(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象において癌を処置するための、ｍＴＯＲ阻害剤および式Ｉ
【化１】
0005936628.tif 000012
［式中、
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、Ｈ、ハロおよびＣ１−４アルキルから独立して選択され、
Ｚは、Ｃ３−６シクロアルキルである。］
で示される化合物、またはその立体異性体、互変異性体、ラセミ体、溶媒和物もしくは薬学的に許容される塩を含む医薬組成物であって、該ｍＴＯＲ阻害剤が、エベロリムス（ＲＡＤ００１）または２−（４−アミノ−１−イソプロピル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−３−イル）−１Ｈ−インドール−５−オール（ＰＰ２４２）であり、該ｍＴＯＲ阻害剤および式Ｉの化合物が共に製剤されるか、または別個に製剤されてもよい、医薬組成物。
【請求項２】
式Ｉの化合物が、（３Ｒ）−３−シクロペンチル−３−［４−（７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］プロパンニトリル、またはその薬学的に許容される塩である、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
ｍＴＯＲ阻害剤および式Ｉの化合物が、単一剤形または単位投与量形態である、請求項１または２記載の医薬組成物。
【請求項４】
薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項３記載の医薬組成物。
【請求項５】
ｍＴＯＲ阻害剤および式Ｉの化合物が、個別投与のために別個に製剤される、請求項１または２記載の医薬組成物。
【請求項６】
癌が脊髄増殖性新生物である、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項７】
脊髄増殖性新生物が、慢性骨髄白血病（ＣＭＬ）、真性赤血球増加（ＰＶ）、本態性血小板血症（ＥＴ）、原発性または特発性の骨髄繊維症（ＰＭＦ）、慢性好中球性白血病、慢性好酸球性白血病、慢性骨髄単球性白血病、若年性骨髄単球性白血病、高好酸球症候群、全身性肥満細胞症および異型性の慢性骨髄性白血病からなる群より選択される、請求項６記載の医薬組成物。
【請求項８】
脊髄増殖性新生物が、原発性骨髄繊維症、真性赤血球増加症後骨髄線維症または本態性血小板血症後の骨髄線維症である、請求項６記載の医薬組成物。
【請求項９】
対象がヒトである、請求項５ないし８のいずれか一項記載の医薬組成物。
【請求項１０】
ｍＴＯＲ阻害剤および式Ｉの化合物が、実質的に同時に投与される、請求項５ないし８のいずれか一項記載の医薬組成物。
【請求項１１】
ｍＴＯＲ阻害剤および式Ｉの化合物が、異なる時間に投与される、請求項５ないし８のいずれか一項記載の医薬組成物。
【請求項１２】
ｍＴＯＲ阻害剤が対象に投与された後、式Ｉの化合物が投与される、請求項１１記載の医薬組成物。
【請求項１３】
式Ｉの化合物が対象に投与された後、ｍＴＯＲ阻害剤が投与される、請求項１１記載の医薬組成物。
【請求項１４】
ｍＴＯＲ阻害剤および（３Ｒ）−３−シクロペンチル−３−［４−（７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］プロパンニトリル（またはその薬学的に許容される塩が、単一剤形または単位投与量形態である、請求項５ないし８のいずれか一項記載の医薬組成物。
【請求項１５】
ｍＴＯＲ阻害剤および（３Ｒ）−３−シクロペンチル−３−［４−（７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］プロパンニトリル（またはその薬学的に許容される塩が、別個の剤形または単位投与量形態である、請求項５ないし８のいずれか一項記載の医薬組成物。
【請求項１６】
ｍＴＯＲ阻害剤および／または式Ｉの化合物が、ｍＴＯＲ阻害剤および式Ｉの化合物の一方または両方が単独で投与されるとき有効ではないが、併用投与されるとき有効な投与量で投与される、請求項５ないし８のいずれか一項記載の医薬組成物。
【請求項１７】
ＳＴＡＴ５リン酸化の阻害のための、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項１８】
それを必要とする対象に投与される、請求項１７記載の医薬組成物。
【請求項１９】
製剤の投与により、対象における脊髄増殖性新生物が処置される、請求項１８記載の医薬組成物。
【請求項２０】
脊髄増殖性新生物が、慢性骨髄白血病（ＣＭＬ）、真性赤血球増加（ＰＶ）、本態性血小板血症（ＥＴ）、原発性または特発性の骨髄繊維症（ＰＭＦ）、慢性好中球性白血病、慢性好酸球性白血病、慢性骨髄単球性白血病、若年性骨髄単球性白血病、高好酸球症候群、全身性肥満細胞症および異型性の慢性骨髄性白血病からなる群より選択される、請求項１９記載の医薬組成物。
【請求項２１】
脊髄増殖性新生物が、原発性骨髄繊維症、真性赤血球増加症後骨髄線維症または本態性血小板血症後の骨髄線維症である、請求項１９記載の医薬組成物。
【請求項２２】
対象において脊髄増殖性新生物を処置するための、エベロリムスおよび（３Ｒ）−３−シクロペンチル−３−［４−（７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］プロパンニトリルまたはその薬学的に許容される塩を含む、医薬組成物。
【請求項２３】
対象において脊髄増殖性新生物を処置するための、ＰＰ２４２および（３Ｒ）−３−シクロペンチル−３−［４−（７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］プロパンニトリルまたはその薬学的に許容される塩を含む、医薬組成物。
【請求項２４】
ｍＴＯＲ阻害剤および式Ｉ
【化２】
0005936628.tif 000013
［式中、
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、Ｈ、ハロおよびＣ１−４アルキルから独立して選択され、
Ｚは、Ｃ３−６シクロアルキルである。］
で示される化合物、またはその立体異性体、互変異性体、ラセミ体、溶媒和物もしくは薬学的に許容される塩を含む組成物であって、該ｍＴＯＲ阻害剤が、エベロリムス（ＲＡＤ００１）または２−（４−アミノ−１−イソプロピル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−３−イル）−１Ｈ−インドール−５−オール（ＰＰ２４２）である、組成物。
【請求項２５】
式Ｉの化合物が、（３Ｒ）−３−シクロペンチル−３−［４−（７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］プロパンニトリルまたはその薬学的に許容される塩である、請求項２４記載の組成物。
【請求項２６】
薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項２４記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１１年２月１８日出願の米国仮特許出願第６１／４４４，５８１号、２０１１年７月１日出願の同第６１／５０３，７８９号、および２０１１年７月１日出願の同第６１／５０３，７８５号に優先権を主張し、それらの内容全体は、引用により本明細書に包含される。本願明細書中で引用された全ての特許、特許出願および文献の内容は、引用によりその内容が本明細書に包含される。
【背景技術】
【０００２】
背景
脊髄増殖性新生物（ＭＰＮ）は、骨髄中の血液細胞（血小板、白血球および赤血球）の過剰産生を引き起こす疾患群である。ＭＰＮとしては、真性赤血球増加（ＰＶ）、原発性または本態性血小板血症（ＥＴ）、原発性または特発性骨髄繊維症、慢性骨髄性（骨髄球）白血病（ＣＭＬ）、慢性好中球性白血病（ＣＮＬ）、若年性骨髄単球性白血病（ＪＭＬ）および慢性好酸球性白血病（ＣＥＬ）／過好酸性症候群（ＨＥＳ）が挙げられる。これらの疾患は、それらが以下の特徴のうちの幾つかまたは全てを共有するため、一群にまとめられる：分化多能性造血前駆細胞の関与、非形質転換造血前駆細胞よりも形質転換したクローンの優勢、定義可能な刺激がない状態での１種またはそれ以上の造血系細胞の過剰産生、インビトロでの増殖因子に依存しないコロニー形成、骨髄過形成、巨核球増殖および異形成、主に１、８、９、１３および２０番染色体に多い異常、血栓性素因および出血性素因、盛んな髄外造血、ならびにＣＭＬでの率と比較して低率だが、急性白血病または骨髄繊維症の発症への自然形質転換。ＭＰＮの発生率は、ＣＭＬについて６０歳以上の１００，０００名当たりおよそ３名／年から、ＪＭＬについて０歳から１４歳までの１００，０００名の小児当たり０．１３名／年までの範囲で大きく変わる（Vardiman JW et al., Blood 100 (7): 2292−302, 2002）。
従って、他の癌と同様にＭＰＮの新規治療法が望まれている。
【発明の概要】
【０００３】
発明の概要
本発明は、ｍＴＯＲ阻害剤およびＪＡＫ阻害剤を含む併用療法を提供する。該併用療法はＭＰＮを含む種々の癌の処置に有用である。該併用療法はまた、多数のＪＡＫ関連疾患の処置にも有用である。
【０００４】
従って、一面において、本発明は、ｍＴＯＲ阻害剤およびＪＡＫ阻害剤を含む併用療法を提供する。一態様において、ＪＡＫ阻害剤は、式Ｉ
【化１】
0005936628.tif 000002
で示される化合物またはその立体異性体、互変異性体、ラセミ体、溶媒和物、代謝産物もしくは薬学的に許容される塩である。別の面において、本発明は、ｍＴＯＲ阻害剤およびＪＡＫ阻害剤を含む組成物を提供する。特定の態様において、式Ｉの化合物は、（３Ｒ）−３−シクロペンチル−３−［４−（７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］プロパンニトリル（化合物Ａ）またはその薬学的に許容される塩である。
【０００５】
別の態様において、ＪＡＫ阻害剤は５−クロロ−Ｎ２−［（１Ｓ）−１−（５−フルオロピリミジン−２−イル）エチル］−Ｎ４−（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−ピリミジン−２，４−ジアミン（ＡＺＤ１４８０）、またはその薬学的に許容される塩である。
【０００６】
別の態様において、ｍＴＯＲ阻害剤はエベロリムス（ＲＡＤ００１）または２−（４−アミノ−１−イソプロピル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−３−イル）−１Ｈ−インドール−５−オール（ＰＰ２４２）である。
【０００７】
１つの特定の態様において、併用療法はエベロリムスおよび化合物Ａまたはその薬学的に許容される塩を含む。別の特定の態様において、併用療法はＰＰ２４２および化合物Ａまたはその薬学的に許容される塩を含む。
【０００８】
本発明で提供される併用療法の一態様において、ｍＴＯＲ阻害剤およびＪＡＫ阻害剤（例えば式Ｉの化合物（例えば化合物Ａまたはその薬学的に許容される塩））は、単一剤形または単位投与量形態である。単一剤形または単位投与量形態は、薬学的に許容される担体をさらに含み得る。別の態様において、ｍＴＯＲ阻害剤およびＪＡＫ阻害剤は別個に投与される。
【０００９】
本発明で提供される併用療法は、対象におけるＪＡＫ関連疾患の処置に有用である。従って、一面において、本発明は、処置を必要とする対象に有効量のｍＴＯＲ阻害剤およびＪＡＫ阻害剤（例えば、式Ｉの化合物（例えば、化合物Ａまたはその薬学的に許容される塩））を投与することを含む、該対象における癌の処置方法を提供する。一態様において、癌は脊髄増殖性新生物である。本発明の併用療法を用いて処置され得る脊髄増殖性新生物の非限定例としては、慢性骨髄白血病（ＣＭＬ）、真性赤血球増加（ＰＶ）、本態性血小板血症（ＥＴ）、原発性または特発性骨髄繊維症（ＰＭＦ）、慢性好中球性白血病、慢性好酸球性白血病、慢性骨髄単球性白血病、若年性骨髄単球性白血病、高好酸球症候群、全身性肥満細胞症、および異型性の慢性骨髄性白血病が挙げられるが、これらに限定されない。別の態様では、併用療法は、原発性骨髄繊維症、真性赤血球増加症後の骨髄線維症または本態性血小板血症後の骨髄線維症を含む中間リスク群または高リスク群の骨髄繊維症の処置に使用可能である。
【００１０】
