(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験試料中のクロストリジウム・ディフィシレ(C. difficile)トキシンの存在を検出する方法であって、該方法は、被験試料をクロストリジウム・ディフィシレ(C. difficile)により産生されるトキシンに結合するアプタマーと接触させることを含み、
該アプタマーは：
クロストリジウム・ディフィシレ(C. difficile)トキシンＡに結合する、配列番号９の配列を含むアプタマーであるか；または
クロストリジウム・ディフィシレ(C. difficile)トキシンＢに結合する、配列番号６７〜７１からなる群から選択される配列を含むアプタマーである、
前記方法。
【請求項２】
前記アプタマーがさらに少なくとも１つの追加の化学修飾を含み、その少なくとも１つの追加の化学修飾が、独立してリボース位置、デオキシリボース位置、ホスフェート位置、および塩基位置からなる群から選択される１以上の位置における化学置換である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも１つの追加の化学修飾が、独立して、２’−アミノ（２’−ＮＨ２）、２’−フルオロ（２’−Ｆ）、２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）、シトシン環外アミンにおける修飾、５−ブロモウラシルの置換、５−ブロモデオキシウリジンの置換、５−ブロモデオキシシチジンの置換、主鎖修飾、メチル化、３’キャップ、および５’キャップからなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
クロストリジウム・ディフィシレ(C. difficile)トキシンＡに結合する前記アプタマーが、クロストリジウム・ディフィシレ(C. difficile)トキシンＡに対して３０ｎＭ以下のＫｄをもつ、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
クロストリジウム・ディフィシレ(C. difficile)トキシンＢに結合する前記アプタマーがクロストリジウム・ディフィシレ(C. difficile)トキシンＢに対して３０ｎＭ以下のＫｄを含む、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記アプタマーがヌクレアーゼ耐性である、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記アプタマーがスロー オフレートをもつ、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
検出方法がプルダウンアッセイ、ドットブロットアッセイ、ＰＣＲアッセイ、またはサンドイッチアッセイから選択される、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
検出方法がサンドイッチアッセイである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
サンドイッチアッセイがアプタマー−標的−抗体アッセイであり、その際、アプタマーを支持体に固定化し、固定化されたアプタマーに結合した標的を、抗体を用いて検出する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
サンドイッチアッセイが抗体−標的−アプタマーアッセイであり、その際、抗体を支持体に固定化し、固定化された抗体に結合した標的を、アプタマーを用いて検出する、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
サンドイッチアッセイがアプタマー−標的−アプタマーアッセイであり、その際、第１アプタマーを支持体に固定化し、固定化された第１アプタマーに結合した標的を、第２アプタマーを用いて検出する、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
検出方法がクロストリジウム・ディフィシレ(C. difficile)により産生されるトキシンの定量測定を提供する、請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の引照
本出願は、35 U.S.C. § 119(e)のもとで、2011年3月10日に出願されたProvisional Application Serial No. 61/451,227に基づく優先権を主張し、その開示内容全体を本明細書に援用する。
【０００２】
発明の分野
[0001]  本発明は、一般に核酸の分野、より具体的にはクロストリジウム・ディフィシレ(C. difficile)により産生されるトキシンに結合することができる、クロストリジウム・ディフィシレの診断検査に有用なアプタマーに関する。本発明はさらに、クロストリジウム・ディフィシレ汚染または感染を診断するための材料および方法に関する。
【０００３】
[0002]  その全体を本明細書に援用するものは、2012年3月9日に作製したサイズ９キロバイトの“20120221SequenceListing005741_ST25.txt”と題する配列リストである。
【背景技術】
【０００４】
[0003]  以下の記載は、本発明に関連する情報の概要を提示し、本明細書に提示する情報または引用する刊行物のいずれかが本発明の先行技術であると認めるものではない。
【０００５】
[0004]  クロストリジウム・ディフィシレ感染（ＣＤＩ）は、この数年にわたって世界的に増加している。臨床的および経済的影響はかなり大きく、米国だけで１年に５０万を超える症例およびＣＤＩ管理のための推定経費３２億ドルを伴う(O’Brien, J.A., et al., Infect. Control Hosp. Epidemiol., 2007. 28(11): p. 1219-27)。
【０００６】
[0005]  ＣＤＩは、下痢を特徴とする大腸の炎症状態であり、軽症から激症までの重症度に及ぶ可能性がある。より重篤なＣＤＩ症候群は、偽膜性腸炎および中毒性巨大結腸症である。大部分のＣＤＩ症例は、入院中または養護ホームの高齢患者に起きる。しかし、入院は健康な成人についても定着のリスクを高める。米国で、ＣＤＩ入院およびＣＤＩ関連症例致死率は２０００〜２００５年で倍増した。最近の大発生が多数報告されており、それらにおいてＣＤＩ症例は主にクローン性であった。ＢＩ／ＮＡＰ１／０２７と分類される株タイプが半数以上の症例に関与しており、この集団“大発生”株の特徴は、高い罹患率および死亡率、より高い抗生物質（たとえば、フルオロキノリン類）耐性、ｔｃｄＣバリアント遺伝子の存在、ならびにきわめて高いトキシン産生である(Freeman, J., et al., Clin. Microbiol. Rev., 2010. 23(3): p. 529-49; Rupnik, M., M.H. Wilcox, and D.N. Gerding, Nat. Rev. Microbiol., 2009. 7(7): p. 526-36)。
【０００７】
[0006]  抗生物質の使用は、それを使用しなければクロストリジウム・ディフィシレを抑制する正常な腸内細菌叢をかく乱するため、ＣＤＩに対する強い素因である。胞子の経口摂取はクロストリジウム・ディフィシレがヒトの腸に定着する主な経路である。胞子は消毒剤に対して著しく抵抗性であり、その環境で生存性または病原性をほとんど失うことなく１２か月以上生き残ることができる。胞子は、処置後に再発するＣＤＩ症例の２０〜２５％に関与することも指摘されている。ＣＤＩに対する現在の処置計画は、バンコマイシンまたはメトロニダゾールである。ＣＤＩの再発率を低下させる有望性をもつ新たなより選択的な幾つかの薬剤が、臨床開発中である。
【０００８】
[0007]  腸裏層の炎症は、クロストリジウム・ディフィシレが発現する２種類のトキシン（トキシンＡおよびトキシンＢ）により引き起こされる。トキシンＡおよびトキシンＢはグルコシルトランスフェラーゼであり、Ｒａｓスーパーファミリーの小型の宿主ＧＴＰａｓｅをターゲティングする。それらは１９．６ｋｂの病原性遺伝子座にコードされ、これらのトキシン遺伝子を欠如する株は非病原性である。トキシン産生株は、病原性遺伝子座内の配列変動性に従ったトキシノタイプ(toxinotype)にさらに分類することができる。トキシンＡまたはトキシンＢのいずれかだけを産生する同質遺伝子型変異体の使用により示されるように両方のトキシンがＣＤＩに関与し、インビトロで細胞毒性であり、インビボでビルレントであった(Kuehne, S.A., et al., Nature, 2010. 467(7316): p. 711-3)。不活化したトキシンＡおよびＢ（トキソイド）に基づくワクチン原型ならびに抗トキシンモノクローナル抗体が、再発性ＣＤＩを予防するそれらの有効性について試験中である。
【０００９】
[0008]  トキシンＡおよびトキシンＢは、構造的に関係のあるＭＷ約３００ｋＤａの大型トキシンであり、アミノ末端触媒ドメイン（グルコシルトランスフェラーゼ）、中心ペプチダーゼＣ８０ドメイン、トランスロケーションドメイン、および多重カルボキシ末端β−ヘアピン反復配列からなる。クロストリジウムトキシンの作用機序は、胃腸細胞の表面に存在する炭水化物へのこれらのβ−ヘアピン反復配列の結合、エンドペプチダーゼ仲介による開裂、および触媒ドメインのインターナリゼーションを伴うことが示されている(Pfeifer, G., et al., J. Biol. Chem., 2003. 278(45): p. 44535-41)。
【００１０】
[0009]  若干のクロストリジウム・ディフィシレ株は、ＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ活性をもつバイナリートキシン(binary toxin)を産生する。発病に際してのそれの役割は不明であるが、バイナリートキシンの存在は集団発生株ＢＩ／ＮＡＰ１／０２７の良好なマーカーである。バイナリートキシンは２つのサブユニット、すなわちアクチンＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼであるバイナリートキシンＡ鎖および細孔形成性のバイナリートキシンＢ鎖からなる。それらは細菌細胞から個別のポリペプチドとして分泌され、結合して強力なサイトトキシンを形成する能力をもち、これはベロ細胞を死滅させることが示されている(Sundriyal, A., et al., Protein Expr. Purif., 2010. 74(1): p. 42-8)。
【００１１】
[0010]  患者のケア、感染の制御および探査のためには、迅速かつ正確なＣＤＩ診断が重要である。クロストリジウム・ディフィシレのトキシンＡおよびＢは十分に病原体特異的な標的であるのでそれらは高い臨床診断関連性をもち、それらの存在の立証がＣＤＩ診断にとって重要である。現在用いられているＣＤＩ診断検査はすべて定性的であり、３タイプのいずれかに属する：（ｉ）サイトトキシンアッセイ（組織培養）、（ｉｉ）非分子的トキシン試験（ＥＩＡ）、および（ｉｉｉ）分子試験（ＰＣＲ）。
【００１２】
[0011]  組織培養に基づくサイトトキシンアッセイはゴールドスタンダードであると考えられるが、煩雑であって大部分の臨床検査室は日常的に実施することができない。本質的に、このアッセイはクロストリジウム・ディフィシレのトキシンを細胞培養におけるそのトキシンの細胞障害作用により検出し、これは特異的な抗血清で中和することができる。細胞毒性アッセイは１０ｐｇ程度の少量のトキシンＢを検出し、ＦＤＡが２０１０年１１月に発表した“Draft Guidance for Industry and Food and Drug Administration Staff Establishing the Performance Characteristics of In Vitro Diagnostic Devices for the Detection of Clostridium difficile”の510(k)提案について推奨される確認試験である；http://www.fda.gov/MedicalDevices/DeviceRegulationandGuidance/GuidanceDocuments/ucm234868.htm.2010。
【００１３】
[0012]  ＣＤＩについての分子試験は幾つかの診断会社から入手できる。ＣｅｐｈｅｉｄのＧｅｎｅＸｐｅｒｔ（商標）試験は多重ＰＣＲ（ｔｃｄＢ、ｃｄｔ、ｔｃｄＣ）に基づき、宣伝によれば＞９５％の感度および特異性を備え、結果を得るまでの時間は３０分である。Ｍｅｒｉｄｉａｎのｉｌｌｕｍｉｇｅｎｅ（商標）クロストリジウム・ディフィシレ試験は等温ループ(isothermal loop)増幅によりトキシン産生領域の存在を検出し、宣伝によれば１時間以内に結果が得られる。ＢＤのＧｅｎｅＯｈｍ（商標）ＣｄｉｆｆアッセイはトキシンＢ遺伝子（ｔｃｄＢ）を糞便試料から直接検出するためのリアルタイムＰＣＲ法であり、２時間未満のアッセイプロトコル時間、９３．８％の感度、および９５．５％の特異性を備えている。Ｇｅｎ−ＰｒｏｂｅはＰｒｏｄｅｓｓｅ  ＰｒｏＧａｓｔｒｏ  Ｃｄ試験を提供し、これもトキシンＢ遺伝子（ｔｃｄＢ）をＰＣＲにより検出し、３時間以内に９１．７％の感度および９４．７％の特異性で結果が得られると宣伝されている。
【００１４】
[0013]  ＣＤＩの疑いがある患者からの糞便試料においてクロストリジウム・ディフィシレのトキシンを検出するための非分子試験も入手できる。エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）は、クロストリジウム・ディフィシレの共通抗原およびトキシンＡ／Ｂ抗原について最も広く用いられている迅速検出法であるが、従来のＥＩＡがもつ感度および特異性はさほど高くない。ウェル型ＥＩＡのうち、ＭｅｒｉｄｉａｎのＰｒｅｍｉｅｒ（商標）トキシンＡ／Ｂ試験およびＴｅｃｈｌａｂのＴＯＸ  Ａ／Ｂ  ＩＩ（商標）試験は最も性能の良いＥＬＩＳＡであると考えられ、糞便検体中の両トキシンを１時間未満で検出する。これらのアッセイは、独立して試験した場合に約８０％の感度および９８％の特異性を備えていた。Ｐｒｅｍｉｅｒ（商標）トキシンＡ／Ｂ（Ｍｅｒｉｄｉａｎ）およびクロストリジウム・ディフィシレＴＯＸ  Ａ／Ｂ  ＩＩ（商標）（ＴｅｃｈＬａｂ）のためのトキシンＢ抗体は、並行試験した場合にそれぞれ１２５ｐｇおよび２５０ｐｇのトキシンＢを検出することができた(Novak-Weekley, S.M. and M.H. Hollingsworth. Clin Vaccine Immunol, 2008. 15(3): p. 575-8)。他の多数のウェル型ＥＩＡアッセイが市販されている（ＧＡのクロストリジウム・ディフィシレ抗原、Ｒ−ＢｉｏｐｈａｒｍのＲｉｄａｓｃｒｅｅｎ（商標）トキシンＡ／Ｂ；ＲｅｍｅｌのＰｒｏＳｐｅｃｔ（商標）トキシンＡ／Ｂ）が、米国では用いられる頻度はより低い。側方流装置を用いて実施されるメンブレンＥＩＡアッセイは、ＭｅｒｉｄｉａｎのＩｍｍｕｎｏＣａｒｄ（商標）トキシンＡおよびＢ、ＴｅｃｈｌａｂのＴｏｘ  Ａ／Ｂ  Ｑｕｉｋ  Ｃｈｅｋ（商標）、およびＲｅｍｅｌのＸｐｅｃｔ（商標）アッセイである。
【００１５】
[0014]  市販されている自動試験が１つある：ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘのＶＩＤＡＳ（商標）クロストリジウム・ディフィシレトキシンＡおよびＢ；これは、トキシン試験および培養に基づく同定を、ＡＰＩ（登録商標）２０ＡストリップおよびＤｉｖｅｒｓｉＬａｂ（登録商標）による自動細菌遺伝子型判定と組み合わせたものである。
【００１６】
[0015]  アプタマーに基づくクロストリジウム・ディフィシレのトキシン試験は、ＥＩＡと同様に分子試験に優る利点をもち、多大な設備投資または高価な試薬を必要としない。アプタマーは、ＥＩＡなどの非分子アッセイに現在用いられている抗体に優る幾つかの顕著な利点をもつ：一般に、アプタマーはより低い分子量をもち、より高い多重化能（低い交差反応性、広範に適用できるアッセイ条件）、化学的安定性（熱、乾燥、および溶媒に対する；可逆的復元）を備え、試薬製造の容易さ、一貫したロット間性能を備え、より低いコストで製造できる。
【００１７】
