(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
発酵油脂産生およびアルコール産生のための統合された方法であって、リグノセルロース系材料またはその画分を発酵油脂およびアルコール産生のための原材料として使用し、そして、前記アルコール産生工程が、発酵油脂および酵素を産生することのできるアスペルギルス属に属する微生物を使用する発酵油脂産生工程からの、ポリマー糖を加水分解することのできる酵素と、アルコール産生微生物と、を使用する方法。
【請求項２】
前記アルコール産生工程が、エタノール、ブタノール、イソプロパノール−ブタノール−エタノールおよび／またはアセトン−ブタノール−エタノールを含む請求項１記載の方法。
【請求項３】
発酵油脂および酵素を産生することのできるアスペルギルス属に属する微生物を使用する発酵油脂産生工程、および
アルコール産生工程
を含む請求項１または２記載の方法であって、
発酵油脂および酵素を産生する前記アスペルギルス属に属する微生物を培養する工程、
アルコール産生微生物を培養し、そして、アルコールを微生物培養物から分離する工程、
発酵油脂をアスペルギルス属に属する微生物細胞から分離する工程、および
発酵油脂産生工程からのアスペルギルス属に属する微生物培養物、上澄みまたは上澄みのタンパク質が富化された画分または触媒的に活性な酵素を含む上澄みの希釈物を、アルコール産生工程へと導入するか、または、アルコール産生工程のためのフィードストックを処理する工程
を含む方法。
【請求項４】
前記発酵油脂および酵素を産生するアスペルギルス属に属する微生物を培養する工程が、上澄みおよびアスペルギルス属に属する微生物細胞を微生物培養物から分離する工程をさらに含む請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記発酵油脂産生工程の生成物が、酵素の触媒的活性を保持する方法を用いて回収される請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記原材料がまた、でんぷんも含む請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記酵素が細胞外酵素を含む請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞外酵素が、ヘミセルロースおよび／またはセルロース加水分解と関連する酵素である請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記酵素が、ヘミセルラーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、アラビナーゼ、ガラクトシダーゼ、グルコシダーゼ、マンノシダーゼ、キシロシダーゼ、アラビノフラノシダーゼ、エステラーゼ、セルラーゼ、エンド−セルラーゼ、エキソ−セルラーゼ、セロビアーゼまたはベータ−グルコシダーゼ、酸化セルラーゼ、またはセルロースホスホリラーゼまたはそれらの任意の混合物を含む請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記酵素の一部が発酵油脂産生工程へリサイクルされる請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リグノセルロース物質からバイオ燃料を製造するための統合された方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
リグノセルロースは地球上で最も豊富に存在するバイオポリマーである。リグノセルロースは木本植物および例えば草のような非木本植物の主要な構造成分である。リグノセルロース系バイオマスとは、セルロース、ヘミセルロースおよびリグニンからなる植物バイオマスを指す。多量のリグノセルロース系残渣が、林業、森林、およびパルプおよび製紙産業ならびに農作業（わら、まぐさ、バガス、もみ殻）および多くの農産業を通じて製造される。一般廃棄物もまた、リグノセルロース残渣とみなされ得る、例えば紙もしくは厚紙の廃棄物、庭からの廃棄物または建設業から出る廃木材などの画分を含む。その豊富さおよび低価格により、リグノセルロース系残渣は、バイオ燃料の製造のための好ましい材料である。加えて、バイオマス生産性に基づく、専用の木本または草本のエネルギー作物が、バイオ燃料としての使用として関心を集めている。
【０００３】
微生物発酵によるリグノセルロース系材料からのバイオ燃料、特にエタノールの製造は広範囲に研究されてきた。バイオ燃料またはバイオ燃料フィードストックの微生物的製造のためのリグノセルロース系の利用に対する最大の課題は、リグノセルロース材料の複雑さおよび生分解へのその抵抗性にある。リグノセルロースでは、セルロース（植物の乾燥重量の２０〜５０％）の繊維は、ヘミセルロース（２０〜４０％）、ペクチン（２〜２０％）およびリグニン（１０〜２０％）のマトリックスに共有結合的に埋め込まれており、生分解に非常に抵抗性の構造を形成していることが見出されている。さらに、ヘミセルロースの糖残基は、バイオマスに依存して様々なヘキソース（例えばグルコース、マンノースおよびガラクトースなど）およびペントース（例えばアラビノースおよびキシロースなど）の混合物を含む。
【０００４】
微生物によって利用され得る糖を多量に含むリグノセルロース系材料の前処理は最も困難な課題の一つである。糖ポリマーを好ましい微生物によって利用可能の糖単量体へと加水分解するために必要である酵素のコストのかなりの軽減が必要とされている。さらに、リグノセルロース系材料からの、経済的に実現可能なバイオ燃料の製造は、この複合材料の全ての主な炭水化物成分のバイオ燃料への効率の良い転換を必要とする。セルロース系エタノールの製造は、２つの主要な課題を含んでいる：醸造用イースト（サッカロマイセス（Saccharomyces））またはザイモモナス  モビリス（Zymomonas mobilis）（バクテリア）などの従来のエタノール産生微生物は、エタノール産生のために炭素源および／またはエネルギー源であるペントース糖を利用できない。このことは、リグノセルロース中の全糖のエタノールへの非効率的な利用を導く。野生型の醸造用イースト（サッカロマイセス）またはザイモモナス  モビリス株はリグノセルロース中のポリマー糖をエタノール産生のための炭素源および／またはエネルギー源として利用できない。糖ポリマーをモノマーへと加水分解するための酵素が購入される必要があるが、酵素のコストは現在のところ非常に高い。キシロースを利用できるように遺伝子組み換えされた醸造用イーストまたはザイモモナス  モビリス株が開発されたが、長期にわたる大規模な運用に充分なほど安定であるとは証明されていない。同様のことが、セルロース発酵能を付与された遺伝子組換えの醸造用イーストにも当てはまる。例えばパキソレン  タノフィラス（Pachysolen tannophilus）ピキア  スティピティス（Pichia stipitis）およびカンジダ  シャハタエ（Candida shehate）などの、ペントース利用性のエタノール産生のバクテリアまたはサッカロマイセス以外の酵母は存在してはいるが、それらの低いエタノール耐性、低い安定性および阻害剤に対する高い感受性はそれらの工業的利用を妨げている。
【０００５】
酵素的加水分解は通常、バイオ燃料製造工程とは分離した工程で、実際のバイオ燃料製造工程外で製造および購入された市販の酵素によって行われる。
【０００６】
リグノセルロース加水分解物は、発酵油脂（single cell oil）の製造にもまた使用されている。リグノセルロース加水分解は通常、バイオプロセスへの供給に先立ってリグノセルロース系材料の単糖類への前処理によって行われる。
【０００７】
特許文献１は、様々なリグノセルロース系およびわら、木材、パルプおよび製紙産業残渣、再生繊維、一般廃棄物、藻類バイオマスなどの他の材料の加水分解物からの発酵油脂製造を開示している。バイオ燃料製造のためには、原料の材料を水、酸またはアルカリとで処理する工程、および、ろ液または沈殿物を脂質産生微生物に接触させる工程を含む。特許文献２は、ストラメノパイル（Stramenopiles）による、バイオディーゼルおよびジェットバイオ燃料の製造のためのセルロース材料加水分解物からの発酵油脂産生を開示している。特許文献３は、例えばわら、木材、パルプ工場廃棄物、スイッチグラスなどの解重合されたリグノセルロース系材料からの、従属栄養的に増殖された藻類および菌類による発酵油脂産生を開示している。特許文献４は、蒸気爆砕による、バクテリアまたは菌類による、小麦、トウモロコシまたは稲わらのヘミセルロース加水分解物からの発酵油脂産生を開示している。
【０００８】
さらに、先行技術文献には、非特許文献１による例えばキシランなどの、また、非特許文献２による例えばセルロースなどの、リグノセルロース中のポリマー糖からの直接的な脂質産生が開示されている。特許文献５は、トウモロコシフィードストックをベースとしたエタノール産生由来の、例えば蒸留廃液またはＤＤＧＳなどの副産物からの発酵油脂産生を開示している。
【０００９】
特許文献６は、リグノセルロース中のポリマー糖を分解することのできる微生物および少なくとも１つの藻類種の混合培養によるリグノセルロース加水分解物からの発酵油脂の産生を開示している。培養物は連続的な好気性および嫌気性培養において増殖され、糖からおよび嫌気性発酵生成物から脂肪酸が産生される。しかしながら、発酵生成物（アルコールなど）は脂質産生における炭素源として使用されるので、工程は、リグノセルロースからのオイル産生の低い産生効率を導く。
【００１０】
特許文献７は、リグノセルロースからのバイオ燃料の逐次的産生を開示している。第一の工程は、リグノセルロース加水分解物中のポリマー糖からのアルコール産生能を有する微生物による嫌気性発酵であり、第二の工程において、場合によっては少なくとも１つの発酵生成物を含む、使用済みの培地が発酵油脂を蓄積するために藻類によって処理される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００９／２１７５６９号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００９／０６４５６７号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００９／００１１４８０号明細書
【特許文献４】中国特許第１０１１４８６３０号明細書
【特許文献５】米国特許出願公開第２０１０／０２８４８４号明細書
【特許文献６】国際公開第２０１０／０４２８４２号
【特許文献７】国際公開第２０１０／００６２２８号
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Fall R, Phelps P, Spindler D. 1984. Bioconversion of xylan to triglycerides by oil-rich yeasts. Applied and Environmental Microbiology. 47:1130-1134.
【非特許文献２】Lin H, Chang W, Ding H-T, Chen X-J, Zhou Q-F, Zhao Y-Hu. 2010. Direct micro-bial conversion of wheat straw into lipid by a cellulolytic fungus of Aspergillus oryzae A-4 in solid-state fermentation. Bioresource Technology 101:7556-7562.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
先行技術において直面する課題への解決法を提供することが本発明の１つの目的である。特には、本発明はバイオ燃料製造工程において直面する課題への技術的に有用な解決法を提供することを目的とする。
【００１４】
バイオ燃料の大規模製造において直面する問題への技術的に有用な解決法を提供することが本発明の別の目的である。とりわけ、例えばアルコールの発酵または発酵油脂の好気性発酵などの、微生物的工程による大規模なバイオ燃料産生において直面する問題への解決法を提供することが本発明の目的である。
【００１５】
エタノールもしくは他のアルコール、またはアルコールの混合物の大規模製造において直面する問題への技術的に有用な解決法を提供することが本発明の第３の目的である。
【００１６】
バイオ燃料製造の経済性を向上させることが可能である解決法を提供することが本発明のさらに別の目的である。
【００１７】
環境的負荷を低減することができる解決法を提供することが本発明のさらに別の目的である。
【００１８】
本発明は、例えばアルコール、バイオディーゼルおよび／または再生可能なディーゼル、ガソリンまたはジェット燃料などの輸送用バイオ燃料の製造に関する課題を解決することを特に目的とする。
【００１９】
これらの目的を達成するために、本発明は、独立クレームに挙げられている特性によって特徴づけられる。他のクレームは発明のより好ましい実施態様を示している。
【００２０】
本発明は、いくつかの脂質産生微生物がリグノセルロース材料中のポリマー糖から直接的に効率良く脂質を産生するという発見に基づく。驚くべきことに、発酵油脂産生工程において、顕著な量の細胞外酵素が産生された。さらにこれらの細胞外酵素が活性を保ち、そして使用済み培養培地から収集され得ることが発見された。
【００２１】
さらに、本発明は、いくつかの微生物が種々の多糖類への活性を有している細胞外酵素を産生するという発見に基づく。
【００２２】
ある様態において、本発明は、バイオ燃料のための成分または出発材料を製造し、そして、酵素を産生することのできる微生物を使用する第一のバイオ技術的工程、および、バイオ燃料のための成分または出発材料を製造する第二のバイオ技術的工程、を含む統合された方法を提供する。工程は、微生物がバイオ燃料および酵素のための成分または出発材料、または、バイオ燃料のための成分または出発材料を産生できるようにされることを含む。
【００２３】
酵素は微生物培養物、使用済み培養培地または上澄みから回収され得る。
【００２４】
上澄みおよび微生物細胞は、任意には、微生物培養物から分離される。バイオ燃料（または複数のバイオ燃料）は、微生物培養物からおよび／または微生物細胞から回収される。典型的には、上澄みまたは上澄みのタンパク質が富化された画分または触媒的に活性な酵素（複数の酵素）を含む上澄みの希釈物が、第一のおよび／または第二のバイオ技術的工程へと導入されるか、または、工程（複数の工程）のためのフィードストックが処理される。
【００２５】
本発明の態様において、ある工程は多糖類（ポリマー糖）から脂質を産生し、そして、同時に糖を解重合することができる細胞外酵素を産生する。酵素は、通常は多糖類を利用することのできない生物によってバイオ燃料またはバイオ燃料フィードストックを産生する別の工程において再利用される。
【００２６】
本発明は以下の有利点／解決法を提供する：
−バイオ燃料の製造のためのより完全なリグノセルロース系材料の利用。
−バイオ燃料製造のためのヘミセルロース流の効率的な利用。現在使用されているエタノール産生株はペントース糖を効率良く利用することができない。
−有用な、酵素の産生とともにバイオ燃料の製造に適した生成物の産生。
−酵素費用に関するコスト削減。エタノール、発酵油脂またはブタノール工程に必要とされる酵素のその場での産生。使用に先立つ、例えば安定化などの酵素処理の必要性が低減される。
−脂質産生のための統合されたバイオ工程（酵素消化および発酵）は、別個の精製所において製造される酵素の必要性を減少または除外することによってコストを低減する。
−酵素流（培養液）が好気性／嫌気性工程以降、最小限の工程しか必要とせず、汚染の危険性が低減される。
【００２７】
さらに、セルロースおよび／またはヘミセルロースの加水分解のためのその場での酵素の産生はいくつかの理由のために優位であり、そしてバイオ燃料製造の経済性を改良する：
−水および酵素安定化などの下流の工程（down-stream processing）のコストを低減した。
−輸送およびパッケージングのためのコストを減少させた。
−第二のバイオ燃料製造工程への酵素の直接的な移送を介して損失を減少させた。
−資本コストの減少  対  専用の（遠隔の）設備。
−酵素産生およびバイオ燃料製造のための、同じ原材料の、または同じ供給源からの原材料の、原材料への酵素の直接的な導入および適応における利用。
−酵素産生およびバイオ燃料製造における、直接的な工程制御および出力同調およびバイオリファイナリー（biorefinery）内での直接的な改善の機会。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】工程スキームを示す図である。
【図２】工程スキームを示す図である。
【図３】工程スキームを示す図である。
【図４】工程スキームを示す図である。
【図５】工程スキームを示す図である。
【図６】工程スキームを示す図である。
【図７】加水分解試験中に遊離された、培養物ブロースの容積当たりのキシロースを示す図である。基質としては、２００ｍｇのカバ材キシランが使用された。
【図８】加水分解試験中に遊離された、タンパク質当たりのキシロースを示す図である。基質としては、２００ｍｇのカバ材キシランが使用された。
【図９】加水分解試験中に遊離された、培養物ブロースの容積当たりのグルコースを示す図である。基質としては、１ｇのセルロースが使用された。
【図１０】加水分解試験中に遊離された、タンパク質当たりのグルコースを示す図である。基質としては、１ｇのセルロースが使用された。
【図１１】加水分解試験中に遊離された、培養物ブロースの容積当たりのキシロースを示す図である。基質としては、２００ｍｇのカバ材キシランが使用された。
【図１２】加水分解試験中に遊離された、タンパク質当たりのキシロースを示す図である。基質としては、２００ｍｇのカバ材キシランが使用された。
