(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
増殖性疾患の治療又は予防において細胞成長及び／又は増殖を阻害するための医薬組成物であって、
上記医薬組成物が以下の：
デルマセプチンB2の配列、デルマセプチンB2の前駆体の配列；及び
前記デルマセプチンB2又はデルマセプチンB2の前駆体の配列と、少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列、
から成る群から選ばれるアミノ酸配列を含むか又はそれから成る単離されたペプチドを含んで成り、ただし、前記単離されたペプチドが細胞成長及び／又は増殖を阻害し、ここで、投与される該ペプチドの用量は、１日あたり０．５〜５mg/kgである、医薬組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の医薬組成物であって、前記ペプチドが以下の：
配列番号１及び配列番号２の配列；並びに
配列番号１又は配列番号２の配列と、少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列、
から成る群から選ばれるアミノ酸配列を含むか又はそれから成り、ただし、前記単離されたペプチドが細胞成長及び／又は増殖を阻害する、医薬組成物。
【請求項３】
増殖性疾患の治療又は予防において細胞成長及び／又は増殖を阻害するための医薬組成物であって、
請求項１又は２に定義されたペプチドを少なくとも１つ含むキメラ分子を含んでなり、ここで、該ペプチドが以下の：
ａ）増殖性疾患の治療のために有用な治療用化合物；
ｂ）増殖性疾患の治療のために有用な治療用化合物に分子を変換することができる酵素；又は
ｃ）キャリア分子、
に連結され、ここで、投与される該ペプチドの用量は、１日あたり０．５〜５mg/kgである、医薬組成物。
【請求項４】
増殖性疾患の治療のために有用な第二の治療用化合物をさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
増殖性疾患の治療又は予防において細胞成長及び／又は増殖を阻害するための医薬の製造のための、
デルマセプチンB2の配列、デルマセプチンB2の前駆体の配列；及び
前記デルマセプチンB2又はデルマセプチンB2の前駆体の配列と、少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列、
から成る群から選ばれるアミノ酸配列を含むか又はそれから成る単離されたペプチドの使用であって、
ただし、上記単離されたペプチドが細胞成長及び／又は増殖を阻害し、ここで、投与される該ペプチドの用量は、１日あたり０．５〜５mg/kgである、使用。
【請求項６】
前記ペプチドが、
配列番号１及び配列番号２の配列；並びに
配列番号１又は配列番号２の配列と、少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列、
から成る群から選ばれるアミノ酸配列を含むか又はそれから成る、
請求項５に記載の、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞増殖及び／又は成長を阻害するためのデルマセプチンB2の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在の癌治療法は、時には最も無効な、放射線療法、手術、及び／又は有糸分裂をブロックするための抗癌剤の使用に基づく。これらの治療法はしばしば非常に攻撃的であって、その使用を制限するかもしれない。他の想定される治療経路は、生物体の免疫防御を刺激するであろう物質を投与することからなる免疫療法である。しかしながら、癌、特に転移性の癌、にかかった患者は、常に免疫療法に反応することはないか、又はわずかに反応する。世界中での主要な研究にもかかわらず、現在、この病状に対する普遍的な治療法はない。
【０００３】
腫瘍細胞の制御されない増殖に加えて、腫瘍の長期の成長は常に血管新生と関連している。したがって、血管新生を誘導する因子の抑制又は阻害が、腫瘍のタイプにかかわらず腫瘍成長の軽減に導くに違いない。
【０００４】
現時点で、癌又は増殖性疾患の治療のために、いくつかの会社が、血管新生因子（又は同定されている場合にはそれらの受容体）の阻害剤などに基づくか、又は血栓形成の触媒のためのアンカーとしての内皮細胞を用いて血管微小血栓形成を誘導することによる、又は常には同定されないメカニズムを介して血管新生を阻害するペプチド剤を用いることによる血管新生抑制ストラテジーを開発中である。これらのアプローチはまだ明確な結果をもたらしてはおらず、そして、単一の血管新生経路をブロックすることに基づく阻害剤は、悪化させるリバウンド効果を誘導するようである。これらの結果は、血管及び腫瘍細胞を過激かつ同時に破壊することが期待できる阻害剤のカクテルを提案することにこれらの会社を導いた。
【０００５】
したがって、現在、この理由により、細胞の成長及び／又は増殖を阻害する新規血管新生阻害剤が必要とされている。
【発明の概要】
【０００６】
発明者らは、驚くべきことにフタイロネコメガエル（Phyllomedusa bicolor）属の南アメリカのカエルの皮膚分泌物から抽出され、かつ抗菌剤として知られたデルマセプチンB2が、第一に腫瘍細胞の増殖を、そして第二に血管新生を阻害することができることをここに示した。
【０００７】
米国特許第US6,440,690号は、宿主の免疫系を刺激することによる、感染性疾患又は癌の治療のためのペプチド、特にデルマセプチンの使用を記載する。より正確には、これらのペプチドは、単核球／マクロファージ細胞系の細胞及び／又は他のリンパ系細胞を活性化することにより、免疫系を刺激する。一方、デルマセプチンB2が細胞成長及び／又は増殖を阻害しうることは示唆されていない。
【０００８】
発明の開示
したがって、本発明は、以下の：
デルマセプチンB2の配列、デルマセプチンB2の前駆体の配列、
デルマセプチンB2の配列又はデルマセプチンB2の前駆体の配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列、及び
これらの配列の断片、
からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むか又はそれから成り、増殖性疾患、眼病変又は自己免疫疾患の治療又は予防において使用するため、好ましくは細胞成長及び／又は増殖を阻害するための、単離されたペプチドに関し、ただし、上記単離されたペプチドは細胞成長及び／又は増殖を阻害する。
【０００９】
本発明は、上で定義されたペプチドを少なくとも１つ含むキメラ分子にも関し、ここで、上記ペプチドは、以下の：
ａ）増殖性疾患の治療のために有用な治療用化合物、
ｂ）増殖性疾患の治療のために有用な治療用化合物に分子を変換することができる酵素、又は
ｃ）キャリア分子、
と連結されている。
【００１０】
本発明はさらに、上で定義されたキメラ分子を生産する方法であって、以下の：
ａ）化学経路を介する、上で定義されたペプチドの合成、及び
ｂ）以下の：
ｉ）増殖性疾患の治療のために有用な治療用化合物、
ｉｉ）増殖性疾患の治療のために有用な治療用化合物に分子を変換することのできる酵素、及び
ｉｉｉ）キャリアタンパク質、
から選ばれる化合物と上記ペプチドのコンジュゲーション、
を含む、上記方法にも関する。
【００１１】
本発明のさらなる主題は、増殖性疾患、眼病変又は自己免疫疾患の治療又は予防において使用するため、好ましくは細胞成長及び／又は増殖を阻害するための、上で定義されたペプチドをコードする配列を含むか又はそれから成る核酸、及びこの核酸を含むベクターであって、ここで、上記核酸が、上記ペプチドの発現を可能とする１つ以上の要素に機能的に連結されている、上記核酸及びベクターに関する。
【００１２】
本発明は、上で定義されたペプチド又は上で定義されたキメラ分子を含む医薬組成物、及び上で定義された核酸又は上で定義されたベクターを含む医薬組成物も記載する。これらの組成物はさらに、増殖性疾患、眼病変又は自己免疫疾患の治療のために有用な第二の治療用化合物も含んでよい。
【００１３】
デルマセプチンＢ２
本明細書においては、「デルマセプチンＢ２」又は「アデノレグリン」は、フタイロネコメガエル（Phyllomedusa bicolor）属の南アメリカのカエルの皮膚分泌物から最初に単離された３３アミノ酸のペプチドを意味する（Daly et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10960-10963）。このペプチドのアミノ酸配列は、以下の配列に相当する：
【００１４】
【化１】
0005898071.tif 000002
【００１５】
このペプチドは、８１アミノ酸からなる前駆体、プレプロアデノレグリン、の形態で発現され、その配列は以下のとおりである（Amiche et al. (1994) J. Biol. Chem. 269: 17847-17852）。
【００１６】
【化２】
0005898071.tif 000003
【００１７】
この前駆体に対応するcDNAが同定され、そして、配列番号３の配列に示される。
【００１８】
