(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者由来の末梢血試料における結腸直腸癌検出のためのキットであって、少なくともＮＥＡＴ１遺伝子に特異的な少なくとも１種の試薬を含み、前記遺伝子は配列番号３５で特定される核酸配列の全長配列を含む、キット。
【請求項２】
少なくとも１種の他の標的遺伝子に特異的な少なくとも１種の他の試薬をさらに含み、前記標的遺伝子が配列番号１−３４及び３６−５９からなる群から選択される全長核酸配列を含む、請求項１に記載のキット。
【請求項３】
さらに標的遺伝子に特異的な試薬の組合せを少なくとも含み、前記標的遺伝子が、
（ｉ）配列番号１で特定されている全長配列を含むＫＬＲＢ１遺伝子、
（ｉｉ）配列番号２、３又は４で特定されている全長配列を含むＫＬＲＣ２遺伝子、
（ｉｉｉ）配列番号５、６又は７で特定されている全長配列を含むＫＬＲＣ３遺伝子、
（ｉｖ）配列番号８、９、１０、１１又は１２で特定されている全長配列を含むＫＬＲＤ１遺伝子、
（ｖ）配列番号１３で特定されている全長配列を含むＫＬＲＫ１遺伝子、
（ｖｉ）配列番号１４、１５、１６又は１７で特定されている全長配列を含むＧＺＭＢ遺伝子、
（ｖｉｉ）配列番号１８、１９又は２０で特定されている全長配列を含むＣＤ２４７遺伝子、
（ｖｉｉｉ）配列番号２１又は２２で特定されている全長配列を含むＲＲＡＳ２遺伝子、
（ｉｘ）配列番号２３又は２４で特定されている全長配列を含むＳＨ２Ｄ１Ｂ遺伝子、
（ｘ）配列番号２５、２６、２７、２８、２９又は３０で特定されている全長配列を含むＬＣＫ遺伝子、
（ｘｉ）配列番号３１、３２又は３３で特定されている全長配列を含むＭＲＰＳ６遺伝子、
（ｘｉｉ）配列番号３４で特定されている全長配列を含むＳＰＲＹ４遺伝子、
（ｘｉｉｉ）配列番号３６で特定されている全長配列を含むＣＹＢＢ遺伝子、
（ｘｉｖ）配列番号３７で特定されている全長配列を含むＤＵＳＰ２遺伝子、
（ｘｖ）配列番号３８又は３９で特定されている全長配列を含むＰＤＥ４Ｄ遺伝子、
（ｘｖｉ）配列番号４０、４１又は４２で特定されている全長配列を含むＳＨ２Ｄ２Ａ遺伝子、
（ｘｖｉｉ）配列番号４３又は４４で特定されている全長配列を含むＩＮＳＲ遺伝子、
（ｘｖｉｉｉ）配列番号４５で特定されている全長配列を含むＩＴＧＡＭ遺伝子、
（ｘｉｘ）配列番号４６、４７、４８又は４９で特定されている全長配列を含むＶＣＡＮ遺伝子、
（ｘｘ）配列番号５０又は５１で特定されている全長配列を含むＣＤ１６３遺伝子、
（ｘｘｉ）配列番号５２又は５３で特定されている全長配列を含むＰ２ＲＹ１０遺伝子、
（ｘｘｉｉ）配列番号５４で特定されている全長配列を含むＣＤ２２６遺伝子、
（ｘｘｉｉｉ）配列番号５５又は５６で特定されている全長配列を含むＭＲＰＬ１０遺伝子、
（ｘｘｉｖ）配列番号５７で特定されている全長配列を含むＩＴＰＲＩＰＬ２遺伝子、
（ｘｘｖ）配列番号５８で特定されている全長配列を含むＣＤ２遺伝子、及び
（ｘｘｖｉ）配列番号５９で特定されている全長配列を含むＮＵＤＴ１６遺伝子
からなる、請求項１に記載のキット。
【請求項４】
さらに標的遺伝子に特異的な試薬の組合せを少なくとも含み、前記標的遺伝子が、
（ｉ）配列番号３１、３２又は３３で特定されている全長配列を含むＭＲＰＳ６遺伝子、
（ｉｉ）配列番号３４で特定されている全長配列を含むＳＰＲＹ４遺伝子、
（ｉｉｉ）配列番号３６で特定されている全長配列を含むＣＹＢＢ遺伝子、
（ｉｖ）配列番号３７で特定されている全長配列を含むＤＵＳＰ２遺伝子、
（ｖ）配列番号３８又は３９で特定されている全長配列を含むＰＤＥ４Ｄ遺伝子、
（ｖｉ）配列番号４０、４１又は４２で特定されている全長配列を含むＳＨ２Ｄ２Ａ遺伝子、
（ｖｉｉ）配列番号１４、１５、１６又は１７で特定されている全長配列を含むＧＺＭＢ遺伝子、
（ｖｉｉｉ）配列番号４３又は４４で特定されている全長配列を含むＩＮＳＲ遺伝子、
（ｉｘ）配列番号４５で特定されている全長配列を含むＩＴＧＡＭ遺伝子、
（ｘ）配列番号４６、４７、４８又は４９で特定されている全長配列を含むＶＣＡＮ遺伝子、
（ｘｉ）配列番号５０又は５１で特定されている全長配列を含むＣＤ１６３遺伝子、
（ｘｉｉ）配列番号５２又は５３で特定されている全長配列を含むＰ２ＲＹ１０遺伝子、
（ｘｉｉｉ）配列番号５４で特定されている全長配列を含むＣＤ２２６遺伝子、
（ｘｉｖ）配列番号５５又は５６で特定されている全長配列を含むＭＲＰＬ１０遺伝子、
（ｘｖ）配列番号５７で特定されている全長配列を含むＩＴＰＲＩＰＬ２遺伝子、
（ｘｖｉ）配列番号５８で特定されている全長配列を含むＣＤ２遺伝子、及び
（ｘｖｉｉ）配列番号５９で特定されている全長配列を含むＮＵＤＴ１６遺伝子
からなる、請求項１に記載のキット。
【請求項５】
さらに標的遺伝子に特異的な試薬の組合せを少なくとも含み、前記標的遺伝子が、
（ｉ）配列番号３７で特定されている全長配列を含むＤＵＳＰ２遺伝子、
（ｉｉ）配列番号３８又は３９で特定されている全長配列を含むＰＤＥ４Ｄ遺伝子、
（ｉｉｉ）配列番号４０、４１又は４２で特定されている全長配列を含むＳＨ２Ｄ２Ａ遺伝子、
（ｉｖ）配列番号１４、１５、１６又は１７で特定されている全長配列を含むＧＺＭＢ遺伝子、
（ｖ）配列番号４５で特定されている全長配列を含むＩＴＧＡＭ遺伝子、
（ｖｉ）配列番号５２又は５３で特定されている全長配列を含むＰ２ＲＹ１０遺伝子、
（ｖｉｉ）配列番号５７で特定されている全長配列を含むＩＴＰＲＩＰＬ２遺伝子、及び
（ｖｉｉｉ）配列番号５９で特定されている全長配列を含むＮＵＤＴ１６遺伝子
からなる、請求項１に記載のキット。
【請求項６】
さらに標的遺伝子に特異的な試薬の組合せを少なくとも含み、前記標的遺伝子が、
（ｉ）配列番号１で特定されている全長配列を含むＫＬＲＢ１遺伝子、
（ｉｉ）配列番号２、３又は４で特定されている全長配列を含むＫＬＲＣ２遺伝子、
（ｉｉｉ）配列番号５、６又は７で特定されている全長配列を含むＫＬＲＣ３遺伝子、
（ｉｖ）配列番号８、９、１０、１１又は１２で特定されている全長配列を含むＫＬＲＤ１遺伝子、及び
（ｖ）配列番号１３で特定されている全長配列を含むＫＬＲＫ１遺伝子
からなる、請求項１に記載のキット。
【請求項７】
さらに標的遺伝子に特異的な試薬の組合せを少なくとも含み、前記標的遺伝子が、
（ｉ）配列番号１４、１５、１６又は１７で特定されている全長配列を含むＧＺＭＢ遺伝子、
（ｉｉ）配列番号１８、１９又は２０で特定されている全長配列を含むＣＤ２４７遺伝子、
（ｉｉｉ）配列番号２１又は２２で特定されている全長配列を含むＲＲＡＳ２遺伝子、
（ｉｖ）配列番号２３又は２４で特定されている全長配列を含むＳＨ２Ｄ１Ｂ遺伝子、及び
（ｖ）配列番号２５、２６、２７、２８、２９又は３０で特定されている全長配列を含むＬＣＫ遺伝子
からなる、請求項１に記載のキット。
【請求項８】
患者由来の生物試料における結腸直腸癌検出のための組成物の製造における、配列番号３５に表記されている核酸配列を含む少なくともＮＥＡＴ１遺伝子に特異的な少なくとも１種の試薬の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、結腸直腸癌の予後判定に関し、特に、このような癌の予後判定のための方法及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
結腸癌又は大腸癌とも称する結腸直腸癌（ＣＲＣ）は、米国における五番目に一般的な形態の癌であり、中国における四番目に一般的な癌であり、欧州における癌関連死の三番目に主要な原因である。ＣＲＣの早期発見は、依然として公衆衛生上の大きな課題である。実際のところ、ＣＲＣは、特に初期段階で診断された場合、多くは治癒可能である。様々なスクリーニング戦略が各国で既に実施されている。従来のＣＲＣスクリーニング検査は、便潜血検査（ＦＯＢＴ）、Ｓ状結腸鏡検査、結腸内視鏡検査、二重造影バリウム注腸又は触指による直腸診を包含する。これら全て利点と制限を有するが、主に設備（logistics）又は患者の不快感のため、コンプライアンス（compliance）は予想よりも低いままである。
【０００３】
ここ数年、特にその簡便さのため、ＣＲＣの早期発見を目的とした血液バイオマーカーの探索が焦点となっている。一方、血液に基づく検査の実現可能性を支持する、血液中の遺伝子バイオマーカーがＣＲＣ患者を対照から区別できることを示す研究はごく僅かであった。これらの研究は、細胞等、顕微鏡レベルの粒子を液体の流れに懸濁して電子検出装置を通過させることにより、これを計数、精査するための技法であるフローサイトメトリーに基づいていた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明者らは、ディファレンシャルに発現した遺伝子が、主として免疫細胞活性化及び輸送に関連することを見出した。特に、本発明者らは、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）が、末梢血試料における重要なバイオマーカーを表すことを示した。本発明者らは、古典的技法であるフローサイトメトリーを用いず、全血における遺伝子のディファレンシャルな発現の決定を行った。一般に当業者が認める通り、特異的な精製ステップが為されずＲＮＡの複合的混合物（全ＲＮＡ）中に薄められている場合、特異的な情報の読み出しは非常に困難であるため、全血における転写産物の解析による遺伝子発現レベルの決定は通常行われない。本方法の利点は、また、ＲＮＡ精製ステップを回避することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
よって、本発明は、患者由来の末梢血試料において結腸直腸癌の予後を決定するための方法であって、
ａ）末梢血試料を得て、該血液試料から全ＲＮＡを抽出するステップと、
