(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）受託番号ＰＴＡ−９８１６によって指定される、ＴｎＩ１９Ｃ７ＡＭ１ｈＧ１ＣＨＯ２０４と呼ばれるチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系。
【請求項２】
請求項１の前記ＣＨＯ細胞系によって産生される組換え抗体。
【請求項３】
トロポニンＩと結合する抗原結合ドメインを含む単離抗体であって、該抗原結合ドメインが、
ＧＹＴＦＴＤＹＮＬＨ（配列番号５２）のアミノ酸配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）１；
ＹＩＹＰＹＮＧＩＴＧＹＮＱＫＦＫＳ（配列番号５３）のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；および
ＤＡＹＤＹＤＹＬＴＤ（配列番号５４）のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３；
を含む重鎖、ならびに
ＲＴＳＫＮＶＧＴＮＩＨ（配列番号５５）のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；
ＹＡＳＥＲＬＰ（配列番号５６）のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；および
ＱＱＳＮＮＷＰＹＴ（配列番号５７）のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３；
を含む軽鎖、
を含む前記抗体。
【請求項４】
ヒトアクセプターフレームワークをさらに含む、請求項３に記載の抗体。
【請求項５】
可変重鎖のアミノ酸配列が配列番号２５であり、および
可変軽鎖のアミノ酸配列が配列番号２８である、抗体をコードする単離核酸分子。
【請求項６】
配列番号２５のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号２８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、単離抗体。
【請求項７】
請求項５に記載の単離核酸分子を含むベクター。
【請求項８】
請求項７に記載のベクターを含む単離宿主細胞。
【請求項９】
トロポニンＩと結合することができる抗体を産生する方法であって、
前記抗体を産生するのに十分な時間および条件下で、請求項８に記載の宿主細胞を培養することを含む、方法。
【請求項１０】
請求項３に記載の抗体、および薬剤として許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項１１】
試験サンプル中のトロポニンＩ抗原を検出する方法であって、
ａ）トロポニンＩと結合し、かつ配列番号２５のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号２８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体と、試験サンプルとを、抗体／抗原複合体の形成に十分な時間および条件下で、接触させるステップ、および
ｂ）前記複合体の存在が、前記試験サンプル中のトロポニンＩ抗原の存在を示す、前記複合体の存在を検出するステップ
を含む、前記方法。
【請求項１２】
前記抗体がＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９８１６を有するＣＨＯ細胞系ＴｎＩ１９Ｃ７ＡＭ１ｈＧ１ＣＨＯ２０４によって産生される、請求項１１の方法。
【請求項１３】
試験サンプル中のトロポニンＩ抗原を検出する方法であって、
ａ）トロポニンＩと結合し、かつ配列番号２５のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号２８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む第一の抗体と、試験サンプルとを、第一の抗体／抗原複合体の形成に十分な時間および条件下で、接触させるステップ、
ｂ）検出可能なシグナルを生成することができるシグナル生成化合物と結合した第二の抗体を含むコンジュゲートを、第一の抗体／抗原／第二の抗体複合体を形成するのに十分な時間および条件下で、前記第一の抗体／抗原複合体に加えるステップ、および
ｃ）前記試験サンプル中のトロポニンＩ抗原の存在を示す、前記シグナル生成化合物によって生成するシグナルの存在を検出するステップ
を含む、前記方法。
【請求項１４】
前記第一の抗体がＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９８１６を有するＣＨＯ細胞系ＴｎＩ１９Ｃ７ＡＭ１ｈＧ１ＣＨＯ２０４によって産生される、請求項１３の方法。
【請求項１５】
試験サンプル中のトロポニンＩ抗原を検出する方法であって、
ａ）配列番号２５のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号２８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、かつ検出可能なシグナルを生成することができるシグナル生成化合物で標識される、トロポニンＩと結合する抗体と、トロポニンＩ抗原とを、トロポニンＩ抗原／抗体複合体を形成するのに十分な時間および条件下で、接触させるステップ、
ｂ）トロポニンＩ抗原／抗体／トロポニンＩ試験サンプル抗原複合体を形成するのに十分な時間および条件下で、前記トロポニンＩ抗原／抗体複合体に試験サンプルを加えるステップ、および
ｃ）前記試験サンプル中のトロポニンＩ抗原の存在を示す、前記シグナル生成化合物によって生成するシグナルの存在を検出するステップ
を含む、前記方法。
【請求項１６】
前記抗体がＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９８１６を有するＣＨＯ細胞系ＴｎＩ１９Ｃ７ＡＭ１ｈＧ１ＣＨＯ２０４細胞系によって産生される、請求項１５の方法。
【請求項１７】
試験サンプル中のトロポニンＩ抗原を検出する方法であって、
ａ）試験サンプルを、１）検出可能なシグナルを生成することができるシグナル生成化合物と結合したトロポニンＩ参照抗原、および２）配列番号２５のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号２８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含むトロポニンＩ抗原に対する抗体と、トロポニンＩ参照抗原／抗体複合体を形成するのに十分な時間および条件下で、接触させるステップ、および
ｂ）前記シグナル生成化合物によって生成するシグナルを検出するステップ
を含み、前記試験サンプル中で検出されるトロポニンＩ抗原の量が前記抗体と結合したトロポニンＩ参照抗原の量と反比例する、前記方法。
【請求項１８】
前記抗体がＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９８１６を有するＣＨＯ細胞系ＴｎＩ１９Ｃ７ＡＭ１ｈＧ１ＣＨＯ２０４によって産生される、請求項１７の方法。
【請求項１９】
患者の急性冠症候群または心筋梗塞の指標として、正常集団の第９９百分位数のトロポニンＩ値の１−５倍を超えるトロポニンＩ抗原量の検出により、急性冠症候群および心筋梗塞の１つを有する疑いがある患者の急性冠症候群または心筋梗塞を診断する、診断薬の製造のための抗体の使用であって、前記抗体が、
トロポニンＩと結合し、かつ配列番号２５のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号２８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み；
トロポニンＩ抗原／抗体複合体の形成に十分な時間および条件下で、患者の生物サンプルと接触させた場合に、トロポニンＩ抗原／抗体複合体を形成し；ならびに
該抗原／抗体複合体から分離したトロポニンＩの検出および測定を可能にする；
前記抗体の使用。  
【請求項２０】
患者の急性冠症候群または心筋梗塞の指標として、正常集団の第９９百分位数のトロポニンＩ値の１−５倍を超えるトロポニンＩ抗原量の検出により、急性冠症候群および心筋梗塞の１つを有する疑いがある患者の急性冠症候群または心筋梗塞を診断する、診断薬の製造のための第一の抗体およびコンジュゲートの使用であって、
前記第一の抗体が、トロポニンＩと結合し、かつ配列番号２５のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号２８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、およびトロポニンＩ抗原／抗体複合体の形成に十分な時間および条件下で、患者の生物サンプルと接触させた場合に、トロポニンＩ抗原／抗体複合体を形成し；ならびに
前記コンジュゲートが、検出可能なシグナルを生成することができるシグナル生成化合物と結合した第二の抗体を含み、該シグナル生成化合物によって生成したシグナルが、該抗原／抗体複合体からのトロポニンＩの検出および測定を可能にする；
前記第一の抗体およびコンジュゲートの使用。
【請求項２１】
請求項３に記載の抗体を含有する容器を含むキット。
【請求項２２】
免疫グロブリン分子、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、ヒト化抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体、ダイアボディ、多重特異性抗体、二機能性抗体、抗イディオタイプ抗体、二重特異性抗体、およびこれらの機能活性エピトープ結合断片からなる群から選択される、請求項３に記載の抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トロポニンＩに対する抗体およびこれらの使用法に関する。
【背景技術】
【０００２】
トロポニンＩは、例えば心筋梗塞後、またはその最中の心筋損傷を判定する際に使用することができる筋タンパク質である。特に、トロポニンＩは、筋収縮装置の細フィラメント上に位置するトロポニン複合体の３サブユニットの１つである。この複合体は、筋収縮のプロセスを制御する際に主な役割を有する。他の２つのサブユニット（すなわちＴおよびＣ）も、心筋組織および骨格筋組織中にトロポニンＩと共に細筋フィラメント上に固定されている。
【０００３】
ヒト血清中の心筋トロポニンＩを測定する、いくつかのアッセイが記載されている。例えば、ラジオアッセイはこの目的で使用されている（Ｃｕｍｍｉｎｓら、Ａｍ  Ｈｅａｒｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ１１３：１３３３−１３４４頁（１９８７）。しかしながら、このアッセイは、骨格系トロポニンＩに対する有意な交差反応性を有するポリクローナル抗体を利用した。さらに、２つの異なるモノクローナル抗体を使用する、サンドイッチアッセイが利用されている（Ｂｏｄａｒら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３８：２２０３−２２１４頁（１９９２）；米国特許第７，２８５，４１８号明細書も参照）。残念ながら、このようなアッセイには非常に高い不正確性がある。したがって、トロポニンＩに対して非常に特異的で感度が高い免疫学的検定に関する必要性が確かに存在する。これらの免疫学的検定は、骨格組織中で見られるトロポニンＩに対する交差反応性を有していない抗体も利用するはずである。特に、このような免疫学的検定が必要とされ、したがって適切な療法は治療する医師によって利用され、これによって罹患患者に考えられる最高の予後を与えることができる。
【０００４】
本明細書で言及する全ての特許および刊行物には、参照によりこれらの全容を本明細書に組み込まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第７，２８５，４１８号明細書
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｃｕｍｍｉｎｓら、Ａｍ  Ｈｅａｒｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １１３：１３３３−１３４４頁（１９８７）
【非特許文献２】Ｂｏｄａｒら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３８：２２０３−２２１４頁（１９９２）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
（発明の要旨）
本発明は、心臓トロポニンＩと結合することができる結合タンパク質、特に抗体に関する。特に、これらの抗体は、トロポニンＩの１つまたは複数のエピトープと結合する。さらに本発明は、例えば診断アッセイにおける、これらの結合タンパク質またはこれらの一部分を産生および使用する方法も提供する。特に本発明は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）受託番号ＰＴＡ−９８１６によって指定される、ＴｎＩ１９Ｃ７ＡＭ１ｈＧ１ＣＨＯ２０４と呼ばれるチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系、およびこの細胞系によって産生される組換え抗体を包含する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
加えて、本発明は、ＧＹＴＦＴＤＹＮＬＨ（配列番号５２）、ＹＩＹＰＹＮＧＩＴＧＹＮＱＫＦＫＳ（配列番号５３）、ＤＡＹＤＹＤＹＬＴＤ（配列番号５４）、ＲＴＳＫＮＶＧＴＮＩＨ（配列番号５５）、ＹＡＳＥＲＬＰ（配列番号５６）およびＱＱＳＮＮＷＰＹＴ（配列番号５７）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１個の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、トロポニンＩと結合する抗原結合ドメインを含む単離結合タンパク質を含む。本発明の結合タンパク質は、例えば少なくとも３個のこれらのＣＤＲを含むことができる。さらに、この結合タンパク質は、ヒトアクセプターフレームワークまたは足場も含むことができる。この結合タンパク質は、例えば免疫グロブリン分子、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、ヒト化抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体、ダイアボディ、多重特異性抗体、二機能性抗体、抗イディオタイプ抗体、二重特異性抗体、またはこれらの物質のいずれか１つの機能活性エピトープ結合断片からなる群から選択することができる。
【０００９】
本発明は、その可変重鎖のアミノ酸配列が配列番号２５と少なくとも７０％の同一性を有する（図１２参照）結合タンパク質をコードする単離核酸分子も包含する。この分子は、配列番号２８と少なくとも７０％の同一性を有する可変軽鎖（図１２参照）も含むことができる。
【００１０】
さらに本発明は、その可変重鎖のアミノ酸配列が配列番号２５である結合タンパク質をコードする単離核酸分子を含む。
【００１１】
加えて、本発明は、その可変軽鎖のアミノ酸配列が配列番号２８である結合タンパク質をコードする単離核酸分子を含む。この分子は、その重鎖のアミノ酸配列が配列番号２５である可変重鎖をコードする単離核酸分子をさらに含むことができる。
【００１２】
本発明は、制御エレメント（例えばプロモーター）と結合した、前に記載した１つまたは複数の核酸分子を含むベクター、およびこのベクターを含む宿主細胞も含む。
【００１３】
さらに本発明は、対象の結合タンパク質を産生するのに十分な時間および条件下で前に記載した宿主細胞を培養することを含む、トロポニンＩと結合することができる前に記載した任意の結合タンパク質を産生する方法を含む。本発明は、この方法によって産生される結合タンパク質も含む。
【００１４】
さらに本発明は、前に記載した任意の１つまたは複数の結合タンパク質および薬剤として許容される担体を含む医薬組成物を包含する。
【００１５】
本発明は、試験サンプル中のトロポニンＩ抗原を検出する方法も含む。この方法は、トロポニンＩと結合し配列番号２５を含む抗体と試験サンプルを、抗体／抗原複合体の形成に十分な時間および条件下で、接触させるステップ、および複合体の存在が前記試験サンプル中のトロポニンＩ抗原の存在を示す、複合体の存在を検出するステップを含む。この抗体は配列番号２８をさらに含むことができる。この抗体はＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９８１６を有するチャイニーズハムスター卵巣細胞系によって産生され得る。
【００１６】
本発明は、トロポニンＩと結合し配列番号２５を含む第一の抗体と試験サンプルを、第一の抗体／抗原複合体の形成に十分な時間および条件下で、接触させるステップ、検出可能なシグナルを生成することができるシグナル生成化合物と結合した第二の抗体を含むコンジュゲートを、第一の抗体／抗原／第二の抗体複合体を形成するのに十分な時間および条件下で、第一の抗体／抗原複合体に加えるステップ、およびシグナルの存在が前記試験サンプル中のトロポニンＩ抗原の存在を示す、シグナル生成化合物によって生成するシグナルの存在を検出するステップを含む、試験サンプル中のトロポニンＩ抗原を検出する方法も含む。第一の抗体は配列番号２８をさらに含むことができ、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９８１６を有するチャイニーズハムスター卵巣細胞系によって産生され得る。
【００１７】
本発明は、抗体が配列番号２５を含み、検出可能なシグナルを生成することができるシグナル生成化合物で標識される、トロポニンＩと結合する抗体とトロポニンＩ抗原を、トロポニンＩ抗原／抗原複合体を形成するのに十分な時間および条件下で、接触させるステップ、トロポニンＩ抗原／抗体／トロポニンＩ試験サンプル抗原複合体を形成するのに十分な時間および条件下で、前記トロポニンＩ抗原／抗体複合体に試験サンプルを加えるステップ、および試験サンプル中のトロポニンＩ抗原の存在を示す、シグナル生成化合物によって生成するシグナルの存在を検出するステップを含む、試験サンプル中のトロポニンＩ抗原を検出する方法も含む。ここでも、抗体は配列番号２８をさらに含むことができ、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９８１６を有するチャイニーズハムスター卵巣細胞系によって産生され得る。
【００１８】
本発明は、試験サンプル中のトロポニンＩ抗原を検出する別の方法も包含する。この方法は、検出可能なシグナルを生成することができるシグナル生成化合物と結合した１）トロポニンＩ参照抗原、および配列番号２５を含む２）トロポニンＩ抗原に対する抗体と試験サンプルを、トロポニンＩ参照抗原／抗体複合体を形成するのに十分な時間および条件下で、接触させるステップ、およびシグナル生成化合物によって生成するシグナルを検出するステップを含み、試験サンプル中で検出されるトロポニンＩ抗原の量が抗体と結合したトロポニンＩ参照抗原の量と反比例する。ここでも、抗体は配列番号２８をさらに含むことができ、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９８１６を有するチャイニーズハムスター卵巣細胞系によって産生され得る。
【００１９】
加えて、本発明は、前に記載した任意の１つまたは複数の結合タンパク質および薬剤として許容される担体を含む医薬組成物を含む。
【００２０】
本発明は、急性冠症候群および心筋梗塞の１つを有する疑いがある患者中の急性冠症候群または心筋梗塞を診断する方法も包含する。この方法は、患者から生物サンプルを単離するステップ、トロポニンＩと結合し配列番号２５を含む抗体と生物サンプルを、トロポニンＩ抗原／抗体複合体の形成に十分な時間および条件下で、接触させるステップ、トロポニンＩ抗原／抗体複合体の存在を検出するステップ、前記複合体中に存在するトロポニンＩ抗原を、前記複合体中に存在する前記抗体から分離するステップ、および分離したトロポニンＩ抗原の量を測定するステップを含み、正常集団の第９９百分位数のトロポニンＩ値の約１−５倍を超えるトロポニンＩ抗原の量が患者中の急性冠症候群または心筋梗塞の診断を示す。
【００２１】
本発明は、急性冠症候群および心筋梗塞の１つを有する疑いがある患者中の急性冠症候群または心筋梗塞を診断する他の方法を含む。この方法は、患者から生物サンプルを単離するステップ、トロポニンＩと結合し配列番号２５を含む第一の抗体と生物サンプルを、トロポニンＩ抗原／抗体複合体の形成に十分な時間および条件下で、接触させるステップ、検出可能なシグナルを生成することができるシグナル生成化合物と結合した第二の抗体を含む、生成したトロポニンＩ抗原／抗原複合体にコンジュゲートを、コンジュゲートが結合トロポニンＩ抗原と結合するのに十分な時間および条件下で加えるステップ、シグナル生成化合物によって生成するシグナルを検出することによって、前記生物サンプル中に存在する可能性があるトロポニンＩ抗原の存在を検出するステップ、およびシグナルの強度を測定することによって試験サンプル中に存在するトロポニンＩ抗原の量を測定するステップを含み、正常集団の第９９百分位数の値の約１−５倍を超えるトロポニンＩ抗原の量が患者中の急性冠症候群または心筋梗塞の診断を示す。
【００２２】
本発明は、前に記載した任意の１つまたは複数のモノクローナル抗体または結合タンパク質、および必要な場合、このキットを使用するための方法を記載する説明書を含むキットも含む。
【００２３】
加えて、本発明は、
Ｘ１がＧであり、
Ｘ２がＹであり、
Ｘ３がＴまたはＳであり、
Ｘ４がＦであり、
Ｘ５がＴであり、
Ｘ６がＤであり、
Ｘ７がＹであり、
Ｘ８がＮであり、
Ｘ９がＩまたはＬであり、および
Ｘ１０がＨである、
ＣＤＲ−ＶＨ１．Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０（配列番号６３）、
Ｘ１がＹであり、
Ｘ２がＩであり、
Ｘ３がＹであり、
Ｘ４がＰであり、
Ｘ５がＹであり、
Ｘ６がＮであり、
Ｘ７がＧであり、
Ｘ８がＩであり、
Ｘ９がＴであり、
Ｘ１０がＧであり、
Ｘ１１がＹであり、
Ｘ１２がＮであり、
Ｘ１３がＱであり、
Ｘ１４がＫであり、
Ｘ１５がＦであり、
Ｘ１６がＫであり、および
Ｘ１７がＳである、
ＣＤＲ−ＶＨ２．Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｘ１６−Ｘ１７（配列番号６４）、
