(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡ（Ａ）を含む２種以上のＤＮＡを含有する試料と該ＤＮＡ（Ａ）に対し相同な塩基配列を有する二本鎖ＲＮＡとを混合し、熱変性してハイブリダイズさせた後、前記ＤＮＡ（Ａ）以外のＤＮＡと前記ＲＮＡとのハイブリダイゼーションが解離し、かつ、前記ＤＮＡ（Ａ）と前記ＲＮＡとのハイブリダイゼーションが維持できる温度を保持してから、該解離したＤＮＡを増幅することを特徴とする、ＤＮＡ増幅方法。
【請求項２】
二本鎖ＲＮＡが、Ｓｍａｌｌ−ＳｕｂＵｎｉｔ  ｒＲＮＡ又はＬａｒｇｅ−ＳｕｂＵｎｉｔ  ｒＲＮＡ遺伝子の配列を有するユニバーサルプライマーを用いて得られたＰＣＲ産物をテンプレートとして得られたものであることを特徴とする、請求項１記載のＤＮＡ増幅方法。
【請求項３】
請求項１記載のＤＮＡ増幅方法を用いて試料中の遺伝子多型を検出する、一塩基多型の検出方法。
【請求項４】
請求項１又は２記載のＤＮＡ増幅方法を用いて試料中の微生物由来ＤＮＡを検出する、微生物叢の解析方法。
【請求項５】
請求項１又は２記載のＤＮＡ増幅方法を用いる、試料に含まれる低含有のＤＮＡ断片の増幅効率を向上させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＣＲ法を介した核酸増幅方法に関する。詳しくは、遺伝子工学、分子生物学、及びこれらに関連する産業分野において有用な核酸増幅方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物叢解析を含む核酸の塩基配列多型解析は、医学診断上や生物の系統分類学上、重要な技術である。しかしながら、多型を有する塩基配列には、野生型と比べて非常に低含量の変異が含まれることがあるほか、環境中の微生物叢解析においては、ある特定の微生物のＤＮＡが多量に存在し、それ以外の微生物のＤＮＡの検出を困難にすることがある。
【０００３】
従来、ＳＮＰ（一塩基置換）の多型解析においては、野生型と比較して低含量の変異型を優先的に増幅する手法として、いくつかの報告例がある。例えば、ｆｕｌｌ−ＣＯＬＤ−ＰＣＲ（ＣＯ−ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｔ  Ｌｏｗｅｒ  Ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）は、ＰＣＲにおける温度変化サイクルに、野生型と変異型のＤＮＡがヘテロ二本鎖を形成するためのハイブリダイゼーションステップを設け、野生型ホモ二本鎖ＤＮＡは一本鎖に変性せずに、野生型−変異型ヘテロ二本鎖ＤＮＡが変性する温度で再変性を行うことで、野生型と比較して変異型を優先的に増幅する手法が挙げられる（非特許文献１参照）。また、ｆａｓｔ−ＣＯＬＤ−ＰＣＲは、Ｔｍ値の減少する変異（Ｇ＞Ｔなど）において、変異が存在することにより生じるＴｍ値の差を利用して、変異がある場合のみ熱変性を受け、野生型では熱変性を受けないような温度（Ｔｃ）をＰＣＲにおける変性温度として利用することで、変異型を優先的に増幅する手法が挙げられる（非特許文献２参照）。
【０００４】
ｆｕｌｌ−ＣＯＬＤ−ＰＣＲは原理の特性上、野生型と変異型の比率を１対１以上にすることは困難かつ増幅に非常に時間がかかる上に、選択的な増幅の効率が低い。また、ｆａｓｔ−ＣＯＬＤ−ＰＣＲは短時間で行えるものの、Ｔ＞ＧなどのＴｍ値の上昇する変異には対応できないなど、それぞれの手法は一長一短があったことから、それらを改善する手法として、ｉｃｅ−ＣＯＬＤ−ＰＣＲが開発された（非特許文献３参照）。ｉｃｅ−ＣＯＬＤ−ＰＣＲは、野生型に相補的でかつ野生型、変異型のテンプレートにもプライマーにもならないオリゴヌクレオチド（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＲＳ）を過剰量反応液中に存在させ、ｆｕｌｌ−ＣＯＬＤ−ＰＣＲと同様にハイブリダイゼーション工程を設けることにより、野生型−ＲＳ及び変異型−ＲＳのヘテロ二本鎖を形成させる。その際、パーフェクトマッチの野生型−ＲＳに比べ、ミスマッチの存在する変異型−ＲＳはＴｍ値が減少することから、変異型−ＲＳが優先的に変性するような変性温度をＰＣＲにおいて設定することで、優先的に変異型を増幅する手法である。この開発により比較的短時間で、変異型を選択的に増幅することが可能となった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｌｉ  Ｊ  ｅｔ．ａｌ．、Ｎａｔ  Ｍｅｄ．、１４（５）、５７９−８４（２００８）
【非特許文献２】Ｌｉ  Ｊ  ｅｔ．ａｌ．、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ．、５５（４）、７４８−５６（２００９）
【非特許文献３】Ｃｏｒｅｎ  Ａ．Ｍ．ｅｔ．ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、３９（１）、ｅ２（２０１１）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、非特許文献３に記載のｉｃｅ−ＣＯＬＤ−ＰＣＲでも、野生型に対応するＲＳを合成する必要があるため、多数の多型解析における変異型の選択的増幅や微生物叢における多量の微生物由来核酸断片の選択的排除に対し汎用性が少なかった。
【０００７】
本発明の課題は、多型解析や微生物群集構造解析を行う際に、変異型核酸もしくは存在比率の少ない微生物由来核酸の増幅効率を向上させる、ＰＣＲ法を介した核酸増幅方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、下記〔１〕〜〔４〕に関する。
