(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式：Ｐ(ＯＳＯ3-Ｍ+)n(Ｌ−Ｇ−Ｅ)mで表される複合体
［式中、
Ｐは、ｎ個のヒドロキシル基が硫酸基ＯＳＯ3-Ｍ+で置換されたポリオール高分子であり、
ｎは、１０よりも大きい数であり、
Ｍは、アニオン性硫酸基に対するカチオン性無機又は有機対イオンであり、
Ｅは、前記複合体が活性化細胞又は増殖細胞の細胞内へ取り込まれることにより、癌、炎症、自己免疫疾患及び線維症を含む群から選択される疾患を治療するための治療エフェクター分子であり、
Ｌは、Ｐ及びＥ間のリンカー又はスペーサーであり、
Ｇは、Ｌ及びＥ間の共有結合のための反応基であり、
ｍは、１−１００の数である。］を含む医薬組成物であって、
癌、炎症、自己免疫疾患及び線維症を含む群から選択される前記疾患を治療するための前記医薬組成物。
【請求項２】
前記硫酸化ポリオール高分子Ｐが、治療エフェクター分子Ｅに共有結合している硫酸化ポリグリセリンである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記エフェクター分子Ｅの割合が前記複合体の５０重量％未満であり、前記複合体の水への溶解度が１００ｍｇ／ｍＬよりも大きい、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
１投与あたりの前記複合体の投与量が１ｍｇ／ｋｇ〜１０００ｍｇ／ｋｇである複数回処置が実施される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物を含む無水製剤。
【請求項６】
緩衝塩、並びに／又は、スクロース、マンノース及びトレハロースからなる群より選択される少なくとも１つの抗凍結剤を含有する凍結乾燥物を含む、請求項５に記載の無水製剤。
【請求項７】
式：Ｐ(ＯＳＯ3-Ｍ+)n(Ｌ−Ｇ−Ｅ)m
［式中、
Ｐは、ｎ個のヒドロキシル基が硫酸基ＯＳＯ3-Ｍ+で置換されたポリオール高分子であり、
ｎは、１０よりも大きい数であり、
Ｍは、アニオン性硫酸基に対するカチオン性無機又は有機対イオンであり、
Ｅは、前記複合体が活性化細胞又は増殖細胞の細胞内へ取り込まれることにより、癌、炎症、自己免疫疾患及び線維症を含む群から選択される疾患を治療するための治療エフェクター分子であり、
Ｌは、Ｐ及びＥ間のリンカー又はスペーサーであり、
Ｇは、Ｌ及びＥ間の共有結合のための反応基であり、
ｍは、１−１００の数である。］
で表され、
ａ）前記硫酸化ポリオール高分子Ｐが、１〜１０００個のＯＨ基を有するポリヒドロキシ化合物である多機能性出発分子上に、式：(ＲＯ−ＣＨ2)2ＣＨ−ＯＲで表されるグリセロールの繰り返し単位を有する高分子ポリグリセリンであって、ＲがＨ又は１以上のさらに別のグリセロール単位であり、前記ポリオール高分子のコアの分岐度が６０％を上回り、平均分子量が５００〜１，０００，０００ｇ／ｍｏｌである前記高分子ポリグリセリンであり、
ｂ）前記グリセロール単位の複数のＯＨ基の、−ＯＳＯ3Ｈ又は−ＯＳＯ3-Ｍ+による置換であって、−ＯＳＯ3Ｈ又は−ＯＳＯ3-Ｍ+基の数が１０よりも大きい前記置換によって得られる硫酸化度Ｘが３０〜１００％であり、
ｃ）得られる硫酸化ポリグリセリンの平均分子量が１，０００〜５，０００，０００ｇ／ｍｏｌであり、
ｄ）リンカー単位Ｌが、少なくとも１個から最大１００−Ｘ％（ここで、Ｘは硫酸化度である）までの、硫酸化されていない残りのＯＨ基に結合した官能基Ｇを有し、前記官能基が、さらに別の治療エフェクター分子と複合化することができ、
ｅ）治療エフェクター分子Ｅが、１から可能な最大数までの前記官能基に共有結合しており、前記治療エフェクター分子が、細胞増殖抑制剤、抗血管新生薬、光増感剤及びｓｉＲＮＡからなる群より選択される、複合体。
【請求項８】
前記硫酸化ポリオール高分子Ｐが、治療エフェクター分子Ｅに共有結合している硫酸化ポリグリセリンである、請求項７に記載の複合体。
【請求項９】
前記エフェクター分子Ｅの割合が前記複合体の５０重量％未満であり、前記複合体の水への溶解度が１００ｍｇ／ｍＬよりも大きい、請求項７又は８に記載の複合体。
【請求項１０】
Ｌは、１又は２以上の非連続メチレン基がＯ、Ｓ、ＮＨ、Ｃ(Ｏ)ＮＨ、Ｃ(Ｏ)、ＳＯ2、ＳＯ、アリール、エテン又はエチンから選択される基で置換されていてもよい分岐鎖状又は直鎖状のＣ1-20アルキル基からなるリンカーであり、
Ｇは、−ＯＨ、−ＯＳＯ3Ｈ、−ＯＳＯ3-、−ＮＨ2、−Ｎ3、−ＣＯＯＨ、−ＳＨ、−ＳＯ3-及び−Ｃ≡Ｃを含む群より選択される、請求項７〜９のいずれか１項に記載の複合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的には、ポリアニオン性多価高分子を用いて、活性化細胞の増殖及びタンパク質合成に関連する細胞内分子をターゲッティングするための方法及び組成物に関する。特定の態様において、ポリオールに結合した多数の硫酸基が、増殖及び活性化細胞の細胞質及び核に対して特異的に標的化される。本発明はさらに、新規なポリアニオン性高分子化合物及び製剤を包含する。
【背景技術】
【０００２】
この数十年間の進歩により、診断及び治療薬の効能が向上した。主要な成果は、急性疾患に関するものである。今日、急性疾患（例えば、感染性疾患，急性血栓症又は血圧の急性調節障害等）は、高い有効性で治療することができる。急性疾患の薬物処置の大部分は、健常組織及び器官に深刻な影響を与えない。薬物治療の期間が短いので、健常組織及び器官は、望ましくない薬物効果から十分に回復することができる。通常短期間の薬物曝露を伴う急性疾患の短期間の薬物処置とは対照的に、慢性疾患の処置は、必然的に、適用薬への人体の曝露が長期間継続される。しかしながら、薬物の長期間の曝露は、たびたび、健常組織及び器官を害する。
【０００３】
健常組織及び器官に対する望ましくない深刻な薬物効果を避けるために、この数十年間、２つの異なる方策がとられた。１つの方策では、薬物研究の焦点が、標的メカニズムの疾患特異的発現が期待される新規薬物標的に当てられた。増殖及び活性化細胞におけるシグナル伝達メカニズムの発見に関し、数多くの新規標的が同定されてきた。しかしながら、数少ない例外を除き、新たに発見された薬物標的の大部分は、治療処置しても、治療効果を改善しかなった。もう１つの方策では、多大な努力が、臨床的に確立された治療薬のバイオアベイラビリティを向上させるために費やされた。バイオアベイラビリティを向上させるために、薬物研究の焦点が、治療又は診断エフェクター分子の化学修飾又は製剤処方に当てられた。
【０００４】
この３０年間で標的化エフェクター複合体の使用は確立されている。特に、診断又は治療効果を誘導できる分子を、ターゲッティング特性を有する担体分子に結合させている。イムノグロブリンの高結合アフィニティーにより、タンパク質である抗体又は抗原フラグメントは、しばしば、標的化送達のための担体分子として使用される。腫瘍性疾患の処置において、抗体は、腫瘍に対する毒素又は化学療法剤を保持可能でる。腫瘍の標的分子に対する抗体−エフェクター複合体の強い結合により、腫瘍環境におけるエフェクターの濃度は、有意に高い濃度となる。一方、抗体−エフェクター複合体は、実験及び臨床における一連の腫瘍に対して有効であることが判明している。エフェクター分子の標的化送達のその他の利点は、エフェクター分子の望ましくない効果の低減である。具体的には、ターゲッティング特性を有する担体に結合していない薬物分子の大部分は、疾患部位に到達せず、必要な血中薬物濃度を得るために人体に投与されるだけである。したがって、投与薬物の大部分は、疾患部位に到達することなく、血流から除去される。例えば、慢性疾患として見なし得る悪性固形腫瘍は、診断及び治療の時点で１〜１０グラムのサイズを有するので、人体の０．０１〜０．００１％に相当する。この割合は、投与薬物を疾患に向けることにより薬物処置を有意に最適化することができ、したがって投与量を低減することができることを示す。
【０００５】
しかしながら、急性疾患の処置における顕著な進歩にも関わらず、大部分の処置は慢性疾患の治療を実現できていない。急性疾患とは対照的に、大部分の慢性疾患は、疾患関連のシグナル伝達及び遺伝子転写を選択的にターゲティング可能である場合のみ治療することができる。この目的を達成するために、治療薬には、細胞膜を十分に透過して疾患の標的細胞内に蓄積することが求められる。遺伝子転写及びタンパク質合成の主要な標的分子は遍在的に発現するため、将来の治療薬には、疾患部位での選択的取り込みを示すことが求められる。遺伝子転写及びタンパク質合成の主要な制御因子に対する、疾患過程以外での結合及び阻害は、人体に害を与える可能性があるので、将来の治療薬の後者の特性は、非常に重要である。
【０００６】
科学的調査の結果によって、遺伝子転写及びタンパク質合成の５００以上の因子の役割に関する証拠が示された。しかしながら、様々な因子のうち、ＮＦ−κＢ及びＡＰ−１は重要であり、既に治療標的として確立されている（Letoha等, Mol. Pharmacol. 69: 2027, 2006; Sliva et al, Curr Cancer Drug Targets. 4: 327, 2004）。これら２つの遺伝子転写制御因子は、細胞の活性化及び増殖において中心的な役割を果たし、異なるシグナル伝達カスケードの下流シグナルである。ＮＦ−κＢ及びＡＰ−１はともに、細胞の細胞質及び核に存在する。ＮＦ−κＢ及びＡＰ−１の治療的ターゲッティングにおいて、薬物には、２つの重要な要件を満たすことが求められる。第一に、治療薬には、十分量が細胞膜を透過して細胞質内に蓄積することが求められる。第二に、治療薬には、健常な器官又は組織の細胞と疾患過程にある細胞とを区別することが求められる。ＮＦ−κＢ及びＡＰ−１は人体のあらゆる細胞で発現しており、これら２つの疾患標的の阻害は繊細な身体機能を有意に害する可能性があるので、後者の点は非常に重要である。
【０００７】
ＮＦ−κＢ（nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells）は、ＤＮＡ転写を制御するタンパク質複合体である。ＮＦ−κＢは、ほぼ全ての動物細胞型で観察され、ストレス，サイトカイン，フリーラジカル，紫外線照射，酸化ＬＤＬ及びバクテリア又はウイルス抗原等の刺激に対する細胞応答に関与する。ＮＦ−κＢは、感染に対する免疫反応の制御において重要な役割を果たす。逆に言えば、ＮＦ−κＢの不正確な制御は、癌，炎症性及び自己免疫疾患，敗血性ショック，ウイルス感染並びに不適当な免疫発達に関連している。また、ＮＦ−κＢは、シナプス可塑性及び記憶の過程に関与している（Baud等., Nat Drug Discov. 8:33, 2009）。
【０００８】
ＮＦ−κＢは、真核細胞において、細胞増殖及び細胞生存を制御する遺伝子の制御因子として広く利用されている。このため、数多くの異なる種類のヒト腫瘍では、ＮＦ−κＢが正確に制御されない。すなわち、ＮＦ−κＢは、構成的に活性である。活性ＮＦ−κＢは、細胞増殖を維持する遺伝子の発現を促進し、そうしなければアポトーシスを通じて細胞を死に至らしめる条件から細胞を保護する。ＮＦ−κＢの異常によって、細胞死の増加を引き起こすアポトーシスに対する感受性の上昇が生じる。ＮＦ−κＢは炎症に関連する数多くの遺伝子を制御するので、数多くの炎症性疾患（例えば、炎症性腸疾患，関節炎，敗血症，胃炎，喘息等）においてＮＦ−κＢの慢性的な活性が観察されることは驚くべきことではない。抗癌及び抗炎症作用を有する数多くの天然物（例えば、抗酸化物）についても、ＮＦ−κＢを阻害することが示されている（Kaur等, Curr Cancer Drug Targets 7: 355, 2007）。
【０００９】
アクチベータータンパク質１（ＡＰ−１）は、aｃ−Ｆｏｓ，ｃ−Ｊｕｎ，ＡＴＦ及びＪＤＰファミリーに属するタンパク質からなるヘテロ二量体タンパク質である転写因子である。それは、様々な刺激（例えば、サイトカイン，成長因子，ストレス並びにバクテリア及びウイルス感染）に対する応答において、遺伝子発現を制御する。ＡＰ−１は、同様に、分化，増殖及びアポトーシスを含む多数の細胞過程を制御する（Vesely等, Mutat Res. 682: 7, 2009）。
【００１０】
ＮＦ−κＢ及びＡＰ−１の活性化は、腫瘍増殖，アポトーシス，炎症，自己免疫疾患及び線維症に関与する多数のシグナリング分子をコードする遺伝子の転写を生じる。サイトカイン（例えば、インターロイキン−１，インターロイキン−６，ＴＮＦ−α又はＴＧＦ−ベータ（ＴＧＦ−β）等の増殖因子）は、ＮＦ−κＢ及びＡＰ−１活性化の下流シグナルのうち最も重要なものである。特に、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）は、多様な細胞機能（例えば、細胞増殖，分化，遊走，アポトーシス，接着，血管形成，免疫監視及び生存）を制御する高度に多機能的なサイトカインであり、したがって、治療薬に関する重要な標的である（Jakowlew, Cancer Metastasis Rev 2006; 25:435-57）。ＴＧＦ−βは、数多くの細胞型で産生され、血漿中に常に（その潜在的な形態で）存在し、全ての器官に浸透し、基質成分に結合し、この免疫抑制分子の貯留を形成する。一方、数多くの病的状態では過剰に産生される。このような病的状態としては、例えば、肺線維症，糸球体硬化症，間質性腎線維症，肝硬変，クローン病，心筋症，強皮症及び慢性移植片対宿主病が挙げられる（Prud'homme等, Lab Invest 2007; 87:1077-91）。腫瘍性疾患において、ＴＧＦ−βは、初期の病変の進行を抑制するが、その後、この効果は失われ、癌細胞によってＴＧＦ−βが産生され、それにより転移が促進する。このサイトカインも、腫瘍間質，血管形成及び免疫抑制の形成に寄与する（Jakowlew, Cancer Metastasis Rev 2006; 25:435-57）。この点から、ＴＧＦ−β活性を阻害するために、幾つかのアプローチが研究されており、そのようなアプローチとしては、例えば、中和抗体，可溶性受容体，受容体キナーゼアンタゴニスト薬物及びアンチセンス試薬が挙げられる。ＴＧＦ−βを標的とする新規治療の効果について、精力的に研究されている（Prud'homme, Lab Invest 2007; 87:1077-91）。
【００１１】
治療的介入において、全ての自己免疫疾患は、その病理過程が、免疫系の細胞成分及び非細胞成分の異常で無秩序な相互作用によって特徴付けられると考えられており、そのような疾患としては、例えば、セリアック病，Ｉ型糖尿病（ＩＤＤＭ），全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ），シェーグレン症候群，チャーグ・ストラウス症候群，多発性硬化症（ＭＳ），橋本甲状腺炎，グレーブス病，特発性血小板減少性紫斑病，アジソン病，貧血，強直性脊椎炎，変形性関節症，ベーチェット症候群，潰瘍性口内炎，慢性疲労，慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ），クローン病，クッシング病，疱疹状皮膚炎，皮膚筋炎，湿疹，線維筋痛症，脱毛，肝炎，甲状腺機能低下症，扁平苔癬，メニエール病，筋無力症，ライター症候群，サルコイドーシス，強皮症，敗血症，シェーグレン症候群，太陽中毒（sun poisoning），ＳＩＲＳ（全身性炎症反応症候群）及びブドウ膜炎が挙げられる（Masters等, Annu Rev Immunol 2009; 27:621-68）。
【００１２】
ヒトの癌において、ＴＧＦ−βは、ＮＦ−κＢ又はＡＰＩの活性化によって産生され、初期腫瘍発生におけるＴＧＦ−βシグナル伝達の減少及び進行した進行性疾患におけるＴＧＦ−βの増加の両方を通じて、腫瘍形成を促進する。ＴＧＦ−βが腫瘍細胞の細胞周期活動を制御し、これにより腫瘍細胞増殖が制御されることを示す証拠が存在する。正常細胞及び分化腫瘍細胞の増殖がＴＧＦ−βによってブロックされる一方、未分化腫瘍細胞の増殖は亢進される。未分化腫瘍細胞におけるＴＧＦ−βの亢進作用は、シグナル伝達経路の変異に起因する。原発腫瘍細胞の増殖に対するＴＧＦ−βの効果に関わらず、ＴＧＦ−βは、腫瘍細胞溢出の亢進による腫瘍転移の最も期待される制御因子の１つである。腫瘍血管形成に対する効果は、腫瘍増殖及び転移を亢進するＴＧＦ−βの別のメカニズムに基づく（Tian等, Future Oncol 2009; 5:259-71）。ＴＧＦ−βレベルの増加は、多数の腫瘍、例えば、急性リンパ性白血病，急性骨髄性白血病，副腎皮質癌，ＡＩＤＳ関連癌，ＡＩＤＳ関連リンパ腫，星状細胞腫，基底細胞癌，皮膚癌（非黒色腫），胆管癌，膀胱癌，骨癌，線維性組織球腫，脳腫瘍，乳癌，気管支腫瘍，Burkittリンパ腫，カルチノイド腫瘍，子宮頸癌，慢性リンパ性白血病，慢性骨髄性白血病，慢性骨髄増殖性疾患，大腸癌，皮膚Ｔ細胞リンパ腫，菌状息肉腫，胚芽腫，食道癌，眼癌，胆嚢癌，胃癌，消化管カルチノイド，胚細胞腫瘍，グリオーマ，有毛細胞白血病，頭頸部癌，肝細胞癌（肝臓癌），ホジキンリンパ腫，膵島細胞腫瘍，腎臓癌（腎細胞癌），喉頭癌，肝臓癌，肺癌，リンパ腫，黒色腫，中皮腫，脊髄形成異常症，上咽頭癌，卵巣癌，膵臓癌，副甲状腺癌，前立腺癌，前立腺肥大症，直腸癌，サルコーマ，胃癌，甲状腺癌，膣癌等で観察された（Jones等, Expert Opin Ther Targets 2009; 13:227-34）。
【００１３】
ＴＧＦ−βの重要な役割は、心臓血管系の疾患でも確認された。腫瘍におけるＴＧＦ−β誘導メカニズムと同様に、循環器疾患におけるＴＧＦ−β合成の主要な刺激も、ＮＦ−κＢの活性化である（Frangogiannis, Pharmacol Res 2008; 58:88）。ＴＧＦ−βは、数多くの循環器疾患（例えば、脳卒中再かん流，虚血，心臓発作，心筋炎，心内膜炎，心筋不全）に関与している（Goumans等, Trends Cardiovasc 2008; 18:293-8）。ＴＧＦ−βは、血管形成に関連する内膜新生及び収縮性リモデリング（constrictive remodeling）の進行において重要な役割をもつ。アテローム性動脈硬化症において、その作用は未だ十分に解明されていないが、免疫系を制御するその能力は、特に進行する病変の種類に影響を及ぼすことにより、病変の進行に対して重大な影響を及ぼす。ＴＧＦ−βは、血管新生促進効果及び血管新生抑制効果の両方を有し、動脈形成を誘導することもでき、血管新生の過程に著しい影響を与える（Galinka等, Annu Rev Immunol 2009; 27:165-97）。また、ＴＧＦ−βは、様々な循環器の線維症（例えば、血管系、心臓及び腎臓における線維症）の進行に対する主要な寄与因子である。ＴＧＦ−βは、線維症の発症及び進行においても重要な役割を果たすことが示されている。線維症は、器官又は組織の修復過程又は反応過程における過剰な線維結合組織の形成又は発達であり、器官又は組織の正常な構成要素である線維組織の形成とは対照的である。その具体例には、膵臓及び肺の嚢胞性線維症、筋肉内注射の合併症として生じ得る注射部位線維症、心内膜心筋線維症、肺の特発性肺線維症、縦隔線維症、骨髄線維症、後腹膜線維症、進行性塊状、炭坑夫塵肺の合併症、腎性全身性線維症がある（Pohlers等, Biochim Biophys Acta, 2009, 1792, 746-756）。
【００１４】
現在使用されている抗ＴＧＦ−β治療薬には、幾つかの欠点がある。自己免疫疾患の治療用として確立された薬物の重大な欠点は、治療域が狭いことである。繰り返し投与されると、通常、薬物副作用及び重篤な器官障害が引き起こされる。心毒性、腎毒性及び肝炎は、自己免疫疾患の治療用として臨床で使用される薬物の一般的な副作用である（Cohen, International Journal of Clinical Practice 2007; 1922-1930）。臨床の場では、不可逆的な毒性を回避するために、確立された薬物の大部分が断続的に投与される。しかしながら、断続的な処置スケジュールは、疾患の進行リスクを増加させる。これらの理由から、より効率的かつ忍容性が良好なＴＧＦ−β関連疾患治療用薬物の必要性が存在している。
【００１５】
