(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を一定の昇温速度で加熱して、細胞の形状または硬度の温度依存性を決定する工程を含んでなる、細胞の耐熱性評価法。
【請求項２】
加熱手段を備えた走査型プローブ型顕微鏡（ＳＰＭ）を用いて、細胞の形状または硬度の温度依存性を決定する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞が、細菌、真菌および酵母からなる群から選択される微生物である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
所望のＤ値を示す前記細胞の加熱温度を算出する工程を更に含んでなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
所望の加熱温度における前記細胞のＤ値を算出する工程を更に含んでなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
細胞が存在する環境下における前記細胞の耐熱性を評価する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の耐熱性評価法に関し、具体的には、細胞の形状または硬度の温度依存性を決定することによる、細胞の耐熱性評価法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、細胞の耐熱性評価は、一般的な加熱殺菌理論に基づいて、試料を一定時間加熱し、加熱後の生残菌数を測定することにより行われていた。これにより、特に飲食料品中の細菌等の適切な加熱条件を検討することができるため、細菌の加熱殺菌理論は、産業上極めて重要であると認識されている。しかしながら、従来型の細胞の耐熱性評価法は、バイオマスとして培養した細胞を用いた耐熱性評価であるため、多種多様な細菌の混合物を用いることは困難である。そのため、従来型の細胞の耐熱性評価法では単離やその後の培養に手間を要し、生残菌数の測定も煩雑であり、細胞の耐熱性評価は大変な時間と手間を要するものであった。
【０００３】
近年、細胞の硬度を測定することにより、細胞の耐熱性を評価する方法が開発された（特許文献１）。この方法は、細胞の硬度と細胞の耐熱性とが比例することを利用した細胞の耐熱性評価法である。すなわち、各種細胞を用いて細胞の硬度と耐熱性に関して予め作成した検量線に、耐熱性未知の細胞の特定温度での硬度を当てはめることで、特定温度における当該細胞の耐熱性を評価することができる。この方法によれば、検量線さえ作成しておけば、その後は、細胞の特定温度における耐熱性を簡便かつ迅速に評価することができる。しかしながら、この方法では、評価対象が、細胞の硬度と細胞の耐熱性との比例関係が認められる芽胞形成細菌の芽胞に限られていた。例えば、好熱性偏性嫌気性芽胞形成細菌の芽胞やカビの子嚢胞子などでは、細胞の硬度と耐熱性の間に相関性が認められず、このような微生物種には適用できないという問題があった。そのため、幅広い微生物種に適用できる簡便かつ迅速な細胞の耐熱性評価法の開発が望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００９−１８３２０７号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】佐藤順、「加熱殺菌理論の基礎知識」、現場必携・微生物殺菌実用データ集第１版、株式会社サイエンスフォーラム、２００５年８月１１日、３１〜４２頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、細胞の耐熱性を簡便かつ迅速に評価する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、細胞の形状または硬度の温度依存性を決定することによって、細胞の耐熱性を簡便かつ迅速に評価できることを見いだした。本発明は、このような知見に基づくものである。
【０００８】
すなわち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）細胞の形状または硬度の温度依存性を決定する工程を含んでなる、細胞の耐熱性評価法。
（２）加熱手段を備えた走査型プローブ顕微鏡（ＳＰＭ）を用いて、細胞の形状または硬度の温度依存性を決定する、（１）に記載の方法。
（３）細胞が、細菌、真菌および酵母からなる群から選択される微生物である、（１）または（２）に記載の方法。
（４）所望のＤ値を示す前記細胞の加熱温度を算出する工程を更に含んでなる、（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）所望の加熱温度における前記細胞のＤ値を算出する工程を更に含んでなる、（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（６）細胞が存在する環境下における前記細胞の耐熱性を評価する、（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
【０００９】