デルマセプチンB2は、アデノシンA1の受容体とアゴニストとの結合を増加させることが知られている（Daly et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10960-10963;Moni et al. (1995) Cell. Mol. Neurobiol. 15:465-493）。構造的及び薬理学的分析は、それが、アマゾンのアマガエルから単離された広域スペクトルの抗菌ペプチドであるデルマセプチンの大きなファミリーに関連していることを示した（Amiche et al (1994) J. Biol. Chem. 269: 17847-17852; Charpentier et al. (1998) J. Biol. Chem. 273: 14690-14697; Mor et al. (1994) J. Biol. Chem. 269: 31635-31641; Mor et al. (1991) Biochemistry 30: 8824-8830）。このペプチドは、比較的サイズが短くその構造は翻訳後修飾により変化しないか又はわずかに変化させられるのみであるため、その固相化学合成はいかなる特別な困難性も提示しない。さらに、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）中での組換え発現を介するその産生も、そのcDNAの利用可能性により可能である。
【００１９】
当業者には周知であるとおり、マイクロモル用量のデルマセプチンB2は、グラム陽性及びグラム陰性細菌、酵母、原生動物並びに糸状菌を急速に殺滅する。さらに、それは溶血活性を欠いている。
【００２０】
ペプチド
本発明のペプチドは生理活性を有する。本明細書においては、「生理活性」は特に、血管新生及び／又は細胞増殖及び／又は腫瘍成長を阻害する活性を意味する。本発明のペプチドは、上記の活性の少なくとも１つを有し次第、生理活性を有する。好ましくは、該ペプチドは細胞増殖及び／又は細胞成長、特に腫瘍又は血管細胞の増殖及び／又は成長、を阻害する活性を有する。
【００２１】
ペプチドの細胞増殖及び／又は腫瘍成長の阻害活性は、インビトロ又はインビボにおいて当業者により、特に以下のアッセイ： 
−インビトロで、（ｉ）上記ペプチドを、成長因子により刺激された（NIH3T3などの）線維芽細胞タイプの細胞と血清の非存在下で接触させ、（ｉｉ）放射能標識されたチミジンを添加し、そして（ｉｉｉ）液体シンチレーションなどを用いて、細胞により取り込まれた放射能を測定することにより；
−インビトロで、軟寒天中で上記ペプチドを（PC-3などの）腫瘍細胞と接触させ、そしてその直径の測定による細胞成長の観察により；
−インビボで、PC-3の注射により腫瘍が誘発されたヌードマウスにペプチドを注射し、そして上記腫瘍の体積及び／又は重量の測定による腫瘍成長の観察により；
容易に評価されることができる。
【００２２】
本明細書においては、「単離された」ペプチドは、動物又は微生物の生体から単離されたペプチドを意味する。しかしながら、単離されたペプチドは、例えば医薬組成物又はキット中に存在してもよい。好ましくは、ペプチドは、以下に記載の医薬組成物のうちの一つの中に存在する。このペプチドは、精製された形態であることが好ましい。本発明のペプチドは、化学的又は生物学的経路を介して合成可能である。特に、それは組換えにより産生されることができる。
【００２３】
好ましくは、本発明のペプチドは、６及び８１、６及び７６、６及び７１、６及び６６、６及び６１、６及び５６、６及び５１、６及び４６、６及び４１、６及び３６、６及び３３、６及び３０、６及び２８、６及び２６、６及び２４、６及び２２、６及び２０、６及び１８、６及び１６、６及び１４、６及び１２、６及び１０の間のアミノ酸、好ましくは、９、８又は７のアミノ酸のサイズを有する。最も好ましくは、本発明のペプチドは、３３アミノ酸のサイズを有する。
【００２４】
上記ペプチドは、特に、配列番号１及び配列番号２の配列；配列番号１又は配列番号２の配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列；及びこれらの配列の断片から成る群から選ばれるアミノ酸配列を含むか又はそれから成り、ただし、上記単離されたペプチドが細胞成長及び／又は増殖を阻害する。好ましくは、上記ペプチドは、配列番号１及び配列番号２の配列から成る群から選ばれるアミノ酸配列から成る。
【００２５】
上記ペプチドは、配列番号１又は配列番号２の配列の断片から成ることもできる。
【００２６】
本明細書においては、参照配列の「断片」は、参照配列の連続したアミノ酸の鎖であって、そのサイズが参照配列のサイズよりも小さいものにより構成される配列を意味する。本発明の関連において、断片は、例えば、６及び７６、６及び７１、６及び６６、６及び６１、６及び５６、６及び５１、６及び４６、６及び４１、６及び３６、６及び３３、６及び３０、６及び２８、６及び２６、６及び２４、６及び２２、６及び２０、６及び１８、６及び１６、６及び１４、６及び１２、６及び１０の間のアミノ酸のサイズ、好ましくは、９、８又は７のアミノ酸のサイズを有する。特別には、断片は３３アミノ酸のサイズを有することができる。好ましくは、これらの断片は、デルマセプチンB2又はデルマセプチンB2の前駆体のC−末端に由来する。
【００２７】
本発明のペプチドは、配列番号１又は配列番号２の配列のうちの一つとの配列同一性パーセントにより定義される、配列番号１又は配列番号２の配列に由来するか或いは配列番号１又は配列番号２の配列の断片に由来する配列を有するペプチドも含む。これらの派生配列は、これらの修飾が該ぺプチドの生理活性に対していかなる重要な影響も与えないような位置における、１つ以上のアミノ酸の置換、欠失及び／又は挿入によって、参照配列と異なることができる。特に、置換は、保存的置換或いは天然のアミノ酸の、非天然アミノ酸又は擬似アミノ酸による置換に相当することができる。
【００２８】
本明細書においては、「参照配列と（例えば）少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列」は、参照配列と同一の配列であるが、この配列が、参照配列の各１００アミノ酸の部分あたり２０以下の突然変異（置換、欠失及び／又は挿入）を有しうることを意味する。したがって、１００アミノ酸の参照配列については、８０アミノ酸の断片及び参照配列に比較して２０の置換を含む１００アミノ酸の配列は、参照配列と８０％の配列同一性を有する配列の２つの例である。
【００２９】
パーセント同一性は一般に、（Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705などの）配列分析ソフトウエアを用いて決定される。比較されるべきアミノ酸配列は、最大のパーセント同一性を得るために整列化される。この目的のためには、配列中に人工的にギャップを付加することが必要かもしれない。整列化は、手動で又は自動で実施可能である。ヌクレオチド配列の自動化された整列化アルゴリズムは、当業者に周知であり、そして、Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389などに記載され、そして、Blastソフトウエアなどのソフトウエアにより実行される。単離されることのできるアルゴリズムは、例えば、Needleman-Wunschアルゴリズム（Needleman and Wunsch (1970) J Mol Biol. 48: 443-53）である。最適な整列化がいったん達成されると、２つの比較される配列のアミノ酸が同一であるすべての位置を記録することによって、位置の総数に対するパーセント同一性が確立される。
【００３０】
したがって、本発明のペプチドは、以下の：
−配列番号１又は配列番号２と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％の配列同一性を有する配列の断片；及び
−配列番号１又は配列番号２の配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％の配列同一性を有する配列、
から選ばれる配列を含むか又はそれから成ることができる。
【００３１】
１つの特別な実施態様においては、上記ペプチドの配列は、配列番号１又は配列番号２の配列、或いは、配列番号１又は配列番号２の配列の断片と、保存的置換の存在のみにより異なる。保存的置換は、（アスパラギン、グルタミン、セリン、システイン及びチロシンなどの）無電荷側鎖を有するアミノ酸、（リジン、アルギニン及びヒスチジンなどの）塩基性側鎖を有するアミノ酸、（アスパラギン酸及びグルタミン酸などの）酸性側鎖を有するアミノ酸、（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン及びトリプトファンなどの）非極性側鎖を有するアミノ酸の置換などの同じクラスのアミノ酸の置換である。
【００３２】
本発明によれば、上記ペプチドは、それらの安定性又はバイオアベイラビリティーを改善するために、化学的又は酵素的に修飾されることができる。かかる化学的又は酵素的修飾は当業者に周知である。以下の修飾： 
−N-末端脱アミノ化又はアシル化（好ましくは、アセチル化）、或いは、C-末端アミド化又はエステル化などの、ペプチドのC-末端又はN-末端の修飾；
−窒素又はα炭素におけるアシル化（好ましくは、アセチル化）又はアルキル化などの、２つのアミノ酸間のアミド結合の修飾；
−天然アミノ酸（L-エナンチオマー）の対応するD-エナンチオマーによる置換などのキラリティーの変化、この修飾は、場合により、側鎖の（C-末端からN-末端への）反転を伴ってよい；
