまたはマトリックス混合物が溶解されて検体を含めずにいずれかの表面上に塗布される、表面作成法を用いることができる。マトリックス化合物の(共)結晶化は溶剤の蒸発によっておこる。検体溶液が結晶化したマトリックス上に被着され、表面に近いマトリックス層だけが溶解することにより、再結晶化中に、検体化合物が濃縮形態で含有される。
【００５１】
揮発法は表面作成法に対応するが、マトリックスが溶液から結晶化せず、揮発下で気相からの分離により表面上に被着される点が異なる。
【００５２】
最後に、マトリックス及び検体が共通の(混合)溶剤に溶解され、スプレー器具を用いる散布(エアロゾル形成)によって散布される、いわゆるエアブラシ法が可能である。大面積により溶剤の迅速な蒸発がおこり、小さなマトリックス-検体結晶が形成される。あるいは、検体を含めずにマトリックスを溶解させ、調べられるべき表面(例えば組織切片標本)上にスプレーするかまたは別の方法で塗布することができる。
【００５３】
新規な適用可能性はイオン性液体としてのマトリックスの作成である。この目的のため、マトリックス溶液が等モル量の、ピリジンまたはジエチルアミンのような、塩基と混合／撹拌され、よって、いずれかの所望の表面上に検体溶液とともに塗布することができる、液体イオン性マトリックスフィルムが形成される。
【００５４】
さらに、以下で、術語「消化物」は、酵素によりいくつかのアミノ酸位置で切断されて、多くの小さなペプチドになった、タンパク質を意味する。
【００５５】
実施した研究には、ＡＢＩ４８００ ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ/ＴＯＦ(登録商標)アナライザーを３５５ｎｍにおけるＭＳ及びＭＳ/ＭＳモードで、またＭＡＬＤＩ ＬＴＱ Ｏｒｂｉｔｒａｐ ＸＬを、３３４ｎｍのレーザ波長を用い、フーリエ変換質量分析法モードで用いた。
【００５６】
質量分析計は様々なイオンタイプ(検体イオン、マトリックスイオン)をそれぞれの質量/電荷比にしたがって分離する。すなわち、電荷＝１の場合に質量／電荷比がイオンの質量に等しいように、ＭＡＬＤＩにおけるイオンはただ一つの(正または負の)電荷を有する。スペクトルの横座標はイオンの質量/電荷比(したがって、ほとんどの場合に、質量)を与え、単位はドルトン(Ｄａ)またはｇ/モルである。
【００５７】
強い信号−スペクトルの垂直線で表され、線(信号)の高さがその信号を発生するイオン種の量と相関する−はそれぞれの質量または質量/電荷比によって個々に示される。
【００５８】
座標のスケールはそれぞれのスペクトル内の最も強い信号に基づき、最も強い信号の装置依存絶対値を与える。スペクトルに表されるその他の全ての信号は最も強い信号(左座標軸)に対して示される。右座標軸は、与えられたスペクトルまたは同じ質量分析計の他のスペクトル内の他の信号に対する比較においてのみ有意である。
【実施例】
【００５９】
実施例１
信号強度の増大
検体信号強度は、より高感度のハロゲン化マトリックスの使用により、かなり高めることができる。これは、プロテアーゼトリプシンによるタンパク質βカゼインの酵素消化物について、図１に示される。標準マトリックスのα-シアノ-４-ヒドロキシケイ皮酸(ＣＨＣＡ)を用いて検出できる最も強い信号は、検体に無関係なマトリックス自体の信号による(図１ａ上段)。ペプチド信号は拡大図(図１ａ下段)でなければ明瞭に見ることができない。最も強いフラグメントに対する絶対信号強度は４３９単位の大きさでしかない。比較して、高反応性マトリックスのα-シアノ-２,３,４,５,６-ペンタフロロケイ皮酸(ペンタＦＣＣＡ)を加えることで、感度をかなり高めた測定を行うことが可能になる(図１ｂを見よ)。この場合の最も強い検体信号の絶対信号強度は同じ検体量において９６００単位である。さらに、検体信号は低質量範囲においてマトリックス自体の信号よりも明瞭に検出可能である。
【００６０】
パラメータ：
質量分析計：ＡＢＩ４８００ ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ/ＴＯＦアナライザー，
