(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式：
【化１】
0005898768.tif 000031
の化合物またはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項２】
下記式：
【化２】
0005898768.tif 000032
のＮ−メチル−（Ｄ）−グルカミン塩化合物。
【請求項３】
請求項１に記載の化合物を含む医薬組成物。
【請求項４】
請求項２に記載の化合物を含む医薬組成物。
【請求項５】
請求項１に記載の化合物含む炎症性腸疾患の予防又は治療用医薬。
【請求項６】
請求項２に記載の化合物含む炎症性腸疾患の予防又は治療用医薬。
【請求項７】
請求項１に記載の化合物を含む潰瘍性大腸炎の予防又は治療用医薬。
【請求項８】
請求項２に記載の化合物を含む潰瘍性大腸炎の予防又は治療用医薬。
【請求項９】
請求項１に記載の化合物を含むクローン病の予防又は治療用医薬。
【請求項１０】
請求項２に記載の化合物を含むクローン病の予防又は治療用医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、炎症性腸疾患の治療に使用するための新規化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、二つの特発性炎症性疾患、すなわち潰瘍性大腸炎（ＵＣ）及びクローン病（ＣＤ）からなる。ＵＣとＣＤ間の最大の相違は、炎症を起こした腸組織の範囲である。ＣＤの炎症は、限局性腸炎として知られる不連続に分割された炎症であるが、ＵＣは、直腸から近位及び連続的に広がる表在性炎症である。現在のところ、ＩＢＤの正確な原因は不明である。疾患は、炎症誘発性分子と免疫調節分子の不均衡のために、腸上皮の感染に対して過剰な粘膜免疫応答が生じることに関連していると見られる。ＩＢＤの遺伝パターンは病因の複雑な遺伝的要素を示唆しており、病因はいくつかの複合遺伝子突然変異からなるのかもしれない。現在、ＩＢＤの特異的診断試験は存在しないが、病因の理解が向上すれば試験法も改良される。ＩＢＤの治療は寛解の誘導と維持からなる。ＩＢＤ患者は、５−アミノサリチル酸の使用によって寛解を維持できる。しかしながら、ＵＣへのアミノサリチル酸の使用は、軽度〜中等度の疾患における寛解の誘導にも再発防止にも相当の利益を提供するが、ＣＤにおける寛解を維持するためのこれらの薬物の有用性は疑問で、もはや推奨されていない。活動性疾患の治療の中心はコルチコステロイドで、一般的にＵＣ及びＣＤ患者を寛解に戻すために期間を限定して使用される。しかし、全身吸収が限定的な局所投与用に設計されたブデソニドは、寛解の維持に利益がない。免疫抑制薬のアザチオプリン及びメルカプトプリンのような代替薬は、メトトレキサートやシクロスポリンと共に、限定的な効果しかなく、重大な有害作用を誘発する可能性もある。インフリキシマブ及びアダリムマブのような抗ＴＮＦα抗体は、標準的な免疫抑制療法に不応性の患者に使用できる。しかしながら、多くの患者は、彼らの特別な表現型のためか又は自己抗体の産生によって、抗ＴＮＦα療法に応答できない。
【発明の概要】
【０００３】
本発明に従って、クローン病及び潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾患の治療に使用するための化合物を提供する。
特に、本発明は、構造式Ｉ：
【０００４】
【化１】
0005898768.tif 000002
【０００５】
の化合物を提供する。
また、式（Ｉ）の化合物−化合物１の薬理学的に許容可能な異性体及び塩も提供する。
特に、本発明は、構造式II：
【０００６】
【化２】
0005898768.tif 000003
【０００７】
に示されるような相対立体化学の化合物を提供する。
また、式（II）の化合物−化合物２の薬理学的に許容可能な塩も提供する。
活性エナンチオマーは、分光学的に、それらの物理的及び化学的性質によって、そして標準及びキラルＨＰＬＣリテンションデータによって特徴付けされている。
【０００８】
特定のエナンチオマー形がＩＢＤの治療に特に有用であることが見出された。
本発明は、式IIIの化合物のＮ−メチル−（Ｄ）−グルカミン塩：
【０００９】
【化３】
0005898768.tif 000004
【００１０】
も提供する。
本発明の化合物は二つ以上の形態に結晶化されうる。この特徴は多形現象（多形性）と呼ばれ、そのような多形（“polymorphs”）も本発明の範囲に含まれる。多形現象は、一般的に、温度、圧力、又はその両方の変化に対する応答として発生しうる。多形現象は、結晶化工程の違いにも由来しうる。多形は、当該技術分野で公知の様々な物理的特徴、例えばｘ線回折パターン、溶解度、及び融点によって区別できる。
【００１１】
本明細書中に記載のある種の化合物は立体異性体として存在できる。本発明の範囲は、立体異性体の混合物も精製又は富化混合物も含む。同じく本発明の範囲に含まれるのは、本発明の化合物の個別異性体のほか、そのあらゆる完全又は部分平衡混合物である。本発明のある種の化合物は一つ又は複数のキラル中心を含有する。従って、本発明は、本発明の化合物のラセミ化合物、精製エナンチオマー、及びエナンチオ富化混合物を含む。本発明の化合物は、ラセミ及びキラルインダン二量体を含む。
【００１２】
薬学的に許容可能な塩という用語に包含される塩とは、本発明の化合物の非毒性塩のことを言う。本発明の化合物の塩は酸付加塩を含みうる。
本発明は、本発明のいずれの化合物の溶媒和物も含む。溶媒和物という用語は、溶質（本発明においては、本発明の化合物、又はその塩もしくは生理学的に機能する誘導体）及び溶媒によって形成される様々な化学量論の複合体のことを言う。本発明の目的のためのそのような溶媒は溶質の生物活性を妨害すべきでない。適切な溶媒の非制限的例は、水、メタノール、エタノール、及び酢酸などであるが、これらに限定されない。好ましくは、使用される溶媒は薬学的に許容可能な溶媒である。適切な薬学的に許容可能な溶媒の非制限的例は、水、エタノール、及び酢酸などである。最も好ましくは、使用される溶媒は水である。
【００１３】
本発明は、本発明のいずれの化合物のプロドラッグも含む。プロドラッグという用語は、哺乳動物に投与すると本発明の化合物又はその活性代謝産物を（直接的に又は間接的に）提供できる本発明の化合物のあらゆる薬学的に許容可能な誘導体のことを言う。そのような誘導体、例えばエステル及びアミドは、当業者には明白であろう。
【００１４】
本発明はさらに、上記化合物のいずれかを含む医薬組成物も提供する。
活性化合物は、ヒトに使用するための医薬中に、所望の効果を達成するために適切な用量で存在しうる。例えば、最終用量は０．１〜１０ｍｇ／ｋｇであろう。
【００１５】
本発明の化合物をバルク活性薬品の形態で投与することは可能であろう。しかしながら、本発明の化合物は、医薬製剤又は組成物の形態で投与されるのが好適である。そのような製剤は、一つ又は複数の薬学的に許容可能な賦形剤、担体又は希釈剤を含みうる。
【００１６】
本発明の化合物は、いくつかの異なる方式で投与できる。本発明の化合物は経口投与できる。経口投与用の好適な医薬製剤は、錠剤、カプセル、カプレット、溶液、懸濁液又はシロップを含む。
【００１７】
医薬製剤は、持続放出(time release)カプセル又は錠剤のような、調節された放出のための形態で提供されてもよい。
医薬は、経口、非経口、鼻腔内、経皮、又は吸入投与されうる。
【００１８】
医薬製剤は、任意の適切な経路、例えば、経口（バッカル又は舌下を含む）、直腸、鼻腔、局所（バッカル、舌下又は経皮を含む）、経膣、又は非経口（皮下、筋肉内、静脈内又は皮内を含む）経路による投与にふさわしいように適応されうる。そのような製剤は、活性成分を担体又は賦形剤と合わせることによって製造できる。
【００１９】
経口投与用に適応された医薬製剤は、個々に区別された単位、例えばカプセル又は錠剤；散剤又は顆粒；溶液又は懸濁液（それぞれ水性又は非水性液体と共に）；食用泡沫又はホイップ；又は水中油型液体エマルションもしくは油中水型液体エマルションとして提供できる。錠剤又はカプセルの形態の経口投与の場合、活性薬物成分は、経口用の非毒性の薬学的に許容可能な不活性担体、例えばエタノール、グリセロール、水などと組み合わせることができる。散剤は、化合物を適切な微細サイズに粉砕し、食用の炭水化物、例えばデンプン又はマンニトールのような適切な薬学的担体と混合することによって製造できる。フレーバー、保存剤、分散剤及び着色剤などを含めてもよい。
【００２０】