−１つ以上のα炭素が窒素原子で置換される、アザペプチドへの変化；及び／又は
−1つ以上の炭素が主鎖のN-α側又はC-α側へ付加される、ベータペプチドへの変化
が言及されてよいが、これらには限定されない。
【００３３】
これに関して、特に以下の：
−アミド化：この修飾は、（アセチル又はフェニルアセチルなどの）疎水性基により置換されているリジンを陽性荷電するために単純であり；
−アミノ化：例えば、N-メチル、N-アリル又はN-ベンジル基の形成による、一級アミンR=(CH2)4-NH3+からの二級アミドの形成による；及び
−N-オキシド、N-ニトロソ、N-ジアルキルホスホリル、N-スルフェニル、又はN-グリコシド基の形成、
により、ペプチドの１つ以上のリジンアミノ酸（K）を修飾することが可能である。
【００３４】
さらに又は或いは、特にスレオニン及び／又はセリンの側鎖のOH基においてエステル又はエーテル基を付加することにより、上記ペプチドの１つ以上のスレオニン（T）及び／又はセリン（S）アミノ酸を修飾することが可能である。単純な操作であるエステル化は、カルボン酸、無水物を用いて、架橋などによりアセテート又はベンゾエートを形成することによって実施可能である。より安定な化合物を生じるエーテル化は、アルコール、ハライドなどを用いて実施されて、例えばメチルエーテル又はO-グリコシドを形成することができる。
【００３５】
さらに又は或いは、アミド化により、特に、官能化された又はされていないメチル、エチルタイプの基により二級又は三級アミンを形成することなどにより、１つ以上のグルタミン（Q）アミノ酸を修飾することが可能である。
【００３６】
さらに又は或いは、例えば、以下の：
−エステル化により、置換された又はされていないメチルエステル、エチルエステル、ベンジルエステル、チオール（活性化エステル）を形成して；及び
−アミド化により、特に、N,Nジメチル基、ニトロアニリド、ピロリジニルを形成して、1つ以上のグルタミン酸（E）及び／又はアスパラギン酸（D）アミノ酸を修飾することが可能である。
【００３７】
一方、一般的にアミノ酸G、A及びMは明らかに興味深い修飾の可能性を提示しないことも心にとどめつつ、ペプチドの二次構造に参加するプロリンアミノ酸を修飾しないことが好ましい。
【００３８】
キメラ分子
本発明は、少なくとも上で定義された本発明のペプチドを含む、キメラ分子にも関し、ここで、該ペプチドは、以下の：
ａ）増殖性疾患の治療のために有用な治療用化合物；
ｂ）増殖性疾患の治療のために有用な治療用化合物に分子を変換することのできる酵素；又は
ｃ）キャリア分子、
に連結されている。
【００３９】
本明細書においては、「キメラ分子」は、他の分子に連結された本発明のペプチドを含むか又はそれから成る分子を意味する。本発明のペプチドは、共有結合を介して他の分子に連結される。該結合は化学的カップリングに相当することが好ましい。しかしながら、上記ペプチドが連結される分子が他のポリペプチドである場合、該２つのペプチドは、融合タンパク質の形態であることができる。
【００４０】
本明細書においては、「キャリア分子」は、少なくとも１つのペプチドがそれとカップリング（コンジュゲーション）されることができる任意の分子を意味する。好ましくは、キャリア分子は、それが少なくとも３つの本発明のペプチド、好ましくは３〜８個の本発明のペプチドと連結されることが可能であるように十分なサイズである。本発明の意味において、ペプチドに関する「カップリングされた」は、それが直接的に又は上記ペプチドと上記キャリア分子の間のスペーサー化合物を介する共有結合を介してキャリア分子に連結されることを意味する。許容可能なスペーサーの例は、エチレングリコール、ピペラジンタイプの化合物、或いは、アミノヘキサン酸又はベータアラニンタイプのアミノ酸を含む。
【００４１】
当業者は、ペプチドがそれと有利にカップリングされることができるキャリア分子を知っている。
【００４２】
例えば、ペプチドは一般的に、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、オボアルブミン（ＯＶＡ）、チログロブリン（ＴＨＹ）又はＭＡＰ（多重抗原性ぺプチド）とカップリングされる。
【００４３】
１つの好ましい実施態様においては、キャリア分子は、WO2007/125210号の番号のもとに公開されたPCT出願に記載されたような支持体に相当する。かかる支持体は、特に、線状ペプチド又は環状ペプチド、線状若しくは環状ペプトイド（N-置換グリシンのオリゴマー）、フォルダマー（溶液中での、予測可能でコンパクトな、よく定義されたコンフォメーションをとる傾向が強いオリゴマー又はポリマー）、線状ポリマー又は球状デンドリマー（中心の多機能性コアの周りに高度に分岐した過程にしたがって集合するモノマーによって構成されるマクロ分子）、糖、又はナノ粒子から選ばれることができる。有利には、上記支持体は、線状又は環状ペプチド、或いは、線状又は環状ペプトイドから選ばれる。線状ぺプチドの使用は、上記支持体の容易な合成を可能とする。本発明における支持体として作用する線状ペプチドは、有利には、２５％超の割合のリジンを含むことができる。より正確には、線状ペプチドが本発明における支持体として使用される場合、本発明のペプチドはリジン上に移植されることが好ましい。該支持体が線状又は環状ペプチドである場合、そして、本発明のぺプチドが上記ペプチドに直接移植される場合、支持体ペプチドと本発明のペプチドの間の結合は、支持体ペプチドのリジン残基のα又はε位のアミノ基において、好ましくは該リジンの（側鎖上の）ε位におけるアミノ基において形成されることが好ましい。したがって、本発明のペプチドのペプチド性支持体への直接的移植は、擬似−ペプチドモチーフのC-末端におけるアミノ酸の酸性COOH官能基とリジン残基のアミノ基、好ましくは該リジンの（側鎖上の）ε位のアミノ基、との間のアミド結合を介して有利に実施される。有利には、本発明のぺプチドの支持体は、D配座のアラニン残基（A）及びL配座のリジン残基（K）から交互に構成される環状ヘキサペプチドから選ばれる。
【００４４】
本発明のキメラ分子は、酵素又は増殖性疾患の治療のために有用な治療用化合物に連結された、少なくとも１つの本発明のペプチドを含むこともできる。
【００４５】
１つの好ましい実施態様においては、本発明のペプチドは、細胞障害性化合物に連結される。
【００４６】
或いは、本発明のペプチドは、プロドラッグを増殖性疾患を治療するために有用な治療用化合物に変換することのできる酵素に連結されることができる（例えば、米国特許第US5760072号及び同第US5433955号を参照のこと）。
【００４７】
本発明のペプチドは、例えば、マトリックスメタロプロテイナーゼファミリーのメンバー、ウロキナーゼ又はプラスミンなどのマトリックス環境中に存在する酵素に連結されることができる。
【００４８】
本発明のペプチドは、例えば、ヒトアネキシン−１、抗炎症性サイトカイン（特に、IL10及びIL13）、前炎症性サイトカインの膜受容体の非活性化阻害剤、グルココルチコイド、非ステロイド抗炎症剤及びメトトレキセートからなる群から選ばれる治療用化合物に連結されることができる。
【００４９】
本発明のペプチドは、癌細胞の環境に特異的な酵素又は酵素群によって認識されそして切断されるリンカーを介して治療用化合物に連結されることができる。より具体的には、この酵素は、細胞外マトリックスのメタロプロテアーゼ、ウロキナーゼ及び膜サイトカイン又はそれらの受容体の細胞外セグメントを特異的に切断するプロテアーゼから選ばれることができる。癌細胞におけるリンカーの切断は、次に、２つの活性成分、第一に本発明のぺプチドそして第二に治療用化合物、の放出を可能とする。
【００５０】
かかるキメラ分子は、医薬、より具体的には増殖性疾患、眼病変及び／又は自己免疫疾患の治療又は予防のための医薬として使用可能である。好ましくは、かかるキメラ分子は、癌などの増殖性疾患の治療又は予防において使用される。
【００５１】
治療用途
本発明のペプチドは、細胞増殖及び／又は細胞成長を阻害する性質を有する。これに関して、これらのペプチド及びそれらを含むキメラ分子は、細胞増殖及び成長に関連するさまざまな病状の治療のために特に有用である。
【００５２】
したがって、本発明の１つの側面は、増殖性疾患、眼病変及び／又は自己免疫疾患の治療又は予防における使用のため、特に、細胞成長及び／又は増殖を阻害するための本発明のペプチド又はキメラ分子に関する。
【００５３】
本明細書においては、「増殖性疾患」は、良性又は悪性（癌性）の、任意の異常な細胞増殖を意味する。本発明のペプチドは、特に、癌の治療及び／又は予防のために有用である。
【００５４】
増殖性疾患は特に、腫瘍を含む。本発明は、より具体的には、固形又はそうでない癌性腫瘍に関する。本発明は、黒色腫、癌腫、肉腫、横紋筋肉腫、網膜芽腫、神経芽細胞腫、骨肉腫、神経膠芽細胞腫、（原発性であるかまたはそうでない）乳腺及び卵巣腫瘍、肺癌、子宮頚部の腫瘍、消化管、特に結腸の腫瘍、泌尿器系の腫瘍、肝臓の腫瘍、膵臓の腫瘍、骨の腫瘍などの固形腫瘍の治療及び／又は予防に関する。非固形腫瘍、すなわち、特に白血病又はリンパ腫、にも関する。再び癌性腫瘍に関して、本発明のペプチドは、腫瘍転移の治療及び／又はその形成の予防のために特に有用である。中でも、本発明は良性腫瘍にも関し、血管腫及び肝細胞腺腫にも言及されることができる。
【００５５】
