(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
15〜95質量％のコラーゲン、4.9〜70質量％のプロテオグリカン及び0.1〜20質量％のヒアルロン酸を含み、50〜99％の気孔率及び0.025〜0.091 MPaの弾性率を有することを特徴とする人工軟骨。
【請求項２】
請求項1に記載の人工軟骨において、架橋処理されていることを特徴とする人工軟骨。
【請求項３】
請求項1又は2に記載の人工軟骨において、滅菌処理されていることを特徴とする人工軟骨。
【請求項４】
コラーゲン、プロテオグリカン及びヒアルロン酸からなる人工軟骨を製造する方法であって、ヒアルロン酸及びコラーゲンからなる第一の組成物を得る工程と、プロテオグリカン及びコラーゲンからなる第2の組成物を得る工程と、前記第一及び第2の組成物を混合して混合物を得る工程と、得られた混合物を凍結乾燥する工程とを有することを特徴とする人工軟骨の製造方法。
【請求項５】
請求項4に記載の人工軟骨の製造方法において、前記凍結乾燥の後、架橋処理することを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項5に記載の人工軟骨の製造方法において、前記架橋処理が熱脱水架橋であることを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項5又は6に記載の人工軟骨の製造方法において、架橋後の人工軟骨にガンマ線照射処理することを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項4に記載の人工軟骨の製造方法において、得られた凍結乾燥物を粉砕する工程と、得られた凍結乾燥物粉末を水に分散させる工程と、得られた分散物を再度凍結乾燥する工程とをさらに有することを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項8に記載の人工軟骨の製造方法において、前記再度の凍結乾燥の後、架橋処理することを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項9に記載の人工軟骨の製造方法において、前記架橋処理が熱脱水架橋であることを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項9又は10に記載の人工軟骨の製造方法において、架橋後の人工軟骨にガンマ線照射処理することを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体軟骨の成分を原料とした弾力性に富んだ人工軟骨、及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
軟骨組織は軟骨細胞と軟骨基質(マトリックス)とからなる。軟骨細胞は、高度に分化した細胞であり、軟骨組織中の約10％を占めるに過ぎず、また細胞分裂によって増殖することはほとんどないが、軟骨組織内で軟骨基質成分を産生し、軟骨組織の約90％を占める軟骨基質の維持を担っている。
【０００３】
軟骨細胞を用いて人工的に軟骨組織を再現し、軟骨の破壊・変性に対する治療に利用する試みがなされているが、軟骨様組織を形成するためには、軟骨細胞自体に軟骨基質成分を産生させるプロセスが不可欠である。しかしながら、現状の技術では、欠損部補填に十分な量の軟骨基質を軟骨細胞に効率よく作らせることは困難であり、未だ解決すべき問題が多く存在している。
【０００４】
