(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体試料中の標的物質が特異的に結合するアプタマーと、
前記アプタマーと相補的な塩基配列を有する第１の核酸断片と、
前記アプタマーの一部及び前記第１の核酸断片の一部が固定された固定部材と、
を備え、
前記アプタマーは、前記第１の核酸断片と二本鎖を形成する二本鎖形成部位を有している、複合体を準備する工程と、
前記標的物質を前記アプタマーに結合させることにより、前記第１の核酸断片を前記アプタマーの前記二本鎖形成部位から分離させる工程と、
前記第１の核酸断片が前記アプタマーから分離する、前記二本鎖の開裂を検出する工程と、
を有し、
前記第１の核酸断片を前記アプタマーの前記二本鎖形成部位から分離させる工程の前、または前記第１の核酸断片を前記アプタマーの前記二本鎖形成部位から分離させる工程において、前記アプタマーと前記第１の核酸断片との二本鎖の結合エネルギー以上の開裂エネルギーを投入する開裂エネルギー投入工程を含み、
前記二本鎖の開裂を検出する工程の前、または前記二本鎖の開裂を検出する工程において、前記アプタマーと前記第１の核酸断片との二本鎖の結合力を強める二本鎖安定化工程を含む標的物質の検出方法。
【請求項２】
検体試料中の標的物質が特異的に結合するアプタマーと、
前記アプタマーと相補的な塩基配列を有する第１の核酸断片と、
前記アプタマーの一部及び前記第１の核酸断片の一部が固定された固定部材と、
を備え、
前記アプタマーは、前記第１の核酸断片と二本鎖を形成する二本鎖形成部位を有している、複合体を準備する工程と、
前記標的物質を前記アプタマーに結合させることにより、前記第１の核酸断片を前記アプタマーの前記二本鎖形成部位から分離させる工程と、
前記第１の核酸断片が前記アプタマーから分離する、前記二本鎖の開裂を検出する工程と、
を有し、
前記第１の核酸断片を前記アプタマーの前記二本鎖形成部位から分離させる工程の前、または前記第１の核酸断片を前記アプタマーの前記二本鎖形成部位から分離させる工程において、前記アプタマーと前記第１の核酸断片との二本鎖の結合エネルギー未満の開裂エネルギーを投入する開裂エネルギー投入工程を含み、
前記二本鎖の開裂を検出する工程の前、または前記二本鎖の開裂を検出する工程において、前記アプタマーと前記第１の核酸断片との二本鎖の結合力を強める二本鎖安定化工程を含む標的物質の検出方法。
【請求項３】
前記アプタマーの前記二本鎖形成部位は、前記第１の核酸断片の塩基配列と相補的な塩基配列のみを有する請求項１または２に記載の標的物質の検出方法。
【請求項４】
前記複合体は、前記アプタマーの一部と前記第１の核酸断片の一部とが互いに連結した連結部を備えており、
前記連結部が前記固定部材に固定されている請求項１乃至３のいずれか一項に記載の標的物質の検出方法。
【請求項５】
前記二本鎖の開裂を検出する工程は、
前記二本鎖形成部位から分離した前記第１の核酸断片に、前記第１の核酸断片と相補的な塩基配列を有する第２の核酸断片を結合させる工程と、
前記第１の核酸断片と前記第２の核酸断片の結合を検出することにより、前記二本鎖の開裂を検出する工程と、
を有する請求項１乃至４のいずれか一項に記載の標的物質の検出方法。
【請求項６】
前記固定部材は、前記アプタマー及び前記第１の核酸断片が固定された固定領域とは別の領域に、親溶媒性の領域を有する請求項５に記載の標的物質の検出方法。
【請求項７】
前記第２の核酸断片を結合させる工程は、前記二本鎖形成部位から分離した前記第１の核酸断片に、基板に固定された前記第２の核酸断片を結合させる工程を有しており、
前記基板は、前記第２の核酸断片が固定された固定領域とは別の領域に、親溶媒性の領域を有する請求項５に記載の標的物質の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的物質の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アプタマーとは、特定の物質と結合する能力を有する核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ）のことをいう。アプタマーの結合対象物質（以下、標的物質と呼ぶ）は、タンパク質や、ホルモン、ペプチドなどの生体分子や、農薬などの人工的な分子、カリウムイオンなどの小分子など多岐にわたっている。したがって、アプタマーと標的物質の結合を検出することにより、検体中に含まれる標的物質を定量することができる。また、アプタマーと標的物質の結合を電気シグナルとして取り出すことにより、標的物質に対して特異的に応答するセンサが構築できる。【０００３】
アプタマーを利用した物質検出をおこなう際は、溶液交換時等におけるアプタマーの取り扱いが容易になったり、多数のアプタマーを同時に扱うことが容易になったりする等の利点のため、アプタマーは固体上に担持して用いられることがあった（例えば、特許文献１、２、非特許文献１〜４）。【０００４】
例えば、非特許文献１および２には、電極反応物質１０３，１１３であるメチレンブルーが標識されたアプタマー１０１，１２１が電極１０４，１１４上に固定されたセンサが記載されている（図１（ａ）〜（ｄ））。これらのセンサは、標的物質（トロンビン等の標的物質１０７、又はコカイン１２７）の結合によって、アプタマー１０１，１２１に生じる立体構造変化を、電極１０４，１１４と電極反応物質１０３，１１３間の距離の変化、すなわち、電極反応物質１０３，１１３の反応電流変化として検出している。しかし、図１の模式図から明らかなように、標的物質との結合によるアプタマーの立体構造変化の様式や変化量はアプタマーによって大きく異なることになる。すなわち、図１（ｃ）に示すように、アプタマー１２１の構造変化後、電極反応物質１１３は、電極１１４から離れることがある。一方、図１（ｄ）に示すように、アプタマー１２１の構造変化後、電極反応物質１１３は、電極１１４に近づくことがある。したがって、都合良く標識物質と電極間の距離が大きく変化して、非特許文献１および２の方法を用いてセンサ化した場合、充分なシグナル変化を得ることができるアプタマーは限られる。すなわち、非特許文献１及び２の技術は、検出精度の面で改善の余地を有していた。【０００５】
特許文献１には、標的物質の存在の検出メカニズムを改善した技術が記載されている。すなわち、特許文献１では、図２に示すように、アプタマー１０１とその相補鎖１０２とを用いたアプタマーセンサが記載されている。同文献によれば次のようなメカニズムにより標的物質の存在を検出できると記載されている。すなわち、アプタマーセンサにおいて、アプタマー１０１と相補鎖１０２は、標的物質不在時は相補的な塩基対の形成により二本鎖核酸領域（二本鎖形成部位１０５）を形成している（図２（ａ））。この二本鎖核酸領域は、標的物質１０７が存在すると、アプタマー１０１と標的物質１０７が結合することにともない、相補的な塩基対形成が解離して解消される（図２（ｂ））。それによって生じる物理的、化学的性質の変化を検出することで標的物質が検出される。例えば、電極反応物質１０３を有する相補鎖１０２が、電極１０４（表面プラズモン共鳴センサ基板）から分離することを検知することにより、標的物質の存在を検出することができることが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００８−２７８８３７号公報
【特許文献２】特表２００３−５０８７２９号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｙｉ  Ｘｉａｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ．  Ｅｄ．，２００５年，４４号，ｐ５４５６−５４５９．
【非特許文献２】Ｂｒｉａｎ  Ｒ  Ｂａｋｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｏｃｉｅｔｙ，２００６年，１２８号，ｐ３１３８−３１３９．
【非特許文献３】Ｙｉ  Ｘｉａｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｏｃｉｅｔｙ，２００５年，１２７号，ｐ１７９９０−１７９９１．
【非特許文献４】Ｊｕｅｗｅｎ  Ｌｉｕ，  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ，２００６年，１８号，ｐ１６６７−１６７１．
【非特許文献５】Ｍａｒｋｈａｍ，Ｎ．Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００５年，３３号，ｐ５７７−５８１．
【非特許文献６】Ｈｕｉ  Ｘｕ，  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００９年，８１号，ｐ６６９−６７５．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明者が検討した結果、上記特許文献１に記載の技術において、標的物質の非結合時の二本鎖維持能と標的物質の結合時の二本鎖開裂能と相反する特性を両立させることに改善の余地が見出された。【０００９】
すなわち、検体試料中の標的物質をうまく検出するには、標的物質がアプタマーに結合する前に、アプタマーと相補鎖との二本鎖が維持されていることが必要となる。しかしながら、アプタマーと相補鎖との結合力が不十分であると、解離平衡反応に従って二本鎖が解離する。これにより、相補鎖がアプタマーから分離し、検体試料の溶液中に拡散する。また、溶液中に拡散した相補鎖が再びアプタマーに結合する確率はかなり低い。このため、アプタマーと相補鎖との二本鎖の数は徐々に減少することになり、標的物質の検出が阻害されてしまう可能性がある。【００１０】
一方、アプタマーと相補鎖との結合力不足を補うために、アプタマーと相補鎖とがハイブリダイズする塩基数を多くすることが考えられる。しかしながら、二本鎖形成領域の塩基数を過剰に多くした場合、二本鎖は開裂し難くなる。このため、標的物質の検出が阻害されてしまう可能性がある。【００１１】
したがって、従来のアプタマーの二本鎖形成部位の設計は、このような二本鎖維持能と二本鎖開裂能との相反する特性のために、非常に困難なものであった。【００１２】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、その目的とするところは、互いに相反する特性が改善されたアプタマー及び核酸断片を用いることにより、信頼性に優れた標的物質の検出方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明によれば、
検体試料中の標的物質が特異的に結合するアプタマーと、
前記アプタマーと相補的な塩基配列を有する第１の核酸断片と、
前記アプタマーの一部及び前記第１の核酸断片の一部が固定された固定部材と、
を備え、
前記アプタマーは、前記第１の核酸断片と二本鎖を形成する二本鎖形成部位を有している、複合体を準備する工程と、
前記標的物質を前記アプタマーに結合させることにより、前記第１の核酸断片を前記アプタマーの前記二本鎖形成部位から分離させる工程と、
前記第１の核酸断片が前記アプタマーから分離する、前記二本鎖の開裂を検出する工程と、
を有し、
前記第１の核酸断片を前記アプタマーの前記二本鎖形成部位から分離させる工程の前、または前記第１の核酸断片を前記アプタマーの前記二本鎖形成部位から分離させる工程において、前記アプタマーと前記第１の核酸断片との二本鎖の結合エネルギー以上の開裂エネルギーを投入する開裂エネルギー投入工程を含み、
前記二本鎖の開裂を検出する工程の前、または前記二本鎖の開裂を検出する工程において、前記アプタマーと前記第１の核酸断片との二本鎖の結合力を強める二本鎖安定化工程を含む標的物質の検出方法が提供される。
【００１４】
さらに、本発明によれば、
検体試料中の標的物質が特異的に結合するアプタマーと、
前記アプタマーと相補的な塩基配列を有する第１の核酸断片と、
前記アプタマーの一部及び前記第１の核酸断片の一部が固定された固定部材と、
を備え、
前記アプタマーは、前記第１の核酸断片と二本鎖を形成する二本鎖形成部位を有している、複合体を準備する工程と、
前記標的物質を前記アプタマーに結合させることにより、前記第１の核酸断片を前記アプタマーの前記二本鎖形成部位から分離させる工程と、
前記第１の核酸断片が前記アプタマーから分離する、前記二本鎖の開裂を検出する工程と、
を有し、
前記第１の核酸断片を前記アプタマーの前記二本鎖形成部位から分離させる工程の前、または前記第１の核酸断片を前記アプタマーの前記二本鎖形成部位から分離させる工程において、前記アプタマーと前記第１の核酸断片との二本鎖の結合エネルギー未満の開裂エネルギーを投入する開裂エネルギー投入工程を含み、
