(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖蛋白質糖鎖に結合する糖結合モジュール（ＣＢＭ）領域を、他の糖質関連酵素またはその触媒領域のＣ末端に融合させてキメラ型ポリペプチドにすることによって、その糖質関連酵素またはその触媒領域の機能を向上させ、または新たな機能を付与する方法であって、
糖蛋白質糖鎖に結合する糖結合モジュール（ＣＢＭ）領域が、グリコシルハイドロラーゼファミリー８９（ＧＨ８９）に属するα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼに付随するＣＢＭ領域であり、
他の糖質関連酵素が、グリコシルハイドロラーゼファミリー８９（ＧＨ８９）に属するα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼであり、
その糖質関連酵素またはその触媒領域の機能または新たな機能が、（１）糖供与体を用いて目的とするオリゴ糖、多糖または糖蛋白質糖鎖に糖を導入する糖転移活性、（２）オリゴ糖、多糖または糖蛋白質糖鎖に対する加水分解活性、もしくは（３）有機溶剤耐性である方法。
【請求項２】
融合の際にスペーサーとして、糖蛋白質糖鎖に結合する糖結合モジュール（ＣＢＭ）領域の元の酵素においてそのＣＢＭ領域のＮ末端に隣接する１０アミノ酸残基以上のアミノ酸配列を有するポリペプチドを用いる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
糖蛋白質糖鎖に結合する糖結合モジュール（ＣＢＭ）領域を、他の糖質関連酵素またはその触媒領域のＣ末端に融合させたキメラ型ポリペプチドであって、
糖蛋白質糖鎖に結合する糖結合モジュール（ＣＢＭ）領域が、グリコシルハイドロラーゼファミリー８９（ＧＨ８９）に属するα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼに付随するＣＢＭ領域であり、
他の糖質関連酵素が、グリコシルハイドロラーゼファミリー８９（ＧＨ８９）に属するα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼであるキメラ型ポリペプチド。
【請求項４】
融合のスペーサーとして、糖蛋白質糖鎖に結合する糖結合モジュール（ＣＢＭ）領域の元の酵素においてそのＣＢＭ領域のＮ末端に隣接する１０アミノ酸残基以上のアミノ酸配列を有するポリペプチドを有する請求項３に記載のキメラ型ポリペプチド。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖質関連酵素またはその触媒領域の機能を改良する方法に関する。具体的には、糖蛋白質糖鎖に結合する糖結合モジュール（ＣＢＭ）領域を、他の糖質関連酵素またはその触媒領域に融合させてキメラ型ポリペプチドにすることによって、その糖質関連酵素またはその触媒領域の機能を向上させ、または新たな機能を付与する方法、およびそのキメラ型ポリペプチドに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ピロリ菌(Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ)は全世界の人口の約半数が感染しており、いまだに胃癌や胃悪性腫瘍および胃潰瘍の原因菌とされている。現在、ピロリ菌の検査体制はほぼ充足しつつあり、除菌治療においても健康保険の適用が相次いで認可されるなど、ピロリ菌感染によるリスクからの低減効果が高まりつつある。しかし、除菌治療においては、抗生物質の使用は新たな耐性菌の発生リスクを誘発することとなり、実際、抗生物質の種類を２剤、３剤併用して行われている近年でも、新たな耐性菌の発生率が増加傾向にある（非特許文献１）。さらにこのような抗生物質の多用は人体へダメージを与え、腸内細菌類を死滅させてしまうなど、結果として保菌者に悪影響を及ぼす可能性がある。一方、ピロリ菌の人体へのリスクは、胃内に定着するピロリ菌の数によって変動すると考えられるが、動物実験ではネズミの胃内のピロリ菌平均存在数が１／１０程度になると、極端に胃潰瘍が発症しなくなることが報告されている（非特許文献２）。このことはピロリ菌の数をある程度までに抑え込めばリスクを大幅に減らすことができることを意味する。この状況から、現在いくつかの乳業メーカーから、ピロリ菌に対して効果のある乳酸菌やビフィズス菌入りのヨーグルトなどが販売されリスク低減効果が説明されている。しかし、乳酸菌やビフィズス菌類は胃内の厳しい環境(強酸性条件)での生存は難しいので、それだけでは効果は限定的である。
【０００３】
ピロリ菌は、胃粘膜の表層から分泌される表層粘液内に棲息するが、粘膜中ないし粘膜深層から分泌される腺粘液中には棲息していない。この腺粘液は特異的な構造を有する胃ムチンからなり、胃ムチン（ムチン型糖タンパク質）は、α結合型Ｎ−アセチルグルコサミン残基（αＧｌｃＮＡｃ残基）とガラクトース残基（Ｇａｌ残基）が結合したＧｌｃＮＡｃα１→４Ｇａｌβ残基を非還元末端に有するＯ結合型糖蛋白質糖鎖（Ｏ−グリカン）を特徴的に含んでいる。また、これらの糖鎖は、近年、胆嚢癌、膵臓癌、子宮頚癌その他の新生物出現に伴って現れることも報告されている（非特許文献３）。
【０００４】
中山らは、αＧｌｃＮＡｃ残基を非還元末端に有するコア２分岐型Ｏ−グリカン（主にＧａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→６（Ｇａｌβ１→３）ＧａｌＮＡｃα１→Ｒの構造を有する糖鎖のＧａｌ末端（下線部で示した糖残基）にＧｌｃＮＡｃがαで結合したもの）が結合した糖蛋白質糖鎖がピロリ菌の増殖を抑制することを見出し、さらに、この増殖抑制が、ヘリコバクター類(ピロリ菌を含む)のみが有するグルコシルコレステロール合成酵素(ＣＨＬαＧｃＴ)（非特許文献４、非特許文献５）の酵素活性阻害であることを明らかにしている（非特許文献４）。ピロリ菌は、自己の増殖のためにグリコシルコレステロール成分（ＣＧＬ）を必須とするが、自らＣＧＬを合成できないため、外界からコレステロールを摂取し、菌の細胞膜付近でグルコースを付加して細胞壁を構築していると考えられている。従って、αＧｌｃＮＡｃ残基を含有するＯ−グリカンを持つ糖蛋白質糖鎖は、ピロリ菌の細胞壁の構築を阻害する性質があると推察されるから、ピロリ菌特異的な増殖抑制剤としての応用が期待できる。αＧｌｃＮＡｃを含有する胃ムチンは豚などの家畜も有しているので、それらからの抽出による調製も考えられる。しかし、分離抽出には多段階の複雑な抽出過程を経なければならない上、原料となる動物の胃ムチンの供給量に問題がある。これに対し、αＧｌｃＮＡｃに特異的な分離剤（抗体やレクチン）を用いて行う方法も考えられる。αＧｌｃＮＡｃを含む胃ムチンに特異的に結合するタンパク質については、これまで堀田らにより見出されたモノクローナル抗体(ＨＩＫ１０８３（非特許文献６）；ＩｇＭ、とＨＧＭ５０４（関東化学）；ＩｇＭ、ＨＧＭ５０７（関東化学）；ＩｇＭ)を挙げることができる。ＨＩＫ１０８３はαＧｌｃＮＡｃ残基を認識するモノクローナル抗体であり、ＨＧＭ５０４はＧｌｃＮＡｃα１→４Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃ残基を認識するモノクローナル抗体であり、かつＨＧＭ５０７はＧｌｃＮＡｃα１→４Ｇａｌ残基を認識するモノクローナル抗体であり、それぞれ病理検査などに利用されている。しかしながら、機能性物質としての胃ムチンの調製を考えた場合、高価な抗体の利用は現実的ではない（しかも上述の抗体はＩｇＭであるので費用対効果はかなり低い）。また、αＧｌｃＮＡｃに対するレクチンの開発については報告例（非特許文献７）はあるが、遺伝子工学的応用や大量生産性に関しては課題が多い。
【０００５】
他方、このような糖蛋白質糖鎖を多段階による合成化学的な方法で調製することも、生産性において解決策にはならない。また、特許文献１にＧａｌβ１→３ＧｌｃＮＡｃＧａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃ構造を有するオリゴ糖であるヘリコバクターピロリ結合性物質が開示されている。しかしこの物質も構造が複雑なため、多工程を経て調製しなければならないうえ、大量かつ簡便に調製できない。
【０００６】