【図１３】加水分解試験中に遊離された、培養物ブロースの容積当たりのグルコースを示す図である。基質としては、１ｇのセルロースが使用された。使用された培養ブロース由来のヘミセルロースから、多少のキシロースが遊離された。
【図１４】加水分解試験中に遊離された、タンパク質当たりのグルコースを示す図である。基質としては、１ｇのセルロースが使用された。使用された培養物ブロース由来のヘミセルロースから、多少のキシロースが遊離された。
【図１５】加水分解試験中に遊離された、培養物ブロースの容積当たりのキシロースを示す図である。基質としては、２００ｍｇのカバ材キシランが使用された。
【図１６】加水分解試験中に遊離された、タンパク質当たりのキシロースを示す図である。基質としては、２００ｍｇのカバ材キシランが使用された。
【図１７】加水分解試験中に遊離された、培養物ブロースの容積当たりのグルコースを示す図である。基質としては、１ｇのセルロースが使用された。使用された培養ブロース由来のヘミセルロースから、多少のキシロースが遊離された。
【図１８】加水分解試験中に遊離された、タンパク質当たりのグルコースを示す図である。基質としては、１ｇのセルロースが使用された。使用された培養物ブロース由来のヘミセルロースから、多少のキシロースが遊離された。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
定義
本明細書において、「発酵油脂産生工程（a single cell oil production process）」とは、脂質合成微生物の形成またはその形成を可能にし、そして脂質を産生するおよび／または蓄える（store）（蓄積する（accumulate））ための微生物マス（organism mass）を得ることを可能にする工程、液相から細胞を回収する工程、および細胞から脂質を抽出または回収する工程を含む工程を指す。ある場合には、発酵油脂は、培養のあいだまたは培養後の培養培地中に細胞から例えば分泌されるまたは遊離されるなど、細胞外であってもよい。
【００３０】
本明細書中に記載されるように、本発明は、好ましくは脂質および酵素の両方を産生することが可能な微生物を使用する。本明細書のいくつかの実施態様において「微生物（a microorganism）」とは、２つまたはそれ以上の微生物を指す。ある実施態様では、酵素は１つの微生物によって産生され、そして脂質は別の微生物によって産生される。ある実施態様では、２つ以上の異なる微生物株が脂質および／または酵素産生のために使用される。
【００３１】
用語「脂質（lipid）」は、脂肪性物質であって、その分子が一般的に、脂肪族炭化水素鎖を部分的に含み、非極性有機溶媒に溶解するが水には溶解しにくい物質を意味する。脂質は生体細胞における巨大分子の不可欠な一群である。脂質としては例えば、脂肪、オイル、ワックス、ろうエステル、ステロール、テルペノイド、イソプレノイド、カロテノイド、ポリヒドロキシアルカノエート、核酸、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪アルデヒド、脂肪酸エステル、リン脂質、糖脂質、スフィンゴ脂質、および、例えばトリアシルグリセロール、ジアシルグリセロールまたはモノアシルグリセロールなどのアシルグリセロールが挙げられる。
【００３２】
本発明における好ましい脂質は、脂肪、オイル、ワックス、アシルグリセロールおよび脂肪酸ならびにその誘導体、特にはトリアシルグリセロールおよびろうエステルである。
【００３３】
本発明と関連して、発酵油脂は脂質および脂肪の同義語として使用される。
【００３４】
「脂質回収（lipid recovery）」とは、そこで脂質（細胞内脂質）が、機械的、化学的、熱機械的もしくは自己触媒的な方法によって、または、これらの方法の組み合わせによって、微生物細胞から回収される工程を指す。
【００３５】
「残渣細胞質量（residual cell mass）」とは、細胞内脂質の回収のために処理される微生物を含む、固体、半固体または流動物質の画分を表わす。
【００３６】
用語「アルコール」とは、ヒドロキシル官能基（−ＯＨ）が炭素原子に結合している任意の有機化合物を意味する。「アルコール」とは、本明細書において、一般的に、ヒドロキシル基を含む、微生物によって産生される有機化合物を指す。微生物によって産生される典型的なアルコールとしては、エタノール、ｎ−ブタノール、イソブタノール、プロパノールおよび／またはイソプロパノールが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。アルコールは典型的には嫌気性発酵により産生される。アルコールは、例えばアセトンなどのアルデヒド、または例えば酢酸および／または酪酸などの有機酸、および、ＣＯ2および／またはＨ2などのガス状生成物とともに産生され得る。
【００３７】
用語「統合された工程（integrated process）」または「工程統合（prrocess integrate）」とは、リソースを効率よく使用するため、エネルギー効率を改良するため、物質収支を改善するため、利益を最大化しおよび／またはコストを最小化するために種々のユニット間の相互作用を十分に引き出す、少なくとも２つのユニット作用の組み合わせを意味する。工程統合における２つのユニット作用のうちの少なくとも１つは、他のユニット作用からの材料および／またはエネルギーを受容し、そして、それらに依存しているかもしれない。工程統合は、それらを個々に最適化するというよりは、むしろ、初めからの種々のユニット作用の間の相互作用を考慮する。工程統合は、新しいプラントの設計に限られている訳ではなく、改造設計（例えば古いプラントに新しいユニットが導入されるなど）および既存のシステムの操作に及ぶ。好ましくは、ユニット作用はその場である。しかしながら、これは必要なわけではなく、そして本発明のいくつかの実施態様においては、ユニット作用は別々にあってもよい。
【００３８】
本発明の実施態様において、酵素産生は、微生物培養物中に酵素誘導物質を添加することによって開始および／または維持される。一般的にこれは、産生される酵素の量を増大させる結果となる。特に、連続的な培養において、誘導物質の量を細胞外酵素の産生を維持するために十分なレベルに維持することは重要である。
【００３９】
「培養培地（a cultivation medium）」とは、本明細書において微生物を培養するために使用される培地を意味する。培養培地は、本明細書において典型的には、ポリマー糖を含む。培養培地は、無機物、微量栄養素、主要栄養素、成長因子および緩衝剤で補充され得る。
【００４０】
本発明は、リグノセルロース系材料からのバイオ燃料製造の効率および経済性を改良するための方法を提供する。本発明はまた、細胞外酵素によりポリマー糖を分解する能力を有している、バイオ燃料を産生する微生物を利用することによって、糖ポリマー（sugar polymers）の加水分解のための外部で製造された酵素の投入を減少させるための方法を提供する。さらに、本発明は、酵素の産生とともにバイオ燃料としてまたはバイオ燃料製造のための原料として適切な有用な化合物を製造するための方法を提供する。酵素は好ましくは、少なくとも部分的には、その場で使用されるおよび／または統合工程外で販売される。
【００４１】
本願発明は、バイオ燃料の脂質産生のための効果的なリグノセルロース系材料の利用に関する。本発明は、統合工程における微生物的方法によるセルロースおよび／またはヘミセルロース画分から、例えば脂質、エタノールおよびブタノールなどのバイオ燃料を製造する工程を示す。より具体的には、細胞外酵素によってポリマー糖を利用できる微生物による脂質産生のための原材料としてのヘミセルロースまたはセルロース画分の使用のための方法を提供する。
【００４２】
ある態様において、本発明は、統合工程における微生物的方法による、リグノセルロース材料またはその画分からの、例えばセルロースおよび／またはヘミセルロース画分などからの、例えば脂質、エタノールおよび／またはブタノールなどのバイオ燃料を製造するための方法を提供する。
【００４３】
さらに、本発明は、リグノセルロースの種々の画分（例えば、セルロースおよびヘミセルロースまたはそれらの画分など）からのバイオ燃料産生において種々の微生物を使用することによって、炭水化物利用の総効率を改良する。セルロースおよびヘミセルロースからのバイオ燃料の産生のために使用される生物は、糖の利用および前記画分からのバイオ燃料産生の効率という観点から最適化される。
【００４４】
本発明の一実施態様において、本発明は、細胞外酵素によってポリマー糖を利用できる微生物による脂質産生のための原材料としてのリグノセルロース画分、とりわけヘミセルロースおよび／またはセルロース画分の利用のための方法を提供する。
【００４５】
本発明の好ましい実施態様において、ポリマー糖を含むリグノセルロースからのヘミセルロース画分は、細胞外酵素を産生することによってポリマーヘミセルロースを利用できる油性生物（oleaginous organisms）を使用する脂質産生のために使用される。ヘミセルロースからの脂質産生由来の使用済み培養培地から回収および／または富化された酵素はまた、セルロース分解活性を有しており、そして、別の工程においてセルロース加水分解のために使用することができる。
【００４６】
本発明の別の実施態様は、原材料としてのリグノセルロース画分、とりわけヘミセルロースおよび／またはセルロース画分の利用のための、細胞外酵素によってポリマー糖を利用できるアルコール産生微生物を利用する。ポリマー糖の利用に関与する細胞外酵素は、第一のバイオ燃料産生工程においてまたは第二のバイオ燃料産生工程に先立って、バイオ燃料産生またはバイオ燃料フィードストック産生において再利用される。バイオ燃料（例えば、脂質、エタノール、ブタノール、ＡＢＥすなわちアセトン−ブタノール−エタノール）を第一のバイオプロセス（バイオプロセス１）においてヘミセルロースおよび／またはセルロースから産生する微生物（例えば、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、グルコシダーゼ、キシラナーゼ、アラビナーゼ、ガラクトシダーゼ、マンナーゼ）によって産生されるポリマー糖分解細胞外酵素は、セルロースおよび／またはヘミセルロースからのバイオ燃料またはバイオ燃料フィードストック産生（例えば、エタノール、ブタノール、ＡＢＥ、脂質）において再使用され得る。
【００４７】
本発明のある具体的な実施態様において、酵素は、バイオ燃料および酵素を産生することができる生物を利用する第一のバイオ燃料産生工程において部分的に再利用される。
【００４８】
本発明の一実施態様において、工程は、どのような場合でも、リグノセルロース材料（セルロースまたはヘミセルロース）からの糖ポリマーおよびこれらの糖ポリマーを利用する能力を有する生物、好ましくは脂質産生生物を使用する、１つのバイオ燃料産生工程、好ましくは脂質産生工程を含む。本発明の別の実施態様は、原料としてのリグノセルロース画分、とりわけヘミセルロースおよび／またはセルロース画分の利用のための、細胞外酵素によってポリマー糖を利用できるアルコール産生微生物を利用する。さらに、糖を加水分解することのできる細胞外酵素は、バイオ燃料産生のための別のバイオプロセスにおいて再使用される。酵素は、例えば、第二のバイオ燃料産生工程に先立って、または第二のバイオ燃料産生工程において（のあいだに）、ポリマー糖を糖化するためなどに再使用され得る。第二のバイオ燃料産生工程は、発酵油脂、エタノール、ブタノールまたはＡＢＥ産生工程であり得る。工程は、好ましくは、統合されている（バイオリファイナリー（biorefinery））であるか、または、第一のバイオ燃料産生工程において産生された酵素がリグノセルロース材料からのバイオ燃料産生において使用されるために収集され、精製され、そして他で販売され得る。
【００４９】
本発明のある実施態様において、第一のバイオ燃料産生工程（工程１）はポリマー糖を含むフィードストックを利用する。工程１は細胞外酵素によってポリマー糖を利用でき、そして、同じ工程においてバイオ燃料を産生することのできる微生物を使用する。工程１は、エタノール、ブタノール、アセトン−ブタノール−エタノール、または脂質を産生する。工程１は、好ましくは脂質を産生する好気性または嫌気性の工程である。工程１は、好ましくは、細胞外酵素の産生によってヘミセルロースおよびセルロースの両方を利用することのできる微生物を使用する。
【００５０】
工程１において産生される細胞外酵素は、回収され、そして、第二のバイオ燃料産生工程（工程２）のためのポリマー糖の加水分解において、または工程２において再利用される。
【００５１】
本発明のある実施態様において、工程２は、単糖類からのバイオ燃料を産生することができるが、ポリマー糖を利用するための細胞外酵素を産生することはできない微生物を使用する。工程２は、エタノール、ブタノール、アセトン−ブタノール−エタノール、または脂質を産生する。工程２は、好ましくはエタノール、ブタノールまたはアセトン−ブタノール−エタノールを産生する嫌気性工程である。
【００５２】
典型的な工程のオプションおよび原材料として、原材料は、ヘミセルロースおよび／またはセルロースに加えて、例えばリグニンおよび／またはペクチンなどのリグノセルロースの他の成分を含んでいてもよい。
ケース１：工程１はヘミセルロースを使用し、工程２はセルロースを使用する。
ケース２：工程１はセルロースを使用し、工程２はヘミセルロースを使用する。
ケース３：工程１はセルロースを使用し、工程２もセルロースを使用する。
ケース４：工程１はヘミセルロースを使用し、工程２もヘミセルロースを使用する。
ケース５：工程１はヘミセルロースおよびセルロースの混合物（任意の混合物）を使用し、工程２もヘミセルロースおよびセルロースの混合物（任意の混合物）を使用する。
ケース６：工程１はヘミセルロースおよびセルロースの混合物（任意の混合物）を使用し、工程２はセルロースを使用する。
ケース７：工程１はヘミセルロースおよびセルロースの混合物（任意の混合物）を使用し、工程２はヘミセルロースを使用する。
【００５３】
本発明の好ましいある実施態様において、ポリマー糖を加水分解することのできる酵素であって、バイオ燃料またはバイオ燃料のための出発材料、好ましくは脂質もまた産生する酵素が、好気性または曝気されたバイオプロセスにおいて産生される。好気性バイオプロセスは、効率的な酵素産生を可能にする。
【００５４】
本発明の好ましい実施態様によれば、加水分解、および、バイオ燃料またはバイオ燃料フィードストック産生は、オリゴマー糖を加水分解することのできる酵素およびバイオ燃料の両方を産生することのできる微生物を利用することによる単一工程で行われる。１つの工程でのセルラーゼ（および／またはヘミセルラーゼ）産生、セルロース（および／またはヘミセルロース）加水分解および発酵を特徴とするこの種のアプローチは、しばしば併合されたバイオプロセス（consolidated bioprocessing）と称される。併合されたバイオプロセスは、専用のセルラーゼ（および／またはヘミセルラーゼ）産生を特徴とする工程と比較して、より低いコストおよびより高い効率性の可能性を提供する。これは、資本、基質および他の原料の経費、ならびにセルラーゼ産生に関連する設備を回避するという結果をもたらす。加えて、併合されたバイオプロセスを用いることにより、これはより高い加水分解速度を得る可能性を提供し、そのため反応器容エで産生される酵素の必要性を排除するまたは少なくとも減少させることによってコストを顕著に低減する。
【００５５】
本発明の一実施態様において、酵素産生および発酵油脂産生は同時に、または、任意の順序で逐次的におこる。典型的には、酵素産生がより早く開始される。産生された酵素は、培養培地中のポリマーバイオマスを分解し、それにより、微生物の増殖のための成分を産生する。
【００５６】
本発明の一実施態様において、セルロースまたはヘミセルロース画分は、２つの部分に分けられる。セルロースまたはヘミセルロースの１つの部分は、ポリマー糖の分解を可能にする酵素的能力を有するバイオ燃料産生生物を培養するために使用され得る。酵素は、使用済み培養培地から回収され得、または、酵素を含む使用済み培養培地がセルロースまたはヘミセルロースの第２の部分からのバイオ燃料産生のために再使用され得る。本発明の好ましい一実施態様において、脂質およびアルコールは、例えば脂質を蓄積できるポリマー糖利用微生物がセルロースまたはヘミセルロースの１つの部分に対し使用されるなどの微生物的工程によって産生される。アルコールは、ポリマー糖を利用することのできる脂質産生微生物を使用する第一の工程由来の使用済み培養培地から回収される酵素によって処理されるセルロースまたはヘミセルロースの他の部分から産生される。本発明の一実施態様において、脂質およびエタノール、脂質およびブタノール、または、脂質およびアセトン−ブタノール−エタノール（ＡＢＥ）が産生される。同様に、ＡＢＥおよび脂質、ＡＢＥおよびエタノール、エタノールおよびＡＢＥまたはエタノールおよび脂質が産生され得る。本明細書中で記載されるように工程は、バイオ燃料の産生における使用に限定されるものではない。炭素源および／またはエネルギー源として多糖類を用いて開始される任意の種類の好気性または嫌気性発酵と組み合わせられ得る。
【００５７】
本発明の一実施態様において、セルロースおよびヘミセルロースの混合物は、ポリマー糖を分解する酵素的能力を有する微生物によるバイオ燃料産生に使用される。酵素は使用済みの培養培地から回収されるか、または、酵素を含む使用済み培養培地が、ポリマー糖を利用することのできない生物を用いたバイオ燃料産生のためのセルロースまたはヘミセルロースを加水分解するために再使用され得る。本発明の好ましい一実施態様において、脂質およびエタノールは、例えば脂質を蓄積できるポリマー糖利用微生物がセルロースまたはヘミセルロースの一部分に対し使用されるなどの微生物的工程によって産生される。エタノールは、ポリマー糖を利用する能力を有する脂質産生微生物を使用する第一の工程からの使用済み培養培地から回収される酵素によって処理されるセルロースまたはヘミセルロースの他の部分から産生される。同様に、本発明のさらに別の実施様態において、脂質およびブタノールまたは脂質およびＡＢＥが産生される。同様に、ＡＢＥおよび脂質、ＡＢＥおよびエタノール、エタノールおよびＡＢＥ、または、エタノールおよび脂質が産生され得る。