Ｘ１がＤであり、
Ｘ２がＡまたはＦであり、
Ｘ３がＹであり、
Ｘ４がＤであり、
Ｘ５がＹまたはＳであり、
Ｘ６がＤであり、
Ｘ７がＷ、ＹまたはＡであり、
Ｘ８がＬであり、
Ｘ９がＡまたはＴであり、および
Ｘ１０がＹまたはＤである、
ＣＤＲ−ＶＨ３．Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０（配列番号６５）、
Ｘ１がＲであり、
Ｘ２がＡまたはＴであり、
Ｘ３がＳであり、
Ｘ４がＱまたはＫであり、
Ｘ５がＳまたはＮであり、
Ｘ６がＩまたはＶであり、
Ｘ７がＧであり、
Ｘ８がＴであり、
Ｘ９がＮであり、
Ｘ１０がＩであり、および
Ｘ１１がＹまたはＨである、
ＣＤＲ−ＶＬ１．Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０（配列番号６６）、
Ｘ１がＹであり、
Ｘ２がＡまたはＧであり、
Ｘ３がＳまたはＴであり、
Ｘ４がＥであり、
Ｘ５がＳまたはＲであり、
Ｘ６がＩ、ＬまたはＶであり、および
Ｘ７がＳ、ＰまたはＦである、
ＣＤＲ−ＶＬ２．Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７（配列番号６７）、
および
Ｘ１がＱであり、
Ｘ２がＱであり、
Ｘ３がＳであり、
Ｘ４がＮであり、
Ｘ５がＮであり、
Ｘ６がＷであり、
Ｘ７がＰであり、
Ｘ８がＹであり、および
Ｘ９がＴである、
ＣＤＲ−ＶＬ３．Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０（配列番号６８）
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１個のＣＤＲを含む抗原結合ドメインを含む単離結合タンパク質を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】トロポニンＩに対する改善された親和性を有する抗体を同定および作製するために使用したステップを示すフローチャートである。
【図２Ａ】野生型ＴｎＩ１９Ｃ７単鎖可変断片（「ｓｃＦｖ」）のヌクレオチドの記載（配列番号１０９および配列番号１１０）を示す図である。
【図２Ｂ】野生型ＴｎＩ１９Ｃ７単鎖可変断片（「ｓｃＦｖ」）のヌクレオチドの記載（配列番号１０９および配列番号１１０）を示す図である。
【図３Ａ】完全長ＴｎＩ１９Ｃ７単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を発現する酵母が、ｓｃＴｎＩ−Ｃ−２として知られる単鎖トロポニンＩ（２８−１１０アミノ酸）リンカートロポニンＣ（Ｓｐｅｃｔｒａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ＲＰ−３７００）と結合することを示す図である。より詳細には、この図は、ＴｎＩ１９Ｃ７ｓｃＦｖ発現酵母を、ｓｃＴｎＩ−Ｃ−２または抗Ｖ５、次にそれぞれ抗トロポニンｍＡｂおよびヤギ抗マウス−フィコエリスリン（ＧＡＭ：ＰＥ）（図３Ｂ）またはＧＡＭ：ＰＥ（図３Ａ）のいずれかとインキュベートしたことを示す。フローサイトメトリーのヒストグラムは、抗Ｖ５によって検出したＴｎＩ１９Ｃ７ｓｃＦｖの完全長発現、およびｓｃＴｎＩ−Ｃ−２と結合するＴｎＩ１９Ｃ７ｓｃＦｖの能力を示す。ＰＥ−Ａ単位（横座標）：１０２、１０３、１０４、および１０５。計数単位（縦座標）：１０２、１０３、１０４、および１０５。
【図３Ｂ】完全長ＴｎＩ１９Ｃ７単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を発現する酵母が、ｓｃＴｎＩ−Ｃ−２として知られる単鎖トロポニンＩ（２８−１１０アミノ酸）リンカートロポニンＣ（Ｓｐｅｃｔｒａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ＲＰ−３７００）と結合することを示す図である。より詳細には、この図は、ＴｎＩ１９Ｃ７ｓｃＦｖ発現酵母を、ｓｃＴｎＩ−Ｃ−２または抗Ｖ５、次にそれぞれ抗トロポニンｍＡｂおよびヤギ抗マウス−フィコエリスリン（ＧＡＭ：ＰＥ）（図３Ｂ）またはＧＡＭ：ＰＥ（図３Ａ）のいずれかとインキュベートしたことを示す。フローサイトメトリーのヒストグラムは、抗Ｖ５によって検出したＴｎＩ１９Ｃ７ｓｃＦｖの完全長発現、およびｓｃＴｎＩ−Ｃ−２と結合するＴｎＩ１９Ｃ７ｓｃＦｖの能力を示す。ＰＥ−Ａ単位（横座標）：１０２、１０３、１０４、および１０５。計数単位（縦座標）：１０２、１０３、１０４、および１０５。
【図４】ＴｎＩ１９Ｃ７ｓｃＦｖのオフレート測定を示す図である。より詳細には、ＴｎＩ１９Ｃ７ｓｃＦｖ発現酵母を飽和濃度のｓｃＴｎＩ−Ｃ−２とインキュベートした。細胞は二回洗浄し、それぞれの時間地点で細胞を氷に移し、洗浄し抗ＴｎＩｍＡｂとインキュベートした。３０分後、細胞を再度洗浄し、ヤギ抗マウスフィコエリスリンとインキュベートした。再度３０分後、細胞を洗浄し、フローサイトメーターで分析した。一次崩壊反応式を使用して個々の時間地点を適合させ、この場合ｍ１は時間０での理論上の最大平均蛍光単位（「ＭＦＵ」）であり、ｍ２はオフレート（「ｋｏｆｆ」）であり、ｍ３は自己蛍光によるバックグラウンドＭＦＵであり、Ｍ０は時間ｘであり（ｘは測定中の時間である）、時間ｘは測定を行う時間である。ＴｎＩ−Ｃ−２と結合したＴｎＩ１９Ｃ７ｓｃＦｖの半減期（ｔ１／２）は、ｔ１／２＝ｌｎ２／ｋｏｆｆを使用して計算した。半減期の５倍が、ＴｎＩ１９Ｃ７ｓｃＦｖのＣＤＲ突然変異ライブラリーを選別するために使用した時間であった。
【図５】ＴｎＩ１９Ｃ７ｓｃＦｖの平衡解離定数（ＫＤ）測定を示す図である。より詳細には、ＴｎＩ１９Ｃ７ｓｃＦｖ発現酵母を様々な濃度のｓｃＴｎＩ−Ｃ−２とインキュベートした。細胞はＰＢＳｐＨ６．８／２％ＢＳＡ／０．０２％ＳｔａｎｄａｐｏｌＥＳ−１で二回洗浄し、３０分間抗ＴｎＩｍＡｂとインキュベートした。細胞を再度洗浄し、３０分間ヤギ抗マウスフィコエリスリンとインキュベートした。最後に、細胞を洗浄し、フローサイトメーターで分析した。
【図６】どのようにして縮重オリゴヌクレオチドを設計し、したがってそれぞれのＣＤＲヌクレオチド残基の７０％が野生型残基であり３０％が他の３残基の混合物であるプライマーを作製するかを示す概略図である。それぞれのライブラリーに関して２個のＰＣＲ産物、スパイク（ｓｐ）ＰＣＲ産物および非スパイクＰＣＲ産物を作製する。スパイクＰＣＲ産物と非スパイクＰＣＲ産物を組合せて、完全ＣＤＲ突然変異ｓｃＦｖライブラリーを作製する。
【図７】酵母の相同組換えを使用し、どのようにしてＴｎＩ１９Ｃ７ｓｃＦｖライブラリーを構築したかを示す概略図である。より詳細には、スパイクＣＤＲＰＣＲ産物および切除した酵母ディスプレイベクターをＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）菌株ＥＢＹ１００に形質転換した。形質転換クローンをトリプトファン欠損グルコース培地中で選択した。
【図８Ａ】ｓｃＦｖ構築物を作製するために使用したＰＣＲプライマー（ｔｐＶＨｆｏｒからｔｐＶＬｒｅｖ）、ＣＤＲスパイクライブラリーを作製するために使用したＰＣＲプライマー（１９Ｈ１ｓｐｆｏｒからｐＹＤ４１ｒｅｖ２）、およびコンビネーションライブラリーを作製するために使用したＰＣＲプライマー（１９ＦＲＨ２ｆｏｒから１９ＦＲＬ３）を示す概要である（配列番号１−２２参照）。プライマーの太字および拡大領域は、プライマーを作製しながら「７０％野生型、３０％他のヌクレオチド混合物」が取り込まれた領域を表す。このような「スパイク」プライマーはライブラリー内に多様性をもたらした。
【図８Ｂ】ｓｃＦｖ構築物を作製するために使用したＰＣＲプライマー（ｔｐＶＨｆｏｒからｔｐＶＬｒｅｖ）、ＣＤＲスパイクライブラリーを作製するために使用したＰＣＲプライマー（１９Ｈ１ｓｐｆｏｒからｐＹＤ４１ｒｅｖ２）、およびコンビネーションライブラリーを作製するために使用したＰＣＲプライマー（１９ＦＲＨ２ｆｏｒから１９ＦＲＬ３）を示す概要である（配列番号１−２２参照）。プライマーの太字および拡大領域は、プライマーを作製しながら「７０％野生型、３０％他のヌクレオチド混合物」が取り込まれた領域を表す。このような「スパイク」プライマーはライブラリー内に多様性をもたらした。
【図９】図５において前に記載したように決定した選択ＴｎＩ１９Ｃ７ｓｃＦｖの平衡解離定数（ＫＤ）測定を示す図である。
【図１０】抗原５０％（Ａｇ５０）として測定した相対的抗体親和性の結果を示す図である。可変ドメインを免疫グロブリン定常ドメインにクローニングすることによって、４個のＴｎＩ１９Ｃ７クローンをマウスＩｇＧ２ａｋ抗体に変換した。抗体は一過性ＨＥＫ２９４細胞系中で発現させた。Ａｇ５０は最高シグナルの５０％であるｓｃＴｎＩ−Ｃの濃度であり、選択したＴｎＩ１９Ｃ７ＡＭ候補の相対的親和性ランキングを表す。ＴｎＩ１９Ｃ７ＡＭ１はＴｎＩ１９Ｃ７野生型抗体と比較して確かな相対的親和性を示す。
【図１１】ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）アッセイ形式（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、ＩＬ）でｓｃＴｎＩ−Ｃと結合するＴｎＩ１９Ｃ７ＡＭ１の能力を示す図である。ＴｎＩ１９Ｃ７はアクリジニウムで標識し、抗ＴｎＩ捕捉ビーズを使用してｓｃＴｎＩ−Ｃとの結合に関してアッセイした（Ｘ＝ｓｃＴｎＩ−Ｃの所与のキャリブレーター濃度で生成したシグナル；Ｘ／Ａ＝キャリブレーターＸシグナルとキャリブレーターＡシグナルの比；ＲＬＵ＝相対光単位）。ＴｎＩ１９Ｃ７ＡＭ１は、野生型ＴｎＩ１９Ｃ７抗体と比較して、このアッセイ形式においてキャリブレーターの範囲でより良い結合を示した。
【図１２Ａ】モノクローナル抗体ＴｎＩ１９Ｃ７ＡＭ１、特に相補性決定領域（ＣＤＲ）の重鎖（配列番号２５）および軽鎖（配列番号２８）の、ヌクレオチド（配列番号２３、配列番号２４（相補配列）、配列番号２６および配列番号２７（相補配列））およびコードアミノ酸配列を示す図である。
【図１２Ｂ】モノクローナル抗体ＴｎＩ１９Ｃ７ＡＭ１、特に相補性決定領域（ＣＤＲ）の重鎖（配列番号２５）および軽鎖（配列番号２８）の、ヌクレオチド（配列番号２３、配列番号２４（相補配列）、配列番号２６および配列番号２７（相補配列））およびコードアミノ酸配列を示す図である。
【図１３】図１２中に示したアミノ酸以外のアミノ酸（配列番号２４−４９）で置換することができるＴｎＩ１９Ｃ７ＣＤＲの重鎖および軽鎖内の位置を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本明細書で他に定義しない限り、本発明に関して使用する科学および技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。用語の意味および範囲は明らかでなければならないが、しかしながら、何らかの潜在的な曖昧さが存在する場合、本明細書で与える定義は如何なる辞書または外部定義より優先される。さらに、文脈によって他に必要とされない限り、単数形の用語は複数形を含むものとし、複数形の用語は単数形を含むものとする。本出願中、「または」の使用は他に言及しない限り「および／または」を意味する。さらに、用語「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」、ならびに「ｉｎｃｌｕｄｅｓ」および「ｉｎｃｌｕｄｅｄ」などの他の形の使用は非制限的である。さらに、「エレメント」または「構成要素」などの用語は、他に具体的に言及しない限り、１単位を含むエレメントおよび構成要素と、２つ以上のサブユニットを含むエレメントおよび構成要素の両方を包含する。
【００２６】
一般に、本明細書に記載する細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、およびタンパク質および核酸化学、およびハイブリダイゼーション、およびこれらの技法に関して使用する命名は、当技術分野でよく知られており一般に使用される命名である。本発明の方法および技法は、他に示さない限り、当技術分野でよく知られており本明細書を通じて引用および論説する様々な一般的およびより具体的な参照中に記載される従来の方法に従って一般的に実施する。酵素反応および精製技法は、当技術分野または本明細書で記載されるのと同様に一般に実施されるように、製造者の仕様書に従って実施する。本明細書に記載する分析化学、合成有機化学、および医学および薬化学、ならびにこれらの実験手順および技法に関して使用する命名は、当技術分野でよく知られており一般に使用される命名である。標準的な技法を、化学合成、化学分析、薬剤調製、製剤、および送達、および患者の治療に使用する。
【００２７】
本発明をさらに容易に理解することができるように、選択用語を以下に定義する。
【００２８】
本明細書で使用する用語「ポリペプチド」は、アミノ酸の任意のポリマー鎖を指す。用語「ペプチド」および「タンパク質」は用語ポリペプチドと相互に使用し、アミノ酸のポリマー鎖も指す。用語「ポリペプチド」は、天然または人工タンパク質、タンパク質断片、およびタンパク質配列のポリペプチドアナログを包含する。ポリペプチドはモノマーまたはポリマーであってよい。
【００２９】
用語「単離タンパク質」または「単離ポリペプチド」は、その派生起源または供給源によって、その天然状態で付随した本来結合した構成要素と結合していない、同種由来の他のタンパク質を実質的に含まない、異種由来の細胞によって発現される、または天然に存在しない、タンパク質またはポリペプチドである。したがって、化学的に合成されたまたはそれが本来由来する細胞と異なる細胞系中で合成されたポリペプチドは、その本来結合した構成要素から「単離」されている。当技術分野でよく知られているタンパク質精製技法を使用した単離によって、タンパク質を本来結合した構成要素を実質的に含まない状態にすることもできる。
【００３０】
本明細書で使用する用語「回収」は、例えば当技術分野でよく知られているタンパク質精製技法を使用した単離によって、ポリペプチドなどの化学種を本来結合した構成要素を実質的に含まない状態にするプロセスを指す。
【００３１】
本発明は、本明細書に記載する抗体の可変軽鎖および重鎖をコードする単離ヌクレオチド配列（またはこれらの断片）、およびこれらのコードヌクレオチド配列と少なくとも約７０％（例えば７０％７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％または７９％）、好ましくは少なくとも約８０％（例えば８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％または８９％）、およびより好ましくは少なくとも約９０％（例えば９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一である配列を含む、これらと対応する、同一である、ハイブリダイズ可能である、または相補的である配列を有するヌクレオチド配列（またはこれらの断片）も含む。（７０％から１００％までの全ての整数（およびこれらの一部分）はパーセント同一性に関して本発明の範囲内にあると考えられる）。このような配列は（例えば天然供給源から単離したか、半合成経路、またはデノボ合成により生成したいずれかの）任意の供給源から誘導することができる。特にこのような配列は、実施例中に記載した供給源（例えば細菌、真菌、藻類、マウスまたはヒト）以外の供給源から単離または誘導することができる。
【００３２】
前に記載したヌクレオチド配列以外に、本発明は、本明細書に記載する抗体の可変軽鎖および重鎖のアミノ酸配列（またはこれらのアミノ酸配列の断片）も含む。さらに本発明は、本発明のタンパク質のアミノ酸配列と少なくとも約７０％（例えば７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％または７９％）、好ましくは少なくとも約８０％（例えば８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％または８９％）、およびより好ましくは少なくとも約９０％（例えば９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であるアミノ酸配列（またはこれらの断片）を含む、これらと対応する、同一である、または相補的であるアミノ酸配列（またはこれらの断片）も含む。（再度、（前述のヌクレオチド配列パーセント同一性に関して列挙したように）７０％から１００％までの全ての整数（およびこれらの一部分）もパーセント同一性に関して本発明の範囲内にあると考えられる）。
【００３３】
本発明の目的で、ヌクレオチド配列の「断片」は、指定ヌクレオチド配列の領域に対応する少なくとも約６個、好ましくは少なくとも約８個、より好ましくは少なくとも約１０個のヌクレオチド、およびさらにより好ましくは少なくとも約１５個のヌクレオチドの隣接配列として定義する。
【００３４】
用語「同一性」は、特定の比較ウインドウまたはセグメントにわたるヌクレオチド−ヌクレオチドベースでの２配列の関連性を指す。したがって、２つのＤＮＡセグメント（または２つのアミノ酸配列）の同じ鎖（センスまたはアンチセンスのいずれか）の間の同一性、対応性または均一性の程度として同一性を定義する。「配列同一性のパーセンテージ」は、特定領域にわたる２つの最適アラインメント配列を比較すること、両配列中の同一塩基または同一アミノ酸が存在する位置の数を決定して適合位置の数を得ること、比較するセグメント中の全位置数でこのような位置の数を割ること、およびこの結果に１００を掛けることによって計算する。配列の最適アラインメントは、Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｗａｔｅｒｍａｎ、Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）のアルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆  Ｗｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）のアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８５：２４４４（１９８８）の方法によって、および関連アルゴリズムを実行するコンピュータプログラム（例えば、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｍａｃａｗ  Ｐｉｌｅｕｐ（ｈｔｔｐ：／／ｃｍｇｍ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ｂｉｏｃｈｅｍ２１８／１１Ｍｕｌｔｉｐｌｅ．ｐｄｆ；Ｈｉｇｇｉｎｓら、ＣＡＢＩＯＳ．５Ｌ１５１−１５３（１９８９））、ＦＡＳＴＤＢ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ）、ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ２５：３３８９−３４０２頁（１９９７））、ＰＩＬＥＵＰ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）またはＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ７．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）（米国特許第５，９１２，１２０号参照）によって実施することができる。
【００３５】
本発明の目的で、「相補性」は、２つのＤＮＡセグメント間の関連性の程度として定義する。相補性は、二重らせんを形成するのに適した条件下で、他のＤＮＡセグメントのアンチセンス鎖とハイブリダイズするあるＤＮＡセグメントのセンス鎖の能力を測定することによって決定する。「相補配列」は、正統的な塩基対形成法則に基づいて所与の配列と対形成する配列として定義する。例えば、あるヌクレオチド鎖中の配列Ａ−Ｇ−Ｔは他の鎖中のＴ−Ｃ−Ａと「相補的」である。
【００３６】
二重らせん中、アデニンが一方の鎖中に見られ、チミンが他方の鎖中に見られる。同様に、グアニンが一方の鎖中に見られるところでは、シトシンが他方の鎖中に見られる。２つのＤＮＡセグメントのヌクレオチド配列間の関連性が高くなるほど、２つのＤＮＡセグメントの鎖間でハイブリッド二本鎖を形成する能力が高くなる。
【００３７】
２つのアミノ酸配列間の「類似性」は、両配列中の一連の同一および保存アミノ酸残基の存在として定義する。２つのアミノ酸配列間の類似性の程度が高くなるほど、２つの配列の対応性、同一性または均一性が高くなる。（２つのアミノ酸配列間の同一性は、両配列中の一連の正確に同様または不変アミノ酸残基の存在として定義する。）「相補性」、「同一性」および「類似性」の定義は当業者によく知られている。
【００３８】
「によってコードされる」はポリペプチド配列をコードする核酸配列を指し、この場合ポリペプチド配列またはこれらの一部分は、核酸配列によってコードされるポリペプチド由来の、少なくとも３アミノ酸、より好ましくは少なくとも８アミノ酸、およびさらにより好ましくは少なくとも１５アミノ酸のアミノ酸配列を含有する。
【００３９】
本明細書で使用する「生物活性」は、トロポニンＩに対する抗体またはトロポニンＩの全ての固有の生物学的性質を指す。このような性質には、例えば、トロポニンＩおよび本明細書で記載する機能上関連がある抗体と結合する抗体の能力がある。
【００４０】
抗体、タンパク質、またはペプチドと第二の化学種の相互作用に関して本明細書で使用する用語「特異的結合」または「特異的に結合」は、相互作用が化学種上の特定構造（例えば、抗原決定基またはエピトープ）の存在に依存すること、例えば、抗体が一般に複数のタンパク質ではなく１つの特異的タンパク質構造を認識し結合することを意味する。抗体がエピトープ「Ａ」に特異的である場合、標識「Ａ」および抗体を含有する反応物中のエピトープＡ（または遊離、非標識Ａ）を含有する分子の存在によって、抗体と結合する標識Ａの量は低減する。
【００４１】
本明細書で使用する用語「抗体」は、４本のポリペプチド鎖、２本の重鎖（Ｈ）および２本の軽鎖（Ｌ）で構成される任意の免疫グロブリン（Ｉｇ）分子、またはＩｇ分子の必須エピトープ結合特性を保持する、これらの任意の機能断片、突然変異体、変異体、または誘導体を広く指す。このような突然変異体、変異体、または誘導体抗体物質、以下で論じる非制限的実施形態は当技術分野で知られている。
【００４２】