これらの処置方法の一態様において、対象はヒトである。別の態様において、該処置はｍＴＯＲ阻害剤およびＪＡＫ阻害剤（例えば、式Ｉの化合物（例えば、化合物Ａまたはその薬学的に許容される塩））を共投与することを含む。別の態様において、ｍＴＯＲ阻害剤およびＪＡＫ阻害剤（例えば、式Ｉの化合物（例えば、化合物Ａまたはその薬学的に許容される塩））は、単一剤形または単位投与量形態である。ｍＴＯＲ阻害剤およびＪＡＫ阻害剤（例えば、式Ｉの化合物（例えば、化合物Ａまたはその薬学的に許容される塩））は、別個の剤形であるか、または単位投与量形態であり得る。さらに別の態様において、処置は、ｍＴＯＲ阻害剤およびＪＡＫ阻害剤（例えば、式Ｉの化合物（例えば、化合物Ａまたはその薬学的に許容される塩））を実質的に同時に、または異なる時間に投与することを含む。該方法の別の態様において、ｍＴＯＲ阻害剤を対象に投与し、次いでＪＡＫ阻害剤（例えば、式Ｉの化合物（例えば、化合物Ａまたはその薬学的に許容される塩））を投与する。さらに別の態様において、ＪＡＫ阻害剤（例えば、式Ｉの化合物（例えば、化合物Ａまたはその薬学的に許容される塩））を対象に投与し、次いでｍＴＯＲ阻害剤を投与する。方法の別の態様において、ｍＴＯＲ阻害剤および／またはＪＡＫ阻害剤（例えば、式Ｉの化合物（例えば、化合物Ａまたはその薬学的に許容される塩））は、ｍＴＯＲ阻害剤およびＪＡＫ阻害剤（例えば、式Ｉの化合物（例えば、化合物Ａまたはその薬学的に許容される塩））の一方または両方が単独で投与されるとき、有効ではないが、該量が併用投与のとき有効である量で投与される。
【００１１】
本発明で供される併用療法はまた、ＳＴＡＴ５リン酸化を阻害するのに有用である。ＳＴＡＴ５リン酸化は、その必要のある対象において阻害され得る。一態様において、対象におけるＳＴＡＴ５リン酸化の阻害により、対象の脊髄増殖性新生物が処置される。脊髄増殖性新生物は、慢性骨髄白血病（ＣＭＬ）、真性赤血球増加（ＰＶ）、本態性血小板血症（ＥＴ）、原発性または特発性の骨髄繊維症（ＰＭＦ）、慢性好中球性白血病、慢性好酸球性白血病、慢性骨髄単球性白血病、若年性骨髄単球性白血病、高好酸球症候群、全身性肥満細胞症および異型性の慢性骨髄性白血病からなる群より選択され得る。
【００１２】
別の面において、本発明は、処置の必要な対象にエベロリムスおよび化合物Ａまたはその薬学的に許容される塩を投与することを含む、脊髄増殖性新生物の処置方法を提供する。別の面において、本発明は、処置の必要な対象にＰＰ２４２および化合物Ａまたはその薬学的に許容される塩を投与することを含む、脊髄増殖性新生物の処置方法を提供する。これらの面の一態様において、脊髄増殖性新生物は、原発性骨髄繊維症、真性赤血球増加症後の骨髄線維症または本態性血小板血症後の骨髄線維症である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１Ａ〜１Ｅは、ＳＥＴ２またはＨＥＬ細胞の細胞アポトーシスおよび細胞周期における、選択されたｍＴＯＲ阻害剤、ＪＡＫ１／ＪＡＫ２阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、およびヒドロキシ尿素の効果を示す。
【図２】図２は、ＳＥＴ２細胞のｍＴＯＲおよびＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達における、選択されたｍＴＯＲ阻害剤、ＪＡＫ１／ＪＡＫ２阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、およびヒドロキシ尿素の効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
詳細な説明
ｍＴＯＲ阻害剤およびＪＡＫキナーゼ阻害剤（例えば、式ＩのＪＡＫキナーゼ阻害剤（例えば、化合物Ａまたはその薬学的に許容される塩））の併用投与が、対象における癌、例えば脊髄増殖性新生物（ＭＰＮ）の処置に対して驚くべき相乗効果を提供することが発見された。かかるアプローチ（２種の薬剤の併用または共投与）は、現在利用可能な治療法に応答しないか、または耐性のある癌に罹患する個体の処置に有用であり得る。本発明で提供される併用療法はまた、効能を改善し、かつ／または、かかる療法に応答する個体のための現在利用可能な癌治療法の副作用を軽減するのに有用である。
【００１５】
本明細書で用いるある種の用語は以下に説明されている。本発明の化合物は標準的命名法を用いて記載される。特に他に記載がなければ、本明細書で用いる技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者に一般に理解されるのと同様の意味を有する。
【００１６】
ｍＴＯＲ阻害剤／ＪＡＫ阻害剤 併用療法
本発明は、治療剤の組合せおよび癌、例えばＭＰＮを処置するための薬剤の併用投与法を提供する。本明細書で用いる、“薬剤の組合せ”および同様の用語は以下の２種の薬剤の併用を意味する。（１）ｍＴＯＲ阻害剤および（２）ＪＡＫ阻害剤（例えば、式ＩのＪＡＫキナーゼ阻害剤（例えば、化合物Ａまたはその薬学的に許容される塩））。
【００１７】
ｍＴＯＲとして周知のラパマイシンの哺乳動物標的は、セリン／トレオニンプロテインキナーゼであり、細胞成長、細胞増殖、細胞運動、細胞生存、タンパク質合成および転写を制御する。ｍＴＯＲは、複数の細胞分裂シグナル伝達経路の重要な仲介因子であり、正常組織および腫瘍過程における増殖および血管形成を調整する際に中心的な役割を果たす。ｍＴＯＲシグナル伝達の過活性化は腫瘍形成に関与し、いくつかの種類の腫瘍における研究は、ｍＴＯＲ阻害剤の抗増殖特性および抗血管形成特性が癌治療に有用であることを示唆している。ｍＴＯＲは２種類の複合体、ｍＴＯＲＣ１およびｍＴＯＲＣ２内に存在する。ｍＴＯＲＣ１はラパマイシン類縁体（例えば、テムシロリムスまたはエベロリムス）に感受性であり、ｍＴＯＲＣ２は大部分がラパマイシン非感受性である。いくつかのｍＴＯＲ阻害剤は、癌の処置のための治験において評価されたか、または評価されている。
【００１８】
本明細書で用いる用語“ｍＴＯＲ阻害剤”は、ｍＴＯＲの少なくとも１種の活性、例えばその基質（例えば、ｐ７０Ｓ６キナーゼ１、４Ｅ−ＢＰ１、ＡＫＴ／ＰＫＢおよびｅＥＦ２）の少なくとも１種の上のセリン／トレオニンプロテインキナーゼ活性を阻害する化合物またはリガンドを意味する。当業者は、ラパマイシンまたはその類縁体または誘導体のような化合物がｍＴＯＲ阻害剤であるかどうかを容易に判断することができる。かかる化合物またはリガンドを同定する方法は、当技術分野において公知である。ｍＴＯＲ阻害剤の例としては、ラパマイシン（シロリムス）、ラパマイシン誘導体、ＣＩ−７７９、エベロリムス（サーティカン（商標））、ＡＢＴ−５７８、タクロリムス（ＦＫ５０６）、ＡＢＴ−５７８、ＡＰ−２３６７５、ＢＥＺ−２３５、ＯＳＩ−０２７、ＱＬＴ−０４４７、ＡＢＩ−００９、ＢＣ−２１０、サリラシブ、ＴＡＦＡ−９３、デフォロリムス（deforolimus）（ＡＰ−２３５７３）、テムシロリムス（Temsirolimus）（トーリセル（商標）））、２−（４−アミノ−１−イソプロピル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−３−イル）−１Ｈ−インドール−５−オール（ＰＰ２４２）およびＡＰ−２３８４１が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１９】
本明細書で用いる用語“選択的ｍＴＯＲ阻害剤”は、ｍＴＯＲ活性を阻害するが、ＰＩ３Ｋ活性を阻害しない化合物またはリガンドを意味する。好適な選択的ｍＴＯＲ阻害剤としては、ＲＡＤ００１が挙げられる。従って、一面において、本発明は、選択的なｍＴＯＲ阻害剤およびＪＡＫ阻害剤を含む併用療法を提供する。
【００２０】
ラパマイシンは、ストレプトマイセス・ハイグロスコピカス（Streptomyces hygroscopicus）によって生産される公知のマクロライド系抗生物質である。ラパマイシンの好適な誘導体としては、例えば式ＩＩ：
【化２】
0005936628.tif 000003
［式中、
Ｒ１ａａは、ＣＨ３またはＣ３−６アルキルであり、
Ｒ２ａａは、Ｈまたは−ＣＨ２−ＣＨ２−ＯＨ、３−ヒドロキシ−２−（ヒドロキシメチル）−２−メチル−プロパノイルまたはテトラゾリルであり、
Ｘａａは、＝Ｏ、（Ｈ，Ｈ）または（Ｈ，ＯＨ）である。］
で示される化合物またはそのプロドラッグ（Ｒ２ａａが、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＯＨであるとき）、例えば、その生理学的に加水分解され得るエーテルが挙げられる。
【００２１】
式ＩＩの化合物は、例えば、ＷＯ９４／０９０１０、ＷＯ９５／１６６９１、ＷＯ９６／４１８０７、米国特許番号第５，３６２，７１８号およびＷＯ９９／１５５３０に記載されており、それらは引用により本明細書中に包含される。該化合物はこれらの文献に記載の方法を用いて製造され得る。
【００２２】
式ＩＩの代表的なラパマイシン誘導体は、例えば３２−デオキソラパマイシン、１６−ペンタ−２−イニルオキシ−３２−デオキソラパマイシン、１６−ペンタ−２−イニルオキシ−３２（ＳまたはＲ）−ジヒドロ−ラパマイシン、１６−ペンタ−２−イニルオキシ−３２（ＳまたはＲ）−ジヒドロ−４０−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−ラパマイシン、４０−［３−ヒドロキシ−２−（ヒドロキシメチル）−２−メチルプロパノアート］−ラパマイシン（ＣＣＩ７７９とも称される）または４０−エピ−（テトラゾリル）−ラパマイシン（ＡＢＴ５７８とも称される）である。ラパマイシン誘導体はまた、いわゆるラパログ(rapalog)、例えば、ＷＯ９８／０２４４１およびＷＯ０１／１４３８７に記載のもの、例えばＡＰ２３５７３、ＡＰ２３４６４、ＡＰ２３６７５またはＡＰ２３８４１を含み得る。ラパマイシン誘導体のさらなる例は、ＴＡＦＡ−９３（ラパマイシンプロドラッグ）、バイオリムス−７またはバイオリムス−９の名称で開示されているものである。
【００２３】
好ましい態様では、本発明で提供される併用療法において使用されるｍＴＯＲ阻害剤は、エベロリムス（ＲＡＤ００１）または２−（４−アミノ−１−イソプロピル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−３−イル）−１Ｈ−インドール−５−オール（ＰＰ２４２）（例えば、Apsel et al., Nature Chemical Biology 4, 691−699 (2008)を引用）である。
【００２４】
ＪＡＫファミリーは、免疫応答に伴う細胞の増殖および機能のサイトカイン依存性調節に役割を果たす。現在、４種の既知の哺乳動物ＪＡＫファミリーメンバーが存在する。ＪＡＫ１（ヤヌスキナーゼ−１としても公知）、ＪＡＫ２（ヤヌスキナーゼ−２としても公知）、ＪＡＫ３（ヤヌスキナーゼ（白血球）としても公知；ＪＡＫＬ；Ｌ−ＪＡＫおよびヤヌスキナーゼ−３）およびＴＹＫ２（プロテインチロシンキナーゼ２としても公知）。ＪＡＫタンパク質は１２０から１４０ｋＤａまで大きさであり、７つの保存されたＪＡＫ相同（ＪＨ）ドメインを含む。これらのうちの１つは、機能的触媒キナーゼドメインであり、他のものは潜在的に制御機能を果たすか、および／またはＳＴＡＴに対するドッキング部位として役割を果たす偽キナーゼドメインである（Scott, M. J., C. J. Godshall, et al. (2002) Clin Diagn Lab Immunol 9(6): 1153−9）。
【００２５】
本明細書で用いる“ＪＡＫ阻害剤”は、ＪＡＫキナーゼの少なくとも１種の活性を阻害する化合物またはリガンドを意味する。“ＪＡＫ阻害剤”はまた、“ＪＡＫ１／ＪＡＫ２阻害剤”でもあり得る。ある態様において、ＪＡＫ阻害剤はＪＡＫを阻害された状態を引き起こす。ＪＡＫ阻害剤の例としては、式Ｉの化合物およびＡＺＤ１４８０が挙げられる。
【００２６】
式Ｉの化合物は、
【化３】
0005936628.tif 000004
［式中、
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、Ｈ、ハロおよびＣ１−４アルキルから独立して選択され、
Ｚは、Ｃ３−６シクロアルキル（例えば、シクロペンチル）である。］
で示される化合物または立体異性体、互変異性体、ラセミ体、溶媒和物、代謝産物もしくは薬学的に許容される塩と定義される。
【００２７】