[0016]  アプタマーは、実質的にいかなるタンパク質標的に対しても、すなわちトキシンＡ／Ｂだけでなくバイナリートキシン（それについて、抗体に基づく試験法であって本出願人が知っているものはない）に対しても作製できる。検出および読出しの方法は既存の試験法のものと同じであってよく、したがって装置の必要性および訓練の要件は最小限に抑えられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】O’Brien, J.A., et al., Infect. Control Hosp. Epidemiol., 2007. 28(11): p. 1219-27
【非特許文献２】Freeman, J., et al., Clin. Microbiol. Rev., 2010. 23(3): p. 529-49
【非特許文献３】Rupnik, M., M.H. Wilcox, and D.N. Gerding, Nat. Rev. Microbiol., 2009. 7(7): p. 526-36
【非特許文献４】Kuehne, S.A., et al., Nature, 2010. 467(7316): p. 711-3
【非特許文献５】Pfeifer, G., et al., J. Biol. Chem., 2003. 278(45): p. 44535-41
【非特許文献６】Sundriyal, A., et al., Protein Expr. Purif., 2010. 74(1): p. 42-8
【非特許文献７】“Draft Guidance for Industry and Food and Drug Administration Staff Establishing the Performance Characteristics of In Vitro Diagnostic Devices for the Detection of Clostridium difficile”, 510(k), November 2010 FDA
【非特許文献８】Novak-Weekley, S.M. and M.H. Hollingsworth. Clin Vaccine Immunol, 2008. 15(3): p. 575-8
【発明の概要】
【００１９】
[0017]  本発明は、クロストリジウム・ディフィシレにより産生されるトキシンに結合する種々のアプタマーを提供する。そのようなアプタマーを含む診断キットおよび診断方法、ならびにそのようなアプタマーを作製および使用する方法が含まれる。
【００２０】
[0018]  提供するアプタマーは、クロストリジウム・ディフィシレのトキシンＡ、トキシンＢ、バイナリートキシンＡ鎖、またはバイナリートキシンＢ鎖に結合する。クロストリジウム・ディフィシレのトキシンを検出するための診断方法であって、クロストリジウム・ディフィシレにより産生されるトキシンに対するアプタマーを含む方法を提供し、これにはプルダウンアッセイ(pull-down assay)、ドットブロットアッセイ、ＰＣＲアッセイ、およびサンドイッチアッセイが含まれるが、これらに限定されない。
【００２１】
[0019]  提供するアプタマーは、場合により、Ｃ−５位において修飾した少なくとも１つのピリミジンを含み、かつ少なくとも１つの追加の化学修飾を含むことができる。クロストリジウム・ディフィシレのトキシンに結合するアプタマーであってトキシンからのスローオフレート（slow off-rate、遅い解離速度）をもつもの、およびそのようなアプタマーを同定または作製するための方法も提供される。さらに、クロストリジウム・ディフィシレのトキシンに結合するアプタマーであってヌクレアーゼ耐性をもつもの、およびそのようなアプタマーを同定または作製するための方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１Ａ】[0020]  図１Ａは下記を示す；クロストリジウム・ディフィシレのトキシンＡ（ｒＴｃｄＡ）の結晶構造：５つのカルボキシ末端−受容体結合反復配列を含む(Ho, J.G., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2005. 102(51): p. 18373-8)；アフィニティークロマトグラフィーにより精製した組換えタグ付きタンパク質としてのトキシンＡの精製：Ｎｉ−ＮＴＡアガロースおよびＳｔｒｅｐ・Ｔａｃｔｉｎ樹脂を用い、トキシンＡのＨｉｓタグおよびＳｔｒｅｐタグを利用；ならびに、トキシンＡをコードするトキシン遺伝子（ｔｃｄＡ）の対応する部分のＰＣＲ増幅。
【図１Ｂ】図１Ｂは下記を示す；クロストリジウム・ディフィシレのトキシンＢ（ｒＴｃｄＢ）の結晶構造：アミノ末端触媒ドメイン(Reinert, D.J. et al. (2005), J. Mol. Biol. 351: 973-981)；アフィニティークロマトグラフィーによる組換えタグ付きタンパク質としてのトキシンＢの精製：Ｎｉ−ＮＴＡアガロースおよびＳｔｒｅｐ・Ｔａｃｔｉｎ樹脂を用い、トキシンＢのＨｉｓタグおよびＳｔｒｅｐタグを利用；ならびに、トキシンＢをコードするトキシン遺伝子（ｔｃｄＢ）の対応する部分のＰＣＲ増幅。
【図１Ｃ】図１Ｃは下記を示す；全長クロストリジウム・ディフィシレのバイナリートキシンＡ鎖（ｒＣｄｔＡ）の結晶構造(Sundriyal, A., et al., J Biol. Chem. 2009. 284(42): p. 28713-9)；アフィニティークロマトグラフィーによる組換えタグ付きタンパク質としてのバイナリートキシンＡ鎖の精製：Ｎｉ−ＮＴＡアガロースおよびＳｔｒｅｐ・Ｔａｃｔｉｎ樹脂を用い、バイナリートキシンＡ鎖のＨｉｓタグおよびＳｔｒｅｐタグを利用；ならびに、バイナリートキシンＡ鎖をコードするトキシン遺伝子（ｃｄｔＡ）の対応する部分のＰＣＲ増幅。
【図１Ｄ】図１Ｄは下記を示す；全長クロストリジウム・ディフィシレのバイナリートキシンＢ鎖（ｒＣｄｔＢ）のモデル構造；アフィニティークロマトグラフィーによる組換えタグ付きタンパク質としてのバイナリートキシンＢ鎖の精製：Ｎｉ−ＮＴＡアガロースおよびＳｔｒｅｐ・Ｔａｃｔｉｎ樹脂を用い、バイナリートキシンＢ鎖のＨｉｓタグおよびＳｔｒｅｐタグを利用；ならびに、バイナリートキシンＢ鎖をコードするトキシン遺伝子（ｃｄｔＢ）の対応する部分のＰＣＲ増幅。
【図２−１】[0021]  図２Ａは、トキシンＡアプタマーを用いる組換えおよび天然トキシンＡのプルダウンアッセイの結果を示し、これは対照タンパク質であるトキシンＢまたはＢＳＡを上回る高い特異性を示す。図２Ｂは、トキシンＢアプタマーを用いる組換えおよび天然トキシンＢのプルダウンアッセイの結果を示し、これは対照タンパク質である組換えおよび天然トキシンＡを上回る高い特異性を示す表す。
【図２−２】図２Ｃは、バイナリートキシンＡ鎖に対するアプタマーによるバイナリートキシンのプルダウンアッセイの結果を示し、これはバイナリートキシンＡ鎖に対してバイナリートキシンＢ鎖および対照タンパク質ＢＳＡを上回る特異性を示す。図２Ｄは、ランダムアプタマーによる組換えおよび天然トキシンＡならびに組換えおよび天然トキシンＢのプルダウンアッセイの結果を示し、これはプルダウン画分にタンパク質が存在しないことを示す。
【図３】[0022]  図３Ａは、トキシンＡに対するビオチニル化アプタマーおよびストレプトアビジン−アルカリホスファターゼコンジュゲートを用いるドットブロットにおける、クロストリジウム・ディフィシレのトキシンＡの検出を示す。図３Ｂは、トキシンＢに対するビオチニル化アプタマーおよびストレプトアビジン−アルカリホスファターゼコンジュゲートを用いるドットブロットにおける、クロストリジウム・ディフィシレのトキシンＢの検出を示す。
【図４】[0023]  図４Ａは、トキシンＡと複合体形成したアプタマーを含有する試料から溶出したアプタマーのｑＰＣＲによるトキシンＡの定量検出を示し、その際、トキシンＡの代理測定としてアプタマーを定量測定する前に、結合していないアプタマーを除去した。図４Ｂは、トキシンＢと複合体形成したアプタマーを含有する試料から溶出したアプタマーのｑＰＣＲによるトキシンＢの定量検出を示し、その際、トキシンＢの代理測定としてアプタマーを定量測定する前に、結合していないアプタマーを除去した。
【図５Ａ】[0024]  図５Ａは、ストレプトアビジンプレートサンドイッチ（アプタマー−標的−抗体）アッセイによるクロストリジウム・ディフィシレのトキシンＡの検出結果を示す；トキシンＡに対するビオチニル化アプタマーおよびトキシンＡに対するマウスモノクローナル抗体を用い、ヤギ抗マウス抗体で検出した。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ストレプトアビジンプレートサンドイッチ（アプタマー−標的−抗体）アッセイによるクロストリジウム・ディフィシレのトキシンＢの検出結果を示す；トキシンＢに対するビオチニル化アプタマーおよびトキシンＢに対するマウスモノクローナル抗体を用い、ヤギ抗マウス抗体で検出した。
【図６】[0025]  図６は、ニトロセルロース上でのサンドイッチ（抗体−標的−アプタマー）アッセイによるクロストリジウム・ディフィシレのトキシンＡおよびＢの検出結果を示す；その際、モノクローナル抗体をニトロセルロース上にスポットし、風乾し、ブロックし、トキシンＡおよびＢを含有する試料を添加し、洗浄し、ビオチニル化アプタマーを添加し、洗浄し、そしてストレプトアビジン−アルカリホスファターゼコンジュゲートで顕色させた。
【図７】[0026]  図７は、サンドイッチ（アプタマー−標的−アプタマー）アッセイによるクロストリジウム・ディフィシレのバイナリートキシンＡ鎖の検出結果を示す；バイナリートキシンＡ鎖に対する第１ビオチニル化アプタマーをストレプトアビジンビーズに付着させ、標的を添加し、バイナリートキシンＡ鎖に対する第２の放射性標識アプタマーを添加した。
【図８】[0027]  図８は、キャッチ(Catch)１−キャッチ(Catch)２アッセイの関連段階を示す。
【図９−１】[0028]  図９は、本明細書に記載するアプタマーの作製方法に使用できるＣ−５修飾ピリミジンの例を示す。
【図９−２】図９続き。
【図９−３】図９続き。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
[0029]  本発明の代表的態様について以下に詳細に述べる。列記した態様に関連して本発明を記載するが、本発明をそれらの態様に限定することを意図したものでないことは理解されるであろう。そうではなく、本発明は特許請求の範囲により定義される本発明のすべての別形態、改変形態および均等物を含むものとする。
【００２４】
[0030]  当業者には、本明細書に記載するものと類似または同等な多数の方法および材料が認識されるであろう；それらは本発明の実施に際して使用でき、本発明の範囲に含まれる。本発明は記載した方法および材料に決して限定されない。
【００２５】
[0031]  別途定義しない限り、本明細書中で用いる技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野（単数または複数）の当業者が一般的に理解しているものと同じ意味をもつ。本明細書に記載するものと類似または同等な方法、装置および材料をいずれも本発明の実施または試験に使用できるが、好ましい方法、装置および材料を以下に記載する。
【００２６】
[0032]  本明細書に引用したすべての刊行物、公開された特許書類、および特許出願は、本発明が関係する技術分野（単数または複数）の技術水準の指標となる。本明細書に引用したすべての刊行物、公開された特許書類、および特許出願を、個々の刊行物、公開された特許書類、および特許出願が具体的かつ個々に援用すると指摘されたと同じ程度に、本明細書に援用する。
【００２７】
[0033]  特許請求の範囲を含めて本明細書中で用いる単数形“a”、“an”および“the”は、内容からそうではないことが明らかに要求されない限り複数表記を含み、“少なくとも１つ”および“１以上”と互換性をもって用いられる。たとえば、“アプタマー”という記述はアプタマーの混合物を含む、など。
【００２８】
[0034]  本明細書中で用いるように、用語“約”は、数値の有意ではない修飾または変動を表わし、したがってその数値が関係する品目の基本的機能は変化しない。
【００２９】
[0035]  本明細書中で用いるように、用語“アプタマークローン”は、特定のヌクレオチド配列のアプタマーを表わす。アプタマークローンは、本明細書中で“アプタマーＩＤ  Ｎｏ．”および“ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：”により示される。
【００３０】
[0036]  本明細書中で用いるように、“競合分子”と“競合体”は、非標的分子と非特異的複合体を形成しうるいずれかの分子を表わすために互換性をもって用いられる。“競合分子”または“競合体”は、１つの分子タイプまたは分子種のコピーのセットである。“競合分子類”または“競合体類”は、１より多いそのような分子のセットを表わす。競合分子には、オリゴヌクレオチド、ポリアニオン（たとえば、ヘパリン、一本鎖サケ精子ＤＮＡ、およびポリデキストラン（たとえば、デキストラン硫酸））、非塩基ホスホジエステルポリマー、ｄＮＴＰ、およびピロホスフェートが含まれる。競合体を用いる動的攻撃(kinetic challenge)の場合、競合体はアプタマーと非特異的複合体を形成しうるいずれかの分子であってよい。そのような競合分子には、ポリカチオン（たとえば、スペルミン、スペルミジン、ポリリジン、およびポリアルギニン）およびアミノ酸（たとえば、アルギニンおよびリジン）が含まれる。
【００３１】
[0037]  表４、６、８および１０で用いるように、用語“カウント”は、ＳＥＬＥＸにより得られたプールからクローニングおよび配列決定したすべてのアプタマーのうち特定のアプタマー配列の出現数を表わす。
【００３２】
[0038]  本明細書中で用いるように、用語“ドットブロット”は、検出すべき標的分子を含有する混合物を支持体上にドットとして直接適用し、続いて標的分子の存在を親和性分子により検出するアッセイを表わし、その際、親和性分子はアプタマーまたは抗体であってもよいが、それらに限定されない。
【００３３】
[0039]  用語“それぞれ（各）”は、本明細書中で複数の品目を表わすために用いる場合、少なくとも２つの品目を表わすものとする。その複数を形成するすべての品目が関連の追加限定を満たす必要はない。
【００３４】
[0040]  本明細書中で用いるように、用語“含む”(“comprises”、“comprising”、“includes”、“including”、“contains”、“containing”)およびそのいずれかの変形は、排他的ではない包含をカバーするためのものであり、したがって、ある要素または要素のリストを含む(comprises、includes、contains)プロセス、方法、プロセス生成物または組成物は、それらの要素を含むだけでなく、明確に挙げていないかまたはそのようなプロセス、方法、プロセス生成物または組成物に本来は付随しない他の要素を含む可能性がある。
【００３５】
[0041]  本明細書中で用いるように、“コンセンサス配列”は、一連の関連核酸に関して用いる場合、その配列中の各位置の塩基の最も一般的な選択肢を反映するヌクレオチド配列を表わし、その際、その一連の関連核酸には数学的分析および／または配列分析が施されている。
【００３６】
[0042]  本明細書中で用いるように、用語“ヌクレオチド”は、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドまたはその修飾形態、およびその類似体を表わす。ヌクレオチドには、プリン類（たとえば、アデニン、ヒポキサンチン、グアニン、およびそれらの誘導体および類似体）およびピリミジン類（たとえば、シトシン、ウラシル、チミン、およびそれらの誘導体および類似体）を含む種が含まれる。
【００３７】
[0043]  本明細書中で用いるように、用語“核酸”、“オリゴヌクレオチド”および“ポリヌクレオチド”は、ヌクレオチドのポリマーを表わすために互換性をもって用いられ、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、ならびにこれらの種類の核酸、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの修飾体を含み、これにはいずれかの位置のヌクレオチド単位への種々の構成要素または部分の結合が含まれる。用語“ポリヌクレオチド”、“オリゴヌクレオチド”および“核酸”には、一本鎖または二本鎖の分子および三重らせん分子が含まれる。核酸、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドは用語アプタマーより広い用語であり、したがって核酸、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドという用語にはアプタマーであるヌクレオチドポリマーが含まれるが、核酸、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドという用語はアプタマーに限定されない。