完全長抗体では、それぞれの重鎖は重鎖可変領域（本明細書ではＨＣＶＲまたはＶＨと略す）および重鎖定常領域で構成される。重鎖定常領域は、３ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３で構成される。それぞれの軽鎖は軽鎖可変領域（本明細書ではＬＣＶＲまたはＶＬと略す）および軽鎖定常領域で構成される。軽鎖定常領域は１ドメイン、ＣＬで構成される。ＶＨおよびＶＬ領域は、より保存的なフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる領域間に散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域にさらに細分することができる。それぞれのＶＨおよびＶＬは、以下の順：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４でアミノ末端からカルボキシ末端に配列する、３個のＣＤＲおよび４個のＦＲで構成される。免疫グロブリン分子は、任意の型（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはサブクラスであってよく、任意の種（例えば、マウス、ヒト、ニワトリ、ラット、ウサギ、ヒツジ、サメおよびラクダ）に由来してよい。
【００４３】
本発明の抗体のＣＤＲを以下の表１および表２中に示す：
【００４４】
【表１】
0006055593.tif 000002
【００４５】
【表２】
0006055593.tif 000003
【００４６】
本明細書で使用する用語、抗体の「抗原結合部分」（または単に「抗原部分」）は、抗原と特異的に結合する能力を保持する１つまたは複数の抗体の断片を指す。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体の１つまたは複数の断片によって実施され得ることは示されている。このような抗体の実施形態は、２個以上の異なる抗原と特異的に結合する、二重特異性、二機能性、または多重特異性であってもよい。用語、抗体の「抗原結合部分」内に包含される結合断片の例には、（ｉ）Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価断片、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結した２個のＦａｂ断片を含む二価断片、（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）１個の可変ドメインを含む、ｄＡｂ断片（参照により本明細書に組み込む、Ｗａｒｄら、（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ３４１：５４４−５４６頁、Ｗｉｎｔｅｒら、Ｉｎｔｅｒｎ．Ａｐｐｌｎ．Ｐｕｂｌｉｃ．Ｎｏ．ＷＯ９０／０５１４４Ａ１）、および（ｖｉ）単離相補性決定領域（ＣＤＲ）がある。さらに、Ｆｖ断片の２個のドメイン、ＶＬおよびＶＨは別々の遺伝子によってコードされているが、組換え法を使用して、ＶＬとＶＨ領域が対になり一価分子を形成する単鎖タンパク質としてそれらを作製することができる合成リンカーによって（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる、例えばＢｉｒｄら、（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２：４２３−４２６頁；およびＨｕｓｔｏｎら、（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：５８７９−５８８３頁を参照）、それらを接合することができる。このような単鎖抗体も、本明細書において用語、抗体の「抗原結合部分」の範囲内に包含される。ダイアボディなどの、他の型の単鎖抗体も包含される。ダイアボディは、ＶＨおよびＶＬドメインが一本のポリペプチド鎖上で発現される二価の二重特異性抗体であるが、同じ鎖上の２ドメイン間の対形成を可能にするのに短すぎるリンカーを使用し、それによって別の鎖の相補的ドメインとこれらのドメインを対形成させ、２個の抗原結合部位を作製する（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ、Ｐ．ら、（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：６４４４−６４４８頁；Ｐｏｌｊａｋ、Ｒ．Ｊ．ら、（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ２：１１２１−１１２３頁を参照）。このような抗体結合部分は当技術分野で知られている（Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｄｕｂｅｌ  ｅｄｓ、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（２００１）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．７９０頁（ＩＳＢＮ３−５４０−４１３５４−５）。
【００４７】
本明細書で使用する用語「抗体構築物」は、リンカーポリペプチドまたは免疫グロブリン定常ドメインと結合した１つまたは複数の本発明の抗原結合部分を含むポリペプチドを指す。リンカーポリペプチドは、ペプチド結合によって連結した２個以上のアミノ酸残基を含み、これらを使用して１つまたは複数の抗原結合部分を結合させる。このようなリンカーポリペプチドは当技術分野でよく知られている（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ、Ｐ．ら、（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：６４４４−６４４８頁；Ｐｏｌｊａｋ、Ｒ．Ｊ．ら、（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ２：１１２１−１１２３頁を参照）。免疫グロブリン定常ドメインは、重鎖または軽鎖定常ドメインを指す。ヒトＩｇＧ重鎖および軽鎖定常ドメインのアミノ酸配列は当技術分野で知られており、例は表３中に表す。
【００４８】
【表３】
0006055593.tif 000004
0006055593.tif 000005
【００４９】
他にさらに、抗体またはこれらの抗原結合部分は、１つまたは複数の他のタンパク質またはペプチドと抗体または抗体部分の共有または非共有結合によって形成される、より大きな免疫接着分子の一部分である可能性がある。このような免疫接着分子の例は、ストレプトアビジンコア領域を使用してテトラマーｓｃＦｖ分子を作製すること（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ、Ｓ．Ｍ．ら、（１９９５）Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ６：９３−１０１頁）、およびシステイン残基、マーカーペプチドおよびＣ末端ポリヒスチジンタグを使用して二価およびビオチニル化ｓｃＦｖ分子を作製することを含む（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ、Ｓ．Ｍ．ら、（１９９４）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：１０４７−１０５８頁）。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片などの抗体部分は、完全抗体のそれぞれパパインまたはペプシン消化などの従来の技法を使用して、完全抗体から調製することができる。さらに、抗体、抗体部分および免疫接着分子は、本明細書に記載するような標準的な組換えＤＮＡ技法を使用して得ることができる。
【００５０】
本明細書で使用する「単離抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指すものとする（例えば、トロポニンＩと特異的に結合する単離抗体は、トロポニンＩ以外の抗原と特異的に結合する抗体を実質的に含まない。）。トロポニンＩと特異的に結合する単離抗体は、しかしながら、他種由来のトロポニンＩ分子などの、他の抗原と交差反応性を有する可能性がある。さらに、単離抗体は他の細胞物質および／または化学物質を実質的に含まない可能性がある。
【００５１】
本明細書で使用する用語「ヒト抗体」は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列由来の可変および定常領域を有する抗体を含むものとする。本発明のヒト抗体は、例えばＣＤＲ中、特にＣＤＲ３中に、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基を含むことができる（例えば、インビトロでのランダムまたは部位特異的突然変異誘発によって、またはインビボでの体細胞突然変異によって導入された突然変異）。しかしながら、本明細書で使用する用語「ヒト抗体」は、マウスなどの他の哺乳動物種の生殖細胞系由来のＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列に移植されている抗体を含まないものとする。
【００５２】
本明細書で使用する用語「組換えヒト抗体」は、（以下に記載する）宿主細胞にトランスフェクトした組換え発現ベクターを使用して発現された抗体、組換え、コンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離した抗体（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  Ｈ．Ｒ．、（１９９７）ＴＩＢ  Ｔｅｃｈ．１５：６２−７０頁；Ａｚｚａｚｙ  Ｈ．、およびＨｉｇｈｓｍｉｔｈ  Ｗ．Ｅ．、（２００２）Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３５：４２５−４４５頁；Ｇａｖｉｌｏｎｄｏ  Ｊ．  Ｖ．、およびＬａｒｒｉｃｋ  Ｊ．Ｗ．（２００２）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ２９：１２８−１４５頁；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  Ｈ．、およびＣｈａｍｅｓ  Ｐ．（２０００）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ２１：３７１−３７８頁）、ヒト免疫グロブリン遺伝子に関してトランスジェニックである動物（例えば、マウス）から単離した抗体（例えば、Ｔａｙｌｏｒ、Ｌ．Ｄ．ら、（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：６２８７−６２９５頁；Ｋｅｌｌｅｒｍａｎｎ、Ｓ−Ａ．およびＧｒｅｅｎ、Ｌ．Ｌ．（２００２）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１３：５９３−５９７頁；Ｌｉｔｔｌｅ  Ｍ．ら（２０００）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ２１：３６４−３７０頁を参照）、または他のＤＮＡ配列とヒト免疫グロブリン遺伝子配列のスプライシングを含む任意の他の手段によって調製、発現、作製または単離された抗体などの、組換え手段によって調製、発現、作製または単離された全てのヒト抗体を含むものとする。このような組換えヒト抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列由来の可変および定常領域を有する。しかしながら、特定の実施形態では、このような組換えヒト抗体にインビトロでの突然変異誘発（または、ヒトＩｇ配列に関してトランスジェニックである動物を使用するとき、インビボでの体細胞突然変異）を施し、したがって組換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系ＶＨおよびＶＬ配列に由来し関連がある一方で、インビボでヒト抗体生殖細胞系レパートリー内に本来存在し得ない配列である。
【００５３】
用語「キメラ抗体」は、一種由来の重鎖および軽鎖可変領域配列と別種由来の定常領域配列を含む抗体を指す。本発明は、例えばヒト定常領域と結合したマウス重鎖および軽鎖可変領域を有する、キメラ抗体を包含する。
【００５４】
用語「ＣＤＲ移植抗体」は、一種由来の重鎖および軽鎖可変領域配列を含むが、ＶＨおよび／またはＶＬの１つまたは複数のＣＤＲ領域の配列が別種のＣＤＲ配列で置換された抗体、１つまたは複数のマウスＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ３）がヒトＣＤＲ配列で置換されたマウス重鎖および軽鎖可変領域を有する抗体などを指す。
【００５５】
用語「ヒト化抗体」は、非ヒト種（例えば、マウス）由来の重鎖および軽鎖可変領域配列を含むが、ＶＨおよび／またはＶＬ配列の少なくとも一部分がより「ヒト様」に改変されている、すなわちヒト生殖細胞系可変配列により類似している抗体を指す。ヒト化抗体の１つの型は、ヒトＣＤＲ配列が非ヒトＶＨおよびＶＬ配列中に導入され対応する非ヒトＣＤＲ配列に置換された、ＣＤＲ移植抗体である。
【００５６】
用語「カバットのナンバリング」、「カバットの定義」および「カバットの標識」は、本明細書において相互に使用する。当技術分野で理解されるこれらの用語は、抗体、またはこれらの抗原結合部分の重鎖および軽鎖可変領域中の他のアミノ酸残基より可変性（すなわち超可変性）であるアミノ酸残基のナンバリングのシステムを指す（Ｋａｂａｔら、（１９７１）Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ、Ｓｃｉ．１９０：３８２−３９１頁およびＫａｂａｔ、Ｅ．Ａ．ら、（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２）。重鎖可変領域に関して、超可変領域はＣＤＲ１に関してアミノ酸位置３１から３５、ＣＤＲ２に関してアミノ酸位置５０から６５、およびＣＤＲ３に関してアミノ酸位置９５から１０２の範囲である。軽鎖可変領域に関して、超可変領域はＣＤＲ１に関してアミノ酸位置２４から３４、ＣＤＲ２に関してアミノ酸位置５０から５６、およびＣＤＲ３に関してアミノ酸位置８９から９７の範囲である。（さらに、本発明の目的で、Ｏｘｆｏｒｄ  ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡＢＭ抗体モデリングソフトウェアによって定義されたＡｂＭの定義を使用して、重鎖に関してアミノ酸２６から３５のＣＤＲ−Ｈ１領域を定義した。）
本明細書で使用する用語「アクセプター」および「アクセプター抗体」は、１つまたは複数のフレームワーク領域の少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または１００％のアミノ酸配列を提供またはコードする抗体または核酸配列を指す。いくつかの実施形態では、用語「アクセプター」は、（１つまたは複数の）定常領域を提供またはコードする抗体アミノ酸または核酸配列を指す。さらに別の実施形態では、用語「アクセプター」は、１つまたは複数のフレームワーク領域および（１つまたは複数の）定常領域を提供またはコードする抗体アミノ酸または核酸配列を指す。特定の実施形態では、用語「アクセプター」は、１つまたは複数のフレームワーク領域の少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または１００％のアミノ酸配列を提供またはコードするヒト抗体アミノ酸または核酸配列を指す。この実施形態によれば、アクセプターは、ヒト抗体の１つまたは複数の特定位置に存在しない、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、または少なくとも１０個のアミノ酸残基を含有することができる。アクセプターフレームワーク領域および／または（１つまたは複数の）アクセプター定常領域は、例えば、生殖細胞系抗体遺伝子、成熟抗体遺伝子、機能抗体（例えば、当技術分野でよく知られている抗体、開発中の抗体、または市販の抗体）から誘導または入手することができる。
【００５７】
本明細書で使用する用語「ＣＤＲ」は、抗体可変配列内の相補性決定領域を指す。重鎖および軽鎖の可変領域のそれぞれの中に３個のＣＤＲが存在し、それらはそれぞれの可変領域に関してＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３で表す。本明細書で使用する用語「ＣＤＲセット」は、抗原と結合することができる１個の可変領域中に存在する３個のＣＤＲの一群を指す。これらのＣＤＲの正確な境界は、異なるシステムに従い異なる定義がされている。Ｋａｂａｔによって記載されたシステム（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９８７）および（１９９１））は抗体の任意の可変領域に適用可能な明確な残基ナンバリングシステムを与えるだけでなく、３個のＣＤＲを画定する正確な残基境界も与える。これらのＣＤＲはＫａｂａｔのＣＤＲと呼ぶことができる。Ｃｈｏｔｈｉａおよび同僚（Ｃｈｏｔｈｉａ  ＆  Ｌｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７頁（１９８７）およびＣｈｏｔｈｉａら、Ｎａｔｕｒｅ３４２：８７７−８８３頁（１９８９））は、ＫａｂａｔのＣＤＲ内の特定微小部分は、アミノ酸配列のレベルで多大な多様性を有するにもかかわらず、ほぼ同一のペプチド骨格立体配座をとることを発見した。これらの微小部分は、Ｌ１、Ｌ２およびＬ３またはＨ１、Ｈ２およびＨ３として表し、この場合「Ｌ」および「Ｈ」は、それぞれ軽鎖および重鎖領域を表す。これらの領域は、ＫａｂａｔのＣＤＲと重複する境界を有するＣｈｏｔｈｉａのＣＤＲと呼ぶことができる。ＫａｂａｔのＣＤＲと重複するＣＤＲを画定する他の境界は、Ｐａｄｌａｎ（ＦＡＳＥＢ  Ｊ．９：１３３−１３９頁（１９９５）およびＭａｃＣａｌｌｕｍ（Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ２６２（５）：７３２−４５頁（１９９６）によって記載されている。さらに他のＣＤＲ境界の定義は、ＡｂＭの定義などの前述のシステムの１つに厳密には従わない可能性があるが、それにもかかわらずＫａｂａｔのＣＤＲと重複し、ただし、特定残基または残基群またはさらにＣＤＲ全体が抗原結合に有意に影響を与えないという予想または実験の発見に照らして、それらを短縮または延長することができる。本明細書で使用する方法はこれらのシステムのいずれかに従い定義したＣＤＲを利用することができるが、好ましい実施形態はＫａｂａｔ、ＡｂＭまたはＣｈｏｔｈｉａ定義のＣＤＲを利用する。
【００５８】
本明細書で使用する用語「標準」残基は、Ｃｈｏｔｈｉａら（いずれも参照により本明細書に組み込む、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９０７頁（１９８７）；Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７９９（１９９２））によって定義された個々の標準ＣＤＲ構造を画定するＣＤＲまたはフレームワーク中の残基を指す。Ｃｈｏｔｈｉａらによれば、多くの抗体のＣＤＲの重要部分は、アミノ酸配列のレベルでの多大な多様性にもかかわらず、ほぼ同一のペプチド骨格立体配座を有する。それぞれの標準構造は、ループを形成するアミノ酸残基の隣接セグメントに関する一組のペプチド骨格のねじれ角を主に指定する。
【００５９】
本明細書で使用する用語「ドナー」および「ドナー抗体」は、１つまたは複数のＣＤＲを与える抗体を指す。好ましい実施形態では、ドナー抗体は、フレームワーク領域が入手または誘導される抗体と異なる種由来の抗体である。ヒト化抗体の文脈で、用語「ドナー抗体」は、１つまたは複数のＣＤＲを与える非ヒト抗体を指す。
【００６０】
本明細書で使用する用語「フレームワーク」および「フレームワーク配列」は、ＣＤＲを引いた可変領域の残りの配列を指す。ＣＤＲ配列の正確な定義は異なるシステムによって決定することができるので、フレームワーク配列の意味には相応して異なる解釈が施される。６個のＣＤＲ（軽鎖のＣＤＲ−Ｌ１、−Ｌ２、および−Ｌ３および重鎖のＣＤＲ−Ｈ１、−Ｈ２、および−Ｈ３）はさらに軽鎖および重鎖上のフレームワーク領域を各鎖上の４個の微小領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４）に分かれ、この中でＣＤＲ１はＦＲ１とＦＲ２の間、ＣＤＲ２はＦＲ２とＦＲ３の間、およびＣＤＲ３はＦＲ３とＦＲ４の間に位置する。ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３またはＦＲ４として個々の微小領域を特定せずに、フレームワーク領域は、他に言及されるように、一本の本来存在する免疫グロブリン鎖の可変領域内の組合せＦＲを表す。本明細書で使用する１つのＦＲは４個の微小領域の１つを表し、複数のＦＲはフレームワーク領域を構成する４個の微小領域の２つ以上を表す。
【００６１】
本発明の一実施形態では、マウス重鎖および軽鎖ドナー配列は以下に記載する配列から選択される：
【００６２】
【表４】
0006055593.tif 000006
0006055593.tif 000007
【００６３】
【表５】
0006055593.tif 000008
【００６４】
本明細書で使用する用語「生殖細胞系抗体遺伝子」または「遺伝子断片」は、遺伝子再編成および個々の免疫グロブリンの発現のための成熟をもたらす成熟プロセスを経ていない、非リンパ系細胞によってコードされる免疫グロブリン配列を指す（例えば、Ｓｈａｐｉｒｏら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２（３）：１８３−２００頁（２００２）；Ｍａｒｃｈａｌｏｎｉｓら、Ａｄｖ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ．４８４：１３−３０頁（２００１）を参照）。本発明の様々な実施形態によって与えられる利点の１つは、生殖細胞系抗体遺伝子は種において個々の必須アミノ酸配列構造特性を保存する可能性が成熟抗体遺伝子より高く、したがってその種で治療上使用すると外来供給源からであると認識される可能性が低いという認識に由来する。
【００６５】
本明細書で使用する用語「重要」残基は、抗体、特にヒト化抗体の結合特異性および／または親和性に対してより影響がある可変領域内の特定残基を指す。重要残基は、以下の：ＣＤＲと隣接する残基、潜在的グリコシル化部位（Ｎ−またはＯ−グリコシル化部位のいずれかであってよい）、希少残基、抗原と相互作用することができる残基、ＣＤＲと相互作用することができる残基、標準残基、重鎖可変領域と軽鎖可変領域の間の接触残基、ベルニアーゾーン内の残基、およびＣｈｏｔｈｉａ定義の可変重鎖ＣＤＲ１とＫａｂａｔ定義の第一重鎖フレームワークの間の重複する領域中の残基の１つまたは複数だけには限られないが、これらを含む。