【００５８】
本発明の一実施態様において、工程のための原料は、ヘミセルロースおよびセルロースの両方（任意の混合物）のポリマー糖を含み、そして、ポリマー糖の加水分解のための細胞外酵素およびバイオ燃料を産生する（工程１）ことのできる微生物を利用する。細胞外酵素は使用済み培養培地中に存在し、回収され、そして、ポリマー糖を利用することのできない生物を用いたバイオ燃料を産生する別のバイオプロセス（工程２）の前、またはそのあいだにヘミセルロースおよびセルロースの両方のポリマー糖の糖化に再使用される。例えば、ヘミセルロースおよびセルロースのポリマー糖を含む加水分解生成物が、１つの画分が工程１に使用され、そして、別の画分が工程２に使用される２つの画分に分けられる。
【００５９】
本発明の一実施態様において、工程１に使用される糖類は、主にヘミセルロースからなるが、また、ポリマーの形状である、ある程度の、通常０．５〜２０％（ｗ／ｗ）、典型的には０．５〜１０％（ｗ／ｗ）のセルロース糖も含む。例えば、ポリマーヘミセルロース糖を含む供給流は、セルロースのポリマー糖を含む供給流で補充される。さらに本発明の別の実施態様においては、工程１で使用される糖は、主にセルロースからなるが、また、ポリマーの形状である、ある程度の、通常０．５〜３０％（ｗ／ｗ）、典型的には１〜２０％（ｗ／ｗ）のヘミセルロース糖を含む。例えば、ポリマーセルロース等を含む供給流は、ヘミセルロースのポリマー糖を含む供給流で補充される。
【００６０】
本発明の別の実施態様において、ポリマー糖利用微生物は、ヘミセルロースおよびセルロースの両方を利用する能力を有する酵素群を産生する。
【００６１】
本発明の一実施態様において、ポリマー糖を利用し、かつバイオ燃料またはバイオ燃料のための出発材料を産生することのできる生物、ならびに、バイオ燃料またはバイオ燃料のための出発材料を産生することができるがポリマー糖を利用することはできない別の生物が、同じ反応器に添加される（混合培養）。
【００６２】
本発明の一実施態様において、ポリマー糖を使用するバイオ燃料産生工程から細胞が除かれ、そして、糖ポリマーを加水分解できる酵素を含む使用済み培養培地それ自体が、ポリマー糖を利用することのできない生物とともに、別のバイオ燃料産生工程へ供給される。
【００６３】
上澄みおよび細胞が完全に分離される必要はない。いくつかの実施態様において、上澄みは、１％〜３０％の元々の微生物培養物の細胞を含む。いくつかの実施態様において、上澄みは、２％〜１５％の、いくつかの実施態様では３〜１０％の、いくつかの実施態様では５〜８％の元々の微生物培養物の細胞を含む。
【００６４】
本発明の一実施態様において、同じ微生物がリグノセルロース系材料からの脂質およびエタノールの産生において使用される。脂質産生は、好気性工程（好気性培養）で得られ、エタノール産生は嫌気性または微好気性培養で得られる。
【００６５】
好気性および嫌気性バイオプロセスの統合により、原料および化学薬品の経費が顕著に減少し、そして独立して操作されるユニットと比較して、バイオ燃料の総体的生産性の増加が得られる。
【００６６】
第一のバイオプロセス（工程１）としての脂質の好気性産生と、第二のバイオプロセス（工程２）としてのアルコール産生とを組み合わせることにより、大部分のリグノセルロース系材料をバイオ燃料適用に適した化合物（アルコール、短い炭素鎖である溶媒および脂質）へと転換することが可能である。脂質および酵素産生バイオプロセスの、エタノール、ブタノールまたはＡＢＥを製造する燃料蒸留所への統合は、脂質産生能力とともに総計のアルコール産生能力を増加し得る。
【００６７】
本発明の一実施態様において、好気性工程は、嫌気性工程へプロセス水を供給し、また逆も同様である。好気性および嫌気性バイオプロセスのあいだのプロセス水の再循環は、酸素が嫌気性微生物株にとって非常に有害であるが、他方で好気性微生物は嫌気性条件においては良好に増殖しないため、微生物汚染リスクを低下させる。
【００６８】
嫌気性工程（プロセス１または２）の後、溶媒は従来、蒸留によって水性画分から分離され、そして、懸濁物は、蒸留後に水から傾斜法によって分離される。本発明の一実施態様において、細胞バイオマスおよび残余のセルロースポリマー（および、原材料としてタンパク質を含む原材料が使用された場合、タンパク質）は、好気性プロセスへと循環される。例えば分解されていないオリゴマー、ペントースおよびセロビオース、ジアラビノースおよびキシロビオースなどの残余の糖を含んでいる可能性のある、使用済み培養培地は、同様に、好気性工程に再循環され得る。エタノール産生のために嫌気性工程が野生型のサッカロマイセス酵母を使用する場合、これらの糖は利用されない。クロストリジウムをベースとしたＡＢＥの産生において、バクテリアは、好気性工程での類似の典型的な脂質産生生物と同様にペントースを利用し得る。
【００６９】
本発明の一実施態様によれば、バイオ燃料は、リグノセルロース系材料が、１つがセルロースを含み、そしてもう１つがヘミセルロースを含む２つの画分に分けられる統合バイオプロセス中で産生される。リグノセルロースのセルロースおよびヘミセルロース画分への分留は、任意の適切な方法によって行われ得る。ヘミセルロースおよび／またはセルロース画分は、リグニン、またはリグニンの残渣および／またはペクチンを含み得る。本発明の一実施態様において、バイオ燃料（脂質、エタノール、ブタノールまたはＡＢＥ）は、ポリマー糖の分解のための酵素的能力を有する生物を使用することによってポリマーヘミセルロースから産生される。酵素は、使用済み培養培地から回収され得、または、酵素を含む使用済み培養培地がバイオ燃料（エタノール、ブタノール、ＡＢＥ、脂質）を産生する第二のバイオプロセスのためのポリマーセルロースの加水分解に再使用され得る。代わりに、本発明のさらに別の実施態様において、バイオ燃料は、ポリマー糖の分解のための酵素的能力を有する生物を使用することによってポリマーセルロースから産生される。酵素は、使用済み培養培地から回収され得、または、酵素を含む使用済み培養培地が第二のバイオプロセスにおけるバイオ燃料産生のためのポリマーヘミセルロースの加水分解に再使用され得る。
【００７０】
実際には、セルロースからのヘミセルロースの分離効率は１００％でなく、そして、セルロース画分はヘミセルロースを含んでいる。セルロース画分中に残るヘミセルロースは、第一のバイオプロセス（工程１）由来の使用された培養培地から回収される酵素によって加水分解され得る。さらに、実際には、ヘミセルロース画分はポリマーセルロースを含んでいるかもしれず、ポリマーヘミセルロースおよびセルロースの両方を利用できる生物が使用された場合、ヘミセルラーゼおよびセルラーゼの両方の酵素が使用済み培養培地から回収され、そして第二のバイオ燃料産生工程（工程２）において再使用され得る。
【００７１】
さらに、ヘミセルロースおよびセルロースの分解は、同じ酵素、例えば、これに限定されるわけではないが、セロビアーゼなどを含んでいてもよい。したがって、ポリマーヘミセルロース上での培養由来の使用済み培養培地からの有用な酵素は、回収され、そして、ポリマーセルロースの加水分解に再使用され得る。
【００７２】
図１は、好気性脂質産生および嫌気性アルコール産生が統合されている本発明の一実施態様を示す。この概念において、両方のバイオプロセスのためのリグノセルロース原材料は、これらに限定されるわけではないが例えば熱水抽出またはオルガノソルブ（organosolv）方法などの任意の技術によってセルロースおよびヘミセルロースを形成するために前処理され得る。好気性脂質産生工程は、原材料としてヘミセルロースを利用し、一方、アルコール産生は原材料としてセルロースを使用する。好気性脂質産生工程（工程１）のため、少なくともヘミセルラーゼを産生する、好ましくはヘミセルラーゼおよびセルラーゼの両方を産生する脂質産生微生物（または複数の脂質産生微生物）が選択される。
【００７３】
図１に記載される本発明の一実施態様によれば、好気性脂質産生および嫌気性アルコール産生が統合される、嫌気性アルコール発酵を含む第二のバイオプロセス（工程２）は、セロビアーゼ酵素が添加された場合により迅速である。セロビアーゼ酵素は、好ましくは、少なくとも部分的には、好気性脂質産生工程からの使用済み培養培地から得られるか、または代わりに、またはそれに加えて、市販のセロビアーゼが使用され得る。
【００７４】
アルコール産生バイオプロセスを含む第二のバイオプロセス（工程２）において、ペントースまたはリグノセルロース系二糖類を使用することのできない、例えばサッカロマイセス酵母などの産生株が使用され得る。ペントースおよび／またはポリマー糖を利用することのできる生物、例えばエタノールまたはＡＢＥの産生のためのクロストリジアなどもまた使用され得る。潜在的には、使用済み培養培地および／または生成物回収後の工程２からの培養培地が脂質産生バイオプロセスへとリサイクルされ得る。嫌気性工程からの蒸留廃液、すなわちアルコール発酵からの固体画分は、好気性脂質産生へと供給される前にリグノセルロースと同じ前処理工程または加水分解工程において処理される可能性もある。さらに、嫌気性工程からの蒸留廃液および／または使用済み培養液（液相）は、例えばセルロースオリゴマーなどのセルロースの残渣を含んでいるかもしれず、これは、セルラーゼ活性を有する生物を使用する脂質産生工程におけるセルラーゼ産生への誘導物質として機能し得る。さらに、嫌気性工程（工程２）からの使用済み培養液は、嫌気性バイオプロセスにおいて脂質へと転換され得る、例えば有機酸、アルコール、グリセロールなどの他の有機化合物を含み得る。
【００７５】
好気性脂質産生工程（工程１）からの使用済み培養培地は、回収され、または、酵素を富化するために濃縮されるか、または、工程２への流入セルロース加水分解物の希釈水としてそのまま使用され得る。
【００７６】
図２は、好気性脂質産生および嫌気性アルコール産生が統合された本発明の一実施態様を示す。好気性脂質産生工程は、原材料としてセルロースを使用し、一方、アルコール産生は原材料としてヘミセルロースを使用する。好気性脂質産生工程（工程１）のため、少なくともセルラーゼを産生する、好ましくはヘミセルラーゼおよびセルラーゼの両方を産生する脂質産生微生物（または複数の脂質産生微生物）が選択される。ヘミセルラーゼおよび／またはセルラーゼ酵素は回収され、そして、エタノール、ブタノールまたはＡＢＥなどのアルコールの嫌気性発酵、好ましくはエタノールまたはブタノールの産生、を含む別のバイオプロセスにおけるセルロース加水分解のために再使用される。
【００７７】
本発明の一実施態様において、セルロースまたはヘミセルロース画分は２つの部分に分けられる。セルロースまたはヘミセルロースの１つの部分は、ポリマー糖の分解のための酵素的能力を有するバイオ燃料産生生物を培養するために使用され得る。酵素は、使用済み培養培地から回収され得、または、酵素を含む使用済み培養培地がセルロースまたはヘミセルロースの第二の部分からのバイオ燃料産生のために再使用され得る。本発明の好ましい一実施態様において、脂質およびエタノールは、例えば脂質を蓄積できるポリマー糖利用微生物がセルロースまたはヘミセルロースの一部分に対し使用されるなどの微生物的工程によって産生される。エタノールは、ポリマー糖を利用することのできる脂質産生生物を用いた第一の工程からの使用済み培養培地から回収される酵素によって処理されることによって、セルロースまたはヘミセルロースの他の部分から産生される。同様に、本発明のさらに別の実施態様において、脂質およびブタノール、または、脂質およびアセトン−ブタノール−エタノールが産生される。同様に、アセトン−ブタノール−エタノールおよびエタノールが産生され得る。
【００７８】
図３は、２つのバイオプロセスの統合による、セルロースからのバイオ燃料産生の例を示す。第一のバイオプロセスは、ポリマーセルロースの分解が可能である細胞外酵素をもまた産生する好気性脂質産生を含む。酵素は、セルロースを使用する別のバイオプロセスであって、例えばエタノール、ブタノールまたはＡＢＥなどのアルコールの嫌気性発酵、好ましくはエタノールまたはブタノールの産生を含むセルロースを用いる別のバイオプロセス中でのセルロース加水分解のために再使用される。図４は、バイオ燃料の生物学的生産のための類似の統合バイオプロセスを示しているが、前記プロセスは原材料としてヘミセルロースを使用する。好ましくは第一のバイオプロセスは脂質産生であり、そして、第二のバイオプロセスはブタノールまたはＡＢＥ産生である。
【００７９】
したがって、脂質＋エタノール；脂質＋ブタノール；脂質＋ＡＢＥ；ブタノール＋エタノール；ＡＢＥ＋エタノール；エタノール＋エタノールなどの、任意の順番の任意の組み合わせが、本発明の様々な実施態様において使用され得る。
【００８０】
本発明の一実施態様によれば、セルロースまたはヘミセルロースを含む原材料は２つの画分に分けられる。
【００８１】
本明細書中で記載される工程は、バイオ燃料の産生における使用のみに限定されるわけではない。炭素源および／またはエネルギー源として多糖類を用いて開始される任意の種類の好気性または嫌気性発酵と組み合わせられ得る。
【００８２】
本発明の一実施態様において、セルロースおよびヘミセルロースの混合物は、ポリマー糖を分解する酵素的能力を有する微生物によるバイオ燃料産生に使用される。セルロースおよびヘミセルロースは同じ材料由来であってもよく、また、異なる原材料由来の画分であってもよい。混合物は、リグニン、またはリグニンの残渣または分解生成物および／またはペクチンを含み得る。あるバイオプロセスにおいては、バイオ燃料ならびにヘミセルロースおよびセルロースもまた産生するような生物が好ましくは使用される。酵素は使用済みの培養培地から回収されるか、または、酵素を含む使用済み培養培地が、ポリマー糖を利用することのできない生物を用いたバイオ燃料産生のためにセルロースまたはヘミセルロースを加水分解するために再使用され得る。本発明の好ましい一実施態様において、脂質およびエタノールは、例えば脂質を蓄積できるポリマー糖利用微生物がセルロースまたはヘミセルロースの一部分に対し使用されるなどの微生物的工程によって産生される。例えばエタノール、ブタノールまたはＡＢＥなどのアルコールは、ポリマー糖を利用する能力を有する脂質産生生物を使用する第一の工程からの使用済み培養培地から回収される酵素によって処理されるセルロースまたはヘミセルロースの他の部分から産生される。同様に、本発明のさらに別の実施様態において、脂質およびブタノールまたは脂質およびアセトン−ブタノール−エタノールが産生される。同様に、アセトン−ブタノール−エタノールおよびエタノール、ＡＢＥおよび脂質、エタノールおよびＡＢＥ、エタノールまたは脂質が産生され得る。
【００８３】
本発明の一実施態様において、工程のための原料は、ヘミセルロースおよびセルロース両方のポリマー糖を含み、そして、ポリマー糖の加水分解のための細胞外酵素およびバイオ燃料を産生する（工程１）ことのできる微生物を利用する。使用済み培養培地中の細胞外酵素は回収され、そして、ポリマー糖を利用することができないかもしれない生物を用いた、バイオ燃料を産生する別のバイオプロセス（工程２）の前またはそのあいだに、ヘミセルロースおよびセルロース両方のポリマー糖の糖化に再使用される。例えば、ヘミセルロースおよびセルロースのポリマー糖を含む加水分解生成物は２つの画分に分けられ、１つの画分は工程１に、そして、別の画分が工程２に使用される。
【００８４】
リグノセルロース系原料からのセルロースおよびヘミセルロースの混合物を利用する、本発明の一つの具体的な実施態様が図５に示されている。本発明のこの実施態様において、セルロースおよびヘミセルロース中のポリマー糖を利用することのできる生物を含む好気性脂質産生工程が、嫌気性アルコール産生工程、例えばエタノール、ブタノールまたはＡＢＥ産生工程（工程２）に統合される。脂質産生工程におけるヘミセルラーゼおよびセルラーゼの産生への誘導物質として機能し得るポリマー糖を含み得る蒸留廃液および／または使用済み培養液は、アルコール産生工程から脂質産生工程へとリサイクルされ得る。さらに、嫌気性工程（工程２）からの使用済み培養液は、例えば有機酸、アルコール、グリセロールなどの嫌気性バイオプロセスにおいて脂質へと転換され得る他の有機化合物を含み得る。さらにまた、工程２からの使用済み培養培地または蒸留廃液は、工程１にとって有用である酵素を含み得る。
【００８５】
本発明の一実施態様において、第一のバイオプロセス（工程１）のために使用される糖は、主に、ヘミセルロースであるポリマー糖を含むが、また、ポリマーの形状であるセルロース系の糖も含む。例えば、ポリマーヘミセルロース糖を含む供給流は、セルロースのポリマー糖を含む供給流で補充される。第一のバイオプロセスは、ポリマー糖の加水分解のための細胞外酵素およびバイオ燃料を産生することのできる微生物を使用する。第二のバイオプロセス（工程２）は、セルロースを含む原材料、および、セルロース中の糖からバイオ燃料を産生することができるが、ポリマー糖を利用することができることが必要とされているわけではない微生物を使用する。工程１からの使用済み培養培地由来の細胞外酵素が使用され、回収され、第二のバイオプロセス（工程２）の前またはそのあいだに、ヘミセルロースおよびセルロース両方のポリマー糖の糖化に再使用される。図６は、第一のバイオプロセスが好気性の、微生物脂質産生工程であり、そして、第二のバイオプロセスが、嫌気性の、アルコール発酵工程である統合されたバイオプロセスである一例を示す。最も好ましくは、第二のバイオプロセスはエタノールまたはブタノール発酵工程である。
【００８６】
