(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
５量体ＣＲＰの製造方法であって、
絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするＤＮＡのプロモーターの下流に機能的に結合した転写因子をコードするＤＮＡと、該転写因子の標的プロモーターの下流に機能的に結合した単量体ＣＲＰをコードするＤＮＡと
が導入された遺伝子組換えカイコを作成する作成工程と、
作成された遺伝子組換えカイコが製造する５量体ＣＲＰを回収する回収工程と
を有する５量体ＣＲＰの製造方法。
【請求項２】
前記作成工程が、
絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするＤＮＡのプロモーターの下流に機能的に結合した転写因子をコードするＤＮＡが導入されカイコと、
該転写因子の標的プロモーターの下流に機能的に結合した単量体ＣＲＰをコードするＤＮＡが導入されたカイコと
を交配させて遺伝子組換えカイコを作成する工程である請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記転写因子がＧＡＬ４であり、標的プロモーターがＵＡＳである請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記回収工程が、
作成された遺伝子組換えカイコがその絹糸腺に製造する５量体ＣＲＰを回収する工程である請求項１から３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項５】
前記ＣＲＰがイヌＣＲＰである請求項１から４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項６】
前記単量体ＣＲＰをコードするＤＮＡが配列番号１に示される配列を含むアミノ酸配列をコードするＤＮＡである請求項１から５のいずれかに記載の製造方法。
【請求項７】
前記単量体ＣＲＰをコードするＤＮＡが配列番号４に示される塩基配列を含むＤＮＡである請求項１から６のいずれかに記載の製造方法。
【請求項８】
遺伝子組換えカイコであって、
絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするＤＮＡのプロモーターの下流に機能的に結合した転写因子をコードするＤＮＡと
該転写因子の標的プロモーターの下流に機能的に結合した単量体ＣＲＰをコードするＤＮＡと
が導入され、５量体ＣＲＰを絹糸腺に製造する遺伝子組換えカイコ。
【請求項９】
前記転写因子がＧＡＬ４であり、標的プロモーターがＵＡＳである請求項８に記載の遺伝子組換えカイコ。
【請求項１０】
前記ＣＲＰがイヌＣＲＰである請求項８または９のいずれかに記載の遺伝子組換えカイコ。
【請求項１１】
前記単量体ＣＲＰをコードするＤＮＡが配列番号１に示される配列を含むアミノ酸配列をコードするＤＮＡである請求項８から１０のいずれかに記載の遺伝子組換えカイコ。
【請求項１２】
前記単量体ＣＲＰをコードするＤＮＡが配列番号４に示される塩基配列を含むＤＮＡである請求項８から１１のいずれかに記載の遺伝子組換えカイコ。
【請求項１３】
５量体ＣＲＰを絹糸腺に製造する遺伝子組換えカイコの製造方法であって、  絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするＤＮＡのプロモーターの下流に機能的に結合した転写因子をコードするＤＮＡと、
該転写因子の標的プロモーターの下流に機能的に結合した単量体ＣＲＰをコードするＤＮＡと
をカイコに導入する導入工程を含む、５量体ＣＲＰを絹糸腺に製造する遺伝子組換えカイコの製造方法。
【請求項１４】
前記導入工程が、
絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするＤＮＡのプロモーターの下流に機能的に結合した転写因子をコードするＤＮＡが導入されたカイコと、
該転写因子の標的プロモーターの下流に機能的に結合した単量体ＣＲＰをコードするＤＮＡが導入されたカイコと
を交配させてＤＮＡが導入されたカイコを作成する工程である、請求項１３に記載の製造方法。
【請求項１５】
前記転写因子がＧＡＬ４であり、標的プロモーターがＵＡＳである請求項１３又は１４に記載の製造方法。
【請求項１６】
前記ＣＲＰがイヌＣＲＰである請求項１３から１５のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１７】
前記単量体ＣＲＰをコードするＤＮＡが配列番号１に示される配列を含むアミノ酸配列をコードするＤＮＡである請求項１３から１６のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１８】
前記単量体ＣＲＰをコードするＤＮＡが配列番号４に示される塩基配列を含むＤＮＡである請求項１３から１７のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１９】
単量体イヌＣＲＰをコードするＤＮＡであって、配列番号１に示される配列からなるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する単量体イヌＣＲＰをコードするＤＮＡ。
【請求項２０】
前記塩基配列が配列番号４に示される配列からなる塩基配列である請求項１９に記載の単量体イヌＣＲＰをコードするＤＮＡ。
【請求項２１】
発現ベクターであって、請求項１９又は２０に記載の単量体イヌＣＲＰをコードするＤＮＡの塩基配列を有する発現ベクター。
【請求項２２】
前記塩基配列がＵＡＳの下流に機能的に結合している請求項２１に記載の発現ベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カイコを用いた５量体ＣＲＰ（C-Reactive Protein；Ｃ反応性タンパク質）の製造方法に関する。本発明は更に、５量体ＣＲＰを製造する遺伝子組換えカイコ及びその製造方法に関する。本発明は、また、単量体イヌＣＲＰをコードするＤＮＡ及びそのＤＮＡを含む発現ベクターに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＣＲＰは、５つの単量体ＣＲＰが非共有結合的に結合して形成される５量体ＣＲＰの状態で活性を有するタンパク質である。生体内において、ほとんどのＣＲＰは５量体ＣＲＰとして存在する。なお、以下本明細書において、特に指定しない場合には、ＣＲＰは５量体ＣＲＰを意味するものとする。【０００３】
臨床検査分野において、ＣＲＰは、急性炎症又は急性の組織崩壊で増加する急性期タンパク質の一種であり、代表的な炎症マーカーとして知られている。ＣＲＰの定量は、炎症・組織障害を起こす種々の疾患の活動性・重症度・経過をみる際に不可欠である。従って、病院、臨床検査センター等において、ＣＲＰはルーチンで測定されている。この際に用いられるＣＲＰ測定キットには標準ＣＲＰ溶液が含まれる場合が多く、多量のＣＲＰが日々消費されている。そのため、高純度かつ安価なＣＲＰの製造が求められている。【０００４】