ｂ）全ＲＮＡを、少なくとも１種のＮＫ細胞遺伝子に特異的な少なくとも１種の試薬且つ２５種のＮＫ細胞遺伝子のための２５種以下の特異的試薬と接触させるステップと、
ｃ）少なくとも１種のＮＫ細胞遺伝子且つ最大２５種のＮＫ細胞遺伝子の発現レベルを決定して、患者の発現プロファイルを得るステップと、
ｄ）以前に予後良好として臨床的に分類された患者由来のＮＫ細胞遺伝子の発現プロファイル及び以前に予後不良として分類された患者由来のＮＫ細胞遺伝子の発現プロファイルを用いて、患者の発現プロファイルの解析を行うステップであって、
患者の発現プロファイルが、以前に予後不良として臨床的に分類された患者由来の発現プロファイルとクラスター化される場合、患者は予後不良であると決定され、
患者の発現プロファイルが、以前に予後良好として臨床的に分類された患者由来の発現プロファイルとクラスター化される場合、患者は予後良好であると決定されるステップと
を含む方法に関する。
【０００６】
特に、上述のステップｂ）において、全ＲＮＡを、少なくとも１種のＮＫ細胞遺伝子に特異的な少なくとも１種の試薬且つ２５種のＮＫ細胞遺伝子のための２５種以下の特異的試薬と接触させ、前記ＮＫ細胞遺伝子は、配列番号１〜１２に表記されている核酸配列を含み、少なくとも１種の試薬は、
（ｉ）配列番号１で特定されているような全長配列を含むＫＬＲＢ１遺伝子、
（ｉｉ）配列番号２、３又は４で特定されているような全長配列を含むＫＬＲＣ２遺伝子、
（ｉｉｉ）配列番号５、６又は７で特定されているような全長配列を含むＫＬＲＣ３遺伝子、
（ｉｖ）配列番号８、９、１０、１１又は１２で特定されているような全長配列を含むＫＬＲＤ１遺伝子、及び
（ｖ）配列番号１３で特定されているような全長配列を含むＫＬＲＫ１遺伝子
からなる群から選択される少なくとも１種のＮＫ細胞遺伝子に特異的であり、
少なくとも１種のＮＫ細胞遺伝子の発現レベルをステップｃ）において決定して、患者の発現プロファイルを得る。
【０００７】
上述の遺伝子のうち少なくとも１種の発現レベルは、実験データに詳述する通り、ＣＲＣリスクを予見するのに十分な情報である。
【０００８】
一実施形態において、ステップｂ）において、全ＲＮＡを、最小５種のＮＫ細胞遺伝子且つ２５種以下のＮＫ細胞遺伝子の組み合わせに特異的な試薬と接触させ、試薬は、少なくとも、
（ｉ）配列番号１で特定されているような全長配列を含むＫＬＲＢ１遺伝子、
（ｉｉ）配列番号２、３又は４で特定されているような全長配列を含むＫＬＲＣ２遺伝子、
（ｉｉｉ）配列番号５、６又は７で特定されているような全長配列を含むＫＬＲＣ３遺伝子、
（ｉｖ）配列番号８、９、１０、１１又は１２で特定されているような全長配列を含むＫＬＲＤ１遺伝子、及び
（ｖ）配列番号１３で特定されているような全長配列を含むＫＬＲＫ１
からなるＮＫ細胞遺伝子に特異的な試薬を包含し、
少なくとも前記４種のＮＫ細胞遺伝子の発現レベルをステップｃ）において決定して、患者の発現プロファイルを得る。
【０００９】
更に、ステップｂ）において、全ＲＮＡを、少なくとも１種の標的細胞遺伝子に特異的な少なくとも１種の試薬且つ５種の標的細胞遺伝子のための５種以下の特異的試薬と接触させることができ、前記標的細胞遺伝子は、配列番号１２〜２４に表記されている核酸配列を含み、少なくとも１種の試薬は、
（ｉ）配列番号１４、１５、１６又は１７で特定されているような全長配列を含むＧＺＭＢ遺伝子、
（ｉｉ）配列番号１８、１９又は２０で特定されているような全長配列を含むＣＤ２４７遺伝子、
（ｉｉｉ）配列番号２１又は２２で特定されているような全長配列を含むＲＲＡＳ２遺伝子、
（ｉｖ）配列番号２３又は２４で特定されているような全長配列を含むＳＨ２Ｄ１Ｂ遺伝子、及び
（ｖ）配列番号２５、２６、２７、２８、２９又は３０で特定されているような全長配列を含むＬＣＫ遺伝子
からなる群から選択される少なくとも１種の標的細胞遺伝子に特異的であり、
少なくとも１種の細胞遺伝子の発現レベルをステップｃ）において決定して、患者の発現プロファイルを得る。また、一実施形態において、全ＲＮＡを、５種の標的細胞遺伝子の組み合わせに特異的な試薬と接触させ、試薬は、
（ｉ）配列番号１４、１５、１６又は１７で特定されているような全長配列を含むＧＺＭＢ遺伝子、
（ｉｉ）配列番号１８、１９又は２０で特定されているような全長配列を含むＣＤ２４７遺伝子、
（ｉｉｉ）配列番号２１又は２２で特定されているような全長配列を含むＲＲＡＳ２遺伝子、
（ｉｖ）配列番号２３又は２４で特定されているような全長配列を含むＳＨ２Ｄ１Ｂ遺伝子、及び
（ｖ）配列番号２５、２６、２７、２８、２９又は３０で特定されているような全長配列を含むＬＣＫ遺伝子
からなる標的細胞遺伝子に特異的であり、
少なくとも５種の細胞遺伝子の発現レベルをステップｃ）において決定して、患者の発現プロファイルを得る。
【００１０】
別の一実施形態において、ステップｂ）において、全ＲＮＡを、少なくとも１種の標的細胞遺伝子に特異的な少なくとも１種の試薬且つ１００種の標的細胞遺伝子のための１００種以下の特異的試薬と更に接触させ、前記標的細胞遺伝子は、配列番号２５〜５９に表記されている核酸配列を含み、少なくとも１種の試薬は、
（ｉ）配列番号３１、３２又は３３で特定されているような全長配列を含むＭＲＰＳ６遺伝子、
（ｉｉ）配列番号３４で特定されているような全長配列を含むＳＰＲＹ４遺伝子、
（ｉｉｉ）配列番号３５で特定されているような全長配列を含むＮＥＡＴ１遺伝子、
（ｉｖ）配列番号３６で特定されているような全長配列を含むＣＹＢＢ遺伝子、
（ｖ）配列番号３７で特定されているような全長配列を含むＤＵＳＰ２遺伝子、
（ｖｉ）配列番号３８又は３９で特定されているような全長配列を含むＰＤＥＡＤ遺伝子、
（ｖｉｉ）配列番号４０、４１又は４２で特定されているような全長配列を含むＳＨ２Ｄ２Ａ遺伝子、
（ｖｉｉｉ）配列番号４３又は４４で特定されているような全長配列を含むＩＮＳＲ遺伝子、
（ｉｘ）配列番号４５で特定されているような全長配列を含むＩＴＧＡＭ遺伝子、
（ｘ）配列番号４６、４７、４８又は４９で特定されているような全長配列を含むＶＣＡＮ遺伝子、
（ｘｉ）配列番号５０又は５１で特定されているような全長配列を含むＣＤ１６３遺伝子、
（ｘｉｉ）配列番号５２又は５３で特定されているような全長配列を含むＰ２ＲＹ１０遺伝子、
（ｘｉｉ）配列番号５４で特定されているような全長配列を含むＣＤ２２６遺伝子、
（ｘｉｉｉ）配列番号５５又は５６で特定されているような全長配列を含むＭＲＰＬ１０遺伝子、
（ｘｉｖ）配列番号５７で特定されているような全長配列を含むＩＴＰＲＩＰＬ２遺伝子、
（ｘｖ）配列番号５８で特定されているような全長配列を含むＣＤ２遺伝子、及び
（ｘｖｉ）配列番号５９で特定されているような全長配列を含むＮＵＤＴ１６遺伝子
からなる群から選択される少なくとも１種の標的細胞遺伝子に特異的であり、
少なくとも１種の細胞遺伝子の発現レベルをステップｃ）において決定して、患者の発現プロファイルを得る。
【００１１】
特に、ステップｂ）において、全ＲＮＡを、最小１７種の標的細胞遺伝子且つ１００種以下の標的細胞遺伝子の組み合わせに特異的な試薬と接触させ、試薬は、少なくとも、
（ｉ）配列番号３１、３２又は３３で特定されているような全長配列を含むＭＲＰＳ６遺伝子、
（ｉｉ）配列番号３４で特定されているような全長配列を含むＳＰＲＹ４遺伝子、
（ｉｉｉ）配列番号３５で特定されているような全長配列を含むＮＥＡＴ１遺伝子、
（ｉｖ）配列番号３６で特定されているような全長配列を含むＣＹＢＢ遺伝子、
（ｖ）配列番号３７で特定されているような全長配列を含むＤＵＳＰ２遺伝子、
（ｖｉ）配列番号３８又は３９で特定されているような全長配列を含むＰＤＥＡＤ遺伝子、
（ｖｉｉ）配列番号４０、４１又は４２で特定されているような全長配列を含むＳＨ２Ｄ２Ａ遺伝子、
（ｖｉｉｉ）配列番号４３又は４４で特定されているような全長配列を含むＩＮＳＲ遺伝子、
（ｉｘ）配列番号４５で特定されているような全長配列を含むＩＴＧＡＭ遺伝子、
（ｘ）配列番号４６、４７、４８又は４９で特定されているような全長配列を含むＶＣＡＮ遺伝子、
（ｘｉ）配列番号５０又は５１で特定されているような全長配列を含むＣＤ１６３遺伝子、
（ｘｉｉ）配列番号５２又は５３で特定されているような全長配列を含むＰ２ＲＹ１０遺伝子、
（ｘｉｉ）配列番号５４で特定されているような全長配列を含むＣＤ２２６遺伝子、
（ｘｉｉｉ）配列番号５５又は５６で特定されているような全長配列を含むＭＲＰＬ１０遺伝子、
（ｘｉｖ）配列番号５７で特定されているような全長配列を含むＩＴＰＲＩＰＬ２遺伝子、
（ｘｖ）配列番号５８で特定されているような全長配列を含むＣＤ２遺伝子、及び
（ｘｖｉ）配列番号５９で特定されているような全長配列を含むＮＵＤＴ１６遺伝子
からなる標的細胞遺伝子に特異的な試薬を包含し、
少なくとも１７種の細胞遺伝子の発現レベルをステップｃ）において決定して、患者の発現プロファイルを得る。
【００１２】
より正確には、上述の方法において、ステップｂ）の少なくとも１種の特異的試薬は、少なくとも１種のハイブリダイゼーションプローブ、特に、少なくとも１種のハイブリダイゼーションプローブ及び少なくとも１種のプライマー、より具体的には、少なくとも１種のハイブリダイゼーションプローブ及び２種のプライマーを含む。
【００１３】
全ＲＮＡは、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、標的遺伝子から転写された伝令ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）と共にその他の遺伝子から転写されたｍＲＮＡ等、ｍＲＮＡ及びリボソームＲＮＡを含む。
【００１４】
