(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
上流プライマーを使用しない反復的エキソ核酸切断反応（ｃｙｃｌｉｃ  ｅｘｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ  ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＣＥＲ）により固相でＤＮＡ又は核酸混合物からターゲット核酸配列を検出する方法であって、
（ａ）ターゲット核酸配列を固定化プローブにハイブリッド形成させる工程であって、前記固定化プローブは、前記ターゲット核酸配列に相補的なヌクレオチド配列及び検出可能なシグナルを発生させる単一標識を含み、前記固定化プローブは、その３’−末端を通じて固相基質に固定化されている工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）の結果物を前記固定化プローブの切断が発生する条件下で５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する熱安定性酵素と接触させる工程であって、前記固定化プローブは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する前記熱安定性酵素により切断され、前記固定化プローブから前記単一標識が解離されて前記固相基質上のシグナルの減少を引き起こし、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する前記熱安定性酵素は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的核酸ポリメラーゼである工程と、
（ｃ）前記工程（ｂ）の結果物を変性させる工程と、
（ｄ）上流プライマーを使用しないで前記工程（ａ）−（ｃ）を少なくとも２回反復して、前記固相基質上の前記シグナルを更に減少させる工程と、
（ｅ）前記固相基質上の前記シグナルの減少を検出する工程であって、前記固定化プローブの切断による前記シグナルの減少は、前記ターゲット核酸配列の存在を示す工程と、
を含み、前記上流プライマーは、前記固定化プローブのハイブリッド形成位置（ｈｙｂｒｉｄｉｚｅｄ  ｓｉｔｅ）より下流位置にハイブリッド形成し、鋳型依存的核酸ポリメラーゼにより伸長されるプライマーであることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記検出は、前記工程（ｄ）の反復の終了時点で行われる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記検出は、前記工程（ｄ）の反復のサイクル毎に行われる請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記検出は、前記反復の間、所定の時間間隔のそれぞれにおいて行われる請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記固定化プローブ上の前記単一標識は、プローブの５’−末端又は５’−末端から１〜５ヌクレオチド離隔された位置にある請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記工程（ａ）は、前記固定化プローブにハイブリッド形成される前記ターゲット核酸配列を生成するための逆方向プライマーを更に含む請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記工程（ａ）は、前記固定化プローブのハイブリッド形成位置（ｈｙｂｒｉｄｉｚｅｄ  ｓｉｔｅ）の下流位置にハイブリッド形成される上流プローブを更に含み、前記上流プローブの３’−末端は、伸長反応が抑制されるようにブロッキングされている請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記方法は、前記ターゲット核酸配列の定量的検出に利用される請求項３又は４に記載の方法。
【請求項９】
前記ターゲット核酸配列は、少なくとも２種の核酸配列を含み、前記固定化プローブは、少なくとも２種のプローブを含む請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ターゲット核酸配列は、ヌクレオチド変異を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
上流プライマーを使用しない反復的エキソ核酸切断反応（ｃｙｃｌｉｃ  ｅｘｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ  ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＣＥＲ）により固相でＤＮＡ又は核酸混合物からターゲット核酸配列を検出する、請求項１から１０のいずれかに記載の方法の実施における使用のためのキットであって、
（ａ）固相基質と、
（ｂ）前記ターゲット核酸配列に相補的なヌクレオチド配列及び検出可能なシグナルを発生させる単一標識を含む固定化プローブであって、その３’−末端を通じて前記固相基質に固定化されている固定化プローブと、
（ｃ）５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的核酸ポリメラーゼと、
を含み、前記上流プライマーは、前記固定化プローブのハイブリッド形成位置（ｈｙｂｒｉｄｉｚｅｄ  ｓｉｔｅ）より下流位置にハイブリッド形成し、鋳型依存的核酸ポリメラーゼにより伸長されるプライマーであることを特徴とするキット。
【請求項１２】
前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する熱安定性酵素である請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
前記固定化プローブ上の前記単一標識は、プローブの５’−末端又は５’−末端から１〜５ヌクレオチド離隔された位置にある請求項１１に記載のキット。
【請求項１４】
前記キットは、前記固定化プローブにハイブリッド形成される前記ターゲット核酸配列を生成するための逆方向プライマーを更に含む請求項１１に記載のキット。
【請求項１５】
前記キットは、前記固定化プローブのハイブリッド形成位置（ｈｙｂｒｉｄｉｚｅｄ  ｓｉｔｅ）の下流位置にハイブリッド形成される上流プローブを更に含み、前記上流プローブの３’−末端は、伸長反応が抑制されるようにブロッキングされている請求項１１に記載のキット。
【請求項１６】
前記キットは、前記ターゲット核酸配列の定量的検出に利用される請求項１１に記載のキット。
【請求項１７】
前記固定化プローブは、少なくとも２種のプローブを含む請求項１１に記載のキット。
【請求項１８】
前記固定化プローブは、ヌクレオチド変異に相補的なヌクレオチド又はヌクレオチド変異に相当するヌクレオチドを含む請求項１１に記載のキット。
【請求項１９】
前記ターゲット核酸配列は、ヌクレオチド変異を含み、前記固定化プローブは、前記ヌクレオチド変異に相補的なヌクレオチド又は前記ヌクレオチド変異に相当するヌクレオチドを含む請求項１１に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、単一標識固定化プローブを利用し、固相で反復的エキソ核酸切断反応（ｃｙｃｌｉｃ  ｅｘｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ  ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＣＥＲ）又はエキソ核酸切断反応（ｅｘｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ  ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＥＲ）によりターゲット核酸配列を検出する新規な方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
マイクロアレイ技術は、遺伝子又は遺伝子群の存在、水準又は発現パターンを分析可能な有望なツールとして大きな脚光を浴びている（非特許文献１〜２）。しかし、従来のＤＮＡマイクロアレイ方法は、主にハイブリッド形成方式に依存してターゲットヌクレオチド配列を検出するため、偽陽性の比率が高いという深刻な短所がある。特に、普段従来のＤＮＡマイクロアレイで発生する交差反応（非特異的ハイブリッド形成）及び減少された低下した感度により、最終ハイブリッド形成シグナルの信頼度が急激に低下する（非特許文献３）。
【０００３】
このようなマイクロアレイ技術の問題点を克服するために、ハイブリッド形成方式にのみ依存せず、ＤＮＡポリメラーゼ反応又はリガーゼ（ｌｉｇａｓｅ）反応のような酵素的反応を利用してターゲット検出の信頼度を向上させる、多様で新規なマイクロアレイアプローチが提示された。
【０００４】
ＳＢＥ（ｓｉｎｇｌｅ  ｂａｓｅ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）又はミニシーゲンシング（ｍｉｎｉｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）方法（ＳＢＥ：非特許文献４〜５）は、単一標識ｄｄＮＴＰｓ存在下で５’→３’ＤＮＡポリメラーゼを利用し、単一標識ｄｄＮＴＰｓを含むプライマーの単一塩基延長を誘導することによりターゲットを検出する。
【０００５】
ライゲーション方法（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，ＩＮＣ，Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｏｎ  ａｒｒａｙｓ；特許文献１）は、リガーゼを利用してアレイプローブと単一標識プローブをライゲーションさせることによりターゲット配列を検出する。
【０００６】
例えこのような従来方法が単一標識分子を利用したマイクロアレイターゲット検出アプローチを提供しているにもかかわらず、前記方法は、深刻な短所を有している。例えば、ＳＢＥ方法及びライゲーション方法は、それぞれ標識されたｄｄＮＴＰｓ及び第２の標識されたプローブのような追加的な構成要素が必要であり、さらにこのような追加的な構成要素に対する追加的な反応が要求される。また、このような方法は、ＤＮＡポリメラーゼ及びリガーゼが有している内在的な反応エラー率により、偽陽性シグナルが発生する可能性がある。
【０００７】
一方、ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’ヌクレアーゼ活性及び二重標識プローブを利用してターゲット配列を検出する固相ＴａｑＭａｎプローブ方法が紹介された（非特許文献６）。上記方法において、二重標識プローブは、固相基質上に固定化される。前記方法は、ＤＮＡポリメラーゼのプライマー依存的５’→３’ヌクレアーゼ活性による二重標識プローブの切断から発生するシグナルの増加を検出することにより、ターゲット配列を検出する。前記プライマー依存的５’→３’ヌクレアーゼ活性は、上流プライマー又は上流プライマーの延長産物に結合されたＤＮＡポリメラーゼによってのみ二重標識プローブが切断されることを意味する。
【０００８】
このような二重標識方法は、問題とされる考慮要因を有している。例えば、プローブ上のレポーター及びクエンチャー分子の位置は、酵素的切断によって２種の標識分子が分離されて、切断反応後にもレポーター分子が固相基質上に残っているように考慮して決定しなければならない。レポーター及びクエンチャー分子間の距離が遠いほど、不安定なクエンチングにより、バックグラウンドシグナルが発生する可能性が多い。このようなプローブ上の二重標識システムに関わるややこしい考慮要因は、固相ＴａｑＭａｎプローブ方法のためのプローブのデザインにおいて、限界及び困難を招く。さらに、２種の標識分子の利用は、費用効率的な面で適していない。また、切断反応のための追加的な上流プライマーの使用は、このような方法を更に難しくする。
【０００９】
したがって、単一標識分子のみを利用し、ターゲット配列、好ましくは多数のターゲット配列を一つのＤＮＡマイクロアレイ上で、より簡便でありながらも改善された信頼度及び再現性で検出することができる新規なＤＮＡマイクロアレイ技術の開発に対する長年の切実な要求が当業界で依然として残っている。また、ターゲット核酸配列の定量的分析のために、単一標識分子のみを利用する新規なリアルタイムマイクロアレイ方法に対しても当業界に求められている。
【００１０】
本明細書全体にかけて多数の特許及び文献が参照され、その引用が表示されている。このような特許及び文献の公開は、その全体が本明細書に参照として取り込まれ、本発明の属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許第２００８／０１３１８９４号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｓｃｈｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｗｉｔｈ  ａ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７０：４６７−４７０
