(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
迅速自己更新性である間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の精製集団を含む医薬組成物の製造方法であって、
ＴＮＦ−α、ＩＬ１、及びＬＰＳの１つ又は複数と接触することにより、前記間葉系幹細胞のＴＳＧ−６タンパク質の発現を増加させる工程を有することを特徴とする医薬組成物の製造方法。
【請求項２】
前記医薬組成物が哺乳類被検者における心筋梗塞のサイズを低下させるために使用されることを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物の製造方法。
【請求項３】
前記精製集団が、（ａ）ＴＳＧ−６タンパク質をコードする異種ヌクレオチド配列を含みかつ（ｂ）前記ＴＳＧ−６タンパク質を発現する遺伝子組換え間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の集団であることを特徴とする請求項１又は２に記載の医薬組成物の製造方法。
【請求項４】
前記間葉系幹細胞が、
（ａ）ＲＳ−ＭＳＣを含む細胞の第１集団を提供し、
（ｂ）前記細胞の集団を（ｉ）ＰＯＤＸＬに特異的に結合する抗体、及び（ｉｉ）ＣＤ４９ｆに特異的に結合する抗体、の一方又は双方に接触させ、及び
（ｃ）前記抗体の一方又は双方に結合する細胞を分離し、それによって精製ＲＳ−ＭＳＣの集団を産生する、
各工程を含むプロセスによって精製されたことを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００８年６月１８日に出願された本出願人の米国仮特許出願第６１／０７３７３９号の優先権の利益を主張し、あらゆる目的において、その全体を本願明細書においても参照して取り入れられる。
【０００２】
本発明は、アメリカ国立衛生研究所の国立心肺血液研究所によって賄われる認可番号ＨＬ０７３２５２、Ｐ４０ＲＲ１７４４７、ＰＯｌＨＬ０７５１６１、及び１Ｒ０１ＨＬ０８０６８２−０１Ａ２による米国政府の支援の下でなされた。米国政府は本発明に関して特定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、間葉系幹細胞（間充織幹細胞又はＭＳＣとも称する）を含む組成物、及び心臓障害の修復と炎症性疾患の治療のためのその新規な使用に関する。また、本発明は、特定の条件下でＭＳＣによって分泌されるタンパク質（ＴＳＧ−６）、及び心臓障害の修復と炎症性疾患の治療のためのその新規な使用に関する。本発明の組成物は、限定されるものではないが、心筋梗塞などの心臓障害の後の心臓機能の回復、及び炎症性疾患の症状の抑制に特に有用と考えられる。
【背景技術】
【０００４】
現在、心臓疾患に対する細胞に基づく治療について、非常に楽観的な注力がなされている。しかしながら、細胞治療は初期段階にあり、種々の問題が存在する。例えば、細胞治療から最も恩恵を得る患者の特定、急性疾患と慢性疾患の患者についての最適な細胞の種類と数、細胞送達の最適な時間と仕方、及び細胞が有益な効果を示す作用のメカニズムについて、さらに評価がなされる必要がある。
【０００５】
最近の総説（シーガーとリー、２００８年）に記載のように、心筋梗塞の患者における細胞治療を含む３１件の臨床試験報告がなされている。これらのうち、１４件は左心室の駆出率における統計的に有意な改善を報告し、１件は死亡率の減少に注目し、２件は評価に十分なデータを提供せず、１４件は駆出率における有意な改善を報告していない。ここで明らかなことは、骨髄有核細胞、循環前駆細胞、ＣＤ１３３造血幹細胞、ＣＤ３４造血幹細胞、骨格筋芽細胞、ＭＳＣ、ＭＳＣと内皮前駆細胞の併存、及び不特定の骨髄細胞などの様々な細胞が使用されているため、これらの結果の意味が非常に難しいことである。また、評価する患者、対象標準の性質、含める患者の数、平均の追跡時間、投与する細胞数、投与ルートの選定に関し、種々の研究機関が大きく異なる基準を使用している。したがって、現時点で言える最適なことは、細胞に基づく治療は、心臓病の患者に希望を与えるが、有望な治療の多くの局面がさらなる検討を必要としているということである（参照：シーガーとリー、２００８年；ディメラーとレリー、２００８年；チャーワットら、２００８年；バートら、２００８年）。最適な細胞、投与ルート、及び心臓を修復できるＭＳＣのメカニズムをさらに改良することにニーズが存在している。したがって、本発明の技術的課題は、心臓病の細胞に基づく治療に適する細胞種を特定し、心臓病における改良結果をもたらす少なくとも１つの細胞に基づく因子と特定することによって、従来技術の問題を解決することである。この技術的課題に対する解決策は、特許請求の範囲に特徴づけられる態様によって提供される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本明細書で記載のように、本発明者は、間葉系幹細胞又は多能性間充織幹細胞（いずれも「ＭＳＣ」）と称される骨髄からの幹細胞又は前駆細胞を用いた細胞治療に関し、上記の課題のいくつかにおいて、重要な進展を達成した。とりわけ、本発明者は、致死的肺動脈塞栓を発生する傾向の減少、マウスの梗塞心臓への生着の増加、及び当該分野の殆どの研究者に現在採用されているＭＳＣ標本よりも効率的な分化、を実証するＭＳＣ亜集団（ＲＳ−ＭＳＣと定義）を規定する表面エピトープを見出した。ここで、本発明者は、ヒトＭＳＣのマウスへの静脈（ＩＶ）注入後、肺に捕捉されたＭＳＣが活性化され、「ＴＮＦα刺激遺伝子」（ＴＳＧ−６）として知られる多能性抗炎症性遺伝子を非常な高レベルで発現することを実証した。ＴＳＧ−６は、「腫瘍壊死因子α誘導タンパク質６」又はＴＮＦＡＩＰ６としても知られており、その発現は、インターロイキン−１（ＩＬ１）及びリポ多糖体（ＬＰＳ）によっても誘導される。ＭＳＣによるＴＳＧ−６の発現は、梗塞に対する有害な炎症反応を抑制し、心筋梗塞症（ＭＩ）のマウスにおける機能改善は、主に、ＭＳＣの活性化とＴＳＧ−６の発現に由来する。即ち、本発明者は、心筋梗塞症（ＭＩ）の後、ＭＳＣのＩＶ注入が、注入された細胞の殆どが肺に捕捉されるにもかかわらず機能を改善するといった、多数の人によって報告されている奇妙な事象に対する説明を提供する。さらに、データは、ＭＩに対する細胞に基づく治療の有益な効果の少なくとも一部が、（１）高いレベルのＴＳＧ−６の発現するためにＴＮＦ−α、ＩＬ１、及び／又はＬＰＳを用いたプレインキュベーションで活性化されたＭＳＣを含む注入、（２）高いレベルのＴＳＧ−６の発現するように操作されたＭＳＣ（例、ＴＳＧ−６を過剰発現させる形質移入ＭＳＣ）を含む注入、及び（３）組換え型ＴＳＧ−６（例、組換え型ヒトＴＳＧ−６）を含む注入、によって得ることができることを示唆する。本明細書における「注入」は、特に明記しない限り、静脈注入と心臓内注入の双方を含む。
【０００７】
即ち、１つの態様において、本発明は、複数のＭＳＣを、それを必要とする哺乳類に投与することを含む心臓障害の治療方法を提供し、前記ＭＳＣは予備活性化されたＭＳＣであり、前記予備活性化されたＭＳＣは高いレベルのＴＳＧ−６を発現する。また、本発明は、複数のＭＳＣを、それを必要とする哺乳類に投与することを含む心臓障害の治療方法を提供し、前記ＭＳＣはＴＳＧ−６を過剰発現する。また、組換え型ヒトＴＳＧ−６を、それを必要とする哺乳類に投与することを含む心臓障害の治療方法が提供される。さらに、本発明は、ＭＳＣを提供し、前記ＭＳＣは、ＴＳＧ−６を過剰発現するように形質移入される。さらに、本発明は、薬学的に許容されるＭＳＣ製剤を提供し、前記ＭＳＣは、ＴＮＦ−α、ＩＬ１、又はＬＰＳの１つ又は複数で予備活性化される。
【０００８】
より詳しくは、本発明は、１つ又は複数のサイトカインで予備活性化されたＭＳＣの集団からＴＳＧ−６陽性細胞を選択・分離することを含む（例、濃縮集団、即ち、ＴＳＧ−６陰性細胞の数が低下した集団から分離）。１つの態様において、正の選択は、ＴＳＧ−６に対する抗体を用いて達成される（例、細胞捕獲に対する固定化抗体、細胞分類に対する蛍光抗体、等）。
【０００９】
本発明は、さらに、高いレベルのＴＳＧ−６タンパク質を発現する条件下で１つ又は複数のリガンドと接触した間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の精製集団を提供する。好ましい態様において、接触はインビトロ処理を含む。さらなる態様において、リガンドは、サイトカイン、ケモカイン、及び／又はＬＰＳを含む。
【００１０】
また、本発明は、高いレベルのＴＳＧ−６タンパク質を発現する条件下でＴＮＦ−α、ＩＬ１、及びＬＰＳの１つ又は複数と接触した間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の精製集団を提供する。より好ましい態様において、前記精製集団は、精製した迅速自己更新性の間葉系幹細胞（ＲＳ−ＭＳＣ）を含む。
【００１１】
また、本発明は、高いレベルのＴＳＧ−６タンパク質を発現する条件下でＴＮＦ−α、ＩＬ１、及びＬＰＳの１つ又は複数と接触した迅速自己更新性の間葉系幹細胞（ＲＳ−ＭＳＣ）の精製集団を提供する。
【００１２】
本発明は、さらに、（ａ）ＴＳＧ−６タンパク質をコードする異種ヌクレオチド配列を含み、かつ（ｂ）ＴＳＧ−６タンパク質を発現する、遺伝子組換え間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の集団を提供する。１つの好ましい態様において、前記集団は精製される。別な態様において、遺伝子組換え間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の集団は、（ａ）ＴＳＧ−６タンパク質をコードする異種ヌクレオチド配列を含み、かつ（ｂ）ＴＳＧ−６タンパク質を発現する、遺伝子組換えの迅速自己更新性の間葉系幹細胞（ＲＳ−ＭＳＣ）を含む。さらなる態様において、前記遺伝子組換えの迅速自己更新性の間葉系幹細胞（ＲＳ−ＭＳＣ）は精製される。
【００１３】
また、本発明において、（ａ）ＴＳＧ−６タンパク質をコードする異種ヌクレオチド配列を含み、かつ（ｂ）ＴＳＧ−６タンパク質を発現する、遺伝子組換えの迅速自己更新性の間葉系幹細胞（ＲＳ−ＭＳＣ）の集団が提供される。
【００１４】
本発明は、さらに、本明細書に記載の任意の細胞の集団を含む医薬組成物を提供する。
【００１５】
本発明は、さらに、（ａ）ＲＳ−ＭＳＣを含む細胞の第１集団を提供し、（ｂ）細胞の集団を（ｉ）ＰＯＤＸＬに特異的に結合する抗体、及び（ｉｉ）ＣＤ４９ｆに特異的に結合する抗体、の一方又は双方に接触させ、及び（ｃ）前記抗体の一方又は双方に結合する細胞を分離し、それによって精製ＲＳ−ＭＳＣの集団を産生することを含む、迅速自己更新性の間葉系幹細胞（ＲＳ−ＭＳＣ）の精製方法を提供する。１つの態様において、本方法は、（ｄ）精製ＲＳ−ＭＳＣの集団によって発現するＴＳＧ−６タンパク質レベルに比較して高いレベルのＴＳＧ−６タンパク質を発現する細胞の接触集団を産生する条件下で、精製ＲＳ−ＭＳＣの集団をＴＮＦ−α、ＩＬ１、及びＬＰＳの１つ又は複数と接触させる、ことをさらに含む。さらにもう１つの態様において、ＴＳＧ−６タンパク質の増加レベルは１０倍から５００倍である。さらなる態様において、本方法は、（ｄ）精製ＲＳ−ＭＳＣの集団に、ＴＳＧ−６タンパク質をコードするヌクレオチド配列を移入する、ことをさらに含む。本発明は、さらに、本段落に記載の任意の方法によって産生された迅速自己更新性の間葉系幹細胞（ＲＳ−ＭＳＣ）の精製集団を含む。
【００１６】
また、本発明は、（ａ）（ｉ）心筋細胞壊死の１つ又は複数の症状を減少させる必要のある哺乳類被検者、及び（ｉｉ）精製された腫瘍壊死因子α刺激遺伝子６（ＴＳＧ−６）タンパク質を含む組成物を提供し、（ｂ）前記哺乳類被検者に前記組成物の治療的有効量を投与し、それによって心筋細胞壊死の１つ又は複数の症状を減少させる、ことを含む哺乳類被検者の心筋細胞壊死の１つ又は複数の症状を減少させる方法を提供する。投与ルートは限定されるものではなく、１つの態様において、投与は、心筋への筋肉内投与と静脈内投与からなる群より選択される。さらなる態様において、ＴＳＧ−６タンパク質は、（ａ）ＴＳＧ−６タンパク質をコードする異種ヌクレオチド配列を含み、かつ（ｂ）ＴＳＧ−６タンパク質を発現する、遺伝子導入細胞から精製される。
【００１７】
また、本発明は、（ａ）（ｉ）心筋細胞壊死の１つ又は複数の症状を減少させる必要のある哺乳類被検者、及び（ｉｉ）高いレベルのＴＳＧ−６タンパク質を発現する条件下でケモカイン、サイトカイン、及びＬＰＳの１つ又は複数と接触した精製間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の集団を提供し、（ｂ）前記哺乳類被検者に精製間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の集団の治療的有効量を投与し、それによって心筋細胞壊死の１つ又は複数の症状を減少させる、ことを含む哺乳類被検者の心筋細胞壊死の１つ又は複数の症状を減少させる方法を提供する。特定の態様において、精製間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の集団は、迅速自己更新性の間葉系幹細胞（ＲＳ−ＭＳＣ）の精製集団を含む。さらなる態様において、投与の工程は、心筋への筋肉内投与と静脈内投与からなる群より選択される。
【００１８】
また、本発明は、（ａ）（ｉ）心筋細胞壊死の１つ又は複数の症状を減少させる必要のある哺乳類被検者、及び（ｉｉ）（イ）ＴＳＧ−６タンパク質をコードする異種ヌクレオチド配列を含み、かつ（ロ）ＴＳＧ−６タンパク質を発現する、遺伝子組換え間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の集団、を提供し、（ｂ）前記哺乳類被検者に遺伝子組換え間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の集団の治療的有効量を投与し、それによって心筋細胞壊死の１つ又は複数の症状を減少させる、ことを含む哺乳類被検者の心筋細胞壊死の１つ又は複数の症状を減少させる方法を提供する。１つの態様において、遺伝子組換え間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の集団は、精製された迅速自己更新性の間葉系幹細胞（ＲＳ−ＭＳＣ）を含む。さらなる態様において、投与の工程は、心筋への筋肉内投与と静脈内投与からなる群より選択される。
【００１９】
また、本発明は、（ａ）（ｉ）組織における無菌性炎症の１つ又は複数の症状を減少させる必要のある哺乳類被検者、及び（ｉｉ）高いレベルのＴＳＧ−６タンパク質を発現する条件下でＴＮＦ−α、ＩＬ１、及びＬＰＳの１つ又は複数と接触した精製間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の集団を提供し、（ｂ）前記哺乳類被検者に前記精製間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の集団の治療的有効量を投与し、それによって組織における無菌性炎症の１つ又は複数の症状を減少させる、ことを含む哺乳類被検者の無菌性炎症の１つ又は複数の症状を減少させる方法を提供する。１つの態様において、精製間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の集団は、精製された迅速自己更新性の間葉系幹細胞（ＲＳ−ＭＳＣ）を含む。さらなる態様において、投与の工程は、心筋組織への筋肉内投与と静脈内投与からなる群より選択される。もう１つの態様において、組織は心筋組織を含み、投与は、心筋組織への筋肉内投与と静脈内投与からなる群より選択される。もう１つの態様において、被検者は、無菌性炎症疾患を有するか又は有する恐れがある。
【００２０】
また、本発明は、（ａ）（ｉ）組織における無菌性炎症の１つ又は複数の症状を減少させる必要のある哺乳類被検者、及び（ｉｉ）（イ）ＴＳＧ−６タンパク質をコードする異種ヌクレオチド配列を含み、かつ（ロ）ＴＳＧ−６タンパク質を発現する、遺伝子組換え間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の集団を提供し、（ｂ）前記哺乳類被検者に前記遺伝子組換え間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の集団の治療的有効量を投与し、それによって組織における無菌性炎症の１つ又は複数の症状を減少させる、ことを含む哺乳類被検者の無菌性炎症の１つ又は複数の症状を減少させる方法を提供する。１つの態様において、遺伝子組換え間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の集団は、精製された迅速自己更新性の間葉系幹細胞（ＲＳ−ＭＳＣ）を含む。さらなる態様において、組織は心筋組織を含み、投与の工程は、心筋への筋肉内投与と静脈内投与からなる群より選択される。もう１つの態様において、組織は心筋組織を含み、投与は、心筋組織への筋肉内投与と静脈内投与からなる群より選択される。もう１つの態様において、被検者は、無菌性炎症疾患を有するか又は有する恐れがある。
【００２１】
また、本発明は、（ａ）（ｉ）組織における無菌性炎症の１つ又は複数の症状を減少させる必要のある哺乳類被検者、及び（ｉｉ）精製された腫瘍壊死因子α刺激遺伝子６（ＴＳＧ−６）タンパク質を含む組成物を提供し、（ｂ）前記哺乳類被検者に前記組成物の治療的有効量を投与し、それによって組織における無菌性炎症の１つ又は複数の症状を減少させる、ことを含む哺乳類被検者の無菌性炎症の１つ又は複数の症状を減少させる方法を提供する。１つの態様において、組織は心筋組織を含み、投与は、心筋組織への筋肉内投与と静脈内投与からなる群より選択される。別な態様において、被検者は、無菌性炎症疾患を有するか又は有する恐れがある。さらなる態様において、ＴＳＧ−６タンパク質は、ＴＳＧ−６タンパク質をコードする異種ヌクレオチド配列を含みかつＴＳＧ−６タンパク質を発現する遺伝子組換え細胞から精製される。
【００２２】
さらに、本発明は、（ａ）組織における無菌性炎症の１つ又は複数の症状を減少させる必要のある哺乳類被検者を提供し、（ｂ）プラスミン活性、マクロファージ誘導タンパク質−１（ＭＣＰ−１）、マクロファージ炎症性タンパク質−１α（ＭＩＰ−１α）、βトロンボグロブリン、可溶性ＳＴ２受容体、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、及びナトリウム利尿ペプチドの２つ以上（３、４、５、６等）の血清レベルの増加を、組織における無菌性炎症を有しない対照標準の哺乳類被検者に比較して検出することを含む、哺乳類被検者の組織における無菌性炎症を検出する方法を提供する。１つの態様において、組織は心筋組織を含む。もう１つの態様において、本方法は、さらに、（ｃ）（ｉ）精製された腫瘍壊死因子α刺激遺伝子６（ＴＳＧ−６）タンパク質を含む組成物、（ｉｉ）高いレベルのＴＳＧ−６タンパク質を発現する条件下でＴＮＦ−α、ＩＬ１、及びＬＰＳの１つ又は複数と接触した精製間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の集団、及び（ｉｉｉ）ＴＳＧ−６タンパク質をコードする異種ヌクレオチド配列を含んでＴＳＧ−６タンパク質を発現する遺伝子組換え間葉系幹細胞（ＲＳ−ＭＳＣ）の集団の１つ又は複数の治療的有効量を前記被検者に投与することを含み、前記投与は治療被検者を産出し、さらに（ｄ）前記治療被検者において、工程（ｂ）で検出した血清レベルに比較して、プラスミン活性、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、βトロンボグロブリン、可溶性ＳＴ２受容体、Ｃ反応性タンパク質、ＣＲＰ、及びナトリウム利尿ペプチドの２つ以上の血清レベルの減少を検出することを含む。
