(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
レボイソバレリルスピラマイシンＩＩＩ、ＩＩ、Ｉの３つの成分を主とする混合物であり、前記レボイソバレリルスピラマイシンＩＩＩ、ＩＩ、Ｉのうちの１つの成分が結晶体化合物として含まれ、イソブチリルスピラマイシンＩＩＩ、ＩＩ、ブチリルスピラマイシンＩＩＩ、ＩＩ、プロピオニルスピラマイシンＩＩＩ、ＩＩ及びアセチルスピラマイシンＩＩＩ、ＩＩを所定量含有し、前記混合物のうち、レボイソバレリルスピラマイシンＩＩＩ、ＩＩ、Ｉの含量はそれぞれ順に３０重量％、２０．０２重量％、２．３０重量％を上回り、レボイソバレリルスピラマイシンＩＩＩ、ＩＩ、Ｉの合計含量は６０重量％を上回り、アシル化スピラマイシンの含量は８０〜９８重量％とし、温度２５℃、０．０２ｇ／ｍｌのクロロホルム溶液の中での比旋度は［α］Ｄ＝−５２°〜−５７°とするレボロキタマイシンであって、
前記アシル化スピラマイシンは、イソブチリルスピラマイシンＩＩＩ、ＩＩ、ブチリルスピラマイシンＩＩＩ、ＩＩ、プロピオニルスピラマイシンＩＩＩ、ＩＩ、アセチルスピラマイシンＩＩＩ、ＩＩ、およびレボイソバレリルスピラマイシンＩＩＩ、ＩＩ、Ｉの合計であり、
レボイソバレリルスピラマイシンＩＩＩがレボイソバレリルスピラマイシンＩＩＩ結晶体化合物である場合、該結晶体を、Ｃｕ−Ｋα放射線を用いて測定し得られるＸ−放射線粉末回折は、２θが８．０°、１０．０°、１１．２°、１１．７°、１６．４°、１９．１°、１９．６°、２０．０°、２１．４°、２２．９°、２３．６°及び２９．４°であるときに、特徴的なピークがあり；
レボイソバレリルスピラマイシンＩＩがレボイソバレリルスピラマイシンＩＩ結晶体化合物である場合、該結晶体を、Ｃｕ−Ｋα放射線を用いて測定し得られるＸ−放射線粉末回折は、２θが１０．０°、１１．６°、１６．４°、１７．３°、１９．１°、２１．２°、２２．１°、２２．７°、２６．４°、２６．９°、２７．５°及び３１．５°であるときに、特徴的なピークがあり；
レボイソバレリルスピラマイシンＩがレボイソバレリルスピラマイシンＩ結晶体化合物である場合、該結晶体を、Ｃｕ−Ｋα放射線を用いて測定し得られるＸ−放射線粉末回折は、２θが７．６°、８．０°、１０．０°、１１．４°、１６．４°、１７．０°、１７．５°、１７．９°、１９．５°、２２．７°、２３．７°及び２４．４°であるときに、特徴的なピークがあることを特徴とする、レボロキタマイシン。
【請求項２】
前記レボロキタマイシンの融点は１１２〜１２２℃とすることを特徴とする、請求項１に記載されたレボロキタマイシン。
【請求項３】
前記レボロキタマイシンの融点は１１４〜１２０℃とすることを特徴とする、請求項１に記載されたレボロキタマイシン。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載されたレボロキタマイシンと薬学的に許容されるキャリアを含有することを特徴とするレボロキタマイシン薬物組成物。
【請求項５】
前記レボロキタマイシンの含量は薬物組成物の１０〜９０重量％とすることを特徴とする、請求項４に記載されたレボロキタマイシン薬物組成物。
【請求項６】
４”−イソバレリルトランスフェラーゼ遺伝子を含有するスピラマイシンが生じる細菌クローニング菌株ＷＳＪ−１９５を斜面培養基において培養後、種培養基に接種し、培養後、さらに発酵培養基に接種し、ｐＨ調節剤によって発酵過程をコントロールし、ｐＨ値６．０〜９．０の条件下で発酵を行い、またｐＨ値が時間が経つに伴って変化する曲線は３つの連続的な段階を呈し、第一段階は方程式ｙ１＝ｋ１ｘ１＋６．０を満たし、前記第一段階の方程式のうちｋ１およびｘ１は０．０２２７≦ｋ１≦０．１３６４、０＜ｘ１≦２２、第二段階は方程式ｙ２＝ｋ２ｘ２＋ｂ２を満たし、前記第二段階の方程式のうちｋ２、ｂ２およびｘ２は−０．０７３５≦ｋ２＜０、６．５＜ｂ２≦１０．６２、２２≦ｘ２≦５６、第三段階は方程式ｙ３＝ｋ３ｘ３＋ｂ３を満たし、前記第三段階の方程式のうちｋ３、ｂ３およびｘ３は０＜ｋ３≦０．００７８、６．０６≦ｂ３＜６．５、５６≦ｘ３≦１２０とすることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載された、培養、発酵、抽出を含むレボロキタマイシンの調製方法であって、
前記ｘ１、ｘ２、ｘ３は時間を表し、前記ｙ１、ｙ２、ｙ３はｐＨ値を表し、前記ｋ１、ｋ２、ｋ３、ｂ２、ｂ３は各発酵過程における定数を表し、
前記調製方法はさらに、
ａ）レボロキタマイシンについて分離・純化を行い、レボイソバレリルスピラマイシンＩ、ＩＩ又はＩＩＩを得る；
ｂ）得られたレボイソバレリルスピラマイシンＩ、ＩＩ又はＩＩＩを再結晶させ、レボイソバレリルスピラマイシンＩ、ＩＩ及びＩＩＩ結晶体化合物を得る；
ｃ）ステップａ）においてレボイソバレリルスピラマイシンＩ、ＩＩ又はＩＩＩの成分を分離・純化した後のレボロキタマイシンを、回転蒸発によってアセトニトリルを除去し、そして１倍の量の酢酸エチルを用いて抽出を行い、回転蒸発によって抽出液の中の酢酸エチルを除去し、ペースト状サンプルを得、石油エーテル再溶解によって得られたサンプルを用い、回転蒸発によって石油エーテルを除去し、レボロキタマイシンを得る；
ｄ）ステップｂ）において得られたレボイソバレリルスピラマイシンＩ、ＩＩ又はＩＩＩ結晶体化合物をステップｃ）において得られたレボロキタマイシンと混合させて得られたレボイソバレリルスピラマイシンＩ、ＩＩ又はＩＩＩはレボイソバレリルスピラマイシンＩ、ＩＩ又はＩＩＩ結晶体化合物のレボロキタマイシンであるといったステップを含み；
ステップａ）に記載された分離・純化において、調製型高速液体クロマトグラフィーを用いて最初の分離によって得られたレボロキタマイシンについて純化を行い、ＯＤＳ調製カラムを用い、アセトニトリルと酢酸アンモニウム緩衝液を用いて勾配溶出を行い、ＵＶ検出によって、分離のＵＶスペクトルを記録し、レボイソバレリルスピラマイシンＩ、ＩＩ又はＩＩＩの成分ターゲットピークを収集し、
カラム：ＯＤＳ調製カラム
流動相：アセトニトリル（Ａ）、１００ｍＭ酢酸アンモニア水溶液（Ｂ）
グラデーション条件：０〜６０分間、Ａは２５％〜６５％、６１〜９０分間、Ａは６５％〜９０％という線形グラデーションを用いる。
流速：２６０ ｍＬ／分
サンプル注入量：１０ｍＬ
サンプル注入濃度：０．５ｇ／ｍＬ
検出波長：２３１ｎｍ
収集方式：ＵＶトリガ収集
レボイソバレリルスピラマイシンＩの保留時間ＲＴ ４４．７５９分によってレボイソバレリルスピラマイシンＩのサンプルを収集し、又はレボイソバレリルスピラマイシンＩＩの保留時間ＲＴ ４３．３４分によってレボイソバレリルスピラマイシンＩＩのサンプルを収集し、或いはレボイソバレリルスピラマイシンＩＩＩの保留時間ＲＴ ４８．００９分によってレボイソバレリルスピラマイシンＩＩＩのサンプルを収集し、そして回転蒸発によってアセトニトリルを除去し、１倍の量の酢酸エチルで抽出を行ない、回転蒸発によって抽出液の中の酢酸エチルを除去し、ペースト状サンプルを得、石油エーテル再溶解によって得られたサンプルを用い、さらに回転蒸発によって石油エーテルを除去し、レボイソバレリルスピラマイシンＩ、ＩＩ又はＩＩＩの白色の粉末状固形物を得る方法であり；
レボイソバレリルスピラマイシンＩがレボイソバレリルスピラマイシンＩ結晶体化合物である場合、該結晶体は次の再結晶方法を用いて得、まず得られたレボイソバレリルスピラマイシンＩの白色の粉末状固形物を無水メタノール、無水エタノール及び無水アセトンの混合溶剤に溶解させ、純水を加えながら撹拌し、純水を加えた後、温度を５℃〜１５℃まで下げると当時に撹拌を続け、レボイソバレリルスピラマイシンＩ結晶体化合物を得、使用する混合溶剤における酢酸エチル、無水エタノール及び無水アセトンの体積比は１：０．１〜１０：０．５〜１とし、
レボイソバレリルスピラマイシンＩＩがレボイソバレリルスピラマイシンＩＩ結晶体化合物である場合、該結晶体は次の再結晶方法を用いて得、まず得られたレボイソバレリルスピラマイシンＩＩの白色の粉末状固形物を無水メタノール、無水アセトン及び無水エタノールの混合溶剤に溶解させ、そして純水を加えながら撹拌し、純水を加えた後、温度を５℃〜１５℃まで下げると当時に撹拌を続け、レボイソバレリルスピラマイシンＩＩ結晶体化合物を得、使用する混合溶剤における無水メタノール、無水アセトン及び無水エタノールの体積比は１：０．１〜１０：０．５〜１とし、
レボイソバレリルスピラマイシンＩＩＩがレボイソバレリルスピラマイシンＩＩＩ結晶体化合物である場合、前記レボイソバレリルスピラマイシンＩＩＩ結晶体の再結晶方法として、まず得られたレボイソバレリルスピラマイシンＩＩＩの白色の粉末状固形物を無水メタノール、無水エタノール及び無水アセトンの混合溶剤に溶解させ、そして純水を加えながら撹拌し、純水を加えた後、温度を５℃〜１５℃まで下げると当時に撹拌を続け、レボイソバレリルスピラマイシンＩＩＩ結晶体を得、使用する混合溶剤における無水メタノール、無水エタノール及び無水アセトンの体積比は１：０．１〜１０：０．５〜１とすることを特徴とする、
調製方法。
【請求項７】
前記抽出として、培養発酵後の発酵液を、硫酸アルミニウムを用いて処理しろ液を得、ｐＨを８．５−９．０まで調節し、酢酸ブチルを用いて抽出を行い、酢酸ブチル抽出液はそれぞれ無塩水及び１％ＮａＨ２ＰＯ４を用いて洗浄し、さらにｐＨ２．０−２．５の水で抽出を行い、水相抽出液を得、ｐＨを４．５−５．５まで調節し、揮発によって残りの酢酸ブチルを除去し、水抽出液を得、ろ過を行い、ろ液のｐＨを８．５−９．０まで調節し、沈澱物を得、精製水を用いて沈澱物をすすぎ、湿品を得、乾燥させ、レボロキタマイシンを得ることを特徴とする、請求項６に記載された調製方法。
【請求項８】
斜面培養基での培養は温度２８〜３８℃の条件下で８〜１５日培養し、種培養基での培養は温度２５〜３０℃の条件下で４０〜８０時間培養し、発酵培養基での発酵は２６〜３０℃の条件下で７２〜１２０時間培養することを特徴とする、請求項６に記載された調製方法。
【請求項９】
前記発酵過程において、ｐＨ値６．０〜８．０の条件下で発酵を行うことを特徴とする、請求項６に記載された調製方法。
【請求項１０】
レボイソバレリルスピラマイシンＩがレボイソバレリルスピラマイシンＩ結晶体化合物である場合、該結晶体は次の再結晶方法を用いて得、まず得られたレボイソバレリルスピラマイシンＩの白色の粉末状固形物を無水メタノール、無水エタノール及び無水アセトンの混合溶剤に溶解させ、純水を加えながら撹拌し、純水を加えた後、温度を５℃〜１５℃まで下げると当時に撹拌を続け、レボイソバレリルスピラマイシンＩ結晶体化合物を得、使用する混合溶剤における酢酸エチル、無水エタノール及び無水アセトンの体積比は１：２〜８：０．８〜１とし、
レボイソバレリルスピラマイシンＩＩがレボイソバレリルスピラマイシンＩＩ結晶体化合物である場合、該結晶体は次の再結晶方法を用いて得、まず得られたレボイソバレリルスピラマイシンＩＩの白色の粉末状固形物を無水メタノール、無水アセトン及び無水エタノールの混合溶剤に溶解させ、そして純水を加えながら撹拌し、純水を加えた後、温度を５℃〜１５℃まで下げると当時に撹拌を続け、レボイソバレリルスピラマイシンＩＩ結晶体化合物を得、使用する混合溶剤における無水メタノール、無水アセトン及び無水エタノールの体積比は１：２〜８：０．８〜１とし、
レボイソバレリルスピラマイシンＩＩＩがレボイソバレリルスピラマイシンＩＩＩ結晶体化合物である場合、前記レボイソバレリルスピラマイシンＩＩＩ結晶体の再結晶方法として、まず得られたレボイソバレリルスピラマイシンＩＩＩの白色の粉末状固形物を無水メタノール、無水エタノール及び無水アセトンの混合溶剤に溶解させ、そして純水を加えながら撹拌し、純水を加えた後、温度を５℃〜１５℃まで下げると当時に撹拌を続け、レボイソバレリルスピラマイシンＩＩＩ結晶体を得、使用する混合溶剤における無水メタノール、無水エタノール及び無水アセトンの体積比は１：２〜８：０．８〜１とすることを特徴とする、請求項６に記載された調製方法。
【請求項１１】
請求項１〜３のいずれか一項に記載されたレボロキタマイシン又は請求項４もしくは５に記載されたレボロキタマイシン薬物組成物の感染症治療・予防薬の調製のための使用方法。
【請求項１２】
前記感染症はグラム陽性菌、黄色ブドウ球菌、肺炎連鎖球菌、肺炎マイコプラズマ、肺炎クラミジア、マイコプラズマウレアリチクム、クラミジアトラコマチス、化膿連鎖球菌、カタル球菌、淋菌、インフルエンザ桿菌、レジオネラ菌又は嫌気性菌による感染に起因する疾病であることを特徴とする、請求項１１に記載された使用方法。
【請求項１３】
請求項１〜３のいずれか一項に記載されたレボロキタマイシン又は請求項４もしくは５に記載されたレボロキタマイシン薬物組成物の、抗菌薬調製のための使用方法であって、上記の菌は、肺炎連鎖球菌、Ａ群連鎖球菌、化膿連鎖球菌、腸球菌、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、カタル球菌、淋菌、インフルエンザ桿菌、大腸菌、毒素産生性大腸菌、病原性大腸菌、侵襲性大腸菌、緑膿菌、肺炎桿菌、プロテウスブルガリス、チフス菌、アシネトバクター属、シトロバクター属、セラチア菌、ソンネ赤痢菌、フレクスナー赤痢菌、カンジダアルビカンス、並びにレジオネラニューモフィラ、ゴールドマンレジオネラ菌、レジオネラボウズマニイ、レジオネラダモフィイ、レジオネラジョルダニス、レジオネラミクダーディなどのレジオネラ菌、及びバクテロイデスフラジリス、多形性菌、バクテロイデスブルガタス、バクテロイデスディスタソニス、バクテロイデスルミニコラ、ブルセラアサッカロリティカ、口腔ブルセラ、核酸桿菌、フソバクテリウムルッシイ、ビフィズス菌、乳酸桿菌、ペプトストレプトコッカス属、プロピオニバクテリウムアクネス、ウェルシュ菌、酵母様真菌などの嫌気性菌がある使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はレボロキタマイシン原料薬及びその薬物製剤分野に属し、具体的にいえば、１種のマクロライド系遺伝子工学的抗生物質、とりわけ１種のレボロキタマイシン薬物、その調製方法及び感染症治療・予防薬物調製での応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