【非特許文献２】ＤｅＲｉｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｕｓｅ  ｏｆ  ａ  ｃＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｔｏ  Ａｎａｌｙｓｅ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １４：４５７−４６０
【非特許文献３】Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｅ．Ｂｕｎｎｅｙ，ｅｔ  ａｌ．２００３．Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｎｅｗ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｔｏ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒ  Ｃａｎｄｉｄａｔｅ  Ｖｕｌｎｅｒａｂｉｌｉｔｙ  Ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，Ａｍ．Ｊ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  １６０：４，６５７−６６６
【非特許文献４】Ｓｈｕｍａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｓｏｌｉｄ  ｐｈａｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ．Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．７：３４６−３５４（１９９６）
【非特許文献５】Ｐａｓｔｉｎｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｎｉｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：  ａ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ｏｎ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｒｒａｙｓ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．７：６０６−６１４（１９９７）
【非特許文献６】Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，ＴａｑＭａｎ  ｐｒｏｂｅ  ａｒｒａｙ  ｆｏｒ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｔａｒｇｅｔｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．３４：ｅ４（２００６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
このような状況において、本発明者らは、ターゲット核酸配列を、より簡便でありながらも偽陽性及び偽陰性結果無しに固相で検出、同定及び定量することができる新規なターゲット検出技術を開発するために鋭意研究した。その結果、本発明者らは、固相における新規な検出プロトコールを確立して、この新規プロトコールによると、単一標識を有する固定化されたプローブを利用し、固相で反復的エキソ核酸切断反応（ｃｙｃｌｉｃ  ｅｘｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ  ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＣＥＲ）又はエキソ核酸切断反応（ｅｘｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ  ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＥＲ）により、ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルの減少が発生してシグナル減少が増幅される。前記新規な検出プロトコールは、単一標識システムを利用して固相でターゲット核酸配列を検出するのに非常に適している。
【００１４】
したがって、本発明の目的は、固相で反復的エキソ核酸切断反応（ＣＥＲ）を利用して、ＤＮＡ又は核酸混合物からターゲット核酸配列を検出する方法を提供することにある。
【００１５】
本発明の他の目的は、固相でエキソ核酸切断反応（ＥＲ）を利用して、ＤＮＡ又は核酸混合物からターゲット核酸配列を検出する方法を提供することにある。
【００１６】
本発明のまた他の目的は、固相で反復的エキソ核酸切断反応（ＣＥＲ）又はエキソ核酸切断反応（ＥＲ）を利用して、ＤＮＡ又は核酸混合物からターゲット核酸配列を検出するキットを提供することにある。
【００１７】
本発明の他の目的及び利点は、発明の詳細な説明、請求の範囲及び図面により、さらに明確にされる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、本発明の方法を図式的に示す図である。固相基質上の単一標識固定化プローブがターゲット核酸配列にハイブリッド形成される場合、その５’−末端部位は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断されて、単一標識は、プローブから解離される。このような単一標識の解離により固相基質上のシグナルの減少が発生し、これは、ターゲット核酸配列の存在を示す。
【図２Ａ】図２Ａ及び図２Ｂは、固相基質上に固定化された単一標識プローブを利用する本発明の反復的エキソ核酸切断反応（ｃｙｃｌｉｃ  ｅｘｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ  ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＣＥＲ）によるターゲット検出結果を示す。図２Ａは、サイクル数に相当する蛍光イメージを示し、図２Ｂは、前記イメージの蛍光強度を示す。
【図２Ｂ】図２Ａ及び図２Ｂは、固相基質上に固定化された単一標識プローブを利用する本発明の反復的エキソ核酸切断反応（ｃｙｃｌｉｃ  ｅｘｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ  ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＣＥＲ）によるターゲット検出結果を示す。図２Ａは、サイクル数に相当する蛍光イメージを示し、図２Ｂは、前記イメージの蛍光強度を示す。
【図３Ａ】図３Ａ及び図３Ｂは、固相基質上に固定化された単一標識プローブを利用する本発明のエキソ核酸切断反応（ｅｘｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ  ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＥＲ）によるターゲット検出結果を示す。図３Ａは、インキュベーション時間に相当する蛍光イメージを示し、図３Ｂは、前記イメージの蛍光強度を示す。
【図３Ｂ】図３Ａ及び図３Ｂは、固相基質上に固定化された単一標識プローブを利用する本発明のエキソ核酸切断反応（ｅｘｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ  ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＥＲ）によるターゲット検出結果を示す。図３Ａは、インキュベーション時間に相当する蛍光イメージを示し、図３Ｂは、前記イメージの蛍光強度を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明は、単一標識プローブ及び５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を利用する新規な固相方法に関する。
【００２０】
本発明は、反復的エキソ核酸切断反応（ｃｙｃｌｉｃ  ｅｘｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ  ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＣＥＲ）又は非反復的エキソ核酸切断反応（ｎｏｎ−ｃｙｃｌｉｃ  ｅｘｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ  ｒｅａｃｔｉｏｎ、以下エキソ核酸切断反応（ＥＲ）という）により固相基質で実施される。
【００２１】
本発明者らは、ターゲット核酸配列を、より簡便でありながらも偽陽性及び偽陰性結果無しに固相で検出、同定及び定量することができる新規なターゲット検出技術を開発するために鋭意研究した。その結果、本発明者らは、固相における新規な検出プロトコールを確立して、この新規プロトコールによると、単一標識を有する固定化されたプローブを利用し、固相で反復的エキソ核酸切断反応（ｃｙｃｌｉｃ  ｅｘｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ  ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＣＥＲ）又はエキソ核酸切断反応（ｅｘｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ  ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＥＲ）により、ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルの減少が発生してシグナル減少が増幅される。前記新規な検出プロトコールは、単一標識システムを利用して固相でターゲット核酸配列を検出するのに非常に適している。
【００２２】
本明細書で使用される用語‘反復的エキソ核酸切断反応（ｃｙｃｌｉｃ  ｅｘｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ  ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＣＥＲ）’は、ハイブリッド形成及び変性のサイクルに利用する５’→３’エキソヌクレアーゼ活性による切断反応を意味する。
【００２３】
本明細書で使用される用語‘エキソ核酸切断反応（ｅｘｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ  ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＥＲ）’は、単一標識プローブがターゲット核酸配列にハイブリッド形成されて、人為的な（意図的な）変性工程の過程無しにターゲット核酸配列から解離された後、新しい単一標識プローブがターゲット核酸配列にハイブリッド形成される５’→３’エキソヌクレアーゼ活性誘導切断反応を意味する。
【００２４】
本明細書で使用される用語‘シグナルの減少’は、単一標識プローブが固定化された固相基質上で検出されるシグナルの減少を意味する。本発明は、ターゲット核酸配列の検出において、シグナルの増加ではなく、シグナルの減少として検出する。本明細書で使用される用語‘シグナル減少の増幅’は、固相基質上で検出されたシグナルがより減少されたことを意味する。本発明によると、前記シグナルの減少は増幅されて、より正確で高感度の方式でターゲット核酸配列を検出する。
【００２５】
本発明者らは、二本鎖ＤＮＡから５’→３’方向に５’ヌクレオチドの連続的な除去を触媒するＴ７エキソヌクレアーゼ又は一部ＤＮＡポリメラーゼが、ターゲット核酸配列とのハイブリッド形成によって固相に固定化された単一標識プローブからのシグナル変化を誘導することができるということを構想した。ターゲット核酸配列とのハイブリッド形成によって、固相に固定化された単一標識プローブは、二本鎖核酸分子を形成して、切断反応のための５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により特異的に認識される。プローブの５’−末端部位に存在する単一標識が切断反応により解離されて、固相におけるシグナル減少が誘導され、これによりターゲット核酸配列の存在の検出を可能とする。また、本発明者らは、固相におけるシグナル減少の増幅は、ターゲット核酸配列の増幅の助け無しに反復的エキソ核酸切断反応又はエキソ核酸切断反応により達成できて、より正確で高感度の方式で、固相でターゲット核酸配列を検出することができるということを見出した。
【００２６】
固相におけるターゲット検出に対する従来技術は、反応の終了時点で検出されるシグナルに最も大きな重点を置いた。
【００２７】
これとは異なって、本発明は、反復的エキソ核酸切断反応又はエキソ核酸切断反応により、シグナル減少の増幅の間、シグナル強度が変化することをベースとして、これにより本発明者らはシグナル減少の変化を検出し、これは、より正確なターゲット核酸配列の定性及び定量分析を可能にする。
【００２８】
本発明は、固相基質上に固定化された二重標識プローブから解離された標識分子の干渉無しに、洗浄工程の要らない共焦点レーザースキャナのような適した機器を利用して固相基質上のシグナルを検出又は測定することができる。したがって、本発明は、ターゲット核酸配列とのハイブリッド形成によって、固相基質上に固定化された単一標識プローブが切断されて標識が解離されて、リアルタイム方式で固相基質上のシグナルの減少が検出でき、これによりリアルタイム方式でターゲット核酸配列を検出する。