目安として、全ＲＮＡの抽出は、患者の細胞内に含有されている核酸を遊離させるための、血液試料中に存在する細胞の溶解からなるステップにより行うことができる。例として、次の特許出願に記載されている溶解方法を用いることができる。磁気及び機械的溶解の混合型に関する国際公開第００／０５３３８号パンフレット、電気的溶解に関する国際公開第９９／５３３０４号パンフレット、機械的溶解に関する国際公開第９９／１５３２１号パンフレット。当業者であれば、熱若しくは浸透圧ショック又はグアニジウム塩等、カオトロピック剤を用いた化学的溶解（米国特許第５，２３４，８０９号明細書）等、他のよく知られた溶解方法を用いることができる。溶解ステップにおいて遊離した他の細胞構成成分から核酸を分離するための追加的なステップを設けることも可能である。このステップは、一般に、核酸の濃縮を可能にする。例として、必要に応じて吸着又は共有原子価によりオリゴヌクレオチドでコーティングされた磁気粒子を用いることができ（これに関して、米国特許第４，６７２，０４０号明細書及び米国特許第５，７５０，３３８号明細書を参照）、これにより、この磁気粒子と結合している核酸を洗浄ステップによって精製することができる。この核酸精製ステップは、その後に前記核酸を増幅することが望ましい場合、特に有利である。この磁気粒子の特に有利な実施形態は、特許出願、国際公開第Ａ−９７／４５２０２号パンフレット及び国際公開第Ａ−９９／３５５００号パンフレットに記載されている。
【００１５】
用語「特異的な試薬」は、上に定義されている生物材料と接触させると、前記標的遺伝子に特異的な材料と結合する試薬を意味する。目安として、特異的な試薬及び生物材料が、核酸起源（nucleic origin）のものである場合、特異的な試薬を生物材料と接触させると、特異的な試薬は、標的遺伝子に特異的な材料とハイブリダイズする。用語「ハイブリダイゼーション」は、適切な条件下で、２本のヌクレオチド断片が、安定的且つ特異的な水素結合により結合して、二本鎖複合体を形成するプロセスを意味するよう企図されている。これらの水素結合は、相補的なアデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）（又はウラシル（Ｕ））塩基の間（これをＡ−Ｔ結合と言う）、或いは相補的なグアニン（Ｇ）とシトシン（Ｃ）塩基の間（これをＧ−−Ｃ結合と言う）に形成される。２本のヌクレオチド断片のハイブリダイゼーションは、完全（相補的ヌクレオチド断片又は配列のことをいう）であってもよく、即ち、このハイブリダイゼーションにおいて得られる二本鎖複合体は、Ａ−Ｔ結合及びＣ−Ｇ結合のみを含む。このハイブリダイゼーションは、部分的（十分に相補的なヌクレオチド断片又は配列のことをいう）であってもよく、即ち、得られる二本鎖複合体は、二本鎖複合体を形成できるＡ−Ｔ結合及びＣ−Ｇ結合のみならず、相補塩基と結合していない塩基を含む。２本のヌクレオチド断片間のハイブリダイゼーションは、用いられている作業条件、特にストリンジェンシーに依存する。ストリンジェンシーは、特に、２本のヌクレオチド断片の塩基組成に応じると共に、２本のヌクレオチド断片間のミスマッチ形成の程度により定義される。ストリンジェンシーは、ハイブリダイゼーション溶液中に存在するイオン種の濃度及び種類、変性剤の性質及び濃度、及び／又はハイブリダイゼーション温度等、反応パラメータにも依存し得る。これらデータの全てはよく知られており、当業者であれば、適切な条件を決定することができる。一般に、ハイブリダイズさせようとするヌクレオチド断片の長さに応じて、ハイブリダイゼーション温度は、およそ０．５〜１Ｍ濃度の生理食塩水溶液において、およそ２０〜７０℃、特に３５〜６５℃である。配列又はヌクレオチド断片又はオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドは、ヌクレオチド断片とハイブリダイズできる天然の核酸の情報的配列によって特徴づけられる、リン酸エステル結合によって一体的に集合した一連のヌクレオチドモチーフであり、この一連のモチーフは、異なる構造を有するモノマーを含有し、天然の核酸分子から及び／又は遺伝的組換えにより及び／又は化学合成により得ることができる。モチーフは、その構成要素が糖、リン酸基及び窒素性塩基である核酸の天然のヌクレオチドとなり得るモノマーの誘導体である。ＤＮＡにおける糖はデオキシ−２−リボースであり、ＲＮＡにおける糖はリボースである。ＤＮＡが関与するかＲＮＡが関与するかに応じて、窒素性塩基は、アデニン、グアニン、ウラシル、シトシン及びチミンから選択される。或いは、モノマーは、３種の構成要素のうち少なくとも１種が修飾されたヌクレオチドである。例として、修飾は、イノシン、メチル−５−デオキシシチジン、デオキシウリジン、ジメチルアミノ−５−デオキシウリ���ン、ジアミノ−２，６−プリン、ブロモ−５−デオキシウリジン等、修飾塩基又はハイブリダイゼーション可能なその他の修飾塩基を含む塩基のレベルか、糖のレベル、例えば少なくとも１個のデオキシリボースのポリアミドへの置換か（Ｐ．Ｅ．Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５４、１４９７〜１５００（１９９１）［３］）、或いはリン酸基のレベル、例えば、そのエステル、特に、二リン酸エステル、アルキル及びアリールホスホネート並びにホスホロチオエートから選択されるエステルへの置換のいずれかで生じ得る。
【００１６】
本発明の特定の一実施形態によると、特異的試薬は、少なくとも１つのハイブリダイゼーションプローブ、或いは少なくとも１つのハイブリダイゼーションプローブ及び標的遺伝子に特異的な少なくとも１つのプライマー、或いは少なくとも１つのハイブリダイゼーションプローブ及び標的遺伝子に特異的な２つのプライマーを含む。
【００１７】
本発明の目的で、用語「増幅プライマー」は、酵素による重合、例えば酵素増幅反応を開始させる、５〜１００ヌクレオチド、好ましくは１５〜３０ヌクレオチドを含むヌクレオチド断片を意味する。用語「酵素増幅反応」は、少なくとも１つの酵素の作用によりヌクレオチド断片の複数コピーを生成するプロセスを意味する。このような増幅反応は当業者によく知られており、特に次の技法について言及することができる。米国特許第４，６８３，１９５号明細書、米国特許第４，６８３，２０２号明細書及び米国特許第４，８００，１５９号明細書に記載されているＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）、例えば特許出願、欧州特許第０２０１１８４号明細書に開示されているＬＣＲ（リガーゼ連鎖反応）、特許出願、国際公開第９０／０１０６９号パンフレットに記載されているＲＣＲ（修復連鎖反応（repair chain reaction））、特許出願、国際公開第９０／０６９９５号パンフレットによる３ＳＲ（自家持続配列複製法）、特許出願、国際公開第９１／０２８１８号パンフレットによるＮＡＳＢＡ（核酸配列ベース増幅）、米国特許第５，３９９，４９１号明細書によるＴＭＡ（転写増幅法）並びにＲＴ−ＰＣＲ。
酵素増幅がＰＣＲである場合、特異的な試薬は、標的遺伝子に特異的な材料の増幅を可能にする、標的遺伝子に特異的な少なくとも２種の増幅プライマーを含む。そこで、標的遺伝子に特異的な材料は、好ましくは、標的遺伝子に由来するメッセンジャーＲＮＡの逆転写によって得られる相補的ＤＮＡ（標的遺伝子特異的ｃＤＮＡのことをいう）、又は標的遺伝子に特異的なｃＤＮＡの転写によって得られる相補的ＲＮＡ（標的遺伝子特異的ｃＲＮＡのことをいう）を含む。酵素増幅が逆転写反応後に行われるＰＣＲである場合、ＲＴ−ＰＣＲのことをいう。
【００１８】
用語「ハイブリダイゼーションプローブ」は、所定の条件下におけるハイブリダイゼーション特異性を有し、標的遺伝子に特異的な材料とハイブリダイゼーション複合体を形成する、５〜１００ヌクレオチド、特に、１５〜３５ヌクレオチド及び６０〜７０ヌクレオチド等の１０〜７５ヌクレオチド等、少なくとも５ヌクレオチドを含むヌクレオチド断片を意味する。本発明において、標的遺伝子に特異的な材料は、標的遺伝子に由来するメッセンジャーＲＮＡに包含されるヌクレオチド配列（標的遺伝子特異的ｍＲＮＡのことをいう）、前記メッセンジャーＲＮＡの逆転写によって得られる相補的ＤＮＡに包含されるヌクレオチド配列（標的遺伝子特異的ｃＤＮＡのことをいう）、或いは、上述の前記ｃＤＮＡの転写によって得られる相補的ＲＮＡに包含されるヌクレオチド配列（標的遺伝子特異的ｃＲＮＡのことをいう）となることができる。ハイブリダイゼーションプローブは、その検出のための標識を包含し得る。用語「検出」は、計数方法等、直接検出か、標識を用いた検出方法による間接検出のいずれかを意味するよう企図されている。核酸を検出するための多くの検出方法が存在する（例えば、Ｋｒｉｃｋａら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９９年、４５（４）巻、４５３〜４５８頁又はＫｅｌｌｅｒ  Ｇ．Ｈ．ら、ＤＮＡ  Ｐｒｏｂｅｓ、第２版、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、１９９３年、第５及び６節、１７３〜２４９頁を参照）。用語「標識」は、検出可能なシグナルを発生させることのできるトレーサーを意味するよう企図されている。これらトレーサーの非限定的な一覧として、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素等、例えば比色分析、蛍光又は発光によって検出できるシグナルを生じる酵素；蛍光、発光又は色素化合物等、発色団；電子顕微鏡によって、伝導率等、その電気的特性のため、電流測定若しくはボルタメトリー（voltametry）の方法によって又はインピーダンス測定によって検出可能な電子密度の高い化学基；回折、表面プラズモン共鳴法若しくは接触角変動等、光学的方法又は原子間力分光測定、トンネル効果その他等、物理的方法によって検出できる化学基；３２Ｐ、３５Ｓ又は１２５Ｉ等、放射性分子が挙げられる。