レボロキタマイシンは遺伝子工学技術を利用して開発された新型スピラマイシンの誘導体であり、もともとはバイオテクノロジースピラマイシンと命名され、かつて、生技マイシン［特許番号：ＺＬ９７１０４４４０．６］という名称が使用されていた。「中国薬品通用名称命名原則」に基づき、中国国家薬典委員会による技術審査及び検討を経て、バイオテクノロジースピラマイシンの中国語通用名称はレボロキタマイシンに変更され、英文名称はＣａｒｒｉｍｙｃｉｎである。
【０００３】
レボロキタマイシンは遺伝子組み換え細菌の発酵によってできたものであり、その化学構造は４”−レボイソバレリルスピラマイシンを主成分とし、４”−レボイソバレリルスピラマイシンＩ、ＩＩ、ＩＩＩを含み、さらに約６種の４”−位のヒドロキシアシル化のスピラマイシンを含有するため、その化学名称は４”アシル化スピラマイシンと総称されている。
【０００４】
レボロキタマイシンの主成分の化学構造は式（１）の示すとおり：
【０００５】
【化１】
0005866737.tif 000002
【０００６】
（１）
そのうち、
【０００７】
【表１】
0005866737.tif 000003
【０００８】
レボロキタマイシンは１６員環マクロライド系抗生物質であり、その作用方法として、細菌リボソームとの結合によりそのタンパク質の合成を抑制する。
【０００９】
体外試験の結果によると、レボロキタマイシンはグラム陽性菌とりわけ一部の耐薬菌（β−ラクタム耐性黄色ブドウ球菌、エリスロマイシン耐性黄色ブドウ球菌など）に対し効果があり、同種類の薬と明らかな交差耐薬性がない。同時に、レボロキタマイシンはマイコプラズマ、クラミジアに対し優れた抗菌活性を持ち、一部のグラム陰性菌に対しても抗菌活性を持ち、また、トキソプラズマ、レジオネラ菌などに対して、良好な抗菌活性及び組織透過性を持ち、さらに潜在的な免疫調節作用がある。その動物体内抗菌活性は明らかに体外より優れている（ＺＬ２００３１０１２２４２０．９）。臨床研究によると、毎日、レボロキタマイシン錠剤０．２−０．４ｍｇを５〜７日服用すれば、化膿連鎖球菌に起因する急性細菌性咽頭炎、急性化膿性扁桃炎、感受性菌に起因する細菌性副鼻腔炎、急性気管支炎、肺炎連鎖球菌、インフルエンザ菌及び肺炎マイコプラズマに起因する軽度の肺炎、マイコプラズマ、クラミジアに起因する非淋菌性尿道炎、感受性菌に起因する皮膚軟部組織感染症、歯周炎、中耳炎などの感染症を治療することができる。総有効率は９２．６８％である。レボロキタマイシンは安全かつ効果的な薬物である。
【００１０】
薬物動態学の研究結果によると、レボロキタマイシンに含まれる活性を有する有効な成分は主にレボイソバレリルスピラマイシン  Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩである。レボロキタマイシンは動物体内に入ってから、間もなくスピラマイシンに代謝され、親薬物レボイソバレリルスピラマイシン  Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩと活性代謝物スピラマイシン  Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ  のＡＵＣ０−ｔ合計で計算し、その経口絶対的バイオアベイラビリティは平均して９１．６％である。文献の報道によると、スピラマイシンの経口絶対的バイオアベイラビリティは３０〜４０％（Ｆｒｙｄｍａｎ  ＡＭ  ｅｔ  ａｌ  Ｊ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．１９８８，２２（ｓｕｐｐｌ  Ｂ）：９３−１０３）である。このことから、レボイソバレリルスピラマイシンの構造は明らかに活性成分スピラマイシンのバイオアベイラビリティを改善していることが明らかである。１回薬を飲むことでレボロキタマイシンの解消が比較的に遅く、Ｔ１／２は２３〜２７時間の間にある。
【００１１】
レボロキタマイシンの有効成分に対する研究を通じ、レボロキタマイシンにおいて活性を有する有効成分レボイソバレリルスピラマイシン  Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩの分子構造には複数のキラル炭素原子が存在していることが明らかになった。キラリティー（Ｃｈｉｒａｌｉｔｙ）は三次元オブジェクトの基本的な属性であり、自然界の本質的な属性の１つである。タンパク質、多糖類、核酸、酵素など生命活動の重要な基礎としての生体高分子はほとんどキラルなものであり、これらの高分子は動物体内で重要な生理機能を持つ場合が多い。キラル薬物（ｃｈｉｒａｌ  ｄｒｕｇ）は薬物の分子構造にキラル中心を導入後に得られる互いに実物と鏡像になる一対の鏡像異性体のことをいう。これらの鏡像異性体は、物理的化学的性質が基本的に似ており、旋光性のみが異なり、それぞれＲ−タイプ（右巻き）又はＳ−タイプ（左巻き）、ラセミと命名されている。しかし、ここ２０年来、薬学研究の進展に伴い、薬物エナンチオマーの立体選択性（ｓｔｅｒｅｏｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ）の違いにより各受容体との親和性が異なるため薬理作用が大きく異なることが証明されている。人々はキラル薬物の中で活性の高いエナンチオマーを優性エナンチオマー（Ｅｕｔｏｍｅｒ）と呼び、活性の低い又は活性のないエナンチオマーを劣性エナンチオマー（Ｄｉｓｔｏｍｅｒ）と呼んでいる。多くの場合、劣性エナンチオマーは、効果がないばかりか、優性エナンチオマーの一部の効果を解消し、さらに深刻な毒性副反応を生じ、効果の差異の複雑性を示す場合がある。単一エナンチオマーの治療指数はそのラセミ体とかなりの違いがあることも明らかになってくる。たとえば、周知のＤＬ−（＋−）シントマイシンの治療効果はＤ（−）クロラムフェンコルの半分しかなく、プロプラノロール（ｐｒｏｐｒａｎｏｌｏｌ）Ｌ−異性体の薬物活性はＤ−異性体より１００倍高く、（−）メタドンは強力な鎮痛剤だが、（＋）は効果がない。また、毒性の方も差異があり、たとえば、サリドマイド（ｔｈａｌｉｄｏｍｉｄｅ）の２つのエナンチオマーのマウスに対する鎮痛作用が類似するが、Ｓ（−）異性体及びその代謝物のみが、胎児毒性及び催奇形性がある。ケタミンは、広く応用される特性のある麻酔・鎮痛薬だが、幻覚を引き起こすなどの副作用がある。研究によると、Ｓ（＋）体の作用はＲ（−）体より３〜４倍強く、毒性副作用は明らかに後者に関連している。キラル薬物の効果の大きな違いはキラル薬物の研究開発や分離分析の発展を促している。「キラリティー」技術を利用することにより、人々は薬物に含まれる働きのない又は毒性副作用のある成分を効果的に取り除き、単一の指向性構造を有する純粋なキラル薬物を生産することが可能になり、これにより、薬物の成分はより純粋になり、疾病治療時に効果がより早く現れ、治療過程がより短くなる。したがって、キラル薬物の研究は目下国際的な新薬研究の新方向の１つになっており、各国政府及び各大手医薬会社は多額の資金を投下し、キラル薬物製剤、キラル原材料、キラル中間体などの分野で研究・開発を展開し、世界のキラリティー制薬市場の占有に取り組んでいる。また、キラリティー技術の継続的な改善とりわけ液体クロマトグラフィーの迅速かつ広範囲に��たる応用に伴い、キラル薬物エナンチオマーの分離分析及び測定が促進された。単一エナンチオマーキラル薬物は広汎な応用が得られた。
【００１２】
レボロキタマイシンは光学活性を持っているか？本発明の発明者はこの点について大量の研究を行った結果、培養・発酵条件の調整及び改善により、意外に旋光性を持つレボロキタマイシンが得られた。旋光性を持つこのレボロキタマイシンはより優れた抗感染活性を持っている。よって、本発明は１種のレボロキタマイシン、その調製方法及び感染症予防・治療薬物調製での応用を提供する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の一番目の目的は、旋光性を持つとともにより優れた抗感染活性を持つレボロキ
タマイシンを提供することにある。
【００１４】
本発明の二番目の目的は、本発明において提供する旋光性を持つレボロキタマイシンと
薬学的に許容されるキャリアを含有するレボロキタマイシン薬物組成物を提供することに
ある。
【００１５】
本発明の三番目の目的は、製造工程が簡単で、品質標準が管理しやすく、調製したレボ
レボロキタマイシンの効果が良く、旋光性を持つとともにより優れた抗感染活性を持つレボロキタマイシンの調製方法を提供することにある。
【００１６】
本発明の四番目の目的は、特に抗細菌、抗クラミジア及び抗マイコプラズマにおいて比
較的に良い効果があって、感染症薬物として用いられる、本発明におけるレボロキタマイ
シン又はレボロキタマイシン薬物組成物の感染症治療・予防薬物の調製での応用を提供す
ることにある。
【００１７】
本発明の一番目の目的を実現するために、以下の技術方案を用いる。
【００１８】
レボイソバレリルスピラマイシンＩＩＩ、ＩＩ、Ｉの３つの成分を主とする混合物であり、
イソブチリルスピラマイシンＩＩＩ、ＩＩ、ブチリルスピラマイシンＩＩＩ、ＩＩ、プロ
ピオニルスピラマイシンＩＩＩ、ＩＩ及びアセチルスピラマイシンＩＩＩ、ＩＩを一定量
含有し、そのうちレボイソバレリルスピラマイシンＩＩＩの含量は３０重量％を上回り、レボイソバレリルスピラマイシンＩＩＩ、ＩＩ、Ｉの合計含有量は６０重量％を上回り、アシル化スピラマイシンの含量は８０〜９８重量％、好ましくは８５〜９８重量％、より好ましくは９０〜９８重量％、最も好ましくは９５〜９８重量％とし、温度２５℃、０．０２ｇ／ｍｌのクロロホルム溶液の中での比旋度は［α］Ｄ＝−５２°〜−５７°、好ましくは−５４°〜−５６°、より好ましくは−５５°とすることを特徴とするレボロキタマイシン。
【００１９】
本発明の発明者はレボロキタマイシンについて大量の研究を行い、培養・発酵条件の調整と改善、とりわけｐＨ調節剤による発酵中のｐＨ値に対する厳格なコントロールにより、発酵中にｐＨ値が時間が経つに伴って変化する曲線は３つの連続的な段階を呈し、各段階はそれぞれ所定の方程式を満足するようにし、これにより光学活性を有するレボロキタマイシンが得られた。これについては、上記の培養・発酵条件により光学活性を有するレボロキタマイシンの成分の含量が変化することが原因と考えられるとともに、上記の培養・発酵条件によりレボロキタマイシンの光学構造が変化することも原因と考えられる。
【００２０】
本発明におけるレボロキタマイシンの比旋度の測定方法として、本発明において調製し
たレボロキタマイシンをとって正確に秤量し、クロロホルムを加えて溶解させ、１ｍｌご
とに約２０ｍｇ含む溶液に希釈し、ナトリウムスペクトルのＤ線（５８９．３ｎｍ）を用
いて旋光度を測定し、測定長さは１ｄｍとし、測定温度は２５℃とし、目盛り０．０００
１°までのテスト済みの旋光計を使用する。
【００２１】
本発明におけるレボロキタマイシンは、融解範囲が１１２〜１２２℃、好ましくは１１
４〜１２０℃、より好ましくは１１６〜１１８℃とする。
【００２２】
その測定方法として、乾燥したレボロキタマイシンを適量とって、融点測定用毛細管の
中に入れ、融点を測定し，測定を３回繰り返し、平均値をとる。
【００２３】
本発明におけるレボロキタマイシンは旋光性を持つ。現代の薬理学の研究によれば、薬物エナンチオマーは立体選択性が異なるため、各受容体との親和性が異なり、薬理作用に大きな違いが生じる。本発明では、動物体内外の効果により本発明におけるレボロキタマイシンは優れた抗感染効果を持つとともにかなり強い薬理活性をを持つことを証明し、これにより感染症の治療のために新しい薬物を提供し、レボロキタマイシンのキラル薬物製剤の研究開発のための基盤も築き上げられた。
【００２４】
動物体内外試験により、本発明におけるレボロキタマイシンは、感受性が高く、耐薬性
が低く、耐性黄色ブドウ球菌に対し効果があるほか、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Ｍ
ＲＳＡ）感染、ハイパースペクトルβ−ラクタマーゼ（ＥＳＢＬ）によって生成される大
腸菌感染など抗生物質の乱用に起因する細菌感染に対しても計り知れないほどの価値があ
ることが証明された。クロストリジウムディフィキル（Ｃ−ｄｉｆｆ）に起因する全ての
伝染病は抗生物質乱用によるものだが、レボロキタマイシンの誕生により、抑制されるこ
とが期待できる。
【００２５】
本発明におけるレボロキタマイシンは、さらにスピラマイシンＩＩＩとその他の成分を
含有し、そのうち、スピラマイシンＩＩＩの含量は１．０％を下回り、その他の成分の合
計含量は２．０〜１９重量％、好ましくは２．０〜１４．０重量％、より好ましくは２．
０〜９．０重量％、最も好ましくは２．０〜４．０重量％とする。
【００２６】
本発明におけるその他の成分には、改善されたスピラマイシンの同族体を少なくとも３
種含有する。
【００２７】
本発明におけるレボロキタマイシンはレボイソバレリルスピラマイシンＩＩＩ、ＩＩ、Ｉの３つの成分を主とする混合物であり、上記のレボイソバレリルスピラマイシンＩＩＩはレボイソバレリルスピラマイシンＩＩＩ結晶体化合物であり、又は上記のレボイソバレリルスピラマイシンＩＩはレボイソバレリルスピラマイシンＩＩ結晶体化合物であり、或いは上記のレボイソバレリルスピラマイシンＩはレボイソバレリルスピラマイシンＩ結晶体化合物である。
【００２８】
レボイソバレリルスピラマイシンＩＩＩがレボイソバレリルスピラマイシンＩＩＩ結晶体化合物である場合、該結晶体化合物を、Ｃｕ−Ｋα放射線を用いて測定し得られるＸ−放射線粉末回折は、２θが８．０°、１０．０°、１１．２°、１１．７°、１６．４°、１９．１°、１９．６°、２０．０°、２１．４°、２２．９°、２３．６°及び２９．４°であるときに、特徴的なピークがある。
【００２９】
レボイソバレリルスピラマイシンＩＩがレボイソバレリルスピラマイシンＩＩ結晶体化合物である場合、該結晶体を、Ｃｕ−Ｋα放射線を用いて測定し得られるＸ−放射線粉末回折は、２θが１０．０°、１１．６°、１６．４°、１７．３°、１９．１°、２１．２°、２２．１°、２２．７°、２６．４°、２６．９°、２７．５°及び３１．５°であるときに、特徴的なピークがある；
