(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＥＮＣ１（Ｔｅｎｓｉｎ  ｌｉｋｅ  Ｃ１  ｄｏｍａｉｎ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）の発現抑制剤を有効成分として含み、
該発現抑制剤は、配列番号８または配列番号９の塩基配列を含むｓｉＲＮＡである、
糖尿病または糖尿病性合併症の予防及び治療用の薬学的組成物。
【請求項２】
前記ＴＥＮＣ１は、配列番号１のアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項３】
前記ＴＥＮＣ１は、ＰＴＰａｓｅ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔｓｅ）活性を有することを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項４】
前記ＴＥＮＣ１は、ＩＲＳ−１（ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−１）を基質で使用することを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項５】
前記糖尿病性合併症は、筋萎縮症、糖尿病性網膜病症、糖尿病性白内障、糖尿病性腎症、糖尿病性神経病症、心臓病、がん、骨粗しょう症、腎不全、性機能の障害、皮膚疾患、高血圧、動脈硬化症、脳卒中、及びアテローム性動脈硬化症よりなる群から選ばれることを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項６】
前記薬学的組成物は、ＴＥＮＣ１のＩＲＳ−１分解能を抑制することを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項７】
前記薬学的組成物は、ＴＥＮＣ１のＩＲＳ−１脱リン酸化を抑制することを特徴とする請求項１記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＴＥＮＣ１（Ｔｅｎｓｉｎ  ｌｉｋｅ  Ｃ１  ｄｏｍａｉｎ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）の発現または活性抑制剤を有効成分として含む糖尿病または糖尿病性合併症の予防または治療用の薬学的組成物に関するものであり、より具体的にはＴＥＮＣ１のＰＴＰａｓｅ活性によりＩＲＳ−１（ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−１）のリン酸化が抑制されたりＩＲＳ−１が分解（ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）されることを抑制する糖尿病または糖尿病性合併症の予防または治療用の薬学的組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病（Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｍｅｌｌｉｔｕｓ）はインシュリンの分泌量が不足したり正常的に機能をしないなどの代謝疾患の一種であり、血中ブドウ糖の濃度が高くなる高血糖を特徴にして、高血糖により様々な症状及び兆候を起こして、小便からブドウ糖を排出するようになる。また長い時間が経過することにより血管障害と神経、腎臓及び網膜などの機能異常を招いて、これにより生命まで失うことにする疾患である。
【０００３】
糖尿病は第１型と第２型に区分されるが、第１型糖尿病は「小児糖尿病」とも呼ばれて、インシュリンを全く生産できないことが原因になって発生する疾患である。インシュリンが相対的に足りない第２型糖尿病はインシュリン抵抗性（ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ：血糖を下げるインシュリンの機能が低下して細胞がブドウ糖を効果的に燃焼できないこと）を特徴とする。第２型糖尿病は食生活の西欧化による高熱量、高脂肪、高タンパクの献立、運動不足、ストレスなどの環境的な要因が大きく作用することに見えるが、それ以外に特定遺伝子の欠陥によっても糖尿病が発生できるし、膵臓の手術、感染、薬剤によりも発生できる。
【０００４】
最近食生活の西欧化とストレス、運動不足などにより動脈硬化、高血圧及び糖尿病などの慢性生活習慣性成人病が増加している。特に国内糖尿病の有病率は１９７０年代には人口１％未満であったが、１９８０年代末には約３％、１９９０年代には５−８％で持続的に増加している勢いである。従って、現在まで多様な種類の糖尿病の治療剤が開発されているが、満足できるような治療方法や薬物は開発できていない。
【０００５】
