(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
テクスチャを改変する乳酸菌株を得るための方法であって、前記方法が
ａ）乳酸菌母株を提供する工程；
ｂ）Ｄ−シクロセリン及び／又は機能的に同等な抗生物質に対する耐性を有する前記母株の突然変異体を単離する工程であって、ここで前記機能的に同等な抗生物質は、Ｄ−アラニンラセマーゼの阻害剤である、工程；及び
ｃ）乳中で増殖させた場合に、母株と比較して、より高い剪断応力及び／又はより高いゲル剛性により決定される、より高いテクスチャを生産する場合に前記突然変異体を選択する工程
を含む、方法。
【請求項２】
前記突然変異体が、母株により生産される剪断応力よりも少なくとも５％高い剪断応力を生産する場合に、ｃ）において選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記突然変異体が、母株により生産されるゲル剛性よりも少なくとも５％高いゲル剛性を生産する場合に、ｃ）において選択される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
工程ｂ）が、Ｄ−シクロセリン及び／又は前記の機能的に同等な抗生物質を含有する成長培地中／上で前記乳酸菌母株をインキュベートし、そしてＤ−シクロセリン及び／又は機能的に同等な抗生物質により死滅しない前記母株の突然変異体を単離することを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記突然変異体が、自然突然変異体である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
工程ｂ）の前又は間に、前記母株を変異誘発させることをさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記乳酸菌母株が、ラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリクス（Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus）及びストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）からなる群から選択される株である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ＤＳＭ  ２４０１９の受託番号でドイツ微生物細胞培養コレクション（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen）に寄託されたＣＨＣＣ１２９４４株、及び、ＤＳＭ  ２４０２０の受託番号でドイツ微生物細胞培養コレクションに寄託されたＣＨＣＣ１２９４５株からなる群から選択される、ラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリクス種に属する乳酸菌株。
【請求項９】
ＤＳＭ  ２４０１０の受託番号でドイツ微生物細胞培養コレクション（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen）に寄託されたＣＨＣＣ１３２３５株、及び、ＤＳＭ  ２４０１１の受託番号でドイツ微生物細胞培養コレクションに寄託されたＣＨＣＣ１３２３６株からなる群から選択される、ストレプトコッカス・サーモフィルス種に属する乳酸菌株。
【請求項１０】
請求項８又は９に記載の乳酸菌株を含む組成物。
【請求項１１】
混合物又はキットの部分のいずれかとして、
ｉ）請求項９に記載のストレプトコッカス・サーモフィルス種に属する株、及び
ｉｉ）請求項８に記載のラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリクス種に属する株
を含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
スターター培養物として用いることができ、凍結形態、凍結乾燥形態、又は液体形態である、請求項１０又は１１に記載の組成物。
【請求項１３】
請求項８又は９に記載の乳酸菌株、あるいは請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の組成物を用いて乳基質を発酵させることを含む、乳製品を生産する方法。
【請求項１４】
請求項８又は９に記載の乳酸菌株を含む乳製品。
【請求項１５】
乳製品の製造のための、請求項８又は９に記載の乳酸菌株の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、乳酸菌、例えばラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリクス（Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus）及びストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）の突然変異体であって、抗生物質Ｄ−シクロセリン及び／又は機能的に同等な抗生物質に対する耐性を有し、親株の他の増殖特性を維持しつつ、乳中で増殖させた場合に増加したテクスチャを与えることが発見されている突然変異体に関する。本発明はさらに、培養物、例えばかかる突然変異体を含むスターター培養物、及び前記培養物で発酵させた乳製品に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
食品産業は、食品の風味及びテクスチャを改良するためだけでなく、これらの食品の保管寿命を延長するために多数の細菌、特に乳酸菌を使用する。乳業の場合では、乳酸菌は、（発酵による）乳の酸性化をもたらすためだけでなく、これらが組み込まれる製品のテクスチャを改変するために、集中的に用いられる。
【０００３】
