(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号７４に示すセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼの２６〜４１７番目のアミノ酸配列からなるペプチドに結合し、かつ２９〜４１７番目のアミノ酸配列からなるペプチドには結合しない、モノクローナルＩｇＡ抗体。
【請求項２】
（１）配列番号３に示すアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号４に示すアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、配列番号５に示すアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び
配列番号８に示すアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号９に示すアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、配列番号１０に示すアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む；
（２）配列番号１３に示すアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１４に示すアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、配列番号１５に示すアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び
配列番号１８に示すアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１９に示すアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、配列番号２０に示すアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む；
（３）配列番号２３に示すアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２４に示すアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、配列番号２５に示すアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び
配列番号２８に示すアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２９に示すアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、配列番号３０に示すアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む；
（４）配列番号３３に示すアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号３４に示すアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、配列番号３５に示すアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び
配列番号３８に示すアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号３９に示すアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、配列番号４０に示すアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む；または
（５）配列番号４３に示すアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号４４に示すアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、配列番号４５に示すアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び
配列番号４８に示すアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号４９に示すアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、配列番号５０に示すアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む；
請求項１に記載のモノクローナルＩｇＡ抗体。
【請求項３】
（Ｉ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号７に示すアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む；
（ＩＩ）配列番号１２に示すアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号１７に示すアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む；
（ＩＩＩ）配列番号２２に示すアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号２７に示すアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む；
（ＩＶ）配列番号３２に示すアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号３７に示すアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む；または
（Ｖ）配列番号４２に示すアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号４７に示すアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む；
請求項２に記載のモノクローナルＩｇＡ抗体。
【請求項４】
モノクローナル抗体がモノクローナルＩｇＡ抗体であり、
（ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号６に示すアミノ酸配列からなる軽鎖を含む；
（ｂ）配列番号１１に示すアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号１６に示すアミノ酸配列からなる軽鎖を含む；
（ｃ）配列番号２１に示すアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号２６に示すアミノ酸配列からなる軽鎖を含む；
（ｄ）配列番号３１に示すアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号３６に示すアミノ酸配列からなる軽鎖を含む；または
（ｅ）配列番号４１に示すアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号４６に示すアミノ酸配列からなる軽鎖を含む；
請求項２又は３に記載のモノクローナルＩｇＡ抗体。
【請求項５】
少なくとも２種類の腸内細菌に結合する、請求項１〜４の何れか１項に記載のモノクローナルＩｇＡ抗体。
【請求項６】
腸内細菌が、
Ｍｅｇａｍｏｎａｓ  ｈｙｐｅｒｍｅｇａｌｅ、
Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ、
Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｕｔａｃｔｕｓ、
Ｂｌａｕｔｉａ  ｃｏｃｃｏｉｄｅｓ、
Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｅｃｔａｌｅ、
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｕｒｉｎｕｓ、
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ、
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｕｌｖａ、及び
Ｅｎｔｅｒｏｒｈａｂｄｕｓ  ｍｕｃｏｓｉｃｏｌａ
からなる群より選択される少なくとも２種の細菌である、請求項５に記載のモノクローナル抗体。
【請求項７】
モノクローナルＩｇＡ抗体が、ＩｇＡ１又はＩｇＡ２である、請求項１〜６の何れか１項に記載のモノクローナルＩｇＡ抗体。
【請求項８】
モノクローナルＩｇＡ抗体がＪ鎖を含む多量体である、請求項１〜７の何れか１項に記載のモノクローナルＩｇＡ抗体。
【請求項９】
モノクローナルＩｇＡ抗体が分泌成分を含む、請求項１〜８の何れか１項に記載のモノクローナルＩｇＡ抗体。
【請求項１０】
モノクローナルＩｇＡ抗体が、ヒト化抗体またはキメラ抗体である、請求項１〜９の何れか１項に記載のモノクローナルＩｇＡ抗体。
【請求項１１】
以下の工程１及び２を含む、請求項１及び５〜９の何れか１項に記載のモノクローナルＩｇＡ抗体の製造方法：
（１）腸管粘膜固有層から採取されたＢ細胞と、それ以外の種類の細胞を混合して融合させ、ハイブリドーマを作製する工程１、
（２）工程１にて作製した該ハイブリドーマを培養し、腸内細菌と結合するモノクローナル抗体を産生する細胞を決定し、該細胞から、該抗体を回収する工程２であって、腸内細菌が、
Ｍｅｇａｍｏｎａｓ  ｈｙｐｅｒｍｅｇａｌｅ、
Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ、
Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｕｔａｃｔｕｓ、
Ｂｌａｕｔｉａ  ｃｏｃｃｏｉｄｅｓ、
Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｅｃｔａｌｅ、
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｕｒｉｎｕｓ、
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ、
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｕｌｖａ、及び
Ｅｎｔｅｒｏｒｈａｂｄｕｓ  ｍｕｃｏｓｉｃｏｌａ
からなる群より選択される少なくとも２種の細菌である。
【請求項１２】
請求項１〜１０の何れか１項に記載のモノクローナル抗体を含む、医薬組成物。
【請求項１３】
請求項１〜１０の何れか１項に記載のモノクローナル抗体を含む、経口又は経腸組成物。
【請求項１４】
モノクローナル抗体を含む炎症性腸疾患の治療用の医薬組成物であって、前記モノクローナル抗体がモノクローナルＩｇＡ抗体であり、前記モノクローナルＩｇＡ抗体が請求項１、請求項２の（１）、請求項３の（Ｉ）、及び請求項４の（ａ）に記載の少なくとも１種である、医薬組成物。
【請求項１５】
請求項１〜１０の何れか１項に記載のモノクローナル抗体をコードする核酸。
【請求項１６】
請求項１〜１０の何れか１項に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項１７】
請求項１〜７に記載のモノクローナル抗体由来のＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、及びｍｉｎｉｂｏｄｙからなる群から選択される少なくとも一種の抗体断片。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、モノクローナルＩｇＡ抗体、それを含む経口又は経腸組成物、及びそれを含む医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
腸管内は、生体にとっては言わば『体外』に当たるため、非常に多種、且つ多数の腸内常在細菌、ウイルス、食物由来等の抗原に、常に晒された状態となっている。この様な腸内常在細菌は、腸内細菌叢（以後、本明細書において、これを「腸内細菌フローラ」と呼ぶ場合がある。）を形成している。【０００３】
この腸内細菌叢は、腸上皮細胞等から構成される粘膜面を介して、生体に対して様々な機能を果たしていることが明らかになっており、腸内細菌が存在しないと腸管免疫系が正常に発達しないことも分かってきた（非特許文献１〜３）。【０００４】
もし腸内細菌叢が変化して宿主との共生関係が崩れると、腸管免疫系が過剰に刺激されてその恒常性が破綻し、延いては炎症性腸疾患、大腸がん、喘息、アレルギー、肥満等といった多くの疾患が誘発されてしまう。この様なことから、腸管免疫系は病原体等を排除するだけではなく、免疫系全体の恒常性の維持に重要な役割を担っていることが知られている（非特許文献４〜７）。【０００５】
消化管の粘膜組織表面は、常在細菌、病原性微生物、アレルゲン等といった抗原の生体内への侵入経路の一つであり、これら多数の外界からの病原性微生物の侵入部位として絶えず攻撃を受け、また様々な抗原に曝されている。これらの病原性微生物をはじめとする外来性抗原に対する認識及び／又は応答システムが、粘膜免疫システムと言われるものである。消化管の粘膜組織表面の直下には、多数の粘膜免疫システムを担う細胞が存在し、これらの細胞が、病原性微生物、食物抗原、アレルゲン外来性の異種抗原等に対する免疫応答を行う、ダイナミックな免疫機構を構成している。【０００６】
粘膜免疫システムは、腸上皮細胞からなる粘膜面を介して取り込まれた外来性の異種抗原に対して、腸管由来のＩｇＡ抗体を中心とした独自の免疫システムを構成している。腸管由来のＩｇＡ抗体はパイエル板、腸管膜リンパ節、孤立リンパ濾胞等のようないわゆる免疫反応の場としての特別な組織内でＴ細胞依存性に産生されるだけでなく、腸管粘膜固有層に散在する抗体産生細胞によっても大量に産生される（非特許文献８、９）。【０００７】
腸管由来のＩｇＡ抗体の機能の１つは病原菌を排除する機能である。管腔側へ分泌された腸管由来のＩｇＡ抗体は腸管腔内の病原菌やその毒素と結合し中和する。あるいは腸上皮細胞内、粘膜固有層等に侵入してきた病原菌、毒素等と結合し中和すると共に、腸管由来のＩｇＡ抗体そのものが管腔側へ分泌されるときにそれと共に斯かる病原菌も排除する。腸管由来のＩｇＡ抗体の機能で特徴的な点は、一般的な抗体が関与する全身免疫系の反応と異なり、炎症反応を起こさないことである（非特許文献１０〜１２）。【０００８】
もう一つの腸管由来のＩｇＡ抗体の機能は、腸内常在細菌と宿主の共生関係の維持である。腸管由来のＩｇＡ抗体は病原菌だけでなく常在細菌も認識してそれらと結合し、常在細菌が粘膜内へ過剰に侵入しないように防いでいる。しかも単に常在細菌を排除するのではなく、常在細菌と結合した腸管由来のＩｇＡ抗体は上皮細胞上のムチン層に担持され、常在細菌と腸管由来のＩｇＡ抗体によるバイオフィルムを形成して病原菌の上皮細胞への接触、侵入等を防いでいると考えられている（非特許文献１３、１４）。【０００９】
このような腸管粘膜免疫システムのうち、特に体液性免疫システムの構築において、抗体の体細胞突然変異とクラススイッチが、重要な役割を果たしていることが知られている。体細胞突然変異は、抗体を産生するＢ細胞の免疫グロブリン遺伝子を多様化して、高親和性抗体を産生するための、生体内に備わっている機構である。一方、抗体のクラススイッチは、抗体の可変領域は変化させずに、Ｈ鎖定常領域の構造を変化させる現象、すなわち、生体内で選択されたＩｇＭ抗体を産生する細胞において、そのＩｇＭ抗体と同じ可変領域を有するＩｇＧ抗体、ＩｇＥ抗体、ＩｇＡ抗体等といった、他のクラスの免疫グロブリンを産生するようにクラスを変更する現象である。これら２つの現象が組み合わさることにより、多様な抗原結合部位を有する多種類の抗体が産生され、かつ各抗原結合部位のそれぞれについて各クラスの抗体が産生されることになり、身体の免疫機能を適切に調整することができる。【００１０】
体細胞突然変異とクラススイッチには、ともにａｃｔｉｖａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃｙｔｉｄｉｎｅ  ｄｅａｍｉｎａｓｅ（ＡＩＤ）タンパク質が必要であることが知られている。ＡＩＤタンパク質のＮ末端側が体細胞突然変異に関与しており、Ｃ末端側がクラススイッチに関与していることまで知られている（非特許文献１５、１６）。体細胞突然変異では、抗体遺伝子に高い確率でＡＩＤによるＤＮＡ切断が生じ、それが引き金になって抗体遺伝子に変異が導入される（非特許文献１７）。【００１１】
また、このようなＡＩＤタンパク質のＮ末端側の２３位のグリシンをセリンに置換し変異を導入したＡＩＤ  Ｇ２３Ｓを発現するマウス（ＡＩＤ  Ｇ２３Ｓマウス）では、クラススイッチは生じるために各クラスの抗体が十分に産生されるものの、体細胞突然変異が起こらず、抗体の抗原結合性が低下していることが明らかになっている（非特許文献１８）。【００１２】
炎症性腸疾患は、治療に難渋する事が多く難病に指定されている。この疾患は、宿主免疫系と腸内細菌のバランスが崩れること、即ち腸内細菌の異常増殖や、腸内フローラの病的変化により発症する疾患の一つに挙げられるものである。この疾患の治療には、臨床現場においてステロイドや抗ＴＮＦ抗体等の免疫抑制剤の全身投与が行われている。しかしながら、これらの薬剤は長期投与が必要で、その副作用が大きな問題となっている。そのため、副作用が少なく、効率的に炎症性腸疾患等といった腸内疾患の治療又は予防に有効な医薬品の開発が望まれている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｃｅｒｆ−Ｂｅｎｓｕｓｓａｎ  Ｎ，  ａｎｄ  Ｇａｂｏｒｉａｕ−Ｒｏｕｔｈｉａｕ  Ｖ．，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０１０；１０：７３５
【非特許文献２】Ｈｏｏｐｅｒ  ＬＶ，ａｎｄ  Ｍａｃｐｈｅｒｓｏｎ  ＡＪ．，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０１０；１０：１５９
【非特許文献３】Ｒｏｕｎｄ  ＪＬ，ａｎｄ  Ｍａｚｍａｎｉａｎ  ＳＫ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２０１０；１０７：１２２０４
【非特許文献４】Ｖｉｊａｙ−Ｋｕｍａｒ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１０；３２８：２２８
【非特許文献５】Ｓｈｕｌｚｈｅｎｋｏ  Ｎ，ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ２０１１；１７：１５８５
【非特許文献６】Ｂｒｙ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９６；２７３：１３８０
【非特許文献７】Ｔｕｒｎｂａｕｇｈ  ＰＪ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２００６；４４４：１０２７
【非特許文献８】Ｃｅｒｕｔｔｉ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ２０１１；１２３８：１３２
【非特許文献９】Ｆａｇａｒａｓａｎ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０１０；２８：２４３
【非特許文献１０】Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ  ＭＩ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２００３；１８：７３９
【非特許文献１１】Ｍａｒｔｉｎｏｌｉ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２００７；２７：９７５
【非特許文献１２】Ｂｏｕｌｌｉｅｒ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００９；１８３：５８７９
【非特許文献１３】Ｐｈａｌｉｐｏｎ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２００２；１７：１０７
【非特許文献１４】Ｍａｃｐｈｅｒｓｏｎ  ＡＪ，ａｎｄ  Ｕｈｒ  Ｔ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００４；３０３：１６６２
【非特許文献１５】Ｓｈｉｎｋｕｒａ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００４；５：７０７
【非特許文献１６】Ｔａ  ＶＴ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００３；４：８４３
【非特許文献１７】Ｃｈａｕｄｈｕｒｉ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ２００３；４２２：７２６
【非特許文献１８】Ｗｅｉ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １２（３），  ２６４−２７０，  ２０１１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の課題は、生体における腸内環境の改善若しくは最適化、腸内腐敗の抑制、又は腸内細菌の異常増殖及び／又は腸内細菌叢の病的変化を抑制する効果を発揮する成分を提供することである。また、腸内疾患の治療に好適に用いられる有効成分を提供することも、本発明の課題である。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、上述の課題を解決すべく、鋭意検討したところ、特定のアミノ酸配列を有するタンパク質の特定の部位に特異的に結合するモノクローナルＩｇＡ抗体が、腸内免疫システムにおける過剰な応答を抑制し、大腸の粘膜固有層における腺管の減少から復帰させる作用を有することを見出した。また、このようなモノクローナルＩｇＡ抗体の作用は、個体に対して経口投与することによって確認された。【００１６】