〔１〕  ＤＮＡ（Ａ）を含む２種以上のＤＮＡを含有する試料と該ＤＮＡ（Ａ）に対し相同な塩基配列を有する二本鎖ＲＮＡとを混合し、熱変性してハイブリダイズさせた後、前記ＤＮＡ（Ａ）以外のＤＮＡと前記ＲＮＡとのハイブリダイゼーションが解離し、かつ、前記ＤＮＡ（Ａ）と前記ＲＮＡとのハイブリダイゼーションが維持できる温度を保持してから、該解離したＤＮＡを増幅することを特徴とする、ＤＮＡ増幅方法。
〔２〕  前記〔１〕記載のＤＮＡ増幅方法を用いて試料中の遺伝子多型を検出する、一塩基多型の検出方法。
〔３〕  前記〔１〕記載のＤＮＡ増幅方法を用いて試料中の微生物由来ＤＮＡを検出する、微生物叢の解析方法。
〔４〕  前記〔１〕記載のＤＮＡ増幅方法を用いる、試料に含まれる低含有のＤＮＡ断片の増幅効率を向上させる方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の核酸増幅方法によれば、多型解析や微生物群集構造解析を行う際に、多量の野生型核酸もしくは主たる割合で生育する微生物由来核酸のＰＣＲによる増幅が抑制され、変異型核酸もしくは存在比率の少ない微生物由来核酸の増幅効率を向上させることが可能となる。これにより、多型解析における感度の向上や、微生物群集における少数微生物の検出感度の向上など、多型解析技術もしくは微生物群集構造解析技術の向上が行なわれる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、本発明の核酸増幅方法の模式図を示す図である。
【図２】図２は、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）法の泳動像を示す図である。レーン１はＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのｇｅｎｏｍｅ  ＤＮＡ及びＳ．ｐｏｍｂｅのｇｅｎｏｍｅ  ＤＮＡの等量混合物を通常のＰＣＲサイクルにより増幅したものである。レーン２は、レーン１と同様に調製したＤＮＡ混合物をＣＯＬＤ−ＰＣＲサイクルにより増幅したものである。
【図３】図３は、図２と同様にＤＧＧＥ法の泳動像を示す図である。レーン１〜５は、それぞれＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ及びＳ．ｐｏｍｂｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ＤＮＡを１：１、１０：１、１００：１、１０００：１、１００００：１の重量比で混合し、得られたＤＮＡ混合物を通常のＰＣＲサイクルにより増幅したものである。レーン６〜１０は、同様に調製したＤＮＡ混合物をＣＯＬＤ−ＰＣＲと同じサイクル数となるよう通常のＰＣＲサイクルにより増幅したものである。レーン１１〜１５は、同様に調製したＤＮＡ混合物をＣＯＬＤ−ＰＣＲサイクルにより増幅したものである。
【図４】図４は、図２と同様にＤＧＧＥ法の泳動像を示す図である。赤ワイン発酵もろみから得られた環境ゲノムをテンプレートＤＮＡとしたものであり、レーン１、２は赤ワイン発酵開始日酵母添加直後のサンプルから得られたＤＮＡを、レーン３、４は赤ワイン発酵開始８日目のサンプルから得られたＤＮＡを使用している。また、レーン１、３は通常のＰＣＲサイクルにより増幅し、レーン２、４はＣＯＬＤ−ＰＣＲサイクルにより増幅したものである。
【図５】図５は、アガロースゲル電気泳動による泳動像を示す図である。レーン１は分子量マーカーである。レーン２はＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのｇｅｎｏｍｅ  ＤＮＡ及びＳ．ｐｏｍｂｅのｇｅｎｏｍｅ  ＤＮＡの等量混合物を通常のＰＣＲサイクルにより増幅したものである。レーン３は、レーン２と同様に調製したＤＮＡ混合物をＣＯＬＤ−ＰＣＲサイクルにより増幅したものである。レーン４は、前記ＰＣＲ産物を制限酵素ＫｐｎＩにより処理したものである。レーン５は、前記ＣＯＬＤ−ＰＣＲ産物を制限酵素ＫｐｎＩにより処理したものである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の核酸増幅方法は、増幅を希望しない（増幅を抑制したい）核酸（核酸Ａともいう）に対して相同な塩基配列を有する二本鎖ＲＮＡを合成し、当該二本鎖ＲＮＡを試料に添加してＣＯＬＤ−ＰＣＲを行うことにより、前記核酸Ａの増幅が抑制されて、それ以外の核酸が増幅されることに大きな特徴を有する。なお、本明細書において「核酸」とは、「ＤＮＡ」及び「ＲＮＡ」のいずれをも意味するが、「ＤＮＡ」が好ましい。
【００１２】
より具体的には、任意の特定塩基配列を有する核酸（核酸Ａ）と核酸Ａと同一のプライマーにて増幅されうる核酸（核酸Ｂという）を含有する試料の溶液に、核酸Ａに対して相同な塩基配列を有する核酸断片（二本鎖ＲＮＡ）を混合してハイブリダイズさせることで、核酸Ａと二本鎖ＲＮＡに由来するホモ二本鎖と、核酸Ｂと二本鎖ＲＮＡに由来するヘテロ二本鎖が形成される。次いで、該ホモ二本鎖の結合が維持され、かつ、該ヘテロ二本鎖が一本鎖に解離される温度にて熱変性することにより、解離した一本鎖の核酸を選択して増幅することが可能となる。即ち、前記二本鎖ＲＮＡとの結合性によって選択された核酸ＢのみをＰＣＲにより増幅することが可能となり、例えば、微生物叢解析において、特定微生物由来の核酸断片の増幅を抑制し、その他の微生物由来の核酸断片をより高感度に増幅することが可能となる。
【００１３】
