(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
粒子の濃度の推定値Ｅ（Ｃ）を決定するための方法であって、ここで、所定の体積のサンプルが、ある数（Ｎ）個のコンパートメントに分割され、該（Ｎ）個のコンパートメントのいずれかに存在する粒子の少なくとも一部は、測定可能なシグナルを提供し、粒子の推定濃度Ｅ（Ｃ）は、測定されたシグナルの関数であり、該方法は、
ａ）別個のコンパートメントの数（Ｎ）を決定する工程であって、ここで、該数（Ｎ）は、関数
【数１】
0006055838.tif 000152
の値以下であり、
式中、（Ａ）は、整数６である実数を表し、
式中、（Ｃ＋）は、該方法によって推定される濃度（Ｃ）の区間の所定の上限を表し、
式中、（Ｃ−）は、該方法によって推定される濃度（Ｃ）の区間の所定の下限を表し、
式中、（σＭＡＸ）は、粒子の濃度の推定値Ｅ（Ｃ）の所定の許容可能な最大の相対標準偏差を表し、ここで、Ｃ−＜Ｃ＜Ｃ＋である、工程、および
ｂ）該（Ｎ）個のコンパートメントの少なくとも一部または全部におけるサンプルの体積（ｖｉ）および希釈因子（ｄｉ）の関数である調節因子（ｚｉ）を決定し、該サンプルを該（Ｎ）個のコンパートメントに分配する工程であって、該（Ｎ）個のコンパートメントのうちの２つ以上の少なくとも一部または全部が、異なるサンプル体積（ｖｉ）および／または異なる希釈因子（ｄｉ）のサンプルを含むかまたはそれらからなり、
ここで、（ｉ）は、整数０〜Ｎ−１によって表される（Ｎ）個のコンパートメントの添字番号を表し、
ここで、（ｖｉ）は、コンパートメント（ｉ）におけるサンプルの体積を表し、（ｄｉ）は、コンパートメント（ｉ）におけるサンプルの希釈因子を表す、工程
を含むかまたはそれらからなることを特徴とする、方法。
【請求項２】
前記調節因子（ｚｉ）が、関数ｚｉ＝（ｖｉｄｉ）／（ｖ０ｄ０）によって決定可能であり、
ここで、（ｉ）、（ｖｉ）および（ｄｉ）は、請求項１におけるように定義され、
（ｖ０）は、参照コンパートメントにおけるサンプルの体積を表し、（ｄ０）は、参照コンパートメントにおけるサンプルの希釈因子を表し、該参照コンパートメントは、コンパートメント（ｉ）とは異なる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程ｂ）において、前記（Ｎ）個のコンパートメントの少なくとも２つが、前記調節因子（ｚｉ）の値だけ互いに異なる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
工程ｂ）において、前記調節因子（ｚｉ）の値が、詳細に明らかにされた羃乗数列、指数関数列、多項式列もしくは等比数列に基づいて、またはコンパートメントのセットにおける分布に基づいて、決定される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
工程ｂ）において、前記サンプルが、条件：
（ｖｉ＋１ｄｉ＋１）／（ｖｉｄｉ）＝ｚｉ＋１／ｚｉ＝ｘ
を満たすような体積（ｖｉ）および希釈因子（ｄｉ）を有する（Ｎ）個のコンパートメントに分配され、ここで、ｘ＞０かつｘ≠１であり、
コンパートメントの数（Ｎ）は、関数：
【数２】
0006055838.tif 000153
によって決定可能な値以上の整数に設定され、式中、（ΔＮ）は、関数：
ΔＮ＝４．５６３７（１−ｘ）−０．７９８
によって決定可能な値以上の整数であり、ｄ０ｖ０に対する値は、関数
【数３】
0006055838.tif 000154
によって決定可能であり、ここで、（Ｃ＋）、（Ｃ−）、（σＭＡＸ）、（ｄ０）および（ｖ０）は、請求項１および２において定義されたとおりである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
工程ｂ）において、前記サンプルが、条件：
【数４】
0006055838.tif 000155
を満たすような体積（ｖｉ）を有する（Ｎ）個のコンパートメントに分配され、ここで、（Ａ）および（Ｂ）は、互いに独立して任意の実数を表し、
ここで、該サンプルは、
【数５】
0006055838.tif 000156
であり、式中ａおよびｂは
【数６】
0006055838.tif 000157
【数７】
0006055838.tif 000158
であり、
ここで、（Ｃ＋）、（Ｃ−）および（σＭＡＸ）は、請求項１において定義されたとおりである、
請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記方法が、以下の工程：
ｃ）コンパートメントにおける所定の閾値数の粒子の存在を示唆する測定可能なシグナルを得るために、１つ以上の好適な試薬および必要に応じて１つ以上の希釈剤を用いて該コンパートメントの粒子を必要に応じて増幅する工程、
ｄ）（Ｎ）個のコンパートメントの各々において該シグナルを測定し、少なくとも一部のコンパートメントに値（ｋｉ）を割り当てる工程であって、ここで、（ｉ）は、整数０〜Ｎ−１によって表されるコンパートメントの添字番号を表し、コンパートメント（ｉ）が、所定の閾値数以上の粒子を含むかまたはそれらからなる場合、コンパートメント（ｉ）は、第１の値（ｋｉ）を割り当てられ、コンパートメント（ｋｉ）が、第１の値を示唆する閾値数未満の粒子を含むかまたはそれらからなる場合、コンパートメント（ｉ）は、第２の値（ｋｉ）を割り当てられる、工程、および
ｅ）粒子の推定濃度Ｅ（Ｃ）を決定する工程であって、ここで、該粒子の推定濃度Ｅ（Ｃ）は、
ｉ．第１および／もしくは第２の値（ｋｉ）の和Ｋの関数、ならびに／または
ｉｉ．重み付けされた第１および／もしくは第２の値（ｗｉｋｉ）の和Ｋの関数であって、ここで、該値（ｋｉ）の少なくとも一部は、重み値（ｗｉ）によって調節され、ここで、（ｉ）は、整数０〜Ｎ−１によって表されるコンパートメントの添字番号を表す、関数、ならびに／または
ｉｉｉ．微視的状態μの任意の次数の数、ベクトル、行列、テンソルもしくは他の任意の明白な表示の関数であって、ここで、該任意の次数の数、ベクトル、行列、テンソルもしくは他の任意の表示は、工程ｅ）において測定される値（ｋｉ）の少なくとも一部を反映する情報を含む、関数
によって決定可能である、工程
を含むか、またはそれらからなる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
工程ｂ）において、前記サンプルが、２以上の数（ＮＬＩＢ）個の別個のコンパートメントセット（ライブラリー）に分配され、各ライブラリーセットは、（ｊ）という添字を付与され、
【数８】
0006055838.tif 000159
個のコンパートメントを含み、同じライブラリーにおける各コンパートメントは、同じ値の調節因子（ｚｊ）を有するサンプル体積の一部を含むかまたはそれらからなり、ここで、ｚｊは、ライブラリーセット（ｊ）におけるサンプルの体積（ｖｊ）および希釈因子（ｄｊ）の関数であり、該ＮＬＩＢ個の別個のライブラリーセットｊは、異なる値の調節因子（ｚｊ）によって互いに識別可能であり、ここで、ｊは、整数０〜ＮＬＩＢ−１によって表される数（ＮＬＩＢ）個のライブラリーセットの添字番号である、
請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
工程ｂ）において、数（ＮＬＩＢ）個のライブラリーセット（ｊ）の少なくとも一部、好ましくは、全部が、各ライブラリーセット（ｊ）に対して
【数９】
0006055838.tif 000160
個のコンパートメントを含むかまたはそれからなり、条件：
（ｖｊ＋１ｄｊ＋１）／（ｖｊｄｊ）＝ｚｊ＋１／ｚｊ＝ｘ
を満たし、ここで、ｘ＞０かつｘ≠１であり、
該商（ｘ）は、前記方法を実行するための技術的優先性に対して調整することができ、各ライブラリーセット（ｊ）におけるコンパートメントの数
【数１０】
0006055838.tif 000161
は、関数：
【数１１】
0006055838.tif 000162
によって決定可能な値以上の整数に設定され、ライブラリーセット（ｊ）の数（ＮＬＩＢ）は、関数
【数１２】
0006055838.tif 000163
によって決定可能な値以上の整数に設定され、ここで、
ΔＮＬＩＢ＝４．５６３７（１−ｘ）−０．７９８
であり、
【数１３】
0006055838.tif 000164
は、関数
【数１４】
0006055838.tif 000165
によって決定可能であり、ここで、（Ｃ＋）、（Ｃ−）および（σＭＡＸ）は、請求項１において定義されたとおりであり、（ｄ０）および（ｖ０）は、請求項２において定義されたとおりである、
請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
数（ＮＬＩＢ）個のライブラリーセット（ｊ）の少なくとも一部が、工程ｄ）においてライブラリーセット（ｊ）に含まれるコンパートメントの各々に割り当てられる値（ｋｉ）の少なくとも一部の関数である値
【数１５】
0006055838.tif 000166
を割り当てられ、その後、該値
【数１６】
0006055838.tif 000167
を、微視的状態μの任意の次数の数、ベクトル、行列、テンソルまたは他の任意の明白な表示に写像し、ここで、該任意の次数の数、ベクトル、行列、テンソルまたは他の任意の表示は、該値
【数１７】
0006055838.tif 000168
の少なくとも一部を反映する情報を含むかまたはそれからなる、
請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
２つ以上の異なる粒子の濃度および／または本質的に同じ粒子の２つ以上の異なる部分の濃度が決定され、（Ｎ）個のコンパートメントのいずれかに存在する該異なる粒子および／または本質的に同じ粒子の異なる部分の少なくとも一部が、２つ以上の識別可能かつ測定可能なシグナルを提供し、該（Ｎ）個のコンパートメントのいずれかにおける該２つ以上の識別可能なシグナルが測定され、該（Ｎ）個のコンパートメントの各々に対して、それぞれ２つ以上の異なる値が割り当てられ、ここで、該異なる値は、互いに独立して、ある閾値数の同じ粒子および／または本質的に同じ粒子の同じ部分が、コンパートメントに存在することまたは存在しないことを示唆する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に従って粒子の濃度を決定する際に使用するための装置であって、該装置は、
ａ）別個のコンパートメントの数（Ｎ）を決定するように構成されており、ここで、該数（Ｎ）は、関数
【数１８】
0006055838.tif 000169
の値以下であり、
式中、（Ａ）は、整数６である実数を表し、（Ｃ＋）は、該方法によって推定される濃度（Ｃ）の区間の所定の上限を表し、（Ｃ−）は、該方法によって推定される濃度（Ｃ）の区間の所定の下限を表し、（σＭＡＸ）は、粒子の濃度の推定値Ｅ（Ｃ）の所定の許容可能な最大の相対標準偏差を表し、ここで、Ｃ−＜Ｃ＜Ｃ＋であり、
ｂ）調節因子（ｚｉ）を決定するように構成されており、ここで、（ｚｉ）は、該（Ｎ）個のコンパートメントの少なくとも一部または全部における該サンプルの体積（ｖｉ）および希釈因子（ｄｉ）の関数であり、該（Ｎ）個のコンパートメントのうちの２つ以上の少なくとも一部または全部が、異なるサンプル体積（ｖｉ）および／または異なる希釈因子（ｄｉ）の該サンプルを含むかまたはそれからなり、ここで、（ｉ）は、整数０〜Ｎ−１によって表される（Ｎ）個のコンパートメントの添字番号を表し、（ｖｉ）は、コンパートメント（ｉ）における体積を表し、（ｄｉ）は、コンパートメント（ｉ）における所定の体積のサンプルの希釈因子を表す
ことを特徴とする、装置。
【請求項１３】
ａ）前記所定のサンプル体積を含むコンパートメントの総数（Ｎ）を減少させるための、ならびに／または
ｂ）（Ｎ）個のコンパートメントのすべてにおいて、サンプル、前記粒子の少なくとも一部を測定可能なシグナルまで増幅するために適した１つ以上の試薬、および必要に応じて１つ以上の希釈剤を含むかもしくはそれらからなる混合物の総体積を減少させるための、ならびに／または
ｃ）（Ｎ）個のコンパートメントの各々において、サンプル、前記粒子の少なくとも一部を測定可能なシグナルまで増幅するために適した１つ以上の試薬、および必要に応じて１つ以上の希釈剤を含むかもしくはそれらからなる混合物の体積を予め決定するための、ならびに／または
ｄ）調節因子（ｚｉ）、好ましくは、所定のサンプル体積を（Ｎ）個のコンパートメントに分配するために適した最小もしくは最大の調節因子（ｚｉ）を予め決定するための
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法の使用または請求項１２に記載の装置の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、粒子の濃度の推定値Ｅ（Ｃ）を決定するための方法（ここで、所定の体積のサンプルが、ある数（Ｎ）個のコンパートメントに分割され、その（Ｎ）個のコンパートメントは、異なるサンプル体積（ｖｉ）および／または異なる希釈因子（ｄｉ）のサンプルを含むかまたはそれらからなり、その（Ｎ）個のコンパートメントのいずれかに存在する粒子の少なくとも一部は、測定可能なシグナルを提供し、粒子の推定濃度Ｅ（Ｃ）は、測定されたシグナルの関数である）ならびに本発明の方法において使用するための装置、本発明の方法の使用、本発明の方法において使用するためのサンプルホルダーおよびキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
分析化学において、被検体粒子の濃度を定量する標準的な（または「アナログの」）方法は、それが測定可能な大きさの物理量、例えば、サンプルを通過する光の吸光度とどのように関係するかを対応させるものである。そして、被検体粒子の濃度Ｃの推定値Ｅ（Ｃ）は、そのシグナルの関数として取得される。
【０００３】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、核酸の濃度を定量するための従来技術の１つの方法を構成する。ＰＣＲ手順は、一般に、ＤＮＡ鎖の断片を複製させる。典型的には、複製された断片の長さは、１００００塩基対（ｂｐ）を超えることはなく、定量的ＰＣＲでは、通常、より短い断片が複製される。従来技術の方法によると、複製されたＤＮＡコピーは、例えば、測定可能なシグナル（蛍光レベル）を提供する、二本鎖ＤＮＡと複合体（色素−ＤＮＡ複合体）を形成した後にだけ強い蛍光を示す蛍光色素、例えば、ＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎまたはＥｖａＧｒｅｅｎで標識される［（非特許文献１）］。その蛍光レベルは、ＤＮＡ断片の倍増に比例して増加する。
【０００４】
標的ＤＮＡ断片がサンプル中に存在するとき、その数は、ＰＣＲプロセスの間に非常に速く、完了したサイクル数に応じて幾何級数的に増加する。コピー数の急速な増加は、調製用の用途、および標的ＤＮＡの存在の検出（例えば、サンプル中の特定の微生物の存在についての証明として）を目指している定性的な診断アッセイにおいて魅力的である。同時に、標的ＤＮＡの複製の指数関数的増殖（サイクル数に応じた）は、ＰＣＲプロセスを行う前のサンプル中の標的ＤＮＡの最初のコピー数のアッセイを著しく妨害する。従来技術によると、いわゆるリアルタイムＰＣＲは、サンプルの蛍光活性（すなわち、シグナル強度）が各ＰＣＲサイクルの後にモニターされ、その後、時間に応じたサンプルの蛍光強度を検量線と比較することによって、そのサンプル中の最初のＤＮＡ濃度を近似する方法を提供する。これらの手順の精度は限られている。それらのさらなる欠点は、各定量に対してさらなる比較（参照）実験を行わなければならない点である。
【０００５】
１９９９年に、ＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎおよびＫｉｎｚｌｅｒは、検査されている体積が少なくとも１つの被検体粒子を偶然含むときは正値（ｋ＝１）またはそうでないときは負値（ｋ＝０）を採用する二項確率関数ｋ（Ｃ）を検出する観測装置の能力を用いるデジタルアッセイを提唱した。濃度は、「陽性」コンパートメント（すなわち、ｋ＝１をもたらすコンパートメント）の割合に基づいて推定される。これらのアッセイは、被検体粒子の存在の強力な増幅を必要とするので、それらの重要な応用法は、通常、定量的ＰＣＲまたは酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）である。
【０００６】
従来技術のデジタルＰＣＲ法によると、総体積Ｖを有するＰＣＲ混合物（サンプルおよび試薬）を、Ｎ個のコンパートメントに等体積ｖ＝Ｖ／Ｎで分配する。次いで、すべてのコンパートメントにおいて（好ましくは、同時に）ＰＣＲ反応サイクルを、例えば、温度の周期的変動によって行う。続いて、ＰＣＲプロセスの完了（エンドポイント測定）の後に、各コンパートメントについて、およびコンパートメントの数に対して、別々に、典型的には蛍光強度を測定し、反応が完了したら、「陽性」シグナルをもたらすコンパートメントをカウントし、陽性コンパートメントの数ＫをＮとともに使用して、試験されたサンプル中の標的ＤＮＡの実際の最初のコピー数Ｍの推定値Ｅ（Ｍ）を計算する。
【０００７】
デジタルアッセイの概念の発生は、分析化学において新しいパラダイムを提供した。それは、実験装置の較正のない絶対的定量を可能にする。また、それは、単純化された実験室でのルーチン、すなわち、エンドポイント測定、および実験結果を解釈するために必要な比較的平易な数学的ツールの恩恵を受ける。しかしながら、従来技術のデジタルアッセイは、限度に影響される。
【０００８】
１．決定される被検体粒子の最大数Ｍは、そのアッセイにおけるコンパートメントの数Ｎに正比例する。診断用定量アッセイの多くの用途および潜在的な用途では、ダイナミックレンジの範囲（Ω＝Ｃ＋／Ｃ−）（Ｃ＋は、そのアッセイにおける被検体粒子の推定濃度の上限を表し、Ｃ−は下限を表す）が大きいこと、例えば、１００万以上であることが好ましい。標準的なデジタルＰＣＲ手順においてそのような大きなダイナミックレンジの範囲に達するためには、サンプルを、比例的に多数のコンパートメントに（前記例において、非常に低い濃度での低精度を好ましくないことに見過ごす分野における既知知識に照らして、２００，０００個ものコンパートメント、または実際には、下記の説明に示されるように６００，０００個ものコンパートメントに）分配しなければならない。サンプルをそのような莫大な数のコンパートメントに分配することは、可能ではあるが好ましくなく、そのようなアッセイは、実施するために、特殊化した複雑かつ高価な機器を必要とする。特に、数万または数十万または数百万のコンパートメントを分配し、増幅し、検査することを目指すアッセイのデザインは、微細加工、自動化、および複数の小体積からの迅速かつ高感度の検出という高価な技術を必要とする。
【０００９】
さらに、従来技術のデジタルアッセイによって達成される精度およびダイナミックレンジは、個別に調整することができず、結果として、用途の範囲が狭まり、アッセイの技術的コストが上昇する。したがって、従来技術のデジタルアッセイを使用して、少数Ｎのコンパートメントを使用しながら、狭い濃度範囲において高精度（低標準偏差）を得ることはできない。
【００１０】
従来技術は、古典的なデジタル定量アッセイを種々のダイナミックレンジと組み合わせることによって、そのアッセイのダイナミックレンジの範囲を広げるおよびコンパートメントの数を減少させる解決法を提供している［（非特許文献２）］。この解決法は、複数のコンパートメントセットに対して同時に行われるアッセイに依存している。各セットに属するコンパートメントは、同じ体積を有する。引用した例では、ＮＺ＝４セットが各々Ｎｊ＝１６０コンパートメント（ｊ＝１〜４）で使用され、ここで、コンパートメントの体積は、４セットの各々においてｖｊ＝１、５、２５および１２５ｎＬに等しい。この手順は、ｉ）サンプルをセットおよびコンパートメントに分割する工程、ｉｉ）シグナル増幅を同時に行う工程、ｉｉｉ）ＮＺセットの各々における陽性シグナルの数Ｋｊを別々にカウントする工程、およびｉｖ）サンプル中の粒子の最も確からしい初濃度を計算する工程からなる。この計算は、積
【数１】
0006055838.tif 000002
（式中、乗算演算子
【数２】
0006055838.tif 000003
は、ＮＺ個のコンパートメントファミリーの各々について計算されたＮＺ個の項の積を表し、各項は、ｊ番目のファミリーからのＫｊ個の陽性シグナルを観測する確率を含む）を繰り返し計算することが求められるので、大変な労力を要する骨の折れる計算である。結果の計算は、上記積を最大値と見なす値Ｃが見出されるまで、試験ダイナミックレンジ内のＣの試験された仮定上の各値に対して前記積の反復計算を必要とする。上記手順は、サンプルからのシグナルの各測定の後に、繰り返されなければならない（これは、試験結果の解析を妨げるか、十分に速い電子デバイスを必要とするか、またはサンプル中の粒子の数の推定値を得るために必要な時間を延長する）。上記手順は、コンパートメントが１セット内において同じ体積を有するが２つの異なる各セットに対しては異なる体積を有することを特徴とする多数（例えば、１０個または数十個または１００個またはそれ以上）のコンパートメントセットの場合、特に明らかに好ましくないだろう。
【００１１】
さらに、（特許文献１）は、様々な体積でデジタル測定を行うための方法、ゆえに、ダイナミックレンジを広げるための方法を開示している。
【００１２】
上述のデジタルアッセイは、ダイナミックレンジを広げるが、その解析は、非常に骨の折れる解析であり、なおもコンパートメントの数が多い。したがって、サンプルホルダーの調製、サンプルの分配、増幅および検出の手順、これらの課題を実現する装置、ならびにアッセイの結果の解析に対する技術的要件を減少させるために少ない数のコンパートメントの使用を可能にする、より解析しやすい方法を提供することが望ましいだろう。
【００１３】
したがって、粒子の濃度の推定値Ｅ（Ｃ）を決定するための改善された方法を提供する必要があり、ここで、そのアッセイの所望のダイナミックレンジおよび所望の精度は個別に調整することができ、かつ／またはその数学的解析はより容易であり、かつ／または所定のダイナミックレンジおよび所定の標準偏差について
ａ）所定のサンプル体積を含むコンパートメントの総数（Ｎ）を、調整すること、好ましくは、減少させることができ、かつ／もしくは
ｂ）その（Ｎ）個のコンパートメントのすべてにおいて、サンプル、粒子の少なくとも一部を測定可能なシグナルまで増幅するために適した１つ以上の試薬、および必要に応じて１つ以上の希釈剤を含むかまたはそれらからなる混合物の総体積を、調整すること、好ましくは、減少することができ、かつ／もしくは
ｃ）その（Ｎ）個のコンパートメントの各々において、サンプル、粒子の少なくとも一部を測定可能なシグナルまで増幅するために適した１つ以上の試薬および必要に応じて１つ以上の希釈剤を含むかまたはそれらからなる混合物の体積、好ましくは、最小体積または最大体積を、予め決定することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】ＷＯ２０１２／１００１９８（Ａ２）