式Ｉの化合物の例としては、米国特許第７，５９８，２５７号（その内容全体は引用により本明細書中に包含される）に記載された化合物が挙げられる。化合物Ａを含む式Ｉの化合物の製造方法は、米国特許第７，５９８，２５７号およびＰＣＴ公開番号ＷＯ／２０１０／０８３２８３（ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０２１００３）に見出され得て、それらの両文献は、その内容全体が引用により本明細書中に包含される。
【００２８】
特定の態様において、式Ｉの化合物は、３−シクロペンチル−３−［４−（７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］プロパンニトリルまたはその薬学的に許容される塩である。別の態様において、式Ｉの化合物は、（３Ｒ）−３−シクロペンチル−３−［４−（７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］プロパンニトリル（化合物Ａ）またはその薬学的に許容される塩である。さらに別の態様において、式Ｉの化合物は、（３Ｓ）−３−シクロペンチル−３−［４−（７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］プロパンニトリルまたはその薬学的に許容される塩である。これらの化合物の合成法は、例えば米国特許第７，５９８，２５７号およびＰＣＴ公開番号ＷＯ／２０１０／０８３２８３（ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０２１００３）に記載されている。
【００２９】
別の態様において、式Ｉの化合物は、（３Ｒ）−３−シクロペンチル−３−［４−（７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］プロパンニトリルマレイン酸塩である。さらに別の態様において、式Ｉの化合物は、（３Ｒ）−３−シクロペンチル−３−［４−（７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］プロパンニトリル硫酸塩である。さらに別の態様において、式Ｉの化合物は、（３Ｒ）−３−シクロペンチル−３−［４−（７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］プロパンニトリルリン酸塩（化合物Ａのリン酸塩）である。これらの化合物の合成法は、例えば米国特許出願番号第１２／１３７，８９２号に記載されており、その内容全体は引用により本明細書中に包含される。
【００３０】
一態様において、本発明は、化合物ＡおよびｍＴＯＲ阻害剤（例えば、エベロリムスまたはＰＰ２４２）のリン酸塩を含む併用療法を提供する。
【００３１】
本明細書で用いる用語“Ｃｘ−Ｃｙ−アルキル基”（式中、ｘは１〜５であり、ｙは２〜１０である）は、特定の範囲の炭素数の特定のアルキル基（直鎖または分枝状）を意味する。例えば、用語Ｃ１−Ｃ４アルキルは、メチル、エチル、プロピル、ブチル、イソプロピル、tert−ブチルおよびイソブチルを含むが、これらに限定されない。
【００３２】
本明細書で用いる用語“Ｃ３−６シクロアルキル”は、３ないし６個の炭素原子、好ましくは５個の炭素原子の、飽和もしくは不飽和の単環もしくは二環式炭化水素基を意味する。単環式炭化水素基の例としては、シクロプロピル、シクロブチルおよびシクロペンチルが挙げられるが、これに限定されない。
【００３３】
用語“ハロゲン”または“ハロ”は、クロロ、ブロモ、フルオロおよびヨードを意味する。
【００３４】
薬剤は、化合物が異なる立体異性形態で存在し得るため、立体中心または立体軸のような１個以上の非対称要素、例えば不斉炭素原子を含み得る。これらの化合物は、例えばラセミ体または光学的に活性な形態をとり得る。２個またはそれ以上の非対称要素を有する化合物については、これらの化合物はさらにジアステレオマーの混合物となり得る。不斉中心を有する化合物については、光学異性体およびその混合物が全て包含されることが理解されるべきである。さらに、炭素−炭素二重結合を有する化合物は、Ｚ形態およびＥ毛形態で生じ得る。化合物の全ての異性体形態は、本発明に包含される。これらの状況において、単一の鏡像体（光学活性形態）が、不斉合成、光学的に純粋な前駆体からの合成、またはラセミ体の分解によって得られ得る。ラセミ体の分解はまた、例えば、分割剤の存在下での結晶化、または例えばキラルＨＰＬＣカラムを用いるクロマトグラフィーのような常套法によって達成され得る。
【００３５】
他に別段の記載がない限り、または本明細書に明確に記載がない限り、本発明の併用療法において有用な化合物への言及は、該化合物の遊離塩基および化合物の全ての薬学的に許容される塩の両方を含む。
【００３６】
本明細書で用いる用語“薬学的に許容される塩”は、本発明のピリミジン化合物の非毒性の酸性塩またはアルカリ土類金属塩を意味する。これらの塩は、ピリミジン化合物の最終単離および精製中にインサイチュウで製造され得るか、または塩基または酸性の官能基を好適な有機または無機の酸または塩基とそれぞれ個別に反応させることにより製造され得る。代表的な塩としては、以下：酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、クエン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩、樟脳硫酸塩、ジグルコン酸塩、シクロペンタプロピオン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、フマル酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、シュウ酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、p−トルエンスルホン酸塩およびウンデカン酸塩が挙げられるが、これに限定されない。また、塩基性窒素含有基は、ハロゲン化アルキル（塩化、臭化およびヨウ化メチル、エチル、プロピルおよびブチルなど）；硫酸ジアルキル（硫酸ジメチル、ジエチル、ジブチル、およびジアミルなど）；長鎖ハロゲン化物（塩化、臭化およびヨウ化デシル、ラウリル、ミリスチルおよびステアリルなど）；ハロゲン化アラルキル（臭化ベンジルおよびフェネチルなど）、ならびにその他などの薬剤で四級化され得る。水溶性または油溶性または分散性生成物がそれによって得られる。
【００３７】
薬学的に許容される酸付加塩を形成するために使用される得る酸の例としては、塩酸、ヒドロホウ酸、硝酸、硫酸およびリン酸のような無機酸、ならびにギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、フマル酸、酒石酸、シュウ酸、マレイン酸、メタンスルホン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、クエン酸、およびアスパラギン酸とグルタミン酸のような酸性アミノ酸のような有機酸が挙げられる。
【００３８】
本発明は、ｍＴＯＲ阻害剤およびＪＡＫ阻害剤（例えば、式ＩのＪＡＫ阻害剤（例えば、化合物Ａまたはその薬学的に許容される塩））を含む併用療法を提供する。組合せの投与（すなわち、ｍＴＯＲ阻害剤およびＪＡＫ阻害剤（例えば、式ＩのＪＡＫ阻害剤（例えば、化合物Ａまたはその薬学的に許容される塩））の組合せ）は、単一剤形または単位投与量形態での組合せ剤の投与、組合せ剤の個々の薬剤の同時であるか別個の投与、または組合せ剤の個々の薬剤の任意の好適な経路による連続投与を含む。組合せ剤の個々の薬剤の量は、組合せ剤中の他の薬剤と比較して、１個の薬剤のより頻繁な投与を要し得る。故に、適当な投薬を可能にするために、パッケージ化された医薬品は、薬剤の組合せを含む１個またはそれ以上の投与量形態、ならびに薬剤の組合せのうち１つを含むが、組合せの他の薬剤は含まない１個またはそれ以上の投与量形態を含み得る。
【００３９】
本明細書で用いる用語“単一剤形”は、患者に有効量の両方の治療剤を送達するために剤形化された単一の担体またはビークルを意味する。単一のビークルは、任意の薬学的に許容される担体または添加剤に加えて、有効量の各薬剤を送達するように設計される。いくつかの態様において、ビークルは、錠剤、カプセル剤、丸剤またはパッチ剤である。他の態様において、ビークルは溶液または懸濁液である。
【００４０】
本明細書中、用語“単位用量”は、治療されるべき患者に、１つの投与量形態で両方の薬剤を同時に投与することを意味するために用いられる。いくつかの態様において、単位用量は単一剤形である。ある態様において、単位用量は、ビークルがそれぞれ薬学的に許容される担体および添加剤と共に少なくとも１種の薬剤の有効量を含むように、１個またはそれ以上のビークルを含む。いくつかの態様において、単位用量は、患者に同時に投与される、１個以上の錠剤、カプセル剤、丸剤またはパッチ剤である。
【００４１】
本明細書中、用語“処置”は、対象における疾患の少なくとも１つの症状を取り除くか、軽減するか、または緩和することを意味するために用いられる。本発明の意味内において、用語“処置”はまた、疾患の症状を停止させるか、発症（すなわち、疾患の臨床症状または疾患の症状に先立つ期間）を遅らせるか、または疾患の症状を進行させるか、もしくは悪化させるリスクを減少させることを意味する。
【００４２】
用語“対象”は、動物を含むことを意図する。対象の例としては、哺乳動物（例えば、ヒト、イヌ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、マウス、ウサギ、ラットおよび遺伝子組み換えされたヒト以外の動物が挙げられる。ある態様において、対象はヒト、例えば、癌、例えば脊髄増殖性新生物に罹患しているヒト、罹患する危険のあるヒト、または罹患する可能性のあるヒトである。
【００４３】
用語“約”または“およそ”は、通常、所定の値または範囲の２０％以内、より好ましくは１０％以内、もっとも好ましくは５％以内を意味する。あるいは、特に生物系において、用語“約”は、好ましくは任意の値の２つの指数の範囲以内のｌｏｇ（すなわち、対数）の範囲以内であることを意味する。
【００４４】
用語“併用療法”は、本明細書に記載される病状または疾患を処置するための２種またはそれ以上の治療薬の投与を意味する。かかる投与は、一定の比率で複数の有効成分を含む単一のカプセル剤または複数のカプセル剤、あるいはそれぞれの有効成分を個別の容器（例えば、複数のカプセル）に含むカプセル剤でのような、実質に同時のこれらの治療剤の共投与を包含する。さらに、かかる投与はまた、ほぼ同時に、または異なる時間に、連続して、各種治療剤を使用することを包含する。いずれの場合も、処置レジメンは、本明細書に記載の病状または疾患を処置する際に併用薬剤の有益な効果を提供し得る。
【００４５】
本明細書に記載の薬剤の組合せは相乗効果を示す。本明細書で用いる用語“相乗効果”は、例えば、癌またはその関連徴候の症状の進行を遅延するのに、それらが各薬剤単独で投与されるときの効果を単純に加えた効果よりも大きい効果を生じる、例えばｍＴＯＲ阻害剤およびＪＡＫ阻害剤（例えば、式ＩのＪＡＫ阻害剤）のような２種の薬剤の作用を意味する。相乗効果は、シグモイドＥｍａｘ方程式（Holford, N. H. G. and Scheiner, L. B., Clin. Pharmacokinet. 6: 429−453 (1981)）、Ｌｏｅｗｅの相加方程式（Loewe, S. and Muischnek, H., Arch. Exp. Pathol Pharmacol. 114: 313−326 (1926)）、およびmedian−effect方程式 (Chou, T. C. and Talalay, P., Adv. Enzyme Regul. 22: 27−55 (1984))のような適当な方法を用いて計算され得る。上記の各方程式を実験データに適用し、対応するグラフを作成し、併用薬の効果を評価する際に援用することができる。上記の方程式に関連する対応グラフはそれぞれ、濃度−効果曲線、アイソボログラム曲線、および組合せ指数曲線である。
【００４６】
一態様において、本発明は、有効量のＪＡＫ阻害剤およびｍＴＯＲ阻害剤を含む併用療法を提供する。薬剤の組合せ（すなわち、ｍＴＯＲ阻害剤およびＪＡＫ阻害剤（例えば、式ＩのＪＡＫ阻害剤））の“有効量”は、併用剤で処置される疾患の臨床的に観察され得る徴候および症状の顕著な改善を提供するのに十分な量である。
【００４７】
“経口投与量形態”は、規定の、または経口投与が意図される単位投与量形態を含む。
【００４８】
ｍＴＯＲ阻害剤／ＪＡＫ阻害剤の併用剤を用いる処置法