第２型糖尿病の特徴であるインシュリン抵抗性はインシュリン分泌そのものの欠陥だけではなくインシュリンの信号伝達の減少にも現す。従って、最近にはインシュリンの信号伝達を増進させることで糖尿病を治療する方法が新しく提案されて、これのためにインシュリン受容体（ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）の機能を阻害するＰＴＰ１Ｂ（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  １Ｂ）のようなタンパク質の発見を抑制する方法の開発が進められている。しかし、第２型糖尿病の場合、インシュリンの信号伝達の問題はインシュリン受容体の機能低下よりは大体ＩＲＳ−１（ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−１）の機能（ＩＲＳ−１のチロシンリン酸化（ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）及びタンパク質量の減少）低下のためである。したがって、ＩＲＳ−１の機能を調節することができるタンパク質は糖尿及び糖尿連関合併症の治療の標的ができるという点で重要である。しかし、いままで糖尿病と連関されてＩＲＳ−１の直接的なＰＴＰａｓｅ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔｓｅ）として影響を与えるタンパク質は報告されたことはなく、このようなＰＴＰａｓｅがＩＲＳ−１のリン酸化及びタンパク質の量、すべてを調節する例も報告されたことはない。
【０００６】
このように、ＩＲＳ−１のリン酸化及びタンパク質の量の減少を調節できるタンパク質は効果的な糖尿病または糖尿病性合併症の治療剤標的ができるという点でこのような標的タンパク質の発掘及びこれを利用した糖尿病または糖尿病性合併症の治療剤の開発が要求されている実情である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は上記のような従来の技術上の問題点を解決するために案出されたものであり、ＴＥＮＣ１（Ｔｅｎｓｉｎ  ｌｉｋｅ  Ｃ１  ｄｏｍａｉｎ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）の発見または活性抑制剤を有効成分として含む、糖尿病または糖尿病性合併症の予防または治療用の薬学的組成物を提供することをその目的にする。また、本発明はＴＥＮＣ１（Ｔｅｎｓｉｎ  ｌｉｋｅ  Ｃ１  ｄｏｍａｉｎ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）を発見する細胞を試験物質と一緒にまたは試験物質なしに培養する段階、及び上記の細胞でＴＥＮＣ１の発現または活性の程度を測定する段階を含む、ＴＥＮＣ１の発見または活性抑制剤のスクリーニング方法を提供することをその目的にする。
【０００８】
しかし、本発明が成し遂げようとする技術的課題は以上で言及した課題に制限されなく、言及されていない他の課題は下記の記載から当業者に明確に理解できるであろう。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明はＴＥＮＣ１（Ｔｅｎｓｉｎ  ｌｉｋｅ  Ｃ１  ｄｏｍａｉｎ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）の発見または活性抑制剤を有効成分として含む、糖尿病または糖尿病性合併症の予防または治療用の薬学的組成物を提供する。
【００１０】
本発明の一具現例として、上記の発見抑制剤はｓｉＲＮＡであるｓｉ６またはｓｉ７であることを特徴とする。
【００１１】
本発明の別の具現例として、上記の活性抑制剤はウルソル酸であることを特徴とする。
【００１２】
本発明の別の具現例として、上記のＴＥＮＣ１は配列番号１のアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
【００１３】
本発明の別の具現例として、上記のＴＥＮＣ１はＰＴＰａｓｅ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔｓｅ）活性を有することを特徴とする。
【００１４】
本発明の別の具現例として、上記のＴＥＮＣ１はＩＲＳ−１（insulin  receptor  substrate−1）を気質（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）で使用することを特徴とする。
【００１５】
本発明の別の具現例として、上記の糖尿病性合併症は筋萎縮症、糖尿病性網膜病症、糖尿病性白内障、糖尿病性腎症、糖尿病性神経病症、心臓病、がん、骨粗しょう症、腎不全、性機能の障害、皮膚疾患、高血圧、動脈硬化症、脳卒中、及びアテローム性動脈硬化症よりなる群から選ばれることを特徴とする。
【００１６】
本発明の別の具現例として、上記の組成物はＴＥＮＣ１のＩＲＳ−１分解能及び／または脱リン酸化を抑制することを特徴とする。
【００１７】
また、本発明はＴＥＮＣ１（Ｔｅｎｓｉｎ  ｌｉｋｅ  Ｃ１  ｄｏｍａｉｎ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）を発見する細胞を試験物質と一緒に、または、試験物質なしに培養する段階、及び上記の細胞でＴＥＮＣ１の発見または活性の程度を測定する段階を含む、糖尿病または糖尿病性合併症の治療または予防用ＴＥＮＣ１の発見または活性抑制剤のスクリーニング方法を提供する。
