(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検物質で処理されたBhas42細胞における、下記遺伝子群A〜Dから少なくとも１つずつ選択される遺伝子の発現量の変化を指標として、前記被検物質の発がんプロモーション活性を検出する方法であって、(1)〜(38)、(40)〜(60)、(62)〜(80)、(82)〜(126)の遺伝子は、発現増大した場合に発がんプロモーション活性が検出される遺伝子であり、(127)〜(199)の遺伝子は、発現減少した場合に発がんプロモーション活性が検出される遺伝子である、方法。
遺伝子群A:
(2)(6)(9)(12)(18)(19)(20)(22)(25)(27)(28)(32)(34)(41)(56)(57)(59)(60)(62)(63)(65)(66)(70)(73)(74)(75)(76)(77)(78)(80)(82)(86)(87)(89)(90)(93)(94)(99)(103)(105)(107)(111)(113)(114)(117)(123)(127)(128)(130)(131)(133)(134)(135)(136)(137)(138)(139)(140)(141)(142)(143)(146)(147)(149)(150)(151)(152)(154)(155)(156)(157)(158)(159)(160)(161)(164)(165)(166)(167)(168)(169)(171)(172)(173)(175)(176)(177)(178)(179)(180)(181)(182)(183)(184)(186)(187)(188)(189)(191)(193)(195)(196)(197)(199)
遺伝子群B:
(11)(16)(29)(37)(46)(47)(50)(54)(55)(58)(64)(67)(68)(69)(71)(72)(83)(85)(91)(95)(96)(101)(102)(104)(109)(110)(115)(116)(122)(125)(129)(132)(145)(151)(162)(163)(170)(184)(185)(192)(194)(198)
遺伝子群C:
(1)(3)(4)(5)(8)(10)(13)(14)(15)(17)(21)(23)(26)(30)(31)(33)(35)(36)(40)(42)(44)(45)(48)(49)(51)(52)(53)(64)(71)(79)(88)(92)(97)(100)(106)(107)(108)(112)(119)(120)(121)(124)(126)(190)(192)
遺伝子群D:
(7)(21)(24)(33)(38)(43)(84)(98)(118)(133)(144)(145)(148)(153)(156)(157)(174)(192)
ここで、前記遺伝子はそれぞれ下記の通りである。
(1) 1100001G20Rik（配列番号1）
(2) 2310002L13Rik（配列番号2）
(3) 2410066E13Rik（配列番号3）
(4) 5430417L22Rik（配列番号4）
(5) 6430527G18Rik（配列番号5）
(6) Aen（配列番号6）
(7) Aldh1a7（配列番号7）
(8) Apcdd1（配列番号8）
(9) Aspm（配列番号9）
(10) Atp2a2（配列番号10）
(11) AW112010（配列番号11）
(12) Bcat1（配列番号12）
(13) C3（配列番号13）
(14) Car5b（配列番号14）
(15) Cbs（配列番号15）
(16) Ccl11（配列番号16）
(17) Ccl9（配列番号17）
(18) Ccne2（配列番号18）
(19) Ccrn4l /// LOC100047134（配列番号19）
(20) Cdc6（配列番号20）
(21) Cebpd（配列番号21）
(22) Ces1（配列番号22）
(23) Cib2（配列番号23）
(24) Cp（配列番号24）
(25) Ctps（配列番号25）
(26) Cyr61（配列番号26）
(27) Dkc1（配列番号27）
(28) Dtl（配列番号28）
(29) Emilin1（配列番号29）
(30) Enpp3（配列番号30）
(31) Ephb2（配列番号31）
(32) Eps8 /// LOC632638（配列番号32）
(33) Errfi1（配列番号33）
(34) Exo1（配列番号34）
(35) Fam171a2（配列番号35）
(36) Fam43a（配列番号36）
(37) Fbn1（配列番号37）
(38) Fkbp5（配列番号38）
(40) Foxf1a（配列番号40）
(41) Foxm1（配列番号41）
(42) Galntl2（配列番号42）
(43) Gdpd2（配列番号43）
(44) Gdpd5（配列番号44）
(45) Gfod1（配列番号45）
(46) Gla（配列番号46）
(47) Glb1（配列番号47）
(48) Gm10638（配列番号48）
(49) Gm11428（配列番号49）
(50) Gm14446（配列番号50）
(51) Gm22（配列番号51）
(52) Gpr133（配列番号52）
(53) Grk5（配列番号53）
(54) Gsta1 /// Gsta2（配列番号54）
(55) Herc5（配列番号55）
(56) Hirip3（配列番号56）
(57) Hmga2（配列番号57）
(58) Ifi205 /// Mnda（配列番号58）
(59) Ifrd2（配列番号59）
(60) Il13ra1（配列番号60）
(62) Ivns1abp（配列番号62）
(63) Kif20b（配列番号63）
(64) Lgals2（配列番号64）
(65) LOC100045677 /// Mcm3（配列番号65）
(66) Ltbp1（配列番号66）
(67) Lum（配列番号67）
(68) Ly6e（配列番号68）
(69) Masp1（配列番号69）
(70) Matr3（配列番号70）
(71) Mmp13（配列番号71）
(72) Mpeg1（配列番号72）
(73) Mthfd1（配列番号73）
(74) Mtm1（配列番号74）
(75) Myc（配列番号75）
(76) Nolc1（配列番号76）
(77) Nop16（配列番号77）
(78) Nop56（配列番号78）
(79) Nr2f2（配列番号79）
(80) Nsl1（配列番号80）
(82) Pdss1（配列番号82）
(83) Peg3（配列番号83）
(84) Per1（配列番号84）
(85) Plekhg4（配列番号85）
(86) Pnn（配列番号86）
(87) Polr1b（配列番号87）
(88) Prelp（配列番号88）
(89) Prkg2（配列番号89）
(90) Prl2c2 /// Prl2c3 /// Prl2c4（配列番号90）
(91) Ptgfr（配列番号91）
(92) Ptprf（配列番号92）
(93) Rrm2（配列番号93）
(94) Rrp12（配列番号94）
(95) Rsad2（配列番号95）
(96) S100b（配列番号96）
(97) S1pr3（配列番号97）
(98) Sema3g（配列番号98）
(99) Shmt2（配列番号99）
(100) Slc7a3（配列番号100）
(101) Slfn2（配列番号101）
(102) Slfn4（配列番号102）
(103) Smc2（配列番号103）
(104) Spon2（配列番号104）
(105) Srm（配列番号105）
(106) St3gal5（配列番号106）
(107) Steap1（配列番号107）
(108) Tbc1d4（配列番号108）
(109) Timp4（配列番号109）
(110) Tjp2（配列番号110）
(111) Tk1（配列番号111）
(112) Tmem41a（配列番号112）
(113) Tmem97（配列番号113）
(114) Tnfrsf12a（配列番号114）
(115) Tnfsf10（配列番号115）
(116) Trim25（配列番号116）
(117) Trp53（配列番号117）
(118) Tsc22d3（配列番号118）
(119) Tspan2（配列番号119）
(120) Ttc7b（配列番号120）
(121) Ttll1（配列番号121）
(122) Ttyh2（配列番号122）
(123) Ung（配列番号123）
(124) Vdr（配列番号124）
(125) Wwp2（配列番号125）
(126) Zc3h8（配列番号126）
(127) Adamts4（配列番号127）
(128) Agt（配列番号128）
(129) Ankrd1（配列番号129）
(130) Apod（配列番号130）
