(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト由来細胞に、ヒトテロメラーゼ触媒サブユニット(hTERT)遺伝子、SV40スモールT抗原(SV40ST)遺伝子、及びAlu7配列由来オリゴヌクレオチドを導入する工程を含む、ヒト由来細胞の癌化細胞の作製方法であって、前記Alu7配列由来オリゴヌクレオチドが、
(i) 配列番号１で示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、又は配列番号１で示される塩基配列に対して95％以上の相同性を有し、かつ、配列番号１で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを使用する場合と同等の癌細胞化を可能とするオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド、あるいは
(ii) 配列番号２で示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、又は配列番号２で示される塩基配列に対して95％以上の相同性を有し、かつ、配列番号２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを使用する場合と同等の癌細胞化を可能とするオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド
である、ヒト由来細胞の癌化細胞の作製方法。
【請求項２】
ヒト由来細胞がヒト線維芽細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ヒトテロメラーゼ触媒サブユニット(hTERT)遺伝子、SV40スモールT抗原(SV40ST)遺伝子、及びAlu7配列由来オリゴヌクレオチドを、同一又は異なるベクターに組み込み、ヒト由来細胞に導入する、ヒト由来細胞を癌細胞化する遺伝子の導入方法であって、前記Alu7配列由来オリゴヌクレオチドが、
(i) 配列番号１で示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、又は配列番号１で示される塩基配列に対して95％以上の相同性を有し、かつ、配列番号１で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを使用する場合と同等の癌細胞化を可能とするオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド、あるいは
(ii) 配列番号２で示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、又は配列番号２で示される塩基配列に対して95％以上の相同性を有し、かつ、配列番号２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを使用する場合と同等の癌細胞化を可能とするオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド
である、ヒト由来細胞を癌細胞化する遺伝子の導入方法。
【請求項４】
請求項１又は２記載の方法により得られる、ヒト由来細胞の癌化細胞。
【請求項５】
ヒトテロメラーゼ触媒サブユニット(hTERT)遺伝子、SV40スモールT抗原(SV40ST)遺伝子、及びAlu7配列由来オリゴヌクレオチドを含有してなる、請求項１〜３いずれか記載の方法に用いるためのキットであって、前記Alu7配列由来オリゴヌクレオチドが、
(i) 配列番号１で示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、又は配列番号１で示される塩基配列に対して95％以上の相同性を有し、かつ、配列番号１で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを使用する場合と同等の癌細胞化を可能とするオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド、あるいは
(ii) 配列番号２で示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、又は配列番号２で示される塩基配列に対して95％以上の相同性を有し、かつ、配列番号２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを使用する場合と同等の癌細胞化を可能とするオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド
であるキット。
【請求項６】
請求項１又は２記載の方法により得られたヒト由来細胞の癌化細胞を、候補化合物の存在下又は非存在下で培養し、非存在下と比べて存在下の方がヒト由来細胞の癌細胞化の程度が抑制される場合に、候補化合物が抗癌剤としての作用を有する可能性が高いと判定することを特徴とする、抗癌剤のスクリーニング方法。
【請求項７】
請求項３記載の方法により遺伝子が導入されたヒト由来細胞を、候補化合物の存在下又は非存在下で培養し、非存在下と比べて存在下の方がヒト由来細胞の癌細胞化の程度が抑制される場合に、候補化合物が抗癌剤としての作用を有する可能性が高いと判定することを特徴とする、抗癌剤のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、ヒト由来細胞の特異細胞の作製方法に関する。さらに詳しくは、Ａｌｕ７配列由来オリゴヌクレオチドを用いたヒト由来細胞の癌化細胞の作製方法、該方法により得られる細胞、該方法に用いるためのキット、及び該細胞を抗癌剤の薬効評価に用いる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】  一般に、癌化は、クローン増殖を示して良性腫瘍に進化するような、ただの１個の細胞における変異を起点として生じる。【０００３】  本発明者は、これまで、特定配列を有するノンコーディングｍＲＮＡが、ラット不死化細胞を特異細胞に誘導できることを報告している（非特許文献１、２参照）。具体的には、かかるｍＲＮＡにおける特定のポリプリン配列がリボソームの２８Ｓ  ｒＲＮＡに結合する一方で、該ポリプリン配列のアンチセンス配列がシグナル認識顆粒（ＳＲＰ）の７ＳＬ  ＲＮＡのＡｌｕ部分に結合することを見出し、これらの配列が２８Ｓ  ｒＲＮＡと７ＳＬ  ＲＮＡの双方に影響を及ぼすことで、タンパク合成を制御して特異細胞へと形質転換させる。【０００４】  また、本発明者は、ヒト２８Ｓ  ｒＲＮＡのＥＳ２７に相補的な短鎖ＲＮＡ（ａｓＲ７０、ａｓＲ５６、ａｓＲ４６）を、ヒトテロメラーゼ触媒サブユニット（ｈＴＥＲＴ）遺伝子及びＳＶ４０スモールＴ抗原（ＳＶ４０ＳＴ）遺伝子と併用して、ヒト由来細胞を形質転換させることができることを報告している（特許文献１参照）。得られた形質転換細胞は、足場非依存性増殖能を有し、染色体異常も示す。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１１−２３９７２６号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｋ．Ｈａｍａｄａ，“Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｃａｕｓｅｄ  ｂｙ  ａ  ｐａｒｔｉａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｕ５  ｓｍａｌｌ  ｎｕｃｌｅａｒ  ＲＮＡ．”Ｍｏｌ．Ｃａｒｃｉｎｏｇ．，１９９７，２０，ｐ１７５−１８８
【非特許文献２】Ｋ．Ｈａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ，“Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ＲＮＡ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ａ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｗｉｔｈ  ａ  Ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ．”Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９９，２７４（２２），ｐ１５７８６−１５７９６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】  しかしながら、癌化の起点となる分子メカニズムは未だ解明されていないのが現状である。また、前記短鎖ＲＮＡ（ａｓＲ７０、ａｓＲ４６）を用いて形質転換した細胞をヌードマウスに移植したところ、腫瘍形成が認められず、形質転換が十分ではないことが判明した。【０００８】  本発明の課題は、安全性に問題がない、ヒト由来細胞を特異細胞に形質転換させる方法、該方法により得られる細胞、該方法に用いるためのキット、及び該細胞を抗癌剤の薬効評価に用いる方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】  本発明者は、高いコピー数を有する遺伝子において生じる最初の変異によって、癌が多発するのではないかと考え、Ａｌｕ転写産物に着目して鋭意検討した結果、特定のＡｌｕ配列が癌化に関与することを見出し、本発明を完成するに至った。【００１０】
