(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２のアミノ酸配列を有するＡＡＶｒｈ３２／３３キャプシドを含んでなるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであって、宿主細胞中で遺伝子産物の発現を制御する調節配列の制御下に該遺伝子産物をコードする導入遺伝子を保有する、ＡＡＶベクター。
【請求項２】
遺伝子産物が免疫原または抗原である、請求項１に記載のＡＡＶベクター。
【請求項３】
遺伝子産物がウイルス抗原または免疫原である、請求項１または２に記載のＡＡＶベクター。
【請求項４】
調節配列が３’および５’逆方向末端反復配列を含んでなる、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＡＡＶベクター。
【請求項５】
逆方向末端反復配列がＡＡＶｒｈ３２／３３に対して異種ＡＡＶからのものである、請求項４に記載のＡＡＶベクター。
【請求項６】
遺伝子産物が免疫グロブリンである、請求項１〜５のいずれか１項に記載のＡＡＶベクター。
【請求項７】
導入遺伝子ががん遺伝子ポリペプチドまたはがん遺伝子産物をコードする、ＡＡＶベクター。
【請求項８】
製薬学的に許容され得る担体と請求項１〜７のいずれか１項に記載のＡＡＶベクターを含んでなる組成物。
【請求項９】
請求項１〜７に記載のＡＡＶベクターによりインビトロでトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項１０】
配列番号２のアミノ酸配列を有するＡＡＶｒｈ３２／３３キャプシドをコードする核酸配列を含んでなる核酸分子。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
パルボウイルス科の１メンバー、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、４．７キロ塩基対（ｋｂ）〜６ｋｂの一本鎖の直鎖状ＤＮＡゲノムを有する小型のエンベロープを持たない２０面体ウイルスである。ＡＡＶは、精製したアデノウイルスストック中の混入物質として発見されたため、該ウイルスはデペンドウイルス属（Ｄｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ）に割り当てられている。ＡＡＶの生活環は、感染後のＡＡＶゲノムが宿主染色体に部位特異的に組み込まれる潜伏期、およびアデノウイルスもしくは単純疱疹ウイルスいずれかの感染後に組み込まれたゲノムがその後レスキューされ、複製され、そして感染性ウイルスにパッケージングされる感染期を含む。非病原性の特性、非分裂細胞を含む感染性の広範な宿主範囲、および潜在的な部位特異的染色体組み込みが、ＡＡＶを遺伝子移入のための魅力的なツールとしている。
【０００２】
ＡＡＶベクターは、治療および免疫原分子の両方に送達媒体としての使用が記載されてきた。今日まで、ヒトまたは非ヒト霊長類（ＮＨＰ）から単離された数種の異なる十分に特徴づけられたＡＡＶが存在する。
【０００３】
最近、研究者達は多数のＡＡＶの異なる配列を記載し［非特許文献１（２００３年５月１３日）；特許文献１（２００３年６月２４日）］、そしてこれらのＡＡＶを異なる血清型およびクレードに特徴付けた［非特許文献２（２００４年６月）；特許文献２］。異なる血清型のＡＡＶが異なるトランスフェクション効率を表し、かつまた異なる細胞もしくは組織に対する向性も表すことが報告された。
【０００４】
望まれているものは、異種分子を種々の細胞型に送達のためのＡＡＶに基づく構築物である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】ＵＳ−２００３−０１３８７７２−Ａ１
【特許文献２】国際公開第２００５／０３３３２１号パンフレット
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｇ．Ｇａｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１００（１０）：６０８１−６０８６
【非特許文献２】Ｇ．Ｇａｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８（１２）：６３８１−６３８８