(131) Aspn（配列番号131）
(132) Atrx（配列番号132）
(133) AU015680（配列番号133）
(134) Bdh2（配列番号134）
(135) Boc（配列番号135）
(136) Btg2（配列番号136）
(137) Calml4（配列番号137）
(138) Cbr2（配列番号138）
(139) Cd1d1（配列番号139）
(140) Clu /// LOC100046120（配列番号140）
(141) Col27a1（配列番号141）
(142) Col3a1（配列番号142）
(143) Crlf1（配列番号143）
(144) Cxcl5（配列番号144）
(145) Cyr61（配列番号145）
(146) D0H4S114（配列番号146）
(147) D530037H12Rik（配列番号147）
(148) Dbp（配列番号148）
(149) Dcn（配列番号149）
(150) Dhrs3（配列番号150）
(151) Dleu2（配列番号151）
(152) Dusp1（配列番号152）
(153) Dusp5（配列番号153）
(154) Ebf1（配列番号154）
(155) Egr1（配列番号155）
(156) Egr2（配列番号156）
(157) Egr3（配列番号157）
(158) Enpp2（配列番号158）
(159) Fbxo32（配列番号159）
(160) Fmod（配列番号160）
(161) Fos（配列番号161）
(162) Gpc6（配列番号162）
(163) Hist1h1c（配列番号163）
(164) Ier2（配列番号164）
(165) Jhdm1d（配列番号165）
(166) Kdm6b（配列番号166）
(167) Lgals7（配列番号167）
(168) Lipa（配列番号168）
(169) LOC100047324 /// Sesn1（配列番号169）
(170) LOC640441 /// Thbs1（配列番号170）
(171) Matn2（配列番号171）
(172) Mmp14（配列番号172）
(173) Nr4a1（配列番号173）
(174) Per3（配列番号174）
(175) Pik3ip1（配列番号175）
(176) Plac8（配列番号176）
(177) Postn（配列番号177）
(178) Ppargc1a（配列番号178）
(179) Prelp（配列番号179）
(180) Prokr1（配列番号180）
(181) Ptgfr（配列番号181）
(182) Ptn（配列番号182）
(183) Ptplb（配列番号183）
(184) Rbms3（配列番号184）
(185) Rhobtb3（配列番号185）
(186) Scn2a1（配列番号186）
(187) Sesn3（配列番号187）
(188) Slc9a3r2（配列番号188）
(189) Sned1（配列番号189）
(190) Sorbs2（配列番号190）
(191) Sox4（配列番号191）
(192) Tpm1（配列番号192）
(193) Trp53inp2（配列番号193）
(194) Tsc22d2（配列番号194）
(195) Wbscr27（配列番号195）
(196) Ypel1（配列番号196）
(197) Ypel2（配列番号197）
(198) Zbed6（配列番号198）
(199) Zfp36（配列番号199）
【請求項２】
前記(1)〜(38)、(40)〜(60)、(62)〜(80)、(82)〜(199)から選択される10種以上の遺伝子の発現量の変化を指標とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記(1)〜(38)、(40)〜(60)、(62)〜(80)、(82)〜(199)から選択される50種以上の遺伝子の発現量の変化を指標とする請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記(1)〜(38)、(40)〜(60)、(62)〜(80)、(82)〜(199)から選択される100種以上の遺伝子の発現量の変化を指標とする請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記(1)〜(38)、(40)〜(60)、(62)〜(80)、(82)〜(199)の遺伝子の発現量の変化を指標とする請求項４記載の方法。
【請求項６】
指標とする発現量の変化は、被検物質と接触させたBhas42細胞における遺伝子の発現量と、被検物質と接触させないコントロールのBhas42細胞における遺伝子の発現量とを対比した相対変化である、請求項１ないし５のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、被検物質の発がんプロモーション活性を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】  一般に、発がんの過程は、変異原性物質によるＤＮＡの損傷で引き起こされる正常細胞の潜在性細胞への変化を含む段階（イニシエーション）と、潜在性細胞をがん細胞に発展させる段階（プロモーション）の異なる２過程からなるとされている。イニシエートされた細胞は、発がんプロモーターに繰り返し曝露されてがんに発展する。【０００３】  発がんプロモーターの検出手段を提供することはがん予防に大いに貢献するが、発がんプロモーターの多くは遺伝毒性がなく、そのため短時間で検出できる方法の確立は困難である。【０００４】  例えば、特許文献１、２に記載される方法は、動物を使用し、Ａｍｅｓ試験（発がんイニシエーション試験）陽性化合物及び陰性化合物のｍＲＮＡ発現パターンとの一致度により被検化学物質の発がん性を予測する方法であるが、これは発がんプロモーション活性の予測ではない。動物を使用するため、動物愛護の点でも培養細胞を用いた代替法開発が必要である。【０００５】  特許文献３には、マウス胎児由来のＢａｌｂ／ｃ  ３Ｔ３細胞を用いて同定した発がんプロモーター検出マーカー遺伝子が記載されている。しかしながら、細胞を発がんイニシエーターで処理後に発がんプロモーター処理を行なってマーカーを同定しているため、イニシエーター処理による遺伝子発現への影響も含んでいる可能性がある。さらに、被検物質処理時間は４８時間を要する。【０００６】  Ｂｈａｓ４２細胞はＢａｌｂ／ｃ  ３Ｔ３細胞にｖ−Ｈａ−ｒａｓ遺伝子を導入した細胞株であり（非特許文献１）、Ｂｈａｓ４２細胞の形態変化（フォーカス形成）を指標として発がんプロモーション活性を評価する形質転換試験が知られている（非特許文献２）。この試験では発がんイニシエーション処理は不要であるが、被検物質処理に１０日間を要する上、フォーカス形成の観察は被検物質処理からさらに７日後であり、長期間を要する。形態変化が指標のため自動化も困難である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００７−２５２２７７号公報
【特許文献２】特開２００７−５４０２２号公報
【特許文献３】国際公開第２００９／００１９３９号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（Ｇａｎｎ），１９８８，７９，９２１−９３０
【非特許文献２】Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００４，５５７（２）：１９１−２０２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】  従って、本発明の目的は、任意の化学物質の発がんプロモーション活性を迅速に調べることができる新規な手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】  本願発明者らは、Ｂｈａｓ４２細胞を５種類の既知発がんプロモーターで２４時間処理した時点での遺伝子発現をマイクロアレイ分析し、コントロールの溶媒処理群における遺伝子発現と対比して発現量の相対変化を調べた。その結果、Ｂｈａｓ４２形質転換試験が陽性であるプロモーターの場合には、各プロモーターごとにそれぞれ有意な発現変化を示す遺伝子群が存在することを見出し、これら遺伝子を特定した。これら遺伝子を発がんプロモーションマーカー遺伝子とし、被検物質で処理したＢｈａｓ４２細胞におけるマーカー遺伝子の発現量の相対変化を指標とすれば、従来よりも短時間の被検物質処理で発がんプロモーション活性を検出できること、さらに、既知発がんプロモーターによって発現変化する遺伝子群との一致性を調べることで、被検物質がいずれの発がんプロモーターに似ているか、すなわちプロモーターの系統分類ができることを見出し、本願発明を完成した。【００１１】
