(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む標的中型縦列繰り返しＤＮＡ配列を検出する方法：
（ａ）少なくとも２回縦並びに繰り返される５塩基対の配列から成る少なくとも１つの繰り返し単位を含むＤＮＡの一領域である標的中型縦列繰り返し配列を含む少なくとも一つのマーカーを有するＤＮＡサンプルを提供する工程であって、前記ＤＮＡサンプルがヒトＤＮＡであり、前記マーカーが、配列番号：２６の配列を有し；
（ｂ）前記標的中型縦型繰り返し配列を増幅する工程；及び
（ｃ）ＤＮＡサンプル中の前記標的中型縦列繰り返し配列を検出する工程。
【請求項２】
前記標的中型縦列繰り返し配列が完全な中型縦列繰り返し配列である請求項１の方法。
【請求項３】
前記標的中型縦列繰り返し配列が不完全な中型縦列繰り返し配列である請求項１の方法。
【請求項４】
前記工程（ａ）で提供されるＤＮＡサンプルがヒトゲノムＤＮＡである請求項１の方法。
【請求項５】
前記標的中型縦列繰り返し配列の増幅に用いられるオリゴヌクレオチドプライマーが、それに共有結合によって付加された蛍光標識を有する請求項１の方法。
【請求項６】
前記オリゴヌクレオチドプライマーが以下から成る配列群の１つから選択される配列を含む請求項５の方法：
配列番号：１０７、配列番号：１０８、配列番号：１０９、配列番号：１１０、配列番号：１１１。
【請求項７】
少なくとも２回縦並びに繰り返される５塩基対の配列から成る少なくとも１つの繰り返し単位を含む二本鎖ＤＮＡマーカーの一領域である鋳型中型縦列繰り返し配列と隣接する二本鎖ＤＮＡマーカーの一方の鎖と相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーであって、前記二本鎖ＤＮＡマーカー配列が、配列番号：２６であり、
前記オリゴヌクレオチドプライマーが以下から成る群から選ばれる配列を含む前記オリゴヌクレオチドプライマー：
配列番号：１０７、配列番号：１０８、配列番号：１０９、配列番号：１１０、配列番号：１１１。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般にゲノム系における遺伝的マーカーの特定および分析を目的とする。より具体的には本発明は、中型（intermediate）（５から７塩基）配列繰り返し数の変化による長さの多形性現象を有するＤＮＡ、特にゲノムＤＮＡ中の遺伝子座の特定を目的とする。本発明はまた、そのような多形性遺伝子座の検出を目的とする。さらに本発明は、そのような遺伝子座のゲノムＤＮＡ増幅生成物の主としてサイズの違いを基にそれらを個々に特定し識別する方法を目的とする。この場合、中型縦列繰り返し配列の数はそれぞれ個々に異なっている。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡの型分けは、小児の出生を特定するために、さらに馬、犬、および他の受賞動物の血統を確認するために用いられる。ＤＮＡ型分けはまた一般に、犯罪現場で発見された血液、唾液、精液および他の組織の出所を特定するために利用される。今日使用されるＤＮＡ型分け方法は、１つの集団内で少なくとも２つの異なる形態で出現することが判明しているＤＮＡの１つまたは２つ以上の領域の長さおよび／または配列の違いを検出および分析できるようにデザインされている。ＤＮＡ型分けはまた、骨髄移植の成否および特定の癌性疾患の存在を決定するために臨床セッティングで用いられる。そのような長さおよび／または配列の変化は“多形性現象”と称される。そのような変化が生じるＤＮＡの任意の領域（すなわち“遺伝子座”）は“多形性遺伝子座”と称される。ほとんどのＤＮＡ型分け技術は、少なくとも１つのそのような多形性遺伝子座を含む少なくとも１つの“マーカー”を利用する。個々のマーカーの各々は、最終的に１集団内のただ１つの個体に由来するゲノムＤＮＡのただ１つの対立形質を含んでいる。本発明の材料および方法は、全て、主として長さの変化を特徴とするＤＮＡの特定の種類の多形性の検出に使用するためにデザインされている。
【０００３】
長さまたは配列に関して十分に多形性である遺伝的マーカーは、出所確認用途（例えば実父確認検査および法廷での分析のために採集された組織サンプルの特定）で使用するために長い間探し求められてきた。そのようなマーカーの発見および開発、並びにそのようなマーカーを分析する方法はここ数年の間にいくつかの進展段階を経てきた。最近、遺伝的マーカーとして多形性を有する短い縦列繰り返し（ＳＴＲ）の発見および開発によって、連鎖マップの作製、病的遺伝子の特定および性状決定、並びにＤＮＡ型分けの簡素化および精密さにおける進展が促進された。本明細書で用いられるように“短い縦列繰り返し”または“ＴＲ”という用語は、任意の生物のゲノム内で完璧にまたはほぼ完璧に縦並びに繰り返される２から７ヌクレオチドの長さの全ての配列を指す。例えば、米国特許第５３６４７５９号の４段目、５８行目以下でヒトのゲノムＤＮＡで用いられる“短い縦列繰り返し”の定義を参照されたい。
【０００４】
最初に特定されたＤＮＡ変種マーカーは単純な塩基置換（すなわち単純な配列多形性）で、これらは非常に頻繁にサザンハイブリダイゼーションアッセイで検出された。そのようなマーカーの特定について述べている参考文献の例として以下を参照されたい（それらアッセイは放射性プローブを用いて制限エンドヌクレアーゼ消化ＤＮＡを分析するために用いることができるようにデザインされている）：E.M. Southern, J. Mol. Biol. 98(3):503-507(1975); Schumm et al., American Journal of Human Genetics 42:143-159(1988); A. Wyman & R. White, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:6754-6758(1980))。
【０００５】
その次の世代のマーカーはサイズの変種、すなわち長さの多形性で、特に“縦列繰り返し数の可変性”（ＶＮＴＲ）を示すマーカー(Y. Nakamura et al., Science 235:1616-1622(1987); 米国特許第４９６３６６３号（White et al.(1990)；米国特許第５４１１８５９号（４９６３６６３号の継続特許、White et al.(1995)）、および“ミニサテライト”マーカー（Jeffreys et al., Nature 314:67-73(1985a); Jeffreys et al., Nature 316:76-79(1985b)；米国特許第５１７５０８２号（Jeffreys))であった。ＶＮＴＲおよびミニサテライトマーカーはともに、縦並びの態様で繰り返されるほとんど同一の配列の領域を含んでいる。コアの繰り返し配列は長さが１０から７０塩基で、短いコア繰り返し配列（“ミニサテライト”繰り返しと称される）および長い繰り返し（ＶＮＴＲと称される）をもつ。人間の集団で個々の個体は異なる数のこれらの繰り返しを含む。これらのマーカーは、塩基置換多形性よりもより強く多形性で、時には１つの遺伝子座で４０またはそれ以上の対立形質を提示する。しかしながら、だらだらと時間のかかる制限酵素消化の過程およびそれに続くサザンハイブリダイゼーション分析が、そのようなマーカーのほとんどの検出および分析に要求される。
【０００６】
次の進展では、ＶＮＴＲ遺伝子座の分析（K. Kasai et al., Journal Fornsic Science 35(5):1196-1200(1990)）に関してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術（米国特許第４６８３２０２号（K.B. Mullis)）が加わった。増幅可能なＶＮＴＲ遺伝子座が発見された。これはサザントランスファーの必要がなく検出することができた。増幅生成物をアガロースまたはポリアクリルアミドゲルで分離し、増幅時の放射能の取り込みによって、または臭化銀またはエチジウムによる後染色によって検出する。しかしながら、ＰＣＲは相対的に小さなＤＮＡセグメントを信頼できる状態で増幅させるために用いることができる。すなわち、長さが３０００塩基以下のＤＮＡセグメントが信頼できる状態で増幅可能である（M. Ponce & L. Micol, NAR 20(3):623(1992); R. Decorte et al., DNA Cell Biol. 9(6):461-469(1990)）。結果として、極めてわずかの増幅可能なＶＮＴＲしか得られず、連鎖マップ作製にはそれらは実用的な種類ではない。
【０００７】
多形性ジヌクレオチド繰り返し（Litt & Luty, Am. J. Hum. Genet. 3(4):599-605(1989); D. Tautz, NAR 17:64636471(1989); Weber & May, Am. J. Hum. Genet. 44:388-396(1989);ドイツ国特許第ＤＥ３８３４６３６Ｃ２号（D. Tautz);米国特許第５５８２９７９号（L. Weber出願))および多形性の短い縦列繰り返し（ＳＴＲ）（A. Edwards et al., Am. J. Hum. Genet. 49:746-756(1991); H.A. Hammond et al., Am. J. Hum. Genet. 55:175-189(1994); C.J. Fregeau & R.M. Fourney, BioTechniques 15(1):100-119(1993); J.W. Schumm et al., "The Fourth International Symposium on Human Identification 1993", pp.177-187;および米国特許第５３６４７５９号（Caskey et al.); ドイツ国特許第ＤＥ３８３４６３６Ｃ２号（D. Tautz))をもつ多形性マーカーの最近の進歩により、従来の方法の欠点の多くが克服された。ジヌクレオチドまたはＳＴＲ繰り返し（定義では２−７ｂｐ繰り返しを含む）を含む２つのタイプのマーカーは、一般に“ミクロサテライト”マーカーと称される。最も入手しやすいマーカーであるとしばしば考えられるこのミクロサテライト遺伝子座では、それらの対立形質は長さが変化するということで区別できるという点で増幅可能なＶＮＴＲと同様である。
