(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対照レベルに対する骨格筋特異的架橋配位子１（ＢＩＮ１）アイソフォーム８発現レベルを対象における骨格筋量の判定の指標とする方法であって、
ａ．前記対象からの血液、血清または血漿中のＢＩＮ１アイソフォーム８発現レベルを検出することと、
ｂ．前記検出されたＢＩＮ１アイソフォーム８発現レベルを前記対照のＢＩＮ１アイソフォーム８発現レベルと比較することと、を含み、前記対照レベルに対する前記ＢＩＮ１アイソフォーム８発現レベルが、前記対象における骨格筋量を示す、方法。
【請求項２】
前記対照レベルが正常であり、前記対照レベル未満の検出されたレベルが、前記対象における骨格筋量の低下を示し、前記対照レベルよりも高い検出されたレベルが、前記対象における筋量の増加を示すか、または
前記対象からの対照レベルよりも低い検出されたレベルが、前記対象における骨格筋量の減少を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記対照レベルが正常より低く、前記対照レベルと同等か、またはそれ未満の検出されたレベルが、前記対象における骨格筋量の低下を示すか、あるいは
前記対照レベルが正常より高く、前記対照レベルと同等か、またはそれより高い検出されたレベルが、前記対象における骨格筋量の増加を示すか、あるいは
前記対象からの対照レベルよりも高い検出されたレベルが、前記対象における骨格筋量の増加を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
対照レベルに対するＢＩＮ１アイソフォーム８発現レベルを対象における骨格筋量の低下に関連する状態もしくは疾患の診断の指標とする方法であって、
ａ．前記対象からの血液、血清または血漿中のＢＩＮ１アイソフォーム８発現レベルを検出することと、
ｂ．前記検出されたＢＩＮ１アイソフォーム８発現レベルを前記対照のＢＩＮ１アイソフォーム８発現レベルと比較することと、を含み、前記対照レベルに対する前記ＢＩＮ１アイソフォーム８発現レベルが、前記対象が骨格筋量の低下に関連する疾患もしくは状態を有することを示す、方法。
【請求項５】
前記対照レベルが正常であり、前記対照レベル未満の検出されたレベルが、前記対象が骨格筋量の低下に関連する疾患もしくは状態を有することを示すか；あるいは
前記対照レベルが正常より低く、前記対照レベルと同等か、またはそれ未満の検出されたレベルが、前記対象が骨格筋量の低下に関連する疾患もしくは状態を有することを示すか；あるいは
前記対象からの対照レベルよりも低い前記検出されたレベルが、前記対象が骨格筋量の低下に関連する疾患もしくは状態を有することを示す、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
骨格筋量の低下に関連する疾患もしくは状態を有するか、または有する疑いがある対象が選択されることを特徴とし、ここで、場合によっては、前記疾患もしくは状態が、多発性硬化症、萎縮、神経原性萎縮、慢性炎症状態、およびサルコペニアからなる群から選択され、ここで好ましくは前記対象がサルコペニアを有するか、または有する疑いがある、請求項１、２、４または５に記載の方法。
【請求項７】
前記骨格筋特異的ＢＩＮ１アイソフォームが配列番号１を含むか、または場合によっては、前記骨格筋特異的ＢＩＮ１アイソフォームが配列番号２を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＢＩＮ１アイソフォーム８発現レベルが、前記血液、血清または血漿中のＢＩＮ１アイソフォーム８ポリペプチドを検出することによって、検出されるか、または
前記ＢＩＮ１アイソフォーム８発現レベルが、前記血液、血清または血漿中のＢＩＮ１アイソフォーム８をコードする核酸を検出することによって検出される、請求項１または４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１０年１１月９日出願の米国特許仮出願第６１／４１１，６８３号の利益を請求し、それは、参照により全体として本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
骨格筋は、体内で最も大きい器官であり、生物学的機能における骨格筋の重要性に対する認識が増加している。骨格筋の損失は、様々な機能不全および障害を引き起こし、多くの個人を悩ませている。例えば、サルコペニアは、６０歳以上の個人の約１０パーセントに影響を及ぼし、年齢が上がるほど比率が高くなる。例えば、多発性硬化症または慢性疾患等の他の状態もまた、筋量の低下につながる可能性がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
対象における骨格筋量を判定する方法が提供される。本方法は、対象からの生体サンプル中のＢＩＮ１発現レベルを検出すること、および検出されたＢＩＮ１発現レベルを対照のＢＩＮ１発現レベルと比較することを含む。対照レベルに対するＢＩＮ１発現レベルは、対象の骨格筋量を示す。
【０００４】
対象における骨格筋量の低下または増加に関連する状態もしくは疾患を診断する方法も提供される。本方法は、対象からの生体サンプル中のＢＩＮ１発現レベルを検出すること、および検出されたＢＩＮ１発現レベルを対照のＢＩＮ１発現レベルと比較することを含む。対照レベルに対するＢＩＮ１発現レベルは、対象が、対照と比較して骨格筋量の低下または増加に関連する疾患もしくは状態を有することを示す。
【０００５】
神経性状態もしくは疾患を診断する方法も提供される。本方法は、対象からの生体サンプル中のＢＩＮ１発現レベルを検出すること、および検出されたＢＩＮ１発現レベルを対照のＢＩＮ１発現レベルと比較することを含む。対照レベルに対するＢＩＮ１発現レベルは、対象が神経性疾患もしくは状態を有することを示す。
【０００６】
骨格筋内に特異的に発現するＢＩＮ１ポリペプチドに特異的に結合する精製された抗体がさらに提供される。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
対象における骨格筋量を判定する方法であって、
ａ．前記対象からの生体サンプル中のＢＩＮ１発現レベルを検出することと、
ｂ．前記検出されたＢＩＮ１発現レベルを対照のＢＩＮ１発現レベルと比較することと、を含み、前記対照レベルに対する前記ＢＩＮ１発現レベルが、前記対象における骨格筋量を示す、方法。
（項目２）
前記対照レベルが正常であり、前記対照レベル未満の検出されたレベルが、前記対象における骨格筋量の低下を示し、前記対照レベルよりも高い検出されたレベルが、前記対象における筋量の増加を示す、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記対照レベルが正常より低く、前記対照レベルと同等か、またはそれ未満の検出されたレベルが、前記対象における骨格筋量の低下を示す、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記対照レベルが正常より高く、前記対照レベルと同等か、またはそれより高い検出されたレベルが、前記対象における骨格筋量の増加を示す、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記対象からの対照レベルよりも低い検出されたレベルが、前記対象における骨格筋量の減少を示す、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記対象からの対照レベルよりも高い検出されたレベルが、前記対象における骨格筋量の増加を示す、項目１に記載の方法。
（項目７）
骨格筋量の低下に関連する疾患もしくは状態を有するか、または有する疑いがある対象を選択することをさらに含む、項目１、２、および５に記載の方法。
（項目８）
前記疾患もしくは状態が、多発性硬化症、萎縮、神経原性萎縮、慢性炎症状態、およびサルコペニアからなる群から選択される、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記対象がサルコペニアを有するか、または有する疑いがある、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記ＢＩＮ１が、骨格筋内に特異的に発現する、項目１〜９に記載の方法。
（項目１１）
前記ＢＩＮ１が骨格筋特異的ＢＩＮ１アイソフォームである、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記アイソフォームがＢＩＮ１アイソフォーム８である、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記骨格筋特異的ＢＩＮ１アイソフォームが配列番号１を含む、項目１１に記載の方法。
（項目１４）
前記骨格筋特異的ＢＩＮ１アイソフォームが配列番号２を含む、項目１１に記載の方法。
（項目１５）
前記ＢＩＮ１発現レベルが、前記生体サンプル中のＢＩＮ１ポリペプチドを検出することによって、検出される、項目１に記載の方法。
（項目１６）
前記ＢＩＮ１発現レベルが、前記生体サンプル中のＢＩＮ１をコードする核酸を検出することによって検出される、項目１に記載の方法。
（項目１７）
対象における骨格筋量の低下に関連する状態もしくは疾患を診断する方法であって、
ａ．前記対象からの生体サンプル中のＢＩＮ１発現レベルを検出することと、
ｂ．前記検出されたＢＩＮ１発現レベルを対照のＢＩＮ１発現レベルと比較することと、を含み、前記対照レベルに対する前記ＢＩＮ１発現レベルが、前記対象が骨格筋量の低下に関連する疾患もしくは状態を有することを示す、方法。
（項目１８）
前記対照レベルが正常であり、前記対照レベル未満の検出されたレベルが、前記対象が骨格筋量の低下に関連する疾患もしくは状態を有することを示す、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記対照レベルが正常より低く、前記対照レベルと同等か、またはそれ未満の検出されたレベルが、前記対象が骨格筋量の低下に関連する疾患もしくは状態を有することを示す、項目１７に記載の方法。
（項目２０）
前記対象からの対照レベルよりも低い前記検出されたレベルが、前記対象が骨格筋量の低下に関連する疾患もしくは状態を有することを示す、項目１７に記載の方法。
（項目２１）
骨格筋量の低下に関連する状態もしくは疾患を有するか、または有する疑いのある対象を選択することをさらに含む、項目１７〜２０に記載の方法。
（項目２２）
前記疾患もしくは状態が、多発性硬化症、萎縮、神経原性萎縮、慢性炎症状態、およびサルコペニアからなる群から選択される、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記対象がサルコペニアを有するか、または有する疑いがある、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記生体サンプルが血液または血漿である、項目１〜２３に記載の方法。
（項目２５）
前記検出されたＢＩＮ１が、骨格筋内に特異的に発現する、項目１８〜２４に記載の方法。
（項目２６）
前記検出されたＢＩＮ１が、骨格筋特異的ＢＩＮ１アイソフォームである、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記アイソフォームがＢＩＮ１アイソフォーム８である、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
前記筋特異的ＢＩＮ１アイソフォームが配列番号１を含む、項目２６に記載の方法。
（項目２９）
前記筋特異的ＢＩＮ１アイソフォームが、配列番号２を含む、項目２６に記載の方法。
（項目３０）
前記ＢＩＮ１発現レベルが、前記生体サンプル中のＢＩＮ１ポリペプチドを検出することによって検出される、項目１７に記載の方法。
（項目３１）
前記ＢＩＮ１発現レベルが、前記生体サンプル中のＢＩＮ１をコードする核酸を検出することによって検出される、項目１７に記載の方法。
（項目３２）
骨格筋内に特異的に発現するＢＩＮ１ポリペプチドに特異的に結合する単離された抗体。
（項目３３）
前記ＢＩＮ１ポリペプチドが、骨格筋特異的ＢＩＮ１アイソフォームである、項目３２に記載の抗体。
（項目３４）
前記ＢＩＮ１アイソフォームがＢＩＮ１アイソフォーム８である、項目３３に記載の抗体。
（項目３５）
前記筋特異的ＢＩＮ１アイソフォームが配列番号１を含む、項目３３に記載の抗体。
（項目３６）
前記筋特異的ＢＩＮ１アイソフォームが配列番号２を含む、項目３３に記載の抗体。
（項目３７）
前記抗体が配列番号２に特異的に結合する、項目３６に記載の抗体。
（項目３８）
前記抗体が、モノクローナル抗体である、項目３２〜３７のいずれか１項に記載の抗体。
（項目３９）
配列番号８、配列番号９、および配列番号１０を含むポリペプチド配列を有する軽鎖と、配列番号１１、配列番号１２、および配列番号１３を含むポリペプチド配列を有する重鎖とを含む抗体と同一のエピトープ特異性を有する抗体。
（項目４０）
前記抗体が、配列番号８、配列番号９、および配列番号１０のポリペプチド配列を有する軽鎖と、配列番号１１、配列番号１２、および配列番号１３を含むポリペプチド配列を有する重鎖とを含む、項目３９に記載の抗体。
（項目４１）
前記軽鎖が配列番号５を含み、前記重鎖が配列番号７を含む、項目４０に記載の抗体。
（項目４２）
配列番号１８、配列番号１９、および配列番号２０を含むポリペプチド配列を有する軽鎖と、配列番号２１、配列番号２２、および配列番号２３を含むポリペプチド配列を有する重鎖とを含む抗体と同一のエピトープ特異性を有する抗体。
