(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学療法レジメンへのベバシズマブ治療の追加に応答性又は感受性である患者の同定のためのインビトロ方法であって、前記方法が、乳癌を患っていると疑われるか又は患う傾向がある患者からの血液、血漿、又は血清サンプルにおけるＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＡ及びＶＥＧＦＲ２、又はＶＥＧＦＡ及びＰＬＧＦのタンパク質発現レベルを決定する工程を含んでなり、それによって、乳癌を患っている患者において決定されるコントロール発現レベルと比較したＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＡ及びＶＥＧＦＲ２、又はＶＥＧＦＡ及びＰＬＧＦの増加した発現レベルが、前記化学療法レジメンへのベバシズマブの追加に対する患者の感受性の指標である、方法。
【請求項２】
投与されるベバシズマブの用量が低用量ベバシズマブである、請求項１に記載の方法であって、ここで、低用量ベバシズマブが、毎週に体重の２．５ｍｇ／ｋｇ、毎２週に体重の５ｍｇ／ｋｇ、又は毎３週に体重の７．５ｍｇ／ｋｇである、方法。
【請求項３】
低用量ベバシズマブが、毎３週に体重の７．５ｍｇ／ｋｇである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
投与されるベバシズマブの用量が高用量ベバシズマブである、請求項１に記載の方法であって、ここで、高用量ベバシズマブが、毎週に体重の５ｍｇ／ｋｇ、毎２週に体重の１０ｍｇ／ｋｇ、又は毎３週に体重の１５ｍｇ／ｋｇである、方法。
【請求項５】
高用量ベバシズマブが、毎３週に体重の１５ｍｇ／ｋｇである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
高用量ベバシズマブが、毎２週に体重の１０ｍｇ／ｋｇである、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
乳癌を患っていると疑われるか、患っているか又は患う傾向がある患者の化学療法レジメンへのベバシズマブの追加に対する応答性又は感受性を予測するインビトロ方法であって、患者の血液、血漿、又は血清サンプルにおけるＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＡ及びＶＥＧＦＲ２、又はＶＥＧＦＡ及びＰＬＧＦのタンパク質発現レベルを決定することを含んでなる、方法。
【請求項８】
前記発現レベルが、イムノアッセイ方法によって検出される、請求項１〜７の何れか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記イムノアッセイ方法がＥＬＩＳＡである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記患者サンプルが血液サンプルである請求項１〜９の何れか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記患者サンプルが血漿サンプルである、請求項１〜９の何れか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記乳癌が、局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ-２陰性乳癌である、請求項１〜１１の何れか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記化学療法レジメンが、ドセタキセル又はパクリタキセルを含む、請求項１〜１２の何れか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記化学療法レジメンが、ドセタキセルを含む、請求項１〜１３の何れか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記患者が、一又は複数の抗癌療法で共治療されている、請求項１〜１４の何れか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記抗癌療法が放射線である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記サンプルが、ネオアジュバント又はアジュバント療法の前に得られる、請求項１〜１６の何れか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記サンプルが、ネオアジュバント又はアジュバント療法の後に得られる、請求項１〜１６の何れか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳癌、特に局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ-２陰性乳癌と診断された患者のコントロールレベルと比較した、一又は複数のＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＲ２及びＰＬＧＦの発現レベル、特に血漿発現レベルを決定することによって、化学療法レジメンにベバシズマブ(Ａｖａｓｔｉｎ(登録商標))を加えることによって、乳癌、特に局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ-２陰性乳癌を患っている患者の化学療法レジメンの治療効果を改善するための方法を提供する。特に、本発明は、治療効果を改善する方法であって、治療効果が患者の無進行生存である方法を提供する。本発明は更に、乳癌、特に局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ-２陰性乳癌と診断された患者におけるコントロールレベルと比較した、一又は複数のＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＲ２及びＰＬＧＦの発現レベル、特に血漿発現レベルを決定することによって、化学療法レジメンとの組合せにおけるベバシズマブ(Ａｖａｓｔｉｎ(登録商標))に対する患者の感受性又は応答性を評価するための方法を提供する。
【０００２】
従って、本発明は、化学療法レジメン、例えば又はドセタキセル療法との組合せにおける血管新生阻害剤、例えばベバシズマブ(Ａｖａｓｔｉｎ(登録商標))に対する感受性又は応答性と相関する、乳癌、又は局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ-２陰性乳癌のバイオマーカーの同定及び選択に関する。この点において、発明は、標準的化学療法への、血管新生阻害剤、例えばベバシズマブ(アバスチン(登録商標))の追加に対し感受性又は応答性の患者を同定するための、乳癌、特に局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ-２陰性乳癌と診断された患者において得られるコントロールと比較した、一又は複数のＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＲ２及びＰＬＧＦの血漿特異的発現プロファイルの使用に関する。発明は更に、乳癌、特に局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ-２陰性乳癌と診断された患者におけるコントロールと比較した、一又は複数のＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＲ２及びＰＬＧＦの血漿特異的発現レベルを決定することによって、標準的化学療法、例えばドセタキセル療法への血管新生阻害剤、例えばベバシズマブ(アバスチン(登録商標))の追加によって、乳癌、特に局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ-２陰性乳癌を患っている患者の治療効果、特に無進行生存を改善するための方法に関する。発明は更に、本発明の方法に従って決定され定義される、血管新生阻害剤、特にベバシズマブ(アバスチン(登録商標))に感受性又は応答性の患者の同定のためのキット及び組成物を提供する。
【０００３】
血管新生は癌形成に必要であり、原発腫瘍サイズ及び増殖を制御するだけでなく、浸潤及び転移能にも影響する。従って、血管新生プロセスを媒介するメカニズムが、指向化抗癌療法の潜在標的として調査されてきた。血管新生調節因子の研究初期では、血管内皮増殖因子(ＶＥＧＦ)シグナル伝達経路が、複数の癌タイプにおいて血管新生活性を選択的に制御することが発見された。この因子は、出芽血管新生を媒介する主要なＶＥＧＦシグナル伝達受容体である、ＶＥＧＦ受容体２(ＶＥＧＦＲ-２)を通してシグナルを伝達する。複数の治療法が、様々なポイントでこの経路を調節するために開発された。これらの療法は、とりわけ、ベバシズマブ、スニチニブ、ソラフェニブ及びバタラニブを含む。臨床における血管新生阻害剤の使用は成功を示したが、全ての患者が、血管新生阻害剤療法に応答又は十分に応答しなかったわけではない。このような不完全な応答の根底にあるメカニズムは不明である。従って、抗血管新生癌療法に感受性又は応答性の患者サブグループの同定に対するニーズが増加している。
【０００４】
血管新生阻害剤の数は不明であるが、最も著名な血管新生阻害剤はベバシズマブ(アバスチン(登録商標))である。ベバシズマブは、ＶＥＧＦ(血管内皮増殖因子)に特異的に結合し、その生物学的効果を遮断する組換えヒト化モノクローナルＩｇＧ１抗体である。ＶＥＧＦは、腫瘍増殖及び転移、すなわち身体の他の部分への腫瘍の播種に必要な必須プロセスである腫瘍血管新生の鍵となる推進因子である。アバスチン(登録商標)は、毎年、合わせて２．５百万を超える死をもたらす４つの一般的なタイプの癌：結腸直腸癌、乳癌、非小細胞肺癌(ＮＳＣＬＣ)及び腎臓癌の進行ステージの治療のために、欧州において承認されている。米国では、アバスチン(登録商標)は、ＦＤＡによって承認された最初の抗血管新生療法であり、５つの腫瘍タイプ：結腸直腸癌、非小細胞肺癌、乳癌、脳(グリオブラストーマ)及び腎臓(腎細胞癌)の治療のために現在承認されている。５０万を超す患者がこれまでにアバスチンで治療されており、４５０を越す臨床治験による総合的な臨床プログラムが、異なる設定(例えば、進行又は早期ステージの疾患)における、複数の癌タイプ(結腸直腸、乳房、非小細胞肺、脳、胃、卵巣及び前立腺を含む)の治療におけるアバスチンの更なる使用を調査している。重要なことには、アバスチン(登録商標)は、共治療法として見込みを示しており、広範な化学療法及び他の抗癌治療と組み合わせられた時に、効果を示している。フェーズＩＩＩ試験が公開され、ベバシズマブを標準的な化学療法レジメンと組み合わせることの有益な効果を実証している(例えば、Saltz et al., 2008, J. Clin. Oncol., 26:2013-2019; Yang et al., 2008, Clin. Cancer Res., 14:5893-5899; Hurwitz et al., 2004, N. Engl. J. Med., 350:2335-2342を参照)。しかしながら、血管新生阻害剤の過去の研究でのように、幾つかのこれらのフェーズＩＩＩ試験は、一部の患者が、彼らの化学療法レジメンへのベバシズマブ(アバスチン(登録商標))の追加に対し不完全な応答を経験することを示している。
【０００５】
従って、血管新生阻害剤、特にベバシズマブ(アバスチン(登録商標))を含んでなる併用療法に応答するか又は応答しそうである、それらの患者を決定する方法に対するニーズがある。このように、本発明の根底にある技術的問題は、化学療法治療、例えばドセタキセル療法への、血管新生阻害剤、特にベバシズマブ(アバスチン(登録商標))の追加から利益を得うる、乳癌、特に局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ-２陰性乳癌を患っているか又は患う傾向がある患者の同定のための、方法及び手段の提供である。
【０００６】
技術的問題は、請求の範囲に特徴付けられている実施態様の提供によって解消される。
【０００７】
本発明は、従って、乳癌を患っている患者の化学療法レジメンの治療効果を、前記化学療法レジメンにベバシズマブを加えることによって、改善するための方法であって、前記方法が次を含んでなる方法を提供する：
(ａ)患者サンプルにおける一又は複数のＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＲ２及びＰＬＧＦのタンパク質発現レベル決定する工程；及び
(ｂ)乳癌と診断された患者において決定されるコントロール発現レベルと比較して、一又は複数のＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＲ２及びＰＬＧＦの増加した発現レベルを有する患者に、化学療法レジメンとの組合せにおいてベバシズマブを投与する工程。
【０００８】
本発明は、化学療法レジメンにベバシズマブを加えることによって、乳癌を患っている患者の化学療法レジメンの治療効果を改善するための方法であって、前記方法が次を含んでなる方法に関する：
(ａ)前記患者からサンプルを得る工程；
(ｂ)一又は複数のＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＲ２及びＰＬＧＦのタンパク質発現レベルを決定する工程；及び
(ｃ)乳癌と診断された患者において決定されるコントロール発現レベルと比較して、一又は複数のＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＲ２及びＰＬＧＦの増加した発現レベルを有する患者に、化学療法レジメンとの組合せにおいてベバシズマブを投与する工程。
【０００９】
本発明は、化学療法レジメンにベバシズマブを加えることによって、乳癌を患っている患者の無進行生存を改善するための方法であって、前記方法が次を含んでなる方法に関する：
(ａ)患者サンプルにおける一又は複数のＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＲ２及びＰＬＧＦのタンパク質発現レベル決定する工程；及び
(ｂ)乳癌と診断された患者において決定されるコントロール発現レベルと比較して、一又は複数のＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＲ２及びＰＬＧＦの増加した発現レベルを有する患者に、化学療法レジメンとの組合せにおいてベバシズマブを投与する工程。
【００１０】
本発明は、化学療法レジメンにベバシズマブを加えることによって、乳癌を患っている患者の無進行生存を改善するための方法であって、前記方法が次を含んでなる方法に関する：
(ａ)前記患者からサンプルを得る工程；
(ｂ)一又は複数のＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＲ２及びＰＬＧＦのタンパク質発現レベルを決定する工程；及び
(ｃ)乳癌と診断された患者において決定されるコントロール発現レベルと比較して、一又は複数のＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＲ２及びＰＬＧＦの増加した発現レベルを有する患者に、化学療法レジメンとの組合せにおいてベバシズマブを投与する工程。
【００１１】
本発明は、化学療法レジメンにベバシズマブを加えることによって、局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ-２陰性乳癌を患っている患者の無進行生存を改善するための方法であって、前記方法が次を含んでなる方法に関する：
(ａ)患者サンプルにおける一又は複数のＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＲ２及びＰＬＧＦのタンパク質発現レベル決定する工程；及び
(ｂ)前記乳癌と診断された患者において決定されるコントロール発現レベルと比較して、一又は複数のＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＲ２及びＰＬＧＦの増加した発現レベルを有する患者に、化学療法レジメンとの組合せにおいてベバシズマブを投与する工程、
ここで、化学療法レジメンは、ドセタキセル療法を含む。
【００１２】
本発明は、化学療法レジメンにベバシズマブを加えることによって、局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ-２陰性乳癌を患っている患者の無進行生存を改善するための方法であって、前記方法が次を含んでなる方法に関する：
(ａ)前記患者からサンプルを得る工程；
(ｂ)一又は複数のＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＲ２及びＰＬＧＦのタンパク質発現レベルを決定する工程；及び
(ｃ)前記乳癌と診断された患者において決定されるコントロール発現レベルと比較して、一又は複数のＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＲ２及びＰＬＧＦの増加した発現レベルを有する患者に、化学療法レジメンとの組合せにおいてベバシズマブを投与する工程、
ここで、化学療法レジメンは、ドセタキセル療法を含む。
【００１３】
本発明は、化学療法レジメンにベバシズマブを加えることによって、乳癌を患っている患者の無進行生存を改善するための方法であって、前記方法が次を含んでなる方法に関する：
(ａ)患者サンプルにおけるＶＥＧＦＡ又はＶＥＧＦＲ２のタンパク質発現レベルを決定する工程；及び
(ｂ)乳癌と診断された患者において決定されるコントロール発現レベルと比較して、ＶＥＧＦＡ又はＶＥＧＦＲ２の増加した発現レベルを有する患者に、化学療法レジメンとの組合せにおいてベバシズマブを投与する工程。
【００１４】
本発明は、化学療法レジメンにベバシズマブを加えることによって、乳癌を患っている患者の無進行生存を改善するための方法であって、前記方法が次を含んでなる方法に関する：
(ａ)前記患者からサンプルを得る工程；
(ｂ)ＶＥＧＦＡ又はＶＥＧＦＲ２のタンパク質発現レベルを決定する工程；及び
(ｃ)乳癌と診断された患者において決定されるコントロール発現レベルと比較して、ＶＥＧＦＡ又はＶＥＧＦＲ２の増加した発現レベルを有する患者に、化学療法レジメンとの組合せにおいてベバシズマブを投与する工程。
【００１５】
本発明は、化学療法レジメンにベバシズマブを加えることによって、局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ-２陰性乳癌を患っている患者の無進行生存を改善するための方法であって、前記方法が次を含んでなる方法に関する：
(ａ)患者サンプルにおけるＶＥＧＦＡ又はＶＥＧＦＲ２のタンパク質発現レベルを決定する工程；及び
(ｂ)前記乳癌と診断された患者において決定されるコントロール発現レベルと比較して、ＶＥＧＦＡ又はＶＥＧＦＲ２の増加した発現レベルを有する患者に、化学療法レジメンとの組合せにおいてベバシズマブを投与する工程、
ここで、化学療法レジメンは、ドセタキセル療法を含む。
【００１６】
本発明は、化学療法レジメンにベバシズマブを加えることによって、局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ-２陰性乳癌を患っている患者の無進行生存を改善するための方法であって、前記方法が次を含んでなる方法に関する：
(ａ)前記患者からサンプルを得る工程；
(ｂ)ＶＥＧＦＡ又はＶＥＧＦＲ２のタンパク質発現レベルを決定する工程；及び
(ｃ)前記乳癌と診断された患者において決定されるコントロール発現レベルと比較して、一又は複数のＶＥＧＦＡ又はＶＥＧＦＲ２の増加した発現レベルを有する患者に、化学療法レジメンとの組合せにおいてベバシズマブを投与する工程、
ここで、化学療法レジメンは、ドセタキセル療法を含む。
【００１７】
発明は、乳癌を患っている患者の化学療法レジメンの治療効果を、化学療法レジメンにベバシズマブを加えることによって、改善するための方法であって、前記方法が次を含んでなる方法を提供する：
(ａ)患者サンプルにおけるＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＲ２及びＰＬＧＦのタンパク質発現レベルを決定する工程；及び
(ｂ)乳癌と診断された患者において決定されるコントロール組合せ発現レベルと比較して、ＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＲ２及びＰＬＧＦの増加した組合せ発現レベルを有する患者に、化学療法レジメンとの組合せにおいてベバシズマブを投与する工程。
乳癌は、局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ-２陰性乳癌でありうる。化学療法レジメンは、タキサン療法、例えばドセタキセル又はパクリタキセル療法を含みうる。
【００１８】
従って、発明は、化学療法レジメンにベバシズマブを加えることによって、乳癌を患っている患者の化学療法レジメンの治療効果を改善するための方法であって、前記方法が次を含んでなる方法に関する：
(ａ)前記患者からサンプルを得る工程；
(ｂ)ＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＲ２及びＰＬＧＦのタンパク質発現レベルを決定する工程；及び
(ｃ)乳癌と診断された患者において決定されるコントロール組合せ発現レベルと比較して、ＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＲ２及びＰＬＧＦの増加した組合せ発現レベルを有する患者に、化学療法レジメンとの組合せにおいてベバシズマブを投与する工程。