軟骨組織を模した組織再生用材料を化学的に調製する研究もなされている。例えば、特開2002-80501号（特許文献１）は、グリコサミノグリカンとポリカチオンの縮合反応により得られる組織再生マトリックス用グリコサミノグリカン−ポリカチオン複合体を開示しており、軟骨、肝臓、血管、神経等、さまざまな組織の再生材料として有用であると記載している。しかしながら、特許文献１に記載の複合体は、生体軟骨とは異なり、グリコサミノグリカンとポリカチオンを主とする二成分からなるため、十分な生体親和性が得られない恐れがある。また製造過程で架橋剤及び縮合剤を使用しているため、これらの架橋剤、縮合剤、及びこれらの副生成物を洗浄除去する必要があり、多くの手聞がかかってしまうとともに、得られた複合体を体内に移植した場合は、化学物質の残留問題が生じるリスクがある。さらには、架橋剤や縮合剤を用いて作られた複合体の構造がナノレベルで、生体組織を模したものにならないため、軟骨の機能として必要な低摩擦性、耐荷重性や生体親和性を満たすことができない恐れがある。
【０００５】
国際公開第2007/032404号（特許文献２）は、(a) グリコサミノグリカンとプロテオグリカンとを混合し、グリコサミノグリカンプロテオグリカン凝集体を調製する工程、及び(b) 前記グリコサミノグリカンプロテオグリカン凝集体にコラーゲンを混合する工程を含む、自己組織化グリコサミノグリカン／プロテオグリカン／コラーゲン複合体の製造方法を開示しており、このグリコサミノグリカン／プロテオグリカン／コラーゲン複合体は、軟骨再生医療のバイオマテリアルとして極めて適した性質を有するとともに、自己組織化によって製造されるため不純物等を除去する工程が不要であると記載している。しかしながら、特許文献２に記載の方法によって得られる複合体は実質的にコラーゲン成分のみからなり、十分な複合化が起こっていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開2002-80501号公報
【特許文献２】国際公開第2007/032404号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って本発明の目的は、グリコサミノグリカン／プロテオグリカン／コラーゲン複合体からなり、機械的強度、生体親和性及び自己組織化に優れた人工軟骨を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的に鑑み鋭意研究の結果、本発明者らは、コラーゲン、プロテオグリカン及びヒアルロン酸を所望の割合で含む分散物を凍結乾燥することにより得られる複合体は人工軟骨として好適であることを見出し、本発明に想到した。
【０００９】
すなわち、本発明の人工軟骨は、15〜95質量％のコラーゲン、4.9〜70質量％のプロテオグリカン及び0.1〜20質量％のヒアルロン酸を含むことを特徴とする。
【００１０】
前記人工軟骨は、架橋処理されているのが好ましい。
【００１１】
前記人工軟骨は、滅菌処理されているのが好ましい。
【００１２】
コラーゲン、プロテオグリカン及びヒアルロン酸からなる人工軟骨を製造する本発明の第一の方法は、ヒアルロン酸及びコラーゲンからなる第一の組成物を得る工程と、プロテオグリカン及びコラーゲンからなる第2の組成物を得る工程と、前記第一及び第2の組成物を混合する工程と、得られた混合物を凍結乾燥（第一の凍結乾燥）する工程とを有することを特徴とする。
【００１３】
コラーゲン、プロテオグリカン及びヒアルロン酸からなる人工軟骨を製造する本発明の第二の方法は、コラーゲン、プロテオグリカン及びヒアルロン酸を混合する工程と、得られた混合物を凍結乾燥（第一の凍結乾燥）する工程とを有することを特徴とする。
【００１４】
前記凍結乾燥の後、架橋処理するのが好ましい。
【００１５】