本発明では、測定対象となる細胞の形状または硬度の温度依存性を決定することによって、簡便かつ迅速に細胞の耐熱性を評価することができる。細胞の単離が不要なため、細胞の混合物をそのまま測定に供することもできる。そのため、細胞の存在環境下における耐熱性を評価することができる。また、本発明によれば、任意の加熱温度におけるＤ値、または任意のＤ値を示す加熱温度を簡便かつ迅速に評価することができる。従って、本発明によれば、例えば、細菌類の存在環境下における耐熱性を評価し、飲食品の加熱処理時間を現状に即して決定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、供試微生物株から調製した測定試料の細胞の加熱温度とその際の細胞の厚みの増加量との関係を示す図である。図は、横軸を細胞の加熱温度（℃）とし、縦軸を２５℃からの細胞の厚みの増加量（ｎｍ）とした。図１Ａは芽胞形成細菌の芽胞（B. licheniformisおよびB. coagulans）における結果を示し、図１Ｂは好熱性偏性嫌気性芽胞形成細菌の芽胞（T. mathraniiおよびM. thermoacetica）における結果を示し、図１Ｃは通常の細胞（栄養細胞）（E. coli、S. aureus subsp. aureusおよびS. pastrianus）における結果を示し、図１Ｄはカビの子嚢胞子（B. fulvaおよびT. flavus）における結果を示す。グラフ中の縦の線が、細胞固有の温度Ｔ１またはＴ２を求めるための直線である。
【図２】図２は、微生物の代表的な加熱致死時間曲線（ＴＤＴ曲線）を示す図である。データは、縦軸を加熱温度（℃）とし、対数目盛を有する横軸をＤ値（分）とする片対数グラフ上に示した。●は、B. licheniformis株おける加熱温度とＤ値との関係を示し、▲は、B. coagulans株における加熱温度とＤ値との関係を示す。それぞれの株に対するＴＤＴ曲線をグラフ内の直線で示す。ＴＤＴ曲線の回帰式ｌｏｇ１０Ｄ＝ｃ＋ｄ×Ｔ（ｃおよびｄは定数）を求めることで、Ｄ値が０．００５分となるときの加熱温度やＤ値が０．０１分となるときの加熱温度を推定することが可能である（グラフ内点線）。
【図３】図３は、細胞の厚みの熱分析の際のカンチレバーの昇温速度を変化させることで、Ｔ１の温度が変化することを示す図である。毎秒１０℃または毎秒２０℃の昇温速度でB. licheniformisおよびB. coagulansにおける細胞の厚みと加熱温度との関係をそれぞれグラフに図示すると、昇温速度依存的にＴ１の温度が変化することが分かる。
【発明の具体的説明】
【００１１】
本発明において評価対象となる細胞は、細菌などの原核生物、真菌などの真核生物、および古細菌の細胞が挙げられる。単細胞生物であればいずれの細胞でも測定対象とすることができる。また、動物や植物などの多細胞生物の細胞であっても、測定に用いることができる。単細胞生物の場合は、細胞壁の有無に関わらず測定することができる。細胞壁がある場合であっても、細胞壁の種類に関わらず測定することができ、しかも、測定に際して、細胞壁等の除去の必要はない。従って、厚い細胞壁を有するグラム陰性菌、真菌、植物、古細菌の細胞であっても、簡単な手順で、細胞の硬度または形状を測定することができる。なお、本明細書において「細胞」は、単細胞生物自体を意味するものとして用いられることがある。
【００１２】
本発明の測定対象となる細菌としては、細菌であれば特に限定されないが、例えば、ナイセリア属（Neisseria）、ブランハメラ属（Branhamella）、ヘモフィルス属（Haemophilus）、ボルデテラ属（Bordetella）、エシェリキア属（Escherichia）、シトロバクター属（Citrobacter）、サルモネラ属（Salmonella）、シゲラ属（Shigella）、クレブシエラ属（Klebsiella）、エンテロバクター属（Enterobacter）、セラチア属（Serratia）、ハフニア属（Hafnia）、プロテウス属（Proteus）、モルガネラ属（Morganella）、プロビデンシア属（Providencia）、エルシニア属（Yersinia）、カンピロバクター属（Campylobacter）、ビブリオ属（Vibrio）、エロモナス属（Aeromonas）、シュードモナス属（Pseudomonas）、キサントモナス属（Xanthomonas）、アシネトバクター属（Acinetobacter）、フラボバクテリウム属（Flavobacterium）、ブルセラ属（Brucella）、レジオネラ属（Legionella）、ベイロネラ属（Veillonella）、バクテロイデス属（Bacteroides）およびフゾバクテリウム属（Fusobacterium）などのグラム陰性菌；ならびに、ブドウ球菌属（Staphylococcus）、レンサ球菌属（Streptococcus）、腸球菌属（Enterococcus）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）、バシラス属（Bacillus）、ゲオバシラス属（Geobacillus）、デスルホトマクルム属（Desulfotomaculum）、リステリア属（Listeria）、ペプトコッカス属（Peptococcus）、ペプトストレプトコッカス属（Peptostreptococcus）、クロストリジウム属（Clostridium）、ユーバクテリウム属（Eubacterium）、プロピオニバクテリウム属（Propionibacterium）、ラクトバチルス属（Lactobacillus）、ビフィドバクテリウム属（Bifidobacterium）、エンテロコッカス属（Enterococcus）、ラクトコッカス属（Lactococcus）、ペディオコッカス属（Pediococcus）、ロイコノストック属（Leuconostoc）、ストレプトコッカス属（Streptococcus）、サーモアナエロバクター属（Thermoanaerobacter）、ムーレラ属（Moorella）などのグラム陽性菌が挙げられる。