カプセルは、粉末、液体、又は懸濁液混合物を用意し、ゼラチン又は他の適切なシェル材料内に封入することによって製造できる。コロイドシリカ、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、又は固体ポリエチレングリコールのような滑沢剤を混合物に添加してもよい。炭酸カルシウム又は炭酸ナトリウムのような崩壊剤又は可溶化剤も、カプセルを摂取したときの医薬のアベイラビリティを改良するために添加することができる。バインダ、滑沢剤、崩壊剤、及び着色剤のような他の薬剤も混合物に配合できる。適切なバインダの例は、デンプン、ゼラチン、天然糖、コーンシロップ(corn sweetener)、天然及び合成ゴム、トラガカント、又はアルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコールなどである。このような剤形のための適切な滑沢剤は、例えばオレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウムなどである。適切な崩壊剤は、制限なしに挙げると、デンプン、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンガムなどである。
【００２１】
錠剤は、粉末混合物を用意し、該混合物を粒状化し、滑沢剤及び崩壊剤を加え、そして打圧して錠剤にすることにより製剤化できる。粉末混合物は、適切には粉砕された化合物を上記の希釈剤又は基剤と混合することによって製造できる。任意の成分としては、カルボキシメチルセルロース、アルギネート、ゼラチン、又はポリビニルピロリドンのようなバインダ、パラフィンのような溶解遅延剤、第四級塩のような吸収促進剤、及び／又はベントナイト、カオリンなどの吸収剤などが挙げられる。粉末混合物は、シロップ、デンプン糊、又はセルロース性もしくはポリマー性材料の溶液のようなバインダと共に湿式粒状化し、圧をかけてスクリーンに通せばよい。
【００２２】
本発明の化合物は、自由流動不活性担体と組み合わせて、粒状化などの他の工程を経ずに直接錠剤に圧縮してもよい。シェラック、糖又はポリマー材料のような適切な材料の封止コートからなる透明又は不透明の保護コーティング及びワックスなどの艶出しコーティングを施すこともできる。適切な場合、異なる単位用量を区別するために、これらのコーティングに着色剤を加える。
【００２３】
溶液、シロップ、及びエリキシルのような経口用流体は、所与の量（の経口用流体）が予定量の化合物を含有するように用量単位形態に製造することができる。シロップは、例えば、化合物を適切に風味付けされた水溶液中に溶解することによって製造できるが、エリキシルは非毒性のアルコール性ビヒクルを使用して製造される。懸濁液は、化合物を非毒性ビヒクル中に分散させることによって製剤化できる。エトキシ化イソステアリルアルコール及びポリオキシエチレンソルビトールエーテルのような可溶化剤及び乳化剤、保存剤；ペパーミント油のようなフレーバー添加剤、又は天然甘味料、サッカリン、もしくはその他の人工甘味料などを添加することもできる。
【００２４】
適切な場合、経口投与用の用量単位製剤はマイクロカプセル化することができる。製剤は、例えばコーティングによって又は粒状材料を適切なポリマー、ワックスなどの中に包埋することによって、放出を延長又は持続するように製造することもできる。
【００２５】
本明細書中に記載の化合物及びその塩、溶媒和物、及び生理学的に機能する誘導体は、小単層ベシクル、大単層ベシクル、及び多重層ベシクルのようなリポソーム送達システムの形態で投与することもできる。リポソームは、様々なリン脂質、例えばコレステロール、ステアリルアミン、又はホスファチジルコリンから形成できる。
【００２６】
本発明の化合物及びその塩、溶媒和物、及び生理学的に機能する誘導体は、化合物分子が結合される個別担体としてモノクローナル抗体を使用することによって送達することもできる。
【００２７】
化合物は、標的可能な薬物担体としての可溶性ポリマーと結合させることもできる。そのようなポリマーは、例えばポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などでありうる。化合物は、薬物の制御放出を達成するために生分解性ポリマーと結合させることもできる。そのようなポリマーは、ポリ乳酸、ポリシアノアクリレート、及びヒドロゲルのブロックコポリマーなどである。
【００２８】
経皮投与用に適応された医薬製剤は、患者の皮膚／上皮と長期間密着するように意図された個々に区別されたパッチとして提供できる。例えば、活性成分はパッチからイオン導入によって送達されうる。
【００２９】
局所投与用に適応された医薬製剤は、軟膏、クリーム、懸濁液、ローション、粉末、溶液、ペースト、ゲル、スプレー、エアゾール、又はオイルとして製剤化できる。外部組織の治療の場合、製剤は局所軟膏又はクリームとして適用（塗布）できる。
【００３０】
口内の局所投与の場合、製剤は、ロゼンジ、トローチ(pastille)、及び洗口液などでありうる。
鼻腔内投与の場合、例えば２０〜５００ミクロンの範囲の粒径を有する粉末が使用できる。粉末は、鼻の近くに保持された粉末の容器から急速吸入によって鼻道を通じて投与できる。鼻腔用スプレー又は点鼻薬として投与するための、担体が液体である適切な製剤は、活性成分の水性又は油性溶液などである。
【００３１】
吸入投与用に適応された医薬製剤は微粒子ダスト又はミストなどであるが、これらは定量（計量式）加圧エアゾール、ネブライザー、又は吸入器などによって発生させることができる。
【００３２】
直腸投与の場合、製剤は、坐剤又は浣腸剤として提供できる。
経膣投与の場合、製剤は、ペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、スプレーなどの形態であり得る。
【００３３】
非経口投与の場合、製剤は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、及び対象レシピエントの血液と製剤を等張にする溶質などの様々な添加剤を含有しうる水性及び非水性の無菌注射用溶液；そして、懸濁化剤及び増粘剤を含みうる水性及び非水性の無菌懸濁液でありうる。製剤は、単位用量用又は複数用量用の容器、例えば密封アンプル及びバイアル中に提供でき、使用直前に例えば注射用水などの無菌液体担体の添加のみを必要とする凍結乾燥状態で貯蔵できる。即席の注射溶液及び懸濁液は、無菌粉末、顆粒などから調製できる。
【００３４】
本発明の化合物及びそれらの塩、溶媒和物、及びその生理学的に機能する誘導体は、単独で使用しても又は他の治療薬と併用してもよい。本発明の化合物及びその他の薬学的活性剤は一緒に又は別個に投与できる。別個に投与される場合、投与は同時でも又は任意の順序で逐次でもよい。本発明の化合物及び他の薬学的活性剤の量、及び投与の相対的タイミングは、所望の併用治療効果を達成するために選ばれる。本発明の化合物、その塩、溶媒和物、又は生理学的に機能する誘導体と他の治療薬とを併用する投与は、両化合物を含む単一の医薬組成物か又は化合物の一つをそれぞれ含む別個の医薬組成物の同時投与による組合せでよい。場合によっては、薬物の併用は、一つの薬剤を最初に投与し、第二の薬剤を次に投与するか、又はその逆というような逐次方式で別々に投与されてもよい。そのような投与は、同じような時間枠で行われても又は長時間かけて行われてもよい。
【００３５】
本発明は、単なる例として提供される以下の説明によって、より明確に理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】図１は、エナンチオマー化合物４の（Ｒ）−（＋）−メチルベンジルアミン塩（化合物９）の絶対立体化学を示すＸ線結晶構造である。
【図２】図２は、エナンチオマー化合物２の（Ｓ）−（−）−メチルベンジルアミン塩（化合物８）の絶対立体化学を示すＸ線結晶構造である。
【図２Ａ】図２Ａは、化合物８の結晶構造を基にした分子図であり、使用された番号付与スキームが示されている。非水素原子に関する異方性原子変位楕円体は５０％の確率レベルで示されている。水素原子は、任意に小さな半径で示されている。主な不規則成分のみが示されている。
【図３】図３は、３０ｍｇ／ｋｇの化合物２、３、４及び５の、５％ＤＳＳ大腸炎における７日間の疾患活動性指数（ＤＡＩ）に対する効果を示すグラフである。
【図４】図４は、３０ｍｇ／ｋｇの化合物２、３、４及び５の、５％ＤＳＳ大腸炎における第７日目の疾患活動性指数（ＤＡＩ）に対する効果を示す棒グラフである。
【図５】図５は、１０ｍｇ／ｋｇの化合物５、７、２及び６の、５％ＤＳＳ大腸炎における７日間の疾患活動性指数（ＤＡＩ）に対する効果を示すグラフである。