乳癌は、局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ-２陰性乳癌でありうる。化学療法レジメンは、タキサン療法、例えばドセタキセル又はパクリタキセル療法を含みうる。
【００１９】
発明は、化学療法レジメンにベバシズマブを加えることによって、乳癌を患っている患者の無進行生存を改善するための方法であって、前記方法が次を含んでなる方法を提供する：
(ａ)患者サンプルにおけるＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＲ２及びＰＬＧＦのタンパク質発現レベルを決定する工程；及び
(ｂ)乳癌と診断された患者において決定されるコントロール組合せ発現レベルと比較して、ＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＲ２及びＰＬＧＦの増加した組合せ発現レベルを有する患者に、化学療法レジメンとの組合せにおいてベバシズマブを投与する工程。
乳癌は、局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ-２陰性乳癌でありうる。化学療法レジメンは、タキサン療法、例えばドセタキセル又はパクリタキセル療法を含みうる。
【００２０】
従って、発明は、化学療法レジメンにベバシズマブを加えることによって、乳癌を患っている患者の無進行生存を改善するための方法であって、前記方法が次を含んでなる方法に関する：
(ａ)前記患者からサンプルを得る工程；
(ｂ)ＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＲ２及びＰＬＧＦのタンパク質発現レベルを決定する工程；及び
(ｃ)乳癌と診断された患者において決定されるコントロール組合せ発現レベルと比較して、ＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＲ２及びＰＬＧＦの増加した組合せ発現レベルを有する患者に、化学療法レジメンとの組合せにおいてベバシズマブを投与する工程。
乳癌は、局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ-２陰性乳癌でありうる。化学療法レジメンは、タキサン療法、例えばドセタキセル又はパクリタキセル療法を含みうる。
【００２１】
発明は、従って、化学療法レジメンにベバシズマブを加えることによって、局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ-２陰性乳癌を患っている患者の無進行生存を改善するための方法であって、前記方法が次を含んでなる方法に関する：
(ａ)患者サンプルにおけるＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＲ２及びＰＬＧＦのタンパク質発現レベルを決定する工程；及び
(ｂ)前記乳癌と診断された患者において決定されるコントロール組合せ発現レベルと比較して、ＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＲ２及びＰＬＧＦの増加した組合せ発現レベルを有する患者に、化学療法レジメンとの組合せにおいてベバシズマブを投与する工程、
ここで、化学療法レジメンは、ドセタキセル療法を含む。
【００２２】
発明は、化学療法レジメンにベバシズマブを加えることによって、局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ-２陰性乳癌を患っている患者の無進行生存を改善するための方法であって、前記方法が次を含んでなる方法に関する：
(ａ)前記患者からサンプルを得る工程；
(ｂ)ＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＲ２及びＰＬＧＦのタンパク質発現レベルを決定する工程；及び
(ｃ)前記乳癌と診断された患者において決定されるコントロール組合せ発現レベルと比較して、ＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＲ２及びＰＬＧＦの増加した組合せ発現レベルを有する患者に、化学療法レジメンとの組合せにおいてベバシズマブを投与する工程、
ここで、化学療法レジメンは、ドセタキセル療法を含む。
【００２３】
発明は、化学療法レジメンにベバシズマブを加えることによって、乳癌を患っている患者の無進行生存を改善するための方法であって、前記方法が次を含んでなる方法を提供する：
(ａ)患者サンプルにおけるＶＥＧＦＡ及びＶＥＧＦＲ２のタンパク質発現レベルを決定する工程；及び
(ｂ)乳癌と診断された患者において決定されるコントロール組合せ発現レベルと比較して、ＶＥＧＦＡ及びＶＥＧＦＲ２の増加した組合せ発現レベルを有する患者に、化学療法レジメンとの組合せにおいてベバシズマブを投与する工程。
乳癌は、局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ-２陰性乳癌でありうる。化学療法レジメンは、タキサン療法、例えばドセタキセル又はパクリタキセル療法を含みうる。投与されるベバシズマブの用量は、低又は高用量ベバシズマブでありうる。添付の説明的実施例に示すように、ＶＥＧＦＡ及びＶＥＧＦＲ２の組合せ発現レベルは、低用量ベバシズマブを投与された患者において特に予測的であった。
【００２４】
従って、発明は、化学療法レジメンにベバシズマブを加えることによって、局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ-２陰性乳癌を患っている患者の無進行生存を改善するための方法であって、前記方法が次を含んでなる方法に関する：
(ａ)前記患者からサンプルを得る工程；
(ｂ)ＶＥＧＦＡ及びＶＥＧＦＲ２のタンパク質発現レベルを決定する工程；及び
(ｃ)前記乳癌と診断された患者において決定されるコントロール組合せ発現レベルと比較して、ＶＥＧＦＡ及びＶＥＧＦＲ２の増加した組合せ発現レベルを有する患者に、化学療法レジメンとの組合せにおいてベバシズマブを投与する工程。
化学療法レジメンは、タキサン療法、例えばドセタキセル又はパクリタキセル療法を含みうる。投与されるベバシズマブの用量は、低又は高用量ベバシズマブでありうる。添付の説明的実施例に示すように、ＶＥＧＦＡ及びＶＥＧＦＲ２の組合せ発現レベルは、低用量ベバシズマブを投与された患者において特に予測的であった。
【００２５】
発明は、従って、化学療法レジメンにベバシズマブを加えることによって、局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ-２陰性乳癌を患っている患者の無進行生存を改善するための方法であって、前記方法が次を含んでなる方法に関する：
(ａ)患者サンプルにおけるＶＥＧＦＡ及びＶＥＧＦＲ２のタンパク質発現レベルを決定する工程；及び
(ｂ)前記乳癌と診断された患者において決定されるコントロール組合せ発現レベルと比較して、ＶＥＧＦＡ及びＶＥＧＦＲ２の増加した組合せ発現レベルを有する患者に、化学療法レジメンとの組合せにおいてベバシズマブを投与する工程、
ここで、化学療法レジメンは、ドセタキセル療法を含む。投与されるベバシズマブの用量は、低又は高用量ベバシズマブでありうる。添付の説明的実施例に示すように、ＶＥＧＦＡ及びＶＥＧＦＲ２の組合せ発現レベルは、低用量ベバシズマブを投与された患者において特に予測的であった。
【００２６】
発明は、化学療法レジメンにベバシズマブを加えることによって、局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ-２陰性乳癌を患っている患者の無進行生存を改善するための方法であって、前記方法が次を含んでなる方法に関する：
(ａ)前記患者からサンプルを得る工程；
(ｂ)ＶＥＧＦＡ及びＶＥＧＦＲ２のタンパク質発現レベルを決定する工程；及び
(ｃ)前記乳癌と診断された患者において決定されるコントロール組合せ発現レベルと比較して、ＶＥＧＦＡ及びＶＥＧＦＲ２の増加した組合せ発現レベルを有する患者に、化学療法レジメンとの組合せにおいてベバシズマブを投与する工程、
ここで、化学療法レジメンは、ドセタキセル療法を含む。投与されるベバシズマブの用量は、低又は高用量ベバシズマブでありうる。添付の説明的実施例に示すように、ＶＥＧＦＡ及びＶＥＧＦＲ２の組合せ発現レベルは、低用量ベバシズマブを投与された患者において特に予測的であった。
【００２７】
本発明は、化学療法レジメンにベバシズマブを加えることによって、乳癌を患っている患者の無進行生存を改善するための方法であって、前記方法が次を含んでなる方法を提供する：
(ａ)患者サンプルにおけるＶＥＧＦＡ及びＰＬＧＦのタンパク質発現レベルを決定する工程；及び
(ｂ)乳癌と診断された患者において決定される組合せコントロール発現レベルと比較して、ＶＥＧＦＡ及びＰＬＧＦの増加した組合せ発現レベルを有する患者に、化学療法レジメンとの組合せにおいてベバシズマブを投与する工程。
乳癌は、局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ-２陰性乳癌でありうる。化学療法レジメンは、タキサン療法、例えばドセタキセル又はパクリタキセル療法を含みうる。投与されるベバシズマブの用量は、低用量又は高用量ベバシズマブでありうる。
【００２８】
従って、本発明は、化学療法レジメンにベバシズマブを加えることによって、乳癌を患っている患者の無進行生存を改善するための方法であって、前記方法が次を含んでなる方法に関する：
(ａ)前記患者からサンプルを得る工程；
(ｂ)ＶＥＧＦＡ及びＰＬＧＦのタンパク質発現レベルを決定する工程；及び
(ｃ)乳癌と診断された患者において決定されるコントロール組合せ発現レベルと比較して、ＶＥＧＦＡ及びＰＬＧＦの増加した組合せ発現レベルを有する患者に、化学療法レジメンとの組合せにおいてベバシズマブを投与する工程。
乳癌は、局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ-２陰性乳癌でありうる。化学療法レジメンは、タキサン療法、例えばドセタキセル又はパクリタキセル療法を含みうる。投与されるベバシズマブの用量は、低用量又は高用量ベバシズマブでありうる。
【００２９】
発明は、従って、化学療法レジメンにベバシズマブを加えることによって、局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ-２陰性乳癌を患っている患者の無進行生存を改善するための方法であって、前記方法が次を含んでなる方法に関する：
(ａ)患者サンプルにおけるＶＥＧＦＡ及びＰＬＧＦのタンパク質発現レベルを決定する工程；及び
(ｂ)前記乳癌と診断された患者において決定される組合せコントロール発現レベルと比較して、ＶＥＧＦＡ及びＰＬＧＦの増加した組合せ発現レベルを有する患者に、化学療法レジメンとの組合せにおいてベバシズマブを投与する工程、
ここで、化学療法レジメンは、ドセタキセル療法を含む。投与されるベバシズマブの用量は、低用量又は高用量ベバシズマブでありうる。
【００３０】
従って、本発明は、化学療法レジメンにベバシズマブを加えることによって、局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ-２陰性乳癌を患っている患者の無進行生存を改善するための方法であって、前記方法が次を含んでなる方法に関する：
(ａ)前記患者からサンプルを得る工程；
(ｂ)ＶＥＧＦＡ及びＰＬＧＦのタンパク質発現レベルを決定する工程；及び
(ｃ)前記乳癌と診断された患者において決定されるコントロール組合せ発現レベルと比較して、ＶＥＧＦＡ及びＰＬＧＦの増加した組合せ発現レベルを有する患者に、化学療法レジメンとの組合せにおいてベバシズマブを投与する工程、
ここで、化学療法レジメンは、ドセタキセル療法を含む。投与されるベバシズマブの用量は、低用量又は高用量ベバシズマブでありうる。
【００３１】
本発明は、化学療法レジメンへのベバシズマブ治療の追加に応答性又は感受性である患者の同定のためのインビトロ方法であって、前記方法が、乳癌、特に局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ-２陰性乳癌を患っているか、患っていると疑われるか又は患う傾向がある患者からのサンプルにおける一又は複数のＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＲ２及びＰＬＧＦのタンパク質発現レベルを決定する工程を含んでなり、それによって、乳癌、特に局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ-２陰性乳癌を患っている患者において決定されるコントロール発現レベルと比較した、一又は複数のＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＲ２及びＰＬＧＦの増加した発現レベルが、前記化学療法レジメンへのベバシズマブの追加に対する患者の感受性の指標である方法を提供する。化学療法レジメンは、タキサン療法、例えばドセタキセル又はパクリタキセル療法を含みうる。
【００３２】
従って、本発明は、化学療法レジメンへのベバシズマブ治療の追加に応答性又は感受性である患者の同定のためのインビトロ方法であって、前記方法が次を含んでなる方法に関する：
(ａ)乳癌、局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ-２陰性乳癌を患っているか、患っていると疑われるか又は患う傾向がある患者からサンプルを得る工程；及び
(ｂ)一又は複数のＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＲ２及びＰＬＧＦのタンパク質発現レベルを決定する工程；
それによって、乳癌、特に局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ-２陰性乳癌を患っている患者において決定されるコントロール発現レベルと比較した、一又は複数のＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＲ２及びＰＬＧＦの増加した発現レベルが、前記化学療法レジメンへのベバシズマブの追加に対する患者の感受性の指標である。化学療法レジメンは、タキサン療法、例えばドセタキセル又はパクリタキセル療法を含みうる。
【００３３】
本発明は、化学療法レジメンへのベバシズマブ治療の追加に応答性又は感受性である患者の同定のためのインビトロ方法であって、前記方法が、局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ-２陰性乳癌を患っているか、患っていると疑われるか又は患う傾向がある患者からのサンプルにおけるＶＥＧＦＡ及びＶＥＧＦＲ２のタンパク質発現レベルを決定する工程を含んでなり、それによって、局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ-２陰性乳癌を患っている患者において決定されるコントロール組合せ発現レベルと比較したＶＥＧＦＡ及びＶＥＧＦＲ２の組合せの増加した発現レベルが、前記化学療法レジメンへのベバシズマブの追加に対する患者の感受性の指標である方法を提供する。化学療法レジメンは、タキサン療法、例えばドセタキセル又はパクリタキセル療法を含みうる。
【００３４】
本発明は、化学療法レジメンへのベバシズマブ治療の追加に応答性又は感受性である患者の同定のためのインビトロ方法であって、前記方法が、局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ-２陰性乳癌を患っているか、患っていると疑われるか又は患う傾向がある患者からのサンプルにおけるＶＥＧＦＡ及びＰＬＧＦのタンパク質発現レベルを決定する工程を含んでなり、それによって、局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ-２陰性乳癌を患っている患者において決定されるコントロール組合せレベルと比較したＶＥＧＦＡ及びＰＬＧＦの組合せの増加した発現レベルが、前記化学療法レジメンへのベバシズマブの追加に対する患者の感受性の指標である方法を提供する。化学療法レジメンは、タキサン療法、例えばドセタキセル又はパクリタキセル療法を含みうる。
【００３５】
従って、本発明は、同定された技術的問題を解消し、そこでは、乳癌、特に局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ-２陰性乳癌と診断された患者において決定されるコントロールレベルと比較した、任意の患者における一又は複数のＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＲ２及びＰＬＧＦの血漿特異的発現レベルが、化学療法レジメンとの組合せにおいて血管新生阻害剤を投与されるそれらの患者における治療効果と相関することが、驚くべきことに示された。具体的には、ＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＲ２及び／又はＰＬＧＦのタンパク質発現レベルにおけるバリエーションが、ドセタキセル療法の化学療法レジメンへのベバシズマブ(アバスチン(登録商標))の追加への応答による局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ-２陰性乳癌の改善された無進行生存のためのマーカー／予測因子として、驚くべきことに同定された。化学療法レジメンへのベバシズマブ(アバスチン(登録商標))の追加に対し応答性又は感受性を呈する患者が、乳癌、特に局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ-２陰性乳癌と診断された患者から得られたサンプルにおいて得られるコントロール発現レベルと比較して、一又は複数のＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＲ２及びＰＬＧＦの増加したタンパク質発現レベルを有することが明らかにされた。「マーカー」及び「予測因子」なる用語は互換的に使用でき、ここに記載の一又は複数のＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＲ２及びＰＬＧＦの発現レベルを指す。発明はまた、ＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＲ２及びＰＬＧＦの血漿発現レベルの何れか２つ以上の組合せを指すための、「マーカー」及び「予測因子」なる用語の使用を包含する。
【００３６】
本発明の関連において、「ＶＥＧＦＡ」は血管内皮増殖因子プロテインＡを指し、配列番号：１によって例示され、図８に示されている(Swiss Prot Accession Number P15692, Gene ID (NCBI): 7422)。「ＶＥＧＦＡ」なる用語は、配列番号：１のアミノ酸配列を有するタンパク質並びにその相同体及びアイソフォームを包含する。「ＶＥＧＦＡ」なる用語はまた、ＶＥＧＦＡの既知のアイソフォーム、例えばスプライスアイソフォーム、例えばＶＥＧＦ１１１、ＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１４５、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１８９及びＶＥＧＦ２０６、並びにその変異体、相同体及びアイソフォームを包含し、Ferrara Mol. Biol. Cell 21:687 (2010) and Leung et al. Science 246:1306 (1989), and Houck et al. Mol. Endocrin. 5:1806 (1991)に記載されるような、ＶＥＧＦ１６５のプラスミン切断によって生成される１１０アミノ酸ヒト血管内皮細胞増殖因子を含む。本発明の特定の実施態様では、「ＶＥＧＦＡ」は、ＶＥＧＦ１２１及び／又はＶＥＧＦ１１０を指す。本発明の特定の実施態様では、「ＶＥＧＦＡ」は、ＶＥＧＦ１１１を指す。発明の関連において、「ＶＥＧＦＡ」なる用語はまた、配列番号：１のアミノ酸配列に、又はその変異体及び／又は相同体のアミノ酸配列、並びに該配列の断片に、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％の相同性を有するタンパク質を包含するが、ただし、変異体タンパク質(アイソフォームを含む)、相同タンパク質及び／又は断片は、一又は複数のＶＥＧＦＡ特異的抗体、例えば抗体クローン３Ｃ５及び２６５０３(それぞれ、Bender RELIATech及びR&D Systemsから入手可能)及びＡ４．６．１(Kim et al., Growth Factors 7(1): 53-64 (1992)に記載)によって認識されることとする。発明の関連において、ＶＥＧＦ又はＶＥＧＦ-Ａの「アイソフォーム」なる用語は、スプライスアイソフォーム及び酵素的切断(例えば、プラスミン)によって生成される形態の双方を指す。
【００３７】
一実施態様では、「ＶＥＧＦＡ」は、非修飾ＶＥＧＦを指す。本発明の関連において、非修飾ＶＥＧＦは、ＶＥＧＦの非修飾アミノ酸配列、そのアイソフォーム及びその切断産物に関連する。非修飾ＶＥＧＦは、原核生物発現システム、例えば大腸菌において合成的に、又は好ましくは組換え的に生産できる。非修飾ＶＥＧＦは、例えばグリコシル化のような、翻訳後修飾を持たない。発明の関連において、「非修飾ＶＥＧＦ-Ａ」なる用語はまた、その変異体及び／又は相同体、並びにＶＥＧＦ-Ａの断片を包含するが、ただし、変異体タンパク質(アイソフォームを含む)、相同タンパク質及び／又は断片は、非修飾ＶＥＧＦ-Ａ特異的抗体、例えばRELIATech GmbH, Wolfenbuttel, Germanyから入手可能である抗体クローン３Ｃ５によって認識されることとする。
【００３８】
