(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
交換可能なカートリッジを受容するよう適合化されたカートリッジホルダー；
流動物の流動を制御する流動制御サブシステム；および
マイクロアレイの画像をキャプチャーするよう構成された光学サブシステム、
を含むマイクロアレイベースサンプル分析（ＭＢＳＡ）システムであって、
該交換可能なカートリッジは反応チャンバーおよび該反応チャンバー内のマイクロアレイを収容するサンプル分析ユニットを含み、
該反応チャンバーはポリメラーゼ連鎖反応の増幅反応のための反応チャンバーとしての役割を果たし、及び
該反応チャンバーは親水性内面を有する、前記ＭＢＳＡシステム。
【請求項２】
請求項１に記載のＭＢＳＡシステムであって、光学サブシステムがレーザー光源を含む、前記ＭＢＳＡシステム。
【請求項３】
請求項１に記載のＭＢＳＡシステムであって、光学サブシステムが、ピクセル毎にマイクロアレイ画像を取得する共焦点または準共焦点レーザースキャナーを含む、前記ＭＢＳＡシステム。
【請求項４】
請求項１に記載のＭＢＳＡシステムであって、光学サブシステムが、全てのマイクロアレイエレメントを同時に照明するフラッドイルミネーションによる撮像機器を含む、前記ＭＢＳＡシステム。
【請求項５】
請求項１に記載のＭＢＳＡシステムであって、前記光学サブシステムが高輝度ＬＥＤ光源を含む、前記ＭＢＳＡシステム。
【請求項６】
請求項１に記載のＭＢＳＡシステムであって、前記光学サブシステムがマルチエレメント光検出器を含む、前記ＭＢＳＡシステム。
【請求項７】
請求項６に記載のＭＢＳＡシステムであって、前記マルチエレメント光検出器がＣＣＤベースの撮像機器である、前記ＭＢＳＡシステム。
【請求項８】
請求項７に記載のＭＢＳＡシステムであって、前記ＣＣＤベースの撮像機器が非冷却ＣＣＤカメラである、前記ＭＢＳＡシステム。
【請求項９】
請求項１に記載のＭＢＳＡシステムであって、前記光学サブシステムが蛍光撮像および蛍光非依存的撮像ができる、前記ＭＢＳＡシステム。
【請求項１０】
請求項９に記載のＭＢＳＡシステムであって、前記光学サブシステムが蛍光撮像のための第１の光源および蛍光非依存的撮像のための第２の光源を含む、前記ＭＢＳＡシステム。
【請求項１１】
請求項１０に記載のＭＢＳＡシステムであって、前記第２の光源が発光ダイオード（ＬＥＤ）である、前記ＭＢＳＡシステム。
【請求項１２】
請求項１１に記載のＭＢＳＡシステムであって、前記ＬＥＤが反射光の暗視野照明を目的として構成される、前記ＭＢＳＡシステム。
【請求項１３】
請求項１１に記載のＭＢＳＡシステムであって、前記ＬＥＤが透過光の傾斜照明を目的として構成される、前記ＭＢＳＡシステム。
【請求項１４】
請求項１０に記載のＭＢＳＡシステムであって、前記第２の光源がハロゲン化金属または水銀球である、前記ＭＢＳＡシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本明細書は、その全文を参照文献として本明細書に援用する２００９年９月２１日出願の米国仮特許出願第６１／２７２，３９７号の優先権を主張する。
【０００２】
本技術分野はバイオテクノロジーであり、かつ、より具体的には、生体分子の分析を目的とした方法および装置に関する。
【背景技術】
【０００３】
サンプル調製およびサンプル分析機能を共に有する分析機器を有することは望ましい。軽量かつ小型でありかつ低コストで製造することのできる分析機器を有することも好ましい。しかし、微量流動上の困難がそのような分析機器の開発を妨げていた。これらの困難は、部分的に、小スケールにおける流体力学が原因となっている。たとえば、Ｈａｇｅｎ−Ｐｏｉｓｅｕｉｌｌｅの式によると、微量流動導管の直径が減少するにつれて導管の直径上の圧力損失はその４乗増加する。複雑な微量流動形状寸法を採用する場合、これらの大きな圧力損失は、特に系内の気泡により、予測が非常に困難な流動パターンをもたらすことがある。空気の熱膨張は液状物の５倍以上であり、さらなる困難をもたらす。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
サンプルの処理および分析を目的とした一体型カートリッジが開示される。一体型カートリッジは、サンプル入口およびサンプル出口を有するサンプル調製チャンバー、およびハウジングおよびハウジングの内部の抽出フィルターを収容する交換可能なサンプル精製ユニットを受容するよう適合化されたサンプル精製チャンバーを収容する。抽出フィルターは目的分子と特異的に結合する。サンプル精製チャンバーは、サンプル調製チャンバーのサンプル出口と流動的に連絡するサンプル入口を有する。
【０００５】
マイクロアレイベースサンプル分析（ＭＢＳＡ）システムも開示される。ＭＢＳＡシステムは、反応チャンバーおよびマイクロアレイを有する脱着式の交換可能なサンプル分析ユニットを受容するよう構成された脱着式カートリッジを受容するよう適合化されたカートリッジホルダー、液状物の流動を制御する流動制御システム、およびマイクロアレイの画像をキャプチャーするよう設計された光学サブシステムを含む。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
発明を実施するための形態は、以下の図面を参照する：
【図１Ａ】一体型カートリッジの実施形態を示す模式図である。
【図１Ｂ】一体型カートリッジの実施形態を示す模式図である。
【図２】細胞溶解手段を伴う一体型カートリッジを示す模式図である。
【図３】図３Ａ〜Ｃはデュアルファンクション一体型カートリッジのタンパク質精製コンポーネントの相異なる実施形態を示す模式図である。
【図４】マイクロアレイベースサンプル分析システム（ＭＢＳＡ）のブロック図である。
【図５】一体型カートリッジに接続されたポンプおよび選択バルブ（ＳＶ）を示す流動サブシステムの模式図である。
【図６】図６Ａはサーモサイクラー嚢を伴わない流動マニホールド内に存在する一体型カートリッジを示す模式図である。図６Ｂはサーモサイクラー嚢を伴う流動マニホールド内に存在する一体型カートリッジを示す模式図である。
【図７】一体型カートリッジにおけるオンボード微量流動カートリッジバルブの位置を示す模式図である。
【図８】オンボード微量流動カートリッジバルブの実施形態を示す模式図である。
【図９】フローセル内のチャンバー配置の実施形態を示す模式図である。
【図１０】部位ＲＳ１８００４０７における眼色ＳＮＰについて得られたＰＣＲ／ＡＰＥＸアレルシグナル比率の結果を示す図である。ＰＣＲは、嚢状サーモサイクラー内に位置するＡｋｏｎｎｉフローセル、ＭＪサーモサイクラー内に配置された０．２ｍＬ  ＰＣＲ管、および嚢状サーモサイクラー内に位置するＣｅｐｈｅｉｄ管において実施した。ＡＰＥＸをオフラインで１時間実施した。結果より、３つのＰＣＲ法全てについて同様のＡＰＥＸシグナルが示された。
【図１１Ａ】レーザー光源による光学サブシステムの実施形態を示す模式図である。
【図１１Ｂ】同軸照明を用いて図１１Ａに記載の光学サブシステムで撮影した３００μｍピッチのＣｙ３アレイの典型的画像を示す。
【図１２Ａ】レーザー光源による光学サブシステムの他の実施形態を示す模式図である。
【図１２Ｂ】図１２Ａの光学サブシステムにより撮影した１１×１８  Ｃｙ３アレイの典型的画像を示す。
【図１３−１】図１３Ａは高輝度ＬＥＤによる光学サブシステムの実施形態を示す模式図である。図１３Ｂは蛍光およびＦＩＩ撮像を目的とした光学縦列を示す模式図である。
【図１３−２】図１３Ｃは蛍光およびＦＩＩ撮像を目的とした他の光学縦列を示す模式図である。図１３Ｄは図１３Ｂおよび１３Ｃにおいて用いた平行光源を示す。
【図１４】図１４ＡはゲルアレイのＦＩＩ画像を示す。図１４Ｂは図１４Ａにおけるアレイエレメントの正規化ピクセル強度プロフィールを示す図である。
【図１５−１】ＩｍａｇｅＪソフトウェアで利用可能な相異なる方法によって処理したゲルアレイ画像を示す複合画像である。パネルＡ、処理前の画像；パネルＢ、ＩｍａｇｅＪ処理：Ｐｒｏｃｅｓｓ＝＞Ｆｉｎｄ  Ｅｄｇｅｓ；パネルＣ、ＩｍａｇｅＪ処理：Ｐｒｏｃｅｓｓ＝＞Ｆｉｌｔｅｒｓ＝＞Ｍｅｄｉａｎ，Ｒ＝５；パネルＤ、ＩｍａｇｅＪ処理：Ｐｒｏｃｅｓｓ＝＞Ｆｉｌｔｅｒｓ＝＞Ｍｅａｎ、Ｒ＝５；
【図１５−２】パネルＥ、ＩｍａｇｅＪ処理：Ｉｍａｇｅ＝＞Ａｄｊｕｓｔ  Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ；パネルＦ、ＩｍａｇｅＪ処理：Ｐｒｏｃｅｓｓ＝＞Ｆｉｌｔｅｒｓ＝＞Ｍａｘｉｍｕｍ．．．．Ｒ＝２；パネルＧ、ＩｍａｇｅＪ処理：Ｐｒｏｃｅｓｓ＝＞Ｂｉｎａｒｙ＝＞Ｆｉｎｄ  Ｍａｘｉｍａ；パネルＨ、確認されたスポットの中心および検出されたスポットの境界をそれぞれ示す画像の重ね合わせ。
【図１６】スポット形状の評価を示す複合図である。パネルＡ：蛍光撮像モードで撮影した画像；パネルＢ：平行ビームによる傾斜照明を用いて撮影した同アレイのＦＩＩ画像；パネルＣ：ＩｍａｇｅＪにおいてＰｒｏｃｅｓｓ＝＞Ｆｉｎｄ  Ｅｄｇｅｓを用いた画像処理；パネルＤ：ＩｍａｇｅＪにおいてＰｒｏｃｅｓｓ＝＞Ｆｉｌｔｅｒｓ＝＞Ｍｅｄｉａｎ、Ｒ＝２；Ｉｍａｇｅ＝＞Ａｄｊｕｓｔ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄを用いた画像処理。
【図１７Ａ】図１５のパネルＡにおけるゲルスポットについての形態の評価を示すグラフである。
【図１７Ｂ】図１５のパネルＡにおけるゲルスポットについての形態の評価を示すグラフである。
【図１８】図１８ＡはプロトタイプＭＢＳＡシステムおよびＡｕｒｏｒａイメージャーによるＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓの検出を示す写真である。図１８ＢはプロトタイプＭＢＳＡシステムおよびＡｋｏｎｎｉイメージャーによるＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓの検出を示す写真である。
【図１９】図１９ＡはプロトタイプＭＢＳＡシステムおよび図１１Ａに示す撮像手法によるＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓの検出を示す写真である。図１９Ｂは図１９Ａに用いられるマイクロアレイのアレイマップである。
【図２０】ビーズミキサーを有する一体型カートリッジを用いて抽出したＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  ＤＮＡのＰＣＲの結果を示す図である。ミキサー１およびミキサー２：ビーズミキサーを有する一体型カートリッジを用いて２つの独立した実験において抽出したＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  ＤＮＡ。ボルテックス：標準的なボルテキシング法を用いて抽出したＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  ＤＮＡ。ＮＴＣ：陰性対照。