本発明のさらに別の実施態様において、第一のバイオプロセス（工程１）のために使用される糖は、主に、セルロースであるポリマー糖からなるが、また、ポリマーの形状であるヘミセルロース糖も含む。例えば、ポリマーセルロース糖を含む供給流は、ヘミセルロースのポリマー糖を含む供給流で補充される。第一のバイオプロセスは、ポリマー糖の加水分解のための細胞外酵素およびバイオ燃料を産生することのできる微生物を使用する。第二のバイオプロセス（工程２）は、ヘミセルロースを含む原材料、および、ヘミセルロース中の糖からバイオ燃料を産生することができるが、ポリマー糖を利用することができることが必要とされるわけではない微生物を使用する。工程１からの使用済み培養培地由来の細胞外酵素が回収され、第二のバイオプロセス（バイオプロセス２）の前またはそのあいだに、ヘミセルロースおよびセルロース両方のポリマー糖の糖化に再使用される。図７は、第一のバイオプロセスが好気性の、微生物脂質産生工程であり、そして、第二のバイオプロセスが、嫌気性の、アルコール発酵工程である統合されたバイオプロセスである一例を示す。最も好ましくは、第二のバイオプロセスはブタノールおよび／またはＡＢＥ発酵工程である。
【００８７】
本発明の別の実施態様において、ポリマー糖利用微生物は、ヘミセルロースおよびセルロース両方を利用する能力を有する酵素群を産生する。
【００８８】
本発明の一実施態様において、ポリマー糖を利用し、かつ、バイオ燃料のための成分を産生することのできる生物、ならびに、バイオ燃料成分を産生することができるがポリマー糖を利用することはできない別の生物が、同じ反応器に添加される（混合培養）。
【００８９】
本発明の一実施態様において、ポリマー糖を使用するバイオ燃料産生工程からの細胞が除かれ、そして、糖ポリマーを加水分解できる酵素を含む使用済み培養培地それ自身が、ポリマー糖を利用することのできない生物とともに、別のバイオ燃料産生工程へ供給される。
【００９０】
より具体的には、本発明の一実施態様において、例えば、ペントース糖を利用することができ、そのためリグノセルロースの利用効率を向上させることのできる、脂質を蓄積できるか、または、例えばエタノール、ブタノールまたはＡＢＥなどのアルコールを産生する微生物のような微生物が使用される。さらに、脂質蓄積生物またはアルコール産生生物などの生物はまた、細胞外酵素により、セルロース中および／またはヘミセルロース中のポリマー糖を利用できる。酵素は使用済みの培養培地から回収され、そして、微生物がポリマー糖を利用することができないバイオ燃料産生工程においてポリマー糖の加水分解のために使用され得る。本発明の具体的な一実施態様において、両方のバイオプロセスは。ポリマー糖を利用することができ、かつ、バイオ燃料またはバイオ燃料のための出発材料を産生することのできる微生物を使用する。
【００９１】
本発明の一実施態様において、同じ微生物が、リグノセルロース系材料からの脂質およびアルコール、とりわけエタノールの産生に使用される。脂質産生は、好気性工程（好気性培養）において得られ、アルコール、とりわけエタノールの産生は、嫌気性または微好気性培養において得られる。
【００９２】
本発明の具体的な一実施態様において、統合工程のうちのバイオプロセスの１つが、動作温度が４５℃以下、好ましくは４０℃以下である、バイオ燃料および場合によっては酵素を産生する中温性バイオプロセスであり、一方、別のバイオプロセスが、動作温度が４５℃より高い、好ましくは５５℃より高い、バイオ燃料および場合によっては酵素を産生する好熱性工程である統合工程を含む。このような統合工程の一例としては、例えばエタノールなどのアルコール（または複数のアルコール）の好熱性嫌気性産生工程をともなう中温性好気性脂質産生である。中温性および好熱性の工程の組み合わせは、バイオプロセス間の酵素のリサイクルおよび再使用に有益であり得る。例えば例として、中温性工程における培地中に産生される、酵素を含み、細胞もまた含み得る上澄み液は、好熱性工程において再使用される。中温性工程からの酵素は、好熱性工程における温度に耐えるほどに耐熱性であり得るが、一方、上澄み中の残渣細胞は不活性化され、したがって、好熱性工程において増殖することができない。代わりに、反対に、好熱性の温度範囲で増殖される生物は、次のバイオプロセスにおける中温性の温度範囲で良好に増殖せず、したがって工程を汚染しない。
【００９３】
廃液およびバイオマスのリサイクル
本発明は、あるバイオプロセスからの廃液の、別のバイオプロセスへのリサイクルを可能にする。本発明の好ましい実施態様において統合は、バイオ燃料産生のためにの、少なくとも１つの好気性および１つの嫌気性バイオプロセスを使用する。これは、好気性工程からの廃液を嫌気性工程へとリサイクルする際の汚染リスクを低減する。脂質を産生する好気性バイオプロセスは、炭素源および栄養源として嫌気性バイオプロセス由来の廃液からの化合物を利用し得る。嫌気性バイオプロセスは、例えばエタノール発酵、ブタノール発酵またはアセトン−ブタノール−エタノール発酵（ＡＢＥ−発酵）などであり得る。これらのバイオプロセスは典型的には、発酵廃液中に、例えば酢酸、酪酸などの有機酸、またはアセトアルデヒドを生じる。
【００９４】
酵素に加えて、バイオマスおよび／または使用済み培養培地のバイオプロセスの間のリサイクルは、例えばタンパク質、アミノ酸、ビタミン、代謝産物、補酵素などの栄養素、無機物および／または成長因子を提供し、これは微生物の同化作用の必要性を減少させ、それゆえ微生物バイオ燃料産生、とりわけ好気性工程段階である脂質産生を増加させる。さらに、嫌気性工程からの微生物細胞は、脂質産生生物によって利用され得る、例えば脂質産生生物によって取り込まれまたはトリアシルグリセロールへと転換され得る、脂質、例えば膜脂質などを含む。脂質産生生物は、生成物回収後のアルコール産生工程からの発酵ブロース由来の残渣のアルコールを利用することができる。本発明の具体的な一実施態様において、アルコール発酵からのアルコールは回収されず、そして、アルコールおよび場合によっては活性な酵素を含む発酵ブロースが、それらが脂質に転換される好気性脂質産生工程へと供給される。
【００９５】
好気性バイオプロセスにおける脂質産生および嫌気性バイオプロセスにおけるアルコール産生からの上澄みが、別のバイオプロセスにおいて再使用されるための酵素の量を最適化するために、種々の時間に収集され得る。本発明の一実施態様において、バイオマスおよび／または上澄みは、再使用のための酵素の活性度およびバイオマス中の脂質量を最適化するために、発酵のあいだに好気性バイオプロセスから部分的に除去される。
【００９６】
本発明の一実施態様において、脂質回収後の脂質産生由来の細胞残渣および他の固体残渣、または、嫌気性アルコール産生由来のバイオマスは、脂質産生工程へ、または嫌気性アルコール産生バイオプロセスへリサイクルされる前に、（熱）機械的、化学的または酵素的に処理され得る。カスケードシステムが使用される場合、バイオマスはカスケードシステムにおける任意のまたは全ての反応器へとリサイクルされ得る。バイオマスおよび／または発酵ブロースをカスケード発酵槽の間で、その中間で細胞の処理をともなってまたはともなわずに、リサイクルすることもまた可能である。これは、バイオマスまたは活性微生物および／または酵素の量を増加させることによって発酵時間を短縮し得る。
【００９７】
本発明の一実施態様において、固体残渣またはバイオマス、使用済み培養培地および／または培養培地から回収されたまたはそれで富化された酵素は、部分的に同じバイオプロセス中にリサイクルされる。これは、バイオプロセスにおける酵素および／またはバイオ燃料の産生を改良し得る。
【００９８】
バイオマスおよび／または使用済み培養培地のリサイクルは、無機物、不活性物質および他の化合物の蓄積を生じ、そして抑制を導き得る。したがって、再循環の量は最適化され、そして、ある一定量のバイオマスおよび／または使用済み培養培地が時々除去される。
【００９９】
発酵前のリグノセルロースの前処理
ポリマー糖加水分解酵素の消化効率を改良するためのリグノセルロースの前処理は、任意の公知の方法によって行われ得る。前処理は、ヘミセルロースおよびセルロースならびに場合によってリグニンの任意の公知の方法による分画（分離）を含み得る。正しい前処理方法を選択することは、工程において使用されるリグノセルロース系フィードストックの種類に大部分依存する。ある種類の原材料に対してのみ適切であるいくつかの方法／技術が存在する。好ましくは、ヘミセルロースおよび／またはセルロースの分離は、脂質産生微生物の増殖を阻害しない加水分解物を産生する方法で行われる。ヘミセルロースおよびセルロース画分は、主にまたは少なくとも部分的にポリマーの形状である糖類を含み得る。本発明の一実施態様は、ヘミセルロースを抽出するために熱水抽出を使用するものである。熱水抽出は、ヘミセルロースに加えて、リグノセルロース系材料から発酵に好ましい無機物を除去するかもしれず、そしてこれは培養培地中への無機物添加の必要性を低下させる。別の実施態様において、例えば酢酸、ギ酸、酢酸エチル、乳酸もしくはマレイン酸またはそれらの任意の組み合わせを用いた処理などの、有機酸前処理が行われる。本発明のさらに別の実施態様において、例えば硫酸などを用いた、酸前処理が行われ得る。また、酸触媒を用いた、または用いない蒸気爆砕が使用される。また、例えばオルガノソルブ前処理などのような方法、場合によっては例えば硫酸などの酸触媒または二酸化硫黄（ＳＯ2）で補充され得る、例えばエタノール  メタノール、アセトンまたはそれらの任意の混合物を用いた処理などの方法が使用され得る。また、例えばアンモニアによる前処理、アンモニア繊維爆砕（ammonia fibre expansion）、アンモニア循環浸出（ammonia recycle percolation）または石灰前処理（lime pretreatments1）が使用され得る。リグノセルロース材料は、前処理に先立ってまたはそのあいだに、これらに限定されるわけではないが例えば粉砕（crushing）または摩砕（milling）などの任意の方法による例えば粒子サイズ減少など、（熱）機械的に処理されてもよい。
【０１００】
リグノセルロース材料中のポリマー糖を加水分解することのできる細胞外酵素を産生し、かつ例えば脂質などのバイオ燃料を産生する工程へとバイオマスを供給する前に、セルロース、ヘミセルロースおよびリグニン画分の精製および／または分離は、必要ではないかもしれない。
【０１０１】
バイオマスのリサイクリング
微生物のバイオマス（細胞）、または例えば脂質回収後のバイオマスなどのバイオマス残渣は、第一のバイオプロセスから第二のバイオプロセスへとリサイクルされ得る。加えて、または代わりに、微生物のバイオマス、またはバイオマス残渣は、第二のバイオプロセスから第一のバイオプロセスへとリサイクルされ得る。微生物のバイオマスは、場合によっては上澄みとともにリサイクルされ得る。微生物のバイオマスは、バイオプロセスに供給される前に、（熱）機械的、酵素的および化学的に処理され得る。本発明の一実施態様において、再利用のための微生物のバイオマスは、リグノセルロース系バイオマスが処理される同じユニット作用において処理される。本発明の一実施態様において、再利用のための微生物のバイオマスは、バイオプロセスへの供給の前の、即ちバイオ燃料の微生物的産生への供給前の微生物的産生への供給などの、リグノセルロース系バイオマスまたはバイオ燃料産生のための原料と同じ処理を受ける。リサイクルされた微生物のバイオマスは、それが供給されるであろうバイオプロセスにとって有用であり得る。第一のバイオプロセスは、脂質またはアルコール産生であり、一方、第二のバイオプロセスはアルコールまたは脂質産生であり得る。
【０１０２】
微生物バイオマス、例えばオイル回収後のバイオマスなどのバイオマス残渣、およびバイオプロセスからの上澄みは、バイオプロセス間でリサイクルされ得る。バイオプロセスからの上澄みおよび細胞は、バイオプロセス間でリサイクルされ得る栄養素および／または酵素を含み、そして、バイオプロセスにとって有用である。バイオマスおよび／または上澄みをリサイクルすることは、バイオプロセスにおける生成物の総収率を向上させ、そして、外部で無機物または栄養素を購入する必要性を減少させ、したがって、バイオ燃料工程の経済性を改良し得る。
【０１０３】
本発明の一実施態様において、バイオプロセス１からの、上澄みの少なくとも一部分および微生物のバイオマス、またはバイオマス残渣の少なくとも一部分がバイオプロセス２へと供給される。
【０１０４】
本発明の一実施態様において、バイオプロセス２からの、上澄みの少なくとも一部分および／または細胞および／または細胞残渣の少なくとも一部分がバイオプロセス１へとリサイクルされ得る。
【０１０５】
バイオプロセス１が例えば微生物的脂質産生などのような好気性工程である場合、それは、アルコール産生工程からの上澄み中の、例えば有機酸、アルコール、またはアルデヒドなどの有機残渣を利用することができる。
【０１０６】
本発明の一実施態様において、バイオ燃料分離後の第二の生物工学的工程からのプロセス水またはその一部は、第一の生物工学的工程および／または第二の生物工学的工程、好ましくは第一の生物工学的工程の原材料の希釈水に再利用される。
【０１０７】
本発明の一実施態様において、エタノールまたはブタノール産生工程からのアルコール回収からのまたはその後の上澄みまたは廃液は、脂質産生工程へとリサイクルされる。脂質産生工程は、上澄みまたは廃液中の残余のエタノールまたはブタノールを微生物の増殖および／または脂質産生のために利用し得る。したがって、残余のエタノールまたはブタノールは、廃液を再循環させることによりその後のバイオ燃料産生工程において脂質産生のために利用され得るため、エタノールまたはブタノールの回収は、完全に行われる必要はない。非常に高効率（収率）な生成物（エタノールまたはブタノール）除去は、通常、運用または資本のコストを増加させるため、このことは有益である。わずかにより低い回収収率が許容されることは、運用または資本のコストを低下させ得る。
【０１０８】
本発明の別の実施態様において、ＡＢＥ発酵工程からのＡＢＥの回収からのまたはその後の上澄みまたは廃液は、脂質産生工程へとリサイクルされる。脂質産生工程は、上澄みまたは廃液中の残余のＡＢＥを微生物の増殖および／または脂質産生のために利用することができる。したがって、残余のＡＢＥは、廃液を再循環させることによりその後のバイオ燃料産生工程において脂質産生のために利用され得るため、エタノール回収は、完全に行われる必要はない。
【０１０９】
原材料
本方法は、木本植物または非木本の草木植物またはセルロースおよび／またはヘミセルロースを含む他の材料を含む任意のリグノセルロース系材料に適用され得る。材料は、農業残渣（例えば麦わら、稲わら、まぐさ、さや、トウモロコシ茎葉、さとうきびバガス）、専用のエネルギー作物（例えばスイッチグラス、ススキ、リードカナリーグラス、ヤナギ、ホテイアオイなど）、木材材料または残渣（例えばヘミセルロース、使用済み亜硫酸パルプ液、屑繊維および／または一次汚泥などの、製材所およびパルプおよび／または製紙工場残渣または画分を含む）、コケまたは泥炭、微生物または都市紙くずであり得る。また、低リグニン含有材料である、例えば大型藻類のまたは微細藻類のバイオマスなどの材料もまた使用され得る。加えて、材料は産業活動からのヘミセルロースまたはセルロース画分であってもよい。本発明は任意の種類のセルロース画分を利用することができる。本発明は、これらに限られるわけではないが、主な画分として例えばガラクトグルコマンナン、キシランまたはアラビノキシランなどを含む任意の種類のヘミセルロース画分を利用することができる。例えばヘミセルロースおよび／またはセルロースなどの、異なる起源、植物種または産業的プロセスからの原材料または特定の画分がともに混合され、そして、本発明によるバイオプロセスのための原材料として使用され得る。
【０１１０】
ポリマー糖を含むヘミセルロースおよび／またはセルロース画分は、リグノセルロース系材料中のポリマー糖を加水分解することのできる細胞外酵素を産生し、そして、任意の形状の、すなわち固体の形状または溶解された形状または部分的に固体でありかつ部分的に溶解された形状の、例えば脂質またはアルコールなどのバイオ燃料を産生するバイオプロセスへと供給され得る。
【０１１１】
本発明の一実施態様において、リグノセルロース系バイオマスは、リグノセルロース系材料中のポリマー糖を加水分解することのできる細胞外酵素を産生するバイオプロセス中に固体の形状として添加され、例えば脂質などのバイオ燃料を産生する。本発明の一実施態様において、固体のリグノセルロースは、より小さい粒子サイズを得るために、例えば摩砕または粉砕などの機械的に処理されてもよいが、発酵に先立ってセルロース、ヘミセルロースまたはリグニン画分を分離するために前処理されていなくてもよい。本発明のさらに別の実施態様において、リグノセルロースの固体画分は、粒子サイズを減少させるための機械的処理に加えて、ポリマー糖を分解することのできる細胞外酵素およびバイオ燃料を産生するバイオプロセスへと供給される前に、リグノセルロースの構造を開く、または解く方法を用いて処理される（工程１）。このようなリグノセルロースの固体画分は、ポリマーの形状のセルロースおよび／またはヘミセルロースおよびリグニンを含んでいてもよい。
【０１１２】
リグノセルロースから分画された場合、リグニン画分は、これらに限定されるわけではないが例えば、電力および熱製造のため、バイオ化学製品（バイオプラスティック、樹脂）の製造のため、構造バイオ材料のため、化学製品、バイオ燃料および／または潤滑剤として使用され得る化合物の熱分解の、水素化脱酸素反応のまたはガス化およびフィッシャー−トロプシュ法合成のためなどの、任意の公知の目的のために使用され得る。
【０１１３】