【００２３】
本発明の特徴、目的、効果をさらに理解するために、以下に説明する図面と併せて以下の詳細な説明を理解するべきである。ここで、同じ参照番号は同じ要素を示す。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、有用な表面エピトープのための予備スクリーンとしてのマイクロアレイの使用を示す。図１Ａは、ヒトＭＳＣを調製するために使用される２つのプロトコルの概略である。多くの研究者が高密度培養を採用し、低密度培養は、ＲＳ−ＭＳＣを保持するために設計される。図１Ｂは、１００細胞／ｃｍ２で蒔いて５〜９日間インキュベートし、継代２のＭＳＣを生成した、継代１／ドナー１からの生存ＭＳＣの位相差顕微鏡像を示す。図１Ｃは、図１ＢからのＭＳＣの前方と側方の光の散乱によるアッセイを示す。アッセイを標準化するために、ミクロビーズとともに縦線と横線を示した。本発明者は、以前に、ＲＳ−ＭＳＣをＳＭ−ＭＳＣと区別するためにアッセイを用いたが、再現性は高くなかった（スミスら、２００４年）。図１Ｄは、１００細胞／ｃｍ２で蒔いてインキュベートし、５日間で約５０％培養密度、１０日間で約１００％培養密度、１５日間で過剰培養密度となった、継代１／ドナー６からの生存ｈＭＳＣによるｍＲＮＡのマイクロアレイのアッセイを示す。これらの値は、１５日（左側）又は５日（右側）のｍＲＮＡ信号に標準化した。
【図２】図２は、１００細胞／ｃｍ２で蒔いて、５日間又は９日間インキュベートし、継代２のＭＳＣを生成した、生存ＭＳＣの継代１／ドナー５の培養アッセイを示す。継代３のＭＳＣを調製するため、９日培養物をトリプシン／ＥＤＴＡとともに上げ、１００細胞／ｃｍ２で再び蒔いて、５日間又は９日間インキュベートした。図２ＡはＲＴ−ＰＣＲアッセイを示す。図２Ｂはウエスタンブロットアッセイを示す。図２Ｃは免疫細胞化学によるアッセイを示す。バーは２００μｍである。細胞核をＤＡＰＩで標識化した（９日カラム、継代２と継代３）。
【図３】図３は、培養物の増殖を伴うＭＳＣにおけるエピトープの変化のＦＡＣＳｃａｎを示す。図３Ａは、１００細胞／ｃｍ２で蒔いて、５、６、７、８、又は９日間インキュベートした、生存の継代１／ドナー４のＭＳＣを示す。細胞はトリプシン／ＥＤＴＡとともに上げた。図３Ｂは、図３Ａと同じ条件下の５つのドナーからの、ＭＳＣを用いて得られたデータを示す。各値は、平均蛍光強度（Ｘ平均）又は陽性細胞％のいずれかで表わした。図３Ｃは、第５日の値に標準化した図３ＢのＸ平均値を示す。図３Ｄは、図３Ａと同様にインキュベートし、ＳＴＲＯ−１とＧＤ２についてアッセイした、継代１／ドナー１のＭＳＣのＦＡＣＳｃａｎを示す。図３Ｅは、継代１／ドナー１とドナー７のＭＳＣのＸ平均値を示す。
【図４】図４は、静脈内注入したＭＳＣの組織分布を示す（注入細胞の％として表わす）。ＰＯＤＸＬｈｉ／ＣＤ４９ｆｈｉ又はＰＯＤＸＬｌｏ／ＣＤ４９ｆｌｏのいずれかの１００万の継代２のＭＳＣ（ドナー１とドナー２）を、対照標準マウス又は心筋梗塞（ＭＩ）マウスに静脈内注入した。ＭＳＣ注入の１日後に組織を回収した。ヒトＡｌｕ配列についてのリアルタイムＰＣＲアッセイ値を注入ヒト細胞又はヒト細胞の数の％として表わす。；  誤差バー：値の範囲；  ｎ＝４〜６；  ★：ノンパラメトリックなマンホイットニー検定による対照標準マウスにおけるｐ＜０．０５対ＰＯＤＸＬｈｉ／ＣＤ４９ｆｈｉ、及びＭＩマウスにおけるｐ＜０．０５対ＰＯＤＸＬｌｏ／ＣＤ４９ｆｌｏ； コルモゴルフ・スミルノフ検定は、データが標準的に分布していないことを示した。；  ★★：両側スチューデントｔ検定による対照標準マウスにおけるｐ＜０．０５対ＰＯＤＸＬｈｉ／ＣＤ４９ｆｈｉ、及びＭＩマウスにおけるｐ＜０．０５対ＰＯＤＸＬｌｏ／ＣＤ４９ｆｌｏ； ＋：両側スチューデントｔ検定によるＭＩマウスにおけるｐ＜０．０５対ＰＯＤＸＬｌｏ／ＣＤ４９ｆｌｏ
【図５】図５は、注入されたｈＭＳＣ、癌細胞、及びヒトＷＢＣの組織分布を示す。図５の左上は、静脈注入されたＭＳＣが、５分間以内に血液から浄化されていくことを示す。７つの他の組織についてのＡｌｕ配列の全回復が、下側曲線と数値で示されている。図５の右上は、心臓の左心室に注入されたｈＭＳＣもまた５分間以内に浄化されることを示す。図５の左下は、ｈＭＳＣのＩＶ注入の１５分後のヒトＡｌｕ配列、乳癌細胞株（ＭＤＡＭＢ−２３１）、及びヒトＷＢＣの組織分布を示す。図５の右下は、ｈＭＳＣのＩＣ注入の１５分後及び癌細胞株の分布を示す。
【図６】図６は、ＩＶ注入ｈＭＳＣ（２×１０６）の組織分布を示す（注入した細胞の％で表わす）。図６Ａは、注入された細胞の８０％以上が肺に捕獲され、次いで約５０時間にわたって徐々に消失することを表わした、Ａｌｕ配列とヒトｍＧＡＰＨＤについてのアッセイを示す。図６Ｂは、ｈＭＳＣのＩＶ注入から１５分後の肺中のヒト細胞の存在を実証する免疫組織化学の結果を示す（ヒトβ２ミクログロブリン＋）。図６Ｃは、ｈＭＳＣ（１０６）のＩＶ投与１５分後のヒトＡＬｕ配列の組織分布であり、血管拡張剤の事前投与の有無、ＣＤ４９ｆ又はＣＤ４９ｄへの抗体を用いた細胞の事前インキュベーション、及びヒトＷＢＣ（１０６）の併投与を含む。図６Ｄは、ＭＩの１日後のＩＶ注入ｈＭＳＣの遅発的出現を示す。
【図７】図７は、ヒト特異的ｍＲＮＡについてのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイの結果を示す。「インビトロＭＳＣ」は、マウスへのＩＶ注入前のｈＭＳＣについてのＲＮＡを示す。「インビボＭＳＣ１」と「インビボＭＳＣ２」は、ｈＭＳＣ（１０６）のＩＶ注入の１０時間後の２匹の別なマウス（マウス１、マウス２）の肺からのＲＮＡを示す。値は、インビトロＭＳＣ（値＝１に設定）での観察レベルに対する増加倍数である。
【図８】図８は、ＴＳＧ−６の発現を示す。図８の左上は、ｈＭＳＣのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイ（継代２と３）及び１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαを用いて無血清培地でインキュベートされた線維芽細胞を示す。図８の右上は、細胞溶解物のウエスタンブロットを示す。一部のＴＳＧ−６は、より大きい分子形態で回収され、これは明らかに、ヒアルロナンその他のタンパク質へのその強い結合によるものである。図８の中段左は、ｈＭＳＣと線維芽細胞（Ｆｉｂｒｏｓ）からの培地のＥＬＩＳＡアッセイを示す。図８の中段右は、馴化培地（最初の４列）とローディングコントロール（次の４列、クーマシィ着色）のウエスタンブロットを示す。図８の左下は、ｓｉＲＮＡによるＴＳＧ−６への形質導入後のｈＭＳＣのＴＳＧ−６のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイを示す。図８の右下は、図８の左下のサンプルからの培地におけるＴＳＧ−６についてのＥＬＩＳＡアッセイを示す。
【図９】図９は、ＭＩのマウスにおける静脈注入（ＩＶ）ｈＭＳＣの効果を示す。持続性ＭＩをマウスに引き起こし、２×１０６ｈＭＳＣ又は１００ｍｇの組換え型ＴＳＧ−６を１時間後に尾静脈に注入した。４８時間後に血清又は心臓を回収した。図９Ａは、クロモジムＰＬ（ロシュ・アプライド・サイエンス）による血清プラスミン活性を示す。値は±ＳＤ、「★★」はｐ＜０．０１、ｎ＝３である。図９Ｂは、カゼインのチモーゲンゲル（インビトロゲン）の上の組織プラスミノーゲン活性化剤（ｔＰＡ）とウロキナーゼ（ｕＰＡ）についてアッセイした心臓の結果を示す。図９Ｃは、ゼラチンのチモーゲンゲル（インビトロゲン）のプロマトリックスと活性マトリックスの金属プロテアーゼについてアッセイした心臓の結果を示す。
【図１０】図１０は、静脈内投与後の循環するｈＭＳＣを示す。ｈＭＳＣの静脈内投与の１５分後にマウス血液についてＣＦＵ−ｆアッセイを行った。抗ヒト核、β２ミクログロブリン、及びＤＡＰＩでコロニーを標識化した。
【図１１】図１１は、心臓内投与後の循環するｈＭＳＣと組織の分布を示す。図１１Ａは、マウスに約２×１０６ｈＭＳＣを心臓内注入した後の血液からのヒトＡｌｕ配列の浄化を示す。各値は、平均±ＳＤ（標準偏差）であり、ｎ＝６である。図１１Ｂは、マウスに約２×１０６ｈＭＳＣを心臓内注入した１５分後のヒトＡｌｕ配列の組織分布を示す。各値は、平均±ＳＤであり、ｎ＝６である。
【図１２】図１２は、ＭＩから３週間後の心臓の組織断面である。心臓を尖部から底部を通して５μｍの薄片に切り、マッソントリクロームで染色した。梗塞症をカバーする各２０番目の薄片を示す。記号は図１６Ｂと同様であり、心臓：ｎ＝３又は４である。
【図１３】図１３は、マウスに注入したｈＭＳＣの運命についてのアッセイを示す。図１３Ａは、マウスに約２×１０６ｈＭＳＣをＩＶ注入した後の血液からのヒトＡｌｕ配列の浄化を示す。各値は、平均±ＳＤであり、ｎ＝６である。図１３Ｂは、７つの器官におけるヒトＡｌｕ配列のリアルタイムＰＣＲアッセイについての標準曲線である。各値は、マウス／ヒトＧＡＰＤＨ遺伝子のプライマーと同サンプルのＡｌｕ配列についてのΔΔＣＴを示す。図１３Ｃは、マウスに約２×１０６ｈＭＳＣをＩＶ注入した１５分後のヒトＡｌｕ配列の組織分布を示す。各値は、平均±ＳＤであり、ｎ＝６である。図１３Ｄは、ＧＡＰＤＨについてのヒトｍＲＮＡのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイについての標準曲線である。各値は、マウス／ヒトＧＡＰＤＨ遺伝子のプライマーと同サンプルのヒト特異的ＧＡＰＤＨのｃＤＮＡについてのΔΔＣＴを示す。図１３Ｅは、約２×１０６ｈＭＳＣをＩＶ注入した後の肺とその他６つの組織におけるｈＭＳＣの動態を示す。各値は、平均±ＳＤであり、ｎ＝６である。図１３Ｆは、約２×１０６ｈＭＳＣをＩＶ注入した後、左前下行枝冠状動脈の永続的連結から１日後の心臓におけるｈＭＳＣの出現を示す。
【図１４】図１４は、ｈＭＳＣのＩＶ注入後のマウス肺におけるマイクロアレイのアッセイのヒートマップを示す。約２×１０６ｈＭＳＣをＩＶ注入し、１０時間後に肺ＲＮＡを回収し、マウス特異的マイクロアッセイとヒト特異的マイクロアッセイ（アフィメトリクス、サンタクララ、カリフォルニア州）の双方についてアッセイした。データをクロスハイブリダイゼーションについてフィルタにかけ（ＣＶ＞０．５、コール＞３３％）、マイクロアレイスイート５．０プログラムで解析し、値１と３ＳＤの分散に標準化した（＋３、赤；３、青）。遺伝子の遺伝子存在カテゴリーが示されている。発現の差異がある遺伝子の数が枠の中に示されている。図１４Ａは、マウス特異的チップ上のアッセイである。図１４Ｂは、ヒト特異的チップ上の同じアッセイである。図中の記号として、「ｃｏｎ」は対照標準マウスからの肺、「ｈＭＳＣｓ  ｃｏｎ」はＲＮＡ抽出前の対照標準マウスから肺に添加したｈＭＳＣのサンプル、「ｈＭＳＣｓ  ＩＶ」はｈＭＳＣｓのＩＶ注入後１０時間のマウス肺からのサンプルである。
【図１５】図１５は、ＴＳＧ−６を発現するためのｈＭＳＣの活性化を示す。図１５Ａは、２×１０６ｈＭＳＣをＩＶ注入して１０時間後の、肺のヒト特異的ｍＲＮＡについてのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイを示す。各値は、ｈＧＡＰＤＨについてΔΔＱによって標準化した、培養したｈＭＳＣについての値に対する増加倍数である。図中の記号として、「ｈＭＳＣｓ  ｃｏｎ」はＲＮＡ抽出前の対照標準マウスから肺に添加したｈＭＳＣのサンプル、「ｈＭＳＣｓ  ＩＶ１」と「ｈＭＳＣｓ  ＩＶ２」はｈＭＳＣｓのＩＶ注入後１０時間の２匹のマウスの肺からのサンプルである。図１５Ｂは、マウス肺におけるヒトＴＳＧ−６についてのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイを示す。約２×１０６ｈＭＳＣを、未処理マウス（ＩＶ−ｎｏｒ）又はＭＩから１時間後のマウス（ＩＶ−ＭＩ）にＩＶ注入し、注入から０．２５〜２４時間後に肺を回収した。各値は平均±ＳＤであり、正常マウスについてｎ＝２又は３、ＭＩマウスについてｎ＝６である。図１５Ｃは、１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−αを含む無血清培地中で２４時間又は４８時間にわたってインキュベートした同じドナーからのｈＭＳＣのＴＳＧ−６とヒト線維芽細胞についてのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイを示す。同じ細胞の２つの継代の結果を示す。各値は±ＳＤであり、ｎ＝３である。図１５Ｄは、１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−αを含む無血清培地中で４８時間にわたってインキュベートしたｈＭＳＣからの培地中のＴＳＧ−６とヒト線維芽細胞についてのＥＬＩＳＡアッセイを示す。各値は±ＳＤであり、ｎ＝３である。図１５Ｅは、対照標準ｈＭＳＣ（Ｃｏｎ）、形質移入試薬のみで処理したｈＭＳＣ（ｎｏ  ｓｉＲＮＡ）、スクランブルしたｓｉＲＮＡで形質移入したｈＭＳＣ（ｓｃｒ  ｓｉＲＮＡ）、又はＴＳＧ−６のｓｉＲＮＡで形質移入したｈＭＳＣ（ＴＳＧ−６  ｓｉＲＮＡ）のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイのＴＳＧ−６を示す。細胞は１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−αの有り又は無しで６時間にわたってインキュベートした。各値は±ＳＤであり、ｎ＝３である。図１５Ｆは、ＴＮＦ−αの有り又は無しで細胞を４８時間にわたってインキュベートした後の培地中のＴＳＧ−６についてのＥＬＩＳＡアッセイを示す。記号は図１５Ｅと同様である。各値は±ＳＤであり、ｎ＝３である。
【図１６】図１６は、血清と心臓のアッセイを示す。図１６Ａは、ＭＩから４８時間後の血清中の心臓トロポニンＩについてのアッセイを示す。各値は±ＳＤであり、「★★」はマウスのグループあたりｎ＝３（正常）又はｎ＝６（ＭＩ）でｐ＜０．０１である。図１６Ｂは、ＭＩから４８時間後の血清中のプラスミン活性を示す。図中の記号として、「正常」は未処理マウス、「−」はＭＩのみ、「ｈＭＳＣ」はＭＩから１時間後に２×１０６ｈＭＳＣをＩＶ注入、「ｓｃｒ  ｓｉＲＮＡ」はＭＩから１時間後にＩＶ注入したスクランブルｓｉＲＮＡを形質移入した２×１０６ｈＭＳＣ、「ＴＳＧ−６  ｓｉＲＮＡ」はＭＩから１時間後にＩＶ注入したＴＳＧ−６  ｓｉＲＮＡを形質移入した２×１０６ｈＭＳＣ、「ｒｈＴＳＧ−６」はＭＩから１時間後と２４時間後にＩＶ注入した３０μｇのｒｈＴＳＧ−６タンパク質である。各値は±ＳＤであり、「★★」はグループあたりｎ＝３のマウスでｐ＜０．０１である。「Ｎ．Ｓ．」は有意でないことを表わす。図１６Ｃは、ＭＩから４８時間後のゼラチンのチモーゲンゲル上のプロマトリックスと活性マトリックスＭＭＰ９についての心臓アッセイである。像は反転させた。記号は、図１６Ｂと同様である。図１６Ｄと図１６Ｅは、ＭＩから４８時間後の心臓の顆粒球と単球の浸潤である。薄片を抗Ｌｙ−６ＧとＬｙ−６Ｃで染色した。記号は、ＭＩから１時間後と２４時間後に１００μｇのｒｈＴＳＧ−６タンパク質をＩＶ注入した以外は、図１６Ｂと同様である。倍率は×４で、寸法バーは２５０μｍである。各値は±ＳＤであり、各グループについてｎ＝３又は４である。「★★」はｐ＜０．００１、「Ｎ．Ｓ．」は有意でないことを表わす。
【図１７】図１７は、梗塞サイズのアッセイを示す。心臓を尖部から底部を通して４００枚を順次の５μｍの薄片に切り、マッソントリクロームで染色した。各２０番目の薄片を示す。図１２に示すものに加えたサンプルである。図１７Ａ〜Ｅにおいて、記号は、ＭＩから１時間後と２４時間後に１００μｇのｒｈＴＳＧ−６タンパク質をＩＶ注入した以外は、図１６Ｂと同様である。図１７Ｆは、各心臓の合計２０枚の薄片につき、梗塞領域の第１０薄片の正中線長さを測定して得られた梗塞サイズの測定（％）を示す（タカガワら、２００７年）。各値は±ＳＤであり、各グループについてｎ＝３又は４のマウスである。「★★★」はＭＩ対照標準に比較してｐ＜０．０００１を、「Ｎ．Ｓ．」はＭＩ対照標準に比較して有意でないことを表わす。「★」はＭＩ＋ｒｈＴＳＧ−６に対するＭＩ＋ＭＳＣについてｐ＜０．０５を表わす。
【図１８】図１８は、ＭＩから３週間後の心エコーのアッセイを示す。図１８Ａは、代表的なＭモードの心エコー図である。記号は図１６Ｂと同様である。図１８Ｂは、心エコーのデータからの左心室の短縮率（ＬＶＦＳ）と左心室の駆出率（ＬＶＦＥ）を示す。各値は±ＳＤであり、各グループについてｎ＝５又は６である。「★」はＭＩに対して０．０５を表わし、「Ｎ．Ｓ．」は有意でないことを表わす。
【図１９】図１９Ａは、ＴＳＧ−６アミノ酸配列、図１９Ｂは、ヒト腫瘍壊死因子をコードするヌクレオチド配列、α誘導タンパク質６（ＴＳＧ−６）（ＴＮＦＡＩＰ６）（ジェンバンクＮｏ．ＮＭ＿００７１１５）を表わす。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明の理解を容易にするため、いくつかの用語を以下のように定義する。
【００２６】
本明細書と特許請求の範囲において、各用語は、特段の明記がなければ、複数のものについての言及を含む。特段の明記がなければ、本願における技術的用語及び科学的用語は、本発明が属する分野における当業者が一般に理解しているものと同じ意味を有する。
【００２７】
用語「細胞」と「細胞の集団」は、複数の細胞、即ち、１を超える細胞を、いずれも指称することができる。集団は、１つの細胞種類を含む純粋な集団であってもよい。あるいは、集団は、複数の細胞種類を含んでもよい。本発明において、細胞の集団が含んでもよい細胞の種類には制限がない。
【００２８】
「間葉系幹細胞」、「ＭＳＣ」、「骨髄間質細胞」、及び「多能性間質細胞」は、互換的に用いることができ、骨髄（プロコップ、１９９７年）、末梢血（クズネツォーフら、２００１年）、脂肪組織（ギラックら、２００４年）、臍帯血（ロサーダら、２００３年）、滑液膜（デバリら、２００１年）、歯周靭帯（セオら、２００５年）に由来する細胞を指称する。ＭＳＣは、プラスチック組織培養表面に付着する能力（フリーデンシュタインら、オーエンとフリーデンシュタイン、１９８８年に概説）、及び造血幹細胞の効率的なフィーダー層である（イーブスら、２００１年）という特徴がある。また、ＭＳＣは、培養下とインビボの双方において、骨芽細胞と軟骨細胞の中、含脂肪細胞、筋肉細胞（ワキタニら、１９９５年）、及び心筋細胞（フクダとユアサ、２００６年）の中、神経前駆体（ウッドベリーら、２０００年；デングら、２００１年；キムら、２００６年；マレシら、２００６年；クランペラら、２００７年）で分化することができる。間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、当該分野で知られる方法によって精製することができる（ワキタニら、１９９５年；フクダとユアサ、２００６年；ウッドベリーら、２０００年；デングら、２００１年；キムら、２００６年；マレシら、２００６年；クランペラら、２００７年）。
【００２９】
「迅速自己更新性の間葉系幹細胞」、「ＲＳ−ＭＳＣ」、及び「１型間葉系幹細胞」は、互換的に用いることができ、初期前駆細胞を指称する。これらは、典型的に、紡錘状であり、低密度で蒔かれた初期継代ＭＳＣに存在する。迅速自己更新性の間葉系幹細胞（ＲＳ−ＭＳＣ）は、本明細書に記載の方法を用いて、骨髄細胞から及び／又は間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の精製集団から精製することができる（例、ＰＯＤＸＬに特異的に結合する抗体及びＣＤ４９ｆに特異的に結合する抗体の１つ又は複数に結合）。
【００３０】
「遅増殖性の間葉系幹細胞」、「２型間葉系幹細胞」、及び「ＳＲ−ＭＳＣ」は、互換的に用いることができ、初期前駆細胞を指称する。細胞は、ＲＳ−ＭＳＣよりもサイズが大きく、低密度で蒔かれた初期継代ＭＳＣに存在する。典型的に、ＳＲ−ＭＳＣは、培養物が集密度に拡大するときに、ＲＳ−ＭＳＣから発生する。