【図２１Ａ】６重ＰＣＲ生成物についてのマイクロアレイの結果を示す。左上パネルは、矢印が多重ＰＣＲにおいて生成された６つのＰＣＲ産物を示すマイクロアレイ画像である。右上パネルはマイクロアレイマップである。下のパネルは、異なる３つのアニーリング温度の下で生成されたＰＣＲ産物のプローブ番号／プライマー識別子／蛍光シグナル強度を示す。
【図２１Ｂ】カートリッジ精製した血液ＤＮＡのリアルタイムＰＣＲ分析を示す図である。
【図２２】ＰＩＤポンプおよびヒーター制御のサーモサイクリングプロフィールを示す。線Ａは高温ゾーンの温度を示し、線Ｂは低温ゾーンを示し、線Ｃは嚢に挟まれた熱電対の温度を示し、かつ線Ｄは嚢に流入する直前の作業液状物の温度を示す。
【図２３】デュアルファンクション一体型カートリッジの実施形態を示す図である。
【図２４】完全なＭＢＳＡシステムの実施形態を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
本記述は、本発明の文面による記述の一部と見なすべき付属の図面と関連付けて読まれることを意図している。図面は必ずしも縮尺を定める必要がなく、かつ明確性および簡略性を図るために本発明の一定の特徴が縮尺において誇張されるかまたは幾分模式的な形態で示されることもある。記述において、「前方」、「後方」、「上へ」、「下へ」、「最上部」、「底部」などの相対的な用語およびその派生語は、そのときに記述されるかまたは議論されている図面において示される方向を指すと解釈すべきである。これらの相対的な用語は記載の簡便性を目的としており、かつ通常は具体的な方向を要求することを意図していない。「連結される」および「着接される」などの接続、着接などに関連する用語は、特に説明的に記述されない限り、構造物が互いに直接的または介在構造を介して間接的に固定または着接される関係、および両者が可動性または剛直性の着接または関係を指す。
【０００８】
本発明を実施するための形態を記述する際には、明確性を目的として具体的な用語を用いる。しかし、本発明はそのように選択される具体的な用語に限定されることを意図していない。各具体的要素が、同様の目的を遂行するために同様の様式で作動する全ての技術的等価物を含むことを理解すべきである。
【０００９】
サンプルの処理および分析を目的とした一体型カートリッジが開示される。一体型カートリッジはサンプル調製チャンバー、サンプル精製チャンバーおよび脱着式サンプル分析ユニットを含む。サンプル調製チャンバーは、サンプル入口およびサンプル出口を有し、かつサンプル精製チャンバーと流動的に連絡する。サンプル精製チャンバーは、目的分子と特異的に結合する抽出フィルターを含む。脱着式サンプル分析ユニットは、マイクロアレイを含むサンプル分析チャンバーを少なくとも１つ含む。
【００１０】
図１Ａは一体型カートリッジの１つの実施形態を示す。一体型カートリッジは、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドなどの生体分子の抽出、および同カートリッジの内におけるその後の生体分子分析を可能とする。この実施形態においては、一体型カートリッジ１００はカートリッジ本体１およびサンプル分析ユニット２を含む。カートリッジ本体１はサンプル調製チャンバー１０、サンプル調製チャンバー１０と流動的に連絡するサンプル精製チャンバー２０、サンプル精製チャンバー２０と流動的に連絡するサンプル溶離チャンバー３０、サンプル精製チャンバー２０と流動的に連絡する廃液チャンバー４０、サンプル分析ユニット２がカートリッジ本体１と接続される時にサンプル分析ユニットと流動的に連絡する生成物廃棄チャンバー５０、チャンバーを互いに接続する流動導管６０、および一体型カートリッジ１００がカートリッジベース（示さず）に接続されることを可能とする流動インターフェース７０を含む。１つの実施形態においては、サンプル分析ユニット２はカートリッジ本体１の一部分である。他の実施形態においては、サンプル分析ユニット２はカートリッジ本体１から脱着可能である。図１Ｂは、各チャンバーにおける流動物の流動を制御するオンボードバルブ８０を有する同カートリッジ１００を示す模式図である。
【００１１】
サンプル調製チャンバー１０はチャンバーの上部にサンプル入口１１およびチャンバーの下部にサンプル出口１２を有する。図１Ａおよび１Ｂに示す実施形態においては、サンプル入口１１はサンプル調製チャンバー１０の最上部に位置し、かつサンプル出口１２はサンプル調製チャンバー１０の底部に位置する。１つの実施形態においては、サンプル入口１１はドームバルブである。ポンプと接続する時、サンプル出口１２は空気入口の役割も果たす。サンプル調製チャンバーの内部におけるサンプル混合は、サンプル出口１２より空気または不活性ガス（例：窒素）などの気体をポンプによりサンプル調製チャンバー１０に流すことによって達成してもよい。気体はチャンバー１０の底部から最上部まで移動し、かつ処理中のサンプルを混合する気泡を形成する。
【００１２】
他の実施形態においては、サンプル調製チャンバー１０でサンプル／試薬混合物を均一に加熱する手段を提供するために気体を加熱する。
【００１３】
サンプル精製チャンバー２０は１つの分析物と特異的に結合する抽出フィルター２１を含む。分析物の例はポリヌクレオチド、ポリペプチド、脂質および多糖類を含むが、これに限定されない。１つの実施形態においては、抽出フィルターはＤＮＡと特異的に結合するシリカ抽出フィルターである。他の実施形態においては、抽出フィルターはタンパク質と特異的に結合する多孔質材料である。１つの実施形態においては、抽出フィルター２１は、カートリッジ本体１より容易に脱着しかつ新たなサンプル精製ユニット２２に置換することのできる置換可能なサンプル精製ユニット２２の内部に位置する。サンプル精製ユニット２２は入口および出口を有するハウジング、および分析物と特異的に結合する抽出フィルター２１を含む。１つの実施形態においては、サンプル精製ユニット２２は、ピペットチップの形態にある。好ましい実施形態においては、ピペットチップはサンプル精製チャンバー２０の領域内に嵌合するよう寸法取りされる。他の好ましい実施形態においては、抽出フィルター２１は、いずれもがその全文を本明細書に参照文献として援用する米国特許出願番号第１１／９３３，１１３号および第１２／２１３，９４２号に記載されたガラスフリットである。
【００１４】
溶離チャンバー３０は、カートリッジ本体に着接される時に、サンプル精製チャンバー２０およびサンプル分析ユニット２の両者に接続される。一定の実施形態においては、溶離チャンバー３０は一体型カートリッジより排除され、かつサンプル精製チャンバー２０はサンプル分析ユニット２に直接接続される。
【００１５】
一体型カートリッジ１００は、図１Ａおよび１Ｂに示すように直立位置で作動するよう設計される。サンプル調製チャンバーおよびサンプル精製チャンバーは気泡が最上部まで上昇することを可能とするために十分な直径を有するよう設計される。
【００１６】
サンプル分析ユニット２は、サンプル分析を目的としたチャンバーを１つまたはそれ以上含んでもよい。１つの実施形態においては、サンプル分析ユニット２は分析物の分析を目的としたマイクロアレイ４を含むマイクロアレイチャンバー３を含む。マイクロアレイ４は任意の種類のマイクロアレイとすることができる。１つの実施形態においては、マイクロアレイ４はＤＮＡアレイである。他の実施形態においては、マイクロアレイ４はタンパク質またはペプチドアレイである。他の実施形態においては、マイクロアレイは、その全文を参照文献として本明細書に援用する米国特許第５，７４１，７００号、第５，７７０，７２１号、第５，９８１，７３４号および第６，６５６，７２５号および米国特許出願番号第１０／０６８，４７４号、第１１／４２５，６６７号および第６０／７９３，１７６号に記載されるゲルエレメントアレイである。さらに他の実施形態においては、マイクロアレイ４は抗体アレイである。
【００１７】
１つの実施形態においては、マイクロアレイチャンバー３はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはアレイ化プライマー伸長（ＡＰＥＸ）などの増幅反応のための反応チャンバーの役割も果たす。
【００１８】
他の実施形態においては、サンプル分析ユニット２は増幅チャンバー５をさらに含む。１つの実施形態においては、増幅チャンバー５は、繰り返し加熱および冷却して増幅チャンバー５の内部でＤＮＡ標的を増幅することのできるＰＣＲチャンバーである。
【００１９】
サンプル分析ユニット２および／またはカートリッジ本体１は、サーモサイクリングに耐えることができ、かつエタノールなどの溶媒に影響されない材料より作製される。カートリッジ本体は機械切削または射出成形することができる。
【００２０】
１つの実施形態においては、マイクロアレイチャンバー３および／または増幅チャンバー５は親水性内面を有する。好ましい実施形態においては、マイクロアレイチャンバー３および／または増幅チャンバー５は、その全文を本明細書に参照文献として援用する米国特許出願番号第１２／１４９，８６５号に記載の親水性フローセルである。
【００２１】
作動中、カートリッジ１００は流動ドッキングステーションに挿入される。１つの実施形態においては、流動ドッキングステーションは、カートリッジ上でルアー作動バルブを作動させるルアーテーパー突起を介してカートリッジ１００と掛合する。細胞懸濁液などのサンプルを、サンプル入口１１を経て一体型カートリッジ１００のサンプル調製チャンバー１０に装填する。サンプル調製チャンバー１０に細胞溶解バッファーを添加し、さらにサンプル調製チャンバー１０の底部から最上部まで移動する気泡によってサンプルと混合する。気泡はエアーポンプからの調節気流によって制御する。この空気は、高温でのインキュベーションを必要とするプロトコルのために加熱してもよい。次に、混合サンプルを、目的の分析物と特異的に結合する抽出フィルター２１を収容するサンプル精製チャンバー２０に導入する。サンプルは抽出フィルター２１を通過し、目的の分析物が抽出フィルター２１と結合することを可能とする。一定の実施形態においては、サンプルを抽出フィルター２１の前後に多数回循環させて分析物の結合効率を向上させる。次に、未結合サンプルを、オンボードカートリッジピンバルブ８０および流動導管６０を経て廃液チャンバー４０に誘導する。廃液をカートリッジに残すと次のサンプルによる汚染が防止される。
【００２２】