本発明の関連において、「ＶＥＧＦＲ２」は血管内皮増殖因子受容体２を指し、配列番号：２によって例示され、図９に示されている(Swiss Prot Accession Number P35968, Gene ID (NCBI): 3791)。「ＶＥＧＦＲ２」なる用語は、配列番号：２のアミノ酸配列を有するタンパク質並びにその相同体及びアイソフォームを包含する。発明の関連において、「ＶＥＧＦＲ２」なる用語はまた、配列番号：２のアミノ酸配列に、又はその変異体及び／又は相同体のアミノ酸配列、並びに該配列の断片に、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％の相同性を有するタンパク質を包含するが、ただし、変異体タンパク質(アイソフォームを含む)、相同タンパク質及び／又は断片は、一又は複数のＶＥＧＦＲ２特異的抗体、例えばR&D Systemsから入手可能である抗体クローン８９１１５及び８９１０９によって認識されることとする。
【００３９】
本発明の関連において、「ＰＬＧＦ」は胎盤増殖因子を指し、配列番号：３によって例示され、図１０に示されている(Swiss Prot Accession Number P49763, Gene ID (NCBI): 5228)。「ＰＬＧＦ」なる用語は、配列番号：３のアミノ酸配列を有するタンパク質並びにその相同体及びアイソフォームを包含する。発明の関連において、「ＰＬＧＦ」なる用語はまた、配列番号：３のアミノ酸配列に、又はその変異体及び／又は相同体のアミノ酸配列、並びに該配列の断片に、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％の相同性を有するタンパク質を包含するが、ただし、変異体タンパク質(アイソフォームを含む)、相同タンパク質及び／又は断片は、一又は複数のＰＬＧＦ特異的抗体、例えばRoche Diagnostics GmbHから入手可能である抗体クローン２Ｄ６Ｄ５及び６Ａ１１Ｄ２によって認識されることとする。
【００４０】
従って、本発明は、限定するものではないが、ここに記載のアミノ酸配列を含むタンパク質の発現レベルの決定を包含する。この関連において、発明は、一又は複数のＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＲ２及びＰＬＧＦの相同体、変異体及びアイソフォームの検出を包含する；前記アイソフォーム又は変異体は、とりわけ、対立遺伝子バリアント又はスプライスバリアントを含みうる。また考えられるのは、ここに記載の一又は複数のＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＲ２及びＰＬＧＦ、又はその断片に相同である、例えば配列番号：１、配列番号：２又は配列番号：３のアミノ酸配列、又はその断片に、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するタンパク質の検出である。あるいは又は加えて、本発明は、配列番号：１、配列番号：２又は配列番号：３をコードする核酸配列、又はその断片、変異体又はアイソフォームに、少なくとも少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である核酸配列、又はその断片によってコードされるタンパク質の発現レベルの検出を包含する。この関連において、「変異体」なる用語は、ＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＲ２及び／又はＰＬＧＦアミノ酸配列、又は前記アミノ酸配列をコードする核酸配列が、配列番号：１、配列番号：２又は配列番号：３によって同定される、及び／又は上記Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ受入番号下で入手可能な別個の配列と、変異、例えば欠失、付加、置換、逆位等によって異なることを意味する。更に、「相同体」なる用語は、配列番号：１、配列番号：２又は配列番号：３に示す一又は複数のポリペプチド、又はその断片に、少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有する分子を指す。
【００４１】
アミノ酸又は核酸配列が、ここに記載のアミノ酸又は核酸配列に所定の度合いの同一性を有するか否か決定するために、当業者は、当分野でよく知られている手段及び方法を使用でき、例えば、手動、又は当分野でしられているか又はここに記載のコンピュータープログラムの使用によるアラインメントを使用できる。
【００４２】
本発明によると、２つ以上のアミノ酸又は核酸配列の関連において「同一」又は「パーセント同一性」なる用語は、当分野で知られる配列比較アルゴリズムの使用、又は手動アライメント及び目視検査による測定により、比較のウィンドウにわたって又は指定領域にわたって最大一致について比較及び整列した時に、同じであるか、又は特定パーセンテージの同じアミノ酸残基又はヌクレオチド(例えば、例えば配列番号：１、配列番号：２又は配列番号：３のアミノ酸配列と、６０％又は６５％の同一性、好ましくは７０−９５％の同一性、より好ましくは少なくとも９５％の同一性)を有する２つ以上の配列又はサブ配列を指す。例えば、６０％〜９５％以上の配列同一性を有する配列は、実質的に同一であると考えられる。このような定義は、試験配列の相補体にも適用される。好ましくは、記載の同一性は、少なくとも約１５〜２５のアミノ酸又はヌクレオチド長である領域にわたって、より好ましくは、約５０〜１００のアミノ酸又はヌクレオチド長である領域にわたって存在する。当業者は、例えば、当分野で知られているＣＬＵＳＴＡＬＷコンピュータープログラム(Thompson Nucl. Acids Res. 2 (1994), 4673-4680)又はＦＡＳＴＤＢ(Brutlag Comp. App. Biosci. 6 (1990), 237-245)に基づくものなどのアルゴリズムを使用し、どのように配列同士/間のパーセント同一性を決定するか知るだろう。 
【００４３】
ＦＡＳＴＤＢアルゴリズムは典型的には、配列における内部の非一致欠失又は付加、すなわちギャップを考慮しないが、これは、％同一性の過剰評価を避けるために手動で訂正できる。しかしながら、ＣＬＵＳＴＡＬＷは、その同一性計算に配列ギャップを考慮する。また、当業者に利用可能なものは、ＢＬＡＳＴ(Basic Local Alignment Search Tool)及びBLAST 2.0アルゴリズム(Altschul, 1997, Nucl. Acids Res. 25:3389-3402; Altschul, 1993 J. Mol. Evol. 36:290-300; Altschul, 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410)である。核酸配列のＢＬＡＳＴＮプログラムは、デフォルトとして、１１のワード長(Ｗ)、１０の期待(Ｅ)、Ｍ＝５、Ｎ＝４、及び両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、３のワード長(Ｗ)、１０の期待(Ｅ)を使用する。ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス(Henikoff (1989) PNAS 89:10915)は、５０のアラインメント(Ｂ)、１０の期待(Ｅ)、Ｍ＝５、Ｎ＝４、及び両鎖の比較を使用する。
【００４４】
上述のように、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、配列類似性を決定するために、アミノ及びヌクレオチド配列双方のアラインメントを生成する。アラインメントのローカル特性により、ＢＬＡＳＴは、正確な一致の決定、又は類似な配列の同定に特に有用である。ＢＬＡＳＴアルゴリズム出力の基本ユニットは、高スコアセグメント対(High-scoring Segment Pair (HSP))である。ＨＳＰは、アラインメントが局所的に最大であり、アラインメントスコアがユーザーによって設定される閾値又はカットオフを満たすか超す、任意であるが等しい長さの２つの配列断片から成る。ＢＬＡＳＴアプローチは、問い合わせ配列及びデータベース配列間のＨＳＰを探し、見つけた何れかの一致の統計的有意性を評価し、有意性のユーザー選択閾値を満たすその一致のみを報告する。パラメーターＥは、データベース配列一致を報告するための統計的に有意な閾値を定める。Ｅは、全データベース検索の設定において、ＨＳＰの(又はＨＳＰのセット)の発生の機会の期待頻度の上限として解釈される。その一致がＥを満たす何れかのデータベース配列が、プログラムの出力において報告される。
【００４５】
ＢＬＡＳＴを使用する類似なコンピューター技術が、タンパク質又はヌクレオチドデータベース、例えばＧｅｎＢａｎｋ又はＥＭＢＬにおける同一又は関連分子の検索に使用されうる。この分析は、多重膜ベースハイブリダイゼーション(multiple membrane-based hybridizations)よりはるかに早い。更に、コンピューター検索の感度は、任意の特定の一致が、正確又は類似として分類されるか決定するように変更できる。検索の基本は、次のように定義されるプロダクトスコアであり：
％配列同一性  ｘ  ％最大ＢＬＡＳＴスコア
１００
２つの配列間の類似性の度合い、及び配列一致の長さの双方を考慮する。例えば、４０のプロダクトスコアでは、一致は１−２％エラー内で正確であろう；７０では、一致は正確であろう。類似分子は通常、１５及び４０の間のプロダクトスコアを示すものを選択することによって同定されるが、低いスコアは関連した分子を同定しうる。配列アラインメントを生成できるプログラムの他の例は、当分野で知られているＣＬＵＳＴＡＬＷコンピュータープログラム(Thompson, 1994, Nucl. Acids Res. 2:4673-4680)又はFASTDB (Brutlag, 1990, Comp. App. Biosci. 6:237-245)である。
【００４６】
ここに記載の発明の関連において、発現レベル、特にＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＲ２及び／又はＰＬＧＦのタンパク質発現レベルは、個々のマーカーとして別個に、又は発現プロファイル又はマーカーパネルとして２つ以上のグループにおいて考えられうる。ここに記載の発明の関連において、発現プロファイル又はマーカーパネル(ここでは、２つ以上のマーカーの発現プロファイルが一緒に考慮されうる)は、組合せ発現レベルとしても言及されうる。例えば、２つ以上のマーカーの発現レベルが加えられ、類似に決定されたコントロール組合せ発現レベルと比較されうる。従って、発明の方法は、一又は複数のマーカーの発現レベルに基づく、組合せ発現レベルを含む、発現プロファイルの決定を包含する。
【００４７】
ここに記載の発明の関連であって、添付の説明的実施例に従うと、ＶＥＧＦＡ又はＶＥＧＦＲ２の別個の検討では、次の値を、マーカーの対応する高又は低発現値として使用した：高ＶＥＧＦＡ(≧１２５ｐｇ／ｍｌ)、低ＶＥＧＦＡ(＜１２５ｐｇ／ｍｌ)、高ＶＥＧＦＲ２(≧１１ｍｇ／ｍｌ)及び低ＶＥＧＦＲ２(＜１１ｎｇ／ｍｌ)。これらのレベルを、プロスペクティブ分析計画により、サンプル中央値として決定した。更に、特定マーカーの高及び低発現間のカットオフ値を構成する最適化レベルは、カットオフの上及び下の患者のサブセットが、関連する統計的最適性基準を満たすまで、カットオフを変更することによって決定されうる。例えば、最適カットポイントは、サブセットの上及び下間の治療ハザード比における差異を最大にするように、又は一サブグループにおける治療効果、又は何れかの他の関連統計的基準を最大にするように選択されうる。しかしながら、当業者は、特定マーカーの発現レベル、従って、高又は低発現レベルを構成しているものが、患者ごとの集団によって異なりうることを理解するだろう。従って、当業者は、添付の説明的実施例に記載するもの以外の検出方法を使用し、添付の説明的実施例に記載するもの以外の患者及び患者集団を研究する場合、当業者が特定のバイオマーカーについて高及び／又は低発現レベルと考えるものは、ここに記載の値と異なりうることを理解するだろう。ここに記載の方法により、当業者は、特定のバイオマーカーの高及び／又は低レベルの発現を構成するものを決定できる。
【００４８】
当業者が理解するように、調査中の診断的質問を改善するために、２つ以上のマーカーの測定を使用する多くの方法があることを理解するだろう。非常に単純だが、しばしば効果的なアプローチでは、サンプルが、調査されるマーカーの少なくとも一つについて陽性である場合、陽性結果が仮定される。
【００４９】
しかしながら、マーカーの組合せも評価されうる。例えばＶＥＧＦＡ及びＶＥＧＦＲ２又はＶＥＧＦＡ及びＰＬＧＦ又はＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＲ２及びＰＬＧＦの、マーカーパネルのマーカーについて測定された値(又は組合せ発現レベル)は数学的に組合せられ得、組合せられた値は、根底にある診断的質問と相関されうる。マーカー値は、任意の適切な技術水準の数学的方法によって組み合せられうる。マーカーの組合せを疾患又は治療効果に相関させるためのよく知られた数学的方法は、判別分析(ＤＡ)(すなわち、線形-、二次-、正規化-ＤＡ)、カーネル法(すなわち、ＳＶＭ)、ノンパラメトリック手法(すなわち、ｋ近傍分類)、ＰＬＳ(部分最小二乗法)、樹木ベース法(すなわち、ロジック回帰、ＣＡＲＴ、ランダムフォレスト方法、ブースティング／バギング方法)、一般化線形モデル(すなわち、ロジスティック回帰)、主成分ベース方法(すなわち、ＳＩＭＣＡ)、一般加法モデル、ファジー論理ベース方法、ニューラルネットワーク及び遺伝的アルゴリズムベース方法等の方法を使用する。当業者は、本発明のマーカーの組合せを評価するための適切な方法の選択に問題はないだろう。ここに開示の発明によるマーカーの組合せの、例えば、化学療法剤／化学療法レジメンへのベバシズマブの追加に対する改善された全生存、無進行生存、応答性又は感受性、及び／又はベバシズマブ(一又は複数の化学療法剤／化学療法レジメンに追加して)への応答性又は感受性の予測との相関において使用される方法は、ＤＡ(すなわち、線形-、二次-、正規化判別分析)、カーネル法(すなわち、ＳＶＭ)、ノンパラメトリック手法(すなわち、ｋ近傍分類)、ＰＬＳ(部分最小二乗法)、樹木ベース法(すなわち、ロジック回帰、ＣＡＲＴ、ランダムフォレスト方法、ブースティング方法)、又は一般化線形モデル(すなわち、ロジスティック回帰)から選択される。これらの統計的方法に関する詳細は、次の参照文献に見られる：Ruczinski, I., et al, J. of Computational and Graphical Statistics, 12 (2003) 475-511; Friedman, J. H., J. of the American Statistical Association 84 (1989) 165-175; Hastie, Trevor, Tibshirani, Robert, Friedman, Jerome, The Elements of Statistical Learning, Springer Series in Statistics, 2001; Breiman, L., Friedman, J. H., Olshen, R. A., Stone, C. J. (1984) Classification and regression trees, California: Wadsworth; Breiman, L., Random Forests, Machine Learning, 45 (2001) 5-32; Pepe, M. S., The Statistical Evaluation of Medical Tests for Classification and Prediction, Oxford Statistical Science Series, 28 (2003); and Duda, R. O., Hart, P. E., Stork, D. G., Pattern Classification, Wiley Interscience, 2nd Edition (2001)。
【００５０】
従って、ここに開示の発明は、根本にある組合せのバイオマーカーのための、及び状態Ａと状態Ｂとを区別するための、例えば化学療法レジメンへのベバシズマブの追加に応答性又は感受性の患者と、化学療法レジメンへのベバシズマブ療法の追加に乏しい応答の患者とを区別するための最適化多変量カットオフの使用に関する。このタイプの分析では、マーカーはもはや独立的ではなく、マーカーパネル又は組合せ発現レベルを形成する。
【００５１】
本発明は、従って、ＶＥＧＦＡ、ＰＬＧＦ及びＶＥＧＦＲ２の２つ以上の発現レベルを決定し、各発現レベルを重み関数(又は重み付け係数)で乗じるように、これらの発現レベルを加えることによって、化学療法レジメンにベバシズマブを加えることによって、乳癌、特に局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ-２陰性乳癌を患っている患者の化学療法レジメンの治療効果を改善するための方法に関する。驚くべきことに、結果(「値」、数学的操作の結果、又は組合せ発現レベル)は、併用化学療法レジメンにおいてベバシズマブを投与される患者における治療効果と相関し、事前に定めた(多変量)カットオフより上の値は、患者の良好な治療効果の指標となり、このカットオフより下の値は、乏しい治療効果の指標となる。
【００５２】
従って、発明は、ＶＥＧＦＡ及びＶＥＧＦＲ２の２つ以上の発現レベルを決定し、各発現レベルを重み関数(又は重み付け係数)で乗じるように、これらの発現レベルを加えることによって、化学療法レジメンにベバシズマブを加えることによって、乳癌、特に局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ-２陰性乳癌を患っている患者の化学療法レジメンの治療効果を改善するための方法に関する。驚くべきことに、結果(「値」、数学的操作の結果、又は組合せ発現レベル)は、併用化学療法レジメンにおいてベバシズマブを投与される患者における治療効果と相関し、事前に定めた(多変量)カットオフより上の値は、患者の良好な治療効果の指標となり、このカットオフより下の値は、乏しい治療効果の指標となる。
【００５３】
発明は、ＶＥＧＦＡ及びＰＬＧＦの２つ以上の発現レベルを決定し、各発現レベルを重み関数(又は重み付け係数)で乗じるように、これらの発現レベルを加えることによって、化学療法レジメンにベバシズマブを加えることによって、乳癌、特に局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ-２陰性乳癌を患っている患者の化学療法レジメンの治療効果を改善するための方法に関する。驚くべきことに、結果(「値」、数学的操作の結果、又は組合せ発現レベル)は、併用化学療法レジメンにおいてベバシズマブを投与される患者における治療効果と相関し、事前に定めた(多変量)カットオフより上の値は、患者の良好な治療効果の指標となり、このカットオフより下の値は、乏しい治療効果の指標となる。
【００５４】
本発明は、従って、ＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＲ２及びＰＬＧＦの発現レベルを決定し、各発現レベルを重み関数(又は重み付け係数)で乗じるように、これらの発現レベルを加えることによって、化学療法レジメンにベバシズマブを加えることによって、乳癌、特に局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ-２陰性乳癌を患っている患者の化学療法レジメンの治療効果を改善するための方法に関する。驚くべきことに、結果(「値」、数学的操作の結果、又は組合せ発現レベル)は、併用化学療法レジメンにおいてベバシズマブを投与される患者における治療効果と相関し、事前に定めた(多変量)カットオフより上の値は、患者の良好な治療効果の指標となり、このカットオフより下の値は、乏しい治療効果の指標となる。
【００５５】
例えば、添付の説明的実施例に示すように、治療効果が局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ-２陰性乳癌を患っている患者における無進行生存であり、治療が、プラセボ＋ドセタキセル療法と比較した、低(７．５ｍｇ／ｋｇ毎３週)又は高用量(１５ｍｇ／ｋｇ毎３週)のベバシズマブ＋ドセタキセル療法である場合、次の式が、ＶＥＧＦＡ及びＶＥＧＦＲ２又はＶＥＧＦＡ及びＰＬＧの組合せ発現レベルを評価するために使用できる。
式１：ノルム(ＶＥＧＦＡ)＋１．３＊ノルム(ＶＥＧＦＲ２)
等価式：０．７１＊ｌｏｇ２(ＶＥＧＦＡ)＋３．１６＊ｌｏｇ２(ＶＥＧＦＲ２)−１５．６
及び
式２：０．２５＊ノルム(ＶＥＧＦＡ)＋０．２１＊ノルム(ＰＬＧＦ)
等価式：０．１８＊ｌｏｇ２(ＶＥＧＦＡ)＋０．４２＊ｌｏｇ２(ＰＬＧＦ)−３．１
ここで我々はｌｏｇ２変換及び
0006055764.tif 000002
を使用し、ここでｍａｄは、１．４８２６の係数で調節される絶対偏差中央値である。
【００５６】
従って、ここに記載の発明の関連であって、添付の説明的実施例に従うと、低及び高用量双方のベバシズマブ療法の追加についての無進行生存に関し、ＶＥＧＦＡ及びＶＥＧＦＲ２の高組合せ発現レベルは式１≧−０．１３２であり、ＶＥＧＦＡ及びＶＥＧＦＲ２の低組合せ発現は式１＜−０．１３２である。ここに記載の発明の関連であって、添付の説明的実施例に従うと、低及び高用量双方のベバシズマブ療法の追加についての無進行生存に関し、ＶＥＧＦＡ及びＰＬＧＦの高組合せ発現レベルは式２≧−０．００６であり、ＶＥＧＦＡ及びＰＬＧＦの低組合せ発現は式２＜−０．００６である。しかしながら、当業者は、例えばＶＥＧＦＡ及びＶＥＧＦＲ２又はＶＥＧＦＡ及びＰＬＧＦの、マーカーパネルのマーカーについて測定された発現レベル(又は組合せ発現レベル)が数学的に組合せられ得、組合せられた発現レベルが、一以上の方法において、根底にある診断的質問と相関されうることを理解するだろう。従って、マーカーレベルは、任意の適切な技術水準の数学的方法によって組み合せられうる。
