(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
光学焦点区域5、6を生じさせる、透明媒質1中の透明物体2、3の特性を決定する方法であって、
-  特性決定されるべき前記物体2、3を含む試料を指向性光7の光源によって照明し、それによって、前記透明物体の前記焦点区域に光強度ピーク5、6を誘起する段階であって、前記焦点区域が前記物体2、3の後方の実際の焦点区域5、または前記物体2、3の前方の仮想区域6である、段階と、
-  前記誘起された光強度ピーク5、6の少なくとも1つの特性を決定して、前記光強度ピーク5、6の前記少なくとも1つの特性から前記物体2、3の少なくとも1つの性質を決定する段階と
を含む、方法。
【請求項２】
-  前記照明された試料のホログラフィック表示を記録する段階と、
-  前記ホログラフィック表示から、前記試料によって誘起された明視野強度の3次元表示を再構成する段階と、
-  所定の閾値よりも高い強度を示す前記光強度ピーク5、6を決定するために前記明視野強度の前記3次元表示を走査する段階であって、前記光強度ピーク5、6の各々が1つの物体2、3に対応する、段階と
をさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記ホログラフィック表示がホログラフィック顕微鏡によって得られる、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
前記顕微鏡が微分モードにより操作される、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
前記顕微鏡が暗視野モードで操作される、請求項3または4に記載の方法。
【請求項６】
前記光源が部分コヒーレントである、請求項3から5のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記顕微鏡が軸外しで操作される、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
前記少なくとも1つの粒子特性が前記物体の数を含む、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記物体が、気泡、エマルション中の液体小胞、固体ビード、生細胞、死細胞、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記物体が、生細胞、死細胞、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
少なくとも1つのピーク特性が決定され、前記ピーク特性が、前記光強度ピークと前記対応する物体との間の距離、前記光強度ピークの面積、および前記光強度ピークの強度からなる群から選択される、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ピーク特性が、物体の少なくとも2つのサブセットに前記物体を分類するために使用される、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
物体の1つのサブセットが生細胞に対応し、物体の第2のサブセットが死細胞に対応する、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
前記特性決定する方法が、連続ホログラフィック表示に関して動的に行われる、請求項1から13のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
光学焦点区域を生じさせる透明物体を、前記物体を含む透明試料のデジタルホログラフィック表示から計数するための、コンピュータ可読媒体に記録されたコンピュータプログラムであって、コンピュータにロードされたとき、請求項2から7のいずれか一項に記載の方法を実行することにより前記ホログラフィック表示中の光強度ピークの数を決定する、コンピュータプログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は粒子の特性を決定する光学的方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
透明媒質中の小さい透明粒子の計数は、いくつかの技術分野において周知の問題である。これは、材料科学における分散相粒子の数の計数、生物培養における細胞の数の計数、化学またはポリマー合成におけるラテックス中のミセルの数の計数などである場合がある。
【０００３】
この問題を解決する最初の試みは、標準透明格子(目盛板)を使用し、次に顕微鏡写真に対して格子で画定された正方形ごとに粒子の数を手作業で計数することである。そのような手作業の計数方法はいくつかの欠点がある。第一に、それは非常に時間がかかり、それは少数に関する統計的妥当性が不十分であり、通常信頼性に限界がある。
