(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的サンプルにおいて、ＣＤ３１膜貫通タンパク質の可溶性形態のなかから、該膜貫通タンパク質の分断された外部ドメインであって第６の細胞外免疫グロブリン様ドメインを欠損しているドメインを検出するための方法であって、該可溶性形態が、該膜貫通タンパク質の可溶性スプライスバリアントを含み、かつ該分断された外部ドメインを任意に含むものであり、該方法が、以下の工程：
ａ）該分断された外部ドメインおよび該スプライスバリアントの双方に存在する領域中に局在しているエピトープに特異的に結合する抗体（第１の識別抗体）に連結している第１の型のビーズを提供すること；
ｂ）該分断された外部ドメインに存在し、かつ該スプライスバリアントに存在しないか、または該スプライスバリアントに存在し、かつ該分断された外部ドメインに存在しないかのいずれかである領域中に局在しているエピトープに特異的に結合する抗体（第２の識別抗体）に連結している少なくとも１つの第２の型のビーズを提供すること；
ｃ）該分断された外部ドメインおよび該スプライスバリアントの双方に存在する領域に特異的に結合する蛍光標識リガンド（シグナル伝達リガンド）を提供すること；
ｄ）該抗体を、該膜貫通タンパク質の該可溶性形態を含有すると思われる生物学的サンプルに接触させること；
ｅ）各々の型のビーズについて、該蛍光標識リガンドとともに得られるシグナルを、フローサイトメトリーにより測定すること；ならびに
ｆ）各々の型のビーズについて得られたシグナルを比較すること；
を含み、
工程（ｅ）で測定されたシグナルにおける差異は、生物学的サンプルが該分断された外部ドメインを含むことを示す、方法。
【請求項２】
生物学的サンプルにおいて、ＣＤ３１膜貫通タンパク質の可溶性形態のなかから、該膜貫通タンパク質の分断された外部ドメインであって第６の細胞外免疫グロブリン様ドメインを欠損しているドメインを検出するための方法であって、該可溶性形態が、該膜貫通タンパク質の可溶性スプライスバリアントを含み、かつ該分断された外部ドメインを任意に含むものであり、該方法が、以下の工程：
ａ）該分断された外部ドメインおよび該スプライスバリアントの双方に存在する領域に特異的に結合するリガンド（補足リガンド）に連結しているビーズを提供すること；
ｂ）該分断された外部ドメインおよび該スプライスバリアントの双方に存在する領域中に局在しているエピトープに特異的に結合する第１の型の蛍光標識抗体（第１の識別抗体）を提供すること；
ｃ）該分断された外部ドメインに存在し、かつ該スプライスバリアントに存在しないか、または該スプライスバリアントに存在し、かつ該分断された外部ドメインに存在しないかのいずれかである領域中に局在しているエピトープに特異的に結合する少なくとも１つの第２の型の蛍光標識抗体（第２の識別抗体）を提供すること；
ｄ）該抗体を、該膜貫通タンパク質の該可溶性形態を含有すると思われる生物学的サンプルに接触させること；
ｅ）各々の蛍光標識について、該蛍光標識で得られるシグナルを、フローサイトメトリーにより測定すること；ならびに
ｆ）各々の蛍光標識について得られたシグナルを比較すること；
を含み、
工程（ｅ）で測定されたシグナルにおける差異は、生物学的サンプルが該分断された外部ドメインを含むことを示す、方法。
【請求項３】
以下である、請求項１または２記載の方法：
ｉ）該可溶性形態が、少なくとも３つの可溶性形態を含む；
ｉｉ）識別抗体が、該可溶性形態間を識別するような様式で選択される；ならびに
ｉｉｉ）補足リガンドまたはシグナル伝達リガンドが、全ての該可溶性形態に存在する領域に特異的に結合する。
【請求項４】
該補足リガンドまたはシグナル伝達リガンドが抗体である、請求項１〜３のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
該分断された外部ドメインに対応する該可溶性形態の百分率および／または量を算出する工程をさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
可溶性形態に対する分断された外部ドメインの比率、または可溶性形態に対する可溶性スプライスバリアントの比率のいずれかを算出する工程をさらに含む、請求項１〜５のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
第１の識別抗体が、ＣＤ３１の第１の細胞外免疫グロブリン様ドメイン中に局在しているエピトープに特異的に結合し、第２の識別抗体が、ＣＤ３１の第６の細胞外免疫グロブリン様ドメイン中に局在しているエピトープに特異的に結合する、請求項１〜６のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
識別抗体が、ＣＤ３１の第５の細胞外免疫グロブリン様ドメイン中に局在しているエピトープに特異的に結合する抗体をさらに含む、請求項７記載の方法。
【請求項９】
該生物学的サンプルが、血栓障害または自己免疫障害に罹患している、または罹患する危険性がある個体から得られる血漿である、請求項１〜８のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
個体が血栓障害に罹患しているかどうかを診断するための方法であって、該方法は、該個体の生物学的サンプルにおいて、ＣＤ３１の分断された外部ドメインであって第６の細胞外免疫グロブリン様ドメインを欠損しているドメインを検出する工程を含み、ＣＤ３１の該分断された外部ドメインの存在は、該個体が該血栓障害に罹患していることを示し、ＣＤ３１の該分断された外部ドメインを検出する該工程が、請求項１〜６のいずれか一項に規定される方法にしたがって行なわれ、該血栓障害は、アテローム性血栓症、アテローム性動脈硬化症、急性冠状動脈症候群、または末梢動脈疾患である、方法。
【請求項１１】
該個体における該障害の進行をモニターするために、および／または該個体における該障害の重篤性を評価するために、ＣＤ３１の分断された外部ドメインを検出する該工程が、少なくとも２つの異なる時点で繰り返される、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
以下を含む、診断キット：
ｉ）ＣＤ３１膜貫通タンパク質の分断された外部ドメインおよび該膜貫通タンパク質の可溶性スプライスバリアントの双方に存在する領域中に局在しているエピトープに特異的に結合する抗体に連結している第１の型のビーズ；
ｉｉ）該可溶性スプライスバリアントに存在し、かつ該分断された外部ドメインに存在しない領域中に局在しているエピトープに特異的に結合する抗体であって、ＣＤ３１の第６の細胞外免疫グロブリン様ドメイン中に局在しているエピトープに特異的に結合する抗体に連結している第２の型のビーズ；ならびに
ｉｉｉ）該分断された外部ドメインおよび可溶性該スプライスバリアントの双方に存在する領域中に局在しているエピトープに特異的に結合する蛍光標識抗体。
【請求項１３】
以下を含む、診断キット：
ｉ）ＣＤ３１膜貫通タンパク質の分断された外部ドメインおよび該膜貫通タンパク質の可溶性スプライスバリアントの双方に存在する領域中に局在しているエピトープに特異的に結合する抗体に連結しているビーズ；
ｉｉ）該可溶性スプライスバリアントに存在し、かつ該分断された外部ドメインに存在しない領域中に局在しているエピトープに特異的に結合し、ＣＤ３１の第６の細胞外免疫グロブリン様ドメイン中に局在しているエピトープに特異的に結合する第１の型の蛍光標識抗体；ならびに
ｉｉｉ）該分断された外部ドメインおよび可溶性該スプライスバリアントの双方に存在する領域中に局在しているエピトープに特異的に結合する第２の型の蛍光標識抗体。
【請求項１４】
個体が関節リウマチ又は脊椎関節症に罹患しているかどうかを診断するための方法であって、該方法は、該個体の生物学的サンプルにおいて、ＣＤ３１の分断された外部ドメインであって第６の細胞外免疫グロブリン様ドメインを欠損しているドメインを検出する工程を含み、ＣＤ３１の該分断された外部ドメインの存在は、該個体が該関節リウマチ又は脊椎関節症に罹患している、または罹患する危険性があることを示し、ＣＤ３１の該分断された外部ドメインを検出する該工程が、請求項１〜６のいずれか一項に規定される方法にしたがって行われる、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、血液白血球上に存在するＣＤ３１タンパク質の細胞外ドメインが分断され、かつ可溶性形態のＣＤ３１として循環中に放出されるという知見に起因する。分断ＣＤ３１を検出するための方法が、さらに開示される。したがって、本発明は、ＣＤ３１等の膜貫通タンパク質の分断された外部ドメインを検出するための方法、および診断ツールとしてのこのような方法の使用に関する。本発明はさらに、候補タンパク質が分子複合体の一部であるかどうかを決定するための方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
ＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ−１）
免疫応答は、血管接触面の細胞に排他的かつ構成的に発現している阻害性免疫レセプター、なかでもＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ−１）により制御され得る。
【０００３】
ＣＤ３１は、６個のＩｇ様細胞外ドメイン、短い膜貫通セグメントおよび２個の免疫チロシンベースの阻害性モチーフ（ＩｍｍｕｎｏＴｙｒｏｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ｍｏｔｉｆ：ＩＴＩＭ）を含有する細胞質テイルを含む単鎖分子からなる。ＣＤ３１の構造を、以下の表に示す。
【０００４】
【表Ａ】
0005866198.tif 000002
【０００５】
ＣＤ３１の結果として生じる推定免疫調節特性は、ＣＤ３１シグナル伝達が血液白血球の相互反発を誘起し、かつ自然および獲得免疫細胞の双方の阻害性シグナルと刺激性シグナルとの間の平衡を調節するという事実により支持される。ＣＤ３１の遠位Ｉｇ様細胞外ドメインの機械的な係合（ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ）は、そのＩＴＩＭのリン酸化により誘発される外側から内側への阻害性シグナル伝達、ならびにＳＨ２含有ホスファターゼの動員および活性化を誘導する。
【０００６】
Ｚｅｈｎｄｅｒら（非特許文献１）は、特異的かつ用量依存的な様式において混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を阻害するＣＤ３１抗体を同定した。彼らはさらに、この抗体のエピトープ（即ち、ＣＤ３１の２３個の膜近位アミノ酸）に対応するＣＤ３１ペプチドがＭＬＲを強力に阻害することを見出した。彼らは、ＣＤ３１の２３個の膜近位アミノ酸が機能的に重要な領域であり、そしてＣＤ３１ペプチドが結合性エピトープについて競合することによりリンパ球活性化に干渉すると仮定した。しかしながら、Ｚｅｈｎｄｅｒらは、ＣＤ３１媒介シグナル伝達がＣＤ３１ペプチドにより活性化されるかまたは阻害されるかを教示し得なかった。
【０００７】
Ｃｈｅｎら（非特許文献２）は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）のマウスモデルにおいて、このペプチドがこの疾患の発症を遅延させ、かつ長期生存を向上させることを示した。彼らは、ＣＤ３１ペプチドがＴ細胞活性化における通常の経路を阻害すると仮定した。また、Ｃｈｅｎらは、Ｔ細胞活性化においてＣＤ３１ペプチドにより果たされる役割を解明し得なかった。特に、これらの従来の研究は、ＣＤ３１シグナル伝達カスケードに対する、より正確には、ＣＤ３１  ＩＴＩＭのリン酸化状態に対するこのペプチドの推定効果を評価しなかった。
【０００８】
依然として未知の機構によって、ＣＤ３１は、所定の循環リンパ球上で「消失」している。その消失は、リンパ球の活性化の際に観察されており、そして、リンパ球のＣＤ３１シグナル伝達の非存在が、次いで、アテローム性血栓症の発症に関与する病的免疫応答を高めることが最近示されている。
【０００９】
膜貫通セグメントを欠損するバリアント転写物に起因する可溶性形態のＣＤ３１もまた、報告されており、したがって、循環ＣＤ３１の個々の量は、遺伝的に決定されると現在では考えられている。結果として、多数の従来の研究は、可溶性ＣＤ３１の血漿レベルとアテローム性血栓症または他の自己免疫疾患の危険性との間の相関性を見出すことを試みていた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｚｅｈｎｄｅｒら，１９９５，Ｂｌｏｏｄ，８５（５）：１２８２−８
【非特許文献２】Ｃｈｅｎら，１９９７，Ｂｌｏｏｄ，８９（４）：１４５２−９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかしながら、解析された特定の遺伝的多型とは無関係に、データは、広範な範囲の血漿ＣＤ３１値を示し、これらの異なる研究の結果は、相反していた。
【００１２】
したがって、ＣＤ３１の生物学的機能をより良く理解する必要性が存在する。これは、血栓障害および自己免疫障害等のＴ細胞活性化に関連付けられる疾患の診断のためのより良好なツールの提供を可能にする。
【００１３】
シグナル伝達経路を解析するための方法
３つの異なるアッセイが、シグナル伝達経路を解析するために、現在のところ利用可能である：共免疫沈降、続いてウエスタンブロット（共ＩＰ／ＷＢ）、シグナル伝達ＥＬＩＳＡアッセイの細胞活性化（ＣＡＳＥ）およびＣＢＡ  Ｆｌｅｘセット（ＢＤ）アッセイ。
【００１４】
共ＩＰ／ＷＢアッセイでは、細胞を溶解し、先ずタンパク質抽出を行う。次いで、研究用タンパク質を、会合するタンパク質と共免疫沈降させ、２Ｄ電気泳動を行う。最後に、ウエスタンブロット後に得られた膜を、標識抗体とハイブリダイズさせ、シグナルを検出する。したがって、それは、時間を浪費するアッセイである。膜を脱ハイブリダイズさせ、かつ別の標識抗体で再ハイブリダイズさせてもよいが、４回を超えるべきでない。したがって、４つのパラメータのみを、単一のサンプル／膜で解析してもよい。また、共ＩＰ／ＷＢアッセイは定性的であるが、定量的アッセイではない。最後に、当業者は、リン酸化状態において研究用タンパク質と会合したタンパク質を、未リン酸化状態において研究用タンパク質に会合したものと比較することを望む場合には、２つの別々の共ＩＰ／ＷＢアッセイを行わなければならない。
【００１５】
ＣＡＳＥ（スーパーアレイ）およびＰｈｏｓｐｈｌｏｗ（ＢＤ）アッセイは、共ＩＰ／ＷＢアッセイよりも、単純かつ迅速である。なぜならば、標識抗体は、溶解細胞ではなく、透過処理細胞を含むサンプルに添加されるためである。また、如何なるブロッティングも必要とされない。抗体を、蛍光団（Ｐｈｏｓｐｈｌｏｗ）で標識するか、または酵素を介して検出し（ＣＡＳＥ）、その活性を容易に測定することができる。しかしながら、これらのアッセイは、単一のサンプルで多くのパラメータを解析することを依然として可能にしない。なぜならば、限定された数の酵素のみが利用可能なためである。また、両アッセイは、共ＩＰ／ＷＢアッセイよりもはるかに特異的ではない。なぜならば、研究用分子は補足されず、したがって、シグナル伝達経路の異なる分子間の相互作用を決定することができないためである。ＰｈｏｓｐｈｌｏｗおよびＣＡＳＥアッセイは、所定のシグナル伝達経路のうちのどの分子が細胞に存在するか、または細胞中のリン酸化状態に存在するかを決定することを可能にするのみである。
