(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
両性イオン性緩衝液および界面活性剤を含む核酸抽出用試薬を、被検試料と接触させる工程からなる核酸抽出方法であって、両性イオン性緩衝液がグッド緩衝液であり、界面活性剤がグリココール酸またはその塩であり、核酸抽出用試薬中における緩衝剤の濃度が、９〜３６４ｍｍｏｌ／Ｌであり、核酸抽出用試薬中における界面活性剤の濃度が、０．００９〜９ｍｍｏｌ／Ｌであり、核酸抽出用試薬の被検試料との懸濁が一回のみであり、被検試料が細胞壁を有する生物由来の試料である、前記方法。
【請求項２】
核酸抽出用試薬が、タンパク質分解酵素を含む、請求項１に記載の核酸抽出方法。
【請求項３】
タンパク質分解酵素が、プロテアーゼＫである、請求項２に記載の核酸抽出方法。
【請求項４】
核酸抽出用試薬中におけるタンパク質分解酵素の濃度が、０．０９〜４５Ｕ／ｍＬである、請求項２または３に記載の核酸抽出方法。
【請求項５】
両性イオン性緩衝液が、トリシンを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸抽出方法。
【請求項６】
細胞壁を有する生物が、グラム陽性菌、真菌または酵母である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の核酸抽出方法。
【請求項７】
被検試料から核酸としてＤＮＡおよび／またはＲＮＡが、抽出される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の核酸抽出方法。
【請求項８】
被検試料と接触させ、被検試料から核酸を抽出した核酸抽出用試薬は、核酸増幅反応に供されるものである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の核酸抽出方法。
【請求項９】
両性イオン性緩衝液および界面活性剤を含み、被検試料が細胞壁を有する生物由来の試料である核酸抽出用試薬であって、両性イオン性緩衝液がグッド緩衝液であり、界面活性剤がグリココール酸またはその塩であり、核酸抽出用試薬中における緩衝剤の濃度が、９〜３６４ｍｍｏｌ／Ｌであり、核酸抽出用試薬中における界面活性剤の濃度が、０．００９〜９ｍｍｏｌ／Ｌであり、核酸抽出用試薬の被検試料との懸濁が一回のみである、前記試薬。
【請求項１０】
核酸抽出用試薬を構成する両性イオン性緩衝液と界面活性剤と各構成成分とを含み、被検試料が細胞壁を有する生物由来の試料である核酸抽出試薬キットであって、両性イオン性緩衝液がグッド緩衝液であり、界面活性剤がグリココール酸またはその塩であり、核酸抽出用試薬中における緩衝剤の濃度が、９〜３６４ｍｍｏｌ／Ｌであり、核酸抽出用試薬中における界面活性剤の濃度が、０．００９〜９ｍｍｏｌ／Ｌであり、核酸抽出用試薬の被検試料との懸濁が一回のみである、前記キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被検試料からＰＣＲ法やＲＴ−ＰＣＲ法等の遺伝子増幅反応に直接適用可能な核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡ）を簡便かつ迅速に調製するための、核酸抽出方法、核酸抽出試薬キットおよび核酸抽出用試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子増幅反応に供するための核酸は、通常、被検試料の細胞壁や細胞膜を物理的または化学的に破壊した後、被検試料中のタンパク質を変性させ、核酸のみを分離することにより、調製される。この際に使用される試薬としては、強アルカリ性の水酸化ナトリウム溶液や、フェノール、クロロホルム等の有機溶剤、毒物である２−メルカプトエタノール等が用いられるが、これらの試薬はいずれも慎重に取り扱う必要がある。これに加えて、このような試薬が調製後の核酸に残存すると、その後の遺伝子増幅反応に悪影響を与える可能性がある。この問題を回避するために、遠心分離操作やカラムクロマトグラフィー等を用いて、さらに核酸を精製する操作や、若干の夾雑物が存在しても遺伝子増幅反応がなされるように反応液に妨害反応を抑制する効果を有する試薬を添加することが、頻繁に行われている。
【０００３】
上記のうち前者の精製操作については、生化学実験にて汎用的に用いられる緩衝液を含む溶解液に核酸を含む試料を入れた溶液（吸着液）を、シリカ、ガラス、ラテックス、ポリスチレン、セルロース、アガロース、塩基性タンパク質（プロタミン等）を原料して作成した粒子および／または基板、また、その粒子および／または基板の表面にイオン性や疎水性等の官能基を結合させた固体材料に接触させて、固体材料に核酸を吸着させる工程を経た後、固定材料に回収液を接触させて核酸を含む溶出液を得る方法がよく用いられる。例えば、特許文献２では吸着液もしくは回収液を得るために固定材料を遠心することを特徴とした方法が、特許文献３では両性イオン性緩衝液を吸着液および回収液に用いる方法が開示されている。また、核酸と夾雑成分の分子量の差に基づく方法（ゲル濾過クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー等）も良く用いられる。
【０００４】
後者の試薬の添加についても頻繁に研究がなされており、例えば、被検試料由来の陽イオンおよび陰イオンによる遺伝子増幅反応の妨害を抑制するために、これらの成分を捕捉し、中和することのできる両性イオン性緩衝成分を核酸抽出液に添加・混在させる方法が特許文献１に開示されている。
【０００５】
ところが、被検試料の由来によっては、上記の核酸抽出・精製操作そのものを妨害する成分が多量に含まれていることがあり、このような場合には、被検試料毎に特化した精製方法をさらに組み合わせることが、しばしば必要とされていた。
【０００６】
その一方で、現在国内外の試薬メーカーから使用者の利便性を高めるための種々の核酸抽出・精製キットが開発され、製品として販売されているが、これらの多くは、調製可能な核酸がＤＮＡまたはＲＮＡに限定されており、被検試料が個別に限定されているといった制限がある。このため、使用者は、被検試料の種類、状態、検出対象等となる核酸の種類等を鑑みて、種々の選択肢の中から最適な方法、キットを選択する必要があった。
【０００７】
被検試料が十分に入手できる場合、被検試料に含まれる夾雑成分が推測可能な場合、検出対象となるＤＮＡまたはＲＮＡが決定されている場合には、既存の方法の中から最適な方法およびその組み合わせを選択することも可能である。しかしながら、被検試料がごく微量しか入手できない場合、被検試料に含まれる夾雑成分に関する情報が不足している場合、検出対象となるＤＮＡまたはＲＮＡが複数存在する場合には、既存の方法との適合性を事前に調査することが困難である場合もある。したがって、このような場合にも、例えば事前の調査が必要ない、広い範囲で適用可能な核酸の抽出方法が望まれている。
【０００８】
また、被検試料数が著しく多い場合には、短時間にＰＣＲもしくはＲＴ−ＰＣＲ測定に適用できる試料を調製する必要があるため、核酸抽出前後に精製操作が必要な煩雑な方法は適用しづらく、精製操作が省略可能な核酸の抽出方法も望まれている。
【０００９】
このようなニーズに応じるべく、簡便かつ短時間に遺伝子増幅反応に直接適用可能な核酸が試薬キット（例えば、製品名：セルイーズ（Ｂｉｏｃｏｓｍ株式会社製）、製品名：シカジーニアスＤＮＡ抽出試薬（関東化学株式会社製）等）が販売されている。しかしながら、これらの試薬キットの添付文書（例えば、非特許文献１）に記載されている核酸はＤＮＡのみであるためＲＮＡに適用可能であるか否かについては不明であり、さらに、その組成については開示されていない。
【００１０】
また、特許文献４および５には、人体に有毒性を示さない試薬だけで構成された組成物を用いて、カラムクロマトグラフィー等の精製操作を行うことなく遺伝子増幅反応に直接適用可能な核酸を抽出・調製する方法が開示されている。特許文献４の実施例には、クリプトスポリジウム属および、細胞壁を有しない被検試料の代表例として、レジオネラ（グラム陰性菌）とＨｅＬａ細胞（ヒト培養細胞）からＤＮＡを抽出した結果が、また、特許文献５の実施例には、これらに加え、煮沸処理にて細胞壁を破壊したイネ種子（植物）から、ＤＮＡを抽出した結果が、それぞれ記載されている。しかしながら、例えば、細胞壁を有するグラム陽性菌や真菌・酵母等の研究試料としてニーズの高い他の被検試料に対し、これらの方法が適用可能か否かについては、不明である。
