(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(a1)〜(c2)のいずれかのREIC/Dkk-3タンパク質の部分領域からなるポリペプチド：
(a1)  配列番号３に示すアミノ酸配列からなる、REIC/Dkk-3タンパク質の部分領域からなるポリペプチド；
(a2)  配列番号３に示すアミノ酸配列において、１〜５個のアミノ酸を置換、欠失若しくは付加してなるアミノ酸配列からなるポリペプチドタンパク質であって、単球からの樹状細胞様細胞分化誘導活性を有するポリペプチド；
(b1)  配列番号５に示すアミノ酸配列からなる、REIC/Dkk-3タンパク質の部分領域からなるポリペプチド；
(b2)  配列番号５に示すアミノ酸配列において、１〜５個のアミノ酸を置換、欠失若しくは付加してなるアミノ酸配列からなるポリペプチドタンパク質であって、単球からの樹状細胞様細胞分化誘導活性を有するポリペプチド；
(c1)  配列番号７に示すアミノ酸配列からなる、REIC/Dkk-3タンパク質の部分領域からなるポリペプチド；及び
(c2)  配列番号７に示すアミノ酸配列において、１〜５個のアミノ酸を置換、欠失若しくは付加してなるアミノ酸配列からなるポリペプチドタンパク質であって、単球からの樹状細胞様細胞分化誘導活性を有するポリペプチド。
【請求項２】
以下の(f1)〜(h3)のいずれかのREIC/Dkk-3タンパク質の部分領域からなるポリペプチドをコードするDNA；
(f1)  配列番号４に示す塩基配列からなるDNA；
(f2)  配列番号４に示す塩基配列に対し９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつ単球からの樹状細胞様細胞分化誘導活性を有するポリペプチドをコードするDNA；
(f3)  配列番号３に示すアミノ酸配列をコードするDNA配列からなり、かつ単球からの樹状細胞様細胞分化誘導活性を有するポリペプチドをコードするDNA;
(g1)  配列番号６に示す塩基配列からなるDNA；
(g2)  配列番号６に示す塩基配列に対し９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつ単球からの樹状細胞様細胞分化誘導活性を有するポリペプチドをコードするDNA；
(g3)  配列番号５に示すアミノ酸配列をコードするDNA配列からなり、かつ単球からの樹状細胞様細胞分化誘導活性を有するポリペプチドをコードするDNA;
(h1)  配列番号８に示す塩基配列からなるDNA；
(h2)  配列番号８に示す塩基配列に対し９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつ単球からの樹状細胞様細胞分化誘導活性を有するポリペプチドをコードするDNA；及び
(h3)  配列番号７に示すアミノ酸配列をコードするDNA配列からなり、かつ単球からの樹状細胞様細胞分化誘導活性を有するポリペプチドをコードするDNA。
【請求項３】
請求項２記載のDNAを含むベクター。
【請求項４】
ベクターがアデノウイルスベクターである、請求項３記載のベクター。
【請求項５】
請求項１記載のREIC/Dkk-3タンパク質の部分領域からなるポリペプチドを有効成分として含む、単球からの樹状細胞様細胞分化誘導剤。
【請求項６】
請求項１記載のREIC/Dkk-3タンパク質の部分領域からなるポリペプチドのうちの(c1)又
は(c2)のポリペプチドを有効成分として含む、樹状細胞、ヘルパーT細胞、CTL及びNK細胞からなる群から選択される免疫活性化細胞の分化誘導促進剤。
【請求項７】
請求項１記載のREIC/Dkk-3タンパク質の部分領域からなるポリペプチドのうちの(c1)又は(c2)のポリペプチドを有効成分として含む、MDSC又はTregである免疫抑制機能系細胞の分化誘導阻害剤。
【請求項８】
請求項１記載のREIC/Dkk-3タンパク質の部分領域からなるポリペプチドのうちの(c1)又は(c2)のポリペプチドを有効成分として含む、抗癌剤。
【請求項９】
請求項２記載のREIC/Dkk-3タンパク質の部分領域からなるポリペプチドをコードするDNA又は請求項３若しくは４に記載のベクターを有効成分として含む、単球からの樹状細胞様細胞分化誘導剤。
【請求項１０】
請求項２記載のREIC/Dkk-3タンパク質の部分領域からなるポリペプチドをコードするDNAのうちの(h1)、(h2)及び(h3)のいずれかのDNA又は該DNAを含む請求項３若しくは４に記載のベクターを有効成分として含む、樹状細胞、ヘルパーT細胞、CTL及びNK細胞からなる群から選択される免疫活性化細胞の分化誘導促進剤。
【請求項１１】
請求項２記載のREIC/Dkk-3タンパク質の部分領域からなるポリペプチドをコードするDNAのうちの(h1)、(h2)及び(h3)のいずれかのDNA又は該DNAを含む請求項３若しくは４に記載のベクターを有効成分として含む、MDSC又はTregである免疫抑制系細胞の分化誘導阻害剤。
【請求項１２】
請求項２記載のREIC/Dkk-3タンパク質の部分領域からなるポリペプチドをコードするDNAのうちの(h1)、(h2)及び(h3)のいずれかのDNA又は該DNAを含む請求項３若しくは４に記載のベクターを有効成分として含む、抗癌剤。
【請求項１３】
動物から採取した単球を、in vitroで請求項１記載のREIC/Dkk-3タンパク質の部分領域からなるポリペプチドの存在下で培養することを含む、CD14陽性単球より樹状細胞様細胞を分化誘導する方法。
【請求項１４】
単球が末梢血単球である請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
以下の(i)〜(k)のいずれかのREIC/Dkk-3タンパク質の部分領域からなるポリペプチド：
(i)  REIC/Dkk-3タンパク質の部分領域からなる、Tctex-1タンパク質に結合し得るポリペプチドであって、配列番号１７に表されるアミノ酸配列からなる、REIC/Dkk-3タンパク質の部分領域からなるポリペプチド；
(j)  配列番号１７に表されるアミノ酸配列において、１個若しくは２個のアミノ酸を置換、欠失若しくは付加してなるアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、Tctex-1タンパク質への結合活性を有するポリペプチド；及び
(k)  REIC/Dkk-3タンパク質の部分領域からなる、Tctex-1タンパク質に結合し得るポリペプチドであって、配列番号１８に表されるコンセンサス配列を含む、７〜２２残基のアミノ酸からなるポリペプチド。
【請求項１６】
以下の(l)〜(n)のいずれかのREIC/Dkk-3タンパク質の部分領域からなるポリペプチドをコードするDNA；
(l)  REIC/Dkk-3タンパク質の部分領域からなる、Tctex-1タンパク質に結合し得るポリペプチドをコードするDNAであって、配列番号８に表される塩基配列の４番目のgから６９番
目のgからなる塩基配列からなるDNA；
(m)  配列番号８に表される塩基配列の４番目のgから６９番目のgからなる塩基配列に対し９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつTctex-1タンパク質への結合活性を有するポリペプチドをコードするDNA；及び
(n)  REIC/Dkk-3タンパク質の部分領域からなる、Tctex-1タンパク質に結合し得るポリペプチドであって、配列番号１７に表されるアミノ酸配列をコードするDNA配列からなり、かつTctex-1タンパク質への結合活性を有するポリペプチドをコードするDNA。
【請求項１７】
請求項１６記載のDNAを含むベクター。
【請求項１８】
ベクターがアデノウイルスベクターである、請求項１７記載のベクター。
【請求項１９】
請求項１５記載のREIC/Dkk-3タンパク質の部分領域からなるポリペプチドを有効成分として含む、抗癌剤。
【請求項２０】
請求項１６記載のREIC/Dkk-3タンパク質の部分領域からなるポリペプチドをコードするDNA又は請求項１７若しくは１８に記載のベクターを有効成分として含む、抗癌剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗癌免疫活性を高める癌の治療又は予防のための医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞の不死化に関連した遺伝子として、ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３遺伝子が知られており、癌細胞ではこの遺伝子の発現が抑制されていることが報告されている（特許文献１及び非特許文献１から４を参照）。
ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３遺伝子はＤｋｋファミリーのメンバーであり、Ｗｎｔ受容体を介してＷｎｔシグナル伝達を阻害することが示唆されている（非特許文献５及び６を参照）。Ｗｎｔ遺伝子は、細胞の成長、分化、癌化などの重要な生物学的状況に多面的な役割を果たすことが報告されている（非特許文献７を参照）。
ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３については、全長ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質を１０μｇ／ｍｌの濃度で末梢血単核球（単球）を培養している培養液中に添加すると、同細胞が樹状細胞様細胞に分化することが報告されている（特許文献２を参照）。
一般に、血液前駆細胞より樹状細胞（様）の分化を誘導できると認められている物質は、数えるほどしか報告されておらず、そのほとんどは周知のサイトカインである。例えば、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４の併用について、それらを培養液に添加することによる単球からの樹状細胞分化誘導について多くの報告がなされ、樹状細胞分化のゴールデンスタンダードとされている。その他に、単独又は併用により樹状細胞を分化誘導できる物質として、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＨＧＦ（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、ＣＤ４０  ｌｉｇａｎｄ、Ｍ−ＣＳＦ、Ｆｉｔ３  ｌｉｇａｎｄ、ＴＧＦ−β等が報告されている。これらのタンパク質のうち、全長ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質のように、単剤のみでその前駆細胞から樹状（様）細胞を分化誘導できる物質として、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＨＧＦ、ＣＤ４０  ｌｉｇａｎｄが知られていた。また、これらの中でｉｎ  ｖｉｖｏで抗癌効果が認められるのは、ＩＬ−２のみであった。なお、ＧＭ−ＣＳＦが奏功しない理由として、抗がん免疫だけでなく、骨髄由来免疫抑制性細胞（ＭＤＳＣ）や免疫制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に代表される免疫抑制系細胞を分化誘導し「負の免疫系」を活性化することが原因と考えられている（非特許文献８を参照）。
【特許文献１】国際公開第ＷＯ０１／０３８５２３号パンフレット
【特許文献２】国際公開第ＷＯ０９／１１９８７４号パンフレット
【非特許文献１】Ｔｓｕｊｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２６８，２０−４（２０００）
【非特許文献２】Ｔｓｕｊｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２８９，２５７−６３（２００１）
【非特許文献３】Ｎｏｚａｋｉ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｎｃｏｌ  １９，１１７−２１（２００１）
【非特許文献４】Ｋｕｒｏｓｅ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｕｒｏｌ  １７１，１３１４−８（２００４）
【非特許文献５】Ｂａｆｉｃｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ３，６８３−６（２００１）
【非特許文献６】Ｈｏａｎｇ，Ｂ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６４，２７３４−９（２００４）
【非特許文献７】Ｍｏｏｎ，Ｒ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６，１６４４−６（２００２）
【非特許文献８】Ｐａｒｍｉａｎｉ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  １８，２２６−３２（２００７）
【発明の概要】
【０００３】
本発明は、樹状細胞様細胞を強力に誘導・活性化し、癌を免疫療法により治療又は予防することができるポリペプチド、並びに該ポリペプチドをコードするＤＮＡの提供を目的とする。
本発明者らは、生体内における免疫・炎症現象における全長ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質の有用性・優位性並びに幅広い分野、疾患におけるその利用の可能性を明らかにしてきた（国際公開第ＷＯ０９／１１９８７４号パンフレット）。
本発明者らは、さらに、ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質の部分領域についての活性について検討を行い、特定の部分領域に単球から樹状細胞様分化を誘導する強い生理活性が存在すること、その生理活性が全長ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質よりも非常に大きいことを見出した。このことは、ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質の特定の部分領域が単球から樹状細胞様細胞の分化誘導を行い、癌免疫活性化により、癌の治療や予防に用いることができることを示している。
このような免疫学的な癌治療剤として、ＩＬ−２タンパク質が、腎細胞癌などの特殊な癌種において治療効果を有することがあることは報告されていた。しかしながら、その投与適応のある癌種及びその効果は限定的なものであることも、臨床的には周知の事実である。ほとんどすべての癌種において発現・分泌低下の認められるＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質は、それらの様々な癌種において癌免疫活性化作用を有する癌治療剤として使用できる可能性があり、またその治療効果についてもＩＬ−２と比べて優位性を持つ可能性がある。
上記のように、本発明者らはＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質の特定の部分領域が、全長ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質に比べてより強い「単球から樹状細胞様分化を誘導する生理活性」を有することを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］  以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかのＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質の部分領域からなるポリペプチド：
（ａ）  配列番号３、配列番号５、配列番号７及び配列番号９に示すアミノ酸配列、並びに配列番号２に示すアミノ酸配列の第２０５番目のＧｌｙから第２８８番目のＰｈｅからなる部分領域を含み、かつ配列番号２に示すアミノ酸配列の第１３５番目のＳｅｒから第３５０番目のＩｌｅからなる部分領域の断片からなるポリペプチドのアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質の部分領域からなるポリペプチド；
（ｂ）  配列番号３、配列番号５、配列番号７及び配列番号９に示すアミノ酸配列、並びに配列番号２に示すアミノ酸配列の第２０５番目のＧｌｙから第２８８番目のＰｈｅからなる部分領域を含み、かつ配列番号２に示すアミノ酸配列の第１３５番目のＳｅｒから第３５０番目のＩｌｅからなる部分領域の断片からなるポリペプチドのアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸を置換、欠失若しくは付加してなるアミノ酸配列からなるポリペプチドタンパク質であって、単球からの樹状細胞様細胞分化誘導活性を有するポリペプチド；
（ｃ）  ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質の部分領域からなる、Ｔｃｔｅｘ−１タンパク質に結合し得るポリペプチドであって、配列番号１７に表されるアミノ酸配列からなる、ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質の部分領域からなるポリペプチド；
（ｄ）  配列番号１７に表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸を置換、欠失若しくは付加してなるアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、Ｔｃｔｅｘ−１タンパク質への結合活性を有するポリペプチド；及び