受容体シグナル伝達の阻害を生じる幾つかのアプローチによってＴＧＦ−βを阻害することができることが知られている。しかしながら、これらのアプローチは、in vivoにおける限定された効能及び忍容性の欠如によって制限される。ＴＧＦ−βをブロックするアンチセンスオリゴヌクレオチドの合成が文献に記載されている（Flanders, Clinical Medicine & Research 2003, 1, 13-20）。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＴＧＦ−βタンパク質の合成を低減させることができる。しかしながら、このアプローチは、しばしば、ＴＧＦ−β合成の不完全な阻害を生じる。アンチセンスオリゴヌクレオチドのその他の欠点は、疾患部位に蓄積される薬物量が少ないことである。ＴＧＦ−β受容体の低分子阻害剤（ＳＭＩ）も知られている（Hjelmeland等, Mol Cancer Ther 2004; 3: 737-745）。これらの分子は、しばしば、経口投与されるが、十分な忍容性及び安全性が欠如している。ＴＧＦ−β受容体の既知ＳＭＩの毒性副作用は、特異性の欠如に起因している。既知化合物は、ＴＧＦ−β受容体のシグナル伝達だけでなく、構造類似性を有するその他の数多くの受容体のシグナル伝達も阻害する。ＴＧＦ−βに結合する又は受容体へのＴＧＦ−β結合をブロックする抗体も知られている。これらの分子は、疾患部位における十分な蓄積を示し、長期間にわたってシグナル伝達をブロックする（Saunier等, Curr Cancer Drug Targets 2006; 6:565-78）。しかしながら、抗体は、治療への適用を制限する幾つかの欠点を有する。第一に、ＴＧＦ−βを阻害する抗体は、免疫系成分に対する結合部位を有する一部の抗体によって免疫系が活性化されることにより、望ましくない副作用を生じる可能性がある。この免疫系の活性化は、治療に関連する毒性を引き起こす可能性がある。その他の欠点として、中和抗体の産生を生じる可能性がある。中和抗体の発現は、しばしば、複数回投与の後に観察される。中和抗体が発現すると、治療の効能が低下する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
既知治療の制限から、活性化ＮＦ−κＢ及びＡＰ−１並びにＴＧＦ−β合成の増加に関連する疾患を治療するための新規アプローチが求められている。新規治療アプローチの最終目標は、高い有効性及び良好な忍容性である。したがって、本発明の目的は、合成が容易であるとともに、ＮＦ−κＢ又はＡＰ−１の活性化及びサイトカイン（例えばＴＧＦ−β）合成の増加に関連する疾患の治療に適する化合物及び化合物群を提供することにある。本発明によって、ポリアニオン性多価高分子が、エフェクター分子を増殖及び活性化細胞の細胞質及び核に選択的に送達する新しい種類の治療分子であることが、驚くべきことに見出された。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は、樹状分岐高分子担体上の複数の硫酸基の多価アセンブリを基礎とするポリアニオン性高分子の、診断又は治療エフェクター分子の細胞内送達のための使用を提案する。さらに詳細には、本発明は、診断又は治療エフェクター分子が、ＮＦ−κＢ及びＡＰ−１の活性化並びにＴＧＦ−β合成の亢進に関連する疾患を治療する薬物として共有結合している超分岐構造を有する、硫酸化ポリオールの使用を包含する。
【００１８】
本発明の主題は、以下の通りである：
硫酸化ポリグリセリンと、該硫酸化ポリグリセリンに共有結合している治療又は診断エフェクター分子とを含む医薬組成物。
【００１９】
好ましい態様では、式：Ｐ(ＯＳＯ3-Ｍ+)n(Ｌ−Ｇ−Ｅ)m
［式中、
Ｐは、ｎ個のヒドロキシル基が硫酸基ＯＳＯ3-Ｍ+で置換されたポリオール高分子であり、
Ｍは、アニオン性硫酸基に対するカチオン性無機又は有機対イオンであり、
Ｅは、治療又は診断エフェクター分子であり、
Ｌは、Ｐ及びＥ間のリンカー又はスペーサーであり、
Ｇは、Ｌ及びＥ間の共有結合のための反応基であり、
ｍは、１−１００の数である。］
の医薬組成物。
【００２０】
さらに好ましい態様では、硫酸化ポリグリセリン及び治療又は診断エフェクター分子の活性化細胞又は増殖細胞への細胞内取り込みにより、並びに、細胞におけるＮＦ−κＢ及び／又はＡＰ−１の阻害及び／又はＴＧＦ−β合成の阻害により、疾患を治療するための医薬組成物。
【００２１】
硫酸化ポリグリセリンと、該硫酸化ポリグリセリンに共有結合している治療又は診断エフェクター分子とを含む複合体。
【００２２】
好ましい態様では、式：Ｐ(ＯＳＯ3-Ｍ+)n(Ｌ−Ｇ−Ｅ)m
［式中、
Ｐは、ｎ個のヒドロキシル基が硫酸基ＯＳＯ3-Ｍ+で置換されたポリオール高分子であり、
Ｍは、アニオン性硫酸基に対するカチオン性無機又は有機対イオンであり、
Ｅは、治療又は診断エフェクター分子であり、
Ｌは、Ｐ及びＥ間のリンカー又はスペーサーであり、
Ｇは、Ｌ及びＥ間の共有結合のための反応基であり、
ｍは、１−１００の数である。］
で表される複合体。
【００２３】
さらに好ましい態様では、ｎ個のヒドロキシル基が硫酸基ＯＳＯ3-Ｍ+で置換されており、ｎが１０個よりも大きい数である、式：Ｐ(ＯＳＯ3-Ｍ+)n(Ｌ−Ｇ−Ｅ)mで表される複合体。
【００２４】
さらに好ましい態様では、エフェクター分子の割合が複合体の５０重量％未満であり、複合体の水への溶解度が１００ｍｇ／ｍＬよりも大きい複合体。
【００２５】
さらに好ましい態様では、活性化細胞又は増殖細胞への細胞内取り込みにより、並びに、前記細胞におけるＮＦ−κＢ及び／又はＡＰ−１の阻害及び／又はＴＧＦ−β合成の阻害により、疾患を治療するための、硫酸化ポリグリセリンと、該硫酸化ポリグリセリンに共有結合している治療又は診断エフェクター分子とを含む複合体。
【００２６】
さらに好ましい態様では、癌、炎症、自己免疫疾患及び線維症を含む群から選択される疾患を治療するための、硫酸化ポリグリセリンと、該硫酸化ポリグリセリンに共有結合している治療又は診断エフェクター分子とを含む複合体。
【００２７】
さらに好ましい態様では、１投与あたりの投与量が１ｍｇ／ｋｇ〜１０００ｍｇ／ｋｇである複数回処置が実施される、硫酸化ポリグリセリン及び治療又は診断エフェクター分子の活性化細胞又は増殖細胞への細胞内取り込みにより、並びに、前記細胞におけるＮＦ−κＢ及び／又はＡＰ−１の阻害及び／又はＴＧＦ−β合成の阻害により、疾患を治療するための、硫酸化ポリグリセリンと、該硫酸化ポリグリセリンに共有結合した治療又は診断エフェクター分子とを含む複合体。
【００２８】
さらに好ましい態様では、
ａ）１〜１０００個のＯＨ基を有するポリヒドロキシ化合物である多機能性出発分子上に、式：(ＲＯ−ＣＨ2)2ＣＨ−ＯＲで表されるグリセロールの繰り返し単位を有する高分子ポリグリセリンＰであって、ＲがＨ又はさらに別のグリセロール単位であり、コアの分岐度が０〜６７％であり、平均分子量が５００〜１，０００，０００ｇ／ｍｏｌである前記高分子ポリグリセリンＰ、
ｂ）前記グリセロール単位の複数のＯＨ基の、−ＯＳＯ3Ｈ又は−ＯＳＯ3-Ｍ+による置換であって、−ＯＳＯ3Ｈ又は−ＯＳＯ3-Ｍ+基の好ましい数が１０よりも大きく、得られる硫酸化度Ｘが３０〜１００％であり、Ｍ+がカチオン性無機又は有機対イオンである前記置換、
ｃ）１，０００〜５，０００，０００ｇ／ｍｏｌという、得られる硫酸化ポリグリセリンの平均分子量、
ｄ）少なくとも１個から最大１００−Ｘ％までのＯＨ基に結合した官能基Ｇを有するリンカー単位Ｌであって、前記官能基が、さらに別の治療又は診断エフェクター分子と複合化することができ、Ｘが硫酸化度である前記リンカー単位Ｌ、
ｅ）１から可能な最大数までの前記官能基に共有結合した診断及び／又は治療エフェクター分子であって、前記診断エフェクター分子が、蛍光色素及び放射性又は常磁性金属のキレート剤からなる群より選択され、前記治療エフェクター分子が、細胞増殖抑制剤、抗血管新生薬、光増感剤及びｓｉＲＮＡからなる群より選択される前記診断及び／又は治療エフェクター分子、
を含む複合体。
【００２９】
さらに好ましい態様では、式：Ｐ(ＯＳＯ3-Ｍ+)n(Ｌ−Ｇ−Ｅ)m
［式中、
Ｌは、１又は２以上の非連続メチレン基がＯ、Ｓ、ＮＨ、Ｃ(Ｏ)ＮＨ、Ｃ(Ｏ)、ＳＯ2、ＳＯ、アリール、エテン及びエチンから選択される基で置換されていてもよい分岐鎖状又は直鎖状のＣ1-20アルキル基であり、
Ｇは、−ＯＨ、−ＯＳＯ3Ｈ、−ＯＳＯ3-、−ＮＨ2、−Ｎ3、−ＣＯＯＨ、−ＳＨ、−ＳＯ3-及び−Ｃ≡Ｃを含む群から選択される。］
で表される複合体。
【００３０】
活性化細胞又は増殖細胞への細胞内取り込みにより、並びに、前記細胞におけるＮＦ−κＢ及び／又はＡＰ-1の阻害、及び／又はＴＧＦ−β合成の阻害により、疾患を治療するための、一般式：Ｐ(ＯＳＯ3-Ｍ+)n(Ｌ−Ｇ)m
［式中、
Ｐは、ｎ個のヒドロキシル基が硫酸基ＯＳＯ3-Ｍ+で置換されたポリグリセリンであり、
Ｍは、アニオン性硫酸基に対するカチオン性無機又は有機対イオンであり、
ｍは、１−１００の数であり、
Ｌは、リンカーであり、
Ｇは、エフェクター分子との共有結合のための反応基である。］
で表される硫酸化ポリグリセリンであって、
Ｌが、１又は２以上の非連続メチレン基がＯ、Ｓ、ＮＨ、Ｃ(Ｏ)ＮＨ、Ｃ(Ｏ)、ＳＯ2、ＳＯ、アリール、エテン及びエチンから選択される基で置換されていてもよい分岐鎖状又は直鎖状のＣ1-20アルキル基であり、
Ｇが、−ＯＨ、−ＯＳＯ3Ｈ、−ＯＳＯ3-、−ＮＨ2、−Ｎ3、−ＣＯＯＨ、−ＳＨ、−ＳＯ3-及び−Ｃ≡Ｃを含む群から選択される、前記硫酸化ポリグリセリン。
【００３１】
さらに好ましい態様では、活性化細胞又は増殖細胞への細胞内取り込みにより、並びに、前記細胞におけるＮＦ−κＢ及び／又はＡＰ−１の阻害、及び／又はＴＧＦ−β合成の阻害により、癌、炎症、自己免疫疾患及び線維症を含む群から選択される疾患を治療するための、硫酸化ポリグリセリン。
【００３２】
さらに好ましい態様では、活性化細胞又は増殖細胞への細胞内取り込みにより、並びに、前記細胞におけるＮＦ−κＢ及び／又はＡＰ−１の阻害、及び／又はＴＧＦ−β合成の阻害により、癌、炎症、自己免疫疾患及び線維症を含む群から選択される疾患を治療するための硫酸化ポリグリセリンであって、
１投与あたりの投与量が１ｍｇ／ｋｇ〜１０００ｍｇ／ｋｇである複数回処置が実施される前記硫酸化ポリグリセリン。
【００３３】
以下の硫酸化ポリグリセリン：
硫酸化ポリグリセリンと、該硫酸化ポリグリセリンに共有結合している治療又は診断エフェクター分子とを含む複合体、
好ましい態様では、式：Ｐ(ＯＳＯ3-Ｍ+)n(Ｌ−Ｇ−Ｅ)m［式中、Ｐは、ｎ個のヒドロキシル基が硫酸基ＯＳＯ3-Ｍ+で置換されたポリオール高分子であり、Ｍは、アニオン性硫酸基に対するカチオン性無機又は有機対イオンであり、Ｅは、治療又は診断エフェクター分子であり、Ｌは、Ｐ及びＥ間のリンカー又はスペーサーであり、Ｇは、Ｌ及びＥ間の共有結合のための反応基であり、ｍは、１−１００の数である。］
で表される複合体、
さらに好ましい態様では、ｎ個のヒドロキシル基が硫酸基ＯＳＯ3-Ｍ+で置換されており、ｎが１０よりも大きい数である、式：Ｐ(ＯＳＯ3-Ｍ+)n(Ｌ−Ｇ−Ｅ)mで表される複合体
の、対象の活性化又は増殖細胞へ治療又は診断エフェクター分子を送達するための使用。
【００３４】
以下の硫酸化ポリグリセリン：
活性化細胞又は増殖細胞への細胞内取り込みにより、並びに、前記細胞におけるＮＦ−κＢ及び／又はＡＰ−１の阻害、及び／又はＴＧＦ−β合成の阻害により、疾患を治療するための、一般式：Ｐ(ＯＳＯ3-Ｍ+)n(Ｌ−Ｇ)m［式中、Ｐは、ｎ個のヒドロキシル基が硫酸基ＯＳＯ3-Ｍ+で置換されたポリグリセリンであり、Ｍは、アニオン性硫酸基に対するカチオン性無機又は有機対イオンであり、ｍは、１−１００の数であり、Ｌは、リンカーであり、Ｇは、エフェクター分子との共有結合のための反応基である。］で表される硫酸化ポリグリセリンであって、Ｌは、１又は２以上の非連続メチレン基がＯ、Ｓ、ＮＨ、Ｃ(Ｏ)ＮＨ、Ｃ(Ｏ)、ＳＯ2、ＳＯ、アリール、エテン及びエチンから選択される基で置換されていてもよい分岐鎖状又は直鎖状のＣ1-20アルキル基であり、Ｇは、−ＯＨ、−ＯＳＯ3Ｈ、−ＯＳＯ3-、−ＮＨ2、−Ｎ3、−ＣＯＯＨ、−ＳＨ、−ＳＯ3-及び−Ｃ≡Ｃを含む群から選択される前記硫酸化ポリグリセリン、
さらに好ましい態様では、活性化細胞又は増殖細胞への細胞内取り込みにより、並びに、前記細胞におけるＮＦ−κＢ及び／又はＡＰ−１の阻害、及び／又はＴＧＦ−β合成の阻害により、癌、炎症、自己免疫疾患及び線維症を含む群から選択される疾患を治療するための、硫酸化ポリグリセリン
の、対象の活性化又は増殖細胞へ治療又は診断エフェクター分子を送達するための使用。
【００３５】
さらに好ましい態様では、治療又は診断エフェクター分子が、硫酸化ポリグリセリンに共有結合している硫酸化ポリグリセリンの使用。
【００３６】
以下の硫酸化ポリグリセリン：
硫酸化ポリグリセリンと、該硫酸化ポリグリセリンに共有結合している治療又は診断エフェクター分子とを含む複合体
の無水製剤。
【００３７】
以下の硫酸化ポリグリセリン：
活性化細胞又は増殖細胞への細胞内取り込みにより、並びに、前記細胞におけるＮＦ−κＢ及び／又はＡＰ−１の阻害、及び／又はＴＧＦ−β合成の阻害により、疾患を治療するための、一般式：Ｐ(ＯＳＯ3-Ｍ+)n(Ｌ−Ｇ)m［式中、Ｐは、ｎ個のヒドロキシル基が硫酸基ＯＳＯ3-Ｍ+で置換されたポリグリセリンであり、Ｍは、アニオン性硫酸基に対するカチオン性無機又は有機対イオンであり、ｍは、１−１００の数であり、Ｌは、リンカーであり、Ｇは、エフェクター分子との共有結合のための反応基である。］で表される硫酸化ポリグリセリンであって、Ｌが、１又は２以上の非連続メチレン基がＯ、Ｓ、ＮＨ、Ｃ(Ｏ)ＮＨ、Ｃ(Ｏ)、ＳＯ2、ＳＯ、アリール、エテン及びエチンから選択される基で置換されていてもよい分岐鎖状又は直鎖状のＣ1-20アルキル基であり、Ｇが、−ＯＨ、−ＯＳＯ3Ｈ、−ＯＳＯ3-、−ＮＨ2、−Ｎ3、−ＣＯＯＨ、−ＳＨ、−ＳＯ3-及び−Ｃ≡Ｃを含む群から選択される前記硫酸化ポリグリセリン
の無水製剤。
【００３８】
さらに好ましい態様では、活性化細胞又は増殖細胞への細胞内取り込みにより、並びに、前記細胞におけるＮＦ−κＢ及び／又はＡＰ−１の阻害、及び／又はＴＧＦ−β合成の阻害により、疾患を治療するための、無水製剤。
【００３９】
さらに好ましい態様では、癌、炎症、自己免疫疾患及び線維症を含む群から選択される疾患を治療するための、無水製剤。
【００４０】
さらに好ましい態様では、１投与あたりの投与量が１ｍｇ／ｋｇ〜１０００ｍｇ／ｋｇである複数回処置が実施される、無水製剤。
【００４１】
さらに好ましい態様では、緩衝塩、並びに／又は、スクロース、マンノース及びトレハロースからなる群より選択される少なくとも１つの抗凍結剤を含有する凍結乾燥物を含む、無水製剤。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】図１は、樹状ポリグリセリン骨格を有するポリアニオン性ポリ硫酸高分子の例示的な化学構造の模式図である。出発分子はＴＭＰである。化学式は、樹状高分岐硫酸化ポリグリセリンの基本的構造部分を示す。様々な誘導体の合成は実施例１及び２に記載される。
【図２】図２は、ポリ（アミドアミン）デンドリマー骨格を有するポリアニオン性ポリ硫酸高分子の例示的な化学構造の模式図である（Bioconjug. Chem. 20: 693, 2009）。デンドリマーの硫酸化は、ポリグリセリンに対して実施される。化学式は、平均硫酸化度９０％の化合物を示す。
【図３】図３は、Boltornポリエステルデンドリマー骨格を有するポリアニオン性ポリ硫酸高分子の例示的な化学構造の模式図である（Bioconjug. Chem. 14: 817, 2003）。デンドリマーの硫酸化は、ポリグリセリンに対して実施される。化学式は、平均硫酸化度８３％の化合物を示す。
【図４】図４は、実施例２のリンカーを有する硫酸化ポリグリセリンを示す。具体例には、硫酸化グリセロールの代表的な構造サブユニット及びリンカーが結合しているサブユニットを有する硫酸化ポリグリセリン高分子骨格（球）の模式図が含まれる。
【図５】図５は、実施例３のシアニン色素の部類から選ばれる診断エフェクター分子を有する硫酸化ポリグリセリン複合体を示す。具体例には、硫酸化グリセロールの代表的な構造サブユニット並びにリンカー及びエフェクター分子が結合しているサブユニットを有する硫酸化ポリグリセリン高分子骨格（球）の模式図が含まれる。
【図６】図６は、実施例４の放射性標識（放射線診断及び放射線治療）のためのキレート剤及び実施例５のＭＲＩのための金属錯体の部類から選択される診断エフェクター分子を有する硫酸化ポリグリセリン複合体を示す。具体例には、硫酸化グリセロールの代表的な構造サブユニット並びにリンカー及びエフェクター分子が結合しているサブユニットを有する硫酸化ポリグリセリン高分子骨格（球）の模式図が含まれる。
【図７】図７は、実施例６の光増感剤、細胞増殖抑制剤（クロランブシル及びパクリタキセル）及びｓｉＲＮＡの部類から選択される治療エフェクター分子を有する硫酸化ポリグリセリン複合体を示す。具体例には、硫酸化グリセロールの代表的な構造サブユニット並びにリンカー及びエフェクター分子が結合しているサブユニットを有する硫酸化ポリグリセリン高分子骨格（球）の模式図が含まれる。
【図８】図８は、細胞化学染色（ＤＡＰＩによる核染色）（実施例７）における、異なる分子量の蛍光トリグリセロール又はポリグリセリン複合体（ＩＣＣ色素）の、in vitroで１時間インキュベーションされたＡ５４９ヒト肺癌細胞による細胞取り込みを示す。
【図９】図９は、細胞化学染色（ＤＡＰＩによる核染色）における、ＩＣＣ−トリグリセロール複合体及び硫酸化高分子ヘパリン及び硫酸化ポリグリセリン（実施例３ｃ）の、in vitroで４時間インキュベーションされたＡ５４９ヒト肺癌細胞による細胞取り込みを示す。硫酸化ポリグリセリン（ＳＰＧ）だけが細胞内に局在化する（実施例８）。
【図１０】図１０は、フローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ）を示す。単球は硫酸化ポリグリセリン（実施例３ｃの化合物）を非常に多量に取り込むことができる一方、リンパ球はわずかな取り込みしか示さない（実施例９）。
【図１１】図１１は、硫酸化ポリグリセリンがＣＡＳＫＩ細胞からのＴＧＦβ１放出の統計的に有意な阻害を誘導することを示す。細胞は４８時間処理され、培養上清中のＴＧＦβ１がＥＬＩＳＡによって検出された（実施例１０）。
【図１２】図１２は、硫酸化ポリグリセリン（ＳＰＧ）、リンカーを有する硫酸化ポリグリセリン（ＳＰＧＬ）及びエフェクター分子を有する複合体が、ＳＰＲ／Ｂｉａｃｏｒｅによる測定において、高アフィニティーで細胞内転写因子ＮＦ−κＢに結合することを示す。結合アフィニティーは、硫酸化度及び分子量の増加とともに増加することが、ＩＣ５０値の減少によって示される。リンカー及びエフェクター分子は、結合アフィニティーを阻害しない（実施例１１）。
【図１３】図１３は、硫酸化ポリグリセリンが、統計的に有意であって生物学的に関連した、肺腫瘍細胞Ａ５４９の増殖（図１３Ａ)及び代謝活性（図１３Ｂ）の阻害を誘導することを示す。Ａ５４９細胞は、硫酸化ポリグリセリンとともに７日間培養され、細胞数及び代謝活性が検出された。培養７日後の腫瘍細胞数（Ａ）及びＭＴＴ試験の結果（Ｂ）が示されている（ＭＷ＋／−ＳＤ）（実施例１２）。
【図１４】図１４は、硫酸化ポリグリセリン又はＰＢＳ（対照）で処置されたヌードマウス（Ａ５４９肺癌モデル）の腫瘍容積の経時変化を示す。１日あたりの投与量が３０ｍｇ／ｋｇ体重である硫酸化ポリグリセリン（化合物Ｐ３）は、腫瘍増殖を阻害し、これは処置４５日後の強力な治療効果を示す（実施例１３）。
【図１５】図１５は、コラーゲン誘導関節炎ラット及び健常対照ラットに対する、硫酸化ポリグリセリンでの毎日の皮下処置の効果を示す。臨床スコア、マスト細胞数及び滑膜における炎症性浸潤が、１日あたりの投与量が３０ｍｇ／ｋｇである硫酸化ポリグリセリン処置後に影響を受け、これは有意な治療効果を示す（実施例１４）。
【図１６】図１６は、コラーゲン誘導関節炎を有する麻酔ラットの蛍光イメージを示し、シアニン色素との硫酸化ポリグリセリン複合体の迅速で高い取り込み（化合物Ｐ２６／Ｅ２，実施例３ｂ）及び関節炎の関節における蛍光コントラスト（１０分）は、疾患活性とともに増加する（スコア１〜３の高低差）。矢印は、高蛍光コントラストを有する関節炎の関節を示す（実施例１７）。