【００１１】
さらに、特許文献４および５には、核酸としてＤＮＡが抽出できることは具体的に示されているものの、ＲＮＡの抽出および引き続く分析が可能であるか否かについては、具体的に記載されていない。さらに、これらの文献に記載の方法は、試薬の混合と加熱操作を繰り返すステップが多く、簡便とは言い難く、このような方法で抽出された核酸は損傷を受けることも考えられる。したがって、損傷の少ない核酸を、より温和な条件で、短時間かつ簡便に調製するための方法が望まれている。
【００１２】
ＲＮＡを抽出する方法としては、グアニジンチオシアネートによりＲＮＡ分解酵素を失活させ、密度勾配遠心によりＲＮＡを回収することを特徴とするグアニジン−塩化セシウム超遠心法が知られている（例えば、非特許文献２）。本方法は、高純度のＲＮＡが得られるという利点を有するが、超遠心分離機が必要で多大な時間（例えば、数日）を要する、低分子ＲＮＡは回収できないといった課題を有する。
【００１３】
次に、グアニジンチオシアネートによりＲＮＡ分解酵素を失活させ、フェノール・クロロホルムを加えて遠心分離後、上層を回収（上層にＲＮＡ、中間層にタンパク質、下層にＤＮＡが含まれる）する、ＡＧＰＣ(Acid Guanidinium-Phenol-Chloroform)法が知られている（例えば、非特許文献３）。本方法は、現在でも広く用いられている方法であり、超遠心分離機ではなく通常の遠心分離機が使用できる、コストが低いといった利点を有するが、有毒なフェノールやクロロホルムを使用する必要がある、方法の実施に比較的長時間を要する（数時間程度）といった課題を有する。
【００１４】
また、核酸を結合させた固相を含む試料をシリカメンブレンに通すことで液体を取り除いた後、固相から核酸を分離することで精製する、シリカメンブレン（スピンカラム）を用いた方法が知られている（例えば、特許文献２）。本方法は、比較的簡便な操作により、高純度の核酸が得られるとの利点を有するものの、高度に精製された核酸を得るためには遠心操作を何度も繰り返す必要があり、本精製作業を実施するためには比較的長時間（３０分〜数時間）を要する、試料の種類に合わせて抽出用溶液とシリカメンブレンとの相性を考慮する必要がある（固相から核酸が分離しない溶液を選択する）といった課題を有する。
【００１５】
さらに、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）を磁性ビーズに可逆的に結合させ、磁石を用いてビーズを回収した後、ビーズから核酸を分離することで精製する、磁性ビーズを用いた方法が知られている（例えば、非特許文献４）。このような方法は、遠心操作と比べて簡便な操作手順で高純度の核酸が得られるとの利点を有するものの、試料の種類に合わせて抽出用溶液と磁性ビーズとの相性を考慮する必要がある（磁性ビーズから核酸が分離しない溶液を選択する）、コストが高いといった課題を有する。
【００１６】
上記のとおり、これまで行われたＲＮＡの抽出方法は、試薬の混合、ピペット操作、遠心分離等多くの工程を経る必要があり、調製に時間を要していたことから、かかる調製作業中に安定性の低いＲＮＡは分解されやすく、特に試料に含まれるＲＮＡが少量である場合には、抽出を行うことができないといった問題があった。また、抽出工程数が多いと、環境中に普遍的に存在するＲＮＡ分解酵素が、器具や作業者を介して混入するという問題がある。
そのため、より短時間かつ少ない工程で、ＲＮＡが調製可能な方法、特に、遺伝子増幅反応に供することのできるＲＮＡの鋳型が調製可能な方法が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】特表２００８−５３１０３９号公報
【特許文献２】特開平２−２８９５９６号公報
【特許文献３】特開２００９−２８４７８４号公報
【特許文献４】特開２００６−６１０４１号公報
【特許文献５】国際公開２００７／１１６４５０号公報
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】「シカジーニアスＤＮＡ抽出試薬」添付文書
【非特許文献２】Chirgwin,J. M. et al. (1979) Isolation of biologically active ribonucleic acid fromsources enriched in ribonuclease.  Biochemistry 18 (24): 5294-5299
【非特許文献３】Chomczynski,P. and Sacchi, N. (1987) Single-step method of RNA isolation by acidguanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.  AnalyticalBiochemistry 162 (1): 156-159
【非特許文献４】DeAngelis, M. M. et al. (1995) Solid-phase reversibleimmobilization for the isolation of PCR products.  Nucleic Acids Research23 (22): 4742-4743
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
したがって、本発明が解決しようとする課題は、多種多様な被検試料に適用可能であり、ＰＣＲ法やＲＴ−ＰＣＲ法等の遺伝子増幅反応に直接使用可能な核酸鋳型を、簡便かつ迅速に、好ましくは温和な条件で、調製する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明者らは、上記問題点に鑑み鋭意検討する中で、両性イオン性緩衝液を含む核酸抽出用試薬を用いることにより、ＤＮＡおよびＲＮＡとともに抽出される夾雑成分によって遺伝子増幅反応が妨害されることが抑制されることを見出し、さらに研究を進めた結果、本発明を完成するに至った。
【００２１】
すなわち、本発明は、以下に関する。
（１）  両性イオン性緩衝液を含む核酸抽出用試薬を、被検試料と接触させる工程を含む、核酸抽出方法。
（２）  核酸抽出用試薬が、タンパク質分解酵素および／または界面活性剤を含む、（１）に記載の核酸抽出方法。
（３）  タンパク質分解酵素が、プロテアーゼＫである、（２）に記載の核酸抽出方法。
（４）  核酸抽出用試薬中におけるタンパク質分解酵素の濃度が、０．０９〜４５Ｕ／ｍＬである、（２）または（３）に記載の核酸抽出方法。
（５）  界面活性剤が、ステロイド骨格を有する界面活性剤である、（２）〜（４）のいずれかに記載の核酸抽出方法。
（６）  界面活性剤が、グリココール酸またはその塩である、（２）〜（５）のいずれかに記載の核酸抽出方法。
（７）  核酸抽出用試薬中における界面活性剤の濃度が、０．００９〜９ｍｍｏｌ／Ｌである、（２）〜（６）のいずれかに記載の核酸抽出方法。
（８）  両性イオン性緩衝液が、グッド緩衝液である、（１）〜（７）のいずれかに記載の核酸抽出方法。
（９）  両性イオン性緩衝液が、トリシンを含む、（１）〜（８）のいずれかに記載の核酸抽出方法。
（１０）  核酸抽出用試薬中における緩衝剤の濃度が、９〜３６４ｍｍｏｌ／Ｌである、（１）〜（９）のいずれかに記載の核酸抽出方法。
（１１）  被検試料が、細胞壁を有する生物由来の試料である、（１）〜（１０）のいずれかに記載の核酸抽出方法。
（１２）  細胞壁を有する生物が、グラム陽性菌、真菌または酵母である、（１）〜（１１）のいずれかに記載の核酸抽出方法。
（１３）  被検試料から核酸としてＤＮＡおよび／またはＲＮＡが、抽出される、（１）〜（１２）のいずれかに記載の核酸抽出方法。