【００１８】
本発明の一具現例として、上記の試験物質は化学物質、微生物培養液または抽出物、核酸、抗体、アプタマー及び天然抽出物よりなる群から選択されることを特徴とする。
【００１９】
本発明の別の具現例として、上記のＴＥＮＣ１の発見程度を測定する段階はＲＴ−ＰＣＲ（ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）またはウェスタンブロッティング法（ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ）で測定することを特徴とする。
【００２０】
本発明の別の具現例として、上記のＴＥＮＣ１の活性程度を測定する段階はＴＥＮＣ１のＰＴＰａｓｅ活性またはＴＥＮＣ１とＩＲＳ−１との結合程度を測定することを特徴とする。
【発明の効果】
【００２１】
本発明ではＴＥＮＣ１のＰＴＰａｓｅ活性がＩＲＳ−１のリン酸化を抑制したりまたはＩＲＳ−１を直接分解することにより糖吸収の減少及び筋萎縮症を誘導することを証明することによって、糖尿病治療の新しい標的を提示した。したがって、本発明によるＴＥＮＣ１の発現または活性抑制剤を有効成分として含む糖尿病または糖尿病性合併症の予防または治療用の薬学的組成物は、ＴＥＮＣ１により惹起されるＩＲＳ−１の脱リン酸化及び分解を抑制することでＩＲＳ−１の減少により発生する糖吸収の減少及び筋萎縮症を効果的に防止できるので、糖尿病または糖尿病性合併症の予防及び／または治療に幅広く適用できることが期待される。また、本発明によるＴＥＮＣ１の発見または活性抑制剤のスクリーニング方法を通じてＩＲＳ−１機作を活性化させる効果的な糖尿病または糖尿病性合併症の予防及び／または治療剤の開発が可能であると期待される。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】ｄｂ／ｄｂマウスでＴＥＮＣ１発見の増加を確認した結果を現す図面である。
【図２】ＴＥＮＣ１のＡｋｔ及びＥＲＫ１／２リン酸化抑制能を測定した結果を現す図面である。
【図３】ＴＥＮＣ１のインシュリン受容体及びＩＲＳ−１リン酸化抑制能を測定した結果を現す図面である。
【図４】ＴＥＮＣ１とＩＲＳ−１の結合を確認した結果を現す図面である。
【図５】ＴＥＮＣ１のＰＴＰａｓｅドメインとＩＲＳ−１の結合を確認した結果を現す図面である。
【図６】ＴＥＮＣ１のＰＴＰａｓｅ酵素活性を測定した結果を現す図面である。
【図７】ＴＥＮＣ１の発現の際に、筋肉でのＩＲＳ−１と連関されたタンパク質のリン酸化を測定した結果を現す図面である。
【図８】ＴＥＮＣ１の発見の際に、ＩＲＳ−１のｍＲＮＡ量を測定した結果を現す図面である。
【図９】ＴＥＮＣ１の発現の際に、ＩＲＳ−１のセリンリン酸化を測定した結果を現す図面である。
【図１０】はＴＥＮＣ１のＰＴＰａｓｅ活性がＩＲＳ−１の分解に与える影響を確認した結果を現す図面である。
【図１１】はＴＥＮＣ１の酵素活性に依存的にｉｎ  ｖｉｔｒｏで筋萎縮症の誘発能を確認した結果を現す図面である。
【図１２】はＴＥＮＣ１のＭＹＨ減少能を測定した結果を現す図面である。
【図１３】はＴＥＮＣ１がＦｏｘＯタンパク質のリン酸化に与える影響を確認した結果を現す図面である。
【図１４】はＴＥＮＣ１の酵素活性に依存的にｉｎ  ｖｉｖｏで筋萎縮症の誘発能を確認した結果を現す図面である。
【図１５】はＴＥＮＣ１の発現抑制がｍｕｓｃｌｅ  ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙを誘導して、ＩＲＳ−１分解を抑制することによって筋萎縮症を阻害することを表す図面である。
【図１６】はＴＥＮＣ１の活性抑制がＩＲＳ−１脱リン酸化及び分解を阻害することを確認した結果を現す図面である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明者はＩＲＳ−１（ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−１）の機能減少を調節して効果的に糖尿病の治療に使用できる標的タンパク質に対して研究した結果、本発明を完成するようになった。
【００２４】
最近、糖尿病治療の標的で注目を浴びているＰＴＰ１Ｂ（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  １Ｂ）のようなタンパク質の場合、インシュリンの受容体（ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）に作用するため、糖吸収での役割は究明されたが、一般的に糖尿病と一緒に誘発される筋肉量（ｍｕｓｃｌｅ  ｍａｓｓ）減少では効果を現すことができなかった。したがって、本発明者は糖尿病だけではなく糖尿病と一緒に発生する筋萎縮症を一緒に治療できる治療剤の標的をスクリーニングするために糖尿病が誘導されたマウスの筋肉で正常マウスに比べて発見が増加されたタンパク質を分析してＴＥＮＣ１タンパク質（配列番号１）を選別した。
【００２５】
