(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者由来の膵液サンプルにおいて、MUC1遺伝子の配列番号１に示される塩基配列から成る領域におけるCpG部位、MUC2遺伝子の配列番号２に示される塩基配列から成る領域におけるCpG部位、MUC4遺伝子の配列番号３に示される塩基配列から成る領域におけるCpG部位及びMUC5AC遺伝子の配列番号４に示される塩基配列から成る領域におけるCpG部位のメチル化度を検出する第１工程と、
前記メチル化度を指標として、膵腫瘍を膵癌、膵管内乳頭粘液性腫瘍・胃型及び膵管内乳頭粘液性腫瘍・腸型から成る群より選択される膵腫瘍の病型に分類する第２工程であって、前記MUC1遺伝子の領域におけるCpG部位について50％以上、前記MUC2遺伝子の領域におけるCpG部位について70％以上、前記MUC4遺伝子の領域におけるCpG部位について50％以上及び前記MUC5AC遺伝子の領域におけるCpG部位について60％以上の割合でメチル化されている場合に該CpG部位についてメチル化されている状態と判定し、膵腫瘍を、
(a) 前記MUC1遺伝子の領域におけるCpG部位、前記MUC2遺伝子の領域におけるCpG部位、前記MUC4遺伝子の領域におけるCpG部位及び前記MUC5AC遺伝子の領域におけるCpG部位についてメチル化されている状態である場合に、膵管内乳頭粘液性腫瘍・胃型に分類し、
(b) 前記MUC1遺伝子の領域におけるCpG部位、前記MUC2遺伝子の領域におけるCpG部位、前記MUC4遺伝子の領域におけるCpG部位及び前記MUC5AC遺伝子の領域におけるCpG部位について非メチル化されている状態である場合に、膵管内乳頭粘液性腫瘍・腸型に分類し、又は、
(c) 前記MUC1遺伝子の領域におけるCpG部位、前記MUC2遺伝子の領域におけるCpG部位及び前記MUC4遺伝子の領域におけるCpG部位について非メチル化されている状態であり、前記MUC5AC遺伝子の領域におけるCpG部位についてメチル化されている状態である場合に、膵癌に分類する、
前記第２工程と、
を含む、膵腫瘍の病型を判定するための検査方法。
【請求項２】
第１工程が、
膵液サンプル由来のDNAを重亜硫酸塩処理に供する工程と、
前記MUC1遺伝子の領域、前記MUC2遺伝子の領域、前記MUC4遺伝子の領域及び前記MUC5AC遺伝子の領域の外側の領域に対応する各第1プライマーセットを用いて重亜硫酸塩処理後のDNAを第1のPCRに供する工程と、
前記MUC1遺伝子の領域、前記MUC2遺伝子の領域、前記MUC4遺伝子の領域及び前記MUC5AC遺伝子の領域に対応する各第2プライマーセットを用いて第1のPCR後の増幅DNAを第2のPCRに供する工程と、
第2のPCR後の増幅DNAを変性剤濃度勾配ゲル電気泳動に供する工程と、
を含み、各第2プライマーセットのプライマーのアニーリング位置は、前記MUC1遺伝子の領域、前記MUC2遺伝子の領域、前記MUC4遺伝子の領域及び前記MUC5AC遺伝子の領域に対して各第1プライマーセットのプライマーのアニーリング位置の内側に存在する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
各第2プライマーセットの一方のプライマーは、5'側にGC-clamp配列を有する、請求項２記載の方法。
【請求項４】
変性剤濃度勾配ゲルが濃度勾配として変性剤濃度勾配のみを有する、請求項２又は３記載の方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項記載の方法を実施するために用いることを特徴とする、膵腫瘍の病型を判定するための検査キットであって、
請求項１〜４のいずれか１項記載の方法を実施するためのプライマーセットと、
膵腫瘍を、
(a) 前記MUC1遺伝子の領域におけるCpG部位、前記MUC2遺伝子の領域におけるCpG部位、前記MUC4遺伝子の領域におけるCpG部位及び前記MUC5AC遺伝子の領域におけるCpG部位についてメチル化されている状態である場合に、膵管内乳頭粘液性腫瘍・胃型に分類し、
(b) 前記MUC1遺伝子の領域におけるCpG部位、前記MUC2遺伝子の領域におけるCpG部位、前記MUC4遺伝子の領域におけるCpG部位及び前記MUC5AC遺伝子の領域におけるCpG部位について非メチル化されている状態である場合に、膵管内乳頭粘液性腫瘍・腸型に分類し、又は、
(c) 前記MUC1遺伝子の領域におけるCpG部位、前記MUC2遺伝子の領域におけるCpG部位及び前記MUC4遺伝子の領域におけるCpG部位について非メチル化されている状態であり、前記MUC5AC遺伝子の領域におけるCpG部位についてメチル化されている状態である場合に、膵癌に分類する、
ことを説明する膵腫瘍の病型の判定のための説明書と、
を含む、前記キット。
【請求項６】
前記MUC1遺伝子の領域、前記MUC2遺伝子の領域、前記MUC4遺伝子の領域及び前記MUC5AC遺伝子の領域の外側の領域に対応する各第1プライマーセットと、前記MUC1遺伝子の領域、前記MUC2遺伝子の領域、前記MUC4遺伝子の領域及び前記MUC5AC遺伝子の領域に対応する各第2プライマーセットとを含み、各第2プライマーセットのプライマーのアニーリング位置が、前記MUC1遺伝子の領域、前記MUC2遺伝子の領域、前記MUC4遺伝子の領域及び前記MUC5AC遺伝子の領域に対して各第1プライマーセットのプライマーのアニーリング位置の内側に存在する、請求項５記載のキット。
【請求項７】
配列番号１４に示される塩基配列から成るプライマーと配列番号１５に示される塩基配列から成るプライマーとから成る前記MUC1遺伝子の領域の外側の領域に対応する第1プライマーセット、
配列番号１６に示される塩基配列から成るプライマーと配列番号１７に示される塩基配列から成るプライマーとから成る前記MUC1遺伝子の領域に対応する第2プライマーセット、
配列番号１８に示される塩基配列から成るプライマーと配列番号１９に示される塩基配列から成るプライマーとから成る前記MUC2遺伝子の領域の外側の領域に対応する第1プライマーセット、
配列番号２０に示される塩基配列から成るプライマーと配列番号２１に示される塩基配列から成るプライマーとから成る前記MUC2遺伝子の領域に対応する第2プライマーセット、
配列番号２２に示される塩基配列から成るプライマーと配列番号２３に示される塩基配列から成るプライマーとから成る前記MUC4遺伝子の領域の外側の領域に対応する第1プライマーセット、
配列番号２４に示される塩基配列から成るプライマーと配列番号２５に示される塩基配列から成るプライマーとから成る前記MUC4遺伝子の領域に対応する第2プライマーセット、
配列番号２６に示される塩基配列から成るプライマーと配列番号２７に示される塩基配列から成るプライマーとから成る前記MUC5AC遺伝子の領域の外側の領域に対応する第1プライマーセット、及び、
配列番号２８に示される塩基配列から成るプライマーと配列番号２９に示される塩基配列から成るプライマーとから成る前記MUC5AC遺伝子の領域に対応する第2プライマーセット、
を含む、請求項５又は６記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば膵液サンプルを利用した膵腫瘍の病型診断方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
胃癌や大腸癌等の消化管の癌の大半は、エックス線造影や内視鏡検査等の発達により早期のうちに発見及び治療できるようになり、個々人の面倒さや検査費用といった社会的なシステムを整備することにより克服できる、いわば、「人類の手中」にある癌になってきた。
しかしながら、膵癌は、ＰＥＴ−ＣＴ等の最新の機器を用いても、未だに早期発見どころか、治癒を望める段階での診断が不可能であることが多く、難治性癌の代表となっている。また、腫瘍の存在が画像診断で判明しても、その生検等による病理学的な質的診断が難しく、「高度な悪性腫瘍であり即侵襲性の高い手術が必要」か、「良性であり経過観察」かの判断に難渋するのも、膵胆管系の腫瘍の特徴である。従って、膵癌の早期診断及び病型診断方法が切望されている。
一方、ＤＮＡのメチル化を検出及び分析し、癌の診断を行う方法が一般的に知られている。
例えば、特許文献１は、Ｈ１９遺伝子、ＩＧＦ２遺伝子等のターゲット遺伝子のメチル化状態の変化又はその多型性に関して、生物学的試料を分析する工程を含む、被験体が新生物性又は細胞増殖障害を発症する素因を決定する方法を開示する。
特許文献２は、対象からの試料におけるメチル化ＳＰＡＲＣ核酸分子又はその変異体の検出を含む、癌を診断するための方法を開示する。
特許文献３は、対象由来の核酸含有標本を、少なくとも１つの遺伝子又は該遺伝子の関連調節領域のメチル化状態の判定を与える作用因子と接触させる工程、遺伝子又は調節領域の諸領域の異常メチル化を同定し、それによって対象における膵癌を検出する工程を含む、対象における膵癌を検出する方法を開示する。