以下の表１に、既存のＣＯＬＤ−ＰＣＲと本願発明ＣＯＬＤ−ＰＣＲの原理等を対比した結果を示す。
【００１４】
【表１】
0005924648.tif 000002
【００１５】
表１より、任意の特定塩基配列を有する核酸に相同な塩基配列を有する核酸断片として、二本鎖ＲＮＡを用いることにより、二本鎖ＲＮＡの調製が容易であることから、汎用性が高くなると考えられる。また、増幅を希望しない核酸のＤＮＡ鎖を添加して選択する場合と比較し、パーフェクトマッチのＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドのＴｍ値は、通常、同一塩基長の二本鎖ＤＮＡよりも高い値をとるため、増幅された二本鎖ＤＮＡのほとんどが解離していながらも抑制対象のＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドはほとんど解離せず、ＤＮＡを使用する場合と比較し、変性温度の設定が容易かつ効率的に選択的増幅が可能となる。さらには通常オリゴヌクレオチドの合成は１５０ｎｔ〜２００ｎｔ程度が限界であるため、それ以上の増幅産物には対応できないものの、二本鎖ＲＮＡを使用することにより６００ｂｐ程度の長さまでは、対応可能となるという効果が奏されることが示唆される。
【００１６】
以下に、本発明の核酸増幅方法を、図１を用いて説明する。
【００１７】
本発明で用いられる試料は、核酸Ａ（図１における主要二本鎖ＤＮＡ）を含む２種以上の核酸であって、核酸Ａと同一プライマーで増幅されうる核酸を含有するのであれば特に限定はない。例えば、ある種の微生物叢を構成している環境サンプル、食品中および糞便等からガラスビーズ法、酵素法などやキット化された市販試薬により直接ＤＮＡを抽出して用いることができる。なお、以降、核酸Ａ以外の核酸を核酸Ｂ（図１における低含有二本鎖ＤＮＡ）といい、核酸Ｂは核酸Ａの多型であってもよい。
【００１８】
また、核酸Ａに対して相同な塩基配列を有する二本鎖ＲＮＡとしては、核酸ＡのＤＮＡ鎖に対し相補的にハイブリダイズするのであれば特に限定はない。
【００１９】
二本鎖ＲＮＡは、ＲＮＡ化学合成法又は各種ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼを使用することにより合成することができる。例えば、ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼを使用する場合、変性剤濃度勾配ゲル等のゲルから切り出した核酸断片をテンプレートとして、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼが認識するプロモーター配列、例えば、Ｔ７プロモーター配列を付加したプライマーを用いてＰＣＲにより増幅し、増幅された断片をテンプレートとして二本鎖ＲＮＡを合成することができる。
【００２０】
また、微生物叢解析においては、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（以下、「ＤＧＧＥ」という）法により、リボゾーマルＲＮＡ遺伝子、例えば、Ｓｍａｌｌ−ＳｕｂＵｎｉｔ  ｒＲＮＡ又はＬａｒｇｅ−ＳｕｂＵｎｉｔ  ｒＲＮＡの配列を有するユニバーサルプライマーを用いたＰＣＲ産物を塩基配列毎に分離し、各ＤＮＡ断片の配列から微生物種を推定する手法がしばしば取られる。よって、本発明では、その際に抑制したい核酸断片のバンドを切り出し、上記手法により二本鎖ＲＮＡを合成することができる。
【００２１】
前記二本鎖ＲＮＡの長さは、ハイブリダイズに要する時間及び配列選択性の観点から、好ましくは２５ヌクレオチド残基以上、より好ましくは５０ヌクレオチド残基以上であり、好ましくは１０００ヌクレオチド残基以下、より好ましくは６００ヌクレオチド残基以下である。
【００２２】
本発明では、前記試料と二本鎖ＲＮＡを含有する組成物をＰＣＲ法による増幅反応に供する。よって、ＰＣＲ反応を行うための組成物、すなわちＰＣＲ反応液としては、前記成分に加えてプライマー、緩衝液、マグネシウムイオン等の各種成分を適切な濃度で含有するものであれば特に限定はなく、当業者に周知の方法に従って、調製することができる。試料（核酸）と二本鎖ＲＮＡの濃度比（核酸／二本鎖ＲＮＡ）としては、核酸の種類などによって一概に決定することができず特に限定はないが、例えば、１／１００〜１／１０００が例示される。また、二本鎖ＲＮＡを用いた増幅反応に供するＰＣＲ反応液は、二本鎖ＲＮＡとの選択的増幅を向上させるために、二本鎖ＲＮＡを添加する前に予め対象核酸のみを増幅してから用いることができる。
【００２３】
例えば、プライマーとしては、核酸Ａ及び核酸Ｂに対してアニールするオリゴヌクレオチドであれば特に限定されるものではない。また、本発明では、環境、食品、糞便等サンプル中の微生物叢解析に利用する観点から、微生物間で良く保存されている領域を用いてもよい。また、ＤＧＧＥ分析に供するＤＮＡ断片はＧＣ塩基含量に富んだ方が好ましいことから、ＧＣクランプ（ＧＣ−Ｃｌａｍｐ）を付加したプライマーを用いてもよい。プライマーの鎖長（ＧＣクランプを付加する場合は、それを除いた鎖長）は、好ましくは１５ヌクレオチド残基以上、より好ましくは２０ヌクレオチド残基以上であり、好ましくは３０ヌクレオチド残基以下、より好ましくは２５ヌクレオチド残基以下である。なお、プライマーは市販品でも、公知の方法に従って合成したものであっても良い。
【００２４】
プライマーの添加濃度は、プライマーの種類や使用二本鎖ＲＮＡ濃度により一概に決定することができないが、二本鎖ＲＮＡとアニーリングにより減少する有効プライマー濃度を補填する観点から、反応溶液の最終濃度が０．２μＭ〜０．４μＭが好ましく、０．３μＭ〜０．４μＭがより好ましい。