すなわち、本発明は、被検物質で処理されたBhas42細胞における、下記遺伝子群A〜Dから少なくとも１つずつ選択される遺伝子の発現量の変化を指標として、前記被検物質の発がんプロモーション活性を検出する方法であって、(1)〜(38)、(40)〜(60)、(62)〜(80)、(82)〜(126)の遺伝子は、発現増大した場合に発がんプロモーション活性が検出される遺伝子であり、(127)〜(199)の遺伝子は、発現減少した場合に発がんプロモーション活性が検出される遺伝子である方法を提供する。
遺伝子群A:
(2)(6)(9)(12)(18)(19)(20)(22)(25)(27)(28)(32)(34)(41)(56)(57)(59)(60)(62)(63)(65)(66)(70)(73)(74)(75)(76)(77)(78)(80)(82)(86)(87)(89)(90)(93)(94)(99)(103)(105)(107)(111)(113)(114)(117)(123)(127)(128)(130)(131)(133)(134)(135)(136)(137)(138)(139)(140)(141)(142)(143)(146)(147)(149)(150)(151)(152)(154)(155)(156)(157)(158)(159)(160)(161)(164)(165)(166)(167)(168)(169)(171)(172)(173)(175)(176)(177)(178)(179)(180)(181)(182)(183)(184)(186)(187)(188)(189)(191)(193)(195)(196)(197)(199)
遺伝子群B:
(11)(16)(29)(37)(46)(47)(50)(54)(55)(58)(64)(67)(68)(69)(71)(72)(83)(85)(91)(95)(96)(101)(102)(104)(109)(110)(115)(116)(122)(125)(129)(132)(145)(151)(162)(163)(170)(184)(185)(192)(194)(198)
遺伝子群C:
(1)(3)(4)(5)(8)(10)(13)(14)(15)(17)(21)(23)(26)(30)(31)(33)(35)(36)(40)(42)(44)(45)(48)(49)(51)(52)(53)(64)(71)(79)(88)(92)(97)(100)(106)(107)(108)(112)(119)(120)(121)(124)(126)(190)(192)
遺伝子群D:
(7)(21)(24)(33)(38)(43)(84)(98)(118)(133)(144)(145)(148)(153)(156)(157)(174)(192)
ここで、前記遺伝子はそれぞれ下記の通りである。
(1) 1100001G20Rik（配列番号1）、(2) 2310002L13Rik（配列番号2）、(3) 2410066E13Rik（配列番号3）、(4) 5430417L22Rik（配列番号4）、(5) 6430527G18Rik（配列番号5）、(6) Aen（配列番号6）、(7) Aldh1a7（配列番号7）、(8) Apcdd1（配列番号8）、(9) Aspm（配列番号9）、(10) Atp2a2（配列番号10）、(11) AW112010（配列番号11）、(12) Bcat1（配列番号12）、(13) C3（配列番号13）、(14) Car5b（配列番号14）、(15) Cbs（配列番号15）、(16) Ccl11（配列番号16）、(17) Ccl9（配列番号17）、(18) Ccne2（配列番号18）、(19) Ccrn4l /// LOC100047134（配列番号19）、(20) Cdc6（配列番号20）、(21) Cebpd（配列番号21）、(22) Ces1（配列番号22）、(23) Cib2（配列番号23）、(24) Cp（配列番号24）、(25) Ctps（配列番号25）、(26) Cyr61（配列番号26）、(27) Dkc1（配列番号27）、(28) Dtl（配列番号28）、(29) Emilin1（配列番号29）、(30) Enpp3（配列番号30）、(31) Ephb2（配列番号31）、(32) Eps8 /// LOC632638（配列番号32）、(33) Errfi1（配列番号33）、(34) Exo1（配列番号34）、(35) Fam171a2（配列番号35）、(36) Fam43a（配列番号36）、(37) Fbn1（配列番号37）、(38) Fkbp5（配列番号38）、(40) Foxf1a（配列番号40）、(41) Foxm1（配列番号41）、(42) Galntl2（配列番号42）、(43) Gdpd2（配列番号43）、(44) Gdpd5（配列番号44）、(45) Gfod1（配列番号45）、(46) Gla（配列番号46）、(47) Glb1（配列番号47）、(48) Gm10638（配列番号48）、(49) Gm11428（配列番号49）、(50) Gm14446（配列番号50）、(51) Gm22（配列番号51）、(52) Gpr133（配列番号52）、(53) Grk5（配列番号53）、(54) Gsta1 /// Gsta2（配列番号54）、(55) Herc5（配列番号55）、(56) Hirip3（配列番号56）、(57) Hmga2（配列番号57）、(58) Ifi205 /// Mnda（配列番号58）、(59) Ifrd2（配列番号59）、(60) Il13ra1（配列番号60）、(62) Ivns1abp（配列番号62）、(63) Kif20b（配列番号63）、(64) Lgals2（配列番号64）、(65) LOC100045677 /// Mcm3（配列番号65）、(66) Ltbp1（配列番号66）、(67) Lum（配列番号67）、(68) Ly6e（配列番号68）、(69) Masp1（配列番号69）、(70) Matr3（配列番号70）、(71) Mmp13（配列番号71）、(72) Mpeg1（配列番号72）、(73) Mthfd1（配列番号73）、(74) Mtm1（配列番号74）、(75) Myc（配列番号75）、(76) Nolc1（配列番号76）、(77) Nop16（配列番号77）、(78) Nop56（配列番号78）、(79) Nr2f2（配列番号79）、(80) Nsl1（配列番号80）、(82) Pdss1（配列番号82）、(83) Peg3（配列番号83）、(84) Per1（配列番号84）、(85) Plekhg4（配列番号85）、(86) Pnn（配列番号86）、(87) Polr1b（配列番号87）、(88) Prelp（配列番号88）、(89) Prkg2（配列番号89）、(90) Prl2c2 /// Prl2c3 /// Prl2c4（配列番号90）、(91) Ptgfr（配列番号91）、(92) Ptprf（配列番号92）、(93) Rrm2（配列番号93）、(94) Rrp12（配列番号94）、(95) Rsad2（配列番号95）、(96) S100b（配列番号96）、(97) S1pr3（配列番号97）、(98) Sema3g（配列番号98）、(99) Shmt2（配列番号99）、(100) Slc7a3（配列番号100）、(101) Slfn2（配列番号101）、(102) Slfn4（配列番号102）、(103) Smc2（配列番号103）、(104) Spon2（配列番号104）、(105) Srm（配列番号105）、(106) St3gal5（配列番号106）、(107) Steap1（配列番号107）、(108) Tbc1d4（配列番号108）、(109) Timp4（配列番号109）、(110) Tjp2（配列番号110）、(111) Tk1（配列番号111）、(112) Tmem41a（配列番号112）、(113) Tmem97（配列番号113）、(114) Tnfrsf12a（配列番号114）、(115) Tnfsf10（配列番号115）、(116) Trim25（配列番号116）、(117) Trp53（配列番号117）、(118) Tsc22d3（配列番号118）、(119) Tspan2（配列番号119）、(120) Ttc7b（配列番号120）、(121) Ttll1（配列番号121）、(122) Ttyh2（配列番号122）��(123) Ung（配列番号123）、(124) Vdr（配列番号124）、(125) Wwp2（配列番号125）、(126) Zc3h8（配列番号126）、(127) Adamts4（配列番号127）、(128) Agt（配列番号128）、(129) Ankrd1（配列番号129）、(130) Apod（配列番号130）、(131) Aspn（配列番号131）、(132) Atrx（配列番号132）、(133) AU015680（配列番号133）、(134) Bdh2（配列番号134）、(135) Boc（配列番号135）、(136) Btg2（配列番号136）、(137) Calml4（配列番号137）、(138) Cbr2（配列番号138）、(139) Cd1d1（配列番号139）、(140) Clu /// LOC100046120（配列番号140）、(141) Col27a1（配列番号141）、(142) Col3a1（配列番号142）、(143) Crlf1（配列番号143）、(144) Cxcl5（配列番号144）、(145) Cyr61（配列番号145）、(146) D0H4S114（配列番号146）、(147) D530037H12Rik（配列番号147）、(148) Dbp（配列番号148）、(149) Dcn（配列番号149）、(150) Dhrs3（配列番号150）、(151) Dleu2（配列番号151）、(152) Dusp1（配列番号152）、(153) Dusp5（配列番号153）、(154) Ebf1（配列番号154）、(155) Egr1（配列番号155）、(156) Egr2（配列番号156）、(157) Egr3（配列番号157）、(158) Enpp2（配列番号158）、(159) Fbxo32（配列番号159）、(160) Fmod（配列番号160）、(161) Fos（配列番号161）、(162) Gpc6（配列番号162）、(163) Hist1h1c（配列番号163）、(164) Ier2（配列番号164）、(165) Jhdm1d（配列番号165）、(166) Kdm6b（配列番号166）、(167) Lgals7（配列番号167）、(168) Lipa（配列番号168）、(169) LOC100047324 /// Sesn1（配列番号169）、(170) LOC640441 /// Thbs1（配列番号170）、(171) Matn2（配列番号171）、(172) Mmp14（配列番号172）、(173) Nr4a1（配列番号173）、(174) Per3（配列番号174）、(175) Pik3ip1（配列番号175）、(176) Plac8（配列番号176）、(177) Postn（配列番号177）、(178) Ppargc1a（配列番号178）、(179) Prelp（配列番号179）、(180) Prokr1（配列番号180）、(181) Ptgfr（配列番号181）、(182) Ptn（配列番号182）、(183) Ptplb（配列番号183）、(184) Rbms3（配列番号184）、(185) Rhobtb3（配列番号185）、(186) Scn2a1（配列番号186）、(187) Sesn3（配列番号187）、(188) Slc9a3r2（配列番号188）、(189) Sned1（配列番号189）、(190) Sorbs2（配列番号190）、(191) Sox4（配列番号191）、(192) Tpm1（配列番号192）、(193) Trp53inp2（配列番号193）、(194) Tsc22d2（配列番号194）、(195) Wbscr27（配列番号195）、(196) Ypel1（配列番号196）、(197) Ypel2（配列番号197）、(198) Zbed6（配列番号198）、(199) Zfp36（配列番号199）
【発明の効果】
【００１３】  本発明により、従来よりも短時間で遺伝子発現の変化を指標に発がんプロモーション活性を検出できる新規な方法が提供された。Ｂｈａｓ４２細胞を用いれば、被検物質処理は２４時間と短時間でよく、また発がんイニシエーション処理は不要なため、イニシエーターの影響を排除できる。１９９の遺伝子の一部又は全てを含むマイクロアレイチップを設計すれば、簡便な発がんプロモーター検出用のチップを提供できる。また、新規ＤＮＡマイクロアレイ以外にも、発がんプロモーター検出に特化したトランスクリプトミクス（リアルタイムＰＣＲ測定用遺伝子リストおよびプライマーセットなど）、プロテオミクス（プロテインチップなど）、メタボロミクス（代謝産物リストなど）へと展開し、発がんプロモーターの検出に広く応用することも可能である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】  本発明の方法で使用する細胞は、マウス胎児由来のＢａｌｂ／ｃ  ３Ｔ３細胞にｖ−Ｈａ−ｒａｓ遺伝子を導入したＢｈａｓ４２細胞である。Ｂｈａｓ４２細胞は、非特許文献１及び２に記載されるように公知であり、当業者であれば容易に入手ないしは調製できる。培養条件も公知であり、通常、３７℃、５％  ＣＯ２インキュベーター内で培養する。
【００１５】  本発明の方法では、Ｂｈａｓ４２細胞は、例えば５％牛胎児血清（ＦＢＳ）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（ＤＦ５Ｆ）で前培養を行なった後、同培地で７ｘ１０３ｃｅｌｌｓ／ｍＬ程度の細胞密度の細胞浮遊液を調製して培養を開始する。６ｗｅｌｌプレートを用いる場合には細胞浮遊液を２ｍＬ／ｗｅｌｌ程度ずつ播種すればよい。播種から４日程度後に被検物質処理又はコントロールの溶媒処理を行なう。通常、被検物質を含む新鮮な培地に交換することで、被検物質処理が行なわれる。プロモーター活性未知の被検物質を調べる場合、ｎｇ／ｍｌ〜ｍｇ／ｍｌのオーダーで数段階の濃度で処理を行ない、サンプルを得てよい。被検物質処理から２４時間後、細胞をサンプリングし、常法によりトータルＲＮＡを抽出、このＲＮＡ試料について発現解析を行なえばよい。
【００１６】  マイクロアレイを用いて発現解析を行なう場合、使用するマイクロアレイで推奨される品質のＲＮＡ試料を調製する必要があるが、当業者であれば適宜調製できる。特に限定されないが、通常、Ａｇｉｌｅｎｔ社のＢｉｏ  ＡｎａｌｙｚｅｒにてＲＩＮ９．０以上を保証される程度の品質であれば、マイクロアレイ解析に好ましく供することができる。例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社の３’ＩＶＴ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ｋｉｔにてａＲＮＡを調製した場合、Ａｇｉｌｅｎｔ社のＢｉｏ  ＡｎａｌｙｚｅｒにてＳｍｅａｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓを実行し、１０００ｎｔにピーク中心があること、１０００−４０００ｎｔのＡＵＣが全体の３５％以上を占めることがＲＮＡ試料の条件となり得るが、他社製品使用の場合はこの限りではない。
【００１７】  本発明でマーカー遺伝子として使用され得る遺伝子を表１及び表２に示す。配列表に記載されるこれら遺伝子の塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋに登録されている塩基配列であり、各ＲｅｆＳｅｑ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ＩＤなどで検索可能な配列である。これらの遺伝子は、下記実施例において、５種類の既知発がんプロモーターのうちの少なくともいずれか１つで有意に（Ｆａｌｓｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｒａｔｅ（ＦＤＲ）＜０．０１）発現量が変化した遺伝子である。表１の１２６遺伝子（（１）〜（１２６）の遺伝子）が、溶媒処理の対照群に対し２倍以上に発現量が増大した遺伝子であり、表２の７３遺伝子（（１２７）〜（１９９）の遺伝子）が、溶媒処理の対照群に対し０．５倍以下に発現量が減少した遺伝子である。表中、「ｍＲＮＡを増大（減少）させるプロモーター」の欄には、Ｂｈａｓ４２細胞を２４時間処理した場合に発現増大（減少）が確認された発がんプロモーターを示す（１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール１３−アセテート（ＴＰＡ）、オカダ酸（ＯＡ）、リトコール酸（ＬＣＡ）、プロゲステロン（ＰＲＯＧ）及び１７β−エストラジオール（ＥＤ））。
【００１８】
【表１−１】
0005866598.tif 000002
【００１９】
【表１−２】
0005866598.tif 000003
【００２０】
【表１−３】
0005866598.tif 000004
【００２１】
【表１−４】
0005866598.tif 000005
【００２２】
【表１−５】
0005866598.tif 000006
【００２３】
【表１−６】
0005866598.tif 000007
【００２４】
【表１−７】
0005866598.tif 000008
【００２５】
【表１−８】