（ｅ）  ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質の部分領域からなる、Ｔｃｔｅｘ−１タンパク質に結合し得るポリペプチドであって、配列番号１８に表されるコンセンサス配列を含む、７〜２２残基のアミノ酸からなるポリペプチド。
［２］  以下の（ｆ）〜（ｌ）のいずれかのＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質の部分領域からなるポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（ｆ）  配列番号４、配列番号６、配列番号８及び配列番号１０に示す塩基配列、並びに配列番号１に示す塩基配列の第６１３番目のｇから第８６４番目のｃからなる部分配列を含み、かつ配列番号１に示す塩基配列の第４０３番目のｔから第１０５０番目のｔからなる部分配列の断片からなる塩基配列からなる群から選択される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｇ）  配列番号４、配列番号６、配列番号８及び配列番号１０に示す塩基配列、並びに配列番号１に示す塩基配列の第６１３番目のｇから第８６４番目のｃからなる部分配列を含み、かつ配列番号１に示す塩基配列の第４０３番目のｔから第１０５０番目のｔからなる部分配列の断片からなる塩基配列からなる群から選択される塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ単球からの樹状細胞様細胞分化誘導活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（ｈ）  配列番号４、配列番号６、配列番号８及び配列番号１０に示す塩基配列、並びに配列番号１に示す塩基配列の第６１３番目のｇから第８６４番目のｃからなる部分配列を含み、かつ配列番号１に示す塩基配列の第４０３番目のｔから第１０５０番目のｔからなる部分配列の断片からなる塩基配列からなる群から選択される塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなり、かつ単球からの樹状細胞様細胞分化誘導活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（ｉ）  配列番号３、配列番号５、配列番号７及び配列番号９に示すアミノ酸配列、並びに配列番号２に示すアミノ酸配列の第２０５番目のＧｌｙから第２８８番目のＰｈｅからなる部分領域を含み、かつ配列番号２に示すアミノ酸配列の第１３５番目のＳｅｒから第３５０番目のＩｌｅからなる部分領域の断片からなるポリペプチドのアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列からなり、かつ単球からの樹状細胞様細胞分化誘導活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（ｊ）  ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質の部分領域からなる、Ｔｃｔｅｘ−１タンパク質に結合し得るポリペプチドをコードするＤＮＡであって、配列番号８に表される塩基配列の４番目のｇから６９番目のｇからなる塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｋ）  配列番号８に表される塩基配列の４番目のｇから６９番目のｇからなる塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＴｃｔｅｘ−１タンパク質への結合活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；及び
（ｌ）  ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質の部分領域からなる、Ｔｃｔｅｘ−１タンパク質に結合し得るポリペプチドであって、配列番号１７に表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列からなり、かつＴｃｔｅｘ−１タンパク質への結合活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
［３］  ［２］のＤＮＡを含むベクター。
［４］  ベクターがアデノウイルスベクターである、［３］のベクター。
［５］  ［１］のＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質の部分領域からなるポリペプチドを有効成分として含む、単球からの樹状細胞様細胞分化誘導剤。
［６］  ［１］のＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質の部分領域からなるポリペプチドを有効成分として含む、樹状細胞、ヘルパーＴ細胞、ＣＴＬ及びＮＫ細胞からなる群から選択される免疫活性化細胞の分化誘導促進剤。
［７］  ［１］のＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質の部分領域からなるポリペプチドを有効成分として含む、ＭＤＳＣ又はＴｒｅｇである免疫抑制機能系細胞の分化誘導阻害剤。
［８］  ［１］のＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質の部分領域からなるポリペプチドを有効成分として含む、抗癌剤。
［９］  ［２］のＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質の部分領域からなるポリペプチドをコードするＤＮＡ又は［３］若しくは［４］のベクターを有効成分として含む、単球からの樹状細胞様細胞分化誘導剤。
［１０］  ［２］のＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質の部分領域からなるポリペプチドをコードするＤＮＡ又は［３］若しくは［４］のベクターを有効成分として含む、樹状細胞、ヘルパーＴ細胞、ＣＴＬ及びＮＫ細胞からなる群から選択される免疫活性化細胞の分化誘導促進剤。
［１１］  ［２］のＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質の部分領域からなるポリペプチドをコードするＤＮＡ又は［３］若しくは［４］のベクターを有効成分として含む、ＭＤＳＣ又はＴｒｅｇである免疫抑制系細胞の分化誘導阻害剤。
［１２］  ［２］のＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質の部分領域からなるポリペプチドをコードするＤＮＡ又は［３］若しくは［４］のベクターを有効成分として含む、抗癌剤。
［１３］  動物から採取した単球を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで［１］のＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質の部分領域からなるポリペプチドの存在下で培養することを含む、ＣＤ１４陽性単球より樹状細胞様細胞を分化誘導する方法。
［１４］  単球が末梢血単球である［１３］の方法。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２０１０−１５０９３５号及び特願２０１１−０１４３１９号の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、ヒトＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質の全長、並びに部分領域１［Ａｒｇ１２１−３２９］及び部分領域２［Ｇｌｙ１８４−Ｉｌｅ３２９］の調製方法を示す図である。
図２は、単独（添加なし）（図２Ａ）、ＧＭ−ＣＳＦ＋ＩＬ−４（図２Ｂ）（それぞれ、２ｎｇ／ｍｌ）、又はヒトＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質の全長（図２Ｃ）、部分領域１［Ａｒｇ  １２１−Ｉｌｅ  ３２９］（図２Ｄ）若しくは部分領域２［Ｇｌｙ  １８４−Ｉｌｅ  ３２９］（図２Ｅ）（１０μｇ／ｍｌ）の存在下で７日間培養したＰＢＭＣの位相差顕微鏡像を示す写真である（弱拡大像）。
図３は、単独（添加なし）（図３Ａ）、ＧＭ−ＣＳＦ＋ＩＬ−４（図３Ｂ）（それぞれ、２ｎｇ／ｍｌ）、又は部分領域２［Ｇｌｙ  １８４−Ｉｌｅ  ３２９］（１０μｇ／ｍｌ）（図３Ｃ）の存在下で７日間培養したＰＢＭＣの位相差顕微鏡像を示す写真である（強拡大像）。
図４は、単独（添加なし）、ＧＭ−ＣＳＦ＋ＩＬ−４（それぞれ、２ｎｇ／ｍｌ）、又はヒトＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質の全長、部分領域１［Ａｒｇ  １２１−Ｉｌｅ  ３２９］若しくは部分領域２［Ｇｌｙ  １８４−Ｉｌｅ  ３２９］（１０μｇ／ｍｌ）により分化誘導される樹状細胞様細胞の出現頻度を示す図である。
図５−１は、ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質の部分領域３［Ｓｅｒ  １１４−Ｐｈｅ  ２６７］の製造法及び精製法のプロトコールを示す図である。
図５−２は、ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質の部分領域３［Ｓｅｒ  １１４−Ｐｈｅ  ２６７］の精製における第１回目のイオン交換クロマトグラフィー精製のチャートを示す図である。
図５−３は、ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質の部分領域３［Ｓｅｒ  １１４−Ｐｈｅ  ２６７］の精製における第２回目のイオン交換クロマトグラフィー精製のチャートを示す図である。
図６は、ヒト組織由来培養細胞発現ヒトＲＥＩＣタンパク質添加による末梢血単球からの樹状細胞様分化誘導を示す写真であり、単独（添加なし）（図６Ａ）、又はＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質の部分領域１［Ａｒｇ  １２１−Ｉｌｅ  ３２９］（１０μｇ／ｍｌ）（図６Ｂ）若しくは部分領域３［Ｓｅｒ  １１４−Ｐｈｅ  ２６７］（１０μｇ／ｍｌ）（図６Ｃ）により分化誘導される樹状細胞様細胞（７日目）の位相差顕微鏡写真（弱拡大）である。
図７は、ヒト組織由来培養細胞発現ヒトＲＥＩＣタンパク質添加による末梢血単球からの樹状細胞様分化誘導を示す写真であり、単独（添加なし）（図７Ａ）、又はＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質の部分領域１［Ａｒｇ  １２１−Ｉｌｅ  ３２９］（１０μｇ／ｍｌ）（図７Ｂ）若しくは部分領域３［Ｓｅｒ  １１４−Ｐｈｅ  ２６７］（１０μｇ／ｍｌ）（図７Ｃ）により分化誘導される樹状細胞様細胞（７日目）の位相差顕微鏡写真（強拡大）である。
図８は、ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質の部分領域３［Ｓｅｒ  １１４−Ｐｈｅ  ２６７］の安定性確認実験の結果を示す図である。
図９は、実施例３で用いた遺伝子高発現プラスミドが含む発現カセットのコンストラクトを示す図である。
図１０は、ヒト全長ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質、及び部分領域３［Ｓｅｒ  １１４−Ｐｈｅ  ２６７］の腹腔内投与実験のプロトコールを示す図である。
図１１Ａは、ヒト全長ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質、及び部分領域３［Ｓｅｒ  １１４−Ｐｈｅ  ２６７］の腹腔内投与による腫瘍増殖抑制効果（腫瘍体積の経時的変化）を示す図である。
図１１Ｂは、ヒト全長ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質、及び部分領域３［Ｓｅｒ  １１４−Ｐｈｅ  ２６７］の腹腔内投与による腫瘍増殖抑制効果（腫瘍重量）を示す図である。
図１１Ｃは、ヒト全長ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質、及び部分領域３［Ｓｅｒ  １１４−Ｐｈｅ  ２６７］の腹腔内投与による腫瘍増殖抑制効果を示す腫瘍の写真である。図１１Ｃ−ａはＰＢＳを投与した場合、図１１Ｃ−ｂはヒト全長ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質を投与した場合、図１１Ｃ−ｃは部分領域３を投与した場合の結果を示す。
図１２Ａは、ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質（全長又は部分領域３）治療実験終了時（安楽死直前）又は無処置群又はＰＢＳバッファー投与群における各末梢血中の骨髄由来免疫抑制性細胞の陽性率（％）を示すグラフである。
図１２Ｂは、ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質（全長又は部分領域３）治療実験終了時（安楽死直前）又は無処置群又はＰＢＳバッファー投与群における各末梢血中の樹状細胞細胞の陽性率（％）を示すグラフである。
図１２Ｃは、ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質（全長又は部分領域３）治療実験終了時（安楽死直前）又は無処置群又はＰＢＳバッファー投与群における各末梢血中の活性化樹状細胞（ＣＤ１１ｃ＋／ＣＤ８０＋）の陽性率（％）を示すグラフである。
図１２Ｄは、ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質（全長又は部分領域３）治療実験終了時（安楽死直前）又は無処置群又はＰＢＳバッファー投与群における各末梢血中の活性化樹状細胞（ＣＤ１１ｃ＋／ＣＤ８６＋）の陽性率（％）を示すグラフである。
図１２Ｅは、ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質（全長又は部分領域３）治療実験終了時（安楽死直前）又は無処置群又はＰＢＳバッファー投与群における各末梢血中のヘルパーＴ細胞の陽性率（％）を示すグラフである。
図１２Ｆは、ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質（全長又は部分領域３）治療実験終了時（安楽死直前）又は無処置群又はＰＢＳバッファー投与群における各末梢血中の免疫抑制性Ｔ細胞の陽性率（％）を示すグラフである。
図１２Ｇは、ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質（全長又は部分領域３）治療実験終了時（安楽死直前）又は無処置群又はＰＢＳバッファー投与群における各末梢血中の細胞傷害性Ｔ細胞の陽性率（％）を示すグラフである。
図１２Ｈは、ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質（全長又は部分領域３）治療実験終了時（安楽死直前）又は無処置群又はＰＢＳバッファー投与群における各末梢血中の活性型細胞傷害性Ｔ細胞の陽性率（％）を示すグラフである。
図１２Ｉは、ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質（全長又は部分領域３）治療実験終了時（安楽死直前）又は無処置群又はＰＢＳバッファー投与群における各末梢血中のＮＫ細胞の陽性率（％）を示すグラフである。
図１３は、ヒト全長ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質の同所性腎細胞がん・肺転移モデルマウスでの腹腔内投与実験のプロトコールを示す図である。
図１４Ａは、ヒト全長ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質（１０μｇ、１００μｇ）の同所性腎細胞がん・肺転移モデルマウスでの腹腔内投与実験における腎がん原発巣の腫瘍組織の写真である。
図１４Ｂは、全長ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質（１０μｇ、１００μｇ）治療実験終了時（安楽死直前）又はＰＢＳバッファー投与群における腎がん原発巣の腫瘍重量（ｇ）の平均値を示すグラフである。
図１５Ａは、ヒト全長ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質（１０μｇ、１００μｇ）の同所性腎細胞がん・肺転移モデルマウスでの腹腔内投与実験における肺転移巣の腫瘍組織の写真である。
図１５Ｂは、全長ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質（１０μｇ、１００μｇ）の治療実験終了時（安楽死直前）又はＰＢＳバッファー投与群における肺転移巣の腫瘍重量（ｇ）の平均値を示すグラフである。
図１６Ａは、無処置マウスから採取した骨髄細胞にＧＭ−ＣＳＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）（１６Ａ−ａ）又はＲＥＩＣタンパク質（１０ｕｇ／ｍｌ）とＧＭ−ＣＳＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）の混合液（１６Ａ−ｃ）を投与した際の、ＭＤＳＣ細胞の分化誘導を示したサイトグラムである。１６Ａ−ａはコントロールである。
図１６Ｂは、図１６Ａに示したサイトグラムから割り出されたＭＤＳＣ細胞の陽性率のグラフである。