【００６６】
本明細書で使用する用語「ヒト化抗体」は、対象の抗原と免疫特異的に結合し、ヒト抗体のアミノ酸配列を実質的に有するフレームワーク（ＦＲ）領域および非ヒト抗体のアミノ酸配列を実質的に有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、抗体または変異体、誘導体、アナログまたはこれらの断片である。ＣＤＲの文脈において本明細書で使用する用語「実質的に」は、非ヒト抗体ＣＤＲのアミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％、および最も好ましくは少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有するＣＤＲを指す。ヒト化抗体は、少なくとも１つ、および典型的には２つの可変ドメイン（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＦａｂＣ、Ｆｖ）の全てを実質的に含み、その中で全てまたは実質的に全てのＣＤＲ領域は非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し（すなわちドナー抗体）、全てまたは実質的に全てのフレームワーク領域はヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のフレームワーク領域である。好ましくは、ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分、典型的にはヒト免疫グロブリンのそれも含む。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体は、軽鎖と重鎖の少なくとも可変ドメインの両方を含有する。抗体は、重鎖のＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４領域も含むことができる。他の実施形態では、ヒト化抗体はヒト化軽鎖のみ含有する。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体はヒト化重鎖のみ含有する。特定の実施形態では、ヒト化抗体は軽鎖および／またはヒト化重鎖のヒト化可変ドメインのみ含有する。
【００６７】
ヒト化抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＥ、およびＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を非制限的に含む任意のアイソタイプを含めた、任意のクラスの免疫グロブリンから選択することができる。ヒト化抗体は２クラスまたはアイソタイプ由来の配列を含むことができ、当技術分野でよく知られている技法を使用して、特定の定常ドメインを選択し望ましいエフェクター機能を最適化することができる。
【００６８】
ヒト化抗体のフレームワークおよびＣＤＲ領域は親配列に正確に対応する必要はない。例えば、ドナー抗体ＣＤＲまたはコンセンサスフレームワークは、その部位のＣＤＲまたはフレームワーク残基がドナー抗体またはコンセンサスフレームワークのいずれかに対応しないように、少なくとも１つのアミノ酸残基の置換、挿入および／または欠失によって突然変異誘発することができる。しかしながら、好ましい実施形態では、このような突然変異は広範囲ではない。通常、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、および最も好ましくは少なくとも９５％のヒト化抗体残基が、親ＦＲおよびＣＤＲ配列の残基に対応する。本明細書で使用する用語「コンセンサスフレームワーク」は、コンセンサス免疫グロブリン配列中のフレームワーク領域を指す。本明細書で使用する用語「コンセンサス免疫グロブリン配列」は、関連免疫グロブリン配列のファミリー中で最も頻繁に出現するアミノ酸（またはヌクレオチド）から形成される配列を指す（例えば、Ｗｉｎｎａｋｅｒ、Ｆｒｏｍ  Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ｃｌｏｎｅｓ（Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ、Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、ドイツ  １９８７）を参照）。免疫グロブリンのファミリーにおいて、コンセンサス配列中のそれぞれの位置は、ファミリー中のその位置に最も頻繁に出現するアミノ酸によって占められる。２つのアミノ酸が同程度頻繁に出現する場合、いずれかがコンセンサス配列中に含まれ得る。
【００６９】
本明細書で使用する用語「ベルニアー」ゾーンは、ＦｏｏｔｅおよびＷｉｎｔｅｒ（参照により本明細書に組み込む、１９９２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：４８７−４９９頁）によって記載されたように、ＣＤＲ構造を調節し抗原との適合を微調整することができるフレームワーク残基の部分集合を指す。ベルニアーゾーン残基はＣＤＲの下に層を形成し、抗体のＣＤＲの構造および親和性に影響を与えることができる。
【００７０】
用語「活性」は、抗原に対する抗体、例えばトロポニンＩと結合する抗トロポニンＩ抗体の結合特異性／親和性などの活性を含む。
【００７１】
用語「エピトープ」は、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体と特異的に結合することができる任意のポリペプチド抗原決定基を含む。特定の実施形態では、エピトープ抗原決定基は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル、またはスルホニルなどの化学的活性がある表面分子群を含み、また特定の実施形態では、特異的三次元構造特性、および／または特異的電荷特性を有する可能性がある。エピトープは、抗体によって結合される抗原の領域である。特定の実施形態では、抗体は、それがタンパク質および／またはマクロ分子の複合混合物中のその標的抗原を優先的に認識するとき、抗原と特異的に結合すると言える。
【００７２】
本明細書で使用する用語「表面プラズモン共鳴」は、例えばＢＩＡｃｏｒｅシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ  ａｎｄ  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を使用した、バイオセンサーマトリクス内のタンパク質濃度の変化の検出によって、リアルタイムの生体特異的相互作用の分析を可能にする光学現象を指す。さらなる記載に関しては、Ｊｏｎｓｓｏｎ、Ｕ．ら、（１９９３）Ａｎｎ．Ｂｉｏｌ．Ｃｌｉｎ．５１：１９−２６頁；Ｊｏｎｓｓｏｎ、Ｕ．ら、（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１１：６２０−６２７頁；Ｊｏｈｎｓｓｏｎ、Ｂ．ら、（１９９５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．８：１２５−１３１頁；およびＪｏｈｎｓｓｏｎ、Ｂ．ら、（１９９１）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８：２６８−２７７頁を参照。
【００７３】
本明細書で使用する用語「Ｋｏｎ」は、当技術分野で知られているように、抗体／抗原複合体を形成するための抗原と抗体の結合に関する速度定数を指すものとする。
【００７４】
本明細書で使用する用語「Ｋｏｆｆ」は、当技術分野で知られているように、抗体／抗原複合体を形成するための抗体の解離に関するオフレート定数を指すものとする。
【００７５】
本明細書で使用する用語「Ｋｄ」または「ＫＤ」は、当技術分野で知られているように、特定の抗体−抗原相互作用の解離定数を指すものとする。
【００７６】
本明細書で使用する用語「標識結合タンパク質」は、結合タンパク質の同定をもたらす取り込み標識を有するタンパク質を指す。好ましくは、標識は検出可能なマーカー、例えば放射標識アミノ酸の取り込み、または標識アビジンによって検出することができるビオチニル部分のポリペプチドとの結合である（例えば、光学または比色定量法によって検出することができる蛍光マーカーまたは酵素活性を含有するストレプトアビジン）。ポリペプチド用の標識の例には、以下の：放射性同位体または放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１７７Ｌｕ、１６６Ｈｏ、または１５３Ｓｍ）、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニドリン光体）、酵素標識（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光マーカー、ビオチニル基、二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）、およびガドリニウムキレートなどの磁性物質があるが、これらだけには限られない。
【００７７】
用語「抗体コンジュゲート」は、治療剤または細胞毒性薬などの第二の化学成分と化学結合した抗体などの、結合タンパク質を指す。用語「作用物質」は、化学化合物、化学化合物の混合物、生物学的マクロ分子、または生物材料から作製した抽出物を示すために本明細書で使用する。好ましくは、治療剤または細胞毒性薬には、百日咳毒素、タクソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシン、ならびにこれらのアナログまたはホモログがあるが、これらだけには限られない。本明細書で使用する用語「結晶」および「結晶化」は、結晶の形で存在する抗体、またはこの抗原結合部分を指す。結晶は、非晶質固体状態または液状結晶状態などの他の形と異なる、固形状物質の１つの形である。結晶は、原子、イオン、分子（例えば、抗体などのタンパク質）、または分子構築体（例えば、抗原／抗体複合体）の規則的な反復三次元配列で構成される。これらの三次元配列は、当技術分野で十分理解されている特異的数学的関係に従い配列する。結晶内で反復される基本単位、または構成単位は非対称単位と呼ばれる。所与の、明確に定義された結晶対称性に従う配列中の非対称単位の反復は、結晶の「単位格子」を与える。全ての三次元中の規則正しい配置による単位格子の反復が結晶を与える。Ｇｉｅｇｅ、Ｒ．ａｎｄ  Ｄｕｃｒｕｉｘ、Ａ．Ｂａｒｒｅｔｔ、Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、第２版、２０  １−１６頁、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、（１９９９）を参照。
【００７８】
本明細書で言及する用語「ポリヌクレオチド」は、ポリマー型の２個以上のヌクレオチド、リボヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドのいずれか、またはいずれかの型のヌクレオチドの修飾型を意味する。この用語は一本鎖および二本鎖型のＤＮＡを含むが、二本鎖ＤＮＡであることが好ましい。
【００７９】
本明細書で使用する用語「単離ポリヌクレオチド」は、その起源によって、「単離ポリヌクレオチド」が本来見られるポリヌクレオチドの全部または一部と関係がない、本来連結していないポリヌクレオチドに作動可能に連結した、または大きな配列の一部分として本来存在しない、（例えば、ゲノム、ｃＤＮＡ、または合成起源、またはこれらのいくつかの組合せ）ポリヌクレオチドを意味するものとする。
【００８０】
本明細書で使用する用語「ベクター」は、それが連結している別の核酸を運ぶことができる核酸分子を指すものとする。１つの型のベクターは「プラスミド」であり、これは追加的ＤＮＡセグメントを連結することができる環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別の型のベクターはウイルスベクターであり、この場合追加的ＤＮＡセグメントをウイルスゲノム中に連結することができる。特定のベクターは、それらを導入する宿主細胞中で自律複製することができる（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）を、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込むことができ、したがって宿主ゲノムと共に複製される。さらに、特定のベクターは、それらが作動可能に連結した遺伝子の発現を誘導することができる。このようなベクターは、本明細書では「組換え発現ベクター」（または単に「発現ベクター」）と呼ぶ。一般に、組換えＤＮＡ技法において有用である発現ベクターはプラスミドの型であることが多い。本明細書中、「プラスミド」と「ベクター」は相互に使用することができる。プラスミドは、最も一般に使用される型のベクターであるからである。しかしながら本発明は、同等の機能を果たすウイルスベクター（例えば、複製欠陥レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ関連ウイルス）などの、このような他の型の発現ベクターを含むものとする。
【００８１】
本明細書で使用する用語「作動可能に連結した」は、本明細書に記載する構成要素が、それらの意図する形式でそれらが働くのを可能にする関係にある並置を指す。コード配列と「作動可能に連結した」制御配列は、コード配列の発現が制御配列と適合性がある条件下で実施される様な形式で連結する。「作動可能に連結した」配列は、対象の遺伝子と隣接した発現制御配列と、トランスまたは対象の遺伝子を制御する距離で作用する発現制御配列の両方を含む。本明細書で使用する用語「発現制御配列」は、それらが連結するコード配列の発現およびプロセシングを実行するのに必要であるポリヌクレオチド配列を指す。発現制御配列には、適切な転写開始、終了、プロモーターおよびエンハンサー配列、スプライシングおよびポリアデニル化シグナルなどの有効なＲＮＡプロセシングシグナル、細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列、翻訳効率を高める配列（すなわち、コザックのコンセンサス配列）、タンパク質の安定性を高める配列、および望ましいとき、タンパク質の分泌を高める配列がある。このような制御配列の性質は宿主生物に応じて異なり、原核生物では、このような制御配列は一般にプロモーター、リボソーム結合部位、および転写終了配列を含み、真核生物では、一般にこのような制御配列はプロモーターおよび転写終了配列を含む。用語「制御配列」は、その存在が発現およびプロセシングに必要不可欠である構成要素を含むものとし、その存在が有益である追加的構成要素、例えば、リーダー配列および融合パートナー配列も含むことができる。
【００８２】
本明細書で定義する「形質転換」は、それによって外来ＤＮＡが宿主細胞に入る任意のプロセスを指す。当技術分野でよく知られている様々な方法を使用して、形質転換を天然または人為的条件下で行うことができる。形質転換は、原核または真核宿主細胞に外来核酸配列を挿入するための、任意の知られている方法に頼ることができる。方法は形質転換する宿主細胞に基づいて選択し、ウイルス感染、エレクトロポレーション、リポフェクション、および粒子衝突だけには限られないが、これらを含むことができる。このような「形質転換」細胞は、挿入ＤＮＡが自律的複製プラスミドまたは宿主染色体の一部のいずれかとして複製することができる、安定的に形質転換された細胞を含む。これらは、限られた時間の間挿入ＤＮＡまたはＲＮＡを一過的に発現する細胞も含む。
【００８３】
本明細書で使用する用語「組換え宿主細胞」（または単に「宿主細胞」）は、その中に外来ＤＮＡが導入されている細胞を指すものとする。このような用語は、特定の対象細胞だけでなく、このような細胞の子孫も指すことを意図することは理解されるはずである。突然変異または環境的影響のいずれかのため、世代を継承する際に特定の修飾が起こる可能性があるので、このような子孫は実際、親細胞と同一でない可能性があるが、本明細書で使用する用語「宿主細胞」の範囲内に依然として含まれる。宿主細胞は、区系界のいずれかから選択される原核細胞および真核細胞を含むことが好ましい。好ましい真核細胞には、原生生物、真菌、植物および動物細胞がある。最も好ましくは、宿主細胞は、原核細胞系イーコリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、哺乳動物細胞系ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３およびＣＯＳ、昆虫細胞系Ｓｆ９、および真菌細胞サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）またはピキア・パストリス（Ｐｉｃｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）を含むが、これらだけには限られない。
【００８４】
標準的技法を、組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、ならびに組織培養および形質転換（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）に使用することができる。酵素反応および精製技法は、製造者の仕様書に従い、または当技術分野で一般に実施されるように、または本明細書で記載するように実施することができる。前述の技法および手順は、当技術分野でよく知られている従来の方法に従い、本明細書を通じて引用および論説する様々な一般的およびより具体的な参照文献中に記載されるように、一般的に実施することができる。例えば、あらゆる目的で参照により本明細書に組み込む、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９））を参照。
【００８５】
本明細書で使用し当技術分野で知られている「トランスジェニック生物」はトランス遺伝子を含有する細胞を有する生物を指し、生物（またはその祖先）に導入されるトランス遺伝子はその生物中で本来発現されないポリペプチドを発現する。「トランス遺伝子」は、トランスジェニック生物が発生する細胞のゲノムに安定的および作動可能に組み込まれ、トランスジェニック生物の１つまたは複数の細胞型または組織においてコードされる遺伝子産物の発現を誘導する、ＤＮＡ構築物である。
【００８６】
用語「制御する」と「調節する」は相互に使用し、また本明細書で使用するように、対象の分子の活性（例えば、トロポニンＩの生物活性）の変化または改変を指す。調節は、対象の分子の特定活性または機能の程度の増大または低下であってよい。分子の例示的な活性および機能には、結合特性、酵素活性、細胞受容体活性化、およびシグナル伝達があるが、これらだけには限られない。
【００８７】
相応して、本明細書で使用する用語「モジュレーター」は、対象の分子の活性または機能（例えば、トロポニンＩの生物活性）を変えるまたは改変することができる化合物である。例えば、モジュレーターは、モジュレーターの不在下で観察される活性または機能の程度と比較して、分子の特定活性または機能の程度の増大または低下を引き起こすことができる。特定の実施形態では、モジュレーターは、分子の少なくとも１つの活性または機能の程度を低下させる阻害剤である。例示的な阻害剤には、タンパク質、ペプチド、抗体、ペプチボディ、炭水化物または有機低分子があるが、これらだけには限られない。ペプチボディは例えば国際出願公開第ＷＯ０１／８３５２５号中に記載されている。
【００８８】
本明細書で使用する用語「アゴニスト」は、アゴニストの不在下で観察される活性または機能の程度と比較して、対象の分子との接触時に、分子の特定活性または機能の程度の増大を引き起こすモジュレーターを指す。対象の個々のアゴニストは、トロポニンＩポリペプチド、核酸、炭水化物、またはトロポニンＩと結合する任意の他の分子だけには限られないが、これらを含むことができる。
【００８９】
本明細書で使用する用語「アンタゴニスト」または「阻害剤」は、アンタゴニストの不在下で観察される活性または機能の程度と比較して、対象の分子との接触時に、分子の特定活性または機能の程度の低下を引き起こすモジュレーターを指す。
【００９０】
本明細書で使用する用語「有効量」は、障害またはその１つまたは複数の症状の重度および／または期間を低減または改善する、障害の進行を予防する、障害の退行を引き起こす、障害に伴う１つまたは複数の症状の再発、発達、発症または進行を予防する、障害を検出する、または別の治療（例えば、予防または治療剤）の（１つまたは複数の）予防もしくは治療効果を増大もしくは改善するのに十分な療法の量を指す。
【００９１】
本明細書で使用する用語「サンプル」は、その最も広い意味で使用する。本明細書で使用する「生物サンプル」には、生物または以前生存していた物体由来の任意の量の物質だけには限られないが、これらがある。このような生物には、ヒト、マウス、ラット、サル、イヌ、ウサギおよび他の哺乳動物もしくは非哺乳動物だけには限られないが、これらがある。このような物質には、血液、血漿、尿、滑液、細胞、臓器、組織（例えば、脳）、骨髄、リンパ節、脳脊髄液、および脾臓だけには限られないが、これらがある。
【００９２】
抗体を作製する方法
本発明の抗体は、当技術分野で知られている任意のいくつかの技法によって作製することができる。例えば、組換えもしくはファージディスプレイ技術の使用、またはこれらの組合せを含めた、広く様々な技法を使用して抗体を調製することができる。用語「モノクローナル抗体」は、任意の真核生物、原核生物、またはファージクローンを含めた単一クローンから誘導される抗体を指し、それを産生する方法は指さない。
【００９３】
一実施形態では、本発明は、本発明の抗体を分泌するチャイニーズハムスター卵巣細胞系を培養することを含む、組換え抗体を作製する方法（およびこの方法によって産生される抗体）を提供する。
【００９４】
さらに、特異的エピトープを認識する本発明の抗体の断片は、知られている技法によって作製することができる。例えば、本発明のＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片は、（Ｆａｂ断片を産生するために）パパインまたは（Ｆ（ａｂ’）２断片を産生するために）ペプシンなどの酵素を使用して、免疫グロブリン分子のタンパク質分解切断によって産生することができる。Ｆ（ａｂ’）２断片は、可変領域、軽鎖定常領域および重鎖のＣＨ１ドメインを含有する。