抽出フィルター２１を洗浄バッファーで１回またはそれ以上洗う。使用した洗浄バッファーを、オンボードカートリッジバルブ８０および流動導管６０を経て廃液チャンバー４０に誘導する。１つの実施形態においては、洗浄バッファーはエタノールベースの洗浄バッファーでありかつ抽出フィルター２１を通して５回循環させる。次に、溶離バッファーを、抽出フィルター２１を経てサンプル精製チャンバー２０に導入する。溶離した分析物を溶離チャンバー３０に誘導し、溶離物中の気泡を除去する。次に、溶離した分析物は、サンプル分析ユニット内で次のサンプル分析に用いる。また溶離した分析物の一部を他の種類の分析のために取出してもよい。１つの実施形態においては、溶離したＤＮＡサンプルを増幅チャンバー５に誘導してＰＣＲ増幅する。増幅チャンバー５における温度変化は、たとえば、その全文が本明細書に参照文献として援用される、米国特許出願番号第１１／８４３，８４３号および第１２／２３２，６６９号に記載されるところの、２つの温度の流体を増幅チャンバー５と密着する柔軟性嚢内で往復させることにより達成される。オンボードカートリッジバルブ８０は、温度制御レザバーの間で切替えを行って迅速な温度変化を提供する。増幅生成物は、マイクロアレイチャンバー内に誘導されてマイクロアレイにハイブリダイズされる。
【００２３】
（細胞溶解ビーズを有する一体型カートリッジ）
一定の実施形態においては、サンプル調製チャンバー１０は細胞サンプルを溶解するためのサンプル溶解手段をさらに含む。図２に示す実施形態においては、サンプル調製チャンバー１０は多数の細胞溶解ビーズ１３および磁石１５を有する磁気撹拌子１４を収容する。無傷の細胞の懸濁液をサンプル調製チャンバー１０に加え、さらにサンプル調製チャンバー１０に回転磁場を適用し、細胞を溶解するのに十分な回転速度で磁気撹拌子１４を回転させる。
【００２４】
本明細書で用いるところの用語「細胞」は真核細胞、原核細胞およびその構成要素または断片を指す。用語「細胞」は寄生虫、細菌、細菌芽胞、真菌、ウイルス粒子、さらには多細胞生物、組織およびその断片などの細胞凝集物を含む。用語「細胞懸濁液」は、細胞が液状培地中に懸濁されることを特徴とする細胞および液状培地の混合物を指す。好ましくは、細胞は磁気撹拌子の動きを妨害するほど濃すぎないかまたは粘稠すぎない濃度で懸濁される。
【００２５】
一定の実施形態においては、真核細胞または原核細胞は１×１０２〜１×１０５細胞／ｍＬの濃度範囲で懸濁される。他の実施形態においては、真核細胞または原核細胞は１×１０３〜１×１０４細胞／ｍＬの濃度範囲で懸濁される。他の実施形態においては、ウイルス粒子は１×１０７〜１×１０１３細胞／ｍＬの濃度範囲で懸濁される。さらに他の実施形態においては、ウイルス粒子は１×１０９〜１×１０１１細胞／ｍＬの濃度範囲で懸濁される。
【００２６】
液状培地は等張、低張または高張とすることができる。一部の実施形態においては、液状培地は水性である。一定の実施形態においては、液状培地はバッファーおよび／または少なくとも１つの塩または塩の組合せを含有する。一部の実施形態においては、液状培地のｐＨの範囲は約５〜約８、約６〜８、または約６．５〜約８．５である。所望のｐＨを達成するために多様なｐＨバッファーを用いてよい。適切なバッファーはＴｒｉｓ、ＭＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＡＤＡ、ＡＣＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳＯ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓプロパン、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＭＯＢＳ、ＴＡＰＳＯ、ＨＥＰＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＴＥＡ、ＨＥＰＰＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ｂｉｃｉｎｅ、およびリン酸バッファー（例：とりわけリン酸ナトリウムまたはリン酸ナトリウムカリウムなど）を含むが、これに限定されない。液状培地は約１０ｍＭ〜約１００ｍＭのバッファー、約２５ｍＭ〜約７５ｍＭのバッファー、またはとりわけ約４０ｍＭ〜約６０ｍＭのバッファーを含んでもよい。液状培地に用いるバッファーの種類および量は用途毎に変化させることができる。一部の実施形態においては、液状培地は、約５０ｍＭのＴｒｉｓバッファーを用いて達成することのできる約７．４のｐＨを有する。一部の実施形態においては、液状培地は水である。
【００２７】
細胞溶解ビーズは、溶解する細胞の硬度を上回る硬度を有するあらゆる粒子状またはビーズ状材料とすることができる。細胞溶解ビーズはプラスチック、ガラス、セラミックス、または非磁性金属ビーズなどの他の任意の非磁性材料より作製してよい。１つの実施形態においては、細胞溶解ビーズは１つの軸について回転対称である（例：球状、円形、広楕円形、楕円形、卵形、および水滴形粒子など）。他の実施形態においては、細胞溶解ビーズは多面体形状を有する。他の実施形態においては、細胞溶解ビーズは不規則な形状の粒子である。さらに他の実施形態においては、細胞溶解ビーズは突起を有する粒子である。
【００２８】
１つの実施形態においては、細胞溶解ビーズは１０〜１，０００μｍの範囲の直径を有する。他の実施形態においては、細胞溶解ビーズは２０〜４００μｍの範囲の直径を有する。さらに他の実施形態においては、細胞溶解ビーズは５０〜２００μｍの範囲の直径を有する。
【００２９】
磁気撹拌子はあらゆる形状のものとすることができ、かつ容器に適合する寸法を有する。換言すれば、磁気撹拌子は容器内に留置しかつ容器内で回転または攪拌するために十分小さくなければならない。所与の容器に対して適切なサイズの磁気撹拌子を選択することは当業者の知識の範囲内である。磁気撹拌子は棒状、円柱状、桿状、十字型、Ｖ字型、三角形、長方形または円盤形状撹拌子とすることができる。１つの実施形態においては、磁気撹拌子は長方形の形状を有する。他の実施形態においては、磁気撹拌子は二又音叉型を有する。さらに他の実施形態においては、磁気撹拌子はＶ字型を有する。一部の実施形態においては、磁気撹拌子はプラスチック、ガラスまたはポーセリンなどの化学的に不活性な材料によりコーティングされる。
【００３０】
１つの実施形態においては、細胞溶解ビーズ１３および／または磁気撹拌子１４をサンプル調製チャンバー１０内に事前包装する。他の実施形態においては、細胞溶解ビーズ１３および／または磁気撹拌子１４を、容易にサンプル調製チャンバー１０内に留置しかつ細胞溶解後に廃棄することのできる脱着式サンプル溶解ユニット内に事前包装する。さらに他の実施形態においては、細胞溶解ビーズ１３および／または磁気撹拌子１４は、細胞懸濁液と共にサンプル調製チャンバー１０内に加えられる。細胞溶解ビーズ１３、磁気撹拌子１４および細胞懸濁液は、任意の順序でサンプル調製チャンバー１０に留置してよい。１つの実施形態においては、始めに細胞懸濁液、さらにその後細胞溶解ビーズまたは磁気撹拌子のいずれかをサンプル調製チャンバー１０内に装填する。他の実施形態においては、始めに硬質ビーズおよび／または磁気撹拌子、その後に細胞懸濁液をサンプル調製チャンバー１０内に留置する。
【００３１】
次に、カートリッジを磁気攪拌器のごく近傍に載置する。容器内の細胞を溶解するために十分な回転速度で磁気撹拌子により細胞懸濁液を攪拌する。最適な攪拌速度および時間は溶解する細胞、ウイルスまたは組織に基づいて経験的に決定することができる。適切な回転速度は用途に依存し、かつ当業者が決定することができる。一般的に言って、細胞を溶解するために十分な回転速度は、細胞の種類、細胞懸濁液の濃度、磁気撹拌子のサイズおよび形状、硬質ビーズの量、サイズ、形状および硬度、ならびに容器のサイズ、形状および内面の粗さなどの因子によって決定される。一部の実施形態においては、試験管またはエッペンドルフチューブの形態の容器を標準的な実験用磁気攪拌プレート上のラックに載置し、さらに最高速度設定で攪拌する。
【００３２】
一定の実施形態においては、特定の種類の細胞の溶解は、攪拌ステップ前に細胞懸濁液に添加剤を加えることにより促進することができる。添加剤の例は酵素、洗剤、界面活性剤、および塩基および酸などの他の薬品を含む。アルカリ性条件（例：１０ｍＭ  ＮａＯＨなど）によって一定の種類の細胞に対する溶解効率が高まりうることが確認されている。しかし、添加剤はサンプル分析過程の下流の反応を妨害してはならないことに留意すべきである。細胞懸濁液は、攪拌中に加熱して溶解効率を向上させてもよい。
【００３３】
ビーズ／磁気攪拌器溶解法およびシステムの１つの実施形態は、その全文が本明細書に参照文献として援用される米国仮特許出願第６１／２７２，３９６号に記載されている。
【００３４】
ビーズ／磁気攪拌器法の他、サンプル調製チャンバー１０内の細胞はビーズビーティング、ボルテキシング、超音波処理および化学的溶解などの他の方法によって溶解してもよい。
【００３５】
微量流動機器に共通して付随する問題を回避するために、一体型カートリッジは以下の特徴を１つまたはそれ以上含むことがある（１）一体型カートリッジ内の微量流動導管は、逆圧を低下させるために十分大きく（直径０．２〜１ｍｍ、好ましくは０．５ｍｍ）、かつ０．１ｍｍを下回る微量流動形状寸法を作製する際には高度に有用となりうる、再現性のある射出成形された形体を可能とする。（２）微量流動導管の内面は、微量流動導管内部の気泡トラッピングを低下させるために、親水性フィルムによって完全に被覆されるか、部分的に被覆されるか、またはコーティングされる。（３）一体型カートリッジ内の反応チャンバー（すなわちサンプル調製チャンバー、サンプル精製チャンバーおよびサンプル溶離チャンバー）は、水と比較した空気の密度の差によってチャンバーの最上部まで気泡を確実に上昇させるために、直立型タワー形状に設計される。またタワー設計は、タワーの底部からサンプルに空気を流入させることによるタワー内でのサンプル混合も可能とする。液状物は底部から最上部まで上昇する気泡によって激しく混合される。（５）一体型カートリッジの抽出フィルターは、逆圧を低下させるために大きな空隙率を有する。（６）一体型カートリッジにおけるオンボードカートリッジバルブは流路を遮断し、かつ液状物が望ましくない経路に流れることを防止する。（７）カートリッジは、液状物がディスポーザブルカートリッジの精密ポンプおよび選択バルブによって制御されるよう設計される。小さな気泡が試薬の比率の大きなばらつきを引き起こすことを防止するため、液状物の計量は１０μＬを上回る体積で実施する。
【００３６】