食品産業に用いられる乳酸菌の中でも、ストレプトコッカス（Streptococcus）属、ラクトコッカス（Lactococcus）属、ラクトバチルス属（Lactobacillus）、リューコノストック（Leuconostoc）属、ペディオコッカス（Pediococcus）属、及びビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属を挙げることができる。ストレプトコッカス・サーモフィルス種の乳酸菌は、食品、特に発酵食品の製造に単独で、又は他の細菌、例えばラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリクスと組み合わせて広く用いられる。これらは、特に発酵乳、例えばヨーグルトの製造のために用いられる発酵の処方に用いられる。これらのうちのいくつかは、発酵食品のテクスチャの開発において重要な役割を果たす。この特性は、多糖の産生に密接に関連している。
【０００４】
ヨーグルトにおける最近の傾向は、マイルドな風味と高いテクスチャである。今日、これはマイルドな風味を生み出す培養物の使用、及び所望のとろみ（thickness）を与える増粘剤又はタンパク質の添加により達成される。ヨーグルトの製造者は、増粘剤を添加することなくこれらの特性を有するヨーグルトを作りたいと考える。これは、彼らがコストを減少し、そしてよりクリーンな表示（cleaner label）を与えるのに寄与する。これを達成するための大変魅力的な一つの方法は、高いレベルのテクスチャを生み出すスターター培養物を有することである。
【０００５】
前記産業の要求を満たすため、食品のテクスチャを改変するための、新規のテクスチャを改変する乳酸菌株、特にラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリクス及びストレプトコッカス・サーモフィルスを提供することが必要となる。特に、ストレプトコッカス・サーモフィルスの新規のテクスチャを改変する株と一緒に用いることができるラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリクスの新規のテクスチャを改変する株が必要とされている。
【０００６】
Ｄ−シクロセリンに対する耐性を有する突然変異体は、多数の様々な細菌について記載されているが、これらの突然変異体を乳製品のテクスチャを増加させるために用いることができることは報告されていない。ストレプトコッカス・サーモフィルス又はラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリクス突然変異体は、記載されていない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の概要
本発明の発明者らは、驚くべきことに、Ｄ−シクロセリンに対する耐性を有する乳酸菌突然変異体の群が、前記細菌が乳の発酵に用いられる場合、母株よりも高い剪断応力及び／又はゲル剛性を生成することを発見した。
【０００８】
本発明者らは、Ｄ−シクロセリン及び／又は機能的に同等な抗生物質に対する耐性を有するかかるテクスチャを改変する乳酸菌株を得るための方法を提供し、彼らは、高いテクスチャ改変特性を有するラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリクス及びストレプトコッカス・サーモフィルス種のＤ−シクロセリン耐性乳酸菌株の新規の群を提供する。
【０００９】
上記の驚くべき発見に従って、本発明は、Ｄ−シクロセリン耐性、及び／又は機能的に同等な抗生物質に対する耐性を有する、テクスチャを改変する乳酸菌株、例えばラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリクス及びストレプトコッカス・サーモフィルス株、並びにかかる株を得るための方法に関する。さらに、本発明は、培養物、例えば前記突然変異体を含むスターター培養物、及び乳製品、例えば前記培養物を用いて発酵させた乳製品に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、母株であるラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリクスＣＨＣＣ１３９９５、並びにＣＨＣＣ１２９４４及びＣＨＣＣ１２９４５と称されるＣＨＣＣ１３９９５の二つのＤ−シクロセリン突然変異体について、４３℃における乳中の酸性化プロファイル（時間の関数としてｐＨ）を示す。
【００１１】
【図２】図２は、母株であるラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリクスＣＨＣＣ１３９９５、並びにＣＨＣＣ１２９４４及びＣＨＣＣ１２９４５と称されるＣＨＣＣ１３９９５の二つのＤ−シクロセリン突然変異体について、４３℃における脱脂粉乳を２％含む全脂肪乳中の剪断応力（３００  １／ｓ（Ｐａ））を表す。
【００１２】
【図３】図３は、母株であるラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリクスＣＨＣＣ１３９９５、並びにＣＨＣＣ１２９４４及びＣＨＣＣ１２９４５と称されるＣＨＣＣ１３９９５の二つのＤ−シクロセリン突然変異体について、４３℃における脱脂粉乳を２％含む全脂肪乳中のゲル剛性（３００  １／ｓ（Ｐａ））を表す。
【００１３】
【図４】図４は、母株であるストレプトコッカス・サーモフィルスＣＨＣＣ１３９９４、並びにＣＨＣＣ１３２３５及びＣＨＣＣ１３２３６と称されるＣＨＣＣ１３９９４の二つのＤ−シクロセリン突然変異体について、４３℃における脱脂粉乳を２％含む全脂肪乳中の剪断応力（３００  １／ｓ（Ｐａ））を表す。
【００１４】
【図５】図５は、母株であるストレプトコッカス・サーモフィルスＣＨＣＣ１３９９４、並びにＣＨＣＣ１３２３５及びＣＨＣＣ１３２３６と称されるＣＨＣＣ１３９９４の二つのＤ−シクロセリン突然変異体について、４３℃における脱脂粉乳を２％含む全脂肪乳中のゲル剛性（３００  １／ｓ（Ｐａ））を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
詳細な開示
定義