前記二本鎖の開裂を検出する工程の前、または前記二本鎖の開裂を検出する工程において、前記アプタマーと前記第１の核酸断片との二本鎖の結合力を強める二本鎖安定化工程を含む標的物質の検出方法が提供される。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、信頼性に優れた標的物質の検出方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
上述した目的、およびその他の目的、特徴および利点は、以下に述べる好適な実施の形態、およびそれに付随する以下の図面によってさらに明らかになる。【００１８】
【図１】従来の標的物質の検出方法の手順を示す図である。
【図２】従来の標的物質の検出方法の手順を示す図である。
【図３】従来の標的物質の検出方法の手順を示す図である。
【図４】従来の標的物質の検出方法のアプタマービーコンを説明する図である。
【図５】従来の標的物質の検出方法のプローブ設計方法を示す図である。
【図６】第１の実施形態における標的物質の検出方法の手順を示す図である。
【図７】第２の実施形態における標的物質の検出に用いる複合体の構成を示す図である。
【図８】第３の実施形態における標的物質の検出方法の手順を示す図である。
【図９】第４の実施形態における標的物質の検出方法の手順を示す図である。
【図１０】第５の実施形態における標的物質の検出に用いる複合体の構成を示す図である。
【図１１】第５の実施形態における標的物質の検出方法の手順を示す図である。
【図１２】第６の実施形態における標的物質の検出方法の手順を示す図である。
【図１３】第６の実施形態における標的物質の検出方法の手順を示す図である。
【図１４】実施例１の測定結果を示す図である。
【図１５】実施例１〜５のＤＮＡ配列を示す表である。
【図１６】実施例２のシミュレーション結果を示す表である。
【図１７】実施例３の測定結果を示す図である。
【図１８】実施例４の測定結果を示す図である。
【図１９】実施例５の測定結果を示す図である。
【図２０】実施例６の測定結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明の実施の形態について、図面を用いて説明する。尚、すべての図面において、同様な構成要素には同様の符号を付し、適宜説明を省略する。
【００２０】
（第１の実施の形態）
第１の実施の形態について、図６を用いて説明する。
本実施の形態では、本発明に係る標的物質の検出方法および標的物質検出用のセンサの一例を示す。
【００２１】
第１の実施の形態の標的物質７の検出方法は、次の工程を含む。まず、複合体１１を準備する。複合体１１は、アプタマー１、第１の核酸断片２、及び固定部材４を備える。アプタマー１は、検体試料（検査対象物）中の標的物質７が特異的に結合する。また、アプタマー１は、第１の核酸断片２と二本鎖を形成する二本鎖形成部位５を有している。第１の核酸断片２は、アプタマー１と相補的な塩基配列を有する。アプタマー１の一部及び第１の核酸断片２の一部が、固定部材４に固定されている。次いで、標的物質７をアプタマー１に結合させる。この後、第１の核酸断片２がアプタマー１から分離し、二本鎖の開裂を検出する。本実施の形態において、二本鎖が開裂するとは、例えば、第１の核酸断片２が固定部材４に固定された状態で、第１の核酸断片２がアプタマー１の二本鎖形成部位５から分離することを意味する。
また、固定部材４に固定されたとは、二本鎖形成を構成する水素結合を除いた、化学結合及び／又は化学吸着により結合されることを意味する。また、二本鎖の開裂を検出する手法としては、各種の公知の手段を用いることができ、具体的には後述する。
【００２２】
本実施の形態において、アプタマー１は第１の核酸断片２との二本鎖を形成している二本鎖形成部位５を有する。くわえて、第１の核酸断片２の一部は、アプタマー１の一部と同様に固定部材４に固定されている。第１の核酸断片２は、標的物質７の非結合時にアプタマー１から分離したとしても、固定部材４にその一部が固定されている。このため、第１の核酸断片２は、従来のように溶液中に拡散しにくくなる。このような第１の核酸断片２は、アプタマー１と再度二本鎖を形成することが可能となる。そのため、従来のように二本鎖維持能を向上させることを目的として、二本鎖形成部位５の塩基数を増大させる必要がなくなる。したがって、アプタマー１の二本鎖形成部位５の設計は、二本鎖開裂能に適合させることが可能となる。
【００２３】
以上のように、二本鎖維持能は、アプタマー１の二本鎖形成部位５とは別に、第１の核酸断片２の一部を固定部材４に固定することにより実現される。すなわち、二本鎖維持能及び二本鎖開裂能を二本鎖形成部位のみに付与せず、二本鎖維持能は、固定された第１の核酸断片２の一部に付与し、二本鎖開裂能は、二本鎖形成部位５に付与することができる。これにより、２つの機能を別の部位に分配することが可能となる。従って、本実施の形態の複合体１１によれば、従来の技術では互いに相反する特性である二本鎖維持能及び二本鎖開裂能を両立させることが可能となる。このような複合体１１を用いることにより、優れた標的物質の検出を実現することができる。
【００２４】
また、本実施の形態の標的物質の検出方法は、標的物質に対して特異的に結合するアプタマー１と、アプタマーと相補的な塩基配列を有する核酸断片（第１の核酸断片２）とが同一の部材に化学結合および化学吸着により固定された複合体の調整工程と、複合体を検体と接触させる接触工程と、検体中の標的物質がアプタマーと結合する結合工程と、部材上のアプタマーと核酸断片による二本鎖核酸部位が開裂する開裂工程と、アプタマーと核酸断片の二本鎖核酸部位を検知する検出工程と、を含んでいる。
【００２５】
以下、本実施の形態の標準物質の検出工程について詳述する。
まず、複合体１１を用意する。この複合体１１は、アプタマー１と、第１の核酸断片２と、固定部材４を有している。アプタマー１の端部と第１の核酸断片２の端部は、固定部材４に化学結合および化学吸着により固定されている。本実施の形態では、アプタマー１の端部及び第１の核酸断片２の端部が、直接固定部材４に固定される。さらに、アプタマー１は、標的物質との結合を形成可能な塩基配列のうち少なくとも一部が第１の核酸断片２と二本鎖形成部位５を形成している（図６（ａ））。また、第１の核酸断片２の先端部には標識物質３が結合されている。第１の実施の形態において、二本鎖形成部位５（二本鎖核酸部位）とは、アプタマーとその相補的な配列を有する核酸とが核酸の二本鎖を形成している部位を意味する。
【００２６】
続いて、複合体１１を用意する工程から標的物質７を検出する工程を、下記の第１の工程から第２の工程に分けて説明する。
【００２７】
第１の実施の形態の第１の工程では、標的物質７がアプタマー１に結合する（図６（ｂ））。複合体１１において、アプタマー１は、標的物質との結合を形成可能な塩基配列の一部が二本鎖形成部位５を形成しているが、他の部位は一本鎖状態である。すなわち、アプタマー１の一本鎖部位の構造が自在に変形できる。言い換えると、アプタマー１は、第１の核酸断片２との二本鎖形成部位５を有するとともに、標的物質７との結合能を有する結合部位を有している。従って、アプタマー１はアプタマーとしての立体構造をとることができ、検査対象物中の標的物質７と結合することができる。
【００２８】
続いて、第１の実施の形態の第２の工程では、アプタマー１と第１の核酸断片２の間で形成された二本鎖形成部位５における二本鎖が開裂する。すなわち、第１の工程でアプタマー１と標的物質７とが結合すると、ブランチマイグレーションが生じることによって二本鎖形成部位５は解消する。このブランチマイグレーションは、標的物質７とアプタマー１との結合が、アプタマー１の二本鎖核酸部位を形成していた核酸同士の結合よりも強い場合に起こる。このようにしてアプタマー１の二本鎖核酸部位が消えると、アプタマー１は第１の核酸断片２から解離する（図６（ｃ））。第１の核酸断片２は、アプタマー１から分離した後も、固定部材４に固定されたままの状態を維持する。ここで、標的物質７が結合するアプタマー１の塩基配列は、アプタマー１の二本鎖形成部位の塩基配列の一部または全部と共通している。このため、標的物質７がアプタマー１に結合すると、アプタマー１の二本鎖核酸部位における構造が変形し、アプタマー１と第１の核酸断片２とが開裂する。
【００２９】
この後、アプタマー１の二本鎖形成部位の開裂を検出する。ここで、アプタマー１の二本鎖形成部位における開裂を検出するとは、二本鎖核酸部位における二本鎖の開裂によって生じる物理的、化学的変化を検出できる限り限定されず、例えば、光学的シグナル、電気的シグナル、色彩的シグナル等のシグナル変化を検出することを意味する。
【００３０】
ここで、第１の実施の形態の作用効果について、特許文献１に記載の技術と比較しつつさらに説明する。
【００３１】
上記の特許文献１には、アプタマーまたは核酸断片のうちどちらか一方のみが部材に直接固定されることが記載されている。すなわち、同文献には、アプタマーが部材に直接固定される場合、核酸断片は、部材に固定されずにアプタマーと二本鎖を形成することにより、アプタマーに固定されることが記載されている。
【００３２】
ここで、アプタマーと核酸断片との間の結合力が不充分な場合がある。この場合、標的物質が存在しないときであっても、二本鎖の解離平衡反応に応じて二本鎖核酸部位が解消してしまう。固定されていない方の核酸は、二本鎖核酸部位の解消後、ただちに溶液中を拡散して部材表面から離れる。このため、ひとたび二本鎖核酸部位が解消されると、再度二本鎖核酸部位が形成される可能性は極めて少ない。したがって、標的物質不在時であっても、二本鎖核酸部位が時間経過と共に減少してしまい、標的物質の検知の妨げとなる。
【００３３】
そこで、安定的な二本鎖核酸部位を形成するために、過剰な塩基数が必要となる。しかし、過剰な塩基同士の結合力は、二本鎖核酸部位のアプタマーが二重らせん構造をとり標的物質と結合する為の立体構造の変化を阻害する。このため、二本鎖核酸部位が過剰に長くなると標的物質に対するアプタマーの結合能力が損なわれてしまうという問題が生じる。
【００３４】
これに対して、第１の実施の形態においては、アプタマー１と第１の核酸断片２とが同一の固定部材４に化学結合および化学吸着により固定されることにより、これらの核酸は部材表面に局所的に濃縮された状態となる。すると、アプタマー１と第１の核酸断片２とが接触する頻度が高くなり、見かけ上の結合定数は高くなる。したがって、第１の実施の形態におけるアプタマー１は、二本鎖核酸状態を安定的に形成するのに必要とされる二本鎖形成部位５の長さを短くすることができ、それにより二本鎖核酸形成による結合能力への悪影響が低減される。
【００３５】
また、アプタマーのみが部材に直接固定される技術は、例えば、前述の特許文献１の他に、非特許文献３に記載されている。非特許文献３では、トロンビンアプタマー１１１が電極１０４に固定される。相補鎖１０２は、２つの二本鎖形成部位１０５、１０６で、トロンビンアプタマー１１１と二本鎖を形成している。この相補鎖１０２は、メチレンブルー（電極反応物質１１３）で標識されている（図３（ａ））。次いで、トロンビン１１７が添加されると、二本鎖形成部位１０６が解消される（図３（ｂ））。そして、メチレンブルーの移動度が向上する。メチレンブルーの反応電流が向上することにより、トロンビン１１７が検出される。しかし、この方法は、トロンビンが添加されても、二本鎖形成部位１０５が完全に解消しない。このため、トロンビン添加前後のメチレンブルーの移動度の向上が少なく、電流変化量も僅か（ベース電流に対して１〜２％程度）である。
【００３６】
これに対して、本実施の形態では、二本鎖形成部位５は１つである。このため、二本鎖形成部位５の二本鎖が開裂したのち、第１の核酸断片２は、アプタマー１に対して自由に動くことができる。すなわち、第１の核酸断片２は、アプタマー１に標的物質７が結合した後に、アプタマー１と二本鎖を形成していない。一方、非特許文献３に記載の相補鎖１０２は、トロンビンアプタマー１１１にトロンビン１１７が結合した後に、トロンビンアプタマー１１１と二本鎖形成部位１０５で二本鎖を形成している。本実施の形態の第１の核酸断片２は、二本鎖形成部位５の所定領域に亘って結合された部分を有していない分だけ、アプタマー１に対して自由に動くことができる。このため、本実施の形態の標識物質３の移動度は、非特許文献３のものと比較して高くなり、本実施の形態の電流変化量も増大することになる。したがって、本実施の形態によれば、検知精度に優れた標的物質の測定方法を実現することができる。
【００３７】
