(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
絹由来のオリゴペプチドを製造する方法であって、
絹繭を準備することと、
抽出溶媒中へ前記絹繭からセリシンを含むタンパク質又はペプチドを抽出することと、
該抽出溶媒を濾過することと、
該抽出溶媒の濾過後、目的のオリゴペプチドを得るために、抽出されたタンパク質の消化のために前記濾過された抽出溶媒中へプロテアーゼを含む酵素溶液を導入することと、
６０００ダルトン未満の分子量をもつ目的のオリゴペプチドを得るために中空繊維膜を通過させ、該目的のオリゴペプチドを他のペプチドから分離することと、
ここで、前記酵素溶液は前記プロテアーゼの効果を上昇させるために塩化カルシウムを含んでいる、
を含む、方法。
【請求項２】
抽出が、抽出圧１２０ｐｓｉ〜１９０ｐｓｉで行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
抽出が、抽出温度摂氏８０度〜摂氏１６０度で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記抽出溶媒が水である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
水と前記絹繭が３０：１の重量比である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
酵素活性を不活性化することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
プロテアーゼ酵素が絹タンパク質１ｇ当たり０．００８単位の濃度を持ち、塩化カルシウムが絹タンパク質１ｇ当たりおよそ２ｍｇの濃度をもつ、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、生物活性が増進したオリゴペプチド、より具体的にはセリシンベースのオリゴペプチドと、生物活性又は生物活性特性を増進する又は最大にする、目的のオリゴペプチドの分子サイズ又は分子量の条件を満たすセリシンベースのオリゴペプチドを作製する単純で短期間の安全な方法とに関する。
【背景技術】
【０００２】
様々な高タンパク質産物がタンパク質加水分解物の形態で存在する。タンパク質加水分解物は、酸、アルカリ又は酵素によるタンパク質分解（splitting）によって調製されるペプチド混合物であり、構成アミノ酸に対して元物質の栄養同等物をもたらし、特別食における（例えば通常の食品タンパク質を摂取することができない又は疲労状態にある患者への）栄養素及び補給液として使用される。
【０００３】
２個〜５０個のアミノ酸分子を有し、分子量が５５００ダルトン（Ｄａ）未満のペプチドは生物活性特性を備える。このように、タンパク質加水分解物の生物活性はその構成ペプチドの分子量又はサイズによって異なる。既存のタンパク質加水分解産物は、製造中にペプチドのサイズが適切に達成、分離又は選択されることがないために大きなペプチド部分が存在することから、非最適の生物活性及び有効性を呈するか又は生物活性及び有効性の低下を示す。
【０００４】
タンパク質加水分解物を作製する方法は一般的にタンパク質を消化する酸性溶液又は塩基性溶液を伴うものである。かかる方法は、毒性のある化学物質を使用するとともに、最終産物から酸性試薬又は塩基性試薬を取り除くのに付加的な工程又はサブプロセスを必要とする。このようなサブプロセスの例としては脱塩又はナノ濾過が挙げられるが、これらは比較的複雑で、時間がかかり、及び／又は費用がかかる。その上、酸性溶液又は塩基性溶液が存在することで、既存のタンパク質加水分解産物において好ましくない苦味及び強烈な匂いが生じる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
生物活性又は生物有効性を最適化する又は最大にするのに適切なペプチドサイズ又は分子量を有する高タンパク質産物が必要とされている。さらに、上記の生物活性が増進したペプチド又は関連する高タンパク質産物を調製又は作製する費用効率の高いより単純な方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
一態様では、本開示による絹由来のオリゴペプチドを製造する、提供する又は得る方法は、絹繭を準備することと、絹繭からタンパク質又はペプチドを抽出することと、酵素溶液を導入してオリゴペプチドを得ることと、目的のオリゴペプチドを他のペプチドから分離することとを含む。更なる態様では、本方法は酵素活性を阻害又は不活性化することを含む。
【０００７】
目的のオリゴペプチドの分離は中空繊維膜又は他の技法によって行うことができる。絹繭からペプチドを抽出する際、抽出圧はおよそ１２０ｐｓｉ〜１９０ｐｓｉ（例えば１５０ｐｓｉ）とすることができ、抽出温度はおよそ摂氏８０度〜摂氏１６０度（例えば摂氏１２０度）とすることができ、抽出溶媒は水を含むか又は水とすることができる。水と絹繭との重量比はおよそ３０：１とすることができる。酵素溶液はプロテアーゼを含むことができ、塩化カルシウム溶液を導入して、酵素溶液の効力を改善することができる。プロテアーゼ酵素の量は絹タンパク質１ｇ当たりおよそ０．００８単位とすることができ、塩化カルシウムの量は絹タンパク質１ｇ当たりおよそ２ｍｇとすることができる。
【０００８】
本開示による目的のオリゴペプチドの分子量は、１つ又は複数の生物活性特性を増進する又は最大にするために６０００ダルトン未満又は５０００ダルトン未満とすることができる。一態様では、生物活性特性を有するオリゴペプチドは、絹繭を準備することと、絹繭からタンパク質又はペプチドを抽出することと、酵素溶液を導入してオリゴペプチドを得ることと、目的のオリゴペプチドを、分子量が６０００ダルトン又は５０００ダルトンといった特定の（例えば目的の又は閾値）分子量限界を超える目的のものではないペプチドから分離することにより、生物活性特性の増進を達成することとによって調製される。
【０００９】
本開示に従って製造される、調製される、提供される、得られる、消費される又は利用されるオリゴペプチドは、抗酸化特性、チロシナーゼ酵素阻害活性、血清枯渇細胞死阻害特性、細胞増殖加速特性、コレステロール低下活性、脂質酸化抑制特性、血糖低下特性、血圧低下特性、ナチュラルキラー細胞増進活性、インスリン産生増進活性、体重調節活性、中枢神経系刺激特性、記憶保護特性、記憶欠如改善特性、空間記憶改善特性、認識記憶改善特性、抗アルツハイマー病特性、認知機能保護特性、学習改善特性及びシナプス伝達促進特性の内の少なくとも１つを呈する。
【００１０】
一態様では組成物は、絹繭を準備することと、絹繭からタンパク質又はペプチドを抽出することと、酵素溶液を導入してオリゴペプチドを得ることと、目的のオリゴペプチドを分子量が６０００ダルトンを超えるペプチドから分離することとにより調製される又は得られるオリゴペプチドを含む。本組成物は食品、飲料、栄養補助食品、カプセル、丸薬、小丸薬又は錠剤の形態をとることができ、生物活性特性（例えば上記の１つ又は複数の特性又は活性）の増進、好ましい又は許容可能な風味及び好ましい又は許容可能な臭いの内の少なくとも１つを呈する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本開示の実施形態によるセリシン由来のオリゴペプチドを調製又は作製する方法のフローチャートを示す図である。