測定対象としては、ブドウ球菌属、リステリア属、ラクトバチルス属、ビフィドバクテリウム属、エンテロコッカス属、ラクトコッカス属、ペディオコッカス属、ロイコノストック属、ストレプトコッカス属、ビブリオ属、サルモネラ属、エシェリキア属、カンピロバクター属、アンフィバシラス属、バシラス属、ゲオバシラス属、クロストリジウム属、デスルホトマクルム属、サーモアナエロバクター属、ムーレラ属およびスポロサルシナ属の細菌が好ましく、黄色ブドウ球菌；リステリア菌；乳酸菌；腸炎ビブリオ；サルモネラ菌；大腸菌；カンピロバクター；ならびにアンフィバシラス属、バシラス属、ゲオバシラス属、クロストリジウム属、デスルホトマクルム属、サーモアナエロバクター属、ムーレラ属およびスポロサルシナ属などの芽胞形成細菌がより好ましい。黄色ブドウ球菌Staphylococcus aureus、特にStaphylococcus aureus subsp. aureus、大腸菌Escherichia coli、およびバシラス属の芽胞形成菌であるBacillus subtilis、Bacillus subtilis ver. subtilis、Bacillus coagulans、Bacillus licheniformis、Bacillus megaterium、Geobacillus属の芽胞形成菌であるGeobacillus stearothermophillus、好熱性偏性嫌気性芽胞形成細菌であるThermoanaerobacter mathranii、Moorella thermoaceticaが最も好ましい。
【００１３】
本発明の測定対象となる真菌としては、担子菌門（Basidiomycota）、子嚢菌門（Ascomycota）、ツボカビ門（Chytridiomycota）、ネオカリマスティクス菌門（Neocallimastigomycota）、コウマクノウキン門（Blastocladiomycota）、微胞子虫門（Microsporidia）、グロムス門（Glomeromycota）、ケカビ亜門（Mucoromycotina）、ハエカビ亜門（Entomophthoromycotina）、トリモチカビ亜門（Zoopagomycotina）、キックセラ亜門（Kickxellmycotina）などの真菌が挙げられる。測定対象としては担子菌門若しくは子嚢菌門に属する酵母、または、接合菌門、子嚢菌門若しくは担子菌門に属する真菌（カビ）が好ましい。酵母としては、例えば、サッカロマイセス属（Saccharomyces）、カンジダ属（Candida）、トルロプシス属（Torulopsis）、ザイゴサッカロマイセス属（Zygosaccharomyces）、スキゾサッカロマイセス属（Schizosaccharomyces）、ピチア属（Pichia）、ヤロウィア属（Yarrowia）、ハンセヌラ属（Hansenula）、クルイウェロマイセス属（Kluyeromyces）、デバリオマイセス属（Debaryomyces）、ゲオトリクム属（Geotrichum）、ウィッケルハミア属（Wickerhamia）、フェロマイセス属（Fellomyces）などの子嚢菌門に属する酵母および、スポロボロマイセス属（Sporobolomyces）などの担子菌門に属する酵母が好ましい。サッカロマイセス属の出芽酵母であるSaccharomyces cerevisiaeおよびSaccharomyces pastrianus、ならびにスキゾサッカロマイセス属の分裂酵母であるSchizosaccharomyces pombeがより好ましい。測定対象となるカビとしては、ビソクラミス属（Byssochlamys）およびタラロセミス属（Talaromyces）などの子嚢菌門に属する真菌が好ましく、Byssochlamys fulvaおよびTalaromyces flavusがより好ましい。これらの子嚢菌門の真菌は、子嚢胞子の状態であってもそのまま本発明の測定対象となる。
【００１４】
本発明の測定対象となる細胞としては、単離して培養した細胞だけでなく、飲食料品中や溶液中等に混入した細胞や細胞の混合物を用いることができる。これは、本発明の測定対象となる細胞は、当該細胞の存在環境下から採取したものを直接測定に用いることができるためである。本発明では、少なくとも１つの細胞を測定できれば細胞の耐熱性の評価が可能であるため、評価したい細胞を必ずしも単離する必要はなく、当該細胞の存在する環境下での細胞の耐熱性を評価することが可能である。また、本発明の測定対象となる細胞は、当該細胞の増殖に適した培養条件下で培養してから測定に用いることもできる。各細胞の増殖に適した培養条件は、当業者であれば適宜決めることができる。細胞は、当該細胞の存在環境下から採取したものを直接測定に用いる場合も、当該細胞の増殖に適した培養条件下で培養してから測定に用いる場合も、適宜固定してから測定に用いることができる。生きた細胞を測定する固定法としては特に限定されないが、風乾固定が挙げられる。
【００１５】
本発明の細胞の耐熱性評価法では細胞の形状または硬度の温度依存性を決定することにより細胞の耐熱性を評価することができる。後記実施例に示されるように、一定応力を加えられた細胞を一定の昇温速度で加熱すると温度依存的に細胞の形状が変化し、その変化割合がある温度を境に急激に変化すること、さらには、該温度が細胞の耐熱性の指標となることが見出された。従って、本発明によれば、細胞の形状（例えば、細胞の厚みや直径（桿菌の場合は、長さおよび／または幅）のような細胞形状の変化を客観的に特定できる指標）の温度依存性を決定することにより細胞の耐熱性を評価することができる。また、本発明によれば、細胞の硬度の温度依存性を決定することにより細胞の耐熱性を評価しても良く、さらにはヤング率や弾性率のような細胞の物性値の温度依存性を決定することにより細胞の耐熱性を評価しても良い。従って、本発明によれば、細胞の形状の温度依存性、あるいは、細胞の硬度、ヤング率若しくは弾性率などの細胞の物性値の温度依存性を決定することにより細胞の耐熱性を評価することができる。以下の理論に拘束されるわけではないが、細胞を昇温条件下に置いた場合、細胞の死滅前後で細胞自体の物性が変化し、その変化を捉えることにより細胞の耐熱性を評価することが可能になると考えられる。