【００５７】
一又は複数のマーカーＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＲ２及びＰＬＧＦの発現レベルは、患者サンプルにおける特定のタンパク質レベルの決定に適切な当分野で知られている任意の方法によって評価され得、好ましくは、一又は複数のＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＲ２及びＰＬＧＦに特異的な抗体を用い、ＥＬＩＳＡなどのイムノアッセイ方法によって決定される。このような方法はよく知られており、当分野でルーチン的に実施され、対応する市販の抗体及び／又はキットは容易に入手可能である。例えば、ＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＲ２及びＰＬＧＦのための市販の抗体／試験キットは、クローン３Ｃ５及び２６５０３はBender RELIATech及びR&D Systemsから、クローン８９１１５及び８９１０９はR&D systemsから、クローン２Ｄ６Ｄ５及び６Ａ１１Ｄ２はRoche Diagnostics GmbHからそれぞれ得ることができる。好ましくは、発明のマーカー／指標タンパク質の発現レベルは、抗体又はキット製造者の推奨試薬及び／又はプロトコルを使用して評価される。当業者はまた、イムノアッセイ方法により一又は複数のＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＲ２及びＰＬＧＦの発現レベルを決定するための更なる手段に気付くだろう。従って、発明のマーカー／指標の一又は複数の発現レベルは、不当な負担無く、当業者によってルーチン的に、また再現性よく決定できる。しかしながら、正確性及び再現性のある結果を確実にするために、発明はまた、試験手順の検証を確実にする専門研究所における患者サンプルの試験を包含する
【００５８】
ＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０タンパク質は、当業者に知られている任意の方法を使用して検出できる。例えば、哺乳類からの組織又は細胞サンプルは、ウェスタン、ＥＬＩＳＡ等を使用して、例えばタンパク質について簡便にアッセイできる。上記技術の適用におけるガイダンスの提供のために、多くの参照文献が入手可能である(Kohler et al., Hybridoma Techniques (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1980); Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays (Elsevier, Amsterdam, 1985); Campbell, Monoclonal Antibody Technology (Elsevier, Amsterdam, 1984); Hurrell, Monoclonal Hybridoma Antibodies:Techniques and Applications (CRC Press, Boca Raton, FL, 1982); and Zola, Monoclonal Antibodies:A Manual of Techniques, pp. 147-1 58 (CRC Press, Inc., 1987))。
【００５９】
ＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０の検出又はレベルに言及する場合、これは、例えば、ＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０双方を検出するアッセイを使用して、双方の分子の合計が測定されることを意味する。双方の分子ＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０を検出するアッセイは、例えば、対応する他の形態について(すなわち、ＶＥＧＦ１１０が良好に認識される場合はＶＥＧＦ１２１について、又はＶＥＧＦ１２１が良好に認識される場合はＶＥＧＦ１１０ついてそれぞれ)少なくとも２５％の感受性を有するアッセイを含む。ある実施態様では、アッセイでは、少なくとも５０％、７５％、８０％、８５％、９０％以上の、対応する他の形態に対する感受性を有する。一実施態様では、ＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０は、基本的に同じ感受性で測定される。
【００６０】
ＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０タンパク質の検出については、様々なアッセイが利用可能である。例えば、サンプルは、長い、天然に生じるＶＥＧＦ-ＡアイソフォームＶＥＧＦ１６５及びＶＥＧＦ１８９それぞれと比較して、短いＶＥＧＦ-Ａアイソフォーム、ＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０それぞれと優先的に又は特異的に結合する抗体又は抗体の組合せ(例えば、サンドイッチアッセイにおいて)と接触され得る。好ましくは、短アイソフォームは、長アイソフォームと比較して少なくとも３倍高い感受性で検出される。標準曲線が、短アイソフォーム(ＳＤＳ-ＰＡＧＥにより少なくとも９０％の純度及びＯＤ２８０ｎｍによって決定される濃度)を使用して得られ、同じ試薬及び同じ標準曲線を使用する所定の濃度での長アイソフォーム(ＳＤＳ-ＰＡＧＥにより少なくとも９０％の純度及びＯＤ２８０ｎｍによって決定される濃度)について、標準曲線の読取り値が、期待した濃度の３分の１以下のみである場合、少なくとも３倍高い感受性が確認される。また好ましくは、短アイソフォームの感受性は、長アイソフォームと比較して、特にＶＥＧＦ１６５と比較して少なくとも４倍、５倍、６倍、７倍、８倍又は９倍高い。
【００６１】
一実施態様では、短アイソフォームＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０双方が特異的に検出される。このような特異的検出は、例えば、ＶＥＧＦ１２１におけるエクソン４及び８を連結することによって生成される配列又はＶＥＧＦ１１０のフリーＣ末端それぞれに結合する抗体、特にモノクローナル抗体が使用及び適用される場合に可能である。このようなＶＥＧＦ１１０抗Ｃ末端抗体は、長ポリペプチド鎖の一部としてアミノ酸１１０を含んでなる何れかのＶＥＧＦ-Ａアイソフォームに、又は例えばアミノ酸１０９の短ＶＥＧＦ-Ａ断片末端に結合しない。ＶＥＧＦ１２１においてそれぞれエクソン４及び８を連結することによって生成される配列に結合するモノクローナル抗体は、長ＶＥＧＦアイソフォーム１６５及び１８９それぞれに含まれるアミノ酸配列に結合しないだろう。なぜなら、そこでは、エクソン４及びエクソン７の、及びエクソン４及びエクソン５それぞれの連結により、他のアミノ酸配列が存在するからである(Ferrara, N., Mol.Biol. of the Cell 21 (2010) 687-690を参照)。使用する抗体が、短断片と１０％未満の交差反応、及び抗ＶＥＧＦ１１０抗体の場合フリーＣ末端アミノ１１０を持たないそれらのＶＥＧＦ-Ａアイソフォームと、又は抗ＶＥＧＦ１２１抗体の場合、エクソン４及び８の連結によって生成される配列を含んでなるそれらのアイソフォームとそれぞれ１０％未満の交差反応を呈する場合に、上記配列の特異的結合が確認される。また好ましくは、交差反応は、短断片及び、フリーＣ末端アミノ酸１１０をもたないか又はエクソン４及び８の連結によって生成される配列を持たないＶＥＧＦアイソフォーム双方それぞれに、それぞれ５％、４％、３％、２％及び１％未満であろう。
【００６２】
短ＶＥＧＦアイソフォームＶＥＧＦ１２１又はＶＥＧＦ１１０にのみそれぞれ結合する適切な特異的抗体は、標準的な手順に従って得ることができる。ＶＥＧＦ１１０の最も少なくとも４、５、６、７、８、９、１０以上のアミノ酸Ｃ末端を呈するか含んでなるペプチド、又はＶＥＧＦ１２１のアミノ酸１１５にアミノ酸Ｃ末端及びＮ末端を含んでなる少なくとも５、６、７、８、９、１０以上のアミノ酸を呈するか又は含んでなるペプチドがそれぞれ合成され、場合によっては担体にカップリングされ、免疫化に使用されるだろう。特異的ポリクローナル抗体は、適切な免疫吸着工程によって得ることができる。モノクローナル抗体は、ＶＥＧＦ１２１又はＶＥＧＦ１１０それぞれとの反応性、及び適切な低交差反応について容易にスクリーニングできる。ＶＥＧＦ１１０特異的抗体に関して、低交差反応は、ＶＥＧＦ１１０の短断片(例えば、ＶＥＧＦ１１０のＣ末端アミノ酸を欠如)及びＶＥＧＦ１１０のフリーＣ末端を持たないＶＥＧＦ-Ａアイソフォーム双方について評価できる。ＶＥＧＦ１２１特異的抗体に関する低交差反応性は、エクソン４及びエクソン７の、及びエクソン４及びエクソン５の連結によって形成されるアミノ酸配列を含むＶＥＧＦアイソフォームを使用して評価できる。
【００６３】
ＶＥＧＦ１１１タンパク質又は核酸は、当分野で知られている任意の方法を使用して検出できる。例えば、哺乳類からの組織又は細胞サンプルは、例えば、ウエスタン、ＥＬＩＳＡを使用してタンパク質について、ノーザン、ドットブロット、又はポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)分析、アレイハイブリダイゼーション、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイを使用して、又はＤＮＡ ＳＮＰチップマイクロアレイを使用して、興味の遺伝的バイオマーカーからのｍＲＮＡ又はＤＮＡについて、簡便にアッセイでき、これらは市販されており、ＤＮＡマイクロアレイスナップショットを含む。例えば、リアルタイムＰＣＲ(ＲＴ-ＰＣＲ)アッセイ、例えば定量ＰＣＲアッセイは、当分野でよく知られている。発明の説明的実施態様では、生物学的サンプルにおける興味の遺伝的バイオマーカーからのｍＲＮＡの検出のための方法は、少なくとも一つのプライマーを使用して逆転写によってサンプルからｃＤＮＡを生成すること；そのように生成されたｃＤＮＡを増幅すること；及び増幅されたｃＤＮＡの存在を検出することを含む。更に、このような方法は、生物学的サンプルにおけるｍＲＮＡのレベルの決定を可能にする一又は複数の工程を含むことができる(例えば、「ハウスキーピング」遺伝子、例えばアクチンファミリーメンバーの比較コントロールｍＲＮＡ配列のレベルを同時に調べることによって)。場合によっては、増幅ｃＤＮＡの配列が決定されうる。
【００６４】
上記技術の適用におけるガイダンスの提供のために、多くの参照文献が入手可能である(Kohler et al., Hybridoma Techniques (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1980); Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays (Elsevier, Amsterdam, 1985); Campbell, Monoclonal Antibody Technology (Elsevier, Amsterdam, 1984); Hurrell, Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications (CRC Press, Boca Raton, FL, 1982); and Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-1 58 (CRC Press, Inc., 1987)。
【００６５】
ＶＥＧＦ１１１タンパク質の検出について、様々なアッセイが利用可能である。例えば、サンプルは、長い天然に生じるＶＥＧＦ-ＡアイソフォームＶＥＧＦ１６５及びＶＥＧＦ１８９それぞれと比較して、ＶＥＧＦ１１１に選択的又は特異的に結合する抗体又は抗体の組合せ(例えば、サンドイッチアッセイにおいて)と接触されうる。好ましくは、短アイソフォームＶＥＧＦ１１１は、長アイソフォームと比較して少なくとも３倍高い感受性で検出される。標準曲線が、短アイソフォーム(ＳＤＳ-ＰＡＧＥにより少なくとも９０％の純度及びＯＤ２８０ｎｍによって決定される濃度)を使用して得られ、同じ試薬及び同じ標準曲線を使用する所定の濃度での長アイソフォーム(ＳＤＳ-ＰＡＧＥにより少なくとも９０％の純度及びＯＤ２８０ｎｍによって決定される濃度)について、標準曲線の読取り値が、期待した濃度の３分の１以下のみである場合、少なくとも３倍高い感受性が確認される。また好ましくは、短アイソフォームの感受性は、長アイソフォームと比較して少なくとも４倍、５倍、６倍、７倍、８倍又は９倍高い。
【００６６】
一実施態様では、アイソフォームＶＥＧＦ１１１が特異的に検出される。このような特異的検出は、例えば、ＶＥＧＦ１１１に独自のエクソン接合部に結合する抗体、特にモノクローナル抗体が使用及び適用される場合に、可能である。このような抗体は、他のＶＥＧＦ-Ａアイソフォーム、又はこの特異的エクソン接合部を含まないその切断産物に結合しない。上記の意味での特異的結合は、もし、使用する抗体が、この独自のエクソン接合部を持たない、ＶＥＧＦ１２１又はＶＥＧＦ１６５のような他のＶＥＧＦ-Ａアイソフォームとそれぞれ、１０％未満の交差反応を呈する場合に、確認される。また好ましくは、例えばＶＥＧＦ１２１への交差反応は、それぞれ５％、４％、３％、２％及び１％未満であろう。
【００６７】
ＶＥＧＦ１１１の特異性は、一実施態様では、同じ試薬を使用して、ＶＥＧＦ１１１(ＳＤＳ-ＰＡＧＥにより少なくとも９０％の純度及びＯＤ２８０ｎｍにより決定される濃度)及びＶＥＧＦ１２１(ＳＤＳ-ＰＡＧＥにより少なくとも９０％の純度及びＯＤ２８０ｎｍにより決定される濃度)を比較することによって評価される。この比較において、ＶＥＧＦ１２１材料について得られるシグナルが、ＶＥＧＦ１１１材料で得られるシグナルの１０分の１以下のみである場合、ＶＥＧＦ１２１についての交差反応は１０％未満である。当業者は、ＶＥＧＦ１２１シグナルが好ましくは、ＶＥＧＦ１１１の最大シグナルの約５０％をもたらす濃度で読み取られることを理解するだろう。
【００６８】
短ＶＥＧＦアイソフォームＶＥＧＦ１１１にのみ結合する適切な特異的抗体は、標準的な手順に従って得ることができる。通常、ＶＥＧＦ１１１のアミノ酸１０５に、アミノ酸Ｃ末端及びＮ末端を示すか又は含んでなるペプチドが合成され得、場合によっては担体にカップリングされ、免疫化に使用される。好ましくは、このようなペプチドは、少なくとも６アミノ酸長であり、少なくとも、ＶＥＧＦ１１１のアミノ酸１０５及び１０６を含むだろう。また好ましいのは、少なくとも、ＶＥＧＦ１１１のアミノ酸１０４、１０５、１０６及び１０７を含むだろう。当業者が理解できるように、ＶＥＧＦ１１１のアミノ酸１０５及び１０６間のエクソン接合部に、例えば３以上のアミノ酸Ｎ及びＣ末端を含んでなる、より長いペプチドも、ＶＥＧＦ１１１に特異的に結合する抗体を得るために使用できる。
【００６９】
非修飾ＶＥＧＦタンパク質は、当分野で知られている任意の適切な方法を使用して検出できる。好ましくは、抗体は、RELIATech GmbH, Wolfenbutel, Germanyから市販されているＭＡＢ３Ｃ５のような、修飾ＶＥＧＦと比較して、非修飾ＶＥＧＦへの優先的な結合特性を少なくとも有する抗体が使用されるだろう。例えば、哺乳類からの組織又は細胞サンプルは、ウエスタン、ＥＬＩＳＡ等を使用して、非修飾ＶＥＧＦタンパク質について簡便にアッセイできる。上記技術の適用におけるガイダンスの提供のために、多くの参照文献が入手可能である(Kohler et al., Hybridoma Techniques (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1980); Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays (Elsevier, Amsterdam, 1985); Campbell, Monoclonal Antibody Technology (Elsevier, Amsterdam, 1984); Hurrell, Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications (CRC Press, Boca Raton, FL, 1982); and Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-1 58 (CRC Press, Inc., 1987))。
【００７０】
非修飾ＶＥＧＦの検出又はレベルに言及する場合、これは、例えばＭＡＢ３Ｃ５に結合される、非修飾ＶＥＧＦ分子(アイソフォーム又は切断産物)が測定されることを意味する。
【００７１】
非修飾ＶＥＧＦタンパク質の検出については、様々なアッセイが利用可能である。例えば、サンプルは、例えば、患者のサンプルにおいて天然に生じるような修飾ＶＥＧＦと比較して、非修飾ＶＥＧＦに優先的又は特異的に結合する抗体又は抗体の組合せ(例えば、サンドイッチアッセイにおいて)と接触されうる。好ましくは、非修飾ＶＥＧＦは、非修飾ＶＥＧＦに特異的に結合する抗体を使用して、すなわち、修飾ＶＥＧＦ１６５と比較して、非修飾ＶＥＧＦ１６５に少なくとも３倍高い感受性を有する抗体で、検出される。非修飾ＶＥＧＦについての、このような少なくとも３倍高い感受性は、大腸菌において組換え的に生産されるＶＥＧＦ１６５(ＳＤＳ-ＰＡＧＥにより少なくとも９０％の純度、及びＯＤ２８０ｎｍにより決定される濃度)と、ＨＥＫ細胞において組換え的に生産されるＶＥＧＦ１６５(ＳＤＳ-ＰＡＧＥにより少なくとも９０％の純度、及びＯＤ２８０ｎｍにより決定される濃度)とを、同じ試薬を使用して比較することによって評価される。この比較において、ＨＥＫ生産による材料について得られるシグナルが、大腸菌由来の材料で得られるシグナルの３分の１以下のみである場合、非修飾ＶＥＧＦは、少なくとも3倍高い感受性で検出される。当業者は理解するように、シグナルは好ましくは最大シグナルの約５０％で読み取られる。好ましくは、この評価では、実施例５のアッセイが使用される。また好ましくは、非修飾ＶＥＧＦ(ＶＥＧＦ１６５ ｅｘ Ｅ．ｃｏｌｉ)に特異的に結合する抗体は、修飾ＶＥＧＦ材料(ＶＥＧＦ１６５ ｅｘ ＨＥＫ細胞)と比較して、少なくとも４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍又は１０倍高い感受性で非修飾ＶＥＧＦを検出する抗体である。
【００７２】
一実施態様では、非修飾ＶＥＧＦは、市販のＭＡＢ３Ｃ５のように、修飾ＶＥＧＦと比較して非修飾ＶＥＧＦに少なくとも同じ結合優先性を有する抗体を使用して特異的に検出される。一実施態様では、非修飾ＶＥＧＦへの抗体の相対感受性又は優先的結合は、サンドイッチイムノアッセイにおいて評価され、ここで、非修飾ＶＥＧＦに対する抗体は捕獲抗体として使用され、全ての主要ＶＥＧＦアイソフォーム又は切断産物上に存在するエピトープに結合する検出抗体が使用される。一実施態様では、検出抗体は、ＭＡＢ３Ｃ５のエピトープ外のエピトープに結合するだろう。すなわちそれは、ＶＥＧＦのアミノ酸３３〜４３におよぶ合成ペプチドから成るエピトープに結合しないだろう。好ましくは、検出抗体は、１〜３２、４４〜１０５の範囲のアミノ酸から成るエピトープに、成熟ＶＥＧＦ１６５の最後の６のアミノ酸に、又はＭＡＢ３Ｃ５に結合されるエピトープと重複しない立体構造エピトープに結合するだろう。一実施態様では、修飾ＶＥＧＦと比較して非修飾ＶＥＧＦに特異的に結合する抗体は、ＶＥＧＦのアミノ酸３３〜４３におよぶ合成ペプチドから成るエピトープに結合する特性を有する。
【００７３】
非修飾ＶＥＧＦに特異的に結合する適切な特異的抗体は、標準的な手順に従って得ることができる。通常、大腸菌において組換え的に生産されるか、又は合成的に、例えば固相ポリペプチド合成によって得られるＶＥＧＦのアイソフォーム、又は大腸菌において組換え的に生産されるか、又は合成的に、例えば固相ポリペプチド合成によって得られるＶＥＧＦのエピトープを表すか又は含んでなるペプチドが、免疫原として使用されるだろう。モノクローナル抗体は容易に、標準的なプロトコルに従って生産でき、非修飾ＶＥＧＦを用いて反応性について、また修飾ＶＥＧＦを用いて適切な低交差反応についてスクリーニングできる。一つの簡便で好ましいスクリーニング方法は、大腸菌において組換え的に生産されるＶＥＧＦ１６５(ＳＤＳ-ＰＡＧＥにより少なくとも９０％の純度、及びＯＤ２８０ｎｍにより決定される濃度)の、及びＨＥＫ細胞において組換え的に生産されるＶＥＧＦ１６５(ＳＤＳ-ＰＡＧＥにより少なくとも９０％の純度、及びＯＤ２８０ｎｍにより決定される濃度)の使用に基づく。
【００７４】
一又は複数のＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＲ２及びＰＬＧＦの発現レベルは、生物学的サンプルである患者サンプルにおいて評価されうる。患者サンプルは、血液サンプル、血清サンプル又は血漿サンプルでありうる。一実施態様では、サンプルはＥＤＴＡ-血漿である。一実施態様では、サンプルはクエン酸-血漿である。血液サンプル、血清サンプル及び血漿サンプルを得る方法は当分野でよく知られている。患者サンプルは、ネオアジュバント療法より前又は後に、又はアジュバント療法より前又は後に患者から得られうる。
【００７５】