【０００４】
したがって、時には画像解析を使用して、そのような計数を自動化する。そのような方法では、顕微鏡画像は、通常、閾値レベル、分割、膨張および収縮変換、境界検出などを使用するものなどの標準手順によって変換される。次に、個々の粒子は多かれ少なかれ複雑なアルゴリズムによって計数される。そのような自動方法には、通常、いくつかの欠点がある。例えば、取得した画像のコントラストが制限されている場合、または部分的に重なっている粒子の場合、アルゴリズムは異なる粒子を正確に分離しないことがあり、計数は不十分な信頼性しか有していない。
【０００５】
液体中を流れる粒子を計数する他の既知の方法は、陰影効果または光拡散効果に基づいている。例えば、製薬の分野で広く使用されるそのような方法は、やはり、いくつかの欠点がある。第一に、通常、泡と固体粒子とを区別することができない。これは、測定を乱す大量の溶解CO2を含む生理緩衝液の清浄度を評価するときに特に深刻である。そのような種類の測定では、粒子の性質に関する情報を結果から抽出することが全くできない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】EP1399730
【特許文献２】EP1631788
【特許文献３】国際公開第2010/037861号
【特許文献４】PCT/EP2010/64843
【特許文献５】米国特許出願公開第2004/156098号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、先行技術の欠点がなく、透明媒質中の回転楕円体(spheroid)透明粒子の特性を決定し、かつ/またはそれを計数する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の利点は以下の説明から明らかになる。
【０００９】
本発明は、焦点区域(focal area)(焦点)を生じさせる、透明媒質中に存在する透明物体の少なくとも1つの性質の特性を決定する方法であって、
-  特性決定されるべき物体を含む試料を指向性光の光源によって照明し、それによって、前記透明物体の焦点区域に光強度ピークを誘起する段階と、
-  光強度ピークの少なくとも1つの特性を決定して、光強度ピークの前記少なくとも1つの特性から前記物体の少なくとも1つの性質を決定する段階と
を含む方法に関する。
【００１０】
透明物体が焦点区域(焦点)を生じさせるとは、本明細書では、指向性光の光源で照明されたとき物体が前記焦点区域に光を集束させることができ、集束された光が光強度ピークを形成することを意味する。本発明では、前記光強度ピークは、撮像デバイスと無関係に物体と指向性光との間の相互作用によって直接誘起される(すなわち、観察されなくても光ピークは存在する)。
【００１１】
特定の好ましい実施形態によれば、本発明の方法は、以下の特徴の1つまたは少なくとも2つの好適な組合せを含む。
-  この方法は、
・  照明された試料のホログラフィック表示を記録する段階と、
・  前記ホログラフィック表示から、前記試料によって誘起された明視野強度の3次元表示を再構成する段階と、
・  所定の閾値よりも高い強度を示す光ピーク区域を決定するために明視野強度の3次元表示を走査する段階であって、前記光ピークの各々が1つの粒子に対応する、段階と、
をさらに含み、
-  少なくとも1つの物体特性が前記物体の数を含み、光強度ピークの決定された特性がピークの数を含み、
-  物体は、気泡、エマルション中の液体小胞、固体ビード、生細胞、死細胞、およびそれらの混合物からなる群から選択され、
-  物体は、生細胞、死細胞、およびそれらの混合物からなる群から選択され、
-  前記少なくとも1つのピーク特性は、光ピークと対応する物体との間の距離、光ピークの面積、および光ピーク強度からなる群から選択された少なくとも1つの特性を含み、
-  ピーク特性は、物体の少なくとも2つのサブセットに前記物体を分類するために使用され、
-  物体の1つのサブセットが生細胞に対応しており、物体の第2のサブセットが死細胞に対応しており、
-  特性決定する方法は連続ホログラフィック表示に関して動的に行われ、
-  透明媒質は物体を搬送する流動液体であり、
-  ホログラフィック表示はホログラフィック顕微鏡によって得られ、
-  顕微鏡は微分モードにより操作され、
-  顕微鏡は暗視野モードで操作され、
-  光源は部分コヒーレントであり、
-  顕微鏡は軸外しで操作される。
【００１２】
本発明の別の態様は、本発明の方法または本発明の好ましい実施形態を実施するコンピュータプログラムに関する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の基本原理を概略的に示す図である。
【図２】本発明による方法を使用する接触角の測定を概略的に示す図である。
