(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
貯蔵安定なプロバイオティック含有食品又は飲料を提供する方法であって、
プロバイオティック、高分子量ポリマー及び有効量の静菌剤を含む半透過性微小球を形成すること、
前記微小球を比較的高湿度の食品又は飲料中に導入すること、ここで、前記比較的高湿度の食品は水分１０％を超える残留水分レベルを有する、及び
前記食品又は飲料を消費前に冷凍せずに少なくとも６週間貯蔵すること、
を含み、前記静菌剤がラウリン酸である、貯蔵安定なプロバイオティック含有食品又は飲料を提供する方法。
【請求項２】
前記プロバイオティックは、１ｌｏｇ  ｃｆｕ以下の個体群の減少を経験する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記高分子量ポリマーがエチルセルロースである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記高分子量ポリマーがアルギネートである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
前記微小球が飲料中に存在する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記飲料が５未満のｐＨを有する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記微小球が、残留水分レベルが水分２０％を超える食品中に存在する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記微小球がワックスを含まないことを条件として、前記微小球が多層組成物を有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記微小球が５００ミクロン未満の粒径を有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
貯蔵安定なプロバイオティック含有食品又は飲料を提供する方法であって、
プロバイオティック、高分子量ポリマー及び有効量の静菌剤を含む半透過性微小球を用意すること、
前記微小球を比較的高湿度の食品又は飲料中に入れること、ここで、前記比較的高湿度の食品は水分１０％を超える残留水分レベルを有する、及び
水を前記微小球中に入らせること、
を含み、前記静菌剤がラウリン酸であり、前記プロバイオティックは、前記食品又は飲料を冷凍せずに少なくとも６週間貯蔵した後に１．５ｌｏｇ  ｃｆｕ以下の個体群の減少を経験する、貯蔵安定なプロバイオティック含有食品又は飲料を提供する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、プロバイオティックス（probiotics）に関し、より具体的には、食品及び飲料中でプロバイオティックスを安定化する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロバイオティックスは、適量で被験体に投与された場合に、当該被験体に健康上の利益をもたらす生きている微生物、好ましくは細菌である。幾つかの健康上の利益は、菌株特異的、すなわち、属及び種によって変わることがあるが、利益のタイプにかかわらず、利益を与えるためには、有効量の細菌が投与時に生きている（又は生存可能である）ことが必要である。当該技術分野でのこの重要な事柄のために、乾燥貯蔵安定性（dry shelf stability）と、プロバイオティックスが被験体の胃を通過する際にプロバイオティックスを保護する腸溶性コーティングに関する方策についてかなりの研究がなされてきた。安定性は、典型的には、生菌の減少として求められ、例えば、コロニー形成単位（ｃｆｕ）の１ｌｏｇの減少は１０倍の減少である。
【０００３】