増殖性疾患は、激しい血管新生を伴う炎症性疾患であるリューマチ関節炎（RA）及び乾癬などの皮膚疾患のような腫瘍以外の疾患も含む。この病状においては、炎症性パンヌスの生成に基づく滑膜細胞の増殖がある。このタイプの病状に関連するメカニズムは、腫瘍成長に導くメカニズムのように見える。
【００５６】
「眼病変」は特に、糖尿病性網膜症、黄斑変性症、腎静脈又は腎動脈の閉塞、緑内障などの網膜の病状を含む。上記ペプチドは、角膜移植などの修復手術の結果であるかもしれない眼病変の治療にも有用であることができる。特に、「浸出性」であるといわれる、加齢に関連した黄斑変性症の１つの形態がある。このタイプの病状は、網膜下の異常な血管形成に導く。この制御されない血管の増加は、黄斑を長期にわたって傷害し、そして失明に至るかも知れない。糖尿病性網膜症に関しては、この病状は周辺細胞の顕著な消失により異常となる、網膜毛細血管の病気である。その後、血液網膜関門の破裂が観察され、血管の過透過性に導く。これらの悪化は、血管新生を引き起こす網膜虚血をもたらし、長期的には失明に導くであろう。これらのタイプの病状においては、病因論は制御されない血管ネットワークの発達に基づく。したがって、本発明のペプチドのような血管新生抑制性分子の使用は、これらの病状に対する有効な治療法である。
【００５７】
本発明のペプチドが血管新生抑制特性を有するため、それらは自己免疫疾患を治療又は予防するために有用である(Griffioen et al. (1999) Int J Cancer. 80: 315-9; Griffioen (2008) Cancer Immunol Immunother. 57:1553-8)。「自己免疫疾患」は、具体的には、多発性硬化症（MS）、炎症性腸疾患（IBD）、特に、クローン病及びエリテマトーデスを含む。
【００５８】
最後に、本発明のペプチド及びキメラ分子は、子宮血管新生そして胚着床をブロックすることによる、避妊のための妊娠中絶化合物としても有用である。
【００５９】
増殖性疾患は、増殖の任意の段階で治療可能である。「治療」は、(少なくとも病状の進行を緩和し、遅らせ又は停止させることを目的とする）治癒的処置を意味する。「予防」は、（病状の発症のリスクを低下させることを目的とする）予防的処置を意味する。
【００６０】
本発明のぺプチド及びキメラ分子は、同じ病気を治療又は予防することを目的とする第２の活性成分とともに使用されることもできる。癌の治療及び／又は予防の関係において、上記ペプチドは、例えば、腫瘍の除去のための手術、放射線療法、化学療法、ホルモン療法及び／又は免疫療法と組み合わせて使用可能である。
【００６１】
したがって、本発明のさらなる主題は、増殖性疾患、眼病変又は自己免疫疾患の治療及び／又は予防における使用のための、増殖性疾患、眼病変又は自己免疫疾患の治療のために有用な少なくとも１つの治療用化合物と組み合わせた、本発明のペプチド又はキメラ分子である。
【００６２】
「増殖性疾患、眼病変又は自己免疫疾患の治療のために有用な治療用化合物」は、本発明のペプチド以外の、増殖性疾患、眼病変又は自己免疫疾患の治療及び／又は予防のために有用な任意の活性成分を意味する。例えば、本発明のペプチドを、すでに製造承認を得ているこれらの病気の治療を目的とする活性成分と併用することが可能である。増殖性疾患の治療に有用な上記治療用化合物は、具体的には、さまざまな癌の治療に関して承認された以下の化合物を含む：アブラキサン（Abraxane）、アドリアマイシン（Adriamycin）（ドキソルビシン・ハイドロクロライド（Doxorubicin Hydrochloride））、アドルシル(Adrucil)（フルオロウラシル（Fluorouracil））、アルダラ（Aldara）（イミキモド（Imiquimod））、アレムツズマブ（Alemtuzumab）、アリムタ（Alimta）（ペメトレキセド２ナトリウム（Pemetrexed Disodium））、アミノレブリン酸（Aminolevulinic Acid）、アナストロゾール（Anastrozole）、アプレピタント（Aprepitant）、アリミデックス（Arimidex）（アナストロゾール）、アロマシン（Aromasin）（エキセメスタン（Exemestane））、アラノン（Arranon）（ネララビン（Nelarabine））、三酸化砒素（Arsenic Trioxide）、アバスチン(Avastin)（ベバシズマブ（Bevacizumab））、アザシチジン（Azacitidine）、ベンダムスチン・ハイドロクロライド（Bendamustine Hydrochloride）、ベバシズマブ（Bevacizumab）、ベキサロテン（Bexarotene）、ベキサール（Bexxar）（トシツモマブ（Tositumomab）及びヨウ素131トシツモマブ（I 131 Iodine Tositumomab））、ボルテゾミブ（Bortezomib）、キャンパス（Campath）（アレムツズマブ（Alemtuzumab））、カンプト（Camptosar）（イリノテカン・ハイドロクロライド（Irinotecan Hydrochloride））、カペシタビン（Capecitabine）、カルボプラチン（Carboplatin）、セツキシマブ（Cetuximab）、シスプラチン（Cisplatin）、クラフェン（Clafen）（シクロホスファミド（Cyclophosphamide））、クロファラビン（Clofarabine）、クロファレックス（Clofarex）（クロファラビン）、クロラール（Clolar）（クロファラビン）、シクロホスファミド（Cyclophosphamide）、シタラビン（Cytarabine）、サイトサール−U（Cytosar-U）（シタラビン（Cytarabine））、シトキサン（Cytoxan）（シクロホスファミド）、ダコゲン（Dacogen）（デシタビン（Decitabine））、ダサチニブ（Dasatinib）、デシタビン（Decitabine）、デポシト（DepoCyt）（リポソーム化シタラビン（Liposomal Cytarabine））、デポフォーム（DepoFoam）（リポソーム化シタラビン）、デクスラゾキサン・ハイドロクロライド（Dexrazoxane Hydrochloride）、ドセタキセル（Docetaxel）、ドキシル（Doxil）（ドキソルビシン・ハイドロクロライド・リポソーム（Doxorubicin Hydrochloride Liposome））、ドキソルビシン・ハイドロクロライド、ドキソルビシン・ハイドロクロライド・リポソーム、Dox-SL（ドキソルビシン・ハイドロクロライド・リポソーム）、エフデックス（Efudex）（フルオロウラシル（Fluorouracil））、エレンス（Ellence）（エピルビシン・ハイドロクロライド（Epirubicin Hydrochloride））、エロキサチン（Eloxatin）（オキサリプラチン（Oxaliplatin））、エメンド（Emend）（アプレピタント（Aprepitant））、エピルビシン・ハイドロクロライド、アービタックス（Erbitux）（セツキシマブ（Cetuximab））、エルロチニブ・ハイドロクロライド（Erlotinib Hydrochloride）、エバセット（Evacet）（ドキソルビシン・ハイドロクロライド・リポソーム）、エビスタ（Evista）（ラロキシフェン・ハイドロクロライド（Raloxifene Hydrochloride））、エキセメスタン（Exemestane）、ファスロデックス（Faslodex）（フルベストラント（Fluvestrant））、フェマーラ（Femara）（レトロゾール（Letrozole））、フルオロプレックス（Fluoroplex）（フルオロウラシル）、フルオロウラシル、フルベストラント、ゲフィチニブ（Gefitinib）、ゲムシタビン・ハイドロクロライド（Gemcitabine Hydrochloride）、ゲムツズマブ・オゾガマイシン（Gemtuzumab Ozogamicin）、ジェムザール（Gemzar）（ゲムシタビン・ハイドロクロライド）、グリベック（Gleevec）（イマチニブ・メシレート（Imatinib Mesylate））、ハーセプチン（Herceptin）（トラスツズマブ（Trastuzumab））、ハイカムチン（Hycamtin）（トポテカン・ハイドロクロライド（Topotecan Hydrochloride））、イブリツモマブ・チウキセタン（Ibritumomab Tiuxetan）、イマチニブ・メシレート（Imatinib Mesylate）、イミキモド（Imiquimod）、イレッサ（Iressa）（ゲフィチニブ）、イリノテカン・ハイドロクロライド（Irinotecan Hydrochloride）、イクサベピロン（Ixabepilone）、イクセンプラ（Ixempra）（イクサベピロン）、ケオキシフェン（Keoxifene）（ラロキシフェン・ハイドロクロライド）、ケピバンス（Kepivance）（パリフェルミン（Palifermin））、ラパチニブ・ジトシレート（Lapatinib Ditosylate）、レナリドミド（Lenalidomide）、レトロゾール（Letrozole）、レブラン（Levulan）(アミノレブリン酸)、リポドックス（LipoDox）（ドキソルビシン・ハイドロクロライド・リポソーム）、リポソーム化シタラビン（Liposomal