高純度なＣＲＰを製造するために遺伝子工学的な手法の利用が検討されている。遺伝子工学的なＣＲＰの製造方法としては、大腸菌を宿主としたもの（特許文献１）が唯一商業的に実現されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第５７０２９２１号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
遺伝子工学的な手法を用いて高純度でありかつ現状より安価なＣＲＰを製造するためには、宿主のＣＲＰ産生効率を向上させるとともに、宿主が産生するＣＲＰの回収に要するコストを低減する必要がある。これらを実現するために、従来の宿主よりもＣＲＰの製造に適した宿主を探索しなければならない。【０００７】
すなわち、特許文献１に記載された大腸菌を宿主としたＣＲＰの製造方法では、ｋｉｌ遺伝子の作用により本来ならばペリプラズム領域に蓄積するＣＲＰを菌体外に分泌させている。ＣＲＰを培地に分泌させることでＣＲＰの精製を容易にし、ＣＲＰ回収のコスト低減を図っている。しかしながら、ｋｉｌ遺伝子を過剰発現させた菌株は一般的に高密度培養に適さない（Yoon,S.H. et al.,Recent Pat. Biotechnol.,4,23-29,2010）。そのため、高純度のＣＲＰを得るための濃縮・精製作業が煩雑となり、ＣＲＰ産生効率のさらなる向上を実現することが困難である。【０００８】
この実状に鑑み、本発明の課題は、５量体ＣＲＰを高効率で製造可能な新たな５量体ＣＲＰの製造方法、５量体ＣＲＰの製造に適した遺伝子組換えカイコとその製造方法、単量体イヌＣＲＰをコードするＤＮＡ及びそのＤＮＡを含む発現ベクターを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、前記した課題を解決することを目的として鋭意研究した結果、驚くべきことに、分泌を促進するようなｋｉｌ遺伝子などを共発現することなくかつ非共有結合により形成される５量体構造と活性を維持した状態で、遺伝子組換えカイコが５量体ＣＲＰを発現し分泌させて高効率で製造し、また、製造された５量体ＣＲＰを遺伝子組換えカイコから容易に回収可能なことを見出し、本発明を完成させるに至ったものである。【００１０】
従って、本発明は、以下の［１］から［２５］に挙げる、５量体ＣＲＰの製造方法、５量体ＣＲＰを製造する遺伝子組換えカイコとその製造方法、単量体イヌＣＲＰをコードするＤＮＡ及びそのＤＮＡを含む発現ベクターに関する。
［１］．５量体ＣＲＰの製造方法であって、単量体ＣＲＰをコードするＤＮＡが導入された遺伝子組換えカイコを作成する作成工程と、作成された遺伝子組換えカイコが製造する５量体ＣＲＰを回収する回収工程とを有する５量体ＣＲＰの製造方法。
［２］．前記作成工程が、絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするＤＮＡのプロモーターの下流に機能的に結合した転写因子をコードするＤＮＡと、該転写因子の標的プロモーターの下流に機能的に結合した単量体ＣＲＰをコードするＤＮＡとが導入された遺伝子組換えカイコを作成する工程である［１］に記載の製造方法。
［３］．前記作成工程が、絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするＤＮＡのプロモーターの下流に機能的に結合した転写因子をコードするＤＮＡが導入されたカイコと、該転写因子の標的プロモーターの下流に機能的に結合した単量体ＣＲＰをコードするＤＮＡが導入されたカイコとを交配させて遺伝子組換えカイコを作成する工程である［１］に記載の製造方法。
［４］．前記転写因子がＧＡＬ４であり、標的プロモーターがＵＡＳである［２］又は［３］に記載の製造方法。
［５］．前記回収工程が、作成された遺伝子組換えカイコがその絹糸腺に製造する５量体ＣＲＰを回収する工程である［２］から［４］のいずれかに記載の製造方法。
［６］．前記ＣＲＰがイヌＣＲＰである［１］から［５］のいずれかに記載の製造方法。
［７］．前記単量体ＣＲＰをコードするＤＮＡが配列番号１に示される配列を含むアミノ酸配列をコードするＤＮＡである［１］から［６］のいずれかに記載の製造方法。
［８］．前記単量体ＣＲＰをコードするＤＮＡが配列番号４に示される塩基配列を含むＤＮＡである［１］から［７］のいずれかに記載の製造方法。
［９］．遺伝子組換えカイコであって、単量体ＣＲＰをコードするＤＮＡが導入され、５量体ＣＲＰを製造する遺伝子組換えカイコ。
［１０］．遺伝子組換えカイコであって、絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするＤＮＡのプロモーターの下流に機能的に結合した転写因子をコードするＤＮＡと該転写因子の標的プロモーターの下流に機能的に結合した単量体ＣＲＰをコードするＤＮＡとが導入され、５量体ＣＲＰを絹糸腺に製造する遺伝子組換えカイコ。
［１１］．前記転写因子がＧＡＬ４であり、標的プロモーターがＵＡＳである［１０］に記載の遺伝子組換えカイコ。
［１２］．前記ＣＲＰがイヌＣＲＰである［９］から［１１］のいずれかに記載の遺伝子組換えカイコ。
［１３］．前記単量体ＣＲＰをコードするＤＮＡが配列番号１に示される配列を含むアミノ酸配列をコードするＤＮＡである［９］から［１２］のいずれかに記載の遺伝子組換えカイコ。
［１４］．前記単量体ＣＲＰをコードするＤＮＡが配列番号４に示される塩基配列を含むＤＮＡである［９］から［１３］のいずれかに記載の遺伝子組換えカイコ。
［１５］．５量体ＣＲＰを製造する遺伝子組換えカイコの製造方法であって、単量体ＣＲＰをコードするＤＮＡをカイコに導入する導入工程を含む、５量体ＣＲＰを製造する遺伝子組換えカイコの製造方法。
［１６］．５量体ＣＲＰを絹糸腺に製造する遺伝子組換えカイコの製造方法であって、絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするＤＮＡのプロモーターの下流に機能的に結合した転写因子をコードするＤＮＡと、該転写因子の標的プロモーターの下流に機能的に結合した単量体ＣＲＰをコードするＤＮＡとをカイコに導入する導入工程を含む、５量体ＣＲＰを絹糸腺に製造する遺伝子組換えカイコの製造方法。
［１７］．前記導入工程が、絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするＤＮＡのプロモーターの下流に機能的に結合した転写因子をコードするＤＮＡが導入されたカイコと、該転写因子の標的プロモーターの下流に機能的に結合した単量体ＣＲＰをコードするＤＮＡが導入されたカイコとを交配させてＤＮＡが導入されたカイコを作成する工程である、［１６］に記載の製造方法。
［１８］．前記転写因子がＧＡＬ４であり、標的プロモーターがＵＡＳである［１６］又は［１７］に記載の製造方法。
［１９］．前記ＣＲＰがイヌＣＲＰである［１５］から［１８］のいずれかに記載の製造方法。