従来の知見に従う貯蔵安定性に関係する問題に関し、当業者は、細菌を凍結乾燥し、次に、通常、疎水性コーティングを使用することによってそれらを乾燥した状態に保つことに努力を集中してきた。それにもかかわらず、乾燥環境中であっても、活性は経時的に減少するようである。湿度が水分約１０％である環境中では、活性は急激に低下する。例えば、米国特許出願第２００５／０２６６０６９号明細書の段落［００２５］には、水分１０％の環境中にある１つの種類のカプセル化されたプロバイオティックについて、３７℃で１４日間で４ｌｏｇの減少が報告されている。食品は、典型的には、ドライ（理論的には水分０〜１５％）、セミモイスト（semi-moist）（水分１５〜７０％）、又はモイスト（moist）（７０〜９０％）として記載される。飲料は、明らかに、水分９０％を超える。理解されるように、乾燥環境に限られている場合に、大きなマーケットセグメントは、プロバイオティックスに対して依然として閉鎖的であるか、又は有効量が生き延びることを期待して非常に過剰のプロバイオティックスを投与することを要求する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許出願第２００５／０２６６０６９号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って、必要とされているのは、水分が１０％を超える食品中又は飲料中でのプロバイオティックスの貯蔵安定性を高める方法である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
一実施形態において、本発明は、貯蔵安定なプロバイオティック含有食品又は飲料を提供する方法であって、プロバイオティック、高分子量ポリマー及び有効量の静菌剤を含む半透過性微小球を形成すること、微小球を比較的高湿度の食品又は飲料中に導入すること、ここで、前記比較的高湿度の食品は水分１０％を超える残留水分レベルを有する、及び、前記食品又は飲料を消費前に冷凍せずに少なくとも６週間貯蔵することを含む、貯蔵安定なプロバイオティック含有食品又は飲料を提供する方法を提供する。
【０００７】
別の実施形態において、本発明は、貯蔵安定なプロバイオティック含有食品又は飲料を提供する方法であって、プロバイオティック、高分子量ポリマー及び有効量の静菌剤を含む半透過性微小球を用意すること、微小球を比較的高湿度の食品又は飲料中に入れること、ここで、前記比較的高湿度の食品は水分１０％を超える残留水分レベルを有する、及び、水を微小球中に入らせることを含み、プロバイオティックは、前記食品又は飲料を冷凍せずに少なくとも６週間貯蔵した後に１．５ｌｏｇ  ｃｆｕ以下の個体群の減少を経験する、貯蔵安定なプロバイオティック含有食品又は飲料を提供する方法を提供する。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
「貯蔵安定」とは、プロバイオティックが、その健康上の利益を与えるのに十分な生存能を保持することを意味する。かかる量は、プロバイオティックの各菌株について当業者に知られている。好ましい一実施形態において、プロバイオティックは、１．５ｌｏｇ  ｃｆｕ未満、好ましくは１．３ｌｏｇ  ｃｆｕ未満、好ましくは１．１ｌｏｇ  ｃｆｕ未満、好ましくは１．０ｌｏｇ  ｃｆｕ未満、好ましくは０．９ｌｏｇ  ｃｆｕ未満、好ましくは０．８ｌｏｇ  ｃｆｕ未満の個体群の減少を経験する。
【０００９】
これまで、当業者は、安定性を保つためにプロバイオティックを乾燥した状態に保つことは必須であると考えていた。出願人は、後述するように、有効量の静菌剤が含まれることを条件として、半透過性微小球を使用して良好な安定性を達成できることを驚くべきことに見出した。「半透過性」は、水に対して透過性であることを意味する。一実施形態において、透過性は、高分子量ポリマーに応じて変わる。
【００１０】
微小球は、様々な従来の方法、例えば、流動床アグロメレーション、ゲルビーズ形成、噴霧乾燥、又はフォーム造粒などにより形成できる。一実施形態において、微小球が平均で５００ミクロン未満の粒径を有するように条件が制御される。典型的には、プロバイオティックを、凍結乾燥し、次に、コーティング、分散、又は他の方法で微小球中に取り込ませる。一実施形態において、微小球は多層組成物である。多層の実施形態の一実施形態において、微小球はワックスを含まない。
【００１１】
好適なプロバイオティック微生物の例としては、酵母、例えばサッカロミセス属（Saccharomyces）、デバロマイセス属（Debaromyces）、カンジダ・ピキア（Candidaw