【００９５】
組換え抗体ライブラリーを使用した抗トロポニンＩ抗体の産生
インビトロ法を使用して本発明の抗体を作製することもでき、この場合抗体ライブラリーをスクリーニングして、望ましい結合特異性を有する抗体を同定する。組換え抗体ライブラリーのこのようなスクリーニング法は当技術分野でよく知られており、例えば、そのそれぞれの内容を参照により本明細書に組み込む、Ｌａｄｎｅｒら、米国特許第５，２２３，４０９号、Ｋａｎｇら、国際出願公開第ＷＯ９２／１８６１９号、Ｄｏｗｅｒら、国際出願公開第ＷＯ９１／１７２７１号、Ｗｉｎｔｅｒら、国際出願公開第ＷＯ９２／２０７９１号、Ｍａｒｋｌａｎｄら、国際出願公開第ＷＯ９２／１５６７９号、Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇら、国際出願公開第ＷＯ９３／０１２８８号、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／０１０４７号、Ｇａｒｒａｒｄら、国際出願公開第ＷＯ９２／０９６９０号、Ｆｕｃｈｓら、（１９９１）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ９：１３７０−１３７２頁、Ｈａｙら、（１９９２）Ｈｕｍ  Ａｎｔｉｂｏｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ３：８１−８５頁、Ｈｕｓｅら、（１９８９）、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４６：１２７５−１２８１頁、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９０）３４８：５５２−５５４頁、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら、（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ１２：７２５−７３４頁、Ｈａｗｋｉｎｓら、（１９９２）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ２２６：８８９−８９６頁、Ｃｌａｃｋｓｏｎら、（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ３５２：６２４−６２８頁、Ｇｒａｍら、（１９９２）ＰＮＡＳ８９：３５７６−３５８０頁、Ｇａｒｒａｄら、（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ９：１３７３−１３７７頁、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、（１９９１）、Ｎｕｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ１９：４１３３−４１３７頁、およびＢａｒｂａｓら、（１９９１）、ＰＮＡＳ８８：７９７８−７９８２頁、米国特許出願公開第２００３０１８６３７４号、および国際出願公開第ＷＯ９７／２９１３１号中に記載された方法を含む。
【００９６】
組換え抗体ライブラリーは、トロポニンＩ、またはその一部分で免疫処置した対象に由来してよい。あるいは、組換え抗体ライブラリーは、ナイーブ対象、すなわちトロポニンＩで免疫処置していない対象に由来してよく、ヒトトロポニンＩで免疫処置していないヒト対象由来のヒト抗体ライブラリーなどであってよい。ヒトトロポニンＩを含むペプチドで組換え抗体ライブラリーをスクリーニングして、それによってトロポニンＩを認識する抗体を選択することによって、本発明の抗体を選択する。前段落中の参照文献中に記載された方法など、このようなスクリーニングおよび選択を実施するための方法は、当技術分野でよく知られている。トロポニンＩに対する特定の結合親和性を有する本発明の抗体、特定ｋｏｆｆ速度定数でヒトトロポニンＩから解離する抗体などを選択するために、当技術分野で知られている表面プラズモン共鳴の方法を使用して、望ましいｋｏｆｆ速度定数を有する抗体を選択することができる。
【００９７】
一態様では、本発明は、ヒトトロポニンＩと結合する、単離抗体、またはその抗原結合部分に関する。様々な実施形態において、抗体は組換え抗体である。
【００９８】
別の手法では、本発明の抗体を、当技術分野で知られている酵母ディスプレイ法を使用して作製することもできる。酵母ディスプレイ法では、遺伝的方法を使用して抗体ドメインを酵母細胞壁に係留させ、それらを酵母の表面上に提示する。特に、このような酵母を利用して、レパートリーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば、ヒトまたはマウス）から発現される抗原結合ドメインを提示することができる。本発明の抗体を作製するために使用することができる酵母ディスプレイ法の例には、参照により本明細書に組み込む、Ｗｉｔｔｒｕｐら、米国特許第６，６９９，６５８号で開示された方法がある。
【００９９】
組換え抗体の産生
前述のように、当技術分野で知られている任意の数の技法によって、本発明の抗体を産生することができる。例えば、重鎖および軽鎖をコードする（１つまたは複数の）発現ベクターを標準技法によって宿主細胞にトランスフェクトする、宿主細胞からの発現は、本発明の抗体を産生するのに好ましい方法である。（様々な型の用語「トランスフェクション」は、原核生物または真核生物宿主細胞に外来ＤＮＡを導入するのに一般に使用される広く様々な技法、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム共沈殿法、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクションなどを包含するものとする。）原核生物または真核生物宿主細胞のいずれかにおいて本発明の抗体を発現させることは可能であるが、真核生物細胞中での抗体の発現が好ましく、哺乳動物宿主細胞中が最も好ましい。このような真核生物細胞（特に哺乳動物細胞）は、正確にフォールディングされ免疫活性がある抗体を構築および分泌する可能性が原核生物細胞より高いからである。
【０１００】
本発明の組換え抗体を発現するのに好ましい哺乳動物宿主細胞には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（例えばＲ．Ｊ．  Ｋａｕｆｍａｎ  ａｎｄ  Ｐ．Ａ．Ｓｈａｒｐ（１９８２）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１−６２１頁中に記載されたＤＨＦＲ選択可能マーカーを使用した、Ｕｒｌａｕｂ  ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ、（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７：４２１６−４２２０頁中に記載されたｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含む）、ＮＳ０ミエローマ細胞、ＣＯＳ細胞およびＳＰ２細胞がある。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターを哺乳動物宿主細胞中に導入するとき、宿主細胞中での抗体の発現、またはより好ましくは宿主細胞を増殖させる培養培地中への抗体の分泌を可能にするのに十分な期間、宿主細胞を培養することによって抗体を産生する。抗体は標準的タンパク質精製法を使用して培養培地から回収することができる。
【０１０１】
宿主細胞を使用して、Ｆａｂ断片またはｓｃＦｖ分子などの、機能性抗体断片を産生することもできる。前述の手順の変形は、本発明の範囲内にあることは理解される。例えば、本発明の抗体の軽鎖および／または重鎖の機能断片をコードするＤＮＡで宿主細胞をトランスフェクトすることは望ましい可能性がある。組換えＤＮＡ技術を使用して、対象の抗原との結合に必ずしも必要ではない軽鎖および重鎖の片方または両方をコードするＤＮＡの一部、または全部を除去することもできる。このような切断型ＤＮＡ分子から発現される分子も、本発明の抗体によって包含される。さらに、標準的な化学架橋法によって第二の抗体と本発明の抗体を架橋させることによって、１本の重鎖と１本の軽鎖が本発明の抗体であり他の重鎖と軽鎖が対象の抗原以外の抗原に特異的である、二重機能性抗体を産生することができる。
【０１０２】
本発明の抗体、またはその抗原結合部分の組換え発現に好ましい系では、抗体重鎖と抗体軽鎖の両方をコードする組換え発現ベクターを、リン酸カルシウム仲介トランスフェクションによってｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞中に導入する。組換え発現ベクター内では、抗体重鎖および抗体軽鎖遺伝子が、ＣＭＶエンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター制御エレメントとそれぞれ作動可能に連結して、遺伝子の高レベルの転写を誘導する。組換え発現ベクターは、メトトレキセート選択／増幅を使用してベクターでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の選択を可能にするＤＨＦＲ遺伝子も保有する。選択した形質転換体宿主細胞を培養して抗体重鎖および抗体軽鎖を発現させ、完全抗体を培養培地から回収する。標準的な分子生物学の技法を使用して、組換え発現ベクターを調製し、宿主細胞をトランスフェクトし、形質転換体を選択し、宿主細胞を培養し、培養培地から抗体を回収する。さらに他に本発明は、本発明の組換え抗体が合成されるまで適切な培養培地中で本発明の宿主細胞を培養することによって、本発明の組換え抗体を合成する方法を提供する。この方法は、培養培地から組換え抗体を単離することをさらに含むことができる。
【０１０３】
抗トロポニン抗体
本明細書に記載する（表１および２参照）単離抗トロポニンＩ抗体のＣＤＲ配列は、本発明に従い単離し、前の表１および２中に挙げたＣＤＲ配列を含むポリペプチドを含む、トロポニンＩ結合タンパク質の新規なファミリーを確定する。好ましいトロポニンＩ結合活性を有する本発明のＣＤＲを作製および選択するために、本明細書に具体的に記載する方法だけには限られないがこれらを含めた、本発明の結合タンパク質を作製するため、およびそれらの結合特性を評価するための、当技術分野で知られている標準的な方法を使用することができる。
【０１０４】
抗トロポニンＩキメラ抗体
キメラ抗体は、抗体の異なる部分が異なる動物種に由来する分子、マウスモノクローナル抗体由来の可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有する抗体などである。本発明の方法などのキメラ抗体を産生するための方法は当技術分野でよく知られている。例えば、それらの全容を参照により本明細書に組み込む、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ２２９：１２０２（１９８５）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ４：２１４（１９８６）；Ｇｉｌｌｉｅｓら、（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ１２５：１９１−２０２頁、米国特許第５，８０７，７１５号、同第４，８１６，５６７号、および同第４，８１６，３９７号を参照。さらに、適切な生物活性のヒト抗体分子由来の遺伝子と一緒の適切な抗原特異性のマウス抗体分子由来の遺伝子のスプライシングによる、「キメラ抗体」の産生のために開発された技法（それらの全容を参照により本明細書に組み込む、Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、１９８４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：８５１−８５５頁、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、１９８４、Ｎａｔｕｒｅ３１２：６０４−６０８頁、Ｔａｋｅｄａら、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ３１４：４５２−４５４頁）を使用することができる。
【０１０５】
一実施形態では、本発明のキメラ抗体を、ヒトＩｇＧ１定常領域で前に記載した抗体の重鎖定常領域を置換することによって産生する。特定の実施形態では、本発明のキメラ抗体は、配列番号２５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、および配列番号２８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
【０１０６】
抗トロポニンＩＣＤＲ移植抗体
本発明のＣＤＲ移植抗体は、ＶＨおよび／またはＶＬの１つまたは複数のＣＤＲ領域が本発明のマウス抗体のＣＤＲ配列で置換されたヒト抗体由来の、重鎖および軽鎖可変領域配列を含む。任意のヒト抗体由来のフレームワーク配列が、ＣＤＲ移植の鋳型として働くことができる。しかしながら、このようなフレームワークへの直鎖置換は、抗原に対する結合親和性のある程度の消失をもたらすことが多い。ヒト抗体が元のマウス抗体と相同的であるほど、マウスＣＤＲとヒトフレームワークの組合せが親和性を低減し得るＣＤＲの歪みをもたらす可能性は低い。したがって、ＣＤＲとは別のマウス可変フレームワークを置換するために選択したヒト可変フレームワークは、マウス抗体可変領域フレームワークと少なくとも６５％の配列同一性を有することが好ましい。ＣＤＲとは別のヒト可変領域とマウス可変領域は、少なくとも７０％の配列同一性を有することがより好ましい。ＣＤＲとは別のヒト可変領域とマウス可変領域は、少なくとも７５％の配列同一性を有することがさらにより好ましい。ＣＤＲとは別のヒト可変領域とマウス可変領域は、少なくとも８０％の配列同一性を有することが最も好ましい。キメラ抗体の産生（ＥＰ２３９，４００、国際出願公開第ＷＯ９１／０９９６７号、米国特許第５，２２５，５３９号、同第５，５３０，１０１号、および同第５，５８５，０８９号も参照）、ベニアリングまたは表面再処理（ＥＰ５９２，１０６、ＥＰ５１９，５９６、Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ２８（４／５）：４８９−４９８頁（１９９１）、Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ７（６）：８０５−８１４頁（１９９４）、Ｒｏｇｕｓｋａら、ＰＮＡＳ９１：９６９−９７３頁（１９９４））、および鎖シャッフリング（米国特許第５，５６５，３５２号）に関する方法は当技術分野で知られており、実施例２．２中で詳細に論じる。
【０１０７】
ヒト化抗体
ヒト化抗体は、非ヒト種由来の１つまたは複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する所望の抗原と結合する、非ヒト種抗体由来の抗体分子である。知られているヒトＩｇ配列は、例えばｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ−／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ；ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／ｐｈａｇｅ／ｈｄｂ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｓｃｉｑｕｅｓｔ．ｃｏｍ／；ｗｗｗ．ａｂｃａｍ．ｃｏｍ／；ｗｗｗ．ａｎｔｉｂｏｄｙｒｅｓｏｕｒｃｅ．ｃｏｍ／ｏｎｌｉｎｅｃｏｍｐ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｐｕｂｌｉｃ．ｉａｓｔａｔｅ．ｅｄｕ／．ａｂｏｕｔ．ｐｅｄｒｏ／ｒｅｓｅａｒｃｈ＿ｔｏｏｌｓ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｍｇｅｎ．ｕｎｉ−ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ／ＳＤ／ＩＴ／ＩＴ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｗｈｆｒｅｅｍａｎ．ｃｏｍ／ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ／ＣＨ−０５／ｋｕｂｙ０５．ｈｔｍ；ｗｗｗ．ｌｉｂｒａｒｙ．ｔｈｉｎｋｑｕｅｓｔ．ｏｒｇ／１２４２９／Ｉｍｍｕｎｅ／Ａｎｔｉｂｏｄｙ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｈｈｍｉ．ｏｒｇ／ｇｒａｎｔｓ／ｌｅｃｔｕｒｅｓ／１９９６／ｖｌａｂ／；ｗｗｗ．ｐａｔｈ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／．ａｂｏｕｔ．ｍｒｃ７／ｍ−ｉｋｅｉｍａｇｅｓ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ａｎｔｉｂｏｄｙｒｅｓｏｕｒｃｅ．ｃｏｍ／；ｍｃｂ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ／ＢｉｏＬｉｎｋｓ／Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．ｈｔｍｌ．ｗｗｗ．ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙｌｉｎｋ．ｃｏｍ／；ｐａｔｈｂｏｘ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／．ａｂｏｕｔ．ｈｃｅｎｔｅｒ／ｉｎｄｅｘ．−ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｂｉｏｔｅｃｈ．ｕｆｌ．ｅｄｕ／．ａｂｏｕｔ．ｈｃｌ／；ｗｗｗ．ｐｅｂｉｏ．ｃｏｍ／ｐａ／３４０９１３／３４０９１３．ｈｔｍｌ−；ｗｗｗ．ｎａｌ．ｕｓｄａ．ｇｏｖ／ａｗｉｃ／ｐｕｂｓ／ａｎｔｉｂｏｄｙ／；ｗｗｗ．ｍ．ｅｈｉｍｅ−ｕ．ａｃｊｐ／．ａｂｏｕｔ．ｙａｓｕｈｉｔｏ−／Ｅｌｉｓａ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ．ｃｏｍ／ｔａｂｌｅ．ａｓｐ；ｗｗｗ．ｉｃｎｅｔ．ｕｋ／ａｘｐ／ｆａｃｓ／ｄａｖｉｅｓ／ｌｉｎ−ｋｓ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｂｉｏｔｅｃｈ．ｕｆｌ．ｅｄｕ／．ａｂｏｕｔ．ｆｃｃｌ／ｐｒｏｔｏｃｏｌ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｉｓａｃ−ｎｅｔ．ｏｒｇ／ｓｉｔｅｓ＿ｇｅｏ．ｈｔｍｌ；ａｘｉｍｔｌ．ｉｍｔ．ｕｎｉ−ｍａｒｂｕｒｇ．ｄｅ／．ａｂｏｕｔ．ｒｅｋ／ＡＥＰ−Ｓｔａｒｔ．ｈｔｍｌ；ｂａｓｅｒｖ．ｕｃｉ．ｋｕｎ．ｎｌ／．ａｂｏｕｔ．ｊｒａａｔｓ／ｌｉｎｋｓｌ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｒｅｃａｂ．ｕｎｉ−ｈｄ．ｄｅ／ｉｍｍｕｎｏ．ｂｍｅ．ｎｗｕ．ｅｄｕ／；ｗｗｗ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｉｍｔ−ｄｏｃ／ｐｕ−ｂｌｉｃ／ＩＮＴＲＯ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｉｂｔ．ｕｎａｍ．ｍｘ／ｖｉｒ／Ｖ＿ｍｉｃｅ．ｈｔｍｌ；ｉｍｇｔ．ｃｎｕｓｃ．ｆｒ：８１０４／；ｗｗｗ．ｂｉｏｃｈｅｍ．ｕｃｌ．ａｃ．ｕｋ／．ａｂｏｕｔ．ｍａｒｔｉｎ／ａｂｓ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ；ａｎｔｉｂｏｄｙ．ｂａｔｈ．ａｃ．ｕｋ／；ａｂｇｅｎ．ｃｖｍ．ｔａｍｕ．ｅｄｕ／ｌａｂ／ｗｗｗａｂｇｅｎ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｕｎｉｚｈ．ｃｈ／．ａｂｏｕｔ．ｈｏｎｅｇｇｅｒ／ＡＨＯｓｅｍ−ｉｎａｒ／Ｓｌｉｄｅ０１．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｃｒｙｓｔ．ｂｂｋ．ａｃ．ｕｋ／．ａｂｏｕｔ．ｕｂｃｇ０７ｓ／；ｗｗｗ．ｎｉｍｒ．ｍｒｃ．ａｃ．ｕｋ／ＣＣ／ｃｃａｅｗｇ／ｃｃａｅｗｇ．ｈｔｍ；ｗｗｗ．ｐａｔｈ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／．ａｂｏｕｔ．ｍｒｃ７／ｈ−ｕｍａｎｉｓａｔｉｏｎ／ＴＡＨＨＰ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｉｂｔ．ｕｎａｍ．ｍｘ／ｖｉｒ／ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ／ｓｔａｔ＿ａｉｍ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｂｉｏｓｃｉ．ｍｉｓｓｏｕｒｉ．ｅｄｕ／ｓｍｉｔｈｇｐ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｃｒｙｓｔ．ｂｉｏｃ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／．ａｂｏ−ｕｔ．ｆｍｏｌｉｎａ／Ｗｅｂ−ｐａｇｅｓ／Ｐｅｐｔ／ｓｐｏｔｔｅｃｈ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｊｅｒｉｎｉ．ｄｅ／ｆｒｒｏｄｕｃｔｓ．ｈｔｍ；ｗｗｗ．ｐａｔｅｎｔｓ．ｉｂｍ．ｃｏｍ／ｉｂｍ．ｈｔｍｌ．Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｓｔ、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ（１９８３）中に開示されており、それぞれ完全に参照により本明細書に組み込む。このようなインポート配列を使用して免疫原性を低減することができ、または結合、親和性、オンレート、オフレート、親和力、特異性、半減期、または当技術分野で知られている任意の他の適切な特徴を低減、増大もしくは改変することができる。
【０１０８】