本明細書において、用語「乳酸菌」とは、グラム陽性の微好気性細菌、又は嫌気性細菌を指し、これは、乳酸、主に生成する酸として酢酸、及びプロピオン酸を含む酸の生成と共に糖を発酵させる。工業的に最も有用な乳酸菌は、ラクトコッカス種、ストレプトコッカス種、ラクトバチルス種、リューコノストック種、ペディオコッカス種、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）種、エンテロコッカス（Enterococcus）種、及びプロピオニバクテリウム（Propionibacterium）種を含む「ラクトバチルス」目内で発見されている。加えて、偏性嫌気性細菌の群に属する乳酸を生産する細菌であるビフィズス菌、すなわちビヒトバクテリウム種は、一般的に乳酸菌の群に含まれる。これらは、単独で、又は他の乳酸菌と組み合わせて、しばしば食品培養物として用いられる。ラクトバチラス種、及びストレプトコッカス・サーモフィラスの細菌を含む乳酸菌は、乳製品、例えば発酵乳製品の製造のために、バルクスターター増殖のための凍結若しくは凍結乾燥された培養物、又は発酵ベッセル若しくはバットへの直接植菌を意図したいわゆる「直接バット投入（Direct Vat Set）」（ＤＶＳ）培養物のいずれかとして、通常、乳業に供給される。かかる培養物は、一般的に「スターター培養物」又は「スターター」として呼ばれる。
【００１６】
用語「乳」とは、任意の哺乳動物、例えばウシ、ヒツジ、ヤギ、バッファロー、又はラクダを搾乳することにより得られる乳状分泌物として理解される。好ましい実施形態では、乳は牛乳である。乳なる用語はまた、植物材料から作られるタンパク質／脂肪溶液、例えば豆乳を含む。
【００１７】
用語「乳基質」とは、本発明の方法に従って発酵に供することができる任意の未加工及び／又は加工された乳原料でもよい。従って、有用な乳基質としては、限定することなく、任意の乳若しくはタンパク質を含む乳様製品の溶液／懸濁液、例えば、全脂肪乳若しくは低脂肪乳、脱脂粉乳、バターミルク、再構成された粉乳、コンデンスミルク、乾燥乳、乳清、乳清透過物、乳糖、乳糖の結晶化由来の母液、乳清タンパク質濃縮物、又はクリームが挙げられる。言うまでもなく、乳基質は、任意の哺乳動物に由来してもよく、例えば実質的に純粋な哺乳動物乳、又は再構成された粉乳でもよい。
【００１８】
好ましくは、乳基質中の少なくとも一部のタンパク質は、乳中に天然に生じるタンパク質、例えばカゼイン又は乳清タンパク質でもよい。しかしながら、タンパク質の一部は、乳中に天然に生じないタンパク質でもよい。
【００１９】
発酵の前に、乳基質は、当該技術分野において知られている方法に従って均質化及び殺菌されてもよい。
【００２０】
「均質化すること」とは、本明細書で用いられるように可溶性懸濁液又はエマルジョンを得るために激しく混合することを意味する。均質化が発酵の前に行われる場合、これは、乳脂肪が乳から分離しないように、小さいサイズに分散するように行われてもよい。これは、乳を高圧で小孔に強制的に通すことにより達成されてもよい。
【００２１】
本明細書において、「殺菌すること」とは、生きている有機体、例えば微生物の存在を減少させる、あるいは取り除くための乳基質の処理を意味する。好ましくは、殺菌は、特定の時間、特定の温度を維持することにより達成される。特定の温度は、通常加熱することにより達成される。温度及び持続時間は、特定の細菌、例えば有害な細菌を死滅させる、あるいは不活化させるために選択されてもよい。急速に冷却する行程が続いてもよい。
【００２２】
本発明の方法において、「発酵」とは、微生物の作用を介する、アルコール又は酸への糖質の変換を意味する。好ましくは、本発明の方法における発酵は、乳酸への乳糖の変換を含む。
【００２３】
発酵乳製品の製造に用いられる発酵プロセスはよく知られており、当業者は、好適な処理条件、例えば温度、酸素、微生物の量及び特性、並びに処理時間を選択する方法をよく知っている。言うまでもないが、発酵条件は、本発明の達成を支持するために、すなわち、固体又は液体形態における乳製品（発酵乳製品）を得るために選択される。
【００２４】
本明細書において、ヨーグルトスターター培養物は、少なくとも一つのラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリクス株及び少なくとも一つのストレプトコッカス・サーモフィルス株を含む細菌培養物である。これに従って、「ヨーグルト」とは、ラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリクス株及びストレプトコッカス・サーモフィルス株を含む組成物を用いて乳に植菌し、そして発酵させることにより得られる発酵乳製品を意味する。
【００２５】
本明細書において、用語「剪断応力」とは、粘度を決定する。粘度（単位はＰａ  ｓ）は、剪断応力（Ｐａ）／剪断速度（１／ｓ）として定義される。
【００２６】
剪断応力値は、剪断速度＝３００  １／ｓにおける標準として報告される。感覚的実験は、剪断速度３００  １／ｓにおいて測定される粘度を用いた場合、レオロジー測定値と感覚的粘度／口内でのとろみ（mouth thickness）との最大の相関関係が見られることを示す（データは示さない）。
【００２７】
本明細書において、用語「機能的に同等な抗生物質」とは、Ｄ−シクロセリンと同一の作用機構、又は同一の標的を有する抗生物質、例えばＤ−アラニル−Ｄ−アラニンリガーゼの阻害剤、例えばバンコマイシン（Tytgat et al. (2009), Curr. Med. Chem. 16(20) : 2566-2580）、及びＤ−アラニンラセマーゼの他の阻害剤、例えばＯ−カルバモイル−Ｄ−セリン、アラホスフィン、及びハロアラニン（Holtje (2004), The Desk Encyclopedia of Microbiology: 239-258）として理解されるべきである。
【００２８】
本明細書において、用語「Ｄ−シクロセリン及び／又は機能的に同等な抗生物質に対する耐性」とは、前記抗生物質の存在下の培地中で、特定の変異誘発された細菌株が死滅しない、あるいは前記変異誘発された株が由来する変異誘発されていない株と比較して有意によりゆっくりと死滅することを意味する。培地中の抗生物質の濃度に依存して、耐性はまた、変異誘発された株、及び変異誘発されていない株の改変された増殖特性に反映され得る。例えば、培地中の抗生物質の低濃度は、変異誘発された株の増殖に影響を与えない一方で、変異誘発されていない株の増殖を防ぐ、あるいは有意に減少させる。耐性の評価における感受性の対照株として用いることができる変異誘発されていない株は、ＣＨＣＣ１３９９５及びＣＨＣＣ１３９９４を含む。
【００２９】