【００３１】
用語「減少」、「抑制」、「軽減」、「抑止」、「低減」、及びこれらの文法的に同等な用語（「より低い」、「より少ない」、等）は、第１サンプル（又は患者）の第２サンプル（又は治療された患者）に対する、何らかの分子（例えば、ＰＯＤＸＬタンパク質、ＣＤ４９ｆタンパク質、ＴＳＧ−６タンパク質、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−１α、βトロンボグロブミン、可溶性ＳＴ２受容体、ＣＲＰ、ナトリウム利尿ペプチド、ＰＯＤＸＬに特異的に結合する抗体、ＣＤ４９ｆタンパク質に特異的に結合する抗体、ＴＳＧ−６タンパク質に特異的に結合する抗体、等のようなアミノ酸配列、及び本明細書に記載の任意のポリペプチドをコードするもののような核酸配列）、細胞（例、骨髄細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、迅速自己更新性の間葉系幹細胞（ＲＳ−ＭＳＣ）、遅増殖性の間葉系幹細胞（ＳＲ−ＭＳＣ）、等）、及び／又は現象（例、プラスミン活性、病気の症状、細胞増殖、細胞分化、細胞移植、細胞死、細胞予定死、細胞生存能力、細胞生存、分子への結合、結合の親和性、核酸配列の発現、核酸配列の転写、酵素活性、等）のレベルに関し、当該分野で認められている何らかの統計的方法を用いた統計的に有意な量によって、第１サンプル（又は患者）の分子、細胞、及び／又は現象の量が、第２サンプル（又は治療された患者）よりも低いことを意味する。１つの態様において、減少は、例えば、患者が痛み、疲労、呼吸困難、視覚の明瞭性、吐気、等のような病徴の主観的感じ方について述べるときは、主観的に判定することがある。もう１つの態様において、第１サンプルにおける分子、細胞、及び／又は現象の量が、第２サンプルにおける分子、細胞、及び／又は現象の量よりも、５％〜１００％の数値割合の範囲で、例えば、限定されるものではないが、１０％〜１００％、２０％〜１００％、３０％〜１００％、４０％〜１００％、５０％〜１００％、６０％〜１００％、７０％〜１００％、８０％〜１００％、及び９０％〜１００％の範囲で低い。
【００３２】
用語「増加」、「上昇」、「増大」、及びこれらの文法的に同等な用語（「より高い」、「より大きい」、等）は、第１サンプル（又は患者）の第２サンプル（又は治療された患者）に対する、何らかの分子（例えば、ＰＯＤＸＬタンパク質、ＣＤ４９ｆタンパク質、ＴＳＧ−６タンパク質、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−１α、βトロンボグロブミン、可溶性ＳＴ２受容体、ＣＲＰ、ナトリウム利尿ペプチド、ＰＯＤＸＬに特異的に結合する抗体、ＣＤ４９ｆタンパク質に特異的に結合する抗体、ＴＳＧ−６タンパク質に特異的に結合する抗体、等のようなアミノ酸配列、及び本明細書に記載の任意のポリペプチドをコードするもののような核酸配列）、細胞（例、骨髄細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、迅速自己更新性の間葉系幹細胞（ＲＳ−ＭＳＣ）、遅増殖性の間葉系幹細胞（ＳＲ−ＭＳＣ）、等）、及び／又は現象（例、プラスミン活性、病気の症状、細胞増殖、細胞分化、細胞移植、細胞死、細胞予定死、細胞生存能力、細胞生存、分子への結合、結合の親和性、核酸配列の発現、核酸配列の転写、酵素活性、等）のレベルに関し、当該分野で認められている何らかの統計的方法を用いた統計的に有意な量によって、第１サンプル（又は患者）の分子、細胞、及び／又は現象の量が、第２サンプル（又は治療された患者）よりも大きいことを意味する。１つの態様において、増加は、例えば、患者が痛み、疲労、呼吸困難、視覚の明瞭性、吐気、等のような病徴の主観的感じ方について述べるときは、主観的に判定することがある。もう１つの態様において、第１サンプルにおける分子、細胞、及び／又は現象の量が、第２サンプルにおける同じ分子、細胞、及び／又は現象の量よりも、５％〜１００％の数値割合で、例えば、１０％以上、２５％以上、５０％以上、７５％以上、及び／又は９０％以上多い。さらにもう１つの態様において、第１サンプルにおける分子、細胞、及び／又は現象の量が、５倍から１０００倍までの何らかの数値範囲で、例えば、１０〜４００倍、２０〜３００倍、３０〜２００倍、４０〜２００倍、又は５０〜２００倍の範囲で多い。
【００３３】
「心筋梗塞症」、「心筋梗塞」、「ＭＩ」、「急性心筋梗塞」、及び「ＡＭＩ」は、一般に、心臓麻痺として知られるもので、心臓の器官への血液供給の遮断が生じて、心筋壊死を引き起こす。最も多くは、脆弱な動脈硬化プラークの破裂後の冠状動脈の閉塞（封鎖）による。結果としての虚血（血液供給の制限）と酸素不足は、かなりの時間にわたって処置されないと、心臓筋肉組織（心筋）の障害及び／又は死（梗塞症）を生じることがある。
【００３４】
用語「治療」、「処置」、及びこれらの文法的に同等な用語は、疾病（例、心筋梗塞、心筋細胞壊死、炎症、等）に関する場合、１つ又は複数の客観的症状及び／又は１つ又は複数の主観的症状のレベルを遅延及び／又は低下させることを含む。
【００３５】
「腫瘍壊死因子α刺激遺伝子６タンパク質」、「ＴＳＧ−６タンパク質」、「ＴＮＦ−α刺激遺伝子６」、及び「ＴＮＦＡＩＰ６タンパク質」は、互換的に用いることができ、ヒアルロン酸結合ドメインを含む分泌タンパク質、即ち、ヒアルロン酸結合タンパク質ファミリーのメンバーを指称する。ヒアルロン酸結合ドメインは、細胞外マトリックス安定性と細胞移動に関与することが知られている。このタンパク質は、インターαインヒビター（ＩαＩ）とともに安定な複合体を形成することが実証されており、即ち、ＩαＩのセリンプロテアーゼの阻害活性を高め、このことは、炎症に伴うプロテアーゼネットワークにおいて重要である。この遺伝子の発現は、腫瘍壊死因子αとインターロイキン−１によって誘導することができる。また、この発現は、血管平滑筋細胞の機械的刺激によって誘導することができ、プロテオグリカンの合成と凝集に関与することが見出されている。ＴＳＧ−６タンパク質は、図１９Ａのヒトアミノ酸配列によって例示され、これは、図１９Ｂのヌクレオチド配列によってコードされる（ジェンバンクＮｏ．ＮＭ＿００７１１５）。組換え型精製ヒトＴＳＧ−６タンパク質は市販されている（Ｒ＆Ｄシステムズ社、ミネアポリス、カタログ＃２１０４−ＴＳ−０５０）。ＴＳＧ−６に特異的に結合する抗体は市販されている（ＥＬＩＳＡ、ＴＳＧ−６特異的モノクローナル抗体（クローンＡ３８．１．２０）；サンタクルス・バイオテクノロジー社、カタログ＃ＢＡＦ２１０４；ビオチニル化抗ヒトＴＳＧ−６（ＴＳＧ−６ビオチニル化ＰＡｂ検出抗体；Ｒ＆Ｄシステムズ社、ミネアポリス））。
【００３６】
「ＰＯＤＸＬ」、「ポドカリキシン−様２」、「エンドグリカン」、「ＰＯＤＬＸ２」、「ポドカリキシン−様タンパク質２前駆体」、及び「ＵＮＱ１８６１／ＰＲＯ３７４２」は、互換的に用いることができ、ジェンバンク受入Ｎｏ．ＮＭ＿０１５７２０によって例示され、これは、ｍＲＮＡ（ジェンバンク）ＡＦ２１９１３７でコードされている。ＰＯＤＸＬに特異的に結合する抗体は、当該分野で知られており、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＰＣＬＰ１（カタログ＃Ｍ０８４−４、ＭＢＬインターナショナル社、ウォーバン、マサチューセッツ州）が挙げられる。
【００３７】
「ＣＤ４９ｆ」、「α６−インテグリン」、「インテグリン、α６」、及び「ＩＴＧＡ６」タンパク質生成物は、インテグリンα鎖α６である。インテグリンは、α鎖とβ鎖を含む複合的な細胞表面タンパク質である。所与の鎖が、多数のパートナーと結合し、種々のインテグリンを生じることができる。例えば、α６は、ＴＳＰ１８０と称されるインテグリンのβ４、又はインテグリンＶＬＡ−６のβ１と結合することができる。インテグリンは、細胞粘着とともに細胞表面仲介シグナル伝達に関わることが知られている。異なるアイソフォームをコードする２つの転写異性体が、この遺伝子について見出されている。例示のヒトのインテグリンのアミノ酸配列とヌクレオチド配列、α６（ＩＴＧＡ６）、転写異性体２が、ジェンバンク受入Ｎｏ．ＮＭ＿０００２１０に記載されている。ヒト染色体２、参照アセンブリー、完全な配列が、ジェンバンク受入Ｎｏ．ＮＣ＿０００００２．１１に記載されている。ＣＤ４９ｆに特異的に結合する抗体は、ＰＥ−Ｃｙ５ラット抗ヒトＣＤ４９ｆなどが当該分野で知られている（カタログ＃５５１１２９、ＢＤファーミンゲン／ＢＤバイオサイエンシズ）。
【００３８】
本発明は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を含む組成物、心臓障害の修復と炎症性疾患の治療におけるその新規な使用方法を提供する。また、本発明は、心臓障害の修復と炎症性疾患の治療のために、特定の条件下でＭＳＣによって分泌された、ＴＳＧ−６の使用方法を提供する。本発明の組成物は、心臓障害に、限定されるものではないが、心筋梗塞症の後に心臓機能を回復させること、及び炎症性疾患の症状を低下させることに、特に有用であることができる。本発明者は、（１）ＭＳＣ製剤のＲＳ−ＭＳＣ含量の定量的データを最初に提供することができる新規なエピトープの同定、（２）ＲＳ−ＭＳＣは、よりクローン原性であり、培養物中で分化するより高い可能性を有し、他の殆どの研究者によって採用されたＭＳＣ（ＳＲ−ＭＳＣ）の集密的培養物よりもマウスのＭＩ心臓と他の組織により効率的に生着すること、（３）肺に捕獲された細胞が、活性化され、負傷した心臓のセリンプロテアーゼを阻害する多機能抗炎症性タンパク質ＴＳＧ−６を多量に分泌するため、ｈＭＳＣのＩＶ注入後にＭＩマウスの心臓機能が改善すること、及び（４）ＭＩにおけるｈＭＳＣの一部の保護効果が、ｒｈＴＳＧ−６の体系的注入によって再生され得ることを、本明細書において開示する。
【００３９】
以下、本発明を、（Ａ）間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、（Ｂ）肺の塞栓形成細胞が活性化されて抗炎症性タンパク質ＴＳＧ−６を分泌するため、静脈注入ｈＭＳＣがマウスの心筋梗塞症を改善、（Ｃ）ＴＳＧ−６タンパク質を過剰発現する予備活性化された間葉系幹細胞（ＭＳＣ）及び／又は予備活性化された迅速自己更新性の間葉系幹細胞（ＲＳ−ＭＳＣ）、（Ｄ）ＴＳＧ−６タンパク質を過剰発現する遺伝子組換え間葉系幹細胞（ＭＳＣ）及び／又は遺伝子組換え迅速自己更新性の間葉系幹細胞（ＲＳ−ＭＳＣ）、（Ｅ）医薬組成物、（Ｆ）ＲＳ−ＭＳＣの精製方法、（Ｇ）予備活性化されたＭＳＣ及び／又は予備活性化されたＲＳ−ＭＳＣを投与する心筋障害の治療方法、（Ｈ）遺伝子組換えＭＳＣ及び／又は遺伝子組換えＲＳ−ＭＳＣを投与する心筋障害の治療方法、（Ｉ）ＴＳＧ−６タンパク質を投与する心筋障害の治療方法、（Ｊ）予備活性化されたＭＳＣ及び／又は予備活性化されたＲＳ−ＭＳＣを用いる無菌性炎症の治療方法、（Ｋ）遺伝子組換えＭＳＣ及び／又は遺伝子組換えＲＳ−ＭＳＣを用いる無菌性炎症の治療方法、（Ｌ）ＴＳＧ−６タンパク質を投与する無菌性炎症の治療方法、及び（Ｍ）バイオマーカーを用いる炎症の検出方法、についてさらに記載する。
【００４０】
（Ａ）間葉系幹細胞（ＭＳＣ）
１００年以上前に行われた最初の実験は、哺乳類の骨髄からの血液感染症細胞が組織修復と再生に関与することを示唆した（プロコップ、１９９７年に概説）。多数の組織の修復に寄与すると考えられる骨髄細胞についての最初の直接的証明のいくつかは、フリーデンシュタインらによって４０年以上前に発表され（オーエンとフリーデンシュタイン、１９８８年に概説）、組織培養物表面に付着した骨髄からのごく僅かの細胞が、培養物とインビボの双方で、骨芽細胞と軟骨細胞の中に分化し得ることを実証した。その後、骨髄細胞からの同じプラスチック付着細胞が、造血幹細胞にとって有効なフィーダー層であることが見出された（参照：エバンスら、２００１年）。フリーデンシュタインらによる最初の観察は、多数の以降の研究者によって確認・拡大された（カストロ−マラスピナら、１９８０年；メッツとベルドンク、１９８１年；ピエルスマ、１９８３年；オーエンとフリーデンシュタイン、１９８８年；カプラン、１９９０年；プロコップ、１９９７年）。その後の研究は、細胞が培養下で含脂肪細胞、筋肉細胞（ワキタニら、１９９５年）、心筋細胞（フクダとユアサ、２００６年）の中で分化できることを実証した。ＭＳＣが神経系前駆体の中に分化し得るといった本発明者による最初の報告は（ウッドベリーら、２０００年；デングら、２００１年）、決定的ではないと批評されたが、神経系細胞の電気生理学的性質を果たす細胞にＭＳＣが培養下で分化し得るという、別な研究機関による粘り強い報告があった（キムら、２００６年；マレシら、２００６年；クランペラら、２００７年）。また、骨髄に非常によく似た特性を有する細胞が、末梢血（クズネツォーフら、２００１年）、脂肪組織（ギラックら、２００４年）、臍帯血（ロサダら、２００３年）、滑膜（デバリら、２００１年）、及び歯周靭帯（セオら、２００５年）などの多数の組織で特定された。これらの結果は、多くの組織の中のＭＳＣ状の幹／前駆細胞の広範囲なネットワークの存在を示唆した。このネットワークは、恐らく、負傷に対して最初に応答するが、その後必要時に骨髄からのＭＳＣによって補充されるレスポンダーを含む。
【００４１】
骨髄ＭＳＣは、細胞療法を開発する努力を注がれてきたが（カプラン、１９９０年；プロコップ、１９９７年；プロコップら、２００３年；カプラン、２００５年）、その理由は、容易に、患者から得られて培養下で増大されるためである。ＭＳＣを用いた最初の臨床試験は、重症の骨形成不全症の患者（ホロウィッツ、１９９９年、２００２年）、１型コラーゲンの遺伝子における突然変異によって生じる脆性骨症の患者（プロコップ、１９８５年；プロコップとキビリッコ、１９９５年）においてであった。試験は、本発明者らの研究室で開発した遺伝子組換えマウスのモデルにおける実験データに基づいて立案された（ペレイラら、１９９８年）。その後の試験は、ムコ多糖症の患者（コックら、２００２年）、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の患者におけるものであり、免疫反応を抑制する細胞の能力を利用するものであった（アガワルとピッテンジャー、２００５年；リンデンら、２００６年）。ＭＳＣを用いた新たな臨床試験の最近の急増が、この１年半以内に新規株式公開（ＩＰＯ）を成功裏に行った３つのバイオ企業によって大きく促進された。これらの最初の企業のオシリス・セラピーティクス（ボルチモア、メリーランド州）は、関節炎、心臓病、クローン病（フェーズＩＩＩ）、１型糖尿病（フェーズＩＩ）、移植片対宿主病（フェーズＩＩＩ）における臨床試験を公表した。他の企業は、脳卒中などの広範囲な疾病の試験を公表した。
【００４２】
ＭＳＣは、そもそも、多数の細胞表現型に分化する幹状特性によって関心を呼んだが、最近の結果はパラドックスを生んでおり、即ち、移植又は分化のいずれにもそれほどの証拠なしに傷害組織を修復することが多い。例えば、重度の骨形成不全症の子供を治療するためにＭＳＣを使用した最初の臨床試験において（ホロウィッツら、１９９９年、２００２年）、子供は、成長速度とその他の症状を改善した。ここで、子供からの組織のアッセイは、ドナーＭＳＣの１％未満が生着したことを明らかにした。その後、機能改善の同様な観察が、パーキンソン症、脊髄損傷、脳卒中、及び心筋梗塞などの疾病について、一連の動物モデルにおいて行われた（概説：プロコップら、２００３年；プロコップ、２００７年；カプランとデニス、２００６年）。心筋梗塞症において、例えば、何人かの研究者は、ＭＩ後の心筋細胞の中にＭＳＣが分化することを観察している（フクダとユアサ、２００６年）。とはいえ、殆どは、梗塞心臓中のＭＳＣの僅かな期間の移植を伴う改善機能を報告し（参照：ミシェラ、２００８年）、ある観察では、ＭＩの免疫不全マウスの中へのヒトＭＳＣのＩＶ注入後に確認した（イソら、２００７年）。したがって、どのようにしてＭＳＣが傷害組織を修復できるかについての説明に、パラダイム変化がある。現在は、ＭＳＣが造血細胞に効果的なフィーダー層を提供するという早期の観察に新たな関心があり（参照：エバンスら、２００１年）、これは、その細胞が種々のサイトカインとケモカインを分泌するためである（参照：ザチャレックら、２００７年；シンコーゼら、２００８年；ペノラッジら、２００７年）。
【００４３】
このパラダイム変化は、（１）組織内在幹／前駆細胞の高められた増殖と分化、（２）ミトコンドリア又はミトコンドリアＤＮＡの転写による虚血細胞の救出、（３）過剰炎症反応の抑制、及び（４）過剰免疫反応の抑制、などのいくつかの異なるメカニズムを介して修復を高めるために、ＭＳＣが傷害組織とのクロストークに応答するといった、最近の証拠によって支持されている。
【００４４】
本発明者は、マウスの海馬の歯状回の中にヒトＭＳＣを注入することが、マウスの内部神経幹細胞の増殖、移動、及び神経分化を高めることを観察した（ムノスら、２００５年）。本発明が特定のメカニズムに限定されるものではないが、組織内在幹／前駆細胞のこうした刺激が、ＭＳＣの心臓内注入は血漿糖質を低下させ、ストレプトゾトシンで糖尿病を引き起こした免疫不全マウスのマウスインスリンを高めるといった本発明者の以降の観察を、一部において説明することができる（リーら、２００６年）。
【００４５】
また、本発明者は、ヒトＭＳＣが非機能的ミトコンドリアを有する肺上皮細胞（Ａ５４９ρ０細胞）と共培養された後、完全ミトコンドリア機能を有するＡ５４９ρ０細胞の救出クローンが回収されたことを観察した（スピースら、２００６年）。遺伝学的解析は、ゲノムＤＮＡの転写又は他の細胞融合の証拠なしに、救出クローンがＭＳＣからミトコンドリアＤＮＡを受け入れたことを示した。本発明が特定のメカニズムに限定されるものではないが、機能的ミトコンドリアの損失は、虚血の早期帰結であることから、虚血性傷害の最も早期の事象の１つがミトコンドリア機能の低下であるため、ＭＳＣは、心筋その他の組織への虚血性傷害を、一部においては、救出できるかもしれない。
【００４６】
現在、頑固な慢性炎症は、パーキンソン症（タンセイら、２００７年；マックギア、２００７年）から糖尿病（シューマとフォンセカ、２００４年；ショエルソンら、２００７年）までの範囲の様々な疾病における要因として認識されている。最近の一連の報告は、哺乳類における組織障害に対する炎症反応は、過度であることが多く、細胞伝達部分を要求して反応を積極的に抑制し、それによって組織修復を改善すると強調している（シュワープら、２００７年；セルハンら、２００８年）。ある種類の炎症抑制剤は、リポキシン、レゾルビン、及びプロテクシンと称される脂質を含む（セルハンら、２００８年）。ここで、最近の一連の報告は、ＭＳＣが活性化されて、炎症反応と免疫反応の双方を調節するペプチドとタンパク質を分泌することから、ＭＳＣが炎症抑制の別なメカニズムを与えることを示している。インターロイキン１（ＩＬ１）受容体アンタゴニストのＭＳＣによる分泌は、恐らく、ブレオマイシンによって引き起こされる線維症の肺モデルにおけるＭＳＣ投与で観察される改善を説明した（オルティスら、２００７年）。ＬＰＳによって急性肺炎が引き起こされた後、ＭＳＣの気管内投与は、ＭＩＰ−１とその他のサイトカインの発現によって、炎症を抑制し、マウスの生存を長くした（グプタら、２００７年）。下記に示すように、本発明者は、ヒトＭＳＣがマウスに静脈注入されると、殆どの細胞が肺に捕獲されて活性化され、多能性の抗炎症性タンパク質ＴＳＧ−６を分泌することを観察した（ゲッティングら、２００２年；ウイスニースキーとヴィルチェック、２００４年；フォルテーザら、２００７年；ミルナーら、２００６年）。
【００４７】