一方、発明者らは、αＧｌｃＮＡｃにエチル基などのアルキル基を導入した誘導体もピロリ菌の増殖を抑制する効果を有することを見出している（特許文献１）。しかし、この単純な構造を有する化合物は、調製においては有利であっても、その効果は上述したαＧｌｃＮＡｃを有するムチン型糖蛋白質に比べて数十から数百分の一以下であり、費用面においても効果を期待しがたい（非特許文献５）。
したがって、安価なムチン型糖蛋白質を原料とした新たなαＧｌｃＮＡｃ含有ムチンの調製法が望まれていた。
【０００７】
ところで発明者らは、これまでに上述のαＧｌｃＮＡｃを含有する胃ムチンから、ＧｌｃＮＡｃを特異的に遊離する酵素（ＡｇｎＣ）を、腸内細菌に見出している。この酵素は、加水分解するための触媒機能を有する領域と、胃ムチンが有するＯ−グリカンの糖残基に特異的に結合する領域からなる。後者は複数の糖結合モジュール（ＣＢＭ）で構成されており、Ｍｕｃ６型のＯ−グリカンに特に強く結合し、複数のＣＢＭ領域のうち、あるＣＢＭがαＧｌｃＮＡｃ特異的に、他のいくつかが非還元末端のβ結合型ガラクトース（Ｇａｌβ）特異的に結合することが示唆されている（非特許文献８および特願２０１０−１７３２２９号を優先権主張した特願２０１１−１６７９００号を参照）。そこで発明者らは、ＡｇｎＣが、パラニトロフェニルαＮアセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃαｐＮＰ）や以下に示すような化合物を糖供与体として、ガラクトース（Ｇａｌ）へ転移するかどうかを調査してきたが、ＡｇｎＣには糖を転移する機能（転移機能）を全く有しないことがわかった。
【０００８】
発明者らは上記の現状を踏まえ、他の宿主由来の酵素に転移機能があるかどうかを調査し、その結果、一部の腸内細菌の酵素に、効率的にＧｌｃＮＡｃをα結合型でＧａｌに転移する機能があることを見出している（特許文献２）。当該発明の技術的特徴は、水溶液中で一段階で調製可能な糖供与体（Ｎアセチルαグルコサミニルα―ジメトキシトリアゾール、ＧｌｃＮＡｃα−ＤＭＴ）を、バクテロイデス  セタイオタオミクロン（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ）由来のαＮアセチルグルコサミニダーゼ（ＡｇｎＢＴ）の作用によって、Ｇａｌを含む糖受容体にＧｌｃＮＡｃを転移させるというものである。この方法によって、ＧｌｃＮＡｃα１→４Ｇａｌを含むオリゴ糖鎖が調製できることが示された。また、これらの方法によって得られたオリゴ糖は、すでに抗ピロリ菌活性があること（非特許文献９）が示唆されている。しかし、それらのオリゴ糖の効果の程度はあくまでも数百μＭレベルである上に、そのオリゴ糖の調製において、糖受容体となるオリゴ糖（Ｇａｌを末端に有する化合物）の調製工程が煩雑となるデメリットが課題となっている。
【０００９】
そこで発明者らは、ＧｌｃＮＡｃをα結合で末端に有しないムチン型糖蛋白質糖鎖へ、α結合型ＧｌｃＮＡｃを導入するために上記の転移手法（特許文献２に記載の方法）を試みたが、ほとんど導入された生成物を得ることはできなかった。この原因として、酵素の触媒領域が、目的とする反応点（すなわちガラクトース）が密集するムチン型糖蛋白質糖鎖に埋もれてしまい、近づけないことにあると考えられた。従って、ムチン型糖蛋白質糖鎖を糖受容体とする上記ＡｇｎＢＴの糖転移反応において、酵素を反応点に近づける工夫をすることで、転移活性を向上させる必要性が生じていた。
【００１０】
本発明者らは上記の状況に鑑み、糖蛋白質に親和性を有するＣＢＭの利用について検討した。ＣＢＭは微生物由来のものが多く、遺伝子工学的にも利用しやすいからである。すなわち、上記のＡｇｎＣのＣＢＭが糖蛋白質糖鎖に親和性を有するので、このようなＣＢＭを酵素の転移反応に利用できないかを考えた。
【００１１】
ＣＢＭはアミノ酸配列の相同性から、現在、６４のグループに分類されており（非特許文献１０）、糖質関連酵素類に付随して見いだされる。各ファミリーにおいて、それぞれＸ線結晶構造解析などの３次元構造解析データ等から、糖基質に対し結合するために必須のアミノ酸残基が定義されている。これまでにセルロースやアミロースなどの多糖に親和性を有するＣＢＭが多数報告されてきたが、近年、多くのファミリーに、糖蛋白質糖鎖に対して親和性を持つＣＢＭがあることがわかってきている。
【００１２】
今までにいくつかのＣＢＭとの融合化酵素が報告されている。例えば古くからセルラーゼにＣＢＭ（セルロースの構成単位であるβ結合型グルコースに親和性を有する）を導入し、セルロース粉末をセロオリゴ糖にする試みは報告されている。また、セロデキストリンを加リン酸分解する酵素へセルロースに結合するＣＢＭを導入することで、その酵素の活性を２−３倍に向上させている（非特許文献１１）。一方糖蛋白質糖鎖については、近年、Ｎ−結合型糖蛋白質糖鎖を加水分解する酵素にセルロースに親和性のあるＣＢＭ（非特許文献１２）を酵素のＮ末端領域にＣＢＭを導入し、その活性が一部の融合体において維持されることが報告されているが、活性の向上は報告されていない。
【００１３】
このように、今までに、セルロースやキチンといったヒトの生体にはない糖鎖（多糖）への応用例は上述のように多数存在するが、ヒトの生体内の糖鎖（糖蛋白質糖鎖）そのものをターゲットにした例はほとんどない。また、上記のセルロースやキチンといった多糖に親和性を有するＣＢＭと、Ｏ−結合型グリカンやＮ−結合型グリカンなどの生体内に多くみられる糖鎖に対して親和性を有するＣＢＭでは、アミノ酸配列においては別のグループに属し（非特許文献１３）、性質もかなり異なると考えられる。
【００１４】
以上の事実から、糖蛋白質糖鎖に親和性を有するＣＢＭ（たとえば上述のαＧｌｃＮＡｃ含有ムチン型糖蛋白質糖鎖）を、適当なリンカーを介して他の機能を有する蛋白質に融合/導入させることで、融合させる前の機能を維持すれば、目的とする糖蛋白質に、目的とする糖を効率的に導入（糖転移）できるような、新規でかつ有効な手法になりうる、という考えに想到した。
【００１５】
糖質加水分解酵素（微生物由来）は工業レベルでの生産性は高いが、その糖転移反応によって生産されている目的物が、未だにほとんどがオリゴ糖合成レベルにあるのが現状である。したがって、本発明が、医療分野に有用な“糖蛋白質糖鎖”を工業レベルで調製するための重要な手段になりうるものと考えた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】国際公開第２００８／０８４５６１号パンフレット
【特許文献２】特開２０１１−２４４８３２号公報
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】パンデー  アール（Ｐａｎｄｅｙ  Ｒ）ら、アジアン  パシフィック  ジャーナル  オブ  キャンサー  プリベンション（Ａｓｉａｎ  Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）、２０１０年、第１１巻、ｐ．５８３−５８８．
【非特許文献２】キムラ  ケー（Ｋｉｍｕｒａ  Ｋ）、プロバイオティクスとバイオジェニクス、２００５年、ｐ．３４５−３５６．
【非特許文献３】ミカミ  ワイ（Ｍｉｋａｍｉ  Ｙ）ら、モダーン  パソロジー（Ｍｏｄｅｒｎ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ）、２００４年、第１７巻、ｐ．９６２−９７２．
【非特許文献４】ヒライ  ワイ（Ｈｉｒａｉ  Ｙ）ら、ジャーナル  オヴ  バクテリオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）、１９９５年、第１７７巻、ｐ．５３２７−５３３３．
【非特許文献５】カワクボ  エム（Ｋａｗａｋｕｂｏ  Ｍ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２００４年、第３０５巻、ｐ．１００３−１００６．
【非特許文献６】イシハラ  ケイ（Ｉｓｈｉｈａｒａ  Ｋ）ら、バイオケミストリー  ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ）、１９６６年、第３１８巻、ｐ．４０９−４１６．
【非特許文献７】モルカノバ（Ｍｏｌｃｈａｎｏｖａ  Ｖ）ら、バイオキミカ  バイオフィジカ  アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ）、２００５年、第１７２３巻、ｐ．８２−９０．