レボイソバレリルスピラマイシンＩがレボイソバレリルスピラマイシンＩ結晶体化合物である場合、該結晶体を、Ｃｕ−Ｋα放射線を用いて測定し得られるＸ−放射線粉末回折は、２θが７．６°、８．０°、１０．０°、１１．４°、１６．４°、１７．０°、１７．５°、１７．９°、１９．５°、２２．７°、２３．７°及び２４．４°であるときに、特徴的なピークがある。
【００３０】
本発明の発明者はさらなる研究により、得られたレボロキタマイシンについて純化・分
離を行ってレボイソバレリルスピラマイシンＩＩＩ、ＩＩ又はＩの単一成分を得た後、その中の１種の成分を再結晶させてレボイソバレリルスピラマイシンＩＩＩ、ＩＩ、Ｉの結晶体を得、さらにレボロキタマイシンと混合し、レボイソバレリルスピラマイシンＩＩＩ、ＩＩ又はＩがレボイソバレリルスピラマイシンＩＩＩ、ＩＩ又はＩ結晶体化合物であるレボロキタマイシンを得、動物体内効果によって、レボイソバレリルスピラマイシンＩＩＩ、ＩＩ又はＩがレボイソバレリルスピラマイシンＩＩＩ、ＩＩ又はＩ結晶体化合物であるレボロキタマイシンの効果は明らかに単純なレボロキタマイシンより優れれいることを明らかにした。
【００３１】
本発明の二番目の目的を実現するために、以下の技術方案を用いる。
【００３２】
上記のレボロキタマイシンと薬学的に許容されるキャリアを含有するレボロキタマイシ
ン薬物組成物。
【００３３】
本発明における薬物組成物に含まれるレボロキタマイシンの含量は安全かつ治療的に有
効な量、好ましくは薬物組成物の１０〜９０重量％、より好ましくは２５〜７５重量％、
さらに好ましくは４０〜６０重量％とする。
【００３４】
本発明において用いられる用語「安全かつ治療的に有効な量」は、人体又は他の哺乳動
物の疾病を軽減又は逆転或いは治療でき、かつ服用する薬物又は薬剤が哺乳動物の組織に
対して重大な危害を与えない薬物、化合物、組成物、製品又は薬剤の十分な用量のことを
いう。
【００３５】
本発明において用いられる用語「薬学的に許容されるキャリア」は、希釈剤、賦形剤、
充填剤、接着剤、湿潤剤、崩壊剤、吸収促進剤、表面活性剤、吸着キャリア、潤滑剤など
薬学分野の通常の薬物キャリアのことをいう。賦形剤は水などがあり、充填剤はでんぷん
、ショ糖などがあり、接着剤は繊維素誘導体、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロ
リドンなどがあり、湿潤剤はグリセリンなどがあり、崩壊剤は寒天、炭酸カルシウム、重
炭酸カルシウムなどがあり、吸収促進剤は第４級アンモニウム化合物などがあり、表面活
性剤はセタノールなどがあり、吸着キャリアはカオリン、ベントナイトなどがあり、潤滑
剤はタルクパウダー、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、ピリエチレ
ングリコールなどがある。また、組成物に香味剤、甘味剤など他の補助材料を加えて用い
ることも可能である。
【００３６】
本発明における組成物は、安全かつ有効な量で希釈剤、崩壊剤、潤滑剤、充填剤、接着
剤、湿潤剤、吸収促進剤、表面活性剤、賦形剤又はその他本分野でよく用いられる全ての
薬物キャリアから任意に選択し使用することができる。
【００３７】
本発明におけるレボロキタマイシン薬物組成物は薬用に適する製剤形式にて存在し、該
製剤形式は液体製剤、固形製剤、半固形製剤又は気体製剤である。
【００３８】
上記の液体製剤は注射剤、輸液剤、溶液剤、合剤、シロップ剤、チンキ剤、ペプタイザ
ー、芳香水剤、グリセリン剤、コロイド溶液剤、粘質物、懸濁液又は乳濁液である。
【００３９】
上記の固形製剤は注射用パウダー、注射用凍結乾燥パウダー、錠剤、カプセル剤、散剤
、顆粒剤、丸剤、丹剤又はフィルム剤である。
【００４０】
上記の半固体製剤は軟膏剤、硬膏剤、坐剤、エキス剤又はゲル剤である。
【００４１】
上記の気体製剤はエーロゾル剤又はスプレー剤である。
本発明におけるレボロキタマイシン薬物組成物については、レボロキタマイシンの用量は
１剤形１０〜１５００ｍｇ、好ましくは１００〜１０００ｍｇ、より好ましくは２００〜
５００ｍｇとする。
【００４２】
本発明の三番目の目的を実現するために、以下の技術方案を用いる。
【００４３】
４”−イソバレリルトランスフェラーゼ遺伝子を含有するスピラマイシンが生じる細菌
クローニング菌株ＷＳＪ−１９５を斜面培養基において培養後、種培養基に接種し、培養
後、さらに発酵培養基に接種し、ｐＨ調節剤によって発酵過程をコントロールし、ｐＨ値
６．０〜９．０、好ましくは６．０〜８．０、より好ましくは６．０〜７．５の条件下で
発酵を行い、またｐＨ値が時間が経つに伴って変化する曲線は３つの連続的な段階を呈し
、第一段階は方程式ｙ１＝ｋ１ｘ１＋６．０を満たし、そのうち０．０２２７≦ｋ１≦０
．１３６４、０＜ｘ１≦２２、第二段階は方程式ｙ２＝ｋ２ｘ２＋  ｂ２を満たし、その
うち−０．０７３５≦ｋ２＜０，６．５＜ｂ２≦１０．６２、２２≦ｘ２≦５６、第三段
階は方程式ｙ３＝ｋ３ｘ３＋  ｂ３を満たし、そのうち０＜ｋ３≦０．００７８、６．０
６≦ｂ３＜６．５、５６≦ｘ３≦１２０とする培養、発酵、抽出を含むレボロキタマイシ
ンの調製方法。
【００４４】
本発明では、培養・発酵条件の調整と改善、とりわけｐＨ調節剤による発酵中のｐＨ値
に対する厳格なコントロールにより、発酵中に時間が経つに伴って変化するｐＨ値の曲線
は３つの連続的な段階を呈し、各段階はそれぞれ所定の方程式を満足するようにし、これ
により光学活性を有するレボロキタマイシンを得る。
【００４５】
本発明では発酵過程が重要であり、発酵の全過程において時々ｐＨ値を検出することが
必要となり、ｐＨ値はｐＨ調節剤を加えることによってコントロールし、上記のｐＨ調節
剤はブドウ糖、クエン酸、酢酸、塩酸、アンモニア水、水酸化ナトリウム又は水酸化カリ
ウムの１つ又はその組み合わせ、好ましくはブドウ糖、クエン酸、酢酸、アンモニア水又
はその組み合わせ、より好ましくはブドウ糖、アンモニア水又はその組み合わせとする。
【００４６】
本発明の調製方法における抽出として、培養発酵後の発酵液を、硫酸アルミニウムを用
いて処理しろ液を得、ｐＨを８．５−９．０まで調節し、酢酸ブチルを用いて抽出を行い
、酢酸ブチル抽出液は無塩水及び１％ＮａＨ２ＰＯ４を用いて洗浄し、さらにｐＨ  ２．
０−２．５の水で抽出を行い、水相抽出液を得、ｐＨを４．５−５．５まで調節し、揮発
によって残りの酢酸ブチルを除去し、水抽出液を得、ろ過を行い、ろ液のｐＨを８．５−
９．０まで調節し、沈殿物を得、精製水を用いて沈澱物をすすぎ、湿品を得、乾燥させ、
レボロキタマイシンを得る。
【００４７】
本発明の調製方法における斜面培養基には、大豆粕粉２％、ブドウ糖１％、でんぷん３
％、ＣａＣＯ３０．５％、ＮａＣｌ  ０．４％及び寒天２％を含有する。
【００４８】
本発明の調製方法における種培養基には、大豆粕粉１．５％、でんぷん  ３．０％、Ｎ
ａＣｌ  ０．４％、ＣａＣＯ３  ０．５％、ペプトン０．３％及びＫＨ２ＰＯ４  ０．０
５％を含有する。
【００４９】
本発明の調製方法における発酵培養基には、ブドウ糖  ０．５％、でんぷん  ６．０％
、酵母粉０．５％、魚粉２．０％、ＮＨ４ＮＯ３  ０．６％、ＮａＣｌ  １．０％、Ｃａ
ＣＯ３  ０．５％、ＫＨ２ＰＯ４  ０．０５％、ＭｇＳＯ４  ０．１％、豆油０．５％及
び消泡剤０．０２％を含有する。
【００５０】
本発明の調製方法における斜面培養基での培養は、温度２８〜３８℃の条件下で８〜１
５日培養するということである。
【００５１】
本発明の調製方法における種培養基での培養は、温度２５〜３０℃の条件下で４０〜８
０時間培養するということである。
【００５２】
本発明の調製方法における発酵培養基での発酵は、２６〜３０℃の条件下で７２〜１２
０時間培養するということである。
【００５３】
レボロキタマイシンにはレボイソバレリルスピラマイシンＩ、ＩＩ又はＩＩＩの結晶体を含
有する場合、前述の調製方法はさらに次のステップを含む。
【００５４】
ａ）レボロキタマイシンについて分離・純化を行い、レボイソバレリルスピラマイシン
Ｉ、ＩＩ又はＩＩＩを得る。
【００５５】
ｂ）得られたレボイソバレリルスピラマイシンＩ、ＩＩ又はＩＩＩを再結晶させ、レボ
レボイソバレリルスピラマイシンＩ、ＩＩ又はＩＩＩ結晶体化合物を得る。
【００５６】
ｃ）ステップａ）においてレボイソバレリルスピラマイシンＩ、ＩＩ又はＩＩＩの成分
を分離・純化した後のレボロキタマイシンを、回転蒸発によってアセトニトリルを除去し
、そして１倍の量の酢酸エチルを用いて抽出を行い、回転蒸発によって抽出液の中の酢酸
エチルを除去し、ペースト状サンプルを得、石油エーテル再溶解によって得られたサンプ
ルを用いて、回転蒸発によって石油エーテルを除去し、レボロキタマイシンを得る。
【００５７】
ｄ）ステップｂ）において得られたレボイソバレリルスピラマイシンＩ、ＩＩ又はＩＩ
Ｉ結晶体化合物をステップｃ）において得られたレボロキタマイシンと混合させて得られ
たレボイソバレリルスピラマイシンＩ、ＩＩ又はＩＩＩはレボイソバレリルスピラマイシンＩ
、ＩＩ又はＩＩＩ結晶体化合物のレボロキタマイシンである。
【００５８】
本発明の調製方法におけるステップａ）に記載された分離・純化において、調製型高速
液体クロマトグラフィーを用いて最初の分離によって得られたレボロキタマイシンについ
て純化を行い、ＯＤＳ調製カラムを用い、アセトニトリルと酢酸アンモニウム緩衝液を用
いて勾配溶出を行い、ＵＶ検出によって、分離のＵＶスペクトルを記録し、レボイソバレ
リルスピラマイシンＩ、ＩＩ又はＩＩＩの成分ターゲットピークを収集する。
【００５９】
カラム：ＯＤＳ調製カラム
流動相：アセトニトリル（Ａ）、１００ｍＭ酢酸アンモニア水溶液（Ｂ）
グラデーション条件：０〜６０分間、Ａは２５％〜６５％、６１〜９０分間、Ａは６５
％〜９０％という線形グラデーションを用いる。
【００６０】
流速：２６０  ｍＬ／分
サンプル注入量：１０ｍＬ
サンプル注入濃度：０．５ｇ／ｍＬ
検出波長：２３１ｎｍ
収集方式：ＵＶトリガ収集
レボイソバレリルスピラマイシンＩの保留時間ＲＴ  ４４．７５９分によってレボイソ
バレリルスピラマイシンＩのサンプルを収集し、又はレボイソバレリルスピラマイシンＩ
Ｉの保留時間ＲＴ  ４３．３４分によってレボイソバレリルスピラマイシンＩＩのサンプ
ルを収集し、或いはレボイソバレリルスピラマイシンＩＩＩの保留時間ＲＴ  ４８．００
９分によってレボイソバレリルスピラマイシンＩＩＩのサンプルを収集し、そして回転蒸
発によってアセトニトリルを除去し、１倍の量の酢酸エチルで抽出を行い、回転蒸発によ
って抽出液の中の酢酸エチルを除去し、ペースト状サンプルを得、石油エーテル再溶解に
よって得られたサンプルを用い、さらに回転蒸発によって石油エーテルを除去し、レボイ
ソバレリルスピラマイシンＩ、ＩＩ又はＩＩＩの白色の粉末状固形物を得る。
【００６１】
本発明の調製方法では、レボイソバレリルスピラマイシンＩがレボイソバレリルスピラマイ
シンＩ結晶体化合物である場合、該結晶体は次の再結晶方法を用いて得る：まず得られた
レボイソバレリルスピラマイシンＩの白色の粉末状固形物を無水メタノール、無水エタノ
ール及び無水アセトンの混合溶剤に溶解させ、そして純水を加えながら撹拌し、純水を加
えた後、温度を５℃〜１５℃まで下げると当時に撹拌を続け、レボイソバレリルスピラマ
イシンＩ結晶体を得、使用する混合溶剤における酢酸エチル、無水エタノール及び無水ア
セトンの体積比は１：０．１〜１０：０．５〜１、好ましくは１：２〜８：０．８〜１と
する。
【００６２】
そのうち、上記のレボイソバレリルスピラマイシンＩ結晶体化合物の再結晶方法の第一
の好ましい技術方案として、加える純水の体積は酢酸エチル、無水エタノール及び無水ア
セトンの体積の和の２〜９倍、好ましくは２．５〜７．５倍とし、純水を加える速度は４
〜１０ｍｌ／分、好ましくは６〜８ｍｌ／分とする。
【００６３】
上記のレボイソバレリルスピラマイシンＩ結晶体化合物の再結晶方法の第二の好ましい
技術方案として、使用する混合溶剤における酢酸エチル、無水エタノール及び無水アセト
ンの体積比は１：０．１〜１０：０．５〜１、好ましくは１：２〜８：０．８〜１とする
。
【００６４】
上記のレボイソバレリルスピラマイシンＩ結晶体化合物の再結晶方法の第三の好ましい
技術方案として、加えた純水の撹拌速度は３０〜６０回転／分、好ましくは４５〜６０回
転／分とし、純水を加えた後の撹拌速度は１０〜３０回転／分、好ましくは１０〜２０回
転／分とする。
【００６５】
上記のレボイソバレリルスピラマイシンＩ結晶体化合物の再結晶方法の第四の好ましい
技術方案として、純水を加えた後の温度を下げる速度は１〜３℃／時、好ましくは１〜１
．５℃／時とする。
【００６６】
レボイソバレリルスピラマイシンＩＩがレボイソバレリルスピラマイシンＩＩ結晶体化合物
である場合、該結晶体を次の再結晶方法を用いて得る：まず得られたレボイソバレリルス
ピラマイシンＩＩの白色の粉末状固形物を無水メタノール、無水アセトン及び無水エタノ
ールの混合溶剤に溶解させ、そして純水を加えながら撹拌し、純水を加えた後、温度を５
℃〜１５℃まで下げると当時に撹拌を続け、レボイソバレリルスピラマイシンＩＩの結晶
体を得、使用する混合溶剤における無水メタノール、無水アセトン及び無水エタノールの
体積比は１：０．１〜１０：０．５〜１、好ましくは１：２〜８：０．８〜１とする。
【００６７】
そのうち、上記のレボイソバレリルスピラマイシンＩＩ結晶体化合物の再結晶方法の第
一の好ましい技術方案として、加える純水の体積は無水メタノール、無水エタノール及び
無水アセトンの体積の和の２〜９倍、好ましくは２．５〜７．５倍とし、純水を加える速
度は４〜１０ｍｌ／分、好ましくは６〜８ｍｌ／分とする。
【００６８】
上記のレボイソバレリルスピラマイシンＩＩ結晶体化合物の再結晶方法の第二の好まし
い技術方案として、使用する混合溶剤における無水メタノール、無水アセトン及び無水エ
