(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アドレノメジュリン（ＡＤＭ：Ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ）、プロアドレノメジュリンＮ−末端２０ペプチド（ＰＡＭＰ：ｐｒｏａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ２０  ｐｅｐｔｉｄｅ）、及びアドレノメジュリン２／インテルメジン（ＡＤＭ２／ＩＭＤ：Ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ２／Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｎ）からなる群より選ばれる少なくとも１種のペプチドの産生抑制作用を評価する工程を含むメラニン産生抑制剤のスクリーニング方法であって、
前記ペプチドの産生抑制作用の評価が、被験物質を添加した場合の細胞、及び被験物質を添加しない場合の細胞における前記ペプチドの産生量又は前記ペプチドに係る遺伝子発現量を比較して行われ、
前記細胞が、角化細胞（ケラチノサイト）及び／又は色素細胞（メラノサイト）であることを特徴とする、メラニン産生抑制剤のスクリーニング方法。
【請求項２】
前記細胞にＡＤＭ等産生促進因子を付与する工程を含み、前記ＡＤＭ等産生促進因子の付与が、紫外線照射及び／又はメラニン添加である、請求項１に記載のメラニン産生抑制剤のスクリーニング方法。
【請求項３】
前記ペプチドに係る遺伝子発現量が、ＡＤＭｍＲＮＡ発現量及び／又はＡＤＭ２／ＩＭＤｍＲＮＡ発現量である、請求項１または２に記載のメラニン産生抑制剤のスクリーニング方法。
【請求項４】
請求項１〜３の何れか１項に記載のスクリーニング方法によりメラニン産生抑制剤をスクリーニングする工程、
前記工程によりメラニン産生抑制作用を有すると判別された成分を含有させる工程、を含むことを特徴とする、美白組成物の設計方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化粧料に好適な、新規な作用機序を介しメラニン産生抑制効果を発揮するメラニン産生抑制剤のスクリーニング方法、該メラニン産生抑制剤を含有する美白用組成物、並びにその美白用組成物の製造方法に関するものである。尚、本発明の説明において、化粧料との用語は、医薬部外品を含むものとして定義する。
【背景技術】
【０００２】
紫外線暴露、炎症をはじめとする皮膚への刺激の結果生じる色素沈着は、日焼け等の一時的な皮膚色素沈着症状に留まらず、しみ、くすみ等の慢性的な皮膚色素沈着症状として加齢と共に顕在化する。また、この様な慢性的な皮膚色素沈着症状は、他人の見た目の印象に大きな影響を与えるため、肌に関する調査を実施した場合には、必ず肌トラブルとして上位にのぼる皮膚症状である。
【０００３】
前述の皮膚色素沈着症状は、紫外線暴露や炎症等の刺激による情報伝達物質、サイトカイン、ホルモン等の分泌により表皮に存在する色素細胞（メラノサイト）のメラニン産生が亢進され、表皮にメラニンが過剰沈着することにより生じることが報告されている。この様な皮膚色素沈着症状に関する研究成果・情報を基礎とし、日焼け、しみ、くすみ等の色素沈着症状の予防又は改善を目的としたメラニン過剰産生及び蓄積等を抑制するメラニン産生抑制剤が見出され、化粧料等に配合されている。前記のメラニン産生抑制剤としては、チロシナーゼ酵素に対する阻害作用を有するレゾルシン誘導体、アルブチン及びハイドロキノン誘導体、チロシナーゼ活性発現に必須な銅イオンをキレートするエラグ酸及びコウジ酸、α−ＭＳＨ（ＭＳＨ：Ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ）阻害作用を有するマメ科クララ（苦参）より得られる植物抽出物（例えば、特許文献１を参照）、メラノサイトのデンドライド伸長抑制作用を有するスイカズラ科スイカズラより得られる植物抽出物（例えば、特許文献２を参照）、エンドセリン−１産生抑制作用を有するハヤトウリ果実抽出物（例えば、特許文献３を参照）等の作用機序の異なるメラニン産生抑制剤が知られている。しかしながら、前記のメラニン産生抑制剤を含有する化粧料には、一定の美白効果が認められるものの、使用者が望むような高い美白効果又は持続性が十分に得られているとは言い難い。これは、メラニン産生機構が依然として十分に解明されておらず、既知の作用機序に基づいた美白作用だけでは、その効果が十分でないためであると考えられる。さらに、前記のメラニン産生抑制剤には、安全性又は安定性に課題を有するものも存する。
【０００４】
一方、１９９３年にＫｉｔａｍｕｒａ等によってアドレノメジュリン（ＡＤＭ：Ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ）なる循環調節ペプチドが報告された（例えば、非特許文献１を参照）。ＡＤＭは、副腎髄質、心臓、血管、肺、脳、腎臓等の多くの組織に存在し、細胞内ｃＡＭＰ濃度を上昇させ、血圧降下（例えば、非特許文献２を参照）、血管新生又は再生促進作用（例えば、非特許文献３を参照）等の生理活性を発現することが報告されている。また、ＡＤＭは前駆体である１８５個のアミノ酸プレプロホルモンから連続的な酵素的分解及びアミド化反応を経由して生合成されるが、かかる前駆体のＮ末端領域からはプロアドレノメジュリンＮ−末端２０ペプチド（ＰＡＭＰ：Ｐｒｏａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ２０  ｐｅｐｔｉｄｅ）と称されるペプチドが生合成されることも明らかにされ、かかるペプチドの生理活性も報告されている（例えば、特許文献４を参照）。さらに、ＡＤＭと同様にカルシトニン遺伝子関連ペプチドファミリーに属し、ＡＤＭと類似した構造を有するアドレノメジュリン２／インテルメジン（ＡＤＭ２／ＩＭＤ：Ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ２／Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｎ）なるペプチドも発見されている。ＡＤＭ、ＡＤＭ２／ＩＭＤ、及びカルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲ
Ｐ：Ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ  ｇｅｎｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ）は、共にカルシトニン受容体様受容体（ＣＲＬＲ：Ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）を共有し、生理活性を発現することが知られている。ほ乳類のＣＲＬＲは、受容体活性調節蛋白質（ＲＡＭＰ１−３：Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ａｃｔｉｖｉｔｙ−ｍｏｄｙｆｙｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）と複合体を形成することにより受容体として機能するが、ＲＡＭＰとの組み合わせによって、ＡＤＭ、ＡＤＭ２／ＩＭＤ又はＣＲＬＲとの特異性が調整されることが明らかとされている。
【０００５】
ＡＤＭ又はＡＤＭ関連ペプチドの作用については様々報告されており（例えば、特許文献５を参照）、皮膚外用剤に含有させることも既に報告されている（例えば、特許文献６を参照）。しかしながら、皮膚におけるＡＤＭ又はＡＤＭ関連ペプチドの生物活性はあまり詳しく研究されておらず、取り分け、ＡＤＭ又はＡＤＭ関連ペプチドと色素沈着症状との関連性については報告されていないのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００９−０６７８０４号公報
【特許文献２】特開２００３−０８１７４７号公報
【特許文献３】特開２００８−０９４７３７号公報
【特許文献４】特開２００６−２９０８１４号公報
【特許文献５】特開２００７−１４５８５０号公報