【００１６】
ＣＢＡ  Ｆｌｅｘセット（ＢＤ）アッセイは、複数のシグナル伝達分子の同時決定を可能にするが、分子複合体の解析を可能にし得ず、したがって、特定のレセプター依存性シグナル伝達カスケードの決定は、不可能である。
【００１７】
したがって、共ＩＰ／ＷＢ、Ｐｈｏｓｐｈｌｏｗ／ＣＡＳＥおよびＣＢＡ  Ｆｌｅｘセットのそれぞれの利点を組み合せる、シグナル伝達経路を解析するための改善された方法の必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
（発明の説明）
この状況において、驚くべきことに、活性化／記憶Ｔリンパ球上のＣＤ３１の推測された消失が、実際には不完全であり、そして第５の細胞外Ｉｇ様ドメインと第６の細胞外Ｉｇ様ドメインとの間でのＣＤ３１の分断から生じることが見出された。次いで、ＣＤ３１の分断された細胞外ドメイン（「分断ＣＤ３１（ｓｈｅｄ  ＣＤ３１）」とさらに称する）は、循環中に放出され、そこで、それはＣＤ３１の可溶性スプライスバリアントと共に存在する。
【００１９】
また、アテローム性血栓症の高い危険性が、循環中における分断ＣＤ３１の増加およびスプライスバリアントＣＤ３１の減少と関連付けられること、ならびに循環ＣＤ３１の全体レベルと関連付けられないことが示された。
【００２０】
この知見は、強力な診断ツールの提供につながる。実際、これまでに市販されていた試験は、ＣＤ３１ドメイン１〜５に対する抗体の使用を介して血漿ＣＤ３１を検出していたので、それらは、ＣＤ３１の可溶性スプライスバリアント（６個全ての細胞外Ｉｇ様ドメインを含有する）と、ＣＤ３１の分断形態（ドメイン１〜５のみを含有する）との間を区別できなかった。一方、本明細書中に記載されるサブトラクティブ方法は、可溶性ＣＤ３１の２つの形態間を区別することを可能にし、生物学的サンプル中におけるそれらの各々の割合を正確に定量する。
【００２１】
さらに、このサブトラクティブ方法が、ＣＤ３１以外の膜貫通タンパク質の可溶性形態を解析するために、ならびに分子複合体およびシグナル伝達経路を解析するために（例、シグナル伝達経路が活性化されるか、またはそうではないか、ならびに／あるいは候補タンパク質が分子複合体の一部であるかどうかを決定するために）適応できることが見出された。
【００２２】
したがって、本発明は、本明細書中にさらに記載されるように、膜貫通タンパク質の分断された外部ドメインを検出および／または定量するための方法、個体が血栓障害または自己免疫障害に罹患しているかどうかを診断するための方法、診断キット、シグナル伝達経路が活性化されるかどうかを決定するための方法、ならびに候補分子が分子複合体の一部であるかどうかを決定するための方法を提供する。
【００２３】
本発明の方法は、ＥＬＩＳＡによる可溶性形態の検出等の先行技術の方法と比較して、多くの利点を有する。先ず、それらは、無制限に繰り返すことができる。実際、各ビーズは、個体の試験単位を示し、得られたビーズの数は、繰返し数に対応する。ＥＬＩＳＡ試験は、通常、２連または３連で行われる。しかしながら、本発明の方法により、少なくとも３００個の複製物（即ち、細胞測定ビーズ）を同時に得ることができる。第２に、本発明の方法は、時間を浪費しない。なぜならば、それらは、約３０分で行うことができるためである。第３に、必要とされる出発材料（例、生物学的サンプル）の量が非常に少ない（約５μｇ）。第４に、幾つかの異なる可溶性形態を、同じ生物学的サンプルにおいて同時に検出することができる。最後に、本発明の方法は、比色測定方法に対する蛍光方法により可能にされる広域範囲に起因して、ＥＬＩＳＡよりも感度が良い。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、健常ドナーからのヒト末梢血細胞の１０色フローサイトメトリー解析の代表的な例を示す。抗体である抗ＣＤ３１  ｄｏｍ１および抗ＣＤ３１  ｄｏｍ６のアイソタイプコントロールを、挿入図中に示す。リンパ球、単球および顆粒球を、ＦＳＣ／ＳＳＣ散乱内でゲートした。Ｂ（ＣＤ２０  Ａ７００＋）およびＴ（ＣＤ３  ＰＥ−ＴＲ＋）リンパ球を同定し、「リンパ球」内にゲートし、ＣＤ８＋（ＰｅｒＣＰ）およびＣＤ４＋（ＡＰＣ）亜集団を、Ｔリンパ球内にゲートした。ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＨＬＡ−ＤＲおよびＣＤ４５ＲＡの発現についてさらに解析し、それにより活性化（１）、記憶（２）およびナイーブ（３）細胞に細分割した。全ての白血球は、ＣＤ３１  ｄｏｍ６について陽性であった。ｄｏｍ１の欠損は、ナイーブ（３）から記憶（２）から活性化（１）Ｔ細胞へと増加した。
【図２ａ】図２ａは、リンパ球上のＣＤ３１の見かけ上の消失がその細胞外分断に起因することを示す。可溶化された細胞膜結合ＣＤ３１分子を、培養Ｊｕｒｋａｔ  ＣＤ４＋Ｔ細胞から抽出し、蛍光ビーズにカップリングした。ｄｏｍ１ビーズ結合分子の百分率は、休止状態では６％未満であり、ＴＣＲ係合５’後では９９％を超えている。
【図２ｂ】図２ｂは、リンパ球上のＣＤ３１の見かけ上の消失がその細胞外分断に起因することを示す。ＴＣＲ活性化Ｔ細胞の培養上清（）中、およびヒト血漿（）中の殆どの可溶性ＣＤ３１は、ｄｏｍ１〜ｄｏｍ５を含み、かつｄｏｍ６を欠損する単一の短縮型フラグメントからなる。ｄｏｍ５およびｄｏｍ６の双方を欠損する、無視し得るレベルの短縮型ＣＤ３１が、血漿中でのみ検出できた。
【図３ａ】図３ａは、ＣＤ３１ｓｈｅｄＴ上の残留細胞外フラグメントの同型のペプチドがＣＤ３１−ＩＴＩＭリン酸化を誘導することを示す。漸増用量のＣＤ３１ペプチド５５１〜５７４の存在下におけるヒト末梢血単核細胞のＴＣＲ係合に対する増殖応答。＊ｐ＜０．０５  ｖｓ  用量「０」。
【図３ｂ】図３ｂは、ＣＤ３１ｓｈｅｄＴ上の残留細胞外フラグメントの同型のペプチドがＣＤ３１−ＩＴＩＭリン酸化を誘導することを示す。培養Ｊｕｒｋａｔ  ＣＤ４＋Ｔ細胞からの可溶化された膜結合ＣＤ３１に対する６８６ＩＴＩＭリン酸化のフローサイトメトリー評価。可溶化されたタンパク質を、Ｅ９−ＰＥＣＡＭ−１．２（ｄｏｍ６）機能性ＣＢＡビーズにより補足し、検出を、抗ｐＹ６８６ウサギ血清、続いてＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８−抗ウサギ二次抗体により行った。柱状図は、２０００  Ｅ９−ＰＥＣＡＭ−１．２獲得ビーズに対するＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８（ｐＹ６８６）の中央蛍光強度（ＭＦＩ）±変動係数（ＣＶ％）の％を示す。Ｐｅｒｖａｎ＝陽性コントロール（ペルバナデート：ｐｅｒｖａｎａｄａｔｅ）；ＣＤ３／ＣＤ２８＝抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体（各１μｇ／ｍｌ）；ペプチド＝ＣＤ３１ペプチド５５１〜５７４（１００μＭ）。
【図４】図４は、本発明の方法の原理を説明する。
【図５】図５は、本発明の方法の原理を説明する。黒囲いが識別用抗体を表す。白囲いが補足またはシグナル伝達抗体を表す。
【図６ａ】図６ａは、分断ＣＤ３１が炎症疾患に対する診断および／または予後マーカーとして使用できることを示す。白囲いは、不良な予後の患者を示し、黒囲いは、良好な予後の患者を示す。「ＶＳ」は、赤血球の沈降速度を示す。「ＣＲＰ」は、Ｃ反応性タンパク質を示す。「ｓＣＤ３１全体」は、本発明の方法で測定された、ＣＤ３１の可溶性形態の全体レベルを示す。「ｓＣＤ３１ｃｌｉｖｅ」は、本発明の方法で測定された、ＣＤ３１の分断された外部ドメインを示す。
【図６ｂ】図６ｂは、本発明の方法がＧＰＶＩの分断された外部ドメインを測定するために使用できることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
分断された外部ドメインの検出
タンパク質の異なる可溶性アイソフォーム間の鑑別を可能にする方法が、開発された。この方法は、細胞測定ビーズで標識された抗体および蛍光標識抗体の同時使用に基づく。次いで、標識抗体は、フローサイトメトリーにより検出される。簡潔には、可溶性アイソフォームを含むサンプルは、解析されるべき全ての可溶性アイソフォームに結合する第１の標識抗体（「補足抗体」または「シグナル伝達抗体」と称する）と接触される。サンプルはまた、幾つかの可溶性アイソフォームのみに結合する標識「識別抗体」と接触される。次いで、サンプルは、フローサイトメトリーにより解析され、当該サンプル中のアイソフォームの各々の割合が、算出される。
【００２６】
したがって、本発明は、生物学的サンプルにおいて、膜貫通タンパク質の可溶性形態のなかから、当該膜貫通タンパク質の分断された外部ドメインを検出するための方法を提供する。ここで、当該可溶性形態は、当該膜貫通タンパク質の可溶性スプライスバリアントを含み、かつ当該分断された外部ドメインを任意に含む。この方法は、以下の工程を含む：
ａ）当該分断された外部ドメインおよび当該スプライスバリアントの双方に存在する領域中に局在しているエピトープに特異的に結合する抗体に連結している第１の型のビーズを提供すること；
ｂ）当該分断された外部ドメインに存在し、かつ当該スプライスバリアントに存在しないか、または当該スプライスバリアントに存在し、かつ当該分断された外部ドメインに存在しないかのいずれかである領域中に局在しているエピトープに特異的に結合する抗体に連結している少なくとも第２の型のビーズを提供すること；
ｃ）当該分断された外部ドメインおよび当該スプライスバリアントの双方に存在する領域に特異的に結合する蛍光標識リガンドを提供すること；
ｄ）当該抗体を、当該膜貫通タンパク質の当該可溶性形態を含有すると思われる生物学的サンプルに接触させること；
ｅ）各々の型のビーズについて、当該蛍光標識で得られるシグナルを、フローサイトメトリーにより測定すること；ならびに
ｆ）各々の型のビーズについて得られたシグナルを比較すること。
ここで、工程（ｅ）で測定されたシグナルにおける差異は、生物学的サンプルが当該分断された外部ドメインを含むことを示す。好ましい実施形態では、先ず、生物学的サンプルは、ビーズ連結抗体と接触され、次いで、ビーズは、回収され、蛍光標識リガンドと接触される。
【００２７】
上記方法では、分断された外部ドメインは、シグナル伝達リガンドとして、１つの単一の蛍光標識リガンド、および識別抗体として、少なくとも２つの型のビーズ連結抗体を用いて検出される。
【００２８】
あるいは、分断された外部ドメインは、補足リガンドとして、１つの型のビーズ連結リガンド、および識別抗体として、少なくとも２つの蛍光標識抗体を用いて検出されてもよい。
【００２９】
生物学的サンプルにおいて、膜貫通タンパク質の可溶性形態のなかから、当該膜貫通タンパク質の分断された外部ドメインを検出するためのこのような方法（ここで、当該可溶性形態は、当該膜貫通タンパク質の可溶性スプライスバリアントを含み、かつ当該分断された外部ドメインを任意に含む）は、以下の工程を含む：
ａ）当該分断された外部ドメインおよび当該スプライスバリアントの双方に存在する領域に特異的に結合するリガンドに連結しているビーズを提供すること；
ｂ）当該分断された外部ドメインおよび当該スプライスバリアントの双方に存在する領域中に局在しているエピトープに特異的に結合する第１の型の蛍光標識抗体を提供すること；
ｃ）当該分断された外部ドメインに存在し、かつ当該スプライスバリアントに存在しないか、または当該スプライスバリアントに存在し、かつ当該分断された外部ドメインに存在しないかのいずれかである領域中に局在しているエピトープに特異的に結合する少なくとも第２の型の蛍光標識抗体を提供すること；
ｄ）当該抗体を、当該膜貫通タンパク質の当該可溶性形態を含有すると思われる生物学的サンプルに接触させること；
ｅ）各々の蛍光標識抗体について、当該蛍光標識で得られるシグナルを、フローサイトメトリーにより測定すること；ならびに
ｆ）各々の蛍光標識抗体について得られたシグナルを比較すること。
ここで、工程（ｅ）で測定されたシグナルにおける差異は、生物学的サンプルが当該分断された外部ドメインを含むことを示す。この方法では、各々の型の蛍光標識抗体は、異なる標識で標識される。したがって、第２の型の蛍光標識抗体の標識は、第１の型の蛍光標識抗体の標識とは異なる。この方法の枠組みでは、ビーズは、好ましくは、蛍光標識されていない。好ましい実施形態では、先ず、生物学的サンプルは、ビーズ連結リガンドと接触され、次いで、ビーズは、回収され、蛍光標識抗体と接触される。
【００３０】
生物学的サンプルにおいて、膜貫通タンパク質の可溶性形態のなかから、当該膜貫通タンパク質の分断された外部ドメインを検出するための上記方法はさらに、当該分断された外部ドメインに対応する当該可溶性形態の割合、百分率および／または量を算出する工程、ならびに／あるいは測定されたシグナルを、既知量の当該分断された外部ドメインおよび当該可溶性スプライスバリアントを含む少なくとも１つの生物学的サンプルで得られたものと比較する工程、ならびに／あるいは可溶性形態（即ち、全ての可溶性アイソフォームまたは「総可溶性形態」）に対する分断された外部ドメイン（またはスプライス形態）の比率を算出する工程を含んでいてもよい。
【００３１】
本明細書中で用いられる場合、用語「ビーズ」とは、フローサイトメトリーにおける使用のための細胞測定ビーズをいう。本発明の方法では、異なる型のビーズとは、互いに区別可能なビーズをいう。このようなビーズは、例えば、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）により市販されているＢＤ（登録商標）  細胞測定ビーズに対応していてもよい。ビーズは、当該分野において周知であり、以下にさらに記載される。
【００３２】
フローサイトメーターは、光散乱および粒子の蛍光に基づく粒子の特徴付けを可能にする。フローサイトメーターでは、粒子は、各粒子を励起光、代表的には１つ以上のレーザーに曝すことによって個別に解析され、粒子の光散乱および蛍光特性が測定される。分子、被験物結合ビーズ、個別の細胞またはそれらの亜成分等の粒子が、代表的には、スペクトルの異なる１つ以上の蛍光色素で標識され、検出が、光検出器の多重性（検出されるべき各々の異なる色素に対するもの）を用いて行われる。フローサイトメーターは、例えば、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，Ｃａｌｉｆ．）から市販されている。フローサイトメトリーの開発の初期には、種々の型のリガンド結合アッセイが、結合対の一方のメンバーでコーティングされたビーズ（微粒子とも称する）を用いて行うことができると認識されていた。コーティングされたビーズおよびレポーターは、ビーズ−被験物−レポーター複合体の形成を可能にするために、目的の被験物を含有する（または含有することが疑われる）サンプルと共にインキュベートされる。フローサイトメトリーによる解析は、ビーズ−被験物−レポーター複合体の存在を検出すること、およびサンプル中に存在する被験物の定量的測定として、複合体に付随するレポーターの蛍光の量を同時に測定することの双方を可能にする。フローサイトメトリーの開発の初期には、サンプル中の複数の被験物の同時解析は、区別可能なビーズのセット（各々の型のビーズが、独特の被験物特異的な結合剤でコーティングされている）を用いて行うことができるとも認識されていた。ビーズのセットおよび蛍光標識レポーター試薬（検出されるべき被験物の各々の種に対するもの）は、存在する各被験物についてのビーズ−被験物−レポーター複合体の形成を可能にするために、目的の被験物を含有するサンプルと共にインキュベートされ、生じた複合体は、サンプル中に存在する被験物を同定するために、および必要に応じて、定量するために、フローサイトメトリーにより解析される。複合体に結合した被験物の同一性は、ビーズの同一性により示されるため、複数の被験物が、全てのレポーター試薬について同じ蛍光団を用いて同時に検出することができる。