本願の実施例１及び２は、それぞれ、Ｄ−シクロセリンに対する耐性を有するラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリクス及びストレプトコッカス・サーモフィルスの突然変異体株の単離を例証する。実施例１及び２に参照される方法に基づいて、当業者は、それぞれの変異誘発されていない母株について、母株の細胞の大部分を死滅させる一方で、Ｄ−シクロセリン及び／又は機能的に同等な抗生物質に対する耐性を有する突然変異体株を死滅させない、あるいは有意にゆっくりと死滅させる効果を有するＤ−シクロセリンの量又は機能的に同等な抗生物質の量を容易に選択することができる。
【００３０】
本明細書において、用語「突然変異体」とは、例えば、遺伝子操作、放射線及び／又は化学処理の手法により本発明の株（若しくは母株）から得られる株、あるいは得ることができる株として理解されるべきである。前記突然変異体は自然発生的に生じる突然変異体でもよい。前記突然変異体は、機能的に同等な突然変異体、例えば、母株と実質的に同等又は改良された特性（例えば、粘度、ゲル剛性、マウスコーティング（mouth coating）、風味、後酸性化（post acidification）、酸性化速度、及び／又はファージ頑健性（phage robustness）に関して）を有する突然変異体であることが好ましい。かかる突然変異体は、本発明の一部である。特に、用語「突然変異体」とは、本発明の菌株を化学的突然変異原、例えばエタンメタンスルホン酸（ＥＭＳ）、又はＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトログアニジン（ＮＴＧ）、ＵＶ光での処理を含む任意の従来から用いられている変異誘発処理に供することにより得られる株、又は自然発生的に生じる突然変異体を意味する。突然変異体は、いくつかの変異誘発処理（１回の処理は、スクリーニング／選択行程が後に続く、１回の変異誘導行程であると理解されるべきである）に供されてもよいが、２０回以下、又は１０回以下、又は５回以下の処理（又はスクリーニング／選択行程）が行われることが目下好ましい。目下好ましい突然変異体では、細菌のゲノムにおいて、１％未満、０．１％未満、０．０１％未満、０．００１％未満又はさらに０．０００１％未満のヌクレオチドが、母株と比較して別のヌクレオチドと置換されている、又は欠損している。
【００３１】
本明細書において、用語「変異体」とは、発明の株と機能的に同等である菌株、例えば、実質的に同等又は改良された特性（例えば、粘度、ゲル剛性、マウスコーティング（mouth coating）、風味、後酸性化（post acidification）、酸性化速度、及び／又はファージ頑健性（phage robustness）に関して）を有する株として理解されるべきである。適切なスクリーニング技術を用いて同定され得るかかる変異体は、本発明の一部である。
【００３２】
本発明を記載する明細書において（特に添付の特許請求の範囲において）、用語「a」、「an」、及び「the」並びに同様の指示語の使用は、本明細書で他に指示されない限り、又は文脈により明らかに矛盾しない限り、単数及び複数の双方を網羅すると解釈される。用語「含むこと（comprising）」、「有すること（having）」、「含むこと（including）」、及び「含むこと（containing）」は、他に記載のない限り、開放式の用語（すなわち、「限定せずに含むこと（including,but not limited to）」を意味する）として解釈される。本明細書での値の範囲の記述は、本明細書で他に指示のない限り、範囲内にあるそれぞれの別個の値を個別に示す簡単な方法として役割を果たすことが意図されるにすぎず、それぞれの別個の値は、これがあたかも本明細書で個別に詳述されたように、本明細書中に組み込まれる。本明細書で記述される全ての方法は、本明細書で他に指示のない限り、又は文脈により明らかに矛盾しない限り、任意の好適な順序で行われることができる。本明細書で提供されるありとあらゆる実施例、又は例示的な言語（例えば、「例えば」）の使用は、本発明をより説明することを意図するにすぎず、他に請求のない限り、本発明の範囲について制限を課すものではない。本明細書におけるいかなる言語も、本発明の実施に必須である任意の請求されない要素を指すものとして解釈されるべきでない。
【００３３】
本発明の実施及び態様
Ｄ−シクロセリン（Ｄ−４−アミノ−イソオキサゾリドン）は、アラニンラセマーゼ、Ｄ−アラニル−Ｄ−アラニンリガーゼ、Ｄ−アラニルアラニンシンターゼ及びＤ−アラニンパーミアーゼを阻害する抗生物質であり、細胞溶解を引き起こす。Ｄ−アラニンラセマーゼは、細胞壁のペプチドグリカン層の必須部分であるＤ−アラニンの生産に必須である。Ｄ−シクロセリンに耐性を示すマイコバクテリウム属（Mycobacterium）の突然変異体は、Ｄ−アラニンラセマーゼ遺伝子の発現を増加させることによりＤ−アラニンを過剰生産する（Caceres et al. (1997), J. Bacteriol. 179: 5046-5055）。従って、本発明の発明者らは、Ｄ−アラニンの高い生産性を天然に有する乳酸菌株の自然突然変異体を単離することができる可能性があることを予測した。かかる突然変異体は単離され、特徴付けられた。
【００３４】
当業者は、Ｄ−シクロセリンと同一の作用機構、又は同一の標的を有する他の抗生物質が、本明細書に記載される種類の突然変異体を単離するために、単独で、又はＤ−シクロセリンと組み合わせて用いることができることを認識するだろう。本発明は、それ故、かかる他の機能的に同等な抗生物質、例えばＤ−アラニル−Ｄ−アラニンリガーゼ又はＤ−アラニンラセマーゼの他の阻害剤の使用を包含する。
【００３５】
本明細書において、用語「Ｄ−シクロセリンと機能的に同等な抗生物質」とは、Ｄ−アラニンの合成、細胞へのＤ−アラニンの輸送、Ｄ−アラニンからのＤ−アラニル−Ｄアラニンの形成、又はペプチドグリカンポリマーの構成要素へのＤ−アラニル−Ｄ−アラニンの組み込みを阻害する任意の化合物を含む。かかる抗生物質としては、限定することなく、酵素であるＤ−アラニン−ラセマーゼ、Ｄ−アラニル−Ｄ−アラニンリガーゼ、Ｄ−アラニルアラニンシンターゼ、及びＤ−アラニンパーミアーゼを阻害する抗生物質が挙げられる。かかるＤ−シクロセリンと機能的に同等な抗生物質としては、限定することなく、バンコマイシン、Ｏ−カルバモイル−Ｄ−セリン、アラホスフィン、及びハロアラニンが挙げられる。
【００３６】