【００１６】
細胞の形状の温度依存性を決定する工程は、細胞に応力をかけた状態で測定してもよく、応力をかけずに測定してもよい。応力をかける場合は、特に限定されないが、応力をかけた方向の細胞の形状を測定することができる。一つの具体的態様では、細胞の形状は細胞の厚みである。
【００１７】
細胞の形状の変化を測定する装置は、細胞の形状が測定できる限り特に制限無く用いることができるが、例えば、走査型プローブ顕微鏡（ＳＰＭ）が挙げられる。また、走査型プローブ顕微鏡としては、例えば、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）を用いることができる。走査型プローブ顕微鏡を用いた細胞の形状の測定方法は当業者に周知である。
【００１８】
細胞に対する応力は、走査型プローブ顕微鏡などのカンチレバーを用いて発生させることができる。また、細胞の形状は、走査型プローブ顕微鏡などのカンチレバーを用いて測定することができる。応力の発生と細胞の形状の測定のためのカンチレバーは別々のカンチレバーとすることができるが、好ましくは、同一のカンチレバーを用いて、応力を発生させ、同時にその際の細胞の形状を測定することができる。
【００１９】
細胞の硬度は弾性率あるいはヤング率（Ｎ／ｍ２またはＰａ）により表すことができる。従って、細胞の硬度の温度依存性を決定する工程は、細胞の弾性率あるいはヤング率の温度依存性を決定する工程とすることができる。すなわち、細胞の弾性率あるいはヤング率を様々な温度で測定することで細胞の硬度の温度依存性を決定することができる。なお、弾性率とヤング率は変形のしにくさを表す物性値である点で共通することから、本明細書では両者を同義のものとして扱うこととする。
【００２０】
ヤング率Ｅは、一般的に、
【数１】
0005866942.tif 000002
として表すことができる｛ここで、応力σは、単位面積当たりの力（Ｎ／ｍ２またはＰａ）であり、ひずみεは、応力σによる変形の単位長さ当りの伸縮量である｝。従って、上記数式に基づいて、細胞に負荷する応力σと細胞のひずみεから、細胞のヤング率Ｅを決定することができる。細胞のひずみεは、例えば、応力σを負荷した際の細胞の厚みを無負荷時の細胞の厚みで除して求めることができる。応力の無負荷時の細胞の厚みに温度依存性がほとんど見られないときには、細胞のひずみεに代えて、(i)応力σを負荷した際の細胞の厚み若しくは厚みの変化量、または、(ii)細胞の厚みを一定にするために要する応力σを用いて細胞のヤング率の温度依存性を決定することができる。なお、細胞のひずみεは細胞の厚みだけでなく細胞の直径（桿菌の場合は、長さおよび／または幅）などを指標にしてもよい。
【００２１】
細胞の形状または硬度の温度依存性は、細胞を昇温させながらこれらを測定することにより決定することができる。細胞を昇温させる手段は特に限定されないが、例えば、細胞に接触させた試料台やカンチレバーにより昇温させることができ、あるいは加熱雰囲気下に試料を置くことでも昇温させることができる。
【００２２】
昇温は、好ましくは単位時間当りの温度変化（昇温速度）を一定にして行うことができる。昇温速度に制限はないが、例えば、毎秒０．１℃〜毎秒１００℃とすることができ、毎秒１℃〜毎秒５０℃とすることができ、または、毎秒１０〜２０℃とすることができる。細胞の昇温と形状または硬度の測定とを独立した手段で行うこともできるが、好ましくは、加熱手段を備えたカンチレバーを用いて、昇温と形状または硬度の測定とを同時に行うことができる。加熱手段を備えたカンチレバーとしては、例えば、局所加熱型カンチレバーが挙げられ、好ましくは、局所加熱型カンチレバーを備えたＳＰＭを用いることができる。なお、細胞の形状の温度依存性を測定する際には、温度変化前後の細胞の大きさの差のように細胞形状の変化を客観的に測定できれば、細胞形状そのものを測定する必要はない。
【００２３】
細胞の形状または硬度の温度依存性を決定した後に、更に細胞の形状または硬度の温度依存性が特徴的に変化する温度を決定することができる。すなわち、本発明による細胞の耐熱性の評価方法は、ａ）細胞の形状または硬度の温度依存性を決定する工程に加えて、ｂ）決定された形状または硬度の温度依存性から、温度依存性が特徴的に変化する温度を導出する工程をさらに含んでいてもよい。上記工程ｂ）で求められた温度依存性が特徴的に変化する温度は、その高低を比較することによって、細胞の耐熱性の比較に用いることができる。このような温度依存性が特徴的に変化する温度は以下のように導出することができる。
【００２４】
細胞の形状または硬度の温度依存性が変化する温度としては、細胞の形状（例えば、厚み）、または細胞の硬度の逆数を加熱温度に対してプロットしたグラフ上で、細胞の形状、または細胞の硬度の逆数の温度に対する傾きが急激に変化する温度（本明細書中、単に「Ｔ１」（℃）ということがある）若しくは細胞の形状、または細胞の硬度の逆数が極大値をしめす温度（本明細書中、単に「Ｔ２」（℃）ということがある）が該当する。上記温度Ｔ１（℃）は、上記グラフから視覚的に求めてもよいし、視覚的に求めたＴ１の前後から任意に２点を選択し、その２点を通る直線から最も距離が遠い点の温度として求めてもよい。また、このようにして求めたＴ１値を仮のＴ１値とし、この値より高い温度域および低い温度域においてそれぞれ１本の直線の回帰式を求め、得られた２本の回帰式の交点の温度をＴ１値として求めてもよい。その他、周知の方法により折れ線回帰モデルを作成し、Ｔ１を求めてもよい。このような温度Ｔ１を有する細胞としては、例えば、芽胞形成細菌の芽胞が挙げられる。
【００２５】