人工軟骨を製造する本発明の第一及び第二の方法は、得られた凍結乾燥物を粉砕する工程と、得られた凍結乾燥物粉末を水に分散させる工程と、得られた分散物を再度凍結乾燥（第2の凍結乾燥）する工程とをさらに有するのが好ましい。
【００１６】
前記第2の凍結乾燥の後、架橋処理するのが好ましい。
【００１７】
前記架橋処理は熱脱水架橋であるのが好ましい。
【００１８】
架橋後の人工軟骨にガンマ線照射処理するのが好ましい。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の人工軟骨はコラーゲン、プロテオグリカン及びヒアルロン酸を所望の割合で含むので、機械的強度、生体親和性及び自己組織化に優れている。本発明の方法は、機械的強度、生体親和性及び自己組織化に優れた人工軟骨を簡便に製造することができる。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
[1] 人工軟骨
本発明の人工軟骨は、15〜95質量％のコラーゲン、4.9〜70質量％のプロテオグリカン及び0.1〜20質量％のヒアルロン酸を含む。コラーゲンにより軟骨組織の骨格となる網目構造が形成され、さらにヒアルロン酸及びプロテオグリカンとの架橋が物理的及び／又は化学的に形成され、十分な水分を保持することができ、軟骨特有の弾力性を有する人工軟骨が得られる。人工軟骨中のコラーゲン、プロテオグリカン及びヒアルロン酸の量は、それぞれ45〜65質量％、20〜40質量％及び1.5〜5質量％であるのがより好ましい。この範囲である場合、人工軟骨は特に関節軟骨として好適である。
【００２１】
コラーゲン含有量が15質量％未満の場合、生体中に挿入したときの膨張率が大きいため人工軟骨を軟骨欠損部へ適合させるのが難しくなり、また膨張により人工軟骨の気孔率が低下してしまう。コラーゲン含有量が95質量％超の場合、人工軟骨の着色が大きくなる。プロテオグリカン含有量が4.9質量％未満の場合、人工軟骨の弾性率が低下して軟骨としての性能が低下する。プロテオグリカン含有量が70質量％超の場合、人工軟骨の膨張による大きさの変化が大きく、気孔率が低下してしまう。ヒアルロン酸含有量が0.1質量％未満の場合、人工軟骨の弾性率が低下して軟骨としての性能が低下するとともに、人工軟骨表面の潤滑性（低摩擦性）が低下する。ヒアルロン酸含有量が20質量％超の場合、生体軟骨に含まれている割合を大きく超え、生体軟骨とは異なる成分の材料になってしまうため、適用部位によっては、コラーゲンとプロテオグリカンの所望の含有割合を確保することが難しくなる。
【００２２】
コラーゲンとしては特に限定されず、動物等から抽出したものを使用できる。また由来する動物の種、組織部位、年齢等も特に限定されない。一般的には哺乳動物（例えばウシ、ブタ、ウマ、ウサギ、ネズミ等）や鳥類（例えばニワトリ等）の皮膚、骨、軟骨、腱、臓器等から得られるコラーゲンが使用できる。また魚類（例えばタラ、ヒラメ、カレイ、サケ、マス、マグロ、サバ、タイ、イワシ、サメ等）の皮、骨、軟骨、ひれ、うろこ、臓器等から得られるコラーゲン様蛋白を使用してもよい。なおコラーゲンの抽出方法は特に限定されず、一般的な抽出方法を使用することができる。動物組織から抽出したコラーゲンの代わりに、合成コラーゲンや遺伝子組み替え技術によって得られたコラーゲンを使用してもよい。
【００２３】
グリコサミノグリカンは、アミノ糖とウロン酸又はガラクトースが結合した2糖の繰り返し構造からなる酸性多糖類である。本発明において用いられるヒアルロン酸は、グリコサミノグリカンの一種であり、ヒアルロン酸以外にもコンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン等を使用できるが、ヒアルロン酸を用いるのが好ましい。
【００２４】