本願発明は、この様な知見に基づいて完成したものであり、以下に示す広い態様の発明を包含するものである。【００１７】
＜項１＞
セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼの１１〜３３３番目のアミノ酸に結合する、モノクローナルＩｇＡ抗体。【００１８】
なお、項１に示す態様の発明には、以下の項１−１〜項１−１７にて示す態様の、モノクローナルＩｇＡ抗体に関する発明も広く包含される。【００１９】
＜項１−１＞
セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼの２５〜４４番目のアミノ酸に結合する、項１に記載のモノクローナルＩｇＡ抗体。【００２０】
＜項１−２＞
セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼの２５〜２８番目のアミノ酸に結合する、項１に記載のモノクローナルＩｇＡ抗体。【００２１】
＜項１−３＞
モノクローナルＩｇＡ抗体が、
（１）配列番号３、１３、２３、３３、又は４３に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、
（２）配列番号４、１４、２４、３４、又は４４に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、及び
（３）配列番号５、１５、２５、３５、又は４５に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３
を含む重鎖可変領域；及び／又は
（Ｉ）配列番号８、１８、２８、３８、又は４８に示すアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、
（ＩＩ）配列番号９、１９、２９、３９、又は４９に示すアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、及び
（ＩＩＩ）配列番号１０、２０、３０、４０、又は５０に示すアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域を含む、項１及び項１−１、又は項１ー２に記載のモノクローナルＩｇＡ抗体。【００２２】
＜項１−４＞
モノクローナルＩｇＡ抗体が、配列番号２、１２、２２、３２、又は４２に示すアミノ酸配列からなる重鎖可変領域；及び／又は配列番号７、１７、２７、３７、又は４７に示すアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、項２及び項１−１〜項１ー３の何れか１項に記載のモノクローナルＩｇＡ抗体。【００２３】
＜項１−５＞
モノクローナルＩｇＡ抗体が、配列番号１、１１、２１、３１、又は４１に示すアミノ酸配列からなる重鎖；及び／又は配列番号６、１６、２６、３６、又は４６に示すアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、上記項１及び項１−１〜項１ー４の何れか１項に記載のモノクローナルＩｇＡ抗体。【００２４】
＜項１−６＞
少なくとも２種類の腸内細菌の成育を阻害する、上記項１及び項１−１〜項１−５の何れか１項に記載のモノクローナルＩｇＡ抗体。【００２５】
＜項１−７＞
腸内細菌が、
Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ属に属する細菌、
Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属に属する細菌、
Ｍｅｇａｍｏｎａｓ属に属する細菌、
Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する細菌、
Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する細菌、
Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ属に属する細菌、
Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ属に属する細菌、
Ｂｌａｕｔｉａ属に属する細菌、
Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する細菌、
Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ属に属する細菌、
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する細菌、
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属に属する細菌、
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属に属する細菌、
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属に属する細菌、
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属に属する細菌、
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属に属する細菌、及び
Ｅｎｔｅｒｏｒｈａｂｄｕｓ属に属する細菌
からなる群に属する細菌より選択される少なくとも２種の細菌である、項１、及び項１−１〜項１−６の何れか１項に記載のモノクローナルＩｇＡ抗体。【００２６】
＜項１−８＞
腸内細菌が、
Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃａ、
Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ  ｖｕｌｇａｔｕｓ、
Ｍｅｇａｍｏｎａｓ  ｆｕｎｉｆｏｒｍｉｓ、
Ｍｅｇａｍｏｎａｓ  ｈｙｐｅｒｍｅｇａｌｅ、
Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ、
Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ、
Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｕｔａｃｔｕｓ、
Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｂｅｕｍ、
Ｂｌａｕｔｉａ  ｐｒｏｄｕｃｔｕｓ、
Ｂｌａｕｔｉａ  ｃｏｃｃｏｉｄｅｓ、
Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｅｃｔａｌｅ、
Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｕｒｉｎｕｓ、
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ、
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｕｌｖａ、及び
Ｅｎｔｅｒｏｒｈａｂｄｕｓ  ｍｕｃｏｓｉｃｏｌａ
からなる群より選択される少なくとも２種の細菌である、項１、及び項１−１〜項１−７の何れか１項に記載のモノクローナルＩｇＡ抗体。【００２７】
＜項１−９＞
モノクローナルＩｇＡ抗体が、ＩｇＡ１又はＩｇＡ２である、項１、及び項１−１〜項１−８の何れか１項に記載のモノクローナルＩｇＡ抗体。【００２８】
＜項１−１０＞
モノクローナルＩｇＡ抗体が、Ｊ鎖を含む多量体である、項１、項１−１〜項１−９の何れか１項に記載のモノクローナルＩｇＡ抗体。【００２９】
＜項１−１１＞
モノクローナルＩｇＡ抗体が、分泌成分を含む、項１、項１−１〜項１−
１０の何れか１項に記載のモノクローナルＩｇＡ抗体。
【００３０】
＜項１−１２＞
モノクローナルＩｇＡ抗体が、同一種に由来するアミノ酸配列を有する、項１、項１−１〜項１−１１の何れか１項に記載のモノクローナルＩｇＡ抗体。【００３１】
＜項１−１３＞
モノクローナルＩｇＡ抗体が、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ロバ、ブタ、ウシ、ウマ、ニワトリ、サル、チンパンジー、又はヒトの何れかのアミノ酸に由来するアミノ酸配列を有する、項１、及び項１−１〜項１−１２の何れか１項に記載のモノクローナルＩｇＡ抗体。【００３２】
＜項１−１４＞
モノクローナルＩｇＡ抗体が、異種に由来するアミノ酸配列を有する、項１、及び項１−１〜項１ー１１の何れか１項に記載のモノクローナルＩｇＡ抗体。【００３３】
＜項１−１５＞
モノクローナルＩｇＡ抗体が、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ロバ、ブタ、ウシ、ウマ、サル、ニワトリ、チンパンジー、及びヒトからなる群より選択される２種以上に由来するアミノ酸配列を有する、項１、項１−１〜項１−１１、及び項１−１４の何れか１項に記載のモノクローナルＩｇＡ抗体。【００３４】
＜項１−１６＞
モノクローナルＩｇＡ抗体が、ヒト化抗体である、項１、項１−１〜項１ー１１、１−１４、及び項１−１５の何れか１項に記載のモノクローナルＩｇＡ抗体。【００３５】
＜項１−１７＞
モノクローナルＩｇＡ抗体が、キメラ抗体である、項１、項１−１〜項１ー１１、１−１４、及び項１−１５の何れか１項に記載のモノクローナルＩｇＡ抗体。【００３６】
＜項２＞
以下の工程１及び２を含む、項１に記載のモノクローナルＩｇＡ抗体の製造方法：
（１）腸管粘膜固有層から採取されたＢ細胞と、それ以外の種類の細胞を混合して融合させ、ハイブリドーマを作製する工程１、
（２）工程１にて作製した該ハイブリドーマを培養し、少なくとも２種類の腸内細菌と結合するモノクローナルＩｇＡ抗体を産生する細胞を決定し、該細胞から、該ＩｇＡ抗体を回収する工程２。【００３７】
なお、項２に示す態様の発明には、以下の項２−１〜項２−１８にて示す態様の、モノクローナルＩｇＡ抗体の製造方法に関する発明も広く包含される。【００３８】
＜項２−１＞
Ｂ細胞がＩｇＡ抗体を産生する細胞である、項２に記載の製造方法。【００３９】
＜項２−２＞
腸管粘膜固有層が、マウス由来、ラット由来、ハムスター由来、ウサギ由来、ヤギ由来、ヒツジ由来、ロバ由来、ブタ由来、ウシ由来、ウマ由来、ニワトリ由来、サル、チンパンジー又はヒト由来である、項２又は項２−１に記載の製造方法【００４０】
＜項２−３＞
他の細胞が、ミエローマ細胞である項２、項２−１、及び項２−２に記載の製造方法。【００４１】
＜項２−４＞
他の細胞が、マウス由来、ラット由来、ハムスター由来、ウサギ由来、ヤギ由来、ヒツジ由来、ロバ由来、ブタ由来、ウシ由来、ウマ由来、ニワトリ由来、サル由来、チンパンジー由来、又はヒト由来である、項２、及び項２−１〜項２−３の何れか１項に記載の製造方法。【００４２】
＜項２−５＞
腸内細菌が、
Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ属に属する細菌、
Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属に属する細菌、
Ｍｅｇａｍｏｎａｓ属に属する細菌、
Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する細菌、
Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する細菌、
Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ属に属する細菌、
Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ属に属する細菌、
Ｂｌａｕｔｉａ属に属する細菌、
Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する細菌、
Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ属に属する細菌、
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する細菌、
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属に属する細菌、
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属に属する細菌、
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属に属する細菌、
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属に属する細菌、
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属に属する細菌、及び
Ｅｎｔｅｒｏｒｈａｂｄｕｓ属に属する細菌
からなる群に属する細菌より選択される少なくとも２種の細菌である、項２、及び項２−１〜項２−４の何れか１項に記載の製造方法。【００４３】
＜項２−６＞
腸内細菌が、
Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃａ、
Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ  ｖｕｌｇａｔｕｓ、
Ｍｅｇａｍｏｎａｓ  ｆｕｎｉｆｏｒｍｉｓ、
Ｍｅｇａｍｏｎａｓ  ｈｙｐｅｒｍｅｇａｌｅ、
Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ、
Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ、
Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｕｔａｃｔｕｓ、
Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｂｅｕｍ、
Ｂｌａｕｔｉａ  ｐｒｏｄｕｃｔｕｓ、
Ｂｌａｕｔｉａ  ｃｏｃｃｏｉｄｅｓ、
Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｅｃｔａｌｅ、
Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｕｒｉｎｕｓ、
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ、
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｕｌｖａ、及び
Ｅｎｔｅｒｏｒｈａｂｄｕｓ  ｍｕｃｏｓｉｃｏｌａ
からなる群より選択される少なくとも２種の細菌である、項２、及び項２−１〜項２−５の何れか１項に記載の製造方法。【００４４】
＜項２−７＞
モノクローナルＩｇＡ抗体が、ＩｇＡ１又はＩｇＡ２である、項２、及び項２−１〜項２ー６の何れか１項に記載の製造方法。【００４５】
＜項２−８＞
モノクローナルＩｇＡ抗体が、Ｊ鎖を含む多量体である、項２、及び項２−１〜項２ー７の何れか１項に記載の製造方法。【００４６】
＜項２−９＞
モノクローナルＩｇＡ抗体が、分泌因子を含む、項２、及び項２−１〜項２ー８の何れか１項に記載の製造方法。【００４７】
＜項２−１０＞
モノクローナルＩｇＡ抗体が、同一種に由来するアミノ酸配列を有する、項２、及び項２−１〜項２−９の何れか１項に記載の製造方法。【００４８】
＜項２−１１＞
モノクローナルＩｇＡ抗体が、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ロバ、ブタ、ウシ、ウマ、ニワトリ、サル、チンパンジー、又はヒトの何れかに由来するアミノ酸配列を有する、項２、及び項２−１〜項２ー１０の何れか１項に記載の製造方法。【００４９】
＜項２−１２＞
モノクローナルＩｇＡ抗体が、異種に由来するアミノ酸配列を有する、項２、及び項２−１〜項２ー９の何れか１項に記載の製造方法。【００５０】
＜項２−１３＞
モノクローナルＩｇＡ抗体が、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ロバ、ブタ、ウシ、ウマ、ニワトリ、サル、チンパンジー、及びヒトからなる群より選択される２種以上に由来するアミノ酸配列を有する、項２、項２−１〜項２ー９、及び項２−１２の何れか１項に記載の製造方法。【００５１】
＜項２−１４＞
モノクローナルＩｇＡ抗体が、ヒト化抗体である、項２、項２−１〜項２ー９、項２−１２、及び項２−１３の何れか１項に記載の製造方法。【００５２】
＜項２−１５＞
モノクローナルＩｇＡ抗体が、キメラ抗体である、項２、項２−１〜項２ー９、項２−１２、及び項２−１３の何れか１項に記載の製造方法。【００５３】
＜項２−１６＞
モノクローナルＩｇＡ抗体が、
（１）配列番号３、１３、２３、３３、又は４３に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、
（２）配列番号４、１４、２４、３４、又は４４に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、及び
（３）配列番号５、１５、２５、３５、又は４５に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３
を含む重鎖可変領域；及び／又は
（Ｉ）配列番号８、１８、２８、３８、又は４８に示すアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、
（ＩＩ）配列番号９、１９、２９、３９、又は４９に示すアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、及び
（ＩＩＩ）配列番号１０、２０、３０、４０、又は５０に示すアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域を含む、項２及び項２−１〜項２〜１５の何れか１項に記載の製造方法。【００５４】
＜項２−１７＞
モノクローナルＩｇＡ抗体が、配列番号２、１２、２２、３２、又は４２に示すアミノ酸配列からなる重鎖可変領域；及び／又は配列番号７、１７、２７、３７、又は４７に示すアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、項２及び項２−１〜項２ー１６の何れか１項に記載の製造方法。【００５５】
＜項２−１８＞
モノクローナルＩｇＡ抗体が、配列番号１、１１、２１、３１、又は４１に示すアミノ酸配列からなる重鎖；及び／又は配列番号６、１６、２６、３６、又は４６に示すアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、項２及び項２−１〜項２〜１７の何れか１項に記載の製造方法。【００５６】
＜項３＞
項１に記載のモノクローナルＩｇＡ抗体を含む、医薬組成物。【００５７】
なお、項３に示す態様の発明には、以下の項３−１〜項３−６にて示す態様の、医薬組成物に関する発明も広く包含される。【００５８】
＜項３−１＞
医薬組成物が、腸内疾患の治療用である、項３に記載の医薬組成物。【００５９】
＜項３−２＞
腸内疾患が、腸内細菌の異常増殖及び／又は腸内細菌叢の病的変化により発症する疾患である、項３又は項３−１に記載の医薬組成物。【００６０】
＜項３−３＞
腸内細菌の異常増殖及び／又は腸内細菌叢の病的変化により発症する疾患が、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、アレルギー、喘息、肥満、及び自己免疫疾患からなる群から選択される、項３、項３−１、及び項３−２に記載の医薬組成物。【００６１】
＜項３−４＞
腸内細菌が、
Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ属に属する細菌、
Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属に属する細菌、
Ｍｅｇａｍｏｎａｓ属に属する細菌、
Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する細菌、
Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する細菌、
Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ属に属する細菌、
Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ属に属する細菌、
Ｂｌａｕｔｉａ属に属する細菌、
Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する細菌、
Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ属に属する細菌、
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する細菌、
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属に属する細菌、
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属に属する細菌、
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属に属する細菌、
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属に属する細菌、
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属に属する細菌、及び
Ｅｎｔｅｒｏｒｈａｂｄｕｓ属に属する細菌
からなる群に属する細菌より選択される少なくとも２種の細菌である、項３、及び項３−１〜項３−３の何れか１項に記載の医薬組成物。【００６２】
＜項３−５＞
腸内細菌が、
Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃａ、
Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ  ｖｕｌｇａｔｕｓ、
Ｍｅｇａｍｏｎａｓ  ｆｕｎｉｆｏｒｍｉｓ、