親水性被覆またはコーティングに用いることのできる親水性材料の例は、ポリ（Ｎ−ビニルラクタム）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（プロピレンオキシド）、ポリアクリルアミド、セルロース誘導体、メチルセルロース、ポリ酸無水物、ポリアクリル酸、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、アルキルフェノールエトキシレート、ポリオールモノエステル複合体、オレイン酸ポリオキシエチレンエステル、オレイン酸ポリオキシエチレンソルビタンエステル、およびソルビタン脂肪酸エステルなどの親水性ポリマー；無機酸化物、金、ゼオライト、およびダイヤモンド状炭素などの無機親水性材料；およびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ラウリル硫酸アンモニウム、アルキル硫酸塩、ラウリルエーテル硫酸ナトリウム（ＳＬＥＳ）、アルキルベンゼンスルホン酸塩、石けん、脂肪酸塩、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）、別名ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド、アルキルメチルアンモニウム塩、セチルピリジニウムクロリド（ＣＰＣ）、ポリエトキシ化獣脂アミン（ＰＯＥＡ）、塩化ベンザルコニウム（ＢＡＣ）、塩化ベンゼトニウム（ＢＺＴ）、ドデシルベタイン、ドデシルジメチルアミンオキシド、コカミドプロピルベタイン、ココヤシ両性グリシネートアルキルポリ（エチレンオキシド）、ポリ（エチレンオキシド）とポリ（プロピレンオキシド）のコポリマー（商品名ＰｏｌｏｘａｍｅｒｓまたはＰｏｌｏｘａｍｉｎｅｓ）、アルキルポリグルコシド、脂肪アルコール、コカミドＭＥＡ、コカミドＤＥＡ、コカミドＴＥＡなどの界面活性剤を含むが、これに限定されない。界面活性剤は、ポリウレタンおよびエポキシドなどの反応ポリマーと混合して親水性コーティングとなることができる。
【００３７】
（簡易型一体型カートリッジ）
サンプルの処理を目的とした簡易型カートリッジも開示される。カートリッジは、入口および出口を有するサンプル調製チャンバー、ならびに入口および出口を有するサンプル精製チャンバーを含む。サンプル調製チャンバーは、その中に排置された磁気撹拌子および多数の細胞溶解ビーズを含む。サンプル精製チャンバーは抽出フィルターを収容し、かつサンプル調製チャンバーと流動的に連絡する。
【００３８】
１つの実施形態においては、サンプル調製チャンバー内に容易に挿入またはこれより取出することのできる容器内に、磁気撹拌子および多数の細胞溶解ビーズを事前包装し、かつサンプル精製チャンバー内に容易に挿入またはこれより取出することのできる容器内に抽出フィルターを事前包装する。
【００３９】
（デュアルファンクション一体型カートリッジ）
タンパク質精製能力および核酸精製能力を共に有するデュアルファンクションカートリッジも開示される。簡単に述べると、デュアルファンクションカートリッジは核酸精製モジュールおよびタンパク質精製モジュールを収容する。各モジュールはサンプル精製チャンバーおよびサンプル溶離チャンバーを収容する。１つの実施形態においては、モジュールは単一のサンプル調製チャンバーおよび／または単一の廃液チャンバーを共有する。他の実施形態においては、モジュールは単一のサンプル調製チャンバーを共有するが、各モジュールは専用の廃液チャンバーを収容する。さらに他の実施形態においては、各モジュールは専用のサンプル調製チャンバーおよび廃液チャンバーを有する。適切なカートリッジベース設定は、核酸およびタンパク質の同時精製または核酸およびタンパク質の連続精製を可能とするよう構築することができる。
【００４０】
１つの実施形態においては、サンプルは連続的な様式で処理される。図３Ａに示すように、サンプルにはまず核酸精製の処理を行う。核酸廃液チャンバー内の核酸を除去されたサンプルを第２の精製チャンバーに吸引して（例：ＴｒｕＴｉｐ）タンパク質精製を実施し、次に第２の廃液チャンバーに送液する。試薬は、ｍｉｌｌｉＧＡＴポンプなどの二方向ポンプで駆動する。タンパク質洗浄バッファーをバッファーレザバー（示さず）より第２の精製チャンバーに直接添加してもよい。
【００４１】
他の実施形態においては、一体型カートリッジは第２の精製チャンバー上のカートリッジバルブがシリンジ型ポンプの役割をとして働くよう変更される。図３Ｂに示すように、単一の廃液チャンバーのみが必要とされる。具体的には、第２の精製チャンバー上のカートリッジバルブと接続するレザバーポケットを有するようカートリッジを変更し（図３Ｂに「シリンジポンプ」として示す）、核酸廃液チャンバー内の液状物が、「シリンジポンプ」が「抜取」状態である間は（シリンジの外筒を充填するのと同様に）レザバーポケットを充填し、かつ「シリンジポンプ」が「送液」状態である間は第２の精製チャンバーに流入することができるようにする。レザバーポケットのサイズは、一体型カートリッジのサイズおよび機能に応じて変化させてよい。一定の実施形態においては、レザバーは０．０１〜１０ｍＬ、０．２〜５ｍＬ、０．５〜３ｍＬ、または１〜５ｍＬの容積を有する。レザバーの形状および正確な位置は、一体型カートリッジの全体的な設計に基づいて調節してよい。核酸廃液チャンバーと第２の精製チャンバーの間にチェックバルブを設置し、液状物の一方向への流動を確保する。第２の精製チャンバーにおける洗浄ステップは、カートリッジバルブを閉じ、核酸廃液チャンバーのベント（示さず）を開き、さらにバッファーレザバーから「シリンジポンプ」を経て第２の精製チャンバー内にタンパク質洗浄バッファーを連続的に流入させることにより達成することができる。
【００４２】
さらに他の実施形態においては、第２の精製チャンバーは、溶液を第２の精製チャンバー内のフリットを通過させて連続的に再循環させるギアポンプと着接される（図３Ｃ）。ギアポンプは二方向的に操作することができ、かつ核酸廃液チャンバーと第２の精製チャンバーの間のチェックバルブが不要である。タンパク質洗浄ステップは、カートリッジバルブを閉じ、核酸廃液チャンバーのベントを開き、さらにバッファーレザバーからギアポンプを経て第２の精製チャンバー内にタンパク質洗浄バッファーを連続的に流入させることにより達成してもよい。
【００４３】
（マイクロアレイベースサンプル分析（ＭＢＳＡ）システム）
マイクロアレイベースサンプル分析（ＭＢＳＡ）システムも開示される。図４に示すように、ＭＢＳＡシステム２００の実施形態はカートリッジホルダー２１０、流動制御サブシステム２２０、光学サブシステム２３０、制御ソフトウェア２４０および、任意選択で、サーモサイクラー２５０を含む。
【００４４】
カートリッジホルダー２１０は、流動マニホールド２１２を経て一体型カートリッジ１００に接続されるよう設計される。またカートリッジホルダー２１０は、一体型カートリッジの多様なコンポーネントとＭＢＳＡシステムのサブシステムの間の相互作用を促進する位置に、一体型カットリッジ１００を維持する。たとえば、適切に着接されたカートリッジは、カートリッジのＰＣＲチャンバー５をサーモサイクラー２５０の加熱エレメント間に配置し、かつ光学サブシステムによるマイクロアレイ４の光学的インタロゲーションを可能とする。
【００４５】
流動制御サブシステム２２０はＭＢＳＡシステム２００内の流動を制御する。サブシステムは複数の流動物容器、ポンプ、バルブおよび配管を含む。流動制御サブシステム２２０は、流動マニホールド２１２を経て一体型カートリッジ１００に直接接続される。
【００４６】
光学サブシステム２３０は、サンプルのハイブリダイゼーション後にサンプル分析ユニット２のマイクロアレイ４の画像をキャプチャーするよう設計される。一定の実施形態においては、光学サブシステムはマイクロアレイ上の低レベル蛍光検出を目的として特別に設計される。１つの実施形態においては、光学サブシステムは、厳密に焦点を合わせたレーザービームにより物質表面をインタロゲートするプロセスにおいて、ピクセル毎にマイクロアレイ画像を取得する共焦点または準共焦点レーザースキャナーを用いる。レーザースキャナーは、空間的に均一な感度、広いダイナミックレンジ、および焦点外の迷光の効率的な除去という利点を提供する。しかし、レーザースキャナーは非常に損傷しやすくかつ高価な機器である。
【００４７】
他の実施形態においては、光学サブシステムは、全てのマイクロアレイエレメント（フィーチャー）を同時に照明し、さらにＣＣＤカメラなどのマルチエレメント光検出器が、全て同時に、または後でスティッチングする数個の連続した部分フレームのいずれかによってマイクロアレイ画像を取得する、フラッドイルミネーションによる撮像機器を用いる。レーザースキャナーと比較して、ＣＣＤベースの撮像機器は設計がより単純でかつコストが低い。ＣＣＤベースの撮像機器は、中程度の複雑さのマイクロアレイ（すなわち数百またはそれ以下のアレイエレメントを有する）に依拠する費用に敏感な用途におけるスタンドアローンおよびビルトインリーダーの両者にとって魅力的な選択肢である。市販の機器は、典型的には冷却ＣＣＤカメラを使用し、かつ励起スキームの低効率のバランスをある程度取る上で有用な集光能力の高い高価な特注設計対物レンズを用いる。
【００４８】
他の実施形態においては、光学サブシステムは非冷却ＣＣＤカメラを用いる撮像機器を含む。非冷却カメラは典型的には冷却モデルと比較して著しく高い暗電流を有するものの、光学サブシステムは、（１）励起強度を高めるか、または（２）高い集光効率を有する対物レンズを用いるか、または（３）上記の２つの手法を組み合わせることにより、数秒を超える露出を用いることなく必要とされる感度を提供することも可能であろう。光源は、ハロゲン化金属または水銀球などのような従来の光源、レーザーベースシステム、または高輝度ＬＥＤとすることができる。
【００４９】
他の実施形態においては、光学サブシステムはマイクロアレイリーダー操作の補足的撮像モードとして蛍光非依存的撮像（ＦＩＩ）モードを有する。ＦＩＩモードにより、アレイエレメントをその蛍光レベルにかかわらずに撮像することができる。
【００５０】
実践的なＦＩＩの実装は、マイクロアレイスキャナーおよびフラッド照明を用いるイメージャーのいずれにおいても困難である。撮像するマイクロアレイが主流の平板型アレイである場合は、マイクロアレイ基板上に固定された生体分子プローブの層が薄すぎ、スライド表面のプロービングに用いる光線の強度に著しい変化が起こらないので、問題は特に困難である。
【００５１】
１つの実施形態においては、本発明は不透明（黒色）プラスチック基板上にプリントされたゲルアレイの撮像を目的とした反射光の暗視野照明を用いる。他の実施形態においては、本発明は透明（ガラス）スライド上にプリントされたゲルアレイの撮像を目的とした透過光の傾斜照明を用いる。いずれの場合も、ＦＩＩに用いられる光源はリーダーの発光フィルターの透過バンド内で発光する任意の光源とすることが可能である。
【００５２】
制御ソフトウェア２４０は、流動制御サブシステム２２０、光学サブシステム２３０、サーモサイクラー２５０および任意の追加的サブシステムを含めた、ＭＢＳＡシステムの全てのコンポーネントを制御するよう設計される。制御ソフトウェア２４０は、ＭＢＳＡシステムに接続されかつＭＢＳＡシステムにユーザーインターフェースを提供する任意のコンピュータにインストールしてよい。１つの実施形態においては、ＭＢＳＡシステムはプロセッサ、メモリ、およびユーザーインターフェースを含むコントローラを含む。
【００５３】
サーモサイクラー２５０は、一体型カートリッジ１００のＰＣＲチャンバー５に加熱および冷却を提供するよう設計される。１つの実施形態においては、サーモサイクラー２５０は、そのいずれもが本明細書に参照文献として援用される米国特許出願番号第１１／８４３，８４３号および第１２／２３２，６６９号に記載の嚢状サーモサイクラーである。
【００５４】