細胞の形状、または細胞の硬度の逆数が極大値をしめす加熱温度Ｔ２（℃）は、例えば、細胞の形状、または細胞の硬度の逆数が最大値を示す温度として求めることができる。このようなＴ２を有する細胞としては、例えば、芽胞形成細菌の栄養細胞、芽胞形成細菌以外の細菌および真菌を挙げることができる。これらの細胞では、温度Ｔ２の前後でもデータが高い直線性を示すので、温度Ｔ１を決定する際と同様の方法で、２本の回帰曲線または折れ線回帰モデルから、形状、または硬度の逆数が極大値を示す加熱温度Ｔ２（℃）を求めてもよい。
【００２６】
決定された細胞の形状または硬度の温度依存性から細胞固有の温度Ｔ１またはＴ２を導出する工程は、上記と数学的に等価な方法によっても行うことができる。数学的に等価な方法としては、測定値を逆数にして温度Ｔ１またはＴ２を導出する方法、測定値にある定数を乗じて（若しくはある定数を加算して）またはある定数で除して（若しくはある定数を減じて）あるいはこれらの加減乗除を組み合わせて温度Ｔ１またはＴ２を導出する方法などを挙げることができる。具体的には、例えば、細胞の形状、または細胞の硬度の逆数が最大値（極大値）を示す温度は、細胞の形状の逆数または硬度が最小値（極小値）を示す温度を決定することでも求めることができる。
【００２７】
このようにして求められたＴ１またはＴ２の温度は、その高低を比較することで、それぞれの微生物の耐熱性の評価に用いることができる。具体的には、各種微生物のＴ１またはＴ２を比較し、Ｔ１またはＴ２の温度が高いほど、耐熱性が高いと評価することができる。
【００２８】
本発明による細胞の耐熱性の評価方法では、加熱殺菌理論において、ある温度で微生物の生残数を１０分の１とするのに必要な時間（本明細書中、単に「Ｄ値」ということがある）を求めることができ、また、あるＤ値を示す加熱温度を求めることもできる。すなわち、本発明による細胞の耐熱性の評価方法は、前述の工程ａ）および工程ｂ）に加えて、ｃ）温度依存性が特徴的に変化する温度、すなわち、細胞固有の温度Ｔ１若しくはＴ２、が対応するＤ値を決定する工程を含んでいても良く、また、工程ｃ）に加えて、ｄ）所望のＤ値を示す加熱温度または所望の加熱温度におけるＤ値を算出する工程を更に含んでいてもよい。さらに、工程ｄ）で求められた所望のＤ値を示す加熱温度または所望の温度におけるＤ値からは、微生物の加熱殺菌条件を決めることができる。なお、一般的な加熱殺菌理論としては、現場必携・微生物殺菌実用データ集第１版、３１〜４２頁に記載の理論を挙げることができる。
【００２９】
細胞固有の温度Ｔ１またはＴ２が対応するＤ値を決定する工程ｃ）は、以下のように行うことができる。具体的には、本発明の方法により決定したＴ１またはＴ２に対応するＤ値が如何なる値をとるかは、一般的な微生物の加熱殺菌理論を用いることで、当業者であれば容易に求めることができる。
【００３０】
後記実施例に示されるように、ある特定の昇温速度条件で細胞の形状または硬度の温度依存性を決定し、温度依存性が特徴的に変化する温度を決定すると、その決定された温度に対応するＤ値は菌種によらずほぼ一定の数値を取る。すなわち、昇温速度条件を一定にして工程ａ）を行い、それに引き続いて工程ｂ）を行うと、それにより決定された温度Ｔ１またはＴ２は菌種によらずある特定のＤ値に対応することになる。この知見に従えば、微生物の加熱殺菌理論に基づく一般的な方法によってある微生物（好ましくは２〜３種の微生物）について加熱温度Ｔと微生物の生残数を１０分の１とするのに必要な時間Ｄの関係式を決定し、決定されたその関係式に、その微生物についてある特定の昇温速度条件で実施された工程ａ）および工程ｂ）で決定された温度Ｔ１またはＴ２を導入し、対応するＤ値を一旦決定すれば、その後他の微生物について決定された温度Ｔ１またはＴ２も、同じ昇温速度条件を用いて測定する限り、同様のＤ値を持つと決定できる。上記のように決定されるＤ値は、細胞の昇温速度に依存して変化することから、工程ａ）における昇温速度条件を変更するときには、昇温速度条件毎にＤ値を決定することが好ましい。
【００３１】
ある昇温速度条件下で決定された温度Ｔ１またはＴ２とＤ値との関係を決定するために用いる関係式は、具体的には、微生物の加熱殺菌理論に基づく一般的な方法によって微生物の様々な温度におけるＤ値を取得し、それにより得られた回帰式ｌｏｇ１０Ｄ＝ｃ＋ｄ×Ｔ（ｃおよびｄは定数）（この式は「加熱致死時間曲線」または「ＴＤＴ曲線」と呼ばれる）を用いることができる。ＴＤＴ曲線は測定対象の微生物が存在する環境毎に決定し、決定したＴＤＴ曲線に基づいて、温度依存性が特徴的に変化する温度、すなわち、細胞固有の温度Ｔ１若しくはＴ２に対応するＤ値を決定してもよい。この場合、その環境下（培養条件下）での温度Ｔ１若しくはＴ２に対応するＤ値と決定してもよい。
【００３２】
また、本発明によれば、所望のＤ値を示す加熱温度または所望の加熱温度におけるＤ値を更に算出することができる。工程ｄ）は、以下のように行うことができる。具体的には、一般的な加熱殺菌理論によれば、Ｄ値と温度Ｔは、回帰式ｌｏｇ１０Ｄ＝ｃ＋ｄ×Ｔ（ｃおよびｄは定数）の関係を示すことが知られており、ＴＤＴ曲線の回帰式は、以下の２つの方法により求めることができる：（ｉ）あるＤ値を示す温度と定数ｄとからＴＤＴ曲線の回帰式を決定する方法、または、（ｉｉ）あるＤ値を示す温度と他のＤ値を示す温度とからＴＤＴ曲線の回帰式を決定する方法。このようにして決定された回帰式を用いることで、任意の加熱温度におけるＤ値や任意のＤ値を示す加熱温度を算出することができ、さらには、所望のＤ値を示す加熱温度や所望の加熱温度におけるＤ値を算出することができる。なお、工程ｃ）において決定された、特定の昇温速度条件に対応するＤ値が所望のＤ値である場合には、当該昇温速度条件下で細胞を測定することにより、当該所望のＤ値を示す加熱温度を算出してもよい。Ｄ値と温度Ｔとの関係は、微生物毎に変化するため、工程ｄ）を行うときは回帰式を微生物毎に決定することが好ましい。また、同一微生物であっても培養条件（存在環境）により変化する可能性があるため、この回帰式は培養条件（存在環境）毎に決定することが好ましい。