【００１９】
本発明の目的で、ハイブリダイゼーションプローブは、「検出」プローブとなることができる。この場合、「検出」プローブは、標識によって標識される。検出プローブは、特にＴｙａｇｉ＆Ｋｒａｍｅｒ（Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈ、１９９６、１４：３０３〜３０８）によって記載されている「分子ビーコン」検出プローブとなることができる。これら「分子ビーコン」は、ハイブリダイゼーションの際に蛍光となる。これらは、ステムループ型の構造を有し、フルオロフォア及び「クエンチャー」基を含有する。特異的ループ配列とその相補的標的核酸配列との結合により、ステムがほどけ、適切な波長の励起により蛍光シグナルが放出される。検出プローブは、特に、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇＴＭの技術に従った「色分けバーコード（color-coded barcode）」を含む「レポータープローブ」となることができる。
【００２０】
ハイブリダイゼーション反応の検出のため、直接的に（特に、標識を標的配列中へと取り込むことにより）、或いは間接的に（特に、上に定義されている検出プローブを用いて）標識された標的配列を用いることができる。特に、ハイブリダイゼーションステップの前に、例えば、酵素増幅反応の際に標識デオキシリボヌクレオチド三リン酸を用いた標的配列の標識及び／又は開裂に存するステップを行うことができる。開裂は、特に、イミダゾール又は塩化マンガンの作用によって行うことができる。標的配列は、例えば、文書、国際公開第９１／１９８１２号パンフレットに記載されているサンドイッチハイブリダイゼーション技法に従った検出プローブのハイブリダイズによって、増幅ステップの後に標識してもよい。別の特定の好ましい核酸標識方法は、出願、仏国特許出願公開第２７８００５９号明細書に記載されている。
【００２１】
本発明の好ましい一実施形態によると、検出プローブは、フルオロフォア及び消光剤を含む。本発明の更により好ましい一実施形態によると、ハイブリダイゼーションプローブは、ＦＡＭ（６−カルボキシ−フルオレセイン）又はＲＯＸ（６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン）フルオロフォアをその５’末端に、消光剤（ダブシル）をその３’末端に含む。
【００２２】
ハイブリダイゼーションプローブは、「捕捉（capture）」プローブであってもよい。この場合、「捕捉」プローブは、任意の適切な手段、即ち、直接的又は間接的に、例えば共有原子価又は吸着により、固体基板（solid substrate）上に固定化される、或いは固定化することができる。固体基板として、必要に応じて化学修飾された合成材料又は天然材料、特に、セルロースベースの材料、例えば紙、酢酸セルロース及びニトロセルロース等のセルロース誘導体又はデキストラン等、多糖類、特にスチレン型モノマーに基づくポリマー、コポリマー、綿等、天然繊維並びにナイロン等、合成繊維；シリカ、石英、ガラス又はセラミクス等、無機材料；ラテックス；磁気粒子；金属誘導体、ゲル等を用いることができる。固体基板は、マイクロタイタープレート（microtitration plate）、出願、国際公開第Ａ−９４／１２６７０号パンフレットに記載されているメンブレン又は粒子の形態となることができる。それぞれ、標的遺伝子に特異的な数種の異なる捕捉プローブを基板上に固定化することも可能である。特に、多数のプローブを固定化できるバイオチップを基板として用いることができる。用語「バイオチップ」は、小サイズの、数多くの捕捉プローブをその所定の位置に付着させる固体基板を意味するよう企図されている。バイオチップ又はＤＮＡチップの概念は、１９９０年代初頭を端緒とする。これは、マイクロエレクトロニクス、核酸化学、画像解析及び情報技術を統合した集学的技術に基づく。その動作原理は、分子生物学的基盤、ハイブリダイゼーション現象、即ち、２種のＤＮＡ及び／又はＲＮＡ配列の塩基の相補性による対形成に基づく。バイオチップ方法は、固体基板に付着した捕捉プローブの使用に基づき、プローブにおいて、蛍光色素で直接的又は間接的に標識された標的ヌクレオチド断片の試料が作用する。捕捉プローブは、基板又はチップ上に特異的に配置され、各ハイブリダイゼーションは、標的ヌクレオチド断片に関し特異的な情報を提供する。得られた情報は累積的であり、例えば、１又は複数の標的遺伝子の発現レベルの定量化を可能にする。標的遺伝子の発現を解析するため、次に、ｍＲＮＡへと転写される標的遺伝子の全部又は一部に対応する数多くのプローブを含む基板を調製することができる。本発明の目的で、用語「低密度基板」は、５０未満のプローブを含む基板を意味するよう企図されている。本発明の目的で、用語「中密度基板」は、５０のプローブから１００００のプローブを含む基板を意味するよう企図されている。本発明の目的で、用語「高密度の基板」は、１００００を超えるプローブを含む基板を意味するよう企図されている。
【００２３】
次に、解析が望まれる標的遺伝子に特異的なｃＤＮＡ又はｃＲＮＡは、例えば、特異的捕捉プローブとハイブリダイズされる。ハイブリダイゼーション後、基板又はチップは洗浄され、標識ｃＤＮＡ又はｃＲＮＡ／捕捉プローブ複合体は、例えば、蛍光色素型標識との高親和性リガンド結合によって明らかになる。蛍光は、例えばスキャナにより読み取られ、蛍光の解析は、情報技術により処理される。目安として、分子診断のためＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社（「高密度のＤＮＡアレイによる遺伝情報アクセス（Accessing Genetic Information with High-Density DNA arrays）」、Ｍ．Ｃｈｅｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９６、２７４、６１０〜６１４、「迅速なＤＮＡ配列解析のための発光オリゴヌクレオチドアレイ（Light-generated oligonucleotide arrays for rapid DNA sequence analysis）」、Ａ．Ｃａｖｉａｎｉ  Ｐｅａｓｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９４、９１、５０２２〜５０２６）によって開発されたＤＮＡチップについて言及することができる。本技術において、捕捉プローブは、一般にサイズが小さく、ほぼ２５ヌクレオチドである。バイオチップの他の例は、Ｇ．Ｒａｍｓａｙ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９９８、１６巻、４０〜４４頁；Ｆ．Ｇｉｎｏｔ、Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ、１９９７、１０巻、１〜１０頁；Ｊ．Ｃｈｅｎｇら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ、１９９６、１（３）巻、１８３〜２００頁；Ｔ．Ｌｉｖａｃｈｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９４、２２（１５）巻、２９１５〜２９２１頁；Ｊ．Ｃｈｅｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９９８、１６巻、５４１〜５４６頁による刊行物又は米国特許第４，９８１，７８３号明細書、米国特許第５，７００，６３７号明細書、米国特許第５，４４５，９３４号明細書、米国特許第５，７４４，３０５号明細書及び米国特許第５，８０７，５２２号明細書に記されている。固体基板の主な特徴は、標的ヌクレオチド断片における捕捉プローブのハイブリダイゼーション特徴を保存するが、同時に、検出方法に対し最小バックグラウンドノイズを生じることであるべきである。プローブを基板上に固定化するための製作法（fabrication）の主要な型を３通りに区別することができる。
【００２４】
まず第一に、予め合成（pre-synthesized）されたプローブを置くことに存する第一の技法が存在する。プローブの付着は、マイクロピペット若しくはマイクロドットによって又はインクジェット装置によって直接移植することによって行われる。この技法は、数塩基（５〜１０）から最大で比較的大サイズの６０塩基（プリント）から数百塩基（マイクロデポジション（microdeposition））の範囲のサイズを有するプローブを付着させる。
【００２５】
プリントは、インクジェットプリンターにより用いられる方法の適応である。これは、４０００滴／秒に到達し得る速度の液体の微小球体（容量＜１ｎｌ）の推進力に基づく。プリントは、液体を放出するシステムと、それが置かれる表面とのいかなる接触にも関与しない。
【００２６】
マイクロデポジションは、数十〜数百塩基の長いプローブをスライドグラス表面に付着させることに存する。これらのプローブは、一般に、データベースから抽出され、増幅及び精製された産物の形態である。本技法は、４ｃｍ２弱の表面積におけるＤＮＡの認識ゾーン（recognition zone）と称する、およそ一万スポットを有するマイクロアレイと称するチップの作製を可能にする。尚、直径０．５〜１ｍｍ、最大密度２５スポット／ｃｍ２の、一般にＰＣＲにより増幅された産物を有する「マクロアレイ（macroarray）」と呼ばれるナイロンメンブレンの使用も忘れてはいけない。この非常に柔軟な技法は、多くの研究室で用いられている。本発明において、後者の技法は、バイオチップに包含されると考慮される。しかし、特許出願、国際公開第Ａ−００／７１７５０号パンフレット及び仏国特許出願公開第００／１４８９６号明細書の場合のように、マイクロタイタープレートの各ウェルの底に一定容量の試料を置いても、或いは、別の特許出願、仏国特許出願公開第００／１４６９１号明細書に従って、同じペトリ皿の底に明確に形成された滴を一定数置いてもよい。