（項目４３）
前記抗体が、配列番号１８、配列番号１９、および配列番号２０のポリペプチド配列を有する軽鎖と、配列番号２１、配列番号２２、および配列番号２３を含むポリペプチド配列を有する重鎖とを含む、項目４２に記載の抗体。
（項目４４）
前記軽鎖が配列番号１５を含み、前記重鎖が配列番号１７を含む、項目４３に記載の抗体。
（項目４５）
配列番号２８、配列番号２９、および配列番号３０を含むポリペプチド配列を有する軽鎖と、配列番号３１、配列番号３２、および配列番号３３を含むポリペプチド配列を有する重鎖とを含む抗体と同一のエピトープ特異性を有する抗体。
（項目４６）
前記抗体が、配列番号２８、配列番号２９、および配列番号３０のポリペプチド配列を有する軽鎖と、配列番号３１、配列番号３２、および配列番号３３を含むポリペプチド配列を有する重鎖とを含む、項目４５に記載の抗体。
（項目４７）
前記軽鎖が配列番号２５を含み、前記重鎖が配列番号２７を含む、項目４６に記載の抗体。
（項目４８）
対象における神経性状態もしくは疾患を診断する方法であって、
ａ．前記対象からの生体サンプル中のＢＩＮ１発現レベルを検出することと、
ｂ．前記検出されたＢＩＮ１発現レベルを対照のＢＩＮ１発現レベルと比較することと、を含み、前記対照レベルに対する前記ＢＩＮ１発現レベルが、前記対象が、神経性疾患もしくは状態を有することを示す、方法。
（項目４９）
前記生体サンプルが脳脊髄液（ＣＳＦ）を含む、項目４８に記載の方法。
（項目５０）
前記対照レベルが正常であり、前記対照レベル未満の検出されたレベルが、前記対象が神経性疾患もしくは状態を有することを示す、項目４８に記載の方法。
（項目５１）
前記対照レベルが正常より低く、前記対照レベルと同等か、またはそれ未満の検出されたレベルが、前記対象が神経性疾患もしくは状態を有することを示す、項目４８に記載の方法。
（項目５２）
前記対象からの対照レベルより低い検出されたレベルが、前記対象が神経性疾患もしくは状態を有することを示す、項目４８に記載の方法。
（項目５３）
神経性状態もしくは疾患を有するか、または有する疑いのある対象を選択することをさらに含む、項目４８〜５２に記載の方法。
【０００７】
１つもしくは複数の実施形態の詳細は、付属の図面および下記の発明を実施するための形態に記載される。他の特性、目的、および利点は、発明を実施するための形態および図面、ならびに請求項から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】イヌ科対象において測定されたＢＩＮ１レベル（Ａ．Ｕ．）対測定された体重（キログラム（ｋｇ））の分散プロットである。線形回帰による線形フィットは、−０．０７の勾配を有し、すべての品種のイヌにわたり体重へのＢＩＮ１のわずかな依存性があることを示す。
【図２】イヌ科対象における測定されたＢＩＮ１レベル（Ａ．Ｕ．）対年齢（歳）の分散プロットである。線形回帰による線形フィットは、−０．６の勾配を有し、年齢へのＢＩＮ１の潜在的な依存性を示唆する。
【図３】２匹の小型のイヌ科における測定されたＢＩＮ１レベル（Ａ．Ｕ．）対年齢（歳）の分散プロットである。ＢＩＮ１の品種依存性に対して評価するために、分散プロットを、共に同様の大きさであり、イヌ科研究において数が多かった上位２位の二匹の品種（シェルティー、ｎ＝２０、平均体重＝９．５ｋｇ、およびハバニーズ、ｎ＝１２、平均体重＝４．６ｋｇ）において、ＢＩＮ１と年齢（歳）との間で得た。線形回帰による線形フィットは、−３．５の勾配を有し、これらの単離された品種では、ＢＩＮ１と年齢との間で強い逆相関を有する。これらのデータは、特定の品種のイヌ科では、ＢＩＮ１が年齢とともに減少することを示す。
【図４】イヌ科対象における測定されたＢＩＮ１レベル（Ａ．Ｕ．）対筋量（ＭＭ）の棒グラフである。最大のＭＭ（４）を有するイヌ科は、より少ない筋量（３または２のいずれかでスコア付けされた）のイヌ科よりも著しく高いレベルのＢＩＮ１を有する。１の筋量でスコア付けされたイヌ科はなかった。＊ｐ＜０．０５。これらのデータは、ＢＩＮ１が、臨床的に評価された筋量と直接的に相関することを示し、図３のＢＩＮ１と年齢との間の逆相関が年齢に伴う筋萎縮に続発することを確定する。
【図５】血漿ｓｋＢＩＮ１が臨床的に評価されたイヌ科の筋重量を予想することを示す。図５は、イヌ科の筋重量（ｋｇ、生体量の割合によって算出され、ＭＭに対して調整された）対静脈血の血漿分画から定量化された、測定されたｓｋＢＩＮ１レベル（Ａ．Ｕ．）の分散プロットである。線形回帰による線形フィットは、０．８の勾配を有する。＊Ｐ＜０．０５、ｎ＝３４。
【図６】血漿ｓｋＢＩＮ１が、解体処理後の枝肉ウシ筋重量を予想することを示す。図６は、ウシ筋重量（ｋｇ、骨を占めるため２０％少ない（温かい）枝肉重量によって算出された）対静脈血サンプルの血漿分画から定量化された、測定されたｓｋＢＩＮ１レベル（Ａ．Ｕ．）の分散プロットである。線形回帰による線形フィットは、＊Ｐ＜０．０５、ｎ＝２５で０．２の勾配を有する。
【図７】血漿ｓｋＢＩＮ１レベルが、イヌ科サンプルに対してウシ科で比例的に高いことを示す。図７は、動物種（左のグラフ）に対する平均の測定されたｓｋＢＩＮ１レベル（Ａ．Ｕ．）、および動物種（右のグラフ）に対する平均の判定された筋重量の棒グラフを示す。ウシ対イヌの相対比は、ｓｋＢＩＮ１または正味筋重量として測定されたパラメータにかかわらず同様である。値を平均±標準偏差で表した。
【図８】健康なヒト対象の血漿ｓｋＢＩＮ１レベル対無脂肪の割合のグラフを示す。
【図９】健康なヒト対象の血漿ジェネリックＢＩＮ１レベル対無脂肪の割合のグラフを示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本明細書に説明される方法は、対象における筋量が、対象におけるＢＩＮ１発現レベルに直接的に相関することができるという所見に基づく。例えば、ＢＩＮ１発現の減少は、対照と比較したとき、対象の骨格筋量の減少と相関する。故に、ＢＩＮ１発現は、対象の骨格筋量を判定するためのマーカーとして使用することができる。
【００１０】
架橋配位子１（ＢＩＮ１）遺伝子は、腫瘍抑制因子の特性を有するＭｙｃ相互作用タンパク質として初期に同定された、核細胞質タンパク質をコードする。ＢＩＮ１はまた、アンフィフィジンＩＩ、アンフィフィジン様、およびボックス依存性ＭＹＣ相互作用タンパク質１としても既知である。ＢＩＮ１遺伝子の代替的スプライシングは、異なるアイソフォームをコードする、１０個の転写変異体をもたらす。ＢＩＮ１のいくつかのアイソフォームは、偏在的に発現し、その他は、組織特異的発現を示す。ＢＩＮ１アイソフォーム１〜７は、ニューロンにおいて発現する。アイソフォーム８は、骨格筋特異的であり、アイソフォーム９および１０は、偏在的である。中枢神経系に発現するアイソフォームは、シプナス小胞エンドサイトーシスに関与し得、ダイナミン、シナプトジャニン、エンドフィリン、およびクラスリンと相互作用し得る。腫瘍細胞株内に発現した異常スプライス変異体もまた説明されている。骨格筋特異的ＢＩＮ１は、他の組織と比較して、骨格筋内のみに発現するか、または主に骨格筋内に発現するＢＩＮ１である。
【００１１】
対象における骨格筋量を判定する方法が本明細書に提供される。対象は、脊椎動物、より具体的には、哺乳類（例えば、ヒト、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、非ヒト霊長類、ウシ、ネコ、モルモット、またはげっ歯類）、魚類、鳥類、または爬虫類、または両生類であることができる。用語は、特に年齢または性別を表さない。したがって、雄または雌にかかわらず、成熟および新生の対象、ならびに胎児が含まれることを意図する。本明細書に使用するとき、患者もしくは対象は、互換的に使用し得、疾患もしくは障害を発達しているか、またはリスクがある対象を指すことができる。患者もしくは対象という用語は、ヒトおよび家畜対象を含む。
【００１２】
方法は、対象からの生体サンプル中のＢＩＮ１発現レベルを検出すること、および検出されたＢＩＮ１発現レベルを対照のＢＩＮ１発現レベルと比較することを含む。対照レベルに対するＢＩＮ１発現レベルを使用して、対象における骨格筋量を示すことができる。例えば、対照レベルよりも低い検出されたレベル（例えば、開始前、または疾患もしくは不活性等のパラメータの不在下での同一の対象から、対照対象から、または対照対象のプールに基づく既知の対照値）は、対象における骨格筋量の減少を示す。その上、対照レベルよりも高い検出されたレベルは、対象における骨格筋量の増加を示す。
【００１３】
本明細書に使用されるとき、対照レベルは、同一の対象、または異なる対象もしくは複数の対象からのＢＩＮ１発現レベルを指す。同一の対象からのＢＩＮ１発現レベルは、ＢＩＮ１発現との比較の最新の時点前の様々な時点で取得することができる。異なる対象からのＢＩＮ１発現レベルは、本対象と同一時点で取得することができる（例えば、対照対象および本対象は、同年齢である）。一般に、対照対象および本対象は、多くの同一または同様の特徴（例えば、年齢、体重、身長、民族性、および品種）を共有する。
【００１４】
生体サンプルは、有機体から取得された任意のサンプルであってもよい。生体サンプルの例には、体液および組織標本が挙げられる。サンプル源は、血液、血清、血漿、骨格筋組織、脳脊髄液、母乳、膿、組織剥離物、洗浄液、尿、糞便、リンパ節等の組織、脾臓、または同等物等の生理学的培地であり得る。組織という用語は、血液、結合組織、上皮、収縮組織（骨格筋を含む）、神経組織、および同等物を含む、身体の任意の組織を指す。
【００１５】
対照レベルは、対照サンプルから取得し得、それは、対照対象から（例えば、生体サンプルと異なる時間で同一の対象から）、もしくは第２の対象から取得された、いずれかのサンプルを含むことができるか、または既知の標準を含むことができる。任意に、対照レベルは、その集団の個々に対して予想される筋量、または標準の筋量を有する集団の個々から採取される。例えば、男性のヒトでは、対照レベルは、中肉中背で、２２〜２３ｋｇ／ｍ２の肥満度指数（ＢＭＩ）を有する２５歳の男性から取得されたＢＩＮ１発現レベルであり得る。女性のヒトでは、対照レベルは、中肉中背で、２２〜２３ｋｇ／ｍ２の肥満度指数（ＢＭＩ）を有する２５歳の女性から取得されたＢＩＮ１発現レベルであり得る。
【００１６】
任意に、生体サンプルは、血液または血漿である。任意に、生体サンプルは、骨格筋組織（例えば、筋生検）である。血液、血漿、または骨格筋組織内で検出されたＢＩＮ１は、骨格筋特異的ＢＩＮ１であってもよい。
【００１７】
対照レベルは、正常であってもよい。かかる場合において、対照レベル未満の検出されたレベルは、対象における骨格筋量の低下を示し、対照よりも高い検出されたレベルは、対象における筋量の増加を示す。任意に、対照レベルは、正常よりも低く、対照レベルと同等か、またはそれ未満の検出されたレベルは、対象における骨格筋量の低下を示す。任意に、対照レベルが正常よりも高く、対照レベルと同等か、またはそれより高い検出されたレベルは、対象における骨格筋量の増加を示す。
【００１８】
対象における骨格筋量の低下に関連する状態もしくは疾患を診断する、および／またはモニタリングする方法も本明細書に提供される。モニタリングは、疾患もしくは状態が改善した、悪化した、または変化していないかどうかの判定を含む。疾患もしくは状態は、多発性硬化症、萎縮、神経原性萎縮、慢性炎症状態、およびサルコペニアからなる群から選択することができる。モニタリングが変化を検出する場合、次いで、治療は、任意に修正される。例えば、筋量の低下が検出される場合、理学療法のレジームが開始または増加される。
【００１９】
疾患もしくは状態は、任意に、筋萎縮に関連する別の疾患もしくは状態であってもよく、筋肉損傷、長期臥床もしくは非活動、長期不動状態、神経損傷、神経障害、糖尿病性神経障害、アルコール性神経障害、亜急性脊髄連合変性症、糖尿病、間接リウマチ、運動ニューロン疾患、筋ジストロフィー（例えば、デュシェーヌ、ベッカー型、顔面肩甲上腕型、肢帯型眼咽頭筋ジストロフィー、筋強直性ジストロフィー）、手根管症候群、慢性感染症、結核、筋肉および関節の廃用、関節炎、関節損傷、関節炎症、四肢まひ、神経絞扼、神経分布筋肉への損傷、脊髄病変、原発性筋疾患（ミオパシー）、栄養不良、アルコール依存症、薬物使用（例えば、コカイン）、薬（例えば、スタチン、ペニシラミン）、神経性無食欲症、悪性腫瘍、慢性疾患、ウイルス感染（例えば、ＨＩＶ、コクサッキーＢウイルス）、腺熱、細菌感染（例えば、結核）、寄生虫感染（例えば、住血吸虫症）、内分泌障害（例えば、甲状腺疾患、アジソン病、クッシング病）、椎間板ヘルニア、副腎皮質機能亢進症、熱傷、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脊髄損傷、タンパク質欠乏症、神経根障害、甲状腺機能亢進症、末梢神経損傷、変形性関節炎、パーキンソン病、多発性硬化症、長期ステロイド療法、脳血管発作、末梢神経障害、マラリア、鉤虫侵入、慢性下痢、老齢、四肢廃用、固定された骨折、血管疾患、大血管血栓症、大血管塞栓症、運動神経虚血、バージャー病、結節性多発動脈炎、虚血性まひ、フォルクマン拘縮、軟組織浮腫、軟組織出血、ポリオ、脊髄空洞症、脊髄出血、髄内腫瘍、梅毒性筋萎縮症、帯状疱疹、アテローム性疾患、髄膜血管性奇形、脊髄腫瘍、腰部脊椎症、腰部脊柱管狭窄症、脊髄腫瘍、腰部椎間板すべり症、頸部脊椎症、多発性筋炎、皮膚筋炎、旋毛虫症、トキソプラズマ症、グリコーゲン貯蔵ミオパシー、カルチニン欠乏症、副腎機能障害、半月版断裂、クロイツフェルト・ヤコブ病、サルコイドーシス、ステロイド使用が挙げられるが、それらに限定されない。