本発明の関連において、ベバシズマブは、当分野で知られる標準的な化学療法レジメンの一部として投与される一又は複数の化学療法剤に追加して、又は共療法又は共治療として投与される。このような標準的な化学療法レジメンに含まれる薬剤の例は、５-フルオロウラシル、ロイコボリン、イリノテカン、ゲムシタビン、エルロチニブ、カペシタビン、タキサン、例えばドセタキセル及びパクリタキセル、インターフェロンアルファ、ビノレルビン、及び白金ベース化学療法剤、例えばカルボプラチン、シスプラチン及びオキサリプラチンを含む。添付の説明的な実施例に示されるように、へのベバシズマブの追加は、一又は複数のＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＲ２及びＰＬＧＦの発現レベルによって定義及び選択される患者及び／又は患者集団における無進行生存における増加に影響した。このように、ベバシズマブは、添付の説明的実施例で示されるように、化学療法レジメン、例えばドセタキセル療法と組み合わせられうる。
【００７６】
投与の一般的な方法は、ボーラス投与としての、又は一定時間にわたる注入、例えば１０分、２０分、３０分、４０分、５０分、６０分、７５分、９０分、１０５分、１２０分、３時間、４時間、５時間又は６時間にわたる一日総投与量の投与としての非経口投与を含む。例えば、体重の２．５ｍｇ／ｋｇ〜体重の１５ｍｇ／ｋｇのベバシズマブ(アバスチン(登録商標))が、毎週、毎２週又は毎３週、治療されている癌のタイプに依存して投与されうる。投与量の例は、毎週、毎２週又は毎３週与えられる、体重の２．５ｍｇ／ｋｇ、体重の５ｍｇ／ｋｇ、体重の７．５ｍｇ／ｋｇ、体重の１０ｍｇ／ｋｇ及び体重の１５ｍｇ／ｋｇを含む。投与量の更なる例は、体重の５ｍｇ／ｋｇを毎２週、１０ｍｇ／ｋｇを毎２週、体重の７．５ｍｇ／ｋｇを毎３週及び体重の１５ｍｇ／ｋｇを毎３週である。ここに記載の発明の関連において、低用量ベバシズマブは、例えば、体重の２．５ｍｇ／ｋｇを毎週、体重の５ｍｇ／ｋｇを毎２週及び体重の７．５ｍｇ／ｋｇを毎３週の投与を含む。ここに記載の発明の関連において、高用量ベバシズマブは、例えば、体重の５ｍｇ／ｋｇを毎週、体重の１０ｍｇ／ｋｇを毎２週及び体重の１５ｍｇ／ｋｇを毎３週の投与を含む。乳癌、特に局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ-２陰性乳癌の治療では、投与量は、低用量ベバシズマブ、特に７．５ｍｇ／ｋｇを毎３週、及び高用量ベバシズマブ、特に毎３週に１回与えられる体重の１５ｍｇ／ｋｇを含む。当業者は、ベバシズマブの投与の更なる方法が、特定の患者及び化学療法レジメンによって決定され、発明によって包含され、投与の特定の方法及び治療用量が、当分野で知られている方法に従って、主治医によって最適に決定されることを理解するだろう。
【００７７】
本発明の方法によって選択される患者は、化学療法レジメンとの組合せにおいてベバシズマブで治療され、一又は複数の更なる抗癌療法で更に治療されうる。ある態様では、一又は複数の更なる抗癌療法は、放射線である。
【００７８】
本発明はまた、一又は複数のＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＲ２及びＰＬＧＦの発現レベルの決定に適したオリゴヌクレオチド又はポリペプチドを含んでなる診断用組成物又はキットに関する。ここに詳細に記載するように、オリゴヌクレオチド、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ又はＤＮＡ及びＲＮＡの混合のプローブが、マーカー／指標タンパク質のｍＲＮＡレベルの検出に有用であり得、ポリペプチドは、特異的タンパク質-タンパク質相互作用によるマーカー／指標タンパク質のタンパク質レベルの直接の検出に有用でありうる。発明の好ましい態様では、一又は複数のＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＲ２及びＰＬＧＦの発現レベルのためのプローブとして包含され、ここに記載のキット又は診断用組成物に含まれるポリペプチドは、これらのタンパク質に特異的な、又はその相同体及び／又はトランケーションに特異的な抗体である。
【００７９】
従って、本発明の更なる実施態様は、一又は複数のＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＲ２及びＰＬＧＦの発現レベルを決定できるオリゴヌクレオチド又はポリペプチドを含んでなる、ここに記載の方法を実施するのに有用なキットを提供する。オリゴヌクレオチドは、ここに記載のマーカー／指標の一又は複数をコードするｍＲＮＡに特異的なプライマー及び／又はプローブを含み得、ポリペプチドは、マーカー／指標タンパク質との特異的な相互作用が可能なタンパク質、例えばマーカー／指標特異的抗体又は抗体断片を含む。
【００８０】
従って、本発明は、乳癌を患っている患者のための改善された化学療法レジメンにおける使用のためのベバシズマブに関し、ここで、患者サンプルにおける一又は複数のＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＲ２及びＰＬＧＦの発現レベルが決定され、それによって、乳癌と診断された患者において決定されるコントロールレベルと比較して、一又は複数のＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＲ２及びＰＬＧＦの増加したレベルを有する患者は、化学療法レジメンに加えて、ベバシズマブが投与される。
【００８１】
以下の類似な使用が、変更すべきところは変更して適用されうる。
【００８２】
本発明は、乳癌を患っている患者の化学療法レジメンの治療効果を改善するためのベバシズマブの使用であって、次の工程を含んでなる使用に関する：
(ａ)患者サンプルにおける一又は複数のＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＲ２及びＰＬＧＦの発現レベルを決定する工程；及び
(ｂ)乳癌と診断された患者において決定されるコントロールレベルと比較して、一又は複数のＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＲ２及びＰＬＧＦの増加したレベルを有する患者に、化学療法レジメンとの組合せにおいてベバシズマブを投与する工程。
乳癌は、局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ-２陰性乳癌でありうる。化学療法レジメンは、タキサン療法、例えばドセタキセル又はパクリタキセル療法を含みうる。
【００８３】
従って、本発明は、乳癌を患っている患者の化学療法レジメンの治療効果を改善するためのベバシズマブの使用であって、次の工程を含んでなる使用に関する：
(ａ)前記患者からサンプルを得る工程；
(ｂ)一又は複数のＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＲ２及びＰＬＧＦの発現レベルを決定する工程；及び
(ｃ)乳癌と診断された患者において決定されるコントロールレベルと比較して、一又は複数のＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＲ２及びＰＬＧＦの増加したレベルを有する患者に、化学療法レジメンとの組合せにおいてベバシズマブを投与する工程。
乳癌は、局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ-２陰性乳癌でありうる。化学療法レジメンは、タキサン療法、例えばドセタキセル又はパクリタキセル療法を含みうる。
【００８４】
本発明は、乳癌を患っている患者の無進行生存を改善するためのベバシズマブの使用であって、次の工程を含んでなる使用に関する：
(ａ)患者サンプルにおける一又は複数のＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＲ２及びＰＬＧＦの発現レベルを決定する工程；及び
(ｂ)乳癌と診断された患者において決定されるコントロールレベルと比較して、一又は複数のＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＲ２及びＰＬＧＦの増加したレベルを有する患者に、化学療法レジメンとの組合せにおいてベバシズマブを投与する工程。
乳癌は、局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ-２陰性乳癌でありうる。化学療法レジメンは、タキサン療法、例えばドセタキセル又はパクリタキセル療法を含みうる。
【００８５】
従って、本発明は、乳癌を患っている患者の無進行生存を改善するためのベバシズマブの使用であって、次の工程を含んでなる使用に関する：
(ａ)前記患者からサンプルを得る工程；
(ｂ)一又は複数のＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＲ２及びＰＬＧＦの発現レベルを決定する工程；及び
(ｃ)乳癌と診断された患者において決定されるコントロールレベルと比較して、一又は複数のＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＲ２及びＰＬＧＦの増加したレベルを有する患者に、化学療法レジメンとの組合せにおいてベバシズマブを投与する工程。
乳癌は、局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ-２陰性乳癌でありうる。化学療法レジメンは、タキサン療法、例えばドセタキセル又はパクリタキセル療法を含みうる。
【００８６】
本発明は、乳癌を患っている患者の無進行生存を改善するためのベバシズマブの使用であって、次の工程を含んでなる使用を提供する：
(ａ)患者サンプルにおけるＶＥＧＦＡ又はＶＥＧＦＲ２の発現レベルを決定する工程；及び
(ｂ)乳癌と診断された患者において決定されるコントロール組合せ発現レベルと比較して、ＶＥＧＦＡ又はＶＥＧＦＲ２の増加した組合せ発現レベルを有する患者に、化学療法レジメンとの組合せにおいてベバシズマブを投与する工程。
乳癌は、局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ-２陰性乳癌でありうる。化学療法レジメンは、タキサン療法、例えばドセタキセル又はパクリタキセル療法を含みうる。投与されるベバシズマブの用量は、低又は高用量ベバシズマブでありうる。
【００８７】
本発明は、乳癌を患っている患者の無進行生存を改善するためのベバシズマブの使用であって、次の工程を含んでなる使用に関する：
(ａ)前記患者からサンプルを得る工程；
(ｂ)ＶＥＧＦＡ又はＶＥＧＦＲ２の発現レベルを決定する工程；及び
(ｃ)乳癌と診断された患者において決定されるコントロール組合せ発現レベルと比較して、ＶＥＧＦＡ又はＶＥＧＦＲ２の増加した組合せ発現レベルを有する患者に、化学療法レジメンとの組合せにおいてベバシズマブを投与する工程。
乳癌は、局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ-２陰性乳癌でありうる。化学療法レジメンは、タキサン療法、例えばドセタキセル又はパクリタキセル療法を含みうる。投与されるベバシズマブの用量は、低又は高用量ベバシズマブでありうる。
【００８８】
本発明は、局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ-２陰性乳癌を患っている患者の無進行生存を改善するためのベバシズマブの使用であって、次の工程を含んでなる使用を提供する：
(ａ)患者サンプルにおけるＶＥＧＦＡ又はＶＥＧＦＲ２の発現レベルを決定する工程；及び
(ｂ)前記乳癌と診断された患者において決定されるコントロール組合せ発現レベルと比較して、ＶＥＧＦＡ又はＶＥＧＦＲ２の増加した組合せ発現レベルを有する患者に、化学療法レジメンとの組合せにおいてベバシズマブを投与する工程。
化学療法レジメンは、タキサン療法、例えばドセタキセル又はパクリタキセル療法を含みうる。投与されるベバシズマブの用量は、低又は高用量ベバシズマブでありうる。
【００８９】
本発明は、局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ-２陰性乳癌を患っている患者の無進行生存を改善するためのベバシズマブの使用であって、次の工程を含んでなる使用に関する：
(ａ)前記患者からサンプルを得る工程；
(ｂ)ＶＥＧＦＡ又はＶＥＧＦＲ２の発現レベルを決定する工程；及び
(ｃ)前記乳癌と診断された患者において決定されるコントロール組合せ発現レベルと比較して、ＶＥＧＦＡ又はＶＥＧＦＲ２の増加した組合せ発現レベルを有する患者に、化学療法レジメンとの組合せにおいてベバシズマブを投与する工程。
化学療法レジメンは、タキサン療法、例えばドセタキセル又はパクリタキセル療法を含みうる。投与されるベバシズマブの用量は、低又は高用量ベバシズマブでありうる。
【００９０】
発明は、局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ-２陰性乳癌を患っている患者の無進行生存を改善するためのベバシズマブの使用であって、次の工程を含んでなる使用に関する：
(ａ)患者サンプルにおけるＶＥＧＦＡ又はＶＥＧＦＲ２の発現レベルを決定する工程；及び
(ｂ)前記乳癌と診断された患者において決定されるコントロール組合せ発現レベルと比較して、ＶＥＧＦＡ又はＶＥＧＦＲ２の増加した組合せ発現レベルを有する患者に、化学療法レジメンとの組合せにおいてベバシズマブを投与する工程、
ここで、化学療法レジメンが、ドセタキセル療法である。投与されるベバシズマブの用量は、低又は高用量ベバシズマブでありうる。
【００９１】
従って、本発明は、局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ-２陰性乳癌を患っている患者の無進行生存のためのベバシズマブの使用であって、次の工程を含んでなる使用に関する：
(ａ)前記患者からサンプルを得る工程；
(ｂ)ＶＥＧＦＡ又はＶＥＧＦＲ２の発現レベルを決定する工程；及び
(ｃ)前記乳癌と診断された患者において決定されるコントロール組合せ発現レベルと比較して、ＶＥＧＦＡ又はＶＥＧＦＲ２の増加した組合せ発現レベルを有する患者に、化学療法レジメンとの組合せにおいてベバシズマブを投与する工程、
ここで、化学療法レジメンが、ドセタキセル療法である。投与されるベバシズマブの用量は、低又は高用量ベバシズマブでありうる。
【００９２】
本発明は、乳癌を患っている患者の無進行生存を改善するためのベバシズマブの使用であって、次の工程を含んでなる使用を提供する：
(ａ)患者サンプルにおけるＶＥＧＦＡ及びＶＥＧＦＲ２の発現レベルを決定する工程；及び
(ｂ)乳癌と診断された患者において決定されるコントロール組合せ発現レベルと比較して、ＶＥＧＦＡ及びＶＥＧＦＲ２の増加した組合せ発現レベルを有する患者に、化学療法レジメンとの組合せにおいてベバシズマブを投与する工程。
乳癌は、局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ-２陰性乳癌でありうる。化学療法レジメンは、タキサン療法、例えばドセタキセル又はパクリタキセル療法を含みうる。投与されるベバシズマブの用量は、低又は高用量ベバシズマブでありうる。添付の説明的実施例に示すように、ＶＥＧＦＡ及びＶＥＧＦＲ２の組合せ発現レベルは、低用量ベバシズマブを投与された患者において特に予測的であった。
【００９３】
本発明は、乳癌を患っている患者の無進行生存を改善するためのベバシズマブの使用であって、次の工程を含んでなる使用に関する：
(ａ)前記患者からサンプルを得る工程；
(ｂ)ＶＥＧＦＡ及びＶＥＧＦＲ２の発現レベルを決定する工程；及び
(ｃ)乳癌と診断された患者において決定されるコントロール組合せ発現レベルと比較して、ＶＥＧＦＡ及びＶＥＧＦＲ２の増加した組合せ発現レベルを有する患者に、化学療法レジメンとの組合せにおいてベバシズマブを投与する工程。
乳癌は、局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ-２陰性乳癌でありうる。化学療法レジメンは、タキサン療法、例えばドセタキセル又はパクリタキセル療法を含みうる。投与されるベバシズマブの用量は、低又は高用量ベバシズマブでありうる。添付の説明的実施例に示すように、ＶＥＧＦＡ及びＶＥＧＦＲ２の組合せ発現レベルは、低用量ベバシズマブを投与された患者において特に予測的であった。
【００９４】
本発明は、局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ-２陰性乳癌を患っている患者の無進行生存を改善するためのベバシズマブの使用であって、次の工程を含んでなる使用を提供する：
(ａ)患者サンプルにおけるＶＥＧＦＡ及びＶＥＧＦＲ２の発現レベルを決定する工程；及び
(ｂ)前記乳癌と診断された患者において決定されるコントロール組合せ発現レベルと比較して、ＶＥＧＦＡ及びＶＥＧＦＲ２の増加した組合せ発現レベルを有する患者に、化学療法レジメンとの組合せにおいてベバシズマブを投与する工程。
化学療法レジメンは、タキサン療法、例えばドセタキセル又はパクリタキセル療法を含みうる。投与されるベバシズマブの用量は、低又は高用量ベバシズマブでありうる。添付の説明的実施例に示すように、ＶＥＧＦＡ及びＶＥＧＦＲ２の組合せ発現レベルは、低用量ベバシズマブを投与された患者において特に予測的であった。
【００９５】
本発明は、局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ-２陰性乳癌を患っている患者の無進行生存を改善するためのベバシズマブの使用であって、次の工程を含んでなる使用に関する：
(ａ)前記患者からサンプルを得る工程；
(ｂ)ＶＥＧＦＡ及びＶＥＧＦＲ２の発現レベルを決定する工程；及び
(ｃ)前記乳癌と診断された患者において決定されるコントロール組合せ発現レベルと比較して、ＶＥＧＦＡ及びＶＥＧＦＲ２の増加した組合せ発現レベルを有する患者に、化学療法レジメンとの組合せにおいてベバシズマブを投与する工程。
化学療法レジメンは、タキサン療法、例えばドセタキセル又はパクリタキセル療法を含みうる。投与されるベバシズマブの用量は、低又は高用量ベバシズマブでありうる。添付の説明的実施例に示すように、ＶＥＧＦＡ及びＶＥＧＦＲ２の組合せ発現レベルは、低用量ベバシズマブを投与された患者において特に予測的であった。
【００９６】
発明は、局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ-２陰性乳癌を患っている患者の無進行生存を改善するためのベバシズマブの使用であって、次の工程を含んでなる使用に関する：
(ａ)患者サンプルにおけるＶＥＧＦＡ及びＶＥＧＦＲ２の発現レベルを決定する工程；及び
(ｂ)前記乳癌と診断された患者において決定されるコントロール組合せ発現レベルと比較して、ＶＥＧＦＡ及びＶＥＧＦＲ２の増加した組合せ発現レベルを有する患者に、化学療法レジメンとの組合せにおいてベバシズマブを投与する工程、
ここで、化学療法レジメンが、ドセタキセル療法である。投与されるベバシズマブの用量は、低又は高用量ベバシズマブでありうる。添付の説明的実施例に示すように、ＶＥＧＦＡ及びＶＥＧＦＲ２の組合せ発現レベルは、低用量ベバシズマブを投与された患者において特に予測的であった。
【００９７】
従って、本発明は、局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ-２陰性乳癌を患っている患者の無進行生存のためのベバシズマブの使用であって、次の工程を含んでなる使用に関する：
(ａ)前記患者からサンプルを得る工程；
(ｂ)ＶＥＧＦＡ及びＶＥＧＦＲ２の発現レベルを決定する工程；及び
(ｃ)前記乳癌と診断された患者において決定されるコントロール組合せ発現レベルと比較して、ＶＥＧＦＡ及びＶＥＧＦＲ２の増加した組合せ発現レベルを有する患者に、化学療法レジメンとの組合せにおいてベバシズマブを投与する工程、
ここで、化学療法レジメンが、ドセタキセル療法である。投与されるベバシズマブの用量は、低又は高用量ベバシズマブでありうる。添付の説明的実施例に示すように、ＶＥＧＦＡ及びＶＥＧＦＲ２の組合せ発現レベルは、低用量ベバシズマブを投与された患者において特に予測的であった。
【００９８】
本発明は、乳癌を患っている患者の無進行生存を改善するためのベバシズマブの使用であって、次の工程を含んでなる使用を提供する：
(ａ)患者サンプルにおけるＶＥＧＦＡ及びＰＬＧＦの発現レベルを決定する工程；及び
(ｂ)乳癌と診断された患者において決定されるコントロール組合せ発現レベルと比較して、ＶＥＧＦＡ及びＰＬＧＦの増加した組合せ発現レベルを有する患者に、化学療法レジメンとの組合せにおいてベバシズマブを投与する工程。
乳癌は、局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ-２陰性乳癌でありうる。化学療法レジメンは、タキサン療法、例えばドセタキセル又はパクリタキセル療法を含みうる。投与されるベバシズマブの用量は、低又は高用量ベバシズマブでありうる。
【００９９】
従って、本発明は、乳癌を患っている患者の無進行生存のためのベバシズマブの使用であって、次の工程を含んでなる使用に関する：
(ａ)前記患者からサンプルを得る工程；
(ｂ)ＶＥＧＦＡ及びＰＬＧＦの発現レベルを決定する工程；及び
(ｃ)乳癌と診断された患者において決定されるコントロール組合せ発現レベルと比較して、ＶＥＧＦＡ及びＰＬＧＦの増加した組合せ発現レベルを有する患者に、化学療法レジメンとの組合せにおいてベバシズマブを投与する工程。
乳癌は、局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ-２陰性乳癌でありうる。化学療法レジメンは、タキサン療法、例えばドセタキセル又はパクリタキセル療法を含みうる。投与されるベバシズマブの用量は、低又は高用量ベバシズマブでありうる。
【０１００】
本発明は、局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ-２陰性乳癌を患っている患者の無進行生存を改善するためのベバシズマブの使用であって、次の工程を含んでなる使用を提供する：