一連の報告は、ＭＳＣが培養液中の混合リンパ球反応を抑制し、動物モデルにおける多発性硬化症の改善をもたらし（ゲルドニら、２００７年）、移植片対宿主拒絶反応の患者を改善する（アガワルとピッテンジャー、２００５年；ルブランとリンデン、２００７年）ことを実証している。最近、ＭＳＣによる免疫抑制のメカニズムが明らかにされ、即ち、ＩＦＮγとともにＴリンパ球を引き付ける別な３つの炎症性サイトカインの１つによってＭＳＣが活性化される。次いで、ＭＳＣは亜酸化窒素を分泌し、Ｔリンパ球を抑制する。本発明者は、最近、一過性全脳虚血の後のマウスの海馬に注入されたヒトＭＳＣが活性化され、炎症性反応と免疫反応の双方を抑制することにより、神経学的欠損と神経細胞死を低減することを観察した（オータキら、２００８年）。
【００４８】
多くの研究者が、動物モデル（ペレイラら、１９９８年；アキヤマら、２００２年；チェンら、２００３年；ノムラら、２００５年、ウーら、２００８年）と患者（ホロウィッツら、１９９９年、２００２年；コックら、２００２年；リンデンら、２００６年）の双方において、ＩＶ投与によってＭＳＣが有益な効果を生じ得ることを独自に観察している。ＩＶ注入された殆どのＭＳＣが迅速に肺に捕獲されることが納得のいくように実証されているため、その結果は驚くべきである（ガオら、２００１年；シュレップファーら、２００７年）。肺におけるＭＳＣの捕獲は、捕獲が多形核球（ＰＭＮ）細胞（ホッグら、１９９４年）、転移性腫瘍（マクドナルドら、２００２年）、及び恐らく造血幹細胞（ドーナーら、２００４年）でも生じることから、それ自体は予想外ではない。しかしながら、肺に捕獲されたＭＳＣが、心臓、脳、及びその他の組織の修復をどのようにして促進できるのかは、明らかではなかった。このため、ＭＩのマウスへのＩＶ注入（下記に示す）の効果についての本発明者の観察が、大幅な進歩を提示する。
【００４９】
（Ｂ）肺の塞栓形成細胞が活性化されて抗炎症性タンパク質ＴＳＧ−６を分泌するため、静脈注入ｈＭＳＣがマウスの心筋梗塞症を改善
ここでのデータは、ヒトのＤＮＡとｍＲＮＡについての定量分析を用いて得られたデータを示し、静脈注入（ＩＶ）されたヒト多能性間質細胞（ｈＭＳＣ）が、有意な移植なしに組織修復を促進できるといったパラドックスを検討するために使用した。２×１０６ｈＭＳＣをマウスにＩＶ注入した後、殆どの細胞が、塞栓として肺に捕獲された。肺の細胞は、約２４時間の半減期で消失したが、１０００未満の細胞が６つの別な組織に出現した。肺のｈＭＳＣは、多数の遺伝子の発現を上方調節し、抗炎症性タンパク質ＴＳＧ−６が大きく増加した。心筋梗塞の後、ＩＶのｈＭＳＣは（ＴＳＧ−６のｓｉＲＮＡを形質移入されたｈＭＳＣではない）、炎症反応を低下させ、梗塞サイズを減少させ、心臓機能を改善した。組換え型ＴＳＧ−６のＩＶ投与もまた炎症反応を低下させ、梗塞サイズを減少させた。この結果は、ＭＳＣのＩＶ注入後の動物モデルと患者における改善が、少なくとも部分的に、ＴＳＧ−６を分泌するＭＳＣの活性化によって説明されることを示唆する。
【００５０】
本発明者は、最初に、マウスに注入されたヒト細胞の運命についての定量的データを与えるアッセイを開発した。次いで、本発明者は、ＩＶ注入されたヒトＭＳＣ（ｈＭＳＣ）が心筋梗塞（ＭＩ）のマウスに機能的改善を与えるのは、少なくとも部分的に、肺に塞栓として捕獲された細胞が活性化され、抗炎症因子のＴＮＦ−α誘導タンパク質６（ＴＮＡＩＰ６又はＴＳＧ−６）を発現するためであることを実証した。
【００５１】
ＩＶ注入後のマウスの肺に捕獲されたｈＭＳＣは、肺血管系における細胞のミクロ塞栓によって生じた肺への損傷に反応して、遺伝子発現のパターンに大きな変化を受ける（フルラーニら、２００９年；リーら、２００９年）。タンパク質の抗炎症作用のため（ミルナーら、２００６年；ウイスニースキーとヴィルチェック、２００４年）、及び過度の炎症反応がＭＩによって生じる病変の一因となるため（オベーチキンら、２００５年；パオロッチら、２００６年；カルバリョ、２００６年；ファングら、２００７年；モーシャルら、２００８年）、ヒトＴＳＧ−６の上方調節は特に関心が高い。したがって、この結果は、ＭＳＣのＩＶ注入が、ＭＩのモデルにおける心臓機能を改善したという観察に対して、あり得る説明を示唆する（ハルコスら、２００８年；イソら、２００７年；クラウゼら、２００７年；ウルフら、２００７年）。ＭＩのマウスモデルにおいて、ｈＭＳＣにおけるＴＳＧ−６発現の大幅低下は、ｈＭＳＣのＩＶ注入によって生じる炎症反応、梗塞サイズ、及び心臓機能の改善を大きく否定した。また、ｒｈＴＳＧ−６のＩＶ注入は、炎症反応と梗塞サイズに及ぼすｈＭＳＣの治療効果をかなり複製した。したがって、この結果は、肺に捕獲されたｈＭＳＣが活性化されてＴＳＧ−６を分泌し、そのＴＳＧ−６がＬＡＤに対する過度の炎症反応を抑制し、そして心臓に対するタンパク分解性損傷及び以降の線維瘢痕と心臓機能低下を減少させることを示した。１０６ｈＭＳＣの注入後に損傷心臓に一時的に表れた約１５００のｈＭＳＣもまた、抗炎症作用に寄与したとも考えられる。
【００５２】
ＴＳＧ−６の上方調節は、ＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスに注入するｈＭＳＧの異種間ストラテジーによって検出した。動物モデルにｈＭＳＣを用いる同様なストラテジーは、以前より、有用であることが証明されており、この理由は、ｈＭＳＣが細胞に多数の内的マーカーを与え、明らかな異種間人為現象に遭遇しないため（ウォンら、２００８年；ルーら、２００９年；バイら、２００９年；ゴンザレスとレイら、２００９年；サスポータスら、２００９年）、明らかに細胞の免疫調節効果によるためである（ウッチェリら、２００８年）。また、ｈＭＳＣを用いるストラテジーは、マウスＭＳＣを分離する技術的困難（バドゥーら、２００３年；グネッキとメロ、２００９年；ペイスタら、２００４年；ソンら、２００８年）、及び培養下で増殖するときのゲノム不安定性を生じて発癌性になるマウスＭＳＣの顕著な傾向（ソンら、２００８年；トラールら、２００７年）を回避する。マウスにおける永久的ＬＡＤ連結は、大型動物における虚血と再灌流ほどは、ヒトＭＩによく似てはいない。しかしながら、マウスがＭＩへの過度な炎症反応を保有するため（イソら、２００７年）、ＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスの永久的ＬＡＤ連結は、ｈＭＳＣに及ぼす効果の試験に有用なモデルを与えた。
【００５３】
ＴＳＧ−６は、３０ｋＤａの糖タンパク質であり（ヘングら、２００８年；ミルナーら、２００６年）、次の３つの明確な抗炎症効果を生じることが実証されている（ミルナーら、２００６年；ウイスニースキーとヴィルチェック、２００４年）。即ち、（ａ）主としてインターα阻害剤の阻害活性を高めることにより、プロテアーゼの炎症性ネットワークを阻害する、（ｂ）ヒアルロナンの断片に結合し、それによって炎症反応促進効果を鈍らせる、（ｃ）炎症箇所への好中球浸潤を阻害する。遺伝子組換えマウスにおいて、遺伝子の不活化が炎症反応を高め（スザントら、２００４年）、遺伝子の過剰発現が炎症反応を低下させた（ミンドレスキューら、２００２年）。また、組換え型タンパク質の投与が、いくつかのネズミ科モデルにおいて、関節炎を改善した（バルドスら、２００１年；ミンドレスキューら、２０００年）。ＴＳＧ−６は、最初は、ＴＮＦ−αとともにインキュベートされた線維芽細胞からｃＤＮＡをスクリーニングすることによって発見されたが、ここでの結果は、ｈＭＳＣが、ＴＮＦ−αに応えて、皮膚線維芽細胞よりもはるかに多くのＴＳＧ−６を生成することを実証した。
【００５４】
肺に捕獲されたｈＭＳＣは、ＴＳＧ−６のほか、さらなる心保護的因子を分泌した。マウスの梗塞サイズに及ぼすｒｈＴＳＧ−６の効果は、ｈＭＳＣのＩＶ注入の効果よりも若干小さい。ケモカイン又は損傷細胞に反応する培養下のＭＳＣは、ＴＧＦ−β、ＨＧＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＰＧＥ２、及びスタニオカルシン−１などの治療的因子を多量に分泌する（カプラン、２００９年；グネッキら、２００８年；ブロックら、２００９年；オータニら、２００８年）。ここで、ＴＳＧ−６は、ＭＳＣの多くの有益な効果において重要な役割を果たす。無菌組織傷害に対する炎症反応は過剰であって、能動抑制を必要とすることが多い（シュバーブら、２００７年）。また、慢性炎症は、糖尿病、脳卒中、アルツハイマー病、及びパーキンソン症のような疾病において重要な役割を果たす（ベルグスバッケンら、２００９年；マッコームとリード、２００８年；ショールソンら、２００６年；シューマとフォンセカ、２００４年）。したがって、肺に塞栓として捕獲されたＭＳＣによるＴＳＧ−６の分泌は、これら及び他の疾病についての動物モデルにおけるＭＳＣのＩＶ注入後に観察される治療効果を、一部において説明することができる（ウッチェリら、２００８年；イズカーら、２００８年；パールら、２００７年）。また、ＴＳＧ−６の分泌は、骨格筋芽細胞、胎児筋芽細胞、及びＥＳ細胞のような他の細胞を用いた心臓病の治療において、役割を果たすことがある（ジョリクールら、２００７年）。
【００５５】
（Ｃ）ＴＳＧ−６タンパク質を過剰発現する予備活性化された間葉系幹細胞（ＭＳＣ）及び／又は予備活性化された迅速自己更新性の間葉系幹細胞（ＲＳ−ＭＳＣ）
１つの態様において、本発明は、高いレベルのＴＳＧ−６タンパク質を発現する条件下で、炎症促進性ケモカイン、炎症促進性サイトカイン（例、ＴＮＦ−α、ＩＬ１）、及びＬＰＳからなる群より選択された１つ又は複数のリガンドと接触した、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の精製集団を提供する。特定の態様において、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の精製集団は、精製された迅速自己更新性の間葉系幹細胞（ＲＳ−ＭＳＣ）を含む。これらの細胞集団の各々は、心筋細胞壊死及び／又は組織の無菌性炎症の１つ又は複数の症状を減少させるための下記の方法に有用である。
【００５６】
用語「精製」、「分離」、及びこれらの文法的に同等な用語は、少なくとも１つの望ましくない成分（例えば、細胞種類、タンパク質、及び／又は核酸配列）の量をサンプルから減少させることを指称し、５％から１００％までの任意の数値割合での減少を含み、限定されるものではないが、１０％〜１００％、２０％〜１００％、３０％〜１００％、４０％〜１００％、５０％〜１００％、６０％〜１００％、７０％〜１００％、８０％〜１００％、及び９０％〜１００％などが挙げられる。こうした精製は「濃縮」をもたらし、即ち、サンプル中の所望の細胞種類、タンパク質、及び／又は核酸配列の量が増加する。例えば、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、当該分野で公知の方法を用いて、骨髄細胞から精製することができる（ワキタニら、１９９５年；フクダとユアサ、２００６年；ウッドベリーら、２０００年；デングら、２００１年；キムら、２００６年；マレスキら、２００６年；クランペラら、２００７年）。もう１つの例において、迅速自己更新性の間葉系幹細胞（ＲＳ−ＭＳＣ）は、本明細書に記載の方法を用い、骨髄細胞及び／又は間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の精製集団から精製することができる（例、ＰＯＤＸＬに特異的に結合する抗体、及び／又はＣＤ４９ｆに特異的に結合する抗体の１つ又は複数に結合）。
【００５７】
「サイトカイン」は、細胞通信に関与するシグナル分子（タンパク質、ペプチド、糖タンパク質）のカテゴリーである。「炎症性サイトカイン」は、主に小膠細胞のような活性化された免疫細胞によって産生されるサイトカインを指称し、炎症反応の増幅に関与する。炎症性サイトカインには、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、及びＴＧＦ−βが例示される。その他の炎症性媒介物には、ＬＩＦ、ＩＦＮ−γ、ＯＳＭ、ＣＮＴＦ、ＴＧＦ−β、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１７、ＩＬ１８、及びＩＬ８が挙げられる。
【００５８】
「ケモカイン」と「炎症性ケモカイン」は、互換的に用いることができ、炎症細胞を化学誘引し、分子の三次元形状の形成に関与する少なくとも２つ（好ましくは、少なくとも３つ）のシステイン残基を有するポリペプチドを含む分子を指称する。ケモカインは、ＣＣケモカイン、ＣＨＣケモカイン、Ｃケモカイン、及びＣＸ３Ｃケモカインを含む。「ＣＣケモカイン」（「βケモカイン」とも称す）は、アミノ末端の近くに２つの隣接システインを有し、４つのシステインを有するもの（Ｃ４−ＣＣケモカイン）と６つのシステインを有するもの（Ｃ６−ＣＣケモカイン）を包含する。ＣＣケモカインには、ＲＡＮＴＥＳ、ＡＯＰ−ＲＡＮＴＥＳ、ＣＡＰ−ＲＡＮＴＥＳ、ＨＥＹ−ＧＩｙ１−ＲＡＮＴＥＳ、ＨＥＡ−ＧＩｙ１−ＲＡＮＴＥＳ、ＮＮＹ−ＲＡＮＴＥＳ、ＮＮＡ−ＲＡＮＴＥＳ、ＤＤＹ−ＲＡＮＴＥＳ、ＰＳＣ−ＲＡＮＴＥＳ、Ｐｌ−ＲＡＮＴＥＳ、Ｐ２−ＲＡＮＴＥＳ、Ｃ１，Ｃ５−ＲＡＮＴＥＳ、Ｌ−ＲＡＮＴＥＳ、Ｍｅｔ−ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１αＰ、ＡＯＰ−ＭＩＰ−ｌα、ＭＩＰ−１β、γＭＩＰ−ＩＩが挙げられる。「ＣＸＣケモカイン」（「αケモカイン」とも称す）において、２つのＮ末端システインが、１つのアミノ酸（「Ｘ」）によって分離される。ＣＸＣケモカインは、ＣＸＣモチーフ（ＥＬＲ陽性）（例えば、ＣＸＣＬｌ、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ８）の第１サイトカインの直前にモチーフのグルタミン酸−ロイシン−アルギニン（ＥＬＲ）を備えたケモカイン、及びＥＬＲモチーフを有しないもの（ＥＬＲ陰性）を包含する。ＥＬＲ配列モチーフを備えたケモカインは、主として、好中球を化学誘引して活性化することが見出されている。ＥＬＲ配列モチーフを備えないケモカインは、単球、樹枝状細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂリンパ球、好塩基球、及び好酸球を化学誘引して活性化すると思われる。「Ｃケモカイン」（「γケモカイン」としても知られる）は２つのみのシステインを有し、即ち、１つのＮ末端システインと１つのシステイン下流である。「ＣＸ３Ｃケモカイン」（「δケモカイン」としても知られる）は、２つのシステインの間に３つのアミノ酸を有する。
【００５９】
本発明者は、現状で殆どの研究者に採用されており、本発明者が「ＳＭ−ＭＳＣ」と特定するより融合性の培養物からのより成熟したＭＳＣ（スミスら、２００４年）よりも、ＲＳ−ＭＳＣの分離調製が、はるかにクローン原性であって、培養下で分化する高い可能性を有することを実証した。本発明者は、培養物の血清飢餓によって得られるＭＳＣの亜集団が（ｐｒｅ−ＲＳ−ＭＳＣ）、Ｏｃｔ−４と他の胚性遺伝子の高い発現を備えた非常に早期の前駆細胞（ポチャムパリーら、２００４年）であることを実証した。本発明者は、Ｗｎｔシグナリングを阻害するＤｋｋ−１由来合成ペプチドを特定しており、したがって、ＭＳＣの早期前駆体亜集団の培養下の回収と操作の手段を提供する（グレゴリーら、２００５年）。本発明者は、ＲＳ−ＭＳＣと特定されるＭＳＣの亜集団が、ＩＶ注入後、免疫不全マウスの中に優先的に生着されること、及びＣＸＣＲ４とＣＸ３Ｒ１、ＳＤＦ−１の受容体、及びフラクタルカインの発現により（リーら、２００６年）、幹細胞を引き付けるサイトカインまでより効率的に移動することを立証した。
【００６０】
本発明者は、生体外で共培養実験を用い、ＭＳＣが熱ショックを与えた肺上皮細胞又は心臓内皮細胞（スピースら、２００３年）とともに共培養されると、細胞融合の証拠なしに、細胞の融合と分化の双方が生じることを実証した。本発明者は、生体外で共培養実験を用い、インタクトなミトコンドリア又はミトコンドリアＤＮＡのいずれかの転写によって（スピースら、２００３年）、ＭＳＣが非機能的ミトコンドリアを有する細胞を救出することができるといった驚くべき発見を実証した。本発明者は、ニワトリ胚を用いる実験により、細胞融合の証拠なしに（ポチャムパリーら、２００４年）、ラットＭＳＣが初期心筋細胞に分化可能なことを実証した。
【００６１】
フリーデンシュタインらは（オーエンとフリーデンシュタイン、１９９８年）、最初に、組織培養表面への容易な付着によってＭＳＣを同定し、その後、殆どの研究者がその分離技術を追従した。数多くの試みが、ＭＳＣ上の表面エピトープに抗体を調製することによる、細胞の分離と特性評価のためのより特定の処置を開発するためになされた（シモンズとトロック・ストーブ、１９９１年；ハイネスワースら、１９９２年；グロントスら、２００３年；アンジョス・アフォンソ、ボンネット、２００７年；ゲングら、２００７年；バチュラら、２００７年；マルチネス、２００７年）。ＭＳＣに対する公表された抗体は有用であるが、低密度で蒔かれる初期継代ヒトＭＳＣに存在する２つの大きな亜集団が区別されておらず、即ち、（ａ）１型細胞（メッツとベルダンク、１９８２年）又は「ＲＳ−ＭＳＣ」（コルターら、２００２年）と称される紡錘状の迅速自己更新性細胞、及び（ｂ）培養物が集密度に拡大するときに１型又はＲＳ−ＭＳＣから生じる遅増殖性の２型細胞又は「ＳＲ−ＭＳＣ」である。
【００６２】
このように、１つの態様において、本発明は、高いレベルのＴＳＧ−６タンパク質を発現する条件下で、ＴＮＦ−α、ＩＬ１、及びＬＰＳのようなリガンドの１つ又は複数と接触した迅速自己更新性の間葉系幹細胞（ＲＳ−ＭＳＣ）の精製集団を提供する。これらの細胞は、心筋細胞壊死及び／又は組織の無菌性炎症の１つ又は複数の症状を減少させる下記の方法に有用である。
【００６３】
（Ｄ）ＴＳＧ−６タンパク質を過剰発現する遺伝子組換え間葉系幹細胞（ＭＳＣ）及び／又は遺伝子組換え迅速自己更新性の間葉系幹細胞（ＲＳ−ＭＳＣ）
さらなる態様において、本発明は、（ａ）ＴＳＧ−６タンパク質をコードする異種ヌクレオチド配列を含み、かつ（ｂ）ＴＳＧ−６タンパク質を発現する、遺伝子組換え間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の集団を提供する。特定の態様において、遺伝子組換え間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の集団が精製される。さらなる態様において、遺伝子組換え間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の集団は、（ａ）ＴＳＧ−６タンパク質をコードする異種ヌクレオチド配列を含み、かつ（ｂ）ＴＳＧ−６タンパク質を発現する、遺伝子組換え迅速自己更新性の間葉系幹細胞（ＲＳ−ＭＳＣ）を含む。これらの細胞集団の各々は、心筋細胞壊死及び／又は組織の無菌性炎症の１つ又は複数の症状を低減させる下記の方法に有用である。
【００６４】
また、本発明は、（ａ）ＴＳＧ−６タンパク質をコードする異種ヌクレオチド配列を含み、かつ（ｂ）ＴＳＧ−６タンパク質を発現する、遺伝子組換え迅速自己更新性の間葉系幹細胞（ＲＳ−ＭＳＣ）の集団を提供する。これらの細胞は、心筋細胞壊死及び／又は組織の無菌性炎症の１つ又は複数の症状を低減させる下記の方法に有用である。
【００６５】
用語「遺伝子組換え」は、細胞に関して用いた場合、導入遺伝子を含む細胞、又はそのゲノムが導入遺伝子によって変化した細胞を指称する。遺伝子組換え細胞はいくつかの方法によって産生することができ、ベクター（例、プラスミド、線状ＤＮＡ、キャプシド形成ウイルス、等）のような当該分野で公知の方法を用いる人間の介入による、標的細胞の中に核酸（通常はＤＮＡ）を含む「導入遺伝子」の導入、又は標的細胞の染色体の中に導入遺伝子を統合、などが挙げられる。
【００６６】