本発明の利点は、本方法が、記載される工程中において使用される株によって産生されない他の酵素の添加の必要性なしに、または減少された必要性で、それ自身により（その場で）で必要とされる細胞外酵素を産生することである。脂質をセルロースおよび／またはヘミセルロースから産生する１つの工程において産生される細胞外酵素は、培養培地から回収され、そしてポリマー糖を利用することのできない生物を用いたバイオ燃料またはバイオ燃料フィードストックを産生するための統合工程において使用される。本発明の別の実施態様において、ポリマー糖を分解することのできる細胞外酵素を含む、ポリマー糖からの脂質産生由来の細胞回収後の培養培地が、酵素について濃縮されるか、または、富化されることなく、ポリマー糖を使用することのできない生物によるポリマー糖からのバイオ燃料またはバイオ燃料フィードストック産生のための培養培地として使用される。
【０１１４】
本発明のバイオ燃料産生のための原材料としては、好ましくは少なくともある程度のポリマー糖を含むものが挙げられる。
【０１１５】
本発明の最も好ましい実施態様において、原材料はリグノセルロース系バイオマスまたはその任意の画分である。
【０１１６】
本発明の別の実施態様において、原材料は、でんぷんであるか、またはでんぷんを含む。でんぷん含有の材料の例としては、トウモロコシ、例えば小麦および大麦などの穀類、タピオカ、キャッサバ、コメ、ジャガイモ、サツマイモ、タロイモおよび微細藻類などが挙げられるがこれらに限定されるわけではない。
【０１１７】
本発明によれば、第一のバイオプロセスは、でんぷん中のポリマー糖を利用し、そしてバイオ燃料を産生することのできる微生物を使用することによって、でんぷんを含む原材料を利用する。第一のバイオプロセスからの上澄み中のでんぷん加水分解酵素は、ポリマー糖でんぷんを加水分解するためのバイオ燃料の微生物的産生のための第二のバイオプロセスへと供給される。第二のバイオプロセスは、でんぷん中のポリマー糖を利用できない微生物を利用するか、代わりに、でんぷん中のポリマー糖を利用できる微生物を利用する。でんぷんに対する加水分解活性を有する酵素を導入することは、第二のバイオプロセスでのでんぷんの加水分解を促進するであろう。
【０１１８】
リグノセルロース加水分解
セルロースは通常、実際上水に溶解しない。固体のセルロースの加水分解は３つの異なる種類の酵素：エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼおよびβ−グルコシダーゼを通常必要とする。主にセルロースのアモルファスな部分に作用するエンドグルカナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．４）はセルロースの巨大分子の内部結合をランダムにアタックする。エキソグルカナーゼまたはセロビオヒドラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．９１）はセルロース鎖の端部をアタックし、一度に主に１つのセロビオースを加水分解する。エキソグルカナーゼはまた、結晶性セルロースポリマーを加水分解することもできる。最後に、セロビオースのグルコースモノマーへの加水分解がβ−グルコシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．２１）によって行われる。
【０１１９】
セルロース加水分解は通常、多くの異なるセルラーゼの連携を必要とする。分析された異なるグリコシド結合切断酵素の量は非常に高く、９０を超える種々の酵素が、例えばセロビオヒドラーゼドメイン（ＣＢＨ  Ｉ、ＩＩ）、エンドグルカナーゼドメイン（ＥＧ  Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ）およびベータグルコシダーゼドメイン（ＢＧＬ  Ｉ、ＩＩ）などの１４の異なるファミリー中にすでに数えられている（さらに多くが研究途中でさえある）。
【０１２０】
ヘミロース（キシラン、アラビノキシランおよびグルコマンナス）の完全な酵素加水分解のためには、いくつかの異なる酵素が必要とされ、これらはほぼ同時に活性化されなければならない。第一のアタックは、例えばエンドキシラナーゼ（１，４−β−Ｄ−キシラン  キシラノハイドロラーゼ）、エンドアラビナーゼおよびエンドマンナナーゼ（１，４−β−Ｄ−マンナン  マナノハイドロラーゼなどの酵素によって典型的には行われる。例えば、トリコデルマ  リーゼイ（Trichoderma reesei）は少なくとも４つの異なるエンド−キシラナーゼおよび１つのエンド−マンナナーゼを有している。
【０１２１】
エンド−ヘミセルラーゼ作用の後、ヘミセルロースオリゴマーを加水分解することのできる酵素としては、例えばβ−キシロシダーゼ、β−アラビノシダーゼ、β−マンノシダーゼおよびβ−グルコシダーゼ（ＥＣ  ３３．２．１．２１）などが挙げられる。オリゴマーに含まれているの残余の側鎖結合を分解するために、α−グルクロニダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．１３９）、α−アラビノダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．５５）およびα−Ｄ−ガラクトシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．２２）が必要とされる。アセチル成分の除去のためには、エステラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．７２）の作用が必要とされる。
【０１２２】
さらに、リグニンの酵素的加水分解は、リグニンペロキシダーゼ（ＬｉＰ  ＥＣ  １．１１．１．１４）、マンガネーゼ−依存性ペロキシダーゼ（ＭｎＰ  ＥＣ  １．１１．１．１３）およびラッカーゼ（ＥＣ  １．１０．３．２）などの酸化酵素の活性を必要とする。リグニンの修飾は、多くの酵素、補酵素およびドナーと最終的なアクセプターとのあいだの電子移動システムの連携を必要とする。化学構造およびリグニンのセルロースおよびヘミセルロースへの付加が、リグニンの量よりもより重要である。
【０１２３】
「ＡＢＥ発酵（ABE fermentation）」または「ＡＢＥ産生（ABE production）」とは、アセトン、ブタノール（ｎ−ブタノール）およびエタノールの混合物がバクテリアの発酵によって産生される工程を指す。いくつかの場合において、バクテリアの株に依存して、イソプロパノールがアセトンの代わりに産生される。
【０１２４】
アルコールを産生するための工程は、典型的には、バイオリアクター中で、典型的には発酵槽中での微生物の嫌気性培養を含む。微生物はアルコールを産生し得る。アルコールは発酵ブロースから、典型的には蒸留によって収集される。例えばエタノールおよび／またはブタノールなどの回収されたアルコールは、バイオ燃料として使用され得る。エタノールは典型的にはバイオ燃料として、例えば自動車のガソリンおよびエタノールブレンドなどとして使用されるに先立ち、９９．５％の濃度にまで脱水される必要がある。
【０１２５】
微生物
ポリマー糖を含むフィードを含むバイオプロセス（工程１）のための、適切な微生物は、ポリマー糖を利用することができ、そしてバイオ燃料としての目的に適切な化合物を産生することができるような任意の微生物であり得る。本発明の好ましい実施態様において、本発明において使用される脂質産生生物はヘミセルロースおよび／またはセルロース中のポリマー糖を利用することのできる任意の生物であり得る。
【０１２６】
これらの生物としては、例えばストレプトマイセスまたはバチラスなどのバクテリア、Ａ．ニガー（A. niger）、Ａ．テレウス（A. terreus）、Ａ．オリザエ（A. oryzae）、Ａ．ニデュランス（A. nidulans）、Ｆ．オキシスポルム（F. oxysporum）、ファネロカエテ  クリソスポリウム（Phanerochaete chrysosporium）、Ｒ．オリザエ（R. oryzae）またはトリコデルマ  リーゼイ（Trichoderma reesei）などの例えばアスペルギルス（Aspergillus）、セファロスポリウム（Cephalosporium）、フザリウム（Fusarium）、フミコーラ（Humicola）、マイクロスファエロプシス（Microsphaeropsis）、ニグロスポラ（Nigrospora）、アオカビ（Penicillium）、ファネロカエテ（Phanerochaete）、ホモプシス（Phomopsis）、クモノスカビ（Rhizopus）、スクレオサイティス（Sclerocystis）またはトリコデルマ（Trichoderma）などの糸状菌類（filamentous fungi）、クリプトコッカス  アルビダス（Cryptococcus albidus）またはトリコスポロン  クタネウム（Trichosporon cutaneum）などの例えばクリプトコッカス（Cryptococcus）またはトリコスポロン（Trichosporon）などの酵母（yeasts）が例えば挙げられるが、これらに限定されるわけではない。セルロースおよび／またはヘミセルロース中のポリマー糖を利用することができるように遺伝子組み換えされている油性生物はまた、本発明の一部分である。さらに、脂質の産生が向上するように遺伝子組み換えされた、セルロースおよびヘミセルロース中のポリマー糖を利用することのできる生物がまた、本発明に含まれる。
【０１２７】
脂質および酵素の両方を産生することのできる微生物は、好ましくは、真菌、酵母またはバクテリアであり、好ましくはアスペルギルス、フミコーラ、クモノスカビおよびトリコデルマの群より選択される属に属しているか、または、クリプトコッカス属に属する酵母、またはストレプトマイセスに属するバクテリアである。
【０１２８】
本発明の最も好ましい実施態様において、ヘミセルロースおよびセルロースの両方のポリマー糖を利用できる、すなわちヘミセルラーゼおよびセルラーゼ活性の両方を有している脂質産生微生物が使用される。このような生物としては、アスペルギルス  テレウスなどの例えばアスペルギルスなどの糸状菌類、および、例えばストレプトマイセスなどのバクテリアなどが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
【０１２９】
ポリマー糖が酵素的に分解される第二のバイオプロセス（工程２）での使用のために、ポリマー糖を利用することができない脂質産生生物が使用され得る。しかしながら、工程はまた、ポリマー糖を利用することができる生物を使用することもできる。脂質産生生物は、バクテリア、シアノバクテリア、例えば酵母およびカビなどの真菌（糸状菌類）、古細菌または微細藻類の群より選択される。微生物は脂質を容易に蓄積することができるか、または、脂質を蓄積するようにまたは脂質の蓄積を向上させるように遺伝子組み換えされている。脂質産生生物としては、以下の生物が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
【０１３０】
ドナリエラ（Dunaliella）、クロレラ（Chlorella）、ボツリオコッカス（Botryococcus）、ブラキオモナス（Brachiomonas）、クロロコッカム（Chlorococcum）、クリプテコジウム（Crypthecodinium）、ユーグレナ（Euglena）、ヘマトコッカス（Haematococcus）、クラミドモナス（Chlamydomonas）、イソクリシス（Isochrysis）、プレウロクリシス（Pleurochrysis）、パブロバ（Pavlova）、プロトテカ（Prototheca）、フェオダクチラム（Phaeodactylum）、シュードクロレラ（Pseudochlorella）、パラクロレラ（parachlorella）、ブラクテアコッカス（Bracteococcus）、イカダモ（Scenedesmus）、スケレトネマ（Skeletonema）、キートセロス（Chaetoceros）、ニッチア（Nitzschia）、ナンノクロロプシス（Nannochloropsis）、ナビクラ（Navicula）、ナンノクロリス（Nannochloris）、シゾキトリウム（Schizochytrium）、スケレトネマ（Sceletonema）、スラウストキトリウム（Thraustochytrium）、ウルケニア（Ulkenia）、テトラセルミス（Tetraselmis）およびシネコシスティス（Synechocystis）を含む属に属する微細藻類種。
【０１３１】
アスペルギルス（Aspergillus）、クサレケカビ（Mortierella）、ケタマカビ（Chaetomium）、麦角菌（Claviceps）、クラドスポリジウム（Cladosporidium）、クスダマカビ（Cunninghamella）、エメリセラ（Emericella）、フザリウム（Fusarium）、グロムス（Glomus）、ケカビ（Mucor）、ペシロマイセス（Paecilomyces）、アオカビ（Penicillium）、フハイカビ（Pythium）、クモノスカビ（Rhizopus）、トリコデルマ（Trichoderma）、ジゴリンクス（Zygorhynchus）、フミコーラ（Humicola）、クラドスポリウム（Cladosporium）、マルブランキア（Malbranchea）、黒穂菌（Ustilago）属に属する糸状菌類種。
【０１３２】
クラビスポラ（Clavispora）、デバリオミケス（Deparyomyces）、パチソレン（Pachysolen）、クルイベロミセス（Kluyveromyces）、ガラクトマイセス（Galactomyces）、ハンゼヌラ（Hansenula）、サッカロマイセス（Saccharomyces）、ウォルトマイセス（Waltomyces）、エンドミコプシス（Endomycopsis）、クリプトコッカス  カルバタス（Cryptococcus curvatus）などのクリプトコッカス（Cryptococcus）、ロドスポリジウム  トルロイデス（Rohodosporidium toruloides）などのロドスポリジウム（Rhodosporidium）、ロドトルラ  グルチニス（Rhodotorula glutinis）などのロドトルラ（Rhodotorula）、ヤロウイア  リポリティカ（Yarrowia lipolytica）などのヤロウイア（Yarrowia）、ピキア  スティピティス（Pichia stipitis）などのピキア（Pichia）、カンジダ  クルバータ（Candida curvata）などのカンジダ（Candida）、リポマイセス  スターケイ（Lipomyces starkeyi）などのリポマイセス（Lipomyces）、および、トリコスポロン  クタネウム（Trichosporon cutaneum）またはトリコスポロン  プルランス（Trichosporon pullulans）などのトリコスポロン（Trichosporon）属に属している酵母。
【０１３３】
アシネトバクター（Acinetobacter）、アクチノバクター（Actinobacter）、アルカニボラックス（Alcanivorax）、アエロゲネス（Aerogenes）、アナベナ（Anabaena）、アルスロバクター（Arthrobacter）、バチラス（Bacillus）、クロストリジウム（Clostridium）、ディエジア（Dietzia）、ゴードニア（Gordonia）、エシェリキア（Escherichia）、フレキシバクテリウム（Flexibacterium）、マイクロコッカス（Micrococcus）、マイコバクテリウム（Mycobacterium）、ノカルディア（Nocardia）、ネンジュモ（Nostoc）、オシラトリア（Oscillatoria）、シュードモナス（Pseudomonas）、ロードコッカス（Rhodococcus）、ロードマイクロビウム（Rhodomicrobium）、ロードシュードモナス（Rhodopseudomonas）、シュワネラ（Shewanella）、シゲラ（Shigella）、ストレプトマイセス（Streptomyces）およびビブリオ（Vibrio）属に属しているバクテリア。最も好ましいバクテリアは、ロードコッカス  オパカス（Rhodococcus opacus）、アシネトバクター（Acinetobacter）、ノカルディア（Nocardia）、またはストレプトマイセス（Streptomyces）を含む。
【０１３４】
エタノールの産生のために使用される生物は、バクテリア、シアノバクテリア、例えば酵母およびカビなどの真菌（糸状菌類）、および微細藻類の群、より好ましくはバクテリア、糸状菌類および酵母の群より選択され得る。微生物はエタノールを容易に産生することができるか、または、脂質を蓄積するようにまたは脂質の蓄積を向上させるように遺伝子組み換えされ得る。エタノール産生生物としては、リグノセルロース系材料中のモノマーのまたはポリマーの糖を利用することのできる生物が挙げられる。エタノール産生生物としては、以下の生物が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
【０１３５】
Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）またはＳ．ウバルム（S. uvarum）のようなサッカロマイセス、Ｃ．シャハタエ（C. shehatae）のようなカンジダ、Ｐ．タノフィラス（P. tannophilus）のようなパキソレン、Ｐ．スティピティス（P. stipitis）のようなピキア、および、Ｓ．ポンベ（S. pombe）のようなシゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）属に属する酵母などの真菌。
【０１３６】
例えば、Ａ．プルランス（A. pullulans）のようなアウレオバシジウム（Aureobasidium）、および、Ｆ．アベナシューム（F. avenaceum）またはＦ．オキシスポルム （F. oxysporum）のようなフザリウム（Fusarium）などの属に属する糸状菌類。
【０１３７】