プロテオグリカンとは、一つの核となるタンパク質に、一本又は多数のグリコサミノグリカン鎖が結合したものである。プロテオグリカンとしては特に制限はなく、アグリカン、バーシカン、ニューロカン、ブレビカン、デコリン、ビグリカン、セルグリシン、パールカン、シンデカン、グリピカン、ルミカン、ケラトカン等が挙げられるが、アグリカンを用いるのが好ましい。
【００２５】
プロテオグリカンの由来に特に制限はなく、複合体の使用目的に応じて、ほ乳類(ヒト、ウシ、ブタ等)、鳥類(ニワトリ等)、魚類(サメ、鮭等)、甲殻類(カニ、エビ等)等の各種動物由来の中から適宜選択することができる。特に本発明の人工軟骨をヒトの軟骨欠損又は変性の治療用として用いるのであれば、ヒトにおける免疫原性の低い由来の中から選択するのが望ましい。
【００２６】
人工軟骨中のコラーゲンの定量法として、UV吸収の測定による方法、HPLCによる方法等が挙げられる。ヒアルロン酸の定量として、カルバゾール硫酸法、ヒアルロン酸結合性タンパク質を利用した阻害法、HPLCによる方法等が挙げられる。プロテオグリカンの定量法として、比色定量法（色素DMMBを用いる）、HPLCによる方法等が挙げられる。
【００２７】
人工軟骨に架橋処理を施すのが好ましい。架橋処理は、物理的又は化学的方法により行うことができる。また人工軟骨はガンマ線処理等の方法により滅菌処理するのが好ましい。
【００２８】
人工軟骨の気孔率は50〜99％であるのが好ましく、60〜99％であるのがより好ましい。人工軟骨の平均気孔径は1〜1000μmであるのが好ましく、50〜800μmであるのがより好ましい。
【００２９】
[2] 製造方法
(1) 第一の方法
本発明の人工軟骨を製造する第一の方法は、ヒアルロン酸及びコラーゲンからなる第一の組成物を得る工程と、プロテオグリカン及びコラーゲンからなる第2の組成物を得る工程と、前記第一及び第2の組成物を混合し混合物を得る工程と、得られた混合物を凍結乾燥する工程（第一の凍結乾燥工程）とを有する。第一の方法はさらに、得られた凍結乾燥物を粉砕する工程と、粉砕した凍結乾燥物を水に分散させる工程と、得られた分散物を再度凍結乾燥する工程（第2の凍結乾燥工程）とを有してもよい。以下、人工軟骨を製造する第一の方法について詳細に説明する。
【００３０】
(a) 第一及び第2の組成物の調製
前記第一の組成物を調製する工程において、ヒアルロン酸及びコラーゲンの混合比（質量比）は10000：1〜1：10000であるのが好ましく、5000：1〜1：5000であるのがより好ましく、15：1〜1：15であるのが最も好ましい。コラーゲンはあらかじめ希塩酸（5〜50 mM程度の濃度）に0.1〜20質量％の濃度で溶解したものを用いるのが好ましい。またヒアルロン酸は、あらかじめ無菌水（注射用水等）に0.1〜20質量％の濃度で溶解したものを用いるのが好ましい。ヒアルロン酸水溶液とコラーゲン水溶液との混合は3〜25℃で行うのが好ましい。
【００３１】
前記第2の組成物を調製する工程において、プロテオグリカン及びコラーゲンの混合比（質量比）は10000：1〜1：10000であるのが好ましく、5000：1〜1：5000であるのがより好ましく、10：1〜1：10であるのが最も好ましい。コラーゲンはあらかじめ希塩酸（5〜50 mM程度の濃度）に0.1〜20質量％の濃度で溶解したものを用いるのが好ましい。またプロテオグリカンは、あらかじめ無菌水（注射用水等）に0.1〜20質量％の濃度で溶解したものを用いるのが好ましい。プロテオグリカン水溶液とコラーゲン水溶液との混合は3〜25℃で行うのが好ましい。
【００３２】