【非特許文献８】フジタ  エム（Ｆｕｊｉｔａ  Ｍ）ら、ジャーナル  オヴ  バイオロジカル  ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、２０１１年、第２８６巻、ｐ．６４７９−６４８９．
【非特許文献９】リー  エッチ（Ｌｅｅ  Ｈ）ら、バイオケミカル  アンド  バイオフィジックス  リサーチ  コミュニケーション、２００６年、第３４９巻、ｐ．１２３５−１２４１．
【非特許文献１０】ＣＡＺｙサイト、インターネット（ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｚｙ．ｏｒｇ）
【非特許文献１１】シンハオ  イー（Ｘｉｎｈａｏ  Ｙ）ら、アプライド  マイクロバイオロジー  アンド  バイオテクノロジー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、２０１１年、第９２巻、ｐ．５５１−５６０．
【非特許文献１２】クワン  イー  エム（Ｋｗａｎ  Ｅ  Ｍ）ら、プロテイン  エンジニアリング  デザイン  アンド  セレクション（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）、２００５年、第１８巻、ｐ．４９７−５０１．
【非特許文献１３】ガイラン  ディー（Ｇｕｉｌｌｅｎ  Ｄ）ら、アプライド  マイクロビオロジー  アンド  バイオテクノロジー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、２０１０年、第８５巻、ｐ．１２４１−９．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明は前記の課題を解決するためになされたもので、糖蛋白質糖鎖に目的とする糖を効率的に導入するために、糖蛋白質糖鎖に親和性を有するＣＢＭと糖質関連酵素との融合化蛋白質が、融合前の機能を維持し、かつ糖蛋白質調製にとって有用な機能を新たに付与することにある。具体的にはＧｌｃＮＡｃα１→４Ｇａｌを含むムチン型糖蛋白質糖鎖に特異的に結合するＣＢＭ領域のポリペプチドを、酵素機能を有するポリペプチドに融合させ、その融合前の酵素に比べ酵素機能を向上させる。すなわち結果としてＧｌｃＮＡｃをムチン型糖蛋白質糖鎖にα選択的に効率的に導入することである。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明においては、糖質関連酵素そのもの、もしくはその触媒領域のＮもしくはＣ末端に、他の糖蛋白質糖鎖に関する糖質関連酵素のＣＢＭ領域（すなわち糖蛋白質に結合するＣＢＭ）を融合させたキメラ型ポリペプチド（実施例１）を、糖供与体存在下、糖受容体となる糖蛋白質糖鎖に緩衝溶液中で作用させることにより、糖転移活性を向上させ、目的の糖が導入された糖蛋白質を得ることができる。なお、ＣＢＭと触媒領域のリンカーは１０アミノ酸残基以上あればよいが、ＣＢＭを有する元の酵素の、そのＣＢＭのＮ末端よりも１０アミノ酸残基上流の配列を用いることによって、融合後も、その酵素機能をそれぞれ維持する可能性を高める。
【００２０】
具体的には、ＧＨファミリー８９に属するＡｇｎＣのＣＢＭ２から６までの領域のうちＣＢＭ一つ以上の長さの領域（図１）を、同じＧＨファミリー８９に属するＡｇｎＢＴのＣ末端にアミノ酸残基数２５残基のポリペプチドを介して融合させたポリペプチド（キメラ型蛋白質）を緩衝溶液中、糖供与体（ＧｌｃＮＡｃ−αＤＭＴ）存在下、糖受容体（ムチン型糖蛋白質）に作用させることで、効率的にαＧｌｃＮＡｃ含有ムチン型糖蛋白質を得る（実施例７、実施例９）。なお、この時アミノ酸残基数１０残基以上の長さのポリペプチド部位があれば、酵素機能が維持される。また、本発明のポリペプチドは、オリゴ糖だけでなく糖蛋白質糖鎖に対する加水分解活性（ＧｌｃＮＡｃを遊離する活性）の向上をもたらす（実施例２、実施例３および実施例６）。以上の方法により、目的とする糖（ＧｌｃＮＡｃ）を目的とする結合様式（立体選択率１００％）で導入することができる。酵素（触媒領域）が厳密な立体選択性を有するからである。
【００２１】
すなわち、本発明は、以下のポリペプチド（キメラ型ポリペプチド）の使用方法、およびそのキメラ型ポリペプチドに関する。
（請求項１）  糖蛋白質糖鎖に結合する糖結合モジュール（ＣＢＭ）領域を、他の糖質関連酵素またはその触媒領域に融合させてキメラ型ポリペプチドにすることによって、その糖質関連酵素またはその触媒領域の機能を向上させ、または新たな機能を付与する方法。
（請求項２）  その糖質関連酵素またはその触媒領域の機能または新たな機能が、糖供与体を用いて目的とするオリゴ糖、多糖または糖蛋白質糖鎖に糖を導入する糖転移活性である請求項１に記載の方法。
（請求項３）  その糖質関連酵素またはその触媒領域の機能または新たな機能が、オリゴ糖、多糖または糖蛋白質糖鎖に対する加水分解活性である請求項１に記載の方法。
（請求項４）  その糖質関連酵素またはその触媒領域の機能または新たな機能が、有機溶剤耐性である請求項１に記載の方法。
（請求項５）  糖蛋白質糖鎖に結合する糖結合モジュール（ＣＢＭ）領域が、ＣＢＭファミリー３２に属するＣＢＭ領域である請求項１に記載の方法。
（請求項６）  糖蛋白質糖鎖に結合する糖結合モジュール（ＣＢＭ）領域が、グリコシルハイドロラーゼファミリー８９（ＧＨ８９）に属するα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼに付随するＣＢＭ領域である請求項１に記載の方法。
（請求項７）  他の糖質関連酵素が、グリコシルハイドロラーゼファミリー８９（ＧＨ８９）に属するα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼである請求項１に記載の方法。
（請求項８）  融合の際にスペーサーとして、糖蛋白質糖鎖に結合する糖結合モジュール（ＣＢＭ）領域の元の酵素においてそのＣＢＭ領域のＮ末端に隣接する１０アミノ酸残基以上のアミノ酸配列を有するポリペプチドを用いる請求項１に記載の方法。
【００２２】
（請求項９）  糖蛋白質糖鎖に結合する糖結合モジュール（ＣＢＭ）領域を、他の糖質関連酵素またはその触媒領域に融合させたキメラ型ポリペプチド。
（請求項１０）  糖蛋白質糖鎖に結合する糖結合モジュール（ＣＢＭ）領域が、ＣＢＭファミリー３２に属するＣＢＭ領域である請求項９に記載のキメラ型ポリペプチド。
（請求項１１）  糖蛋白質糖鎖に結合する糖結合モジュール（ＣＢＭ）領域が、グリコシルハイドロラーゼファミリー８９（ＧＨ８９）に属するα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼに付随するＣＢＭ領域である請求項９に記載のキメラ型ポリペプチド。
（請求項１２）  他の糖質関連酵素が、グリコシルハイドロラーゼファミリー８９（ＧＨ８９）に属するα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼである請求項９に記載のキメラ型ポリペプチド。
（請求項１３）  融合のスペーサーとして、糖蛋白質糖鎖に結合する糖結合モジュール（ＣＢＭ）領域の元の酵素においてそのＣＢＭ領域のＮ末端に隣接する１０アミノ酸残基以上のアミノ酸配列を有するポリペプチドを有する請求項９に記載のキメラ型ポリペプチド。
【発明の効果】
【００２３】
本発明の様々なＣＢＭを有するキメラ型ポリペプチドによって、目的とする糖蛋白質に目的とする糖をその非還元末端に導入することができる。すなわち、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける新たな糖残基の導入においては、糖鎖が密集しているような糖蛋白質に対しては、酵素的糖転移反応による糖の導入が進行しにくかったが、本発明によって、顕著に目的とする糖残基が導入できることになる。
【００２４】
本発明の請求項５から７に記載の方法によって、α結合型ＧｌｃＮＡｃをガラクトースが密集した糖鎖（Ｏ−グリカン）へ効率的に導入できる（実施例９）。なお、これにより調製後、さらにＧｌｃＮＡｃα１→４Ｇａｌβ残基含有Ｏ−グリカンに親和性を有するＣＢＭ（ＣＢＭ４、特許文献３に記載）を固定化したものなどを用いてα結合型ＧｌｃＮＡｃを非還元末端に有するＯ−グリカンを精製（高純度化）することができる。
【００２５】