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、非機能的および／または弱く機能する（ｐｅｒｆｏｒｍ）ＡＡＶから誘導されるベクター、該ベクターを改善する方法を提供する。
【０００８】
１つの観点では、この方法は選択したＡＡＶのパッケージング収量、形質導入効率および／または遺伝子導入効率を上げるために、選択したＡＡＶ配列のシングルトンを補正する方法を提供する。この方法には、このシングルトンを、並置された機能的ＡＡＶキャプシド配列の対応する位置（１もしくは複数）のアミノ酸と同じにするために、親のＡＡＶキャプシド中の１もしくは複数のシングルトンを改変することが含まれる。
【０００９】
別の観点では、本発明は修飾されたＡＡＶ配列、すなわち１もしくは複数のシングルト
ンが排除された配列を提供する。
【００１０】
さらに別の観点では、本発明は本発明に従い修飾されたＡＡＶキャプシドを有するＡＡＶベクターを提供する。
【００１１】
本発明の他の観点および利点は、本発明の以下の詳細な説明から容易に明らかとなるだろう。
【００１２】
発明の詳細な説明
本発明はＡＡＶベクターの機能を改善する方法を提供する。本発明は、特に１もしくは複数のシングルトンを含むＡＡＶのキャプシドを有するＡＡＶベクターのパッケージング収量、形質導入効率および／または遺伝子導入効率を改善するために良く適している。さらに本発明は本発明に従い同定および調製した新規ＡＡＶキャプシド配列を提供する。
【００１３】
本明細書および特許請求の範囲を通して使用するように、用語「含んでなる」および「含む」とは他の成分、要素、完全体（ｉｎｔｅｇｅｒ）、工程等を包含する。逆に用語「からなる」およびその変更体は、他の成分、要素、完全体（ｉｎｔｅｇｅｒ）、工程等を排除する。
【００１４】
本発明のシングルトン法
本明細書で使用する用語「シングルトン」とは、選択した（すなわち親の）ＡＡＶキャプシド配列の所定位置の１つの可変アミノ酸を指す。可変アミノ酸の存在は、親のＡＡＶキャプシドの配列を機能的なＡＡＶキャプシド配列のライブラリーと並べることにより決定することができる。この配列は次いで分析されて親のＡＡＶキャプシド中の可変アミノ酸の存在が決定され、ここで機能的ＡＡＶのライブラリー中のＡＡＶの配列は完全な保存を有する。次いで親のＡＡＶ配列は、シングルトンを機能的ＡＡＶキャプシド配列中の該位置で同定された保存アミノ酸に変えるように改変される。本発明に従い、親のＡＡＶ配列は１〜６、１〜５、１〜４、１〜３または２個のシングルトンを有することができる。親のＡＡＶ配列は６より多くのシングルトンを持つことができる。
【００１５】
いったん修飾されれば、修飾された（または改変された）ＡＡＶキャプシドは、修飾されたキャプシドを有するＡＡＶベクターを構築するために使用することができる。このベクターは当業者に既知の技術を使用して構築することができる。
【００１６】
本発明の方法に従い修飾するために選択されるＡＡＶは、以下の３つのＡＡＶの機能的特性、すなわち親のＡＡＶと比べた時の選択されたＡＡＶ配列のキャプシドを有するウイルス粒子へのパッケージング、形質導入効率の上昇、または遺伝子導入効率の上昇の１もしくは複数を上げることが望まれるものである。例えば親のＡＡＶは、他の近縁のＡＡＶに比べて低いパッケージング効率を有することを特徴とすることができる。別の例では、親のＡＡＶは他の近縁のＡＡＶに比べて低い形質導入効率を有するかもしれない。別の例では、親ＡＡＶは他の近縁のＡＡＶに比べて低い遺伝子導入効率（すなわちインビボで標的分子を送達する能力が低い）を有するかもしれない。１つの実施態様では、親のＡＡＶはこれら各範疇において十分な機能を特徴とするが、これら分野の１もしくは複数の機能の上昇が望まれる。
【００１７】
このように本発明は、機能的ＡＡＶのライブラリー、選択した（親の）ＡＡＶと比べる配列を提供する。適当ならばライブラリーは、選択した親のＡＡＶの改善のための標的とされる所望する機能を有するＡＡＶを含む。換言すると、機能的ＡＡＶのライブラリー中の各配列は、所望するレベルのパッケージング能、所望するレベルのインビトロ形質導入効率、または所望するレベルのインビトロ遺伝子導入効率（すなわち個体の標的とする選