ヒアルロン酸水溶液とコラーゲン水溶液との混合（第一の組成物の調製）及びプロテオグリカン水溶液とコラーゲン水溶液との混合（第2の組成物の調製）は特に高いせん断を必要しないので、通常用いられているスターラー、ミキサー等の器具を用いて行うことができる。混合は、ヒアルロン酸及びコラーゲンの均一混合物、及びプロテオグリカン及びコラーゲンの均一混合物が得られるように、3〜25℃で1秒〜3分程度行うのが好ましい。
【００３３】
(b) 第一及び第2の組成物の混合
第一の組成物と第2の組成物との混合比は、混合後に15〜95質量％のコラーゲン、4.9〜70質量％のプロテオグリカン及び0.1〜20質量％のヒアルロン酸を含む組成となるように決める。第一及び第2の組成物の混合は、ホモジナイザー、ディゾルバー等の器具を用いて、せん断力を有する方法により行うのが好ましい。例えば、ホモジナイザーを使用する場合、1,000〜12,000 rpmの回転数で、30秒〜3分の攪拌を2〜5回繰り返して行うのが好ましい。混合時の試料は3〜25℃程度に保つのが好ましい。別々に調製した第一及び第2の組成物を混合することにより、軟骨の合成の進行を促すことができる。
【００３４】
(c) 第一の凍結乾燥
第一の組成物及び第2の組成物を混合して得られた混合物を、熱伝導性のよい容器（金属のバット等）に入れ、−80℃〜−60℃で一晩凍結する。凍結した混合物に対して、棚温度−50℃〜−5℃程度（好ましくは−40℃〜−5℃）で混合物の水分（氷）がほぼなくなるまで10時間〜10日間程度真空引きする第一の乾燥工程を行い、棚温度を20〜40℃程度（好ましくは25〜40℃）に上げてさらに3〜24時間真空引きする第2の乾燥工程を行う。このように、二段階に温度を変化させて凍結乾燥することにより、結合水までもが除去され、より乾燥して優れた保存性を有する凍結乾燥物が得られる。
【００３５】
得られた凍結乾燥物は、そのまま人工軟骨として使用することができるが、さらに以下に述べるように(d) 粉砕工程〜(g) 第2の凍結乾燥を行っても良い。このように粉砕工程を経ることにより、高密度の人工軟骨が得られる。第一及び第2の凍結乾燥によって得られた凍結乾燥体に、後述の架橋及び／又は滅菌処理を施すのが好ましい。
【００３６】
(d) 粉砕
得られた凍結乾燥物はミル等の固体粉砕器で粉砕する。粉砕方法は特に限定されないが、凍結乾燥物があまり高い温度にならない方法が好ましい。
【００３７】
(e) 分散
粉砕した凍結乾燥物は3〜20質量％の濃度となるように水又は生理食塩水と混合し、ホモジナイザー等の器具を用いて、3〜25℃及び1,000〜15,000 rpmの条件で、30秒〜3分間×1〜5回分散する。
【００３８】
(f) ゲル化
得られた分散物は、シャーレ等の容器に入れフタをし、30〜40℃で1〜5時間静置してゲル化させる。
【００３９】
(g) 第2の凍結乾燥
ゲル化させた分散物は再度凍結乾燥するのが好ましい。ゲル化させた分散物を2〜10℃で1〜20時間冷蔵し、さらに−20℃〜−60℃程度で一晩凍結する。凍結は、ゲル化させた分散物を入れた容器をステンレスバット内に置いた網皿の上に載せて行うのが好ましい。凍結した分散物は、前述の第一の凍結乾燥の場合と同様にして乾燥する。
【００４０】
(h) 架橋及び滅菌処理
凍結乾燥物は、機械的強度を高めるとともに、体内に挿入された人工軟骨を長期間に渡って保持し得るようにするため、架橋処理するのが好ましい。架橋処理は、γ線、紫外線、電子線、熱脱水等を用いた物理的架橋方法、架橋剤や縮合剤を用いた化学的架橋方法により行うことができる。化学的架橋方法には、例えば凍結乾燥物を架橋剤の溶液に浸漬する方法、凍結乾燥物に架橋剤を含有する蒸気を作用させる方法、及び製造中の人工軟骨の水性分散物に架橋剤を添加する方法が挙げられる。
【００４１】
