(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程１）〜３）を含む抗ヒトインスリンモノクローナルの製造方法によって取得された抗ヒトインスリンモノクローナル抗体。
工程１）ヒトインスリンを抗原として抗ヒトインスリン産生ハイブリドーマを取得する工
程
工程２）工程１で取得したハイブリドーマから以下の条件を満たすハイブリドーマをスクリーニングする工程、
条件；
当該ハイブリドーマが産生する抗体が、
ＲＧＦＦＹＴＰＫＴ（配列表配列番号１）の配列から成る立体構造を喪失したペプチド断
片とは反応せず、かつ、インスリンの立体構造が維持された状態で反応する抗体
工程３）工程２で選択されたハイブリドーマが産生する抗体を取得する工程
【請求項２】
下記の特徴（ａ）〜（ｉ）を有する、請求項１に記載の抗ヒトインスリンモノクローナル
抗体。
（ａ）ヒトインスリンと反応する
（ｂ）ブタインスリンと反応しない
（ｃ）ウシインスリンと反応しない
（ｄ）イヌインスリンと反応しない
（ｅ）ウサギインスリンと反応しない
（ｆ）プロインスリンと反応しない
（ｇ）インスリンリスプロ、インスリンアスパルト、インスリングラルギン、インスリン
デテミル、インスリングルリジンよりなる群より選ばれる1以上のインスリン類似化合物
と反応しない
（ｈ）ＲＧＦＦＹＴＰＫＴ（配列表配列番号１）の配列から成るぺプチド断片と反応しな
い
（ｉ）以下の溶液中で取りうるヒトインスリン分子におけるβ鎖Ｃ末端ＲＧＦＦＹＴＰＫ
Ｔ領域の立体構造を認識する
０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．５）、０．１５Ｍ  塩化ナトリウム、３ｍＭ  Ｅ
ＤＴＡ、０．００５％  ＳｕｒｆａｃｔａｎｔＰ２０
【請求項３】
受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３１４のハイブリドーマより産生される請求項１または２
に記載の抗ヒトインスリンモノクローナル抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトインスリンに対して特異的に反応する抗体に関する。さらに本発明は、当該ヒトインスリンに対して特異的に反応するモノクローナル抗体を用いるヒトインスリン測定方法及び測定試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
インスリンは、膵臓中のランゲルハンス島β細胞において前駆体であるプロインスリンを経て生成される分子量約５８００のペプチドホルモンであり、２１アミノ酸よりなるペプチドα鎖（Ａ鎖ともいわれる）と３０アミノ酸よりなるペプチドβ鎖（Ｂ鎖ともいわれる）により構成されている。インスリンは、糖代謝並びにアミノ酸代謝や脂質代謝に関与し、代表的な生理作用は血糖降下である。糖尿病は、β細胞の減少や機能低下に基づくインスリン分泌不足や末梢組織でのインスリン作用不足により発症する。それゆえ、β細胞のインスリン分泌機能を反映する血中インスリン濃度の測定は、糖尿病の診断や病態の把握及び耐糖能異常の原因鑑別に有用な指標となっている。
【０００３】
一方、インスリン補充療法は糖尿病治療の重要な手段である。従来のウシインスリン、ブタインスリンに加え、遺伝子組換により得られたヒトインスリン、さらには、ヒトインスリンのアミノ酸配列を変化（置換、欠失、付加、挿入）させたり、構成アミノ酸の一部を脂肪酸などで修飾したインスリンアナログ製剤（以下、インスリン類似化合物ということがある）の投与が行われている。このようなインスリン補充療法の臨床上の精密な効果判定などのため、糖尿病患者本人が体内で産生した内因性のインスリンと体外から体内に投与された外来性のインスリンとを区別し、ヒト体内に存在する内因性のヒトインスリンを特異的に測定したいとの要望がある。
【０００４】
モノクローナル抗体を用いたヒトインスリンの測定方法などに関して、次の開示がある。
【０００５】
特許文献１には、水不溶性担体に結合させた抗ヒトインスリンモノクローナル抗体と、該抗体と競合しないエピトープを認識し且つ酵素で標識された抗ヒトインスリンモノクローナル抗体とを用いた酵素免疫測定法（以下、ＥＬＩＳＡ法ということがある）によるヒトインスリンの定量方法が開示されている。特許文献１には、ブタインスリンをはじめとするヒト以外の動物種由来インスリン及びインスリン類似化合物との反応性について一切記載がなく、ヒトインスリンを特異的に測定できるかどうかは不明である。
【０００６】
特許文献２には、認識部位の異なる２種類のマウス産生抗ヒトインスリンモノクローナル抗体を水不溶性担体に担持させた粒子凝集免疫測定法によるヒトインスリンの定量方法が開示されている。当該２種類のマウス産生抗ヒトインスリンモノクローナル抗体は、特許文献３に記載された方法に基づいて製造したと記載されているが、特許文献３には、ブタインスリンを免疫原としてマウス産生抗ヒトインスリンモノクローナル抗体を製造したことが記載されている。また特許文献２には、粒子凝集免疫測定法に、モルモット産生抗ブタインスリン抗血清から精製したポリクローナル抗体を使用した場合と、２種類のマウス産生抗ヒトインスリンモノクローナル抗体を使用した場合で、標準ヒトインスリンに対する反応性が同様であったことも記載されている。
【０００７】
特許文献３には、ブタインスリンもしくはヒトインスリンに対する単クローン性抗体とその製造方法、及び前記単クローン抗体を用いた放射免疫測定法（以下、ＲＩＡ法ということがある）が開示されている。特許文献３には、（１）モルモットなどの動物をウシインスリンまたはブタインスリンで免疫して得られる抗血清がヒトインスリンの測定に用いられていること、（２）ウシインスリンを免疫原としたとき、ブタインスリンあるいはヒトインスリンを免疫原にした場合に比較して、ヒトインスリンに対して反応性を有する単クローン性抗体が得られにくいこと、（３）ブタインスリンは、ウシインスリンと違って、Ｂ鎖Ｃ末端のアミノ酸が相違するに過ぎないので、これを免疫原としてもヒトインスリンに対して反応性を有する単クローン性抗体が得られること、についての言及があったうえで、ブタインスリンを免疫原として単クローン性抗体を取得し、当該取得された単クローン性抗体がブタインスリンとヒトインスリンに対してよく交叉することが記載されている。
【０００８】
特許文献２、３の記載を参酌すると、特許文献３の方法に基づいて作製された特許文献２に記載の２種類のマウス産生抗ヒトインスリンモノクローナル抗体は、ブタインスリンを免疫原としていると推測され、このような抗体はブタインスリンと反応するはずである。
特許文献１、２は、いずれもヒトインスリンに対する認識部位の異なる複数のモノクローナル抗体を用いてヒトインスリンを測定する方法であるが、少なくともブタインスリンと反応しない抗体を使用してヒトインスリンを特異的に測定しようとの発想はない。
【０００９】
非特許文献１〜３では、市販されているヒトインスリン測定試薬の反応特異性（ヒトインスリンに対するブタインスリン、インスリン類似化合物の交差反応性（率））が報告されている。
【００１０】
非特許文献１には、２種類の市販試薬のうち、一方の試薬におけるブタインスリンとの交差反応性が１９．２％であり、インスリン類似化合物であるインスリンリスプロとの交差反応性が０．０２％未満であること、及び、もう一方の試薬におけるブタインスリンとの交差反応性が１００％であり、インスリンリスプロとの交差反応性が７５％であったことが記載されている。
【００１１】
非特許文献２には、２６種類の市販試薬のうち、１６種類の試薬におけるブタインスリンとの交差反応性が１９．２％〜４５０％であり、８種類の試薬におけるインスリンリスプロとの交差反応性が０．１％未満〜１００％であったことが記載されている。
【００１２】
非特許文献３には、６種類の市販試薬についてインスリン類似化合物の希釈系列を測定し、１種類の試薬は、インスリンアスパルト、インスリングラルギン、インスリンリスプロとの平均交差反応性が０．７％未満であったが、その他の５種類の試薬は、前記３種類のインスリン類似化合物との平均交差反応性が３．６％〜１４３％であったことが記載されている。しかし、当該文献には、これらの試薬のブタインスリンとの交差反応性について一切開示されていない。
【００１３】
以上のように、ヒトインスリン測定用の市販試薬のなかに、ブタインスリンと交差反応しない試薬は存在しなかった。また、複数のインスリン類似化合物との交差反応性が０．７％未満の市販試薬は１種類で、１０％未満の市販試薬は１種類であった。なお、非特許文献３において、複数のインスリン類似化合物との交差反応性が０．７％未満である市販試薬は、非特許文献１、２におけるブタインスリンとの交差反応性が１９．２％である市販試薬であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】特開平１−１４８９６２号公報
【特許文献２】特開平３−１１８４７２号公報
【特許文献３】特開昭６０−１８８３２７号公報
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４７〔３〕（２００１）Ｐ．６０２−５
【非特許文献２】Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，４９〔３−４〕（２００３）Ｐ．１１３−２１
【非特許文献３】Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５０〔１〕（２００４）Ｐ．２５７−９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明は、ブタインスリンと反応せず、ヒトインスリンと特異的に反応する抗ヒトインスリン抗体と、該抗体を用いたヒトインスリン特異的な測定方法及び測定試薬の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者らは、上記課題を解決するべく鋭意検討した結果、ヒトインスリンが固相に固定化された状態ではなく、溶液中においてその立体構造を保った状態で、抗ヒトインスリン抗体をスクリーニングした場合、ブタインスリン、ウシインスリン、プロインスリン、インスリン類似化合物のいずれとも反応せず、ヒトインスリンと特異的に反応する抗ヒトインスリン抗体を見出し、さらに当該特異的抗体を免疫学的測定方法に用いることでヒトインスリンをブタインスリンなどと区別して、正確に測定できることを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は以下の構成を有する。
〔１〕下記の特徴（ａ）及び（ｂ）を有する、抗ヒトインスリン抗体。
（ａ）ヒトインスリンと反応する
（ｂ）ブタインスリンと反応しない
〔２〕以下のいずれか１以上の特徴をさらに有する、請求項１に記載の抗ヒトインスリン抗体。
（ｃ）ウシインスリンと反応しない
（ｄ）イヌインスリンと反応しない
（ｅ）ウサギインスリンと反応しない
（ｆ）プロインスリンと反応しない
（ｇ）インスリン類似化合物と反応しない
（ｈ）ＲＧＦＦＹＴＰＫＴ（配列表配列番号１）の配列から成るぺプチド断片と反応しない
〔３〕インスリン類似化合物が、インスリンリスプロ、インスリンアスパルト、インスリングラルギン、インスリンデテミル、インスリングルリジンよりなる群より選ばれるものである、前記〔２〕に記載の抗ヒトインスリン抗体。