択した標的組織もしくは細胞に送達する能力）を特徴とする。ライブラリーを構成する機能的ＡＡＶは、これらの機能的特徴の１、２もしくはすべてを個別に有することができる。ライブラリーに所望する他の機能は、当業者により容易に決定され得る。
【００１８】
１つの態様では、機能的ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９のいずれか１つと均等な、またはそれより高いパッケージングおよび形質導入効率を持つウイルス粒子を生産する能力により特徴つけられるＡＡＶである。機能はＡＡＶ２ｒｅｐおよびＡＡＶ２ＩＴＲで設定するシュードタイピングで評価することができる。すなわち改変された親のＡＡＶは通例の技術を使用して構築することができ、そしてＡＡＶベクターはＡＡＶ２の生産と比べた時、ウイルスが少なくとも５０％の力価で親のＡＡＶから生産されるならば、ＡＡＶは機能的であると考える。さらにＡＡＶが細胞を形質導入する能力は、当業者により容易に測定され得る。例えば親のＡＡＶは、ウイルスの容易な検出を可能にするマーカー遺伝子を含むように構築することができる。例えばＡＡＶは蛍光検出を可能にするｅＧＦＰもしくは他の遺伝子を含む。ＡＡＶがＣＭＶ−ｅＧＦＰを含む場合、改変された親のＡＡＶキャプシドから生産されたウイルスが２９３細胞に１０4の感染多重度で形質導入された時、機能は細胞が２０の感染多重度で２時間、野生型ヒトアデノウイルス５型で前処理される内容で、形質導入効率が全細胞の５％ＧＦＰ蛍光よりも大きい場合に証明される。
【００１９】
適当にはライブラリーは、少なくとも２つの異なるクレードを表す少なくとも３つ、もしくは少なくとも４つの機能的ＡＡＶキャプシド配列からなる。好ましくは示した各クレードから少なくとも２つの配列がライブラリーに含まれる。特定の態様では、３、４、５、６以上のクレードが示される。
【００２０】
「クレード」は、ＡＡＶ  ｖｐ１アミノ酸配列のアライメントに基づきネイバー−ジョイニング（Ｎｅｉｇｈｂｏｒ−Ｊｏｉｎｉｎｇ）アルゴリズムを用いて決定した場合に、（少なくとも１０００個の複製物の）少なくとも７５％のブーツストラップ値および０．０５を超えないポアソン補正距離測定値により相互に系統発生的に関連づけられるＡＡＶの一群である。
【００２１】
ネイバー−ジョイニングアルゴリズムは文献に広範囲に記載されている。例えばＭ．Ｎｅｉ  ａｎｄ  Ｓ．Ｋｕｍａｒ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｓ（オックスフォード大学出版（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク（２０００）を参照されたい。このアルゴリズムを実行するのに使用し得るコンピュータプログラムは入手可能である。例えば、ＭＥＧＡ  ｖ２．１プログラムは、修飾Ｎｅｉ−Ｇｏｊｏｂｏｒｉを実行する。これらの技術およびコンピュータプログラム、ならびにＡＡＶ  ｖｐ１キャプシドタンパク質の配列を使用して、当業者は選択したＡＡＶが本明細書で同定されるクレードの１つに含有されるか、別のクレードに含有されるか、若しくはこれらのクレードの外側にあるかどうかを容易に決定し得る。
【００２２】
本明細書で定義されるクレードは、天然に存在するＡＡＶ  ｖｐ１キャプシドに主として基づく一方、クレードは天然に存在するＡＡＶに制限されない。クレードは、ＡＡＶ  ｖｐ１アミノ酸配列のアライメントに基づいて、ネイバー−ジョイニング  アルゴリズムを用いて決定した場合に、（少なくとも１０００個の複製物の）少なくとも７５％のおよび０．０５を超えないポアソン補正距離測定値により系統発生学的に関連づけられる、組換え、修飾もしくは変更、キメラ、ハイブリッド、合成、人工などのＡＡＶを制限なしに包含する天然に存在しないＡＡＶを包含し得る。
【００２３】
本明細書に記載されるクレードは、クレードＡ（ＡＡＶ１およびＡＡＶ６により代表さ
れる）、クレードＢ（ＡＡＶ２により代表される）ならびにクレードＣ（ＡＡＶ２−ＡＡＶ３ハイブリッドにより代表される）、クレードＤ（ＡＡＶ７により代表される）、クレードＥ（ＡＡＶ８により代表される）ならびにクレードＦ（ヒトＡＡＶ９により代表される）を包含する。これらのクレードは、以前に記述されたＡＡＶ血清型であるクレードの１メンバーにより代表される。以前に記述されたＡＡＶ１およびＡＡＶ６は、４種の単離物が３例のヒトから回収された単一クレード（クレードＡ）のメンバーである。以前に記述されたＡＡＶ３およびＡＡＶ５血清型は相互と明確に異なるが、しかし本明細書に記述されるスクリーニングで検出されず、また、これらのクレードのいずれにも包含されない。