【００２０】
骨格筋量の低下に関連する状態もしくは疾患を診断する方法は、対象からの生体サンプル中のＢＩＮ１発現レベルを検出すること、および検出されたＢＩＮ１発現レベルを対照のＢＩＮ１発現レベルと比較することを含む。対照レベルに対するＢＩＮ１発現レベルは、対象が、骨格筋量の低下に関連する疾患もしくは状態を有することを示す。対象からの対照レベルよりも低い検出されたレベルは、対象が、骨格筋量の低下に関連する疾患もしくは状態を有することを示す。任意に、対照レベルは、選択された生体サンプル中のＢＩＮ１の正常レベルであり、対照レベル未満の検出されたレベルを使用して、対象が骨格筋量の低下に関連する疾患もしくは状態を有することを示す。検出されたレベルは、対照レベルと同一の組織の種類から採取され得る。例えば、対照レベルが血液からである場合、対照レベルとの比較のための検出されたレベルは、血液からであり得る。任意に、対照レベルは、正常よりも低く、対照レベルと同等か、またはそれ未満の検出されたレベルは、対象が骨格筋量の低下に関連する疾患もしくは状態を有することを示す。任意に、本方法はさらに、骨格筋量の低下に関連する疾患もしくは状態を有するか、または有する疑いのある対象を選択することを含む。
【００２１】
対象における骨格筋量の増加に関連する状態もしくは疾患を診断する方法も本明細書に提供される。本方法は、対象からの生体サンプル中のＢＩＮ１発現レベルを検出すること、および検出されたＢＩＮ１発現レベルを対照のＢＩＮ１発現レベルと比較することを含む。対照レベルに対するＢＩＮ１発現レベルは、対象が、骨格筋量の増加に関連する疾患もしくは状態を有することを示す。任意に、本方法はさらに、筋量の増加に関連する疾患もしくは状態を有するか、または有する疑いのある対象を選択することを含む。疾患もしくは状態は、筋力トレーニング、アナボリックステロイドの使用、甲状腺機能低下症、および筋強直性ジストロフィー症候群からなる群から選択することができる。
【００２２】
神経性状態もしくは疾患を診断するための方法もまた提供される。本方法は、対象からの生体サンプル中のＢＩＮ１発現レベルを検出すること、および検出されたＢＩＮ１発現レベルを対照のＢＩＮ１発現レベルと比較することを含む。対照レベルに対するＢＩＮ１発現レベルは、対象が神経性疾患もしくは状態を有することを示す。任意に、生体サンプルは、脳脊髄液を含む。対照レベルよりも低い検出されたレベルは、対象が神経性状態または疾患を有することを示す。任意に、対照レベルは、ＢＩＮ１の正常レベルであり、対照レベル未満の検出されたレベルを使用して、対象が神経性状態もしくは疾患を有することを示す。任意に、対照レベルは、正常よりも低く、対照レベルと同等か、またはそれ未満の検出されたレベルは、対象が、神経性状態もしくは疾患を有することを示す。任意に、本方法はさらに、神経性状態もしくは疾患を有するか、または有する疑いのある対象を選択することを含む。
【００２３】
神経性疾患および状態には、神経細胞の損失に関連する疾患および状態が挙げられる。神経性疾患および状態には、例えば、アルツハイマー病、脳卒中、脊髄損傷、外傷性脳損傷、鬱病、認知症、多発性硬化症、パーキンソン病、鬱病、ハンチントン病、ＡＬＳ、および精神病が挙げられる。
【００２４】
対照レベルは、対照サンプルから取得され得、対照対象から（例えば、生体サンプルと異なる時間で同一の対象から）、もしくは第２の対象から取得された、いずれかのサンプルを含むことができるか、または既知の標準を含むことができる。任意に、対照レベルは、その集団の個々に対して、神経性状態もしくは疾患の兆候を有さない集団の個々から採取される。例えば、対照レベルは、神経性状態もしくは疾患の特定の兆候もしくは症状を有さない２５歳の男性または女性から取得されたＢＩＮ１発現レベルであり得る。
【００２５】
本明細書にわたって説明されるように、本方法は、ヒトおよび非ヒト対象の両方で実施することができる。例えば、ＢＩＮ１発現レベルを使用して、非ヒト動物における上述の疾患および状態を診断および／またはモニタリングすることができる。任意に、ＢＩＮ１発現レベルを使用して、イヌ科、ネコ科、ウマ科動物における萎縮（例えば、ＢＩＮ１レベルの低下）、または肥大（例えば、ＢＩＮ１レベルの増加）に関連する状態を診断またはモニタリングする。その上、ＢＩＮ１発現レベルを使用して、筋量を評価し、生産段階を客観的に判定する、筋肉発達を等級分けする、および／または例えば、鳥類、ウシ科、ヤギ、ヒツジ、およびブタ対象、およびその集団等の生産動物における遺伝系列を改善することができる。
【００２６】
例えば、ＢＩＮ１発現レベルは、生産動物対象、または生産動物対象集団（例えば、２匹もしくは複数の生産動物）において判定することができる。ＢＩＮ１の対照レベルと比較して、ＢＩＮ１の検出されたレベルは、対象または対象集団における筋量の増加を示すことができる。例えば、ＢＩＮ１発現レベルの増加を有する個々の動物または集団は、より高い筋量に対する遺伝材料を改善するための増殖プログラムに対して任意に選択することができる。
【００２７】
他の例において、ＢＩＮ１発現レベルを使用して、例えば、イヌ科およびウマ科を含むパフォーマンス動物における筋量発達を評価することができる。対照ＢＩＮ１レベルと比較して、ＢＩＮ１の検出されたレベルは、競争馬およびイヌ等のパフォーマンス動物における筋量の増加を示すことができる。筋量の増加は、動物のパフォーマンスを強化するために使用されたトレーニング、栄養、または他の要因の効果を示す。任意に、対照ＢＩＮ１レベルと比較して、ＢＩＮ１の検出されたレベルは、競走馬またはイヌ等のパフォーマンス動物における筋量の減少を示す。筋量の減少はまた、動物のパフォーマンスを強化するために使用されたトレーニング、栄養、または他の要因の効果も示し得る。したがって、トレーナーまたはブリーダー等の個人は、ＢＩＮ１レベルを使用して、動物のパフォーマンスに関連する管理決定を誘導することができる。その上、生産動物と同様に、ＢＩＮ１の所望のレベル、例えば、増加したＢＩＮ１発現レベルを有する、個々のパフォーマンス動物または集団は、筋量の増加等、所望レベルの筋量をより達成するよう、遺伝材料を改善するための増殖プログラムに対して任意に選択することができる。
【００２８】
説明される方法において、ＢＩＮ１は、骨格筋内に特異的に発現するＢＩＮ１であってもよい。上述のように、骨格筋特異的ＢＩＮ１は、他の組織と比較して、骨格筋内のみに発現する、または主に骨格筋内に発現するＢＩＮ１である。ＢＩＮ１は、例えば、骨格筋特異的ＢＩＮ１アイソフォームであってもよい。任意に、骨格筋特異的ＢＩＮ１アイソフォームは、ＢＩＮ１アイソフォーム８である。任意に、骨格筋特異的ＢＩＮ１アイソフォームは、配列番号１を含む。任意に、骨格筋特異的アイソフォームは、配列番号２を含む。
【００２９】
ＢＩＮ１発現レベルは、例えば、生体サンプル中のＢＩＮ１ポリペプチドを検出することによって判定することができる。任意に、ＢＩＮ１発現レベルは、生体サンプル中のＢＩＮ１をコードする核酸（例えば、ＢＩＮ１  ｍＲＮＡ）もしくはそのフラグメントを検出することによって判定することができる。ＢＩＮ１の発現を判定する上で有用な分析技術の例には、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、定量リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）、ワンステップＰＣＲ，ＲＮａｓｅ保護アッセイ、プライマー伸張アッセイ、マイクロアレイ分析、ジーンチップ、インサイツハイブリダイゼーション、免疫組織化学、ノーザンブロット、ウエスタンブロット、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射免疫測定（ＲＩＡ）、またはタンパク質アッセイが挙げられる。これらの技術は既知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（２００１）を参照。
【００３０】
ＲＴ−ＰＣＲを使用して、ＢＩＮ１発現を判定するとき、ｍＲＮＡは、生体サンプルから単離することができる。任意に、ＲＮＡは、対象の血液、血漿、または骨格筋組織から、かつ任意に、対照として対応する正常組織または対象から単離される。
【００３１】
ｍＲＮＡ抽出の一般的方法は、当該技術分野において周知であり、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９７）を含む、分子生物学の標準的教材に開示されている。パラフィン包埋組織からのＲＮＡ抽出の方法は、例えば、Ｒｕｐｐ  ａｎｄ  Ｌｏｃｋｅｒ，Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ．５６：Ａ６７（１９８７）、およびＤｅ  Ａｎｄｒeｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １８：４２０４４（１９９５）に開示されている。任意に、ＲＮＡ単離は、製造業者の説明に従い、商業用製造業者からの精製キット、緩衝剤セット、およびプロテアーゼを使用して実施することができる。例えば、総ＲＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ（登録商標）ミニカラム（Ｈｉｌｄｅｎ，ＤＥ）を使用して単離することができる。他の市販されるＲＮＡ単離キットには、ＭａｓｔｅｒＰｕｒｅ（登録商標）Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＤＮＡおよびＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ（登録商標）、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ならびにＰａｒａｆｆｉｎ  Ｂｌｏｃｋ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（登録商標）（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）が挙げられる。組織サンプルからの総ＲＮＡは、ＲＮＡ  Ｓｔａｔ−６０（登録商標）（Ｔｅｌ−Ｔｅｓｔ，Ｆｒｉｅｎｄｓｗｏｏｄ，ＴＸ）を使用して単離することができる。生体サンプルから調製されたＲＮＡは、例えば、塩化セシウム密度勾配遠心法によって単離することができる。
【００３２】
ＲＮＡテンプレートは、ｃＤＮＡ内に転写された後、ＰＣＲ反応において指数関数的に増幅することができる。多くの逆転写を使用し得、ニワトリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素（ＡＭＶ−ＲＴ）、モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（ＭＭＬＶ−ＲＴ）、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ−Ｉ）からの逆転写酵素、ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびサーマスサーモフィルス（Ｔｔｈ）が挙げられるが、これらに限定されない。逆転写ステップは、典型的には、ＲＴ−ＲＣＰの状況および目的に依って、特異的プライマー、ランダムヘキサマー、またはオリゴｄＴプライマーを使用して感作される。例えば、抽出されたＲＮＡは、製造業者の説明に従い、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＲＮＡ  ＰＣＲキット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用して逆転写することができる。次いで、得られたｃＤＮＡは、その後のＰＣＲ反応において、テンプレートとして使用することができる。
【００３３】
ＰＣＲステップは、様々な熱安定性のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを使用することができるが、典型的には、５’−３’ヌクレアーゼ活性を有するが、３’−５’プルーフリーディングエンドヌクレアーゼが欠乏する、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを採用する。したがって、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲは、典型的には、ＴａｑまたはＴｔｈポリメラーゼの５’−ヌクレアーゼ活性を利用して、その標的アンプリコンに結合するハイブリダイゼーションプローブを加水分解するが、等価の５’ヌクレアーゼ活性を有する任意の酵素を使用することができる。２つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ＰＣＲ反応に特有のアンプリコンを生成する。第３のオリゴヌクレオチドまたはプローブは、２つのＰＣＲプライマーの間に位置するヌクレオチド配列を検出するように設計される。プローブは、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ酵素によって延長可能ではなく、レポーター蛍光染料および消光蛍光染料で標識される。レポーター染料からの任意のレーザー誘起発光は、それらがプローブ上にあるため、２つの染料が互いに近接して位置するとき、消光染料によって消光される。増幅反応中、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ酵素は、テンプレートに依存する方法でプローブを開裂する。得られたプローブフラグメントは、溶液中で解離される、放出されたレポーター染料からの信号は、第２のフルオロフォアの消光効果がない。レポーター染料の１つの分子は、合成されたそれぞれの新規分子に対して遊離され、消光されていないレポーター染料の検出は、データの定量的説明に対する基準を提供する。