【図２】本開示によるオリゴペプチドの血糖を低減する生物活性特性に関する実験グラフを示す図である。
【図３】図３Ａは、本開示によるオリゴペプチドの血圧を低下する生物活性特性に関する実験グラフを示す図である。図３Ｂは、エナラプリルの血圧を低下する生物活性特性に関する実験グラフを示す図である。図３Ｃは、本開示によるオリゴペプチド及びエナラプリルの血圧を低下する生物活性特性又は有効性に関する比較実験グラフを示す図である。
【図４】図４Ａは、本開示により提供されるオリゴペプチド及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の抗酸化特性又は有効性に対応する脂質過酸化産物（ＭＤＡ）レベルに関する実験グラフを示す図である。図４Ｂは、ＬＤＬの脂質過酸化に対するオリゴペプチド及びＢＳＡの５０％阻害濃度（ＩＣ５０）の算出値に関する実験グラフを示す図である。
【図５】図５Ａは、２５：１というエフェクター対標的比での本開示により提供されるオリゴペプチドのナチュラルキラー細胞活性の増進に関する実験グラフを示す図である。図５Ｂは、５０：１というエフェクター対標的比での本開示により提供されるオリゴペプチドのナチュラルキラー細胞活性の増進に関する実験グラフを示す図である。
【図６】本開示により提供されるオリゴペプチドに関連する弱い中枢神経系刺激特性に関する実験グラフを示す図である。
【図７】アルツハイマー病のマウスモデルにおける本開示により提供されるオリゴペプチドに関連する神経保護特性に関する実験グラフを示す図である。
【図８】新規物体認識試験を用いたアルツハイマー病のマウスモデルにおける本開示により提供されるオリゴペプチドに関連する神経保護特性に関する実験グラフを示す図である。
【図９】本開示により提供されるオリゴペプチドに関連する学習及び記憶の改善に関する実験グラフを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本開示の実施形態は、低減した又は最小の生物活性又は生物活性特性を有する非選択的範囲の（より）高い分子量のペプチドを含む既存の高タンパク質産物又はタンパク質加水分解物と比較して、増進した又は最適な生物活性又は生物活性特性（例えば抗酸化特性、チロシナーゼ酵素阻害特性、血清枯渇細胞死阻害特性、細胞増殖加速特性、コレステロール低下特性、脂質酸化抑制特性、血糖低下特性、血圧低下特性、体重調節特性、ナチュラルキラー細胞増進特性、中枢神経系刺激特性、及び神経保護特性、神経機能改善特性又は抗神経変性特性）をもたらす特定の又は選択的な目的の分子量範囲を有するオリゴペプチド又はオリゴペプチドベースの組成物（例えばオリゴペプチドの抽出物、溶液、混合物又は系）（以下オリゴペプチドと称する）に関する。本開示によるオリゴペプチドを、他の混加物、組成物又は化合物で更に処理するか、それらを組み込むか、又はそれらと併用若しくは組み合わせて目的の最終組成物又は産物、例えば食品、飲料、栄養補助食品、カプセル、丸薬、小丸薬又は錠剤の組成物を得ることができる。
【００１３】
本開示によるオリゴペプチドは、絹タンパク質をベースとするものであるか又は絹タンパク質から誘導されるものである。より具体的には、このようなオリゴペプチドは、絹産生中にボンビックス・モリ（Bombyx mori）（カイコ（silkworms））により生成されるセリシンタンパク質から誘導され、主に３０％〜３５％がセリンアミノ酸からなる。一般的に、セリシンの分子量は２０ｋＤａ〜２２０ｋＤａの範囲である。セリシンは広い分子量分布を有し、大型のペプチド部分は水への溶解度が極めて低い。本開示の実施形態に従って調製されたセリシン由来のオリゴペプチドは、小さく分子量分布が狭いオリゴペプチドであり、このため天然セリシンと比較して水溶性が高くなる。
【００１４】
他に明確に述べられていない限り、本明細書中において特定の数値又は数値範囲の言及は、特定の概数値又は概数値範囲の言及であるとする。例えば、下記に提示される所与の数値又は数値範囲は、概数値又は概数値範囲であると解釈又は規定されるものとする（例えば６０００ダルトン（Ｄａ）という分子量はおよそ又は約６０００Ｄａであると解釈されるものとする）。
【００１５】
本開示の実施形態に従って提供される、調製される又は得られるオリゴペプチドの分子量には、６０００Ｄａ未満、実施形態によっては５０００Ｄａ未満が選択される。本開示によるオリゴペプチドは、既存の高タンパク質産物と比較してペプチド分子量又はサイズ分布が狭い。
【００１６】
既存の高タンパク質産物は一般的に、タンパク質源及び／又は或る特定の化学物質若しくは試薬を伴う製造プロセスに起因して、苦味があり、かつ望ましくない又は許容し難い匂いを有する。本開示に従って提供されるオリゴペプチドは、製造中に毒性のある化学物質又はバッファー試薬が存在しないことから、許容可能な風味及び匂いを有する。本開示による製造プロセスに使用される化学物質又は試薬は、一般に安全と認められる物品（Generally Recognized as Safe）（ＧＲＡＳ）に分類されている。本開示の幾つかの実施形態により提供されるオリゴペプチドは、許容可能な風味及び匂いを伴う安全かつ非毒性のものであるとみなされる。
【００１７】
オリゴペプチド調製プロセスの代表的な態様
図１に、典型的に無菌環境下で行われる、本開示の一実施形態によるオリゴペプチドを調製、作製又は製造するプロセス１００のフローチャートを示す。第１のプロセス部分１１０では、カイコ（ボンビックス・モリ）によって産生される絹繭を準備又は入手する。絹繭の例としては、黄絹繭、白絹繭等が挙げられるが、これらに限定されない。絹繭を物質又は混入物を手で取り除いてきれいにした後、水道水で洗浄することができる。様々な実施形態では、絹繭のサイズを（例えば切断することにより）、例えば元のサイズの２分の１、４分の１、６分の１、８分の１又は１０分の１に縮小する。
【００１８】
第２のプロセス部分１２０では、絹繭からセリシンタンパク質を抽出する。水（例えば原水、脱イオン水、蒸留水及び／又は精製水）は抽出プロセスの溶媒としての機能を果たすことができる。代表的な実施形態では、逆浸透精製水を溶媒として使用する。ほとんどの実施形態では、水のｐＨ値を５．５〜７．５（例えば６．０〜７．０）の範囲に調整する。抽出パラメーターは、効率を高めるか又はセリシン収率が最大となるように選択又は制御する。水と繭との重量比は、１５：１〜５０：１（例えば２５：１〜４０：１又は３０：１）の間で選択することができる。別の溶媒を水の代わりに又は水に加えて使用する場合、それに応じて溶媒と繭との重量比を調整することができる。
【００１９】
抽出は高圧及び高温下で行うことができる。抽出温度は８０℃〜１６０℃（例えば１００℃〜１４０℃又は１２０℃、１２１℃若しくは１２２℃）とすることができる。抽出圧力は１２０ｐｓｉ〜１９０ｐｓｉ（例えば１４０ｐｓｉ〜１９０ｐｓｉ、又は１５０ｐｓｉ、１５１ｐｓｉ若しくは１５２ｐｓｉ）とすることができる。抽出期間は１０分〜３０分（例えば１５分）とすることができる。抽出期間は、最適な抽出プロセスが確保され、収率が最大となるように、溶媒のタイプ若しくは抽出の温度及び／又は圧力に応じて変更することができる。さらに、得られる溶液を濾過して、室温へと冷却することができる。
【００２０】