0005866598.tif 000009
【００２６】
【表１−９】
0005866598.tif 000010
【００２７】
【表１−１０】
0005866598.tif 000011
【００２８】
【表１−１１】
0005866598.tif 000012
【００２９】
【表１−１２】
0005866598.tif 000013
【００３０】
【表１−１３】
0005866598.tif 000014
【００３１】
【表１−１４】
0005866598.tif 000015
【００３２】
【表１−１５】
0005866598.tif 000016
【００３３】
【表１−１６】
0005866598.tif 000017
【００３４】
【表１−１７】
0005866598.tif 000018
【００３５】
【表１−１８】
0005866598.tif 000019
【００３６】
【表１−１９】
0005866598.tif 000020
【００３７】
【表１−２０】
0005866598.tif 000021
【００３８】
【表１−２１】
0005866598.tif 000022
【００３９】
【表１−２２】
0005866598.tif 000023
【００４０】
【表１−２３】
0005866598.tif 000024
【００４１】
【表１−２４】
0005866598.tif 000025
【００４２】
【表１−２５】
0005866598.tif 000026
【００４３】
【表２−１】
0005866598.tif 000027
【００４４】
【表２−２】
0005866598.tif 000028
【００４５】
【表２−３】
0005866598.tif 000029
【００４６】
【表２−４】
0005866598.tif 000030
【００４７】
【表２−５】
0005866598.tif 000031
【００４８】
【表２−６】
0005866598.tif 000032
【００４９】
【表２−７】
0005866598.tif 000033
【００５０】
【表２−８】
0005866598.tif 000034
【００５１】
【表２−９】
0005866598.tif 000035
【００５２】
【表２−１０】
0005866598.tif 000036
【００５３】
【表２−１１】
0005866598.tif 000037
【００５４】
【表２−１２】
0005866598.tif 000038
【００５５】
【表２−１３】
0005866598.tif 000039
【００５６】
【表２−１４】
0005866598.tif 000040
【００５７】  （１）〜（１９９）の遺伝子について、発がんプロモーターごとにグループ分けすると以下の通りである。なお、ＥＤ処理で発現量の変化が認められた遺伝子は（１６１）のみであり、該遺伝子は遺伝子群Ａの減少遺伝子にも属する。
【００５８】遺伝子群Ａ：ＴＰＡ処理で発現量が変化する遺伝子（１０６遺伝子）
Ａ−１）発現増大する遺伝子（４８遺伝子）
（２）（６）（９）（１２）（１８）（１９）（２０）（２２）（２５）（２７）（２８）（３２）（３４）（３９）（４１）（５６）（５７）（５９）（６０）（６１）（６２）（６３）（６５）（６６）（７０）（７３）（７４）（７５）（７６）（７７）（７８）（８０）（８２）（８６）（８７）（８９）（９０）（９３）（９４）（９９）（１０３）（１０５）（１０７）（１１１）（１１３）（１１４）（１１７）（１２３）
Ａ−２）発現減少する遺伝子（５８遺伝子）
（１２７）（１２８）（１３０）（１３１）（１３３）（１３４）（１３５）（１３６）（１３７）（１３８）（１３９）（１４０）（１４１）（１４２）（１４３）（１４６）（１４７）（１４９）（１５０）（１５１）（１５２）（１５４）（１５５）（１５６）（１５７）（１５８）（１５９）（１６０）（１６１）（１６４）（１６５）（１６６）（１６７）（１６８）（１６９）（１７１）（１７２）（１７３）（１７５）（１７６）（１７７）（１７８）（１７９）（１８０）（１８１）（１８２）（１８３）（１８４）（１８６）（１８７）（１８８）（１８９）（１９１）（１９３）（１９５）（１９６）（１９７）（１９９）
【００５９】遺伝子群Ｂ：オカダ酸処理で発現量が変化する遺伝子（４３遺伝子）
Ｂ−１）発現増大する遺伝子（３１遺伝子）
（１１）（１６）（２９）（３７）（４６）（４７）（５０）（５４）（５５）（５８）（６４）（６７）（６８）（６９）（７１）（７２）（８１）（８３）（８５）（９１）（９５）（９６）（１０１）（１０２）（１０４）（１０９）（１１０）（１１５）（１１６）（１２２）（１２５）
Ｂ−２）発現減少する遺伝子（１２遺伝子）
（１２９）（１３２）（１４５）（１５１）（１６２）（１６３）（１７０）（１８４）（１８５）（１９２）（１９４）（１９８）
【００６０】遺伝子群Ｃ：リトコール酸処理で発現量が変化する遺伝子（４６遺伝子）
Ｃ−１）発現増大する遺伝子（４４遺伝子）
（１）（３）（４）（５）（８）（１０）（１３）（１４）（１５）（１７）（２１）（２３）（２６）（３０）（３１）（３３）（３５）（３６）（４０）（４２）（４４）（４５）（４８）（４９）（５１）（５２）（５３）（６４）（７１）（７９）（８１）（８８）（９２）（９７）（１００）（１０６）（１０７）（１０８）（１１２）（１１９）（１２０）（１２１）（１２４）（１２６）
Ｃ−２）発現減少する遺伝子（２遺伝子）
（１９０）（１９２）
【００６１】遺伝子群Ｄ：プロゲステロン処理で発現量が変化する遺伝子（１９遺伝子）
Ｄ−１）発現増大する遺伝子（１０遺伝子）
（７）（２１）（２４）（３３）（３８）（４３）（８１）（８４）（９８）（１１８）
Ｄ−２）発現減少する遺伝子（９遺伝子）
（１３３）（１４４）（１４５）（１４８）（１５３）（１５６）（１５７）（１７４）（１９２）
【００６２】遺伝子群Ｅ：１７β−エストラジオール処理で発現量が変化する遺伝子（１遺伝子）
発現減少する遺伝子（１遺伝子）
（１６１）
【００６３】
本発明の方法では、(1)〜(199)のマーカー遺伝子（ただし(39)、(61)及び(81)を除く）のうちの少なくともいずれか１つの遺伝子、より具体的には、遺伝子群A〜Dから少なくとも１つずつ選択される遺伝子の発現量を測定し、コントロール処理群に対する相対変化を調べる。測定する遺伝子数は特に限定されず、例えば196遺伝子中の１０種以上、３０種以上、５０種以上、７０種以上、１００種以上、又は１５０種以上としても良く、196遺伝子の全てを測定しても良い。複数の遺伝子を測定対象とする場合、遺伝子群A〜Dのいずれか１つから測定対象の遺伝子を選択しても良いが、遺伝子群A〜Dの各群から少なくとも１つずつを選択しても良い。例えば、遺伝子群A〜Dから５以上又は１０以上の遺伝子を測定対象としても良いし、あるいは、各群から１割以上（具体的には、遺伝子群Dであれば１９遺伝子なので１遺伝子以上）、３割以上（遺伝子群Dであれば５遺伝子以上）、５割以上、又は７割以上の遺伝子を測定対象としても良い。網羅的に解析する観点では、できる限り多数のマーカー遺伝子の発現量を調べることが望ましく、また、対象とするマーカー遺伝子には、遺伝子群A〜Dの少なくとも１遺伝子ずつが含まれることが望ましい。なお、上記の遺伝子に加えて、発がんプロモーションマーカー遺伝子として有用であり得る他の遺伝子（例えば後掲の表４、表５に記載される遺伝子など）の発現量をさらに調べることは差し支えない。
【００６４】  多数の遺伝子について発現量を調べる場合にはマイクロアレイを好ましく用いることができる。（１）〜（１９９）の遺伝子の全てが搭載されたマイクロアレイとしては、例えば下記実施例でも用いた市販のＭｏｕｓｅ  Ｇｅｎｏｍｅ４３０  ２．０アレイ（アフィメトリクス（株））が挙げられるが、これに限定されず、他の市販品を用いることができる。あるいは、上記の１９９遺伝子を含むアレイを適宜設計して用いても良い。なお、Ｍｏｕｓｅ  Ｇｅｎｏｍｅ４３０  ２．０アレイに固定化されている上記（１）〜（１９９）の遺伝子に対するプローブの配列情報は、アフィメトリクス社のホームページから入手可能であり、当業者であれば下記表３に示すＩＤ番号（Ｐｒｏｂｅｓｅｔ  ｎａｍｅ）で容易に特定し入手できる。配列表の配列番号２００〜４４０には、各ＩＤ番号で識別されているプローブ配列の具体例を示すが、これら具体例以外の各プローブ配列も当業者であれば容易に入手可能である。アレイ測定データの正規化（ｓｕｍｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）の手法は、用いるアレイに応じて適宜検討し、解析に最適な手法を選択して用いることができる。群間比較解析には、採用した正規化手法に適した手法を選択して用いることができる。例えば、Ｍｏｕｓｅ  Ｇｅｎｏｍｅ４３０  ２．０アレイを用いて被検物質処理したＢｈａｓ４２細胞の遺伝子発現量を調べる場合には、下記実施例で用いた正規化手法等をそのまま用いることができる。