【００２９】
本発明は、本発明に適用される酵素的反応により、より高いターゲット特異性を示して、二重標識ではなく単一標識を利用するため、バックグラウンドシグナルの除去及び費用効用性の観点で非常に優れている。
【００３０】
本発明の特徴の一つは、プローブからの単一標識分子の解離に依存的な固相基質上のシグナル減少を測定することにより、ターゲット核酸配列を検出するということである。従来方法は、ターゲット核酸配列の存在を判定するために、一般に固相基質上におけるシグナルの発生（即ち、シグナルの増加）を測定又は分析する。したがって、従来方法は、二重標識システムを要求するか、あるいは単一標識システムでは、更なる標識成分（例えば、標識されたｄｄＮＴＰ又は更なる標識されたプローブ）の助けを必要とする。
【００３１】
興味深いことに、固相に固定化された単一標識プローブを利用する本発明は、液相では単一標識プローブにより得られない効果を示す。
【００３２】
単一標識プローブ及び５’→３’エキソヌクレアーゼを利用する液相ターゲット検出方法は、単一標識プローブの切断を判定するために、電気泳動のような複雑な過程が必要となる。これとは異なって、固相で実施される本発明は、複雑な分離工程の助け無しに、単一標識のみを利用するとしても、プローブ切断の発生が検出されることを保障する。
【００３３】
従来の液相ベースの方法は、リアルタイム方式で単一標識プローブの切断を検出することができない。その反面、固相で実施される本発明は、リアルタイム方式で単一標識プローブの切断の検出を可能とする。
【００３４】
Ｉ．単一標識プローブ及びＣＥＲを利用した固相基質上におけるターゲット検出。
本発明の一様態によると、本発明は、
反復的エキソ核酸切断反応（ｃｙｃｌｉｃ  ｅｘｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ  ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＣＥＲ）により固相でＤＮＡ又は核酸混合物からターゲット核酸配列を検出する方法であって、
（ａ）ターゲット核酸配列を固定化プローブにハイブリッド形成させる工程であって、前記固定化プローブは、前記ターゲット核酸配列に相補的なヌクレオチド配列及び検出可能なシグナルを発生させる単一標識を含み、前記固定化プローブは、その３’−末端を通じて固相基質に固定化されている工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）の結果物を前記固定化プローブの切断が発生する条件下で５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する熱安定性酵素と接触させる工程であって、前記固定化プローブは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する前記熱安定性酵素により切断され、前記固定化プローブから前記単一標識が解離されて前記固相基質上のシグナルの減少を引き起こす工程と、
（ｃ）前記工程（ｂ）の結果物を変性させる工程と、
（ｄ）前記工程（ａ）−（ｃ）を少なくとも２回反復して、前記固相基質上の前記シグナルを更に減少させる工程と、
（ｅ）前記固相基質上の前記シグナルの減少を検出する工程であって、前記固定化プローブの切断による前記シグナルの減少は、前記ターゲット核酸配列の存在を示す工程と、
を含む方法を提供する。
【００３５】
反復的エキソ核酸切断反応（ｃｙｃｌｉｃ  ｅｘｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ  ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＣＥＲ）による本発明は、反復的エキソ核酸切断反応（ｃｙｃｌｉｃ  ｅｘｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ  ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＣＥＲ）によりターゲット核酸配列を検出するために、固相におけるシグナルを獲得する新規なアプローチに関し、前記反復的エキソ核酸切断反応は、（ｉ）５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する熱安定性酵素による単一標識プローブの切断によるシグナルの減少、及び（ｉｉ）単一標識プローブとターゲット核酸配列間のハイブリッド形成及び変性の反復によるシグナルの増幅（即ち、シグナルの減少を増幅すること）を含む。
【００３６】
本発明のＣＥＲ過程は、ハイブリッド形成及び変性のサイクルによりシグナルの減少が増幅されるようにする。ＣＥＲ過程は、ターゲット核酸配列の増幅無しに、ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルの減少の増幅を保障し、極微量のターゲット核酸配列の検出を可能とする。また、ＣＥＲ過程は、比較的短い切断反応時間内に、より迅速で効率的な方式でシグナルの減少を増幅させる。ハイブリッド形成及び人為的な（意図的な）変性工程の反復は、ターゲット核酸配列と非切断単一標識プローブ間のハイブリッド形成に対する機会を増加させることにより、シグナル減少の増幅がなされるようにする。さらに、比較的短い時間に反復されたハイブリッド形成は、非−特異的ハイブリッド形成の可能性を減少させて、非−特異的シグナルを防止することに寄与する。二本鎖ターゲット核酸配列が使用される場合は、前記二本鎖は、サイクル毎に一本鎖に変性されて、ハイブリッド形成に参与する。この点で、ＣＥＲ過程は、人為的な（意図的な）変性工程のないＥＲ過程に比べ、さらに効果的なハイブリッド形成反応を示す。
【００３７】
本発明において、ターゲット核酸配列は、固相基質上に固定化された単一標識プローブとハイブリッド形成される。
【００３８】
本明細書で使用された用語‘ターゲット核酸’、‘ターゲット核酸配列’又は‘ターゲット配列’は、検出しようとする核酸配列を意味し、ハイブリッド形成、アニーリング又は増幅条件下でプローブ又はプライマーとアニーリング又はハイブリッド形成される。
【００３９】
本明細書で使用される用語‘プローブ（ｐｒｏｂｅ）’は、ターゲット核酸配列に実質的に相補的な部位又は部位を含む一本鎖核酸分子を意味する。好ましくは、プローブは、一本鎖デオキシリボヌクレオチド分子である。また、プローブは、リボヌクレオチドを含むことができる。
【００４０】
本明細書で使用される用語‘プライマー’は、オリゴヌクレオチドを意味するものであり、核酸鎖（鋳型）に相補的なプライマー延長産物の合成が誘導される条件、即ち、ヌクレオチドとＤＮＡポリメラーゼのような重合剤の存在、そして適した温度とｐＨの条件で合成の開始点として作用できる。好ましくは、プライマーは、増幅において最大効率を有する一本鎖である。好ましくは、プライマーは、オリゴデオキシリボヌクレオチドである。
【００４１】
本発明で利用されるプローブ又はプライマーは、天然（ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）ｄＮＭＰ（即ち、ｄＡＭＰ、ｄＧＭＰ、ｄＣＭＰ及びｄＴＭＰ）、修飾ヌクレオチド又は非天然ヌクレオチドが含まれる。
【００４２】
プライマーは、重合剤の存在下で伸長産物の合成をプライミングさせることができるほど十分長くなければならない。プライマーの適した長さは、例えば、温度、応用分野及びプライマーのソース（ｓｏｕｒｃｅ）を含む複数の要素によって決定される。本明細書で使用される用語‘アニーリング’又は‘プライミング’は、鋳型核酸にオリゴデオキシヌクレオチド又は核酸が並置（ａｐｐｏｓｉｔｉｏｎ）されることを意味し、前記並置は、ポリメラーゼがヌクレオチドを重合させて、鋳型核酸又はその一部分に相補的な核酸分子を形成するようにする。
【００４３】
本明細書で使用された用語‘ハイブリッド形成（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）’は、相補的な一本鎖核酸が二本鎖核酸を形成することを意味する。ハイブリッド形成は、二つの核酸鎖間の相補性が完全である場合（ｐｅｒｆｅｃｔ  ｍａｔｃｈ）に起こるか、又は一部ミスマッチ（ｍｉｓｍａｔｃｈ）塩基が存在しても起こる。ハイブリッド形成に必要な相補性の程度は、ハイブリッド形成条件によって変わり、特に温度によって調節されえる。
【００４４】
本明細書で使用された用語‘アニーリング’と‘ハイブリッド形成’に差はなく、本明細書で混用される。
【００４５】
本発明で利用される固定化プローブは、ターゲット核酸配列に相補的なヌクレオチド配列を有する。用語‘相補的’は、所定のアニーリング条件又は厳格条件（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）下でプライマー又はプローブがターゲット核酸配列に選択的にハイブリッド形成するほど十分相補的であることを意味し、‘実質的に相補的（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）’及び‘完全に相補的（ｐｅｒｆｅｃｔｌｙ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）’を包括する意味を有して、好ましくは、完全に相補的なことを意味する。
【００４６】
本発明で利用される固定化プローブは、その３’−末端を通じて固相基質上に固定化される。好ましい固相基質は、適した固相又は半固相支持体を含み、例えば、膜、フィルター、チップ、スライド、ウェハー、ファイバー、磁性又は非磁性ビーズ、ゲル、管、プレート、高分子、極微粒子及び毛細管である。
【００４７】
例え一部具現例において、異なる化合物のための合成領域を、例えば、ウェル、隆起した領域（ｒａｉｓｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ）、ピン、エッチングされた溝（ｅｔｃｈｅｄ  ｔｒｅｎｃｈ）などの領域で物理的に分離させることが望ましいかもしれないが、多数の具現例では、固相基質の少なくとも一つの表面は、実質的に平面であってもよい。本発明の他の具現例によると、固相基質は、ビーズ、樹脂、ゲル、マイクロスフィア、又は他の幾何学的配列の形態を有する。
【００４８】
好ましくは、固相基質は、マイクロアレイを含む。プローブは、固相基質の表面に直接的又は間接的に固定化されて、好ましくは、間接的に固定化される。また、プローブは、共有又は非共有結合方式で固相基質の表面に固定化できる。プローブが間接的に固相基質の表面に固定化される場合、適したリンカーを利用することができる。本発明で使用できるリンカーは、マイクロアレイでプローブを固定化するために利用される如何なるリンカーも含む。例えば、アミン基を有するアルキル又はアリール化合物、又はチオール基を有するアルキル又はアリール化合物がプローブ固定化のためのリンカーとして利用される。また、ポリ（Ｔ）塩基又はポリ（Ａ）塩基がリンカーとして利用されて、酵素作用（例えば、酵素的切断反応）を抑制する可能性の高い空間的妨害（ｓｐａｃｅ  ｈｉｎｄｒａｎｃｅ）を減少させるか、又はハイブリッド形成効率を増加させることができる。ポリ（Ｔ）テール又はポリ（Ａ）テールは、プローブの配列に含まれない。
【００４９】
本発明の反応環境を提供するマイクロアレイは、当業界に公知である如何なるマイクロアレイも含む。本発明の全ての過程、即ち、ターゲット配列とのアニーリング、伸長／切断反応及び蛍光の検出は、マイクロアレイ上でなされる。マイクロアレイで固定化プローブは、ハイブリッド形成アレイ要素（Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｂｌｅ  ａｒｒａｙ  ｅｌｅｍｅｎｔ）として利用される。マイクロアレイを製作するための固相基質は、例えば、金属（例えば、金、金と銅の合金、アルミニウム）、金属オキシド、ガラス、セラミック、石英、シリコン、半導体、Ｓｉ／ＳｉＯ２ウェハー、ゲルマニウム、ガリウムアルセニド、カーボン、炭素ナノチューブ、ポリマー（例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアクリルアミド）、セファロース、アガロース及びコロイドを含むが、これらに限定されるものではない。本発明の複数の固定化プローブは、固相基質上の一つのアドレサブル（ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ）領域又は複数のアドレサブル領域に固定化されて、固相基質は、２個〜１，０００，０００個のアドレサブル領域を含むことができる。フォトリソグラフィー、インクジェッティング、機械的マイクロスポッティング及びこれの類似方法のような従来製作技術により、アレイ又は特定応用のためのアレイを提供するために、固定化プローブが製作（ｆａｂｒｉｃａｔｅ）され得る。
【００５０】
本発明は、固相基質上に固定化されたプローブが互いに物理的に離隔されているため、一種類の標識分子を利用するとしても、多数のターゲット核酸配列を固相基質上で検出することができる。
【００５１】
本発明で利用される固定化プローブは、検出可能なシグナルを発生させる単一標識を有する。前記単一標識は、特に制限されず、例えば化学的標識（例えば、ビオチン）、酵素標識（例えば、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、ルシフェラーゼ、シトクロムＰ４５０及びホースラディッシュペルオキシダーゼ）、放射能標識（例えば、Ｃ１４、Ｉ１２５、Ｐ３２及びＳ３５）、蛍光標識、発光（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ）標識、化学発光（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ）標識又は金属標識（例えば、金）である。