第３のプロセス部分１３０では、プロテアーゼ酵素を得られたセリシン溶液に導入して、タンパク質を消化する。塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）溶液を更に添加し、プロテアーゼ酵素の効力を増進する。ＣａＣｌ２は一般に安全と認められる物品（ＧＲＡＳ）であり、１６０ｍｇ／日／人〜３４５ｍｇ／日／人での消費が米国食品医薬品局（ＦＤＡ）により承認されている。セリシン溶液、プロテアーゼ酵素及び／又は塩化カルシウムの所定の濃度、容量又は比は、必要であれば、例えば最終産物において安全かつ許容可能なＣａＣｌ２レベル内に維持しながら高いプロテアーゼ酵素の効力を確保するように選択することができる。代表的な実施形態では、５００ｍｌ容の三角フラスコ内で、得られたセリシン溶液３００ｍｌを、１：１の体積比の１ｍｌの０．０１単位／ｍｌプロテアーゼ酵素溶液及び０．０３６モルＣａＣｌ２溶液と合わせて混合する。別の代表的な実施形態では、０．８ｍｌの０．０１単位／ｍｌプロテアーゼ酵素溶液及び２ｍｇのＣａＣｌ２を１ｇのセリシンタンパク質と混合する。得られた混合物を密封して、所定の温度及び期間で混合する（例えば３７℃で１時間振盪する）。一実施形態では、オリゴペプチド最終産物中のＣａＣｌ２の量は、（極めて少量でかつ安全であるとみなされる）１ｇのオリゴペプチド最終産物当たり２ｍｇである。他の酸性溶液、塩基性溶液又は緩衝溶液を更に使用せずに、所望のプロテアーゼ活性の増進を維持しながら本開示によるＣａＣｌ２を使用することで、苦味及び望ましくない強い臭いを有する既存の高タンパク質産物と比較して、僅かな苦味及び極めて弱い絹のような匂いを有するオリゴペプチド最終産物を得る単純で安価なプロセスがもたらされる。
【００２１】
第４のプロセス部分１４０では、プロテアーゼ酵素活性を停止又は不活性化する。得られた混合物を消化温度（例えば３７℃）から所定の温度（例えば９０℃）まで再加熱する。混合物を室温に冷却した後、固体成分又は構成成分を混合溶液から分離することができる。幾つかの実施形態では、分離工程を遠心分離により（例えば４℃で１５分間、９５００ｇの速度で）行い、固形分を除去又は分離することができる。
【００２２】
第５のプロセス部分１５０では、閾値分子量、目的の分子量又は目的の分子量範囲の（例えば約６０００Ｄａ未満の）オリゴペプチドを得られた溶液中でより大きなオリゴペプチド部分から分離する。目的のオリゴペプチド分子量は５０００Ｄａ未満となるように選択することができる。代表的な実施形態では、分子量が５０００Ｄａ未満のオリゴペプチドを中空繊維膜技術によってより大きなオリゴペプチドから分離する。中空繊維膜カートリッジの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）は、分子量が５０００Ｄａを超えるオリゴペプチドが、分子量が５０００Ｄａ未満のオリゴペプチド最終産物から分離又は除去されるように５０００Ｄａとすることができる。付加的には又は代替的には、分子量が５０００Ｄａ未満のオリゴペプチドを、所定の分子量カットオフの透析チューブの使用等といった別の技法によってより大きなオリゴペプチドから分離することができる。得られたオリゴペプチド最終産物は溶液中に存在しており、これを任意に（例えば凍結乾燥法によって）乾燥させることができる。
【００２３】
下記の代表的な実施例では、本開示に従って提供されるオリゴペプチドの特定の態様を説明する実験が与えられる。当業者であれば、本開示の範囲は下記の代表的な実施例によって限定されるものではないことを理解するであろう。
【実施例】
【００２４】
実施例１
実験により、体重１８０ｇ〜２００ｇの８週齢の雄ウィスターラットである糖尿病ラットの血中グルコースレベルに対する本開示により提供される特定のセリシン由来のオリゴペプチドの効果を評価した。糖尿病は体重（ＢＭ）１ｋｇ当たり５５ｍｇの濃度のストレプトゾトシンの単回静脈内（ｉ．ｖ．）注射を用いて導入した。７日目に、ラットの血糖レベルを、血液採取及びグルコース試験キット（ＡＣＣＵＣＨＥＫ、Roche Laboratory Pharma.）によって決定した。血糖レベルが３００ｍｇ／ｄｌを超えるラットを更なる実験工程の糖尿病群に選択した。
【００２５】
実施例１では、ラットを各群６匹のラットで下記のように群１〜群６に分類した：
（ｉ）群１：蒸留水を投与した正常対照ラット群。
（ｉｉ）群２：蒸留水を投与した糖尿病対照ラット群。
（ｉｉｉ）群３：糖尿病ラットに体重１ｋｇ当たり０．６ｍｇのグリベンクラミド（血糖レベルを低減する標準薬）を単回所定量投与した。
（ｉｖ）群４：糖尿病ラットに体重１ｋｇ当たり１００ｍｇの本開示により提供されるオリゴペプチドを単回所定量投与した。
（ｖ）群５：糖尿病ラットに体重１ｋｇ当たり３００ｍｇの本開示により提供されるオリゴペプチドを単回所定量投与した。
（ｖｉ）群６：糖尿病ラット体重１ｋｇ当たり６００ｍｇの本開示により提供されるオリゴペプチドを単回所定量投与した。
【００２６】
当業者であれば、糖尿病を誘導する代替試薬；ラットの性別、年齢、種；血糖レベルを低減する対照として使用される試薬；ストレプトゾトシン、グリベンクラミド、オリゴペプチドの濃度；及び／又は投与方法を変更することができることを理解するであろう。
【００２７】
上記のようなラットの準備後、体重１ｋｇ当たり５ｇの濃度で既知量のグルコース溶液を、３０分後各群のラットに投与した。各群のラットの血液サンプルを回収して、グルコース溶液を導入する前の時点でのグルコースレベル（−３０分）、グルコース溶液を導入した時点でのグルコースレベル（０分）、並びにグルコース溶液を導入して３０分後、６０分後、９０分後及び１８０分後のグルコースレベルを測定した。
【００２８】
結果
図２に、対照ラット並びにグリベンクラミド及び異なる濃度の本開示によるオリゴペプチドを投与した糖尿病ラットの血糖レベルを示している。対照群１のラットの血糖レベルはＢＷ１ｋｇ当たり５ｇの濃度でグルコース溶液を導入して３０分後に増大し、その後続いて、１８０分で初期血糖レベルまで低減した。対照群２のラットの血糖レベルはグルコース溶液を投与して３０分後及び６０分後に増大した。群２のラットの血糖レベルはその後もほとんど低減しないか又は相対的に同じ状態を維持した。これに対して、グリベンクラミド（群３）、ＢＷ１ｋｇ当たり１００ｍｇ（群４）、ＢＷ１ｋｇ当たり３００ｍｇ（群５）、及びＢＷ１ｋｇ当たり６００ｍｇ（群６）の濃度の本開示により提供されるオリゴペプチドを投与したラットの血糖レベルはグルコース溶液を投与して３０分後及び６０分後で増大し、１８０分後に有意に低減した。群２と比較した上での１８０分での群３〜群６のラットの血糖レベルの低減はｐ値＜０．０５で統計的に有意であった。
【００２９】
結論
本開示により提供されるオリゴペプチドを投与したラットの血糖レベルは、或る特定の期間にわたって大幅に低減し、血糖レベルを低減することで知られる薬物であるグリベンクラミドを投与したラットの血糖レベルと相対的に同程度であった。ＢＷ１ｋｇ当たり１００ｍｇ、３００ｍｇ及び６００ｍｇの濃度の本開示により提供されるオリゴペプチドは血糖レベルを低減する有効性又は生物活性を備える。
【００３０】
実施例２
実験により、体重１８０ｇ〜２００ｇの８週齢の雄ウィスターラットである糖尿病ラットの血圧低下に対する本開示により提供される特定のセリシン由来のオリゴペプチドの効果を評価した。