【００２７】
プローブを基板又はチップに付着させるための第二の技法は、ｉｎ  ｓｉｔｕ合成と称する。本技法は、直接チップ表面における短いプローブの作製を可能にする。これは、ｉｎ  ｓｉｔｕオリゴヌクレオチド合成（特に、特許出願、国際公開第８９／１０９７７号パンフレット及び国際公開第９０／０３３８２号パンフレットを参照）に基づき、また、オリゴヌクレオチド合成機プロセスに基づく。この技法は、オリゴヌクレオチド伸長反応が行われている反応チャンバーをガラス表面に沿って動かすことに存する。
【００２８】
最後に、第三の技法は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘによって開発されたバイオチップに関与するプロセスであるフォトリソグラフィーと称する。この技法もｉｎ  ｓｉｔｕ合成である。フォトリソグラフィーは、マイクロプロセッサ技法に由来する。チップの表面は、光活性化され得る感光性化学基の付着によって修飾される。照射されると、この化学基は、オリゴヌクレオチドの３’末端と反応することができる。この表面を定義された形状のマスクによって保護することにより、選択的な照射と、従って、４種のヌクレオチドのいずれか１種の付着が望ましいチップの領域の活性化が可能になる。異なるマスクの逐次的な使用により、保護／反応の交互のサイクルと、従って、およそ数十平方マイクロメートル（μｍ２）のスポット上におけるオリゴヌクレオチドプローブの作製が可能になる。この解像度は、数平方センチメートル（ｃｍ２）の表面積に最大数十万個のスポットの作製を可能にする。フォトリソグラフィーは、次の利点を有する。大量に（in bulk）並行して、Ｎ塩基長（mer）のチップの作製をほんの４×Ｎサイクルで可能にする。これら技法は全て、本発明により用いることができる。本発明の好ましい一実施形態によると、上に定義されているステップｂ）の少なくとも１種の特異的試薬は、好ましくは、基板上に固定化された少なくとも１種のハイブリダイゼーションプローブを含む。この基板は、好ましくは、上に定義されている低、高又は中密度の基板である。
【００２９】
数多くのプローブを含む基板におけるこれらハイブリダイゼーションステップに先行して、標的遺伝材料の量を増加させるための、上に定義されている酵素増幅反応ステップが行われ得る。ステップｃ）において、標的遺伝子の発現レベルの決定は、当業者にとって公知のプロトコールのいずれかにより行うことができる。一般に、標的遺伝子の発現は、所定の期間で標的遺伝子から転写されるｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）を検出することにより解析することができる。
【００３０】
本発明は、好ましくは、当業者によく知られたプロトコールのいずれかに従った、標的遺伝子の発現レベルの、該標的遺伝子に由来するｍＲＮＡの検出による決定に関する。本発明の特定の一実施形態によると、各ｍＲＮＡが標的遺伝子に由来する数種の異なるｍＲＮＡの検出により、数種の標的遺伝子の発現レベルが同時に決定される。
【００３１】
特異的な試薬が、少なくとも１種の増幅プライマーを含む場合、次の仕方による標的遺伝子の発現レベルの決定が可能となる。１）全血から全ＲＮＡ（転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）及びメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含む）を抽出した後、前記ｍＲＮＡの相補的ＤＮＡ（又はｃＤＮＡ）を得るために逆転写ステップを行う。目安として、この逆転写反応は、ＲＮＡ断片から相補的ＤＮＡ断片の獲得を可能にする逆転写酵素を用いて行うことができる。ＡＭＶ（トリ骨髄芽球症ウイルス（Avian Myoblastosis Virus））又はＭＭＬＶ（モロニーマウス白血病ウイルス）由来の逆転写酵素を特に用いることができる。より具体的には、ｍＲＮＡのｃＤＮＡのみを得ることが望ましい場合、この逆転写ステップは、相補性によりｍＲＮＡのポリＡ配列とハイブリダイズして、逆転写酵素の行う逆転写反応の開始点として機能するポリＴ−ポリＡ複合体を形成するチミン塩基（ポリＴ）のみを含むヌクレオチド断片の存在下で行うことができる。続いて、標的遺伝子に由来するｍＲＮＡに相補的なｃＤＮＡ（標的遺伝子特異的ｃＤＮＡ）及び標的遺伝子以外の遺伝子に由来するｍＲＮＡに相補的なｃＤＮＡ（標的遺伝子特異的ではないｃＤＮＡ）が得られる。２）標的遺伝子に特異的な増幅プライマー（複数可）を、標的遺伝子特異的ｃＤＮＡ及び標的遺伝子特異的ではないｃＤＮＡと接触させる。標的遺伝子に特異的な増幅プライマー（複数可）は、標的遺伝子特異的ｃＤＮＡとハイブリダイズし、標的遺伝子に由来するｍＲＮＡから生じるｃＤＮＡの公知の長さの所定の領域が特異的に増幅される。標的遺伝子特異的ではないｃＤＮＡは増幅されず、その一方で、大量の標的遺伝子特異的ｃＤＮＡが得られる。本発明の目的では、「標的遺伝子特異的ｃＤＮＡ」又は「標的遺伝子に由来するｍＲＮＡから生じるｃＤＮＡ」と区別なくいう。このステップは、特にＰＣＲ型増幅反応により、或いは上に定義されているその他の増幅技法により行うことができる。ＰＣＲにより、それぞれ標的遺伝子に特異的な数組の異なる増幅プライマーを用いることにより、それぞれ異なる標的遺伝子に特異的な数種の異なるｃＤＮＡを同時に増幅することも可能となる：マルチプレックス増幅のことをいう。３）標的遺伝子の発現は、上述のステップ２）において得られた標的遺伝子特異的ｃＤＮＡを検出及び定量化することにより決定される。この検出は、標的遺伝子特異的ｃＤＮＡをそのサイズに応じて泳動する電気泳動の後に行うことができる。所定の泳動時間の後に、ＵＶ（紫外）光のライトテーブル上にゲルを置いたときに、光シグナルの放出によって標的遺伝子特異的ｃＤＮＡの直接検出できるよう、泳動用のゲル及び培地は、エチジウムブロマイドを包含し得る。標的遺伝子特異的ｃＤＮＡの量が多い程、この光シグナルは明るくなる。このような電気泳動技法は、当業者によく知られている。標的遺伝子特異的ｃＤＮＡは、飽和するまで行われた増幅反応によって得られた定量化範囲を用いて検出及び定量化してもよい。種々のステップ（逆転写、ＰＣＲ等）において観察され得る酵素効率の可変性を考慮に入れるため、種々の患者群の標的遺伝子の発現は、その発現が種々の患者群において類似する「ハウスキーピング」遺伝子の発現を同時に決定することにより正規化することができる。ハウスキーピング遺伝子の発現に対する標的遺伝子の発現の比率を理解することにより、即ち、ハウスキーピング遺伝子特異的ｃＤＮＡの量に対する標的遺伝子特異的ｃＤＮＡの量の比率を理解することにより、種々の実験間のいかなる可変性も補正される。当業者は、特に、次の刊行物を参照することができる。Ｂｕｓｔｉｎ  Ｓ  Ａ、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、２００２、２９：２３〜３９；Ｇｉｕｌｉｅｔｔｉ  Ａ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２００１、２５：３８６〜４０１。
【００３２】
特異的試薬が、少なくとも１つのハイブリダイゼーションプローブを含む場合、標的遺伝子の発現は、次の仕方で決定することができる。１）全血から全ＲＮＡを抽出した後、標的遺伝子に由来するｍＲＮＡに相補的なｃＤＮＡ（標的遺伝子特異的ｃＤＮＡ）及び標的遺伝子以外の遺伝子に由来するｍＲＮＡに相補的なｃＤＮＡ（標的遺伝子特異的でないｃＤＮＡ）を得るため、上述の通り逆転写ステップを行う。２）標的遺伝子特異的ｃＤＮＡと捕捉プローブのハイブリダイゼーション反応を行うため、その発現の解析が望まれる標的遺伝子に特異的な捕捉プローブが固定化された基板と全ｃＤＮＡを接触させ、ここで標的遺伝子特異的でないｃＤＮＡは捕捉プローブとハイブリダイズしない。ハイブリダイゼーション反応は、上に示されているあらゆる材料を包含する固体基板上で行うことができる。好ましい一実施形態によると、ハイブリダイゼーションプローブは、基板上に固定化される。好ましくは、基板は、上に定義されている低、高又は中密度の基板である。ハイブリダイゼーション反応に先行して、上述の標的遺伝子特異的ｃＤＮＡの酵素増幅からなるステップを行って、大量の標的遺伝子特異的ｃＤＮＡを得て、標的遺伝子特異的ｃＤＮＡが標的遺伝子に特異的な捕捉プローブとハイブリダイズする確率を増加させることができる。ハイブリダイゼーション反応に先行して、例えば、増幅反応のために標識デオキシリボヌクレオチド三リン酸を用いた、上述の標的遺伝子特異的ｃＤＮＡの標識及び／又は開裂に存するステップを行うこともできる。開裂は、特に、イミダゾール及び塩化マンガンの作用によって行うことができる。標的遺伝子特異的ｃＤＮＡは、例えば、文書、国際公開第Ａ−９１／１９８１２号パンフレットに記載されているサンドイッチハイブリダイゼーション技法に従って標識プローブをハイブリダイズさせることにより、増幅ステップの後に標識してもよい。核酸を標識及び／又は開裂させるための他の好ましい特定の方法は、出願、国際公開第９９／６５９２６号パンフレット、国際公開第０１／４４５０７号パンフレット、国際公開第０１／４４５０６号パンフレット、国際公開第０２／０９０５８４号パンフレット、国際公開第０２／０９０３１９号パンフレットに記載されている。３）その後、ハイブリダイゼーション反応の検出からなるステップが行われる。検出は、標的遺伝子に特異的な捕捉プローブが標的遺伝子特異的ｃＤＮＡとハイブリダイズする基板を、標識で標識された「検出」プローブと接触させ、標識により放射されたシグナルを検出することにより行うことができる。標的遺伝子特異的ｃＤＮＡが、標識で前もって標識された場合、標識によって放射されたシグナルは直接的に検出される。