【００２５】
また、マグネシウムイオンを含有する場合には、その濃度は、反応溶液中に過剰量含まれるＲＮＡとマグネシウムイオンが結合することにより低下する有効マグネシウムイオン濃度を補填する観点から、反応溶液の最終濃度が１．０ｍＭ〜３．０ｍＭが好ましく、１．５ｍＭ〜２．５ｍＭがより好ましい。前記条件は、添加する二本鎖ＲＮＡの濃度に応じて適宜調節すればよい。
【００２６】
得られたＰＣＲ反応液は、公知のＣＯＬＤ−ＰＣＲ法（例えば、ｆｕｌｌ−ＣＯＬＤ−ＰＣＲ、ｉｃｅ−ＣＯＬＤ−ＰＣＲ）に従って、ＰＣＲ法を介して増幅させる。具体的には、先ず、前記反応液を熱変性Ｉに供してからハイブリダイズさせる。
【００２７】
熱変性Ｉでは、ＰＣＲ反応液中の二本鎖ＤＮＡや二本鎖ＲＮＡを解離させる。熱変性のインキュベーションの条件としては、特に限定するものではないが、温度条件としては９４℃〜９８℃が例示され、９６℃〜９８℃がより好適である。また、反応時間としては、５秒〜３０秒が例示され、１０秒〜１５秒がより好適である。前記条件は使用する試料や二本鎖ＲＮＡ量に応じて適宜調節すればよい。なお、熱変性Ｉの前に、ＰＣＲ反応液中の二本鎖ＤＮＡや二本鎖ＲＮＡを十分に解離させる観点から、熱変性（予備加熱）として、例えば、９４℃〜９６℃で、１分〜３分インキュベーションを行なうことができる。
【００２８】
ハイブリダイズの条件としては、特に限定するものではないが、温度条件としては７０℃〜８０℃が例示され、７０℃〜７５℃がより好適である。また、反応時間としては、３０秒〜１０分が例示され、５分〜１０分がより好適である。前記条件は使用する試料や二本鎖ＲＮＡ量に応じて適宜調節すればよい。
【００２９】
ハイブリダイズ後の反応液には、核酸Ａと二本鎖ＲＮＡに由来するホモ二本鎖と、核酸Ｂと二本鎖ＲＮＡに由来するヘテロ二本鎖が含有される。次いで、該反応液を熱変性ＩＩに供する。
【００３０】
熱変性ＩＩでは、核酸Ｂと二本鎖ＲＮＡとのハイブリダイゼーションが解離し、かつ、核酸Ａと二本鎖ＲＮＡとのハイブリダイゼーションが維持できる温度範囲内にてインキュベーションを行なう。即ち、核酸Ａと二本鎖ＲＮＡに由来するホモ二本鎖は前記温度範囲内でのインキュベーションでは解離せずに、核酸Ｂと二本鎖ＲＮＡに由来するヘテロ二本鎖のみが一本鎖に解離される。
【００３１】
なお、本発明では、ＰＣＲ条件検討の効率化の観点から、選択的に増幅を抑制したい核酸Ａの塩基配列について、ＤＮＡ−ＤＮＡ二本鎖のＴｍ値及びＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二本鎖のＴｍ値を予め測定もしくは算出しておくことが好ましい。核酸Ａとそれ以外の核酸配列（核酸Ｂ）の相同性が低い場合は、塩濃度や塩基配列等から理論的な計算により算出したＴｍ値を用いても差し支えない。なお、本明細書においてＴｍ値は、オリゴヌクレオチドの融解温度のことであり、ＳＹＢＲ ＧＲＥＥＮ  Ｉ等の蛍光色素を用いて、Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ等を使用して測定することができる。また、Ｔｍ値は塩基配列から最近接塩基対法又はＧＣ％法を使用して算出することができる。
【００３２】
熱変性ＩＩにおけるインキュベーションの条件としては、温度条件としては７９℃〜９２℃が例示され、８０℃〜９０℃がより好適、８３℃〜８７℃がさらに好適である。また、反応時間としては、３秒〜３０秒が例示され、５秒〜２０秒がより好適、１０秒〜１５秒がさらに好適である。前記条件はハイブリダイズにおける条件と比べて１０℃〜１５℃程度高い温度が望ましい。本発明では、熱変性ＩＩと熱変性Ｉにおけるインキュベーションの温度の違いから、熱変性ＩＩを低温度熱変性ともいう。
【００３３】
かくして、低温度熱変性後の反応液には、核酸Ａと二本鎖ＲＮＡに由来するホモ二本鎖と、ヘテロ二本鎖が解離して生じた核酸Ｂの一本鎖、二本鎖ＲＮＡの一本鎖が含有される。よって、該反応液をアニーリング、伸長反応に供することにより、核酸Ｂの増幅が可能となる。
【００３４】
アニーリング、伸長反応の条件としては、特に限定するものではないが、微生物叢解析のようにミスマッチの可能性もあるものも同時に増幅したい場合には、例えば、アニーリング温度条件として４８℃〜６０℃が例示され、４８℃〜５０℃がより好適である。また、アニーリング反応時間としては、２０秒〜３０秒が例示され、３０秒程度がより好適である。伸長反応における温度条件としては６８〜７２℃が好適である。また、伸長反応における反応時間としては、３０秒〜１分／１ｋｂが例示され、増幅対象が５００ｂｐ以下の場合は３０秒程度がより好適である。前記条件は使用する試料や二本鎖ＲＮＡ量に応じて適宜調節すればよい。
【００３５】
かくして、１サイクルのＰＣＲ反応を行うことができ、核酸Ａの増幅を抑制して、核酸Ｂの増幅を向上させることが出来る。なお、得られたＰＣＲ反応液は、前記熱変性Ｉに供して再びＰＣＲ反応を行うことができる。ＰＣＲは、例えば３０サイクル〜４０サイクルの温度サイクルで行えばよい。
【００３６】
なお、得られた核酸Ｂの定量や解析手法は特に限定されず、公知の方法に従って行なうことができる。例えば、ＣＯＬＤ−ＰＣＲ法によって増幅されたＤＮＡ断片を、さらに、ＧＣ−Ｃｌａｍｐを付加したプライマーを用いた通常のＰＣＲにより増幅後、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）法により確認することができる。
【００３７】