図１７Ａ−１は、全長ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質（１０μｇ、１００μｇ）の治療実験終了時（安楽死直前）又はＰＢＳバッファー投与群から採取した各末梢血に対し、フローサイトメトリー解析を用いて、ＭＤＳＣ（Ｇｒ−１＋，ＣＤ１１ｂ＋）の陽性率を測定した結果（サイトグラム）を示す図である。図１７Ａ−１ａはＰＢＳ、図１７Ａ−１ｂは全長ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質（１０μｇ）、図１７Ａ−１ｃは全長ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質（１００μｇ）を用いた場合の結果である。
図１７Ａ−２は、全長ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質（１０μｇ、１００μｇ）の治療実験終了時（安楽死直前）又はＰＢＳバッファー投与群から採取した各末梢血に対し、フローサイトメトリー解析を用いて、ＭＤＳＣ（Ｇｒ−１＋，ＣＤ１１ｂ＋）の陽性率を測定した結果（陽性率のグラフ）を示す図である。
図１７Ｂ−１は、全長ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質（１０μｇ、１００μｇ）の治療実験終了時（安楽死直前）又はＰＢＳバッファー投与群から採取した各末梢血に対し、フローサイトメトリー解析を用いて、樹状細胞（ＣＤ１１ｃ＋，ＣＤ８０＋）の陽性率を測定した結果（サイトグラム）を示す図である。図１７Ｂ−１ａはＰＢＳ、図１７Ｂ−１ｂは全長ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質（１０μｇ）、図１７Ｂ−１ｃは全長ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質（１００μｇ）を用いた場合の結果である。
図１７Ｂ−２は、全長ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質（１０μｇ、１００μｇ）の治療実験終了時（安楽死直前）又はＰＢＳバッファー投与群から採取した各末梢血に対し、フローサイトメトリー解析を用いて、樹状細胞（ＣＤ１１ｃ＋，ＣＤ８０＋）の陽性率を測定した結果（陽性率のグラフ）を示す図である。
図１７Ｃ−１は、全長ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質（１０μｇ、１００μｇ）の治療実験終了時（安楽死直前）又はＰＢＳバッファー投与群から採取した各末梢血に対し、フローサイトメトリー解析を用いて、Ｔｒｅｇ（ＣＤ４＋，Ｆｏｘｐ３＋）の陽性率を測定した結果（サイトグラム）を示す図である。図１７Ｃ−１ａはＰＢＳ、図１７Ｃ−１ｂは全長ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質（１０μｇ）、図１７Ｃ−１ｃは全長ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質（１００μｇ）を用いた場合の結果である。
図１７Ｃ−２は、全長ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質（１０μｇ、１００μｇ）の治療実験終了時（安楽死直前）又はＰＢＳバッファー投与群から採取した各末梢血に対し、フローサイトメトリー解析を用いて、Ｔｒｅｇ（ＣＤ４＋，Ｆｏｘｐ３＋）の陽性率を測定した結果（陽性率のグラフ）を示す図である。
図１７Ｄ−１は、全長ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質（１０μｇ、１００μｇ）の治療実験終了時（安楽死直前）又はＰＢＳバッファー投与群から採取した各末梢血に対し、フローサイトメトリー解析を用いて、活性型ＣＴＬ（ＣＤ８＋，ＣＤ６９）の陽性率を測定した結果（サイトグラム）を示す図である。図１７Ｄ−１ａはＰＢＳ、図１７Ｄ−１ｂは全長ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質（１０μｇ）、図１７Ｄ−１ｃは全長ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質（１００μｇ）を用いた場合の結果である。
図１７Ｄ−２は、全長ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質（１０μｇ、１００μｇ）の治療実験終了時（安楽死直前）又はＰＢＳバッファー投与群から採取した各末梢血に対し、フローサイトメトリー解析を用いて、活性型ＣＴＬ（ＣＤ８＋，ＣＤ６９＋）の陽性率を測定した結果（陽性率のグラフ）を示す図である。
図１７Ｅ−１は、全長ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質（１０μｇ、１００μｇ）の治療実験終了時（安楽死直前）又はＰＢＳバッファー投与群から採取した各末梢血に対し、フローサイトメトリー解析を用いて、ＮＫ細胞（ＣＤ３ｅ＋，ＮＫ１．１＋）の陽性率を測定した結果（サイトグラム）を示す図である。図１７Ｅ−１ａはＰＢＳ、図１７Ｅ−１ｂは全長ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質（１０μｇ）、図１７Ｅ−１ｃは全長ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質（１００μｇ）を用いた場合の結果である。
図１７Ｅ−２は、全長ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質（１０μｇ、１００μｇ）の治療実験終了時（安楽死直前）又はＰＢＳバッファー投与群から採取した各末梢血に対し、フローサイトメトリー解析を用いて、ＮＫ細胞（ＣＤ３ｅ＋，ＮＫ１．１＋）の陽性率を測定した結果（陽性率のグラフ）を示す図である。
図１８Ａは、ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質とＴｃｔｅｘ−１タンパク質の相互作用を示した酵母ツーハイブリッドの解析の結果を示す図である。図中、青色のコロニーはＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質とＴｃｔｅｘ−１タンパク質の相互作用があることを示す。
図１８Ｂは、ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質とＴｃｔｅｘ−１タンパク質の相互作用を示した免疫沈降解析とウエスタン・ブロット解析の結果を示す図である。
図１９Ａは、全長ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質とＴｃｔｅｘ−１タンパク質の相互作用を示した動物細胞ツーハイブリッド解析の結果を示す図である。
図１９Ｂは、ヒト全長ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質の部分領域とＴｃｔｅｘ−１タンパク質の相互作用を示した動物細胞ツーハイブリッド解析の結果を示す図である。
図２０Ａは、ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質とｄｙｎｅｉｎ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｃｈａｉｎ（ＤＩＣ）のＴｃＴｅｘ−１結合領域のアミノ酸配列アラインメントを示す図である。
図２０Ｂは、ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質のＴｃｔｅｘ結合ドメインと既知結合タンパク質のアミノ酸配列アラインメントを示す図である。
図２１Ａは、ヒト全長ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質とＴｃｔｅｘ−１タンパク質の細胞内局在を示す写真である。図２１Ａの写真はヒト線維芽細胞ＯＵＭＳ２４においてヒト全長ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質（Ａ−ｂ）と小胞体マーカーであるＣｏｎｃａｎａｖａｌｉｎＡ（Ａ−ａ）との２重蛍光染色（Ａ−ｃ）の共焦点顕微鏡による撮像である。
図２１Ｂは、ヒト全長ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質とＴｃｔｅｘ−１タンパク質の細胞内局在を示す写真である。図２１Ｂの写真はヒト線維芽細胞ＯＵＭＳ２４においてＴｃｔｅｘ−１タンパク質（Ｂ−ｂ）と小胞体マーカーであるＣｏｎｃａｎａｖａｌｉｎＡ（Ｂ−ａ）との２重蛍光染色（Ｂ−ｃ）の共焦点顕微鏡の写真である。
図２２Ａは、Ａｄ−ＲＥＩＣのアポトーシス誘導能が、Ｔｃｔｅｘ−１の発現減少により減弱し、発現増幅により増強することを、蛍光顕微鏡によるＨｏｃｈｅｓｔ染色の撮像により示した写真である。上段の写真はＡｄ−ＬａｃＺを用いた場合、下段の写真はＡｄ−ＲＥＩＣを用いた場合であり、ａ、ｂ及びｃは、それぞれ、ＧＦＰプラスミド、ｓｈＲＮＡ−Ｔｃｔｅｘ−１、Ｔｃｔｅｘ−１発現プラスミドを投与した場合の結果を示す。
図２２Ｂは、Ａｄ−ＲＥＩＣのアポトーシス誘導能が、Ｔｃｔｅｘ−１の発現減少により減弱し、発現増幅により増強することを、アポトーシスの誘導率グラフで示した図である。
【発明を実施するための形態】
【０００５】
以下、本発明を詳細に説明する。
REIC/Dkk-3遺伝子（REIC遺伝子）の全長塩基配列及び該遺伝子のコードするタンパク質のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１及び配列番号２に表される。配列番号２に表すアミノ酸配列中、１番から21番のアミノ酸からなる配列がシグナル配列と予測される。REIC/Dkk-3遺伝子は、配列番号１の配列情報に基づいて、ヒト細胞、ヒト組織等から得ることができる。また、国際公開第WO01/038523号パンフレットの記載に従って得ることも可能である。
本発明の、REIC/Dkk-3タンパク質（REICタンパク質）の部分領域からなるポリペプチドは、以下のポリペプチドを含む。
（１）REIC/Dkk-3タンパク質のシグナル配列部分を除いた部分の第121番目のArgから第329番目のIleからなる部分領域を含む209アミノ酸からなる。該ポリペプチドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列の142番目のArgから350番目のIleからなる。本発明のポリペプチドをREIC/Dkk-3タンパク質の部分領域[Arg 121-Ile 329]と称することがある。本発明のREIC/Dkk-3タンパク質の部分領域[Arg 121-Ile 329]のアミノ酸配列を配列番号５に、該アミノ酸配列をコードする塩基配列を配列番号６に示す。
（２）REIC/Dkk-3タンパク質のシグナル配列部分を除いた部分の第184番目のGlyから第329番目のIleからなる部分領域を含む146アミノ酸からなる。該ポリペプチドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列の205番目のGlyから350番目のIleからなる。本発明のポリペプチドをREIC/Dkk-3タンパク質の部分領域[Gly 184-Ile 329]と称することがある。本発明のREIC/Dkk-3タンパク質の部分領域[Gly 184-Ile 329]のアミノ酸配列を配列番号３に、該アミノ酸配列をコードする塩基配列を配列番号４に示す。
（３）REIC/Dkk-3タンパク質のシグナル配列部分を除いた部分の第114番目のSerから第267番目のPheからなる部分領域を含む154アミノ酸からなる。該ポリペプチドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列の135番目のSerから288番目のPheからなる。本発明のポリペプチドをREIC/Dkk-3タンパク質の部分領域[Ser 114-Phe 267]と称することがある。本発明のREIC/Dkk-3タンパク質の部分領域[Ser 114-Phe 267]のアミノ酸配列を配列番号７に、該アミノ酸配列をコードする塩基配列を配列番号８に示す。
（４）REIC/Dkk-3タンパク質のシグナル配列部分を除いた部分の第184番目のGlyから第267番目のPheからなる部分領域を含む83アミノ酸からなる。該ポリペプチドは上記の３種類のポリペプチドのコンセンサス配列からなるポリペプチドであり、生理活性のコアとなるポリペプチドであると考えられる。該ポリペプチドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列の205番目のGlyから288番目のPheからなる。本発明のポリペプチドをREIC/Dkk-3タンパク質の部分領域[Gly 184-Phe 267]と称することがある。本発明のREIC/Dkk-3タンパク質の部分領域[Gly 184-Phe 267]のアミノ酸配列を配列番号９に、該アミノ酸配列をコードする塩基配列を配列番号１０に示す。
（５）さらに、本発明の、REIC/Dkk-3タンパク質（REICタンパク質）の部分領域からなるポリペプチドは、REIC/Dkk-3タンパク質のシグナル配列部分を除いた部分の第184番目のGlyから第267番目のPheからなる部分領域を含み、かつ第114番目のSerから第329番目のIleからなる部分領域の断片からなるポリペプチドを含む。該ポリペプチドは、配列番号２に示すアミノ酸配列の第205番目のGlyから第288番目のPheからなる部分領域を含み、かつ配列番号２に示すアミノ酸配列の第135番目のSerから第350番目のIleからなる部分領域の断片からなるポリペプチドである。また、該ポリペプチドをコードする塩基配列は、配列番号１に示す塩基配列の第613番目のgから第864番目のcからなる部分配列を含み、かつ配列番号１に示す塩基配列の第403番目のtから第1050番目のtからなる部分配列の断片からなる塩基配列である。該ポリペプチドのアミノ酸残基数は、83〜216である。
さらに、REIC/Dkk-3タンパク質は、Tctex-1（t-complex testis expressed-1)タンパク質と相互作用（会合）して作用する。Tctex-1タンパク質は、dyneinモーター複合体を構成する軽鎖タンパク質(dynein light chain)であり、Tctex-1結合タンパク質と会合することによってdyneinモーターと小胞積荷間の介在分子として重要な役割を果たす。
REIC/Dkk-3タンパク質とTctex-1タンパク質はいずれも小胞体周辺に局在しており、Tctex-1タンパク質はREIC/Dkk-3タンパク質のアポトーシス誘導能を促進する。REIC/Dkk-3タンパク質の、配列番号２で表されるアミノ酸配列の136番目のValから157番目のMetからなる２２アミノ酸からなる部分領域がTctex-1タンパク質と相互作用する。該部分領域ポリペプチドは、REIC/Dkk-3タンパク質のシグナル配列部分を除いた部分の第115番目のValから第136番目のMetからなる部分領域に相当する。該部分領域のアミノ酸配列を配列番号１７に示す。
該部分領域のアミノ酸配列中、EXGRRXH（配列番号１８、配列番号１７の４〜１０番目のアミノ酸からなる配列に相当）（Xは任意の天然アミノ酸）がTctex-1タンパク質との結合に関するコンセンサス配列（コンセンサスモチーフ）である。
本発明は、REIC/Dkk-3タンパク質の上記のTctex-1タンパク質と相互作用する部分領域ペプチド及び上記のコンセンサスモチーフを包含する。
従って、本発明の、REIC/Dkk-3タンパク質（REICタンパク質）の部分領域からなるポリペプチドはREIC/Dkk-3タンパク質の部分領域からなる、Tctex-1タンパク質に結合し得るポリペプチドであって、配列番号１７に表されるアミノ酸配列からなる、REIC/Dkk-3タンパク質の部分領域からなるポリペプチドを包含する。
さらに、上記のEXGRRXH（配列番号１８）で表されるコンセンサスモチーフの配列を含む、７〜２２残基のアミノ酸からなるポリペプチドを包含する。該ポリペプチドは、例えば、配列番号１７に表されるアミノ酸配列の中の連続する７〜２２残基のアミノ酸からなるポリペプチであって、第４番目のGluから第１０番目のHisの７アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含むポリペプチドである。この場合、５番目のGlu及び９番目のSerは他の任意の天然アミノ酸に置換されていてもよい。
本発明のREIC/Dkk-3タンパク質の部分領域ポリペプチドは、上記のアミノ酸配列、すなわち配列番号３、配列番号５、配列番号７若しくは配列番号９に表されるアミノ酸配列、又はREIC/Dkk-3タンパク質のシグナル配列部分を除いた部分の第184番目のGlyから第267番目のPheからなる部分領域を含み、かつ第114番目のSerから第329番目のIleからなる部分領域の断片からなるポリペプチドのアミノ酸配列あるいは該アミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、樹状細胞様細胞分化誘導活性を有するポリペプチドである。また、本発明のREIC/Dkk-3タンパク質の部分領域ポリペプチドは、配列番号１７に表されるアミノ酸配列あるいは該アミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、Tctex-1タンパク質への結合活性を有するポリペプチドである。ここで、実質的に同一のアミノ酸配列としては、当該アミノ酸配列に対して1又は複数若しくは数個(1〜10個、好ましくは1〜5個、さらに好ましくは1個若しくは2個)のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と、BLAST（Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information（米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール））等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータを用いて）を用いて計算したときに、少なくとも85％以上、好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは97％以上の同一性を有しているものが挙げられる。