〔４〕以下の特徴をさらに有する、前記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の抗ヒトインスリン抗体。
（ｉ）ヒトインスリン分子におけるβ鎖Ｃ末端ＲＧＦＦＹＴＰＫＴ領域の立体構造を認識する
〔５〕ヒトインスリン分子におけるβ鎖Ｃ末端ＲＧＦＦＹＴＰＫＴ領域の立体構造が、以下の溶液中で取りうる構造である前記〔４〕に記載の抗ヒトインスリン抗体。
０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．５）、０．１５Ｍ  塩化ナトリウム、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００５％  ＳｕｒｆａｃｔａｎｔＰ２０
〔６〕モノクローナル抗体である、前記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の、抗ヒトインスリン抗体。
〔７〕受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３１４のハイブリドーマより産生される、前記〔６〕に記載の抗ヒトインスリン抗体。
〔８〕受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３１４のハイブリドーマより産生されるモノクローナル抗体が認識するエピトープと同一のエピトープを認識しうる前記〔６〕に記載の抗ヒトインスリン抗体。
〔９〕請求項１〜８のいずれかに記載の抗体と生物由来試料とを接触させ、接触により形成された当該抗体とヒトインスリンとの複合体を検出する工程を含む、ヒトインスリン測定方法。
〔１０〕前記〔１〕〜〔８〕のいずれかに記載の抗体が、検出可能な標識物質で標識されている、前記〔９〕に記載のヒトインスリン測定方法。
〔１１〕下記２種類の抗体を用いるヒトインスリン測定方法。
１）前記〔１〕〜〔８〕のいずれかに記載の抗ヒトインスリン抗体
２）少なくともヒトインスリンと反応する性質を有する抗体Ａ
〔１２〕下記２種類の抗体を用いるヒトインスリン測定方法。
１）前記〔１〕〜〔８〕のいずれかに記載の抗ヒトインスリン抗体
２）上記１）の抗体を特異的に認識する性質を有する抗体Ｂ
〔１３〕１）及び２）の抗体が、ともにモノクローナル抗体である前記〔１１〕又は〔１２〕に記載のヒトインスリン測定方法。
〔１４〕１）の抗体がモノクローナル抗体であり、２）の抗体がポリクローナル抗体である前記〔１１〕又は〔１２〕に記載のヒトインスリンの測定方法。
〔１５〕１）の抗体及び／又は２）の抗体が、固相に固定化されている、前記〔１１〕〜〔１４〕のいずれかに記載のヒトインスリン測定方法。
〔１６〕固相がラテックスであり、ラテックス免疫凝集法でインスリンを測定する、前記〔１５〕に記載のヒトインスリン測定方法。
〔１７〕１）の抗体は固相に固定化され、２）の抗体は標識物質で標識されている、ＥＬＩＳＡ法又はイムノクロマトグラフ法でインスリンを測定する、前記〔１６〕に記載のヒトインスリン測定方法。
〔１８〕以下の工程を含む外来性インスリンを測定する方法。
（１）ヒトインスリン及び外来性インスリンの総濃度を求める工程
（２）前記〔９〕〜〔１７〕のいずれかのインスリン測定方法によってヒトインスリン濃度を求める工程
（３）（１）で求めた濃度から（２）で求めた濃度を差し引くことによって外来性インスリン濃度を求める工程
〔１９〕前記〔１〕〜〔８〕のいずれかに記載の抗体を用いることを特徴とする、インスリン測定試薬。
〔２０〕下記２種類の抗体を用いるインスリン測定試薬。
１）前記〔１〕〜〔８〕のいずれかに記載の抗ヒトインスリン抗体
２）少なくともヒトインスリンと反応する性質を有する抗体Ａ
〔２１〕下記２種類の抗体を用いるインスリン測定試薬。
１）前記〔１〕〜〔８〕のいずれかに記載の抗ヒトインスリン抗体
２）上記１）の抗体を特異的に認識する性質を有する抗体Ｂ
〔２２〕１）及び２）の抗体が、ともにモノクローナル抗体である前記〔２０〕又は〔２１〕に記載のインスリン測定試薬。
〔２３〕１）の抗体がモノクローナル抗体であり、２）の抗体がポリクローナル抗体である前記〔２０〕又は〔２１〕に記載のインスリンの測定試薬。
〔２４〕１）の抗体及び／又は２）の抗体が、固相に固定化されている、前記〔２０〕〜〔２３〕のいずれかに記載のヒトインスリン測定試薬。
〔２５〕固相がラテックスであり、ラテックス免疫凝集法によりインスリンを測定する前記〔２４〕に記載のヒトインスリン測定試薬。
〔２６〕１）の抗体は固相に固定化され、２）の抗体は標識物質で標識されている、ＥＬＩＳＡ法又はイムノクロマトグラフ法によりインスリンを測定する、前記〔２４〕に記載のヒトインスリン測定試薬。
〔２７〕以下の測定試薬を含む外来性インスリン測定試薬キット。
（１）ヒトインスリン及び外来性インスリンの総インスリン濃度を測定する試薬
（２）前記〔１９〕〜〔２６〕のいずれかのヒトインスリン測定試薬
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、ブタインスリン、ウシインスリン、プロインスリン、インスリン類似化合物の影響を受けずに、ヒトインスリンの正確な測定が可能となる。即ち本発明によれば、ブタインスリン、インスリン類似化合物などを投与されているインスリン補充療法中の糖尿病患者においても、当該患者のβ細胞から分泌されたヒトインスリンのみを正確に測定できることから、糖尿病患者の病態把握を正確に行うことができる。
さらに、ヒトインスリン並びにインスリン補充療法に用いられるヒト以外の動物種由来のインスリン及びインスリン類似化合物とも交差反応性を示す抗ヒトインスリン抗体を用いた測定方法によるヒトインスリン並びにヒト以外の動物種由来のインスリン及びインスリン類似化合物の総量（総濃度）の測定結果と、本発明の抗体を用いた測定方法によるヒトインスリンのみの測定結果より、ヒト以外の動物種由来のインスリンやインスリン類似化合物など外来性のインスリンのみを測定することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】ヒトインスリンのアミノ酸配列を示す概念図である。図中（ａ）〜（ｇ）部分は本発明の抗体との反応性を検討したヒト以外の動物種由来インスリン（ブタインスリン、ウシインスリン、ウサギインスリン、イヌインスリン）及びインスリン類似化合物（インスリンリスプロ、インスリンアスパルト、インスリングラルギン、インスリンデテミル、インスリングルリジン）と、ヒトインスリンとのアミノ酸配列の違いを示す部分である。図中の○の中のアルファベットはアミノ酸の１文字表記である。＜ヒト以外の動物種由来インスリン＞ブタインスリン：（ｃ）部分は「Ｔ」ではなく「Ａ」を有する。ウシインスリン：（ｃ）部分は「Ｔ」ではなく「Ａ」を有し、（ｆ）部分は「Ｔ」ではなく「Ａ」を有し、更に（ｇ）部分は「Ｉ」ではなく「Ｖ」を有する。ウサギインスリン：（ｃ）部分は「Ｔ」ではなく「Ｓ」を有する。イヌインスリン：ブタインスリンに同じ。＜インスリン類似化合物＞インスリンリスプロ：（ａ）、（ｂ）部分は「Ｐ−Ｋ」ではなく「Ｋ−Ｐ」を有する。インスリンアスパルト：（ａ）部分は「Ｐ」ではなく「Ｄ」を有する。インスリングラルギン：（ｄ）部分は「Ｎ」ではなく「Ｇ」を有し、更に（ｃ）部分「Ｔ」に「ＲＲ」が付加されている。インスリンデテミル：（ｃ）部分は「Ｔ」を有さず、更に（ｂ）部分「Ｋ」にミリスチン酸（C14H28O2）が付加されている。インスリングルリジン：（ｂ）部分は「Ｋ」ではなく「Ｅ」を有し、更に（ｅ）部分は「Ｎ」ではなく「Ｋ」を有する。
【図２−１】ヒトインスリン、プロインスリン、各種インスリン類似化合物、ブタインスリン、ウシインスリンと６６２２４抗体の反応性について、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００を用いた試験結果を示す図である。図中、（ａ）ヒトインスリン、（ｂ）プロインスリン、（ｃ）インスリンリスプロ、（ｄ）インスリンアスパルトである。
【図２−２】同上。図中、（ｅ）インスリングラルギン、（ｆ）インスリンデテミル、（ｇ）インスリングルリジン、（ｈ）ブタインスリン、（ｉ）ウシインスリンである。
【図３−１】ヒトインスリン、プロインスリン、各種インスリン類似化合物、ブタインスリン、ウシインスリンと６６４０８抗体の反応性についてＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００を用いた試験結果を示す図である。図中、（ａ）ヒトインスリン、（ｂ）プロインスリン、（ｃ）インスリンリスプロ、（ｄ）インスリンアスパルトである。
【図３−２】同上。図中、（ｅ）インスリングラルギン、（ｆ）インスリンデテミル、（ｇ）インスリングルリジン、（ｈ）ブタインスリン、（ｉ）ウシインスリンである。
【図４】ヒトインスリンβ鎖のＣ末端領域の配列「ＲＧＦＦＹＴＰＫＴ」（配列表配列番号１）から成るペプチド断片（前記ペプチドのアミノ酸配列は、Ｃ末端アミノ酸が「Ｔ」である点のみが、ブタインスリン（Ｃ末端アミノ酸「Ａ」）と異なる）と６６２２４抗体の反応性を競合ＥＬＩＳＡ法を用いて試験した結果を示す図である。
【図５】１次抗体として６６２２４抗体、２次抗体として６６４０８抗体を用い、１次抗体をプレートに固相化して、ヒトインスリン、プロインスリン、各種インスリン類似化合物、ブタインスリン、ウシインスリン、ウサギインスリン、イヌインスリンとの反応性をサンドイッチＥＬＩＳＡ法を用いて試験した結果を示す図である。
【図６】１次抗体として６６４０８抗体、２次抗体として６６２２４抗体を用い、１次抗体をプレートに固相化して、ヒトインスリン、プロインスリン、各種インスリン類似化合物、ブタインスリン、ウシインスリン、ウサギインスリン、イヌインスリンとの反応性をサンドイッチＥＬＩＳＡ法を用いて試験した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本明細書において、抗体とある化合物が「反応する」、「反応性を示す」、「反応性を有する」、「結合する」、あるいは抗体がある化合物を「認識する」と表現する場合、本発明の分野で通常使用される意味を有し、いずれも同義で用いる。ただし、これらの例示に限定されることはなく、「親和性を有する」など、本発明の分野で用いられる同義の意味を含む別の表現も含め、最も広義に解釈する必要がある。抗体とある化合物とが「反応する」か否かの確認は、後述する当業者に周知の抗原固相化ＥＬＩＳＡ法、競合ＥＬＩＳＡ法、サンドイッチＥＬＩＳＡ法などにより行うことができるほか、表面プラズモン共鳴（ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｓｍｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）の原理を利用した方法（ＳＰＲ法）などにより行うことができる。ＳＰＲ法は、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）の名称で市販されている、装置、センサー、試薬類を使用して行うことができる。
【００２１】