【００３４】
ＲＴ−ＰＣＲは、例えば、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００  ＴＭ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）またはＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，ＤＥ）等の市販の装置を使用して実施することができる。任意に、５’ヌクレアーゼ手順は、リアルタイム定量ＰＣＲデバイス上で行われる。かかるシステムは、サーモサイクラー、レーザー、電荷結合素子（ＣＣＤ）、カメラ、およびコンピューターを含むことができる。システムは、サーモサイクラー上で９６ウェルフォーマットのサンプルを増幅する。増幅中、レーザー誘起蛍光信号は、すべての９６ウェルに対して、光ファイバーケーブルを介してリアルタイムで収集され、ＣＣＤで検出される。システムは、器具を動作するための、およびデータを分析するためのソフトウエアを含む。
【００３５】
５’−ヌクレアーゼアッセイデータは、まず、Ｃｔ、または閾値サイクルとして表される。蛍光値は、すべてのサイクル中に記録され、増幅反応のその地点までに増幅された生産物の量を示す。蛍光信号が、統計的に有意であると最初に記録されるときの地点は、閾値サイクル（Ｃｔ）である。
【００３６】
サンプルとサンプルの変化の誤差および効果を最小限にするために、ＲＴ−ＰＣＲは、内部標準を使用して、任意に実施される。理想的な内部標準は、異なる組織の中で一定レベルとして表わされ、実験的治療によって影響を受けない。遺伝子発現のパターンを標準化するために最も頻繁に使用されるＲＮＡは、ハウスキーピング遺伝子グリセルアルデヒド−３−リン酸−デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）およびβ−アクチンのためのｍＲＮＡである。
【００３７】
ＲＴ−ＰＣＲ技術のバリエーションは、リアルタイム定量的ＰＣＲであり、それは、２重標識蛍光プローブを介してＰＣＲ生産物の蓄積を測定する。リアルタイムＰＣＲは、各標的配列に対する内部競合が標準化のために使用される定量的競合性ＰＣＲ、およびサンプル中に含有される標準化遺伝子、またはＲＴ−ＰＣＲのためのハウスキーピング遺伝子を使用する定量的競合ＰＣＲの両方と適合する。
【００３８】
測定されたＲＮＡの量における差異、および使用されたＲＮＡの品質におけるばらつきの両方を補正（標準化する）するために、アッセイは、任意に、ＧＡＰＤＨ、ＨＰＲＴ１、ユビキチン等の周知のハウスキーピング遺伝子を含む、ある特定の参照遺伝子（または「標準化遺伝子」）の発現の分析を組み込むことができる。
【００３９】
あるいは、標準化は、評価された遺伝子のすべて、またはその大きなサブセット（しばしば、「国際標準化」アプローチと称される）の平均または中央信号（Ｃｔ）に基づくことができる。遺伝子対遺伝子ベースで、対象組織ｍＲＮＡの測定された標準化された量は、対応する正常組織内に見られる量と比較され得る。
【００４０】
例えば、プライマーおよびプローブ（例えば、ＰＣＲ増幅ベースの方法に使用するため）は、増幅されるエクソン配列に基づき設計することができる。故に、プライマー／プローブ設計は、関心対象の遺伝子内の標的エクソン配列を判定することを含むことができる。これは、Ｋｅｎｔ，Ｗ．Ｊ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１２（４）：６５６−６４（２００２）によって開発された、ＤＮＡ  ＢＬＡＳＴソフトウエア等の公的に入手可能なソフトウエアによって、またはそのバリエーションを含むＢＬＡＳＴソフトウエアによって行うことができる。使用することができる、１つの標的エクソン配列は、配列番号２である。その後のステップは、ＰＣＲプライマーおよびプローブ設計の十分に確立された方法に従う。
【００４１】
非特異的信号を回避するために、遺伝子の標的配列内の反復配列は、プライマーおよびプローブを設計するときに、任意にマスキングすることができる。次いで、マスキングされた配列は、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ＭＧＢ  ａｓｓａｙ−ｂｙ−ｄｅｓｉｇｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）等の任意の市販の、またはさもなければ公的に入手可能なプライマー／プローブ設計パッケージを使用して、プライマーおよびプローブ配列を設計するために使用することができる。
【００４２】
ＰＣＲプライマー設計に考慮される因子は、プライマーの長さ、融解温度（Ｔｍ）、Ｇ／Ｃ内容物、特異性、相補的プライマー配列、および３’末端配列を含むことができる。ＰＣＲプライマーは、任意に、１７〜３０の塩基の長さであってもよく、約２０〜８０％のＧ＋Ｃ塩基（例えば、約５０〜６０％のＧ＋Ｃ塩基）を含有する。Ｔｍは、５０℃〜８０℃、例えば、約５０℃〜７０℃である。
【００４３】
マイクロアレイ技術を使用して、対象の生体サンプル、および正常もしくは対照の生体サンプル中のＢＩＮ１の差次的発現を検出し得る。この方法において、関心対象のポリヌクレオチド配列（ｃＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドを含む）を、マイクロチップ基板上にプレーティングまたは配置した。次いで、配置された配列は、関心対象の細胞または組織からの特異的ＤＮＡプローブとハイブリダイズされる。ＲＴ−ＰＣＲ方法と同様に、ｍＲＮＡ源は、任意に、対象の生体サンプル、および任意に、対応する正常または対照生体サンプルから単離された総ＲＮＡである。
【００４４】
蛍光標識されたｃＤＮＡプローブは、関心対象の組織から抽出されたＲＮＡの逆転写による蛍光ヌクレオチドの組み込みを介して生成することができる。チップに適用された標識されたｃＤＮＡプローブは、アレイ上のＤＮＡの各スポットに対する特異性を有してハイブリダイズする。非特異的結合プローブを除去するためのストリンジェントな洗浄後、チップは、共焦点レーザー顕微鏡によって、またはＣＣＤカメラ等の別の検出方法によって走査される。各配置された要素のハイブリダイゼーションの定量化は、対応するｍＲＮＡの存在量の評価に使用することができる。
【００４５】
二色蛍光を用いて、２つのＲＮＡ源から生成された、別個に標識されたｃＤＮＡプローブは、対でアレイにハイブリダイズされる。したがって、各特定された遺伝子に対応する２つの源からの転写物の相対的存在量は、同時に判定される。マイクロアレイ方法は、細胞当たり数個のコピーで表わされる、希少な転写物を検出、および発現レベルにおける少なくとも約２倍の差異を再生可能に検出できる感度を有することが示されている（Ｓｃｈｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３（２）：１０６−１４９（１９９６））。
【００４６】
配置されたオリゴヌクレオチドは、ＢＩＮ１核酸の特異的領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含み得る。ある特定の実施形態において、ＢＩＮ１核酸の第１の領域に特異的にハイブリダイズする第１のオリゴヌクレオチドの複数のコピーは、配置される。ある特定の実施形態において、ＢＩＮ１核酸の第１および第２の領域に特異的にハイブリダイズする第１および第２のオリゴヌクレオチドの複数のコピーは、それぞれ配置される。ある特定の実施形態において、ＢＩＮ１発現レベルは、これらのオリゴヌクレオチドのそれぞれからの信号の平均値によって判定される。ある特定の実施形態において、アレイもまた、ハウスキーピング遺伝子、または罹患組織対正常組織、例えば、ＣａＶ１．２において、著しく異なって発現しないことで知られる他の遺伝子等の標準化遺伝子の核酸に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドも含み得る。
【００４７】
免疫組織化学方法もまた、ＢＩＮ１の発現レベルを検出するために使用し得る。したがって、ＢＩＮ１に対して特異的なポリクローナル抗血清およびモノクローナル抗体等の抗体もしくは抗血清を使用して、ＢＩＮ１発現を評価し得る。抗体は、抗体自体の直接標識によって、例えば、放射性標識、蛍光標識、ビオチン等のハプテン標識、またはホースラディッシュペルオキシダーゼもしくはアルカリホスファターゼ等の酵素を用いて検出することができる。あるいは、非標識の一次抗体は、一次抗体に対して特異的な抗血清、ポリクローナル抗血清、またはモノクローナル抗体を含む、標識された二次抗体と併せて使用される。任意に、患者からの組織サンプル中のＢＩＮ１発現は、正常な組織サンプル中、または正常な対象におけるＢＩＮ１発現と比較され得る。
【００４８】
ある特定の場合において、生体サンプル中に存在するＢＩＮ１タンパク質の量は、ウエスタンブロットによって判定され得る。例えば、生体サンプルからの全細胞溶解液中に存在するタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離され得、分離されたタンパク質は、ニトロセルロース膜に送達され、ＢＩＮ１は、ＢＩＮ１に対して特異的な抗体もしくは抗血清、またはＢＩＮ１の特異的アイソフォームによって検出される。少なくとも１つの標準化タンパク質、例えば、Ｃａｖ１．２、またはＧＡＰＤＨ等のハウスキーピングタンパク質もまた、同時に、または並行して検出することができ、ＢＩＮタンパク質発現レベルを標準化するために使用することができる。代替的実施形態において、ＢＩＮ１発現レベルは、過剰の抗ＢＩＮ１抗体を使用するＢＩＮ１免疫沈降の実施後に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる免疫沈降の分離を実施することによって判定され得、分離されたタンパク質は、ニトロセルロース膜に送達され、ゲルを染色することによって、例えば、クマシーブルーまたは銀染色によって検出される。ＧＡＰＤＨまたはユビキチン等の対照タンパク質の免疫沈降もまた、同時に、または並行して実行され得る。任意に、同一の手段も、対応する正常組織上で、または正常な対象のサンプルから実行し得る。
【００４９】
任意に、検出されたＢＩＮ１ポリペプチド、核酸、または該ポリペプチドもしくは核酸のフラグメントは、ヒトである。任意に、検出されたＢＩＮ１ポリペプチド、核酸、または該ポリペプチドもしくは核酸のフラグメントは、非ヒトである（例えば、げっ歯類、ウマ科、イヌ科、またはネコ科）。
【００５０】
ＧｅｎＢａｎｋに開示される様々なＢＩＮ１配列が存在し、これらの配列および他の配列は、その中に含有される個々の部分配列またはフラグメントであるため、参照することによりその全体として本明細書に組み込まれる。本明細書に使用されるとき、ＢＩＮ１は、ＢＩＮ１および相同体、変異体、ならびにそのアイソフォームを指す。これらのポリペプチドのＤＮＡおよびｍＲＮＡ配列もまた、生体サンプル中のＢＩＮ１発現を検出するために判定され得る。
【００５１】
ヒト骨格筋特異的ＢＩＮ１アイソフォーム８のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００４３０５．３およびＮＰ＿０４２９６．１（配列番号１）で確認することができる。別の例として、ＢＩＮ１アイソフォーム１〜７、９、および１０のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、アイソフォーム１では、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿１３９３４３．２およびＮＰ＿６４７５９３．１、アイソフォーム２では、ＮＭ＿１３９３４４．２およびＮＰ＿６４７５９４．１、アイソフォーム３では、ＮＭ＿１３９３４５．２およびＮＰ＿６４７５９５．１、アイソフォーム４では、ＮＭ＿１３９３４６．２およびＮＰ＿６４７５９６．１、アイソフォーム５では、ＮＭ＿１３９３４７．２およびＮＰ＿６４７５９７．１、アイソフォーム６では、ＮＭ＿１３９３４８．２およびＮＰ＿６４７５９８．１、アイソフォーム７では、ＮＭ＿１３９３４９．２およびＮＰ＿６４７５９９．１、アイソフォーム９では、ＮＭ＿１３９３５０．２およびＮＰ＿６４７６００．１、アイソフォーム１０では、ＮＭ＿１３９３５１．２およびＮＰ＿６４７６０１．１で確認することができる。
【００５２】
したがって、先述のＧｅｎＢａｎｋ受託番号のヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％またはそれ以上、同一のヌクレオチド配列を含む、ＢＩＮ１のヌクレオチド配列が提供される。先述のＧｅｎＢａｎｋ受託番号の配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％またはそれ以上、同一のアミノ酸配列を含む、ＢＩＮ１のアミノ酸配列も提供される。
【００５３】
ＢＩＮ１もしくはそのフラグメントを含む、上述のポリペプチドを結合する抗体を使用して、生体サンプル中のＢＩＮ１発現を検出することができる。例えば、上述のポリペプチドを使用して、ＢＩＮ１に対する抗体もしくはそのフラグメントを生産することができる。
【００５４】