本発明の一実施例では上記のＴＥＮＣ１がＩＲＳ−１リン酸化を抑制する同時にＩＲＳ−１を分解することによりＩＲＳの機能を抑制することを証明したし（図４ないし１０を参考）、別の実施例ではＴＥＮＣ１がＩＲＳ−１の機能を抑制することで筋萎縮症を誘発することを証明した（図１１ないし図１３を参考）。本発明の別の実施例ではＴＥＮＣ１の発現を抑制することによってＩＲＳ−１下位信号の増加と糖尿病により惹起される筋萎縮症を抑制することができることを証明した（図１５を参考）。
【００２６】
本発明の別の実施例ではＴＥＮＣ１の活性を抑制することによりＩＲＳ−１の脱リン酸化及びＩＲＳ−１の分解を阻害できることを確認した（図１６を参考）。
【００２７】
上記の結果から、ＴＥＮＣ１は糖尿病または糖尿病性合併症の治療のための標的タンパク質として使用できることとＴＥＮＣ１の発現または活性抑制剤は効果的な糖尿病または糖尿病性合併症の治療剤または予防剤として使用できることを確認した。これで本発明はＴＥＮＣ１（Ｔｅｎｓｉｎ  ｌｉｋｅ  Ｃ１  ｄｏｍａｉｎ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）の発現または活性抑制剤を有効成分として含む、糖尿病または糖尿病性合併症の予防または治療用の薬学的組成物を提供する。上記の糖尿病性合併症の種類には筋萎縮症、糖尿病性網膜病症、糖尿病性白内障、糖尿病性腎症、糖尿病性神経病症、心臓病、がん、骨粗しょう症、腎不全、性機能の障害、皮膚疾患、高血圧、動脈硬化症、脳卒中、アテローム性動脈硬化症などがあるが、糖尿病により発生される疾病であればこれに限定されない。
【００２８】
また、本発明はＴＥＮＣ１（Ｔｅｎｓｉｎ  ｌｉｋｅ  Ｃ１  ｄｏｍａｉｎ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）を発現する細胞を試験物質と一緒に、また試験物質なしに培養する段階、及び上記の細胞でＴＥＮＣ１の発現または活性の程度を測定する段階を含む、糖尿病または糖尿病性合併症の予防または治療用で使用できるＴＥＮＣ１の発現または活性抑制剤のスクリーニング方法を提供する。ＴＥＮＣ１の発現の程度を測定する方法はＲＴ−ＰＣＲ、ウェスタンブロッティング法（ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ）などがあるが、ｍＲＮＡまたはタンパク質の量を測定する方法であれば、これに限定されない。また、ＴＥＮＣ１の活性程度を測定する方法はＴＥＮＣ１のＰＴＰａｓｅ活性またはＴＥＮＣ１とＩＲＳ−１との結合程度を測定することを特徴とする。しかし、これに現例されない。上記の試験物質は化学物質、微生物培養液または抽出物、核酸、抗体、アプタマー及び天然抽出物よりなる群から選択されることができるが、これに限定されない。
【００２９】
本発明の薬学的組成物は薬剤学的に許容可能な担体を含むことができる。上記の薬剤学的に許容可能な担体は生理食塩水、ポリエチレングリコール、エタノール、植物性オイル及びイソプロピルミリステートなどを含むことができるし、これに限定されない。
【００３０】
本発明の別の側面はＴＥＮＣ１の発現または活性抑制剤を有効成分として含む薬学的組成物の薬剤学的有効量を固体に投与して糖尿病を治療する方法を提供する。本発明で固体とは疾病の治療を必要とする対象を意味して、より具体的にはヒト、または非ヒト霊長類、マウス（ｍｏｕｓｅ）、ラット（ｒａｔ）、犬、猫、馬及び牛などの哺乳類を意味する。また、本発明で薬剤学的有効量は患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率及び疾患の重症度などによりその範囲が多様に調節できることは当業者に明白である。
【００３１】
本発明の薬学的組成物の望ましい投与量は患者の状態及び体重、疾病の程度、薬物の形態、投与経路、及び期間により違うが、当業者により適切に選択できる。しかし、望ましくは、１日０．００１ないし１００ｍｇ／体重ｋｇで、より望ましくは０．０１ないし３０ｍｇ／体重ｋｇで投与する。投与は一日に一回、投与することもできるし、数回に分けて投与することもできる。本発明のＴＥＮＣ１の発現または活性抑制剤は全体組成物の総重量に対して０．０００１ないし１０重量％、望ましくは０．００１ないし１重量％の量で存在できる。
【００３２】
本発明の薬学的組成物は、ラット、マウス、家畜、ヒトなどの哺乳動物に多様な経路で投与できる。投与方法には制限がなく、例えば、経口、直腸、または静脈、筋肉、皮下、子宮内の硬膜、または脳血管（ｉｎｔｒａ  ｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）注射により投与できる。
【００３３】
以下、本発明の理解を助けるために望ましい実施例を提示する。しかし、下記の実施例は本発明をより分かりやすくするために提供されるものであり、下記の実施例により本発明の内容が限定されることはない。
【実施例】
【００３４】
実施例１．糖尿病と関連されたタンパク質の選別