本願における用語「導入遺伝子」は、実験的操作によって細胞の中に導入された核酸配列を指称する。導入遺伝子は、「内在性ＤＮＡ配列」又は「異種性ＤＮＡ配列」であることができる。用語「内在性ＤＮＡ配列」は、自然発生的配列に対する何らかの修飾（例、点変異、選択可能マーカーの存在、等）を含まない限り、それが導入される細胞に自然に見られるヌクレオチド配列を指称する。用語「異種性ＤＮＡ配列」と「異種ＤＮＡ配列」は、互換的に用いることができ、自然には連結しない又は自然の別な場所で連結する核酸配列に、連結する又は操作によって連結するようになったヌクレオチド配列を指称する。異種ＤＮＡは、それが導入される細胞に対して内在性ではないが、別な細胞から得られている。また、異種ＤＮＡは、ある修飾を含む内在性ＤＮＡ配列を含む。一般に、必ずしもではないが、異種ＤＮＡは、その中で発現する細胞によっては通常は産生されないＲＮＡとタンパク質をコードする。異種ＤＮＡの例には、レポーター遺伝子、転写翻訳制御配列、選択可能なマーカータンパク質（例、薬剤耐性を与えるタンパク質）が挙げられる。
【００６７】
ベクターは（例、プラスミド、線状ＤＮＡ、キャプシド形成ウイルス、等）、当該分野で周知の技術を用いて細胞に導入することができる。細胞の中に核酸配列を「導入する」とは、標的細胞の中に核酸配列を導入して、「形質転換」又は「遺伝子組換え」の細胞を産生することを指称する。細胞の中に核酸配列を導入する方法は、当該分野でよく知られている。例えば、核酸配列が線状ＤＮＡのプラスミド又は裸片の場合、例えば、リン酸カルシウム−ＤＮＡの共沈、ＤＥＡＥ−デキストランの媒介形質転換、ポリブレン媒介の形質転換、電気穿孔、マイクロインジェクション、リポソーム融合、リポフェクション、原形質融合、及び微粒子銃を用いて、配列を細胞の中に「形質導入」することができる。あるいは、核酸配列がウイルス粒子の中に包まれている場合、細胞をそのウイルスに感染させることによって配列を細胞の中に導入することができる。
【００６８】
細胞の形質転換は安定又は一時的であってよい。用語「一時的な形質転換」と「一時的に形質転換される」は、宿主細胞のゲノムの中に問題のヌクレオチド配列を統合することなしに、問題のヌクレオチド配列の１つ又は複数を細胞の中に導入することを指称する。一時的な形質転換は、例えば、問題のヌクレオチド配列の１つ又は複数によってコードされたポリペプチドの存在を検出する酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によって検出することができる。あるいは、一時的な形質転換は、問題のヌクレオチド配列によってコードされたタンパク質の活性を検出することによって検出してもよい。用語「一時的な形質転換体」は、問題のヌクレオチド配列の１つ又は複数を一時的に取り入れた細胞を指称する。
【００６９】
これに対し、用語「安定な形質転換」と「安定に形質転換される」は、細胞のゲノムの中に問題のヌクレオチド配列の１つ又は複数を導入して統合することを指称する。「安定な形質転換体」は、一時的な形質転換体とは以下のように区別され、即ち、安定な形質転換体からのゲノムＤＮＡは、問題の異種ヌクレオチド配列の１つ又は複数を含むのに対し、一時的な形質転換体からのゲノムＤＮＡは、問題の異種ヌクレオチドを含まない。細胞の安定な形質転換は、問題のヌクレオチド配列の１つ又は複数を結合することができる核酸配列を有する細胞のゲノムＤＮＡのサザンブロットハイブリダイゼーション法によって検出することができる。あるいは、細胞の安定な形質転換は、問題のヌクレオチド配列を増幅する細胞のゲノムＤＮＡのポリメラーゼ鎖反応によっても検出することができる。
【００７０】
「遺伝子発現」とは、遺伝子の「転写」を介して（即ち、ＲＮＡポリメラーゼの酵素作用を経て）、遺伝子にコードされた遺伝情報をＲＮＡ（例、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、又はｓｎＲＮＡ）に変換するプロセスを指称し、遺伝子をコードするタンパク質については、ｍＲＮＡの「翻訳」を介してタンパク質に変換するプロセスを指称する。遺伝子発現は、プロセスの多くの段階で規制することができる。「上方制御」又は「活性化」とは、遺伝子発現の産物（即ちＲＮＡ又はタンパク質）の産生を増加させる制御を指称し、一方、「下方制御」又は「抑制」とは、産生を減少させる制御を指称する。上方制御又は下方制御に関与する分子（即ち、転写因子）は、それぞれ「活性化因子」又は「抑制因子」と称されることが多い。
【００７１】
（Ｅ）医薬組成物
本発明は、さらに、精製ＭＳＣ、及び／又は精製ＲＳ−ＭＳＣ、及び／又はＴＳＧ−６を発現する遺伝子組換えＭＳＣ、及び／又はＴＳＧ−６を発現する遺伝子組換えＲＳ−ＭＳＣ、及び／又は精製ＴＳＧ−６を提供する。
【００７２】
用語「医薬」組成物と「生理的許容」組成物は、互換的に用いることができ、薬学的に許容される分子を含む組成物を指称し、即ち、被検者に投与することができる分子であって、例えば、被検者に投与したときに拒絶又はアレルギー反応、眩暈、異常高進、毒性などのような不都合な作用を実質的に生じない分子を含む組成物を指称する。また、好ましくは、薬学的に許容される分子は、本発明の組成物の活性を実質的に低減しない。薬学的分子には、限定されるものではないが、賦形剤と希釈剤が挙げられる。
【００７３】
「賦形剤」は、本発明の組成物の担体として使用される不活性な物質であって、本発明の組成物の便利で正確な用量を可能にする搬送、吸収、及び増量に使用することができる物質である。賦形剤には、限定されるものではないが、固着防止剤、バインダー（例、スターチ、糖、セルロース；ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、及びメチルセルロースなどの改質セルロース；ラクトース；キシリトール、ソルビタール、及びマルチトールなどの糖アルコール；ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール）、コーティング（例、セラック、トウモロコシタンパク質ゼイン、多糖類）、錠剤分解物質（例、スターチ、セルロース、架橋ポリビニルピロリドン、グリコール酸ナトリウム、カルボキシメチルナトリウム、セルロースメチルセルロース）、フィラー（例、セルロース、ゼラチン、リン酸カルシウム、植物油脂、ラクトースなどの糖類）、希釈剤、香味料、着色剤、流動促進剤（例、二酸化ケイ素、タルク）、潤滑剤（例、タルク、シリカ、脂肪、ステアリン、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸）、保存料（例、ビタミンＡ、Ｂ、Ｃなどの酸化防止剤、セレン、システイン、メチオニン、クエン酸、クエン酸ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン）、吸着剤、甘味料（例、シロップ）が挙げられる。特定の態様において、賦形剤は、ノニオン系の水溶性ポリマーであって、増粘、懸濁、結合、乳化、膜形成、安定化、分散、保水、及び保護コロイド作用を与えることができるポリマーのＨＥＣ（ヒドロキシエチルセルロース）を含む。
【００７４】
代表的な「希釈剤」には、水、食塩水、ヒト血清アルブミン、オイル、ポリエチレングリコール、ブドウ糖水溶液、グリセリン、プロピレングリコール、又はその他の合成溶媒が挙げられる。
【００７５】
（Ｆ）ＲＳ−ＭＳＣの精製方法
本発明は、（ａ）ＲＳ−ＭＳＣを含む細胞の第１集団を提供し、（ｂ）細胞の集団を（ｉ）ＰＯＤＸＬに特異的に結合する抗体、及び（ｉｉ）ＣＤ４９ｆに特異的に結合する抗体、の一方又は双方に接触させ、及び（ｃ）前記抗体の一方又は双方に結合する細胞を分離し、それによって精製ＲＳ−ＭＳＣの集団を産生することを含む、迅速自己更新性の間葉系幹細胞（ＲＳ−ＭＳＣ）の精製方法を提供する。
【００７６】
例えば、図３は、培養物の増殖を伴うＭＳＣにおけるエピトープの変化を示し、ＰＯＤＸＬｈｉ／ＣＤ４９Ｆｈｉ細胞に富む細胞集団が、それらが分離されたＭＳＣ細胞集団に比較して高いクローン形成能と分化能を実証している。
【００７７】
用語「抗体」は、任意の源（例、ヒト、齧歯類、ヒト以外の霊長類、ヤギ、ウシ、ウマ、ヒツジ、等）から得られる任意の免疫グロブリン（例、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、等）を包含する。この定義には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、及びキメラ抗体が含まれる。モノクローナル抗体の製造方法が公知である（例、「Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)、「Kohler and Milstein, Nature, 256:495-497 (1975)」、PCT/US90/02545、「Kozbor et al., Immunol. Today, 4:72 (1983)」、「Cole et al., in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96 (1985）」、参照）。２つの異なる抗体の部分、典型的には２つの異なる種類を含む「キメラ抗体」もまた当該技術で標準的である（例、キャビリーらの米国特許第４８１６５６７号、シューマーカーらの米国特許第４９７８７４５号、ビーバーらの米国特許第４９７５３６９号、及びボスらの米国特許第４８１６３９７号、参照）。
【００７８】
用語「特異的結合」、「結合特異性」、及びこれらの文法的に同等な用語は、第１分子（ポリペプチド、糖タンパク質、核酸配列、等）の第２分子（ポリペプチド、糖タンパク質、核酸配列、等）に対する結合が言及された場合、第２分子と第３分子の間の相互作用よりも、第１分子と第２分子の間の優先的な相互作用を言及するものである。特異的結合は、結合の絶対的特異性を必要としない相対的用語であり、言い換えると、「特異的結合」は、第２分子が第３分子と相互作用をせずに、第２分子が第１分子と相互作用することを要求しない。正しくは、第１分子と第２分子の間の相互作用のレベルが第２分子と第３分子の間の相互作用のレベルよりも高ければ十分である。また、第１分子の第２分子との「特異的結合」は、第１分子と第２分子の間の相互作用が、第１分子における特殊な構造の存在によることを意味する。例えば、第２分子が第１分子における構造Ａに特異的であるならば、構造Ａを含む第３核酸配列の存在は、第１分子に結合する第２分子の量を減少させると考えられる。
【００７９】
ＰＯＤＸＬに特異的に結合する抗体は、当該分野で公知であり、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＰＣＬＰ１（カタログ＃Ｍ０８４−４、ＭＢＬインターナショナル社、ウォバーン、マサチューセッツ州）が挙げられる。ＣＤ４９に特異的に結合する抗体は、当該分野で公知であり、ＰＥ−Ｃｙ５ラット抗ヒトＣＤ４９ｆ（カタログ＃５５１１２９、ＢＤファーミンゲン／ＢＤバイオサイエンセス）が挙げられる。
【００８０】
特定の態様において、本方法は、精製ＲＳ−ＭＳＣの集団によって発現するＴＳＧ−６タンパク質レベルよりも増加したレベルのＴＳＧ−６タンパク質を発現する細胞の接触集団を産生する条件下で、精製ＲＳ−ＭＳＣの集団をＴＮＦ−α、ＩＬ１、及びＬＰＳの１つ又は複数と接触させる工程（ｄ）をさらに含む。より好ましい態様において、ＴＳＧ−６タンパク質の増加レベルは、１０倍から５００倍である。さらなる態様において、ＴＳＧ−６タンパク質の増加レベルは、５倍から１０００倍であり、５倍から５００倍、１０倍から４００倍、２０倍から３００倍、３０倍から２００倍、４０倍から２００倍、５０倍から２００倍などである。例えば、図８は、６０倍〜１２０倍で増加した発現を示す。
【００８１】
さらなる態様において、本方法は、精製ＲＳ−ＭＳＣの集団を、ＴＳＧ−６タンパク質をコードするヌクレオチド配列（例、図１９の配列）で形質移入する工程（ｄ）を含む。
【００８２】
本発明は、さらに、本明細書に記載の方法によって産生した迅速自己更新性の間葉系幹細胞（ＲＳ−ＭＳＣ）の精製集団に関する。
【００８３】
（Ｇ）予備活性化されたＭＳＣ及び／又は予備活性化されたＲＳ−ＭＳＣを投与する心筋障害の治療方法
特定の態様において、本発明は、（ａ）（ｉ）心筋細胞壊死の１つ又は複数の症状を減少させる必要のある哺乳類被検者、及び（ｉｉ）高いレベルのＴＳＧ−６タンパク質を発現する条件下でＴＮＦ−α、ＩＬ１、及びＬＰＳの１つ又は複数と接触した精製間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の集団を提供し、（ｂ）前記哺乳類被検者に前記精製間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の集団の治療的有効量を投与し、それによって心筋細胞壊死の１つ又は複数の症状を減少させる、ことを含む哺乳類被検者の心筋細胞壊死の１つ又は複数の症状を減少させる方法を提供する。特定の態様において、精製間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の集団は、精製された迅速自己更新性の間葉系幹細胞（ＲＳ−ＭＳＣ）を含む。
【００８４】
「被検者」と「動物」は、互換的に用いることができ、任意の多細胞動物、好ましくは、動物（例、ヒト、ヒト以外の霊長類、ネズミ、ヒツジ、ウシ、反芻動物、ウサギ、ブタ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、トリ、等）を指称する。即ち、哺乳類被検者には、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、フェレット、及びチンチラが含まれる。
【００８５】
心筋細胞壊死や炎症などの疾病の１つ又は複数の症状を減少させる必要のある被検者には、疾病の１つ又は複数の症状を示している又は示す恐れのある被検者が含まれる。例えば、被検者は、家族歴、遺伝因子、環境要因に基づいて恐れのあるものでもよい。この用語には、本明細書に記載のマウスモデルにおける疾病の動物モデルが含まれる。
【００８６】
本明細書における心筋細胞壊死及び／又は心筋梗塞に関する組成物（例、細胞、ヌクレオチド配列、タンパク質配列、等）の「治療的有効量」と「保護的量」は、互換的に用いることができ、１つの態様において、問題の組成物が不在の場合に比較して疾病の１つ又は複数の症状を遅延、低減、軽減、緩和、安定化、防止、及び／又は逆転させる組成物の量を指称する。全ての症状が完全に解消する必要は必ずしもない。症状を「遅延する」とは、症状が検出される期間を長くすることを指称する。症状を「解消する」とは、１つ又は複数の症状を１００％低減することを指称する。治療的有効量は、当該分野では公知で本明細書にも開示され、臨床試験としてのインビトロとインビボのアッセイを用いて求めることができる。その量は、例えば、投与ルート、患者の体重（例、薬剤ｍｇ／体重ｋｇ）によって決まる。この量を決定する因子とそれらの関係は、医薬、獣医、及びその他の関連分野における当業者によく知られている。この投与の量と方法は、最適な有効性を得るように調整できるが、体重、食生活、併用投薬のような因子、及び当業者が知るその他の因子によって決まる。投与量と頻度は、実質的に有害な作用がない組成物の有効レベルを形成するように選択される。経口又は静脈に投与される場合、ポリペプチドの用量は、一般に、０．００１〜１０００ｍｇ／ｋｇ／日、より好ましくは、０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ／日、最も好ましくは、０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲と考えられる。
【００８７】
「心筋細胞壊死の症状」と「心筋梗塞の症状」は、客観的及び／又は主観的症状に言及して用いられる。客観的症状には、血清中の高いプラスミン活性（図９Ａ）、プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）の１つ又は複数の高い心臓組織レベル、ウロキナーゼ（ｕＰＡ）、プロマトリックスメタロプロテアーゼ９（ｐｒｏ−ＭＭＰ９）、活性ＭＭＰ（図９Ｂ、９Ｃ）、及び心筋細胞死が挙げられる。症状には、胸痛、息切れ、吐気、嘔吐、動悸、発汗、不安症、消化不良感、疲労、等の客観的症状も含まれる。
【００８８】
「壊死」とは、細胞と生体組織の早死を指称する。壊死は、一般に、感染、毒、トラウマ、血液供給の低下などの外的因子によって生じる。これは、自然に生じる細胞死の原因であるアポトーシスと異なる。
【００８９】
用語「投与する」は、ポリペプチドを導入する、ポリペプチドをコードする核酸配列を導入する、及び／又はポリペプチドを発現する宿主細胞を導入することを指称する。ポリペプチドは、当業者に公知の方法を用いて被検者に投与することができ（例、エリクソンらの米国特許第６６３２９７９号、フルタらの米国特許第６９０５８３９号、ジャコブセンらの米国特許第６２３８８７８号、シモンらの米国特許第５８５１７８９号）、バクテリアを投与する方法（ベリンガーらの米国特許第６９６４８５６号）、アンチセンスを投与する方法（デラモンテらの米国特許第７２９１４５４号、スミスらのＷＯ９０／０９１８０、スキントらのＷＯ９３／００９０９）、オリゴヌクレオチドを投与する方法（イノウエらの米国特許第５２７２０６５号）もまた挙げられる。ポリペプチド、核酸配列、及び／又は細胞は、予防的に（即ち、疾病の症状が観られる前）及び／又は治療的に（即ち、疾病の症状が観られた後）に投与することができる。また、投与は、１つ又は複数の疾病の症状の徴候に合わせることもできる（即ち、同時に又はその間）。また、本発明の組成物は、別な種類の薬物の投与又は治療手段（例、外科的）の前、同時、及び／又は後に投与することができる。本発明の組成物の投与方法には、限定されるものではないが、非経口、経口、腹腔内、鼻腔内、局所（例、直腸、膣）、及び舌下における投与が挙げられる。非経口の投与ルートには、例えば、皮下、静脈内、筋肉内、胸骨内、及び輸液のルートが挙げられる。
【００９０】
特定の態様において、投与ルートは、心筋への筋内投与と静脈内投与からなる群より選択される。
【００９１】
（Ｈ）遺伝子組換えＭＳＣ及び／又は遺伝子組換えＲＳ−ＭＳＣを投与する心筋障害の治療方法
本発明は、（ａ）（ｉ）心筋細胞壊死の１つ又は複数の症状を減少させる必要のある哺乳類被検者、及び（ｉｉ）（イ）ＴＳＧ−６タンパク質をコードする異種ヌクレオチド配列を含み、かつ（ロ）ＴＳＧ−６タンパク質を発現する、遺伝子組換え間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の集団、を提供し、（ｂ）前記哺乳類被検者に遺伝子組換え間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の集団の治療的有効量を投与し、それによって心筋細胞壊死の１つ又は複数の症状を減少させる、ことを含む哺乳類被検者の心筋細胞壊死の１つ又は複数の症状を減少させる方法を提供する。
【００９２】
１つの態様において、遺伝子組換え間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の集団は、精製された迅速自己更新性の間葉系幹細胞（ＲＳ−ＭＳＣ）を含む。
【００９３】
投与ルートを特定のルートに限定するものではないが、１つの態様において、投与ルートは、心筋への筋内投与と静脈内投与からなる群より選択される。
【００９４】
（Ｉ）ＴＳＧ−６タンパク質を投与する心筋障害の治療方法
また、本発明は、（ａ）（ｉ）心筋細胞壊死の１つ又は複数の症状を減少させる必要のある哺乳類被検者、及び（ｉｉ）精製された腫瘍壊死因子α刺激遺伝子６（ＴＳＧ−６）タンパク質を含む組成物を提供し、（ｂ）前記哺乳類被検者に前記組成物の治療的有効量を投与し、それによって心筋細胞壊死の１つ又は複数の症状を減少させる、ことを含む哺乳類被検者の心筋細胞壊死の１つ又は複数の症状を減少させる方法を提供する。
【００９５】