モード：ＭＳ，
レーザ波長：３５５ｎｍ，
検体：３０％アセトニトリル／０.０１％三フッ化酢酸に溶解させた、１ピコモルのβカゼインのトリプシン消化物，
極性：負，
マトリックス：Ｃ＝２０ミリモル，Ｖ＝０.５μｌにおいて、７０％アセトニトリルに溶解させた、１０ナノモルの対応するマトリックスまたはマトリックス混合物。
【００６１】
実施例２
三元マトリックス混合物によって示される信号強度の増大
三元マトリックス系としての特許請求の範囲に定義される誘導体と２つの他の化合物の混合物も、本発明にしたがって感度を高めるために用いることができる。これは、６つのβカゼイントリプシン消化物のペプチドフラグメントの絶対信号強度に基づいて、図２に示される。この目的のために用いられたプロテアーゼトリプシンはさらに、例えばフェニルアラニンによるさらなる切断可能性による、シーケンス(Ｆ)ＬＬＹＱＥＰＶＬＧＰＶＲ(Ｇ)による(脱プロトン化された)ｍ/ｚ＝１３８１.７９Ｄａのペプチドまたはｍ/ｚ＝２２２１.１９Ｄａの(脱イオン化された)酸化ペプチド(Ｆ)ＬＱＰＥＶＭＧＶＳＫＶＫＥＡＭＡＰＫＨＫ(Ｅ)の生成を可能にする、キモトリプシン活性を示した。それぞれのペプチドの絶対強度はそれぞれのｍ/ｚ比に基づき、用いたマトリックスまたはマトリックス混合物にしたがって、表される。この図表示のため、それぞれのペプチドの信号強度には、ｍ/ｚ比に基づいて横座標に続けて印される一定の係数が乗じられている。用いたマトリックス比は対応する物質量比に相関する。
【００６２】
図２から明らかに、基準マトリックスＣＨＣＡが用いられた場合には、非常に低い信号強度しか得られないことが分かる。ＣＨＣＡとα-シアノ-２,４-ジフロロケイ皮酸(ジ-ＦＣＣＡ)と４-クロロ-α-シアノケイ皮酸(ＣｌＣＣＡ)の２：１：１の三元マトリックス混合物により、ほとんどの場合、純ＣＨＣＡマトリックスより強い信号強度が可能になる。しかし、三元マトリックスの形成に４-ブロモ-α-シアノケイ皮酸(ＢｒＣＣＡ)またはペンタ-ＦＣＣＡを使用しても明らかに検体のさらに高感度検出が可能になる。
【００６３】
高ハロゲン化α-シアノケイ皮酸またはＢｒＣＣＡの使用による検体感度の増大は、図２で分析されたペプチドの信号対雑音(Ｓ/Ｎ)比が決定され、より良い比較のため、平均値に平均され、ＣＨＣＡに規格化されている、図３にさらに明瞭に見られる。Ｓ/Ｎ比はそれぞれの信号環境において信号がスペクトルの雑音の何倍強いかを示し、したがって、例えば検出器の電子雑音によって生じる雑音レベルは信号強度だけからは読み取ることができないから、与えられた信号の品位の尺度である。図３から当然、本発明にしたがうマトリックスとしての三元混合物は明らかに、これまで用いられたマトリックスまたはマトリックス混合物より高感度である。
【００６４】
パラメータ：
質量分析計：ＡＢＩ４８００ ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ/ＴＯＦアナライザー，
モード：ＭＳ，
レーザ波長：３５５ｎｍ，
検体：３０％アセトニトリル／０.０１％三フッ化酢酸に溶解させた、１ピコモルのβカゼインのトリプシン消化物，
極性：負，
マトリックス：Ｃ＝２０ミリモル，Ｖ＝０.５μｌにおいて、７０％アセトニトリルに溶解させた、１０ナノモルの対応するマトリックスまたはマトリックス混合物。
【００６５】
実施例３
標準較正ペプチド混合物の使用の下に検体感度を高めるための別の実施例が図４に提示される。測定は、この場合も負イオンモードで、様々なマトリックス及びマトリックス混合物を用いて行い、較正混合物に含まれるペプチドのＳ/Ｎ比を測定した。標準較正混合物のペプチドを検体として用いた。２,５-ヒドロキシ安息香酸と２-ヒドロキシ-５-メトキシ安息香酸の９：１(ｎ/ｎ)混合物及び、ＣＨＣＡ，ＣｌＣＣＡ，ジ-ＦＣＣＡも、またＣＨＣＡを加えたＣｌＣＣＡとジ-ＦＣＣＡの混合物及びＣＨＣＡを加えていないＣｌＣＣＡとジ-ＦＣＣＡの混合物も、基準としてはたらいた。本発明にしたがって適用されるケイ皮酸誘導体の代表例として、ＢｒＣＣＡ，ペンタ-ＦＣＣＡ及びα-シアノ-２,３,４,５,６-ペンタブロモケイ皮酸(ペンタ-ＢｒＣＣＡ)を選択した。図４から分かるように、本発明にしたがうマトリックス混合物の適用により感度の明瞭な向上が得られる。