【図１７】図１７は、皮膚炎（接触過敏症）のマウスモデルにおける、64ＣｕによるＤＯＴＡ放射性標識を有する硫酸化ポリグリセリン複合体（化合物Ｐ１７／Ｅ１３，実施例４ａ）のＰＥＴイメージを示す。麻酔マウスのイメージは、炎症耳組織における高コントラストを示す。矢印は、炎症領域を示す（実施例１８）。
【図１８】図１８は、パクリタキセル（タキソール）との硫酸化ポリグリセリン複合体（実施例６ｂの化合物）が、複合体化していないパクリタキセル（タキソール）と比較して、肺腫瘍細胞Ａ５４９の細胞増殖の阻害及び代謝活性の阻害を増加させることを示す。培養４８時間後の腫瘍細胞数（図１８Ａ）及びＭＴＴ試験の結果（図１８Ｂ）が示される（ＭＷ＋／−ＳＤ，ｎ＝４）（実施例１９）。
【図１９】図１９は、ＶＥＧＦ−ｓｉＲＮＡと複合体化した硫酸化ポリグリセリン（ＳＰＧ）（実施例６ｅ）又はＶＥＧＦ−ｓｉＲＮＡ単独とのインキュベーション後の、Ａ５４９肺癌細胞株におけるＶＥＧＦ産生を示す。ＶＥＧＦタンパク質は、４８時間調整した細胞培養液中でのＥＬＩＳＡによって測定された。各バーは、３回の独立した実験で得られた３回の測定の平均値±ＳＥＭである（実施例２０）。
【図２０】図２０は、診断エフェクター分子として使用された、ＩＣＧの化学構造（図２０ａ）、本発明のＩＣＧアナログ（図２０ｂ）及び好ましい誘導体の構造（図２０ｃ−ｄ）を示す。
【図２１】図２１は、０．９％ＮａＣｌ中での凝集による、シアニン色素との硫酸化ポリグリセリン複合体（化合物Ｐ１７／Ｅ１，実施例３ｃ）の蛍光の減少を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
本発明の目的は、高い治療有効性及び良好な忍容性によって特徴付けられる、腫瘍疾患、炎症、自己免疫疾患及び線維症の治療のための薬物を提供することにある。本発明のポリアニオン性多価高分子は、腫瘍疾患、炎症、自己免疫疾患及び線維症を診断又は治療するための、増殖及び活性化細胞の細胞質及び核へのエフェクター分子の送達に適しており、これは特に、高い有効性及び高用量の適用後も良好な忍容性を示すという驚くべき知見に基づいている。
【００４４】
体系的に研究された細胞経路は、分子量の増加に伴って生じる高分子のエンドサイトーシスである。エンドサイトーシスは、細胞が、その細胞膜によって分子（例えば高分子）を包み込む（engulf）ことにより、該分子を細胞外から取り込むプロセスである。体細胞にとって重要な大部分の物質及び基質は疎水性原形質膜又は細胞膜を通過できない巨大極性分子であるため、それは全ての体細胞に適用される一般的なメカニズムである。エンドサイトーシスのプロセスは、正常細胞及び疾患過程と関連する細胞の両方に存在する（Liu等, PLOS Biology 2009; 7: 1000204）。
【００４５】
エンドサイトーシスのメカニズムは、高分子構造の巨大分子又は粒子をベースとする分子（entity）（有機又は無機ナノ粒子）が細胞膜に到達したときに特に関係する。このため、ターゲッティング特性を改良した薬物デザインは、高分子担体分子の利用によって達成されてきた。特に、多様な高分子又はデンドリマーが合成されてきた（ori等, Adv Drug Deliv Rev. 57: 609, 2005, Haag等, Angew. Chem. Int. Ed. 45: 1198, 2006）。高分子のターゲッティング特性に関する高分子の化学修飾は十分に確立されている。高分子に存在するカチオン性構造が、エンドサイトーシスによる高分子の細胞膜の通過を可能とする強力な証拠が存在する。これと関連して、カチオン性高分子は、診断及び治療エフェクターの細胞内送達に使用されている（Paleos等, Curr Top Med Chem. 8: 1204, 2008）。しかしながら、カチオン性高分子は、エンドサイトーシスのメカニズムを機能させる全ての細胞の一般的な能力によって、人体の全ての細胞に取り込まれる。このように、薬物送達には、カチオン性要素を含む成分及び構造が使用される（例えばＷＯ２００９１４２８９３）。これは、薬物処置による数多くの望ましくない効果及び毒性を引き起こすとともに、体内の望まない部位への薬物の沈着を引き起こす。カチオン性ペプチドであるペネトラチンは、ＮＦ−κＢに対する細胞内阻害物質として同定された（Letoha等, Mol. Pharmacol. 69: 2027, 2006）。
【００４６】
アニオン性構造の大部分は、無傷細胞の細胞膜の負電荷によって、細胞に取り込まれず、細胞膜透過の反発及び阻害が生じることが知られている。ポリアニオン性挙動を示す高分子は、様々な文献に記載されてきた。このような分子として、天然に存在する化合物、例えば、プロテオグリカン、脂質二重層表面、微小管及びポリヌクレオチド（例えばＤＮＡ又はＲＮＡ）がある。それらは、遺伝子転写及びタンパク質合成において中心的な役割を果たす。その他の化合物として、人工的な高分子又はデンドリマー（例えば、ポリアミノ酸、ポリカルボキシレート及び合成オリゴヌクレオチド）がある。無傷細胞の細胞膜の負電荷のために、ポリアニオン性高分子と細胞膜との静電相互作用によって細胞膜透過の反発及び阻害が生じる可能性があることが予想される。したがって、ポリアニオン性高分子を、増殖及び活性化細胞の細胞質及び核へのエフェクター分子の送達に使用できることは知られていなかった。実際、カチオン性又は特定の担体分子を利用してＲＮＡ又はｓｉＲＮＡを細胞内部位に送達するために、多大な努力が払われてきた。これは、ＲＮＡ又はｓｉＲＮＡを薬物として単独で投与しても、エフェクターが細胞内に十分に局在できないためである（Jeong等, Bioconjug. Chem. 20: 5, 2009）。
【００４７】
原理的には、薬物送達の担体として利用されてきた数多くの公知の高分子化合物が存在する。これらの高分子は、高分子骨格又は樹状骨格の化学構造の種類、アニオン性頭部電荷の結合（attachment）、分子量及び完全な直鎖又は超分岐構造から広がる分岐度の点で相違する可能性がある。このような化学的性質の高分子骨格は、多分散分子量分布をもたらす重合から生じ得るし、所定の構造及び分子量のデンドリマーを理論的に生じるように合成され得る。十分に研究された具体例には、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）、ポリリシン（ＰＬ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）があり、これら全ては、直鎖又は分岐鎖構造の多分散ポリマーとして、又は所定の化学構造のデンドリマーとして合成される。高分子実体（例えば、ＰＡＭＡＭ、ＰＥＩ、ＰＬ及びその他）の細胞取り込みの一般的なメカニズムが、上記したようなエンドサイトーシス経路に基づくことは、当業者に公知である。高分子薬物送達に関するさらなる情報は、以下の文献に見出すことができる：Saovapakhiran等, Bioconjug. Chem. 20: 693, 2009; Seib等, J. Contr. Release 1 17: 291 , 2007, Nori等, Adv Drug Deliv Rev. 57: 609, 2005, Haag等, Angew. Chem. Int. Ed. 45: 1198, 2006.
【００４８】
驚くべきことに、硫酸化ポリオールの化合物群の樹状ポリアニオン性高分子が、特異的なメカニズムにより、細胞内に選択的に局在することが見出された。同一分子量であるが硫酸基を有しないポリオールは、ヒトＡ５４９肺癌細胞に局在しなかった。特に、硫酸基を有せず、したがってポリオール骨格の遊離のヒドロキシル基のみを有する、５ｋＤａ〜２０８ｋＤａの範囲の様々な分子量の超分岐樹状ポリグリセリンを、ヒトＡ５４９肺癌細胞への細胞内取り込みを比較測定するために、蛍光カルボシアニン色素（ＩＣＣ）で標識した。本発明者は、驚くべきことに、複数の硫酸基を有しない場合、分子量１２０ｋＤａ以上の高分子のみがエンドサイトーシスによってヒトＡ５４９肺癌細胞に取り込まれることを見出した。さらに、分子量２０ｋＤａ以下で硫酸基を有しない超分岐樹状ポリグリセリンは、エンドサイトーシスによって細胞膜を通過しない（実施例７，図２）一方、分子量２０ｋＤａ以下の硫酸化ポリグリセリンは細胞内に局在する。これは、明らかに、硫酸化樹状ポリグリセリンが、細胞内に取り込まれるので、硫酸かされていないものと比較して有利であることを示す。
【００４９】
さらに、高分子担体上にアセンブリされた複数の硫酸基の数がある値よりも小さいとき、オリゴマー硫酸エステル（sulfate）が細胞内局在を示さないこと、及びＮＦ−κＢに対する十分な（reasonable）結合親和性を有しないことが見出された。シアニン色素に結合した、グリセロールをベースとする分岐硫酸化デンドリマー（４個の硫酸エステルを有する第１世代、８個の硫酸エステルを有する第２世代、１６個の硫酸エステルを有する第３世代）は、全てのケースにおいて、ＩＣ５０＞１０００ｎＭというＮＦ−κＢに対する結合親和性を示した（本発明の実施例１１）。それによって、ポリマー又は樹状担体骨格上の複数の硫酸基の多価アセンブリが、細胞局在並びに転写因子ＮＦ−κＢ及びＡＰ−１の結合という驚くべき新たな特性をもたらす重要な因子であること、並びに、最小数の硫酸基が必要であることを導き出すことができる。したがって、硫酸化ポリグリセリン及び硫酸化ポリグリセリン複合体が呈する硫酸基の個数は、好ましくは１０個よりも多く、好ましくは１５個よりも多く、さらに好ましくは２０個よりも多く、そして最も好ましくは２５個よりも多い。
【００５０】
したがって、アニオン電荷が高分子に複数存在するようにアセンブリされると、アニオン電荷が、細胞内部への特異的な担体として作用することができるとともに、増殖及びタンパク質合成の細胞内ターゲッティングに関するエフェクター機能を発揮することができることは、新規かつ進歩性のある特性である。さらに詳細には、アニオン性硫酸基は、高分子担体分子上に共有結合しており、これによって、細胞局在、転写因子ＮＦ−κＢ及びＡＰ−１の結合、並びにＴＧＦ−β合成の阻害という上記の驚くべき新たな特性がもたらされる。本発明において、エンドサイトーシスのプロセスを通じて細胞内に局在させることができる、高分子特性よりも小さな分子サイズを有する硫酸化ポリグリセリン（硫酸基を有しないポリグリセリンでは、細胞内に局在するために、より大きい分子量が要求される；上記参照）は、エンドサイトーシスが関与しない細胞への特異的なメカニズムによって、特異的に輸送されることが見出された。具体的には、分子量２０ｋＤａ未満の硫酸化ポリグリセリンを使用した輸送メカニズムの研究により、これまで知られていなかった、有機アニオン性高分子の流入ポンプ（influx pump）に関する証拠が示された。流入ポンプは、増殖及び活性化細胞に特異的に存在する。
【００５１】
生理的ｐＨ範囲でポリアニオン性の性質を示すポリマー又はデンドリマーが、スルホネート、スルフェート、ホスホネート、ホスフェート、カルボキシレートとなり得る。これらの基の高分子への人工的導入は汎用性があり、ポリオールのヒドロキシル基を硫酸塩に変換してポリ硫酸塩を生じるための合理的な方法である。反応条件によって、変換度が決定される（詳細については下記参照）。硫酸化ポリグリセリンは、最初は、新しいクラスのポリアニオン性高分子としてＴｕｒｋ等の文献に記載された（Bioconjugate Chemistry 15, 2004, 162-167）。ＷＯ２００８／０１５０１５には、凝集を阻害することが見出された様々な物質が記載されている。この先行技術文献には、細胞内局在、並びにＮＦ−κＢ及びＡＰ−１に対する選択的結合、並びにＴＧＦ−β放出の阻害に関する示唆はない。
【００５２】
ナフタレン二硫酸塩（二硫酸化ナフタレン）に結合したポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）又はポリリシン骨格をベースとするポリアニオン性デンドリマーは、ＨＩＶ予防のための殺菌性薬物候補として知られている（McCarthy等, Molecular Pharmaceutics 2005, 2, 312-318; Witvrouw等, Molecular Pharmacol. 2000, 58, 1 100-1 108）。この化合物は、ウイルス粒子の細胞膜上の受容体をターゲッティングする。ヒト細胞株において細胞内ターゲットまで到達し得ることは、これらのデータから導き出せない。ＥＤ５０濃度の２５００倍以上の濃度において、細胞透過性が観察されたことは、細胞浸潤の非特異的メカニズムを示す。
【００５３】
さらに、ポリアニオン性ポリオールが、診断及び治療エフェクター分子の標的細胞への送達に適しており、したがって、治療薬の担体として機能することが、驚くべきことに見出された。ＷＯ９３０１８７９３には、内皮細胞への送達のためのポリアニオン性薬物複合体の調製が記載されている。ＷＯ９３０１８７９３に概説された具体例は、内皮細胞の標的化送達に使用するためのヘパリン薬物複合体の調製に関する。
【００５４】
ヘパリン薬物複合体が内皮細胞膜に結合する根拠が示されている。ヘパリン薬物複合体が、内皮細胞の細胞質への薬物送達に適することは何ら記載されていない。ＷＯ９３０１８７９３に沿って、本発明者は、ヘパリンが通常の（relevant）濃度では細胞膜を通過せず、診断エフェクターを細胞へ送達しないことを見出した。ヘパリンは、７ｋＤａ〜３０ｋＤａの範囲の分子量を有するが、それはエンドサイトーシス細胞内取り込みに必要なサイズを下回る。さらに、本発明の実験結果により確認されたところによると、ヘパリンは、細胞内部に局在することができない（本発明の実施例８）。
【００５５】
さらに詳細には、本発明に係る治療エフェクターは、阻害作用又は毒性作用を標的細胞に対して直接的又は間接的に誘導することができる分子である。増殖及び活性化に必要不可欠な細胞内標的に結合する治療エフェクターは、直接的エフェクターである。本発明者は、驚くべきことに、硫酸化ポリグリセリン類のうち、ポリアニオン性ポリオールが、ＮＦ−κＢ及びＡＰ−１への強力な結合により、細胞内に強力かつ持続的に蓄積することを見出した（実施例８）。対照的に、硫酸基を有しないポリオールは、インキュベーション停止後、細胞の細胞質から速やかに排除される（実施例７）。つまり、本発明者は、驚くべきことに、ポリアニオン性ポリオールが細胞内標的分子に高アフィニティーで結合し、これにより迅速排除を抑制することを見出した。見出されたこの驚くべき特性は、ポリオール系担体骨格に結合した複数の硫酸基が直接的治療効果を発揮し、したがって硫酸基が本発明に係る直接的エフェクターであることを示す。本発明者は、ＮＦ−κＢに対するこれらのエフェクターが、ＴＧＦ−βの合成を極めて効果的に阻害することを明らかにした（実施例１０）。ＴＧＦ−βは自己免疫疾患，敗血症，ＳＩＲＳ，線維症，癌及び循環器疾患の主要なメディエーターであるので、究極の治療効果が観察され得る。
【００５６】
明らかにされた上記特性に基づいて、硫酸化ポリオールは、追加的な診断及び治療エフェクター分子の細胞への送達に最適であることが見出された。本発明に係るこれらの間接的な治療エフェクターは、ＮＦ−κＢ及びＡＰ−１の活性阻害とは無関係に、細胞に対して追加的な阻害作用又は毒性作用を誘導することができる分子である。したがって、ポリアニオン性ポリオールの特性は、治療及び診断エフェクターを細胞へ送達し、対応する治療及び診断分子単独の場合よりも持続する細胞への蓄積及び取り込みを示すことである。治療及び診断分子は、ポリグリセリン類のうち硫酸化ポリオールに共有結合し、したがって、硫酸化ポリグリセリンと治療及び診断エフェクターとの複合体を生じる。
【００５７】
したがって、上記に概説した知見から、本発明は、活性化細胞の増殖及びタンパク質合成に関連する細胞内分子をターゲッティングするためのポリアニオン性高分子の使用を含む。特定の態様では、ポリオールに結合した多数の硫酸基が、増殖及び活性化細胞の細胞質及び核を特異的にターゲティングする。このターゲッティングは、エンドサイトーシスの公知の細胞取り込みメカニズムと根本的に異なるし、あらゆる細胞型で生じることが知られている高分子の取り込みとも根本的に異なることが見出された。本発明により、ポリアニオン性高分子が、エンドサイトーシス経路を下回る分子量で効果的であるとともに、活性化及び増殖細胞に対して選択的であることが示される（実施例８及び実施例９）。
【００５８】
当業者は、活性化細胞を、代謝活性が増加している細胞と理解する。活性化細胞は、ＭＴＴ−アッセイにより特徴付けることができる。さらに、細胞活性化は、様々な細胞型（例えば、単離された末梢血単核細胞又は造血細胞株）の上清中の様々な炎症性サイトカインの検出によって示すことができる。したがって、本発明において、活性化細胞は、免疫系細胞又は腫瘍細胞を含む。免疫系細胞は、例えば、単球、マクロファージ又はリンパ球であり得る。
【００５９】
上記知見に基づいて、本発明は、一般式：
Ｐ(ＯＳＯ3-Ｍ+)n(Ｌ−Ｇ−Ｅ)m
［式中、
Ｐは、複数のヒドロキシル基が硫酸基ＯＳＯ3-Ｍ+で置換されており、硫酸基の数が好ましくはｎ＞１０である高分子であり、
Ｍは、アニオン性硫酸基に対するカチオン性無機又は有機対イオンであり、
Ｅは、治療又は診断エフェクター分子であり、
Ｌは、Ｐ及びＥ間のリンカー又はスペーサーであり、
Ｇは、Ｌ及びＥ間の結合のための反応基であり、
ｍは、０−１００である。］
で表される化合物の使用を包含する。
【００６０】
好ましい態様において、本発明は、一般式：
Ｐ(ＯＳＯ3-Ｍ+)n(Ｌ−Ｇ−Ｅ)m
［式中、
Ｐは、複数のヒドロキシル基が硫酸基ＯＳＯ3-Ｍ+で置換されており、ヒドロキシル基の数が好ましくはｎ＞１０であるポリオールであり、
Ｍは、アニオン性硫酸基に対するカチオン性無機又は有機対イオンであり、
Ｅは、治療又は診断エフェクター分子であり、
Ｌは、Ｐ及びＥ間のリンカー又はスペーサーであり、
Ｇは、Ｌ及びＥ間の結合のための反応基であり、
ｍは、０−１００である。］
で表される化合物の使用を包含する。
【００６１】
さらに好ましい態様において、本発明は、一般式：
Ｐ(ＯＳＯ3-Ｍ+)n(Ｌ−Ｇ−Ｅ)m
［式中、
Ｐは、複数のヒドロキシル基が硫酸基ＯＳＯ3-Ｍ+で置換されており、硫酸基の数が好ましくはｎ＞１０であるポリグリセリンであり、
Ｍは、アニオン性硫酸基に対するカチオン性無機又は有機対イオンであり、
Ｅは、治療又は診断エフェクター分子であり、
Ｌは、Ｐ及びＥ間のリンカー又はスペーサーであり、
Ｇは、Ｌ及びＥ間の結合のための反応基であり、
ｍは、０−１００である。］
で表される化合物の使用を包含する。
【００６２】
治療又は診断エフェクター分子が共有結合したポリアニオン性ポリオールは、新規であり、これまで文献に記載されていない。したがって、本発明は、一般式：
Ｐ(ＯＳＯ3-Ｍ+)n(Ｌ−Ｇ−Ｅ)m
［式中、
Ｐは、複数のヒドロキシル基が硫酸基ＯＳＯ3-Ｍ+で置換されており、硫酸基の数が好ましくはｎ＞１０であるポリオールであり、
Ｍは、アニオン性硫酸基に対するカチオン性無機又は有機対イオンであり、
Ｅは、治療又は診断エフェクター分子であり、
Ｌは、Ｐ及びＥ間のリンカー又はスペーサーであり、
Ｇは、Ｌ及びＥ間の結合のための反応基であり、
ｍは、１−１００である。］
で表される化合物を包含する。
【００６３】
治療又は診断エフェクター分子との共有結合のためのリンカーユニットが共有結合したポリアニオン性ポリオールは、新規であり、これまで文献に記載されていない。したがって、本発明は、一般式：
Ｐ(ＯＳＯ3-Ｍ+)n(Ｌ−Ｇ)m
［式中、
Ｐは、複数のヒドロキシル基が硫酸基ＯＳＯ3-Ｍ+で置換されており、硫酸基の数が好ましくはｎ＞１０であるポリオールであり、
Ｍは、アニオン性硫酸基に対するカチオン性無機又は有機対イオンであり、
Ｅは、治療又は診断エフェクター分子であり、
Ｌは、Ｐ及びＥ間のリンカー又はスペーサーであり、
Ｇは、Ｌ及びＥ間の結合のための反応基であり、
ｍは、１−１００である。］
で表される化合物を包含する。
【００６４】
さらに好ましい態様において、本発明は、一般式：
Ｐ(ＯＳＯ3-Ｍ+)n(Ｌ−Ｇ−Ｅ)m
［式中、
Ｐは、複数のヒドロキシル基が硫酸基ＯＳＯ3-Ｍ+で置換されており、硫酸基の数が好ましくはｎ＞１０であるポリグリセリンであり、
Ｍは、アニオン性硫酸基に対するカチオン性無機又は有機対イオンであり、
Ｅは、治療又は診断エフェクター分子であり、