Ｍｅｇａｍｏｎａｓ  ｈｙｐｅｒｍｅｇａｌｅ、
Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ、
Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ、
Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｕｔａｃｔｕｓ、
Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｂｅｕｍ、
Ｂｌａｕｔｉａ  ｐｒｏｄｕｃｔｕｓ、
Ｂｌａｕｔｉａ  ｃｏｃｃｏｉｄｅｓ、
Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｅｃｔａｌｅ、
Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｕｒｉｎｕｓ、
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ、
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｕｌｖａ、及び
Ｅｎｔｅｒｏｒｈａｂｄｕｓ  ｍｕｃｏｓｉｃｏｌａ
からなる群より選択される少なくとも２種の細菌である、項３、及び項３−１〜項３−４の何れか１項に記載の医薬組成物。【００６３】
＜項３−６＞
医薬組成物が、経口又は経腸にて投与される事を特徴とする、項３、項３−１〜項３−５の何れか１項に記載の医薬組成物。【００６４】
＜項４＞
項１に記載のモノクローナルＩｇＡ抗体を含む経口又は経腸組成物。【００６５】
なお、項４に示す態様の発明には、以下の項４−１〜項４−６にて示す態様の、経口又は経腸組成物に関する発明も広く包含される。【００６６】
＜項４−１＞
経口又は経腸組成物が、腸内細菌の異常増殖及び／又は腸内細菌叢の病的変化を抑制する、項４に記載の経口又は経腸組成物。【００６７】
＜項４−２＞
腸内細菌が、
Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ属に属する細菌、
Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属に属する細菌、
Ｍｅｇａｍｏｎａｓ属に属する細菌、
Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する細菌、
Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する細菌、
Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ属に属する細菌、
Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ属に属する細菌、
Ｂｌａｕｔｉａ属に属する細菌、
Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する細菌、
Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ属に属する細菌、
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する細菌、
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属に属する細菌、
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属に属する細菌、
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属に属する細菌、
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属に属する細菌、
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属に属する細菌、及び
Ｅｎｔｅｒｏｒｈａｂｄｕｓ属に属する細菌
からなる群に属する細菌より選択される少なくとも２種の細菌である、項４又は項４−１に記載の経口又は経腸組成物。【００６８】
＜項４−３＞
腸内細菌が、
Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃａ、
Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ  ｖｕｌｇａｔｕｓ、
Ｍｅｇａｍｏｎａｓ  ｆｕｎｉｆｏｒｍｉｓ、
Ｍｅｇａｍｏｎａｓ  ｈｙｐｅｒｍｅｇａｌｅ、
Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ、
Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ、
Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｕｔａｃｔｕｓ、
Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｂｅｕｍ、
Ｂｌａｕｔｉａ  ｐｒｏｄｕｃｔｕｓ、
Ｂｌａｕｔｉａ  ｃｏｃｃｏｉｄｅｓ、
Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｅｃｔａｌｅ、
Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｕｒｉｎｕｓ、
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ、
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｕｌｖａ、及び
Ｅｎｔｅｒｏｒｈａｂｄｕｓ  ｍｕｃｏｓｉｃｏｌａ
からなる群より選択される少なくとも２種の細菌である、項４、項４−１、又は項４−２に記載の経口又は経腸組成物。【００６９】
＜項４−４＞
経口又は経腸組成物が、腸内環境改善組成物、腸内環境最適化組成物、又は腸内腐敗防止組成物である、項４及び項４−１〜４−３の何れか１項に記載の経口又は経腸組成物。【００７０】
＜項４−５＞
経口又は経腸組成物が、飲食品組成物である、項４、及び項４−１〜項４−４の何れか１項に記載の経口又は経腸組成物。【００７１】
＜項４−６＞
経口又は経腸組成物が、飼料組成物である、項４、及び項４−１〜項４−５の何れか１項に記載の経口又は経腸組成物。【００７２】
＜項５＞
項１に記載のモノクローナルＩｇＡ抗体をコードする核酸。【００７３】
＜項６＞
項１に記載のモノクローナルＩｇＡ抗体を産生するハイブリドーマ。【００７４】
なお、項６に示す態様の発明には、以下の項６−１〜項６−４にて示す態様の、ハイブリドーマに関する発明も広く包含される。【００７５】
＜項６−１＞
ハイブリドーマが、同一種由来である、項６に記載のハイブリドーマ。【００７６】
＜項６−２＞
ハイブリドーマが、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ロバ、ブタ、ウシ、ウマ、ニワトリ、サル、チンパンジー、又はヒトの何れか由来する、項６又は項６−１に記載のハイブリドーマ。【００７７】
＜項６−３＞
ハイブリドーマが、異種由来である、項６に記載のハイブリドーマ。【００７８】
＜項６−４＞
ハイブリドーマが、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ロバ、ブタ、ウシ、ウマ、ニワトリ、サル、チンパンジー、及びヒトからなる群より選択される２種以上を由来とする、項６又は項６−２に記載のハイブリドーマ。【００７９】
＜項７＞
少なくとも２種類の腸内細菌に項１に記載の抗体を接触させる工程を含む、少なくとも２種類の腸内細菌の増殖を抑制する方法。【００８０】
なお、項７に示す態様の発明には、以下の項７−１〜項７−３にて示す態様の、疾患の治療方法に関する発明も広く包含される。【００８１】
＜項７−１＞
腸内で接触させる、項７に記載の方法。【００８２】
＜項７−２＞
腸内細菌が、
Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ属に属する細菌、
Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属に属する細菌、
Ｍｅｇａｍｏｎａｓ属に属する細菌、
Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する細菌、
Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する細菌、
Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ属に属する細菌、
Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ属に属する細菌、
Ｂｌａｕｔｉａ属に属する細菌、
Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する細菌、
Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ属に属する細菌、
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する細菌、
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属に属する細菌、
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属に属する細菌、
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属に属する細菌、
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属に属する細菌、
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属に属する細菌、及び
Ｅｎｔｅｒｏｒｈａｂｄｕｓ属に属する細菌
からなる群に属する細菌より選択される少なくとも２種の細菌である、項７又は項７−１に記載の治療方法。【００８３】
＜項７−３＞
腸内細菌が、
Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃａ、
Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ  ｖｕｌｇａｔｕｓ、
Ｍｅｇａｍｏｎａｓ  ｆｕｎｉｆｏｒｍｉｓ、
Ｍｅｇａｍｏｎａｓ  ｈｙｐｅｒｍｅｇａｌｅ、
Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ、
Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ、
Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｕｔａｃｔｕｓ、
Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｂｅｕｍ、
Ｂｌａｕｔｉａ  ｐｒｏｄｕｃｔｕｓ、
Ｂｌａｕｔｉａ  ｃｏｃｃｏｉｄｅｓ、
Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｅｃｔａｌｅ、
Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｕｒｉｎｕｓ、
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ、
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｕｌｖａ、及び
Ｅｎｔｅｒｏｒｈａｂｄｕｓ  ｍｕｃｏｓｉｃｏｌａ
からなる群より選択される少なくとも２種の細菌である、項７、項７−１、又は項７−２に記載の治療方法。【００８４】
＜項８＞
腸内疾患の治療方法であって、項１に記載の抗体の有効量を、腸内疾患に罹患したヒトに投与する工程を含む、治療方法。【００８５】
なお、項８に示す態様の発明には、以下の項８−１〜項８−５にて示す態様の、疾患の治療方法に関する発明も広く包含される。【００８６】
＜項８−１＞
腸内疾患が、腸内細菌の異常増殖及び／又は腸内細菌叢の病的変化により発症する疾患である、項８に記載の治療方法。【００８７】
＜項８−２＞
腸内細菌の異常増殖や腸内細菌叢の病的変化により発症する疾患が、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、アレルギー、喘息、肥満、及び自己免疫疾患からなる群より選択される、項８又は項８−１に記載の治療方法。【００８８】
＜項８−３＞
腸内細菌が、
Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ属に属する細菌、
Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属に属する細菌、
Ｍｅｇａｍｏｎａｓ属に属する細菌、
Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する細菌、
Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する細菌、
Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ属に属する細菌、
Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ属に属する細菌、
Ｂｌａｕｔｉａ属に属する細菌、
Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する細菌、
Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ属に属する細菌、
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する細菌、
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属に属する細菌、
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属に属する細菌、
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属に属する細菌、
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属に属する細菌、
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属に属する細菌、及び
Ｅｎｔｅｒｏｒｈａｂｄｕｓ属に属する細菌
からなる群に属する細菌より選択される少なくとも２種の細菌である、項８、項８−１、又は項８−２の何れかに記載の治療方法。【００８９】
＜項８−４＞
腸内細菌が、
Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃａ、
Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ  ｖｕｌｇａｔｕｓ、
Ｍｅｇａｍｏｎａｓ  ｆｕｎｉｆｏｒｍｉｓ、
Ｍｅｇａｍｏｎａｓ  ｈｙｐｅｒｍｅｇａｌｅ、
Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ、
Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ、
Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｕｔａｃｔｕｓ、
Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｂｅｕｍ、
Ｂｌａｕｔｉａ  ｐｒｏｄｕｃｔｕｓ、
Ｂｌａｕｔｉａ  ｃｏｃｃｏｉｄｅｓ、
Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｅｃｔａｌｅ、
Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｕｒｉｎｕｓ、
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ、
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｕｌｖａ、及び
Ｅｎｔｅｒｏｒｈａｂｄｕｓ  ｍｕｃｏｓｉｃｏｌａ
からなる群より選択される少なくとも２種の細菌である、項８、及び項８−１〜項８−３の何れか１項に記載の治療方法。【００９０】
＜項８−５＞
投与が経口投与又は経腸投与である、項８、項８−１〜項８−４の何れか１項に記載の疾患の治療方法。【００９１】
＜項９＞
腸内疾患の治療方法における使用のための、項１に記載のモノクローナルＩｇＡ抗体。【００９２】
なお、項９に示す態様の発明には、以下の項９−１〜項９−５にて示す態様の、モノクローナルＩｇＡ抗体に関する発明も広く包含される。【００９３】
＜項９−１＞
腸内疾患が、腸内細菌の異常増殖及び／又は腸内細菌叢の病的変化により発症する疾患の治療方法である、項８に記載のモノクローナルＩｇＡ抗体。【００９４】
＜項９−２＞
腸内細菌の異常増殖や腸内細菌叢の病的変化により発症する疾患が、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、アレルギー、喘息、肥満、及び自己免疫疾患からなる群より選択される、項８又は項８−１に記載のモノクローナルＩｇＡ抗体。【００９５】
＜項９−３＞
腸内細菌が、
Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ属に属する細菌、
Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属に属する細菌、
Ｍｅｇａｍｏｎａｓ属に属する細菌、
Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する細菌、
Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する細菌、
Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ属に属する細菌、
Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ属に属する細菌、
Ｂｌａｕｔｉａ属に属する細菌、
Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する細菌、
Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ属に属する細菌、
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する細菌、
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属に属する細菌、
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属に属する細菌、
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属に属する細菌、
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属に属する細菌、
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属に属する細菌、及び
Ｅｎｔｅｒｏｒｈａｂｄｕｓ属に属する細菌
からなる群に属する細菌より選択される少なくとも２種の細菌である、項９、項９−１、又は項９−２に記載のモノクローナルＩｇＡ抗体。【００９６】
＜項９−４＞
腸内細菌が、
Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃａ、
Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ  ｖｕｌｇａｔｕｓ、
Ｍｅｇａｍｏｎａｓ  ｆｕｎｉｆｏｒｍｉｓ、
Ｍｅｇａｍｏｎａｓ  ｈｙｐｅｒｍｅｇａｌｅ、
Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ、
Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ、
Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｕｔａｃｔｕｓ、
Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｂｅｕｍ、
Ｂｌａｕｔｉａ  ｐｒｏｄｕｃｔｕｓ、
Ｂｌａｕｔｉａ  ｃｏｃｃｏｉｄｅｓ、
Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｅｃｔａｌｅ、
Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｕｒｉｎｕｓ、
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ、
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｕｌｖａ、及び
Ｅｎｔｅｒｏｒｈａｂｄｕｓ  ｍｕｃｏｓｉｃｏｌａ
からなる群より選択される少なくとも２種の細菌である、項９、及び項９−１〜項９−３の何れか１項に記載のモノクローナルＩｇＡ抗体。【００９７】
＜項９−５＞
経口投与又は経腸投与による使用である、項９、項９−１〜項９−４の何れか１項に記載の疾患のモノクローナルＩｇＡ抗体。【００９８】
＜項１０＞
腸内疾患の治療するための、医薬の製造のための、項１に記載のモノクローナルＩｇＡ抗体の使用。【００９９】
なお、項１０に示す態様の発明には、以下の項１０−１〜項１０−５にて示す態様の、モノクローナルＩｇＡ抗体の使用に関する発明も広く包含される。【０１００】
＜項１０−１＞
腸内疾患が、腸内細菌の異常増殖及び／又は腸内細菌叢の病的変化により発症する疾患の治療方法である、項１０に記載の使用。【０１０１】