ヒトフレームワーク領域中のフレームワーク残基をＣＤＲドナー抗体由来の対応する残基で置換して、抗原結合を改変する、好ましくは改善することができる。これらのフレームワーク置換は、当技術分野でよく知られている方法、例えば、抗原結合に重要なフレームワーク残基を同定するためのＣＤＲとフレームワーク残基の相互作用のモデリング、および特定位置での異常なフレームワーク残基を同定するための配列比較によって同定する。（例えば、参照によりそれらの全容を本明細書に組み込む、Ｑｕｅｅｎら、米国特許第５，５８５，０８９号、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ３３２：３２３（１９８８）を参照。）三次元免疫グロブリンモデルが一般に利用可能であり、当業者には熟知されている。選択した候補免疫グロブリン配列の考えられる三次元立体配座構造を例示し示す、コンピュータプログラムが利用可能である。これらのディスプレイの調査は、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の考えられる役割の分析、すなわちその抗原と結合する候補免疫グロブリンの能力に影響を与える残基の分析を可能にする。このようにして、（１つまたは複数の）標的抗原に対する高い親和性などの望ましい抗体特性が得られるように、コンセンサスおよびインポート配列からＦＲ残基を選択し組合せることができる。一般にＣＤＲ残基は、抗原結合に影響を与える際に直接および最も実質的に関与する。それぞれ完全に参照により本明細書に組み込む、その中に引用される参照文献を含めた、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ３２１：５２２（１９８６）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２３９：１５３４（１９８８））、Ｓｉｍｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６（１９９３）；Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１（１９８７）、Ｃａｒｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：４２８５（１９９２）；Ｐｒｅｓｔａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２６２３（１９９３）、Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ２８（４／５）：４８９−４９８頁（１９９１）；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ７（６）：８０５−８１４頁（１９９４）；Ｒｏｇｕｓｋａら、ＰＮＡＳ９１：９６９−９７３頁（１９９４）；国際出願公開第ＷＯ９１／０９９６７号、ＰＣＴ／：ＵＳ９８／１６２８０、ＵＳ９６／１８９７８、ＵＳ９１／０９６３０、ＵＳ９１／０５９３９、ＵＳ９４／０１２３４、ＧＢ８９／０１３３４、ＧＢ９１／０１１３４、ＧＢ９２／０１７５５、ＷＯ９０／１４４４３、ＷＯ９０／１４４２４、ＷＯ９０／１４４３０、ＥＰ２２９２４６、ＥＰ５９２，１０６；ＥＰ５１９，５９６、ＥＰ２３９，４００、米国特許第５，５６５，３３２号、同第５，７２３，３２３号、同第５，９７６，８６２号、同第５，８２４，５１４号、同第５，８１７，４８３号、同第５８１４４７６号、同第５７６３１９２号、同第５７２３３２３号、同第５，７６６，８８６号、同第５，７１４，３５２号、同第６，２０４，０２３号、同第６，１８０，３７０号、同第５，６９３，７６２号、同第５，５３０，１０１号、同第５，５８５，０８９号、同第５，２２５���５３９号、同第４，８１６，５６７号中に記載された技法だけには限られないが、これらの方法などの当技術分野で知られている様々な技法を使用して、抗体をヒト化することができる。
【０１０９】
抗体および抗体産生細胞系の産生
前述のように、本発明の抗体は、例えば当技術分野で知られているいくつかのインビトロおよびインビボアッセイのいずれか１つにより評価して（例えば、以下の実施例参照）、トロポニンＩと特異的に結合する高い能力を示すことが好ましい。
【０１１０】
特定の実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＤ定常領域などの重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１重鎖定常領域またはＩｇＧ４重鎖定常領域であることが好ましい。さらに抗体は、軽鎖定常領域、ｋａｐｐａ軽鎖定常領域またはラムダ軽鎖定常領域のいずれかを含むことができる。抗体はｋａｐｐａ軽鎖定常領域を含むことが好ましい。あるいは、抗体の一部分は、例えばＦａｂ断片または単鎖Ｆｖ断片であってよい。
【０１１１】
抗体エフェクター機能を改変するための、Ｆｃ部分中のアミノ酸残基の置換は当技術分野で知られている（Ｗｉｎｔｅｒら、米国特許第５，６４８，２６０号および同第５，６２４，８２１号）。抗体のＦｃ部分は、いくつかの重要なエフェクター機能、例えばサイトカイン誘導、ＡＤＣＣ、ファゴサイトーシス、補体依存性細胞障害作用（ＣＤＣ）ならびに抗体および抗原−抗体複合体の半減期／クリアランス率を仲介する。いくつかの例では、これらのエフェクター機能は治療用抗体に望ましいが、しかしながら他の例では、治療目的に応じて不要またはさらに有害である可能性がある。特定ヒトＩｇＧアイソタイプ、特にＩｇＧ１およびＩｇＧ３は、それぞれＦｃγＲおよび補体Ｃ１ｑとの結合を介して、ＡＤＣＣおよびＣＤＣを仲介する。新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）は、抗体の循環半減期を決定する重要な構成要素である。さらに別の実施形態では、抗体のエフェクター機能が改変するように、抗体の定常領域、例えば抗体のＦｃ領域中の少なくとも１つのアミノ酸残基が置換される。
【０１１２】
一実施形態は、本発明の抗体または抗体部分が別の機能分子（例えば、別のペプチドまたはタンパク質）と誘導体化または連結した、標識結合タンパク質を提供する。例えば、本発明の標識結合タンパク質は、（化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合またはその他によって）本発明の抗体または抗体部分と、（ストレプトアビジンコア領域またはポリヒスチジンタグなどの）別の分子と抗体または抗体部分の結合を仲介することができる、別の抗体（例えば、二重特異性抗体またはダイアボディ）、検出剤、細胞毒性薬、薬剤、および／またはタンパク質またはペプチドなどの、１つまたは複数の他の分子体を機能的に連結させることによって誘導することができる。
【０１１３】
本発明の抗体または抗体部分を誘導体化することができる有用な検出剤には、蛍光化合物がある。例示的な蛍光検出剤には、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、５−ジメチルアミン−１−ナフタレンスルホニルクロリド、フィコエリスリンなどがある。抗体は、例えばアルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼなどの検出可能な酵素で誘導体化することもできる。抗体を検出可能な酵素で誘導体化するとき、その酵素が検出可能な反応産物を生成するのに用いる追加試薬を加えることによってそれを検出する。例えば、検出剤ホースラディッシュペルオキシダーゼが存在するとき、過酸化水素およびジアミノベンジジンの添加によって、検出可能である着色反応産物が生成する。抗体をビオチンで検出し、アビジンまたはストレプトアビジン結合の間接的測定によって検出することもできる。
【０１１４】
本発明の別の実施形態は、結晶化結合タンパク質を提供する。本発明は、本明細書で開示する完全抗トロポニンＩ抗体およびその断片の結晶、ならびにこのような結晶を含む製剤および組成物に関することが好ましい。一実施形態では、結晶化結合タンパク質は、結合タンパク質の可溶性対照物より長いインビボ半減期を有する。別の実施形態では、結合タンパク質は結晶化後に生物活性を保持する。
【０１１５】
本発明の結晶化結合タンパク質は、当技術分野で知られており、参照により本明細書に組み込む国際出願公開第ＷＯ０２／０７２６３６号中に開示される方法に従い産生することができる。
【０１１６】
本発明の別の実施形態は、抗体またはその抗原結合部分が１つまたは複数の炭水化物残基を含む、グリコシル化結合タンパク質を提供する。発生期インビボタンパク質産生は、翻訳後修飾として知られるさらなるプロセシングを経る可能性がある。特に、糖（グリコシル）残基を酵素によって加えることができる、グリコシル化として知られるプロセス。共有結合したオリゴ糖側鎖を有する生成したタンパク質は、グリコシル化タンパク質または糖タンパク質として知られる。抗体はＦｃドメイン、および可変ドメイン中に１つまたは複数の炭水化物残基を有する糖タンパク質である。Ｆｃドメイン中の炭水化物残基は、Ｆｃドメインのエフェクター機能に対して重要な影響、および抗体の抗原結合または半減期に対して最小の影響がある（Ｒ．Ｊｅｆｆｅｒｉｎｓ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２１（２００５）、１１−１６頁）。対照的に、可変ドメインのグリコシル化は、抗体の抗原結合活性に対して影響がある可能性がある。可変ドメインのグリコシル化は、おそらく立体障害が原因で抗体結合親和性に対して悪影響があり（Ｃｏ、Ｍ．Ｓ．ら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９３）３０：１３６１−１３６７頁）、または抗原に対する高い親和性をもたらす可能性がある（Ｗａｌｌｉｃｋ、Ｓ．Ｃ．ら、Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９８８）１６８：１０９９−１１０９、Ｗｒｉｇｈｔ、Ａ．ら、ＥＭＢＯ  Ｊ．（１９９１）１０：２７１７２７２３）。
【０１１７】
本発明の一態様は、その中で結合タンパク質のＯ−またはＮ−結合グリコシル化部位が突然変異している、グリコシル化部位突然変異体の作製を対象とする。当業者は、標準的なよく知られている技法を使用して、このような突然変異体を作製することができる。生物活性を保持するが高いまたは低い結合活性を有するグリコシル化部位突然変異体の作製は、本発明の別の目的である。
【０１１８】
さらに別の実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合部分のグリコシル化を修飾する。例えば、非グリコシル化抗体（すなわち、グリコシル化がない抗体）を作製することができる。グリコシル化を改変して、例えば抗原に対する抗体の親和性を増大することができる。このような炭水化物の修飾は、例えば抗体配列内の１つまたは複数のグリコシル化部位を改変することによって実施することができる。例えば、１つまたは複数の可変領域グリコシル化部位の排除をもたらして、それによってその部位のグリコシル化を排除する、１つまたは複数のアミノ酸置換を作製することができる。このような非グリコシル化は、抗原に対する抗体の親和性を増大する可能性がある。このような手法は、その各々を参照によりその全容を本明細書に組み込む、国際出願公開第ＷＯ０３／０１６４６６Ａ２、および米国特許第５，７１４，３５０号および同第６，３５０，８６１号中にさらに詳細に記載される。
【０１１９】
追加的または代替的に、少量のフコシル残基を有する低フコシル化抗体、または多量の二等分ＧｌｃＮＡｃ構造を有する抗体などの、改変型のグリコシル化を有する本発明の修飾抗体を作製することができる。このような改変型グリコシル化パターンは、抗体のＡＤＣＣ能力を増大することが実証されている。このような炭水化物の修飾は、例えば改変型グリコシル化機構で宿主細胞中の抗体を発現させることによって実施することができる。改変型グリコシル化機構を有する細胞は当技術分野で記載されており、本発明の組換え抗体を発現させそれによって改変型グリコシル化がある抗体を産生する、宿主細胞として使用することができる。例えば、その各々を参照によりその全容を本明細書に組み込む、Ｓｈｉｅｌｄｓ、Ｒ．Ｌ．ら、（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３−２６７４０頁、Ｕｍａｎａら、（１９９９）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：１７６−１、および欧州特許第ＥＰ１，１７６，１９５号、国際出願公開第ＷＯ０３／０３５８３５号および同第ＷＯ９９／５４３４２８０号を参照。
【０１２０】
タンパク質のグリコシル化は、対象のタンパク質のアミノ酸配列、およびその中でタンパク質が発現される宿主細胞に依存する。異なる生物は異なるグリコシル化酵素（例えば、グリコシルトランスフェラーゼおよびグリコシダーゼ）を生成し、利用可能な異なる基質（ヌクレオチド糖）を有する可能性がある。このような要因のため、タンパク質のグリコシル化パターン、およびグリコシル残基の組成は、その中で個々のタンパク質が発現される宿主系に応じて異なる可能性がある。本発明において有用であるグリコシル残基は、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、ｎ−アセチルグルコースアミンおよびシアル酸だけには限られないが、これらを含むことができる。グリコシル化結合タンパク質は、グリコシル化パターンがヒトであるようなグリコシル残基を含むことが好ましい。
【０１２１】
異なるタンパク質のグリコシル化は異なるタンパク質特性をもたらす可能性があることは、当業者には知られている。例えば、酵母などの微生物宿主中で産生される治療用タンパク質、および酵母内因性経路を利用するグリコシル化の有効性は、ＣＨＯ細胞系などの哺乳動物細胞中で発現される同じタンパク質のそれと比較して低減する可能性がある。このような糖タンパク質はヒトにおいて免疫原性があり、投与後に低減したインビボ半減期を示す可能性もある。ヒトおよび他の動物において特異的受容体が、特異的グリコシル残基を認識し、血流からのタンパク質の迅速な除去を促進することができる。他の悪影響は、タンパク質のフォールディング、可溶性、プロテアーゼに対する感受性、運搬、輸送、区画化、分泌、他のタンパク質または因子による認識、抗原性、またはアレルギー性の変化を含み得る。したがって当業者は、特異的グリコシル化組成およびパターン、例えば、ヒト細胞中または目的対象動物の種特異的細胞中で生じるそれと同一、または少なくとも類似したグリコシル化組成およびパターンを有する治療用タンパク質を好み得る。
【０１２２】
宿主細胞の発現と異なるグリコシル化タンパク質の発現は、宿主細胞を遺伝的に改変して異種グリコシル化酵素を発現させることによって実施することができる。当技術分野で知られている技法を使用して、当業者は、ヒトタンパク質のグリコシル化を示す抗体またはそれらの抗原結合部分を作製することができる。例えば、酵母菌株を遺伝的に改変して非天然グリコシル化酵素を発現させており、したがって、これらの酵母菌株中で産生されるグリコシル化タンパク質（糖タンパク質）は、動物細胞、特にヒト細胞のグリコシル化と同一のタンパク質のグリコシル化を示す（米国特許出願公開第２００４００１８５９０および同第２００２０１３７１３４号および国際出願公開第ＷＯ０５／１００５８４Ａ２号）。
【０１２３】
用語「多価結合タンパク質」は、２つ以上の抗原結合部位を含む結合タンパク質を示すために本明細書中で使用する。多価結合タンパク質は３つ以上の抗原結合部位を有するように操作することが好ましく、一般に天然に存在する抗体ではない。用語「多重特異性結合タンパク質」は、２つ以上の関連または無関連標的と結合することができる結合タンパク質を指す。本明細書で使用する二重可変ドメイン（ＤＶＤ）結合タンパク質は、２つ以上の抗原結合部位を含む結合タンパク質であり、四価または多価結合タンパク質である。このようなＤＶＤは単一特異性である可能性があり、すなわち１つの抗原と結合することができ、または多重特異性である可能性があり、すなわち２つ以上の抗原と結合することができる。２つの重鎖ＤＶＤポリペプチドおよび２つの軽鎖ＤＶＤポリペプチドを含むＤＶＤ結合タンパク質は、ＤＶＤＩｇと呼ばれる。ＤＶＤＩｇのそれぞれ半分は、重鎖ＤＶＤポリペプチド、および軽鎖ＤＶＤポリペプチド、および２つの抗原結合部位を含む。それぞれの結合部位は、抗原結合部位当たり抗原結合に関与する合計６個のＣＤＲを有する、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む。ＤＶＤ結合タンパク質およびＤＶＤ結合タンパク質を作製する方法は、米国特許出願第１１／５０７，０５０号中に開示されており、参照により本明細書に組み込む。
【０１２４】
本発明の一態様は、トロポニンＩと結合することができる結合タンパク質を含むＤＶＤ結合タンパク質に関する。ＤＶＤ結合タンパク質は、トロポニンＩおよび第二の標的と結合することができることが好ましい。本発明は、その中で抗体がトロポニンＩおよび２つの他の標的（すなわち、第二および第三の標的）と結合することができる、三重可変ドメイン（ＴＶＤ）結合タンパク質も包含する。
【０１２５】
結合タンパク質以外に、本発明は、本発明のこのような結合タンパク質に特異的な抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体も対象とする。抗Ｉｄ抗体は、別の抗体の抗原結合領域と一般に結合した特有の抗原決定基を認識する抗体である。結合タンパク質（例えば、対象の抗体）またはそのＣＤＲ含有領域で動物を免疫処置することによって、抗Ｉｄを調製することができる。免疫処置した動物は、免疫処置抗体のイディオタイプ抗原決定基を認識し、これらに応答し、抗Ｉｄ抗体を産生する。抗Ｉｄ抗体を「免疫原」として使用して、いわゆる抗抗Ｉｄ抗体を産生するさらに別の動物中で免疫応答を誘導することもできる。
【０１２６】
さらに、ライブラリーのメンバーである宿主細胞が変形グリコシル化パターンを有する対象のタンパク質を産生するように、様々なグリコシル化酵素を発現するように遺伝的に操作した宿主細胞のライブラリーを使用して、対象のタンパク質を発現させることが可能であることは当業者によって理解される。したがって当業者は、個々の新規なグリコシル化パターンを有する対象のタンパク質を選択および単離することができる。特に選択した新規なグリコシル化パターンを有するタンパク質は、改善または改変された生物学的性質を示すことが好ましい。
【０１２７】
抗トロポニンＩ抗体の診断用途
トロポニンＩと結合するそれらの能力を前提として、従来の免疫学的検定、競合または非競合アッセイ、例えば酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオ免疫学的検定（ＲＩＡ）、免疫測定アッセイまたは組織免疫組織化学法などを使用し、本発明の抗トロポニンＩ抗体、またはその一部分を使用して、（例えば、血清、全血、ＣＳＦ、脳組織または血漿などの生物サンプル中の）トロポニンＩを検出することができる。したがって本発明は、生物サンプルと本発明の抗体、または抗体部分を接触させること、およびトロポニンＩと結合した抗体（抗体部分）または非結合抗体（抗体部分）のいずれかを検出して、それによって生物サンプル中のトロポニンＩを検出することを含む、生物サンプル中のトロポニンＩを検出するための方法を提供する。結合または非結合抗体の検出を容易にするための検出可能な物質を用いて、抗体を直接または間接的に標識する。適切な検出可能な物質には、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質および放射性物質がある。適切な酵素の例には、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼがあり、適切な補欠分子族複合体の例には、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンがあり、適切な蛍光物質の例には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリスリンがあり、発光物質の一例にはルミノールがあり、また適切な放射性物質の例には、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１７７Ｌｕ、１６６Ｈｏ、または１５３Ｓｍがある。
【０１２８】
抗体標識に対する代替として、検出可能な物質で標識した組換えトロポニンＩ標準、および非標識抗トロポニンＩ抗体を利用する競合免疫学的検定によって、生体液中のトロポニンＩをアッセイすることができる。このアッセイ中、生物サンプル、標識した組換えトロポニンＩ標準、および抗トロポニンＩ抗体を組合せ、非標識抗体と結合した標識した組換えトロポニンＩ標準の量を測定する。生物サンプル中のトロポニンＩの量は、抗トロポニンＩ抗体と結合した標識した組換えトロポニンＩ標準の量に反比例する。
【０１２９】
特に、本発明の一実施形態では、１つまたは複数の本発明の抗体を固相にコーティングする（または液相中に存在する）。試験または生物サンプル（例えば、血清、血漿、尿など）を次いで固相と接触させる。トロポニンＩ抗原がサンプル中に存在する場合、このような抗原は固相上の抗体と結合し、次いで直接法または間接法のいずれかによって検出される。直接法は、複合体自体の存在、したがって抗原の存在を単に検出することを含む。固相にコーティングした抗体と共に完全抗体またはその断片を使用することが可能であることに留意しなければならない。（本発明の目的で、抗体の「断片」または「一部分」は、結合性に関して完全抗体と機能上同じ形式で反応する抗体のサブユニットとして定義する。）
前述のように、間接法では、コンジュゲートを結合抗原に加える。このコンジュゲートは、結合抗原と結合し、シグナル生成化合物または標識と結合した第二の抗体を含む。第二の抗体が結合抗原と結合する場合、シグナル生成化合物は測定可能なシグナルを生成する。したがって、このようなシグナルは、試験サンプル中の抗原（すなわちトロポニンＩ）の存在を示す。
【０１３０】
診断免疫学的検定中で使用する固相の例は、多孔性および非多孔性材料、ラテックス粒子、磁気粒子、マイクロ粒子（米国特許第５，７０５，３３０号参照）、ビーズ、膜、マイクロタイターウエルおよびプラスチックチューブである。固相材料およびコンジュゲート中に存在する抗原または抗体を標識する方法の選択は、望む場合、望ましいアッセイ形式の性能特性に基づいて決定する。
【０１３１】