例えば、バクテロイデス（Bacteroides）、ゲオバチルス（Geobacillus）、Ｃ．テルモセルム（C. thermocellum）またはＣ．サッカロリチカム（C. saccharolyticum）のようなクロストリジウム、Ｅ．クリサンセミ（E. chrysanthemi）のようなエルウィニア（Erwinia）、Ｅ．コーライのようなエシェリキア、Ｋ．オキシトカ（K. oxytoca）のようなクレブシエラ（Klebsiella）、サルシナ（Sarcina）、ラオウルテラ（Raoultella）、ルミノコッカス（Ruminococcus）、スピロヘータ（Spirochaeta）、Ｔ．エタノリカス（T. ethanolicus）、Ｔ．マスラニイ（T. mathranii）、Ｔ．サーモヒドロスルフリカス（T. thermohydrosulfuricus）のようなサーモアナエロバクター（Thermoanaerobacter）、Ｔ．アシジトレランス（T. aciditolerans）、Ｔ．アオテアロエンス（T. aotearoense）、Ｔ．ポリサッカロリティカム（T. polysaccharolyticum）、Ｔ．サーモサッカロリティカム（T. thermosaccharolyticum）、Ｔ．ゼアエ（T.zeae）のようなサーモアネロバクテリウム（Thermoanaerobacterium）、Ｔ．セレレ（T. cekere）のようなサーモブラチウム（Thermobrachium）およびＺ．モビリス（Z. mobilis）のようなザイモモナス（Zymomonas）などの属に属するバクテリア。
【０１３８】
ブタノール、アセトン−ブタノール−エタノール、またはイソブタノール−エタノール−アセトンを産生するために使用される生物は、バクテリア、シアノバクテリア、例えば酵母およびカビなどの真菌（糸状菌類）、および微細藻類の群、より好ましくはバクテリア、糸状菌類および酵母の群、より好ましくはバクテリアの群より選択され得る。ブタノールまたはアセトン−ブタノール−エタノール産生生物は、リグノセルロース材料中の単量体のまたはポリマーの糖を利用することのできるものを含む。ブタノールまたはアセトン−ブタノール−エタノール産生生物としては、以下の生物が挙げられるがこれらに限定されるわけではない。
【０１３９】
例えば、Ｃ．アセトブチリカム（C. acetobutylicum）、Ｃ．ベイジェリンキ（C.beijerinckii），Ｃ．ブチリカム（C. butyricum）、Ｃ．オーランチブチリカム（C. aurantibutyricum）、Ｃ．サッカロパーブチルアセトニカム（C. saccharoperbutylacetonicum）のようなクロストリジウムおよびＥ．コーライ（E. coli）のようなエシェリキアなどの属に属しているバクテリア。
【０１４０】
「油性生物（oleaginous microorganism）」とは本明細書において、脂質産生のために適切であるかまたは最適化されている条件における培養時に、そのバイオマスの少なくとも１５％（ｗ／ｗ）を脂質として蓄積する微生物として参照される。
【０１４１】
「脂質含有単細胞マス（lipid-containing single-cell mass）」とは、独立栄養的に、従属栄養的におよび／または混合栄養的に形成される、微生物の乾燥物量の少なくとも３％、好ましくは少なくとも１０％、好ましくは少なくとも１５％（ｗ／ｗ）またはそれ以上の脂質量を有する単細胞マスおよび細胞の菌糸体を表わしている。
【０１４２】
酵素
本発明の一部である酵素としては、特に、糖を微生物にとって利用可能な形状へと転換することのできるものが挙げられる。典型的には、そのような酵素は、例えば糖ポリマーを糖単量体へと転換することのできるものなどの、加水分解酵素である。典型的には、これは単一の酵素によってではなく酵素群によって行われる。代わりに、糖を微生物にとって利用可能な形状へと転換することのできる酵素としては、イソメラーゼが挙げられる。
【０１４３】
「セルラーゼ（cellulase）」または「セルロース分解性の酵素（cellulolytic enzyme）」とは、主に、例えば糸状菌類または酵母などの真菌、バクテリア、植物などによって、またはセルロースの加水分解（セルロース分解とも称される）を触媒する動物によって産生される酵素の群を意味する。セルラーゼ酵素のためのＥＣ番号は、ＥＣ  ３．２．１．４．である。いくつかの異なる種類のセルラーゼが公知であり、それらは構造的におよび反応機構的に異なっている。セルラーゼの概要としては、触媒される反応のタイプにしたがって、エンドセルラーゼ、エキソセルラーゼ、セルビアーゼ、またはベータグルコシダーゼ、酸化セルラーゼ、およびセルロースホスホリラーゼなどが挙げられる。
【０１４４】
「ヘミセルラーゼ（hemicellulase）」とは、主に、例えば糸状菌類または酵母などの真菌、バクテリア、植物などによって、またはヘミセルロースの加水分解を触媒する動物によって産生される酵素の群を意味する。例えば、キシランの加水分解に関与する酵素としては、エンドキシラーゼ、アセチル−キシランエステラーゼ、α−Ｄ−グルクロニダーゼ、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ、フェルラ酸エステラーゼおよびβ−キシロシダーゼが挙げられる。加えて、ガラクトグルコマンナンの加水分解に関与する酵素としては、エンドマンナーゼ、アセチル−マンナンエステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、β−マンノシダーゼが挙げられる。加えて、アラビノガラクタンの加水分解に関与する酵素としては、β−ガラクトシダーゼおよびエンド−α−Ｌ−アラビナーゼが挙げられる。これらの酵素は例えば以下のＥＣ番号のもとに見出すことができる：EC 3.2.1.8, EC 3.2.1.37, EC 3.2.1.55, EC 3.2.1.99, EC 3.2.1.139, EC 3.2.1.78, EC 3.2.1.25, EC 3.2.1.22, EC 3.2.1.21, EC 3.2.1.89, EC 3.1.1.72, EC 3.1.1.6, EC 3.1.1.73。
【０１４５】
「ヘミセルロース（hemicellulose）」とは、植物細胞のセルロース繊維を他の炭水化物（例えばペクチンなど）とともに取り巻いている、リグノセルロース系材料中に見出される炭水化物複合体を意味する。ヘミセルロースの構成成分は、植物の種類に依存する。ヘミセルロースの最も一般的な種類としては、キシラン、グルコノキシラン、グルコマンナン、ガラクトグルコマンナン、アラビノキシラン、キシログルカンおよびアラビノガラクタンが挙げられる。
【０１４６】
「リグノセルロース系材料（lignocellulosic material）」または「リグノセルロース系バイオマス（lignocellulosic biomass）」とは、セルロース、ヘミセルロース、およびリグニンまたはそれらの任意の画分からなるバイオマスを意味する。
【０１４７】
「糖化（saccharification）」とは、ポリマー糖の糖単量体への加水分解として意味される。糖化は一般的には、ポリマー糖を加水分解することのできる酵素の使用によって達成される。
【０１４８】
バイオプロセス
微生物的な脂質産生は、任意の公知の方法または将来において開発される方法で行われ得る。典型的には、微生物的脂質産生工程は、好気性バイオリアクター中の微生物の液内培養での培養を含む。微生物は、例えばヘミセルロースおよび／またはセルロース糖などの炭素源およびエネルギー源ならびに主要および微量栄養素を含む液体培養培地中で増殖される。培養は、例えば回分培養、流加回分培養、連続回分培養などで行われ得る。培養はまた、カスケード法で行われてもよい。培養において、微生物は増殖されそして、細胞内に脂質が蓄積される。一部の微生物は脂質を培養培地へと分泌することができる。
【０１４９】
微生物脂質産生工程は、遊離水の量が少ないか、または産生が固体または半固体表面上で行われる反応器中でもまた行われ得る。水に溶解しない細胞マスまたは他のバイオマスは、酵素を溶解可能な形状で得るために水溶液を用いて抽出され得る。
【０１５０】
エタノール、ブタノールまたはアセトン−ブタノール−エタノールの微生物による産生は、任意の公知の方法または将来において開発される方法で行われ得る。典型的には、微生物は、発酵槽中で液内培養で培養される。微生物は、例えばヘミセルロースおよび／またはセルロース糖などの炭素源およびエネルギー源ならびに主要および微量栄養素を含む液体培養培地中で増殖される。培養は、例えば回分培養、流加回分培養、連続回分培養などで行われ得る。培養はまた、カスケード法で行われてもよい。
【０１５１】
使用済み培養培地からの酵素の回収
酵素は、微生物培養物、使用済み培養培地、上澄みおよび微生物細胞から、任意の公知かつ適切な方法で、または将来において開発される任意の適切な方法で行われ得る。それによって所望の酵素活性を有する酵素を画分に分離し得るような方法についても同様のことが適用される。
【０１５２】
酵素の回収のための好ましい方法は、それによって微生物培養物、上澄みまたはそれらの任意の組み合わせが、当業者によって、その触媒活性を維持しながらの酵素の回収を達成するために処理され得るような方法である。
【０１５３】
上澄みおよび／または微生物細胞は、微生物培養物から分離され、そして酵素調製物として、または酵素源として使用され得る。上澄みとは、使用済み培養培地を含む、実質的に細胞を含まない画分を意味する。上澄みはまた、「発酵液（hermentation liquid）」、「液相（a liquid phase）」または「培養物ブロース（culture broth）」または「培養ブロース（cultivation broth）」とも称され得る。
【０１５４】
上澄みおよび細胞の分離は、酵素の触媒活性を維持する任意の適切な方法によって行われ得る。
【０１５５】
それによって触媒的に活性な酵素（または複数の酵素）を含む、微生物培養物または上澄みまたは富化されたタンパク質画分が回収されるような方法は、それらの分子サイズ、イオン性の挙動、水への溶解度、種々の溶質の溶解性、または緩衝因子もしくは表面活性因子もしくは表面−活性化合物もしくは塩を含む溶質混合物中の溶解度に依存し得る。
【０１５６】
酵素は、例えば遠心分離、ろ過、抽出、噴霧乾燥、エバポレーションまたは沈降などを含むがこれらに限定されるわけではない、様々な方法によって培養培地から回収され得る。
【０１５７】
必要であれば、酵素は、クロマトグラフィー、電気泳動法、種々の溶解性、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、または抽出などを含むがこれらに限定されるわけではない、様々な方法によって精製または単離されてもよい。
【０１５８】
酵素は、例えば塩、糖、またはグリセロールなどによって安定化されてもよい。
【０１５９】
さらに、酵素は、所望の適用のために製剤化されてもよい。
【０１６０】
「細胞外酵素（extracellular enzymes）」は、培養培地中へと分泌された、または細胞から培養培地へと細胞分解によって遊離された酵素である。細胞外酵素は、上澄みから回収され得る。
【０１６１】
本発明の一実施態様において、タンパク質画分は、上澄み中に富化される。富化は、例えば上澄みを濃縮することなどによってなど簡単に行うことができる。
【０１６２】
いくつかの実施態様において、タンパク質画分は、元々の液相と比較して、少なくとも１０％、典型的には少なくとも２０％、様々な実施態様では少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％富化される。適切な方法の例としては、タンパク質のイオン特性、分子サイズ、溶解度、表面活性特性または疎水性相互作用に基づく方法が挙げられる。好ましくは、酵素画分の回収は、温度が７０℃またはそれより低い温度である条件下で行われる。
【０１６３】
本発明の一実施態様において、上澄み中のタンパク質画分は、少なくとも１倍（１×）、典型的には少なくとも２倍（２×）、好ましくは少なくとも３倍（３×）富化される。いくつかの実施態様において、微生物培養物の水相中または上澄み中のタンパク質画分は、容積当たりおよび／または総タンパク質当たりの酵素活性として計算して、少なくとも５倍、いくつかの実施態様においては少なくとも１０×、または２０×、または３０×、または４０×、または５０×、または６０×、または７０×、または８０×、または９０×、または１００×富化される。
【０１６４】
さらに、いくつかの実施態様において、上澄みは、統合された工程において使用される前に希釈されてもよい。
【０１６５】
脂質からのバイオ燃料産生
「バイオ燃料（biofuel）」は、主にバイオマスまたはバイオ廃棄物由来の固体、液体、ガス状の燃料を意味し、有史以前の植物および動物の有機遺物由来である化石燃料とは異なる。
【０１６６】
ＥＵ指令（directive）２００３／３０／ＥＵに従えば、「バイオディーゼル（biodiesel）」は植物油または動物油から製造されるメチルエステルであって、バイオ燃料として使用されるディーゼル品質のものを意味する。より広義には、バイオディーゼルは、ディーゼル品質の、植物油または動物油由来の、例えばメチル、エチルまたはプロピルエステルなどの、長鎖アルキルエステルを意味する。バイオディーゼルは微生物脂質からもまた製造されることができ、ここで微生物脂質は、バクテリア、真菌（酵母またはカビ）、藻類または別の微生物起源であり得る。
【０１６７】
「再生可能ディーゼル（renewable diesel）」とは、動物、植物もしくは微生物起源の脂質またはそれらの混合物の水素処理によって製造される燃料を意味し、ここで微生物脂質は、バクテリア、真菌（酵母またはカビ）、藻類または別の微生物起源であり得る。再生可能ディーゼルはまた、ガス化およびフィッシャー−トロプシュ合成によりバイオマスに由来するワックスから製造され得る。任意には、水素処理に加えて、異性化または他の処理工程が行われてもよい。再生可能ディーゼル製造方法はまた、ジェット燃料および／またはガソリンの製造に使用され得る。再生可能ディーゼルの製造は、欧州特許第１３９６５３１号明細書、欧州特許第１３９８３６４号明細書、欧州特許第１７４１７６７号明細書および欧州特許第１７４１７６８号明細書の特許文献に記載されている。
【０１６８】
バイオディーゼルまたは再生可能ディーゼルは、化石燃料と混合されてもよい。適切な添加物、例えば防腐剤および酸化防止剤などが燃料製品に添加されてもよい。
【０１６９】
「潤滑剤（lubricant）」とは、例えばグリース、脂質またはオイルなどの、可動部への表面コーティングとして適用された場合に摩擦を減少させる物質を意味する。潤滑剤の他の２つの主な機能は、熱の除去および不純物を溶解させることである。潤滑剤の適用の例としては例えば、内燃エンジン内におけるエンジンオイルとしての使用、燃料中への添加物、例えばポンプおよび油圧装置などのオイル駆動機器における使用、または、種々のタイプの軸受部における使用などが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。典型的には潤滑剤は、７５〜１００％のベースオイルを含み、そして、残りは添加物である。適切な添加物としては例えば、界面活性剤、貯蔵安定剤、酸化防止剤、腐食防止剤、曇り防止剤、抗乳化剤、消泡剤、共溶媒および潤滑性添加物（例えば米国特許第７，６９１，７９２号明細書などを参照のこと）が挙げられる。潤滑剤のためのベースオイルは鉱物油、植物油、動物油起源、または、バクテリア、真菌（酵母またはカビ）、藻類または別の微生物起源であり得る。ベースオイルはまた、バイオマスに由来するワックスからガス化およびフィッシャー−トロプシュ合成により生じ得る。粘度指数がベースオイルを特徴付けるために使用される。典型的には高い粘度指数が好ましい。
【０１７０】
本発明において記載される方法を用いて産生される脂質は、バイオディーゼル、再生可能ディーゼル、ジェット燃料またはガソリンの製造のためのフィードストックとして使用され得る。バイオディーゼルは脂肪酸メチルエステルからなり、そして、典型的にはエステル交換によって製造される。エステル交換において、アシルグリセロールは長鎖脂肪酸アルキル（メチル、エチルまたはプロピル）エステルへと変換される。再生可能なディーゼルとは、脂質の水素処理（水素脱酸素化、水素化または水素化処理）によって製造される燃料を意味する。水素処理において、アシルグリセロールは対応するアルカン（パラフィン）へと変換される。アルカン（パラフィン）はさらに異性化によってまたは他の代替の工程によって修飾され得る。再生可能なディーゼルの製造工程はジェット燃料および／またはガソリンを製造するためにもまた使用され得る。加えて、脂質のクラッキングがバイオ燃料を製造するために行われてもよい。さらに、脂質は特定の適用においては直接的にバイオ燃料として使用され得る。
【０１７１】
本方法によって産生される脂質は、潤滑剤（潤滑油）のためのベースオイルとして、または潤滑剤のためのベースオイルの製造のための出発材料として使用され得る。
【０１７２】
用語「脂質（lipid）」とは、脂肪性物質であって、その分子が一般的に、その一部として、脂肪族炭化水素鎖を含み、非極性有機溶媒に溶解するが水には溶解しにくい物質を意味する。脂質は生体細胞における巨大分子の不可欠な一群である。脂質としては例えば、脂肪、オイル、ワックス、ろうエステル、ステロール、テルペノイド、イソプレノイド、カロテノイド、ポリヒドロキシアルカノエート、核酸、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪酸エステル、リン脂質、糖脂質、スフィンゴ脂質およびアシルグリセロールが挙げられる。
【０１７３】
用語「アシルグリセロール」とは、グリセロールおよび脂肪酸のエステルを意味する。アシルグリセロールは天然に脂肪および脂肪油として存在する。アシルグリセロールの例としては例えば、トリアシルグリセロール（ＴＡＧｓ、トリグリセリド）、ジアシルグリセロール（ジグリセリド）およびモノアシルグリセロール（モノグリセリド）が挙げられる。
【０１７４】
オイルの回収