(ａ)患者サンプルにおけるＶＥＧＦＡ及びＰＬＧＦの発現レベルを決定する工程；及び
(ｂ)前記乳癌と診断された患者において決定されるコントロール組合せ発現レベルと比較して、ＶＥＧＦＡ及びＰＬＧＦの増加した組合せ発現レベルを有する患者に、化学療法レジメンとの組合せにおいてベバシズマブを投与する工程。
化学療法レジメンは、タキサン療法、例えばドセタキセル又はパクリタキセル療法を含みうる。投与されるベバシズマブの用量は、低又は高用量ベバシズマブでありうる。
【０１０１】
従って、本発明は、局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ-２陰性乳癌を患っている患者の無進行生存のためのベバシズマブの使用であって、次の工程を含んでなる使用に関する：
(ａ)前記患者からサンプルを得る工程；
(ｂ)ＶＥＧＦＡ及びＰＬＧＦの発現レベルを決定する工程；及び
(ｃ)前記乳癌と診断された患者において決定されるコントロール組合せ発現レベルと比較して、ＶＥＧＦＡ及びＰＬＧＦの増加した組合せ発現レベルを有する患者に、化学療法レジメンとの組合せにおいてベバシズマブを投与する工程。
化学療法レジメンは、タキサン療法、例えばドセタキセル又はパクリタキセル療法を含みうる。投与されるベバシズマブの用量は、低又は高用量ベバシズマブでありうる。
【０１０２】
本発明は、局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ-２陰性乳癌を患っている患者の無進行生存を改善するためのベバシズマブの使用であって、次の工程を含んでなる使用を提供する：
(ａ)患者サンプルにおけるＶＥＧＦＡ及びＰＬＧＦの発現レベルを決定する工程；及び
(ｂ)前記乳癌と診断された患者において決定されるコントロール組合せ発現レベルと比較して、ＶＥＧＦＡ及びＰＬＧＦの増加した組合せ発現レベルを有する患者に、化学療法レジメンとの組合せにおいてベバシズマブを投与する工程、
ここで、化学療法レジメンが、ドセタキセル療法である。
投与されるベバシズマブの用量は、低又は高用量ベバシズマブでありうる。
【０１０３】
従って、本発明は、局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ-２陰性乳癌を患っている患者の無進行生存のためのベバシズマブの使用であって、次の工程を含んでなる使用に関する：
(ａ)前記患者からサンプルを得る工程；
(ｂ)ＶＥＧＦＡ及びＰＬＧＦの発現レベルを決定する工程；及び
(ｃ)前記乳癌と診断された患者において決定されるコントロール組合せ発現レベルと比較して、ＶＥＧＦＡ及びＰＬＧＦの増加した組合せ発現レベルを有する患者に、化学療法レジメンとの組合せにおいてベバシズマブを投与する工程、
ここで、化学療法レジメンが、ドセタキセル療法である。
投与されるベバシズマブの用量は、低又は高用量ベバシズマブでありうる。
【０１０４】
本発明は、乳癌を患っている患者の無進行生存を改善するためのベバシズマブの使用であって、次の工程を含んでなる使用を提供する：
(ａ)患者サンプルにおけるＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＲ２及びＰＬＧＦの発現レベルを決定する工程；及び
(ｂ)乳癌と診断された患者において決定されるコントロール組合せ発現レベルと比較して、ＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＲ２及びＰＬＧＦの増加した組合せ発現レベルを有する患者に、化学療法レジメンとの組合せにおいてベバシズマブを投与する工程。
乳癌は、局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ-２陰性乳癌でありうる。化学療法レジメンは、タキサン療法、例えばドセタキセル又はパクリタキセル療法を含みうる。投与されるベバシズマブの用量は、低又は高用量ベバシズマブでありうる。
【０１０５】
本発明は、乳癌を患っている患者の無進行生存を改善するためのベバシズマブの使用であって、次の工程を含んでなる使用に関する：
(ａ)前記患者からサンプルを得る工程；
(ｂ)ＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＲ２及びＰＬＧＦの発現レベルを決定する工程；及び
(ｃ)乳癌と診断された患者において決定されるコントロール組合せ発現レベルと比較して、ＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＲ２及びＰＬＧＦの増加した組合せ発現レベルを有する患者に、化学療法レジメンとの組合せにおいてベバシズマブを投与する工程。
乳癌は、局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ-２陰性乳癌でありうる。化学療法レジメンは、タキサン療法、例えばドセタキセル又はパクリタキセル療法を含みうる。投与されるベバシズマブの用量は、低又は高用量ベバシズマブでありうる。
【０１０６】
本発明は、局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ-２陰性乳癌を患っている患者の無進行生存を改善するためのベバシズマブの使用であって、次の工程を含んでなる使用を提供する：
(ａ)患者サンプルにおけるＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＲ２及びＰＬＧＦの発現レベルを決定する工程；及び
(ｂ)前記乳癌と診断された患者において決定されるコントロール組合せ発現レベルと比較して、ＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＲ２及びＰＬＧＦの増加した組合せ発現レベルを有する患者に、化学療法レジメンとの組合せにおいてベバシズマブを投与する工程。
化学療法レジメンは、タキサン療法、例えばドセタキセル又はパクリタキセル療法を含みうる。投与されるベバシズマブの用量は、低又は高用量ベバシズマブでありうる。
【０１０７】
本発明は、局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ-２陰性乳癌を患っている患者の無進行生存を改善するためのベバシズマブの使用であって、次の工程を含んでなる使用に関する：
(ａ)前記患者からサンプルを得る工程；
(ｂ)ＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＲ２及びＰＬＧＦの発現レベルを決定する工程；及び
(ｃ)前記乳癌と診断された患者において決定されるコントロール組合せ発現レベルと比較して、ＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＲ２及びＰＬＧＦの増加した組合せ発現レベルを有する患者に、化学療法レジメンとの組合せにおいてベバシズマブを投与する工程。
化学療法レジメンは、タキサン療法、例えばドセタキセル又はパクリタキセル療法を含みうる。投与されるベバシズマブの用量は、低又は高用量ベバシズマブでありうる。
【０１０８】
発明は、局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ-２陰性乳癌を患っている患者の無進行生存を改善するためのベバシズマブの使用であって、次の工程を含んでなる使用に関する：
(ａ)患者サンプルにおけるＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＲ２及びＰＬＧＦの発現レベルを決定する工程；及び
(ｂ)前記乳癌と診断された患者において決定されるコントロール組合せ発現レベルと比較して、ＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＲ２及びＰＬＧＦの増加した組合せ発現レベルを有する患者に、化学療法レジメンとの組合せにおいてベバシズマブを投与する工程、
ここで、化学療法レジメンが、ドセタキセル療法である。
投与されるベバシズマブの用量は、低又は高用量ベバシズマブでありうる。
【０１０９】
従って、本発明は、局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ-２陰性乳癌を患っている患者の無進行生存のためのベバシズマブの使用であって、次の工程を含んでなる使用に関する：
(ａ)前記患者からサンプルを得る工程；
(ｂ)ＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＲ２及びＰＬＧＦの発現レベルを決定する工程；及び
(ｃ)前記乳癌と診断された患者において決定されるコントロール組合せ発現レベルと比較して、ＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＲ２及びＰＬＧＦの増加した組合せ発現レベルを有する患者に、化学療法レジメンとの組合せにおいてベバシズマブを投与する工程、
ここで、化学療法レジメンが、ドセタキセル療法である。
投与されるベバシズマブの用量は、低又は高用量ベバシズマブでありうる。
【０１１０】
添付の説明的実施例に記載のように、本発明は、同定された技術的問題を解消し、そこでは、乳癌、特に局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ-２陰性乳癌と診断された患者において決定されるコントロールレベルと比較した、任意の患者における一又は複数のＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＲ２及びＰＬＧＦの発現レベルレベルが、ドセタキセル化学療法レジメンとの組合せにおいてベバシズマブを投与された患者における治療効果と相関することが、驚くべきことに示された。添付の説明的実施例に示すように、ＶＥＧＦＡ又はＶＥＧＦＲ２の増加したタンパク質発現レベルが、プラセボ及びドセタキセル化学療法レジメンで治療された患者と比較して、ベバシズマブ及びドセタキセル化学療法レジメンで治療された局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ-２陰性乳癌を患っている患者の改善された無進行生存と相関することが、驚くべきことに発見された(図２〜５)。ＶＥＧＦＡ及びＶＥＧＦＲ２の増加した組合せ発現レベルが、プラセボ及びドセタキセル化学療法レジメンで治療された患者と比較して、ベバシズマブ及びドセタキセル化学療法レジメンで治療された局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ-２陰性乳癌を患っている患者の改善された無進行生存と相関することが更に、驚くべきことに発見された(図６)。ＶＥＧＦＡ及びＰＬＧＦの増加した組合せ発現レベルが、プラセボ及びドセタキセル化学療法レジメンで治療された患者と比較して、ベバシズマブ及びドセタキセル化学療法レジメンで治療された局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ-２陰性乳癌を患っている患者における無進行生存と相関することがまた、驚くべきことに発見された(図７)。
【０１１１】
発明は、従って、乳癌、特に局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ-２陰性乳癌を患っているか、患っていると疑われるか又は患う傾向がある患者の、化学療法レジメンへのベバシズマブの追加に対する応答性又は感受性を予測するインビトロ方法であって、患者サンプルにおける一又は複数のＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＲ２及びＰＬＧＦの、組合せ発現レベルを含む発現レベルを決定することを含んでなる方法に関する。従って、ここに記載されている方法との関連で、発明は、患者サンプルにおける一又は複数のＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＲ２及びＰＬＧＦの、組合せ発現レベルを含む発現レベルを決定することを含んでなる、乳癌、特に局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ-２陰性乳癌を患っているか、患っていると疑われるか又は患う傾向がある患者の、化学療法レジメンへのベバシズマブの追加に対する応答性又は感受性の予測のための診断用組成物の調製のための、例えば抗体及びアプタマーのような結合分子を含む、特異的プローブの使用を提供する。発明は、従って、患者サンプルにおけるＶＥＧＦＡ又はＶＥＧＦＲ２の発現レベルを決定することを含んでなる、乳癌、特に局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ-２陰性乳癌を患っているか、患っていると疑われるか又は患う傾向がある患者の、化学療法レジメンへのベバシズマブの追加に対する応答性又は感受性の予測のための診断用組成物の調製のための、例えば抗体及びアプタマーのような結合分子を含む、特異的プローブの使用に関する。
【０１１２】
発明は、乳癌、特に局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ-２陰性乳癌を患っているか、患っていると疑われるか又は患う傾向がある患者の、化学療法レジメンへのベバシズマブの追加に対する応答性又は感受性を予測するインビトロ方法であって、患者サンプルにおけるＶＥＧＦＡ及びＶＥＧＦＲ２の組合せ発現レベルを決定することを含んでなる方法を提供する。従って、ここに記載されている方法との関連で、発明は、患者サンプルにおけるＶＥＧＦＡ及びＶＥＧＦＲ２の組合せ発現レベルを決定することを含んでなる、乳癌、特に局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ２陰性乳癌を患っているか、患っていると疑われるか又は患う傾向がある患者の、化学療法レジメンへのベバシズマブの追加に対する応答性又は感受性の予測のための診断用組成物の調製のための、例えば抗体及びアプタマーのような結合分子を含む、特異的プローブの使用を提供する。
【０１１３】
発明は、乳癌、特に局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ２陰性乳癌を患っているか、患っていると疑われるか又は患う傾向がある患者の、化学療法レジメンへのベバシズマブの追加に対する応答性又は感受性を予測するインビトロ方法であって、患者サンプルにおけるＶＥＧＦＡ及びＰＬＧＦの組合せ発現レベルを決定することを含んでなる方法を提供する。従って、ここに記載されている方法との関連で、発明は、患者サンプルにおけるＶＥＧＦＡ及びＰＬＧＦの組合せ発現レベルを決定することを含んでなる、乳癌、特に局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ２陰性乳癌を患っているか、患っていると疑われるか又は患う傾向がある患者の、化学療法レジメンへのベバシズマブの追加に対する応答性又は感受性の予測のための診断用組成物の調製のための、例えば抗体及びアプタマーのような結合分子を含む、特異的プローブの使用を提供する。
【０１１４】
発明は、乳癌、特に局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ-２陰性乳癌を患っているか、患っていると疑われるか又は患う傾向がある患者の、化学療法レジメンへのベバシズマブの追加に対する応答性又は感受性を予測するインビトロ方法であって、患者サンプルにおけるＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＲ２及びＰＬＧＦの組合せ発現レベルを決定することを含んでなる方法を提供する。従って、ここに記載されている方法との関連で、発明は、患者サンプルにおけるＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＲ２及びＰＬＧＦの組合せ発現レベルを決定することを含んでなる、乳癌、特に局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ-２陰性乳癌を患っているか、患っていると疑われるか又は患う傾向がある患者の、化学療法レジメンへのベバシズマブの追加に対する応答性又は感受性の予測のための診断用組成物の調製のための、例えば抗体及びアプタマーのような結合分子を含む、特異的プローブの使用を提供する。
【０１１５】
本発明の関連で、「に応答性」なる言いまわしは、乳癌、特に局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ-２陰性乳癌を患っているか、患っていると疑われるか又は患う傾向がある被験体／患者が、ベバシズマブを含んでなる化学療法レジメンに応答を示すことを意味する。当業者は、発明の方法によりベバシズマブで治療された人が応答を示すかどうか容易に決定できる立場にある。例えば、応答は、乳癌、特に局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ-２陰性乳癌からの低下した苦痛、例えば減少した及び／又は停止した腫瘍増殖、腫瘍のサイズの低減、及び／又は癌の一又は複数の症状の寛解に反映されうる。好ましくは、応答は、乳癌の転移性変換の低下又は減少インデックス、例えば、転移の形成の防止、又は転移の数又はサイズの低減に反映されうる(例えば、Eisenhauser et al., New response evaluation criteria in solid tumours: Revised RECIST guideline (version 1.1) Eur. J. Cancer 2009 45: 228-247を参照)。 
【０１１６】
本発明の関連で、「に感受性」なる言いまわしは、乳癌、特に局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ-２陰性乳癌を患っているか、患っていると疑われるか又は患う傾向がある被験体／患者が、何らかの形で、化学療法レジメンとの組合せにおけるベバシズマブでの治療に陽性反応を示すことを意味する。上記のような、「に応答性」の患者と比較して、患者の反応はあまりはっきりしないだろう。例えば、腫瘍増殖又は転移指標における低下はないが、患者は疾患に関して苦痛をあまり経験せず、及び／又は化学療法レジメンとの組合せにおけるベバシズマブの反応は一過性のみであり得、すなわち、腫瘍及び／又は転位の増殖は一過性にのみ低減又は停止されうる。
【０１１７】
発明によると、「を患っている患者」なる言いまわしは、乳癌、特に局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ-２陰性乳癌の臨床徴候を示している患者を指す。乳癌、特に局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ-２陰性乳癌の関連において、「患っていると疑われる」、「感受性である」、「患う傾向がある」又は「傾向がある」なる言いまわしは、例えばありうる遺伝的素因、有害及び／又は発癌性化合物への前又は最終的曝露、又は発癌性物理的ハザード、例えば放射線への曝露に基づく、患者における徴候疾患を指す。
【０１１８】
本発明の関連で、「化学療法レジメンの治療効果」なる言いまわしは、「全生存」及び「無進行生存」なる用語を包含する。
【０１１９】
本発明の関連で、「全生存」なる言いまわしは、患者が生存する治療中及び後の時間の長さを指す。当業者が理解するように、患者が、他の患者のサブグループと比較して、統計的に有意に長い平均生存時間を有する患者のサブグループに属する場合に、患者の全生存は改善又は増強される。
【０１２０】
本発明の関連で、「無進行生存」なる言いまわしは、その間、臨床医又は調査員の評価により、患者の疾患が悪化していない、すなわち進行していない、治療中及び後の時間の長さを指す。当業者が理解するように、類似な状況の患者のコントロールグループの平均(average又はmean)の無進行生存時間と比較して、患者が、疾患が進行しない、より長い時間を経験する場合、患者の無進行生存は改善又は増強される。
【０１２１】
「投与」又は「投与する」なる用語は、ここで使用される場合、治療用抗体の投与について当分野で知られている任意の適切な手段による、このような治療又は医療介入を必要としている患者への、血管新生阻害剤、例えばベバシズマブ(アバスチン(登録商標))、及び／又は血管新生阻害剤、例えばベバシズマブ(アバスチン(登録商標))を含んでなる薬学的組成物／治療レジメンの投与を意味する。投与の非限定的経路は、経口、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、局所、皮内、鼻腔内又は気管支内投与(例えば、吸入によって達成される)を含む。この発明の関連で、特に好ましいのは、非経口投与、例えば静脈内投与である。
【０１２２】
「抗体」なる用語は、ここでは、最も広い意味で使用され、限定するものではないが、所望の生物学的活性、特に一又は複数のＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＲ２及びＰＬＧＦへの、又はその相同体、変異体、断片及び／又はアイソフォームへの特異的結合を示す、モノクローナル及びポリクローナル抗体、多重特異性抗体(例えば、二重特異性抗体)、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、ヒト化抗体、ラクダ化抗体、単鎖抗体及び抗体断片及び断片コンストラクト、例えば、Ｆ(ａｂ′)２断片、Ｆａｂ断片、Ｆｖ断片、単鎖Ｆｖ断片(ｓｃＦｖｓ)、二重特異性ｓｃＦｖｓ、ダイアボディ、単ドメイン抗体(ｄＡｂｓ)及びミニボディを含む。
【０１２３】