なお、第１の実施の形態の標的物質の検出方法において、化学結合および化学吸着には、相補的な塩基対形成などの核酸分子同士の水素結合による結合は含まない。核酸分子同士の水素結合で固定することによりアプタマーおよび核酸断片の立体構造が変化し、それにより、二本鎖形成部位５が充分に形成できなくなったり、アプタマー１と標的物質７の結合が阻害されたりするなどして、標的物質７の検出が妨害されるためである。
【００３８】
また、特許文献２には、分子ビーコンの機構が組み込まれたアプタマーの一端が基板（電極１０４）上に固定されたアプタマーセンサアレイが記載されている（図４）。また、アプタマーの末端には修飾物質１０９が結合される。ビーコンを機能させるための修飾物質１０９が、立体障害などによってアプタマーとの結合を阻害する場合がある。このような阻害を回避する為に、アプタマーの中心付近の配列は、二本鎖形成不可部位１１０となる。二本鎖形成不可部位１１０は、ビーコン機構を動作させる為の二本鎖核酸領域として利用できないといった制限を有する。
【００３９】
さらに、非特許文献４には、アプタマー配列１３１の延長上に、アプタマーの結合能力と無関係の塩基配列（のりしろ配列１３６）が追加されたアプタマーが記載されている（図５）。二本鎖形成領域１３５の一部を、のりしろ配列１３６とすることにより、ハイブリダイズ形成とアプタマーの結合能力のバランスを図ることが記載されている。しかし、この場合、のりしろ配列１３６の追加可能な部位は、アプタマーの端部に限定される。このため、のりしろ配列１３６は、例えば、端部の構造変化よりも中心部の構造変化が大きいようなアプタマーには適用できないといった制限がある。
【００４０】
言い換えると、アプタマーの配列の延長上にアプタマーの結合能力と無関係なのりしろ配列を追加して二本鎖核酸部位の一部として利用する場合、二本鎖核酸部位の形成に使用されるアプタマーの塩基数が減少するため結合能力への悪影響を低減することが可能である。一方、のりしろ配列をアプタマーの配列の途中に挿入するとアプタマーの結合能力が損なわれる。このため、二本鎖核酸部位の形成箇所がアプタマーの端部に限定される。したがって、例えば、標的物質の結合によりアプタマーの中心部分の配列に大きな構造変化が生じるようなアプタマーは、中心部分の配列に二本鎖核酸部位を形成することができないため、その構造変化を有効に利用できないという制限がある。
【００４１】
これに対して、本実施の形態のアプタマー１の二本鎖形成部位５は、のりしろ配列を含まない塩基配列とすることができる。言い換えると、アプタマー１の二本鎖形成部位５は、第１の核酸断片２の塩基配列と相補的な塩基配列のみを有する。これにより、アプタマーの端部以外にも二本鎖形成部位５を設定することができる。すなわち、標的物質７と結合する際に立体構造が大きく変化する等、標的物質７の存在下で開裂がおこりやすい部位に二本鎖形成部位５を形成することができる。従って、大きなシグナル変化を得ることが可能となる。
【００４２】
以上のように、従来の手法では、固体上に担持したアプタマーを有効に機能させる為の配列設計の制限により、多種多様なアプタマーを標的物質の検出に用いることの妨げとなっていた。
【００４３】
これに対して、第１の実施の形態によれば、上記特許文献と比較して、アプタマーをセンサとして利用する際の配列設計に対する制限が少なく、多種多様なアプタマーを標的物質の検出に用いることができる。
【００４４】
また、第１の実施の形態において、検査対象物がアプタマー１と結合する物質を含まない場合、アプタマーは、検査対象物中の物質と結合せず、二本鎖形成部位５における二本鎖は解消されない。したがって、アプタマー１と第１の核酸断片２との間で形成された二本鎖核酸部位における開裂を検出することによって、検査対象物に標的物質７が含まれるかどうかを検知することができる。
【００４５】
第１の実施の形態の標的物質の検出方法において、アプタマー１は、標的物質７と特異的に結合できる核酸であり、第１の核酸断片２と二本鎖形成部位５を形成可能な相補な塩基配列を持っていればよい。このアプタマー１としては、例えば、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよいし、ＰＮＡのような人工核酸であってもよい。アプタマー１は、特に制限されないが、標的物質７のエピトープと特異的に結合するアプタマーの構造を有するものが好ましく、一部に標的物質７と結合しない構造部分を有していてもよい。アプタマー１は、例えば、ＳＥＬＥＸ法等の公知のアプタマースクリーニング方法を用いて取得できる。また、必要に応じて、ＳＥＬＥＸ等で取得された核酸配列に所望する塩基配列を足したものを合成しても良い。塩基配列を足すことにより、アプタマーと基板の間の距離を長くして立体障害を低減させたり、アプタマー１と相補鎖（第１の核酸断片２）の二本鎖核酸領域の長さを調節して両者の結合力の強さを調節することができる。アプタマー１と第１の核酸断片２との二本鎖形成部位５は、アプタマー１の任意の部分にあってもよく、例えば、アプタマーの端部にあってもよいし、中央部にあってもよい。また、アプタマー１の一本鎖核酸の全配列が二本鎖形成部位５を形成していてもよい。ただし、ここでの二本鎖形成部位５は、標的物質７とアプタマー１が結合した際に、ブランチマイグレーションを生じ易くするために、標的物質７と結合する塩基配列の一部を含むよう形成することが好ましく、その長さは２〜２０塩基であることが好ましく、より好ましくは４〜１５塩基であり、さらに好ましくは６〜１２塩基である。また、アプタマー１は、二本鎖形成部位５の検出を容易にする為に、必要に応じて、標識物質３が修飾されていても良い。
【００４６】
第１の実施の形態の標的物質の検出方法において、第１の核酸断片２は、アプタマー１と二本鎖核酸部位を形成できる相補な塩基配列を有しており、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ等を用いることができる。また、第１の核酸断片２は、その一部に、アプタマー１と相補的な塩基配列に加えて、相補的でない塩基配列を有していてもよい。相補でない塩基配列を足すことにより、核酸断片と基板の間や、標識物質３と核酸断片とのあいだのスペーサとして用いることができ、立体障害を低減することができる。アプタマー１との二本鎖核酸部位は、第１の核酸断片２の任意の部分にあってもよく、例えば、端部にあってもよいし、中央部にあってもよい。また、第１の核酸断片２は、二本鎖核酸部位の検出を容易にする為に、必要に応じて、標識物質３が修飾されていても良い。
【００４７】
また、アプタマー１と第１の核酸断片２との二本鎖形成部位５を形成する塩基配列と、基板との間には、スペーサが形成されることが好ましい。すなわち、アプタマー１に第１スペーサが形成され、第１の核酸断片２に第２スペーサが形成されることが好ましい。これらの第１スペーサ及び第２スペーサを合わせて、単にスペーサと呼称する。また、第１スペーサの長さは、第２スペーサの長さと同一でもよいが異なってもよい。このスペーサは３Å以上であることが好ましい。これにより、アプタマー１と第１の核酸断片２の立体障害などにより二本鎖核酸部位（二本鎖形成部位５）の形成効率が落ちることを抑制することができる。さらに、スペーサは、２００Å以下であることが好ましい。これにより、アプタマーと核酸断片が部材表面に近接して固定されることによる濃縮効果が損なうことを抑制することができる。さらに好ましくは、スペーサは１０Å以上５０Å以下である。このようなスペーサは、アプタマーと核酸断片との間で結合を形成しないものであれば特に限定されず、相補的な塩基配列でない核酸や、糖鎖、ポリペプチド、炭化水素鎖やオリゴエチレングリコールなどの一般的なリンカーを用いることができる。たとえば、第１スペーサは、第２スペーサの塩基配列とは異なり、すなわち相補的な塩基配列を有しない。この場合には、スペーサの塩基数は、８以下が好ましく、より好ましくは７以下である。本実施の形態において、スペーサの塩基数は、検出方法に応じて適切に決定される。スペーサの塩基数は、たとえば、電気化学測定の場合には、より好ましくは７以下であるが、電気化学測定以外の場合には、たとえば、８以上としてもよく、１２以上としてもよい。
【００４８】
また、アプタマー１の端部および第１の核酸断片２の端部は、化学結合および化学吸着により部材に固定する為の官能基を有する。そのような官能基としては、使用される溶媒やｐＨ条件などによって部材との結合が解離しない結合を形成可能なものであれば限定されず、カルボキシル基、アミノ基、チオール基、ジスルフィド基、スクシンイミジル基、マレイミド基、ビオチンなどの一般的なものを用いることができる。これらの官能基は、一般的な核酸合成方法で作製したり、また、それらの核酸に市販のリンカーなどを修飾して形成したものを用いることができる。また、官能基は、アプタマーと標的物質の特異的結合を妨げない限り、任意の部位に修飾されても良く、例えば、アプタマー１および第１の核酸断片２の端部にあっても良いし、中央部にあっても良い。官能基はアプタマー１及び第１の核酸断片２の端部に形成することにより、アプタマー１の設計マージンを向上させることができる。
【００４９】
また、部材表面におけるアプタマー１および第１の核酸断片２の存在比率を調節することにより、二本鎖核酸部位の形成効率や安定性を変化させることができ、第１の実施の形態の標的物質の検出方法における応答特性を変化させることができる。
【００５０】
例えば、アプタマーに対して核酸断片の存在比率を高めた場合、部材表面のアプタマーはその多くが二本鎖核酸部位を形成した状態となる。この場合、一本鎖核酸状態のアプタマーが少ないことから、標的物質は、効率的に二本鎖核酸部位を形成したアプタマーと結合し、二本鎖核酸部位を開裂させる。そのため、標的物質が低濃度であっても高い検出感度が得られる。一方、核酸断片に対してアプタマーの存在比率を高めた場合、部材表面の核酸断片はその多くが二本鎖核酸部位を形成した状態となる。この場合、一本鎖核酸状態の核酸断片が少ないことから、第１の核酸断片２に修飾した標識物質３によって二本鎖形成部位５の開裂を検出する場合のＳ／Ｎを向上させることができる。
【００５１】
上記、部材表面におけるアプタマーと核酸断片の存在比率は、特に限定されず、アプタマーの配列や測定溶液のイオン強度や温度などに応じて適宜設定することができるが、二本鎖核酸部位の存在量が少なくなりすぎないように、アプタマー／核酸断片のモル分率が０．０５〜２０の間であることが好ましい。
【００５２】
第１の実施の形態に係る固定部材４は、アプタマー１および第１の核酸断片２を固定可能なもの、もしくは、固定させるように処理が可能なものであれば、その材料は特に限定されない。部材に核酸を固定する方法としては、例えば、核酸の官能基と部材表面の官能基を利用してペプチド結合を形成する方法や、部材表面に金、白金、銀、パラジウムなどを存在させた上で、その表面に核酸のチオール基を化学吸着させる方法や、部材表面にアビジンを固定して、ビオチン−アビジン結合を形成する方法などがある。また、ＤＮＡチップなどで一般に用いられる、部材の表面の官能基を利用して核酸を順次成長させていく方法を用いてもよい。部材がこれらの官能基を持たない場合は、部材をチオールやシランカップリング剤などで処理するなどして、所望の官能基を形成すればよい。部材としては、基板、ビーズ等の粒子、またはマイクロアレイチップ等を用いても良い。部材の形状は、特に限定されないが、例えば、板状または球状のいずれでもよい。固定部材４にアプタマー１および第１の核酸断片２が固定されると、それぞれが有する相補な塩基配列によって、近接したアプタマー１と第１の核酸断片２とが二本鎖形成部位５を形成し、複合体１１が構成される。なお、二本鎖核酸部位の形成率を高めるために、アニール処理をおこなっても良い。その処理条件は、二本鎖核酸の形成に用いられる一般的な条件でよく、使用する配列の相補的な塩基対の長さや種類、塩濃度などに基づいて適切に設定する。また、アニールはそれぞれの核酸溶液やその混合液、または、それらを部材に固定した後など、適宜おこなうことができる。
【００５３】
また、固定部材４は、アプタマー１および第１の核酸断片２を固定した後に、ブロッキング処理をおこなっても良い。ブロッキング処理により、部材表面への非特異的な物質の吸着を抑えることで擬陽性の低減やＳ／Ｎを向上させることができたり、アプタマー１および第１の核酸断片２を部材から略垂直方向に起き上がらせた状態にすることで、標的物質とアプタマーの結合率を高めて高感度にすることができる。ブロッキング処理は、ポリエチレングリコールやアクリルアミドなどの親水性高分子や、牛血清アルブミンなどのタンパク質、デキストリンなどの糖鎖、フォスファチジルコリンなどの脂質、メルカプトヘキサノールなどの親水性チオール、など、一般的なブロッキング剤を用いることができる。
【００５４】