本発明のポリペプチドは、単球から樹状細胞様細胞を分化誘導する活性を有し、さらに、CTL細胞、NK細胞、ヘルパーT細胞等の免疫活性化細胞を分化誘導する活性を有する、さらにMDSC細胞やTreg細胞を分化抑制する活性も有する。本発明のポリペプチドはこれらの細胞分化誘導活性や抑制活性を有するため、免疫抑制系を阻害し得る。従って本発明のポリペプチドを抗がん免疫賦活剤、抗がん剤、抗腫瘍剤、免疫細胞分化誘導・抑制剤として利用することができる。
本発明のREIC/Dkk-3タンパク質の部分領域ポリペプチドをコードするDNAは、配列番号４、配列番号６、配列番号８若しくは配列番号１０に表される塩基配列、配列番号８に表される塩基配列の４番目のgから６９番目のgからなる塩基配列、又は配列番号１に示す塩基配列の第613番目のgから第864番目のcからなる部分配列を含み、かつ配列番号１に示す塩基配列の第403番目のtから第1050番目のtからなる部分配列の断片からなる塩基配列に相補的な塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA、配列番号４、配列番号６、配列番号８若しくは配列番号１０、配列番号８に表される塩基配列の４番目のgから６９番目のgからなる塩基配列、又は配列番号１に示す塩基配列の第613番目のgから第864番目のcからなる部分配列を含み、かつ配列番号１に示す塩基配列の第403番目のtから第1050番目のtからなる部分配列の断片からなる塩基配列に表される塩基配列と、BLAST（Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information（米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール））等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータを用いて）を用いて計算したときに、少なくとも85％以上、好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは97％以上の同一性を有しているDNA、又は前記DNAによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列に対して1又は複数若しくは数個(1〜10個、好ましくは1〜5個、さらに好ましくは1個若しくは2個)のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNAなどのうち、単球からの樹状細胞様細胞分化誘導活性；CTL細胞、NK細胞、ヘルパーT細胞等の免疫活性化細胞分化誘導活性；MDSC細胞やTreg細胞の分化抑制活性を有するタンパクをコードするものである。
REIC/Dkk-3タンパク質の部分領域ポリペプチドは、上記の配列情報に基づいて、化学合成により得ることができる。また、遺伝子工学的手法により組換えポリペプチドとして得ることができる。すなわち、本発明のREIC/Dkk-3タンパク質の部分領域ポリペプチドをコードするDNAを適当なベクターに導入し、該ベクターを宿主中に挿入し、該宿主を培養し、培養物からポリペプチドを得ればよい。本発明のDNAを挿入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミドDNA、ファージDNA等が挙げられ、公知のものを用いることができる。この際、宿主としては真核細胞又は原核細胞系を使用することができる。真核細胞としては、例えば樹立されたヒト、げっ歯類などの哺乳類細胞系、昆虫細胞系、真糸状菌細胞及び酵母細胞などの動物細胞等が挙げられ、原核細胞としては、例えば大腸菌細胞等の細菌細胞が挙げられる。本発明のREIC/Dkk-3タンパク質の部分領域ポリペプチドをコードするDNAを含む宿主細胞をin vitro又はin vivoで培養して該宿主を公知の方法で培養することにより、培養物からREIC/Dkk-3タンパク質の部分領域ポリペプチドを得ることができる。ここで、「培養物」とは、培養上清、あるいは培養細胞若しくは培養菌体又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味する。発現、産生されたポリペプチドは、前記培養物から精製することができる。精製は、通常のタンパク質で使用されている精製方法を用いればよく、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル濾過、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせることにより精製することができる。さらに、本発明のREIC/Dkk-3タンパク質の部分領域ポリペプチドはWO01/038523号公報の記載に従って得ることも可能である。
本発明のREIC/Dkk-3タンパク質の部分領域ポリペプチドのうち、特にREIC/Dkk-3タンパク質の部分領域[Gly 184-Phe 267]は、室温から３７℃程度の高温で保存しても分解を受けることなく安定である。また、PEG等の各種試薬に対しても安定である。
本発明は上記のREIC/Dkk-3タンパク質の部分領域ポリペプチドをコードするDNAを含むベクターをも包含する。該ベクターを被験体に導入することにより、被験体体内でREIC/Dkk-3タンパク質の部分領域ポリペプチドが発現し、被験体体内で生理活性を発揮し得る。
REIC/Dkk-3タンパク質の部分領域ポリペプチドは、がん細胞においてアポトーシスを誘導する。
遺伝子治療における目的の遺伝子（DNA)の被験体への導入は公知の方法により行うことができる。遺伝子を被験体へ導入する方法として、ウイルスベクターを用いる方法及び非ウイルスベクターを用いる方法があり、種々の方法が公知である(別冊実験医学、遺伝子治療の基礎技術、羊土社、1996；別冊実験医学、遺伝子導入&発現解析実験法、羊土社、1997；日本遺伝子治療学会編、遺伝子治療開発研究ハンドブック、エヌ・ティー・エス、1999)。
遺伝子導入のためのウイルスベクターとしては、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス等のウイルスベクターを用いた方法が代表的なものである。無毒化したレトロウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス、センダイウイルス、SV40、免疫不全症ウイルス(HIV)等のDNAウイルス又はRNAウイルスに目的とする遺伝子を導入し、細胞に組換えウイルスを感染させることによって、細胞内に遺伝子を導入することが可能である。
本発明に係る遺伝子を,ウイルスを用いた遺伝子治療に使用するとき、アデノウイルスベクターが好ましく用いられる。アデノウイルスベクターの特徴として、（１）多くの種類の細胞に遺伝子導入ができる、（２）増殖停止期の細胞に対しても効率よく遺伝子導入ができる、（３）遠心により濃縮が可能であり、高タイター（10〜11PFU/ml以上）のウイルスが得られる、（４）in vivoの組織細胞への直接の遺伝子導入に適している、という点が挙げられる。遺伝子治療用のアデノウイルスとしては、E1/E3領域を欠失させた第１世代のアデノウイルスベクター(Miyake,S.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,93,1320,1996)から、E1/E3領域に加え、E2若しくはE4領域を欠失させた第２世代のアデノウイルスベクター(Lieber,A.,et al.,J.Virol.,70,8944,1996;Mizuguchi,H.&Kay,M.A.,Hum.Gene Ther.,10,2013,1999)、アデノウイルスゲノムをほぼ完全に欠失させた(GUTLESS)第３世代のアデノウイルスベクター(Steinwaerder,D.S.,et al.,J.Virol.,73,9303,1999)が開発されているが、本発明に係る遺伝子を導入するには、特に限定されずいずれのアデノウイルスベクターでも使用可能である。さらに、AAVの染色体に組み込み能を付与したアデノ-AAVハイブリッドベクター(Recchia,A.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,96,2615,1999)や、トランスポゾンの遺伝子を用いることにより染色体に組み込む能力を有したアデノウイルスベクターなどを利用すれば、長期的な遺伝子発現にも応用が可能である。また、アデノウイルスファイバーのH1ループに組織特異的な移行性を示すペプチド配列を挿入することにより、アデノウイルスベクターに組織特異性を付与することも可能である(Mizuguchi,H.&Hayakawa,T.,Nippon Rinsho,7,1544,2000)。
また、上記ウイルスを用いることなく、プラスミドベクター等の遺伝子発現ベクターが組み込まれた組換え発現ベクターを用いて、目的遺伝子を細胞や組織に導入することができる。例えば、リポフェクション法、リン酸-カルシウム共沈法、DEAE-デキストラン法、微小ガラス管を用いたDNAの直接注入法などにより細胞内へ遺伝子を導入することができる。また、内包型リポソーム(internal liposome)による遺伝子導入法、静電気型リポソーム(electorostatic type liposome)による遺伝子導入法、HVJ-リポソーム法、改良型HVJ-リポソーム法(HVJ-AVEリポソーム法)、HVJ-E(エンベロープ)ベクターを用いた方法、レセプター介在性遺伝子導入法、パーティクル銃で担体(金属粒子)とともにDNA分子を細胞に移入する方法、naked-DNAの直接導入法、種々のポリマーによる導入法等によっても、組換え発現ベクターを細胞内に取り込ませることが可能である。この場合に用いる発現ベクターとしては、生体内で目的遺伝子を発現させることのできるベクターであれば如何なる発現ベクターも用いることができるが、例えばpCAGGS（Gene 108, 193-200(1991)）や、pBK-CMV、pcDNA3、1、pZeoSV(インビトロゲン社、ストラタジーン社)、pVAX1などの発現ベクターが挙げられる。
REIC/Dkk-3タンパク質の部分領域ポリペプチドをコードするDNAを含むベクターは、適宜遺伝子を転写するためのプロモーターやエンハンサー、ポリAシグナル、遺伝子が導入された細胞の標識及び／又は選別のためのマーカー遺伝子等を含んでいてもよい。この際のプロモーターとしては、公知のプロモーターを用いることができる。
本発明のREIC/Dkk-3タンパク質の部分領域ポリペプチドをコードするDNAを含む遺伝子治療用医薬を被験体へ導入するには、遺伝子治療用医薬を直接体内に導入するin vivo法、及び、ヒトからある種の細胞を取り出して体外で遺伝子治療用医薬を該細胞に導入し、その細胞を体内に戻すex vivo法等を用いればよい(日経サイエンス、1994年4月号、20-45頁;月刊薬事、36(1), 23-48 (1994); 実験医学増刊、12(15)、(1994); 日本遺伝子治療学会編、遺伝子治療開発研究ハンドブック、エヌ・ティー・エス、1999)。
本発明のREIC/Dkk-3タンパク質の部分領域ポリペプチド、該ポリペプチドをコードするDNA及び該DNAを含むベクターは医薬や試薬として利用することができる。
本発明のREIC/Dkk-3タンパク質の部分領域ポリペプチド、該ポリペプチドをコードするDNA及び該DNAを含むベクターは、単球から樹状細胞様細胞を分化誘導することができ、抗癌免疫活性を高め、癌の治療に利用することが可能である。
本発明のREIC/Dkk-3タンパク質の部分領域ポリペプチド、該ポリペプチドをコードするDNA及び該DNAを含むベクターを、単球からの樹状細胞様細胞分化誘導剤、癌免疫活性化剤及び癌免疫活性化作用を有する、癌の治療又は予防のための医薬組成物として用いることができる。ここで、単球からの樹状細胞様細胞分化誘導活性とは、単球に作用して樹状細胞様細胞に分化させる活性をいう。REIC/Dkk-3タンパク質の部分領域ポリペプチドの添加により樹状細胞様細胞が分化誘導されたか否かは、形態的特徴及び表面抗原により検出することができる。すなわち、この樹状細胞様細胞の特徴としては、形態学的に樹状突起を有するということと、さらにフローサイトメトリーによる解析により、表面抗原として、樹状細胞のマーカーであるCD11c、CD40、CD80、CD86、HLA-DRが陽性であることが挙げられる。
また、REIC/Dkk-3タンパク質の部分領域ポリペプチドをコードするDNAを含むベクターを被験体に導入することにより、被験体体内でREIC/Dkk-3タンパク質の部分領域ポリペプチドが発現し単球からの樹状細胞様細胞分化誘導効果、癌免疫活性化効果及び癌免疫活性化作用による癌の治療又は予防効果を発揮し得る。
単球は末梢血由来単球、骨髄由来単球、脾臓細胞由来単球、臍帯血由来単球が含まれ、この中でも末梢血由来の単球が好ましい。単球は、CD14陽性を特徴とし、生体から単球を採取し、REIC/Dkk-3タンパク質の部分領域ポリペプチドで樹状細胞様細胞に誘導させる場合、CD14の存在を指標にFACS（Fluorescent activated cell sorter）又はフローサイトメーター等により採取することができる。単球の由来動物種は限定されず、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、サル、ヒト等の哺乳動物を用いることができる。FACSによる特定の細胞集団の単離は公知の方法により行なえばよい。FACS、フローサイトメーターとしては例えばFACS vantage(ベクトン・ディッキンソン社製)、FACS Calibur(ベクトン・ディッキンソン社製)等を用いることができる。
単球の培養は、周知のヒトリンパ系細胞の培養技術により行なうことができる。培養液としては例えばRPMI1640やDMEMの公知の基本培地を用いればよい。これらの基本培地に適当な抗生物質や動物血清等を添加して培養すればよい。培養容器は限定されず、培養規模に応じて市販のプレート、ディッシュ、フラスコを適宜選択して用いることができる。
本発明は、in vitroで単球をREICタンパク質の存在下で培養し、単球を樹状細胞様細胞に分化誘導させる方法を含む。該方法においては、例えば単球を104〜107細胞/mlの濃度で用い、REIC/Dkk-3タンパク質の部分領域ポリペプチドを１〜20μg/mlの濃度で添加して培養すればよい。
樹状細胞は、生体内において、癌免疫、炎症などの機構に極めて重要な役割を果たしている。本発明の方法によりREIC/Dkk-3タンパク質により分化誘導された樹状細胞様細胞は、IL-4 + GM-CSFで誘導される樹状細胞に形態学的に似ているが、厳密には異なる新規な樹状細胞様細胞である。REIC/Dkk-3タンパク質の部分領域ポリペプチドにより誘導される樹状細胞様細胞は、樹状の形態を有している。また、樹状細胞のマーカーである、CD11c、CD40、CD80、CD86、HLA-DRが陽性である。この点、本発明の新規な樹状細胞様細胞は樹状細胞として分類することができる。しかしながら、樹状細胞のマーカーであるCD1aは陰性であり、一般的に樹状細胞では陰性化するとされるCD14は陽性である。
REIC/Dkk-3タンパク質の部分領域ポリペプチドの刺激によりCD14陽性単球から誘導される場合は、「REICタンパク質により活性化された、樹状細胞様に分化した細胞（REIC activated monocyte with dendritic cell features)」と呼ぶ。
本発明のREIC/Dkk-3タンパク質の部分領域ポリペプチドの樹状細胞様細胞を分化誘導する能力は、全長REIC/Dkk-3タンパク質よりも大きい。
本発明は、REIC/Dkk-3タンパク質の部分領域ポリペプチドによりCD14陽性単球から誘導された樹状細胞様細胞を包含する。
REIC/Dkk-3タンパク質の部分領域ポリペプチドに誘導され、得られた樹状細胞様細胞は、癌免疫療法に用いることができる。すなわち、被験体より単球を採取し、該単球をREIC/Dkk-3タンパク質の部分領域ポリペプチドと共に培養し、樹状細胞様細胞を誘導し、得られた樹状細胞様細胞を被験体に戻すことにより、樹状細胞様細胞自体を癌治療又は予防等に用いることができる。この際、REIC/Dkk-3タンパク質の部分領域ポリペプチドにより誘導された樹状細胞様細胞は、癌種非特異的に作用し、癌免疫治療効果を発揮し得るが、樹状細胞様細胞を誘導する際に癌種特異的な腫瘍抗原や自家の腫瘍ライセートを添加してもよい。また、誘導した樹状細胞様細胞を特定の腫瘍抗原や自家の腫瘍ライセートと共に培養してもよい。樹状細胞様細胞を癌種特異的な腫瘍抗原や自家の腫瘍ライセートで刺激することにより、腫瘍特異的に癌細胞を攻撃することが可能になる。
樹状細胞様細胞は、皮内投与、皮下投与、静脈内投与又はリンパ節内投与により投与することができる。