【００３３】
区別可能な微粒子のセットを作製および使用する多数の方法が、刊行物に記載されている。これらとしては、サイズにより区別可能なビーズであって、各々のサイズの微粒子が異なる標的特異的抗体でコーティングされているもの（例、ＦｕｌｗｙｌｅｒおよびＭｃＨｕｇｈ，１９９０，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３３：６１３−６２９を参照）、種々の濃度で２つ以上の蛍光色素を有するビーズであって、ビーズが蛍光色素のレベルによって識別されるもの（例、欧州特許出願第０  １２６，４５０号を参照）、ならびに２つの異なる色素で区別可能に標識されたビーズであって、ビーズが各々の色素の蛍光強度を別々に測定することにより識別されるもの（例、米国特許第４，４９９，０５２号および同第４，７１７，６５５号を参照）が挙げられる。
【００３４】
フローサイトメトリーによる複数の被験物の同時解析のための一次元アレイおよび二次元アレイの双方が、市販されている。蛍光強度のレベルにより区別可能である単一の色素を付されたビーズの一次元アレイの例としては、ＢＤ（登録商標）細胞測定ビーズアレイ（ＣＢＡ）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，Ｃａｌｉｆ．）およびＣｙｔｏ−Ｐｌｅｘ（登録商標）フローサイトメトリーマイクロスフェア（Ｄｕｋｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる。蛍光強度（５つのレベル）およびサイズ（２つのサイズ）の組合せにより区別可能であるビーズの二次元アレイの例は、ＱｕａｎｔｕｍＰｌｅｘ（登録商標）マイクロスフェア（Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｆｉｓｈｅｒ，Ｉｎｄ．）である。２つの色素の各々の蛍光のレベルにより区別可能である二重に色素を付されたビーズの二次元アレイの例は、Ｆｕｌｔｏｎら（１９９７，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４３（９）：１７４９−１７５６）に記載されている。
【００３５】
本明細書中で用いられる場合、用語「特異的結合」は、当該分野内におけるその通常の意味を有する。分子が別の分子に特異的に結合するかどうかの事実は、一般に、競合的な結合アッセイによって決定される。
【００３６】
生物学的サンプルは、例えば、血漿、血液または尿に対応していてもよい。生物学的サンプルは、好ましくは、血漿に対応する。最も好ましくは、生物学的サンプルは、血栓障害または自己免疫障害に罹患している、または罹患する危険性がある個体から得られる。
【００３７】
「リガンド」は、天然リガンド、抗体またはアプタマーを意味する。リガンドは、好ましくは、分断された外部ドメインおよびスプライスバリアントの双方に存在する領域中に局在しているエピトープに特異的に結合する抗体である。
【００３８】
本明細書中で用いられる場合、用語「抗体」とは、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体の双方をいう。抗体は、好ましくは、モノクローナル抗体である。しかしながら、それはまた、ポリクローナル抗体に対応していてもよい。
【００３９】
蛍光標識リガンドおよび／または抗体は、例えば、ＦＩＴＣ（ＦＬ１）、ＰＥ（ＦＬ２）、青色レーザーにおける使用のための蛍光団（例、ＰｅｒＣＰ、ＰＥ−Ｃｙ７、ＰＥ−Ｃｙ５、ＦＬ３およびＡＰＣまたはＣｙ５、ＦＬ４）、赤色、紫色またはｕｖレーザーにおける使用のための蛍光団（例、パシフィック・ブルー、パシフィック・オレンジ）等の、当該分野において知られている任意の蛍光化合物で標識されてもよい。最適化された方法としては、ビーズおよび検出抗体についての異なる発光スペクトルが挙げられる。抗体は、好ましくは、直接的に標識される。しかしながら、それはまた、特に抗体がポリクローナル抗体である場合に、間接的に標識されてもよい。
【００４０】
本明細書中で用いられる場合、用語「膜貫通タンパク質の分断された外部ドメイン」とは、タンパク質溶解プロセスにより切断された、膜貫通タンパク質の細胞外部分をいう。分断された外部ドメインが存在する膜貫通タンパク質の例としては、Ｌ−セレクチン（Ａｓｉｍａｋｏｐｏｕｌｏｓら，Ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ，２０００．１５（６）：ｐ．４９５−９）、ＩＣＡＭ−１（Ｂｅｃｋｅｒら，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９１．１４７（１２）：ｐ．４３９８−４０１）、ＶＣＡＭ−１（Ｇａｒｔｏｎら，ＳＪ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２００３．２７８（３９）：ｐ．３７４５９−６４）、ＶＣＡＭ−１レセプター（Ｂｅｌｇｏｒｅら，Ａｍ  Ｊ  Ｃａｒｄｉｏｌ，２００１．８７（６）：ｐ．８０５−７，Ａ９）、Ｐ−セレクチン（Ｄｏｌｅら，Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ，２００７．９８（４）：ｐ．８０６−１２）、ＣＤ４０（Ｃｏｎｔｉｎら．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２００３．２７８（３５）：ｐ．３２８０１−９）、ＣＤ２３（Ｇｕら，Ｂｌｏｏｄ，１９９８．９２（３）：ｐ．９４６−５１）、ＣＤ２１（Ｆｒｅｍｅａｕｘ−Ｂａｃｃｈｉら，ｌｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９８．１０（１０）：ｐ．１４５９−６６）、ＨＬＡ−Ｅ（Ｄｅｒｒｅら，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００６．１７７（５）：ｐ．３１００−７）、ＮｇＲ（Ａｈｍｅｄら，Ｆａｓｅｂ  Ｊ，２００６．２０（１１）：ｐ．１９３９−４１）、肝細胞増殖因子（Ｗａｊｉｈら  Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ，２００２．９０（１）：ｐ．４６−５２）、ＩＬ−６Ｒ（Ｆｒａｎｃｈｉｍｏｎｔら，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ，２００５．５２（１）：ｐ．８４−９３）、ＴＮＦａ（Ｆａｂｒｉｓら，Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９９．１１７（３）：ｐ．５５６−６０）、ＩＬ−４Ｒ（Ｓｉｌｖｅｓｔｒｉら，Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ，２００６．１４（７）：ｐ．７１７−９）、ＩＬ−１Ｒ（Ｂｅｃｋら，Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９４．３１（１７）：ｐ．１３３５−４４）、トランスフェリンレセプター（Ｃｈｉｔａｍｂａｒら，Ｂｌｏｏｄ，１９９１．７８（９）：ｐ．２４４４−５０）、ならびに免疫グロブリンの共通ガンマ鎖（Ｍｅｉｓｓｎｅｒら，Ｂｌｏｏｄ，２００１．９７（１）：ｐ．１８３−９１）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４１】
本発明の好ましい実施形態では、膜貫通タンパク質は、ＣＤ３１である。
【００４２】
本明細書中で用いられる場合、用語「ＣＤ３１」とは、ＣＤ３１抗原またはＰＥＣＡＭ−１とも称される血小板／内皮細胞接着分子をいう。このタンパク質は、任意の由来であってもよく、好ましくは、哺乳動物に由来し、最も好ましくは、ヒトに由来する。ヒトでは、ＣＤ３１をコードする遺伝子は、ローカス１７ｑ２３に局在する。ヒト野生型ＣＤ３１の配列は、配列番号１として示される。しかしながら、本発明はまた、その対立遺伝子バリアント、および他の種におけるそのホモログに関する。
【００４３】
図５および配列番号１についての配列表（ヒトＣＤ３１）に示されるように、ＣＤ３１タンパク質は、６つの細胞外免疫グロブリン様（Ｉｇ様）ドメインを含む。また、ＣＤ３１は、膜貫通タンパク質としてのみではなく、６つの細胞外Ｉｇ様ドメインを含む可溶性スプライスバリアントとしてもまた存在する（Ｇｏｌｄｂｅｒｇｅｒら  １９９４．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６９：１７１８３−１７１９１を参照）。
【００４４】
予想外なことに、可溶性形態のＣＤ３１は、第１、第２、第３、第４および第５の細胞外Ｉｇ様ドメインを含む、分断された外部ドメインを含むことが見出された。したがって、第６の細胞外Ｉｇ様ドメインは、可溶性スプライスバリアント中に存在するが、分断された外部ドメインには存在しない。
【００４５】
したがって、本発明の好ましい実施形態は、生物学的サンプルにおいて、可溶性形態のＣＤ３１のなかから、ＣＤ３１の分断された外部ドメインを検出するための方法に関する。ここで、少なくとも２つの識別抗体が用いられ、一方は、ＣＤ３１の初めの５つの細胞外免疫グロブリン様ドメイン中のいずれかに局在しているエピトープに特異的に結合し、他方は、ＣＤ３１の第６の細胞外免疫グロブリン様ドメイン中に局在しているエピトープに特異的に結合する。補足またはシグナル伝達リガンドは、例えば、ＣＤ３１の第１および／または第２の細胞外免疫グロブリン様ドメインに特異的に結合してもよい。シグナル伝達リガンドの補足は、好ましくは、補足またはシグナル伝達抗体であり、これは、例えば、ＣＤ３１の第１および／または第２の細胞外免疫グロブリン様ドメイン中に局在しているエピトープに特異的に結合してもよい。
【００４６】
このような抗体は、当該分野において周知であり、例えば、ＨＬＤＡ抗体データベース（ワールドワイドウェブページ９９．ｍｈ−ｈａｎｎｏｖｅｒ．ｄｅ／ａｋｔｕｅｌｌｅｓ／ｐｒｏｊｅｋｔｅ／ｈｌｄａ７／ｈｌｄａｂａｓｅ／ＣＤ３１．ｈｔｍを参照）において列挙されている抗体のいずれか１つに対応していてもよい。
【００４７】
本明細書中で用いられる場合、用語「ＣＤ３１の第６の細胞外免疫グロブリン様ドメイン中に局在しているエピトープ」とは、配列番号１のアミノ酸４９９〜６０１以内、即ち、ＣＤ３１の第６の細胞外免疫グロブリン様ドメイン（配列番号１のアミノ酸４９９〜５９１）以内および／または膜近傍領域（配列番号１の５９２〜６０１）以内に局在しているエピトープをいう。好ましくは、当該エピトープは、配列番号１のアミノ酸４９９〜５９１、５２４〜６０１、または５２４〜５３８以内に局在している。好ましい実施形態では、ＣＤ３１の第６の細胞外免疫グロブリン様ドメイン中に局在しているエピトープに特異的に結合する抗体は、ＰＥＣＡＭ  １．２抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）に対応する。ＰＥＣＡＭ  １．２抗体は、例えば、Ｙａｎら（Ｃｅｌｌ  Ａｄｈｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ３：４５−６６）に記載されている。
【００４８】
本明細書中で用いられる場合、用語「ＣＤ３１の初めの５つの細胞外免疫グロブリン様ドメイン中のいずれかに局在しているエピトープ」とは、配列番号１のアミノ酸２８〜４９３以内、最も好ましくは、配列番号１の３４〜４９３以内に局在しているエピトープをいう。本発明の好ましい実施形態では、当該エピトープは、ＣＤ３１の第５の細胞外免疫グロブリン様ドメイン中に、あるいはＣＤ３１の第１および／または第２の細胞外免疫グロブリン様ドメイン中に局在している。
【００４９】
本明細書中で用いられる場合、用語「ＣＤ３１の第５の細胞外免疫グロブリン様ドメイン中に局在しているエピトープ」とは、配列番号１のアミノ酸４２４〜４９３以内に局在しているエピトープをいう。好ましくは、当該エピトープは、配列番号１の４４８〜４７０以内に局在している。好ましい実施形態では、ＣＤ３１の第５の細胞外免疫グロブリン様ドメイン中に局在しているエピトープに特異的に結合する抗体は、ＭＥＭ−０５抗体（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）に対応する。
【００５０】
本明細書中で用いられる場合、用語「ＣＤ３１の第１および／または第２の細胞外免疫グロブリン様ドメイン中に局在しているエピトープ」とは、配列番号１のアミノ酸３４〜２３３以内に局在しているエピトープをいう。ＣＤ３１の第１の細胞外免疫グロブリン様ドメイン中に局在しているエピトープは、好ましくは、配列番号１の配列番号４９〜６８以内に局在している。ＣＤ３１の第１の細胞外免疫グロブリン様ドメイン中に局在しているエピトープは、好ましくは、配列番号１のアミノ酸１６６〜１８７以内に局在している。好ましい実施形態では、ＣＤ３１の初めの２つの細胞外免疫グロブリン様ドメイン中に局在しているエピトープに特異的に結合する抗体は、ＷＭ５９抗体（ドメイン２，ＢＤ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、ＪＣ７０Ａ抗体（ドメイン１，ＤＡＫＯ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）、または９Ｇ１１抗体（ドメイン１，Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＵＳＡ）に対応する。ＷＭ５９およびＪＣ７０Ａ抗体は、例えば、Ｆａｗｃｅｔｔら（Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １２８：１２２９−１２４１）に記載されている。
【００５１】
膜貫通タンパク質の当該可溶性形態としては、例えば、さらなる可溶性スプライスバリアント、さらなる分断された外部ドメイン、またはタンパク質溶解プロセスにより生じたバリアントに対応する、さらなる可溶性形態が挙げられてもよい。可溶性形態が少なくとも３つの可溶性形態を含む場合、２つよりも多くの識別抗体が用いられてもよい。この実施形態では、識別抗体は、可溶性形態間を識別するような様式において選択され、補足またはシグナル伝達抗体は、全ての当該可溶性形態に存在する領域中に局在しているエピトープに特異的に結合する。
【００５２】
５つの血漿サンプルからのデータは、殆どの循環している分断ＣＤ３１がＩｇ様ドメイン１〜５を含むことを示した。しかしながら、Ｉｇ様ドメイン５は、１６％までの血漿ＣＤ３１において存在し得なかった。このことは、１つよりも多くの切断部位が細胞外ＣＤ３１ドメインに存在し得ることを示す。したがって、ＣＤ３１の全ての可溶性形態間を鑑別するためのより正確な試験はまた、ＣＤ３１のＩｇ様ドメイン５および６の検出に加えて、Ｉｇ様ドメイン１の検出を含む。したがって、生物学的サンプルにおいて、ＣＤ３１の可溶性形態のなかから、ＣＤ３１の分断された外部ドメインを検出するための方法は、ＣＤ３１の第１および／または第２の細胞外免疫グロブリン様ドメイン中、ＣＤ３１の第５の細胞外免疫グロブリン様ドメイン中、ならびにＣＤ３１の第６の細胞外免疫グロブリン様ドメイン中に局在しているエピトープにそれぞれ特異的に結合する、３つの識別抗体の使用を含んでいてもよい。この実施形態では、補足またはシグナル伝達抗体は、ＣＤ３１の第１および／または第２の細胞外免疫グロブリン様ドメイン中に局在しているエピトープに特異的に結合しなければならない。