第１の実施の形態の標的物質の検出方法は、通常は検査対象物を含む溶液中でおこなう。ここで溶液は一般的な反応溶液でよい。また、各工程を行う際の温度、ｐＨ、金属イオン等の条件は適切に設定する。ただし、第１の実施の形態の標的物質の検出方法は、核酸の二本鎖部分を利用するため、核酸の二本鎖結合が維持できるような温度条件やｐＨ等が望ましい。
【００５５】
第１の実施の形態の標的物質の検出方法において、アプタマー１と第１の核酸断片２との間で形成された二本鎖形成部位５における開裂を検出する方法は、特に限定されず、二本鎖核酸部位の開裂によって生じる核酸自身およびその標識物質３の物理的・化学的変化を検出する手法を用いることができる。物理的・化学的変化とは、特に限定されないが、色彩変化、蛍光変化、誘電率変化、電子伝達効変化、質量変化、粘性変化、熱変化、などが利用でき、例えば、蛍光物質を標識したアプタマー１とクエンチャーを標識した第１の核酸断片２を用いて二本鎖核酸部位の開裂に伴う蛍光物質とクエンチャーの距離の増大を蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の測定によって検出したり、二本鎖核酸部位にインターカレートして蛍光するＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ  Ｉなどの二本鎖核酸指示薬を使用する方法、などを用いることができる。また、二本鎖核酸の開裂による部材表面の電荷密度変化や標識物質３と部材表面との間の距離変化や接触頻度変化などを、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）や表面弾性波（ＳＡＷ）や電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）や電気化学測定などの公知の方法により検出しても良い。
【００５６】
第１の実施形態に係る標識物質３は、上記二本鎖形成部位５の開裂によって生じる、物理的・化学的変化を増幅しうるものであれば限定されず、例えば、蛍光物質や、クエンチャー、誘電体、核酸、電気化学反応物質、極性分子、酵素、触媒、放射性物質、タンパク質、ビーズ、などが挙げられる。なお、二本鎖核酸部位の開裂を水晶振動マイクロバランス（ＱＣＭ）やＦＥＴやＳＰＲのような核酸自体の重さや誘電率変化によって検出する場合、核酸への修飾物質を省略しても良い。
【００５７】
ここでは、電極反応物質を標識物質３として用いる場合の二本鎖核酸部位の開裂の検出例について、再度、図６を用いて説明する。図６（ａ）では、第１の核酸断片２の先端に標識物質３が標識されている。アプタマー１の末端および第１の核酸断片２の末端は、電極である固定部材４に固定されて複合体１１を形成している。標識物質３と固定部材４の距離が近接しないように、アプタマー１の塩基配列と、第１の核酸断片２の塩基配列は連続する相補な配列を有している。固定部材４は、図示しない対極および参照電極とともに、電気化学測定装置に接続されている。
【００５８】
はじめに、検査対象物の溶液に接触させる前に、固定部材４を作用極として電気化学測定をおこなう。この状態では、アプタマー１と第１の核酸断片２が二本鎖形成部位５を形成していることから、標識物質３は固定部材４から離れた位置となり固定部材４との接触頻度が低下する。そのため、固定部材４に対して、標識物質３が酸化および還元される電位を印加すると、低い電流値が観測される。
【００５９】
次に、検査対象物を複合体１１に接触させた後、固定部材４を作用極として電気化学測定をおこなう。検査対象物に標的物質７が含まれていた場合、アプタマー１の二本鎖核酸部位に標的物質７が結合し（図６（ｂ））、アプタマー１が第１の核酸断片２から離れる（図６（ｃ））。これにより、標識物質３と固定部材４の接触頻度が回復する。その結果、標識物質３の反応電流が回復する。したがって、標識物質３の反応電流は、標的物７をアプタマー１に接触させた方が大きくなる。検査対象物に標的物質７が含まれない場合は、アプタマー１は第１の核酸断片２に結合し続ける為、上記標識物質３の反応電流は変化しない。
【００６０】
以上の方法を用いて、検査対象物を接触させる前後の反応電流を比較することによって、標的物質７の有無を調べることができる。
【００６１】
なお、検査対象物を接触させる前の反応電流があらかじめわかっている場合や、無視できるほど小さい場合など、必要に応じて、検査対象物を接触させる前の測定は省略することができる。
【００６２】
また、各工程のあいだ又は途中で、必要に応じて部材表面を洗浄しても良い。
【００６３】
また、第１の実施の形態においては、上記複合体１１を含むセンサチップは、標的物質７の検出に用いることができる。すなわち、このセンサチップは、検体試料中の標的物質７が特異的に結合するアプタマー１と、アプタマー１と相補的な塩基配列を有する第１の核酸断片２と、アプタマー１の一部及び第１の核酸断片２の一部が固定された固定部材４と、を備えており、アプタマー１は、第１の核酸断片２と二本鎖を形成する二本鎖形成部位５を有している、複合体１１からなる。
また、センサチップにおいて、アプタマー１と第１の核酸断片２により形成される二本鎖形成部位５が、のりしろ配列を含まなくてもよい。また。センサチップにおいて、二本鎖形成部位５が、アプタマー１の端部以外に形成されていてもよい。また、センサチップにおいて、後述するように、アプタマー１と第１の核酸断片２とが、化学結合および化学吸着により結合した連結部を備え、連結部は、少なくとも１カ所が化学結合および化学吸着により部材に固定されてもよい。このように、センサチップにおいて、複合体１１は、各実施の形態のものを適宜採用することができる。
【００６４】
このセンサチップにおいては、標的物質７とアプタマー１との結合により、二本鎖形成部位５が開裂する。これにより、本実施の形態の効果が得られる。
【００６５】
また、第１の実施の形態に係る標的物質７の検出装置は、上記のセンサチップと、アプタマー１に標的物質７を結合させる結合部と、二本鎖の開裂を検出する検出部と、を備える。結合部は、標的物質７を含む検査対象物と複合体１１とを接触させる。言い換えると、結合部は、センサチップと標的物質７とを接触させてもよい。また、二本鎖核酸部位の開裂を検出する検出部は、二本鎖核酸部位の開裂によって生じる物理的、化学的変化を検出できる限り限定されず、例えば、光学的シグナル、電気的シグナル、色彩的シグナル等のシグナル変化の検出が挙げられる。この標的物質の検出装置においては、先に説明した標的物質の検出方法によって、標的物質が低濃度の場合であっても、大きなシグナル変化が起こり、高い測定感度が得られる。また、検知したい物質に応じてアプタマーを適宜変更したセンサチップを用いることにより、様々な標的物質の検知に用いることができる。
【００６６】
（第２の実施の形態）
第２の実施の形態では、複合体１１は、アプタマー１の一部と第１の核酸断片２の一部とが互いに連結した連結部８を備えており、連結部８が固定部材４に固定されている。例えば、アプタマー１と第１の核酸断片２とが化学結合および化学吸着により連結されている。また、アプタマー１の一部と第１の核酸断片２の一部とはリンカー分子に結合していてもよい。以下、第２の実施の形態について説明する。図７は、第２の実施の形態における複合体１１を示す図である。
【００６７】
なお、第２の実施の形態は、第１の実施の形態の応用であるので、第１の実施の形態と同様な点については説明を省略する。
【００６８】
第２の実施の形態の複合体１１においては、アプタマー１と第１の核酸断片２とが、化学結合および化学吸着により結合した連結部８を備え、連結部８は、少なくとも１カ所が化学結合および化学吸着により固定部材４に固定されている。
【００６９】
第２の実施の形態においては、アプタマー１と第１の核酸断片２が連結されることにより、固定部材４の表面におけるアプタマー１と第１の核酸断片２の固定状態を正確に制御することができるようになる。それにより、測定値のバックグラウンドが低減したり、センサチップのバラツキが低減され、測定の信頼性や検出感度が向上する。
【００７０】
第２の実施の形態の効果と作用について、図７（ａ）を用いて具体的に説明する。
【００７１】
まず、複合体１１を用意する。アプタマー１と第１の核酸断片２を、二本鎖を構成する水素結合を除いた、化学結合および化学吸着により連結し、連結部８を形成する。なお、本実施の形態において、連結部８は、アプタマー１と第１の核酸断片２とが連結した部位を意味する。続いて、連結部８は、二本鎖を構成する水素結合を除いた、化学結合および化学吸着により、固定部材４に固定される。固定されたアプタマー１および第１の核酸断片２は、相補的な塩基配列によって二本鎖形成部位５を形成し、複合体１１を形成する。
【００７２】
このようにして作成した複合体１１は、第１の実施の形態における方法と同様に、二本鎖核酸部位の開裂の有無を指標として、標的物質の検出に用いることができる。
【００７３】
ここで、アプタマー１と第１の核酸断片２とが連結された後に部材に固定されたことにより、アプタマー１と第１の核酸断片２とは互いに近接した状態で固定される。すると、二本鎖形成部位５が効率的に形成されるようになる。そのため、第２の実施の形態の標的物質の検出方法は、バックグラウンドが低減して測定感度が向上する。
【００７４】
また、核酸断片とアプタマーとが部材表面に均質に分散して固定されることから、第２の実施の形態のセンサチップは、製造時のバラツキが低減し、歩留まりが向上する。
【００７５】
また、部材表面におけるアプタマー１および第１の核酸断片２の存在比率がアプタマーと核酸断片の連結体における各核酸の含有比率と等しくなることから、連結体の製造条件の検討により、上記存在比率を正確に制御することができる。これにより、第２の実施の形態の標的物質の検出方法は、二本鎖核酸部位の形成効率や安定性の調節が容易であり、検出感度を向上させることができる。
【００７６】
第２の実施の形態において、アプタマー１、第１の核酸断片２は、第１の実施の形態と同様の物を用いることができるが、アプタマー１および第１の核酸断片２の官能基は、連結部８を形成することが可能なものが適宜用いられる。また、その連結の形成は、特に限定されず、一般的な化学反応を利用できるが、連結部８が固定部材４と化学結合および化学吸着を形成するための官能基を有することが好ましい。そのような連結方法として、例えば、異なる３種の官能基を有するリンカー分子の２つの官能基にアプタマー１および第１の核酸断片２を結合させた後に、残りの官能基を部材と固定する方法が挙げられる。また、アプタマーの配列と核酸断片との間に、部材との結合用の官能基を含む修飾塩基およびリンカー分子などを挿入した核酸を、一般的な核酸合成方法によって合成しても良い。そのようなリンカーは、特に限定されず、市販される様々な試薬を用いることができるが、例えば、Ｄｉｔｈｉｏｌ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ（Ｇｌｅｎ  ｒｅｓｅａｒｃｈ製）などを用いることができる。
【００７７】
第２の実施の形態において、固定部材４は、第１の実施の形態と同様の物を用いることができ、必要に応じて連結部８と固定するための官能基を有することが好ましい。
【００７８】
なお、図７（ａ）では、連結されたアプタマー１および第１の核酸断片２が、連結部８を介して１点で部材に固定されているが、連結部と部材との間の固定は複数箇所あっても良い。
【００７９】
また、連結部８にリンカー分子を用いる場合、その構造は図７（ａ）のような３分岐型の物に限らず、様々な化学構造のリンカー分子を用いることができ、例えば、図７（ｂ）に示すように、はしご形の構造であっても良いし、さらに多分岐のリンカー分子を用いて、アプタマーと核酸断片の連結比率を１対１以外にしてもよい。
【００８０】
また、リンカー分子の長さは特に限定されないが、アプタマーと核酸断片の立体障害などにより二本鎖核酸部位の形成効率が落ちることを防ぐために、３Å以上であることが好ましく、アプタマーと核酸断片が部材表面に近接して固定されることによる濃縮効果を損なわないために２００Å以下であることが好ましい。
【００８１】
（第３の実施の形態）
第３の実施の形態は、第１の実施の形態および第２の実施の形態の応用であり、同様な点については説明を省略する。図８は、第３の実施の形態における標的物質の検出手法の手順を示す図である。第３の実施の形態においては、アプタマー１と、第１の核酸断片２とが、固定部材４に固定され、アプタマー１および第１の核酸断片２が二本鎖形成部位５を形成する点は第１〜第２の実施の形態と同じであるが、標的物質７による二本鎖核酸部位の開裂を、第２の核酸断片１０を用いて検出する。すなわち、第３の実施の形態の標的物質の検出方法は、二本鎖の開裂を検出する工程が、二本鎖形成部位５から分離した第１の核酸断片２に、第１の核酸断片２と相補的な塩基配列を有する第２の核酸断片１０を結合させる工程と、第１の核酸断片２と第２の核酸断片１０の結合を検出することにより、二本鎖の開裂を検出する工程と、を有するものである。