精製された組換え型ＴＳＧ−６タンパク質は市販されている（Ｒ＆Ｄシステムズ社、ミネアポリス、カタログ＃２１０４−ＴＳ−０５０）。もう１つの態様において、ＴＳＧ−６タンパク質は、（ａ）ＴＳＧ−６タンパク質をコードする異種ヌクレオチド配列を含み、かつ（ｂ）ＴＳＧ−６タンパク質を発現する遺伝子組換え細胞から精製することができる。
【００９６】
形質転換して異種ヌクレオチド配列を発現するいずれの細胞も、ＴＳＧ−６タンパク質を発現するために使用することができる。こうした細胞には、ヒトとヒト以外の真核動物細胞が挙げられる。１つの態様において、細胞はヒトの真核動物細胞であり、以下のものが例示される：Ｕ９３７細胞（マクロファージ）、ＡＴＣＣ＃ｃｒｌ１５９３．２；Ａ−３７５細胞（メラノーマ／メラニン形成細胞）、ＡＴＣＣ＃ｃｒｌ−１６１９；ＫＬＥ細胞（子宮内膜）、ＡＴＣＣ＃ｃｒｌ−１６２２；Ｔ９８Ｇ細胞（グリア芽腫）、ＡＴＣＣ＃ｃｒｌ−１６９０；ＣＣＦ−ＳＴＴＧｌ細胞（星状細胞腫）、ＡＴＣＣ＃ｃｒｌ−１７１８；ＨＵＶ−ＥＣ−Ｃ細胞（血管内皮）、ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１７３０；ＵＭ−ＵＣ−３細胞（膀胱）、ＡＴＣＣ＃ｃｒｌ−１７４９；ＣＣＤ８４１−ＣｏＮ細胞（結腸、ＡＴＣＣ＃ｃｒｌ−１７９０；ＳＮＵ−４２３細胞（肝細胞癌）、ＡＴＣＣ＃ｃｒｌ−２２３８；ＷＩ３８細胞（肺、正常）、ＡＴＣＣ＃ｃｒｌ−７５；ラジ細胞（リンパ芽球様）、ＡＴＣＣ＃ｃｃｌ−８６；ＢｅＷｏ細胞（胎盤、絨毛腫）、ＡＴＣＣ＃ｃｃｌ−９８；ＨＴ１０８０細胞（線維肉腫）、ＡＴＣＣ＃ｃｃｌ−１２１；ＭＩＡＰａＣａ２細胞（膵臓）、ＡＴＣＣ＃ｃｒｌ−１４２０；ＣＣＤ−２５ＳＫ細胞（皮膚線維芽細胞）、ＡＴＣＣ＃ｃｒｌ−１４７４；ＺＲ７５−３０細胞（乳腺）、ＡＴＣＣ＃ｃｒｌ−１５０４；ＨＯＳ細胞（骨肉腫）、ＡＴＣＣ＃ｃｒｌ−１５４３；２９３−ＳＦ細胞（腎臓）、ＡＴＣＣ＃ｃｒｌ−１５７３；ＬＬ４７（ＭａＤｏ）細胞（正常リンパ芽球）、ＡＴＣＣ＃ｃｃｌ−１３５；ａｎｄヒーラ細胞（子宮頸癌）、ＡＴＣＣ＃ｃｃｌ−２。
【００９７】
もう１つの態様において、細胞はヒト以外の真核動物細胞であり、限定されるものではないが、以下のものが例示される：酵母細胞（ＡＨ１０９）、ＬＭ細胞（マウス線維芽細胞）、ＡＴＣＣ＃ｃｃｌ−１．２；ＮＣＴＣ３５２６細胞（赤毛猿腎臓）、ＡＴＣＣ＃ｃｃｌ−７．２；ＢＨＫ−２１細胞（ゴールデンハムスター腎臓）、ＡＴＣＣ＃ｃｃｌ−１０；ＭＤＢＫ細胞（ウシ腎臓）、ＡＴＣＣ＃ｃｃｌ−２２；ＰＫ１５細胞（ブタ腎臓）、ＡＴＣＣ＃ｃｃｌ−３３；ＭＤＣＫｃｅｌｌｓ（イヌ腎臓）、ＡＴＣＣ＃ｃｃｌ−３４；ＰｔＫｌ細胞（カンガルーネズミ腎臓）、ＡＴＣＣ＃ｃｃｌ−３５；Ｒｋ１３細胞（ウサギ腎臓）、ＡＴＣＣ＃ｃｃｌ−３７；Ｄｅｄｅ細胞（チャイニーズハムスター肺線維芽細胞）、ＡＴＣＣ＃ｃｃｌ−３９；Ｂｕ（ＩＭＲ３１）細胞（バイソン肺線維芽細胞）、ＡＴＣＣ＃ｃｃｌ−４０；ＦＨＭ細胞（ミノウ上皮）、ＡＴＣＣ＃ｃｃｌ−４２；ＬＣ−５４０細胞（ラットライディヒ細胞腫瘍）、ＡＴＣＣ＃ｃｃｌ−４３；ＴＨ−Ｉ細胞（カメ心臓上皮）、ＡＴＣＣ＃ｃｃｌ−５０；イーデルム（ＮＢＬ−６）細胞（ウマ線維芽細胞）、ＡＴＣＣ＃ｃｃｌ−５７；ＭｖＬｎ細胞（ミンク上皮）、ＡＴＣＣ＃ｃｃｌ−６４；ＣｈＩＥｓ細胞（ヤギ線維芽細胞）、ＡＴＣＣ＃ｃｃｌ−７３；ＰｌＩＮｔ細胞（アライグマ線維芽細胞）、ＡＴＣＣ＃ｃｃｌ−７４；ＳｐＩｋ細胞（イルカ上皮）、ＡＴＣＣ＃ｃｃｌ−７８；ＣＲＦＫ細胞（ネコ上皮）、ＡＴＣＣ＃ｃｃｌ−９４；ＧｅｋｋｏＬｕｎｇ１細胞（トカゲ・ヤモリ上皮）、ＡＴＣＣ＃ｃｃｌ−１１１；ネッタイシマカ細胞（蚊上皮）、ＡＴＣＣ＃ｃｃｌ−１２５；ＩＣＲ１３４細胞（カエル上皮）、ＡＴＣＣ＃ｃｃｌ−１２８；アヒル胚細胞（アヒル線維芽細胞）、ＡＴＣＣ＃ｃｃｌ−１４１；ＤＢＳＦｃＩ−Ｉ細胞（サル肺線維芽細胞）、ＡＴＣＣ＃ｃｃｌ−１６１。
【００９８】
（Ｊ）予備活性化されたＭＳＣ及び／又は予備活性化されたＲＳ−ＭＳＣを用いる無菌性炎症の治療方法
また、本発明は、限定されるものではないが、哺乳類被検者における無菌性炎症などの炎症の１つ又は複数の症状を減少させる方法を提供するものであり、（ａ）（ｉ）組織における無菌性炎症の１つ又は複数の症状を減少させる必要のある哺乳類被検者、及び（ｉｉ）高いレベルのＴＳＧ−６タンパク質を発現する条件下でＴＮＦ−α、ＩＬ１、及びＬＰＳの１つ又は複数と接触した精製間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の集団を提供し、（ｂ）前記哺乳類被検者に前記精製間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の集団の治療的有効量を投与し、それによって組織における無菌性炎症の１つ又は複数の症状を減少させることを含む。１つの態様において、精製間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の集団は、精製された迅速自己更新性の間葉系幹細胞（ＲＳ−ＭＳＣ）を含む。もう１つの態様において、被検者は、無菌性炎症疾患を有するか又は有する恐れがある。炎症は、自己免疫反応によるものであってもよい。
【００９９】
「炎症」、「炎症性」、及びその文法的同義語は、疾病に関する場合、病原体、損傷細胞、又は刺激物のような有害な刺激に対する血管組織の複雑な生物学的反応を指称する。これは、組織に対する有害な刺激を除去すると同時に治癒プロセスを開始するための生命体による保護的企てである。
【０１００】
炎症は、急性又は慢性であってもよい。急性炎症は、有害な刺激に対する生命体の初期反応であり、血液から損傷組織への血漿と白血球の増加した動きによって達成される。生化学的事象のカスケードが伝搬し、局所血管系、免疫系、及び損傷組織内の種々の細胞などに炎症反応を成熟させる。慢性炎症として知られる長期間の炎症は、炎症箇所に存在する細胞種類に漸進的変化をもたらし、炎症過程による同時破壊と組織治癒を特徴とする。
【０１０１】
炎症は、病原体による感染と同義語ではない。即ち、「無菌性炎症」とは、病原体（例、バクテリア、ウイルス、等）によって生じたものではなく、傷害、又は物理的、化学的、もしくは生物分子（タンパク質、ＤＮＡ、等）によって生じる異常刺激に反応して生じる炎症を指称し、これらの反応には、局所的反応とそれによる形態変化、損傷を与えた物質の破壊又は排除、及び修復と治癒をもたらす反応が含まれる。炎症における１つの基本的テーマとして、疾病は、宿主タンパク質（抗原）などのタンパク質や異種物質の認識をもたらす細胞免疫反応の動揺である。即ち、炎症反応は、特定の臓器又は組織を標的にするエフェクター細胞を有する宿主組織で誤った方向に行き、不可逆的損傷に帰結することが多い。自己免疫疾患の自己認識面は、疾病状態における特定のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）サブタイプによって特徴づけられるＴ細胞サブタイプのクローン性増殖に反映されることが多い。多くの場合、炎症性疾患は、Ｔヘルパー（Ｔｈ）サブセットのレベルにおける不釣り合い（即ち、ＴｈＩ細胞対Ｔｈ２細胞）によっても特徴づけられる。
【０１０２】
無菌性炎症疾患と状態は、体系的（例、狼瘡）であっても特定の組織又は臓器に限定されてもよい。
【０１０３】
無菌性炎症疾患の例には、限定されるものではないが、心筋梗塞（ＭＩ）、糖尿病、脳卒中、アルツハイマー病、多発性硬化症、パーキンソン症、腎炎、癌、間接における骨及び／又は軟骨の急性又は慢性炎症を伴う炎症疾患、アナフィラキシー反応、喘息、結膜炎、全身性エリテマトーデス、肺サルコイドーシス、眼の炎症、アレルギー、肺気腫、虚血・再かん流傷害、線維筋痛、乾癬と皮膚炎から選択される炎症性皮膚疾患、間接リウマチ、通風性関節炎、若年性関節リウマチ、及び変形性関節症から選択される関節炎が挙げられる。
【０１０４】
「炎症の症状」と「無菌性炎症の症状」は、互換的に用いることができ、客観的及び／又は主観的症状に言及して用いられる。主観的症状には、組織における炎症のない対照標準の哺乳類被検者に比較して、プラスミン活性（実施例１１、図９、図１６）、マクロファージ誘導タンパク質−１（ＭＣＰ−１）、マクロファージ炎症性タンパク質−１α（ＭＩＰ−１α）、βトロンボグロブリン、可溶性ＳＴ２受容体、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、及びナトリウム利尿ペプチドの１つ又は複数（２、３、４、５、６、７など）における高い血清レベルが例示される。主観的症状には痛みが挙げられる。
【０１０５】
１つの態様において、炎症が心筋組織の場合、投与ルートは、心筋への筋内投与と静脈内投与からなる群より選択される。
【０１０６】
（Ｋ）遺伝子組換えＭＳＣ及び／又は遺伝子組換えＲＳ−ＭＳＣを用いる無菌性炎症の治療方法
また、本発明は、（ａ）（ｉ）組織における無菌性炎症の１つ又は複数の症状を減少させる必要のある哺乳類被検者、及び（ｉｉ）（イ）ＴＳＧ−６タンパク質をコードする異種ヌクレオチド配列を含み、かつ（ロ）ＴＳＧ−６タンパク質を発現する、遺伝子組換え間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の集団を提供し、（ｂ）前記哺乳類被検者に前記遺伝子組換え間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の集団の治療的有効量を投与し、それによって組織における無菌性炎症の１つ又は複数の症状を減少させる、ことを含む哺乳類被検者の無菌性炎症の１つ又は複数の症状を減少させる方法を提供する。
【０１０７】
１つの態様において、遺伝子組換え間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の集団は、精製された迅速自己更新性の間葉系幹細胞（ＲＳ−ＭＳＣ）を含む。さらなる態様において、組織は心筋組織を含み、投与のルートは、心筋組織への筋肉内投与と静脈内投与からなる群より選択される。もう１つの態様において、被検者は、無菌性炎症疾患を有するか又は有する恐れがある。
【０１０８】
（Ｌ）ＴＳＧ−６タンパク質を投与する無菌性炎症の治療方法
さらに、本発明は、（ａ）（ｉ）組織における無菌性炎症の１つ又は複数の症状を減少させる必要のある哺乳類被検者、及び（ｉｉ）精製された腫瘍壊死因子α刺激遺伝子６（ＴＳＧ−６）タンパク質を含む組成物を提供し、（ｂ）前記哺乳類被検者に前記組成物の治療的有効量を投与し、それによって組織における無菌性炎症の１つ又は複数の症状を減少させる、ことを含む哺乳類被検者の無菌性炎症の１つ又は複数の症状を減少させる方法を提供する。
【０１０９】
１つの態様において、組織は心筋組織を含み、投与ルートは、心筋組織への筋肉内投与と静脈内投与からなる群より選択される。もう１つの態様において、組織は心筋組織を含み、投与は、心筋組織への筋肉内投与と静脈内投与からなる群より選択される。別な態様において、被検者は、無菌性炎症疾患を有するか又は有する恐れがある。さらなる態様において、ＴＳＧ−６タンパク質は、ＴＳＧ−６タンパク質をコードする異種ヌクレオチド配列を含みかつＴＳＧ−６タンパク質を発現する遺伝子組換え細胞から精製される。
【０１１０】
（Ｍ）バイオマーカーを用いる炎症の検出方法
さらに、本発明は、（ａ）組織における無菌性炎症の１つ又は複数の症状を減少させる必要のある哺乳類被検者を提供し、（ｂ）プラスミン活性、マクロファージ誘導タンパク質−１（ＭＣＰ−１）、マクロファージ炎症性タンパク質−１α（ＭＩＰ−１α）、βトロンボグロブリン、可溶性ＳＴ２受容体、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、及びナトリウム利尿ペプチドの１つ又は複数（２、３、４、５、６、７など）の血清レベルの増加を、組織における無菌性炎症を有しない対照標準の哺乳類被検者に比較して検出することを含む、哺乳類被検者の組織における無菌性炎症を検出する方法を提供する。１つの態様において、組織は心筋組織を含む。
【０１１１】
本発明の方法に用いられるバイオマーカーのレベルは、標準的技術を用いて決めることができる。例えば、プラスミン活性の検出方法は本明細書に記載されており（実施例１１、図９と図１１）、ＭＣＰ−１とＭＩＰ−１αは、市販のＥＬＩＳＡキット（レインコ・テクノロジーズ社、セントルイス、ミズーリ州）を用いてアッセイすることができ、βトロンボグロブリンは市販のＥＬＩＳＡキット（ＡＳＳＥＲＡＣＨＲＯＭＢ−ＴＧ、ダイアグノスチカ・スタゴ社、パーシッパニー、ＮＪ）を用いてアッセイすることができ、ＳＴ２は市販のＥＬＩＳＡキット（ＭＢＬ、ウォーバン、ＭＡ）を用いてアッセイすることができ、ＣＲＰはクエスト・ダイアゴノスティクスによってアッセイすることができる。バイオマーカーのレベルを検出する以下の方法が当該分野で知られている：マクロファージ誘導タンパク質−１（ＭＣＰ−１）（Ａｕｋｒｕｓｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９７：１１３６−１１４３）、マクロファージ炎症性タンパク質−１α（ＭＩＰ−１α）（Ａｕｋｒｕｓｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８））、βトロンボグロブリン（Ｒｉｚａ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）  Ｃｏｒｏｎ  Ａｒｔｅｒｙ  Ｄｉｓ．；１５：２６５−８）、可溶性ＳＴ２受容体（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０６：２９６１−２９６６）、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）（Ｐｙｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）  Ｂｒ  Ｈｅａｒｔ  Ｊ  ６３：２２８−２３０）、及びナトリウム利尿ペプチド（（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００２））。
【０１１２】
もう１つの態様において、本方法は、さらに、（ｃ）（ｉ）精製された腫瘍壊死因子α刺激遺伝子６（ＴＳＧ−６）タンパク質を含む組成物、（ｉｉ）高いレベルのＴＳＧ−６タンパク質を発現する条件下でＴＮＦ−α、ＩＬ１、及びＬＰＳの１つ又は複数と接触した精製間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の集団、及び（ｉｉｉ）ＴＳＧ−６タンパク質をコードする異種ヌクレオチド配列を含んでＴＳＧ−６タンパク質を発現する遺伝子組換え間葉系幹細胞（ＲＳ−ＭＳＣ）の集団の１つ又は複数の治療的有効量を前記被検者に投与することを含み、前記投与は治療被検者を産出し、さらに（ｄ）前記治療被検者において、工程（ｂ）で検出した血中濃度に比較して、プラスミン活性、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、βトロンボグロブリン、可溶性ＳＴ２受容体、Ｃ反応性タンパク質、ＣＲＰ、及びナトリウム利尿ペプチドの２つ以上の血清レベルの減少を検出することを含む。
【実施例】
【０１１３】
以下の実施例は、本発明の特定の態様と局面を例証するためのものであるが、本発明の範囲を限定するものではない。
【０１１４】
実施例１
ＰＯＤＸＬとＣＤ４９ｆのエピトープ発現を用いるＲＳ−ＭＳＣの分離
最近、本発明者は、ＭＳＣの培養物中の早期前駆体を特定する表面タンパク質に対する抗体について探索した（図１Ａ、１Ｂ）。最初のストラテジーとして、本発明者は、低密度で蒔かれたｈＭＳＣと培養物が広がるときの、表面タンパク質の転写物における変化についてのマイクロアレイのデータに疑問を抱いた。その結果は、１０転写物にわたって安定状態レベルが減少し（２倍超）、殆ど同数が減少したことを示した（図２Ｄ）。最大の減少の２つの転写物は、細胞運動性と腫瘍進行に関連することが先に示されているタンパク質をコードしたもので、ＰＯＸＤＬ（ファーネスとマクナグニー、２００６年）とα６インテグリン（ＣＤ４９ｆ）（リプスコムとメルクリオ、２００５年）であった。
【０１１５】
次いで、本発明者は、ＭＳＣの培養物を拡張しながら、市販の抗体を使用し、ＰＯＸＤＬ、α６インテグリン（ＣＤ４９ｆ）、及び細胞の輸送と運動性に関連するいくつかの他のエピトープの発現を追跡した（図２、図３）。示した種々のアッセイにより、ＰＯＸＤＬとα６インテグリン（ＣＤ４９ｆ）に対する抗体が、後期ＳＲ−ＭＳＣから早期前駆体ＲＳ−ＭＳＣを最も一貫して区別した。特に興味深いことは、継代２細胞の培養物が９日間培養後に培養密度に近づきながら、エピトープが消滅したにもかかわらず、細胞が低密度で再度蒔かれて５日間インキュベートされると、それらが再び発現して継代３細胞を発生したことである。同様なパターンがいくつかの他のエピトープで観察されたが（α６インテグリン、ｃ−Ｍｅｔ、ＣＸＣＲ４、及びＣＸ３ＣＲ１）、これらは培養物から細胞を持ち上げるのに必要なトリプシン処理（図示せず）によって切断・内部移行されたため、又はこれらはＭＳＣの種々の調製の中で結果が一貫していないため（図３）、信頼が低いことが分かっている。もう１つの興味深い観察は、ＭＳＣを特定するために先に使用した２つのエピトープ（図３Ｄ、図３Ｅ）、ＳＴＲＯ−１（シモンスとトロック・ストーブ、１９９１年）とＧＤ２（マルチネスら、２００７年）の増殖について、減少ではなく増加があったことである。
【０１１６】
ＰＯＤＸＬｈｉ／ＣＤ４９ｆｈｉＭＳＣの高いクローン形成能と分化能を実証するため、ＭＳＣを１００細胞／ｃｍ２で蒔いた。培養物を５日間増殖させて、ＰＯＤＸＬｈｉ／ＣＤ４９ｆｈｉとしてのＭＳＣを取得し、９日間増殖させて、ＰＯＤＸＬｌｏ／ＣＤ４９ｆｌｏとしてのＭＳＣを取得した。次いで、２つの亜集団を再び１細胞／ｃｍ２で蒔いて、コロニー形成単位（ＣＦＵ−Ｆ）をアッセイした。ＰＯＤＸＬｈｉ／ＣＤ４９ｆｈｉ細胞は、クローン形成能がより高く、ＰＯＤＸＬｌｏ／ＣＤ４９ｆｌｏの４８％±５ＳＤに対して９０％±０．６ＳＤのＣＦＵ−Ｆ値であった（ｎ＝４、ｐ＜０．１）。また、ＰＯＤＸＬｈｉ／ＣＤ４９ｆｈｉ細胞は、鉱化細胞と含脂肪細胞により効率的に分化し、即ち、骨形成培地中のインキュベーション後の抽出アリザリンレッドＳにおける吸光度は０．６５ＯＤ単位±０．０２９ＳＤに対して０．１６ＯＤ単位±０．０５ＳＤであり（ｎ＝４、ｐ＜０．０１）、脂質形成培地中のインキュベーション後の抽出オイルレッドＯにおける吸光度は０．０６ＯＤ単位±０．０１２ＳＤに対して０．７０ＯＤ単位±０．１４ＳＤであった（ｎ＝４、ｐ＜０．０１）。
【０１１７】
実施例２
ＭＩ後のマウス心臓にＲＳ−ＭＳＣのより効率的な生着
本発明者は、ＭＩマウスへのＲＳ−ＭＳＣ（ＰＯＤＸＬｈｉ／ＣＤ４９ｆｈｉ）の生着を比較するためにヒトＡｌｕについての改良ＰＣＲアッセイ（下記参照）を採用した。図４に示すように、ＲＳ−ＭＳＣは、ＭＩ心臓により効率的に生着した。また、細胞は、腎臓により効率的に生着し、血清クレアチニン値濃度の増加に反映されるように、腎臓に対する二次的損傷の結果と思われる（１．０８±０．１４ＳＤに対して０．５３ｍｇ／ｄｃｌ±０．０８ＳＤ、ｎ＝４）。
【０１１８】
図３Ｄに示すように、あるドナーからのＭＳＣ培養物は、１００細胞／ｃｍ２で蒔かれたときＰＯＤＸＬｈｉ／ＣＤ４９ｆｈｉを維持し、７日まで増殖した。適切数の細胞を首尾よく得る目的で、こうした選択ドナーからのＲＳ−ＭＳＣが濃縮された７日培養物を以降の実験に使用した。特に明記がなければ、それらを単にＭＳＣと称する。
【０１１９】
実施例３
注入ｈＭＳＣ、癌細胞、及びヒトＷＢＣの組織分布