かくして、試料に含まれる主要二本鎖ＤＮＡ（核酸Ａ）以外の低含有二本鎖ＤＮＡ（核酸Ｂ）を選択的に増幅することが可能となる。よって、例えば、環境サンプルの試料を用いる場合、微生物群集構造における少数の微生物群を把握することが可能となり、ひいては微生物叢の解析が可能となる。
【００３８】
本発明では、前記の通り、核酸Ｂを選択的に増幅することができるので、本発明はまた、核酸Ｂの増幅効率の向上方法を提供する。
【００３９】
また、核酸Ｂが核酸Ａの多型である場合、本願発明は多型の検出方法を提供する。
【００４０】
本発明の多型の検出方法としては、多型を含む試料を用いて前記ＰＣＲ法を行なうものであれば特に限定はない。例えば、ゲノム由来の核酸を有する試料を用いる場合、増幅した核酸Ｂの多型を分析することにより、遺伝子解析を行なうことが可能となる。
【実施例】
【００４１】
以下、実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は下記実施例に制限されるものではない。
【００４２】
実施例１
モデル実験系として、当所保存菌株のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（１００３）及びＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ（５３１５）を用いて次の実験を行った。具体的には、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ及びＳ．ｐｏｍｂｅは、それぞれ、ＹＰＤ培地で培養し、菌体量が２×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬを超えたところで遠心分離により菌体を得た。得られた菌体から、Ｇｅｎとるくん（登録商標）（酵母用）Ｈｉｇｈ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ（タカラバイオ）を用いてｇｅｎｏｍｅ  ＤＮＡを抽出し、ＮａｎｏＤｒｏｐ  １０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により純度及び濃度を測定した。得られたｇｅｎｏｍｅ  ＤＮＡは重量比で等量混合し、混合溶液中のＤＮＡの総含有量が１０ｎｇ／μＬになるよう濃度を調整し、テンプレートＤＮＡサンプルとした。
【００４３】
ＰＣＲは、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ  Ｎｅｏ（ＴＯＹＯＢＯ）を使用し、サーマルサイクラ−は、ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、表２に示す反応液組成（プライマーの詳細は表３）で行った。温度サイクルは、最初の変性工程（予備加熱）を９６℃、３分で行った後、１サイクルの変性工程が９６℃で１５秒、アニール工程が５０℃で３０秒、鎖伸長工程が６８℃で３０秒とするサイクルを４０サイクル行った。なお、前記温度サイクルを、以降、「通常ＰＣＲサイクル」ともいう。なお、これにより２４５〜２６０塩基程度の増幅産物が得られた。
【００４４】
【表２】
0005924648.tif 000003
【００４５】
【表３】
0005924648.tif 000004
【００４６】
増幅産物をＤＧＧＥ法（Ｄ−ｃｏｄｅ  ｓｙｓｔｅｍ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）により、３０％〜７０％の変性剤濃度勾配（変性剤濃度１００％は７Ｍ  尿素、４０％  ホルムアミドを含む）で１００Ｖ、６０℃、１６ｈｒ泳動し、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのバンドを滅菌したパスツールピペットを用いて切り出した。得られたバンドはテンプレートＤＮＡとして、表４に示すＴ７プロモーター配列を付加したプライマーにより表２と同様の反応液組成で通常ＰＣＲサイクルを４０サイクル行い、得られた増幅産物をＮｕｃｌｅｏｓｐｉｎ（登録商標）Ｅｘｔｒａｃｔ  ＩＩ（ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ）により精製した。次に、これをテンプレートとして、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｔ７  Ｋｉｔ（ｆｏｒ  ｓｉＲＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，タカラバイオ）を用いて二本鎖ＲＮＡを合成した。
【００４７】
【表４】
0005924648.tif 000005
【００４８】
合成された二本鎖ＲＮＡは、エタノール沈殿によりペレットとして回収し、乾燥後、テンプレートＤＮＡ断片の除去のため、ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ  ＤＮａｓｅ  Ｉ（４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．６６ｍＭ  ＭｎＣｌ２）バッファー中で、ＤＮａｓｅ  Ｉ処理を３７℃で２ｈｒ行った。その後、二本鎖ＲＮＡは、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）ＲＮＡ  Ｃｌｅａｎ−ｕｐ  Ｋｉｔ（ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ）により精製し、１０％アクリルアミドゲルで、０．５×ＴＢＥ（４４．５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、４４．５ｍＭ  ホウ酸（試薬特級）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））を用いて１００Ｖ、９０分電気泳動を行い、ＧｅｌＲｅｄ（Ｂｉｏｔｉｕｍ）により３０分染色後、ＵＶトランスイルミネーターによりバンドを確認した。ＲＮＡの純度、サイズ及び濃度はｓｉＲＮＡ  Ｌａｄｄｅｒ  Ｍａｒｋｅｒ（タカラバイオ）と比較することで、確認した。