【００８２】
以下、第３の実施形態の標的物質の検出方法について、図８を用いて説明する。
【００８３】
まず、第１〜第２の実施形態と同様にして、複合体１１を用意する。複合体のアプタマー１および第１の核酸断片２は、相補な塩基配列によって二本鎖核酸部位を形成する（図８（ａ））。
【００８４】
第３の実施形態では、測定溶液の中には、あらかじめ第１の核酸断片２と相補的な塩基配列による結合を形成可能な塩基配列を有する第２の核酸断片１０が添加されている。第２の核酸断片１０には、あらかじめ標識物質３が修飾されている。
【００８５】
続いて、複合体１１に検査対象物を接触させると、検査対象物に標的物質７が含まれる場合、標的物質７とアプタマー１が結合することにより、二本鎖形成部位５が開裂する（図８（ｂ））。
【００８６】
続いて、第１の核酸断片２に、第２の核酸断片１０が結合する（図８（ｃ））。アプタマー１と標的物質７が結合する以前では、第１の核酸断片２は、同一の固定部材４に固定されているアプタマー１と二本鎖形成部位５を形成している。すなわち、第１の核酸断片２とアプタマー１が部材表面に局所的に濃縮された状態で存在することにより、二本鎖形成部位５の見かけ上の結合定数が高い。このため、溶液中に存在する第２の核酸断片１０は、アプタマー１との競合反応に打ち勝って二本鎖形成部位５を解離させることができず、第１の核酸断片２と結合することはない。一方、アプタマー１が標的物質７と結合すると、二本鎖形成部位５が開裂し、アプタマー１と第１の核酸断片２の結合能力も失われる。このため、第２の核酸断片１０が第１の核酸断片２と相補的な塩基対を形成できるようになる。
【００８７】
この後、第１の核酸断片２と結合した第２の核酸断片１０を検出する。ここで、第１の核酸断片２と結合した第２の核酸断片１０を検出するとは、第１の核酸断片２を介して固定部材４に結合した第２の核酸断片１０の標識物質３によって生じる物理的、化学的変化を検出できる限り限定されず、例えば、光学的シグナル、電気的シグナル、色彩的シグナル等のシグナル変化を検出することを意味する。
【００８８】
第３の実施形態において、検査対象物がアプタマー１と結合する物質を含まない場合、アプタマー１と第１の核酸断片２との結合が開裂しないことから、第２の核酸断片１０は第１の核酸断片２と結合しない。したがって、第１の核酸断片２と結合した第２の核酸断片１０を検出することによって、検査対象物中に標的物質７が含まれるかどうかを検知することができる。
【００８９】
第３の実施の形態では、標識物質３が固定部材４上に存在しない結合しない場合のバックグラウンドレベルが低いことから高いＳ／Ｎが得られる。よって、第３の実施の形態によれば、高感度に標的物質を検出することができる。
【００９０】
なお、図８（ａ）において、第２の核酸断片１０は、検査対象物と複合体１１の接触に先立ち添加されているが、第２の核酸断片はアプタマー１と第１の核酸断片２の開裂が生じたときに存在していればよく、その添加タイミングは特に限定されない。
【００９１】
なお、第２の核酸断片１０は、標的物質７と複合体１１が接触する際に測定溶液中に存在していることが特に好ましい。これにより、複合体１１の二本鎖形成部位５が開裂して生じる一本鎖状態の第１の核酸断片２が、速やかに第２の核酸断片１０と結合する。これにより、第１の核酸断片２から離れたアプタマー１が、平衡反応に従って標的物質７を放出して一本鎖状態となっても、第１の核酸断片２との再結合が阻害される。したがって、標的物質７が低濃度の場合でも、アプタマー１と第１の核酸断片２の解離が進行し、大きなシグナルを得ることが可能となる。
【００９２】
第３の実施の形態において、第２の核酸断片１０は、第１の核酸断片２と二本鎖核酸部位を形成できる相補な塩基配列を有しており、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ等を用いることができる。また、第２の核酸断片１０は、その一部に、第１の核酸断片２と相補的な塩基配列に加えて、相補的でない塩基配列を有していてもよい。第１の核酸断片２との二本鎖核酸部位は、第２の核酸断片１０の任意の部分にあってもよく、例えば、端部にあってもよいし、中央部にあってもよい。また、第２の核酸断片１０は、後述する第１の核酸断片２との結合の検出を容易にするために、必要に応じて、蛍光物質や、クエンチャー、電気化学反応物質、極性物質、酵素、触媒などの標識物質３が修飾されていても良い。
【００９３】
また、第３の実施形態において、第２の核酸断片１０と第１の核酸断片２との間の相補な塩基数は、アプタマー１と第１の核酸断片２との間の結合の強さによって依存し、最適な値を適宜用いる。すなわち、標的物質不在時はアプタマー１と第１の核酸断片２との間の結合を剥離しない程度に弱い結合力となるような多すぎない塩基数であり、かつ、標的物質存在下では、第２の核酸断片１０と第１の核酸断片２とが溶液中で安定に結合できる程度に多い塩基数とする。具体的な塩基数は、アプタマー１と第１の核酸断片２の塩基配列および塩強度などによって変化するが、溶液中で安定に結合できる値の目安として相補な塩基数が８塩基以上であり、かつ、アプタマー１と第１の核酸断片２との間の相補な塩基数と同数以上であることが好ましく、さらに好ましくは２塩基以上多い。また、標的物質不在下でアプタマー１と第１の核酸断片２との結合を剥離しない目安として、アプタマー１と第１の核酸断片２との間の相補な塩基数に対する余剰な相補な塩基数は１０塩基以下であることが好ましい。
【００９４】
（第４の実施の形態）
第４の実施の形態は、アプタマー１および第１の核酸断片２が同一の親溶媒性の部材に化学結合および化学吸着により固定された場合について説明する。本実施形態は、第１〜第３の実施の形態の応用であり、同様な点については説明を省略する。
すなわち、本実施の形態では、固定部材４は、アプタマー１及び第１の核酸断片２が固定された固定領域（検出部１３）とは別の領域に、親溶媒性の領域（補足部１４）を有する。補足部１４は、溶媒との親和性が高いために、溶媒中に含まれる第２の核酸断片１０を、その表面に浸透することにより補足することができる。補足部１４に補足された第２の核酸断片１０は、その表面を移動し、検出部１３に固定された第１の核酸断片２に容易に結合することができる。
【００９５】
図９は、第４の実施の形態における標的物質の検出手法の手順を示す図である。第４の実施の形態においては、アプタマー１と、第１の核酸断片２とは、固定部材４の一部分に固定されている。第４の実施の形態において、固定部材４は、全体が親溶媒性の部材であるが、この態様に限定されずに、補足部１４の一部のみが親溶媒性の部材であってもよいし、任意の部材の表面の一部または全体が親溶媒性処理されていてもよい。また、標的物質７によるアプタマーと核酸断片との間の二本鎖核酸部位の開裂を検出するために、第３の実施の形態と同様に、あらかじめ標識物質３が修飾された第２の核酸断片１０を用いる。なお、親溶媒性の固定部材４のうちアプタマーや核酸断片などの核酸が固定されている部分のことを、以降では検出部１３と呼ぶ。
【００９６】
第４の実施形態の標的物質の検出方法について、図９を用いて説明する。
【００９７】
まず、固定部材４の検出部１３にアプタマー１および第１の核酸断片２を化学結合および化学吸着によって固定する。検出部１３に固定されたアプタマー１と第１の核酸断片２とは、相補的な塩基配列によって二本鎖形成部位５を形成する（図９（ａ））。
【００９８】
続いて、固定部材４の検出部１３以外の部位（補足部１４）に、標的物質７と第２の核酸断片１０とを含む測定液を接触させる。測定液が親溶媒性である部材に接触すると、溶液と共に標的物質７と第２の核酸断片１０とが部材に浸透する（図９（ｂ））。
【００９９】
続いて、検出部１３のアプタマー１と標的物質７が結合する。先の工程で述べた溶液の浸透が検出部１３まで到達すると、液中の標的物質７がアプタマー１と接触する。すると、アプタマー１と標的物質７が結合し、アプタマー１と第１の核酸断片２の間の二本鎖核酸部位が開裂する（図９（ｃ））。
【０１００】
続いて、検出部１３の第１の核酸断片２に対して、第２の核酸断片１０が結合する（図９（ｄ））。先の工程で部材に固定されているアプタマー１が標的物質７と結合したことにより、アプタマー１と第１の核酸断片２の結合能力も失われる。このため、第２の核酸断片１０が第１の核酸断片２と相補的な塩基対を形成できるようになる。
【０１０１】
この後、第１の核酸断片２を介して固定部材４に結合した第２の核酸断片１０の標識物質３によって検出部１３に生じる物理的、化学的変化を測定することにより、標的物質を検知する。検査対象物中に標的物質が含まれる場合、上記の工程により、第１の核酸断片２と第２の核酸断片１０が相補的な塩基対を形成することにより結合する。一方、検査対象物中に標的物質が含まれない場合、アプタマー１と第１の核酸断片２による二本鎖形成部位５が解消されないことにより、第２の核酸断片１０は第１の核酸断片２と結合しない。従って、第１の核酸断片２を介して固定部材４に結合した第２の核酸断片１０の標識物質３によって検出部１３に生じる物理的、化学的変化を測定することにより、検査対象物中に標的物質が含まれているかどうかを判別することができる。
【０１０２】
第４の実施形態によれば、親溶媒性の部材に接触した検体が自発的に部材に浸透して検査が進行していくため、検体の取り扱いが容易になり標的物質の検査を簡便におこなうことができる。
【０１０３】
なお、親溶媒性の部材にアプタマーを固定する標的物質の検出手法は、例えば、ラテラルフロー方式のものが非特許文献６で報告されている。報告されている従来の方法は、標的物質に対して部材に固定されたアプタマーと、標識されたアプタマーとが結合した、いわゆるサンドイッチ構造を形成することにより検出をおこなう。そのため、標的物質の異なるエピトープを認識するアプタマーを少なくとも２種類以上用意する必要があり、アプタマー取得の手間が大きい。それに対し、第４の実施形態の検出方法によれば、１種類のアプタマーを用意すれば標的物質の検出をおこなうことが可能であり、アプタマー取得の手間が省ける。
【０１０４】
第４の実施の形態で用いられる親溶媒性の部材とは、接触した測定液が浸透する部材であれば特に限定されないが、検体もしくは検体を希釈する溶媒に対する接触角が９０度未満である材質が用いられることが好ましい。また、部材が多孔性であると、毛細管現象により溶液の浸透が速やかに生じたり、アプタマーの固定量が増えて標的物質結合時のシグナルが増大するなどのため、検出に要する時間を低減したり検出感度が高くなるなどの効果が得られ、好ましい。そのような物として、例えば、ガラス繊維、ニトロセルロース、セルロース、合成繊維、不織布等による多孔性フィルターなどが挙げられる。また、アプタマーと核酸断片が固定された親溶媒性の固定部材４に対して、図９に図示されていない別の親溶媒性の部材が積層されたり連結されていても良い。これにより、例えば、親溶媒性や空隙率が異なる部材を組み合わせることにより検体中に含まれる夾雑物を除去したり、例えば、後述する第２の核酸断片をあらかじめ部材にしみこませておく際に、第２の核酸断片を含む部材と検出部を有する部材とを別々に作成することができ、製造が容易になる等の利点がある。
【０１０５】
第４の実施の形態において、親溶媒性の部材にアプタマーおよび核酸断片を化学結合および化学吸着させる方法は、第１〜第３の実施の形態と同様に官能基を用いるなどの方法を用いればよい。アプタマー１および第１の核酸断片２を検出部１３に固定する方法は特に限定されないが、例えば、部材の一部をマスキングしたり、アプタマー１および第１の核酸断片２の溶液を部材と反応させる際に反応液をスポッティングしたりして、親溶媒性の固定部材４の一部だけで固定反応が生じるようにすればよい。
【０１０６】
第４の実施の形態において、検出部１３に生じる物理的、化学的変化を測定するとは、検出部１３に標識物質３が存在することによって生じる物理的、化学的変化を測定できる限り限定されず、例えば、光学的シグナル、電気的シグナル、色彩的シグナル等のシグナル変化を測定することを意味する。
【０１０７】