ＧｌｃＮＡｃα１→４Ｇａｌβ残基を含有するＯ−グリカンは、ある特定のムチン型糖蛋白質（Ｍｕｃ６）のみに存在するものである。しかし、本発明のポリペプチドは、ガラクトースを末端に有する糖蛋白質糖鎖であれば、そのガラクトースにＧｌｃＮＡｃを転移するものであるので、様々な糖蛋白質（ガラクトースを非還元末端に有するグリカンを有する糖蛋白質）を糖受容体とすることができ、たとえば安価な卵白ムチンなどへもα結合型ＧｌｃＮＡｃ残基を導入することができることになる。また、本発明のポリペプチドと同様の方法で、他の多くの種類の糖蛋白質糖鎖を調製できることになる。なぜなら、糖供与体としては、シアル酸、ガラクトース、フコースやＮアセチルガラクトサミンなどの、糖蛋白質糖鎖を構成する糖、もしくはそれらを含むオリゴ糖鎖に脱離基を導入させることによって糖供与体（加水分解酵素や糖転移酵素に対する基質となり、糖転移するための基質（糖供与体）となるもの）へ誘導する合成法は確立されており、これに対応する糖質関連酵素は、すでに多くの種類が見いだされ、かつ予想されているからである（上述のＣＡＺｙサイトなど）。
【００２６】
また、上述のようなＣＢＭの融合化は、酵素本来の機能（たとえば加水分解活性）の優位な上昇をもたらすことになる（実勢例２、実施例３、実施例６）。したがって、あるオリゴ糖分子に特異性を有する酵素に対し、そのオリゴ糖を有する糖蛋白質糖鎖に対して機能を上昇させたい場合に、その糖蛋白質糖鎖の非還元末端に位置する糖残基に親和性を有するＣＢＭ、特にタンデム型ＣＢＭを上述のような方法によって導入（融合化）させることで、目的を達成させることができる。たとえば、セリンやスレオニンに結合したＮ−アセチルガラクトサミンを含むオリゴ糖（Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃα−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）をエンド型で加水分解する酵素（エンドαＮ−アセチルガラクトサミニダーゼ）（アシダ  エッチ（Ａｓｈｉｄａ  Ｈ）ら、グライコバイオロジー（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ）、２００８年、第１８巻、ｐ．７２７−７３４））に、ムチン型糖蛋白質糖鎖の非還元末端に位置するガラクトースやシアル酸に親和性を有するタンデム型ＣＢＭ（本発明のものに限られない）を酵素に導入することで酵素活性を優位に上昇させることができ、結果的に、加水分解されにくい糖蛋白質糖鎖から、様々なＯ−グリカンのライブラリーを調製できることになる。
【００２７】
さらに、本発明のキメラ型ポリペプチド（キメラ型酵素）は、種々の有機溶剤との混合溶媒中でも酵素活性（糖転移反応）において有利な効果をもたらす（実施例８）。すなわち、本発明のように、ＣＢＭを酵素機能を有する蛋白質へ導入することは酵素の有機溶剤耐性化をもたらすと考えられ、結果的に糖脂質類の加水分解活性の向上、および、糖供与体存在下、脂質類への配糖化も可能となる。
【００２８】
本発明のキメラ型酵素により得られたα結合型Ｏ−グリカンを含有する糖蛋白質糖鎖は、飲食品として含有させて用いることにより、胃疾患を軽減したり治癒したり予防したりするのに有用である。その物質が強いピロリ菌増殖抑制作用を発現するから、飲食品にピロリ菌増殖抑制剤を少量添加するだけで優れた抗ピロリ菌作用を奏する。
【００２９】
本発明のキメラ型酵素により得られたα結合型Ｏ−グリカンを含有する糖蛋白質糖鎖は、医薬製剤として、もしくは抗生物質（ピロリ菌に効果のある）と併用して服用することにより、ピロリ菌に由来する慢性胃炎や胃潰瘍等の胃疾患の治療・症状緩和・予防に用いられる。また、糖鎖含有物質が強いピロリ菌特異的増殖抑制作用を発現するので、この医薬製剤を少量服用するだけで優れた抗ピロリ菌作用を奏し、副作用が発現せず、内科的治療で胃疾患を治癒するのに有用である。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼホモログのアミノ酸配列の一次構造。ＣＢＭ：糖結合モジュール、ＦＩＶＡＲ：ｆｏｕｎｄ  ｉｎ  ｖａｒｉｏｕｓ  ａｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ  ｄｏｍａｉｎ、ＴＭ：ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｄｏｍａｉｎ
【図２】ＧｌｃＮＡｃ−α−Ｇａｌ−β−ｐＭＰ基質に対する加水分解活性のＨＰＬＣによる検出
【図３】ＧｌｃＮＡｃ−α含有Ｃｌａｓｓ  ＩＩＩ  ＭｕｃｉｎからのＧｌｃＮＡｃの遊離
【図４】ＡｇｎＢＴ１キメラ酵素のＣｌａｓｓ  ＩＩＩ  Ｍｕｃｉｎに対する加水分解活性
【図５】ＡｇｎＢＴ１−キメラ酵素のαＧｌｃＮＡｃ転移活性能（酵素濃度の検討）
【図６】ＡｇｎＢＴ１−キメラ酵素のαＧｌｃＮＡｃ転移活性能（有機溶媒（５％ｖ／ｖ）による影響）
【図７】Ｍｕｃｉｎに対するＡｇｎＢＴ１キメラ酵素のαＧｌｃＮＡｃ転移活性能
【発明を実施するための形態】
【００３１】
ＣＢＭは、細菌類から哺乳類などの高等生物を宿主とした糖質関連酵素に広く見いだされ、特に腸内細菌や土壌中に見い出される細菌類の糖質加水分解酵素に顕著に見いだされる。請求項１では、糖蛋白質糖鎖に親和性を有するＣＢＭと糖質関連酵素の融合化が酵素活性を向上させ、新たな機能が付与させることが記載されている。ここでターゲットとする糖蛋白質糖鎖があり、そのうちターゲットとする糖部位が決まっているのであれば、その糖部位を含むオリゴ糖部位に作用する酵素を選定し、かつその糖蛋白質糖鎖に親和性を有するＣＢＭを選択すればよい。ここでＣＢＭは、糖蛋白質糖鎖を構成する糖である、ガラクトース（Ｇａｌ）、フコース（Ｆｕｃ）、シアル酸（Ｓｉａ、（Ｎアセチルノイラミン酸（ＮｅｕＡｃ）およびＮアセチルグリコール酸（ＧｌｃＡｃ）を含む）、Ｎアセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）に親和性を有するもののうち、糖転移反応等のターゲットにしたいものを上述のＣＡＺｙサイト等によって選ぶことができる。この中で、すでに糖蛋白質糖鎖に対して親和性を有する旨の報告のあるものが特に望ましい（ＣＢＭファミリー１３、３２、４０、４７、（５０）、（５１）、５７）。なお、同じファミリー内でも親和性を有する糖蛋白質糖鎖の種類にそれぞれ違いがある可能性はある。また、ＣＢＭを導入させたい酵素は、糖質関連酵素であれば特に制限はないが、以下に示すように、同じＧＨ（もしくは糖転移酵素（ＧＴ））ファミリー間での融合（すなわち、融合される前の酵素ファミリーと、導入させようとするＣＢＭを有する酵素のファミリーが同じものどうしでの融合）は特に好ましい。
【００３２】
請求項２から４までに、上述した請求項１に記載されたポリペプチドによる方法と同様に、糖蛋白質糖鎖に対する糖転移、糖の遊離（加水分解）および有機溶剤耐性化を行う場合に用いられる方法であることが記載されている。また、その時に用いられるポリペプチドがそれぞれ請求項９と請求項１０に記載されている。請求項２に記載の糖転移においては、糖供与体となるものと糖受容体となるものの組み合わせであればよく、糖受容体として糖転移さたい部位を非還元末端に有している糖蛋白質であれば、どのような糖蛋白質へも当該方法を用いることができる。また、糖供与体および糖受容体ともに緩衝液に溶解していればどのような濃度でも用いることができる。請求項３に記載の加水分解においても同様に、糖供与体非存在下では、糖蛋白質そのものを加水分解する方法として用いることができる。この場合も同様に、糖蛋白質が緩衝液に溶解していればどのような濃度でも用いることができる。請求項４では、請求項１に記載の方法が、目的とする酵素の有機溶剤耐性獲得のために用いられることができることが記載されている。ここで用いることができる有機溶剤とは、実施例８にあるように、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、アセトニトリルおよびアセトンなどの非プロトン性溶剤であり、その他、緩衝液と混和する溶剤であればどのようなものも用いることができる。なお、用いる溶剤の濃度は、導入される糖質関連酵素および導入するＣＢＭにもよるが、緩衝液に対し０〜８０％／Ｖｏｌまで用いることができ、融合前に有機溶剤耐性が全くなかった酵素に対しては、５〜２０％／Ｖｏｌの有機溶剤中で顕著な活性を有する。一方、プロトン性溶剤（アルコール類）は、溶剤そのものが糖受容体となりうるので、目的とする反応を阻害する結果となりうる。また、クロロホルム、ヘキサン、エーテルおよびトルエンなど緩衝液と混和しない溶剤を用いた場合は、糖転移活性は維持されるが、反応効率が低くなるおそれがある。