Ｄ−シクロセリン対する耐性を有するラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリクス及びストレプトコッカス・サーモフィルスのいくつかの突然変異体は、親株の他の増殖特性を維持する一方で、親株と比較して乳中で増殖させた場合、増加したテクスチャを与えることが発見された。
【００３７】
上記の驚くべき発見に従って、本発明の第一の態様は、テクスチャを改変する乳酸菌株を得るための方法であって、
ａ）乳酸菌母株を提供する工程；
ｂ）Ｄ−シクロセリン及び／又はＤ−シクロセリンと機能的に同等な抗生物質に対する耐性を有する母株の突然変異体を単離する工程；そして
ｃ）乳中で増殖させた場合に、母株と比較して、より高い剪断応力及び／又はより高いゲル剛性により決定されるより高いテクスチャを生産する場合に突然変異体を選択し、これによりテクスチャを改変する乳酸菌株を得る工程
を含む方法に関する。
【００３８】
従って、第一の態様は、乳中で増殖させた場合に、増加した剪断応力及び／又はゲル剛性をもたらす乳酸菌突然変異体を得る方法であって、
ａ）乳酸菌母株を提供する工程；
ｂ）Ｄ−シクロセリン及び／又はＤ−シクロセリンと機能的に同等な抗生物質に対する耐性を有する母株の突然変異体を単離する工程；そして
ｃ）乳中で増殖させた場合に、母株と比較して、より高い剪断応力及び／又はより高いゲル剛性により決定されるより高いテクスチャを生産する場合に突然変異体を選択し、これにより乳中で増殖させた場合に、増加した剪断応力及び／又はゲル剛性をもたらす乳酸菌突然変異体を得る工程
を含む方法に関する。
【００３９】
母株と比較して、より高い剪断応力及び／又はより高いゲル剛性により決定されるより高いテクスチャの選択された変異株による生産は、全脂肪乳及び低脂肪乳の双方において生じる。
【００４０】
好ましい実施形態では、前記乳は、牛乳である。好ましくは、前記乳は、全脂肪牛乳である。
【００４１】
好ましい実施形態では、前記乳酸菌母株は、ラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリクス及びストレプトコッカス・サーモフィルスからなる群から選択される乳酸菌である。しかしながら、他の乳酸菌、例えばラクトコッカス種、ストレプトコッカス種、ラクトバチルス種、リューコノストック種、ペディオコッカス種、ブレビバクテリウム）種、エンテロコッカス種、プロピオニバクテリウム種、及びビフィドバクテリウム種の細菌の使用は、本発明の一部である。
【００４２】
一つの好ましい実施形態では、突然変異体は、Ｄ−シクロセリン及び／又はＤ−シクロセリンと機能的に同等な抗生物質を含有する成長培地中／上で乳酸菌母株をインキュベートし、Ｄ−シクロセリン及び／又はＤ−シクロセリンと機能的に同等な抗生物質により死滅しない、あるいは試験された変異誘発されていない細胞の大部分よりも有意にゆっくりと死滅する母株の突然変異体を単離することにより得られる。しかしながら、本発明は、Ｄ−シクロセリン及び／又はＤ−シクロセリンと機能的に同等な抗生物質に対する耐性を有する突然変異体を単離する、当業者に知られている他の方法を含む。従って、本発明の第一の態様の方法において用いられる母株は、Ｄ−シクロセリ及び／又はＤ−シクロセリンと機能的に同等な抗生物質に対する耐性を有しない（又は耐性の低い）株である。
【００４３】
一つの実施形態では、前記突然変異体は、Ｄ−シクロセリン及び／又はＤ−シクロセリンと機能的に同等な抗生物質に対する耐性を有する自然突然変異体でもよい。
【００４４】
別の実施形態では、本発明の方法は、例えば行程ｂの前又は間に、母株を変異誘発する（例えば、化学的処理若しくは放射線処理により、又は遺伝子操作技術により）行程を含んでもよい。
【００４５】
従って、一つの実施形態では、前記突然変異体は、例えば化学的処理若しくは放射線処理の手段による母株の変異誘発により得られてもよく、遺伝子操作技術の手段により得られる突然変異体でもよい。
【００４６】
「テクスチャ」又は「食感」とは、口内における製品の物理的及び化学的相互作用を意味する。
【００４７】
乳のテクスチャを決定するための方法は、発酵乳の剪断応力（粘度）又はゲル剛性を測定することを含み、容易に行なうことができ、当該技術分野において知られており、本明細書において例示される。
【００４８】
突然変異体は、これを母株と同一の量、例えば、少なくとも１ｍｌあたり１０4細胞の量で植菌した場合、母株よりも発酵乳中でより高い剪断応力及び／又はより高いゲル剛性により決定されるより高いテクスチャを生産する場合に行程ｃ）において選択される。
【００４９】
好ましい実施形態では、前記突然変異体は、母株により生ずる粘度よりも、少なくとも約５％高い、少なくとも約１０％高い、少なくとも約１５％高い、少なくとも約２０％高い、少なくとも約２５％高い、少なくとも約３０％高い、少なくとも約３５％高い、少なくとも約４０％高い、少なくとも約５０％高い、３００  １／ｓ（Ｐａ）における剪断応力として測定される乳中の粘度を生じる。
【００５０】
別の好ましい実施形態では、前記突然変異体は、母株により生ずるゲル剛性よりも、少なくとも約５％高い、少なくとも約１０％高い、少なくとも約１５％高い、少なくとも約２０％高い、少なくとも約２５％高い、少なくとも約３０％高い、少なくとも約３５％高い、少なくとも約４０％高い、少なくとも約５０％高い、乳中のゲル剛性を生じる。
【００５１】
好ましくは、前記突然変異体は、脱脂粉乳が２％添加された全脂肪牛乳において、ラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリクス株の場合、１ｍｌの乳あたり少なくとも１０4細胞の量で植菌し、３７℃において乳中で１２時間の増殖後、３００  １／ｓ（Ｐａ）において測定される約１０５Ｐａ超の、そしてストレプトコッカス・サーモフィルス株の場合、１ｍｌの乳あたり少なくとも１０4細胞の量で植菌し、３７℃において乳中で１２時間の増殖後、３００  １／ｓ（Ｐａ）において測定される約７５Ｐａ超の粘度を生じる。
【００５２】
好ましい実施形態では、前記突然変異体は、脱脂粉乳が２％添加された全脂肪牛乳において、ラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリクス株の場合、１ｍｌの乳あたり少なくとも１０4細胞の量で植菌し、３７℃において乳中で１２時間の増殖後、約８０Ｐａ超の、そしてストレプトコッカス・サーモフィルス株の場合、１ｍｌの乳あたり少なくとも１０4細胞の量で植菌し、３７℃において乳中で１２時間の増殖後、約１４０Ｐａ超のゲル剛性を生じる。