【００５３】
ＣＤ３１の分断された外部ドメインを検出するための方法はさらに、ＣＤ３１の当該分断された外部ドメインに対応する当該可溶性形態の割合、百分率および／または量を算出する工程、ならびに／あるいは測定されたシグナルを、既知量の当該分断された外部ドメインおよび当該可溶性スプライスバリアントを含む少なくとも１つの生物学的サンプルで得られたものと比較する工程を含んでいてもよい。例えば、算出は、例えば、実施例１における「可溶性ＣＤ３１のサブトラクティブ測定」との表題を付された段落に記載されるように行うことができる。ＣＤ３１の分断された外部ドメインを検出するための方法は、好ましくは、総可溶性形態に対する分断された外部ドメインの比率、即ち、全ての可溶性アイソフォーム（ドメイン１〜６を含む可溶性アイソフォーム、ドメイン１〜５を含む可溶性アイソフォーム、およびドメイン１〜２を含む可溶性アイソフォーム）に対する分断ＣＤ３１の比率を算出する工程を含む。
【００５４】
図４は、ＣＤ３１の分断された外部ドメインの検出および定量についての本発明の方法を説明する。第１、第５または第６の細胞外Ｉｇ様ドメイン中に局在しているエピトープにそれぞれ特異的に結合する抗体に連結されている３つの型のビーズが、用いられる。蛍光標識抗体は、第１および第２の細胞外Ｉｇ様ドメインに局在しているエピトープに特異的に結合する。各ビーズについて得られたシグナルの強度の測定に基づく単純なサブトラクティブ算出は、ＣＤ３１の可溶性形態の各々のそれぞれの割合を定量することを可能にする：
−ドメイン１〜６を含む可溶性アイソフォーム＝ａＣＤ３１ｄ６
−ドメイン１〜５を含む可溶性アイソフォーム＝ａＣＤ３１ｄ５−ａＣＤ３１ｄ６
−ドメイン１〜２を含む可溶性アイソフォーム＝ａＣＤ３１ｄ１−（ａＣＤ３１ｄ５＋ａＣＤ３１ｄ６）
【００５５】
上記方法は、生物学的流体中に可溶である分断された外部ドメインを検出することを目的とする。しかしながら、これらの方法は、当該膜貫通タンパク質を発現している細胞上の膜貫通タンパク質（例、ＣＤ３１ｓｈｅｄ）の分断されたアイソフォームを検出するために適応されてもよい。その場合には、識別抗体は、分断されたアイソフォームおよび全長の膜貫通タンパク質の双方に存在する領域（例、Ｉｇ様ドメイン６）中、あるいは分断されたアイソフォームまたは全長の膜貫通タンパク質のいずれかに存在する領域（例、Ｉｇ様ドメイン１〜２）中のいずれかに局在しているエピトープに特異的に結合する。本発明のこの局面は、実施例２、図１および図２ａにより、ＣＤ３１について説明される。
【００５６】
本発明の別の好ましい実施形態では、膜貫通タンパク質は、ＧＰＶＩである。
【００５７】
本明細書中で用いられる場合、用語「ＧＰＶＩ」とは、血小板糖タンパク質ＶＩをいう。このタンパク質は、任意の由来であってもよく、好ましくは哺乳動物に由来し、最も好ましくはヒトに由来する。ヒト野生型ＧＰＶＩの配列は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ９ＨＣＮ６に示されている。用語「ＧＰＶＩ」は、野生型配列、スプライスおよび対立遺伝子バリアント等のそのバリアント、ならびに他の種におけるそれらのホモログを包含する。
【００５８】
ＧＰＶＩの可溶性形態は、細胞質テイルを含み、したがって、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）−ＧＰＶＩ細胞質テイルの融合タンパク質に対して惹起されたもの（例、Ｓｕｚｕｋｉ−Ｉｎｏｕｅら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００２  ２７７：２１５６１−６６）等の特異的抗体を用いて検出することができる。対照的に、ＧＰＶＩの分断された形態は、全ての外部ドメインを含む。適切な抗外部ドメイン抗体の例としては、ＷＯ／２００１／０００８１０に開示されているクローン１１Ａ１２、６Ｂ１２、３ｊ２４．２および９Ｏ１２．２が挙げられる）。ＧＰＶＩ天然リガンドであるコンブルキシンは、ＧＰＶＩのスプライス形態および分断された形態の双方に結合する。
【００５９】
したがって、ＧＰＶＩの分断された外部ドメインの検出は、以下のいずれかを用いて行うことができる：
−識別抗体として、異なる型のビーズに連結されている抗テイルおよび抗外部ドメイン抗体、ならびにシグナル伝達リガンドとして、蛍光標識されたコンブルキシン、あるいは
−補足リガンドとして、コンブルキシンにカップリングしたビーズ、ならびに識別抗体として、差示的に標識された蛍光抗テイルおよび抗外部ドメイン抗体。
【００６０】
また、上記方法は、当該可溶性形態が膜貫通タンパク質の分断された外部ドメインでない場合でさえも、タンパク質の可溶性アイソフォームを検出するために用いられてもよいことが理解される。本発明の方法は、例えば、２つの可溶性スプライスバリアントとして存在する、少なくとも２つの異なる可溶性形態として存在する任意のタンパク質の可溶性形態を検出するために用いることができる。換言すれば、それらは、タンパク質の異なる可溶性形態間の検出および区別を可能にする。
【００６１】
本発明の方法は、ＣＤ３１の特定の例により説明される。しかしながら、当業者は、当業者が独自に選択した別のタンパク質に、この方法を容易に適応させることができる。可溶性ドメインの構造に依存して、当業者は、可溶性形態の一方のみに存在する、または存在しない領域を認識する抗体を選択する。また、当業者は、幾つかの抗体の同時結合を可能にするような様式において抗体を選択する。このような抗体は、抗体が重複エピトープを認識しないことを確認することにより容易に選択することができる。したがって、本発明の好ましい実施形態は、補足またはシグナル伝達抗体および異なる識別抗体が互いに交差−競合しない方法に関する。抗体が互いに交差−競合するかどうかを決定するための方法は、当該分野において周知であり、例えば、Ｂｌａｎｃｈａｒｄら（１９９７，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，９（１２）：１７７５−１７８４）より記載される方法が挙げられる。
【００６２】
特定の実施形態では、生物学的サンプル中に存在するタンパク質を断片化する工程（例、酵素消化による）を含む方法は、本発明の範囲から除かれる。
【００６３】
膜貫通タンパク質の分断された外部ドメインおよび／または分断されたアイソフォームを検出するための上記方法は、分析応用および診断応用の双方における用途を見出す。幾つかの診断応用が、本明細書の以降の段落により詳細に記載されている。
【００６４】
診断方法および薬物モニタリング
アテローム性血栓症の高い危険性が、循環中の分断ＣＤ３１の存在と関連付けられること、および総循環可溶性ＣＤ３１の量と関連付けられないことが見出された。
【００６５】
したがって、本発明は、個体が血栓障害または自己免疫障害に罹患しているかどうか、または罹患する危険性があるかどうかを診断するための方法を提供する。この方法は、当該個体の生物学的サンプルにおいて、ＣＤ３１の分断された外部ドメインを検出する工程を含む。ここで、ＣＤ３１の当該分断された外部ドメインの存在は、当該個体が当該血栓障害または自己免疫障害に罹患している、または罹患する危険性があることを示す。ＣＤ３１の分断された外部ドメインが検出可能である場合、この方法はさらに、総可溶性形態に対する分断された外部ドメインの比率を算出する工程を含んでいてもよい。実際、この比率は、非常に良好な予測値を有することが見出された（実施例７を参照）。
【００６６】
この診断に基づいて、適切な処置レジメが、当該個体に対して策定されてもよい。好ましくは、ＣＤ３１の当該分断された外部ドメインは、第１、第２、第３、第４および第５の細胞外Ｉｇ様ドメインを含むが、第６の細胞外Ｉｇ様ドメインを欠損する。
【００６７】
本明細書を通じて用いられる場合、用語「血栓障害」としては、アテローム性血栓症、アテローム性動脈硬化症、急性冠状動脈症候群、虚血性発作、末梢動脈疾患および腹部大動脈瘤が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、血栓障害は、アテローム性血栓症である。
【００６８】
本明細書を通じて用いられる場合、用語「自己免疫障害」としては、関節リウマチ（ＲＡ）、脊椎関節症、多発性硬化症（ＭＳ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、グレーブス病および糖尿病が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６９】
ＣＤ３１の当該分断された外部ドメインの検出は、当該分野において知られている任意の方法にしたがって行なわれてもよい。それは、例えば、上記段落に記載される方法の１つによって検出されてもよい。あるいは、検出は、ＥＬＩＳＡアッセイによって行なわれてもよい。しかしながら、本発明の方法にしたがって、分断ＣＤ３１の外部ドメインを検出することが好ましい。なぜならば、このような方法は、設定がより容易であり、より迅速であり、かつより感度が良いためである。
【００７０】
生物学的サンプルは、例えば、血漿、血液または尿に対応していてもよい。生物学的サンプルは、好ましくは、血漿に対応する。
【００７１】
本発明の診断方法は、個体における血栓障害または自己免疫障害の進行をモニターするために、ならびに／あるいは当該個体における当該障害の重篤性を評価するために、ならびに／あるいは薬物に対する個体の応答性をモニターするために、少なくとも２つの異なる時点において繰り返されてもよい。
【００７２】
本明細書中で用いられる場合、「異なる（またはより後の）時点」で生じる事象とは、少なくとも１時間の間隔で生じる事象をいう。好ましくは、この事象は、少なくとも６時間、１２時間、１日、１週、２週または１ヶ月の間隔で生じる。
【００７３】
本発明はまた、個体が血栓障害または自己免疫障害に罹患しているかどうか、あるいは罹患する危険性があるかどうかを診断するための、ＣＤ３１の第６の細胞外免疫グロブリン様ドメイン中に局在しているエピトープに特異的に結合する抗体の使用に関する。
【００７４】
本発明はさらに、個体がアテローム性血栓症に罹患しているかどうか、または罹患する危険性があるかどうかを診断するための方法を提供する。この方法は、以下の工程を含む：
ａ）当該個体の生物学的サンプルを提供すること；
ｂ）当該生物学的サンプルにおいて、例えば、「分断された外部ドメインの検出」という表題が付された上記段落に記載される方法のいずれかにしたがって、ＣＤ３１の分断された外部ドメインを検出すること；ならびに
ｃ）工程（ａ）の結果を、アテローム性血栓症に罹患する危険性と相関付けること。
ここで、当該生物学的サンプルにおけるＣＤ３１の当該分断された外部ドメインの存在は、当該個体がアテローム性血栓症に罹患しているか、または罹患する危険性があることを示す。好ましくは、ＣＤ３１の当該分断された外部ドメインは、第１、第２、第３、第４および第５の細胞外Ｉｇ様ドメインを含むが、第６の細胞外Ｉｇ様ドメインを欠損する。
【００７５】
ＣＤ３１の可溶性形態における少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、９０％または９５％の分断された外部ドメインの存在は、当該個体が血栓障害または自己免疫障害（例、アテローム性血栓症など）に罹患しているか、または罹患する危険性があることを示す。
【００７６】
好ましい実施形態では、診断されるべき当該個体の生物学的サンプルにおける分断ＣＤ３１の量および／または百分率は、健常な個体の生物学的サンプルにおける分断ＣＤ３１の量および／または百分率と比較される。
【００７７】
低レベルの分断ＣＤ３１に伴う高レベルのＣＤ３１可溶性スプライスバリアントは、診断されるべき個体が、最終的には頸動脈の粥腫（ｐｌａｑｕｅ）を伴う非特異的な胸痛に罹患していることを示す。正常または低減したレベルのＣＤ３１可溶性スプライスバリアントに伴う分断ＣＤ３１レベルの僅かな増加は、診断されるべき個体がアテローム性動脈硬化症に罹患していることを示す。検出不能な量のＣＤ３１可溶性スプライスバリアントに伴う分断ＣＤ３１レベルの顕著な増加は、診断されるべき個体がアテローム性血栓症に罹患していることを示す。
【００７８】
本発明の診断方法は、例えば、個体が血栓障害または自己免疫障害に罹患しているかどうかを決定するために、個体における血栓障害または自己免疫障害の重篤性を評価するために、心筋梗塞の再発等の主要な心血管事象の危険性を予知するために、処置レジメを策定するために、患者における血栓障害または自己免疫障害の進行をモニターするために、薬物に対する患者の応答性を予測およびモニターするために、ならびに／あるいは患者の処置を調整するために、用いられてもよい。
【００７９】
本発明の診断方法が、障害の進行をモニターするために、障害の重篤性を評価するために、薬物に対する応答性をモニターするために、および／または患者の処置を調整するために用いられる場合、それは、所定の患者から異なる時点で採取された生物学的サンプルに対して行われる。生物学的サンプルは、例えば、処置に対する患者の応答性を追跡するために、毎月、採取される。これらの解析に基づいて、処置は、次いで、調整されてもよい。その効力を増強させるために、および／または副作用を最小にするために、例えば、薬物の変更、または薬物の投薬量の調整が決定される。このような薬物モニタリングは、長期の処置（例えば、免疫抑制化合物が患者に投与される場合）において特に望ましい。分断ＣＤ３１の検出は、患者における炎症応答をモニターするために、したがって、患者に投与することができる薬物の最小有効用量を決定するために、用いることができる。
【００８０】
したがって、本発明は、血栓障害または自己免疫障害の進行をモニターするための、ならびに／あるいは個体における血栓障害または自己免疫障害の重篤性を評価するための、ならびに／あるいは薬物に対する患者の応答性をモニターするための方法を提供する。当該方法は、以下の工程を含む：
ａ）当該患者の第１の生物学的サンプルを提供すること；
ｂ）当該第１の生物学的サンプルにおいて、ＣＤ３１の分断された外部ドメインを検出すること；
ｃ）当該患者の少なくとも１つの第２の生物学的サンプルを提供することであって、当該少なくとも１つの第２の生物学的サンプルが、第１の生物学的サンプルよりも後の時点で、当該患者から採取されたものであること；
ｄ）当該少なくとも１つの第２の生物学的サンプルにおいて、ＣＤ３１の分断された外部ドメインを検出すること；
ｅ）工程（ｂ）および（ｄ）で得られた結果を比較すること。
【００８１】
異なる時点で同じ患者から採取された幾つかの異なる生物学的サンプルは、工程（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）で用いられてもよい。例えば、患者の長期の処置の枠組みでは、生物学的サンプルは、規則的な間隔（例、毎月、２ヶ月毎または１年に２回）で患者から採取されてもよい。
【００８２】
血栓障害または自己免疫障害の進行をモニターするための；ならびに／あるいは当該障害の重篤性を評価するための；ならびに／あるいは薬物に対する患者の応答性をモニターするためのこのような方法はさらに、工程（ｅ）の結果に基づいて、当該患者についての処置レジメを策定する工程（ｆ）を含んでいてもよい。
【００８３】