【００３３】
請求項５に記載のＣＢＭ３２ファミリーとは、上述のＣＡＺｙサイトに記載のＣＢＭ３２ファミリーに属するＣＢＭであり、この中から特に糖蛋白質糖鎖に結合するという報告のあるもの（あるいは推定されているもの）を利用することが好ましい。
【００３４】
請求項６（方法）および１１（請求項６に用いられる物）に記載のＣＢＭは、ＧＨ８９ファミリーに付随するＣＢＭであることが記載されている。以下の実施例には、ＧＨ８９ファミリーに属する、腸内細菌のクロストリジウム  パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ  ｓｔｒａｉｎ１３）由来のα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（ＡｇｎＣ）のＣ末端に付随するタンデム型のＣＢＭが有効であることが記載されている。ここで、このようなタンデム型ＣＢＭについては、それらのうち１つ以上のＣＢＭが目的とする酵素に導入されれば、機能の向上等が期待できる。ＡｇｎＣと同様に、ビフィドバクテリウム  ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）、ユーバクテリウム  ドリカム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｏｌｉｃｈｕｍ）やコリンセラ  スターコリス（Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ  ｓｔｅｒｃｏｒｉｓ）にも、同様にタンデム型ＣＢＭが見られる（図１）が、同様に用いることができる。なお、この時、導入するＣＢＭの数が増えるほど、糖蛋白質に対する親和性の向上が期待できるので、加水分解活性や糖転移活性の向上等がさらに期待できることになる。
【００３５】
請求項７（方法）および１２（請求項７に用いられる物）には、導入させようとする糖質関連酵素が、グリコシルハイドロラーゼファミリー８９（ＧＨ８９）に属するα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの触媒領域であることが記載されている。なお、ＧＨ８９とは、アシドバクテリウム  カプスラタム（Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）、アカルマンシア  ムシニフィリア（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ  ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）、アリスチペス  シャヒー（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ  ｓｈａｈｉｉ）、アスチカコーリス  エクセントリカス（Ａｓｔｉｃｃａｃａｕｌｉｓ  ｅｘｃｅｎｔｒｉｃｕｓ）、バクテロイデス  キシラニソルベンツ（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｔｓ）、バクテロイデス  フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）、バクテロイデス  ヘルコジェネス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｈｅｌｃｏｑｅｎｅｓ）、バクテロイデス  サラニトロニス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｓａｌａｎｉｔｒｏｎｉｓ）、バクテロイデス  セタイオタオミクロン（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ）、バクテロイデス  バルガタス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｖｕｌｇａｔｕｓ）、ビューテンバルジア  カバルナエ（Ｂｅｕｔｅｎｂｅｒｇｉａ  ｃａｖｅｒｎａｅ）、ビフィドバクテリウム  ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）、ブラキバクテリウム  ファシウム（Ｂｒａｃｈｙｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆａｅｃｉｕｍ）、カンジダタス  アルスロミタス（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ａｒｔｈｒｏｍｉｔｕｓ）、カウロバクター  クレッセンタス（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ）、カウロバクター  セグニス（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｅｇｎｉｓ）、キチノファーガ  ピネンシス（Ｃｈｉｔｉｎｏｐｈａｇａ  ｐｉｎｅｎｎｓｉｓ）、クロストリジウム  パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、クロストリジウム  スピロフォルメ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｉｒｏｆｏｒｍｅ）、フラボバクテリウム  ジョンソニー（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｊｏｈｎｓｏｎｉａｅ）、グラニュリセラ  マレンシス（Ｇｒａｎｕｌｉｃｅｌｌａ  ｍａｌｌｅｎｓｉｓ）、ニアステラ  コリーンシス（Ｎｉａｓｔｅｌｌａ  ｋｏｒｅｅｎｓｉｓ）、ポルジバクター  プロピオニシジェネス（Ｐａｌｕｄｉｂａｃｔｅｒ  ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉｇｅｎｅｓ）、ペドバクター  ヘパリナス（Ｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ  ｈｅｐａｒｉｎｕｓ）、ペドバクター  サルタンス（Ｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓａｌｔａｎｓ）、プレボテラ  ルミニコーラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｒｕｍｉｎｉｃｏｌａ）、サルモネラ  エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）、スタッカブランジア  ナッソエンシス（Ｓｔａｃｋｅｂｒａｎｄｔｉａ  ｎａｓｓａｕｅｎｓｉｓ）、ストレプトミセス  アンボファシエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ）、ストレプトミセス  アベルミチリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）、ストレプトミセス  ビンケンジェンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｂｉｎｃｈｅｎｇｇｅｎｉｓ）、ストレプトミセス  スカビー（Ｓｔ���ｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｃａｂｉｅｉ）、ストレプトミセス  ベネズエラエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ）、ストレプトミセス  ビオラセウスニガー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｏｌａｃｅｕｓｎｉｇｅｒ）、テリグロバス  サーネンシス（Ｔｅｒｒｉｇｌｏｂｕｓ  ｓａａｎｅｎｓｉｓ）、キサントモナス  アクソノポディス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ）、キサントモナス  オリゼー（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｏｒｙｚａｅ）、ゾベリア  ガラクタニボランス（Ｚｏｂｅｌｌｉａ  ｇａｌａｃｔａｎｉｖｏｒａｎｓ）、ズノンワンジア  プロファンダ（Ｚｕｎｏｎｇｗａｎｇｉａ  