前述のように、コンジュゲート（または指標試薬）は、シグナル生成化合物または標識と結合した抗体（アッセイに応じて、またはおそらく抗抗体）を含む。このシグナル生成化合物または「標識」自体は検出可能であり、または１つもしくは複数の他の化合物と反応させて検出可能な産物を生成することができる。シグナル生成化合物の例には、色原体、放射性同位体（例えば、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３２Ｐ、３Ｈ、３５Ｓおよび１４Ｃ）、化学発光化合物（例えば、アクリジニウム）、粒子（可視または蛍光）、核酸、錯化剤、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼおよびリボヌクレアーゼ）などの触媒がある。酵素（例えば、アルカリホスファターゼまたはホースラディッシュペルオキシダーゼ）を使用する場合、クロモ−、フルロ−、またはルモジェニック基質の添加は、検出可能なシグナルの生成をもたらす。時間分解蛍光、内部反射蛍光、増幅（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応）およびラマン分光法などの他の検出システムも有用である。
【０１３２】
前述のように、前述の免疫学的検定によって試験することができる生体液の例には、血漿、尿、全血、乾燥全血、血清、脳脊髄液、唾液、涙、鼻腔洗浄液または組織および細胞の水性抽出物がある。
【０１３３】
加えて、免疫学的検定中で使用する（トロポニンＩ抗原を検出するための）一次捕捉抗体は、固相と共有または（例えば、イオン性、疎水性など）非共有結合させることが可能であることにも留意しなければならない。共有結合の結合剤は当技術分野で知られており、固相の一部であってよく、またはコーティング前にそれを誘導体化することができる。
【０１３４】
さらに、本発明のアッセイおよびキットは、ＡｂｂｏｔｔのＰｏｉｎｔ  ｏｆ  Ｃａｒｅ（ｉ−ＳＴＡＴ（商標））電気化学免疫学的検定システムを含めた、ポイントオブケアアッセイシステム用に適合または最適化することが場合によって可能である。免疫センサーおよび一回使用試験デバイス中でこれらを製造および操作する方法は、例えば（それらに関する教示を参照により本明細書に組み込む）米国特許第５，０６３，０８１号、および公開済み米国特許出願第２００３０１７０８８１号、同第２００４００１８５７７号、同第２００５００５４０７８号、および同第２００６０１６０１６４号中に記載されている。
【０１３５】
当然ながら、本明細書の任意の例示的な形式および本発明による任意のアッセイまたはキットは、例えば米国特許第５，０８９，４２４号および同第５，００６，３０９号中に記載され、例えばＡｂｂｏｔｔのＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）、ＡｘＳＹＭ、ＩＭＸ、ＰＲＩＳＭ、およびＱｕａｎｔｕｍＩＩプラットフォーム、および他のプラットフォームだけには限られないがこれらを含めてＡｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、ＩＬ）によって市販されているように、（マイクロ粒子を含む固相が存在するシステムを含めた）自動および半自動システムにおける使用に適合または最適化することが可能である。
【０１３６】
本発明の目的に使用することができる他のアッセイ形式には、例えば、迅速な試験法、ウエスタンブロット、および例えばＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）アッセイ中での常磁性粒子の使用がある（それらの全容を参照により本明細書に組み込む、Ｄａｖｉｄ  Ｗｉｌｄによって編集されたＦｒａｎｋ  Ｑｕｉｎｎ、Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、第二版、３６３−３６７頁、２００１を参照）。このような形式は当業者には知られている。
【０１３７】
前に記載したアッセイの要素は、キットの形で使用するのに特に適していることにも留意しなければならない。キットはバイアル、ボトルまたはストリップなどの１個の容器を含むこともできる。これらのキットは、洗浄、処理などのアッセイを実施するのに必要な他の試薬、および指標試薬のバイアルまたは容器も含有することができる。
【０１３８】
医薬組成物
本発明は、本発明の抗体、またはその抗原結合部分および薬剤として許容される担体を含む医薬組成物も提供する。本発明の抗体を含む医薬組成物は、障害の診断、検出、またはモニタリング、障害またはその１つまたは複数の症状の予防、治療、管理、または改善、および／または研究だけには限られないが、これらに使用する。特定の実施形態では、組成物は本発明の１つまたは複数の抗体を含む。別の実施形態では、医薬組成物は、トロポニンＩ活性が有害である障害を治療するために、本発明の１つまたは複数の抗体、および本発明の抗体以外の１つまたは複数の予防剤または治療剤を含む。好ましくは、障害またはその１つまたは複数の症状の予防、治療、管理、または改善に有用であることが知られている、使用されていた、または現在使用されている予防剤または治療剤。これらの実施形態によれば、組成物は担体、希釈剤または賦形剤をさらに含むことができる。
【０１３９】
本発明の抗体および抗体部分は、対象への投与に適した医薬組成物中に取り込むことができる。典型的には、医薬組成物は、本発明の抗体または抗体部分、および薬剤として許容される担体を含む。本明細書で使用する「薬剤として許容される担体」は、生理的に適合性がある、任意および全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。薬剤として許容される担体の例には、１つまたは複数の水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびこれらの組合せがある。多くの場合、等張剤、例えば、糖、マンニトールなどのポリアルコール、ソルビトール、または塩化ナトリウムなどを組成物中に含むことが好ましい。薬剤として許容される担体は、抗体または抗体部分の貯蔵寿命または有効性を高める、湿潤剤または乳化剤、防腐剤またはバッファーなどの、微量の補助物質をさらに含むことができる。
【０１４０】
様々な送達系が知られており、これらを使用して、障害またはその１つまたは複数の症状の予防、管理、治療、または改善するのに有用な、本発明の１つまたは複数の抗体、または本発明の１つまたは複数の抗体と予防剤もしくは治療剤の組合せ、例えば、リポソーム封入体、マイクロ粒子、マイクロカプセル、抗体または抗体断片の発現、受容体仲介エンドサイトーシスが可能である組換え細胞（例えば、Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２頁（１９８７）を参照）、レトロウイルスまたは他のベクターの一部として核酸の構築物などを投与することができる。本発明の予防剤または治療剤を投与する方法は、非経口投与（例えば、皮内、筋肉内、腹膜内、静脈内および皮下）、硬膜外投与、腫瘍内投与、および粘膜投与（例えば、鼻腔内および経口経路）だけには限られないが、これらを含む。さらに、例えば吸入器または噴霧器、およびエアロゾル剤を含む製剤の使用によって、肺投与を利用することができる。例えば、そのそれぞれを参照によりそれらの全容を本明細書に組み込む、米国特許第６，０１９，９６８号、同第５，９８５，３２０号、同第５，９８５，３０９号、同第５，９３４，２７２号、同第５，８７４，０６４号、同第５，８５５，９１３号、同第５，２９０，５４０号、および同第４，８８０，０７８号、および国際出願公開第ＷＯ９２／１９２４４号、同第ＷＯ９７／３２５７２号、同第ＷＯ９７／４４０１３号、同第ＷＯ９８／３１３４６号、および同第ＷＯ９９／６６９０３号を参照。一実施形態では、本発明の抗体、併用療法剤、または本発明の組成物を、Ａｌｋｅｒｍｅｓ  ＡＩＲ（登録商標）肺送達系技術（Ａｌｋｅｒｍｅｓ、Ｉｎｃ．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）を使用して投与する。特定の実施形態では、本発明の予防剤または治療剤を、筋肉内、静脈内、腫瘍内、経口、鼻腔内、肺、または皮下投与する。予防剤または治療剤は、任意の好都合な経路によって、例えば注入またはボーラス注射によって、上皮または皮膚粘膜内層（例えば、経口粘膜、直腸および腸粘膜など）を介した吸収によって投与することができ、他の生物活性剤と一緒に投与することができる。投与は全身性または局所性であってよい。
【０１４１】
特定の実施形態では、治療の必要がある領域に本発明の予防剤または治療剤を局所投与することは望ましい可能性がある。これは、例えば、非制限的に、局所注入、注射によって、またはインプラントによって実施することができ、前記インプラントは、シリコン膜、ポリマー、繊維状マトリクス（例えば、Ｔｉｓｓｕｅｌ（登録商標））、またはコラーゲンマトリクスなどの膜およびマトリクスを含めた、多孔性または非多孔性材料である。一実施形態では、有効量の本発明の１つまたは複数の抗体アンタゴニストを対象の患部に局所投与して、障害またはその症状の予防、治療、管理、および／または改善する。別の実施形態では、有効量の本発明の１つまたは複数の抗体を、本発明の対象抗体以外の、有効量の１つまたは複数の療法剤（例えば、１つまたは複数の予防剤または治療剤）と併用して患部に局所投与して、障害またはその１つまたは複数の症状の予防、治療、管理、および／または改善する。
【０１４２】
別の実施形態では、予防剤または治療剤は制御放出系または徐放系に送達することができる。一実施形態では、ポンプを使用して制御放出または徐放を実施することができる（Ｌａｎｇｅｒ、上記、Ｓｅｆｔｏｎ、１９８７、ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０、Ｂｕｃｈｗａｌｄら、１９８０、Ｓｕｒｇｅｒｙ８８：５０７、Ｓａｕｄｅｋら、１９８９、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４を参照）。別の実施形態では、ポリマー材料を使用して、本発明の療法剤の制御放出または徐放を実施することができる（例えば、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ、Ｌａｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｗｉｓｅ（ｅｄｓ．）、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、ＦＬ（１９７４）、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ、Ｄｒｕｇ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ、Ｓｍｏｌｅｎ  ａｎｄ  Ｂａｌｌ（ｅｄｓ．）、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４）、Ｒａｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｐｅｐｐａｓ、１９８３、Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：６１を参照。Ｌｅｖｙら、１９８５、Ｓｃｉｅｎｃｅ２２８：１９０、Ｄｕｒｉｎｇら、１９８９、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１、Ｈｏｗａｒｄら、１９８９、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５）、米国特許第５，６７９，３７７号、米国特許第５，９１６，５９７号、米国特許第５，９１２，０１５号、米国特許第５，９８９，４６３号、米国特許第５，１２８，３２６号、国際出願公開第ＷＯ９９／１５１５４号、および国際出願公開第ＷＯ９９／２０２５３号も参照）。徐放製剤において使用されるポリマーの例には、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エチレン−コ−酢酸ビニル）、ポリ（メタクリル酸）、ポリグリコリド（ＰＬＧ）、ポリ無水物、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアクリルアミド、ポリ（エチレングリコール）、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、およびポリオルトエステルがあるが、これらだけには限られない。好ましい実施形態では、徐放製剤において使用されるポリマーは不活性であり、浸出不純物を含まず、保存時に安定性があり、滅菌状態であり、生分解性である。さらに別の実施形態では、制御放出系または徐放系を予防または治療標的の近くに置くことができ、したがって微量の全身用量を必要とし得る（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ、上記、ｖｏｌ．２、１１５−１３８頁（１９８４）中を参照）。
【０１４３】
制御放出系はＬａｎｇｅｒ（１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：１５２７−１５３３頁）による総説中で論じられている。当業者に知られている任意の技法を使用して、本発明の１つまたは複数の治療剤を含む徐放製剤を生成することができる。例えば、そのそれぞれを参照によりそれらの全容を本明細書に組み込む、米国特許第４，５２６，９３８号、国際出願公開第ＷＯ９１／０５５４８号、国際出願公開第ＷＯ９６／２０６９８号、Ｎｉｎｇら、１９９６、「Ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ａ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｏｌｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｘｅｎｏｇｒａｆｔ  Ｕｓｉｎｇ  ａ  Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ−Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｇｅｌ」、Ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ＆  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ３９：１７９−１８９頁、Ｓｏｎｇら、１９９５、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｌｕｎｇ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｌｏｎｇ−Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｅｍｕｌｓｉｏｎｓ」、ＰＤＡ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＆  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ５０：３７２−３９７頁、Ｃｌｅｅｋら、１９９７、「Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  ｆｏｒ  ａ  ｂＦＧＦ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｏｒ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ」、Ｐｒｏ．Ｉｎｔ’ｌ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｍａｔｅｒ．２４：８５３−８５４頁、およびＬａｍら、１９９７、「Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｏｒ  Ｌｏｃａｌ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」、Ｐｒｏ．Ｉｎｔ’ｌ．Ｓｙｍｐ．ＣｏｎｔｒｏｌＲｅｌ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｍａｔｅｒ．２４：７５９−７６０頁を参照。
【０１４４】
本発明の抗体またはその抗原結合部分を単独、または１つまたは複数の他の作用物質、例えば治療剤（例えば、低分子または生物分子）と併用して使用することができ、前記他の作用物質はその意図する目的で当業者によって選択されることは理解されるはずである。他の作用物質は、治療用組成物に有利な属性を与える作用物質、例えば組成物の粘性に影響を与える作用物質であってもよい。
【０１４５】
本発明内に含まれる組合せは、それらの意図する目的で有用である組合せであることはさらに理解されるはずである。以下で述べる作用物質は、例示目的であり制限することは目的としない。本発明の一部である組合せは、本発明の抗体と以下の表から選択される少なくとも１つの他の作用物質であってよい。組合せが、形成組成物がその目的とする機能を果たすことができるような組合せである場合、組合せは２つ以上の他の作用物質、例えば２つまたは３つの他の作用物質を含むこともできる。
【０１４６】
本発明の医薬組成物は、「治療有効量」または「予防有効量」の本発明の抗体または抗体部分を含むことができる。「治療有効量」は、望ましい治療結果を得るのに必要な用量および期間で有効な量を指す。抗体または抗体部分の治療有効量は当業者によって決定することができ、個体の疾患状態、年齢、性別、および重量、および個体中で望ましい応答を誘導する抗体または抗体部分の能力などの要因によって変わる可能性がある。治療有効量は、抗体または抗体部分のいかなる毒性または有害影響よりも、治療有効効果が上回る量でもある。「予防有効量」は、望ましい予防結果を得るのに必要な用量および期間で有効な量を指す。典型的には、疾患の前または初期段階で対象において予防用量を使用するので、予防有効量は治療有効量未満である。
【０１４７】
ここまで本発明を詳細に記載してきたが、例示目的のみで含め本発明の範囲を制限することは目的としない以下の実施例を参照することによって、本発明はさらに明らかに理解される。
【実施例１】
【０１４８】
１９Ｃ７の作製および単離
免疫グロブリン遺伝子の同定
メッセンジャーＲＮＡをサブクローニング抗ＴｎＩ１９Ｃ７−１４４ハイブリドーマ細胞から単離した。（ハイブリドーマ細胞系ＴｎＩ１９Ｃ７は米国特許出願第ＵＳ２００６／００１８８７９号中に記載される。）ＴｎＩ１９Ｃ７のｍＲＮＡは、Ｎｏｖａｇｅｎ（Ｎｏｖａｇｅｎ（Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツの系列会社である）、カタログ番号６９８３１−３）から購入したマウスＩｇプライマーセットキット、およびキット中に含まれる免疫グロブリン遺伝子特異的プライマーを使用して、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応中で利用した。生成したＰＣＲ産物は配列決定し、したがって免疫グロブリン可変重鎖および可変軽鎖遺伝子を同定した（図２参照）。
【０１４９】
ｐＹＤ４１ベクターへのＴｎＩ１９Ｃ７可変領域遺伝子のクローニング
酵母ディスプレイ系を使用して、（本明細書で前に記載した）非突然変異または野生型抗ＴｎＩタンパク質、および酵母タンパク質ＡＧＡ２との融合体としての酵母表面上の抗ＴｎＩタンパク質のライブラリーを発現させた。ｐＹＤと呼ばれる酵母ディスプレイベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用した。それがＡＧＡ２遺伝子のＣ末端での抗ＴｎＩ遺伝子のクローニングを可能にするからである、酵母接合因子（Ｂｏｄｅｒ  ａｎｄ  Ｗｉｔｔｒｕｐ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１５：５５３−５５７頁（１９９７年６月）参照）。ｐＹＤベクターの他の重要な特徴には、挿入抗ＴｎＩ遺伝子のＣ末端上のガラクトース誘導性プロモーターおよびエピトープタグ、Ｖ５がある（図１２参照）。
【０１５０】
酵母ディスプレイプラットホームは、単鎖可変断片として知られる抗体形式を利用する。ｓｃＦｖ形式では、柔軟性のあるリンカーによって、可変重鎖ドメインと可変軽鎖ドメインを連結させる（可変重鎖ドメイン−リンカーＧＰＡＫＥＬＴＰＬＫＥＡＫＶＳ（配列番号５８）−可変軽鎖ドメイン）。
【０１５１】
ＰＣＲシングルオーバーラップエクステンション（ＳＯＥ）を使用して、ＴｎＩ１９Ｃ７ｓｃＦｖ用に可変重鎖遺伝子（ＶＨ）と可変軽鎖遺伝子（ＶＬ）を組合せた（図２、および配列番号５４および５５）。ＴｎＩ１９Ｃ７ｓｃＦｖのＤＮＡを、ベクター制限部位ＳｆｉＩおよびＸｈｏＩを使用して酵母ディスプレイベクターｐＹＤ４１にクローニングした。ｐＹＤ４１−ＴｎＩ１９Ｃ７ｓｃＦｖベクターはＤＨ５αイーコリに形質転換した。次いでプラスミドＤＮＡをイーコリから単離し、ＴｎＩ１９Ｃ７ｓｃＦｖ挿入体を配列決定して、ＡＧＡ２タンパク質とインフレームでｓｃＦｖがクローニングされたことを確実にした。
【０１５２】
酵母ディスプレイベクターｐＹＤ４１へのｓｃＦｖに関するクローニング部位は、以下の遺伝子：ＡＧＡ２結合リンカー４１−Ｘプレスエピトープタグ−ＴｎＩ１９Ｃ７可変重鎖リンカー４０−ＴｎＩ１９Ｃ７可変軽鎖−Ｖ５エピトープタグ−（配列番号２９）タグを含むＯＲＦ中である。さらに、酵母菌株ＥＢＹ１００はトリプトファン栄養要求性変異株であり、ｐＹＤ４１ベクターは系の選択可能マーカーとしてトリプトファンをコードする。
【０１５３】
サッカロマイセス・セレビシエ菌株ＥＢＹ１００への形質転換
酵母ディスプレイプラスミド、ｐＹＤ４１−ＴｎＩ１９Ｃ７ｓｃＦｖを、ＧｉｅｔｚおよびＳｃｈｉｅｓｔｌの方法（ＳｃｈｉｅｓｔｌおよびＧｉｅｔｚ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１６（５−６）：３３９−４６頁（１９８９年１２月）参照）を使用してサッカロマイセス・セレビシエＥＢＹ１００に形質転換した。形質転換反応の希釈液を選択グルコースプレート（２％グルコース（０．６７％酵母窒素源基礎培地、０．１０５％ＨＳＭ−ｔｒｐ−ｕｒａ、１．８％細菌寒天培地、１８．２％ソルビトール、０．８６％ＮａＨ２ＰＯ４Ｈ２Ｏ、１．０２％Ｎａ２ＨＰＯ４７Ｈ２Ｏ）に平板培養し、４８−７２時間３０℃でインキュベートした。選択グルコース培地に個々のコロニーを接種し、１６−２０時間３０℃で攪拌しながら増殖させた。０．５ＯＤ６００の細胞／ｍｌ（ｌｅ７細胞／０．５ＯＤ／ｍｌ）を選択ガラクトース培地に移すことによって、タンパク質の発現をコロニーにおいて誘導した。コロニーは１６−２４時間２０℃で攪拌し、次いでｓｃＴｎＩ−Ｃ−２および抗Ｖ５との結合に関してＦＡＣＳ  Ａｒｉａフローサイトメーターによって分析した。（ｓｃＴｎＩ−Ｃ−２は、Ｓｐｅｃｔｒａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｔｏｒｏｎｔｏ、カナダからの、結合した、単鎖ＴｎＩ（２８−１１０アミノ酸）−リンカーＴｎＣ（１−１６０アミノ酸）であることに留意しなければならない。ｓｃＴｎＩ−Ｃ−２は本発明の考察の目的で「ｓｃＴｎＩ−Ｃ」として略す。）フローサイトメトリーアッセイ用に、ＴｎＩ１９Ｃ７ｓｃＦｖを発現する酵母細胞を、ｓｃＴｎＩ−Ｃ−２または抗Ｖ５、次にそれぞれ抗トロポニンｍＡｂおよびヤギ抗マウス−フィコエリスリン（ＧＡＭ：ＰＥ）（図３Ｂ）またはＧＡＭ：ＰＥ（図３Ａ）のいずれかとインキュベートした。フローサイトメトリーのヒストグラムは、抗Ｖ５によって検出したＴｎＩ１９Ｃ７ｓｃＦｖの完全長発現、およびｓｃＴｎＩ−Ｃ−２と結合するＴｎＩ１９Ｃ７ｓｃＦｖの能力を示す。