＜項１０−２＞
腸内細菌の異常増殖や腸内細菌叢の病的変化により発症する疾患が、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、アレルギー、喘息、肥満、及び自己免疫疾患からなる群より選択される、項１０又は項１０−１に記載の使用。【０１０２】
＜項１０−３＞
腸内細菌が、
Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ属に属する細菌、
Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属に属する細菌、
Ｍｅｇａｍｏｎａｓ属に属する細菌、
Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する細菌、
Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する細菌、
Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ属に属する細菌、
Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ属に属する細菌、
Ｂｌａｕｔｉａ属に属する細菌、
Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する細菌、
Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ属に属する細菌、
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する細菌、
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属に属する細菌、
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属に属する細菌、
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属に属する細菌、
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属に属する細菌、
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属に属する細菌、及び
Ｅｎｔｅｒｏｒｈａｂｄｕｓ属に属する細菌
からなる群に属する細菌より選択される少なくとも２種の細菌である、項１０、項１０−１、又は項１０−２に記載の使用。【０１０３】
＜項１０−４＞
腸内細菌が、
Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃａ、
Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ  ｖｕｌｇａｔｕｓ、
Ｍｅｇａｍｏｎａｓ  ｆｕｎｉｆｏｒｍｉｓ、
Ｍｅｇａｍｏｎａｓ  ｈｙｐｅｒｍｅｇａｌｅ、
Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ、
Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ、
Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｕｔａｃｔｕｓ、
Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｂｅｕｍ、
Ｂｌａｕｔｉａ  ｐｒｏｄｕｃｔｕｓ、
Ｂｌａｕｔｉａ  ｃｏｃｃｏｉｄｅｓ、
Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｅｃｔａｌｅ、
Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｕｒｉｎｕｓ、
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ、
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｕｌｖａ、及び
Ｅｎｔｅｒｏｒｈａｂｄｕｓ  ｍｕｃｏｓｉｃｏｌａ
からなる群より選択される少なくとも２種の細菌である、項１０、及び項１０−１〜項１０−３の何れか１項に記載の使用。【０１０４】
＜項１０−５＞
経口投与又は経腸投与による使用である、項１０、項１０−１〜項１０−４の何れか１項に記載の使用。
【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１】各種腸内細菌に対するモノクローナルＩｇＡの結合力を検索する実験結果。図中、表の縦項目は各種菌体を示し、上から順にＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（ＤＨ５α株）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（マウス腸内細菌からのクローニング株）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｕｌｖａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｕｒｉｎｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｒｈａｂｄｕｓ  ｍｕｃｏｓｉｃｏｌａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｕｔａｃｔｕｓ、Ｂｌａｕｔｉａ  ｃｏｃｃｏｉｄｅｓ、Ｍｅｇａｍｏｎａｓ  ｈｙｐｅｒｍｅｇａｌｅ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｅｃｔａｌｅ、及びＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｉｕｍである。また、図中、表の横項目は、各種クローン名を示し、左から順にＷ１、Ｗ２、Ｗ３、Ｗ４、Ｗ６、Ｗ７、Ｗ１１、Ｗ１４、Ｗ２４、Ｗ２７、Ｗ２８、Ｗ３０、Ｗ３２、Ｗ３４、Ｗ３７、Ｗ４３、及びＷ４５；次いでＧ１、Ｇ８、Ｇ９、Ｇ１０、Ｇ１２、Ｇ１４、Ｇ１５、Ｇ１６、Ｇ１８、及びＧ１９である。なお、図中のＮ／Ａは未確認であることを示す。
【図２】各種腸内細菌に対するモノクローナルＩｇＡの濃度依存的な結合力を評価する実験結果。グラフは、左から順にＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、及びＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓへの結合結果を示す。図中、グラフの縦軸ＯＤ（４０５ｎｍ）を示し、横軸は使用した各種ＩｇＡ抗体の濃度（０．０１７、０．０５、０．１７、０．５、１．７、５．０、１７、及び５０μｇ／ｍｌ）を示す。
【図３】各種腸内細菌に対するモノクローナルＩｇＡの濃度依存的な結合力を評価する実験結果。グラフは、左上がＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、右上がＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、左下がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、そして右下がＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｕｌｖａへの結合結果を示す。図中、グラフの縦軸ＯＤ（４０５ｎｍ）を示し、横軸は使用したＩｇＡ抗体の濃度（０．０１７、０．０５、０．１７、０．５、１．７、５．０、１７、及び５０μｇ／ｍｌ）を示す。
【図４】各種モノクローナルＩｇＡ抗体を用いた、各種菌体抽出物のウエスタンブロッティング解析結果。（Ａ）はＷ２７モノクローナルＩｇＡ抗体、（Ｂ）はＷ３０モノクローナルＩｇＡ抗体、そして（Ｃ）はＷ４５モノクローナルＩｇＡ抗体の実験結果を示す。また、各図において、レーン左から順にＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（ＤＨ５α株；市販品）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（マウス腸内細菌からのクローニング株）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｕｌｖａ、及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓの抽出物である。また、（Ｄ）はＷ２７モノクローナルＩｇＡ抗体を用いた実験結果を示し、レーン左から順に、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｅｃｔａｌｅ、Ｂｌａｕｔｉａ  ｃｏｃｃｏｉｄｅｓ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｕｔａｃｔｕｓ、Ｍｅｇａｍｏｎａｓ  ｈｙｐｅｒｍｅｇａｌｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ、及びＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍの抽出物である。
【図５】二次元電気泳動の結果を示す図。上段左がＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ、上段右がＭｅｍＣｏｄｅ  Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔａｉｎ、下段が銀染色を示す。全ての図面で同位置にスポット（矢印）が確認され、ゲルを切り出し、ＭＳ解析を行った。
【図６】Ｇ２３Ｓマウスの大腸のＨＥ染色像。
【図７】Ｗ２７モノクローナルＩｇＡ抗体を経口投与した際のパイエル板の胚中心におけるＢ細胞の数を測定した実験結果。
【図８】Ｗ２７モノクローナルＩｇＡ抗体を経口投与した際の体内動態を確認した実験結果を示すグラフ。グラフの縦軸は糞便中におけるＩｇＡ抗体の抗体価（μｇ／ｍｌ）を示す。
【図９】各種モノクローナルＩｇＡ抗体を用いたウエスタンブロッティングの結果を表す図。Ｐｏｌｙ−ｒｅａｃｔｉｖｅなＩｇＡ抗体の多くは、ｓｅｒｉｎｅ ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＳＨＭＴ）を認識する。
【図１０】各種セリンヒドロキシチルトランスフェラーゼの変異体を用いた、各種モノクローナルＩｇＡ抗体のエピトープ特定実験結果を示す図。
【図１１】Ｇ２３Ｓマウスの大腸のＨＥ染色像。Ｗ２７モノクローナルＩｇＡ抗体を投与した場合の腺管の様子を表す。Ｇ２３Ｓマウスの大腸で見られた腺管の萎縮はＷ２７抗体投与で正常化した。
【図１２】本発明に係るモノクローナルＩｇＡ抗体の大腸菌の増殖抑制効果を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【０１０６】
〔モノクローナルＩｇＡ抗体〕
本発明に係るモノクローナルＩｇＡ抗体は、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼの１１〜３３３番目のアミノ酸配列に特異的に結合する。好ましくは、１１番目又は２５番目の何れかから２８番目、３７番目、４４番目、２５０番目、３３３番目の何れかのアミノ酸配列（１１〜２５０、１１〜４４、１１〜３７、１１〜２８、２５〜３３３、２５〜２５０、２５〜４４、２５〜３７、又は２５〜２８番目）であり、さらに好ましくは２５〜４４番目のアミノ酸配列であり、最も好ましくは２５〜２８番目のアミノ酸配列である。
【０１０７】
セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼとは、４５〜５０ｋＤａ程度の分子量を有し、その等電点は４．３〜４．７程度である。具体的には、例えば大腸菌由来であれば、ＮＣＢＩのウェブサイトに収載される、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  Ｎｏ．Ｊ０１６２０  Ｊ０１６２１；ＶＥＲＳＩＯＮ  Ｊ０１６２０．１  ＧＩ：１４６２１６に示されるアミノ酸配列等を有するタンパク質である。さらに具体的には、配列番号７４に示すアミノ酸配列を有するタンパク質である。このタンパク質は、Ｌ−セリンをグリシンに、そして同時にテトラヒドロ葉酸を５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸に可逆的に変換する機能を有する酵素であり、その立体構造は大腸菌から哺乳動物まで非常に保存された酵素である。
【表１】
0005916946.tif 000002
【０１０８】
また、表１に示すように、上記配列番号７４に示すアミノ酸配列を基にしたアライメントから、大腸菌由来のセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼの２５〜２６番目（ＲＱ）及び３１〜４４番目、中でも３１〜３７番目（ＥＬＩＡＳＥＮ）に相当するアミノ酸配列が、上記の多数の種間において非常によく保存されている。これらのアミノ酸配列は、下記実施例に示すように、本発明に係るモノクローナルＩｇＡ抗体が結合する大腸菌由来のセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼのエピトープと考え得る最少単位のアミノ酸配列を含むものである。したがって、配列番号７４に示すアミノ酸配列の２５〜２６番目及び３１〜４４番目のアミノ酸を含む領域が、本発明に係るモノクローナルＩｇＡ抗体のエピトープとして２５〜２８番目のアミノ酸配列と共に含まれると考えられる。
【０１０９】
本発明に係るモノクローナルＩｇＡ抗体が結合するセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼの由来は、大腸菌以外にも、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｕｌｕｖａ等のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属菌；Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ等のブドウ球菌；Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｅｃｔａｌｅ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｐａｒａｔｙｐｈｉ  Ａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ  ｂｖ．  Ａｎｔｉｑｕｅ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｍａｌｌｅｉ等が挙げられ特に限定はされない。
【０１１０】
一方で本発明に係るモノクローナルＩｇＡ抗体は、上記以外に由来するセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼには結合しないか、結合したとしてもすぐに解離してしまう傾向となる。この様な由来は特に限定はされないが、例えばＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ等の乳酸菌、Ｂｌａｕｔｉａ  ｃｏｃｃｏｉｄｅｓ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｕｔａｃｔｕｓ、Ｍｅｇａｍｏｎａｓ  ｈｙｐｅｒｍｅｇａｌｅ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｐｅ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ、ウサギ、マウス、ヒト等の真核生物等に由来するセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼが挙げられる。これらの結合の有無やその傾向については、培養した各種菌体のライセートを、本発明に係るモノクローナルＩｇＡ抗体を用いたウエスタンブロットに供して確認する。
【０１１１】
上述のように、本発明に係るモノクローナルＩｇＡ抗体が特異的に結合するセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ中の特定の部位（エピトープ）は、例えば本願明細書の実施例に示すように、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼのトランケートミュータントを作製し、これと本発明に係るモノクローナルＩｇＡが結合するか否かを、ウエスタンブロッティング法等といった公知の免疫化学的手段で確認すればよい。
【０１１２】
そのほかに、上述のような本発明に係るモノクローナルＩｇＡ抗体が結合することが確認できる、例えば大腸菌に由来する野生型のセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ中の一部のアミノ酸配列を、上述のような本発明に係るモノクローナルＩｇＡ抗体が結合しないか、結合してもすぐに解離してしまう、例えば乳酸菌に由来するセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼの上記一部のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列で置換した変異体を作成し、この変異体が本発明に係るモノクローナルＩｇＡ抗体に結合できないか、又は野生型のセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼよりも結合力が減少した場合に、上記一部のアミノ酸配列を本発明に係るモノクローナルＩｇＡ抗体が特異的に結合するセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ中のアミノ酸配列と決定すればよい。なお、結合するかどうか、結合力の低下等確認する手段は、上述のような公知の免疫化学的手段を適宜採用すればよい。
【０１１３】
本明細書にて使用する用語『モノクローナル』とは、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体等の特徴を示す修飾語である。このような抗体の集団に含まれる個々の抗体は、微量に存在し得る、可能な天然に生じる突然変異を除いて同一である。
【０１１４】
本発明に係るモノクローナルＩｇＡ抗体とは、免疫グロブリンの一種であり、重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域を有する態様が挙げられる。中でも、これらのそれぞれに、更に定常領域を含む、重鎖及び／又は軽鎖を有する態様がより好ましい。より好ましくは、重鎖および軽鎖を有する態様である。
【０１１５】
このような重鎖及び軽鎖は、主としてポリペプチドで構成され、それぞれ抗原を認識する可変領域と呼ばれる部位（一般的に、それぞれ重鎖可変領域及び軽鎖可変領域と呼ばれる。）を含む。
【０１１６】
上述の可変領域の中に、より抗原を認識する部位として特定される、それぞれＣＤＲ１〜３と呼ばれる部位をアミノ末端から順に有する。なお、これらのＣＤＲ１〜３は、より詳細に重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、重鎖ＣＤＲ３、軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、軽鎖ＣＤＲ３等とも呼ばれる。また、重鎖及び軽鎖のＣＤＲ１〜３以外の領域は、それぞれアミノ末端から順に、重鎖ＦＲ１〜４及び軽鎖ＦＲ１〜４と呼ばれる。
【０１１７】
本発明に係るモノクローナルＩｇＡ抗体における可変領域には、上述のような重鎖可変領域及び軽鎖可変領域にそれぞれＣＤＲ１〜３の全てを必ずしも含んでいる必要はなく、ＣＤＲ１〜３のうちの少なくとも１つのＣＤＲを含んでいればよい。中でもＣＤＲ３を含んでいることが好ましい。
【０１１８】
このような、重鎖ＣＤＲ１〜３及び軽鎖ＣＤＲ１〜３を構成するポリペプチドのアミノ酸配列は、特に限定はされないが、例えば、
重鎖ＣＤＲ１としては配列番号３、１３、２３、３３、又は４３の何れかに示すアミノ酸配列等；
重鎖ＣＤＲ２としては配列番号４、１４、２４、３４、又は４４の何れかに示すアミノ酸配列等；
重鎖ＣＤＲ３としては配列番号５、１５、２５、３５、又は４５の何れかに示すアミノ酸配列等；
軽鎖ＣＤＲ１としては配列番号８、１８、２８、３８、又は４８の何れかに示すアミノ酸配列等；
軽鎖ＣＤＲ２としては配列番号９、１９、２９、３９、又は４９の何れかに示すアミノ酸配列等；
軽鎖ＣＤＲ３としては配列番号１０、２０、３０、４０、又は５０の何れかに示すアミノ酸配列等が挙げられる。
【０１１９】
本発明に係るモノクローナルＩｇＡ抗体の重鎖可変領域は、特に限定はされないが、例えばＣＤＲ１〜３を含む態様の重鎖可変領域であれば、上述の
（１）配列番号３、１３、２３、３３、又は４３の何れかに示すアミノ酸配列からなる、重鎖ＣＤＲ１；
（２）配列番号４、１４、２４、３４、又は４４の何れかに示すアミノ酸配列からなる、重鎖ＣＤＲ２；
（３）配列番号５、１５、２５、３５、又は４５の何れかに示すアミノ酸配列からなる、重鎖ＣＤＲ３
が、アミノ末端から順に含まれている重鎖可変領域が挙げられる。
【０１２０】
また、例えばＣＤＲ１〜３を含む態様の軽鎖可変領域も特に限定はされないが、例えば上述の
（Ｉ）配列番号８、１８、２８、３８、又は４８の何れかに示すアミノ酸配列からなる、軽鎖ＣＤＲ１；
（ＩＩ）配列番号９、１９、２９、３９、又は４９の何れかに示すアミノ酸配列からなる、軽鎖ＣＤＲ２；
（ＩＩＩ）配列番号１０、２０、３０、４０、又は５０の何れかに示すアミノ酸配列からなる、軽鎖ＣＤＲ３
が、アミノ末端から順に含まれている軽鎖可変領域が挙げられる。
【０１２１】
より好ましいＣＤＲ１〜３を含む態様の重鎖可変領域としては、
配列番号３に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号４に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３をアミノ末端から順に含む重鎖可変領域；