【００３８】
[0044]  本明細書中で用いるように、用語“修飾する”、“修飾した”、“修飾”、およびそのいずれかの変形は、オリゴヌクレオチドに関して用いる場合、オリゴヌクレオチドの４種類の構成ヌクレオチド塩基（すなわち、Ａ、Ｇ、Ｔ／Ｕ、およびＣ）のうち少なくとも１つが天然ヌクレオチドの類似体またはエステルであることを意味する。ある態様において、修飾したヌクレオチドはそのオリゴヌクレオチドにヌクレアーゼ耐性を付与する。Ｃ−５位が置換されたピリミジンは修飾したヌクレオチドの一例である。修飾には、主鎖修飾、メチル化、異例の塩基対合組合わせ、たとえばイソ塩基であるイソシチジンおよびイソグアニジンなどを含めることができる。修飾には、３’および５’修飾、たとえばキャッピングも含めることができる。他の修飾には、１以上の天然ヌクレオチドを類似体で置換すること、ヌクレオチド間修飾、たとえば下記のものを含めることができる：非荷電結合（たとえば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバメートなど）を含むもの、および荷電結合（たとえば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を含むもの、インターカレーター（たとえば、アクリジン、プソラレン(psoralen)など）を含むもの、キレーター（たとえば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化性金属など）を含むもの、アルキレーターを含むもの、ならびに修飾された結合（たとえば、アルファアノマー核酸など）を含むもの。さらに、ヌクレオチドの糖に通常存在するヒドロキシル基のいずれかをホスホネート基またはホスフェート基により置き換えること；標準的な保護基で保護すること；あるいは追加ヌクレオチドまたは固体支持体への追加結合を作製するために活性化することができる。５’および３’末端ＯＨ基をリン酸化することができ、あるいはアミン、炭素原子約１から約２０個までの有機キャッピング基部分、１態様においては約１０から約８０ｋＤａまでの範囲のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマー、他の態様においては約２０から約６０ｋＤａまでの範囲のＰＥＧポリマー、または他の親水性もしくは疎水性の生体ポリマーもしくは合成ポリマーで置換することができる。１態様において、修飾はピリミジン類のＣ−５位の修飾である。これらの修飾は、Ｃ−５位においてアミド結合によって直接に、または他のタイプの結合によって作製することができる。
【００３９】
[0045]  ポリヌクレオチドは、当技術分野で一般に知られている類似形態のリボース糖またはデオキシリボース糖を含むこともでき、これには下記のものが含まれる：２’−Ｏ−メチル−、２’−Ｏ−アリル、２’−フルオロ−もしくは２’−アジド−リボース、炭素環式糖類似体、α−アノマー糖、エピマー糖、たとえばアラビノース、キシロースもしくはリキソース、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース類、非環式類似体および非塩基ヌクレオシド類似体、たとえばメチルリボシド。前記に述べたように、１以上のホスホジエステル結合を代替連結基により置き換えることができる。これらの代替連結基にはホスフェートが下記のもので置き換えられた態様が含まれる：Ｐ（Ｏ）Ｓ（“チオエート”）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（“ジチオエート”）、（Ｏ）ＮＲ２（“アミデート”）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯまたはＣＨ２（“ホルムアセタール”）；これらにおいてＲまたはＲ’はそれぞれ独立して、Ｈ、または置換もしくは非置換アルキル（１〜２０Ｃ）（場合により、エーテル（−Ｏ−）結合を含む）、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニルもしくはアラルジルである。ポリヌクレオチド中のすべての結合が同一である必要はない。たとえばポリアミド主鎖などの代替主鎖構造がそうであるように、類似形態の糖類、プリン類およびピリミジン類の置換が最終生成物の設計に際して有利な可能性がある。
【００４０】
[0046]  本明細書中で用いるように、用語“Ｃ−５修飾ピリミジン”は、Ｃ−５位が修飾されたピリミジンを表わし、これには図９に示す部分が含まれるが、それらに限定されない。Ｃ−５修飾ピリミジンの例には、U.S. Pat. Nos. 5,719,273および5,945,527に記載されるものが含まれる。Ｃ−５修飾ピリミジンの例には、Ｃ−５位のデオキシウリジンを独立して下記のものから選択される置換基で置換したものが含まれる：ベンジルカルボキシアミド（別名ベンジルアミノカルボニル）（Ｂｎ）、ナフチルメチルカルボキシアミド（別名ナフチルメチルアミノカルボニル）（Ｎａｐ）、トリプタミノカルボキシアミド（別名トリプタミノカルボニル）（Ｔｒｐ）、チロシルカルボキシアミド（別名チロシルアミノカルボニル）（Ｔｙｒ）、２−ナフチルメチルカルボキシアミド（別名２−ナフチルメチルアミノカルボニル）（２Ｎａｐ）およびフェネチル−１−カルボキシアミド（別名フェネチル−１−アミノカルボニル）（ＰＥ）；これらを以下に示す。
【００４１】
【化１】
0006018096.tif 000002
【００４２】
[0047]  Ｃ−５修飾ピリミジンの化学修飾を、単一またはいずれかの組合わせの２’位−糖修飾、環外アミンにおける修飾、および４−チオウリジンの置換などと組み合わせることもできる。
【００４３】
[0048]  代表的なＣ−５修飾ピリミジンには下記のものが含まれる：５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−チロシルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｙｒｄＵ）、５−（Ｎ−チロシルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−チロシルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−（２−ナフチルメチル）カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（２ＮａｐｄＵ）、５−（Ｎ−（２−ナフチルメチル）カルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−（２−ナフチルメチル）カルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−フェネチル−１−カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＰＥｄＵ）、５−（Ｎ−フェネチル−１−カルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、または５−（Ｎ−フェネチル−１−カルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン。
【００４４】
[0049]  ヌクレオチド構造に対する修飾が存在する場合、それはポリマーの組立て前または後に付与することができる。ヌクレオチドの配列を非ヌクレオチド成分により中断することができる。ポリヌクレオチドを、重合後にさらに、たとえば標識用成分とのコンジュゲーションにより修飾することができる。
【００４５】
[0050]  本明細書中で用いるように、用語“少なくとも１つのピリミジン”は、核酸の修飾について述べる場合、核酸中の１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、またはすべてのピリミジンを表わす；これは、核酸中に出現するいずれかまたはすべてのＣ、ＴまたはＵのいずれかまたはすべてが修飾されていてもよく、あるいは修飾されていなくてもよいことを示す。
【００４６】
[0051]  本明細書中で用いるように、用語“動的攻撃する(kinetically challenge)”および“動的攻撃(kinetic challenge)”は、アプタマー親和性複合体および非特異的複合体を含有する複合体セットから、動的負荷(kinetic pressure)をかけ、そのような複合体クラスの構成要素の親和特性（解離速度を含む）の相異を利用することにより、アプタマー親和性複合体を富化するプロセスを表わす。アプタマー−標的複合体と比較してアプタマー−非標的複合体が一般に減少するので、動的攻撃によって一般に特異性が増大する。本明細書中で用いるように、用語“動的負荷”は、複合体が自然解離するきっかけを与えるための、および／または複合体から自然解離した分子が再結合するのを阻害するための手段を表わす。動的負荷は、競合分子の添加により、または試料の希釈により、または複合体を固体支持体に結合させた際に徹底的に洗浄することにより、または当業者に既知である他のいずれかの手段により適用できる。当業者に認識されるように、動的攻撃は一般にアプタマー親和性複合体とアプタマー−非標的複合体の解離速度の相異に依存するので、動的攻撃の期間は、高い割合のアプタマー親和性複合体を保持し、一方でアプタマー−非標的複合体の個数を実質的に減らすように選択される。動的攻撃が有効であるためには、アプタマー親和性複合体の解離速度は、好ましくはアプタマー−非標的複合体のものより有意に低い。特定の特性を含むようにアプタマーを選択できるので、アプタマー親和性複合体の構成要素が相対的に低い解離速度、すなわちスローオフレートをもつように設計することができる。
【００４７】
[0052]  本明細書中で用いるように、用語“核酸リガンド”、“アプタマー”および“クローン”は、自然界に存在しない核酸であって標的分子に対して望ましい作用をもつものを表わすために、互換性をもって用いられる。望ましい作用には下記のものが含まれるが、それらに限定されない：標的を結合する、触媒作用により標的を変化させる、標的または標的の機能活性を修飾または変更するように標的と反応する、標的に共有結合する（自殺阻害剤の場合のように）、および標的と他の分子との反応を促進する。１態様において、その作用は標的分子に対する特異的結合親和性であり、そのような標的分子はポリヌクレオチド以外の三次元化学構造体であって、ワトソン／クリック塩基対合または三重らせん形成とは別の機序により核酸リガンドに結合する；その際、アプタマーは標的分子が結合する既知の生理的機能をもつ核酸ではない。特定の標的に対するアプタマーには核酸の候補混合物から下記を含む方法により同定される核酸が含まれ、その際、アプタマーは標的のリガンドである：（ａ）候補混合物を標的と接触させる；その際、候補混合物中の他の核酸と対比して標的に対する高い親和性をもつ核酸を候補混合物の残りのものから分配することができる；（ｂ）親和性の高い核酸を候補混合物の残りのものから分配する；そして（ｃ）親和性の高い核酸を増幅してリガンドに富む混合物を得る；これにより、標的分子のアプタマーが同定される。親和性相互作用が程度問題であることは認識されている；しかし、これに関して、アプタマーの標的に対するアプタマーの“特異的結合親和性”は、一般的にアプタマーが混合物または試料中の他の非標的成分に結合するよりはるかに高い親和度でそれの標的に結合することを意味する。“アプタマー”または“核酸リガンド”は、特定のヌクレオチド配列をもつ１つのタイプまたは種の核酸分子のコピーのセットである。アプタマーは、いずれか適切な個数のヌクレオチドを含むことができる。“アプタマー類”は、１より多いそのような分子のセットを表わす。異なるアプタマーは同一または異なる個数のヌクレオチドをもつことができる。アプタマーはＤＮＡまたはＲＮＡであってもよく、一本鎖、二本鎖であってもよく、あるいは二本鎖または三本鎖の領域を含んでもよい。
【００４８】
[0053]  本明細書中で用いるように、ＩＵＰＡＣヌクレオチド不確定コード(ambiguity code)は下記のものである：Ｍ＝ＡまたはＣ；Ｒ＝ＡまたはＧ；Ｗ＝ＡまたはＮ；Ｓ＝ＣまたはＧ；Ｙ＝ＣまたはＮ；Ｋ＝ＧまたはＮ（Ｎはプール特異的な修飾ｄＵを表わす）。
【００４９】
[0054]  本明細書中で用いるように、用語“プラトー”は、結合曲線（結合したアプタマー画分はｙ軸の上方へ増加し、標的の濃度はｘ軸の右方へ増大する）の領域を表わし、その際、標的濃度の増大に伴って標的に結合したアプタマー画分の変化が相対的に少なくなるのでプラトーに達する。本明細書に提示するプラトーのパーセントは、標的に結合したアプタマー１００％に対比したものである。
【００５０】
[0055]  本明細書中で用いるように、用語“タンパク質”は、“ペプチド”、“ポリペプチド”、または“ペプチドフラグメント”と同義で用いられる。“精製した”ポリペプチド、タンパク質、ペプチド、またはペプチドフラグメントは、アミノ酸配列をそれから得た細胞、組織、または無細胞源に由来する細胞性物質または他の混入タンパク質を実質的に含まないか、あるいは化学合成した場合は化学物質前駆体または他の化学物質を実質的に含まない。
【００５１】
[0056]  本明細書中で用いるように、用語“プルダウンアッセイ(pull-down assay)”は、標的を溶液から分離することを含むアッセイを表わし、その際、分離は標的と第２分子の間の選択的な親和性相互作用により達成される。１態様において、標的分子に対して選択的親和性をもつ分子はアプタマーである。他の態様において、標的分子に対して選択的親和性をもつ分子は抗体である。
【００５２】
[0057]  本明細書中で用いるように、用語“ＰＣＲ”は、ＤＮＡ分子のコピー数を増幅するために用いられるポリメラーゼ連鎖反応を表わす。本明細書中で用いるように、用語“ｑＰＣＲ”または“定量ＰＣＲ”は、ターゲティングするＤＮＡ分子を増幅し、同時に定量するために用いられる、ポリメラーゼ連鎖反応を表わす。
【００５３】
[0058]  本明細書中で用いるように、用語“サンドイッチアッセイ”は、関心のある標的の存在を検出し、あるいはその量を定量することができるアッセイを表わす。このアッセイには、関心のある標的上の２つの異なる非オーバーラップ（非競合）領域を結合することができる２種類の異なる親和性分子を用いる必要がある。親和性分子にはアプタマーおよび抗体が含まれるが、それらに限定されない。
【００５４】
[0059]  本明細書中で用いるように、用語“支持体”は表面を表わし、これには有機分子が付着しうるプレート、ビーズまたは膜の表面が含まれるが、それらに限定されない。支持体は、第２分子の付着を仲介する第１分子を含んでもよく、含まなくてもよい；たとえば、ビオチンの付着またはビオチン部分を含む分子の付着を仲介しうるストレプトアビジンを含む支持体。１態様において、支持体はニトロセルロースである。
【００５５】
[0060]  本明細書中で用いるように、用語“被験試料”は、関心のある１種類以上の被分析体（たとえば、クロストリジウム・ディフィシレのトキシンＡ、トキシンＢ、バイナリートキシンＡ鎖、およびバイナリートキシンＢ鎖）の存在または量が未知であって、アプタマーを含むアッセイ、好ましくは診断検査で判定すべき試料を表わす。１態様において、被験試料は“生物試料”、たとえば細胞性または非細胞性の生物材料であってもよく、これには組織試料、血液、血清、他の体液、および排出物が含まれるが、これらに限定されない。他の態様において、被験試料は水、土壌または空気から得ることができる“環境試料”であってもよい。普通は環境試料中のクロストリジウム・ディフィシレの検出には前培養の必要がない。
【００５６】
ＳＥＬＥＸ法
[0061]  用語“ＳＥＬＥＸ”および“ＳＥＬＥＸ法”は、一般的に下記の組合わせを表わすために本明細書中で互換性をもって用いられる：（１）希望する様式で標的分子と相互作用する核酸、たとえば高い親和性でタンパク質に結合する核酸のセレクションと、（２）それらのセレクションした核酸の増幅。ＳＥＬＥＸ法は、特定の標的分子またはバイオマーカーに対して高い親和性をもつアプタマーを同定するために使用できる。
【００５７】