【特許文献６】特開２００３−１０４９１３号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｋｉｔａｍｕｒａ  Ｋ．ｅｔ．  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ，１９２，５５３−５６０（１９９３）
【非特許文献２】Ｓｈｉｍｏｓａｗａ  Ｔ．ｅｔ．ａｌ．，  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９６，１６７２（１９９５）
【非特許文献３】Ｍｉｙａｓｈｉｔａ  Ｋ．ｅｔ．ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，５４４，８６−９２（２００３）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上記の様な状況を鑑みてなされたものであり、優れた美白成分の発見に繋がる技術を確立することを課題とする。特に、既知の作用機序に基づいた美白作用に着目するだけでは、優れた美白成分を発見することは困難であると考えられる。
即ち、本発明は、新規な作用機序に基づいた美白作用を評価し得る方法を確立することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者等は、上記の課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、紫外線照射等のメラニン産生を亢進させる要因によって、ケラチノサイトのＡＤＭ産生量（ＡＤＭ遺伝子発現量）、及びＡＤＭ様ペプチドであるＡＤＭ２／ＩＭＤ産生量（ＡＤＭ２／ＩＭＤ遺伝子発現量）が増加し、さらにＡＤＭ量、ＰＡＭＰ量及びＡＤＭ２／ＩＭＤ量の増加に伴って、色素細胞（メラノサイト）のメラニン産生量が増加する事実を明らかにした。
これらの知見に基づき、本発明者らはさらに鋭意検討を重ね、これらのペプチドの産生を抑制する成分を精度よく、効率的に評価し得る方法を確立した。さらにかかる方法によって評価し、選択した成分を含有した組成物が、色素沈着予防又は改善作用を発揮することを確認した。即ち本発明は、以下に示す通りである。
【００１０】
＜１＞  アドレノメジュリン（ＡＤＭ：Ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ）、プロアドレノメジュリンＮ−末端２０ペプチド（ＰＡＭＰ：Ｐｒｏａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ２０  ｐｅｐｔｉｄｅ）、及びアドレノメジュリン２／インテルメジン（ＡＤＭ２／ＩＭＤ：Ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ２／Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｎ）からなる群より選ばれる少なくとも１種のペプチドの産生抑制作用を評価する工程を含むメラニン産生抑制剤のスクリーニング方法であって、
前記ペプチドの産生抑制作用の評価が、被験物質を添加した場合の細胞、及び被験物質を添加しない場合の細胞における前記ペプチドの産生量又は前記ペプチドに係る遺伝子発現量を比較して行われることを特徴とする、メラニン産生抑制剤のスクリーニング方法。
＜２＞  前記細胞にＡＤＭ等産生促進因子を付与する工程を含む、＜１＞に記載のメラニン産生抑制剤のスクリーニング方法。
＜３＞  前記ＡＤＭ等産生促進因子の付与が、紫外線照射及び／又はメラニン添加である、＜２＞に記載のメラニン産生抑制剤のスクリーニング方法。
＜４＞前記ペプチドに係る遺伝子発現量が、ＡＤＭｍＲＮＡ発現量及び／又はＡＤＭ２／ＩＭＤｍＲＮＡ発現量である、＜１＞〜＜３＞の何れかに記載のメラニン産生抑制剤のスクリーニング方法。
＜５＞  前記細胞が、角化細胞（ケラチノサイト）及び／又は色素細胞（メラノサイト）である、＜１＞〜＜４＞の何れかに記載のメラニン産生抑制剤のスクリーニング方法。
＜６＞  ＜１＞〜＜５＞の何れかに記載のメラニン産生抑制剤のスクリーニング方法により選択されたメラニン産生抑制剤を含有することを特徴とする、美白用組成物。
＜７＞  皮膚外用剤である、＜６＞に記載の美白用組成物。
＜８＞化粧料（但し、医薬部外品を含む）である、＜６＞又は＜７＞に記載の美白用組成物。
＜９＞  ＜１＞〜＜５＞の何れかに記載のメラニン産生抑制剤のスクリーニング方法によりメラニン産生抑制作用を有すると判別された成分を含有させることを特徴とする、美白組成物の製造方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、従来明らかとされていなかったＡＤＭ、ＰＡＭＰ又はＡＤＭ２／ＩＭＤ産生に起因したメラニン産生量の増加を抑制する新規なメラニン産生抑制剤を、精度よく、かつ簡便に選択することができる。また、かかるメラニン産生抑制剤を利用した美白用組成物、並びにその製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】紫外線照射によるケラチノサイトにおけるＡＤＭ遺伝子発現量の検討結果を示す図である。
【図２】メラニン添加によるケラチノサイトにおけるＡＤＭ遺伝子発現量の検討結果を示す図である。
【図３】紫外線照射によるケラチノサイトにおけるＡＤＭ２／ＩＭＤ遺伝子発現量の検討結果を示す図である。
【図４】ケラチノサイト及びメラノサイト共培養系におけるｓｉ−ＲＮＡ添加によるメラニン産生量及び細胞数変化の検討結果を示す図である。
【図５】ＡＤＭ添加によるメラノサイトのメラニン産生量及び細胞数に関する検討結果である。
【図６】ＰＡＭＰ添加によるメラノサイトのメラニン産生量及び細胞数に関する検討結果を示す図である。
【図７】ＡＤＭ２／ＩＭＤ添加によるメラノサイトのメラニン産生量及び細胞数に関する検討結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明するが、本発明はこれらの内容に限定されるものではない。
【００１４】
＜本発明のメラニン産生抑制剤のスクリーニング方法＞
本発明のメラニン産生抑制剤のスクリーニング方法は、アドレノメジュリン（ＡＤＭ：Ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ）、プロアドレノメジュリンＮ−末端２０ペプチド（ＰＡＭＰ：Ｐｒｏａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ２０  ｐｅｐｔｉｄｅ）、及びアドレノメジュリン２／インテルメジン（ＡＤＭ２／ＩＭＤ：Ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ２／Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｎ）からなる群より選ばれる少なくとも１種のペプチドの産生抑制作用を評価する工程を含むことを特徴とする。ＰＡＭＰはＡＤＭ前駆体ペプチドのＮ末端領域から生合成されるＡＤＭ遺伝子関連ペプチドであり、ＡＤＭ２／ＩＭＤはＡＤＭと同様にカルシトニン遺伝子関連ペプチドファミリーに属するＡＤＭ様ペプチドである。ＡＤＭを含めたこれらのＡＤＭ関連ペプチドは血圧低下等の共通した作用を発揮することが知られている。本発明者らは、ケラチノサイト等におけるこれらのペプチドの産生量が、紫外線照射等のメラニン産生を亢進する要因によって増加し、さらにこれらのペプチドの産生量の増加に伴って、メラノサイトのメラニン産生量が増加する事実を明らかにした。即ち、これらのペプチドの産生を抑制できる成分が、メラニン産生抑制剤となり得ることを明らかとしたのである。これらのペプチドに関連したメラニン産生抑制作用は、本発明者らの知る限り報告されておらず、かかるメラニン産生抑制作用を発揮する成分は、新規な作用機序に基づくメラニン産生抑制剤と言える。本発明のメラニン産生抑制剤のスクリーニング方法は、かかるメラニン産生抑制剤を評価・選択することができるスクリーニング方法である。
【００１５】