配列番号１３に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号１４に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１５に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３をアミノ末端から順に含む重鎖可変領域；
配列番号２３に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号２４に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２５に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３をアミノ末端から順に含む重鎖可変領域；配列番号３３に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号３４に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３５に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３をアミノ末端から順に含む重鎖可変領域；又は
配列番号４３に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号４４に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号４５に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３をアミノ末端から順に含む重鎖可変領域
が挙げられる。
【０１２２】
さらに好ましくは、配列番号３に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号４に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３をアミノ末端から順に含む重鎖可変領域である。
【０１２３】
また、より好ましい例えばＣＤＲ１〜３を含む態様の軽鎖可変領域としては、配列番号８に示すアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号９に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１０に示すアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３をアミノＮ末端から順に含む軽鎖可変領域；
配列番号１８に示すアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１９に示すアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２０に示すアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３をアミノ末端から順に含む軽鎖可変領域；
配列番号２８に示すアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２９に示すアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３０に示すアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３をアミノ末端から順に含む軽鎖可変領域；
配列番号３８に示すアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３９に示すアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号４０に示すアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３をアミノ末端から順に含む軽鎖可変領域；又は
配列番号４８に示すアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号４９に示すアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５０に示すアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３をアミノ末端から順に含む軽鎖可変領域
が挙げられる。
【０１２４】
さらに好ましくは、配列番号８に示すアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号９に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１０に示すアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３をアミノ末端から順に含む軽鎖可変領域である。
【０１２５】
上述の重鎖可変領域の中でもさらに好ましいのは、配列番号２、１２、２２、３２、又は４２に示すアミノ酸配列からなる重鎖可変領域であり、最も好ましくは配列番号２に示すアミノ酸配列からなる重鎖可変領域である。
【０１２６】
また、上述の軽鎖可変領域の中でもさらに好ましいのは、配列番号７、１７、２７、３７、又は４７に示すアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域であり、最も好ましくは配列番号７に示すアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域である。
【０１２７】
本発明に係るモノクローナルＩｇＡ抗体は、上述のような重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域を適宜組み合わせた構成を有する態様であってもよい。このような他の態様のモノクローナルＩｇＡ抗体は、例えばＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、ｍｉｎｉｂｏｄｙ等と呼ばれる構成を有する。
【０１２８】
本発明に係るモノクローナルＩｇＡ抗体の中でも、さらに好ましい態様として、上述のような重鎖及び／又は軽鎖可変領域にさらに定常領域を含んだ重鎖及び／又は軽鎖を含む態様のモノクローナルＩｇＡ抗体が挙げられる。
【０１２９】
このようなモノクローナルＩｇＡは、特に限定されるものでは無いが、例えば、配列番号１、１１、２１、３１、又は４１に示すアミノ酸配列を含む重鎖及び／又は配列番号６、１６、２６、３６、又は４６に示すアミノ酸配列を含む軽鎖を有するモノクローナルＩｇＡ抗体が挙げられる。
【０１３０】
より好ましくは、配列番号１、１１、２１、３１、又は４１に示すアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号６、１６、２６、３６、又は４６に示すアミノ酸配列を含む軽鎖を有するモノクローナルＩｇＡ抗体である。
【０１３１】
さらに好ましい態様として、配列番号１に示すアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号６に示すアミノ酸配列を含む軽鎖を有するモノクローナルＩｇＡ抗体；
配列番号１１に示すアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号１６に示すアミノ酸配列を含む軽鎖を有するモノクローナルＩｇＡ抗体；
配列番号２１に示すアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号２６に示すアミノ酸配列を含む軽鎖を有するモノクローナルＩｇＡ抗体；
配列番号３１に示すアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号３６に示すアミノ酸配列を含む軽鎖を有するモノクローナルＩｇＡ抗体；
配列番号４１に示すアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号４６に示すアミノ酸配列を含む軽鎖を有するモノクローナルＩｇＡ抗体が挙げられ、より好ましくは、
配列番号１に示すアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号６に示すアミノ酸配列を含む軽鎖を有するモノクローナルＩｇＡ抗体である。
【０１３２】
上記のモノクローナルＩｇＡ抗体は、単量体であっても多量体であってもよい。好ましくは２量体である。なお、上記のモノクローナル抗体が多量体である場合、後述するＪ鎖を含んでいる。
【０１３３】
Ｊ鎖とは、抗原認識部位を有さないアミノ酸配列を含むペプチドであり、上記の重鎖とも軽鎖とも異なるアミノ酸配列を有するペプチドである。当該アミノ酸配列として、具体的には、マウス由来であれば、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）ウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）に収載される、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  Ｎｏ．ＡＡＡ３８６７３；ＶＥＲＳＩＯＮ  ＡＡＡ３８６７３．１  ＧＩ：１９６３７９に示されるアミノ酸配列等が挙げられ、ヒト由来であれば、同じくＮＣＢＩウェブサイトに収載される、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  Ｎｏ．ＮＰ＿６５３２４７；ＶＥＲＳＩＯＮ  ＮＰ＿６５３２４７．１  ＧＩ：２１４８９９５９に示されるアミノ酸配列等が挙げられる。このようなＪ鎖は、上記のモノクローナルＩｇＡ抗体モノマーの重鎖と各々ジスルフィド結合している。
【０１３４】
なお、上記のモノクローナルＩｇＡ抗体を規定するアミノ酸配列には、本明細書にて説明するモノクローナルＩｇＡ抗体の機能、効果等を減衰させない範囲に限り、適宜変異が施されていてもよい。具体的な変異導入の数は、共に特に限定はされないが、通常は変異前のアミノ酸配列と８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する変異体となるような変異導入数とすればよい。
【０１３５】
本明細書にて使用する用語、『同一性』とは、２以上の対比可能なアミノ酸配列又は塩基配列の、お互いに対する同一のアミノ酸配列又は塩基配列の程度をいう。従って、ある２つのアミノ酸配列又は塩基配列の同一性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。アミノ酸配列又は塩基配列の同一性のレベルは、通常は、配列分析用ツールであるＦＡＳＴＡを用い、デフォルトパラメーターを用いて決定される。
【０１３６】
若しくは、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（例えば、Ｋａｒｌｉｎ  Ｓ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ＳＦ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．８７：２２６４−２２６８（１９９０）、Ｋａｒｌｉｎ  Ｓ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ＳＦ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．９０：５８７３−７（１９９３）等）を用いて決定できる。このようなＢＬＡＳＴのアルゴリズムに基づいたＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ＳＦ，ＧｉｓｈＷ，Ｍｉｌｌｅｒ  Ｗ，Ｍｙｅｒｓ  ＥＷ，Ｌｉｐｍａｎ  ＤＪ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０（１９９０）等）。これらの解析方法の具体的な手法は公知であり、ＮＣＢＩのウェブサイトを参照すればよい。
【０１３７】
上述の変異導入とは、置換、欠失、挿入等である。具体的な変異導入については、公知の方法を採用することができ、特に限定はされないが、例えば置換であれば保存的な置換技術を採用すればよい。
【０１３８】
本明細書にて使用する用語『保存的な置換技術』とは、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置換される技術を意味する。
【０１３９】
例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジンといった塩基性側鎖を有するアミノ酸残基同士で置換されることが、保存的な置換技術にあたる。その他、アスパラギン酸、グルタミン酸といった酸性側鎖を有するアミノ酸残基；グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システインといった非帯電性極性側鎖を有するアミノ酸残基；アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンといった非極性側鎖を有するアミノ酸残基；スレオニン、バリン、イソロイシンといったβ−分枝側鎖を有するアミノ酸残基、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジンといった芳香族側鎖を有するアミノ酸残基同士での置換も同様に、保存的な置換技術にあたる。
【０１４０】
上記のモノクローナルＩｇＡ抗体のサブクラスは特に限定はされず、例えばＩｇＡ１であっても、ＩｇＡ２であってもよい。
【０１４１】
上記のモノクローナルＩｇＡ抗体は分泌成分を含んでいてもよい。分泌成分とは、上述のＪ鎖と同様に抗原認識部位を有さないアミノ酸配列を含むペプチドであり、通常は糖鎖が修飾された、上記の重鎖とも軽鎖とも異なるアミノ酸配列を有するペプチドである。
【０１４２】
当該アミノ酸配列として、具体的には、マウス由来であれば、ＮＣＢＩのウェブサイトに収載される、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  Ｎｏ．Ｏ７０５７０；ＶＥＲＳＩＯＮ  Ｏ７０５７０．１  ＧＩ：６２２５８５６に示されるポリイムノグロブリンレセプターのアミノ酸配列等のうちの、細胞外ドメインに相当するアミノ酸配列等が挙げられる。上記の例であれば、１９〜６３８番目のアミノ酸配列が分泌成分に相当する。
【０１４３】
ヒト由来であれば、同じくＮＣＢＩウェブサイトに収載される、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  Ｎｏ．Ｐ０１８３３；ＶＥＲＳＩＯＮ  Ｐ０１８３３．４  ＧＩ：１５０４２１６２５に示されるポリイムノグロブリンレセプターのアミノ酸配列のうちの、細胞外ドメインに相当するアミノ酸配列等が挙げられる。上記の例であれば、１９〜６４５番目のアミノ酸配列が分泌成分に相当する。
【０１４４】
このような分泌因子を含むモノクローナルＩｇＡ抗体を製造するために、上記工程１にて得られるハイブリドーマに、更に上述したポリイムノグロブリンレセプターのＳｅｃｒｅｔｏｒｙ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ領域をコードする塩基配列を有する核酸を導入する工程が含まれていてもよい。具体的な遺伝子導入方法は、公知の方法を適宜改変すればよく、特に限定はされない。
【０１４５】
上記のモノクローナルＩｇＡ抗体は同一種に由来するアミノ酸配列を有していても異種に由来するアミノ酸を有していてもよい。同一種由来の場合、例えば、ヒト由来、マウス由来、ラット由来、ハムスター由来、ウサギ由来、ヤギ由来、ロバ由来、ブタ由来、ウシ由来、ウマ由来、ニワトリ由来、サル由来、チンパンジー由来等が挙げられる。
【０１４６】
異種由来の場合も、特に限定はされないが、例えばヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ロバ、ブタ、ウシ、ウマ、ニワトリ、サル、チンパンジー等の何れか２つ以上に由来するモノクローナルＩｇＡ抗体が挙げられる。
【０１４７】
さらに具体的な異種に由来するアミノ酸配列を有するモノクローナルＩｇＡ抗体の１つの態様として、ヒトに由来するアミノ酸配列及びヒト以外の動物種に由来するアミノ酸配列を有するモノクローナルＩｇＡ抗体であって、重鎖及び軽鎖可変領域の全てがヒト以外の動物種に由来するアミノ酸配列であり、それ以外の領域がヒトに由来するアミノ酸配列を有する態様のモノクローナルＩｇＡ抗体が挙げられる。これを特にキメラ抗体と呼ぶことがある。
【０１４８】
本発明に係るモノクローナルＩｇＡ抗体は、少なくとも２種類の腸内細菌の成育を阻害する。
【０１４９】
本明細書において用いる用語『腸内細菌』とは、生体内の腸内に常在する細菌であれば特に限定はされない。この様な腸内細菌としては、生体内で腸内細菌叢を形成し、腸内免疫系の恒常性の維持に関与する細菌が挙げられる。
【０１５０】
具体的な腸内細菌としては、特に限定されるものでは無いが、例えば、
Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ属に属する細菌、
Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属に属する細菌、
Ｍｅｇａｍｏｎａｓ属に属する細菌、
Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する細菌、
Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する細菌、
Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ属に属する細菌、
Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ属に属する細菌、
Ｂｌａｕｔｉａ属に属する細菌、
Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する細菌、
Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ属に属する細菌、
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する細菌、
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属に属する細菌、
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属に属する細菌、
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属に属する細菌、
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属に属する細菌、
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属に属する細菌、
Ｅｎｔｅｒｏｒｈａｂｄｕｓ属に属する細菌
等が挙げられる。
【０１５１】
これらの細菌の中でも、
Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃａ、
Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ  ｖｕｌｇａｔｕｓ、
Ｍｅｇａｍｏｎａｓ  ｆｕｎｉｆｏｒｍｉｓ、
Ｍｅｇａｍｏｎａｓ  ｈｙｐｅｒｍｅｇａｌｅ、
Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ、
Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ、
Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｕｔａｃｔｕｓ、
Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｂｅｕｍ、
Ｂｌａｕｔｉａ  ｐｒｏｄｕｃｔｕｓ、
Ｂｌａｕｔｉａ  ｃｏｃｃｏｉｄｅｓ、
Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｅｃｔａｌｅ、
Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｕｒｉｎｕｓ、
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ、
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｕｌｖａ、及び
Ｅｎｔｅｒｏｒｈａｂｄｕｓ  ｍｕｃｏｓｉｃｏｌａ
等の細菌が挙げられる。
【０１５２】
また、本発明に係るモノクローナル抗体は、下記実施例に示すように大腸の粘膜固有層における腺管の減少または又は委縮を回復させる作用を有する。大腸の粘膜固有層における腺管の減少は、腸内疾患、特に腸内細菌の異常増殖及び／又は腸内細菌叢の病的変化により発症する腸内疾患に見られる病理組織学所見である。また、一般的に潰瘍性大腸炎の慢性病変としてよく見られる病変でもある。
【０１５３】
従って、本発明に係るモノクローナルＩｇＡ抗体は、腸内細菌の異常増殖及び／又は腸内細菌叢の病的変化を抑制する効果を発揮することが期待され、さらに炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、アレルギー、喘息、肥満、自己免疫疾患等といった、腸内細菌の異常増殖及び／又は腸内細菌叢の病的変化により発症する、例えば腸内疾患の治療に効果を発揮することが期待される。
【０１５４】
上述の腸内細菌の異常増殖とは、特に限定はされないが、例えば腸管内に生息する細菌数が異常に増加する状態を表す。
【０１５５】
上述の腸内細菌叢の病的変化とは、特に限定はされないが、例えば、腸内細菌叢を構成する腸内細菌の種類と、それぞれの腸内細菌の割合が変化することで宿主との間の共生関係の恒常性保持に異常を来す状態を表す。
【０１５６】
なお、このような腸内疾患の異常増殖及び腸内細菌叢の病的変化とは、必ずしも上述した腸内疾患に罹患した状態に限定されるものでは無く、腸内疾患に罹患する要因を誘起する状態を意味するものであってもよい。