【００５３】
第二の態様では、本発明は、本発明の第一の態様の方法により得られる乳酸菌株を目的とする。
【００５４】
好ましい実施形態では、前記乳酸菌株は、ラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリクス及びストレプトコッカス・サーモフィルスからなる群から選択される株である。
【００５５】
別の好ましい実施形態では、前記乳酸菌株は、脱脂粉乳が２％添加された全脂肪牛乳において、ラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリクス株の場合、１ｍｌの乳あたり少なくとも１０4細胞の量で植菌し、３７℃において乳中で１２時間の増殖後、３００  １／ｓ（Ｐａ）において剪断応力として測定される約１０５Ｐａ超の、そしてストレプトコッカス・サーモフィルス株の場合、１ｍｌの乳あたり少なくとも１０4細胞の量で植菌し、３７℃において乳中で１２時間の増殖後、３００  １／ｓ（Ｐａ）において剪断応力として測定される約７５Ｐａ超の粘度を生じる。
【００５６】
好ましくは、前記乳酸菌株は、脱脂粉乳が２％添加された全脂肪牛乳において、ラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリクス株の場合、１ｍｌの乳あたり少なくとも１０4細胞の量で植菌し、３７℃において乳中で１２時間の増殖後、約８０Ｐａ超の、そしてストレプトコッカス・サーモフィルス株の場合、１ｍｌの乳あたり少なくとも１０4細胞の量で植菌し、３７℃において乳中で１２時間の増殖後、約１４０Ｐａ超のゲル剛性を生じる。
【００５７】
第三の態様では、本発明は、ＤＳＭ  ２４０１９の受託番号でドイツ微生物細胞培養コレクション（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen）に寄託されたＣＨＣＣ１２９４４株、ＤＳＭ  ２４０２０の受託番号でドイツ微生物細胞培養コレクションに寄託されたＣＨＣＣ１２９４５株、並びにこれらの任意の突然変異体及び変異体からなる群から選択されるラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリクス種に属する乳酸菌株に関する。前記突然変異体及び変異体は、これらが由来する寄託株の剪断応力及び／又はゲル剛性特性を示す。
【００５８】
第四の態様では、本発明は、ＤＳＭ  ２４０１０の受託番号でドイツ微生物細胞培養コレクションに寄託されているＣＨＣＣ１３２３５株、ＤＳＭ  ２４０１１の受託番号でドイツ微生物細胞培養コレクションに寄託されているＣＨＣＣ１３２３６株、並びにこれらの任意の突然変異体及び変異体からなる群から選択されるストレプトコッカス・サーモフィルス種に属する乳酸菌株に関する。前記突然変異体及び変異体は、これらが由来する寄託株の剪断応力及び／又はゲル剛性特性を示す。
【００５９】
第五の態様では、本発明は、ＤＳＭ  ２４０１９の受託番号でドイツ微生物細胞培養コレクションに寄託されているＣＨＣＣ１２９４４株、又はＤＳＭ  ２４０２０の受託番号でドイツ微生物細胞培養コレクションに寄託されているＣＨＣＣ１２９４５株の、同一又は改善されたゲル剛性及び／又は剪断応力特性を有し、Ｄ−シクロセリン及び／又は機能的に同等な抗生物質に対する耐性を有するラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリクス種の乳酸菌株に関する。
【００６０】
第六の態様では、本発明は、ＤＳＭ  ２４０１０の受託番号でドイツ微生物細胞培養コレクションに寄託されているＣＨＣＣ１３２３５株、又はＤＳＭ  ２４０１１の受託番号でドイツ微生物細胞培養コレクションに寄託されているＣＨＣＣ１３２３６株の、同一又は改善されたゲル剛性及び／又は剪断応力特性を有し、Ｄ−シクロセリン及び／又は機能的に同等な抗生物質に対する耐性を有するストレプトコッカス・サーモフィルス種の乳酸菌株に関する。
【００６１】
第七の態様では、本発明は、本発明の第二〜第六の態様の乳酸菌株を含む組成物に関する。
【００６２】
本発明の一つの実施形態では、前記組成物は、混合物又はキットの部分のいずれかとして、
ｉ）本発明の第二、第四、又は第六の態様のストレプトコッカス・サーモフィルス種に属する株；及び
ｉｉ）本発明の第二、第三、又は第五の態様のラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリクス種に属する株
を含む。
【００６３】
一つの実施形態における組成物は、好ましくは、少なくとも１０9ＣＦＵ（細胞形性単位）のラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリクス種に属する株；及び少なくとも１０10ＣＦＵのストレプトコッカス・サーモフィルス種に属する株を含む。別の実施形態における組成物は、少なくとも１０11ＣＦＵ（細胞形性単位）のラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリクス種に属する株；及び少なくとも１０12ＣＦＵ（細胞形性単位）のストレプトコッカス・サーモフィルス種に属する株を含む。
【００６４】
一つの好ましい実施形態における組成物は、スターター培養物として有利に用いられてもよく、凍結形態、凍結乾燥形態、又は液体形態である。
【００６５】
本発明の第八の態様は、乳製品、例えば発酵乳製品を生産する方法であって、本発明の第二〜第六のいずれか態様の乳酸菌株、又は本発明の第七の態様の組成物を用いて乳基質を発酵させること、そしてそれにより乳製品得ることを含む方法に関する。
【００６６】
本方法により生産される乳製品は、従って、本発明の第二〜第六のいずれかの態様の乳酸菌株、又は本発明の第七の態様の組成物の乳酸菌株をそれぞれ含む。
【００６７】
本方法では、前記乳基質は、本発明の株、例えばラクトバチルス属種に属する株を用いた発酵の前、間、及び／又は後に、本発明の株、例えばストレプトコッカス・サーモフィルス種に属する株で発酵されてもよい。
【００６８】