即ち、本発明は、下記〔１〕〜〔６〕に関する。
〔１〕  ヒト由来細胞に、ヒトテロメラーゼ触媒サブユニット(hTERT)遺伝子、SV40スモールT抗原(SV40ST)遺伝子、及びAlu7配列由来オリゴヌクレオチドを導入する工程を含む、ヒト由来細胞の癌化細胞の作製方法であって、前記Alu7配列由来オリゴヌクレオチドが、
(i) 配列番号１で示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、又は配列番号１で示される塩基配列に対して95％以上の相同性を有し、かつ、配列番号１で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを使用する場合と同等の癌細胞化を可能とするオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド、あるいは
(ii) 配列番号２で示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、又は配列番号２で示される塩基配列に対して95％以上の相同性を有し、かつ、配列番号２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを使用する場合と同等の癌細胞化を可能とするオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド
である、ヒト由来細胞の癌化細胞の作製方法。
〔２〕  ヒトテロメラーゼ触媒サブユニット(hTERT)遺伝子、SV40スモールT抗原(SV40ST)遺伝子、及びAlu7配列由来オリゴヌクレオチドを、同一又は異なるベクターに組み込み、ヒト由来細胞に導入する、ヒト由来細胞を癌細胞化する遺伝子の導入方法であって、前記Alu7配列由来オリゴヌクレオチドが、
(i) 配列番号１で示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、又は配列番号１で示される塩基配列に対して95％以上の相同性を有し、かつ、配列番号１で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを使用する場合と同等の癌細胞化を可能とするオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド、あるいは
(ii) 配列番号２で示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、又は配列番号２で示される塩基配列に対して95％以上の相同性を有し、かつ、配列番号２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを使用する場合と同等の癌細胞化を可能とするオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド
である、ヒト由来細胞を癌細胞化する遺伝子の導入方法。
〔３〕  前記〔１〕記載の方法により得られる、ヒト由来細胞の癌化細胞。
〔４〕  ヒトテロメラーゼ触媒サブユニット(hTERT)遺伝子、SV40スモールT抗原(SV40ST)遺伝子、及びAlu7配列由来オリゴヌクレオチドを含有してなる、前記〔１〕又は〔２〕記載の方法に用いるためのキットであって、前記Alu7配列由来オリゴヌクレオチドが、
(i) 配列番号１で示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、又は配列番号１で示される塩基配列に対して95％以上の相同性を有し、かつ、配列番号１で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを使用する場合と同等の癌細胞化を可能とするオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド、あるいは
(ii) 配列番号２で示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、又は配列番号２で示される塩基配列に対して95％以上の相同性を有し、かつ、配列番号２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを使用する場合と同等の癌細胞化を可能とするオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド
であるキット。
〔５〕  前記〔１〕記載の方法により得られたヒト由来細胞の癌化細胞を、候補化合物の存在下又は非存在下で培養し、非存在下と比べて存在下の方がヒト由来細胞の癌細胞化の程度が抑制される場合に、候補化合物が抗癌剤としての作用を有する可能性が高いと判定することを特徴とする、抗癌剤のスクリーニング方法。
〔６〕  前記〔２〕記載の方法により遺伝子が導入されたヒト由来細胞を、候補化合物の存在下又は非存在下で培養し、非存在下と比べて存在下の方がヒト由来細胞の癌細胞化の程度が抑制される場合に、候補化合物が抗癌剤としての作用を有する可能性が高いと判定することを特徴とする、抗癌剤のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００１１】  本発明のヒト由来細胞の特異細胞の作製方法によると、ヒト由来細胞を、より安全に、かつ、強力な癌化形質を有する特異細胞に誘導できるものである。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、Ａｌｕ７オリゴヌクレオチド及びＡｌｕ７ｉオリゴヌクレオチドの所在を示す図である。図１−ａは、Ａｌｕ７のヒト第９染色体上のアライメントを示す図である。図１−ｂは、Ａｌｕ７オリゴヌクレオチド及びＡｌｕ７ｉオリゴヌクレオチドをヒト第９染色体（１７１６４３５２−１７１６４７２０塩基）上にマッピングした図である。図１−ｃは、ＨＵＶＥＣ細胞及びＭＪ９０細胞から調製したｃＤＮＡにＡｌｕ７が含まれることを示す図である。
【図２】図２は、軟寒天培地でのコロニー形成を示す図である。写真は、左から、大コロニー、中コロニー、小コロニーについて、それぞれ一般的な例を示す。
【図３】図３は、小胞体ストレス反応誘導の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】  本発明のヒト由来細胞の特異細胞の作製方法は、ヒト由来細胞に、ヒトテロメラーゼ触媒サブユニット（ｈＴＥＲＴ）遺伝子、及びＳＶ４０スモールＴ抗原（ＳＶ４０ＳＴ）遺伝子を導入する工程を含むものであるが、その際に、Ａｌｕ７配列由来オリゴヌクレオチドを併用することを大きな特徴とする。
【００１４】  Ａｌｕファミリーは、約３００塩基対の長さで、ヒトゲノム中に約１００万コピー存在するものであり、一般に、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによって核内ＲＮＡ等に転写される。本発明者は、Ｈｅｌａ細胞から種々のＡｌｕ転写産物のｃＤＮＡを調製し、そこから、３３７塩基長のＡｌｕ７クローンを取得して解析したところ、Ａｌｕ７配列が、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによる転写開始部位やコンセンサススプリットプロモータを有さないことを見出し、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによる不完全な転写産物であると推察した。そこで、このＡｌｕ７配列を、ｈＴＥＲＴ及びＳＶ４０ＳＴと併用したところ、驚くべきことにも、ヒト由来細胞を形質転換させることを見出した。得られた形質転換細胞は、足場非依存性増殖能を有し、染色体も異常であることから、Ａｌｕ７配列由来オリゴヌクレオチドを用いることで、ｈＴＥＲＴ及びＳＶ４０ＳＴの導入が可能となり、ヒト由来細胞を特異細胞（癌化細胞）に形質転換できることが示唆される。なお、本明細書において、ヒト由来細胞の「特異細胞化」や「癌細胞化」の程度とは、該細胞が不死化して増殖する程度や、細胞が正常細胞とは異なる様相を呈する程度のことを意味する。
【００１５】  本発明のヒト由来細胞の特異細胞（癌化細胞）の作製方法は、ヒト由来細胞に、ヒトテロメラーゼ触媒サブユニット（ｈＴＥＲＴ）遺伝子、ＳＶ４０スモールＴ抗原（ＳＶ４０ＳＴ）遺伝子、及びＡｌｕ７配列由来オリゴヌクレオチドを導入する工程を含む。
【００１６】  本明細書において、「遺伝子」とは、生物の遺伝情報を担う因子であり、ＤＮＡ及びＲＮＡを含む意味で用いられる。また、「オリゴヌクレオチド」とはＤＮＡ及びＲＮＡを含む意味で用いられる。
【００１７】  ヒトテロメラーゼ触媒サブユニット（ｈＴＥＲＴ）遺伝子としては、特に限定はなく、当該分野で公知のものが挙げられる。テロメラーゼは、細胞分裂によるテロメア長の短縮に拮抗して、テロメア長を維持する酵素である。テロメラーゼは、テロメア配列の鋳型となるＲＮＡ、及び、逆転写酵素を構成要素に含み、この逆転写酵素部分がｈＴＥＲＴである。