本発明のメラニン産生抑制剤のスクリーニング方法は、メラニン産生抑制剤として評価される被験物質のＡＤＭ、ＰＡＭＰ、及びＡＤＭ２／ＩＭＤの何れかのペプチドの産生抑制作用を評価する工程を含むものであるが、かかる評価を、被験物質を添加した場合の細胞、及び被験物質を添加しない場合の細胞におけるＡＤＭ、ＰＡＭＰ、若しくはＡＤＭ２／ＩＭＤの産生量又はこれらのペプチドに係る遺伝子発現量を測定し、その値を比較して行う。ここで「比較」とは、被験物質のペプチド産生抑制作用を評価する上で、被験物質を添加しない場合の値を基準として評価することを意味している。ＡＤＭ産生抑制作用を評価する場合を例に挙げて具体的に説明すると、被験物質を添加した場合の細胞、及び被験物質を添加しない場合のＡＤＭ産生量又はＡＤＭ遺伝子発現量を測定し、被験物質を添加した細胞のＡＤＭ産生量又はＡＤＭ遺伝子発現量が、被験物質を添加しない細胞に比べて小さい場合、被験物質によってＡＤＭ産生が抑制されている、即ち被験物質にはＡＤＭ産生抑制作用があると評価することができる。上述のようなＡＤＭ産生抑制作用の評価は、ＰＡＭＰ産生抑制作用及びＡＤＭ２／ＩＭＤ産生抑制作用を評価する場合にも当てはまり、ＰＡＭＰ産生抑制作用を評価する場合にはＰＡＭＰ産生量又はＡＤＭ遺伝子発現量、ＡＤＭ２／ＩＭＤ産生抑制作用を評価する場合にはＡＤＭ２／ＩＭＤ産生量又はＡＤＭ２／ＩＭＤ産生量を測定することによって評価することができる。
【００１６】
本発明のメラニン産生抑制剤のスクリーニング方法は、上述の方法によって被験物質のＡＤＭ、ＰＡＭＰ、及びＡＤＭ２／ＩＭＤの何れかの産生抑制作用を評価する工程を含むものであれば、スクリーニングにおけるその他の工程は特に限定されない。被験物質にＡＤＭ、ＰＡＭＰ、及びＡＤＭ２／ＩＭＤの何れかの産生抑制作用があると評価された場合には、メラニン産生抑制作用がある、即ちメラニン産生抑制剤として選択されるほか、複数の被験物質についてＡＤＭ等の産生抑制作用を定量的に算出し、これらを相対的に比較して、被験物質のメラニン産生抑制作用の強弱を判断するものであってもよい。さらに、ＡＤＭ等の産生抑制作用についての判定基準を予め設けて置き、その判定基準以上のＡＤＭ等の産生抑制作用が得られた被験物質をメラニン産生抑制剤と判断するものであってもよい。また、本発明のメラニン産生抑制剤のスクリーニング方法は、被験物質のＡＤＭ産
生抑制作用、ＰＡＭＰ産生抑制作用、及びＡＤＭ２／ＩＭＤ産生抑制作用の少なくとも１種を評価するものであればよく、２種或いは全てを評価するものであってもよい。
【００１７】
以下、本発明のスクリーニング方法における工程について、ＡＤＭ産生抑制作用を評価するスクリーニング方法を例に挙げて詳細に説明するが、本発明の要旨を超えない限り、これらの方法に限定されるものではなく、さらに工程の内容はＰＡＭＰ及びＡＤＭ２／ＩＭＤの産生抑制作用を評価する場合に当てはめることができる。
【００１８】
本発明のスクリーニング方法は、以下の工程を含むものが挙げられる。
（i）評価に使用する細胞に、被験物質を添加する（比較対照として被験物質を添加しない細胞も用意する）
（ii）被験物質の添加及び非添加の場合のＡＤＭ産生量又はＡＤＭ遺伝子発現量を測定する
（iii）測定したＡＤＭ産生量又はＡＤＭ遺伝子発現量を比較して、被験物質のＡＤＭ産生抑制作用を評価する
（iv）評価したＡＤＭ産生抑制作用を、予め設定した基準に基づいて判定し、被験物質を判別する
【００１９】
本発明のスクリーニング方法に使用する細胞は、ＡＤＭ、ＰＡＭＰ又はＡＤＭ２／ＩＭＤの産生量、又はこれらのペプチドに係る遺伝子発現量を測定できる細胞であれば特段限定されないが、例えばＡＤＭ、ＰＡＭＰ及びＡＤＭ２／ＩＭＤの産生量とメラニン産生抑制作用との関連性が明らかにされたケラチノサイト及びメラノサイトのほか、線維芽細胞、副腎髄質細胞、血管内皮細胞、単球／マクロファージ、心筋細胞等のＡＤＭ産生細胞又は、更には、遺伝子導入等により作製されたＡＤＭ（過剰）発現細胞等が好適なものとして例示できる。また、ケラチノサイト及びメラノサイトの共培養系を用いることもできる。これらの細胞の内、ケラチノサイトを使用することが好ましい。メラニン産生抑制剤を含有する組成物の使用形態が、主に皮膚外用剤であり、適応部位として皮膚が想定されるためである。
【００２０】
本発明のスクリーニング方法は、評価に使用する細胞に、紫外線照射、メラニン添加、サイトカイン添加、その他メラニン産生を亢進する因子を付与する操作が含まれてもよい。かかる操作が含まれると、日焼け等のメラニン産生が亢進した状態に近い態様で評価することになり、スクリーニングをする上で有効である。実際、メラニン産生抑制剤のスクリーニング方法において、紫外線照射等の操作を加える方法が報告されている（例えば、特開２０１１−００１３２６号公報を参照）。特に、試験例１、２及び３に示されるように、紫外線照射やメラニン添加等は、ＡＤＭ産生及びＡＤＭ２／ＩＭＤ産生を促進する因子にもなる。従って、このような因子を付与した上で、ＡＤＭ、ＰＡＭＰ若しくはＡＤＭ２／ＩＭＤの産生量又は遺伝子発現量を測定すると、測定精度、測定感度、再現性等の実験操作面からも好ましくなる。本発明においては、紫外線等のＡＤＭ、ＰＡＭＰ、又はＡＤＭ２／ＩＭＤの何れかのペプチドの産生を促進する因子をＡＤＭ等産生促進因子といい、本発明のスクリーニング方法は、ＡＤＭ等産生促進因子を付与する工程が含まれることが好ましい。また、ＡＤＭ等産生促進因子の付与は、本発明のスクリーニング方法における何れの段階で行われてもよく、細胞を培養する際、又は被験物質を添加した後であってもよい。
【００２１】
上記（ii）の工程におけるＡＤＭ産生量又はＡＤＭ遺伝子発現量の測定は、被験物質のＡＤＭ産生抑制作用を評価するために利用される測定値である。ＡＤＭ産生量又はＡＤＭ遺伝子発現量を測定する方法としては、例えば、ＡＤＭ遺伝子発現量を測定する方法（特表２００６−５１８０３１号公報参照）、標識抗体等を用いＡＤＭ産生量を直接測定する方法（特開平０７−１９６６９３号公報参照）が挙げられる。また、ＡＤＭ産生抑制作用
を評価できる測定値であれば、ＡＤＭ産生量又はＡＤＭ遺伝子発現量と関連性が高い物性値を測定して代用してもよい。例えば、ＡＤＭ産生関連酵素（合成又は分解酵素）活性を測定する方法が挙げられる。ＡＤＭ産生量又はＡＤＭ遺伝子発現量の測定方法は特に限定されないが、測定感度、操作の簡便性、再現性等の理由により、ＡＤＭ遺伝子発現量を測定することが好ましく、ＡＤＭｍＲＮＡ発現量を測定することが特に好ましい。
【００２２】
ＡＤＭ遺伝子発現量を測定する方法としては、ｍＲＮＡ遺伝子発現量を測定可能なノーザンブロット法（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ）、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ：Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、リアルタイムＰＣＲ（Ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ＰＣＲ）法、更には、リアルタイムＰＣＲとＲＴ−ＰＣＲを組み合わせた測定方法等が挙げられる。測定感度及び測定の簡便性などの面より、リアルタイムＰＣＲ法によってＡＤＭｍＲＮＡ遺伝子発現量を測定する方法が好ましい。かかる方法は、被験物質の添加、並びに、紫外線照射、メラニン添加等のメラニン産生促進要因の影響を受けることなく精度よく、簡便に測定することができる。ＡＤＭｍＲＮＡ遺伝子発現量の測定は、市販の簡易測定キットを使用することにより簡便に行うことができる。例えばＱＩＡＧＥＮ社より販売されているＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを使用してｍＲＮＡを抽出し、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社より販売されているＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＶＩＬＯ  ｃＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔを用いてｃ−ＤＮＡ（プライマー配列非公開）を合成した後、リアルタイムＰＣＲ法により、目的とするＡＤＭｍＲＮＡ遺伝子発現量を測定する方法が好適なものとして例示できる。
ＡＤＭ２／ＩＭＤ遺伝子発現量を測定する場合には、上記ＡＤＭ遺伝子発現量を測定する方法で記載した測定方法を当てはめて測定するほか、公知の方法を適宜利用することができる。