【図６】図６は、１０ｍｇ／ｋｇの化合物５、７、２及び６の、５％ＤＳＳ大腸炎における第７日目の疾患活動性指数（ＤＡＩ）に対する効果を示す棒グラフである。星印はビヒクル対照群からの有意（Ｐ＜０．０５）差（一元配置分散分析(1 way ANOVA)）を示す。
【図７】図７は、化合物６の、５％ＤＳＳ処置マウスにおける体重減少に対する効果を示すグラフである。データは１群あたり６〜７匹のマウスによる平均±ＳＥＭである。
【図８】図８は、化合物６の、５％ＤＳＳ処置マウスにおけるＤＡＩに対する効果を示すグラフである。データは１群あたり６〜７匹のマウスによる平均±ＳＥＭである。
【図９】図９は、化合物６の、５％ＤＳＳ処置マウスにおける第７日目のＤＡＩに対する効果を示す棒グラフである。データは平均±ＳＥＭである。星印はビヒクル対照群からの有意（Ｐ＜０．０５）差（一元配置ＡＮＯＶＡ）を示す。
【図１０】図１０は、化合物６の、５％ＤＳＳ処置マウスの結腸長に対する第７日目の効果を示す棒グラフである。星印はビヒクル対照群からの有意（Ｐ＜０．０５）差（一元配置ＡＮＯＶＡ）を示す。
【図１１】図１１は、マウス遠位結腸の代表的ヘマトキシリン及びエオシン染色切片を示す。高倍率（×１０）の方を示す。
【図１２】図１２は、化合物６の、ＤＳＳ処置マウスの結腸の組織学的スコアに対する効果を示す棒グラフである。データは５〜６匹のマウスの平均±ＳＥＭである。星印はビヒクル対照群からの有意（Ｐ＜０．０５）差（一元配置ＡＮＯＶＡ）を示す。注、最大スコアは１０。
【図１３】図１３は、５％ＤＳＳに暴露された未処置又はビヒクル、プレドニゾロン及び化合物６処置マウスの結腸におけるミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性を示す棒グラフである。データは５〜６匹のマウスの平均±ＳＥＭである。星印はビヒクル対照群からの有意（Ｐ＜０．０５）差（一元配置ＡＮＯＶＡ）を示す。
【図１４Ａ】図１４Ａは、化合物６の、ＤＳＳ処置マウスにおけるサイトカイン（ＩＬ１β）のレベルに対する効果を示す棒グラフである。データは５〜６匹のマウスの平均±ＳＥＭである。星印はビヒクル対照群からの有意（Ｐ＜０．０５）差（一元配置ＡＮＯＶＡ）を示す。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、化合物６の、ＤＳＳ処置マウスにおけるサイトカイン（ＴＮＦα）のレベルに対する効果を示す棒グラフである。データは５〜６匹のマウスの平均±ＳＥＭである。星印はビヒクル対照群からの有意（Ｐ＜０．０５）差（一元配置ＡＮＯＶＡ）を示す。
【図１４Ｃ】図１４Ｃは、化合物６の、ＤＳＳ処置マウスにおけるサイトカイン（ＩＬ６）のレベルに対する効果を示す棒グラフである。データは５〜６匹のマウスの平均±ＳＥＭである。星印はビヒクル対照群からの有意（Ｐ＜０．０５）差（一元配置ＡＮＯＶＡ）を示す。
【図１５】図１５は、ビヒクル又は化合物６で処置されたＩＬ１０−−／−−マウスにおける体重減少を示すグラフである。マウスは、化合物６（３００ｍｇ／ｋｇ／週）又はビヒクルを月／水／金（ＭＷＦ）投与スケジュールで経口投与された。マウスは実験開始時〜４週齢で、９週間処置された。マウスは毎週体重測定され、データは１群あたり９〜１２匹のマウスによる平均±ＳＥＭである。マウスは、顕性疾患、直腸脱についてモニターされ、瀕死の動物は安楽死させた。
【図１６】図１６は、第９週目、生存動物（化合物６又はビヒクル処置群のそれぞれ１１及び９匹のマウス）からの各マウスの血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）レベル及び平均（バー）を表す散布図である。群間の統計学的差異についてはスチューデントｔ検定を用いて検定した。
【図１７】図１７は、ビヒクル又は化合物６で９週間処置されたＩＬ１０−−／−−マウスの遠位結腸の代表的ヘマトキシリン及びエオシン染色切片を示す。そして
【図１８】図１８は、ビヒクル又は化合物６で処置されたＩＬ１０−−／−−マウスの遠位結腸の組織学的スコアを示す散布図である。散布図は、第９週目、生存動物（化合物６又はビヒクル処置群のそれぞれ１１及び９匹のマウス）からの各マウスの組織学的スコア及び平均（バー）を表している。群間の統計学的差異についてはスチューデントｔ検定を用いて検定した。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
化合物１は、ケトン化合物Ａの還元及び脱メチル化から得られた１対のジアステレオ異性体を表す。化合物Ａは、Ｃ−２にキラル中心を有しているので、１対のエナンチオマーとなる。
【００３８】
【化４】
0005898768.tif 000005
【００３９】
この化合物をＬｉＡｌＨ４で還元すると、式：
【００４０】
【化５】
0005898768.tif 000006
【００４１】
の化合物が得られる。
この化合物は二つのジアステレオ異性体：
【００４２】
【化６】
0005898768.tif 000007
【００４３】
を含む。
ジアステレオ異性体Ｂの加水分解により、化合物２及び３：
【００４４】
【化７】
0005898768.tif 000008
【００４５】
が得られる。
ジアステレオ異性体Ｃの加水分解により、化合物４及び５：
【００４６】
【化８】
0005898768.tif 000009
【００４７】
が得られる。
ジアステレオ異性体は、化学的に又はクロマトグラフィー的にそれらの構成エナンチオマーに分割することができる。
【００４８】
化合物４の絶対立体化学は、化合物４の（Ｒ）−（＋）−メチルベンジルアミン塩（化合物９）の単結晶Ｘ線によって確立されている（図１）。
化合物２の絶対立体化学は、化合物２の（Ｓ）−（−）−メチルベンジルアミン塩（化合物８）の単結晶Ｘ線によって確認されている（図２及び２Ａ）。
【００４９】
一般的反応手順
以下に例示されているようなエナンチオマー混合物のカップリングのための一般的合成手順はＷＯ９７２０８０６Ａに記載されており、その全内容は引用によって本明細書に援用する。
【００５０】
酸誘導体化合物Ａの一般的製造
【００５１】
【化９】
0005898768.tif 000010
【００５２】
結合生成物（４ｍｍｏｌ、１．００ｇ）のｔｅｒｔ−ブタノール（５ｍＬ）及びジエチルエーテル（３０ｍＬ）中撹拌溶液に、窒素下でメチル（４−ブロモメチル）ベンゾエート（６ｍｍｏｌ、１．４１ｇ）を加えた。これに、カリウムｔｅｒｔ−ブトキシドのｔｅｒｔ−ブタノール（３０ｍＬ）及びジエチルエーテル（５ｍＬ）中溶液を徐々に滴加した。１滴ごとに混合物は黄変し、その後元の灰色に戻った。混合物をＴＬＣ（８０：２０、ヘキサン：酢酸エチル）で出発材料がもはや示されなくなるまでさらに３時間撹拌した。飽和ＮＨ４Ｃｌを添加して反応をクエンチングした。層を分離し、水性層をジエチルエーテル（２×１２０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を水、ブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、蒸発させた。ほとんどの溶媒の除去により、粗製物から固体生成物が沈殿した。これをろ過し、冷ジエチルエーテルで洗浄して０．９８ｇ（６２％）のクリーム色固体を得た。
【００５３】
メチルベンゾエート化合物の還元
【００５４】
【化１０】
0005898768.tif 000011
【００５５】
メチルベンゾエート化合物（１．２７ｍｍｏｌ、０．５０ｇ）のＴＨＦ（１５ｍＬ）中撹拌溶液に、リチウムトリ−ｔｅｒｔブトキシアルミノ水素化物（１．９ｍｍｏｌ、０．４８ｇ）を徐々に少しずつ加えた。反応をＴＬＣ（８０：２０、ヘキサン：酢酸エチル）でモニターした。３時間後、出発材料がすべて消費された。
【００５６】
氷上に注ぐことによって反応をクエンチングし、水性混合物を１０〜１５分間酢酸エチルと撹拌することによって粗生成物を酢酸エチル中に抽出した後、分液漏斗に注入し、分離させた。合わせた有機層を水、ブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、蒸発させて、０．３４ｇ（６８％）のクリーム色〜淡褐色固体を得た。生成物は約２：１の比率の二つのジアステレオ異性体の混合物として単離された。
【００５７】
二つのジアステレオ異性体混合物の分析結果
純度（ＨＰＬＣ）：９４．９％（２：１の比率のジアステレオ異性体として）
【００５８】
【数１】
0005898768.tif 000012
【００５９】
可能な場合、少ない方のジアステレオ異性体の値も括弧内に示した。