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Ａｄｖａｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｅｄｕｃ．２９：１５１−１５９，２００５
【非特許文献２】Ｓｈｅｎ，Ｆ．；Ｓｕｎ，Ｂ．；Ｋｒｅｕｔｚ，Ｊ．Ｅ．；Ｄａｖｙｄｏｖａ，Ｅ．Ｋ．；Ｄｕ，Ｗ．；Ｒｅｄｄｙ  Ｐ．Ｌ．；Ｊｏｓｅｐｈ，Ｌ．Ｊ．；Ｉｓｍａｇｉｌｏｖ，Ｒ．Ｆ．，“Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｗｉｔｈ  Ｌａｒｇｅ  Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｒａｎｇｅ  Ｕｓｉｎｇ  Ｍｕｌｔｉｖｏｌｕｍｅ  Ｄｉｇｉｔａｌ  ＲＴ−ＰＣＲ  ｏｎ  ａ  Ｒｏｔａｔｉｏｎａｌ  ＳｌｉｐＣｈｉｐ  Ｔｅｓｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ＨＩＶ  ａｎｄ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  Ｖｉｒａｌ  Ｌｏａｄ”，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ａｒｔｉｃｌｅ  ＡＳＡＰ  （Ｘ  ２０１１）
【発明の概要】
【００１６】
本発明の簡単な説明：
上述のニーズは、特許請求される本発明の主題によって、部分的にまたはすべて満たされる。好ましい実施形態は、従属請求項、詳細な説明および／または添付の図面に詳細に記載される。
【００１７】
したがって、本発明の第１の態様は、粒子の濃度の推定値Ｅ（Ｃ）を決定するための方法に関し、ここで、所定の体積のサンプルは、ある数（Ｎ）個のコンパートメントに分割され、その（Ｎ）個のコンパートメントのいずれかに存在する粒子の少なくとも一部は、測定可能なシグナルを提供し、粒子の推定濃度Ｅ（Ｃ）は、測定されたシグナルの関数であり、この方法は、
ａ）別個のコンパートメントの数（Ｎ）を決定する工程（ここで、その数（Ｎ）は、関数
【数３】
0006055838.tif 000004
の値以下であり、式中、（Ａ）は、整数６である実数を表し、（Ｃ＋）は、この方法によって推定される濃度（Ｃ）の区間の所定の上限を表し、（Ｃ−）は、この方法によって推定される濃度（Ｃ）の区間の所定の下限を表し、（σＭＡＸ）は、粒子の濃度（Ｃ）の推定値の所定の許容可能な最大の相対標準偏差を表し、ここで、Ｃ−＜Ｃ＜Ｃ＋である）および
ｂ）その（Ｎ）個のコンパートメントの少なくとも一部または全部におけるサンプルの体積（ｖｉ）および希釈因子（ｄｉ）の関数である調節因子（ｚｉ）を決定し、そのサンプルを（Ｎ）個のコンパートメントに分配する工程（ここで、その（Ｎ）個のコンパートメントのうちの２つ以上の少なくとも一部または全部は、異なるサンプル体積（ｖｉ）および／または異なる希釈因子（ｄｉ）のサンプルを含むかまたはそれらからなり、ここで、（ｉ）は、整数０〜Ｎ−１によって表される（Ｎ）個のコンパートメントの添字番号を表し、（ｖｉ）は、コンパートメント（ｉ）におけるサンプルの体積を表し、（ｄｉ）は、コンパートメント（ｉ）におけるサンプルの希釈因子を表す）
を含むかまたはそれらからなることを特徴とする。
【００１８】
したがって、本発明の第２の態様は、本発明の方法に従って粒子の濃度を決定する際に使用するための装置に関し、その装置は、
ａ）別個のコンパートメントの数（Ｎ）を決定するように構成されており、ここで、その数（Ｎ）は、関数
【数４】
0006055838.tif 000005
の値以下であり、式中、（Ａ）は、整数６である実数を表し、（Ｃ＋）は、その方法によって推定される濃度（Ｃ）の区間の所定の上限を表し、（Ｃ−）は、その方法によって推定される濃度（Ｃ）の区間の所定の下限を表し、（σＭＡＸ）は、粒子の濃度（Ｃ）の推定値の所定の許容可能な最大の相対標準偏差を表し、ここで、Ｃ−＜Ｃ＜Ｃ＋であり、
ｂ）調節因子（ｚｉ）を決定するように構成されており、ここで、（ｚｉ）は、（Ｎ）個のコンパートメントの少なくとも一部または全部におけるサンプルの体積（ｖｉ）および希釈因子（ｄｉ）の関数であり、（Ｎ）個のコンパートメントのうちの２つ以上の少なくとも一部または全部が、異なるサンプル体積（ｖｉ）および／または異なる希釈因子（ｄｉ）のサンプルを含むかまたはそれからなり、ここで、（ｉ）は、整数０〜Ｎ−１によって表される（Ｎ）個のコンパートメントの添字番号を表し、（ｖｉ）は、コンパートメント（ｉ）における体積を表し、（ｄｉ）は、コンパートメント（ｉ）における所定の体積のサンプルの希釈因子を表す
ことを特徴とする。
【００１９】
したがって、本発明の第３の態様は、
ａ）所定のサンプル体積を含むコンパートメントの総数（Ｎ）を調整するため、好ましくは、減少させるための、ならびに／または
ｂ）（Ｎ）個のコンパートメントのすべてにおいて、サンプル、粒子の少なくとも一部を測定可能なシグナルまで増幅するために適した１つ以上の試薬、および必要に応じて１つ以上の希釈剤を含むかもしくはそれらからなる混合物の総体積を調整するため、好ましくは、減少させるための、ならびに／または
ｃ）（Ｎ）個のコンパートメントの各々において、サンプル、粒子の少なくとも一部を測定可能なシグナルまで増幅するために適した１つ以上の試薬、および必要に応じて１つ以上の希釈剤を含むかもしくはそれらからなる混合物の体積、好ましくは、最小体積もしくは最大体積を予め決定するための、ならびに／または
ｄ）調節因子（ｚｉ）、好ましくは、所定のサンプル体積を（Ｎ）個のコンパートメントに分配するために適した最小もしくは最大の調節因子（ｚｉ）を予め決定するための
本発明の方法の使用または本発明の装置の使用に関する。
【００２０】
したがって、本発明の第４の態様は、本発明の方法において使用するためのサンプルホルダーに関し、そのサンプルホルダーは、
ａ）所定の数（Ｎ）個のコンパートメントを含むかまたはそれらからなるように構成されており、ここで、その数（Ｎ）は、関数
【数５】
0006055838.tif 000006
の値以下であり、式中、（Ａ）は、整数６である実数を表し、（Ｃ＋）は、この方法によって推定される濃度（Ｃ）の区間の所定の上限を表し、（Ｃ−）は、この方法によって推定される濃度（Ｃ）の区間の所定の下限を表し、（σＭＡＸ）は、粒子の濃度（Ｃ）の推定値の所定の許容可能な最大の相対標準偏差を表し、ここで、Ｃ−＜Ｃ＜Ｃ＋であり、
ｂ）（Ｎ）個のコンパートメントが、所定の調節因子（ｚｉ）を有する所定のサンプル体積を含むように構成されており、ここで、（ｚｉ）は、（Ｎ）個のコンパートメントの少なくとも一部または全部におけるサンプルの体積（ｖｉ）および希釈因子（ｄｉ）の関数であり、（Ｎ）個のコンパートメントのうちの２つ以上の少なくとも一部または全部が、異なるサンプル体積（ｖｉ）および／または異なる希釈因子（ｄｉ）のサンプルを含み得るかまたはそれからなり得、ここで、（ｉ）は、整数０〜Ｎ−１によって表される（Ｎ）個のコンパートメントの添字番号を表し、（ｖｉ）は、コンパートメント（ｉ）におけるサンプルの体積を表し、（ｄｉ）は、コンパートメント（ｉ）におけるサンプルの希釈因子を表す
ことを特徴とする。
【００２１】
したがって、本発明の第５の態様は、粒子の濃度を決定するための、好ましくは、本発明の方法に従って粒子の濃度を決定するための、本発明のサンプルホルダー、ならびにそのサンプルホルダーのコンパートメントに含まれる粒子の少なくとも一部を測定可能なシグナルまで増幅するために適した１つ以上の試薬、および必要に応じて１つ以上の好適な希釈剤を備えるキットに関する。
【００２２】
上述の本発明の実施形態は、それが技術者に照らして合理的である限り、以下および特に従属請求項に開示される好ましい本発明の実施形態の任意の可能性のある組み合わせを含み得る。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１ａ】同一のコンパートメントを含むアッセイおよび本発明の方法によって達成され得るダイナミックレンジと精度との組み合わせ、本発明に従って所与のダイナミックレンジおよび精度をもたらすために必要なコンパートメントの数Ｎの比較を示しているグラフ。
【図１ｂ】同一のコンパートメントを含むアッセイおよび本発明の方法によって達成され得るダイナミックレンジと精度との組み合わせ、本発明に従って所与のダイナミックレンジおよび精度をもたらすために必要なコンパートメントの数Ｎの比較を示しているグラフ。
【図１ｃ】同一のコンパートメントを含むアッセイおよび本発明の方法によって達成され得るダイナミックレンジと精度との組み合わせ、本発明に従って所与のダイナミックレンジおよび精度をもたらすために必要なコンパートメントの数Ｎの比較を示しているグラフ。
【図２ａ】本発明の定量アッセイによって提供されるダイナミックレンジＣ＋／Ｃ−＝Ωおよび相対標準偏差σ、ならびに本発明における等比数列の公比ｘとコンパートメントのコピー数Ｎ’との関係を示しているグラフ。
【図２ｂ】本発明の定量アッセイによって提供されるダイナミックレンジＣ＋／Ｃ−＝Ωおよび相対標準偏差σ、ならびに本発明における等比数列の公比ｘとコンパートメントのコピー数Ｎ’との関係を示しているグラフ。
【図３ａ】有効ストライプ（ａｃｔｉｖｅ  ｓｔｒｉｐｅ）、微視的状態、および本発明におけるアッセイから得られる推定値の精度の本発明の概念。
【図３ｂ】有効ストライプ（ａｃｔｉｖｅ  ｓｔｒｉｐｅ）、微視的状態、および本発明におけるアッセイから得られる推定値の精度の本発明の概念。
【図３ｃ】有効ストライプ（ａｃｔｉｖｅ  ｓｔｒｉｐｅ）、微視的状態、および本発明におけるアッセイから得られる推定値の精度の本発明の概念。
【図３ｄ】有効ストライプ（ａｃｔｉｖｅ  ｓｔｒｉｐｅ）、微視的状態、および本発明におけるアッセイから得られる推定値の精度の本発明の概念。
【図４ａ】本発明の方法に従ってコンパートメントからのシグナルを解析する２つの異なるアプローチ（総和および微視的状態）に対する、粒子の濃度の推定値Ｅ（Ｃ）の標準偏差を示しているグラフ。
【図４ｂ】本発明の方法に従ってコンパートメントからのシグナルを解析する２つの異なるアプローチ（総和および微視的状態）に対する、粒子の濃度の推定値Ｅ（Ｃ）の標準偏差を示しているグラフ。
【図４ｃ】本発明の方法に従ってコンパートメントからのシグナルを解析する２つの異なるアプローチ（総和および微視的状態）に対する、粒子の濃度の推定値Ｅ（Ｃ）の標準偏差を示しているグラフ。
【図５ａ】本発明においてデザインされた２つの異なるアッセイにおける最初の１０個（図５ａ）および最初の９０個（図５ｂ）の最も頻繁に生じる微視的状態に対する確率分布ｐ（μ｜Ｃ）を示しているグラフ。
【図５ｂ】本発明においてデザインされた２つの異なるアッセイにおける最初の１０個（図５ａ）および最初の９０個（図５ｂ）の最も頻繁に生じる微視的状態に対する確率分布ｐ（μ｜Ｃ）を示しているグラフ。
【図６】本発明の定量アッセイに対する粒子の初濃度Ｃ＝Ｍ／Ｖの較正補正（ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ  ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ）関数ｆｃｏｒｒ＝Ｃ／Ｅ（Ｃ）を表示しているグラフ。
【図７ａ】粒子の数Ｍの関数として、値の和Ｋ＝Σｗｉ・ｋｉ（ここで、重みｗｉ＝１／ｄｉである）を表示しているグラフ（図７ａ）；Ｋの関数として、粒子の初濃度の推定値Ｅ（Ｃ）の値を表示しているグラフ（図７ｂ）；本発明の定量アッセイに対する粒子の初濃度Ｃ＝Ｍ／Ｖの対数の関数として、推定値Ｅ（Ｃ）の相対標準偏差σ（Ｃ）を表示しているグラフ（図７ｃ）。
【図７ｂ】粒子の数Ｍの関数として、値の和Ｋ＝Σｗｉ・ｋｉ（ここで、重みｗｉ＝１／ｄｉである）を表示しているグラフ（図７ａ）；Ｋの関数として、粒子の初濃度の推定値Ｅ（Ｃ）の値を表示しているグラフ（図７ｂ）；本発明の定量アッセイに対する粒子の初濃度Ｃ＝Ｍ／Ｖの対数の関数として、推定値Ｅ（Ｃ）の相対標準偏差σ（Ｃ）を表示しているグラフ（図７ｃ）。
【図７ｃ】粒子の数Ｍの関数として、値の和Ｋ＝Σｗｉ・ｋｉ（ここで、重みｗｉ＝１／ｄｉである）を表示しているグラフ（図７ａ）；Ｋの関数として、粒子の初濃度の推定値Ｅ（Ｃ）の値を表示しているグラフ（図７ｂ）；本発明の定量アッセイに対する粒子の初濃度Ｃ＝Ｍ／Ｖの対数の関数として、推定値Ｅ（Ｃ）の相対標準偏差σ（Ｃ）を表示しているグラフ（図７ｃ）。
【図８ａ】本発明のアッセイに対する１００回のモンテカルロ（ＭＣ）シミュレーションならびに本発明の方法の性能の実験的検証および数値的検証としての７または８回の実験の結果を示しているグラフ。
【図８ｂ】本発明のアッセイに対する１００回のモンテカルロ（ＭＣ）シミュレーションならびに本発明の方法の性能の実験的検証および数値的検証としての７または８回の実験の結果を示しているグラフ。
【図９ａ】同一のコンパートメントを含み、かつサンプル中の有限数の粒子の濃度について解析された（非独立確率変数を用いた解析）アッセイおよびレザバー（ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）の濃度が調整されたサンプル中の粒子の濃度について解析された（同一独立確率変数）アッセイのシグナルの関数としての、相対標準偏差、ダイナミックレンジおよび濃度の推定値を示しているグラフ。
【図９ｂ】同一のコンパートメントを含み、かつサンプル中の有限数の粒子の濃度について解析された（非独立確率変数を用いた解析）アッセイおよびレザバー（ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）の濃度が調整されたサンプル中の粒子の濃度について解析された（同一独立確率変数）アッセイのシグナルの関数としての、相対標準偏差、ダイナミックレンジおよび濃度の推定値を示しているグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明者らは、驚いたことに、本発明の実施形態（パートＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅおよび／またはＦ、ここで、パートＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦの好ましい本発明の実施形態は、互いに独立して組み合わせることができる）、特に、本発明の方法、本発明の装置、本発明のサンプルホルダーおよび／または本発明のキットを使用することによって、本発明の根底にある１つ以上のニーズを満たすことができることを突きとめた（特に図１ａ）、１ｂ）および１ｃ）ならびに詳細な図の説明におけるそれぞれの部分を参照のこと）。
【００２５】
概して、本発明は、規定の濃度範囲において指定の精度および指定の正確度でアッセイを行うために必要な区画の数を好ましくかつ有意に減少させることができる（ただし、個々の区画内の標的粒子の数の推定値は、異なる）という予想外の発見に依存する。形式上、ｉ番目のコンパートメントにおける粒子の推定数は、ｍｉ＝Ｃ・ｄｉ・ｖｉであり、式中、ｖｉは、ｉ番目のコンパートメントの体積を意味し、ｄｉは、ｉ番目のコンパートメントの希釈因子を意味し、Ｃは、サンプル中の未知濃度である。本発明の本質は、値ｍｉが、互いに等しくなく、好ましくは、本質的に異なり、最も好ましくは、要求される濃度範囲とほぼ同じ範囲の値に広がっているという要件が与えられる点であり、そのために、アッセイは、標的粒子の初濃度の正確な推定値を提供するはずであり、粒子の最初の数の定量アッセイを規定の濃度範囲かつ指定の精度で行うために必要な区画の数を好ましく減少させることを可能にする。
【００２６】
本発明者らは、驚いたことに、本発明的に（ｉｎｖｅｎｔｉｖｅｌｙ）決定される数Ｎのコンパートメントおよび決定された調節因子ｚｉにおいてサンプルを分配することによって、アッセイのダイナミックレンジＣ＋／Ｃ−の範囲および粒子の濃度の推定値Ｅ（Ｃ）の相対標準偏差の最大値（σＭＡＸ）を、独立して予め決定することができるか、または換言すれば、コントロールすることもしくは調整することができることを発見した（特に図１ａ）および詳細な図の説明におけるそれぞれの部分を参照のこと）。
【００２７】
粒子の濃度の推定値Ｅ（Ｃ）の本発明の決定は、通常、サンプル中の粒子の濃度の推定値Ｅ（Ｃサンプル）の決定、ならびにレザバー内の粒子の濃度の推定値Ｅ（Ｃレザバー）の決定または検体中の粒子の濃度の推定値Ｅ（Ｃ検体）の決定を含み、これは、以下で詳細に説明される。濃度の推定値Ｅ（Ｃ）は、それぞれの起源、例えば、サンプル体積、レザバー体積または検体体積における粒子の推定数Ｅ（Ｍ）の関数である。したがって、粒子の濃度の推定値Ｅ（Ｃ）が本発明に関して使用される場合、その用語は、別段述べられない限り、通常、サンプル中の粒子の濃度の推定値Ｅ（Ｃサンプル）、レザバー内の粒子の濃度の推定値Ｅ（Ｃレザバー）および濃度の推定値Ｅ（Ｃ検体）を含む。
【００２８】
したがって、好ましい実施形態において、本発明は、サンプル中の粒子の濃度Ｅ（Ｃサンプル）＝Ｅ（Ｍ）／Ｖサンプル（ここで、Ｅ（Ｍ）は、体積Ｖサンプルのサンプル中の粒子の推定数である）の決定に関する。その手順において、サンプルの体積は、分配され、コンパートメント内の粒子の存在を測定可能なシグナルまで増幅することを可能にするためならびに所望の体積ｖｉおよび希釈因子ｄｉ＝（ｍｉ／ｖｉ）／（Ｍ／Ｖサンプル）を得るために適切な体積の試薬と混合される（ここで、ｍｉは、ｉ番目のコンパートメント内の粒子の推定数である）。商（Ｍ／Ｖサンプル）および（ｍｉ／ｖｉ）は、サンプル中の粒子の濃度（Ｃサンプル）およびｉ番目のコンパートメント内の粒子の濃度（Ｃサンプル）として符号化され得るが、サンプル中には有限数の粒子が存在し、１つのコンパートメント内の粒子の配置は、別のコンパートメント内に粒子を見つけ出す確率に影響するので、これらの商は、サンプルまたはコンパートメントのいずれかの体積によって調整される分子の推定数を表すだけであるため、これらは真の濃度ではないことが理解されなければならない。下記で論じるように、コンパートメントからのシグナルの解析にとって適切な（および従来技術において公知の）アプローチは、コンパートメント内の粒子の配置の従属確率変数に基づく。そのような解析は、サンプル中の粒子の推定濃度Ｅ（Ｃサンプル）として表すことができる、サンプル中の粒子の推定数Ｅ（Ｍ）をもたらす。
【００２９】
別の好ましい実施形態において、目的の粒子を含むサンプル体積Ｖサンプルを体積Ｖ検体の検体から調製すること（例えば、粒子の単離または精製によって）が好ましい。そのような場合、サンプル中の粒子の数の推定値Ｅ（Ｍ）は、検体内の粒子の数の推定値と同じである。これらは、サンプル中の粒子の推定濃度Ｅ（Ｃサンプル）＝Ｅ（Ｍ）／Ｖサンプルまたは検体内の粒子の推定濃度Ｅ（Ｃ検体）＝Ｅ（Ｃサンプル）（Ｖサンプル／Ｖ検体）＝Ｅ（Ｍ）／Ｖ検体のいずれかによって表すことができる。
【００３０】
本発明の別の好ましい実施形態において、体積Ｖ検体の検体は、それよりかなり大きい体積のレザバー（例えば、生物または環境）から採取される場合がある。そして、そのレザバー内の粒子の濃度Ｅ（Ｃレザバー）を推定することが重要になり得、それは、本発明を使用することによって可能である。そのような場合、サンプルの分配および必要に応じて希釈によって形成されるコンパートメント内の粒子の配置は、独立確率変数のセットとして扱われる。このアプローチでは、任意の所与のコンパートメント内の粒子を見つけ出す確率は、単に、コンパートメントの体積の関数、コンパートメント内のサンプルの希釈率の関数、ならびにサンプルおよび検体の体積の適切な商によって調整される、レザバー内の粒子の濃度と等しいサンプル中の粒子の濃度Ｃサンプルの関数である。コンパートメントからのシグナルに基づく計算の結果として、本発明は、サンプル中の粒子の濃度の推定値Ｅ（Ｃサンプル）を取得することが可能である。レザバー内の粒子の濃度の推定値は、検体内の粒子の濃度の推定値と同じである：Ｅ（Ｃレザバー）＝Ｅ（Ｃ検体）＝Ｅ（Ｃサンプル）（Ｖサンプル／Ｖ検体）。
【００３１】
あるいは、レザバー内の粒子の濃度の推定値Ｅ（Ｃレザバー）は、好ましくは、従属変数の分布に基づく計算から得られた、サンプル中の粒子の数の推定値Ｅ（Ｍ）を変換することによっても決定することができる。最も一般的な用語において、レザバー内の濃度の確率分布ρ（Ｃレザバー）は、サンプル中の粒子の数の確率の分布の積分変換ρ（Ｍ／Ｖサンプル）に等しい。単純化されたプロトコルにおいて、Ｅ（Ｃレザバー）という推定値は、好ましくは、Ｅ（Ｍ）／Ｖサンプルに補正関数ｆｃｏｒｒ（Ｅ（Ｍ））を掛け合わせ、それを商Ｖサンプル／Ｖ検体によって調整することによって、決定することができる。
【００３２】
したがって、粒子の濃度の推定値Ｅ（Ｃ）を決定する本発明の方法は、サンプルの体積によって分割されるコンパートメント間で非独立的に分布する有限数の粒子の推定値の式であるサンプル中の粒子の濃度の推定値Ｅ（Ｃサンプル）を決定するための解決法、またはサンプルを調製した検体が採取されたレザバー内の粒子の濃度の推定値Ｅ（Ｃレザバー）を決定するための解決法（ここで、Ｅ（Ｃレザバー）は、コンパートメントにおける非依存的配置に基づく粒子の濃度の推定値から計算される）を提供するので、従来技術よりも有益である。
【００３３】
本発明の実施形態パートＡ：
本発明は、ｉ番目のコンパートメント内のサンプルの体積および／または希釈因子をどのように改変するかを教示し、したがって、定量アッセイのダイナミックレンジおよび精度を独立して調整することを可能にするので、特に好ましい。
【００３４】
さらに、本発明の方法は、
ａ）所定のサンプル体積を含むコンパートメントの総数（Ｎ）を、調整すること、好ましくは、減少させることができるように、および、例えば、優良な精度かつ小さいＮでの広範なダイナミックレンジ（例えば、Ω＝１０９かつσ＜５０％が、Ｎ＝６０で実現できる）、ｉｉ）高い精度かつ小さいＮでの広範なダイナミックレンジ（例えば、Ω＝１０９、σ＜１０％、Ｎ＝１６１５）またはｉｉｉ）高い精度かつ再度小さいＮでの狭いダイナミックレンジ（例えば、σ＜３０％かつＮ＝８０およびσ＜１０％かつＮ＝６３１を得る利益を伴うΩ＝１０３）を実現できるように、および／または
ｂ）（Ｎ）個のコンパートメントのすべてにおいて、サンプル、粒子の少なくとも一部を測定可能なシグナルまで増幅するために適した１つ以上の試薬および必要に応じて１つ以上の希釈剤を含むかまたはそれらからなる混合物の総体積を調整すること、好ましくは、減少させることができるように、および／または
ｃ）（Ｎ）個のコンパートメントの各々において、サンプル、粒子の少なくとも一部を測定可能なシグナルまで増幅するために適した１つ以上の試薬および必要に応じて１つ以上の希釈剤を含むかまたはそれらからなる混合物の体積、好ましくは、最小体積または最大体積を予め決定することができるように、