Pichia）及びトルロプシス属（Torulopsis）など、カビ、例えばアスペルギルス属（Aspergillus）、リゾプス属（Rhizopus）、ムコール属（Mucor）、トルロプシス属（Torulopsis）及びペニシリウム属（Penicillium）、並びに細菌、例えばビフィドバクテリウム属、バクテロイド属（Bacteroides）、クロストリジウム属（Clostridium）、紡錘菌属（Fusobacterium）、メリソコッカス属（Melissococcus）、プロピオニバクテリウム属（Propionibacterium）、ストレプトコッカス属（Streptococcus）、エンテロコッカス属（Enterococcus）、ラクトコッカス属（Lactococcus）、コクリア属（Kocuriaw）、スタフィロコッカス属（Staphylococcus）、ペプトストレプトコッカス属（Peptostrepococcus）、バチルス属（Bacillus）、ペディオコッカス属（Pediococcus）、 ミクロコッカス属（Micrococcus）、リューコノストック属（Leuconostoc）、ワイセラ属（Weissella）、アエロコッカス属（Aerococcus）、オエノコッカス属（Oenococcus）及び 乳酸桿菌（Lactobacillus）などが挙げられる。乳酸桿菌の非限定的例としては、ラクトバチルス・アシドフィルス（L. acidophilus）、ラクトバチルス・アリメンタリウス（L. alimentarius）、ラクトバチルス・アミロボラス（L. amylovorus）、ラクトバチルス・クリスパータス（L. crispatus）、ラクトバチルス・ブレビス（L. brevis）、ラクトバチルス・カセ４（L. case4）、ラクトバチルス・クルバタス（L. curvatus）、ラクトバチルス・セロビオサス（L. cellobiosus）、ラクトバチルス・デルブレッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクス（L. delbrueckii ss. Bulgaricus）、ラクトバチルス・ファルシミニス（farciminis）、ラクトバチルス・ファーメンタム（L. fermentum）、ラクトバチルス・ガセリ（L. gasseri）、ラクトバチルス・ヘルベティカス（L. helveticus）、ラクトバチルス・ラクチス（L. lactis）、ラクトバチルス・プランタラム（L. plantarum）、ラクトバチルス・ジョンソニー（L. johnsonii）、ラクトバチルス・ロイテリ（L. reuteri）、ラクトバチルス・ラムノサス（L. rhamnosus）、ラクトバチルス・サケイ（L. sakei）、及びラクトバチルス・サリバリウス（L. salivarius）が挙げられる。
【００１２】
好適なプロバイオティックスは、Jarrow Formulasから入手することができ、例えばラクトバチルス・プランタラム２９９ｖ（Lactobacillus plantarum 299v）（Ideal Bowel Support(登録商標) 299vの活性成分；１００億個の生菌数）であり、又はカスタムプロバイオティックス、例えばラクトバチルス・プランタラム（L. plantarum）、ラクトバチルス・ラムノサス（L. rhamnosus）、又はラクトバチルス・アシドフィルス（L. acidophilus）である。
【００１３】
「高分子量ポリマー」は、質量平均分子量が５０，０００を超える。例えば、ケラチン、カゼイン、アルブミン、コラーゲン、グルテリン、グルカゴン、グルテン、ゼイン、ゼラチンおよびそれらの誘導体、キチンから又はキトサンから誘導されたポリマー、多糖ポリマー、例えばセルロース系ポリマー、例えばエチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース及び第四級化セルロース誘導体など、澱粉及びそれらの誘導体、アクリル系ポリマー又はコポリマー、例えばポリアクリレート、ポリメタクリレート及びそれらの共重合体など、ポリビニルアルコール、天然由来のポリマー（必要に応じて第４級化されたものであってもよい）、例えばアラビアガム、グアーガム、キサンタン誘導体又はカラヤガム、アルギネート、カラギーナン、ウルバン及び他の藻類コロイド、グリコアミノグリカン、ヒアルロン酸及びその誘導体、シェラック、サンダラックガム、ダンマル樹脂、エレミガム及びコパール樹脂、デオキシリボ核酸、ムコ多糖類、例えばヒアルロン酸など、コンドロイチン硫酸、カプロラクタム、プルラン、ペクチン、マンナン及びガラクトマンナン、及びグルコマンナン、並びにそれらの混合物及び／又はそれらの誘導体などの、多くの合成、天然又は変性ポリマーが意図される。前述の例示的なリストはともかく、多くの食品グレードの高分子量ポリマーが意図されることが理解されるであろう。
【００１４】
好ましい高分子量ポリマーの非限定的な例としては、エチルセルロース及びアルギネートが挙げられる。必要に応じて、２種以上の高分子量ポリマーをブレンドしてもよい。