特許文献４〜１１は、哺乳動物由来の検体に含まれる標的遺伝子のメチル化頻度又はそれに相関関係がある指標値を測定する工程と、測定されたメチル化頻度又はそれに相関関係がある指標値と、対照とを比較することにより得られる差異に基づき検体の癌化度を判定する工程とを含む、哺乳動物由来の検体の癌化度を評価する方法を開示する。特許文献４〜１１において、標的遺伝子としては、ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ  ａｎｄ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ｄｏｍａｉｎ  ２３遺伝子、ＨＡＮＤ１遺伝子、Ｓｏｌｕｔｅｃａｒｒｉｅｒ  ｆａｍｉｌｙ  ６  ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ｎｏｒａｄｒｅｎａｌｉｎ  ｍｅｍｂｅｒ  ２遺伝子、Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ  ａｎｄ  ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ−ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ遺伝子、Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ７遺伝子、Ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ３遺伝子、Ｆｉｂｒｉｌｌｉｎ２遺伝子及びｐ５３−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｇｅｎｅ  ２遺伝子が挙げられている。
しかしながら、特定の遺伝子又はその調節領域のメチル化度を検出することで、膵腫瘍の病型を診断できることは、従来において知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特表２００８−５０４０１８号公報
【特許文献２】特表２００７−５２４３９３号公報
【特許文献３】特表２００７−５２４３６９号公報
【特許文献４】特開２００５−１１０６４５号公報
【特許文献５】特開２００４−１３５６６１号公報
【特許文献６】特開２００５−０８７０５０号公報
【特許文献７】特開２００５−０８７０４９号公報
【特許文献８】特開２００５−０８７０４８号公報
【特許文献９】特開２００５−０８７０４７号公報
【特許文献１０】特開２００５−０８７０４６号公報
【特許文献１１】特開２００５−０８７０４５号公報
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、上述した実情に鑑み、膵腫瘍の病型を早期に診断できる方法を提供することを目的とする。
上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、被験者由来の膵液サンプルにおいてムチンコアタンパク質をコードする遺伝子の５’側非翻訳領域又は５’側非翻訳領域と翻訳領域とを含む領域のメチル化度を検出することにより、膵腫瘍の病型を診断できることを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明は、以下を包含する。
（１）被験者由来の膵液サンプルにおいて、ムチンコアタンパク質をコードする遺伝子の５’側非翻訳領域又は５’側非翻訳領域と翻訳領域とを含む領域のメチル化度を検出する第１工程と、前記メチル化度を指標として、膵腫瘍を膵癌、膵管内乳頭粘液性腫瘍・胃型、膵管内乳頭粘液性腫瘍・腸型及び膵管内乳頭粘液性腫瘍・膵胆管上皮型から成る群より選択される膵腫瘍の病型に分類する第２工程とを含む、膵腫瘍の病型を判定するための検査方法。
（２）ムチンコアタンパク質をコードする遺伝子がＭＵＣ１遺伝子、ＭＵＣ２遺伝子、ＭＵＣ４遺伝子及びＭＵＣ５ＡＣ遺伝子から成る群より選択される、（１）記載の方法。
（３）ムチンコアタンパク質をコードする遺伝子がＭＵＣ１遺伝子、ＭＵＣ２遺伝子、ＭＵＣ４遺伝子及びＭＵＣ５ＡＣ遺伝子を含む遺伝子セットである、（２）記載の方法。
（４）ＭＵＣ１遺伝子、ＭＵＣ２遺伝子、ＭＵＣ４遺伝子及びＭＵＣ５ＡＣ遺伝子の５’側非翻訳領域又は５’側非翻訳領域と翻訳領域とを含む領域がそれぞれ配列番号１〜４に示される塩基配列中に存在する１以上のＣｐＧ部位である、（２）又は（３）記載の方法。
（５）ＭＵＣ１遺伝子、ＭＵＣ２遺伝子、ＭＵＣ４遺伝子及びＭＵＣ５ＡＣ遺伝子の５’側非翻訳領域又は５’側非翻訳領域と翻訳領域とを含む領域がそれぞれ配列番号１〜４に示される塩基配列を含む、（２）〜（４）のいずれか１記載の方法。
（６）第２工程において、膵腫瘍を、
（ａ）ＭＵＣ１遺伝子、ＭＵＣ２遺伝子、ＭＵＣ４遺伝子及びＭＵＣ５ＡＣ遺伝子の５’側非翻訳領域又は５’側非翻訳領域と翻訳領域とを含む領域の全てがメチル化である場合に、膵管内乳頭粘液性腫瘍・胃型に分類し、
（ｂ）ＭＵＣ１遺伝子、ＭＵＣ２遺伝子、ＭＵＣ４遺伝子及びＭＵＣ５ＡＣ遺伝子の５’側非翻訳領域又は５’側非翻訳領域と翻訳領域とを含む領域の全てが非メチル化である場合に、膵管内乳頭粘液性腫瘍・腸型に分類し、
（ｃ）ＭＵＣ１遺伝子、ＭＵＣ２遺伝子及びＭＵＣ４遺伝子の５’側非翻訳領域又は５’側非翻訳領域と翻訳領域とを含む領域が非メチル化であり、ＭＵＣ５ＡＣ遺伝子の５’側非翻訳領域又は５’側非翻訳領域と翻訳領域とを含む領域がメチル化である場合に、膵癌に分類し、又は、
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）以外の場合に、膵管内乳頭粘液性腫瘍・膵胆管上皮型に分類する、（３）〜（５）のいずれか１記載の方法。
（７）第１工程が、膵液サンプル由来のＤＮＡを重亜硫酸塩処理に供する工程と、ムチンコアタンパク質をコードする遺伝子の５’側非翻訳領域又は５’側非翻訳領域と翻訳領域とを含む領域の外側の領域に対応する第１プライマーセットを用いて重亜硫酸塩処理後のＤＮＡを第１のＰＣＲに供する工程と、ムチンコアタンパク質をコードする遺伝子の５’側非翻訳領域又は５’側非翻訳領域と翻訳領域とを含む領域に対応する第２プライマーセットを用いて第１のＰＣＲ後の増幅ＤＮＡを第２のＰＣＲに供する工程と、第２のＰＣＲ後の増幅ＤＮＡを変性剤濃度勾配ゲル電気泳動に供する工程とを含み、第２プライマーセットのプライマーのアニーリング位置は、ムチンコアタンパク質をコードする遺伝子の５’側非翻訳領域又は５’側非翻訳領域と翻訳領域とを含む領域に対して第１プライマーセットのプライマーのアニーリング位置の内側に存在する、（１）〜（６）のいずれか１記載の方法。
（８）第２プライマーセットの一方のプライマーは、５’側にＧＣ−ｃｌａｍｐ配列を有する、（７）記載の方法。
（９）変性剤濃度勾配ゲルが濃度勾配として変性剤濃度勾配のみを有する、（７）又は（８）記載の方法。
（１０）（１）〜（９）のいずれか１記載の方法を実施するために用いることを特徴とする、膵腫瘍の病型を判定するための検査キット。
（１１）ムチンコアタンパク質をコードする遺伝子の５’側非翻訳領域又は５’側非翻訳領域と翻訳領域とを含む領域の外側の領域に対応する第１プライマーセットと、ムチンコアタンパク質をコードする遺伝子の５’側非翻訳領域又は５’側非翻訳領域と翻訳領域とを含む領域に対応する第２プライマーセットとを含み、第２プライマーセットのプライマーのアニーリング位置が、ムチンコアタンパク質をコードする遺伝子の５’側非翻訳領域又は５’側非翻訳領域と翻訳領域とを含む領域に対して第１プライマーセットのプライマーのアニーリング位置の内側に存在する、（１０）記載のキット。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２０１１−１４４８４７号の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
図１Ａは、被メチル化によってヒトムチンコアタンパク質１（ＭＵＣ１）遺伝子の発現を調節するプロモーター領域の配列及び隣接する翻訳領域の配列（配列番号５）を示す。
図１Ｂは、被メチル化によってヒトＭＵＣ１遺伝子の発現を調節するプロモーター領域の配列及び隣接する翻訳領域の配列（配列番号６；ただし、Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ処理後のＤＮＡ配列であり、且つ非メチル化シトシンから変換されたウラシルをチミンで表示する）を示す。
図２Ａは、被メチル化によってヒトムチンコアタンパク質２（ＭＵＣ２）遺伝子の発現を調節するプロモーター領域の配列及び隣接する翻訳領域の配列（配列番号７）を示す。
図２Ｂは、被メチル化によってヒトＭＵＣ２遺伝子の発現を調節するプロモーター領域の配列及び隣接する翻訳領域の配列（配列番号８；ただし、Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ処理後のＤＮＡ配列であり、且つ非メチル化シトシンから変換されたウラシルをチミンで表示する）を示す。
図３Ａは、被メチル化によってヒトムチンコアタンパク質４（ＭＵＣ４）遺伝子の発現を調節するプロモーター領域の配列及び隣接する翻訳領域の配列（配列番号９）を示す。
図３Ｂは、被メチル化によってヒトＭＵＣ４遺伝子の発現を調節するプロモーター領域の配列及び隣接する翻訳領域の配列（配列番号１０；ただし、Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ処理後のＤＮＡ配列であり、且つ非メチル化シトシンから変換されたウラシルをチミンで表示する）を示す。
図４Ａは、被メチル化によってヒトムチンコアタンパク質５ＡＣ（ＭＵＣ５ＡＣ）遺伝子の発現を調節するプロモーター領域の配列（配列番号１１）を示す。
図４Ｂは、被メチル化によってヒトＭＵＣ５ＡＣ遺伝子の発現を調節するプロモーター領域の配列（配列番号１２；ただし、Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ処理後のＤＮＡ配列であり、且つ非メチル化シトシンから変換されたウラシルをチミンで表示する）を示す。
図５は、ＩＰＭＮ−ｇａｓｔｒｉｃにおけるメチル化解析と免疫染色の結果を示す。
図６−１は、ＩＰＭＮ−ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌにおけるメチル化解析と免疫染色の結果を示す。