骨格筋内に特異的に発現するＢＩＮ１ポリペプチドに特異的に結合する、単離された抗体もしくはそのフラグメントが提供される。任意に、ＢＩＮ１ポリペプチドは、骨格筋特異的ＢＩＮ１アイソフォームである。任意に、ＢＩＮ１アイソフォームは、ＢＩＮ１アイソフォーム８である。任意に、筋特異的ＢＩＮ１アイソフォームは、配列番号１を含む。任意に、筋特異的ＢＩＮ１アイソフォームは、配列番号２を含む。任意に、抗体は、配列番号２を特異的に結合する。
【００５５】
骨格筋ＢＩＮ１に特異的に結合する単離された抗体もしくはそのフラグメントは、例えば、配列番号８、配列番号９、および配列番号１０、配列番号１８、配列番号１９、および配列番号２０、または配列番号２８、配列番号２９、および配列番号３０を含む、ポリペプチド配列（相補性決定領域またはＣＤＲ）を有する軽鎖、および配列番号１１、配列番号１２、および配列番号１３、配列番号２１、配列番号２２、および配列番号２３、または配列番号３１、配列番号３２、および配列番号３３を含むポリペプチド配列を有する重鎖を有する、抗体もしくはフラグメントと同一のエピトープ特異性を有することができる。任意に、抗体もしくはフラグメントは、配列番号５、配列番号１５、または配列番号２５を含む、軽鎖を含む。任意に、抗体もしくはフラグメントは、配列番号７、配列番号１７、または配列番号２７を含む、重鎖を含む。軽鎖は、例えば、配列番号８、配列番号９、および配列番号１０、配列番号１８、配列番号１９、および配列番号２０、または配列番号２８、配列番号２９、および配列番号３０を含む、ポリペプチド配列（ＣＤＲ）を含むことができる。重鎖は、例えば、配列番号１１、配列番号１２、および配列番号１３、配列番号２１、配列番号２２、および配列番号２３、または配列番号３１、配列番号３２、および配列番号３３を含む、ポリペプチド配列（ＣＤＲ）を含むことができる。
【００５６】
本明細書に使用されるとき、抗体という用語は、任意のクラスの全免疫グロブリン（すなわち、無傷抗体）を包含するが、これに限定されない。天然抗体は、通常、２つの同一の軽（Ｌ）鎖および２つの同一の重（Ｈ）鎖からなるヘテロテトラマー糖タンパク質である。典型的には、各軽鎖は、１つの共有ジスルフィド結合によって重鎖に連結され、ジスルフィド結合の数は異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で異なる。各重鎖および軽鎖もまた、規則的間隔の鎖内ジスルフィド架橋を有する。各重鎖は、一端に、可変ドメイン（Ｖ（Ｈ））に続き、いくつかの定常ドメインを有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン（Ｖ（Ｌ））を、その他端に定常ドメインを有し、軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第１の定常ドメインと整合し、軽鎖の可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと整合する。特定のアミノ酸残基は、軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインの間に界面を形成すると考えられる。任意の脊椎動物種からの抗体の軽鎖は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる、２つの明らかに異なる種類のうちの１つに割り当てることができる。これらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に依り、免疫グロブリンは、異なるクラスに割り当てることができる。５つの主要なクラスの免疫グロブリンＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭが存在し、これらのうちのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３、およびＩｇＧ−４、ならびにＩｇＡ−１およびＩｇＡ−２に分割され得る。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖の定常ドメインはそれぞれ、アルファ、デルタ、エプシロン、ガンマ、およびミューと呼ばれる。
【００５７】
可変という用語は、本明細書において、抗体の中で配列が異なる抗体ドメインのある特定の部分を説明するために使用され、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合および特異性に使用される。しかしながら、可変性は、通常、抗体の可変ドメインにわたって均一に分散されない。それは、典型的には、軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインの両方内の相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域と呼ばれる、３つのセグメントに集中する。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク（ＦＲ）と呼ばれる。天然重鎖および軽鎖の可変ドメインはそれぞれ、ループ接続を形成する３つのＣＤＲによって接続された、βシート構成を広く適応し、いくつかの場合において、βシート構造の一部を形成する、４つのＦＲ領域を含む。各鎖内のＣＤＲは、ＦＲ領域によって近接にともに保持され、他の鎖からのＣＤＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。定常ドメインは、抗原への抗体の結合に直接関与しないが、抗体依存性細胞毒性における抗体の関与等の様々なエフェクター機能を呈する。
【００５８】
本明細書に使用されるとき、エピトープという用語は、提供された抗体との特異的相互作用が可能な任意の決定因子を含むことを意味する。エピトープ決定因子は、通常、アミノ酸または糖側鎖等の化学的活性表面のグルーピングからなり、通常、特定の三次元構造特性、ならびに比電荷特性を有する。抗体が認識するエピトープの同定は、以下のとおり実施される。第１に、モノクローナル抗体が認識する標的分子の様々な部分構造が調製される。部分構造は、分子の部分ペプチドを調製することによって調製される。かかるペプチドは、例えば、既知のオリゴペプチド合成技術によって、または好適な発現プラスミドにおいて所望の部分ポリペプチドをコードするＤＮＡを組み込むことによって調製される。発現プラスミドは、大腸菌等の好適な宿主に送達され、ペプチドを生産する。例えば、標的分子のＣ末端またはＮ末端から機能する、適切に縮小された長さを有する一連のポリペプチドは、確立された遺伝子工学技術によって調製することができる。どのフラグメントが抗体と反応するかどうかを確立することによって、エピトープ領域は、同定される。エピトープは、確立されたオリゴペプチド合成技術を使用して、様々なより小さいペプチドまたはペプチドの突然変異体を合成することによって、より詳しく同定される。より小さいペプチドを、例えば、競合的阻害アッセイに使用して、特異的ペプチドが標的分子への抗体の結合に介入するかどうかを判定する。介入する場合、ペプチドは、抗体が結合するエピトープである。ＳＰＯＴキット（Ｇｅｎｏｓｙｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｈｅ  Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，ＴＸ）等の市販のキットおよびマルチピン合成方法に基づく一連のマルチピンペプチド合成キット（Ｃｈｉｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｅ，ＣＡ）を使用して、多種多様のオリゴペプチドを取得し得る。
【００５９】
抗体もしくはそのフラグメントという用語もまた、２重または多抗原またはエピトープ特異性を有するキメラ抗体およびハイブリッド抗体、ならびにハイブリッドフラグメントを含む、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂおよび同等物等のフラグメントを包含することができる。したがって、それらの特異的抗原を結合する能力を保持する抗体のフラグメントが提供される。例えば、骨格筋内に特異的に発現したＢＩＮ１への結合活性を維持する抗体のフラグメントは、抗体もしくはそのフラグメントという用語の意味に含まれる。かかる抗体およびフラグメントは、当該技術分野において既知の技術によって作製することができ、抗体を生産し、特異性および活性に対して抗体をスクリーニングするための一般的方法に従い、特異性および活性に対してスクリーニングすることができる（Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）参照）。
【００６０】
例えば、米国特許第４，７０４，６９２号に説明される、抗体フラグメントおよび抗原結合タンパク質（単鎖抗体）の複合体もまた、抗体もしくはそのフラグメントの意味に含まれ、その内容は、参照することによりその全体として本明細書に組み込まれる。
【００６１】
任意に、抗体は、モノクローナル抗体である。本明細書に使用されるとき、モノクローナル抗体という用語は、抗体の実質的に均一の集団からの抗体を指す。すなわち、集団を含む個々の抗体は、少量で存在し得る、潜在的な天然に存在する突然変異体を除き、同一である。モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６−４９５（１９７５）またはＨａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）によって説明されるもの等のハイブリドーマ方法を使用して調製され得る。ハイブリドーマ方法において、マウスまたは他の適切な宿主動物は、典型的には、免疫剤に特異的に結合する抗体を生産するか、または生産することが可能なリンパ球を引き起こすように、免疫剤で免疫付与される。あるいは、リンパ球は、インビトロで免疫付与され得る。免疫剤は、骨格筋内に特異的に発現したＢＩＮ１、またはその免疫原性フラグメントであってもよい。
【００６２】
一般に、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）が、ヒト由来の細胞が望ましい場合に、モノクローナル抗体を生産する方法において使用されるか、または非ヒト哺乳類源が望ましい場合に、脾臓細胞もしくはリンパ節細胞が使用される。次いで、リンパ球は、ポリエチレングリコール等の好適な融剤を使用して、不死化細胞株で融合され、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．５９−１０３（１９８６））。不死化細胞株は、通常、げっ歯類、ウシ科、ウマ科、およびヒト由来の骨髄腫細胞を含む、形質転換哺乳類細胞である。通常、ラットまたはマウスの骨髄腫細胞が利用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、非融合不死化細胞の成長もしくは生存を抑制する、１つもしくは複数の物質を含有する好適な培養培地内で培養され得る。例えば、親細胞は、酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）が欠乏している場合、ハイブリドーマの培養培地は、典型的には、ＨＧＰＲＴ−欠損細胞の成長を防止する、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン（「ＨＡＴ培地」）物質を含む。
【００６３】
ここで有用な不死化細胞株は、有効に融合し、選択された抗体生産細胞による抗体の安定した高い発現レベルを支持し、ＨＡＴ培地等の培地に対して感度性があるものである。不死化細胞株は、例えば、Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．およびＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ；Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄから取得することができる、ネズミ科骨髄腫株を含む。ヒト骨髄腫およびマウス−ヒト異種骨髄腫細胞株もまた、ヒトモノクローナル抗体の生産のために説明されている（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）、Ｂｒｏｄｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８７）ｐｐ．５１−６３）。
【００６４】
次いで、ハイブリドーマ細胞が培養される培養培地は、骨格筋内に特異的に発現したＢＩＮ１、またはその選択されたエピトープに対して指向されたモノクローナル抗体の存在に対して評価することができる。ハイブリドーマ細胞によって生産されたモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降によって、またはラジオ免疫アッセイ（ＲＩＡ）もしくは酵素免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）等の結合インビトロ結合アッセイによって判定することができる。かかる技術およびアッセイは、当該技術分野において既知であり、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）にさらに説明される。
【００６５】
所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンは、限界希釈またはＦＡＣＳ選別手順によってサブクローンされ、標準方法によって成長され得る。この目的のための好適な培養培地には、例えば、ダルベッコ変法イーグル培地およびＲＰＭＩ−６培地が挙げられる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は、哺乳類の腹水として、インビボで成長し得る。