タノールの体積比は１：０．１〜１０：０．５〜１、好ましくは１：２〜８：０．８〜１
とする。
【００６９】
上記のレボイソバレリルスピラマイシンＩＩ結晶体化合物の再結晶方法の第三の好まし
い技術方案として、加えた純水の撹拌速度は３０〜６０回転／分、好ましくは４５〜６０
回転／分とし、純水を加えた後の撹拌速度は１０〜３０回転／分、好ましくは１０〜２０
回転／分とする。
【００７０】
上記のレボイソバレリルスピラマイシンＩＩ結晶体化合物の再結晶方法の第四の好まし
い技術方案として、純水を加えた後の温度を下げる速度は１〜３℃／時、好ましくは１〜
１．５℃／時とする。
【００７１】
レボイソバレリルスピラマイシンＩＩＩがレボイソバレリルスピラマイシンＩＩＩ結晶体化
合物である場合、該結晶体は次の再結晶方法を用いて得る：まず得られたレボイソバレリ
ルスピラマイシンＩＩＩの白色の粉末状固形物を無水メタノール、無水エタノール及び無
水アセトンの混合溶剤に溶解させ、そして純水を加えながら撹拌し、純水を加えた後、温
度を５℃〜１５℃まで下げると当時に撹拌を続け、レボイソバレリルスピラマイシンＩＩ
Ｉ結晶体を得、使用する混合溶剤における無水メタノール、無水エタノール及び無水アセ
トンの体積比は１：０．１〜１０：０．５〜１、好ましくは１：２〜８：０．８〜１とす
る。
【００７２】
そのうち，上記のレボイソバレリルスピラマイシンＩＩＩ結晶体化合物の再結晶方法の
第一の好ましい技術方案として、加える純水の体積は無水メタノール、無水エタノール及
び無水アセトンの体積の和の２〜９倍、好ましくは２．５〜７．５倍とし、純水を加える
速度は４〜１０ｍｌ／分、好ましくは６〜８ｍｌ／分とする。
【００７３】
上記のレボイソバレリルスピラマイシンＩＩＩ結晶体化合物の再結晶方法の第二の好ま
しい技術方案として、使用する混合溶剤における無水メタノール、無水エタノール及び無
水アセトンの体積比は１：０．１〜１０：０．５〜１、好ましくは１：２〜８：０．８〜
１とする。
【００７４】
上記のレボイソバレリルスピラマイシンＩＩＩ結晶体化合物の再結晶方法の第三の好ま
しい技術方案として、加えた純水の撹拌速度は３０〜６０回転／分、好ましくは４５〜６
０回転／分とし、純水を加えた後の撹拌速度は１０〜３０回転／分、好ましくは１０〜２
０回転／分とする。
【００７５】
上記のレボイソバレリルスピラマイシンＩＩＩ結晶体化合物の再結晶方法の第四の好ま
しい技術方案として、純水を加えた後の温度を下げる速度は１〜３℃／時、好ましくは１
〜１．５℃／時とする。
【００７６】
本発明では、また上記のレボロキタマイシン又はレボロキタマイシン薬物組成物の感染
症治療薬物の調製での応用を提供する。
【００７７】
本発明における感染症はグラム陽性菌、黄色ブドウ球菌、肺炎連鎖球菌、肺炎マイコプ
ラズマ、肺炎クラミジア、マイコプラズマウレアリチクム、クラミジアトラコマチス、化
膿連鎖球菌、カタル球菌、淋菌、インフルエンザ桿菌、レジオネラ菌又は嫌気性菌による
感染に起因する疾病である。
【００７８】
本発明では、さらに上記のレボロキタマイシン又はレボロキタマイシン薬物組成物の抗
菌薬物の調製での応用を提供する。上記の菌は、肺炎連鎖球菌、Ａ群連鎖球菌、化膿連鎖
球菌、腸球菌、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、カタル球菌、淋菌、インフルエンザ桿
菌、大腸菌、毒素産生性大腸菌、病原性大腸菌、侵襲性大腸菌、緑膿菌、肺炎桿菌、プロ
テウスブルガリス、チフス菌、アシネトバクター属、シトロバクター属、セラチア菌、ソ
ンネ赤痢菌、フレクスナー赤痢菌、カンジダアルビカンス、並びにレジオネラニューモフ
ィラ、ゴールドマンレジオネラ菌、レジオネラボウズマニイ、レジオネラダモフィイ、レ
ジオネラジョルダニス、レジオネラミクダーディなどのレジオネラ菌、及びバクテロイデ
スフラジリス、多形性菌、バクテロイデスブルガタス、バクテロイデスディスタソニス、
バクテロイデスルミニコラ、ブルセラアサッカロリティカ、口腔ブルセラ、核酸桿菌、フ
ソバクテリウムルッシイ、ビフィズス菌、乳酸桿菌、ペプトストレプトコッカス属、プロ
ピオニバクテリウムアクネス、ウェルシュ菌、酵母様真菌などの嫌気性菌がある。
【００７９】
本分野の当業者は通常、治療に要する活性成分の量が疾病の性質や患者の年齢、病状な
ど様々な要素によって変化し、最終的に主治医によって判断することを認識している。本
発明におけるレボロキタマイシン薬物組成物が単位剤形で投与される場合、上記のレボロ
キタマイシンの用量は１剤形１０〜１５００ｍｇ、好ましくは１００〜１０００ｍｇ、よ
り好ましくは２００〜５００ｍｇとする。毎日必要な用量を単回投与量又は分割用量の形
で投与する。
【００８０】
体内外効果の試験によると、本発明で提供したレボロキタマイシン又はレボロキタマイ
シン薬物組成物の活性成分は光学活性を持ち、比較的に良い抗感染効果があり、グラム陽
性菌とりわけエリスロマイシン耐性、β−ラクタマーゼ耐性の黄色ブドウ球菌、肺炎連鎖
球菌、化膿連鎖球菌に対して比較的に良い抗菌活性を持ち、カタル球菌、淋菌、インフル
エンザ桿菌など一部の陰性菌並びに一部のレジオネラ菌及び嫌気性菌に対しても効き目が
あり、特に肺炎マイコプラズマ、肺炎クラミジアに対し著しい活性を持つ。
【発明の効果】
【００８１】
従来の技術と比べ、本発明は次の利点を持つ。
【００８２】
１）本発明におけるレボロキタマイシンは旋光性を持つ。現代の薬理学の研究によれば、薬物エナンチオマーは立体選択性が異なるため、各受容体との親和性が異なり、薬理作用に大きな違いが生じる。本発明では、動物体内外の効果により本発明におけるレボロキタマイシンは優れた抗感染効果を持つとともにかなり強い薬理活性を持つことを証明し、これにより感染症の治療のために新しい薬物を提供し、レボロキタマイシンのキラル薬物製剤
の研究開発のための基盤も築き上げられた。動物体内効果により、レボイソバレリルスピラマイシンＩ、ＩＩ又はＩＩＩはレボイソバレリルスピラマイシンＩ、ＩＩ又はＩＩＩ結晶体化合物のレボロキタマイシンであり、マウスの１２株細菌感染症に対する効果はより優れた保護作用を示していることが明らかになった。
【００８３】
２）本発明で提供したレボロキタマイシンの調製方法は、培養・発酵条件の調整と改善
、とりわけｐＨ調節剤による発酵中のｐＨ値に対する厳格なコントロールにより、発酵中
に時間が経つに伴うｐＨ値の変化は３つの連続的な段階を呈し、各段階はそれぞれ所定の
方程式を満足するようにし、これにより光学活性を有するレボロキタマイシンを得られた
。
【００８４】
３）本発明で提供したレボロキタマイシンの調製方法は、製造工程が簡単で、大規模な
産業化生産に適する。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】本発明の実施例１の発酵過程においてｐＨ値が時間が経つに伴って変化する    曲線図である。
【図２】本発明の実施例２の発酵過程においてｐＨ値が時間が経つに伴って変化する    曲線図である。
【図３】本発明の実施例３の発酵過程においてｐＨ値が時間が経つに伴って変化する    曲線図である。
【図４】レボロキタマイシン標準品成分液体クロマトグラフであり、そのうち、  １−−    スピラマイシンＩＩＩ  ２−−モノアセチルスピラマイシンＩＩ    ３−−モノアセ    チルスピラマイシンＩＩＩ  ４−−プロピオニルスピラマイシンＩＩ    ５−−プロ    ピオニルスピラマイシンＩＩＩ  ６−−（イソ）ブチリルスピラマイシンＩＩ  ７−    −レボイソバレリルスピラマイシンＩ  ８−−（イソ）ブチリルスピラマイシンＩＩＩ      ９−−レボイソバレリルスピラマイシンＩＩ  １０−−レボイソバレリルスピラマイシンＩＩ    Ｉ
【図５】本発明の実施例４において提供したレボロキタマイシンの液体クロマトグラ    フである。
【図６】本発明におけるレボイソバレリルスピラマイシンＩ結晶体化合物のＸ放射線    粉末回折スペクトルである。
【図７】本発明におけるレボイソバレリルスピラマイシンＩＩ結晶体化合物のＸ放射    線粉末回折スペクトルである。
【図８】本発明におけるレボイソバレリルスピラマイシンＩＩＩ結晶体化合物のＸ放    射線粉末回折スペクトルである。
【発明を実施するための形態】
【００８６】
以下は本発明の具体的な実施方法である。記載された実施例はさらに本発明を説明するた
めのものであり、本発明を制限するものではない。  
【実施例１】
【００８７】
レボロキタマイシンの調製
１）培養発酵
４”−イソバレリルトランスフェラーゼ遺伝子を含有するスピラマイシンが生じる細菌
クローニング菌株ＷＳＪ−１９５を、斜面培養基において培養後、種培養基に接種し、培
養後、さらに発酵培養基に接種し、ブドウ糖とアンモニア水によって発酵過程をコントロ
ールし、ｐＨ値６．０〜９．０の条件下で１２０ｈ発酵を行い、またｐＨ値が時間が経つ
に伴って変化する曲線は３つ連続的な段階を呈し、第一段階は方程式ｙ１＝０．１３６４
ｘ１＋６．０を満たし、そのうち０＜ｘ１≦２２とし、第二段階は方程式ｙ２＝−０．０
７３５ｘ２＋１０．６４を満たし、そのうち２２≦ｘ２≦５６とし、第三段階は方程式ｙ
３＝０．００７８ｘ３＋６．０６を満たし、そのうち５６≦ｘ３≦１２０とし、曲線の変
化は図１の示すとおりであり、発酵液を得る。
【００８８】
２）抽出
発酵液を硫酸アルミニウムを用いて処理し、ろ液を得、ｐＨを９．０まで調節し、酢酸
ブチルを用いて抽出を行い、酢酸ブチル抽出液を無塩水及び１％ＮａＨ２ＰＯ４で洗浄し
、さらにｐＨ２．５の水で抽出を行い、水相抽出液を得、ｐＨを４．５まで調節し、揮発
によって残りの酢酸ブチルを除去し、水抽出液を得、ろ過を行い、ろ液のｐＨを８．５ま
で調節し、沈澱物を得、精製水を用いて沈澱物をすすぎ、湿品を得、乾燥させ、レボロキ
タマイシンを得る。
【実施例２】
【００８９】
レボロキタマイシンの調製
１）培養・発酵
４”−イソバレリルトランスフェラーゼ遺伝子を含有するスピラマイシンが生じる細菌
クローニング菌株ＷＳＪ−１９５を、斜面培養基において培養後、種培養基に接種し、培
養後、さらに発酵培養基に接種し、ブドウ糖と水酸化ナトリウムによって発酵過程をコン
トロールし、ｐＨ値６．０〜８．０の条件下で１１０ｈ発酵を行い、またｐＨ値が時間が
経つに伴って変化する曲線は３つの連続的な段階を呈し、第一段階は方程式ｙ１＝０．０
９０９ｘ１＋６．４を満たし、そのうち０＜ｘ１＜２２とし、第二段階は方程式ｙ２＝−
０．０４４１ｘ２＋７．８を満たし、そのうち２２＜ｘ２＜５６とし、第三段階は方程式
ｙ３＝０．００７８ｘ３＋６．０６を満たし、そのうち５６≦ｘ３≦１１０とし、曲線の
変化は図２の示すとおりであり、発酵液を得る。
【００９０】
２）抽出
発酵液を硫酸アルミニウムを用いて処理し、ろ液を得、ｐＨを８．９まで調節し、酢酸
ブチルを用いて抽出を行い、酢酸ブチル抽出液を無塩水及び１％ＮａＨ２ＰＯ４で洗浄し
、さらにｐＨ２．２の水で抽出を行い、水相抽出液を得、ｐＨを４．２まで調節し、揮発
によって残りの酢酸ブチルを除去し、水抽出液を得、ろ過を行い、ろ液のｐＨを８．６ま
で調節し、沈澱物を得、精製水を用いて沈澱物をすすぎ、湿品を得、乾燥させ、レボロキ
タマイシンを得る。
【実施例３】
【００９１】
レボロキタマイシンの調製
１）培養・発酵
４”−イソバレリルトランスフェラーゼ遺伝子を含有するスピラマイシンが生じる細菌
クローニング菌株ＷＳＪ−１９５を、斜面培養基において培養後、種培養基に接種し、培
養後、さらに発酵培養基に接種し、ブドウ糖とクエン酸によって発酵過程をコントロール
し、ｐＨ値６．０〜７．５の条件下で１１５ｈ発酵を行い、またｐＨ値が時間が経つに伴
って変化する曲線は３つの連続的な段階を呈し、第一段階は方程式ｙ１＝０．０６８２ｘ
１＋６．０を満たし、そのうち０＜ｘ１＜２２とし、第二段階は方程式ｙ２＝−０．０２
９４ｘ２＋８．１４７を満たし、そのうち２２＜ｘ２＜５６とし、第三段階は方程式ｙ３
＝０．００７８ｘ３＋６．０６を満たし、そのうち５６＜ｘ３＜１１５とし、曲線の変化
は図３の示すとおりであり、発酵液を得る。
【００９２】
２）抽出
発酵液を硫酸アルミニウムを用いて処理し、ろ液を得、ｐＨを８．６まで調節し、酢酸
ブチルを用いて抽出を行い、酢酸ブチル抽出液を無塩水及び１％ＮａＨ２ＰＯ４で洗浄し
、さらにｐＨ２．３の水で抽出を行い、水相抽出液を得、ｐＨを５．２まで調節し、揮発
によって残りの酢酸ブチルを除去し、水抽出液を得、ろ過を行い、ろ液のｐＨを８．７ま
で調節し、沈澱物を得、精製水を用いて沈澱物をすすぎ、湿品を得、乾燥させ、レボロキ
タマイシンを得る。
【実施例４】
【００９３】
レボロキタマイシンの調製
１）培養・発酵
４”-イソバレリルトランスフェラーゼ遺伝子を含有するスピラマイシンが生じる細菌
クローニング菌株ＷＳＪ−１９５を、大豆粕粉２％、ブドウ糖１％、でんぷん３％、Ｃａ
ＣＯ３  ０．５％、ＮａＣｌ  ０．４％及び寒天２％を含有する斜面培養基において、温
度２８℃の条件下で１５日培養し、大豆粕粉１．５％、でんぷん  ３．０％、ＮａＣｌ  
０．４％、ＣａＣＯ３  ０．５％、ペプトン０．３％及びＫＨ２ＰＯ４  ０．０５％を含
有する種培養基に接種し、温度２５℃の条件下で８０時間培養し、０．１％の接種量でブ
ドウ糖  ０．５％、でんぷん  ６．０％、酵母粉０．５％、魚粉２．０％、ＮＨ４ＮＯ３
０．６％、ＮａＣｌ  １．０％、ＣａＣＯ３  ０．５％、ＫＨ２ＰＯ４  ０．０５％、
ＭｇＳＯ４  ０．１％、豆油０．５％及び消泡剤０．０２％を含有する発酵培養基に植え
込み、ブドウ糖とアンモニア水によって発酵過程をコントロールし、ｐＨ値６．０〜９．
０の条件下で１２０ｈ発酵を行い、またｐＨ値が時間が経つに伴って変化する曲線は３つ
の連続的な段階を呈し、第一段階は方程式ｙ１＝０．１３６４ｘ１＋６．０を満たし、そ
のうち０＜ｘ１≦２２とし、第二段階は方程式ｙ２＝−０．０７３５ｘ２＋１０．６４を
満たし、そのうち２２≦ｘ２≦５６とし、第三段階は方程式ｙ３＝０．００７８ｘ３＋６
．０６を満たし、そのうち５６≦ｘ３≦１２０とし、発酵液を得る。
【００９４】
２）抽出
発酵液を硫酸アルミニウムを用いて処理し、ろ液を得、ｐＨを８．５まで調節し、酢酸