[0062]  ＳＥＬＥＸには一般的に下記のことが含まれる：核酸の候補混合物を調製し、候補混合物を希望する標的分子に結合させて親和性複合体を形成し、結合していない候補核酸からこの親和性複合体を分離し、核酸を親和性複合体から分離および単離し、この核酸を精製し、そして特異的アプタマー配列を同定する。この方法は、セレクションしたアプタマーの親和性をさらに改良するために多数ラウンドを含むことができる。この方法は、プロセスの１以上の時点で増幅段階を含むことができる。たとえば、U.S. Patent No. 5,475,096, タイトル“Nucleic Acid Ligands”を参照。ＳＥＬＥＸ法を用いて、それの標的を共有結合するアプタマーおよびそれの標的を非共有結合するアプタマーを作製することができる。たとえば、U.S. Patent No. 5,705,337, タイトル“Systematic Evolution of Nucleic Acid Ligands by Exponential Enrichment: Chemi-SELEX”を参照。
【００５８】
[0063]  ＳＥＬＥＸ法を用いて、改善された特性、たとえば改善されたインビボ安定性または改善された送達特性をアプタマーに付与する修飾ヌクレオチドを含む、高親和性アプタマーを同定することができる。そのような修飾の例には、リボースおよび／またはリン酸および／または塩基の位置における化学置換が含まれる。ＳＥＬＥＸ法で同定された修飾ヌクレオチドを含むアプタマーは、U.S. Patent No. 5,660,985, タイトル“High Affinity Nucleic Acid Ligands Containing Modified Nucleotides,”に記載されており、それにはピリミジンの５’−および２’−位を化学修飾したヌクレオチド誘導体を含むオリゴヌクレオチドが記載されている。U.S. Patent No. 5,580,737（前掲を参照）には、２’−アミノ（２’−ＮＨ２）、２’−フルオロ（２’−Ｆ）、および／または２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）で修飾した１以上のヌクレオチドを含む高特異性アプタマーが記載されている。U.S. Patent Application Publication No. 2009/0098549, タイトル“SELEX and PHOTOSELEX”も参照されたい；それには、拡張された物理的および化学的特性をもつ核酸ライブラリー、ならびにＳＥＬＥＸおよび光ＳＥＬＥＸ(photoSELEX)におけるそれらの使用が記載されている。
【００５９】
[0064]  ヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレオチドは、Ｃ−５位において図９に示すものから選択される基で修飾した少なくとも１つのピリミジンを含む。多様な態様において、前記に示したように、修飾には独立して下記のものから選択される置換基によるデオキシウリジンのＣ−５位における置換が含まれる：ベンジルカルボキシアミド（Ｂｎ）、ナフチルメチルカルボキシアミド（Ｎａｐ）、トリプタミノカルボキシアミド（Ｔｒｐ）、チロシルカルボキシアミド（Ｔｙｒ）、（２−ナフチルメチル）カルボキシアミド（２Ｎａｐ）、およびフェネチル−１−カルボキシアミド（ＰＥ）。
【００６０】
[0065]  ＳＥＬＥＸを用いて、望ましいオフレート特性をもつアプタマーを同定することもできる。U.S. Patent Publication No. 2009/0004667, タイトル“Method for Generating Aptamers with Improved Off-Rates”を参照；それには、標的分子に結合しうるアプタマーを作製するための改良ＳＥＬＥＸ法が記載されている。それらの各標的分子からの解離速度が遅いアプタマーおよび光アプタマー(photoaptamer)を作製する方法が記載されている。それらの方法は、候補混合物を標的分子と接触させ、核酸−標的複合体の形成を行わせ、そしてスローオフレート富化プロセスを実施することを伴う；その際、速い解離速度をもつ核酸−標的複合体は解離して再形成せず、一方、遅い解離速度をもつ複合体は無傷のままである。さらにそれらの方法は、改善されたオフレート特性を備えたアプタマーを作製するために、修飾したヌクレオチドを候補混合物の調製に際して用いることを含む(U.S. Patent Publication No. 2009/0098549, タイトル“SELEX and PhotoSELEX”を参照)。
【００６１】
[0066]  “標的”または“標的分子”または“標的”は、本明細書中で、それに対して核酸が望ましい様式で作用しうるいずれかの化合物を表わす。標的分子は、タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物、脂質、多糖類、糖タンパク質、ホルモン、受容体、抗原、抗体、ウィルス、病原体、毒物、基質、代謝産物、遷移状態の類似体、補因子、阻害物質、薬物、色素、栄養素、成長因子、細胞、組織、以上のうちいずれかの、いずれかの部分またはフラグメントなどであってもよいが、これらに限定されない。実質的にいかなる化学的または生物学的エフェクターも適切な標的となることができる。いかなるサイズの分子も標的として使用できる。標的は、標的と核酸の相互作用の可能性または強さを増大させるために、特定の方法で修飾することもできる。標的は、特定の化合物または分子の何らかのわずかな変異を含むこともできる；たとえばタンパク質の場合には、たとえばアミノ酸配列のわずかな変異、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または他の操作もしくは修飾、たとえば標識成分とのコンジュゲーション；これらは分子の素性を実質的に変化させることのないものである。“標的分子”または“標的”は、アプタマーに結合しうる１つのタイプまたは種の分子または多分子構造体のコピーのセットである。“標的分子類”または“標的類”は、１より多いそのような分子のセットを表わす。標的がペプチドであるＳＥＬＥＸ法の態様が、U.S. Patent No. 6,376,190, タイトル“Modified SELEX Processes Without Purified Protein”に記載されている。本発明の場合、標的はクロストリジウム・ディフィシレのトキシンＡ、トキシンＢ、バイナリートキシン、バイナリートキシンＡ鎖、およびバイナリートキシンＢ鎖を含む。
【００６２】
クロストリジウム・ディフィシレのトキシンに対するアプタマーを同定または作製する方法
[0067]  本発明は、クロストリジウム・ディフィシレにより産生されるトキシンに結合するスローオフレートアプタマーを同定または作製する方法であって、そのトキシンがトキシンＡ、トキシンＢ、バイナリートキシンＡ鎖、およびバイナリートキシンＢ鎖から選択される、下記を含む方法を提供する：（ａ）核酸の候補混合物を調製する；その際、候補混合物は、候補混合物の少なくとも１つまたはそれぞれの核酸中の１個、数個または全部のピリミジンがＣ−５位における化学修飾を含む修飾した核酸を含む；（ｂ）候補混合物をクロストリジウム・ディフィシレにより産生されるトキシンである標的と接触させ、候補混合物にスローオフレート富化プロセスを施す；その際、候補混合物中の他の核酸と対比して標的からの解離速度が遅い核酸が標的を結合して、核酸−標的分子複合体を形成する；（ｃ）スローオフレート核酸を候補混合物から分配する；そして（ｄ）スローオフレート核酸を増幅して、標的分子にスローオフレートで結合することができる核酸配列に富む核酸混合物を得る；これにより、標的分子に対するスローオフレートアプタマーを同定することができる。クロストリジウム・ディフィシレのトキシンに対するスローオフレートアプタマーを同定または作製する方法は、Ｃ−５位における化学修飾が独立して図９に示す少なくとも１つの修飾から選択される少なくとも１つのピリミジンを含むことができる。クロストリジウム・ディフィシレのトキシンに対するスローオフレートアプタマーを同定または作製する方法は、Ｃ−５位における化学修飾が独立してベンジルカルボキシアミド、ナフチルメチルカルボキシアミド、トリプタミノカルボキシアミド、チロシルカルボキシアミド、２−ナフチルメチルカルボキシアミドおよびフェネチル−１−カルボキシアミドから選択される少なくとも１つのピリミジンを含むことができる。クロストリジウム・ディフィシレのトキシンに対するスローオフレートアプタマーを同定または作製する方法は、少なくとも１つの追加の化学修飾を含むことができ、その少なくとも１つの追加の化学修飾は、独立してリボース位置、デオキシリボース位置、ホスフェート位置、および塩基位置からなる群から選択される１以上の位置における化学置換である。さらに、クロストリジウム・ディフィシレのトキシンに対するスローオフレートアプタマーを同定または作製する方法は、少なくとも１つの追加の化学修飾を含むことができ、その少なくとも１つの追加の化学修飾は、独立して、２’−位の糖修飾、２’−アミノ（２’−ＮＨ２）、２’−フルオロ（２’−Ｆ）、２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）、シトシン環外アミンにおける修飾、５−ブロモウラシルの置換、５−ブロモデオキシウリジンの置換、５−ブロモデオキシシチジンの置換、主鎖修飾、メチル化、３’キャップ、および５’キャップからなる群から選択される。クロストリジウム・ディフィシレのトキシンに対するスローオフレートアプタマーを同定または作製する方法は、競合分子を含む候補混合物のインキュベーション、候補混合物の希釈、または競合分子の存在下での候補混合物の希釈から選択されるスローオフレート富化プロセスを含むことができる。
【００６３】
[0068]  本発明はさらに、クロストリジウム・ディフィシレにより産生されるトキシンからの解離速度が遅いアプタマーを作製する方法であって、そのトキシンがトキシンＡ、トキシンＢ、バイナリートキシンＡ鎖、およびバイナリートキシンＢ鎖から選択され、下記の段階を含む方法により同定された核酸配列に基づいてアプタマーを調製または合成する段階を含む方法を提供する：（ａ）核酸の候補混合物を調製する；その際、候補混合物は、候補混合物の少なくとも１つまたはそれぞれの核酸中の１個、数個または全部のピリミジンがＣ−５位における化学修飾を含む修飾した核酸を含む；（ｂ）候補混合物をクロストリジウム・ディフィシレにより産生されるトキシンである標的と接触させ、候補混合物にスローオフレート富化プロセスを施す；その際、候補混合物中の他の核酸と対比して標的分子からの解離速度が遅い核酸が標的を結合して、核酸−標的分子複合体を形成する；（ｃ）スローオフレート核酸を候補混合物から分配する；そして（ｄ）スローオフレート核酸を増幅して、標的分子にスローオフレートで結合することができる核酸配列に富む核酸混合物を得る；これにより、標的分子に対するスローオフレートアプタマーが同定される。クロストリジウム・ディフィシレのトキシンからの解離速度が遅いアプタマーを作製するそのような方法は、Ｃ−５位における化学修飾が独立して図９に示す少なくとも１つの修飾から選択される少なくとも１つのピリミジンを含むことができる。クロストリジウム・ディフィシレのトキシンからの解離速度が遅いアプタマーを作製する方法は、Ｃ−５位における化学修飾が独立してベンジルカルボキシアミド、ナフチルメチルカルボキシアミド、トリプタミノカルボキシアミド、チロシルカルボキシアミド、２−ナフチルメチルカルボキシアミドおよびフェネチル−１−カルボキシアミドから選択される少なくとも１つのピリミジンを含むことができる。クロストリジウム・ディフィシレのトキシンからの解離速度が遅いアプタマーを作製する方法は、少なくとも１つの追加の化学修飾を含むことができ、その少なくとも１つの追加の化学修飾は、独立してリボース位置、デオキシリボース位置、ホスフェート位置、および塩基位置からなる群から選択される１以上の位置における化学置換である。さらに、クロストリジウム・ディフィシレのトキシンからの解離速度が遅いアプタマーを作製する方法は、少なくとも１つの追加の化学修飾を含むことができ、その少なくとも１つの追加の化学修飾は、独立して、２’−位の糖修飾、２’−アミノ（２’−ＮＨ２）、２’−フルオロ（２’−Ｆ）、２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）、シトシン環外アミンにおける修飾、５−ブロモウラシルの置換、５−ブロモデオキシウリジンの置換、５−ブロモデオキシシチジンの置換、主鎖修飾、メチル化、３’キャップ、および５’キャップからなる群から選択される。クロストリジウム・ディフィシレのトキシンからの解離速度が遅いアプタマーを作製する方法は、競合分子を含む候補混合物のインキュベーション、候補混合物の希釈、または競合分子の存在下での候補混合物の希釈から選択されるスローオフレート富化プロセスを含むことができる。
【００６４】
[0069]  本発明はさらに、クロストリジウム・ディフィシレにより産生されるトキシンに結合するヌクレアーゼ耐性アプタマーを作製する方法であって、そのトキシンがトキシンＡ、トキシンＢ、バイナリートキシンＡ鎖、およびバイナリートキシンＢ鎖から選択され、下記の段階を含む方法により同定された核酸配列に基づいてヌクレアーゼ耐性アプタマーを調製または合成する段階を含む方法を提供する：（ａ）修飾した核酸の候補混合物を調製する；その際、候補混合物は、候補混合物の少なくとも１つまたはそれぞれの核酸中の少なくとも１つのピリミジンがＣ−５位における化学修飾を含む修飾した核酸を含む；（ｂ）候補混合物をクロストリジウム・ディフィシレにより産生されるトキシンである標的と接触させる；その際、候補混合物中の他の核酸と対比して標的分子に対する親和性が高い核酸が標的を結合して、核酸−標的分子複合体を形成する；（ｃ）親和性が高い核酸を候補混合物の残りのものから分配する；そして（ｄ）親和性が高い核酸を増幅して、標的分子に高い親和性で結合することができるヌクレアーゼ耐性である核酸配列に富む核酸混合物を得る；これにより、標的分子に対するヌクレアーゼ耐性アプタマーが同定される。クロストリジウム・ディフィシレのトキシンに対するヌクレアーゼ耐性アプタマーを作製する方法は、Ｃ−５位における化学修飾が独立して図９に示す少なくとも１つの修飾から選択される少なくとも１つのピリミジンを含むことができる。クロストリジウム・ディフィシレのトキシンに対するヌクレアーゼ耐性アプタマーを作製する方法は、Ｃ−５位における化学修飾が独立してベンジルカルボキシアミド、ナフチルメチルカルボキシアミド、トリプタミノカルボキシアミド、チロシルカルボキシアミド、２−ナフチルメチルカルボキシアミドおよびフェネチル−１−カルボキシアミドから選択される少なくとも１つのピリミジンを含むことができる。クロストリジウム・ディフィシレのトキシンに対するヌクレアーゼ耐性アプタマーを作製する方法は、少なくとも１つの追加の化学修飾を含むことができ、その少なくとも１つの追加の化学修飾は、独立してリボース位置、デオキシリボース位置、ホスフェート位置、および塩基位置からなる群から選択される１以上の位置における化学置換である。さらに、クロストリジウム・ディフィシレのトキシンに対するヌクレアーゼ耐性アプタマーを作製する方法は、少なくとも１つの追加の化学修飾を含むことができ、その少なくとも１つの追加の化学修飾は、独立して、２’−位の糖修飾、２’−アミノ（２’−ＮＨ２）、２’−フルオロ（２’−Ｆ）、２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）、シトシン環外アミンにおける修飾、５−ブロモウラシルの置換、５−ブロモデオキシウリジンの置換、５−ブロモデオキシシチジンの置換、主鎖修飾、メチル化、３’キャップ、および５’キャップからなる群から選択される。
【００６５】
アプタマー
[0070]  クロストリジウム・ディフィシレのトキシンに対する本発明のアプタマーは、スローオフレートをもつアプタマーを同定するための前記の改良ＳＥＬＥＸ法を用いて同定された。このセレクション方法に用いたクロストリジウム・ディフィシレのトキシンの形態は、実施例１に記載するように、クロストリジウム・ディフィシレのゲノムＤＮＡに由来する希望する遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅により作製された組換えトキシンであった。
【００６６】