他の実施形態においては、ＭＢＳＡシステムはマイクロアレイチャンバー３用の恒温加熱システムをさらに含む。１つの実施形態においては、恒温加熱システムは空気加熱ユニット、および加熱された空気をノズルを経てマイクロアレイチャンバーの後面に送風する送風器を含む。温度制御は、ノズルまたはマイクロアレイチャンバー近傍の熱電対によって達成される。
【００５５】
他の実施形態においては、マイクロアレイチャンバーを反対側から光学システムによって撮像できるよう、マイクロアレイチャンバーは片側の嚢によって加熱される。この実施形態によって、他の文献に報告されているように（Ｋｈｏｄａｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，（２００８）４４：２４１−２４８）、アレイ内のゲルエレメントのリアルタイムＰＣＲモニタリングが可能となるであろう。
【００５６】
他の実施形態においては、ＭＢＳＡシステムは細胞溶解サブシステムをさらに含む。１つの実施形態においては、細胞溶解サブシステムは回転する磁場を生成する磁気攪拌器を含む。他の実施形態においては、細胞溶解サブシステムは一体型カートリッジに対して超音波処理または振動を生成し、細胞溶解を促進する。
【実施例１】
【００５７】
（マイクロアレイベースサンプル分析（ＭＢＳＡ）システムのコンポーネント）
（Ａ．流動サブシステム）
流動サブシステムは３種類の機能的コンポーネント：二方向微量流動ポンプ、選択バルブ、およびカートリッジ「ピン」バルブよりなる。図５は、一体型カートリッジに接続されたポンプおよび選択バルブを示す流動サブシステムの模式図である。流動配置は、Ｇｌｏｂａｌ  ＦＩＡより入手可能である二方向ポンプおよび選択バルブの組合せを用いる。図５に示すように、流動サブシステムは流動マニホールド９０を介して一体型カートリッジと接続され、かつ一体型カートリッジ１００の外部の貯蔵容器に様々な試薬を保持する。
【００５８】
図６Ａは流動マニホールド９０の１つの実施形態を示す。この実施形態においては、マニホールド９０は２つの流動フィッティング９１が各カートリッジポート７２に接続することを可能とする。マニホールドはルアーテーパーを伴う突起を８つ有する。これらの突起は流動フィッティングからカートリッジポートまでの流路を提供する流動導管を有する。この実施形態においては、流動マニホールド９０は、一体型カートリッジ１００が流動マニホールド９０上に存在する時に、一体型カートリッジ１００のサンプル分析ユニット２の増幅チャンバー５が２つのサーモサイクラー嚢９２の間に配置されるよう、米国特許出願番号第１１／８４３，８４３号および第１２／２３２，６６９号に記載されるサーモサイクラー嚢などの、一対のサーモサイクラー嚢を支持するように構成されたホルダー９６を含む。図６Ｂは、流動マニホールド９０を一体型カートリッジ１００およびサーモサイクラー嚢９２と共に示す模式図である。
【００５９】
一体型カートリッジ１００内の液状物の流れはオンボードカートリッジバルブ８０によっても制御される。図７は、一体型カートリッジ１００の１つの実施形態におけるオンボード微量流動カートリッジバルブ８０の位置を示す。図８はバルブ８０の１つの実施形態を示す。この実施形態においては、バルブ８０は機械切削したプラスチック本体８２、バネ８４、内部Ｏリング８６および外部Ｏリング８８より作製され、所定の位置に螺合される。機械切削された部品は、コストを削減するために射出成形することもできる。他の実施形態においては、バルブはカートリッジ上での迅速かつ一定した挿入を目的としたバルブ位置合わせ取付具（示さず）をさらに含む。バルブは、所定の位置に螺合する代わりに、レーザー溶接、加熱頭付け、超音波溶接またはスナップ契合によってカートリッジ上に固定することができる。
【００６０】
オンボードバルブ８０はねじを回してバルブシャフトを押し込みまたは押し出すことによって手動開閉してもよい。代替的に、支援電子機器およびソフトウェアを有する自動リニアアクチュエーターパネルを実装し、必要とされるプロトコルに基づいてオンボードカートリッジバルブを電子的に制御してもよい。
【００６１】
１つの実施形態においては、流動サブシステムは：一方はサンプル調整用でありもう一方はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および／またはＡＰＥＸ用である２基の二方向ポンプを含む。これらのポンプは担体溶液および選択バルブの中心に接続する。ポンプは、それらに付随する２種類の支持コイル：「レーストラック」効果による混合を提供する円形コイルおよびレーストラック効果を被る流線を交互に切り替えるスイッチバックコイルを有する。
【００６２】
この実施形態において、流動サブシステムは、融通性を提供しかつサンプル調製物をＰＣＲ／ＡＰＥＸ流動から分離する３基の１０ポート選択バルブを含む。選択バルブのうち１基は、Ａｋｏｎｎｉ  ＴｒｕＴｉｐを埋め込んだカートリッジにサンプル調製試薬を分注する働きをし、他の１基はカートリッジにＰＣＲおよびＡＰＥＸペレット再水和バッファーを分注し、かつ３基目はカートリッジ上のレザバーに対してベントするかまたは陽圧を適用する手段となる。選択バルブ毎のポートの個数を増加させることは、ハードウェアの複雑さを増すことなく器具毎のカートリッジ数を増加させる１つの様式である。
【００６３】
カートリッジピンバルブは：（１）単一試薬供給ラインがカートリッジ上で複数のレザバーとして機能することを可能とする、および（２）通常であれば空気のコンプライアンスによって望ましくない経路に向かう液状物の動きを制御するという２つの目的に役立つ。微小リニアアクチュエーターは３５Ｎ未満の力でカートリッジピンバルブを開閉する。
【００６４】
小型のホルダーは、アクチュエーターをピンバルブのシャフトと同軸に剛直的に配置するよう設計および実装される。ホルダーの設計によって、アクチュエーターをピンバルブシャフトの軸に沿って回転させ、複数のアクチュエーターを所定の位置に密集させることが可能となる。この設計が必要であるのは、アクチュエーターの本体が軸から突出して準楕円形のプロフィールを呈しているからである（すなわちアクチュエーターは軸対称でない）。アクチュエーターはＩ−Ｂｅａｍに固定されて器具に剛直的に固定される。アクチュエーターのアームは第２のＩ−Ｂｅａｍの穴を貫通し、カートリッジの支持を提供する。この第２のＩ−Ｂｅａｍは、そこにスタンドオフを固定することを可能とするねじ穴の線形パターンを有する。スタンドオフは、カートリッジを貫通するボルトを受容するねじ穴も有する。ボルトは、カートリッジをｘ、ｙおよびｚディメンションについて固定された位置に保つ。１つの実施形態においては、ピンバルブはねじによって固定される。他の実施形態においては、単一のアクチュエーターによって複数のピンバルブが始動する。
【００６５】
（Ｂ．嚢状サーモサイクラーサブシステム）
嚢状サーモサイクラーサブシステムは、そのいずれもが本明細書に参照文献として援用される米国特許出願番号第１１／８４３，８４３号および第１２／２３２，６６９号に記載される。
【００６６】
１つの実施形態においては、嚢状サーモサイクラーサブシステムは２基のポンプ、３基の３方向バルブ、３基のヒーター（変性フローループ用２基およびアニーリング／伸長フローループ用１基）、気泡トラップおよび再充填として働く２基のレザバー、１基のラジエーター、および互いに向かい合う２個の柔軟性嚢を有する１基の嚢状アセンブリよりなる。この実施形態においては、ポンプは流量の範囲が０．１５〜２．００Ｌ／分であり、かつ８２℃以下で作動する隔膜ポンプである。ポンプの温度をヒーターから保護するため、ＰＶＣフィッティングを用いてヒーターをポンプより断熱する。
【００６７】
このシステムによる時間勾配は、加熱および冷却のいずれについても約１０℃／秒である。この嚢状サーモサイクラーの反復の予備的性能評価を目的として、嚢状サーモサイクラーの嚢状アセンブリの嚢の間に挿入したＣｅｐｈｅｉｄ  Ｓｍａｒｔ  Ｃｙｃｌｅｒ管（扁平反応管）、およびＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈサーモサイクラーに挿入した標準的な０．２ｍＬ  ＰＣＲ管内でＰＣＲ反応を実施した。いずれのサーモサイクラーも同等レベルの産物を作製した。図９は脱着式サンプル分析ユニット２の１つの実施形態を示す。この実施形態においては、脱着式サンプル分析ユニット２は、マイクロアレイ２３、入口ポート２４および出口ポート２５を有するアレイチャンバー２２、ならびに入口ポート２７および出口ポート２８を伴うＰＣＲチャンバー２６を有するフローセルである。図６Ｂに示すように、フローセルを一体型カートリッジの片側に着接するので、ＰＣＲチャンバーは一体型カートリッジの側から流動マニホールドに着接したサーモサイクラーの嚢状加熱ユニットに達する。図１０は、チューブベースフォーマットおよび嚢状サーモサイクラー上のＣｅｐｈｅｉｄ  Ｓｍａｒｔ  Ｃｙｃｌｅｒチューブのいずれにおいても同等の識別を示す、嚢状サーモサイクラーを用いたフローセルＰＣＲおよびこれに続くＡＰＥＸを示す。
【００６８】
１つの実施形態においては、ＭＳＴＡシステムは室温ハイブリダイゼーションを目的として設計される。他の実施形態においては、ＭＳＴＡシステムはアレイチャンバーを加熱するための恒温加熱システムを含む。恒温制御は、気流チューブのノズルに熱電対を有するアレイチャンバーの後面に加熱した空気を送風することにより達成される。一定の実施形態においては、恒温加熱システムは２０℃〜６５℃、２０℃〜７５℃、２０℃〜８５℃または２０℃〜９５℃の範囲でアレイチャンバーの温度を維持することができる。
【００６９】
（Ｃ．光学サブシステム）
図１１Ａは、光学サブシステムの１つの実施形態を示す模式図である。低コスト光学サブシステムは、比較的複雑度の低いアレイ（アレイエレメント数＜５０）を読み取ることを目的として開発される。リーダーのこのサブシステムにおいて用いられるＣＣＤカメラは、解像度６５９×４９３ピクセルかつピクセルサイズ７．４×７．４μｍの１／３”光学フォーマットの微小非冷却カメラ（例：ＰｒｏｓｉｌｉｃａモデルＥＣ６５０）である。
【００７０】
対物およびカメラレンズは、たとえばＥｄｍｕｎｄ  Ｏｐｔｉｃｓ  ｐａｒｔ  ＃ＮＴ４７−７３２などの、いずれも同一のＦ／１．５の単一素子非球面レンズである。レンズは、有効焦点距離３７．５ｍｍを有する。画像システムの倍率が１と等しいため、物体平面のピクセルサイズはＣＣＤセンサーのピクセルサイズと同じである（７．４μｍ）。
【００７１】
有効視野（ＦＯＶ）は直径約２ｍｍであり、これはアレイピッチが３００μｍであるとの推定の下で最大５０スポットを含むアレイを撮像するために十分である。ＦＯＶを制限する因子は、この過度に単純な光学設定に対して比較的高いと予測される像面湾曲である。
【００７２】
光学設計の（１．５と低いｆ数によって確保される高い集光効率を有する対物レンズ以外の）他の特徴的性質は、１５ｍＷ緑色（５３２ｎｍ）ＤＰＳＳレーザーを用いた共軸照明スキーム、およびビーム送達のみならずビーム成形およびスペックルの抑制にも用いられるマルチモード光ファイバーである。