【００６６】
サブクローンから分泌されたモノクローナル抗体は、例えば、タンパク質Ａ−セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、または親和性クロマトグラフィー等の従来の免疫グロブリン精製手段によって、培養培地または腹水流体から単離または精製され得る。
【００６７】
モノクローナル抗体もまた、米国特許第４，８１６，５６７号に説明されるもの等の組み換えＤＮＡ方法によって作製され得る。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手段を使用して（例えば、ネズミ科抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することが可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）、容易に単離し、配列決定することができる。ハイブリドーマ細胞は、かかるＤＮＡの好ましい源として機能することができる。単離されると、ＤＮＡは、発現ベクターに定置され得、次いで、さもなければ免疫グロブリンタンパク質を生産しない、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、形質細胞種細胞、または骨髄腫細胞等の宿主細胞にトランスフェクトされ、組み換え宿主細胞内のモノクローナル抗体の合成を得る。ＤＮＡもまた、例えば、相同性ネズミ配列の代わりに、ヒト重鎖および軽鎖定常ドメインに対するコード配列を置換することによって（米国特許第４，８１６，５６７号）、または非免疫グロブリンポリペプチドに対するコード配列のすべてまたは一部の免疫グロブリンコード配列への共有接合によって修飾され得る。かかる非免疫グロブリンポリペプチドは、本明細書に提供される抗体の定常ドメインに対して置換されるか、または抗体の１つの抗原組み合わせ部位の可変ドメインに対して置換され、骨格筋内に特異的に発現したＢＩＮ１に対する特異性を有する１つの抗原組み合わせ部位、および異なる抗原に対する特異性を有する別の抗原組み合わせ部位を含むキメラ二価抗体を作成することができる。
【００６８】
インビトロ方法もまた、一価抗体を調製するために好適である。そのフラグメント、特に、Ｆａｂフラグメントを生産するための抗体の消化は、当該技術分野において既知の日常的技術を使用して達成することができる。例えば、消化は、パパインを使用して実施することができる。パパイン消化の例は、国際公開第ＷＯ９４／２９３４８号、米国特許第４，３４２，５６６号、およびＨａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）に説明されている。抗体のパパイン消化は、典型的には、Ｆａｂフラグメントと呼ばれる２つの同一の抗原結合フラグメントを生産し、それぞれは、単一の抗原結合部位、および残基Ｆｃフラグメントを有する。ペプシン処理は、２つの抗原結合部位を有し、抗原を架橋連結することが依然として可能である、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントと呼ばれるフラグメントをもたらす。
【００６９】
抗体消化において生産されたＦａｂフラグメントもまた、軽鎖の定常ドメイン、および重鎖の第１の定常ドメインを含有することができる。Ｆａｂ’フラグメントは、抗体ヒンジ領域からの１つもしくは複数のシステインを含む、重鎖ドメインのカルボキシ末端における数個の残基の追加により、Ｆａｂフラグメントとは異なる。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、ヒンジ領域におけるジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ’フラグメントを含む、二価フラグメントである。Ｆａｂ’−ＳＨは、本明細書において、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を持つ、Ｆａｂ’の称号である。
【００７０】
提供された抗体またはポリペプチドを含む、タンパク質を生産する１つの方法とは、タンパク質化学技術によって、２つもしくは複数のペプチドまたはポリペプチドを共に結合することである。例えば、ペプチドまたはポリペプチドは、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメチル−オキシカルボニル）またはＢｏｃ（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）化学（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，；Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）のいずれかを使用する、現在入手可能な実験装置を使用して化学的に合成することができる。当業者は、本明細書に提供される抗体に対応するペプチドまたはポリペプチドが、例えば、標準的化学反応によって合成することができることを容易に理解する。例えば、ペプチドまたはポリペプチドは、合成され、その合成樹脂から切断することができないが、抗体の他のフラグメントは、合成され、その後、樹脂から切断することができ、それによって、他のフラグメント上で機能的にブロッキングされる末端基を曝露する。ペプチド縮合反応によって、これらの２つのフラグメントは、それらのカルボキシルおよびアミノ末端のそれぞれにおいてペプチド結合を介して共有的に接合し、抗体もしくはそのフラグメントを形成することができる（Ｇｒａｎｔ  ＧＡ（１９９２）Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａ  Ｕｓｅｒ  Ｇｕｉｄｅ．Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ．（１９９２）、Ｂｏｄａｎｓｋｙ  Ｍ  ａｎｄ  Ｔｒｏｓｔ  Ｂ．，Ｅｄ．（１９９３）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ  Ｉｎｃ．，ＮＹ）。あるいは、ペプチドまたはポリペプチドは、独立して、インビボで合成することができる。単離されると、これらの独立したペプチドまたはポリペプチドは、同様のペプチド縮合反応を介して結合して、抗体もしくはそのフラグメントを形成し得る。
【００７１】
例えば、クローンされた、または合成ペプチドセグメントの酵素的ライゲーションは、比較的短いペプチドフラグメントを接合させて、より大きいペプチドフラグメント、ポリペプチド、または総タンパク質ドメインを生産することを可能にすることができる（Ａｂｒａｈｍｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０：４１５１（１９９１））。あるいは、合成ペプチドの天然化学ライゲーションを利用して、より短いペプチドフラグメントから大きいペプチドまたはポリペプチドを合成的に構成することができる。この方法は、２ステップの化学反応からなる（Ｄａｗｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  Ｎａｔｉｖｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６６：７７６  ７７９（１９９４）。第１のステップは、初期の共有生産物としてチオエステル結合された中間体を得るための、アミノ末端Ｃｙｓ残基を含有する別の非保護ペプチドセグメントとの非保護合成ペプチド、チオエステルの化学選択的反応である。反応条件の変更なく、この中間体は、自発的な迅速な分子内反応を受け、ライゲーション部位において天然ペプチド結合を形成する。タンパク質分子の全合成へのこの天然化学ライゲーション方法の適用は、ヒトインターロイキン８（ＩＬ−８）の調製によって例示される（Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３０７：９７−１０１（１９９２）、Ｃｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１６０７５（１９９４）、Ｃｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：３１２８（１９９１）、Ｒａｊａｒａｔｈｎａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：６６２３−３０（１９９４））。
【００７２】
あるいは、非保護ペプチドセグメントは、化学的に結合することができ、そこで、化学ライゲーションの結果としてペプチドセグメントの間に形成された結合は、非天然（非ペプチド）結合である（Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：２２１（１９９２））。この技術は、タンパク質ドメインの類似体、ならびに完全な生物活性を有する大量の比較的純度の高いタンパク質を合成するために使用されている（ｄｅＬｉｓｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＩＶ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２５７−２６７（１９９２））。
【００７３】
提供されるポリペプチドフラグメントは、細菌、アデノウイルス、またはバキュロウイルス発現系等のそのポリペプチドフラグメントを生産することが可能な発現系内のポリペプチドをコードする核酸をクローニングすることによって得られた組み換えタンパク質であってもよい。例えば、骨格筋内に特異的に発現したＢＩＮ１との抗体の相互作用に関連する生物学的効果をもたらすことができる特異的ハイブリドーマから活性ドメインを判定することができる。例えば、抗体の活性または結合特異性もしくは親和性に寄与しないことが分かっているアミノ酸は、それぞれの活性における損失なく欠失することができる。
【００７４】
他の配列に付着しているかどうかにかかわらず、提供されるフラグメントもまた、特定の領域または特異的アミノ酸残基の挿入、欠失、置換、または他の選択された修飾を含むことができ、フラグメントの活性が、未修飾の抗体またはエピトープと比較して、著しく変更または低下しないことを条件とする。これらの修飾は、ジスルフィド結合が可能なアミノ酸を除去または追加するため、その生体寿命を増大するため、その分泌特性を変更するため、および同等物等のいくつかの付加的な特性に対して提供することができる。いかなる場合において、フラグメントは、結合活性、結合ドメインにおける結合調節、および同等物等の生物活性特性を保持することができる。機能的または活性領域は、タンパク質の特異的領域の突然変異、その後発現、および発現したポリペプチドの試験によって同定し得る。かかる方法は、当業者には容易に明らかであり、抗原をコードする核酸の部位特異的突然変異を含むことができる（Ｚｏｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１０：６４８７−５００（１９８２））。
【００７５】
抗体のヒト化もしくはヒト型が、本明細書にさらに提供される。任意に、ヒト化もしくはヒト抗体は、本明細書に開示されるハイブリドーマ細胞株と同一のエピトープ特異性を有する抗体の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。例えば、抗体は、ハイブリドーマ細胞株によって生産された抗体と同一のエピトープ特異性を有する抗体のすべてのＣＤＲを含むことができる。
【００７６】
任意に、ヒト化もしくはヒト抗体は、開示されるハイブリドーマ細胞株によって生産されたモノクローナル抗体のフレームワーク領域の少なくとも１つの残基を含むことができる。ヒト化およびヒト抗体は、当業者に既知の方法を使用して作製することができ、例えば、ヒト抗体は、生殖細胞突然変異動物を使用して、またはファージディスプレイライブラリーによって生産することができる。
【００７７】
抗体もまた、他の種において生成され、ヒトへの投与のためにヒト化することができる。あるいは、全ヒト抗体は、全ヒト抗体を作製することが可能なマウスまたは他の種に免疫付与することによって（例えば、ヒト抗体を生産するために遺伝子的に修飾されたマウス）、かつ骨格筋内に特異的に発現したＢＩＮ１を結合するクローンをスクリーニングすることによって作製することもできる。例えば、Ｌｏｎｇｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３，（１９９５）を参照されたく、それは、参照により、全ヒト抗体を生産するための方法のためにその全体として本明細書に組み込まれる。本明細書に使用されるとき、抗体に関してヒト化およびヒトという用語は、ヒト対象における治療的に許容される弱免疫原性反応を引き起こすことが予測される、任意の抗体に関する。したがって、該用語は、全ヒト化もしくは全ヒト、ならびに部分的ヒト化もしくは部分的ヒトを含む。
【００７８】