しかしながらＶＮＴＲと異なり、これらの遺伝子座は、２、３、４、または稀に５塩基の長さの完全または不完全な繰り返し配列を含んでいる。それらは、ただ１つの遺伝子座でほんの数個の対立形質から４０以上の対立形質を出現させる。
増幅プロトコルは小さな生成物（一般に長さが６０から４００塩基対）を製造するためにデザインすることが可能で、各遺伝子座の対立形質はしばしば５０ｂｐ未満の範囲内で含まれる。これは、いくつかの系を同じゲル上で同時に電気泳動で分析することを可能にする（ただし、個々の系から得られる全ての潜在的増幅生成物が同じゲル内で他の系の対立形質の領域と重ならないようにＰＣＲプライマーを注意深くデザインする）。
【０００８】
ミクロサテライト遺伝子座の使用では大きな３つの欠点が存在する。第一は、スリップ増幅（stutter)人工生成物の存在、すなわち各対立形質を表した大きなフラグメントの他に１つまたは２つ以上の小さなフラグメントがしばしば増幅後に見出される。この欠陥は、トリまたはテトラヌクレオチド繰り返しマーカーよりもジヌクレオチド繰り返し遺伝子座ではるかに明瞭に提示される（Edwards et al., Am. J. Hum. Genet. 49:746-756(1991); Edwards et al., Genomics 12:241-253(1992); Weber & May, Am. J. Hum. Genet. 44:388-396(1989)）。これらの人工生成物の存在（おそらくは繰り返しのスリップ現象（repeat slippage)（Levinson & Gutman, Mol. Biol. Evol. 4(3):203-221(1987); Schlotterer & Tautz, NAR 20:211-215(1992))と称されるＤＮＡポリメラーゼ関連現象の結果と思われる）は、この遺伝子座の対立形質の内容の解釈を複雑にする。全ての解釈が複雑になる一方で、各対立形質を表している大きなフラグメントと小さなフラグメントの存在は、特に法定訴訟での分析の場合にこれらマーカーの有用性を制限する（法廷訴訟分析では、２つ以上のＤＮＡサンプルが存在するか否かをしばしば決定しなければならない）。本明細書の実験で述べるマーカーの多くは、既知のマーカーに較べて極めてわずかしか短い人工生成物を生じない新規な種類のマーカーである。
【０００９】
現今のＳＴＲおよびミクロサテライトマーカー系の第二の欠点は、単一ゲル内で多数の遺伝子座を分離することの困難さと関係がある。これは、ＤＮＡフラグメントの分離に当業者がもっとも一般的に用いるゲルの上部領域が異なるサイズのフラグメントで間隙的に圧縮されるためである。大きな繰り返し単位を基にする本実験で述べるマーカーの開発はこのゲル内の有用範囲を広げ、より多くの遺伝子座の同時分析を可能にする。
【００１０】
第三の欠点は、本明細書で開示する発明以前には、ヒトゲノムＤＮＡの遺伝子座の各々で５から７塩基繰り返しの数の相違を基にする長さの多形性をもつほんのわずかのＤＮＡ遺伝子座しか文献に記載されていないということである。例えば以下の文献を参照されたい：Edwards et al., Nucleic Acids Res. 19:4791(1991); Chen et al., Genomics 15(3):621-5(1993); Harada et al., Am. J. Hum. Genet. 55:175-189(1994); Comings et al., Genomics 29(2):390-6(1995); Utah Marker Development Group, Am. J. Genet. 57:619-628(1995)。１９９５年に、ＧｅｎＢａｎｋデータベースを用いて、霊長類ゲノム内の５量体および６量体の縦列繰り返しの相対的豊富さおよび変動性を決定する実験が報告された（Jurka & Pethiyagoda, J. Mol. Evol. 40:120-126(1995))。しかしながら、変動性は間接的に概算されただけで、個々の遺伝子座における多形性レベルは示されなかった（上掲書）。我々は、５から７塩基繰り返し配列の高度に多形性である繰り返しを含有するＤＮＡ遺伝子座を特定し分析する材料および方法を開発した。
本発明の材料および方法は、極めて多様な供給源の一本鎖および二本鎖ＤＮＡを含む種々のＤＮＡタイプの個々の多形性遺伝子座を特定し分析するために使用できるようにデザインされている。本発明は現存の技術を顕著に改善し、遺伝子連鎖分析、犯罪審判、実父確定検査並びに他の訴訟および医学的用途のためのＤＮＡプロフィール調査の性能および精密さを高める。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
したがって、本発明の目的は、中型縦列繰り返し配列をもつ遺伝子座の特定および分析のための材料と方法を提供することである。ここで“中型縦列繰り返し配列”とは、５、６または７塩基の配列から成る少なくとも１つの繰り返し単位を含み、当該単位が少なくとも２回繰り返されているＤＮＡの領域である。
【００１２】
本発明の別の目的は、中型縦列繰り返しを含むＤＮＡの１つまたは２つ以上の遺伝子座を分析または検出するために用いる場合、わずかしか人工生成物を生じない、中型縦列繰り返しＤＮＡマーカーを特定する材料および方法を提供することである。本発明の材料および方法は、好ましくは、その各々が多形性を有する中型縦列繰り返し配列を含むゲノムＤＮＡの遺伝子座の特定および分析に用いられる。本発明の材料には、ヒトゲノムＤＮＡのそのような遺伝子座に対するオリゴヌクレオチドプライマーおよびＤＮＡマーカーが含まれる。本発明の方法を用いて検出される中型縦列繰り返し遺伝子座は、同様な方法を用いて検出される多くの既知の遺伝子座（短いＳＴＲ（すなわち２、３または４塩基ＤＮＡ配列の縦列繰り返し）を含む）の場合よりも少ない人工生成物を生じる。
【００１３】
本発明の具体的な目的は、中型縦列繰り返し領域における核酸の主に繰り返し単位数の相違による主に長さの変化を基にした、多形性を有する個々の遺伝子座の分析のための方法および材料を提供することである。本発明の固有の目的はまた、中型縦列繰り返し多形性（５ヌクレオチド縦列繰り返し多形性を含む）を含有する多形性ゲノムＤＮＡ遺伝子座の検出および分析のための方法、キットおよびプライマーを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の実施態様の１つは、以下の工程を含む、ゲノムＤＮＡから中型縦列繰り返し配列を含むＤＮＡフラグメントを単離する方法から成る：（ａ）少なくとも１つのフラグメントは中型縦列繰り返し配列を含む、複数のＤＮＡフラグメントを提供し；（ｂ）中型縦列繰り返し配列の一部分と相補性を有するヌクレオチド配列を含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを結合させた支持手段（例えば固定支持手段）を提供し；さらに（ｃ）前述の複数のＤＮＡフラグメントとこの支持手段とを、中型繰り返し配列を含むＤＮＡフラグメントおよび少なくとも１つの他のＤＮＡフラグメントが支持手段とハイブリダイズする条件下で混合する。
【００１５】
本発明のまた別の実施態様は、以下の工程を含む、スリップ増幅人工生成物を生じる傾向が低い多形性中型縦列繰り返し配列を検出する方法である；（ａ）少なくとも１つの標的中型縦列繰り返し配列を有するＤＮＡサンプルを提供し；さらに（ｂ）ＤＮＡサンプル中の標的中型縦列繰り返し配列を検出する。この実施態様では１．１％未満の平均スリップ増幅人工生成物が認められた。
【００１６】
本発明のまた別の実施態様は、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを用い、ＤＮＡサンプル中の問題の中型縦列繰り返し配列（以下では“標的中型縦列繰り返し配列”）を増幅させ、ＤＮＡサンプル中の標的中型縦列繰り返し配列を検出する方法を提供する。ここで、オリゴヌクレオチドプライマーは、中型縦列繰り返し配列を含むＤＮＡマーカーの領域と相補的でさらにこれと接する配列（以下では“中型縦列繰り返し配列鋳型”）を含み、ここでこのＤＮＡマーカーは配列番号：１から４３から成る配列群から選ばれる配列を有する。
【００１７】
また別の実施態様では、本発明は、少なくとも１つの標的中型縦列繰り返し配列をＤＮＡサンプル中型縦列繰り返し配列で検出するキットを提供する。このキットは、少なくとも１つの標的中型縦列繰り返し配列を増幅させる少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを含む容器を含み、このオリゴヌクレオチドプライマーは、中型縦列繰り返し配列鋳型を含む二本鎖ＤＮＡマーカーの領域の一部と相補的でこれと接するヌクレオチド配列を含み、このＤＮＡマーカーは配列番号：１から４３から成る群から選ばれる配列を有する。
さらに別の実施態様では、本発明は、中型縦列繰り返し配列鋳型に接するマーカー領域の二本鎖ＤＮＡマーカーの一方の鎖と相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーを提供する。ここで、ＤＮＡマーカーは配列番号：１から６、および配列番号：２８から３３から成る群から選ばれる配列を有する。
【００１８】
本発明の種々の実施態様の各々は、人間および他の動物の特定、法廷訴訟分析、実父確認、骨髄移植のモニタリング、遺伝子連鎖マップ作製および遺伝的疾患および癌の検出の分野で固有の用途を有する。異なる個体の少量の組織間で正確に識別する必要性は、法定訴訟での適用で特に緊急を要する。法廷訴訟では、多くの有罪判決（無罪判決）がＤＮＡ型分け分析（ＳＴＲ遺伝子座の分析を含む）で左右される。
本発明の更なる目的、特色および利点は、以下の本発明の最良の実施態様および説明図から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、フィルターハイブリダイゼーションによる中型縦列繰り返しを濃縮する方法の工程模式図である。