[0071]  クローニングしたクロストリジウム・ディフィシレのトキシン遺伝子フラグメントの過剰発現から得られた精製Ｈｉｓタグ付きタンパク質を用いて、ＳＥＬＥＸを実施した。ｄＵの代わりに下記の６種類の修飾ヌクレオチドのうちの１つを含む４０ｍｅｒランダム配列のライブラリーを用いた：５−チロシルカルボキシアミド−ｄＵ（ＴｙｒｄＵ）、５−ベンジルカルボキシアミド−ｄＵ（ＢｎｄＵ）、５−ナフチルメチルカルボキシアミド−ｄＵ（ＮａｐｄＵ）、５−トリプタミノカルボキシアミド−ｄＵ（ＴｒｐｄＵ）、５−（２−ナフチルメチル）カルボキシアミド（２ＮａｐｄＵ）、または５−フェネチル−１−カルボキシアミド（ＰＥｄＵ）。７または８ラウンドのセレクションを実施し、そしてデキストラン硫酸による動的攻撃をラウンド２〜８で適用した。最終ラウンドのＳＥＬＥＸの後に得られたアプタマープールを、それらの標的に対する親和性についてフィルター結合アッセイで試験し、Ｋｄおよびプラトーを決定した（表２）。十分な親和性（約１０ｎＭ以下のＫｄ）をもつすべてのプールをクローニングし、プール当たり少なくとも４８クローンの配列を決定した。
【００６７】
トキシンＡに対するアプタマー
[0072]  トキシンＡについて、アプタマープール４９４３（ＴｒｐｄＵ）は卓越した親和性をもち、Ｋｄ＝２．４２ｎＭを備えていた。プール４９３６（ＴｙｒｄＵ）および４９３９（ＮａｐｄＵ）は活性であり、それぞれ１１．５および１０．８ｎＭのＫｄを備えていた。プール５５６４（２ＮａｐｄＵ）および５５７７（２ＮａｐｄＵ）は良好な親和性をもち、４．６３および６．４０ｎＭのＫｄを備えていた。トキシンＡについて、アプタマープール５５７０（ＰＥｄＵ）が最良であり、Ｋｄ＝１．６１ｎＭを備えていた。トキシンＡに対する良好な親和性を備えたアプタマークローンを、ＴｒｐｄＵ、ＴｙｒｄＵ、ＮａｐｄＵ、２ＮａｐｄＵ、およびＰＥｄＵ修飾ヌクレオチドを含むすべてのプールから単離した（表３）；クロストリジウム・ディフィシレのトキシンＡアプタマーの配列を表４に挙げる。トキシンＡに対する良好な結合親和性を備えたアプタマークローンを同定するほかに、そのようなアプタマークローン間のコンセンサス配列を同定した。
【００６８】
[0073]  プール５５７０（ＰＥｄＵ）からの主要なアプタマークローンは５５７０−５４であり、組換えトキシンＡに対してＫｄ＝０．１２ｎＭ、天然トキシンＡに対してＫｄ＝６．９１ｎＭを備えていた。
【００６９】
[0074]  若干のアプタマークローンは、組換えトキシンＡと天然トキシンＡの両方に対して卓越した親和性を示した；たとえば、アプタマークローン４９４３−５１（ＴｒｐｄＵ）は、組換えトキシンＡに対してＫｄ＝１．２３ｎＭ、天然トキシンＡに対してＫｄ＝１．７８ｎＭを備えていた；アプタマークローン５５６４−４９（２ＮａｐｄＵ）は、組換えトキシンＡに対してＫｄ＝１．１３ｎＭ、天然トキシンＡに対してＫｄ＝１．７８ｎＭを備えていた。
【００７０】
[0075]  若干のアプタマークローンは、組換えトキシンＡと天然トキシンＡの間で比較的小さな親和性降下を示した；たとえば、アプタマークローン５５７７−１（２ＮａｐｄＵ）は、組換えトキシンＡに対してＫｄ＝１．５９ｎＭ、天然トキシンＡに対してＫｄ＝４．９７ｎＭを備えていた；アプタマークローン５５７７−３（２ＮａｐｄＵ）は、組換えトキシンＡに対してＫｄ＝１．７３ｎＭ、天然トキシンＡに対してＫｄ＝５．５２ｎＭを備えていた；アプタマークローン４９４３−６０（ＴｒｐｄＵ）は、組換えトキシンＡに対してＫｄ＝２．６５ｎＭ、天然トキシンＡに対してＫｄ＝４．５７ｎＭを備えていた。
【００７１】
[0076]  トキシンＡに対する良好な結合親和性を備えたアプタマークローンを同定するほかに、そのようなアプタマークローン間のコンセンサス配列を同定した。
【００７２】
トキシンＢに対するアプタマー
[0077]  トキシンＢに対するアプタマーの親和性は全般的にきわめて良好であり、ＳＥＬＥＸに用いた６８．８ｋＤａのクロストリジウム・ディフィシレのトキシンＢフラグメントのアミノ末端触媒ドメインと２７０ｋＤａの天然全長トキシンＢの間で良好な相関性があった。トキシンＢに対してナノモル濃度以下のＫｄを備えたアプタマークローンを、ＴｙｒｄＵ、ＢｎｄＵ、ＮａｐｄＵ、ＴｒｐｄＵ、２ＮａｐｄＵおよびＰＥｄＵ修飾ヌクレオチドを含むすべてのプールから単離した（表５）；クロストリジウム・ディフィシレのトキシンＢアプタマーの配列を表６に挙げ、最良クローンを太字で示す。
【００７３】
[0078]  最高親和性のアプタマーは、ＮａｐｄＵまたはＴｒｐｄＵ修飾ヌクレオチドを含むクローンであった。５つのアプタマーがきわめて低いＫｄ＜０．１ｎＭを示した：アプタマークローン４９４０−１（ＮａｐｄＵ）は、組換えトキシンＢに対してＫｄ＝０．０４ｎＭ、天然トキシンＢに対してＫｄ＝０．０６を備えていた；アプタマークローン４９４０−２３（ＮａｐｄＵ）は、組換えトキシンＢに対してＫｄ＝０．０７ｎＭ、天然トキシンＢに対してＫｄ＝０．０９ｎＭを備えていた；アプタマークローン４９４０−２７（ＮａｐｄＵ）は、組換えトキシンＢに対してＫｄ＝０．１０ｎＭ、天然トキシンＢに対してＫｄ＝０．０９ｎＭを備えていたＢ；アプタマークローン４９４４−５（ＴｒｐｄＵ）は、組換えトキシンＢに対してＫｄ＝０．０８ｎＭ、天然トキシンＢに対してＫｄ＝０．０９ｎＭを備えていた；およびアプタマークローン４９４４−３０（ＴｒｐｄＵ）は、組換えトキシンＢに対してＫｄ＝０．０６ｎＭ、天然トキシンＢに対してＫｄ＝０．０８ｎＭを備えていた。トキシンＢに対する良好な親和性を備えたアプタマークローンを、ＴｒｐｄＵ、ＴｙｒｄＵ、ＮａｐｄＵ、２ＮａｐｄＵおよびＰＥｄＵ修飾ヌクレオチドを含むすべてのプールから単離した（表５）；クロストリジウム・ディフィシレのトキシンＢアプタマーの配列を表６に挙げる。トキシンＢに対する良好な結合親和性を備えたアプタマークローンを同定するほかに、そのようなアプタマークローン間のコンセンサス配列を同定した。
【００７４】
バイナリートキシン（Ａ鎖）に対するアプタマー
[0079]  組換えバイナリートキシンＡ鎖（ＣｄｔＡ）を用いるＳＥＬＥＸにより、ＴｒｐｄＵ、２ＮａｐｄＵおよびＰＥｄＵ修飾ヌクレオチドを含む活性アプタマーが得られた（表７）。ＣｄｔＡアプタマーの配列および共通配列パターンを表８に示す。プール４７５８（ＴｒｐｄＵ）のクローニングにより、そのプールの１８％を構成する、ＣｄｔＡバイナリートキシンに対して良好な親和性（Ｋｄ＝０．８６ｎＭ）を示すクローン４７５８−６が明らかになった。２ＮａｐｄＵプールから２０の配列が得られ、それらの大部分はナノモル濃度以下の親和性を備え、これらの２ＮａｐｄＵクローン間に共有される幾つかの配列パターンが同定された。ＰＥｄＵプールは５つの活性アプタマーを含んでいた。
【００７５】
バイナリートキシン（Ｂ鎖）に対するアプタマー
[0080]  組換えバイナリートキシンＢ鎖（ＣｄｔＢ）を用いるＳＥＬＥＸにより、２ＮａｐｄＵ修飾ヌクレオチドを含む活性アプタマーが得られた（表９）。ＣｄｔＢアプタマーの配列および共通配列パターンを表１０に示す。最も活性であるクローンは５５５６−５１、Ｋｄ＝１．６８ｎＭであった。
【００７６】
[0081]  本発明は、ＳＥＬＥＸ法により同定した、クロストリジウム・ディフィシレにより産生されるトキシンに対するアプタマーを提供し、表４、６、８および１０に挙げる。クロストリジウム・ディフィシレにより産生されるトキシンに対するアプタマーであって、列記したいずれかのアプタマーと実質的に相同であり、かつクロストリジウム・ディフィシレにより産生される各トキシンの結合について表４、６、８および１０に示すアプタマーのグループから選択されるアプタマーのものと実質的に類似の能力をもつものも、本発明に包含される。さらに、クロストリジウム・ディフィシレにより産生される各トキシンに対するアプタマーであって、本発明において同定したアプタマーと実質的に同じ構造形態をもち、かつクロストリジウム・ディフィシレにより産生される各トキシンの結合について表４、６、８および１０に示すアプタマーのグループから選択されるアプタマーのものと実質的に類似の能力をもつものも、本発明に包含される。
【００７７】
[0082]  １観点において、本発明は、クロストリジウム・ディフィシレにより産生されるトキシンに特異的に結合する一次核酸配列を含むアプタマーを提供する。１態様において、一次核酸配列は表４、６、８および１０に開示する配列から選択される。他の態様において、一次核酸配列は表４、６、８および１０に開示する一次配列と少なくとも約７５％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一であるように選択される。
【００７８】
[0083]  用語“配列同一性”、“配列同一性パーセント”、“同一性パーセント”、“同一％”、“同一性％”、およびその変形は、２以上の核酸配列に関して用いる場合、最大一致が得られるように比較およびアラインさせた際に、配列比較アルゴリズムを用いてまたは目視検査により判定して同一であるかあるいは特定したパーセントの同一ヌクレオチドを含む２以上の配列を表わすために、互換性をもって用いられる。配列比較のために、一般に１配列を基準配列として用い、これと被験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを用いる場合、被験配列および基準配列をコンピューターに入力し、必要ならばサブ配列座標を指定し、そして配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。次いで配列アルゴリズムにより、被験配列（単数または複数）についての基準配列に対する配列同一性パーセントを、指定したプログラムパラメーターに基づいて計算する。比較のための最適な配列アラインメントは、たとえば下記により実施できる：Smith and Waterman, Adv. Appl. Math., 1981. 2:482の局所相同アルゴリズム(local homology algorithm)、Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol., 1970. 48:443の相同アラインメントアルゴリズム(homology alignment algorithm)、Pearson and Lipman, Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA, 1988. 85:2444の類似検索法(search for similarity method)、これらのアルゴリズムのコンピューター処理実行（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ；Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.)、または目視検査(全般的に、Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, pub. by Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1987)を参照)。
【００７９】
[0084]  配列同一性パーセントを決定するのに適したアルゴリズムの一例は、basic local alignment search tool (以下、“ＢＬＡＳＴ”)である；たとえば、Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990. 215:403-410、およびAltschul et al., Nucleic Acids Res., 1997. 15: 3389-3402を参照。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、National Center for Biotechnology Information (以下、“ＮＣＢＩ”)により公開されている。ＮＣＢＩから入手できるソフトウェア、たとえばＢＬＡＳＴＮ（ヌクレオチド配列用）を用いて配列同一性を決定する際に用いるデフォルトパラメーターは、McGinnis et al., Nucleic Acids Res., 2004. 32:W20-W25に記載されている。
【００８０】
[0085]  本明細書中で用いるように、核酸、たとえばクロストリジウム・ディフィシレにより産生されるトキシンに対するアプタマーの同一性パーセントを記載する場合、その配列が基準ヌクレオチド配列に対して少なくともたとえば約９５％同一であることは、核酸配列が基準核酸配列の各１００個のヌクレオチドにつき最大５つの点変異を含むことができる以外はその核酸配列は基準配列に対して同一であることを意図する。言い換えると、希望する核酸配列を得るために、その配列は基準核酸配列に対して少なくとも約９５％同一であり、基準配列中のヌクレオチドのうち５％までは欠失するかまたは他のヌクレオチドで置換されていてもよく、あるいは基準配列中のヌクレオチドの総数の５％までのある個数のヌクレオチドを基準配列に挿入してもよい（以下、本明細書中で挿入と呼ぶ）。希望する配列を作製するための基準配列のこれらの変異は、基準ヌクレオチド配列の５’または３’末端位置において、あるいはこれらの末端位置の間のいずれかの位置において、基準配列中のヌクレオチド間に個々に分散して、または基準配列内に１以上の連続したグループで行なわれてもよい。基準（クエリー）配列は、表４、６、８もしくは１０に示す全ヌクレオチド配列のいずれか１つ、またはこれらのいずれかの配列のいずれかのフラグメントであってもよい。
【００８１】
[0086]  １観点において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、１１、１５、２３、２８、３２、４７、６６、７５、８３、９０、９５、９８、１１０、１２４、１２５、１３４、１３９、１４５、１５１、１５２または１５７からなる群から選択されるコンセンサス配列を修飾して、少なくとも、１つの挿入、１つの欠失および／または１つの転位を含むようにすることができる。１態様において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、１１、１５、２３、２８、３２、４７、６６、７５、８３、９０、９５、９８、１１０、１２４、１２５、１３４、１３９、１４５、１５１、１５２または１５７からなる群から選択されるコンセンサス配列を、少なくとも１つのヌクレオチドがコンセンサス配列に挿入されるように修飾することができる。他の態様において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、１１、１５、２３、２８、３２、４７、６６、７５、８３、９０、９５、９８、１１０、１２４、１２５、１３４、１３９、１４５、１５１、１５２または１５７からなる群から選択されるコンセンサス配列を、少なくとも１つのヌクレオチドがコンセンサス配列から欠失するように修飾することができる。他の態様において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、１１、１５、２３、２８、３２、４７、６６、７５、８３、９０、９５、９８、１１０、１２４、１２５、１３４、１３９、１４５、１５１、１５２または１５７からなる群から選択されるコンセンサス配列を、少なくとも１つのヌクレオチドがコンセンサス配列中の１つの位置からコンセンサス配列中の他の位置へ転位するように修飾することができる。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、１１、１５、２３、２８、３２、４７、６６、７５、８３、９０、９５、９８、１１０、１２４、１２５、１３４、１３９、１４５、１５１、１５２または１５７からなる群から選択されるコンセンサス配列を修飾して、１以上の挿入、欠失または転位を含み、一方でなおかつクロストリジウム・ディフィシレにより産生されるトキシンに対する親和性を維持して診断アッセイにおける有用性をもつことができることも認識される。
【００８２】