【００４９】
次に、ＣＯＬＤ−ＰＣＲを行った。先ず、ＣＯＬＤ−ＰＣＲ用のＤＮＡテンプレートを調製した。具体的には、前述で準備済みのＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ及びＳ．ｐｏｍｂｅのｇｅｎｏｍｅ  ＤＮＡ混合溶液（濃度：１０ｎｇ／μＬ）をテンプレートとして、表５に示すＧＣ−Ｃｌａｍｐ配列のないプライマーで表２と同様の反応液組成で通常ＰＣＲサイクルを４０サイクル行なった後、増幅産物をＮｕｃｌｅｏｓｐｉｎ（登録商標）Ｅｘｔｒａｃｔ  ＩＩ（ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ）により精製した。
【００５０】
【表５】
0005924648.tif 000006
【００５１】
得られた増幅産物を１ｎｇ／μＬに濃度を調整し、表５記載のプライマーセットを用いて表６の反応液組成でＰＣＲ（ＣＯＬＤ−ＰＣＲ）を行った。温度サイクルは、最初の変性工程（予備加熱）を９６℃、３分で行った後、１サイクルの変性工程（変性Ｉ工程）が９８℃で１０秒、ハイブリダイズ工程が７５℃で１０分、低温度変性工程（変性ＩＩ工程）が８６℃で１５秒、アニール工程が５０℃で３０秒、鎖伸長工程が６８℃で３０秒とするサイクルを４０サイクル行った（以下、この温度サイクルを「ＣＯＬＤ−ＰＣＲサイクル」という）。
【００５２】
【表６】
0005924648.tif 000007
【００５３】
得られた増幅産物は、ＤＧＧＥ法で解析するため、ＰＣＲ増幅断片にＧＣ−Ｃｌａｍｐを付加する必要があるため、再度Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ（登録商標）Ｅｘｔｒａｃｔ  ＩＩ  （ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ）により精製後、１ｎｇ／μＬに濃度を調整後、表３のプライマーを用いて表２に示す反応液組成で、通常ＰＣＲサイクルを４０サイクル行って、増幅産物（ＣＯＬＤ−ＰＣＲ産物ともいう）を得た。
【００５４】
一方、対比として、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ及びＳ．ｐｏｍｂｅのｇｅｎｏｍｅ  ＤＮＡ混合溶液（濃度：１０ｎｇ／μＬ）をテンプレートとして、表３のプライマーを用いて表２に示す反応液組成で通常ＰＣＲサイクルを４０サイクル行って、増幅産物（通常のＰＣＲ産物ともいう）を得た。
【００５５】
得られた各増幅産物を３０％〜７０％の変性剤濃度勾配ゲルでＤＧＧＥ法により電気泳動した。結果を図２に示す。通常のＰＣＲの増幅産物からは強く検出されているＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのバンド（レーン１）が、二本鎖ＲＮＡを用いて選択的に増幅を抑制したＣＯＬＤ−ＰＣＲによる増幅産物（レーン２）では非常に弱く検出されることが確認できた。
【００５６】
実施例２
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ及びＳ．ｐｏｍｂｅのｇｅｎｏｍｅ  ＤＮＡを用いて、初期の存在比率がどの程度異なっていても選択的増幅が見られるかを検討した。
【００５７】
具体的には、実施例１で抽出したｇｅｎｏｍｅ  ＤＮＡを重量比でＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ：Ｓ．ｐｏｍｂｅがそれぞれ１：１、１０：１、１００：１、１０００：１、１００００：１となるように混合し、ＤＮＡ混合溶液中のＤＮＡ総含有量がいずれも１０ｎｇ／μＬとなるように濃度を調整した。
【００５８】
実施例１と同様の手法で、ＧＣ−Ｃｌａｍｐ付プライマーを用いた通常のＰＣＲ産物及びＣＯＬＤ−ＰＣＲ産物を得た。
【００５９】
また、ＰＣＲのサイクル数による影響を検討するために、前記に加えて、以下の検討を行なった。具体的には、前記と同じｇｅｎｏｍｅ  ＤＮＡ混合溶液をテンプレートとして用い、ＧＣ−Ｃｌａｍｐなしのプライマー（表５）で表２に示す反応液組成で通常ＰＣＲサイクルを４０サイクル行った。その後、Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ（登録商標）Ｅｘｔｒａｃｔ  ＩＩ（ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ）により精製した増幅産物を１ｎｇ使用して、再度ＧＣ−Ｃｌａｍｐなしのプライマー（表５）で前記と同様に通常ＰＣＲサイクルを４０サイクル行った。次いで、Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ（登録商標）Ｅｘｔｒａｃｔ  ＩＩ（ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ）により精製したものを１ｎｇ使用して、さらに、ＧＣ−Ｃｌａｍｐ付のプライマー（表３）を使用して通常ＰＣＲサイクルを４０サイクル行ったものを用意した（通常のＰＣＲ産物−２）。
【００６０】