別個のコンパートメントの数（Ｎ）、ならびに本方法によって推定される濃度（Ｃ）の区間の所定の上限（Ｃ＋）および下限（Ｃ−）に対する調節因子（ｚｉ）、ならびに粒子の濃度の推定値Ｅ（Ｃ）の所定の許容可能な最大の相対標準偏差（σＭＡＸ）をどのように決定するかを教示する。
【００３５】
さらに本発明の方法は、好ましくは、数学的解析の実施がより容易であり、好ましいことに、増幅、測定および割当という本発明の手順の工程ならびに濃度の決定を行う前に濃度の推定値Ｅ（Ｃ）の精度に関するフィードバックを提供し得る（これは、有効ストライプおよび微視的状態μの本発明の概念に関して、以下の説明のかなり下に詳細に記載される）。
【００３６】
本発明の方法の工程ａ）に関して、コンパートメントの数（Ｎ）は、整数０〜Ｎ−１を表し、ここで、その整数は、通常、所与の関数に従って予め決定され、その整数は、その関数の真の結果より大きく、好ましくは、その整数は、その関数の真の結果よりも大きい最小の整数である。
【００３７】
本発明の方法の工程ｂ）において、調節因子（ｚｉ）の値は、好ましくは、詳細に明らかにされた羃乗数列、指数関数列、好ましくは、等比数列；多項式列に基づいて、またはコンパートメントのセットにおける分布に基づいて決定され、好ましくは、ガウス分布もしくはその組み合わせによって予め決定される。より好ましくは、調節因子（ｚｉ）の値は、指数関数列（例えば、等比数列）（その次のコンパートメントの体積およびまたは希釈は、等比級数の項（ｖｉｄｉ〜ｅｉ）であり、それにより、ダイナミックレンジＣ＋／Ｃ−にわたって粒子の推定濃度Ｅ（Ｃ）に関する均一な分割精度を達成することができる）に基づいて決定される。さらに好ましい実施形態は、以下の説明にも開示される。より一般的には、積ｖｉｄｉの値のセットは、添字ｉの変動の範囲にわたって不均一な任意の関数によって決定することができ、アッセイのダイナミックレンジ、アッセイの精度、ならびにアッセイおよびその技術的実現の他の重要なパラメータの関数であり得る。
【００３８】
本発明の方法は概して、必要に応じて好適な増幅後に好適な測定可能なシグナルを示す任意の粒子のコンパートメントにおける濃度の決定に適している。好ましい実施形態において、本発明の方法は、好ましくは、ウイルス、細菌、核酸（ＮＡ）、好ましくは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）もしくはリボ核酸（ＲＮＡ）、ペプチド、タンパク質、または別の粒子もしくはナノ粒子もしくはコロイド粒子あるいはそれらの組み合わせからなる群より選択される好適な粒子を決定するために使用することができる。
【００３９】
本発明の方法はさらに、概して、従来技術（例えば、分析的および／または診断的定量アッセイ）に従う粒子の濃度の推定値Ｅ（Ｃ）の定量的測定方法のすべてに適用可能であり、ここで、（Ｎ）個のコンパートメントのいずれかに存在する粒子の少なくとも一部は、測定可能なシグナルを提供するか、または通常の手順によって測定可能なシグナルを提供するように増幅され、その粒子の推定濃度Ｅ（Ｃ）は、通常の統計モデルによって決定される、測定されたシグナルの関数である。
【００４０】
好ましくは、本発明の方法は、本発明的に好適な粒子の存在を測定可能なシグナルまで増幅するアッセイに適用可能であり、好ましくは、その粒子は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、好ましくは、周期性の温度変動を含むもの；ループ媒介性等温増幅（ＬＡＭＰ）；ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）；カスケードローリングサークル増幅（カスケードＲＣＡ）；ヘリカーゼ依存性増幅；核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）；ニッキング酵素増幅反応（ＮＥＡＲ）；単一分子酵素結合免疫吸着アッセイ（デジタルＥＬＩＳＡ）；もしくは粒子の存在を測定可能なシグナルまで増幅するための他の任意の手順またはそれらの組み合わせを用いて増幅される。
【００４１】
粒子の推定濃度Ｅ（Ｃ）の本発明の決定に関して、定量的アッセイにおいて粒子の推定濃度Ｅ（Ｃ）を決定するための任意の通常の統計学的方法を使用することができる。本発明の好ましい実施形態は、以下の説明のかなり下に開示される。
【００４２】
本発明において、工程ｂ）における所定のサンプル体積をＮ個のコンパートメントに分配する工程は、任意の好適な通常の方法によって行うことができる。好ましい方法において、サンプルは、決定される数Ｎのコンパートメントに従っておよび決定された調節因子ｚｉに従って、サンプル体積をピペットで移す好適な手段によって；マイクロ流体システムによる液滴作製、好ましくは、積極的および／または受動的な液滴作製の好適な手段によって；デジタルマイクロ流体法（「誘電体上エレクトロウェッティング（ｅｌｅｃｔｒｏ−ｗｅｔｔｉｎｇ  ｏｎ  ｄｉｅｌｅｃｔｒｉｃ）」ＥＷＯＤとも呼ばれる）の好適な手段によって、または分配されたコンパートメントセットを得るための他の任意の好適な方法（例えば、ＷＯ２０１２／１０９６００Ａ２（この分配を含む本文中の開示の全体が本明細書に援用される）に開示されている方法）によって、分配される。
【００４３】
上記のピペットで移す手法に関して、混合、分割および希釈剤（好適な緩衝液）の添加の繰り返しによる通常の段階希釈が、決定される数Ｎのコンパートメントに従ったおよび決定された調節因子ｚｉに従った所定のサンプル体積の本発明の分配を広く可能にする。例として、その系列の第１コンパートメントは、濃度Ｃ０を有するある特定の体積ｖ０の所定のサンプル体積を含み得、その系列の第２コンパートメントは、分率ｘの所定のサンプル体積を含み、次いでそれは、体積ｖ０に達するように好適な希釈剤を加えることによって希釈される（それにより、その第２コンパートメントは、Ｃ１＝Ｃ０ｘ１を含む）。この手順を繰り返すことにより、濃度Ｃｉ＝Ｃ０ｘｉという幾何数列がもたらされる。そのようなピペッティング手順を行うための好適な装置は、例えば、ハンドピペット、または一般に公知のロボットピペッティングステーションのいずれか、または極小体積のピペッティング専用の装置（例えば、ＴＴＰ  Ｌａｂｔｅｃｈが販売するＭｏｓｑｕｉｔｏ装置）である。
【００４４】
通常、上述のピペッティング方法は、各コンパートメントの濃度もしくは体積またはその両方を任意の順序または組み合わせで調節することによって、粒子の推定数の幾何数列：（ｄｉｖｉ）／（ｄ０ｖ０）＝ｚｉ＝ｘｉを示すコンパートメントセットを調製するためにも使用することができる。
【００４５】
マイクロ流体システム法に関して、すべての好適な通常の手法（特に、決定される数Ｎのコンパートメントに従ったおよび決定された調節因子ｚｉに従った所定のサンプル体積の本発明の分配を可能にする、通常の積極的液滴マイクロ流体システムおよび受動的マイクロ流体システム）を、本発明に適用することができる。
【００４６】
積極的液滴マイクロ流体システム法に関して、本発明者らは、特に、マイクロ流体チップにおいて要求に応じて微小滴上で操作を実行するための一連の手法を開発した。その操作は、ｉ）正確に決定された体積の、小さい液滴を作製すること、ｉｉ）その液滴を移動すること、ｉｉｉ）液滴をマージすること、ｉｖ）液滴を分割することを含む。これらの操作によって、希釈および本発明の分配の任意のプロトコルを実際に実行することが可能になる。上述の積極的マイクロ流体法は、特に、以下の特許出願、２０１１年１月２１日に出願されたＰＣＴ／ＰＬ２０１１／０５０００２“Ｓｙｓｔｅｍ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｈａｎｄｌｉｎｇ  ｏｆ  ｌｉｑｕｉｄ  ｍｉｘｔｕｒｅｓ”およびその後の国内出願；２０１１−０７−２７に出願されたＰＬ３９５７７６“Ｓｐｏｓｏｂ  ｄｚｉｅｌｅｎｉａ  ｋｒｏｐｅｌ  ｎａ  ｚａｄａｎｉｅ  ｗ  ｚｌａｃｚｕ  ｍｉｋｒｏｐｒｚｅｐｌｙｗｏｗｙｍ”；２０１１−０７−２７に出願されたＰＬ３９５７７７“Ｓｐｏｓｏｂ  ｄｚｉｅｌｅｎｉａ  ｋｒｏｐｅｌ  ｎａ  ｚａｄａｎｉｅ  ｗ  ｚｌａｃｚｕ  ｍｉｋｒｏｐｒｚｅｐｌｙｗｏｗｙｍ”；２０１１−０７−２７に出願されたＰＬ３９５７７８“Ｓｐｏｓｏｂ  ｄｚｉｅｌｅｎｉａ  ｋｒｏｐｅｌ  ｎａ  ｚａｄａｎｉｅ  ｗ  ｚｌａｃｚｕ  ｍｉｋｒｏｐｒｚｅｐｌｙｗｏｗｙｍ”に開示されており、ここで、各出願の積極的マイクロ流体法に関する内容は、それらの全体が本発明に関して本明細書に援用される。
【００４７】
受動的マイクロ流体システム（ｔｒａｐｓ）に関して、本発明者ら（Ｓｃｏｐｅ  Ｆｌｕｉｄｉｃｓ）は、特に、受動的様式で液滴上で正確な操作を実行するためのシステムおよび方法を開発した。この概念は、マイクロ流体チャネルにおける、詳しく幾何的に規定された「ｔｒａｐｓ」の構築に基づく。そのｔｒａｐｓは、その厳密な幾何学に応じて、ｉ）所与の体積より小さい液滴を捕捉し、それを適所に保つことができ、ｉｉ）正確に定められた体積の液滴を捕捉し、それを適所に保つことができ、ｉｉｉ）捕捉された液滴における液体の一部を交換する（すなわち、さらなる小体積を受け取って、同じ体積の元の混合物を放出する）ことができ、ｉｖ）捕捉し、新しい液滴の到着まで待ち、次いで、それらをマージし、放出することができ、ｖ）捕捉し、その次の液滴の到着まで待ち、次いで、第２の液滴をロックしつつ単に最初の液滴を放出することなどができる。これらの機能性は、本発明において使用することができる多くの異なる液体取扱いプロトコルの確立を可能にする。上述の受動的マイクロ流体法（いわゆる「ＴＲＡＰＳ」システムおよび方法）は、特に以下の特許出願［２０１２−０４−２５に出願されたＰＬ−３９８９７９“Ｕｒｚａｄｚｅｎｉｅ  ｍｉｋｒｏｐｒｚｅｐｌｙｗｏｗｅ  ｉ  ｕｋｌａｄ  ｍｉｋｒｏｐｒｚｅｐｌｙｗｏｗｙ  ｏｂｅｊｍｕｊａｃｙ  ｊｅｄｎｏ  ｌｕｂ  ｗｉｅｃｅｊ  ｕｒｚａｄｚｅｎ  ｍｉｋｒｏｐｒｚｅｐｌｙｗｏｗｙｃｈ”］に開示されており、ここで、その受動的マイクロ流体法に関する内容は、その全体が本発明に関して本明細書中に援用される。
【００４８】
さらに、「デジタルマイクロフルイディクス」または「誘電体上エレクトロウェッティング」（ＥＷＯＤ）と呼ばれる、平面基板上での液滴操作のための十分に確立された技術的プラットフォームは、決定される数Ｎのコンパートメントに従ったおよび決定された調節因子ｚｉに従った所定のサンプル体積の本発明の分配を可能にする。デジタルマイクロ流体法／誘電体上エレクトロウェッティング（ＥＷＯＤ）法は、要求に応じて液滴を作製すること、それらを移動させること、それらをマージすること、混合すること、および分割することが可能である。
【００４９】
所定のサンプル体積は、本発明において、Ｎ個のコンパートメントに分配され、ここで、その別個の体積が本発明のデジタルアッセイに従ってさらに処理され得るおよび／または解析され得るようにそれらの体積を保持するのに適した任意の通常のサンプルホルダーを使用することができる。
【００５０】
好ましい実施形態において、所定のサンプル体積が、本発明の第４の態様に係る本発明のサンプルホルダーに分配される。本発明のサンプルホルダーは、例えば、好適な試験管、マイクロアレイ上のウェルのアレイ、またはマイクロ流体チップ、液滴を作製するように構成されたマイクロ流体チップ、ならびに本発明の方法を行うのに適した個別の体積を保持することができる他の商業的に入手可能なデバイスまたは他の一般に公知のデバイスを備え得る。さらに好ましい実施形態において、所定のサンプル体積は、本発明の第５の態様に係る本発明のキットを使用して分配される。本発明の第４および第５の態様のすべての好ましい実施形態は、互いに独立して、本発明の方法と組み合わせることができる。
【００５１】
本発明の方法の好ましい実施形態において、調節因子（ｚｉ）は、関数ｚｉ＝（ｖｉｄｉ）／（ｖ０ｄ０）またはその類似物によって決定可能であり、好ましくは、決定され、ここで、その類似物は、コンパートメントにおける粒子の推定数の対差（ｐａｉｒｗｉｓｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ）に関する情報を示唆し、
ここで、（ｉ）、（ｖｉ）および（ｄｉ）は、本明細書の上文に示されたように定義され、
（ｖ０）は、参照コンパートメントにおけるサンプルの体積を表し、（ｄ０）は、参照コンパートメントにおけるサンプルの希釈因子を表し、その参照コンパートメントは、コンパートメント（ｉ）とは異なり、好ましくは、その参照コンパートメントは、一連の（Ｎ）個のコンパートメントにおける第１コンパートメントである。用語「一連の（Ｎ）個のコンパートメントにおける第１コンパートメント」は、本発明に関して、開始時の体積および開始時の希釈因子を有する、所定のサンプル体積の一部を構成するコンパートメントとして定義される。
【００５２】
本発明の方法の好ましい実施形態において、工程ｂ）では、（Ｎ）個のコンパートメントの１％、好ましくは、５％、より好ましくは、２５％、なおもより好ましくは、５０％、なおもより好ましくは、７５％、最も好ましくは、１００％が、調節因子（ｚｉ）の値が互いに異なる。調節因子（ｚｉ）の値が互いに異なる（Ｎ）個のコンパートメントが多くなるほど、アッセイできるサンプル中の粒子の濃度の範囲は広くなる。
【００５３】
しかしながら、決定された調節因子（ｚｉ）によってもたらされる差異が、サンプルを分配したときに異なるコンパートメントの体積および／または希釈に対して微小にしか変化させないことがあるとき、所定のサンプル体積を決定される（Ｎ）個（ここで、（Ｎ）個のコンパートメントは、異なるサンプル体積（ｖｉ）および／または異なる希釈因子（ｄｉ）のサンプルを含むかまたはそれらからなり、ゆえに、調節因子（ｚｉ）が異なる）に分配することの実施は、一部の研究室にとっては難しすぎることがある。この場合、本発明の方法は、サンプルを２以上の数（ＮＬＩＢ）個の別個のコンパートメントセット（ライブラリー）に分配する代替の好ましい実施形態を提供し、各ライブラリーセットは、（ｊ）という添字を付与され、
【数６】
0006055838.tif 000007
個のコンパートメントを含み、同じライブラリーにおける各コンパートメントは、同じ値の調節因子（ｚｊ）を有するサンプル体積の一部を含むかまたはそれらからなり、ここで、ｚｊは、ライブラリーセット（ｊ）におけるサンプルの体積（ｖｊ）および希釈因子（ｄｊ）の関数であり、そのＮＬＩＢ個の別個のライブラリーセットｊは、異なる値の調節因子（ｚｊ）によって互いに識別可能であり、ここで、ｊは、整数０〜ＮＬＩＢ−１によって表される数（ＮＬＩＢ）個のライブラリーセットの添字番号を表す。このライブラリーの概念は、さらなる好ましい実施形態とともにかなり下で詳細に記載される。
【００５４】
本発明の方法は、累積的にまたは代替的に好ましく、工程ｂ）において、サンプルは、条件：ｖｉｄｉ＝ｖ０ｄ０ｚｉを満たすような体積（ｖｉ）および希釈因子（ｄｉ）を有する（Ｎ）個のコンパートメントに分配され、ここで、ｚｉ＞０であり、少なくとも（ｉ）の１つの値について商ｚｉ＋１／ｚｉは、１とは異なる。
【００５５】
本発明の好ましい方法において、工程ｂ）では、調節因子ｚｉは、指数級数に基づき、サンプルは、条件：
【数７】
0006055838.tif 000008
および／または
【数８】
0006055838.tif 000009
を満たすような体積（ｖｉ）および／または希釈（ｄｉ）を有する（Ｎ）個のコンパートメントに分配され、ここで、（Ａ）および（Ｂ）は、互いに独立して任意の実数を表し、好ましくは、Ａ＝１／Ｃ＋および／またはＢ＝［１．９５・ｌｎ｛（Ｃ＋／Ｃ−）／Ｎ｝］０．８５６である。この場合、サンプルを、
【数９】
0006055838.tif 000010
、好ましくは、
【数１０】
0006055838.tif 000011
である（Ｎ）個のコンパートメントに分割することがなおもより好ましく、
ここで、（Ｃ＋）、（Ｃ−）および（σＭＡＸ）は、本発明の第１の態様に関する本明細書の上文のとおりである。
【００５６】
本発明の方法の工程ｂ）において所定のサンプル体積が等比級数で分配される場合、本発明の分配は、以下の条件：
（ｖｉ＋１ｄｉ＋１）／（ｖｉｄｉ）＝ｚｉ＋１／ｚｉ＝ｘ
を満たし、ここで、ｘ＞０およびｘ≠１であり、好ましくは、（ｘ）の値は、約０．１、０．５、０．８、０．９、０．９１、０．９２、０．９３、０．９４、０．９５、０．９６、０．９７、０．９８、０．９９、１．０１、１．０２、１．０３、１．０４、１．０５、１．０６、１．０７、１．０８、１．０９、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、２または１０によって表される。この好ましい実施形態では、２つの連続したコンパートメント（ｉ＋１）および（ｉ）の調節因子が比較され、それによって、本明細書の上文にすでに述べられたような好ましい等比級数が示され、そのダイナミックレンジにわたって均一な分割精度が提供され得る（図２ａ）および詳細な図の説明におけるそれぞれの部分を参照のこと）。
【００５７】
本発明者らは、驚いたことに、商ｘ＝（ｖｉ＋１ｄｉ＋１）／（ｖｉｄｉ）の等比級数を含む本発明の方法は、要求される精度の粒子の濃度の推定値Ｅ（Ｃ）について好ましく計測することができることを突き止めた。任意の特定の値のインプット濃度Ｃ＊について、積
【数１１】
0006055838.tif 000012
によって特徴付けられるコンパートメント（ｉ＊）を、予め決定することができる。その結果、その等比級数においてｉ＊に隣接するコンパートメントにおける、起こり得る結果（粒子の存在または不在）を検討することができる。特に、いずれかの「側」のΔＮ／２個のコンパートメントからのシグナルを検討することができる：
【数１２】
0006055838.tif 000013
シグナルを得る確率は、コンパートメントｉ＊＋ｎの体積
【数１３】
0006055838.tif 000014
および／または希釈因子
【数１４】
0006055838.tif 000015
に依存するので：
【数１５】
0006055838.tif 000016
、本発明者らは、
【数１６】
0006055838.tif 000017
よりかなり大きいまたはかなり小さい体積および／または希釈を有するコンパートメントが、粒子の濃度の推定値
【数１７】
0006055838.tif 000018
に関する有意な情報をもたらさないことを突き止めた（図３ａの詳細な図の説明におけるそれぞれの部分を参照のこと）。したがって、本発明者らは、粒子の濃度
【数１８】
0006055838.tif 000019
を決定するための関連情報が、好ましくは、有限のコンパートメントセット（本発明において「有効ストライプ」と呼ばれ、ΔＮ個のコンパートメントを含むかまたはそれらからなる）に由来すべきであることを見出した。
【００５８】
本発明者らは、予想外にも、上記アッセイが、要求されるダイナミックレンジＣ∈（Ｃ−，Ｃ＋）内の任意の濃度を評価するために、ｉ）ｌｎ（２）／Ｃ−からｌｎ（２）／Ｃ＋までの値に及ぶ因子ｖｉｄｉの等比級数を示す主要なコンパートメントセットを調製すること、およびｉｉ）このセットを、上述の主要セットの各末端に配置される、同じ幾何数列を示すΔＮ／２個のコンパートメントの限界値（ｍａｒｇｉｎｓ）で補完することができることを見出した。
【００５９】
上述の好ましい実施形態によると、本発明者らが、実験の任意の結果によって示唆される全情報が、シグナルの特定の配置（本発明の文脈において「微視的状態（μ）」と呼ばれるものであって、所定の閾値数以上の粒子を含むかまたはそれらからなるコンパートメント（ｉ）に第１の値（ｋｉ）（正値）が割り当てられたもの）で含まれることをさらに見出したので、本発明の方法は、さらに最適化される。換言すれば、各コンパートメントの状態を説明するシグナルの詳細な分布は、本発明の文脈において微視的状態（μ）と呼ばれる。
【００６０】
第１の値（ｋｉ）が割り当てられる有効ストライプ内のそれぞれのコンパートメント（ｉ）の数と位置の両方が、確率変数である。同じ初濃度の粒子を用いる反復実験でも、異なる解がもたらされ得る。そのような各結果は、粒子の異なるインプット濃度からの異なる発生確率を有する。したがって、各特定の微視的状態（μ）の観察結果は、粒子の推定濃度Ｅ（Ｃ）に対して異なる期待値を有する（図３ａ、３ｂ、３ｃ、３ｄの詳細な図の説明におけるそれぞれの部分を参照のこと）。
【００６１】
等比級数を使用するとき、粒子の推定濃度Ｅ（Ｃ）の精度は、通常、等比級数の共通因子およびコンパートメントの数に左右される。そして、２つの重要な観察結果がもたらされ得る。第１に、標準偏差の値に応じて、推定濃度Ｅ（Ｃ）の結果のほとんどが、インプット濃度（Ｃ＊）の非常に近くに収まる（図３ｄの詳細な図の説明におけるそれぞれの部分を参照のこと）。第２に、微視的状態の解析によってもたらされる標準偏差は、正値の和Ｋの解析から得られる標準偏差よりも小さい（図４ａ）、４ｂ）および４ｃ））の詳細な図の説明におけるそれぞれの部分を参照のこと）。さらに、微視的状態に関連する標準偏差は、上記から詳細に明らかにされた限度を有する。この限界は、ρ（μ｜Ｃ）を変換するベイズ理論を使用して、最も確からしい微視的状態について計算された標準偏差の確率ρ（Ｃ｜μ）によって与えられる。この微視的状態は、
【数１９】
0006055838.tif 000020
が第１の値（ｋｉ）をもたらすすべてのコンパートメント、および第２の値（ｋｉ）が割り当てられる
【数２０】
0006055838.tif 000021
を含むその他のものを有し、ここで、コンパートメント（ｋｉ）が、第１の値を示唆する閾値数より少ない粒子を含むかまたはそれらからなる場合、第２の値（ｋｉ）（負値）が割り当てられる（図５ａ）および５ｂ）ならびに詳細な図の説明におけるそれぞれの部分を参照のこと）。
【００６２】
長い一連のコンパートメントを含む本発明の方法は、アッセイ使用の圧倒的多数において、最も確からしい本発明の微視的状態に基づいて計算された推定値としての精度と同じか、またはそれよりもおそらく高い、またはそれよりもおそらく有意に高い濃度の推定値の精度をもたらす。さらに、本発明者らは驚いたことに、特に（すなわち、可能性が最も高いことに）、本方法のダイナミックレンジの限界に近い濃度の場合（すなわち、
【数２１】
0006055838.tif 000022
または
【数２２】
0006055838.tif 000023
の場合）に、本発明の方法が、低い精度の推定値をもたらす、起こりそうにないシグナル／値のセットを低い確率で返すことがあり、ゆえに、不適当な事象が生じたことおよびその実験が再度行われるべきであることを（要求されたものよりも高い標準偏差の値を提供することによって）ユーザーに知らせることを見出した。従来技術のデジタルアッセイもまた、誤報の濃度の推定値を提供するという確率の低い起こりそうにない事象を許容するが、微視的状態のアプローチを使用する上述の好ましい本発明の特徴だけは、そのような不適当な起こりそうにない事象についてユーザーにフィードバックを提供することができる。