ｐｒｏｆｕｎｄａ）、アノフェレス  ガンビア（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｇａｍｂｉａｅ）、アラビドプシス  タリアーナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、アスパルギルス  オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、ボス  タウロス（Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ）、カエノラブディティス  ブリグサエ（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｂｒｉｇｇｓａｅ）、カエノラブディティスエレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）、チェロナス  イナニタス（Ｃｈｅｌｏｎｕｓ  ｉｎａｎｉｔｕｓ）、ドロマイウス  ノバホランディー（Ｄｒｏｍａｉｕｓ  Ｎｏｖａｅｈｏｌｌａｎｄｉａｅ）、ドロソフィラ  メラノガスター（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、ホモサピエンス（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）、マイクロモナス（Ｍｉｃｒｏｍｏｎａｓ）、マス  マスキュラス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、ニコチアナ  タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）、オリザ  サティバ  インディカ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  Ｉｎｄｉｃａ）、オリザ  サティバ  ジャポニカ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  Ｊａｐｏｎｉｃａ）、ビティス  ビニフェラ（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）、ジー  メイス（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）、由来のα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼであることを示す（ＣＡＺｙサイト参照）。
【００３６】
また、請求項８（方法）および１３（請求項８に用いられる物）に記載の、融合しようとするＣＢＭと、融合される糖質関連酵素の触媒部位とのリンカー用のポリペプチドとしては、ＣＢＭの方のＮ末端側から上流の１０〜２５残基程度（ＣＢＭを付随していた酵素において、そのＣＢＭのＮ末端アミノ酸部位から１０〜２５残基程度Ｎ末端側にあるポリペプチド部位）を用いることで、融合されたポリペプチドが酵素活性を維持もしくは向上しやすくなる。本発明のＡｇｎＣのＣＢＭにおいては、ＡｇｎＣのＮ末端側から２番目のＣＢＭ（触媒領域のＣ末端側へ1番目のＣＢＭ）のＮ末端からＮ末端方向に２０残基の領域と、それを導入するために用いた制限酵素部位の追加による２残基のアミノ酸配列によって、以下の実施例のように酵素活性が維持されている。
【００３７】
ＡｇｎＣのＣ末端に付随する複数のＣＢＭ領域のＮ末端側から２番目から６番目までのポリペプチドとＡｇｎＢＴとのキメラ蛋白は、特許文献３を参照し、以下の実施例１のように調製することができる。また、その他ＧＨ８９のホモログからのＣＢＭと他のＧＨ８９の触媒領域との組み合わせについても同様にキメラ型として調製することができる。
【００３８】
さらにこれらのキメラ型ポリペプチドは、担体へ固定化して用いることもできる。担体への固定化においては、ヒスチジンタグ（Ｈｉｓ）やグルタチオンーＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳT）などのタグを、Ｎ末端およびＣ末端のどちらの方向へもキメラ型ポリペプチドへ導入が可能である。
【００３９】
本発明（請求項６および１１に記載）において調製したポリペプチドの、糖転移反応の場合におけるＧａｌβ残基含有Ｏ−グリカン、および糖加水分解反応時におけるＧｌｃＮＡｃα１→４Ｇａｌβ残基含有Ｏ−グリカンに対する親和性を発揮する条件は、ｐＨ４から９の緩衝溶液中であれば用いることができるが、具体的には以下のようになる。
【００４０】
溶液は、リン酸緩衝液、炭酸緩衝液、トリス緩衝液などの例を挙げることができ、特にリン酸緩衝化生理食塩水（ｐｈｏｓｐａｈｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ，ＰＢＳ）が好ましい。溶液のｐＨは、中性付近が好ましく、ｐＨ６．０からｐＨ８．０が特に好ましい。反応の温度は、１５℃から４０℃が好ましく、２５℃が特に好ましい。基質であるオリゴ糖の濃度は、加水分解および糖転移反応のいずれにおいても、反応させるための条件においては、基質が緩衝溶液に溶解していればよく、数十ミリＭ程度まで用いることができる。なお、糖転移反応において、糖受容体となる糖蛋白質の濃度および糖供与体の濃度においても、それらが溶解していればよく、数十μＭから数百μＭまで用いることができる。用いるべき糖供与体としては、糖転移反応の基質となるものであれば何でもよい。なお、糖供与体においては、Ｏ−結合型グリカンでは糖蛋白質糖鎖の多くの非還元末端に糖を転移させるので、糖受容体の数十から数百倍以上の濃度で糖転移収率は向上する。反応の時間は、加水分解反応や糖転移反応のいずれも本発明のポリペプチド（キメラ蛋白）濃度が数μＭから数百μＭで数十分から１０時間が好ましく、３０分〜５時間程度が特に好ましい。しかしながら糖転移反応ではポリペプチド濃度が数十ｎＭ以下では５時間以上で比較的反応率が高くなる傾向にある。反応容器においては、系内の温度を制御でき、かつ溶解しているタンパク質や糖質化合物を特に吸着させるものでないかぎり、どのようなものを用いてもよい。また、反応においては、撹拌や振とうを行えば、反応時間を短縮することができる。
【実施例】
【００４１】
以下に、本発明のキメラ型ポリペプチドを調製し、その機能を調査した実施例を挙げて具体的に説明するが、本発明を何ら限定するものではない。
［実施例１］
（１．１）ＣＢＭ結合キメラタンパクの触媒部位となるＨｉｓ−ｔａｇ融合タンパク質（ＡｇｎＢＴ１）の取得
バクテロイデス菌（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｔｈｅｔａｏｉｔａｏｍｉｃｒｏｎ  ＶＰＩ５４８２）のゲノムを鋳型として、センスプライマーＢａｍＨＩ−ＢＴ１Δ３２（下線は制限酵素ＢａｍＨＩサイトを示す）（ＧＣＧ  ＧＡＴ  ＣＣＣ  ＧＡＴ  ＣＣＣ  ＣＡＡ  ＴＣＧ  ＡＴＴ  ＣＡＴ  ＴＧ）（配列表配列番号１）と、アンチセンスプライマーＢＴ１Δ３２−ＳａｃI（下線はＳａｃＩサイト）（ＧＴＧ  ＡＧＣ  ＴＣＣ  ＴＴＴ  ＧＣＴ  ＴＣＡ  ＡＴＣ  ＧＣ）（配列表配列番号２）を用い、ＤＮＡポリメラーゼＰｒｉｍｅＳｔａｒ（Ｔａｋａｒａ製）を利用して、サーマルサイクラーＰＴＣ１００（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ製）で遺伝子増幅（反応条件（順に９８℃３０秒、６３．５℃３０秒、７２℃３３秒で３０サイクル行なう））を行ない、増幅後ＡｇｎＢＴ１−ＤＮＡ断片（２，１４９ｂｐ）を得た。得られた産物に対して制限酵素（ＢａｍＨＩおよびＳａｃＩ）処理を行なった後、タンパク質発現用ベクターｐＥＴ３２ａ（＋）へ、制限酵素サイト（５’末端側にＢａｍＨＩと３’末端側にＳａｃＩ）でライゲーション反応を行ない、発現宿主である大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ（ＢＬ２１（ＤＥ３）株）へ形質転換操作し、アンピシリン濃度５０μｇ／ｍｌを含有するＬＢ寒天培地上で、その形質転換操作体を得た。これをアンピシリン濃度５０μｇ／ｍｌを含有するＬＢ培地中（２ｍｌ）で前培養し、さらに同培養液４００ｍｌへ全量植菌し、ＯＤ６００で０．７になるまで３７℃で震盪培養した後、ＩＰＴＧを０．１ｍＭになるように添加し、室温で２４時間震盪培養することで、本タンパク質を発現した大腸菌を調製した。遠心後上清を除去したのち、集められた菌体へＰＢＳ溶液（５０ｍＭ  ＰＢＳ，３００ｍＭ  ＮａＣｌ）を４ｍｌ加えて懸濁した後、リゾチーム（１０ｍｇ／ｍｌ）を０．７５ｍｇ／ｍｌとなるよう添加し、さらにＰＢＳ溶液を加え全量を４ｍｌとした。この懸濁溶液を氷上で超音波破砕し、２００００×ｇで１０分遠心後、上清をＨｉｓ−ｔａｇアフィニティークロマトグラフィーを使った精製法（ＴＡＬＯＮ  Ｍｅｔａｌ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｒｅｓｉｎｓ，  ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）により精製した。この溶液を、限外濾過膜（排除分子サイズ  ３００００）を用いることにより、上記精製に用いたイミダゾール等を除き、結果的に目的タンパク質を、精製体として、１０００ｍｌ培養当たり約２０ｍｇで得ることができた（図１）。得られたタンパクはＨｉｓ−ｔａｇ融合タンパクのまま、後の解析に用いた。また、調製したＡｇｎＢＴタンパク発現ベクターは、キメラタンパク発現ベクターの調製のために引き続き用いた。