また、REIC/Dkk-3タンパク質の部分領域ポリペプチドは、細胞外から細胞に作用して細胞の分化を司るサイトカイン様作用を有すると考えられ、生体内において広く、免疫性、炎症性に関する機能を有すると考えられる。従って、REIC/Dkk-3タンパク質の部分領域ポリペプチド又はそれをコードするDNAを、被験体に投与し、in vivoでの樹状細胞様細胞分化誘導剤、又は樹状細胞様細胞活性化剤として用いることができる。REIC/Dkk-3タンパク質の部分領域ポリペプチドは被験体内で樹状細胞様細胞を誘導し、その結果、樹状細胞様細胞により被験体内で抗癌性をもつリンパ球が全身性に活性化され癌免疫作用を発揮する。従って、REIC/Dkk-3タンパク質の部分領域ポリペプチド又はそれをコードするDNAを癌免疫活性化剤として用いることができる。さらに、REIC/Dkk-3タンパク質の部分領域ポリペプチドにより誘導された樹状細胞様細胞は癌免疫作用を有しているので、REIC/Dkk-3タンパク質の部分領域ポリペプチド又はそれをコードするDNAを癌の治療又は予防のための医薬組成物（癌免疫治療剤）として用いることができる。この際、REIC/Dkk-3タンパク質の部分領域ポリペプチド又はそれをコードするDNAを単独で投与してもよく、この場合、癌種非特異的に効果を発揮する。あるいは、特定の腫瘍抗原と共に投与してもよい。この場合は、癌種特異的に効果を発揮し得る。
また、癌化の進む組織内では、REIC/Dkk-3タンパク質の濃度が低下しており、抗癌免疫活性が癌組織内では誘導されにくく、生体免疫が癌を見逃して（癌細胞の免疫学的寛容）、癌が増殖し、悪化すると考えられる。従って、本発明のREIC/Dkk-3タンパク質の部分領域ポリペプチドは、癌治療剤（抗癌剤、抗腫瘍剤）としてのみならず、抗癌免疫活性化による癌化・発癌予防剤としても有用であることを示している。また、癌免疫療法剤としても有用である。
さらに、REIC/Dkk-3タンパク質の部分領域ポリペプチド、該ポリペプチドをコードするDNA及び該DNAを含むベクターは、CTL（cytotoxic T lymphocyte;  細胞傷害性Tリンパ球）、NK（Natural killer)細胞、ヘルパーT細胞等の免疫活性化細胞を分化誘導する活性を有する、さらにMDSC(Myeloid derived suppressor cell:  骨髄球由来抑制細胞）やTreg細胞（制御性T細胞）の分化を抑制する活性も有する。本発明のポリペプチドは、抗癌免疫活性を高め、癌の治療に利用することが可能であり、癌の局所巣及び転移巣への抗癌効果を発揮し得る。具体的には、樹状細胞・ヘルパーT細胞・CTL・NK細胞に代表される免疫活性化細胞への分化誘導促進による抗がん剤・抗腫瘍剤・抗がん免疫活性化剤・全身免疫賦活化剤・免疫活性化細胞分化誘導剤、並びにMDSC、Tregに代表される免疫抑制系細胞の分化誘導阻害剤として用いることができる。
本発明の医薬の治療又は予防対象となる癌としては、脳・神経腫瘍、皮膚癌、胃癌、肺癌、肝癌、リンパ腫・白血病、結腸癌、膵癌、肛門・直腸癌、食道癌、子宮癌、乳癌、副腎癌、腎癌、腎盂尿管癌、膀胱癌、前立腺癌、尿道癌、陰茎癌、精巣癌、骨・骨肉腫、平滑筋腫、横紋筋腫、中皮腫等が挙げられる。特に、乳癌、膀胱癌が好ましい。
本発明の医薬は、REIC/Dkk-3タンパク質の部分領域ポリペプチドをコードするDNA、該DNAを含むベクター、若しくは該DNAがコードするポリペプチド並びに薬理学的に許容され得る担体、希釈剤若しくは賦形剤を含む。該癌の治療又は予防のための医薬、種々の形態で投与することができ、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等による経口投与、あるいは注射剤（皮下注、静注、筋注、腹腔内注など）、点滴剤、座薬、スプレー剤、点眼剤、経鼻投与剤、経皮投与剤、経粘膜投与剤、経肺投与剤、貼付剤などによる非経口投与を挙げることができる。
本発明の医薬は、注射等により全身投与してもよく、また、局所投与することも可能である。例えば、癌部位に注射により投与することによりその効果を発揮し得る。特にREIC/Dkk-3タンパク質の部分領域ポリペプチドをコードするDNAを含むベクターを局所投与した場合、癌部位でベクターによりペプチドが長期間にわたって生産され、効果を発揮し得る。
好ましくは、癌病変局所に１回又は複数回、癌病変全体に本剤が行き渡るように直接注入を行う。
本発明の医薬は、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤、賦形剤を含む。たとえば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、ステアリン酸マグネシウムなどが使用される。注射用の水性液としては、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが使用され、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、プロピレングリコールなどのポリアルコール、非イオン界面活性剤などと併用してもよい。油性液としては、ゴマ油、大豆油などが使用され、溶解補助剤としては安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。
その投与量は、症状、年齢、体重などによって異なるが、数日又は数週間又は数ヶ月おきに１回あたり、0.001mg〜100mgを皮下注射、筋肉注射、又は静脈注射によって投与すればよい。また、REIC/Dkk-3タンパク質の部分領域ポリペプチドをコードするDNAを含むベクターを用いる場合、例えば107〜109pfu(plaque forming unit)のベクターを投与すればよい。
本発明の医薬は、癌に罹患した癌患者であって抗癌剤治療等の既存の様々な治療に抵抗性が認められるようになった癌病変を持つ患者に対しても有効である。
本発明の医薬は、単剤投与でも癌細胞死・腫瘍縮小効果が認められる。さらに、本剤と抗癌剤との併用により抗癌作用が２重に誘導され強い腫瘍縮小効果が期待される。
さらに、本発明のREIC/Dkk-3タンパク質の部分領域ポリペプチド、該ポリペプチドをコードするDNA及び該DNAを含むベクターは抗癌免疫活性を有しているため、投与した癌局所のみならず、癌転移巣に対する治療効果や癌転移の予防に用いることもできる。
また、既存の種々の癌抗原タンパク質と本発明のREIC/Dkk-3タンパク質の部分領域ポリペプチド、該ポリペプチドをコードするDNA及び該DNAを含むベクターを同時に投与することにより、樹状（様）細胞などの分化誘導を介して抗癌免疫を系統的に活性化させ、発癌そのものを予防することも可能になる。
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【実施例１】
【０００６】
ヒトＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質の全長、並びに部分領域１［Ａｒｇ１２１−３２９］及び部分領域２［Ｇｌｙ１８４−Ｉｌｅ３２９］の調製
成熟体のＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質をコードする全長［Ａｌａ  １−Ｉｌｅ  ３２９］（サンプルＩ）（配列番号２の第２２番目のＡｌａから第３５０番目のＩｌｅ）、及びＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質の部分領域のＲＥＩＣ［Ａｒｇ  １２１−Ｉｌｅ  ３２９］（サンプルＩＩ）をコードするプラスミドＤＮＡを、大腸菌（Ｔ７  Ｅｘｐｒｅｓｓ株：ＮＥＢ社）に形質転換し、新鮮なコロニーを約１０個程度、１．６リットルの培養液中で大量培養し、対数増殖期の培養液（Ａ６００〜０．７）にＩＰＴＧを０．５ｍＭ添加することで、タンパク質の発現を誘導した。発現誘導条件下での培養は３７℃で３時間行い、遠心分離により菌体を回収した。この発現菌体を超音波破砕などを用いて溶菌後、遠心分離を行い、発現タンパク質は不溶性画分に回収した。不溶性画分に混入する菌体由来の核酸をできるだけ除去するため、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０と５ｍＭのＭｇＣｌ２を含むバッファー中に分散させた不溶性画分に１０ｕｎｉｔ／ｍＬのＢｅｎｚｏｎａｓｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を添加し、２５℃で３０分間インキュベートし、核酸の分解を促進した。その後、再度遠心分離を行うことでより高純度なＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質を含む不溶性画分を得た。次に、この沈殿を６Ｍ塩酸グアニジンを含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８）中でよく懸濁・溶解し、１００ｍＭの２−メルカプトエタノールを添加して３７℃で１時間インキュベートすることでタンパク質を完全に還元した。この時点でタンパク質濃度をブラッドフォード法でタンパク定量を行い、終濃度が０．２ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度となるようにリフォールディングバッファーに希釈し、２５℃で２４時間インキュベートした。リフォールディング時のバッファーは２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．４Ｍ塩酸グアニジン、３０％グリセロールを含み、還元タンパク質溶液に含まれリフォールディングバッファー中に持ち込まれる２−メルカプトエタノールの１／４モル量の酸化型グルタチオン（ナカライテスクス）を含む組成となるように予め調製した。この組成を用い、スターラーでよく攪拌しながら還元したタンパク質溶液を直ちに希釈した。この酸化還元条件下でリフォールディングを行った後は、陰イオン交換樹脂（ＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ６５０Ｍ、東ソー）を充てんしたカラムを用いてタンパク質を吸着させた後、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０バッファー中で、塩化ナトリウムの直線濃度勾配（０〜０．８Ｍ）により溶出を行うことで、塩化ナトリウム濃度が０．５Ｍ程度の条件で、ＲＥＩＣタンパク質のピーク画分を回収した。この時点において、全長ＲＥＩＣ［Ａｌａ  １−Ｉｌｅ  ３２９］（サンプルＩ）は分子間でジスルフィド（ＳＳ）結合が形成されたオリゴマーとして回収されたため、さらに３０ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）を添加して、３７℃で１時間インキュベートすることで、分子間のＳＳ結合のみを限定的に還元したモノマーとした。この限定還元反応後は、直ちにｐＨ６．０に調整したリン酸バッファー又はＭＥＳバッファーで平衡化した。Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５Ｍカラムクロマトグラフィー（ＧＥヘルスケア社）を用いてＤＴＴの除���と、ｐＨ６．０のバッファーへの置換を行うことで、４℃で数週間は安定に保管できるサンプルを回収した。この段階で得られたものがサンプルＩであり、必要に応じて分子量１０ｋＤａ以下の物質のみを透過させる限外濾過フィルターを用いて濃縮することができた。
上記の手順により、陰イオン交換クロマトグラフィーで部分領域のＲＥＩＣ［Ａｒｇ  １２１−Ｉｌｅ  ３２９］（サンプルＩＩ）を安定なモノマーとして単離した。更なる高純度精製を行うため、Ｒｅｓｏｕｒｃｅ−Ｑカラム（ＧＥヘルスケア社）等を用いた陰イオン交換ＨＰＬＣにより塩化ナトリウムの直線濃度勾配で溶出することで、高純度のＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質の部分領域ＲＥＩＣ［Ａｒｇ  １２１−Ｉｌｅ  ３２９］を精製することができた。これをｐＨ７．４のＰＢＳで平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５Ｍカラムクロマトグラフィーでバッファーを置換したものがサンプルＩＩであり、必要に応じて分子量１０ｋＤａ以下の物質のみを透過させる限外濾過フィルターを用いて濃縮することができた。
ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質の部分領域［Ｇｌｙ  １８４−Ｉｌｅ  ３２９］（サンプルＩＩＩ）をコードするタンパク質の調製については、発現用のプラスミドＤＮＡを大腸菌（Ｓｈｕｆｆｌｅ  Ｔ７  Ｅｘｐｒｅｓｓ株：ＮＥＢ社）に形質転換し、新鮮なコロニーを約１０個程度、０．８リットルの培養液中で大量培養し、対数増殖期の培養液（Ａ６００〜０．７）にＩＰＴＧを０．５ｍＭ添加することで、タンパク質の発現を誘導した。発現誘導条件下での培養は３０℃で１６時間行い、遠心分離により菌体を回収した。この発現菌体を超音波破砕などを用いて溶菌後、遠心分離を行い、発現タンパク質を可溶性画分に回収した。本実施例で用いたＲＥＩＣタンパク質［Ｇｌｙ  １８４−Ｉｌｅ  ３２９］にはＮ末端側にＨｉｓタグ配列が付加されているため、ＴＡＬＯＮ  Ｍｅｔａｌ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｒｅｓｉｎ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて、アフィニティー精製を行った。これを更なる高純度精製を行うため、Ｒｅｓｏｕｒｃｅ−Ｑカラム（ＧＥヘルスケア社）等を用いた陰イオン交換ＨＰＬＣにより精製し、ｐＨ７．４のＰＢＳで平衡化されたＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５Ｍカラムクロマトグラフィーでバッファーを置換したものがサンプルＩＩＩである。
アミノ酸配列から推定される分子量は、それぞれ全長ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質が３７．５ｋＤａ、ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質部分領域１［Ａｒｇ  １２１−Ｉｌｅ  ３２９］が２６．９ｋＤａ、ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質部分領域２［Ｇｌｙ  １８４−Ｉｌｅ  ３２９］が１９．７ｋＤａであり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析でほぼ推定通りの分子量にシングルバンドとして泳動されることを確認した。
全長ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質のアミノ酸配列を配列番号２に、ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質部分領域１［Ａｒｇ  １２１−Ｉｌｅ  ３２９］のアミノ酸配列を配列番号５に、ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質部分領域２［Ｇｌｙ  １８４−Ｉｌｅ  ３２９］のアミノ酸配列を配列番号３に示す。さらに、これらに付加したＨｉｓタグを含む配列を配列番号１１に示す。なお、ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質部分領域１［Ａｒｇ  １２１−Ｉｌｅ  ３２９］のアミノ酸配列は、配列番号２に示すアミノ酸配列の第１４２番目から３５０番目のアミノ酸に相当する。
図１に、ヒトＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質の全長、並びに部分領域１［Ａｒｇ１２１−３２９］及び部分領域２［Ｇｌｙ１８４−Ｉｌｅ３２９］の調製方法をまとめた図を示す。
【実施例２】
【０００７】
末梢血単核球からの樹状細胞様分化誘導
ヒト単球の調製
ヒトＰＢＭＣ（末梢血単球）は健康なドナーの血液からＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ遠心分離を用いた標準的方法で行った。細胞の回収率をトリパンブルー排除法で計測し、９９％以上の生存率であることを確認した。単球の調製のために、ＰＢＭＣをＬＧＭ−３培地（リンパ球増殖培地−３、血清非含有、Ｌｏｎｚａ）に再懸濁し、プラスチックに付着した細胞（２時間、３７℃、１０ｃｍディッシュでインキュベート）を単球として使用した。いくつかの実験では、ＣＤ１４＋単球をＣＤ１４＋磁気活性化セルソーティングマイクロビーズ（ＭＡＣＳ；ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）を用いて分離した。精製したＣＤ１４＋単球をＬＧＭ−３培地に再懸濁した。フローサイトメトリーによると、純度は常に、９５％より高かった。
ヒト単球の処理
ＰＢＭＣは単独（添加無し）、ＧＭ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）＋ＩＬ−４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）（それぞれ、２ｎｇ／ｍｌ）、又は実施例１で調製したヒトＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質の全長、部分領域１［Ａｒｇ  １２１−Ｉｌｅ  ３２９］若しくは部分領域２［Ｇｌｙ  １８４−Ｉｌｅ  ３２９］（１０μｇ／ｍｌ）の存在下で培養した。細胞は位相差顕微鏡で観察した。