【００１８】  ＳＶ４０スモールＴ抗原（ＳＶ４０ＳＴ）遺伝子としては、特に限定はなく、当該分野で公知のものが挙げられる。ＳＶ４０（ｓｉｍｉａｎ  ｖｉｒｕｓ  ４０）はポリオーマウイルス科のウイルスで、アカゲザル腎細胞から分離されたものである。このウイルスは、細胞への感染初期（ＤＮＡ合成が起きる前）に、初期タンパク質として、ラージＴ抗原及びスモールＴ抗原を産生するが、本発明においては、スモールＴ抗原を抗原ウイルスとして用いる。
【００１９】  Ａｌｕ７配列由来オリゴヌクレオチドとしては、配列番号１で示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド及び配列番号２で示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが挙げられる。なかでも、実質的に配列番号１で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、実質的に配列番号２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドが好ましく、配列番号１で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、及び配列番号２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドがより好ましい。
【００２０】  また、本発明においては、前記オリゴヌクレオチドとして、前記塩基配列において１もしくは数個のヌクレオチドの欠失、付加、挿入又は置換を有するオリゴヌクレオチドも、好適に用いられる。かかるオリゴヌクレオチドとしては、具体的には、前記塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドに対して少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するオリゴヌクレオチドを挙げることができる。また、塩基長としては、好ましくは３０〜５００、より好ましくは４０〜４２５、さらに好ましくは４５〜３７５、さらに好ましくは４８〜３５５である。このようなオリゴヌクレオチドは、配列番号１で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド又は配列番号２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いる場合と同様の効果（ヒト由来細胞の特異細胞化）を奏するものである。なお、本明細書において、相同性は、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２１５，４０３−４１０（１９９０））の開発したアルゴリズムを使用した検索プログラムＢＬＡＳＴを用いて求めることができる。
【００２１】  配列番号１で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをヒトの第９染色体上にマッピングした図を図１−ｂに示す。配列番号１で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドは、３３７塩基長であり、第９染色体の１７１６４３８４〜１７１６４７２０位に相当する（以降、Ａｌｕ７ともいう）。配列番号２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドは、Ａｌｕ７の一部（５０塩基長）であって、第９染色体の１７１６４５８７〜１７１６４６３６位に相当する（以降、Ａｌｕ７ｉともいう）。
【００２２】  Ａｌｕ７配列由来オリゴヌクレオチドの合成方法としては、特に限定されず、公知のオリゴヌクレオチド合成機を用いたホスホロアミダイト法、ホスホロチオエート法、ホスホトリエステル法等を用いることができる。
【００２３】  前記遺伝子及びオリゴヌクレオチドは、安定性や細胞に対する親和性を高めるために、その活性を著しく低下させない範囲で、公知の方法に従って、修飾体、置換体としてもよく、例えば、リン酸エステル基又はリボース部分の水酸基を他の安定な基に置換した誘導体として用いることも可能である。
【００２４】  このような遺伝子及びオリゴヌクレオチドが導入されるヒト由来細胞としては、特に限定はなく、ヒト線維芽細胞、ヒト内皮細胞、ヒト上皮細胞等が挙げられる。なお、前記細胞の由来、組織は特に限定されない。
【００２５】  ヒト由来細胞へ、前記遺伝子及びオリゴヌクレオチドを導入する方法としては、特に限定はなく、例えば、前記遺伝子及びオリゴヌクレオチドを任意のベクターに組み込んだものを用いることができる。