【００６３】
【数２３】
0006055838.tif 000024
よりもかなり大きいおよびかなり小さいコンパートメントが有する情報は、連続的に次第に少なくなっていくので、本発明に係る有効ストライプにおける区画の数ΔＮが増加すると、推定値のＥ（Ｃ）は、ある特定の限界までであるが明らかに改善される。実際に、ｘという任意の値について、推定濃度の標準偏差は、ΔＮが大きくなるともに、限界
【数２４】
0006055838.tif 000025
までであるが減少する。高精度と少数のコンパートメントとの間に折り合いを付けるΔＮの対応する値は、好ましくは、関数ΔＮ（ｘ）＝４．５６３７（１−ｘ）−０．７９８によって決定することができる。
【００６４】
上述の好ましい本発明の方法を行う１つの方法は、商ｘ＝（ｖｉ＋１ｄｉ＋１）／（ｖｉｄｉ）の等比級数が、関数：
【数２５】
0006055838.tif 000026
によって決定可能であり、好ましくは、決定され、コンパートメントの数（Ｎ）は、好ましくは、関数：
【数２６】
0006055838.tif 000027
によって決定可能な値以上の整数に設定され、ここで、（ΔＮ）は、好ましくは、関数：
ΔＮ＝４．５６３７（１−ｘ）−０．７９８
によって決定可能な、好ましくは、決定される値以上の整数であり、ｄ０ｖ０に対する値は、関数
【数２７】
0006055838.tif 000028
によって決定可能であり、好ましくは、決定され、ここで、（Ｃ＋）、（Ｃ−）、（σＭＡＸ）、（ｄ０）および（ｖ０）は、本発明の第１の態様に関して本明細書の上文で定義されたとおりである、本発明の方法である。
【００６５】
上述の好ましい本発明の方法に従ったサンプルの分配は、以下の工程：（ｉ）所与の（Ｃ＋）、（Ｃ−）および（σＭＡＸ）に対して、Ｎ、ΔＮおよびｘに対する値を決定する工程、ｉｉ）ｘおよびΔＮを使用して、その列における第１コンパートメントの体積ｖ０および希釈因子ｄ０を決定する工程、（ｉｉｉ）（ｖｉｄｉ）＝（ｖ０ｄ０）ｘｉ（ここで、（ｉ）は、０からＮ−１までの整数である、Ｎ個のコンパートメントの添字を表す）を用いてＮ個のコンパートメントを順に並べる工程としてデザインすることができる。
【００６６】
本発明の方法の上記の一次方程式は、強力な分析ツールをもたらす。第１に、ダイナミックレンジ
【数２８】
0006055838.tif 000029
を、精度とは完全に独立して調整することができる。第２に、所与の要求される最低精度およびダイナミックレンジのために、本発明の方法は、コンパートメントにおいて等体積を使用する標準的なデジタルアッセイよりも１０２〜１０４倍も少ないコンパートメントしか要求しない。
【００６７】
例えば、Ω＝１０４またはΩ＝１０７のダイナミックレンジを扱う古典的なアッセイでは、当該分野における既知知識によると、それぞれＮ≧２・１０３またはＮ≧２・１０６個の試験体積が必要である。Ｅ（σ）＜５０％という推定値の精度で十分である場合、わずか３５または４７個のコンパートメントを含む本発明の方法によって同じΩを評価することができる。より正確な実験（すなわちσ＜２５％またはσ＜１０％）が必要とされる場合、それぞれたった１４０および７９５個、または１９２および１１２０個の試験体積が、本発明の方法に関して必要とされる。これらの数は、それらを行うために技術的要件を定性的に変更する古典的なアッセイの場合よりも何桁も小さい。
【００６８】
アルゴリズムの演算を、アッセイにおいて数値的にかつ実験的に検証した（検証されたダイナミックレンジおよび精度：（ｉ）Ω＝１０３、σ≦８０％、Ｎ＝１０、ｘ＝０．５０および（ｉｉ）Ω＝１０２、σ≦６０％、Ｎ＝１０、ｘ＝０．６０（実施例ならびに図８ａ）および図８ｂ）ならびに詳細な図の説明におけるそれぞれの部分を参照のこと）。
【００６９】
本発明の方法はさらに、従来技術のマルチボリュームデジタルアッセイアプローチ［Ｓｈｅｎ，Ｆ．；Ｓｕｎ，Ｂ．；Ｋｒｅｕｔｚ，Ｊ．Ｅ．；Ｄａｖｙｄｏｖａ，Ｅ．Ｋ．；Ｄｕ，Ｗ．；Ｒｅｄｄｙ  Ｐ．Ｌ．；Ｊｏｓｅｐｈ，Ｌ．Ｊ．；Ｉｓｍａｇｉｌｏｖ，Ｒ．Ｆ．，“Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｗｉｔｈ  Ｌａｒｇｅ  Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｒａｎｇｅ  Ｕｓｉｎｇ  Ｍｕｌｔｉｖｏｌｕｍｅ  Ｄｉｇｉｔａｌ  ＲＴ−ＰＣＲ  ｏｎ  ａ  Ｒｏｔａｔｉｏｎａｌ  ＳｌｉｐＣｈｉｐ  Ｔｅｓｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ＨＩＶ  ａｎｄ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  Ｖｉｒａｌ  Ｌｏａｄ”，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ａｒｔｉｃｌｅ  ＡＳＡＰ  （Ｘ  ２０１１）］（これらは、すでに、等体積を使用する標準的なデジタルアッセイと比較してダイナミックレンジの範囲を広げていた）よりも優れていると判明する。このＩｓｍａｇｉｌｏｖのマルチボリューム法は、以下のダイナミックレンジ：（ａ）６４０個のコンパートメントを使用する約１０４（５．２・１０２〜４．０・１０６）（４ファミリー，デザイン１）および（ｂ）８８０個のコンパートメントを使用する約１０５（１．７・１０２〜２．０・１０７）（６ファミリー，デザイン２Ｂ）という３倍の分解能（３０％というシグマ（推定値の標準偏差）に対応する）を示す。
【００７０】
Ｉｓｍａｇｉｌｏｖの方法を本発明の方法と比較すると、本発明の方法は、（ａ）Ｎ＝９８コンパートメント（ｘ＝０．８８１３７３２６４）および（ｂ）Ｎ＝１１７コンパートメント（ｘ＝０．８８１３７３２６４）を用いて同じダイナミックレンジおよび精度を得る。
【００７１】
異なる観点から、６４０個のコンパートメントの使用が可能である場合、本発明の方法は、以下のダイナミックレンジと精度との組み合わせをもたらすことができる：２・１０３のダイナミックレンジとσ＜１０％；５・１０７のダイナミックレンジとσ＜１５％；および＞１０１０のダイナミックレンジとσ＜３０％。８８０個のコンパートメントの使用が可能である場合、本発明の方法は、σ＜１０％で３・１０４のダイナミックレンジ；σ＜１５％で１０１０のダイナミックレンジ；およびσ＜３０％で＞＞１０１０のダイナミックレンジをもたらすことができる。したがって、上記の比較は、本発明の方法が、ｉ）コンパートメントの数を６４０から９８におよび８８０から１１７に減少させること、ｉｉ）同じ数のコンパートメントの場合に、ダイナミックレンジを１００万倍またはそれよりも良好に広げること、ならびにｉｉｉ）ダイナミックレンジおよび精度を自由に調整する選択肢を与えることが可能であることを定量的に示す。
【００７２】
診断において、本アッセイの頻繁に考慮されるパラメータは、２つのサンプルが異なる濃度を有するかの統計学的に有意な判定の分解能である。本発明の方法の分解能は、標準偏差の一般的な掛け算によって近似され、すなわち、２つのサンプルを識別する７０、９０、９５％の信頼度は、濃度がｒσ倍（ここでｒ＝１、２または３である）異なるサンプルの場合に実現される。したがって、要求されるアッセイの分解能Ｒ＝Ｃ１／Ｃ２および要求される信頼度が判明している場合、そのアッセイをデザインする式に挿入されるべき標準偏差は、σ＝（Ｒ−１）／ｒである。
【００７３】
本発明の方法の１つのさらなる利点は、それがその実験の任意の単一の確率実現から完全な情報をもたらすことができる点である。換言すれば、上に列挙された好ましいスケーリングは、おそらく最も高い標準偏差（すなわち、このアッセイによって保証される最低の精度）を提供する：推定値Ｅ（Ｃ）の明らかにされた標準偏差σは、範囲Ｃ∈（Ｃ−，Ｃ＋）内のＣに対するアッセイにおいて観察されたすべての微視的状態に対するおそらく最も高い値
【数２９】
0006055838.tif 000030
である。しかしながら、本方法が、推定値
【数３０】
0006055838.tif 000031
のより小さい標準偏差
【数３１】
0006055838.tif 000032
をもたらすがゆえにより高い精度をもたらす成功の解（微視的状態）μｉを返すことも生じ得る（ここで、ｉは、微視的状態ｉ＝０から２Ｎ−１まで添字を付与する）。ｘが大きくなるにつれて、
【数３２】
0006055838.tif 000033
の分布は、より狭く、かつ最大の標準偏差値に近くなる。興味深いことに、標準偏差の期待値σ期待値（ｘ）は、ｘの多項式関数として好ましく表すことができる。これは、最大標準偏差σｍａｘ（ｘ）の代わりにアッセイをデザインするための基礎として使用することができるだろう。
【００７４】
本発明の概念を用いて、異なる範囲の濃度において、要求される異なる精度を提供するアッセイを構築することがさらに好ましい。これは、診断（例えば、低いおよび高い濃度において、ダイナミックレンジのために精度が犠牲にされ得る場合）において有用であり得る一方で、その濃度の中間の範囲において、正確な推定値は、臨床上、有益である。
【００７５】
したがって、別の好ましい本発明の方法は、
区間（Ｃ−，Ｃ＋）をｑ個の部分区間
【数３３】
0006055838.tif 000034
に、好ましくは、互いに素な部分区間に、分割することに関し、各部分区間において、値ｄｉｖｉのセットは、商ｘｎの等比級数であり、ここで：
１）
【数３４】
0006055838.tif 000035
である場合、
【数３５】
0006055838.tif 000036
ΔＮｎ＝４．５６３７（１−ｘｎ）−０．７９８
【数３６】
0006055838.tif 000037
0006055838.tif 000038
２）
【数３７】
0006055838.tif 000039
である場合、
【数３８】
0006055838.tif 000040
ΔＮｎ＝４．５６３７（１−ｘｎ）−０．７９８
【数３９】
0006055838.tif 000041
２．式中：Ｃ−は、未知濃度Ｃを決定するための区間の下限を意味し、Ｃ＋は、未知濃度Ｃを決定するための区間の上限を意味し、
【数４０】
0006055838.tif 000042
は、番号ｎの部分区間の下限を意味し、
【数４０】
0006055838.tif 000043
は、番号ｎの部分区間の上限を意味し、
【数４２】
0006055838.tif 000044
は、部分区間
【数４３】
0006055838.tif 000045
における、サンプル中の粒子の未知濃度Ｃの推定値Ｅ（Ｃ）の許される最大の標準偏差を意味し、ｎは、１〜ｑの整数にわたる部分区間の番号であり、ｉは、０〜Ｎｎ−１の整数にわたるｎ番目の区間におけるコンパートメントの番号である。
【００７６】
さらに累積的にまたは代替的に好ましい本発明の方法によると、本発明の方法は、以下の工程：
ｃ）コンパートメントにおける所定の閾値数の粒子、好ましくは、１、２、３個またはそれ以上の粒子の存在を示唆する測定可能なシグナルを得るために、１つ以上の好適な試薬および必要に応じて１つ以上の希釈剤を用いてそれらのコンパートメントの粒子を必要に応じて増幅する工程、
ｄ）（Ｎ）個のコンパートメントの各々においてシグナルを測定し、少なくとも一部、好ましくは、全部のコンパートメントに値（ｋｉ）を割り当てる工程（ここで、（ｉ）は、整数０〜Ｎ−１によって表されるコンパートメントの添字番号を表し、コンパートメント（ｉ）が、所定の閾値数以上の粒子を含むかまたはそれらからなる場合、コンパートメント（ｉ）は、第１の値（ｋｉ）を割り当てられ、コンパートメント（ｋｉ）が、第１の値を示唆する閾値数未満の粒子を含むかまたはそれらからなる場合、コンパートメント（ｉ）は、第２の値（ｋｉ）を割り当てられる）および
ｅ）粒子の推定濃度Ｅ（Ｃ）を決定する工程（ここで、その粒子の推定濃度Ｅ（Ｃ）は、
ｉ．第１および／もしくは第２の値（ｋｉ）の和Ｋの関数（ここで、その関数は、好ましくは、較正補正関数を用いて補正される）ならびに／または
ｉｉ．重み付けされた第１および／もしくは第２の値（ｗｉｋｉ）の和Ｋの関数（ここで、それらの値（ｋｉ）の少なくとも一部、好ましくは、各値（ｋｉ）は、重み値（ｗｉ）によって調節され、ここで、（ｉ）は、整数０〜Ｎ−１によって表されるコンパートメントの添字番号を表し、重み値（ｗｉ）は、好ましくは、番号（ｉ）のコンパートメントの体積および／または希釈の程度に反比例し、その関数は、好ましくは、較正補正関数を用いて補正される）ならびに／または
ｉｉｉ．微視的状態μの任意の次数の数、ベクトル、行列、テンソルもしくは他の任意の明白な表示の関数（ここで、その任意の次数の数、ベクトル、行列、テンソルまたは他の任意の表示は、工程ｅ）において測定される値（ｋｉ）の少なくとも一部を反映する情報を含むかまたはそれからなり、好ましくは、微視的状態μを表すベクトルｋ≡｛ｋｉ｝を含むかまたはそれからなり、ここで、そのベクトル（ｋ）は、工程ｅ）において測定される値（ｋｉ）の少なくとも一部、好ましくは、全部を含むかまたはそれらからなる）
によって決定可能である）
を含むかまたはそれらからなる。
【００７７】
測定される粒子が、そのような測定可能なシグナルを提供しない場合、本発明の方法の工程ｃ）によると、それらの粒子の少なくとも一部、好ましくは、それらの粒子の全部が、測定可能なシグナルを提供するように、粒子を増幅することが好ましい。好適な測定可能なシグナルは、視覚的におよび／または好適な手段によって検出することができる任意のシグナルである。好ましい方法において、粒子は、結合して複合体を形成するかまたは別の方法（適切に励起されたとき特定の波長の光および／または電気を励起させるような、好ましくは、蛍光を示す（アップおよびダウンコンバート）、赤外（ＩＲ）範囲（近赤外および／または遠赤外波長，ＮＩＲ／ＦＩＲ）の光を示すかまたは電気を示すような）で粒子と相互作用する好適な成分、例えば、レポーター分子で標識される。本明細書の以後で述べられる増幅方法のいずれかにおける使用に特に適したレポーター分子は、一般に公知である。好ましい方法では、決定される粒子の単一結合部位について競合する２つのレポーター分子を使用することができ、ゆえに、本発明の方法のダイナミックレンジをさらに広げることができる。好適なレポーター分子の例は、ＷＯ２０１２／０４９３１６Ａ１に与えられており、ここで、サンプルの粒子と（直接または間接的に）相互作用する異なるレポーター分子（マーカー）が使用され、それらのレポーター分子は、好ましくは、核酸分子、例えば、オリゴヌクレオチドである。そのようなレポーター分子は、好ましくは、近接プローブベースの検出アッセイにおいて使用され、好適なレポーター分子（マーカー）に関するＷＯ２０１２／０４９３１６Ａ１の開示のその全体が本明細書に援用される。
【００７８】
本発明の方法は、工程ｃ）によると、粒子の存在を定量的に決定するための任意の増幅方法に適用可能である。好ましくは、本発明の方法は、粒子の存在を測定可能なシグナルまで増幅する方法に適用可能であり、好ましくは、それらの粒子は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、好ましくは、周期性の温度変動によるもの、ループ媒介性等温増幅（ＬＡＭＰ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、カスケードローリングサークル増幅（カスケードＲＣＡ）、ヘリカーゼ依存性増幅、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、ニッキング酵素増幅反応（ＮＥＡＲ）、単一分子酵素結合免疫吸着アッセイ（デジタルＥＬＩＳＡ）、もしくは粒子の存在を測定可能なシグナルまで増幅するための他の任意の手順またはそれらの組み合わせを用いて増幅される。上述の増幅方法は、従来技術において公知であり、当業者は、どの好適な１つ以上の試薬および必要に応じて１つ以上の希釈剤を使用することができるかを容易に識別できるだろう。
【００７９】
本発明の方法の工程ｄ）に関して、粒子ならびに必要に応じて１つ以上の試薬および必要に応じて１つ以上の希釈剤を含むすべてのコンパートメントにおける混合物は、少なくとも１つの粒子を含むコンパートメントが、例えば、蛍光および／またはリン光および／または電気の強度によってその粒子の存在を示唆するシグナルを示すように、通常、適切に励起される。少なくとも一部、好ましくは全部のコンパートメントにおけるシグナルの値が、好適な手段を用いて測定される。続いて、そのシグナルの値がそれぞれ、好適な手段（例えば、蛍光、リン光の強度を測定して、そのシグナルを、それらのコンパートメント（ｉ）の少なくとも一部、好ましくは全部にそれぞれ割り当てられる第１または第２の値（ｋｉ）に変換するのに適した検出器）によって変換される。好ましくは、粒子の閾値数は、１つのコンパートメントにおける１、２、３、４、５、６、７個またはそれ以上の粒子であり、より好ましくは、１個の粒子である。第１および第２の値（ｋｉ）は、任意の好適な値、好ましくは、第１の値（ｋｉ）は、コンパートメント（ｉ）における閾値数の粒子の存在を示唆する正値を表し、第２の値（ｋｉ）は、そのコンパートメントにおける閾値数の粒子がコンパートメント（ｉ）に存在しないことを示唆する負値を表す値である。好ましくは、第１および第２の値（ｋｉ）は、二進値を含み、ここで、その第１の値（ｋｉ）は、好ましくは、「１」または他の任意の整数、実数もしくは符号によって表され、第２の値（ｋｉ）は、好ましくは、「０」、または第１の値（ｋｉ）を表す整数とは異なる他の任意の整数、実数もしくは符号によって表される。
【００８０】
本発明の方法の工程ｅ）によると、粒子の推定濃度Ｅ（Ｃ）を決定する好ましい方法が開示される。
【００８１】
本発明の方法の第１の選択肢ｉ）によると、第１および／または第２の値（ｋｉ）の和Ｋ、好ましくは、｛ｋｉ｝、Ｎおよび｛ｖｉｄｉ｝またはＰ（ｖｉｄｉ）値のセット（ここで、Ｐ（ｖｉｄｉ）は、好ましくは、体積および／または希釈の関数である）は、公知の統計的アルゴリズムによって、好ましくは、ベイズの定理を使用することによって、濃度の推定値に変換される。
【００８２】
好ましくは、上述の関数は、較正補正関数を使用して補正される。好適な較正補正関数は、その試験のダイナミックレンジ内の標的粒子の濃度を有する標準的なサンプルを用いて実験的に決定され得る。その較正補正は、サンプル中の粒子の濃度の推定値Ｅ（Ｃ）と、サンプルの体積によって分割されたコンパートメントにおいてランダムに分布した粒子の実際の数Ｍとの依存関係に基づいて数値的にも計算され得る：Ｃ＝Ｍ／Ｖサンプル：ｆｃｏｒｒ（Ｃ）＝Ｃ／Ｅ（Ｃ）。較正補正ｆｃｏｒｒ（Ｃ）を計算すれば、粒子数の補正された推定値は、式Ｅｃｏｒｒ（Ｃ）＝Ｅ（Ｃ）・ｆｃｏｒｒ（Ｃ）を用いて決定可能であり、好ましくは、決定される。例えば、０〜４７３の値にわたる添字ｉについて式ｖｉ＝ｅ０．０１１５・ｉによって与えられる体積を有する４７４区画の分布の場合、その補正は、ｆｃｏｒｒ（Ｃ）＝（−１．４８・１０−５・Ｃ＋１．０９）−１である（図６および詳細な図の説明におけるそれぞれの部分を参照のこと）。
【００８３】
マルチボリュームアッセイの解析における上述の欠点を克服するために、本発明者らは、驚いたことに、通常の統計学的方法を適用して、第１および／または第２の重み付けされた値（ｗｉｋｉ）の単純な和Ｋを使用することによって粒子の推定濃度Ｅ（Ｃ）が本発明的に決定されることを突き止めた（ここで、値（ｋｉ）の少なくとも一部、好ましくは、各値（ｋｉ）は、重み値（ｗｉ）を用いて調節され、その重み値（ｗｉ）は、好ましくは、コンパートメントの希釈因子および／または体積における関数（ｗｉ＝ｆ（ｄｉ，ｖｉ））であり、より好ましくは、番号（ｉ）のコンパートメントの希釈因子および／または体積の程度に反比例する（図７ａ）、７ｂ）および７ｃ）の詳細な図の説明におけるそれぞれの部分を参照のこと）。好ましくは、粒子の濃度Ｃの決定は、好ましくは、｛ｗｉｋｉ｝、Ｎおよび｛ｖｉｄｉ｝またはＰ（ｖｉｄｉ）値のセットを用いて行われ、ここで、Ｐ（ｖｉｄｉ）は、好ましくは、体積および／または希釈の非増加関数であり、公知の統計的アルゴリズムによって、好ましくは、ベイズの定理を使用することによって、濃度の推定値に変換される。重み値（ｗｉ）が、コンパートメントの体積および希釈に依存する場合、ある分布の重みｗ（ｄｉｖｉ）が使用され、前記分布は：
ａ．ｗ（ｄｉｖｉ）≡１、
ｂ．ｗ（ｄｉｖｉ）＝（ｄｉｖｉ）β（ここで指数部βは任意の実数を表す）、
ｃ．ｗ（ｄｉｖｉ）＝ｅｘｐ（βｄｉｖｉ）（ここで乗数βは任意の実数である）
を含む群から選択される。
【００８４】
好ましくは、選択肢ｉｉ）に係る上述の方法は、選択肢ｉ）とともに本明細書の上文に記載されたような較正補正関数を用いて補正される（図６および詳細な図の説明におけるそれぞれの部分を参照のこと）。
【００８５】
コンパートメント間の粒子の確率分布が従属変数の分布であるとき、選択肢ｉ）およびｉｉ）の粒子の濃度の推定値Ｅ（Ｃ）を決定する上述の方法は、所定のサンプル体積における粒子の濃度の推定値Ｅ（Ｃサンプル）の決定に関する。それらの関数を変換して、レザバー内の粒子の濃度の推定値Ｅ（Ｃレザバー）または検体における粒子の濃度の推定値Ｅ（Ｃ検体）をもたらす方法は、本明細書の上文に記載されている。
【００８６】
しかしながら、方法ｉ）およびｉｉ）に係る本発明の総和手順において、値、好ましくは、二進値の和Ｋ、または値、好ましくは、二進値の重み付けされた和Ｋは、コンパートメントが少なくとも１つの標的粒子を含んだかおよび含まなかったかの明白な情報を含まないので、これらの総和手順は、いくらかの情報を失う結果となる。
【００８７】
微視的状態μの任意の次数の数、ベクトル、行列、テンソルまたは他の任意の明白な表示の好ましい本発明の概念が、粒子の推定濃度Ｅ（Ｃ）を決定するために好ましく使用される場合、その任意の次数の数、ベクトル、行列、テンソルまたは他の任意の表示は、工程ｅ）において測定された値（ｋｉ）の少なくとも一部を反映する情報を含むかまたはそれらからなり、好ましくは、微視的状態μを表すベクトルｋ≡｛ｋｉ｝を含むかまたはそれらからなり、ここで、そのベクトル（ｋ）は、工程ｅ）において測定された値（ｋｉ）の少なくとも一部、好ましくは、全部を含むかまたはそれらからなる。本発明の方法の工程ｅ）に関して本明細書の上文に記載されたような（ｋｉ）の第１および／または第２の値の好ましい実施形態もまた、上述の好ましい方法に適用される。微視的状態μのアプローチを使用する驚くべき利点は、粒子の推定濃度Ｅ（Ｃ）を計算するための手順の計算の複雑度が低下する点、および観察されたコンパートメントが少なくとも閾値数の粒子を含むことの根拠となるほぼ確実な濃度に関する情報が、増加する点である。微視的状態μのアプローチは、好ましくは（すなわち、可能性が最も高いことに）、本方法のダイナミックレンジの限界に近い濃度の場合（すなわち、
【数４４】
0006055838.tif 000046
または