ＳＨ２（Ｓｒｃ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ２）ドメイン（ｄｏｍａｉｎ）を持つタンパク質は受容体（ｒｅｃｅｐｔｏｒ）から信号（ｓｉｇｎａｌ）を伝達するのに、重要な役割を担当することとして知られている。したがって、本発明者は糖尿病と関連された新規なタンパク質をスクリーニングするために、レプチン受容体（ｌｅｐｔｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）を除去して肥満及び糖尿病が誘導された １０週齢のオスｄｂ／ｄｂマウスの筋肉で正常のマウスより発現が増加されるＳＨ２ドメインを持つタンパク質をｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲを利用して選別した。ＰＣＲのためにＴＥＮＣ１のフォワードプライマー（ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ）５’−ＣＴＣＡＧＴＧＧＡＧＴＴＴＧＴＴＴＴＣＴＣＣＴＣ−３’（配列番号２）、ＴＥＮＣ１のリバースプライマー（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ）５’−ＧＣＴＧＡＴＴＧＡＡＧＴＴＴＴＣＡＴＡＧＧＡＧＴＣ−３’（配列番号３）、ｐ８５ａフォワードプライマー（ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ）５’−ＧＧＣＧＡＴＴＡＣＡＣＴＣＴＴＡＣＡＣＴＡＡＧＧＡ−３’（配列番号４）、及びｐ８５ａリバースプライマー（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ）５’−ＧＡＧＴＴＧＡＡＧＧＴＴＡＡＴＧＧＡＴＣＡＧＡＧＡ−３’（配列番号５）を利用した。その結果は図１に現した。
【００３５】
図１に現したように、ＴＥＮＣ１のｍＲＮＡがｄｂ／ｄｂマウスの骨格筋で３倍以上顕著に増加したし（図１Ａ）、ＴＥＮＣ１のタンパク質の量も増加することを確認した（図１Ｂ）。第２型糖尿病の場合、筋肉減少症を誘発することがよく知られている。上記の結果を通じてＴＥＮＣ１が第２型糖尿病と連関されて現す病理学的症状と関連されていることを確認することができた。
【００３６】
実施例２．ＴＥＮＣ１がインシュリン機作に与える影響の確認
第２型糖尿病患者はほとんど血糖を下げるインシュリン（ｉｎｓｕｌｉｎ）の機能が低下して細胞がブドウ糖を効果的に燃焼させることができないことを特徴とするため、ＴＥＮＣ１がインシュリン機作に影響を与えるかを確認するために、ＴＥＮＣ１の発現が低いＨＥＫ２９３細胞株にＴＥＮＣ１を過発現させた後にインシュリン機作に関連されているタンパク質のリン酸化（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）をウェスタンブロッティング法（ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ）で確認した。その結果は図２に現した。
【００３７】
図２に現したように、インシュリンにより促進されるＡｋｔ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｋｉｎａｓｅ  Ｂ）Ｔ３０８及びＥＲＫ１／２（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｋｉｎａｓｅ）のリン酸化がすべてＴＥＮＣ１により抑制されることを確認した。
【００３８】
Ａｋｔ及びＥＲＫ１／２のリン酸化はインシュリン受容体とＩＲＳ−１（ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−１）のチロシンリン酸化（ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）により誘発されるので、インシュリン受容体とＩＲＳ−１のリン酸化がＴＥＮＣ１により抑制されたのかを上記と同一な方法で確認した。その結果は図３に現した。
【００３９】
図３Ａに現したように、ＴＥＮＣ１はＩＲＳ−１のリン酸化を約５０％抑制したが、インシュリン受容体のリン酸化には影響を与えないことを確認した。また、ＴＥＮＣ１のリン酸化抑制能がタンパク質チロシンホスファターゼ（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ、ＰＴＰａｓｅ）の活性のためなのかを確認するために、アミノ酸２３１番位置のシステイン（ｃｙｓｔｅｉｎ）をセリン（ｓｅｒｉｎｅ）に変更したＴＥＮＣ１  ＣＳ  変異体を製造した。ＴＥＮＣ１  ＣＳ  変異体は正常的なＴＥＮＣ１に比べて気質（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）とより安定的に結合するが触媒作用はできない突然変異体である。ＴＥＮＣ１  ＣＳ  変異体を利用して上記と同一な方法でＩＲＳ−１のリン酸化を確認した。その結果は図３Ｂに現した。
【００４０】
図３Ｂに現したように、ＴＥＮＣ１  ＣＳを使用する場合、ＩＲＳ−１のリン酸化が再び回復されることを確認した。上記の結果を通じてＴＥＮＣ１はＩＲＳ−１のリン酸化を抑制してＡｋｔ及びＥＲＫ１／２のリン酸化を抑制することによってインシュリン機作を抑制することを確認した。
【００４１】
実施例３．ＴＥＮＣ１のＩＲＳ−１リン酸化の抑制機作の確認