【００５２】
本発明の好ましい具現例によると、単一標識は、リアルタイム方式でシグナルを発生させることができる標識である。より好ましくは、前記単一標識は、蛍光標識である。
【００５３】
蛍光標識の好ましい例は、下記の通りである：Ｃｙ２ＴＭ（５０６）、ＹＯ−ＰＲＯＴＭ−１（５０９）、ＹＯＹＯＴＭ−１（５０９）、Ｃａｌｃｅｉｎ（５１７）、ＦＩＴＣ（５１８）、ＦｌｕｏｒＸＴＭ（５１９）、ＡｌｅｘａＴＭ（５２０）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ１１０（５２０）、Ｏｒｅｇｏｎ  ＧｒｅｅｎＴＭ５００（５２２）、Ｏｒｅｇｏｎ  ＧｒｅｅｎＴＭ４８８（５２４）、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎＴＭ（５２５）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  ＧｒｅｅｎＴＭ（５２７）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  １２３（５２９）、Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  ＧｒｅｅｎＴＭ（５３１）、Ｃａｌｃｉｕｍ  ＧｒｅｅｎＴＭ（５３３）、ＴＯ−ＰＲＯＴＭ−１（５３３）、ＴＯＴＯ１（５３３）、ＪＯＥ（５４８）、ＢＯＤＩＰＹ５３０／５５０（５５０）、Ｄｉｌ（５６５）、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ（５６８）、ＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８（５６８）、ＢＯＤＩＰＹ５６４／５７０（５７０）、Ｃｙ３ＴＭ（５７０）、ＡｌｅｘａＴＭ５４６（５７０）、ＴＲＩＴＣ（５７２）、Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  ＯｒａｎｇｅＴＭ（５７５）、Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ  Ｒ＆Ｂ（５７５）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ（５７５）、Ｃａｌｃｉｕｍ  ＯｒａｎｇｅＴＭ（５７６）、Ｐｙｒｏｎｉｎ  Ｙ（５８０）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｂ（５８０）、ＴＡＭＲＡ（５８２）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  ＲｅｄＴＭ（５９０）、Ｃｙ３．５ＴＭ（５９６）、ＲＯＸ（６０８）、Ｃａｌｃｉｕｍ  ＣｒｉｍｓｏｎＴＭ（６１５）、ＡｌｅｘａＴＭ５９４（６１５）、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（６１５）、Ｎｉｌｅ  Ｒｅｄ（６２８）、ＹＯ−ＰＲＯＴＭ−３（６３１）、ＹＯＹＯＴＭ−３（６３１）、Ｒ−ｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（６４２）、Ｃ−Ｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（６４８）、ＴＯ−ＰＲＯＴＭ−３（６６０）、ＴＯＴＯ３（６６０）、ＤｉＤ  ＤｉｌＣ（５）（６６５）、Ｃｙ５ＴＭ（６７０）、Ｔｈｉａｄｉｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ（６７１）、Ｃｙ５．５（６９４）、ＨＥＸ（５５６）、ＴＥＴ（５３６）、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｂｌｕｅ（４４７）、ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ  Ｇｏｌｄ  ５４０（５４４）、ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ  Ｏｒａｎｇｅ  ５６０（５５９）、ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ  Ｒｅｄ  ５９０（５９１）、ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ  Ｒｅｄ  ６１０（６１０）、ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ  Ｒｅｄ  ６３５（６３７）、ＦＡＭ（５２０）、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（５２０）、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−Ｃ３（５２０）、Ｐｕｌｓａｒ  ６５０（５６６）、Ｑｕａｓａｒ  ５７０（６６７）、Ｑｕａｓａｒ  ６７０（７０５）及びＱｕａｓａｒ  ７０５（６１０）。括弧の数字は、ナノメートル単位で表示した最大発光波長である。
【００５４】
適した蛍光標識は、下記のようなたくさんの文献に開示されている：Ｐｅｓｃｅら、ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７１）；Ｗｈｉｔｅら、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７０）；Ｂｅｒｌｍａｎ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒａ  ｏｆ  Ａｒｏｍａｔｉｃ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７１）；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ｃｏｌｏｒ  ＡＮＤ  Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７６）；Ｂｉｓｈｏｐ，ｅｄｉｔｏｒ，Ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ（Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９７２）；Ｈａｕｇｌａｎｄ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，１９９２）；Ｐｒｉｎｇｓｈｅｉｍ，Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｅｓｃｅｎｃｅ（Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９４９）；Ｈａｕｇｌａｎｄ，Ｒ．Ｐ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，６ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇ．，１９９６；米国特許第３，９９６，３４５号及び第４，３５１，７６０号。
【００５５】
単一標識分子は、多様な方法によりプローブに連結される。好ましくは、単一標識分子は、少なくとも３個の炭素原子を含むスペーサー（例えば、３−炭素スペーサー、６−炭素スペーサー、９−炭素スペーサー又は１２炭素スペーサー）を通じてプローブに連結され得る。
【００５６】
本発明の好ましい具現例によると、固定化プローブ上の前記単一標識は、その５’−末端又は５’−末端から１〜５ヌクレオチド離隔された位置にあり、より好ましくは、５’−末端又は５’−末端から１〜４ヌクレオチド離隔された位置、さらに好ましくは、５’−末端又は５’−末端から１〜３ヌクレオチド離隔された位置、よりさらに好ましくは、５’−末端又は５’−末端から１〜２ヌクレオチド離隔された位置、最も好ましくは、５’−末端にある。
【００５７】
プローブ又はプライマーのアニーリング又はハイブリッド形成は、当業界に公知の多様なハイブリッド形成方法により行うことができる。本発明において、適したハイブリッド形成条件は、最適化手順により一連の過程で決定できる。温度、成分の濃度、ハイブリッド形成及び洗浄時間、バッファー成分及びこれらのｐＨ及びイオン強度のような条件は、多様な因子、例えば、プローブ及びターゲット核酸配列のようなオリゴヌクレオチドの長さ及びＧＣ量によって多様である。ハイブリッド形成の詳細な条件は、Ｊｏｓｅｐｈ  Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ５，Ｎ．Ｙ．（２００１）；及びＭ．Ｌ．Ｍ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．（１９９９）で確認できる。
【００５８】
本発明において、例えば、ターゲット核酸配列と固定化プローブのハイブリッド形成温度は、約３０℃〜８０℃であり、より好ましくは、４０℃〜７５℃であって、さらに好ましくは、５０℃〜７２℃である。
【００５９】
ハイブリッド形成反応に続いて、工程（ａ）の結果物を、固定化プローブの切断が発生する条件下で５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する熱安定性酵素と接触させる。固定化プローブがターゲット核酸配列にハイブリッド形成された場合にのみ、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する熱安定性酵素により切断され、固定化プローブから単一標識が解離されて、最終的に固相基質上のシグナルの減少を引き起こす（参照：図１）。固定化プローブの切断によるこのようなシグナルの減少は、ターゲット核酸配列の存在を示す。
【００６０】
本明細書の表現‘固定化プローブの切断が発生する条件’は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により固定化プローブの切断が発生するに有利な反応条件を意味し、温度、ｐＨ、イオン強度、緩衝液、プローブ長さと配列及びエキソヌクレアーゼの種類を含む。
【００６１】
本発明の好ましい具現例によると、ハイブリッド形成及び切断反応は、１０分間以下として実施されて、好ましくは５分間以下、より好ましくは１分間以下、さらに好ましくは０．５分間以下である。本発明の好ましい具現例によると、ハイブリッド形成及び切断反応は、少なくとも５秒間行われて、好ましくは少なくとも１０秒間、より好ましくは少なくとも２０秒間である。
【００６２】
５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する熱安定性酵素は、ターゲット核酸配列とのハイブリッド形成に係わるプローブに作用し、５’→３’方向にエキソ核酸切断反応を促進する熱安定酵素を含む。前記酵素は、一本鎖核酸分子は切断しない。
【００６３】
選択的に、本発明で利用される単一標識プローブは、その５’−末端に少なくとも１個のミスマッチヌクレオチドを更に含む。一部５’→３’エキソヌクレアーゼは、条件によって、エキソヌクレアーゼ活性だけではなく、５’→３’エンドヌクレアーゼ活性を示す（参考：Ｍｕｒａｎｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｖｏｌ．２６９．１１９１−１１９６（１９９４））。したがって、５’−末端に少なくとも１個のミスマッチヌクレオチドを有する単一標識プローブを利用する場合、本発明は、５’→３’エキソヌクレアーゼ（例えば、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ）の種類及び反応条件によってターゲット核酸配列を検出することができる。好ましくは、単一標識プローブは、その５’−末端に１〜３個のミスマッチヌクレオチドを更に含む。好ましくは、単一標識分子は、ミスマッチヌクレオチドに位置する。
【００６４】
好ましくは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する熱安定性酵素は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する熱安定性鋳型依存的核酸ポリメラーゼであり、より好ましくは、多様なバクテリア種から得る熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、例えば、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｌａｖｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｎｔｒａｎｉｋｉａｎｉｉ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｃａｌｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｃｈｌｉａｒｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｉｇｎｉｔｅｒｒａｅ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｌａｃｔｅｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｒｕｂｅｒ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｒｕｂｅｎｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｉｌｖａｎｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ  Ｚ０５及びＴｈｅｒｍｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｓｐｓ  １７のＤＮＡポリメラーゼを含む。最も好ましくは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的核酸ポリメラーゼは、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼである。