【００７３】
ファイバーのマルチモード性により、ファイバー入力面におけるレーザービームのガウス型強度分布は、ファイバー出力においてはシルクハット型分布に変換される。コリメーティングレンズおよびビーム焦点レンズが共に作用し、ファイバー末端面の画像を対物レンズの物体平面に投射する。その結果、物体平面における強度分布はファイバー出力におけるものと同様である一方、照射スポットのサイズはファイバーコアの直径および２レンズ投射システムの拡大係数によって決定される。
【００７４】
スペックルの抑制は、ファイバーに着接された微小振動モーターの支援によって達成される（図１１Ａ参照）。ファイバーを振動させることにより、異なるファイバーモード間の位相変異が迅速に変調され、スペックルパターンにおいて高周波数強度振動に変換される。後者は、１００ｍｓと短い露出であっても画像を撮像するプロセスにおいて有効に平準化される。
【００７５】
１つの実施形態においては、低コスト光学サブシステムはマイクロアレイをスキャンしかつ画像をスティッチングしてマイクロアレイの全体像を作製する。他の実施形態においては、リニアモーションシステムを用いて複数のカートリッジ上のアレイを連続的にスキャンする。
【００７６】
図１１Ｂは、共軸照明を用いて図１１Ａに記載の光学サブシステムで撮影した３００μｍピッチのＣｙ３アレイの典型的画像を示す。
【００７７】
図１２Ａは他の光学サブシステムの図である。この光学サブシステムのバージョンは、多くの診断的アッセイに十分である、フィーチャーの個数が２００以下のアレイを撮像することを目的として開発された。視野の拡大は高度の異常補正を行う対物レンズを必要とする。よりｆナンバーの高いレンズの使用も必要となる。上記の要件を満たす対物レンズの一例は、作動距離３９ｍｍかつ開口数０．２３４のＬｅｉｃａの無限遠補正Ｐｌａｎａｐｏ  ２ｘレンズである。光学サブシステムの撮像光路における対物レンズおよびカメラレンズは、単純性のみを目的として単一素子レンズとして示すことに留意されたい。実際には、これらのレンズはいずれも無限共役比で作動する高度補正マルチ素子レンズであり、かつ互いに焦点距離が等しい。従って、レンズ系全体の拡大係数は１である。
【００７８】
他の実施形態においては、ビーム焦点レンズの焦点距離を延長して物体表面における照明スポットを約８ｍｍまで拡大した。そのように大きなスポット直径では、ビームの傾斜角によって生じる照明の非均一性の発生率は５％を上回らないことが、経験的に認められている。図１２Ｂは、傾斜照明スキーム（図１２Ａ）を用いた光学サブシステムにより撮影した１１ｘ１８  Ｃｙ３アレイの典型的画像を示す。上述のように、アレイピッチは３００μｍであり、かつアレイスポットの特性直径は約１２０μｍである。
【００７９】
図１３Ａは光学サブシステムの他の実施形態を示す。この実施形態においては、傾斜照明設計におけるレーザーは高輝度発光ダイオード（ＬＥＤ）に置き換えられる。示されるＬＥＤ照明装置は、投射システム用のＫｏｅｈｌｅｒ照明スキーム（その全文を本明細書に参照文献として援用するＡ．Ｖ．Ａｒｅｃｃｈｉ，Ｔ．Ｍｅｓｓａｄｉ，ａｎｄ  Ｒ．Ｊ．Ｋｏｓｈｅｌ，  Ｆｉｅｌｄ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ，  ＳＰＩＥ  Ｐｒｅｓｓ  Ｂｏｏｋ，Ｖｏｌ．ＦＧ１１，２００７年８月３１日、ＩＳＢＮ：９７８０８１９４６７６８３）を実装し、かつ集光レンズとコンデンサーレンズの間に配置されたクリーンアップフィルターおよび励起光を傾斜角のある物体表面に誘導するビーム指向鏡を含む。フィルターは、ＤＮＡ標識に用いた色素の発光スペクトルと重複するＬＥＤ光のスペクトル成分を排除すること意図している（例：Ｃｙ３）。図１３Ａに示す実施形態は好ましいものであるものの、鏡を用いるビーム送達系は本発明の範囲および趣旨から離れることなく変更しうることは、当業者にとって明らかである。特に、液状光線ガイドまたはファイバー光学バンドルを光学縦列に導入し、遠隔光源からのビーム送達を促進することも可能である。
【００８０】
他の実施形態においては、光学サブシステムはＦＩＩ用の微小低出力ＬＥＤを含む。図１３Ｂは、蛍光撮像も透過光の傾斜照明を用いたＦＩＩも可能な光学縦列の実施形態を示す。図１３Ｃは、蛍光撮像も反射光の暗視野照明を用いたＦＩＩも可能な光学縦列の実施形態を示す。図１３Ｃの光学縦列は、スライドホルダー（すなわち物質表面）の後ろに必要とされる空間がより少ない。図１３Ｄは、平行光源の１つの例示的技術的実装を示す。用いられる発光器は、ピーク発光波長５９１ｎｍの低輝度黄色ＬＥＤである。
【００８１】
図１４Ａは、ＬＥＤ光源の平行ビームによる傾斜照明を用いて記録したＡｋｋｏｎｉ  ＭＲＳＡアッセイスライドの画像の１例を示す。図１４Ｂは、図１４Ａにおけるアレイエレメントの正規化ピクセル強度プロフィールを示す。典型的には平行光源による傾斜照明を用いて最高コントラストの画像が得られたものの、傾斜照明を目的とした他の光学配置も可能である。そのようなスキームの一般的な要件は、異なる方位角間の非対称的照明強度分布である。ＦＩＩアレイ画像は、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂｗｅｂ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／）の画像処理ツールなどの比較的単純な画像処理ツールを用いて、グリッド作製およびスポット形態分析を目的として処理することができる。図１５は、ＩｍａｇｅＪソフトウェアで利用可能な互いに異なる方法によって処理したゲルアレイ画像を示す複合画像である。図１６は、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いたスポット形態の評価を示す複合図である。
【００８２】
図１７Ａおよび１７Ｂは、図１５のパネルＡにおけるゲルスポットについての形態の評価を示すグラフである。この試験において、平行ビームによる傾斜照明を用いたＦＩＩ撮像により、アレイスポットの中心の検出、および相当な形態異常のある損傷スポットの特定のいずれも可能となった。データより、形態分析の感度を最高とするために、スポットは複合パラメータによって特徴付けする必要があることが示唆される。たとえば、スポット面積および最も適合する楕円のパラメータなど；
【００８３】
しかし、アレイ画像ＱＣはＦＩＩ撮像モードのみに依拠することができず：ＦＩＩ画像において無害と思われるかもしれない一部の画像特性が、実際にはスポット蛍光強度測定に対して相当な干渉源となることもある（例：図１６のパネルＡおよびＤで矢印表示された粒子）。
【実施例２】
【００８４】
（一体型カートリッジおよびマイクロアレイベースサンプル分析システムによる試験サンプル中の細菌の検出）
ＭＢＳＡシステムのための作業の順序は以下の通りである。ユーザーは一体型カートリッジにサンプルを導入する。次にシステムが以下の自動化ステップを実施する：サンプルを調製し、Ｂｌａｄｄｅｒ  Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ（商標）を用いてＰＣＲを実施し、ＰＣＲ産物をハイブリダイゼーションおよび／またはＡＰＥＸ反応混合物と混合し、混合物をマイクロアレイチャンバーに移し、マイクロアレイとのハイブリダイゼーションを実施し、さらにマイクロアレイ画像を検出する。
【００８５】
１つの実施形態においては、カートリッジ上でサンプルを調製するためのステップの順序は：サンプルをサンプルタワーに導入し、結合バッファーをサンプルタワーに導入し、空気を用いて混合し、サンプル混合物をＴｒｕＴｉｐタワーに移し、タワー間で交互に切換え、廃液タワーに送液し、洗浄バッファーをＴｒｕＴｉｐタワーに導入し、タワー間で交互に切換え、廃液タワーに送液し、溶離バッファーを導入し、さらに溶離タワーに送液する。
【００８６】
ＰＣＲ用のステップの順序は：ＰＣＲ混合物を溶離タワーに加えるかまたは凍結乾燥試薬ペレットを溶離バッファーで再溶解した後サンプル処理し、フローセル上のＰＣＲチャンバーに送液し、全てのカートリッジピンバルブを閉じ、さらにサーモサイクリングを開始する。
【００８７】
ＡＰＥＸ用のステップの順序は：ＰＣＲチャンバーをＡＰＥＸバッファーでフラッシングしさらにＡＰＥＸレザバーに加え、十分に混合し、アレイチャンバーにＡＰＥＸ試薬を加え、６５℃でインキュベートし、洗浄し、撮像する。
【００８８】
１つの実験においては、２分間ボルテキシングすることによりオフラインで溶解させた１０５ｃｆｕ／ｍＬ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  ５００μＬを、一体型カートリッジのサンプルチャンバーに導入した。カートリッジを、カートリッジアダプター、サンプル調製および処理用流動制御サブシステム、ＰＣＲ増幅用温度制御サブシステム、光学サブシステム、ならびに画像取得用データ取得ボードおよびＰＣを含むプロトタイプＭＢＳＡシステムに接続した。
【００８９】
以下の手順は分析システムによって制御される。サンプル混合チャンバーに結合バッファーを添加し、チャンバーの底部からチャンバーの最上部まで移動する気泡によってサンプルと混合した。気泡は計器ポンプからの調節気流によって制御した。次に、混合サンプルを、ＤＮＡと特異的に結合するシリカ抽出フィルターを含むサンプル精製チャンバーに導入し、さらにマトリクスを通過して前後に５回循環させ、結合効率を高めた。次に、オンボードカートリッジバルブにより未結合材料をカートリッジの廃液チャンバーに誘導した。廃液をカートリッジに残すことで、次のサンプルによる汚染が防止される。続いて、洗浄バッファーをＴｒｕＴｉｐタワーとサンプル精製タワーの間で交互に切換え、その後廃液チャンバーに誘導した。次に、溶離体積１２０μＬを分析システムからＴｒｕＴｉｐタワーを経てカートリッジに導入し、次に気泡を除去する溶離チャンバーに誘導した。
【００９０】
溶離したＤＮＡより１０ｕＬ分取を取出し、Ｒｏｃｈｅ  ４８０リアルタイムＰＣＲ  Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ上で処理した。溶離チャンバーより第２の溶離ＤＮＡ分取も取出し、代表的なフローセル内で「オフライン」で増幅した。次に、ＰＣＲマスターミックスを溶離チャンバーに導入した。溶離チャンバーの底部から気泡を発生させることによって、溶離したサンプルを混合した。次に、カートリッジが流動ドッキングステーションに挿入される時サーモサイクラーの２個の適合型嚢の間に配置される一体型カートリッジに着接したフローセルのＰＣＲチャンバーに、オンボードバルブを経て、混合サンプルを誘導した。適合型嚢の使用による製造上の利点は、適合型嚢は膨張してカートリッジフローセルと密着するので、設計を変更することなく幅広い範囲のフローセルの厚さおよび位置の多様性に順応することができることである。Ｂｌａｄｄｅｒ  Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ（商標）法を用いて２つの温度の液体を嚢を経て往復させることにより、４０サイクルの２温度ＰＣＲを実施した。この方法は、加熱された液状物をＰＣＲチャンバーと密着する柔軟性膜（「嚢」）に流入させることに基づいている。バルブを温度制御レザバーの間で切換え、迅速な温度変化を提供する。このサーモサイクリング手法の結果、加熱および冷却をＰｅｌｔｉｅｒｓに依拠する従来のスライドサーモサイクラーよりも約４倍早いＰＣＲプロトコルがもたらされる。