ＴＥＮＣ１がＩＲＳ−１のリン酸化を抑制する機作を確認するために、ＩＲＳ−１を利用して免疫沈降法（ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）を遂行した。対照実験ではＰＴＰａｓｅドメインと結合してＰＴＰａｓｅ活性を阻害するホスホチロシン（ｐｈｏｓｐｈｏｔｙｒｏｓｉｎｅ）の類似体であるバナジン酸塩（ｖａｎａｄａｔｅ）を使用した。その結果は図４及び５に現した。
【００４２】
図４に現したように、ＴＥＮＣ１  ＣＳ  変異体はＴＥＮＣ１  ＷＴよりＩＲＳ−１とより安定的に結合することを確認することができた。また、図５に現したように、バナジン酸塩を処理しない場合にはＴＥＮＣ１  ＷＴがＩＲＳ−１と結合したが、バナジン酸塩を処理する場合にはＩＲＳ−１との結合が減少したことを確認することができた。上記の結果を通じて、ＩＲＳ−１はバナジン酸塩と競争的にＴＥＮＣ１のＰＴＰａｓｅドメインと結合することを確認したし、これを通じてＩＲＳ−１がＴＥＮＣ１の気質としてＰＴＰａｓｅドメインと直接結合することを確認することができた。
【００４３】
また、ＴＥＮＣ１のＰＴＰａｓｅ活性を測定するために、まずＦｌａｇ  ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ／Ｆｌａｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｅｌｕｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍを利用してＨＥＫ２９３細胞株からＴＥＮＣ１を分離した。そして、ホスホチロシンを有するペプチドを利用して、上記の分離されたＴＥＮＣ１の時間によるＰＴＰａｓｅ活性を測定した。ＰＴＰａｓｅ活性はｍａｌａｃｈｉｔｅ  ｇｒｅｅｎ  ａｓｓａｙ法で分析した。対照群ではＰＴＥＮ（Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ａｎｄ  Ｔｅｎｓｉｎ  ｈｏｍｏｌｏｇ）またはＴＥＮＣ１  ＣＳ  変異体を使用した。その結果は図６に現した。
【００４４】
図６Ａ及び６Ｂに現したように、ＴＥＮＣ１のＰＴＰａｓｅ活性はＰＴＥＮと類似したし、ＴＥＮＣ１  ＣＳ  変異体の場合にはＰＴＰａｓｅ活性を現さないことを確認した。上記の結果を通じて、ＴＥＮＣ１はＰＴＰａｓｅ活性を通じてＩＲＳ−１と結合してリン酸化を抑制することが確認できた。また、上記の結果はＴＥＮＣ１がＩＲＳ−１のリン酸化を抑制して糖尿病の発病に影響を与えることができることを意味する。
【００４５】
実施例４．ＴＥＮＣ１のＩＲＳ−１分解機作の確認
ＴＥＮＣ１の生理学的な機能を調べるためにＩＲＳ−１の主な役割をするＬ６  ｍｙｏｔｕｂｅ（筋肉細胞）でアデノウィルス（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）を利用してＴＥＮＣ１を過発現させて実施例１と同一な方法でｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲを遂行してｍｙｏｔｕｂｅでＴＥＮＣ１  ｍＲＮＡが８倍ないし１０倍程度増加されたことを確認した。そして、実施例２と同一な方法でＩＲＳ−１と連関されたタンパク質のリン酸化を確認した。その結果は図７に現した。
【００４６】
図７に現したように、ＩＲＳ−１により調節されるＡｋｔ、Ｓ６Ｋ１、及びＥＲＫ１／２のリン酸化はＴＥＮＣ１を過発現させた細胞ですべて抑制されることを確認した（図７Ａ及び７Ｂ）。しかし、ＩＲＳ−１タンパク質の量も減少されることを確認した（図７Ｃ）。
遺伝子の発現が抑制されてＩＲＳ−１の量が減少されたのかを確認するために、ＩＲＳ−１のｍＲＮＡ量をＩＲＳ−１フォワードプライマー（配列番号６）及びリバースプライマー（配列番号７）を利用してｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲで定量した。その結果は図８に現した。
【００４７】
図８に現したように、ＩＲＳ−１  ｍＲＮＡの量は減少していないことが確認できた。上記の結果を通じて、ＩＲＳ−１タンパク質の量が減少されることは転写（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）段階の遺伝子発現のためではなく転写以降の段階で起こることが確認できた。
【００４８】
したがって、ＩＲＳ−１の減少原因を確認するために、ＴＥＮＣ１がｕｂｉｑｕｉｔｉｎ  ｐｒｏｔｅｏｓｏｍｅ  ｐａｔｈｗａｙまたはＩＲＳ−１のセリンリン酸化に影響を与えるかをウェスタンブロッティング法で確認した。タンパク質分解機作に影響を与えるかを確認するためにはタンパク質分解酵素（ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ）の抑制剤であるＭＧ１３２を処理した。その結果は図９に現した。
【００４９】