【００２４】
ＡＡＶのクレードに関するさらなる考察は、Ｇ．Ｇａｏ，  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８（１２）：６３８１−６３８８（２００４年６月）および国際公開第２００４／０２８８１７号および同第２００５／０３３３２１号パンフレットに提供されている。参考により本明細書に編入する後者の文書は、新規ヒトＡＡＶ配列も提供する。
【００２５】
１つの態様では、本発明の方法で使用するライブラリーはＡＡＶ５を除外する。別の態様では、本発明の方法で使用するライブラリーはＡＡＶ４を除外する。しかし特定の態様、例えば親のＡＡＶがＡＡＶ５に類似する場合、これはアライメントにおいてこの配列に含むことが望ましいかもしれない。
【００２６】
最少数の配列を含むライブラリーが構築され得るが、シングルトンを同定する効率は、より多い数の配列を含むライブラリーを使用することにより至適化することができる。適当には、ライブラリーは最少４つの配列を含み、少なくとも２つのクレードが示される。好ましくはライブラリーは示される各クレードから少なくとも２つの配列を含む。１つの態様では、ライブラリーは１００以上のＡＡＶ配列を含む。別の態様では、ライブラリーは少なくとも３〜１００のＡＡＶ配列を含む。さらに別の態様では、ライブラリーは少なくとも６〜５０のＡＡＶ配列を含む。
【００２７】
本発明の機能的ライブラリーに使用するために適するＡＡＶには、例えばＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９および記載された配列を含む［Ｇ．Ｇａｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．１００（１０）：６０８１：６０８６（２００３年５月１３日）；国際公開第２００４／０４２３９７号および同第２００５／０３３３２１号パンフレット］。当該技術分野の１つの技術は、他のＡＡＶ、例えば国際公開第０３／０９３４６０Ａ１号パンフレット（２００３年１１月１３日）および米国特許出願第２００３−０１３８７７２Ａ１号明細書（２００３年７月２４日）に記載された方法を使用して単離されたものを容易に選択できる。
【００２８】
本発明に従い、ライブラリー中少なくとも３つの配列がそれらの並置されたキャプシド配列の完全長にわたり少なくとも８５％同一である。
【００２９】
用語「パーセント（％）同一性」とは、完全長のタンパク質またはそのフラグメントにわたり、アミノ酸配列について容易に決定され得る。適切には、フラグメントは少なくとも約８アミノ酸長であり、そして約７００個までのアミノ酸であることができる。一般に、２つの異なるアデノ随伴ウイルス間の「同一性」、「相同性」もしくは「類似性」を指す場合、「同一性」、「相同性」もしくは「類似性」は「整列した」に配列に関して決定される。「整列した」配列もしくは「アライメント」は、参照配列に比較して欠けているか、または付加的な塩基若しくはアミノ酸についての補正をしばしば含有する多数の核酸配列もしくはタンパク質（アミノ酸）配列を指す。
【００３０】
アライメントは、多様な公的にもしくは商業的に入手可能な複数の配列アライメントプ
ログラム（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｌｉｇｍｎｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍ）のいずれかを使用して実施する。配列のアライメントプログラムは、アミノ酸配列について、例えば「Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｘ」、「ＭＡＰ」、「ＰＩＭＡ」、「ＭＳＡ」、「ＢＬＯＣＫＭＡＫＥＲ」、「ＭＥＭＥ」および「Ｍａｔｃｈ−Ｂｏｘ」を利用することができる。一般に、これらのプログラムのいずれもデフォルトの設定で使用されるとは言え、当業者はこれらの設定を必要とされるように変更し得る。あるいは当業者は、少なくとも引用されたアルゴリズムおよびプログラムにより提供されるもののような同一性もしくはアライメントのレベルを提供する別のアリゴリズムもしくはコンピュータプログラムを利用し得る。例えばＪ．Ｄ．Ｔｈｏｍｓｏｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，「多数の配列アライメントの包括的比較（Ａ  ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ）」、２７（１３）：２６８２−２６９０（１９９９）を参照されたい。