「アプタマー」なる用語は、ここで使用される場合、最も広い意味で使用され、限定するものではないが、所望の生物学的活性、特に一又は複数のＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＲ２及びＰＬＧＦへの、又はその相同体、変異体、断片及び／又はアイソフォームへの特異的結合を示す、ＲＮＡ、ＤＮＡ及びＲＮＡ／ＤＮＡ分子を含むオリゴヌクレオチド、又はペプチド分子を含む。
【０１２４】
ここで使用される場合、「化学療法レジメン」又は「化学療法剤」は、抗癌治療効果を提供できる任意の活性剤を含み、化学的薬剤又は生物学的薬剤、特に癌又は腫瘍細胞を干渉できるでものありうる。好ましい活性剤は、悪性細胞の形成、成熟又は増殖を阻害又は防止する抗新生物(化学傷害性又は静化学性(chemostatic))剤として作用するものである。化学療法レジメン又は化学療法剤の非限定例は、アルキル化剤、例えばナイトロジェンマスタード(例えば、メクロレタミン、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン及びクロラムブシル)、ニトロソウレア(例えば、アルムスチン(armustine)(ＢＣＮＵ)、ロムスチン(ＣＣＮＵ)、及びセムスチン(メチル-ＣＣＮＵ))、エチレンイミン／メチルメラミン(例えば、トリエチレンメラミン(ＴＥＭ)、トリエチレン、チオホスホルアミド(チオテパ)、ヘキサメチルメラミン(ＨＭＭ、アルトレタミン))、スルホン酸アルキル(例えば、ブスルファン)、及びトリアジン(例えば、ダカルバジン(ＤＴＩＣ))；代謝拮抗剤、例えば葉酸類似体(例えば、メトトレキサート、トリメトレキサート)、ピリミジン類似体(例えば、５-フルオロウラシル、カペシタビン、フルオロデオキシウリジン、ゲムシタビン、シトシンアラビノシド(ＡｒａＣ、シタラビン)、５-アザシチジン、２、２′-ジフルオロデオキシシチジン)、及びプリン類似体(例えば、６-メルカプトプリン、６-チオグアニン、アザチオプリン、２′-デオキシコホルマイシン(ペントスタチン)、エリスロヒドロキシノニルアデニン(ＥＨＮＡ)、リン酸フルダラビン、及び２-クロロデオキシアデノシン(クラドリビン、２-ＣｄＡ))；天然産物から得られる有糸分裂阻害剤(例えば、パクリタキセル、ビンカアルカロイド(例えば、ビンブラスチン(ＶＬＢ)、ビンクリスチン、及びビノレルビン)、ドセタキセル、エストラムスチン、及びリン酸エストラムスチン)、エピポドフィロトキシン(例えば、エトポシド、テニポシド)、抗生物質(例えば、アクチモマイシン(actimomycin)Ｄ、ダウノマイシン(ルビドマイシン)、ダウノルビコン(daunorubicon)、ドキソルビシン、エピルビシン、ミトキサントロン、イダルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン(ミトラマイシン)、マイトマイシンＣ、アクチノマイシン)、酵素(例えば、Ｌ-アスパラギナーゼ)、及び生物学的反応修飾物質(例えば、インターフェロン-アルファ、ＩＬ-２、Ｇ-ＣＳＦ、ＧＭ-ＣＳＦ)；混合型薬剤、例えば、白金配位化合物(例えば、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン)、アントラセンジオン(例えば、ミトキサントロン)、置換尿素(すなわちヒドロキシウレア)、メチルヒドラジン誘導体(例えば、Ｎ-メチルヒドラジン(ＭＩＨ)、プロカルバジン)、副腎皮質抑制剤(例えば、ミトタン(ｏ、ｐ′-ＤＤＤ)、アミノグルテチミド)；ホルモン及びアンタゴニスト、例えば副腎皮質ステロイドアンタゴニスト(例えば、プレドニゾン及び均等なもの、デキサメタゾン、アミノグルテチミド)、プロゲスチン(例えば、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロン、酢酸メゲストロール)、エストロゲン(例えば、ジエチルスチルベストロール、エチニルエストラジオール及びその均等なもの)；抗エストロゲン(例えば、タモキシフェン)、アンドロゲン(例えば、プロピオン酸テス��ステロン、フルオキシメステロン及びその均等なもの)、抗アンドロゲン(例えば、フルタミド、ゴナドトロピン放出ホルモン類似体、ロイプロリド)、非ステロイド抗アンドロゲン(例えば、フルタミド)、上皮増殖因子阻害剤(例えば、エルロチニブ、ラパチニブ、ゲフィチニブ)抗体(例えば、トラスツズマブ)、イリノテカン及び他の薬剤、例えばロイコボリンを含む。局所進行性、再発性又は転移性HER-2陰性乳癌の治療について、ベバシズマブとの投与のための化学療法剤は、タキサン、例えばパクチタキセル(pactitaxel)及びドセタキセルを含む(ここに提供する説明的実施例も参照のこと)。
【０１２５】
本発明の関連で、アミノ酸配列に関連して「相同性」とは、ここに提供している配列番号によって定義される配列の完全長に対し、少なくとも８０％の配列同一性、特に少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％の同一性を指すと理解される。この発明の関連で、当業者は、相同性が、異なる集団及び民族におけるマーカー／指標タンパク質の更なる対立遺伝子バリエーションを包含することを理解するだろう。
【０１２６】
ここで使用される場合、「ポリペプチド」なる用語は、任意の長さのアミノ酸鎖を包含するペプチド、タンパク質、オリゴペプチド又はポリペプチドに関し、アミノ酸残基は共有結合ペプチド結合によって連結されている。しかしながら、このようなタンパク質／ポリペプチドのペプチド模倣物も発明によって包含され、ここで、アミノ酸及び／又はペプチド結合は、機能的類似体、例えば２０の遺伝子コードアミノ酸の内の一以外のアミノ酸残基、例えばセレノシステインによって置換されている。ペプチド、オリゴペプチド及びタンパク質は、ポリペプチドと呼ばれうる。ポリペプチド及びタンパク質なる用語は、ここでは互換的に使用される。ポリペプチドなる用語は、ポリペプチドの修飾、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化及び同様なものも指し、除外しない。このような修飾は基本的な教科書に、より詳細なモノグラフに、並びに多量の研究文献に記載されている。ポリペプチドなる用語は、ここで使用される「抗体」なる用語も指し、包含する。
【０１２７】
「治療する」及び「治療」なる用語は、ここで使用される場合、疾患又はその何れかのパラメーター又は症状の治療、改善、重症度の軽減、時間経過における低減を指す。好ましくは、前記患者はヒト患者であり、治療される疾患は乳癌、特に局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ-２陰性乳癌である。
【０１２８】
このような患者について「評価する」又は「評価」なる用語は、ＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＲ２及びＰＬＧＦを含むここに記載の一又は複数のマーカー／指標タンパク質の発現レベルを決定する方法、及び／又は乳癌、特に局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ-２陰性乳癌と診断された患者において得られるコントロールレベルと比較した、このようなマーカー／指標の発現レベルに基づいて、このような患者を選択するための方法に関する。
【０１２９】
「発現レベル」なる用語はまた、ここで使用される場合、サンプル中における本発明のマーカー／指標タンパク質の濃度又は量を指しうる。
【０１３０】
上記の方法に加え、発明はまた、一又は複数のＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＲ２及びＰＬＧＦの発現レベルを評価又は決定するための更なるイムノアッセイ方法、例えばウェスタンブロッティング及びＥＬＩＳＡベース検出を包含する。当分野で理解されるように、発明のマーカー／指標タンパク質の発現レベルはまた、当分野で知られている任意の適切な方法、例えばノーザンブロッティング、リアルタイムＰＣＲ、及びＲＴ ＰＣＲによって、ｍＲＮＡレベルで評価されうる。イムノアッセイ-及びｍＲＮＡ-ベースの検出方法及びシステムは当分野でよく知られており、標準的な教科書、例えばLottspeich(Bioanalytik, Spektrum Akademisher Verlag, 1998)又はSambrook及びRussell(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press, Cold Spring Harbor, NY, U.S.A., 2001)から導き出すことができる。記載の方法は、乳癌、特に局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ-２陰性乳癌と診断された集団において得られるコントロールレベルと比較した、患者又は患者のグループにおけるＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＲ２及びＰＬＧＦの発現レベルを決定するために特に有用である。
【０１３１】
一又は複数のＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＲ２及びＰＬＧＦの発現レベルはまた、免疫凝集、免疫沈降(例えば、免疫拡散、免疫電気泳動、免疫固定)、ウェスタンブロッティング技術(例えば、(ｉｎ ｓｉｔｕ)免疫細胞化学、アフィニティークロマトグラフィー、酵素イムノアッセイ)、及び同様なものを利用して、タンパク質レベルにおいても決定できる。溶液中における精製ポリペプチドの量も、物理的方法、例えば測光法によって決定されうる。混合物中における特定のポリペプチドを定量化する方法は通常、例えば抗体の、特異的結合に頼る。抗体の特異性を利用する特異的検出及び定量化方法は、例えばイムノアッセイ方法を含む。例えば、患者サンプル中における本発明のマーカー／指標タンパク質の濃度／量は、酵素結合免疫吸着測定法(ＥＬＩＳＡ)によって決定されうる。あるいは、ウエスタンブロット分析又は免疫染色が実施されてもよい。ウェスタンブロッティングは、電気泳動によるタンパク質の混合物の分離と、抗体での特異的検出を組み合わせる。電気泳動は、多次元的、例えば二次元電気泳動でありうる。通常、ポリペプチドは、それらの見かけの分子量によって一次元に沿って、それらの等電点によって他方向に沿って、二次元電気泳動において分離される。
【０１３２】
上記のように、本発明によるマーカー／指標タンパク質の発現レベルはまた、ＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＲ２及び／又はＰＬＧＦをコードする対応遺伝子の増加した発現に反映されうる。従って、翻訳より前の遺伝子産物(スプライシング、非スプライシング又は部分的スプライシングｍＲＮＡ)の定量的評価が、対応遺伝子の発現を評価するために実施されうる。当業者は、この関連で使用される標準的な方法を知っているか、又は標準的な教科書からこれらの方法を導き出しうる(例えばSambrook, 2001, loc. cit.)。例えば、一又は複数のＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＲ２及び／又はＰＬＧＦをコードするｍＲＮＡのそれぞれの濃度／量に関する定量的データは、ノーザンブロット、リアルタイムＰＣＲ及び同様なものによって得ることができる。
【０１３３】
発明の更なる態様では、発明のキットが有利に、発明の方法を実施するために使用され得、とりわけ、診断分野において又は研究道具として、様々な応用において用いられうる。発明のキットの部品は、バイアルに個々に、又は容器又はマルチコンテイナユニットに組合せでパッケージ化されうる。キットの製造は好ましくは、当業者に知られている標準な手順に従う。キット又は診断用組成物は、例えばここに記載の免疫組織化学技術を使用して、ここに記載の発明の方法に従って、一又は複数のＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＲ２及びＰＬＧＦの発現レベルの検出のために使用されうる。
【０１３４】
ベバシズマブの使用によって例示したが、発明は、標準的な化学療法レジメンとの組合せにおける使用のための、当分野で知られている他の血管新生阻害剤の使用を包含する。「血管新生阻害剤」なる用語は、ここで使用される場合、血管新生(例えば、血管を形成するプロセス)を変更する全ての薬剤を指し、血管の形成を阻止し及び／又は血管の成長を停止又は遅くする薬剤を含む。血管新生阻害剤の非限定例は、ベバシズマブに加えて、ペガプタニブ、スニチニブ、ソラフェニブ及びバタラニブを含む。好ましくは、本発明の方法に従った使用のための血管新生阻害剤はベバシズマブである。ここで使用される場合、「ベバシズマブ」なる用語は、米国、欧州及び日本から成る国の群から選択される国又は領域において、同一又はバイオシミラー産物として販売承認を得るために必要な要件を満たしている、全ての対応する抗ＶＥＧＦ抗体又は抗ＶＥＧＦ抗体断片を包含する。
【０１３５】
ここに記載の検出方法における使用について、当業者は、本発明によって包含されるポリペプチド、例えば抗体、又はオリゴヌクレオチドを標識する能力を有する。当分野でルーチン的に実施されるように、ｍＲＮＡレベルの検出における使用のためのハイブリダイゼーションプローブ及び／又はイムノアッセイ方法における使用のための抗体又は抗体断片は、当分野で知られている標準的な方法に従って標識化及び可視化でき、一般的に使用されるシステムの非限定的な例は、放射性標識、酵素標識、蛍光タグ、ビオチン-アビジン複合体、化学発光、及び同様なもの使用を含む。
【０１３６】
当業者、例えば主治医は、ここで選択及び定義されるような患者／患者グループに、化学療法レジメンとの組合せにおいてベバシズマブを容易に投与できる立場にある。特定の状況では、主治医は、彼／彼女の専門的経験に従って、ベバシズマブ及び化学療法レジメンの投与スキームを修正、変更又は補正しうる。従って、本発明のある態様では、方法は、化学療法レジメンとの組合せにおけるベバシズマブによって、乳癌、特に局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ-２陰性乳癌を患っているか又は患っていると疑われる患者の、治療又は全生存及び／又は無進行生存の改善のために提供され、それにより、前記患者／患者グループは、患者からの生物学的サンプル、特に血漿サンプルの評価を特徴とし、前記サンプルは、乳癌、特に局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ-２陰性乳癌と診断された患者において得られるコントロールレベルと比較して、一又は複数のＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＲ２及びＰＬＧＦの増加した発現レベルを呈する。本発明はまた、乳癌、特に局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ-２陰性乳癌を患っているか患っていると疑われる患者の治療のための薬学的組成物の調製におけるベバシズマブの使用を提供し、ここで、患者は、ここに開示のタンパク質マーカー／指標ステータスによって選択されるか特徴付けられる(すなわち、乳癌、特に局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ-２陰性乳癌と診断された患者において得られるコントロールレベルと比較した、一又は複数のＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＲ２及びＰＬＧＦの増加した発現レベル)。
【０１３７】
当業者は、局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ-２陰性乳癌における一又は複数のＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＲ２及びＰＬＧＦの発現レベルが、化学療法レジメンへのベバシズマブの追加に対する患者の感受性又は応答性の予測であるという発見が、他の癌に意味を有しうることを理解するだろう。
【０１３８】
図は以下を示す：
【図面の簡単な説明】
【０１３９】
【図１】局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ-２陰性乳癌について治療されている患者の、ベバシズマブ(低又は高用量)＋ドセタキセル療法対プラセボ＋ドセタキセル療法の、バイオマーカー集団全体の無進行生存についてのカプランマイヤー曲線。短破線はプラセボ＋ドセタキセルを表す。実線は、低用量ベバシズマブ(７．５ｍｇ／ｋｇを毎３週)＋ドセタキセルを表す。長破線は、高用量ベバシズマブ(１５ｍｇ／ｋｇを毎３週)＋ドセタキセルを表す。
【図２】局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ-２陰性乳癌について治療されている患者のベバシズマブ(低用量)＋ドセタキセル療法対プラセボ＋ドセタキセル療法の二分化分析である、バイオマーカー(プラセボ及び低用量ベバシズマブ)による、その後の抗新生物療法の開始の前の、無進行生存のハザード比のフォレストプロット。
【図３】局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ-２陰性乳癌について治療されている患者のベバシズマブ(高用量)＋ドセタキセル療法対プラセボ＋ドセタキセル療法の二分化分析である、バイオマーカー(プラセボ及び高用量ベバシズマブ)による、その後の抗新生物療法の開始の前の、無進行生存のハザード比のフォレストプロット。
【図４】局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ-２陰性乳癌について治療されている患者のベバシズマブ(低又は高用量)＋ドセタキセル療法対プラセボ＋ドセタキセル療法についての、低発現レベル(＜１２５ｐｇ／ｍｌ)ＶＥＧＦＡ、(図４Ａ)、及び高発現レベル(≧１２５ｐｇ／ｍｌ)ＶＥＧＦＡ、(図４Ｂ)についての、その後の抗新生物療法の開始前の、無進行生存のカプランマイヤー曲線。短破線はプラセボ＋ドセタキセルを表す。実線は、低用量ベバシズマブ(７．５ｍｇ／ｋｇを毎３週)＋ドセタキセルを表す。長破線は、高用量ベバシズマブ(１５ｍｇ／ｋｇを毎３週)＋ドセタキセルを表す。
【図５】局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ-２陰性乳癌について治療されている患者のベバシズマブ(低又は高用量)＋ドセタキセル療法対プラセボ＋ドセタキセル療法についての、低発現レベル(＜１１  ｎｇ／ｍｌ)ＶＥＧＦＲ２、(図５Ａ)、及び高発現レベル(≧１１  ｎｇ／ｍｌ)ＶＥＧＦＲ２、(図５Ｂ)についての、その後の抗新生物療法の開始前の、無進行生存のカプランマイヤー曲線。短破線はプラセボ＋ドセタキセルを表す。実線は、低用量ベバシズマブ(７．５ｍｇ／ｋｇを毎３週)＋ドセタキセルを表す。長破線は、高用量ベバシズマブ(１５ｍｇ／ｋｇを毎３週)＋ドセタキセルを表す。
【図６】局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ-２陰性乳癌について治療されている患者のベバシズマブ(低又は高用量)＋ドセタキセル療法対プラセボ＋ドセタキセル療法についての、組合せ低発現レベル(式１−＜０．１３２)及び組合せ高発現レベル(式１≧−０．１３２)のＶＥＧＦＡ及びＶＥＧＦＲ２についての、その後の抗新生物療法の開始前の、無進行生存のカプランマイヤー曲線。実線はプラセボ＋ドセタキセルを表す。長破線は、低用量ベバシズマブ(７．５ｍｇ／ｋｇを毎３週)＋ドセタキセルを表す。短破線は、高用量ベバシズマブ(１５ｍｇ／ｋｇを毎３週)＋ドセタキセルを表す。
【図７】局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ-２陰性乳癌について治療されている患者のベバシズマブ(低又は高用量)＋ドセタキセル療法対プラセボ＋ドセタキセル療法についての、組合せ低発現レベル(式２＜−０．００６)及び組合せ高発現レベル(式２≧−０．００６)のＶＥＧＦＡ及びＰＬＧＦについての、その後の抗新生物療法の開始前の、無進行生存のカプランマイヤー曲線。実線はプラセボ＋ドセタキセルを表す。長破線は、低用量ベバシズマブ(７．５ｍｇ／ｋｇを毎３週)＋ドセタキセルを表す。短破線は、高用量ベバシズマブ(１５ｍｇ／ｋｇを毎３週)＋ドセタキセルを表す。
【図８】配列番号：１、ＶＥＧＦＡの例示的アミノ酸配列。
【図９】配列番号：２、ＶＥＧＦＲ２の例示的アミノ酸配列。
【図１０】配列番号：３、ＰＬＧＦの例示的アミノ酸配列。
【図１１】ＩＭＰＡＣＴチップにおいて測定される、ＶＥＧＦ１１１、ＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１６５及びＶＥＧＦ１８９の増加濃度の測定。
【図１２】自動化Ｅｌｅｃｓｙｓ(登録商標)分析器において、Ｅｌｅｃｓｙｓ(登録商標)アッセイを使用して測定される、ＶＥＧＦ１１０、ＶＥＧＦ１２１、及びＶＥＧＦ１６５の増加濃度の測定。
【図１３】ＩＭＰＡＣＴアッセイを用いて２回測定される、同じ患者からのＥＤＴＡ-及びクエン酸サンプルからのデータ。ＶＥＧＦＡ濃度は、クエン酸よりＥＤＴＡ-血漿が約４０％高く、ＥＤＴＡ-クエン酸方法の比較のスピアマン相関は約０．８である。
【図１４】示されているのは、大腸菌又はＨＥＫ-細胞においてそれぞれ組換え的に生産されたＶＥＧＦ１６５の増加濃度を、自動化Ｅｌｅｃｓｙｓ(登録商標)分析器において測定した場合に測定される計数(ＥＣＬ-シグナル)である。
【０１４０】
本発明は、以下の非限定的の説明的実施例によって更に説明される。  
【０１４１】
実施例１
ＡＶＡＤＯ治験(ＢＯ１７７０８)では、未治療の局所進行性、再発性又は転移性ＨＥＲ-２陰性乳癌を有する患者を、ドセタキセル１００ｍｇ／ｍ２＋ベバシズマブ７．５ｍｇ／ｋｇを毎３週(ｎ＝２４８)、ベバシズマブ１５ｍｇ／ｋｇ(ｎ＝２４７)を毎３週又はプラセボ(ｎ＝２４１)にランダム化した(図１を参照、またMiles, J. Clin. Oncol., 24 May 2010 (e-published)を参照のこと)。