【図２】図２は、５ヌクレオチド繰り返しＳ１５９の電気泳動図である。
【図３】図３は、４ヌクレオチド繰り返しｖＷＡの電気泳動図である。
【図４】図４は、５ヌクレオチド繰り返しＧ２１０の電気泳動図である。
【図５】図５は、４ヌクレオチド繰り返しＤ５Ｓ８１８の電気泳動図である。
【図６】図６は、５ヌクレオチド繰り返しＳ１５９のスリップ増幅百分率のスキャタープロットである。
【図７】図７は、５ヌクレオチド繰り返しＧ２１０のスリップ増幅百分率のスキャタープロットである。
【図８】図８は、４ヌクレオチド繰り返しＤ５Ｓ８１８のスリップ増幅百分率のスキャタープロットである。
【図９】図９は、４ヌクレオチド繰り返しｖＷＡのスリップ増幅百分率のスキャタープロットである。
【図１０】図１０は、ゲル電気泳動分離後の、５ヌクレオチド繰り返しＳ１５９の蛍光標識増幅フラグメントの蛍光画像スキャンの結果をレーザープリントした画像である。
【図１１】図１１は、ゲル電気泳動分離後の、５ヌクレオチド繰り返しＧ２１０の蛍光標識増幅フラグメントの蛍光画像スキャンの結果をレーザープリントした画像である。  図の縮尺は必ずしも正確ではなく、さらに、明瞭さと簡潔さの観点から本発明のある種の特色は縮尺が誇張されるか、または模式的に示されている。
【図１２】ＤＮＡマーカー又はそのプライマーの配列
【図１３】ＤＮＡマーカー又はそのプライマーの配列
【図１４】ＤＮＡマーカー又はそのプライマーの配列
【図１５】ＤＮＡマーカー又はそのプライマーの配列
【図１６】ＤＮＡマーカー又はそのプライマーの配列
【図１７】ＤＮＡマーカー又はそのプライマーの配列
【図１８】ＤＮＡマーカー又はそのプライマーの配列
【図１９】ＤＮＡマーカー又はそのプライマーの配列
【図２０】ＤＮＡマーカー又はそのプライマーの配列
【図２１】ＤＮＡマーカー又はそのプライマーの配列
【図２２】ＤＮＡマーカー又はそのプライマーの配列
【図２３】ＤＮＡマーカー又はそのプライマーの配列
【図２４】ＤＮＡマーカー又はそのプライマーの配列
【図２５】ＤＮＡマーカー又はそのプライマーの配列
【図２６】ＤＮＡマーカー又はそのプライマーの配列
【図２７】ＤＮＡマーカー又はそのプライマーの配列
【図２８】ＤＮＡマーカー又はそのプライマーの配列
【図２９】ＤＮＡマーカー又はそのプライマーの配列
【図３０】ＤＮＡマーカー又はそのプライマーの配列
【図３１】ＤＮＡマーカー又はそのプライマーの配列
【図３２】ＤＮＡマーカー又はそのプライマーの配列
【図３３】ＤＮＡマーカー又はそのプライマーの配列
【図３４】ＤＮＡマーカー又はそのプライマーの配列
【図３５】ＤＮＡマーカー又はそのプライマーの配列
【図３６】ＤＮＡマーカー又はそのプライマーの配列
【図３７】ＤＮＡマーカー又はそのプライマーの配列
【図３８】ＤＮＡマーカー又はそのプライマーの配列
【図３９】ＤＮＡマーカー又はそのプライマーの配列
【図４０】ＤＮＡマーカー又はそのプライマーの配列
【図４１】ＤＮＡマーカー又はそのプライマーの配列
【図４２】ＤＮＡマーカー又はそのプライマーの配列
【図４３】ＤＮＡマーカー又はそのプライマーの配列
【図４４】ＤＮＡマーカー又はそのプライマーの配列
【図４５】ＤＮＡマーカー又はそのプライマーの配列
【図４６】ＤＮＡマーカー又はそのプライマーの配列
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本明細書に開示した発明で種々の置換および改変が本発明の範囲を逸脱することなく実施できることは当業者には明白であろう。
Ａ．定義
本明細書で用いられるように、“中型縦列繰り返し”または“ＩＴＲ”は、少なくとも２回縦並びに繰り返される５から７塩基の配列を含むＤＮＡ配列の一領域を指す。ＩＴＲという用語はまた、５から７塩基を含む２つ以上の配列が縦並びに、または介在する塩基を伴って繰り返されるが、ただしこれら配列の少なくとも１つが少なくとも２回縦並びに繰り返されることを条件とするＤＮＡの一領域を包含する。ＩＴＲ内で少なくとも１回繰り返される各配列を本明細書では“繰り返し単位”と称する。
“ＩＴＲ多形性”とは、主として各染色体の同じ領域内の繰り返し単位の数が異なるために、個体集団内においてある染色体と別の染色体で長さが異なるゲノムＤＮＡ中のＩＴＲを指す。
【００２１】
本発明にしたがって特定および分析される中型縦列繰り返し配列は２つの一般的なカテゴリー（完全および不完全）に分類される。本明細書で用いられる“完全な”ＩＴＲとは、少なくとも２回縦並びに繰り返される５から７塩基のただ１つの繰り返し単位を含む二本鎖ＤＮＡの一領域を指す（例えば（ＡＡＡＡＴ）12）。本明細書で用いられるように、“不完全な”ＩＴＲとは、完全な繰り返し単位の少なくとも２つの縦列繰り返しおよび不完全な繰り返し単位の少なくとも１つの繰り返しを含むＤＮＡの一領域を指し、この場合、不完全な繰り返し単位は、完全な繰り返し単位の配列における１、２または３塩基の挿入、欠失または置換から生じるＤＮＡ配列から成る（例えば（ＡＡＡＡＴ）12（ＡＡＡＡＡＴ）5 ＡＡＴ（ＡＡＡＴＴ）4）。不完全なＩＴＲ配列はいずれも少なくとも１つの完全なＩＴＲ配列を含む。特に、ＩＴＲ配列はいずれも完全であるか不完全であるかにかかわず、少なくとも２回縦並びに出現する、下記式（Ｉ）で表される少なくとも１つの繰り返し単位配列を含む：
（ＡｗＧｘＴｙＣｚ）ｎ      （Ｉ）
式中、Ａ、Ｇ、ＴおよびＣは任意の順序のヌクレオチドを表し、ｗ、ｘ、ｙおよびｚは当該配列の各ヌクレオチドの数を示し、その範囲は０から７であるがｗ＋ｘ＋ｙ＋ｚの合計は５から７の間で、ｎは当該配列が縦並びに繰り返される数を表し、少なくとも２である。
【００２２】
“５ヌクレオチド縦列繰り返し”とは、上記に定義した“中型縦列繰り返し”多形性のサブクラスを指す。また別に特定しないかぎり、“５ヌクレオチド縦列繰り返し”は、繰り返し配列が５塩基の配列である完全なＩＴＲ、および少なくとも１つの繰り返し単位が５塩基の繰り返しである不完全ＩＴＲを包含する。
“ＤＮＡマーカー”とは、ＩＴＲ配列、例えばゲノムＤＮＡの一領域を増幅することによって製造したＩＴＲ配列を含むＤＮＡフラグメントを指す。個々のマーカーはそれぞれ、究極的に集団内のただ１つの個体に由来するゲノムＤＮＡのただ１つの対立形質を含む。
“遺伝子座”という用語はＤＮＡの特定の領域を指す。ゲノムＤＮＡの一領域を指すために用いられる場合は、“遺伝子座”は染色体の特定の場所を指す。同じゲノムの遺伝子座は、集団内のいずれの個体についても相同染色体の各対上で同一の部位に出現する。そのような染色体の各々の同じ遺伝子座に存在するＤＮＡ配列、または同じそのような染色体から発生するＤＮＡの同じ遺伝子座は、“対立形質”と称される。
【００２３】
本明細書で用いられる“多形性”という用語は、同じ種の個々の生物集団のゲノムＤＮＡで見出される少なくとも２つの染色体で観察される遺伝子座の対立形質における変動を指す。“多形性”という用語は、他の担体（例えばＤＮＡベクターまたは別の生物体の染色体ＤＮＡ）中にクローン化された染色体フラグメントの同じ遺伝子座から得られたＤＮＡ配列の変動を含む。
本明細書で用いられるように、“ＩＴＲ隣接配列”とは、ＩＴＲを含むＤＮＡ配列の鎖上でＩＴＲと隣合うヌクレオチド配列をいう。その完全な配列の一部分としてＩＴＲ隣接配列を含む配列はそれ自体隣接配列である。
【００２４】
本明細書で用いられる“オリゴヌクレオチドプライマー”という用語は、３つより多いデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドで構成される分子と定義される。各プライマー配列は鋳型の配列を正確に反映する必要はないが、当該配列が鋳型との相補性をより正確に反映すればするほど、鋳型との結合性は良好である。その正確な長さおよび配列は、当該オリゴヌクレオチドプライマーの最終的な機能および用途に関係する多くの因子（温度、プライマーの配列、および方法の有効性を含む）に左右されるであろう。本発明の各オリゴヌクレオチドプライマーは、ＩＴＲ配列に隣接するＤＮＡマーカーの配列と相補的な核酸配列を含む。本発明のオリゴヌクレオチドプライマーは、核酸の１つの鎖と相補的なプライマー伸長生成物の合成を誘発する条件下に置いた場合、合成の開始点として機能することができる。当該条件には、ヌクレオチドおよび誘発剤の存在、例えば適切な温度およびｐＨ下でのＤＮＡポリメラーゼの存在が含まれる。好ましい実施態様では、当該プライマーは、誘発剤の存在下で特定の配列から伸長生成物の合成を開始させるために十分な長さをもつ一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドプライマーの感受性および特異性は、プライマーの長さおよび与えられた鋳型ＤＮＡサンプル内の配列の固有性によって決定される。本発明では、オリゴヌクレオチドプライマーは通常はおよそ１５塩基より大きく、好ましくは長さが約２０から４０塩基である。
【００２５】
“オリゴヌクレオチドプライマー対”という用語はプライマー対を指し、各々は同じＩＴＲに隣接する二本鎖ＤＮＡの向き合う鎖と相補的なデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド配列を含む。本発明のオリゴヌクレオチドプライマーの各対は、好ましくはただ１つのＩＴＲを検出するために選別される。各プライマー配列は鋳型の正確な配列を反映する必要はないが、当該配列が鋳型との相補性を正確に反映すればするほど、鋳型との結合は良好である。
【００２６】
“伸長生成物”とは、オリゴヌクレオチドプライマーの３’末端から合成され、さらに当該オリゴヌクレオチドが結合している鎖と相補的であるヌクレオチド配列を指す。
本明細書で用いられる“オリゴヌクレオチドプローブ”という用語は、標的配列の一部分（例えばＤＮＡサンプルの中型縦列繰り返し配列）と相補的な配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡの一本鎖分子を指し、ここで相補性を有する当該部分は、プローブが標的配列とハイブリダイズするために十分な長さを有する。
【００２７】