薬物モニタリングの枠組みでは、工程（ａ）の生物学的サンプルは、好ましくは、患者の処置の開始前から採取され、工程（ｃ）の生物学的サンプルは、処置の開始後である。工程（ｂ）で測定された分断ＣＤ３１レベルと比較した場合における工程（ｄ）で測定した分断ＣＤ３１レベルの減少は、薬物が当該患者を治療するために効果的であることを示す。
【００８４】
より具体的には、本発明は、薬物に対する、血栓障害または自己免疫障害に罹患している患者の応答性をモニタリングするための方法に関する。当該方法は、以下の工程を含む：
ａ）当該薬物による当該患者の処置の開始前および後の当該患者の生物学的サンプルにおいて、ＣＤ３１の分断された外部ドメインを検出すること；
ｂ）工程（ａ）で検出されたＣＤ３１の分断された外部ドメインのレベルを比較すること；ならびに、必要に応じて
ｃ）ＣＤ３１の分断された外部ドメインの当該レベルにおける差異を、当該患者を治療するため、薬物の有効性と相関付けること。
【００８５】
処置の開始前のＣＤ３１の分断された外部ドメインのレベルと比較した、処置の開始後のＣＤ３１の分断された外部ドメインのレベルにおける減少は、患者が当該薬物に対して応答すること、および当該薬物が当該患者を治療するために効果的であることを示す。好ましくは、減少は、少なくとも５、１０、２５、５０、７５または９０％である。反対に、ＣＤ３１の分断された外部ドメインのレベルにおいて如何なる有意な差異も工程（ｂ）で見出されない場合、または処置の開始後のＣＤ３１の分断された外部ドメインのレベルにおける増加が工程（ｂ）で見出された場合には、患者は当該薬物に対して応答せず、薬物は、当該患者を治療するために効果的ではない。
【００８６】
本発明はさらに、患者における血栓障害または自己免疫障害の進行をモニターするために、ならびに／あるいは薬物に対する患者の応答性をモニターするために、ＣＤ３１の第６の細胞外免疫グロブリン様ドメイン中に局在しているエピトープに特異的に結合する抗体の使用に関する。
【００８７】
診断キット
本発明はまた、以下を含む診断キットを意図する：
ａ）当該分断された外部ドメインおよび可溶性当該スプライスバリアントの双方に存在する領域中に局在しているエピトープに特異的に結合する蛍光標識抗体。
ｂ）当該分断された外部ドメインに存在し、かつ当該可溶性スプライスバリアントに存在しないか、あるいは当該可溶性スプライスバリアントに存在し、かつ当該分断された外部ドメインに存在しないかのいずれかである領域中に局在しているエピトープに特異的に結合する抗体に連結している第１の型のビーズ；ならびに
ｃ）膜貫通タンパク質の分断された外部ドメインおよび当該膜貫通タンパク質の可溶性スプライスバリアントの双方に存在する領域中に局在しているエピトープに特異的に結合する抗体に連結している第２の型のビーズ。
【００８８】
このようなキットは、例えば、本発明の診断方法において、および／または薬物の選択において、ならびに／あるいは薬物モニタリングにおいて、用いることができる。
【００８９】
好ましい実施形態では、膜貫通タンパク質は、ＣＤ３１である。蛍光標識抗体および第１の型のビーズに連結している抗体は、好ましくは、ＣＤ３１の初めの５つの細胞外免疫グロブリン様ドメイン中のいずれかに局在しているエピトープに特異的に結合する。第２の型のビーズに連結している抗体は、好ましくは、第６のＩｇ様ドメイン中に局在しているエピトープに特異的に結合する。
【００９０】
このような診断キットは、例えば、以下を含む：
−ＣＤ３１の第１および／または第２の細胞外免疫グロブリン様ドメイン中に局在しているエピトープに特異的に結合する蛍光標識抗体（例、標識ＷＭ５９抗体、標識９Ｇ１１抗体、または標識ＪＣ７０Ａ抗体、ＤＡＫＯ、）；
−ＣＤ３１の第６の細胞外免疫グロブリン様ドメイン中に局在しているエピトープに特異的に結合する抗体（例、ＰＥＣＡＭ  １．２抗体）に連結されている第１の型のビーズ；
−以下の一方または双方：
ｉ）ＣＤ３１の第５の細胞外免疫グロブリン様ドメイン中に局在しているエピトープに特異的に結合する抗体（例、ＭＥＭ−０５、ＰＥＣＡＭ  １．１またはＨＣ１／６抗体）に連結している第２の型のビーズ；ならびに
ｉｉ）ＣＤ３１の第１および／または第２の細胞外免疫グロブリン様ドメイン中に局在しているエピトープに特異的に結合する抗体（例、ＪＣ７０Ａ、９Ｇ１１またはＷＭ５９抗体）に連結している第３の型のビーズ。
【００９１】
特定の実施形態では、キットは、ＰＥＣＡＭ１．２．に連結している第１の型のビーズ、ＭＥＭ−０５抗体に連結している第２の型のビーズ、蛍光標識ＷＭ−５９抗体（例、ＰＥ−ＷＭ−５９）、および必要に応じて、ＪＣ７０Ａ抗体に連結している第３の型のビーズを含む。
【００９２】
本発明の他の診断キットは、以下を含む：
ａ）膜貫通タンパク質の分断された外部ドメインおよび当該膜貫通タンパク質の可溶性スプライスバリアントの双方に存在する領域中に局在しているエピトープに特異的に結合する抗体に連結しているビーズ；
ｂ）当該分断された外部ドメインに存在し、かつ当該可溶性スプライスバリアントに存在しないか、または当該可溶性スプライスバリアントに存在し、かつ当該分断された外部ドメインに存在しないかのいずれかである領域中に局在しているエピトープに特異的に結合する第１の型の蛍光標識抗体；ならびに
ｃ）当該分断された外部ドメインおよび可溶性当該スプライスバリアントの双方に存在する領域中に局在しているエピトープに特異的に結合する第２の型の蛍光標識抗体であって、当該第２の蛍光標識抗体の標識が、当該第１の蛍光標識抗体の標識とは異なるもの；ならびに、必要に応じて
ｄ）当該分断された外部ドメインおよび可溶性当該スプライスバリアントの双方に存在する領域中に局在しているエピトープに特異的に結合する第３の型の蛍光標識抗体であって、当該第３の蛍光標識抗体の標識が、当該第１および第２の蛍光標識抗体の標識とは異なるもの。
【００９３】
好ましい実施形態では、膜貫通タンパク質は、ＣＤ３１である。第２の蛍光標識抗体およびビーズに連結されている抗体は、好ましくは、ＣＤ３１の初めの５つの細胞外免疫グロブリン様ドメイン中のいずれかに局在しているエピトープに特異的に結合する。第１の蛍光標識抗体は、好ましくは、第６のＩｇ様ドメイン中に局在しているエピトープに特異的に結合する。
【００９４】
別の好ましい実施形態は、以下を含むキットに関する：
−第１の細胞外Ｉｇ様ドメイン中に局在しているエピトープに特異的に結合する抗体（例、Ｐｅｃａｍ１．３、９Ｇ１１またはＪＣ７０Ａ抗体）に連結しているビーズ；
−第６の細胞外Ｉｇ様ドメイン中に局在しているエピトープに特異的に結合する第１の型の蛍光標識抗体（例、ＦＩＴＣ−ＰＥＣＡＭ  １．２等の標識ＰＥＣＡＭ  １．２抗体）；
−以下の一方または双方：
−第１または第２の細胞外Ｉｇ様ドメイン中に局在しているエピトープに特異的に結合する第２の型の蛍光標識抗体（例、ＰＥ−ＷＭ５９またはＰＥ−Ｌ１３３等の標識ＷＭ５９またはＬ１３３抗体）；ならびに
−第５の細胞外Ｉｇ様ドメイン中に局在しているエピトープに特異的に結合する第３の蛍光標識抗体（例、ＭＥＭ−０５またはＰＥＣＡＭ  １．１あるいはＨＣ１／６抗体）；
【００９５】
蛍光標識抗体は、青色レーザーによって励起され、かつＦＩＴＣ、ＰＥ、ＰｅｒＣＰまたはＰＥ−直列チャネルにおいて発光するか、あるいは赤色レーザーによって励起され、かつＣｙ５／ＡＰＣまたはＡＰＣ−直列チャネルにおいて発光するか、あるいは紫色レーザーによって励起され、かつパシフィック・ブルーまたはパシフィック・オレンジチャネルにおいて発光するか、あるいはＵＶレーザーによって励起され、かつ量子ドットチャネルにおいて発光する蛍光団を含んでいてもよい）；
【００９６】
これらのキットはさらに、例えば、試薬および／または使用説明書等の他の成分を含んでいてもよい。
【００９７】
キットはまた、ＣＤ３１の分断された外部ドメインおよび／または可溶性スプライスバリアントを既知量で含むサンプル、健常な個体からのサンプル、ならびに／あるいはアテローム性動脈硬化症またはアテローム性血栓症に罹患している個体からのサンプルを含んでいてもよい。
【００９８】
シグナル伝達経路を解析するための方法
分断された外部ドメインを検出する上記方法は、タンパク質／タンパク質相互作用およびシグナル伝達経路の解析等の他の目的のために適応されてもよい。この方法は、共ＩＰ／ＷＢよりも容易、迅速かつ強力であり、ＣＡＳＥ／ＰｈｏｓｐｈｌｏｗおよびＣＢＡ  Ｆｌｅｘセットよりも特異的であり、実際には、これらの技術の利点を組み合せている。
【００９９】
したがって、本発明は、候補分子が分子複合体のメンバーであるかどうかを決定するための方法を提供する。この方法は、以下の工程を含む：
ａ）当該分子複合体のメンバーに特異的に結合する抗体に連結しているビーズを提供すること；
ｂ）当該ビーズを、当該分子複合体を含有する生物学的サンプルに接触させること；
ｃ）生物学的サンプルに接触された当該ビーズを、当該候補分子に特異的に結合する少なくとも１つの型の蛍光標識抗体に接触させること；ならびに
ｄ）蛍光をフローサイトメトリーにより検出すること。
−工程（ｄ）でのシグナルの検出は、当該候補分子が当該分子複合体のメンバーであることを示す；および
−１つよりも多くの型の蛍光標識抗体が工程（ｃ）で用いられる場合には、当該抗体は、異なる蛍光標識で標識されている。
【０１００】
本発明の方法は、同じ生物学的サンプルを用いて、幾つかの決定を同時に行うことを可能にする。したがって、上記方法は、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個または１０個の候補分子について同時に行われてもよい。このような場合には、工程（ｃ）は、生物学的サンプルに接触された当該ビーズを、当該少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個または１０個の候補分子の各々に特異的に結合する蛍光標識抗体に接触させることを含む。これらの蛍光標識抗体の各々は、他の蛍光標識とは異なる蛍光標識で標識される。
【０１０１】
生物学的サンプルは、好ましくは、可溶性または可溶化分子（好ましくは、細胞に由来する）に対応する。生物学的サンプルは、例えば、細胞溶解物に対応する。このような細胞溶解物を調製するためのプロトコールは、例えば、実施例５に記載されている。細胞は、例えば、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤のカクテルを含有するＲＩＰＡ緩衝液と共に、氷上で３０分間溶解されてもよい。あるいは、可溶性または可溶化分子は、例えば、細胞を凍結、融解および破砕することにより調製されてもよい。
【０１０２】
上記方法は、所定の分子複合体および／または所定のシグナル伝達経路に関する複数の情報を集積することを可能にする。本明細書中で用いられる場合、「分子複合体」とは、会合した分子の複合体をいう。分子は、例えば、タンパク質、脂質、糖またはヌクレオチドに対応していてもよい。好ましい実施形態では、分子複合体は、タンパク質複合体であり、当該タンパク質複合体のメンバーは、タンパク質である。
【０１０３】
本発明の方法は、例えば、特定の条件下で所定のタンパク質と会合しているタンパク質を決定すること、あるいは所定のタンパク質がリン酸化されているか、またはされていないかを決定すること（タンパク質のリン酸化アイソフォームを特異的に認識する蛍光標識抗体を使用することによる）を可能にする。したがって、候補分子は、例えば、ある条件下でのみ分子複合体のビーズ補足メンバーに会合しているタンパク質、ある条件下でのみリン酸化されているタンパク質、または当該分子複合体のメンバーであるかどうかが不明であるタンパク質に対応していてもよい。本発明の方法はまた、細胞外基質の糖タンパク質およびプロトグリカン（ｐｒｏｔｏｇｌｙｃａｎ）の複合体、または血栓の形成に関与する糖、脂質およびタンパク質の複合体を解析することを可能にする。
【０１０４】
工程（ｃ）で用いられる抗体は、当該分子複合体のメンバーと思われるタンパク質の全てのアイソフォームに特異的に結合してもよく、あるいは当該タンパク質の分断、スプライスまたはリン酸化されたアイソフォームのみに特異的に結合してもよい。
【０１０５】
あるいは、工程（ｃ）で用いられる抗体は、タンパク質の一次構造にかかわらず、ホスホチロシン、ホスホセリンまたはホスホスレオニン等のリン酸化アミノ酸に結合してもよい。
【０１０６】
工程（ｃ）で用いられる抗体はまた、ヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ配列、ＡＭＰｃまたはＧＭＰｃ等の環状ヌクレオチド）、糖（例、シアル酸）、シグナル伝達経路に関与する脂質（例、ステロイドホルモン、イノシトール、ホスファチジルイノシトール、ロイコトリエン、プロスタグランジン、トロンボキサン、ガングリオシド、カベオリン、セラミドなど）、ＴＬＲ媒介シグナル伝達に関与するリポ多糖、および糖脂質（例、オリゴデンドロサイトのシグナル伝達に関与するガラクトセレブロシド）に特異的に結合してもよい。
【０１０７】
分子複合体は、例えば、膜レセプター、細胞外リガンド、および伝達タンパク質等の細胞内タンパク質を含んでいてもよい。最も好ましくは、候補分子は、細胞内分子（例、細胞内タンパク質）である。
【０１０８】
このモデルを用いて解析することができる分子複合体の例としては、以下の表に提示されるものが挙げられる。ビーズ連結抗体で補足されるタンパク質は、分子複合体のメンバーのいずれか１つであってもよい。
【０１０９】
【表Ｂ】
0005866198.tif 000003
【０１１０】
好ましい実施形態では、ビーズ連結抗体で補足される当該分子複合体のメンバーは、ＣＤ３１である。
【０１１１】
蛍光標識抗体は、例えば、６８６位でリン酸化されたチロシンを含むＣＤ３１タンパク質に特異的に結合する抗体に対応していてもよい。あるいは、蛍光標識抗体は、例えば、ＣＤ３１シグナル伝達経路の一部である細胞内タンパク質のリン酸化されたアイソフォーム、またはＣＤ３１シグナル伝達経路の一部である伝達タンパク質に特異的に結合する抗体に対応していてもよい。このようなタンパク質は、例えば、ＮｅｗｍａｎおよびＮｅｗｍａｎ（２００３  Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ  ２３：９５３−９６４）、ならびに／あるいはＮｅｗｔｏｎ−ＮａｓｈおよびＮｅｗｍａｎ（１９９９．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６３：６８２−６８８）に記載されている。このような抗体は、例えば、第６の細胞外免疫グロブリン様ドメインを含むＣＤ３１タンパク質に結合してもよく（例、ＰＥＣＡＭ  １．２）、第２の細胞外免疫グロブリン様ドメインを含むＣＤ３１タンパク質に結合してもよく（例、ＷＭ５９）、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＳＨＰ２、ＣＤ４５、ＣＴＬＡ４、ＳＬＡＭ、ｐ５６ＬｃＫ、ＣＤ３ζ、Ｚａｐ７０、ＮＦｋＢ、ＥＲＫ、ＩｋＢＫ、ＲｈｏＡ、ＣｓＫおよびＰＴＰアーゼに結合してもよい。
【０１１２】
本発明はさらに、分子複合体を解析するためのキットを提供する。この方法は、以下を含む：
ｉ）当該分子複合体のメンバーに特異的に結合する抗体に連結しているビーズ；および
ｉｉ）当該分子複合体の別のメンバーに特異的に結合する少なくとも１つの型の蛍光標識抗体。
ここで、キットが１つよりも多くの型の蛍光標識抗体を含む場合、当該抗体は、異なる蛍光標識で標識されている。
【０１１３】
より具体的には、本発明はさらに、以下を含むキットを提供する：