（１４）  被検試料と接触させ、被検試料から核酸を抽出した核酸抽出用試薬は、核酸増幅反応に供されるものである、（１）〜（１３）のいずれかに記載の核酸抽出方法。
（１５）  両性イオン性緩衝液を含む、核酸抽出用試薬。
（１６）  核酸抽出用試薬を構成する両性イオン性緩衝液と各構成成分とを含む、核酸抽出試薬キット。
【発明の効果】
【００２２】
本発明により、被検試料の種類や夾雑成分の有無を考慮することなく、ごく少量の被検試料から、一定の操作方法で、簡便かつ迅速に核酸を抽出することができ、さらに、ＰＣＲおよびＲＴ−ＰＣＲ法に供するための鋳型を調製することができる。また、食中毒や感染症等の検査市場において、日々、遺伝子検査の需要が高まっているが、本発明を用いることで、これまでネックとなっていた検体調製（ＰＣＲおよびＲＴ−ＰＣＲ用鋳型の調製）の作業の、大幅な短縮および省力化が可能となる。
【００２３】
特に、ＲＮＡは、抽出、精製作業中に容易に分解するため、従来技術では取り扱いが難しかったが、本発明によれば、精製操作を省略することも可能となり精製操作時におけるＲＮＡの損傷、分解が防止されるため、このようなＲＮＡも好適に抽出ができる。さらに、本発明で調製されたＲＮＡは、従来技術により得られたものとは異なり、保存安定性に優れており、再測定等が必要な際にも信頼性のあるデータを得ることが可能である。
【００２４】
さらに、本願発明は、核酸の抽出段階で、遺伝子増幅反応における夾雑物による悪影響を予め防止することが可能であるから、遺伝子増幅反応においてその目的に適した緩衝液を利用することが可能であり、例えば、特許文献１に記載の方法のように遺伝子増幅反応において特定の緩衝液に制限されない。
【００２５】
また、特に、核酸抽出用試薬が界面活性剤およびタンパク質分解酵素、特にグリココール酸およびプロテアーゼＫを組み合わせて含む場合には、細胞壁を有する細胞を被検試料とした場合であっても、好適に核酸を抽出することができ、本発明は、より広範な被検試料に対し適用可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】本発明の核酸抽出方法の好適な実施態様の一例を示すフローチャート図である。
【図２】プロテアーゼＫの濃度を段階的に変更した試薬１を用いて、出芽酵母懸濁液から抽出・増幅したＤＮＡを、アガロース電気泳動した際の観察図である。
【図３】グリココール酸Ｎａの濃度を段階的に変更した試薬１を用いて、出芽酵母懸濁液から抽出・増幅したＤＮＡを、アガロース電気泳動した際の観察図である。
【図４】トリシン濃度の範囲を段階的に変更した試薬１を用いて、ヒト血液成分含む出芽酵母懸濁液から抽出・増幅したＤＮＡを、アガロース電気泳動した際の観察図である。
【図５】本発明の核酸抽出方法および熱水抽出法により、黄色ブドウ球菌、大腸菌Ｏ１５７、出芽酵母の各懸濁液から抽出されたＤＮＡ量を、アガロース電気泳動法で比較した結果を示した観察図である。
【図６】従来の試薬を用いた方法および熱水抽出法により、黄色ブドウ球菌、大腸菌Ｏ１５７、出芽酵母の各懸濁液から抽出されたＤＮＡ量を、アガロース電気泳動法で比較した結果を示した観察図である。
【図７】本発明の核酸抽出試薬キットおよび既存製品（セルイーズ  マウステール）を用いて、動物細胞から抽出したＤＮＡ量を比較した結果を示したアガロース電気泳動の観察図である。
【図８】本発明の核酸抽出方法および熱水抽出法により、黄色ブドウ球菌、大腸菌Ｏ１５７、出芽酵母の各懸濁液から抽出されたＲＮＡ量を、比較した結果を示したアガロース電気泳動の観察図である。
【図９】本発明の方法を用いた、血液成分が混入した出芽酵母懸濁液からのＤＮＡの抽出についての結果を示すアガロース電気泳動の観察図である。
【図１０】本発明の方法を用いた、血液成分が混入した出芽酵母懸濁液からのＲＮＡの抽出についての結果を示すアガロース電気泳動の観察図である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下、本発明の好適な実施態様に基づき、本発明を詳述する。
本発明の核酸抽出方法の説明に先立ち、まず、本発明の核酸抽出用試薬および核酸抽出試薬キットについて説明する。
【００２８】
本発明の核酸抽出用試薬は、被検試料中の核酸、特にＤＮＡおよび／またはＲＮＡの抽出に用いられるものである。そして、本発明の核酸抽出用試薬は、例えば、被検試料中から核酸が抽出した後に、核酸増幅反応に供される遺伝子増幅反応用核酸抽出試薬である。
【００２９】
なお、別段の記載がない限り、本発明において、核酸とは、核酸とは、天然由来のＤＮＡ（デオキシリボ核酸）およびＲＮＡ（リボ核酸）、またはその誘導体（メチル化体、酸化体、２量体）、人工的に作成されたＤＮＡおよびＲＮＡの模倣物（プライマー、非天然型核酸塩基を含む等）、修飾体（チオリン酸エステル体、チオール化体、リン酸化体、アミノ化体、ビオチン化体、蛍光標識体等）をいう。
【００３０】
また、別段の記載がない限り、本発明において、抽出とは、生体膜（細胞壁、細胞膜、核膜、ミトコンドリア膜）等で外界と隔絶された殻状体の中に格納されている物質（内容物）を、その殻状体に対し液体を接触させることによりその構造を破壊し、内容物と液体との親和性及び溶解性に基づいて液体中に内容物を移行させることをいう。
【００３１】
また、本発明の核酸抽出用試薬は、両性イオン性緩衝液を含む。
両性イオン性緩衝液は、緩衝剤として両性イオン性化合物を含むものであり、一定のｐＨ範囲において、当該化合物は、正電荷と負電荷とを同時に有する両性イオンとして両性イオン性緩衝液中に存在する。核酸抽出試薬がこのような両性イオン性緩衝液を含むことにより、抽出および遺伝子増幅反応における検体試料中に含まれる夾雑成分による影響を低減することができ、この結果、被検試料の種類や夾雑成分の有無を考慮することなく、核酸を抽出することができるとともに、核酸抽出後における精製作業の省略が可能となる。このような効果が得られる理由は完全に解明されていないが、例えば、負電荷を有する核酸等に付着することで、核酸がＤＮＡポリメラーゼと結合することを妨害すると考えられている陽イオン性の夾雑物を、両性イオン性化合物が、その負電荷により捕獲するとともに、ＤＮＡポリメラーゼが活性化する際に必須な２価の陽イオン（マグネシウムイオン等）を電気的に中和することで、ＤＮＡポリメラーゼの活性を阻害すると考えられている陰イオン性の夾雑物を、両性イオン性化合物が、その正電荷により捕獲し、これらの夾雑物を凝集、沈降させる結果、夾雑物による核酸やポリメラーゼ等への影響を低減できるためであると考えられる。
【００３２】
核酸抽出用試薬に含まれる両性イオン性緩衝液としては、特に限定されず、例えば、グッド緩衝液を用いることができる。具体的には、緩衝剤として、２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、Ｎ，Ｎ−ジ（２−ヒドロキシエチル）グリシン（ビシン）、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸（ＥＰＰＳ）、２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２−ヒドロキシ−３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、２−ヒドロキシ−３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、ピペラジン−１，４−ビス（２−ヒドロキシ−３−プロパンスルホン酸）（ＰＯＰＳＯ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、２−ヒドロキシ−Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−エタンスルホン酸（ＴＥＳ）、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン（トリシン）、Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−２−アミノエタンアミニウムクロリド（コラミン塩酸）、アセトアミドグリシン、グリシンアミドまたはこれらの塩から選択される１種または２種以上を含む緩衝液が挙げられ、好ましくは、緩衝剤としてＮ，Ｎ−ジ（２−ヒドロキシエチル）グリシン（ビシン）、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、２−ヒドロキシ−Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−エタンスルホン酸（ＴＥＳ）、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン（トリシン）、２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）から選択される１種または２種以上を含む緩衝液を用いることができ、より好ましくは、緩衝剤として、ビシン、トリシン、２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸から選択される１種または２種以上を含む緩衝液を用いることができ、さらに好ましくは、緩衝剤としてトリシンを含む緩衝液を用いることができる。