【００３３】
上記（ｉ）の方法を用いる場合には、以下のように回帰式を決定することができる。任意の温度におけるＤ値を算出する工程において、ＴＤＴ曲線の回帰式ｌｏｇ１０Ｄ＝ｃ＋ｄ×Ｔ（ｃおよびｄは定数）における定数ｄをｄ＝−（１／Ｚ）と表すと、Ｚ値は、Ｄ値の１０倍または１０分の１の変化に対応する加熱温度の変化（℃）に相当する。既に知られた通常培養条件下におけるＤ値からＺ値（または定数ｄ）を算出することは当業者であれば可能であるから、工程ｃ）で特定のＴ１またはＴ２とそれに対応するＤ値が一つでも算出できれば、ＴＤＴ曲線の回帰式を推定することができる。そのような既に知られた通常培養条件下におけるＤ値は、たとえば、ＴｒｉＢｉｏｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社が提供するＴＫＤＢデータベース（例えば、ｖｅｒ３．０）から取得することができる。細胞の培養環境が変化することで、Ｄ値およびＺ値が変動する可能性があることから、測定したい微生物の存在環境にできるだけ近い環境下で得られたデータを用いることが好ましい。また、Ｚ値を適宜補正して、微生物の存在環境下におけるＺ値を推定し、ＴＤＴ曲線の回帰式の導出に用いてもよい。
【００３４】
上記（ｉｉ）の方法を用いる場合は、以下のように回帰式を決定することができる。任意の温度におけるＤ値を算出する工程において、ＴＤＴ曲線の回帰式ｌｏｇ１０Ｄ＝ｃ＋ｄ×Ｔ（ｃおよびｄは定数）は、上記（ｉｉ）に記載されるように、あるＤ値を示す温度と他のＤ値を示す温度とから決定することができる。具体的には、異なる２以上の昇温条件で得られる細胞固有の温度Ｔ１またはＴ２とそれに対応するＤ値とからＴＤＴ曲線の回帰式を求めることができる。この際、２つ以上のＤ値のうちの１つ以上をＴＫＤＢデータベースのＤ値で代用することもできる。上記（ｉｉ）の方法は、微生物の存在環境（培養環境）下におけるＴＤＴ曲線の回帰式を正確に求められる点で有利である。
【００３５】
本発明の方法により得られた任意の温度におけるＤ値を用いて、現実の加熱殺菌の条件を定めることができる。例えば、加熱時間を５Ｄまたは１２Ｄとすることで、生残微生物数をそれぞれ１０５または１０１２のオーダーで減少させることができる。例えば、G. stearothermophilus（B. stearothermophilus）およびC. sporogenes芽胞では、加熱殺菌時間を５Ｄとすることができる。また、命に関わる危険なボツリヌス菌芽胞では、加熱殺菌時間を１２Ｄとすることができる。また、無菌充填法で製造されるロングライフ牛乳（ＬＬ牛乳）やＰＥＴボトル清涼飲料では、加熱殺菌時間を６Ｄとすることができる。このような加熱殺菌時間は、殺菌対象となる細菌の毒性や殺菌する飲食品等の保存性を考慮して、当業者によって適宜設定することができる。
【実施例】
【００３６】
以下、実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
【００３７】
実施例１：加熱機能を有する走査プローブ型顕微鏡（ＳＰＭ）の構築
本願の実施例では局所加熱機能を有するＳＰＭとして、カンチレバーを局所加熱型カンチレバー（日本サーマル・コンサルティング社製）に交換したナノサーチ顕微鏡ＳＦＴ−３５００（島津製作所社製）を用いた。このカンチレバーは、試料表面に数十Ｎ〜１００Ｎの任意の一定の力を加えながら、少なくとも毎秒２０℃で、２００℃または４００℃まで細胞を昇温させるために十分な昇温能力を有していた。以下の実施例では、カンチレバーにより、細胞表面の中央部に数十Ｎ〜約１００Ｎの負荷をかけながら、毎秒２０℃の昇温速度で室温（２５℃）から２００℃まで（好熱性偏性嫌気性芽胞形成細菌の場合は４００℃まで）細胞を昇温させ、その際の細胞の厚みの変化（ｎｍ）を測定した。細胞の厚みまたは細胞の厚みの変化は、ＳＰＭ付属の取扱説明書などを参照して当業者に周知の方法により算出することができる。
【００３８】
実施例２：供試微生物株試料の調製
２−１．供試微生物株
供試微生物株として、Bacillus属の芽胞形成細菌（芽胞および栄養相）、好熱性偏性嫌気性芽胞形成細菌、細菌、カビ、酵母などの幅広い生物種を用いた。具体的には、Bacillus属の芽胞形成細菌としてGeobacillus stearothermophillus  NBRC13737株、Bacillus coagulans DSM1株、Bacillus subtilis NBRC13719T株、Bacillus licheniformis NBRC12200株およびBacillus megaterium NBRC15308T株を用い、好熱性偏性嫌気性芽胞形成細菌としては、Thermoanaerobacter mathranii DSM11426株およびMoorella thermoacetica DSM521T株を用い、細菌としては、Staphylococcus aureus subsp. aureus NBRC100910株、Escherichia coli NBRC3301株およびBacillus subtilis NBRC13719T株の栄養相の細胞を用い、カビの子嚢胞子としては、Byssochlamys fulva DSM1808株およびTalaromyces flavus DSM63536株の子嚢胞子を用い、酵母としては、Saccharomyces pastorianus RIB2010株を用いた。
【００３９】
２−２．培養条件