また、第４の実施の形態において、標識物質３は特に限定されないが、例えば、発色性物質、電気化学反応物質、触媒物質を用いることができる。発色性物質を用いると、第２の核酸断片１０が核酸断片に結合すると検出部の色が変化し、目視や簡単なイメージセンサによって検査結果を容易に判別することができる。そのような発色性物質としては、例えば、色素、色つきビーズ、金ナノ粒子などの表面プラズモンを生じる金属微粒子などが挙げられる。また、電気化学反応物質を用いると、検出部の近傍に導電性物質を設置し、電気化学反応の作用極として用いることで、第２の核酸断片と核酸断片の結合を電流変化として検知でき、簡易な装置によって検査結果を電気信号に変換することが可能となる。そのような電気化学反応物質としては、例えば、金属、金属錯体、キノン類およびその誘導体、メチレンブルーおよびの誘導体、ピロール類やピリジンやビオロゲン等の複素環式化合物などが挙げられる。また、触媒物質を用いると、用いる触媒と基質や電子伝達メディエータの組み合わせによって、検出部に発色や電気化学反応特性の変化を生じさせることができる。触媒を用いた場合、第２の核酸断片１０が第１の核酸断片２と結合すると検出部１３において上記発色や電気化学反応特性変化を生じさせる反応が連続的に生じてシグナルが増幅されるため、標的物質をより高感度に検出できる。このような触媒物質として、例えば、グルコースオキシダーゼ、ビリルビンオキシダーゼなどの酸化酵素、グルコースデヒドロゲナーゼ等の脱水素酵素、ジアフォラーゼ等の補酵素酸化酵素、西洋ワサビペルオキシダーゼやカタラーゼ等の過酸化物還元酵素、Ｐｔや酸化チタン等の金属触媒、リボザイムやデオキシリボザイム等の触媒性核酸、ヘミンアプタマー等の触媒活性物質に対する結合性があるアプタマーを用いることができる。電子伝達メディエータおよび基質は、使用する酵素や触媒の種類に応じて適宜選択することができる。なお、これらの標識物質は、アミンカップリングや金−チオール反応や核酸伸長合成などの一般的な反応によって、容易に核酸断片に修飾することができる。
【０１０８】
なお、図９では、図９（ｂ）において標的物質７と第２の核酸断片１０とを含む測定液が親溶媒性の固定部材４に対して接触しているが、第４の実施の形態の標的物質の検出においては、第２の核酸断片１０は、標的物質７がアプタマー１と接触する際に測定溶液中に存在していればよく、例えば、親溶媒性の部材に対してあらかじめ第２の核酸断片１０をしみこませておいてもよく、検体と第２の核酸断片１０を含む液をあらかじめ混合した後に親溶媒性の部材に接触させてもよい。
【０１０９】
（第５の実施の形態）
第５の実施の形態では、親溶媒性部材（部材２１）に第２の核酸断片１０が固定された場合について、図１０および図１１を用いて説明する。すなわち、本実施の形態において、第２の核酸断片１０を結合させる工程は、二本鎖形成部位５から分離した第１の核酸断片２に、基板（部材２１）に固定された第２の核酸断片１０を結合させる工程を有している。この基板（部材２１）は、第２の核酸断片１０が固定された固定領域（検出部１３）とは別の領域に、親溶媒性の領域（補足部１４）を有する。なお、本実施形態は第１〜第４の実施の形態の応用であり、同様な点については説明を省略する。
【０１１０】
図１１は、第５の実施形態に係る標的物質の検出方法の手順を示す図である。第５の実施形態に係る標的物質の検出装置（図１１（ａ））は、試料導入部１５、複合体保持部１６及び部材２１を備える。試料導入部１５は、親溶媒性の部材である。複合体保持部１６は、あらかじめ複合体１１がしみこませてある親溶媒性の部材である。部材２１は、検出部１３に第２の核酸断片１０が固定されていて、親溶媒性の部材である。なお、図１０に示すように、第５の実施形態の複合体１１は次の構成を有する。すなわち、アプタマー１と第１の核酸断片２とが同一の固定部材４に化学結合および化学吸着により固定される。固定部材４は、微小球体や微小ファイバー等の微粒子状である。固定部材４に標識物質３が修飾されている。アプタマー１と第１の核酸断片２とは、相補的な塩基配列によって二本鎖形成部位５を形成する。
【０１１１】
第５の実施の形態における標的物質の検出方法について、図１１を用いて説明する。
【０１１２】
まず、試料導入部１５に、標的物質７を含む検査対象物を注入する。検査対象物の溶液は、試料導入部１５に浸透し、その後、複合体保持部１６に浸透する。試料導入部１５は、複合体保持部１６と接触している。測定液の浸透にともなって、液中に含まれる標的物質７は、複合体保持部１６に浸透する（図１１（ｂ））。
【０１１３】
続いて、溶液は、さらに浸漬して部材２１に浸透する。この際、複合体保持部１６の複合体１１が測定液中に溶出する。複合体１１は、溶液および標的物質７と共に部材２１に浸透していく。それと同時に、標的物質７は、複合体１１のアプタマー１と結合する。この後、アプタマー１と第１の核酸断片２の二本鎖形成部位５が開裂する。
【０１１４】
続いて、溶液の浸透がさらに進行し、検出部１３に二本鎖核酸部位が開裂した複合体１１が到達する。すると、二本鎖核酸部位を形成していない第１の核酸断片２と第２の核酸断片１０が二本鎖核酸部位を形成して、検出部１３に複合体１１が結合する。
【０１１５】
この後、検出部１３に存在する標識物質３を検出することにより、標的物質を検知する。検査対象物中に標的物質が含まれる場合、上記の工程により、検出部１３に標識物質３を含む複合体１１が結合することにより、検出部１３に標識物質３が存在する。一方、検査対象物中に標的物質が含まれない場合、アプタマー１と第１の核酸断片２による二本鎖形成部位５が解消されないことにより、検出部１３に複合体１１が結合しないため、検出部１３に標識物質３が存在しない。したがって、標識物質３によって検査部１３に生じる物理的、化学的変化を測定することにより、検査対象物中に標的物質が含まれているかどうかを判別することができる。
【０１１６】
このように、親溶媒性の部材の検出部に第２の核酸断片１０が固定されていても標的物質を検出することができる。
すなわち、本実施の形態において、アプタマー１及び第１の核酸断片２、または第２の核酸断片１０のいずれかが親溶媒性の部材（固定部材４又は部材２１）の検出部に固定されている。部材の検出部における第１の核酸断片２と第２の核酸断片１０との結合を検出することにより、アプタマー１と第１の核酸断片２との二本鎖の開裂を検出することができる。
【０１１７】
本実施の形態において、固定部材４は、試料導入部に注入する溶液の溶媒に対して分散性を持つ微粒子であれば特に限定されず、金ナノ粒子やラテックスビーズ、樹脂ビーズなどの、一般的な物を用いることができる。なお、微粒子が、表面プラズモン吸収によって呈色する金属微粒子や着色ビーズのように、微粒子自身の特性によって検出部に物理的、化学的特性変化を生じる場合、標識物質を省くことができる。
【０１１８】
第５の実施形態に係る修飾物質は、第４の実施形態で説明した物と同様のもの用いることができる。また、図１０では、標識物質３は微粒子である固定部材４に修飾されているが、アプタマーと標的物質の結合や、第１の核酸断片と第２の核酸断片の結合を阻害しない限り、核酸断片やアプタマーに修飾されていても良い。
【０１１９】
第５の実施形態に係る試料導入部、複合体保持部および親溶媒性部材は、第４の実施形態で説明した親溶媒性部材と同様のものを用いることができる。また、図１０では、試料導入部と複合体保持部は略水平状に配置されているが、それに限定されず、各部が積層されていても良い。
【０１２０】
（第６の実施形態）
第６の実施形態では、標的物質検出工程の途中でアプタマーと第１の核酸断片との二本鎖の結合力が動的に変化する標的物質の検出方法について説明する。すなわち、本実施形態の標的物質の検出工程は、アプタマーと第１の核酸断片との二本鎖の結合力を弱める開裂エネルギー投入工程と、アプタマーと第１の核酸断片との二本鎖の結合力を強める二本鎖安定化工程を含んでいる。
【０１２１】
第６の実施形態について、図１２および図１３を用いて具体的に説明する。なお、第６の実施形態は第１〜５の実施形態の応用であり、同様な点は説明を省略する。
【０１２２】
図１２は、開裂エネルギー投入工程において、アプタマーと第１の核酸断片の結合エネルギー以上のエネルギーが投入された場合の標的物質検出工程を示した図である。
【０１２３】
まず、第１〜５の実施形態と同様の複合体準備工程によって、アプタマー１および第１の核酸断片２が固定部材４に固定された複合体１１を形成する（図１２（ａ））。
【０１２４】
次いで、開裂エネルギー投入工程によって、複合体１１におけるアプタマー１と第１の核酸断片２の二本鎖結合を弱める。投入された開裂エネルギーは、アプタマー１と第１の核酸断片２の結合エネルギー以上であるため、アプタマー１と第１の核酸断片２は二本鎖状態を維持することができず、開裂する。このとき、アプタマー１および第１の核酸断片２はともに固定部材４に固定されているため、一本鎖状態となって部材表面に存在する（図１２（ｂ））。
【０１２５】
次いで、アプタマー１に標的物質７を結合させる。検体中に標的物質が含まれている場合、標的物質７は一本鎖状態のアプタマー１と容易に結合することができる（図１２（ｃ））。一方、検体が標的物質を含んでいない場合、アプタマーは一本鎖状態を維持する（図１２（ｅ））。
【０１２６】
次いで、二本鎖安定化工程によって、アプタマー１と第１の核酸断片２の結合を強める。ここで、検体が標的物質７を含む場合、先の工程でアプタマー１にはすでに標的物質７が結合しているため、アプタマー１と第１の核酸断片２による二本鎖結合の形成が阻害される（図１２（ｄ））。一方、検体が標的物質を含まない場合、一本鎖状態のアプタマー１と第１の核酸断片２とが再結合し二本鎖を形成する（図１２（ｆ））。
【０１２７】
次いで、二本鎖の開裂の検出工程によって標的物質を検出する。すなわち、標的物質存在時は二本鎖が開裂し（図１２（ｄ））、不在時は開裂していない（図１２（ｆ））。このように、二本鎖の開裂の有無を指標とすることによって、標的物質存在時と不在時を区別することができる。
【０１２８】
本実施の形態によれば、標的物質検出工程の途中でアプタマーと第１の核酸断片の二本鎖結合力を動的に変化させることにより、標的物質の検出感度および信頼性が向上する。すなわち、アプタマーと標的物質が結合する段階においては、二本鎖の結合力を弱めることで、二本鎖維持能が抑制されるとともに、二本鎖開裂能は高まる。これにより、アプタマーは、標的物質存在時は速やかに第１の核酸断片との二本鎖を解離し標的物質と結合する。したがって、低濃度の標的物質に対しても二本鎖の開裂が生じやすくなり、標的物質の検出感度が向上する。
【０１２９】
また、二本鎖開裂検出工程においては、二本鎖の結合力を強めることによって、二本鎖維持能が高められるとともに、二本鎖開裂能は抑制される。これにより、開裂エネルギーの投入により解離したアプタマーおよび核酸断片は、標的物質不在時は、速やかに二本鎖を再形成する。したがって、標的物質不在時の二本鎖解離が抑制され、検出の信頼性が高められる。このように、本実施の形態によれば、検出感度と信頼性が両立された、優れた標的物質の検出方法が提供される。
【０１３０】
この場合、複合体準備工程によって形成された複合体１１（図１３（ａ））は、開裂エネルギーを加えることにより結合エネルギーが弱められた二本鎖状態となる（図１３（ｂ））。結合エネルギーが弱められた二本鎖は、二本鎖維持能が弱められ、二本鎖開裂能が高められた状態となる。したがって、検体中に標的物質７が存在すると、アプタマー１と標的物質７は容易に結合するため、二本鎖は開裂する（図１３（ｃ））。標的物質７と結合したアプタマー１は、二本鎖安定化工程の後でも開裂状態を維持する（図１３（ｄ））。一方、検体中に標的物質７が存在しない場合は、アプタマーは不安定化された二本鎖状態を維持し（図１３（ｅ））、その後の二本鎖安定化工程によって安定な二本鎖状態に戻る（図１３（ｆ））。
【０１３１】
このように、投入される開裂エネルギーがアプタマーと第１の核酸断片の結合エネルギー未満であっても、標的物質存在時にアプタマーと標的物質の結合を促進する効果と、標的物質不在時の二本鎖解離を抑制する効果を得ることができる。
【０１３２】
本実施の形態において、開裂エネルギーの投入とは、アプタマーと第１の核酸断片の間で生じる相補的な塩基配列に基づく結合力を弱めるあらゆる手段を意味し、その手法は特に限定されない。そのような手法として、例えば、測定液に対して、温度の上昇、ｐＨの上昇、塩強度の低下、または有機溶媒濃度の増加などの操作を行ったり、測定液をこのような液体に交換することなどが挙げられる。開裂エネルギーの投入は、標的物質をアプタマーに結合させる工程の前、またはそれと同時におこなわれる。
【０１３３】
また、本実施の形態において、二本鎖安定化工程とは、アプタマーと第１の核酸断片の間で生じる相補的な塩基配列に基づく結合力を強めるあらゆる手段を意味し、その手法は特に限定されない。そのような手法として、例えば、測定液に対して、温度の低下、ｐＨの中性化、塩強度の上昇、または有機溶媒濃度の低下などの操作を行ったり、測定液をこのような液体に交換することなどが挙げられる。二本鎖安定化工程は、標的物質をアプタマーに結合させる工程の後におこなわれ、かつ、二本鎖の開裂を検出する工程の前、またはそれと同時におこなわれる。