δＣ(75.5 MHz, CDCl３):  38.3(CH２), 38.4(CH２), 38.6(CH２), 39.9(CH２), 40.3(CH２), 43.4 (CH２), 51.9 (COOCH３), 52.0 (COOCH３), 55.9 (quat. C), 56.3 (quat. C), 82.0 (CH-OH), 82.8 (CH-OH), 120.5 (tert. C), 120.7 (tert. C), 123.5 (tert. C), 123.6 (tert. C), 124.0 (tert. C), 124.2 (tert. C), 124.5 (tert. C), 124.6 (tert. C), 124.8 (tert. C), 124.9 (tert. C), 125.1 (tert. C), 125.2 (tert. C), 126.1 (tert. C), 126.4 (tert. C), 127.0 (quat. C), 127.1 (quat. C), 128.0 (tert. C), 128.2 (tert. C), 128.5 (tert. C), 128.8 (tert. C), 129.0 (tert. C), 129.2 (tert. C), 129.5 (tert. C), 2 x 130.0 (2 x tert. C), 2 x 130.2 (2 x tert. C), 130.7 (tert. C), 140.4 (quat. C), 141.5 (quat. C), 142.8 (quat. C), 143.2 (quat. C), 143.5 (quat. C), 143.6 (quat. C), 143.7 (quat. C), 144.2 (quat. C), 144.3 (quat. C), 144.5 (quat. C), 150.4 (quat. C), 152.6 (quat. C), 167.0 (C=O), 167.2(C=O)。
【００６０】
メチルベンゾエート部分の加水分解
【００６１】
【化１１】
0005898768.tif 000013
【００６２】
エステルを丸底フラスコに入れ、それに１０％ＮａＯＨ水溶液（１ｍＬ）を加え、次いで溶液（６ｍＬ）を形成するのに十分なメタノールを加えた。溶液を４０℃で加熱し、ＴＬＣ（８０：２０、ヘキサン：酢酸エチル）でモニターした。約４時間後、エステルはこれ以上見られなかった。
【００６３】
混合物を冷却し、飽和ＮＨ４Ｃｌを加えた（ｐＨ１２の溶液）。希ＨＣｌを加えて酸性ｐＨ（ｐＨ２）にした。生成物を混濁溶液から酢酸エチル中に抽出した（３×１０ｍＬ）。合わせた抽出物をＭｇＳＯ４上で乾燥させ、真空下で蒸発させて０．１５ｇ（定量）のクリーム色固体を得た。生成物は約２：１の比率の二つのジアステレオ異性体の混合物として単離された。
【００６４】
二つのジアステレオ異性体混合物の分析結果
純度（ＨＰＬＣ）：９５．２％（２：１の比率のジアステレオ異性体として）
【００６５】
【数２】
0005898768.tif 000014
【００６６】
可能な場合、少ない方のジアステレオ異性体の値も括弧内に示した。
δＣ(100 MHz, CDCl3):  37.9 (CH２), 38.1 (CH２), 38.2 (CH２), 39.5 (CH２), 39.9 (CH２), 43.1 (CH２), 55.5 (quat. C), 55.9 (quat. C), 81.6 (CH-OH), 82.4 (CH-OH), 120.2 (tert. C), 120.3 (tert. C), 123.1 (tert. C), 123.2 (tert. C), 123.5 (tert. C), 123.9 (tert. C), 124.1 (tert. C), 124.4 (tert. C), 124.5 (tert. C), 124.7 (tert. C), 125.9 (tert. C), 126.0 (tert. C), 126.5 (tert. C), 2 x 126.7 (quat. C & tert. C), 126.9 (quat. C), 128.1 (tert. C), 128.2 (tert. C), 128.4 (tert. C), 2 x 129.2 (2 x tert. C), 2 x 129.4 (2 x tert. C), 2 x 129.8 (2 x tert. C), 2 x 129.9 (2 x tert. C), 130.4 (tert. C), 140.0 (quat. C), 141.0 (quat. C), 142.3 (quat. C), 142.7 (quat. C), 143.0 (quat. C), 143.2 (quat. C), 143.8 (quat. C), 144.0 (quat. C), 144.1 (quat. C), 144.7 (quat. C), 150.0 (quat. C), 152.0 (quat. C), 170.8 (C=O), 171.1 (C=O)。
【００６７】
エナンチオマーの化学的分離
メチルベンゾエートジアステレオ異性体のＮ−ＢＯＣ  Ｄ−フェニルアラニン誘導体の製造及び／又はその後のジアステレオ異性体α１及びα２（又はβ１及びβ２）の分離
【００６８】
【化１２】
0005898768.tif 000015
【００６９】
注：手順は両ジアステレオ異性体に適用可能であるが、第一のジアステレオ異性体についての例を示す。
ジアステレオ異性体Ａ（２．５ｍｍｏｌ、１．０ｇ）及びＮ−ＢＯＣ  Ｄ−フェニルアラニン（３．１ｍｍｏｌ、０．８ｇ）を凝縮器を備えた丸底フラスコに入れ、窒素下でＣＨ３ＣＮ（２５ｍＬ）中に懸濁させた。この懸濁液にピリジン（３．１ｍｍｏｌ、０．３ｍＬ）を加え、次いでＤＣＣ（３．１ｍｍｏｌ、０．７ｇ）及びＤＭＡＰ（１０％モル、０．２５ｍｍｏｌ、０．０５ｇ）のＣＨ３ＣＮ（２ｍＬ）中溶液を加えた。混合物を５０℃で２０時間撹拌した後、放置して室温に戻した。
【００７０】
白色固体をろ過し、溶媒を真空下で除去した。酢酸エチルを加え、得られた溶液を１０％Ｈ２ＳＯ４、飽和ＮａＨＣＯ３で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、蒸発させて２．１ｇの黄色油を得た（ＨＰＬＣによる純度８３％、収率：定量的）。
【００７１】
ジアステレオ異性体α１及びα２を、フラッシュクロマトグラフィー（９０ｇのシリカ／ｇ生成物）により、ヘキサン／ＭＴＢＥ  ９０：１０を用いて分離した。４．１７ｇの混合物から１．３ｇのα２誘導体を得た（ほかにα１誘導体１．７１ｇ及び両方の混合物として０．３ｇ）。
【００７２】
メチルベンゾエート化合物のＮ−ＢＯＣ  Ｄ−フェニルアラニン誘導体（α１、α２、β１又はβ２）の加水分解
【００７３】
【化１３】
0005898768.tif 000016
【００７４】
ジアステレオ異性体α２（２．３ｍｍｏｌ、１．４５ｇ）をメタノール（２５ｍＬ）中に溶解し、ＮａＯＨ（１１．５ｍｍｏｌ、０．４５ｇ）を加え、混合物を還流温度で撹拌し、ＴＬＣでモニターした。２０時間後、出発物質は消費された。
【００７５】
反応を室温に冷却し、飽和ＮＨ４Ｃｌの添加によってクエンチングした。メタノールを真空下で除去し、水溶液を濃ＨＣｌでｐＨ１に酸性化した。生成物を酢酸エチルで抽出し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、蒸発させて１．６ｇの黄色ゴムを得た。これをショートシリカカラムによりヘキサン：ＭＴＢＥ  ８０：２０を溶離液として用いて精製した。０．４４ｇの酸誘導体化合物５（収率５０％）を得た。これはＨＰＬＣによれば純度９７．２％であった。
【００７６】
注：メタノール中１０％ＮａＯＨ水溶液を用い、４０〜５０℃で代替の加水分解も実施した。この手順は完了までほぼ５日間を要した。
エナンチオマーα１、α２、β１、β２の分析結果
ジアステレオ異性体Ｂ由来のエナンチオマーβ１−化合物３
【００７７】
【化１４】
0005898768.tif 000017
【００７８】
性状：  クリーム色非晶質固体
融点：  １９５〜１９６℃
［α］Ｄ：  ＋９８．５１（１．０７％、ＭｅＯＨ）
純度：  ９９．０％
δＨ(400 MHz, CDCl３):2.87 (1H, d, J=13.28 Hz, CH２), 3.00-3.09 (2H, m, CH２), 3.29 (1H, d, J=13.36 Hz, CH２), 3.43-3.61 (2H, m, CH２), 5.27 (1H, s, CH-OH), 6.49 (1H, s, CH=C), 7.00 (2H, d, J=7.88 Hz, Ar-H), 7.16-7.32 (6H, m, Ar-H), 7.44 (2H, d, J=7.24 Hz, Ar-H), 7.90 (2H, d, J=7.92 Hz, Ar-H)。