【００３１】
ラットを１群当たり６匹のラットで下記のように群１〜群３に分類した：
（ｉ）群１：対照群、ラットに蒸留水を投与した。
（ｉｉ）群２：大腿静脈注射により１０−７ｍｇ／ｍｌ〜１０−１ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度（すなわち１０−７ｍｇ／ｍｌ、１０−６ｍｇ／ｍｌ、１０−５ｍｇ／ｍｌ、１０−４ｍｇ／ｍｌ、１０−３ｍｇ／ｍｌ、１０−２ｍｇ／ｍｌ及び１０−１ｍｇ／ｍｌ）の本開示により提供されるオリゴペプチドを所定量投与した。最小オリゴペプチド濃度の用量（すなわち１０−７ｍｇ／ｍｌ）を注射することにより本開示によるオリゴペプチドを導入した後、ラットの血圧をモニタリングした。血圧値が初期値に戻った後、オリゴペプチド濃度の２番目のより高い用量（すなわち１０−６ｍｇ／ｍｌ）を投与した。これを実施例２に用いられる最大オリゴペプチド濃度（すなわち１０−１ｍｇ／ｍｌ）に達するまで繰り返した。
（ｉｉｉ）群３：ラットにアンジオテンシン（Angiotensin）ＩＩの活性を阻害することにより血圧を低下することで知られる物質であるエナラプリルを所定量投与した。群２と同様に、エナラプリルを、大腿静脈注射により１０−７ｍｇ／ｍｌ〜１０−１ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度（すなわち１０−７ｍｇ／ｍｌ、１０−６ｍｇ／ｍｌ、１０−５ｍｇ／ｍｌ、１０−４ｍｇ／ｍｌ、１０−３ｍｇ／ｍｌ、１０−２ｍｇ／ｍｌ及び１０−１ｍｇ／ｍｌ）で使用した。初めに最小エナラプリル濃度の用量（すなわち１０−７ｍｇ／ｍｌ）を注射することによりエナラプリルを導入した後、ラットの血圧をモニタリングした。血圧が初期値に戻った後、２番目のより高い用量（すなわち１０−６ｍｇ／ｍｌ）のエナラプリルを導入した。これを実施例２に用いられる最大エナラプリル濃度（すなわち１０−１ｍｇ／ｍｌ）に達するまで繰り返した。
【００３２】
ラットの血圧をＭａｃＬａｂ（GE Healthcare）により大腿動脈で測定した。当業者であれば、代替的なラットの性別、ラットの年齢及びラットの種；血圧を低下させる対照として使用される試薬；エナラプリルの濃度；オリゴペプチドの濃度；及び／又は投与方法を変更することができることを理解するであろう。
【００３３】
結果
図３Ａに、対照ラットの血圧及び本開示に従って調製されたオリゴペプチドを投与したラットの血圧を示している。本開示により提供されるオリゴペプチドの濃度は１０−７ｍｇ／ｍｌ〜１０−１ｍｇ／ｍｌで変えた。対照群１の血圧は１００ｍｍＨｇ〜１２０ｍｍＨｇであった。群２のラット（上述されたオリゴペプチドを投与した）の血圧は群１の対照ラットと比較して大幅に低下した。血圧の低下は統計的に有意であった。より具体的には、ラットに本開示により提供されるオリゴペプチドを１０−７ｍｇ／ｍｌの濃度で導入した場合、血圧は基準値と比べて６４％の低下である３９．３３±５．３９ｍｍＨｇまで激減した。ラットに本開示により提供されるオリゴペプチドを１０−６ｍｇ／ｍｌ、１０−５ｍｇ／ｍｌ、１０−４ｍｇ／ｍｌ、１０−３ｍｇ／ｍｌ、１０−２ｍｇ／ｍｌ及び１０−１ｍｇ／ｍｌの濃度で導入した場合、血圧はそれぞれ５１．１７±７．９９ｍｍＨｇ、５７．５±９．９３ｍｍＨｇ、８８．３３±１０．９５ｍｍＨｇ、８１．３３±９．４２ｍｍＨｇ、７２．３３±６．２８ｍｍＨｇ及び９２．３３±１３．２２ｍｍＨｇへと大幅に低下した。
【００３４】
図３Ｂに、対照ラットの血圧及びエナラプリルを投与したラットの血圧を示している。対照群１のラットの血圧は１００ｍｍＨｇ〜１２０ｍｍＨｇであった。エナラプリルを投与した群３のラットの血圧は対照群１のラットの血圧よりも統計的に低下した。より具体的には、ラットにエナラプリルを１０−７ｍｇ／ｍｌ、１０−６ｍｇ／ｍｌ、１０−５ｍｇ／ｍｌ、１０−４ｍｇ／ｍｌ、１０−３ｍｇ／ｍｌ、１０−２ｍｇ／ｍｌ及び１０−１ｍｇ／ｍｌの濃度で導入した場合、ラットの血圧はそれぞれ８３．００±１２．７０ｍｍＨｇ、９３．１７±６．１１ｍｍＨｇ、９５．１７±６．４６ｍｍＨｇ、８６．８３±１３．２３ｍｍＨｇ、９４．１７±１３．９３ｍｍＨｇ、８６．５０±７．６６ｍｍＨｇ及び７９．６７±１４．１４ｍｍＨｇに大幅に低減した。
【００３５】
図３Ｃに、群１、群２及び群３のラットの血圧の比較結果を示している。同等濃度での結果から、本開示によるオリゴペプチドを摂取したラット（すなわち群２）の血圧が、１０−７ｍｇ／ｍｌ、１０−６ｍｇ／ｍｌ及び１０−２ｍｇ／ｍｌの濃度でエナラプリルを摂取したラットの血圧よりも大幅に低下したことが示される。
【００３６】
結論
本開示により提供されるオリゴペプチドを摂取したラットの血圧は対照ラットと比較して大幅に低下した。１０−７ｍｇ／ｍｌ〜１０−１ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度の本開示により提供されるオリゴペプチドは血圧を低下する有効性又は生物活性を備える。その上、本開示により提供されるオリゴペプチドを摂取したラットの血圧は同一又は同等の濃度のエナラプリルを摂取したラットの血圧よりも大幅に低下し、このことから本開示の幾つかの実施形態により調製されるオリゴペプチドは、既存の血圧低下物質（例えばエナラプリル）を超える優れた特性又は利点を有することが示唆される。したがって、本開示の様々な実施形態に従って調製されたオリゴペプチドは、従来の血圧低下剤と比較して少なくとも同等の又は増進した生物活性を有する。
【００３７】
実施例３
実験により、本開示による特定のセリシン由来のオリゴペプチドの抗酸化特性又は抗酸化効果を評価した。脂質の酸化分解が脂質の過酸化を伴うものであることは当該技術分野において既知である。本開示により提供されるオリゴペプチドの抗酸化特性を、血漿から単離した低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）の酸化度を測定することにより決定した。
【００３８】
密度が１．０１９ｇ／ｍｌ〜１．０６３ｇ／ｍｌの規定量のヒトＬＤＬを密度順次超遠心分離法により健常なボランティアの血漿から単離した。１０μＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含むリン酸緩衝生理食塩水中での透析の際、ＬＤＬタンパク質濃度をＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ（商標））により決定した。ＬＤＬを脂質過酸化工程に使用するまで４℃の窒素ガス下で保管した。
【００３９】
可変濃度の本開示により提供されるセリシン由来のオリゴペプチドを水に溶解して、脂質酸化開始前３０分間、ヒトＬＤＬとともにインキュベートした。同じ濃度範囲のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を対照タンパク質として使用した。ビタミンＥ類似体であるトロロックス及び既知の抗酸化剤を陽性対照として使用した。
【００４０】
実験群１〜実験群１８を規定した。群２〜群１８は、下記のように規定量の（ａ）本開示により提供されるオリゴペプチド、（ｂ）ＢＳＡ又は（ｂ）トロロックスの水への溶解と、ヒトＬＤＬとの３０分間の更なるインキュベートとを伴うものであった：
群１：５０μＭのＣｕＳＯ４とともにインキュベートした１ｍｇ／ｍｌのＬＤＬを含む対照群。