得られた各増幅産物を３０％〜７０％の変性剤濃度勾配ゲルでＤＧＧＥ法により電気泳動を行った。結果を図３に示す。レーン１〜５はｇｅｎｏｍｅ  ＤＮＡから直接ＧＣ−Ｃｌａｍｐ付のプライマーでＰＣＲを行ったときの増幅産物（通常のＰＣＲ産物）、レーン６〜１０は、通常のＰＣＲをＣＯＬＤ−ＰＣＲと同じサイクル数行ったときの増幅産物（通常のＰＣＲ産物−２）、レーン１１〜１５は、二本鎖ＲＮＡを用いたＣＯＬＤ−ＰＣＲを行ったときの増幅産物（ＣＯＬＤ−ＰＣＲ産物）である。ＣＯＬＤ−ＰＣＲでは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＤＮＡ断片の増幅が抑制され、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに対して、１万分の１程度しか存在しないＳ．ｐｏｍｂｅ由来のＤＮＡ断片が増幅されていることが確認できた。
【００６１】
実施例３
ワイン発酵過程では、初期にワイン酵母を添加するため、非常に多くの酵母菌体を含む。そのため、ワイン発酵過程のもろみ中から菌体を回収、ＤＮＡを抽出しＰＣＲ−ＤＧＧＥ法による解析を行うと、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅが主要なバンドとして検出される。そのような状態では、その他の少数しか存在していない微生物由来の増幅断片を検出することは容易ではない。そこで、ワインもろみという実環境サンプルを用いて本手法によるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ以外の微生物由来のバンドの検出を試みた。
【００６２】
赤ワイン発酵酵母添加初日及び酵母添加後８日目に、もろみからサンプリングを行い、１０，０００×ｇにより得られた沈澱画分から、ｎｕｃｌｅｉ  ｌｙｓｉｓ（ｐｒｏｍｅｇａ）及びｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてガラスビーズ法によりＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡは、ＮａｎｏＤｒｏｐ  １０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により濃度を測定し、１００ｎｇ／μＬとなるように濃度を調整した。
【００６３】
先ず、得られたＤＮＡについて通常のＰＣＲ産物を得た。具体的には、表３のプライマーセットを用いて、表７の反応液組成で、通常ＰＣＲサイクルを４０サイクル行って、通常のＰＣＲ産物を得た。
【００６４】
【表７】
0005924648.tif 000008
【００６５】
次に、得られたＤＮＡについてＣＯＬＤ−ＰＣＲ産物を得た。具体的には、プライマーセットは表５記載のＧＣ−Ｃｌａｍｐなしのものを使用し、表７の反応液組成で通常ＰＣＲサイクルを４０サイクル行い、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）Ｅｘｔｒａｃｔ  ＩＩ（ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ）により精製後、得られた増幅産物が１ｎｇ／μＬとなるよう調整した。その後、該増幅産物をＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを抑制するための二本鎖ＲＮＡを用いて、表５記載のプライマーセットを使用し、表６記載の反応液組成でＣＯＬＤ−ＰＣＲサイクルを４０サイクル行った。増幅産物は、再度ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）Ｅｘｔｒａｃｔ  ＩＩ（ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ）により精製後、濃度を測定し、１ｎｇ／μＬに調整した。最後に、ＤＧＧＥ法による解析のため、前述と同様に、表３記載のプライマーセットを用いて、表２記載の反応液組成で通常ＰＣＲサイクルを４０サイクル行いＧＣ−Ｃｌａｍｐ付のＰＣＲ産物（ＣＯＬＤ−ＰＣＲ産物）を調製した。
【００６６】
得られた各増幅産物を４０％〜５５％の変性剤濃度勾配ゲルでＤＧＧＥ法により電気泳動を行った。結果を図４に示す。レーン１、２は赤ワイン発酵開始日酵母添加直後のサンプルから得られたＤＮＡをテンプレートとして使用したものであり、レーン３、４は赤ワイン発酵開始８日目のサンプルから得られたＤＮＡを使用し、また、レーン１、３は通常のＰＣＲ産物を、レーン２、４はＣＯＬＤ−ＰＣＲ産物を示す。発酵開始８日目のサンプルから抽出したＤＮＡをテンプレートとした場合（レーン３と４の比較）、二本鎖ＲＮＡを用いたＣＯＬＤ−ＰＣＲを行うことにより、ワイン発酵開始時の酵母添加により強く検出されていたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のバンドが消失し、その他のバンドを検出できることが示された。
【００６７】
実施例４
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ及びＳ．ｐｏｍｂｅのｇｅｎｏｍｅ  ＤＮＡを用いて、本発明の手法が長鎖ＤＮＡ断片に対しても適用可能であるかを検討した。
【００６８】
具体的には、実施例１で抽出したＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ及びＳ．ｐｏｍｂｅのｇｅｎｏｍｅ  ＤＮＡ等量混合物を、表８記載のプライマーセットを用いて、表７の反応液組成で、通常ＰＣＲサイクルを４０サイクル行って、通常のＰＣＲ産物を得た。これにより、６１０〜６２０塩基程度の増幅産物が得られる。
【００６９】
【表８】