【００３１】
複数の配列アライメントプログラムは、核酸配列についても利用することができる。こうしたプログラムの例は、「ＣｌｕｓｔａｌＷ」、「ＣＡＰ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ」、「ＭＡＰ」および「ＭＥＭＥ」を包含し、これらはインターネット上のウェブサーバーを通じてアクセス可能である。こうしたプログラムの他の供給源は当業者に既知である。あるいは、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩユーティリティーもまた使用される。上述されたプログラムに含有されるものを包含する、ヌクレオチド配列の同一性を測定するのに使用し得る当該技術分野で既知の多数のアルゴリズムもまた存在する。別の例として、ポリヌクレオチド配列は、ＧＣＧ  Ｖｅｒｓｉｏｎ６．１中のプログラムＦａｓｔａ（商標）を使用して比較し得る。Ｆａｓｔａ（商標）はクエリ配列と参照配列の間の最良の重複領域のアライメントおよび配列の同一性パーセントを提供する。例えば、核酸配列間の配列の同一性パーセントは、ＧＣＧ  Ｖｅｒｓｉｏｎ６．１（引用することにより本明細書に組み込まれる）で提供されるそのデフォルトのパラメータ（６のワードサイズおよびスコアリングマトリックスについてのＮＯＰＡＭ係数）を用いるＦａｓｔａ（商標）を使用して決定し得る。
【００３２】
本発明に従い、シングルトンを含有すると思われる標的もしくは親ＡＡＶキャプシドの配列は、ライブラリー中のＡＡＶキャプシドの配列と比較される。この比較はＡＡＶキャプシドの完全長ｖｐ１タンパク質のアライメントを使用して行われる。
【００３３】
ＡＡＶ配列が並べられた時、選択された１つのアミノ酸位について１つのシングルトンが同定される場合、ライブラリー中のすべてのＡＡＶは同じアミノ酸残基を有するが（すなわち完全に保存されている）、親のＡＡＶは異なるアミノ酸残基を有する。
【００３４】
典型的にはアライメントがＡＡＶキャプシドｖｐ１タンパク質に基づき準備された場合、アライメントは参照ＡＡＶ配列（例えばＡＡＶ２）に対して挿入および欠失を含み、そしてそのように同定され、そしてアミノ酸残基の番号付けは、アライメントについて提供される参照スケールに基づく。しかし任意の上記ＡＡＶ配列が参照スケールより少ないアミノ酸残基を有してもよい。本発明では、親のＡＡＶおよび参照ライブラリーの配列を検討する場合、用語「同じ位置」または「対応する位置」は、並置された配列についての参照スケールに関して、各配列中で同じ残基番号に位置するアミノ酸を指す。しかしアライメントから取り出す場合、各ＡＡＶ  ｖｐ１タンパク質は、異なる残基番号に位置するこれらのアミノ酸を有することができる。
【００３５】
場合により、本発明の方法は核酸アライメントを使用し、そして異なるアミノ酸をコードするコドンをシングルトンとして同定することにより行うことができる（すなわち、非類義的コドン）。所定のコドンの核酸配列が、ライブラリー中のそのコドンの配列と比べた時に親のＡＡＶで同一ではないが、同じアミノ酸をコードする場合、それらは類義的と
考え、そしてシングルトンではない。
【００３６】
本発明に従い、シングルトンを含む親のＡＡＶは、シングルトン残基がライブラリー中のＡＡＶの保存されたアミノ酸残基に置き変えられるように改変される。
【００３７】