Cytarabine）、メタゾラストン（Methazolastone）（テモゾロミド（Temozolomide））、ミロサール（Mylosar）（アザシチジン（Azacitidine））、マイロターグ（Mylotarg）（ゲムツズマブ・オゾガミシン）、パクリタキセルナノ粒子（Nanoparticle Paclitaxel）（パクリタキセルアルブミン安定化ナノ粒子製剤）、ネララビン（Nelarabine）、ネオサール（Neosar）（シクロホスファミド（Cyclophosphamide））、ネクサバール（Nexavar）（ソラフェニブ・トシレート（Sorafenib Tosylate））、ニロチニブ（Nilotinib）、ノルバデックス（Nolvadex）（タモキシフェン・シトレート（Tamoxifen Citrate））、オンキャスパー（Oncaspar）（ペグアスパルガーゼ（Pegaspargase））、オキサリプラチン（Oxaliplatin）、パクリタキセル、パクリタキセルアルブミン安定化ナノ粒子製剤、パリフェルミン（Palifermin）、パニツムマブ（Panitumumab）、パラプラット（Paraplat）（カルボプラチン（Carboplatin））、パラプラチン（Paraplatin）（カルボプラチン）、ペグアスパルガーゼ、ペメトレキセド２ナトリウム（Pemetrexed Disodium）、プラチノール−AQ（Platinol-AQ）（シスプラチン）、プラチノール（シスプラチン）ラロキシフェン・ハイドロクロライド、レブリミド（Revlimid）（レナリドマイド（Lenalidomide））、リツキサン（Rituxan）（リツキシマブ（Rituximab））、リツキシマブ、スクレロソール・イントラプルーラル・アエロゾル（Sclerosol Intrapleural Aerosol）（タルク（Talc））、ソラフェニブ・トシレート（Sorafenib Tosylate）、スプリセル（Sprycel）（ダサチニブ（Dasatinib））、ステライル・タルク・パウダー（Sterile Talc Powder）（タルク）、ステリタルク（Steritalc）（タルク）、スニチニブ・マレエート（Sunitinib Malate）、スーテント（Sutent）（スニチニブ・マレエート）、サイノビル（Synovir）（サリドマイド（Thalidomide））、タモキシフェン・シトレート（Tamoxifen Citrate）、タラビンPFS（Tarabine PFS）（シタラビン）、タルセバ（Tarceva）（エルロチニブ・ハイドロクロライド（Erlotinib Hydrochloride））、タルグレチン（Targretin）（ベキサロテン（Bexarotene））、タシグナ（Tasigna）（ニロチニブ（Nilotinib））、タキソール（Taxol）（パクリタキセル）、タキソテレ（Taxotere）（ドセタキセル（Docetaxel））、テモダール（Temodar）（テモゾロマイド（Temozolomide））、テモゾロマイド、テムシロリムス（Temsirolimus）、サロミド（Thalomid）（サリドマイド）、サリドマイド、トテクト（Totect）（デクスラゾキサン・ハイドロクロライド（Dexrazoxane Hydrochloride））、トポテカン・ハイドロクロライド（Topotecan Hydrochloride）、トリセル（Torisel）（テムシロリムス（Temsirolimus））、トシツモマブ（Tositumomab）及びヨウ素１３１トシツモマブ、トラスツズマブ（Trastuzumab）、トレアンダ（Treanda）（ベンダムスチン・ハイドロクロライド（Bendamustine hydrochloride））、トリセノックス（Trisenox）（三酸化ヒ素）、タイケルブ（Tykerb）（ラパチニブ・ジトシレート）、ベクチビックス（Vectibix）（パニツムマブ（Panitumumab））、ベルケード（Velcade）（ボルテゾミブ（Bortezomib））、ビダザ（Vidaza）（アザシチジン（Azacitidine））、ボリノスタット（Vorinostat）、ゼローダ（Xeloda）（カペシタビン）、ゼヴァリン（Zevalin）（イブリツモマブ・チウキセタン）、ザインカード（Zinecard）（デクスラゾキサン・ハイドロクロライド）、ゾレドロン酸（Zoledronic Acid）、ゾリンザ（Zolinza）（ボリノスタット（Vorinostat））、及びゾメタ（Zometa）（ゾレドロン酸）。
【００６３】
本発明のさらなる主題は、少なくとも１つの本発明のペプチド又は少なくとも１つの本発明のキメラ分子の治療的有効量を、場合により、増殖性疾患、眼病変又は自己免疫疾患の治療のために有用な少なくとも１つの治療用化合物とともに投与することを含む、哺乳動物、より特別には、ヒト、における増殖性疾患又は眼病変を治療又は予防する方法である。上記哺乳動物は、好ましくは、増殖性疾患、眼病変及び／又は自己免疫疾患に罹っているか又は罹りやすい哺乳動物である。
【００６４】
本発明はまた、本発明のペプチド又はキメラ分子、及び場合により１つ以上の医薬として許容可能な賦形剤を含む治療用組成物にも関する。
【００６５】
核酸及びベクター
１つの好ましい実施態様においては、本発明は、本発明のペプチド又はキメラ分子の使用又は投与に関する。
【００６６】
しかしながら、本発明のペプチドの代わりに、該ペプチドをコードする核酸を使用すること又は投与することによる、遺伝子治療を使用することを選択するのも可能である。この場合、核酸がその中へ移入されている患者細胞によりインビボで着目のペプチドが発現されるような条件下で、該ペプチドをコードする核酸が患者に投与される。
【００６７】
したがって、本発明は、本発明のペプチドをコードする配列を含むか又はそれから成る核酸にも関する。上記核酸は、デルマセプチンB2又はデルマセプチンB2の前駆体をコードするcDNAの断片をクローニングすることにより容易に得ることができる。より具体的には、本発明のペプチドを含むか又はコードする核酸は、配列番号３の配列により表される。
【００６８】
本発明のペプチドをコードする核酸は、具体的には、プラスミドベクターなどのDNAベクターの形態であることができる。それぞれが少なくとも１つの本発明のペプチドをコードしている１つ以上の配列を担持しているであろう、１つ以上のベクターを投与することが可能である。このベクターにおいては、少なくとも１つの本発明のペプチドをコードしている配列は、転写プロモーター、アクチベーター及び／又はターミネーターなどの、上記ペプチドの発現又は発現の制御を可能とする１つ又は複数の要素に機能的に連結されている。
【００６９】
１つの好ましい実施態様においては、使用されるベクターは、配列番号１又は配列番号２の配列のペプチドをコードする配列を担持している。より好ましい実施態様においては、使用されるベクターは、配列番号３の配列の核酸を担持している。
【００７０】
１又は複数のDNAベクターは、当業者に知られた任意の技術を用いてインビボにおいて挿入されることができる。特に、１又は複数のDNAベクターをインビボにおいて裸の形態で、すなわち、該ベクターの細胞中へのトランスフェクションを容易化するいかなるビヒクル又は系の支援もなしに、挿入することが可能である（EP465529）。
【００７１】
「金」粒子の表面上にDNAを沈着させ、該DNAが患者の皮膚を通過するようにこれらの粒子を発射するなどによる、遺伝銃も使用可能である（Tang et al., (1992) Nature 356: 152-4）。液体ジェルを用いる注射も、皮膚、筋肉、脂肪組織及び乳房組織をすべて同時にトランスフェクトすることが可能である（Furth et al., (1992) Anal. Biochem. 205: 365-8）。
【００７２】
他の利用可能な技術は、マイクロインジェクション、エレクトロポーレーション、リン酸カルシウム共沈殿法、ナノカプセルまたはリポソームを用いる製剤を含む。
【００７３】
ポリアルキルシアノアクリレート中の生分解性ナノ粒子は特に有利である。リポソームに関しては、カチオン性脂質の使用が陰性荷電した核酸の封入を促進し、そして、陰性荷電した細胞膜との融合を容易化する。
【００７４】
或いは、上記ベクターは、そのゲノム中に挿入された上記ペプチドをコードする核酸配列を含む組換えウイルスの形態であることもできる。
【００７５】
ウイルスベクターは、アデノウイルス、レトロウイルス、特に、レンチウイルス、及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ワクチンウイルスなどから選ばれることが好ましい。レンチウイルスベクターは、Firat et al., (2002) J Gene Med 4:38-45などに記載されている。
【００７６】
有利には、組換えウイルスは、欠損ウイルスである。「欠損ウイルス」という用語は、標的細胞中で複製できないウイルスを意味する。一般的に、欠損ウイルスのゲノムは少なくとも、感染細胞中での上記ウイルスの複製に必要な配列を欠いている。これらの領域は、除去されるか又は非機能性とされるか、或いは他の配列、そして特に着目のペプチドをコードする核酸により置き換えられることができる。それにもかかわらず、欠損ウイルスはウイルス粒子を封入するのに必要なそのゲノム配列を維持することが好ましい。
【００７７】
ターゲットを定めた遺伝子の投与は、例えば、ＰＣＴ国際特許出願公開第WO95/28494号に記載されている。
【００７８】
ペプチド及びキメラ分子の生産