本明細書において、本発明の抗体と、ある化合物が「反応しない」とは、本発明の抗体とある化合物とが実質的に反応しないことをいう。「実質的に反応しない」とは、例えば、上記ＳＰＲ法に基づき、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００を使用し、本発明の抗体を固定化して試験する化合物との反応性の測定を行った場合に、本発明の抗体と当該試験する化合物との反応性が、コントロール（試験する化合物の非存在下での試験）の反応性に対して有意に増加しないことをいう。上記ＳＰＲ法以外の当業者に周知の方法・手段によっても「実質的に反応しない」ことを確認できることは言うまでもない。
【００２２】
本明細書において、「交差反応（性）」とは、抗体が本来の抗原のみと特異的（選択的）に反応（結合）する以外に、本来の抗原と化学構造が類似する物質（以下、交差性物質ということがある）と非特異的に反応（結合）する性質をいう。この抗体と交差性物質が非特異的に反応（結合）する程度を、例えば、抗体と本来抗原の反応（結合）に対する割合で示し、交差反応性あるいは交差反応率と表現する。
【００２３】
本明細書において、「不溶性担体」を「固相」と表現することがある。また、抗原や抗体を不溶性担体に物理的あるいは化学的に担持させること、あるいは担持させた状態を、「固定」、「固定化」、「固相化」と表現することがあるが、「感作」や「吸着」など、本発明の分野で用いられる同義に意味を含む別の表現も包含している。
【００２４】
本明細書において、「検出」又は「測定」という用語は、インスリンの存在の証明及び／又は定量などを含めて最も広義に解釈する必要があり、いかなる意味においても限定的に解釈してはならない。
【００２５】
本明細書において、「外来性（の）インスリン」とは、ヒト体内で産生される、いわゆる「内在性（の）インスリン」に対して、糖尿病治療のため、体外から体内に投与されるインスリンをいい、具体的には、ヒト以外の動物種由来のインスリン及び／又はインスリン類似化合物をいう。
【００２６】
本発明の抗ヒトインスリン抗体は、ヒトインスリンと特異的に反応し、ブタインスリンと反応しない抗体である。本発明の抗ヒトインスリン抗体は、さらにウシインスリン、イヌインスリン、ウサギインスリン、プロインスリン、インスリン類似化合物のいずれか１以上と反応しない性質を有していてもよい。インスリン類似化合物として、具体的には、インスリンリスプロ、インスリンアスパルト、インスリングラルギン、インスリンデテミル、インスリングルリジンなどが挙げられる。なお、前記したインスリン類似化合物が「インスリンアナログ製剤」と呼ばれることがあることは前述したとおりである。
【００２７】
本発明の抗ヒトインスリン抗体は、上記の各反応性に加え、ヒトインスリンβ鎖のＣ末端領域の配列「ＲＧＦＦＹＴＰＫＴ」（配列表配列番号１）から成るペプチド断片と反応しない性質をさらに有していることが望ましい。ヒトインスリンとブタインスリンは、β鎖Ｃ末端のアミノ酸が「Ｔ」であるか「Ａ」であるかの点で唯一相違する。よって、ヒトインスリンに特異的に反応し、ブタインスリンと反応しない抗体を得るためには、ヒトインスリンβ鎖Ｃ末端領域のアミノ酸配列を含むペプチド断片それ自体に特異的な反応性を示す抗体を選択すればよいが、ヒトインスリンに反応しブタインスリンには反応せず、かつヒトインスリンβ鎖Ｃ末端領域のアミノ酸配列を含むペプチド断片それ自体には反応しない性質の抗体を選択することで、ヒトインスリンとブタインスリンで相違するアミノ酸を含む配列が関与するヒトインスリンの立体構造を認識する抗体が得られるので、より高い特異性を確保する上で望ましい。
【００２８】
本発明の抗ヒトインスリン抗体は、モノクローナル抗体であってもよい。具体的にはハイブリドーマ６６２２４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３１４）が産生するモノクローナル抗体（６６２２４抗体）が挙げられる。また、本発明の抗ヒトインスリン抗体には、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３１４のハイブリドーマより産生されるモノクローナル抗体が認識するエピトープと同一のエピトープを認識しうる抗体も含まれる。さらに、ＰＣＴ／ＪＰ２０１０／６２２６１に記載された６６２２６抗体（国際寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１２３４のハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体）のように、抗ヒトインスリン抗体と結合したインスリン（以下、複合体インスリンということがある）の立体構造を認識するが、ブタインスリンそれ自体とは反応しない抗体も本発明の抗体と同様に使用することができる。当該抗体は、ヒトインスリンに結合した場合とブタインスリンに結合した場合で、形成される複合体インスリンの立体構造を異にする抗体と組み合わせて使用することにより、本発明の抗体と同様の特性を有する抗体として使用することができる。
【００２９】
本発明の抗体は、抗原（免疫原）としてヒトインスリンをリン酸緩衝生理食塩水などの溶媒に溶解し、この溶液をヒト以外の動物（以下抗体取得に関する記載において単に、動物ということがある）に投与して免疫することによりに容易に製造できる。抗原として利用されるインスリンは、インスリン分子全体であってもよく、その一部であってもよいが、前述したように、特異性のより高い抗体を得るためには、ヒトインスリンβ鎖Ｃ末端領域のアミノ酸配列が関与するヒトインスリンにおける立体構造が維持されるよう、ヒトインスリン分子全体であることが好ましい。必要に応じて前記溶液に適宜のアジュバントを添加してエマルジョンとした後、当該エマルジョンを用いて免疫を行ってもよい。アジュバントとしては、油中水型乳剤、水中油中水型乳剤、水中油型乳剤、リポソーム、水酸化アルミニウムゲルなどの汎用されるアジュバントのほか、生体成分由来のタンパク質やペプチド性物質などを用いてもよい。例えば、フロイントの不完全アジュバント又はフロイントの完全アジュバントなどを好適に用いることができる。アジュバントの投与経路、投与量、投与時期は特に限定されないが、抗原を免疫する動物において所望の免疫応答を増強できるように適宜選択することが望ましい。
【００３０】
免疫に用いる動物の種類は特に限定されないが、哺乳動物が好ましく、例えばマウス、ラット、ウシ、ウサギ、ヤギ、ヒツジなどを用いることができ、より好ましくはマウスを用いることができる。動物の免疫は、一般的な手法に従って行えばよく、例えば、抗原の溶液、好ましくはアジュバントとの混合物を動物の皮下、皮内、静脈、又は腹腔内に注射することにより免疫を行うことができる。免疫応答は、一般的に免疫される動物の種類及び系統によって異なるので、免疫スケジュールは使用される動物に応じて適宜設定することが望ましい。抗原投与は最初の免疫後に何回か繰り返し行うことが好ましい。
【００３１】
モノクローナル抗体を得る場合、引き続き以下の操作が行われるが、それに限定されることはなく、モノクローナル抗体それ自体の製造方法については、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，（１９８８））に記載の方法に準じて行うことができる。
【００３２】
最終免疫後、免疫した動物から抗体産生細胞である脾臓細胞あるいはリンパ節細胞を摘出し、高い増殖能を有するミエローマ細胞と細胞融合させることによりハイブリドーマを作製することができる。細胞融合には抗体産生能（質・量）が高い脾臓細胞あるいはリンパ節細胞を用いることが好ましく、またミエローマ細胞は、融合する抗体産生細胞の由来する動物と適合性があることが好ましい。細胞融合は、当該分野で公知の方法に従って行うことができるが、例えば、ポリエチレングリコール法、センダイウイルスを用いた方法、電流を利用する方法などを採用することができる。得られたハイブリドーマは、公知の方法に従って増殖させることができ、産生される抗体の性質を確認しつつ所望のハイブリドーマを選択することができる。ハイブリドーマのクローニングは、例えば限界希釈法や軟寒天法などの公知の方法により行うことが可能である。
【００３３】
本発明の抗体を産生するハイブリドーマの選択は、産生される抗体が実際の測定に用いられる条件を考慮して、効率的、効果的に行うことができる。標準的な一例としては、ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）を用いる方法などにより、ヒトインスリンに反応する抗体を産生するハイブリドーマを選択することにより得られる。具体的には、まず、ハイブリドーマの培養上清中の抗体を、プレートなどに固相化したヒトインスリンと反応させ、次いで標識抗ＩｇＧ抗体を反応させる抗原固相化ＥＬＩＳＡ法により、ヒトインスリンに対し高い反応性を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択する。
【００３４】
さらに、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００を用いてブタインスリン、ウシインスリン、プロインスリン、インスリン類似化合物（インスリンリスプロ、インスリンアスパルト、インスリングラルギン、インスリンデテミル、インスリングルリジン）との反応性を確認し、所望の反応性（特異性）を示すハイブリドーマを選択することで、本発明の抗ヒトインスリン抗体を産生するハイブリドーマを確実に選択することができる。前記反応性の確認において、固相に固定化されず、溶液中においてその立体構造を保った状態のヒトインスリンとの反応性を確認することで、ヒトインスリンの立体構造を認識する抗ヒトインスリンモノクローナル抗体の絞り込みが容易になると推測される。
【００３５】
さらにまた、ブタインスリンとβ鎖Ｃ末端アミノ酸のみが異なる、ヒトインスリンβ鎖のＣ末端領域のアミノ酸配列を含むヒトインスリンのペプチド断片を作製し、当該ペプチド断片それ自体と反応しないモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択することにより、当該配列の１次構造ではなく、ヒトインスリンの立体構造の中における当該配列を認識するモノロクーナル抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる。当該ペプチド断片としては、ヒトインスリンβ鎖のＣ末端領域の配列「ＲＧＦＦＹＴＰＫＴ」から成るペプチド断片が好適に使用しうるが、ヒトインスリンβ鎖のＣ末端アミノ酸を含み、少なくとも抗体が認識しうる長さであるヒトインスリンＣ末端領域のペプチド断片であればいずれでもよい。ペプチドのアミノ酸の数は、好ましくは、５アミノ酸以上である。
【００３６】
本発明のハイブリドーマ（抗体）のスクリーニング方法を、後述する実施例にそって整理すると以下である。
１次スクリーニング：抗原固相化ＥＬＩＳＡ法を行い、ヒトインスリンに対する反応性を確認し陽性ｗｅｌｌを選別。
２次スクリーニング：ヒトインスリンの競合ＥＬＩＳＡ法を行い、抗体がヒトインスリンに対して反応していることを再確認し、陽性ｗｅｌｌを選択。