図６−２は、ＩＰＭＮ−ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌにおけるメチル化解析と免疫染色の結果を示す。
図７−１は、ＩＰＭＮ−ＰＢにおけるメチル化解析と免疫染色の結果を示す。
図７−２は、ＩＰＭＮ−ＰＢにおけるメチル化解析と免疫染色の結果を示す。
図８は、ＰＤＡＣにおけるメチル化解析と免疫染色の結果を示す。
図９は、ＭＵＣ１遺伝子のメチル化解析に基づく統計解析の結果を示す。
図１０は、ＭＵＣ２遺伝子のメチル化解析に基づく統計解析の結果を示す。
図１１は、ＭＵＣ４遺伝子のメチル化解析に基づく統計解析の結果を示す。
図１２は、ＭＵＣ５ＡＣ遺伝子のメチル化解析に基づく統計解析の結果を示す。
図１３は、４種のムチン遺伝子のメチル化解析の結果に基づく病型予測を示す。
図１４は、４種のムチン遺伝子のメチル化解析の結果に基づく病型予測を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係る膵腫瘍の病型を判定するための検査方法（以下、「本方法」と称する）は、膵腫瘍患者等の被験者由来の膵液サンプルにおいて、ムチンコアタンパク質をコードする遺伝子の５’側非翻訳領域又は５’側非翻訳領域と翻訳領域とを含む領域のメチル化度を検出する第１工程と、当該メチル化度を指標として、膵腫瘍を膵癌、膵管内乳頭粘液性腫瘍・胃型、膵管内乳頭粘液性腫瘍・腸型及び膵管内乳頭粘液性腫瘍・膵胆管上皮型から成る群より選択される膵腫瘍の病型に分類する第２工程とを含む。換言すれば、本方法は、膵腫瘍の病型の診断方法、膵腫瘍の病型を判定するための評価方法、又は膵腫瘍の病型を判定するための情報を収集する方法とすることができる。本方法によれば、低侵襲性で得られる膵液サンプルにおいて、膵腫瘍の病型を早期に診断することができる。
ここで、ムチンコアタンパク質をコードする遺伝子（又はムチン遺伝子とも称される）としては、例えばムチンコアタンパク質（ＭＵＣ）１遺伝子、ＭＵＣ２遺伝子、ＭＵＣ４遺伝子及びＭＵＣ５ＡＣ遺伝子が挙げられる。特に、本方法における膵腫瘍の分類工程（第２工程）において、膵腫瘍を膵癌、膵管内乳頭粘液性腫瘍・胃型、膵管内乳頭粘液性腫瘍・腸型及び膵管内乳頭粘液性腫瘍・膵胆管上皮型から成る群より選択される病型に高度に分類すべく、ＭＵＣ１遺伝子、ＭＵＣ２遺伝子、ＭＵＣ４遺伝子及びＭＵＣ５ＡＣ遺伝子を含む遺伝子セットを、ムチンコアタンパク質をコードする遺伝子とすることが好ましい。
また、メチル化度検出の標的配列（標的領域）であるムチンコアタンパク質をコードする遺伝子の５’側非翻訳領域は、ムチンコアタンパク質をコードする遺伝子の５’側上流に位置する非翻訳領域（ＵＴＲ）であり、特にムチンコアタンパク質をコードする遺伝子のプロモーター領域を含む領域である。さらに、ムチンコアタンパク質をコードする遺伝子の５’側非翻訳領域と翻訳領域とを含む領域は、プロモーター領域等の５’非翻訳領域と当該５’非翻訳領域に隣接する翻訳領域（コーディング領域）とを含む領域である。
本方法においては、ムチンコアタンパク質をコードする遺伝子のプロモーター領域又は当該プロモーター領域と翻訳領域とを含む領域に存在する１以上（１又は複数）のＣｐＧ部位を、メチル化度を検出すべき標的配列とすることができる。ここで、ＣｐＧ部位とは、５’−シトシン−グアニン−３’（５’−ＣＧ−３’）のジヌクレオチドを意味する。２以上のＣｐＧ部位を標的配列とする場合には、各ＣｐＧ部位を個別に、又は２以上のＣｐＧ部位を含む領域を標的配列としてもよい。
図１〜４は、それぞれ被メチル化によってヒトＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ４及びＭＵＣ５ＡＣ遺伝子の発現を調節するプロモーター領域の配列及び隣接する翻訳領域の配列を示す。図１〜４において、（ＴＩＳ）は転写開始部位（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ）を示し、四角で囲こまれたＣＧは被メチル部位（ＣｐＧ部位）を示し、太い四角で囲まれたＣＧは、ヒトＭＵＣ遺伝子の発現に関与する被メチル化部位（ＣｐＧ部位）を示す。また、図１Ｂ、図２Ｂ、図３Ｂ及び図４Ｂにおいて、イタリックのＴは、Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ処理により非メチル化シトシンから変換されたウラシルをチミンで表示したものである。なお、転写開始部位（ＴＩＳ）以降の塩基配列は、翻訳領域（コーディング領域）である。
図１Ａは、被メチル化によってヒトＭＵＣ１遺伝子の発現を調節するプロモーター領域の配列及び隣接する翻訳領域の配列（配列番号５）を示す。図１Ｂは、当該配列のＢｉｓｕｌｆｉｔｅ処理後のＤＮＡ配列（配列番号６）を示し、非メチル化シトシンから変換されたウラシルをチミンで表示する。図１において、下記で説明する第２プライマーセットに相当するＰｒｉｍｅｒ  １−３とＰｒｉｍｅｒ  １−４との間の領域（配列番号１）は、ＣｐＧ部位（又はＣｐＧアイランド）１７２−１８１を有する（Ｎｏｒｉｓｈｉｇｅ  Ｙａｍａｄａ，Ｙｕｋａｒｉ  Ｎｉｓｈｉｄａ，Ｈｉｄｅａｋｉ  Ｔｓｕｔｓｕｍｉｄａ，Ｔｏｍｏｆｕｍｉ  Ｈａｍａｄａ，Ｍａｓａｍｉｃｈｉ  Ｇｏｔｏ，Ｍｉｃｈｉｙｏ  Ｈｉｇａｓｈｉ，Ｍｉｔｓｕｈａｒｕ  Ｎｏｍｏｔｏ  ａｎｄ  Ｓｕｇｕｒｕ  Ｙｏｎｅｚａｗａ（２００８）ＭＵＣ１  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｓ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｈｉｓｔｏｎｅ  Ｈ３−Ｋ９  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６８（８）：２７０８−１６と同様に、ＣｐＧ部位の番号は、ヒトＭＵＣ１遺伝子の推定プロモーター上流（当該遺伝子の転写開始点より上流２，７５３ｂｐ）より順にナンバリングされている）。
図２Ａは、被メチル化によってヒトＭＵＣ２遺伝子の発現を調節するプロモーター領域の配列及び隣接する翻訳領域の配列（配列番号７）を示す。図２Ｂは、当該配列のＢｉｓｕｌｆｉｔｅ処理後のＤＮＡ配列（配列番号８）を示し、非メチル化シトシンから変換されたウラシルをチミンで表示する。図２において、下記で説明する第２プライマーセットに相当するＰｒｉｍｅｒ  ２−３とＰｒｉｍｅｒ  ２−４との間の領域（配列番号２）は、ＣｐＧ部位３７−４３を有する（Ｎｏｒｉｓｈｉｇｅ  Ｙａｍａｄａ，Ｔｏｍｏｆｕｍｉ  Ｈａｍａｄａ，Ｍａｓａｍｉｃｈｉ  Ｇｏｔｏ，Ｈｉｄｅａｋｉ  Ｔｓｕｔｓｕｍｉｄａ，Ｍｉｃｈｉｙｏ  Ｈｉｇａｓｈｉ，Ｍｉｔｓｕｈａｒｕ  Ｎｏｍｏｔｏ  ａｎｄ  Ｓｕｇｕｒｕ  Ｙｏｎｅｚａｗａ（２００６）ＭＵＣ２  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｓ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ｈｉｓｔｏｎｅ  Ｈ３  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１１９（８）：１８５０−７と同様に、ＣｐＧ部位の番号は、ヒトＭＵＣ２遺伝子の推定プロモーター上流（当該遺伝子の転写開始点より上流１，９８９ｂｐ）より順にナンバリングされている）。
図３Ａは、被メチル化によってヒトＭＵＣ４遺伝子の発現を調節するプロモーター領域の配列及び隣接する翻訳領域の配列（配列番号９）を示す。図３Ｂは、当該配列のＢｉｓｕｌｆｉｔｅ処理後のＤＮＡ配列（配列番号１０）を示し、非メチル化シトシンから変換されたウラシルをチミンで表示する。図３において、下記で説明する第２プライマーセットに相当するＰｒｉｍｅｒ  ４−３とＰｒｉｍｅｒ  ４−４との間の領域（配列番号３）は、ＣｐＧ部位１０８−１１８を有する（Ｎｏｒｉｓｈｉｇｅ  Ｙａｍａｄａ，Ｙｕｋａｒｉ  Ｎｉｓｈｉｄａ，Ｈｉｄｅａｋｉ  Ｔｓｕｔｓｕｍｉｄａ，Ｍａｓａｍｉｃｈｉ  Ｇｏｔｏ，Ｍｉｃｈｉｙｏ  Ｈｉｇａｓｈｉ，Ｍｉｔｓｕｈａｒｕ  Ｎｏｍｏｔｏ  ａｎｄ  Ｓｕｇｕｒｕ  Ｙｏｎｅｚａｗａ（２００９）Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ＣｐＧ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ  ｔｏ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＭＵＣ４．Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１００（２）：３４４−５１と同様に、ＣｐＧ部位の番号は、ヒトＭＵＣ４遺伝子の推定プロモーター上流（当該遺伝子の転写開始点より上流３，６２２ｂｐ）より順にナンバリングされている）。