【００２６】  ベクターは、宿主細胞において自立複製可能であると同時に、前記遺伝子及びオリゴヌクレオチド以外に、プロモーター、及び転写終結配列を含有することが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。なお、プロモーターとしては、前記遺伝子及びオリゴヌクレオチドを、宿主細胞中に発現させることが可能であれば特に限定はない。
【００２７】  本発明に用いられる好適なベクターとしては、例えば、アデノウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レトロウイルスベクター等が挙げられる。
【００２８】  前記遺伝子及びオリゴヌクレオチドは、同時に一括又は個々に導入してもよく、異なるタイミングに組み合わせて又は個々に導入してもよいが、ｈＴＥＲＴ遺伝子とＳＶ４０ＳＴ遺伝子を導入した後に、Ａｌｕ７配列由来オリゴヌクレオチドを導入するのが好ましい。また、導入には、前記遺伝子及びオリゴヌクレオチドを別々のベクターに組み込んだものを用いてもよく、同一のベクターに組み込んだものを用いてもよい。別々のベクターに組み込んだものを用いる場合、例えば、ｈＴＥＲＴ遺伝子はｐＢＡＢＥベクターに、ＳＶ４０ＳＴ遺伝子はｐＬＨＣＸベクターに、Ａｌｕ７配列由来オリゴヌクレオチドはｐＬＨＣＸベクターに組み込んだものを用いることができる。また、同一のベクターに組み込んだものを用いる場合、好適なベクターとしてはレトロウイルスベクターが挙げられ、前記遺伝子及びオリゴヌクレオチドの該ベクター内での配置は、特に限定はなく、例えば、プロモーターと転写終結配列の間に、プロモーター側から、ｈＴＥＲＴ遺伝子、ＳＶ４０ＳＴ遺伝子、Ａｌｕ７配列由来オリゴヌクレオチドの順で配置される。
【００２９】  ベクターの導入方法としては、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。
【００３０】  また、前記ベクターに導入細胞への感染用ウイルスＤＮＡをさらに組み込んだベクターを調製して、ベクターが導入されたウイルスをヒト由来細胞に感染させることで、ベクター導入を行ってもよい。感染用ウイルスとしては、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス等が挙げられる。
【００３１】  なお、かかるベクターの構築方法、具体的な用法等については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ；２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ．ＮＹ．，１９８９．等の成書を参照すればよい。
【００３２】  かくして、ヒト由来細胞に、ｈＴＥＲＴ遺伝子、ＳＶ４０ＳＴ遺伝子、及びＡｌｕ７配列由来オリゴヌクレオチドを導入することができる。得られた細胞は、ｈＴＥＲＴ及びＳＶ４０ＳＴによってコードされるタンパク質を発現する、形質転換細胞となる。従って、本発明は、また、前記ｈＴＥＲＴ遺伝子、ＳＶ４０ＳＴ遺伝子、及びＡｌｕ７配列由来オリゴヌクレオチドを導入することにより得られる細胞を提供する。該細胞は、細胞に適した条件下で培養し、集団倍加を繰り返して、公知の薬剤による選択を行ってもよい。なお、本発明においては、ｈＴＥＲＴ遺伝子が既に組み込まれたｈＴＥＲＴ不死化細胞に、ＳＶ４０ＳＴ遺伝子及びＡｌｕ７配列由来オリゴヌクレオチドを導入したものも、本発明の範囲内に含まれる。ｈＴＥＲＴ遺伝子、ＳＶ４０ＳＴ遺伝子、及びＡｌｕ７配列由来オリゴヌクレオチドによって形質転換されたヒト由来細胞の状態については、例えば、位相差顕微鏡を用いて細胞形態を確認することができる。
【００３３】  また、本発明では、ｈＴＥＲＴ遺伝子、ＳＶ４０ＳＴ遺伝子、及びＡｌｕ７配列由来オリゴヌクレオチドを組み合わせて用いることで、ヒト由来細胞を特異細胞化できることから、ｈＴＥＲＴ遺伝子、ＳＶ４０ＳＴ遺伝子、及びＡｌｕ７配列由来オリゴヌクレオチドを含有するキットを、ヒト由来細胞の形質転換用に用いることができる。本発明は、また、ｈＴＥＲＴ遺伝子、ＳＶ４０ＳＴ遺伝子、及びＡｌｕ７配列由来オリゴヌクレオチドを含有するキットを提供する。
【００３４】  またさらに、ｈＴＥＲＴ遺伝子、ＳＶ４０ＳＴ遺伝子、及びＡｌｕ７配列由来オリゴヌクレオチドを組み合わせて導入することで、ヒト由来細胞の特異細胞化が容易であり、また、形質転換の程度も一定であることから、ｈＴＥＲＴ遺伝子、ＳＶ４０ＳＴ遺伝子、及びＡｌｕ７配列由来オリゴヌクレオチドを用いて特異細胞化されたヒト由来細胞を、あるいは、ｈＴＥＲＴ遺伝子、ＳＶ４０ＳＴ遺伝子、及びＡｌｕ７配列由来オリゴヌクレオチドが導入されたヒト由来細胞を、抗癌剤のスクリーニングに用いることができる。従って、本発明は、また、抗癌剤のスクリーニング方法を提供する。前記方法は、ヒトの系でのｉｎ  ｖｉｔｒｏ評価であるため、ｉｎ  ｖｉｖｏへの想定が容易となり、より簡便、かつ、迅速に有効物質を見出すことが可能となる。