【００２３】
ＡＤＭ産生量を測定する方法としては、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ／ＥＬＩＳＡ）法、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法、又はウェスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｎｂｌｏｔ）法等の抗原抗体反応を利用した公知の測定方法が挙げられる。また、ＰＡＭＰ及びＡＤＭ２／ＩＭＤ産生量を測定する場合にも適用することができ、これらのＡＤＭ関連ペプチドの質量の測定は、市販されているキットを利用して好適に実施することができる。市販されているキットとしては、Ｐｈｅｎｉｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ製の以下の測定キットが好適なものとして例示出来る。
・ＡＤＭ測定キット
Ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ（１−５２）（Ｈｕｍａｎ）−ＥＩＡ  Ｋｉｔ
Ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ（１−５２）（Ｈｕｍａｎ）−Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ
ＥＩＡ  ＫＩＴ
Ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ（１−５２）（Ｈｕｍａｎ）−ＲＩＡ  Ｋｉｔ
・ＰＡＭＰ測定キット
Ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ  Ｎ−２０，Ｐｒｏ／ＰＡＭＰ−２０／Ｐｒｏｄｅｐｉｎ（Ｈｕｍａｎ）−ＥＩＡ  Ｋｉｔ
Ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ  Ｎ−２０，Ｐｒｏ／ＰＡＭＰ−２０／Ｐｒｏｄｅｐｉｎ（Ｈｕｍａｎ）−ＲＩＡ  Ｋｉｔ
・ＡＤＭ２／ＩＭＤ測定キット
Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｎ／Ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ−２（Ｈｕｍａｎ）−ＥＩＡ  Ｋｉｔ
Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｎ／Ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ−２（Ｈｕｍａｎ）−ＲＩＡ  Ｋｉｔ
【００２４】
上記（iii）工程における被験物質のＡＤＭ産生抑制作用を評価する方法も特段限定されず、例えば以下の式［数１］を用いて算出する方法が挙げられる。
【数１】
0005901179.tif 000002
また、ＡＤＭ産生抑制作用を評価に使用する測定値（ＡＤＭ産生量又はＡＤＭ遺伝子発現量）も１種類に限定されず、上記複数種類の測定値を用い、任意の処理方法によってＡＤＭ産生抑制作用を評価してもよい。
さらに、上記（ii）の工程において測定されたＡＤＭ産生量又はＡＤＭ遺伝子発現量を直接用いて、スクリーニングを行ってもよく、上記（iii）の工程を必要としないものでもよい。
ＰＡＭＰ又はＡＤＭ２／ＩＭＤ産生抑制作用を評価する場合は、ＰＡＭＰ産生量、ＡＤＭ２／ＩＭＤ産生量若しくは遺伝子発現量の数値を［数１］の式に当てはめることによって評価することができる。
【００２５】
上記（iv）の工程の判定に用いる基準も特に限定されず、目的に応じて適宜設定することができる。例えば、実施例１の条件、即ち被験物質添加群及び被験物質非添加群のＡＤＭｍＲＮＡ遺伝子発現量を［数１］の式に代入した場合、メラニン産生抑制剤としては、ＡＤＭ産生抑制作用が１０％以上であることが好ましく、２０％以上であることがより好ましい。また、実施例２の条件、即ち紫外線照射後の被験物質投与群及び被験物質非添加群のＡＤＭｍＲＮＡ遺伝子発現量を［数１］の式に代入した場合、メラニン産生抑制剤としては、ＡＤＭ産生抑制作用が１０％以上であることが好ましく、２０％以上であることがより好ましい。さらに実施例３の条件、メラニン添加後の被験物質投与群及び被験物質非添加群のＡＤＭｍＲＮＡ遺伝子発現量を［数１］の式に代入した場合、メラニン産生抑制剤としては、ＡＤＭ産生抑制作用が１０％以上であることが好ましく、２０％以上であることがより好ましい。かかる値を示すメラニン産生抑制剤を含有する組成物は、優れた色素沈着予防又は改善効果を発揮する。従って、判定に用いる基準も上記範囲に基づいて設定されることが好ましい。
ＰＡＭＰ又はＡＤＭ２／ＩＭＤ産生抑制作用を評価する場合も、判定に用いる基準は特に限定されず、目的に応じて適宜設定することができる。
【００２６】
本発明のスクリーニング方法の対象となる被験物質は、単純な化学物質、動植物由来の抽出物等の混合組成物等の何れであってもよい。動植物由来の抽出物は、動物又は植物由来の抽出物自体のみならず、抽出物の画分、精製した画分、抽出物乃至は画分、精製物の溶媒除去物の総称を意味する。植物由来の抽出物は、自生若しくは生育された植物、漢方生薬原料等として販売されるものを用いた抽出物、市販（丸善製薬株式会社等）されている抽出物等が挙げられる。
抽出操作は、植物部位は全草を用いるほか、植物体、地上部、根茎部、木幹部、葉部、茎部、花穂、花蕾等の部位のみを使用することできるが、予めこれらを粉砕或いは細切して抽出効率を向上させることが好ましい。抽出溶媒としては、水、エタノール、イソプロピルアルコール、ブタノールなどのアルコール類、１，３−ブタンジオール、ポリプロピレングリコールなどの多価アルコール類、アセトン、メチルエチルケトンなどのケトン類、ジエチルエーテル、テトラヒドロフランなどのエーテル類等の極性溶媒から選択される１種乃至は２種以上が好適なものとして例示出来る。具体的な抽出方法としては、例えば、植物体等の抽出に用いる部位乃至はその乾燥物１質量に対して、溶媒を１〜３０質量部加え、室温であれば数日間、沸点付近の温度であれば数時間浸漬し、室温まで冷却し後、所望により不溶物及び／又は溶媒除去し、カラムクロマトグラフィー等で分画精製する方法が挙げられる。
【００２７】
ＡＤＭ産生系に働き掛けるメラニン産生抑制剤の作用機序解明には、ＡＤＭ遺伝子発現を特異的に抑制するｓｉ−ＲＮＡが有用である。本願におけるｓｉ−ＲＮＡは、ＡＤＭ産生遺伝子発現を特異的に抑制する作用を有するｓｉ−ＲＮＡを意味し、具体的には、ＱＩＡＧＥＮ社より販売されているＨｓ  ＡＤＭ  ６  ＦｌｅｘｉＴｕｂｅ  ｓｉ  ＲＮＡにより作製されるｓｉ−ＲＮＡ（プライマー配列は配列表２に記載）等が好適なものとして例示できる。本願では、ＡＤＭ産生とメラニン産生量との関連性を明らかにするためにｓｉ−ＲＮＡを用いている（試験例４参照）。即ち、紫外線照射によってケラチノサイトのＡＤＭ産生量（ＡＤＭ遺伝子発現量）は増加し（試験例１参照）、それと共にメラニン産生量は増加するが、ＡＤＭ産生遺伝子発現を特異的に阻害するｓｉ−ＲＮＡを添加した後、紫外線照射を行った場合には、ｓｉ−ＲＮＡを添加せずに紫外線照射を行った場合に比べてメラニン産生量が低くなることが明らかとなった（試験例４参照）。即ち、ケラチノサイトにおけるＡＤＭ産生量を抑制することにより、メラノサイトにおけるメラニン産生量を減少させることができることを示している。このように、ｓｉ−ＲＮＡをＡＤＭ産生系とメラニン産生量との関連性の解明（メラニン産生抑制剤の作用機序解明）に使用することは、発明者の知る限り報告されていない。かかる技術は、ＡＤＭ産生系に係るメラニン産生抑制剤の作用機序解明に有効な技術である。
【００２８】
以下に、ケラチノサイトのＡＤＭ産生量（ＡＤＭ遺伝子発現量）及びＡＤＭ２／ＩＭＤ産生量（ＡＤＭ２／ＩＭＤ遺伝子発現量）に対する紫外線照射又はメラニン添加の影響、並びにＡＤＭ、ＰＡＭＰ、及びＡＤＭ２／ＩＭＤとメラニン産生量との関係性について検証した結果を示す。
【００２９】
＜試験例１：紫外線照射によるケラチノサイトにおけるＡＤＭ遺伝子発現量の検討＞
以下の手順に従い、ケラチノサイトのＡＤＭ遺伝子発現量に与える紫外線照射の影響を検討した。