【００６５】
【表３−１】
0005866598.tif 000041
【００６６】
【表３−２】
0005866598.tif 000042
【００６７】
【表３−３】
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【００６８】
【表３−４】
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【００６９】
【表３−５】
0005866598.tif 000045
【００７０】  被検物質処理群におけるマーカー遺伝子の発現量の相対変化を調べ、コントロール処理群に対し有意な変化（ＦＤＲ＜０．０１で、増大遺伝子の場合は２倍以上、減少遺伝子の場合は０．５倍以下）が確認できれば、発がんプロモーション活性が検出されたと判断される。複数のマーカー遺伝子を調べた場合、そのうちの１遺伝子だけでも有意な変化が確認できれば、その被検物質は発がんプロモーション活性を有すると判断でき、２以上の遺伝子で有意な変化が確認できればより確実性が増す。１９９遺伝子について発現量の相対変化を調べた場合であれば、１９９遺伝子全体との発現変化の一致率又は遺伝子群Ａ〜Ｄのうちのいずれか１群との一致率が例えば１０％程度以上、２０％程度以上、又は３０％程度以上であれば、検出結果の確実性がより高まる。例えば、下記実施例に記載されるＴＢＨＱの例では、増大１２６遺伝子のうちの２１遺伝子、減少７３遺伝子のうちの１９遺伝子で有意な変化が確認されており（後掲の表６及び表７参照）、１９９遺伝子全体との一致率が２０％（４０／１９９）、遺伝子群Ａとの一致率が３７％（３９／１０６）である。もっとも、本発明の範囲はこの具体例に限定されるものではない。
【００７１】  本発明の方法で発がんプロモーション活性が検出された場合、該物質は発がんプロモーション活性を有すると判断できる。ただし、本発明の方法で該活性が検出されない場合には、該物質は発がんプロモーション活性を有しないとは判断されず、該活性は不明と判断される。本発明の方法で発がんプロモーション活性が検出されなかった被検物質は、発がんプロモーション活性を有しない物質と、発がんプロモーション活性を有するがＢｈａｓ４２細胞形質転換試験が陰性である物質とのいずれかであり得る。本発明の方法で活性が検出されなかった被検物質については、別途異なる方法で発がんプロモーション活性を調べても良い。
【００７２】  被検物質の発がんプロモーション活性が検出された場合には、さらに、該被検物質が発がんプロモーターとしてＴＰＡ、オカダ酸、リトコール酸、プロゲステロンのいずれに近いかを調べることもできる。被検物質で発現量が増大又は減少した遺伝子を、上記の遺伝子群Ａ〜Ｄと対比し、遺伝子の一致性を調べる。その一致性の度合いに基づいて、被検物質をＴＰＡ型（Ａ群）、オカダ酸型（Ｂ群）、リトコール酸型（Ｃ群）、プロゲステロン型（Ｄ群）のいずれかに分類することが可能である。Ａ〜Ｄの各群で遺伝子数は異なるので、一致性は、例えば各群の遺伝子の何％と一致したかによって評価することができる。特に限定されないが、いずれかの群との一致率が１０％程度以上、例えば２０％程度以上、又は３０％程度以上であれば、その群が表す型に分類できる。複数の群との一致率が高い場合には、その被検物質は複数の型に分類され得る。例えば、Ａ群及びＢ群との一致率が高い場合、その被検物質をＴＰＡ／オカダ酸型と分類してよい。下記実施例のＴＢＨＱの例では、Ａ群との一致率が３７％と非常に高く、ＴＢＨＱをＴＰＡ型に分類することができる。
【実施例】
【００７３】  以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。【００７４】１．ＤＮＡマイクロアレイによるｍＲＮＡ発現量測定
１）細胞試料液の調製
Ｂｈａｓ４２細胞は、実験ごとに新たに保存細胞株を解凍し、５％牛胎児血清（ＦＢＳ）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（ＤＦ５Ｆ）で前培養を行ったものを用いた。同培地を用いてＢｈａｓ４２細胞の７ｘ１０３ｃｅｌｌｓ／ｍＬ細胞浮遊液を調製し、６ｗｅｌｌプレートに２ｍＬ／ｗｅｌｌずつ播種した。細胞播種４日後に発がんプロモーター処理又はコントロールの溶媒処理を行なった。発がんプロモーターとして、既知の発がんプロモーターである１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール１３−アセテート（ＴＰＡ）、オカダ酸（ＯＡ）、リトコール酸（ＬＣＡ）、プロゲステロン（ＰＲＯＧ）及び１７β−エストラジオール（ＥＤ）を用いた。各プロモーターについてＤＭＳＯ溶液を調製し（ＴＰＡは５μｇ／ｍＬ、ＯＡは６μｇ／ｍＬ、ＬＣＡは１０ｍｇ／ｍＬ、ＰＲＯＧ及びＥＤは３μｍｏｌ／ｍＬ）、各ＤＭＳＯ溶液をＤＦ５Ｆに０．１％添加した培地で培地交換を行ない、発がんプロモーター処理群とした（培地中の終濃度は、ＴＰＡ；５ｎｇ／ｍＬ、ＯＡ；６ｎｇ／ｍＬ、ＬＣＡ；１０μｇ／ｍＬ、ＰＲＯＧ及びＥＤ；３ｎｍｏｌ／ｍＬ）。溶媒対照群については、ＤＭＳＯ（０．１％）を添加したＤＦ５Ｆで培地交換を行った。２４時間後に細胞観察とＲＮＡ抽出用細胞試料液の調製を行ない、試料液を−８０℃で保存した。各群の細胞試料液は、細胞解凍から完全繰り返し実験３回分（ｎ＝３）で調製した。【００７５】  また、各プロモーター物質について、公知のＢｈａｓ４２細胞形質転換試験（非特許文献２：Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ２００４  ５５７（２）：１９１−２０２）および結果判定（Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｓ  ｔｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ２００５  ３３：６１９−６３９）を行なった。上記の通りにＢｈａｓ４２細胞を準備し、各プロモーター処理は播種後４日から１４日まで１０日間行なった。播種後７日、１１日に培地交換を行なった。播種後１４日でプロモーター物質を含まない新鮮な培地に交換し、播種後２１日まで培養後、細胞をメタノールで固定、ギムザ染色して形質転換細胞（フォーカス）をカウントした。その結果、ＴＰＡ、ＯＡ、ＬＣＡ、ＰＲＯＧはフォーカス形成頻度（ｆｏｃｉ／ｗｅｌｌ）が溶媒対照群に対して有意（Ｄｕｎｎｅｔｔ検定を行い、片側  ｐ＜０．０５）かつ２倍以上に増大する濃度群が存在し、Ｂｈａｓ４２形質転換活性が陽性であった。ＥＤはフォーカス形成頻度（ｆｏｃｉ／ｗｅｌｌ）が溶媒対照群に対して有意に増大する濃度群も、２倍以上に増大する濃度群も存在しないため、Ｂｈａｓ４２形質転換活性は陰性であった。【００７６】２）ＲＮＡ試料の抽出精製
凍結保存した細胞試料液を解凍し、クロロホルム分配およびイソプロパノール沈殿によりトータルＲＮＡを抽出し、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、キアゲン社のプロトコールに従いトータルＲＮＡを精製した。得られたトータルＲＮＡ試料について、ＲＮＡ濃度測定およびＡｇｉｌｅｎｔ  ２１００バイオアナライザによりクオリティー評価を行った。【００７７】３）ＤＮＡマイクロアレイ分析用ＲＮＡ試料の調製および分析
精製後のトータルＲＮＡについて、３’ＩＶＴ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｋｉｔ（アフィメトリクス（株））を用いて、ｃＤＮＡに逆転写後、ラベル化ａＲＮＡを調製し、精製した後、フラグメンテーションを行った。ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈ，ａｎｄ  ｓｔａｉｎ  Ｋｉｔ（アフィメトリクス（株））の試薬と混合し、Ｍｏｕｓｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  ４３０  ２．０アレイ（アフィメトリクス（株））に注入後、４５℃で１６時間、ハイブリダイゼーションを行った。【００７８】  ハイブリダイゼーションの終了後、アレイの中の溶液を除去し、同キットを用いてＦｌｕｉｄｉｃｓ  Ｓｔａｔｉｏｎ  ４５０（アフィメトリクス（株））で洗浄および染色後、Ｇｅｎｅ  Ｃｈｉｐ  Ｓｃａｎｎｅｒ  ３０００（アフィメトリクス（株））を用いてマイクロアレイ分析を行った。【００７９】２．マイクロアレイ測定結果の解析およびマーカー遺伝の選出