【００１５】
理論に縛られるわけではないが、静菌剤は半透過性微小球の１つの重要な特徴である。添付の実施例から分かるように、少なすぎる静菌剤及び多すぎる静菌剤は両方とも生存率の低下をもたらす。静菌剤は、ナイシン、デカン酸、ラウリン酸、キトサン、安息香酸ナトリウム、フマル酸、ソルビン酸カリウム、ＰＡＢＡ、プロピオン酸、トリクロサン、及びリノール酸から選択することができる。
【００１６】
一実施形態において、静菌剤はラウリン酸である。静菌剤がラウリン酸である場合、ラウリン酸は、約０．３〜約１５、好ましくは約０．３〜約１２、好ましくは約０．４〜約１１、好ましくは約０．５〜約１０の質量％範囲（微小球の全質量に対する）で好ましくは存在する。さらに、上記の範囲内の部分的組み合わせが意図される。
【００１７】
本発明の微小球は、食品又は飲料中に組み込まれた場合、プロバイオティックスを安定化してより長い貯蔵寿命をもたらす。残留水分レベルが水分２０％を超える、好ましくは水分３０％を超える、好ましくは水分４０％を超える、より好ましくは水分５０％を超える比較的高湿度の食品中に微小球が存在する状況が特に好ましい。
【００１８】
水分活性は、（所与の温度での製品の表面における水蒸気の分圧）／（同じ温度での純水の飽和蒸気圧）である。食品分野では、０．３以上乃至０．５以下の水分活性はセミドライ（semi-dry）と見なされており、０．５超乃至０．７以下の水分活性はセミモイストと見なされており、０．７を超える水分活性はモイストと見なされている。過去において、プロバイオティックスを含むセミモイスト及びモイスト食品は冷凍を必要とすると考えられていた。
【００１９】
一実施形態において、０．６を超える水分活性、好ましくは０．７を超える水分活性、好ましくは０．８を超える水分活性、より好ましくは０．９を超える水分活性を有する比較的高湿度の食品中に微小球が存在する。
【００２０】
一実施形態において、比較的高湿度の食品としては、ペットフード、スナックフード、ヘルスバー及び調理されていない予め包装された混合物、例えば粉ミルクなどが挙げられる。
【００２１】
一実施形態において、微小球は飲料中に存在する。参考のため、ほとんどの飲料の水分活性は１．０である。一実施形態において、飲料は５未満のｐＨを有する。かかる飲料の例としては、果汁及び清涼飲料（炭酸飲料）が挙げられる。
【実施例】
【００２２】
以下の例は例示のためだけのものであり、本発明の範囲を限定することを意図していない。全ての百分率は、特に断らない限り、質量を基準とする。
【００２３】
例１
本発明の典型的な微小球を、ミシガン州ミッドランドのザ・ダウ・ケミカル・カンパニー（The Dow Chemical Company）から入手可能なETHOCELエチルセルロース（エトキシル含有量４８．０％〜４９．５％、２５℃でウッベローデ粘度計により５％（８０：２０トルエン：エタノール）溶液中で測定した溶液粘度１２．６〜１５．４ｃＰ）を３．３３％とラウリン酸を含む安定化用材料によりCustom Probiotics Inc製の凍結乾燥されたラクトバチルス・ラムノサス（L. rhamnosus）（出発質量１００ｇ）を変換することにより形成した。ラウリン酸及びエチルセルロースを、酢酸エチル８０％／エタノール２０％の溶剤ブレンド中に分散させて安定化用溶液を形成した。
【００２４】
上記安定化用溶液をウルスター（Wurster）法を使用して流動床コーターにより細菌に適用した。ウルスター法は、流動床コーターチャンバー中に窒素流により懸濁された固体粒子の流動床の底部にあるスプレーノズルの位置により特徴付けられる。粒子はスプレーノズルの上方の環状流に同伴する。ノズルスプレーは、粒子上に安定化用溶液の噴霧流をスプレーし、これにより均一な微小球が生じる。設定温度は８０℃であった。この温度により、約５５℃のチャンバー温度がもたらされた。流速は０．６ｇ／分であった。プロセス圧は０．８バールであった。ノズル圧は１．８バールであった。このプロセスによって、光学顕微鏡により求めた場合に、粒径の平均が上記の５００ミクロンの範囲内にある均一な球状粒子が生じた。
【００２５】
微小球中に含まれていたラウリン酸の量を、各流動床被覆工程の最後に回復した細菌の量と各工程中にチャンバー中に噴射した安定化用溶液の総量とに基づいて推定した。微小球の組成を計算し、表１に質量％範囲（微小球の総質量に対する）で示す。
【００２６】
【表１】
0005866361.tif 000002