【０１４２】
血漿ベースラインサンプルは、この治験では、３９６の患者から入手可能であった。
【０１４３】
血管新生及び腫瘍形成に関連するバイオマーカーのステータスの調査は、バイオマーカー患者集団全体において決定されるコントロールレベルと比較した３つのバイオマーカーの発現レベルが、改善された治療パラメーターと相関することを示した。特に、バイオマーカー患者集団全体において決定されるコントロールレベルと比較して、より高い発現レベルのＶＥＧＦＡを呈する患者は、ドセタキセル療法へのベバシズマブの追加に応答して、延長した無進行生存を示した。バイオマーカー患者集団全体において決定されるコントロールレベルと比較して、より高い発現レベルのＶＥＧＦＲ２を呈する患者は、ドセタキセル療法へのベバシズマブの追加に応答して、延長した無進行生存を示した。また、バイオマーカー患者集団全体において決定されるコントロールレベルと比較して、より高い組合せ発現レベルのＶＥＧＦＡ及びＶＥＧＦＲ２を呈する患者は、ドセタキセル療法へのベバシズマブの追加に応答して、延長した無進行生存を示した。更に、患者集団全体において決定されるコントロールレベルと比較して、より高い組合せ発現レベルのＶＥＧＦＡ及びＰＬＧＦを呈する患者は、ドセタキセル療法へのベバシズマブの追加に応答して、延長した無進行生存を示した。
【０１４４】
患者及び免疫化学法
合計で７３６の患者がＢＯ１７７０８試験に参加し、３９６の参加者からの血漿サンプルがバイオマーカー分析に入手可能であった。バイオマーカー分析における３９６の患者及びバイオマーカー分析が不可能であった残りの患者のベースライン特性を、表１Ａ及び表１Ｂに提供する。
0006055764.tif 000003
0006055764.tif 000004
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【０１４５】
血漿分析
血漿サンプルを、ランダム化後、及び何れかの試験治療を投与する前に採取した。全てのサンプルを、その後、疾患が進行するまでドセタキセル１００ｍｇ／ｍ２＋いずれかベバシズマブ７．５ｍｇ／ｋｇを毎３週、ベバシズマブ１５ｍｇ／ｋｇを毎３週又はプラセボで治療された患者から得た。
【０１４６】
合計で４．９ｍＬの血液を、S-monovette(登録商標)(ＥＤＴＡ)管(又は抗凝固療法における１６の患者についてはクエン酸血漿管)に採った。それらを管の穏やかな反転によってその後すぐに混合し、遠心分離機においておよそ１５００ｇで３０分以内、遠心分離した(１０分間室温)。その後すぐに、上澄み血漿を、透明なポリプロピレンの５ｍＬのtransfer tubeに等分した。その後、血漿を、２つのプラスチックのストレージ管に等分した(各々およそ１．２５ｍｌ)。サンプルを、−７０℃で直立位置で保管した。幾つかの場合では、サンプルを、最高で１ヶ月−２０℃で保管し、次いで−７０℃にした。
【０１４７】
サンプルを、Roche Diagnostics GmbHのImmunological MultiParameter Chip Technology(ＩＭＰＡＣＴ)を使用し、ＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦ受容体-１(ＶＥＧＦＲ１)、ＶＥＧＦＲ２、ＰＬＧＦ及びＥ-ＳＥＬＥＣＴＩＮのレベルの測定に使用した。
【０１４８】
ＩＭＰＡＣＴマルチプレックスアッセイ技術
Roche Professional Diagnostics(Roche Diagnostics GmbH)は、実用名称ＩＭＰＡＣＴ(Immunological MultiParameter Chip Technology)下で、マルチマーカープラットホームを開発した。この技術を、「血漿分析」セクションにおける上記のタンパク質マーカーの測定に使用した。技術は、ＥＰ０９３９３１９及びＥＰ１６１０１２９に開示されている手順によって製造される小ポリスチレンチップに基づく。チップ表面をストレプトアビジン層で被覆し、次いでその上に、全てのアッセイについて、ビオチン化抗体をスポットした。各マーカーについて、抗体のスポットをチップ上に垂直線上にロードした。アッセイ中、アレイを、特異的分析物を含有する試料サンプルで探索した。
【０１４９】
記載の分析では、Ｌｏｔ０１のチップを使用した。
【０１５０】
チップ上の全マーカーを測定するために、試料につき必要な血漿量は８μＬであり、これを、３２μＬのインキュベーションバッファー(５０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．２、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％Ｔｈｅｓｉｔ、０．５％ウシ血清アルブミン及び保護剤として０．１％Ｏｘｙｐｙｒｉｏｎ)と共に適用した。１２分間のインキュベーション、及び洗浄バッファー(５ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ７．９、０．０１％Ｔｈｅｓｉｔ及び０．００１％Ｏｘｙｐｙｒｉｏｎ)を使用したチップの洗浄後、ジゴキシゲニン化モノクローナル抗体ミックス(ジゴキシゲニンで標識された分析物特異的抗体の混合を含む４０μＬのインキュベーションバッファー)を加え、捕獲された分析物上に結合させるために更に６分間インキュベートした。最後に、第二抗体を、蛍光ラテックスでカップリングされた抗ジゴキシゲニン抗体コンジュゲートを含む４０μＬの試薬バッファー(６２．５ｍＭのＴＡＰＳ ｐＨ８．７、１．２５ＭのＮａＣｌ、０．５％ウシ血清アルブミン、０．０６３％Ｔｗｅｅｎ２０及び０．１％Ｏｘｙｐｙｒｉｏｎ)で検出した。この標識の使用により、単一スポットにおける１０の個々の結合イベントが検出され、ｆｍｏｌ／Ｌ濃度に至る非常に高い感受性をもたらした。チップを検出ユニットに移し、電荷結合素子(ＣＣＤ)カメラによって画像を生成し、これを専用のソフトウェアを使用してシグナル強度に変換した。個々のスポットは所定の位置で自動的に位置決定され、画像分析によって定量化される。各マーカーについて、１０−１２スポットのラインがチップ上にロードされ、最小で５のスポットが、サンプルの平均濃度を決定するために必要とされる。技術の利点は、サンドイッチ又は競合フォーマットにおいて、最高で１０パラメーターまで多重化(multiplexing)する能力である。カリブレーター及び患者サンプルを、二重に測定した。一ランは、合計で１００の決定を有するように設計され、ランコントロールとして２つのマルチコントロールを含んだ。幾つかの選択分析物は互いに反応するため(すなわち、ＶＥＧＦＡ及びＰＬＧＦとＶＥＧＦＲ１又はＶＥＧＲＦ２又はＶＥＧＦＡはＰＬＧＦとヘテロ二量体を形成する）、５つの分析物を次のように３つの異なるチップに分けた：
チップ１：ＶＥＧＦＡ
チップ２：ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、Ｅ-セレクチン
チップ３：ＰＬＧＦ
【０１５１】
次の抗体を、異なるアッセイに使用した：
0006055764.tif 000006
【０１５２】
統計的分析
サンプル中央値を、バイオマーカー値を低(中央値未満)又は高(中央値以上)として二分するために使用した。
【０１５３】
高又は低バイオマーカーレベルを有する患者のサブグループにおける治療効果のハザード比を、比例ハザードコックス回帰分析により推定した。
【０１５４】
更に、比例ハザードコックス回帰を使用して、バイオマーカーレベル及び治療効果間の関連を評価した。モデルは次の共変量を含む：治験治療、バイオマーカーレベル、バイナリ層別化因子(ＥＲ／ＰｇＲステータス、ベースラインで測定可能な疾患、過去のアジュバントタキサン療法)、バイオマーカーレベルによる治療の交互作用項。相互作用項のＷａｌｄ検定を使用して、バイオマーカーレベル及び治療効果間の関連を決定した。０．０５未満のｐ値を有意とみなした。
【０１５５】
結果
血漿マーカー
バイオマーカーのベースライン記述統計を表２に示す。
0006055764.tif 000007
【０１５６】
表３は、無進行生存に関する治療効果との、ＶＥＧＦＡ又はＶＥＧＦＲ２の関連性の分析の結果を示す。
0006055764.tif 000008
【０１５７】
この分析では、ＶＥＧＦＡについては、低ＶＥＧＦＡ(＜１２５ｐｇ／ｍｌ)及び高ＶＥＧＦＡ(≧１２５ｐｇ／ｍｌ)を、ＶＥＧＦＲ２については、低ＶＥＧＦＲ２(＜１１ｎｇ／ｍｌ)及び高ＶＥＧＦＲ２(≧１１ｎｇ／ｍｌ)を使用した。
【０１５８】
これらの結果は、治療効果のハザード比は、低ＶＥＧＦＡを有する患者と比較して、高ＶＥＧＦＡを有する患者のサブセットにおいて有意に良好であることを示す。これらの結果はまた、治療効果のハザード比は、低ＶＥＧＦＲ２を有する患者と比較して、高ＶＥＧＦＲ２を有する患者のサブセットにおいて有意に良好であることを示す。プラセボへの低及び高用量ベバシズマブを比較した時、同じ傾向が観察され、高及び低バイオマーカーサブグループ間の差異の統計的証拠は、低用量ベバシズマブで治療された患者において、より強かった。従って、ＶＥＧＦＡ及びＶＥＧＦＲ２は各々、無進行生存に関するベバシズマブ治療効果の独立した予測バイオマーカーである。
【０１５９】
表４は、低用量(７．５ｍｇ／ｋｇを毎３週)ベバシズマブ及び高用量(１５ｍｇ／ｋｇを毎３週)ベバシズマブの、無進行生存に関する治療効果とのバイオマーカー組合せ関連性の分析を表す。
【０１６０】
この分析では
式１：ノルム(ＶＥＧＦＡ)＋１．３＊ノルム(ＶＥＧＦＲ２)
等価式：０．７１＊ｌｏｇ２(ＶＥＧＦＡ)＋３．１６＊ｌｏｇ２(ＶＥＧＦＲ２)−１５．６
及び
式２：０．２５＊ノルム(ＶＥＧＦＡ)＋０．２１＊ノルム(ＰＬＧＦ)
等価式：０．１８＊ｌｏｇ２(ＶＥＧＦＡ)＋０．４２＊ｌｏｇ２(ＰＬＧＦ)−３．１
ここで我々はｌｏｇ２変換、及び
0006055764.tif 000009
を使用し、ここでｍａｄは、１．４８２６の係数で調節される絶対偏差中央値である。
0006055764.tif 000010
この分析では、ＶＥＧＦＡ及びＶＥＧＦＲ２の高組合せ発現レベルは式１≧−０．１３２であり、ＶＥＧＦＡ及びＶＥＧＦＲ２の低組合せ発現レベルは式１＜−０．１３２であり、ＶＥＧＦＡ及びＰＬＧＦの高組合せ発現レベルは式２≧−０．００６であり、ＶＥＧＦＡ及びＰＬＧＦの低組合せ発現レベルは式２＜−０．００６である。
【０１６１】
これらの結果は、治療効果のハザード比は、低ＶＥＧＦＡ＆ＶＥＧＦＲ２組合せを有する患者と比較して、高ＶＥＧＦＡ＆ＶＥＧＦＲ２組合せを有する患者のサブセットにおいて有意に良好であることを示す。これらの結果は、治療効果のハザード比は、低ＶＥＧＦＡ＆ＰＬＧＦ組合せを有する患者と比較して、高ＶＥＧＡ＆ＰＬＧＦ組合せを有する患者のサブセットにおいて有意に良好であることを示す。プラセボへの低及び高用量ベバシズマブを比較した時、同じ傾向が観察され、高及び低バイオマーカーサブグループ間の差異の統計的証拠は、低用量ベバシズマブで治療された患者において、より強かった。従って、ＶＥＧＦＡ＆ＶＥＧＦＲ２組合せ及びＶＥＧＦＡ＆ＰＬＧＦ組合せは各々、無進行生存に関するベバシズマブ治療効果の独立した予測バイオマーカーである。
【０１６２】
ベバシズマブ１５ｍｇ／ｋｇアームにおけるＶＥＧＦ-Ａの予測値を、ＶＥＧＦ-Ａレベルによりコホートを四分位に細分することによって更に調査した。全四分位の９５％信頼区間が重複した。第一四分位(＜６４ｐｇ／ｍｌ)では、非常に限定された治療効果が観察された(ハザード比０．８６)。上位四分位(＞２４０ｐｇ／ｍｌ)では、ＰＦＳのハザード比は０．３９(９５％ＣＩ：０．１９−０．７７)であり、中央値ＰＦＳにおける差異は、他のグループより明瞭であった。全体では、四分位の点推定は、増加するＶＥＧＦ-Ａレベルに伴い、ハザード比において一定した改善を示す。これらの結果を、下の表５に示す。
0006055764.tif 000011
【０１６３】
実施例２：ＩＭＰＡＣＴアッセイを使用した、ＶＥＧＦ-Ａの短アイソフォームの検出
この実施例は、ＩＭＰＡＣＴプラットフォームにおけるＶＥＧＦ-Ａの検出に使用される抗体に基づくと、ＶＥＧＦ-Ａの短アイソフォームが、ＶＥＧＦ-Ａの長アイソフォームと比較して選択的に測定されることを実証する。
【０１６４】
アッセイを、「統計的分析」セクションの前の表に挙げる抗体を使用し、ＩＭＰＡＣＴ技術と関連したセクション下に上述するように実施した。
【０１６５】
４つの異なるＶＥＧＦ-Ａ形態、すなわち、ＶＥＧＦ１１１、ＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１６５及びＶＥＧＦ１８９が利用可能であり、分析において使用した。ＶＥＧＦ１１１、ＶＥＧＦ１２１(双方とも大腸菌における発現から得られた)、及びＶＥＧＦ１６５(昆虫細胞株において組換え的に得られた)を、R&D Systems, Minneapolis, USAから購入し、ＶＥＧＦ１８９を、RELIATech, Wolfenbuttel, Germanyから得た。ＶＥＧＦ１８９はかなり不安定であり、この材料から得られるデータは信用できないことが後に分かった。図１１に示すように、大腸菌において生産され、二次的修飾されていない、例えばグリコシル化されていない１１１又は１２１アミノ酸を有する短アイソフォームはそれぞれ、１６５アミノ酸を有する長アイソフォームと比較して、良好に検出される。ＶＥＧＦ１６５は、昆虫細胞株において得られ、少なくとも部分的にグリコシル化されている。生物学的に興味深いプラスミン切断産物ＶＥＧＦ１１０は、この時点で試験のために入手不可であったが、このアイソフォームの検出は、１１１アミノ酸を有するＶＥＧＦ分子に見られるものに相当するだろうことが期待されなければならない。
【０１６６】
実施例３：Ｅｌｅｃｓｙｓ(登録商標)分析器を使用したＶＥＧＦアイソフォームの検出
この実施例は、Ｅｌｅｃｓｙｓ(登録商標)分析器を使用するアッセイ及び対応するアッセイが、ヒト血漿において、短ＶＥＧＦアイソフォームを検出するために使用できることを示す実験を記載する。
【０１６７】
ＶＥＧＦ-Ａアッセイを、ＩＭＰＡＣＴから、自動化インビトロ診断用システムＥｌｅｃｓｙｓ(登録商標)(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim)に移した。ＩＭＰＡＣＴアッセイと同じ捕獲抗体、＜ｈＶＥＧＦ-Ａ＞-ｍ３Ｃ５(RELIATech, Wolfenbuttel)を使用し、ＩＭＰＡＣＴシステムにおいて使用された捕獲抗体＜ｈＶＥＧＦ-Ａ＞-ｍ２５６０３(R&D Systems, Minneapolis)を、＜ｈＶＥＧＦ-Ａ＞-ｍＡ４．６．１(Genentech, South San Francisco)と交換した。
【０１６８】
自動化Ｅｌｅｃｓｙｓ(登録商標)において実行されるイムノアッセイは、シグナル生成技術として電気化学ルミネセンス(ＥＣＬＩＡ)を使用するイムノアッセイである。本サンドイッチアッセイでは、ビオチン化捕獲抗体が、ストレプトアビジン被覆の磁性微小粒子に結合し、ルテニル化(ruthenylated)検出抗体がシグナル生成を可能にする。反応バッファー(５０ｍＭＴｒｉｓ(ｐＨ７．４)、２ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％ｔｈｅｓｉｔ、０．２％ウシＩｇＧ、１．０％ウシ血清アルブミン)における、１．５μｇ／ｍｌの７５μｌのビオチン化＜ＶＥＧＦ-Ａ＞-ｍ３Ｃ５、及び２μｇ／ｍｌの７５μｌのルテニル化＜ＶＥＧＦ-Ａ＞Ｍ-Ａ．４．６．１を、２０μｌのサンプルと共に、９分間インキュベートした。３０μｌの微小粒子懸濁液を、インキュベーションの最初の９分の後に加え、次いで、全混合物を更に９分間インキュベートした。これらのインキュベーション工程中、抗体分析物抗体サンドイッチが形成され、これが微小粒子に結合する。最後に、シグナル生成及び読取のために、微小粒子をＥｌｅｃｓｙｓシステムの検出チャンバーに移した。
【０１６９】
Ｅｌｅｃｓｙｓ(登録商標)ＶＥＧＦ-Ａアッセイの切断産物／アイソフォーム選択性を、精製された組換えタンパク質で評価した：ＶＥＧＦ１１０(Genentech, South San Franciscoで、プラスミン切断によって生産される)、ＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１６５(双方とも昆虫細胞株において生産され、R&D Systems, Minneapolisに供給される)。ＩＭＰＡＣＴ(登録商標)アッセイで見られた短ＶＥＧＦアイソフォームの選択的結合を、Ｅｌｅｃｓｙｓアッセイにおいて確認した。図１２に示すように、Ｅｌｅｃｓｙｓ(登録商標)アッセイでは、アイソフォームＶＥＧＦ１２１及びプラスミン切断産物ＶＥＧＦ１１０がそれぞれ双方、ＶＥＧＦ１６５よりおよそ５倍高い感受性で検出された。
【０１７０】
実施例４：クエン酸ナトリウム及びＥＤＴＡにおいて収集される血漿における短ＶＥＧＦアイソフォームの検出
対の血漿サンプルを、ＨＥＲ２＋局所再発性又は転移性乳癌を有する患者から、EDTA monovette (5mL)-及びCitrate Monovette採取管(５ｍＬ)双方に採取した。血液採取の３０分以内に、血液管を遠心分離機に置き、室温で１０分間、細胞及び血漿が分離するまで１５００ｇで回転させた。遠心分離の後すぐに、血漿をプロピレン移送管に注意深く移し、次いで、ピペットを使用して２つのストレージ管に等しく等分した(半分の体積は各々およそ１．２５ｍＬ)。サンプルにおけるＶＥＧＦ-Ａのレベルを、上記のＩＭＰＡＣＴアッセイを使用して測定した。図１３に示すように、ＶＥＧＦＡ濃度は、クエン酸に採取され保管された血漿サンプル(登録商標)比較して、ＥＤＴＡに採取され保管された血漿サンプルで約４０％高く、治療より前に採取されたベースラインサンプルについて、ＥＤＴＡ-クエン酸ＭＣのスピアマン相関は約０．８であった。
【０１７１】
実施例５：Ｅｌｅｃｓｙｓ分析器における非修飾及び修飾ＶＥＧＦ１６５の比較測定
この実施例は、Ｅｌｅｃｓｙｓ(登録商標)分析器及び対応するアッセイが、ヒト血漿において、非修飾ＶＥＧＦを検出するために使用できることを示す実験を記載する。
【０１７２】
ＶＥＧＦ-Ａアッセイを、ＩＭＰＡＣＴから、自動化インビトロ診断用システムＥｌｅｃｓｙｓ(登録商標)(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim)に移した。ＩＭＰＡＣＴアッセイと同じ捕獲抗体、＜ｈＶＥＧＦ-Ａ＞-ｍ３Ｃ５(RELIATech GmbH, Wolfenbuttel)を使用し、ＩＭＰＡＣＴシステムにおいて使用された検出抗体＜ｈＶＥＧＦ-Ａ＞-ｍ２５６０３(R&D Systems, Minneapolis)を、＜ｈＶＥＧＦ-Ａ＞-ｍＡ４．６．１(Genentech, South San Francisco)と交換した。
【０１７３】
自動化Ｅｌｅｃｓｙｓにおいて実行されるイムノアッセイは、シグナル生成技術として電気化学ルミネセンス(ＥＣＬＩＡ)を使用するイムノアッセイである。本サンドイッチアッセイでは、ビオチン化捕獲抗体が、ストレプトアビジン被覆の磁性微小粒子に結合し、ルテニル化(ruthenylated)検出抗体がシグナル生成を可能にする。反応バッファー(５０ｍＭ Ｔｒｉｓ(ｐＨ７．４)、２ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％ｔｈｅｓｉｔ、０．２％ウシＩｇＧ、１．０％ウシ血清アルブミン)における、１．５μｇ／ｍｌの７５μｌのビオチン化＜ＶＥＧＦ-Ａ＞-ｍ３Ｃ５、及び２μｇ／ｍｌの７５μｌのルテニル化＜ＶＥＧＦ-Ａ＞Ｍ-Ａ．４．６．１を、２０μｌのサンプルと共に、９分間インキュベートした。３０μｌの微小粒子懸濁液を、インキュベーションの最初の９分の後に加え、次いで、全混合物を更に９分間インキュベートした。これらのインキュベーション工程中、抗体-分析物-抗体サンドイッチが形成され、これが微小粒子に結合する。最後に、シグナル生成及び読取のために、微小粒子をＥｌｅｃｓｙｓシステムの検出チャンバーに移した。
【０１７４】
ＥｌｅｃｓｙｓＶＥＧＦ-Ａアッセイの優先傾向を、精製された組換えタンパク質で評価した：VEGF165(Peprotechにより大腸菌において組換え的に生産)及びＶＥＧＦ１６５(Roche Diagnostics, GermanyでHEK細胞において組換え的に生産)。ＩＭＰＡＣＴアッセイで見られた非修飾ＶＥＧＦ１６５の選択的結合を、Ｅｌｅｃｓｙｓアッセイにおいて確認した。図１４に示すように、Ｅｌｅｃｓｙｓアッセイでは、非修飾ＶＥＧＦ１６５は、修飾ＶＥＧＦ１６５より、およそ５倍高い感度で検出された。
【図１】
0006055764.tif 000012
【図２】
0006055764.tif 000013
【図３】
0006055764.tif 000014
【図４Ａ】
0006055764.tif 000015
【図４Ｂ】
0006055764.tif 000016
【図５Ａ】
0006055764.tif 000017
【図５Ｂ】
0006055764.tif 000018
【図６】
0006055764.tif 000019
【図７】
0006055764.tif 000020
【図８】
0006055764.tif 000021
【図９−１】
0006055764.tif 000022
【図９−２】
0006055764.tif 000023
【図１０】
0006055764.tif 000024
【図１１】
0006055764.tif 000025
【図１２】
0006055764.tif 000026
【図１３】
0006055764.tif 000027
【図１４】
0006055764.tif 000028
【配列表】
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