脂質を含む微生物は、例えばろ過または傾斜法などを用いることによってなど、任意の公知の方法によって、培養培地から分離され得る。代わりに、大容積容量の産業規模の工業用遠心分離器を用いた遠心分離が、所望の製品を分離するために使用されてもよい。
【０１７５】
本発明の様々な実施態様において、オイル、またはオイルのための前駆物質は、細胞バイオマスまたは培養物ブロースから、当該技術において公知のまたは将来において開発される、任意の方法を用いて回収され得る。このような方法としては有機溶媒を用いた抽出などが挙げられるがこれに限定されるわけではない。本発明の様々な実施態様において、微生物細胞は、オイルおよび他の成分の分離を促進するために破砕されてもよい。例えば超音波処理、浸透圧ショック、機械的せん断力、コールドプレス、熱衝撃、酵素触媒のまたは自立の自己消化などの、細胞破砕のための公知の任意の方法が使用され得る。
【０１７６】
オイルが抽出された細胞残渣は、例えば燃焼される、もしくは嫌気性分解方法で処理されるなど、エネルギー産生に使用されるか、または、動物飼料として利用され得る。オイルが抽出された細胞残渣または細胞残渣の画分はまた、栄養源として使用されるべくバイオプロセスへとリサイクルされてもよい。
【０１７７】
アルコール（エタノール、ブタノール、ＡＢＥ）の回収
発酵ブロースからのエタノールの回収は、任意の方法によって行うことができる。従来では蒸留が用いられる。アルコール製品分離技術として蒸留が使用される場合、例えばアルコール製品のための蒸留工程およびオイル抽出溶媒の再生を含む脂質製品のためのオイル抽出工程などの製品回収ユニット工程をエネルギー的に一緒に組み合わせることによって、コスト削減をすることが可能である。回収工程は、統合された工程、例えば富化または加水分解産物の濃縮または他の目的などにおける別のユニット工程で利用され得るプロセス熱を再生し得る。
【０１７８】
本発明の一実施態様において、嫌気性のアルコール産生工程からのアルコールが、場合によっては他の溶媒とともに、微生物細胞からの脂質抽出における抽出溶媒として使用される。本発明の一具体的な実施態様において、嫌気性の発酵工程からのエタノールが、例えばヘキサンなどの非極性溶媒とともに、好気性の脂質産生工程において形成されるオイルに富んだ細胞から脂質を抽出するために使用される。
【０１７９】
アルコールの回収において、大部分の酵素の活性を破壊する蒸留に代わって、蒸留のあいだの高真空、例えば浸透気化法または膜技術などの他の方法が使用され得る。カスケード法発酵の最終的段階のあいだの、または回分発酵の後の、活性酵素およびバイオマスを含む発酵ブロースからのアルコール回収は、これらの方法を用いて実行され得る。これは、例えばリグノセルロース系バイオマスの加水分解のためのバイオプロセスへと酵素をリサイクルするなどの再利用のためにそれらを回収、富化するために、使用済み培養培地中のまたは糖オリゴマーに結合している酵素の酵素活性を維持することを可能にする。膜技術と用いることにより、回収、富化および再使用のために、酵素などの分子の分子サイズを制御することが可能となる。酵素の回収および再使用は、バイオ燃料の製造のための全統合されたシステムにおける効率および生成物収率を向上させることができる。
【０１８０】
例えばプロセス水の触媒的改質などの改質工程などの修飾工程、および、分離されるバイオマスのためのアンモニウムまたは弱酸加水分解工程（収率の増加、発酵の促進）が、蒸留などの上昇された温度を使用する工程段階へ追加されてもよい。
【０１８１】
ブタノールまたはＡＢＥの分離
発酵ブロースからのブタノールおよび／またはアセトン−ブタノール−エタノールの混合物の回収は、任意の公知の方法または将来において開発される任意の方法で行われ得る。従来では、ブタノールはＡＢＥ発酵からの発酵ブロースから蒸留によって回収されるが、これは、大量のエネルギーを消費する。代替の方法としては、発酵ブロースの凍結結晶化、ガスストリッピング、浸透気化法、膜抽出、逆浸透、吸着または液液抽出などが挙げられるがこれらに限られるわけではない。
【０１８２】
アルコール発酵工程からの生成物回収において、非阻害性生成物濃度および高い生産性および高い細胞密度を維持することのできる技術が適用され得る。例えばアルコール回収は、発酵のあいだ、または発酵中へのリサイクル流から、または他の任意の方法によって実行され得る。
【０１８３】
本発明によれば、培養物ブロース中の加水分解酵素の活性を破壊しない、そしてしたがって酵素の再使用を可能にするような生成物回収方法が望ましい。
【０１８４】
要約すると、本発明の様々な実施態様が、１〜２９の番号を付された以下の項を用いて以下に開示される。
【０１８５】
項
１．−バイオ燃料および／またはバイオ燃料のための出発材料を産生し、そして、酵素を産生することのできる微生物を使用する第一のバイオ技術的工程、および
−バイオ燃料および／またはバイオ燃料のための出発材料を産生する第二のバイオ技術的工程
を含む統合された方法であって、
−前記微生物を培養し、そして、バイオ燃料および／またはバイオ燃料のための出発材料および酵素、またはバイオ燃料またはバイオ燃料のための出発材料を産生する工程、
−任意には、上澄みおよび微生物細胞を微生物培養物から分離する工程、
−バイオ燃料またはバイオ燃料のための出発材料を、微生物培養物または微生物細胞から分離する工程、
−微生物培養物、上澄みまたは上澄みのタンパク質が富化された画分または触媒的に活性な酵素を含む上澄みの希釈物を、第一のおよび／または第二のバイオ技術的工程へと導入するか、または、工程のためのフィードストックを処理する工程
を含む統合された方法。
【０１８６】
２．前記第一の工程の生成物がアルコールまたは脂質、好ましくは脂質を含む項１記載の方法。
【０１８７】
３．前記第二の工程の生成物がアルコールまたは脂質、好ましくはアルコールを含む項１または２記載の方法。
【０１８８】
４．前記工程の生成物が、上澄み中の酵素、好ましくは加水分解酵素の触媒的活性を保持する方法を用いて回収される項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【０１８９】
５．前記アルコールが、エタノール、ブタノール、イソプロパノール−ブタノール−エタノールおよび／またはアセトン−ブタノール−エタノールを含む項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【０１９０】
６．脂質産生工程へ供給される有機材料が、糖画分の少なくとも１０％のポリマー糖を好ましくは含む、少なくとも５０％のリグノセルロースまたはリグノセルロースの画分を含む項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【０１９１】
７．リグノセルロース系バイオマスまたはその画分が、例えばわら、バガスまたは茎などの農業残渣、例えばスイッチグラス、ススキ、ヤナギ、ホテイアオイまたはリードカナリーグラスなどの専用のエネルギー作物、微細藻類または大型藻類、木材または林業残渣、パルプおよび製紙工業画分または残渣、リグノセルロースを含む紙くずまたは都市廃棄物を含む項６記載の方法。
【０１９２】
８．脂質産生工程へ供給される有機材料の少なくとも一部がでんぷんを含む項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【０１９３】
９．第一の工程における微生物がヘミセルロース、またはセルロース、それらの両方、またはヘミセルロースおよびセルロースの混合物もしくはその画分を使用する項１〜８のいずれか１項に記載の統合された方法。
【０１９４】
１０．第二の工程における微生物がヘミセルロース、またはセルロース、それらの両方、またはヘミセルロースおよびセルロースの混合物もしくはその画分を使用する項１〜９のいずれか１項に記載の統合された方法。
【０１９５】
１１．脂質および酵素の両方を産生することが可能である微生物が、真菌、酵母またはバクテリアであり、好ましくは、アスペルギルス、フミコーラ、クモノスカビおよびトリコデルマの群より選択される属に属しているか、または、クリプトコッカス属に属する酵母、またはストレプトマイセスに属するバクテリアである項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【０１９６】
１２．エタノール産生微生物が、酵母またはバクテリア、好ましくはサッカロマイセス、ピキアおよびカンジダの群より選択される属に属する酵母、、または、好ましくはザイモモナス、クロストリジア、エシェリキアおよびサーモアネロバクターのの群より選択される属に属するバクテリアである項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【０１９７】
１３．アセトン−ブタノール−エタノールまたはイソプロパノール−ブタノール−エタノール産生生物がクロストリジウム属に属している項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【０１９８】
１４．酵素が細胞外酵素、好ましくはヘミセルロースおよび／またはセルロース加水分解と関連する酵素である項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【０１９９】
１５．酵素が、ヘミセルラーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、アラビナーゼ、ガラクトシダーゼ、グルコシダーゼ、マンノシダーゼ、キシロシダーゼ、アラビノフラノシダーゼ、エステラーゼ、セルラーゼ、エンド−セルラーゼ、エキソ−セルラーゼ、セロビアーゼまたはベータ−グルコシダーゼ、酸化セルラーゼ、またはセルロースホスホリラーゼまたはそれらの任意の混合物を含む項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【０２００】
１６．統合された工程外で得られる特定の酵素の必要性が、少なくとも５％、好ましくは少なくとも３０％、統合された工程において産生される酵素によって減少される項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【０２０１】
１７．前記酵素の一部分が統合された工程の外で使用される項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【０２０２】
１８．第一のバイオ技術工程における微生物がヘミセルラーゼおよび／またはセルラーゼの両方を産生することができる項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【０２０３】
１９．第一のバイオ技術工程からのバイオマスまたはその一部が第二のバイオ技術工程へリサイクルされる項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【０２０４】
２０．第一のバイオ技術工程からのバイオマスまたはその一部、上澄みおよび／または酵素またはその一部またはそれらの一部が第一のバイオ技術工程へリサイクルされる項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【０２０５】
２１．第二のバイオ技術工程からのバイオマス、上澄みおよび／または酵素またはその一部またはそれらの一部が第一のバイオ技術工程へリサイクルされる項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【０２０６】
２２．バイオ燃料の分離の後の第二のバイオ技術工程からのプロセス水またはその一部が、第一のバイオ技術工程および／または第二のバイオ技術工程の原材料の希釈水へ、好ましくは第一のバイオ技術工程へ、リサイクルされる項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【０２０７】
２３．項１〜２２のいずれか１項に記載の方法により製造される脂質の、バイオ燃料としての、バイオ燃料の成分としての、またはバイオ燃料製造のための出発材料としての使用。
【０２０８】
２４．バイオ燃料がバイオディーゼル、または、再生可能なディーセル、ガソリンおよび／またはジェット燃料である項２３記載の使用。
【０２０９】
２５．項１〜２２のいずれか１項に記載の方法により製造されるアルコールの、バイオ燃料としての、バイオ燃料の成分としての、またはバイオ燃料製造のための出発材料としての使用。
【０２１０】
２６．項１〜２２のいずれか１項に記載の方法により得られる酵素調製物。
【０２１１】
２７．項１〜２２のいずれか１項に記載の方法により製造される酵素または項２６に記載の酵素調製物の、バイオ燃料製造工程における、好ましくはアルコール産生工程における、または他の適用における、酵素調製物としてのまたは酵素源としての使用。
【０２１２】
２８．脂質産生およびアルコール産生のための統合された工程システムであって、工程がリグノセルロース系材料またはその画分を脂質およびアルコール産生のための原材料として使用することを含み、それらのどちらかまたは両方がアルコール産生工程への酵素を産生するシステム。
【０２１３】
２９．脂質産生およびアルコール産生のための統合された工程システムであって、工程がリグノセルロース系材料またはその画分を脂質およびアルコール産生のための原材料として使用することを含み、そして脂質産生工程がアルコール産生工程への、好ましくはエタノール産生工程への酵素を産生するシステム。
【０２１４】
本発明を説明することが以下の実施例の目的であって、本発明を限定するものとは決して解釈されるべきではない。
【実施例】
【０２１５】
脂肪産生糸状菌の培養からの使用済み培養物ブロースにおける酵素活性が、基質として純粋なセルロースおよびキシランを用いた加水分解試験によって測定された。
【０２１６】
方法
糖の規定：
溶液の糖濃度を規定するために、溶液は、適切な希釈液とされ、ＨＰＬＣ分析に先立ち、０．２μｍを通してろ過された。
【０２１７】
糖の規定のために使用されたカラムは、鉛型のＳｈｏｄｅｘ  Ｓｕｇａｒ  ＳＰ０８１０  イオン交換体（固定相）であった。カラム寸法は、８．０ｍｍ（ＩＤ）×３００ｍｍであった。溶出液は水（流量０．６ｍＬ／分）であり、カラム温度は６０℃であった。検出器はＲＩ  Ｓｈｉｍａｔｚｕ  ＲＩＤ  １０Ａであり、ポンプはＡ６、およびオートサンプラーはＳｈｉｍａｔｚｕ  ＳＩＬ  ２０Ａであった。結果の処理はＣｌａｓｓ−ＶＰソフトウェアを用いて行われた。
【０２１８】
脂肪酸分析：
サンプルの脂肪酸成分がＳｕｕｔａｒｉら（１９９０）によって記載される方法で測定された。サンプル中の脂質は、初めに遊離脂肪酸へと加水分解され、そのナトリウム塩へとケン化され、そしてその後、メチルエステルへとメチル化された。脂肪酸メチルエステルはガスクロマトグラフィーを用いて分析された。
【０２１９】
タンパク質濃度分析：
培養物ブロースのタンパク質濃度が、Ｗｈａｔｍａｎ３ろ紙を通してブロースをろ過した後に分析された。タンパク質濃度は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ（ブラッドフォード法に基づく）によって分析された。
【０２２０】
加水分解試験：
培養物ブロースは、加水分解試験前にＷｈａｔｍａｎ３ろ紙を通してろ過された。
【０２２１】
キシラーゼ活性は、以下のように測定された。１００ｍＬのエルレンマイヤーフラスコが反応容器として使用された。それを基質としての２０ｍＬの１％カバ材キシラン（Ｓｉｇｍａ）のリン酸緩衝溶液（０．０２Ｍ、ｐＨ５）、１０ｍＬのろ過した培養物ブロースおよび２０ｍＬのリン酸緩衝液（０．０２Ｍ、ｐＨ５）で満たした。加水分解反応が、５０℃の攪拌（１４０ｒｐｍ）水浴中で行われた。１ｍＬのサンプルが培養物ブロースの添加のすぐ後、１、３、５、２１／２３時間後に反応容器から採取された。加水分解反応は、１ｍＬのサンプルにおいて、１．３３Ｍの硫酸５０μＬの添加によってｐＨを低下させることにより停止された。遊離された糖が、マンニトールを基準としてＨＰＬＣによって（糖の規定を参照のこと）分析された。
【０２２２】
セルラーゼ活性は、キシランの代わりにセルロース基質として１ｇのＷｈａｔｍａｎろ紙を用いて測定された。反応容積は、基質として同じサイズの円である（直径約５ｍｍ）１ｇのＷｈａｔｍａｎろ紙、１０ｍＬのろ過された培養物ブロースおよび４０ｍＬのリン酸緩衝液（０．０２Ｍ、ｐＨ５）を含む５０ｍＬであった。実験はまたキシランを用いても行われた。
【０２２３】
微生物株：
脂質産生微生物は、通常、例えばＡＴＣＣ、ＤＳＭなどの複数の公認の微生物培養物保存機関によって一般に公開されている。本発明の様々な実施態様が、以下の実施例において、以下の微生物株を使用することにより議論される。アスペルギルス  オリザエ（Aspergillus oryzae）  ＤＳＭ  １８６１、アスペルギルス  オリザエ（Aspergillus oryzae）  ＤＳＭ  １８６４、アスペルギルス  テレウス（Aspergillus terreus）  ＤＳＭ  １９５８。
【０２２４】
実施例１
本実施例は、脂質産生のための炭素源としてのセルロースベース材料を用いたアスペルギルス  オリザエの培養のあいだに培養物ブロース中に形成される酵素活性を示している。
【０２２５】
アスペルギルス  オリザエは、種々のセルロースをベースとするリグノセルロース系材料上で、脂質産生のため培養された。増殖培地のベースは、水１リットル当たり４０ｇの炭素源としてのリグノセルロース系材料、０．５ｇの酵母エキス、１ｇのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．５ｇのＫ2ＨＰＯ4、１ｇのＫＨ2ＰＯ4および０．２ｇのＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏを含み、そして、窒素源および微量金属で補充された。
【０２２６】