【００２７】
例２
本発明の典型的な微小球を、プロバイオティック含有粉末（バッチＤは、Ideal Bowel Support（登録商標）299v（活性成分ラクトバチルス・プランタラム（L. plantarum）２９９ｖ；１カプセル当り１００億個の生菌数）のカプセルを開けることにより得たJarrow Formulas製の５．４ｇのラクトバチルス・プランタラム（L. plantarum）２９９ｖと不活性成分；バッチＥは、Custom Probioticsから入手した７．３ｇのラクトバチルス・プランタラム（L. plantarum））を０．２７ｇのラウリン酸及びココナッツ油（Ｃ＝２１．３３ｇ（３９．５％）；Ｄ＝１９．４３ｇ（３６％））とともに噴霧乾燥することにより形成した。ラウリン酸及び油をプロバイオティックと共に高温（４０〜４５℃）で溶融及び混合した。この混合物２７ｇを１００ｇのSURELEASE（ETHOCELエチルセルロース分散液（固形分２７％））中に分散させることにより調製し、粘度を調整するためにさらなる滅菌水を加えた。分散混合物を、Mobile Minorスプレードライヤーに備え付けられた二液ノズルアトマイザーに送り込んだ。ノズルに対する空気圧を、６ｋｇ／時の空気流に等価な５０％の流れで１バールに固定した。噴霧乾燥は、窒素環境中で行い、入口温度を１４０℃に固定し、混合物の供給速度を調整することにより出口温度を５０℃±１℃に設定した。サイクロンを使用して微小球を集め、次に、残留水分を除去するために微小球を真空引きした。微小球の組成を計算し、表２に質量％範囲（微小球の総質量に対する）で示す。
【００２８】
【表２】
0005866361.tif 000003
【００２９】
粉末の得られた粒径は、コールターカウンター技術により求めた場合に、平均粒径４３ミクロンであった。
【００３０】
例３
本発明の典型的な微小球をゲルビーズ形成（gel beading）により形成した。ココナッツ油（バッチごとにそれぞれ２．８５ｇ、１．５ｇ、０．７５ｇ及び０）とラウリン酸の混合物を５５℃でブレンドし溶融させた。各得られた溶融物を細菌粉末（Ideal Bowel Support（登録商標）299v（活性成分ラクトバチルス・プランタラム（L. plantarum）２９９ｖ；１カプセル当り１００億個の生菌数）のカプセルを開けることにより得たJarrow Formulas製のラクトバチルス・プランタラム（L. plantarum）２９９ｖ）と混合した（バッチＥ及びＦは０．２５ｇの内容物を使用、バッチＧ及びＨは０．２０ｇの内容物を使用）。
【００３１】
溶融物／細菌粉末を次にそれぞれアルギン酸ナトリウム（KELTONE LV、FMC biopolymer、Ｍｗ＝５００００−７５０００Ｄａ）の２％溶液１０．９３７５ｇ中に分散させた。次に、各バッチの数滴をピペットにより別々の１Ｍ塩化カルシウム溶液に加えてアルギン酸ナトリウムを架橋させ、アルギネートに基づくゲルビーズ微小球を形成し、当該微小球を即座に脱イオン水中に移し入れた。
【００３２】
微小球の組成を計算し、表３に質量％範囲（微小球の総質量に対する）で示す。
【００３３】
【表３】
0005866361.tif 000004
【００３４】
微小球の残りは水であった（百分率は形成の比較的直後に求めた）。微小球の得られた粒径は、光学顕微鏡により求めた場合に１０００ミクロン以上であったが、マイクロピペットにより又は他の従来の方法によって、より小さく作ることができる。
【００３５】
例４（比較）
実質的に例２の方法によるが、ラウリン酸を除外し、２１．６ｇのココナッツ油を使用して、比較用の微小球（以下、比較用バッチ１という）を形成した。
【００３６】
例５（比較）
実質的に例３の方法によるが、ラウリン酸を除外し、０．２５ｇのプロバイオティック粉末内容物及び３．０ｇのココナッツ油を使用して、比較用の微小球（以下、比較用バッチ２という）を形成した。
【００３７】
例６
方法
１００ｍｇの微小球を１ｍｌの水中に懸濁し、次の方法：１）サンプルを３７℃で一晩浸し、激しく渦混合して細菌を遊離させる；２）粒子を３７℃で一晩浸した後に無菌カミソリ刃により細断する；３）乳鉢と乳棒を使用してサンプルを磨砕する、のうちの１つを使用して処理することにより初期細胞数計測生存率を評価した。理解されるように、被覆されていない対照の場合、細菌を遊離させる必要がなかったため、サンプルを水中に一晩浸さなかった。同様に、安定性試験のためにすでに水中に浸した材料についての生存率の試験も、さらに一晩浸すことを必要としなかった。処理後、遊離細菌懸濁液に４ｍｌのＭＲＳブロス培地を加えた。次に、段階希釈を行い、１００μｌをＭＲＳ寒天上に蒔いた。細菌コロニーを数え、生存細胞数を微小球１グラム当りで記録した。