本明細書で用いられるように、“スリップ増幅人工生成物”という用語は、標的ＤＮＡの１つまたは２つ以上の分子を検出する場合に観察される固有のタイプの人工生成物を指す。この場合、標的ＤＮＡは同じ繰り返し単位配列（本発明にしたがって検出および分析される標的中型縦列繰り返し配列を含む）の縦列繰り返しを含む。長さによるサンプル中の全ＤＮＡの分離後に任意のそのような標的ＤＮＡを含むサンプルが検出される場合、標的ＤＮＡ分子の各々はメジャーシグナルを（例えばゲルのメジャーバンド）を生じるが、マイナーシグナルも各メジャーシグナルの直ぐ近くに検出できる。一般に、このマイナーシグナルは、１つまたは２つ以上の繰り返し単位が標的ＤＮＡ配列に付加または欠失したために標的ＤＮＡと長さが異なるＤＮＡフラグメントが検出されたために生じる。スリップ増幅人工生成物は、ＤＮＡの複製中に（in vivoおよびin vitroの両方で）スリップした鎖の対合形成の誤りによるものとされた（例えば以下の文献を参照されたい：Levinson & Gutman(1987), Mol. Biol. Evol. 4(3):203-221; Schlｏtterer & Tauz(1992), Nucleic Acids Research 20(2):211-215）。そのような人工生成物は、そのような任意の繰り返し配列を含むＤＮＡがin vitroでポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のような増幅方法を用いて増幅される場合に特に明瞭である。なぜならば、サンプル中に存在するか、またはポリマー生成中に生産される一切のマイナーフラグメントがメジャーフラグメントともに増幅されるからである。
【００２８】
本明細書で用いられる“スリップ増幅人工生成物百分率”という用語は、ただ１つの供給源（例えばただ１つの細菌コロニーまたはゲノムＤＮＡのただ１つの染色体）から得られたＤＮＡサンプルで観察されるメジャー（すなわち標的）シグナルの大きさに対するマイナー（すなわち人工生成物）シグナルの大きさの比較を指す。スリップ増幅人工生成物百分率は増幅されていないＤＮＡで決定することができるが、好ましくは少なくとも１つの標的中型縦列繰り返し配列の増幅後に決定される。“スリップ増幅人工生成物平均百分率”という用語は、１つの集団内で少なくとも２０の対立形質を含む代表的サンプルで検出されたスリップ増幅人工生成物百分率の測定値から得られたスリップ増幅人工生成物百分率の平均を指す。
【００２９】
本明細書で用いられるように“ゲノムＤＮＡ”という用語は、基本的にゲノムＤＮＡに由来する一切のＤＮＡを指す。この用語には、例えば異種生物のクローン化ＤＮＡ、完全ゲノムＤＮＡおよび部分的ゲノムＤＮＡ（例えばただ１つの単離染色体のＤＮＡ）が含まれる。
本発明によって検出または単離されるＤＮＡは一本鎖でも二本鎖でもよい。例えば、本発明での使用に適した一本鎖ＤＮＡは、細菌ファージ、細菌、またはゲノムＤＮＡのフラグメントから得ることができる。本発明での使用に適した二本鎖ＤＮＡは、中型縦列繰り返し配列をもつＤＮＡを含む多数の種々の供給源のいずれからも得ることができる。これらＤＮＡ供給源には、ファージライブラリー、コスミドライブラリーおよび細菌ゲノムまたはプラスミドＤＮＡ、並びにいずれかの真核細胞生物から単離されたＤＮＡ（ヒトゲノムＤＮＡを含む）が含まれる。ＤＮＡは好ましくはヒトゲノムＤＮＡから得られる。多数のヒトゲノムＤＮＡ供給源のいずれも用いることができるが、これらには医療用または法廷訴訟用サンプル、例えば血液、精液、膣スワブ、組織、毛髪、唾液、尿および体液混合物が含まれる。そのようなサンプルは、新しいものでも古いものでも乾燥したものでも、および／または部分的に分解したものでもよい。サンプルは犯罪現場の証拠物件から採集できる。
【００３０】
Ｂ．ＩＴＲを含む多形性ＤＮＡマーカーを単離する方法：
本発明の実施態様の１つは、ハイブリダイゼーション選別を用いてＩＴＲを含むＤＮＡフラグメントを単離する方法である。本方法は以下の工程を含む：（ａ）少なくとも１つのＤＮＡフラグメントがＩＴＲを含む、複数のＤＮＡフラグメントを提供し；（ｂ）中型縦列繰り返し配列の一部分と相補的なヌクレオチド配列を含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを結合させた支持体手段を提供し；（ｃ）当該複数のＤＮＡフラグメントと当該支持体手段とを、ＩＴＲ配列を含有するＤＮＡフラグメントのいずれかを含むＤＮＡフラグメントが支持体手段とハイブリダイズする条件下で混合する。
【００３１】
本方法の工程（ａ）で提供される複数のＤＮＡフラグメントはＩＴＲを含む任意のＤＮＡサンプルをフラグメント化して得ることができるが、好ましくはゲノムＤＮＡをフラグメント化して得られる。例えば以下の文献を参照されたい：Current Protocols in Human Genetics(1994), Chapter 2: Development of Genetic Markers, Construction of Small-Insert Libraries from Genomic DNA, p.2.2.1およびそれ以降（これは参照により本明細書に含まれる))。工程（ａ）で使用する複数のＤＮＡフラグメントを調製する最も好ましい方法は以下を含む工程にしたがう：サンプルＤＮＡをフラグメント化し、それによって、少なくとも１つのＤＮＡフラグメントがＩＴＲを含むＤＮＡフラグメント集団を作製し；当該ＤＮＡフラグメント集団に各ＤＮＡフラグメントの少なくとも一方の末端にプライミング配列を含むリンカーを連結し；さらに、プライミング配列と相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーを用いて各リンカー連結フラグメントを増幅させる。異なるリンカーを各フラグメントの各々の末端に連結することができる。しかしながら、リンカーのプライミング配列と相補的な配列を有するただ１つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅させることができるように、好ましくはただ１つのリンカーを各末端に連結する。リンカー連結は、好ましくはＴ４ＤＮＡリガーゼのようなリガーゼ酵素の存在化で実施する。
【００３２】
本方法の工程（ａ）で供給される複数のＤＮＡフラグメントを製造するために、多数の異なる手段のいずれも用いることができる。これらには、超音波処理または少なくとも１つの制限酵素によるフラグメント化が含まれるが、二本鎖ＤＮＡは制限酵素でのみフラグメント化できる。二本鎖ＤＮＡサンプルをフラグメント化するために制限酵素を用いる場合は、好ましい制限酵素は一本鎖の突出部を残す４塩基対認識配列をもち、さらに問題のＩＴＲ領域内でＤＮＡサンプルを切断しない酵素である。二本鎖ＤＮＡサンプルのフラグメント化で使用する好ましい制限酵素には、ＭｂｏＩ、ＡｃｉＩ、ＢｆａＩ、ＤｐｎＩＩ、ＨｈａＩ、ＨｉｎＰ１Ｉ、ＨｐａＩＩ、ＭｓｅＩ、ＭｓｐＩ、ＮｌａＩＩＩ、Ｓａｕ３ＡＩ、ＴａｑＩ、Ｃｓｐ６ＩおよびＴａｉＩが含まれる。
【００３３】
上記のように製造されたリンカー連結ＤＮＡフラグメントは、続いて増幅反応を用いて増幅される。これらの増幅反応は、例えばポリメラーゼ連鎖反応（米国特許第４６８３２０２号（K.B. Mullis)）、核酸配列依存増幅（ＮＡＳＢＡ）（Kievits et al.(1991) J. Virol. Methods 35(3):273-286）、連結仲介増幅（Volloch et al.(1994) Nucleic Acids Res. 22(13):2507-2511）、鎖置換増幅（Walker et al.(1992) PNAC 89(1):392-396）、配列非依存性単一プライマー増幅（ＳＩＳＰＡ）（Reyes(1991) Mol. Cell Probes 5(6):473-481)またはリガーゼ連鎖反応（米国特許第５６８６２７２号（Marshall et al))である。
【００３４】
本方法の工程（ｂ）で提供される支持体手段は、少なくとも１つの標的オリゴヌクレオチドを結合させた固定支持体を含む。固定支持体は、好ましくはオリゴヌクレオチドを直接または間接的にカップリングさせることができる物質を含む。オリゴヌクレオチドを直接カップリングさせることができる適切な物質には、ニトロセルロース、ナイロン、ガラス、シリカ、およびラテックスが含まれる。
本方法の好ましい本実施態様で使用する適切な固定支持体の例には、ナイロン膜、シリカ粒子を埋め込んだフィルター、ガラスビーズ、シリカ磁性粒子、またはシリカ含有樹脂が含まれる。オリゴヌクレオチドに結合させた第一のカップリング剤および固定支持体表面に結合させた第二のカップリング剤によってオリゴヌクレオチドに間接的にカップリングさせることができる適切な物質には、アビジンとストレプトアビジン、または抗原とそれに対する抗体が含まれる。
【００３５】
固定支持体に結合させる少なくとも１つの標的オリゴヌクレオチドには、ＤＮＡフラグメントの中型縦列繰り返し配列の一部分と相補的なヌクレオチド配列が含まれる。本明細書で用いる“部分”という用語は、前述の配列と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが、当該配列と接触するときにそれとハイブリダイズすることができるように十分な長さを有するＤＮＡフラグメントのＩＴＲ領域内のヌクレオチド配列を指す。この“部分”は、好ましくは長さが少なくとも２０塩基、より好ましくは少なくとも４０塩基の配列である。より好ましくは、標的オリゴヌクレオチドは、式（ＡｗＧｘＴｙＣｚ）ｎによって示される式を有する。式中、Ａ、Ｇ、ＴおよびＣはヌクレオチドを表し、これらはどのような並び方でもよく；ｗ、ｘ、ｙおよびｚは配列内の各ヌクレオチド数を表し、その範囲は０から７で、ｗ＋ｘ＋ｙ＋ｚの合計は５から７の間で；ｎは配列が縦並びに繰り返される回数で、少なくとも約４回、より好ましくは少なくとも約８回、最も好ましくは少なくとも１５回である。
【００３６】