−ＣＤ３１の第６の細胞外免疫グロブリン様ドメイン中に局在しているエピトープに特異的に結合するビーズ連結抗体（例、ＰＥＣＡＭ  １．２）；ならびに
−以下からなる群より選ばれるタンパク質に特異的に結合する少なくとも１つの蛍光標識抗体：６８６位でリン酸化されたチロシンを含むＣＤ３１タンパク質（例、標識ウサギ抗ＣＤ３１ホスホ−チロシン６８６ポリクローナル抗体。これは、例えば、ＡｌｅｘｉａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８結合（Ｆａｂ’）２フラグメントで標識されていてもよい）；第６の細胞外免疫グロブリン様ドメインを含むＣＤ３１タンパク質（例、ＰＥＣＡＭ  １．２）；第２の細胞外免疫グロブリン様ドメインを含むＣＤ３１タンパク質（例、ＷＭ５９）、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＳＨＰ２、ＣＤ４５、ＣＴＬＡ４、ＳＬＡＭ、ｐ５６ＬｃＫ、ＣＤ３ζ、Ｚａｐ７０、ＮＦｋＢ、ＥＲＫ、ＩｋＢＫ、ＲｈｏＡ、ＣｓＫおよびＰＴＰアーゼ。
【０１１４】
本発明はまた、他の分子複合体を解析するためのキットを提供する。このようなキットは、例えば、ビーズ連結抗体および少なくとも１つの蛍光標識抗体を含んでいてもよい。ここで、各抗体は、以下からなる群より選ばれるタンパク質に特異的に結合する：
−ＩｇＭ、ＣＤ１９、ＣＤ２２、Ｉｇａ／ｂ  ＩＴＡＭ、ＳＹＫ、ＧＲＢ２、ＢＴＫ、ＰＩ３Ｋ、ＲＡＳ、ＩＫＫ、ＰＫＣｂ、ＲＡＣ、ＳＨＰ１、ＳＨＩＰ、ＰＴＥＮおよび切断されたＮｏｔｃｈ；
−ＩＬ−６Ｒ、Ｇｐ１３０、Ｊａｋ１、Ｓｔａｔ３、Ｇａｂ、ＥＲＫ、ＭＡＰＫ、ＳＨＰ２、ＳＯＣＳ３；
−ベータ−インテグリン、タリン、パキシリン、Ｆｙｎ、ＦＡＫ、ａ−アクチニン、ＧＲｂ２、Ｒａｓ、Ｒａｆｌ、ＭＥＫ１／２、ＥＲＫ１／２、ＳｏｓおよびＰＴＰアーゼ；
−Ｃ８３（分断後）、ｂ−セクレターゼ、ａ−セクレターゼ、Ｃ９９（ｂ−セクレターゼにより残される）ＡＰＰ（分子全体）、ＧＳＫ３、Ｃｄｋ５／ｐ２５、Ｃｄｋ５／ｐ３５；あるいは
−ＦａｓＬ、ＦＡＤＤ、ＴＲＡＤＤ、ＴＮＦ−Ｒ１、ＲＩＰ、リーパー、カスパーゼ、ＦＬＩＰ、ｐ５３、Ｂａｘ、ＢＣＬ−２、Ａｐａｆ−１、ＭＤＭ２、ｃ−Ｍｙｃ。
【０１１５】
本発明のキットはさらに、ホスホチロシンまたはホスホセリン／スレオニンに特異的に結合する蛍光標識抗体を含んでいてもよい。
【０１１６】
分子複合体を解析するための方法およびキットにおいて用いられる異なる抗体は、好ましくは、互いに交差−競合しない。
【０１１７】
雑誌の記事または要約、公開または未公開の特許出願、発行された特許あるいは任意の他の参考文献を含む、本明細書中で引用される全ての参考文献は、参照により全体が本明細書中に援用され、引用された参考文献中に提示されている全てのデータ、表、図および文章を含む。
【０１１８】
異なる意味を有するが、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」および「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」は、本明細書を通じて変更可能に使用されており、互いに交換されてもよい。
【０１１９】
本発明はさらに、以下の実施例及び図を参照して評価される。
【実施例】
【０１２０】
実施例１：材料および方法
ＣＤ３１＋およびＣＤ３１ｓｈｅｄ血液白血球の評価
１０色のフローサイトメトリーを、基礎条件における、または可溶性１μｇ/ｍｌの精製抗ＣＤ３抗体（Ｒ＆Ｄシステムズ）による一晩の刺激後のいずれかの５人の健常な個体からの末梢血白血球に対して行った。１０色のフローサイトメトリーを、処理前にＰＢＳ／ホルムアルデヒド  １％／ＦＣＳ  １％中で３７℃にて４分間固定された、５人の健常な個体からのヘパリン処理された末梢血白血球に対する赤血球の低張溶解（３７℃で１０分  Ｔｒｉｓ  １０ｍＭ、ＮＨ４Ｃｌ  １５５ｍＭ、ＫＨＣＯ３  １０ｍＭ中で１：１０  ｖ：ｖ、ｐＨ７．４）後に行った。ヒト血液に対する全ての実験は、国際倫理委員会により承認された（ワールドワイドウェブページｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ；識別番号：ＮＣＴ００４３０８２０を参照）。ペレット細胞を、室温で３０分間インキュベートし、ＢＤ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓからのＣＤ３（ＰＥ−Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ）、ＣＤ４（ＰＥ−Ｃｙ７）、ＣＤ８（ＰｅｒＣＰ）、ＨＬＡ−ＤＲ（ＡＰＣ−Ｃｙ７）、ＣＤ４５ＲＡ（Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ）、および抗ＣＤ３１（ＷＭ５９、ＰＥ）、ならびにＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからの抗ＣＤ２０（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７００）および抗ＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ  １．２、ＦＩＴＣ）に対する蛍光モノクローナル抗体（各１μｌ）のカクテルにより光から保護した。３つのレーザー（４０５、４８８および６３３ｎｍ）が取り付けられたＢＤ  ＬＳＲＩＩ（登録商標）を用いて、少なくとも５０，０００の事象を、リンパ球ゲート中に確認し、ＢＤ  ＤＩＶＡ（登録商標）６．０ソフトウェアで解析した。
【０１２１】
可溶性ＣＤ３１のサブトラクティブ測定
血漿および培養上清中のスプライスバリアントおよび短縮型ＣＤ３１を検出するため、サイトカインビーズアレイ（ＣＢＡ（登録商標）、ＢＤ）をカスタマイズした。３つの異なる機能性ＣＢＡビーズ（Ａ９、Ｄ５およびＥ９）を、以下の精製モノクローナル抗ＣＤ３１抗体ＪＣ７０Ａ（ドメイン１、ＤＡＫＯ）、ＭＥＭ−０５（ドメイン５、Ｚｙｍｅｄ）およびＰＥＣＡＭ  １．２（ドメイン６、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のいずれか一つとカップリングした。次いで、カップリングしたビーズを、同じ５人の健常コントロールの血漿（図２）または培養上清と共にインキュベートし、循環ＣＤ３１の陽性結合を、ＰＥ（ＢＤ）とカップリングした第４の抗ＣＤ３１モノクローナル抗体ＷＭ−５９（ドメイン１〜２）により検出した。ＣＤ３１のうち、少なくともドメイン１（ＪＣ７０Ａ）、またはドメイン１〜５（ＭＥＭ−０５）、あるいは全ての細胞外ドメイン１〜６（ＰＥＣＡＭ  １．２）を含む血漿ＣＤ３１の濃度を、サンプルおよび同じ標品（組換え、全長細胞外ＣＤ３１、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）の連続希釈物に関する１００以上のゲートビーズに対する検出抗体の中央蛍光強度を解析することにより決定した。多様な抗体の結合親和性における差異に起因する任意の偏りを克服するため、標準曲線を、同じ既知濃度の組換えＣＤ３１を用いて、ビーズの各々について得た。ＰＥＣＡＭ  １．２にカップリングしたビーズ（ｄｏｍ  １〜６）により決定されたＣＤ３１のｎｇ／ｍｌにおける濃度を、ＭＥＭ−０５にカップリングしたビーズを用いて得られたものから差し引いて、ｄｏｍ６を欠損する循環ＣＤ３１（ｄｏｍ１〜５）の量を得た。後者を、ＪＣ７０Ａにカップリングしたビーズを用いて得られたＣＤ３１の濃度から差し引いて、ｄｏｍ５および６の双方を欠損するが、少なくともドメイン１および２を含有する可溶性ＣＤ３１（ｄｏｍ１〜２）の値を算出した。
【０１２２】
ＣＤ３１−ＩＴＩＭリン酸化の評価
Ｌｏｇ相のＪｕｒｋａｔ細胞（１０７細胞／条件）を、２０分の間、未刺激で放置するか（陰性コントロール）、またはペルバナデートと共にインキュベートするか（陽性コントロール）、あるいはペプチド５５１〜５７４（１００μＭ）の存在下または非存在下において、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、各１μｇ／ｍｌ）で刺激するか、あるいはペプチド単独と共にインキュベートした。次いで、細胞を、氷上で１ｍｌのＲＩＰＡ緩衝液により３０分間溶解し、超遠心分離し、１６μｌの上清を、ＰＥＣＡＭ  １．２でコーティングされた機能性Ｅ９  ＣＢＡ（登録商標）ビーズ（ＢＤ）と共に室温で２時間インキュベートした。引き続き、ビーズを、ＣＢＡ洗浄緩衝液で洗浄し、２μｌの未希釈のウサギ抗ＣＤ３１ホスホ−チロシン６８６（ｐＹ６８６）血清と共にインキュベートし、続いて２回洗浄し、ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８結合（Ｆａｂ’）２フラグメント（ＣＢＡ洗浄緩衝液中で１：１００）と共にインキュベートした。最後に、ビーズ（２０００／条件）を、ＦＩＴＣチャネル（５３０／３０ｎｍ）においてフローサイトメトリーにより解析し、データを、ＤＩＶＡ  ６．０（登録商標）ソフトウェア（ＢＤ）で算出した中央蛍光強度（ＭＦＩ）±変動係数（ＣＶ％）の百分率として表した。二連の溶解物の分割物および組換えＣＤ３１の連続希釈物を、ＰＥＣＡＭ  １．２でコーティングしたビーズと共にインキュベートし、ｄｏｍ１＋細胞に結合したＣＤ３１の量を、抗ＣＤ３１  ＷＭ５９−Ｒ−ＰＥ（ｄｏｍ１）およびＰＥＣＡＭ  １．２−ＦＩＴＣ（ｄｏｍ６）抗体を用いて明らかにした（データを図３ａに示す）。
【０１２３】
蛍光ペプチド結合
ＣＤ３１＋およびＣＤ３１ｓｈｅｄＣＤ４＋Ｔ細胞に対するペプチド結合の可視化のため、上記のように調製された、新たに精製した末梢血白血球を、２ｍＭ  ＥＤＴＡ（ペプチドのエンドサイトーシスを回避するため）を含有する緩衝化溶液で洗浄し、ポリ−Ｄ−リジンでコーティングしたｉｂｉｄｉ（登録商標）  ８−ウェル培養庫（Ｂｉｏｖａｌｌｅｙ）において、５０μＭ  ＦＩＴＣ標識ＣＤ３１ペプチド５５１〜５７４、および蛍光モノクローナル抗ＣＤ３１（ＰＥ）および抗ＣＤ４（ＡＰＣ）抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の１：１０希釈物と共に、暗加湿器中で室温で一晩インキュベートした。次いで、細胞を２回洗浄し、ＤＡＰＩで核を対比染色し、０．３μｍ細胞内切片のデジタル画像を、ＡｐｏＴｏｍｅ（登録商標）および冷却した単色光デジタルカメラ（Ｚｅｉｓｓ）が取り付けられたＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  Ｍ２００顕微鏡（×６３油浸用対物鏡）で得た。
【０１２４】
カルシウム流動アッセイ
Ｃ５７Ｂｌ／６マウスからの脾臓細胞を、Ｃａｌｉｇｉｕｒｉら（２００５  Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ  ２５：１６５９−１６６４）に記載されるように調製した。細胞を、製造業者の使用説明書に沿ってＦｌｕｏ−３ＡＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、番号Ｆ１２４２）と共にインキュベートした。カルシウム結合トレーサーの蛍光を、ハムスター抗マウスＣＤ３／ＣＤ２８モノクローナル抗体（各４０μｇ／ｍｌ）およびラット／ハムスターｃｏｍｐＢｅａｄ（登録商標）（１：５０）を、単独で、あるいはラット抗マウスＣＤ３１抗体（クローン３９０、１０μｇ/ｍｌ）の存在下、またはＣＤ３１ペプチド５５１〜５７４（１００μＭ）の存在下のいずれかにおいて、添加する前、および添加後に６０秒間、ＬＳＲＩＩ（登録商標）サイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上のＦＩＴＣチャネルにおいて測定した。陰性コントロールは、ラットＩｇＧアイソタイプコントロールおよび混雑（ｓｃｒａｍｂｌｅ）ペプチドを含んでいた。抗体およびｃｏｍｐＢｅａｄｓ（登録商標）は、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓからであった。
【０１２５】
プラズモン表面共鳴
同種親和性結合の会合および解離定数を、表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）２０００、ＧＥ）により算出した。簡潔には、ペプチド５５１〜５７４を、製造業者の使用説明書にしたがって、ＣＭ５チップ上に３４００共鳴単位（ＲＵ）でコーティングした。可溶性ペプチド５５１〜５７４（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．００５％  Ｔｗｅｅｎ２０の２００μｌ中において１２．５、２５、５０および１００μＭ）を、ペプチドでコーティングしたチャネル上に、およびコーティングしていないチャネル上に、２５℃にて２０μｌ／分で注入した。解離を、３００秒間モニターした。会合（ｋｏｎ）および解離（ｋｏｆｆ）定数を、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ（登録商標）３．０ソフトウェア（ＧＥ）を用いて算出した。混雑ペプチドでコーティングしたチャネル上へのペプチド５５１〜５７４の注入は、無視し得るシグナルを生じた。
【０１２６】
インビトロ免疫調節の評価
同種異系マウス大動脈平滑筋細胞に対するＣＤ８＋Ｔ細胞媒介細胞溶解活性、およびマクロファージゼラチナーゼ（ＭＭＰ−２／９）活性の測定を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのキットおよび試薬を用いて、Ｃａｌｉｇｉｕｒｉら（２００６  Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ  ２６：６１８−６２３）においてヒト細胞について以前に記載されているように行った。簡潔には、ＦＶＢ／Ｎマウス大動脈平滑筋細胞の初代培養物を、脂溶性トレーサーＤＩＯ（緑）で標識し、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスからのＣＤ８＋Ｔ細胞強化脾臓細胞と共に３時間共培養した（混雑ペプチド  ｎ＝３、およびペプチド５５１〜５７４  ｎ＝３、５０μＭ）。細胞溶解を、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）の細胞内蓄積により評価した。細胞を、フローサイトメトリーにより解析し、細胞溶解の％を、標的（ＤＩＯ＋）細胞に占める死（ＰＩ＋）細胞の数を表すことにより算出した。細胞内ＭＭＰ−２／９（ゼラチナーゼ）活性を、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスからの７日齢の骨髄由来マクロファージにおいて、ＯｒｅｇｏｎＧｒｅｅｎ（登録商標）ゼラチン（ＭＦＩ）の取り込み３時間後に、フローサイトメトリーにより測定した（混雑ペプチド  ｎ＝３、およびペプチド５５１〜５７４  ｎ＝３、５０μＭ）。Ｔ細胞増殖を、以前に記載（Ｃａｌｉｇｉｕｒｉら  Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ  ２５：１６５９−１６６４）されているように、Ｃ５７Ｂｌ／６（ＣＤ３１＋／＋）およびＣＤ３１−／−マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｆｒａｎｃｅ）からの脾臓細胞のヒト末梢血単核細胞のいずれかを用いて行った。簡潔には、細胞を、１μｇ／ｍｌ抗マウスＣＤ３／ＣＤ２８または５μｇ／ｍｌ抗ヒトＣＤ３抗体（ＢＤ）を適切に含有する完全培地（ＲＰＭＩ  １６４０、１％ピルビン酸、１％グルタミン、１％ペニシリン−ストレプトマイシン−ファンギゾン、１０％非働化仔ウシ血清、全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからである）において、Ｕ底９６ウェルプレート中に０．２×１０６細胞／ウェルにて３連で蒔いた。２５、５０および１００μＭの最終濃度のＣＤ３１（５５１〜５７４）および混雑ペプチドを、細胞を蒔く直前に、ウェル中に沈殿させた。蒔いた細胞を、５％ＣＯ２において３７℃で７２時間培養した。（３Ｈ）チミジン（０．５μＣｉ／ウェル）を、最後の１６時間添加し、増殖を、Ｔｏｍｔｅｃ回収器を用いて評価し、Ｗａｌｌａｃマイクロベータ計数器で解析した。データを、３連におけるｃｐｍの平均±ＳＥＭとして表す。