［２０］．前記単量体ＣＲＰをコードするＤＮＡが配列番号１に示される配列を含むアミノ酸配列をコードするＤＮＡである［１５］から［１９］のいずれかに記載の製造方法。
［２１］．前記単量体ＣＲＰをコードするＤＮＡが配列番号４に示される塩基配列を含むＤＮＡである［１５］から［２０］のいずれかに記載の製造方法。
［２２］．単量体イヌＣＲＰをコードするＤＮＡであって、配列番号１に示される配列を含むアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する単量体イヌＣＲＰをコードするＤＮＡ。
［２３］．前記塩基配列が配列番号４に示される配列を含む塩基配列である［２２］に記載の単量体イヌＣＲＰをコードするＤＮＡ。
［２４］．発現ベクターであって、［２２］又は［２３］に記載の単量体イヌＣＲＰをコードするＤＮＡの塩基配列を有する発現ベクター。
［２５］．前記塩基配列がＵＡＳの下流に機能的に結合している［２４］に記載の発現ベクター。【００１１】
なお、本発明において５量体ＣＲＰとは、５つの単量体ＣＲＰが非共有結合的に結合して形成される５量体であり、生体内で活性を有するものをいう。ここで、生体内で活性を有するとは、好ましくは、臨床検査分野で利用されるＣＲＰ測定キットに含まれるキャリブレーターとして、また、ＣＲＰ測定キットに含まれる抗ＣＲＰ抗体を作成する際に抗原として、血清由来のＣＲＰと同様に機能し使用し得ることを指す。【００１２】
また、本発明において「プロモーターの下流に機能的に結合した」とは、プロモーターに転写因子が結合することによってプロモーターの下流に存在するＤＮＡの発現が誘導されるように、プロモーターとＤＮＡが結合していることをいう。ここで、ＤＮＡが他の遺伝子と結合し、他の遺伝子産物との融合タンパク質を形成する場合であっても、プロモーターに転写因子が結合することによって、この融合タンパク質の発現が誘導されるものであれば、そのＤＮＡはそのプロモーターの下流に機能的に結合しているものとする。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の５量体ＣＲＰの製造方法により、血清由来ＣＲＰと同等の活性を有する５量体ＣＲＰを高効率で製造可能である。とりわけ本発明の５量体ＣＲＰの製造方法では、遺伝子組換えカイコが５量体ＣＲＰを発現し分泌するため、５量体ＣＲＰの回収が容易である。本発明の５量体ＣＲＰの製造方法により製造されるＣＲＰは、臨床検査分野で利用されるＣＲＰ測定キットに含まれるキャリブレーターとして非常に有用である。また、本発明により製造されるＣＲＰは、ＣＲＰ測定キットに含まれる抗ＣＲＰ抗体を作成する際に抗原として利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ｐＢａｃ−ＵＡＳ−ｃｆＣＲＰ−ＳＶ４０の構造を示した図である。
【図２】本発明の製造方法により得られるカイコ産生イヌＣＲＰの希釈系列と対照であるイヌ血清由来ＣＲＰの希釈系列とをイヌＣＲＰ測定ＥＬＩＳＡキットで測定したときの希釈直線性を示した図である。横軸が原液の濃度を１とした場合の希釈液の濃度（ｎ／１６、０≦ｎ≦１６）を表している。縦軸がＣＲＰ濃度（ｎｇ／ｍｌ）を表している。黒丸がカイコ産生イヌＣＲＰの希釈直線性を示し、白丸がイヌ血清由来ＣＲＰの希釈直線性を示している。
【図３】本発明の製造方法により得られるカイコ産生イヌＣＲＰと対照であるヒト血清由来ＣＲＰとをＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ゲルろ過クロマトグラフィーにかけた結果を示した図である。横軸が溶出時間（分）を表している。縦軸が各溶出画分中に含まれるイヌＣＲＰ又はヒトＣＲＰの量（全溶出画分中に含まれるＣＲＰ量に対する割合：重量％）を表している。黒丸及び実線がカイコ産生イヌＣＲＰに対するゲルろ過クロマトグラフィーの結果を示し、白菱形及び破線がヒト血清由来ＣＲＰに対するゲルろ過クロマトグラフィーの結果を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の５量体ＣＲＰの製造方法により製造されるＣＲＰとしては、例えば、ヒト、イヌ、マウス、ラット、ウサギ、ロバ、ヤギ、ウマ、ブタ、トリ、ネコなどに由来するＣＲＰが挙げられる。その中でも、ヒト由来のＣＲＰ、又はイヌ又はネコ等の観賞用動物由来のＣＲＰが好ましく、イヌ又はネコ由来のＣＲＰがより好ましく、イヌ由来のＣＲＰが特に好ましい。臨床検査分野においてヒトＣＲＰの需要が高く、また近年のペット医療の発展からイヌＣＲＰやネコＣＲＰ等の観賞物用動物由来のＣＲＰの需要も高まりつつあるためである。特にイヌやネコ等の観賞用動物の血清由来のＣＲＰは供給量が少なく、高まりつつある需要に見合っていないのが現状である。その中でも、ペットとしての普及度から、イヌ又はネコＣＲＰは需要と供給の不均衡が極めて大きい。本発明の５量体ＣＲＰの製造方法によりヒトＣＲＰ、イヌＣＲＰ、ネコＣＲＰ又はその他の観賞用動物由来のＣＲＰを高効率で製造することでこれらの需要に対応することが可能となる。とりわけ、イヌＣＲＰは遺伝子工学的な製造方法が確立しておらず、本発明の５量体ＣＲＰの製造方法によりイヌＣＲＰの高効率製造を可能にすることの意義が大きい。
【００１６】
本発明に共通して用いられる単量体ＣＲＰをコードするＤＮＡは、前述した本発明の５量体ＣＲＰの製造方法により製造されるＣＲＰの単量体をコードするＤＮＡである。好ましくは、ヒトＣＲＰ又はイヌＣＲＰの単量体をコードするＤＮＡであり、より好ましくは単量体イヌＣＲＰをコードするＤＮＡである。
ここで、単量体イヌＣＲＰをコードするＤＮＡとして、好ましくは配列番号１に示される配列を含むアミノ酸配列をコードするＤＮＡが挙げられ、より好ましくは配列番号４に示される塩基配列を含むＤＮＡが挙げられる。また、単量体ヒトＣＲＰをコードするＤＮＡとして、好ましくは配列番号７に示される配列を含むアミノ酸配列をコードするＤＮＡが挙げられ、より好ましくは配列番号９に示される塩基配列を含むＤＮＡが挙げられる。
なお、配列番号１又は７で示される配列を含むアミノ酸配列をコードするＤＮＡには、このアミノ酸配列に、機能的に同等な限りにおいて、１ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加および挿入から選ばれる少なくとも１種の変異が導入され、かつ、この配列と一定の相同性を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡが含まれる。ここで、一定の相同性としては、例えば、６０％以上の相同性が挙げられ、好ましくは７０％以上の相同性、より好ましくは８０％以上の相同性、更に好ましくは９０％以上の相同性が挙げられる。
また、配列番号４又は９に示される塩基配列には、それがコードするタンパク質が機能的に同等な限りにおいて、１ないし数個の塩基の欠失、置換、付加および挿入から選ばれる少なくとも１種の変異が導入され、かつ、この配列と一定の相同性を有する塩基配列が含まれる。ここで、一定の相同性としては、例えば、６０％以上の相同性が挙げられ、好ましくは７０％以上の相同性、より好ましくは８０％以上の相同性、更に好ましくは９０％以上の相同性が挙げられる。