【図３】実例のデータを発生させるために使用されるデジタルホログラフィック顕微鏡を概略的に示す図である。
【図４ａ】生細胞の「合焦」強度画像を示す図である。
【図４ｂ】照明光線を集束させて、光強度ピークを形成する図4aの透明細胞の焦点区域を示す図である。
【図５】細胞死を誘起する熱処理の前後での細胞培養のピークサイズ(面積)の関数としてのピーク数のヒストグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、光で照明されたときの多くの透明物体に共通する光学的特徴を使用する分析方法に関する。この共通の特徴とは、多くの透明物体がレンズとして働き、前記物体の後方の実際の焦点区域(5)、または前記物体の前方の仮想区域(6)に光を集束させることである。
【００１５】
そのような焦点区域は、例えば、周囲の媒質と異なる屈折率を有する回転楕円体または楕円体(ellipsoid)の透明粒子(2〜3)の形態の物体によって誘起され得る。そのような粒子は、例えば、水溶液中に分散された油滴、液体中の気泡(3)、生細胞または死細胞、ガス流中の液滴などとすることができる。
【００１６】
透明とは、本明細書では、合焦ピークを観察するのに十分な光指向性を維持する媒質を意味する。そのような透明度は、例えば、ヘイズ測定(ASTM D 1003)で特性を決定することができる。高いヘイズから生じる問題は、光バックグラウンドの増加と、バックグラウンドとピークとを区別することの困難性の増加とである。
【００１７】
光合焦強度ピークを観察するために、粒子は、好ましくは入射光の波長を超えるサイズ、より好ましくは光波長の3倍よりも大きいサイズを呈する。可視光の場合、粒子は、好ましくは1マイクロメートルよりも大きい寸法を有する。
【００１８】
焦点区域を誘起する透明粒子は、自由に流動する回転楕円体粒子に限定されず、さらに、ガラスなどに接する液滴または泡などの平面に捕捉された粒子を含むこともできる。
【００１９】
そのような焦点/焦点区域が存在する結果、それらの粒子の各々は、照明されたとき、光強度ピークを生成することになり、その光強度ピークは光強度分布を3次元で走査することによって容易に検出することができる。
【００２０】
有利には、本発明の方法は、最初に、分析されるべき粒子を含む照明された試料のデジタルホログラフィック表示を記録することによって行われる。次に、走査および分析が、好ましくは、照明された試料によって誘起された明視野の再構成3D表示に行われる。
【００２１】
本発明の方法によって単一粒子の特性を決定できる場合でさえ、この方法の自動化の可能性により、この方法は粒子の大きい集合に特に適するようになる。特性決定されるべき粒子は表示の範囲に同時に存在していてもよいし、または時系列で存在していてもよい。
【００２２】
好ましくは、デジタルホログラフィック表示はデジタルホログラフィック顕微鏡(DHM)で記録される。前記DHMは、有利には、参照により本明細書に組み込まれる〔特許文献１〕に記載されたタイプのものとすることができる。
【００２３】
好ましい代替として、DHMは、参照により本明細書に組み込まれる〔特許文献２〕に記載されたものなどの微分ホログラフィック顕微鏡とすることができる。
【００２４】
有利には、DHMは、〔特許文献３〕パンフレットに記載されているように暗視野モードで操作される。そのような暗視野モードの利点は、平均光バックグラウンドを減少させることによって光ピークの検出を容易にすることである。
【００２５】
〔特許文献４〕を有する国際特許出願に記載されたものなどの軸外しDHMを使用すると、流体中の流動粒子などの動的事象を高速記録するという利点がある。
【００２６】
好ましくは、光ピーク強度は、3D表示の体積中の所定の閾値より上の光強度を検出することによって決定される。
【００２７】
そのような合焦点決定の第１の用途は、流動媒質中の回転楕円体粒子を計数する方法である。そのような方法では、光強度ピークの数は、試料中の回転楕円体粒子の数に対応している。そのような計数方法の利点は、合焦された光区域が粒子サイズよりも非常に小さく、その結果、高密度の粒子の場合でさえ、光ピークは容易に分解され、よく分離されることになることである。これは、部分的に重なっている粒子を2D表示で計数する方法と比べて重要な利点である。
【００２８】
粒子の計数はピークの検出を単に使用しているが、形状、強度、および位置などの光ピークの他の特性を有利に使用することもできる。そのような情報は各粒子と同等なレンズの特性である。それらのレンズ特性は、それら自体、粒子の幾何学的形状および屈折率によって決定される。
【００２９】
例えば、粒子の後方に焦点を生じさせる収束レンズとして働くことになる高屈折率粒子とは逆に、液体中の気泡は泡の前方に焦点を生じさせる発散レンズとして働くことになる。したがって、好ましい方法では、粒子は、対応する光ピーク区域の相対位置によって分類される。この分類により、泡および高屈折率粒子などの異なる種類の粒子を容易に区別することができるようになる。