Ｌは、Ｐ及びＥ間のリンカー又はスペーサーであり、
Ｇは、Ｌ及びＥ間の結合のための反応基であり、
ｍは、１−１０である。］
で表される化合物を包含する。
【００６５】
治療又は診断エフェクター分子との共有結合のためのリンカーユニットが共有結合した硫酸化ポリグリセリンは、新規であり、これまで文献に記載されていない。したがって、本発明は、一般式：
Ｐ(ＯＳＯ3-Ｍ+)n(Ｌ−Ｇ)m
［式中、
Ｐは、複数のヒドロキシル基が硫酸基ＯＳＯ3-Ｍ+で置換されており、硫酸基の数が好ましくはｎ＞１０であるポリグリセリンであり、
Ｍは、アニオン性硫酸基に対するカチオン性無機又は有機対イオンであり、
Ｌは、Ｐ及びＥ間の共有結合のためのリンカー又はスペーサーであり、
Ｇは、Ｌ及びＥ間の結合のための反応基であり、
ｍは、１−１００である。］
で表される化合物を包含する。
【００６６】
硫酸基の可能な数ｎは、高分子の分子量に依存する。特定の態様において、高分子は、グリセロール単位の繰り返し単位からなり、各単位が高分子中の１個のＯＨ基をグリセロール単位のために利用可能であるポリグリセリンをベースとする。例えば、理論上の単分散分子として算出すると、１０，０００ｇ／ｍｏｌのポリグリセリンコアは１３５個のＯＨ基を利用可能であり、２，０００ｇ／ｍｏｌのポリグリセリンコアは２７個のＯＨ基を利用可能である（さらに下記説明を参照のこと）。
【００６７】
一実施形態をさらに詳細に記載すると、本発明の化合物は、
ａ）１〜１０００個のＯＨ基、好ましくは１〜４個のＯＨ基を有するポリヒドロキシ化合物である多機能性出発分子上に、式：(ＲＯ−ＣＨ2)2ＣＨ−ＯＲで表されるグリセロールの繰り返し単位を有する高分子ポリグリセリンコアであって、ＲがＨ又はさらに別のグリセロール単位であり、コアの分岐度が０〜６７％、好ましくは２０〜６７％、さらに好ましくは６０％を上回り、平均分子量が５００〜１，０００，０００ｇ／ｍｏｌ、好ましくは２，０００〜２０，０００ｇ／ｍｏｌ、さらに好ましくは４，０００〜１５，０００ｇ／ｍｏｌ、最も好ましくは７，０００〜１０，０００ｇ／ｍｏｌである前記高分子ポリグリセリンコア、
ｂ）前記グリセロール単位の複数のＯＨ基の、−ＯＳＯ3Ｈ又は−ＯＳＯ3-Ｍ+による置換であって、−ＯＳＯ3Ｈ又は−ＯＳＯ3-Ｍ+の数が１６よりも大きく、得られる硫酸化度Ｘが３０〜１００％であり、Ｍ+がカチオン性無機又は有機対イオンである前記置換、
ｃ）１，０００〜５，０００，０００ｇ／ｍｏｌ、好ましくは４，０００〜５０，０００ｇ／ｍｏｌ、さらに好ましくは６，０００〜３０，０００ｇ／ｍｏｌ、最も好ましくは１０，０００〜２０，０００ｇ／ｍｏｌという、得られる硫酸化ポリグリセリンの平均分子量、
を含む硫酸化ポリグリセリンである。
【００６８】
本発明において、「分岐度」とは、重合プロセス間において、グリセロール単位の利用可能な両方のＯＨ基と、２つの追加的なモノマー分子（アニオン重合の場合にはグリシドール）との反応によって得られた分岐の程度を意味する。分岐度０は、グリセロール単位の両方のＯＨ基に結合したグリセロール単位を有しない完全に直線状のポリグリセリンを意味する。分岐度６７％（２／３）は、理論上達成可能な高度分岐ポリグリセリンの最大値であり、グリセロール単位の全てのＯＨ基が２つの追加的なグリセロール単位と反応したことを意味する。本発明において、２０〜６７％の分岐度を有する高分子ポリグリセリンコアが使用される。好ましくは、高度分岐構造が使用され、それは、好ましくは３０〜６７％の分岐度を有し、さらに好ましくは５０〜６７％の分岐度を有し、特に好ましくは６０％を越える分岐度を有する。
【００６９】
高分子ポリグリセリンコアは、グリシドールの開環重合間において、（多）官能性の出発分子（starter molecule）又は開始剤を使用することにより製造される。出発分子又は開始剤は、１〜１，０００個、好ましくは１〜１００個、さらに好ましくは１〜１０個、最も好ましくは１〜４個のＯＨ基を有するポリヒドロキシ化合物である。出発分子は、一般式Ｒ−(ＯＨ)x［式中、Ｒは、アニオン重合の条件下で安定である限り、いかなる分子であってもよく、ｘは１〜１，０００、好ましくは１〜１００、さらに好ましくは１〜１０、最も好ましくは１〜４である。］で表される。好ましくは、使用される開始剤は、三官能性又は四官能性の開始剤であり、例えば、１,１,１−トリスヒドロキシメチルプロパン（ＴＭＰ）又は１,１,１−トリスヒドロキシメチルエタン（ＴＭＥ）が好ましい三官能性開始剤として挙げられ、ペンタエリスリトール（ＰＥ）が好ましい四官能性開始剤として挙げられる。出発分子又は開始剤は、追加的な官能基を有していてもよく、具体的には、例えば、ＳＨ基、ＮＨ2基が挙げられる。特定の態様において、出発分子は、ＯＨ基及び／又は追加的なヘテロ官能基（例えば、適当な保護基で誘導体化されたＳＨ，ＮＨ2）を含有する。その他の出発分子としては、３個を超える、好ましくは１０個を超える、さらに好ましくは２０個を超えるＯＨ基を有する小さなポリグリセリン重合体が挙げられる。さらなる好適な開始剤、ヘテロ官能基及び保護基は、当業者に公知である。
【００７０】
本発明において、「ポリグリセリンコア」という用語は、重合プロセスによって多官能性出発分子上に生じる式：(ＲＯ−ＣＨ2)2ＣＨ−ＯＲで表されるグリセロールの繰り返し単位からなる高分子を意味する。したがって、コアは、遊離ヒドロキシル基及び元素Ｃ，Ｈ，Ｏのみを含む。コア分子量は、例えば、質量分析（ＭＡＬＤＩ）によって測定することができる。コアは、さらなる誘導体化又は官能基化を受けて、本発明の化合物を生じる。このような官能基化には、当業者に公知の適当な試薬を用いた硫酸化が含まれ、また、リンカー分子の共有結合が含まれる。好ましくは、ＳＯ3及びピリジンの複合体が、硫酸化試薬として使用される。この試薬は、−ＯＨ基を−ＯＳＯ3Ｈ又は−ＯＳＯ3-Ｎａ+基に変換する。硫酸化試薬は、好ましくは、所望の硫酸化度に対応する濃度で使用される。使用される硫酸化試薬の濃度が、高分子ポリグリセリンコアの変換されるべきＯＨ基に対して、等モル又はそれよりも大きなモル当量であることを意味する。したがって、生じる官能基化、すなわち硫酸化は、ポリグリセリンのＯＨ基に対するＳＯ3の比によって調節可能である。
【００７１】
本発明において、「硫酸化度」は、高分子ポリグリセリンコアのグリセロール単位において、ＯＨ基の総数に対する、官能基化（硫酸化）されたＯＨ基のパーセンテージを意味する。官能基化は、グリセロール単位の１又は２以上のＯＨ基の、−ＯＳＯ3Ｈ又は−ＯＳＯ3-Ｍ+基による置換、あるいは、グリセロール単位の１又は２以上のＯＨ基への、−ＯＳＯ3Ｈ又は−ＯＳＯ3-Ｍ+基を有するオリゴマースペーサーの結合によって生じる。
【００７２】
カチオン性対イオンＭ+は、無機アルカリ金属であるナトリウム，カリウム，リチウム，カルシウムから選択されるか、あるいは、有機カチオン性化合物であるメグルミン，リシン，グリシン，又はそれらの混合物から選択される。好ましくは、−ＳＯ3-Ｎａ+基を生じるナトリウムである。
【００７３】
ポリオール、特にポリグリセリンに関して、本発明によって提供されるデータは、ポリマーの分子量及びヒドロキシル基の硫酸化度というパラメーターが、細胞内標的に対する結合アフィニティーの向上に重要であることを示す。驚くべきことに、硫酸化度の増加及び分子量の増加の両方が、ＮＦ−κＢに対する結合アフィニティーを増加させることが見出された。この増加は予想外であり、当該分子の新規な特性を強く示唆する。したがって、好ましい硫酸化ポリグリセリンは、コアの分子量が３，０００ｇ／ｍｏｌより大きく，さらに好ましくは６，０００ｇ／ｍｏｌより大きく，さらに一層好ましくは１０，０００ｇ／ｍｏｌより大きいポリグリセリンである。好ましい硫酸化度は、３８％より大きく、さらに好ましくは５０％より大きく、さらに一層好ましくは７６％より大きく、さらに一層好ましくは８６％より大きく、最も好ましくは９０％より大きい。好ましい値及び１００％という達成可能な最大度は、＋／−５％での硫黄の元素分析による測定の一般的な標準誤差に基づくと理解される。
【００７４】
開始剤及び重合条件の選択に応じて、高分子ポリグリセリンコアは、分岐度及び任意に調節可能な平均分子量（これは、規定の分子量ではなく、分子量範囲に広がる分布である）に達する。このいわゆる多分散性は、多分散指数（ＰＤＩ）によって表すことができる。ＰＤＩは、Ｍｗ／Ｍｎとして定義され、ここで、Ｍｗは重量平均分子量であり、Ｍｎは数平均分子量である。高度硫酸化ポリグリセリンの多分散指数は、好ましくは２．３未満、さらに好ましくは１．８未満、最も好ましくは１．５未満である。ポリグリセリンコアの記述で用いられる平均分子量は、数平均分子量Ｍｎである。
【００７５】
硫酸化反応は、上記のように、当業者に公知である。硫酸化は、好ましくは、三酸化硫黄複合体（ピリジニウム−ＳＯ3，トリメチルアミン−ＳＯ3，トリエチルアミン−ＳＯ3，ジメチルホルムアミド−ＳＯ3）を用いて実施される。硫酸化は、単離されたポリグリセリンに対して実施されるか、あるいは、重合後に、硫酸化試薬を重合反応器に直接添加することにより、一段階で実施される。本発明の硫酸化ポリグリセリンを得るためのこの一段階法は、新規であり、従前の文献に記載されていない。硫酸化度は、硫酸化条件を変更することにより、最高水準よりも向上した。１．２倍過剰の硫酸化試薬を、８０℃以上、好ましくは９０℃以上の反応温度に、少なくとも１８時間の反応時間維持することが、８５％以上の硫酸化度を得る上で好適である。驚くべきことに、分解及び副産物は検出されなかった。
【００７６】
驚くべきことに、硫酸化ポリグリセリンに関して実証されたように、高分子に結合した付加的なリンカーユニットが、化合物の独創的な作用機序及び使用を妨げないことが見出された。実施例１１に示されるように、リンカーによる修飾は、リンカーを有しない硫酸化ポリグリセリンと同一のＩＣ50値で、ＮＦ−κＢに対する結合アフィニティーを生じる。反応性官能基を有する誘導体を生じさせるために、リンカー修飾の後に硫酸化及び脱保護工程を行う合成法を用いることにより、診断及び／又は治療エフェクター分子の効率的な共有結合が可能となることが示された。ＷＯ２００８／０１５０１５には、シグナリング分子を有するポリグリセリン硫酸エステルが記載されているが、適当なリンカー修飾を通じてそのような複合体を得るための合成に関する詳細な情報は記載されていないし、そのような複合体に関する実施例もない。
【００７７】
ＷＯ２００８／０１５０１５には、シグナリング分子に関する化学的な詳細は記載されていないし、適用法に関する技術的な解決手段も記載されていない。さらに、「搭載した（loaded）」又は「結合した（bound to）」という用語が使用されているが、これらを実証する合成化学は記載されておらず、明らかになっていない。
【００７８】
リンカーユニットＬは、ＯＨ基のうちの少なくとも１個に結合した官能基を有するアルキル基であり、官能基Ｇは、付加的な治療又は診断エフェクター分子Ｅに結合する潜在力がある。本発明において、リンカーは少なくとも１個のＯＨ基に結合し、それにより、エーテル，カルボキシルエステル，スルホニルエステル，カルバメート，チオカルバメート，尿素，チオ尿素，トリアゾール結合を形成する。本発明の付加的なリンカーを有するポリグリセリン硫酸エステルは新規であり、従前の文献に記載されていない。
【００７９】
さらに詳細に一実施形態を説明すると、本発明の化合物は、
ａ）１〜１０００個、好ましくは１〜４個のＯＨ基を有するポリヒドロキシ化合物である多機能性出発分子上に、式：(ＲＯ−ＣＨ2)2ＣＨ−ＯＲで表されるグリセロールの繰り返し単位を有する高分子ポリグリセリンＰであって、ＲがＨ又はさらに別のグリセロール単位であり、コアの分岐度が０〜６７％、好ましくは２０〜６７％、さらに好ましくは６０％よりも大きく、平均分子量が５００〜１，０００，０００ｇ／ｍｏｌ、好ましくは２，０００〜２０，０００ｇ／ｍｏｌ、さらに好ましくは４，０００〜１５，０００ｇ／ｍｏｌ、最も好ましくは７，０００〜１０，０００ｇ／ｍｏｌである前記高分子ポリグリセリンＰ、
ｂ）前記グリセロール単位の複数のＯＨ基の、−ＯＳＯ3Ｈ又は−ＯＳＯ3-Ｍ+による置換であって、−ＯＳＯ3Ｈ又は−ＯＳＯ3-Ｍ+基の好ましい数が１０よりも大きく、得られる硫酸化度Ｘが３０〜１００％であり、Ｍ+がカチオン性無機又は有機対イオンである前記置換、
ｃ）１，０００〜５，０００，０００ｇ／ｍｏｌ、好ましくは４，０００〜５０，０００ｇ／ｍｏｌ、さらに好ましくは６，０００〜３０，０００ｇ／ｍｏｌ、最も好ましくは１０，０００〜２０，０００ｇ／ｍｏｌという、得られる硫酸化ポリグリセリンの平均分子量、
ｄ）少なくとも１個から最大１００−Ｘ％までのＯＨ基に結合した官能基Ｇを有するリンカー単位Ｌであって、前記官能基が、さらに別の治療又は診断エフェクター分子と複合化することができ、Ｘが硫酸化度である前記リンカー単位Ｌ
を含むリンカーＰ(ＯＳＯ3-Ｍ+)n(Ｌ−Ｇ−Ｅ)mを有する硫酸化ポリグリセリンである。
【００８０】
好ましくは、式（Ｉ），（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）の硫酸化ポリグリセリンである。
【化１】
0005866301.tif 000002
【００８１】
［式中、
Ｌは、１又は２以上（好ましくは１〜３）の非連続メチレン基がＯ、Ｓ、ＮＨ、Ｃ(Ｏ)ＮＨ、Ｃ(Ｏ)、ＳＯ2、ＳＯ、アリール、エテン及びエチンを含む群から選択される基で置換されていてもよい分岐鎖状又は直鎖状のＣ1-20−アルキル基であり、
Ｇは、−ＯＨ、−ＯＳＯ3Ｈ、−ＯＳＯ3Ｎａ、−ＮＨ2、−Ｎ3、−ＣＯＯＨ、−ＳＨ、−ＳＯ3-及び−Ｃ≡Ｃを含む群から選択され、−ＯＨ、−ＮＨ2、−ＳＨ、−ＣＯＯＨは、当業者に公知の保護基で官能化されてもよい又は官能化されたままであってもよい。］
【００８２】
上記式において、単純化のために、１個のリンカーユニットの化学構造を示し、一例であるグリセロールサブユニットに２個の硫酸基を有する硫酸化ポリグリセリンを略図（球）で示す。その他のグリセロールサブユニットは、それぞれの硫酸化度に由来し、硫酸基に加えて遊離ヒドロキシル基を有することができると理解される。本発明において、リンカーユニットは、ＯＨ基のうち、少なくとも１個から最大１００−Ｘ％（ここで、Ｘは硫酸化度である）までのＯＨ基に結合することができる。
【００８３】
リンカー修飾された硫酸化ポリグリセリンは、高分子に共有結合する診断及び／又は治療エフェクター分子に適用され、エフェクター分子を標的部位に輸送することができる。本発明において、これらのエフェクター分子が間接的エフェクターであるのに対して、複数の硫酸エステルは上記のように直接的エフェクターである。診断エフェクター分子との複合体は、標的特異的取り込みの証拠となる標的組織での蓄積を生じることが示された。実施例８及び９で示されるように、蛍光シアニン色素群の診断エフェクター分子を有する硫酸化ポリグリセリンは、１つのトリグリセロール単位（ＩＣＣ−トリグリセロール）のみに対して複合化した低分子量色素と比較して、細胞における色素の輸送及び結合の向上を生じる。したがって、リンカー修飾された硫酸化ポリグリセリンは、驚くべきことに、独創的な化合物であり、診断及び／又は治療エフェクター分子がポリマーに共有結合する能力に基づいて、間接的治療効果を提供する。診断用複合体の合成は、実施例２〜５にさらに記載されている。
【００８４】
さらに、高分子治療化合物は、本発明の間接的治療効果を示す分子の標的特異的送達のために使用することができる。最新の文献には、高分子を基礎とする様々な複合体が記載されている（Nori等, Adv Drug Deliv Rev. 57: 609, 2005, Haag等, Angew. Chem. Int. Ed. 45: 1198, 2006）。治療エフェクター分子とともに複数の硫酸基を有する高分子、特に、そのようなエフェクター分子を有する硫酸化ポリグリセリンは、上記文献に記載されていない。実施例６及び１７には、細胞増殖抑制剤及びｓｉＲＮＡから選ばれた治療エフェクター分子への共有結合が、細胞内取り込み、並びに、転写因子ＮＦ−κＢ及びＡＰ−１に対する結合、及びＴＧＦ−β合成の阻害に関する独創的な作用機序を通じて、向上した治療効果を誘導することが示される。
【００８５】
一実施形態をさらに詳細に記載すると、本発明の化合物は、式：Ｐ(ＯＳＯ3-Ｍ+)n(Ｌ−Ｇ−Ｅ)mで表される、診断又は治療エフェクター分子を有する硫酸化ポリグリセリン複合体であって、
ａ）１〜１０００個、好ましくは１〜４個のＯＨ基を有するポリヒドロキシ化合物である多機能性出発分子上に、式：(ＲＯ−ＣＨ2)2ＣＨ−ＯＲで表されるグリセロールの繰り返し単位を有する高分子ポリグリセリンＰであって、ＲがＨ又はさらに別のグリセロール単位であり、コアの分岐度が０〜６７％、好ましくは２０〜６７％、さらに好ましくは６０％以上であり、平均分子量が５００〜１，０００，０００ｇ／ｍｏｌ、好ましくは２，０００〜２０，０００ｇ／ｍｏｌ、さらに好ましくは４，０００〜１５，０００ｇ／ｍｏｌ、最も好ましくは７，０００〜１０，０００ｇ／ｍｏｌである前記高分子ポリグリセリンＰ、
ｂ）前記グリセロール単位の複数のＯＨ基の、−ＯＳＯ3Ｈ又は−ＯＳＯ3-Ｍ+による置換であって、−ＯＳＯ3Ｈ又は−ＯＳＯ3-Ｍ+基の好ましい数が１０以上であり、得られる硫酸化度Ｘが３０〜１００％であり、Ｍ+がカチオン性無機又は有機対イオンである前記置換、
ｃ）１，０００〜５，０００，０００ｇ／ｍｏｌ、好ましくは４，０００〜５０，０００ｇ／ｍｏｌ、さらに好ましくは６，０００〜３０，０００ｇ／ｍｏｌ、最も好ましくは１０，０００〜２０，０００ｇ／ｍｏｌという、得られる硫酸化ポリグリセリンの平均分子量、
ｄ）少なくとも１個から最大１００−Ｘ％までのＯＨ基に結合した官能基Ｇを有するリンカー単位Ｌであって、前記官能基が、さらに別の治療又は診断エフェクター分子と複合化することができ、Ｘが硫酸化度である前記リンカー単位Ｌ、
ｅ）１から可能な最大数までの前記官能基に共有結合した診断及び／又は治療エフェクター分子であって、前記診断エフェクター分子が、蛍光色素及び放射性又は常磁性金属のキレート剤からなる群より選択され、前記治療エフェクター分子が、細胞増殖抑制剤、抗血管新生薬、光増感剤及びｓｉＲＮＡからなる群より選択される前記診断及び／又は治療エフェクター分子
を含む硫酸化ポリグリセリン複合体である。
【００８６】
好ましくは、ヘテロ原子官能基Ｇを利用して、診断及び／又は治療エフェクター分子Ｅと共有結合反応した、式（ＩＶ）、（Ｖ）又は（ＶＩ）で表される、リンカー単位Ｌを有する誘導体である。
【化２】
0005866301.tif 000003
【００８７】
分岐度、硫酸化度及びリンカーユニットは、上記した通りであり、本発明において適宜使用される。球状の硫酸化ポリグリセリンの説明は、上記した通りである。
【００８８】
本発明において、診断エフェクター分子は、蛍光色素又は放射性若しくは常磁性金属を有するキレート剤からなる群から選択され、治療エフェクター分子は、細胞増殖抑制剤、抗血管新生剤、光増感剤、ｓｉＲＮＡからなる群より選択される。
【００８９】
蛍光色素群から選択された診断機能を有するエフェクター分子（Ｅ）に関し、当該分子は、ＵＶ／可視（４００−８００ｎｍ）又は近赤外(７００−１０００ｎｍ）スペクトル域で蛍光発光する蛍光色素を含む。好ましくは、診断機能を有する光学的エフェクター分子は、ＮＢＤ，フルオレセイン，ローダミン，ペリレン色素，クロコニウム色素，スクアリリウム色素，ポリメチン色素，インドカルボシアニン色素，インドジカルボシアニン色素，インド トリカルボシアニン色素，メロシアニン色素，フタロシアニン，ナフタロシアニン，トリフェニルメチン色素，クロコニウム色素，スクアリリウム色素，ベンゾフェノキサジン色素，ベンゾフェノチアジン色素及びそれらの誘導体を含む群から選択される。さらに好ましくは、診断機能を有する光学的エフェクター分子は、ポリメチン色素，インドカルボシアニン色素，インドジカルボシアニン色素，インドトリカルボシアニン色素，メロシアニン色素，フタロシアニン，ナフタロシアニン，トリフェニルメチン色素，クロコニウム色素，スクアリリウム色素及びそれらの誘導体を含む群から選択される。さらに一層好ましくは、診断機能を有する光学的エフェクター分子は、インドカルボシアニン，インドジカルボシアニン，インドトリカルボシアニン色素及びそれらの誘導体を含む群から選択される。具体例は、Ｃｙ７，Ｃｙ５．５，Ｃｙ３，ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒＤｙｅｓ，インドシアニングリーン（ＩＣＧ）である。本発明で使用することができる、診断機能を有する光学的エフェクター分子を導く合成経路の具体例は、"Topics in Applied Chemistry: Infrared absorbing dyes" Ed. M. Matsuoka, Plenum, N.Y. 1990, "Topics in Applied Chemistry: The Chemistry and Application of Dyes", Waring等, Plenum, N.Y., 1990, J. Org. Chem. 60: 2391-2395 (1995), Lipowska等, Heterocyclic Comm. 1 : 427-430 (1995), Fabian等, Chem. Rev. 92: 1197 (1992), WO 96/23525, Strekowska等, J. Org. Chem. 57: 4578-4580 (1992), Bioconjugate Chem. 16: 1275-128 (2005), Lee et al., J. Org. Chem. 73: 723 (2008)に記載されている。