群２：ヒトＬＤＬとともに３０分間インキュベートした１０μｇ／ｍｌのオリゴペプチド。
群３：ヒトＬＤＬとともに３０分間インキュベートした１０μｇ／ｍｌのＢＳＡ。
群４：ヒトＬＤＬとともに３０分間インキュベートした２０μｇ／ｍｌのオリゴペプチド。
群５：ヒトＬＤＬとともに３０分間インキュベートした２０μｇ／ｍｌのＢＳＡ。
群６：ヒトＬＤＬとともに３０分間インキュベートした５０μｇ／ｍｌのオリゴペプチド。
群７：ヒトＬＤＬとともに３０分間インキュベートした５０μｇ／ｍｌのＢＳＡ。
群８：ヒトＬＤＬとともに３０分間インキュベートした１００μｇ／ｍｌのオリゴペプチド。
群９：ヒトＬＤＬとともに３０分間インキュベートした１００μｇ／ｍｌのＢＳＡ。
群１０：ヒトＬＤＬとともに３０分間インキュベートした２００μｇ／ｍｌのオリゴペプチド。
群１１：ヒトＬＤＬとともに３０分間インキュベートした２００μｇ／ｍｌのＢＳＡ。
群１２：ヒトＬＤＬとともに３０分間インキュベートした４００μｇ／ｍｌのオリゴペプチド。
群１３：ヒトＬＤＬとともに３０分間インキュベートした４００μｇ／ｍｌのＢＳＡ。
群１４：ヒトＬＤＬとともに３０分間インキュベートした８００μｇ／ｍｌのオリゴペプチド。
群１５：ヒトＬＤＬとともに３０分間インキュベートした８００μｇ／ｍｌのＢＳＡ。
群１６：ヒトＬＤＬとともに３０分間インキュベートした１２００μｇ／ｍｌのオリゴペプチド。
群１７：ヒトＬＤＬとともに３０分間インキュベートした１２００μｇ／ｍｌのＢＳＡ。
群１８：ヒトＬＤＬとともに３０分間インキュベートした１００μＭのトロロックス。
【００４１】
上記の調製後、ヒトＬＤＬを５０μＭの硫酸銅（ＣｕＳＯ４）溶液とともにインキュベートして、３７℃で４時間行われる脂質過酸化反応を開始した。脂質過酸化反応を、０．１μＭのＥＤＴＡ溶液を導入することにより停止又は終了させた。脂質過酸化産物であるマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）を従来のチオバルビツール酸反応物質（ＴＢＡＲＳ）アッセイにより測定して、脂質過酸化度を決定した。要約すると、酸化反応の終了後、得られる混合物をＴＢＡＲＳ試薬（すなわち４０％トリクロロ酢酸と、１．４％チオバルビツール酸と、８％塩酸塩との混合物）と混合して、９０℃で１時間更にインキュベートした。得られる混合物を冷却して遠心分離した。上清を取り除き、５３５ｎｍの励起波長及び５９５ｎｍの発光波長で蛍光強度を決定した。ＭＤＡ産物は酸化のレベルに相当し、すなわちより大量のＭＤＡ産物はより高いリポタンパク質酸化に相当する。
【００４２】
当業者であれば、脂質源；脂質単離法；対照タンパク質として使用する試薬及び／又はビタミンＥ類似体；オリゴペプチド、ＢＳＡ及び／又はトロロックスの濃度；脂質過酸化反応誘導法；及び／又は酸化度測定法を実施形態の詳細に応じて必要であれば調整することができることを認識するであろう。
【００４３】
結果
図４Ａに、上記の群１〜群１８に対応する脂質過酸化産物（ＭＤＡ）のレベルを示す。本開示により提供されるオリゴペプチドの濃度が増大するにつれて、ＭＤＡのレベル又は量が低減し、このことから試験濃度の範囲全体にわたってオリゴペプチド濃度が増大するにつれて過酸化反応が低減することが示唆される。これに対してＢＳＡ濃度が１０μｇ／ｍｌ〜８００μｇ／ｍｌの範囲で増大しても、ＭＤＡのレベル又は量はほぼ同一のままであるか又は僅かに低減する。さらに、５０μｇ／ｍｌ〜１２００μｇ／ｍｌの範囲の濃度のオリゴペプチドに対応するＭＤＡレベルは同じ濃度のＢＳＡに対応するＭＤＡレベルより大幅に低下した。結果として、本開示により提供されるオリゴペプチドはＬＤＬ脂質過酸化の阻害に関して同一の濃度条件下でＢＳＡよりも高い有効性を備える。
【００４４】
図４Ｂに、ＬＤＬの脂質過酸化に対するオリゴペプチド及びＢＳＡの５０％阻害濃度（ＩＣ５０）値を示す。オリゴペプチド及びＢＳＡのＩＣ５０値は図４Ｂに示される用量応答曲線に基づいて算出した。本開示によるオリゴペプチドは１０８μｇ／ｍｌのＩＣ５０値でＣｕ２＋誘導性のＬＤＬ酸化に対する用量依存性の阻害効果を呈した。ＢＳＡのＩＣ５０値は２２５８μｇ／ｍｌであったが、これは本開示によるオリゴペプチドのＩＣ５０値よりも極めて高いものである。
【００４５】
結論
本開示によるオリゴペプチドはＬＤＬの脂質過酸化に対する阻害活性を示す。ＢＳＡ対照タンパク質と比較して、本開示により提供されるオリゴペプチドはＬＤＬの脂質過酸化の阻害においてより高い有効性を備える。実施例３の結果から、本開示に記載される様々な実施形態に従って提供又は調製されるオリゴペプチドがＬＤＬのＣｕ２＋誘導性の酸化に対する抗酸化特性又は生物活性を有することが示唆される。
【００４６】
実施例４
実験により、本開示による特定のセリシン由来のオリゴペプチドのナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）活性又は特性を調べた。より具体的には、ナチュラルキラー細胞活性又は特性の亢進を、脾臓単核細胞のリンパ腫細胞を溶解する能力に基づき評価した。
【００４７】
実施例４では、７週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを１群当たり５匹のマウスで群１〜群４に分類した。各群を１２時間明暗サイクルで２５±１℃のステンレス製のケージに収容した。各群では馴化の最初の１週間、滅菌水及び食餌を自由に与えた。各群を下記のように準備した：
（ｉ）群１：対照群、セリシン由来のオリゴペプチド補給剤を含まない標準的食餌を７日間与えた。
（ｉｉ）群２：標準的食餌及び５０ｍｇ／ｋｇ（体重）／日で補給剤として所定量の本開示により提供されるオリゴペプチドを７日間与えた。
（ｉｉｉ）群３：標準的食餌及び１００ｍｇ／ｋｇ（体重）／日で補給剤として所定量の本開示により提供されるオリゴペプチドを７日間与えた。
（ｉｖ）群４：標準的食餌及び５００ｍｇ／ｋｇ（体重）／日で補給剤として所定量の本開示により提供されるオリゴペプチドを７日間与えた。
【００４８】
最後の経口投与の２４時間後、各群のマウスを屠殺して、無菌条件下で脾臓を摘出及び回収した。各マウスの脾臓から単離した単一細胞懸濁液をセルストレーナーに通した。赤血球が赤血球溶解バッファー中で破裂した。得られた細胞を２回洗浄して、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）と、０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、５×１０−５Ｍ濃度のβ−メルカプトエタノールと、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンと、１００単位／ｍｌのペニシリンと、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンとを含む完全ＲＰＭＩ−１６４０培地中で培養した。
【００４９】