【０１５７】
本明細書にて使用する用語『治療』とは、所望の薬理学的効果及び／又は生理学的効果を得ることを意味する。この効果は、疾病及び／又は疾病に起因する悪影響（病態、症状等）を、部分的又は完全に治癒することを含む。また、上記効果には、疾病及び／又は疾病に起因する悪影響（病態、症状等）の進行を阻止又は遅延する効果、病態や症状を緩和する（疾病、症状等の後退、又は進行の逆転を引き起こす）効果、再発を阻止する効果等が含まれる。
【０１５８】
また、上記効果には、疾病及び／又は疾病に起因する悪影響（病態、症状等）の素因を持ち得るが、まだ持っていると診断されていない個体において、疾病及び／又は疾病に起因する悪影響（病態、症状等）が起こることを部分的又は完全に防止する効果が含まれる。従って、『治療』なる用語には、『緩解』、『再発防止』、『予防』等の意味も含まれる。
【０１５９】
上述のように、本発明に係るモノクローナルＩｇＡ抗体は、腸内疾患の治療に用いる事によって、優れた効果を発揮することが期待される。この様な効果は、斯かるモノクローナル抗体が経口又は経腸的に個体に投与されることによって発揮される効果である。このことから、本発明に係るモノクローナルＩｇＡ抗体は、経口又は経腸組成物、医薬組成物の有効成分として有用である。
【０１６０】
〔核酸〕
本発明に係る核酸は、本発明に係るモノクローナルＩｇＡ抗体をコードする核酸である。より具体的には、配列番号１〜５０のいずれか１つに示すアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する核酸である。当該核酸は、リボヌクレオチドであっても、デオキシヌクレオチドであってもよい。また、当該核酸は１本鎖の形態であっても、２本鎖の形態であってもよく特に限定はされない。
【０１６１】
上述のアミノ酸配列をコードする塩基配列は、１つのアミノ酸配列に対して１種類の塩基配列からなる核酸には限定されず、核酸の使用目的に応じて当該アミノ酸をコードする各種コドンを適宜選択して決定されたものであればよい。使用目的としては、例えば、当該塩基配列を用いて、本発明に係るモノクローナルＩｇＡ抗体を発現させ、それを製造すること等が挙げられる。特に製造時に採用する宿主細胞の種類に対応したコドン頻度を考慮して各種コドンを選択すればよい。
【０１６２】
このような塩基配列は、例えば公知のプログラムを採用すれば、インシリコにて容易に決定することができる。また、本発明に係る核酸は、配列番号１〜５０に対して、上記の〔本発明のモノクローナルＩｇＡ抗体〕にて詳述した変異が施されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するものであってもよい。
【０１６３】
このような具体的な塩基配列については、特に限定はされないが、例えば配列番号５１〜６０に示す塩基配列が挙げられる。これらの塩基配列と〔本発明のモノクローナルＩｇＡ抗体〕にて詳述した配列番号１〜５０に示すアミノ酸配列との対応については下記の表２に説明できる。
【０１６４】
【表２】
0005916946.tif 000003
【０１６５】
〔モノクローナルＩｇＡ抗体の製造方法〕
本発明に係るモノクローナルＩｇＡ抗体の製造方法は、上述の〔モノクローナルＩｇＡ〕の製造方法であって、下記の工程１及び２を含むことを特徴とする。
（工程１）
腸管粘膜固有層から採取されたＢ細胞と、それ以外の種類の細胞を混合して融合させ、ハイブリドーマを作製する工程。
（工程２）
上記工程１にて作製したハイブリドーマを培養し、少なくとも２種類の腸内細菌と結合するＩｇＡ抗体を産生する細胞を決定し、該細胞から、前記ＩｇＡ抗体を回収する工程。
【０１６６】
本発明に係るモノクローナルＩｇＡ抗体の製造方法には、工程２の後に、後述するような重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域を必要に応じて、これらを適宜組み合わせた構成とするために、例えば、ＩｇＡに特異的なプロテアーゼ等によって処理する工程、ジスルフィド結合等の化学的結合が可能となるような、官能基を導入する工程、並びにそれに次いで前記官能基を介して前記化学的結合を形成させる工程等が含まれていてもよい。
【０１６７】
本発明のモノクローナルＩｇＡ抗体の製造方法における上記工程１及び工程２について、以下に詳述する。
【０１６８】
(工程１について)
本発明に係るモノクローナルＩｇＡ抗体の製造方法における工程１は、腸管粘膜固有層から採取されたＢ細胞と、それ以外の種類の細胞を混合して融合させ、ハイブリドーマを作製する工程である。
【０１６９】
工程１において用いるＢ細胞とは腸管粘膜固有層に局在するＢ細胞である。また、Ｂ細胞とはＩｇＡ抗体を産生する機能を発揮する細胞であればよく、必ずしもＩｇＡ抗体をコードするＤＮＡ又はｍＲＮＡ含み、当該ｍＲＮＡが翻訳されてＩｇＡ抗体を産生するものには限定されない。例えば、当該Ｂ細胞内でＩｇＡ抗体とは異なるサブタイプのＩｇＧ抗体、ＩｇＭ抗体等といったイムノグロブリンがクラススイッチしてＩｇＡ抗体となり、当該細胞内にてＩｇＡ抗体を産生する細胞も上記Ｂ細胞に含まれる。
【０１７０】
腸管粘膜固有層（Ｌａｍｉｎａ  Ｐｒｏｐｒｉａ）とは、特に限定はされないが、例えば食道、胃、小腸（十二指腸、空腸、回腸等を含む。）、大腸（盲腸、結腸、直腸等を含む。）等に存在する粘膜を構成する層の１つであって、上皮細胞を含む層と粘膜基板（Ｍｕｓｃｕｌａｒｉｓ  ｍｕｃｏｓａｅ）との間に位置する層であればよい。中でも、リンパ系組織、毛細血管、リンパ管等を含んでいる、小腸に存在する腸管粘膜固有層が好ましい。
【０１７１】
腸管粘膜固有層からＢ細胞を採取する方法は、特に限定はされないが、例えば腸管を採取し、得られた腸管を洗浄後に切開して粘膜層を露出させる。次いで、適当な濃度のＥＤＴＡを含む生理食塩水中で振盪させて上皮細胞を遊離させて除去する。その後、適当な濃度のコラゲナーゼ等といった消化酵素で処理することによって、Ｂ細胞を回収する方法が挙げられる。これ以外の公知の方法を採用してもよくまた、市販の腸管粘膜固有層由来のＢ細胞を購入して入手してもよい。
【０１７２】
腸管粘膜固有層の由来、すなわち上記Ｂ細胞の由来は、特に限定はされないが、例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ロバ、ブタ、ウシ、ウマ、ニワトリ、サル、チンパンジー、ヒト等が挙げられる。
【０１７３】
それ以外の細胞の種類（本明細書において、「他の細胞」と呼ぶことがある。）とは、前記Ｂ細胞以外の種類の細胞であって、当該Ｂ細胞と接触することによって融合してハイブリドーマを形成し、当該ハイブリドーマが上述したＢ細胞が発揮するＩｇＡ抗体を産生する機能を失わないものであればよい。
【０１７４】
この様な他の細胞として、前記Ｂ細胞と融合してハイブリドーマを形成し、当該ハイブリドーマが不死化機能を獲得できるような細胞が好ましく、具体的にはガン細胞、中でも、ミエローマ等といった骨髄種に由来する細胞等が挙げられる。好ましい他の細胞は、ミエローマである。
【０１７５】
他の細胞の由来は、特に限定はされないが、例えばマウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ロバ、ブタ、ウシ、ウマ、ニワトリ、サル、チンパンジー、ヒト等が挙げられる。
【０１７６】
融合とは、前記Ｂ細胞と他の細胞が一体不可分に合一することを意味する。ここで、一体不可分とは、融合した後の細胞が増殖する際の現象である細胞分裂は除外するものである。このようにして、融合した細胞が、本明細書におけるハイブリドーマの一例として挙げられる。
【０１７７】
混合及び融合時の条件は特に限定されず、細胞を融合する方法において通常用いられる条件を適宜採用すればよい。例えば、Ｂ細胞、又は他の細胞を培養する際に用いられる条件を適宜改変して行えばよい。このような方法として、例えば適当な培地中において、Ｂ細胞とＢ細胞以外の種類の細胞とを混合してポリエチレングリコール等の存在下でこれらを接触させる方法；上記混合の後に電気刺激を与える方法；センダイウイルス等のウイルスを用いる方法等の後に、これを３７℃、５％の二酸化炭素の条件下でインキュベートする方法が挙げられる。
【０１７８】
融合にかかる時間も、特に限定されるものではなく、融合そのものが完了するまでの時間を適宜設定すればよい。融合が完了したことを確認する方法は、通常の細胞の融合を行う際に用いられる、公知の方法を適宜改変して行えばよい。このような方法として、例えば顕微鏡下にて融合の進行度合いを観察する方法が挙げられ、公知のキットを適宜選択して、その使用条件に沿って細胞を融合してもよい。
【０１７９】
(工程２について)
本発明に係るモノクローナルＩｇＡ抗体の製造方法における工程２は、上記工程１にて作製したハイブリドーマを培養し、少なくとも２種類の腸内細菌と結合するＩｇＡ抗体を産生する細胞を決定し、該細胞から、前記抗体を回収する工程である。
【０１８０】
本発明の工程２の前に、工程１にて得られるハイブリドーマを、モノクローナル抗体を製造する際に通常用いられるような限界希釈法等のサブクローニング工程等に供していてもよい。
【０１８１】
少なくとも２種類の腸内細菌に結合するＩｇＡ抗体を産生するハイブリドーマは、当該ＩｇＡ抗体を、例えば後述する実施例に記載のような、該ＩｇＡ抗体を識別しうる抗ＩｇＡ抗体（必要に応じて、放射性同位体、蛍光、発色等で標識化されていてもよい。）を用いたＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ、ＲＩＡ、ＦＬＩＳＡ、ＦＩＡ等による手段、ＦＡＣＳによる手段等用いて決定すればよい。
【０１８２】
上記の具体的な『少なくとも２種類の腸内細菌との結合するＩｇＡ抗体を産生するバイブリドーマ』を決定する方法は、特に限定はされないが、例えば上述の抗ＩｇＡ抗体を用いた以下に示す２種類の方法等が挙げられる。なお、以下の２種類の方法は、適宜組み合わせて用いてもよい。
【０１８３】
１つ目の決定する方法としては、
（Ａ）上述の工程１にて得られるハイブリドーマの中から、ある１つの腸内細菌に結合するＩｇＡ抗体を産生するハイブリドーマを決定する工程；及び
（Ｂ）工程Ａにて決定されたハイブリドーマの中から、それが産生するＩｇＡ抗体が、前記腸内細菌とは異なるその他の腸内細菌とも結合することを確認し、両方の腸内細菌と結合するＩｇＡ抗体を産生するハイブリドーマを決定する工程、
を含む方法が挙げられる。
【０１８４】
この場合、例えばＥＬＩＳＡ法を用いた手段であれば、工程Ａとして、上述の工程１にて得られるハイブリドーマの培養上清をサンプリングし、斯かるサンプリング物と、ある１つ目の腸内細菌が固相化された、例えばマルチウェルプレートの１つのウェル内にて、斯かる腸内細菌と接触させて、前記サンプリング物に前記腸内細菌と結合するＩｇＡ抗体が存在することを確認することによって、ＩｇＡ抗体を産生するハイブリドーマを決定すればよい。
【０１８５】
次いで、工程Ｂとして、工程Ａにて決定したＩｇＡ抗体を産生するハイブリドーマの培養上清のサンプリング物をそのまま用いて、又は必要に応じて上述の決定したハイブリドーマの培養上清を再度サンプリングして、斯かるサンプリング物と、上記の腸内細菌とは異なる、その他の（２つ目の）腸内細菌が固相化された、例えばマルチウェルプレートの１つのウェル内にて、斯かる２つ目の腸内細菌と接触させて、当該サンプリング物に２つ目の腸内細菌とも結合するＩｇＡ抗体が存在することを確認することによって、少なくとも２種類の腸内細菌と結合するＩｇＡ抗体を産生するハイブリドーマを決定すればよい。
【０１８６】
当然、上述のその他の腸内細菌として、上述の１番目とも２番目とも異なる３番目以上の腸内細菌を用いて、工程Ｂに引き続く工程が繰り返し含まれていてもよい。
【０１８７】
なお、ＥＩＡ、ＲＩＡ、ＦＬＩＳＡ、ＦＩＡ等の手段であれば、上記ＥＬＩＳＡでの方法と同様に、ウェルまたはそれに類する実験器具に、１つ目、及び２つ目（必要に応じて３つ目以上）の腸内細菌をそれぞれ固相化すればよい。
【０１８８】
ＦＡＣＳによる手段を選択するのであれば、上述のサンプリング物を各種腸内細菌と混合した後に、抗ＩｇＡ抗体をさらに接触させて、各種腸内細菌、それに結合するＩｇＡ抗体、更に抗ＩｇＡ抗体の複合体が形成されていることを適宜検出して、腸内細菌に結合するＩｇＡ抗体を産生するハイブリドーマと決定する手段に適用すればよい。
【０１８９】
２つ目の方法として、異なる腸内細菌毎にＩｇＡ抗体の結合を検出する系を各々用いて、上述の工程１にて得られるハイブリドーマの中から、少なくとも２種類の腸内細菌と結合するＩｇＡ抗体を産生するハイブリドーマを特定する工程を含む方法が挙げられる。
【０１９０】
これについて、例えばＥＬＩＳＡ法を用いた手段であれば、上記の１つ目の方法における工程Ａにおいて、異なる２種類の（必要に応じて３種類以上の）腸内細菌を、例えばマルチウェルプレートの異なる２つ（前記腸内細菌の種類数に応じて３つ以上）のウェル内に固相化し、工程１にて得られるハイブリドーマの培養上清のサンプリング物をそれぞれのウェル内にて、斯かる異なる２種類（又は３種類以上）の腸内細菌に接触させ、斯かるサンプリング物中に前記２種類（又は３種類以上）の両方の腸内細菌に結合するＩｇＡが存在することを確認することによって、少なくとも２種類の腸内細菌に結合するＩｇＡを産生するハイブリドーマを同時に特定する方法も挙げられる。
【０１９１】
なお、ＥＩＡ、ＲＩＡ、ＦＬＩＳＡ、ＦＩＡ等の手段であれば、上記ＥＬＩＳＡでの方法と同様に、ウェルまたはそれに類する実験器具に、１つ目及び２つ目（必要に応じて３つ目以上）の腸内細菌をそれぞれ固相化すればよい。
【０１９２】
ＦＡＣＳによる手段を選択するのであれば、それぞれのサンプリング物と各種腸内細菌と混合した後に、抗ＩｇＡ抗体をさらに接触させて、各種腸内細菌、それに結合するＩｇＡ抗体、更に抗ＩｇＡ抗体の複合体が形成されていることを適宜検出して、腸内細菌に結合するＩｇＡ抗体を産生するハイブリドーマを決定する手段に適用すればよい。
【０１９３】
また、上述の方法にて決定した少なくとも２種類の腸内細菌と結合するＩｇＡ抗体を産生するハイブリドーマを決定した後に、上述したようなモノクローナル抗体を製造する方法にて用いられる限界希釈法等を用いて、上記少なくとも２種類の腸内細菌と結合するＩｇＡ抗体を産生するハイブリドーマをさらにクローニングする工程が含まれていてもよい。
【０１９４】
このようなクローニングを行う際には、上述の少なくとも２種類の腸内細菌と結合するＩｇＡ抗体を産生するハイブリドーマを決定する際に採用したものと同一の特定の２種類の腸内細菌を用いて、上述のハイブリドーマの決定方法を繰り返し行えばよい。
【０１９５】
工程２における具体的な回収方法は、特に限定はされないが、例えばＩｇＡ抗体を産生する細胞の培養液の上清を回収する方法、前記細胞の溶解液を回収する方法が挙げられる。細胞の溶解液は、超音波破砕、フレンチプレス等といった公知の機械的手段及び／又は界面活性剤、細胞壁消化酵素、細胞膜消化酵素を用いた公知の化学的処理による方法を適宜組み合わせて細胞を溶解し、その後固液分離工程に供した後の液相画分を回収して本発明のモノクローナルＩｇＡ抗体が製造されうる。
【０１９６】
また、上述のハイブリドーマからＩｇＡを回収する前に、当該ハイブリドーマを適当な培地を用いて一定期間培養した後に、上述のようにその上清を回収する方法、又は細胞の溶解液から回収する方法に供してもよい。この他にも、上述のハイブリドーマを免疫不全マウス等のハイブリドーマの由来に適応した動物個体に腹腔内投与し、斯かる個体の腹水から回収してもよい。
【０１９７】
なお、上述の方法で回収したモノクローナルＩｇＡ抗体は、適宜公知の精製工程に供してもよい。具体的な精製手段は、特に限定はされないが、例えばアセトン、硫酸アンモニウム等を用いた沈殿による精製手段；アフィニティ、陰イオン交換、陽イオン交換、サイズ排除、逆相等のカラムクロマトを用いた精製手段等といった、公知のタンパク質の精製手段を適宜組み合わせて採用すればよい。
【０１９８】
本発明のモノクローナルＩｇＡ抗体の製造方法には、以下の態様の製造方法も含まれる。例えば、上述の〔核酸〕にて詳述した核酸を、モノクローナルＩｇＡ抗体を産生し得る細胞に導入し、当該細胞を培養して、その細胞抽出液又は培養上清から、モノクローナルＩｇＡ抗体を回収し、必要に応じて精製する方法が挙げられる。
【０１９９】
このようなモノクローナルＩｇＡ抗体を産生し得る細胞とは、通常、哺乳類等に由来する高次構造を形成することによって機能を発揮する各種タンパク質を産生し得る細胞であれば、特に限定はされないが、例えばＣＯＳ細胞、ＨＥＫ細胞、ＨＥＬＡ細胞、ＣＨＯ細胞等の哺乳類由来の細胞、Ｓｆ９等といった昆虫由来の細胞等といった公知の細胞を適宜選択すればよい。
【０２００】
具体的な核酸の導入方法、当該核酸を導入した細胞の培養条件、回収方法、精製方法については、用いる細胞の種類等によって区々であり、特に限定されず、公知の方法を適宜改変し、組み合わせることで、本発明に係るモノクローナルＩｇＡ抗体を製造することができる。
【０２０１】
上述の本発明に係るモノクローナルＩｇＡ抗体がキメラ抗体である場合、上述の核酸に関し、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域をコードする塩基配列、並びに異種由来の重鎖定常領域及び軽鎖定常領域をコードする塩基配列を有する核酸を作製し、作製した重鎖可変領域をコードする塩基配列と重鎖定常領域をコードする塩基配列を有する核酸を結合させ、また作製した軽鎖可変領域をコードする塩基配列と軽鎖定常領域をコードする塩基配列を有する核酸を結合させ、結合させたこれら核酸を上述のようにモノクローナルＩｇＡ抗体を産生し得る細胞に導入すればよい。
【０２０２】
更に、本発明に係るモノクローナルＩｇＡ抗体が、重鎖及び／又は軽鎖ＣＤＲ１〜３がマウスに由来するアミノ酸配列を有し、それ以外の領域がヒトに由来するアミノ酸配列を有するといった態様の抗体である場合（これを、ヒト化抗体と称することもある。）の製造方法も、上述のキメラ抗体と同様に、重鎖及び／又は軽鎖ＣＤＲ１〜３をコードする塩基配列、並びにそれら以外の領域をコードする塩基配列を有する核酸を作製し、重鎖および軽鎖を構成するように核酸を再結合し、これらを上述のようにモノクローナルＩｇＡ抗体を産生し得る細胞に導入すればよい。抗体の結合能の保持のため、一部の塩基を他の塩基に置換する必要がある場合もある。
【０２０３】
本発明に係るモノクローナルＩｇＡ抗体が、Ｊ鎖を含む場合の製造方法として、上述のようにモノクローナルＩｇＡ抗体を産生し得る細胞に、当該モノクローナルＩｇＡ抗体をコードする塩基配列を有する核酸と共に、Ｊ鎖をコードする塩基配列を含む核酸を導入すればよい。
【０２０４】
Ｊ鎖をコードする塩基配列は、上述の〔モノクローナルＩｇＡ抗体〕において説明した、ＮＣＢＩのウェブサイトに記載されたＪ鎖のアミノ酸配列を基に、公知の方法を採用して適宜決定することができる。また、斯かる核酸は、決定した塩基配列を基に、公知の方法を用いて製造することが可能である。
【０２０５】
本発明に係るモノクローナルＩｇＡ抗体が、分泌因子を含む場合の製造方法として、上述のようにモノクローナルＩｇＡ抗体を産生し得る細胞に、当該モノクローナルＩｇＡ抗体をコードする塩基配列を有する核酸、並びにＪ鎖をコードする塩基配列を含む核酸と共に、分泌因子をコードする塩基配列を含む核酸を導入すればよい。この様な方法は、例えば、Ｌｉ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｈｅｎｇ  Ｗｕ  Ｇｏｎｇ  Ｃｈｅｎｇ  Ｘｕｅ  Ｂａｏ．２０１１  Ｆｅｂ；２７（２）：２１９−２５．等に記載されており、斯かる記載、及び必要に応じてこれを適宜改変することによって製造することが可能である。
【０２０６】
上述の分泌因子をコードする塩基配列を含む核酸としては、例えば、上述した〔モノクローナルＩｇＡ抗体〕に記載した、ＮＣＢＩのウェブサイトに記載されたポリイムノグロブリンレセプターのアミノ酸配列を基に、公知の方法を採用して適宜決定することができる。また、斯かる核酸は、決定した塩基配列を基に、公知の方法を用いて製造することが可能である。
【０２０７】
〔ハイブリドーマ〕
本発明に係るハイブリドーマは、上述の本発明に係るモノクローナルＩｇＡ抗体を産生するハイブリドーマである。
【０２０８】
具体的なハイブリドーマとは、上述の〔モノクローナルＩｇＡ抗体の製造方法〕における工程１で得られるものである。すなわち、上述の本発明に係るモノクローナルＩｇＡ抗体の製造方法における工程１にて記載したＢ細胞と、それ以外の種類、すなわちＢ細胞以外の種類の細胞を混合させて融合した細胞である。
【０２０９】
ハイブリドーマは、同一種由来のハイブリドーマであっても、異種由来のハイブリドーマであってもよい。同一種由来のハイブリドーマは、上述の〔モノクローナルＩｇＡ抗体の製造方法〕において、前記Ｂ細胞と前記Ｂ細胞以外の種類の細胞の由来種を同一にすればよく、異種由来のハイブリドーマは、前記Ｂ細胞と前記Ｂ細胞以外の種類の細胞の由来種を異なるものにすればよい。
【０２１０】
同一種由来のハイブリドーマとしては、例えば上述〔モノクローナルＩｇＡ抗体の製造方法〕における工程１に記載した由来のうち、Ｂ細胞及びＢ細胞以外の種類の細胞の由来において重複するものから適宜選択すればよい。例えば、ヒト由来、マウス由来、ラット由来、ハムスター由来、ウサギ由来、ヤギ由来、ロバ由来、ブタ由来、ウシ由来、ウマ由来、ニワトリ由来、サル由来、チンパンジー由来等の同一種由来ハイブリドーマが挙げられる。
【０２１１】
異種由来のハイブリドーマとしては、例えば上述の〔モノクローナルＩｇＡ抗体の製造方法〕における工程１に記載した由来のうち、Ｂ細胞及びＢ細胞以外の種類の細胞の由来において記載した由来から、それぞれ適宜選択したものを組み合わせればよい。例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ロバ、ブタ、ウシ、ウマ、ニワトリ、サル、チンパンジー等の由来を適宜組み合わせた異種由来のハイブリドーマが挙げられる。
【０２１２】
〔医薬組成物〕
本発明に係る医薬組成物は、本発明に係るモノクローナルＩｇＡ抗体を含む。
【０２１３】
本発明に係る医薬組成物は、特に限定はされないが、例えば腸内疾患の治療のために好適に用いることができる。さらに好ましくは、腸内細菌の異常増殖及び／又は腸内細菌叢の病的変化により発症する腸内疾患の治療を目的として用いられる。なお、腸内細菌の異常増殖及び腸内細菌叢の病的変化とは、上述の〔本発明のモノクローナルＩｇＡ抗体〕にて説明した通りである。