ブチルを用いて抽出を行い、酢酸ブチル抽出液を無塩水及び１％ＮａＨ２ＰＯ４で洗浄し
、さらにｐＨ２．０の水で抽出を行い、水相抽出液を得、ｐＨを４．５まで調節し、揮発
によって残りの酢酸ブチルを除去し、水抽出液を得、ろ過を行い、ろ液のｐＨを８．５ま
で調節し、沈澱物を得、精製水を用いて沈澱物をすすぎ、湿品を得、乾燥させ、レボロキ
タマイシンを得る。
【実施例５】
【００９５】
レボロキタマイシンの調製
１）培養・発酵
４”-イソバレリルトランスフェラーゼ遺伝子を含有するスピラマイシンが生じる細菌
クローニング菌株ＷＳＪ−１９５を、大豆粕粉２％、ブドウ糖１％、でんぷん３％、Ｃａ
ＣＯ３０．５％、ＮａＣｌ  ０．４％及び寒天２％を含有する斜面培養基において、温度
３８℃の条件下で８日培養し、大豆粕粉１．５％、でんぷん  ３．０％、ＮａＣｌ  ０．
４％、ＣａＣＯ３  ０．５％、ペプトン０．３％及びＫＨ２ＰＯ４  ０．０５％を含有す
る種培養基に接種し、温度３０℃の条件下で４０時間培養し、２０％の接種量でブドウ糖
０．５％、でんぷん  ６．０％、酵母粉０．５％、魚粉２．０％、ＮＨ４ＮＯ３  ０．
６％、ＮａＣｌ  １．０％、ＣａＣＯ３  ０．５％、ＫＨ２ＰＯ４  ０．０５％、ＭｇＳ
Ｏ４  ０．１％、豆油０．５％及び消泡剤０．０２％を含有する発酵培養基に植え込み、
ブドウ糖とアンモニア水によって発酵過程をコントロールし、ｐＨ値６．０〜７．５、温
度３０℃の条件下で１１５ｈ発酵を行い、またｐＨ値が時間が経つに伴って変化する曲線
は３つの連続的な段階を呈し、第一段階は方程式ｙ１＝０．０６８２ｘ１＋６．０を満た
し、そのうち０＜ｘ１＜２２とし、第二段階は方程式ｙ２＝−０．０２９４ｘ２＋８．１
４７を満たし、そのうち２２＜ｘ２＜５６とし、第三段階は方程式ｙ３＝０．００７８ｘ
３＋６．０６を満たし、そのうち５６＜ｘ３＜１１５とし、曲線の変化は図３の示すとお
りであり、発酵液を得る。
【００９６】
２）抽出
発酵液を硫酸アルミニウムを用いて処理し、ろ液を得、ｐＨを９．０まで調節し、酢酸
ブチルを用いて抽出を行い、酢酸ブチル抽出液を無塩水及び１％ＮａＨ２ＰＯ４で洗浄し
、さらにｐＨ２．５の水で抽出を行い、水相抽出液を得、ｐＨを４．５−５．５まで調節
し、揮発によって残りの酢酸ブチルを除去し、水抽出液を得、ろ過を行い、ろ液のｐＨを
９．０まで調節し、沈澱物を得、精製水を用いて沈澱物をすすぎ、湿品を得、乾燥させ、
レボロキタマイシンを得る。
【実施例６】
【００９７】
レボロキタマイシンの調製
１）培養・発酵
４”-イソバレリルトランスフェラーゼ遺伝子を含有するスピラマイシンが生じる細菌
クローニング菌株ＷＳＪ−１９５を、大豆粕粉２％、ブドウ糖１％、でんぷん３％、Ｃａ
ＣＯ３０．５％、ＮａＣｌ  ０．４％及び寒天２％を含有する斜面培養基において、温度
３０℃の条件下で１２日培養し、大豆粕粉１．５％、でんぷん  ３．０％、ＮａＣｌ  ０
．４％、ＣａＣＯ３  ０．５％、ペプトン０．３％及びＫＨ２ＰＯ４  ０．０５％を含有
する種培養基に接種し、温度２８℃の条件下で６０時間培養し、１０％の接種量でブドウ
糖  ０．５％、でんぷん  ６．０％、酵母粉０．５％、魚粉２．０％、ＮＨ４ＮＯ３  ０
．６％、ＮａＣｌ  １．０％、ＣａＣＯ３  ０．５％、ＫＨ２ＰＯ４  ０．０５％、Ｍｇ
ＳＯ４  ０．１％、豆油０．５％及び消泡剤０．０２％を含有する発酵培養基に植え込み
、ブドウ糖とアンモニア水により発酵過程をコントロールし、ｐＨ値６．０〜７．５、温
度２８℃の条件下で９０ｈ発酵を行い、またｐＨ値が時間が経つに伴って変化する曲線は
３つの連続的な段階を呈し、第一段階は方程式ｙ１＝０．０６８２ｘ１＋６．０を満たし
、そのうち０＜ｘ１＜２２とし、第二段階は方程式ｙ２＝−０．０２９４ｘ２＋８．１４
７を満たし、そのうち２２＜ｘ２＜５６とし、第三段階は方程式ｙ３＝０．００７８ｘ３
＋６．０６を満たし、そのうち５６＜ｘ３＜９０とし、曲線の変化は図３の示すとおりで
あり、発酵液を得る。
【００９８】
２）抽出
発酵液を硫酸アルミニウムを用いて処理し、ろ液を得、ｐＨを８．７まで調節し、酢酸
ブチルを用いて抽出を行い、酢酸ブチル抽出液を無塩水及び１％ＮａＨ２ＰＯ４で洗浄し
、さらにｐＨ２．２の水で抽出を行い、水相抽出液を得、ｐＨを５．０まで調節し、揮発
によって残りの酢酸ブチルを除去し、水抽出液を得、ろ過を行い、ろ液のｐＨを８．７ま
で調節し、沈澱物を得、精製水を用いて沈澱物をすすぎ、湿品を得、乾燥させ、レボロキ
タマイシンを得る。
【実施例７】
【００９９】
レボロキタマイシンの調製
１）培養・発酵
４”-イソバレリルトランスフェラーゼ遺伝子を含有するスピラマイシンが生じる細菌
クローニング菌株ＷＳＪ−１９５を、大豆粕粉２％、ブドウ糖１％、でんぷん３％、Ｃａ
ＣＯ３０．５％、ＮａＣｌ  ０．４％及び寒天２％を含有する斜面培養基において、温度
３５℃の条件下で１０日培養し、大豆粕粉１．５％、でんぷん  ３．０％、ＮａＣｌ  ０
．４％、ＣａＣＯ３  ０．５％、ペプトン０．３％及びＫＨ２ＰＯ４  ０．０５％を含有
する種培養基に接種し、温度２６℃の条件下で５５時間培養し、１５％の接種量でブドウ
糖  ０．５％、でんぷん  ６．０％、酵母粉０．５％、魚粉２．０％、ＮＨ４ＮＯ３  ０
．６％、ＮａＣｌ  １．０％、ＣａＣＯ３  ０．５％、ＫＨ２ＰＯ４  ０．０５％、Ｍｇ
ＳＯ４  ０．１％、豆油０．５％及び消泡剤０．０２％を含有する発酵培養基に植え込み
、ブドウ糖とアンモニア水によって発酵過程をコントロールし、ｐＨ値６．０〜７．５、
温度２７℃の条件下で１１５ｈ発酵を行い、またｐＨ値が時間が経つに伴って変化する曲
線は３つの連続的な段階を呈し、第一段階は方程式ｙ１＝０．０６８２ｘ１＋６．０を満
たし、そのうち０＜ｘ１＜２２とし、第二段階は方程式ｙ２＝−０．０２９４ｘ２＋８．
１４７を満たし、そのうち２２＜ｘ２＜５６とし、第三段階は方程式ｙ３＝０．００７８
ｘ３＋６．０６を満たし、そのうち５６＜ｘ３＜１１０とし、曲線の変化は図３の示すと
おりであり、発酵液を得る。
【０１００】
２）抽出
発酵液を硫酸アルミニウムを用いて処理し、ろ液を得、ｐＨを８．６まで調節し、酢酸
ブチルで抽出を行い、酢酸ブチル抽出液を無塩水及び１％ＮａＨ２ＰＯ４で洗浄し、さら
にｐＨ２．３の水で抽出を行い、水相抽出液を得、ｐＨを４．８まで調節し、揮発によっ
て残りの酢酸ブチルを除去し、水抽出液を得、ろ過を行い、ろ液のｐＨを８．８まで調節
し、沈澱物を得、精製水を用いて沈澱物をすすぎ、湿品を得、乾燥させ、レボロキタマイ
シンを得る。
【実施例８】
【０１０１】
レボロキタマイシンの調製
１）培養・発酵
４”-イソバレリルトランスフェラーゼ遺伝子を含有するスピラマイシンが生じる細菌
クローニング菌株ＷＳＪ−１９５を、大豆粕粉２％、ブドウ糖１％、でんぷん３％、Ｃａ
ＣＯ３０．５％、ＮａＣｌ  ０．４％及び寒天２％を含有する斜面培養基において、温度
３６℃の条件下で１３日培養し、大豆粕粉１．５％、でんぷん  ３．０％、ＮａＣｌ  ０
．４％、ＣａＣＯ３  ０．５％、ペプトン０．３％及びＫＨ２ＰＯ４  ０．０５％を含有
する種培養基に接種し、温度２７℃の条件下で７５時間培養し、０．５％の接種量でブド
ウ糖  ０．５％、でんぷん  ６．０％、酵母粉０．５％、魚粉２．０％、ＮＨ４ＮＯ３ 
０．６％、ＮａＣｌ  １．０％、ＣａＣＯ３  ０．５％、ＫＨ２ＰＯ４  ０．０５％、Ｍ
ｇＳＯ４  ０．１％、豆油０．５％及び消泡剤０．０２％を含有する発酵培養基に植え込
み、ブドウ糖とアンモニア水によって発酵過程をコントロールし、ｐＨ値６．０〜８．０
、温度２９℃の条件下で９８ｈ発酵を行い、またｐＨ値が時間が経つに伴って変化する曲
線は３つの連続的な段階を呈し、第一段階は方程式ｙ１＝０．０９０９ｘ１＋６．４を満
たし、そのうち０＜ｘ１＜２２とし、第二段階は方程式ｙ２＝−０．０４４１ｘ２＋７．
８を満たし、そのうち２２＜ｘ２＜５６とし、第三段階は方程式ｙ３＝０．００７８ｘ３
＋６．０６を満たし、そのうち５６≦ｘ３≦１１０とし、曲線の変化は図２の示すとおり
であり、発酵液を得る。
【０１０２】
２）抽出
発酵液を硫酸アルミニウムを用いて処理し、ろ液を得、ｐＨを８．９まで調節し、酢酸
ブチルで抽出を行い、酢酸ブチル抽出液を無塩水及び１％ＮａＨ２ＰＯ４で洗浄し、さら
にｐＨ２．４の水で抽出を行い、水相抽出液を得、ｐＨを４．６まで調節し、揮発によっ
て残りの酢酸ブチルを除去し、水抽出液を得、ろ過を行い、ろ液のｐＨを８．６まで調節
し、沈澱物を得、精製水を用いて沈澱物をすすぎ、湿品を得、乾燥させ、レボロキタマイ
シンを得る。
【実施例９】
【０１０３】
レボロキタマイシンのＨＰＬＣ定量測定法
高速液体クロマトグラフィー（中国薬典２００５年版二部付録Ｖ  Ｄ）に準拠して測定
する。
【０１０４】
Ｖｅｎｕｓｉｌ  ＸＢＰ  Ｃ１８（Ｌ）１５０Å（２００ｍｍ×４．６ｍｍ、５ｕｍ）
カラム（ＡＧＥＬＡ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ）を用いる。流動相Ａはアセトニトリル
、流動相Ｂは０．０１  ｍｏｌ・Ｌ−１の酢酸アンモニウム溶液（アンモニア水を用いて
ｐＨ値を７．０まで調節）とし、下表に基づいて勾配溶出を行い、波長２３２ｎｍ、流速
１．０ｍＬ・分−１、カラム温度２５℃、サンプル注入量２０μｌとする。
【０１０５】
【表２】
0005866737.tif 000004
【０１０６】
クロマトグラフ条件及びシステム適合性の試験は、レボロキタマイシン標準品成分液体クロマ
トグラフ（図４）を参照し、クロマトグラフ条件を調節し、必要な場合には、流動相の勾
配溶出条件を変更し、サンプル注入のレボロキタマイシン成分をレボロキタマイシン標準品成
分スペクトル（図４）と一致させることができる。
【０１０７】
標準品溶液：適量の標準品を正確にとり、０．０１ｍｏｌ／Ｌの酢酸アンモニウム溶液
（アンモニア水を用いてｐＨを７．０まで調節）−アセトニトリル（６５：３５）混合液
を用いて０．４ｍｇ／ｍｌ−０．６ｍｇ／ｍｌまで希釈し、標準品溶液として均一に振る
。
【０１０８】
試験品溶液：試験品を正確に５０ｍｇとり、０．０１ｍｏｌ／Ｌの酢酸アンモニウム溶
液（アンモニア水を用いてｐＨを７．０まで調節）−アセトニトリル（６５：３５）混合
液を用いて５０ｍｌまで希釈し、試験品溶液として均一に振る。
【０１０９】
外部標準法に基づき、レボイソバレリルスピラマイシンＩＩＩのピーク面積にて計算する。
レボイソバレリルスピラマイシンＩＩＩは３０％を上回り、レボイソバレリルスピラマイシン（Ｉ
＋ＩＩ＋ＩＩＩ  ）は６０％を上回り、アシル化スピラマイシンの９つの成分の合計含量
は８０％を上回り、スピラマイシンＩＩＩの量は１．０％を下回り、その他の未知成分の
合計含量は５．０％を下回るものとする。計算公式は次のとおり：
レボイソバレリルスピラマイシンＩＩＩ％＝ＡイソバレリルＩＩＩ×ＷＳ×Ｐ／（ＡＳ×Ｗ
Ｔ）×１００％
レボイソバレリルスピラマイシン（Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩ  ）％＝（ＡイソバレリルＩ＋Ａイソ
バレリルＩＩ＋ＡイソバレリルＩＩＩ）×ＷＳ×Ｐ／（ＡＳ×ＷＴ）×１００％
アシル化スピラマイシンの合計含量％＝（ＡアセチルＩＩ＋ＡアセチルＩＩＩ＋Ａプロ
ピオニルＩＩ＋ＡプロピオニルＩＩＩ＋ＡイソブチリルＩＩ＋ＡイソバレリルＩ＋Ａイソ
ブチリルＩＩＩ＋ＡイソバレリルＩＩ＋ＡイソバレリルＩＩＩ）×ＷＳ×Ｐ／（ＡＳ×Ｗ
Ｔ）×１００％
スピラマイシンＩＩＩ％＝ＡスピラＩＩＩ×ＷＳ×Ｐ／（ＡＳ×ＷＴ）×１００％
未知の成分％＝ＡＷ×ＷＳ×Ｐ／（ＡＳ×ＷＴ）×１００％
式中：ＷＳ−標準品の重量、ｇ
ＡＳ−標準品中のレボイソバレリルスピラマイシンＩＩＩのピーク面積
ＷＴ−試験品の重量、ｇ
ＡＷ−試験品中の未知成分のピーク面積の和
Ｐ−標準品の中のレボイソバレリルスピラマイシンＩＩＩの純度
【実施例１０】
【０１１０】
レボロキタマイシン完成品成分のＨＰＬＣ検出
実施例４で提供したレボロキタマイシンの抽出プロセス及び実施例９で提供したＨＰＬ
Ｃ定量検出法を用いて、レボロキタマイシンについて発酵を８ロット行い、発酵液につい
て抽出を行い、得られる製品の各成分のＨＰＬＣ検出状況は表１の示すとおりであり、液
体クロマトグラフは図５の示すとおりである。
【０１１１】
表１、８ロットレボロキタマイシン完成品成分のＨＰＬＣ検出状況
【０１１２】
【表３】
0005866737.tif 000005
【０１１３】
本発明の他の実施例において調製したレボロキタマイシンについても上記の検出を行い、
得られた液体クロマトグラフは５の示すとおりである。
【実施例１１】
【０１１４】
レボロキタマイシン比旋度の測定
本発明の実施例において調製したレボロキタマイシンをとって正確に秤量し、クロロホ
ルムを加えて溶解させ、１ｍｌごとに約２０ｍｇを含む溶液に希釈し、ナトリウムスペク
トルのＤ線（５８９．３ｎｍ）を用いて旋光度を測定し、測定長さ１ｄｍ、測定温度２５
℃とし、目盛り０．０００１°までかつテスト済みの旋光計を使用する。
【０１１５】
表２、比旋度の調査結果
【０１１６】
【表４】
0005866737.tif 000006
【実施例１２】
【０１１７】
レボロキタマイシン錠剤（１００００枚にて計算）
処方：実施例４のレボロキタマイシン原末１０００ｇ
低置換度ヒドロキシプロピルセルロース（５％）９２．５ｇ
カルボキシメチルデンプンナトリウム（３％）  ５５．５ｇ
ステアリン酸マグネシウム（１％）１８．５ｇ
でんぷん総重量−他の原材料と補助材料の重量
総重量１８５０ｇ
調製方法：でんぷんを適量とり、濃度を１５％まで希釈し、ペースト状まで加熱し、接着剤にする。主要材料レボロキタマイシン、補助材料でんぷん、低置換度ヒドロキシプロピル
セルロース、カルボキシメチルデンプンナトリウム、ステアリン酸マグネシウムをそれぞれ１００メッシュの篩に通し、処方量にて必要な主要材料と補助材料をとり、レボロキタマイシン、でんぷん、低置換度ヒドロキシプロピルセルロースを十分かつ均一に混合後、でんぷん濃度１５％のでんぷん糊を用いて柔らかい素材を作り、１４メッシュの篩を用いて粒を作り、５０−６０℃にて乾燥させ、水分を３−５％にし、１４メッシュの篩を用いて粒を整え、カルボキシメチルデンプンナトリウム、ステアリン酸マグネシウムを加えて混合し、顆粒の含量を測定し、顆粒の含量に基づいて錠の重さを計算し、圧錠を行い（Φ９ｍｍ  凹部の浅いパンチ）、錠の重さの違いを測定し、検査合格後に包装する。