これらの方法のうち、本発明においては熱脱水架橋法が好ましい。熱脱水架橋は、凍結乾燥後の分散物を100〜160℃及び0〜100 hPaの真空オーブン中に10〜30時間保持することにより行うことができる。
【００４２】
このようにして得られた人工軟骨は紫外線、γ線、電子線、乾燥加熱等により滅菌処理するのが好ましい。特に、25 kGy以下のガンマ線を照射することにより滅菌するのが好ましい。
【００４３】
(2) 第二の方法
本発明の人工軟骨を製造する第二の方法は、コラーゲン、プロテオグリカン及びヒアルロン酸を混合する工程と、得られた混合物を凍結乾燥（第一の凍結乾燥）する工程とを有する。第二の方法はさらに、得られた凍結乾燥物を粉砕する工程と、粉砕した凍結乾燥物を水に分散させる工程と、得られた分散物を再度凍結乾燥する工程（第2の凍結乾燥）とを有してもよい。なお、第一の凍結乾燥工程以降は前述の第一の方法と同じであるのでそれらの説明は省略し、第二の方法のうちコラーゲン、プロテオグリカン及びヒアルロン酸を混合する工程についてのみ以下詳細に説明する。
【００４４】
15〜95質量％のコラーゲン、4.9〜70質量％のプロテオグリカン及び0.1〜20質量％のヒアルロン酸を含む組成となるように、コラーゲン、プロテオグリカン及びヒアルロン酸を混合する。コラーゲンはあらかじめ水又は希塩酸（5〜50 mM程度の濃度）に0.1〜20質量％の濃度に溶解しておくのが好ましい。プロテオグリカンはあらかじめ無菌水（注射用水等）に0.1〜20質量％の濃度に溶解しておくのが好ましい。ヒアルロン酸はあらかじめ無菌水（注射用水等）に0.1〜20質量％の濃度に溶解しておくのが好ましい。
【００４５】
コラーゲン、プロテオグリカン及びヒアルロン酸の各溶液は、ホモジナイザー、ディゾルバー等の器具を用いて、せん断力をかけて混合するのが好ましい。例えば、ホモジナイザーを使用する場合、1,000〜12,000 rpmの回転数で、30秒〜3分の攪拌を2〜5回繰り返して行うのが好ましい。コラーゲン水溶液、プロテオグリカン水溶液及びヒアルロン酸水溶液の調製及び混合は3〜25℃に保温して行うのが好ましい。
【実施例】
【００４６】
本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はそれらに限定されるものではない。
【００４７】
比較例1
(1)試料101の作製
市販の1質量％の濃度のコラーゲン水溶液を水で希釈し、0.5質量％の濃度のコラーゲン水溶液を調製した。プロテオグリカンの粉末を水で溶解し、0.5質量％の濃度のプロテオグリカン水溶液を調製した。ヒアルロン酸の粉末を水で溶解し、0.6質量％の濃度のヒアルロン酸水溶液を調製した。得られた0.6質量％の濃度のヒアルロン酸水溶液と、0.5質量％の濃度のプロテオグリカン水溶液とを1：2（質量比）で混合し、さらにこの混合液3 mLに0.5質量％の濃度のコラーゲン水溶液2 mLを混合した。
【００４８】
得られたコラーゲン／プロテオグリカン／ヒアルロン酸の混合液（pH 4.40）に、1 NのNaOH水溶液を8μL添加して前記混合液のpHを6.03に調節した。pH 6.03は実質的に中性とみなした。pH調節後のコラーゲン／プロテオグリカン／ヒアルロン酸の混合液を、37℃の振盪機能つきインキュベーター（ハイブリダイゼーションインキュベーターHB-100、TAITEC社）に入れ60 rpmで4時間振盪した後、1回目の超遠心分離（23000 rpm、30分）し、固形分を沈殿させた。得られた沈殿物及び上清を分離しないでそのまま37℃で一晩静置した。沈殿物は超遠心分離直後の形状を保持していた。一晩静置後の沈殿物及び上清を、2回目の超遠心分離（23000 rpm、30分）し、上清を生理食塩水に置換した後、さらに3回目の超遠心分離（23000 rpm、30分）して人工軟骨（沈殿物）を得た。