非ヒト（例えば、ネズミ科）抗体のヒト化形態は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含有する、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはそのフラグメント（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、または抗体の他の抗原結合部分配列）である。ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン（受容抗体）を含み、受容体のＣＤＲからの残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有する、マウス、ラット、またはラビット等の非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲからの残基で置換される。いくつかの例において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。ヒト化抗体もまた、受容抗体、またはインポートされたＣＤＲもしくはフレームワーク配列の両方に見られない残基を含み得る。一般に、ヒト化抗体は、実質的にすべて、または少なくとも１つ、典型的には、２つの可変ドメインを含み、すべてまたは実質的にすべてのＣＤＲ領域は、非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、すべて、もしくは実質的にすべてのＦＲ領域は、ヒト免疫グロブリコンセンサス配列のＦＲ領域である。ヒト化抗体もまた、任意に、免疫グロブリンの定常領域（Ｆｃ）、典型的には、ヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部分を含む（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）、およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３−５９６（１９９２））。
【００７９】
一般に、ヒト化抗体は、非ヒトである源からその中に導入された１つもしくは複数のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、インポート残基と称され、それらは、典型的には、インポート可変ドメインから取られる。ヒト型化は、ヒト抗体の対応する配列に対して、げっ歯類ＣＤＲもしくはＣＤＲ配列を置換することによって、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７（１９８８）、またはＶｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６（１９８８）に説明される方法に従い本質的に実施することができる。故に、かかるヒト化抗体は、キメラ抗体（米国特許第４，８１６，５６７号）であり、無傷ヒト可変ドメインより実質的に少なく、非ヒト種からの対応する配列によって置換されている。実際には、ヒト化抗体は、典型的には、ヒト抗体であり、そのうちのいくつかのＣＤＲ残基および潜在的にいくつかのＦＲ残基は、げっ歯類抗体の類似部位からの残基によって置換される。
【００８０】
提供される抗体をコードするヌクレオチド配列は、従来の手段を使用して（例えば、ネズミ科抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に対して特異的に結合することが可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）、容易に単離し、配列決定することができる。これらのヌクレオチド配列もまた、例えば、相同性ネズミ科配列の代わりに、ヒト重鎖および軽鎖定常ドメインに対するコード配列を置換することによって、修飾またはヒト化することもできる（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照）。提供される抗体のいずれかをコードするヌクレオチド配列は、適切な宿主細胞内に発現することができる。これらには、大腸菌、枯草菌、ネズミチフス菌または霊菌等の他の腸内細菌科、および様々なシュードモナス種が挙げられるがこれらに限定されない、原核宿主細胞が挙げられる。真核宿主細胞も利用することができる。これらには、イースト細胞（例えば、サッカロミセス・セレヴィシエおよびピチア・パストリス）、ならびにＶＥＲＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、Ｗ１３８細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＯＳ−７細胞、２９３Ｔ細胞、およびＭＤＣＫ細胞等の哺乳類細胞が挙げられるが、これらに限定されない。これらの細胞によって生産された抗体は、本明細書に記載される方法および当該技術分野において標準の方法を利用することによって、培養培地から精製され、モノクローナル抗体の結合、活性、特異性、または任意の他の特性に対して測定することができる。
【００８１】
免疫付与の際、内因性免疫グロブリン産出の不在下で、ヒト抗体の全レパートリーを産出することが可能であるトランスジェニック動物（例えば、マウス）を、利用することができる。例えば、キメラおよび生殖細胞突然変異マウスにおける抗体重鎖接合流域（Ｊ（Ｈ））遺伝子のホモ接合性欠失が、内因性抗体生産の完全な阻害をもたらすことが説明されている。かかる生殖細胞突然変異マウスにおけるヒト生殖細胞免疫グロブリン遺伝子アレイの送達は、抗原チャレンジの際、ヒト抗体の生産をもたらす（例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：２５５１−２５５（１９９３）、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５−２５８（１９９３）、Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏ．７：３３（１９９３）を参照）。ヒト抗体もまた、ファージディスプレイライブラリーにおいて生産することができる（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１（１９９１））。Ｃｏｌｅら、およびＢｏｅｒｎｅｒらの技術もまた、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用可能である（Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｅｄ．，ｐ．７７（１９８５）、Ｂｏｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７（１）：８６−９５（１９９１））。
【００８２】
開示される方法および組成物の産物のために使用することができる、それと併せて使用することができる、その調製に使用することができる、または開示される方法および組成物の産物である、材料、組成物、および構成要素が開示される。これら、および他の材料は、本明細書に開示され、これらの材料の組み合わせ、サブセット、相互作用、グループ等が開示され、かつ、これらの化合物のそれぞれの種々の個々の組み合わせおよび集合的組み合わせ、ならびに順列の特定の言及は、明確に開示され得ないとき、それぞれは、本明細書において、具体的に企図され、説明されることを理解する。例えば、方法が開示され、説明され、その方法を含む、多くの分子に行うことができる多くの修正が説明される場合、その方法のそれぞれ、およびすべての組み合わせおよび順列、ならびに潜在的な修正は、反対に、具体的に指示がない限り具体的に企図される。同様に、これらの任意のサブセットまたは組み合わせもまた、具体的に企図および開示される。この概念は、開示される組成物を使用する方法におけるステップが挙げられるが、これらに限定されない、本開示のすべての態様に適用される。したがって、実施することができる様々な追加のステップが存在する場合、これらの追加のステップのそれぞれが、本開示の方法の任意の特定のステップ、または方法のステップの組み合わせで実施することができ、かかる組み合わせのそれぞれ、または組み合わせのサブセットが、具体的に企図され、開示されるとみなされなければならないことを理解する。
【００８３】
本明細書に記載される刊行物およびそれらが記載される材料は、参照によりその全体として本明細書に具体的に組み込まれる。
【実施例】
【００８４】
材料および方法
対象特徴。イヌを、ＢＩＮ１レベルを判定するために選択した。使用されたイヌは、最小年齢が６ヶ月で、最大体重が２．３キログラム（ｋｇ）であった。イヌは、現在、活動性疾患の兆候がないか、または過去に病歴がなく、外見上健康であった。イヌは、以下の理由により除外された：ａ）過去９６時間以内に運動をしたか、または上昇した体温を有した、ｂ）イヌまたは人へのリスクのない、安全拘束を除外する難治性体内動態を有した、ｃ）著しい皮膚疾患（例えば、皮膚炎、耳炎）、筋骨格障害（例えば、跛行、神経障害、筋萎縮）、腹部障害（例えば、触知腫瘤、器官形状の異常）、心疾患（例えば、頻脈、弱い／異常な末梢脈拍、著しい心雑音）、および呼吸器疾患（例えば、肺音の増加）等の疾患もしくは状態を有した、ｄ）血漿ＢＩＮ１テスト（最低０．５ｍｌ）および血漿化学パネルサブミッション（最低０．５ｍｌ）の両方のために十分な血液を得ることが不可能であった、ｅ）著しい臓器機能不全の血漿プラズマ所見（例えば、クレアチンの上昇、肝臓酵素の増加等）を有した。
【００８５】
筋量（ＭＭ）の臨床評価。イヌの筋量および状態の主観評価を提供するための機構を開発した。後肢筋肉組織の尾側面（例えば、半腱様筋、半膜様筋、薄筋、内転筋下尾側、および大腿二頭筋）を、大腿骨骨幹中央部のレベルで、尾側アプローチから触知し、特定のイヌの筋量を予想した。この部位を、イヌ科の移動のための主な力を提供した後肢として選択し、この筋群の状態は、全体の筋調整を示す。この筋群は、股関節の伸展、ならびに後膝関節の伸展および屈曲の両方、ならびに足根関節の伸展に関与する（Ｅｖａｎｓ  ａｎｄ  Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｍｉｌｌｅｒ’ｓ  Ａｎａｔｏｍｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｄｏｇ，２ｎｄ  Ｅｄ．，ＷＢ  Ｓａｕｄｎｅｒｓ，ｐｐ  ３８３−４００（１９７９））。この面積の触知は、最小限の拘束を必要とする、立位のイヌで容易に実施される。弛緩位の足および伸展している後膝で、正確な弛緩した筋緊張を評価することができる（強い拘束または他の生理学的ストレス因子が原因の筋緊張の状態とは対照的）。加えて、肥満のイヌにおける体幹脂肪等の著しい脂肪沈着がなく、単離された筋腹の触知を促進する。
【００８６】
１〜４の尺度を使用して、筋量を評価した。レベル１は、非常に不足した筋量および筋緊張を特徴とし、大腿骨骨幹中央部の尾側面が、筋腹からの閉塞が少なく、尾側アプローチから容易に触知し得る。筋肉自体は、柔らかく、弛緩性である。この状態は、ほぼ一生にわたりケージの中で過ごし、運動する機会が少ないか、全くないイヌに見られる。レベル２は、正常以下の筋量および筋緊張を特徴とし、尾側アプローチから、大腿骨骨幹中央部の尾側面が、筋腹からの閉塞が原因で触知し得ないが、大腿骨の外側面および内側面のみが、触知され得る。筋肉は、いくつかの緊張および十分な質量を有する。この状態は、排尿または排便するために外を散歩し、帰宅して横になる、あまり動かない室内ペット等の、時々運動するイヌにおいて見られる。レベル３は、平均筋量および筋緊張を特徴とし、尾側アプローチから、大腿骨骨幹中央部は、筋腹による閉塞が原因で全く触知することができない。筋肉が弛緩しているとき、優れた筋緊張が感じられる。この状態は、頻繁にリーシュ付きで散歩する活発な室内ペットであるイヌに見られる。レベル４は、平均を上回る筋量および筋緊張を特徴とし、大腿骨骨幹中央部のレベルで尾側アプローチから触知したとき、弛緩状態の筋肉は、大腿骨骨幹中央部の面積と比較して、硬く感じられ、著しく隆起する。この状態は、有意な時間を室外で大きな庭で走り回って過ごすイヌに見られる。
【００８７】
イヌ科集団における静脈穿刺。各イヌを、腹這い姿勢に拘束した。イヌの毛を、頸静脈の上を１インチのウインドウでクリップ留めし、皮膚をアルコールで処理した。止血帯として機能するように、指を頸静脈溝に定置し、２１ゲージ−１インチの針を有する１２．０ｍｌのシリンジを、静脈穿刺に使用した。３．０〜７．０ｍｌの血液を収集した。指を、穿孔部位の上に定置し、針およびシリンジをイヌから除去し、血腫を防止するために穿孔部位に圧力を印加した。針および管ストッパーの両方をゆっくりと除去し、管の側面内に血液を注入することによって、血液を、７．０ｍｌのガラス製ＥＤＴＡ管に定置した。ストッパーを交換し、管をゆっくりと２０回反転させることによって、抗凝固剤を血液と混合した。
【００８８】
ウシ科集団における血漿取得。サンプルを商業用家畜解体処理場で収集した。家畜を、放血のための頸静脈切断を含む、従来の手順に従い解体処理した。放血のプロセス中、および定常流の血液が造られた後、管ストッパーを除去することによって、７．０ｍｌの全血を、ガラス製ＥＤＴＡ管内に収集した。ストッパーを交換し、管をゆっくりと２０回反転させることによって、抗凝固剤を血液と混合した。血液サンプルの収集は、解体処理後の動物の処理、または解体処理後の死体の処理のペースに影響を及ぼさなかった。
【００８９】
血漿収集および保管。血液収集の３時間以内に、ＥＤＴＡ管を、１５分間、１分あたり３０００回転（ＲＰＭ）の速度で円心分離した。赤血球細胞の収集を注意深く回避しながら、上清（血漿）を除去した。血漿を、２つの均等のアリコート中に分離し、２ｍｌのクライオバイアル内に定置し、−２０℃で凍結した。
【００９０】