【数４５】
0006055838.tif 000047
の場合）に、フィードバックを提供し、本発明の方法は、不適当な事象が生じたことおよびその方法が再度行われるべきであることを（要求されたものよりも高い標準偏差の値を提供することによって）ユーザーに知らせる。本明細書の上文で述べたように、本発明の方法は、サンプル中または検体およびサンプルを調製したレザバー内の粒子の濃度を推定するために使用され得る。
【００８８】
好ましくは、工程ｅ）において、微視的状態μの計算は、ベクトルｋを推定値Ｅ（Ｃ）に写像するニューラルネットワークを使用して行われる。
【００８９】
微視的状態μのアプローチの好ましい実施形態によると、本発明の方法の工程ｅ）において、粒子の推定濃度Ｅ（Ｃ）は、ベイズの定理によってｐ（Ｃ｜μ）に変換される、好ましくは、以下の演算を行うことによって決定される、条件付き確率ｐ（μ｜Ｃ）の関数である：
ｅ１）式：
【数４６】
0006055838.tif 000048
からの条件付き確率ｐ（μ｜Ｃ）の計算
ｅ２）式：
【数４７】
0006055838.tif 000049
からの条件付き確率ｐ（Ｃ｜μ）の計算
（式中：
Ｃｍｉｎ＝−Ｃ−ｌｎ（ｐＴＲ）／ｌｎ（２）、Ｃｍａｘ＝−Ｃ＋ｌｎ（１−ｐＴＲ）／ｌｎ（２）であり：Ｃ−は、未知濃度Ｃを決定するための区間の下限を意味し、Ｃ＋は、未知濃度Ｃを決定するための区間の上限を意味し、０＜ｐＴＲ＜１は、アッセイ精度を特定するパラメータであり、好ましくは、Ｃｍｉｎ＝０およびＣｍａｘ＝∞であり；
一連の値ｖｉｄｉが、商ｘ＜１の等比級数である場合、ＣｍｉｎおよびＣｍａｘは、Ｃｍｉｎ＝Ｃ−ｘΔＮ／２、Ｃｍａｘ＝Ｃ＋ｘ−ΔＮ／２に等しく、式中、ΔＮ＝４．５６３７（１−ｘ）−０．７９８である）
ｅ３）推定値Ｅ（Ｃ）としての濃度Ｃの決定（ここで：
【数４８】
0006055838.tif 000050
であり、標準偏差
【数４９】
0006055838.tif 000051
であり、ここで：
【数５０】
0006055838.tif 000052
である）。
【００９０】
本明細書の上文にすでに記載されたように、本発明の方法は、決定されたコンパートメントの数Ｎおよび決定された調節因子ｚｉが所定のサンプル体積の分配をもたらす場合に好ましい解決法も提供するが、実際にはそれぞれの研究室でそれらを取り扱うことができない（例えば、サンプルを分配する好適な手段がそこに存在しないため）。この場合、本発明の方法は、ライブラリーアプローチの使用を推奨し、ここで、工程ｂ）において、サンプルが、２以上の数（ＮＬＩＢ）個の別個のコンパートメントセット（ライブラリー）に分配され、各ライブラリーセットは、（ｊ）という添字を付与され、
【数５１】
0006055838.tif 000053
個のコンパートメントを含み、同じライブラリーにおける各コンパートメントは、同じ値の調節因子（ｚｊ）を有するサンプル体積の一部を含むかまたはそれらからなり、ここで、ｚｊは、ライブラリーセット（ｊ）におけるサンプルの体積（ｖｊ）および希釈因子（ｄｊ）の関数であり、そのＮＬＩＢ個の別個のライブラリーセットｊは、異なる値の調節因子（ｚｊ）によって互いに識別可能であり、ここで、ｊは、整数０〜ＮＬＩＢ−１によって表される数（ＮＬＩＢ）個のライブラリーセットの添字番号を表す。
【００９１】
ライブラリーアプローチに関して、調節因子（ｚｊ）は、好ましくは、ｚｊ＝（ｖｊｄｊ）／（ｖ０ｄ０）の関数またはその類似物によって決定され、ここで、（ｖｊ）は、ライブラリーセット（ｊ）のコンパートメントにおけるサンプルの体積を表し、（ｄｊ）は、ライブラリーセット（ｊ）のコンパートメントにおけるサンプルの希釈因子を表し、ここで、（ｖ０）は、選択された参照ライブラリーセット（ｊ）のコンパートメントにおけるサンプルの体積を表し、（ｄ０）は、選択された参照ライブラリーセット（ｊ）のコンパートメントにおけるサンプルの希釈因子を表す。
【００９２】
ライブラリーアプローチの別の好ましい実施形態によると、本発明の方法の工程ｂ）において、数（ＮＬＩＢ）個のライブラリーセット（ｊ）の少なくとも一部、好ましくは、全部は、各ライブラリーセット（ｊ）に対して
【数５２】
0006055838.tif 000054
個のコンパートメントを含むかまたはそれからなり、条件：（ｖｊ＋１ｄｊ＋１）／（ｖｊｄｊ）＝ｚｊ＋１／ｚｊ＝ｘを満たし、ここで、ｘ＞０かつｘ≠１である。商ｘ＝（ｖｊ＋１ｄｊ＋１）／（ｖｊｄｊ）の等比級数を使用することによって、濃度の推定値Ｅ（Ｃ）の精度が最適化され、好ましくは、その精度は、本明細書の上文に記載された微視的状態μのアプローチと比較して２０％しか悪くない。
【００９３】
本発明の方法のさらに累積的にまたは代替的に好ましい実施形態によると、値ｖｊｄｊ＝ｖ０ｄ０ｚｊのセットは、商ｘ＝（ｖｊ＋１ｄｊ＋１）／（ｖｊｄｊ）の等比級数を表し、ここで、関数
【数５３】
0006055838.tif 000055
は：商（ｘ）の好ましい最大値を表し、商（ｘ）は、上記方法を実行するための技術的優先性に対して調整することができ、各ライブラリーセット（ｊ）におけるコンパートメントの数
【数５４】
0006055838.tif 000056
は、関数：
【数５５】
0006055838.tif 000057
によって決定可能な値以上の整数に設定され、別個のライブラリーセット（ｊ）の数（ＮＬＩＢ）は、好ましくは、関数
【数５６】
0006055838.tif 000058
によって決定可能な値以上の整数に設定され、ここで、ΔＮＬＩＢは、関数
ΔＮＬＩＢ＝４．５６３７（１−ｘ）−０．７９８
によって決定可能であり、好ましくは、決定され、ｖ０ｄ０は、関数
【数５７】
0006055838.tif 000059
によって決定可能であり、好ましくは、決定され、ここで、（Ｃ＋）、（Ｃ−）および（σＭＡＸ）は、本発明の第１の態様に関する本明細書の上文のとおりであり、（ｄ０）および（ｖ０）は、本発明のライブラリーアプローチに関して本明細書の上文で定義されたとおりである。
【００９４】
本発明に関して、コンパートメントの数ＮＬＩＢおよびΔＮＬＩＢは、ある整数を表し、ここで、その整数は、基礎をなす関数の真の結果に近い、好ましくは、最も近い整数に決定される。
【００９５】
さらに好ましい本発明の方法によると、数（ＮＬＩＢ）個のライブラリーセット（ｊ）の少なくとも一部、または好ましくは各々が、工程ｄ）においてライブラリーセット（ｊ）に含まれるコンパートメントの各々に割り当てられる値（ｋｉ）の少なくとも一部、好ましくは、全部の関数である値
【数５８】
0006055838.tif 000060
を割り当てられ、その後、その値
【数５９】
0006055838.tif 000061
は、微視的状態μの任意の次数の数、ベクトル、行列、テンソルまたは他の任意の明白な表示に写像される（ここで、その任意の次数の数、ベクトル、行列、テンソルまたは他の任意の表示は、値
【数６０】
0006055838.tif 000062
の少なくとも一部を反映する情報を含むかまたはそれらからなり、好ましくは、微視的状態μを表すベクトル
【数６１】
0006055838.tif 000063
を含むかまたはそれらからなり、ここで、そのベクトル（ｋＬＩＢ）は、値
【数６２】
0006055838.tif 000064
の少なくとも一部、好ましくは、全部を含むかまたはそれらからなり、ここで、好ましくは、その値
【数６３】
0006055838.tif 000065
は、工程ｄ）においてライブラリーセット（ｊ）に含まれるコンパートメントの各々に割り当てられた値（ｋｉ）の和Ｋｊを含むかまたはそれからなる）。
【００９６】
３．本発明の好ましい実施形態によると、粒子の濃度の推定値Ｅ（Ｃ）の決定は、以下の演算が行われることを特徴とする：
ｅ１）式：
【数６４】
0006055838.tif 000066
からの条件付き確率ｐ（μ｜Ｃ）の計算
ｅ２）式：
【数６５】
0006055838.tif 000067
からの条件付き確率ｐ（Ｃ｜μ）の計算
（式中：Ｃｍｉｎ＝−Ｃ−ｌｎ（ｐＴＲ）／ｌｎ（２）、Ｃｍａｘ＝−Ｃ＋ｌｎ（１−ｐＴＲ）／ｌｎ（２）であり：Ｃ−は、未知濃度Ｃを決定するための区間の下限を意味し、Ｃ＋は、未知濃度Ｃを決定するための区間の上限を意味し、０＜ｐＴＲ＜１は、アッセイ精度を特定するパラメータであり、好ましくは、ｐＴＲ→１であり；一連の値ｖｉｄｉが、商ｘ＜１の等比級数である場合、ＣｍｉｎおよびＣｍａｘは、好ましくは、Ｃｍｉｎ＝Ｃ−ｘΔＮ／２、Ｃｍａｘ＝Ｃ＋ｘ−ΔＮ／２に等しく、式中、ΔＮ＝４．５６３７（１−ｘ）−０．７９８である）
ｅ３）推定値Ｅ（Ｃ）としての濃度Ｃの決定（ここで：
【数６６】
0006055838.tif 000068
であり、標準偏差
【数６７】
0006055838.tif 000069
であり、ここで：
【数６８】
0006055838.tif 000070
である）。
【００９７】
本発明の方法のさらに好ましい実施形態によると、各ライブラリーにおけるコンパートメントのコピー数は、アッセイの要求されたダイナミックレンジおよび精度を保証しつつ、幾何数列の公比の技術的に好ましい値ｘおよびＮ’を調整するための簡便な方法を提供する
【数６９】
0006055838.tif 000071
に等しい（図２ｂおよび詳細な図の説明のそれぞれの部分を参照のこと）。
【００９８】
本発明の方法のさらに好ましい実施形態によると、好ましくは、リアルタイムＰＣＲ法を用いて番号ｉのライブラリーの各コンパートメントにおいてシグナルが測定され、そのコンパートメントは、そのコンパートメントにおける標的粒子の最初のコピー数に左右される実数値を割り当てられ、その後、その番号ｉのライブラリーは、ある特定の任意に選択された陽性のコンパートメントｖｓｍｉｎｄｓｍｉｎよりも、そのライブラリーに属するすべてのコンパートメントに何倍多くの標的粒子のコピーが存在するかを特定する値ｋｉを割り当てられ、測定されたシグナルは、パラメータｋｉの値を連続的に含む、微視的状態μを特定するベクトルｋ≡｛ｋｉ｝の形で写像される（ここで、ｉは、０〜Ｎ−１の整数にわたるライブラリー番号である）。
【００９９】
４．本発明の第１の態様に係るさらに好ましい本発明の方法によると、その方法は、工程ｄ）において、すべてのライブラリーからのすべてのコンパートメントにおける全シグナルが測定される一方で、アッセイにおいて使用されるｊ番目のライブラリーにおける各コンパートメントｉは、そのコンパートメントにおいて測定されたシグナルの関数であるパラメータ
【数７０】
0006055838.tif 000072
を割り当てられ、次いで、測定されたシグナルは、パラメータＫｊの値を連続的に含む、微視的状態μを特定する値
【数７１】
0006055838.tif 000073
の形に写像されることを特徴とし、ここで、ｊは、０〜数Ｎｌｉｂ−１の整数にわたるライブラリー番号であり、
【数７２】
0006055838.tif 000074
は、総和重み（ｓｕｍｍａｔｉｏｎ  ｗｅｉｇｈｔ）であり、好ましくは、各ｉおよび各ｊに対して、
【数７３】
0006055838.tif 000075
である。この好ましい本発明の方法の場合、以下の演算が、好ましくは工程ｅ）において行われる：
ｅ１）式：
【数７４】
0006055838.tif 000076
からの条件付き確率ｐ（Ｋ｜Ｃ）の計算
ｅ２）式：
【数７５】
0006055838.tif 000077
からの条件付き確率ｐ（Ｃ｜Ｋ）の計算
（式中：Ｃｍｉｎ＝−Ｃ−ｌｎ（ｐＴＲ）／ｌｎ（２）、Ｃｍａｘ＝−Ｃ＋ｌｎ（１−ｐＴＲ）／ｌｎ（２）であり：Ｃ−は、未知濃度Ｃを決定するための区間の下限を意味し、Ｃ＋は、未知濃度Ｃを決定するための区間の上限を意味し、０＜ｐＴＲ＜１は、アッセイ精度を特定するパラメータであり、好ましくは、ｐＴＲ→１であり；一連の値ｖｉｄｉが、商ｘ＜１の等比級数である場合、ＣｍｉｎおよびＣｍａｘは、Ｃｍｉｎ＝Ｃ−ｘΔＮ／２、Ｃｍａｘ＝Ｃ＋ｘ−ΔＮ／２に等しく、式中、ΔＮ＝４．５６３７（１−ｘ）−０．７９８である）
ｅ３）推定値Ｅ（Ｃ）としての濃度Ｃの決定（ここで：
【数７６】
0006055838.tif 000078
であり、標準偏差
【数７７】
0006055838.tif 000079
であり、ここで：
【数７８】
0006055838.tif 000080
である）。
【０１００】
さらに、本発明の方法が、異なるダイナミックレンジに対して異なる標準偏差を許容する場合、以下の好ましい本発明の方法が行われ、ここで、その方法は、区間（Ｃ−，Ｃ＋）がｑ個の部分区間
【数７９】
0006055838.tif 000081
、好ましくは、互いに素な部分区間に分割され、各部分区間において、値ｄｉｖｉのセットは、商ｘｎの等比級数であり、ライブラリーは、一定濃度（ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｃａｒｄｉｎａｌｉｔｉｅｓ）Ｎ’ｎを有することを特徴とし、ここで：
ａ）
【数８０】
0006055838.tif 000082
の場合、
【数８１】
0006055838.tif 000083
【数８２】
0006055838.tif 000084
であり、
ｂ）
【数８３】
0006055838.tif 000085
の場合、
【数８４】
0006055838.tif 000086
0006055838.tif 000087
である。
【０１０１】
ここで、Ｃ−は、未知濃度Ｃを決定するための区間の下限を意味し、Ｃ＋は、未知濃度Ｃを決定するための区間の上限を意味し、
【数８５】
0006055838.tif 000088
は、番号ｎの部分区間の下限を意味し、
【数８６】
0006055838.tif 000089
は、番号ｎの部分区間の上限を意味し、
【数８７】
0006055838.tif 000090
は、部分区間
【数８８】
0006055838.tif 000091
における、粒子の濃度Ｃの推定値Ｅ（Ｃ）の許される最大の標準偏差を意味し、ｎは、１〜ｑの整数にわたる部分区間の番号であり、ｉは、
【数８９】
0006055838.tif 000092
の整数にわたるライブラリーの番号である。
【０１０２】
好ましくは、上述の計算は、ニューラルネットワークを使用することによって行われる。
【０１０３】
本発明の別の累積的にまたは代替的に好ましい実施形態によると、本発明の方法は、多重ＰＣＲ法に関して使用することができる。したがって、２つ以上の異なる粒子および／または本質的に同じ粒子の２つ以上の異なる部分の濃度が決定され、（Ｎ）個のコンパートメントのいずれかに存在するそれらの異なる粒子および／または本質的に同じ粒子の異なる部分の少なくとも一部、好ましくは全部が、２つ以上の識別可能かつ測定可能なシグナルを提供し、好ましくは、提供するように増幅され、その（Ｎ）個のコンパートメントのいずれかにおける２つ以上の識別可能なシグナルが測定され、（Ｎ）個のコンパートメントの各々に対して２つ以上の異なる値がそれぞれ割り当てられる、本発明の方法が、好ましく使用される（ここで、それらの互いに独立して異なる値は、ある閾値数の同じ粒子および／または本質的に同じ粒子の同じ部分が、コンパートメントに存在することまたは存在しないことを示唆する）。
【０１０４】
本発明の第１の態様に係る本発明の方法の別の好ましい実施形態は、以下のとおり記載され得る：
【０１０５】
デジタル定量アッセイの潜在的な用途において、ユーザーは、好ましくは、サンプル中の粒子の数の推定値Ｅ（Ｍ）を得ることに関心がある。そのサンプルが、Ｎ個の同一のコンパートメントのセットに分割される場合、そのアッセイの結果を解析するための適切なアルゴリズムは、コンパートメント間の粒子の確率分布を従属変数の分布として扱うことである。そのような解析によって与えられた推定値の標準偏差は、サンプル中の粒子の濃度Ｅ（Ｃサンプル）＝Ｅ（Ｍ）／Ｖサンプルに左右され、その推定値自体は、アッセイからのシグナルに左右される（図９ａ）および９ｂ）ならびに詳細な図の説明を参照のこと）。本発明の方法の用途において、推定値の相対標準偏差σが、濃度Ｃサンプル＝Ｍ／Ｖサンプルの所与の範囲内の既知の閾値より大きくないことが好ましい。濃度のダイナミックレンジΩ＝Ｃ＋／Ｃ−とそのレンジ内の推定値の相対標準偏差σの最大値との関係Ｃサンプル∈（Ｃ−，Ｃ＋），Ω（σ）は、コンパートメントの数Ｎの関数としてダイナミックレンジΩ（Ｎ）と精度σ（Ｎ）との最適な組み合わせを定義する特徴的な変曲点（ｄｅｆｌｅｃｔｉｏｎ  ｐｏｉｎｔ）
【数９０】
0006055838.tif 000093
を有する。Ｎ個のコンパートメントを含む単一のアッセイは、そのダイナミックレンジおよび精度を互いに独立して調整することができないという欠点を有する。
【０１０６】
本発明者らは、予想外にも、この問題に対する解決法を見出した（その解決法は、要求されるおよび独立して予め決定されたダイナミックレンジならびに粒子濃度の推定値Ｅ（Ｃ）の精度に対してコンパートメントの総数を最小にすることを可能にする）。この技術的問題に対する解決法は、アッセイの組み合わせ（各々が、同一のコンパートメントの数を含むが、コンパートメントの体積および／または希釈因子はアッセイ間で異なる）を使用することである。本発明によると、組み合されたアッセイのダイナミックレンジ（Ωｔｏｔ）の要求される値、およびアッセイによって返される濃度の推定値Ｅ（Ｃサンプル）によって表現することができる粒子の数の推定値Ｅ（Ｍ）の最大の相対標準偏差（σ）が与えられると、そのアッセイのパラメータは、以下の単純なスキームを使用することによって計算することができる。同一のコンパートメントのセットの数Ｎｌｉｂは、
【数９１】
0006055838.tif 000094
によって与えられる。
【０１０７】
各セットにおけるコンパートメントの数（Ｎ’）は、好ましくは、
Ｎ’＝γ・σδ
によって与えられ、異なるアッセイにおけるコンパートメントを特徴づける、調節因子ｚｉ＝ｄｉｖｉ／ｄ０ｖ０＝ｘｉ（ここで、ｉ∈（０，Ｎｌｉｂ−１）である）の等比級数の共通因子ｘ＝ｄｉ＋１ｖｉ＋１／ｄｉｖｉは、好ましくは、
【数９２】
0006055838.tif 000095
によって与えられる。
【０１０８】
参照調節因子ｚ０＝ｄ０ｖ０の値は、好ましくは、式：
ｚ０＝（ε／Ｃ−）Ｎψ
によって与えられ、ここで、定数は、以下の値を有する：α＝０．１６２４、β＝２．２３０７、γ＝０．０３２８およびδ＝−２．３６１、ε＝３．２６０５およびψ＝−０．６１６６。
【０１０９】
本発明の方法の代替的に好ましい用途において、検体を採取した大きなレザバー（例えば、液体または体液などのレザバー）内の粒子の濃度を推定することが好ましい場合がある。その場合、コンパートメント内の粒子の配置は、サンプル中の粒子の濃度Ｃサンプル＝Ｃレザバー（Ｖ検体／Ｖサンプル）の関数ならびにコンパートメントの体積および希釈率の関数である独立確率変数のセットとして扱われる。そして、そのアッセイによって与えられた粒子の濃度の推定値は、推定値Ｅ（Ｃレザバー）＝Ｅ（Ｃサンプル）（Ｖサンプル／Ｖ検体）およびそのような推定値の相対標準偏差σを説明する。アッセイの結果を解析するための適切なアルゴリズムは、コンパートメント間の粒子の確率分布を、独立して分布した同一の変数の分布として扱うことである。そのような解析によって与えられる推定値の標準偏差は、濃度Ｃサンプル＝Ｃレザバー（Ｖ検体／Ｖサンプル）に左右され、その推定値自体は、アッセイからのシグナルに左右される（図９ａ）および９ｃ）ならびに詳細な図の説明のそれぞれの部分を参照のこと）。
【０１１０】
本発明の方法の代替的に好ましい用途において、推定値の相対標準偏差σが、濃度Ｃレザバーの所与の範囲内の既知の閾値より大きくないことが好ましい。濃度のダイナミックレンジ
【数９３】
0006055838.tif 000096
とそのレンジ内の推定値の相対標準偏差σの最大値との関係Ｃサンプル∈（Ｃ−，Ｃ＋），Ω（σ）は、コンパートメントの数Ｎの関数としてダイナミックレンジΩ（Ｎ）と精度σ（Ｎ）との最適な組み合わせを定義する特徴的な変曲点
【数９４】
0006055838.tif 000097
を有する。Ｎ個のコンパートメントを含む単一のアッセイは、そのダイナミックレンジおよび精度を互いに独立して調整することができないという欠点を有する。この技術的問題に対する解決法は、アッセイの組み合わせ（各々が、同一のコンパートメントの数を含むが、コンパートメントの体積および／または希釈因子はアッセイ間で異なる）を使用することである。Ｉｓｍａｇｉｌｏｖら［Ｓｈｅｎ，Ｆ．；Ｓｕｎ，Ｂ．；Ｋｒｅｕｔｚ，Ｊ．Ｅ．；Ｄａｖｙｄｏｖａ，Ｅ．Ｋ．；Ｄｕ，Ｗ．；Ｒｅｄｄｙ  Ｐ．Ｌ．；Ｊｏｓｅｐｈ，Ｌ．Ｊ．；Ｉｓｍａｇｉｌｏｖ，Ｒ．Ｆ．，“Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｗｉｔｈ  Ｌａｒｇｅ  Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｒａｎｇｅ  Ｕｓｉｎｇ  Ｍｕｌｔｉｖｏｌｕｍｅ  Ｄｉｇｉｔａｌ  ＲＴ−ＰＣＲ  ｏｎ  ａ  Ｒｏｔａｔｉｏｎａｌ  ＳｌｉｐＣｈｉｐ  Ｔｅｓｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ＨＩＶ  ａｎｄ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  Ｖｉｒａｌ  Ｌｏａｄ”，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ａｒｔｉｃｌｅ  ＡＳＡＰ  （Ｘ  ２０１１）］は、そのような組み合わせを示したが、提供された解決法は、所与のセットのダイナミックレンジの値および濃度の推定値の相対標準偏差を達成するために必要なコンパートメントの数を最小にしなかった。本発明者らは、予想外にも、この問題に対する解決法を見出した（その解決法は、要求されるおよび独立して予め決定された、粒子濃度の推定値のダイナミックレンジおよび精度に対してコンパートメントの総数を最小にすることを可能にする）。本発明によると、組み合されたアッセイのダイナミックレンジ
【数９５】
0006055838.tif 000098
の要求される値、およびアッセイによって返される濃度の推定値Ｅ（Ｃサンプル）の最大の相対標準偏差（σ）が与えられると、本発明の方法のパラメータは、以下の単純なスキームを使用することによって決定することができる。同一のコンパートメントのセットの数Ｎｌｉｂは、好ましくは、
【数９６】
0006055838.tif 000099
によって与えられる。
【０１１１】
各セットにおけるコンパートメントの数（Ｎ’）は、好ましくは、
Ｎ’＝γ・σδ
によって与えられ、異なるアッセイにおけるコンパートメントを特徴づける、調節因子ｚｉ＝ｄｉｖｉ／ｄ０ｖ０＝ｘｉ（ここで、ｉ∈（０，Ｎｌｉｂ−１）である）の等比級数の共通因子ｘ＝ｄｉ＋１ｖｉ＋１／ｄｉｖｉは、好ましくは、
【数９７】
0006055838.tif 000100
によって与えられる。
【０１１２】
参照調節因子ｚ０＝ｄ０ｖ０の値は、好ましくは、式：
【数９８】
0006055838.tif 000101