本発明は、ＪＡＫ関連疾患、例えば癌、例えば脊髄増殖性新生物の処置法であって、個体にｍＴＯＲ阻害剤およびＪＡＫ阻害剤（例えば、式ＩのＪＡＫ阻害剤）の併用剤を投与することによる諸地方を提供する。
【００４９】
一態様において、本発明は、そのような処置を必要とする個体に治療的有効量または用量の本発明の組合せ剤またはその医薬組成物を投与することにより、対象（例えば、患者）のＪＡＫ関連疾患または障害を処置する方法を提供する。ＪＡＫ関連疾患は、ＪＡＫの過剰発現および／または異常な活性レベルを含む発現または活性に直接または間接的に関連する全ての疾患、障害または病状を含み得る。ＪＡＫ関連疾患はまた、ＪＡＫ活性の調節によって阻止されるか、改善されるか、または治癒され得る全ての疾患、障害または病状を含み得る。
【００５０】
ＪＡＫ関連疾患の例としては、例えば、移植臓器拒絶（例えば、同種異系移植片拒絶および移植片対宿主疾患）を含む免疫系に関連する疾患が挙げられる。
【００５１】
ＪＡＫ関連疾患のさらなる例としては、多発性硬化症、慢性関節リウマチ、若年性関節炎、Ｉ型糖尿病、狼瘡、乾癬、炎症性腸感染、潰瘍性大腸炎、クローン病、重症筋無力症、免疫グロブリン腎症、自己免疫性甲状腺障害などのような自己免疫疾患が挙げられる。いくつかの態様において、自己免疫疾患は、尋常性天疱瘡（ＰＶ）または水疱性類天疱瘡（ＢＰ）のような自己免疫性水疱性皮膚疾患である。
【００５２】
ＪＡＫ関連疾患のさらなる例としては、喘息、食物アレルギー、アトピー性皮膚炎および鼻炎のようなアレルギー状態が挙げられる。ＪＡＫ関連疾患のさらなる例としては、エプスタイン バー ウイルス（ＥＢＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ＨＩＶウイルス、ＨＴＬＶ１ウイルス、水痘−帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）およびヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）のようなウイルス疾患が挙げられる。
【００５３】
ＪＡＫ関連疾患または病状のさらなる例としては、乾癬（例えば、尋常性乾癬）、アトピー性皮膚炎、発疹、皮膚刺激性、皮膚過敏性（例えば、接触皮膚炎またはアレルギー性接触皮膚炎）のような皮膚疾患が挙げられる。例えば、いくつかの医薬を含むある物質は、局所的に適用されたとき、皮膚感作を引き起こすことがある。いくつかの態様において、皮膚疾患は、併用療法の局所投与によって処置される。
【００５４】
さらなる態様において、ＪＡＫ関連疾患は、固形腫瘍（例えば、前立腺癌、腎臓癌、肝癌、膵臓癌、胃癌、乳癌、肺癌、頭頚部の癌、甲状腺癌、膠芽腫、カポジ肉腫、カストルマン病、黒色腫など）、血液の癌（例えば、リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病のような白血病または多発性骨髄腫）、ならびに皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）および皮膚Ｂ細胞リンパ腫のような皮膚癌により特徴付けられるものを含む癌である。皮膚Ｔ細胞リンパ腫の例としては、セザリー症候群および菌状息肉腫が挙げられる。
【００５５】
ＪＡＫ関連疾患は、偽キナーゼドメイン（例えば、ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ）に少なくとも１つの変異を有するもののような変異体ＪＡＫ２の発現により特徴付けられる疾患をさらに含み得る。
【００５６】
ＪＡＫ関連疾患は、真性赤血球増加（ＰＶ）、本態性血小板血症（ＥＴ）、骨髄化生を伴う骨髄線維症（ＭＭＭ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、高好酸球症候群（ＨＥＳ）、全身性肥満細胞症（ＳＭＣＤ）などのような骨髄増殖症候群（ＭＰＤ）をさらに含み得る。
【００５７】
さらに、ＪＡＫ関連疾患は炎症および炎症性疾患を含む。炎症性疾患の例は、眼の炎症性疾患（例えば、虹彩炎、ブドウ膜炎、強膜炎、結膜炎、または関連疾患）、呼吸器官の炎症性疾患（例えば、鼻炎または副鼻腔炎のような鼻および鼻洞を含む上気道の炎症、または気管支炎、慢性閉塞性肺疾患などを含む下気道の炎症）、心筋炎のような炎症性筋疾患、ならびに他の炎症性疾患を含む。
【００５８】
本明細書に記載の併用療法はさらに、虚血再かん流傷害またはストロークもしくは心停止のような炎症性虚血事象と関係する疾患または病状を処置するために使用され得る。本明細書に記載の併用療法はさらに、癌に起因するか、または関連する拒食症、悪液質または疲労を処置するために使用され得る。本明細書に記載の併用療法はさらに、再狭窄、強皮症(sclerodermitis)または繊維症を処置するために使用され得る。本明細書に記載の併用療法はさらに、例えば糖尿病性網膜症、癌または神経変性のような低酸素症またはアストログリア増殖症に関連する病状を処置するために使用され得る。例えば、Dudley, A. C. et al. Biochem. J. 2005, 390(Pt 2):427−36 and Sriram, K. et al. J. Biol. Chem. 2004, 279(19):19936−47. Epub 2004 Mar 2を引用のこと。
【００５９】
真性赤血球増加（ＰＶ）、本態性血小板血症（ＥＴ）および原発性骨髄繊維症（ＰＭＦ）を含む慢性の脊髄増殖性新生物（ＭＰＮ）は、ＰＶ患者の９５％以上およびＥＴまたはＰＭＦ患者の６０％以上で生じる、ヤヌスキナーゼ２（ＪＡＫ２）のエキソン１４におけるＶ６１７Ｆ点変異により特徴付けられる。他のＪＡＫ２エキソン１２の突然変異がＰＶ患者において希に検出されるが、ＭＰＬにおける変異は、ＥＴまたはＰＭＦ患者の５〜１０％で報告されている（Vannucchi AM, Guglielmelli, P, Tefferi, A. Advances in understanding and management of myeloproliferative neoplasms. AC− A Cancer Journal for Clinicians. 2009;59:171−191）。これらの分子異常はすべて、ＪＡＫ／シグナル伝達物質および転写（ＳＴＡＴ）シグナル伝達経路の活性化物質の構成的活性化に関係しており、エリトロポイエチン非依存性の赤血球コロニー（ＥＥＣ）によって例証されるように、変異細胞のサイトカインに対する過敏性およびサイトカイン非依存性の増殖に寄与する。マウスにおけるＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆを過剰発現する造血細胞の移植は、ＰＶ表現型を繰り返すのに十分であり、それはいくつかのモデルにおいて骨髄繊維症に至った。
ＰＶまたはＥＴ表現型を備えるＭＰＮ障害はまた、条件付きノックアウトマウスでも得られた。ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路の調節異常は、固形および血液の癌の発症に関与し、構成的に活性化されたＳＴＡＴ５ＡまたはＳＴＡＴ５Ｂ変異体（ｃａＳＴＡＴ５）は、インビトロおよびインビボで腫瘍形成特性を示す。概して、ＭＰＮのマウスモデルおよび治験における現在の証拠での効果によって支持される通り、ＪＡＫ２はＭＰＮ患者において可能性のある有益な治療標的である（同文献）。
【００６０】
ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）および細胞外シグナルにより調節されたキナーゼ（ＥＲＫ）による他の下流経路の活性化が、ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ変異細胞において実証された。セリン／トレオニンプロテインキナーゼＢ／ＡｋｔはＰＩ３Ｋの下流である。それは、細胞生存、増殖および分化を含む多くの細胞過程の重要な調節因子であり、通常、癌細胞において無調節である。Ａｋｔは、インビトロのＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ変異細胞において、およびＶ６１７Ｆ遺伝子組換えまたはノックインマウスにおいて、構成的に活性化されるが（Akada H, Yan D, Zou H, Fiering S, Hutchison RE, Mohi MG. Conditional expression of heterozygous or homozygous Jak2V617F from its endogenous promoter induces a polycythemia vera−like disease. Blood. 2010;115:3589−3597）、ＭＰＮの病因に対するＰＩ３Ｋ／Ａｋｔシグナル伝達の寄与は、未だにほとんど特徴付けられていない。Ａｋｔは、エリトロポイエチン（ＥＰＯ）受容体のリガンド結合に応答してＰＩ３Ｋによりリン酸化され、活性化されて、正常な赤血球の分化に役割を果たす。特に、Ａｋｔは、ＥｐｏＲの下流メカニズムによって、および少なくとも一部ＧＡＴＡ−１リン酸化と関連して、ＪＡＫ２欠失胎児肝臓始原細胞において赤血球の分化を支持することができる。Ａｋｔは、特にＶ６１７Ｆ同型接合動物において、条件付きＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆノックイン対立遺伝子を有するマウスの骨髄または脾臓由来の赤芽細胞において活性化された。ＳＴＡＴ５およびＡｋｔの同程度の増加したリン酸化が、ＭＰＮ患者の骨髄において、特に巨核球において免疫細胞化学によって実証された。巨核球中のＡｋｔの優先的活性化は、ラパマイシンによるｍＴＯＲシグナル伝達の阻止後のヒト巨核球前駆細胞増殖の強力な阻害と一致し得る。更に、ＪＡＫ／ＳＴＡＴまたはＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路の小分子阻害剤は、培養されたＰＶ始原細胞における自発的、かつＥＰＯにより誘導された赤血球分化の同程度の阻害を引き起こした。
【００６１】
従って、ある態様において、本発明において提供される組合せ剤を用いて処置され得る癌は、骨髄増殖性疾患である。骨髄増殖症候群（ＭＰＤ）（現在、一般に骨髄増殖性腫瘍（ＭＰＮ）と称される）は、造血前駆細胞のクローン性疾患である血液学的悪性腫瘍クラスに分類されている。Tefferi, A. and Vardiman, J. W., Classification and diagnosis of myeloproliferative neoplasms: The 2008 World Health Organization criteria and point−of−care diagnostic algorithms, Leukemia, September 2007, 22: 14−22は、引用によって本明細書中に包含される。それらは、１種またはそれ以上の成熟した骨髄細胞系列細胞型の増強された増殖および生存により特徴付けられる。このカテゴリーは、慢性骨髄白血病（ＣＭＬ）、真性赤血球増加（ＰＶ）、本態性血小板血症（ＥＴ）、原発性または特発性骨髄繊維症（ＰＭＦ）、慢性好中球性白血病、慢性好酸球性白血病、慢性骨髄単球性白血病、若年性骨髄単球性白血病、高好酸球症候群、全身性肥満細胞症、および異型性の慢性骨髄性白血病を含むが、これらに限定されない。Tefferi, A. and Gilliland, D. G., Oncogenes in myeloproliferative disorders, Cell Cycle. March 2007, 6(5): 550−566は、引用によってすべての目的のためにその内容全体を本明細書に完全に包含される。
【００６２】
別の態様において、本発明において提供される併用療法は、原発性骨髄繊維症、真性赤血球増加症後骨髄線維症、本態性血小板血症後の骨髄線維症および第２の急性骨髄性白血病の処置に有用である。
【００６３】
別の態様において、本発明において提供される併用療法は、原発性骨髄繊維症、真性赤血球増加症後骨髄線維症および本態性血小板血症後の骨髄線維症を含む中間リスク群または高リスク群の骨髄繊維症の患者の処置に使用可能である。
【００６４】
いくつかの態様において、処置されるべき対象（例えば、ヒト）は、骨髄増殖症候群のための１種またはそれ以上の治療法に反応しないか、または耐性を有すると決定されている。
【００６５】
特定の態様において、本発明は、処置の必要な対象の骨髄増殖性腫瘍の処置方法であって、該対象にエベロリムスおよび化合物Ａまたはその薬学的に許容される塩を含む組成物の有効量を投与することを含む方法を提供する。