【００４９】
(2) 試料102の作製
得られたコラーゲン／プロテオグリカン／ヒアルロン酸の混合液（pH 4.40）に、1 NのNaOH水溶液を10μL添加して前記混合液のpHを9.04に調節した以外は試料101と同様にして人工軟骨を得た。
【００５０】
ほとんど未満反応成分は2回目の超遠心分離後の上清に含まれるので、その上清中のプロテオグリカン及びヒアルロン酸を定量し、沈殿物（人工軟骨）に含まれるコラーゲン、プロテオグリカン及びヒアルロン酸の組成比を算出した。結果を表1に示す。表1から明らかなように、試料101（実質的に中性）の沈殿物は生体軟骨に含まれるべきプロテオグリカン及びヒアルロン酸をほとんど含まず、ほぼコラーゲンのみからなり、また試料102（アルカリ性）の沈殿物はヒアルロン酸をほとんど含まず、プロテオグリカンの含有量は少量であった。
【００５１】
【表１】
0005973873.tif 000002
注(1)：仕込み量に対して回収した沈殿物量の割合。
【００５２】
実施例1
(1) 原料溶液の調製
5m M塩酸にコラーゲンを溶解し、1質量％の濃度のコラーゲン水溶液を作製した。また注射用水にプロテオグリカンを溶解し、1質量％の濃度のプロテオグリカン水溶液を作製した。さらに、注射用水にヒアルロン酸を溶解し、0.1質量％の濃度のヒアルロン酸水溶液を作製した。なおこれらの調製は全て4℃で行った。
【００５３】
(2) 原料の混合
前記コラーゲン水溶液及びプロテオグリカン水溶液を、1：1（質量比）で混合し、ミキサーで攪拌し混合液Aを得た。同様に、前記コラーゲン水溶液及びヒアルロン酸水溶液を、1：1（質量比）で混合し、ミキサーで攪拌し混合液Bを得た。混合液A及びBを2：1（質量比）で混合し、ホモジナイザーで10,000 rpmの回転数で1分間の攪拌を30秒のインターバルをおいて3回行った。なお攪拌は試料の温度を5℃に保温して行った。
【００５４】
(3) 凍結乾燥
得られた混合物をバットに流し込み-80℃で19時間凍結した後、棚温度-5℃で10日間真空引きし第一の乾燥を行った。この第一の乾燥で、混合物の水分（氷）はほぼなくなった。引き続き真空引きしたまま棚温度を25℃に上げてさらに3時間第2の乾燥を行い、凍結乾燥物を得た。
【００５５】
(4) 粉砕及び分散
得られた凍結乾燥物をミルで粉砕した後、粉砕した凍結乾燥物を10.7質量％の濃度となるように生理食塩水を混合しホモジナイザーで10,000 rpmの条件で、1分間の分散を3回行った。なお、ホモジナイザーによる分散は5℃に保温して行った。
【００５６】
(5) ゲル化
得られた分散物をガラス製のシャーレに入れフタをし、37.5℃で1時間静置してゲル化させた後、5℃で2時間冷蔵した。
【００５７】
(6) 凍結乾燥
ステンレスバット内に置いた網皿の上に前記冷蔵した材料をシャーレごと置き-60℃で16時間凍結した後、棚温度-5℃以下で3日間真空引きし第一の乾燥を行った。この第一の乾燥で、混合物の水分（氷）はほぼなくなった。引き続き真空引きしたまま棚温度を25℃に上げてさらに3時間第2の乾燥を行い、凍結乾燥物を得た。
【００５８】
(7) 架橋及び滅菌
真空オーブンで110℃の条件で20時間熱脱水架橋した後、15 kGyの線量のガンマ線を照射して滅菌処理し、58.8質量％のコラーゲン、39.2質量％のプロテオグリカン及び1.96質量％のヒアルロン酸を含む本発明の人工軟骨を得た。
【００５９】
実施例2
(1) 原料溶液の調製
5m M塩酸にコラーゲンを溶解し、1質量％の濃度のコラーゲン水溶液を作製した。また注射用水にプロテオグリカンを溶解し、1質量％の濃度のプロテオグリカン水溶液を作製した。さらに、注射用水にヒアルロン酸を溶解し、0.2質量％の濃度のヒアルロン酸水溶液を作製した。なおこれらの調製は全て4℃で行った。