【００７９】
ジアステレオ異性体Ｂ由来のエナンチオマーβ２−化合物２
【００８０】
【化１５】
0005898768.tif 000018
【００８１】
性状：  クリーム色非晶質固体
融点：  １８４〜１８５℃
［α］Ｄ：  −１１４．４４（０．１８％、ＭｅＯＨ）
純度：  ９９．８％
δＨ(400 MHz, CDCl３): 2.87 (1H, d, J=13.32 Hz, CH２), 3.00-3.09 (2H, m, CH２), 3.29 (1H, d, J=13.28 Hz, CH２), 3.46 (1H, d, J=22.64 Hz, CH２), 3.58 (1H, d, J=22.56 Hz, CH２), 5.27 (1H, s, CH-OH), 6.49 (1H, s, CH=C), 7.00 (2H, d, J=8.04 Hz, Ar-H), 7.15-7.34 (6H, m, Ar-H), 7.44 (2H, d, J=7.20 Hz, Ar-H), 7.90 (2H, d, J=8.04 Hz, Ar-H)。
【００８２】
ジアステレオ異性体Ｃ由来のエナンチオマーα１−化合物４
【００８３】
【化１６】
0005898768.tif 000019
【００８４】
性状：  クリーム色固体
融点：  １３６〜１４０℃
［α］Ｄ：  −３９．３（０．６６％、ＭｅＯＨ）
純度：  ９４．０％
δＨ(400 MHz, CDCl３):  2.90-3.59 (6H, m, 3 x CH２), 5.08 (1H, s, CH-OH), 6.70 (1H, s, CH=C), 7.05 (2H, d, J=8.08 Hz, Ar-H), 7.19 (1H, t, J=7.34 Hz, Ar-H), 7.26-7.47 (7H, 2 x m, Ar-H), 7.93 (2H, d, J=8.08 Hz, Ar-H)。
【００８５】
ジアステレオ異性体Ｃ由来のエナンチオマーα２−化合物５
【００８６】
【化１７】
0005898768.tif 000020
【００８７】
性状：  クリーム色非晶質固体
融点：  １９５〜１９６℃
［α］Ｄ：  ＋３２．１（１．１８％、ＭｅＯＨ）
純度：  ９７．２％
δＨ(400 MHz, CDCl３):  2.94-3.59 (6H, m, 3 x CH２), 5.08 (1H, s, CH-OH), 6.70 (1H, s, CH=C), 7.05 (2H, d, J=8.12 Hz, Ar-H), 7.19 (1H, t, J=7.34 Hz, Ar-H), 7.26-7.47 (7H, 2 x m, Ar-H), 7.93 (2H, d, J=8.12 Hz, Ar-H)。
【００８８】
ＨＰＬＣ法
エナンチオマー化合物２、３、４、５の定性的及び定量的分離のために、アキラル及びキラルＨＰＬＣ法が確立された。
【００８９】
エナンチオマーのＨＰＬＣ分割
【００９０】
【表１】
0005898768.tif 000021
【００９１】
塩の形成
塩は、化合物２、３、４及び５の遊離酸を適切な塩基の存在下で水性溶媒又は水性有機溶媒中に溶解し、溶媒を蒸発させて塩を単離することによって製造された。
【００９２】
化合物６：化合物２のＮ−メチル−（Ｄ）−グルカミン塩（ＮＭＤＧ）。
【００９３】
【化１８】
0005898768.tif 000022
【００９４】
化合物６の物理化学的性質：
外観：  オフホワイト色固体
分子量：  ５７７（遊離酸：３８２）
分子式：  Ｃ３３Ｈ３９Ｏ８Ｎ（遊離酸：Ｃ２６Ｈ２２Ｏ３）
融点：  １６５〜１６７℃
化合物６：  ［α］Ｄ：−７６．５（サンプル濃度：２００ｍｇ／１０ｍｌ水中）
質量（Ｄａ）：  ＥＳ＋  ［ＮＭＤＧ＋Ｎａ］だけ見えた
元素分析：  計算値：Ｃ（６８．６１）、Ｈ（６．８０）、Ｎ（２．４２）、Ｏ（２２．１６）。実測値：Ｃ（６８．４４）、Ｈ（６．８０）、Ｎ  ２．５０）、Ｏ（２１．９８）。
【００９５】
δＨ(400 MHz, DMSO):      2.48 (3H, apparent s, NCH３), 2.65 (1H, d, J=13.56 Hz, HCH), 2.84-3.02 (4H, m), 3.16 (1H, d, J=13.60 Hz, HCH), 3.40-3.70 (7H, m), 3.85-3.92 (1H, m), 5.06 (1H, s, CH-OH), 5.93 (1H, broad s, CH-OH), 6.41 (1H, s, CH=C), 6.80 (2H, d, J=7.92 Hz, Ar-H), 7.06-7.41 (8H, m, Ar-H), 7.64 (2H, d, J=7.80 Hz, Ar-H)。
【００９６】
δＣ(100 MHz, DMSO):    33.8 (CH３), 37.9 (CH２), 38.2 (CH２), 39.5 (CH２), 51.6 (CH２-N), 55.8 (quat. C), 63.5 (CH２-O), 69.0 (CH-O), 70.3 (CH-O), 70.6 (CH-O), 71.3 (CH-O), 81.1 (CH-OH), 120.1 (tert. C), 123.4 (tert. C), 123.7 (tert. C), 124.3 (tert. C), 124.4 (tert. C), 126.1 (tert. C), 126.3 (tert. C), 127.0 (tert. C), 127.5 (tert. C), 2 x 128.5 (2 x tert. C), 2 x 129.1 (2 x tert. C), 140.4 (quat. C), 141.1 (quat. C), 142.9 (quat. C), 144.5 (quat. C), 145.2 (quat. C), 154.3 (quat. C), 170.4 (C=O)。
【００９７】
Ｘ線研究
化合物２の絶対立体化学は、その（Ｓ）−（−）−メチルベンジルアミン塩（化合物８）の単結晶Ｘ線解析によって確立された。結果を付録２に示す。結果は図２に示された立体化学と一致していた。化合物４及び５の絶対立体化学は、アルコール（化合物２〜５）からそれらのケテンへの変換によって及びそれらの旋光性の相関によって確立された。
【００９８】
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、二つの特発性炎症性疾患、すなわち潰瘍性大腸炎（ＵＣ）及びクローン病（ＣＤ）からなる。ＵＣとＣＤ間の最大の相違は、炎症を起こした腸組織の範囲である。ＣＤの炎症は、限局性腸炎として知られる不連続に分割された炎症であるが、ＵＣは、直腸から近位及び連続的に広がる表在性炎症である。現在のところ、ＩＢＤの原因は不明である。疾患は、炎症誘発性分子と免疫調節分子の不均衡のために、腸上皮の感染に対して過剰な粘膜免疫応答が生じることに関連していると見られる。ＩＢＤの遺伝パターンは病因の複雑な遺伝的要素を示唆しており、病因はいくつかの複合遺伝子突然変異からなるのかもしれない。現在、ＩＢＤの特異的診断は存在しないが、病因の理解が向上すれば試験法も改良される。ＩＢＤの治療は寛解の誘導と維持からなる。ＩＢＤ患者は、５−アミノサリチル酸の使用によって寛解を維持できる。しかしながら、ＵＣへのアミノサリチル酸の使用は、軽度〜中等度の疾患における寛解の誘導にも再発防止にも相当の利益を提供するが、ＣＤにおける寛解を維持するためのこれらの薬物の有用性は疑問で、もはや推奨されていない。活動性疾患の治療の中心はコルチコステロイドで、一般的にＵＣ及びＣＤ患者を寛解に戻すために期間を限定して使用される。しかし、全身吸収が限定的な局所投与用に設計されたブデソニドは、寛解の維持に利益がない。免疫抑制薬のアザチオプリン及びメルカプトプリンのような代替薬は、メトトレキサートやシクロスポリンと共に、限定的な効果しかなく、重大な有害作用を誘発する可能性もある。インフリキシマブ及びアダリムマブのような抗ＴＮＦα抗体は、標準的な免疫抑制療法に不応性の患者に使用できる。しかしながら、多くの患者は、彼らの特別な表現型のためか又は自己抗体の産生によって、抗ＴＮＦα療法に応答できない。
【００９９】
急性マウスＤＳＳ大腸炎モデル
デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）大腸炎モデルは、下痢、血性便、粘膜潰瘍、結腸の短縮、体重減及びある種の結腸サイトカインの変化など、ヒトＵＣで観察される症状の多くを示す実験マウスモデルである。その研究は、ＵＣの病因を研究するためのモデルとして、及びＵＣ治療の新規治療的介入をスクリーニングするためのモデルとしても広く使用されている。