【００３３】
また、両性イオン性緩衝液は、上述したような両性イオン性化合物以外の緩衝剤を含んでいてもよい。このような緩衝剤としては、核酸抽出に関与する酵素の活性が至適になるように、中性から弱アルカリ性に調整できるものであれば良く、特に限定されないが、好ましくは、トリスヒドロキシアミノメタン、リン酸、ホウ酸、３，３−ジメチルグルタル酸、マレイン酸、イミダゾール、トリエタノールアミン、ジエタノールアミン、ピロリン酸、グリシン、またはこれらの塩（例えばＮａ塩、Ｋ塩、塩酸塩）等が挙げられ、これらのうち１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００３４】
核酸抽出用試薬中における緩衝剤の濃度は、その緩衝剤の種類によって異なり、特に限定されないが、陽イオンおよび／または陰イオン性の夾雑物を十分に中和することができるように、夾雑成分に対して過剰量の緩衝剤が両性イオン性緩衝液中に存在し、かつ緩衝剤自身が遺伝子増幅反応を阻害しない濃度に設定する必要があるとの観点から、好ましくは、９〜３６４ｍｍｏｌ／Ｌであり、より好ましくは、９１〜１８２ｍｍｏｌ／Ｌである。特に、両性イオン性化合物、好ましくはトリシンの濃度が上記範囲内であると、本願の効果はより顕著に発揮される。
【００３５】
また、核酸抽出用試薬は、好ましくは、タンパク質分解酵素および／または界面活性剤を含む。これにより、比較的温和な条件において、細胞壁、細胞膜、核膜等を十分に破壊することができ、核酸の抽出をより容易にすることができる。さらに好ましくは、核酸抽出用試薬は、タンパク質分解酵素および界面活性剤を含み、これにより、タンパク質分解酵素および界面活性剤が協調して作用し、細胞壁、細胞膜、核膜等をより好適に破壊することができる。
【００３６】
このようなタンパク質分解酵素としては、被検試料の核酸が抽出される程度に、細胞壁、細胞膜および核膜（真核生物の場合）を破壊できるようタンパク質を分解する能力を有するものであれば、特に限定されず、例えば、セリンプロテアーゼに属しているプロテアーゼＫ、トリプシン、キモトリプシン、スブチリシン等、アスパラギン酸プロテアーゼに属しているペプシン、カテプシンＤ等、システインプロテアーゼに属しているパパイン、カテプシン、カスパーゼ、カルパイン等が挙げられ、これらのうち１種または２種以上を用いることができるが、好ましくは、タンパク質の基質特異性が広く、かつキレート剤や変性剤の存在下でも活性を保つプロテアーゼＫを用いる。
【００３７】
また、核酸抽出用試薬中におけるタンパク質分解酵素の濃度は、タンパク質分解酵素の種類により、特に限定されないが、好ましくは、０．０９〜４５Ｕ／ｍＬであり、さらに好ましくは、０．９〜４５Ｕ／ｍＬである。これにより、核酸の抽出時における細胞壁、細胞膜および核膜の破壊が促進され、核酸の抽出を効率的に行うことができ、遺伝子増幅反応時における核酸配列の増幅量を十分なものとすることができる。特に、核酸抽出用試薬がタンパク質分解酵素としてプロテアーゼＫを上述した濃度含む場合には、顕著に上述した効果が得られる
【００３８】
また、界面活性剤としては、細胞壁、細胞膜および核膜の破壊に寄与するものであれば特に限定されないが、好ましくは、ステロイド骨格を有する界面活性剤を用いることができ、具体的には、デオキシコール酸、グリココール酸、またはこれらの塩（例えば、Ｎａ、Ｋ塩等）を挙げることができ、これらのうち１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。さらに好ましくは、界面活性剤として、グリココール酸またはその塩（例えば、Ｎａ、Ｋ塩）を用いる。
【００３９】
核酸抽出用試薬中における界面活性剤の濃度は、界面活性剤の種類により異なるが、例えばグリココール酸の場合は、好ましくは、０．００９〜９ｍｍｏｌ／Ｌであり、より好ましくは、０．９〜９ｍｍｏｌ／Ｌである。デオキシコール酸の場合は、好ましくは０．００９〜９ｍｍｏｌ／Ｌであり、より好ましくは、０．９〜９ｍｍｏｌ／Ｌである。これにより、核酸の抽出時における細胞壁、細胞膜および核膜の破壊が促進され、核酸の抽出を効率的に行うことができ、遺伝子増幅反応時における核酸配列の増幅量を十分なものとすることができる。特に、核酸抽出用試薬が界面活性剤としてグリココール酸またはその塩を上述した濃度含む場合には、顕著に上述した効果が得られる。
【００４０】
また、核酸抽出用試薬は、上述した以外の成分を含んでもよい。このような成分としては、特に限定されないが、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、Ｏ，Ｏ’−ビス（２−アミノフェニル）エチレングリコール四酢酸（ＢＡＰＴＡ）、ｔｒａｎｓ−１，２−ジアミノシクロヘキサン四酢酸（ＣｙＤＴＡ）およびそれらの塩等のキレート剤、酢酸カルシウム、ギ酸カルシウム、塩化カルシウム等のカルシウム塩、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム等の非特異吸着抑制剤、グリセリン等の凍結防止剤等が挙げられ、タンパク質分解酵素（例えばプロテアーゼＫ）およびＤＮＡ分解酵素（例えばＤＮａｓｅ Ｉ）の酵素反応および遺伝子増幅反応（例えばＰＣＲ用ＤＮＡポリメラーゼ）を妨害しない範囲で、これらのうち１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００４１】
また、核酸抽出用試薬が界面活性剤およびタンパク質分解酵素を同時に含む場合には、界面活性剤としてグリココール酸を、タンパク質分解酵素としてプロテアーゼＫを含むことが好ましい。このような組み合わせにより、十分に温和な条件下において、検体試料中の細胞壁、細胞膜、核膜等をより容易かつ迅速に破壊することができ、核酸をより効率的に抽出することが可能となる。
【００４２】
また、核酸抽出用試薬の２０℃におけるｐＨは、特に限定されないが、タンパク質分解酵素（例えばプロテアーゼＫ）およびＤＮＡ分解酵素（例えばＤＮａｓｅ Ｉ）の酵素反応および遺伝子増幅反応（例えばＰＣＲ用ＤＮＡポリメラーゼ）の活性が全て維持されるよう、好ましくは７．５〜８．７であり、より好ましくは、８．０〜８．５である。
【００４３】
本発明の核酸抽出試薬キットは、少なくとも上述したような核酸抽出用試薬を構成する両性イオン性緩衝液と各構成成分とを含む。
核酸抽出試薬は、核酸抽出試薬キットにおいて、その各構成成分が混合された状態で存在してもよいし、保存安定性の向上、製造コストの低減等の観点から、必要に応じて、これらの成分が分離して存在してもよい。
また、核酸抽出試薬キットは、その目的に応じ、他の試薬を有していてもよい。例えば、核酸抽出試薬キットは、目的とする核酸以外の核酸を分解するための核酸分解試薬（例えば、ＤＮＡ分解試薬、ＲＮＡ分解試薬）、ＲＮＡ分解酵素の活性を阻害するタンパク質（ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、ＰＣＲ等の遺伝子増幅試薬（ＤＮＡポリメラーゼ、プライマー、核酸塩基、Ｍｇ含有緩衝液）、遺伝子増幅産物を検出するための電気泳動関連試薬（アガロースゲル、分子量マーカー、移動度マーカー、検出試薬）等を、１種または２種以上組み合わせて有することができる。