【０１２７】
インビボ免疫調節の評価
遅延型過敏症（ＤＴＨ）の抑制を、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００１）４．０．１−４．０．２  Ｕｎｉｔ  ４．２」に記載されるように評価した。簡潔には、ＴＮＣＢ（２−クロロ−１，３，５−トリニトロベンゼン、Ｆｌｕｋａ  番号７９８７４）を、アセトン／オリーブ油（１：１  ｖ／ｖ）中に、１０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した。ＢＡＬＢ/ｃマウス（ｎ＝６／群）を、腹部ａの剃毛領域に、合計０．２ｍｌの調製物を塗布することによって準備した（ｎ＝６／群）。実験は、ペプチド５５１〜５７４についての３つの群（１０、５０、１００μＭ）および１００μＭの混雑ペプチドで処置した１つの群を含んでいた）。準備の５日後に、１０μｌのＴＮＣＢ溶媒混合物を、ペプチド５５１〜５７４または混雑ペプチドの皮下（肩甲骨間）投与の３０分後に、右耳介上に塗布した。耳の厚さの増大を、各マウスの右および左の耳介の厚みを差し引くことにより算出し（右−左／左×１００）、ダイアル皮脂厚計（「Ｐｏｃｏｔｅｓｔ」、Ｋｒｏｅｐｌｉｎ  Ｌａｎｇｅｎｍｅｓｓｔｅｃｈｎｉｃｋ）で２４時間目に測定した。測定を、各耳に対して５回行い、さらなる解析のために平均した。ペプチドの免疫抑制効果を、抑制％＝（１−ΔＴＥ／ΔＴＳ）×１００〔式中、ΔＴ＝（誘発２４時間後の耳の厚み）−（ベースラインの耳の厚み）、Ｅ＝感作動物、Ｓ＝処置動物〕として算出した。データを、平均±ＳＥＭとして表す。
【０１２８】
アテローム性動脈硬化症の病変サイズおよび大動脈瘤の形成の検出
本発明者らの飼育施設からの２８週齢アポリポタンパク質Ｅ−／−の雄マウス（ｎ＝８〜１０マウス／群）を、通常の固形食餌で維持し、標準的な条件下で保った。アテローム性動脈硬化症の促進および大動脈瘤の形成を、以前に記載（Ｄａｕｇｈｅｒｔｙら  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １０５：１６０５−１６１２）されるように、浸透ミニポンプ（Ａｌｚｅｔ、番号２００４）を用いて、２８日間の皮下アンジオテンシンＩＩ（Ｓｉｇｍａ、番号Ａ９５２５）注入（１ｍｇ／ｋｇ／ｄ）により誘導した。全ての実験は、本発明者らの機関の倫理委員会により承認された。アテローム性動脈硬化症の病変サイズを、以前に記載（Ｃａｌｉｇｉｕｒｉら  Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｂａｓｃ  Ｂｉｏｌ  ２５：１６５９−１６６４）されるように、測定した。これらの実験を２回繰り返したところ、同様の結果であった。
【０１２９】
ペプチド
ヒト材料に対する全ての実験を、ヒトペプチド配列を用いて行い、一方で、マウス等価物を、全てのマウス実験において用いた。ペプチドの配列を、以下の表に示す。
【０１３０】
【表Ｃ】
0005866198.tif 000004
【０１３１】
実施例２：血液リンパ球の表面でのＣＤ３１の見かけ上の消失は、第５の細胞外Ｉｇ様ドメインと第６の細胞外Ｉｇ様ドメインとの間のその分断に起因する。
消失したＣＤ３１がその６つの細胞外Ｉｇ様ドメインの一部に制限されるか、または全体に拡張されるかを確立するために、この分子の膜遠位および膜近位Ｉｇ様ドメインを特異的に認識する２つの異なる抗体を用いて、５人の健常ドナーからの全血白血球の多色フローサイトメトリー解析を行った。異なる白血球集団間を識別し、かつ成熟および活性のそれらの状態を評価できるようにするため、一団の系譜マーカーならびにＣＤ４５ＲＡおよびＨＬＡ−ＤＲの発現を、同時に用いた。ＣＤ３１の第１ドメインに特異的なモノクローナル抗体（クローンＷＭ−５９、ｄｏｍ１〜２）により検出されるような、ＣＤ３１の発現を、ナイーブ血液Ｔ細胞で認識したが、活性化／記憶血液Ｔ細胞では認識しなかった。全ての細胞は、成熟／活性化のそれらの状態にかかわらず、ＣＤ３１の第６のＩｇ様ドメインに特異的な別のモノクローナル抗体（クローンＰＥＣＡＭ  １．２、ｄｏｍ６）により検出される分子の膜近位細胞外フラグメントを発現していた（図１）。
【０１３２】
フロー細胞サイトメトリーは、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）の係合が、８０％を超える血液休止Ｔ細胞について、ＣＤ３１  ｄｏｍ１＋／ｄｏｍ６＋からｄｏｍ１−／ｄｏｍ６＋（ＣＤ３１ｓｈｅｄ）表現型への転換を誘導することを示した。培養Ｔ細胞溶解物からの膜タンパク質の分子解析は、９９％を超えるＴ細胞結合ＣＤ３１分子が、インビトロにおいてＴＣＲ刺激の５’分後に既に、ｄｏｍ１を含有する遠位部分を脱離させることを実証した（図２ａ）。上清の解析は、同時に、ＣＤ３１の初めの５つのＩｇ様ドメインに限定される単一の短縮型可溶性タンパク質が培養上清中に蓄積することを示した（図２ｂ）。さらに、同じ健常ドナーの血漿の解析は、血漿中の大部分の可溶性ＣＤ３１が、Ｉｇ様ドメイン１〜５を含み、かつインビトロおよびインビボの双方で見かけ上ＣＤ３１陰性（ＣＤ３１  ｄｏｍ１−）であるリンパ球に常に係留したままである膜近位の第６ドメインを特異的に欠損する短縮型分子から構成されていることを示した（図２ｂ）。最小量の可溶性ＣＤ３１のみが、培養上清中および血漿中の双方において、以前に報告（Ｇｏｌｄｂｅｒｇｅｒら  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６９：１７１８３−１７１９１）されていたバリアントスプライシング形態で、予測されていた全ての６つの細胞外ドメインを含有していた（図２ｂ）。この分子の有意な他の切断は、第５ドメインの上流で、何ら生じなかった。なぜならば、後者は、実質的に、短縮型可溶性ＣＤ３１タンパク質における第１ドメインに付随して、常に存在していたからである（図２ｂ）。
【０１３３】
ここで、活性化／記憶Ｔリンパ球上でのこの分子の推定される消失は、実際には不完全であり、第５の細胞外Ｉｇ様ドメインと第５の細胞外Ｉｇ様ドメインとの間でのＣＤ３１の分断から生じることが実証される。ＣＤ３１分断は、Ｔリンパ球に対する細胞活性化の直後に生じ、上清中の短縮型分子の蓄積を、この細胞により生成される僅かなレベルのスプライスバリアントと共に伴う。この知見は疑う余地がない。なぜならば、血漿ＣＤ３１を検出する全ての市販の試験は、ＣＤ３１ドメイン１〜５に対する抗体を用いるものであり、したがって、スプライスバリアント（６個の細胞外ドメインの全てを含有する）形態のＣＤ３１と短縮型（ドメイン１〜５）形態のＣＤ３１との間を識別できないためである。本明細書中に記載されるサブトラクティブ免疫吸着アッセイは、可溶性ＣＤ３１の２つの形態間を識別することができ、血漿中のそれらの各々の割合を正確に定量する。このアッセイは、大部分の血漿ＣＤ３１がドメイン１〜５を含むが、血液ＣＤ３１  ｄｏｍ１−リンパ球に係留したままである膜近位の第６ドメインを欠損することを示した。したがって、これらのリンパ球を、ＣＤ３１「陰性」細胞ではなく、ＣＤ３１ｓｈｅｄ細胞と称することを提案する。インビトロにおける以前の研究は、この分子の膜貫通セグメントからＮ末端にある未同定の位置におけるＣＤ３１の分断が、アポトーシスを起こした内皮細胞で生じ得ることを示した（Ｉｌａｎら．２００１．Ｆａｓｅｂ  Ｊ  １５：３６２−３７２）。初めて、分断が血液リンパ球上のＣＤ３１（不完全）消失を担うこと、および循環ＣＤ３１が、分泌されたスプライスバリアント形態からではなく、Ｉｇ様ドメイン５とＩｇ様ドメイン６との間でのその切断に由来する短縮形態から主になることが本明細書中で示された。ＣＤ３１についての遺伝的多型が記載されているが、可溶性ＣＤ３１レベルの予測値は、アテローム性血栓症または他の異常免疫疾患のいずれかにおいて矛盾していた。実際、スプライスされた形態の量は、異なる遺伝的バリアントにより予測することができ、タンパク質の分断から生じる形態の割合は、ＣＤ３１遺伝子多型により決定されない。異なる研究間の不同性は、循環ＣＤ３１が遺伝的バリアントおよび短縮型形態の混合物であり、ＣＤ３１の２つの形態間の識別が可能ではなかったという事実に起因していたと考えられる。本明細書中に記載されるサブトラクティブ方法は、ＣＤ３１の分断に関連付けられるものとは無関係に、ＣＤ３１の遺伝的バリアントにより決定される予後値の鑑別を可能にする。
【０１３４】
実施例３：ＣＤ３１ｓｈｅｄＴ細胞上の残留細胞外ＣＤ３１フラグメント中に含有されるペプチドは、ＣＤ３１−ＩＴＩＭのリン酸化を増進する
このヒト分子の外部ドメインの膜近傍の２３個のアミノ酸（５５１〜５７４）に対応するＣＤ３１  ｄｏｍ６由来合成ペプチドは、ＣＤ３１  ｄｏｍ１＋およびＣＤ３１  ｄｏｍ１−（ＣＤ３１ｓｈｅｄ）ＣＤ４＋Ｔリンパ球の双方にエキソビボで結合する。重要なことに、Ｔ細胞に対するこのペプチドの結合は、免疫細胞の制御に対して機能的な結果をもたらす。なぜならば、それは、インビトロでヒト末梢血Ｔ細胞増殖の用量依存性阻害を発揮するからである（図３ａ）。このペプチドの阻害効果が同種親和性結合およびＣＤ３１シグナル伝達の係合によって媒介され得るかどうかを評価するため、培養Ｔ細胞における６８６位のＣＤ３１  ＩＴＩＭチロシン（６８６ＩＴＩＭ）のリン酸化のレベルを評価した。抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体のみによるＴＣＲの刺激、またはペプチド単独の存在は、ＣＤ３１  ｐＹ６８６の僅かな増加を誘導した（図３ｂ）が、このペプチドの存在下における付随するＴＣＲ刺激は、ＣＤ３１６８６ＩＴＩＭのリン酸化を、２３倍を超えてブーストした（図３ｂ）。
【０１３５】
実施例４：アテローム性血栓症に罹患している患者からの血漿における、および罹患していない個体における分断ＣＤ３１の検出
ＣＤ３１の総量、分断ＣＤ３１の量およびスプライスされたＣＤ３１の量を、アテローム性血栓症に罹患している１１人の個体、および２３人の罹患していない個体の双方において測定した。
【０１３６】
群「アテローム性血栓症」は、安静時でさえも胸痛に苦しみ、かつ異常な冠状動脈造影を呈する１１人の個体を含んでいた。
【０１３７】
群「アテローム性血栓症なし」は、２３人の個体を含んでいた。補足解析を、群「アテローム性血栓症なし」に対して行った。この群は、以下を含むことが判明した。
−胸痛にかかわらず、正常な冠状動脈造影および正常な頸動脈エコードップラー（ｃａｒｏｔｉｄ  ｅｃｈｏｄｏｐｐｌｅｒ）を呈する８人の個体；
−胸痛にかかわらず、正常な冠状動脈造影を呈するが、アテローム性動脈硬化症が頸動脈エコードップラーにより検出された４人の個体；ならびに
−労作時のみ胸痛に苦しみ、かつ異常な冠状動脈造影を呈する（即ち、血栓症を伴わない、冠状動脈のアテローム性動脈硬化症に罹患している）１１人の個体。
【０１３８】
ＣＤ３１の総量、分断ＣＤ３１の量およびスプライスされたＣＤ３１の量を、以下のとおりに決定した。
１．総量（１μｌ／試験）のビーズ（Ｅ９、クローンＪＣ７０Ａとカップリング、ＤＡＫＯ）を、円錐チューブに移し、２００ｇで５分間遠心分離した。上清を注意深く廃棄し、同量の血清強化緩衝液（ＢＤ  番号５１−９００２１５０）に交換し、室温で１５分間インキュベートした。
２．蛍光標識抗体の抗体混合物（ＰＥ−ＷＭ５９；ＦＩＴＣ−ＨＣ１／６；ＰＢ−ＰＥＣＡＭ１．２）を調製した（各々１μｇ／ｍｌ、各１μｌ／条件）。
３．３μｌの標品希釈物または血漿サンプルを各々含有する１個のチューブの前準備物（ｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）を調製した。再構成したビーズを、２００ｇで５分間遠心分離し、上清を廃棄し、血清強化緩衝液を、蛍光標識抗体の混合物に交換した。３μｌのこの溶液を、標品希釈物およびサンプルを含有するチューブの各々に分配し、溶液を、暗中で４℃にて１時間インキュベートした。
４．１５０μｌの洗浄緩衝液（ＢＤ  番号５１−９００３７９７）を、各チューブに添加し、シグナルを得た。
【０１３９】
以下の表に示されるように、分断ＣＤ３１の百分率は、全ての個体が胸痛に罹患しているという事実にもかかわらず、罹患していない個体よりも、アテローム性動脈硬化症に罹患している個体において、より高かった。
【０１４０】
【表Ｄ】
0005866198.tif 000005
【０１４１】
全体のＣＤ３１量は、４つの群において同様であったが、分断ＣＤ３１の量およびスプライスされたＣＤ３１の量は、各々の対をなす群の比較において有意に異なっていた。分断ＣＤ３１は、異常な冠状動脈造影を伴う個体において増加しており、アテローム性動脈硬化症に罹患している個体が最も高い値を有していた。スプライスＣＤ３１は、アテローム性血栓症を伴わないアテローム性動脈硬化症に罹患している患者に依然として存在していたが、それは、アテローム性血栓症に罹患している患者では殆ど検出不能であった。
【０１４２】
これらの結果は、患者が頸動脈粥腫に最終的に付随する非特異的な胸痛に罹患していることを、低レベルの分断ＣＤ３１に付随する高レベルのＣＤ３１可溶性スプライスバリアントが示すことを実証する。正常レベルまたは減少レベルのＣＤ３１可溶性スプライスバリアントに付随する分断ＣＤ３１レベルの僅かな増加は、患者がアテローム性動脈硬化症に罹患していることを示す。検出不能な量のＣＤ３１可溶性スプライスバリアントに付随する分断ＣＤ３１レベルの顕著な増加は、患者がアテローム性血栓症に罹患していることを示す。
【０１４３】
実施例５：タンパク質会合およびリン酸化の定量的評価のためのＣＢＡ（登録商標）の使用
８．１．Ｔ細胞におけるＣＤ３１  ＩＴＩＭ依存性阻害経路を評価するために用いられるプロトコール
細胞の溶解。ｌｏｇ相にあるＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞（１０×１０６／ｍｌ、１ｍｌ）は、触れずに放置にしておくか（陰性コントロール）、またはＮａ３ＶＯ４／Ｈ２Ｏ２（チロシンホスファターゼ阻害剤であるオルトバナジン酸ナトリウム、チロシンリン酸化についての陽性コントロール）と共にインキュベートするかのいずれかであった。並行して、細胞を、抗体媒介架橋によりＣＤ３またはＣＤ３＋ＣＤ３１（ドメイン２、ＷＭ−５９抗体）のいずれかで刺激した。５％ＣＯ２における３７℃での２０’インキュベーション後に、細胞を、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤のカクテルを含有するＲＩＰＡ緩衝液により、氷上で３０’間溶解した。溶解物を超遠心分離し、上清を直接にまたは分割してのいずれかで用い、さらなる解析のために−２０℃で保存した。
【０１４４】