実施例１〜４は、フラスコ培養で行われた。実施例１〜３において、培地ベースは、１リットル当たり３ｇのＮａＮＯ3および０．０２ｇのＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏで補充され、そして、実施例４では培地ベースは、１リットル当たり１ｇの（ＮＨ4）2ＳＯ4で補充された。５０〜１００ｍＬの培養培地を含む２５０ｍＬエルレンマイヤーフラスコ中での培養が同時に行われた。培養培地は、１％（ｗ／ｗ）のアスペルギルス  オリザエの胞子を含む懸濁液で播種された。培養物は６日間オービタルシェーカー（１６０ｒｐｍ）中、２８℃の温度でインキュベートされた。
【０２２７】
実施例５〜６は、バイオリアクター発酵として行われた。
【０２２８】
実施例５において、培養培地ベースは、増殖培地ベース１リットル当たり、６．５ｇのペプトン、０．０００１５ｇのＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．０００１ｇのＣｕＣｌ・２Ｈ2Ｏおよび０．００６２５ｇのＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏで補充された。炭素源はセルロースであり、培養液に最終濃度が５５ｇ／Ｌとなるように添加された。播種のために、胞子を形成しているＡ．オリザエの２つのＰＤＡペトリプレート上に計２４ｍＬの滅菌水を適用することによって胞子懸濁液が調製された。胞子はスプレッダを用いて懸濁され、１Ｌの培養培地が懸濁液を用いて播種された。発酵は、０．６Ｌ／分のエアレーションおよび３５０〜４５０ｒｐｍの攪拌下で２８℃の温度で行われた。培養液のｐＨは５．７であり、培養のあいだ、３Ｍ  ＮａＯＨを用いて調整された。酵素活性が２３３時間のインキュベーション後に測定された。
【０２２９】
実施例６において、増殖培地ベースは、１リットル当たり、１．４６ｇのペプトン、０．０００１５ｇのＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．０００１ｇのＣｕＣｌ・２Ｈ2Ｏおよび０．００６２５ｇのＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏで補充された。炭素源はセルロースであり、最終濃度が５０ｇ／Ｌとなるように培養液に添加された。培養培地は、４８時間前培養されたアスペルギルス  オリザエ懸濁液５０ｍＬを用いて播種された。発酵は、０．８Ｌ／分のエアレーションおよび３５０〜４５０ｒｐｍの攪拌下で２８℃の温度で、１Ｌの培養培地容積で行われた。培養液のｐＨは５．７であり、培養のあいだ、３Ｍ  ＮａＯＨを用いて調整された。酵素活性が１８８時間のインキュベーション後に測定された。
【０２３０】
培養物ブロースが分離され、タンパク質濃度ならびにキシラーゼおよびセルラーゼ活性が、上述されるようにアッセイされた。
【０２３１】
【表１】
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1  Ｌｏｔｕｓ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ製のティッシュ（hand tissue）  スタンダード、繊維原料：リサイクル繊維、Ｇｅｏｒｇｉａ−Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｎｏｒｄｉｃ社
2  ＵＰＭ、Ｗｉｓａｂｅｔｕｌａ、カバ材さらし硫酸塩（Birch Bleached Harwood Sulphate）  ７９０２８８  １５−０４−２００８  Ｗｉｓａｐｕｌｐ。ヘミセルロース約１５％。
3  限外ろ過（攪拌式セル（stirred ultrafiltration cell）Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  ８２００（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製）中の１００００Ｄａフィルター）により３倍濃縮されたブロース
【０２３２】
実施例６において、脂質含有量は４％であると測定された。
【０２３３】
１ミリリットルの培養物ブロース当たりのミリグラム単位の、および１ミリグラムのタンパク質当たりのミリグラム単位としての加水分解試験のあいだに遊離された糖が、時間の関数として図７〜１０に示されている。図７は、加水分解試験中に遊離された、培養物ブロースの容積当たりのキシロースを示している。基質としては、２００ｍｇのカバ材キシランが使用された。図８は、加水分解試験中に遊離された、タンパク質当たりのキシロースを示している。基質としては、２００ｍｇのカバ材キシランが使用された。図９は、加水分解試験中に遊離された、培養物ブロースの容積当たりのグルコースを示している。基質としては、１ｇのセルロースが使用された。図１０は、加水分解試験中に遊離された、タンパク質当たりのグルコースを示している。基質としては、１ｇのセルロースが使用された。
【０２３４】
全ての６つの試験された培養からの培養物ブロースは、顕著なキシラナーゼ活性を示した。６つの培養物ブロースのうち３つだけがセルラーゼ活性を示しており、特定の条件においてこれらの酵素を産生する弱い能力を示している。
【０２３５】
本実施例は、アスペルギルス  オリザエがリグノセルロース分解性の酵素を培養物ブロース中に産生できることを示している。本実施例は、Ａ．オリザエがキシランおよびセルロース両方の分解活性を有し得ることを示す。
【０２３６】
酵素産生は、ほとんどの場合、選択的にキシラン分解性であり、３つの培養物は低いセルラーゼ活性しか示さなかった。Ａ．オリザエによって産生された加水分解酵素の、脂質産生における再使用は、リグノセルロースまたはその画分の加水分解において必要とされる市販の酵素の量を減少させることができる。
【０２３７】
実施例２
本実施例は、脂質産生のための炭素源としてのヘミセルロースベース材料を用いたアスペルギルス  テレウスの培養のあいだに培養物ブロース中に形成される酵素活性を示している。
【０２３８】
アスペルギルス  テレウスは、バイオリアクター中２リットルの容積で、炭素基質として麦わらヘミセルロース上で、脂質産生のため培養された。培養培地は、５０ｍＬの酵母ニトロゲンベース、アミノ酸・硫酸アンモニウム不含（Ｄｉｆｃｏ）の１０倍ストック溶液を２Ｌの水に懸濁したものからなり、１リットル当たり、１．０ｇの酵母エキス、１ｇの（ＮＨ4）2ＳＯ4、１ｇのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．５ｇのＫ2ＨＰＯ4、１ｇのＫＨ2ＰＯ4、０．２ｇのＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏおよび２ｇのセルロースで補充された。培養培地は、２４時間前培養されたＡ．テレウス培養物１５０ｍＬを用いて播種された。発酵は、３．０Ｌ／分のエアレーションおよび２００〜４３０ｒｐｍの攪拌下で３５℃の温度で行われた。培養液のｐＨは５．７であり、培養のあいだ、３Ｍ  ＮａＯＨを用いて調整された。培養のあいだ、ヘミセルロース溶液が発酵槽へと供給された。酵素活性が１６５時間のインキュベーション後に測定された。
【０２３９】
培養物ブロースが分離され、そして、１００００Ｄａフィルターを有するアミコン攪拌式セル（Millipore）中で限外ろ過により部分的に濃縮された。タンパク質濃度ならびに脂質濃度ならびにキシラーゼおよびセルラーゼ活性が、上述されるようにアッセイされた。
【０２４０】
真菌の菌糸体、残余のヘミセルロースおよびセルロースを含むバイオマス中の脂質含有量は、乾燥重量当たり１５％であった。タンパク質濃度は、非濃縮の培養ブロース中で０．７２ｍｇ／ｍＬであり、濃縮されたブロース中で２．１５ｍｇ／ｍＬであった。
【０２４１】
１ミリリットルの培養物ブロース当たりのミリグラム単位の、および１ミリグラムのタンパク質当たりのミリグラム単位としての加水分解試験のあいだに遊離された糖が、時間の関数として図１１〜１４に示されている。図１１は、加水分解試験中に遊離された、培養物ブロースの容積当たりのキシロースを示している。基質としては、２００ｍｇのカバ材キシランが使用された。図１２は、加水分解試験中に遊離された、タンパク質当たりのキシロースを示している。基質としては、２００ｍｇのカバ材キシランが使用された。図１３は、加水分解試験中に遊離された、培養物ブロースの容積当たりのグルコースを示している。基質としては、１ｇのセルロースが使用された。使用された培養ブロース由来のヘミセルロースから、多少のキシロースが遊離された。図１４は、加水分解試験中に遊離された、タンパク質当たりのグルコースを示している。基質としては、１ｇのセルロースが使用された。使用された培養物ブロース由来のヘミセルロースから、多少のキシロースが遊離された。
【０２４２】
本実施例は、アスペルギルス  テレウスが、細胞内に脂質および培養ブロース中に加水分解性の酵素とを両方産生できることを示している。本実施例は、Ａ．テレウスが、キシランおよびセルロース両方の分解活性を有する酵素を産生し、そしてそれらを増殖培地中に分泌することを示す。この酵素は、分離され、濃縮され、そして、例えばポリマーセルロースおよび／またはヘミセルロースの両方を含む材料などのリグノセルロース系材料の加水分解に使用され得る。Ａ．テレウスによって産生された加水分解酵素の、脂質産生における再使用は、リグノセルロースまたはその画分の加水分解において必要とされる市販の酵素の量を減少させることができる。
【０２４３】
実施例３
本実施例は、エタノール産生と脂質産生との統合を示している。エタノールは、カビによる脂質産生から得られる使用済み培地中の酵素によって加水分解されるセルロースから産生される。
【０２４４】
実施例３において、アスペルギルス  テレウスのセルロースで補充された麦わらヘミセルロース上での培養および脂質産生からの使用済み培養培地が、リグノセルロース材料の加水分解が可能である酵素、キシラナーゼおよびセルラーゼを含むことが示された。
【０２４５】
本培養において、使用済み培地はセルロースを加水分解するために使用される。純粋なセルロースまたは麦わらセルロースが、１００００Ｄａフィルターを有するアミコン攪拌式セル（Millipore）中で限外ろ過により処理された、アスペルギルス  テレウスのセルロースで補充された麦わらヘミセルロース上での培養および脂質産生からの使用済み培地へ添加される。溶液は、セルロースの糖化のために１６〜２００時間３０〜７０℃でインキュベートされる。糖化の後、栄養素（ＮＨ4）2ＨＳＯ4（０．５ｇ／Ｌ）、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ（０．０２５ｇ／Ｌ）および酵母エキス（１．０ｇ／Ｌ）が溶液に添加され、そして、溶液はサッカロマイセス  セレビシエ酵母で播種される。Ｓ．セレビシエは、ｐＨを５．０から６．５のあいだに維持しながら嫌気的に３６℃で４８〜１２０時間培養される。培養（発酵）後、細胞が培養培地から０．２μｍまたは０．４５μｍフィルターを通してろ過することによって、および／または５分間５０００×ｇで遠心分離することによって除去される。培養培地からのエタノール濃度はガスクロマトグラフィーまたは例えばＨＰＬＣなどの液体クロマトグラフィーによって測定され得る。
【０２４６】
実施例４
本実施例は、アセトン−エタノール−ブタノール（ＡＢＥ）産生と脂質産生工程の統合を示している。ＡＢＥは、カビによる脂質産生から得られる使用済み培地中の酵素によって加水分解される麦わらヘミロースおよび／またはセルロースから産生される。
【０２４７】
麦わらからのヘミセルロースおよび／または画分は、２つの画分に分けられる。１つの画分は、実施例３で記載されるように、Ａ．テレウスカビにより脂質を産生するために使用される。他の画分はクロストリジウム  アセトブチリカムムバクテリアによりＡＢＥを産生するために使用される。
【０２４８】
実施例３において、アスペルギルス  テレウスのセルロースで補充された麦わらヘミセルロース上での培養および脂質産生からの使用済み培養培地が、リグノセルロース系材料の加水分解が可能である酵素、キシラナーゼおよびセルラーゼを含むことが示された。
【０２４９】
本培養において、使用済み培地は小麦ヘミセルロースを加水分解するために使用される。麦わらヘミセルロースが、１００００Ｄａフィルターを有するアミコン攪拌式セル（Millipore）中で限外ろ過により処理された、アスペルギルス  テレウスのセルロースで補充された麦わらヘミセルロース上での培養および脂質産生からの使用済み培地へ添加される。溶液は、ヘミセルロースの糖化のために１６〜２００時間３０〜７０℃でインキュベートされる。糖化の後、酵母エキス（１．０ｇ／Ｌ）が溶液に添加され、そして、溶液は１５分間１２１℃で滅菌される。滅菌および室温まで冷却した後、無機物、緩衝液およびビタミンが、例えばＢａｅｒら（１９８７）によって開示されるＰ２培地に準じた培地へと添加される。培地は嫌気性ボトルまたはジャー中に入れられ、そして、クロストリジウム  アセトブチリカムバクテリアで播種される。培養物は、ｐＨを５．０から５．５のあいだに維持しながら３５℃で３４〜９０時間インキュベートされる。培養（発酵）後、細胞が培養培地から０．２μｍまたは０．４５μｍフィルターを通してろ過することによって、および／または５分間５０００×ｇで遠心分離することによって除去される。培養培地からのアセトン、ブタノールおよびエタノール濃度はガスクロマトグラフィーまたは例えばＨＰＬＣなどの液体クロマトグラフィーによって測定され得る。
【０２５０】
実施例５
本実施例は、脂質産生のための炭素源としてのヘミセルロースベース材料を用いたアスペルギルス  オリザエの培養のあいだに培養物ブロース中に形成される酵素活性を示している。
【０２５１】
アスペルギルス  オリザエは、バイオリアクター中２リットルの容積で、炭素基質として麦わらヘミセルロース上で、脂質産生のため培養された。培養培地は、５０ｍＬの酵母ニトロゲンベース、アミノ酸・硫酸アンモニウム不含（Ｄｉｆｃｏ）の１０倍ストック溶液を２Ｌの水に懸濁したものからなり、１リットル当たり、１．０ｇの酵母エキス、１ｇの（ＮＨ4）2ＳＯ4、１ｇのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．５ｇのＫ2ＨＰＯ4、１ｇのＫＨ2ＰＯ4および０．２ｇのＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏで補充された。
【０２５２】
培養培地は、７２時間前培養されたＡ．オリザエ培養物２００ｍＬを用いて播種された。発酵は、３．０Ｌ／分のエアレーションおよび２００〜４１０ｒｐｍの攪拌下で３０℃の温度で、２Ｌの培養培地容積中で行われた。培養液のｐＨは５．７であり、培養のあいだ、３Ｍ  ＮａＯＨを用いて調整された。培養のあいだ、ヘミセルロース溶液が発酵槽へと供給された。酵素活性が１４４時間のインキュベーション後に測定された。
【０２５３】
培養物ブロースが分離され、そして、タンパク質濃度ならびにキシラーゼおよびセルラーゼ活性が、上述されるようにアッセイされた。真菌の菌糸体および残余のヘミセルロースを含むバイオマス中の脂質含有量は、乾燥重量当たり２１％であった。タンパク質濃度は、非濃縮の培養ブロース中で０．６１ｍｇ／ｍＬであり、濃縮されたブロース中で１．６５ｍｇ／ｍＬであった。
【０２５４】
１ミリリットルの培養物ブロース当たりのミリグラム単位の、および１ミリグラムのタンパク質当たりのミリグラム単位としての加水分解試験のあいだに遊離された糖が、時間の関数として図１２〜１５に示されている。図１２は、加水分解試験中に遊離された、培養物ブロースの容積当たりのキシロースを示している。基質としては、２００ｍｇのカバ材キシランが使用された。図１３は、加水分解試験中に遊離された、タンパク質当たりのキシロースを示している。基質としては、２００ｍｇのカバ材キシランが使用された。図１４は、加水分解試験中に遊離された、培養物ブロースの容積当たりのグルコースを示している。基質としては、１ｇのセルロースが使用された。使用された培養物ブロース由来のヘミセルロースから、多少のキシロースが遊離された。図１５は、加水分解試験中に遊離された、タンパク質当たりのグルコースを示している。基質としては、１ｇのセルロースが使用された。使用された培養物ブロース由来のヘミセルロースから、多少のキシロースが遊離された。
【０２５５】
本実施例は、アスペルギルス  オリザエが、脂質、および、副生成物として、リグノセルロース材料の加水分解に再使用され得る、加水分解活性を有する培養物ブロースを産生し得ることを示している。
【０２５６】
参考文献
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Lin H, Chang W, Ding H-T, Chen X-J, Zhou Q-F, Zhao Y-Hu. 2010. Direct micro-bial conversion of wheat straw into lipid by a cellulolytic fungus of Aspergillus oryzae A-4 in solid-state fermentation. Bioresource Technology 101:7556-7562.
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Suutari M, Liukkonen K, Laakso S. 1990. Temperature adaptation in yeasts: the role of fatty acids. Journal of General Microbiology 136: 1469-1474.
【図１】
0005936205.tif 000003
【図２】
0005936205.tif 000004
【図３】
0005936205.tif 000005
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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