この置き換えは、可変アミノ酸に関するコドンについて通常の部位特異的突然変異誘発技法を使用することにより都合よく行うことができる。典型的には部位特異的突然変異誘発法は、保存されたアミノ酸残基について所望するコドンを得るために必要なできる限り少ない工程を使用して行われる。そのような方法は当業者には周知であり、そして公開されている方法および／または市販されているキット［例えばストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）およびプロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）」を使用して行うことができる。部位特異的突然変異誘発法は、ＡＡＶゲノム配列について行うことができる。ＡＡＶ配列は都合よくベクター（例えばプラスミド骨格）により運ばれることができる。あるいは当業者は、当該技術分野で既知の他の技法を使用して親のＡＡＶを改変することができる。
【００３８】
親のＡＡＶは１より多くの例えば２、３、４、５、６個以上のシングルトンを有することができる。しかし機能における改善は、１個のシングルトンを補正した後に観察することができる。親のＡＡＶが複数のシングルトンを持つ態様では、各シングルトンを１回で改変し、続いて修飾されたＡＡＶの所望する機能の強化について評価することができる。あるいは所望する機能の強化について評価する前に、複数のシングルトンを改変してもよい。
【００３９】
親のＡＡＶが複数のシングルトンを含み、そして機能的改善が第１のシングルトンの改変で観察される場合でも、残りのシングルトン（１もしくは複数）を改変することにより機能を至適化することが望ましいかもしれない。
【００４０】
典型的には、本発明の方法に従い改変された１もしくは複数のシングルトンを有する親のＡＡＶが、ＡＡＶをＡＡＶ粒子にパッケージングすることによる機能について評価される。これらの方法は当業者には周知である。例えばＧ．Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，（上記引用）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ，モレキュラークローニング：ア  ラボラトリーマニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、コールドスプリングハーバー出版、コールドスプリングハーバー、ニューヨークを参照にされたい。
【００４１】
これらの改変されたＡＡＶは、本発明の方法に従い生産される新規キャプシドを有し、そして機能について評価される。ＡＡＶ機能を評価するために適切な方法は本明細書に記載され、そして例えばＤＮＡｓｅ保護粒子を生産する能力、インビトロ細胞形質導入効率および／またはインビボ遺伝子導入を含む。適切には本発明の改変されたＡＡＶは、親のＡＡＶの機能と比べた時、これらの特性の１つもしくは全部において機能を上げるために改変される十分な数のシングルトンを有する。
【００４２】
ＩＩ．本発明の新規ＡＡＶ
本発明はさらに新規ＡＡＶが機能するかどうかを予想する方法を提供する。この方法には、本発明のシングルトン法を使用すること、および選択したＡＡＶにシングルトンの不存在を同定すること（すなわちシングルトンを欠くＡＡＶの配列）が関与する。
【００４３】
このように１つの態様では、本発明はベクターの生産に使用するためのＡＡＶの選択法を提供する。この方法には、分析のための親のＡＡＶキャプシド配列を選択すること、ならびに親のＡＡＶキャプシド配列および機能的ＡＡＶキャプシド配列のライブラリーを含んでなるアライメント中に、親のＡＡＶキャプシド中のシングルトンの不存在を分析し、
そして同定することが関与する。いったん選択したＡＡＶキャプシド中にシングルトンの不存在が決定されれば、ＡＡＶは既知の技術に従いベクターを生成するために使用することができる。
【００４４】
核酸もしくはそのフラグメントを指す場合、「実質的相同性」もしくは「実質的類似性」という用語は、適切なヌクレオチドの挿入もしくは欠失を伴い別の核酸（もしくはその相補鎖）と至適に整列した場合に、該整列した配列の少なくとも約９５〜９９％にヌクレオチド配列の同一性が存在することを示す。好ましくは、相同性は、完全長配列、もしくはその１オープンリーディングフレーム、または少なくとも１５ヌクレオチド長である別の適するフラグメントにわたる。適するフラグメントの例が本明細書に記載される。
【００４５】