酵母Saccharomyces pastorianus RIB2010株は、ＹＭ培地（Ｄｉｆｃｏ社製、製品番号：２７１１２０）を用いて２５℃で４８時間培養した。好熱性偏性嫌気性芽胞形成細菌は、変法ＴＧＣ培地（日水製薬社製、製品番号：３０２０５６２９３）を用いて５５℃で７２時間〜９６時間培養した。その他の供試微生物株は、肉汁培地（Ｄｉｆｃｏ社製、製品番号：２３４０００）を用いて３５℃で２４時間培養した。好熱性偏性嫌気性芽胞形成細菌に関しては、嫌気ガス発生試薬アネロパック（登録商標）・嫌気培養用ガス発生剤（三菱ガス化学社製）を用いて嫌気培養を行った。
【００４０】
２−３．測定用試料の調製
その後、酵母および細菌の測定用試料は、遠心分離（５，０００ｒｐｍ）により菌体を回収し、純水で２回洗浄を行うことにより、調製した。芽胞の測定用試料は、近藤雅臣、渡部一仁編「スポア実験マニュアル」技報堂出版（１９９５）の１９〜３０頁に記載された方法により調製した。具体的には、５０ｍＬの肉汁培地で芽胞形成細菌を３５℃で４８時間培養して増殖させた後、遠心分離（５，０００ｒｐｍ）で回収した菌体に、１００μｇ／ｍＬのリゾチーム（和光純薬）を溶解した２００μＬの１０ｍＭトリス塩酸緩衝溶液（ｐＨ７．６）を加えた。さらに３５℃にて３０分間培養し、再び菌体を遠心分離（５，０００ｒｐｍ）で回収し、５００ｍＭ塩化ナトリウムを溶解した１ｍＬの１０ｍＭトリス塩酸緩衝溶液（ｐＨ７．６）を加えて洗浄し、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ）で菌体を回収した。その後、さらに菌体を１０ｍＬの純水で洗浄し、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ）で菌体を回収する工程を２回繰り返した。得られた菌体を芽胞の測定試料（芽胞試料）とした。カビの子嚢胞子の測定用試料は、高島浩介、かび検査マニュアルカラー図譜、(株)テクノシステム（２００２）の１３０〜１３１頁に記載された方法により調製した。具体的には、ポテトデキストロース培地（日水製薬社製、製品番号：３０２０５７０９２）を用いて、カビを２５℃で１ヶ月間培養し、光学顕微鏡下で子嚢胞子の形成が確認できたものをカビの子嚢胞子の測定用試料（子嚢胞子試料）とした。
【００４１】
このようにして調製した細胞または芽胞懸濁液の試料をスライドグラス上に滴下し、風乾固定した。風乾固定後の試料は、直ちに測定に用いた。風乾固定後の細胞は生きた状態であると考えられる。
【００４２】
実施例３：熱分析による測定用試料細胞の厚みの増加量（ｎｍ）の測定
スライドグラス上で風乾固定した測定試料細胞の中心表面に、ＳＰＭの局所加熱型カンチレバーを接触させ、細胞の厚み方向に一定の力（約数十Ｎ〜１００Ｎ）を加え続けた。その状態で、カンチレバーの先端温度を一定速度（毎秒２０℃）で２００℃まで（好熱性偏性嫌気性芽胞形成細菌の場合は４００℃まで）昇温させながら、細胞の厚みの増加量（ｎｍ）をモニターした。
【００４３】
供試微生物株における代表的な細胞の厚みの増加量（ｎｍ）と加熱温度（℃）との関係は、図１に示される通りであった。
【００４４】
供試微生物株から調製した試料のうち、芽胞試料（B. licheniformisおよびB. coagulans）における細胞の厚み（ｎｍ）と加熱温度（℃）との関係を図１Ａに示す。これらの芽胞試料では、加熱温度の上昇に伴い細胞の厚みの増加量（ｎｍ）が単調増加を示す傾向にあった（図１Ａ）。いずれの芽胞試料においても、加熱温度に対する細胞の厚みの増加量（ｎｍ）のグラフの傾きが急激に低下する温度Ｔ１（℃）が存在することが分かった（図１Ａ下向き矢印）。
【００４５】
供試微生物株から調製した試料のうち、好熱性偏性嫌気性芽胞形成細菌の芽胞の試料（T. mathraniiおよびM. thermoacetica）における細胞の厚みの増加量（ｎｍ）と加熱温度（℃）との関係を図１Ｂに示す。これらの芽胞試料では、加熱温度の上昇に伴い細胞の厚みの増加量（ｎｍ）が単調増加を示す傾向にあった（図１Ｂ）。いずれの芽胞試料においても、加熱温度に対する細胞の厚みの増加量（ｎｍ）のグラフの傾きが急激に低下する温度Ｔ１（℃）が存在することが分かった（図１Ｂ下向き矢印）。
【００４６】
供試微生物株から調整した試料のうち、細菌の試料（E. coli、S. pastrianusおよびS. aureus subsp. aureus）における細胞の厚みの増加量（ｎｍ）と加熱温度（℃）との関係を図１Ｃに示す。図１Ｃでは、いずれの細菌試料においても加熱温度に対する細胞の厚みの増加量（ｎｍ）のグラフが山なりの形状を示す傾向が見られ、細胞の厚みの増加量（ｎｍ）が極大値（最大値）をとる温度Ｔ２（℃）が存在することが分かった（図１Ｃ下向き矢印）。
【００４７】
試供微生物株から調製した試料のうち、カビの子嚢胞子試料（T. flavusおよびB. fulva）における細胞の厚みの増加量（ｎｍ）と加熱温度（℃）との関係を図１Ｄに示す。カビの子嚢胞子試料では、加熱温度に対する細胞の厚みの増加量（ｎｍ）のグラフが山なりの形状を示す傾向が見られ、細胞の厚みの増加量（ｎｍ）が極大値（最大値）をとる温度Ｔ２（℃）が存在することが分かった（図１Ｄ下向き矢印）。
【００４８】
すなわち、細胞の厚みの増加量（ｎｍ）と加熱温度（℃）との関係は、温度Ｔ１またはＴ２を境に大きく変化する。このような温度Ｔ１またはＴ２では、細胞の物性は大きく変化すると考えられる。
【００４９】
実施例４：細胞の厚みの増加量（ｎｍ）と細胞の死滅との関係
温度Ｔ１またはＴ２の前後では、このような細胞の物性の変化に伴って、細胞の生理的な状態も大きく変化したものと考えられる。温度Ｔ１またはＴ２と細胞の死滅との関係を検討するために、一般的な加熱殺菌の理論（例えば、現場必携・微生物殺菌実用データ集第１版、３１〜４２頁に記載の理論）に従って、加熱殺菌の理論におけるＤ値と温度Ｔ１またはＴ２との関係を調べた。