３次スクリーニング：Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）を用いた反応性測定法により、ヒトインスリンに特異的な反応性を示し、ヒト以外の動物種由来のインスリン、プロインスリン、インスリン類似化合物と交差反応性を示さないｗｅｌｌを選択。
４次スクリーニング：ヒトインスリンβ鎖のＣ末端領域の配列「ＲＧＦＦＹＴＰＫＴ」から成るペプチド断片との競合ＥＬＩＳＡ法を行い、当該ペプチド断片に対して反応性を示さず、ヒトインスリンに対し高い反応性を示すｗｅｌｌを選択。
【００３７】
本発明者は、特定の理論に拘るわけではないが、本発明完成の理由の一つを以下のように推測している。
従来のスクリーニングでは、ヒトインスリンが直接あるいは間接に固相化されているか、標識が施されているため、ヒトインスリン本来の立体構造の一部を喪失していた可能性が考えられる。ブタインスリンとヒトインスリンの構造上の相違がβ鎖Ｃ末端のアミノ酸のみであることは前述しているが、このような場合、微妙な立体構造の変化が、抗体のエピトープ決定に大きく影響する可能性が考えられる。本発明では、上記したように、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）を用いて、ヒトインスリンの立体構造を維持した状態でスクリーニングし、さらにヒトインスリンβ鎖のＣ末端領域のペプチド断片との競合ＥＬＩＳＡ法により立体構造を意図的に喪失させてスクリーニングを行うことで、より高い特異性を持つ抗体を選別している。
【００３８】
なお、本明細書の全記載より、少なくともヒトインスリンとブタインスリンに対する反応性をＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）を用いた反応性測定法において確認することによって、本発明の抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングが可能であることを、当業者は容易に理解しうる。
【００３９】
このようにして選別されたハイブリドーマを大量培養することにより、所望の特性を有するモノクローナル抗体を製造することができる。大量培養の方法は特に限定されないが、例えば、ハイブリドーマを適宜の培地中で培養してモノクローナル抗体を培地中に産生させる方法や、哺乳動物の腹腔内にハイブリドーマを注射して増殖させ、腹水中に抗体を産生させる方法などを挙げることができる。モノクローナル抗体の精製は、例えば陰イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、硫安分画法、ＰＥＧ分画法、エタノール分画法などを適宜組み合わせて行うことができる。
【００４０】
本発明の抗体としては、抗体分子全体のほかに抗原抗体反応活性を有する抗体の機能性断片を使用することも可能であり、前記のように動物への免疫工程を経て得られたもののほか、遺伝子組み換え技術を使用して得られるものや、キメラ抗体を用いることも可能である。抗体の機能性断片としては、例えば、Ｆ（ａｂ’）２  、Ｆａｂ’などが挙げられ、これらの機能性断片は前記のようにして得られる抗体をタンパク質分解酵素（例えば、ペプシンやパパインなど）で処理することにより製造できる。
【００４１】
本発明の抗体は、不溶性担体上に固定された固定（固相）化抗体として使用したり、後述する当業者に周知慣用の標識物質で標識した標識抗体として使用することができる。このような固定化抗体や標識抗体はいずれも本発明の範囲に包含される。例えば、不溶性担体に本発明の抗体を物理的に吸着させ、あるいは化学的に結合（適当なスペーサーを介してもよい）させることにより固定化抗体を製造することができる。不溶性担体としては、ポリスチレン樹脂などの高分子基材、ガラスなどの無機基材、セルロースやアガロースなどの多糖類基材などからなる不溶性担体を用いることができ、その形状は特に限定されず、板状（例えば、マイクロプレートやメンブレン）、ビーズあるいは微粒子状（例えば、ラテックス粒子）、筒状（例えば、試験管）など任意の形状を選択できる。
【００４２】
標識抗体を製造するための標識物質としては、例えば酵素、蛍光物質、化学発光物質、ビオチン、アビジン、又は放射性同位体、金コロイド粒子、着色ラテックスなどが挙げられる。標識物質と抗体との結合法としては、当業者に利用可能なグルタルアルデヒド法、マレイミド法、ピリジルジスルフィド法、又は過ヨウ素酸法などの方法を用いることができるが、固定化抗体や標識抗体の種類、及びそれらの製造方法は前記の例に限定されることはない。例えば、パーオキシダーゼやアルカリホスファターゼなどの酵素を標識物質として用いる場合には、その酵素の特異的基質（酵素が西洋ワサビパーオキシダーゼ（以下、ＨＲＰということがある）の場合には、例えば１，２−フェニレンジアミン（以下、ＯＰＤということがある）あるいは３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン、ＡＬＰの場合には、ｐ−ニトロフェニルホスフェートなど）を用いて酵素活性を測定することができ、ビオチンを標識物質として用いる場合には少なくともアビジンあるいは酵素修飾アビジンを反応させるのが一般的である。
【００４３】
本発明の抗ヒトインスリン抗体は、Ａ：少なくともヒトインスリンと反応する抗ヒトインスリン抗体（以下、抗体Ａということがある）、あるいは、Ｂ：本発明の抗ヒトインスリン抗体を特異的に認識する抗体（以下、抗体Ｂということがある）、と組み合わせて使用することができる。
【００４４】
抗体Ａは、ヒトインスリンに対して反応性を示すものであれば特に限定はされず、プロインスリン、インスリン類似化合物（インスリンリスプロ、インスリンアスパルト、インスリングラルギン、インスリンデテミル、インスリングルリジン）、ブタインスリン、ウシインスリンのいずれかと交差反応性を示すものでもよい。ヒトインスリンと反応する抗体であればモノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよく、モノクローナル抗体の場合、具体的にはハイブリドーマ６６４０８（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３１５）が産生するモノクローナル抗体（６６４０８抗体）、ハイブリドーマ６６２２１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３１４）が産生するモノクローナル抗体が挙げられる。また、抗体分子全体のほかにヒトインスリンと反応する抗体の機能性断片であってもよい。なお、抗体Ａのヒトインスリン認識部位は、本発明の抗体と組み合わせて本発明の測定方法、測定試薬を構成できることを限度として、本発明の抗ヒトインスリン抗体のヒトインスリン認識部位と完全に独立していることまでは要さない。
【００４５】
抗体Ｂは、いわゆる二抗体法などの間接検出系に使用されたり、増感のために用いられる抗体を指し、本発明の抗ヒトインスリン抗体と特異的に反応する抗体であればよく、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよい。また抗体分子全体のほかに本発明の抗ヒトインスリン抗体と反応する抗体の機能性断片であってもよい。本発明の抗体がマウス産生モノクローナル抗体である場合の、抗マウスＩｇＧ抗体を挙げることができる。
【００４６】
本発明の抗体を抗体Ａと組み合わせて使用する場合、本発明の抗体と抗体Ａのいずれか１以上を前記した標識物質で標識したり、不溶性担体に固相化して用いることができる。これらの具体的な態様としては、例えばサンドイッチＥＬＩＳＡ法や粒子凝集免疫測定法が挙げられる。
【００４７】
本発明により提供される測定用試薬（キット）の態様としては、ヒトインスリンの測定ができる試薬であれば、特に限定されるものではない。以下、代表的な標識免疫測定法であるサンドイッチＥＬＩＳＡ法、イムノクロマトグラフ法と、代表的な粒子凝集免疫測定法であるラテックス免疫凝集法（以下、ＬＴＩＡ法ということがある）を例にそれぞれを説明する。
【００４８】
＜標識免疫測定法：サンドイッチＥＬＩＳＡ法＞
試料中に存在するヒトインスリンを検出するための測定用試薬（キット）の態様としては、次のＡ、Ｂの２態様が考えられ、それぞれ（ａ）、（ｂ）の要素が必要とされる。
Ａ．（ａ）本発明の抗ヒトインスリン抗体を固定化した固相及び（ｂ）標識物質で標識され、少なくともヒトインスリンと反応する性質を有する抗体Ａ（以下、標識抗体Ａということがある）。
Ｂ．（ａ）標識物質で標識された本発明の抗ヒトインスリン抗体及び（ｂ）少なくともヒトインスリンと反応する抗体Ａを固定化した固相。
【００４９】
固相に固定化された抗体は、試料中のヒトインスリンを捕捉し、固相上で複合体を形成する。標識物質で標識された抗体は、前記捕捉されたヒトインスリンに結合して前記複合体とサンドイッチを形成する。標識物質に応じた方法により標識物質の量を測定することにより、試料中のヒトインスリンを測定することができる。抗体の固相化の方法、抗体の標識物質での標識の方法など、測定試薬（キット）を構成する上での具体的な方法は、本明細書に記載された方法のほか、当業者に周知の方法を特に制限なく使用することができる。この構成の場合、ホモジーニアスな測定系、ヘテロジーニアスな測定系のいずれも好適に構成することができる。
【００５０】
＜標識免疫測定法：イムノクロマトグラフ法＞
一般的なイムノクロマトグラフ法では、メンブレンなどのシート状の固相上に、被検試料溶液の展開方向にそって、端から順に「１．被検試料供給部位」、「２．標識抗体Ａ（金コロイドや着色ラテックスで標識されている）を、メンブレン上において展開可能に保持した標識試薬部位」、「３．標識抗体Ａとヒトインスリンにより形成された複合体を捕捉するため本発明の抗体を固定化した捕捉試薬部位」を具備した試験片が使用され、被検試料溶液が毛細管現象により連続的に移動するように構成されている。
【００５１】
具体的には、まず、インスリンを含む被検試料を被検試料供給部位に所定量添加すると、試料は毛細管現象により標識試薬部位に侵入し、インスリンと標識抗体Ａとが結合し、インスリンと標識抗体Ａの複合体が形成される。該複合体は、そのままメンブレン上を展開移動し、メンブレン上の本発明の抗体を含む捕捉試薬部位に侵入すると、固相上に固定化された捕捉試薬に捕捉され、捕捉試薬−インスリン−標識抗体Ａの三元複合体が捕捉試薬部位に形成される。そして標識試薬を任意の方法（例えば、金コロイドなど可視化可能な標識の場合にはその凝集像、酵素の場合には、基質を添加することによる発色反応）で検出することで、インスリンの存在を検出することができる。
【００５２】
＜粒子凝集免疫測定法：ＬＴＩＡ法＞
試料中に存在するヒトインスリンを検出するための測定用試薬（キット）の態様としては、次のＡ〜Ｄの４態様が考えられ、それぞれ（ａ）、（ｂ）あるいは（ａ）のみの要素が必要とされる。
Ａ．（ａ）本発明の抗ヒトインスリン抗体を固定化したラテックス粒子及び（ｂ）少なくともヒトインスリンと反応する抗体Ａを固定化したラテックス粒子
Ｂ．（ａ）本発明の抗ヒトインスリン抗体を固定化したラテックス粒子及び（ｂ）少なくともヒトインスリンと反応する抗体Ａ
Ｃ．（ａ）本発明の抗ヒトインスリン抗体及び（ｂ）少なくともヒトインスリンと反応する抗体Ａを固定化したラテックス粒子
Ｄ．（ａ）本発明の抗ヒトインスリン抗体及び少なくともヒトインスリンと反応する抗体Ａの両抗体を固定化したラテックス粒子