図９に現したように、インシュリンを処理しない場合（図９Ａ）及び処理した場合（図９Ｂ）ですべてＭＧ１３２を処理した時、減少されたＩＲＳ−１の量が復旧されたし、またＭＧ１３２を処理してＩＲＳ−１の量が復旧された細胞ではＩＲＳ−１のセリンリン酸化は差がないが、ＩＲＳ−１のリン酸化が抑制されたことが確認できた。上記の結果を通じて、ＴＥＮＣ１はＩＲＳ−１を分解させたりリン酸化を抑制してＩＲＳ−１の機作に影響を与えることを確認した。
【００５０】
ＴＥＮＣ１のＰＴＰａｓｅ活性がＩＲＳ−１の分解にも影響を与えるかを確認するために、バナジン酸塩を処理してＩＲＳ−１分解が抑制されるかをウェスタンブロッティング法で確認した。その結果は図１０に現した。
【００５１】
図１０に現したように、バナジン酸塩を処理した場合ＩＲＳ−１の分解が抑制されたことが確認できたし、ＴＥＮＣ１活性がＩＲＳ−１分解に直接的に関与したことが分かった。
【００５２】
実施例５．ＴＥＮＣ１と筋萎縮症との連関関係の確認
ＩＲＳ−１タンパク質の量の減少によるＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲＣ１信号伝達減少及びＩＲＳ−２タンパク質の量の増加は糖質コルチコイド（ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ）により誘発された筋萎縮症（ｍｕｓｃｕｌａｒ  ａｔｒｏｐｈｙ）だけではなく、ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ（ＳＴＺ）により誘発された急性糖尿病の筋萎縮症でも観察される。したがって、ＴＥＮＣ１がｍｙｏｔｕｂｅの萎縮を誘発するかを確認するために、アデノウィルスを利用してｍｙｏｔｕｂｅでＧＦＰ（ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）が発見されるように製造した後、ＴＥＮＣ１  ＷＴまたはＴＥＮＣ１  ＣＳを過発現させて蛍光を利用してｍｙｏｔｕｂｅの直径を測定した。その結果は図１１に現した。
【００５３】
図１１に現したように、ＴＥＮＣ１を過発現させた細胞はＴＥＮＣ１  ＣＳを過発現させた細胞より４０％程度、その大きさが減少されたことが確認できた。上記の結果はＴＥＮＣ１が糖尿病により惹起された筋萎縮症と連関されていることを意味する。
【００５４】
筋萎縮症でｕｂｉｑｕｉｔｉｎ  ｐｒｏｔｅｏｓｏｍｅ  ｐａｔｈｗａｙは骨格筋の主な構成成分であるミオシン重鎖（ｍｙｏｓｉｎ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ、ＭＹＨ）のような筋線維タンパク質（ｍｙｏｆｉｂｒｉｌｌａｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を分解することで知られている。したがって、ＴＥＮＣ１がｕｂｉｑｕｉｔｉｎ  ｐｒｏｔｅｏｓｏｍｅ  ｐａｔｈｗａｙに影響を与えてＭＹＨを減少させるかを確認するために実験を行った。その結果は図１２に現した。
【００５５】
図１２に現したように、ＴＥＮＣ１はＰＴＰａｓｅの活性によりＭＹＨを分解することを（ウェスタンブロッティング法）確認した。上記の結果を通じてＴＥＮＣ１はＩＲＳ−１を分解してＡｋｔ／Ｓ６Ｋ１機作を抑制することで筋萎縮症を誘発させることができることを確認した。
【００５６】
哺乳動物の細胞はＦｏｘＯ１、ＦｏｘＯ３及びＦｏｘＯ４の３種類のＦｏｘＯ（Ｆｏｒｋｈｅａｄ  Ｂｏｘ  Ｏ）タンパク質を有している。この中、ＦｏｘＯ１及びＦｏｘＯ３のリン酸化は糖質コルチコイドにより誘発された筋萎縮症に必須的である。特に、活性化されたＦｏｘＯ３は筋萎縮症に重要な役割をする遺伝子、つまり、多様なアテロジーン（ａｔｒｏｇｅｎｅ）の発見を促進することにより筋萎縮症を誘発する。したがってＴＥＮＣ１がＦｏｘＯ１及びＦｏｘＯ３のリン酸化に影響を与えるかをウェスタンブロッティング法で確認した。その結果は図１３に現した。
【００５７】
図１３に現したように、ＴＥＮＣ１を過発見させたｍｙｏｔｕｂｅ（図１３Ａ）ではＦｏｘＯ１／３ａのリン酸化が減少されて、ＴＥＮＣ１  ＣＳを過発現させたｍｙｏｔｕｂｅ（図１３Ｂ）ではＦｏｘＯ１タンパク質の量が減少してリン酸化されたＦｏｘＯ１／３ａの量は相対的に増加した。また、ＦｏｘＯタンパク質により調節されるＭｕＲＦ１（ｍｕｓｃｌｅ  ＲＩＮＧ  ｆｉｎｇｅｒ １）はＴＥＮＣ１を過発現させたｍｙｏｔｕｂｅで発現が増加された（図１３Ｃ）。上記の結果を通じてＴＥＮＣ１はＩＲＳ−１を分解してＦｏｘＯタンパク質を活性化させることによりｍｙｏｔｕｂｅの萎縮を誘発させることを確認した。
【００５８】
実施例６．ＴＥＮＣ１の 筋萎縮症誘発の確認
ＴＥＮＣ１がｉｎ  ｖｉｖｏでも筋萎縮症を誘発するかを確認するために、ＹＦＰ（ｙｅｌｌｏｗ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）が結合されているＴＥＮＣ１を電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）でマウスの前脛骨筋（ｔｉｂｉａｌｉｓ  ａｎｔｅｒｉｏｒ  ｍｕｓｃｌｅ）に注入した。そしてＹＦＰを利用して筋繊維（ｍｙｏｆｉｂｅｒ）の大きさの変化を測定した。その結果は図１４に現した。
【００５９】