図２に単独（添加なし）、ＧＭ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）＋ＩＬ−４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）（それぞれ、２ｎｇ／ｍｌ）、又は実施例１で調製したヒトＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質の全長、部分領域１［Ａｒｇ  １２１−Ｉｌｅ  ３２９］若しくは部分領域２［Ｇｌｙ  １８４−Ｉｌｅ  ３２９］（１０μｇ／ｍｌ）の存在下で培養したＰＢＭＣにおける、培養７日目の樹状細胞様分化誘導の結果を示す。図２Ａが添加なし、図２ＢがＧＭ−ＣＳＦ＋ＩＬ−４を添加した場合、図２Ｃが全長ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質を添加した場合、図２ＤがＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質部分領域１［Ａｒｇ  １２１−Ｉｌｅ  ３２９］を添加した場合、図２ＥがＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質部分領域２［Ｇｌｙ１８４−Ｉｌｅ３２９」を添加した場合の結果を示す。図２は、位相差顕微鏡像の弱拡大像を示す。
形態学的な観察から、ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質部分領域２［Ｇｌｙ  １８４−Ｉｌｅ  ３２９］において、最も強い、末梢血単核球からの樹状細胞様細胞の分化誘導の活性が認められた。
図３に単独（添加なし）、ＧＭ−ＣＳＦ＋ＩＬ−４を添加した場合、及びＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質部分領域２［Ｇｌｙ  １８４−Ｉｌｅ  ３２９］を添加した場合の分化誘導の比較を示す。図３Ａが添加無し、図３ＢがＧＭ−ＣＳＦ＋ＩＬ−４を添加した場合、図３ＣがＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質部分領域２［Ｇｌｙ  １８４−Ｉｌｅ  ３２９］を添加した場合の結果を示す。図３は、位相差顕微鏡像の強拡大像を示す。
ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質部分領域２において、末梢血単核球から分化誘導される樹状細胞様細胞は、ＩＬ−４＋ＧＭ−ＣＳＦで誘導される樹状細胞よりも形態学的に小さい。一方、全長ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質及びＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質部分領域１［Ａｒｇ１２１−Ｉｌｅ３２９］において誘導される樹状細胞様細胞と、ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質部分領域２において誘導される樹状細胞様細胞との間に、形態学的な差は認められなかった。
図４に単独（添加なし）、ＧＭ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）＋ＩＬ−４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）（それぞれ、２ｎｇ／ｍｌ）、又はヒトＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質の全長、部分領域１［Ａｒｇ  １２１−Ｉｌｅ  ３２９］若しくは部分領域２［Ｇｌｙ  １８４−Ｉｌｅ  ３２９］（１０μｇ／ｍｌ）を添加した場合の樹状細胞様細胞の出現頻度を示す。７日目に、用手的に攪拌し３分後に、弱拡大写真の倍率でランダムに一視野あたりの樹状細胞様細胞の数をカウントして、グラフ化した（ｎ＝５視野）。形態学的な観察から、ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質部分領域２［Ｇｌｙ  １８４−Ｉｌｅ  ３２９］において、最も強い末梢血単核球からの樹状細胞様細胞の分化誘導の活性が認められ、全長ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質を添加した場合及び部分領域１［Ａｒｇ  １２１−Ｉｌｅ  ３２９］を添加した場合に比べ、非常に強い活性が認められ、さらに、ＧＭ−ＣＳＦ＋ＩＬ−４を添加した場合に比べても、強い活性が認められた。
【実施例３】
【０００８】
ヒトＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質の部分領域３［Ｓｅｒ１１４−Ｐｈｅ２６７］の調製
タンパク質生産用の宿主細胞として、対数増殖期にあるヒト腎臓由来細胞ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３−Ｆ  ｃｅｌｌｓ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を５〜６×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度で５００ｍＬフラスコに１８０ｍＬ幡種したフラスコを５本分準備し、３７℃、８％ＣＯ２存在下にてＦｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉａ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて一晩振とう培養（１２５ｒｐｍ）した。翌日、１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度に調整し、５００ｍＬフラスコに１８０ｍＬ幡種した２９３−Ｆ  ｃｅｌｌへ全長ＲＥＩＣ［Ａｌａ１−Ｉｌｅ３２９］をコードする遺伝子高発現プラスミド（下記）各１８０μｇを２９３  Ｆｅｃｔｉｎ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）と混合しｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎした。Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ後４日間、３７℃、８％ＣＯ２存在下にて振とう培養し、培養上清を回収した。
回収した培養上清は限外濾過により濃縮し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５Ｍカラムクロマトグラフィー（ＧＥヘルスケア社）を用いて溶媒を２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．２）へ置換し、ＲＥＩＣタンパク質含有画分を回収した。その後、陰イオン交換カラムクロマトグラフィー（ＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ６５０Ｍ，東ソー）を用いて、タンパク質を吸着させた後、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．２）中で、塩化ナトリウムの直線濃度勾配（０〜０．７Ｍ）により溶出を行い、塩化ナトリウム濃度が０．３５Ｍ程度の条件で、ＲＥＩＣタンパク質のピーク画分が確認された。そのピーク画分よりＲＥＩＣタンパク質がより多く、かつ、より高純度に含まれる画分よりＲＥＩＣタンパク質を回収した。
この全長ＲＥＩＣ［Ａｌａ１−Ｉｌｅ３２９］タンパク質をｐＨ７．４のＰＢＳで平衡化されたＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５Ｍカラムクロマトグラフィーを用いてバッファーをＰＢＳに置換後、３７℃若しくは室温で５日間インキュベートすることによりＲＥＩＣの部分領域［Ｓｅｒ  １１４−Ｐｈｅ  ２６７］をコードするタンパク質に限定分解した。このＲＥＩＣの部分領域［Ｓｅｒ  １１４−Ｐｈｅ  ２６７］を含むタンパク質溶液をＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５Ｍカラムクロマトグラフィー（ＧＥヘルスケア社）を用いて溶媒を２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．２）へ置換し、ＲＥＩＣタンパク質含有画分を回収した。その後、陰イオン交換カラムクロマトグラフィー（ＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ６５０Ｍ，東ソー）を用いて、タンパク質を吸着させた後、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．２）中で、塩化ナトリウムの直線濃度勾配（０〜０．６Ｍ）により溶出を行い、塩化ナトリウム濃度が０．３Ｍ程度の条件で、ＲＥＩＣの部分領域［Ｓｅｒ  １１４−Ｐｈｅ  ２６７］タンパク質のピーク画分が確認された。そのピーク画分よりＲＥＩＣの部分領域［Ｓｅｒ  １１４−Ｐｈｅ  ２６７］タンパク質を回収したものがサンプルＩＶであり、必要に応じて分子量１０ｋＤａ以下の物質のみを透過させる限外濾過フィルターを用いて濃縮した。
図５−１に調製のプロトコールを示す。また、図５−２に第１回目の陰イオン交換クロマトグラフィー精製チャート（図５−１の（３）の陰イオン交換クロマトグラフィー）を示し、図５−３に第２回目の陰イオン交換クロマトグラフィー（図５−１の（４）の陰イオン交換クロマトグラフィー）精製チャートを示す。
本実施例で用いた遺伝子高発現プラスミドは特定の構造を有する発現カセットを含むプラスミドであり、遺伝子発現による発現させようとする目的タンパク質の超高発現による大量生産を可能にする。該発現用カセットは、少なくとも第１のプロモーターの下流に、発現させようとするタンパク質の遺伝子（発現させようとする遺伝子）及びポリＡ付加配列を含むＤＮＡ構築物を含み、さらに該構築物の下流にエンハンサー又は第２のプロモーターが連結して含まれる構造を有する。発現用カセットの最下流には上記のエンハンサー又は第２のプロモーターが存在し、その下流には他の遺伝子発現用の機構を有しない。すなわち、本発明の発現用カセットは、少なくとも発現させようとする遺伝子を第１のプロモーター１つとエンハンサー少なくとも１つで挟むか、又は第１のプロモーター１つと第２のプロモーター１つで挟んだ構造を有する。ここで、他の遺伝子発現用の機構とは、上記の発現させようとする遺伝子以外の遺伝子を発現させるための機構をいう。プロモーターとしてはＣＭＶ  ｉプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ｈＴＥＲＴプロモーター、βアクチンプロモーター又はＣＡＧプロモーターを用いることができ、エンハンサーとしてはＣＭＶエンハンサー、ＳＶ４０エンハンサー又はｈＴＥＲＴエンハンサーを用いることができる。また、プロモーターの下流に発現させようとするタンパク質をコードするＤＮＡ及びポリＡ付加配列を含むＤＮＡ構築物の上流に１〜４個のＣＭＶエンハンサーが連結されていてもよい。さらに、（ｉ）外来タンパク質をコードするＤＮＡの直ぐ上流に連結されたＲＵ５’、（ｉｉ）エンハンサー及び／又はプロモーターの直ぐ上流に連結されたＵＡＳ、又は（ｉｉｉ）発現用カセットの最上流に連結されたＳＶ４０−ｏｒｉを含んでいてもよい。用いたプラスミドが含む発現カセットのコンストラクトを図９に示す。
【実施例４】
【０００９】
ヒトＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質の部分領域３［Ｓｅｒ１１４−Ｐｈｅ２６７］による末梢血単核球からの樹状細胞様分化誘導
実施例２に記載の方法で、ヒトＰＢＭＣ（末梢血単球）を調製し、単独（添加無し）、実施例１で調製したヒトＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質の全長及び部分領域１［Ａｒｇ  １２１−Ｉｌｅ  ３２９］、並びに実施例３で調製した部分領域３［Ｓｅｒ１１４−Ｐｈｅ２６７］（１０μｇ／ｍｌ）の存在下で培養した。細胞は位相差顕微鏡で観察した。
図６に単独（添加なし）、実施例１で調製したヒトＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質の全長、及び実施例３で調製した部分領域３［Ｓｅｒ１１４−Ｐｈｅ２６７］（１０μｇ／ｍｌ）の存在下で培養したＰＢＭＣにおける、培養７日目の樹状細胞様分化誘導の結果を示す。図６Ａが添加なし、図６Ｂが全長ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質を添加した場合、図６ＣがＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質部分領域３［Ｓｅｒ１１４−Ｐｈｅ２６７］を添加した場合の結果を示す。図６は、位相差顕微鏡像の弱拡大像を示す。形態学的な観察から、ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３部分領域３は、全長、部分領域１と比較した場合に、同等又はそれ以上の末梢血単核球からの樹状細胞様細胞の分化誘導の活性が認められた。図７に強拡大像を示す。図７に示すように、ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３部分領域３において末梢血単核球から分化誘導される樹状細胞様細胞は、部分領域１のそれと形態学的な差は認められなかった。
【実施例５】
【００１０】
ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３部分領域３の安定性
３７℃又は室温（約２０℃）で５日間インキュベート後のサンプル１８μＬをＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分離し、ＣＢＢ染色によって分子量約１７ｋＤａのＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３の部分領域３をコードするタンパク質を検出した。この際、室温（約２０℃）又は３７℃で５日間放置し、さらにＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施し分解パターンを確認した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図８に示す。タンパク質の保存条件としては高温であるにも関わらず、部分領域３はＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離後、約１７ｋＤａのバンドとしてＣＢＢ染色で検出された。
また、部分領域３のタンパク質溶液は、各種ＰＥＧ、硫化アンモニウム・硫化リチウム等の塩・２−ｍｅｔｈｙｌ−２，４−ｐｅｎｔａｎｄｉｏｌ（ＭＰＤ）・エタノール・２−ｐｒｏｐａｎｏｌ等アルコール類の投入・混合に対し凝集・沈殿などの反応を示さないことが分かった。よって部分領域３の安定性は十分に高いことが判明した。
【実施例６】
【００１１】
ｉｎ  ｖｉｖｏ実験によるＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質の部分領域３［Ｓｅｒ  １１４−Ｐｈｅ  ２６７］の腫瘍抑制効果の検定
ＲＥＮＣａ細胞（１×１０６）をマウス（ＢＡＬＢ／ｃ、メス、ｎ＝５）の皮下に注射した。注入後３、５、７、１０、１２及び１４日目（注入後３日目を全長ＲＥＩＣタンパク質及び部分領域３の投与開始とする）に全長ＲＥＩＣタンパク質（１００μｇ（１００μｌ））又は部分領域３（１００μｇ（１００μｌ））又はコントロールとしてＰＢＳ（１００μｌ）を、マウス腹腔に注入した。１７日目に皮下腫瘍における治療効果を判定し、抗癌免疫活性の測定（実施例７）を行ってマウスを安楽死処置した。ｉｎ  ｖｉｖｏ実験のプロトコールを図１０に示す。腫瘍体積は、０．５２×（最小直径）２×（最大直径）により求めた。
図１１Ａに治療後の腫瘍体積の経時的変化を示す。全長ＲＥＩＣタンパク質、部分領域３を投与した治療群の腫瘍体積と、コントロールであるＰＢＳを投与した群のそれとを比較したところ、統計学的に有意に小さいことが判った（＊にて示す）。図１１Ｂにマウスから採取した腫瘍の重量を示す。全長ＲＥＩＣタンパク質、部分領域３を投与した治療群の腫瘍重量と、ＰＢＳを投与した群のそれとを比較したところ、統計学的に有意に小さいことが判った（＊にて示す）。図１１Ｃにマウスから採取した腫瘍の写真を示す。図１１Ａ〜図１１Ｃに示すように全長ＲＥＩＣタンパク質及び部分領域３の投与により腫瘍増殖を抑制することができた。
【実施例７】
【００１２】
実施例６のマウス静脈血中の免疫担当細胞のフローサイトメトリー
実施例６で得たマウスの静脈血に存在する免疫担当細胞の変動をフローサイトメトリーで解析した。下大静脈より採血したマウスの血液７５０μｌに、０．２％ＥＤＴＡ溶液を３０μｌ加え抗凝固処理した。３０μｌの血液に、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社より購入した異なる蛍光標識のなされた以下のそれぞれの抗体１μｌを加え撹拌し、４℃で６０分間インキュベートすることにより、下記に示す免疫担当細胞の染色を行った。
骨髄由来免疫抑制細胞（抗ＧＲ−１抗体，抗ＣＤ１１ｂ抗体）
樹状細胞（抗ＣＤ１１抗体）
活性型樹状細胞（ＣＤ１１ｃ＋／ＣＤ８０＋）（抗ＣＤ１１ｃ抗体，抗ＣＤ８０抗体）
活性型樹状細胞（ＣＤ１１ｃ＋／ＣＤ８６＋）（抗ＣＤ１１ｃ抗体，抗ＣＤ８６抗体）