【００３８】
例１に実質的に準じて微小球を作製し、蒸留水中に表４Ａに記載のとおりの期間浸した後のそれらの生存率について試験した。
【００３９】
【表４】
0005866361.tif 000005
【００４０】
例２及び４に実質的に準じて微小球を作製し、蒸留水中に所定期間浸した後のそれらの生存率について試験した。結果を表４Ｂに示す。
【００４１】
【表５】
0005866361.tif 000006
【００４２】
例３及び５に実質的に準じて微小球を作製し、蒸留水中に所定期間浸した後のそれらの生存率について試験した。結果を表４Ｃに示す。
【００４３】
【表６】
0005866361.tif 000007
【００４４】
例７（比較）
例４に実質的に準じて微小球を作製し、カプセル化されていないラクトバチルス・ラムノサス（L. rhamnosus）プロバイオティックに対してそれらの水吸収性について試験した。サンプルが平衡質量に達するまで、両方のサンプルを相対湿度約３０％の湿度室に入れた。％質量変化は、サンプルにより吸収された水の量を示す。両方のサンプルが３０．４％の質量変化を示した。結果から、均一な疎水性カプセル化が水の吸収を妨げないことが確認された。
【００４５】
本発明は本明細書に具体的に開示及び例示した実施形態に限定されないことが理解されるべきである。本発明の様々な修飾は当業者に明らかであろう。かかる修飾及び変更は、添付の特許請求の範囲に記載の範囲から離れずに行うことができる。
【００４６】
さらに、各記載の範囲は、本明細書に含まれる特定の数値と範囲の全ての組み合わせ及び部分組み合わせを包含する。さらに、本明細書で引用又は記載した各特許、特許出願及び刊行物の開示は、それらの全内容を引用により本明細書に援用する。
本発明に関連する発明の実施態様の一部を以下に示す。
［態様１］
貯蔵安定なプロバイオティック含有食品又は飲料を提供する方法であって、
プロバイオティック、高分子量ポリマー及び有効量の静菌剤を含む半透過性微小球を形成すること、
前記微小球を比較的高湿度の食品又は飲料中に導入すること、ここで、前記比較的高湿度の食品は水分１０％を超える残留水分レベルを有する、及び
前記食品又は飲料を消費前に冷凍せずに少なくとも６週間貯蔵すること、
を含む、貯蔵安定なプロバイオティック含有食品又は飲料を提供する方法。
［態様２］
前記プロバイオティックは、１ｌｏｇ  ｃｆｕ以下の個体群の減少を経験する、上記態様１に記載の方法。
［態様３］
前記高分子量ポリマーがエチルセルロースである、上記態様１に記載の方法。
［態様４］
前記高分子量ポリマーがアルギネートである、上記態様１に記載の方法。
［態様５］
前記微小球が飲料中に存在する、上記態様１に記載の方法。
［態様６］
前記飲料が５未満のｐＨを有する、上記態様５に記載の方法。
［態様７］
前記微小球が、残留水分レベルが水分２０％を超える、好ましくは水分３０％を超える、好ましくは水分４０％を超える、より好ましくは水分５０％を超える比較的高湿度の食品中に存在する、上記態様１に記載の方法。
［態様８］
前記微小球が、水分活性が０．６を超える、好ましくは０．７を超える、好ましくは０．８を超える、より好ましくは０．９を超える比較的高湿度の食品中に存在する、上記態様１に記載の方法。
［態様９］
前記比較的高湿度の食品が、ペットフード、スナックフード、ヘルスバー、及び調理されていない予め包装された混合物を含む、上記態様１に記載の方法。
［態様１０］
前記微小球がワックスを含まないことを条件として、前記微小球が多層組成物を有する、上記態様１に記載の方法。
［態様１１］
前記微小球が５００ミクロン未満の粒径を有する、上記態様１に記載の組成物。
［態様１２］
貯蔵安定なプロバイオティック含有食品又は飲料を提供する方法であって、
プロバイオティック、高分子量ポリマー及び有効量の静菌剤を含む半透過性微小球を用意すること、
前記微小球を比較的高湿度の食品又は飲料中に入れること、ここで、前記比較的高湿度の食品は水分１０％を超える残留水分レベルを有する、及び
水を前記微小球中に入らせること、
を含み、前記プロバイオティックは、前記食品又は飲料を冷凍せずに少なくとも６週間貯蔵した後に１．５ｌｏｇ  ｃｆｕ以下の個体群の減少を経験する、貯蔵安定なプロバイオティック含有食品又は飲料を提供する方法。