マウスへのＩＶ注入後、５分間以内に血液からｈＭＳＣを除去した（図５、左上）。先の報告の確認において（ババシュら、２００３年；ガオら、２００１ｂ；シュレップファーら、２００７年）、注入細胞の殆どは肺に捕獲された（図５、左下）。ヒト乳癌細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）とヒトＷＢＣについて同様な観察を行い、但し、一部のヒトＷＢＣは、肺への捕獲を逃れ、肝臓で回収された。心臓の左心室に注入したｈＭＳＣ（ＩＣ注入）もまた５分間以内に血液から除去したが（図５、右上）、脳、心臓、肺、肝臓、膵臓、脾臓、腎臓、及び骨髄に現れる多数のｈＭＳＣのＩＶ注入と比較した（図５、右下）。
【０１２０】
ＩＶ注入後、４日間（１００時間）までに、マウスの血液、肺、及び７つの組織についてＡｌｕ配列をアッセイした（図６上）。最初の６０分間には、血液に循環するヒト細胞に増加がなく、捕獲細胞は殆ど肺を離れないことを示唆した。また、他の７つの組織における注入ヒト細胞の回収は、合計で０．２％未満、又は２０００細胞未満であった。ヒトＧＡＰＤＨのｍＲＮＡについてのアッセイによって実質的に同じ値が得られたため（図６左上）、肺におけるＡｌｕ配列のアッセイは、生体ＭＳＣを反映した。捕獲されたＭＳＣ数は、血管拡張剤（ニトロプルシド・ナトリウム）によるマウスの即時前処理によって減少した（図６左下）。α４−インテグリン又はα６−インテグリンに対する抗体を用いた細胞の前処理、又はＷＢＣでのインキュベーションからは、効果がなく、全ての手順は、骨髄に対する造血幹細胞の回遊を抑制することを報告した（チエンら、２００６年；チュート、２００６年）。また、注入細胞の数を１０４まで少なくすることにより、肺に捕獲されるｈＭＳＣの割合は減少しなかった（図示せず）。ｈＭＳＣのＩＶ注入の１日前に生成した永久的ＭＩのマウスにおいて、心臓に少数のｈＭＳＣ（＜２０００）の遅発性出現があった（図６右下）。
【０１２１】
実施例４
ｈＭＳＣが肺に捕獲された後のマウス肺細胞とｈＭＳＣの双方の変化のトランスクリプトーム
肺に捕獲されるｈＭＳＣの作用を調べるため、ＭＳＣをＩＶ注入して１０時間後にマウス肺からＲＮＡを抽出し、マウス特異的マイクロアレイとヒト特異的マイクロアレイの双方についてＲＮＡアッセイをした。予想通り、マウスのトランスクリプトームに大きな変化があり、７５５遺伝子が上方制御され、３４７遺伝子が２倍以上に下方制御された（図示せず）。また、ｈＭＳＣのトランスクリプトームに大きな変化があり、４５１遺伝子が上方制御され、１００１遺伝子が２倍以上に下方制御された。したがって、この結果は、ｈＭＳＣがｈＭＳＣの塞栓を含むマウス肺とのクロストークに応答したことを示す。
【０１２２】
ｈＭＳＣにおいて２倍以上に上方制御された数１００のヒト遺伝子の主観解析は、ヒト特異的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイによってデータを確認するための興味ある候補リストを提供した（図７）。最大の増加は、ＴＮＦ−α刺激遺伝子６（ＴＮＦＡＩＰ６又はＴＳＧ−６）についての転写における３０倍以上の増加であった。ＴＳＧ−６における増加は、そのタンパク質が先に有力な抗炎症因子であることが示されていたため、特に興味深い（ゲッティングら、２００２年；ウィスニースキーとビルセク、２００４年；フォルテーザら、２００７年；ミルナーら、２００６年）。３０ｋＤａタンパク質は、いくつかの以下の作用により炎症を減少させることが実証されているおり、即ち、（ｉ）ヒアルロナンの断片と結合して、炎症誘発効果を阻止する、（ｉｉ）インターα阻害剤と安定な複合体を形成し、殆どの炎症反応の基本的成分であるセリンプロテアーゼの阻害において１００倍の増加を産生する、（ｉｉｉ）好中球走化性を阻害する、及び（ｉｖ）関節炎の動物モデルにおいて、関節軟骨の損傷を防止する、が挙げられる。
【０１２３】
実施例５
ｈＭＳＣを活性化して高いレベルのＴＳＧ−６を発現可能
ｈＭＳＣによるＴＳＧ−６の合成を検討するため、ｈＭＳＣを炎症誘発性サイトカインＴＮＦ−αとともにインキュベートした。ｈＭＳＣは活性化し、６０倍〜１２０倍のレベルのＴＳＧ−６転写物を発現した（図８左上）。未刺激のｈＭＳＣは、測定可能な量のタンパク質を分泌しなかったが、ＴＮＦ−αによって活性化されたｈＭＳＣは大量に分泌した（図８中央）。ｓｉＲＮＡを用いた遺伝子のノックダウンは、転写物レベルとタンパク質分泌の双方を低下させた（図８下側）。驚くことに、ＴＮＦ−αとともにインキュベートした線維芽細胞においてＴＳＧ−６が最初に発見されたにもかかわらず（ウイスニースキーとヴィルチェック、２００４年）、ＴＮＦ−αに対するｈＭＳＣの反応は、ヒト線維芽細胞の反応を大きく超えた。
【０１２４】
実施例６
ＩＶのＭＳＣと組換え型ＴＳＧ−６の双方が、ＭＩマウスにおける血清と心臓の炎症促進性プロテアーゼを減少させる
永久的ＭＩを免疫不全マウスに生成させた後、本発明者が先に左心室駆出率を改善すると観察した条件下で（イソら、２００７年）、尾静脈にｈＭＳＣを注入した。血清アッセイは、ＭＩマウスでプラスミン活性が増加すること、及び１時間後のｈＭＳＣのＩＶ投与が活性を低下させることを実証した（図９Ａ）。また、ヒト組換え型ＴＳＧ−６の１回のＩＶ注入によって、ｈＭＳＣの作用を再現した。心臓アッセイは、組織プラスミノゲン活性化因子（ｔＰＡ）、ウロキナーゼ（ｕＰＡ）、プロマトリックスメタロプロテアーゼ９（ｐｒｏ−ＭＭＰ９）、及び活性ＭＭＰ９のレベルがＭＩマウスで増加することを実証した（図９Ｂ、図９Ｃ）。
【０１２５】
既知のＴＳＧ−６の抗炎症作用、及びＭＭＰ９などのプロテイナーゼの活性化（モシャルら、２００７年）が心臓病の炎症反応と悪影響に寄与するとの証拠により（オベーチキンら、２００５年；パオロッチら、２００６年；カルバリョら、２００６年）、この結果は特に興味深い。
【０１２６】
実施例７
補足的方法
以下の方法を用いて得られたデータを下記に示す。
【０１２７】
（Ａ）ＭＳＣの調製
ｈＭＳＣは、成体幹細胞の調製・分配センターから入手した。細胞は、培養物中で一貫して３系列に分化され、造血性マーカー（ＣＤ３４、ＣＤ３６、ＣＤ１１７、及びＣＤ４５）に対して陰性であり、ＣＤ２９（９５％）、ＣＤ４４（＞９３％）、ＣＤ４９ｃ（９９％）、ＣＤ４９ｆ（＞７０％）、ＣＤ５９（＞９９％）、ＣＤ９０（＞９９％）、ＣＤ１０５（＞９９％）、及びＣＤ１６６（＞９９％）に対して陽性であった。約１００万細胞のバイアルを解凍し（継代１又は２）、２５ｍｌの完全培養培地（ＣＣＭ）中の１７４ｃｍ２の皿（Ｎｕｎｃ）に蒔き、５％ＣＯ２の３７℃でインキュベートした。ＣＣＭは、１７％ＦＢＳ（ｈＭＳＣの迅速成長のためにロット選択、アトランタ・バイオロジカルス社、ローレンスビル、ＧＡ）、１００単位／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、及び２ｍＭＬのグルタミン（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）を含むα−ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）とした。１日後、培地を置き換え、培養物をＰＢＳで洗浄して非付着性細胞を除去した後、０．２５％トリプシン／１ｍＭのＥＤＴＡ（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）を用いて３７℃で５分間インキュベートし、生存細胞を回収した。細胞を８００Ｇの１０分間の遠心分離によって濃縮し、ＣＣＭに懸濁させ、１７４ｃｍ２の皿に１００細胞／ｃｍ２で再度蒔き、７０％集密まで６〜７日間にわたってインキュベートし、その結果、約５０％の細胞が、抗細胞接着タンパク質ＰＯＤＯＸＬ（リーら、２００９年）に対して陽性であった。骨髄からのマウス（Ｃ５７／Ｂ１６）ＭＳＣもまた前記センターから入手し、記載のようにして（ペイスタ−ら、２００４年）、継代５まで拡大した。
【０１２８】
凍結バイアルからのヒト乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ２３１、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関）を１００００細胞／ｃｍ２で蒔き、２つの継代を通して８０％密集度まで増殖させた。ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞の培地は、１０％ＦＢＳ（アトランタ・バイオロジカルス社）で補われた高グルコースＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）、１００単位／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、及び２ｍＭＬのグルタミン（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）を含んだ。ｈＭＳＣの提供と同じドナーからのヒト皮膚線維芽細胞（カール・グレゴリー博士から贈呈、再生医療研究所）を、同じ条件下で増殖させた。ヒト白血球（ｈＷＢＣ）を、ヘパリン添加末消血液の新しいサンプルから調製し、密度勾配遠心分離法（フィコール・ハイパック、ファーマシア・バイオテクノロジー社）によって分離し、ＰＢＳで洗浄した。癌細胞とｈＷＢＣを、ｈＭＳＣと同じ条件下でマウスに注入した。
【０１２９】
（Ｂ）血液中のｈＭＳＣの検出
ＩＶ注入から１５分後にマウス血液中のｈＭＳＣを検出するため、５０μｌの血液をＣＣＭ中の１０ｃｍの皿の上に蒔いた。１日後、細胞をＰＢＳで洗浄し、１０ｍｌのＣＣＭで被覆し、３〜４日ごとに培養液を交換しながら、１４日間にわたってインキュベートした。コロニー（図１０）を４％パラホルムアルデヒドで２０分間固定し、抗ヒト核抗原（１：２００、クローン２３５−１、ケミコン社）と抗ヒトβ２ミクログロブリン（１：２００、ロッシェ社）で標識化し、ＤＡＰＩで封入した（ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ（商標）、ＤＡＰＩを用いる封入剤、ベクター・ラボラトリイズ社）。
【０１３０】
（Ｃ）ｈＭＳＣと線維芽細胞のインキュベーション
ｈＭＳＣ、マウスＭＳＣ、及び線維芽細胞を、６ウェルプレートのＣＣＭに５００００細胞／ウェルで蒔き、１８時間にわたってインキュベートした。一部のＦＢＳを細胞上に保有させるために洗浄せずに培地を除去し、１０ｎｇ／ｍｌの組換え型ヒトＴＮＦ−α（Ｒ＆Ｄシステムズ社）を含んで血清を含まないＣＣＭに置き換えた。０〜４８時間のインキュベーションの後、ＲＴ−ＰＣＲアッセイのために全体のＲＮＡを抽出し（ＲＮｅａｓｙミニキット、ＱＩＡＧＥＮ）、培地をＥＬＩＳＡのために回収した。
【０１３１】
（Ｄ）心筋トロポニン−ＥＬＩＳＡ
ネズミトロポニンＩのＥＬＩＳＡキット（ライフダイアグノースティック社）を用い、メーカーの指示書にしたがって、ＬＡＤ連結から２日後のマウスの血清で、心臓トロポニンＩの濃度を測定した。
【０１３２】
（Ｅ）プラスミン活性
２００万の継代２のＭＳＣを、ＭＩから１時間後のマウスにＩＶ注入し、４８時間後に血清と心臓を回収した。５０ｍＭのトリスのｐＨ７．４で０．９％のＮａＣｌ中の発色基質としてクロモジムＰＬ（ロシュ・アプライド・サイエンス社）を用い、マウス血清からプラスミン活性をアッセイした。反応混合物を３７℃でインキュベートし、３０分間にわたって２分ごとに４０５ｎｍで分光光度法によってアッセイした。値を「吸光度／分」の平均変化として表わした。
【０１３３】
（Ｆ）ザイモグラム
溶解緩衝液（１％のトリトンＸ−１００、０．１％のＳＤＳ、ｐＨ７．２のＩＸＰＢＳ中の０．１％アジ化ナトリウム）中の氷上で心臓組織をホモジナイズし、４℃で１時間にわたって回転しながらインキュベートした。溶解物を４℃で１０分間の１２０００Ｇで除去した。プレキャストのゼラチンゲル（１０％ザイモグラムのゼラチンゲル、インビトロゲン／ノベックス）を用いたザイモグラムにより、心臓抽出物の５μｌのアリコートを分析した。一定の軽い撹拌をしながら、室温で３０分間にわたってゲルを再生し、３７℃で一晩展開し、コロイダルブルー（Ｎｏｖｅｘ技術告示ＩＭ−６０２５）で着色し、広範囲に洗浄し（２０時間超）、均一なバックグラウンド信号を生成した。着色したウェットゲルのデジタル像を、スキャナーを用いて捕えた。
【０１３４】
（Ｇ）マイクロアレイによる肺におけるｍＲＮＡのアッセイ
対照標準マウスの肺、約２００万のｈＭＳＣのＩＶ注入から１０時間後のマウスの肺、及び均質化の直前に１００万のｈＭＳＣを添加した肺から、ＲＮＡを分離した。マウス（ＭＧ−４３０２．０）又はヒト（ＨＧ−Ｕｌ３３Ｐｌｕｓ２．０）のマイクロアレイ（アフィメトリクス社）でのアッセイに、約８μｇの合計ＲＮＡを使用した。マイクロアレイＳｕｉｔｅ５．０（ＭＡＳＳ５．０、アフィメトリクス社）とｄＣｈｉｐ１．３＋プログラム（シャートら、２００１年）を用いてデータを解析した。それらの値は、対照標準マウスの肺、均質化前にｈＭＳＣを添加した対照標準マウスの肺、又はｈＭＳＣのＩＶ注入後のマウスの肺における信号強度に対する変化の倍数で表わした。データは、クロスハイブリッド形成（ＣＶ＞０．５とコール＞３３％）についてフィルタ処理し、マイクロアレイＳｕｉｔｅ５．０プログラムで解析し、先に記載のように（オータキら、２００８年）、値１と変動３ＳＤ（＋３、赤；３、青）に標準化した。
【０１３５】
実施例８
ＩＶ注入後に肺において上方制御されたｈＭＳＣの上方制御と下方制御の転写物
【０１３６】
【表１】
0005866601.tif 000002
0005866601.tif 000003
0005866601.tif 000004
【０１３７】
【表２】
0005866601.tif 000005
0005866601.tif 000006
0005866601.tif 000007
【０１３８】
実施例９
ＭＩから３週間後の心エコーのデータ
【表３】
0005866601.tif 000008
【０１３９】
実施例１０
ＰＣＲプライマー配列
【表４】
0005866601.tif 000009
【０１４０】
実施例１１
補足的方法
以下の方法を用いて得られたデータを図１３〜１８に示す。
【０１４１】
（Ａ）調製
骨髄からのｈＭＳＣとマウスＭＳＣを、成体幹細胞の調製・分配センターから入手した。このセンターは、国立衛生研究所と国立研究資源センターの助成金（Ｐ４０ＲＲ１７４４７−０６）の援助下で、２５０以上の研究施設に、初期前駆細胞の濃縮されたＭＳＣの標準調製物を供給している。ｈＭＳＣを継代３と７０％密集度に増殖させ、マウスＭＳＣ培養物も実施例７〜１０に示すように調製した。ヒト乳癌細胞と線維芽細胞の培養物の源と条件もまた実施例７〜１０に示している。
【０１４２】
（Ｂ）ｈＭＳＣのＩＶ注入
マウスに麻酔をかけ、２８ゲージ針を用い、尾静脈を通して又は胸壁を通して左心室に、約１又は２×１０６ｈＭＳＣのサスペンジョンの約１５０μｌを注入した。成功したＩＶ注入について、その箇所で血管外漏出がないか、及び注入から１時間以内の肺におけるＡｌｕ配列の約８０％の回復（図１３Ｃ）をモニターした。注入前に細胞を４℃に維持し、ピペットを用いて軽く再懸濁させ、注入前に凝集していないことを確保した。
【０１４３】
（Ｃ）ＤＮＡとＲＮＡの分離
５０μｌの血液サンプルを、心臓の左心室から針と注射器を用いて抜き出し、２ｍＭのＥＤＴＡに調節した。次いで、２０ｍｌのＰＢＳを左心室を通して、５ｍｌのＰＢＳを右心室を通して、マウスに灌流した。切開によって、脳、心臓、肺、肝臓、膵臓、脾臓、腎臓の組織、及び骨髄を分離し、−８０℃で保存した。ＤＮＡを抽出するため、サンプルを解凍し、５ｍｌの緩衝液（１０ｍＭのトリスＨＣｌ、（ｐＨ８．０）、２０μｌのプロテイナーゼＫ（１０ｍｇ／ｍｌ）、０．１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、０．５％ＳＤＳ、及び２０μｇ／ｍｌのＲＮＡ分解酵素Ａを含む）を各サンプルに添加した。サンプルを均質化し（パワーゲン１２５型ホモジナイザー、フィシャー・サイエンティフィック社）、２００ｒｐｍの振盪機中で、５０℃にて一晩インキュベートした。０．５ｍｌのサンプルに０．５ｍｌのフェノール／クロロホルム溶液（ｐＨ６．７）を添加し、２ｍｌのフェーズロックゲルチューブ（フェーズロックゲル、エッペンドルフ／ブリンクマン社）の中で１５３００Ｇで５分間わたって遠心分離することによって、ＤＮＡを抽出した。半体積の２．５Ｍの酢酸アンモニウムと同体積の１００％エタノールを添加し、４０℃で終夜にわたってＤＮＡを沈殿させた。沈殿物を氷冷の７５％エタノールで洗浄し、無菌水中に再度懸濁させた。トリゾール（インビトロゲン社）を用いて同じマウス組織と細胞培養物からＲＮＡを分離し、ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ社）で洗浄した。
【０１４４】
（Ｄ）Ａｌｕ配列のリアルタイムＰＣＲアッセイ
いくつかの組織からのＤＮＡ抽出物のＵＶ吸光度によるアッセイが、ＰＣＲアッセイについて十分に正確な値を与えなかったため、ジフェニルアミン反応（バートン、１９５６年）によってＤＮＡ濃度を測定した。５μｌのデオキシリボヌクレアーゼ緩衝剤と２μｌの無菌水中の３μｌのデオキシリボヌクレアーゼＩ（フィシャー・サイエンティフィック社）を用い、４０μｌのサンプルを３７℃で１時間にわたって消化した。各サンプルを５０μｌの無菌水で希釈し、ジフェニルアミン試薬の原液２００μｌを添加した（１００ｍｌの氷酢酸（フィシャー・サイエンティフィック社）と２．７５ｍｌのＨ２ＳＯ４（シグマ社）中の１ｇのジフェニルアミン（フィシャー・サイエンティフィック社））。サンプルを１００℃で２１分間インキュベートし、吸光度を５９５ｎｍで測定した。０．０３９〜１．２５ｍｇ／ｍｌの仔ウシ胸腺ＤＮＡ（シグマ社）を用いて検量線を作成した。
【０１４５】
２５μｌのタクマンユニバーサルＰＣＲマスターミックス（アプライド・バイオシステムズ社）、９００ｎＭの各前後プライマー、２５０ｎＭのタクマンプローブ、及び２００ｎｇの標的テンプレートを含む５０μｌの体積で（プライマーとプローブの順序について実施例１０参照）、Ａｌｕ配列についてリアルタイムＰＣＲアッセイを行った（マックブライドら、２００３年）。反応物を５０℃で２分間、及び９５℃で１０分間にわたってインキュベートした後、９５℃で１５秒間と６０℃で１分間を４０サイクル行った。均質化の直前に、マウス組織サンプルにｈＭＳＣを連続希釈で添加することによって検量線を作成した。２５μｌのＳＹＢＲグリーンマスターミックス（アプライド・バイオシステムズ社）、２００ｎＭの各前後プライマー、及び２００ｎｇの標的テンプレートを含む５０μｌの体積で、ＧＡＰＤＨについてヒトとマウスの遺伝子のリアルタイムＰＣＲアッセイを行った。リアルタイムＰＣＲアッセイは、いずれも２回又は３回行い、平均値を示した。サンプル中の合計ＤＮＡについての最終値は、ＧＡＰＨＤについてヒトとマウスの遺伝子の双方を増幅するプライマーを用いた平行リアルタイムＰＣＲアッセイによって修正した（ＮＣＢＩホームページ、実施例７〜１０）。
【０１４６】
（Ｅ）ヒトＧＡＰＤＨについてのｍＲＮＡのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイ
均質化の直前に、マウス組織サンプルにｈＭＳＣを連続希釈で添加することによって検量線を作成した。約２００ｎｇの合計ＲＮＡを使用し、逆転写によって２本鎖ｃＤＮＡを合成した（スーパースクリプトＩＩＩ、インビトロゲン社）。タクマンユニバーサルＰＣＲマスターミックス（アプライド・バイオシステムズ社）を用い、ヒト特異的ＧＡＰＤＨプライマーとプローブ（タクマン（商標）遺伝子発現アッセイＩＤ、Ｈｓ００２６６７０５＿ｇｌ）を用いて、リアルタイムＰＣＲ（ＡＢＩ７９００配列検出器、アプライド・バイオシステムズ社）によってｃＤＮＡを分析した。サンプル中の合計ｃＤＮＡについての最終値は、ＧＡＰＨＤについてヒトとマウスの遺伝子の双方を増幅するプライマーを用いた平行リアルタイムＰＣＲアッセイによって修正した（実施例７〜１０参照）。
【０１４７】
（Ｆ）マイクロアレイによる肺におけるｍＲＮＡのアッセイ