各マウスのＮＫ細胞活性を、対照マウス（すなわち群１）又は処理マウス（すなわち群２〜群４）から単離された調製脾臓単核細胞のＹＡＣ−１リンパ腫細胞を溶解する能力に基づき評価した。調製又は単離された脾臓単核細胞は「エフェクター細胞」と称され、ＹＡＣ−１リンパ腫細胞株は「標的細胞」と称された。脾臓単核細胞を３７℃の９６ウェル組織培養プレート内において５％  ＣＯ２の存在下で２０時間、２つのエフェクター対標的比（Ｅ：Ｔ）、すなわち２５：１及び５０：１でＹＡＣ−１細胞とともにインキュベートした。インキュベーション期間経過後に、細胞成長を３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）アッセイによって５４０ｎｍの吸光波長で光学密度（ＯＤ）を測定することにより決定した。エフェクター細胞、標的細胞及びブランクサンプルを対照として測定した。ＮＫ細胞活性は下記式のとおりに算出した；
ＮＫ細胞活性（％）＝｛１−［（ＯＤ試験−ＯＤエフェクター細胞対照）／ＯＤ標的細胞対照］｝×１００
【００５０】
結果
図５Ａ及び図５Ｂに、それぞれ２５：１及び５０：１のエフェクター対標的比で本開示により提供されるオリゴペプチドを投与したマウスから単離される調製脾臓単核細胞のＮＫ細胞活性（％）を示す。５０ｍｇ／ｋｇ（体重）／日〜１５０ｍｇ／ｋｇ（体重）／日の濃度範囲のオリゴペプチドを投与した（すなわち群２〜群４の）マウスから単離される脾臓単核細胞のＮＫ細胞活性（％）は試験した両方のエフェクター対標的比で群１の対照マウスのものよりも高かった。
【００５１】
結論
対照群と比較して、上記で提供されるオリゴペプチドはより高いＮＫ細胞活性をもたらし、このことから本開示の実施形態に従って提供又は調製されたオリゴペプチドがＮＫ細胞活性の亢進又は改善を促す又は可能にすることが示唆される。
【００５２】
実施例５
実験により、体重１８０ｇ〜２００ｇの８週齢の雄ウィスターラットである２型糖尿病ラットの血漿グルコースレベル、血漿インスリンレベル及び糖尿病網膜症に対する本開示により提供される特定のセリシン由来のオリゴペプチドの効果を評価した。糖尿病ラット（下記においてＤＭと選択的に特定される）を、クエン酸バッファー０．２ｍｌに溶解した体重１ｋｇ当たり３５ｍｇのストレプトゾトシンの単回の静脈内（ｉ．ｖ．）注射を用いることにより誘導した。ストレプトゾトシン注射の１週間後、ラットの血漿グルコースレベルを、血液採取及びグルコース試験キット（ＡＣＣＵＣＨＥＫ、Roche Laboratory Pharma.）の使用によって決定した。血漿グルコースレベルが３００ｍｇ／ｄｌを超えるラットを実施例５の更なる実験の糖尿病ラットに選択した。
【００５３】
実施例５では、ラットを各群６匹のラットで下記のように準備される群１〜群９に分類した：
（ｉ）群１：蒸留水を投与した正常対照ラット群。
（ｉｉ）群２：１日に付き体重１ｋｇ当たり５０ｍｇの本開示により提供されるセリシン由来のオリゴペプチドを所定量投与した正常ラット。
（ｉｉｉ）群３：１日に付き体重１ｋｇ当たり１００ｍｇの本開示により提供されるセリシン由来のオリゴペプチドを所定量投与した正常ラット。
（ｉｖ）群４：１日に付き体重１ｋｇ当たり２００ｍｇの本開示により提供されるセリシン由来のオリゴペプチドを所定量投与した正常ラット。
（ｖ）群５：群５の糖尿病対照ラットに蒸留水を投与した。
（ｖｉ）群６：１日に付き体重１ｋｇ当たり５０ｍｇの本開示により提供されるオリゴペプチドを所定量投与した糖尿病ラット。
（ｖｉｉ）群７：１日に付き体重１ｋｇ当たり１００ｍｇの本開示により提供されるオリゴペプチドを所定量投与した糖尿病ラット。
（ｖｉｉｉ）群８：１日に付き体重１ｋｇ当たり２００ｍｇの本開示により提供されるオリゴペプチドを所定量投与した糖尿病ラット。
（ｉｘ）群９：１日に付き体重１ｋｇ当たり０．６ｍｇのグリベンクラミドを所定量投与した糖尿病ラット。
【００５４】
実験期間中、体重及び眼の検査を定期的に記録した。各群のラットの血漿グルコースレベルを毎週決定した。インスリンレベルを８週経過後に測定した。当業者であれば、代替的なラットの性別、ラットの年齢及びラットの種；ストレプトゾトシン、グリベンクラミド及び／又はオリゴペプチドの濃度；及び／又は投与方法を必要であれば変更することができることを理解するであろう。
【００５５】
結果
表１に、蒸留水、グリベンクラミド及び様々な濃度の本開示によるオリゴペプチドを投与した正常ラット及び糖尿病ラットの平均体重を示す。正常対照群１のラットの平均最終体重は４５３．３３ｇであり、これは５０ｍｇ／ｋｇ／日、１００ｍｇ／ｋｇ／日、２００ｍｇ／ｋｇ／日の濃度の本開示によるオリゴペプチドを投与した正常ラット（すなわち群２〜群４）の平均最終体重よりも有意に高かった。正常ラットと比較して、蒸留水及び５０ｍｇ／ｋｇ／日、１００ｍｇ／ｋｇ／日、２００ｍｇ／ｋｇ／日の濃度のオリゴペプチドを投与した糖尿病ラット（すなわち群５〜群８）の平均最終体重は有意に低かった。さらに、全ての濃度のオリゴペプチドを投与した糖尿病ラット（すなわち群６〜群８）の平均最終体重は糖尿病対照群５のラットの平均最終体重よりも有意に高かった。０．６ｍｇ／ｋｇの濃度のグリベンクラミドを投与した群９の糖尿病ラットの平均最終体重は初期体重よりも僅かに低かった。
【００５６】
表１：全ての群のラットの平均体重
【表１】
0005866015.tif 000002
値は平均±ＳＤとして表し、１群当たりラット６匹。
＊正常対照群と比較してｐ＜０．０５。
＃ＤＭ対照群と比較してｐ＜０．０５。
【００５７】
表２に、蒸留水、グリベンクラミド及び様々な濃度の本開示によるオリゴペプチドを投与した正常ラット及び糖尿病ラットの血漿グルコースレベルを示す。正常対照群１のラットの平均血漿グルコースレベルは５０ｍｇ／ｋｇ／日、１００ｍｇ／ｋｇ／日、２００ｍｇ／ｋｇ／日の濃度のオリゴペプチドを投与した正常ラット（すなわち群２〜群４）の平均血漿グルコースレベルよりも高かった。糖尿病ラットの血漿グルコースレベルは、ラットに５０ｍｇ／ｋｇ／日（すなわち群６）、１００ｍｇ／ｋｇ／日（すなわち群７）及び２００ｍｇ／ｋｇ／日（すなわち群８）の濃度のオリゴペプチドを導入した場合に糖尿病対照群５のラットの３６９．５ｍｇ／ｄｌからそれぞれ３３５．８３ｍｇ／ｄｌ、３２０．００ｍｇ／ｄｌ、３０６．５０ｍｇ／ｄｌ及び３３６．００ｍｇ／ｄｌへと低減した。
【００５８】
表２：全ての群のラットの血漿グルコースレベル
【表２】
0005866015.tif 000003
値は平均±ＳＤとして表し、１群当たりラット６匹。
＊正常対照群と比較してｐ＜０．０５。
＃ＤＭ対照群と比較してｐ＜０．０５。 
【００５９】
表３に、蒸留水、グリベンクラミド及び様々な濃度の本開示によるオリゴペプチドを投与した正常対照ラット及び糖尿病ラットの血漿インスリンレベルを示す。５０ｍｇ／ｋｇ／日（すなわち群６）、１００ｍｇ／ｋｇ／日（すなわち群７）及び２００ｍｇ／ｋｇ／日（すなわち群８）の濃度の本開示によるオリゴペプチドを投与した糖尿病ラットの血漿インスリンレベルは、正常対照ラット（すなわち群１）の血漿インスリンレベルのほぼ５０％までオリゴペプチド濃度が増大するにつれて増大した。表３で得られた結果から、本開示によるセリシン由来のオリゴペプチドはインスリン産生を増大するか、又はインスリン産生に関与する膵臓細胞のインスリン機能若しくはインスリン活性を回復することができることが示唆される。
【００６０】
表３：実験終了時のラットの血漿インスリンレベル
【表３】
0005866015.tif 000004
値は平均±ＳＤとして表し、１群当たりラット６匹。
＊正常対照群と比較してｐ＜０．０５。
＃ＤＭ対照群と比較してｐ＜０．０５。
【００６１】