【００６５】
ターゲット核酸配列とハイブリッド形成された固定化プローブは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する前記熱安定性酵素により切断され、前記単一標識が固定化プローブから解離されて、これにより、固相基質上のシグナルを減少させる。
【００６６】
固定化プローブの切断反応後、工程（ｂ）の結果物を変性させる。変性方法は、熱、アルカリ、ホルムアミド、ウレア及びグリコサール処理、酵素的方法（例えば、ヘリカーゼ反応）、及び結合タンパク質を含むが、これらに限定されるものではない。例えば、変性は、７０℃〜１０５℃の範囲の温度に熱を加えて達成できる。このような処理を達成するための一般的な方法は、Ｊｏｓｅｐｈ  Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２００１）により提供される。
【００６７】
好ましくは、本発明の変性は、ターゲット核酸配列とプローブ間のハイブリッド形成では発生しない条件下で行われる。二本鎖ターゲット核酸配列を利用する場合、ターゲット核酸配列が変性されて一本鎖になる条件下で変性を実施することが好ましい。
【００６８】
以後、工程（ａ）〜（ｃ）を少なくとも２回反復して（好ましくは少なくとも５回、より好ましくは、少なくとも１０回）、固相基質上のシグナルを更に減少させる。
【００６９】
ハイブリッド形成、切断及び変性の反復（即ち、反復的エキソ核酸切断反応）は、シグナル減少を増幅させて、これは、固相基質上のシグナル変化を引き起こす。
【００７０】
核酸分子（ターゲット核酸配列及びプローブ）の濃度と配列及び使用された酵素の種類と活性を含む反応条件は、シグナルの減少の程度に影響を及ぼす。シグナル減少パターンの測定は、多様で有用な情報を提供する（例えば、ターゲット核酸配列の定性及び定量分析）。
【００７１】
本発明では、反復的反応の終了時点で、又は反復的反応の間のシグナルの減少を測定することができ、これは、より正確なターゲット核酸配列の定性及び定量分析を可能にする。
【００７２】
この点で、固相基質上の単一標識プローブを利用する反復的エキソ核酸切断反応は、ターゲット核酸配列の定量的検出に非常に有用である。
【００７３】
最終的に、固相基質上のシグナルの減少が検出され、このような固定化プローブの切断によるシグナル減少は、ターゲット核酸配列の存在を示す。
【００７４】
シグナルの検出は、反復の終了時点で（即ち、エンドポイント方式）、反復の各サイクルで（即ち、リアルタイム方式）、又は反復の間、所定の時間間隔のそれぞれにおいて実施することができる。好ましくは、シグナルの検出は、反復の各サイクルで、又は反復の間、所定の時間間隔（ｐｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ  ｔｉｍｅ  ｉｎｔｅｒｖａｌｓ）のそれぞれにおいて実施することができる
【００７５】
シグナルは、各標識に対して従来方法により検出又は測定できる。例えば、蛍光シグナルは、従来方法、例えば、蛍光測定器（ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ）により検出又は測定できる。
【００７６】
洗浄工程は、工程（ｅ）以前に実施できる。しかし、本発明は、固相基質上の単一標識プローブから解離された標識分子の干渉無しに、固相基質を洗浄しない共焦点レーザースキャナのような適した機器を利用して、固相基質上に存在するシグナルのみを検出することができる。
【００７７】
したがって、シグナルの減少は、リアルタイム方式で検出することができ、その結果、より簡便で正確な方式で固相基質上のターゲット核酸配列のリアルタイム検出をもたらす。
【００７８】
本発明の好ましい具現例によると、工程（ａ）は、固定化プローブにハイブリッド形成されるターゲット核酸配列を生成するための逆方向プライマーを更に含む。逆方向プライマーと５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを利用する場合、プローブにハイブリッド形成される鋳型は、反復工程の間、核酸合成反応により選択的に増加される。前記鋳型の増加は、ターゲット配列を検出するシグナルがより迅速に提供されるようにする。
【００７９】
選択的に、工程（ａ）は、固定化プローブのハイブリッド形成位置（ｈｙｂｒｉｄｉｚｅｄ  ｓｉｔｅ）の下流位置（ｓｉｔｅ）にハイブリッド形成される上流プライマー又はプローブを更に含む。
【００８０】
本明細書で使用される用語‘上流プライマー’は、固定化プローブのハイブリッド形成位置より下流位置にハイブリッド形成されて、ターゲット核酸配列に相補的な配列を形成するプライマーを意味し、前記プライマーは結局、鋳型依存的核酸ポリメラーゼにより伸長される。本明細書で使用される用語‘上流プローブ’は、固定化プローブがハイブリッド形成される位置より下流位置でターゲット核酸配列にハイブリッド形成する非伸長（ｎｏｎ−ｅｘｔｅｎｄｉｂｌｅ）プローブを意味する。上流プライマー又は上流プローブは、固定化プローブの５’−末端の上流に位置する。
【００８１】
５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的核酸ポリメラーゼは、上流プライマーを伸長させた後、固定化プローブを切断させる。選択的に、固定化プローブに隣接して存在する上流プローブ（又は上流プライマー）に接触することにより、前記酵素は、固定化プローブを切断することもできる。上流プライマー又はプローブを利用する場合、固定化プローブは、上流プライマー又は鋳型依存的核酸ポリメラーゼのプローブ依存的５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により切断できる。
【００８２】
上流プライマー又はプローブがターゲット核酸配列にハイブリッド形成される前に、ターゲット核酸配列と単一標識プローブの二本鎖に鋳型依存的核酸ポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性が作用する場合、上流プライマー又はプローブの存在に非依存的な本発明は、シグナルの減少を誘導することができる。したがって、上流オリゴヌクレオチド（上流プライマー又はプローブ）が反応に関与する場合、ＤＮＡポリメラーゼのオリゴヌクレオチド依存的５’→３’エキソヌクレアーゼ活性だけではなく、オリゴヌクレオチド非依存的５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により、シグナルの減少が引き起こされる。
【００８３】
本発明の好ましい具現例によると、上流プローブ及び固定化プローブは、鋳型依存的核酸ポリメラーゼが上流プローブの３’−末端部位及び固定化プローブの５’−末端に同時的に接触する範囲内に近接して位置する。好ましくは、上流プローブの３’−末端は、固定化プローブの５’−末端から１〜２０ヌクレオチド（より好ましくは、１〜１０ヌクレオチド、さらに好ましくは、１〜５ヌクレオチド）離隔された位置にある。最も好ましくは、上流プローブの３’−末端は、固定化プローブの５’−末端にすぐ近接した（ｉｍｍｅｄｉａｔｅｌｙ  ａｄｊａｃｅｎｔ）位置に位置する。
【００８４】
本発明で上流プライマー及び逆方向プライマーを利用する場合、ターゲット核酸配列は、増幅と同時に検出できる。
【００８５】
好ましくは、上流プローブの３’−末端は、伸長反応が抑制されるようにブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）されている。上流プローブの非伸長ブロッキング（Ｎｏｎ−ｅｘｔｅｎｄａｂｌｅ  ｂｌｏｃｋｉｎｇ）は、非相補的ヌクレオチドを追加するか、又は最後のヌクレオチドの３’ヒドロキシル基にホスフェート基のような化学的部分（ｍｏｉｅｔｙ）を追加して達成できる。また、ブロッキングは、最後のヌクレオチドの３’−ヒドロキシル基を除去するか、又はジデオキシヌクレオチドのように、３’−ヒドロキシル基のないヌクレオチドを導入することにより達成できる。
【００８６】
本発明の好ましい具現例によると、固定化プローブは、ブロッカー部位を有する。ブロッカー部位は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素による切断に対して耐性を有する少なくとも１個のヌクレオチドブロッカーを含む。固定化プローブが非ターゲット核酸配列にハイブリッド形成される場合、ブロッカー部位は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断される部位に位置する。
【００８７】
本発明の好ましい具現例によると、ブロッカー部位は、１〜１５ブロッカーを含み、より好ましくは、２〜１０ブロッカー、さらに好ましくは、３〜８ブロッカー、よりさらに好ましくは、３〜６ブロッカーを含む。固定化プローブに存在するブロッカーヌクレオチドは、一つであるか、あるいは連続的に又は断続的に存在する一つ以上のヌクレオチドである。
【００８８】
ブロッカーとしてヌクレオチド、即ち、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素による切断に対して耐性を有するバックボーン（ｂａｃｋｂｏｎｅ）を含むヌクレオチドは、当業界に公知されている如何なるものでも利用できる。例えば、前記ヌクレオチドは、多様なホスホロチオエート連結（ｌｉｎｋａｇｅ）、ホスホネート連結、ホスホロアミデート連結及び２’−カーボヒドレート変形を含む。本発明の好ましい具現例によると、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素による切断に対して耐性を有するバックボーンを含むヌクレオチドは、ホスホロチオエート連結、アルキルホスホトリエステル連結、アリールホスホトリエステル連結、アルキルホスホネート連結、アラルホスホネート連結、ハイドロゲンホスホネート連結、アルキルホスホロアミデート連結、アリールホスホロアミデート連結、ホスホロセレネート連結、２’−Ｏ−アミノプロピール変形、２’−Ｏ−アルキル変形、２’−Ｏ−アリール変形、２’−Ｏ−ブチル変形、α−アノマオリゴデオキシヌクレオチド及び１−（４’−チオ−β−Ｄ−リボフラノシル）変形である。固定化プローブに存在するブロッカーヌクレオチドは、一つであるか、あるいは連続的に又は断続的に存在する一つ以上のヌクレオチドである。
【００８９】
本発明の好ましい具現例によると、本発明に更に利用される上流プライマー及び／又は逆方向プライマーは、下記一般式Ｉの二重プライミングオリゴヌクレオチド（ＤＰＯ）構造を有する：
５’−Ｘｐ−Ｙｑ−Ｚｒ−３’  （Ｉ）
（式中、Ｘｐは、ターゲット核酸配列と相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列を有する５’−第１プライミング部位（５’−ｆｉｒｓｔ  ｐｒｉｍｉｎｇ  ｐｏｒｔｉｏｎ）であり、Ｙｑは、少なくとも三つ以上のユニバーサル塩基を含む分割部位（ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｐｏｒｔｉｏｎ）であり、Ｚｒは、ターゲット配列と相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列を有する３’−第２プライミング部位（３’−ｓｅｃｏｎｄ  ｐｒｉｍｉｎｇ  ｐｏｒｔｉｏｎ）であり、ｐ、ｑ及びｒは、ヌクレオチドの数を示し、Ｘ、Ｙ及びＺは、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドであり、５’−第１プライミング部位のＴｍは、３’−第２プライミング部位のＴｍより高く、前記分割部位は、前記三つの領域のうち、最も低いＴｍを有して、前記分割部位は、ターゲット核酸に対するアニーリングに関して、前記５’−第１プライミング部位を前記３’−第２プライミング部位から分割し、これにより、前記オリゴヌクレオチドの前記アニーリング特異性が前記５’−第１プライミング部位及び前記３’−第２プライミング部位により二重的に決定されるようにして、これは結局、前記プライマーの全体アニーリング特異性を向上させる。）
【００９０】
本発明をプライマーを利用して実施する場合、従来のプライマーは、相対的に低い特異性でターゲット核酸配列を検出する。したがって、ＤＰＯ構造を有するプライマーを利用することが好ましい。しかし、ＤＰＯ構造を有するプライマーは、本発明のターゲット特異性を向上させる（参照：ＷＯ２００６／０９５９８１）。