本方法の工程（ｃ）では、複数のＤＮＡフラグメントは、ＩＴＲ含有ＤＮＡフラグメントが支持体手段とハイブリダイズする条件下で当該支持体手段と混合される。当該複数のフラグメントが複数の二本鎖ＤＮＡフラグメントである場合は、当該ＤＮＡは支持体手段とのハイブリダイゼーションの前に変性させる。ハイブリダイゼーションの前に二本鎖ＤＮＡフラグメントを変性させる適切な手段には、二本鎖ＤＮＡを変性させるために十分に高い温度にＤＮＡを暴露するか、または変性溶液にＤＮＡを暴露することが含まれる。ＤＮＡは好ましくは、変性剤（例えば塩基（例えば水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウム))を含む変性溶液を用いて変性させる。ＤＮＡフラグメントを変性させるために塩基が用いられる場合は、得られる混合物のｐＨは、好ましくはｐＨ約４．８から当該混合物のｐＨの緩衝液を添加することによってほぼ中性ｐＨに調節される。
【００３７】
いったんＤＮＡフラグメントが支持体手段にハイブリダイズしたら、好ましくはこの支持体手段を洗浄して、ＤＮＡフラグメントを除去し、さらに支持体手段が含まれる一切の溶液中に存在する一切の他の物質、またはハイブリダイズしなかった支持体手段の表面に存在する一切の他の物質を除去する。使用されるいずれの洗浄溶液も、好ましくは支持体手段とハイブリダイズしたＤＮＡフラグメントを遊離させることなくそのような物質を除去するように構成される。
【００３８】
支持体手段とハイブリダイズしたＤＮＡフラグメントは、支持体手段とＤＮＡフラグメントとの結合の性質にしたがって熱または適切な遊離溶液を用いて、支持体手段から遊離させることができる。例えば、水または低塩類水溶液（例えばＴＥ緩衝液（例えば１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭのＥＤＴＡ))を用いて、シリカ材料で構成された支持体手段とハイブリダイズしたＤＮＡフラグメントを遊離させることができる。支持体手段から一度遊離させたら、得られた遊離ＤＮＡフラグメントの混合物に存在する他のＤＮＡフラグメントからＩＴＲ配列を含むＤＮＡをさらに単離するためにＤＮＡフラグメントを処理することができる。さらなる処理工程は、上記の本方法にしたがって再ハイブリダイゼーションおよびスクリーニング、またはＤＮＡベクターへのクローニングおよびこれらクローンによる形質転換体のスクリーニングを含むことができる。
【００３９】
図１は、ＩＴＲを含むＤＮＡフラグメントを単離する方法の好ましい実施態様を示す。この態様では、ＤＮＡフラグメント集団を調製し、支持体手段とハイブリダイズさせ、さらに増幅、クローニングおよびＩＴＲ含有形質転換体をスクリーニングする。図１に示す工程の各々はローマ数字で表示されている。工程Ｉは二本鎖ＤＮＡ分子（１）を示し、これは制限酵素（２）で消化され、サイズの異なるＤＮＡフラグメント集団（図には示されていない）を生じ、そのうちの少なくとも１つは標的ＩＴＲを含む。工程ＩおよびＩＩの間の矢印はリンカー（３）を示し、これはＤＮＡフラグメント集団に添加され、異なる２種類のＤＮＡフラグメント（標的ＩＴＲ配列を含むフラグメント（６）と標的配列を含まないフラグメント（４))の各々の末端にリンカー（３）をもつリンカー連結フラグメント（８）集団を生じる。各リンカー（３）のプライミング配列と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドプライマー（７）を工程ＩＩＩのＤＮＡフラグメント（８）集団に添加し、ＰＣＲ反応により増幅し、それによって増幅ＤＮＡフラグメント（９）の集団を製造する。工程増幅ＤＮＡフラグメント（９）の集団を容器（１５）にハイブリダイゼーション溶液（１２）およびフィルター（１０）とともに入れる。このフィルター（１０）には、標的ＩＴＲ配列の一部分と相補的な配列を有する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが結合されている。ハイブリダイゼーション溶液は、ＩＴＲ配列を含むＤＮＡフラグメントのフィルターへのハイブリダイゼーションを促進する。工程Ｖでは、フィルター（１０）を容器（１５）から取り出し、それにハイブリダイズしたＤＮＡフラグメントを当該フィルターから遊離させる。得られた遊離フラグメントの濃縮集団を、工程ＩＩＩの増幅反応で用いたものと同じオリゴヌクレオチドプライマー（７）を用いて工程ＶＩで再度増幅させる。最後に、工程ＶＩＩで濃縮増幅ＤＮＡフラグメント集団の各々のフラグメントをプラスミドベクターでクローニングする。標的ＩＴＲ配列（６）を含むフラグメントをクローニングしたベクターおよびＩＴＲ配列を含まないフラグメント（４）をクローニングしたベクターが工程ＶＩＩに示されている。
【００４０】
Ｃ．スリップ増幅が低い多形性ＩＴＲを検出する方法：
標的ＩＴＲ配列を有するＤＮＡサンプルの標的ＩＴＲ配列を本方法のこの具体的な実施態様で検出するとき、最小のスリップ増幅人工生成物が観察される。観察された平均スリップ増幅人工生成物は好ましくは１．１％未満、より好ましくは０．９％未満である。標的ＩＴＲ配列は完全なＩＴＲでも、不完全なＩＴＲ配列でもよい。検出されるＤＮＡサンプルは好ましくはゲノムＤＮＡである。
平均スリップ増幅人工生成物は好ましくはＤＮＡサンプルのＩＴＲ配列の増幅後に検出される。
【００４１】
Ｄ．プライマー、プローブおよびマーカー
本発明はまた、配列番号：１−４３として下記の配列表で特定したＤＮＡマーカー、プライマー（各プライマーは、これら４３配列の１つによって特定されたＤＮＡマーカーの１つのＩＴＲ領域に隣接する配列と相補的な配列を有する）、およびプローブ（４３マーカーの１つのＩＴＲ領域内に含まれる配列と相補的な配列を有する）を含む。下記の実施例で説明する実験で特定された特に好ましいプライマーは表１に列挙する。
下記の実施例は説明のために提供され、本発明を全く制限しようとするものではない。実施例では、全ての百分率は、固体については重量により、液体については容積による。全ての温度は特に記載がなければ摂氏である。
【００４２】
【表１】
0005898829.tif 000002
【００４３】
【表２】
0005898829.tif 000003
【００４４】
【表３】
0005898829.tif 000004
【００４５】
【表４】
0005898829.tif 000005
【００４６】
【表５】
0005898829.tif 000006
【００４７】
【表６】
0005898829.tif 000007
【実施例】
【００４８】
実施例１：完全ゲノムＰＣＲライブラリーの構築
本実施例および下記の実施例２で用いる個々の増幅およびハイブリダイゼーション選別は、文献に記載された選別方法の改変様式である（J. Armor et al.(1994) Hum. Mol. Genet. 3(4):599-605)）。
ヒトゲノムＤＮＡは、１５人から得た全血プールから標準的フェノール：クロロホルム抽出法（"Current Protocols in Human Genetics"(1994), J. Gilber, ed., Appendix)を用いて精製した。
ＤＮＡ１μｇ当たり５単位のＭｂｏＩ制限酵素を用いて、約１００μｇのゲノムＤＮＡを１６時間３７℃で切断し、続いてフェノール：クロロホルム抽出、エタノール沈澱で精製し、さらに１００μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０))に最終濃度約１μｇ／ｍｌでＤＮＡを再懸濁した。
サイズが２５０−６００ｂｐの範囲のＤＮＡフラグメントを１％ＳｅａＫｅｍＧＴＧ（FMC Bio Products, Rockland, Maine)調製用アガロースゲル（１５ｘ２０ｃｍ）上で１００Ｖで１．２５時間ゲル電気泳動を実施して単離し、電気溶出（リファレンス）によって回収した。Ａ２６０での吸収を測定してＤＮＡを定量し、滅菌したナノピュア純度の水で５００ｎｇ／μｌに希釈して−２０℃で保存した。
【００４９】
リンカーは、等モル量のオリゴＡ（５’−ＧＣＧ  ＧＴＡ  ＣＣＣ  ＧＧＧ  ＡＡＧ  ＣＴＴ  ＧＧ−３’）および５’燐酸化オリゴＢ（５’−ＧＡＴ  ＣＣＣ  ＡＡＧ  ＣＴＴ  ＣＣＣ  ＧＧＧ  ＴＡＣ  ＣＧＣ−３’）を最終濃度１０００ピコモル／μｌでアニールして調製した。サイズ選別した挿入ＤＮＡ（平均サイズ４２５ｂｐを３．５ピコモル）１μｇを１３μｇ（８７５ピコモル）のリンカー（リンカー：挿入物モル比は２５０：１）と１−３単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを１６時間１５℃で用いて連結した。過剰なリンカーおよびリンカー二量体はゲル電気泳動（１％SeaKem GTGアガロース、１．５時間、１００Ｖ）で主要フラグメントから分離した。リンカー連結ＤＮＡフラグメントを電気溶出によってゲルから回収し、５０μｌの滅菌水に再懸濁した。
【００５０】
連結リンカーをもつＤＮＡ（５０ｎｇ）を、１０μｌの１０ＸＳＴＲ緩衝液（５００ｍＭのＫＣｌ、１００ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、１５ｍＭのＭｇＣｌ2、１％トリトンＸ−１００および２ｍＭの各ｄＮＴＰ）、１μｌのＴａｑポリメラーゼ（５単位／μｌ）、および１μＭのオリゴＡプライマー（１０ピコモル／μｌのストックの１０μｌ）を含む１００μｌの反応容積でＰＣＲを用いて増幅した。この反応でプライマーとして用いた“オリゴＡ”は、上記のようにＭｂｏＩリンカーを集めるために用いた“オリゴＡ”と同じである。循環条件は９５℃１分、６７℃１分、７０℃２分で３０サイクルであった。ｄＮＴＰ、プライマーおよびプライマー二量体はセントリコン１００による微小ろ過で除去した（２ｍｌの滅菌水をサンプルに添加し、セントリコン−１００に加え、２０００ＲＰＭで２０分遠心し、セントリコンフィルターを逆にしてさらに２分２０００ＲＰＭで遠心してＤＮＡを回収し、１００μｌの滅菌蒸留水に再懸濁した）。
得られたＰＣＲライブラリーの５μｌの部分標本を１％アガロースゲルで検査し（１００ボルトで１時間）、サイズ範囲が２５０から６００ｂｐであることを確認した。
【００５１】