図１４Ａ、１４Ｂ及び１４Ｃに現したように、ＴＥＮＣ１が注入された筋肉は１２日後に断面積（ｃｒｏｓｓ  ｓｅｃｔｉｏｎａｌ  ａｒｅａ、ＣＳＡ）が２５％程度減少したことを確認した。しかし、ＴＥＮＣ１  ＣＳは筋萎縮症を誘発しないことが確認できた。上記の結果を通じてＴＥＮＣ１はＰＴＰａｓｅ活性によりｉｎ  ｖｉｖｏでも筋萎縮症を誘発させることができることを確認した。
【００６０】
実施例７．ＴＥＮＣ１の発現抑制による効果の確認
ＴＥＮＣ１を糖尿病治療用のターゲットで使用できるかを確認するために、ＴＥＮＣ１に特異的に結合するｓｉＲＮＡであるｓｉ６及びｓｉ７を利用してＴＥＮＣ１の量が減少された時、糖質コルチコイドにより誘導されたＩＲＳ−１分解が回復されてｍｙｏｔｕｂｅの筋萎縮症が防止されるかを確認した。ｓｉＲＮＡはＤｅｌｉｖｅｒＸ  Ｐｌｕｓ  ｓｉＲＮＡ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｐａｎｏｍｉｃｓ）を利用してＬ６  ｍｙｏｔｕｂｅに導入した。その結果は図１５に現した。
【００６１】
図１５に現したように、ｓｉＲＮＡを利用してＴＥＮＣ１の発現を阻害する場合、糖質コルチコイドによるＭＹＨ減少が効果的に抑制されることを確認することができた（図１５Ｃ）。しかし、ｓｉ７の場合はＴＥＮＣ１の発現を強く抑制することにより、ＩＲＳ−１の下位タンパク質の活性化を通じてｍｕｓｃｌｅ  ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙを誘導することが分かった（図１５Ａ及び１５Ｂ）。また、糖質コルチコイドにより誘導されたＩＲＳ−１分解（図１５Ｄ）、及びＭｕＲＦ１の促進も回復されたし（図１５Ｂ）、筋萎縮症も抑制されること（図１５Ｆ）を確認することができた。
【００６２】
実施例８．ＴＥＮＣ１の活性抑制による効果の確認
ウルソル酸は筋萎縮症を抑制してｍｕｓｃｌｅ  ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｙを誘導することが報告されているが、今までその標的や作用機作については明確に明らかにされたことはない。
【００６３】
これで、本発明者はウルソル酸がＴＥＮＣ１を標的にして、その活性を調節できるかの可否を下記の実験を通じて確認した。
【００６４】
具体的に、上記の実施例３と同一な方法で分離したＴＥＮＣ１タンパク質を２０ｕＭのウルソル酸とインキュベーションした後、ｍａｌａｃｈｉｔｅ  ｇｒｅｅｎ  ａｓｓａｙを通じてＰＴＰａｓｅ活性変化を測定した（この時、バナジン酸塩は対照群で使用）。その結果、ＴＥＮＣ１のＰＴＰａｓｅの活性が６０％以上阻害されることを確認した（図１６Ａ）。
【００６５】
また、上記の実施例２の方法のように、ＴＥＮＣ１とＩＲＳ−１を過発現させた細胞（ＨＥＫ２９３細胞株）を試験物質と一緒に培養した時、ＩＲＳ−１のチロシンリン酸化が増加していることがわかって、ＴＥＮＣ１によるＩＲＳ−１の脱リン酸化が阻害されることを細胞水準で確認することができた（図１６Ｂ）。
【００６６】
また、ＴＥＮＣ１を過発現させたｍｙｏｔｕｂｅ（筋肉細胞）にウルソル酸を処理した後、ＩＲＳ−１タンパク質の分解程度をウェスタンブロッティング法で確認した。その結果、ウルソル酸の濃度を増加させながら処理することにより、ＩＲＳ−１が対照群（ＴＥＮＣ１を過発現させていない細胞）と似ている水準で復旧される結果を現したし、これを通じてＴＥＮＣ１の活性によるＩＲＳ−１分解がウルソル酸により抑制されることを確認した（図１６Ｃ）。
【００６７】
上記の結果を通じて、ウルソル酸のようなＴＥＮＣ１の活性抑制剤はＴＥＮＣ１の活性によるＩＲＳ−１の脱リン酸化とＩＲＳ−１分解を阻害することによって、ＩＲＳ−１の減少により発生する糖吸収の減少及び筋萎縮症などを効果的に防止できることを確認したし、これを通じてＴＥＮＣ１活性抑制剤が糖尿病の治療または予防に効果的に使用できるということがわかった。
【００６８】
前述した本発明の説明は例示のためのものであり、本発明が属する技術分野の通常の知識を有するものは本発明の技術的思想や必須的な特徴を変更することなく、別の具体的な形態で簡単に変形できることが理解できるだろう。したがって、以上で記述した実施例はすべての面で例示的なものであり、限定的なものではないと理解されるべきであろう。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
本発明のＴＥＮＣ１発現または活性抑制剤はＴＥＮＣ１により惹起されるＩＲＳ−１の脱リン酸化及び分解を抑制してＩＲＳ−１の減少により発生する糖吸収の減少 筋萎縮症を防止できるので、糖尿病または糖尿病性合併症の予防及び／または治療剤として開発ができる。また、本発明で提案しているスクリーニング方法は新規のターゲット物質であるＴＥＮＣ１を提供することにより、従来の治療剤の限界を克服して新しい機転の糖尿病または糖尿病性合併症の予防及び／または治療剤を開発するのに有用に使用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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