図４Ａは、被メチル化によってヒトＭＵＣ５ＡＣ遺伝子の発現を調節するプロモーター領域の配列（配列番号１１）を示す。図４Ｂは、当該配列のＢｉｓｕｌｆｉｔｅ処理後のＤＮＡ配列（配列番号１２）を示し、非メチル化シトシンから変換されたウラシルをチミンで表示する。図４において、下記で説明する第２プライマーセットに相当するＰｒｉｍｅｒ  ５−３とＰｒｉｍｅｒ  ５−４との間の領域（配列番号４）は、ＣｐＧ部位１−３を有する（Ｙａｍａｄａ  Ｎ，Ｎｉｓｈｉｄａ  Ｙ，Ｙｏｋｏｙａｍａ  Ｓ，Ｔｓｕｔｓｕｍｉｄａ  Ｈ，Ｈｏｕｊｏｕ  Ｉ，Ｋｉｔａｍｏｔｏ  Ｓ，Ｇｏｔｏ  Ｍ，Ｈｉｇａｓｈｉ  Ｍ，Ｙｏｎｅｚａｗａ  Ｓ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＭＵＣ５ＡＣ，ａｎ  ｅａｒｌｙ  ｍａｒｋｅｒ  ｏｆ  ｐａｎｃｒｅａｔｏｂｉｌｉａｒｙ  ｃａｎｃｅｒ，ｉｓ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｉｓｔａｌ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｒｅｇｉｏｎ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｈｅｐａｔｏｂｉｌｉａｒｙ  Ｐａｎｃｒｅａｔ  Ｓｃｉ，１７（６）：８４４−８５４，２０１０と同様に、ＣｐＧ部位の番号は、ヒトＭＵＣ５ＡＣ遺伝子の推定プロモーター上流（当該遺伝子の転写開始点より上流３，７１８ｂｐ）より順にナンバリングされている）。
本方法では、ヒトＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ４及びＭＵＣ５ＡＣ遺伝子の５’側非翻訳領域又は５’側非翻訳領域と翻訳領域として、上述のそれぞれ第２プライマーセットのプライマー間の配列（すなわち、配列番号１〜４に示される塩基配列）に存在する１以上（１又は複数）のＣｐＧ部位（特に、ヒトＭＵＣ遺伝子の発現に関与する被メチル化部位）を、メチル化度を検出すべき標的配列とすることができ、特に、ヒトＭＵＣ遺伝子の発現に関与する被メチル化部位（ＣｐＧ部位）を全て含む、配列番号１〜４に示される塩基配列又は当該塩基配列を含む領域を、メチル化度を検出すべき標的配列とすることが好ましい。
以下、本方法の各工程について説明する。
（１）被験者由来の膵液サンプルにおいて、ムチンコアタンパク質をコードする遺伝子の５’側非翻訳領域又は５’側非翻訳領域と翻訳領域とを含む領域のメチル化度を検出する第１工程
本方法では、先ず膵腫瘍患者等の被験者由来の膵液サンプルを準備する。膵液サンプルは、例えば画像診断のための内視鏡的逆行性膵管造影、並びに膵管鏡検査によって採取することができる。
次いで、得られた膵液サンプルにおいて、ムチンコアタンパク質をコードする遺伝子の５’側非翻訳領域又は５’側非翻訳領域と翻訳領域とを含む領域のメチル化度を検出する。メチル化度の検出（又は測定）は、従来において知られるメチル化を検出する方法であってよく、例えば特定領域におけるメチル化ＤＮＡの検出では、重亜硫酸塩（Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ）処理による塩基置換反応を行い、ＤＮＡの配列を決定する。当該塩基置換反応では、非メチル化シトシンが重亜硫酸ナトリウムと反応して、ウラシルへと変換される。メチル化シトシンは重亜硫酸ナトリウムと反応しないので、原理上全てのシトシンのメチル化状態を塩基の違いとして検出できる。従来におけるメチル化の検出方法としては、例えばＰＣＲを使用したメチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）法、定量的ＰＣＲを使用したＲｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＭＳＰ法、ＴＡクローニングを使用したＢｉｓｕｌｆｉｔｅ−ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法、質量分析を使用したＭａｓｓＡＲＲＡＹ法、次世代ｓｅｑｕｅｎｃｅｒを使用したパイロシークエンス法等が挙げられる。さらに、重亜硫酸塩反応を必要としないＩＣＯＮ−ｐｒｏｖｅ法も開発されている。
また、Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ−ＤＧＧＥ法は、ＡｂｒａｍｓとＳｔａｎｔｏｎ（Ａｂｒａｍｓ，Ｅ．Ｓ．及びＳｔａｎｔｏｎ，Ｖ．Ｐ．Ｊｒ．，Ｕｓｅ  ｏｆ  ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ｔｏ  ｓｔｕｄｙ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ．「Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．」，１９９２年，第２１２巻，ｐｐ．７１−１０４）によって提案された変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（Ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  Ｇｅｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：ＤＧＧＥ）法を基本とし、Ｐ．Ｇｕｌｄｂｅｒｇ等（Ｇｕｌｄｂｅｒｇ，Ｐ．，Ｇｒｏｎｂａｋ，Ｋ．，Ａｇｇｅｒｈｏｌｍ，Ａ．，Ｐｌａｔｚ，Ａ．，ｔｈｏｒ  Ｓｔｒａｔｅｎ，Ｐ．，Ａｈｒｅｎｋｉｅｌ，Ｖ．，Ｈｏｋｌａｎｄ，Ｐ．，及びＺｅｕｔｈｅｎ，Ｊ．，Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ＧＣ−ｒｉｃｈ  ＤＮＡ  ｂｙ  ｂｉｓｕｌｐｈｉｔｅ  ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．」，１９９８年，第２６巻，第６号，ｐｐ．１５４８−１５４９）によって開発された方法である。当該方法では、重亜硫酸塩処理後のサンプルをＰＣＲによって増幅した後、そのアプリコンを、ポリアクリルアミドと変性剤の濃度勾配から成るゲルを使用した電気泳動に供する。ポリアクリルアミドの濃度勾配に基づき二本鎖ＤＮＡの分子量の違いによる分離を行い、さらに変性剤の濃度勾配に基づき二本鎖ＤＮＡの変性度の差異による分離を行い、目的領域中のウラシル（非メチル化シトシン）とシトシン（メチル化シトシン）の違いによる分離が行われる。当該方法は、ＭＳＰ法と同様に視覚的評価を行うことができ、さらに、電気泳動後のゲル中のバンドをシークエンス反応に転用することができる。また、Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ−ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法と比較すると、Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ−ＤＧＧＥ法によれば大幅な時間短縮を行うことができる。
しかしながら、本方法では、メチル化度の検出方法として、微量のＤＮＡサンプルであってもＤＮＡメチル化を検出でき、またＤＮＡメチル化パターン又は連続性を検出できるＭＳＥ（Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）法が特に好ましい（国際出願第ＰＣＴ／ＪＰ２０１１／０６０３３９号（国際公開第２０１１／１３２７９８号））。
ＭＳＥ法は、（ａ）ＤＮＡを重亜硫酸塩処理に供する工程、（ｂ）標的領域の外側の領域に対応する第１プライマーセットを用いて重亜硫酸塩処理後のＤＮＡを第１のＰＣＲに供する工程、（ｃ）標的領域に対応する第２プライマーセットを用いて第１のＰＣＲ後の増幅ＤＮＡを第２のＰＣＲに供する工程、（ｄ）第２のＰＣＲ後の増幅ＤＮＡを変性剤濃度勾配ゲル電気泳動に供する工程を含む方法である。
以下に、本方法におけるＭＳＥ法の各工程について説明する。
（ａ）ＤＮＡを重亜硫酸塩処理に供する工程
先ず膵液サンプルからＤＮＡを抽出し、当該ＤＮＡを重亜硫酸塩処理に供する。当該処理により、非メチル化シトシンが重亜硫酸塩によりスルホン化され、さらに加水分解により脱アミノ化され、さらに、アルカリ存在下での脱スルホン化により、ウラシルに変換される。これに対して、メチル化されたシトシンは、重亜硫酸塩処理してもウラシルに変換されない。このため、ＣｐＧ含有ＤＮＡの塩基配列中のシトシンがメチル化されているか否かを、重亜硫酸塩処理により、ウラシルに変換されているかどうかで区別する。なお、市販の重亜硫酸塩処理用のキット（例えば、ＥｐｉＴｅｃｔ  Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  Ｋｉｔｓ（ＱＩＡＧＥＮ社製））を使用して、当該キットのマニュアルに準じて、ＤＮＡを重亜硫酸塩処理に供することができる。
（ｂ）重亜硫酸塩処理後のＤＮＡを第１のＰＣＲに供する工程
次いで標的領域（すなわち、ムチンコアタンパク質をコードする遺伝子の５’側非翻訳領域又は５’側非翻訳領域と翻訳領域とを含む領域）の外側の領域に対応する第１プライマーセットを用いて重亜硫酸塩処理後のＤＮＡを第１のＰＣＲに供する。重亜硫酸塩処理後にＰＣＲによる増幅により、非メチル化シトシンがチミンに変換され、もとからＤＮＡ配列に存在するチミンと混在するため類似した配列が増加することとなる。当該増加に伴い、ＰＣＲにおいてミスアニーリングが生じやすく、ＰＣＲのサイクル数を上げると、非特異的アンプリコンが増幅されてしまうこととなる。そこでＭＳＥ法では、このようなノイズの発生を防止すべく、標的領域の外側に対応する第１プライマーセットを用いて第１のＰＣＲを行い、次いで、第２のＰＣＲ（Ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ）を行うことで、当該ノイズを低下させる。当該ノイズの低下により、ＰＣＲサイクル数の増加が可能となり、検出限界を向上させることができる（すなわち、微量のＤＮＡサンプルを使用することができる）。