配列番号１に示される単量体イヌＣＲＰのアミノ酸配列と配列番号７に示される単量体ヒトＣＲＰのアミノ酸配列との配列相同性は６０％である。また、配列番号４に示される単量体イヌＣＲＰの塩基配列と配列番号９に示される単量体ヒトＣＲＰの塩基配列との配列相同性は６０％である。
ここで、配列相同性は、ＥＢＩの提供するＣＬＵＳＴＡＬＷ２ツールを用いた、デフォルトの条件下でのペアワイズアラインメントから算出することができる。
【００１７】
本明細書において、「機能的に同等」とは、変異を有しないアミノ酸配列からなるタンパク質／ポリペプチドと、変異を有するアミノ酸配列からなるタンパク質／ポリペプチドとが、同様の生物学的あるいは生化学的活性を有することを意味する。ここで、同様の生物学的あるいは生化学的活性とは、具体的には、臨床検査分野で利用されるＣＲＰ測定キットに含まれるキャリブレーターとして、また、ＣＲＰ測定キットに含まれる抗ＣＲＰ抗体を作成する際に抗原として、血清由来のＣＲＰと同様に機能し使用し得ることを指す。
【００１８】
本発明に共通して用いられる単量体ＣＲＰをコードするＤＮＡは、シグナルペプチドを有する単量体ＣＲＰをコードするＤＮＡであることがより好ましい。シグナルペプチドを有することで、本発明の５量体ＣＲＰの製造方法により製造される５量体ＣＲＰの分泌が促進され、５量体ＣＲＰの回収が容易となるからである。
シグナルペプチドとは、小胞体膜結合性のリボソーム上で合成された後に、分泌タンパク質が脂質二重層を通り抜ける際に必要となるアミノ酸残基である。分泌タンパク質は一般的に、最終的に活性を有する成熟型タンパク質のＮ末端側にシグナルペプチドが連結された状態で合成され、シグナルペプチドは分泌後に除去される。
本発明で用いることができるシグナルペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、ヒト、イヌ、マウス、ラット、ウサギ、ロバ、ヤギ、ウマ、トリ、ネコ、酵母、昆虫に由来するシグナルペプチドをコードするＤＮＡを挙げることができる。その中でも、イヌＣＲＰを製造する場合には、イヌＣＲＰに由来するシグナルペプチド又は昆虫に由来するシグナルペプチドをコードするＤＮＡが好ましい。また、ヒトＣＲＰを製造する場合には、ヒトＣＲＰに由来するシグナルペプチド又は昆虫に由来するシグナルペプチドをコードするＤＮＡが好ましい。
ここで、イヌＣＲＰに由来するシグナルペプチドをコードするＤＮＡとしては、好ましくは配列番号２に示される配列を含むアミノ酸配列をコードするＤＮＡが挙げられ、より好ましくは配列番号５に示される塩基配列を含むＤＮＡが挙げられる。また、ヒトＣＲＰに由来するシグナルペプチドをコードするＤＮＡとしては、好ましくは配列番号８に示される配列を含むアミノ酸配列をコードするＤＮＡが挙げられ、より好ましくは配列番号１０に示される塩基配列を含むＤＮＡが挙げられる。
【００１９】
本発明で用いることのできるシグナルペプチドを有する単量体ＣＲＰをコードするＤＮＡは、前述した本発明に共通して用いられる単量体ＣＲＰをコードするＤＮＡの５´末端に、前述した本発明で用いることができるシグナルペプチドをコードするＤＮＡが連結されたＤＮＡである。
ここで、シグナルペプチドを有する単量体ＣＲＰをコードするＤＮＡとして、好ましくは配列番号３に示される配列を含むアミノ酸配列をコードするＤＮＡが挙げられ、より好ましくは配列番号６に示される塩基配列を含むＤＮＡが挙げられる。
なお、配列番号３で示される配列を含むアミノ酸配列をコードするＤＮＡには、このアミノ酸配列に、機能的に同等な限りにおいて、１ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加および挿入から選ばれる少なくとも１種の変異が導入され、かつ、この配列と一定の相同性を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡが含まれる。ここで、一定の相同性としては、例えば、６０％以上の相同性が挙げられ、好ましくは７０％以上の相同性、より好ましくは８０％以上の相同性、更に好ましくは９０％以上の相同性が挙げられる。
また、配列番号６に示される塩基配列には、それがコードするタンパク質が機能的に同等な限りにおいて、１ないし数個の塩基の欠失、置換、付加および挿入から選ばれる少なくとも１種の変異が導入され、かつ、この配列と一定の相同性を有する塩基配列が含まれる。ここで、一定の相同性としては、例えば、６０％以上の相同性が挙げられ、好ましくは７０％以上の相同性、より好ましくは８０％以上の相同性、更に好ましくは９０％以上の相同性が挙げられる。
【００２０】
本発明の５量体ＣＲＰの製造方法の作成工程又は本発明の遺伝子組換えカイコの製造方法の導入工程では、前述した本発明に共通して用いられる単量体ＣＲＰをコードするＤＮＡを含む導入ＤＮＡを被形質転換カイコに導入して、遺伝子組換えカイコを作成する。
【００２１】
ここで、本発明の５量体ＣＲＰの製造方法の作成工程、又は本発明の遺伝子組換えカイコの製造方法の導入工程における導入ＤＮＡは、前述した本発明に共通して用いられる単量体ＣＲＰをコードするＤＮＡを含めばよいが、好ましくは、カイコ由来の絹糸腺に特異的に発現するタンパク質をコードするＤＮＡのプロモーターにより直接的又は間接的に発現が制御される前述した単量体ＣＲＰをコードするＤＮＡを含むものであり、より好ましくは、カイコ由来の絹糸腺に特異的に発現するタンパク質をコードするＤＮＡのプロモーターの下流に機能的に結合した転写因子をコードするＤＮＡと、その転写因子の標的プロモーターの下流に機能的に結合した前述した単量体ＣＲＰをコードするＤＮＡとを含むものである。なぜなら、カイコ由来の絹糸腺に特異的に発現するタンパク質をコードするＤＮＡのプロモーターを利用すれば、夾雑タンパク質が少ない限られた空間でタンパク質を高密度に発現させる器官である絹糸腺で５量体ＣＲＰが発現されるため、５量体の回収・精製が容易となり、５量体ＣＲＰを高効率に製造可能となるからである。更にこのプロモーターに機能的に結合した転写因子とその転写因子の標的プロモーターとの組み合わせの選択によっては、導入ＤＮＡからのタンパク質の生産効率を向上させることができる。
なお、ＤＮＡの発現において、「プロモーターにより直接的又は間接的に発現が制御される」とは、目的とするＤＮＡがプロモーターの下流に機能的に結合していること、又は、プロモーターの下流に転写因子をコードするＤＮＡが機能的に結合しており、この転写因子によって目的とするＤＮＡの発現が誘導されることをいう。
【００２２】
なお、カイコ由来の絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするＤＮＡのプロモーターとは、カイコ細胞内で有効に働くプロモーターであればいずれでもよいが、カイコの絹糸腺において特異的にタンパク質の発現を誘導するように工夫されたプロモーターが好ましい。例えば、フィブロインＬ鎖タンパク質、フィブロインＨ鎖タンパク質、ｐ２５タンパク質、セリシンＩ遺伝子から合成されるタンパク質、セリシンＩＩ遺伝子から合成されるタンパク質のいずれかをコードするＤＮＡのプロモーターが挙げられる。