また、本発明の核酸抽出試薬キットは、後述する核酸の抽出方法を実施するための器具（例えば、密閉容器等）を備えていてもよい。
【００４４】
上述したような本発明の核酸抽出用試薬および核酸抽出試薬キットは、以下に説明する本発明の核酸抽出方法に好適に適用することができる。
【００４５】
次に、本発明の核酸抽出方法について説明する。
図１に、本発明の核酸抽出方法の好適な実施態様の一例を示すフローチャート図を示す。なお、図中に記載された試薬中の構成成分や反応条件等については、あくまでも本発明の実施態様の一例を示すものであり、本発明はこれに限定されるべきではない。
本発明の核酸抽出方法は、両性イオン性緩衝液を含む核酸抽出用試薬（試薬１）を、被検試料と接触させる工程を含む。
【００４６】
本実施態様においては、まず、被検試料を上述した核酸抽出用試薬と混合して混合液を得、これにより被検試料と核酸抽出用試薬とを接触させる。
【００４７】
本発明の核酸抽出方法では、被検試料として核酸を含む細胞（微生物、動物、植物）またはウイルスを用いる。このような被検試料としては、特に限定されないが、好ましくは、被検試料は、細胞壁を有する生物（真核生物または原核生物）由来の試料であり、より好ましくはグラム陽性菌、真菌または酵母であり、さらに好ましくは、黄色ブドウ球菌または出芽酵母である。
【００４８】
これらの被検試料を含む検体の由来は、特に限定されず、いかなるものであってもよい。例えば、微生物およびウイルス試料を含む検体としては、血液、尿、糞便、粘液（例えば、膣、子宮頚、口腔、鼻腔等）、食品、作物、上下水道、天然水（例えば、河川水、湖沼水、地下水、雨水、海水）、土壌等が挙げられ、それぞれに適した方法で採取された一次検体を直接または培養によって増殖させたものが使用できる。
【００４９】
また、例えば、動物試料を含む検体としては、血液、尿、糞便、粘液（例えば、膣、子宮頚、口腔、鼻腔等）、皮膚、毛根、食品（肉類）、手術で摘出された生検試料等が挙げられ、それぞれに適した方法で採取された一次検体を直接または培養によって増殖させたものが使用できる。また、これらの検体中の細胞を凍結させたもの、パラフィン包埋切片としたものについても使用できる。
【００５０】
また、例えば、植物由来の検体としては、種子、果実、種皮、茎、葉、根等が挙げられる。
【００５１】
なお、本発明の核酸抽出方法では、上述したような被検試料に夾雑物が含まれていた場合であっても、好適に核酸の抽出が可能である。すなわち、夾雑物が含まれ得る検体試料について、その有無を検討することなく、本発明の方法を適用することも可能である。本願明細書中において、夾雑物とは、分子サイズに限らず、正もしくは負に荷電している化合物、タンパク質分解酵素（例えばプロテアーゼＫ）およびＤＮＡ分解酵素（例えばＤＮａｓｅ  Ｉ）および遺伝子増幅用酵素（例えばＰＣＲ用ＤＮＡポリメラーゼ）の活性を阻害する化合物、またはこれらの安定性を低減させる化合物、等を１種または２種以上含む組成物をいう。このような夾雑物としては、特に限定されないが、例えば、血清、血球、尿、便、粘液、髄液、唾液、土壌、細胞断片、培地、タンパク質、脂質、油脂、多糖、オリゴ糖、色素、金属塩、酸性塩、塩基性塩、抗生物質、薬物、界面活性剤等が挙げられる。上述した中でも、血清、尿、粘液、細胞断片、培地、金属塩、酸性塩および塩基性塩は、抽出後の抽出液に存在することにより、核酸増幅反応を妨害しやすいが、このような夾雑物が存在した場合であっても、本発明によれば、このような妨害を抑制できる。
【００５２】
被検試料と核酸抽出用試薬との混合方法は、特に限定されず、適宜被検試料の状態に適した方法を採用することができる。例えば、被検試料が懸濁液であった場合には、混合は、被検試料に核酸抽出用試薬を添加することにより行うことができる。また、例えば、被検試料がコロニーや固形物を大量に含む場合には、混合は、生化学的実験で汎用される緩衝液（例えば、ＰＢＳ）、生理食塩水等にこれらを懸濁させ、これに対し核酸抽出用試薬を添加することにより行うことができる。
【００５３】
また、被検試料と核酸抽出用試薬との混合を、密閉可能な容器中で行うことができる。このような場合、例えば、ピペット、点眼瓶等の器具を用いて、被検試料および核酸抽出用試薬の容器への輸送を行うことができる。
【００５４】
混合液中における被検試料と核酸抽出用試薬との混合比（体積比）は、特に限定されないが、例えば、１：１０００〜１：１０、好ましくは、１：１００〜１：１０とすることができる。
【００５５】
次に、混合液を、所定の温度に調節し、一定時間静置する。
混合液の温度は、例えば、核酸抽出用試薬にタンパク質分解酵素が含まれる場合には、この至適温度付近（例えば、至適温度より５℃低い温度から、至適温度より５℃高い温度範囲内）とすることができる。
また、核酸抽出用試薬にタンパク質分解酵素が含まれない場合には、混合液の温度は、２５〜７０℃とすることができる。
また、静置時間は、特に限定されないが、例えば、５〜３０分、好ましくは、５〜１０分とすることができる。
【００５６】
次に、核酸抽出用試薬に、タンパク質分解酵素が含まれる場合には、この失活温度付近（例えば、失活温度より２℃低い温度から、失活温度より２℃高い温度範囲内）にて、一定時間静置する。
静置時間は、特に限定されないが、例えば、３〜１５分、好ましくは、３〜５分とすることができる。
【００５７】
以上の操作により、検体試料から混合液中に核酸が抽出された抽出液が得られる。
【００５８】
こうして得られた抽出液は、遺伝子増幅反応に供される。  増幅の対象の核酸がＤＮＡの場合には、得られた抽出液をそのまま遺伝子増幅反応におけるＤＮＡの鋳型として用い、ＰＣＲ法に供することも可能であるが、遠心分離や濾過操作等により沈殿物を除去した後の上澄をＰＣＲ法に用いることもできる。
【００５９】
増幅の対象の核酸がＲＮＡ由来のものである場合には、さらに、混合液中のＤＮＡを分解して、分解処理後の混合液をＲＴ−ＰＣＲ法に供する。
このような場合、図１にあるように、本実施態様では、さらにＤＮＡ分解試薬（試薬２）を抽出液に接触させる工程を有する。
上記工程としては、例えば、核酸抽出試薬キットに含まれるＤＮＡ分解試薬を抽出液に添加し、抽出液を所定の温度に調節し、一定時間静置することにより行うことができる。
【００６０】
このような温度としては、例えば、ＤＮＡ分解試薬中に含まれるＤＮＡ分解酵素の至適温度付近（例えば、至適温度より２℃低い温度から、至適温度より２℃高い温度範囲内）とすることができる。
また、静置時間は、ＤＮＡが十分に分解可能な時間であれば特に限定されないが、例えば、１０〜３０分、好ましくは、１０〜１５分とすることができる。
【００６１】
次に、ＤＮＡ分解酵素の失活温度付近（例えば、失活温度より２℃低い温度から、失活温度より２℃高い温度範囲内）にて、抽出液を一定時間静置する。
静置時間は、特に限定されないが、例えば、５〜３０分、好ましくは、５〜１５分とすることができる。
以上の操作により、ＤＮＡが除去され、かつＲＮＡを含む抽出液を得ることができる。そして、この処理後の抽出液中に残存するＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲ法の鋳型として使用することが可能となる。
【００６２】
以上、本発明について好適な実施態様に基づき詳細に説明したが、本発明はこれに限定されず、各構成は、同様の機能を発揮し得る任意のものと置換することができ、あるいは、任意の構成を付加することもできる。
【実施例】
【００６３】
以下、本発明を、実施例をあげてさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
まず、核酸の抽出に用いる試薬として、以下の組成の試薬１および試薬２を調製し、試薬１および試薬２からなる核酸抽出試薬キットを準備した。
【００６４】
試薬１（本発明の核酸抽出用試薬）