【００９１】
本明細書でプライマーを言及しながら使用する用語‘従来’は、ＤＰＯ構造を有しない全てのプライマーを意味する。これらは、本明細書で従来プライマーとして説明される。
【００９２】
本発明では、どんなプローブでも、単一標識分子を含む固定化プローブとして利用できる。選択的に、本発明で利用される固定化プローブは、変形二重特異性オリゴヌクレオチド（ｍＤＳＯ）構造を有するターゲット区別性プローブ（ｔａｒｇｅｔ  ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｖｅ  ｐｒｏｂｅ、ＴＤプローブ）を含まない。ｍＤＳＯ構造は、ＤＳＯ（ｄｕａｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）の変形された新しい構造であって、本発明者らにより最初に提示された（ＷＯ  ２００６／０９５９８１）。また、前記ＤＳＯ構造がプライマーの役割をする場合は、ｄｕａｌ  ｐｒｉｍｉｎｇ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ（ＤＰＯ）と命名される（Ｃｈｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｕａｌ  ｐｒｉｍｉｎｇ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ＳＮＰ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｏｆ  ＣＹＰ２Ｃ１９  ｇｅｎｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３５：６ｅ４０（２００７））。
【００９３】
本発明の好ましい具現例によると、本発明は、ターゲット核酸配列の定量的検出に利用される。特に、検出のための工程（ｅ）が工程（ｄ）の反復の各サイクルで、又は反復の間の所定の時間間隔のそれぞれにおいて実施される場合、本発明は、ターゲット核酸配列の定量的検出において非常に有用である。本発明の定量的検出は、従来の定量的ＰＣＲ方法を一部変更して達成できる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（２００１））。例えば、反応開始時点に存在するターゲット核酸配列の数とプローブの切断程度を示すシグナルとを標準曲線が関連付けることができる場合、本発明の反復的エキソ核酸切断反応と標準曲線を一般的に結び付けることができる。標準曲線は、その数の知られた標準分子を利用して作成することができる。
【００９４】
本発明の好ましい具現例によると、本発明に利用されるターゲット核酸配列は、増幅プライマーを利用して得た前増幅された（ｐｒｅ−ａｍｐｌｉｆｉｅｄ）核酸配列である。
【００９５】
前増幅された核酸配列は、多様なターゲット増幅方法により得ることができる。例えば、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）、ＬＣＲ（Ｌｉｇａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＲＣＡ（Ｒｏｌｌｉｎｇ  Ｃｉｒｃｌｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）又はＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｂａｓｅｓ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）である。
【００９６】
好ましくは、増幅プライマーは、上述のＤＰＯ構造を有する。
【００９７】
本発明の利点は、少なくとも２種のターゲット核酸配列の同時的（マルチプレックス）検出において顕著である。
【００９８】
本発明の好ましい具現例によると、ターゲット核酸配列は、少なくとも２種（より好ましくは、少なくとも３種、さらに好ましくは、少なくとも５種）の核酸配列を含み、固定化プローブは、少なくとも２種（より好ましくは、少なくとも３種、さらに好ましくは、少なくとも５種）のプローブを含む。
【００９９】
本発明の好ましい具現例によると、ターゲット核酸配列は、少なくとも２種（より好ましくは、少なくとも３種、さらに好ましくは、少なくとも５種）の核酸配列を含み、固定化プローブは、少なくとも２種（より好ましくは、少なくとも３種、さらに好ましくは、少なくとも５種）のプローブを含み、上流プライマー及び／又は逆方向プライマーは、少なくとも２種（より好ましくは、少なくとも３種、さらに好ましくは、少なくとも５種）のプライマーを含む。
【０１００】
本発明の好ましい具現例によると、ターゲット核酸配列は、少なくとも２種（より好ましくは、少なくとも３種、さらに好ましくは、少なくとも５種）の核酸配列を含み、固定化プローブは、少なくとも２種（より好ましくは、少なくとも３種、さらに好ましくは、少なくとも５種）のプローブを含み、上流プローブは、少なくとも２種（より好ましくは、少なくとも３種、さらに好ましくは、少なくとも５種）のプローブを含む。
【０１０１】
本発明により検出されるターゲット核酸配列は、特に制限されず、ＤＮＡ（ｇＤＮＡ又はｃＤＮＡ）又はＲＮＡ分子を含む。また、本発明は、検出及び／又は増幅しようとするターゲット核酸配列が、ある特定配列又は長さを有する必要がない。ｍＲＮＡを初期物質として利用する場合、アニーリング工程の実施以前に逆転写工程が必須であり、これの詳細な内容は、Ｊｏｓｅｐｈ  Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２００１）；及びＮｏｏｎａｎ，Ｋ．Ｆ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：１０３６６（１９８８）に開示されている。逆転写反応のためには、ランダムヘキサマー又はｍＲＮＡにハイブリッド形成されるオリゴヌクレオチドｄＴプライマーが利用される。オリゴヌクレオチドｄＴプライマーは、ｄＴＭＰｓから構成され、ｄＴプライマーがプライマーとしての役割ができる範囲内で、これのｄＴＭＰｓの一つ又はそれ以上は、他のｄＮＭＰで代替できる。逆転写は、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有する逆転写酵素で実施できる。ＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有する酵素を利用する場合、慎重に反応条件を選択することにより、別途のＲＮａｓｅ  Ｈ切断過程を省くことができる。
【０１０２】
特に、本発明で検出及び／又は増幅できるターゲット核酸配列は、あらゆる天然（Ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）の原核細胞核酸、真核細胞（例えば、原生動物と寄生動物、菌類、酵母、高等植物、下等動物、及び哺乳動物と人間を含む高等動物）核酸、ウイルス（例えば、ヘルペスウイルス、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス、  Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス、肝炎ウイルス、ポリオウイルスなど）核酸、又はウイロイド核酸を含む。
【０１０３】
また、本発明は、ヌクレオチド変異の検出において非常に有用である。本発明で使用される用語‘ヌクレオチド変異（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ）’は、連続的ＤＮＡ断片又は配列の類似したＤＮＡ断片において、特定位置に存在するＤＮＡ配列のヌクレオチド多型を意味する。そのような連続的ＤＮＡ断片は、一つの遺伝子又は一つの染色体のある他の部位を含む。例えば、本発明で検出されるヌクレオチド変異は、ＳＮＰ（一塩基多型、ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）、欠失、挿入、置換及びトランスロケーションを含む。ヌクレオチド変異の例は、ヒトゲノムにある多様な変異（例えば、ＭＴＨＦＲ（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）遺伝子の変異）、薬剤耐性病原体のヌクレオチド変異及び癌発生関連ヌクレオチドの変異を含む。
【０１０４】
本発明の好ましい具現例によると、固定化プローブは、ヌクレオチド変異に相補的なヌクレオチド又はヌクレオチド変異に相当するヌクレオチドを含む。本発明がターゲット核酸配列のヌクレオチド変異を検出する場合、工程（ａ）で利用されるターゲット核酸配列は、前増幅された核酸配列であることが好ましい。
【０１０５】
本発明の好ましい具現例によると、本発明は、ターゲット核酸配列を増幅するための増幅プライマーを利用して実施する。５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ及び増幅プライマーを利用して、反復的エキソ核酸切断反応により実施される本発明は、ターゲット核酸配列の増幅と共にターゲット核酸配列を検出することができる。
【０１０６】
ＩＩ．単一標識プローブ及びＥＲを利用した固相基質上におけるターゲット検出
本発明の他の様態によると、本発明は、
反復的エキソ核酸切断反応（ｃｙｃｌｉｃ  ｅｘｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ  ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＣＥＲ）により固相でＤＮＡ又は核酸混合物からターゲット核酸配列を検出する方法であって、
（ａ）ターゲット核酸配列を固定化プローブにハイブリッド形成させる工程であって、前記固定化プローブは、前記ターゲット核酸配列に相補的なヌクレオチド配列及び検出可能なシグナルを発生させる単一標識を含み、前記固定化プローブは、その３’−末端を通じて固相基質に固定化されている工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）の結果物を前記固定化プローブの切断が発生する条件下で５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素と接触させる工程であって、前記固定化プローブは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する前記酵素により切断され、前記固定化プローブから前記単一標識が解離されて前記固相基質上のシグナルの減少を引き起こす工程と、
（ｃ）前記工程（ａ）及び（ｂ）で切断されていない固定化プローブの更なる切断のために、前記工程（ｂ）の結果物を前記工程（ｂ）と同一な条件下で維持させる工程であって、これにより、前記固相基質上の前記シグナルが更に減少する工程と、
（ｄ）前記固相基質上の前記シグナルの減少を検出する工程であって、前記固定化プローブの切断による前記シグナルの減少は、前記ターゲット核酸配列の存在を示す工程と、
を含む方法を提供する。
【０１０７】
固相基質におけるＥＲによる本発明は、ＥＲプロトコールが、反復的エキソ核酸切断反応の代わりにエキソ核酸切断反応を利用するという点を除いては、上述のＣＥＲプロトコールと類似している。したがって、その重複する内容は、本明細書の複雑性を避けるために、その記載を省く。
【０１０８】
プローブの切断反応を利用する本発明において、ハイブリッド形成のための反応が一定な温度で維持される場合、切断されたプローブは、自然にターゲット核酸配列から解離されて、非切断されたプローブは、ターゲット核酸配列にハイブリッド形成されて、切断及び解離される。したがって、ＥＲ方法による本発明は、プローブハイブリッド形成、切断及び解離の反復を誘導し、これは、シグナルの減少の増幅を引き起こす。
【０１０９】
また、固相基質上で検出されるシグナルの減少は、時間が経過するにつれてさらに減少するため、本発明のＥＲ方法は、時間−経過方式でシグナル減少を検出する。核酸分子（ターゲット核酸配列及びプローブ）の濃度と配列及び使用された酵素の種類と活性を含む反応条件は、シグナルの減少の程度に影響を及ぼす。シグナル減少パターンの測定は、多様で有用な情報を提供する（例えば、ターゲット核酸配列の定性及び定量分析）。
【０１１０】
本発明のシグナル減少は、反応の終了時点で、又は反応の間に測定することができ、これは、より正確なターゲット核酸配列の定性及び定量分析を可能にする。シグナル減少のリアルタイム検出は、より簡便で正確な方式で固相基質上でのターゲット核酸配列の検出を可能とする。
【０１１１】
本発明の好ましい具現例によると、工程（ｄ）における検出は、工程（ｃ）の終了時点で実施される。選択的に、工程（ｄ）における検出は、工程（ｂ）及び工程（ｃ）の間、所定の時間間隔のそれぞれにおいて実施される。
【０１１２】
好ましくは、工程（ｄ）における検出は、工程（ｂ）及び工程（ｃ）の間、所定の時間間隔のそれぞれにおいて実施される。
【０１１３】
ハイブリッド形成以後、切断反応の温度は、ハイブリッド形成の温度と同一であることが好ましい。選択的に、ハイブリッド形成以後、切断反応の温度は、ハイブリッド形成の温度より低いか高い。例えば、ハイブリッド形成温度が酵素活性に対する最適温度と異なる場合、ハイブリッド形成以後、切断反応の温度は、最適酵素反応によって調節できる。ハイブリッド形成及び切断反応間の温度差は、±２０℃の範囲であることが好ましく、より好ましくは、±１０℃の範囲、さらに好ましくは、±５℃の範囲である。
【０１１４】