【００９０】
最も好ましくは、診断機能を有する光学的エフェクター分子は、図２０に示すインドシアニングリーン（ＩＣＧ）及びその誘導体の構造要素を含む蛍光色素である。ここで、ＩＣＧの誘導体は、好ましくは、構造的に次のように記載される。
ａ）インドール窒素における、１又は２のスルホブチル鎖の、Ｃ1-6アルキル−Ｒ2による任意的な置換［ここで、Ｒ2は、−ＯＨ，−ＣＯＯＨ，−ＯＳＯ3Ｈ，−ＯＳＯ3Ｎａ，−ＮＨ2，−Ｎ3，−ＣＯＯＨ，−ＳＨ，又は−Ｃ≡Ｃである。］、及び／又は
ｂ）ポリメチン鎖の、中心炭素原子に残基Ｒ3を有する置換ポリメチン鎖による置換［ここで、隣接する２個の炭素原子は、ポリメチン鎖の３個の炭素原子と一緒になって５−又は６−員環を形成してもよく、Ｒ3は、−Ｃ1-6アルキル−Ｒ2，−Ｓ−Ｃ1-6アルキル−Ｒ2，−Ｏ−Ｃ1-6アルキル−Ｒ2，−フェニル−Ｃ1-6アルキル−Ｒ2，−フェニル−Ｒ2，−Ｓ−フェニル−Ｃ1-6アルキル−Ｒ2，−Ｓ−フェニル−Ｒ2，−Ｏ−フェニル−Ｃ1-6アルキル−Ｒ2，−Ｏ−フェニル−Ｒ2，−フェニル−ＮＨ−Ｃ1-6アルキル−Ｒ2，−フェニル−ＮＨＲ2，−Ｓ−フェニル−ＮＨ−Ｃ1-6アルキル−Ｒ2，−Ｓ−フェニル−ＮＨＲ2，−Ｏ−フェニル−ＮＨ−Ｃ1-6アルキル−Ｒ2，−Ｏ−フェニル−ＮＨＲ2を含む群より選択され、Ｒ2は上記の通りであり、Ｃ1-6アルキルの１−２個の炭素原子は、カルボニル基で置換されていてもよい。］、及び／又は
ｃ）外部ベンズインドール環の、−ＳＯ3-Ｎａ+，−ＣＯＯＨ又は−ＯＨから独立して選択される１又は２以上の基Ｒ4による置換。
【００９１】
さらに好ましくは、ポリメチン鎖は、中央炭素原子に上記の残基Ｒ3を有し、Ｒ4は、Ｈ又は１若しくは２の−ＳＯ3-Ｎａ+基であり、Ｒ2は、−ＣＯＯＨ又は−ＳＯ3-Ｎａ+であり、隣接する２個の炭素原子は、ポリメチン鎖の３個の炭素原子と一緒になって、５−又は６−員環を形成してもよい（図２０ｂ）。
【００９２】
最も好ましいＩＣＧ誘導体は、図２０ｃによって規定され、残基Ｒ3は、−Ｓ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＯＯＨ，−フェニル−ＣＯＯＨ，−フェニル−ＣＨ2−ＣＯＯＨ，−フェニル−ＣＨ2ＣＨ2−ＣＯＯＨ，−フェニル−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−ＣＯＯＨ，−フェニル−ＮＨ2，−フェニル−ＮＨ（ＣＯ）−ＣＨ2ＣＨ2−ＣＯＯＨ，−フェニル−ＮＨ（ＣＯ）−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−ＣＯＯＨ［ここで、フェニルにおける置換はパラ位である。］である。さらに別の実施形態は、中間炭素に残基Ｒ3を有するペンタメチン鎖を有する誘導体である（図１７ｄ）。
【００９３】
最も好ましいＩＣＧの誘導体は、６個のスルホン酸基を図２０ｃ−ｄに示す反応性リンカーとともに含む誘導体であり、スルホン酸基に基づく最も高い親水性を有する。ＩｇＧ及びＦａｂ抗体の標識化は、抗体の機能性に影響を与えることなく、かつ複合体の沈降を生じることなく、標識率（labeling ratio）＞３で可能であることが示された。これらの結果とは対照的に、４個以下のスルホン酸基を含むＩＣＧ誘導体との複合体は、溶液中での安定性が低下し、沈降及び複合体の機能低下を生じる。本発明に関するシアニン色素は、本発明に係る硫酸化ポリグリセリンに共有結合したエフェクターとして使用される（実施例３，図５）。
【００９４】
さらに別の態様では、エフェクター分子（Ｅ）の少なくとも１つが、放射性核種と、テトラアザシクロドデカンキレート及び大環状又は開鎖アミノカルボン酸から選択されたキレート構造とを含む放射性標識複合体である。好ましくは、放射性標識複合体は、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ’’’−四酢酸（ＤＯＴＡ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−三酢酸（ＤＯ３Ａ）、ｌ−オキサ−４，７，１０−トリアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−三酢酸（ＯＴＴＡ）、１，４，７− トリアザシクロノナン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−三酢酸（ＮＯＴＡ）、トランス（１，２）−シクロヘキサンジエチレントリアミン−五酢酸（ＣＤＴＰＡ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’−ジエチレントリアミン−五酢酸（ＤＴＰＡ）、エチレンジアミン−四酢酸（ＥＤＴＡ）、Ｎ−（２−ヒドロキシ）エチレンジアミン三酢酸、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、Ｎ，Ｎ−ジ（２−ヒドロキシエチル）グリシン及びそれらの誘導体を含む群から選択されたキレート剤と、90Ｙ，99mＴｃ，111Ｉｎ，47Ｓｃ，67Ｇａ，51Ｃｒ，177mＳｎ，67Ｃｕ，167Ｔｍ，97Ｒｕ，188Ｒｅ，177Ｌｕ，199Ａｕ，203Ｐｂ，141Ｃｅ，86Ｙ，94mＴｃ，110mＩｎ，68Ｇａ，64Ｃｕから選択された放射性核種とを含む。さらに好ましくは、放射性標識複合体は、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸（ＤＯＴＡ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−三酢酸（ＤＯ３Ａ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’−ジエチレントリアミン−五酢酸（ＤＴＰＡ）を含む群から選択され、放射性核種は、90Ｙ，99mＴｃ，111Ｉｎ，68Ｇａ，86Ｙ，64Ｃｕから選択される。さらに一層好ましくは、放射性標識複合体は、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸（ＤＯＴＡ）であって、１個の酢酸がＧとの共有結合のための反応構造を用いて１個の酢酸がアミドに修飾されたもの（式Ｉ−ＩＩＩ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−三酢酸（ＤＯ３Ａ）であって、ヒドロキシエチル基を有する１個の窒素がＧとの共有結合のための反応構造で置換されたもの（式Ｉ−ＩＩＩ）を含む群から選択され、放射性核種は、111Ｉｎ，68Ｇａ，86Ｙ，64Ｃｕから選択される。治療的に活性な放射線を放出する（radioemission）放射性同位体（例えば、β放射線を放出する放射性核種）が選択されたとき、放射性同位体によって、診断機能及び治療機能が付与され得ると理解される。錯体形成化学は、基本的に同一であり、放射線放射（radioemission）の種類に依存しない。本発明において、β放射線を放出する放射性同位体は、好ましくは90Ｙである。イメージング及び放射線治療のための放射性標識は、当業者に公知である。次の文献も参照のこと：Liu等, Adv Drug Deliv Rev. 60: 1347, 2008; Zwanziger等, Curr Pharm Des. 14: 2385, 2008; Maecke, Ernst Schering Res Found Workshop. 49: 43, 2005.
【００９５】
さらに別の態様において、少なくとも１つのエフェクター分子（Ｅ）が、常磁性金属と、テトラアザシクロドデカンキレート及び大環状又は開鎖アミノカルボン酸から選択された錯体構造とを含む複合体である（Kobayashi等, Curr Pharm Biotechnol. 5: 539, 2004）。本発明では、最大５個までのガドリニウム複合体をアジド修飾した硫酸化ポリグリセリンにカップリングする能力が示される（実施例５）。このような特徴的な複合体は、ガドリニウムを活性化細胞の細胞内に高度に送達できるので、磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）の造影剤として使用される。したがって、常磁性金属は、好ましくはガドリニウム(Gd3+)であり、錯体構造は、１個の酢酸が、Ｇとの共有結合のための反応構造を用いてアミドに修飾された１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸（ＤＯＴＡ）（式Ｉ−ＩＩＩ），Ｇとの共有結合のための反応構造で置換されて、１個の窒素がヒドロキシエチル基を有する１，４，７，１０テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−三酢酸（ＤＯ３Ａ）（式Ｉ−ＩＩＩ）を含む群から選択される。
【００９６】
さらに別の好ましい態様において、エフェクター分子（Ｅ）は、ＵＶ／可視（４００−８００ｎｍ）又は近赤外（７００−１０００ｎｍ）スペクトル域（実施例６ａ）での励起後に光線治療効果を有する光増感剤を含む、治療機能を有するエフェクター分子である。さらに好ましくは、光増感剤は、テトラピロール，ポルフィリン，サッフィリン，クロリン，テトラフェニルポルフィリン，テトラフェニルクロリン，バクテリオクロリン，テトラフェニルバクテリオクロリン，フェオホルビド，バクテリオフェオホルビド，ピロフェオホルビド，バクテリオピロフェオホルビド，プルプリンイミド，バクテリオプルプリンイミド，ベンゾポルフィリン，フタロシアニン，ナフタロシアニン及びそれらの誘導体を含む群から選択される。さらに一層好ましくは、光増感剤は、フェオホルビドａ，ピロフェオホルビドａ，３−アセチルフェオホルビドａ，３−アセチルピロフェオホルビドａ，プルプリン−１８−Ｎ−アルキルイミド，プルプリン−１８−Ｎ−ヒドロキシルイミド，３−アセチルプルプリン−１８−Ｎ−アルキルイミド，３−アセチルプルプリン−１８−Ｎ−ヒドロキシルイミド，クロリンｅ６，Ｓｎ−クロリンｅ６，ｍ−テトラヒドロキシフェニルクロリン（ｍ−ＴＨＬＣ）及びベンゾポルフィリン誘導体，ベンゾポルフィリン誘導体一酸（ＢＰＤ−ＭＡ，ベルテポルフィン）を含む群から選択される。さらに一層好ましくは、光増感剤は、フェオホルビドａ，ピロフェオホルビドａ，３−アセチルフェオホルビドａ，３−アセチルピロフェオホルビドａ，プルプリン−１８−Ｎ−アルキルイミド，プルプリン−１８−Ｎ−ヒドロキシルイミド，３−アセチルプルプリン−１８−Ｎ−アルキルイミド，３−アセチルプルプリン−１８−Ｎ−ヒドロキシルイミド及びクロリンｅ６，ベンゾポルフィリン誘導体，ベンゾポルフィリン誘導体一酸（ＢＰＤ−ＭＡ，ベルテポルフィン）を含む群から選択される。最も好ましくは、光増感剤は、フェオホルビドａ，ピロフェオホルビドａ，プルプリン−１８−Ｎ−アルキルイミド，プルプリン−１８−Ｎ−ヒドロキシルイミド及びクロリンｅ６，ベルテポルフィンを含む群から選択される。
【００９７】
本発明で使用可能な光増感剤の合成経路の具体例は、文献に記載されている（ＷＯ２００３／０２８６２８，ＵＳ２００５／００２０５５９，Zheng G等, J Med Chem 2001, 44, 1540-1559；Li G等, J. Med. Chem. 2003, 46, 5349-5359；Lunardi CN等, Curr Org Chem 2005, 9, 813-821；Chen Y等, Curr Org Chem 2004, 8, 1 105-1 134）。
【００９８】
さらに別の好ましい態様において、必要に応じて、少なくとも１個のエフェクター分子（Ｅ）は、抗腫瘍薬の部類の治療エフェクター分子、例えば、アルキル化及びアルキル化様抗腫瘍薬（例えば、シスプラチン，カルボプラチン，オキサリプラチン，メクロレタミン，シクロホスファミド，イホスファミド，トロホスファミド，メルファラン，クロランブシル，スルホン酸アルキル，ブスルファン，トレオスルファン，カルムスチン，ロムスチン，ニムスチン，エストラムスチン，ストレプトゾトシン，プロカルバジン，ダカルバジン，テモゾロミド，チオテパ），あるいは、代謝拮抗薬の部類の治療エフェクター分子、例えば、プリン類似体（例えば、６−チオグアニン，ペントスタチン，アザチオプリン，６−メルカプトプリン，フルダラビン，クラドリビン）又はピリミジン類似体（例えば、ゲムシタビン，５−フルオロウラシル）又は葉酸拮抗薬（メトトレキサート），植物アルカロイド及びテルペノイド（例えば、ビンクリスチン，ビンブラスチン，ビノレルビン，ビンデシン等のビンカアルカロイド），ジソラゾール及び誘導体（例えば、ジソラゾールＡ１，Ａ２，Ｅ１，Ｚ），ポドフィロトキシン（例えば、エトポシド及びテニポシド），タキサン（例えば、ドセタキセル，パクリタキセル），トポイソメラーゼ阻害剤（例えば、カンプトテシン誘導体であるイリノテカン及びトポテカン，アムサクリン，エトポシド，リン酸エトポシド，及びテニポシド），抗腫瘍抗生物質（例えば、ダクチノマイシン，ドキソルビシン，ダウノルビシン，エピルビシン，ブレオマイシン，マイトマイシン）である。
【００９９】
別の種類の治療エフェクター分子は、毒素、例えば、アブリン，アルファトキシン，ジフテリア毒素，外毒素，ゲロニン，ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質，リシン，サポニン及び緑膿菌外毒素である。
【０１００】
その他の種類の治療エフェクター分子は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、例えば、ＶＥＧＦ又はＥＧＦｓｉＲＮＡである。ｓｉＲＮＡは、好ましくは、開裂可能な結合（例えば、ジスルフィド結合）を介してポリグリセリン−リンカーに結合している（実施例６ｅ及び実施例２０）。
【０１０１】
好ましい治療エフェクター分子は、パクリタキセル及びクロランブシル，高分子との共有結合の形成に適した官能基を有するその誘導体である。本発明において、複合体の合成に、共有結合のための反応基を有するその前駆誘導体が使用される。好ましい基は、プロパギル，カルボン酸，カルボン酸−ＮＨＳ−エステル，イソチオシアネート，マレイミド，ピリジニウム−ジスルフィドである。最も好ましくは、パクリタキセル−スクシネート−ＮＨＳ−エステル（表１中の式Ｅ２８，Thierry等, J. Am. Chem. Soc. 127 : 1626, 2005）及びクロランブシル−ＮＨＳ−エステル（式Ｅ２５，ＷＯ９６／０２２３０３），パクリタキセル−スクシネート−プロパギルアミド（式Ｅ２７），クロランブシル−プロパギルアミド（式Ｅ２４）である。
【０１０２】
本発明において、エフェクター分子（Ｅ）は、硫酸ポリグリセリン誘導体の少なくとも１個のリンカーの官能基（Ｇ）に結合しており、それにより、エーテル，チオエーテル，カルボン酸エステル，スルホニルエステル，アミド，アミン，カルバメート，チオカルバメート，尿素，チオ尿素，ヒドラゾン，イミン，ジスルフィド，トリアゾール，又はビニル結合を形成する。
【０１０３】
本発明の特定の実施形態は、式：Ｐ(ＯＳＯ3-Ｍ+)n(Ｌ−Ｇ)m
［式中、Ｌは、−Ｏ−であり、ｍは＞１の数であり、Ｇは、ＳＯ3-Ｍ+であり、従って硫酸基を生じる。］
で表される化合物である。上記の通り、硫酸基は、それらが多数アセンブリされて活性化及び増殖細胞への取り込み効果を生じると、直接的エフェクター機能を呈する。Ｍは、好ましくはナトリウムである。
【０１０４】
本発明において、高分子は、上記のように、それに共有結合しているエフェクター分子を活性化及び増殖細胞に輸送することができる。本発明の実施例では、硫酸化ポリグリセリンの生物学的有効性を阻害することなく、エフェクター分子の種類を選択することができることが示されている。本発明の一態様では、硫酸化ポリグリセリンが１−１００個のエフェクター分子に結合している。しかしながら、エフェクター分子の全体の分子量は、硫酸化ポリグリセリンの平均分子量を超えないようにすべきである。したがって、好ましい態様では、１−１０個のエフェクター分子、さらに好ましくは１−５個のエフェクター分子が結合している。硫酸化ポリグリセリンに結合する全エフェクター分子の全体の分子量に対する、硫酸化ポリグリセリンの平均分子量の比は、好ましくは３、さらに好ましくは５、さらに一層好ましくは１０である。
【０１０５】
水溶液への硫酸化ポリグリセリンの溶解度は高く、＞２００ｍｇ／ｍＬである。脂溶性エフェクター分子は、水性媒体に溶解しないが、硫酸化ポリグリセリンへの結合によって溶液中に組み入れることができる。驚くべきことに、パクリタキセルとの複合体（実施例６ｂ）は、＞１００ｍｇ／ｍＬの水溶解度を示す。したがって、エフェクター複合体の全体の水又は水性緩衝液（ｐＨ範囲６．０〜８．５）に対する溶解度は、好ましくは＞５０ｍｇ／ｍＬであり、さらに好ましくは＞１００ｍｇ／ｍＬである。
【０１０６】
複数の硫酸基がアセンブリされた高分子は、硫酸化ポリグリセリンに関して示されるように、細胞内転写因子ＮＦ−κＢに、ＩＣ５０値１０ｎＭ未満で結合し（実施例１１）、ＴＧＦβ放出を阻害する（実施例１０）。したがって、本発明の好ましい実施形態は、複合体としての硫酸化ポリグリセリン及びポリグリセリンであって、実施例１１に記載の結合アッセイにおけるＮＦ−κＢに対する結合性は、ＩＣ５０５０ｎＭよりも良好であり、さらに好ましくは２０ｎＭよりも良好であり、最も好ましくは１０ｎＭよりも良好である。
【０１０７】
反応性エフェクター分子に関する好ましい具体例は、高分子、特に基Ｇ（式Ｉ−ＩＩＩ）、に対して共有結合可能な前駆体であり、表１に示される。
【０１０８】
【表１−１】
0005866301.tif 000004
【０１０９】
【表１−２】
0005866301.tif 000005
【０１１０】
【表１−３】
0005866301.tif 000006
【０１１１】
【表１−４】
0005866301.tif 000007
【０１１２】
【表１−５】
0005866301.tif 000008
【０１１３】
【表１−６】
0005866301.tif 000009
【０１１４】
【表１−７】
0005866301.tif 000010
【０１１５】
【表１−８】
0005866301.tif 000011
【０１１６】
硫酸化ポリグリセリンの合成は、上記のように、当業者に公知である。リンカー誘導体の合成は、１又は２以上の追加的な合成ステップを含む。一般的には、リンカーは、ポリグリセリンの１又は２以上のＯＨ基との反応により、ポリグリセリンコアに共有結合している。ＯＨ基との反応は、適当な求電子リンカー前駆体を反応溶液にグリシドールモノマーの１〜５０ｍｏｌ％の量で加えることにより、重合反応間にin situで達成される。また、ＯＨ基との反応は、単離ポリグリセリンを使用し、これを適当な塩基で脱プロトン化し、次いで、適当な求電子リンカー前駆体を反応溶液にグリシドールモノマーの１〜５０ｍｏｌ％の量で加えることにより実施される。適当な塩基の具体例としては、水素化ナトリウム、ナトリウムメチラート、炭酸ナトリウム、カリウムｔ−ブチラートが挙げられる。硫酸化は、好ましくは、三酸化硫黄複合体（ピリジニウム−ＳＯ3、トリメチルアミン−ＳＯ3、トリエチルアミン−ＳＯ3、ジメチルホルムアミド−ＳＯ3）を用いて実施される。硫酸化は、分離された ポリグリセリン又はポリグリセリン−リンカー誘導体に対して実施されるか、あるいは、重合の後、硫酸化試薬を重合反応器に直接添加することにより１工程で実施される。