【００６０】
(2) 原料の混合
作製したコラーゲン水溶液22.5 mL、プロテオグリカン水溶液105 mL、及びヒアルロン酸水溶液112.5 mLを混合し、ホモジナイザーで2,000 rpmの回転数で1分間の攪拌行った。なお攪拌は試料の温度を5℃に保温して行った。
【００６１】
(3) 凍結乾燥
得られた混合物をバットに流し込み-80℃で12時間凍結した後、棚温度-5℃で8日間真空引きし第一の乾燥を行った。この第一の乾燥で、混合物の水分（氷）はほぼなくなった。引き続き真空引きしたまま棚温度を25℃に上げてさらに24時間第2の乾燥を行い、凍結乾燥物を得た。
【００６２】
(4) 粉砕及び分散
得られた凍結乾燥物をミルで粉砕した後、粉砕した凍結乾燥物を10.7質量％の濃度となるように生理食塩水を混合し、ホモジナイザーで10,000 rpmの条件で、1分間の分散を3回（インターバル：1分）行った。なお、ホモジナイザーによる分散は5℃に保温して行った。
【００６３】
(5) 脱泡
得られた分散物を、自転・公転ミキサー（シンキー社製、あわとり練太郎ARE-250）で1分攪拌し、分散物中に含まれる気泡を取り除いた。
【００６４】
(6) ゲル化
脱泡した分散物をガラス製のシャーレに入れフタをし、37.5℃で3時間静置してゲル化した後、5℃で3時間冷蔵した。
【００６５】
(6) 凍結乾燥
ステンレスバット内に置いた網皿の上に前記冷蔵した材料をシャーレごと置き-60℃で12時間凍結した後、棚温度-5℃で4日間真空引きし第一の乾燥を行った。この第一の乾燥で、混合物の水分（氷）はほぼなくなった。引き続き真空引きしたまま棚温度を25℃に上げてさらに4時間第2の乾燥を行い、凍結乾燥物を得た。
【００６６】
(7) 架橋及び滅菌
真空オーブン中で110℃の条件で20時間凍結乾燥物に熱脱水架橋をした後、15 kGyの線量のガンマ線を照射して滅菌処理し、15質量％のコラーゲン、70質量％のプロテオグリカン及び15質量％のヒアルロン酸を含む本発明の人工軟骨を得た。
【００６７】
実施例3
285 mLのコラーゲン水溶液、14.7 mLのプロテオグリカン水溶液、及び1.5 mLのヒアルロン酸水溶液を用いた以外は実施例2と同様にして、95質量％のコラーゲン、4.9質量％のプロテオグリカン及び0.1質量％のヒアルロン酸を含む本発明の人工軟骨を得た。
【００６８】
実施例4
82.5 mLのコラーゲン水溶液、37.5 mLのプロテオグリカン水溶液、及び150 mLのヒアルロン酸水溶液を用いた以外は実施例2と同様にして、55質量％のコラーゲン、25質量％のプロテオグリカン及び20質量％のヒアルロン酸を含む本発明の人工軟骨を得た。
【００６９】
比較例1（試料101及び102）及び実施例1〜4で得られた試料中のコラーゲン、プロテオグリカン及びヒアルロン酸の組成比を表2に示す。
【００７０】
【表２】
0005973873.tif 000003
【００７１】
表3に実施例1〜4の弾性率を示す。なお、比較例1の試料101及び102は弾性試験において試料が破損し測定できなかった。これらの結果から、本発明の範囲内の実施例1〜4の人工軟骨は、高い弾性率を有していることが分る。
【００７２】
【表３】
0005973873.tif 000004
【００７３】
以上から明らかなように、従来の方法（比較例1の方法）で作製した人工軟骨はプロテオグリカン及びヒアルロン酸をほとんど含まず、生体軟骨とは異なる組成を有し、人工軟骨として必要な性能を有していないのに対して、本発明の人工軟骨は、コラーゲン、プロテオグリカン及びヒアルロン酸を所望の組成比で含有する生体軟骨と類似した組成を有し、比較例1より十分に高い機械的強度を有している。