実施例２：ハイブリダイゼーション選別による５ヌクレオチド繰り返しの濃縮  実施例１にしたがって製造した完全ゲノムＰＣＲライブラリーから得た種々の異なる繰り返しを含むＤＮＡフラグメントを、固形支持体に結合させた種々のオリゴヌクレオチド混合物を用いてハイブリダイゼーションによって濃縮した。（ＡＡＡＡＸ）ｎの５ヌクレオチド繰り返しを含むフラグメントをハイブリダイゼーション選別によって濃縮した。この工程は、先ずハイブリダイゼーション選別で使用するオリゴヌクレオチドを構築することによって達成された。このオリゴヌクレオチド構築物は、長さが１０００ｂｐの中に（ＡＡＡＡＣ）ｎ、（ＡＡＡＡＧ）ｎおよび（ＡＡＡＡＴ）ｎが縦並びに並べられたものから成る。これらのオリゴヌクレオチドを膜に固定し、完全ゲノムＰＣＲライブラリーとハイブリダイズさせて（ＡＡＡＡＸ）ｎの繰り返しを含むフラグメントを選別した。
【００５２】
オリゴヌクレオチドアレイは以下のように構築した：（ａ）５’−燐酸化３０量体オリゴヌクレオチドである〔ＡＡＡＡＣ〕6、〔ＡＡＡＡＧ〕6、および〔ＡＡＡＡＴ〕6並びにそれらの相補物、〔ＧＴＴＴＴ〕6、〔ＣＴＴＴＴ〕6および〔ＡＴＴＴＴ〕6を合成し、ナノピュアの純度の水に１０００ピコモル／μｌの濃度で懸濁し、（ｂ）相補配列をもつ等モル濃度（各々１０μｌまたは１０ナノモルもしくは１９８μｇを用いた）のオリゴヌクレオチドを混合し、６５℃で１５分加熱し、さらに数時間４℃に置いて互いにアニールさせ、（ｃ）続いてＤＮＡ１μｇにつき１ワイス単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを１５℃で一晩用いてアニールしたオリゴヌクレオチドを互いに連結し、（ｄ）２００ｂｐ以上の連鎖体を１％ＳｅａＫｅｍＧＴＧアガロースでサイズ選別し、（ｅ）連結ＤＮＡをプライマー非含有ＰＣＲに付して縦列アレイを延長し、（ｆ）見かけのサイズが１０００ｂｐを越えるフラグメントを１％アガロースゲルから回収し、微小ろ過によって精製した。Ａ260での吸収を求め、ナノピュア純度の滅菌水で１μｇ／μｌのストックを作製した。
【００５３】
合計１μｇのオリゴヌクレオチド、（ＡＡＡＡＣ）200、（ＡＡＡＡＧ）200または（ＡＡＡＡＴ）200で４ｍｍｘ４ｍｍ片のナイロン製ハイボンドＮｆｐ膜（Amersham Life Sciences, Inc)フィルターにスポットを作製し、２回予備ハイブリダイゼーション緩衝液で３０分攪拌しながら洗浄して弱く結合したオリゴを除去して風乾し、ＤＮＡを結合させるために１２００μジュールでＵＶ架橋連結を施し、続いて−２０℃で保存した。
【００５４】
上記のようにナイロンフィルターに結合させたオリゴヌクレオチドを有する支持媒体との完全ゲノムＰＣＲライブラリーのハイブリダイゼーション選別は、以下のように実施した：（ａ）１ｍｌの予備ハイブリダイゼーション緩衝液〔１％ＢＳＡ（Sigma B-4287）、１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、７％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ、０．５ＭのＭａ2ＨＰＯ4〕で、前述のフィルターを（ＡＡＡＡＣ）ｎおよび（ＡＡＡＡＧ）ｎの配列を有するオリゴヌクレオチドを含むフィルターについては４０℃で、さらに（ＡＡＡＡＴ）ｎの配列を含むフィルターについては３７℃で予備ハイブリダイズした。２０分後に緩衝液を除去し、１００μｌの新しい予備ハイブリダイゼーション緩衝液を添加し、（ｂ）完全ゲノムＰＣＲライブラリーＤＮＡ（２０μｇ）をアルカリ（ＫＯＨ、最終濃度１５０ｍＭ）で変性させ、さらに０．２５容の１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ４．８）を加えて中性にし、フィルターを含む緩衝液に加えた。得られた反応混合物を予備ハイブリダイゼーション温度（３７℃または４０℃）で一晩保温し、（ｃ）（ＡＡＡＡＣ）200および（ＡＡＡＡＧ）200フィルターを２回１ｍｌの洗浄緩衝液＃１（４０ｍＭのＮａ2ＨＰＯ4（ｐＨ７．２）、０．１％ＳＤＳ）で４０℃で洗浄し、さらに１回室温で１５分攪拌しながら洗浄した。（ＡＡＡＡＴ）200のフィルターは１ｍｌの洗浄緩衝液＃１で１回３７℃で洗浄し、さらに１回室温で洗浄し、（ｄ）各フィルターに結合したＤＮＡを９５℃で５分、１００μｌのナノピュア純度の水の中で加熱して遊離させた。再アニーリングを９５℃で防止しながらサンプルを取り出した。フィルターは、０．４ＭのＮａＯＨで４５℃３０分保温し、続いて０．１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、０．２Ｍトリス（ｐＨ７．５）に移し、さらに１５分保温することによって清浄にし再使用した。膜にブロットを付け乾燥させ、栓をした試験管に入れて−２０℃で保存した。
【００５５】
実施例３：５ヌクレオチド繰り返しが濃縮されたＤＮＡフラグメントライブラリーのクローニング
実施例２のようにして５ヌクレオチド繰り返しが濃縮されたＤＮＡフラグメント集団をＰＣＲによって再度増幅した。続いて再増幅フラグメントを下記に述べるようにプラスミドベクターｐＧＥＭ−３Ｚｆ（＋）でクローニングした。この工程は、選別挿入物をｐＧＥＭベクターに連結し、続いて環状プラスミドでＪＭ１０９大腸菌ホストを形質転換することによって実施された。
【００５６】
挿入物とベクターとの連結は以下のように実施した：（ａ）ハイブリダイゼーションで選別した５μｌのＤＮＡを１００μｌの反応容積で以下を用いて再増幅した：１ＸＳＴＲ緩衝液（５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、１．５ｍＭのＭｇＣｌ2、０．１％トリトンＸ−１００および各ｄＮＴＰを０．２ｍＭ）、１μｌのＴａｑポリメラーゼ（５単位／μｌ）、および１μＭのオリゴＡプライマー（１００ピコモル／μｌのストックを１μｌ）。循環条件は９５℃１分、６７℃１分、７０℃２分で３０サイクル。（ｂ）１１μｌのプロメガ制限酵素１０Ｘ緩衝液Ｃおよび２μｌ（８単位／μｌ）のＭｂｏＩを１００μｌのＰＣＲ反応に添加し、得られた反応混合物を３７℃で一晩保温し、６５℃で２０分混合物を保温して制限酵素を熱不活化することによって、再増幅したＤＮＡを消化した。（ｃ）ｐＧＥＭ−３Ｚｆ（＋）ベクター（約２０μｇまたは１０．６ピコモル）を、ＢａｍＨＩ（５単位／μｇ）で１６時間３７℃で消化し、続いて適切な量のウシ腸アルカリホスフェート（Calf Intestinal Alkaline Phosphate, CIAP）１０Ｘ緩衝液（Promega)および1 μｌのＣＩＡＰ（単位／μｌ）を加え、さらに３７℃で１時間保温してフラグメント挿入のために準備した。
この反応を０．５ＭのＥＤＴＡを０．０２Ｍの最終濃度で添加して停止し、続いてフェノール抽出しエタノールで沈澱させＴＥ緩衝液に１μｇ／μｌで再懸濁させた。（ｄ）最後に１μｌまたは２００ｎｇの脱燐酸ｐＧＥＭ３Ｚｆ（＋）（工程ｃ参照）および１μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼ（１から３単位／μｌ）とともに、ＭｂｏＩで切断したＤＮＡ１μｌ（工程ｂ参照）を２時間室温で保温して、２０μｌの挿入物−ベクター連結を実施した。
最後に、テクニカルブリテン＃０９５に記載されたプロメガ形質転換プロトコルを用いて、１０μｌの挿入物−ベクター連結反応物で１００μｌのＪＭ１０９コンピテント細胞を形質転換した。
【００５７】
実施例４：（ＡＡＡＡＸ）ｎ５ヌクレオチド繰り返しを含む小挿入物ゲノムライブラリークローンのコロニーハイブリダイゼーションによる選別
ライトスミスＩＩ試薬およびプロトコル（プロメガテクニカルブリテン＃ＴＭ２２７を参照）を用いてコロニーハイブリダイゼーションスクリーニングによって、（ＡＡＡＡＸ）ｎ５ヌクレオチド繰り返しを含むクローンを選別し、アルカリホスファターゼ共役プローブとのハイブリダイゼーションにより可視化した。
【００５８】
細菌のコロニーを含む平板上にマグナグラフ（MagnaGraph）ナイロン膜（Micron Separations, Inc. Westboro, MA)を静置し、３分間放置して膜にコロニーＤＮＡを移し、続いて乾燥濾紙にブロッティングした。次に、以下を含む一連のトレーに膜を移した：１０％ＳＤＳで３分、続いて変性溶液（５ｍｌのＮａＯＨ＋３０ｍｌのＮａＣｌ＋６５ｍｌの蒸留水から成る）で５分、続いて中和溶液（３０ｍｌの５ＭＮａＣｌ＋２５ｍｌトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）＋４５ｍｌの蒸留水から成る）で５分、最後に２ＸＳＳＣで５分。続いて膜を室温で３０分乾燥させ、その後スタータリンカー（Statalinker(登録商標）、Stratagene, La Jolla, CA）を用いて１２００μジュールでＵＶ架橋する。
【００５９】
（ＡＡＡＡＸ）ｎ繰り返しをもつクローンを含むコロニーの検出は、ＡＰ共役プローブおよび化学発光を用いて実施した。ＡＰ共役プローブとハイブリダイズさせたフィルターでＸ線フィルムを感光させることによって、所望のクローンを含むコロニーが表示された。第二のハイブリダイゼーションは最初の結果を確認するために実施した。
【００６０】
この検出工程はプロメガ（Promega)のライトスミスＩＩキットを用いた（この工程の詳細な説明はプロメガブリテン＃ＴＭ２２７を参照のこと）。簡単に記せば、使用した検出方法は以下の工程から成る：（ａ）フィルターをクォンタムイールド（Quantum Yield(登録商標))封鎖溶液（プロメガカタログ番号Ｆ１０２１）で４５分５６℃で激しく攪拌しながら保温し、（ｂ）封鎖溶液を捨て、ＡＰプローブを含む膜の単位ｃｍ2当たり０．０５ｍｌのクォンタムイールド（登録商標）高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション溶液（プロメガカタログ番号Ｆ１２３１）を加え、激しく震盪しながら５６℃で４５分保温し、（ｃ）ハイブリダイゼーション溶液／プローブをフィルターから除き、フィルターを２回１５０−２００ｍｌの予め加温した洗浄溶液＃１（２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）で５６℃で１０分洗浄し、（ｅ）全てのフィルターを一緒にし、洗浄溶液＃２（１ＸＳＳＣ）で１回室温で１０分洗浄し、（ｆ）ブロットを２００ｍｌの１００ｍＭジエタノールアミン、１ｍＭのＭｇＣｌ2中で５分間平衡化させ、（ｆ）十分な０．２５ｍＭのＣＤＰ−スター基質（Tropix, Bedford, MA)を加えてフィルターを飽和させ、続いて少なくとも５分室温で保温し、（ｇ）この基質飽和フィルターをハイブリダイゼーションホルダー内のポリスチレンプラスチックシートプロテクター上に置き、ホルダーを閉じ、（ｈ）フィルムカセットにフィルターを含むハイブリダイゼーションホルダーを置き、その中のフィルターでＸ線フィルムを感光させ、（ｉ）少なくとも１時間、フィルムを感光させた後フィルムを現像する。