[0087]  多様な態様において、クロストリジウム・ディフィシレにより産生されるトキシンに対するアプタマーは、表４、６、８もしくは１０に示すヌクレオチド配列のいずれかに含まれる連続ヌクレオチドの配列と同一である連続ヌクレオチドの配列を含む。多様な態様において、クロストリジウム・ディフィシレにより産生されるトキシンに対するアプタマー中の連続ヌクレオチドの配列は、表４、６、８もしくは１０に示すいずれかの配列に含まれる連続ヌクレオチドの配列中の同数のヌクレオチドと同一であるいずれかの個数のヌクレオチドを含むことができる。多様な態様において、クロストリジウム・ディフィシレにより産生されるトキシンに対するアプタマー中の連続ヌクレオチドの配列は、表４、６、８もしくは１０に示すいずれかの配列に含まれる約４から約３０個までの連続ヌクレオチドの配列と同一である約４から約３０個までの連続ヌクレオチドの配列を含む。代表的態様において、クロストリジウム・ディフィシレにより産生されるトキシンに対するアプタマーは、表４、６、８もしくは１０に示す配列のいずれかであって４０個以上の連続ヌクレオチドをもつものに含まれる４０個の連続ヌクレオチドの配列と同一である４０個の連続ヌクレオチドの配列を含む。代表的態様において、クロストリジウム・ディフィシレにより産生されるトキシンに対するアプタマーは、表４、６、８もしくは１０に示す配列のいずれかに含まれる３０個の連続ヌクレオチドの配列と同一である３０個の連続ヌクレオチドの配列を含む。他の代表的態様において、クロストリジウム・ディフィシレにより産生されるトキシンに対するアプタマーは、表４、６、８もしくは１０に示す配列のいずれかに含まれる２０個の連続ヌクレオチドの配列と同一である２０個の連続ヌクレオチドの配列を含む。さらに他の代表的態様において、クロストリジウム・ディフィシレにより産生されるトキシンに対するアプタマーは、表４、６、８もしくは１０に示す配列のいずれかに含まれる８個の連続ヌクレオチドの配列と同一である８個の連続ヌクレオチドの配列を含む。さらに他の代表的態様において、クロストリジウム・ディフィシレにより産生されるトキシンに対するアプタマーは、表４、６、８もしくは１０に示す配列のいずれかに含まれる４個の連続ヌクレオチドの配列と同一である４個の連続ヌクレオチドの配列を含む。
【００８３】
[0088]  １態様において、トキシンＡに対するアプタマーは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜４、６〜１０、１２〜１４、１６〜２２、２４〜２７または２９〜３１からなる群から選択される。さらに他の態様において、トキシンＡに対するアプタマーは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、１１、１５、２３または２８のいずれか１つから選択されるコンセンサス配列に由来する。１態様において、トキシンＡに対するアプタマーは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜３１のいずれかに対して少なくとも約９５％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約７５％同一である。他の態様において、トキシンＡに対するアプタマーは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜３１のいずれかまたはこれらのいずれかのフラグメントからの配列を含む。
【００８４】
[0089]  １態様において、トキシンＢに対するアプタマーは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３〜４６、４８〜６５、６７〜７４、７６〜８２、８４〜８９、９１〜９４、９６〜９７または９９〜１０８からなる群から選択される。さらに他の態様において、トキシンＢに対するアプタマーは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２、４７、６６、７５、８３、９０、９５および９８のいずれか１つから選択されるコンセンサス配列に由来する。１態様において、トキシンＢに対するアプタマーは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２〜１０８のいずれかに対して少なくとも約９５％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約７５％同一である。他の態様において、トキシンＢに対するアプタマーは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２〜１０８のいずれかまたはこれらのいずれかのフラグメントからの配列を含む。
【００８５】
[0090]  １態様において、バイナリートキシンＡ鎖に対するアプタマーは、１０９、１１１〜１２３、１２６〜１３３、１３５〜１３８、１４０〜１４４または１４６〜１５０からなる群から選択される。さらに他の態様において、バイナリートキシンＡ鎖に対するアプタマーは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１０、１２４〜１２５、１３４、１３９または１４５のいずれか１つから選択されるコンセンサス配列に由来する。１態様において、バイナリートキシンＡ鎖に対するアプタマーは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０９〜１５０のいずれかに対して少なくとも約９５％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約７５％同一である。他の態様において、バイナリートキシンＡ鎖に対するアプタマーは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０９〜１５０のいずれかまたはこれらのいずれかのフラグメントからの配列を含む。
【００８６】
[0091]  １態様において、バイナリートキシンＢ鎖に対するアプタマーは、１５３〜１５６、１５８〜１６２からなる群から選択される。さらに他の態様において、バイナリートキシンＢ鎖に対するアプタマーは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５１、１５２または１５７のいずれか１つから選択されるコンセンサス配列に由来する。１態様において、バイナリートキシンＢ鎖に対するアプタマーは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５１〜１６２のいずれかに対して少なくとも約９５％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約７５％同一である。他の態様において、バイナリートキシンＢ鎖に対するアプタマーは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５１〜１６２のいずれかまたはこれらのいずれかのフラグメントからの配列を含む。
【００８７】
[0092]  クロストリジウム・ディフィシレにより産生されるトキシンに対するアプタマーは、クロストリジウム・ディフィシレのトキシンを結合する領域のほかに、いずれかの個数のヌクレオチドを含むことができる。多様な態様において、アプタマーは最大で約１００個のヌクレオチド、最大で約９５個のヌクレオチド、最大で約９０個のヌクレオチド、最大で約８５個のヌクレオチド、最大で約８０個のヌクレオチド、最大で約７５個のヌクレオチド、最大で約７０個のヌクレオチド、最大で約６５個のヌクレオチド、最大で約６０個のヌクレオチド、最大で約５５個のヌクレオチド、最大で約５０個のヌクレオチド、最大で約４５個のヌクレオチド、最大で約４０個のヌクレオチド、最大で約３５個のヌクレオチド、最大で約３０個のヌクレオチド、最大で約２５個のヌクレオチド、最大で約５個のヌクレオチド、最大で約２０個のヌクレオチドを含むことができる。
【００８８】
[0093]  クロストリジウム・ディフィシレにより産生されるトキシンに対するアプタマーは、各トキシンに対していずれか適切な解離定数（Ｋｄ）をもつように選択できる。代表的態様において、クロストリジウム・ディフィシレにより産生されるトキシンに対するアプタマーは、各トキシンに対して約１０ｎＭ以下の解離定数（Ｋｄ）をもつ。他の代表的態様において、クロストリジウム・ディフィシレにより産生されるトキシンに対するアプタマーは、各トキシンに対して約１５ｎＭ以下の解離定数（Ｋｄ）をもつ。さらに他の代表的態様において、クロストリジウム・ディフィシレにより産生されるトキシンに対するアプタマーは、各トキシンに対して約２０ｎＭ以下の解離定数（Ｋｄ）をもつ。さらに他の代表的態様において、クロストリジウム・ディフィシレにより産生されるトキシンに対するアプタマーは、各トキシンに対して約２５ｎＭ以下の解離定数（Ｋｄ）をもつ。適切な解離定数は、多点タイトレーションを用い、方程式ｙ＝（最大値−最小値）（タンパク質）／（Ｋｄ＋タンパク質）＋最小値  を当てはめる結合アッセイで決定できる。解離定数の決定はそれらを測定する条件に著しく依存し、したがってこれらの数値は平衡化時間などの要因に関連して有意に変動することを理解すべきである。他の態様において、クロストリジウム・ディフィシレにより産生されるトキシンに対するアプタマーは、表４、６、８および１０に開示する配列から選択されるアプタマーのＫｄ以下のＫｄを備えたアプタマーである。
【００８９】
[0094]  バイナリートキシンはＡ鎖およびＢ鎖から構成されるので、二量体または他の多量体の形態のアプタマーを用いることによって、より効率的な結合を達成できる。したがって、他の態様において、アプタマーは表８の配列および表１０の配列のいずれかの組合わせが多量体化したものである。バイナリートキシンに対する適切な結合特性を備えたいずれかのアプタマー配列に、同じ方策を適用できる。他の態様において、サンドイッチアッセイにおいてＡ鎖に対するアプタマーをＢ鎖に対するアプタマーと組み合わせて用いて、バイナリートキシンを検出することができる。
【００９０】
クロストリジウム・ディフィシレにより産生されるトキシンに対するアプタマーを含むキット
[0095]  本発明は、クロストリジウム・ディフィシレにより産生されるトキシンに対するいずれかのアプタマーを含むキットを提供する。そのようなキットは、たとえば（１）クロストリジウム・ディフィシレにより産生されるトキシンに対する少なくとも１種類のアプタマー；および（２）少なくとも１種類の診断検査試薬、たとえば溶媒または溶液を含むことができる。追加のキット構成要素は、場合によりたとえば（１）キット構成要素を収容および/または混合するための、少なくとも１つの容器、バイアルまたはこれらに類する器具；ならびに（２）クロストリジウム・ディフィシレのトキシンの存在につき検査すべき試料を採集するための器具を含むことができる。
【００９１】
クロストリジウム・ディフィシレにより産生されるトキシンを検出する方法
[0096]  本発明は、被験試料中のクロストリジウム・ディフィシレのトキシンの存在を検出する方法であって、被験試料をクロストリジウム・ディフィシレにより産生されるトキシンに結合するアプタマーと接触させることを含む方法を提供し、そのトキシンはトキシンＡ、トキシンＢ、バイナリートキシンＡ鎖、およびバイナリートキシンＢ鎖から選択される。さらに、クロストリジウム・ディフィシレのトキシンの存在を検出する方法であって、Ｃ−５位において化学修飾した少なくとも１つのピリミジンを含むアプタマーを含む方法を開示し、その際、Ｃ−５位において修飾した少なくとも１つのピリミジンは、独立して図９に示す少なくとも１つの修飾から選択されるＣ−５修飾を含む。また、クロストリジウム・ディフィシレのトキシンの存在を検出する方法であって、Ｃ−５位において化学修飾した少なくとも１つのピリミジンを含むアプタマーを含む方法を開示し、その際、Ｃ−５位において修飾した少なくとも１つのピリミジンは、独立してベンジルカルボキシアミド、ナフチルメチルカルボキシアミド、トリプタミノカルボキシアミド、チロシルカルボキシアミド、２−ナフチルメチルカルボキシアミドおよびフェネチル−１−カルボキシアミドから選択される。本明細書に開示するクロストリジウム・ディフィシレのトキシン検出の方法は、少なくとも１つの追加の化学修飾を含むアプタマーを含むことができ、その少なくとも１つの追加の化学修飾は、独立してリボース位置、デオキシリボース位置、ホスフェート位置、および塩基位置からなる群から選択される１以上の位置における化学置換である。さらに、本明細書に開示するクロストリジウム・ディフィシレのトキシンの検出方法は、少なくとも１つの追加の化学修飾を含むことができ、それは独立して、２’−位の糖修飾、２’−アミノ（２’−ＮＨ２）、２’−フルオロ（２’−Ｆ）、２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）、シトシン環外アミンにおける修飾、５−ブロモウラシルの置換、５−ブロモデオキシウリジンの置換、５−ブロモデオキシシチジンの置換、主鎖修飾、メチル化、３’キャップ、および５’キャップからなる群から選択される。
【００９２】
[0097]  本発明は、被験試料中のクロストリジウム・ディフィシレのトキシンの存在を検出する方法を提供し、その際、検出方法はプルダウンアッセイ、ドットブロットアッセイ、ＰＣＲアッセイ、またはサンドイッチアッセイから選択される。
【００９３】
[0098]  本発明はさらに、被験試料中のクロストリジウム・ディフィシレのトキシンＡの存在を検出する方法であって、被験試料をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜４、６〜１０、１２〜１４、１６〜２２、２４〜２７もしくは２９〜３１またはそのフラグメントからなる群から選択される配列を含むアプタマーと接触させることを含む方法を提供する。被験試料中のクロストリジウム・ディフィシレのトキシンＡの存在を検出する方法は、プルダウンアッセイ、ドットブロットアッセイ、ＰＣＲアッセイ、またはサンドイッチアッセイを含むことができる。クロストリジウム・ディフィシレのトキシンＡの存在を検出する方法に用いるサンドイッチアッセイは、アプタマー−標的−抗体アッセイ、抗体−標的−アプタマーアッセイ、およびアプタマー−標的−アプタマーアッセイから選択できる。被験試料中のクロストリジウム・ディフィシレのトキシンＡの存在を検出する方法は、トキシンＡの定量測定を提供することができる。
【００９４】
[0099]  本発明はさらに、被験試料中のクロストリジウム・ディフィシレのトキシンＢの存在を検出する方法であって、被験試料をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３〜４６、４８〜６５、６７〜７４、７６〜８２、８４〜８９、９１〜９４、９６〜９７もしくは９９〜１０８またはそのフラグメントからなる群から選択される配列を含むアプタマーと接触させることを含む方法を提供する。被験試料中のクロストリジウム・ディフィシレのトキシンＢの存在を検出する方法は、プルダウンアッセイ、ドットブロットアッセイ、ＰＣＲアッセイ、またはサンドイッチアッセイを含むことができる。クロストリジウム・ディフィシレのトキシンＢの存在を検出する方法に用いるサンドイッチアッセイは、アプタマー−標的−抗体アッセイ、抗体−標的−アプタマーアッセイ、およびアプタマー−標的−アプタマーアッセイから選択できる。被験試料中のクロストリジウム・ディフィシレのトキシンＢの存在を検出する方法は、トキシンＢの定量測定を提供することができる。
【００９５】
[00100]  本発明はさらに、被験試料中のクロストリジウム・ディフィシレのバイナリートキシンＡ鎖の存在を検出する方法であって、被験試料をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０９、１１１〜１２３、１２６〜１３３、１３５〜１３８、１４０〜１４４もしくは１４６〜１５０またはそのフラグメントからなる群から選択される配列を含むアプタマーと接触させることを含む方法を提供する。被験試料中のクロストリジウム・ディフィシレのバイナリートキシンＡ鎖の存在を検出する方法は、プルダウンアッセイ、ドットブロットアッセイ、ＰＣＲアッセイ、またはサンドイッチアッセイを含むことができる。クロストリジウム・ディフィシレのバイナリートキシンＡ鎖の存在を検出する方法に用いるサンドイッチアッセイは、アプタマー−標的−抗体アッセイ、抗体−標的−アプタマーアッセイ、およびアプタマー−標的−アプタマーアッセイから選択できる。被験試料中のクロストリジウム・ディフィシレのバイナリートキシンＡ鎖の存在を検出する方法は、バイナリートキシンＡ鎖の定量測定を提供することができる。
【００９６】
[00101]  本発明はさらに、被験試料中のクロストリジウム・ディフィシレのバイナリートキシンＢ鎖の存在を検出する方法であって、被験試料をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５３〜１５６、１５８〜１６２またはそのフラグメントからなる群から選択される配列を含むアプタマーと接触させることを含む方法を提供する。被験試料中のクロストリジウム・ディフィシレのバイナリートキシンＢ鎖の存在を検出する方法は、プルダウンアッセイ、ドットブロットアッセイ、ＰＣＲアッセイ、またはサンドイッチアッセイを含むことができる。クロストリジウム・ディフィシレのバイナリートキシンＢ鎖の存在を検出する方法に用いるサンドイッチアッセイは、アプタマー−標的−抗体アッセイ、抗体−標的−アプタマーアッセイ、およびアプタマー−標的−アプタマーアッセイから選択できる。被験試料中のクロストリジウム・ディフィシレのバイナリートキシンＢ鎖の存在を検出する方法は、バイナリートキシンＢ鎖の定量測定を提供することができる。