【実施例１３】
【０１１８】
レボロキタマイシンカプセル剤（１００００粒にて計算）
処方：実施例４のレボロキタマイシン原末  １０００ｇ
でんぷん（薬用）１０８０−レボロキタマイシン原末の重量
薬用３号カプセル１０００粒
流動パラフィン  ５０ｍｌ
調製方法：主要材料レボロキタマイシン、補助材料薬用でんぷんを所定の配合量にてそれぞ
れとり、混合器具に入れて１．５−２時間十分混合後；サンプルをとり含量を測定して得
られるデータは理論データとほぼ一致するものとし（カプセル１粒に入れる重量は約０．
１０５ｇ）、検査合格後の薬用３号カプセル及び混合後の原料を、全自動カプセル機の操
作基準に従ってそれぞれローダーに入れ、充填を行い、充填後のカプセルについて差異検
査を行い（±１０％以内、＜０．３ｇ）、溶出度は要求を満たすものとし、検査合格後の
カプセルを研磨機に入れ、流動パラフィンを加え、研磨を１５−２０分間行った後、取り
出して完成品包装箱の検査を行う。
【実施例１４】
【０１１９】
レボロキタマイシン糖衣錠（１００００枚にて計算）
処方：実施例１２と同じ。
【０１２０】
調製方法：実施例１２の方法に従って作業を進め、検査合格後の錠芯を糖衣鍋に入れ、
配合済みのシロップ（濃度６５−７０％）をゆっくりと糖衣鍋に入れ、そして温度を４０
℃前後に上げ、タルクパウダーを適量加え、２５−３０分間のブラスト乾燥を何度か行っ
て、パウダーコート層が平らになった後、糖衣層のコーティングを１５−２０分間行い、
糖衣層が平らになった後、所要色調のコーティング層のコーティングを行い、着色剤を調
製完了後、シロップに入れて均一に撹拌し、そして鍋の中に入れ、１回に約１５−２０分
間で均一に撹拌する。
【実施例１５】
【０１２１】
レボロキタマイシンドライシロップ（１００００袋にて計算）
処方：実施例４のレボロキタマイシン原末１２５０ｇ
クエン酸（０．５％）１５ｇ
ショ糖総重量−他の原材料と補助材料
総重量約５００ｇ
色素（クルクミン）  約１ｇ
調製方法：レボロキタマイシン原末、クエン酸、ショ糖を、それぞれ高速ジェットミルを用
いて、顆粒８５％は３００メッシュを、１５％は１８０メッシュを通る程度まで粉砕し、
そして粉砕後のパウダーを、処方量にてとった後、１〜１．５時間十分混合させ、含量を
測定し、充填量を計算し（理論充填量は１袋５００ｍｇ）、そして混合物を袋詰め機に入
れ、アルミ箔を据え付け、充填機の操作基準に従って充填を行い、充填量の差は±５％以
内とし、充填完了後、検査し合格になったら外包装を行う。
【実施例１６】
【０１２２】
レボロキタマイシン腸溶錠（１００００枚にて計算）
処方：実施例１２参照。
調製方法：錠芯の調製は実施例１２に従って行い、合格の錠芯を糖衣鍋に入れ、濃度６０
〜７０％のシロップとタルクパウダーを用いてサブコート層のコーティングを３層行い、
そして隔離層のコーティングを行い、１０％のゼインアルコール溶液を加え、回転法にて
１０〜１５分間乾燥させ、さらにフタル酸ジエチル、アセトン、酢酸フタル酸セルロース
、アルコール溶液すなわち腸溶液を鍋の中に加え、回転法にて１０〜１５分間、２〜３回
乾燥させる。検査合格後、実施例７に従って糖衣コーティングを行う。
【実施例１７】
【０１２３】
レボロキタマイシン胃溶錠（１００００枚にて計算）
処方：実施例１２参照。
【０１２４】
調製方法：錠芯の調製は実施例１２に従って行い、合格の錠芯をコーティング機に入れ
、そして標準を満たすコーティング粉（脂溶性と水溶性を含む）を、要求に従ってコーテ
ィング液に配合し、さらにコーティング液をコロイドミルに入れ、粉砕・ろ過する。錠芯
を入れたコーティング鍋を予熱し、回転速度を５〜１０回転／分にし、温度を４５〜６０
℃にし、エアゾールノズル（＞３００メッシュ）を用いてコーティング穴液を鍋の中に噴
き入れ、２５〜３５分間乾燥させ、均一なコーティングになるまで繰り返し８−１２回行
い、そして乾燥させ、検査合格後に包装する。
【実施例１８】
【０１２５】
レボロキタマイシン顆粒剤（１００００袋にて計算）
処方：実施例５のレボロキタマイシン原末１２５０ｇ
糖粉  ２００００ｇ
糊精  ９０００ｇ
５％ＰＶＰ−Ｋ３０適量
調製方法：レボロキタマイシン原末、糖粉、糊精を１２０メッシュの篩に通し、処方量にて
レボロキタマイシン、糖粉、糊精をとり、均一に混合し、混合後のものを、５％ＰＶＰ−Ｋ３
０ゴム液を用いて柔らかい素材を作り、揺り動かす方法によって顆粒剤を作り、７０℃に
て乾燥させ、粒を整え、検査合格後に包装する。
【実施例１９】
【０１２６】
レボロキタマイシン注射用凍結乾燥パウダー
実施例６のレボロキタマイシン原末を５００ｍｇとり、等しいモル数のアジピン酸と均
一に混合させ、５ｍｌの水に溶解させ、ｐＨ４．６−５．６の淡黄色の透明な液体を得、
さらに凍結乾燥プロッパントとしてマンニトール４０ｍｇを加え、低温にて９ｈ急速冷凍
の後、冷凍乾燥を行い、淡黄色のふっくらとした塊状物を得、前に使用した１０ｍｌの無
菌水を用いて溶解する。
【実施例２０】
【０１２７】
レボロキタマイシン注射用凍結乾燥パウダー
実施例４のレボロキタマイシン原末を５００ｍｇとり、等しいモル数のクエン酸と均一
に混合させ、５ｍｌの水に溶解させ、ｐＨ４．６−５．６の淡黄色の透明な液体を得、さ
らに凍結乾燥プロッパントとしてマンニトール４０ｍｇを加え、低温にて９ｈ急速冷凍の
後、冷凍乾燥を行い、淡黄色のふっくらとした塊状物を得、前に使用した１０ｍｌの無菌
水を用いて溶解する。
【実施例２１】
【０１２８】
レボロキタマイシン注射用凍結乾燥パウダー
実施例５のレボロキタマイシン原末を５００ｍｇとり、等しいモル数のマレイン酸と均
一に混合させ、５ｍｌの水に溶解させ、ｐＨ４．６−５．６の淡黄色の透明な液体を得、
さらに凍結乾燥プロッパントとしてマンニトール４０ｍｇを加え、低温にて９ｈ急速冷凍
の後、冷凍乾燥を行い、淡黄色のふっくらとした塊状物を得、前に使用した１０ｍｌの無
菌水を用いて溶解する。
【実施例２２】
【０１２９】
レボイソバレリルスピラマイシンＩがレボイソバレリルスピラマイシンＩ結晶体化合物である
レボロキタマイシンの調製
実施例１において得られたレボロキタマイシンを分離・純化させる。
【０１３０】
レボイソバレリルスピラマイシンＩの純化：調製型高速液体クロマトグラフィーを用い
て最初の分離によって得られたサンプルについて純化を行い、ＯＤＳ調製カラムを用い、
アセトニトリルと酢酸アンモニウム緩衝液で勾配溶出を行い、ＵＶ検出によって、分離の
ＵＶスペクトルを記録し、レボイソバレリルスピラマイシンＩの成分ターゲットピークを
収集する。
【０１３１】
カラム：ＯＤＳ調製カラム
流動相：アセトニトリル（Ａ）、１００ｍＭ酢酸アンモニア水溶液（Ｂ）
グラデーション条件：０〜６０分間、Ａは２５％〜６５％、６１〜９０分間、Ａは６５
％〜９０％という線形グラデーションを用いる。
【０１３２】
流速：２６０  ｍＬ／分
サンプル注入量：１０ｍＬ
サンプル注入濃度：０．５ｇ／ｍＬ
検出波長：２３１ｎｍ
収集方式：ＵＶトリガ収集
レボイソバレリルスピラマイシンＩの保留時間ＲＴ  ４４．７５９分によってレボイソ
バレリルスピラマイシンＩのサンプルを収集し、回転蒸発によってアセトニトリルを除去
し、そして１倍の量の酢酸エチルで抽出を行い、回転蒸発によって抽出液の中の酢酸エチ
ルを除去し、ペースト状サンプルを得、石油エーテル再溶解によって得られたサンプルを
用い、回転蒸発によって石油エーテルを除去し、レボイソバレリルスピラマイシンＩの白
色の粉末状固形物を得る。
【０１３３】
得られたレボイソバレリルスピラマイシンＩの白色の粉末状固形物をさらに再結晶させ
、結晶体にする。再結晶の方法は次のとおり：
（１）実施例１において得られたレボイソバレリルスピラマイシンＩ化合物の固形物を
酢酸エチル、無水エタノール及び無水アセトンの混合溶剤に溶解させ、使用する混合溶剤
における酢酸エチル、無水エタノール及び無水アセトンの体積比は１：  １０：  １とす
る。
【０１３４】
（２）純水を加えながら撹拌し、加える純水の体積は酢酸エチル、無水エタノール及び
無水アセトンの体積の和の２．５倍とし、純水を加える速度は４ｍｌ／分とし、純水を加
える際の撹拌速度は３０回転／分とする。
【０１３５】
（３）純水を加えた後、温度を５℃まで下げ、温度を下げる速度は１℃／時とし、温度
を下げると同時に撹拌を続け、撹拌速度は１０回転／分とし、レボイソバレリルスピラマ
イシンＩ結晶体化合物を得る。
【０１３６】
調製によって得られたレボイソバレリルスピラマイシンＩ結晶体化合物を、Ｃｕ−Ｋα
放射線を用いて測定し得られたＸ−放射線粉末回折は、２θが７．６°、８．０°、１０
．０°、１１．４°、１６．４°、１７．０°、１７．５°、１７．９°、１９．５°、
２２．７°、２３．７°及び２４．４°であるときに、特徴的なピークがある。そのＸ−
放射線粉末回折のスペクトルは、図６の示すとおりである。
【０１３７】
以上でレボイソバレリルスピラマイシンＩの成分を分離・純化した後のレボロキタマイ
シンを回転蒸発によってアセトニトリルを除去し、そして１倍の量の酢酸エチルで抽出を
行い、回転蒸発によって抽出液の中の酢酸エチルを除去し、ペースト状サンプルを得、石
油エーテル再溶解によって得られたサンプルを用い、回転蒸発によって石油エーテルを除
去し、レボロキタマイシンを得、さらに得られたレボロキタマイシンを以上で得られたレ
ボレボイソバレリルスピラマイシンＩ結晶体化合物と混合させ、レボイソバレリルスピラマイシン
ＩがレボイソバレリルスピラマイシンＩ結晶体化合物であるレボロキタマイシンを得る。
【実施例２３】
【０１３８】
レボイソバレリルスピラマイシンＩがレボイソバレリルスピラマイシンＩ結晶体化合物である
レボロキタマイシンの調製
再結晶以外のステップは実施例２２と同じである。再結晶の方法は次のとおり：
（１）レボイソバレリルスピラマイシンＩ化合物の固形物を酢酸エチル、無水エタノー
ル及び無水アセトンの混合溶剤に溶解させ、使用する混合溶剤における酢酸エチル、無水
エタノール及び無水アセトンの体積比は１：  １０：１とする。
【０１３９】
（２）純水を加えながら撹拌し、加える純水の体積は酢酸エチル、無水エタノール及び
無水アセトンの体積の和の９倍とし、純水を加える速度は１０ｍｌ／分とし、加えた純水
の撹拌速度は６０回転／分とする。
【０１４０】
（３）純水を加えた後、温度を１５℃まで下げ、温度を下げる速度は３℃／時とし、温
度を下げると同時に撹拌を続け、撹拌速度は１０回転／分とし、レボイソバレリルスピラ
マイシンＩ結晶体化合物を得る。
【０１４１】
該レボイソバレリルスピラマイシンＩ結晶体化合物を、Ｃｕ−Ｋα放射線を用いて測定
し得られるＸ−放射線粉末回折のスペクトルは、図６に似ている。
【実施例２４】
【０１４２】
レボイソバレリルスピラマイシンＩがレボイソバレリルスピラマイシンＩ結晶体化合物である
レボロキタマイシンの調製
再結晶以外のステップは実施例２２と同じである。再結晶の方法は次のとおり：
（１）レボイソバレリルスピラマイシンＩ化合物の固形物を酢酸エチル、無水エタノー
ル及び無水アセトンの混合溶剤に溶解させ、使用する混合溶剤における酢酸エチル、無水
エタノール及び無水アセトンの体積比は１：５：０．８とする。
【０１４３】
（２）純水を加えながら撹拌し、加える純水の体積は酢酸エチル、無水エタノール及び
無水アセトンの体積の和の７．５倍とし、純水を加える速度は６ｍｌ／分とし、加えた純
水の撹拌速度は４０回転／分とする。
【０１４４】
（３）純水を加えた後、温度を１０℃まで下げ、温度を下げる速度は２℃／時とし、温
度を下げると同時に撹拌を続け、撹拌速度は１５回転／分とし、レボイソバレリルスピラ
マイシンＩ結晶体化合物を得る。
【０１４５】
該レボイソバレリルスピラマイシンＩ結晶体化合物を、Ｃｕ−Ｋα放射線を用いて測定
し得られるＸ−放射線粉末回折のスペクトルは、図６に似ている。
【実施例２５】
【０１４６】
レボイソバレリルスピラマイシンＩがレボイソバレリルスピラマイシンＩ結晶体化合物である
レボロキタマイシンの調製
再結晶以外のステップは実施例２２と同じである。再結晶の方法は次のとおり：
（１）レボイソバレリルスピラマイシンＩ化合物の固形物を酢酸エチル、無水エタノー
ル及び無水アセトンの混合溶剤に溶解させ、使用する混合溶剤における酢酸エチル、無水
エタノール及び無水アセトンの体積比は１：２：１とする。
【０１４７】
（２）純水を加えながら撹拌し、加える純水の体積は酢酸エチル、無水エタノール及び
無水アセトンの体積の和の７．５倍とし、純水を加える速度は８ｍｌ／分とし、加えた純
水の撹拌速度は４５回転／分とする。
【０１４８】
（３）純水を加えた後、温度を１２℃まで下げ、温度を下げる速度は２．５℃／時とし
、温度を下げると同時に撹拌を続け、撹拌速度は２０回転／分とし、レボイソバレリルス
ピラマイシンＩ結晶体化合物を得る。
【０１４９】
該レボイソバレリルスピラマイシンＩ結晶体化合物を、Ｃｕ−Ｋα放射線を用いて測定
し得られるＸ−放射線粉末回折のスペクトルは、図６に似ている。
【実施例２６】
【０１５０】
レボイソバレリルスピラマイシンＩがレボイソバレリルスピラマイシンＩ結晶体化合物である
レボロキタマイシンの調製
再結晶以外のステップは実施例２２と同じである。再結晶の方法は次のとおり：
（１）レボイソバレリルスピラマイシンＩ化合物の固形物を酢酸エチル、無水エタノー
ル及び無水アセトンの混合溶剤に溶解させ、使用する混合溶剤における酢酸エチル、無水
エタノール及び無水アセトンの体積比は１：５：０．８とする。
【０１５１】
（２）純水を加えながら撹拌し、加える純水の体積は酢酸エチル、無水エタノール及び
無水アセトンの体積の和の５倍とし、純水を加える速度は７ｍｌ／分とし、加えた純水の
撹拌速度は６０回転／分とする。
【０１５２】
（３）純水を加えた後、温度を１２℃まで下げ、温度を下げる速度は１．２℃／時とし