表４に、正常ラット及び糖尿病ラットに蒸留水、グリベンクラミド及び様々な濃度の本開示によるオリゴペプチドを投与した場合の正常眼及び盲目眼を有する正常ラット及び糖尿病ラットの数により分類する眼検査の結果を示す。結果から、対照群１の正常ラットは全て正常眼を有していたことが示される。これに対して、対照群５の糖尿病ラットは６匹全て左右両眼とも盲目状態であった。糖尿病ラットに本開示によるオリゴペプチドを導入した後、両眼とも盲目のラットの数は、糖尿病対照群５の６匹から５０ｍｇ／ｋｇ（すなわち群６）、１００ｍｇ／ｋｇ（すなわち群７）、２００ｍｇ／ｋｇ（すなわち群８）とオリゴペプチド濃度が増大するにつれてそれぞれ４匹、３匹及び３匹に減少した。
【００６２】
表４：研究期間終了時の正常眼及び盲目眼を有するラットの数
【表４】
0005866015.tif 000005
【００６３】
結論
実施例５の結果から、本開示の実施形態に従って調製され、５０ｍｇ／ｋｇ／日〜２００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲の濃度で投与されたオリゴペプチドは、２型糖尿病ラットにおいて血漿グルコースレベルを低減するとともに、血漿インスリンレベルを増大することに加えて、網膜症を低減する有効性又は生物活性を備えることが示唆される。上記の濃度で投与された本開示によるオリゴペプチドには、既存の血漿グルコース低減物質及び既存の血漿インスリン増大物質（すなわちグリベンクラミド）を超える利点がある。
【００６４】
実施例６
実験により、４週齢の雄ＩＣＲマウスの自発運動及び中枢神経系（ＣＮＳ）刺激特性に対する本開示により提供される特定のセリシン由来のオリゴペプチドの効果を評価した。
【００６５】
実施例６では、マウスを各群１５匹のマウスで下記のように群１〜群５に分類した：
（ｉ）群１：蒸留水を投与したビヒクル対照マウス群。
（ｉｉ）群２：体重１ｋｇ当たり１ｍｇの本開示により提供されるセリシン由来のオリゴペプチドを所定量投与したマウス。
（ｉｉｉ）群３：体重１ｋｇ当たり１０ｍｇの本開示により提供されるセリシン由来のオリゴペプチドを所定量投与したマウス。
（ｉｖ）群４：体重１ｋｇ当たり１００ｍｇの本開示により提供されるセリシン由来のオリゴペプチドを所定量投与したマウス。
（ｖ）群５：体重１ｋｇ当たり３０ｍｇのプソイドエフェドリンを所定量投与したマウス。
【００６６】
各群を、およそ１０分間（例えば最初すなわち初期の１０分間隔）、運動モニタリングユニットの円柱チャンバ内で自由に運動させた後、蒸留水又は本開示によるオリゴペプチド又は上記のエフェドリンを投与した。投与したら、各マウスをチャンバに戻し、自発運動を１０分間隔で６０分間記録した。当業者であれば、代替的なマウスの性別、マウスの年齢、エフェドリン及び／又はオリゴペプチドの濃度、及び／又は投与方法を必要であれば変更することができることを理解するであろう。
【００６７】
結果
図６に、本開示により提供されるオリゴペプチドに関連する弱い中枢神経系刺激特性に関する実験グラフを示す。結果から、マウスにエフェドリンを投与した場合（すなわち群５）のマウスの運動回数が、２０分以降、マウス対照群（すなわち群１）の運動回数よりも有意に高くなったことが示される。マウスに体重１ｋｇ当たり１００ｍｇの本開示により提供されるセリシン由来のオリゴペプチドを投与した場合（すなわち群４）のマウスの運動回数は、４０分以降、マウス対照群（すなわち群１）の運動回数よりも有意に高くなった。マウスに体重１ｋｇ当たり１ｍｇ及び１０ｍｇの濃度のセリシン由来のオリゴペプチドを投与した場合（すなわち群２及び群３）のマウスの運動回数は、５０分以降、マウス対照群（すなわち群１）の運動回数よりも有意に高くなった。
【００６８】
結論
実施例６の結果から、本開示の実施形態に従って調製され、１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲の濃度で投与されたオリゴペプチドは、弱い中枢神経系刺激物質として有効性又は生物活性を備えることが示唆される。
【００６９】
実施例７
実験により、４週齢の雄ＩＣＲマウスであるアルツハイマー病のマウスモデルにおける神経保護特性、認知機能保護特性及び／又は記憶保護特性、特に空間記憶に対する本開示により提供される特定のセリシン由来のオリゴペプチドの効果を評価した。
【００７０】
実施例７では、マウスを各群およそ１７匹のマウスで下記のように群１〜群５に分類した：
（ｉ）群１：偽対照群。マウスに蒸留水を与え、生理食塩水溶液を脳室内注射した。
（ｉｉ）群２：健忘対照群。マウスに蒸留水を与え、１０μｇ／１０μｌの濃度のＡβ２５−３５ペプチドを含む溶液を脳室内注射した（図７では「対照ＡＢ」と示す）。
（ｉｉｉ）群３：マウスに体重１ｋｇ当たり１ｍｇの本開示により提供されるセリシン由来のオリゴペプチドを与え、１０μｇ／１０μｌの濃度のＡβ２５−３５ペプチドを含む溶液を脳室内注射した（図７では「ＡＢ＋ＯＰ１」と示す）。
（ｉｖ）群４：マウスに体重１ｋｇ当たり１０ｍｇの本開示により提供されるセリシン由来のオリゴペプチドを与え、１０μｇ／１０μｌの濃度のＡβ２５−３５ペプチドを含む溶液を脳室内注射した（図７では「ＡＢ＋ＯＰ１０」と示す）。
（ｖ）群５：マウスに体重１ｋｇ当たり１００ｍｇの本開示により提供されるセリシン由来のオリゴペプチドを与え、１０μｇ／１０μｌの濃度のＡβ２５−３５ペプチドを含む溶液を脳室内注射した（図７では「ＡＢ＋ＯＰ１００」と示す）。
【００７１】
各マウスに蒸留水又はオリゴペプチドを７週間毎日与えた。給餌の３週間後、マウスに１０日間、モリス水迷路内の逃避台（hidden platform）を見つけ出すトレーニングを行った。モリス水迷路は、スイミングプールと、逃避台と、４つの視覚刺激と、ＰＣコンピュータに接続したＣＣＤとで構成されていた。１１日目に、各マウスに３０ｍｇ／ｋｇのペントバルビタールを用いて軽度麻酔を行った後、２６ゲージ針及び１０μｌ容のマイクロシリンジを用いて左脳室に生理食塩水溶液又は上記のＡβ２５−３５ペプチドを脳室内注射した。脳室内注射したら、マウスを５日間回復させた。脳室内注射の６日目及び７日目に、マウスの空間記憶を、モリス水迷路を用いて評価した。当業者であれば、代替的なマウスの性別、マウスの年齢、Ａβ２５−３５ペプチド及び／又はオリゴペプチドの濃度、投与方法、及び／又はアルツハイマー病のマウスモデルを必要であれば変更することができることを理解するであろう。
【００７２】
結果
図７に、アルツハイマー病マウスモデルにおける本開示により提供されるオリゴペプチドにより促進される又は本開示により提供されるオリゴペプチドから生じる神経保護特性に関する実験グラフを示す。結果から、蒸留水並びに体重１ｋｇ当たり１ｍｇ及び１０ｍｇの濃度の本開示により提供されるオリゴペプチドを与えた後、Ａβ２５−３５ペプチドを含む溶液を脳室内注射したマウス（すなわち群２、群３及び群４）は、蒸留水を与え、生理食塩水溶液を脳室内注射した対照マウス群（すなわち群１）よりも逃避台を見つけるのに有意に多くの時間を要したことが示された。一方で、体重１ｋｇ当たり１００ｍｇの濃度の本開示により提供されるオリゴペプチドを与えた後、Ａβ２５−３５ペプチドを含む溶液を脳室内注射したマウス（すなわち群５）が逃避台を見つけるのに要した時間は、偽対照群（すなわち群１）のマウスの時間と同程度であったか又は有意に異なるものではなかった。結果から、十分な用量（例えば体重１ｋｇ当たり１００ｍｇの用量）での本開示により提供されるオリゴペプチドの投与は、Ａβ２５−３５ペプチドの作用を逆転させ、神経保護効果の促進若しくは実現及び／又はアルツハイマー病においてＡβ２５−３５ペプチドにより引き起こされる記憶障害又は認知機能不全の抑制若しくは逆転を助けることができることが示唆される。