【０１００】
これらの研究では、ＢＡＬＢ／ｃマウスの飲料水に投与された５％ＤＳＳを用いた急性大腸炎モデルを使用した。この投与計画は重症の急性大腸炎を誘導する。７〜８日目までにマウスは明らかな直腸出血と著明な体重減を示し、前もって屠殺されない限り、全マウスとも１０〜１２日目までに死亡する。
【０１０１】
マウス
６〜８週齢の特定病原体未感染ＢＡＬＢ／ｃマウスを商業的供給業者（Ｈａｒｌａｎ  ＵＫ）から入手した。マウスは、照射済みの食餌を給餌され、陽圧下、個別に換気されたケージ（Ｔｅｃｎｉｐｌａｓｔ  ＵＫ）に収容された。
【０１０２】
ＤＳＳ処置
ＤＳＳ（５％）を飲料水中に溶解した。化合物は、０〜７日目に１０ｍｇ／ｋｇ又は３０ｍｇ／ｋｇの用量で経口投与され、マウスは、疾患の重症度に応じて８日目又は９日目に選抜淘汰(cull)された。マウスの病状は毎日チェックされ、各マウスの体重も記録された。大腸炎の誘導は、剖検、結腸の長さ及び組織学で判定した。結腸を免疫学的分析のために回収し、−２０℃で貯蔵した。すべての化合物及び実験群とも無作為にアルファベット順に標識化された。実験期間中、すべてのデータ記録は盲検式に実施された。ボックス／群のコードはデータが分析された後まで破られることはなかった。すなわち、Ａ、Ｂ、Ｃなどで標識されたボックスは、未処置、ＤＳＳ処置、又はＤＳＳ＋化合物処置として識別された。
【０１０３】
大腸炎の程度を定量化するために、疾患活動性指数（ＤＡＩ(disease activity index)）を体重減、便潜血及び便の硬さに基づいて決定した。各パラメーターに対してスコアを与え、スコアの合計をＤＡＩとして使用した。各処置群ともｎ＝８であった。
【０１０４】
【表２】
0005898768.tif 000023
【０１０５】
定義：
１軟便−形作られていない便であるが、処理するとペーストになる。
２下痢−便の形成なく、肛門周囲の被毛が汚れている。
３肉眼的出血−肛門周囲の被毛に鮮血、便中に過剰血。
【０１０６】
化合物の投与
全化合物とも、０．５％カルボキシメチルセルロース／２％Ｔｗｅｅｎ８０中の懸濁液として、３〜３０ｍｇ／ｋｇの用量で経口胃管投与用に調製された（０．１ｍＬ／経口（ｐ．ｏ．）／１０ｇ体重）。遊離酸としての化合物をまず無水アルコール中に溶解し、０．５％カルボキシメチルセルロース／２％Ｔｗｅｅｎ８０で１４＋１で希釈した。これにより、懸濁した微細析出物が得られたが、Ｎ−メチル−（Ｄ）−グルカミン塩はビヒクル単独に可溶であった。
【０１０７】
個別エナンチオマー化合物２、３、４及び５の５％ＤＳＳマウス大腸炎における効果
飲料水中に５％ＤＳＳを与えられたＢＡＬＢ／ｃに、化合物２、３、４及び５を０．５％カルボキシメチルセルロース／２％Ｔｗｅｅｎ８０中懸濁液として毎日７日間、３０ｍｇ／ｋｇで経口投与した。ＤＡＩは、このモデルにおける疾患の程度を表す尺度である。化合物４はこの変数に対して活性がなく、どの時点でもＤＡＩにおいて何ら有意の差がなかった（Ｐ＞０．０５）（図３）。７日目に化合物２及び化合物５はどちらも、ＤＡＩをビヒクル対照の９．０±０．５３から、化合物５の３．２±０．７３及び化合物２の２．５±０．７１へと、かなりの差をつけて著しく低減した（Ｐ＜０．５）。この二つの間には有意差はなかった（図４）。これに比べて、化合物３はＤＡＩを５．３±０．６に低減しただけであった。これは、化合物２又は化合物５のいずれかより著しく低い効力であった（Ｐ＞０．０５）。さらに、化合物３処置マウスのＤＡＩは、７日目にはビヒクル対照より統計的に低いが（Ｐ＜０．０５）（図４）、６日目には化合物３とビヒクルの間に統計的な差はなかった（Ｐ＞０．０５）（図３）。結論として、４つのエナンチオマー、化合物２、３、４及び５のうち、化合物２及び５が３０ｍｇ／ｋｇでこのモデルにおいては高活性である。化合物３は、化合物２及び化合物５より著しく（Ｐ＜０．０５）低い最小の活性を有している。化合物４は、この５％ＤＳＳマウス大腸炎モデルにおいてほとんど活性がない。
【０１０８】
化合物２及び５の塩の選択
エナンチオマー化合物２及び５の水溶性が限られているため、我々は化合物５の５種類の塩の合成を試みた。ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、α−メチルベンジルアミン塩及びＮ−メチル−（Ｄ）−グルカミン塩を合成した。ナトリウム及びカルシウム塩はうまくいかなかった。化合物５の３種類の塩、すなわちカリウム塩、α−メチルベンジルアミン塩及びＮ−メチル−（Ｄ）−グルカミン塩を溶解度及び分配係数（ｌｏｇＰ）研究に使用した。
【０１０９】
４つの化合物の溶解度が決定された。
【０１１０】
【表３】
0005898768.tif 000024
【０１１１】
化合物５のＮ−メチル−（Ｄ）−グルカミン塩（化合物７）が、驚いたことに、この類似化合物群の中で、かなりの差をつけて最も可溶性の化合物であることが分かった。その溶解度は、Ｍｉｌｌｉ−ＲＯ水中で＞６０，０００μｇ／ｍＬ、ｐＨ４緩衝液中で０．１４μｇ／ｍＬ、ｐＨ７．０中で＞６０，０００μｇ／ｍＬ及びｐＨ９．０緩衝液中で＞３，０００μｇ／ｍＬであった。化合物２のＮ−メチル−（Ｄ）−グルカミン塩（化合物６）でもほぼ同一の値が得られ、その溶解度は、Ｍｉｌｌｉ−ＲＯ水中で＞６０，０００μｇ／ｍＬ、ｐＨ４緩衝液中で０．５μｇ／ｍＬ、ｐＨ７．０中で＞６０，０００μｇ／ｍＬ及びｐＨ９．０緩衝液中で＞３，０００μｇ／ｍＬであった。
【０１１２】
化合物５及び関連類似化合物の分配係数を、中性、酸性及びアルカリ性のｐＨでＨＰＬＣ法（逆相Ｃ１８  ＨＰＬＣカラム）を用いて調べた。
４つの化合物の分配係数が決定された。
【０１１３】
【表４】
0005898768.tif 000025
【０１１４】
化合物５の各塩の分配係数はどれも同様であることが分かった。このようなことが起こるのは、塩が溶解している場合、化合物は親化合物５と随伴塩イオンとに解離しているためであるということが示唆される。この結果、測定された分配係数は、塩分子というより親イオンに由来するものであった。
【０１１５】
化合物２のＮ−メチル−Ｄ−グルカミン塩（化合物６）の分配係数（Ｌｏｇ１０  ＰＯＷ）も、中性、塩基性及び酸性条件下で決定に成功し、それぞれ３．５、４．３及び２．６であった。
【０１１６】
Ｎ−メチル−（Ｄ）−グルカミンが、化合物２及び化合物５両方の塩候補として選ばれた。
１０ｍｇ／ｋｇのエナンチオマー化合物２及び化合物５及びそれらのＮ−メチル−（Ｄ）−グルカミン塩（化合物６及び７）の５％ＤＳＳマウス大腸炎における効果
化合物２及び５とも３０ｍｇ／ｋｇで５％ＤＳＳモデルにおいてかなりの活性を示したことから、我々はそれらの活性を、それらのＮ−メチル−（Ｄ）−グルカミン塩と共に、より低用量の１０ｍｇ／ｋｇで再検査した。０．５％カルボキシメチルセルロース／２％Ｔｗｅｅｎ８０中の懸濁液又は溶液として７日間毎日投与した。塩の用量に、それらの増大した分子量を補正するための調整は行わなかった。１０ｍｇ／ｋｇの化合物５及び７はどちらも、ビヒクル対照と比べた場合、５％ＤＳＳマウス大腸炎モデルにおけるＤＡＩに有意の効果はなかった（Ｐ＞０．０５）（図５参照）。これに対し、７日目に１０ｍｇ／ｋｇの化合物２及び化合物６、すなわちＮ−メチル−（Ｄ）−グルカミン塩はどちらも、ＤＡＩを９．３±０．５１（ビヒクル）から、それぞれ２．１±０．７及び３．３±０．５２へと有意に（Ｐ＜０．０５）強力に低減した（図６）。
【０１１７】
結論として、化合物２（及びそのＮ−メチル−（Ｄ）−グルカミン塩、化合物６）は、４つのエナンチオマーのうち、かなりの差で最も強力であり、低用量の１０ｍｇ／ｋｇでも活性を保持した唯一のエナンチオマーである。
【０１１８】
５％ＤＳＳマウス大腸炎に対する化合物６の用量範囲の効果及びプレドニゾロンとの比較
化合物６を最も好適なエナンチオマーとして選択した。５％ＤＳＳマウス大腸炎モデルにおける化合物６の活性を様々な用量レベルで試験して、用量／反応関係があるかどうかを確認し、強力な経口ステロイド、プレドニゾロンと比較した。プレドニゾロンは、ＩＢＤの急性増悪を患う患者を寛解に戻すのに一般的に使用されている。
【０１１９】