によって与えられ、ここで、定数は、以下の値を有する：α＝０．６８１３、β＝−２．０９６６、γ＝０．９９２５およびδ＝−２．０６５、ε＝０．７４６およびψ＝−０．２３５７。
【０１１３】
本発明の第２の態様によると、本発明の方法において粒子の濃度を決定する際に使用するための装置が提供される。本発明の第１の態様の実施形態のすべてが、本発明の第２の態様に関して、互いに独立して組み合せることができる。
【０１１４】
本発明の装置は、好適な手段によって、数（Ｎ）の決定および調節因子（ｚｉ）の決定を可能にする。好適な手段は、通常の装置、好ましくは、記憶された実行可能命令によって設定された記憶デバイスを有するコンピュータを備える通常の装置であり、その命令は、プロセッサーによって実行されると、そのプロセッサーに、本発明の第１の態様の本発明の方法に従って数（Ｎ）および調節因子（ｚｉ）を決定させる。したがって、本発明の装置は、本発明の根底にあるニーズを少なくとも部分的に満たすことを可能にする。
【０１１５】
本発明の装置の累積的にまたは代替的に好ましい実施形態において、その装置は、
ｃ）所定のサンプル体積の少なくとも一部を、決定される数（Ｎ）個の別個のコンパートメントに分配し（ここで、それらのコンパートメントの少なくとも一部、好ましくは、全部は、決定された調節因子（ｚｉ）を有する所定のサンプル体積を含む）、
ｄ）コンパートメントにおける所定の閾値数の粒子、好ましくは、１、２、３個またはそれ以上の粒子の存在を示唆する測定可能なシグナルを得るために、１つ以上の好適な試薬および必要に応じて１つ以上の希釈剤を用いてそれらのコンパートメントの粒子を必要に応じて増幅し、
ｅ）その（Ｎ）個のコンパートメントの各々においてシグナルを測定し、少なくとも一部、好ましくは、全部のコンパートメントに値（ｋｉ）を割り当て（ここで、（ｉ）は、整数０〜Ｎ−１によって表されるコンパートメントの添字番号を表し、コンパートメント（ｉ）が、所定の閾値数以上の粒子を含むかまたはそれらからなる場合、コンパートメント（ｉ）は、第１の値（ｋｉ）を割り当てられ、コンパートメント（ｋｉ）が、第１の値を示唆する閾値数未満の粒子を含むかまたはそれらからなる場合、コンパートメント（ｉ）は、第２の値（ｋｉ）を割り当てられる）、
ｆ）粒子の推定濃度Ｅ（Ｃ）を決定する（ここで、その粒子の推定濃度Ｅ（Ｃ）は、
ｉ．値（ｋｉ）の和Ｋの関数（ここで、この関数は、好ましくは、較正補正関数を用いて補正される）、および／または
ｉｉ．重み値（ｗｉｋｉ）の和Ｋの関数（ここで、その値（ｋｉ）の少なくとも一部、好ましくは、各値（ｋｉ）は、重み値（ｗｉ）によって調節され、ここで、（ｉ）は、整数０〜Ｎ−１によって表されるコンパートメントの添字番号を表し、重み値（ｗｉ）は、好ましくは、番号（ｉ）のコンパートメントの体積および／または希釈の程度に反比例し、その関数は、好ましくは、較正補正関数を用いて補正される）および／または
ｉｉｉ．微視的状態μの任意の次数の数、ベクトル、行列、テンソルまたは他の任意の明白な表示（ここで、その任意の次数の数、ベクトル、行列、テンソルまたは他の任意の表示は、工程ｅ）において測定された値（ｋｉ）の少なくとも一部を反映する情報を含むかまたはそれからなり、好ましくは、その微視的状態μを表すベクトルｋ≡｛ｋｉ｝を含むかまたはそれからなり、ここで、そのベクトル（ｋ）は、工程ｅ）において測定された値（ｋｉ）の少なくとも一部、好ましくは、全部を含むかまたはそれらからなる）
によって決定される）
ように、構成される。
【０１１６】
好ましい本発明の装置は、本明細書の上文に記載されたような好適な手段による、数（Ｎ）の決定と調節因子（ｚｉ）の決定の両方、ならびに好適な手段を用いて任意の増幅反応を行うことによる濃度の推定値Ｅ（Ｃ）の決定、好適な手段を用いた値の測定、好適な手段を用いた第１および第２の値ｋｉの割当、ならびに好適な手段による濃度の推定値Ｅ（Ｃ）の最終的な決定の実際の決定を行うことを可能にする（例えば、記憶された実行可能命令によって設定された記憶デバイスを有するコンピュータ（その命令は、プロセッサーによって実行されると、そのプロセッサーに、本発明に従って濃度の推定値Ｅ（Ｃ）を決定させる））。
【０１１７】
好ましい装置を構成するための好適な手段は、本発明の第１の態様に関して開示されており、互いに独立して、本発明の上述の好ましい装置と組み合わせることができる。
【０１１８】
本発明の第３の態様によると、本発明の方法の使用または本発明の装置の使用は、
ａ）所定のサンプル体積を含むコンパートメントの総数（Ｎ）を調整するため、好ましくは、減少させるために、ならびに／または
ｂ）（Ｎ）個のコンパートメントのすべてにおいて、サンプル、粒子の少なくとも一部を測定可能なシグナルまで増幅するために適した１つ以上の試薬、および必要に応じて１つ以上の希釈剤を含むかもしくはそれらからなる混合物の総体積を調整するため、好ましくは、減少させるために、ならびに／または
ｃ）（Ｎ）個のコンパートメントの各々における、サンプル、粒子の少なくとも一部を測定可能なシグナルまで増幅するために適した１つ以上の試薬、および必要に応じて１つ以上の希釈剤を含むかもしくはそれらからなる混合物の体積、好ましくは、最小体積もしくは最大体積を予め決定するために、ならびに／または
ｄ）所定のサンプル体積を（Ｎ）個のコンパートメントに分配するための調節因子（ｚｉ）、好ましくは、好適な最小もしくは最大の調節因子（ｚｉ）を予め決定するために
提供される。
【０１１９】
本発明の第１および第２の態様の好ましい実施形態のすべてが、互いに独立して、本発明の第３の態様の実施形態と組み合わせることができる。
【０１２０】
本発明の第４の態様によると、本発明の方法においてまたは本発明の装置とともに使用するためのサンプルホルダーが提供され、ここで、そのサンプルホルダーは、
ａ）所定の数（Ｎ）個のコンパートメントを含むかまたはそれらからなるように本発明的に構成され（ここで、その数（Ｎ）は、関数
【数９９】
0006055838.tif 000102
の値以下であり、式中、（Ａ）は、整数６である実数を表し、（Ｃ＋）は、本方法によって推定される濃度（Ｃ）の区間の所定の上限を表し、（Ｃ−）は、本方法によって推定される濃度（Ｃ）の区間の所定の下限を表し、（σＭＡＸ）は、粒子の濃度（Ｃ）の推定値の所定の許容可能な最大の相対標準偏差を表し、ここで、Ｃ−＜Ｃ＜Ｃ＋である）、
ｂ）その（Ｎ）個のコンパートメントは、所定の調節因子（ｚｉ）を有する所定のサンプル体積を含むように構成される（ここで、（ｚｉ）は、その（Ｎ）個のコンパートメントの少なくとも一部または全部におけるサンプルの体積（ｖｉ）および希釈因子（ｄｉ）の関数であり、その（Ｎ）個のコンパートメントのうちの２つ以上の少なくとも一部または全部が、異なるサンプル体積（ｖｉ）および／または異なる希釈因子（ｄｉ）のサンプルを含み得るかまたはそれからなり得、ここで、（ｉ）は、整数０〜Ｎ−１によって表される（Ｎ）個のコンパートメントの添字番号を表し、（ｖｉ）は、コンパートメント（ｉ）におけるサンプルの体積を表し、（ｄｉ）は、コンパートメント（ｉ）におけるサンプルの希釈因子を表す）。
【０１２１】
本発明の第１、第２および第３の態様の好ましい実施形態のすべてが、互いに独立して、本発明の第４の態様の実施形態と組み合わせることができる。
【０１２２】
本発明のサンプルホルダーは、好ましくは、好適な試験管、マイクロアレイ上のウェルのアレイ、またはマイクロ流体チップ、液滴を作製するように構成されたマイクロ流体チップ、ならびに個別の体積を保持することができ、かつそれぞれのシグナルの増幅および測定を可能にすることができる他の商業的に入手可能なデバイスまたは他の一般に公知のデバイスを備え得る。
【０１２３】
本発明の第５の態様は、粒子の濃度を決定するため、好ましくは、本発明の方法に従って粒子の濃度を決定するための、本発明のサンプルホルダー、およびそのサンプルホルダーのコンパートメントに含まれる粒子の少なくとも一部を測定可能なシグナルまで増幅するために適した１つ以上の試薬、および必要に応じて１つ以上の好適な希釈剤を備えるキットに関する。
【０１２４】
本発明の第１、第２、第３および第４の態様の好ましい実施形態のすべてが、互いに独立して、本発明の第５の態様の実施形態と組み合わせることができる。
【０１２５】
図面の詳細な説明：
図１ａ）、１ｂ）および１ｃ）
図１ａ）、１ｂ）および１ｃ）は、異なるデジタルアッセイのデザインの性能の比較を示している。
【０１２６】
図１ａ）において、陰影部分は、
【数１００】
0006055838.tif 000103
、ΔＮ＝γ・（１−ｘ）−δ、Ｎ＝２・ΔＮ−ｌｏｇｘ（Ω）およびｖ０＝ｌｎ２・ｘ−ΔＮ１／Ｃ−（ここで、α＝１．２４、β＝１．９４９３、γ＝４．５６３７およびδ＝０．７９８である）を用いてデザインされた等比数列によって決定されたコンパートメントの体積を用いる本発明の定量アッセイによって達成される濃度の推定値のダイナミックレンジと精度（濃度の推定値の相対標準偏差として表現されている）との組み合わせを示している。灰色の線は、幾何学的アッセイにおける一定数のコンパートメントに対する例示的なトレースを示している。黒色の点線は、同一独立確率変数として扱われる同一のコンパートメントを含むアッセイの相対標準偏差およびダイナミックレンジのあり得る組み合わせを示し、黒色の破線は、従属確率変数として扱われる同一のコンパートメントを含むアッセイに対する同じものを示している。白色四角（□）は、独立確率変数として扱われ、濃度範囲Ω＝１０６をカバーする、同一のコンパートメントを含むアッセイを示している。灰色四角（■）は、従属確率変数として扱われ、濃度範囲Ω＝１０６をカバーする、同一のコンパートメントを含むアッセイを示している。
【０１２７】
図１ｂ）は、ダイナミックレンジを一定かつΩ＝１０６に等しく維持しつつ本発明の方法を用いてデザインされたアッセイのあり得る調整を示している。このグラフは、本発明のデザインおよび最先端のデザインに対するパラメータｐ＝ｌｎ（Ω）／σ２の関数としてのコンパートメントの最小数を示している。
【０１２８】
長い破線は、
【数１０１】
0006055838.tif 000104
（ここで、Ａ＝１／Ｃ＋および＝［１．９５・ｌｎ｛（Ｃ＋／Ｃ−）／Ｎ｝］０．８５６である）によって与えられる体積の連続物を含む本発明の定量アッセイを表しており、そのようなアッセイにおけるコンパートメントの数は、
【数１０２】
0006055838.tif 000105
に等しく、濃度範囲Ω＝１０６をカバーする。
【０１２９】
点線は、より好ましい
【数１０３】
0006055838.tif 000106
個のコンパートメントを含み、かつ濃度範囲Ω＝１０６をカバーする本発明の定量アッセイを表している。
【０１３０】
実線は、
【数１０４】
0006055838.tif 000107
、ΔＮ＝γ・（１−ｘ）−δ、Ｎ＝２・ΔＮ−ｌｏｇｘ（Ω）および
【数１０５】
0006055838.tif 000108
（ここで、α＝１．２４、β＝１．９４９３、γ＝４．５６３７およびδ＝０．７９８であり、濃度範囲Ω＝１０６をカバーする）を用いてデザインされた等比数列によって決定されるコンパートメントの体積を用いる本発明の定量アッセイを表している。
【０１３１】
一点短鎖線は、レザバーから取り出されたサンプルより大きい、粒子のレザバー内の粒子の濃度（ＣＲ）の推定値を提供するようにデザインされた本発明のマルチボリュームアッセイを表している。このアッセイは、以下の等式：
【数１０６】
0006055838.tif 000109
（ここで、α＝０．６８１３、β＝−２．０９６６、γ＝０．９９２５およびδ＝−２．０６５であり、濃度範囲Ω＝１０６をカバーする）を使用してデザインされる。
【０１３２】
短い破線（２）は、サンプル中の粒子の濃度（Ｃサンプル）の推定値を提供するようにデザインされたマルチボリューム定量アッセイを表している。このアッセイは、以下の等式：
【数１０７】
0006055838.tif 000110
（ここで、α＝０．１６２４、β＝２．２３０７、γ＝０．０３２８およびδ＝−２．３６１であり、濃度範囲Ω＝１０６をカバーする）を使用してデザインされる。
【０１３３】
白四角（□）は、独立確率変数として扱われ、濃度範囲Ω＝１０６をカバーする、同一のコンパートメントを含むアッセイを示している。
【０１３４】
灰色四角（■）は、従属確率変数として扱われ、濃度範囲Ω＝１０６をカバーする、同一のコンパートメントを含むアッセイを示している。
【０１３５】
図１ｃ）は、本発明に関するアッセイならびにそれと比較される従来技術に関するアッセイの異なるデザインにおいて、所与のダイナミックレンジおよび精度をもたらすのに必要なコンパートメントの数Ｎの比較を示している。関数Ｎｍａｘ＝６ｐによって正規化されたコンパートメントの数が、パラメータｐ＝ｌｎ（Ω）／σ２の関数としてプロットされている。
【０１３６】
白菱形（◇）および黒菱形（◆）は、本発明のアッセイの性能を示しており、ここで、コンパートメントの体積は、
【数１０８】
0006055838.tif 000111
（ここで、Ａ＝１／Ｃ＋および＝［１．９５・ｌｎ｛（Ｃ＋／Ｃ−）／Ｎ｝］０．８５６である）の調節因子の幾何数列によって決定される。そのようなアッセイにおけるコンパートメントの数は、
【数１０９】
0006055838.tif 000112
（黒菱形◆で記されたアッセイ）または好ましくは、
【数１１０】
0006055838.tif 000113
（白菱形◇で記されたアッセイ）に等しい。
【０１３７】
黒三角（▲）は、
【数１１１】
0006055838.tif 000114
、ΔＮ＝γ・（１−ｘ）−δ、Ｎ＝２・ΔＮ−ｌｏｇｘ（Ω）およびｖ０＝ｌｎ２・ｘ−ΔＮ１／Ｃ−（ここで、α＝１．２４、β＝１．９４９３、γ＝４．５６３７およびδ＝０．７９８である）を用いてデザインされた等比数列によって決定されるコンパートメントの体積を有する本発明の定量アッセイを表している。
【０１３８】
白三角（△）は、反復（またはＮ’コピーの各コンパートメント）を用いる等比数列によって決定されるコンパートメントの体積を有する本発明の定量アッセイを表しており、ここで、所与のコピー数（Ｎ’）について、等比級数の共通因子は、値
【数１１２】
0006055838.tif 000115
を有し、他のすべてのパラメータは、反復なしの等比級数と同じ方法で定義される。
【０１３９】
白丸（○）は、レザバーから取り出されたサンプルより大きい、粒子のレザバー内の粒子の濃度（Ｃレザバー）の推定値を提供するようにデザインされた本発明のマルチボリュームアッセイのコンパートメントの数を表している。このアッセイは、以下の等式：
【数１１３】
0006055838.tif 000116
（ここで、α＝０．６８１３、β＝−２．０９６６、γ＝０．９９２５およびδ＝−２．０６５である）を使用してデザインされる。
【０１４０】
黒丸（●）は、サンプル中の粒子の濃度（Ｃサンプル）の推定値を提供するようにデザインされたマルチボリューム定量アッセイを表している。このアッセイは、以下の等式：
【数１１４】
0006055838.tif 000117
（ここで、α＝０．１６２４、β＝２．２３０７、γ＝０．０３２８およびδ＝−２．３６１である）を使用してデザインされる。
【０１４１】
破線を伴うプラス符号は、Ｒ．Ｆ．ＩｓｍａｇｉｌｏｖによってＦ．Ｓｈｅｎ，Ｒ．Ｆ．Ｉｓｍａｇｉｌｏｖら，ＪＡＣＳ  ２０１１  １３３：１７７０５−１７７１２に記載された従来技術のマルチボリュームアッセイの性能を表している。
【０１４２】
黒実線は、Ｉｓｍａｇｉｌｏｖによって提供された解決法と本願において開示される技術的により好ましい解決法との間の明確な境界線を示している。本明細書中に記載される定量アッセイと以前に示されたマルチボリュームアッセイとの違いが、明らかに見られる。
【０１４３】
図２ａ）および２ｂ）
図２ａ）は、公比（または商）ｘの等比数列によって決定される体積を有するＮ個のコンパートメントを含む本発明の定量アッセイによって提供されるダイナミックレンジＣ＋／Ｃ−＝Ωおよび相対標準偏差σのグラフを示している。そのダイナミックレンジＣ＋／Ｃ−＝Ωは、精度σとは独立して調整することができ、所与の要求されるダイナミックレンジについて、提案されるアッセイは、標準的なデジタルアッセイよりも１０２〜１０４倍も少ないコンパートメントしか必要としなかった。
【０１４４】
図２ｂ）は、本発明のアッセイのコンパートメントの体積を決定する等比数列の公比ｘと、推定値Ｅ（Ｃ）の最大相対標準偏差σ（Ｃ）を提供する本発明のアッセイにおける各コンパートメントのコピー数との関係を表示しているグラフを示している。任意の所定のダイナミックレンジおよび精度について、体積の幾何数列の因子ｘは、実現する際にアッセイのデザインを技術的要件に対して調整することを可能にするコンパートメントのコピー数Ｎ’と置き換えることができる。
【０１４５】
図３ａ）、３ｂ）、３ｃ）および３ｄ）
図３ａ）は、異なる体積のコンパートメントを含む本発明のアッセイを示している（各コンパートメントは、その特徴的な濃度Ｃに対応する）。言い換えると、任意のインプット濃度Ｃ＊について、それらのコンパートメントのうちの１つだけが、この濃度に最も近く対応する。コンパートメントが徐々に大きくなる（または小さくなる）と、インプット濃度に関する情報が徐々に少なくなる。これは、これらのコンパートメントからシグナルを得る確率が１（または０）に近付くということに反映される。有効ストライプ（ここでは灰色の破線長方形で記されており、ｖｉ＊−１、ｖｉ＊、ｖｉ＊＋１のコンパートメントを含む）は、０または１とは有意に異なるシグナルを与える確率によって特徴づけられる有限のコンパートメントセットとして定義される。その有効ストライプ内のコンパートメントより大きい体積を有する有効ストライプ外のコンパートメント（ｖｉ＊−２、ｖｉ＊−３、ｖｉ＊−４の濃い灰色で記されたコンパートメント）は、常に陽性シグナルである確率を含み、すなわち、少なくとも閾値量が測定されることを示唆する確率を含むのに対し、有効ストライプ内のコンパートメントよりも小さい体積を含む有効ストライプ外のコンパートメント（ｖｉ＊＋２、ｖｉ＊＋３、ｖｉ＊＋４の薄い灰色で記されたコンパートメント）は、常に陰性シグナルである確率を含み、すなわち、閾値量未満が測定されることを示唆する確率を含む。
【０１４６】
図３ｂ）は、アッセイのすべての回においてシグナル（微視的状態）の確率的組み合わせをもたらす試験体積セットを含む本発明に係る有効ストライプを示しており、ここで、整数１は、少なくとも閾値量の粒子、好ましくは、少なくとも１個の粒子が、そのコンパートメントに存在することを示唆し、整数０は、閾値量未満の粒子がそのコンパートメントに存在すること、好ましくは、粒子が存在しないことを示唆する。各微視的状態は、ただひとつの数の値Ｋから取得される（ρＫ）よりも多い情報を提供する
【数１１５】
0006055838.tif 000118
をもたらす。これらの分布の各々は、異なる標準偏差（すなわち、Ｃに関する異なる情報）によって特徴付けられる。分布ρ（Ｃ）の標準偏差の限界（すなわち、最大値）は、最も確からしい微視的状態によって与えられる。総和（△）および微視的状態（◆）アプローチにおいて、これは、図３ｃ）において３つのコンパートメントおよび図３ｄ）において１６個のコンパートメントを含む有効ストライプに対して図示されている。興味深いことに、より確からしくない微視的状態の多くは、最も確からしい微視的状態よりもＣに関する有意に多い情報を有する。
【０１４７】
図４ａ）、４ｂ）および４ｃ）
図４ａ）、４ｂ）、４ｃ）は、本発明の方法に従ってコンパートメントからのシグナルを解析する２つの異なるアプローチ（総和（△）および微視的状態（◆）アプローチ）に対する、粒子の濃度の推定値の標準偏差を表示しているグラフを示している。三角形は、値の和
【数１１６】
0006055838.tif 000119
から得られた粒子の濃度の推定値の標準偏差を示しており、菱形は、所与の値のＫに対して可能性のあるユニークな各微視的状態μ＝｛ｋｉ｝から得られた粒子の濃度の推定値の標準偏差を示している。その可能性のある微視的状態の大部分について、微視的状態から得られた粒子の濃度の標準偏差は、その値の和に基づくものよりも小さい。各グラフは、異なる商の等比級数ｄｉ＋１ｖｉ＋１＝ｘ（ｄｉｖｉ）を用いた異なるアッセイに対応する。
【０１４８】
図５ａ）および５ｂ）
図５ａ）は、Ｃ−＝１ｍＬ−１からＣ＋＝１０２ｍＬ−１、すなわち、Ｃ＋／Ｃ−＝１０２という濃度範囲におけるσｍａｘ＝６２％未満の相対標準偏差で粒子の濃度の推定値を提供するようにデザインされた、２０μＬの体積を有するサンプルの本発明の定量アッセイの１０個の最も頻繁に生じる微視的状態（灰色の線）に対する確率分布ｐ（μ｜Ｃ）を表示しているグラフを示している。要求されるダイナミックレンジは、希釈率Ｃｉ／ＣＳ＝ｄｉ＝ｘｉ（ここで、ｘ＝０．５である）を用いてサンプルを１０個の区画に分配することによって達成される。黒線は、微視的状態を記しており、ここで、最初の５つのコンパートメントは、少なくとも１コピーの標的粒子の存在を示している。分布の幅は、測定の精度、この場合、６２％に等しい精度を規定している。この図に示されている各曲線は、左側（陽性区画）および右側（陰性区画）において急勾配の隆起部を形成するそれぞれ陽性区画に対する項
【数１１７】
0006055838.tif 000120
および陰性区画に対する
【数１１８】
0006055838.tif 000121
の積に由来する。
【０１４９】
図５ｂ）は、
【数１１９】
0006055838.tif 000122
から
【数１２０】
0006055838.tif 000123
すなわち、
【数１２１】
0006055838.tif 000124
という濃度範囲におけるσｍａｘ＿１＝６２％未満、
【数１２２】
0006055838.tif 000125
、すなわち、
【数１２３】
0006055838.tif 000126
という濃度範囲におけるσｍａｘ＿２＝２５％未満、および
【数１２４】
0006055838.tif 000127
、すなわち、
【数１２５】
0006055838.tif 000128
という濃度範囲におけるσｍａｘ＿３＝６２％未満の相対標準偏差で前記サンプル中のＤＮＡ粒子の濃度の推定値を提供するようにデザインされた、２０μＬの体積を有するサンプルの本発明の定量アッセイの最初の９０個の最も頻繁に生じる微視的状態（灰色の線）に対する確率分布ｐ（μ｜Ｃ）を表示しているグラフを示している。要求されるダイナミックレンジは、サンプルを、希釈率Ｃｉ／ＣＳ＝ｄｉ＝ｘｉ（ここで、ｘ＝０．５である）を用いて連続して１４個のコンパートメント、ｘ＝０．９１７を用いて８６個のコンパートメント、およびｘ＝０．５を用いて１４個のコンパートメントに分配することによって達成される。本発明の説明に提示された数値アルゴリズムを使用して、推定値Ｅ（ＣＳ）は、条件付き確率分布ｐ（ＣＳ｜μ）（ここで、μは、分析的アッセイを行うために使用される区画の系の微視的状態である）に基づいて計算される。黒線は、２つの微視的状態を記している；第１の微視的状態（左側）において、最初の７つの７区画は、少なくとも１コピーの標的粒子の存在を示している一方で、残りの区画は、陰性であり、第２の場合（右側）において、最初の５７区画は、少なくとも１コピーの標的粒子の存在を示している一方で、残りの区画は陰性である。第１群（ｘ＝０．５）および第２群（ｘ＝０．９１７）の微視的状態を容易に区別することができる。第２群の微視的状態は、明らかにより狭く（これはアッセイのより高い精度をもたらす）、濃度軸上により密に存在する。