【００６１】
実施例５：ＤＮＡの配列決定および解析
細胞溶解物を用いる配列決定用鋳型を調製する単純化した方法を開発し、少なくとも１つの（ＡＡＡＡＸ）ｎ配列をもつ挿入物を多分に含むであろうと実施例４で同定された多数のクローンの配列を決定した。この方法は以下の工程から成る：陽性クローンをコロニーハイブリダイゼーションアッセイから２００μｌのＬＢ／Ａｍｐ（１００μｇ／ｍｌ）を含む滅菌９６穴（ウェル）マイクロプレート（Falcon Cat.#3072）に移し、一晩３７℃で２５０ｒｐｍで保温する。次にこの一晩培養を分割し、以下の３つの異なる工程で用いた：細胞溶解物の作製、最初の観察を確認するための第二のハイブリダイゼーション用レプリカフィルター作製、またはクローンの長期保存用グリセロールストックの作製。
【００６２】
細胞溶解物は２μｌの一晩培養を取り、これを９６穴反応プレート（Perkin Elmaer cat.#N801-0560）に入れた１００μｌのナノピュア純度の滅菌水に加え、９６００サーモサイクラーで４分１００℃で加熱して作製した。これを冷却し氷結させ、使用まで−２０℃で保存した。
９６ピンのレプリケーターを火炎滅菌し、このレプリケーターを一晩培養を含む９６穴プレートに浸漬し、ＬＢ／Ａｍｐ（１００μｇ／ｍｌ）プレート上の１３７ｍｍの丸いナイロン膜（MagnaGraph, MSI)に押しつけ、この膜を一晩３７℃で保温して、第二のハイブリダイゼーションアッセイ用複製フィルターを作製した。
残りの一晩培養は、４６μｌの８０％グリセロールを各ウェルに加えてグリセロールストックにし、２５０ｒｐｍに設定した振盪培養機に数分間プレートを置いて混合し、続いて−７０℃で保存した。
【００６３】
２つのコロニーハイブリダイゼーションアッセイで陽性であった全てのクローンを選別し、細胞溶解物プレートから得た対応するクローンをＰＣＲ増幅に用いた。ＰＣＲ反応生成物をキアゲンキアクイック（Qiagen QIAquick)９６ＰＣＲ精製プレート（カタログ番号＃２８１８０）で精製し、配列決定のために鋳型を用いた。２μｌの細胞溶解物を５０μｌのＰＣＲ反応物で用いた。当該反応物は、２μＭのＭ１３−４７前進方向プライマー（プロメガカタログ番号＃Ｑ５６０Ａ）、２μＭのＭ１３逆方向プライマー（プロメガカタログ番号＃Ｑ５４２Ａ）、１ＸＳＴＲ緩衝液、および２．５単位のＡｍｐｌｉＴａｑ（Perkin Elmer）を含んでいた。以下の循環プロフィールをＰＥ４８０サーモサイクラーで使用した：９６℃／２分で１サイクル、９４℃／１分、５６℃／１分、７０℃／１．５分で１０サイクル；９０℃／１分、５６℃／１分、７０℃／１．５分で２０サイクル；４℃で保持。ＰＣＲ反応生成物は、キアゲンキアクイック９６ＰＣＲ精製プレート（カタログ番号＃２８１８０）を用い製造元のプロトコルにしたがいクリーンアップし、７０μｌのトリス−ＨＣｌ１０ｍＭ（ｐＨ８．５）に最終濃度約３５ｎｇ／μｌで回収し、−２０℃で保存した。
【００６４】
ＤＮＡ配列決定は、ＡＢＩダイターミネーターシークェンシングケミストリー（ABI Dye Terminator Sequencing Chemistry)およびＡＢＩ３７７シークェンサーを用いて実施した。配列決定用鋳型はＡＢＩダイターミネーターキットおよび製造元のプロトコル（プロトコルＰ／Ｎ４０２０７８）を用いて調製した。２μｌまたは約３０から９０ｎｇの精製ＰＣＲ生成物（上記）を配列決定反応の鋳型ＤＮＡとして用いた。配列決定反応物は、８μｌのダイターミネーターミックス、２μｌの鋳型ＤＮＡ（３５ｎｇ／μｌ）、４μｌのＭ１３−２１前進方向プライマー（０．８μＭ）および６μｌのナノピュア純度の滅菌水から成っていた。
ジーンアンプ（GeneAmp)ＰＣＲシステム９６００でのサイクルシークェンシングの循環プロフィールは以下のとおりであった：９６℃／１０秒、５０℃／５秒、６０℃／４分で２５サイクル；４℃で保持。伸長生成物は５０μｌの９５％エタノールおよび２μｌの酢酸ナトリウム（３Ｍ）（ｐＨ４．６）を各試験管に添加し、ボルテックスミキサーを用いて混合し、氷上に１０分静置し、続いて最大速度で３０分遠心して精製した。ペレットを１５０μｌの７０％エタノールで洗浄し、真空遠心で約３分乾燥させ、乾燥状態で使用まで−２０℃で保存した。乾燥ペレットは６−９μｌのローディング緩衝液に再懸濁し、続いて２分９５℃で変性させ、ゲルに添加するまで氷上で保存した。
【００６５】
５％のロングレンジャー（Long Ranger)ゲル（FMC BioProducts, Rockland, ME)を製造元のプロトコルにしたがって調製し、２時間重合させた。ゲルを４５分１０００ボルトで予備泳動した。ローディング緩衝液中の１．５μｌの鋳型をゲルに添加し、２Ｘまたは４Ｘの条件下でそれぞれ３．５時間または７時間泳動した。
【００６６】
ＡＢＩ３７７シークェンサーから得られたＤＮＡ配列データを整理して一切のｐＧＥＭベクター配列を除去し、続いてジネティクスコンピュータグループ＝ウィスコンシンパッケージソフト（バージョン９．０）（Madison, WI)を用いて作製した、評価された全てのクローンの配列情報を含むローカルデータベースに入れた。次に、５量体繰り返しの存在、長さおよび配列パターンについてクローンを調べた。続いて５または６以上の繰り返しを含むものをＢＬＡＳＴ配列比較プログラム（Altschul et al., 1990)で比較し、複製されたクローンおよびＧｅｎＢａｎｋデータベース（National Center for Biotechnology Information in Besthesda, Maryland, USA)に既に存在するものを特定した。いったん固有のクローンが特定されたら、ＯＬＩＧＯプライマーアナリシスソフト（バージョン５．０）（National Biosciences, Inc., Plymouth, MN）を用いてＰＣＲのためのプライマーをデザインした。
【００６７】
実施例６：多形性レベルについてクローンをスクリーニングし染色体上の位置を決定する
多形性についての最初のスクリーニングは、２つのプールしたＤＮＡサンプルで実施した。このサンプルは一方は任意の１５人のヒトゲノムＤＮＡを含み、他方はＮＩＧＭＳヒューマンジネティックミュータントセルレポジトリから得られた５４人のＣＥＰＨ（CEPH Collection DNA Pool, Cat.#NA13421, Coriell Cell Repositories, Camden, NJ)を含む。蛍光で標識したＰＣＲプライマーをゲノムＤＮＡの標的遺伝子座のＰＣＲ増幅のために用い、ＰＣＲ生成物をポリアクリルアミドゲルで分離し、蛍光スキャナーで可視化した。４つの対立形質および５０％のヘテロ接合性をもつ遺伝子座を１６人のＣＥＰＨのＤＮＡ（１０２−１、１０２−２、８８４−１、８８４−２、１３３１−１、１３３１−２、１３３２−１、１３３２−２、１３４７−１、１３４７−２、１３６２−１、１３６２−２、１４１３−１、１４１３−２、１４１６−１、１４１６−２）とともに調べ、予備的なヘテロ接合性値を求めた。続いて同じ遺伝子座のデータさらに分析し、対立形質の数、対立形質の頻度およびヘテロ接合性値を求めた（表２参照）。
【００６８】
５量体繰り返し配列を含むことが分かったクローン（４以上の対立形質および５０％以上のヘテロ接合性の選別基準を満たす）をマッピングし、正確な染色体上の位置を決定した（表２参照）。マッピングには３つの異なる方法を用いた：（１）染色体上の起源を特定するために、ただ１つのヒト染色体を表す２６の体細胞ハイブリッド（Coriell Cell Repositories, Camden, NJ)のＮＩＧＭＳパネルを用いる体細胞ハイブリッドマッピング；（２）９３ＲＨクローン（Schuler et al., 1996）のＧｅｎｅＢｒｉｄｇｅ４ＲＨパネルを用いる放射ハイブリッドマッピング；および標準的減数分裂連鎖マッピングおよびＣＥＰＨ血族リファレンスパネル由来の８家族（Ｋ１０２、Ｋ８８４、Ｋ１３４７、１３６２、１３３１、１３３２、１４１３、１４１６）のＣＲＩ−ＭＡＰマルチポイント連鎖プログラム（Lander & Green, 1987）によるマッピング。
【００６９】
１６人のＣＥＰＨで７０％を越えるヘテロ接合性をもつクローンを、主要な四人種（アフリカ系アメリカ人、白人、アジア人およびスペイン語系アメリカ人を含む）に由来する１００人を越える個体を含むより大きな集団で遺伝型および対立形質頻度について調べた。図１０および１１は、ある集団内の２４の異なる個体に由来するゲノムＤＮＡサンプルの２つの異なる多形性ＩＴＲ遺伝子座から増幅させた対立形質の泳動は大きく変動することを示している（ＤＮＡサンプルＳ０２からＳ２５）。この分析で用いたプライマー対の配列については上記の表１を参照されたい。ゲル像は、蛍光標識プライマーを用いて各５ヌクレオチド繰り返し遺伝子座を増幅し、続いてポリアクリルアミドゲルで分離し、ＦＭＢＩＯＩＩ蛍光スキャナー（Hitachi Software Engineering America, Ltd., San Francisco, CA)で走査して可視化することによって作製した。各アッセイ遺伝子座について周知の対立形質を含む対立形質ラダーは、電気泳動ゲルの各々の端のレーン（レーンＳ０１およびレーンＳ２６）に含まれている。各遺伝子座を増幅するために用いたプライマー対は、上記の実施例で示したように、クローンＳ１５９またはクローンＧ２１０から単離されたＤＮＡマーカーの配列の少なくとも一部分と相補的な配列を有する。このプライマー対の配列は、上記の表１でクローンＳ１５９およびＧ２１０について列挙したプライマー対から選ばれた。