ヘルパーＴ細胞（抗ＣＤ４抗体）
免疫制御性Ｔ細胞（抗ＣＤ４抗体、抗Ｆｏｘｐ３抗体）
細胞傷害性Ｔ細胞（抗ＣＤ８抗体）
活性型細胞傷害性Ｔ細胞（抗ＣＤ６９抗体、抗ＣＤ８抗体）
ＮＫ細胞（抗ＣＤ３ｅ抗体，抗ＮＫ１．１抗体）
その後、赤血球ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒで赤血球を溶解処理し、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳ２００μｌに再懸濁して解析する細胞液とした。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて３×１０４個の細胞を採取し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて分析した。これらの細胞の特徴的なｆｏｒｗａｒｄ  ｓｃａｔｔｅｒパターンに基づいて適当なゲートを設定し、ゲート内の細胞のみを分析した。結果、全長ＲＥＩＣタンパク質及び部分領域３では、殆ど全ての免疫賦活化細胞で分化誘導活性が認められた（図１２Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ）。一方、免疫抑制系細胞の分化誘導抑制が観察された（図１２Ａ、Ｆ）。特に部分領域３は細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の分化誘導に優れており（図１２Ｇ、Ｈ）、また免疫制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に対する強力な分化抑制が観察された（図１２Ｆ）。以上から、部分領域３を含むタンパク質は、抗がん免疫賦活剤、抗がん剤、抗腫瘍剤、免疫細胞分化誘導・抑制剤として応用可能であり、部分領域３を含む全長ＲＥＩＣタンパク質も同様に応用可能であると判断できる。
【実施例８】
【００１３】
腎細胞がんモデルマウスを用いた全長ＲＥＩＣタンパク質の抗腫瘍効果に関する実験
マウス腎細胞がん細胞ＲＥＮＣＡ−Ｌｕｃ細胞株は、ＲＥＮＣＡ細胞株にＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ遺伝子を安定発現させることにより作製した。ｉｎ  ｖｉｖｏ実験によるＲＥＩＣタンパク質の腫瘍抑制効果について検討するため、このＲＥＮＣＡ−Ｌｕｃ細胞株を用いて腎細胞がんモデルマウスを作製した。同所性の腫瘍を作製するために、雄のＢＡＬＢ／Ｃマウスをネンブタールで麻酔後、ＲＥＮＣＡ−Ｌｕｃ細胞（１０３ｃｅｌｌｓ）を左腎に局所注入した。その後直ちに、１０４ｃｅｌｌｓを尾静脈より注入し、肺転移病巣を持った腎細胞がんマウスモデルとした（Ｄａｙ０）。コントロール群・治療群に下記の処置を行った。
Ａ：ＰＢＳ（１００μｌ）を連日（１３日間）で計１３回腹腔内投与
Ｂ：ＲＥＩＣタンパク質（１０μｇ／１００μｌ  ＰＢＳ）を連日（１３日間）で計１３回腹腔内投与
Ｃ：ＲＥＩＣタンパク質（１００μｇ／１００μｌ  ＰＢＳ）を連日（１３日間）で計１３回腹腔内投与
投与開始後１４日目（Ｄａｙ１４）にマウスを安楽死させ、摘出した腫瘍の腫瘍サイズ、重量を解析した。図１４Ａに示すとおり、無処置及びバッファー投与群に対してＲＥＩＣタンパク質投与群は、腫瘍の縮小が認められた。この腫瘍縮小効果は、ＲＥＩＣタンパク質の投与量に応じ顕著になることが示唆された（図１４Ｂ）。また肺転移巣でも同様に腫瘍の縮小が認められた（図１５Ａ、Ｂ）。
【実施例９】
【００１４】
マウスの骨髄細胞を用いた分化誘導実験
無処置の正常マウスから骨髄を採取し、パイペッティングにより懸濁し、平底６ウェルプレートにてマウス骨髄細胞の培養を行った。翌日、ＰＢＳにより２回洗浄し、付着した細胞を実験に用いた。ＧＭ−ＣＳＦ（２０ｎｇ／ｍｌ，Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社より購入）単独、又は全長ＲＥＩＣタンパク質（１０μｇ／ｍｌ）を添加することにより、骨髄由来免疫抑制細胞（ＭＤＳＣ）へのＲＥＩＣタンパク質による分化誘導抑制効果を解析した。マウス骨髄細胞培養開始後６日目に、トリプシン処理により細胞を回収し、ＭＤＳＣの表面抗原マーカーＧＲ−１，ＣＤ１１ｂに対する抗体を用いて細胞の染色を行った。３×１０４個の細胞を、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて解析した。無処置の場合は、ＭＤＳＣの割合は２．５６％であるのに対し、ＧＭ−ＣＳＦを投与した場合は、ＭＤＳＣの割合が５３．０４％に増加した（図１６Ａ、Ｂ）。これはＧＭ−ＣＳＦによりＭＤＳＣの分化誘導が亢進し、免疫活性能が抑制されることを意味する。ＧＭ−ＣＳＦと全長ＲＥＩＣタンパク質の両者を混合した場合、ＭＤＳＣの分化誘導はＧＭ−ＣＳＦ単独の場合よりも低率（３４．７１％）であった。この結果は、ＲＥＩＣタンパク質はＭＤＳＣ細胞の分化誘導に対し抑制的に作用し、免疫活性化能を発揮することを意味する。
【実施例１０】
【００１５】
実施例８のマウス静脈血中の免疫担当細胞のフローサイトメトリー
実施例８で得たマウスの静脈血中の免疫担当細胞の割合をフローサイトメトリーで解析した。実施例７と同様、下大静脈より採血したマウスの末梢血７５０μｌに、０．２％ＥＤＴＡ溶液を３０μｌ加え抗凝固処理した。３０μｌの血液に、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社より購入した異なる蛍光標識のなされた以下のそれぞれの抗体１μｌを加え撹拌し、４℃で６０分間インキュベートすることにより、下記に示すそれぞれの免疫担当細胞の染色を行った。
骨髄由来免疫抑制細胞（抗ＧＲ−１抗体，抗ＣＤ１１ｂ抗体）
活性型樹状細胞（ＣＤ１１ｃ＋／ＣＤ８０＋）（抗ＣＤ１１ｃ抗体，抗ＣＤ８０抗体）
免疫制御性Ｔ細胞（抗ＣＤ４抗体、抗Ｆｏｘｐ３抗体）
活性型細胞傷害性Ｔ細胞（抗ＣＤ６９抗体、抗ＣＤ８抗体）
ＮＫ細胞（抗ＣＤ３抗体，抗ＮＫ１．１抗体）
その後、赤血球ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒで赤血球を溶解処理し、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳ２００μｌに再懸濁して解析する細胞液とした。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて３×１０４個の細胞を採取し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて分析した。これらの細胞の特徴的なｆｏｒｗａｒｄ  ｓｃａｔｔｅｒパターンに基づいて適当なゲートを設定し、ゲート内の細胞のみを分析した。結果を図１７Ａ〜Ｅに示す。樹状細胞（図１７Ｂ−１及びＢ−２）・活性化細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ・図１７Ｄ−１及びＤ−２）・ＮＫ細胞（図１７Ｅ−１及びＥ−２）は、ＲＥＩＣタンパク質の投与量に応じて陽性率が高まることが分かった。これらの免疫担当細胞は、いずれも免疫活性に促進的に機能する。さらに、免疫系に対し抑制的に働くＭＤＳＣ（図１７Ａ−１及びＡ−２）、Ｔｒｅｇ（図１７Ｃ−１及びＣ−２）は、ＲＥＩＣタンパク質の投与量に応じて陽性率が低下することが分かった。
以上から、ＲＥＩＣタンパク質は、免疫抑制系を減弱させることにより、免疫系を活性化する機能を有することを発見した。生体の微小環境における免疫能の低下は、腫瘍の発生・増殖を促進し得ることが知られており、免疫抑制系細胞の発生・誘導が主因となっている。よって、ＲＥＩＣタンパク質及びそれを発現するＤＮＡベクターは、免疫抑制阻害剤として抗癌剤・抗腫瘍剤・抗がん免疫活性化剤・免疫担当細胞分化誘導剤として応用することが可能である。
【実施例１１】
【００１６】
酵母ツーハイブリッド法（Ｙ２Ｈ：Ｙｅａｓｔ  ２  ｈｙｂｒｉｄ法）によるＲＥＩＣタンパク質とＴｃｔｅｘ−１相互作用解析酵母ツーハイブリッド法はＰｒｏＱｕｅｓｔ  Ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いた。ヒトＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３の全長ｃＤＮＡは下記に示す２本のプライマーＤＮＡで増幅した。
0005936129.tif 000002
増幅したｃＤＮＡをベイトベクターｐＤＢＬｅｕのＳａｌｌとＮｏｔｌ酵素切断サイト間に挿入し、酵母ＭａＶ２０３株に導入した。続いてＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３発現クローンを単離し、ｐＰＣ８６（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングしたヒト心臓ｃＤＮＡライブラリに転換した。遺伝子導入に成功したクローンはβ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅの基質を添加した選択培地で回収した。遺伝子導入、プラスミド単離、ＤＮＡコンストラクトの確認、酵母融解液の調製は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎのインストラクションを参考にした。
ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３の相互作用パートナーを同定するために、ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質をベイトとした酵母ツーハイブリッド法によるスクリーニングを実施した。マウスやヒトの心組織ではＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３の発現が亢進しているため、スクリーニングは正常心組織のヒトｃＤＮＡライブラリを対象とした。レポーター遺伝子が活性化したクローンのうち、４クローンが培養に成功した。これらのクローンからプラスミド・レスキュー法で挿入遺伝子を分離・回収し、再度遺伝子導入しレポーター選択培地で培養した。結果を図１８Ａに示す。図１８Ａ中、Ｔｃｔｅｘ−１を含む右のパネルにおいて青色のコロニーが観察された。青色のコロニーはＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質とＴｃｔｅｘ−１タンパク質の相互作用（会合）を明示している。この結果より、Ｔｃｔｅｘ−１がＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３の相互作用パートナーであることが示唆された（図１８Ａ）。
【実施例１２】
【００１７】
免疫沈降、ウエスタン・ブロットによりＲＥＩＣ−Ｔｃｔｅｘ−１相互作用解析
免疫沈降法による結合パートナーの確認を目的とし、ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３またＴｃｔｅｘ−１のヒト全長ｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ（−）Ａ又はｐｃＤＮＡ３．２／Ｖ５／ＧＷ／Ｄ−ＴＯＰＯ  ｐｌａｓｍｉｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入し、クローニングを行った。トランジエントな遺伝子発現を目的に、リポフェクタミン２０００を用いてプラスミドＤＮＡを２９３Ｔ細胞に導入した。２９３Ｔ細胞にＭｙｃ−ｔａｇ付加ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３又はＶ５タグ付加Ｔｃｔｅｘ−１を同時に導入し、遺伝子導入後４８時間に２９３Ｔ細胞を融解させ、バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，５ｍＭ  ＥＤＴＡ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ））を加えた。細胞融解液にマウス由来非特異的ＩｇＧ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）１ｍｇを加えインキュベートし、ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１ｍｌ、又は抗Ｍｙｃマウス由来モノクローナル抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｒ９５０２５）を添加した。４℃で１２時間インキュベートした後、沈降物を洗浄、ＳＤＳを溶解させたバッファーで煮沸した。沈殿物について、マウス由来Ｖ５モノクローナル抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｒ９６０２５）を用いたウエスタン・ブロット法を行った。
ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３とＴｃｔｅｘ−１の相互作用を確認するため、免疫沈降法によるｉｎ  ｖｉｔｒｏプルダウンアッセイを実施した。Ｍｙｃ−ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３融合タンパク質を発現する２９３Ｔの細胞融解液を用いてＶ５−Ｔｃｔｅｘ−１融合タンパク質の結合アッセイを実施した。Ｔｃｔｅｘ−１への結合はＶ５抗体を用いたウエスタン・ブロット法で検出した。Ｔｃｔｅｘ−１とＲＥＩＣ／Ｄｋｋ３−タンパク質の結合は、ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３とＴｃｔｅｘ−１を同時に導入した細胞の融解液にＭｙｃ抗体を加えて得た免疫沈降サンプルから検出した。結果を図１８Ｂに示す。実施例１１及び１２の結果は、ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質とＴｃｔｅｘ−１タンパク質の相互作用が酵母ツーハイブリッドと免疫沈降法の両者で証明・再現されたことを示す。
【実施例１３】
【００１８】
哺乳動物２ハイブリッド法（Ｍ２Ｈ）によりＲＥＩＣタンパク質のＴｃｔｅｃ−１結合領域の解析
哺乳類細胞ツーハイブリッドアッセイを実施するために、様々なアミノ酸長のＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３をコードしたｃＤＮＡをｐＭ  ＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメインのクローニング用プラスミドに導入し、さらに、全長Ｔｃｔｅｘ−１をコードしたｃＤＮＡをｐＶＰ１６転写活性ドメインのクローニングプラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）に導入した。各アミノ酸長のヒトＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３の鋳型は適当なプライマー対を用いたＰＣＲ法で生成・増幅した。Ｔｃｔｅｘ−１の完全長ｃＤＮＡは以下に示すプライマーで増幅した。
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約２×１０５個の２９３Ｔ細胞に、４００ｎｇのｐＶＰ１６、４００ｎｇのｐＭ、２５０ｎｇのｐＦＲ−Ｌｕｃホタル由来ルシフェラーゼレポータープラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、１０ｎｇのｐｈＲＬ−ＴＫウミシイタケ由来ルシフェラーゼのレポータープラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ）を同時に遺伝子導入した。導入した当該細胞を４８時間培養し、ルシフェラーゼ活性をｄｕａｌ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ａｓｓａｙ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて測定した。導入効率の違いによる誤差は、ｐｈＲＬ−ＴＫ遺伝子導入によるウミホタル由来ルシフェラーゼ活性を測定し標準化した。
Ｔｃｔｅｘ−１との相互作用に重要なＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３の部分領域の探索を目的とし、ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３とＴｃｔｅｘ−１の相互作用を哺乳類細胞ツーハイブリッド法で解析した。各アミノ酸長のＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３のｃＤＮＡを導入したＧＡＬ４プラスミドと、全長Ｔｃｔｅｘ−１のｃＤＮＡを導入したＶＰ１６プラスミドを同時に導入した２９３Ｔ細胞の融解液のルシフェラーゼ活性を測定、活性が認められた場合にＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３の各部分領域とＴｃｔｅｘ−１とが結合したと判定した。結果、２０〜１４６アミノ酸残基で構成されるＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３の部分領域が、Ｔｃｔｅｘ−１への結合領域として重要であることが分かった。また、それ以上のアミノ酸長を持つＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３の部分領域は、Ｔｃｔｅｘ−１との結合活性が低いことが明らかとなった（図１９Ａ）。ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３のＴｃｔｅｘ−１との結合領域をさらに絞り込むため、ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３の部分領域を段階的に短縮させた。２０−１４６アミノ酸を持つＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３と、２０−１５７アミノ酸残基の部分領域で、Ｔｃｔｅｘ−１との結合を示すルシフェラーゼ活性が検出された。２０−１３５アミノ酸残基で構成される部分領域では微弱な活性しか認められなかった。これらの結果は、ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３とＴｃｔｅｘ−１との相互作用は、１３６−１５７アミノ酸残基で構成されるＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３の部分領域が関与することを示唆している（図１９Ｂ）。