第１プライマーセットの一対のプライマーは、標的領域の外側の領域に対応し、当該外側の領域にアニーリングするように設計される。当該外側の領域は、標的領域の両末端の各々から外側方向に例えば１０〜１００塩基（好ましくは２０〜８０塩基）離れた位置とすることができる。また、第１プライマーセットのプライマーの長さとしては、例えば１５〜３０塩基、好ましくは１８〜２２塩基が挙げられる。
ＰＣＲは、例えば増幅産物の長さやＧＣ含量等を考慮し、ＰＣＲ反応液組成（例えばＰＣＲバッファー、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰミックス、プライマー等を含む）、熱変性、アニーリング、伸長反応等における温度設定並びにサイクル数を適宜決定し、行うことができる。このようなＰＣＲ条件は、例えば使用するポリメラーゼに最適な条件下で行う等適宜決定することができる。なお、当該ＰＣＲによれば、非メチル化シトシンから変換されたウラシルは、チミンへと変換される。
（ｃ）第１のＰＣＲ後の増幅ＤＮＡを第２のＰＣＲに供する工程
第１のＰＣＲ後、標的領域に対応する第２プライマーセットを用いて第１のＰＣＲ後の増幅ＤＮＡ（増幅産物）を第２のＰＣＲに供する。当該第２のＰＣＲは、ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲと呼ばれるものである。すなわち、第１のＰＣＲ後の増幅産物の内側に第２のプライマーセットのプライマーを設計し、第１のＰＣＲ後の増幅産物を新たな鋳型として第２のＰＣＲを行う。
第２プライマーセットのプライマーは、アニーニング位置が、標的領域を基準として第１プライマーセットのプライマーのアニーニング位置の内側に存在するように設計する。すなわち、第２プライマーセットのプライマーのアニーニング位置は、標的領域の両末端又はその隣接領域とする。なお、第２プライマーセットのプライマーと第１プライマーセットのプライマーとは、第２プライマーセットのプライマーのアニーリング位置が第１プライマーセットのプライマーのアニーニング位置の内側にある限り、一部重複していてもよい。第２プライマーセットのプライマーの長さとしては、例えば１５〜３０塩基、好ましくは１８〜２２塩基が挙げられる。なお、第２のプライマーの一方のプライマー（例えば、フォワード（センス）プライマー）の５’側にＧＣ−ｃｌａｍｐ配列を付加することで、後続の変性剤濃度勾配ゲル電気泳動工程において、分離能を向上させることができる。ここで、ＧＣ−ｃｌａｍｐ配列とは、３０〜５０塩基程度のＧ−Ｃが豊富で安定な配列を意味し、例えば配列番号１３に記載の塩基配列が挙げられる。
また、第１のＰＣＲと同様に、ＰＣＲは、標的領域の長さやＧＣ含量等を考慮し、ＰＣＲ反応液組成（例えばＰＣＲバッファー、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰミックス、プライマー等を含む）、熱変性、アニーリング、伸長反応等における温度設定並びにサイクル数を適宜決定し、行うことができる。
（ｄ）第２のＰＣＲ後の増幅ＤＮＡを変性剤濃度勾配ゲル電気泳動に供する工程
第２のＰＣＲ後、増幅ＤＮＡを変性剤濃度勾配ゲル電気泳動に供することで、増幅ＤＮＡを分離し、視覚的にメチル化パターンや連続性を評価することができる。
変性剤濃度勾配ゲルは、例えばゲル成分（アクリルアミド）、尿素とホルムアミドとの組合せ等の変性剤、ＴＡＥバッファー等を使用して作製される。具体的には、例えばポリアクリルアミドゲルを使用し、且つ変性剤として尿素及びホルムアミドの組合せを使用する場合には、増幅産物の長さ等に応じて、ゲルにおいて例えば６〜１５％（好ましくは８〜１０％）のアクリルアミド濃度となるように、且つ尿素及びホルムアミドの組合せの濃度勾配が例えば１０％→５０％〜２０％→３０％（好ましくは濃度勾配の幅が１０％以上）となるように作製する。また、最適条件の検討としては、濃度勾配の幅の広い（１０％〜５０％）ゲルで検討し、濃度勾配の幅を狭くする方法を検討する。また、検出したバンドがスメアを呈する場合はアクリルアミドの濃度を上げる。なお、変性剤濃度勾配は、電気泳動における陰極から陽極方向へ（ＤＮＡが泳動する方向へ）低濃度から高濃度へと勾配をつける。
第２のＰＣＲ後の増幅ＤＮＡ（例えば４〜１５μｌ、好ましくは５〜１０μｌ）を変性剤濃度勾配ゲルにアプライし、電気泳動に供する。電気泳動条件としては、例えば泳動槽温度：６０℃、定電圧：７０〜２５０Ｖ及び泳動時間：３００〜９００分が挙げられる。
電気泳動後、変性剤濃度勾配ゲルをエチジウムプロマイド染色、もしくはゲルレッドによる染色に供することで、アプライした増幅ＤＮＡのバンドを視覚的に観察することができる。ＧとＣとの対における水素結合は３本であり、一方、ＡとＴとの対における水素結合は２本である。従って、ＧＣの結合は、ＡＴの結合よりも変性剤に対して耐性を有する。そのため、ＧＣの結合を多数有するＤＮＡは、ＡＴの結合を多数有するＤＮＡと比べて変性剤濃度勾配ゲルにおいてより泳動することとなる。
ＤＮＡにおける非メチル化シトシンがウラシル、そしてチミンに変換されているため、非メチル化シトシンを有する標的領域に対応する増幅ＤＮＡは、メチル化シトシンを有する標的領域に対応する増幅ＤＮＡよりも泳動速度が遅く、変性剤濃度勾配ゲルの陰極に近い側に位置することとなる。一方、メチル化シトシンを有する標的領域に対応する増幅ＤＮＡは、泳動速度が早く、変性剤濃度勾配ゲルの陽極に近い側に位置することとなる。従って、当該泳動の違いにより、メチル化シトシンを有する標的領域と非メチル化シトシンを有する標的領域とを判断でき、標的領域におけるメチル化パターン又は連続性を評価することができる。
（２）検出したメチル化度を指標として、膵腫瘍を膵癌、膵管内乳頭粘液性腫瘍・胃型、膵管内乳頭粘液性腫瘍・腸型及び膵管内乳頭粘液性腫瘍・膵胆管上皮型から成る群より選択される病型に分類する第２工程
本方法では、検出したメチル化度を指標として、膵腫瘍を膵癌（ＰＤＡＣ）、膵管内乳頭粘液性腫瘍・胃型（ＩＰＭＮ−ｇａｓｔｒｉｃ）、膵管内乳頭粘液性腫瘍・腸型（ＩＰＭＮ−ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ）、又は膵管内乳頭粘液性腫瘍・膵胆管上皮型（ＩＰＭＮ−ＰＢ（Ｐａｎｃｒｅａｔｏｂｉｌｉａｒｙ））に分類する。
例えばＭＳＥ法におけるＤＧＧＥ後のゲルの写真におけるバンドの発光強度をＩｍａｇｅ  Ｊ等の画像処理ソフトウェアにより数値化し、統計解析ソフトウェア（例えば、統計解析ソフト「Ｒ」）により統計処理を行う。当該統計処理により算出されたメチル化ＤＮＡ含有率を比較し、例えば非メチル化のバンドを示していても全体としては高いメチル化ＤＮＡの含有率を示す場合には、メチル化傾向の判別となる。例えば、ＭＵＣ１遺伝子、ＭＵＣ２遺伝子、ＭＵＣ４遺伝子及びＭＵＣ５ＡＣ遺伝子を含む遺伝子セットにおいて、各種遺伝子のメチル化傾向及び非メチル化傾向の判定では、メチル化ＤＮＡ含有率について、ＭＵＣ１遺伝子：５０％（±２０％）、ＭＵＣ２遺伝子：７０％（±２０％）、ＭＵＣ４遺伝子：５０％（±２０％）及びＭＵＣ５ＡＣ遺伝子：６０％（±２０％）をカットオフ値として設定し、当該４種のムチンコアタンパク質をコードする遺伝子を用いた病型予測において、
（ａ）ＩＰＭＮ−ｇａｓｔｒｉｃにおいて、４遺伝子全てメチル化傾向；
（ｂ）ＩＰＭＮ−ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌにおいて、４遺伝子全て非メチル化傾向；
（ｃ）ＰＤＡＣにおいて、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２及びＭＵＣ４遺伝子が非メチル化傾向、ＭＵＣ５ＡＣ遺伝子がメチル化傾向；及び
（ｄ）ＩＰＭＮ−ＰＢが上記（ａ）〜（ｃ）以外
として、膵腫瘍を分類することができる。このようにして、予後の極めて悪いＰＤＡＣか、予後の比較的良い膵管内乳頭粘液性腫瘍（ＩＰＭＮ）のいずれであるか、さらにＩＰＭＮにおいても癌化の可能性が高い病型の「ＩＰＭＮ−ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ」であるのか、比較的安全な病型の「ＩＰＭＮ−ｇａｓｔｒｉｃ」であるのかも含めて早期診断を行うことができる。
以上に説明した本方法は、低侵襲性で得られる膵液サンプルを用いた診断方法であり、現在の各種検査（例えば組織診による診断）に加えることで、より高精度の膵腫瘍検査を実施できる。また、本方法によれば、高度に発達してきた画像診断による存在診断に加え、低侵襲的に採取可能な膵液という排出液を有効に利用し、エピジェネティクス異常を検出することにより、悪性度を推し量る質的診断を加味して、早期に明確な治療戦略を立てることが可能になる。
また、本発明は、本方法を実施するために用いる、膵腫瘍の病型を判定するための検査キット（以下、単に「キット」と称する）に関する。キットは、膵腫瘍の病型の診断キット、膵腫瘍の病型を判定するための評価キット、又は膵腫瘍の病型を判定するための情報を収集するためのキットということもできる。
キットには、例えば上記ＭＳＥ法を行うための試薬を含むことができる。当該試薬としては、例えば重亜硫酸塩処理用の重亜硫酸塩（重亜硫酸ナトリウム）；第１のＰＣＲ用の第１プライマーセット；第２のＰＣＲ用の第２プライマーセット；第１及び第２のＰＣＲのための反応液組成成分（ＰＣＲバッファー、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰミックス等）；変性剤濃度勾配ゲル電気泳動用のゲル成分（アクリルアミド等）、変性剤（尿素、ホルムアミド等）、バッファー（ＴＡＥバッファー等）等が挙げられる。