プロテアーゼＫ                   １８  Ｕ／ｍＬ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ７．５     ０．９  ｍＭ
酢酸カルシウム                  ０．０９  ｍＭ
グリココール酸ナトリウム              ９  ｍＭ
ＥＤＴＡ・２Ｎａ                  ０．９  ｍＭ
トリシン  ｐＨ  ８．５            １８２  ｍＭ
塩化ナトリウム                        ９  ｍＭ
グリセリン                            ５  ％（ｖ／ｖ）
【００６５】
試薬２（ＤＮＡ分解試薬）
ＤＮａｓｅ  Ｉ                  １  Ｕ／μＬ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ７．５    ２０  ｍＭ
塩化マグネシウム                  ５０  ｍＭ
グリセリン                        ５０  ％（ｖ／ｖ）
なお、別段の記載がない限り、以下で述べる試薬１および２の組成は上記のとおりである。
【００６６】
また、本実施例において、試薬１および試薬２は、核酸の抽出において、原則以下のように使用することとした。
増幅対象がＤＮＡに由来する場合：  検体（１μＬ）を試薬１（１００μＬ）で懸濁し、６５℃で６分間、９４℃で３分間連続的に加温する。その後、遠心操作（１０，０００×ｇ、５分）で上清を回収して抽出液を得、これをＰＣＲ法の鋳型として使用する。
【００６７】
増幅対象がＲＮＡに由来する場合：  ＤＮＡの場合と同様に被検試料（１μＬ）と試薬１（１００μＬ）を懸濁し、加温操作と遠心操作を経て上清を回収する。この上清５μＬに５μＬの試薬２と４５μＬの超純水を加え、３７℃で１５分間、７５℃で５分間連続的に加熱して抽出液を得、これをＲＴ−ＰＣＲ法の鋳型として使用する。
【００６８】
（実施例１）
・プロテアーゼＫ濃度が異なる試薬１を用いたＤＮＡの抽出
出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、ＡＴＣＣ  ９７６３）をサブローブドウ糖寒天培地に播種し、３７℃で一晩好気培養した。得られたコロニーを被検試料とした。プロテアーゼＫのみ０〜４５Ｕ／ｍＬの範囲で段階的に濃度を変更した上記試薬１を用いて、増幅対象をＤＮＡとして被検試料から核酸の抽出を行い、ＰＣＲ法の鋳型を調製した。
【００６９】
次に、９３９ｂｐのＰＣＲ産物を得るために、センスプライマー（配列番号１：URA3-U、5’-GCACAGAACAAAAACCT-3’）およびアンチセンスプライマー（配列番号２：URA3-L、5’-TCATTACGACCGAGATT-3’）を用いてＵＲＡ３遺伝子配列をＰＣＲ法により増幅した。まず、１０μＭ  フォワードプライマー  １μＬ、１０μＭ  リバースプライマー  １μＬ、５×ＡｐｔａＴａｑ  ＤＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ（ロシュ）４μＬ、上記鋳型２μＬおよび超純水１２μＬを混合して全量２０μＬのＰＣＲ反応混合液を調製した。そして、ＰＣＲを次のような温度条件で行った：〔９４℃、３０秒→４８℃、９０秒→７２℃、６０秒〕×３０回→７２℃、７分。増幅産物をアガロースゲル電気泳動に供した結果を図２に示す。
図中、各レーンの実験において、試薬１中のプロテアーゼＫ濃度を以下のように構成した。
レーン１：            ０  Ｕ／ｍＬ
レーン２：    ０．００９  Ｕ／ｍＬ
レーン３：      ０．０９  Ｕ／ｍＬ
レーン４：        ０．９  Ｕ／ｍＬ
レーン５：            ９  Ｕ／ｍＬ
レーン６：          ４５  Ｕ／ｍＬ
レーンＭ：  １００ｂｐ  ＤＮＡ  Ｌａｄｄｅｒ
【００７０】
図２に示された結果において、いずれの方法で行った被検試料についても、ＤＮＡが抽出され、また増幅されたことが確認できた。また、試薬１中のプロテアーゼＫの濃度が０．０９〜４５Ｕ／ｍＬの範囲の場合には、増幅産物量が比較的多いことが確認できた。
【００７１】
（実施例２）
・グリココール酸濃度が異なる試薬１を用いたＤＮＡの抽出
出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、ＡＴＣＣ  ９７６３）をサブローブドウ糖寒天培地に播種し、３７℃で一晩好気培養した。得られたコロニーを被検試料とした。グリココール酸Ｎａのみ０〜９ｍｍｏｌ／Ｌの範囲で段階的に濃度を変更した上記試薬１を用いて、増幅対象をＤＮＡとして被検試料から核酸の抽出を行い、ＰＣＲ法の鋳型を調製した。
【００７２】
次に、９３９ｂｐのＰＣＲ産物を得るために、センスプライマー（配列番号１：URA3-U、5’-GCACAGAACAAAAACCT-3’）およびアンチセンスプライマー（配列番号２：URA3-L、5’-TCATTACGACCGAGATT-3’）を用いてＵＲＡ３遺伝子配列をＰＣＲ法により増幅した。まず、１０μＭ  フォワードプライマー  １μＬ、１０μＭ  リバースプライマー  １μＬ、５×ＡｐｔａＴａｑ  ＤＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ（ロシュ）４μＬ、上記鋳型２μＬおよび超純水１２μＬを混合して全量２０μＬのＰＣＲ反応混合液を調製した。そして、ＰＣＲを次のような温度条件で行った：〔９４℃、３０秒→４８℃、９０秒→７２℃、６０秒〕×３０回→７２℃、７分。増幅産物をアガロースゲル電気泳動に供した結果を図３に示す。
【００７３】
図中、各レーンの実験において、試薬１中のグリココール酸Ｎａ濃度を以下のように構成した。
レーンＭ：  １００ｂｐ  ＤＮＡ  Ｌａｄｄｅｒ
レーン１：            ０  ｍｍｏｌ／Ｌ
レーン２：    ０．００９  ｍｍｏｌ／Ｌ
レーン３：      ０．０９  ｍｍｏｌ／Ｌ
レーン４：        ０．９  ｍｍｏｌ／Ｌ
レーン５：            ９  ｍｍｏｌ／Ｌ
図３に示された結果において、試薬１中のグリココール酸Ｎａの濃度が０．００９〜９ｍｍｏｌ／Ｌの範囲の場合には、増幅産物量が比較的多いことが確認できた。
【００７４】
（実施例３）
・トリシン濃度の異なる試薬１を用いたＤＮＡの抽出
出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、ＡＴＣＣ  ９７６３）をサブローブドウ糖寒天培地に播種し、３７℃で一晩好気培養した。得られたコロニー１μＬをヒトプール血清１０μＬに懸濁し、この全量を被検試料とした。トリシンのみ０〜３６４ｍｍｏｌ／Ｌの範囲で段階的に濃度を変更した上記試薬１を用いて、増幅対象をＤＮＡとして被検試料から核酸の抽出を行い、ＰＣＲ法の鋳型を調製した。なお、トリシンを含まない試薬１は、対照として用いた。
【００７５】
次に、９３９ｂｐのＰＣＲ産物を得るために、センスプライマー（配列番号１：URA3-U、5’-GCACAGAACAAAAACCT-3’）およびアンチセンスプライマー（配列番号２：URA3-L、5’-TCATTACGACCGAGATT-3’）を用いてＵＲＡ３遺伝子配列を増幅した。まず、１０μＭ  フォワードプライマー  １μＬ、１０μＭ  リバースプライマー  １μＬ、５×ＡｐｔａＴａｑ  ＤＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ（ロシュ）４μＬ、鋳型２μＬおよび超純水１２μＬを混合して全量２０μＬのＰＣＲ反応混合液を調製した。そして、ＰＣＲを次のような温度条件で行った：〔９４℃、３０秒→４８℃、９０秒→７２℃、６０秒〕×３０回→７２℃、７分。増幅産物をアガロースゲル電気泳動に供した結果を図４に示す。
図中、各レーンの実験において、試薬１中のトリシン濃度を以下のように構成した。
レーン１：            ０  ｍｍｏｌ／Ｌ
レーン２：            ９  ｍｍｏｌ／Ｌ
レーン３：          ９１  ｍｍｏｌ／Ｌ
レーン４：        １８２  ｍｍｏｌ／Ｌ