、温度を下げると同時に撹拌を続け、撹拌速度は１５回転／分とし、レボイソバレリルス
ピラマイシンＩ結晶体化合物を得る。
【０１５３】
該レボイソバレリルスピラマイシンＩ結晶体化合物を、Ｃｕ−Ｋα放射線を用いて測定
し得られるＸ−放射線粉末回折のスペクトルは、図６に似ている。
【実施例２７】
【０１５４】
レボイソバレリルスピラマイシンＩＩがレボイソバレリルスピラマイシンＩＩ結晶体化合物で
あるレボロキタマイシンの調製
実施例２において得られたレボロキタマイシンを純化させる。具体的なステップは、レ
ボレボイソバレリルスピラマイシンＩＩの保留時間ＲＴ  ４３．３４によってレボイソバレリ
ルスピラマイシンＩＩのサンプルを収集する点以外は、実施例２２と同じである。
【０１５５】
得られたレボイソバレリルスピラマイシンＩＩの白色の粉末状固形物をさらに調製し、
結晶体にする。その調製方法は次のとおり：
（１）実施例２において得られたレボイソバレリルスピラマイシンＩＩ化合物の固形物
を無水メタノール、無水エタノール及び無水アセトンの混合溶剤に溶解させ、使用する混
合溶剤における無水メタノール、無水アセトン及び無水エタノールの体積比は１：  １０
：  １とする。
【０１５６】
（２）純水を加えながら撹拌し、加える純水の体積は無水メタノール、無水エタノール
及び無水アセトンの体積の和の２．５倍とし、純水を加える速度は４ｍｌ／分とし、加え
た純水の撹拌速度は３０回転／分とする。
【０１５７】
（３）純水を加えた後、温度を５℃まで下げ、温度を下げる速度は１℃／時とし、温度
を下げると同時に撹拌を続け、撹拌速度は１０回転／分とし、レボイソバレリルスピラマ
イシンＩＩ結晶体化合物を得る。
【０１５８】
調製によって得られたレボイソバレリルスピラマイシンＩＩ結晶体化合物を、Ｃｕ−Ｋ
α放射線を用いて測定し得られたＸ−放射線粉末回折は、２θが１０．０°、１１．６°
、１６．４°、１７．３°、１９．１°、２１．２°、２２．１°、２２．７°、２６．
４°、２６．９°、２７．５°及び３１．５°であるときに、特徴的なピークがある。そ
のＸ−放射線粉末回折のスペクトルは、図７の示すとおりである。
【０１５９】
以上でレボイソバレリルスピラマイシンＩＩの成分を分離・純化した後のレボロキタマイシンを、回転蒸発によってアセトニトリルを除去し、そして１倍の量の酢酸エチルで抽出を行い、回転蒸発によって抽出液の中の酢酸エチルを除去し、ペースト状サンプルを得、石油エーテル再溶解によって得られたサンプルを用い、さらに回転蒸発によって石油エーテルを除去し、レボロキタマイシンを得、さらに得られたレボロキタマイシンを以上で得られたレボイソバレリルスピラマイシンＩＩ結晶体化合物と混合させ、レボイソバレリルスピラマイシンＩＩがレボイソバレリルスピラマイシンＩＩ結晶体化合物であるレボロキタマイシンを得る。
【実施例２８】
【０１６０】
レボイソバレリルスピラマイシンＩＩがレボイソバレリルスピラマイシンＩＩ結晶体化合物で
あるレボロキタマイシンの調製
再結晶以外のステップは実施例２７と同じである。再結晶の方法は次のとおり：
（１）レボイソバレリルスピラマイシンＩＩ化合物の固形物を無水メタノール、無水エ
タノール及び無水アセトンの混合溶剤に溶解させ、使用する混合溶剤における無水メタノ
ール、無水アセトン及び無水エタノールの体積比は１：１０：０．８とする。
【０１６１】
（２）純水を加えながら撹拌し、加える純水の体積は無水メタノール、無水エタノール
及び無水アセトンの体積の和の９倍とし、純水を加える速度は１０ｍｌ／分とし、加えた
純水の撹拌速度は６０回転／分とする。
【０１６２】
（３）純水を加えた後、温度を１５℃まで下げ、温度を下げる速度は３℃／時とし、温
度を下げると同時に撹拌を続け、撹拌速度は１０回転／分とし、レボイソバレリルスピラ
マイシンＩＩ結晶体化合物を得る。
【０１６３】
該レボイソバレリルスピラマイシンＩＩ結晶体化合物を、Ｃｕ−Ｋα放射線を用いて測
定し得られるＸ−放射線粉末回折のスペクトルは、図７に似ている。
【実施例２９】
【０１６４】
レボイソバレリルスピラマイシンＩＩがレボイソバレリルスピラマイシンＩＩ結晶体化合物で
あるレボロキタマイシンの調製
再結晶以外のステップは実施例２７と同じである。再結晶の方法は次のとおり：
（１）レボイソバレリルスピラマイシンＩＩ化合物の固形物を無水メタノール、無水エ
タノール及び無水アセトンの混合溶剤に溶解させ、使用する混合溶剤における無水メタノ
ール、無水アセトン及び無水エタノールの体積比は１：５：１とする。
【０１６５】
（２）純水を加えながら撹拌し、加える純水の体積は無水メタノール、無水エタノール
及び無水アセトンの体積の和の７．５倍とし、純水を加える速度は６ｍｌ／分とし、加え
た純水の撹拌速度は４０回転／分とする。
【０１６６】
（３）純水を加えた後、温度を１０℃まで下げ、温度を下げる速度は２℃／時とし、温
度を下げると同時に撹拌を続け、撹拌速度は１５回転／分とし、レボイソバレリルスピラ
マイシンＩＩ結晶体化合物を得る。
【０１６７】
該レボイソバレリルスピラマイシンＩＩ結晶体化合物を、Ｃｕ−Ｋα放射線を用いて測
定し得られるＸ−放射線粉末回折のスペクトルは、図７に似ている。
【実施例３０】
【０１６８】
レボイソバレリルスピラマイシンＩＩがレボイソバレリルスピラマイシンＩＩ結晶体化合物で
あるレボロキタマイシンの調製
再結晶以外のステップは実施例２７と同じである。再結晶の方法は次のとおり：
（１）レボイソバレリルスピラマイシンＩＩ化合物の固形物を無水メタノール、無水エ
タノール及び無水アセトンの混合溶剤に溶解させ、使用する混合溶剤における無水メタノ
ール、無水アセトン及び無水エタノールの体積比は１：３：１とする。
【０１６９】
（２）純水を加えながら撹拌し、加える純水の体積は無水メタノール、無水エタノール
及び無水アセトンの体積の和の７．５倍とし、純水を加える速度は８ｍｌ／分とし、加え
た純水の撹拌速度は４５回転／分とする。
【０１７０】
（３）純水を加えた後、温度を１２℃まで下げ、温度を下げる速度は２．５℃／時とし
、温度を下げると同時に撹拌を続け、撹拌速度は２０回転／分とし、レボイソバレリルス
ピラマイシンＩＩ結晶体化合物を得る。
【０１７１】
該レボイソバレリルスピラマイシンＩＩ結晶体化合物を、Ｃｕ−Ｋα放射線を用いて測
定し得られるＸ−放射線粉末回折のスペクトルは、図７に似ている。
【実施例３１】
【０１７２】
レボイソバレリルスピラマイシンＩＩがレボイソバレリルスピラマイシンＩＩ結晶体化合物で
あるレボロキタマイシンの調製
再結晶以外のステップは実施例２７と同じである。再結晶の方法は次のとおり：
（１）レボイソバレリルスピラマイシンＩＩ化合物の固形物を無水メタノール、無水エ
タノール及び無水アセトンの混合溶剤に溶解させ、使用する混合溶剤における無水メタノ
ール、無水アセトン及び無水エタノールの体積比は１：６：０．８とする。
【０１７３】
（２）純水を加えながら撹拌し、加える純水の体積は無水メタノール、無水エタノール
及び無水アセトンの体積の和の５倍とし、純水を加える速度は７ｍｌ／分とし、加えた純
水の撹拌速度は６０回転／分とする。
【０１７４】
（３）純水を加えた後、温度を１２℃まで下げ、温度を下げる速度は１．２℃／時とし
、温度を下げると同時に撹拌を続け、撹拌速度は１５回転／分とし、レボイソバレリルス
ピラマイシンＩＩ結晶体化合物を得る。
【０１７５】
該レボイソバレリルスピラマイシンＩＩ結晶体化合物を、Ｃｕ−Ｋα放射線を用いて測
定し得られるＸ−放射線粉末回折のスペクトルは、図７に似ている。
【実施例３２】
【０１７６】
レボイソバレリルスピラマイシンＩＩＩがレボイソバレリルスピラマイシンＩＩＩ結晶体化合
物であるレボロキタマイシンの調製
実施例３において得られたレボロキタマイシンを純化させる。具体的なステップは実施
例２２と同じであり、レボイソバレリルスピラマイシンＩＩＩの保留時間ＲＴ  ４８．０
０９によってレボイソバレリルスピラマイシンＩＩＩのサンプルを収集する。
【０１７７】
得られたレボイソバレリルスピラマイシンＩＩＩの白色の粉末状固形物をさらに調製し
、結晶体にする。その調製方法は次のとおり：
（１）実施例３において得られたレボイソバレリルスピラマイシンＩＩＩ化合物の固形
物を無水メタノール、無水エタノール及び無水アセトンの混合溶剤に溶解させ、使用する
混合溶剤における無水メタノール、無水エタノール及び無水アセトンの体積比は１：  １
０：  １とする。
【０１７８】
（２）純水を加えながら撹拌し、加える純水の体積は無水メタノール、無水エタノール
及び無水アセトンの体積の和の２．５倍とし、純水を加える速度は４ｍｌ／分とし、加え
た純水の撹拌速度は３０回転／分とする。
【０１７９】
（３）純水を加えた後、温度を５℃まで下げ、温度を下げる速度は１℃／時とし、温度
を下げると同時に撹拌を続け、撹拌速度は１０回転／分とし、レボイソバレリルスピラマ
イシンＩＩＩ結晶体化合物を得る。
【０１８０】
調製によって得られたレボイソバレリルスピラマイシンＩＩＩ結晶体化合物を、Ｃｕ−
Ｋα放射線を用いて測定し得られるＸ−放射線粉末回折は８．０°、１０．０°、１１．
２°、１１．７°、１６．４°、１９．１°、１９．６°、２０．０°、２１．４°、２
２．９°、２３．６°及び２９．４°であるときに、特徴的なピークがある、そのＸ−放
射線粉末回折のスペクトルは、図８の示すとおりである。
【０１８１】
以上でレボイソバレリルスピラマイシンＩＩＩの成分を分離・純化した後のレボロキタマイシンを、回転蒸発によってアセトニトリルを除去し、そして１倍の量の酢酸エチルで抽出を行い、回転蒸発によって抽出液の中の酢酸エチルを除去し、ペースト状サンプルを得、石油エーテル再溶解によって得られたサンプルを用い、回転蒸発によって石油エーテルを除去し、レボロキタマイシンを得、さらに得られたレボロキタマイシンを以上で得られたレボイソバレリルスピラマイシンＩＩＩ結晶体化合物と混合させ、レボイソバレリルスピラマイシンＩＩＩがレボイソバレリルスピラマイシンＩＩＩ結晶体化合物であるレボロキタマイシンを得る。
【実施例３３】
【０１８２】
レボイソバレリルスピラマイシンＩＩＩがレボイソバレリルスピラマイシンＩＩＩ結晶体化合
物であるレボロキタマイシンの調製
再結晶以外のステップは実施例３２と同じである。再結晶の方法は次のとおり：
（１）レボイソバレリルスピラマイシンＩＩＩ化合物の固形物を無水メタノール、無水
エタノール及び無水アセトンの混合溶剤に溶解させ、使用する混合溶剤における無水メタ
ノール、無水エタノール及び無水アセトンの体積比は１：  １０：１とする。
【０１８３】
（２）純水を加えながら撹拌し、加える純水の体積は無水メタノール、無水エタノール
及び無水アセトンの体積の和の９倍とし、純水を加える速度は１０ｍｌ／分とし、加えた
純水の撹拌速度は６０回転／分とする。
【０１８４】
（３）純水を加えた後、温度を１５℃まで下げ、温度を下げる速度は３℃／時とし、温
度を下げると同時に撹拌を続け、撹拌速度は１０回転／分とし、レボイソバレリルスピラ
マイシンＩＩＩ結晶体化合物を得る。
【０１８５】
該レボイソバレリルスピラマイシンＩＩＩ結晶体化合物を、Ｃｕ−Ｋα放射線を用いて
測定し得られるＸ−放射線粉末回折のスペクトルは、図８に似ている。
【実施例３４】
【０１８６】
レボイソバレリルスピラマイシンＩＩＩがレボイソバレリルスピラマイシンＩＩＩ結晶体化合
物であるレボロキタマイシンの調製
再結晶以外のステップは実施例３２と同じである。再結晶の方法は次のとおり：
（１）レボイソバレリルスピラマイシンＩＩＩ化合物の固形物を無水メタノール、無水
エタノール及び無水アセトンの混合溶剤に溶解させ、使用する混合溶剤における無水メタ
ノール、無水エタノール及び無水アセトンの体積比は１：５：０．８とする。
【０１８７】
（２）純水を加えながら撹拌し、加える純水の体積は無水メタノール、無水エタノール
及び無水アセトンの体積の和の７．５倍とし、純水を加える速度は６ｍｌ／分とし、加え
た純水の撹拌速度は４０回転／分とする。
【０１８８】
（３）純水を加えた後、温度を１０℃まで下げ、温度を下げる速度は２℃／時とし、温
度を下げると同時に撹拌を続け、撹拌速度は１５回転／分とし、レボイソバレリルスピラ
マイシンＩＩＩ結晶体化合物を得る。
【０１８９】
該レボイソバレリルスピラマイシンＩＩＩ結晶体化合物を、Ｃｕ−Ｋα放射線を用いて
測定し得られるＸ−放射線粉末回折のスペクトルは、図８に似ている。
【実施例３５】
【０１９０】
レボイソバレリルスピラマイシンＩＩＩがレボイソバレリルスピラマイシンＩＩＩ結晶体化合
物であるレボロキタマイシンの調製
再結晶以外のステップは実施例３２と同じである。再結晶の方法は次のとおり：
（１）レボイソバレリルスピラマイシンＩＩＩ化合物の固形物を無水メタノール、無水
エタノール及び無水アセトンの混合溶剤に溶解させ、使用する混合溶剤における無水メタ
ノール、無水エタノール及び無水アセトンの体積比は１：２：１とする。
【０１９１】
（２）純水を加えながら撹拌し、加える純水の体積は無水メタノール、無水エタノール
及び無水アセトンの体積の和の７．５倍とし、純水を加える速度は８ｍｌ／分とし、加え
た純水の撹拌速度は４５回転／分とする。
【０１９２】
（３）純水を加えた後、温度を１２℃まで下げ、温度を下げる速度は２．５℃／時とし
、温度を下げると同時に撹拌を続け、撹拌速度は２０回転／分とし、レボイソバレリルス
ピラマイシンＩＩＩ結晶体化合物を得る。
【０１９３】
該レボイソバレリルスピラマイシンＩＩＩ結晶体化合物を、Ｃｕ−Ｋα放射線を用いて
測定し得られるＸ−放射線粉末回折のスペクトルは、図８に似ている。
【実施例３６】
【０１９４】
レボイソバレリルスピラマイシンＩＩＩがレボイソバレリルスピラマイシンＩＩＩ結晶体化合
物であるレボロキタマイシンの調製
再結晶以外のステップは実施例３２と同じである。再結晶の方法は次のとおり：
（１）レボイソバレリルスピラマイシンＩＩＩ化合物の固形物を無水メタノール、無水
エタノール及び無水アセトンの混合溶剤に溶解させ、使用する混合溶剤における無水メタ
ノール、無水エタノール及び無水アセトンの体積比は１：５：０．８とする。
【０１９５】
（２）純水を加えながら撹拌し、加える純水の体積は無水メタノール、無水エタノール