下記の実施例で説明するように、第１プライマーセットしては、例えばＭＵＣ１遺伝子については、配列番号１４に記載の塩基配列から成るプライマーと配列番号１５に記載の塩基配列から成るプライマーとのセット；ＭＵＣ２遺伝子については、配列番号１８に記載の塩基配列から成るプライマーと配列番号１９に記載の塩基配列から成るプライマーとのセット；ＭＵＣ４遺伝子については、配列番号２２に記載の塩基配列から成るプライマーと配列番号２３に記載の塩基配列から成るプライマーとのセット；ＭＵＣ５ＡＣ遺伝子については、配列番号２６に記載の塩基配列から成るプライマーと配列番号２７に記載の塩基配列から成るプライマーとのセットが挙げられる。また、第２プライマーセットしては、例えばＭＵＣ１遺伝子については、配列番号１６に記載の塩基配列から成るプライマーと配列番号１７に記載の塩基配列から成るプライマーとのセット；ＭＵＣ２遺伝子については、配列番号２０に記載の塩基配列から成るプライマーと配列番号２１に記載の塩基配列から成るプライマーとのセット；ＭＵＣ４遺伝子については、配列番号２４に記載の塩基配列から成るプライマーと配列番号２５に記載の塩基配列から成るプライマーとのセット；ＭＵＣ５ＡＣ遺伝子については、配列番号２８に記載の塩基配列から成るプライマーと配列番号２９に記載の塩基配列から成るプライマーとのセットが挙げられる。
さらに、キットは、取扱い説明書、膵腫瘍の病型の判定のための説明書等を含むことができる。
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【０００７】
４種のムチン遺伝子のメチル化解析による膵腫瘍の病型予測
本実施例では、ヒトの膵癌（ＰＤＡＣ）、膵管内乳頭粘液性腫瘍・胃型（ＩＰＭＮ−ｇａｓｔｒｉｃ）、膵管内乳頭粘液性腫瘍・腸型（ＩＰＭＮ−ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ）及び膵管内乳頭粘液性腫瘍・膵胆管上皮型（ＩＰＭＮ−ＰＢ（Ｐａｎｃｒｅａｔｏｂｉｌｉａｒｙ））の膵液サンプルにおいて、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ４及びＭＵＣ５ＡＣ遺伝子プロモーター又は当該プロモーターと隣接する翻訳領域上の発現に関与する被メチル化部位（ＣｐＧ部位）のメチル化解析をＭＳＥ法にて行い、また免疫組織化学染色によるこれら遺伝子によりコードされるタンパク質の発現確認を行った。
１．材料及び方法
１−１．サンプル
解析に使用したサンプルのセットを下記の表１に示す。
【表１】
0005866739.tif 000002
１−２．ＭＳＥ法を用いたＭＵＣ１遺伝子プロモーターの発現に関与する被メチル化部位（ＣｐＧ部位）のメチル化解析
ＭＳＥ法を使用して、ヒトＭＵＣ１遺伝子プロモーターの発現に関与する被メチル化部位（ＣｐＧ部位）を解析した。図１Ａは、被メチル化によってヒトＭＵＣ１遺伝子の発現を調節するプロモーター領域の配列及び隣接する翻訳領域の配列（配列番号５）を示す。図１Ｂは、当該配列のＢｉｓｕｌｆｉｔｅ処理後のＤＮＡ配列（配列番号６）を示し、非メチル化シトシンから変換されたウラシルをチミンで表示する。図１において、下記で説明するＰｒｉｍｅｒ  １−３とＰｒｉｍｅｒ  １−４との間の領域（配列番号１）は、ＣｐＧ部位１７２−１８１を有し、当該ＣｐＧ部位を含む領域を標的領域とする。なお、論文（Ｎｏｒｉｓｈｉｇｅ  Ｙａｍａｄａ，Ｙｕｋａｒｉ  Ｎｉｓｈｉｄａ，Ｈｉｄｅａｋｉ  Ｔｓｕｔｓｕｍｉｄａ，Ｔｏｍｏｆｕｍｉ  Ｈａｍａｄａ，Ｍａｓａｍｉｃｈｉ  Ｇｏｔｏ，Ｍｉｃｈｉｙｏ  Ｈｉｇａｓｈｉ，Ｍｉｔｓｕｈａｒｕ  Ｎｏｍｏｔｏ  ａｎｄ  Ｓｕｇｕｒｕ  Ｙｏｎｅｚａｗａ（２００８）ＭＵＣ１  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｓ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｈｉｓｔｏｎｅ  Ｈ３−Ｋ９  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６８（８）：２７０８−１６）と同様に、ＣｐＧ部位の番号は、ヒトＭＵＣ１遺伝子の推定プロモーター上流（当該遺伝子の転写開始点より上流２，７５３ｂｐ）より順にナンバリングされている。
膵液サンプルからＤＮＡを、ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ＆  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を使用して抽出した。
次いで、ＥｐｉＴｅｃｔ  Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  Ｋｉｔｓ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を使用して、抽出したＤＮＡをＢｉｓｕｌｆｉｔｅ処理に供した。
Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ処理後のＤＮＡを、以下のプライマーを使用したＰＣＲに供した。
プライマーセット（小文字の塩基配列はＧＣ  ｃｌａｍｐである）：
0005866739.tif 000003
各ＰＣＲは、図１に示すように、１ｓｔＰＣＲは上記Ｐｒｉｍｅｒ  １−１とＰｒｉｍｅｒ  １−２を用いて、２ｎｄＰＣＲ（ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ）は上記Ｐｒｉｍｅｒ  １−３とＰｒｉｍｅｒ  １−４を用いて行った。ポリメラーゼは、ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（登録商標）Ｆａｓｔ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製）を使用した。ＰＣＲ条件及び温度設定を下記表２に示す。
【表２】
0005866739.tif 000004
次いで、下記表３に示すＤＧＧＥゲル条件下の変性剤濃度勾配ゲルを使用し、２ｎｄＰＣＲ後の反応液をＤＧＧＥに供した。なお、電気泳動条件は、泳動槽温度：６０℃、定電圧：２３０Ｖ、泳動時間：３００分であった。電気泳動槽は、Ｄｃｏｄｅシステム（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を使用した。
【表３】
0005866739.tif 000005
0005866739.tif 000006
１−３．ＭＳＥ法を用いたＭＵＣ２遺伝子プロモーターの発現に関与する被メチル化部位（ＣｐＧ部位）のメチル化解析
ＭＳＥ法を使用して、ヒトＭＵＣ２遺伝子プロモーターの発現に関与する被メチル化部位（ＣｐＧ部位）を解析した。図２Ａは、被メチル化によってヒトＭＵＣ２遺伝子の発現を調節するプロモーター領域の配列及び隣接する翻訳領域の配列（配列番号７）を示す。図２Ｂは、当該配列のＢｉｓｕｌｆｉｔｅ処理後のＤＮＡ配列（配列番号８）を示し、非メチル化シトシンから変換されたウラシルをチミンで表示する。図２において、下記で説明するＰｒｉｍｅｒ  ２−３とＰｒｉｍｅｒ  ２−４との間の領域（配列番号２）は、ＣｐＧ部位３７−４３を有し、当該ＣｐＧ部位を含む領域を標的領域とする。なお、論文（Ｎｏｒｉｓｈｉｇｅ  Ｙａｍａｄａ，Ｔｏｍｏｆｕｍｉ  Ｈａｍａｄａ，Ｍａｓａｍｉｃｈｉ  Ｇｏｔｏ，Ｈｉｄｅａｋｉ  Ｔｓｕｔｓｕｍｉｄａ  ，Ｍｉｃｈｉｙｏ  Ｈｉｇａｓｈｉ，Ｍｉｔｓｕｈａｒｕ  Ｎｏｍｏｔｏ  ａｎｄ  Ｓｕｇｕｒｕ  Ｙｏｎｅｚａｗａ（２００６）ＭＵＣ２  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｓ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ｈｉｓｔｏｎｅ  Ｈ３  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１１９（８）：１８５０−７）と同様に、ＣｐＧ部位の番号は、ヒトＭＵＣ２遺伝子の推定プロモーター上流（当該遺伝子の転写開始点より上流１，９８９ｂｐ）より順にナンバリングされている。
上記１−２節と同様にして、膵液サンプルからＤＮＡをＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ＆  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を使用して抽出した後、ＥｐｉＴｅｃｔ  Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  Ｋｉｔｓ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を使用して、抽出したＤＮＡをＢｉｓｕｌｆｉｔｅ処理に供した。
Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ処理後のＤＮＡを、以下のプライマーを使用したＰＣＲに供した。
プライマーセット（小文字の塩基配列はＧＣ  ｃｌａｍｐである）：
0005866739.tif 000007
各ＰＣＲは図２に示すように、１ｓｔＰＣＲは上記Ｐｒｉｍｅｒ  ２−１とＰｒｉｍｅｒ  ２−２を用いて、２ｎｄＰＣＲ（ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ）は上記Ｐｒｉｍｅｒ  ２−３とＰｒｉｍｅｒ  ２−４を用いて行った。ポリメラーゼは、ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（登録商標）Ｆａｓｔ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製）を使用した。ＰＣＲ条件及び温度設定を下記表４に示す。