【００２３】
また、カイコ由来の絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするＤＮＡのプロモーターの下流に機能的に結合した転写因子とその標的プロモーターとの組み合わせとしては、例えば、転写因子ＧＡＬ４とＵＡＳ配列、転写因子ＴｅｔＲとＴＲＥ配列が挙げられる。その中でも、ＧＡＬ４とＵＡＳが好ましい。なぜなら、ＧＡＬ４とＵＡＳを用いたＧＡＬ４／ＵＡＳシステム（Fischer,J.A.et al.,Nature,332,853-856,1988；Brand,A.H & Perrimon,N.,Development,118,401-415,1993）を利用することにより、目的とする遺伝子の発現部位や時期、量を正確に制御でき、多くの組織で容易に発現させることができるからである。また、発現させる遺伝子が致死性の遺伝子でも系統の作出が可能となる。
【００２４】
本発明で用いられる導入ＤＮＡの好ましい一態様として、セリシンＩ遺伝子から合成されるタンパク質をコードするＤＮＡのプロモーターの下流に連結されたＧＡＬ４をコードするＤＮＡと、ＵＡＳ配列の下流に連結された前述のシグナルペプチドを有する単量体ＣＲＰをコードするＤＮＡとを含むＤＮＡが挙げられる。
【００２５】
本発明の５量体ＣＲＰの製造方法の作成工程、又は本発明の遺伝子組換えカイコの製造方法の導入工程における被形質転換カイコは、特に制限はされないが、５量体ＣＲＰの高効率生産のためには、フィブロインタンパク質などの絹糸を構成するタンパク質をコードするＤＮＡ領域（コード領域、プロモーター領域、非翻訳領域を含む）の変異によって、絹糸を構成するタンパク質の生産が抑制されているカイコであることが好ましい。このようなカイコとしては、絹糸を構成するタンパク質の生産が抑制されている突然変異系統のカイコ、好ましくは該変異によって絹糸を構成するタンパク質の生産が抑制されている裸蛹系統のカイコが挙げられるが、絹糸を構成するタンパク質の生産抑制の原因が、人為的か否か、また、自然界において生じた変異に依存するか否かに関わらず、絹糸を構成するタンパク質の生産が抑制されているカイコであればよい。
また、被形質転換カイコとしては、非休眠卵を産下する性質を有するカイコ、休眠卵を産下する性質を有するカイコ（例えば実用品種である、ぐんま２００、春嶺、鐘月、錦秋、鐘和等）を使用することができる。ここで、休眠卵とは産卵後胚発生が一時的に停止する卵を言い、非休眠卵とは産卵後胚発生が停止せず、幼虫が孵化する卵を言う。
【００２６】
本発明の５量体ＣＲＰの製造方法の作成工程、又は本発明の遺伝子組換えカイコの製造方法の導入工程において導入ＤＮＡを被形質転換カイコに導入するＤＮＡ導入方法は、導入ＤＮＡが安定に被形質転換カイコの染色体に組み込まれる方法であれば特に限定されない。例えば、導入ＤＮＡを含む遺伝子組換えベクターを構築し、この遺伝子組換えベクターをカイコ卵にマイクロインジェクションする方法（Tamura,T.et al.,Nat.Biotechnol.,18,81-84,2000）、遺伝子銃を用いる方法等を用いることができる。その中でも、トランスポゾンの逆位末端反復配列の間に前記本発明においてカイコに導入されるＤＮＡを含有する遺伝子組換えベクターとともに、トランスポゾン転移酵素をコードするＤＮＡを含むヘルパーベクターを同時にカイコ卵にマイクロインジェクションする方法（Tamura,T.et al.,Nat.Biotechnol.,18,81-84,2000）が好ましい。
上前記ヘルパーベクターとしては、ｐＨＡ３ＰＩＧ（Tamura,T.et al.,Nat.Biotechnol.,18,81-84,2000）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
前記トランスポゾンとしては、ｐｉｇｇｙＢａｃが好ましいが、これに限定されるものではなく、ｍａｒｉｎｅｒ、ｍｉｎｏｓ等を用いることもできる。
なお、導入ＤＮＡを分割して被形質転換カイコに導入することも可能である。例えば、２分割したうちの一方のＤＮＡが導入されたカイコが産卵した卵に、もう一方のＤＮＡを前述の方法で人為的に導入する方法、又は２分割されたＤＮＡのうち両方を前述の方法で一つの卵に導入する方法が挙げられる。
【００２７】
本発明の５量体ＣＲＰの製造方法の作成工程、又は本発明の遺伝子組換えカイコの製造方法の導入工程では、導入ＤＮＡを分割してそれぞれ異なる被形質転換カイコに導入し、次いで、それぞれ異なるＤＮＡが導入された成体遺伝子組換えカイコを交配させることで導入ＤＮＡが全て導入された遺伝子組換えカイコを作成することもできる。
好ましくは、前述した導入ＤＮＡのうち、カイコ由来の絹糸腺に特異的に発現するタンパク質をコードするＤＮＡのプロモーターの下流に機能的に結合した転写因子をコードするＤＮＡを、前述のＤＮＡ導入方法で被形質転換カイコに導入する。次いで、前述した導入ＤＮＡのうち、前記転写因子の標的プロモーターの下流に機能的に結合した前述した本発明に共通して用いられる単量体ＣＲＰをコードするＤＮＡを、前述のＤＮＡ導入方法で別の被形質転換カイコに導入する。次いで、これら２種類の成体カイコ同士を交配させ、次世代のカイコとして前述の導入ＤＮＡを全て有する遺伝子組換えカイコを得る。
この方法では、一の被形質転換カイコに転写因子を導入し、この転写因子により発現する組織、時期、量などを決めることができる。そのため、発現させたい遺伝子を導入した系統と交配させることにより、多くの系統を作ることなく、各組織や時期、量などを変えることができる利点がある。また、目的遺伝子を発現させることで遺伝子組換えカイコが不妊になる場合でも系統作出が可能である。更には、転写因子の選択によっては、導入ＤＮＡからの生産物の量を増加させることができる。
【００２８】
本発明の交配を伴う遺伝子組換えカイコ作成の好ましい一態様としては、セリシンＩ遺伝子から合成されるタンパク質をコードするＤＮＡのプロモーターの下流に連結されたＧＡＬ４をコードするＤＮＡが導入されたカイコと、ＵＡＳ配列の下流に連結された前述のシグナルペプチドを有する単量体ＣＲＰをコードするＤＮＡとを含むＤＮＡが導入されたカイコとを交配させ、遺伝子組換えカイコを作成する。
【００２９】
本発明の５量体ＣＲＰの製造方法の作成工程で作成される遺伝子組換えカイコは、単量体ＣＲＰをコードするＤＮＡを含んでいる前述した導入ＤＮＡが染色体に安定に組み込まれており、５量体ＣＲＰを製造するカイコであり、好ましくは、５量体ＣＲＰを発現し分泌するカイコである。ここで、５量体ＣＲＰを遺伝子組換えカイコが分泌することで、カイコからの５量体ＣＲＰの回収が容易となる。