及び無水アセトンの体積の和の５倍とし、純水を加える速度は７ｍｌ／分とし、加えた純
水の撹拌速度は６０回転／分とする。
【０１９６】
（３）純水を加えた後、温度を１２℃まで下げ、温度を下げる速度は１．２℃／時とし
、温度を下げると同時に撹拌を続け、撹拌速度は１５回転／分とし、レボイソバレリルス
ピラマイシンＩＩＩ結晶体化合物を得る。
【０１９７】
該レボイソバレリルスピラマイシンＩＩＩ結晶体化合物を、Ｃｕ−Ｋα放射線を用いて
測定し得られるＸ−放射線粉末回折のスペクトルは、図８に似ている。
【実施例３７】
【０１９８】
レボイソバレリルスピラマイシンＩ結晶体を含有するレボロキタマイシン錠剤
レボロキタマイシン原末は実施例２２において得られたレボイソバレリルスピラマイシンＩ
がレボイソバレリルスピラマイシンＩ結晶体化合物であるレボロキタマイシン原末である
という点のほか、処方及び調製方法は実施例１２と同じである。
【実施例３８】
【０１９９】
レボイソバレリルスピラマイシンＩＩ結晶体を含有するレボロキタマイシン錠剤
レボロキタマイシン原末は実施例２７において得られたレボイソバレリルスピラマイシンＩ
ＩがレボイソバレリルスピラマイシンＩＩ結晶体化合物であるレボロキタマイシン原末で
あるという点のほか、処方及び調製方法は実施例１２と同じである。
【実施例３９】
【０２００】
レボイソバレリルスピラマイシンＩＩＩ結晶体を含有するレボロキタマイシン錠剤
レボロキタマイシン原末は実施例３２において得られたレボイソバレリルスピラマイシンＩ
ＩＩがレボイソバレリルスピラマイシンＩＩＩ結晶体化合物であるレボロキタマイシン原
末であるという点のほか、処方及び調製方法は実施例１２と同じである。
【実施例４０】
【０２０１】
レボイソバレリルスピラマイシンＩ結晶体を含有するレボロキタマイシンカプセル剤
レボロキタマイシン原末は実施例２３において得られたレボイソバレリルスピラマイシンＩ
がレボイソバレリルスピラマイシンＩ結晶体化合物であるレボロキタマイシン原末である
という点のほか、処方及び調製方法は実施例１３と同じである。
【実施例４１】
【０２０２】
レボイソバレリルスピラマイシンＩＩ結晶体を含有するレボロキタマイシンカプセル剤
レボロキタマイシン原末は実施例２８において得られたレボイソバレリルスピラマイシンＩ
ＩがレボイソバレリルスピラマイシンＩＩ結晶体化合物であるレボロキタマイシン原末で
あるという点のほか、処方及び調製方法は実施例１３と同じである。
【実施例４２】
【０２０３】
レボイソバレリルスピラマイシンＩＩＩが結晶体であるレボロキタマイシンカプセル剤
レボロキタマイシン原末は実施例３３において得られたレボイソバレリルスピラマイシンＩ
ＩＩがレボイソバレリルスピラマイシンＩＩＩ結晶体化合物であるレボロキタマイシン原
末であるという点のほか、処方及び調製方法は実施例１３と同じである。
【０２０４】
レボイソバレリルスピラマイシンＩ、ＩＩ又はＩＩＩがレボイソバレリルスピラマイシンＩ
、ＩＩ又はＩＩＩ結晶体化合物であるレボロキタマイシンの他の製剤に用いられる補助材
料及び調製方法は前述と同じである。
【０２０５】
（試験例１）
動物体内効果
試験方法：感染菌液の調製：−８０℃の冷蔵庫で保存される試験菌液を取り出して室温
に１ｈ程度置き、そして肺炎連鎖球菌、化膿連鎖球菌、腸球菌の菌液を０．１ｍｌ吸い取
り、それぞれ２ｍｌ  ＭＨの汁（１０％の不活化ウマ血清を加える）に接種し、黄色ブド
ウ球菌も、上記の方法で０．１ｍｌの菌液を２ｍｌ  ＭＨの汁に接種し、３７℃のインキ
ュベーターに置き、１８ｈ培養し、原菌液にし、５％の胃ムチンを用いて原菌液を希釈し
、動物感染時の１００％の致死菌数を感染菌液とした。
【０２０６】
レボロキタマイシンの臨床投薬は経口投薬としたので、レボロキタマイシンの試験では
、投薬ルートを強制経口投与にした。マウスの腹腔に０．５ｍｌの致死菌を注射後、マウ
スは、明らかに活動が減少する、静かに寝る、毛がふっくらするなどの症状が現れた。感
染後、それぞれ０．５−６ｈにて各マウスに対し０．２ｍｌ強制経口投与を１回実施し、
不良反応は一切なかった。７日間のマウス死亡数を観察し、Ｂｌｉｓｓプログラムを用い
て、それぞれ感染後のマウスに対する各薬の半数保護量（ＥＤ５０）を計算し、保護効果
を各薬物と比較した。
【０２０７】
動物体内試験の結果は表３と表４を参照のこと。
【０２０８】
表３：マウス腹腔の６株連鎖球菌感染に対する４種の抗生物質の効果比較
【０２０９】
【表５】
0005866737.tif 000007
0005866737.tif 000008
【０２１０】
0005866737.tif 000009
【０２１１】
表４：マウス腹腔の腸球菌と黄色ブドウ球菌感染に対する４種の抗生物質の効果比較
【０２１２】
【表６】
0005866737.tif 000010
【０２１３】
0005866737.tif 000011
【０２１４】
マウスの１２株細菌感染に対するレボロキタマイシンの効果については、表３、表４を
参照のこと。優れた保護効果を示している。レボイソバレリルスピラマイシンＩ、ＩＩ又はＩ
ＩＩがレボイソバレリルスピラマイシンＩ、ＩＩ又はＩＩＩ結晶体化合物であるレボロキ
タマイシンは、より優れた保護効果を示している。
【０２１５】
本発明の他の実施例において調製したレボロキタマイシン又はレボロキタマイシンの製
剤についても同様な試験を実施し、似たような結果が得られた。
【０２１６】
（試験例２）動物体外効果
臨床分離菌の測定：
試験方法：２倍平板希釈法：所定量の溶融寒天培養基を、系列薬物濃度を含む平板内に
入れ、薬液と均一に混合し（連鎖球菌と腸球菌の場合、５％のヒツジ脱繊維血液を加えて
血液培養基にし、インフルエンザ桿菌の場合、７％加え、淋菌用淋菌培養基の場合、７％
のヒツジ脱繊維血液を加えてチョコレート培養基にする）、凝固後、新鮮な培養菌液を１
０６ＣＦＵ／ｍＬに希釈し、抗菌デタミナーを用いて本発明の実施例４におけるレボロキ
タマイシンと対照用アジスロマイシン、アセチルスピラマイシンとエリスロマイシンを含
む平板寒天に接種し、３７℃にて１８ｈ培養する。淋菌を５％のＣＯ２インキュベーター
に入れて２４ｈインキュベートし、レジオネラ菌を５％のＣＯ２インキュベーターに入れ
て４８ｈ培養し、嫌気性菌を嫌気箱に入れて３７℃にて４８ｈ嫌気培養する。抗菌薬が細
菌増殖を阻止する最低濃度すなわち最低阻止濃度（ＭＩＣ）を観察し、さらに薬物のＭＩ
Ｃ５０とＭＩＣ９０を計算し、対照対象の薬と比較する。
【０２１７】
注）ＭＩＣ５０とは５０％の細菌増殖を阻止するための最低阻止濃度のことをいう
ＭＩＣ９０とは９０％の細菌増殖を阻止するための最低阻止濃度のことをいう。
【０２１８】
試験の結果は下表を参照のこと。
【０２１９】
表５：臨床分離菌に対するレボロキタマイシンの感受性分布
【０２２０】
【表７】
0005866737.tif 000012
0005866737.tif 000013
【０２２１】
0005866737.tif 000014
【０２２２】
本発明の他の実施例において調製したレボロキタマイシン又はレボロキタマイシンの製剤
についても同様な試験を実施し、似たような結果が得られた。
【０２２３】
（試験例３）動物体外抗クラミジアトラコマチスと肺炎クラミジアの測定
試験方法：
１．ＨＥｐ−２とＭｃＣｏｙ細胞系を、それぞれ９６ウェル細胞培養プレート（Ｃｏｓ
ｔａｒ社）に植え込み、３７℃、５％のＣＯ２にて４８時間培養し、単層細胞にする。
【０２２４】
２．接種待ちの菌種を１００００〜２００００  ｉｆｕ（封入体形成単位）／ｍｌに希
釈し、０．１ｍｌ／ウェルにて接種する。クラミジアトラコマチス血清型Ｂ／ＴＷ−５／
ＯＴ、Ｄ／ＵＷ−３／ＣｘをＭｃＣｏｙ細胞培養プレートし接種し、肺炎クラミジアＣＷ
Ｌ−０２９をＨＥｐ−２細胞培養プレートに接種する。まず９６ウェル培養プレート内の
細胞培養液を吸い取り、そして０．１ｍｌ／ウェルにて接種を行う。そのうち、Ａ１１〜
Ｄ１１の４つのウェル、Ｃ１２とＤ１２の２つのウェルは菌種を接種しない。
【０２２５】
３．菌種接種完了後、Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ社のＪ−６ＭＣ遠心機を用いて
９６ウェル細胞培養プレートについて遠心処理を行い、遠心力×１５００ｇ、遠心温度３
５℃、遠心時間６０分間とする。
【０２２６】
４．遠心処理完了後、接種したクラミジアトラコマチス又は肺炎クラミジアを吸い取り
、それぞれ０．１ｍｌ／ウェルにて系列希釈の４種の抗生物質薬物（すなわち本発明の実
施例４において調製したレボロキタマイシン、対照用アセチルスピラマイシン、エリスロ
マイシン及びアジスロマイシン）に加える。
【０２２７】
５．３７℃、５％のＣＯ２にて培養し、クラミジアトラコマチス感受性試験プレートは
４８時間培養し、肺炎クラミジア感受性試験プレートは７２時間培養する。培養完了後、
抗生物質薬物溶液を吸い取り、ＰＢＳ（０．０１Ｍ、  ｐＨ  ７．４）を２回洗浄し、１
００％のメタノール、室温にて１５分間固定する。
【０２２８】
６．間接免疫蛍光染色の鑑定：トラコーマ及び肺炎クラミジア感受性試験プレートには
、それぞれ純化された抗クラミジアトラコマチスモノクローナル抗体（Ｎ５４クローニン
グ）及び肺炎クラミジアモノクローナル抗体（Ｐ３３クローニング）を５０μｌ／ウェル
にて加え、３７℃のウェットボックス内で３０分間インキュベートし、そしてウォッシャ
ーを用いて４回洗浄し、さらに５０μｌ／ウェルにてウサギ抗マウス蛍光抗体（Ｓｉｇｍ
ａ社）を加え、同様な方法及び条件でインキュベート・洗浄を行う。１００μｌ／ウェル
にて封入グリセリンを加え、Ｎｉｋｏｎ倒立蛍光顕微鏡（Ｄｉａｐｈｏｔ−２００）の下
で結果を観察する。
【０２２９】
７．ＭＩＣの定義：９６ウェル試験プレートにおけるクラミジアトラコマチス又は肺炎
クラミジア封入体の増殖が完全に阻止されるウェル（全てのウェルで蛍光染色の封入体が
見られていない）の最小抗生物質希釈濃度。
【０２３０】
試験の結果は次のとおり：
表６：トラコーマ及び肺炎クラミジアの体外作用に対する４種のマクロライド系抗生物質
の最小阻止濃度の比較（ＭＩＣ）
【０２３１】
【表８】
0005866737.tif 000015
【０２３２】
１、トラコーマ血清型Ｂ／ＴＷ−５／ＯＴに対し、レボロキタマイシンＭＩＣは０．２５μ
ｇ／ｍｌ、エリスロマイシン、アジスロマイシン（０．５μｇ／ｍｌ）はその次、アセチ
ルスピラマイシン（ＭＩＣは４μｇ／ｍｌ）は比較的に効果が悪い。
【０２３３】
２、トラコーマ血清型Ｄ／ＵＷ−３／Ｃｘに対し、レボロキタマイシン、アジスロマイシン
は、体外作用が同じで、ＭＩＣが０．２５μｇ／ｍｌ、感受性を持ち、エリスロマイシン
（０．５μｇ／ｍｌ）はその次で、アセチルスピラマイシン（ＭＩＣは２μｇ／ｍｌ）は
比較的に効果が悪い。
【０２３４】
３、肺炎クラミジアＣＷＬ−０２９に対し、レボロキタマイシンとエリスロマイシンは、体
外作用が最も感受性を持ち、ＭＩＣ≦０．０１６μｇ／ｍｌ、アジスロマイシン（ＭＩＣ
は０．０３２μｇ／ｍｌ）は比較的に感受性を持ち、アセチルスピラマイシン（ＭＩＣは
０．５μｇ／ｍｌ）は比較的に効果が悪い。
【０２３５】
４、全体的に見て、本発明で調製したレボロキタマイシンのクラミジアに対する効果は
他の試験薬物より優れている。
【０２３６】
本発明の他の実施例において調製したレボロキタマイシン又はレボロキタマイシンの製
剤についても同様な試験を実施し、似たような結果が得られた。
【０２３７】
（試験例４）体外抗マイコプラズマウレアリチクムと肺炎クラミジア
１、試験方法：無菌の１２ウェル細胞培養プレートの各ウェルにＵ−ＰＰＬＯ  ０．８ｍ
ｌを加える（菌液対照ウェルは０．９ｍｌ加え、培養基対照ウェルは１．０ｍｌ加える）
。
２、各実験ウェルに１０４ＣＣＵ／ｍｌのＵｕ菌液を０．１ｍｌ加え、ウェルの中の最終
的な菌量は１０３ＣＣＵ／ｍｌである（培養基対照ウェルは菌液を加えない）。
３、３組（１００μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ抗生物質原液）に分けて２
倍降順濃度グラデーションにて無菌Ｔｉｐを用いて各実験ウェルに実験用抗生物質（本発
明の実施例６におけるレボロキタマイシン、アセチルスピラマイシン、エリスロマイシン
及びアジスロマイシン）１００μｌ、５０μｌ、２５μｌ、１２．５μｌを加える（菌液
対照ウェル、培養基対照ウェルは抗生物質を加えない。同時に、抗生物質対照ウェルを設
ける）。
４、上記各ウェルを均一に混合し、培養プレートの口をテープで封じ、３７℃のインキュ
ベーターに入れて培養する。
５、実験後の１７−２４ｈにＵｕの増殖状況を観察・記録する。Ｕｕ菌液対照ウェルが陽
性増殖を示すとき、Ｕｕの増殖を阻止できる最低抗生物質濃度は該薬剤の最低ＭＩＣであ
り、実験完了時のＭＩＣは最終的なＭＩＣ（２４ｈ）である。
【０２３８】
抗マイコプラズマウレアリチクム菌株についてＭＩＣ測定を４回行い、結果は次のとお
り：
レボロキタマイシンは０．０２５−０．１２５μｇ／ｍｌである。
【０２３９】
アセチルスピラマイシンは０．５μｇ／ｍｌである。
【０２４０】
エリスロマイシンは５μｇ／ｍｌである。
【０２４１】
アジスロマイシンは０．０２５−０．１２５μｇ／ｍｌである。
【０２４２】
上記の結果によれば、レボロキタマイシンは優れた抗Ｕｕ作用があり、アジスロマイシンの
作用に似ており、アセチルスピラマイシンより優れ、エリスロマイシンのこの組の試験で
抗Ｕｕ作用が最も悪い。
【０２４３】
本発明の他の実施例において調製したレボロキタマイシン又はレボロキタマイシンの製剤に
ついても同様な試験を実施し、似たような結果が得られた。
【図１】
0005866737.tif 000016
【図２】
0005866737.tif 000017
【図３】
0005866737.tif 000018
【図４】
0005866737.tif 000019
【図５】
0005866737.tif 000020
【図６】
0005866737.tif 000021
【図７】
0005866737.tif 000022
【図８】
0005866737.tif 000023