【０１５０】
図６
図６は、希釈因子
【数１２６】
0006055838.tif 000129
（ここで、ｘ＝０．９９８１４である）で２，８１４個のコンパートメントを含む本発明の定量アッセイに対する粒子の初濃度
【数１２７】
0006055838.tif 000130
を表示しているグラフを示している（ここで、コンパートメントからのシグナルは、因子ｗｉ＝１／ｄｉによって重み付けされている）。
【０１５１】
図７ａ）、７ｂ）および７ｃ）
図７ａ）は、値の和Ｋ＝Σｗｉｋｉを表示しているグラフを示しており、粒子の数Ｍの関数としての重みｗｉ＝１／ｄｉは、本発明の方法に従ってＮ＝２，８１４個のコンパートメントにわたってランダムに分布している。ｉという添字を付与されたコンパートメントは、希釈因子
【数１２８】
0006055838.tif 000131
によって特徴づけられ、ここで、等比級数の商ｘ＝０．９９８１４である。そのコンパートメントの数および商ｘは、その定量アッセイが、濃度のダイナミックレンジＣ＋／Ｃ−＝１０５においてσＭＡＸ＝１０％未満の最大相対標準偏差で、粒子の濃度の推定値ｃ＝Ｅ（Ｃ）を提供するように選択されている。図１に示された結果は、数値アルゴリズムの１００反復から得られる。
【０１５２】
図７ｂ）は、希釈因子
【数１２９】
0006055838.tif 000132
（ここで、ｘ＝０．９９８１４である）で２，８１４個のコンパートメントを含む本発明の定量アッセイに対する、粒子の初濃度の推定値Ｅ（Ｃ）の値をＫの関数として表示しているグラフを示している（ここで、Ｋは、重み付けされたシグナルの和Ｋ＝Σｗｉｋｉであり、ここで重みｗｉ＝１／ｄｉである）。
【０１５３】
図７ｃ）は、希釈因子
【数１３０】
0006055838.tif 000133
（ここで、ｘ＝０．９９８１４である）で２，８１４個のコンパートメントを含む本発明の定量アッセイに対する、粒子の初濃度Ｃ＝Ｍ／Ｖの対数の関数として推定値Ｅ（Ｃ）の相対標準偏差σ（Ｃ）を表示しているグラフを示している（ここで、コンパートメントからのシグナルは、因子ｗｉ＝１／ｄｉによって重み付けされている）。
【０１５４】
図８ａ）、８ｂ）および８ｃ）
図８ａ）、８ｂ）および８ｃ）のグラフは、以下のアッセイの各々に対する１００回のモンテカルロ（ＭＣ）シミュレーションならびに本発明の方法の性能の実験的検証および数値的検証としての７または８回の実験の結果を示している（実施例の項も参照のこと）。本発明において、ダイナミックレンジおよび精度を変動させた幾何学的アッセイのセットをデザインした：（ｉ）Ω＝１０３、σ≦８０％、Ｎ＝１０、ｘ＝０．５０、（ｉｉ）Ω＝１０２、σ≦６０％、Ｎ＝１０、ｘ＝０．６０、および（ｉｉｉ）Ω＝１０１、σ≦２５％、Ｎ＝３０、ｘ＝０．９２。上記の本発明のアッセイの各々を、モンテカルロシミュレーションを用いて検証した。さらに、本発明の定量アッセイを実験的に行った。本発明のアッセイの各々について、単一の固定値のインプット濃度Ｃインプット：ａ、ｂおよびｃに対してそれぞれ１４２０、５６８および６６［粒子／ｍＬ］を用いて追跡を行った。ＭＣの結果を、７０％信頼区間を示す黒線として示す（Ｅ（Ｃ）±σ）。この実験アッセイのシグナルから取得された期待値は、赤色菱形およびエラーバー付きの７０％信頼区間で示されている。灰色の細長い領域は、Ｃインプット±σｍａｘの範囲を示している。
【０１５５】
図９ａ）および９ｂ）
図９ａ）および９ｂ）のグラフは、ｉ．ｉ．ｄ．（破線）および非ｉ．ｉ．ｄ．アプローチ（実線）に基づくサンプル中の分子の濃度／数の推定値の標準偏差、ならびにシグナルに応じた濃度自体の推定値を示している。点線は、推定値の標準偏差の例示的な閾値を示している。各閾値について、ダイナミックレンジΩ＝Ｃ＋／Ｃ−（ここで、Ｃ−は、少なくとも要求される精度でアッセイされる最小濃度であり、Ｃ＋は、少なくとも要求される精度でアッセイされる最大濃度である）は、一義的に決定され得る。非ｉ．ｉ．ｄ．アプローチの場合のシグマの分布の「波状の」挙動は、正確度を計算することによって引き起こされる。
【０１５６】
本発明のさらなる実施形態パートＢ：
１．サンプル中の粒子の濃度を決定するための方法であって、その方法は、以下の工程：
ａ）サンプルをＮ個の互いに素な部分体積に分割する工程（各部分体積は、ｖｉという体積を有し、ここで、ｉは、その部分体積の添字であり、ここで、
・サンプルは、決定論的方法で、すなわち、体積ｖｉが、解析関数ｆ（ｉ）の値の列または予め定義された値の集合によって与えられるように、部分体積に分割されるか、
・またはサンプルは、ランダムな方法で、すなわち、それらの部分体積の体積の分布が、確率分布Ｐ（ｖ）に対応するように、部分体積に分割される（これは、範囲（ｖ，ｖ＋Δｖ）内のｖｉの体積を有する部分体積の数が式：
【数１３１】
0006055838.tif 000134
によって与えられることを意味する））；
ｂ）このように得られた部分体積の各々において、少なくとも１つの前記粒子の存在を測定可能なシグナルまで増幅するプロセスを行う工程；
ｃ）それらの部分体積の各々において前記シグナルを測定し、この部分体積にパラメータｋｉを割り当てる工程（ここで、前記シグナル測定の結果が、所与の部分体積に少なくとも１つの前記粒子が存在することを示唆する場合、パラメータｋｉは、１に等しい値を有し、そうではない場合は０に等しい値を有し、ｉは、部分体積の番号である）；
ｄ）和Ｋ＝Σｋｉ・ｗｉ（ｖｉ）を計算する工程（ここで、ｉは、部分体積の番号であり、その和は、サンプルが分割された部分体積ｉ＝１．．．Ｎのすべてにわたるものであり、ｗｉ（ｖｉ）は、部分体積の体積に左右され得る重みである）；
ｅ）ベイズの形式（Ｂａｙｅｓ  ｆｏｒｍａｌｉｓｍ）に基づく公知の統計的アルゴリズムを用いて、Ｋ、Ｎおよび｛ｖｉ｝またはＰ（ｖ）の値に基づいてサンプル中の前記粒子の濃度の推定値Ｅ（Ｃ）を決定する工程
を含み、工程ａ）におけるサンプルの分割が、異なる体積を有する少なくとも２つの部分体積を含むことを特徴とする、方法。
【０１５７】
ポーランド特許出願ＰＬ３９７０２８（２０１１年１１月１７日出願；発明の名称：“Ｓｐｏｓｏｂ  ｐｒｚｅｐｒｏｗａｄｚａｎｉａ  ｃｙｆｒｏｗｙｃｈ  ｏｚｎａｃｚｅｎ  ａｎａｌｉｔｙｃｚｎｙｃｈ  ｉ  ｄｉａｇｎｏｓｔｙｃｚｎｙｃｈ”）を基礎とする発明に関する開示（特にそのすべての好ましい実施形態および実施例ならびに関係する図面を含む）は、その全体が本明細書に援用され、本発明に関するさらなる本発明の実施形態も示す。
【０１５８】
２．本発明のさらなる実施形態パートＣ：
１．サンプル中の粒子の濃度を決定するための方法であって、その方法は、以下の工程：
ａ）サンプルをＮ個の互いに素な部分体積に分割する工程（各部分体積は、ｖｉという体積を有し、ここで、ｉは、部分体積の添字であり、ここで、
・サンプルは、決定論的方法で、すなわち、体積ｖｉが、解析関数ｆ（ｉ）の値の列または予め定義された値の集合によって与えられるように、部分体積に分割されるか、
・またはサンプルは、ランダムな方法で、すなわち、それらの部分体積の体積の分布が、確率分布Ｐ（ｖ）に対応するように、部分体積に分割される（これは、範囲（ｖ，ｖ＋Δｖ）内のｖｉの体積を有する部分体積の数が式：
【数１３２】
0006055838.tif 000135
によって与えられることを意味する））；
ｂ）このように得られた部分体積の各々において、少なくとも１つの前記粒子の存在を測定可能なシグナルまで増幅するプロセスを行う工程；
ｃ）それらの部分体積の各々において前記シグナルを測定し、この部分体積にパラメータｋｉを割り当てる工程（ここで、前記シグナル測定の結果が、所与の部分体積に少なくとも１つの前記粒子が存在することを示唆する場合、パラメータｋｉは、１に等しい値を有し、そうではない場合は０に等しい値を有し、ｉは、部分体積の番号である）；
ｄ）公知の統計的アルゴリズムを用いて、｛ｋｉ｝、Ｎおよび｛ｖｉ｝またはＰ（ｖ）の値のセットに基づいてサンプル中の前記粒子の濃度の推定値ｍを決定する工程
を含み、
２．工程ａ）においてサンプルが分割されるＮ個の部分体積の各々の体積ｖｉが異なることを特徴とする、方法。
【０１５９】
ポーランド特許出願ＰＬ３９７０２７（２０１１年１１月１７日出願；発明の名称：“Ｓｐｏｓｏｂ  ｐｒｚｅｐｒｏｗａｄｚａｎｉａ  ｃｙｆｒｏｗｙｃｈ  ｏｚｎａｃｚｅｎ  ａｎａｌｉｔｙｃｚｎｙｃｈ  ｉ  ｄｉａｇｎｏｓｔｙｃｚｎｙｃｈ”）を基礎とする発明に関する開示（特にそのすべての好ましい実施形態および実施例ならびに関係する図面を含む）は、その全体が本明細書に援用され、本発明に関するさらなる本発明の実施形態も示す。
【０１６０】
３．本発明のさらなる実施形態パートＤ：
１．既知の体積ＶＰを有するサンプル中の粒子の未知濃度ＣＰを決定するための方法であって、その方法は、以下の工程：
ａ）ＶＰという体積を有するサンプルを、前記粒子の少なくとも１つの存在を測定可能なシグナルまで増幅する反応を行うために必要なＶＲという体積の試薬の溶液と混合し、その結果として、未知濃度ＣＳ＝ＣＰ・ＶＰ／（ＶＰ＋ＶＲ）の前記粒子を含むＶＳという体積を有する反応性溶液を得る工程、
ｂ）その反応性溶液（それは、ＶＰという体積を有する、前記粒子の少なくとも１つの存在を測定可能なシグナルまで増幅する反応を行うために必要な試薬のさらなる溶液の、反応性溶液である）から、各々がｕという体積を有するＮ個の互いに素な部分体積（それらの部分体積の各々が、必要な濃度の試薬および前記粒子の所与の希釈度ｄｎを含むように）を作製する工程（ここで
【数１３３】
0006055838.tif 000136
であり、添字ｎは、部分体積に添字付与し、０からＮ−１までの整数に及び、Ｃｎは、番号ｎを有する部分体積における前記粒子の未知濃度を表す）；
ｃ）このように得られた部分体積の各々において、少なくとも１つの前記粒子の存在を測定可能なシグナルまで増幅するプロセスを行う工程；
ｄ）それらの部分体積の各々において前記シグナルを測定し、この部分体積にパラメータｋｎを割り当てる工程（ここで、前記シグナル測定の結果が、所与の部分体積に少なくとも１つの前記粒子が存在することを示唆する場合、パラメータｋｎは、１に等しい値を有し、そうではない場合は０に等しい値を有し、ｎは、部分体積の番号である）；
ｅ）公知の統計的アルゴリズム、好ましくは、ベイズの形式に基づくものを用いて、｛ｋｎ｝、Ｎおよび｛ｄｎ｝の値のセットに基づいて、ＶＳという体積を有する反応性溶液中の前記粒子の濃度の推定値Ｅ（ＣＳ）を決定する工程、
ｆ）式：ＣＰ＝ＣＳ・（ＶＰ＋ＶＲ）／ＶＰから濃度ＣＰを決定する工程
を含み、
２．工程ｂ）において述べられた部分体積の少なくとも２つについて、希釈ｄｎが異なることを特徴とする、方法。
【０１６１】
ポーランド特許出願ＰＬ３９７０２６（２０１１年１１月１７日出願；発明の名称：“Ｓｐｏｓｏｂ  ｐｒｚｅｐｒｏｗａｄｚａｎｉａ  ｃｙｆｒｏｗｙｃｈ  ｏｚｎａｃｚｅｎ  ａｎａｌｉｔｙｃｚｎｙｃｈ  ｉ  ｄｉａｇｎｏｓｔｙｃｚｎｙｃｈ”）を基礎とする発明に関する開示（特にそのすべての好ましい実施形態および実施例ならびに関係する図面を含む）は、その全体が本明細書に援用され、本発明に関するさらなる本発明の実施形態も示す。
【０１６２】
３．本発明のさらなる実施形態パートＥ：
１．既知の体積ＶＳのサンプル中の粒子の未知濃度ＣＳを決定するための方法であって、その方法は、以下の工程：
ａ）サンプルの少なくとも一部を、少なくとも１つの標的粒子の存在を測定可能なシグナルまで増幅する反応を行うために必要なある特定の体積の試薬の溶液と混合することによって、前記サンプルを、各々、体積ｖｉおよび希釈度ｄｉのＮ個の別個のコンパートメントに分配する工程（ここで、０＜ｄｉ≦０は、希釈因子、すなわち、サンプル中の粒子の未知濃度ＣＳに対する所与のコンパートメントにおける粒子の濃度Ｃｉの比、ｄｉ＝Ｃｉ／ＣＳを意味し、ｉは、０〜Ｎ−１の整数にわたるコンパートメントの番号である）；
ｂ）そのように生成された各コンパートメントにおいて、少なくとも１つの前記粒子の存在を測定可能なシグナルまで増幅するプロセスを行う工程；
ｃ）各コンパートメントにおける前記シグナルを測定し、前記コンパートメントにパラメータｋｎを割り当てる工程（前記パラメータｋｉは、前記測定の結果が、所与のコンパートメントが少なくとも１つの前記粒子を含むことを示唆する場合は１という値、および反対の場合は０という値を仮定する）；
ｄ）工程ｃ）において測定されたｋｉパラメータの値を順に含む、微視的状態μを特定するベクトルｋ≡｛ｋｉ｝を構築する工程；
を含み、
２．
ｅ）サンプル中の粒子の未知濃度ＣＳは、工程ｄ）において構築されたベクトルｋの関数であって、微視的状態μを特定する、推定値：Ｅ（ＣＳ）＝ｆ（μ）として計算され、工程ａ）において生成されたコンパートメントのうち少なくとも２つは、商ｚｉ＝（ｖｉｄｉ）／（ｖ０ｄ０）に等しい調節因子ｚｉの値だけ互いに異なることを特徴とする、方法。
【０１６３】
ポーランド特許出願ＰＬ３９９６７３（２０１２年６月２６日出願；発明の名称：“Ｓｐｏｓｏｂ  ｐｒｚｅｐｒｏｗａｄｚａｎｉａ  ｃｙｆｒｏｗｙｃｈ  ｏｚｎａｃｚｅｎ  ａｎａｌｉｔｙｃｚｎｙｃｈ  ｉ  ｄｉａｇｎｏｓｔｙｃｚｎｙｃｈ”）を基礎とする発明に関する開示（特にそのすべての好ましい実施形態および実施例ならびに関係する図面を含む）は、その全体が本明細書に援用され、本発明に関するさらなる本発明の実施形態も示す。
【０１６４】
３．本発明のさらなる実施形態パートＦ：
１．既知の体積ＶＳのサンプル中の粒子の未知濃度ＣＳを決定するための方法であって、その方法は、以下の工程：
ａ）サンプルを、ライブラリーと呼ばれるＮ個の別個のコンパートメントのセットに分配する工程（ここで、各セットは、Ｎ’ｉ＞０個のコンパートメントを含み、各セット内において、式ｄｉｖｉの値は、サンプルの少なくとも一部を、少なくとも１つの標的粒子の存在を測定可能なシグナルまで増幅する反応を行うために必要なある特定の体積の試薬の溶液と混合することによって、設定され：ｖｉは、所与のコンパートメントの体積を意味し、ｄｉ＞０は、希釈因子、すなわち、サンプル中の粒子の未知濃度ＣＳに対する所与のコンパートメントにおける粒子の濃度Ｃｉの比，ｄｉ＝Ｃｉ／ＣＳを意味し、ｉは、０〜Ｎ−１の整数にわたるライブラリーの番号である）；
ｂ）そのように生成された各ライブラリーの各コンパートメントにおいて、少なくとも１つの前記粒子の存在を測定可能なシグナルまで増幅するプロセスを行う工程；
ｃ）各コンパートメントにおける前記シグナルを測定し、測定されたシグナルを、微視的状態μを特定する任意の次数の数、ベクトル、行列またはテンソルの形で写像する工程（ここで、それらの添字は、所与の希釈因子ｄｉおよび所与の体積ｖｉによって各コンパートメントを明白に特定し、所与の添字のセットを有する成分の値は、そのコンパートメントからのシグナル値を写像する）
を含み；
２．
ｄ）サンプル中の粒子の未知濃度ＣＳは、工程ｃ）において得られた、任意の次数の前記数、ベクトル、行列またはテンソルの関数であって、微視的状態μを特定する、推定値：Ｅ（ＣＳ）＝ｆ（μ）として計算され、工程ａ）において生成されたライブラリーのうち少なくとも２つは、商ｚｉ＝（ｖｉｄｉ）／（ｖ０ｄ０）に等しい調節因子ｚｉの値だけ互いに異なることを特徴とする、方法。
【０１６５】
ポーランド特許出願ＰＬ３９９９０８（２０１２年７月１１日出願；発明の名称：“Ｓｐｏｓｏｂ  ｐｒｚｅｐｒｏｗａｄｚａｎｉａ  ｃｙｆｒｏｗｙｃｈ  ｏｚｎａｃｚｅｎ  ａｎａｌｉｔｙｃｚｎｙｃｈ  ｉ  ｄｉａｇｎｏｓｔｙｃｚｎｙｃｈ”）を基礎とする発明に関する開示（特にそのすべての好ましい実施形態および実施例ならびに関係する図面を含む）は、その全体が本明細書に援用され、本発明に関するさらなる本発明の実施形態も示す。
【実施例】
【０１６６】
本発明の好ましい実施形態において、エプスタイン・バーウイルスＤＮＡを定量的に決定するアッセイが行われる。複製される配列は、２１８塩基対の長さを有する高度に保存的なＥＢＮＡ−１遺伝子の断片である。以下の配列を有するプライマーを使用した：順方向プライマー：ＣＴＡＴＡＴＧＣＣＴＧＣＴＴＣＣＴＣＣＧＧＣＧＧＡＣＣＣＧＧＣＣＣＡＣＡＡＣＣＴＧＧＣおよび逆方向プライマー：ＣＧＣＣＧＧＡＧＧＡＡＧＣＡＧＧＣＡＴＡＴＡＧＣＧＡＣＴＣＡＡＴＧＧＴＧＴＡＡＧＡＣＧＡＣ。１反応あたり１０コピー〜１０，０００コピーの濃度を用いるリアルタイムＰＣＲ反応において使用されるキャリブレーター（ＥＢＮＡ−１アンプリコンを含むプラスミド溶液）に対して、ＤＮＡ濃度を決定するアッセイの一貫性を解析することによって、この方法を確かめた。
【０１６７】
体積Ｖサンプル＝２０μＬの反応混合物は各々、４μｌの水、１μｌのプライマー１０×、１０μｌのマスターミックス（Ｈｏｔ  ｓｔａｒｔ  ＤＮＡ、Ｔａｑポリメラーゼ、ｄＮＴＰ混合物、ＭｇＣｌ２）、濃度（２０／５）Ｃサンプル［コピー／ｍＬ］の５μｌのＤＮＡ鋳型を含む。各実験について、必要とされる体積の、前記反応混合物を希釈するために使用される混合物も調製する。
【０１６８】
非限定的な例において、体積ＶＳ＝２０μＬの反応混合物、および必要とされる体積の、サンプルを希釈するために使用される試薬の混合物を、ＰＤＭＳ製またはポリカーボネート製のマイクロ流体システムに投入する。次いで、同じ添字を有する液滴をマージした後に（ｕＳｉ＋ｕＲｉ≡ｕ）、一定の体積ｕかつ標的分子の未知濃度Ｃｉ＝Ｃサンプル（ｕＳｉ／ｕ）の定義された数列の一連の液滴が得られるように、体積｛ｕＳｉ｝のサンプル溶液を含む液滴および体積｛ｕＲｉ｝の反応試薬を含む液滴を、要求に応じて生成する。
【０１６９】
非限定的な例において、そのように調製された混合物を、希釈後に、ストリップの形態の試験管（各２０μｌ）にピペットで移す。遠心分離の後、そのストリップをＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  Ｎａｎｏ装置に入れる。
【０１７０】
以下の反応プロトコルを使用する：９５℃での１０分間の最初の変性の後の、９５℃での３０秒間の変性、５５℃での３０秒間のアニーリングおよび７２℃での３０秒間の伸長から構成される４５サイクル。チップを２０℃に冷却することによって全手順を完了させる。チャネル５３０〜５４８ｎｍにおいて高い蛍光レベルを示す区画をカウントする。
【０１７１】
実行実施例１
好ましい実施形態において、２０μＬの体積を有するサンプルに対する定量アッセイを、前記サンプル中のＤＮＡ分子の濃度の推定値をＣ−＝１ｍＬ−１〜Ｃ＋＝１０２ｍＬ−１の濃度範囲、すなわち、Ｃ＋／Ｃ−＝１０２においてσｍａｘ＝６２％未満の相対標準偏差で提供するように、デザインする。このアッセイは、独立確率変数を使用して計算されるサンプルの濃度を返し、ゆえに、スケーリングによって、そのサンプル中の濃度の推定値は、レザバー内の濃度の推定値に変換することができる。要求されるダイナミックレンジは、サンプルを、希釈率Ｃｉ／Ｃサンプル＝ｄｉ＝ｘｉ（ここでｘ＝０．５である）を有する１０区画に分配することによって達成される。本発明の説明に提示された数値アルゴリズムを使用して、条件付き確率分布ｆ（Ｃサンプル｜μ）に基づいて推定値Ｅ（Ｃサンプル）を計算する（ここで、μは、この分析アッセイを行うために使用される区画の系の微視的状態である）（図５ａ）および詳細な図の説明のそれぞれの部分も参照のこと）。
【０１７２】
好ましい実施形態において、エプスタイン・バーＤＮＡのコピー数を、２０μＬの体積を有するサンプルを使用して決定する。反応混合物を、ＰＤＭＳ／ポリカーボネート製のシステムに入れ、希釈率ｄｉ＝ｘｉ（ここでｘ＝０．５である）を用いて要求に応じて１０個の液滴を生成する。液滴を含む系をサーモサイクラーに入れ、ＰＣＲ反応を行い、その後、各液滴からのシグナル（その系の微視的状態）を読み出す。
【０１７３】
例えば、Ｃサンプル＝５５．５ｍＬ−１の濃度で遺伝子コピーを含む２０μＬのサンプルを使用した。５回の反復実験において、以下の結果を得た：第１の試行では、μ１＝｛１，１，１，１，１，０，０，０，０，０｝、第２の試行では、μ２＝｛１，１，１，１，０，０，０，０，１，０｝、第３の試行では、μ３＝｛１，１，１，０，０，０，０，０，０，０｝、第４の試行では、μ４＝｛１，１，１，０，０，０，０，０，０，０｝、および第５の試行では、μ５＝｛１，１，０，１，０，０，０，０，０，０｝（ここで、添字は実験の反復に番号を付けている）。所与の希釈分布に対して得られた統計モデルを使用して、これらの値を、サンプル中のＤＮＡコピーの初濃度の推定値ｃｌ＝Ｅｌ（Ｃサンプル）に再計算するｃ１＝５６．８、ｃ２＝４５．２、ｃ３＝３４．８、ｃ４＝３４．８およびｃ５＝２７．９ｍＬ−１。
【０１７４】
実行実施例２
好ましい実施形態において、２０μＬの体積を有するサンプルに対する定量アッセイを、前記サンプル中のＤＮＡ分子の濃度の推定値をＣ−＝５ｍＬ−１〜Ｃ＋＝５・１０２ｍＬ−１の濃度範囲、すなわち、Ｃ＋／Ｃ−＝１０２においてσｍａｘ＝２５％未満の相対標準偏差で提供するように、デザインする。そのアッセイは、独立確率変数を使用して計算されたサンプルの濃度を返し、ゆえに、スケーリングによって、そのサンプル中の濃度の推定値は、レザバー内の濃度の推定値に変換することができる。要求されるダイナミックレンジは、サンプルを、希釈率ｄｉ＝ｘｉ（ここでｘ＝０．９１７である）を有する８６区画に分配することによって達成される。本発明の説明に提示された数値アルゴリズムを使用して、条件付き確率分布ｆ（Ｃサンプル｜μ）に基づいて推定値Ｅ（Ｃサンプル）を計算する（ここで、μは、この分析アッセイを行うために使用される区画の系の微視的状態である）。好ましい実施形態において、エプスタイン・バーＤＮＡのコピー数を、２０μＬの体積を有するサンプルを使用して決定する。反応混合物を、ＰＤＭＳ／ポリカーボネート製のシステムに入れ、希釈率ｄｉ＝ｘｉ（ここでｘ＝０．９１７である）を用いて要求に応じて８６個の液滴を生成する。液滴を含む系をサーモサイクラーに入れ、ＰＣＲ反応を行い、その後、各液滴からのシグナル（その系の微視的状態）を読み出す。
【０１７５】