より好ましい態様では、本発明の５量体ＣＲＰの製造方法で用いられる遺伝子組換えカイコは、絹糸腺に５量体ＣＲＰを製造し、特に好ましい態様では、絹糸腺に５量体ＣＲＰを発現し分泌させて製造する。夾雑タンパク質が少ない限定された空間でタンパク質を高密度に発現させる器官である絹糸腺で５量体ＣＲＰが製造され、絹糸腺に５量体ＣＲＰが分泌されることで、５量体ＣＲＰの回収・精製が容易となり、５量体ＣＲＰを高効率で製造可能となるからである。
【００３０】
本発明の５量体ＣＲＰの製造方法の回収工程では、前述した遺伝子組換えカイコが製造した５量体ＣＲＰ、好ましくは前述した遺伝子組換えカイコが発現し分泌させて製造した５量体ＣＲＰを回収し、精製することで５量体ＣＲＰを製造する工程である
【００３１】
本発明の５量体ＣＲＰの製造方法の回収工程において、前述した遺伝子組換えカイコが製造した５量体ＣＲＰを回収する方法としては、５量体ＣＲＰを含有する分泌物から５量体ＣＲＰを抽出する方法が挙げられる。ここで分泌物としては、絹糸腺において分泌される液状絹又は絹糸、若しくは脂肪体の分泌物が挙げられる。とりわけ、中部絹糸腺又は後部絹糸腺から分泌される液状絹又は絹糸が、その分泌量が特に多いため好ましく、回収が容易なことから、液状絹がより好ましい。
絹糸腺からの液状絹の回収方法としては、例えば、吐糸期になったカイコを解剖し、絹糸腺を摘出した後、緩衝液中でピンセットやメスで絹糸腺に傷を入れ、又は絹糸腺を緩衝液中に入れ緩衝液をボルテックスミキサーにより攪拌して、緩衝液中に放出された液状絹を回収する方法が挙げられる。その他にも、遺伝子組換えカイコが吐糸した繭から回収する方法、界面活性剤を用いる方法又は水溶液で溶かす等の当業者であれば公知の方法を絹糸の回収方法として挙げることができる。
一方、脂肪体からの分泌物の回収方法としては、幼虫体内から脂肪体を摘出し、緩衝液中でピンセットやメスで脂肪体に傷を入れ、緩衝液中に放出された分泌物を回収する方法や、分泌物を脂肪体から体液に分泌させ、その体液を分取する等の当業者であれば公知の方法を挙げることができる。
本発明における５量体ＣＲＰを含有する分泌物の回収方法の好ましい一態様としては、吐糸期になったカイコを解剖し、絹糸腺を摘出した後、緩衝液中で液状絹を抽出して回収する方法が挙げられる。この方法によれば、液状絹を回収後の５量体ＣＲＰの精製が容易となる。
【００３２】
本発明の５量体ＣＲＰの製造方法の回収工程において、分泌物に含まれる５量体ＣＲＰの精製は、例えば、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、又はこれらの組み合わせを利用することにより行うことができる。その中でも、アフィニティークロマトグラフィーが、５量体ＣＲＰを容易に精製可能であるため好ましい。アフィニティークロマトグラフィーとしては、Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ  Ｃｈｏｌｉｎｅカラムを用いたものが、５量体ＣＲＰを変性させず構造を維持したまま精製可能なので好ましい。
【００３３】
本発明の５量体ＣＲＰの製造方法により製造された５量体ＣＲＰの反応性は、例えば、当業者においては公知のＥＬＩＳＡ法を用いて評価することができる。ＥＬＩＳＡ法においては、公知の抗ＣＲＰ抗体を利用することができる。
後段の実施例で詳述するが、本発明の５量体ＣＲＰの製造方法により製造された５量体ＣＲＰは、ＥＬＩＳＡ法における反応性評価において、血清由来のＣＲＰと同様に濃度依存的な反応性を示す。従って、本発明の５量体ＣＲＰの製造方法により製造された５量体ＣＲＰによって、ＣＲＰ測定キット等に用いられる血清由来ＣＲＰを代替可能である。
【００３４】
本発明で提供される遺伝子組換えカイコは、単量体ＣＲＰをコードするＤＮＡを含んでいる前述した導入ＤＮＡが染色体に安定に組み込まれており、５量体ＣＲＰを製造するカイコであり、好ましくは、５量体ＣＲＰを発現し分泌するカイコである。ここで、５量体ＣＲＰを遺伝子組換えカイコが分泌することで、カイコからの５量体ＣＲＰの回収が容易となる。
より好ましい態様では、本発明で提供される遺伝子組換えカイコは、絹糸腺に５量体ＣＲＰを製造し、特に好ましい態様では、絹糸腺に５量体ＣＲＰを発現し分泌させて製造する。夾雑タンパク質が少ない限定された空間でタンパク質を高密度に発現させる器官である絹糸腺で５量体ＣＲＰが製造され、絹糸腺に５量体ＣＲＰが分泌されることで、５量体ＣＲＰの回収・精製が容易となり、５量体ＣＲＰを高効率で製造可能となるからである。
【００３５】
本発明で提供される遺伝子組換えカイコ、又は本発明の５量体ＣＲＰの製造方法の作成工程で作成される遺伝子組換えカイコは、元来カイコが有さない５量体ＣＲＰを発現させているが、通常のカイコと同様な方法で、継代維持可能である。更には子孫のカイコは５量体ＣＲＰを製造することができる。
例えば、卵を通常の条件で催青し、孵化した蟻蚕を人工飼料等へ掃立てし、通常のカイコと同様な条件で飼育することで５令カイコまで飼育できる。
本発明で提供される遺伝子組換えカイコ、又は本発明の５量体ＣＲＰの製造方法に用いられる遺伝子組換えカイコは、通常のカイコと同様に蛹化する。蛹の段階で雌雄を区別し、発蛾したのち雌雄を交尾させ、翌日採卵する。カイコ卵は通常のカイコ卵と同様に保存することが可能である。本発明で提供される遺伝子組換えカイコ、又は本発明の５量体ＣＲＰの製造方法に用いられる遺伝子組換えカイコはこうした飼育を繰り返すことで継代することが可能である。
継代して得られた遺伝子組換えカイコは人工飼料による清浄飼育が可能であり、数万匹規模での大量飼育を容易に行うことができる。しかも、自然界に豊富にある桑の葉を用いてカイコの大量飼育を行えば、５量体ＣＲＰを安価かつ大量に得ることができる。
すなわち、大量飼育した本発明で提供される遺伝子組換えカイコ、又は本発明の５量体ＣＲＰの製造方法に用いられる遺伝子組換えカイコを用いて５量体ＣＲＰを高効率で製造可能である。
【００３６】
本発明の遺伝子組換えカイコの製造方法は、前述した導入工程を経ることにより、５量体ＣＲＰを製造する遺伝子組換えカイコを製造する方法であり、好ましくは５量体ＣＲＰを発現し分泌する遺伝子組換えカイコを製造する方法である。
より好ましい態様では、本発明の遺伝子組換えカイコの製造方法は、５量体ＣＲＰを絹糸腺に製造する遺伝子組換えカイコを製造する方法である。特に好ましい態様では、本発明の遺伝子組換えカイコの製造方法は、５量体ＣＲＰを絹糸腺に発現し分泌する遺伝子組換えカイコを製造する方法である。
【００３７】
本発明で提供される単量体イヌＣＲＰをコードするＤＮＡは、配列番号１に示される配列を含むアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡであり、好ましくは、配列番号４に示される塩基配列を有するＤＮＡである。
さらに好ましい態様では、本発明で提供される単量体イヌＣＲＰをコードするＤＮＡは、シグナルペプチドを有する単量体イヌＣＲＰをコードするＤＮＡである。シグナルペプチドを有する単量体イヌＣＲＰをコードするＤＮＡとしては、配列番号３に示される配列を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ、好ましくは、配列番号６に示される塩基配列を有するＤＮＡが挙げられる。