【００６６】
パラメータ：
質量分析計：ＡＢＩ４８００ ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ/ＴＯＦアナライザー，
モード：ＭＳ，
レーザ波長：３５５ｎｍ，
検体：３０％アセトニトリル／０.０１％三フッ化酢酸に溶解させた、０.５μモルのSequazyme Mass Standard Kit (混合：１＋２)
極性：負，
マトリックス：Ｃ＝２０ミリモル，Ｖ＝０.５μｌ、ＤＨＢＳでは、ｃ＝２０ｍｇ/ｍｌ(水溶)，Ｖ＝１μｌにおいて、７０％アセトニトリルに溶解させた、１０ナノモルの対応するマトリックスまたはマトリックス混合物。
【００６７】
実施例４
ホスホリル化ペプチドの検出強度の増強
リン酸官能基が容易に脱プロトン化可能であることにより、ホスホリル化ペプチドは正イオンモードにおいて、対応する非ホスホリル化検体よりも低いイオン化効率を示すことが多い(非特許文献７)。したがって、検体の検出に十分な感度がある限り、負イオンモードでホスホペプチドの分析を実施することが推奨される。図５は、ホスホペプチドの例の検出感度に関する、様々な従来のマトリックスの使用の比較を、また本発明にしたがうマトリックスの使用の比較も、含む。ホスホリル化位置は図２の横座標に表示されたシーケンスにおいて対応するアミノ酸の前に挿入された‘ｐ’で印される。標準的に用いられるＣＨＣＡ及びＤＨＢＳが、補助剤を追加せずに作成された、すなわち二元マトリックスの形態の、α-シアノ-２,４-ジクロロケイ皮酸(ジ-ＣｌＣＣＡ)及びＢｒＣＣＡの誘導体に対して対照される。明らかに、純ＢｒＣＣＡ誘導体の、または他のマトリックスとの組み合わせて作成された、マトリックスにより、全ての検体に対してより高感度の検出が可能になる。他のマトリックスが追加されているかまたは追加されていない、ジ-ＣｌＣＣＡは高分子量のホスホリル化検体について特に高い感度を示す。
【００６８】
パラメータ：
質量分析計：ＭＡＬＤＩ ＬＴＱ Ｏｒｂｉｔｒａｐ ＸＬ，
モード：フーリエ変換質量分析，
レーザ波長：３３７ｎｍ，
検体：３０％アセトニトリル／０.０１％三フッ化酢酸に溶解させた、０.５μｌの合成ホスホペプチド混合物
極性：負，
マトリックス：Ｃ＝２０ミリモル，Ｖ＝０.５μｌ、ＤＨＢＳでは、ｃ＝２０ｍｇ/ｍｌ(水溶)，Ｖ＝１μｌにおいて、７０％アセトニトリルに溶解させた、１０ナノモルの対応するマトリックスまたはマトリックス混合物。
【００６９】
全てのホスホペプチドについて図５から得られた平均強度のマトリックス毎の平均化及びその後のＣＨＣＡ標準に基づく規格化により、様々な誘導体及びそれらの混合物の効率または感度の迅速な概観が可能になり、新規に開発された誘導体について検体信号強度の強い増大が示される。図６を参照されたい。
【００７０】
図７Ａ〜７ｃに、図５及び６に基づくスペクトルデータの例が、対応する絶対強度の増大とともに、ＣＨＣＡ(絶対強度：４６４０００単位)、ＢｒＣＣＡ：ＣｌＣＣＡ＝２：８(絶対強度：８２３００００単位)及びジ-ＣｌＣＣＡ：ＣｌＣＣＡ＝１：１(絶対強度：６４５００００単位)について表示される。
【００７１】
実施例５
ＭＳ/ＭＳ分析におけるさらに強いフラグメンテーション
ＭＳ/ＭＳ分析は検体の構造検証に役立つ。この目的のため、フラグメント化されるべき検体が前駆体フィルタによって単離され、次いで、例えば衝突ガスを用いてフラグメント化される。形成されたフラグメントにより検体構造、例えば、ペプチド内のアミノ酸シーケンスに関して、また可能な翻訳後実現性に関しても、言明することが可能になる。複数の可能な結合転移に基づいて、通常は多数のフラグメントが表れ、よって、与えられた信号の初期総合強度が多数のフラグメント信号に分割され、これには明瞭な強度減損がともなう。したがって、ＭＳ/ＭＳスペクトルは弱い強度しか示さないことが多く、これが多くのフラグメントが検出可能ではない理由であり、あるいは、弱い前駆体の場合に対応するＭＳ/ＭＳスペクトルが全く有意ではない理由である。したがって、より高感度のマトリックスによってより高い前駆体強度が得られ、したがって、その後により有意なフラグメントスペクトルを生成できれば、極めて有用である。