【００３３】
ステップｂ）において接触させる少なくとも１つの特異的試薬が、少なくとも１つのハイブリダイゼーションプローブを含む場合、標的遺伝子の発現は、次の仕方で決定することもできる。１）全血から全ＲＮＡを抽出した後、生物材料のｍＲＮＡのｃＤＮＡを得るため、逆転写ステップが上述の通りに行われる。その後、プロモーターの制御下において機能し、ＤＮＡテンプレートから相補的ＲＮＡを得ることを可能にするＴ７ポリメラーゼ酵素を用いて、ｃＤＮＡの相補的ＲＮＡの重合が行われる。次に、標的遺伝子に特異的なｍＲＮＡのｃＤＮＡのｃＲＮＡ（標的遺伝子特異的ｃＲＮＡのことをいう）及び標的遺伝子に特異的でないｍＲＮＡのｃＤＮＡのｃＲＮＡが得られる。２）標的遺伝子特異的ｃＲＮＡと捕捉プローブのハイブリダイゼーション反応を行うため、その発現の解析が望ましい標的遺伝子に特異的な捕捉プローブが固定化された基板と全ｃＲＮＡを接触させ、ここで標的遺伝子特異的でないｃＲＮＡは、捕捉プローブとハイブリダイズしない。数種の標的遺伝子の発現を同時に解析することが望ましい場合、それぞれ標的遺伝子に特異的な数種の異なる捕捉プローブを基板上に固定化することができる。ハイブリダイゼーション反応に先行して、上述の標的遺伝子特異的ｃＲＮＡの標識及び／又は開裂に存するステップを行うことができる。３）その後、ハイブリダイゼーション反応の検出からなるステップが行われる。検出は、標的遺伝子に特異的な捕捉プローブが、標的遺伝子特異的ｃＲＮＡとハイブリダイズする基板を、標識で標識された「検出」プローブと接触させ、標識により放射されたシグナルを検出することにより行うことができる。標的遺伝子特異的ｃＲＮＡが標識で前もって標識される場合、標識により放射されたシグナルは、直接的に検出される。多数のプローブがハイブリダイズされるバイオチップ型の基板が用いられる場合、ｃＲＮＡの使用は特に有利である。
【００３４】
本発明は、また、患者由来の末梢血試料における結腸直腸癌の予後判断のためのキットであって、少なくとも配列番号１〜１３に表記されている核酸配列を含む少なくとも１種のＮＫ細胞遺伝子のための少なくとも１種の特異的試薬且つ２５種のＮＫ細胞遺伝子のための２５種以下の特異的試薬を含み、少なくとも１種の試薬が、
（ｉ）配列番号１で特定されているような全長配列を含むＫＬＲＢ１遺伝子、
（ｉｉ）配列番号２、３又は４で特定されているような全長配列を含むＫＬＲＣ２遺伝子、
（ｉｉｉ）配列番号５、６又は７で特定されているような全長配列を含むＫＬＲＣ３遺伝子、
（ｉｖ）配列番号８、９、１０、１１又は１２で特定されているような全長配列を含むＫＬＲＤ１遺伝子、及び
（ｖ）配列番号１３で特定されているような全長配列を含むＫＬＲＫ１遺伝子
からなる群から選択される少なくとも１種のＮＫ細胞遺伝子に特異的であるキットを包含する。
【００３５】
一実施形態において、キットは、
（ｉ）配列番号１で特定されているような全長配列を含むＫＬＲＢ１遺伝子、
（ｉｉ）配列番号２、３又は４で特定されているような全長配列を含むＫＬＲＣ２遺伝子、
（ｉｉｉ）配列番号５、６又は７で特定されているような全長配列を含むＫＬＲＣ３遺伝子、
（ｉｖ）配列番号８、９、１０、１１又は１２で特定されているような全長配列を含むＫＬＲＤ１遺伝子、及び
（ｖ）配列番号１３で特定されているような全長配列を含むＫＬＲＫ１遺伝子
からなるＮＫ細胞遺伝子に特異的な試薬の組み合わせを含む。
【００３６】
このような実施形態において、特異的試薬は、数種のＮＫ細胞遺伝子であるが２５種以下のＮＫ遺伝子の組み合わせを標的とすることができる。
【００３７】
更に、キットは、少なくとも１種の標的細胞遺伝子且つ５種以下の標的細胞遺伝子に特異的な少なくとも１種の試薬を含むことができ、前記少なくとも１種の標的細胞遺伝子は、
（ｉ）配列番号１４、１５、１６又は１７で特定されているような全長配列を含むＧＺＭＢ遺伝子、
（ｉｉ）配列番号１８、１９又は２０で特定されているような全長配列を含むＣＤ２４７遺伝子、
（ｉｉｉ）配列番号２１又は２２で特定されているような全長配列を含むＲＲＡＳ２遺伝子、
（ｉｖ）配列番号２３又は２４で特定されているような全長配列を含むＳＨ２Ｄ１Ｂ遺伝子、及び
（ｖ）配列番号２５、２６、２７、２８、２９又は３０で特定されているような全長配列を含むＬＣＫ遺伝子
からなる群から選択される。
【００３８】
特に、キットは、
（ｉ）配列番号１４、１５、１６又は１７で特定されているような全長配列を含むＧＺＭＢ遺伝子、
（ｉｉ）配列番号１８、１９又は２０で特定されているような全長配列を含むＣＤ２４７遺伝子、
（ｉｉｉ）配列番号２１又は２２で特定されているような全長配列を含むＲＲＡＳ２遺伝子、
（ｉｖ）配列番号２３又は２４で特定されているような全長配列を含むＳＨ２Ｄ１Ｂ遺伝子、及び
（ｖ）配列番号２５、２６、２７、２８、２９又は３０で特定されているような全長配列を含むＬＣＫ遺伝子
からなる標的細胞遺伝子に特異的な５種の試薬を含む。
【００３９】
このような実施形態において、特異的試薬は、上に記載されているような数種の標的細胞遺伝子であるが５種以下の標的細胞遺伝子の組み合わせを標的とすることができる。
【００４０】
別の一実施形態において、上に定義されているようなキットは、少なくとも１種の標的細胞遺伝子に特異的な少なくとも１種の試薬且つ１００種の標的細胞遺伝子に特異的な最大１００種の試薬を含むことができ、前記少なくとも標的細胞遺伝子は、
（ｉ）配列番号３１、３２又は３３で特定されているような全長配列を含むＭＲＰＳ６遺伝子、
（ｉｉ）配列番号３４で特定されているような全長配列を含むＳＰＲＹ４遺伝子、
（ｉｉｉ）配列番号３５で特定されているような全長配列を含むＮＥＡＴ１遺伝子、
（ｉｖ）配列番号３６で特定されているような全長配列を含むＣＹＢＢ遺伝子、
（ｖ）配列番号３７で特定されているような全長配列を含むＤＵＳＰ２遺伝子、
（ｖｉ）配列番号３８又は３９で特定されているような全長配列を含むＰＤＥＡＤ遺伝子、
（ｖｉｉ）配列番号４０、４１又は４２で特定されているような全長配列を含むＳＨ２Ｄ２Ａ遺伝子、
（ｖｉｉｉ）配列番号４３又は４４で特定されているような全長配列を含むＩＮＳＲ遺伝子、
（ｉｘ）配列番号４５で特定されているような全長配列を含むＩＴＧＡＭ遺伝子、
（ｘ）配列番号４６、４７、４８又は４９で特定されているような全長配列を含むＶＣＡＮ遺伝子、
（ｘｉ）配列番号５０又は５１で特定されているような全長配列を含むＣＤ１６３遺伝子、
（ｘｉｉ）配列番号５２又は５３で特定されているような全長配列を含むＰ２ＲＹ１０遺伝子、
（ｘｉｉ）配列番号５４で特定されているような全長配列を含むＣＤ２２６遺伝子、
（ｘｉｉｉ）配列番号５５又は５６で特定されているような全長配列を含むＭＲＰＬ１０遺伝子、
（ｘｉｖ）配列番号５７で特定されているような全長配列を含むＩＴＰＲＩＰＬ２遺伝子、
（ｘｖ）配列番号５８で特定されているような全長配列を含むＣＤ２遺伝子、及び
（ｘｖｉ）配列番号５９で特定されているような全長配列を含むＮＵＤＴ１６遺伝子、
からなる群から選択される。
【００４１】
また、特に、キットは、
（ｉ）配列番号３１、３２又は３３で特定されているような全長配列を含むＭＲＰＳ６遺伝子、
（ｉｉ）配列番号３４で特定されているような全長配列を含むＳＰＲＹ４遺伝子、
（ｉｉｉ）配列番号３５で特定されているような全長配列を含むＮＥＡＴ１遺伝子、
（ｉｖ）配列番号３６で特定されているような全長配列を含むＣＹＢＢ遺伝子、
（ｖ）配列番号３７で特定されているような全長配列を含むＤＵＳＰ２遺伝子、
（ｖｉ）配列番号３８又は３９で特定されているような全長配列を含むＰＤＥＡＤ遺伝子、
（ｖｉｉ）配列番号４０、４１又は４２で特定されているような全長配列を含むＳＨ２Ｄ２Ａ遺伝子、
（ｖｉｉｉ）配列番号４３又は４４で特定されているような全長配列を含むＩＮＳＲ遺伝子、
（ｉｘ）配列番号４５で特定されているような全長配列を含むＩＴＧＡＭ遺伝子、
（ｘ）配列番号４６、４７、４８又は４９で特定されているような全長配列を含むＶＣＡＮ遺伝子、
（ｘｉ）配列番号５０又は５１で特定されているような全長配列を含むＣＤ１６３遺伝子、
（ｘｉｉ）配列番号５２又は５３で特定されているような全長配列を含むＰ２ＲＹ１０遺伝子、
（ｘｉｉ）配列番号５４で特定されているような全長配列を含むＣＤ２２６遺伝子、
（ｘｉｉｉ）配列番号５５又は５６で特定されているような全長配列を含むＭＲＰＬ１０遺伝子、
（ｘｉｖ）配列番号５７で特定されているような全長配列を含むＩＴＰＲＩＰＬ２遺伝子、
（ｘｖ）配列番号５８で特定されているような全長配列を含むＣＤ２遺伝子、及び
（ｘｖｉ）配列番号５９で特定されているような全長配列を含むＮＵＤＴ１６遺伝子
からなる１７種の標的細胞遺伝子に特異的な１７種の試薬を含む。
【００４２】
このような実施形態において、特異的試薬は、上に記載されているような数種の標的細胞遺伝子であるが１００種以下の標的細胞遺伝子の組み合わせを標的とすることができる。
【００４３】
上に説明されている通り、少なくとも１種の特異的試薬は、少なくとも１種のハイブリダイゼーションプローブ、特に、少なくとも１種のハイブリダイゼーションプローブ及び少なくとも１種のプライマー、より具体的には、少なくとも１種のハイブリダイゼーションプローブ及び２種のプライマーを含む。
【００４４】
最後に、本発明は、患者由来の生物試料における結腸直腸癌の予後判断のための組成物の製造における、配列番号１〜１２に表記されている核酸配列を含む少なくとも１種のＮＫ細胞遺伝子のための少なくとも１種の特異的試薬且つ２５種のＮＫ細胞遺伝子のための２５種以下の特異的試薬の使用であって、少なくとも１種の試薬が、配列番号１〜１２のうちいずれか一配列に表記されている核酸配列から選択される核酸配列を含む少なくとも１種のＮＫ細胞遺伝子に特異的である使用に関し、