なお、配列番号１又は３で示される配列を含むアミノ酸配列をコードするＤＮＡには、このアミノ酸配列に、機能的に同等な限りにおいて、１ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加および挿入から選ばれる少なくとも１種の変異が導入され、かつ、この配列と一定の相同性を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡが含まれる。ここで、一定の相同性としては、例えば、６０％以上の相同性が挙げられ、好ましくは７０％以上の相同性、より好ましくは８０％以上の相同性、更に好ましくは９０％以上の相同性が挙げられる。
また、配列番号４又は６に示される塩基配列には、それがコードするタンパク質が機能的に同等な限りにおいて、１ないし数個の塩基の欠失、置換、付加および挿入から選ばれる少なくとも１種の変異が導入され、かつ、この配列と一定の相同性を有する塩基配列が含まれる。ここで、一定の相同性としては、例えば、６０％以上の相同性が挙げられ、好ましくは７０％以上の相同性、より好ましくは８０％以上の相同性、更に好ましくは９０％以上の相同性が挙げられる。
【００３８】
本発明で提供される単量体イヌＣＲＰをコードするＤＮＡを、５量体ＣＲＰの製造が可能な宿主に導入することで、後段の実施例で詳述するように活性を有する５量体イヌＣＲＰの遺伝子工学的な製造が可能となる。
【００３９】
本発明で提供される発現ベクターは、前述した単量体イヌＣＲＰをコードするＤＮＡを含む発現ベクターであり、好ましくは、前述した単量体イヌＣＲＰをコードするＤＮＡがＵＡＳの下流に機能的に結合している発現ベクターである。ここで、部位特異的に発現するタンパク質をコードするＤＮＡのプロモーターの下流に機能的に結合したＧＡＬ４をコードするＤＮＡを有する宿主に、ＵＡＳの下流に単量体イヌＣＲＰをコードするＤＮＡが機能的に結合される発現ベクターを導入することで、ＣＲＰの発現部位や時期、量を正確に制御できるようになる。
本発明で提供される発現ベクターの基礎となるベクターについては特に限定されないが、Ｍ１３系ベクター、ｐＵＣ系ベクター、ｐＢａｃ系ベクター、ｐＢＰ３２２、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ等が挙げられる。
【００４０】
本発明で提供される発現ベクターは、本発明の５量体ＣＲＰの製造方法の作成工程又は本発明の遺伝子組換えカイコの製造方法の導入工程において、単量体イヌＣＲＰをコードするＤＮＡを被形質転換カイコに導入する際に利用される他、カイコ以外の宿主へのＤＮＡ導入に利用することができる。
なお、発現ベクターの宿主への導入は、当業者においては公知の方法、例えばエレクトロポレーション法などにより実施することができる。
本発明で提供される発現ベクターを５量体ＣＲＰの製造が可能な宿主に導入することで、後段の実施例で詳述するように活性を有する５量体イヌＣＲＰの遺伝子工学的な製造が可能となる。
【００４１】
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００４２】
以下に詳細に記載するように、ＵＡＳ配列の下流に連結されたシグナルペプチドを有する単量体イヌＣＲＰをコードするＤＮＡが導入されたカイコと、セリシンＩ遺伝子から合成されるタンパク質をコードするＤＮＡのプロモーターの下流に連結されたＧＡＬ４をコードするＤＮＡが導入されたカイコとを交配させて遺伝子組換えカイコを作成し、該遺伝子組換えカイコがその絹糸腺に産生するイヌＣＲＰを回収して、その物性を調べた。【００４３】
（１）プラスミドベクターｐＢａｃ−ＵＡＳ−ｃｆＣＲＰ−ＳＶ４０の構築
ＵＡＳ配列及びその下流に連結されたシグナルペプチドを有する単量体イヌＣＲＰをコードするＤＮＡ（ｃｆＣＲＰ）を含むプラスミドベクターを構築した。すなわち、イヌＣＲＰ遺伝子中のＭａｔｕｒｅ  Ｒｅｇｉｏｎに相当する塩基配列を決定し、その塩基配列を含んだ図１に示すプラスミドベクターを構築した。なお、イヌＣＲＰ遺伝子の塩基配列として、イヌＣＲＰと予測される配列（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＸＭ＿５４５７４６）を参照した。【００４４】
具体的には、イヌＣＲＰ遺伝子と予測される塩基配列を翻訳して得られるアミノ酸配列と、アミノ酸配列が同定されているヒト、マウス、ウサギ、ブタ、ウシの各種動物ＣＲＰのｍａｔｕｒｅ  ｆｏｒｍのアミノ酸配列との間で相同性検索を行い、相同性の高い領域をＭａｔｕｒｅ  Ｒｅｇｉｏｎとした。なお、このＭａｔｕｒｅ  ＲｅｇｉｏｎとはＣＲＰの単量体となると推定される部分であり、配列番号４の塩基配列を有し、その分子量はアミノ酸配列から２２．９ｋＤａであると推定された。また、各種動物ＣＲＰのシグナルペプチドのアミノ酸配列を用いて同様に相同性検索を行い、相同性の高い領域を、配列番号５の塩基配列を有するシグナルペプチドとした。
次いで、Ｍａｔｕｒｅ  Ｒｅｇｉｏｎに相当する配列番号４の塩基配列の５’末端に、配列番号５の塩基配列を有するシグナルペプチドに相当する塩基配列を付加した配列番号６の塩基配列を有する塩基配列（ｃｆＣＲＰ）を設計した。設計した塩基配列を全合成した後、合成ＤＮＡをｐＵＣ５７プラスミドに挿入してｐＵＣ５７−ｃｆＣＲＰプラスミドを構築した。なお、ｃｆＣＲＰのＯＲＦの両端には制限酵素サイト（ＳｐｅＩ）を設けた。
次いで、ｐＵＣ５７−ｃｆＣＲＰプラスミドをＳｐｅＩ処理し、ｃｆＣＲＰフラグメントを得た。最後に、ｃｆＣＲＰフラグメントを、ｐＢａｃ−ＵＡＳ−ＳＶ４０のＢｌｎＩサイトに挿入して、遺伝子組換えカイコを作成するためのプラスミドベクターｐＢａｃ−ＵＡＳ−ｃｆＣＲＰ−ＳＶ４０（図１）を構築した。【００４５】
（２）イヌＣＲＰ産生遺伝子組換えカイコの作成
前記（１）で構築したプラスミドベクターｐＢａｃ−ＵＡＳ−ｃｆＣＲＰ−ＳＶ４０が導入されたカイコと、セリシンＩ遺伝子から合成されるタンパク質をコードするＤＮＡのプロモーター（Ｓｅｒ１）及びその下流に連結されたＧＡＬ４をコードするＤＮＡ（ＧＡＬ４）が導入されたカイコとを作成し、それらを交配させてイヌＣＲＰを産生する遺伝子組換えカイコを作成した。【００４６】
具体的には、（１）で構築したｐＢａｃ−ＵＡＳ−ｃｆＣＲＰ−ＳＶ４０と、転移酵素遺伝子をコードするヘルパープラスミドｐＡ３ＰＩＧ（Tamura,T.et al.,Nat.Biotechnol.,18,p81-84,2000）とを４３３粒の発生初期のカイコ卵にマイクロインジェクションにより導入した。ここで、遺伝子導入は、特開２００３−８８２７３号公報記載のポリヌクレオチド導入方法に従って行った。
次いで、遺伝子が導入されたカイコ卵から孵化した第１世代のカイコを交配させ、得られた第２世代の幼虫の体表におけるＫＭＯマーカー遺伝子の発現を調べた。
交配させた６２蛾区中１蛾区からＫＭＯマーカー遺伝子を発現する幼虫８個体を同定した。これらの個体を継代飼育することによりイヌＣＲＰ遺伝子を持ったカイコを系統化した。