【００７０】
多形性スクリーンのためのＰＣＲ条件は以下のとおりであった：プールしたＤＮＡ鋳型については約２００ｎｇ、個々のＣＥＰＨのＤＮＡについては２５ｎｇ、１ＸＳＴＲ緩衝液、１単位ＴａｑＤＮＡポリメラーゼおよび１μＭの対応するプライマー対を含む２５μｌの反応物。表２に挙げたクローンの各々を増幅するために用いた各プライマー対の配列は表１に提供されている。各プライマーは表１に挙げた配列番号を割り当てられていることに留意されたい。パーキンエルマージーンアンプＰＣＲシステム９６００サーマルサイクラー（Perkin Elmer, Foster City, CA)のための循環条件は以下のとおりであった：９６℃１分；続いて９４℃３０秒、６０℃への下降６８秒、３０秒維持、７０℃への上昇５０秒、４５秒維持の１０サイクル；続いて９０℃３０秒、６０℃への下降６０秒、３０秒維持、７０℃への上昇５０秒、４５秒維持、６０℃３０分の２０サイクル。ＰＣＲサンプルは、２．５μｌの各サンプルと２．５μｌの２Ｘブロモフェノールブルーローディング溶液とを混合し、９５℃で２分加熱して変性させ、氷冷して調製し、続いて各サンプルの３μｌを４％ポリアクリルアミドゲルで４０Ｗで５０分泳動した。ＰＣＲ生成物は、ＦＭＢＩＯ蛍光スキャナー（Hitachi)で走査して可視化し、添付のソフト（ＦＭＢＩＯアナリシスバージョン６．０）（Hitachi Software Engineering, San Francisco, CA)で分析した。
【００７１】
【表７】
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【００７２】
【表８】
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【００７３】
【表９】
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【００７４】
実施例７：ＧｅｎＢａｎｋ検索による短い縦列繰り返しの特定
縦並びに繰り返される配列を特定するまた別の方法は、中型縦列繰り返しの有無について米国立遺伝子工学情報センター（National Center for Biotechnology Information(NCBI))のＧｅｎＢａｎｋを検索することによって実施した。いくつかの方法を用いたが、これらには以下が含まれる：ＣＤ−ＲＯＭによるＧｅｎＢａｎｋ登録をＤＮＡＳＴＡＲ（Madison, WI)のレーザージーンソフトパッケージを用いてバッチ検索する；ジネティクスコンピューターグループ＝ウィスコンシンパッケージソフト（バージョン９．０）（Madison, WI)を用いてＧｅｎＢａｎｋをバッチ検索する。
存在する可能性がある５量体の繰り返しを作製する場合、４文字のアルファベット（Ａ、Ｃ、ＧおよびＴ）から組み立てることができる５文字の言葉には４5＝１０２４文字があり、６および７塩基の繰り返しでは６文字および７文字の言葉で４6＝４０９６および４7＝１６３８４の言葉が存在する。しかしながら、固有の繰り返しモチーフの数は、２つの相補的な鎖の同等物のために（例えばＡＡＡＡＴはＡＴＴＴＴと同等である）、さらに環状置換の同等物のために（例えばＡＡＴＡＡ．．．はＡＴＡＡＡ．．．と同等である）顕著に減少する。５塩基繰り返しの場合には、このことは、単ヌクレオチド繰り返し（Ａ5／Ｔ5およびＣ5／Ｇ5）を除外したとき５量体繰り返しでは１０２個の固有種が存在することを意味する。
【００７５】
少なくとも３つの連続コピーをもつ５，６および７塩基の繰り返しの固有の組み合わせを全て用いてＧｅｎＢａｎｋのヒトゲノムデータベースを検索した。３つまたは４つ以上の繰り返しコピー（または時に塩基置換をもつコピー）を含む全ての繰り返し領域を特定した。現今の配列データを用いて、繰り返し領域に隣接するプライマーをデザインし、標的遺伝子座をＰＣＲ増幅し、実施例６で述べたように多形性の内容を評価した。
【００７６】
続いて、ＧｅｎＢａｎｋデータベースから得られた情報を用いて組み立てたプライマーを用いて特定した配列を含有する各クローンを、実施例７で述べたように繰り返し配列の内容についてスクリーニングした。ＩＴＲ配列（すなわちＩＴＲマーカー）を含むことが判明した各クローンの配列を配列番号：２８から４３の１つに割り当てた。そのような各マーカーのＩＴＲ領域に隣接する配列を含むプライマーの配列については表１を参照されたい。そのようなＩＴＲマーカーの各々の配列の特徴を分析した結果の要約については表２を参照されたい。
【００７７】
実施例８：ＰＣＲ人工生成物に対する中型縦列繰り返し遺伝子座の評価（すなわちスリップ増幅百分率）
本明細書に記載したマーカーの多くは新規な種類のマーカーであり、これらでは“スリップ増幅（Stutter)”として知られているＰＣＲ人工生成物の発生が少ない（発明の詳細な説明の定義の項を参照されたい）。このような人工生成物の発生はＰＣＲ増幅時に、おそらくは反復スリップと称されるＤＮＡポリメラーゼ関連現象の結果として生じる（Levinson & Gutman(1987), Mol. Biol. Evol. 4(3):203-221; Schlotterer & Tautz(1992), NAR 20:211-215)。反復スリップの最終的な結果は、本物の対立形質とは異なる数の繰り返し単位を含むＰＣＲ生成物の発生である。ＰＣＲ時に相当量の増幅スリップが発生すると、増幅生成物はメジャーバンドおよびマイナーバンドとして可視化されるであろう。ここで、メジャーバンドは本物の対立形質に対応し、マイナーバンドは、いくらかの繰り返し配列を含む変型生成物に対応する。
【００７８】
異なる遺伝子座に存在するスリップ増幅の量を定量するために、６つのＩＴＲ遺伝子座（Ｃ２２１、Ｇ０２３、Ｇ０２５、Ｇ２１０、Ｓ１５９および本特許には記載されていない別のＩＴＲ、Ｓ１１７）および１７の５ヌクレオチド縦列繰り返し遺伝子座（Ｆ１３Ａ０１、ＴＨＯ１、ＴＰＯＸ、Ｆ１３Ｂ、ＦＥＳＦＰＳ、Ｄ７Ｓ８２０、ＣＳＦ１ＰＯ、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ８Ｓ１１７９、Ｄ１６Ｓ５３９、ＬＰＬ、ＦＧＡ、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ３Ｓ１３５８、Ｄ１８Ｓ５１、ｖＷＡおよびＤ２１Ｓ１１）をＡＢＩ３７７シークェンサーで泳動し、ジェンスキャン（GenScan)ソフト（PE Applied Biosystems, Foster City, CA）を用いて解析した。相対蛍光単位（ＦＲＵ）で測定したピークの高さを全てのメジャーピーク、および各遺伝子座で精査した２５から４０人のサンプルで観察されたマイナーピークについて求めた。マイナーピーク（一般に５ヌクレオチドでは本物の対立形質よりも５ｂｐ小さく、４ヌクレオチド繰り返しでは４ｂｐ小さい）で観察されたＲＦＵのメジャーな本物の対立形質のピークに対する百分率を計算した（表３参照）。
【００７９】
ＩＴＲ遺伝子座Ｓ１５９（図２）およびＧ２１０（図３）並びに４ヌクレオチド繰り返し遺伝子座ｖＷＡ（図４）およびＤ５Ｓ８１８（図５）のＡＢＩ３７７電気泳動図の結果は、ＩＴＲ遺伝子座ではスリップ増幅が極めて少ないかまたは存在せず、４ヌクレオチド繰り返し遺伝子座については明瞭にスリップ増幅が観察されることを示している。特に、ｖＷＡ４ヌクレオチド繰り返し遺伝子座の電気泳動図の矢印１４および１５（図３に複写）、さらにＤ５Ｓ８１８の４ヌクレオチド繰り返し遺伝子座の電気泳動図の矢印１６および１７（図５に複写）によって表示されているスリップ増幅人工生成物を参照されたい。これらの明瞭な人工生成物のピークを、図２に示すクローンＳ１５９（すなわち配列番号：３４によって特定される配列をもつマーカー）から単離されたＤＮＡマーカー、および図４のクローンＧ２１０から単離されたＤＮＡマーカー（すなわち配列番号：１９によって特定された配列を有するマーカー）の５ヌクレオチド繰り返しの電気泳動図の極めてわずかな人工生成物とを比較されたい。図２−５に複写した個々の電気泳動図は遺伝子座の各々について観察されたスリップ増幅の最も高い発生を示している。
スリップ増幅量のある程度の変動性は全ての遺伝子座で観察された。一般に、最も高い繰り返し数を含む対立形質（塩基対によりそのサイズが表示されている）は最も大きなスリップ増幅量を示す傾向があった。検査した２５から４０人の各々の百分率スリップ増幅値をスキャタープロットとして示した（図６、７、８および９）。
【００８０】
要約すれば、本物の対立形質バンドに対する“スリップ増幅”バンドの百分率は、４ヌクレオチド縦列繰り返し遺伝子座と比較して、調べたＩＴＲ遺伝子座のほとんどで顕著に低かった。現在知られているこのタイプのマーカーで最良のものである４ヌクレオチド遺伝子座でもこれは真実である。例えば、米連邦捜査局（ＦＢＩ）は国家の総合ＤＮＡインデックスシステム（ＣＯＤＩＳ）のための全てのＤＮＡサンプル分析で使用するものとして、そのような１３個の４ヌクレオチドマーカー（高いスリップ増幅百分率を有すると下記の表３に報告した、記載のようにアッセイした４ヌクレオチドのいくつかを含む）を選択している（I. Macivee (1998) Profiles in DNA 1(3):2)。
【００８１】
【表１０】
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【００８２】
【表１１】
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【符号の説明】
【００８３】
１  二本鎖ＤＮＡ分子
２  制限酵素
３  リンカー
４  標的配列を含まないフラグメント
６  標的ＩＴＲ配列を含むフラグメント
７  オリゴヌクレオチドプライマー
８  リンカー連結フラグメント
９  増幅ＤＮＡフラグメント
１０  フィルター
１２  ハイブリダイゼーション溶液
１５  容器
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【配列表】
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