【００９７】
[00102]  本発明はさらに、被験試料中のクロストリジウム・ディフィシレのトキシンの存在を検出する方法であって、被験試料をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、１１、１５、２３、２８、３２、４７、６６、７５、８３、９０、９５、９８、１１０、１２４−１２５、１３４、１３９、１４５、１５１−１５２および１５７またはそのフラグメントからなる群から選択されるコンセンサス配列を含むアプタマーと接触させることを含む方法を提供する。被験試料中のクロストリジウム・ディフィシレのトキシンの存在を、そのようなコンセンサス配列を含むアプタマーで検出する方法は、プルダウンアッセイ、ドットブロットアッセイ、ＰＣＲアッセイ、またはサンドイッチアッセイを含むことができる。クロストリジウム・ディフィシレのトキシンの存在を検出する方法に用いるサンドイッチアッセイは、アプタマー−標的−抗体アッセイ、抗体−標的−アプタマーアッセイ、およびアプタマー−標的−アプタマーアッセイから選択できる。被験試料中のクロストリジウム・ディフィシレのトキシンの存在を検出する方法は、そのようなクロストリジウム・ディフィシレのトキシンの定量測定を提供することができる。
【実施例】
【００９８】
[00103]  以下の実施例は説明のために提示され、特許請求の範囲により定める本発明の範囲を限定するためのものではない。本明細書に記載するすべての実施例は、当業者に周知の慣用される標準法の背景で考慮すべきである。慣用される分子生物学的手法は、標準的な実験室マニュアル、たとえばSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd. ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,  N.Y., (2001)の記載に従って実施できる。
【００９９】
実施例１．クロストリジウム・ディフィシレのトキシンＡ／Ｂおよびバイナリートキシンを用いるＳＥＬＥＸ：標的取得
[00104]  標的取得
[00105]  ＳＥＬＥＸに適した標的を、クロストリジウム・ディフィシレのゲノムＤＮＡ由来の希望する遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅、ベクターｐＥＴ−５１ｂのＳｔｒｅｐ−タグ配列とＨｉｓ−タグ配列の間へのフレーム内クローニング、および大腸菌(E. coli)Ｒｏｓｅｔｔａにおける過剰発現により調製した（表１）。トキシンＡについて、カルボキシ末端β−ヘアピン反復配列１７−３２からなる組換えポリペプチドを得た。このトキシンドメインを選択したのは、ちょうど５つの受容体結合反復配列をもつ類似のトキシンＡペプチドについて結晶構造が公表されているからである(Ho, J.G., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2005. 102(51): p. 18373-8)。トキシンＢについて、アミノ末端触媒ドメインを精製した；このドメインの結晶構造は得られている(Reinert, D.J., et al., J. Mol. Biol., 2005. 351(5): p. 973-81)。バイナリートキシンについて、全長ＣｄｔＡサブユニットであってただし推定シグナル配列を含まないものを組換え形態（結晶構造を入手できる(Sundriyal, A., et al., J. Biol. Chem., 2009. 284(42): p. 28713-9))で作製し、また、おそらくＣｄｔＢ前駆タンパク質から開裂したいわゆる活性化ドメインであると思われるＣｄｔＢフラグメント（アミノ酸残基３０−２０７）を作製した(Perelle, S., et al., Infect. Immun., 1997. 65(4): p. 1402-7)。すべてのクロストリジウム・ディフィシレのトキシンのクローニングおよび精製を、入手できる結晶構造と共に図１Ａ〜１Ｄに示す。この組換え二重タグ付きタンパク質を、Ｎｉ−ＮＴＡアガロースおよびｓｔｒｅｐｔａｃｔｉｎアガロース上でのアフィニティークロマトグラフィーにより標準プロトコルを用いて精製した。
【０１００】
表１．クローニングおよび過剰発現のためのクロストリジウム・ディフィシレのトキシン遺伝子のＰＣＲ増幅
【０１０１】
【表１】
0006018096.tif 000003
【０１０２】
実施例２．クロストリジウム・ディフィシレのトキシンＡ／Ｂおよびバイナリートキシンを用いるＳＥＬＥＸ：ＳＥＬＥＸおよびプール親和性
精製したＨｉｓ−タグ付きタンパク質を用いるＳＥＬＥＸを、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）（Ｔａｌｏｎ（登録商標）またはＨｉｓ−タグ）分配法により実施した。ｄＵの代わりに下記の６種類の修飾ヌクレオチドのうち１つを含む４０ｍｅｒランダム配列のライブラリーを用いた：５−チロシルカルボキシアミド−ｄＵ（ＴｙｒｄＵ）、５−ベンジルカルボキシアミド−ｄＵ（ＢｎｄＵ）、５−ナフチルメチルカルボキシアミド−ｄＵ（ＮａｐｄＵ）、５−トリプタミノカルボキシアミド−ｄＵ（ＴｒｐｄＵ）、５−（２−ナフチルメチル）カルボキシアミド（２ＮａｐｄＵ）、または５−フェネチル−１−カルボキシアミド（ＰＥｄＵ）。７または８ラウンドのセレクションを実施し、デキストラン硫酸による動的攻撃をラウンド２〜８において適用した。最終ラウンドのＳＥＬＥＸの後に得られたアプタマープールを、それらの標的に対する親和性についてフィルター結合アッセイで試験し、Ｋｄおよびプラトーを決定した（表２）。
【０１０３】
[00106]  最終ラウンドのＳＥＬＥＸの後に得られたアプタマープールを、それらの標的に対する親和性についてフィルター結合アッセイで試験し、Ｋｄおよびプラトーを決定した（表２）。トキシンＡについて、アプタマープール４９４３（ＴｒｐｄＵ）は良好な親和性をもち、Ｋｄ＝２．４２ｎＭを備えていた。プール４９３６（ＴｙｒｄＵ）および４９３９（ＮａｐｄＵ）は活性であり、それぞれ１１．５および１０．８ｎＭのＫｄを備えていた。プール５５６４（２ＮａｐｄＵ）および５５７７（２ＮａｐｄＵ）も活性であり、４．６３および６．４０ｎＭのＫｄを備えていた。トキシンＡについて、アプタマープール５５７０（ＰＥｄＵ）が最良であり、Ｋｄ＝１．６１ｎＭを備えていた。
【０１０４】
[00107]  トキシンＢについて、アプタマープールＴｙｒｄＵ、ＢｎｄＵ、ＮａｐｄＵ、ＴｒｐｄＵ、２ＮａｐｄＵおよびＰＥｄＵは卓越した親和性を示し、０．１１〜１．１１ｎＭの範囲のＫｄを備えていた。
【０１０５】
[00108]  バイナリートキシンA鎖も高親和性アプタマーのセレクションに有効であり、下記のものが得られた：プール４７５８（ＴｒｐｄＵ），Ｋｄ＝０．４０ｎＭ；プール５５６７（２ＮａｐｄＵ），Ｋｄ＝０．１９ｎＭ；およびプール５５７４（ＰＥｄＵ），Ｋｄ＝０．３０ｎＭ。バイナリートキシンＢ鎖を用いて、活性プール５５５６（２ＮａｐｄＵ），Ｋｄ＝７．５８ｎＭがセレクションされた。
【０１０６】
[00109]  十分な親和性（約１０ｎＭ以下のＫｄ）を備えたすべてのプールをクローニングし、プール当たり少なくとも４８クローンの配列を決定した。
【０１０７】
表２．クロストリジウム・ディフィシレのトキシンを用いたＳＥＬＥＸ
【０１０８】
【表２】
0006018096.tif 000004
【０１０９】
１  親和性不十分のためクローニングしなかったプール
実施例３．トキシンＡアプタマークローン
[00110]  ＳＥＬＥＸプール４９３６（ＴｙｒｄＵ）、４９３９（ＮａｐｄＵ）、４９４３（ＴｒｐｄＵ）、５５６４（２ＮａｐｄＵ）、５５７７（２ＮａｐｄＵ）および５５７０（ＰＥｄＵ）からの代表的クローンを、トキシンＡに対する親和性についてフィルター結合アッセイで評価した。ほぼすべてのクローンが、セレクションに用いた組換え体である５７．１ｋＤａのトキシンＡフラグメントに対する良好な親和性を備えていたが、天然の３０８ｋＤａのトキシンＡに対しては若干のクローンが親和性を示したにすぎない。より小さな組換えタンパク質上のエピトープのうちあるものは全長天然トキシンのアプタマー結合に利用できない場合があるので、これは意外ではない。
【０１１０】
[00111]  親和性（Ｋｄ）および結合曲線のプラトーを表３に示し、対応する配列を表４に挙げ、最良クローンを太字で示す。
【０１１１】
[00112]  プール４９３６（ＴｙｒｄＵ）からのクローン：クローン４９３６−４はこのプール中の配列の２０％を占め、最も活性であり、組換えトキシンＡドメインに対するＫｄ＝３．８ｎＭ、および天然トキシンＡに対するＫｄ＝１４．５ｎＭを備えていた。
【０１１２】
[00113]  プール４９３９（ＮａｐｄＵ）からのクローン：このプールには無関係な配列がそれぞれ５倍みられた。クローン４９３９−２８０はこのプール中の最も活性なクローンであり、組換えタンパク質に対するＫｄ＝２．３４ｎＭ、および天然トキシンＡに対するＫｄ＝１５．３ｎＭを備えていた。
【０１１３】
[00114]  プール４９４３（ＴｒｐｄＵ）からのクローン：天然トキシンＡに対する良好な（低ナノモル濃度）親和性を備えた４つのクローンがこのプール中にみられた。最良クローン４９４３−５１（天然トキシンＡに対するＫｄ＝１．７８ｎＭ）がこのプール中の全配列の１９％を構成していた。他の３クローンは共通モチーフNNANAnnCNNNCnnCnN（Ｎ＝ＴｒｐｄＵ；ｎ＝Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＴｒｐｄＵ）をもっていた。ランダム領域に通常の４０個の代わりにわずか３２個のヌクレオチドを含むクローン４９４３−５０、４９４３−６０、および４９４３−４９（天然トキシンＡに対するＫｄは、それぞれ５．６０ｎＭ、４．５７ｎＭ、および７．９１ｎＭ）は良好な親和性を示した。
【０１１４】
[00115]  プール５５６４（２ＮａｐｄＵ）からのクローン：このプールの最も活性なクローンは５５６４−４９（天然トキシンＡに対するＫｄ＝１．７８ｎＭ）であった。下記の３つの配列パターンのうちの１つを共有する他の幾つかのクローンもこのプールに存在していた：それぞれ、NAAAGNAGGN、GNNRNCMKNCNGA（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）、またはCGGGNCGNGACAGANCGCA（Ｎ＝２ＮａｐｄＵ；Ｒ＝ＡまたはＧ；Ｍ＝ＡまたはＣ；Ｋ＝ＧまたはＮ）。
【０１１５】
[00116]  プール５５７０（ＰＥｄＵ）からのクローン：組換えトキシンＡに対するＫｄ＝０．１２ｎＭおよび天然トキシンＡに対するＫｄ＝６．９１ｎＭを備えた主クローン５５７０−５４は、このプールに最も多量に存在する配列であった。
【０１１６】
[00117]  プール５５７７（２ＮａｐｄＵ）からのクローン：活性クローンは配列パターンNACCGAACGNNnNCAGNCNGA（Ｎ＝２ＮａｐｄＵ；ｎ＝Ａ、Ｇ、Ｃ、または２ＮａｐｄＵ）の全部または一部を共有していた。これらの配列は、競合するトキシンＡアプタマー（４９４３−５１）が標的タンパク質濃度の２倍過剰に存在する特殊なＳＥＬＥＸでセレクションされた。
【０１１７】
表３．クロストリジウム・ディフィシレのトキシンＡを用いたＳＥＬＥＸからのアプタマークローンの親和性
【０１１８】
【表３】
0006018096.tif 000005
【０１１９】
表４．クロストリジウム・ディフィシレのトキシンＡのアプタマークローン。リード配列はそれらの“アプタマーＩＤ  Ｎｏ．”を太字で示し、コンセンサス配列には下線を施し、それらを表示“配列パターン”の下に示す。塩基文字“Ｎ”は、そのプールについて指示した修飾ヌクレオチド（ＴｙｒｄＵ、ＮａｐｄＵ、ＴｒｐｄＵ、２ＮａｐｄＵ、またはＰＥｄＵ）を表わす。コンセンサス配列中の塩基小文字“ｎ”は、モチーフ内の可変塩基を示し、それはＡ、Ｇ、Ｃ、または特定のプールについては修飾ヌクレオチド（ＴｙｒｄＵ、ＮａｐｄＵ、ＴｒｐｄＵ、２ＮａｐｄＵ、またはＰＥｄＵ）から選択される。ＩＵＰＡＣヌクレオチド不確定コードを用いた：Ｍ＝ＡまたはＣ；Ｒ＝ＡまたはＧ；Ｋ＝ＧまたはＮ（Ｎはプール特異的な修飾ｄＵを表わす）；コンセンサス配列を規定するために９０％リプレゼンテーションのカットオフを採用した。
【０１２０】
【表４】
0006018096.tif 000006
【０１２１】
実施例４．トキシンＢアプタマークローン
[00118]  トキシンＢに対するアプタマーの親和性は全般的にきわめて良好であり、ＳＥＬＥＸに用いたクロストリジウム・ディフィシレのトキシンＢフラグメントの６８．８ｋＤａアミノ末端触媒ドメインと２７０ｋＤａの天然全長トキシンＢとの間で良好に相関していた。トキシンＢに対してナノモル以下のＫｄを備えたアプタマークローンが、ＴｙｒｄＵ、ＢｎｄＵ、ＮａｐｄＵ、ＴｒｐｄＵ、２ＮａｐｄＵおよびＰＥｄＵ修飾ヌクレオチドを含む全プールから単離された（表５）；クロストリジウム・ディフィシレのトキシンＢアプタマーの配列を表６に挙げ、最良クローンを太字で示す。
【０１２２】
[00119]  プール４９３７（ＴｙｒｄＵ）からのクローン：ＴｙｒｄＵアプタマーのアラインメントにより、２つの別個の配列パターン(YNNSSNGAAW（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２）、YGAAWN（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７））（Ｎ＝ＴｙｒｄＵ；Ｗ＝ＡまたはＮ；Ｓ＝ＣまたはＧ；Ｙ＝ＣまたはＮ）、ならびに１つのオーファン配列の存在が示された。
【０１２３】
[00120]  プール４９３８（ＢｎｄＵ）からのクローン：このプールは３つの無関係な配列を含み、すべてが多数コピーで存在していた。
【０１２４】
[00121]  プール４９４０（ＮａｐｄＵ）からのクローン：４つの主クローンを含めて最も多量に存在する配列は、パターンKSGANNGGRW（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６）（Ｎ＝ＮａｐｄＵ；Ｒ＝ＡまたはＧ；Ｗ＝ＡまたはＮ；Ｓ＝ＣまたはＧ；Ｋ＝ＧまたはＮ）の全部または一部を含んでいた。さらに、３つの無関係なオーファン配列が存在していた。
【０１２５】
[00122]  プール４９４４（ＴｒｐｄＵ）からのクローン：大部分の配列がパターンNnCYnnnNCNNnAARWNMAMSYN（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７５）を含んでいた；他の２つの配列は異なるパターンCNnGnANCNGGAAAN（Ｎ＝ＴｒｐｄＵ；ｎ＝Ａ、Ｇ、ＣまたはＴｒｐｄＵ；Ｍ＝ＡまたはＣ；Ｒ＝ＡまたはＧ；Ｗ＝ＡまたはＮ；Ｓ＝ＣまたはＧ；Ｙ＝ＣまたはＮ）を共有し、４つのオーファン配列も存在していた。
【０１２６】
[00123]  プール５５６６（２ＮａｐｄＵ）からのクローン：パターンAnCnNNNAAGNGAACNNNnAnnnnnnnnnGnGNNnANA（Ｎ＝２ＮａｐｄＵ；ｎ＝Ａ、Ｇ、Ｃ、または２ＮａｐｄＵ）が一対のクローンにみられた。このプールはさらに２つの無関係な配列を多数コピーで含んでいた。
【０１２７】
[00124]  プール５５７３（ＰＥｄＵ）からのクローン：２つのパターンが同定された：GCCNNNCNNGNNAAACGNCCNNGANGGCAGCGNNおよびAGNNNGANCCC（Ｎ＝ＰＥｄＵ）。さらに６つの無関係なクローンが存在していた。
【０１２８】
[00125]  プール５５７８（ＮａｐｄＵ）からのクローン：２つの活性クローンが多数コピーで存在していた。これらの配列は、競合するトキシンＢアプタマー（４９４０−２３）が標的タンパク質濃度の２倍過剰に存在する特殊なＳＥＬＥＸで選択された。
【０１２９】
[00126]  最高親和性のアプタマーは、ＮａｐｄＵまたはＴｒｐｄＵ修飾ヌクレオチドを含むクローンであった。５つのアプタマーが天然トキシンＢに対してきわめて低いＫｄ＜０．１ｎＭを示した。
【０１３０】
表５．クロストリジウム・ディフィシレのトキシンＢを用いたＳＥＬＥＸからのアプタマークローンの親和性
【０１３１】
【表５】
0006018096.tif 000007
【０１３２】