0005924648.tif 000009
【００７０】
別途、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのｇｅｎｏｍｅ  ＤＮＡを表９記載のプライマーセットを用いて、表７の反応液組成で、通常のＰＣＲを行い、実施例１と同様の方法で、本実施例に対応した二本鎖ＲＮＡを調製した。
【００７１】
【表９】
0005924648.tif 000010
【００７２】
上記で調製された通常のＰＣＲ産物の濃度を１ｎｇ／μＬに調整し、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの増幅を抑制するために新たに調製した二本鎖ＲＮＡを用いて、表１０の反応液組成でＣＯＬＤ−ＰＣＲを行った。
【００７３】
【表１０】
0005924648.tif 000011
【００７４】
長鎖になるにつれてＤＧＧＥにより明瞭なバンドを得ることが困難になることから、本実施例では、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅが内部配列にＫｐｎＩ切断ｓｉｔｅを持ち、Ｓ．ｐｏｍｂｅがＫｐｎＩ切断ｓｉｔｅを持たないことを利用して、ＫｐｎＩによる切断の有無で、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅかＳ．ｐｏｍｂｅを判断することとした。すなわち、通常のＰＣＲによる増幅産物はほぼ同一塩基長であり、アガロースゲル電気泳動では分離が困難であり、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ及びＳ．ｐｏｍｂｅの両方のバンドがほぼ同じ位置にバンドとして現われる。しかしながら、ＫｐｎＩで切断することにより、Ｓ．ｐｏｍｂｅは処理前と同じ位置に、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅはそれよりも短い位置にバンドが検出される。
【００７５】
具体的には、ＫｐｎＩはタカラバイオ社製を用い、１×Ｌバッファーを含む反応液２０μＬ当たり１０Ｕとなるよう使用し、処理は、３７℃で１時間行った。泳動した結果を図５に示す。ＫｐｎＩで処理しない場合、レーン２（通常のＰＣＲ産物）及びレーン３（本発明のＣＯＬＤ−ＰＣＲ産物）で同程度の長さのバンドが検出されていることから、いずれのＰＣＲ法でもＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ及びＳ．ｐｏｍｂｅのバンドが増幅されていることが分かる。レーン４（通常のＰＣＲ産物）及びレーン５（本発明のＣＯＬＤ−ＰＣＲ産物）の比較を行うと、レーン３では、ＫｐｎＩ処理をすることで、短いバンドが検出され、これがＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのバンドであり、そのまま残っているバンドは、Ｓ．ｐｏｍｂｅであると考えられ、レーン４では、ＫｐｎＩ処理で短い断片が検出されなくなったことから、バンドのほぼすべてがＳ．ｐｏｍｂｅであると考えられた。したがって、６００塩基程度の長鎖ＤＮＡに対しても本手法による選択的抑制は適用可能であることが示唆された。
【００７６】
実施例５
一塩基多型の検出
本発明の手法により一塩基多型を含む配列を野生型より優先的に増幅したい場合は、そのＴｍ値の差が非常に小さいことに留意する必要がある。すなわち、理論値で算出したＴｍ値を用いても選択的増幅ができないことが予想されるため、事前に正確なＴｍ値を測定しておくことが望ましい。一例としては、実際に使用するＰＣＲ反応液からプライマーと酵素を除いた溶液を作成し、ＳＹＢＲ  ＧＲＥＥＮ  Ｉ及びＲｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲを用いてそれぞれの正確なＴｍ値を算出し、ミスマッチを含むＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドの解離とパーフェクトマッチのＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドの解離の差が最も大きい温度を熱変性ＩＩの温度として使用することで、ミスマッチの存在する変異型を優先的に増幅することが可能である。したがって、Ｔｍ値の正確な測定と熱変性ＩＩの温度設定は行う必要があるものの、それ以外の点に関しては、その他の多型解析及び微生物叢解析を実施する際と同様の条件での実施が可能である。
【産業上の利用可能性】
【００７７】
本発明の核酸増幅方法によれば、任意の配列を持つ核酸断片の増幅を抑制し、それ以外の核酸断片を高効率に増幅することが可能となるため、遺伝子工学や分子生物学及びこれらに関連する産業分野において有用である。
【配列表フリーテキスト】
【００７８】
配列表の配列番号１は、ＧＣ−Ｃｌａｍｐ付のＮＬ１プライマーの塩基配列である。
配列表の配列番号２は、ＬＳ２プライマーの塩基配列である。
配列表の配列番号３は、Ｔ７プロモーター付のＮＬ１プライマーの塩基配列である。
配列表の配列番号４は、Ｔ７プロモーター付のＬＳ２プライマーの塩基配列である。
配列表の配列番号５は、ＧＣ−ＣｌａｍｐなしのＮＬ１プライマーの塩基配列である。
配列表の配列番号６は、ＮＬ４プライマーの塩基配列である。
配列表の配列番号７は、Ｔ７プロモーター付のＮＬ４プライマーの塩基配列である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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