【０１１７】
好適な求電子性リンカー前駆体は、一般式（ＶＩＩ）〜（ＸＩ）で表されるものである。
【０１１８】
【化３】
0005866301.tif 000012
【０１１９】
［式中、Ｌは、１又は２以上（好ましくは１〜４）の非連続メチレン基がＯ、Ｓ、ＮＨ、Ｃ(Ｏ)ＮＨ、Ｃ(ＮＨ2+)ＮＨ、ＳＯ2、ＳＯ、アリール、エテン又はエチンを含む群より選択される基で置換されていてもよい分岐鎖状又は直鎖状のＣ1-20アルキル基であり、Ｇは、−ＯＨ、−ＯＳＯ3Ｈ、−ＯＳＯ3Ｎａ、−ＮＨ2、−Ｎ3、−ＣＯＯＨ、−ＳＨ、−ＳＯ3-及び−Ｃ≡Ｃを含む群より選択され、−ＯＨ、−ＮＨ2、−ＳＨ、−ＣＯＯＨは、必要に応じて、当業者に公知の保護基で官能化されていてもよく、Ｙは、求核置換反応の脱離基（例えば、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、トシレート、メシラート、トリフラート、ノシレート（nosylate））であり、Ｚは、Ｃｌ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、イミダゾイル、ｐ−ニトロフェニルオキシから選択される脱離基である。］
【０１２０】
好ましい求電子性リンカー前駆体は、式ＶＩＩで表されるものであり、１又は２以上（好ましくは１〜４）の非連続メチレン基が−ＣＨ2ＣＨ2Ｏ−単位を生じる基Ｏ及び／又はＣ(Ｏ)ＮＨ、Ｃ(ＮＨ2+)ＮＨ、Ｃ(Ｏ)で置換されていてもよい直鎖状のＣ1-20アルキル基であり、Ｇは、−ＮＨ2、−Ｎ3、−ＣＯＯＨ、−ＳＨを含む群より選択され、これらの基は、必要に応じて、当業者に公知の保護基で官能化されていてもよい。本発明における例示的な構造が、図４に示される。式ＶＩＩの化合物の共有結合は、１個のヒドロキシル基がサブユニットＬ−Ｇで置換された３−炭素グリセロール部分の付加を表すと理解されるべきである。この結果、ヒドロキシル基との反応の際、エポキシド反応性部分の開裂により、リンカーによって、追加的な遊離のヒドロキシル基が全体的なポリマー骨格に対して付加されたポリグリセリンが生じる。エポキシドの開裂により生じた遊離のヒドロキシル基は、適宜、硫酸化に供される（図４の最初の部分を参照）。
【０１２１】
好ましい反応性リンカー前駆体は、Ｎ−２，３−エポキシプロピルフタルイミド，Ｎ−Ｂｏｃ−２，３−エポキシプロピルアミン，Ｎ−Ｃｂｚ−２，３−エポキシプロピルアミンである。
【０１２２】
特に好ましいリンカーは、アミノ基をイミノチオラン（トラウト試薬（Traut's reagent））と反応させることにより得られ、これにより、 yielding a リンカーユニット−ＮＨ−Ｃ(ＮＨ2+)−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＳＨが生じる。リンカー前駆体化合物の化学構造は、表２に示される。
【０１２３】
【表２−１】
0005866301.tif 000013
【０１２４】
【表２−２】
0005866301.tif 000014
【０１２５】
本発明の化合物は、例えば、医薬として使用される場合、１又は２以上の本発明の化合物と薬学的に許容され得る担体とを含む医薬組成物の形態で提供することができる。
【０１２６】
好ましくは、これらの医薬組成物は、単位投与剤形（例えば、錠剤，丸薬，カプセル，粉末，顆粒，滅菌非経口溶液又は懸濁液）を有する。その他の剤形は、当業者に公知である。別の態様では、本発明の化合物と、薬学的に許容され得る公知の担体及び／又は賦形剤とを含む固形製剤である。薬学的に許容され得る担体及び／又は賦形剤は。所望の投与経路（例えば、皮下，静脈内，腹腔内）に応じて、様々な形態をとることができる。好適な担体及び賦形剤は、当業者に公知であり、当業者が適宜選択し得る。担体としては、例えば、不活性医薬品賦形剤（例えば、結合剤、懸濁剤、潤滑剤、香味剤、甘味料、防腐剤、着色剤及びコーティング剤）が挙げられる。
【０１２７】
特に好ましい態様は、凍結乾燥物の剤形である。驚くべきことに、水性媒体又は緩衝液に溶解した硫酸化ポリグリセリンの溶液は、凝集物を形成し、保存時間の増加とともにより凝集物が増大する傾向を示すことが見出された。薬学的に許容され得る添加剤を含有する凍結乾燥固形物から溶液への迅速な再構成は、凝集物又は凝集物の増大を生じないことが見出された。再構成は、投与前に行うことができる。好ましい添加剤は、凍結防止化合物（抗凍結剤又は凍結保護剤（lyoprotectant））、例えば、スクロース，マンノース又はトレハロースであり、これらは、単独で使用してもよいし、混合物として使用してもよいし、その他の公知の結合剤，懸濁剤，緩衝剤，潤滑剤，香味剤，甘味料，防腐剤，着色剤及びコーティング剤と組み合わせて使用してもよい。
スクロース，マンノース又はトレハロースは、本発明の硫酸化ポリグリセリン及びその複合体の量の好ましくは１−１００倍，さらに好ましくは５−２０倍の量で使用される。最も好ましくは、トレハロースの５−２０倍量での使用（例えば、１０ｍｇの薬物に対して１００ｍｇのトレハロース）である。
【０１２８】
実施例２１は、水溶液中のＩＣＧ誘導体及び硫酸化ポリグリセリンの複合体（複合体Ｐ１７／Ｅ１）の蛍光経時変化を示す。蛍光強度の減少は、凝集及びそれに伴って生じる蛍光消光の進行度を示す。驚くべきことに、上記添加剤を用いて凍結乾燥薬物から新たに調製された溶液は、試験された時間（約１時間）内で凝集を生じないことが見出された。したがって、本発明によって、独創的な硫酸化高分子、好ましくは硫酸化ポリグリセリン、リンカーを有する硫酸化ポリグリセリン、及びエフェクター分子を有するその複合体の凍結乾燥物が提供される。
【０１２９】
医薬又は医薬組成物は、治療有効量の１の薬物又は幾つかの薬物、治療有効量の１又は２以上の本発明の化合物を含む。当業者は、治療すべき疾患に基づいて、そして患者の状態を考慮して、治療有効量を決定することができる。医薬又は医薬組成物は、好適には、約５〜１０００ｍｇ、好ましくは約１０〜５００ｍｇの本発明の化合物を含有することができる。
【０１３０】
本発明の化合物の投与経路は、好ましくは、非経口、例えば、皮下，静脈内，腹腔内，眼内，筋肉内，腫瘍内である。さらに好ましい投与経路は、静脈内及び皮下である。驚くべきことに、様々な動物疾患モデル（実施例１３，１４，１５）において、毎日の投与（皮下）を最大３０日まで繰り返しても、処置の間を通じて、毒性は観察されず、有害事象も生じなかった。したがって、本発明は、化合物の複数回投与により癌，炎症，自己免疫疾患及び線維症を含む群から選択される疾患を治療するための、硫酸化ポリグリセリンの使用及び硫酸化ポリグリセリンとエフェクター分子との複合体の使用を包含する。複数回投与は、２回以上の投与による処置を意味し、例えば、毎日の処置、２日〜７日ごとの処置、１日２回以上の処置、５日間隔等の時間間隔での処置が含まれる。さらに具体的には、本発明は、皮下投与量１０ｍｇ／ｋｇ〜１０００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは２０ｍｇ／ｋｇ〜５００ｍｇ／ｋｇ、さらに好ましくは５０ｍｇ／ｋｇ〜２００ｍｇ／ｋｇ体重での患者の複数回処置を包含する。さらに、本発明は、静脈内投与量１ｍｇ／ｋｇ〜２００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１０ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、さらに好ましくは２０ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ体重での患者の複数回処置を包含する。
【実施例】
【０１３１】
実施例１：硫酸化ポリグリセリンの合成による、増殖及びタンパク質合成の細胞内ターゲッティングのためのポリアニオン性多価高分子の調製
【０１３２】
実施例１ａ：グリシドールのアニオン重合による、樹状ポリグリセリン中心部の調製
Bioconjugate Chemistry 15, 2004, 162-167; Advanced Materials 12, 2000, 235-239; Macromolecules 32, 1999, 4240に従って、樹状ポリグリセリンを得、特性決定する。
異なる平均分子量の様々な高分子材料を、異なる出発分子（１，１，１−トリス（ヒドロキシメチル）プロパン（ＴＭＰ）、１，１，１−トリス（ヒドロキシメチル）エタン（ＴＭＥ）及びペンタエリスリトール（ＰＥ））から得、硫酸化反応に供する。
【０１３３】
実施例１ｂ：高度硫酸化ポリグリセリンの合成
硫酸化ポリグリセリンを、Bioconjugate Chemistry 15, 2004, 162-167の実験に関する記載に基づいて合成する。高度の硫酸化を達成するために、文献記載の方法を改良する。ＳＯ3／ピリジン複合体を、９０℃下、１．２倍モル過剰で加え、９０℃下での攪拌を１８時間継続する。透析及び限外ろ過（ＭＷカットオフ２０００）によって精製を行う。硫酸化度を元素分析によって測定する。全ての化合物はナトリウム塩として得られる（表３）。
所望の硫酸化度は、反応混合物中の硫酸化試薬を規定モル比で使用することによって調節することはできない。なぜなら、その反応性は、試薬の性質、純度及び製造元（origin）、並びに使用される出発物質に依存するからである。しかしながら、過剰の硫酸化試薬を使用することにより、９０％を上回る硫酸化度が保証される一方、それよりも少ない硫酸化試薬、好ましくは０．６〜１モル当量を使用することにより、５０〜９０％の硫酸化度の産物が得られる。
表３は、実施例１ｂで得られた硫酸化ポリグリセリンを示す。
【０１３４】
【表３】
0005866301.tif 000015
【０１３５】
実施例１ｃ：硫酸化ポリグリセリンの合成に関する一般的な「一段階」法
反応は、攪拌装置を備えたリアクターで実施する。装置全体を減圧下で乾燥し、乾燥アルゴンをフラッシュする。乾燥工程は４回繰り返す。Ａｃｒｏｓからのグリシドール（純度＞９６％）をＣａＨ2とともに一晩攪拌し、４５℃及び１ｍｂａｒで蒸留する。フラクション１（グリシドール使用量は５％）は、ダイマー／トリマーからなる。フラクション２は、所望の純グリシドールである。蒸留されたグリシドールは、冷蔵庫に保管し、乾燥条件下でのみ開く。ＴＭＰ（２．６８ｇ，２０ｍｍｏｌ）をリアクターに加え、減圧下、６０℃で融解する。アルゴン雰囲気下、ＫＯｔＢｕ（１ＭのＴＨＦ溶液，６ｍＬ）を加え、沈殿物をＮＭＰの添加により溶解する。混合物を１２０℃に加熱し、２時間攪拌して、ｔ−ブチルアルコールを除去する。グリシドール（１００ｇ，１．３５ｍｏｌ）を、ドーシングポンプ（dosing pump）で１８時間かけて加えた２２５ｍＬの無水ＴＨＦ（比１：２．５）に溶解する。混合物を９０℃に冷却し、２００ｍＬの無水ＤＭＦで希釈する。ピリジン−ＳＯ3複合体（２１５ｇ，１．３５ｍｏｌ）を固体として加え、さらに５０ｍＬの無水ＤＭＦを加える。２４時間の攪拌後、３５０ｍＬの水を、別のフラスコ中の反応混合物に加え、混合物を２Ｍ  ＮａＯＨで中和し、ｐＨを約９−１０とする。蒸発乾固の後、結晶性固体をジエチルエーテル中で攪拌し、ＮＭＰを除去する。限外ろ過（水，標準的セルロース膜；ＭＷＣＯ１０００）によって精製を行う。高減圧下での蒸発乾固の後、生成物が淡黄色無定形固体として得られる。
【０１３６】
実施例２：エフェクター分子の共有結合のためのリンカーを有する硫酸化ポリグリセリンの合成による、増殖及びタンパク質合成の細胞内ターゲッティングのためのポリアニオン性高分子担体分子の調製
実施例２ａ：追加の機能性リンカーユニットが重合反応の過程で結合した樹状ポリグリセリンコアの合成のための一般的方法：
改良した重合合成を、文献記載の合成（Bioconjugate Chemistry 15, 2004, 162-167）に基づいて実施する。モノマー反応パートナーであるグリシドールの添加が終了した後、脱プロトン化ヒドロキシル基に結合する反応性リンカー種を添加して、重合反応を６０〜１００℃の温度で継続する。リンカーは、グリシドールに対して１〜５０ｍｏｌ％加え、反応は２〜２４時間継続する。メタノール／アセトンからの沈殿を繰り返し、高減圧下、５０〜８０℃で２４時間、乾燥することにより、粗製ポリマーを得る。この物質が硫酸化反応で使用される。
【０１３７】
実施例２ｂ：実施例化合物Ｐ１４〜Ｐ２５を生じる、分離したポリグリセリン材料を用いた第２の合成段階を通じて、エーテル結合を介するリンカーの結合のための一般的方法
実施例１ａで得られた樹状ポリグリセリンを、透析（水，ＭＷＣＯ３０００）により精製し、減圧濃縮し、高減圧下（０．０５ｍｂａｒ）、６０℃で２４時間、乾燥する。１ｇのポリグリセリンを、６０℃下、無水ＤＭＦ（２０ｍＬ）に溶解し、水素化ナトリウム（リンカーで誘導体化される１個のＯＨあたり２．５モル当量）で処理した後、８０℃で１８時間、攪拌する。次いで、ブロマイド又はトシレート脱離基あるいはエポキシド反応基（表２）を含む等モル量のリンカーのＤＭＦ溶液を８０℃で加え、溶液をさらに１８時間攪拌する。メタノールの添加により生成物を急冷し、アセトンで沈殿させ、減圧下で乾燥し、メタノールで２日間透析（ＭＷＣＯ１０００）した後、高減圧下、６０℃で乾燥する。
【０１３８】
実施例２ｃ：実施例化合物Ｐ２６及びＰ２７を生じる、分離したポリグリセリン材料を用いた第２の合成段階を通じて、カルバメート結合を介するリンカーの結合のための一般的方法
実施例１で得られた樹状ポリグリセリンを、透析（水，ＭＷＣＯ３０００）により精製し、減圧濃縮し、高減圧下（０．０５ｍｂａｒ）、６０℃で２４時間、乾燥する。１ｇのポリグリセリンを無水ＤＭＦ（２０ｍＬ）に溶解する。この溶液に、カルボニルジイミダゾール（ＣＤ１；リンカーで誘導体化される１個のＯＨのあたり５モル当量）を加え、溶液を２４時間攪拌する。次いで、アセトンを加えて活性化ポリグリセリンを沈殿させる。残渣を１５ｍＬのＤＭＦに溶解し、ＬＰ１２（１個のＯＨあたり１．５当量；全体では１２当量；表２参照）のＤＭＦ溶液を加え、混合物を室温でさらに１８時間攪拌する。生成物をアセトンで沈殿させ、減圧下で乾燥し、メタノールで２日間透析（ＭＷＣＯ２０００）した後、高減圧下、６０℃で乾燥する。
【０１３９】
実施例２ｄ：実施例２ａ−ｃの化合物の硫酸化による、リンカーを有する硫酸化ポリグリセリンの合成
Bioconjugate Chemistry 15, 2004, 162-167及び実施例１ｂに従って、反応を実施する。透析及び限外ろ過により精製を行う。硫酸化度を元素分析により決定する。全ての化合物はナトリウム塩として得られる（表４）。
表４は、実施例２ａ−ｄ（保護基の切除前）で得られた、リンカーを有するポリグリセリン硫酸エステルＰ１４〜Ｐ２７及び実施例２ｅで得られたＰ２８を示す。
【０１４０】
【表４】
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【０１４１】
保護基を除去するために、以下の方法を適用することができるが、これに限定されるわけではない。Ｂｏｃ−保護アミノ基，tブチルエステル，tブチル−保護化ヒドロキシル基，ＴＨＰ−保護化ヒドロキシル基：１００ｍｇのポリマーを５ｍＬのトリフルオロ酢酸／水（１：２）に溶解し、室温で２時間、攪拌する。溶媒を減圧留去し、残渣を繰り返しジクロロメタンで処理し、エバポレーションする。次いで、５ｍＬの水を加える。１Ｍ  ＮａＯＨ溶液の添加により、溶液のｐＨを８に調節する。蒸留水を用いた限外ろ過により、最終産物の精製を行う。
【０１４２】
フタルイミド−保護化アミノ基：１００ｍｇのポリマーを５ｍＬのメタノール／水（１：１）に溶解し、この溶液にヒドラジン一水和物（１ｍＬ）を加える。溶液を室温で４時間攪拌する。溶媒を減圧留去し、残渣を繰り返しジクロロメタンで処理し、エバポレーションする。次いで、５ｍＬの水を加える。１Ｍ  ＮａＯＨ溶液の添加により、溶液のｐＨを８に調節する。水を用いた限外ろ過により、最終産物の精製を行う。
【０１４３】
水素化ホウ素ナトリウム及び酢酸を用いてフタルイミド基を脱保護する第２の方法が実施例２ｅに記載されている。
カルボベンジルオキシ(Ｃｂｚ)−保護化アミノ基，ベンジル及びジベンジル−保護化アミノ基，ベンジルエステル：１００ｍｇのポリマーを１０ｍＬのメタノール／水（９：１）に溶解し、この溶液に１０ｍｇの１０％Ｐｄ／Ｃ触媒を加える。溶液を、水素下、３ｍｂａｒで２４時間、攪拌する。混合物をセライトでろ過し、溶媒を減圧留去し、残渣を繰り返しジクロロメタンで処理し、エバポレーションする。次いで、５ｍＬの水を加える。１Ｍ  ＮａＯＨ溶液の添加により、溶液のｐＨを８に調節する。蒸留水を用いた限外ろ過により、最終産物の精製を行う。
【０１４４】
アジド基のアミノ基への還元：１００ｍｇのポリマーを２０ｍＬのＴＨＦ／水（１：１）に溶解し、この溶液に、１個のアジド基あたり５ｍｏｌ当量のトリフェニルホスフィンを加える。溶液を、アルゴン下、室温で４８時間、攪拌する。溶媒を減圧留去し、残渣を水に再懸濁し、沈殿物をろ別し、廃棄する。次いで、水溶液を、蒸留水を用いた限外ろ過に供する。
【０１４５】
実施例２ｅ：リンカー前駆体誘導体Ｎ−(２，３−エポキシプロピル)フタルイミド（ＬＰ２）を用いた、リンカーを有する硫酸化ポリグリセリンの合成のための「一段階」法
反応を、攪拌装置を備えたリアクターで実施する。装置全体を減圧乾燥し、乾燥アルゴンをフラッシュする。乾燥工程を４回繰り返す。Ａｃｒｏｓからのグリシドール（純度＞９６％）をＣａＨ2とともに一晩攪拌し、４５℃及び１ｍｂａｒで蒸留する。フラクション１（グリシドールの使用量は５％）は、ダイマー／トリマーからなる。フラクション２は、所望の純グリシドールである。蒸留したグリシドールを冷蔵庫に保管し、乾燥条件下でのみ開く。ＴＭＰ（２．６８ｇ，２０ｍｍｏｌ）をリアクターに加え、減圧下、６０℃で融解する。アルゴン雰囲気下、ＫＯｔＢｕ（１ＭのＴＨＦ溶液，６ｍＬ）を加え、ＮＭＰを加えて沈殿物を溶解する。混合物を１２０℃に加熱し、２時間攪拌して、ｔ−ブチルアルコールを除去する。グリシドール（１００ｇ，１．３５ｍｏｌ）を、ドーシングポンプで１８時間かけて加えた２２５ｍＬの無水ＴＨＦ（比１：２．５）に溶解する。Ｎ−（２，３−エポキシプロピル）フタルイミド（２７．４ｇ，１３５ｍｍｏｌ）を、加熱により、シリンジを用いて７０分かけて加えた５５ｍＬの無水ＴＨＦに溶解し、一晩攪拌する。混合物を９０℃に冷却し、２００ｍＬの無水ＤＭＦで希釈する。ピリジン−ＳＯ3複合体（２１５ｇ，１．３５ｍｏｌ）を固体として加え、さらに５０ｍＬの無水ＤＭＦを加える。２４時間の攪拌後、３５０ｍＬの水を、別のフラスコ中の反応混合物に加え、混合物を２Ｍ  ＮａＯＨで中和し、ｐＨを約９〜１０にする。蒸発乾固の後、結晶性固体をジエチルエーテル中で攪拌し、ＮＭＰを除去する。限外ろ過（水，標準的セルロース膜；ＭＷＣＯ１０００）により精製を行う。高減圧下での蒸発乾固の後、生成物が淡黄色無定形固体として得られる。
【０１４６】
化合物例Ｐ２８について、ピリジン−ＳＯ3複合体の添加前に除去されたプローブ（probe）をＧＰＣ分析（溶離液：水，標準物質：プルラン）すると、Ｍｎは５，５００ｇ／ｍｏｌであり、多分散指数が１．４である。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにより、平均で４〜５個のフタルイミドリンカーのサンプルの測定を可能とする。硫酸化により、その度数は８８％となる。１０ｇ（約１３，０００ｇ／ｍｏｌ）の硫酸化中間体を、水素化ホウ素ナトリウム(１．５ｇ）水溶液２５ｍＬを用いて室温で５時間処理することにより、脱保護を実施する。この混合物に酢酸（５ｍＬ）を加えた後、８０℃で３時間攪拌する。限外ろ過（飽和ＮａＣｌ，次いで蒸留水，標準的セルロース膜；ＭＷＣＯ２０００）により精製を実施し、これにより８ｇの硫酸化アミノポリグリセリンが白色無定形固体として得られる。
【０１４７】
実施例３：硫酸化ポリグリセリンと、シアニン色素の種類から選択される診断エフェクター分子（Ｅ）との複合体の合成
【０１４８】
実施例３ａ：イソチオシアネートシアニン色素（Ｅ３）とアミノ修飾硫酸化ポリグリセリンＰ１４との反応による、シアニン色素複合体の生成