マウスに化合物６を３、１０及び３０ｍｇ／ｋｇの用量レベル（化合物２の６．６〜２０ｍｇ／ｋｇに相当）で投与した。ＤＳＳ処置マウスの１群は、５ｍｇ／ｋｇのプレドニゾロンでも処置された。プレドニゾロンはヒトＩＢＤの治療に臨床使用されるコルチコステロイドで、この研究で使用される量は、このモデルに対するプレドニゾロンの最適用量である。飲料水中５％ＤＳＳでＢＡＬＢ／ｃマウスを３日間処置した後、大腸炎の徴候が明らかになった。これは、体重減（図７）及び疾患ＤＡＩの増加（図８）として現れた。しかしながら、３用量（３、１０及び３０ｍｇ／ｋｇ）の化合物６は、毎日７日間の経口投与後、マウスに明らかな反応を起こさなかった。化合物６は、急性ＤＳＳ処置後の大腸炎の重症度を、試験した多数の疾患パラメーターにおいて改善した。ＤＳＳモデルの疾患を改善する化合物６の能力は用量依存性であった。３０ｍｇ／ｋｇの化合物６は、ＤＳＳモデルにおいて、５ｍｇ／ｋｇのプレドニゾロンと比べて同等の又はより良好な治療効果があった。
【０１２０】
これらの症状の重症度は進行性である。７日目までにＤＳＳ処置マウスは体重が最大１５％減少し、全マウスとも直腸出血を撒き散らしていた。剖検日のＤＡＩ値は、３〜３０ｍｇ／ｋｇの化合物６で処置されたマウスは、各用量レベルで、ビヒクル対照よりも有意に（Ｐ＜０．０５〜Ｐ＜０．０１）低いＤＡＩであったことを示していた。プレドニゾロン（５ｍｇ／ｋｇ）もＤＡＩスコアを有意に（Ｐ＜０．０１；分散分析(ANOVA)；ダネット多重比較検定(Dunnett Multiple Comparison Test)）低減した（図９）。
【０１２１】
第７日の剖検時、ＤＳＳで処置されなかったマウスの結腸と比べて、すべてのＤＳＳ処置群で結腸長の有意の短縮（Ｐ＜０．０５〜Ｐ＜０．０１；ＡＮＯＶＡ；ダネット多重比較検定）があった（図１０）。最小用量の３ｍｇ／ｋｇの化合物６は、ビヒクル対照と比べた場合に結腸短縮の阻害に有意の効果はなかったが、１０及び３０ｍｇ／ｋｇ群とプレドニゾロン群は確かに有意の効果があった。３０ｍｇ／ｋｇの化合物６はプレドニゾロンよりも有意に良好であった（Ｐ＜０．０５；ＡＮＯＶＡ；ダネット多重比較検定）（図１０）。
【０１２２】
ＤＳＳ処置後、遠位結腸の組織学的切片は、広範な陰窩損傷と細胞浸潤を示していた（図１１）。
結腸損傷の程度を任意スコアリングシステム(arbitrary scoring system)を用いて定量化した。１０及び３０ｍｇ／ｋｇの化合物６は、ビヒクル群と比べて、結腸病変の用量依存性で高度に統計的に有意な減退をもたらした（Ｐ＜０．０１；クラスカル−ウォリス(Kruskal-Wallis)ＡＮＯＶＡ；ダネット多重比較検定）。これに対し、プレドニゾロン（５ｍｇ／ｋｇ）処置群ではビヒクル処置マウスと比べて組織学的スコアに有意の改良は見られなかった（図１２）。
【０１２３】
マウスの結腸の炎症を示す組織学的結果と一致して、ビヒクルのみを投与されたＤＳＳ処置マウスに、結腸ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性の有意（Ｐ＜０．００１；クラスカル−ウォリスＡＮＯＶＡ；ダネット多重比較検定）の上昇が見られた。炎症性好中球の腸壁への浸潤のレベルを表す結腸ミエロペルオキシダーゼ活性（ＭＰＯ）は、ＤＳＳ処置によってほぼ８倍増加したが、３０ｍｇ／ｋｇの化合物６とプレドニゾロンによって７日目までにそれぞれ６３％及び５４％有意に（Ｐ＜０．０５）減少した（図１３）。
【０１２４】
結腸サイトカインのレベルの定量化から、ＤＳＳ処置は、ＩＬ１β（図１４（ａ））、ＴＮＦα（図１４（ｂ））及びＩＬ６（図１４（ｃ））の上昇を誘導することが示された（それぞれ０．７４４±０．０７６ｎｇ／ｍｇ、１．４７８±０．３７８ｎｇ／ｍｇ及び１．０５７±０．１７８４ｎｇ／ｍｇへ）。いずれの場合も、化合物６は、これらのサイトカインレベルの有意（Ｐ＜０．０５、３０ｍｇ／ｋｇ）かつ用量依存性の減少をもたらした。プレドニゾロン（５ｍｇ／ｋｇ）も、サイトカインレベルにおけるこれらの増加を減少させた（ｐ＜０．０５）。各サイトカインについて、プレドニゾロン５ｍｇ／ｋｇと化合物６の高用量レベル３０ｍｇ／ｋｇの効果の間に７日時点で有意の差はなかった。
【０１２５】
要約すると、３用量（３、１０及び３０ｍｇ／ｋｇ）の化合物６は、毎日７日間の経口投与後、マウスに明らかな反応を起こさなかった。化合物６は、急性５％ＤＳＳ処置後の大腸炎の重症度（検査した多数の疾患パラメーターによる）を改善し、疾患を改善する能力は用量依存性である。さらに、３０ｍｇ／ｋｇの化合物６は、ＤＳＳモデルにおいて、プレドニゾロン（５ｍｇ／ｋｇ）と比べて同等の又はより良好な治療効果があった。
【０１２６】
慢性ＩＬ１０−−／−−モデル
ＩＬ１０−−／−−遺伝子欠失マウスは慢性大腸炎を自然発症し、発症年齢及び疾患の重症度は背景のマウス株及び動物の飼育条件に依存する。本研究で使用された条件下で飼育されたＩＬ１０−−／−−マウスの大腸炎の発症も株依存性で、ＢＡＬＢ／ｃ株のマウスではＣ５７ＢＬ／６株の動物に比べてより早い発症及びより重症（死亡率に関して）であった。この実験で、動物は９週間にわたってＭＷＦ計画で経口処置を受けた。最初は両群のマウスとも次第に体重が増加する（図１５）。ビヒクル処置マウスは処置５週目から体重増加が停止したが、化合物６処置マウスは８週まで体重増加を維持した。９週までに動物は著明な体重減少があり、各群の１匹の瀕死動物を６０日目に安楽死させた。他のマウスも体重が減少し、疾患の臨床症状が発現したので、両群とも第９週（６３日）に処分し、分析した。カプラン−マイヤー(Kaplan-Meier)分析によれば、ビヒクル処置群（２５％）の死亡率の方が化合物６処置マウス（９．２％）に比べて高かったが、９週間にわたるＩＬ１０−／−マウスの生存に統計的な差はなかった。マウスから血清を回収し、血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）を大腸炎の重症度のマーカーとして分析した。化合物６処置マウスでは、ビヒクル処置ＩＬ１０−−／−−マウスと比べてＳＡＡレベルが有意に（Ｐ＜０．０５；スチューデントｔ検定）減少した（図１６）。
【０１２７】
ビヒクル又は化合物６で処置されたＩＬ１０−−／−−マウスの結腸の組織学的切片を図１７に示す。
ビヒクル又は化合物６で処置されたＩＬ１０−−／−−マウスの結腸の組織学的切片をスコア化した。結腸病変の程度は、ビヒクル処置マウスと比べて、化合物を投与されたＩＬ１０−−／−−マウスにおいて有意に減少した（Ｐ＜０．０５；スチューデントｔ検定）（図１８）。
【０１２８】
要約すると、ＩＬ１０−−／−−ＢＡＬＢ／ｃ株のマウスでのＭＷＦ計画を用いた９週間にわたる化合物６（３００ｍｇ／ｋｇ／週）による経口処置は、ビヒクル処置マウスと比べて、体重減少を遅らせ、大腸炎による死亡を低減した。この慢性大腸炎のモデルにおいて、化合物６は、結腸炎症の血清マーカー及び炎症の程度及び結腸に対する損傷に関する疾患指数を著しく低減した。このことは、化合物６の血漿中半減期（ｔ１／２）はラットで３時間であるという事実を考慮すると特に注目に値する。標準的なＭＷＦ投与スケジュールを用いると、マウスは、実験中かなりの期間、化合物６に暴露されずにすむであろう。
【０１２９】
本発明は上記の態様に限定されない。それらは詳細において変動しうる。
付録１
使用された略語のリスト
ａｑ  水性
ｂ．ｐ．  沸点
ＣＤＣｌ３  クロロホルム−ｄ
ＣＨ（ＯＣＨ３）３  トリメチルシリルオルトホルメート
ＣＯ２  二酸化炭素
ＤＣＭ  ジクロロメタン
ｄＩＷ  蒸留イオン水
ＤＭＳＯ  ジメチルスルホキシド
Ｅｔ２Ｏ  エーテル
ＥｔＯＨ  エタノール
Ｈ２Ｏ  水
ＨＣｌ  塩酸
ＩＲ  赤外線
ＩＰＡ  イソプロピルアルコール
ＫＣｌ  塩化カリウム
Ｍ  モル
ｍｉｎ  分
μｌ  マイクロリットル
ｍＭ  ミリモル
ｍ．ｐ．  融点
Ｎ２  窒素
ＮａＢＨ４  水素化ホウ素ナトリウム
ＮａＯＨ  水酸化ナトリウム
Ｎａ２ＳＯ４  硫酸ナトリウム
ＮＭＲ  核磁気共鳴
Ｏ２  酸素
ＲＴ  室温
ｔＢｕＯＨ  ｔｅｒｔブタノール
ｔＢｕＯＫ  カリウムｔｅｒｔブトキシド
Ｓ．Ｅ．Ｍ．  標準誤差
ＴＨＦ  テトラヒドロフラン
ＴＬＣ  薄層クロマトグラフィー
μｌ  マイクロリットル
トリフル酸(triflic acid)  トリフルオロメタンスルホン酸
ＴＭＳトリフレート  トリメチルシリルトリフルオロメタンスルホネート
ｖ／ｖ  体積／体積
ｗ／ｖ  重量／体積
lｅｍ  発光波長
lｅｘｃ  励起波長
付録２
Ｘ線研究
単結晶Ｘ線解析を、化合物２の（Ｓ）−（−）−メチルベンジルアミン塩（化合物８）に対して、ＳｕｐｅｒＮｏｖａ，Ｄｕａｌ，Ｃｕ  ａｔ  ｚｅｒｏ，Ａｔｌａｓ回折計及び表１に概要を示したパラメーターを用いて実施した。
【０１３０】
表１．化合物８すなわち化合物２の（Ｓ）−（−）−メチルベンジルアミン塩のデータ収集及び構造精密化