【００９１】
増幅後、ＰＣＲ生成物をオンボードカートリッジバルブを経てフローセルのマイクロアレイチャンバーに自動的に移し、マイクロアレイチャンバー内のマイクロアレイに室温で１時間ハイブリダイズした。次に、マイクロアレイをＡｕｒｏｒａ  ＰｏｒｔＡｒｒａｙ  ５０００イメージャーで読み取った。図１８Ａは、Ａｕｒｏｒａ  Ｐｏｒｔ  Ａｒｒａｙ  ５０００より撮像したハイブリダイズマイクロアレイの画像を示す。陽性シグナルをボックスで示す。
【００９２】
溶離ＤＮＡの第２の分取は、一体型カートリッジを着接したフローセルと同一のフローセルにおいて「オフライン」で増幅した。簡潔に述べると、ＤＮＡサンプルをフローセルのＰＣＲチャンバーに手動装填し、上記の方法で増幅した。次に、増幅産物をマイクロアレイチャンバーに手動装填し、マイクロアレイチャンバーにおいて室温で１時間マイクロアレイにハイブリダイズした。次に、ゲルエレメントアレイおよびフローセルアセンブリ用に特に設計したＡｋｏｎｎｉイメージャーでマイクロアレイを読み取った。図１８Ｂは、Ａｋｏｎｎｉイメージャーより撮像したハイブリダイズマイクロアレイの画像を示す。陽性シグナルをボックスで示す。
【００９３】
他の実験においては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓサンプル（１０４ｃｆｕ／ｍＬ水）５００μＬを処理し、上述の手順を用いて分析した。図１９Ａは、試験サンプル中のＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ検出陽性を示すマイクロアレイの画像を示す。図１９Ｂは、図１９Ａに用いられるマイクロアレイのアレイマップである。
【００９４】
他の実験においては、サンプル調製チャンバー内に磁気ビーズミキサーを有する一体型カートリッジを用いて、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓサンプル（１０４ｃｆｕ／ｍＬ水）５００μＬを処理した。ガラスビーズをチャンバーに加え、ビーズミキサーを振盪してチャンバー内の細菌を溶解した。図２０は、ミキサーで抽出したＤＮＡのＰＣＲ結果を示す。サンプル体積が５０／５０の比率となるようビーズを混合し、さらに１．５ｍＬμ遠心管内で２分間ボルテキシングすることによりボルテキシング法を遂行した。
【実施例３】
【００９５】
（一体型カートリッジおよびマイクロアレイベースサンプル分析システムによる単一ヌクレオチド多型の遺伝子型解析（ＳＮＰ遺伝子型解析））
この実施例は、法医学用途に利用することも可能な身体外観マーカーのＳＮＰ遺伝子型解析用微量流動制御システムの実施可能性を証明する。実験環境では、サンプル調製、ＰＣＲ増幅およびアレル特異的配列プライマー伸長（ＡＳ−ＡＰＥＸ）用コンポーネントを組み合わせ、眼色マーカーを検出するための一体型システムを形成する。システムは、液状物操作サブシステム（例：ポンプ）、サーマルサイクリングサブシステム（例：Ａｋｏｎｎｉ  Ｂｌａｄｄｅｒ  Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ）、光学器具（例：Ａｋｏｎｎｉ  Ｒｅａｄｅｒ）、ディスポーザブル一体型カートリッジ（すなわちＡｋｏｎｎｉ  ＴｒｕＴｉｐ、Ａｋｏｎｎｉ  ＰＣＲ／ＴｒｕＡｒｒａｙフローセル、微量流動回路、および微量流動バルブ）およびカートリッジドッキングステーションを含む。
【００９６】
表１に挙げられた６つのＳＮＰを、実験用の試験モデルとして用いる。これらのＳＮＰは、目の色の主な指標として文献に報告されている。
【００９７】
（主な眼色決定因子として同定された６つのＳＮＰ）
【表１】
0005993928.tif 000002
【００９８】
ＳＮＰ用の配列情報を編集し、またフォワードおよびリバースＰＣＲプライマーを合成した。各アンプリコンに対して単回ＰＣＲ反応を試験し、さらに最適化した。眼色アンプリコン用の標準的６重ＰＣＲ反応を生成するための複数回フォーマットにおけるプライマーの体系的プールを達成した。この標準的６重ＰＣＲ反応を低温（ＬｏｗＴｅｍｐ）６重ＰＣＲ反応に変換した。ＬｏｗＴｅｍｐ  ＰＣＲは、温度アニーリングの厳密性を補う薬品の使用を包含する。マスターミックスにホルムアミド（一般的なＰＣＲ添加剤）を加えることにより、変性温度を通常の９５℃に替えて８５℃に低下させた。この戦略によって、我々の一体型カートリッジ用のプラスチックおよびに接着剤にとってより多くの選択肢が可能となるため；製造コストが低下する。さらに、より低い温度によって嚢状サーモサイクラーコンポーネントおよび配管にとってより多くの材料選択肢が可能となる。１つの実施形態においては、ＰＣＲおよびＡＰＥＸに対して単一の酵素を用いる。
【００９９】
図２１Ａは、ＬｏｗＴｅｍｐ  ６重ＰＣＲにおいて作製された各アンプリコンについてのマイクロアレイ画像およびゲルスポットシグナルの蛍光強度を示す。６つのアンプリコンが全て検出され、アンプリコンシグナル強度はアレイ上でポジティブコールの許容閾値を上回った。相対シグナル強度は産物間で異なるものの、シグナル強度は多重ＰＣＲにおけるプライマー濃度および／またはＡＰＥＸに用いるプライマーの長さを調節することによって精密に調節することができる。
【０１００】
ＡＰＥＸ法においては、プライマーは、末端の３’塩基がＳＮＰ部位にあるように、アレイ上の各ゲルエレメント内に単一のプライマーを固定するよう設計される。検出する各ＳＮＰに対して異なるプライマーを設計する。たとえば、あるＳＮＰ部位にＡまたはＣがあると思われる場合、それぞれに対して一方が３’Ａを末端とし、もう一方が３’Ｃを末端とする別個のプライマーを設計する。プライマーの３’ヌクレオチドがターゲットと一致しない場合、ポリメラーゼによる伸長は阻害される。正しい標的および一致する３’塩基の存在下で、ポリメラーゼは蛍光標識ヌクレオチドを取り込んで最終シグナルを生成する。
【０１０１】
１つの実施形態においては、ゲノムＤＮＡは一体型カートリッジを用いて血液サンプル５０ｕＬより精製された。このプロセスにおいて、全てのサンプルおよびサンプル廃棄物は、サンプルと接触する全ての試薬／バッファーと共に、カートリッジ内に保持された。使用済みの試薬／バッファーはカートリッジ廃液チャンバーに移動し、かつ貯蔵された。全てのプロセスはコンピュータ制御の下で実施された。カートリッジより手動取出した抽出、精製ＤＮＡサンプルのリアルタイムＰＣＲの結果より、強い陽性ＰＣＲシグナルが証明された（図２１Ｂ）。より重要なことに、この精製ＤＮＡは手動ＰＣＲおよびＡＰＥＸに対して成功裏に使用され、正しい遺伝子型を呼び出した（表２）。簡潔に述べると、（手動ＰＣＲ（２０ｎｇ  ＤＮＡ）／ＡＰＥＸ遺伝子型決定に対して自動化一体型カートリッジで精製したＤＮＡを用いた。アレイ上の各プライマーの蛍光強度を撮像し、シグナル強度生データを用いて各ＳＮＰに対するプライマー（アレル）シグナル比率値を生成した。呼び出した遺伝子型はゲノムＤＮＡ配列結果と一致した。
【０１０２】
（プライマー（アレル）シグナル比率値を用いた血液サンプルの遺伝子型決定）
【表２】
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【実施例４】
【０１０３】
（ソフトウェア開発：ＤＸ３０００自動タスク実行プログラム）
一体型分析システムの制御を目的として、ＤＸ３０００自動タスク実行プログラムと称するソフトウェアプログラムが作成された。３つの主要なサブシステム（流動操作サブシステム、サーモサイクラーサブシステム、および光学サブシステム）の制御を目的として、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ産業用コンピュータ（ＮＩ  ３１１０）上のＬａｂｖｉｅｗにおいてコードを書いた。ＮＩ  ３１１０は、一方のコアがＷｉｎｄｏｗｓ用のタスクを実行し、かつもう一方のコアがＲｅａｌ−Ｔｉｍｅオペレーティングシステム（ＯＳ）用のタスクを実行するデュアルコアプロセッサを有する。このアーキテクチャにより、ユーザーインターフェースの管理、連続通信および画像処理といった高レベルのＷｉｎｄｏｗｓタスク、ならびにヒーター、リニアアクチュエーター、サーモサイクラーポンプ、および時間が厳密に決められたイベントの制御といった低レベルの決定論的タスクを実行することが可能となる。Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＯＳは、アナログ入力、アナログ出力、およびデジタルＩ／ＯモジュールをスキャンするＥｔｈｅｒｃａｔ  Ｉ／Ｏモジュールと通信する。
【０１０４】
３つの主要なサブシステムはそれぞれＷｉｎｄｏｗｓおよびＲｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＯＳからのリソースを利用し、かつ２つのオペレーティングシステム間の通信を必要とする。Ｗｉｎｄｏｗｓ環境内では、ユーザーが作製した一連のタスクが管理され、かつ共有変数を介してＲｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＯＳまたはＷｉｎｄｏｗｓ  ＯＳのいずれかにある適切なプロセスに伝達される。流動操作サブシステムに関連するタスクは：選択バルブの位置の変更、カートリッジバルブの開閉、および微量流動ポンプによる送液／吸上げを含む。サーモサイクラーサブシステムに関連するタスクは：サーモサイクラーの加温およびサーモサイクリングの開始を含む。さらに光学サブシステムに関連するタスクは：ＡＰＥＸ加熱の開始および画像の取得を含む。シークエンスを保存してＤＸ３０００自動タスク実行プログラムにインポートすることができる。
【０１０５】