ＤＮＡマイクロアレイ分析により得られたデータ（ＣＥＬデータ）に対し、はじめに採用する正規化（ｓｕｍｍａｒｉｚａｔｉｏｎ，ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）手法の検討を行った。ＤＦＷ、ＭＡＳ５、ＲＭＡおよびｑＦＡＲＭＳによる正規化を、「Ｒ」（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ／）により実行し、階層的クラスター解析を行った。その結果、既知発がんプロモーター処理群と溶媒対照群との間で異なるクラスターを形成する正規化手法としてｑＦＡＲＭＳを選択した。【００８０】  続いて、ｑＦＡＲＭＳにより正規化したデータに対し、統計法としてＲａｎｋ  ｐｒｏｄｕｃｔｓを実行し、解析結果をＥｘｃｅｌファイルに変換した。【００８１】  ５種の各既知発がんプロモーター処理により有意に発現変動したＧｅｎｅ（遺伝子）を抽出するために、Ｒａｎｋ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ実行により得られたデータのＦａｌｓｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｒａｔｅ（ＦＤＲ）をオートフィルターにより昇順に並べなおし、０．０５未満のｐｒｏｂｅ  ｓｅｔｓ（プローブセット）を抽出した。一部の遺伝子については一つの遺伝子が複数のプローブセットによりコードされる場合があることから、抽出されたプローブセットについて、Ｇｅｎｅ  Ｔｉｔｌｅ（遺伝子名）または、Ｇｅｎｅ  Ｓｙｍｂｏｌ（遺伝子略名）の重複を削除し、溶媒対照群に対して既知発がんプロモーター処理群で有意にｍＲＮＡ量が増大または減少した遺伝子名を抽出した（増大：１６６８遺伝子、減少：１２３８遺伝子）。これらの遺伝子を下記表４及び表５に示す。【００８２】
【表４−１】
0005866598.tif 000046
【００８３】
【表４−２】
0005866598.tif 000047
【００８４】
【表４−３】
0005866598.tif 000048
【００８５】
【表４−４】
0005866598.tif 000049
【００８６】
【表４−５】
0005866598.tif 000050
【００８７】
【表４−６】
0005866598.tif 000051
【００８８】
【表４−７】
0005866598.tif 000052
【００８９】
【表４−８】
0005866598.tif 000053
【００９０】
【表４−９】
0005866598.tif 000054
【００９１】
【表４−１０】
0005866598.tif 000055
【００９２】
【表４−１１】
0005866598.tif 000056
【００９３】
【表４−１２】
0005866598.tif 000057
【００９４】
【表４−１３】
0005866598.tif 000058
【００９５】
【表４−１４】
0005866598.tif 000059
【００９６】
【表４−１５】
0005866598.tif 000060
【００９７】
【表４−１６】
0005866598.tif 000061
【００９８】
【表４−１７】
0005866598.tif 000062
【００９９】
【表４−１８】
0005866598.tif 000063
【０１００】
【表４−１９】
0005866598.tif 000064
【０１０１】
【表４−２０】
0005866598.tif 000065
【０１０２】
【表４−２１】
0005866598.tif 000066
【０１０３】
【表４−２２】
0005866598.tif 000067
【０１０４】
【表４−２３】
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【０１０５】
【表４−２４】
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【０１０６】
【表４−２５】
0005866598.tif 000070
【０１０７】
【表４−２６】
0005866598.tif 000071
【０１０８】
【表４−２７】
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【０１０９】
【表４−２８】
0005866598.tif 000073
【０１１０】
【表４−２９】
0005866598.tif 000074
【０１１１】
【表４−３０】
0005866598.tif 000075
【０１１２】
【表４−３１】
0005866598.tif 000076
【０１１３】
【表４−３２】
0005866598.tif 000077
【０１１４】
【表４−３３】
0005866598.tif 000078
【０１１５】
【表４−３４】
0005866598.tif 000079
【０１１６】
【表４−３５】
0005866598.tif 000080
【０１１７】
【表４−３６】
0005866598.tif 000081
【０１１８】
【表４−３７】
0005866598.tif 000082
【０１１９】
【表４−３８】
0005866598.tif 000083
【０１２０】
【表４−３９】
0005866598.tif 000084
【０１２１】
【表４−４０】
0005866598.tif 000085
【０１２２】
【表４−４１】
0005866598.tif 000086
【０１２３】
【表４−４２】
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【０１２４】
【表４−４３】
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【０１２５】
【表４−４４】
0005866598.tif 000089
【０１２６】
【表４−４５】
0005866598.tif 000090
【０１２７】
【表４−４６】
0005866598.tif 000091
【０１２８】
【表４−４７】
0005866598.tif 000092
【０１２９】
【表４−４８】
0005866598.tif 000093
【０１３０】
【表４−４９】
0005866598.tif 000094
【０１３１】
【表４−５０】
0005866598.tif 000095
【０１３２】
【表４−５１】
0005866598.tif 000096
【０１３３】
【表４−５２】
0005866598.tif 000097
【０１３４】
【表４−５３】
0005866598.tif 000098
【０１３５】
【表４−５４】
0005866598.tif 000099
【０１３６】
【表４−５５】
0005866598.tif 000100
【０１３７】
【表４−５６】
0005866598.tif 000101
【０１３８】
【表４−５７】
0005866598.tif 000102
【０１３９】
【表４−５８】
0005866598.tif 000103
【０１４０】
【表４−５９】
0005866598.tif 000104
【０１４１】
【表４−６０】
0005866598.tif 000105
【０１４２】
【表４−６１】
0005866598.tif 000106
【０１４３】
【表４−６２】
0005866598.tif 000107
【０１４４】
【表４−６３】
0005866598.tif 000108
【０１４５】
【表４−６４】
0005866598.tif 000109
【０１４６】
【表４−６５】
0005866598.tif 000110
【０１４７】
【表４−６６】
0005866598.tif 000111
【０１４８】
【表４−６７】
0005866598.tif 000112
【０１４９】
【表４−６８】
0005866598.tif 000113
【０１５０】
【表４−６９】
0005866598.tif 000114
【０１５１】
【表４−７０】
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【０１５２】
【表４−７１】
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【０１５３】
【表４−７２】
0005866598.tif 000117
【０１５４】
【表５−１】
0005866598.tif 000118
【０１５５】
【表５−２】
0005866598.tif 000119
【０１５６】
【表５−３】
0005866598.tif 000120
【０１５７】
【表５−４】
0005866598.tif 000121
【０１５８】
【表５−５】
0005866598.tif 000122
【０１５９】
【表５−６】
0005866598.tif 000123