【表４】
0005866739.tif 000008
次いで、下記表５に示すＤＧＧＥゲル条件下の変性剤濃度勾配ゲルを使用し、２ｎｄＰＣＲ後の反応液をＤＧＧＥに供した。なお、電気泳動条件及び電気泳動槽は、上記１−２節と同様であった。
【表５】
0005866739.tif 000009
0005866739.tif 000010
１−４．ＭＳＥ法を用いたＭＵＣ４遺伝子プロモーターの発現に関与する被メチル化部位（ＣｐＧ部位）のメチル化解析
ＭＳＥ法を使用して、ヒトＭＵＣ４遺伝子プロモーターの発現に関与する被メチル化部位（ＣｐＧ部位）を解析した。図３Ａは、被メチル化によってヒトＭＵＣ４遺伝子の発現を調節するプロモーター領域の配列及び隣接する翻訳領域の配列（配列番号９）を示す。図３Ｂは、当該配列のＢｉｓｕｌｆｉｔｅ処理後のＤＮＡ配列（配列番号１０）を示し、非メチル化シトシンから変換されたウラシルをチミンで表示する。図３において、下記で説明するＰｒｉｍｅｒ  ４−３とＰｒｉｍｅｒ  ４−４との間の領域（配列番号３）は、ＣｐＧ部位１０８−１１８を有し、当該ＣｐＧ部位を含む領域を標的領域とする。なお、論文（Ｎｏｒｉｓｈｉｇｅ  Ｙａｍａｄａ，Ｙｕｋａｒｉ  Ｎｉｓｈｉｄａ，Ｈｉｄｅａｋｉ  Ｔｓｕｔｓｕｍｉｄａ，Ｍａｓａｍｉｃｈｉ  Ｇｏｔｏ，Ｍｉｃｈｉｙｏ  Ｈｉｇａｓｈｉ，Ｍｉｔｓｕｈａｒｕ  Ｎｏｍｏｔｏ  ａｎｄ  Ｓｕｇｕｒｕ  Ｙｏｎｅｚａｗａ（２００９）Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ＣｐＧ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ  ｔｏ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＭＵＣ４．Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１００（２）：３４４−５１）と同様に、ＣｐＧ部位の番号は、ヒトＭＵＣ４遺伝子の推定プロモーター上流（当該遺伝子の転写開始点より上流３，６２２ｂｐ）より順にナンバリングされている。
上記１−２節と同様にして、膵液サンプルからＤＮＡをＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ＆  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を使用して抽出した後、ＥｐｉＴｅｃｔ  Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  Ｋｉｔｓ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を使用して、抽出したＤＮＡをＢｉｓｕｌｆｉｔｅ処理に供した。
Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ処理後のＤＮＡを、以下のプライマーを使用したＰＣＲに供した。
プライマーセット（小文字の塩基配列はＧＣ  ｃｌａｍｐである）：
0005866739.tif 000011
各ＰＣＲは図３に示すように、１ｓｔＰＣＲは上記Ｐｒｉｍｅｒ  ４−１とＰｒｉｍｅｒ  ４−２を用いて、２ｎｄＰＣＲ（ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ）は上記Ｐｒｉｍｅｒ  ４−３とＰｒｉｍｅｒ  ４−４を用いて行った。ポリメラーゼは、ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（登録商標）Ｆａｓｔ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製）を使用した。ＰＣＲ条件及び温度設定を下記表６に示す。
【表６】
0005866739.tif 000012
次いで、下記表７に示すＤＧＧＥゲル条件下の変性剤濃度勾配ゲルを使用し、２ｎｄＰＣＲ後の反応液をＤＧＧＥに供した。なお、電気泳動条件及び電気泳動槽は、上記１−２節と同様であった。
【表７】
0005866739.tif 000013
0005866739.tif 000014
１−５．ＭＳＥ法を用いたＭＵＣ５ＡＣ遺伝子プロモーターの発現に関与する被メチル化部位（ＣｐＧ部位）のメチル化解析
ＭＳＥ法を使用して、ヒトＭＵＣ５ＡＣ遺伝子プロモーターの発現に関与する被メチル化部位（ＣｐＧ部位）を解析した。図４Ａは、被メチル化によってヒトＭＵＣ５ＡＣ遺伝子の発現を調節するプロモーター領域の配列（配列番号１１）を示す。図４Ｂは、当該配列のＢｉｓｕｌｆｉｔｅ処理後のＤＮＡ配列（配列番号１２）を示し、非メチル化シトシンから変換されたウラシルをチミンで表示する。図４において、下記で説明するＰｒｉｍｅｒ  ５−３とＰｒｉｍｅｒ  ５−４との間の領域（配列番号４）は、ＣｐＧ部位１−３を有し、当該ＣｐＧ部位を含む領域を標的領域とする。なお、論文（Ｙａｍａｄａ  Ｎ，Ｎｉｓｈｉｄａ  Ｙ，Ｙｏｋｏｙａｍａ  Ｓ，Ｔｓｕｔｓｕｍｉｄａ  Ｈ，Ｈｏｕｊｏｕ  Ｉ，Ｋｉｔａｍｏｔｏ  Ｓ，Ｇｏｔｏ  Ｍ，Ｈｉｇａｓｈｉ  Ｍ，Ｙｏｎｅｚａｗａ  Ｓ．（２０１０）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＭＵＣ５ＡＣ，ａｎ  ｅａｒｌｙ  ｍａｒｋｅｒ  ｏｆ  ｐａｎｃｒｅａｔｏｂｉｌｉａｒｙ  ｃａｎｃｅｒ，ｉｓ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｉｓｔａｌ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｒｅｇｉｏｎ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｈｅｐａｔｏｂｉｌｉａｒｙ  Ｐａｎｃｒｅａｔ  Ｓｃｉ，１７（６）：８４４−８５４）と同様に、ＣｐＧ部位の番号は、ヒトＭＵＣ５ＡＣ遺伝子の推定プロモーター上流（当該遺伝子の転写開始点より上流３，７１８ｂｐ）より順にナンバリングされている。
上記１−２節と同様にして、膵液サンプルからＤＮＡをＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ＆  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を使用して抽出した後、ＥｐｉＴｅｃｔ  Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  Ｋｉｔｓ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を使用して、抽出したＤＮＡをＢｉｓｕｌｆｉｔｅ処理に供した。
Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ処理後のＤＮＡを、以下のプライマーを使用したＰＣＲに供した。
プライマーセット（小文字の塩基配列はＧＣ  ｃｌａｍｐである）：
0005866739.tif 000015
各ＰＣＲは図４に示すように、１ｓｔＰＣＲは上記Ｐｒｉｍｅｒ  ５−１とＰｒｉｍｅｒ  ５−２を用いて、２ｎｄＰＣＲ（ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ）は上記Ｐｒｉｍｅｒ  ５−３とＰｒｉｍｅｒ  ５−４を用いて行った。ポリメラーゼは、ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（登録商標）Ｆａｓｔ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製）を使用した。さらに、ＰＣＲ条件及び温度設定を下記表８に示す。
【表８】
0005866739.tif 000016
次いで、下記表９に示すＤＧＧＥゲル条件下の変性剤濃度勾配ゲルを使用し、２ｎｄＰＣＲ後の反応液をＤＧＧＥに供した。なお、電気泳動条件は、泳動槽温度：６０℃、定電圧：２３０Ｖ、泳動時間：３００分であった。電気泳動槽は、Ｄｃｏｄｅシステム（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を使用した。
【表９】
0005866739.tif 000017
0005866739.tif 000018
１−６．免疫組織化学染色によるＭＵＣ遺伝子によりコードされるタンパク質の発現解析
ヒトのＰＤＡＣ、ＩＰＭＮ−ｇａｓｔｒｉｃ、ＩＰＭＮ−ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ及びＩＰＭＮ−ＰＢの手術検体組織サンプルにおいて、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ４及びＭＵＣ５ＡＣ遺伝子によりコードされるタンパク質の発現を免疫組織化学染色に解析した。
これらタンパク質の発現を検索する免疫組織化学染色に際して、ＭＵＣ１に関しては、従来の抗ＭＵＣ１抗体である「ＭＵＣ１−ＤＦ３」（ＴＦＢ社製）のみでなく、「ＭＵＣ１  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｔａｉｌ」に対する新規開発の抗ＭＵＣ１抗体（ハイブリドーマ株ＭＵＣ１−ｃｏｍｍｏｎ（ｃｌｏｎｅ  ０１４Ｅ）由来（特願２０１０−０９７９２２（特開２０１１−１８４４２７号公報）、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−８６７））を用いた。ＭＵＣ２に関しては、抗ＭＵＣ２抗体「ＭＵＣ２−Ｃｃｐ５８」（ｎｏｖｏ社製）を使用した。ＭＵＣ４に関しては、Ｎ末端側ｓｕｂｕｎｉｔに対する抗体である抗ＭＵＣ４抗体「ＭＵＣ４−８Ｇ７」（ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ｎｅｂｒａｓｋａ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｃｅｎｔｅｒ，ｏｍａｈａ）とＣ末端側ｓｕｂｕｎｉｔに対する抗体である抗ＭＵＣ４抗体「ＭＵＣ４−１Ｇ８」（ｚｙｍｅｄ社製）の双方を用いた。ＭＵＣ５ＡＣに関しては、抗ＭＵＣ５ＡＣ抗体「Ｍｕｃ５ＡＣ」（Ｎｏｖｏ社製）を用いた。