さらに、本方法は、発酵の前、間、及び／又は後に、乳基質に酵素、例えば、タンパク質を架橋させることができる酵素、トランスグルタミナーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、キモシン、及びレンネットからなる群から選択される酵素を添加することを含んでもよい。
【００６９】
第九の態様では、本発明は、本発明の第八の態様の方法により得られる乳製品、例えば発酵乳製品（例えばヨーグルト若しくはバターミルク）、又はチーズ（例えばパスタ・フィラータのフレッシュチーズ）に関する。
【００７０】
前記乳製品は、乳酸菌を含む。
【００７１】
前記乳製品は、任意で、果実濃縮物、シロップ、プロバイオティック細菌培養物、着色剤、増粘剤、香料、及び保存剤からなる群から選択される成分を含んでもよく；そして／あるいは、これは任意で、かき混ぜるタイプの製品、セットタイプの製品、又は飲料製品の形態である。
【００７２】
第十の態様では、本発明は、本発明の第二〜第六のいずれかの態様による乳酸菌株を含む乳製品に関する。
【００７３】
第十一の態様では、本発明は、発酵乳製品の製造のための第二〜第六のいずれかの態様による乳酸菌株の使用に関する。
【００７４】
本発明は、以下の非限定的な実施例によりさらに例証される。
【実施例】
【００７５】
実施例
実施例１：改良されたレオロジー特性を有するラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリクスにおける突然変異体を単離するためのＤ−シクロセリンの使用
材料及び方法
株
ラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリクスＣＨＣＣ１３９９５
ラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリクスＣＨＣＣ１２９４４（ＣＨＣＣ１３９９５のＤ−シクロセリン耐性突然変異体）
ラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリクスＣＨＣＣ１２９４５（ＣＨＣＣ１３９９５のＤ−シクロセリン耐性突然変異体）
【００７６】
突然変異体の単離
ラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリクス株ＣＨＣＣ１３９９５の突然変異体を単離するために、単一コロニーの増殖に由来する細胞を、５０〜１００μｇ／ｍｌの範囲でＤ−シクロセリン含むＭＲＳ培地に植菌し、飽和するまで増殖させた。細胞を希釈し、ＭＲＳプレートにプレートし、５０〜１００μｇ／ｍｌの範囲のＤ−シクロセリン存在下において増殖する能力について、コロニーをマイクロタイタープレートでスクリーニングした。典型的には、得られたコロニーの２５％を、Ｄ−シクロセリンの存在下で早く増殖するものとして同定した。これらをさらなる研究のために選択した。選択されたＤ−シクロセリン耐性突然変異体を更に純化し、乳中で増殖するこれらの能力について試験した。この研究の間、いくつかの突然変異体が、これらの条件下で親株よりも著しく高いテクスチャを生産したことが観察された。
【００７７】
レオロジー
レオロジー解析は、脱脂粉乳が２％添加された全脂肪牛乳中での増殖後、ReoLogica Instruments AB, Sweden製のStressTechレオメーターで行なった。
【００７８】
結果
ＣＨＣＣ１２９４４及びＣＨＣＣ１２９４５と称されるＣＨＣＣ１３９９５の二つ派生体は、母株よりも増加した剪断応力（粘度）及びゲル剛性を有する有意に高いテクスチャを生産した。これは、発酵乳中をピペットでかき混ぜることにより明らかであった。さらに、乳清の量が様々な突然変異体間で異なることが観察され、これは、さらなる研究のための突然変異体を選択するために用いられるパラメーターの一つとなった（下記の表１を参照のこと）。選択された突然変異体は、低いレベルのシネレシスを示したものであった：下記の実施例（表１）中の突然変異体１及び突然変異体１１は、それぞれ突然変異体ＣＨＣＣ１２９４４とＣＨＣＣ１２９４５に対応する。
【００７９】
表１：生成する乳清の量が少なかったので、２０個の突然変異体の中から突然変異体１及び突然変異体１１を選択した。空のレーンは乳を凝固しなかった突然変異体である。前記の２個の突然変異体は、それぞれＣＨＣＣ１２９４５及びＣＨＣＣ１２９４４と指定される。
【表１】
0005898220.tif 000002
４３℃において１００ｍｌのＢ−乳中で２４時間増殖後の乳清（ｍｌ）
【００８０】
実際のレオロジー試験は、増加したとろみの観察を支持した（表２並びに図２及び３）。突然変異体ＣＨＣＣ１２９４５及びＣＨＣＣ１２９４４のゲル剛性の増加は、５２％〜５９％であった。剪断応力はまた高いが、ゲル剛性と同程度ではない（表２並びに図２及び３）。
【００８１】
表２
【表２】
0005898220.tif 000003
【００８２】
レオロジーが改良されても、他の重要な特性、例えば酸性化が影響を受ける場合、前記突然変異体は魅力的ではない。４３℃において脱脂粉乳が２％添加された全脂肪牛乳中で増殖させた場合の酸性化プロファイルは、選択された突然変異体と関連する母株とで同じである（図１）。
【００８３】
結論
本明細書に記載されるラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリクス  Ｄ−シクロセリン突然変異体は、培養物、例えばスターター培養物に組み込まれてもよく、これは所望の高レベルのテクスチャを生産する。
【００８４】
実施例２：改良されたレオロジー特性を有するストレプトコッカス・サーモフィルスにおける突然変異体を単離するためのＤ−シクロセリンの使用
材料及び方法
株
ストレプトコッカス・サーモフィルス  ＣＨＣＣ１３９９４
ストレプトコッカス・サーモフィルス  ＣＨＣＣ１３２３６（ＣＨＣＣ１３９９４のＤ−シクロセリン耐性突然変異体）
ストレプトコッカス・サーモフィルス  ＣＨＣＣ１３２３５（ＣＨＣＣ１３９９４のＤ−シクロセリン耐性突然変異体）
【００８５】
突然変異体の単離：