【０１６０】
【表５−７】
0005866598.tif 000124
【０１６１】
【表５−８】
0005866598.tif 000125
【０１６２】
【表５−９】
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【０１６３】
【表５−１０】
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【０１６４】
【表５−１１】
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【０１６５】
【表５−１２】
0005866598.tif 000129
【０１６６】
【表５−１３】
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【０１６７】
【表５−１４】
0005866598.tif 000131
【０１６８】
【表５−１５】
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【０１６９】
【表５−１６】
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【０１７０】
【表５−１７】
0005866598.tif 000134
【０１７１】
【表５−１８】
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【０１７２】
【表５−１９】
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【０１７３】
【表５−２０】
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【０１７４】
【表５−２１】
0005866598.tif 000138
【０１７５】
【表５−２２】
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【０１７６】
【表５−２３】
0005866598.tif 000140
【０１７７】
【表５−２４】
0005866598.tif 000141
【０１７８】
【表５−２５】
0005866598.tif 000142
【０１７９】
【表５−２６】
0005866598.tif 000143
【０１８０】
【表５−２７】
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【０１８１】
【表５−２８】
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【０１８２】
【表５−２９】
0005866598.tif 000146
【０１８３】
【表５−３０】
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【０１８４】
【表５−３１】
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【０１８５】
【表５−３２】
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【０１８６】
【表５−３３】
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【０１８７】
【表５−３４】
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【０１８８】
【表５−３５】
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【０１８９】
【表５−３６】
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【０１９０】
【表５−３７】
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【０１９１】
【表５−３８】
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【０１９２】
【表５−３９】
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【０１９３】
【表５−４０】
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【０１９４】
【表５−４１】
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【０１９５】
【表５−４２】
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【０１９６】
【表５−４３】
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【０１９７】
【表５−４４】
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【０１９８】
【表５−４５】
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【０１９９】
【表５−４６】
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【０２００】
【表５−４７】
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【０２０１】
【表５−４８】
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【０２０２】
【表５−４９】
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【０２０３】
【表５−５０】
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【０２０４】
【表５−５１】
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【０２０５】
【表５−５２】
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【０２０６】
【表５−５３】
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【０２０７】
【表５−５４】
0005866598.tif 000171
【０２０８】  それらの有意に増大または減少した遺伝子から、さらに、有意性の高い遺伝子を選出する目的で、増大または減少のそれぞれについて、ＦＤＲ０．０１未満のプローブセットを抽出した。それらのプローブセットについて、ＭＡＳ５の正規化データにおいて、発がんプロモーター処理群でシグナル強度比が２倍以上に増大し、シグナル強度が３００以上のプローブセットを抽出した。続いて、遺伝子名または遺伝子略名の重複を削除することにより、増大遺伝子（１２６遺伝子）を選出した（上掲の表１）。同様に有意（ＦＤＲ０．０１未満）に減少したプローブセットについて、シグナル強度比が発がんプロモーター処理群において０．５倍【０２０９】以下に減少し、溶媒対照群のシグナル強度が３００以上のプローブセットを抽出した。遺伝子名または遺伝子略名の重複を削除することにより、減少遺伝子（７３遺伝子）を選出した（上掲の表２）。【０２１０】３．選出したマーカー遺伝子による被検物質の発がんプロモーション活性の判定と分類
ｔｅｒｔ−ブチルヒドロキノン（ＴＢＨＱ）は、上記したＢｈａｓ４２細胞形質転換試験により強い陽性反応が得られた化学物質である。上記と同様の手順で、ＴＢＨＱ処理後２４時間のＢｈａｓ４２細胞からｍＲＮＡ試料を調製し、マイクロアレイ解析を行ない、ＦＤＲ０．０１未満で且つシグナル強度が２倍以上又は０．５倍以下に変化した遺伝子を調べた。変化が認められた遺伝子について、上記で選出した１９９遺伝子（増大１２６遺伝子、減少７３遺伝子）との一致性を調べた。その結果を下記表６及び表７に示す。【０２１１】
【表６】
0005866598.tif 000172
【０２１２】
【表７】
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【０２１３】  ＴＢＨＱ処理したＢｈａｓ４２細胞で発現量が変化した遺伝子の一致性は、ＴＰＡとの間で非常に高かった。Ｂｈａｓ４２形質転換活性陰性であるＥＤとの間では、一致する遺伝子は見出されなかった。ＴＢＨＱは発がんプロモーション活性を有し、その活性はＴＰＡ型と判定することができた。
【配列表】
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