１）４８穴プレートに正常ケラチノサイト（ＮＨＥＫ）（倉敷紡績株式会社）を、７．０×１０4（ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）の密度で、Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２培地（倉敷紡績株式会社）を用いて、播種し、２４時間培養した。
２）東芝ＦＬ２０・Ｅ−３０／ＤＭＲランプを使用し、６５ｍＪ／ｃｍ2のＵＶ−Ｂを照射した後、２４時間培養した。
３）再度、東芝ＦＬ２０・ＥＬ−３０／ＤＭＲランプを使用し、６５ｍＪ／ｃｍ2のＵＶ−Ｂを照射し、６時間培養後、Ｂｕｆｆｅｒ  ＲＬＴ（ＱＩＡＧＥＮ社）により細胞を溶解し回収した。
４）細胞回収後、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いｍＲＮＡを抽出し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＶＩＯＬ  ｃＤＮＡ  ｓｙｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いｃＤＮＡ（プライマー配列は非公開）を合成し、Ｈｓ  ＡＤＭ  １  ＳＧ  ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ａｓｓａｙ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用い、リアルタイムＰＣＲ法によりＡＤＭ遺伝子発現量を測定した（紫外線照射群）。紫外線照射群のＡＤＭ遺伝子発現量は、ＴＢＰ（ＴＢＰ：ＴＡＴＡ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ、内在性コントロール、ＴＡＴＡ  ｂｏｘ結合因子であり、ハウスキーピング遺伝子の一種、プライマー配列は配列表１に記載）のｍＲＮＡ発現量を測定し、ＴＢＰのｍＲＮＡ発現量との比率で算出した。
５）紫外線非照射サンプルのＡＤＭｍＲＮＡ発現量を同様に測定し、測定された紫外線非照射サンプルのＡＤＭｍＲＮＡ発現量を、ＴＢＰのｍＲＮＡ発現量との比率で算出した。
【００３０】
結果を図１に示す。紫外線照射によって、ケラチノサイトのＡＤＭｍＲＮＡ発現量が増加することが確認された。即ち、メラニン産生を亢進する要因によって、ケラチノサイトのＡＤＭ産生量が増加することが明らかである。
【００３１】
＜試験例２：メラニン添加によるケラチノサイトにおけるＡＤＭ産生遺伝子発現量の検討
＞
以下の手順に従い、ケラチノサイトのＡＤＭ遺伝子発現量に与えるメラニン添加の影響を検討した。
１）４８穴プレートに正常ケラチノサイト（ＮＨＥＫ）（倉敷紡績株式会社）を、３．０×１０4（ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）の密度で、Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２培地（倉敷紡績株式会社）を用いて、播種し、播種と同時に、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ：Ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ、和光純薬工業株式会社）に懸濁した合成メラニン（ＳＩＧＭＡ社）を最終濃度１．５×１０-3（％）になるように添加し、６時間培養後、Ｂｕｆｆｅｒ  ＲＬＴ（ＱＩＡＧＥＮ社）により細胞を溶解し回収した。
２）細胞回収後、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いｍＲＮＡを抽出し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＶＩＯＬ  ｃＤＮＡ  ｓｙｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いｃＤＮＡ（プライマー配列は非公開）を合成し、Ｈｓ  ＡＤＭ  １  ＳＧ  ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ａｓｓａｙ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用い、リアルタイムＰＣＲ法によりＡＤＭ遺伝子発現量を測定した。メラニン添加サンプルのＡＤＭｍＲＮＡ発現量は、ＴＢＰ（内在性コントロール、プライマー配列は配列表１に記載）のｍＲＮＡ発現量を測定し、ＴＢＰのｍＲＮＡ発現量との比率で算出した。
３）メラニン非添加サンプルのＡＤＭｍＲＮＡ発現量を同様に測定し、測定されたメラニン非添加サンプルのＡＤＭｍＲＮＡ発現量を、ＴＢＰのｍＲＮＡ発現量との比率で算出した。
【００３２】
結果を図２に示す。メラニン添加によって、ケラチノサイトのＡＤＭｍＲＮＡ発現量が増加することが確認された。試験例１の紫外線照射と同様に、メラニン添加によって、ケラチノサイトのＡＤＭ産生量が増加することが明らかである。
【００３３】
＜試験例３：紫外線照射によるケラチノサイトにおけるＡＤＭ２／ＩＭＤ産生遺伝子発現量の検討＞
以下の手順に従い、ケラチノサイトのＡＤＭ２／ＩＭＤ遺伝子発現量に与える紫外線照射の影響を検討した。
１）４８穴プレートに正常ケラチノサイト（ＮＨＥＫ）（倉敷紡績株式会社）を、７．０×１０4（ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）の密度で、Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２培地（倉敷紡績株式会社）を用いて、播種し、２４時間培養した。
２）東芝ＦＬ２０・Ｅ−３０／ＤＭＲランプを使用し、６５ｍＪ／ｃｍ2のＵＶ−Ｂを照射した後、２４時間培養した。
３）再度、東芝ＦＬ２．０・ＥＬ−３０／ＤＭＲランプを使用し、６５ｍＪ／ｃｍ2のＵＶ−Ｂを照射し、６時間培養後、Ｂｕｆｆｅｒ  ＲＬＴ（ＱＩＡＧＥＮ社）により細胞を溶解し回収した。
４）細胞回収後、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いｍＲＮＡを抽出し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＶＩＯＬ  ｃＤＮＡ  ｓｙｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いｃＤＮＡ（プライマー配列は非公開）を合成し、ＨＳ  ＡＤＭ２  １  ＳＧ  ＱｕａｎｔｉＴｅｓｔ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ａｓｓａｙ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用い、リアルタイムＰＣＲ法により遺伝子発現量を測定した（紫外線照射群）。紫外線照射群のＡＤＭ２／ＩＭＤ遺伝子発現量は、ＴＢＰ（ＴＢＰ：ＴＡＴＡ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ、内在性コントロール、ＴＡＴＡ  ｂｏｘ結合因子であり、ハウスキーピング遺伝子の一種、プライマー配列は配列表１に記載）のｍＲＮＡ発現量を測定し、ＴＢＰのｍＲＮＡ発現量との比率で算出した。
５）紫外線非照射サンプルのＡＤＭ２／ＩＭＤｍＲＮＡ発現量を同様に測定し、測定された紫外線非照射サンプルのＡＤＭ２／ＩＭＤｍＲＮＡ発現量を、ＴＢＰのｍＲＮＡ発現量との比率で算出した。
【００３４】
結果を図３に示す。紫外線照射によって、ケラチノサイトのＡＤＭ２／ＩＭＤ遺伝子発
現量が増加することが確認された。即ち、メラニン産生を亢進する要因によって、ＡＤＭ２／ＩＭＤの産生量も増加することが確認された。
【００３５】
＜試験例４：ケラチノサイト及びメラノサイト共培養系におけるｓｉ−ＲＮＡ添加によるメラニン産生量及び細胞数変化の検討＞
以下の手順に従い、ケラチノサイト及びメラノサイト共培養系における紫外線照射によるメラニン産生量変化を検討した。更に、ケラチノサイト及びメラノサイト共培養系における紫外線照射により増加したメラニン産生量に対するＡＤＭ産生遺伝子発現を特異的に阻害するｓｉ−ＲＮＡ添加の影響を調べた。