レーン５：        ３６４  ｍｍｏｌ／Ｌ
レーンＭ：  １００ｂｐ  ＤＮＡ  Ｌａｄｄｅｒ
【００７６】
図４に示された結果において、試薬１中のトリシンの濃度が９〜３６４ｍｍｏｌ／Ｌの範囲の場合には、増幅産物由来のバンドが十分に認められた。
【００７７】
（実施例４）
・本発明の核酸抽出試薬キットを用いた、黄色ブドウ球菌（グラム陽性菌）、大腸菌Ｏ１５７（グラム陰性菌）、真菌（出芽酵母）からのＤＮＡの抽出
黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、ＮＢＲＣ  １０２１４１）と大腸菌Ｏ１５７（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、ＡＴＣＣ  ３５１５０）とをＳＣＤ寒天培地に、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、ＡＴＣＣ  ９７６３）をサブローブドウ糖寒天培地にそれぞれ播種し、３７℃で一晩好気培養した。得られた各コロニーを被検試料として、上記試薬１を用いて、増幅対象をＤＮＡとして被検試料から核酸の抽出を行い、ＰＣＲ法の鋳型を調製した。また、本発明（試薬１）の代わりに超純水を用いて同様の操作を行い、これを対照の鋳型とした。
【００７８】
次に、各鋳型について、１０μＭ  フォワードプライマー  １μＬ、１０μＭ  リバースプライマー  １μＬ、５×ＡｐｔａＴａｑ  ＤＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ（ロシュ）４μＬ、各鋳型２μＬおよび超純水１２μＬを混合して全量２０μＬのＰＣＲ反応混合液をそれぞれ調製し、これをＰＣＲ反応によるＤＮＡの増幅反応に供した。
【００７９】
黄色ブドウ球菌については、３２４ｂｐのＰＣＲ産物を得るために、センスプライマー（配列番号３：S4F、5’-GACAACTAGAGATAGAGCCTTCC-3’）およびアンチセンスプライマー（配列番号４：S4R、5’-AGTCGAGTTGCAGACTAC-3’）を用いて１６Ｓ  ｒＲＮＡの配列をＰＣＲ法により増幅した。ＰＣＲは次のような温度条件で行った：〔９４℃、３０秒→５４℃、９０秒→７２℃、６０秒〕×３０回→７２℃、７分。
【００８０】
Ｏ１５７については、１８０ｂｐのＰＣＲ産物を得るために、センスプライマー（配列番号５：stx1F、5’-ATAAATCGCCATTCGTTGACTAC-3’）およびアンチセンスプライマー（配列番号６：stx1R、5’-AGAACGCCCACTGAGATCATC-3’）を用いてベロ毒素１遺伝子配列をＰＣＲ法により増幅した。ＰＣＲは次のような温度条件で行った：〔９４℃、３０秒→６２℃、９０秒→７２℃、６０秒〕×３０回→７２℃、７分。
【００８１】
出芽酵母については、９３９ｂｐのＰＣＲ産物を得るために、センスプライマー（配列番号１：URA3-U、5’-GCACAGAACAAAAACCT-3’）およびアンチセンスプライマー（配列番号２：URA3-L、5’-TCATTACGACCGAGATT-3’）を用いてＵＲＡ３遺伝子配列をＰＣＲ法により増幅した。ＰＣＲは次のような温度条件で行った：〔９４℃、３０秒→４８℃、９０秒→７２℃、６０秒〕×３０回→７２℃、７分。
【００８２】
各増幅産物をアガロースゲル電気泳動に供した結果を図５に示す。
図中、黄色ブドウ球菌、腸管出血性大腸菌Ｏ１５７、出芽酵母のいずれについても、各レーンは下記の構成とした。
レーンＭ：  １００ｂｐ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ
レーン１：  本発明の試薬１を用いて調製したＰＣＲ用鋳型
レーン２：  本発明の試薬１の代わりに超純水を用いて調製したＰＣＲ用鋳型（対照）
図５に示された結果において、３種全ての被検試料において増幅産物に由来するバンドが検出されたことが確認された。特に、黄色ブドウ球菌や出芽酵母に対しては、対照よりも多くの増幅産物が得られることが確認された。
【００８３】
（比較例１）
・従来の核酸抽出試薬キットを用いた、黄色ブドウ球菌（グラム陽性菌）、大腸菌Ｏ１５７（グラム陰性菌）、真菌（出芽酵母）からのＤＮＡの抽出
本発明の核酸抽出試薬キットに変えて、既存製品（シカジーニアスＤＮＡ抽出試薬、関東化学社製）を用い、核酸の抽出およびＰＣＲ法の鋳型の調製を同製品の製品マニュアルに従って行った以外は、前記実施例４と同様にして、ＰＣＲ法の鋳型を調製し、当該鋳型の増幅を行った。
【００８４】
増幅産物をアガロース電気泳動に供した結果を図６に示す。
図中、黄色ブドウ球菌、腸管出血性大腸菌Ｏ１５７、出芽酵母のいずれについても、各レーンは下記の構成とした。
レーンＭ：  １００ｂｐ  ＤＮＡ  Ｌａｄｄｅｒ
レーン１：  従来の核酸抽出試薬キット（シカジーニアスＤＮＡ抽出試薬、関東化学社製）を用いて調製した試料
レーン２：  上記試薬に代えて超純水を用いて調製した試料（対照）
図６に示された結果において、黄色ブドウ球菌およびＯ１５７の被検試料においては、実施例４（図５）と同等の増幅産物由来のバンドが検出されたが、出芽酵母の被検試料においては、増幅産物量が有意に少ないことが確認された。
【００８５】
（実施例５および参考例１）
本発明の核酸抽出試薬キットまたは既存製品（セルイーズ  マウステール）を用いた、動物細胞からのＤＮＡの抽出
マウステールを約３ｍｍ切り取ったものを動物細胞の被検試料として用いた。
試薬１を用いて、増幅対象をＤＮＡとして被検試料から核酸の抽出を行い、ＰＣＲ法の鋳型を調製した（実施例５）。一方、既存製品（セルイーズ  マウステール；関東化学）のマニュアルに従って被検試料から核酸の抽出を行い、ＰＣＲ法の鋳型を調製し、これを対照として用いた（参考例１）。
【００８６】
次に、４９４ｂｐのＰＣＲ産物を得るために、センスプライマー（配列番号７：bGlo-F、5’-CCAATCTGCTCACACAGGATAGAGAGGGCAGG-3’）およびアンチセンスプライマー（配列番号８：bGlo-R5’-CCTTGAGGCTGTCCAAGTGATTCAGGCCATCG-3’）を用いてβ−グロビン遺伝子を増幅した。まず、１０μＭ  フォワードプライマー  ０．４μＬ、１０μＭ  リバースプライマー  ０．４μＬ、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２  １．６μＬ、各２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  １．６μＬ、１０×Ｅｘ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｍｇ２＋  ｆｒｅｅ、タカラバイオ）２μＬ、ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（タカラバイオ）０．１μＬ、超純水で３倍に希釈された鋳型１．２μＬおよび超純水１２．７μＬを混合して全量２０μＬのＰＣＲ反応混合液を調製した。そして、ＰＣＲを次のような温度条件で行った：９４℃、１分→〔９４℃、３０秒→６０℃、３０秒→７２℃、３０秒〕×３５回→７２℃、４分。各増幅産物をアガロースゲル電気泳動に供した結果を図７に示す。
図中、本発明の核酸酸抽出キットおよび既存製品（セルイーズ  マウステール；関東化学）のいずれについても、各レーンは下記の構成とした。
レーンＭ：  １００ｂｐ  ＤＮＡ  Ｌａｄｄｅｒ
レーン１：  本発明の試薬１もしくは既存製品を用いて調製した試料
レーン２：  本発明の試薬１もしくは既存製品の代わりに超純水を用いて調製した試料（対照）
【００８７】
図７に示された結果において、本発明の核酸抽出試薬キットを用いた場合（実施例５）の増幅産物量は、マウステール、牛肉、豚肉等の生体試料（動物細胞）に対象を特化した既存製品（セルイーズ  マウステール；関東化学）の場合（参考例１）と同等以上であったことが確認された。
【００８８】
（実施例６）
・黄色ブドウ球菌（グラム陽性菌）、大腸菌Ｏ１５７（グラム陰性菌）、真菌（出芽酵母）からのＲＮＡの抽出
黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、ＮＢＲＣ  １０２１４１）と大腸菌Ｏ１５７（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、ＡＴＣＣ  ３５１５０）をＳＣＤ寒天培地に、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、ＡＴＣＣ  ９７６３）をサブローブドウ糖寒天培地に播種し、３７℃で一晩好気培養した。得られた各コロニーを被検試料として、上記試薬１および試薬を用いて、増幅対象をＲＮＡとして被検試料から核酸の抽出を行い、ＲＴ−ＰＣＲ法の鋳型を調製した。
【００８９】
２μＭ  リバースプライマー（ＰＣＲ反応混合液調製時に使用するものと同じ）０．５μＬ、５×ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  Ｂｕｆｆｅｒ  ｆｏｒ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ（タカラバイオ）２μＬ、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘ  Ｉ（タカラバイオ）０．５μＬ、鋳型５μＬおよび超純水２μＬを混合して全量１０μＬの逆転写反応混合液を調製した。次に、逆転写反応を次のような温度条件で行った：４２℃、１５分→８５℃、５秒。これにより逆転写反応済みの鋳型を調製した。
【００９０】
次に、１０μＭ  フォワードプライマー  １μＬ、１０μＭ  リバースプライマー  １μＬ、５×ＡｐｔａＴａｑ  ＤＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ（ロシュ）４μＬ、逆転写反応済みの鋳型２μＬ、超純水１２μＬを混合して全量２０μＬのＰＣＲ反応混合液を調製し、これをＰＣＲ反応によるＤＮＡの増幅反応に供した。それぞれの被検試料におけるプライマーと温度条件を以下に示す。
【００９１】
黄色ブドウ球菌については、３２４ｂｐのＲＴ−ＰＣＲ産物を得るために、センスプライマー（配列番号３：S4F、5’-GACAACTAGAGATAGAGCCTTCC-3’）およびアンチセンスプライマー（配列番号４：S4R、5’-AGTCGAGTTGCAGACTAC-3’）を用いて１６Ｓ  ｒＲＮＡの配列を増幅した。ＰＣＲは次のような温度条件で行った：〔９４℃、３０秒→５４℃、９０秒→７２℃、６０秒〕×３０回→７２℃、７分。
【００９２】
Ｏ１５７については、１８０ｂｐのＲＴ−ＰＣＲ産物を得るために、センスプライマー（配列番号５：stx1F、5’-ATAAATCGCCATTCGTTGACTAC-3’）およびアンチセンスプライマー（配列番号６：stx1R、5’-AGAACGCCCACTGAGATCATC-3’）を用いてベロ毒素１遺伝子配列を増幅した。ＰＣＲは次のような温度条件で行った：〔９４℃、３０秒→６２℃、９０秒→７２℃、６０秒〕×３０回→７２℃、７分。
【００９３】
出芽酵母については、７５６ｂｐのＲＴ−ＰＣＲ産物を得るために、センスプライマー（配列番号９：ACT1f、5’-TACGTTTCCATCCAAGCCGTT-3’）およびアンチセンスプライマー（配列番号１０：ACT1r、5’-AACATACGCGCACAAAAGCAGA-3’）を用いてＵＲＡ３遺伝子配列を増幅した。ＰＣＲは次のような温度条件で行った：〔９４℃、３０秒→５３℃、９０秒→７２℃、６０秒〕×３０回→７２℃、７分。
【００９４】
増幅産物をアガロースゲル電気泳動に供した結果を図８に示す。
図中、黄色ブドウ球菌、腸管出血性大腸菌Ｏ１５７、出芽酵母のいずれについても、各レーンは下記の構成とした。
レーンＭ：  １００ｂｐ  ＤＮＡ  Ｌａｄｄｅｒ
レーン１：  本発明の試薬１および試薬２を用いて調製した試料（PrimeScript
RT Enzyme Mix Iを添加した状態）
レーン２：  本発明の試薬１および試薬２を用いて調製した試料（PrimeScript
RT Enzyme Mix Iを添加しなかった状態）
レーン３：  本発明の試薬１を超純水に置き換え、さらに試薬２を用いて調製した試料（PrimeScript RT Enzyme Mix Iを添加した状態）
レーン４：  本発明の試薬１を超純水に置き換え、さらに試薬２を用いて調製した試料（PrimeScript RT Enzyme Mix Iを添加しなかった状態）
図８に示された結果において、３種全ての被検試料において増幅産物由来のバンドが確認された。
【００９５】
（実施例７および比較例２）
・血液成分が混入した真菌（出芽酵母）試料における核酸の抽出
出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、ＡＴＣＣ  ９７６３）をサブローブドウ糖寒天培地に播種し、３７℃で一晩好気培養した。得られたコロニー１μＬをヒトプール血清１０μＬに懸濁し、この全量を被検試料とした。
【００９６】
この被検試料について、ＤＮＡの抽出およびＰＣＲ法を実施例４と同様に、ＲＮＡの抽出およびＲＴ−ＰＣＲ法を実施例６と同様に行い、増幅産物を得た（実施例７）。対照として、本発明の核酸抽出試薬キットに変えて既存製品（シカジーニアスＤＮＡ抽出試薬；関東化学）を用いて、比較例１と同様に、ＰＣＲ用の鋳型を調製した。なお、ＲＮＡは同既存製品の適用外のためＲＴ−ＰＣＲ鋳型の調製は実施していない。増幅産物をアガロースゲル電気泳動に供した結果を図９（ＰＣＲ）および図１０（ＲＴ−ＰＣＲ）に示す。
図９において、本発明の核酸抽出試薬キットおよび既存製品（シカジーニアスＤＮＡ抽出試薬；関東化学）のいずれについても、各レーンは下記の構成とした。
レーンＭ：  １００ｂｐ  ＤＮＡ  Ｌａｄｄｅｒ
レーン１：  本発明の試薬１もしくは既存製品を用いて調製した試料
レーン２：  本発明の試薬１もしくは既存製品の代わりに超純水を用いて調製した試料
また、図１０において、各レーンは下記の構成とした。
レーンＭ：  １００ｂｐ  ＤＮＡ  Ｌａｄｄｅｒ
レーン１：  本発明の核酸抽出試薬キット（試薬１および試薬２）を用いて調製した試料（PrimeScript RT Enzyme Mix Iを添加した状態）
レーン２：  本発明の核酸抽出試薬キット（試薬１および試薬２）を用いて調製した試料（PrimeScript RT Enzyme Mix Iを添加しなかった状態）
レーン３：  本発明の試薬１を超純水に置き換え、さらに試薬２を用いて調製した試料（PrimeScript RT Enzyme Mix Iを添加した状態）
レーン４：  本発明の試薬１を超純水に置き換え、さらに試薬２を用いて調製した試料（PrimeScript RT Enzyme Mix Iを添加しなかった状態）
【００９７】
図９および図１０に示される結果において、本発明の核酸抽出試薬キットを用いた場合には、血清（血液成分）が混入していてもＤＮＡやＲＮＡが検出できた。一方、既存製品を用いた対照実験では、ＤＮＡは検出されなかった。これにより、夾雑物の有無にかかわらず、本発明の方法により、核酸の抽出およびそれに引き続く対象となる核酸配列の増幅が可能となることが確認できた。
【００９８】
以上により、本発明の核酸抽出試薬キットおよび本発明の核酸抽出方法を用いた場合には、多種多様な被検試料に適用可能であり、ＰＣＲ法やＲＴ−ＰＣＲ法等の遺伝子増幅反応に直接使用可能な核酸鋳型を、簡便かつ迅速に、好ましくは温和な条件で、調製することができることが確認できた。
【図１】
0005924888.tif 000002
【図２】
0005924888.tif 000003
【図３】
0005924888.tif 000004
【図４】
0005924888.tif 000005
【図５】
0005924888.tif 000006
【図６】
0005924888.tif 000007
【図７】
0005924888.tif 000008
【図８】
0005924888.tif 000009
【図９】
0005924888.tif 000010
【図１０】
0005924888.tif 000011
【配列表】
0005924888000001.app