特に、患者由来の生物試料における結腸直腸癌の予後判断のための組成物の製造における、少なくとも５種のＮＫ細胞遺伝子且つ２５種以下のＮＫ細胞遺伝子の組み合わせに特異的な試薬の使用であって、試薬が、それぞれ配列番号１、２〜４、５〜７及び８〜１２に表記されている核酸配列から選択される核酸配列を含む少なくとも５種のＮＫ細胞遺伝子に特異的である使用に関し、
具体的には、患者由来の生物試料における結腸直腸癌の予後判断のための組成物の製造における、１０種の標的細胞遺伝子の組み合わせに特異的な試薬の使用であって、試薬が、それぞれ配列番号１、２〜４、５〜７、８〜１２、１３、１４〜１７、１８〜２０、２１〜２２、２３〜２４及び２５〜３０に表記されている核酸配列から選択される核酸配列を含む標的細胞遺伝子に特異的である使用に関し、
より具体的には、患者由来の生物試料における結腸直腸癌の予後判断のための組成物の製造における、１０種の標的細胞遺伝子且つ１００種以下の標的遺伝子の組み合わせに特異的な試薬の使用であって、試薬が、それぞれ配列番号１、２〜４、５〜７、８〜１２、１３、１４〜１７、１８〜２０、２１〜２２、２３〜２４、２５〜３０、３１〜３３、３４、３５、３６、３７、３８〜３９、４０〜４２、４３〜４４、４５、４６〜４９、５０〜５１、５２〜５３、５４、５５〜５６、５７、５８及び５９に表記されている核酸配列から選択される核酸配列を含む標的細胞遺伝子に特異的である使用に関し、
少なくとも１種の特異的試薬は、少なくとも１種のハイブリダイゼーションプローブ、又は少なくとも１種のハイブリダイゼーションプローブ及び少なくとも１種のプライマー、又は少なくとも１種のハイブリダイゼーションプローブ及び２種のプライマーを含む。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】結腸内視鏡検査陰性対照（ＣＮＣ）及び結腸直腸癌（ＣＲＣ）患者血液試料における、癌のステージに従ったＣＲＣ試料の分布によるＮＫ細胞スコアを示す図である。丸はＣＮＣを表し、四角形、正三角形、逆三角形及びひし形は、それぞれＣＲＣステージＩ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶを表す。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００４６】
Ｉ）材料と方法
１．患者及び試料採取
本試験は、臨床研究のための地方倫理委員会（local Ethical Committee）によって認可された。全参加者に対し書面によるインフォームドコンセントを得た。
【００４７】
ＣＲＣ群に対し、本試験のため、２００６年７月から２００８年３月にかけて、中国復旦大学癌病院結腸直腸手術部門（Department of Colorectal Surgery, Fudan University Cancer Hospital）（ＦＵＣＨ）において、１１９名の結腸直腸患者を継続的に採用した。国際対がん連合（International Union Against Cancer）（ＵＩＣＣ）推奨の腫瘍−リンパ節−転移（tumor-node-metastasis）（ＴＮＭ）システムに従って腫瘍をステージ分類した。患者は、術前放射線療法又は化学療法を受けなかった。遺伝性結腸直腸癌又は炎症性腸疾患（クローン病又は潰瘍性大腸炎）を患う患者は、本試験から除外した。結腸内視鏡検査の少なくとも１週間後、手術前に、患者毎に２．５ｍｌの末梢血を採取してＰＡＸｇｅｎｅ(商標)血液ＲＮＡチューブ（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉＸ  ＧｍｂＨ、スイス、ホンブレヒティコン（Hombrechtikon））に入れ、メーカーのガイドラインに従って処理した。対照群のため、上海地区の地域病院からポリープ又は結腸直腸癌の症状が全くない（結腸内視鏡検査によって確認）１０１名のＦＯＢＴ検査陽性の参加者を登録した。結腸内視鏡検査試験の１週間前に、末梢血試料を採取してＰＡＸｇｅｎｅチューブに入れた。本試験に含まれている全参加者の詳細な特性評価を表１に記す。
【００４８】
【表１】
0005916718.tif 000002
【００４９】
２．ＲＮＡ抽出及びマイクロアレイ実験
ＰＡＸｇｅｎｅ(商標)血液ＲＮＡシステム（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉｘ）により、メーカーの説明書に従って全ＲＮＡを抽出した。分光光度計により光学密度２６０ナノメートルにて全ＲＮＡの量を測定し、ＲＮＡ  ６０００  Ｎａｎｏ  ＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）キットを用いてＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ  Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国カリフォルニア州パロアルト）において質を評価した。ＲＮＡ品質数値（RNA Integrity Number）が７〜１０の間である試料のみを解析した。次に、５０ナノグラムの全ＲＮＡを逆転写し、直線的に増幅して、Ｒｉｂｏ−ＳＰＩＡ(商標)技術を用いたＷＴ−Ｏｖａｔｉｏｎ(商標)ＲＮＡ増幅システム（ＮｕＧＥＮ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、米国カリフォルニア州サンカルロス）により、メーカーの標準プロトコールに従って一本鎖ｃＤＮＡとし、ＱＩＡｑｕｉｃｋ(商標)ＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ  ＧｍｂＨ、ドイツ、ヒルデン）により産物を精製した。その後、２マイクログラムの増幅、精製されたｃＤＮＡをＲＱ１  ＲＮａｓｅ不含ＤＮａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．、米国ウィスコンシン州フィッチバーグ）により断片化し、末端転移酵素（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐ．、米国インディアナ州インディアナポリス（Indianapoli））及びＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）ＤＮＡ標識試薬（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｉｎｃ．、米国カリフォルニア州サンタ・クララ）によりビオチン化デオキシヌクレオシド三リン酸で標識した。ハイブリダイゼーションオーブン６４０（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にて６０毎分回転数、５０℃で１８時間、標識されたｃＤＮＡをＨＧ  Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ  ２．０  Ａｒｒａｙ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）上にハイブリダイズさせた。ＨＧ  Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ  ２．０  Ａｒｒａｙは、およそ３９，０００種の最もよく特徴づけられたヒト遺伝子を表す５４，６７５種のプローブセットを含有する。ハイブリダイゼーション後、ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘプロトコールＥｕｋＧＥ−ＷＳ２ｖ４に従ってＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）流体ステーション４５０（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を用いてアレイを洗浄、染色した。ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）スキャナ３０００（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）によりアレイをスキャンした。
【００５０】
３．マイクロアレイデータ解析
標準Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ品質管理パラメータの示唆するところに従って品質管理解析を行った。評価判断基準に基づくと、本出願人らの実験は全て最小品質要求事項を満たしていた。バックグラウンド補正、分位正規化及び中央値洗練要約（median polish summarization）によるＲＭＡ（ロバストマルチチップアベレージ）により、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ発現アレイを前処理した［１］。極端なシグナル強度（５０より低く２  １０１４より高い）のプローブセットを除去した。バッチ効果の尤度を低下させるため、フィルタリングした発現データに正規化アルゴリズム、Ｃｏｍｂａｔを適用した１１。ＣｏｍＢａｔ方法（ｈｔｔｐ：／／ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ．ｂｙｕ．ｅｄｕ／ｊｏｈｎｓｏｎ／ＣｏｍＢａｔ／）は、所定のデータセットにおけるバッチ効果を調整するため、パラメトリック又はノンパラメトリック経験的ベイズフレームワークのいずれかを適用する。偽発見率（False Discovery Rate）（ＦＤＲ）０．０５に相当するマイクロアレイの有意性分析（ＳＡＭ）により、ディファレンシャルに発現した遺伝子（ＤＥＧ）を同定した１２。ＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒライブラリーによるＲ−環境を用いて前処理及び統計学的ステップを実行した１３、１４。Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアバージョン８．５（Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、米国カリフォルニア州レッドウッドシティー）を用いることにより、遺伝子オントロジー及び定型的経路（Canonical Pathways）解析を行った。