１）４８穴プレートに、正常ヒトケラチノサイト（ＮＨＥＫ）（倉敷紡績株式会社）を、７．０×１０4（ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）の密度で、また、正常ヒトメラノサイト（ＮＨＥＭ）（倉敷紡績株式会社）を２．６×１０4（ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）の密度でＨｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２培地（倉敷紡績株式会社）を用いて播種し、２４時間培養した（Ｕ紫外線非照射群）。
２）ｓｉ−ＲＮＡ溶液を、Ｈｓ  ＡＤＭ  ６  ＦｌｅｘｉＴｕｂｅ  ｓｉＲＮＡ（ＱＩＡＧＥＮ社、プライマー配列は配列２に記載）を用い作製した後、上記細胞に添加した。
３）ｓｉ−ＲＮＡ溶液添加２４時間、４８時間後に東芝ＦＬ２０Ｓ・Ｅ−３０／ＤＭＲランプで６５ｍＪ／ｃｍ2の紫外線（ＵＶ−Ｂ）を照射した（紫外線照射＋ｓｉ−ＲＮＡ添加群）。その後14Ｃ−ｔｈｉｏｕｒａｃｉｌを０．２５μＣｉ／ｗｅｌｌ添加した。
４）比較対照群として、紫外線照射を行い、ｓｉ−ＲＮＡを添加しない群（紫外線照射群）を設定した。
５）さらに４８時間培養後Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８（株式会社  同仁化学研究所）を用い、細胞数を測定後、液体シンチレーションカウンター（アロカ株式会社）により14Ｃの取り込みを測定した。メラニン産生量は、紫外線照射群から回収した細胞の放射線量を１００％とした場合の、紫外線非照射群又は紫外線照射＋ｓｉ−ＲＮＡ添加群から回収した細胞の放射線量の百分率として算出した。即ち、各細胞内に取り込まれた放射線量が小さい程、メラニン量が小さいと判断することができる。
【００３６】
結果を図４に示す。ケラチノサイト及びメラノサイト共培養系における紫外線照射群のメラニン産生量は、紫外線非照射群に比較して多いことが明らかである。この場合、細胞数には大きな変化は認められなかった。一方、ケラチノサイト及びメラノサイト共培養系にｓｉ−ＲＮＡを添加した後に、紫外線照射した場合にはｓｉ−ＲＮＡを添加せずに紫外線照射した紫外線照射群と比較してメラニン産生量が少ないことが確認された。即ち、ＡＤＭ産生遺伝子発現を特異的に抑制するｓｉ−ＲＮＡの添加によって、メラニン産生量が減少することが確認された。このことは、ケラチノサイトにより産生されたＡＤＭがメラノサイトのメラニン産生量を調節していることを示しており、ＡＤＭ産生を抑制することによりメラニン産生も抑制できることを示している。
【００３７】
＜試験例５：ＡＤＭ添加によるメラノサイトのメラニン産生量及び細胞数に関する検討＞
以下の手順に従い、ＡＤＭ添加によるメラノサイトの産生量及び細胞数への影響を検討した。
１）４８穴プレートに正常ヒトメラノサイト（ＮＨＥＭ）（倉敷紡績株式会社）１．５×１０4（ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）の密度での密度で、Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２培地（倉敷紡績株式会社）を用いて、播種し、２４時間培養した。
２）合成ＡＤＭ（ペプチド研究所）を２（μＭ）になる様に添加し、その後14Ｃ−ｔｈｉｏｕｒａｃｉｌを０．２５μＣｉ／ｗｅｌｌ添加した。
３）ＣＯ2インキュベーターにて７２時間培養後、Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８（株式会社  同仁化学研究所）を用い、細胞数を測定後、液体シンチレーションカウンター（アロカ株式会社）により14Ｃの取り込みを測定した。メラニン産生量は、ＡＤＭを添加した細胞の放射線量を、ＡＤＭを添加しない細胞の放射線量の比率で算出した。即
ち、各細胞内に取り込まれた放射線量が小さい程、メラニン量が小さいと判断することができる。
【００３８】
結果を図５に示す。ＡＤＭを添加することによりメラノサイトのメラニン産生量が増加することが確認された。このことは、ＡＤＭ産生を抑制することにより、メラニン産生も抑制できることを示していると言える。
【００３９】
＜試験例６：ＰＡＭＰ添加によるメラノサイトのメラニン産生量及び細胞数に関する検討＞
以下の手順に従い、ＰＡＭＰ添加によるメラノサイトの産生量及び細胞数への影響を検討した。
１）４８穴プレートに正常ヒトメラノサイト（ＮＨＥＭ）（倉敷紡績株式会社）１．５×１０4（ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）の密度での密度で、Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２培地（倉敷紡績株式会社）を用いて、播種し、２４時間培養した。
２）合成ＰＡＭＰ（ペプチド研究所）を２（μＭ）になる様に添加し、その後14Ｃ−ｔｈｉｏｕｒａｃｉｌを０．２５μＣｉ／ｗｅｌｌ添加した。
３）ＣＯ2インキュベーターにて７２時間培養後、Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８（株式会社  同仁化学研究所）を用い、細胞数を測定後、液体シンチレーションカウンター（アロカ株式会社）により14Ｃの取り込みを測定した。メラニン産生量は、ＰＡＭＰを添加した細胞の放射線量を、ＰＡＭＰを添加しない細胞の放射線量の比率で算出した。即ち、各細胞内に取り込まれた放射線量が小さい程、メラニン量が小さいと判断することができる。
【００４０】
結果を図６に示す。ＰＡＭＰを添加することによりメラノサイトのメラニン産生量が増加することが確認された。このことは、ＰＡＭＰ産生を抑制することにより、メラニン産生も抑制できることを示していると言える。
【００４１】
＜試験例７：ＡＤＭ２／ＩＭＤ添加によるメラノサイトのメラニン産生量及び細胞数に関する検討＞
以下の手順に従い、ＡＤＭ２／ＩＭＤ添加によるメラノサイトの産生量及び細胞数への影響を検討した。
１）４８穴プレートに正常ヒトメラノサイト（ＮＨＥＭ）（倉敷紡績株式会社）１．５×１０4（ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）の密度での密度で、Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２培地（倉敷紡績株式会社）を用いて、播種し、２４時間培養した。
２）合成ＡＤＭ２／ＩＭＤ（ペプチド研究所）を２（μＭ）になる様に添加し、その後14Ｃ−ｔｈｉｏｕｒａｃｉｌを０．２５μＣｉ／ｗｅｌｌ添加した。
３）ＣＯ2インキュベーターにて７２時間培養後、Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８（株式会社  同仁化学研究所）を用い、細胞数を測定後、液体シンチレーションカウンター（アロカ株式会社）により14Ｃの取り込みを測定した。メラニン産生量は、ＡＤＭ２／ＩＭＤを添加した細胞の放射線量を、ＡＤＭ２／ＩＭＤを添加しない細胞の放射線量の比率で算出した。即ち、各細胞内に取り込まれた放射線量が小さい程、メラニン量が小さいと判断することができる。
【００４２】
結果を図７に示す。ＡＤＭ２／ＩＭＤを添加することによりメラノサイトのメラニン産生量が増加することが確認された。このことは、ＡＤＭ２／ＩＭＤ産生を抑制することにより、メラニン産生も抑制できることを示していると言える。
【００４３】
＜本発明の美白用組成物及び美白用組成物の製造方法＞
上述した本発明のメラニン産生抑制剤のスクリーニング方法によって、メラニン産生抑制効果に優れるメラニン産生抑制剤を選択することができるが明らかであるが、本スクリ
ーニング方法により選択されたメラニン産生抑制剤を用い調製された美白用組成物、及び本スクリーニング方法を利用して美白用組成物を製造する方法も本発明である。
本発明の美白用組成物及び美白用組成物の製造方法は、上述したスクリーニング方法によって選択されたメラニン産生抑制剤を用いるものであれば、その他の構成については特に限定されず、公知の調製方法を適宜用いることができる。
【００４４】