【００５３】
これらの測定用試薬（キット）は特にＬＴＩＡ法に好適に使用できる。上記Ａ〜Ｄに使用されるラテックス粒子は、感度向上などの所望の性能を得るため、粒子径や種類を適宜選択することができる。ラテックス粒子としては、抗原あるいは抗体の担持に適したものであれば良い。例えば、ポリスチレン、スチレン−スルフォン酸（塩）共重合体、スチレン−メタクリル酸共重合体、アクリルニトリル−ブタジエン−スチレン共重合体、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重合体、酢酸ビニル−アクリル酸エステル共重合体などが挙げられる。ラテックス粒子の形状は特に限定されないが、その平均粒子径は、ラテックス粒子表面の抗体又は抗原と、測定対象物との凝集反応の結果生じる凝集体が、肉眼又は光学的に検出できるに十分な大きさを有することが好ましい。透過型電子顕微鏡装置を用いた場合の好ましい平均粒子径としては０．０２〜１．６μｍであり、特に０．０３〜０．５μｍが好ましい。なお、金属コロイド、ゼラチン、リポソーム、マイクロカプセル、シリカ、アルミナ、カーボンブラック、金属化合物、金属、セラミックス又は磁性体などの材質よりなる粒子をラテックス粒子に代えて使用することもできる。
【００５４】
臨床検査で使用されるＬＴＩＡ法の試薬は、通常、第一試薬（液）、第二試薬（液）の形態で提供され、順次被検試料と混合して使用される。上記Ａ〜Ｄの各態様における、（ａ）、（ｂ）は、その両方または一方を、第一試薬あるいは第二試薬に含有させることができる。それぞれの含有のさせかたは、臨床検査における測定機器や測定試薬の設計（性能や使いやすさなど）を考慮し、適宜選択しうる。一般にはＡの態様の（ａ），（ｂ）の両方を第二試薬に含有させることが好適であるが、Ａの態様の（ａ）を第一試薬、（ｂ）を第二試薬に含有させることも好適に使用しうる。
【００５５】
以上、本発明の測定方法、測定試薬の代表的な態様を例として説明したが、本発明の抗体を使用することを限度として、競合免疫測定法など当業者に周知な各種態様をとりうることは当然に理解できる。
【００５６】
上記で説明した、本発明の測定方法、測定試薬におけるブタインスリンとの交差反応性は１８％未満である。ヒトインスリンの測定目的に応じて要求される交差反応性の程度は変わるが、好ましくは１５％未満、より好ましくは１０％未満、さらに好ましくは５％未満〜２％未満、特に好ましくは１％未満である。本発明の抗体を使用した場合、実質的な交差反応性を０％と評価することができるので、１％未満の交差反応性として、０．９〜０．０１％といった交差反応性の測定方法、測定試薬を設計することができる。
【００５７】
測定方法、測定試薬における交差反応性の定量的な評価方法としては、交差反応性を評価したい測定方法、測定試薬を用い、（１）試験化合物による競合試験を行いＩＣ５０（５０％阻害濃度）を求める方法、（２）試験化合物の濃度を測定し、理論濃度に対する割合を求める方法、（３）上記（２）において、試験化合物の系列希釈試料を測定し、各試料毎に交差反応性を求め、相加平均（平均交差反応性）を求める方法、などがある。上記（２）の具体的な計算式としては、以下を示すことができる。
交差反応性（率）（％）＝測定された試験化合物の濃度／試験化合物の理論濃度×１００
なお、交差反応性の厳密な意味からは、モル換算して比較するべきであるが、本発明におけるヒトインスリンとブタインスリンなど交差性物質の分子量は同一であるか、近似しているので、モル換算せず、質量のまま簡易に計算することでも、見積もることができる。
【００５８】
本発明は、以下の工程を含む、治療のために投与中のインスリン類似化合物及びヒト以外の動物種由来のインスリンなどの外来性インスリンを測定する方法も提供する。すなわち、ヒトインスリン及び外来性インスリンを測定し、ヒトインスリン及び外来性インスリンの総濃度を求める工程と組み合わせ、前記のヒトインスリン測定方法によってヒトインスリン濃度を求め、総濃度から差し引くことによって治療のために投与中の外来性インスリンの濃度を求めることができる。
【００５９】
本発明の抗体を用いる測定方法における検出対象の「試料」としては、主に生体（生物）由来の体液（生物由来試料）を挙げることができ、ヒトインスリンが含有される試料であれば特に限定されない。好ましくは、血液、血清、血漿、尿、唾液、喀痰、膵臓抽出液など、より好ましくは、血液、血清、血漿などを挙げることができる。
【００６０】
以下、実施例をあげて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００６１】
〔試験例１〕本発明のモノクローナル抗体の製造方法
１．免疫用抗原の調製
ヒトインスリン（リコンビナント、Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ社製 ３０−ＡＩ５１）をコンプリートフロインドアジュバント（Ｗａｋｏ社製）と１：１で混合後、連結シリンジを用いてエマルジョンを作製し、免疫用抗原とした。
【００６２】
２．ハイブリドーマの作製
上記、免疫用抗原を雌のＢＡＬＢ／ｃマウスの背部皮下に注射した（１匹当たり２０〜５０μｇ）。この操作（免疫）を１週間毎に２回繰り返した。免疫開始３週間後、試験採血して得た抗血清のうち、後述する抗原固相化ＥＬＩＳＡ法による試験にて、高い抗体価が確認されたマウスから脾臓を摘出し、５０％−ＰＥＧ１４５０（シグマ社製）を用いた常法により細胞融合を行った。ミエローマ細胞はＳＰ２／Ｏを用いた。得られた融合細胞は、脾臓細胞として２．５×１０６個／ｍＬになるようにＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）、１５％ウシ胎児血清、及び１０％のＢＭ−Ｃｏｎｄｉｍｅｄ  Ｈ１  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、９６穴培養プレートに０．２ｍＬずつ分注した。これを５％ＣＯ２インキュベーター中で３７℃にて培養した。
【００６３】
３．本発明のモノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニング
細胞融合７日後に１次スクリーニングとして、培養上清を用いて後述する抗原固相化ＥＬＩＳＡ法を行い、ヒトインスリンに対し高い反応性を示したｗｅｌｌを１次陽性ｗｅｌｌとして選別した。該１次陽性ｗｅｌｌ中の細胞は、２４穴プレートにおいて継代した。継代２日後、２次スクリーニングとして、培養上清を用いて後述するヒトインスリンの競合ＥＬＩＳＡ法を行い、ヒトインスリンに対し高い反応性を示すｗｅｌｌを２次陽性ｗｅｌｌとして選択した。３次スクリーニングとして、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）を用いた反応性測定法により、ヒトインスリンのみに特異的な反応性を示し、その他プロインスリン、インスリン類似化合物（インスリンリスプロ、インスリンアスパルト、インスリングラルギン、インスリンデテミル、インスリングルリジン）、ブタインスリン、ウシインスリンとは交差反応性を示さないｗｅｌｌを選択して３次陽性ｗｅｌｌとした。さらに、４次スクリーニングとして、３次陽性ｗｅｌｌ中の細胞を培養し、培養上清を用いてヒトインスリンと、ヒトインスリンβ鎖のＣ末端領域の配列「ＲＧＦＦＹＴＰＫＴ」から成るペプチド断片（配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチド断片であって、前記ペプチドのアミノ酸配列は、Ｃ末端アミノ酸が「Ｔ」である点のみが、ブタインスリン（Ｃ末端アミノ酸「Ａ」）と異なる）との競合ＥＬＩＳＡ法を行い、当該ペプチド断片に対して反応性を示さず、ヒトインスリンに対し高い反応性を示すｗｅｌｌを選択して４次陽性ｗｅｌｌとした。
【００６４】
３−１．抗原固相化ＥＬＩＳＡ法用プレートの作製
１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２；以下、ＰＢＳということがある）で１μｇ／ｍＬの濃度に調製したヒトインスリン（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ社製３０−ＡＩ５１）をスクリーニング用抗原として、５０μＬ／ｗｅｌｌずつ９６穴プレートに固相化し、４℃で一晩静置した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０及び０．１％プロクリン３００（ＳＵＰＥＬＣＯ社製）を含むＰＢＳ溶液（以下、ＰＢＳＴということがある）４００μＬ／ｗｅｌｌで３回洗浄後、１％ＢＳＡを含むＰＢＳＴ（以下、ＢＳＡ−ＰＢＳＴということがある）を１００μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、室温で１時間静置してブロッキングを行い、抗原固相化ＥＬＩＳＡ法用プレートを作製した。該抗原固相化ＥＬＩＳＡ法用プレートは、ＰＢＳＴで３回洗浄後、下記、抗原固相化ＥＬＩＳＡ法はじめ各試験例、実施例に記載の試験に用いた。なお、本明細書に記載の試験例、実施例で使用されたヒトインスリンは、２６ＩＵ／ｍｇで国際単位に換算される。
【００６５】
３−２．抗原固相化ＥＬＩＳＡ法
（i）上記、抗原固相化ＥＬＩＳＡ法用プレートに、ＢＳＡ−ＰＢＳＴにより段階希釈した試験採血により得た各マウス抗血清、あるいは融合細胞の培養上清を５０μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、室温で１時間静置した。
（ii）ＰＢＳＴで３回洗浄後、ＨＲＰ−Ｇｔ  Ｆ（ａｂ’）２−Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  Ｉｇ’ｓ（ＢＩＯＳＯＵＲＣＥ社製  ＡＭＩ４４０４）をＢＳＡ−ＰＢＳＴで５０００倍希釈した溶液を５０μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、室温で１時間静置した。
（iii）ＰＢＳＴで３回洗浄後、０．０２％過酸化水素水を含む０．２Ｍクエン酸緩衝液（以下、基質溶解液ということがある）にＯＰＤ（東京化成工業社製）を２ｍｇ／ｍＬにて溶解し、５０μＬ／ｗｅｌｌずつ添加して室温で１時間静置した。
（iv）１ｍＭ ＥＤＴＡを含む１．５Ｎ硫酸（以下、反応停止液ということがある）を５０μＬ／ｗｅｌｌずつ添加し、タイターテック（登録商標）マルチスキャンプラスＭＫII（Ｆｌｏｗ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を用いて波長４９２ｎｍにて吸光度を測定した。
【００６６】
３−３．ヒトインスリンの競合ＥＬＩＳＡ法
（i）抗原固相化ＥＬＩＳＡ法用プレートに、ヒトインスリン（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ社製 ３０−ＡＩ５１）をＢＳＡ−ＰＢＳＴで各々０μｇ／ｍＬ、２．５μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬに希釈した溶液を２５μＬ／ｗｅｌｌずつ分注した。