【００７２】
より高強度及びより大量のフラグメントがペンタ-ＦＣＣＡの使用によって得られる、強められたフラグメンテーションを図８ａ〜８ｃに見ることができる。記録された原スペクトルは、横軸の数値によって再現された、測定信号のｍ/ｚ比を含み、オンラインサーチエンジン,Ｍａｓｃｏｔ(www.matrixscience.com)による自動スペクトル分析の結果が原スペクトルの下に表示され、ジョンソン(Johnson)、マーティン(Martin)及びビーマン(Biemann)により提案された分類命名法(ジョンソン等，「ペプチドの(Ｍ＋Ｈ)＋イオンの衝突有機フラグメンテーション。側鎖固有シーケンスイオン(Collision-induced fragmentation of (M+H)+ ions of peptides. Side chains specific sequence ions)」，International Journal of Mass Spectrometry and Ion Processes，１９８８年，第８６巻，ｐ.１７３〜１７４)に基づく、同定されたフラグメントの注釈を含む。２０％の量のペンタ-ＦＣＣＡ物質を加えることで、基準ＣＨＣＡに比較してフラグメント信号強度の強い増大を達成することができる。図８から絶対強度(８ａ：ＣＨＣＡ ５８２７，ＣＨＣＡ＋ペンタ-ＦＣＣＡ ９７００；８ｂ：ＣＨＣＡ ８３０，ＣＨＣＡ＋ペンタ-ＦＣＣＡ ２０３０；８ｃ：ＣＨＣＡ ４０，ＣＨＣＡ＋ペンタ-ＦＣＣＡ ２１４)を参照されたい。これにより、ｍ/ｚ比が高いフラグメントの検出(図８ｃを見よ)も、強度が高いフラグメントの検出(図８ａ，８ｂを見よ)も、可能になり、よって、一方では構造解明に成功する確率が高まり、他方では引き続くＭＳ３実験における高い強度、すなわち生成されたフラグメントのさらに先の分裂分析を得ることができる。
【００７３】
図８ｃにおいて、ＣＨＣＡ基準マトリックスで得られたスペクトル(最上段)については得られた信号の強度が低いことから自動フラグメント分析／評定を実施することができなかった。これとは対照的に、本発明にしたがうマトリックスを用いて得られた、図８ｃの下段のスペクトルはより強い信号を示し、よって自動評定を実施することができた。
【００７４】
パラメータ：
質量分析計：ＡＢＩ４８００ ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ/ＴＯＦアナライザー，
モード：ＭＳ/ＭＳ，
レーザ波長：３５５ｎｍ，
検体：１ピコモルのβカゼインのトリプシン消化物，
極性：正。
【００７５】
上記説明，添付される特許請求の範囲及び図面において開示される本発明の特徴は様々な実施形態における本発明の実施に対し、個々別々に、肝要であり得る。
【図１ａ−１】
0005916227.tif 000006
【図１ａ−２】
0005916227.tif 000007
【図１ｂ】
0005916227.tif 000008
【図７ａ】
0005916227.tif 000009
【図７ｂ】
0005916227.tif 000010
【図７ｃ】
0005916227.tif 000011
【図８ａ−１】
0005916227.tif 000012
【図８ａ−２】
0005916227.tif 000013
【図８ｂ−１】
0005916227.tif 000014
【図８ｂ−２】
0005916227.tif 000015
【図８ｃ−１】
0005916227.tif 000016
【図８ｃ−２】
0005916227.tif 000017
【図２】
0005916227.tif 000018
【図３】
0005916227.tif 000019
【図４】
0005916227.tif 000020
【図５】
0005916227.tif 000021
【図６】
0005916227.tif 000022