２．結果
２−１．メチル化解析と免疫染色の結果
結果を図５〜８に示す。図５は、ＩＰＭＮ−ｇａｓｔｒｉｃにおけるメチル化解析と免疫染色の結果を示す。図６（図６−１及び図６−２）は、ＩＰＭＮ−ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌにおけるメチル化解析と免疫染色の結果を示す。図７（図７−１及び図７−２）は、ＩＰＭＮ−ＰＢにおけるメチル化解析と免疫染色の結果を示す。図８は、ＰＤＡＣにおけるメチル化解析と免疫染色の結果を示す。図５〜８において、（Ａ）のパネルはＭＳＥ法のゲルの写真であり、（Ｂ）のパネルは免疫組織化学染色によるヒトＭＵＣ遺伝子によりコードされるタンパク質の発現を示す写真である。
図５〜８の（Ａ）のパネルにおいて、ゲルにおける変性剤濃度勾配は、電気泳動における陰極から陽極方向へ（パネルにおける左側から右側方向へ）低濃度から高濃度へと勾配をつけている。従って、「Ｕ」は非メチル化を示し、「Ｍ」はメチル化を示し、緑色から黄色、赤色へのグラデーションは、非メチル化（０％）からメチル化（１００％）の程度を示す。
一方、図５〜８の（Ｂ）のパネルにおいて、「ＨＥ」はヘマトキシリン・エオシン染色の結果である。
２−２．ＭＳＥ法のゲルの写真におけるバンドの発光強度に基づく統計解析の結果
図５〜８に示すＭＳＥ法のＤＧＧＥ後のゲルの写真におけるバンドの発光強度をＩｍａｇｅ  Ｊにより数値化し、統計解析ソフト「Ｒ」により統計処理を行った。
結果を図９〜１２に示す。図９は、ＭＵＣ１遺伝子についての統計解析の結果である。図１０は、ＭＵＣ２遺伝子についての統計解析の結果である。図１１は、ＭＵＣ４遺伝子についての統計解析の結果である。図１２は、ＭＵＣ５ＡＣ遺伝子についての統計解析の結果である。また、図９〜１２において、縦軸は、メチル化ＤＮＡ含有率（ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ  ＤＮＡ  ｃｏｎｔｅｎｔ  ｒａｔｉｏ（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ％））を示す。
図９〜１２から判るように、ＩＰＭＮ−ｇａｓｔｒｉｃ  ｔｙｐｅとＩＰＭＮ−ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｔｙｐｅにおけるＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ４及びＭＵＣ５ＡＣ遺伝子のメチル化状況は、ＩＰＭＮ−ｇａｓｔｒｉｃであれば全ての４種のムチン遺伝子がメチル化であり、ＩＰＭＮ−ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌであれば全ての４種のムチン遺伝子が非メチル化であることが示され、統計処理においても有意差を示す。
さらに、ＩＰＭＮ−ｇａｓｔｒｉｃ  ｔｙｐｅは、ＩＰＭＮ−ＰＢ  ｔｙｐｅに対して、ＭＵＣ１遺伝子とＭＵＣ５ＡＣ遺伝子においてメチル化状況の差に傾向を有していた。
２−３．４種のムチン遺伝子のメチル化解析の結果に基づく病型予測の結果
上記４種のムチン遺伝子のメチル化解析の結果に基づく病型予測の結果を図１３に示す。図１３の左側のパネルにおいて、「ＰＸ」（Ｘは１〜１８である）は、各サンプルである。
図１３において、各種遺伝子のメチル化傾向及び非メチル化傾向の判定では、ＭＵＣ１：５０％、ＭＵＣ２：７０％、ＭＵＣ４：５０％及びＭＵＣ５ＡＣ：６０％をカットオフ値として設定した。
図１３に示すように、４種のムチン遺伝子を用いた病型予測において、
（１）Ｇａｓｔｒｉｃ  ｔｙｐｅにおいて、４遺伝子全てメチル化傾向；
（２）Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｔｙｐｅにおいて、４遺伝子全て非メチル化傾向；
（３）ＰＤＡＣ（膵癌）において、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２及びＭＵＣ４遺伝子が非メチル化傾向、ＭＵＣ５ＡＣ遺伝子がメチル化傾向；
（４）Ｐａｎｃｒｅａｔｏｂｉｌｉａｒｙ  ｔｙｐｅが上記以外、
の条件で病型予測を行ったところ、全てにおいて高い感度と特異度を有していた。
従って、膵液中に含まれる上記４種の遺伝子のメチル化状況の当該ＭＳＥ法による解析は、病型予測へ有用な情報をもたらすと考えられる。
なお、本実施例では、メチル化ＤＮＡ含有率を比較しており、例えばＩＰＭＮ−ｇａｓｔｒｉｃ  ｔｙｐｅにおけるＭＵＣ１遺伝子のように、非メチル化のバンドを示していても全体としては高いメチル化ＤＮＡの含有率を示し、メチル化傾向の判別となる。
また、膵腫瘍の悪性度のイメージは、Ｇａｓｔｒｉｃ（胃型）＜Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ（腸型）＜ＰＢ（膵胆管上皮型）＜ＰＤＡＣ（膵癌）である。
【実施例２】
【０００８】
４種のムチン遺伝子のメチル化解析による膵腫瘍の病型予測２
実施例１と同様に、本実施例では、ヒトの膵癌（ＰＤＡＣ）、膵管内乳頭粘液性腫瘍・胃型（Ｇａｓｔｒｉｃ−ｔｙｐｅ  ＩＰＭＮ）、膵管内乳頭粘液性腫瘍・腸型（Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ−ｔｙｐｅ  ＩＰＭＮ）、及び膵管内乳頭粘液性腫瘍・膵胆管上皮型（Ｐ．Ｂ．−ｔｙｐｅ  ＩＰＭＮ）の膵液サンプルにおいて、４種のムチン遺伝子（ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ４及びＭＵＣ５ＡＣ遺伝子）のメチル化解析を行い、当該メチル化解析結果に基づく病型予測を行った。メチル化解析及び病型予測の方法は、実施例１に記載の方法に準じたものである。
解析に使用したサンプルのセットを下記の表１０に示す。
【表１０】
0005866739.tif 000019
0005866739.tif 000020
その他（ｏｔｈｅｒ）のサンプルは、Ｇａｓｔｒｉｃ−ｔｙｐｅ、Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ−ｔｙｐｅ、Ｐ．Ｂ．−ｔｙｐｅ、膵癌（ＰＤＡＣ）以外の症例サンプルである。
上記４種のムチン遺伝子のメチル化解析の結果に基づく病型予測の結果を図１４に示す。図１４の左側のパネルにおいて、各番号は、サンプル番号である。
図１４に示すように、４種のムチン遺伝子を用いた病型予測において、
（１）Ｇａｓｔｒｉｃ  ｔｙｐｅにおいて、４遺伝子全てメチル化傾向；
（２）Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｔｙｐｅにおいて、４遺伝子全て非メチル化傾向；
（３）ＰＤＡＣ（膵癌）において、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２及びＭＵＣ４遺伝子が非メチル化傾向、ＭＵＣ５ＡＣ遺伝子がメチル化傾向；
（４）Ｐａｎｃｒｅａｔｏｂｉｌｉａｒｙ  ｔｙｐｅが上記以外、
の条件で病型予測を行ったところ、全てにおいて高い感度と特異度を有していた。
【産業上の利用可能性】
【０００９】
本発明によれば、低侵襲性で得られる被験者由来の膵液サンプルにおいて、膵腫瘍の病型を早期に診断することができる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
［配列表］
0005866739.tif 000021
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0005866739.tif 000030
0005866739.tif 000031
0005866739.tif 000032
【図１Ａ】
0005866739.tif 000033
【図１Ｂ】
0005866739.tif 000034
【図２Ａ】
0005866739.tif 000035
【図２Ｂ】
0005866739.tif 000036
【図３Ａ】
0005866739.tif 000037
【図３Ｂ】
0005866739.tif 000038
【図４Ａ】
0005866739.tif 000039
【図４Ｂ】
0005866739.tif 000040
【図１３】
0005866739.tif 000041
【図１４】
0005866739.tif 000042
【図５】
0005866739.tif 000043
【図６−１】
0005866739.tif 000044
【図６−２】
0005866739.tif 000045
【図７−１】
0005866739.tif 000046
【図７−２】
0005866739.tif 000047
【図８】
0005866739.tif 000048
【図９】
0005866739.tif 000049
【図１０】
0005866739.tif 000050
【図１１】
0005866739.tif 000051
【図１２】
0005866739.tif 000052