（ii）次いで、ＢＳＡ−ＰＢＳＴで各々５倍、２５倍に希釈した融合細胞の培養上清あるいは培養上清の原液を２５μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、室温で１時間静置した。
（iii）以降の操作は、前記３−２．抗原固相化ＥＬＩＳＡ法の工程（ii）〜（iv）と同様に行った。
【００６７】
３−４．Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）を用いた抗体と各試験化合物との反応性測定法
Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製  ＪＪ−１０３７−０２）を用いて抗体の反応特異性を指標にハイブリドーマのスクリーニング試験を行った。
（i）Ｓｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ  ＣＭ５（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製  ＢＲ−１００５−３０）に  Ｍｏｕｓｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｋｉｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製  ＢＲ−１００８−３８）及びＡｍｉｎｅ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製  ＢＲ−１０００−５０）を使用してＡｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓを固定化した。
（ii）Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓを固定化したＳｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ  ＣＭ５に、細胞融合の培養上清の原液を流速３０μＬ／ｍｉｎで３００秒間添加し、培養上清中に含まれる抗体をＡｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓに捕捉させた。
（iii）ＨＢＳ−ＥＰ＋  １０×（ランニングバッファー）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製  ＢＲ−１００６−６９）をＮａＯＨでｐＨ８．５に調整したのち、精製水にて最終的に１０倍希釈してＨＢＳ−ＥＰ＋使用液を調整し、以下に挙げる試験化合物を１０ｎｇ／ｍＬに希釈するため用いた。Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓを固定化したＳｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ  ＣＭ５に、各試験化合物の希釈液を、０ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬの２濃度につき流速３０μＬ／ｍｉｎで各１２０秒間添加した。またその際にフリーランニングによる解離時間を１２０秒間と設定した。なお、ＨＢＳ−ＥＰ＋使用液の処方は０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．５）、０．１５Ｍ  塩化ナトリウム、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００５％  ＳｕｒｆａｃｔａｎｔＰ２０である。
＜試験化合物＞
（１）ヒトインスリン：Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ社製  ３０−ＡＩ５１
（２）プロインスリン：ＩＲＲ社製  Ｐｒｏｉｎｓｕｌｉｎ，Ｈｕｍａｎ，ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，ＮＩＢＳＣ  ｃｏｄｅ：  ８４／６１１
（３）インスリン類似化合物
インスリンリスプロ１００単位／ｍＬ：日本イーライリリー社製
インスリンアスパルト１００単位／ｍＬ：ノボノルディスクファーマ社製
インスリングラルギン１００単位／ｍＬ：サノフィ・アベンティス社製
インスリンデテミル１００単位／ｍＬ：ノボノルディスクファーマ社製
インスリングルリジン１００単位／ｍＬ：サノフィ・アベンティス社製
（４）ヒト以外の動物種由来インスリン
ウシインスリン：ＳＩＧＭＡ  Ｉ５５００
ブタインスリン：ＷＡＫＯ  ０９１−０４２１１
（iv）Ｇｌｙｃｉｎｅ  １．５（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製  ＢＲ−１００３−５４）とＧｌｙｃｉｎｅ  ２．０（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製  ＢＲ−１００３−５５）を１：１で混合して再生溶液とし、再生処理を１８０秒間行った。
【００６８】
３−５．合成ペプチド断片の競合ＥＬＩＳＡ法
（i）ヒトインスリンβ鎖のＣ末端領域の配列「ＲＧＦＦＹＴＰＫＴ」（配列表配列番号１）から成るペプチド断片を作製した。当該ペプチド断片の作製にはペプチド自動合成装置を使用し、Ｆｍｏｃ法により合成、及び精製した。ＨＰＬＣを用い、ペプチドの純度が９５％以上であることを確認した。また、分子量は質量分析装置（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）にて理論値と同じであることを確認した。
（ii）抗原固相化ＥＬＩＳＡ法用プレートに上記（i）で作製した合成ペプチド断片、またはヒトインスリン（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ社製 ３０−ＡＩ５１）をＢＳＡ−ＰＢＳＴで各０μｇ／ｍＬ、２．５μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬに希釈した溶液を２５μＬ／ｗｅｌｌずつ分注した。
（iii）以降の操作は、前記３−３．ヒトインスリンの競合ＥＬＩＳＡ法の工程（ii）、(iii）と同様に行った。
【００６９】
４．本発明のモノクローナル抗体と組み合わせて使用するモノクローナル抗体Ａを産生するハイブリドーマのスクリーニング
細胞融合７日後に１次スクリーニングとして、培養上清を用いて抗原固相化ＥＬＩＳＡ法を行い、ヒトインスリンに対して高い反応性を示したｗｅｌｌを１次陽性ｗｅｌｌとして選別した。該１次陽性ｗｅｌｌ中の細胞は、２４穴プレートで継代した。継代２日後、２次スクリーニングとして、培養上清を用いて競合ＥＬＩＳＡ法を行い、ヒトインスリンに対し高い反応性を示すｗｅｌｌを２次陽性ｗｅｌｌとして選択した。
【００７０】
５．クローニング及びモノクローナル抗体採取
上記３．（４次スクリーニングまで完了）及び４．（２次スクリーニングまで完了）のスクリーニングで選択したハイブリドーマを限界希釈法にてクローニングし、それぞれハイブリドーマ６６２２４、６６４０８を得た。次いで各ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体を採取するため、ハイブリドーマ投与の２週間前にプリスタン０．５ｍＬを腹腔内に注射しておいた１２週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスに、ハイブリドーマを細胞数０．５×１０６個の量で腹腔内に投与した。１４日後に腹水を採取し、遠心処理して上清を得た。上清を等量の吸着用緩衝液（３ｍｏｌ／Ｌ  塩化ナトリウム、１．５ｍｏｌ／Ｌ  Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＮａＯＨ緩衝液、ｐＨ８．５）と混和後、ろ過した。該ろ液を、吸着用緩衝液で平衡化したプロテインＡセファロースカラムに通し、ろ液中の抗体をカラムに吸着させた後、０．１ｍｏｌ／Ｌ  クエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）で溶出させた。該溶出液を、１ｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で中和後、ＰＢＳで透析を行い、抗体を採取した。
以下、６６２２４抗体、６６４０８抗体としてそれぞれ試験に用いた。
【００７１】
６６２２４抗体及び６６４０８抗体を産生するハイブリドーマは、出願人によって独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（住所：日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に２００９年６月２６日に寄託手続がされ、受託番号（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３１４、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３１５）が付与されている。
【００７２】
〔試験例２〕本発明のモノクローナル抗体のヒトインスリン、プロインスリン、インスリン類似化合物、ブタインスリン、ウシインスリンとの交差反応性
６６２２４抗体あるいは６６４０８抗体のプロインスリン、インスリン類似化合物、ブタインスリン、ウシインスリンとの交差反応性についてＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００を用いて試験を行った。試験方法は、試験例１の３−４．と同様であり、６６２２４抗体については抗体精製後における各試験化合物に対する特異反応性を確認するため、さらに６６４０８抗体についても抗体精製後における各試験化合物に対する特異反応性を評価するため、同試験を実施した。
【００７３】
１．試験方法
Ｓｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ  ＣＭ５に固定化したＡｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓに６６２２４抗体あるいは６６４０８抗体を捕捉させ、試験化合物としてヒトインスリン、プロインスリン、各種インスリン類似化合物、ブタインスリン、ウシインスリンを添加することでそれぞれの反応性を評価した。具体的な操作手順は以下のとおりであり、試験化合物は試験例１と同じものである。
（i）Ｓｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ  ＣＭ５にＡｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ  
ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓを固定化した。
（ii）ＨＢＳ−ＥＰ＋使用液（ｐＨ８．５）で６６２２４抗体あるいは６６４０８抗体を５μｇ／ｍＬとなるよう希釈し、流速３０μＬ／ｍｉｎで３００秒間添加し、Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓが固定化されたＳｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ  ＣＭ５に６６２２４抗体あるいは６６４０８抗体を捕捉させた。