本発明の美白用組成物及び美白用組成物の製造方法における、メラニン産生抑制剤の量は特段限定されないが、美白用組成物全量に対し、０．００００１質量％〜１５質量％、より好ましくは、０．０００１質量％〜１０質量％、さらに好ましくは、０．００１質量〜５質量％含有させることが好ましい。メラニン産生抑制剤の含有量が少なすぎると、目的とする色素沈着予防又は改善効果が低下する傾向にあり、多すぎても効果が頭打ちになる傾向があり、この系の自由度を損なう場合がある。
また、美白用組成物に含有させるメラニン産生抑制剤の種類も１種類に限定されず、２種類以上を含有させてもよい。
【００４５】
本発明の美白用組成物の製剤化にあたっては、通常の食品、医薬品、化粧料などの製剤化で使用される任意成分を含有することができる。この様な任意成分としては、経口投与組成物であれば、例えば、乳糖や白糖などの賦形剤、デンプン、セルロース、アラビアゴム、ヒドロキシプロピルセルロースなどの結合剤、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウムなどの崩壊剤、大豆レシチン、ショ糖脂肪酸エステルなどの界面活性剤、マルチトールやソルビトールなどの甘味剤、クエン酸などの酸味剤、リン酸塩などの緩衝剤、シェラックやツェインなどの皮膜形成剤、タルク、ロウ類などの滑沢剤、軽質無水ケイ酸、乾燥水酸化アルミニウムゲルなどの流動促進剤、生理食塩水、ブドウ糖水溶液などの希釈剤、矯味矯臭剤、着色剤、殺菌剤、防腐剤、香料など好適に例示出来る。経皮投与組成物であれば、スクワラン、ワセリン、マイクロクリスタリンワックスなどの炭化水素類、ホホバ油、カルナウバワックス、オレイン酸オクチルドデシルなどのエステル類、オリーブ油、牛脂、椰子油などのトリグリセライド類、ステアリン酸、オレイン酸、レチノイン酸などの脂肪酸、オレイルアルコール、ステアリルアルコール、オクチルドデカノール等の高級アルコール、スルホコハク酸エステルやポリオキシエチレンアルキル硫酸ナトリウム等のアニオン界面活性剤類、アルキルベタイン塩等の両性界面活性剤類、ジアルキルアンモニウム塩等のカチオン界面活性剤類、ソルビタン脂肪酸エステル、脂肪酸モノグリセライド、これらのポリオキシエチレン付加物、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル等の非イオン界面活性剤類、ポリエチレングリコール、グリセリン、１，３−ブタンジオール等の多価アルコール類、増粘・ゲル化剤、酸化防止剤、紫外線吸収剤、色剤、防腐剤、粉体等を含有することができる。製造は、常法に従い、これらの成分を処理することにより、困難なく、為しうる。
【００４６】
本発明の組成物としては、医薬品、化粧品、食品、飲料などが好適に例示でき、日常的に摂取できることから、食品、化粧品等に適応することが好ましい。その投与経路も、経口投与、経皮投与の何れもが可能であるが、皮膚における色素沈着予防又は改善作用を発揮するためには、皮膚への貯留性、標的部位への到達効率等を考慮し、経皮投与を採用することが好ましい。
【００４７】
また、後述する実施例に記載の本発明のメラニン産生抑制剤であるシソ科ハナハッカ属マジョラムより得られる植物抽出物、トクサ科トクサ属スギナより得られる植物抽出物、マメ科クララ属クララより得られる植物抽出物、アブラナ科オランダカラシ属オランダカラシより得られる植物抽出物、シナノキ科シナノキ属シナノキより得られる植物抽出物は、丸善製薬株式会社より購入した植物抽出物を使用した。シソ科ハナハッカ属マジョラムは、エジプト、地中海沿岸を原産地とする多年草であり、香辛料、精油等に使用されてい
る。また、前記の精油や植物抽出物には、沈静、抗不安作用等が存することが知られている。トクサ科トクサ属スギナは、日本、北半球の温暖地域を原産地とする多年草であり、日本においては、本州、四国、九州の山野、湿地に自生する。また、中国名を問荊と呼ばれ、漢方薬等に使用され、利尿作用、解熱作用、鎮咳作用、皮膚病治療作用等の作用があるとされている。マメ科クララ属は、東アジアを原産地とする多年草であり、本州、四国、九州の日当たりのよい草原等に自生する。根は、苦参（クジン）と呼ばれ、生薬として日本薬局方に収載されている。また、薬理作用としては、消炎、鎮痒、苦味健胃作用等が知られている。アブラナ科オランダカラシ属オランダカラシは、欧州、中央アジアを原産地とする多年草であり、日本各地の水中や湿地に自生する。別名クレソンとも呼ばれ、食用として用いられる。シナノキ科シナノキ属シナノキは、日本を原産地とする落葉高木であり、本州に自生する。街路樹などに見られるシナノキの樹皮は、繊維が強くロープの材料などに使用される。
【００４８】
以下に、本発明について、実施例を挙げて更に詳しく説明するが、本発明がかかる実施例のみに限定されないことは言うまでもない。
【実施例】
【００４９】
＜実施例１：本発明のメラニン産生抑制剤のスクリーニング方法１＞
以下の手順に従い、メラニン産生抑制剤のスクリーニング操作を行った。
１）４８穴プレートに、正常ケラチノサイト（ＮＨＥＫ）（倉敷紡績株式会社）を、７．０×１０4（ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）の密度で、Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２培地（倉敷紡績株式会社）を用いて播種し、２４時間培養した。
２）被験物質の植物抽出物を最終濃度１％となる様に、培地中に添加した。
３）２４時間後にＣｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８（株式会社  同仁化学研究所）溶液を各ウェルに添加した。ＣＯ2インキュベーター内で１時間呈色反応を行った後に、マイクロプレートリーダーを用い、４５０ｎｍ（参照波長：６００ｎｍ以上）の吸光度を測定し細胞数を測定した。細胞数を測定後、細胞をＢｕｆｆｅｒ  ＲＬＴ（ＱＩＡＧＥＮ社）により溶解し、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いｍＲＮＡを抽出、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＶＩＬＯ  ｃＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いｃＤＮＡ（プライマー配列非公開）を合成し、Ｈｓ  ＡＤＭ  １  ＳＧ  ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ａｓｓａｙ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いリアルタイムＰＣＲ法によりｍＲＮＡ発現量を測定した。
４）ＴＢＰ（内在性コントロール、プライマー配列は配列表に記載）のｍＲＮＡ発現量を測定し、被験物質添加及び非添加時のＡＤＭｍＲＮＡ発現量を、ＴＢＰのｍＲＮＡ発現量との比率で算出した。被験物質のＡＤＭ産生抑制作用は、下記［数２］の式に被験物質添加及び非添加時のＡＤＭｍＲＮＡ発現量（ＴＢＰのｍＲＮＡ発現量との比率）を代入して算出した。
【数２】
0005901179.tif 000003
【００５０】
ＡＤＭ産生抑制作用を評価した結果、シソ科ハナハッカ属マジョラムより得られる植物抽出物は１２％、トクサ科トクサ属スギナより得られる植物抽出物は１０％、マメ科クララ属クララより得られる植物抽出物は１４％、アブラナ科オランダカラシ属オランダカラシより得られる植物抽出物は３６％、シナノキ科シナノキ属シナノキより得られる植物抽出物は８５％であった。上記の結果より、シソ科ハナハッカ属マジョラムより得られる植物抽出物、トクサ科トクサ属スギナより得られる植物抽出物、マメ科クララ属クララより得られる植物抽出物、アブラナ科オランダカラシ属オランダカラシより得られる植物抽出
物、シナノキ科シナノキ属シナノキより得られる植物抽出物には、ＡＤＭ産生抑制作用に基づくメラニン産生抑制効果が期待できる。
【００５１】
＜実施例２：本発明のメラニン産生抑制剤のスクリーニング方法２＞
以下の手順に従い、メラニン産生抑制剤のスクリーニング操作を行った。