【０２１４】
腸内細菌の異常増殖及び／又は腸内細菌叢の病的変化により発症する腸内疾患とは、特に限定はされないが、例えば、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、アレルギー、喘息、肥満、自己免疫疾患等が挙げられ、中でも炎症性腸疾患が好ましい。
【０２１５】
このような本発明に係る医薬組成物は、本発明に係るモノクローナルＩｇＡ抗体を有効量含んでいればよく、例えば、医薬組成物１００重量％中の本発明に係る抗体の含有割合が０．００１〜９９．９９重量％の範囲になるように、対象とする腸内疾患の種類、剤型、投与方法、投与対象、投与対象者の症状の度合い、並びに投与によって発揮される効果の程度等を勘案して、適宜設定することができる。
【０２１６】
本明細書にて使用する用語『有効量』とは、本発明に係るモノクローナルＩｇＡ抗体が腸内疾患に対する治療効果を発揮できる量、又は上述する所望の薬理学的効果及び／又は生理学的効果（腸内疾患治療効果）を発揮する量をいう。
【０２１７】
本発明に係る医薬組成物には、本発明に係るモノクローナルＩｇＡ抗体と共に、薬学的に許容可能な担体或いは添加物を配合しても良い。薬学的に許容可能な担体或いは添加物とは、任意の担体、希釈剤、賦形剤、懸濁剤、潤滑剤、アジュバント、媒体、送達システム、乳化剤、錠剤分解物質、吸収剤、保存剤、界面活性剤、着色剤、香料、または甘味料を意味し、公知のものを採用すればよい。
【０２１８】
本発明に係る医薬組成物は、上述の腸内疾患に罹患した個体に投与する工程を含む腸内疾患の治療方法における利用可能性を有している。また、上述のような腸内疾患の病態や症状を発症していないものの、腸内疾患の素因を持ち得る個体に投与する工程を含む腸内疾患の予防方法における利用可能性も有している。これらの個体を、本発明に係る医薬組成物の投与対象とすればよい。
【０２１９】
この様な投与対象となる個体は、特に限定はされないが、例えばヒト、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ハムスター、イヌ、ネコ、イタチ等が挙げられる。
【０２２０】
当該医薬組成物の投与量並びに投与方法は、投与対象となる個体が罹患する腸内疾患の種類、性別、種、年齢、全身状態、疾患の重篤度、所望する効果の程度等に区々ではある。投与量としては、通常は、０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲で適宜設定すればよい。
【０２２１】
また、投与方法については、特に限定はされないが、消化管に直接投与することが好ましく、このような投与方法として、例えば経口投与、経鼻投与、経粘膜投与、経腸投与等が挙げられる。
【０２２２】
なお、経腸投与とは、肛門を介した投与には限られず、例えば胃瘻等の様に個体外からチューブ等を消化管に挿入して、それを経由した投与も含まれる。消化管を挿入する位置は腸に限らず、食道、胃、小腸（十二指腸、空腸、回腸等を含む。）、大腸（盲腸、結腸、直腸等を含む。）等が挙げられる。
【０２２３】
なお、このような本発明に係る医薬組成物の投与は、上記の量を１日に１度に投与してもよく、数回に分けて投与してもよい。また、上記疾患に対する治療効果を有する範囲において、投与間隔は、毎日、隔日、毎週、隔週、２〜３週毎、毎月、隔月または２〜３ヶ月毎でもよい。
【０２２４】
〔経口又は経腸組成物〕
本発明に係る経口又は経腸組成物は、本発明に係るモノクローナルＩｇＡ抗体を含む。
この様な経口又は経腸組成物を使用することによって、腸内細菌の異常増殖及び／又は腸内細菌叢の病的変化を抑制する効果を発揮する。なお、腸内細菌の異常増殖及び腸内細菌叢の病的変化とは、上述の〔本発明のモノクローナルＩｇＡ抗体〕にて説明した通りである。
【０２２５】
この様な経口又は経腸組成物における上記モノクローナルＩｇＡ抗体の配合割合は、特に限定はされず、経口又は経腸組成物の形態、用途等に応じて適宜調整すればよいが、通常は経口又は経腸組成物の総量に対して、０．００１〜９９重量％程度とすればよい。
【０２２６】
本発明に係る経口又は経腸組成物の使用対象とする個体は、特に限定はされないが、例えばヒト、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ハムスター、イヌ、ネコ、イタチ等が挙げられる。
【０２２７】
上述のように、本発明に係る経口又は経腸組成物に含有される上述のモノクローナルＩｇＡ抗体は腸内細菌の異常増殖及び／又は腸内細菌叢の病的変化を抑制する効果を発揮することから、整腸組成物、腸内環境改善組成物、腸内環境最適化組成物、又は腸内腐敗防止組成物として特に有用である。
【０２２８】
本発明に係る経口又は経腸組成物の使用量は、上述のような経口又は経腸組成物の効果が発揮される範囲であれば、特に限定はされず、更に経口又は経腸組成物を摂取する個体の種類や、目的とする効果、その目的とする度合い、並びにその他の諸条件などに応じて設定すればよい。具体的には本発明に係るモノクローナルＩｇＡ抗体の量に換算して、通常は０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ／日程度とすればよく、これを１日１回〜数回に分けて摂取してもよい。
【０２２９】
なお、経腸とは、上述の〔医薬組成物〕にて説明したように、肛門を介した投与に限られない。例えば、本発明の経腸組成物を、公知の成分と共に配合して腸内洗浄液として使用することも可能である。
【０２３０】
本発明に係る経口又は経腸組成物は、腸内細菌の異常増殖及び／又は腸内細菌叢の病的変化を抑制する効果を発揮する本発明に係るモノクローナルＩｇＡ抗体を含むものであり、このような効果を発揮することを期待して食品の分野、飼料の分野に好適に用いることができる。従って、本発明の経口又は経腸組成物は、食品組成物又は飼料組成物とすることができる。
【０２３１】
上述の食品組成物は、本発明の経口又は経腸組成物を食品の分野に専ら好適に用いる組成物である。このような食品組成物は、整腸用、腸内環境改善用、腸内環境最適化用、腸内腐敗防止用等と表示された食品組成物として提供することができる。
【０２３２】
上述の食品組成物としては、一般の食品の他、条件付き特定保健用食品を含む特定保健用食品、栄養補助食品、機能性食品、病者用食品等を挙げることができる。
【０２３３】
上述の食品組成物の具体的な形態は特に限定はされないが、例えば、清涼飲料、炭酸飲料、栄養飲料、果実飲料、乳酸飲料、乳飲料等の飲料；アイスクリーム、アイスシャーベット、かき氷等の冷菓；飴、キャンディー、ガム、チョコレート、錠菓、スナック菓子、ビスケット、ゼリー、ジャム、クリーム、焼き菓子等の菓子類；そば、うどん、はるさめ、中華麺、即席麺等の麺類；かまぼこ、ハム、ソーセージ等の水産・畜産加工食品；加工乳、発酵乳等の乳製品；サラダ油、てんぷら油、マーガリン、マヨネーズ、ショートニング、ホイップクリーム、ドレッシング等の油脂及び油脂加工食品；ソース、たれ等の調味料；スープ、シチュー、サラダ、惣菜、ふりかけ、漬物、パン、シリアル等を例示できる。また、特定保健用食品、栄養補助食品、機能性食品等の場合であれば、粉末、顆粒、カプセル、トローチ、タブレット、シロップ等の形態が挙げられる。
【０２３４】
上述の飼料組成物は、本発明の飼料組成物を飼料の分野に専ら用いられる組成物である。このような飼料組成物は、整腸用、腸内環境改善用、腸内環境最適化用、腸内腐敗防止用等と表示された食品組成物として提供することができる。
【０２３５】
上述の飼料組成物の具体的な形態は特に限定はされないが、例えば上述した本発明に係る飼料組成物が発揮する効果が損なわれない限りにおいて、通常の飼料に混合、又は必要に応じて通常の飼料に配合可能な成分と共に混合して飼料組成物とすればよく、飼料組成物そのものを飼料としてもよい。
【０２３６】
〔疾患の治療方法〕
本発明に係る疾患の治療方法は、腸内疾患の治療方法であって、上述の本発明に係るモノクローナルＩｇＡ抗体、本発明に係る医薬組成物、又は本発明に係る経口組成物の有効量を、腸内疾患に罹患したヒトに投与する工程を含む方法である。
【０２３７】
上述の腸内疾患に罹患したヒトとは、上記〔本発明に係る医薬組成物〕にて説明した投与対象とすればよい。また、具体的な投与方法、投与量についても上記〔本発明に係る医薬組成物〕にて説明したものとすればよい。
【実施例】
【０２３８】
以下に、本発明をさらに説明する。但し、本発明が以下に示す実施例に限定されないのは言うまでもない。【０２３９】
実験例１：抗体の調製
〔１−１：腸管粘膜固有層細胞の分離〕
８週齢の野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウス（日本クレア）を、自由飲食条件下で長浜バイオ大学付属実験施設にて２０週齢まで飼育した。次いで飼育したマウスを、炭酸ガスにより安楽死させた後、開腹して小腸全長を摘出した。この摘出した小腸サンプルから、結合組織とパイエル板を取り除いた後、小腸を縦切開し、腸内容物をＰＢＳで満たした１０ｃｍのｄｉｓｈ内で洗い流した。そしてＰＢＳをさらに３〜４回交換して、小腸を十分洗浄した。【０２４０】
また、野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスと同様に、ＡＩＤタンパク質のＮ末端側に変異を導入したＡＩＤ  Ｇ２３Ｓを発現するマウス（ＡＩＤ  Ｇ２３Ｓマウス）からも小腸を採取した。この様なＡＩＤ  Ｇ２３Ｓマウスは、例えば非特許文献１８に示す公知の方法を用いて作成することが可能である。【０２４１】
次に、５０ｍｌチューブに１ｍＭのＥＤＴＡを含有する５０ｍｌのＰＢＳを入れ、洗浄した小腸を０．５〜１ｃｍの長さに切断して加えた。３７℃で２０分間振盪した後、ストレイナーに小腸断片を集め、その後ＰＢＳを廃棄した。さらに上述のチューブに小腸を入れて、１０秒間激しく振盪させた後、再びストレイナーに小腸断片を集め、その後同様にＰＢＳを廃棄した。この５０ｍｌのＰＢＳを用いた１０秒間の小腸の激しい振盪を２回繰り返した。【０２４２】
次に、５０ｍｌ容チューブに３７℃に温めた５０ｍｌの消化酵素液（５００ｍｌのＲＰＭＩ  １６４０、２５ｍｌのＦＣＳ（最終濃度５％）、２μｌの２−メルカプトエタノール（最終濃度５５μＭ）、０．７５ｇのコラゲナーゼ、及び５ｍｌジスパーゼ（最終濃度１Ｕ／ｍｌ）にて調製）を入れ、はさみでさらに切り刻んだ小腸断片を加え、これを３７℃で６０分間振盪した後、フラスコを１０秒間静置し、小腸組織を沈めた後に、その上清を新しい５０ｍｌ容チューブに移した。この消化酵素液を用いた消化工程を２回繰り返した。【０２４３】
上記の消化工程において分離した上清を、１，５００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心し、その上清を廃棄した。さらに得られた沈殿物を１ｍｌの２％ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ  １６４０に懸濁した。懸濁液をフィルターに通して組織片を取り除き、細胞懸濁液を氷上に保存した。【０２４４】
上述の２回目の酵素反応を６０分間行った後、同様に細胞懸濁液を回収した。１回目の細胞懸濁液と２回目の細胞懸濁液の２本の細胞懸濁液を合わせ、これを腸管粘膜固有層の細胞とした。【０２４５】
〔ＩｇＡ産生ハイブリドーマの作製〕
上記〔腸管粘膜固有層細胞の分離〕において得られた腸管粘膜固有層の細胞と、マウスミエローマ細胞であるＮＳ１細胞を融合してハイブリドーマを作成した。ＮＳ１細胞は細胞融合に先立って培養及び維持を行った。細胞融合は、ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＣｌｏｎａＣｅｌｌ（登録商標）−ＨＹ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔに従い、その試薬と手順に従って行った。【０２４６】
次いで、得られたハイブリドーマを上記キットに従ってメチルセルロース含有培地内で増殖させクローニングを行った。その後、その増殖中のハイブリドーマから上清を分離した。この上清中に含まれる抗体に関して、サンドイッチＥＬＩＳＡにより、産生される抗体がＩｇＡであること、そして上清中のＩｇＡ抗体価を測定し、ＩｇＡ産生ハイブリドーマのクローンを分離した。この結果、計３７クローンが樹立されたことが確認された。【０２４７】
各クローンからＩｓｏｇｅｎＩＩ（Ｎｉｐｐｏｎ  Ｇｅｎｅ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）を使用してＲＮＡを抽出し、これを鋳型にしてｃＤＮＡを合成し、抗体のＶｈ領域に対する７種のプライマー（ＭＨ１〜７）及びＣα領域特異的プライマー（ＩｇＡＲ）を用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。これらのプライマーの具体的な塩基配列を表３に示す。【０２４８】
【表３】
0005916946.tif 000004
【０２４９】
増幅されたＶＤＪ領域ＰＣＲ産物を直接シークエンスすることで、ＶＤＪ  ｕｓａｇｅと突然変異の数を解析した。この解析により、独立クローンとして１７種類のＩｇＡ産生ハイブリドーマを得たことが明らかになった。これらを、それぞれＷ１、Ｗ２、Ｗ３、Ｗ４、Ｗ６、Ｗ７、Ｗ１１、Ｗ１４、Ｗ２４、Ｗ２７、Ｗ２８、Ｗ３０、Ｗ３２、Ｗ３４、Ｗ３７、Ｗ４３、及びＷ４７と呼ぶ。【０２５０】
また、同様の実験によりＧ２３Ｓマウスから、１０種類のＩｇＡ産生ハイブリドーマの独立クローンが得られた。これらをそれぞれ、Ｇ１、Ｇ８、Ｇ９、Ｇ１０、Ｇ１２、Ｇ１４、Ｇ１５、Ｇ１６、Ｇ１８、及びＧ１９と呼ぶ。【０２５１】
〔１−２：ＩｇＡ抗体の調製〕
上述の〔ＩｇＡ産生ハイブリドーマの作製〕において得られた１７クローンのＩｇＡ抗体産生ハイブリドーマを１０％のＦＣＳを含有するＲＰＭＩ  １６４０にて大量培養し、その培養上清を遠心分離によって採取した。次いで得られた培養上清を０．２２μｍフィルターに通した後に、硫安沈殿とＰＢＳに対して透析することによって、それぞれ２７種類のモノクローナルＩｇＡ抗体（以下、本実施例において、〔クローン名〕モノクローナルＩｇＡ抗体と呼ぶことがある。）を粗精製した。【０２５２】
もう一つの方法として、〔ＩｇＡ産生ハイブリドーマの作製〕にて得られた２７クローンのハイブリドーマを、免疫不全マウスに腹腔内注射し、１０〜２１日間の育種の後、マウスから腹水を採取した。採取した腹水は硫安沈殿後ＰＤ−１０カラムを使ってＰＢＳにバッファーを置換した。これによっても、それぞれ２７種類のモノクローナルＩｇＡ抗体が粗精製された。【０２５３】
これらの方法で調製した２７種類のモノクローナルＩｇＡ抗体を、ＥＬＩＳＡ法を用いてその濃度を測定した。ここで使用した抗体としては、固層へのコーティングにヤギ抗−マウスＩｇＡ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を２μｇ／ｍｌ、検出用にＡＬＰ−標識化ヤギ抗−マウスＩｇＡ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を０．５μｇ／ｍｌで用いた。標準検品としてマウスＩｇＡ  κ（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｎｓｕｌｔａｎｔｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を用いた。【０２５４】
〔１−３：腸内常在細菌の準備〕
長浜バイオ大学付属実験施設ＳＰＦ室で飼育中の野生型マウス糞便をＰＢＳに懸濁後、血液寒天培地に希釈懸濁液をぬり拡げ、４８〜７２時間３７℃で培養した。その後、コロニーから直接１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物をシークエンスして、各コロニーの細菌の種類を同定した。この方法により、６種類のマウス腸内細細菌をクローニングした。【０２５５】
クローニングされたマウス腸内常在菌は、具体的には以下の６種類である：
Ｅｎｔｅｒｏｒｈａｂｄｕｓ  ｍｕｃｏｓｉｃｏｌａ；
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ；
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ；
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｕｒｉｎｕｓ；
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ；
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｕｌｖａ。【０２５６】
〔１−４：各種腸内細菌に対する結合力及び特異性の検索〕
上述のクローニングした６種類の腸内常在菌及び市販の
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（ＤＨ５α株：ＴＯＹＯＢＯ社から入手）；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ（ＡＴＣＣより入手）、
Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｕｔａｃｔｕｓ（ＡＴＣＣより入手）、
Ｂｌａｕｔｉａ  ｃｏｃｃｏｉｄｅｓ（ＡＴＣＣより入手）、
Ｍｅｇａｍｏｎａｓ  ｈｙｐｅｒｍｅｇａｌｅ（ＡＴＣＣより入手）、
Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｅｃｔａｌｅ（ＡＴＣＣより入手）、
Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｉｕｍ（ＡＴＣＣより入手）
の合計１３種類の腸内細菌を至適条件で培養し遠心により集菌した。【０２５７】
具体的には０．０５ＭのＮａ２ＣＯ３バッファーに細菌を懸濁し、ＥＬＩＳＡ法用のプレートにコーティングした。公知の方法でブロッキングした後に、上述の２７種類のモノクローナルＩｇＡ抗体（濃度は１．４μｇ／ｍｌ）をそれぞれに加え、上記１３種類の腸内細菌に対するこれらのクローナルＩｇＡ抗体の結合力と特異性をそれぞれ、上述のＥＬＩＳＡ法を用いて測定した。なお、検出用の抗体は上述のものを使用した。【０２５８】
この結果を図１に示す。上述の２７種類のモノクローナルＩｇＡのうち２２種類のモノクローナルＩｇＡ（野生型マウス由来のＷ１、Ｗ３、Ｗ４、Ｗ６、Ｗ７、Ｗ１１、Ｗ１４、Ｗ２４、Ｗ２７、Ｗ３０、Ｗ３２、Ｗ３４、Ｗ４３、及びＷ４５モノクローナルＩｇＡ抗体；Ｇ２３Ｓマウス由来のＧ１、Ｇ９、Ｇ１０、Ｇ１２、Ｇ１４、Ｇ１５、Ｇ１８、及びＧ１９モノクローナルＩｇＡ抗体。）が、２種以上の腸内細菌に結合することが明らかとなった。【０２５９】
次いで、これらのモノクローナルＩｇＡ抗体の使用濃度を変化させ、各種腸内細菌に対する結合力の強さを比較する実験を行った。具体的な実験方法は上述のＥＬＩＳＡ法を採用した測定方法であり、使用したモノクローナルＩｇＡ抗体は、Ｗ２７、Ｇ１５、Ｇ１９モノクローナルＩｇＡ抗体である。また、ネガティブコントロールとしてＷ２クローンモノクローナルＩｇＡ抗体を用いた。【０２６０】
そして、使用した腸内常在菌は、
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、及びＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓである。【０２６１】
結果を図２に示す。各種腸内細菌に対して、Ｗ２７モノクローナルＩｇＡ抗体クローンが濃度依存的に最も効果的に結合することが明らかとなった。【０２６２】
同様の実験を、Ｗ２７モノクローナルＩｇＡ抗体、これに分泌因子が結合したＷ２７ＳＣ３Ｆ、Ｗ１１、Ｗ３４、Ｗ４３、及びＧ１５モノクローナルＩｇＡ抗体を用いて行った。また、ネガティブコントロールとしてＷ２モノクローナルＩｇＡ抗体を用いた。【０２６３】
Ｗ２７ＳＣ３ＦモノクローナルＩｇＡ抗体の製造は、以下のようにして行った。まず、野生型マウス小腸の約１ｃｍの断片よりＲＮＡを抽出した。これを基に、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩを用いて逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを得た。このｃＤＮＡを鋳型に用いて、２つプライマー（ＥｃｏＲＩ  ＳＣＦ：５’−ｇａａｔｔｃａｃｃａｔｇａｇｇｃｔｃｔａｃｔｔｇ−３’；配列番号６９、Ｆｌａｇ  ＳＣ３Ｒ：５’−ｃｔｃｇａｇｔｃａｃｔｔｇｔｃｇｔｃａｔｃｇｔｃｔｔｔｇｔａｇｔｃｃｃｃｇｇｇａｔｔ−３’；配列番号７０）でポリイムノグロブリンレセプターの細胞外ドメインをＰＣＲで増幅した。その際、リバースプライマーにＦｌａｇ−ｔａｇの塩基配列を付加し、細胞内での発現を抗Ｆｌａｇ抗体で検出可能になるように設定した。増幅されたＤＮＡが有する塩基配列は、配列番号７１に示すアミノ酸配列をコードするものである。なお、Ｃ末端にはＦＬＡＧタグ配列が付加されている（ｍＳＣ３Ｆ−ＦＬＡＧ）。【０２６４】
得られたＰＣＲ産物を制限酵素処理し、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にクローニングした。以下完成した発現ベクターをｐｃＤＮＡ３．１（＋）／ｍＳＣ３Ｆと記載する。ｐｃＤＮＡ３．１（＋）／ｍＳＣ３ＦのプラスミドＤＮＡを大腸菌より調製し、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（ＡＭＡＸＡ社）によりＷ２７モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマに遺伝子導入を行った。その後、Ｇ４１８による選択を行った。これによって選択されたハイブリドーマより、上述のようにバイブリドーマからモノクローナルＩｇＡ抗体を回収する方法に準じて、Ｗ２７ＳＣ３ＦモノクローナルＩｇＡ抗体を得た。【０２６５】
そして、使用した腸内常在菌は、
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｕｌｖａである。【０２６６】