回折計  ＳｕｐｅｒＮｏｖａ，Ｄｕａｌ，Ｃｕ  ａｔ  ｚｅｒｏ，Ａｔｌａｓ
放射線源  ＳｕｐｅｒＮｏｖａ（Ｃｕ）Ｘ線源、ＣｕＫα
データ収集法  オメガスキャン
データ収集のためのシータ範囲  ３．７４〜７６．２２°
指数範囲  −１３≦ｈ≦１３、−１１≦ｋ≦１２、−１４≦ｌ≦１４
収集された反射数  １２７５３
独立反射数  ５２６３［Ｒ（ｉｎｔ）＝０．０１９６］
独立反射のカバー範囲  ９９．４％
チェック反射における変動  Ｎ／Ａ
吸収補正  等価反射から半経験的(semi-empirical from equivalents)
最大及び最小透過率  １．０００００及び０．９０２３８
構造解析技術  直接法
構造解析プログラム  Ｂｒｕｋｅｒ  ＳＨＥＬＸＴＬ
精密化技術  Ｆ２に対するフルマトリックス最小二乗法
精密化プログラム  Ｂｒｕｋｅｒ  ＳＨＥＬＸＴＬ
最小化関数  Σｗ（Ｆｏ２−Ｆｃ２）２
データ／拘束(restraints)／パラメーター  ５２６３／１／３６３
Ｆ２に対する適合度  １．００７
Δ／σｍａｘ  ０．００１
最終Ｒ因子
５１６１データ；Ｉ＞２σ（Ｉ）  Ｒ１＝０．０３２１、ｗＲ２＝０．０８５７
全データ  Ｒ１＝０．０３２７、ｗＲ２＝０．０８６５
重み付けスキーム  ｗ＝１／［σ２（Ｆｏ２）＋（０．０６００Ｐ）２＋０．２２００Ｐ］  式中Ｐ＝（Ｆｏ２＋２Ｆｃ２）／３
絶対構造パラメーター  ０．０４（１４）
消衰係数  ０．００３５（５）
最大差のピーク及びホール  ０．２１４及び−０．１５４ｅÅ−３
精密化のまとめ
規則非Ｈ原子、ＸＹＺ  自由に精密化
規則非Ｈ原子、Ｕ  異方性
Ｈ原子（炭素上）、ＸＹＺ  結合原子上にライディングしている理想的な位置
Ｈ原子（炭素上）、Ｕ  結合原子に対しＵ（ｅｑ）の適当な倍数
Ｈ原子（ヘテロ原子上）、ＸＹＺ  自由に精密化
Ｈ原子（ヘテロ原子上）、Ｕ  等方性
不規則原子、ＯＣＣ  全部の結合体(unity)に拘束された２パートモデルによる精密化
不規則原子、ＸＹＺ  自由に精密化
不規則原子、Ｕ  自由に精密化
・単結晶Ｘ線データにより、化合物６の構造は、単斜晶系、空間群Ｐ２１であり、化合物６の１個の分子が非対称単位中にあることが確立される（表２）。
【０１３１】
表２．化合物８のサンプル及び結晶データ
結晶化溶媒  ジエチルエーテル、ＭｅＯＨ、ＴＨＦ
結晶化法  緩徐蒸発法
実験式  Ｃ３４Ｈ３３Ｎ１Ｏ３
式量  ５０３．６１
温度  １００（１）Ｋ
波長  １．５４１７８Å
結晶サイズ  ０．５０×０．５０×０．５０ｍｍ
晶癖  無色ブロック
結晶系  単斜晶系
空間群  Ｐ２１
単位格子寸法  ａ＝１１．０３４４（２）Å  α＝９０°
ｂ＝１０．１７２７（２）Å  β＝９３．６８２（２）°
ｃ＝１１．８５３２（２）Å  γ＝９０°
体積  １３２７．７７（４）Å３
Ｚ  ２
密度（計算値）  １．２６０Ｍｇ／ｍ３
吸収係数  ０．６２７ｍｍ−１
Ｆ（０００）  ５３６
・絶対立体化学は、化合物２についてＣ９及びＣ１０でＳ、Ｓ、そしてメチルベンジルアミンカチオンについてＣ３３でＳと決定された。帰属は、Ｆｌａｃｋパラメーター（０．０４（１４）であると決定された）及び塩形成剤(salt former)の立体化学の推測的(a priori)知識の両方を考慮してなされた。
・絶対立体化学は、バイフットペア(Bijvoet pair)の差に対するベイズ統計学(Bayesian statistics)を用いても決定された。この結果、キラル中心Ｃ９、Ｃ１０及びＣ３３における立体化学は、それぞれＳ、Ｓ及びＳであることの確率１．０００、そしてＲ、Ｒ及びＲの確率０．０００となった。これは、Ｆｌａｃｋパラメーター測定によるＣ９、Ｃ１０及びＣ３３に対するそれぞれＳ、Ｓ及びＳの帰属を裏付けるものである。
・単結晶Ｘ線構造から計算されたＸ線粉末回折パターンは、図２（又は以下）に示された立体化学と一致した。
【０１３２】
表３．化合物８の原子座標及び等価等方性原子変位パラメーター、（Å２）。Ｕ（ｅｑ）は直交化Ｕｉｊテンソルの軌跡の３分の１と定義される。
【０１３３】
【表５】
0005898768.tif 000026
【０１３４】
表４．化合物８の選択結合長、（Å）
【０１３５】
【表６】
0005898768.tif 000027
【０１３６】
表５．化合物８の選択結合角、（°）
【０１３７】
【表７】
0005898768.tif 000028
【０１３８】
表６．化合物８の選択ねじれ角、（°）
【０１３９】
【表８】
0005898768.tif 000029
【０１４０】
表７．化合物８の異方性原子変位パラメーター、（Å２）。異方性原子変位因子の指数は次の形態を取る：−２π２［ｈ２ａ＊２Ｕ１１＋  ．．．  ＋２ｈｋａ＊ｂ＊Ｕ１２
【０１４１】
【表９】
0005898768.tif 000030
【０１４２】
付録３
化合物１  ４−（（−１−ヒドロキシ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ，１’Ｈ−２，２’−ビインデン−２−イル）メチル）安息香酸
化合物２  ４−（（（１Ｓ，２Ｓ）−１−ヒドロキシ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ，１’Ｈ−２，２’−ビインデン−２−イル）メチル）安息香酸
化合物３  ４−（（（１Ｒ，２Ｒ）−１−ヒドロキシ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ，１’Ｈ−２，２’−ビインデン−２−イル）メチル）安息香酸
化合物４  ４−（（（１Ｒ，２Ｓ）−１−ヒドロキシ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ，１’Ｈ−２，２’−ビインデン−２−イル）メチル）安息香酸
化合物５  ４−（（（１Ｓ，２Ｒ）−１−ヒドロキシ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ，１’Ｈ−２，２’−ビインデン−２−イル）メチル）安息香酸
化合物６  ６−（メチルアミノ）ヘキサン−１，２，３，４，５−ペンタノール４−（（（１Ｓ，２Ｓ）−１−ヒドロキシ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ，１’Ｈ−２，２’−ビインデン−２−イル）メチル）ベンゾエート
化合物７  ６−（メチルアミノ）ヘキサン−１，２，３，４，５−ペンタノール４−（（（１Ｓ，２Ｒ）−１−ヒドロキシ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ，１’Ｈ−２，２’−ビインデン−２−イル）メチル）ベンゾエート
化合物８  （Ｓ）−１−フェニルエチルアンモニウム４−（（（１Ｓ，２Ｓ）−１−ヒドロキシ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ，１’Ｈ−２，２’−ビインデン−２−イル）メチル）ベンゾエート
化合物９  （Ｒ）−１−フェニルエチルアンモニウム４−（（（１Ｒ，２Ｓ）−１−ヒドロキシ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ，１’Ｈ−２，２’−ビインデン−２−イル）メチル）ベンゾエート
【図２】
0005898768.tif 000033
【図２Ａ】
0005898768.tif 000034
【図１】
0005898768.tif 000035
【図３】
0005898768.tif 000036
【図４】
0005898768.tif 000037
【図５】
0005898768.tif 000038
【図６】
0005898768.tif 000039
【図７】
0005898768.tif 000040
【図８】
0005898768.tif 000041
【図９】
0005898768.tif 000042
【図１０】
0005898768.tif 000043
【図１１】
0005898768.tif 000044
【図１２】
0005898768.tif 000045
【図１３】
0005898768.tif 000046
【図１４Ａ】
0005898768.tif 000047
【図１４Ｂ】
0005898768.tif 000048
【図１４Ｃ】
0005898768.tif 000049
【図１５】
0005898768.tif 000050
【図１６】
0005898768.tif 000051
【図１７】
0005898768.tif 000052
【図１８】
0005898768.tif 000053