固体支持体上での標的タンパク質の補足（室温で１時間）。この工程は、免疫沈降の原理にしたがうが、シグナル伝達複合体が変性も低減もせず、かつ如何なる電気泳動および／またはブロッティングも行われない。固相支持体として、膜近位ＣＤ３１  Ｉｇ様ドメイン６に対する抗体（ＰＥＣＡＭ１．２とも呼ばれるクローンＭＢＣ７８．２）と予めカップリングしたＣＢＡ（登録商標）機能性ビーズを、製造業者の使用説明書にしたがって用いた。各条件からの２０μｌの溶解物上清の分割物を、５μｌ  ＰＥＣＡＭ１．２−ＣＢＡ（登録商標）と共に、室温で１時間インキュベートした。
【０１４５】
ＣＤ３１に会合した分子およびＣＤ３１  ＩＴＩＭ  ６８６のリン酸化状態の検出。ビーズをＣＢＡ洗浄緩衝液（１００μｌ／チューブ）で一回洗浄した後、ビーズを、４つの別々のチューブ中に分割し、以下に対する蛍光抗体と共にインキュベートした：
−ＣＤ３−ＦＩＴＣ；
−ＣＤ２８−ＰＥ；
−ＣＤ３１ドメイン６（ＰＥＣＡＭ１．２  ＦＩＴＣ）
−ＣＤ３１ドメイン２（ＷＭ−５９  ＰＥ）
−ホスホチロシン（クローン４Ｇ１０  ＦＩＴＣ）；
−ホスホセリン／スレオニン（ＦＩＴＣで標識）
−ＣＤ３１ホスホチロシン６８６（ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ  ４８８抗ウサギ二次抗体と結合したウサギポリクローナル）；あるいは
−ＳＨＰ２−ＰＥ。
【０１４６】
暗中における室温での１時間のインキュベーション後、ビーズを１００μｌ  ＣＢＡ洗浄緩衝液で一回洗浄し、６００個を超えるビーズを、ＬＳＲ  ＩＩおよびＤＩＶＡ（登録商標）ソフトウエアを用いて得た。
【０１４７】
４．解析。各蛍光チャネルにおける中央蛍光値を記録した。ＤＩＶＡ（登録商標）ソフトウエアもまた、％ＣＶ（変動係数）を算出した。これは、繰り返した測定についての誤差バー値の等価物として考慮することができ、サンプル間の統計的比較を可能にする。
【０１４８】
（８．２．結果）
結果を、以下の表に示す。
【０１４９】
【表Ｅ】
0005866198.tif 000006
【０１５０】
【表Ｆ】
0005866198.tif 000007
【０１５１】
太字の値は、ＣＤ３架橋条件に対する増加を示し、イタリック体の値は、減少を示す。
【０１５２】
１係合したＣＤ３１分子は、シス（ｃｉｓ）でオリゴマー化する。ＣＤ３１分子は、Ｔ細胞活性化において調節性分子として生理学的に係合しており、このことは、Ｔ細胞刺激サンプルにおけるＣＤ３１ドメイン６量の増加を説明する。
【０１５３】
２ＣＤ３１のドメイン２のみが検出された場合、補足分子の量は全てのサンプルにおいて同様であったと結論付ける。実際、殆どのＣＤ３１シスオリゴマー化分子は、「％分断」の欄に示されるように、Ｔ細胞活性化の際にドメイン６と２との間で分断する。
【０１５４】
３総ホスホチロシンは、ＣＤ３１抗体処置により僅かに減少したが、それは、ＣＤ３１ペプチド処置により僅かに増加した。実際、ＣＤ３１  ＩＴＩＭのみならず、Ｔ細胞活性化の際にＣＤ３１と会合している他の膜タンパク質（例、ＣＤ３およびＣＤ２８）上に存在するチロシンもまた、リン酸化されることができる。ＣＤ３１ホスホＩＴＩＭに特異的な差異は、配列特異的ホスホＩＴＩＭに対する抗体を用いることにより検出することができた。ホスホチロシンのみならず、ホスホセリン／スレオニンもまた増加する。これらのアミノ酸は、ＣＤ３１細胞質テイルまたは会合した分子のうちの一つのいずれかにおいてリン酸化されることができる。
【０１５５】
４ＣＤ３１に会合したＳＨＰ−２の量は、抗体処置により５０％、およびペプチド処置により１００％増加する。
【０１５６】
５活性化レセプター（ＣＤ３）およびＣＤ３１に会合している共刺激分子（ＣＤ２８）の量は、抗体処置により減少するが、それらは、ＣＤ３１ペプチドにより増加する。これは、Ｔ細胞活性化に反対に作用するＣＤ３１  ＩＴＩＭリン酸化の劇的増加の観点から、細胞の対抗調節機構として考えることができる。
【０１５７】
８．３．結論
全てのこれらのデータを、非常に少量の同じサンプル（２０μｌ）から開始して得た。多色フローサイトメトリーの使用は、同時様式におけるそれらの解析を保障する。標品の利用可能性は、シグナル伝達複合体中の各分子の絶対量の正確な決定を可能にする。
【０１５８】
上記実験を、ＦＩＴＣ（ＦＬ１）またはＰＥ（ＦＬ２）結合抗体のいずれかを用いて行った。タンパク質補足のための非蛍光ビーズの使用は、青色レーザーにおける使用のための少なくとも２つの他の蛍光団の使用を可能にする（ＰｅｒＣＰまたはＰＥ−Ｃｙ７またはＰＥ−Ｃｙ５、ＦＬ３およびＡＰＣまたはＣｙ５、ＦＬ４）。細胞測定に対するさらなるレーザー（赤色、紫色、ｕｖ）の利用可能性はさらに、この方法の能力を拡張する。１７個までの異なる蛍光抗体を同時に用いることができ、したがって、１７個までの異なるパラメータ（会合している膜タンパク質、シグナル伝達分子、リン酸化配列）を、確保できる多数のビーズに起因する強力な統計値を伴って、同じサンプルに対して同時に検出することができる。
【０１５９】
上記方法は、先行技術の方法に比較して、多くの利点を有する。以下の表は、この方法を共ＩＰ／ＷＢ、ＣＢＡＦｌｅｘおよびＣＡＳＥ／Ｐｈｏｓｐｈｌｏｗと比較する。
【０１６０】
【表Ｇ】
0005866198.tif 000008
【０１６１】
共ＩＰ／ＷＰに比較して、この方法は、定量的、直接的かつはるかにより迅速である。また、それは、標的タンパク質、ホスホ分子ならびに会合している膜および細胞内分子の同時検出を可能にする。それはまた、はるかにより多くのパラメータの同時解析を可能にする。なぜならば、ウエスタンブロットは、限定された回数で再ハイブリダイズするに過ぎず、一方、細胞測定器の最新の世代によるこの方法の枠組みでは、２０個までの抗体を同時に用いることができるためである。
【０１６２】
ＣＡＳＥ／Ｐｈｏｓｐｈｌｏｗ、またはＣＢＡ  Ｆｌｅｘセットに比較して、この方法は、はるかにより特異的である。なぜならば、標的分子を補足し、分子複合体内の相互作用を解析できるためである。また、それは、標的タンパク質、ホスホ分子ならびに会合している膜および細胞内分子の同時検出を可能にする。
【０１６３】
実施例６：プロトコールの最適化
５μｌのサンプルを、蛍光団にカップリングされた、機能性ＣＢＡビーズに固定したモノクローナルＭＥＭ−０５抗体（ＣＤ３１ドメイン５、Ｅｘｂｉｏ、Ｃａｌｔａｇ）、ＷＭ−５９（ＣＤ３１ドメイン２）およびＰＥＣＡＭ  １．２（ＭＢＣ  ７８．２とも呼ばれる、ＣＤ３１ドメイン６）を含有する１μｌの混合物と共に、暗中において４℃にて３０〜６０’間インキュベートする。インキュベーション後、ビーズを、２００μｌのアッセイ希釈緩衝液で希釈し、得た。１０００個を超えるゲートしたビーズに対するＰＥおよびＦＩＴＣチャネルの中央蛍光強度を、サンプルおよび標品（組換え、全長細胞外ＣＤ３１、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）の連続希釈物に対して解析した。多様な抗体の結合特性における差異に起因する任意の偏りを克服するために、２つの標準曲線を、組換えＣＤ３１と同時に用いられた検出抗体の各々で得た。ドメイン２、５および６に対する３つの識別抗体により、完全なＣＤ３１を、ドメイン６（Δ６）を欠損するＣＤ３１から、ドメイン５および６（Δ５〜６）の双方を欠損するＣＤ３１から識別することが可能である。
【０１６４】
試験の特異性を向上させるため、ＣＤ３１ドメイン１に対するモノクローナル抗体（クローンＪＣ７０Ａ、Ｄａｋｏ）を、補足ビーズにカップリングさせる。検出は、ＣＤ３１ドメイン２（ＷＯＭ−５９、ＢＤ）、ドメイン５（ＨＣ１／６、Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）およびドメイン６に対する３つの蛍光抗体に基づく。精製したＰＥＣＡＭ  １．２／ＭＢＣ  ７８．２を、適切な蛍光団とカップリングする。現在の機能性ビーズでは、蛍光団の最適なセットは、ＦＩＴＣ、ＰＥおよびＰｅｒＣＰである。この組合せは、病院の生物実験室において利用可能である任意の基本的な青色レーザー細胞測定器（ＦＡＣＳａｎ、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒなど）での測定を可能にする。
【０１６５】
蛍光団としてのＦＩＴＣおよびＰＥにより（実施例５を参照）、最低の検出限界は、３ｎｇ／ｍｌである。これは、アテローム性血栓症に罹患する高い危険性を呈する患者におけるスプライスＣＤ３１の陰性値を生じる。これとは対照的に、異なる蛍光団は、感度の向上につながり得る。したがって、蛍光団および抗体の異なる組合せを試験する。
【０１６６】
実施例７：ＢＩＯｃｏｒｅコホートの解析
患者のコホートを解析した。個体を、実施例４に示されるように、異なる群に分類した。
【０１６７】
細胞測定による細胞解析により、短縮型（分断）ＣＤ３１を示すＴ（ＣＤ３＋）リンパ球が急性冠状動脈事象の危険性のある患者において有意により高いことが確認された（表１を参照）。
【０１６８】
【表１】
0005866198.tif 000009
【０１６９】
上記表では、「ACS」は、急性冠状動脈症候群を表し、「Carotide」は、末梢アテローム性動脈硬化症を表し、「Norm」は、正常な冠状動脈の血管造影を表し、「SA」は安定な狭心症を表す。
【０１７０】
亜集団の解析は、この結論がＣＤ４＋Ｔ（ＣＤ３＋）細胞およびＣＤ８＋Ｔ（ＣＤ３＋）細胞の双方で有効であることを示した（それぞれ、表２および３を参照）。
【０１７１】
【表２】
0005866198.tif 000010
【０１７２】
【表３】
0005866198.tif 000011
【０１７３】
また、血漿解析により、総可溶性ＣＤ３１のレベルは、群間を識別できなかったことが確認された（表４を参照）。
【０１７４】
【表４】
0005866198.tif 000012
【０１７５】
血漿中のスプライスＣＤ３１および分断ＣＤ３１の測定を可能にする、本発明の方法のみが、急性冠状動脈症候群を診断および／または予知するために適応できる（それぞれ、表５および６を参照）。
【０１７６】
【表５】
0005866198.tif 000013
【０１７７】
【表６】
0005866198.tif 000014
【０１７８】
特に、分断可溶性ＣＤ３１の割合（全体の％）は、急性冠状動脈症候群、安定な冠状動脈疾患および末梢アテローム性動脈硬化症の間を区別するために非常に有用である（表７を参照）。
【０１７９】
【表７】
0005866198.tif 000015
【０１８０】
重要なことに、スプライスおよび分断ＣＤ３１の患者の血漿における測定（総ＣＤ３１のものではない）が、主要な有害な心血管事象（ＭＡＣＥ、死亡、致命的または非致命的な心筋梗塞など）の再発を予測することを可能にすることもまた見出された。
【０１８１】
【表８】
0005866198.tif 000016
【０１８２】
実施例８：炎症疾患の診断および／または予後マーカーとしての分断ＣＤ３１
本発明の方法を用いる可溶性スプライスおよび分断ＣＤ３１の測定が、慢性炎症疾患を患う患者における処置不全の危険性を評価するために役立てることができるかどうかを調査した。
【０１８３】
関節リウマチまたは脊椎関節症のいずれかに冒された７３人の患者からのデータを収集した。
【０１８４】
ＣＤ３１の血漿レベルは、患者の予後および生物療法に対する陽性応答と関連することが見出された（図６Ａを参照）。これは、現在のところ用いられているバイオマーカー（ＥＳＲおよびＣＲＰ）によっては予測できなかった。
【０１８５】
上記患者は、非常に重篤な炎症に罹患していた。このような場合には、分断ＣＤ３１のレベルは、ベースライン値よりも数倍（１０００ｎｇ／ｍｌよりもさらに）に上昇し得、結果として、総可溶性ＣＤ３１の有意な上昇につながる。したがって、分断ＣＤ３１のみならず、総可溶性ＣＤ３１もまた、炎症が非常に重篤である場合には、炎症に対するバイオマーカーとして用いることができる。
【０１８６】
しかしながら、炎症状態がより明白でない患者では、総可溶性ＣＤ３１からの分断ＣＤ３１の鑑別が必要とされる。
【０１８７】
実施例９：可溶性ＧＰＶＩの血漿レベルの測定
本発明の方法を、可溶性ＧＰＶＩの血漿レベルを測定するために適応させた。可溶性形態のＧＰＶＩは、活性化の際に血小板から切り出され、これは、危険性のある患者における血栓形成の発生を評価し得る。
【０１８８】
（ｉ）補足用の抗体（ＣＢＡビーズにカップリング）；および（ｉｉ）検出用のＧＰＶＩ（コンブルキシン）の蛍光標識天然リガンドを用いる血漿中の分断ＧＰＶＩを測定するための再現性のある方法を設定した。補足用の抗体は、クローン番号３ｊ２４．２またはクローン番号９Ｏ１２．２のいずれかであった。これらの２つのモノクローナル抗体は、ＷＯ／２００１／０００８１０として公開された特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０００／０１８１５２に記載されている。これらの抗体は、ＧＰＶＩの外部ドメインに局在しているエピトープを特異的に認識する。
【０１８９】
如何なる現在のＥＬＩＳＡも、この新しい方法の感度および精度を達成できない（図６Ｂを参照）。標準曲線は、組換えＧＰＶＩ二量体および組換えＧＰＶＩ単量体の双方で得ることができる。この知見は価値がある。なぜならば、ＧＰＶＩは、切断される直前の血小板活性化の際に二量体化するためである。分断後に、それは、二量体として、および単量体としての双方で循環し、機能および／または診断的な価値は、二量体状態に依存して異なり得る。
【０１９０】
したがって、本発明の方法は、個体の血漿中における二量体および単量体の分断ＧＰＶＩを測定することを可能にする。
【０１９１】
具体的には、ＧＰＶＩの分断形態の検出は、以下のとおりに行うことができる。ＧＰＶＩスプライス形態は、細胞質テイルを含み、したがって、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）−ＧＰＶＩ細胞質テイルの融合タンパク質（Ｓｕｚｕｋｉ−Ｉｎｏｕｅら  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００２  ２７７：２１５６１−６）に対して惹起されたもの等の、細胞質テイルを認識する特異的な抗体を用いて検出することができる。一方、分断形態のＧＰＶＩは、完全な外部ドメインを含む。したがって、本発明の方法は、補足用の別々のビーズ上の特異的な抗体（抗テイルおよび抗外部ドメイン）および検出用の蛍光標識コンブルキシン、またはその逆（コンブルキシンにカップリングしたビーズによる補足、および差示的に標識された蛍光抗テイルおよび抗外部ドメイン抗体による検出）のいずれかを用いて行われる。
【配列表フリーテキスト】
【０１９２】
（配列の簡単な説明）
配列番号１は、ヒトＣＤ３１の配列に対応する。
配列番号２および３は、ＣＤ３１ペプチドに対応する。
配列番号４は、ネガティブコントロールとして用いられる混雑ペプチドに対応する。
【図２ａ】
0005866198.tif 000017
【図２ｂ】
0005866198.tif 000018
【図３ａ】
0005866198.tif 000019
【図３ｂ】
0005866198.tif 000020
【図４】
0005866198.tif 000021
【図５】
0005866198.tif 000022
【図６ａ】
0005866198.tif 000023
【図６ｂ】
0005866198.tif 000024
【図１】
0005866198.tif 000025
【配列表】
0005866198000001.app