２００ｍｇのＰ１４を実施例２ｄに従ってヒドラジンで脱保護し、これにより透析後に１６０ｍｇの物質が得られる。この１６０ｍｇのポリマーＰ１４を１ｍＬの酢酸ナトリウム緩衝液（１００ｍＭ）に溶解し、イソチオシアネートシアニン色素Ｅ３（３当量）を用いて４０℃で２４時間処理する。水を用いた限外ろ過（標準的セルロース，ＭＷＣＯ３０００）により未反応色素を分離して生成物を精製した後、凍結乾燥する。
生成物：１４０ｍｇの緑色無定形固体（図５参照）。
【０１４９】
実施例３ｂ：プロパギルシアニン色素（Ｅ２）とアジド修飾硫酸化ポリグリセリンＰ２６との反応による、シアニン色素複合体の生成
ポリマーＰ２６（３０ｍｇ）及び色素Ｅ２（５．５ｍｇ）を０．６ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；ｐＨ７．４）及び０．２ｍＬのメタノールの混合物に溶解する。この混合物に、ＣｕＳＯ4五水和物（ＰＢＳ中に１２ｍｇ／ｍＬ）及び０．１ｍＬのアスコルビン酸ナトリウム（ＰＢＳ中に３．８ｍｇ／ｍＬ）を含む０．１ｍＬの溶液を加える。この溶液を、激しく振盪しながら、遮光下、４０℃で５日間、インキュベーションする。蒸留水を用いた限外ろ過（標準的セルロース，ＭＷＣＯ４０００−６０００）の後、サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０）を実施することにより、精製を実施する。凍結乾燥により、緑色固体（１９ｍｇ）が得られる（図５参照）。
【０１５０】
実施例３ｃ：プロパギルシアニン色素Ｅ５（Sisson等, Angew. Chem. Int. Ed. 48: 7540-7545, 2009）とアジド修飾硫酸化 ポリグリセリンＰ１７との反応による、シアニン色素複合体の生成
ポリマーＰＩ７（３０ｍｇ）及び色素Ｅ５（５ｍｇ）を、０．４ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；ｐＨ７．４）及び０．４ｍＬのエタノールの混合物に溶解する。この混合物に、０．１ｍＬのＣｕＳＯ4五水和物溶液（ＰＢＳ中に１２ｍｇ／ｍＬ）及び０．１ｍＬのアスコルビン酸ナトリウム（ＰＢＳ中に３．８ｍｇ／ｍＬ）を加える。この溶液を、激しく振盪しながら、遮光下、４０℃で５日間、インキュベーションする。メタノールを用いた限外ろ過（標準的セルロース，ＭＷＣＯ４０００−６０００）及び分取ＨＰＬＣ（ＲＰ１８，水）を組み合わせて精製を実施することにより、生成物は、直ちに溶離したピークとして得られる。凍結乾燥により、１８ｍｇのインドカルボシアニン（ＩＣＣ）複合体（紫がかった赤の凍結乾燥物）が得られた（図５参照）。実施例３ｂ及び３ｃの反応工程を、ポリマー／色素の組み合わせ（例えば、Ｐ１７／Ｅ１，Ｐ１７／Ｅ２，Ｐ２６／Ｅ１，Ｐ２６／Ｅ５，Ｐ２７／Ｅ１，Ｐ２７／Ｅ２，Ｐ２７／Ｅ５）に基づいて、複合体の調製にさらに適用することができる。
【０１５１】
実施例３ｄ：シアニン色素−ＮＨＳ−エステルＥ７のアミノ修飾硫酸化ポリグリセリンＰ２８との反応による、シアニン色素複合体の生成
２００ｍｇのＰ２８を、ＤＭＦ／水が９：１である混合物（２ｍＬ）に溶解する。この混合物に８６ｍｇのＮＨＳ−エステル色素Ｅ７（４モル当量）を加えた後、室温で４８時間攪拌する。蒸発乾固の後、固体残渣の精製を実施例３ｃに記載したように実施した。凍結乾燥により、１８５ｍｇのインドジカルボシアニン複合体（青色凍結乾燥物）が得られた。
実施例３ｄの反応工程を、Ｐ２８と、色素Ｅ８及び診断及び治療エフェクター分子のその他のＮＨＳエステルとの複合体の調製にさらに適用することができる（実施例４ｂも参照）。
【０１５２】
実施例３ｅ：実施例３ａ−ｄで用いたシアニン色素の合成
プロパギルシアニン色素（Ｅ１）を、フェニルボロン酸前駆体を用いた鈴木反応によるＩＲ−８２０の誘導体化に関するＬｅｅ等の方法（J. Org. Chem. 73 : 723 (2008)）を改良して合成する。本発明では、ＩＲ−８２０を４−カルボキシエチルフェニルボロン酸と反応させ、対応する鈴木−カップリング生成物を得た。アミド形成の公知の工程により、プロパギルアミン及びＨＢＴＵを用いて、Ｅ１への変換を実施した。この工程において、芳香環がスルホン酸基で高度に置換された、ＩＲ−８２０の新規アナログが得られ、その後、鈴木カップリング及びプロパギルアミンを用いたアミド化が実施される（表１中のＥ２−Ｅ４参照）。
【０１５３】
この目的のために、１−（４−スルホナトブチル)−２，３，３−トリメチルベンズインドレニニウム−５，７−ジスルホネート，二ナトリウム塩及び１−（４−スルホナトブチル）−２，３，３−トリメチルベンズインドレニニウム−６−スルホネート，ナトリウム塩を文献記載の方法に従って調製し、その後、Ｎ−［（３−（アニリノメチレン）−２−クロロ−１−シクロヘキセン−１−イル）メチレン］アニリン一塩酸塩を用いて、ＩＲ−８２０アナログへ変換した（Salon等, J. Heterocycl. Chem. 42: 959 (2005)）。
【０１５４】
実施例３ｆ：シアニン色素Ｅｌと硫酸化グリセロールデンドロンとの複合体の合成
合成により、１６個の硫酸基を含む所定のデンドロンとの色素複合体が生じる。実施例３ｂに記載したように、Ｅｌを［Ｇ３．０］−アジド（Wyszogrodzka等, Chemistry 14: 9292 (2008)中の化合物１４）と反応させた。Wyszogrodzka等が記載するように、アセタールの脱保護を実施し、その後、実施例２ｄに従って硫酸化を実施する。ＨＰＬＣ分析により、複合体が収率２５％で得られる。
【０１５５】
実施例４：硫酸化ポリグリセリンと、放射性標識のためのキレート剤／錯化剤の種類から選ばれる診断エフェクター分子（Ｅ）との複合体の合成
【０１５６】
実施例４ａ：プロパギル−ＤＯＴＡ（Ｅ１３）とアジド修飾硫酸化ポリグリセリンＰ１７との反応による、ポリグリセリンキレート剤複合体の生成
ポリマーＰ１７（３０ｍｇ）及びプロパギル−ＤＯＴＡ  Ｅ１３（３ｍｇ）を０．４ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；ｐＨ７．４）及び０．４ｍＬのエタノールの混合物に溶解する。この混合物に、ＣｕＳＯ4五水和物（ＰＢＳ中に１２ｍｇ／ｍＬ）及び０．１ｍＬのアスコルビン酸ナトリウム（ＰＢＳ中に３．８ｍｇ／ｍＬ）を含む０．１ｍＬの溶液を加える。この溶液を、激しく振盪しながら、遮光下、４０℃で５日間、インキュベーションする。水を用いた限外ろ過（標準的セルロース，ＭＷＣＯ４０００−６０００）により精製を実施し、これにより２０ｍｇの複合体が白色固体として得られる（図６）。
【０１５７】
実施例４ｂ：プロパギル−ＤＯ３Ａ（Ｅ１４）とアジド修飾ポリグリセリン硫酸エステルＰ１７との反応による、ポリグリセリンキレート剤複合体の生成
実施例４ａに記載したように、反応を実施する。
さらに、例えば、Ｐ２８及びＥ１２を用いて実施例３ｄの手順に従い、アミノで修飾された硫酸化ポリグリセリンをＤＯＴＡ−ＮＨＳエステルと反応させることにより、ＤＯＴＡキレート剤複合体を得ることができる。
【０１５８】
実施例５：硫酸化ポリグリセリンと、磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）のためのＧｄ3+錯体の種類から選択される診断エフェクター分子（Ｅ）との複合体の合成
【０１５９】
実施例５ａ：プロパギル−Ｇｄ3+ＤＯ３Ａ誘導体（Ｅ１６）とアジド修飾ポリグリセリン硫酸エステルＰ２７との反応による、ガドリニウム錯体を有するポリグリセリン複合体の生成
多数のアジド基（１５％）が、高いエフェクター／ポリマー比を得るために必要となる。ポリマーＰ２７（５０ｍｇ）及び複合体Ｅ１６（３６ｍｇ）を０．８ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；ｐＨ８．５）及び０．４ｍＬのメタノールの混合物に溶解する。この混合物に、ＣｕＳＯ4五水和物（ＰＢＳ中に１２ｍｇ／ｍＬ）及び０．２ｍＬのアスコルビン酸ナトリウム（ＰＢＳ中に３．８ｍｇ／ｍＬ）を含む０．２ｍＬの溶液を加える。この溶液を、２５℃で３日間、激しい振盪下に維持する。水を用いた限外ろ過（標準的セルロース，ＭＷＣＯ４０００−６０００）により精製を実施し、これにより５２ｍｇの複合体が白色固体として得られる。ＩＣＰ−ＭＳによる金属分析により、ポリマー１モルあたりガドリニウム複合体５モルというガドリニウム含量が生じる（図６）
【０１６０】
実施例６：硫酸化ポリグリセリンと、光増感剤、細胞増殖抑制剤又はｓｉＲＮＡから選ばれる種類の治療エフェクター分子（Ｅ）との複合体の合成
【０１６１】
実施例６ａ：マレイミド光増感剤（Ｅ２０）とチオール修飾硫酸化ポリグリセリンとの反応による、光増感剤複合体の生成
ポリマーＰ１６を用いて、硫酸化 ポリグリセリンのチオール−修飾を実施する。５０ｍｇのポリマーＰ１６を、１ｍＬの水／トリフルオロ酢酸中で２時間攪拌した後、エタノールで沈殿させ、次いで、高減圧下で乾燥する。これを０．５ｍＬの１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、１０モル当量の２−イミノチオランを用いて室温で１時間処理する。この混合物に、０．６７ｍＬ（１０モル当量）のマレイミド−ピロフェオホルビド（Ｅ１６）のＤＭＦ溶液（濃縮，２０ｍｇ／ｍＬ）を加える。反応混合物を、４５℃で２４時間、激しく振盪する。混合物をエバポレーションし、残渣を数回、ジクロロメタンで洗浄／遠心することにより、生成物を分離する。分取ＨＰＬＣ（ＲＰ１８，水／メタノール）により最終的な精製を実施し、これにより２０ｍｇの複合体が得られる（図７）。
【０１６２】
実施例６ｂ：クロランブシル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（Ｅ２５）とアミノ修飾硫酸化ポリグリセリンとの反応による、クロランブシル複合体の生成
２００ｍｇのＰ１４を、実施例２ｅに従って、水素化ホウ素ナトリウム／酢酸で脱保護し、これにより透析後に１６０ｍｇの物質が得られる。この１６０ｍｇのポリマーＰ１４を、ＤＭＦ及び５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）の１ｍＬの混合物（９：１）に溶解した。この混合物に、Ｅ２５（１５当量）を加えた後、４０℃で２４時間、激しく攪拌する。混合物をエバポレーションし、残渣を数回、ジクロロメタンで洗浄／遠心することにより、生成物を分離する。1Ｈ−ＮＭＲの芳香族シグナルにより、ポリマー１個あたり平均で約１．８のクロランブシル分子の複合化が判明する（図７）。
同様に、パクリタキセルスクシネートＮＨＳエステル（Ｅ２８）との反応により、ポリマー１個あたり平均で１．２個のパクリタキセル分子が得られる。
【０１６３】
実施例６ｃ：マレイミドパクリタキセル（Ｅ２６）とチオール修飾硫酸化ポリグリセリンとの反応による、パクリタキセル複合体の生成
２−イミノチオランを用いたポリグリセリン硫酸エステルのチオール修飾を、実施例６ａに記載したように実施する。チオール修飾された硫酸化ポリグリセリン（５０ｍｇ／ｍＬ）の溶液に、１０モル当量のマレイミドパクリタキセル（Ｅ２０；１０ｍｇ／ｍＬのＤＭＦ溶液）を加える。反応混合物を、２５℃で２４時間、激しく振盪する。混合物をエバポレーションし、残渣を数回、ジクロロメタンで洗浄／遠心することにより、生成物を分離する。1Ｈ−ＮＭＲの芳香族シグナルにより、ポリマー１個あたり平均で約２個のパクリタキセル分子の複合化が判明する（図７）。
【０１６４】
同様に、クロランブシルマレイミド（Ｅ２２又はＥ２３）との反応により、ポリマー１個あたり平均で２．２個のクロランブシル分子が得られる。
さらに、Ｐ２８及びＥ２８を用いて実施例３ｄの手順に従い、アミノ−修飾された硫酸化ポリグリセリンをパクリタキセル−ＮＨＳエステルと反応させることにより、パクリタキセル複合体が得られ、これにより、ポリマー１個あたり平均で１個のパクリタキセル分子の複合化が生じる。
【０１６５】
実施例６ｄ：マレイミドリンカー誘導体（Ｅ３１）と、チオール修飾硫酸化ポリグリセリンとの反応による、ジアミン白金（ＩＩ）錯体（カルボプラチンアナログ）との複合体の生成
実施例６ａに記載したように、２−イミノチオランを用いたポリグリセリン硫酸エステルのチオール−修飾を実施する。Warnecke等の方法（Bioconjugate Chem. 2004, 15(6), 1348-1359）に従って、カルボプラチンマレイミド（Ｅ３１）を合成する。チオール−修飾された硫酸化ポリグリセリン（５０ｍｇ／ｍＬ）の溶液に、１５モル当量のＥ３１（２０ｍｇ／ｍＬのエタノール溶液）を加え、２５℃で２４時間、反応混合物を激しく振盪する。混合物をエバポレーションし、残渣を数回、ジクロロメタン及びｎ−ブタノールで洗浄／遠心することにより、生成物を分離する。ＩＣＰ−ＭＳにより白金含量を測定する（金属：ポリマー比は２：１）。
【０１６６】
実施例６ｅ：硫酸化ポリグリセリンとｓｉＲＮＡとの複合体の合成
ＶＥＧＦ  ｓｉＲＮＡを、J. Contr. Release 2006, 1 16, 123-129に従って得た。
センス鎖：5'-GGAGUACCCUGAUGAGAUCdTdT-3'
アンチセンス鎖：5'-GAUCUCAUCAGGGUACUCCdTdT-3'-hexylaminom (E32)
【０１６７】
２−ピリジルジスルフィド基を付与するＳＰＤＰを用いた活性化を実施し（J. Contr. Release 2006, 1 16, 123-129）、これにより、チオール−修飾された硫酸化ポリグリセリンとの反応のためのエフェクターＥ３３が得られ、スルフヒドリル交換反応による共有結合が可能となる。実施例６ａに従ってポリマーＰ１６を用いて、アミノ−修飾された硫酸化ポリグリセリンのチオール−修飾を実施する。１０ｍｇのポリマーＰ１６を、１００μＬの水／トリフルオロ酢酸中で２時間攪拌した後、エタノールで沈殿させ、次いで、高減圧下で乾燥した。この物質を、２００μＬの１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解し、室温で１時間、５モル当量の２−イミノチオランで処理する。この溶液にＶＥＧＦ  ｓｉＲＮＡ（１．２モル当量）を加え、室温下、４０℃で２時間、混合物をインキュベーションする。この混合物を、ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）を用いてＮＡＰ１０カラムに通過させた後、細胞培養実験に直接使用する（図７）。
【０１６８】
実施例７：ヒト肺腫瘍Ａ５４９細胞と、異なる分子量の蛍光性ポリグリセリンとのインキュベーション、及びin vitro蛍光イメージング
上皮ヒト肺癌細胞株を、次の通り、常法に従って増殖させた：ＤＥＭＥＭ培養液に、１０％ウシ胎児血清，２％グルタミン及びペニシリン／ストレプトマイシン（全てPAN Biotech社製）を加えた。細胞を、１×１０5細胞／ｍＬで培養液に播種し、５％ＣＯ2下、３７℃で培養し、１週間に２回、１：５に分割した。in vitro蛍光イメージングのために、細胞を、２×１０5細胞／ｍＬで２４ウェル培養プレート（Sigma社製）のカバーガラスに播種し、３７℃で２４時間、培養した。その後、細胞を、インドカルボシアニン（ＩＣＣ）プロパギルエステル（化合物Ｅ５）と複合化した様々な分子量を有する１０-6Ｍ  ポリグリセリンを含有する培養液、又は対照として１０-6Ｍ  ＩＣＣ−トリグリセロール複合体（Angew Chem Int Ed Engl. 48: 7540, 2009）を含有する培養液中、３７℃で１時間、培養した。次いで、細胞を、冷アセトンで固定した。４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ，Ａｂｅａｍ）を用いて核を対比染色した。イメージ獲得を、Ｌｅｉｃａ  ＤＭＲＢ顕微鏡（Ｌｅｉｃａ）を用いて行った。イメージは、デジタルカメラ（Ｓｐｏｔ３２，Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で得た。
低分子量（最大２０ｋＤａまで）のポリグリセリン又はＩＣＣ−トリグリセロール複合体の細胞取り込みは観察されなかった。高分子量（１２０又は２０８ｋＤａ）のポリグリセリンの細胞内局在が判明した。結果を図８に示す。
【０１６９】
実施例８：ヒト肺腫瘍Ａ５４９細胞と蛍光性ポリアニオン性高分子とのインキュベーション、及びin vitro蛍光イメージング
ヒト上皮肺癌細胞株を、常法に従って増殖し、実施例７に記載したように、２４ウェル培養プレート中で処理した。細胞を、１０-6Ｍ  ヘパリン−ＩＣＣ複合体若しくは硫酸化ポリグリセリン−ＩＣＣ複合体（実施例３ｃ）を含有する培養液、又は対照として１０-6Ｍ  ＩＣＣ−トリグリセロール複合体（Angew Chem Int Ed Engl. 48: 7540, 2009）を含有する培養液を用いて、３７℃で４時間、培養した。その後、細胞を冷アセトンで固定した。４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ，Ａｂｅａｍ）を用いて核を対比染色した。イメージ獲得を、Ｌｅｉｃａ  ＤＭＲＢ顕微鏡（Ｌｅｉｃａ）を用いて実施した。イメージは、デジタルカメラ（Ｓｐｏｔ３２，Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で得た。ヘパリン又はグリセロール−ＩＣＣ複合体の細胞取り込みは観察されなかったが、硫酸化ポリグリセリン−ＩＣＣはＡ５４９細胞の細胞質に存在することが判明した。結果を図９に示す。
【０１７０】
実施例９：ＩＣＣ−複合体化した硫酸化ポリグリセリンとインキュベーションした分離ヒト末梢血単核細胞のフローサイトメトリー分析
Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅでの分画遠心分離により、ヒト血液の単核球フラクション由来の細胞を分離し、次いで、１０％ウシ胎児血清を含有するＲＰＭＩ（ＰＡＮ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）で洗浄した。２×１０5細胞／ｍＬの細胞を、２４ウェルプレート中、ＲＰＭＩ培養液、又は１０-6Ｍ  硫酸化ポリグリセリン−ＩＣＣ複合体（実施例３ｃ）を含有する培養液、又は対照として１０-6Ｍ  ＩＣＣ−トリグリセロール複合体（Angew Chem Int Ed Engl. 48: 7540, 2009）を含有する培養液で、４時間、培養した。その後、細胞をＰＢＳで洗浄し、２００μＬ／ウェルのアキュターゼ（ＰＡＡ）で剥がし、ＰＢＳで２回洗浄した。細胞を、４℃で１０分間、５００μＬの３％パラホルムアルデヒドで固定し、２ｍＬのＰＢＳで停止させ、４℃で１０分間、遠心（２５０ｇ）した。上清を除去し、細胞を２００μＬのＰＢＳ（０．５％ウシ血清アルブミン（Ｒｏｔｈ）含有）に懸濁した。固定した細胞を、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ分析装置（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で分析するまで、４℃で保存した。細胞のサイズ及び粒度（前方散乱／側方散乱）の分析により、単球又はリンパ球を同定するとともに、硫酸化ポリグリセリン−ＩＣＣ複合体の取り込みを定量した。単球において、リンパ球よりも約１００倍（hundertfold）大きな量の硫酸化ポリグリセリンが検出された。結果を図１０に示す。
【０１７１】
実施例１０：ＴＧＦβ１放出の阻害
ＣＡＳＫＩ細胞を、次の通り、培養した：１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ），２％グルタミン及びペニシリン／ストレプトマイシン（全てＰＡＮ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を加えたＤＥＭＥＭ培養液を使用した。細胞を、１×１０5細胞／ｍＬで培養液に播種し、５％ＣＯ2下、３７℃で培養し、１週間に２回、１：５に分割した。様々な硫酸化度（３０％，７０％，８６％又は９２％の硫酸化）又は様々な分子量のポリグリセリンコア（２６００又は７５００Ｄａ）を有する硫酸化ポリグリセリンをＣＡＳＫＩ細胞に１０-8Ｍの濃度で４８時間適用した。培養液のみでの培養を対照として用いた。培養上清を採取し、遠心し、−２０℃で保管した。市販のＥＬＩＳＡキット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ）を用いて、培養上清中のＴＧＦβ１含量を検出した。結果を図１１に示す。