マウスの肺からＲＮＡを分離し、マウス（ＭＧ−４３０２．０）とヒト（ＨＧ−Ｕｌ３３Ｐｌｕｓ２．０）のマイクロアレイ（アフィメトリクス社、サンタクララ、ＣＡ）の双方についてアッセイし、そのデータを実施例７〜１０に記載のようにしてフィルタ処理した。
【０１４８】
（Ｇ）選択したｍＲＮＡについてのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析
約２００ｎｇの合計ＲＮＡを使用し、逆転写によって２本鎖ｃＤＮＡを合成した（スーパースクリプトＩＩＩ、インビトロゲン社）。タクマンユニバーサルＰＣＲマスターミックス（アプライド・バイオシステムズ社）を用い、リアルタイムＰＣＲによってｃＤＮＡを分析した。アッセイのため、反応物を５０℃で２分間、及び９５℃で１０分間にわたってインキュベートした後、９５℃で１５秒間と６０℃で１分間を４０サイクル行った。遺伝子発現の相対的計量のため、ヒト特異的ＧＡＰＤＨプライマーとプローブ（タクマン（商標）遺伝子発現アッセイＩＤ、Ｈｓ００２６６７０５＿ｇｌ）を使用した。それ以外のＰＣＲプライマーとプローブ配列は、実施例１０に列挙した。
【０１４９】
（Ｈ）ＴＳＧ−６ｓｉＲＮＡの形質移入
６ウェルのプレートのＣＣＭに５００００細胞／ウェルで蒔いた生存可能な継代１のｈＭＳＣを用い、形質移入用の標的ｈＭＳＣを調製した。１日間のインキュベーションの後、市販のキット（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＲＮＡｉＭＡＸ試薬、インビトロゲン社）を用い、ＴＳＧ−６（ｓｃ−３９８１９、サンタクルス・バイオテクノロジー社、サンタクルス、ＣＡ）について１０ｎＭもしくは２０ｎＭのｓｉＲＮＡ、又はＲＮＡｉ陰性対照標準（Ｓｔｅａｌｔｈ（商標）ＲＮＡｉ陰性対照標準、インビトロゲン社）を用いて、細胞を形質移入した。６時間後、３ｍｌ／ウェルの抗生物質を含まないＣＣＭで培地を置き換え、１６〜２０時間にわたってｈＭＳＣをインキュベートした。
【０１５０】
（Ｉ）ＴＳＧ−６のＥＬＩＳＡ
ＴＮＦ−α処理ＭＳＣからの培地中のＴＳＧ−６タンパク質のレベルをＥＬＩＳＡによって測定した。９６ウェルのプレート（マキシソープ（商標）、ヌンク社）を、０．２Ｍ重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．２）中のＴＳＧ−６（クローンＡ３８．１．２０、サンタクルス・バイオテクノロジー社）に特異的な１０μｇ／ｍｌのモノクローナル抗体の５０μｌで、４０℃にて一晩被覆した。プレートを、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中の０．２５％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＢＳＡと０．０５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のＴｗｅｅｎ−２０で、室温にて３０分間にわたってブロックした。プレートをＰＢＳで再度洗浄した。ブロック緩衝液中の５０μｌのサンプル又は組換え型ヒトＴＳＧ−６タンパク質（Ｒ＆Ｄシステムズ社）の対照標準を添加した。室温で２時間後、ＰＢＳと、さらに５０μｌ／ウェルの０．５μｇ／ｍｌのビオチニル化抗ヒトＴＳＧ−６（ＴＳＧ−６ビオチニル化ＰＡｂ検出抗体、Ｒ＆Ｄシステムズ社）で洗浄した。２時間後、プレートをＰＢＳで洗浄した。各ウェルに５０μｌのストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｒ＆Ｄシステムズ社）を添加した。プレートを被覆し、室温で２０分間にわたってインキュベートした。１００μｌの基質溶液（Ｒ＆Ｄシステムズ社）を添加し、サンプルを室温で１０分間にわたってインキュベートした。吸光度を４５０ｎｍで測定した（フロースターオプティマ、ＢＭＧラボテクノロジーズ社）。
【０１５１】
（Ｊ）冠動脈前下行枝の永久的連結（ＬＡＤ）
生後７〜８週間のオスの免疫不全ＮＯＤ／ｓｃｉｄマウス（ＮＯＯ．ＣＢ１７−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／Ｊ、ザジャクソン・ラボラトリィ）をイソフルオリンによる麻酔下で機械的に人口呼吸し、胸を開き、左冠動脈前下降枝を連結し、胸を閉じた。ＬＡＤの有効性は、予備実験によって確立されており、外科措置から４８時間後に７匹のマウスで血清の心臓トロポニンＩのレベルが増加したことが実証されている（図１６Ａ）。
【０１５２】
（Ｋ）その他のアッセイ
実施例７〜１０に示したように、市販のキットを使用し、マウス血清中の心臓トロポニンＩ（ＥＬＩＳＡキット、ライフ・ダイアグノスティクス社）、血清中のプラスミン活性（ロシュ・アプライド・サイエンス）、酵素電気泳動による心臓のＭＭＰ（１０％ザイモグラムのゼラチンゲル、インビトロゲン／ノベックス）をアッセイした。
【０１５３】
（Ｌ）心臓の白血球湿潤アッセイ
ＭＩ誘発マウスの５μｍの凍結心臓片を抗−Ｌｙ−６ＧとＬｙ−６Ｃ（ＲＢ６−８Ｃ５、ＢＤバイオサイエンス社）で着色し、Ｌｙ−６ＧとＬｙ−６Ｃの陽性細胞をソフトウエアプログラム（ＩｍａｇｅＪ、ＮＩＨイメージ社）でカウントした。
【０１５４】
（Ｍ）心筋の顕微鏡検査
ＭＩから２１日後のパラフィン包埋心臓サンプルを、４００以上の連続した５μｍの片に切断し、マッソントリクロームで着色した。先に記載のように（タカガワら、２００７年）、梗塞サイズについて定量的アッセイを行った。手短に言えば、梗塞領域に及ぶ第１０番目の片ごとの像（１つの心臓につき合計で２０片）を、×４対物レンズを用いたスピニングディスク顕微鏡（オリンパス社）によって調べ、ステレオ・インベスティゲータ・ソフトウエア（ステレオ・インベスティゲータ・バージョン７、ＭＢＦバイオサイエンス社）で把握した。立体的定量ソフトウエアを使用し、心臓の正中線の梗塞長さを測定した。
【０１５５】
（Ｎ）心エコー検査
ＭＩから２１日後に心エコー検査を行った（アクソンセコイアＣ５１２心エコー検査システム、シーメンス・メディカル・ソリューションズＵＳＡ社）。
【０１５６】
（Ｏ）統計的解析
２つのグループ間の比較は、非対の両側スチューデントｔ−検定を用いて行った。Ｐ＜０．０５を有意とみなした。
【０１５７】
実施例１２
全身注入ｈＭＳＣの血液と捕獲からの浄化
マウスにＩＶ注入したｈＭＳＣの結末を追跡するため、本発明者は、ヒト特異的Ａｌｕ配列についてのリアルタイムＰＣＲアッセイを用いた（マックブライドら、２００３年）。２×１０６ヒトＭＳＣのＩＶ注入後、Ａｌｕアッセイは、細胞の９９％±１．０７ＳＤが５分間以内に循環から浄化されることを示した（図１３Ａ）。約１０分間の遅延期の後、２％〜３％の細胞（４〜６×１０４）が再度循環に現れ、肺から放出されたものと思われた。血液中に検出された少数のＡｌｕ配列がｈＭＳＣを反映することを立証するため、１５分後に回収した５０μｌの末梢血を、ｈＭＳＣ培地のプラスチック培養皿の上に蒔き、１４日間にわたってインキュベートした。培養物は、紡錘状ｈＭＳＣの典型的なコロニーを発生し、ヒト核抗原とヒトβ２ミクログロブリンの両方に、抗体によって標識した（補足的な図１３）。組織における細胞の分布を追跡するため、均質化直前の未処理マウスからの組織に対し、いろいろな数のｈＭＳＣを加えることによって、各々の組織について個々の検量線を作成した（図１３Ｂ）。組織特異的検量線の使用は、抽出ＤＮＡの収率、臓器の細胞数、又はＰＣＲ反応の効率の相違によって生じる変動を最小限にする。アッセイの感度は、アッセイしたマウス臓器あたり約１００のヒト細胞であった。アッセイを容易にするため、ＵＶ吸光度に代えて、抽出物中のＤＮＡについて定量的比色分析を使用し（バートン、１９５６年）、ＰＣＲ反応について適切なアリコートを選択した。予想通り（ガオら、２００１年；シュレップファーら、２００７年；リーら、２００９年）、循環から浄化された細胞の殆どは肺に捕獲されていた。１５分後に屠殺したマウスにおいて、ヒトＤＮＡの８３％±６．３ＳＤが肺で回収され、僅かな痕跡量が別な組織で回収された（図１３Ｃ）。一連の転移性乳癌細胞のＩＶ注入による対照標準実験でも同様な結果が得られた（図１３ＣのＭＤＡ−ＭＢ−２３１）。ヒト白血球のＩＶ注入後、少ない割合で１５分後に肺において回収され、多い割合で循環系に残って肝臓にも現れた（図１３Ｃ）。肺に捕獲されるｈＭＳＣの割合は、同じ体積（１５０μｌ）の媒体中で注入ＭＳＣの数を１００００まで少なくすること、インテグリン−α４又はインテグリン−α６に対する抗体で細胞を前処理すること（チェンら、２００６年）、又はラット白血球とともに細胞を前インキュベートすること（チュート、２００６年）によっては、有意には減少しなかった。動脈内注入の効果を検討するため、心臓の左心室に２×１０６ｈＭＳＣを注入した。５分間で血液から殆どの細胞が同様に浄化されたが（補足的な図１４Ａ）、１５〜６０分間にわたって注入細胞の約１．７２％±１．８１ＳＤのわずかな再循環がやはり存在した（補足的な図１４Ａ）。また、ＩＶ注入に比較して、注入から１５分後に、脳、心臓、肺、肝臓、及び腎臓などの臓器で多数の細胞が回収された（補足的な図１４Ｂ）。転移性乳癌細胞による対照実験は、同様なパターンの組織分布を生じた（補足的な図１４Ｂ）。
【０１５８】
生存細胞についての半定量的なアッセイについて（ニシダら、２００６年）、同様な方策を用い、ヒトＧＡＰＤＨのｍＲＮＡに特異的な定量的ＲＴ−ＰＣＲアッセイを開発した（図１３Ｄ）。このアッセイは、Ａｌｕアッセイとほぼ同じ感度を有するが、サンプルのより多くの操作を必要とした。このアッセイで得られたデータは、Ａｌｕ配列の分布が生細胞を大きく反映することを示した（図１３Ｅ、１３Ｆ）。
【０１５９】
実施例１３
肺に捕獲されたｈＭＳＣの動態学と再分配
肺からの細胞の経時な再分配を検討するため、２×１０６ｈＭＳＣをＩＶ注入し、マウスの７つの組織を４日以内にアッセイした（図１３Ｅ）。Ａｌｕ配列のアッセイは、肺に最初に捕獲された細胞が、約２４時間の半減期で消失することを示した。同様な値が、ＧＡＰＤＨについてのヒトｍＲＮＡのレベルで、生存ヒト細胞についてのアッセイによって得られた（図１３Ｅ）。肺の組織切片は、肺に捕獲されたヒトＭＳＣが、輸入血管に塞栓を形成し（リーら、２００９年）、多くの細胞がアポトーシスすることを実証した（図示せず）。肺から消失した細胞は、６つの他の組織に有意な数で現れず、注入したＡｌｕ配列の合計０．０４％（約４０００細胞に相当）が、４８時間後に６つの組織で回収され、９６時間後には０．０１であった（図１３Ｅ）。
【０１６０】
実施例１４
梗塞心臓におけるｈＭＳＣの捕獲
多数のＩＶ注入ｈＭＳＣがＭＩ後の心臓に現れるかどうかを調べるため、冠動脈前下行枝（ＬＡＤ）の永久的連結によってＭＩを発生させてから１日後のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの尾静脈に、ｈＭＳＣを注入した。Ａｌｕ配列のアッセイは、注入細胞の０．０４％±０．０３ＳＤ（４００細胞±３００ＳＤ、ｎ＝５）が、注入から１５分後の梗塞心臓で回収されたことを示した（図１３Ｆ）。ＩＶ注入から１日後、心臓のＡｌｕ配列は約５倍の０．１４８％±０．０５３ＳＤに増加し、約１４８０細胞±５３０ＳＤ（ｎ＝５）に相当した。同様な値が、注入から１日後のヒトＧＡＰＤＨのｍＲＮＡのアッセイによって得られた（７９２細胞±１４０ＳＤ、ｎ＝５）。
【０１６１】
実施例１５
塞栓によって生じるマウスとヒトのトランスクリプトームにおける変化
双方のトランスクリプトームをアッセイするため、約２×１０６ｈＭＳＣをマウスの尾静脈に注入し、１０時間後に肺からＲＮＡを抽出した。その１０時間後は、ヒトＧＡＰＤＨのｍＲＮＡについてのアッセイが、アッセイに適当な量のヒトｍＲＮＡが存在することを示した時間である（図１３Ｅ）。ヒトｍＲＮＡによるクロスハイブリダイゼーションについてのフィルタ処理後、このデータは、ｈＭＳＣの塞栓が、７５５マウス転写物の発現を上方制御し、３４７マウス転写物の発現を２倍以上に下方制御することを示した（図１４Ａ）。また、このデータは、肺における塞栓後に、４５１ヒト転写物が上方制御され、１００９転写物が下方制御されることを示した（図１４Ｂ）。
【０１６２】
上方制御された４５１ヒト転写物を、興味のある候補遺伝子について主観的に検討し、ヒト特異的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイを用いて、マイクロアレイのデータを確認した（図１５Ａ）。その結果は、ＳＭＡＤ６、ＣＳＦｌ、ＶＣＡＭ−１、及びＴＮＦＡＩＰ６（ＴＳＧ−６）の転写物において、２倍以上の増加を確認した。ＴＳＧ−６における増加は、２８倍と４７倍であり、又はマイクロアレイにより７．５倍よりかなり大きい増加が検出された（補足的な表１）。最近報告されたように（イロスタロら、２００８年）、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイは、本願で採用するシステムを用いたマイクロアレイのアッセイよりも、転写物において大きな変化を示すことが多い。
【０１６３】
実施例１６
インビトロＭＳＣは活性化してＴＳＧ−６を分泌
ＴＳＧ−６の増加は、そのタンパク質が先に有力な抗炎症因子であると示されていたため、特に興味が深い（フォルテーザら、２００７年；ゲッティングら、２００２年；ウィスニースキーとビルセク、２００４年；ミルナーら、２００６年）。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイは、肺におけるヒトＴＳＧ−６ｍＲＮＡが、ｈＭＳＣのＩＶ注入から１０時間後に増加し、２４時間後にさらに増加することを示した（図１５Ｂ）。未処理マウスとＭＩマウスの肺において、ＴＳＧ−６の発現に相違はない（図１５Ｂ）。ＴＳＧ−６は、ＴＮＦ−αとともにインキュベートされたヒト線維芽細胞からのｃＤＮＡクローンの分析によって発見された（リーら、１９９２年）。したがって、同じドナーからのｈＭＳＣと線維芽細胞をＴＮＦ−αとともにインキュベートし、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによってｍＲＮＡをアッセイした。ｈＭＳＣにおけるＴＳＧ−６の転写物は、４８時間にわたる１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−αを用いたインキュベート後に約１２０倍増加し、ｈＭＳＣの次の継代では約８０倍に増加した（図１５Ｃ）。ＥＬＩＳＡは、４８時間にわたるＴＮＦ−αを用いたインキュベーションが、ＴＳＧ−６タンパク質の分泌を、検出不能レベルから２０００ｐｇ／ｍｌ／１０５細胞／４８時間を超えるレベルまで増加させることを示した（図１５Ｄ）。驚くことに、ＴＮＦ−αに対するｈＭＳＣの反応は、ヒト線維芽細胞の反応をはるかに超えた。並列実験において、同じ条件下でＴＮＦ−αとともにインキュベートしたマウスＭＳＣは、ＴＳＧ−６についての転写物の発現を３．９４倍（±０．４９ＳＤ、ｎ＝４）に上方制御した。
【０１６４】
ＴＳＧ−６のｓｉＲＮＡを用いたｈＭＳＣの一時的形質導入は、ＴＳＧ−６の転写（図１５Ｅ）と分泌（図３Ｆ）に及ぼすＴＮＦ−αの効果を抑止した。ＴＳＧ−６の発現は、スクランブルｓｉＲＮＡを用いたニセ形質導入又は形質導入によって部分的に低減した。
【０１６５】
実施例１７
ＩＶのＭＳＣとｒｈＴＳＧ−６はいずれもＭＩマウスの炎症促進性プロテアーゼを減少
急性ＭＩは急性炎症反応を発生し、湿潤性好中球が心筋を劣化させるＭＭＰを生成する（ファングら、２００７年；リンジーら、２００１年）。永久的ＬＡＤは、心臓トロポニンＩ（図１６Ａ）、心筋障害のバイオマーカー（チャペル、１９９８年；パルベイズ、１９９７年）、プラスミン活性（図１６Ｂ）、及び炎症反応のマーカー（ハイマンスら、１９９９年；グリフィンら、２００５年）の血清レベルを増加させる。プラスミン活性は、ｒｈＴＳＧ−６の２回の注入で減少し、その既知の抑制効果（バルドスら、２００１年；ミルナーら、２００６年）と矛盾のない観察であった。また、プラスミン活性は、ｈＭＳＣ、又はｈＭＳＣとスクランブルｓｉＲＮＡのＩＶ注入によって減少したが、ＴＳＧ−６のｓｉＲＮＡを形質移入されたｈＭＳＣでは減少しなかった。
【０１６６】
予想通り（ファングら、２００７年）、プロＭＭＰ９と活性ＭＭＰ９の双方の酵素活性は、ＭＩから２日後の心臓において増加した（図１６Ｃ）。スクランブルｓｉＲＮＡで形質導入したｈＭＳＣ又はｈＭＳＣのＩＶ注入は、双方の活性を低下させた（図１６Ｃ）。ｈＭＳＣの効果は、細胞注入前のＴＳＧ−６遺伝子のノックダウンによって部分的に否定された。また、ｈＭＳＣの効果は、ヒト組換え型ＴＳＧ−６の２つの注入によって、部分的に複製された。プロＭＭＰ活性における減少は、心臓における顆粒球と単球の浸透の減少に反映された（図１６Ｄ、１６Ｅ）。
【０１６７】
実施例１８
ＭＩにおける梗塞サイズと心臓機能に及ぼすＴＳＧ−６の効果
先に報告されたように（イソら、２００７年）、ｈＭＳＣのＩＶ注入は、ＭＩから３週間後の梗塞サイズを低下させた（図１７Ａ、１７Ｂ、１７Ｆ、及び図１２）。ＴＳＧ−６遺伝子のｓｉＲＮＡノックダウンをともなうｈＭＳＣは、梗塞サイズに効果を有しなかった（図１７Ｄ、１７Ｆ）。スクランブルｓｉＲＮＡで形質導入したｈＭＳＣは、梗塞サイズに中間的効果を生じ（図１７Ｄ、１７Ｆ）、スクランブルｓｉＲＮＡが、ＴＳＧ−６の分泌に部分的な効果を有するためと思われた（図１５Ｅ、１５Ｆ）。また、外科処置の直後と２４時間後の１００μｇのｒｈＴＳＧ−６のＩＶ注入は、梗塞サイズを減少させた（図１７Ｅ、１７Ｆ、図１２）。しかしながら、ｒｈＴＳＧ−６の効果は、ｈＭＳＣ（ｐ＜０．０５）の投与後の梗塞サイズの減少よりも若干小さかった。
【０１６８】
心エコー検査によるアッセイは、心臓機能に及ぼす同等な効果を実証した。ＭＩから１時間後の２×１０６ｈＭＳＣ又はスクランブルｓｉＲＮＡと併せたｈＭＳＣのＩＶ注入は、３週間後にアッセイした心臓において、左心室短縮率と左心室駆出率の割合に有意な改良を生じた（図１８、表３）。ＴＳＧ−６のノックダウンをともなうｈＭＳＣの注入は、効果を有しなかった。
【０１６９】
参考文献
以下の参考文献は、本願明細書に示した記載に対して例示的手順又は他の補足的事項を与える範囲で、本願でも具体的に参考にして取り入れられる。
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【０１７０】
本明細書で引用する参考文献、特許、公開特許は、各々の引用が具体的かつ個々に本明細書に記載されているように、本願にも参考にして取り入れられる。各引用文献についての引用は、本出願日前の開示事項に関するものであり、先行発明を参考にすることから本発明が特許を受ける資格がないと解釈すべきではない。
【０１７１】
また、本発明は、本明細書に記載の特定の態様に限定されるものではなく、特定の態様の変形がなされてもよく、それらは、本願の特許請求の範囲に含まれるものと理解すべきである。また、本明細書における用語は、特定の態様を記載するためであって、発明の範囲を制限しないものと理解するべきである。言い換えれば、本発明の範囲は、本願の特許請求の範囲によって規定される。
【０１７２】
さらに、上述の各要素又は２以上の組み合わせは、本願に記載の種類とは異なる別は種類の方法に有用な応用を見出し得ると理解される。さらなる解析をしなくても、上述の記載は、本発明の要旨を十分に明らかにしており、当業者は、現状知識を適用することにより、本発明の特徴を逸脱することなく種々の用途に容易に適用するものと考えられ、したがって、本明細書の記載は、従来技術の見地からは、本願の特許請求の範囲に示した本発明の一般的又は固有的な局面の基本的特徴を公平に構成するものである。そして、上述の態様は、例示の目的に過ぎない。
【０１７３】
本明細書で引用した文献と特許は、各々がいずれも全ての目的において、本願に参照して取り入れられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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