【００６６】
一態様において、本発明は、癌の、例えば原発性骨髄繊維症、真性赤血球増加症後骨髄線維症および本態性血小板血症後の骨髄線維症を含む骨髄増殖性疾患、例えば中間リスク群または高リスク群の骨髄繊維症の処置用薬剤の製造におけるｍＴｏｒ阻害剤およびＪＡＫ阻害剤の使用を提供する。
【００６７】
別の態様において、処置の必要な対象における脊髄増殖性新生物の処置方法であって、該対象にＰＰ２４２および化合物Ａまたはその薬学的に許容される塩を含む組成物の有効量を投与することを含む方法を提供する。
【００６８】
本発明は、疾患に罹患する個体へのｍＴＯＲ阻害剤およびＪＡＫ阻害剤の化合物の有効量を投与することにより、疾患、例えば骨髄増殖症候群を処置する方法を提供する。薬剤の組合せの量は、該疾患を治療するのに有効である。薬剤の組合せの相乗効果について以下のことに注意しなくてはならない：たとえ薬剤の１種またはそれ以上を特定の投与量で単独で投与したとき、有効でなくても、各薬剤を同じ投与量で併用投与したとき、治療は有効である。故に、組合せ剤中の１種またはそれ以上の薬剤の用量は、ＦＤＡが承認した各薬剤の用量未満であってもよい。
【００６９】
投与量
疾患の処置のための薬剤の組合せの至適用量は、公知の方法を用いて各個体用に経験的に決定することができ、疾患の進行の程度、個体の年齢、体重、全身状態、性別および食事、投与時間および経路、ならびに個体が受容している他の薬剤を含むが、これらに限定されない種々の因子によって変わり得る。最適な投与量は、当技術分野において周知の常用試験および手法を用いて確立され得る。
【００７０】
単一の投与量形態を製造するために担体材料と組み合わされ得る薬剤の組合せの量は、投与される個体および特定の投与方法によって変化し得る。いくつかの態様において、本明細書に記載の薬剤の組合せを含む単位投与量形態は、該薬剤が単独で投与されるとき典型的に投与される併用剤の各薬剤の量を含み得る。
【００７１】
投与回数は、用いる化合物および治療または予防されるべき特定の状態によって変わり得る。一般に、有効な治療を提供するのに十分な最小の投与量の使用が好ましい。患者は、一般的に、当業者に周知であり得る、処置または予防されるべき状態に適当なアッセイを用いて、治療有効性を測定され得る。
【００７２】
投与量形態は、製剤化学分野の当業者に容易に明らかな種々の従来の混合法、粉砕法および製造技術によって製造され得る。
【００７３】
薬剤の組合せまたは薬剤の組合せの個々の薬剤を含む経口投与量形態は、マイクロタブレットを内部に含むカプセル、例えばゼラチンカプセルの形態であり得る。これについて、ＣＡＰＳＵＧＥＬ（ファイザーの製品）として公知の硬ゼラチンカプセルのような、医薬製剤中で用いられるようなゼラチンカプセルが使用可能である。
【００７４】
本発明において有用な経口投与量形態の多くは、薬剤の組合せまたは薬剤の組合せの個々の薬剤を粒子状物質の形態で含む。そのような粒子状物質は、圧縮されて錠剤とされ得るか、風味を遮蔽した投与量形態、圧縮コーティング投与量形態もしくは腸溶性投与量形態のようなコーティング投与量形態のコア物質として存在し得るか、またはカプセル、浸透圧ポンプを利用した投与量形態もしくは他の投与量形態中に包含され得る。
【００７５】
本発明の薬剤化合物（例えば、ｍＴＯＲ阻害剤およびＪＡＫ阻害剤）は、１００：１ないし１：１００の範囲の比率で、本明細書に記載された組合せ剤、投与量形態、医薬組成物および医薬製剤中に存在する。例えば、式Ｉの化合物：ｍＴＯＲ阻害剤の比率は、１：１００ないし１：１の範囲、例えば、１：１００、１：９０、１：８０、１：７０、１：６０、１：５０、１：４０、１：３０、１：２０、１：１０、１：５、１：２または１：１であり得る。別の例において、ｍＴＯＲ阻害剤：式Ｉの化合物の比率は、１：１００ないし１：１の範囲、例えば、１：１００、１：９０、１：８０、１：７０、１：６０、１：５０、１：４０、１：３０、１：２０、１：１０、１：５、１：２または１：１であり得る。
【００７６】
毒性なく効果が得られる薬剤化合物の最適比、個々の投与量、併用投与量および濃度は、標的部位への有効成分の利用能の動態に基づき、当業者に公知の方法を用いて決定される。
【００７７】
本発明で提供される医薬組成物または組合せ剤（すなわち、ｍＴＯＲ阻害剤およびＪＡＫ阻害剤（例えば、式ＩのＪＡＫ阻害剤））は、臨床試験で試験され得る。適切な臨床試験は、例えば、増殖性疾患に罹患する患者における非盲検の用量漸増試験であり得る。かかる試験は、本発明の組合せ剤の有効成分の相乗作用を特に証明する。増殖性疾患における有益な効果は、当業者に公知のこれらの試験結果によって直接決定され得る。かかる試験は、特に、有効成分を用いる単独療法および本発明の併用療法の効果を比較するのに適切であり得る。一態様において、ｍＴＯＲ阻害剤化合物、例えばエベロリムス（ＲＡＤ００１）またはＰＰ２４２の用量は、最大許容投与量に達するまで増大され、ＪＡＫ阻害剤（例えば、式ＩのＪＡＫ阻害剤）は固定用量で投与される。あるいは、ＪＡＫ阻害剤（例えば、式ＩのＪＡＫ阻害剤）は固定用量で投与され得て、ｍＴＯＲ阻害剤の用量は増大され得る。患者はそれぞれ、化合物の用量を毎日または断続的に投与される。処置の効果は、かかる臨床試験において、６週ごとの症状スコアの評価によって、例えば１２週、１８週または２４週後に決定され得る。
【００７８】
本発明の併用療法剤の投与は、本発明の組合せ剤に使用される薬学的有効成分のうちの１種のみを用いる単剤療法と比較して、有益な効果、例えば相乗的治療効果、例えば、症状の緩和、進行の遅延または阻止をもたらすだけでなく、さらに驚くべき有益な効果、例えばより少ない副作用、生活の質の向上または罹患率の減少をもたらし得る。
【００７９】
さらなる利点は、本発明の組合せ剤の有効成分のより低用量が使用され得ること、例えば、要される投与量が多くの場合より少ないだけでなく、適用頻度も少なくてよいことであり、それは副作用の発生率または重症度を減少させ得る。このことは、処置されるべき患者の望みおよび要求に合致する。
【００８０】
本発明の１つの目的は、ある量を含む医薬組成物を提供することであって、それが癌、例えば骨髄増殖性疾患を標的とするか、または予防することに共同して治療上有効であり得ることである。この組成物において、ｍＴＯＲ阻害剤およびＪＡＫ阻害剤（例えば、式ＩのＪＡＫ阻害剤）は、１つの組合せ単位投与量形態または２つの別個の単位投与量形態で共に、順に、または別個に投与され得る。単位投与量形態は固定された組合せ剤でもあり得る。
【００８１】
本発明の両化合物の別個の投与、または固定された組合せ剤、すなわち両化合物を含む生薬組成物の投与のための医薬組成物は、それ自体公知の方法で製造され得て、例えば上記の通り、治療上有効な量の少なくとも１つの薬理学的に活性な組合せパートナーを単独で含むか、または例えば経腸もしくは非経口投与に適する１種もしくはそれ以上の薬学的に許容される担体またはビークルと組み合わせて含む、ヒトを含む哺乳動物（温血動物）への経腸投与、例えば経口または直腸投与、および非経口投与に好適な組成物である。
【００８２】
製剤
本発明で提供される併用剤は、医薬製剤の当業者に明白な種々の方法によって剤形化され得る。上記の種々の放出特性は、多数の異なる方法で達成され得る。適切な製剤は、例えば、錠剤、カプセル剤、圧縮コーティング製剤および他の容易に投与される製剤を含む。
【００８３】
適切な医薬製剤は、例えば、約０．１％ないし約９９．９％の有効成分、好ましくは約１％ないし約６０％の有効成分を含み得る。経腸投与または非経口投与用の併用医薬製剤は、例えば糖衣錠、錠剤、カプセル剤もしくは坐剤のような単位投与量形態、またはアンプル剤である。他に特に記載されなければ、これらは、例えば従来の混合、造粒、糖衣、溶解または凍結乾燥法により、それ自体公知の方法で製造される。必要とされる有効量が複数の投与量単位の投与によって到達され得るため、要される各投与量形態の個々の用量に包含される組合せパートナーの単位内容物が、それ自体で有効量を構成する必要がないことが認識され得る。
【００８４】
特に、本発明の組合せ剤の各組合せパートナーの治療的有効量は、同時にまたは連続して、および任意の順で投与され得て、複数の成分が、別個にまたは固定された組合せ剤として投与され得る。例えば、本発明による疾患の処置方法は、（ｉ）遊離形または薬学的に許容される塩形の第一剤、および（ｉｉ）遊離形または薬学的に許容される塩形の第２剤を、同時にまたは任意の順に連続して、合して治療上有効量で、好ましくは、例えば本明細書に記載の量に対応する１日投与量または断続的投与量にて相乗的に有効な量で投与することを含む。本発明の組合せ剤の個々の組合せパートナーは、治療中の異なる時間に別個に、または分割用量もしくは単一の組合せ形態を同時に投与され得る。さらに、用語「投与」はまた、インビボで組合せパートナー自体に変換される組合せパートナーのプロドラッグの使用を含む。故に、本発明は、同時または交互の処置のような全てのレジメンが包含されることが理解され、用語「投与」はそれに従い解釈されるべきである。
【００８５】
本発明の組合せ剤に用いる組合せパートナー各々の有効量は、使用される特定の化合物または医薬組成物により、投与方法、処置される病状、処置される病状の重篤度によって変わり得る。従って、本発明の組合せ剤の投与レジメンは、投与方法ならびに患者の腎機能および肝機能を含む種々の因子によって選択される。当技術分野の臨床医または医師は、病状の進行を緩和するか、対抗するか、または阻止するのに必要とされる単一の有効成分の有効量を容易に決定し、指示することができる。
【００８６】
本明細書に記載の処置にて使用される化合物の好ましい好適な量は、約１ｍｇないし約６００ｍｇであり、好ましくは約３ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、１５ｍｇ、２０ｍｇ、２５ｍｇ、３０ｍｇ、３５ｍｇ、４０ｍｇ、４５ｍｇ、５０ｍｇ、５５ｍｇ、６０ｍｇ、６５ｍｇ、７０ｍｇ、７５ｍｇ、８０ｍｇ、９０ｍｇ、９５ｍｇ、１００ｍｇ、１２０ｍｇ、１４０ｍｇ、１６０ｍｇ、１８０ｍｇ、２００ｍｇ、２２０ｍｇ、２４０ｍｇ、２６０ｍｇ、２８０ｍｇ、３００ｍｇ、３２０ｍｇ、３４０ｍｇ、３６０ｍｇ、３８０ｍｇ、４００ｍｇ、４２０ｍｇ、４４０ｍｇ、４６０ｍｇ、４８０ｍｇ、５００ｍｇ、５２０ｍｇ、５４０ｍｇ、５６０ｍｇ、５８０ｍｇないし約６００ｍｇである。一態様において、ＪＡＫ阻害剤は、５ｍｇ、１０ｍｇ、１５ｍｇ、２０ｍｇまたは２５ｍｇ用量で投与される。
【００８７】
従って、一態様において、本発明は、ｍＴＯＲ阻害剤および式Ｉの化合物を含む組成物を提供する。一態様において、式Ｉの化合物は、（３Ｒ）−３−シクロペンチル−３−［４−（７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］プロパンニトリルまたはその薬学的に許容される塩である。別の態様において、ｍＴＯＲ阻害剤は、エベロリムス（ＲＡＤ００１）または２−（４−アミノ−１−イソプロピル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−３−イル）−１Ｈ−インドール−５−オール（ＰＰ２４２）である。さらに別の態様において、組成物はさらに薬学的に許容される担体を含む。
【実施例】
【００８８】
実施例
本発明は、以下の実施例によってさらに説明される。実施例はさらに限定するものとして解釈されるべきではない。
【００８９】
ｍＴＯＲシグナル伝達を標的とする薬剤が、ＭＰＮの種々の細胞モデルにおいてサイトカインにより誘導される細胞増殖およびサイトカイン非依存性の細胞増殖を阻止し、ＪＡＫ１／ＪＡＫ２阻害剤またはインターフェロンαでの同時処置が、相乗効果をもたらしたという証拠を以下に示す。これらの発見は、脊髄増殖性新生物の処置におけるＡｋｔ／ｍＴＯＲを標的とする有効性を探索するための論理的根拠を提供する。
【００９０】
方法および材料
反応材