流動操作サブシステムに制御されると分類されるコンポーネントは：２基の二方向ポンプ、３基の選択バルブ、およびカートリッジバルブを開閉する８基のリニアアクチュエーターを含む。二方向ポンプおよび選択バルブはＵＳＢシリアルポートによって制御される。シリアルコマンドは、Ｇｌｏｂａｌ  ＦＩＡが開発したＬａｂｖｉｅｗドライバを経てそれらに伝達される。ポンプ用の制御コマンドは方向、流速、体積およびアドレスであり、かつ選択バルブ用の制御コマンドは選択バルブポート番号およびアドレスを含む。これらのコマンドがＷｉｎｄｏｗｓ内のみで実行されるのに対し、リニアアクチュエーターは主としてＲｅａｌ−Ｔｉｍｅオペレーティングシステムより制御される。Ｆｉｒｇｅｌｌｉ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．（カナダ、ビクトリア）より入手可能なリニアアクチュエーターは、各バルブにつき４基のＭＯＳＦＥＴのＨブリッジにより制御される。各アクチュエーターに対して２本のデジタルＩ／Ｏラインがアクチュエーターをトリガして前進、後退、または休止させる。アクチュエーターの休止時は電力を必要としない。アクチュエーターは、アクチュエーターアームの位置のフィードバックを提供する内部電位差計を含む。較正ルーチンを用いて、カートリッジバルブに対して閉じた、または開いた位置に対応するアクチュエーターアームの到達範囲を判定する。比較アルゴリズムを用いて、アームの所望の位置と実際の位置を比較する。適切な動作を実行して、既定の許容ウインドゥ内の所望の位置に到達させる。較正ルーチン後、各カートリッジバルブ、全カートリッジバルブ、または一部のカートリッジバルブの組合せを、シークエンサーにおける１つのタスクとして開閉することができる。
【０１０６】
サーモサイクラーサブシステムによって制御されると分類されるコンポーネントは：２基の隔膜ポンプ、３基の三方バルブ、３基のコイルヒーター（高熱ゾーン用２基および低温ゾーン用１基）、および微小ラジエーターに冷却を提供するファン１基を含む。Ｄａｒｌｉｎｇｔｏｎ  ＢＪＴトランジスタは、ＤＸ３０００自動タスク実行プログラムによって制御されるアナログ出力シグナルに比例した電流を隔膜ポンプに供給する。線形プロポーショナルリレーは、ヒーターおよびラジエーター用ＡＣファンに電源を供給するＡＣシグナルの振幅を制御する。アナログ電圧出力シグナルは、これらのリレーの出力を制御する。再循環流に曝露される３基のインラインサーミスタは、高温ゾーンおよび低温ゾーンヒーターの後かつ嚢の前に配置される。異なる２つの仮想プロセスにより、高温ゾーン流動ループおよび低温ゾーン流動ループの再循環温度が制御される。これらの仮想プロセスは、ループ内温度のＰＩＤ制御を目的としたアルゴリズムを含む。ヒーターＰＩＤは広範囲の温度制御に用いることができるが、反応が遅い。ポンプ流量ＰＩＤは温度制御の範囲が狭いが、反応が速い。従って、図２２に示すように、安定したプラトーを有する高温ゾーンと低温ゾーンの間の迅速な切換えを達成するために両ＰＩＤループを用いる。ラジエーターファンの速度は典型的には４０％出力に維持される。
【０１０７】
光学サブシステムによって制御されると分類されるコンポーネントは：ＬＥＤ、カメラ、ヒーターおよびエアーポンプを含む。ＬＥＤ、カメラ、およびエアーポンプは、ソリッドステートリレーによって電源投入および切断される。パルス幅調節アルゴリズムは、ソリッドステートリレーを用いてヒーターへのＡＣ出力のデューティサイクルを制御する。エアーポンプの流量は一定流量に維持される。ヒーター内部の熱電対は、ＰＩＤ仮想インターフェースへのフィードバックを提供する。
【実施例５】
【０１０８】
（同一カートリッジにおけるタンパク質および核酸の精製）
一体型カートリッジは、タンパク質精製能力および核酸精製能力を共に含むよう変更することができる。図２３は、デュアルファンクション一体型カートリッジ３００の１つの実施形態を示す。簡潔に述べると、カートリッジ３００はタンパク質精製モジュールおよび核酸精製モジュールを含む。タンパク質精製モジュールはタンパク質廃液タワーＴ１、タンパク質精製タワーＴ２、タンパク質溶離タワーＴ３、カートリッジピンバルブＣＶ１、ＣＶ２、ＣＶ３およびＣＶ４ならびにルアー作動バルブＬＶ１、ＬＶ２、ＬＶ３およびＬＶ４を含む。核酸精製モジュールは、核酸廃液タワーＴ４、サンプル調製タワーＴ５、核酸精製タワーＴ６、核酸溶離タワーＴ７、カートリッジピンバルブＣＶ５、ＣＶ６、ＣＶ７、ＣＶ８およびＣＶ９、ならびにルアー作動バルブＬＶ５、ＬＶ６、ＬＶ７、ＬＶ８およびＬＶ９を含む。
【０１０９】
１つの実施形態においては、核酸は以下の手順を経て精製される：
１）Ａ．全てのＣＶを閉じる。
Ｂ．サンプル５００μＬをサンプル入口よりＴ５に入れる。
Ｃ．ＣＶ６およびＣＶ７を開く。
Ｄ．細胞溶解液５００μＬをＬＶ５よりＴ５に入れる（ＬＶ７を大気にベントしながら）。
２）混合用空気をＬＶ５よりＴ５に入れる（ＬＶ７を大気にベントしながら）。
３）室温で５分間インキュベートする。
４）Ａ．ＣＶ６を閉じ、ＣＶ８を開く（ＣＶ７は開いたままとし、ＣＶ８はタンパク質精製プロトコルの開始まで開いたままとする）。
Ｂ．ＬＶ７より空気を流す（ＬＶ８を大気にベントしながら）。
Ｃ．ＬＶ８より空気を流す（ＬＶ７を大気にベントしながら）。
ステップＢとＣを５回繰り返す。混合物はＴ５とＴ６の間で往復して流れ、Ｔ６で止まる。
５）Ａ．ＣＶ７を閉じ、ＣＶ２を開く。
Ｂ．ＬＶ８より空気を流し（ＬＶ２を大気にベントしながら）、混合物１ｍＬをＴ１に押し出す。
６）Ａ．ＣＶ６を開き、ＣＶ２を閉じる。
Ｂ．洗浄液をＬＶ５よりＴ６に入れる（ＬＶ８を大気にベントしながら）。
Ｃ．ＣＶ６を閉じ、ＣＶ７を開く。
Ｄ．ＬＶ８より空気を流す（ＬＶ７を大気にベントしながら）。
Ｅ．ＬＶ７より空気を流す（ＬＶ８を大気にベントしながら）。
ステップＤとＥを５回繰り返す。洗浄液はＴ５とＴ６の間で往復して流れ、Ｔ６で止まる。
Ｅ．ＣＶ７を閉じ、ＣＶ５を開く。
Ｆ．ＬＶ８より空気を流し（ＬＶ６を大気にベントしながら）、洗浄液をＴ４に押し出す。
７）Ａ．ＣＶ６を開き、ＣＶ５を閉じる。
Ｂ．空気をＬＶ５よりＴ６に入れる（ＬＶ８を大気にベントしながら）。
８）Ａ．溶離液をＬＶ５よりＴ６に入れる（ＬＶ８を大気にベントしながら）。
Ｂ．ＣＶ６を閉じ、ＣＶ９を開く。
Ｃ．ＬＶ８より空気を流す（ＬＶ９を大気にベントしながら）。
Ｄ．ＬＶ９より空気を流す（ＬＶ８を大気にベントしながら）。
ステップＣとＤを５回繰り返す。混合物はＴ６とＴ７の間で往復して流れ、Ｔ７で止まる。
【０１１０】
Ｔ１に貯留されたサンプル混合液１ｍＬ（ステップ５Ｂ参照）中のタンパク質を以下の手順を経て精製する。
９）  Ａ．ＣＶ１およびＣＶ２を開き、その他のＣＶは全て閉じる。
Ｂ．タンパク質結合液をＬＶ１よりＴ１に入れる（ＬＶ２を大気にベントしながら）。
１０）混合用空気をＬＶ１よりＴ１に入れる（ＬＶ２を大気にベントしながら）。
１１）室温で２分間インキュベートする。
１２）Ａ．ＣＶ３を開き、ＣＶ１を閉じる（ＣＶ２は開いたままとし、ＣＶ３はプロトコルの終了まで開いたままとする）。
Ｂ．ポンプアームを後方に引き、接続導管を経て溶液２５０μＬをＴ１からＴ２に引き出す（ＬＶ２およびＬＶ３はベントしない）。
Ｃ．ポンプアームを前方に押し、接続導管を経て溶液２５０μＬをＴ１からＴ２に押し出す（ＬＶ２およびＬＶ３はベントしない）。
ステップＢおよびＣを１０〜１５回繰り返す。ＣＶ２の直上かつＴ１の直下に位置するカートリッジ上の一方向チェックバルブによって、溶液は一方向ループにのみ流れる。
Ｄ．ＣＶ５を開き、ＣＶ２を閉じる。
Ｅ．ＬＶ３より空気を流し（ＬＶ６を大気にベントしながら）、溶液をＴ４に押し出す。
註：この段階でタンパク質廃液チャンバー（Ｔ１）が満たされているので、核酸廃液チャンバー（Ｔ４）が用いられている。
Ｅ．ＣＶ１を開き、ＣＶ５を閉じる。
１３）Ａ．洗浄液をＬＶ１よりＴ２に入れる（ＬＶ３を大気にベントしながら）。
Ｂ．ＣＶ５を開き、ＣＶ１を閉じる。
Ｃ．ＬＶ３より空気を流し（ＬＶ６を大気にベントしながら）、洗浄液をＴ４に押し出す。
Ｄ．ＣＶ１を開き、ＣＶ５を閉じる。
ステップＡ〜Ｄを５回繰り返す。洗浄液をＴ２に加えた後Ｔ４に流し込む。
１４）空気をＬＶ１よりＴ２に加える（ＬＶ３を大気にベントしながら）。
１５）空気の流量を上げて残余の液体を吹き飛ばす。
１６）Ａ．溶離液をＬＶ１よりＴ２に加える（ＬＶ３を大気にベントしながら）。
Ｂ．ＣＶ１を閉じ、ＣＶ４を開く。
Ｃ．ＬＶ３より空気を流す（ＬＶ４を大気にベントしながら）。
Ｄ．ＬＶ４より空気を流す（ＬＶ３を大気にベントしながら）。
ステップＣとＤを５回繰り返す。溶離液はＴ２とＴ３の間で往復して流れ、Ｔ３で止まる。
【０１１１】
１つの実施形態においては、サンプル溶解溶液は６Ｍイソチオシアン酸グアニジンである。他の実施形態においては、タンパク質結合溶液は０．１％トリフルオロ酢酸である。
【０１１２】
図２４は、サンプル分析ユニット２（すなわちアレイチャンバーおよびＰＣＲチャンバーを有するフローセル）を有する一体型カートリッジ５１０、流動制御サブシステム５２０、光学サブシステム５３０、嚢状サーモサイクラー５５０、および流動マニホールド５６０を含むプロトタイプＭＢＳＡシステム５００を示す。この実施形態においては、流動制御サブシステム５２０は、デュアルファンクション一体型カートリッジにおいてタンパク質および核酸の平行処理が可能な設定を含む。設定は２基のポンプ５２１および５２３、ならびに３基の選択バルブ５２５、５２７および５２９を含む。一方のポンプおよび１基の選択バルブは核酸抽出用となり、他方のポンプおよびもう１基の選択バルブはタンパク質用となるであろう。第３の選択バルブはベントの開閉のために用いられる。そのような設定はタンパク質および核酸の同時平行処理を可能とするであろう。光学サブシステム５３０はＣＣＤカメラ５３１、レンズアセンブリ５３３および照明アセンブリ５３５を含む。嚢状サーモサイクラーサブシステム５５０は２基のポンプ５５１および５５２、３基のヒーター５５３、５５４および５５５（変性フローループ用２基およびアニーリング／伸長フローループ用１基）、気泡トラップおよびアクセスの再充填の役割を果たす２基のレザバー５５６および５５７、ならびに互いに向かい合う２個の柔軟性嚢を有する１基の嚢状アセンブリ５５８を含む。
【０１１３】
本発明は、本発明の構造および操作の原理の理解を促進するための詳細を組み入れた具体的な実施形態の点から記述されている。本明細書における具体的な実施形態およびその詳細に対するそのような言及は、本明細書に添付の請求項の範囲を制限することを意図していない。本発明の趣旨および範囲を離れることなく例示のために選択された実施形態に変更を行ってもよいことは、当業者にとって明らかであろう。本明細書に引用された全ての参照文献は、その全文を本明細書に参照文献として援用する。
【図１Ａ】
0005993928.tif 000004
【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１２Ａ】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１Ｂ】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ｂ】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６】
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【図１８】
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【図２１Ａ】
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