【０１７２】
実施例１１：ＳＰＲテクノロジーを用いた、硫酸化ポリグリセリンのＮＦ−κＢ結合
ＢＩＡＣＯＲＥ  Ｘ装置（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて、２５℃で実験を行った。リガンド固定には、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４），１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，３ｍＭ  ＥＤＴＡ及び０．００５％界面活性剤Ｐ２０からなるＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ）を使用した。アッセイには、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液及びランニングバッファーを使用した。κＢ  ＤＮＡ配列モチーフ（下線）のビオチン化一本鎖（５’−ビオチン−ＡＧＴＴＧＡＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＣＡＧＧＣ−３’（フォワード）及び５’−ビオチン−ＧＣＣＴＧＧＧＡＡＡＧＴＣＣＣＣＴＣＡＡＣＴ−３’（リバース））を、ｍｅｔａｂｉｏｎ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＡＧ（Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。３０μＬの両一本鎖溶液（各濃度は１００μＭ）を混合し、８０℃で５分間加熱し、完全なハイブリダイゼーションが可能となるように、ゆっくりと室温まで冷却した。次いで、６０μＬのＨＢＳ−ＥＰ緩衝液をサンプルに加え、ビオチン化プローブを、ストレプトアビジン官能化センサーチップＳＡ（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ）に固定した。参照用として、同じチップの２番目のレーンを空のままにした。性能を高めるために、１Ｍ  ＮａＣｌの５０ｍＭ  ＮａＯＨ溶液を固定開始前に３回連続して１分間インジェクションすることにより、センサーチップを初期調整した。チップにκＢ  ＤＮＡ配列モチーフをローディングしたところ、ベースラインがシフトして１３００レゾナンスユニット（resonance unit）（ＲＵ）を示した。固定工程の後、ランニングバッファーで数回洗浄し、チップ表面を平衡化した。組換えＮＦ−κＢ  ｐ５０タンパク質は、Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）から購入したものである。ＮＦ−κＢタンパク質の最終的な作用濃度（working concentration）は、約２８．６ｎＭであった（モル濃度は、ＮＦ−κＢモノマーの分子量（５０，０００Ｄａ）に基づく）。ローディングの前に、各サンプルを、室温で１８分間、最終的な阻害濃度（inhibitor concentration）を０ｎＭ，０．１ｎＭ，１ｎＭ，１０ｎＭ，１００ｎＭ，１μＭ，１０μＭ又は１００μＭをして、それぞれの硫酸化ポリグリセリン化合物とインキュベーションした（表５参照）。サンプルを、参照及びリガンド（κＢ  ＤＮＡオリゴヌクレオチド）レーンに、流速２０μＬ／分でインジェクションした。各測定サイクルは、１０５秒間のサンプルインジェクション（会合段階），１８０秒間維持される解離段階及び１Ｍ  ＮａＣｌによるフローシステムの洗浄から構成した。データ評価のために、リガンド（κＢ  ＤＮＡ配列）レーンのデータから、参照レーンのデータを差し引いた。サンプルインジェクションの応答を、インジェクションの開始時（０秒）及びat the end of the 解離段階の終了時（２８５秒）にセットされたリポートポイント間で抽出した。最終応答値を、曲線作成に使用した。各データ点は、２つの測定値の平均値（±ＳＥＭ）を表す。結合曲線を図１２に示す。ＩＣ５０値を表５に示す。結合アフィニティーは、ＩＣ５０値の減少によって示される硫酸化度及び分子量の増加に伴って増加する。リンカー及びエフェクター分子は、結合アフィニティーを阻害しな��。デンドロンにアセンブリされた硫酸エステルの数が１６個だけである場合、十分な結合アフィニティーを示さない（Ｇ３．０−デンドロン／Ｅ１）。
表５は、硫酸化ポリグリセリン、リンカーを有する硫酸化ポリグリセリン、及びエフェクター分子との複合体（実施例１，２，３）のＩＣ５０値を示す。
【０１７３】
【表５】
0005866301.tif 000017
【０１７４】
実施例１２：肺腫瘍細胞のin vitro増殖の阻害
肺腫瘍細胞の細胞増殖に対する硫酸化ポリグリセリンの潜在的な効果を試験するために、ヒトＡ５４９細胞株を使用した。Ａ５４９細胞株を、常法に従って、次の通り増殖させた。１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ），２％グルタミン及びペニシリン／ストレプトマイシン（すべてＰＡＮ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を添加したＤＥＭＥＭ培養液を使用した。細胞を、１×１０5細胞／ｍＬで培養液に播種し、５％ＣＯ2下、３７℃で培養し、１週間に２回、１：５に分割した。
【０１７５】
２４ウェルプレートで培養した細胞を用いて、細胞増殖の分析を実施した。２×１０5細胞／ｍＬの培養液１ｍＬを、それに含有される試験物質の濃度を増加させながら、インキュベーションした。培養２日後、アポトーシスのプロセスのパラメーターである細胞数、生存率及び細胞直径を、細胞計数器及び分析システム（ＣＡＳＹ（Ｒ），Ｓｃｈａｒｆｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）で分析した。さらに、細胞代謝活性試験であるＭＴＴアッセイ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミドの細胞還元）により、薬物の影響をin vitroで評価した。すなわち、１ウェルあたり１×１０4個の細胞を、９６ウェルプレートにプレーティングする。１００μＬの培養液を、そこに含有される試験物質の濃度を増加させながら、
培養２日後、１０μＬのＭＴＴ（５ｍｇ／ｍＬのＰＢＳ溶液，Ｓｉｇｍａ社製）を各ウェルに加え、プレートを４時間インキュベーションした。生じたホルマザン生成物を酸イソプロパノールで溶解し、波長５７０ｎｍでの吸光度（Ｅｘ５７０）をマイクロプレート分光光度計（Ａｎｔｈｏｓ  ｈｔｌｌ，Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）で測定した。
硫酸化ポリグリセリン（化合物Ｐ３）を、１０-5Ｍ〜１０-9Ｍの濃度で、Ａ５４９細胞に４８時間適用した。培養液単独での培養を対照として使用した。
結果を図１３に示す。
【０１７６】
実施例１３：腫瘍マウスモデルにおけるin vivo効果
硫酸化ポリグリセリンが、in vivoにおける腫瘍増殖の抑制に有効であるか否かを試験するために、よく知られている肺癌ヌードマウスモデルを使用した。ヒト非小細胞肺癌細胞Ａ５４９（０．７×１０7細胞／マウス）を、無胸腺雄ＮＭＰＪ  ｎｕ／ｎｕ  マウス（Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｅｕｒｏｐｅ）の脇腹に皮下注射した。１日あたり１００μＬのＰＢＳ又は３０ｍｇ／ｋｇ体重の硫酸化ポリグリセリン（化合物Ｐ３）を含む１００μＬs.c.中の投与を、細胞移植後１２−１６，１９−２３及び２６−３０日目に実施した。腫瘍容積を細胞移植後１２〜４４日の間の１０の時点で測定した。腫瘍サイズをキャリパーで測定し、容積を次式に従って計算した：容積（ｃｍ3）＿１／２（Ｚ＿Ｗ２）、Ｌ及びＷは移植腫瘍の長さ（ｃｍ）及び幅（ｃｍ）である。結果を図１４に示す。さらに、薬物処理による毒性及び有害事象の兆候は、マウス処理の間を通じて、観察されなかった。
【０１７７】
実施例１４：コラーゲン誘導化関節リウマチモデルにおける効果
硫酸化ポリグリセリンが関節リウマチの抑制に有効であるか否かを試験するために、実験用コラーゲン誘導性関節リウマチ（ＣＩＡ）をラットに誘導した。ＣＩＡは、ウシＩＩ型コラーゲン及び不完全フロイントアジュバント（ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）のエマルションで雌Ｌｅｗｉｓラットを免疫することにより誘導した。肢の炎症を、２週間後に、肢の容積の増加により評価した。ラットを、疾患の臨床兆候について毎日モニタリングし、０〜３の疾患スコアを決定した。in vivo処置について、硫酸化ポリグリセリン（化合物Ｐ３）３０ｍｇ／ｋｇ体重のＰＢＳ溶液２００μＬを、免疫後１４日目から１６日目まで毎日、対照及びＣＩＡラットに皮下注射により投与した。骨及び軟骨の病変及び炎症性浸潤を、膝関節のパラフィン切片の組織学的変化に基づいて評価した。肥満細胞をトルイジンブルー（Ｓｉｇｍａ）の０．５Ｎ  ＨＣＬ（Ｒｏｔｈ）溶液で一晩染色し、滑膜における数を計測した。結果を図１５に示す。さらに、毒性及び有害事象の兆候は、マウス処理の間を通じて、観察されなかった。
【０１７８】
実施例１５：実験的ＥＡＥモデルにおける効果
硫酸化ポリグリセリンが実験用多発性硬化症の抑制に有効であるか否かを試験するために、実験用自己免疫性脳炎（ＥＡＥ）をマウスに誘導した。ＥＡＥは、ＰＬＰ１００μｇのＰＢＳ溶液１００μＬ及びＣＦＡ１００μＬをマウスに皮下注射して免疫することにより、雌ＳＪＬマウス（８〜１２週齢）に誘導した。ＣＦＡは、不完全フロイントアジュバント（ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を８ｍｇ／ｍＬの結核菌Ｈ３７ＲＡ（乾燥物；ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と混合することにより調製した。免疫の時点及びその２日後に、マウスに、百日咳毒素（Ｌｉｓｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）２００ｎｇのＰＢＳ溶液１００μＬを静脈内注射した。疾患の臨床兆候についてマウスを毎日モニタリングし、次のようなＥＡＥ重症度に基づいて０〜５の疾患スコアを決定した：０は疾患なし；１は尾を引きずる；２は後肢が弱化；３は後肢が麻痺；４は後肢及び前肢が麻痺；５は病的状態及び死亡。in vivo処置において、硫酸化ポリグリセリン（化合物Ｐ３）を、２日目から２０日目まで毎日、皮下注射によりＰＬＰ免疫化マウスに投与した。疾患の臨床兆候について、マウスを毎日モニタリングした。表６は、１日投与量３０ｍｇ／ｋｇで皮下注射された硫酸化ポリグリセリンの治療効果を示す。対照動物は、免疫後１０日目及び２０日目に、それぞれ３．１及び２．３という臨床スコアを示したのに対して、１日投与量３０ｍｇ／ｋｇ体重の硫酸化ポリグリセリンでは、臨床スコアがそれぞれ１．７及び１．１まで減少した。さらに、薬物処置による毒性及び有害事象の兆候は、マウス処置の間を通じて観察されなかった。
表６は、ＥＡＥマウスモデルの臨床スコアに対する、硫酸化ポリグリセリン（Ｐ３）の効果を示す。
【０１７９】
【表６】
0005866301.tif 000018
【０１８０】
実施例１６：実験的亜急性敗血症モデルにおける効果
硫酸化ポリグリセリンを、雌ＮＭＲＩマウスの亜急性敗血症モデルで試験した。敗血症は、単回投与量０．２ｍｇ／ｋｇでのＬＰＳの単回腹腔内注射により誘導した。陰性対照群には、生理食塩水を単回注射した。ＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）投与の３０分前に、硫酸化ポリグリセリン（化合物Ｐ３）を単回投与量１５ｍｇ／ｋｇでの皮下注射により投与した。非致死性敗血症の指標として、補体タンパク質Ｃ５ａ（Ａｌｐｃｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）の血清レベルを測定した。測定は、ＬＰＳ投与の２時間後又は６時間後に実施した。ＬＰＳは、血清Ｃ５ａの亢進を誘導し、陰性対照群と比較して２４５％となった。単回投与量１５ｍｇ／ｋｇの硫酸化ポリグリセリンは、ＬＰＳ媒介性亢進の強力な阻害を誘導し、陰性対照群のレベルの１０５％となった。この阻害は、ＬＰＳ投与の６時間後も顕著であった。
表７は、マウスに誘導されたＬＰＳ誘導敗血症に対する、硫酸化ポリグリセリンの効果を示す。
【０１８１】
【表７】
0005866301.tif 000019
【０１８２】
実施例１７：in vivo 蛍光イメージングによる、関節リウマチの実験的モデルにおける硫酸化ポリグリセリンの取り込み
エフェクター複合体Ｐ２６／Ｅ２（実施例３ｂ）を０．９％ＮａＣｌ（濃度：１ｍｇ／ｍＬ）に溶解し、コラーゲン誘導性関節リウマチのラット（実施例１４に記載した動物モデル；投与量：２ｍｇ／ｋｇ）の尾静脈に注射した。レーザーユニット（励起波長７６０ｎｍ）及びロングパスフィルター（観察＞７８０ｎｍ）を有するＣＣＤカメラを備える平面蛍光イメージングセットアップを、J. Biomed. Optics 10, 41205 (2005)に従って使用した。麻酔ラットの蛍光イメージングを、インジェクション後１０分，３０分，１時間，６時間及び２４時間に実施した。結果を図１６に示す。図１６に示すように、関節炎の関節における迅速かつ高い取り込み及び蛍光コントラスト（１０分）が最大２４時間持続する（データは示さない）一方、健常な関節は、蛍光の亢進を示さない。矢印は、疾患進行度（疾患スコア１，２及び３）が増加する関節炎の関節であり、蛍光コントラストはスコアとともに増加し、このことは、疾患活性をモニタリングする複合体の能力を示す。
【０１８３】
実施例１８：in vivo ＰＥＴイメージングによる、皮膚炎（マウス）の実験的モデルにおける、ＤＯＴＡ複合体との硫酸化ポリグリセリン複合体の取り込み
４５０μｇのＴＮＣＢを腹部皮膚へ局所適用することにより、Ｃ５７Ｂ１／６マウス（雌，8週齢）をＴＮＣＢに感作した。５日後、４５μｇのＴＮＣＢを右耳へ局所適用することにより、マウスをチャレンジした。文献記載の方法に従って、エフェクター複合体Ｐ１７／Ｅ１３（実施例４ａ）をＣｕ−６４で標識化した。（ＣｕＣｌ2溶液の形態でのＣｕ−６４の生成： Appl. Radiat Isot. 2007, 65, 1 1 15）。標識化は、０．１ｍｇの複合体を用いて、酢酸緩衝液（ｐＨ５）中、３７℃で１時間実施した（１００ＭＢｑ）。放射化学的純度をＨＰＬＣ及びラジオＴＬＣにより測定した。放射化学的収率は９０％であった。ＳＥＣ精製の後、Ｃｕ−６４標識化ＨＳＰＧ  ＤＯＴＡ複合体をリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）の溶液として得た。１００μＣｉをマウスの尾静脈に注射した。臨床ＰＥＴスキャナーを用いて、高解像１０分ＰＥＴイメージングを繰り返し得た。麻酔マウスのイメージは、Ｃｕ−６４標識ＨＳＰＧ  ＤＯＴＡ複合体のインジェクション後３０分に得た。結果を図１７に示す。図１７は、炎症領域（マウス耳における炎症組織）における迅速で高い取り込みを矢印で示す。
【０１８４】
実施例１９：硫酸化ポリグリセリンに複合体化した細胞増殖抑制性エフェクターによる、腫瘍細胞に対する細胞増殖抑制薬の細胞毒性の増加
細胞増殖抑制薬の細胞毒性に対する硫酸化ポリグリセリン複合体の潜在的効果を試験するために、ヒトＡ５４９細胞株を使用した。Ａ５４９細胞を、常法に従って、次のように増殖した。１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ），２％グルタミン及びペニシリン／ストレプトマイシン（全てＰＡＮ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を添加したＤＥＭＥＭ培養液を使用した。細胞を、１×１０5細胞／ｍＬで培養液に播種し、５％ＣＯ2下、３７℃で培養し、１週間に２回、１：５に分割した。
細胞増殖の分析を、２４ウェルプレートで培養した細胞を用いて実施した。２×１０5細胞／ｍＬを、漸増する濃度の試験物質を含有する１ｍＬの培養液中でインキュベーションした。 培養の２４時間後、試験物質を含有する培養液を除去し、標準的な培養液で置換した。培養のさらに２４時間後、アポトーシスのプロセスのパラメーターである細胞数、生存率及び細胞直径を細胞計数器及び分析システム（ＣＡＳＹ(Ｒ)，Ｓｃｈａｒｆｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）で分析した。さらに、細胞代謝活性試験であるＭＴＴアッセイ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミドの細胞還元）により、薬物の影響をin vitroで評価した。すなわち、１ウェルあたり１×１０4個の細胞を、漸増する濃度の試験物質（実施例６ｂのパクリタキセル複合体）を含有する１００μＬの培養液中、９６ウェルプレートにプレーティングする。培養２日後、１０μＬのＭＴＴ（５ｍｇ／ｍＬのＰＢＳ溶液，Ｓｉｇｍａ社製）を各ウェルに加え、プレートを４時間インキュベーションした。生じたホルマザン生成物を酸イソプロパノールで溶解し、波長５７０ｎｍでの吸光度（Ｅｘ５７０）をマイクロプレート分光光度計（Ａｎｔｈｏｓ  ｈｔｌｌ，Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）で測定した。パクリタキセル（タキソール）を、１０-7Ｍの濃度でＡ５４９細胞に適用し、試験物質を濃度１０-7〜１０-10Ｍで適用した。培養液単独での培養を対照として使用した。
結果を図１８に示す。図１８は、１０-7Ｍに相当する濃度での優れた効果、及び１／１００よりも低い濃度での細胞毒性を示す。
【０１８５】
実施例２０：エフェクターＶＥＧＦ−ｓｉＲＮＡに複合体化した硫酸化ポリグリセリンによる、ＶＥＧＦ発現の阻害
肺癌細胞株Ａ５４９を、実施例１１に記載したように増殖させた。ＶＥＧＦ検出用に上清を回収するために、細胞を、１×１０6細胞／ｍＬで２４ウェル培養プレートに播種し、２４時間培養した。その後、硫酸化ポリグリセリン（複合体Ｐ１６／Ｅ３３，実施例６ｅ）に結合したＶＥＧＦ−ｓｉＲＮＡ又はＶＥＧＦ−ｓｉＲＮＡを用いて、その他のトランスフェクション試薬を添加することなく、細胞をインキュベーションした。トランスフェクションの４時間後、培養液を新しい培養液（１０％ＦＣＳ含有）で置換した。さらに４８時間後、培養上清をＥＬＩＳＡ用に回収した。上清中のＶＥＧＦ含量を、市販のＥＬＩＳＡキット（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ，Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて検出した。結果を図１９に示し、図１９は、試験物質とインキュベーションした後のＡ５４９肺癌細胞株のＶＥＧＦ産生を示す。ＶＥＧＦタンパク質を、４８時間調整した細胞培養液中、ＥＬＩＳＡにより測定した。各バーは、３回の独立した試験で得られた３つの測定値の平均値±ＳＥＭである。
【０１８６】
実施例２１：硫酸化ポリグリセリンの緩衝溶液の凝集試験
シアニン色素と複合化した硫酸化ポリグリセリン（化合物Ｐ１７／Ｅ１）の０．９％ＮａＣｌ（生理食塩水）溶液を濃度０．１μＭで調製した。暗所中、室温で様々な時間（０，１，２．５，３，４，２４時間）保管した溶液の蛍光強度を測定した（励起７６０ｎｍ，検出＞７８０ｎｍ）。結果を図２１に示し、図２１は、溶液中の凝集による蛍光の定常減少を示す。蒸留水又はメタノールでは、そのような減少は観察されなかった。蒸留水を用いて透析し、トレハロース（硫酸化ポリグリセリン１ｍｇあたり１０ｍｇ）を添加し、凍結乾燥して、固形物質を得た。蒸留水中に再懸濁し、初期レベルの蛍光シグナルを得た。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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