表６．クロストリジウム・ディフィシレのトキシンＢのアプタマークローン。リード配列はそれらの“アプタマーＩＤ  Ｎｏ．”を太字で示し、コンセンサス配列には下線を施し、それらを表示“配列パターン”の下に示す。塩基文字“Ｎ”は、そのプールについて指示した修飾ヌクレオチド（ＴｙｒｄＵ、ＢｎｄＵ、ＮａｐｄＵ、ＴｒｐｄＵ、２ＮａｐｄＵ、またはＰＥｄＵ）を表わす。コンセンサス配列中の塩基小文字“ｎ”は、モチーフ内の可変塩基を示し、それはＡ、Ｇ、Ｃ、または特定のプールについては修飾ヌクレオチド（ＴｙｒｄＵ、ＮａｐｄＵ、ＴｒｐｄＵ、２ＮａｐｄＵ、またはＰＥｄＵ）から選択される。ＩＵＰＡＣヌクレオチド不確定コードを用いた：Ｍ＝ＡまたはＣ；Ｒ＝ＡまたはＧ；Ｗ＝ＡまたはＮ；Ｓ＝ＣまたはＧ；Ｙ＝ＣまたはＮ；Ｋ＝ＧまたはＮ（Ｎはプール特異的な修飾ｄＵを表わす）；コンセンサス配列を規定するために９０％リプレゼンテーションのカットオフを採用した。
【０１３３】
【表６−１】
0006018096.tif 000008
【０１３４】
【表６−２】
0006018096.tif 000009
【０１３５】
実施例５．バイナリートキシン（Ａ鎖）アプタマークローン
[00127]  組換えバイナリートキシン（Ａ鎖）（ＣｄｔＡ）を用いるＳＥＬＥＸにより、ＴｒｐｄＵ、２ＮａｐｄＵおよびＰＥｄＵ修飾ヌクレオチドを含む活性アプタマーが得られた（表７）。
【０１３６】
[00128]  ＣｄｔＡアプタマーの配列および共通配列パターンを表８に示す。
【０１３７】
[00129]  プール４７５８（ＴｒｐｄＵ）のクローニングによりクローン４７５８−６が明らかになり、これはそのプールの１８％を構成し、ＣｄｔＡバイナリートキシンに対する良好な親和性（Ｋｄ＝０．８６ｎＭ）を示した。
【０１３８】
[00130]  ２ＮａｐｄＵプールから２０の配列が得られ、それらは大部分がナノモル以下の親和性を備え、これらの２ＮａｐｄＵクローン間で共有されている幾つかの配列パターンが同定された：GAANANnNCCGNGAnGNAANGnnANANNS（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１０）、ANNRGCNnCCNGGCS（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２４）、WAWNNANNA（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２５）、およびGGANNGCAGGNNCMC（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３４）（Ｎ＝ＰＥｄＵ；ｎ＝Ａ、Ｇ、ＣまたはＰＥｄＵ；Ｍ＝ＡまたはＣ；Ｗ＝ＡまたはＮ；Ｓ＝ＣまたはＧ；Ｒ＝ＡまたはＧ）。
【０１３９】
[00131]  ＰＥｄＵプールは５つの活性アプタマーを含んでいた；それらは多数コピーで存在し、３つの配列はパターンNAAAWGNNN（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４５）（Ｎ＝ＰＥｄＵ；Ｗ＝ＡまたはＮ）を共有していた。
【０１４０】
表７．クロストリジウム・ディフィシレのバイナリートキシンＡ鎖を用いたＳＥＬＥＸからのアプタマークローンの親和性
【０１４１】
【表７】
0006018096.tif 000010
【０１４２】
表８．クロストリジウム・ディフィシレのバイナリートキシンＡ鎖のアプタマークローン。リード配列はそれらの“アプタマーＩＤ  Ｎｏ．”を太字で示し、コンセンサス配列には下線を施し、それらを表示“配列パターン”の下に示す。塩基文字“Ｎ”は、そのプールについて指示した修飾ヌクレオチド（ＴｒｐｄＵ、２ＮａｐｄＵ、またはＰＥｄＵ）を表わす。コンセンサス配列中の塩基小文字“ｎ”は、モチーフ内の可変塩基を示し、それはＡ、Ｇ、Ｃ、または特定のプールについては修飾ヌクレオチド（ＴｒｐｄＵ、２ＮａｐｄＵ、またはＰＥｄＵ）から選択される。ＩＵＰＡＣヌクレオチド不確定コードを用いた：Ｍ＝ＡまたはＣ；Ｒ＝ＡまたはＧ；Ｗ＝ＡまたはＮ；Ｓ＝ＣまたはＧ（Ｎはプール特異的な修飾ｄＵを表わす）；コンセンサス配列を規定するために９０％リプレゼンテーションのカットオフを採用した。
【０１４３】
【表８】
0006018096.tif 000011
【０１４４】
実施例６．バイナリートキシン（Ｂ鎖）アプタマークローン
[00132]  組換えバイナリートキシンＢ鎖を用いるＳＥＬＥＸにより、２ＮａｐｄＵ修飾ヌクレオチドを含む活性アプタマーが得られた（表９）。ＣｄｔＢアプタマーの配列および共通配列パターンを表１０に示す。最も活性なクローン５５５６−５１はこれらのすべてのパターンを含んでいた：NNARASCS（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５１）、NNNGGCNNNACG（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５２）、およびAGCCNNNGRCNN（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５７）（Ｎ＝２ＮａｐｄＵ；Ｒ＝ＡまたはＧ；Ｓ＝ＣまたはＧ）；これらのうち幾つかが他の配列中に存在していた。さらに３つのクローンは無関係な配列をもっていた。
【０１４５】
表９．クロストリジウム・ディフィシレのバイナリートキシンＢ鎖を用いたＳＥＬＥＸからのアプタマークローンの親和性
【０１４６】
【表９】
0006018096.tif 000012
【０１４７】
表１０．クロストリジウム・ディフィシレのバイナリートキシンＢ鎖のアプタマークローン。リード配列はそれらの“アプタマーＩＤ  Ｎｏ．”を太字で示し、コンセンサス配列には下線を施し、それらを表示“配列パターン”の下に示す。塩基文字“Ｎ”は、２ＮａｐｄＵを表わす。ＩＵＰＡＣヌクレオチド不確定コードを用いた：Ｒ＝ＡまたはＧ；Ｓ＝ＣまたはＧ；コンセンサス配列を規定するために９０％リプレゼンテーションのカットオフを採用した。
【０１４８】
【表１０】
0006018096.tif 000013
【０１４９】
実施例７．診断試薬としてのトキシンＡ／Ｂおよびバイナリートキシンに対するアプタマーの使用：プルダウンアッセイ
[00133]  アプタマーを用いてそれらの各標的であるトキシンＡ、トキシンＢまたはバイナリートキシンをスパイク試料から特異的にプルダウンし、こうして必要に応じてこれらのタンパク質のアフィニティー精製が達成される。
【０１５０】
[00134]  このアッセイでは、ビオチニル化アプタマーをＭｙＯｎｅストレプトアビジンビーズ上に固定化し、それらの標的と１時間混合して結合させた。次いでビーズを洗浄し、捕獲された標的にＮＨＳ−Ａｌｅｘａ−６４７タグを付けた。徹底的に洗浄した後、捕獲された標的を２０ｍＭ  ＮａＯＨで溶離し、中和し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、ｃｙ５チャンネルを用いてタンパク質を視覚化した。
【０１５１】
[00135]  図２は下記のプルダウンアッセイ結果を示す：トキシンＡアプタマーは、トキシンＡ（組換えまたは天然）をトキシンＢまたはＢＳＡより良好にプルダウンした；トキシンＢアプタマーは、トキシンＢ（組換えまたは天然）をプルダウンしたが、トキシンＡをプルダウンしなかった；バイナリートキシンＡサブユニットに対するアプタマーはＣｄｔＡをプルダウンしたが、ＣｄｔＢをプルダウンしなかった；ランダムアプタマーを用いた場合にはプルダウン画分中にタンパク質は存在しなかった。
【０１５２】
実施例８．診断試薬としてのトキシンＡ／Ｂおよびバイナリートキシンに対するアプタマーの使用：ドットブロットアッセイ
[00136]  たとえば、ビオチニル化アプタマー、および信号増強酵素、たとえばアルカリホスファターゼ（ＡＰ）または西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を用いるドットブロットアッセイにおけるトキシン検出のために、アプタマーを用いた。
【０１５３】
[00137]  トキシンＡおよびＢの単純なドットブロット法でトキシン検出を立証した（図３Ａおよび３Ｂ）。このアッセイでは、ニトロセルロース膜上に系列希釈した標的１μＬをスポットし、風乾した。ブロックした後、このビオチニル化アプタマー（１ｎＭ）、続いてＳＡ−ＡＰコンジュゲート（２００ｎｇ／ｍＬ）を添加し、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ基質で顕色させた。アプタマーによる検出限界はトキシンＡおよびＢのいずれについても約１ｆｍｏｌｅ（３００ｐｇ）であった。同じアッセイおよび同じ濃度（１ｎＭ）で用いたモノクローナル抗体はこれほど良好ではなかったが、２ｆｍｏｌｅ（６００ｐｇ）のトキシンＡおよび２０ｆＭｏｌｅ（６ｎｇ）のトキシンＢを検出できた。
【０１５４】
実施例９．診断試薬としてのトキシンＡ／Ｂおよびバイナリートキシンに対するアプタマーの使用：ｑＰＣＲによるキャッチ(Catch)１および２アッセイ
[00138]  キャッチ１−キャッチ２アッセイを図８に示す。トキシンＡおよびＢをキャッチ２溶出液のｑＰＣＲにより定量検出した（図４Ａ〜Ｂ）。キャッチ１では、トキシン（０．００１〜１０ｎＭ）および過剰のＢＳＡ（１．５μＭ）を含有するスパイク試料を、光開裂性ビオチン−Ｄスペーサーを含むアプタマー（１０ｎＭ）と平衡化し、ストレプトアビジンアガロースビーズ（光を透過させる比較的透明なビーズ）上に捕獲した。遊離タンパク質を洗浄除去した後、キャッチ１試料のトキシン（標的）にＮＨＳ−ビオチンでタグ付けし、アプタマーをストレプトアビジンアガロースビーズから光開裂させ、複合体をＭｙＯｎｅストレプトアビジンビーズ上に捕獲した（キャッチ２）。光開裂後に光開裂性ビオチン−ＤスペーサーがＭｙＯｎｅストレプトアビジンビーズへの結合を仲介することはもはやできないので、キャッチ２ではＭｙＯｎｅストレプトアビジンビーズへの結合はトキシン（標的）上のＮＨＳ−ビオチンが仲介した。遊離アプタマーを洗浄除去した後、標的に結合したアプタマーを高ｐＨで溶離し、ｑＰＣＲに用いた；並行してアプタマーの標準曲線を作成した。トキシンＡおよＢについての定量結果は＞０．１ｎＭの濃度でのみ得られた。これより低い標的濃度では非特異的バックグラウンドがあり、ｐＰＣＲ曲線は１２サイクル未満後にプラトーに達した。これは、キャッチ１と２の間での遊離アプタマーのかなりのキャリーオーバーに起因する可能性、およびかなり高い（１０ｎＭ）アプタマー濃度に起因する可能性が最も大きかった。
【０１５５】
実施例１０．診断試薬としてのトキシンＡ／Ｂおよびバイナリートキシンに対するアプタマーの使用：アプタマー−標的−抗体サンドイッチアッセイ
[00139]  ストレプトアビジンプレートサンドイッチアッセイで、ビオチニル化アプタマーおよびモノクローナル抗体を用いてトキシンを検出した（図５Ａ〜Ｂ）。
【０１５６】
[00140]  トキシンＡおよびＢについてトキシン検出を立証した。ビオチニル化アプタマー（１ｐｍｏｌｅ／ウェル）をストレプトアビジンプレート上に固定化し、標的タンパク質を添加した（１ｎＭ、１００ｐＭ、１０ｐＭ、無タンパク質）；これらは１００ｆＭｏｌｅ（３０ｎｇ）、１０ｆＭｏｌｅ（３ｎｇ）、１ｆＭｏｌｅ（３００ｐｇ）および無タンパク質対照に対応する。プレートを洗浄し、トキシンＡまたはＢに対するモノクローナル抗体（それぞれ２ｎＭ）を添加し、室温で振とうしながら１時間結合させた。複合体を、ヤギ抗マウスＨＲＰコンジュゲート、およびＨＲＰ基質としてのＴＭＢで検出した（図５Ａおよび５Ｂ）。
【０１５７】
[00141]  このサンドイッチアッセイにより、標的濃度依存性信号および低いバックグラウンドで堅実な結果が得られた。４つすべてのトキシンＡアプタマーが１０ｐＭのトキシンＡ（１ｆＭｏｌｅ，３００ｐｇ）をそれらのＫｄに関係なく検出でき、トキシンＢと交差反応しなかった。トキシンＢに対するアプタマーは、より良好なＫｄにもかかわらずこのアッセイで低い感度をもっていた；これは、おそらくアプタマーと抗体の結合部位のオーバーラップに起因すると思われる。トキシンＢアプタマーのひとつ（４９３７−４９）はトキシンＡと交差反応しなかった；これはプルダウン実験からのデータと一致する。
【０１５８】
実施例１１．診断試薬としてのトキシンＡ／Ｂおよびバイナリートキシンに対するアプタマーの使用：抗体−標的−アプタマーサンドイッチアッセイ
[00142]  たとえばディップスティック型のアッセイ方式でのビオチニル化アプタマーおよびモノクローナル抗体を用いる抗体−標的−アプタマーサンドイッチアッセイにおけるトキシン検出のために、アプタマーを用いた（図６）。
【０１５９】
[00143]  トキシンＡおよびＢに対するモノクローナル抗体を別個にニトロセルロースの小さな（０．６ｃｍ×２．５ｃｍ）ストリップにスポットし、風乾した。ＳＢ１８Ｔ＋１％  ＢＳＡでブロックした後、ストリップをディープウェルプレートに立てて入れ、トキシンＡおよび／またはトキシンＢあるいは対照を含有する試料０．６ｍＬを添加した。室温で１時間振とうした後、ストリップを３回洗浄した。ビオチニル化アプタマー（１ｎＭ）を添加し（０．６ｍＬ）、室温で１時間結合させた。ストリップを再び洗浄し、１ｎＭストレプトアビジン−アルカリホスファターゼコンジュゲート（１時間）およびＮＢＴ／ＢＣＩＰで顕色させた（図６）。
【０１６０】
[00144]  トキシンＡアプタマー４９４３−５１は、トキシンＡのみ、またはトキシンＡとＢの両方（１０００ｆＭｏｌｅまたは１００ｆＭｏｌｅ）を含有するすべての試料において、トキシンＡを正確に検出し、トキシンＢと交差反応しなかった。同様にトキシンＢアプタマーはトキシンＢを検出できた。バックグラウンドは、特にトキシンＢのスポットにおいて、試料中にタンパク質が存在しない場合およびランダム対照アプタマーを用いた場合ですら高かった；これは、トキシンＢモノクローナル抗体に対するストレプトアビジン−アルカリホスファターゼコンジュゲートの非特異的結合を示唆する。
【０１６１】
実施例１２．診断試薬としてのトキシンＡ／Ｂおよびバイナリートキシンに対するアプタマーの使用：アプタマー−標的−アプタマーサンドイッチアッセイ
[00145]  たとえばビーズに基づくアッセイ方式で、アプタマー対を用い、抗体を何ら必要としないアプタマー−アプタマーサンドイッチアッセイにおけるトキシン検出のために、アプタマーを用いた（図７）。
【０１６２】
[00146]  第１のビオチニル化アプタマー（クローン４７５８−６）をＭｙＯｎｅ（商標）ストレプトアビジンビーズに結合させることにより、捕獲ビーズを調製した。系列希釈した標的タンパク質（ＣｄｔＡ）を含有する試料を添加し、ＣｄｔＡをこれらの捕獲用ビーズに結合させた。ビーズを洗浄した後、第２の放射性標識ＣｄｔＡアプタマークローンを平衡結合のために添加した。次いで、捕獲ビーズ自体を分配のために用いて、混合物をＭＡＨＶＮプレート（０．２２μ）によりろ過した。この方法は、サンドイッチ型の方式でストレプトアビジン−アプタマー４７５８−６−ＣｄｔＡ複合体に結合した標識アプタマーのみを検出するであろう。
【０１６３】
[00147]  ＣｄｔＡアプタマー対についての捕獲ビーズアッセイの結果を図７に示す。適切なアプタマー対は標的濃度に依存した信号を発生した。同一アプタマー（同一エピトープに結合）または対照アプタマー（異なる標的に結合）を用いた場合、信号が発生しなかった。
【０１６４】
[00148]  このアッセイを用いて、標的上の別個のエピトープに結合させるためのアプタマー、すなわち同じエピトープに対して競合するのではなく別の部位に結合する各アプタマーをスクリーニングすることができる。
【図１Ａ】
0006018096.tif 000014
【図１Ｂ】
0006018096.tif 000015
【図１Ｃ】
0006018096.tif 000016
【図１Ｄ】
0006018096.tif 000017
【図２−１】
0006018096.tif 000018
【図２−２】
0006018096.tif 000019
【図３】
0006018096.tif 000020
【図４】
0006018096.tif 000021
【図５Ａ】
0006018096.tif 000022
【図５Ｂ】
0006018096.tif 000023
【図６】
0006018096.tif 000024
【図７】
0006018096.tif 000025
【図８】
0006018096.tif 000026
【図９−１】
0006018096.tif 000027
【図９−２】
0006018096.tif 000028
【図９−３】
0006018096.tif 000029
【配列表】
0006018096000001.app