【００５０】
まず、Ｄ値と加熱温度Ｔ１との関係を調べるために、一般的な手法によりB. licheniformis株およびB. coagulans株の芽胞試料におけるＤ値を測定し、加熱温度との関係をグラフ上にプロット（●：B. licheniformis株、▲：B. coagulans株）した（図２）。各微生物株におけるＴＤＴ曲線（図２の実線）の回帰式から加熱温度Ｔ１で加熱した際のＤ値の推定値を求めたところ、どちらの芽胞試料においても推定値は０．００５分であることが分かった（図２の点線）。すなわち、上記２種の芽胞試料においては、細胞の厚みの増加量（ｎｍ）の熱分析により求められたＴ１と、Ｄ値が０．００５分となる温度Ｔ（Ｄ＝０．００５）とがほぼ一致することが分かった。
【００５１】
同様の方法により、すべての供試微生物株においてＴ１またはＴ２を測定し、ＴＤＴ曲線の回帰式から求めたＴ（Ｄ＝０．００５）と比較した。結果は表１に示される通りであった。
【００５２】
【表１】
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【００５３】
表１は、各供試微生物株における、細胞の形状の温度依存性から求めたＴ１またはＴ２の実測値（℃）と従来法で調べたＤ値およびＺ値から算出したＴ（Ｄ＝０．００５）の理論値（℃）とを比較するための表である。
【００５４】
表１で示されるように、カビ、細菌、酵母に関わらず、いずれの供試微生物株においてもＴ１およびＴ２の温度を測定することができた。また、温度Ｔ１およびＴ２は、微生物種毎に大きく異なっていた。さらに、温度Ｔ１およびＴ２とＴ（Ｄ＝０．００５）とを比較したところ、いずれの供試微生物株においても、温度Ｔ１およびＴ２とＴ（Ｄ＝０．００５）とがほぼ一致した。このように、温度Ｔ１およびＴ２とＴ（Ｄ＝０．００５）との一致は、「界」を超えた広範な微生物種（カビ（真菌）、細菌、酵母）において共通した現象であることから、細胞の厚みの増加量（ｎｍ）の熱分析は、広範な微生物種を対象とした簡便かつ迅速な耐熱性の評価の有用なツールになりうる。特に、幅広い微生物種において、細胞の厚みの増加量（ｎｍ）の熱分析によりＴ１またはＴ２を決定することで、Ｄ値が０．００５分となる温度Ｔ（Ｄ＝０．００５）を予測することが可能であった。このことから、温度Ｔ１およびＴ２の大小は、その微生物の耐熱性を評価する上で重要な判断基準となり、例えば、温度Ｔ１およびＴ２が高いほど、微生物の耐熱性が高いと評価できることが示された。今回の実施例では一例として一定応力負荷時の細胞の厚みの変化をモニターしているが、仮に、細胞の硬度、ヤング率または細胞の直径、長さ、若しくは幅、またはそれらの変化をモニターしたとしても、同様の結果が得られると考えられる。
【００５５】
実施例５：熱分析において算出されるＤ値の特性
温度Ｔ１およびＴ２とＤ値との関係を更に詳細に調べるために、カンチレバーの昇温速度を変化させて、温度Ｔ１またはＴ２（℃）を決定し、Ｄ値との関係を調べた。まず、昇温速度を変化させても、温度上昇と細胞の厚みの増加量（ｎｍ）との関係から、Ｔ１またはＴ２（℃）を求められることを確認した（図３）。次に、ＴＤＴ曲線の回帰式から求められた温度Ｔ１またはＴ２に対応するＤ値を算出したところＤ値は０．０１（分）であることが分かった（図２）。
【００５６】
【表２】
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【００５７】
表２は、細胞の形状の温度依存性から求めたＴ１またはＴ２の実測値（℃）と従来法により算出したＴ（Ｄ＝０．００５）およびＴ（Ｄ＝０．０１）の理論値（℃）とを比較するための表である。
【００５８】
表２により、確かに細胞の熱分析時の昇温速度を変化させることで、異なるＤ値を示す温度を算出することが可能であることが分かった。
【００５９】
微生物の加熱理論によれば、微生物は一定温度で加熱すると細胞数が１０分の１となる加熱時間Ｄ値を有し、Ｄ値は微生物の耐熱性の指標とされている。一般的に、加熱時間を短くして同等の加熱殺菌効果を得るためには、加熱温度を高める必要があり、逆に、加熱温度を低くして同等の加熱殺菌効果を得るためには、加熱時間を長くする必要がある。すなわち、同等の加熱殺菌効果を得るための加熱時間と加熱時間とは一方を増やせば他方が減る関係にある。この点を考慮した上で、本実施例におけるこの熱分析結果を検討してみると、昇温速度を速めるほど、より短い加熱時間で温度Ｔ（ここでＴは任意の温度）に到達するので、同等の加熱殺菌効果を得るためには、結果としてより長時間の加熱が必要となり、昇温速度の速い測定環境下では、温度Ｔ１またはＴ２（℃）が上昇すると考えられる。また、一般的に、Ｔ１またはＴ２（℃）が上昇するとＤ値は低下することとなる。これが、昇温速度を速めると温度Ｔ１またはＴ２（℃）が上昇し、Ｄ値が低下する理由であると考えられる。同様に、昇温速度を遅くするほど、より長い時間をかけなければ温度Ｔに到達さないので、より低い温度で（温度Ｔに達する前に）同等の加熱殺菌効果を得ることとなり、昇温速度の遅い測定環境下では、温度Ｔ１またはＴ２（℃）が低下する。また、一般的に、Ｔ１またはＴ２（℃）が低下するとＤ値は上昇することとなる。これが、昇温速度を遅くすると温度Ｔ１またはＴ２（℃）が低下し、Ｄ値が上昇する理由であると考えられる。このように、熱分析時の昇温速度条件によって異なるＤ値を示す加熱温度を導出できるとの結果は、一般的な加熱殺菌理論によれば合理的に解釈することができる。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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