次いで、イヌＣＲＰ系統のカイコと、セリシンＩ遺伝子から合成されるタンパク質をコードするＤＮＡのプロモーター（Ｓｅｒ１）及びその下流に連結されたＧＡＬ４をコードするＤＮＡ（ＧＡＬ４）が導入された、既に系統化されているＳｅｒ１ＧＡＬ４系統のカイコ（田村俊樹ら，日蚕講要，７４，ｐ５１，２００４）とを交配した。交配により得られた次世代のカイコの中から、イヌＣＲＰ系統が有するＫＭＯマーカー遺伝子とＳｅｒ１ＧＡＬ４系統が有するＤｓＲｅｄマーカー遺伝子との双方を発現する個体を選抜した。【００４７】
（３）イヌＣＲＰの抽出
前記（２）で選抜した遺伝子組換えカイコの吐糸期の幼虫から、イヌＣＲＰを抽出し、反応性を確認した。【００４８】
具体的には作成したイヌＣＲＰ産生遺伝子組換えカイコの絹糸腺から緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２）中にイヌＣＲＰを抽出し、４℃、２４０００ｒｐｍ、１５ｍｉｎにて遠心し、遠心上清を回収した。
得られた遠心上清中にイヌＣＲＰが存在することをイヌＣＲＰ測定ＥＬＩＳＡキット（ＩＣＬ社製）にて確認した。また、遠心上清を段階的に希釈し、希釈液中のイヌＣＲＰ量を測定して希釈直線性を確認した（図２）。【００４９】
対照として、イヌ血清を段階的に希釈し、イヌＣＲＰ測定ＥＬＩＳＡキット（ＩＣＬ社製）を用いて希釈液中のイヌＣＲＰ量を測定して希釈直線性を確認した（図２）。【００５０】
この結果より、イヌＣＲＰ産生遺伝子組換えカイコから得られた組換えイヌＣＲＰがイヌ血清由来のＣＲＰと同等の反応性を有することが確認された。【００５１】
（４）イヌＣＲＰの精製
前記（３）でイヌＣＲＰ産生遺伝子組換えカイコから抽出したイヌＣＲＰ溶液からイヌＣＲＰを分離精製した。【００５２】
具体的には、抽出したイヌＣＲＰ溶液を０．４５μｍのフィルターでろ過して精製サンプルとした。この精製サンプルをＩｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｐ−Ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ  Ｃｈｏｌｉｎｅカラム（ＰＩＥＲＣＥ社製；１ｍｌ）に通液した。なお、このカラムはあらかじめ５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２で平衡化されている。
次いで、２０ｍｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、２Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２でカラムを洗浄後、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ  Ｃｈｏｌｉｎｅを通液してカラムよりイヌＣＲＰを溶出させた。
得られたイヌＣＲＰ画分について、イヌＣＲＰ測定ＥＬＩＳＡキット（ＩＣＬ社製）により吸光度の上昇を確認した（表１）。【００５３】
【表１】
0005924649.tif 000002
【００５４】
（５）イヌＣＲＰの分子量分析
前記（４）で精製されたイヌＣＲＰの分子量を測定した。【００５５】
具体的には、イヌＣＲＰ精製溶液をゲルろ過クロマトグラフィー用サンプルとし、このサンプルをＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ゲルろ過クロマトグラフィーカラムに通液した（図３）。なお、このカラムはあらかじめ５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．５Ｍ  ＮａＣｌで平衡化されている。また、各溶出画分中のＣＲＰ量はイヌＣＲＰ測定ＥＬＩＳＡキット（ＩＣＬ社製）により測定した。
分子量マーカーであるＴｈｙｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ（Ｍ．Ｗ．６７０ｋＤａ）、ｒ−ｇｌｏｂｕｌｉｎ（Ｍ．Ｗ．１５８ｋＤａ）、Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ（Ｍ．Ｗ．４４ｋＤａ）、Ｍｙｏｇｌｏｂｉｎ（Ｍ．Ｗ．１７ｋＤａ）、Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｂ１２（Ｍ．Ｗ．１．３５ｋＤａ）を同条件化で通液し、溶出時間をイヌＣＲＰのものと比較することによってイヌＣＲＰの分子量を測定した。【００５６】
対照として、ヒト血清由来ヒトＣＲＰを同条件下で通液し、溶出時間をイヌＣＲＰのものと比較した（図３）。なお、各溶出画分中のＣＲＰ量はＬＡ  ＣＲＰ−Ｓ（Ｄ）（ニットーボーメディカル社製）により測定した。
ここで、イヌＣＲＰの単量体の分子量がその２２．９ｋＤａと推定されるのに対し、ヒトＣＲＰはその単量体の分子量は２３．０ｋＤａであり、血清中に５量体で存在する。【００５７】
結果として、分子量マーカーとの比較より、イヌＣＲＰの分子量は約１００ｋＤａであることを確認した。また遺伝子組換カイコ産生イヌＣＲＰとヒト血清由来ヒトＣＲＰが同一の溶出時間を示すことを確認した。この分子量分析結果から、カイコより精製したイヌＣＲＰは５量体を形成していることが確認された。なお、単量体のイヌＣＲＰはこの精製画分には含まれず、生体内に存在するものと同様の５量体イヌＣＲＰが獲得できた。
【産業上の利用可能性】
【００５８】
本発明の５量体ＣＲＰの製造方法により、血清由来ＣＲＰと同等の活性を有する５量体ＣＲＰを高効率で製造することができる。本発明の５量体ＣＲＰの製造方法により製造されるＣＲＰは、臨床検査分野で使用されているＣＲＰ測定キットに含まれるキャリブレーターとして利用することができる。また、本発明により製造されるＣＲＰは、ＣＲＰ測定キットに含まれる抗ＣＲＰ抗体を作成する際に抗原として利用することができる。
【配列表フリーテキスト】
【００５９】
配列番号１−イヌＣＲＰのアミノ酸配列
配列番号２−イヌＣＲＰに由来するシグナルペプチドのアミノ酸配列
配列番号３−人工配列の説明：イヌＣＲＰのアミノ酸配列（配列番号１）とイヌＣＲＰに由来するシグナルペプチドのアミノ酸配列（配列番号２）を連結したアミノ酸配列
配列番号４−イヌＣＲＰの塩基配列
配列番号５−イヌＣＲＰに由来するシグナルペプチドの塩基配列
配列番号６−人工配列の説明：イヌＣＲＰの塩基配列（配列番号４）とイヌＣＲＰに由来するシグナルペプチドの塩基配列（配列番号５）を連結した塩基配列
配列番号７−ヒトＣＲＰのアミノ酸配列
配列番号８−ヒトＣＲＰに由来するシグナルペプチドのアミノ酸配列
配列番号９−ヒトＣＲＰの塩基配列
配列番号１０−ヒトＣＲＰに由来するシグナルペプチドの塩基配列
【図１】
0005924649.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【配列表】
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