本発明において有用なポリペプチドは、当業者に知られた任意の方法を用いて合成されることができる。かかる方法は、特に、（固相又は液体均一相中での）慣用の化学合成、構成的アミノ酸又はその誘導体からの酵素的合成、及び組換え宿主細胞を介する生物学的生産方法を含む。
【００７９】
化学的経路を介する合成は、純度、抗原特異性、望ましくない二次生産物がないという理由及びその容易な生産により特に有利である。そして、得られたペプチドは、場合により、当業者に周知の任意の方法を用いて精製されることができる。生産方法は、その安定性又はバイオアベイラビリティーを改善するための、ペプチドの化学的又は酵素的修飾の１つ以上のステップ、及び該ペプチドを治療用化合物に結合するための１つ以上のステップも含むことができる。
【００８０】
化学的経路を介する合成は、中でも、Merrifieldタイプの合成及びFmoc固相ペプチド合成（例えば、「Fmoc solid Phase peptide synthesis, a practical approach」W.C. Chan and P.D. White発行、Oxford University Press, 2000を参照のこと）を含む。
【００８１】
本発明はさらに、本発明のキメラ分子の生産方法であって、以下の：
ａ）好ましくは化学的経路を介する、本発明のペプチドの合成、
ｂ）増殖性疾患を治療するために有用な治療用化合物、増殖性疾患を治療するために有用な治療用化合物に分子を変換することのできる酵素、又はキャリアタンパク質と、上記ペプチドのコンジュゲーション、
を含む、上記方法にも関する。
【００８２】
本発明のキメラ分子の生産方法はさらに、得られたキメラ分子を医薬組成物、例えば、以下のパラグラフに記載の組成物の一つ、の中に製剤化するステップを含むことができる。
【００８３】
本発明のペプチドはまた、組換え宿主細胞による生物学的生産方法を用いて得られることもできる。かかる方法においては、本発明のペプチドをコードする核酸を含むベクターが、対応するペプチドの発現を可能とする条件下で培養される宿主細胞へ移入される。
【００８４】
その後、生産されたペプチドが集められ、そして精製されることができる。
【００８５】
使用される精製方法は、当業者に知られている。得られた組換えペプチドは、分画法、クロマトグラフィー法、特異的なモノクローナル又はポリクローナル抗体を用いるイムノアフィニティー技術などの方法を個別に、又は組み合わせて使用して、ライセート及び細胞抽出物から、培地の上清から得られることができる。
【００８６】
着目の核酸配列は、転写プロモーター、アクチベーター及び／又はターミネーターなどの該配列の発現又は発現の制御を可能とする１つ以上の要素にその中で機能的に連結される発現ベクター中に挿入されることができる。
【００８７】
ヌクレオチド配列の発現を制御するシグナル（プロモーター、アクチベーター、ターミネーター配列など）は、使用される宿主細胞にしたがって選択される。この目的のためには、本発明のヌクレオチド配列が、選択された宿主内の自己複製ベクター又は選択された宿主の組み込みベクター中に挿入されることができる。かかるベクターは、当業者により一般的に使用される方法を用いて調製され、そして、得られたクローンは、エレクトロポーレーション又はリン酸カルシウム共沈殿法などの標準的な方法を用いて好適な宿主中に挿入されることができる。
【００８８】
本発明により定義されたヌクレオチド配列を含む上記のクローニング及び／又は発現ベクターも、本発明の一部である。
【００８９】
本発明は、これらの発現ベクターによって一過性に又は安定な形態でトランスフェクトされた宿主細胞にも関する。これらの細胞は、上で定義されたベクター中に挿入されたヌクレオチド配列を、原核生物又は真核生物宿主細胞中に導入し、そして、上記細胞を、トランスフェクトされたヌクレオチド配列の複製及び／又は発現を可能とする条件下で培養することによって得られることができる。
【００９０】
宿主細胞の例は特に、HEK293、PER.C6などのヒト細胞、CHO、COS、MDCKなどの非ヒト哺乳動物細胞、SF9細胞などの昆虫細胞、エシェリキア・コリなどの細菌、L40及びY90などの真菌及び／又は酵母株を含む。
【００９１】
医薬組成物
本出願はまた、少なくとも本発明のペプチド又はキメラ分子を活性成分として含む、医薬組成物も記載する。一般的に、上記組成物は、１つ以上の医薬として許容可能な賦形剤を含む。
【００９２】
本発明のペプチド及びキメラ分子は、上記のペプチド及びキメラ分子のいずれか１つに相当することができる。本発明の１つの好ましい実施態様によれば、該ペプチドは、配列番号１又は配列番号２の配列のペプチドである。
【００９３】
「賦形剤」又は「医薬として許容可能なビヒクル」は、アレルギー反応などのいかなる二次的反応もヒト又は動物において引き起こさない、任意の溶媒、分散媒、吸収遅延剤などを意味する。
【００９４】
或いは、本発明は、好ましくは本発明のペプチドの発現又はその発現の制御を可能とする１つ以上の要素に機能的に連結された、本発明のペプチドをコードする核酸を活性成分として、１つ以上の医薬として許容可能な賦形剤とともに含む、医薬組成物も提供する。好ましい医薬組成物は、配列番号１又は配列番号２の配列のペプチドをコードする核酸を含む。
【００９５】
本発明は、１つ以上の医薬として許容可能な賦形剤の存在下で、本発明のペプチド、キメラ分子又は核酸を少なくとも含み、及び増殖性疾患、眼病変及び／又は自己免疫疾患の治療のために有用な少なくとも１つの治療用化合物を含む医薬組成物も提供する。
【００９６】
本発明の他の実施態様は、一方で本発明のペプチド、キメラ分子又は核酸を少なくとも含み、そして他方では増殖性疾患、眼病変及び／又は自己免疫疾患の治療のために有用な少なくとも１つの治療用化合物を含む、別個の組成物の本質的な同時投与を含む。
【００９７】
投与は、一方で本発明のペプチド、キメラ分子又は核酸を少なくとも含み、そして他方では増殖性疾患、眼病変及び／又は自己免疫疾患の治療のために有用な少なくとも１つの治療用化合物を含む、別個の組成物を用いて連続的に実施されることもできる。
【００９８】
用量は、考慮される活性成分、投与様式、治療指標、患者の年齢及び状態に明らかに依存する。
【００９９】
ペプチドの用量は、好ましくは1日あたり０．１〜２５０mg/kg、好ましくは１日あたり１〜１００又は０．５〜１００mg/kg、特別には、０．５〜５mg/kgである。ペプチドの単位用量は好ましくは、１２．５〜２００mgの上記ペプチドを含む。
【０１００】
医薬組成物が核酸を含む場合、投与される核酸（配列又はベクター）の用量も、特に投与様式、標的とされる病状及び治療期間にしたがって適合させられる。一般的に、組換えウイルスが使用される場合、これらは約１０4〜１０14pfu/ml、好ましくは106〜１０10pfu/mlの用量の形態で製剤化され、そして投与される。「pfu（プラーク形成単位）」という用語は、ウイルス溶液の感染の多重度に対応し、そして、好適な培養細胞を感染させ、そして、一般的には、４８時間後に感染細胞のプラーク数を測定することによって決定されることができる。ウイルス溶液のpfu力価を決定するための技術は、文献中に十分に記載されている。
【０１０１】
本発明の医薬組成物は、それらが単一経路又は異なる経路を介して患者に投与されることができるように、製剤化されることができる。
【０１０２】
本発明の医薬組成物は、例えば、非経口経路、特に静脈内、皮下又は筋肉内経路を介して、経口経路を介して、吸入を介して、或いは、局所又は眼内適用を介して投与されることができる。
【０１０３】
非経口経路、より具体的には注射による、が想定される場合、活性成分を含む本発明の組成物は、速度の遅い注入のためにアンプル又はボトル中に充填された溶質及び注射用懸濁液の形態である。注入は、具体的には、皮下、筋肉内又は静脈内経路を介して実施されることができる。
【０１０４】
好ましくは、特に固形腫瘍のためには、医薬組成物は腫瘍中に注射されることができる。
【０１０５】
経口経路を介する投与のためには、本発明の組成物は、カプセル、発泡性錠剤、被覆又は非被覆ピル、サシェ、糖衣錠、飲用アンプル又は溶質、微粒剤或いは持続放出形態である。
【０１０６】
非経口投与のための形態は、通常は、活性成分を緩衝剤、安定化剤、保存剤、可溶化剤、等張剤及び懸濁剤と混合することによって得られる。その後、知られた技術にしたがってこれらの混合物は滅菌され、そして静脈内注射用の溶液の形態で包装される。
【０１０７】
緩衝剤として、当業者は有機リン酸塩を含む緩衝剤を使用することができる。
【０１０８】
懸濁剤の例は、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、アカシア及びカルボキシメチルセルロースナトリウムを包含する。
【０１０９】
また、本発明にしたがって有用な安定化剤は、亜硫酸ナトリウム及びメタ亜硫酸ナトリウムを含むが、ｐ−ヒドロキシ安息香酸ナトリウム、アスコルビン酸、クレゾール及びクロロクレゾールが保存剤として言及されることができる。経口用溶液又は懸濁液の調製のためには、活性成分は、分散剤、保湿剤、（ポリビニルピロリドンなどの）懸濁剤、（メチルパラベン又はプロピルパラベンなどの）保存剤、味矯正剤又は香味剤とともに好適なビヒクル中に溶解又は懸濁される。
【０１１０】
マイクロカプセルの調製のためには、活性成分は、好適な希釈剤、好適な安定化剤、活性物質の持続放出を促進する剤、又はその後に（水溶性樹脂又は水不溶性樹脂などの）好適なポリマーで被覆される中心コアの形成のための他の任意の付加剤と併合される。当業者に知られた技術がこの目的のために使用される。