【０１５４】
酵母におけるＴｎＩ１９Ｃ７ｓｃＦｖおよびＴｎＩ１９Ｃ７変異体に関するオフレート分析
酵母におけるＴｎＩ１９Ｃ７ｓｃＦｖおよびＴｎＩ１９Ｃ７変異体のオフレートの測定値を、３０−６０分間室温で０．０５ＯＤ酵母（１×１０６個の細胞）と５０ｎＭのｓｃＴｎＩ−Ｃ−２をインキュベートすることによって測定した。次いで細胞を、リン酸緩衝生理食塩水ｐＨ６．８および２％ウシ血清アルブミンおよび０．２％Ｓｔａｎｄａｐｏｌ  ＥＳ−１（ＰＢＳ／ＢＳＡ／Ｓｔａｎｄａｐｏｌ）を含有するブロッキングバッファーで二回洗浄し、様々な時間量（０、０．２５時間、０．５時間、１時間、２時間、４．２５時間、２５．５時間、５０時間、７５時間および１４４時間）で室温においてインキュベートした（図４参照）。それぞれの時間地点で酵母細胞を氷に移し、反応を停止させた。次いで細胞をブロッキングバッファーで二回洗浄し、次の染色試薬、具体的には抗ＴｎＩｍＡｂ８Ｅ１０、１００ｎＭで縣濁した。細胞は氷上で３０分間インキュベートし、二回洗浄し、次いでヤギ抗マウス−フィコエリスリン（ＧＡＭ：ＰＥ）とインキュベートした。最後に、細胞を洗浄し、ＦＡＣＳ  Ａｒｉａフローサイトメーターによって分析した。図４は、平均蛍光単位（「ＭＦＵ」）対時間（秒単位）としてプロットしたオフレートデータを示す。一次崩壊反応式を使用してデータを適合させた。オフレート、図４中に示す式中のｍ２は０．００７ｓｅｃ−１に適合させた。ＴｎＩ１９Ｃ７ｓｃＦｖの半減期（ｔ１／２）は、約８．５分であった（ｔ１／２＝ｌｎ２／ｋｏｆｆ）。
【０１５５】
オフレート選別戦略を使用して、突然変異ライブラリーからオフレート改善ＴｎＩ１９Ｃ７変異体を同定した。したがって、ＴｎＩ１９Ｃ７ｓｃＦｖ、非突然変異または野生型（「ｗｔ」）の半減期を使用して突然変異ライブラリーを選別するのに適した時間を決定した。ＴｎＩ１９Ｃ７突然変異ライブラリーを、野生型ＴｎＩ１９Ｃ７ｓｃＦｖに関して記載したのと同じアッセイ条件で、ｓｃＴｎＩ−Ｃ−２を含まない細胞の洗浄後約９分で選別した。
【０１５６】
ＴｎＩ１９Ｃ７ｓｃＦｖおよびＴｎＩに関する平衡解離（ＫＤ）の分析
酵母におけるＴｎＩ１９Ｃ７ｓｃＦｖおよびＴｎＩ１９Ｃ７変異体のＫＤ測定値を、４５−６０分間室温で０．０５ＯＤ酵母（１×１０６個の細胞）と様々な濃度のｓｃＴｎＩ−Ｃ−２をインキュベートすることによって測定した。リン酸緩衝生理食塩水ｐＨ６．８および２％ウシ血清アルブミンおよび０．２％Ｓｔａｎｄａｐｏｌ  ＥＳ−１（ＰＢＳ／ＢＳＡ／Ｓｔａｎｄａｐｏｌ）を含有するブロッキングバッファーを洗浄および試薬希釈に使用した。次いで細胞を二回洗浄し、抗ＴｎＩｍＡｂ、８Ｅ１０と３０分間インキュベートした。細胞を再度洗浄し、ヤギ抗マウス−フィコエリスリンと３０分間インキュベートした。最後に、細胞を洗浄し、ＦＡＣＳ  Ａｒｉａフローサイトメーターによって分析した（図５参照）。図５は、標準化平均蛍光単位（「ＭＦＵ」）対ｓｃＴｎＩ−Ｃ−２濃度（モル濃度単位）としてプロットしたＫＤデータを示す。抗体標準化、抗原結合平均蛍光強度を抗原濃度に対してプロットし、非線形最小二乗法の適合（ｙ＝ｍ１＋ｍ２＊ｍ０／（ｍ３＋ｍ０））を使用してＫＤを決定した。
【０１５７】
ＴｎＩ１９Ｃ７スパイクＣＤＲライブラリーの作製
突然変異誘発を抗体ＴｎＩ１９Ｃ７の３個の重鎖および軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）に誘導した。これらのループは主な抗原接触部位であるからである。ＣＤＲループの長さおよびナンバリングは、ＫａｂａｔおよびＯｘｆｏｒｄのＭｏｌｅｃｕｌａｒ  ＡｂＭモデリングの命名法を使用して定義した。１個のライブラリーに関してランダムな突然変異がＣＤＲの各アミノ酸位置に組み込まれるように、個々のライブラリーを構成した。各ＣＤＲ当たり１個のライブラリーに相当する合計６個のライブラリーを作製した。
【０１５８】
化学的コンピテントＥＢＹ１００酵母を用いてＳｆｉＩ／ＸｈｏＩ消化ｐＹＤ４１ベクターとＰＣＲ産物を組合せてライブラリーを作製した（図７参照）。２個のＰＣＲ産物を各ＣＤＲライブラリーに関して作製して、ＰＣＲ選別および酵母への相同組換えを可能にした。１個のＰＣＲ産物は、ＣＤＲの全長に関して、７０％が野生型と３０％が他のヌクレオチドである比をプライマー合成中に使用するように設計したプライマーを使用した。この産物はスパイク（ｓｐ）産物と呼んだ（図７参照）。第二のＰＣＲ産物を、ｓｃＦｖ遺伝子の残り部分を含むように設計した。２個のＰＣＲ産物を組合せ、これらを使用して単鎖可変断片またはｓｃＦｖ産物を作製した。消化ベクター（１ｕｇ）およびｓｃＦｖＰＣＲ産物（５ｕｇ）をＥＢＹ１００酵母（５．２ｅ８−６．４ｅ８細胞）と組合せ、エレクトロポレーションを使用して形質転換した。ｓｃＦｖＰＣＲ産物およびｐＹＤ４１消化ベクターは、ヌクレオチド重複および酵母内因性ギャップの修復の機構によって助長される相同組換えのため形質転換中に環化する。ライブラリーは選択グルコース培地中で４８−７２時間３０℃において増殖させ、ライブラリー選別用のタンパク質発現の誘導前に選択グルコース培地中で再度継代した。
【０１５９】
ＴｎＩ１９Ｃ７突然変異ＣＤＲライブラリー
ＴｎＩ１９Ｃ７ライブラリーをオフレート選別戦略に基づいて選別した。ＴｎＩ１９Ｃ７ＣＤＲ突然変異ライブラリーを、１８−２４時間２０℃でガラクトース発現培地において誘導した。酵母におけるＴｎＩ１９Ｃ７ｓｃＦｖおよびＴｎＩ１９Ｃ７ライブラリーを、室温で１０−１５分間２５−５０ｎＭのｓｃＴｎＩ−Ｃ−２とインキュベートした。次いで細胞を、リン酸緩衝生理食塩水ｐＨ６．８および２％ウシ血清アルブミンおよび０．２％Ｓｔａｎｄａｐｏｌ  ＥＳ−１（ＰＢＳ／ＢＳＡ／Ｓｔａｎｄａｐｏｌ）を含有するブロッキングバッファーで二回洗浄し、８分間室温でインキュベートした。酵母細胞は氷に移し、反応を停止させた。次いで細胞をブロッキングバッファーで二回洗浄し、次の染色試薬、具体的には抗ＴｎＩｍＡｂ８Ｅ１０、１００ｎＭおよび抗Ｖ５、１．５−２ｕｇ／ｍｌで縣濁した。細胞は氷上で３０分間インキュベートし、二回洗浄し、次いでヤギ抗マウスＩｇＧ２ａ−フィコエリスリン（ＧＡＭＩｇＧ２ａ：ＰＥ）および１：２００希釈ヤギ抗マウスＩｇＧ１−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８（ＧＡＭＩｇＧ１：４８８）とインキュベートした。最後に、細胞を洗浄し、分析し、ＦＡＣＳ  Ａｒｉａフローサイトメーターで選別した。選別ゲートを８−９分での非突然変異ＴｎＩ１９Ｃ７の結合に基づいて設定し、完全長ＴｎＩ結合クローンを選別するためにゲートを設定した。それぞれの選別によってＴｎＩ結合集合の上部０．１−０．５％を回収した。選別した細胞は選択グルコース培地中で増殖させ、３０℃で１８−２４時間増殖させた。選別１の細胞を誘導し、選別はさらに２または３ラウンド繰り返した。
【０１６０】
最終選別後、選別した細胞は選択グルコースプレートに平板培養し、７２時間３０℃で放置した。これらのライブラリーからの個々の酵母コロニーを選択グルコース培地に接種し、凍結保存し、選択ガラクトース培地において誘導した。次いで個々のコロニーを特徴付けし、オフレートアッセイ中でランク付けした。ＴｎＩ１９Ｃ７ＡＭ４を単離し、この選別アウトプットから同定した。
【０１６１】
ＴｎＩ１９Ｃ７コンビナトリアル突然変異クローンの作製および分析
それぞれのマスターＣＤＲライブラリーまたは全マスターＣＤＲライブラリーのアウトプットからオフレートに関して特徴付けしたコロニーを使用して、異なる個々の突然変異対を含有するｓｃＦｖ遺伝子を構築した。この手法は、個々の突然変異を組合せることによって結合性がさらに増大したかどうかの決定を可能にした。それぞれのＣＤＲ領域中に様々な突然変異を含有するコンビナトリアルクローンをＰＣＲ増幅によって構築し、当業者に知られている通常の技法を使用して組合せた。コンビナトリアル突然変異ライブラリーは前に記載したように酵母に形質転換し、オフレートおよびＫＤ選択圧を使用して二回選別した。ＫＤ選択用に、１００ｐＭ（ラウンド１）および５０ｐＭ（ラウンド２）ｓｃＴｎＩ−Ｃを前に記載したように（図５）ＫＤ実験中で使用した。オフレート選別に関しては、選別は抗原の洗浄後３時間４０分（ラウンド１）および４時間２５分（ラウンド２）のインキュベーション時間で前に記載したように実施した。選別ゲートをそれぞれの条件に関して非突然変異ＴｎＩ１９Ｃ７の結合に基づいて設定し、完全長ＴｎＩ結合クローンを選別するためにゲートを設定した。それぞれの選別によってＴｎＩ結合集合の上部０．１％を回収した。選別した細胞は選択グルコース培地中で、３０℃において１８−２４時間増殖させた。選別１の細胞を誘導し、選別はさらに１ラウンド繰り返した。
【０１６２】
最終選別後、選別した細胞は選択グルコースプレートに平板培養し、７２時間３０℃で放置した。これらのライブラリーからの個々の酵母コロニーを選択グルコース培地に接種し、凍結保存し、選択ガラクトース培地において誘導した。次いで個々のコロニーを特徴付けし、オフレートアッセイ中でランク付けした。ＴｎＩ１９Ｃ７ＡＭ１、ＡＭ２、およびＡＭ３を単離し、このコンビナトリアルライブラリーから同定した。
【０１６３】
選択したＴｎＩ１９Ｃ７変異体の分析
選択したクローンは、野生型ＴｎＩ１９Ｃ７ｓｃＦｖに関して前に記載したように、ＫＤの改善に関して最初に特徴付けした。図９は、４つの選択したクローンに関して決定したｓｃＦｖのＫＤ値を示す。野生型ＴｎＩ１９Ｃ７抗体の１．７ｎＭと比較して、ＴｎＩ１９Ｃ７ＡＭ１クローンは０．３６ｎＭで最も改善された結合を示した。
【０１６４】
選択したＴｎＩ１９Ｃ７ｓｃＦｖ変異体を配列決定して、発現されたアミノ酸突然変異体を決定した。最初に、プラスミドＤＮＡを、酵母用ミニ−調製キット（カタログ番号Ｄ２００１、Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｏｒａｎｇｅ、ＣＡ）を使用して酵母縣濁培養液から単離した。配列決定等級プラスミドＤＮＡを得るために、酵母用ミニ−調製キット由来のプラスミドをＤＨ５αイーコリに形質転換し、次いでイーコリ用ミニ−調製キットを使用して培養液から精製した。ｐＹＤ４１ベクター特異的プライマー（ｐＹＤ４１  ｆｏｒ−ＴＡＧＣＡＴＧＡＣＴＧＧＴＧＧＡＣＡＧＣ（配列番号５９）およびｐＹＤ４１  ｒｅｖ−ＣＧＴＡＧＡＡＴＣＧＡＧＡＣＣＧＡＧ（配列番号６０）を使用して、次いで純プラスミドＤＮＡを配列決定した。ＴｎＩ１９Ｃ７ｓｃＦｖ変異体に関するアミノ酸配列のデータは図１３中に示す。位置番号は、（Ｋａｂａｔの方法に従い番号処理した）それぞれのＣＤＲ中のアミノ酸の位置を指す。
【０１６５】
全体として、野生型クローン由来の配列多様性の原因はＣＤＲＬ２およびＣＤＲＨ１中に見られ、一方ＣＤＲＬ１およびＨ３はコンセンサスモチーフ中にフォールディングされた。ＣＤＲＬ３およびＣＤＲＨ２は非突然変異状態のままであった。ＣＤＲＨ１に関する配列のデータは、コンビナトリアルライブラリーから単離した３クローンにおいて同定したように、位置３４においてイソロイシンからロイシンの保存的変化の優先性を示した。ＣＤＲＨ３のコンセンサス配列は、コンビナトリアルライブラリーから単離した３クローンにおいて同定したように、位置１００ａにおいてトリプトファンではなくチロシン、位置１０１においてアラニンではなくトレオニン、および位置１０２においてチロシンではなくアスパラギン酸の強い優先性を示した。クローン１９Ｃ７ＡＭ４を同定したマスターＣＤＲ選別から、ＣＤＲＨ３は、コンビナトリアルコンセンサス配列組と異なる突然変異を有する唯一のＣＤＲであった。具体的には、突然変異はＡｌａ９６Ｐｈｅ、Ｔｙｒ９９Ｓｅｒ、Ｔｒｐ１００ａＡｌａ、およびＴｙｒ１０２Ａｓｐであった。
【０１６６】
ＣＤＲＬ１に関するコンセンサス配列のデータは、位置２５でトレオニン、位置２７でリシン、位置２８でアスパラギン、位置２９でバリン、および位置３４でヒスチジンの優先性を示した。ＣＤＲＬ２に関しては、それぞれのクローンは特有の突然変異を有するか全く有さず、ＴｎＩ１９Ｃ７ＡＭ１とＡＭ２のみがＳｅｒ５４Ａｒｇ突然変異のみを共有した。
【０１６７】
一過的または安定的発現系中でのＴｎＩ１９Ｃ７キメラ抗体のクローニングおよび可溶性発現
選択したＴｎＩ１９Ｃ７変異体を、ｐＢＯＳと呼ばれる一過的発現ベクター系（Ａｂｂｏｔｔ  Ｂｉｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、ＭＡ）へのＴｎＩ１９Ｃ７可変ドメインのクローニングによって、キメラマウス−マウスＩｇＧ２ａ／マウスｋａｐｐａおよび／またはマウス−ヒトＩｇＧ１／ヒトｋａｐｐａ抗体に転換した。より詳細には、ＰＣＲを使用して、別のｐＢＯＳベクターへのクローニング用の制限部位を有する可変重鎖および可変軽鎖遺伝子を増幅した（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ  ａｎｄ  Ｎａｇａｔａ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１８：５３２２（１９９０））。可変重鎖遺伝子と可変軽鎖遺伝子を消化および脱リン酸化ベクターで連結させ、ＤＨ５αイーコリに形質転換した。プラスミドＤＮＡをイーコリから精製し、ＰＥＩ（１ｍｇ／ｍｌ）を使用して２９３Ｈ細胞にトランスフェクトした。以下のＴｎＩ１９Ｃ７変異体：ＴｎＩ１９Ｃ７野生型、ＡＭ１、ＡＭ２、ＡＭ３およびＡＭ４の一過的抗体が発現した。
【０１６８】
例えば、ｐＢＯＳ−ＴｎＩ１９Ｃ７ＡＭ１重鎖および軽鎖ベクターを使用して、安定的ＣＨＯ細胞系プラスミドを２ステップのクローニング手順で作製した。最初に、可変重鎖遺伝子と可変軽鎖遺伝子を、制限酵素ＳｒｆＩ／ＮｏｔＩを使用して、それぞれｐＢＶおよびｐＪＶプラスミド（Ａｂｂｏｔｔ  Ｂｉｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、ＭＡ）中のヒト定常領域とインフレームで連結させた。連結反応物はＤＨ５αイーコリに形質転換し、プラスミドＤＮＡは個々のコロニーから後に単離した。ｐＢＶ−ＴｎＩ１９Ｃ７マウス可変重鎖−ヒトＩｇＧ１およびｐＪＶ−ＴｎＩ１９Ｃ７マウス可変軽鎖−ヒトｋａｐｐａを、クローニング部位で配列決定した。
【０１６９】
第二のクローニングステップは、１つの安定細胞系ベクターに重鎖ＩｇＧ１遺伝子と軽鎖ｋａｐｐａ遺伝子を組合せることを含んでいた。ｐＢＶ−ＴｎＩ１９Ｃ７ＡＭ１ヒトＩｇＧ１とｐＪＶ−ＴｎＩ１９Ｃ７ＡＭ１ヒトｋａｐｐａベクターをＡｓｃＩ／ＰａｃＩで消化した。ＶＬ−ヒトｋａｐｐａ定常およびＶＨ−ヒトＩｇＧ１定常ＤＮＡ断片をゲル精製し、連結させてｐＢＪ−ＴｎＩ１９Ｃ７ＡＭ１と呼ばれる安定細胞系ベクターを生成した。ｐＢＪ−ＴｎＩ１９Ｃ７ＡＭ１ヒト重鎖／軽鎖キメラプラスミドは、リポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）プロトコールを使用してＣＨＯ細胞に形質転換した。安定細胞系は初回形質転換からサブクローニングした。（「ＴｎＩ１９Ｃ７ＡＭ１ｈＧ１ｋＣＨＯ２０４」とも呼ばれる）安定的ＣＨＯ細胞系がクローンＡＭ１用に開発され、２００９年２月１１日にアメリカンタイプカルチャーコレクション、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ２０１１０−２２０９に寄託され、受託番号ＰＴＡ−９８１６を得た。
【実施例２】
【０１７０】
トロポニンＩクローン１９Ｃ７野生型と親和性成熟抗体の相対的親和性
トロポニンＩクローン１９Ｃ７野生型（マウス完全構築物）および親和性成熟（ヒト定常領域）抗体を、マイクロタイター酵素免疫学的検定中で相対的親和性に関して評価した。９６ウエルアッセイプレート（ＮＵＮＣ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）を、ヒツジ抗マウスＩｇＧＦｃγ特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）またはロバ抗ヒトＩｇＧＦｃγ断片特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）のいずれかの１００ｕＬ／ウエルの２ｕｇ／ｍＬ溶液を加えることによってコーティングした。両方の抗体をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、ＩＬ）中に希釈した。アッセイプレートは１５−３０℃で一晩インキュベートした。翌日コーティング試薬を除去し、２００ｕＬ／ウエルのＢＳＡ溶液（ＰＢＳ中に希釈したウシ血清アルブミン［Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ］）を加えた。ＢＳＡ溶液は１５−３０℃において３０分間アッセイウエル中でインキュベートし、除去し、アッセイウエルは３００ｕＬ／ウエルの蒸留水（ｄＨ２Ｏ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を加えることによって洗浄し、３洗浄サイクルで吸引した。次に、１００ｕＬ／ウエルの試験サンプルを加えた。試験サンプルは、それぞれの抗体の開始２ｕｇ／ｍＬ溶液（ＢＳＡ溶液中）を作製し、次にＢＳＡ溶液中にｌｏｇ３希釈によって調製した。試験サンプルは１５−３０℃において２−３時間インキュベートし、その後サンプルを吸引除去し、ウエルは前に記載したようにｄＨ２Ｏで洗浄した。次に、１００ｕＬ／ウエルの試験抗原溶液をそれぞれのアッセイウエルに加えた。試験抗原溶液は、ＢＳＡ溶液中のｓｃＴｎＩ−Ｃ−２（完全長心筋トロポニンＣと結合した心筋トロポニンＩのアミノ酸２８−１００、Ｓｐｅｃｔｒａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）の１０００ｎｇ／ｍＬ溶液を最初に調製し、次にｌｏｇ２希釈によって作製した。抗原溶液は１５−３０℃において１０分間アッセイウエル中でインキュベートし、溶液を叩き出すことによって除去した。次いでアッセイプレートを前に記載したようにｄＨ２Ｏで洗浄した。次に、１００ｕＬ／ウエルのビオチン標識ヤギ抗トロポニンＩ抗体（ＨｙＴｅｓｔ、ＢＳＡ溶液中に５００ｎｇ／ｍＬに希釈）をそれぞれのアッセイウエルに加え、１５−３０℃において３０分間インキュベートした。次いで抗体を吸引除去し、ウエルは記載したようにｄＨ２Ｏで洗浄した。次に、ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（ＳＡ−ＨＲＰＯ、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）の１００ｕＬ／ウエルの２００ｎｇ／ｍＬ溶液（ＢＳＡ溶液中）を加え、１５−３０℃において３０分間インキュベートした。次いでＳＡ−ＨＲＰＯ試薬を吸引除去し、プレートを記載したように洗浄した。次に基質溶液を、１０ｍＬのＯＰＤ希釈液当たり１ＯＰＤ錠剤を溶かすことによって調製した（ｏ−フェニレンジアミン、いずれもＡｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。１００ｕＬ／ウエルの調製基質溶液をアッセイプレートに加え、約４−５分間インキュベートし、次いで１００ｕＬ���ウエルの１Ｎ硫酸（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を加えることによって反応を停止させた。生成したシグナルは、蛍光光度計を使用して４９２ｎｍで読み取った。実験からの結果はカレイダグラフソフトウエアを使用してプロットした。Ａｇ５０値（最大結合の５０％での抗原の濃度）を決定し、これを使用して試験抗原に対する相対的親和性に関して抗体を比較した。
【実施例３】
【０１７１】
免疫学的検定中でのモノクローナル抗体１９Ｃ７の使用
トロポニンＩクローン１９Ｃ７野生型（マウス完全構築物）および親和性成熟（ヒト定常領域）抗体を、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）免疫学的検定アナライザー（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で相対的親和性に関して評価した。このアッセイは全自動式であり、アナライザーは全てのステップで機能する。マウス抗トロポニンＩ抗体（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、ＩＬ）でコーティングした磁気マイクロ粒子を、様々なレベルのｓｃＴｎＩ−Ｃ−２（完全長心筋トロポニンＣと結合した心筋トロポニンＩのアミノ酸２８−１００、（Ｓｐｅｃｔｒａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）と混合し、１５−３０℃において１８分間インキュベートした。この時間中、マイクロ粒子コーティング抗体はｓｃＴｎＩ−Ｃ−２と結合した。次いでマイクロ粒子を磁石で引き寄せ、残りのアッセイ溶液は吸引し、粒子はアッセイ希釈液（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、ＩＬ）で洗浄した。次に、その全てをアクリジニウムで標識した野生型または親和性成熟１９Ｃ７抗体（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、ＩＬ）をマイクロ粒子に加え、１５−３０℃において４分間インキュベートした。次に、マイクロ粒子を磁石で引き寄せ、残りのアッセイ溶液は吸引し、粒子はアッセイ希釈液で洗浄した。シグナル（相対光単位）はプレトリガーおよびトリガー溶液（いずれもＡｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を加えることによって生成した。シグナル比を計算し、これらを使用して抗体を比較した。図１１中に示す結果に基づいて確定することができるように、ＡＭ１抗体は野生型抗体より良いシグナルを与えた。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【配列表】
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