（iii）Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓを固定化したＳｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ  ＣＭ５に、ＨＢＳ−ＥＰ＋使用液（ｐＨ８．５）で希釈した試験化合物を０ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬの２濃度につき流速３０μＬ／ｍｉｎで各１２０秒間添加した。またその際にフリーランニングによる解離時間を１２０秒間と設定した。
（iv）Ｇｌｙｃｉｎｅ  １．５とＧｌｙｃｉｎｅ  ２．０を１：１で混合して再生溶液とし、再生処理を１８０秒間行った。
【００７４】
２．結果
２−１．６６２２４抗体の反応性
６６２２４抗体について、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００を用いてヒトインスリン、プロインスリン、各種インスリン類似化合物（インスリンリスプロ、インスリンアスパルト、インスリングラルギン、インスリンデテミル、インスリングルリジン）、ブタインスリン、ウシインスリンとの反応性を確認した。結果を図２に示す。図２中、縦軸は、センサー表面上での反応（抗体への抗原の結合）による質量変化を表しており（Ｒｅｓｐｏｎｓｅ）、「ＲＵ」は、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）測定系における独自の単位である。また、横軸は時間（Ｔｉｍｅ）を示しており、単位は「秒（ｓ）」である（以下、同様）。ヒトインスリン濃度１０ｎｇ／ｍＬにおいて２．０ＲＵの反応性が認められた一方で、その他の試験化合物（１０ｎｇ／ｍＬ）ではＲＵが０と算出され、全く反応性が認められなかった（図２）。これより、６６２２４抗体は、本明細書でいう「ヒトインスリンと反応し、ブタインスリンとは反応しない抗体」で、「さらに、ウシインスリン、プロインスリン、インスリン類似化合物の１以上と反応しない性質を有する抗体」であることが確認された。
２−２．６６４０８抗体の反応性
６６４０８抗体について、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００を用いてプロインスリン、各種インスリン類似化合物（インスリンリスプロ、インスリンアスパルト、インスリングラルギン、インスリンデテミル）、ブタインスリン、ウシインスリンとの反応性を確認した。結果を図３に示す。ヒトインスリン濃度１０ｎｇ／ｍＬにおいて、２．５ＲＵの反応性が認められた一方で、ウシインスリンではＲＵが０と算出され、ウシインスリンに対する反応性は認められなかった。その一方で、その他の試験化合物については０．６ＲＵ〜１３ＲＵが算出され、反応性が認められた（図３）。これより６６４０８抗体は、本明細書でいう「少なくともヒトインスリンと反応する抗体Ａ」（ヒトインスリンと反応し、ヒト以外の動物種由来のインスリン及びインスリン類似化合物（の一部）と反応する抗体）であることが確認された。
【００７５】
〔試験例３〕６６２２４抗体の認識エピトープの確認
試験例２の結果より、６６２２４抗体は、ヒトインスリンには反応し、ブタインスリンには反応しないことが確認された。ヒトインスリンとブタインスリンは、β鎖Ｃ末端のアミノ酸が「Ｔ」であるか「Ａ」である点が唯一相違しており（図１）、６６２２４抗体はこの１アミノ酸の相違に起因してヒトインスリンとブタインスリンを識別認識していることが考えられた。そこで６６２２４抗体の認識エピトープを確認するため、ヒトインスリンとブタインスリンの間で異なっているアミノ酸配列部位を含む合成ペプチド断片（前記〔試験例１〕３−５にて作製）を用いた競合ＥＬＩＳＡ法を行った。この試験において６６２２４抗体が当該合成ペプチド断片と反応（競合）すれば、６６２２４抗体はインスリンβ鎖Ｃ末端を含むアミノ酸配列の一次構造の違い（置換）を認識していると考えられる。６６２２４抗体が当該合成ペプチド断片と反応しない場合には、６６２２４抗体はヒトインスリン分子中で当該β鎖Ｃ末端アミノ酸配列領域が形成する立体構造を認識していると考えることができる。
【００７６】
１．試験方法
以下の手順に従って合成ペプチド断片と６６２２４抗体との反応性の有無を調べた。
（i）ＰＢＳを用いて、ヒトインスリン（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ社製 ３０−ＡＩ５１）を１μｇ／ｍＬに希釈して９６穴プレートに５０μLずつ添加し、室温で２時間静置した。
（ii）０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０及び０．１％プロクリン３００（ＳＵＰＥＬＣＯ社製）を含むＰＢＳ溶液（以下ＰＢＳＴという）４００μＬ／ｗｅｌｌで３回洗浄した。
（iii）ＢＳＡ−ＰＢＳＴを１００μＬずつ添加し、室温で１時間静置した。
（iv）添加したＢＳＡ-ＰＢＳＴ溶液を全て吸引除去した。
（v）競合させる試験化合物としてヒトインスリンあるいは合成ペプチド断片をＢＳＡ-ＰＢＳＴで各０μｇ／ｍＬ、２．５μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬに希釈して２５μLずつ添加し、さらにその上から６６２２４抗体をＢＳＡ-ＰＢＳＴで２μｇ／ｍＬに希釈して ２５μＬずつ添加し、室温で１時間静置した。
（vi）ＰＢＳＴ溶液４００μＬ／ｗｅｌｌで３回洗浄した。
（vii）ＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧγ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ 社製、１０３０−０５）を５０００倍に希釈して５０μＬずつ添加し、室温で１時間静置した。
（viii）ＰＢＳＴ溶液４００μＬ／ｗｅｌｌで３回洗浄した。
（ix）基質溶解液にＯＰＤ（東京化成工業社製）を２ｍｇ／ｍＬになるよう溶解し、ｗｅｌｌに５０μＬずつ添加して室温で１時間静置した。
（x）反応停止液を５０μＬずつ添加し、タイターテック（登録商標）マルチスキャンプラスＭＫII（Ｆｌｏｗ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を用いて波長４９２nmにて吸光度を測定した。
なお、希釈溶液は、記述のあるもの以外については全てＢＳＡ-ＰＢＳＴとした。
【００７７】
２．結果
試験結果を表１及び図４に示す。
６６２２４抗体はヒトインスリンと反応性を示すため、固相化されたヒトインスリンと競合させる試験化合物としてヒトインスリンを使用した場合には、その濃度に依存して反応性が低下した。これは競合させた溶液中のヒトインスリンによって６６２２４抗体が吸収されるため、固相化されたヒトインスリンと反応する６６２２４抗体量が少なくなるためである。しかしながら合成ペプチド断片を競合させる試験化合物として使用した場合には、合成ペプチド断片の濃度に依存した反応性の変動は全く見られなかった。これより、６６２２４抗体は、合成ペプチド断片それ自体とは反応性が無いことが確認された。以上の結果から、６６２２４抗体はヒトインスリンのβ鎖Ｃ末端のアミノ酸を含むアミノ酸配列の１次構造とは反応性を示さず、ヒトインスリン分子中で当該β鎖Ｃ末端アミノ酸配列領域が形成する立体構造を認識していると考えられた。
【００７８】
【表１】
0006055062.tif 000002
【００７９】
〔実施例１〕本発明のモノクローナル抗体と、少なくともヒトインスリンと反応する抗体Ａの組み合わせによるヒトインスリンの測定１＜ＬＴＩＡ法＞
１．ラテックス粒子の作製
攪拌機、還流用冷却器、温度検出器、窒素導入管及びジャケットを備えたガラス製反応容器（容量２Ｌ）に、蒸留水１１００ｇ、スチレン２００ｇ、スチレンスルホン酸ナトリウム０．２ｇ、及び、蒸留水５０ｇに過硫酸カリウム１．５ｇを溶解した水溶液を仕込み、容器内を窒素ガスで置換した後、７０℃で攪拌しながら４８時間重合した。重合終了後、上記溶液をろ紙にてろ過処理し、ラテックス粒子を取り出した。得られたラテックス粒子の粒子径を、透過型電子顕微鏡装置  （日本電子社製、「ＪＥＭ−１０１０型」）を用いて１００００倍の倍率でラテックス粒子を撮影し、最低１００個以上の粒子について画像解析することにより平均粒子径を測定した。得られた平均粒子径は０．３μｍであった。
【００８０】
２．抗インスリン抗体感作ラテックス粒子の調製
２−１．６６２２４抗体感作ラテックス粒子溶液の作製
平均粒子径０．３μｍの１．０％ラテックス溶液（５ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（以下、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌという）（ｐＨ８．５））に、５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）で０．６０ｍｇ／ｍＬに希釈した６６２２４抗体溶液を等量添加して４℃２時間攪拌した。その後、上記ラテックス溶液と抗体溶液の混合溶液に０．５％ＢＳＡ含有５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）を等量添加して４℃１時間攪拌した。次に、これを遠心して上清を除去後、沈殿を５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）で再懸濁し、６６２２４抗体感作ラテックス粒子溶液を作製した。
２−２．６６４０８抗体感作ラテックス粒子溶液の作製
平均粒子径０．３μｍのラテックスを用いて上記と同じ方法により６６４０８抗体感作ラテックス粒子溶液を作製した。
【００８１】
３．試薬の調製
３−１．第一試薬の調製
５００ｍＭの塩化ナトリウム及び０．２％ＢＳＡを含む５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）を調製し第一試薬とした。
３−２．第二試薬の調製
６６２２４抗体感作ラテックス粒子溶液及び６６４０８抗体感作ラテックス粒子溶液を等量混合し、５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）で波長６００ｎｍでの吸光度が５．０Ａｂｓとなるように希釈して第二試薬とした。
【００８２】
４．測定方法
第一試薬と第二試薬を組合せ、日立７１７０形自動分析装置を用いてヒトインスリン濃度依存的な粒子凝集塊の形成を確認した。具体的には、濃度０μＵ／ｍＬ、５μＵ／ｍＬ、２５μＵ／ｍＬ、５０μＵ／ｍＬ、１００μＵ／ｍＬ、２００μＵ／ｍＬヒトのインスリン溶液１０μＬに、第一試薬１５０μＬを加えて３７℃で５分間加温後、第二試薬５０μＬを加えて攪拌した。その後５分間の凝集形成に伴う吸光度変化を、主波長５７０ｎｍ、副波長８００ｎｍにて測定した。
【００８３】
５．測定結果
測定結果を表２に示す。表２よりヒトインスリン濃度依存的に感度が上昇し定量が可能であることが確認された。
【００８４】
【表２】
0006055062.tif 000003
【００８５】
〔実施例２〕本発明のモノクローナル抗体の組み合わせによるヒトインスリンの測定２＜サンドイッチＥＬＩＳＡ法＞