ＲＡＤ００１（ｍＴＯＲの特定のアロステリック阻害剤）、ＰＰ２４２（ｍＴＯＲのＡＴＰ領域阻害剤）およびヒドロキシ尿素は、Sigma−Aldrich (St. Louis, Germany)から入手した。インターフェロン−αはPegasysから入手した。ｐｈｏｓｐｈｏ（ｐ）−ＳＴＡＴ５（Ｔｙｒ６９４）、ＳＴＡＴ５、ｐ−４ＥＢＰ１（Ｔｈｒ７０）、４ＥＢＰ１、ｍＴＯＲ、ｐ−ＪＡＫ２（Ｔｙｒ１００７／１００８）およびＪＡＫ２に対する抗体は、Cell Signaling Technology (Danvers, MA, US)から入手した。抗ヒトチューブリン抗体は、Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, US)から入手した。組換えヒトＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦ、ＳＣＦおよびＥＰＯは、Miltenyi Biotec (Gladbach, Germany)から購入した。ｍＴＯＲに対するｓｉＲＮＡは、Dharmacon siGENOME Smart pool (Thermo Scientific, Waltham, MA, US)から入手した。siGENOME Non−Targeting siRNA Pool＃1 (Thermo Scientific)を、陰性対照として用いた。
【００９１】
細胞株および細胞培養
ＨＥＬ、ＳＥＴ２およびＫ５６２ヒト細胞株を、German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ, Braunschweig, Germany)から購入した。ＪＡＫ２野生型（ｗｔ）またはＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆを発現するマウスＢａＦ／３およびＢａＦ／３−ＥＰＯＲ細胞は、R. Skoda (Basel, Switzerland)によって提供された。細胞株を、１０％のウシ胎仔血清(FBS; Lonza, Belgium)(SET2細胞用に２０％)、抗生物質およびＬ−グルタミンを添加したＲＰＭＩ１６４０中で培養した。ｍＩＬ−３およびＥＰＯを、ＪＡＫ２ ＷＴ ＢａＦ／３およびＢａＦ／３−ＥＰＯＲ細胞の培地にそれぞれ加えた。
【００９２】
ヒト細胞
末梢血（ＰＢ）または骨髄（ＢＭ）試料は、Azienda Ospedaliera−Universitaria Careggiの施設内治験審査委員会によって承認されたプロトコールにより、ＰＶまたはＰＭＦを有すると診断された患者（２００８年のＷＨＯ基準）から、インフォームド・コンセントを得た後に得られた。造血幹細胞の健康な提供者は、過剰なＣＤ３４＋細胞を提供するためにインフォームド・コンセントを提供した。研究はヘルシンキ宣言で述べられた法則に従って行なわれた。ＣＤ３４＋細胞は、本明細書に記載の通りに免疫磁気的（immunomagnetically）に選択した。ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆの変異状態を、顆粒球中の定量的リアルタイムＰＣＲ分析によって決定した。
【００９３】
増殖阻害アッセイ、クローン形成阻害アッセイおよびアポトーシスまたは細胞周期阻害アッセイ
細胞（２ｘ１０４）を、増加濃度の薬剤を含む９６ウェル培養組織プレート中にトリプリケートで播種した。生細胞を、ＷＳＴ−１アッセイ(Roche, USA)を用いて評価し、等量のビークル（ＤＭＳＯ）のみを含むウェルに標準化した。増殖の５０％阻害が生じた濃度（ＩＣ５０）を、Origin software (V 7.5, OriginLab Northampton, MA)を用いて計算した。いくつかの実験において、クローン形成試験も用いた。細胞（５ｘ１０３）を、ＦＢＳを添加した０．５％寒天培地中に播種し、可変量の薬剤（または、対照プレート中の等量のビークル）を、培養の初めに一度に添加した。コロニーを、７日間のインキュベーション後に倒立顕微鏡で数えた。アポトーシス細胞の定量化を、Annexin−V−FLUOS Staining kit (Roche)を用いて、フローサイトメトリー法によって行った。少なくとも２０，０００事象が得られた。フローサイトメトリー法による細胞周期分配分析については、１ｘ１０６細胞を、エタノール９５％、リボヌクレアーゼ１０μｇ／ｍＬおよびヨウ化プロピジウム５０ｍｇ／ｍＬで処理した。
【００９４】
ヒト造血前駆細胞のコロニーアッセイおよびコロニー遺伝子型決定
ＭＰＮ患者または対照患者由来のＢＭ単核細胞を、ＢＦＵ−ＥおよびＣＦＵ−ＧＭの増殖のためにＳＣＦ ５０ｎｇ／ｍＬ、ＩＬ−３ １０ｎｇ／ｍＬ、ＩＬ−６ １０ｎｇ／ｍＬ、ＧＭ−ＣＳＦ １０ｎｇ／ｍＬ、Ｇ−ＣＳＦ １０ｎｇ／ｍＬ、およびのＥＰＯ ３Ｕ／ｍＬを添加したメチルセルロース(MethoCult; StemCell Technologies, Vancouver, Canada)中に１ｘ１０５／ｍＬで播種した。ＥＥＣアッセイを、ＥＰＯ(StemCell Technol., cat. No.＃04531)無添加白血球調整培地を含むメチルセルロース中にＰＶ患者由来の２．５ｘ１０５／ｍＬ ＰＢ単核細胞を播種することにより行った。ＣＦＵ−Ｍｋの増殖について、５ｘ１０４／ｍＬ ＣＤ３４＋細胞を、トロンボポイエチン ５０ｎｇ／ｍＬ、ＩＬ−３ １０ｎｇ／ｍＬ、ＩＬ−６ １０ｎｇ／ｍＬを添加した脂質(StemCell Technol.)を含むMegacult Collagen培地中に播種した。コロニーを、標準的基準に従い１４日目に数えた。
【００９５】
ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ単一コロニー遺伝子型決定については、アレル特異的ＰＣＲアッセイを用いた。十分に分離されたコロニー（１点当たり少なくとも４０コロニー）を、５μＬのＤＮase／リボヌクレアーゼ不含有水中の半固形培地から個々に取り出し、５分間９５℃で溶解し、ＰＣＲ増幅およびゲル電気泳動を行った。
【００９６】
細胞溶解およびＳＤＳ−ＰＡＧＥウェスタンブロッティング
細胞を、標準プロトコールに従って、プロテイナーゼ阻害剤カクテル(Halt Protease Inhibitor Cocktail Kit, PIERCE, Rockford, IL, US)を含む、ＲＩＰＡ溶解バッファー（50mM pH 7.4のトリス−HCl、150mM NaCl、1％ NP−40、1mM EDTA）中に再懸濁し、ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動分離を行い、Immunoblot PVDF膜(BioRad, Hercules, CA, US)上でウェスタンブロティングした。膜を、一次抗体でプローブ化し、次いでウサギで製造したホースラディッシュペルオキシダーゼ接合型抗免疫グロブリン抗体（Sigma−Aldrich）でプローブ化した。免疫反応性タンパク質を、Image Quant 350 apparatus (GE Healthcare, Little Chalfont, UK)を用いてＥＣＬで暴露した。
【００９７】
ＲＮＡ単離およびリアルタイム定量的ＰＣＲ（ＲＴＱ−ＰＣＲ）
合計ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ(Invitrogen−Life Technologies, Paisley, UK)を用いて精製し、ＲＮＡ濃度および純度／完全性を、NanoDrop ND−1000 spectrophotometer (NanoDrop Techn., Wilmington, DE, USA)で決定した。１μｇのＲＮＡを、High Capacity cDNA Archive Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA)を用いて逆転写した。ＲＴ−ＱＰＣＲ反応を、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７３００ ＨＴおよびTaqMan（登録商標）Gene Expression Assays (Applied Biosystems)を用いてTaqMan Universal PCR Master Mixでトリプリケートで行った。遺伝子発現解析を、ハウスキーピング遺伝子(ΔＣＴ)としてＶＩＣ標識したＲＮａｓｅＰプローブを用いて、相対的定量法であるComparative cycle threshold (CT)法（ＣＴ）を用いて達成した。
【００９８】
細胞トランスフェクション
指数関数的増殖するＨＥＬ細胞を、Amaxa kit Rを用いて、Amaxa Nucleofector (Amaxa Biosystems, Gaithersburg, MD, USA)中でｓｉＲＮＡを用いてエレクトロポレーションした。簡単には、０．１ｍＬ容量中の２ないし５ｘ１０６細胞に１μＭ ｓｉＲＮＡをトランスフェクトし、直ちに予め温めた培地を含む２４ウェルプレートに移した。トランスフェクション効率および細胞生存率を、ｐｍａｘＧＦＰ（登録商標）(Amaxa Biosystems)を備えるフローサイトメトリーによって評価し、その結果、常に８５％以上であった。
【００９９】
統計的手法
グループ間の比較を、ＳＰＳＳ(StatSoft, Inc., Tulsa, OK)またはOriginソフトウェアを用いて、必要に応じてMann−Whitney U または Fisher testによって行った。両側検定からの有意水準はＰ＜０．０５であった。２つの薬剤の間の相互作用の指標である組合せ指数（ＣＩ）を、ＣａｌｃｕＳｙｎソフトウェアを用いて、ChouおよびTalalay法の半有効原理に基づき計算した。この式に従い、ＣＩ＜１のとき、２剤の相互作用は相乗的であり、ＣＩ＝１のとき、相互作用は付加的であり、ＣＩ＞１のとき、相互作用は拮抗的であると見なされる。
【０１００】
結果
ｍＴＯＲ阻害剤は、ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ突然変異細胞株の増殖を阻止する
ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ変異ヒト白血病細胞株がｍＴＯＲ阻害に感受性であったかどうかを確認するために、選択的アロステリックｍＴＯＲ阻害剤ＲＡＤ００１、およびｍＴＯＲの活性部位のＡＴＰ拮抗阻害剤（ＰＰ２４２）を用いた。ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ変異ＨＥＬおよびＳＥＴ２細胞が、対照として用いたＢＣＲ／ＡＢＬ陽性Ｋ５６２細胞と少なくとも同程度ｍＴＯＲ阻害に感受性であったことが見出された。ＩＣ５０値を表１に示す。ＪＡＫ２野生型マウスＩＬ−３依存性（Ｂａ／Ｆ３）もしくはＥＰＯ依存性（Ｂａ／Ｆ３−ＥＰＯＲ）細胞またはサイトカイン非依存性ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ対照におけるｍＴＯＲ阻害剤の効果を調べた。Ｖ６１７Ｆ Ｂａ／Ｆ３細胞が、培地中ＩＬ−３存在または不存在下でＪＡＫ２ ｗｔ対照よりもＲＡＤ００１により感受性であったことが見出された。同様に、Ｂａ／Ｆ３−ＥＰＯＲ細胞において、Ｖ６１７Ｆ変異細胞のＩＣ５０は、ＪＡＫ２ ｗｔ細胞のＩＣ５０＞１０，０００ｎＭと比較して、ＥＰＯ不存在および存在下でそれぞれ６５１ｎＭおよび１，２１３ｎＭであった。ＰＰ２４２は同様に有効であった。Ｖ６１７Ｆ  Ｂａ／Ｆ３細胞において、ＩＣ５０は、ＩＬ−３不存在または存在下でそれぞれ８００ｎＭおよび１，６００ｎＭであるのに対し、野生型細胞において３，４００ｎＭであった。ｗｔ  Ｂａ／Ｆ３−ＥＰＯＲ細胞において、ＩＣ５０は５，９３１ｎＭであったのに対して、ＥＰＯを添加した、または添加しないＶ６１７Ｆ細胞において、それぞれ５００ｎＭおよび７５０ｎＭであった（表１）。それらのＩＣ５０濃度において、ＲＡＤ００１およびＰＰ２４２（図示せず）は、細胞周期のＧ０／Ｇ１期にＳＥＴ２細胞およびＨＥＬ細胞を細胞周期停止させた（図１Ａ）。一方、ＲＡＤ００１での処理は、細胞死を引き起こすのに大部分は効果がなかったが、ＰＰ２４２は、用量依存的ではあるが、ＳＥＴ２細胞（図１Ｂ）またはＨＥＬ細胞（図示せず）において最も高濃度で細胞アポトーシスを促進した。細胞増殖の阻害に加えて、ＲＡＤ００１がＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ変異ＨＥＬ、ＳＥＴ２およびＵＫＥ−１細胞のクローン形性能をＫ５６２より効率よく阻止したことが見出された。また、Ｖ６１７Ｆ Ｂａ／Ｆ３細胞によるコロニー形成は、野生型対照（データ非表示）よりも、培地中のサイトカインに関係なく顕著に低いＲＡＤ００１濃度で阻害された。全体として、これらのデータは、ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ変異細胞が、ｍＴＯＲ阻害に一様に感受性であることを示し、細胞増殖の抑制がアポトーシスの結果ではなく主として細胞増殖抑制性を反映することを示唆する。