【０１３４】
なお、本実施の形態のアプタマーと第１の核酸断片との二本鎖の結合力が動的に変化する標的物質の検出方法は、アプタマーと第１の核酸断片とがともに固定部材に固定されていることにより特に顕著な効果を示す。アプタマー及び第１の核酸断片がともに固定部材に固定されている場合、開裂エネルギーの投入により二本鎖維持能が抑制され、標的物質と無関係な二本鎖の開裂が生じやすくなっても両者は部材表面に留まる。そして、標的物質が不在の場合、二本鎖安定化工程によって速やかに二本鎖を再形成することができる。
【０１３５】
一方で、特許文献１のようにアプタマーおよび第１の核酸断片の一方のみが基板に固定されている場合、開裂エネルギーの投入により標的物質と無関係な二本鎖の開裂が生じやすくなり、固定されていない方の核酸断片などが基板から離れ、溶液中に希釈されてしまう。そのため、二本鎖安定化工程のあとでも二本鎖が再形成されず、誤検知を生じさせる。
【０１３６】
ここでは、測定液の加熱を開裂エネルギー投入工程として用い、測定液の冷却を二本鎖安定化工程として用いる場合の標的物質の検出例について、再度、図１２を用いて説明する。
【０１３７】
図１２（ａ）では、第１の核酸断片２の先端に標識物質３が標識されている。アプタマー１の末端および第１の核酸断片２の末端は、電極である固定部材４に固定されて複合体１１を形成している。固定部材４は、図示しない対極および参照電極とともに、電気化学測定装置に接続されている。
【０１３８】
はじめに、検査対象物の溶液に接触させる前に、固定部材４を作用極として電気化学測定をおこなう（図１２（ａ））。この状態では、アプタマー１と第１の核酸断片２が二本鎖を形成していることから、低い電流値が観測される。
【０１３９】
次に、図示されていない加熱部により、測定液の温度をアプタマー１および第１の核酸断片２の二本鎖のメルト温度まで上昇させる。メルト温度では、アプタマー１及び第１の核酸断片２の半数が二本鎖を解離して一本鎖状態となる（図１２（ｂ））。すなわち、測定液をメルト温度まで加熱する行為は、二本鎖結合エネルギーと等しい開裂エネルギーを投入することを意味する。
【０１４０】
次に、検査対象物を複合体１１に接触させる。検査対象物に標的物質が含まれていた場合、一本鎖状態のアプタマー１に標的物質７が結合する（図１２（ｃ））。検査対象物に標的物質７が含まれていない場合は、アプタマー１は一本鎖状態を維持する（図１２（ｅ））。
【０１４１】
次に、図示されていない冷却部により、測定液の温度を室温まで下降させる。測定液を冷却することにより、アプタマー１及び第１の核酸断片２の二本鎖結合は再び安定化する。しかし、検査対象物に標的物質７が含まれていた場合、アプタマー１と標的物質７が結合していることにより、アプタマー１と第２の核酸断片による二本鎖の形成が阻害され、二本鎖は開裂した状態を維持する（図１２（ｄ））。一方、検査対象物に標的物質７が含まれていない場合、アプタマー１と第２の核酸断片は再び二本鎖を形成する（図１２（ｆ））。
【０１４２】
次に、再び固定部材４を作用極として電気化学測定をおこなう。標的物質７が含まれている場合は、二本鎖が開裂しているため高い反応電流が計測され、標的物質が含まれていない場合は二本鎖が形成されているため低い反応電流が計測される。
【０１４３】
以上の方法を用いて、測定液の加熱および冷却することによって、標的物質存在時の速やかな二本鎖部位の開裂と標的物質不在時の二本鎖部位の維持を両立した標的物質の検出ができる。
【０１４４】
なお、測定液をメルト温度よりも低い温度に加熱した場合は、アプタマー１と第１の核酸断片２の結合エネルギー以下の開裂エネルギーを投入した場合に相当する。アプタマー１と第１の核酸断片２の結合力は弱める効果は、測定液の温度が加熱前よりも高い温度であれば得られることから、メルト温度未満であっても、標的物質存在時の速やかな二本鎖部位の開裂を促進する効果は得られる。
【０１４５】
また、加熱後の温度はメルト温度よりも１０℃未満の低さが好ましく、さらに好ましくは５℃未満の低さである。この温度範囲内ではアプタマーおよび核酸断片の熱運動によって二本鎖部位の一部に開裂が生じることから、標的物質存在時の二本鎖部位の開裂促進効果を得ることに適しているためである。
以下、参考形態の例を付記する。
１．検体試料中の標的物質が特異的に結合するアプタマーと、
前記アプタマーと相補的な塩基配列を有する第１の核酸断片と、
前記アプタマーの一部及び前記第１の核酸断片の一部が固定された固定部材と、
を備え、
前記アプタマーは、前記第１の核酸断片と二本鎖を形成する二本鎖形成部位を有している、複合体を準備する工程と、
前記標的物質を前記アプタマーに結合させることにより、前記第１の核酸断片を前記アプタマーの前記二本鎖形成部位から分離させる工程と、
前記第１の核酸断片が前記アプタマーから分離する、前記二本鎖の開裂を検出する工程と、
を有する標的物質の検出方法。
２．前記アプタマーの前記二本鎖形成部位は、前記第１の核酸断片の塩基配列と相補的な塩基配列のみを有する１．に記載の標的物質の検出方法。
３．前記複合体は、前記アプタマーの一部と前記第１の核酸断片の一部とが互いに連結した連結部を備えており、
前記連結部が前記固定部材に固定されている１．または２．に記載の標的物質の検出方法。
４．前記二本鎖の開裂を検出する工程は、
前記二本鎖形成部位から分離した前記第１の核酸断片に、前記第１の核酸断片と相補的な塩基配列を有する第２の核酸断片を結合させる工程と、
前記第１の核酸断片と前記第２の核酸断片の結合を検出することにより、前記二本鎖の開裂を検出する工程と、
を有する１．乃至３．のいずれか一つに記載の標的物質の検出方法。
５．前記固定部材は、前記アプタマー及び前記第１の核酸断片が固定された固定領域とは別の領域に、親溶媒性の領域を有する４．に記載の標的物質の検出方法。
６．前記第２の核酸断片を結合させる工程は、前記二本鎖形成部位から分離した前記第１の核酸断片に、基板に固定された前記第２の核酸断片を結合させる工程を有しており、
前記基板は、前記第２の核酸断片が固定された固定領域とは別の領域に、親溶媒性の領域を有する４．に記載の標的物質の検出方法。
７．前記第２の核酸断片は、標識物質を有する４．乃至６．のいずれか一つに記載の標的物質の検出方法。
８．前記複合体は、前記第１の核酸断片に結合した標識物質を備える１．乃至３．のいずれか一つに記載の標的物質の検出方法。
９．前記第１の核酸断片を前記アプタマーの前記二本鎖形成部位から分離させる工程の前、または前記第１の核酸断片を前記アプタマーの前記二本鎖形成部位から分離させる工程において、前記アプタマーと前記第１の核酸断片との二本鎖の結合エネルギー以上の開裂エネルギーを投入する開裂エネルギー投入工程を含み、
前記二本鎖の開裂を検出する工程の前、または前記二本鎖の開裂を検出する工程において、前記アプタマーと前記第１の核酸断片との二本鎖の結合力を強める二本鎖安定化工程を含む１．乃至８．のいずれか一つに記載の標的物質の検出方法。
１０．前記第１の核酸断片を前記アプタマーの前記二本鎖形成部位から分離させる工程の前、または前記第１の核酸断片を前記アプタマーの前記二本鎖形成部位から分離させる工程において、前記アプタマーと前記第１の核酸断片との二本鎖の結合エネルギー未満の開裂エネルギーを投入する開裂エネルギー投入工程を含み、
前記二本鎖の開裂を検出する工程の前、または前記二本鎖の開裂を検出する工程において、前記アプタマーと前記第１の核酸断片との二本鎖の結合力を強める二本鎖安定化工程を含む１．乃至８．のいずれか一つに記載の標的物質の検出方法。
１１．前記開裂エネルギー投入工程は、測定液の温度上昇であり、
前記二本鎖安定化工程は、測定液の温度降下である９．または１０．に記載の標的物質の検出方法。
１２．検体試料中の標的物質が特異的に結合するアプタマーと、
前記アプタマーと相補的な塩基配列を有する第１の核酸断片と、
前記アプタマーの一部及び前記第１の核酸断片の一部が固定された固定部材と、を備えており、
前記アプタマーは、前記第１の核酸断片と二本鎖を形成する二本鎖形成部位を有している、複合体からなる、
標的物質の検出に用いるセンサチップ。
１３．１．から１１．のいずれか１つに記載の検出方法を用いて標的物質を検出することを特徴とする１２．に記載のセンサチップ。
１４．１２．または１３．に記載のセンサチップと、
前記アプタマーに前記標的物質を結合させる結合部と、
前記二本鎖の開裂を検出する検出部と、
を備える標的物質の検出装置。
【実施例】
【０１４６】
以下、実施例を用いて本発明を説明する。ただし、本発明は、これら実施例に限定されない。【０１４７】
（実施例１）  ＡＴＰの検出
本実施例では、アデノシン３リン酸（以下、ＡＴＰ）と特異的に結合するＡＴＰアプタマーによって、本発明の標的物質の検出方法によりＡＴＰを検出した。【０１４８】
本実施例で用いたＡＴＰアプタマー（配列２）および、ＡＴＰアプタマーに相補な核酸断片（配列３）を図１５に示す。本実施例において、ＡＴＰアプタマーは、ＡＴＰとの結合を形成するＡＴＰアプタマーの塩基配列（図１５の配列１）に対して、５'末端にスペーサとしてＡＴＰと結合しない配列を追加し、さらに基板と固定する為の官能基として５'末端にチオール基を修飾したＤＮＡを用いた。また、核酸断片は、配列２に対して相補な７塩基と、基板と核酸断片間のスペーサである相補でない５塩基とを有し、さらに、５'末端に標識物質として電極反応物質であるメチレンブルー（ＭＢ）と、３'末端に基板と固定する為の官能基であるチオール基とを修飾したＤＮＡを用いた。なお、配列２および配列３は、つくばオリゴサービス株式会社のＤＮＡ合成サービスを利用して合成した。【０１４９】
ＡＴＰアプタマーおよび核酸断片を、固定バッファ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５００ｍＭ  ＮａＣｌ，  ｐＨ７．４）中に、それぞれ１００ｎＭとなるよう溶解し、プラスチックチューブに封入して９５℃で３分間アニール処理した。その後、チューブを５分間氷浴させ、室温で３０分間静置した。【０１５０】
この溶液に、アルミナ研磨処理により表面を清浄にした金電極（ＢＡＳ製）を１時間浸漬し、金電極表面にＡＴＰアプタマーと核酸断片を固定した。【０１５１】
その後、電極表面を超純水でリンスし、１ｍＭのメルカプトヘキサノールを溶解した固定バッファに１時間浸漬し、ブロッキングした。【０１５２】
この電極を超純水でリンスした後、測定溶液（２０ｍＭ  ｔｒｉｓ，  ３００ｍＭ  ＮａＣｌ，  ５ｍＭ  ＭｇＣｌ２  （ｐＨ  ７．４））で満たしたガラスセルに浸し、ポテンショスタット（Ｉｖｉｕｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  製  ＣｏｍｐａｔＳｔａｔ）の作用極に接続した。また、白金線を対極端子に、銀／塩化銀電極（ＢＡＳ製）を参照極端子に接続して、交流ボルタンメトリー（ＡＣＶ）により、メチレンブルーの反応電流を測定した。測定は、２０秒間隔で繰り返しおこない、測定開始から４００秒後に終濃度１ｍＭとなるように  ＡＴＰを添加した。    【０１５３】
上記の測定における、ＡＣＶのピーク電流の時間変化を図１４に示す。なお、電流値は、ＡＴＰ添加直前のピーク電流を基準に規格化した。ピーク電流はＡＴＰ添加直後に増加し始め、最終的には添加前の約１．７倍の値を示した。ＡＴＰ添加前の電流値は、ほぼ一定であったことから、この電流増加はＡＴＰに対して特異的なものであるといえる。【０１５４】
この結果は、次のように説明できる。【０１５５】
同一の電極上に固定されたＡＴＰアプタマーと核酸断片とが、それぞれが近接して固定されることによって見かけ上の結合定数が高くなり、溶液中では二本鎖核酸部位を形成しないような７塩基の相補な塩基配列によって二本鎖核酸部位を形成する。すると、核酸断片に標識されたメチレンブルーの移動度が低下し、メチレンブルーと電極の接触頻度が低下し、それにより、ＡＣＶ測定におけるメチレンブルーの反応電流が抑制された状態となる。続いて、測定溶液内にアプアタマーの標的物質であるＡＴＰが添加されると、ＡＴＰとＡＴＰアプタマーが結合することにより、二本鎖核酸部位が開裂する。すると、メチレンブルーの移動度が回復し、ＡＣＶにおけるメチレンブルーの反応電流が増加する。【０１５６】
以上の結果から、本発明の標的物質の検出方法に基づき、ＡＴＰに対して特異的に結合するＡＴＰアプタマー（図１５の配列２）とその相補な核酸断片（図１５の配列３）とが固定された部材である電極を用いて、標的物質であるＡＴＰを検出することができたといえる。【０１５７】
（実施例２）  実施の形態３のシミュレーション
本発明の第３の実施形態に係る、第２の核酸断片の添加によるアプタマーと核酸断片の間の二本鎖核酸部位の開裂の検出を、シミュレーションにより検討した。【０１５８】