６６２２４抗体及び６６４０８抗体をそれぞれプレートに固相化（１次抗体）し、標識抗体（２次抗体）としてそれぞれ他方の抗体を組み合わせた。ヒトインスリン、プロインスリン、インスリン類似化合物、ウサギインスリン、イヌインスリン、ブタインスリン、ウシインスリンとの反応性についてサンドイッチＥＬＩＳＡ法を用いて試験を行った。
１．使用した抗体及び試験化合物
（１）モノクローナル抗体
６６２２４抗体：４．０３ｍｇ／ｍＬ
６６４０８抗体：９．０４ｍｇ／ｍＬ
（２）試験化合物
ヒトインスリン、プロインスリン、各種インスリン類似化合物（インスリンリスプロ、インスリンアスパルト、インスリングラルギン、インスリンデテミル、インスリングルリジン）、ブタインスリン、ウシインスリンは、試験例１、２と同じものを用いた。ウサギインスリン、イヌインスリンについては、それぞれ以下のとおりである。
ウサギインスリン：（株）森永生科学研究所  ２００７２３
イヌインスリン：（株）森永生科学研究所  ２００７２２
【００８６】
２．サンドイッチＥＬＩＳＡ測定方法
（i）ＰＢＳに６６２２４抗体あるいは６６４０８抗体を２μｇ／ｍＬに希釈した溶液を９６穴プレートに５０μＬ／ｗｅｌｌずつ固相化し、室温で２時間静置した。
（ii）ＰＢＳＴ４００μＬ／ｗｅｌｌで３回洗浄後、ＢＳＡ−ＰＢＳＴを１００μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、室温で１時間静置してブロッキングを行い、サンドイッチＥＬＩＳＡ用プレートを作製した。
（iii）サンドイッチＥＬＩＳＡ用プレートに、ヒトインスリン、プロインスリン、各種インスリンアナログ製剤、ブタインスリン、ウシインスリン、ウサギインスリン、イヌインスリンをＢＳＡ−ＰＢＳＴで各０ｎｇ／ｍＬ、２．５ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬに希釈した溶液を５０μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、室温で１時間静置した。
（iv）ＰＢＳＴで３回洗浄後、ビオチン標識化した６６２２４抗体あるいは６６４０８抗体をＢＳＡ−ＰＢＳＴで１μｇ／ｍＬに希釈した溶液を５０μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、室温で１時間静置した。
（v）ＰＢＳＴで３回洗浄後、Ｉｍｍｕｎｏ  Ｐｕｒｅ（登録商標）Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ，ＨＲＰ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ（ＰＩＥＲＣＥ社製  Ｐｒｏｄ＃２１１２６）をＢＳＡ−ＰＢＳＴで５０００倍に希釈した溶液を５０μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、室温で１時間静置した。
（vi）ＰＢＳＴで３回洗浄後、基質溶解液にＯＰＤ（東京化成工業社製）を２ｍｇ／ｍＬにて溶解し、５０μＬ／ｗｅｌｌずつ添加して室温で１時間静置した。
（vii）反応停止液を５０μＬ／ｗｅｌｌずつ添加し、タイターテック（登録商標）マルチスキャンプラスＭＫII（Ｆｌｏｗ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を用いて波長４９２ｎｍにて吸光度を測定した。
【００８７】
３．結果
３−１．６６２２４抗体固相化プレート測定結果
試験結果を表３及び図５に示す。
６６２２４抗体を１次抗体、６６４０８抗体を２次抗体とした場合、ヒトインスリンでは濃度依存的な吸光度の上昇が認められた一方で、その他の試験化合物では濃度依存的な吸光度の上昇が認められず、測定された吸光度自体も測定誤差程度のものであった。
【００８８】
【表３】
0006055062.tif 000004
【００８９】
３−２．６６４０８抗体固相化プレート測定結果
試験結果を表４及び図６に示す。
６６４０８抗体を１次抗体、６６２２４抗体を２次抗体とした場合、ヒトインスリンでは濃度依存的な吸光度の上昇が認められた一方で、その他の試験化合物では濃度依存的な吸光度の上昇が認められず、測定された吸光度自体も測定誤差程度のものであった。
【００９０】
【表４】
0006055062.tif 000005
【００９１】
４．考察
前記実施例２の結果より、６６２２４、６６４０８のいずれの抗体を１次抗体、２次抗体とした場合においても、ヒトインスリン以外の試験化合物は測定されないことから、本発明の測定方法は、それらの影響を受けずにヒトインスリンのみを定量できることがわかる。すなわち、本発明の測定方法によれば、プロインスリン、インスリン類似化合物、ブタインスリン、ウシインスリン、ウサギインスリン、イヌインスリンのいずれの影響も受けずにヒトインスリンのみを特異的に測定することができた。また、実施例２の結果に基づけば、ヒトインスリン以外の試験化合物に対する交差反応性が、市販試薬と比較して極めて低い（例えば、ブタインスリンに対する交差反応性が１８％未満）か、あるいは実質０％であるヒトインスリン測定方法及び測定試薬を構成することができる。
前記試験例２のＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００を用いた本発明のモノクローナル抗体の交差反応性試験結果では、６６２２４抗体はヒトインスリンとは反応するものの、それ以外の試験化合物とはいずれとも反応性を示さなかった。その一方で、６６４０８抗体ではウシインスリン以外の試験化合物とはいずれとも反応性を示したことから、６６２２４抗体のヒトインスリンに対する高い特異性により、ヒトインスリン特異的な測定が可能となったと考えられる。
また、前記試験例３により、６６２２４抗体はヒトインスリンのβ鎖Ｃ末端領域のアミノ酸配列が関与するヒトインスリンの立体構造を認識すると考えられるため、ヒトインスリンとブタインスリンの立体的に異なる特定部位をエピトープとする特性により、ヒトインスリン特異的な測定が可能になったことも本発明のひとつの特徴である。
【産業上の利用可能性】
【００９２】
本発明によれば、ブタインスリンをはじめとするヒト以外の動物種由来インスリン、プロインスリン、インスリン類似化合物の影響を受けず、ヒトインスリンの正確な測定が可能となった。即ち本発明によれば、インスリン類似化合物などを投与中の糖尿病患者においても、糖尿病患者自身のβ細胞から分泌された内因性のヒトインスリンのみを正確に測定できることから、糖尿病患者の病態把握を正確に行うことができる。
さらに、本発明の測定方法の測定結果と、ヒトインスリンに加えヒト以外の動物種由来のインスリンやインスリン類似化合物とも交差反応性を示す、例えば従来のインスリン測定方法による測定結果と組み合わせることで、糖尿病患者自身が産生している内因性のインスリンとインスリン類似化合物やヒト以外の動物種由来のインスリンの識別測定が可能になり、投与している外来性インスリンがどれだけ治療に寄与しているのか把握できるため、非常に有用である。
【受託番号】
【００９３】
（１）ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３１４
（２）ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３１５
（３）ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１２３３
（４）ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１２３４
【００９４】
[寄託生物材料への言及]
（１）６６２２４抗体を産生するハイブリドーマ６６２２４
イ  当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター
日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６）
ロ  イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
平成２１年６月２６日（２００９年６月２６日）（原寄託日）
平成２２年１２月６日（２０１０年１２月６日）（原寄託によりブタペスト条約に基づく寄託への移管日）
ハ  イの寄託機関が寄託について付した受託番号
ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３１４
（２）６６４０８抗体を産生するハイブリドーマ６６４０８
イ  当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
（１）に同じ
ロ  イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
平成２１年６月２６日（２００９年６月２６日）（原寄託日）
平成２２年１２月６日（２０１０年１２月６日）（原寄託によりブタペスト条約に基づく寄託への移管日）
ハ  イの寄託機関が寄託について付した受託番号
ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３１５
（３）６６２２１抗体を産生するハイブリドーマ６６２２１
イ  当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
（１）に同じ
ロ  イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
平成２１年４月８日（２００９年４月８日）（原寄託日）
平成２２年２月１７日（２０１０年２月１７日）（原寄託によりブタペスト条約に基づく寄託への移管日）
ハ  イの寄託機関が寄託について付した受託番号
ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１２３３
（４）６６２２６抗体を産生するハイブリドーマ６６２２６
イ  当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
（１）に同じ
ロ  イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
平成２１年４月８日（２００９年４月８日）（原寄託日）
平成２２年２月１７日（２０１０年２月１７日）（原寄託によりブタペスト条約に基づく寄託への移管日）
ハ  イの寄託機関が寄託について付した受託番号
ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１２３４
【図１】
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【図２−１】
0006055062.tif 000007
【図２−２】
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【図３−１】
0006055062.tif 000009
【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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