ストレプトコッカス・サーモフィルスＣＨＣＣ１３９９４の突然変異体を単離するために、単一コロニーの増殖に由来する細胞を５０〜７０μｇ／ｍｌの範囲でＤ−シクロセリン含むＭ１７＋２％乳糖培地に植菌し、飽和するまで増殖させた。細胞を希釈し、Ｍ１７＋２％乳糖プレートにプレートし、５０〜７０μｇ／ｍｌの範囲のＤ−シクロセリン存在下において増殖する能力について、コロニーをマイクロタイタープレートで選択し、スクリーニングした。典型的に、得られたコロニーの２５％を、Ｄ−シクロセリンの存在下で早く増殖するものとして同定した。これらをさらなる研究のために選択した。選択されたＤ−シクロセリン耐性突然変異体を更に純化し、乳中で増殖するこれらの能力について試験した。この研究の間、いくつかの突然変異体が、これらの条件下で親株よりもより有意により高いテクスチャを生産したことが観察された。乳清の量はまた、高い又は低いゲル剛性の指標として測定された。
【００８６】
レオロジー
レオロジー解析は、脱脂粉乳が２％添加された全脂肪牛乳中での増殖後、ReoLogica Instruments AB, Sweden製のStressTechレオメーターで行なった。
【００８７】
結果
ＣＨＣＣ１３２３５及びＣＨＣＣ１３２３６と称されるＣＨＣＣ１３９９４の二つの突然変異体派生物は、母株と比較してより高いテクスチャを生産した。これは、発酵乳中をピペットでかき混ぜることにより明らかであった。さらに、乳清の量が様々な突然変異体間で異なることが観察され、これは、さらなる研究のための突然変異体を選択するために用いられるパラメーターの一つとなった（下記の表３を参照のこと）。選択された突然変異体である表３中のｎｏ．９及びｎｏ．１３は、低いレベルのシネレシスを示した二つであった。二つの突然変異体は、それぞれ指定されたＣＨＣＣ１３２３６及びＣＨＣＣ１３２３５と称された。
【００８８】
表３：二つの突然変異体、ｎｏ．９及びｎｏ．１３が、２０個の突然変異体の中から選択された。
【表３】
0005898220.tif 000004
３７℃において５０ｍｌのＢ−乳中で２４時間増殖後の乳清（ｍｌ）
【００８９】
実際のレオロジー試験は、増加したとろみの観察を支持した（図４及び図５）。突然変異体ＣＨＣＣ１３２３６が、１５％増加した剪断応力、及び１９％増加したゲル剛性を有する一方で、突然変異体ＣＨＣＣ１３２３５は、増加したゲル剛性（２３％）のみを示した（表４）。
【００９０】
表４
【表４】
0005898220.tif 000005
【００９１】
酸性化に関して、前記プロファイルは、選択された突然変異体と関連する母株とで同じである（データは示さない）。
【００９２】
結論
本明細書に記載されるストレプトコッカス・サーモフィルス  Ｄ−シクロセリン突然変異体は、培養物、例えばスターター培養物に組み込まれてもよく、これは所望の高レベルのテクスチャを生産する。
【００９３】
実施例３：発酵乳製品の調製のためのストレプトコッカス・サーモフィルス及びラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリクス  Ｄ−シクロセリン突然変異体の使用
ヨーグルトは、９：１の比で混合されたＳ．サーモフィルス及びＬｂ．デルブルッキー亜種ブルガリクスの組み合わせで作り、脱脂粉乳が２％添加された全脂肪牛乳を植菌した。一つの混合物は、親株ＣＨＣＣ１３９９４とＣＨＣＣ１３９９５を含み；第二の混合物は、Ｓ．サーモフィルス  Ｄ−シクロセリン突然変異体ＣＨＣＣ１３２３６とＬｂ．デルブルッキー亜種ブルガリクス  Ｄ−シクロセリン突然変異体ＣＨＣＣ１２９４５を含み；そして第三の混合物は、Ｓ．サーモフィルス  Ｄ−シクロセリン突然変異体ＣＨＣＣ１３２３５とＬｂ．デルブルッキー亜種ブルガリクス  Ｄ−シクロセリン突然変異体ＣＨＣＣ１２９４５を含む。３つの組み合わせ間の酸性化プロファイルの比較は、二つの突然変異体を含む混合物は、親株との組み合わせよりも、僅かに高い最終ｐＨを有したことを示した（データは示さない）。スプーンでの撹拌は、Ｄ−シクロセリン突然変異体で作られた製品が、親株を用いて生産された製品と比較して、撹拌に対する著しく増加した抵抗を有することを示した。加えて、得られたヨーグルトは、３人のヒトにより評価された場合、よりクリーミーなテクスチャ、及び新鮮な風味を有すると考えられた。
【００９４】
寄託及び専門家の解決手段
ラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリクス株ＣＨＣＣ１２９４４、ＣＨＣＣ１２９４５、及びＣＨＣＣ１３９９５は、２０１０年９月２２日にそれぞれＤＳＭ  ２４０１９、ＤＳＭ  ２４０２０、及びＤＳＭ  ２４０２１の受託番号でＤＳＭＺ  （ドイツ微生物細胞培養コレクション（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH）、Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, Germany）に寄託された。
【００９５】
ストレプトコッカス・サーモフィルス株ＣＨＣＣ１３２３５、ＣＨＣＣ１３２３６、及びＣＨＣＣ１３９９４は、２０１０年９月２２日にそれぞれＤＳＭ  ２４０１０、ＤＳＭ  ２４０１１、及びＤＳＭ  ２４０１２の受託番号でＤＳＭＺ（ドイツ微生物細胞培養コレクション、Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, Germany）に寄託された。
【００９６】
寄託は、特許手続き上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約の条件下でなされる。
【００９７】
出願人は、寄託された微生物のサンプルが、出願人により承認された専門家にのみ入手可能であるべきであることを要求する。
【００９８】
参考文献
Tytgat et al. (2009), Curr. Med. Chem. 16(20) : 2566-2580.
Caceres et al. (1997), J. Bacteriol. 179: 5046-5055.
Holtje (2004), The Desk Encyclopedia of Microbiology: 239-258.
【００９９】
本特許文書に引用される全ての参考文献は、参照によりこれらの全体において本明細書に組み込まれる。
【図１】
0005898220.tif 000006
【図２】
0005898220.tif 000007
【図３】
0005898220.tif 000008
【図４】
0005898220.tif 000009
【図５】
0005898220.tif 000010