例えば、Ｃサンプル＝１．５・１０２ｍＬ−１の濃度で遺伝子コピーを含む２０μＬのサンプルを使用した。５回の反復実験において、以下の結果を得た：第１の試行では、μ１＝｛１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，０，１，１，１，１，１，１，１，１，０，０，１，１，０，１，１，１，１，１，１，０，１，１，０，１，１，１，０，０，０，０，１，０，０，０，０，０，０，０，１，０，０，１，０，１，０，１｝、第２の試行では、μ２＝｛１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，０，１，１，１，１，１，１，０，０，１，１，０，１，１，１，１，１，１，１，０，１，１，１，１，０，１，０，０，０，０，０，１，０，０，１，０，０，０，１，１，１，０，０，１，０｝、第３の試行では、μ３＝｛１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，０，０，１，１，１，０，１，１，１，１，１，１，１，１，０，１，１，０，１，０，１，１，０，１，０，０，１，０，０，０，０，１，０，０，０，０，０，０，０，０｝、第４の試行では、μ４＝｛１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，０，１，１，１，０，１，１，０，１，１，１，１，０，１，１，１，１，０，１，１，１，１，１，０，０，０，１，１，１，１，１，０，０，０，０，０，０，１，０，０，０，０，０，０，１，１｝、および第５の試行では、μ５＝｛１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，０，０，１，１，０，０，０，１，０，０，１，０，０，１，１，１，１，１，０，１，１，１，１，１，０，０，１，０，０，１，０，１，１，１，０，０，１，０，１，１｝（ここで、添字は実験の反復に番号を付けている）。所与の希釈分布に対して得られた統計モデルを使用して、これらの値を、サンプル中のＤＮＡコピーの初濃度の推定値ｃｌ＝Ｅｌ（Ｃサンプル）に再計算するｃ１＝１．５１・１０２、ｃ２＝１．７２・１０２、ｃ３＝１．５２・１０２、ｃ４＝１．６１・１０２およびｃ４＝１．８４・１０２［ｍＬ−１］。
【０１７６】
実行実施例３
好ましい実施形態において、２０μＬの体積を有するサンプルに対する定量アッセイを、前記サンプル中のＤＮＡ分子の濃度の推定値を
【数１３４】
0006055838.tif 000137
の濃度範囲、すなわち、
【数１３５】
0006055838.tif 000138
においてσｍａｘ＿１＝６２％未満、
【数１３６】
0006055838.tif 000139
の濃度範囲、すなわち、
【数１３７】
0006055838.tif 000140
においてσｍａｘ＿２＝２５％未満および
【数１３８】
0006055838.tif 000141
の濃度範囲、すなわち、
【数１３９】
0006055838.tif 000142
においてσｍａｘ＿３＝６２％未満の相対標準偏差で提供するように、デザインする。そのアッセイは、独立確率変数を使用して計算されるサンプルの濃度を返し、ゆえに、スケーリングによって、そのサンプル中の濃度の推定値は、レザバー内の濃度の推定値に変換することができる。必要とされるダイナミックレンジは、サンプルを、希釈率ｄｉ＝ｘｉ（ここでｘ＝０．５である）を有する１４区画、８６区画（ｘ＝０．９１７）および１４区画（ｘ＝０．５）に連続的に分配することによって達成される。本発明の説明に提示された数値アルゴリズムを使用して、条件付き確率分布ｐ（Ｃサンプル｜μ）に基づいて推定値Ｅ（Ｃサンプル）を計算する（ここで、μは、この分析アッセイを行うために使用される区画の系の微視的状態である）（図５ｂ）および詳細な図の説明のそれぞれの部分も参照のこと）。
【０１７７】
好ましい実施形態において、エプスタイン・バーＤＮＡのコピー数を、２０μＬの体積を有するサンプルを使用して決定する。反応混合物を、ＰＤＭＳ／ポリカーボネート製のシステムに入れ、希釈率ｄｉ＝ｘｉを用いて要求に応じて１４個の液滴（ここでｘ＝０．５である）、８６個の液滴（ｘ＝０．９１７）および１４個の液滴（ｘ＝０．５）を生成する。液滴を含む系をサーモサイクラーに入れ、ＰＣＲ反応を行い、その後、各液滴からのシグナル（その系の微視的状態）を読み出す。
【０１７８】
例えば、Ｃサンプル＝５・１０３ｍＬ−１の濃度で遺伝子コピーを含む２０μＬのサンプルを使用した。５回の反復実験において、以下の結果を得た：第１の試行では、μ１＝｛１，１，１，１，１，０，１，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，１，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０｝、第２の試行では、μ２＝｛１，１，１，１，１，１，１，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，１，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０｝、第３の試行では、μ３＝｛１，１，１，１，１，０，０，１，０，０，０，０，０，１，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０｝、第４の試行では、μ４＝｛１，１，１，１，０，１，１，１，１，０，０，０，０，０，０，１，０，０，０，０，１，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，１，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０｝、第５の試行では、μ５＝｛１，１，１，１，１，０，１，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，１，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０｝（ここで、添字は実験の反復に番号を付けている）。所与の希釈分布に対して得られた統計モデルを使用して、これらの値を、サンプル中のＤＮＡコピーの初濃度の推定値ｃｌ＝Ｅｌ（Ｃサンプル）に再計算するｃ１＝２．３０・１０３、ｃ２＝６．１２・１０３、ｃ３＝２．１４・１０３、ｃ４＝２．９０・１０３およびｃ５＝２．３０・１０３［ｍＬ−１］。
【０１７９】
例えば、Ｃサンプル＝１．５・１０５ｍＬ−１の濃度で遺伝子コピーを含む２０μＬのサンプルを使用した。５回の反復実験において、以下の結果を得た：第１の試行では、μ１＝｛１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，０，１，１，１，１，１，１，０，１，０，１，０，１，０，１，０，１，１，０，１，１，０，１，０，０，１，０，０，０，０，０，０，０，１，１，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０｝、第２の試行では、μ２＝｛１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，０，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，０，０，１，０，１，０，０，１，０，１，１，１，０，０，１，１，０，０，０，１，０，０，１，０，１，１，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０｝、第３の試行では、μ３＝｛１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，０，１，１，１，１，１，１，１，１，０，１，１，１，１，１，１，１，０，１，１，１，１，０，１，０，１，０，１，０，１，０，０，０，１，０，０，１，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０｝、第４の試行では、μ４＝｛１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，０，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，０，１，１，０，０，０，１，１，０，１，０，０，０，０，１，０，０，１，０，０，１，０，１，０，０，１，０，１，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０｝、第５の試行では、μ５＝｛１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，０，１，１，１，０，１，１，１，１，１，０，０，１，０，１，１，１，０，０，０，０，０，０，０，１，０，０，０，０，０，１，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０｝（ここで、添字は実験の反復に番号を付けている）。所与の希釈分布に対して得られた統計モデルを使用して、これらの値を、サンプル中のＤＮＡコピーの初濃度の推定値ｃｌ＝Ｅｌ（Ｃサンプル）に再計算するｃ１＝１．４５・１０５、ｃ２＝１．８４・１０５、ｃ３＝１．７４・１０５、ｃ４＝１．４３・１０５およびｃ５＝１．５２・１０５［ｍＬ−１］。
【０１８０】
例えば、Ｃサンプル＝５・１０７ｍＬ−１の濃度で遺伝子コピーを含む２０μＬのサンプルを使用した。５回の反復実験において、以下の結果を得た：第１の試行では、μ１＝｛１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，０，１，１，０，０，０，０，０，０｝、第２の試行では、μ２＝｛１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，０，１，０，０，０，０，０，０｝、第３の試行では、μ３＝｛１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，０，０，０，０，０，０，０，０｝、第４の試行では、μ４＝｛１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，０，０，０，０，０，０，０，０，０｝、第５の試行では、μ５＝｛１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，１，０，０，０，０，０，０，０｝（ここで、添字は実験の反復に番号を付けている）。所与の希釈分布に対して得られた統計モデルを使用して、これらの値を、サンプル中のＤＮＡコピーの初濃度の推定値ｃｌ＝Ｅｌ（Ｃサンプル）に再計算するｃ１＝２．８４・１０７、ｃ２＝３．０８・１０７、ｃ３＝３．４２・１０７、ｃ４＝３．８１・１０７およびｃ５＝３．３１・１０７［ｍＬ−１］。
【０１８１】
実行実施例４
好ましい実施形態において、２０μＬの体積を有するサンプルに対する本発明の定量アッセイを、前記サンプル中のＤＮＡ分子の濃度の推定値を
【数１４０】
0006055838.tif 000143
の濃度範囲、すなわち、（Ｃ＋／Ｃ−−）＝１０５においてσｍａｘ＝１５％未満の相対標準偏差で提供するように、デザインする。要求されるダイナミックレンジは、サンプルを、希釈度
【数１４１】
0006055838.tif 000144
（ここでｘ＝０．９８８６である）を有する４７４区画に分配することによって達成される。本発明の説明に提示された数値アルゴリズムを使用して、サンプル中の分子の初濃度の補正された推定値を計算するｃｃｏｒｒ＝ｃ・ｆｃｏｒｒ（ｃ）（ここで、ｃ＝Ｅ（Ｃサンプル）は、条件付き確率分布Ｐ（Ｃサンプル｜Ｋ）を使用して計算された、サンプル中の分子の濃度の推定値であり、Ｋは、カウントされた個々の区画からのシグナルの、重みｗｎ＝１／ｄｎで重み付けされた和である）。
【０１８２】
そのように準備された統計ツール（ｆｃｏｒｒ（ｃ）およびｃ（Ｋ）関数）を使用することにより、最初は不明だった、サンプル中の標的ＤＮＡ分子の濃度を決定することができる。
【０１８３】
好ましい実施形態において、エプスタイン・バーＤＮＡのコピー数を、２０μＬの体積を有するサンプルを使用して決定する。反応混合物を、ＰＤＭＳ／ポリカーボネート製のシステムに入れ、希釈度
【数１４２】
0006055838.tif 000145
（ここでｘ＝０．９８８６である）を有する４７４個の要求に応じた液滴を生成する。液滴を含む系をサーモサイクラーに入れ、ＰＣＲ反応を行った後、各液滴からのシグナルをカウントする。高い蛍光レベルを示す液滴からのシグナルを、重みｗｎ＝１／ｄｎを用いて合計する。
【０１８４】
例えば、Ｃサンプル＝５・１０２ｍＬ−１の濃度で遺伝子コピーを含む２０μＬのサンプルを使用した。５回の反復実験において、以下の結果を得た：第１の試行では、Ｋ１＝０．１７８、第２の試行では、Ｋ２＝０．４０４、第３の試行では、Ｋ３＝０．２９２、第４の試行では、Ｋ４＝０．１５５、第５の試行では、Ｋ５＝０．２１２（ここで、添字は実験の反復に番号を付けている）。所与の希釈分布に対して得られた統計モデルを使用して、これらの値を、サンプル中のＤＮＡコピーの初濃度の推定値に再計算するｃ１＝８．５３・１０２、ｃ２＝１．５６・１０３、ｃ３＝１．２７・１０３、ｃ４＝７．４１・１０２およびｃ５＝１．０２・１０３［ｍＬ−１］。補正ｃｃｏｒｒ（ｃ）＝ｃ（Ｋ）・ｆｃｏｒｒ（ｃ）を考慮した後、以下の推定値が得られる：ｃｃｏｒｒ１＝７．８４・１０２、ｃｃｏｒｒ２＝１．４３・１０３、ｃｃｏｒｒ３＝１．１７・１０３、ｃｃｏｒｒ４＝６．８０・１０２およびｃｃｏｒｒ５＝９．３２・１０２［ｍＬ−１］。
【０１８５】
例えば、Ｃサンプル＝５・１０５ｍＬ−１の濃度で遺伝子コピーを含む２０μＬのサンプルを使用した。５回の反復実験において、以下の結果を得た：第１の試行では、Ｋ１＝５４．６０、第２の試行では、Ｋ２＝５９．６２、第３の試行では、Ｋ３＝５８．６５、第４の試行では、Ｋ４＝６２．０３、第５の試行では、Ｋ５＝５５．５５（ここで、添字は実験の反復に番号を付けている）。所与の希釈分布に対して得られた統計モデルを使用して、これらの値を、サンプル中のＤＮＡコピーの初濃度の推定値に再計算するｃ１＝３．８８・１０５、ｃ２＝４．５７・１０５、ｃ３＝４．３８・１０５、ｃ４＝４．８９・１０５およびｃ５＝３．９４・１０５［ｍＬ−１］。補正ｃｃｏｒｒ（ｃ）＝ｃ（Ｋ）・ｆｃｏｒｒ（ｃ）を考慮した後、以下の推定値が得られる：ｃｃｏｒｒ１＝３．９９・１０５、ｃｃｏｒｒ２＝４．７９・１０５、ｃｃｏｒｒ３＝４．５７・１０５、ｃｃｏｒｒ４＝５．１７・１０５およびｃｃｏｒｒ５＝４．０５・１０５［ｍＬ−１］。
【０１８６】
例えば、Ｃサンプル＝１０６ｍＬ−１の濃度で遺伝子コピーを含む２０μＬのサンプルを使用した。５回の反復実験において、以下の結果を得た：第１の試行では、Ｋ１＝７４．９９、第２の試行では、Ｋ２＝７８．９９、第３の試行では、Ｋ３＝７７．１６、第４の試行では、Ｋ４＝７５．８５、第５の試行では、Ｋ５＝７９．２２（ここで、添字は実験の反復に番号を付けている）。所与の希釈分布に対して得られた統計モデルを使用して、これらの値を、サンプル中のＤＮＡコピーの初濃度の推定値に再計算するｃ１＝７．４８・１０５、ｃ２＝８．５０・１０５、ｃ３＝８．０６・１０５、ｃ４＝７．８０・１０５およびｃ５＝８．５５・１０５［ｍＬ−１］。補正ｃｃｏｒｒ（ｃ）＝ｃ（Ｋ）・ｆｃｏｒｒ（ｃ）を考慮した後、以下の推定値が得られる：ｃｃｏｒｒ１＝８．６２・１０５、ｃｃｏｒｒ２＝１．０１・１０６、ｃｃｏｒｒ３＝９．４７・１０５、ｃｃｏｒｒ４＝９．０９・１０５およびｃｃｏｒｒ５＝１．０２・１０６［ｍＬ−１］。
【０１８７】
実行実施例５
本発明の好ましい実施形態において、サンプル中のＤＮＡ粒子の濃度の推定値を
【数１４３】
0006055838.tif 000146
の濃度範囲、すなわち、
【数１４４】
0006055838.tif 000147
においてσｍａｘ１＝２０％未満、
【数１４５】
0006055838.tif 000148
の濃度範囲、すなわち、
【数１４６】
0006055838.tif 000149
においてσｍａｘ２＝１０％未満および
【数１４７】
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の濃度範囲、すなわち、
【数１４８】
0006055838.tif 000151
においてσｍａｘ３＝２０％未満の相対標準偏差で提供するように、アッセイをデザインする。要求されるダイナミックレンジは、サンプルを、希釈率Ｃｉ／ＣＳ＝ｄｉ＝ｘｉを有するＮ＝３８個のライブラリーの等比級数（ここでｘ＝０．５であり、初項ｄ０ｖ０＝１１．１μＬである）に分配することによって達成され、０〜９の添字を有するライブラリーは、濃度Ｎ’１＝１０を有し、１０〜２７の添字を有するライブラリーは、濃度Ｎ’２＝４０を有し、２８〜３７の添字を有するライブラリーは、濃度Ｎ’３＝１０を有する。本発明の説明に提示された数値アルゴリズムを使用して、条件付き確率分布ｆ（ＣＳ｜μ）（ここで、μは、この分析アッセイを行うために使用されるコンパートメントの系の微視的状態である）に基づいて推定値Ｅ（ＣＳ）を計算する。
【０１８８】
反応混合物を、ＰＤＭＳ／ポリカーボネートおよび希釈度Ｃｉ／ＣＳ＝ｄｉ＝ｘｉ（ここでｘ＝０．５である）を有するＮ＝３８個のライブラリーでできたシステムに入れ、０〜９の添字を有するライブラリーは、濃度Ｎ’１＝１０を有し、１０〜２７の添字を有するライブラリーは、濃度Ｎ’２＝４０を有し、２８〜３７の添字を有するライブラリーは、濃度Ｎ’３＝１０を有する。液滴を含む系をサーモサイクラーに入れ、ＰＣＲ反応を行い、その後、各液滴からのシグナル（その系の微視的状態）を読み出すと、ｉ番目のライブラリーに属し、陽性シグナルをもたらす液滴の数に等しい座標ｋｉを有するＮ次元のベクトルｋが生成される。
【０１８９】
例えば、ＣＳ＝１０２ｍＬ−１の濃度で遺伝子コピーを含むサンプル。５回の反復実験において、以下の結果を得た：第１において、ｋ１＝｛１０，１０，１０，１０，１０，１０，１０，１０，１０，９，２６，１８，７，７，２，２，１，０，１，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０｝、ｋ２＝｛１０，１０，１０，１０，１０，１０，１０，１０，１０，９，２５，１８，７，４，２，２，１，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０｝、ｋ３＝｛１０，１０，１０，１０，１０，１０，１０，１０，１０，８，２６，１７，１１，４，５，３，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０｝、ｋ４＝｛１０，１０，１０，１０，１０，１０，１０，１０，１０，１０，２８，１６，１１，８，２，２，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０｝、ｋ５＝｛１０，１０，１０，１０，１０，１０，１０，１０，１０，１０，２５，１４，１１，８，３，０，１，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０｝（ここで、添字は実験の反復に番号を付けている）。所与の希釈分布に対して得られた統計モデルを使用して、これらの値を、サンプル中のＤＮＡコピーの初濃度の推定値に再計算するｃ１＝１０４±１２、ｃ２＝９６±１２、ｃ３＝１０４±１２、ｃ４＝１１５±１４およびｃ５＝１０３±１２μＬ−１。
【０１９０】
例えば、ＣＳ＝１０５ｍＬ−１の濃度で遺伝子コピーを含むサンプル。５回の反復実験において、以下の結果を得た：ｋ１＝｛１０，１０，１０，１０，１０，１０，１０，１０，１０，１０，４０，４０，４０，４０，４０，４０，４０，４０，４０，３６，２３，１４，１１，４，１，１，０，１，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０｝、ｋ２＝｛１０，１０，１０，１０，１０，１０，１０，１０，１０，１０，４０，４０，４０，４０，４０，４０，４０，４０，３９，３４，２７，１６，９，４，２，３，２，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０｝、ｋ３＝｛１０，１０，１０，１０，１０，１０，１０，１０，１０，１０，４０，４０，４０，４０，４０，４０，４０，４０，４０，３４，２４，２０，８，３，３，１，０，１，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０｝、ｋ４＝｛１０，１０，１０，１０，１０，１０，１０，１０，１０，１０，４０，４０，４０，４０，４０，４０，４０，４０，３９，３６，２７，１５，１０，１０，３，０，０，１，１，０，０，０，０，０，０，０，０，０｝、ｋ５＝｛１０，１０，１０，１０，１０，１０，１０，１０，１０，１０，４０，４０，４０，４０，４０，４０，４０，４０，３９，３７，３０，１９，１０，４，３，３，３，２，０，０，０，０，０，０，０，０，０，０｝（ここで、添字は実験の反復に番号を付けている）。所与の希釈分布に対して得られた統計モデルを使用して、これらの値を、サンプル中のＤＮＡコピーの初濃度の推定値に再計算するｃ１＝（９６±１０）・１０３、ｃ２＝（９８±１０）・１０３、ｃ３＝（９９±１０）・１０３、ｃ４＝（１０８±１１）・１０３およびｃ５＝（１２３±１２）・１０３μＬ−１。
【０１９１】
例えば、ＣＳ＝１０８ｍＬ−１の濃度で遺伝子コピーを含むサンプル。５回の反復実験において、以下の結果を得た：ｋ１＝｛１０，１０，１０，１０，１０，１０，１０，１０，１０，１０，４０，４０，４０，４０，４０，４０，４０，４０，４０，４０，４０，４０，４０，４０，４０，４０，４０，４０，１０，７，８，２，１，２，１，０，０，０｝、ｋ２＝｛１０，１０，１０，１０，１０，１０，１０，１０，１０，１０，４０，４０，４０，４０，４０，４０，４０，４０，４０，４０，４０，４０，４０，４０，４０，４０，４０，４０，１０，８，７，５，２，０，１，０，０，０｝、ｋ３＝｛１０，１０，１０，１０，１０，１０，１０，１０，１０，１０，４０，４０，４０，４０，４０，４０，４０，４０，４０，４０，４０，４０，４０，４０，４０，４０，４０，４０，１０，９，６，１，３，２，０，０，０，０｝、ｋ４＝｛１０，１０，１０，１０，１０，１０，１０，１０，１０，１０，４０，４０，４０，４０，４０，４０，４０，４０，４０，４０，４０，４０，４０，４０，４０，４０，４０，４０，９，９，６，５，２，１，１，０，０，０｝、ｋ５＝｛１０，１０，１０，１０，１０，１０，１０，１０，１０，１０，４０，４０，４０，４０，４０，４０，４０，４０，４０，４０，４０，４０，４０，４０，４０，４０，４０，３９，１０，１０，７，４，４，０，１，２，１，０｝（ここで、添字は実験の反復に番号を付けている）。所与の希釈分布に対して得られた統計モデルを使用して、これらの値を、サンプル中のＤＮＡコピーの初濃度の推定値に再計算するｃ１＝（８９±１７）・１０６、ｃ２＝（１０３±２１）・１０６、ｃ３＝（９４±１９）・１０６、ｃ４＝（９４±１８）・１０６およびｃ５＝（１０４±１９）・１０６μＬ−１。
【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
0006055838.tif 000179
【図３ｄ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図７ｃ】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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