【００４２】
（１．２）Ｈｉｓ−ｔａｇ融合ＣＢＭ２−キメラタンパク質の取得（ＡｇｎＢＴ１−ＣＢＭ２）
ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ  ｓｔｒａｉｎ１３）のゲノムを鋳型として、ＣＢＭ２とその前後領域（Ｎ末端側からアミノ酸９１２番目〜１０９０番目）の遺伝子配列を、センスプライマーＳａｃＩ−ＣＢＭ２（下線は制限酵素ＳａｃＩサイトを示す）（ＣＧＧ  ＡＧＣ  ＴＣＡ  ＴＧＧ  ＡＴＡ  ＡＡＡ  ＴＡＴ  ＴＡＧ  Ｇ）（配列表配列番号３）と、アンチセンスプライマーＣＢＭ２−ＸｈｏＩ（下線はＸｈｏＩサイト）（ＡＡＣ  ＴＣＧ  ＡＧＴ  ＴＣＣ  ＴＴＴ  ＴＣＴ  ＴＴＴ  ＣＣ）（配列表配列番号４）を用い、ＤＮＡポリメラーゼＰｒｉｍｅＳｔａｒ（Ｔａｋａｒａ製）を利用して、サーマルサイクラーＰＴＣ１００（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ製）で遺伝子増幅（反応条件（順に９８℃５秒、５８．１℃３０秒、７２℃１分で３０サイクル行なう））を行ない、増幅後ＣＢＭ２−ＤＮＡ断片（４８７ｂｐ）を得た。得られた産物に対して制限酵素（ＳａｃＩおよびＸｈｏＩ）処理を行なった後、上記で作製したＡｇｎＢＴ１タンパク発現ｐＥＴ３２ａ（＋）ベクターへ、制限酵素サイト（５’末端側にＳａｃＩと３’末端側にＸｈｏＩ）でライゲーション反応を行ない、発現宿主である大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ（ＢＬ２１（ＤＥ３）株）へ形質転換操作し、アンピシリン濃度５０μｇ／ｍｌを含有するＬＢ寒天培地上で、その形質転換操作体を得た。これをアンピシリン濃度５０μｇ／ｍｌを含有するＬＢ培地中（２ｍｌ）で前培養し、さらに同培養液４００ｍｌへ全量植菌し、ＯＤ６００で０．７になるまで３７℃で震盪培養した後、ＩＰＴＧを０．１ｍＭになるように添加し、室温で２４時間震盪培養することで、本タンパク質を発現した大腸菌を調製した。遠心後上清を除去したのち、集められた菌体へＰＢＳ溶液（５０ｍＭ  ＰＢＳ，３００ｍＭ  ＮａＣｌ）を４ｍｌ加えて懸濁した後、リゾチーム（１０ｍｇ／ｍｌ）を０．７５ｍｇ／ｍｌとなるよう添加し、さらにＰＢＳ溶液を加え全量を４ｍｌとした。この懸濁溶液を氷上で超音波破砕し、２００００×ｇで１０分遠心後、上清をＨｉｓ−ｔａｇアフィニティークロマトグラフィーを使った精製法（ＴＡＬＯＮ  Ｍｅｔａｌ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｒｅｓｉｎｓ，  ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）により精製した。この溶液を、限外濾過膜（排除分子サイズ  ３００００）を用いることにより、上記精製に用いたイミダゾール等を除き、結果的に目的タンパク質を、精製体として、１０００ｍｌ培養当たり約２１ｍｇで得ることができた（図１）。Ｈｉｓ−ｔａｇ融合タンパクのまま、後の解析に用いた。
【００４３】
（１．３）Ｈｉｓ−ｔａｇ融合ＣＢＭ２−６−キメラタンパク質の取得（ＡｇｎＢＴ１−ＣＢＭ２−６）
ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ  ｓｔｒａｉｎ１３）のゲノムを鋳型として、ＣＢＭ２〜６とその前後領域（Ｎ末端側からアミノ酸９１２〜１６４０）の遺伝子配列を、センスプライマーＳａｃＩ−ＣＢＭ２（下線は制限酵素ＳａｃＩサイトを示す）（ＣＧＧ  ＡＧＣ  ＴＣＡ  ＴＧＧ  ＡＴＡ  ＡＡＡ  ＴＡＴ  ＴＡＧ  Ｇ）（配列表配列番号５）と、アンチセンスプライマーＣＢＭ２６−ＸｈｏＩ（下線はＸｈｏＩサイト）（ＡＴＣ  ＴＣＧ  ＡＧＴ  ＧＡＡ  ＧＴＧ  ＧＡＡ  ＴＣＴ  Ｃ）（配列表配列番号６）を用い、ＤＮＡポリメラーゼＰｒｉｍｅＳｔａｒ（Ｔａｋａｒａ製）を利用して、サーマルサイクラーＰＴＣ１００（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ製）で遺伝子増幅（反応条件（順に９８℃５秒、５９．７℃３０秒、７２℃３３秒で２８サイクル行なう））を行ない、増幅後ＣＢＭ２−６−ＤＮＡ断片（２，１７３ｂｐ）を得た。得られた産物に対して制限酵素（ＳａｃＩおよびＸｈｏＩ）処理を行なった後、上記で作製したＡｇｎＢＴ１タンパク発現ｐＥＴ３２ａ（＋）ベクターへ、制限酵素サイト（５’末端側にＳａｃＩと３’末端側にＸｈｏＩ）でライゲーション反応を行ない、発現宿主である大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ（ＢＬ２１（ＤＥ３）株）へ形質転換操作し、アンピシリン濃度５０μｇ／ｍｌを含有するＬＢ寒天培地上で、その形質転換操作体を得た。これをアンピシリン濃度５０μｇ／ｍｌを含有するＬＢ培地中（２ｍｌ）で前培養し、さらに同培養液４００ｍｌへ全量植菌し、ＯＤ６００で０．７になるまで３７℃で震盪培養した後、ＩＰＴＧを０．１ｍＭになるように添加し、室温で２４時間震盪培養することで、本タンパク質を発現した大腸菌を調製した。遠心後上清を除去したのち、集められた菌体へＰＢＳ溶液（５０ｍＭ  ＰＢＳ，３００ｍＭ  ＮａＣｌ）を４ｍｌ加えて懸濁した後、リゾチーム（１０ｍｇ／ｍｌ）を０．７５ｍｇ／ｍｌとなるよう添加し、さらにＰＢＳ溶液を加え全量を４ｍｌとした。この懸濁溶液を氷上で超音波破砕し、２００００×ｇで１０分遠心後、上清をＨｉｓ-ｔａｇアフィニティークロマトグラフィーを使った精製法（ＴＡＬＯＮ  Ｍｅｔａｌ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｒｅｓｉｎｓ，  ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）により精製した。この溶液を、限外濾過膜（排除分子サイズ  ３００００）を用いることにより、上記精製に用いたイミダゾール等を除き、結果的に目的タンパク質を、精製体として１０００ｍｌ培養当たり約１９ｍｇで得ることができた（図１）。Ｈｉｓ−ｔａｇ融合タンパクのまま、後の解析に用いた。
【００４４】
［実施例２］
４−ニトロフェニル誘導体（ＧｌｃＮＡｃ−α−ｐＮＰ）に対する酵素活性
上記で調製した各タンパク溶液（３１−３４μｇ／μｌ）を３−５μｌ、１５ｍＭ  ＧｌｃＮＡｃ−α−ｐＮＰ溶液を２０μｌ、１０倍濃縮ＰＢＳ（ｐＨ７．４）溶液を１０μｌ添加し、滅菌水により全量を１００μｌとした。これを撹拌しながら、３７℃でインキュベートした。一定時間反応後、遊離したｐＮＰ量を吸光度計で測定することで比活性および反応速度を算出し、各タンパク質のＧｌｃＮＡｃ−α−ｐＮＰ基質に対する反応性を比較した。（表１）ＣＢＭ２を付与したキメラタンパク（ＡｇｎＢＴ１−ＣＢＭ２）では、野生型のＡｇｎＢＴ１タンパクよりもＶｍａｘ値が約１３倍、比活性が約１２倍向上した。一方、ＣＢＭ２−６を付与したキメラタンパク（ＡｇｎＢＴ１−ＣＢＭ２−６）では、有意な活性の向上は見られなかった。
＜表１＞  ＧｌｃＮＡｃ−α−ｐＮＰに対する加水分解活性の速度論的解析
【００４５】
【表１】
0005917913.tif 000002
【００４６】
［実施例３］
４−メトキシフェニル誘導体（ＧｌｃＮＡｃ−α−Ｇａｌ−β−ｐＭＰ）に対する酵素活性