【００５１】
ＩＩ）結果
１．結腸直腸癌及び対照患者集団の特徴
１１９名の結腸直腸癌（ＣＲＣ）患者及び１０１名の結腸内視鏡検査陰性対照（ＣＮＣ）の臨床的及び人口統計学的変数を表１にまとめる。ＣＲＣのため、結腸直腸癌の診断は、病理学者によって大腸内視鏡検査（colonscopy）に従って確認された。対照は、復旦大学癌病院（ＦＵＣＨ）で行った結腸内視鏡検査が最終的に陰性であった、地域病院に登録されたＦＯＢＴ陽性患者の中から選択した。年齢及び性別は、ＣＲＣ及びＣＮＣ群の間で十分に釣り合いが取れていた。
【００５２】
２．末梢血における発現が結腸直腸癌患者と結腸内視鏡検査陰性対照とで異なる遺伝子の同定
本発明者らは、ＣＲＣ群全体（ステージＩ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶ）を考慮しつつ、１１９名のＣＲＣと１０１名のＣＮＣとの間の２群間で最も高度に異なる、ディファレンシャルに発現する遺伝子（ＤＥＧ）を探索した。適切な前処理の後、２０，１６９種のプローブセットを保持して、ＤＥＧ解析を行った。ＳＡＭを用いて、０．０５に相当するＦＤＲで１．２より高い倍数変化（ＦＣ）を有する３２７種のＤＥＧを同定した。
【００５３】
この３２７種のＤＥＧのうち、１９５種（５９．６％）及び１３２種（４０．３６％）は、ＣＲＣ試料においてそれぞれより高レベル及び低レベルで発現することが判明した。ｔ検定ｐ値は、１．４３  １０−２５〜１．５１  １０−０１の範囲に収まり、１８種のＤＥＧは、６．２７  １０−１５より低いｔ検定ｐ値を有し、これら全て、十分にアノテートされている遺伝子、ＭＲＰＳ６、ＳＰＲＹ４、ＮＥＡＴ１、ＣＹＢＢ、ＤＵＳＰ２、ＰＤＥ４Ｄ、ＳＨ２Ｄ２Ａ、Ｇ（１−２）ＮＳＲ、ＩＴＧＡＭ、ＶＣＡＮ、ＣＤ１６３、Ｐ２ＲＹ１０、ＣＤ２２６、ＭＲＰＬ１０、ＩＴＰＲＩＰＬ２、ＣＤ２及びＮＵＤＴ１６（表２）に対応する。最も高い倍数変化（ＦＣ）値は、１．８３（ＮＥＡＴ１、ＣＲＣでより高レベル）及び１．７１（ＨＢＧ２、ＣＲＣでより低レベル）であったが、３２７種のＤＥＧのうち２６種（８％）が、１．４０より高いＦＣ値を有していた。
【００５４】
実例として、ＳＰＲＹ４（ＣＲＣでより高い発現レベルによって一位にランク付けられる、ｔ検定ｐ値４．０４  １０−２３、ＦＣ１．７９）及びＭＲＰＳ６（ＣＲＣでより低い発現レベルにより一位にランク付けられる、ｔ検定ｐ値１．４３  １０−２５、ＦＣ１．２７）に対し観察された結果を示す。このような例は、ＣＲＣ及びＣＮＣ患者の間で有意にディファレンシャルに発現する遺伝子を説明する。ＳＰＲＹ４に関し、１０１名のＣＮＣに対し幾分均一なハイブリダイゼーションシグナル値が観察され、一方、ＣＲＣの値はより不均一であったが、ＣＮＣと比較して有意に（ｐ値４．０４  １０−２３）増加（ＦＣ１．７８）した平均値であった。ＭＲＰＳ６に関し、両集団は、ＣＲＣ（ＦＣ１．２７）に対し有意な（ｐ値１．４３  １０−２５）平均減少で同様の分散を示した。
【００５５】
上位１８種のＤＥＧのうち、ＣＲＣ患者の末梢血においてＣＮＣと比較して異なる発現レベルを示す４種の膜白血球マーカーが観察された。それぞれＴ細胞及び主にＮＫ細胞によって発現されたＣＤ２及びＣＤ２２６は、より低レベルであり、それぞれ単球及び自然免疫系に関与する多くの白血球で主に発現されたＣＤ１６３及びＣＤ１１Ｂ（ＩＴＧＡＭ）は、より高レベルであった。同様に、ＣＲＣ試料の細胞傷害性Ｔリンパ球及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞における、ＧＺＭＢ遺伝子によってコードされるグランザイムＢのより低い発現が興味深い。ＩＮＳＲ、ＳＰＲＹ４、ＤＵＳＰ２、ＰＤＥ４Ｄ及びＩＴＰＲＩＰＬ２等、他の遺伝子は、様々なシグナル伝達経路の一部であると報告され、ＳＨ２Ｄ２Ａは、Ｔ細胞特異的であると報告された。ＶＣＡＮは、単球において発現すると報告され、そのＣＲＣ試料におけるより高い発現レベルは、ＣＤ１６３及びＩＴＧＡＭと共に、ＣＮＣと比較したこの患者の末梢血における循環単球の活性化と関連し得る。
【００５６】
Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＩＰＡ）を用いて３２７種のＤＥＧの解析を行ったところ、関連生物機能（Bio Function）及び定型的経路の解釈に適した３２１種のマッピングＩＤを返した。生理機構発生及び機能（Physiological System Development and Function）に関し、様々な免疫細胞の活性化、遊走、蓄積、流入、走化性、細胞伸展、細胞運動、化学誘引、予備刺激及び接着を網羅する免疫細胞輸送（Immune Cell Trafficking）に対し高スコアが観察された（ｐ値１．４４  １０−１２〜１．５７  １０−０２、５０分子による）。定型的経路に関して興味深いことに、ナチュラルキラー細胞シグナル伝達は、最低ｐ値（２．５５  １０−０５）であり、１０種の遺伝子、ＣＤ２４７、ＫＬＲＢ１、ＫＬＲＣ２、ＫＬＲＣ３、ＫＬＲＤ１、ＫＬＲＫ１、ＬＣＫ、ＰＲＫＣＨ、ＲＲＡＳ２及びＳＨ２Ｄ１Ｄを含んだ。ＮＫ細胞に特異的な５種の膜受容体（ＫＬＲＢ１、ＫＬＲＣ２、ＫＬＲＣ３、ＫＬＲＤ１、ＫＬＲＫ１）の意義は、ＣＲＣ患者の末梢血における遺伝子発現レベルの差における特定のＮＫ細胞構成成分を非常に強く示唆する。全ＮＫ細胞遺伝子は、ＣＲＣにおいて下方発現された。次の表２及び３に結果をまとめる。
【００５７】
【表２】
0005916718.tif 000003
【００５８】
【表３】
0005916718.tif 000004
【００５９】
これら１０種のＮＫ細胞関連遺伝子に関し、ＣＲＣ群においてより低い発現レベルが観察され、この結果は、循環ＮＫ細胞数の減少か、この細胞の他の器官／組織区画、特に腫瘍部位への流出のいずれかを示唆する。ＧＺＭＢに対し観察されたより低い発現レベルも顕著であり、ＣＲＣ患者における細胞レベルの細胞傷害性で起こる主要な事象に刺激的である。
【００６０】
上位の定型的経路は、それぞれ９．０８  １０−０５、２．８５  １０−０４及び５．７８  １０−０４に相当するｐ値で、Ｔ細胞受容体シグナル伝達、自然及び獲得免疫細胞間の連絡並びにＴヘルパー細胞におけるｉＣＯＳ−ｉＣＯＳＬシグナル伝達に関連した。
【００６１】
興味深いことに、１１９種のＣＲＣ患者試料のうち５１種に対し、また１０１種のＣＮＣ患者試料においては４種のみに対し、１／４（first quarter）を下回る低いＮＫ細胞スコアが観察された。このような直接的なカットオフの使用により、この識別の能力は、４３％感度及び９６％特異性として表すことができる。更に、その腫瘍ＴＮＭステージ分類（ステージＩ、ＩＩ、ＩＩＩ又はＩＶ）に従ってＣＲＣ患者試料を層別化する場合、本出願人らは、このＮＫ細胞スコアが、ステージＩからステージＩＶのＣＲＣ患者において徐々に減少することを観察した（図１）。統計学的有意差は、ＣＮＣと、ＣＲＣステージＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶとの間、ＣＲＣステージＩと、ＣＲＣステージＩＩ〜ＩＩＩ及びＩＶとの間で主に観察された。
【００６２】
本試験は、結腸直腸癌における免疫応答に関するバイオマーカーを発見し、新たな見識を提供するための、末梢血におけるトランスクリプトミクスの可能性を示す。現在のスクリーニング様式の代替／補足物候補の準備に加えて、これらの結果は、ＮＫ細胞に関する遺伝子等、遺伝子の発現解析が、結腸直腸癌患者を層別化し、オーダーメード医療を実現するべきであることも示す。
【００６３】
参考文献：
1. Irizarry RA, Hobbs B, Collin F, Beazer-Barclay YD, Antonellis KJ, Scherf U, Speed TP. Exploration, normalization, and summaries of high density oligonucleotide array probe level data. Biostatistics 2003;4:249-64)
2. Johnson WE, Li C, Rabinovic A. Adjusting batch effects in microarray expression data using empirical Bayes methods. Biostatistics 2007;8:118-27.
3. Tusher VG, Tibshirani R, Chu G. Significance analysis of microarrays applied to the ionizing radiation response. Proc Natl Acad Sci U S A 2001;98:5116-21.
4. Team RDC. R: A Language and Environment for Statistical Computing. Vienna, Austria, 2009.
【図１】
0005916718.tif 000005
【配列表】
0005916718000001.app