【０１１１】
こうして得られたマイクロカプセルはその後、場合により好適な用量単位に製剤化される。
【０１１２】
眼内経路を介する投与も、特に眼病変の治療のために考慮されることができる。
【０１１３】
そのとき、本発明の医薬組成物は、洗眼液又は眼軟膏などの、眼への局所投与のための眼科用組成物の形態にある。
【０１１４】
眼科用組成物は、その中に本発明のペプチドが溶解される、蒸留水、生理食塩水を含む水溶液であることができる。緩衝剤、涙との等張性を確保するための剤、保存剤、増粘剤、安定化剤、抗酸化剤、pH調節剤、キレート剤などの、いくつかの付加剤が必要に応じて眼科用組成物中に取り入れられることができる。
【０１１５】
点眼薬は無菌の取り扱いにより調製されるか、又は調製の適切な段階において滅菌が実施される。
【０１１６】
眼軟膏は、活性成分を通常の基剤と混合することにより無菌的に調製されることができる。眼軟膏のための基剤は、例えば：ワセリン、ジェレン５０（jelen 50）又はプラスチベース、マクロゴールなどである。親水性を増加させるために界面活性剤が添加されることができる。保存剤などの上記のような付加剤が、必要に応じて添加されることができる。
【０１１７】
一般に、局所の眼科適用のためには、０．００１〜１０％、好ましくは０．０１〜１重量／体積％の本発明の化合物又は医薬として許容可能なその塩を含む製剤の１滴を、好ましくは１日に１〜６回、好ましくは各回１〜４滴、眼に投与することにより、そして、眼軟膏が使用される場合には、０．００１〜１０％、好ましくは０．０１〜１重量／体積％の本発明の化合物又は医薬として許容可能なその塩を含む製剤が、好ましくは１日に１〜６回、眼に適用されることにより、満足のいく結果が成人において得られる。
【０１１８】
本発明のペプチド、キメラ分子及び核酸は、リポソームの形態に製剤化されることもできる。リポソームは、水性媒体中に分散されて自然発生的に多層の同心円状の二層小胞を形成するリン脂質から形成される。これらの小胞は一般に、２５nm〜４μmの直径を有し、そして、超音波処理されて、そのコアが水溶液を含んでいる直径２００〜５００Åのより小さな単層状の小胞を形成する。
【０１１９】
リポソームは、正確な細胞又は組織標的に医薬製品を投与するために特に有利である。この目的のためには、脂質は、（ホルモンなどの）標的化ペプチド又は抗体などの標的化分子に化学的に結合されることができる。
【０１２０】
以下の実施例及び図は、その範囲を制限することなく本発明を例解する。
【図面の簡単な説明】
【０１２１】
【図１】図１Aは、処置において使用されたデルマセプチンB2の濃度（μg/ml）に対する、ウエルあたりの前立腺腺癌細胞PC-3の数（Y軸に沿って示される数×１０4）を示すヒストグラムを表す。**：対照（０）に対してｐ＜０．０１；***：対照（０）に対してｐ＜０．００１。図１Bは、処置において使用されたデルマセプチンB2の濃度（μg/ml）に対する、ウエルあたりのマウス胚細胞CESの数（Y軸に沿って示される数×１０4）を示すヒストグラムを表す。*：対照（０）に対してｐ＜０．０５；***：対照（０）に対してｐ＜０．００１。図１Cは、処置において使用されたデルマセプチンB2の濃度（μg/ml）に対する、ウエルあたりの前立腺過形成細胞G1947の数（Y軸に沿って示される数×１０4）を示すヒストグラムを表す。*：対照（０）に対してｐ＜０．０５。
【図２】図２Aは、処置において使用されたデルマセプチンB2の濃度（μM）に対する、ウエルあたりのヒトリンパ腫細胞LB-EBVの数（Y軸に沿って示される数×１０4）を示すヒストグラムを表す。**：対照（C）に対してｐ＜０．０１。***：対照（C）に対してｐ＜０．００１。図２Bは、処置において使用されたデルマセプチンB2の濃度（μM）に対する、ウエルあたりのヒトリンパ腫細胞Rajiの数（Y軸に沿って示される数×１０4）を示すヒストグラムを表す。***：対照（C）に対してｐ＜０．００１。
【図３】図３Aは、５μMのデルマセプチンB2で処置された、又は未処置（C）の、ヒト腺癌細胞PC-3の１mm3あたりのコロニー数を示すヒストグラムを表す。***：対照（C）に対してｐ＜０．００１。図３Bは、５μMのデルマセプチンB2で処置された、又は未処置（C）の、ヒト癌細胞MBA-MB231の１mm3あたりのコロニー数を示すヒストグラムを表す。***：対照（C）に対してｐ＜０．００１。
【図４】図４Aは、無胸腺マウスへのPC-3細胞の異種移植により得られた腫瘍の腫瘍体積(mm3)の経時変化を示すグラフを表す。マウスはPBS（黒四角）、タキソール（黒丸）又はデルマセプチンB2（黒逆三角）で処置され、該処置は細胞の注射の１週間後に開始した。矢印は、異なる用量のデルマセプチンB2による処置を示す。図４Bは、無胸腺マウスへのPC-3細胞の異種移植により得られた腫瘍の、２９日間の処置後の重量（ｇ）を示すグラフを表す。マウスは、PBS（黒四角）、タキソール（黒三角）又はデルマセプチンB2（黒逆三角）で処置され、該処置は細胞の注射の１週間後に開始した。
【図５】図５Aは、処置において使用されたデルマセプチンB2の濃度（μM）に対する、ウエルあたりのABAE細胞の数（パーセンテージ）を示すヒストグラムを表す。***：対照（０）に対してｐ＜０．００１。図５Bは、FGF-2の存在下における、５μMのデルマセプチンB2により処置された、又は未処置（C）のABAE細胞により形成された毛細血管の視野あたりの数を示すヒストグラムを表す。***：対照（C）に対してｐ＜０．００１。
【図６】図６は、２．５μMのデルマセプチンB2の非存在下（C）又は存在下（D）で、２４時間又は７２時間インキュベートされた、アネキシンV標識及びヨウ化プロピジウム標識の両方に対して陽性である、PC-3細胞のパーセンテージを示すヒストグラムを表す。
【図７】図７は、２．５μMのデルマセプチンB2の非存在下（C）又は存在下（D）で、２４時間又は７２時間インキュベートされた、アネキシンV標識及びヨウ化プロピジウム標識の両方に対して陰性である、PC-3細胞のパーセンテージを示すヒストグラムを表す。
【図８】図８は、２．５μMのデルマセプチンB2の非存在下（C）又は存在下（D）で、２４時間又は７２時間インキュベートされた、アネキシンV標識に対しては陽性であるが、ヨウ化プロピジウム標識に対して陰性である、PC-3細胞のパーセンテージを示すヒストグラムを表す。
【図９】図９は、２．５μMのデルマセプチンB2の非存在下（C）又は存在下（D）で、２４時間又は７２時間インキュベートされた、アネキシンV標識に対しては陰性であるが、ヨウ化プロピジウム標識に対して陽性である、PC-3細胞のパーセンテージを示すヒストグラムを表す。
【図１０】図１０は、アネキシンV FITC及びヨウ化プロピジウム（PI）で標識された、未処置PC-3細胞のドットブロットフローサイトメトリー分析を表す。
【図１１】図１１は、アネキシンV FITC及びヨウ化プロピジウム（PI）で標識された、２．５μMのデルマセプチンB2で２４時間処置されたPC-3細胞のドットブロットフローサイトメトリー分析を表す。
【実施例】
【０１２２】
実施例
以下の実施例は、細胞増殖を阻害するデルマセプチンB2の能力、そしてしたがって増殖性疾患の治療におけるその使用の利益を示す。
【０１２３】
実施例１：デルマセプチンB2は、接着性又は非接着性腫瘍細胞の成長を阻害するが、非腫瘍細胞にはわずかな効果のみを有する。
デルマセプチンB2の抗増殖作用を、異なるタイプの細胞：PC-3腺癌細胞及びG1947ヒト前立腺過形成細胞及びマウス胚細胞（CES）においてインビトロで評価した。異なるタイプの細胞を、０．５mlの培地（PC-3及びG1947細胞のための、５％ウシ胎仔血清を補充したRPMI、又はCES細胞のための、１０％ウシ胎仔血清を補充したDMEM）中、１０4細胞／cm2で、２４ウエルプレート中に播いた。２４時間後、細胞を異なる用量のデルマセプチンB2で処置した。その後、細胞播種の３及び５日後に処置を更新した。６日目にクリスタルバイオレットによる染色により、細胞カウントの推定を行った。細胞をPBSですすぎ、無水エタノールで脱水することによりプラスチック上に固定し、そして、２％エタノール中のクリスタルバイオレットの０．２％溶液で１５分間染色した。洗浄後、細胞を１％SDS溶液で可溶化した。分光光度計を用いて５９５nmにおいてクリスタルバイオレットの光学密度（OD）を測定した。細胞のOD数の変換のために、標準レンジを作成した。
【０１２４】
デルマセプチンB2は、PC-3腫瘍細胞の増殖を用量依存的に阻害することができる(図１)。この阻害は、５μM以上のデルマセプチンB2では、９０％超である。この濃度において、デルマセプチンB2の効果はこれらの細胞に対する細胞障害性効果を反映するよりも高かった。発明者らは、これらの濃度における細胞の大半がアッセイの最後には培養皿の底から剥離していたことを事実上観察した。７．５μMのデルマセプチンB2により、約２０％のわずかな阻害をヒトG1947過形成細胞において観察した。CES細胞においては、この阻害は試験した最大用量でもより低かった（約１０％）。PC-3細胞とは異なり、胚及びG1947細胞については、細胞の剥離は処置中に観察されなかった。
【０１２５】