【０１０１】
次に、ｍＴＯＲ阻害剤によって引き起こされた細胞増殖の阻害機序を、ＪＡＫ１／ＪＡＫ２阻害剤化合物Ａおよびヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤Ｐａｎｏｂｉｎｏｓｔａｔのそれと比較した。それらの分子は全て、Ｋ５６２細胞で測定されたものより顕著に低いＩＣ５０濃度で、ＨＥＬおよびＳＥＴ２細胞において増殖を阻害した（表１）。しかしながら、ｍＴＯＲ阻害剤と異なり、それらは、細胞アポトーシスの用量依存的に強力な誘導剤であった（図１Ｃ、Ｄ）。ＨＥＬ（ＩＣ５０＝４１０μＭ）およびＳＥＴ２（ＩＣ５０＝３３０μＭ）細胞は、Ｋ５６２細胞（ＩＣ５０＝４，９１０μＭ）よりも、リボヌクレオシド2リン酸還元酵素を阻害するヒドロキシ尿素により感受性であった（表１）。ヒドロキシ尿素は用量依存的に細胞アポトーシスを引き起こした（図１Ｅ）。
【０１０２】
ＪＡＫ１／ＪＡＫ２阻害剤の効果はまた、薬剤感受性へのサイトカイン暴露の影響を利用するために、Ｂａ／Ｆ３細胞において評価された。Ｖ６１７Ｆ Ｂａ／Ｆ３およびＢａ／Ｆ３−ＥＰＯＲ細胞が、それらの野生型対照（化合物Ａに対して、それぞれ１，６００ｎＭまたは４５７ｎＭ）と比較して、化合物Ａにより感受性であったことが見出された（それぞれ、ＩＣ５０＝３４ｎＭおよび２２０ｎＭ）。しかしながら、培地への適当なサイトカインの添加は、Ｖ６１７Ｆ変異細胞におけるＪＡＫ１／ＪＡＫ２阻害剤の優先的増殖阻害効果を阻止した（Ｂａ／Ｆ３細胞における化合物ＡについてのＩＣ５０＝１６００ｎＭ；Ｂａ／Ｆ３−ＥＰＯＲ細胞における化合物ＡについてのＩＣ５０＝５２１ｎＭ）（表１）。
【０１０３】
全体として、これらのデータは、ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ白血病細胞株におけるＪＡＫ１／ＪＡＫ２阻害剤およびＨＤＡＣ阻害剤の増殖阻害活性が細胞アポトーシスによって広く調節されることを示す。さらに、サイトカインがＪＡＫ１／ＪＡＫ２阻害剤に対する細胞感受性を顕著に低減させたことが確認された。
【０１０４】
図１は、ＳＥＴ２細胞またはＨＥＬ細胞における細胞アポトーシスおよび細胞周期に対する、選択されたｍＴＯＲ阻害剤、ＪＡＫ１／ＪＡＫ２阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤およびヒドロキシ尿素の作用を示す。パネル（Ｂ）から（Ｅ）中、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ陽性のアポトーシス細胞の割合は、可変量のｍＴＯＲ阻害剤ＲＡＤ００１またはＰＰ２４２（Ｂ）、ＪＡＫ１／ＪＡＫ２阻害剤化合物Ａ（Ｃ）、ＨＤＡＣ阻害剤Ｐａｎｏｂｉｎｏｓｔａｔ（Ｄ）またはヒドロキシ尿素（Ｅ）へ４８時間暴露されたＳＥＴ２細胞のフローサイトメトリーによって測定された。結果は、ビークル（ＤＭＳＯ）のみを含む対照ウェルと比較した、生細胞の割合として表す。壊死細胞画分を、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ／ヨウ化プロピジウムに二重陽性の細胞として同定した。３つの同様の実験の１つの代表。＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１。
【０１０５】
表４は、ｍＴＯＲ阻害剤ＲＡＤ００１またはＰＰ２４２およびＪＡＫ１／ＪＡＫ２阻害剤化合物ＡによるＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ変異細胞株のクローン形成増殖の阻害を示す。ヘテロ接合（ＳＥＴ−２）または同型接合体（ＨＥＬ）のいずれかのＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ変異ヒト起源細胞株、ならびにＢＣＲ／ＡＢＬ変異Ｋ５６２細胞株（対照として使用）を、増大濃度のＲＡＤ００１、ＰＰ２４２または化合物Ａに暴露した。１０３細胞を、可変量の薬剤が存在する寒天培地中に播種した。コロニーを７日目に数え、ビークルを含む対照プレート中で増殖したコロニー数の割合として表した。ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆを過剰表現するマウスＢａＦ／３細胞を、ＲＡＤ００１、ＰＰ２４２または化合物Ａに同様に露出し、野生型細胞（ｗｔ）と比較した。インターロイキン３（１０ｎｇ／ｍＬ）を培地に添加するか、または添加しなかった。示されたＩＣ５０値は、少なくとも３つの独立した実験の平均±ＳＤである。
【０１０６】
ｍＴＯＲ阻害剤は、ｍＴＯＲ経路の下流シグナルを低減させ、ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ変異細胞株中においてＳＴＡＴ５リン酸化を減少させる
モデルとしてＳＥＴ２細胞を用いるＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ変異細胞のシグナル伝達に対するｍＴＯＲ阻害の影響を、次のとおりに調べた（図２）。ＲＡＤ００１およびＰＰ２４２での処理が、ｍＴＯＲ標的４Ｅ−ＢＰ１、および予期せずＳＴＡＴ５のリン酸化を用量依存的に減少させたが、リン酸化されたＪＡＫ２および総ＪＡＫ２は影響を受けなかったことが観察された。それと比較して、ＪＡＫ１／ＪＡＫ２阻害剤化合物Ａは、４ＥＢＰ１に影響はなかったが、ＪＡＫ２およびＳＴＡＴ５のリン酸化を顕著に用量依存的に減少させた。ＨＤＡＣ阻害剤ｐａｎｏｂｉｎｏｓｔａｔは、リン酸化されたＪＡＫ２および総ＪＡＫ２、リン酸化されたＳＴＡＴ５を用量依存的に減少させ、リン酸化された４Ｅ−ＢＰ１に対する適度の作用を示した。反対に、ヒドロキシ尿素は、４ＥＢＰ１またはＳＴＡＴ５のレベルまたはリン酸化状態に影響を与えなかった。
【０１０７】
ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ変異およびｍＴＯＲ活性化の相関関係、ならびにＳＴＡＴ５リン酸化に対するｍＴＯＲ阻害がもたらす結果をより特徴付けるために、ＢＡ／Ｆ３およびＢａ／Ｆ３−ＥＰＯＲ細胞を用いた。初めに、４Ｅ−ＢＰ１がサイトカインを除去したＪＡＫ２ ｗｔ Ｂａ／Ｆ３細胞およびＢａ／Ｆ３−ＥＰＯＲ細胞においてわずかにリン酸化されるが、Ｖ６１７Ｆ細胞においては高リン酸化されたことが観察去れ、このことは、ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ変異細胞におけるＡｋｔ構成的活性化に関する既存データを支持する。サイトカインの添加は、ＪＡＫ２ ｗｔ、Ｖ６１７Ｆ変異Ｂａ／Ｆ３細胞およびＢａ／Ｆ３−ＥＰＯＲ細胞（データ非表示）において増加した４Ｅ−ＢＰ１リン酸化をもたらした。ＲＡＤ００１と共に培養された細胞において、４Ｅ−ＢＰ１リン酸化の顕著な阻害が起こり（データ非表示）、少なくとも２４時間まで持続した（データ非表示）。ＳＴＡＴ５リン酸化は、ＩＬ−３またはＥＰＯ欠失ＪＡＫ２ ｗｔ Ｂａ／Ｆ３またはＢａ／Ｆ３−ＥＰＯＲ細胞と比較して、Ｖ６１７Ｆ細胞においてより増加し、それはサイトカイン暴露後に顕著に増加した。ＳＴＡＴ５リン酸化は、４ＥＢＰ１に対する影響を反映して、顕著に下方制御された。阻害は、６０分で既に明らかであったが、２４時間まで維持された（非表示）。
【０１０８】
ＳＴＡＴ５リン酸化の減少が、ＳＴＡＴ５リン酸化に対するＲＡＤ００１の直接的影響に起因するよりも、ｍＴＯＲ阻害によって実際に仲介されることを確認するために、ｍＴＯＲをＨＥＬ細胞の特異的ｓｉＲＮＡにより遺伝子サイレンシングさせた。ｓｉＲＮＡ処理は２４時間でｍＴＯＲレベルを５０ないし６０％に減少させたが、リン酸化された４Ｅ−ＢＰ１のレベルは、無関係な対照ｓｉＲＮＡで処理した細胞と比較して劇的に減少した。総４Ｅ−ＢＰ１タンパク質含有量は全く変わらなかった（データ非表示）。４８時間で、ｍＴＯＲおよびリン酸化された４Ｅ−ＢＰ１の両方がわずかに検出可能であった。同時に、リン酸化されたＳＴＡＴ５のレベルは、対照と比較して、ｍＴＯＲ特異的ｓｉＲＮＡを遺伝子導入された細胞において２４から４８時間で顕著に減少されたことが見出された。総ＳＴＡＴ５濃度は変化しなかった。
【０１０９】
図２は、ＳＥＴ２細胞におけるｍＴＯＲおよびＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達に対する選択されたｍＴＯＲ阻害剤、ＪＡＫ１／ＪＡＫ２阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤およびヒドロキシ尿素の作用を示す。ＳＥＴ２細胞を増加濃度の薬剤で２４時間インキュベートし、合計およびリン酸化されたＪＡＫ２、ＳＴＡＴ５および４ＥＢＰ１のレベルを、ウエスタンブロットによって分析した。チューブリンを、充填標準化に用いた。示した結果は、異なる薬剤の２〜４つの同様の実験の代表例である。
【０１１０】
ＲＡＤ００１またはＰＰ２４２と化合物Ａとの併用は、ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ白血病細胞株増殖およびコロニー形成の相乗的阻害をもたらす
ＳＥＴ２およびＶ６１７ＦのＢａ／Ｆ３−ＥＰＯＲ細胞におけるｍＴＯＲおよびＪＡＫ１／ＪＡＫ２の同時阻害の影響を、増殖阻害作用の測定により評価した。細胞を異なる濃度のＲＡＤ００１またはＰＰ２４２を用いてインキュベートした。これらの薬剤の併用によって、０．１２ないし０．４４の範囲の組合せ指数（ＣＩ）が測定され、２つの薬剤の強い相乗的活性が示唆された（表３）。
【０１１１】
ＳＥＴ２およびＢａ／Ｆ３ ｅｐｏＲ Ｖ６１７Ｆ細胞を用いるさらなる実験が、クローン形成寒天培地アッセイにて行なわれた（表５）。０．２２から０．８１の範囲のＣＩがこれらの培養にて測定され、該薬剤の相乗作用が再び示された。
【０１１２】
ＲＡＤ００１またはＰＰ２４２と化合物Ａとの併用は、ＥＥＣコロニー形成アッセイにおいてＭＰＮに罹患する患者由来の造血前駆細胞の相乗的阻害作用をもたらす
ＭＰＮ患者由来の白血病細胞の増殖がｍＴＯＲおよびＪＡＫ経路の同時標的化に影響を受けるかどうかを決定するために、ＰＶに罹患する患者由来のＰＢＭＣを、ＥＥＣアッセイにおいて、増加濃度のＲＡＤ００１、ＰＰ２４２、化合物Ａ、またはＲＡＤ００１もしくはＰＰ２４２および化合物Ａの併用にてインキュベートした。ＰＶ患者からの末梢血単核細胞を、一定量のＲＡＤ００１、ＰＰ２４２および／または化合物Ａの不存在または存在下で、ＥＥＣ増殖用のＥＰＯ不含有メチルセルロース培地中で培養した。ＥＥＣを１２日目にスコア計数し、ビークルのみを含む対照プレートで測定されたコロニー数の割合として表した。＊、Ｐ＜０．０５、＊＊、Ｐ＜０．０１。表６に記載の結果は、これらの培養における０．２および０．２６のＣＩを示し、このことは、ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ細胞増殖の阻害におけるｍＴＯＲおよびＪＡＫ阻害剤の相乗作用をさらに実証している。
【０１１３】
考察
ＭＰＮ関連ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ変異は、ＪＡＫ２／ＳＴＡＴ経路の構成的活性化を決定付ける。ＪＡＫ２阻害剤は、インビトロでＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ変異細胞の増殖を減少させ、ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ形質転換動物における骨髄増殖性（myeloproliferation）を軽減し (Liu PC, Caulder E, Li J, et al. Combined inhibition of Janus kinase 1/2 for the treatment of JAK2V617F−driven neoplasms: selective effects on mutant cells and improvements in measures of disease severity. Clin Cancer Res. 2009;15:6891−6900)、骨髄繊維症に罹患する患者(Verstovsek S, Kantarjian H, Mesa RA, et al. Safety and efficacy of INCB018424, a JAK1 and JAK2 inhibitor, in myelofibrosis. N Engl J Med. 2010;363:1117−1127)またはヒドロキシ尿素耐性ＰＶもしくはＥＴ患者における測定可能な臨床的改善を生じる。しかしながら、ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ負荷の変化は大きくなく、分子的寛解は未だ報告されていない。さらに、ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆノックインマウスにおける疾患起因細胞増殖は、ＪＡＫ２阻害剤ＴＧ１０１３４８での処置に影響を受けなかった。全体として、これらの観察は、ＭＰＮクローンの効果的標的化は、利用可能なＪＡＫ２阻害剤を用いて達成され得ない可能性を示す。故に、変異細胞の増殖調節異常に伴う細胞シグナル伝達のより詳細な知見が、より有効な治療戦略を設計するために望ましい。この観点で、個々の薬剤と比較して、ＨＤＡＣｉ パノビノスタットおよびＪＡＫ２阻害剤ＴＧ１０１２０９の併用処置が、ヒトおよびマウスＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ変異細胞におけるＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達の顕著な減少、ならびにＭＰＮ ＣＤ３４＋細胞に対する増加した細胞毒性を決定付けたことが示された。