【００３５】  具体的な方法としては、
前記遺伝子を導入して得られたヒト由来細胞の特異細胞を、候補化合物の存在下又は非存在下で培養し、非存在下と比べて存在下の方がヒト由来細胞の特異細胞化の程度が抑制される場合に、候補化合物が抗癌剤としての作用を有する可能性が高いと判定する態様（態様１）
前記遺伝子が導入されたヒト由来細胞を、候補化合物の存在下又は非存在下で培養し、非存在下と比べて存在下の方がヒト由来細胞の特異細胞化の程度が抑制される場合に、候補化合物が抗癌剤としての作用を有する可能性が高いと判定する態様（態様２）
が挙げられる。
【００３６】  態様１及び態様２において、細胞を候補化合物の存在下又は非存在下で培養させる条件としては、候補化合物の存在有無が異なる以外は、前記遺伝子が導入される前の細胞を培養する際の公知の条件に従って同じように行なうことができ、特に限定はない。
【００３７】  態様１において候補化合物を抗癌剤としての作用を有する可能性が高いと判定する場合は、例えば、候補化合物の存在下で培養した細胞の一部が非存在下で培養した細胞に比べて、トランスフォーム形態消失、アポトーシスの誘導、及び足場非依存性の消失等の変化が認められる場合に、該細胞に接触させた候補化合物が、抗癌剤としての作用を有し、癌化を縮小する効果があると判定することができる。
【００３８】  また、態様２において候補化合物を抗癌剤としての作用を有する可能性が高いと判定する場合は、例えば、候補化合物の存在下で培養した細胞の一部が非存在下で培養した細胞に比べて、集団倍加の程度や、細胞形態の変化が少ない場合に、該細胞に接触させた候補化合物が、抗癌剤としての作用を有し、癌化を縮小する効果があると判定することができる。
【実施例】
【００３９】  以下、本発明を実施例に基づいて説明するが、本発明はこれらの実施例等によりなんら限定されるものではない。なお、ｈＴＥＲＴ遺伝子は、Ｄｒ．Ｆ．Ｉｓｈｉｋａｗａ又はａｄｄｇｅｎｅ１７７４より入手したものを、ＳＶ４０ＳＴ遺伝子は、ＪＣＲＢ  ｇｅｎｅ  ｂａｎｋ（ｐＭＴＩ０Ｄ）より入手したものを用いた。Ａｌｕ７配列由来オリゴヌクレオチドは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製のキットを用いて取得した。また、ＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈内皮細胞）はＪＣＲＢ  ｂａｎｋより、ＭＪ９０（ヒト皮膚由来線維芽細胞）はＪ．Ｒ．Ｓｍｉｔｈより入手したものを用いた。【００４０】参考例１＜Ａｌｕ７とＡｌｕ７ｉの所在＞
ＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈内皮細胞）抽出液、又は、ＭＪ９０（ヒト皮膚由来線維芽細胞）抽出液を用いて、Ａｌｕ７特異的な下記に示すプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。結果を図１−ｃに示す。
0005917722.tif 000002
【００４１】  その結果、いずれの細胞抽出液にもＡｌｕ７が含まれることが分かる。【００４２】実施例１＜形質転換細胞の形態、癌化形質＞
ｈＴＥＲＴ、Ａｌｕ７又はＡｌｕ７ｉ、とＳＶ４０ＳＴによって形質転換されたＭＪ９０細胞、ＨＵＶＥＣ細胞について、軟寒天培地でのコロニー形成試験を行った。【００４３】  具体的には、形質転換細胞は次のようにして調製したものを用いた。先ず、Ａｌｕ７又はＡｌｕ７ｉは、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩで切断したｐＬＰＣＸ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）に挿入してベクターを調製した（ｐＬＰＣＸ−Ａｌｕ７、ｐＬＰＣＸ−Ａｌｕ７ｉ）。ＰＣＲで増幅したＳＶ４０ＳＴ断片をｐＬＨＣＸ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）に挿入したベクターを調製した（ｐＬＨＣＸ−ＳＴ）。ｈＴＥＲＴ発現用プラスミドは、ｐｃＤＮＡｈＴＥＲＴｎ２（Ｄｒ．Ｆ．Ｉｓｈｉｋａｗａより提供）及びｐＢＡＢＥ−ｎｅｏ−ｈＴＥＲＴ（Ａｄｄｇｅｎｅ  ｐｌａｓｍｉｄ  １７７４）を用いた。