【００７３】
結論
実施例７の結果から、本開示の実施形態に従って調製されたオリゴペプチドは、アルツハイマー病に関連する記憶欠如、特に空間記憶欠如を抑制、実質的に抑制若しくは改善する、神経保護、認知機能保護及び／又は記憶保護の有効性又は生物活性を備えることが示唆される。
【００７４】
実施例８
実験により、４週齢の雄ＩＣＲマウスを伴ったアルツハイマー病のマウスモデルにおける新規物体認識試験を用いることで、認知及び／又は記憶、特に認識記憶の側面に対する本開示により提供される特定のセリシン由来のオリゴペプチドの或る特定の神経保護効果を評価した。
【００７５】
実施例８では、マウスは、実施例７のマウスと同じように群１〜群５に分類し、準備した。各マウスに、２回実施する新規物体認識試験を用いて、認識記憶の試験を行った。１回目の試験は摂餌の３週間後（脳室内注射前）に実施した。２回目の試験は脳室内注射の５日後に実施した。要約すると、初めに各マウスを２つの異なる物体、すなわち物体Ａ及び物体Ｂの入った観察箱に入れ、これらの物体を５分間探索させた。この期間は「トレーニング段階」と称した。次いでマウスを飼育ケージ（home cage）に５分間戻した後、物体Ａ（馴化（familiar）物体）と物体Ｃ（新規物体）とが入った観察箱に戻し、更に５分間、これらの物体を探索させた。この第２の段階は「試験段階」と称した。当業者であれば、代替的なマウスの性別、マウスの年齢、Ａβ２５−３５ペプチド及び／又はオリゴペプチドの濃度、投与方法、及び／又はアルツハイマー病における認識記憶のマウスモデルを必要であれば変更することができることを理解するであろう。
【００７６】
結果
図８に、新規物体認識試験を用いたアルツハイマー病マウスモデルにおける本開示により提供及び／又は投与されるオリゴペプチドに関連する神経保護特性、認知機能保護特性及び／又は記憶保護特性に関する実験グラフを示す。結果から、偽対照群のマウス（すなわち群１）は生理食塩水溶液の脳室内注射の前後で認識記憶の変化を示さなかったことが示された。これに対して、蒸留水を与えた後、Ａβ２５−３５ペプチドを含む溶液を脳室内注射したマウス（すなわち群２）は記憶欠如を示し、新規物体（Ｃ）を認識することができなかった。体重１ｋｇ当たり１０ｍｇ及び１００ｍｇの濃度の本開示により提供されるオリゴペプチドを与えた後、Ａβ２５−３５ペプチドを含む溶液を脳室内注射したマウス（すなわち群４及び群５）は、これらのマウスが試験段階において新規物体（Ｃ）を探索するのに実質的により長い期間を費やしたことから、群２のマウスよりも良好な認識記憶を呈した。結果から、体重１ｋｇ当たり１０ｍｇ〜１００ｍｇの適切な用量での本開示により提供されるオリゴペプチドの投与が、Ａβ２５−３５ペプチドに関連するようなアルツハイマー病により引き起こされる認識記憶欠如の矯正又は抑制を促進することができることが示唆される。
【００７７】
結論
実施例８の結果から、本開示の実施形態に従って調製されたオリゴペプチドが、認知衰退、特に認識記憶欠如に対する保護を助ける若しくは認識衰退、特に認識記憶欠如を軽減する神経保護の有効性又は生物活性を備えることが示唆される。
【００７８】
実施例９
実験により、老齢ラットにおける学習及び記憶の改善に対する本開示により提供される特定のセリシン由来のオリゴペプチドの効果を評価した。より具体的には、実施例９の実験を、長期増強（ＬＴＰ）評価を用いて自然に加齢した１４ヶ月齢の雌スプラーグ−ドーリー（Ｓ．Ｄ．）ラットにおける海馬伝達に関して行った。
【００７９】
実施例９では、マウスを下記のように群１〜群３に分類して準備した：
（ｉ）群１：対照群。マウスに所定量の蒸留水を２ヶ月間毎日与えた。
（ｉｉ）群２：マウスに１ｍｇ／ｋｇの濃度のドネペジル（アリセプト（商標））を所定量、２ヶ月間毎日与えた。
（ｉｉｉ）群３：マウスに１０ｍｇ／ｋｇの本開示により提供されるセリシン由来のオリゴペプチドを所定量、２ヶ月間与えた。
【００８０】
２ヶ月の摂餌後、ラットを１．５ｇのウレタンの注射により麻酔した。ラットの頭部を定位固定装置に固定して、ラットの頭蓋骨の正中切開を行った。刺激微小電極及び記録微小電極を導入するために、海馬の上の頭蓋骨に穿頭孔を２箇所設けた。刺激微小電極を苔状線維に配置し、ラットの脳地図を用いて記録微小電極を海馬のＣＡ１錐体ニューロンに配置した。興奮性シナプス後電位（ＥＰＳＰ）の測定値を、最大のＥＰＳＰ振幅の７５％を生じる低強度刺激（０．０１ｍｓ、８０μＡ〜１２０μＡ、０．５Ｈｚ）を加えることにより得た。次いで、Ｃｈａｒｔ  Ｐｒｏ（ADInstruments、オーストラリア）のピーク分析プログラムを用いて、傾きに対してＥＰＳＰを算出した。ＥＰＳＰ傾き（％）のベースラインを、高周波刺激（ＨＦＳ）前の４０分のサンプリング期間から算出した。ＨＦＳ（パルス内２００Ｈｚ、バースト間期間  ２秒、１０回のバースト）を適用して、長期の高振幅ＥＰＳＰを誘導した。
【００８１】
結果
図９に、本開示により提供及び／又は投与されるオリゴペプチドに関連する学習及び記憶の改善に関する実験グラフを示す。図９に示されるように、海馬ＬＴＰは対照老齢ラット（すなわち群１）では誘導することができなかった。驚くべきことに、ドネペジル及び本開示により提供されるオリゴペプチドを与えたマウス（すなわち群２及び群３）は海馬ＬＴＰの誘導を示した。結果から、本開示によるオリゴペプチドが、海馬におけるシナプス伝達を促進することにより示されるように老齢ラットにおいて学習及び記憶の改善を促進することができることが示唆される。
【００８２】
結論
実施例９の結果から、本開示の実施形態に従って調製されたオリゴペプチドが、（例えば長期増強に伴って）海馬におけるシナプス伝達を促進することにより示されるように学習及び記憶の改善を助ける生体活性特性を備えることが示唆される。
【００８３】
本開示の特定の実施形態が、先に示された欠点、課題又は必要性の内の少なくとも１つに対処するために上で示されている。或る特定の実施形態の利点が記載されているが、他の実施形態がこのような利点を呈することがあり、全ての実施形態が本開示の範囲内にあるこのような利点を呈する必要はない。上で開示される態様の幾つかを組み合わせて、他の又は異なるオリゴペプチドのプロセス又は産物としてもよいことが理解される。上で開示される態様に加えて、現時点では予見されていない又は予測不能であるが、後に当業者が作製することができる代替形態、変化形態又は改良形態も添付の特許請求の範囲に包含される。
【図１】
0005866015.tif 000006
【図２】
0005866015.tif 000007
【図３】
0005866015.tif 000008
【図４】
0005866015.tif 000009
【図５】
0005866015.tif 000010
【図６】
0005866015.tif 000011
【図７】
0005866015.tif 000012
【図８】
0005866015.tif 000013
【図９】
0005866015.tif 000014