１）４８穴プレートに正常ヒトケラチノサイト（ＮＨＥＫ）（倉敷紡績株式会社）を、３．０×１０4（ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）の密度で、Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２培地（倉敷紡績株式会社）を用いて播種した。播種と同時にジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ，和光純薬工業株式会社）に懸濁した合成メラニン（ＳＩＧＭＡ社）を最終濃度１．５×１０-3（％）となる様に添加した。
２）細胞播種６時間後に植物抽出物を、最終濃度１％となる様に培地中に添加した。
３）添加２４時間後に細胞回収し、Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８（株式会社
同仁化学研究所）を用い、細胞数を測定後、細胞を回収し、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いｍＲＮＡを抽出、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＶＩＬＯ  ｃＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いｃＤＮＡ（プライマー配列非公開）を合成し、Ｈｓ  ＡＤＭ  １  ＳＧ  ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ａｓｓａｙ  （ＱＩＡＧＥＮ社）を用いリアルタイムＰＣＲ法により発現量を測定した。
４）ＴＢＰ（内在性コントロール、プライマー配列は配列表に記載）のｍＲＮＡ発現量を測定し、被験物質添加及び非添加時のＡＤＭｍＲＮＡ発現量を、ＴＢＰのｍＲＮＡ発現量との比率で算出した。被験物質のＡＤＭ産生抑制作用は、上記［数２］の式に算出した被験物質添加及び非添加時のＡＤＭｍＲＮＡ発現量（ＴＢＰのｍＲＮＡ発現量との比率）を代入して算出した。
【００５２】
メラニンを添加した場合のＡＤＭ産生抑制作用を評価した結果、シソ科ハナハッカ属マジョラムより得られる植物抽出物は３７％、トクサ科トクサ属スギナより得られる植物抽出物は４５％、マメ科クララ属クララより得られる植物抽出物は２６％、アブラナ科オランダカラシ属オランダカラシより得られる植物抽出物は３９％、シナノキ科シナノキ属シナノキより得られる植物抽出物は６８％であった。上記の結果より、シソ科ハナハッカ属マジョラムより得られる植物抽出物、トクサ科トクサ属スギナより得られる植物抽出物、マメ科クララ属クララより得られる植物抽出物、アブラナ科オランダカラシ属オランダカラシより得られる植物抽出物、シナノキ科シナノキ属シナノキより得られる植物抽出物には、ＡＤＭ産生抑制作用に基づくメラニン産生抑制効果が期待できる。
【００５３】
＜実施例３：本発明のメラニン産生抑制剤のスクリーニング方法３＞
以下の手順に従い、メラニン産生抑制剤のスクリーニング操作を行った。
１）４８穴プレートに、正常ケラチノサイト（ＮＨＥＫ）（倉敷紡績株式会社）を、７．０×１０4（ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）の密度で、Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２培地（倉敷紡績株式会社）を用いて播種し、２４時間培養した。
２）被験物質の植物抽出物を最終濃度１％となる様に、培地中に添加した。
３）２４時間後にＣｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８（株式会社  同仁化学研究所）溶液を各ウェルに添加した。ＣＯ2インキュベーター内で１時間呈色反応を行った後に、マイクロプレートリーダーを用い、４５０ｎｍ（参照波長：６００ｎｍ以上）の吸光度を測定し細胞数を測定した。細胞数を測定後、細胞をＢｕｆｆｅｒ  ＲＬＴ（ＱＩＡＧＥＮ社）により溶解し、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いｍＲＮＡを抽出、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＶＩＬＯ  ｃＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いｃＤＮＡ（プライマー配列非公開）を合成し、ＨＳ  ＡＤＭ２  １  ＳＧ  ＱｕａｎｔｉＴｅｓｔ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ａｓｓａｙ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いリアルタイムＰＣＲ法によりＡＤＭ２／ＩＭＤｍＲＮＡ発現量を測定した。
４）ＴＢＰ（内在性コントロ−ル、プライマー配列は配列表１に記載）のｍＲＮＡ発現量
を測定し、被験物質添加及び非添加時のＡＤＭ２／ＩＭＤｍＲＮＡ発現量を、ＴＢＰのｍＲＮＡ発現量との比率で算出した。被験物質のＡＤＭ２／ＩＭＤ産生抑制作用は、［数２］の式（ただし、ＡＤＭｍＲＮＡはＡＤＭ２／ＩＭＤｍＲＮＡに読み替える）に被験物質添加及び非添加時のＡＤＭ２／ＩＭＤｍＲＮＡ発現量（ＴＢＰのｍＲＮＡ発現量との比率）を代入して算出した。
【００５４】
ＡＤＭ２／ＩＭＤ産生抑制作用を評価した結果、オリーブ葉抽出液は２０％、ファーメンテージ  セイヨウナシ抽出物は４２％、ファルコックス  レモングラスＢ、５７％であった。上記の結果より、オリーブ葉抽出液、ファーメンテージ  セイヨウナシ抽出物、ファルコックス  レモングラスＢには、ＡＤＭ２／ＩＭＤ産生抑制作用に基づくメラニン産生抑制効果が期待できる。
【００５５】
＜実施例４：本発明のメラニン産生抑制剤を含有する組成物（皮膚外用剤）＞
以下の手順に従い、本発明のメラニン産生抑制剤のスクリーニング方法により選択されたメラニン産生抑制剤を含有する組成物（皮膚外用剤）を作製した。即ち、表１の処方成分（Ａ）に記載の各成分を合わせ、室温下に溶解した。一方、処方成分（Ｂ）に記載された各成分を室温下に溶解し、これを前記（Ａ）に記載された成分の混合物を加え可溶化し、本発明の美白用組成物（皮膚外用剤１）を得た。また、本発明のシソ科ハナハッカ属マジョラムより得られる植物抽出物を水に置換した比較例１を作製した。
【００５６】
【表１】
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【００５７】
＜試験例８：本発明の組成物（皮膚外用剤）の色素沈着改善作用評価＞
実施例４に記載の方法に従い製造された本発明の組成物（皮膚外用剤１）及び比較例１に関し、以下の手順に従い色素沈着抑制作用を評価した。自由意思で参加したパネラーの上腕内側部に１．５ｃｍ×１．５ｃｍの部位を合計３ヶ所設けた。最少紅斑量（１ＭＥＤ）の紫外線照射を設けた部位に１日１回、３日連続して３回照射した。試験１日目の紫外線照射終了時（一回目照射終了後）より、１日１回３５日連続してローション５０μＬを塗布した。３部位のうち１部位は無処置部位とした。３５回の塗布終了２４時間後に色彩色差計（ＣＲ−３００、コニカミノルタ株式会社）にて各試験部位の皮膚明度（Ｌ＊値）を測定し、処理部位のＬ＊値と無処理部位Ｌ＊値の差（ΔＬ＊値＝処理部位のＬ＊値−無処理部位Ｌ＊値）を算出した。ΔＬ＊値は、色素沈着の程度が大きいほど低い値となる。従って、ΔＬ＊値が大きいほど、色素沈着が改善されたと判断することが出来る。結果を
表２に示す。これにより、本発明の皮膚外用剤１は優れた色素沈着抑制効果を有することが分かる。これは、皮膚外用剤１に含有されるメラニン産生抑制剤（シソ科ハナハッカ属マジョラムより得られる植物抽出物）のＡＤＭ産生抑制作用によって、メラニン産生が抑制されたものと考えられる。
【００５８】
【表２】
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【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明は、食品、医薬品、化粧料等に応用出来る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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