１５ｍＭ  ＧｌｃＮＡｃ−α−Ｇａｌ−β−ｐＭＰを２μｌ、上記で調製した各タンパク溶液（３．１−３．４μｇ／μｌ）を１μｌ、１０倍濃縮ＰＢＳ（ｐＨ７．４）溶液を１μｌ添加し、滅菌水により全量を１０μｌとした。反応溶液を撹拌しながら、３７℃で３時間インキュベートした後、ＧｌｃＮＡｃ切断後に遊離すると考えられるＧａｌ−β−ｐＭＰ量をＨＰＬＣ（ＨＰＬＣ装置；ＧＬ７４００（島津製）、分析用カラム；ＯＤＳ−３（４．６×２５０ｍｍ）、検出；ＵＶ２８３ｎｍ）にて測定した。すべてのタンパクにおいて、Ｇａｌ−β−ｐＭＰのピークが確認され、とくにＡｇｎＢＴ１−ＣＢＭ２−６キメラタンパクにおいて加水分解活性が高いことが分かった。（図２）
【００４７】
ＧｌｃＮＡｃ−α−Ｇａｌ−β−ｐＭＰは０．０５−３ｍＭの溶液となるように希釈し、上記で調製した各タンパク溶液（３．１−３．４μｇ／μｌ）を０．４−０．５μｌ、１０倍濃縮ＰＢＳ（ｐＨ７．４）溶液を３μｌ添加し、滅菌水により全量を３０μｌとした。一定時間反応させたのち、Ｇａｌ−β−ｐＭＰ量をＨＰＬＣにより測定し、比活性および反応速度を算出し、各タンパク質のＧｌｃＮＡｃ−α−Ｇａｌ−β−ｐＭＰ基質に対する反応性を比較した。（表２）ＡｇｎＢＴ１−ＣＢＭ２−６タンパクでは、野生型のＡｇｎＢＴ１タンパクよりもＶｍａｘ値が約５倍、ｋｃａｔ値が約９倍向上した。一方、ＡｇｎＢＴ１−ＣＢＭ２キメラタンパクでは、Ｖｍａｘ値、ｋｃａｔ値ともに約２〜３倍程度の向上が認められた。
＜表２＞  ＧｌｃＮＡｃ−α−Ｇａｌ−β−ｐＭＰ基質に対する加水分解活性の速度論的解析
【００４８】
【表２】
0005917913.tif 000003
【００４９】
［実施例４］
末端にαＧｌｃＮＡｃ残基を有する糖タンパク質に対する加水分解活性の評価
ブタ胃ムチン糖タンパク質Ｐｏｒｃｉｎ  Ｇａｓｔｒｉｃ  Ｍｕｃｉｎ（ＰＧＭ）もしくは  ＣｌａｓｓＩＩＩ  Ｍｕｃｉｎ（ＳＩＧＭＡ−Ａｌｄｒｉｃｈ製）の２％溶液５０μｌ，１０倍濃縮ＰＢＳ（ｐＨ７．４）溶液を１０μｌ、上記に調製した各タンパク約３１−３４μｇをそれぞれ添加し、全量を５００μｌにして、撹拌しながら３７℃で５時間インキュベートした。反応後、溶液を遠心濾過し、ろ液を遠心濃縮した後、所定量の蒸留水で溶解させ、以下のそれぞれの方法で測定した。
【００５０】
［実施例５］
後処理をした濾液をＨＰＬＣ（ＨＰＬＣ装置；ＧＬ７４００（島津製）、分析用カラム；Ａｓａｈｉｐａｋ  ＮＨ２Ｐ−５０（４．６×２５０ｍｍ）、検出；ＵＶ２１０ｎｍ）に供して、酵素反応後にＰＧＭから遊離すると考えられるＧｌｃＮＡｃの検出を行なった。溶出時間約１０〜１２分にＧｌｃＮＡｃと思われるピークの増大が確認できた。野生型のＡｇｎＢＴ１タンパクやＡｇｎＢＴ１−ＣＢＭ２キメラタンパクより、ＡｇｎＢＴ１−ＣＢＭ２−６キメラタンパクを酵素源に用いた場合に、もっともＧｌｃＮＡｃの検出量が多かった（図３）。
【００５１】
［実施例６］
Ｍｕｃｉｎ上の非還元末端のαＧｌｃＮＡｃ残基量に変化が見られるかどうかを、ＧｌｃＮＡｃα−残基を認識するＨＩＫ１０８３抗体（関東化学）を用いたドットブロットにより確認した。一次抗体ＨＩＫ１０８３（５００倍希釈）により３７℃一時間処理し、二次抗体として抗ＩｇＭ−ＨＲＰ（２０００倍希釈）（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｉｎｃ．）を使用した。非還元末端のαＧｌｃＮＡｃの切断により新たに出現するＧａｌβ−残基の変化量について、ＲＣＡ１２０レクチン（生化学バイオビジネス株式会社）を用い、ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ  ＡＢＣ  ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）により検出した。ＡｇｎＢＴ１−ＣＢＭ２−６キメラタンパクで処理したＭｕｃｉｎは、野生型のＡｇｎＢＴ１タンパクやＡｇｎＢＴ１−ＣＢＭ２キメラタンパクで処理したムチンに比べ、ＨＩＫ１０８３抗体に対する反応性が低下し、逆にＲＣＡ１２０レクチンに対する反応性が上がった。（図４）
【００５２】
［実施例７］
ＡｇｎＢＴ１キメラタンパクのαＧｌｃＮＡｃ転移活性能の有無について確認するため、Ｇａｌβ−ｐＭＰをアクセプターに、ＤＭＴ−αＧｌｃＮＡｃを糖供与体として用い、糖転移反応を行なった。具体的には、２５０ｍＭ  Ｇａｌβ−ｐＭＰを１２μｌ、２５０ｍＭ  ＤＭＴ−αＧｌｃＮＡｃを４μｌ、１０倍濃縮ＰＢＳ（ｐＨ７．０）溶液を２μｌ添加し、上記で調製した各タンパク溶液を最終濃度０．４−１．２μｌになるように、滅菌水により全量を２０μｌとした。反応溶液を撹拌しながら、３７℃で３０ｍｉｎ、１ｈ、５ｈ、１６時間インキュベートした。反応産物をＨＰＬＣに供し、ＧｌｃＮＡｃ転移後に生成するＧｌｃＮＡｃ−α−Ｇａｌ−β−ｐＭＰのピークを（ＨＰＬＣ装置；ＧＬ７４００（島津製）、分析用カラム；ＯＤＳ−３（４．６×２５０ｍｍ）、検出；ＵＶ２８３ｎｍ）にて検出した。野生型ＡｇｎＢＴ１だけでなくＡｇｎＢＴ１キメラ酵素にも糖転移活性能があることを確認し、ＡｇｎＢＴ１−ＣＢＭ２タンパクおよびＡｇｎＢＴ１−ＣＢＭ２−６タンパクは、野生型ＡｇｎＢＴ１タンパクよりも低濃度（０．４μＭ）であっても十分に糖転移活性を示すことが分かった。（図５）
【００５３】
［実施例８］
有機溶媒含有条件下での糖転移活性能を確認した。２５０ｍＭ  Ｇａｌβ−ｐＭＰを１２μｌ、２５０ｍＭ  ＤＭＴ−αＧｌｃＮＡｃを４μｌ、１０倍濃縮ＰＢＳ（ｐＨ７．０）溶液を２μｌ添加し、上記で調製した各タンパク溶液を最終濃度０．４−１．２μｌになるように加え、さらに最終濃度５％（ｖ／ｖ）になるようアセトニトリルを１μｌ添加し、滅菌水により全量を２０μｌとした。他にアセトン、テトラヒドロフランについても同様に反応させた。反応溶液を撹拌しながら、３７℃で３０ｍｉｎ、１ｈ、１．５ｈ、１６時間インキュベートし、反応終了後に反応産物をＨＰＬＣに供した。その結果、アセトニトリル、テトラヒドロフランを用いた場合には、野生型ＡｇｎＢＴ１タンパクの活性は失われ転移反応が進行しないが、キメラタンパクでは活性を保持していることが明らかとなった。とくにアセトニトリル中で、その反応性が高く保持されていた。また、アセトン中においては、とくにＡｇｎＢＴ１−ＣＢＭ２タンパクが高い活性を保持していることが分かった。（図６）
【００５４】
［実施例９］
Ｍｕｃｉｎ上のＧａｌ残基に対するＡｇｎＢＴ１キメラ酵素のαＧｌｃＮＡｃ転移活性能について検討した。あらかじめＡｇｎＣタンパクにより末端ＧｌｃＮＡｃα−残基を切断したＭｕｃｉｎを準備し、アクセプターとして用いた。ＡｇｎＣ処理した０．２％Ｍｕｃｉｎ溶液あるいは０．５％ＰＧＭ溶液を０．５μｌ、２５０ｍＭ  ＤＭＴ−αＧｌｃＮＡｃを８μｌ、１０倍濃縮ＰＢＳ（ｐＨ７．０）溶液を２μｌ添加し、上記で調製した各タンパク溶液を最終濃度０．４−１．２μｌになるように、滅菌水により全量を２０μｌとした。反応溶液を撹拌しながら、３７℃で１ｈ、５ｈインキュベートした。反応溶液をニトロセルロース膜上へスポットし、上記の方法を用い、Ｍｕｃｉｎ上のＧｌｃＮＡｃα−残基およびＧａｌβ−残基をそれぞれＨＩＫ１０８３抗体、ＲＣＡ１２０レクチン用いたドットブロットにより確認した。ＡｇｎＢＴ１−ＣＢＭ２−６キメラタンパクで処理したＭｕｃｉｎは、野生型のＡｇｎＢＴ１タンパクやＡｇｎＢＴ１−ＣＢＭ２キメラタンパクで処理したＭｕｃｉｎに比べ、ＨＩＫ１０８３抗体に対する反応性が上がり、逆にＲＣＡ１２０レクチンに対する反応性が下がった。（図７）
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明により提供されたポリペプチドは、腸内細菌類が有する糖鎖結合ツールを利用する全く新しい方法であり、用いるタンパク質は植物由来のレクチン類とは異なり、糖鎖に対する高い結合力、遺伝子工学的な利便性、および大量調製の潜在性を兼ね備えるために、産業上の利用可能性は高い。
【００５６】
また、本発明により提供されるポリペプチドによって得られるα結合型ＧｌｃＮＡｃ含有Ｏ−グリカンは、胃疾患の治療としての医薬製剤としてだけでなく、ビフィズス菌などの善玉菌の増殖ファクター、すなわち整腸剤としても利用可能性がある。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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