結果を図３に示す。この実験からも、Ｗ２７モノクローナルＩｇＡ抗体が濃度依存的に最も効果的に各種腸内細菌に対して、結合することが明らかとなった。【０２６７】
〔１−５：各種モノクローナルＩｇＡ抗体を用いた各種細菌に対するウエスタンブロット解析〕
腸内細菌として、
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（ＤＨ５α；市販品）、
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（マウス腸内細菌からのクローニング株）、
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｕｌｖａ、
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ及び
Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｅｃｔａｌｅ
を１０ｍｌのＬＢ又は至適培養液中で、それぞれの菌体に適した条件下で振蕩培養を行った。遠心して集菌後、１％のＮＰ−４０を含むＰＢＳに懸濁し氷上で超音波破砕を行った。氷上で３０分間静置後、遠心分離によって上清を得た。これにＳＤＳ−ｂｕｆｆｅｒ（２−ＭＥ含有）を加え、９５℃で１０分間の熱処理によりタンパク質を変性させた。８％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、フィルターに転写し、ブロッキング後、Ｗ２７、Ｗ３０、及びＷ４５モノクローナルＩｇＡ抗体（２μｇ／ｍｌ）、続いてＧｏａｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＡ（１μｇ／ｍｌ）（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、ＩＲ８００  ａｎｔｉ−ｇｏａｔ  ＩｇＧ（０．２μｇ／ｍｌ）（Ｒｏｃｋｌａｎｄ社）、更に必要に応じでラベル化されたａｎｔｉ−Ｇｏａｔ  ＩｇＧにより反応を行うウエスタンブロッティング法に供し、Ｏｄｙｓｓｅｙ（ＬＩ−ＣＯＲ）により、そのシグナルを検出した。【０２６８】
結果を、図４に示す。Ｗ２７、Ｗ３０、及びＷ４５モノクローナルＩｇＡ抗体は、上述の全ての菌の抽出物に結合することが明らかとなった。従って、この実験結果からＷ２７、Ｗ３０、及びＷ４５モノクローナルＩｇＡ抗体は腸内細菌の構成タンパク質１種類を抗原とすることが示唆された。さらに、この構成タンパク質の分子量が４５〜５０ｋＤａ程度であることも明らかとなった。【０２６９】
更に、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｅｃｔａｌｅ、Ｂｌａｕｔｉａ  ｃｏｃｃｏｉｄｅｓ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｕｔａｃｔｕｓ、Ｍｅｇａｍｏｎａｓ  ｈｙｐｅｒｍｅｇａｌｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ、及び
Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍも上記方法と同様の実験を行った。使用したモノクローナルＩｇＡ抗体は、Ｗ２７である。結果を図４に合わせて示す。Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｅｃｔａｌｅ以外の菌体の抽出物中のタンパク質に、Ｗ２７モノクローナルＩｇＡ抗体は結合しないことが明らかとなった。【０２７０】
〔１−６：各種モノクローナルＩｇＡ抗体のアミノ酸配列の解析〕
上述の方法によって得られたモノクローナルＩｇＡ抗体のうち、２種類以上の腸内細菌に結合することが確認されたＷ２７クローン、Ｗ３０クローン、Ｗ３４クローン、Ｗ４３クローン、及びＷ１１モノクローナルＩｇＡ抗体の５つのモノクローナルＩｇＡ抗体のアミノ酸配列を、公知の方法によって解析した。【０２７１】
アミノ酸配列を公知の方法によって解析した。具体的には５’及び３’ＲＡＣＥ反応を行って、その全長塩基配列を得た。ＲＡＣＥ法はＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＳＭＡＲＴｅｒＴＭ  Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ｃＤＮＡ  ｌｉｂｒａｒｙ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）の方法に従った。Ｋｉｔに付属のプライマーおよび上述したプライマーを組み合わせて重鎖に関してはシークエンス解析を行った。軽鎖に関しては、以下のプライマーを組み合わせてシークエンス解析を行った。【０２７２】
ＣｋＲ：５’−ＡＡＣＧＴＧＡＧＧＧＴＧＣＴＧＣＴＣＡＴＧ−３’（配列番号７２）
ｄｅｇ  Ｖｋ：５’−ＧＧＣＴＧＣＡＧＳＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＲＴＣＷＧＧＲＡＣ−３’（配列番号７３）
結果を表４〜表８に示す。なお、これらの表中の「全長配列」の下線部は可変領域を示し、「全長配列」及び「可変領域」の太字部は、前から（Ｎ末端から）順に、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を示す。【０２７３】
また、これらのアミノ酸をコードする核酸配列は以下の通りである；
・Ｗ２７モノクローナルＩｇＡ抗体；重鎖：配列番号５１、軽鎖：配列番号５２；
・Ｗ３０モノクローナルＩｇＡ抗体；重鎖：配列番号５３、軽鎖：配列番号５４；
・Ｗ３４モノクローナルＩｇＡ抗体；重鎖：配列番号５５、軽鎖：配列番号５６；
・Ｗ４３モノクローナルＩｇＡ抗体；重鎖：配列番号５７、軽鎖：配列番号５８；
・Ｗ１１モノクローナルＩｇＡ抗体；重鎖：配列番号５９、軽鎖：配列番号６０。【０２７４】
【表４】
0005916946.tif 000005
【０２７５】
【表５】
0005916946.tif 000006
【０２７６】
【表６】
0005916946.tif 000007
【０２７７】
【表７】
0005916946.tif 000008
【０２７８】
【表８】
0005916946.tif 000009
【０２７９】
実施例２：モノクローナルＩｇＡ抗体の抗原特定実験
〔２−１：免疫沈降実験〕
上記〔１−５〕の方法で上述の方法でＥｓｃｅｈｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（ＤＨ５α）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｕｌｖａ、及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのそれぞれ３種類の細菌より細胞抽出成分を得た後、２−ＭＥ（終濃度３００ｍＭ）とＳＤＳ（終濃度１％）を加え９５℃１０分間で熱変性を行った。その後、溶液中の２−ＭＥ濃度を６０ｍＭにＳＤＳ濃度を０．２％に調整した。まず細胞抽出成分に洗浄済みＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥ社）を１００μｌ加えて、４℃で３０分間の転倒混和を行い、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅへの非特異的結合成分を遠心操作により排除した。このＰｒｅ−ｃｌｅａｒ後の細胞抽出成分に、５μｇのＷ２７モノクローナルＩｇＡ抗体を加え氷上３０分間静置、その後Ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＡを５μｇ加えさらに氷上３０分間静置した。続いて洗浄済みＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥ社）を３０μｌ加えて４℃で１５時間の転倒混和を行った。１％のＮＰ−４０を含むＰＢＳによる洗浄操作を４回行い、洗浄液を排除後のＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ＳｅｐｈａｒｏｓｅにＳＤＳ−ｂｕｆｆｅｒ（２−ＭＥを含む）を加え、９５℃１０分間の熱処理によりタンパク質を変性させた（免疫沈降サンプル）。これを８％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いて上述のウエスタンブロッティングに供して上述の〔１−５〕にて確認したタンパク質が濃縮されたことを確認した（図５）。【０２８０】
〔２−２：２次元電気泳動・ＭＳ解析〕
上述の免疫沈降サンプルに対してアセトン沈殿を行い、２次元電気泳動用のバッファーに溶解した。１次元目のゲルはＡｇａｒ  Ｇｅｌ（ｐＨ３〜８；ＡＴＴＯ社）を使用した。２次元目は６％のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。毎回、サンプルを２組作成し同時に電気泳動した後は、１組目のサンプルは上述のウエスタンブロッティングを行い、標的タンパク質のゲル内の位置の確認を行った。具体的にはフィルターに転写後、まず転写タンパク質をＭｅｍＣｏｄｅＴＭ  Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔａｉｎ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて染色してその染色画像を得た（図５）。【０２８１】
続いて除染してから上述の通常のウエスタンブロッティングを行い、標的タンパク質の位置を確認する画像を得た（図５）。２つの画像から標的タンパク質が２次元に展開されたタンパク質のどのスポットであるかを特定した。２組目のゲルはそのまま銀染色（シルベストステイン；Ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ社）を行い、すべてのタンパク質を可視化した。ウエスタンブロッティングから得られた位置情報をもとに標的タンパク質を特定し、ゲルから切り出した。【０２８２】
そして切り出したゲルはトリプシンによるゲル内酵素消化を３７℃で１５時間行った。
ＭＳ解析はＬＣＭＳ−ＩＴ−ＴＯＦ（Ｓｈｉｍａｚｕ社）により実施した。解析の結果、スポットのタンパク質は、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼを抗原とすることが明確となった。【０２８３】
次いで、Ｃ末端側にｃ−Ｍｙｃタグを付けた配列番号７４に示すアミノ酸配列に示すセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼの全長を大腸菌（ＤＨ５α）にて発現させ、これに対して上記の各種抗体（Ｗ１１、Ｗ２７、Ｗ３０、Ｗ３４、及びＷ４３モノクローナルＩｇＡ抗体）との結合をウエスタンブロッティングによって確認した。結果を図９に示す。【０２８４】
この結果、Ｗ２７モノクローナルＩｇＡ抗体のみならず、Ｗ１１、Ｗ３０、Ｗ３４、及びＷ４３モノクローナルＩｇＡ抗体もセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼを抗原とすることが明らかとなった。【０２８５】
〔２−３：エピトープ特定実験〕
次いで、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼの各種変異体及び野生型を、大腸菌発現系及び２９３Ｔ細胞を用いて作製し、上記各種モノクローナル抗体のエピトープを検討する実験を行った。【０２８６】
作成した各種変異体は、配列番号７４に示すアミノ酸配列の
（１）１〜４１７番目のアミノ酸配列（ｆｕｌｌ  ｌｅｎｇｔｈ：野生型）、
（２）１１〜４１７番目のアミノ酸配列（△２−１０）、
（３）２６〜４１７番目のアミノ酸配列（△２−２５）、
（４）２９〜４１７番目のアミノ酸配列（△２−２８）、
（５）１〜３３３番目のアミノ酸配列（△３３４−４１７）及び
（６）１〜２５０番目のアミノ酸配列（△２５１−４１７）であり、
Ｃ末端側にＭｙｃタグ（４０ａａ）を設けた。【０２８７】
これらの野生型及び変異型のセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼを上述の同様の方法を用いてウエスタンブロッティングに供した。抗体はＷ２７モノクローナルＩｇＡ抗体を使用した。結果を図１０に示す。【０２８８】
図１０に示す結果によると、Ｗ２７モノクローナルＩｇＡ抗体は、△２−２５変異体には結合するものの、△２−２８変異体には結合しないことが明らかとなった。これは、大腸菌に由来する内在性の野生型セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼの影響がないと考えられる２９３Ｔの系を用いた場合の実験から明らかである。また、Ｗ２７モノクローナルＩｇＡ抗体は△２５１−４１７変異体及び△３３４−４１７変異体に結合することが明らかとなった。【０２８９】
実施例３：Ｗ２７モノクローナルＩｇＡ抗体経口投与実験
〔３−１：Ｇ２３Ｓマウスの病態モデル解析〕
Ｇ２３Ｓマウスの、大腸組織切片を作成し、これをＨＥ染色によって炎症の度合いを調べたところ、１３−１６週齢においても野生型マウスに比べて腺管の減少または萎縮が多く観察された（図６）。とくに４０週齢以上では腺管の減少または萎縮、炎症性細胞の大腸粘膜内への浸潤が多く観察された。免疫染色ではＣＤ１１ｂ＋細胞やＩＬ−６陽性細胞、ＩＬ−６、ＩＬ−１７等の炎症性細胞の数が野生型マウスに比べて多く存在していた。【０２９０】
また、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＩＬ−１β、ＩＬ−１７、ＩＬ−６等の炎症性サイトカインの発現量を、定量ＰＣＲ法を用いた方法によって測定した結果からも同様に炎症性細胞の数が、野生型マウスよりも多く存在する結果が明らかとなった。以上のことから、Ｇ２３Ｓマウスは、炎症性大腸炎、潰瘍性大腸炎等のモデルマウスとして用いるにふさわしいことが明らかとなった。【０２９１】
〔３−２：Ｗ２７モノクローナルＩｇＡ抗体の効果〕
上述のＷ２７モノクローナルＩｇＡ抗体を、腸管免疫系過剰反応状態、即ちパイエル板胚中心過形成を示し、腸組織において炎症性サイトカインの産生が亢進しているマウスに対して経口投与を行った。【０２９２】
本実験では１０〜１２週齢のオスのＧ２３Ｓマウスを用いた（バックグラウンドはＢａｌｂ／ｃ）。飼育用の飲料水中に２５μｇ／ｍｌの濃度になるようにＷ２７モノクローナルＩｇＡ抗体を加え、これを２８日間経口摂取させた。ネガティブコントロールとしては水のみを摂取させた実験、また野生型マウスに同様に水のみを摂取させた実験を行った。
なお、全マウス個体に対して、通常の飼育時と同様に飼料も与えた。【０２９３】
投与開始一ヶ月後にマウスを安楽死させ、小腸よりパイエル板を分離した。パイエル板組織を、スライドガラスを使って単細胞に分離し、下記の抗体で表面抗原を染色した。フローサイトメトリー解析でＢ２２０＋ＰＮＡｈｉｇｈを示した胚中心Ｂ細胞画分の細胞数の割合を求め、抗体投与の有無で胚中心そのものが退縮したかどうかを検討した。【０２９４】
フローサイトメトリーで使用した抗体を以下に示した：
・ＰＥ−Ｃｙ７−ｌａｂｅｌｌｅｄ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  Ｂ２２０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）；
・Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ  ｐｅａｎｕｔ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＶＥＣＴＯＲ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）；
・Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  ＡＰＣ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）。【０２９５】
パイエル板胚中心のB細胞の割合を分散分析とｔ検定により投与群と対照群の２群間の差が有意であるかどうかを検定した。具体的な、パイエル板胚中心のＢ細胞の割合及びＢ細胞数について解析した、結果を図７に示す。【０２９６】
ネガティブコントロールのＧ２３Ｓマウスでは、パイエル板の胚中心Ｂ細胞数が顕著に増加していたが、Ｗ２７モノクローナルＩｇＡ抗体を経口投与することにより、胚中心のＢ細胞数が野生型マウスの程度にまで顕著に減少することが明らかになった。【０２９７】
上述のように、Ｇ２３Ｓマウスは炎症性大腸炎、潰瘍性大腸炎等のモデルマウスとして用いるにふさわしいことが明らかである。また、Ｇ２３Ｓマウスでは、パイエル板の胚中心のＢ細胞が過剰に増殖していた。パイエル板の胚中心のＢ細胞は、腸内免疫システムにおけるＩｇＡ抗体の産生の場である。ここで、Ｂ細胞が過剰に増加することは、腸内免疫システムにおいてＩｇＡ抗体が過剰に産生している状態を示し、これは腸内細菌の腸管粘膜の侵入に対応しきれていない状態を意味する。この様な状態を改善すべく、腸内免疫システムにおいては補完的にＴ細胞が活性化され、これが上述のような炎症性サイトカインの産生を亢進し、炎症が生じる。【０２９８】
このことから、Ｗ２７モノクローナルＩｇＡ抗体は、パイエル板の胚中心のＢ細胞を減少させる効果を有することから、腸内免疫システムが正常化しており、Ｔ細胞等の働きを抑えることが可能になるため、炎症が解消する。従って、Ｗ２７モノクローナルＩｇＡ抗体は、炎症性大腸炎、潰瘍性大腸炎等といった、腸内細菌の異常増殖及び／又は腸内細菌叢の病的変化により発症する疾患、延いては腸内疾患に対して有効であることが明確に示唆された。【０２９９】
図１１は１３−１５週齢の野生型マウス、および未処置のＧ２３ＳマウスとＷ２７モノクローナルＩｇＡ抗体の経口投与を４週間行ったＧ２３Ｓマウスの大腸粘膜組織の腺管の減少または委縮病変を示す解析結果を示す。大腸全長の内容物を取り除き、生理食塩水で洗浄後、楊枝を軸にロールを作り、ＯＣＴコンパウンドに封入して凍結した。その後、６ミクロンの厚さの凍結切片を作製し、ヘマトキシリンーエオジン染色を行った。顕微鏡下に腺管が減少した病変部分を特定し、大腸全長に占める病変部位の広がりを数値化し、図１１ａのグラフにまとめた。典型的な組織像を図１１ｂに示した。【０３００】
〔３−３：経口投与によるＷ２７モノクローナルＩｇＡ抗体の体内での動態実験〕
上述のＷ２７モノクローナルＩｇＡ抗体を経口投与して、それが消化管を経由して腸にまで到達するかどうかを確認する実験を、ＩｇＡが産生されないＡＩＤノックアウトマウスを用いて行った。【０３０１】
ＡＩＤノックアウトマウスに上述の経口投与実験と同様の抗体投与量、方法を用いて、Ｗ２７モノクローナルＩｇＡ抗体を経口投与した。具体的には飲料水にＷ２７モノクローナルＩｇＡ抗体を２５μｇ／ｍｌになるように調製し、２８日間、持続して経口摂取によって投与した。そして、２日目に糞便を回収した。回収した糞便１００ｍｇに対して０．９ｍｌのＰＢＳを加え懸濁後、遠心して上清を回収し上清中のＩｇＡ濃度をＥＬＩＳＡによって測定した。【０３０２】
結果を図８に示す。Ｗ２７モノクローナルＩｇＡ抗体が糞便中から検出されたことから、これを経口投与しても、消化管内で分解酵素などの影響を受けることなく腸に到達していることが明らかとなった。このことは、Ｗ２７モノクローナル抗体が経口組成物として十分に機能を発揮することを示唆している。【０３０３】
〔３−４：各種モノクローナルＩｇＡ抗体を用いた菌体増殖抑制効果〕
大腸菌株ＤＨ５αをＬＢ液体培地に加え、３７℃で一晩震盪培養を行った。翌日、大腸菌液を適宜希釈し、ＬＢプレートに播種し、３７℃で一晩培養を行った。翌日にプレート上のコロニー数を数えることで、上記の大腸菌液中の大腸菌数を算定した。これを増殖抑制実験開始時の大腸菌数とした。【０３０４】
上記のＬＢプレートに大腸菌液を播種すると同時に、９６穴プレートにＬＢ液体培地で希釈した５０μＬの大腸菌を加え、さらに終濃度が１．６ｍｇ／ｍＬになるようにＷ２７モノクローナルＩｇＡ抗体、Ｗ２７ＳＣ３ＦモノクローナルＩｇＡ抗体、及びＷ２モノクローナルＩｇＡ抗体それぞれを加えた。【０３０５】
９６穴プレートを３７℃で７時間静置培養を行った。７時間後に大腸菌液を適宜希釈し、これをＬＢプレートに播種し、３７℃で一晩培養した。翌日、ＬＢプレート上のコロニー数を数えて大腸菌数を計測し、上記の開始時大腸菌数を１とした場合に算出される細菌数をＰｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｒａｔｅ（図１２グラフ縦軸）としてグラフにプロットした。結果を図１２に示す。【０３０６】
図１２に示す結果から、Ｗ２モノクローナルＩｇＡ抗体とＷ２７モノクローナルＩｇＡ抗体による大腸菌の増殖率に有意な差が見られた。詳しい機序は不明であるが、Ｗ２モノクローナルＩｇＡ抗体は大腸菌に結合しない傾向であることが上記実験例の結果から明らかであることから、Ｗ２７モノクローナルＩｇＡ抗体は大腸菌に結合することで大腸菌の増殖を抑制していることが示唆される。【０３０７】
さらに分泌型ＩｇＡであるＷ２７ＳＣ３ＦモノクローナルＩｇＡ抗体は、最も強力な増殖抑制効果示すことから、実際に生体の腸管内に分泌されている分泌型ＩｇＡ２量体が細菌を認識して結合した後に独自のエフェクター機能を発揮し、結果として大腸菌の増殖を抑制していることが示唆される。したがって、腸内細菌制御のためにモノクローナルＩｇＡ抗体を利用する際の剤型を分泌型ＩｇＡとすることが好ましいことが示唆される。
【図１】
0005916946.tif 000010
【図２】
0005916946.tif 000011
【図３】
0005916946.tif 000012
【図４】
0005916946.tif 000013
【図５】
0005916946.tif 000014
【図６】
0005916946.tif 000015
【図７】
0005916946.tif 000016
【図８】
0005916946.tif 000017
【図９】
0005916946.tif 000018
【図１０】
0005916946.tif 000019
【図１１】
0005916946.tif 000020
【図１２】
0005916946.tif 000021
【配列表】
0005916946000001.app