本発明の好ましい具現例によると、エキソ核酸切断反応は、ハイブリッド形成以後、一定な反応温度で一定な反応時間実施する等温反応（ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）である。
【０１１５】
ＥＲの反応時間は、好ましくは２時間以下であり、より好ましくは、１時間以下、さらに好ましくは、３０分間以下である。
【０１１６】
本発明の好ましい具現例によると、単一標識は、蛍光分子である。
【０１１７】
好ましくは、固定化プローブ上の単一標識は、プローブの５’−末端又は５’−末端から１〜５ヌクレオチド離隔された位置にある。最も好ましくは、固定化プローブ上の単一標識は、プローブの５’−末端に位置する。
【０１１８】
５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素は、非熱安定性エキソヌクレアーゼ又は熱安定性エキソヌクレアーゼである。Ｔ７エキソヌクレアーゼ及びλエキソヌクレアーゼのような５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する非熱安定性酵素を利用することができる。好ましくは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素は、熱安定性エキソヌクレアーゼであり、より好ましくは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的核酸ポリメラーゼ（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩ、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ及びバクテリオファージＴ７  ＤＮＡポリメラーゼ）、最も好ましくは、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼである。
【０１１９】
本発明の好ましい具現例によると、工程（ａ）は、固定化プローブのハイブリッド形成位置（ｈｙｂｒｉｄｉｚｅｄ  ｓｉｔｅ）の下流にハイブリッド形成される上流プライマー又はプローブを更に含む。
【０１２０】
本発明の好ましい具現例によると、本発明の方法は、ターゲット核酸配列の定量的検出に利用される。
【０１２１】
好ましくは、ターゲット核酸配列は、前増幅された（ｐｒｅ−ａｍｐｌｉｆｉｅｄ）核酸配列である。
【０１２２】
本発明の好ましい具現例によると、ターゲット核酸配列は、少なくとも２種の核酸配列を含み、前記固定化プローブは、少なくとも２種のプローブを含む。
【０１２３】
本発明の好ましい具現例によると、ターゲット核酸配列は、ヌクレオチド変異を含む。
【０１２４】
ＩＩＩ．単一標識プローブ及びＣＥＲ又はＥＲを利用した固相基質上におけるターゲット検出用キット
本発明のまた他の様態によると、本発明は、
反復的エキソ核酸切断反応（ｃｙｃｌｉｃ  ｅｘｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ  ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＣＥＲ）又はエキソ核酸切断反応（ｅｘｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ  ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＥＲ）により固相でＤＮＡ又は核酸混合物からターゲット核酸配列を検出するキットであって、
（ａ）固相基質と、
（ｂ）前記ターゲット核酸配列に相補的なヌクレオチド配列及び検出可能なシグナルを発生させる単一標識を含む固定化プローブであって、その３’−末端を通じて前記固相基質に固定化されている固定化プローブと、
（ｃ）５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素と、
を含むキットを提供する。
【０１２５】
本発明のキットは、上述の本発明の検出方法を実施するために構成されたもので、その重複する内容は、本明細書の過度なる複雑性を避けるためにその記載を省く。
【０１２６】
本発明のキットは、バッファー、ＤＮＡポリメラーゼ助因子及びデオキシリボヌクレオチド−５−トリホスフェートのようなターゲット増幅ＰＣＲ反応（例えば、ＰＣＲ反応）に必要な試薬を選択的に含むことができる。更に、本発明のキットは、多様なポリヌクレオチド分子、逆転写酵素、多様なバッファー及び試薬、及びＤＮＡポリメラーゼ活性を抑制する抗体を含むことができる。
【０１２７】
また、本発明のキットは、陽性対照群及び陰性対照群反応を実施するに必要な試薬を含むことができる。特定反応で使用される試薬の最適量は、本明細書の開示事項を習得した当業者により容易に決定できる。典型的に、本発明のキットは、上記言及された構成成分を含む別途の包装又は区分で製作される。
【０１２８】
本発明の特徴及び利点を要約すると、以下の通りである：
（ａ）本発明は、単一標識システムを利用して固相でターゲット核酸配列の検出を可能とする。二重標識法のような多重標識システムと比較し、単一標識プローブを利用する本発明は、プローブデザイン及び製作において、便宜性及び費用効用性面で非常に卓越な利点を有する。
（ｂ）上述のように、本発明は、プローブとターゲット配列間のハイブリッド形成及び酵素的反応（５’→３’エキソヌクレアーゼ）によるプローブ切断の両方に依存的で、ターゲット核酸配列を示すシグナルの減少が誘発される。したがって、本発明のターゲット特異性は、二重的に決定されて、これは、従来のプローブ技術で現れる非特異的ハイブリッド形成による偽陽性シグナル問題を克服可能にする。
（ｃ）本発明の特徴の一つは、プローブからの単一標識分子の解離に依存的な固相基質上のシグナル減少を測定することにより、ターゲット核酸配列を検出するということである。従来の方法は、一般にターゲット核酸配列の存在を判定する固相基質上におけるシグナルの発生（即ち、シグナルの増加）を測定又は分析する。したがって、従来方法は、二重標識システムを要求するか、あるいは単一標識システムでは、更なる標識成分（例えば、標識されたｄｄＮＴＰ又は更なる標識されたプローブ）の助けを要求する。
（ｄ）反復的エキソ核酸切断反応を利用した本発明の好ましい具現例は、ターゲット核酸配列と固相基質上に固定化されたプローブ間のより効果的なハイブリッド形成を保障し、これは、より迅速で信頼性の高い方式でターゲット核酸配列を示すシグナル減少の増幅を引き起こす。実施例に開示されたように、反復的エキソ核酸切断反応を利用した本発明の具現例は、エキソ核酸切断反応を利用した場合に比べ、さらに迅速なシグナル変化（例えば、シグナル減少）を示す。
（ｅ）本発明は、反応の終了時点における最終シグナル又は反応の間のシグナル減少の変化を測定する。反応の間のシグナル減少の変化測定は、ターゲット核酸配列のより正確な定性及び定量的分析をもたらす。
（ｆ）本発明は、ターゲット核酸配列の検出のために、経時方式でエキソ核酸切断反応によるシグナル減少の変化の測定を可能とする。前記経時測定は、ターゲット核酸配列のより信頼性の高い検出だけではなく、定性的検出にも寄与する。
（ｇ）単一標識システムを利用する本発明は、二重標識システムを利用する従来技術であらわれる問題点から自由である。二重標識システムを利用する従来技術によると、従来技術は、エキソヌクレアーゼ作用範囲、反応後、固相基質上のレポーター分子の残留及びレポーター分子とクエンチャー分子間のクエンチング効率を考慮して、プローブ上のレポーター及びクエンチャー分子の位置を決定しなければならない。しかし、本発明は、このような要因を考慮する必要がない。
また、従来技術は、レポーター分子とクエンチャー分子間の不安定なクエンチングにより発生するバックグラウンドシグナルにより悩まされる。その反面、本発明は、このようなバックグラウンドシグナルの問題を完璧に克服する。
（ｈ）熱安定性５’→３’エキソヌクレアーゼを利用する場合、ハイブリッド形成工程を高厳格（ｈｉｇｈ  ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）温度で実施することができ、これは、プローブとターゲット核酸配列間のハイブリッド形成特異性を向上させる。さらに、熱安定性５’→３’エキソヌクレアーゼを利用することにより、変性及びハイブリッド形成の反復が可能になり、これにより、より効果的な方法でシグナルの減少が誘導される。
【０１２９】
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明するが、これら実施例は、本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれら実施例に限定されないことは、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者にとっては自明なことであろう。
【実施例】
【０１３０】
実施例１：固相基質表面上に固定化された単一標識プローブ及び反復的エキソ核酸切断反応を利用したターゲット核酸配列の検出
本発明者らは、固相でターゲット核酸配列を検出するために、反復的エキソ核酸切断反応及び単一標識プローブを適用した。
【０１３１】
このような適用のために、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＳＡ）遺伝子の合成オリゴヌクレオチドを鋳型として使用した。５’−末端に蛍光レポーター分子（ＴＡＭＲＡ）及びリンカーとしてポリ（Ｔ）５を有するプローブを、その３’−末端にあるアミノ基を利用して固相基質表面に固定した。位置マーカーとして、５’−末端に蛍光分子（ＴＡＭＲＡ）を有するマーカープローブを固相基質表面に固定した。５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＴａｑポリメラーゼを５’→３’エキソ核酸切断反応に利用した。
【０１３２】
本実施例で利用された合成鋳型、単一標識プローブ及びマーカーの配列は、下記の通りである：
ＳＡ＿Ｔ７０
５’−ＧＧＴＧＴＡＧＧＴＧＧＴＧＧＣＧＧＴＡＡＣＡＡＣＧＣＣＧＴＡＡＡＣＣＧＡＡＴＧＡＴＴＧＡＣＣＡＣＧＧＡＡＴＧＡＡＴＡＡＴＧＴＴＧＡＡＴＴＴＡ−３’
（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）
ＳＡ＿Ｃｏｎ
５’−［ＴＡＭＲＡ］ＣＡＴＴＣＣＧＴＧＧＴＣＡＡＴＣＡＴＴＣＧＧＴＴＴＡＣＧＧＣＧＴＴＧＴＴＡＣＣＴＴＴＴＴ［Ａｍｉｎｏ］−３’
（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）
Ｍａｒｋｅｒ
５’−［ＴＡＭＲＡ］ＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴ［Ａｍｉｎｏ］−３’
（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）
【０１３３】
ＮＳＢ９  ＮＨＳスライド（ＮＳＢＰＯＳＴＥＣＨ、Ｋｏｒｅａ）をプローブ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２及び３）の製作に利用した。ＮＳＢスポッティングバッファー（ＮＳＢ  ｓｐｏｔｔｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）で最終濃度５０μＭになるように溶解させたそれぞれのプローブを、ＰｅｒｓｏｎａｌＡｒｒａｙｅｒＴＭ１６  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｐｏｔｔｅｒ（ＣａｐｉｔａｌＢｉｏ、Ｃｈｉｎａ）を利用してＮＳＢ９  ＮＨＳスライド上にプリントした。前記プローブを２×１フォーマット（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ  ｓｐｏｔｓ）で並べてスポッティング（ｓｐｏｔｔｉｎｇ）して、このようにして製作したマイクロアレイを約８５％湿度のチャンバに一晩中インキュベートした。非特異的に結合したプローブを除去するために、前記スライドを２×ＳＳＰＥ（０．３Ｍ塩化ナトリウム、０．０２Ｍリン酸水素ナトリウム及び２．０ｍＭ  ＥＤＴＡ）、ｐＨ７．４及び７．０ｍＭ  ＳＤＳを含有したバッファー溶液で３７℃、３０分間洗浄して、蒸留水で洗浄した。その後、スライド遠心分離機を利用して、前記ＤＮＡ機能化された（ＤＮＡ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ）スライドを乾燥させて、使用前まで４℃暗室で保管した。
【０１３４】