ヒトB-リンパ腫由来の２つの非接着性系統：Raji及びLB-EBV系統の成長に対してもデルマセプチンB2を試験した。２．５％の補体除去ウシ胎仔血清を補充したRPMI培地０．５ml中、ウエルあたり１０4細胞で細胞を播いた。播腫の２４時間後、細胞を異なる濃度のデルマセプチンB2で処置した。そして、細胞播種の３及び５日後に処置を更新した。７日目に、先に記載したように、クリスタルバイオレットで染色することにより、細胞カウントを推定した。
【０１２６】
デルマセプチンB2は、試験した２つのヒトリンパ腫系統の増殖も用量依存的に阻害する（図２）。１０μMにおいて、デルマセプチンB2は、LB-EBV及びRaji細胞の成長を約９５％阻害する。
【０１２７】
実施例２：デルマセプチンB2は、軟寒天中、インビトロで培養した腫瘍細胞の成長を阻害する。
PC-3細胞についてプラスチック上で観察した細胞成長の阻害を確認するために、発明者らは、寒天中でコロニーを形成することによる固着とは無関係に増殖するPC-3細胞の能力に対するデルマセプチンB2の効果を試験した。このアッセイのために、０．３５％の寒天及び可変濃度のデルマセプチンB2を含む完全培地（５％ウシ胎仔血清を補充したRPMI）で希釈した細胞を１cm2あたり２．５×１０3個の密度で、１mlの０．６％固形寒天を含む１２ウエルの皿に播種した。同じ可変濃度のデルマセプチンB2を、播種の日及び１週間に２回、培養上に被覆した完全培地にも加えた。水蒸気で飽和し、７％CO2を含むインキュベーター中、３７℃での１２日間のインキュベーション後、直径が５０μmより大きいコロニーを数えた。各測定を三連で行い、各実験は３回繰り返した。
【０１２８】
５μMの濃度において、デルマセプチンB2は、軟寒天上でのPC-3細胞の成長を完全に阻害する（図３A）。第５日において、デルマセプチンB2で処置したウエル中に細胞は存在しなかった。
【０１２９】
この増殖阻害は、誘導された細胞死又は細胞障害性効果に対する使用した用量のデルマセプチンB2の効果を反映する。位相差顕微鏡下で観察した場合、デルマセプチンで処置した細胞は、その播種後の３日目には早くも未処置細胞のような屈折性であるようには見えない。この実験をヒト乳癌MBA-MB231細胞系統で実施した場合、同様の結果を観察した（図３B）。
【０１３０】
実施例３：デルマセプチンB2は、ヌードマウスモデルにおいてインビボでPC-3細胞の腫瘍成長を阻害する。
デルマセプチンB2が寒天上のPC-3及びMDA-MB231細胞の成長を阻害する能力を有するということを立証して、発明者らは、PC-3のヌードマウスへの注射により誘導された腫瘍の成長に対するこのペプチドの効果を試験した。１群１０匹のヌードマウス（ヌード／ヌード、Laboratoire IFFA CREDO）の群に２×１０6個のPC-3細胞を注射した。細胞の注射の１週間後に、触知可能な腫瘍を有する動物を無作為にケージに割り当て、1日あたり１００μlのPBS溶液（対照群）又はPBSで希釈したデルマセプチンB2溶液を腫瘍中に注射することによって処置した。処置の第１週にはデルマセプチンB2を５mg/kgの濃度で注射し、その後、１２日間はこの用量を０．５mg/kgに減少させた。いくつかの処置動物における腫瘍成長の再開に続いて、デルマセプチンB2を再び５mg/kgで１週間注射し、その後、処置終了まで用量を２mg/kgに減少させた。対照として、１群のマウスをタキソール（登録商標）（パクリタキセル、Bristol-Myers Squibb）で１週間に２回、１０mg/kgの腹腔内注射により処置した。処置開始から２９日後に動物をと殺するまで、腫瘍のサイズを１週間に２回キャリパーを用いて測定した。と殺後、腫瘍を除去して重量測定した。
【０１３１】
結果を図４Aに示し、そして、結果はデルマセプチンB2が、非処置腫瘍に比べて４７％の腫瘍成長の阻害を誘導することを示している。この阻害は、それがわずか３６％であったタキソール（登録商標）で観察されたものよりも実質的に高い。
【０１３２】
動物のと殺後、腫瘍を取り出して重量測定した。図４Bは、対照動物及びデルマセプチンB2又はタキソールのいずれかで処置した動物から得られた腫瘍の重量の違いを示している。得られた結果は、特に、処置中の腫瘍体積の測定により、デルマセプチンB2で処置した３匹のマウスにおいて腫瘍が完全に消失したことを確認した。
【０１３３】
実施例４：デルマセプチンB2は、インビトロにおいて、内皮細胞の成長及び擬似毛細血管の形成を阻害する。
デルマセプチンB2の血管新生抑制活性を、第一にプラスチック上でのウシ成体動脈内皮細胞（ABAE）の増殖、そして、第二にコラーゲンゲル中でのこれらの同じ細胞による擬似毛細血管の形成、を阻害するその能力に関して評価した。増殖試験のために、ABAE細胞を１０4細胞／ウエルの密度で、１０％ウシ胎仔血清及び５ng/mlのFGF-2を補充したDMEM培地中、２４ウエルプレートに播いた。先に記載の増殖試験については、播種の２４時間後に細胞を異なる用量のデルマセプチンB2で処置した。その後、細胞播種の３及び５日後に処置を更新した。７日目に細胞カウントを、クリスタルバイオレット染色により推定した。
【０１３４】
発明者らは、デルマセプチンB2が、ABAE細胞の成長の用量依存的な及び完全な阻害を誘導することを示した（図５A）。PC-3細胞については、得られた結果は、デルマセプチンB2によるABAE細胞に対する細胞障害性又は誘導された細胞死に関連するように見える。なぜなら、５及び７．５μMの用量については、発明者らは死細胞の存在（処置中に観察された細胞の剥離）の増加を観察したからである。
【０１３５】
擬似毛細血管の形成に対するデルマセプチンB2の効果を、Montessano試験を使用して評価した。この試験は、コラーゲン１ゲル上に単層で播種した場合のABAE細胞の擬似毛細血管への分化を評価することを可能とする。このアッセイのために、ABAE細胞を１０5細胞／ウエルの割合で、１０％ウシ胎仔血清を補充したDMEM培地中、２４ウエルプレート中のコラーゲン１ゲルの単層上に播いた。播種の２４時間後、可変濃度のデルマセプチンB2の非存在下又は存在下で２０ng/mlのFGF-2を細胞に添加した。この処置を２日で更新し、擬似毛細血管のネットワークの形成を、２４時間後に位相差顕微鏡下で観察視野あたりの形成された毛細血管数を測定することにより評価した（図５C及びD）。
【０１３６】
図５Bは、ここで５μMで使用したデルマセプチンB2が、FGF-2により誘導された擬似毛細血管の形成を強力に阻害することを示している。増殖アッセイとは反対に、デルマセプチンB2は、ABAE細胞の単層に対していかなる細胞障害性作用も有さなかった。
【０１３７】
示したすべての結果は、デルマセプチンB2が、血管新生の２つの本質的ステップ：内皮細胞の増殖及び分化、を阻害可能であることを示している。
【０１３８】
実施例５：デルマセプチンB2は、ヒトPC-3腺癌細胞においてアポトーシス及びネクローシスを増加させる。
PC-3又はABAE細胞の増殖アッセイの間、デルマセプチンB2の存在下、急速に観察された阻害剤効果及び処置した細胞の非屈折性は、デルマセプチンB2が、感受性細胞の成長をブロックするよりも、細胞障害性の役割又は細胞死を誘導する役割を有しうるとの推測に導く。デルマセプチンB2が感受性細胞のアポトーシスを誘導しうるか否かを決定するために、発明者らは、プラスチック上の培養中の、デルマセプチンB2で処置されるか又はされないPC-3細胞に対する、アネキシンV及びヨウ化プロピジウムによる二重標識実験を実施した。これらの実験に続いて、標識細胞のフローサイトメトリー分析を行った。
【０１３９】
この目的のために、細胞を、２．５μMのデルマセプチンB2の非存在下又は存在下において、２４又は７２時間、６ウエルプレートに播いた。そして、細胞を剥離し、冷PBSで洗浄し、そして１００μlのアネキシンV FITCを含む固定バッファー(MACs、Miltenyi Biotec)中に、暗所で１０分間再懸濁した。PBS中での洗浄後、最終濃度１μg/mlのヨウ化プロピジウム（PI）を含む固定バッファー中、暗所で５分間インキュベーションすることによって再び標識した。更なる洗浄後、フローサイトメーター（FACScan、Becton Dickinson Labware）を通過させることにより、細胞を分析した（図１０及び１１）。
【０１４０】
２．５μMのデルマセプチンB2による２４時間のPC-3細胞の処置は、アネキシンV及びPIで２重に標識された細胞の強力な増加（約３０％）を誘導し、これは細胞のアポトーシスの増加を表す（図６）。このパーセンテージは、細胞を７２時間処置しても変わらない。反対に、非標識細胞のパーセンテージは、同じ比率で急激に低下した（図７）。デルマセプチンB2はまた、２４時間の処置後にアネキシンVでのみ標識された細胞のパーセンテージも５倍に増加させ、それにより、細胞が初期のアポトーシスに入っていることを表している（図８）。最後に、デルマセプチンB2は、PIのみにより標識された細胞のパーセンテージも３倍に増加させ、それにより、ネクローシスと同義の急激な細胞死を表す（図９）。ここでも、２４及び７２時間の処置時間の間にはわずかの変化しか観察しなかった。
【０１４１】
これらの結果は、PC-3細胞に対するデルマセプチンB2の効果が、２４時間の処置時間後の細胞死の強力な増加として現れることを示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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