【００３０】
高屈折率または低屈折率とは、本明細書では、それぞれ、粒子を囲む媒質の屈折率よりも高い屈折率または低い屈折率を意味する。
【００３１】
光学的性質だけ異なっている粒子の別の例として、驚いたことに、本発明の方法は、細胞に対応する光ピークの特性に基づいて液体媒質中を流れる死細胞と生細胞とを区別することができることが示された。
【００３２】
以下に示す実験例では、図5に示すように、ピークのサイズが区別の基準として使用された(すなわち、光強度が閾値よりも高い体積または面積)。ピークの絶対強度(すなわち、ピーク内の光強度の最大強度または積分)などの他の基準を使用することができることも発見された。
【００３３】
この方法は容易に自動化して連続時系列で自動的に行うことができるので、本発明の方法は、有利には、個々の細胞の変位を研究するために使用することができる。
【００３４】
本発明のさらなる動的用途として、いくつかのピーク特性を使用して噴霧乾燥プロセスを研究することができる。そのような研究では、噴霧された粒子は、本明細書で上述した方法によって計数され、流れの中の粒子の個々の移動は正確に決定することができ、時間の関数としての粒子のサイズは再構成された粒子(「合焦」画像)を分析することによって同時に決定することができ、溶液の濃度は、粒子の形状と焦点区域での光強度ピーク位置との間の相関から決定される粒子屈折率から計算することができる。そのような方法によってもたらされる利点の1つは、例えば、過飽和現象と、対応する核生成および成長プロセスとを決定する能力である。
【００３５】
透明物体の焦点を決定することに関する別の有利な用途は、透明な平面上の液滴の幾何形状パラメータを正確に決定することである。次に、それらの幾何形状パラメータを使用して、例えば接触角を正確に計算することができる。
【００３６】
より一般的には、以下のパラメータ、すなわち、ピークの数、ピーク形状およびサイズ、ピーク強度(積分および/または最大値)、対応する粒子からの相対位置が対象となり得る。
【００３７】
それらのピークパラメータは、有利には、対応する粒子の形状および位置と相関し得る。
【００３８】
有利には、粒子から生じる対応する蛍光データとの相関も使用して粒子の特性を決定することができる。そのような蛍光相関は、参照により本明細書に組み込まれる文献〔特許文献５〕に記載されている方法を使用することができる。
【００３９】
それらのパラメータから、以下の特性、すなわち、生細胞の生存能力、溶液濃度、細胞のタイプ、粒子運動などを、有利には、推測することができる。
【実施例】
【００４０】
本発明の方法を使用して細胞培養の特性を決定した。
【００４１】
図3に示したような顕微鏡を使用して、デジタルホログラムを記録した。ホログラムサンプリングレートは2.5Hzであり、200個のホログラムが順に取られた。
【００４２】
図1に示したように、試料ホルダ4はフローセルであり、液体試料は流れ8中に存在し、粒子は動的に観察された。
【００４３】
図4aは、得られたホログラフィック記録のうちの1つの再構成写真を示す。図4bは、合焦ピークの対応する突起部を示す。図4bにおいて、対応する細胞表示の代わりに光ピークを考慮すると、接触している細胞でさえ十分に分解されることが分かる。表示しやすくするために、ピークは2次元で示されたことに留意されたい。実際の表示では、それらは深さでも分解される。
【００４４】
本方法で決定された細胞の数は372万細胞/mlであった。それと比べて、ビュルケル計数セルでの手作業計数は371万細胞/mlであった。非常に高い細胞濃度の場合でさえこの非常に良好な一致が確認された。この直前の場合、通常の自動計数方法では不正確な結果が生じる。
【００４５】
さらなる実験では、第1に、本発明の方法を使用して、培養物中の細胞の数が計数された。第2ステップでは、培地は42.5℃で3時間の熱処理にかけられた。そのような処理は細胞の生存能力を減少させることが知られている。
【００４６】
次に、観察した光ピークサイズの分布が熱処理前後で決定された。結果が図5に示される。その図で分かるように、ピークサイズ分布は細胞の生存能力に強く相関している。
【符号の説明】
【００４７】
1  透明媒質
2、3  回転楕円体透明物体
4  試料容器の透明な壁、試料フォルダ
5、6  照明光線(7)を集束させて光強度ピークを形成する透明物体(2、3)の焦点区域
7  照明光線
8  流動透明媒質の方向
【図１】
0006039570.tif 000002
【図２】
0006039570.tif 000003
【図４ａ】
0006039570.tif 000004
【図４ｂ】
0006039570.tif 000005
【図３】
0006039570.tif 000006
【図５】
0006039570.tif 000007