図２０ＡにＲＥＩＣタンパク質とｄｙｎｅｉｎ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｃｈａｉｎ（ＤＩＣ）のＴｃＴｅｘ−１結合領域のアミノ酸配列アラインメントを示す。Ｄｙｎｅｉｎ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎタンパク質であるＴｃｔｅｘ−１と、ｄｙｎｅｉｎ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｃｈａｉｎ（ＤＩＣ）の部分領域［１２０ＳＤＳＥＬＧＲＲＬＨＫＬＧＶＳＫＶＴＱＶＤＦＬ１４２］（配列番号１６）の結合が別のグループにより報告されている。ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３のＴｃｔｅｘ−１結合領域は、［１３６ＶＧＤＥＥＧＲＲＳＨＥＣＩＩＤＥＤＣＧＰＳＭ１５７］（配列番号１７）であった。ＤＩＣのＴｃｔｅｘ−１結合領域との配列比較により、そのコンセンサス配列は［−Ｅ−Ｘ−Ｇ−Ｒ−Ｒ−Ｘ−Ｈ−］（Ｘは任意の天然アミノ酸を示す）（配列番号１８）であることが明らかとなった。
図２０ＢにＲＥＩＣタンパク質のＴｃｔｅｘ−１結合ドメインと既知Ｔｃｔｅｘ−１結合タンパク質のアミノ酸配列アラインメントを示す。Ｔｃｔｅｘ−１結合タンパク質のアミノ酸配列モチーフ［−Ｒ／Ｋ−Ｒ／Ｋ−Ｘ−Ｘ−Ｒ／Ｋ−］（Ｘは任意の天然アミノ酸を示す）（配列番号２０）。ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３の結合領域のアミノ酸配列は、［−ＲＲ−］を含むモチーフのみが一致し、Ｔｃｔｅｘ−１の他の結合パートナーのモチーフ比べ特徴的である。
【実施例１４】
【００１９】
ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質とＴｃｔｅｘ−１の細胞内における局在パターンの解析
ＯＵＭＳ２４細胞におけるＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３とＴｃｔｅｘ−１の免疫細胞化学染色を、小胞体の共染色により行った。細胞を２４穴ウエル上で３０〜４０％コンフルエントの条件で培養した。さらに、４％パラホルムアルデヒド・１００ｍＭリン酸塩バッファーで細胞を固定し、生理食塩水と３％ＢＳＡでブロッキング処理した。細胞はウサギ由来抗ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３ポリクローナル抗体（生理食塩水で２００倍希釈）、又はウサギ由来抗Ｔｃｔｅｘ−１ポリクローナル抗体（１００希釈，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｓｃ−２８５３７）を添加し室温で２時間インキュベートし、さらにＡｌｅｘａ４８８緑色蛍光色素を付加したウサギ由来２次抗体を加えて１時間インキュベートした。小胞体での分布を検出するため、Ａｌｅｘａ５４６赤色蛍光色素を付与したｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ  Ａ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を細胞に添加し室温で１５分間インキュベートした。
各種アッセイ系で明示されたＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３とＴｃｔｅｘ−１の相互作用を踏まえ、これら２つのタンパク質の細胞内における共局在を解析した。ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３は小胞体内だけでなく細胞質内にも局在することが報告されており、また最近の我々の研究では、ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質の安定発現細胞においてＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質は小胞体に局在していることが証明された。そこで、小胞体におけるＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質とＴｃｔｅｘ−１タンパク質との局在を確認するために、蛍光色素を付加した小胞体局在マーカータンパク質であるｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ  Ａを用いた免疫蛍光二重染色法を実施した。図２１Ａはヒト線維芽細胞ＯＵＭＳ２４においてヒト全長ＲＥＩＣタンパク質と小胞体マーカーｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ  Ａとの二重蛍光染色の共焦点顕微鏡による撮像である。赤（図２１Ａ−ａの明るい部分）はｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ  Ａ、緑（図２１Ａ−ｂの明るい部分）は全長ＲＥＩＣタンパク質を示す。小胞体と全長ＲＥＩＣタンパク質との重複領域は黄色（図２１Ａ−ｃの明るい部分）で表示されている（重複像）。図２１Ｂは、ヒト線維芽細胞ＯＵＭＳ２４においてＴｃｔｅｘ−１タンパク質と小胞体マーカーｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ  Ａとの２重蛍光染色の共焦点顕微鏡による撮像である。赤（図２１Ｂ−ａの明るい部分）はｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ  Ａ、緑（図２１Ｂ−ｂの明るい部分）はＴｃｔｅｘ−１タンパク質を示す。小胞体とＴｃｔｅｘ−１タンパク質との重複領域は黄色（図２１Ａ−ｃの明るい部分）で表示されている（重複像）。図２１Ａ及び図２１Ｂの重複像において、ほとんど黄色で染色されている。すなわち、期待された通り、ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３（図２１Ａ）とＴｃｔｅｘ−１（図２１Ｂ）は共に小胞体に局在しており、これらのタンパク質の正常線維芽細胞ＯＵＭＳ２４の細胞内における局在パターンは一致していた。すなわちＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３とＴｃｔｅｘ−１は共に小胞体周辺に局在し、またＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３の相互作用パートナーはＴｃｔｅｘ−１であると判断できる。
【実施例１５】
【００２０】
Ｔｃｔｅｘ−１のＲＥＩＣのアポトーシス誘導能の促進因子機能の解析
アデノウイルスＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３（Ａｄ−ＲＥＩＣ）の作製は、以下の通り実施した。ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３の全長ｃＤＮＡをコスミドベクターｐＡｘＣＡｗｔに挿入し、さらにＣＯＳ−ＴＰＣ法（タカラバイオ、滋賀、日本）によりアデノウイルスベクター導入した。ＬａｃＺ遺伝子を導入したアデノウイルスベクター（Ａｄ−ＬａｃＺ）は比較対象として用いた。
アポトーシスアッセイ法を下記に示す。各処理後のｉｎ  ｖｉｔｒｏアポトーシス誘導率を検証するために、ＰＣ３前立腺がん細胞を６穴平底培養プレートで２４時間培養した。培養したＰＣ３細胞は、ＧＦＰ発現プラスミド（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）、Ｔｃｔｅｘ−１発現プラスミド（ｐｃＤＮＡ３．２／Ｖ５／ＧＷ／Ｄ−ＴＯＰＯ）、又はＴｃｔｅｘ−１−ｓｈ−ＲＮＡプラスミド（ｓｃ−４３３１９−ＳＨ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を添加、６時間後に培地交換を行った。遺伝子導入には、ＦｕＧＥＮＥ  ＨＤ（Ｒｏｃｈｅ）を用いた。ＧＦＰプラスミドの遺伝子導入効率は、プラスミド添加後４８時間で６０％以上であった。ＧＦＰ発現プラスミドの遺伝子導入２４時間後、Ａｄ−ＬａｃＺ、Ａｄ−ＲＥＩＣ  ５０ＭＯＩ（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）を添加し無血清培地で２時間反応させた後、培地交換を行った。さらに４８時間培養後、２μｇ／ｍｌのＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２溶液を培地に添加し、暗所に１０分間静置した。Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２は総クロマチン含量の評価とクロマチン凝縮を検出するインタカレータ試薬である。高度に凝縮又は分断した細胞核を蛍光顕微鏡によって観測し、アポトーシス誘導が生じた死細胞を特定した。５点の異なる顕微鏡像においてアポトーシス誘導細胞の数を計測した。１点の顕微鏡像につき１００個の細胞を判定した。
統計学的検定については、以下の通り実施した。データは平均値±標準誤差で示した。２群間のＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｕｎｐａｉｒｅｄ  ｔ−ｔｅｓｔを用いて検定し、Ｐ値が０．０５より低い場合に、両者の差は統計学的に有意であると判定した。
ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３のアポトーシス誘導能へのＴｃｔｅｘ−１の機能を検証するために、本発明者がこれまでの研究により確立したヒト前立腺がん細胞ＰＣ３とＡｄ−ＲＥＩＣを用いたＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３の過剰発現によるアポトーシス誘導モデルを活用した。ウエスタン・ブロット解析の結果によると、ＰＣ３は内在性Ｔｃｔｅｘ−１タンパク質を発現しており、一方、ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質は発現していなかった。図２２ＡにＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２によるアポトーシスアッセイの結果を示す。該アッセイの結果では、Ａｄ−ＲＥＩＣを投与したＰＣ３においてはアポトーシスが生じたが、Ａｄ−ＬａｃＺでは起こらなかった（図２２Ａ、矢印）。図２２ＡはＡｄ−ＲＥＩＣのアポトーシス誘導能が、Ｔｃｔｅｘ−１の発現減少により減弱し、発現増幅により増強することを示す。Ａｄ−ＲＥＩＣ投与群におけるアポトーシス誘導率は、ＧＦＰプラスミド、ｓｈＲＮＡ−Ｔｃｔｅｘ−１、Ｔｃｔｅｘ−１発現プラスミド各投与群において、それぞれ３０％、１５％、７５％であった（図２２Ｂ）。すなわち、Ａｄ−ＲＥＩＣのアポトーシス誘導能は、Ｔｃｔｅｘ−１の発現減少により減弱し、発現増幅により増強することを示唆する。Ａｄ−ＲＥＩＣを投与したＧＦＰプラスミド処置群と比べ、ｓｈＲＮＡ−Ｔｃｔｅｘ−１処置群ではアポトーシス誘導率が低下していることが明らかになった。一方、Ｔｃｔｅｘ−１発現プラスミドはアポトーシス誘導を促進することが分かった。この結果は、Ｔｃｔｅｘ−１の発現レベルとＡｄ−ＲＥＩＣを用いたＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３の過剰発現によるアポトーシス誘導は、正の相関を示すことを示唆している。すなわち、Ｔｃｔｅｘ−１はＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３のアポトーシス誘導を促進していると結論付けられる。
【産業上の利用可能性】
【００２１】
本発明のＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質の部分領域ポリペプチドは、ＩＬ−２や従来から数多く知られている免疫活性作用を持つサイトカイン群、並びに全長ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質と比べて、
（１）単剤でも抗癌免疫活性化による抗腫瘍効果を有する、
（２）ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３遺伝子発現が多くの癌種において欠如・低下しているというＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質そのものの特性により、ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質製剤は、広い範囲の癌種に対して有効である、
（３）ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質による抗癌免疫活性化により、投与した癌局所のみならず、癌転移巣の改善や予防といった作用が期待できる、並びに
（４）既存の様々な癌抗原タンパク質と本剤を同時に投与することにより、樹状（様）細胞などの分化誘導を介して抗癌免疫を系統的に活性化させ、発癌そのものを予防することが可能となる、という効果を有する。
さらに、本発明のＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質の部分領域ポリペプチドは、サイズも小さいため、生産も容易であり、かつ低コストで生産することが可能である。
本発明のＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質部分領域は、癌免疫療法剤として用いることができ、癌の予防、治療に有用である。
【配列表フリーテキスト】
【００２２】
配列番号１１  合成
配列番号１２〜１５  プライマー
配列番号１６〜２８  合成
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
［配列表］
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【図４】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１３】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２２Ｂ】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１１Ｃ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１２Ｆ】
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【図１２Ｇ】
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【図１２Ｈ】
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【図１２Ｉ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ−１】
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【図１７Ａ−２】
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【図１７Ｂ−１】
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【図１７Ｂ−２】
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【図１７Ｃ−１】
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【図１７Ｃ−２】
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【図１７Ｄ−１】
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【図１７Ｄ−２】
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【図１７Ｅ−１】
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【図１７Ｅ−２】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２Ａ】
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