シミュレーションをおこなうにあたり、ＤＮＡ配列条件として、配列４〜６（図１５）を用いた。また、バッファ条件は（３００ｍＭ  Ｎａ＋，５ｍＭ  Ｍｇ２＋，ｐＨ７．４）、液温は３７℃とした。【０１５９】
なお、本実施例において、配列４は、ＡＴＰアプタマーとその相補な核酸断片とが連結されたＤＮＡであり、配列５は、第３の実施形態における第２の核酸断片である。また、配列６は、配列４からアプタマーの塩基配列を除いた塩基配列であり、ＡＴＰアプタマーの配列部分がＡＴＰと結合することにより核酸断片との結合能力を失った配列４に相当する。具体的には、配列４は、ＡＴＰに対して特異的に結合する２７塩基と、この２７塩基の一部に相補な核酸断片に相当する７塩基とが、両者のリンカーである１３塩基によって連結されている。また、配列５は、配列４における核酸断片の全領域と相補な７塩基と、核酸断片から連続するリンカー配列である５塩基に対して相補な塩基で構成されている。【０１６０】
上記条件において、異なる塩基配列のＤＮＡを混合した際の、相補的な塩基配列による二本鎖核酸部位を形成されやすさを、ＤＮＡの自由エネルギーが最小となる二次構造を算出（非特許文献５を参考）して求めた。【０１６１】
図１６に、配列４と配列５、および、配列６と配列５について、全ＤＮＡの存在量に対する二本鎖核酸部位を形成したＤＮＡの存在量の比率を求めた結果を示す。【０１６２】
配列４と配列５を共存させた場合、両者は２％が相補な塩基配列によって二本鎖核酸部位を形成する。また、図１６には示さないが、配列４は、その約９７％が、自身が有するＡＴＰアプタマーの配列部分と核酸断片部分とで二本鎖核酸部位を形成した。すなわち、この状態では、近接しているＡＴＰアプタマーと核酸断片とが二本鎖核酸領域を形成することにより、第２の核酸断片である配列５は、配列４の核酸断片部分とほとんど二本鎖核酸部位を形成しない。【０１６３】
一方で、配列６と配列５を共存させた場合、両者は８５％が二本鎖核酸部位を形成する。すなわち、ＡＴＰが添加され、配列４のＡＴＰと結合する塩基配列にＡＴＰが結合することにより核酸断片部分との二本鎖核酸部位が解消すると、第２の核酸断片である配列５は、配列６の核酸断片部分と容易に二本鎖核酸部位を形成する。【０１６４】
以上の結果から、第３の実施形態に示した、標的物質不在時は、第２の核酸断片と核酸断片とが結合せず、標的物質存在下では結合する、という仕組みが実現可能であることが示された。【０１６５】
（実施例３）最適な二本鎖核酸部位の長さの検討
本実施例では、ＡＴＰアプタマーに対する相補的な塩基数が異なる核酸断片によって、本発明の標的物質の検出方法によりＡＴＰを検出した。すなわち、本実施例では、二本鎖核酸部位の長さが異なる場合の、ＡＴＰ検出能力を比較した。【０１６６】
本実施例で用いたＡＴＰアプタマー（配列２）、および、ＡＴＰアプタマーに相補な核酸断片（配列７，８）を図１５に示す。配列２は第１の実施例のＡＴＰアプタマーと同一である。配列７の核酸断片は、配列２に対して相補な９塩基と、スペーサである相補でない５塩基とを有する。配列８の核酸断片は、配列２に対して相補な５塩基と、スペーサである相補でない５塩基とを有している。つまり、配列２と配列７とを同一の部材上に固定した場合、二本鎖核酸部位は５塩基となり、配列２と配列８の組み合わせ時は、二本鎖核酸部位が９塩基である。なお、実施例１の配列２と配列３の組み合わせ時は、二本鎖核酸部位は７塩基である。【０１６７】
配列２と配列７、および、配列２と配列８とを、実施例１と同様の方法で金電極上に固定し、ＡＣＶ測定をおこないながら終濃度１ｍＭとなるようにＡＴＰを添加した。【０１６８】
上記の測定および実施例１の測定における、二本鎖核酸部位の塩基数と、ＡＴＰ添加前および添加４００秒後のＡＣＶのピーク電流の相関を、図１７に示した。なお、ＡＣＶのピーク電流は、実施例１のＡＴＰ添加前におけるピーク電流で規格化している。【０１６９】
図１７に示したように、二本鎖核酸部位の長さが５から９塩基のいずれの場合も、ＡＴＰ添加後に電流値が増加し、本発明の方法によるＡＴＰの検出に適用できることが確認されたが、添加前後のピーク電流変化量、および変化率は、７塩基の場合に最も大きな値を示した。また、ＡＴＰ添加前における各条件のピーク電流を比較すると、二本鎖核酸部位の塩基数が多いほど、電流値が減少する傾向が見られた。【０１７０】
この結果から、本発明の標的物質の検出方法の二本鎖核酸部位の最適な長さについて、次のように説明することができる。【０１７１】
二本鎖核酸部位が短すぎると、二本鎖核酸部位の安定性が低すぎるため、二本鎖核酸部位の形成効率が著しく低下する。そのため、標的物質添加前後の二本鎖核酸部位の変化率、および変化量が少なくなり、標的物質を高感度に検出することの妨げになる。一方、二本鎖核酸部位が長すぎると、二本鎖核酸部位の安定性が高すぎるため、標的物質添加後も二本鎖核酸部位が開裂しにくくなる。そのため、標的物質添加前後の二本鎖核酸部位の変化率、および変化量が少なくなり、標的物質を高感度に検出することの妨げになる。【０１７２】
すなわち、二本鎖核酸部位を形成する塩基配列の構成などのパラメータに基づいて二本鎖核酸部位の長さを適宜最適な値に設定することにより、標的物質の検出を効果的に実施することができる。【０１７３】
（実施例４）  最適なスペーサ長さの検討
本実施例では、二本鎖核酸部位と基板間のスペーサ長さが異なるＡＴＰアプタマーおよび核酸断片によって、本発明の標的物質の検出方法によりＡＴＰを検出した。すなわち、本実施例では、スペーサの長さが異なる場合のＡＴＰ検出能力を比較した。【０１７４】
本実施例で用いたＡＴＰアプタマー（配列９〜１１）、および、ＡＴＰアプタマーに相補な核酸断片（配列１２〜１４）を図１５に示す。配列９〜１１、および配列１２〜１４は、スペーサ配列の長さが異なる点を除き、第１の実施例と同様である。同一の部材上に配列９のＡＴＰアプタマーと配列１２の核酸断片を固定した場合、スペーサ長さは７塩基である。また、配列１０と配列１３の組み合わせの場合のスペーサ長さは３塩基、配列１１と配列１４の組み合わせの場合は１塩基である。なお、上記の組み合わせにおいて、二本鎖核酸部位を形成する塩基数はいずれも７塩基であり、また、その塩基配列も同一である。【０１７５】
配列９と配列１２、配列１０と配列１３、および、配列１１と配列１４とを、実施例１と同様の方法で金電極上に固定し、ＡＣＶ測定をおこないながら終濃度１ｍＭとなるようにＡＴＰを添加した。【０１７６】
上記の測定および実施例１の測定における、スペーサの塩基数と、ＡＴＰ添加前および添加４００秒後のＡＣＶのピーク電流の相関を、図１８に示した。なお、ＡＣＶのピーク電流は、実施例１のＡＴＰ添加前におけるピーク電流で規格化している。【０１７７】
図１８に示したように、スペーサ長さが５塩基の場合には顕著な電流増加が見られたが、７塩基の場合には増加は僅かであり、１塩基および３塩基の場合にはＡＴＰ添加後に有意な電流増加は見られなかった。また、ＡＴＰ添加前の電流値は、５塩基の場合を最小として、それより長い場合と短い場合のいずれも増加する傾向が見られた。【０１７８】
この結果から、本発明の標的物質の検出方法における最適なスペーサ長さについて、次のように説明することができる。【０１７９】
スペーサ長さが短すぎると、二本鎖核酸部位を形成する塩基が基板から近い距離に位置する。すると、基板からの立体障害を強く受けるようになり、二本鎖核酸部位の形成が阻害される。そのため、基板に固定されたアプタマーと核酸断片は、ＡＴＰ添加前であっても二本鎖核酸部位が開裂した状態となる。また、基板からの立体障害により、アプタマーが標的物質と結合を形成するための二次構造の形成も阻害される。すると、ＡＴＰ添加時もＡＴＰとアプタマーが結合を形成できず、二本鎖核酸部位の開裂が進行しない。これらの影響によって、本実施例のように、核酸断片に修飾した標識物質の電気化学反応によって二本鎖核酸部位の開裂を検出する場合、ＡＴＰ添加に非依存的に高い電流が観測される。【０１８０】
一方で、スペーサが長すぎると、アプタマーと核酸断片が部材表面に近接して固定されることによる濃縮効果が低減する。すると、二本鎖核酸部位の形成効率が低下し、基板に固定されたアプタマーと核酸断片は、ＡＴＰ添加前であっても二本鎖核酸部位が開裂した状態となる。本実施例のように、核酸断片に修飾した標識物質の電気化学反応によって二本鎖核酸部位の開裂を検出する場合、ＡＴＰ添加に非依存的に高い電流が観測される。  【０１８１】
なお、スペーサ部位は自由に構造変化できることから、スペーサ部位が長いと二本鎖核酸部位を形成した状態であっても標識物質が電極表面に接触できるようになる。従って、本実施例のような、核酸断片に修飾した標識物質の電気化学反応によって二本鎖核酸部位の開裂を検出する場合、スペーサが長すぎる場合の影響が特に顕著に表れる。【０１８２】
すなわち、スペーサ長さを適宜最適な値に設定することにより、標的物質の検出を効果的に実施することができるといえる。【０１８３】
（実施例５）濃度依存性
本実施例では、第１の実施例と同様のアプタマーおよび核酸断片を使用して、ＡＴＰ濃度と電流値の濃度依存性を調べた。【０１８４】
第１の実施例と同様に、配列２のＡＴＰアプタマーおよび、配列３の核酸断片を電極表面に固定した。その電極でＡＣＶ測定をおこないながら、測定液中に徐々にＡＴＰを添加した。【０１８５】
ＡＴＰ濃度と、ピーク電流の相関を図１９に示す。ピーク電流は、ＡＴＰ添加前のピーク電流で規格化した。【０１８６】
図１９に示したように、ピーク電流はＡＴＰ濃度に依存的に増加した。このように、本発明の標的物質の検出方法によって、標的物質による二本鎖核酸部位の開裂を検出することにより、測定溶液中に存在する標的物質を検出し、また、定量することができる。【０１８７】
（実施例６）
本実施例では、スペーサ配列を含まないＡＴＰアプタマーおよび核酸断片によって、本発明の標的物質の検出方法によりＡＴＰを検出した。【０１８８】
本実施例で用いたＡＴＰアプタマー（配列１５）、および、ＡＴＰアプタマーに相補な核酸断片（配列３）を図１５に示す。【０１８９】
配列１５は、第１の実施例において用いられたＡＴＰアプタマー（配列２）のスペーサ配列部分を、配列３のスペーサとして用いられた部分と相補な塩基配列に変更したものである。すなわち、同一の部材上に配列１５のＡＴＰアプタマーと配列３の核酸断片を固定した場合、スペーサ長さはゼロで、二本鎖核酸部位を形成する塩基数は１２である。また、二本鎖核酸部位のうち基板側の５塩基は、ＡＴＰとの結合に関与しないのりしろ配列である。【０１９０】
配列１５と配列３とを、実施例１と同様の方法で金電極上に固定し、ＡＣＶ測定をおこないながら終濃度１ｍＭとなるようにＡＴＰを添加した。【０１９１】
上記の測定における、ＡＣＶのピーク電流の時間変化を図２０に示す。なお、電流値は、ＡＴＰ添加直前のピーク電流を基準に規格化した。ピーク電流はＡＴＰ添加直後に増加し始め、最終的には添加前の約２．５倍の値を示した。ＡＴＰ添加前の電流値は、ほぼ一定であったことから、この電流増加はＡＴＰに対して特異的なものであるといえる。【０１９２】
この結果は、次のように説明することができる。
すなわち、電極上に固定されたＡＴＰアプタマーおよび核酸断片は、互いの相補な塩基配列によって二本鎖核酸部位を形成する。この際、基板に近い位置の塩基配列は基板との立体障害によって二本鎖核酸部位を形成できないが、基板から離れた位置に安定な二本鎖領域を形成できるだけの長さの相補な塩基配列が存在することにより、ＡＴＰ添加前は低い電流値を示す。続いて、ＡＴＰが添加されると、ＡＴＰとＡＴＰアプタマーが結合することにより二本鎖核酸部位が開裂し、電流値が増加する。【０１９３】
以上のように、本発明の標的物質の検出方法における最適なスペーサ長さは、二本鎖核酸部位を形成可能な相補的な塩基数等によって変化し、スペーサ配列を省略しても良い。
また、本発明の標的物質の検出方法において、二本鎖核酸部位には標的物質との結合に関与しない、のりしろ配列を含んでいても良い。【０１９４】
なお、当然ながら、上述した実施の形態および複数の変形例は、その内容が相反しない範囲で組み合わせることができる。また、上述した実施の形態および変形例では、各部の構造などを具体的に説明したが、その構造などは本願発明を満足する範囲で各種に変更することができる。【０１９５】
この出願は、２０１１年７月２５日に出願された日本出願特願２０１１−１６２０２３号および２０１２年３月２日に出願された日本出願特願２０１２−０４６５８９号を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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