ＳＡに対する合成オリゴヌクレオチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）１０ｐｍｏｌｅ、１０×反応バッファー（５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）３μＬ、ｄＮＴＰｓそれぞれ５０μＭ及びＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｏｌｇｅｎｔ、Ｋｏｒｅａ）２ｕｎｉｔを含有した３０μＬの最終容量で、ＤＮＡ機能化されたスライドの表面上で反復的エキソ核酸切断反応を行った。前記プローブが交互結合（ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｄ）されたＮＳＢガラススライドの表面上に組み立てられたチャンバに前記全体混合物を適用した。スライドをｉｎ  ｓｉｔｕブロック方式でサーマルサイクラー（Ｇｅｎｅｐｒｏ  Ｂ４Ｉ、Ｃｈｉｎａ）に設置した。反復的エキソ核酸切断反応の間の各サイクルの分析のために、５個の同一なスライドを製作した。反復的エキソ核酸切断反応を以下のように実施した：９５℃で２分間初期変性させて、９５℃で２０秒間、５５℃で２０秒間の反応過程を０、５、１０、３０又は５０サイクル行った。各サイクル数による反応以後、各スライドに対するイメージ獲得は、共焦点レーザースキャナーＡｘｏｎ  ＧｅｎｅＰｉｘ４１００Ａ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ、ＵＳＡ）を利用し、１０−μｍピクセル解像度のスキャニングで行った。蛍光強度は、定量的なマイクロアレイ分析ソフトウェア、ＧｅｎｅＰｉｘソフトウェア（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ、ＵＳＡ）を利用して分析した。蛍光強度は、周辺バックグラウンドを除去した後、スポット−中央値で表現した。再現性を調べるために、各スポットは２個ずつスポッティングした。蛍光強度は、２個のスポットの平均値で示した。
【０１３５】
図２Ａ及び２Ｂに示されたように、鋳型の存在下で単一標識固定化プローブを利用した場合、蛍光シグナルは、サイクル数によって減少した（０サイクル＿ＲＦＵ：６５，４７１±１．４１；５サイクル＿ＲＦＵ：２５，３７５±５３４．５７；１０サイクル＿ＲＦＵ：１６，７４５±８６３．３８；３０サイクル＿ＲＦＵ：９，４４４±２４７．４９；及び５０サイクル＿ＲＦＵ：５，７０３±６０８．１１）。陰性対照群として鋳型のない場合は、サイクル数による蛍光シグナルの変化がなかった（０サイクル＿ＲＦＵ：６５，４７１±０．００；５サイクル＿ＲＦＵ：６５，４６２±０．００；１０サイクル＿ＲＦＵ：６２，２２６±９．９０；３０サイクル＿ＲＦＵ：６５，４５４±０．００；及び５０サイクル＿ＲＦＵ：６４，６９９±１，０７１．９１）。
【０１３６】
実施例２：固相基質表面上に固定化された単一標識プローブ及びエキソ核酸切断反応を利用したターゲット核酸配列の検出
本発明者らは、固相でターゲット核酸配列を検出するために、エキソ核酸切断反応及び単一標識プローブを適用した。
【０１３７】
このような適用のために、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＳＡ）遺伝子の合成オリゴヌクレオチドを鋳型として使用した。５’−末端に蛍光レポーター分子（ＴＡＭＲＡ）及びリンカーとしてポリ（Ｔ）５を有するプローブを、その３’−末端にあるアミノ基を利用して固相基質表面に固定した。位置マーカーとして、５’−末端に蛍光分子（ＴＡＭＲＡ）を有するマーカープローブを固相基質表面に固定した。５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＴａｑポリメラーゼを５’→３’エキソ核酸切断反応に利用した。
【０１３８】
本実施例で利用した合成鋳型、単一標識プローブ及びマーカーの配列は、実施例１で利用したものと同一である。
【０１３９】
ＮＳＢ９  ＮＨＳスライド（ＮＳＢＰＯＳＴＥＣＨ、Ｋｏｒｅａ）をプローブ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２及び３）の製作に利用した。ＮＳＢスポッティングバッファー（ＮＳＢ  ｓｐｏｔｔｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）で最終濃度５０μＭになるように溶解させたそれぞれのプローブを、ＰｅｒｓｏｎａｌＡｒｒａｙｅｒＴＭ１６  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｐｏｔｔｅｒ（ＣａｐｉｔａｌＢｉｏ、Ｃｈｉｎａ）を利用してＮＳＢ９  ＮＨＳスライド上にプリントした。前記プローブを２×１フォーマット（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ  ｓｐｏｔｓ）で並べてスポッティング（ｓｐｏｔｔｉｎｇ）して、このようにして製作されたマイクロアレイを約８５％湿度のチャンバに一晩中インキュベートした。非特異的に結合されたプローブを除去するために、前記スライドを２×ＳＳＰＥ（０．３Ｍ塩化ナトリウム、０．０２Ｍリン酸水素ナトリウム及び２．０ｍＭ  ＥＤＴＡ）、ｐＨ７．４及び７．０ｍＭ  ＳＤＳを含有したバッファー溶液で３７℃、３０分間洗浄して、蒸留水で洗浄した。その後、スライド遠心分離機を利用して、前記ＤＮＡ機能化された（ＤＮＡ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ）スライドを乾燥させて、使用前まで４℃暗室で保管した。
【０１４０】
ＳＡに対する合成オリゴヌクレオチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）１０ｐｍｏｌｅ、１０×反応バッファー（６ｍＭ  ＭｇＣｌ２）３μＬ、ｄＮＴＰｓそれぞれ２００μＭ及びＤｉａｓｔａｒ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｏｌｇｅｎｔ、Ｋｏｒｅａ）１．２ｕｎｉｔを含有した３０μＬの最終容量で、ＤＮＡ機能化されたスライドの表面上でエキソ核酸切断反応を行った。前記プローブが交互結合（ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｄ）されたＮＳＢガラススライドの表面上に組み立てられたチャンバに前記全体混合物を適用した。スライドをｉｎ  ｓｉｔｕブロック方式でサーマルサイクラー（Ｇｅｎｅｐｒｏ  Ｂ４Ｉ、Ｃｈｉｎａ）に設置した。エキソ核酸切断反応の間の所定の時間間隔（ｐｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ  ｔｉｍｅ  ｉｎｔｅｒｖａｌ）分析のために、６個の同一なスライドを製作した。９５℃で２分間初期変性後、エキソ核酸切断反応を時間依存的方式で以下のように行った：５５℃で０、１、５、２０、３０又は６０分間反応過程を実施した。各指定時間インキュベーションによる反応以後、各スライドに対するイメージ獲得は、共焦点レーザースキャナーＡｘｏｎ  ＧｅｎｅＰｉｘ４１００Ａ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ、ＵＳＡ）を利用し、１０−μｍピクセル解像度のスキャニングで行った。蛍光強度は、定量的なマイクロアレイ分析ソフトウェア、ＧｅｎｅＰｉｘソフトウェア（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ、ＵＳＡ）を利用して分析した。蛍光強度は、周辺バックグラウンドを除去した後、スポット−中央値で表現した。再現性を調べるために、各スポットは２個ずつスポッティングした。蛍光強度は、２個のスポットの平均値で示した。
【０１４１】
図３Ａ及び３Ｂに示されたように、鋳型の存在下で単一標識固定化プローブを利用した場合、蛍光シグナルは、サイクル数によって減少した（０分＿ＲＦＵ：６５，４４９±１１．３；１分＿ＲＦＵ：５６，５７６±４，４７１．０；５分＿ＲＦＵ：２９，６０３±１，５４７．９；２０分＿ＲＦＵ：１６，１７１±２０６．５；３０分＿ＲＦＵ：１０，５４０±４７．４；及び６０分＿ＲＦＵ：５，８８９±１００．４）。陰性対照群として鋳型のない場合は、インキュベーション時間による蛍光シグナルの変化がなかった（０分＿ＲＦＵ：６５，４６４±０．７；１分＿ＲＦＵ：６５，４３３±１．４；５分＿ＲＦＵ：６５，４４４±１．４；２０分＿ＲＦＵ：６５，４４３±１．４；３０分＿ＲＦＵ：６５，４２６±１．４；及び６０分＿ＲＦＵ：６５，４４９±０．７）。
【０１４２】
実施例３：反復的エキソ核酸切断反応によるそれぞれ異なる量のターゲット核酸配列の検出
本発明者らは、固相で３種の異なる量のターゲット核酸配列を検出するために、反復的エキソ核酸切断反応及び単一標識プローブを適用した。
【０１４３】
このような適用のために、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＳＡ）遺伝子の合成オリゴヌクレオチドを鋳型として使用した。５’−末端に蛍光レポーター分子（ＴＡＭＲＡ）及びリンカーとしてポリ（Ｔ）５を有するプローブを、その３’−末端にあるアミノ基を利用して固相基質表面に固定した。位置マーカーとして、５’−末端に蛍光分子（ＴＡＭＲＡ）を有するマーカープローブを、その３’−末端にあるアミノ基を利用して固相基質表面に固定した。５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＴａｑポリメラーゼを５’→３’エキソ核酸切断反応に利用した。
【０１４４】
本実施例で利用した合成鋳型、単一標識プローブ及びマーカーの配列は、実施例１で利用したものと同一である。
【０１４５】
ＮＳＢ９  ＮＨＳスライド（ＮＳＢＰＯＳＴＥＣＨ、Ｋｏｒｅａ）をプローブ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２及び３）の製作に利用した。ＮＳＢスポッティングバッファー（ＮＳＢ  ｓｐｏｔｔｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）で最終濃度５０μＭになるように溶解させたそれぞれのプローブを、ＰｅｒｓｏｎａｌＡｒｒａｙｅｒＴＭ１６  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｐｏｔｔｅｒ（ＣａｐｉｔａｌＢｉｏ、Ｃｈｉｎａ）を利用してＮＳＢ９  ＮＨＳスライド上にプリントした。前記プローブを２×１フォーマット（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ  ｓｐｏｔｓ）で並べてスポッティング（ｓｐｏｔｔｉｎｇ）して、このようにして製作されたマイクロアレイを約８５％湿度のチャンバに一晩中インキュベートした。非特異的に結合されたプローブを除去するために、前記スライドを２×ＳＳＰＥ（０．３Ｍ塩化ナトリウム、０．０２Ｍリン酸水素ナトリウム及び２．０ｍＭ  ＥＤＴＡ）、ｐＨ７．４及び７．０ｍＭ  ＳＤＳを含有したバッファー溶液で３７℃、３０分間洗浄して、蒸留水で洗浄した。その後、スライド遠心分離機を利用して、前記ＤＮＡ機能化された（ＤＮＡ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ）スライドを乾燥させて、使用前まで４℃暗室で保管した。
【０１４６】
ターゲット核酸配列であるＳＡに対する合成オリゴヌクレオチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）１０、１又は０．１ｐｍｏｌｅ、１０×反応バッファー（５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）３μＬ、ｄＮＴＰｓそれぞれ５０μＭ及びＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｏｌｇｅｎｔ、Ｋｏｒｅａ）２ｕｎｉｔを含有した３０μＬの最終容量で、ＤＮＡ機能化されたスライドの表面上で反復的エキソ核酸切断反応を行った。前記プローブが交互結合（ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｄ）されたＮＳＢガラススライドの表面上に組み立てられたチャンバに前記全体混合物を適用した。スライドをｉｎ  ｓｉｔｕブロック方式でサーマルサイクラー（Ｇｅｎｅｐｒｏ  Ｂ４Ｉ、Ｃｈｉｎａ）に設置した。実験されるターゲット核酸配列のそれぞれの含量に対して５個のスライドを利用した。反復的エキソ核酸切断反応を以下のように行った：９５℃で２分間初期変性させて、９５℃で２０秒間、５５℃で２０秒間の反応過程を０、５、１０、３０又は５０サイクル行った。各サイクル数による反応以後、各スライドに対するイメージ獲得は、共焦点レーザースキャナーＡｘｏｎ  ＧｅｎｅＰｉｘ４１００Ａ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ、ＵＳＡ）を利用し、１０−μｍピクセル解像度のスキャニングで行った。蛍光強度は、定量的なマイクロアレイ分析ソフトウェア、ＧｅｎｅＰｉｘソフトウェア（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ、ＵＳＡ）を利用して分析した。蛍光強度は、周辺バックグラウンドを除去した後、スポット−中央値で表現した。再現性を調べるために、各スポットは２個ずつスポッティングした。蛍光強度は、２個のスポットの平均値で示した。
【０１４７】
鋳型の存在下で単一標識固定化プローブを利用した場合、蛍光シグナルは、ターゲット核酸配列の量によって減少した。
【０１４８】
以上、本発明の望ましい具現例を詳細に記述したが、当業界の通常の知識を有する者にとっては、このような具体的な記述はただ望ましい具現例に過ぎなく、これに本発明の範囲が限定されないことは明らかである。従って、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とその等価物により定義されると言える。
【図１】
0005916732.tif 000002
【図２Ａ】
0005916732.tif 000003
【図２Ｂ】
0005916732.tif 000004
【図３Ａ】
0005916732.tif 000005
【図３Ｂ】
0005916732.tif 000006
【配列表】
0005916732000001.app