血漿化学分析。凍結の３日以内に、血漿サンプルを解凍し、商業的参照試験所（Ａｎｔｅｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ；Ｔａｍｐａ，ＦＬ）で、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＡＵ２７００血液化学分析器で分析した。実施した試験は、総タンパク質、アルブミン、グロブリン、血清グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（ＳＧＯＴ）、血清グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＳＧＰＴ）、アルカリ性ホスファターゼ、ガンマグルタミントランスペプチターゼ（ＧＧＴＰ）、総ビルリビン、尿素窒素、クレアチン、亜リン酸、グルコース、カルシウム、マグネシウム、ナトリウム、カリウム、塩化物、コレステロール、トリグリセリド、アミラーゼ、リパーゼ、およびクレアチンホスホキナーゼレベルを含んだ。高い筋肉不純物（クレアチンキナーゼ＞５００ＩＵ／Ｌ）を有するサンプルは、分析に使用しなかった。
【００９１】
捕捉ＥＬＩＳＡによる血清ＢＩＮ１タンパク質の検出。新規のカスタマイズされたウサギポリクローナル抗骨格ＢＩＮ１（抗ｓｋＢＩＮ１）抗体を、ＢＩＮ１（転写変異体８）の骨格特異的ホスホイノシトール結合ドメインの抗原に対して産生した（Ａｎａｓｐｅｃ；Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）。丸底の９６ウェルプレートを、４℃で、１６時間、ｐＨ９．０で、０．１Ｍの炭酸ナトリウム緩衝液中で希釈されたマウス抗ＢＩＮ１（１／１０００）または抗ｓｋＢＩＮ１（１／１０００）でコーティングした。プレートを、トリス緩衝食塩水ｔｗｅｅｎ−２０（商標）（ＴＢＳＴ）で３回洗浄し、未結合抗体を除去し、１時間、室温で、ＴＢＳＴ（ブロッキング緩衝液）内の５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロッキングした。１００ｍｌの各血清サンプルを追加し、プレートを、１時間、室温で、回転させながらインキュベートした。次いで、サンプルを吸引し、プレートを素早く２回洗浄し、ＴＢＳＴで５分間３回洗浄した。次いで、ヤギ抗ＢＩＮ１（ブロッキング緩衝液中の１／１０００）を、検出抗体として適用し、プレートを、１時間、室温で、回転させながらインキュベートした。次いで、検出抗体を吸引し、プレートを２回素早く洗浄した後、ＴＢＳＴで５分間３回洗浄した。その後、プレートを、２回の素早い洗浄し、およびＴＢＳＴでの３回の５分間洗浄する前に、１時間、室温で、ＨＲＰ抱合されたロバ抗ヤギＩｇＧ（ブロッキング緩衝液中の１／４０００）でインキュベートした。ＴＭＢ基質を追加し、プレートを、１Ｎの塩酸（ＨＣＬ）での反応終了前に、暗室で１時間インキュベートした。反応終了の後、プレートを、ＥＬｘ８００  Ｂｉｏ  Ｔｅｋマイクロプレート分光光度計（ＢｉｏＴｅｋ；Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ）を使用して読み込み、ＯＤ値を、４０５ｎｍで判定した。値を、標準イヌ科血清サンプルのＯＤの１０分の１に正規化し、すべてのプレート上に含んだ。ボンフェローニ事後試験で、ワンウェイＡＮＯＶＡを、ＭＭスコアによってグループ分けされたＢＩＮ１またはｓｋＢＩＮ１レベルの統計的分析に使用した。分散プロットの補正では、直線回帰を適用し、９５％の信頼区間の勾配をグラフに示した。
【００９２】
モノクローナルｓｋＢＩＮ１抗体のシークエンシング。総ＲＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮＡ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ；Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用して、ハイブリドーマから抽出した。ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）ＯｎｅＳｔｅｐ  ＲＴ−ｐＣＲキットを使用して、ＲＴ−ＰＣＲを、重鎖および軽鎖に特異的なプライマーセットで実施した。各ＲＮＡサンプルでは、１２の個々の重鎖および１１の軽鎖ＲＴ−ＰＣＲ反応を、可変領域のリーダー配列を覆う縮重組織順方向プライマー混合物を使用して始動した。逆方向プライマーは、重鎖および軽鎖の定常領域内に位置する。制限部位は、プライマー内に改変されない。
【００９３】
第１ラウンドの反応からのＲＴ−ＰＣＲ産物をさらに、第２ラウンドのＰＣＲで増幅した。１２の個々の重鎖および１１の軽鎖ＲＴ−ＰＣＲ反応を、抗体可変領域に対して特異的なセミネステッドプライマーセットを使用して始動した。ＰＣＲ反応が終了した後、ＰＣＲ反応を、アガロースゲル上で行い、増幅されたＤＮＡフラグメントを可視化した。正確な抗体可変領域ＤＮＡフラグメントは、４００〜５００の塩基対の寸法を有さなければならない。正のＰＣＲバンドをクローンし、サンプル当たり１０〜２０個のクローンを配列決定した。
【００９４】
結果
大規模なイヌ科研究を行い、血清ＢＩＮ１および骨格特異的ＢＩＮ１レベルと、臨床的に得られたパラメータ（例えば、年齢、体重、および筋量）との相互関係を判定した。０．５〜１０歳の範囲の３４匹の健康な純血種のハバニーズおよびシェルティーのイヌ科を研究した。上記に提供される基準を使用して、イヌ科を、研究のために選択し、表１および２は、研究に使用したイヌ科の内訳を示す。血清を、イヌ科から取得し、血清を使用し、捕捉酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を使用して、ＢＩＮ１タンパク質のレベルを測定した。
【００９５】
ＢＩＮ１レベルを、検査したすべての種類のイヌ科の体重（図１）、検査したすべての種類のイヌ科の年齢（図２）、検査した２種類のイヌ科の年齢（図３）、およびイヌ科の筋量（図４）と比較した。検査したイヌのすべての種類に対して、データをプロットしたとき、重量へのＢＩＮ１のわずかな依存性が存在すること（図１）、および年齢へのＢＩＮ１の潜在的な依存性が存在すること（図２）が発見された。データが、大半のデータが存在する特定の２種類（シェルティーおよびハバニーズ）に限定されたとき、ＢＩＮ１レベルと、イヌの年齢との間の逆相関が存在したことを発見した（図３）。ＢＩＮ１レベルを筋量の臨床スコアに対して測定したとき、高いＢＩＮ１レベルが、高レベルの筋量と強く相関することを発見した（図４）。
【表１−１】
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【表１−２】
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【表２】
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【００９６】
ｓｋＢＩＮ１レベルも、検査されたすべてのイヌ科にわたって筋重量と比較した。筋重量を、物理的に触知した筋量（ＭＭ、１〜４でスコア付け）のすべての地点に対して、測定された生体重の２５％プラス体重の追加の４％で判定した。結果を、図５に示す。イヌ科の筋重量は、測定されたｓｋＢＩＮ１と正比例で増加する。得られた勾配は、０８ｋｇ／Ａ．Ｕ．（Ｐ＜０．０５）である。この統計的に著しい相関は、イヌ科の筋重量が、静脈血サンプルｓｋＢＩＮ１によって予測することができることを示唆する。したがって、イヌ科の筋重量のｓｋＢＩＮ１予測は、特定の物理的検査に依存しない。
【００９７】
筋量測定の標準は、非筋構造が排除される、動物の死体から得られた直接的体重である。商業用ウシ解体処理所において、血液を、成熟したホルスタイン乳牛から得た。次いで、吊り下げ、または枝肉重量を得た。枝肉重量は、頭部、皮、ひずめ、内臓、および腔内脂肪の除去後に残された、骨格筋、筋肉内脂肪、および骨の組み合わせである。典型的には、骨は、この重量の２０％である。ここから、さもなければ、測定される筋重量から推定される骨の断片を差し引くと、ウシは、４４８．６ｋｇの平均筋重量を有した。図６は、解体処理時に得られた、静脈ｓｋＢＩＮ１の関数として、測定されたウシ筋重量を表す。イヌ科と同様に、ウシデータは、測定された筋重量と、血漿ベースのｓｋＢＩＮ１との間の強い線形相関を有する（勾配は、０．２ｋｇ／Ａ．Ｕ．、Ｐ＜０．０５である）。注目すべきは、ウシのｓｋＢＩＮ１と、測定された生体重との間の著しい相関（Ｐ＝０．２３）が存在しないことであり、生動物からの筋肉収率を推定することが困難であると知られることに一致する。
【００９８】
ｓｋＢＩＮ１（０．２ｋｇ／Ａ．Ｕ．）に対するウシ筋重量の勾配は、ｓｋＢＩＮ１（０．８ｋｇ／Ａ．Ｕ．）のイヌ科筋重量の勾配と同様であり、実際、それよりも少なかった。これらの勾配は、ウシとイヌの寸法における大きな差異にもかかわらず、ウシｓｋＢＩＮ１における単位増加は、イヌと比較してより総合的な筋肉に対応しないことを示唆した。この観察は、２種類の動物に対して、平均ｓｋＢＩＮ１対平均骨格筋の比率を可視化することによって実証された（図７）。ウシ対イヌ科の平均ｓｋＢＩＮ１は、４２２．０対０．６であり、ウシ対イヌ科の平均筋重量は、４４８．６対２．８である。したがって、ｓｋＢＩＮ１は、独立した哺乳類の寸法であるが、むしろ、代わりに純動物筋重量に対応する。
【００９９】
ヒトｓｋＢＩＮ１レベル。骨格特異的ＢＩＮ１抗体を使用して、ヒトｓｋＢＩＮ１レベルを、ＥＬＩＳＡによって評価した。ヒトの脂肪の割合も、９ポイントキャリパー方法によって評価し、胸部、腹部、大腿部、二頭筋、三頭筋、肩甲下、上腸骨、下背部、およびふくらはぎを含む領域を測定した。遺伝的ＢＩＮ１抗体を使用して、同一の患者の血漿内の総ＢＩＮ１含有量も判定した。無脂肪の割合は、９ポイントキャリパー測定値からの割合と、１００％との間の差異であった。
【０１００】
合計６０人の対象を研究した。８人の患者は、採血中に、汚染筋損傷を示す、高い血漿ＣＰＫ（＞２５０）のため含まなかった。血漿ＢＩＮ１は、他の５２人の対象において判定した。これらのうち、４人の対象は、連続アッセイで非一貫性であった値を有した。残りの４８人の対象を、本研究に使用した（表３）。図８は、ｓｋＢＩＮ１レベル対無脂肪の割合を判定したＥＬＩＳＡの結果を示す。図９は、遺伝的ＢＩＮ１対無脂肪の割合を判定したＥＬＩＳＡの結果を示す。血漿ＢＩＮ１対無脂肪（脂肪分が少ない）の割合との間に直接的関係が存在することに注記する。データに対する線形フィットは、ｓｋＢＩＮ１で検出された集団において、統計的に著しいが、遺伝的ＢＩＮ１で検出された集団では著しくなかった。
【表３】
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【０１０１】
モノクローナルｓｋＢＩＮ１抗体の配列決定。モノクローナルｓｋＢＩＮ１抗体を産出するこれらのハイブリドーマ（ＭＨＣ１５６、ＭＨＣ１５７、およびＭＨＣ１５８）を、配列決定のために、ＬａｋｅＰｈａｒｍａ（ＬａｋｅＰｈａｒｍａ；Ｂｅｌｍｏｎｔ，ＣＡ）に送った。簡潔に述べると、総ＲＮＡを、ハイブリドーマ細胞から抽出し、逆転写の後に、ポリメラーゼ鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を実施し、可変重鎖および可変軽鎖に対してＤＮＡを増幅させた。陽性クローンを、電気泳動によって同定し、陽性ＤＮＡをクローンし、配列決定した。
【０１０２】
ハイブリドーマＭＨＣ１５６から生産されたモノクローナル抗体の配列決定は、以下の配列を生産した：軽鎖の可変領域（配列番号４および５）ならびに重鎖の可変領域（配列番号６および７）の核酸およびアミノ酸配列。軽鎖の可変領域のさらなる分析は、ＱＤＶＳＴＡ（配列番号８）の相補性決定領域１（ＣＤＲ１）配列、ＳＡＳＹ（配列番号９）のＣＤＲ２配列、およびＱＱＨＹＳＴＰＬＴ（配列番号１０）のＣＤＲ３配列を示した。重鎖のさらなる分析は、ＧＹＴＦＴＲＹＹ（配列番号１１）のＣＤＲ１配列、ＩＹＰＧＮＶＮＴ（配列番号１２）のＣＤＲ２配列、およびＡＲＥＧＳＹＥＹＤＥＡＤＹ（配列番号１３）のＣＤＲ３配列を示した。
【０１０３】
ハイブリドーマＭＨＣ１５７から生産されたモノクローナル抗体の配列決定は、以下の配列を生産した：軽鎖の可変領域（配列番号１４および１５）、および重鎖の可変領域（配列番号１６および１７）の核酸およびアミノ酸配列。軽鎖の可変領域のさらなる分析は、ＱＤＶＳＴＡ（配列番号１８）のＣＤＲ１配列、ＳＡＳＹ（配列番号１９）のＣＤＲ２配列、およびＱＱＨＹＳＴＰＬＴ（配列番号２０）のＣＤＲ３配列を示した。重鎖のさらなる分析は、ＧＹＴＦＴＲＹＹ（配列番号２１）のＣＤＲ１配列、ＩＹＰＧＮＶＮＴ（配列番号２２）のＣＤＲ２配列、およびＡＲＥＧＳＹＥＹＤＥＡＤＹ（配列番号２３）のＣＤＲ３配列を示した。
【０１０４】
ハイブリドーマＭＨＣ１５８から生産されたモノクローナル抗体の配列決定は、以下の配列を生産した：軽鎖の可変領域（配列番号２４および２５）および重鎖の可変領域（配列番号２６および２７）の核酸およびアミノ酸配列。軽鎖の可変領域のさらなる分析は、ＱＳＬＬＤＳＤＧＫＴＹ（配列番号２８）のＣＤＲ１配列、ＬＶＳＫ（配列番号２９）のＣＤＲ２配列、およびＷＱＧＴＨＦＰＹＴ（配列番号３０）のＣＤＲ３配列を示した。重鎖の可変領域のさらなる分析は、ＧＦＮＩＫＤＹＹ（配列番号３１）のＣＤＲ１配列、ＩＤＰＥＮＧＤＴ（配列番号３２）のＣＤＲ２配列、およびＮＳＤＹ（配列番号３３）のＣＤＲ３配列を示した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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