【０１１４】
本研究は、ＰＩ３ｋ／Ａｋｔ経路の重要な下流標的であるラパマイシンの哺乳動物標的（ｍＴＯＲ）に注目してなされた。セリン／トレオニンキナーゼであるｍＴＯＲは、細胞代謝、生存、生長、増殖および自食作用の中心的調節因子として働く。ｍＴＯＲは、ラパマイシンに次いで発見されたメンバーであるラパログと称される分子ファミリーにより阻害され、それらは、癌の治験において最近使用されている。ｍＴＯＲは、２種の複合体、ＴＯＲＣ１およびＴＯＲＣ２で存在する。raptorと共に形成されるＴＯＲＣ１は、cap依存性のｍＲＮＡ翻訳のレベルを調節し、真核生物翻訳開始因子４Ｅ結合蛋白質１（４Ｅ−ＢＰ１）およびＳ６キナーゼ１（Ｓ６Ｋ１）のようなエフェクターをリン酸化する。次いで、リン酸化された４Ｅ−ＢＰ１は、真核生物翻訳開始因子４Ｅ（ｅＩＦ４Ｅ）への結合阻害をもたらし、サイクリンＤ１、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ＸＬ、および血管内皮細胞増殖因子を含むいくつかの遺伝子の翻訳活性化を妨げる。他方、Ｓ６Ｋ１は、ｅＩＦｅ４、ｍＴＯＲ、真核生物翻訳開始因子４Ｂおよび伸長因子−２キナーゼのような重要な標的のリン酸化により細胞増殖を制御する。ｅＩＦ４ＥおよびＳＫ１は両方とも、細胞形質転換に関与しており、いくつかの予後不良の癌において過剰発現されている。ＴＯＲＣ１のさらなる構成成分は、哺乳動物ＬＳＴ８／Ｇタンパク質βサブユニット様タンパク質（ｍＬＳＴ８／ＧβＬ）ならびに最近同定されたパートナーであるＰＲＡＳ４０およびＤＥＰＴＯＲを含む。ｍＴＯＲはまた、ｍＴＯＲＣ２においてＲｉｃｔｏｒとも結合され、ｍＴＯＲＣ２は大部分がラパマイシン非感受性であり、ＧβＬおよび哺乳動物ストレス活性化プロテインキナーゼ相互作用タンパク質１（ｍＳＩＮ１）からなる。ＴＯＲＣ２は、Ｓｅｒ４７３でのＡｋｔのリン酸化に関与する。ＲＡＤ００１は、ｍＴＯＲＣ１およびｍＴＯＲＣ２の両方の阻害によって白血病細胞における強力に阻害されたＡｋｔ活性が報告されているが、ｍＴＯＲＣ２からＡｋｔまでのこのネガティブフィードバックループは、いくつかの例において、悪化した腫瘍進行をもたらす。ＲＡＤ００１のようなアロステリックなｍＴＯＲ阻害剤の可能性のある制限および欠点を克服するために、ｍＴＯＲ ＡＴＰ活性部位の競合阻害剤として作用する新規分子が開発されている。これらのうちの１つであるＰＰ２４２は、ＴＯＲＣ１およびＴＯＲＣ２仲介活性の両方を強力に抑制し、白血病細胞に対する有力な細胞毒性を及ぼした。ＲＡＤ００１およびＰＰ２４２を、ＭＰＮの治療標的としてのｍＴＯＲの推定上の役割をインビトロで調査するために使用した。
【０１１５】
初めに、ｍＴＯＲ阻害剤が、対照細胞より顕著に低い薬剤濃度でＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ変異ヒトおよびマウス白血病細胞株の細胞増殖の停止を促進したことが実証された（表１）。反対に、ＲＡＤ００１は、細胞死を誘導しなかったが、ＰＰ２４２は、最高濃度で細胞アポトーシスを引き起こした。故に、これらの実験設定において、ｍＴＯＲ阻害剤は主として細胞増殖抑制性である。この作用機序は、すべて強力に細胞アポトーシスを引き起こしたＪＡＫ１／ＪＡＫ２阻害剤化合物ＡおよびＨＤＡＣ阻害剤パノビノスタットとは異なっていた（図１）。他方、ｍＴＯＲ阻害剤によって引き起こされる細胞増殖抑制が、ＪＡＫ１／ＪＡＫ２阻害剤の場合と異なり、Ｂａ／ＦＥおよびＢａ／Ｆ３−ＥＰＯＲ細胞のサイトカイン暴露に続くＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路の最大活性により影響を受けなかったことが実証された。後の観察は、ＰＶ患者由来の赤血球前駆細胞のＪＡＫ２阻害剤への感受性が、培地へのＥＰＯの添加によって抑制されたという証明が発表され、このことは、ＲＡＤ００１による細胞増殖阻害の基礎となる機序がサイトカイン誘導性ＪＡＫ／ＳＴＡＴ活性に少なくとも一部非依存的であることが間接的に示唆する。Ｖ６１７Ｆコロニー数が野生型コロニー数よりも平均３９％減少したため、ＲＡＤ００１が、ＰＶに罹患する患者における野生型前駆細胞よりも変異ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆに対してより選択的であったことが証明された（表２）。
【０１１６】
ＲＡＤ００１のアポトーシス促進作用よりも一般的な抗増殖作用が、いくつかの他の癌細胞で実証されており、優先的にアポトーシスを誘導する薬剤との併用療法の論理的根拠を示している。これを踏まえて、ｍＴＯＲおよびＪＡＫ１／ＪＡＫ２阻害剤をインビトロで組み合わる効果が調べられ、白血病細胞株の増殖（表３）およびクローン形成可能性（表５）の阻害に関する顕著な相乗作用の証拠が得られた。加えて、ＭＰＮ患者由来の前駆細胞による造血細胞コロニーの形成は、ＲＡＤ００１またはＰＰ２４２とＪＡＫ１／ＪＡＫ２阻害剤化合物Ａとを組み合わせることにより相乗的に阻害された（表６）。
【０１１７】
重要なシグナル伝達分子の分析は、ＲＡＤ００１およびＰＰ２４２は下流標的の４ＥＢＰ１のリン酸化を阻害するが、ＪＡＫ１／ＪＡＫ２阻害剤およびＨＤＡＣ阻害剤はＪＡＫ２およびＳＴＡＴの両方のリン酸化を減少したことを示した。ＨＤＡＣ阻害剤はまた、総ＪＡＫ２の発現を減少させたことを特記する（図２）。興味深い観察は、ＲＡＤ００１およびＰＰ２４２によるｍＴＯＲ阻害が、ＳＴＡＴ５リン酸化の顕著な減少に関係したということであり、それは減少した総ＳＴＡＴ５タンパク質含有量によって説明がつかなかった。ｍＴＯＲとＳＴＡＴ５との間のこの正のフィードバックは、ｍＴＯＲに対する特異的阻害ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を使用する４Ｅ−ＢＰ１およびＳＴＡＴ５リン酸化の同時減少を証明することにより実証された（データ非表示）。ＲＡＤ００１によって仲介されるＳＴＡＴ５リン酸化の阻害の程度は、４Ｅ−ＢＰ１リン酸化に影響しなかったＪＡＫ１／ＪＡＫ２阻害剤での阻害よりはるかに低く、これは、ＭＰＮ細胞におけるｍＴＯＲ活性化が大部分はＪＡＫ２非依存的であり得ることを示唆している。一方、ＨＤＡＣ阻害剤は、４ＥＢＰ１のリン酸化のわずかな阻害が証明されたが、我々は、現在のデータからこの結果が直接的であったか、または間接的であったかどうか結論付けることができない。全体として、これらの観察は、ＪＡＫ２およびｍＴＯＲにより開始されるシグナル伝達を標的化することによりＳＴＡＴ５リン酸化が影響を受け得ることを示唆する。この点で、受容体チロシンキナーゼ／ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔシグナル伝達によるＳＴＡＴ３のラパマイシン感受性活性化は、いくつかの癌細胞、およびマウス腫瘍またはヒト腫瘍において証明されている。
【０１１８】
表１．ヒトおよびマウスＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ変異およびＪＡＫ２野生型対照細胞株における、増殖阻害アッセイで用いる、ｍＴＯＲ阻害剤、ＪＡＫ１／ＪＡＫ２阻害剤、ＨＤＡＣ阻害剤およびヒドロキシ尿素のＩＣ５０の決定
【表１】
0005936628.tif 000005
【表２】
0005936628.tif 000006
【０１１９】
表２．ＭＰＮ患者由来のＣＤ３４＋細胞のクローン形成アッセイにおける、ＪＡＫ２野生型およびＶ６１７Ｆコロニーの割合に対するＲＡＤ００１の効果
【表３】
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【０１２０】
表３．ｍＴＯＲ阻害剤およびＪＡＫ１／ＪＡＫ２阻害剤の併用は、ＳＥＴ２細胞株およびＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ Ｂａ／Ｆ３−ＥＰＯＲ細胞の増殖阻害において相乗作用をもたらす。
【表４】
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【０１２１】
ＩＣ５０値は、増殖阻害アッセイにおいて異なる薬剤組合せの存在下で計算された。併用された薬剤の少なくとも３つの試験からの平均ＩＣ５０値が報告される。組合せ指数（ＣＩ）は、材料および方法に記載のChouおよびTalalay法に従って計算された。ＣＩ＜１は、２剤の相互作用が相乗的であることを示す。便宜上、最初の２つのカラム（表中、灰色部分）は、表１のデータから計算される個々の薬剤のＩＣ５０値を記載する。
【０１２２】
表４．ヒトおよびマウスＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ変異細胞株および対照における、クローン形成アッセイで用いる、ＲＡＤ００１、ＰＰ２４２およびＩＮＣ２４２のＩＣ５０の決定
【表５】
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【０１２３】
ＩＣ５０値（すなわち、ビークルのみの対照において測定したコロニー数を５０％まで減少させた薬剤濃度）は、異なる薬物濃度の存在下での７日目のコロニーを計数することにより寒天コロニー形成アッセイにおいて計算された。ヒト細胞株の場合には、対照細胞株はＫ５６２であり、マウス細胞の場合には、ＩＬ−３の存在下で維持されたＢａ／Ｆ３野生型細胞であった。＊＊、Ｐ＜０．０１。
【０１２４】
表５．ＲＡＤ００１またはＰＰ２４２およびＩＮＣ２４２の併用は、ヒトおよびマウスＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ変異細胞株のクローン形成能の阻害において、相乗作用をもたらす。
【表６】
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【０１２５】
ＩＣ５０値は、異なる薬剤組合せの存在下で確立された培養中の７日目の増殖コロニーを計数することにより寒天コロニー形成アッセイにおいて計算された。併用された２剤の少なくとも３つの試験からの平均ＩＣ５０値が報告される。組合せ指数（ＣＩ）は、材料および方法に記載の通りに計算された。ＣＩ＜１は、２剤の相互作用が相乗的であることを示す。便宜上、最初の２つのカラム（表中、灰色部分）は、表４のデータから計算される個々の薬剤のＩＣ５０値を示す。
【０１２６】
表６．ＲＡＤ００１またはＰＰ２４２およびＩＮＣ２４２の併用は、ＰＶ患者由来のヒト末梢血単核細胞のクローン形成能の阻害において、相乗作用をもたらす。
【表７】
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【０１２７】
ＩＣ５０値は、異なる薬剤組合せの存在下で確立された培養中の７日目の増殖コロニーを計数することにより寒天コロニー形成アッセイにおいて計算された。組合せ指数（ＣＩ）は、材料および方法に記載の通りに計算された。ＣＩ＜１は、２剤の相互作用が相乗的であることを示す。
【図１】
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【図２】
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