次に、ｐＬＰＣＸ−Ａｌｕ７、ｐＬＰＣＸ−Ａｌｕ７ｉ及びｐＬＨＣＸ−ＳＴは、レトロウイルスパッケイジングプラスミドｐＣＬ−１０Ａ１（Ｉｍｇｅｎｅｘ社製）と共に、２９３Ｔ細胞（Ｒｉｋｅｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋから入手）にトランスフェクトした後、ウイルス回収の上、ＭＪ９０細胞又はＨＵＶＥＣ細胞に感染させた。一方、ｐｃＤＮＡｈＴＥＲＴｎ２を用いる場合は、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００を用いてＭＪ９０細胞又はＨＵＶＥＣ細胞にトランスフェクトした。例えば、ｈＴＥＲＴ、Ａｌｕ７又はＡｌｕ７ｉ、とＳＶ４０ＳＴのいずれもをトランスフェクトする場合は、ｈＴＥＲＴを導入したＭＪ９０細胞又はＨＵＶＥＣ細胞に上記方法に従って、Ａｌｕ７又はＡｌｕ７ｉ、とＳＶ４０ＳＴをトランスフェクトした。得られた細胞は、薬剤選択を行って親株よりもライフスパンの長いものを選択して実験に供した。【００４４】  得られた細胞を軟寒天培地で培養し、コロニー形成試験を行った（ｎ＝３）。コロニー形成が認められた場合は、コロニーを大きさ「大（ｌａｒｇｅ、細胞の１０倍以上の大きさ）」、「中（ｍｉｄｄｌｅ、細胞の５〜９倍程度の大きさ）」、「小（ｓｍａｌｌ、細胞の３〜４倍程度の大きさ）」によって分類し、それぞれのコロニー数を計数した。結果を図２に示す。なお、対比のために、ａｓＲ７０、ａｓＲ４６を導入した細胞を特開２０１１−２３９７２６号公報に記載の方法に従って調製し、同様の実験を行った。【００４５】  結果、ｈＴＥＲＴ、Ａｌｕ７又はＡｌｕ７ｉ、とＳＶ４０ＳＴによって形質転換された細胞は、軟寒天中でのコロニー形成が確認され、いずれの細胞も足場非依存性増殖能を有し癌化していることが分かる。なかでも、Ａｌｕ７ｉを導入した細胞は、ａｓＲ７０、ａｓＲ４６、Ａｌｕ７を導入した細胞よりも、より多くのコロニーを形成していることから、癌化効率が高いことが示唆される。【００４６】実施例２＜形質転換細胞における小胞体ストレス反応誘導＞
実施例１と同様にして形質転換されたＨＵＶＥＣ細胞について、小胞体ストレス応答を示す物質の発現を確認した。また、対比のために、ａｓＲ７０、ａｓＲ４６を導入した細胞を特開２０１１−２３９７２６号公報に記載の方法に従って調製し、同様の実験を行った。【００４７】  具体的には、３５Ｓメチオニンを用いたパルスラベル・免疫沈降法に従って、細胞外マトリックスのフィブロネクチン（ＦＮ）、膜透過型レセプターのインテグリン  ベータ１（ｉｎｔｅｇｒｉｎ  β１）、小胞体局在シャペロンのＢｉｐ、及びギャップ結合タンパク質コネキシン４３（Ｃｘ４３）の発現量を各細胞について測定した。なお、β−ｔｕｂｕｌｉｎの発現量をコントロールとして用いた。結果を図３に示す。【００４８】  図３より、Ｃｘ４３の発現は、細胞（ａｓＲ４６）と細胞（Ａｌｕ７ｉ）で顕著に減少していることが分かった。一方、ＦＮ及びｉｎｔｅｇｒｉｎ  β１の発現は、シグナル非依存性のβ−ｔｕｂｕｌｉｎと同様の傾向を示し、殆ど変化が認められなかった。ＦＮ及びｉｎｔｅｇｒｉｎ  β１は、細胞内で生産性が高いため変化が認められなかったが、Ｃｘ４３の発現量に変化が認められたことから、細胞（ａｓＲ４６）と細胞（Ａｌｕ７ｉ）のリボゾームにおいてＣｘ４３の合成が抑制されていることが示唆される。【００４９】実施例３＜抗癌剤のスクリーニング＞
ｈＴＥＲＴ、ＳＶ４０ＳＴ、及びＡｌｕ７配列由来オリゴヌクレオチドが導入された細胞を細胞培養器具にて培養し、そこに、候補化合物を溶媒に溶解したものを添加して、さらに培養する。一方、対照として、候補化合物を添加しない群も設定する。候補化合物を添加しない群をコントロールとして、添加しない群よりも細胞のトランスフォーム形態の消失、アポトーシスの誘導、及び足場非依存性増殖の消失等の変化が認められる場合に、該細胞に添加した候補化合物は、抗癌剤としての作用を有する可能性が高いと判断することができる。
【産業上の利用可能性】
【００５０】  本発明のヒト由来細胞の特異細胞の作製方法は、癌発症メカニズムの解明のため、様々なヒト正常細胞に癌化を誘導する際に利用することができ、新たな創薬ターゲット分子の探索に有効に利用することができる。
【配列表フリーテキスト】
【００５１】配列表の配列番号１は、Ａｌｕ７配列由来オリゴヌクレオチド（Ａｌｕ７）である。
配列表の配列番号２は、Ａｌｕ７配列由来オリゴヌクレオチド（Ａｌｕ７ｉ）である。
配列表の配列番号３は、Ａｌｕ７用プライマーである。
配列表の配列番号４は、Ａｌｕ７用プライマーである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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