核酸配列の情況での「配列の同一性」「配列の同一性パーセント」もしくは「同一性パーセント」という用語は、最大の対応のため整列した場合に同じである２配列中の残基を指す。配列の同一性の比較の長さは、ゲノムの完全長、遺伝子コーディング配列の完全長にわたることができ、または少なくとも約５００ないし５０００ヌクレオチドのフラグメントが望ましい。しかし例えば少なくとも約９ヌクレオチド、通常少なくとも約２０〜２４ヌクレオチド、少なくとも約２８〜３２ヌクレオチド、少なくとも約３６以上のヌクレオチドのより小さいフラグメント間の同一性もまた望ましいかもしれない。
【００４６】
アミノ酸もしくはそれらのフラグメントを指す場合の「実質的相同性」もしくは「実質的類似性」という用語は、適切なアミノ酸の挿入もしくは欠失を伴い別のアミノ酸（もしくはその相補鎖）と至適に整列した場合に、整列した配列の少なくとも約９５〜約９９％の、そして特定の態様では整列した配列の約９７％のアミノ酸配列の同一性が存在することを示す。好ましくは、相同性は完全長配列、もしくはその１タンパク質、例えばｃａｐタンパク質、ｒｅｐタンパク質、または長さが少なくとも８アミノ酸、もしくはより望ましくは少なくとも１５アミノ酸であるそのフラグメントにわたる。適するフラグメントの例が本明細書に記載される。
【００４７】
「高度に保存された」という用語により、少なくとも８０％の同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一性、およびより好ましくは９７％を超える同一性を意味する。同一性は、当業者により既知のアルゴリズムおよびコンピュータプログラムを用いることにより当業者により容易に決定される。
【００４８】
「血清型」という用語は、他のＡＡＶ血清型と血清学的に異なるキャプシドを有するＡＡＶに関する差違である。血清学的特殊性は、他のＡＡＶと比較して該ＡＡＶに対する抗体間の交差反応性の欠如に基づき決定される。交差反応性は典型的には中和抗体アッセイで測定する。このアッセイのためには、ウサギもしくは他の適する動物モデルでアデノ随伴ウイルスを使用して特定のＡＡＶに対するポリクローナル血清を生成させる。このアッセイでは、特異的ＡＡＶに対し生成させた血清をその後、同一（同種）もしくは異種いずれかのＡＡＶを中和するその能力において試験する。５０％中和を達成する希釈を中和抗体力価とみなす。２つのＡＡＶについて、同種の力価により除算した異種の力価の商が相反する様式で１６より低い場合は、それら２種のベクターは同一血清型とみなす。逆に、同種の力価に対する異種の力価の比が相反する様式で１６もしくはそれより多くである場合、該２種のＡＡＶは異なる血清型とみなす。
【００４９】
さらなる態様では、本発明はｒｈ．２０、ｒｈ．３２／３３、ｒｈ．３９、ｒｈ．４６、ｒｈ．７３およびｒｈ．７４を含む新規キャプシドを有するＡＡＶを提供する。ｒｈ．２０の配列は配列番号１のアミノ酸配列、または配列番号１の完全長にわたり９５〜９９％同一の配列を有する。ｒｈ．３２／３３のキャプシドは配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号２の完全長にわたりそれに９５〜９９％同一の配列を有する。ｒｈ．３９の
キャプシドは配列番号３のアミノ酸配列、または配列番号３の完全長にわたりそれに９５〜９９％同一の配列を有する。ｒｈ．４６のキャプシドは配列番号４のアミノ酸配列、または配列番号４の完全長にわたりそれに９５〜９９％同一の配列を有する。ｒｈ．７３のキャプシドは配列番号５のアミノ酸配列、または配列番号５の完全長にわたりそれに９５〜９９％同一の配列を有する。ｒｈ．７４のキャプシドは配列番号６のアミノ酸配列、または配列番号６の完全長にわたりそれに９５〜９９％同一の配列を有する。好ましくはこれら新規ＡＡＶキャプシドの配列同一性は、いかなるシングルトンも欠くようなものである。新規ＡＡＶの配列は、配列表に提供される。
【００５０】
さらに別の態様では、本発明の新規ＡＡＶ配列にはシングルトン補正（ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ−ｃｏｒｒｅｃｔｅｄ）ＡＡＶキャプシドタンパク質およびこれらキャプシドタンパク質をコードする配列を含む。適切なシングルトン補正ＡＡＶ配列の例には、ＡＡＶ６．１、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ６．１．２、ｒｈ．８Ｒ、ｒｈ．４８．１、ｒｈ．４８．２、ｒｈ．４８．１．２、ｈｕ．４４Ｒ１、ｈｕ．４４Ｒ２ｈｕ．４４Ｒ３、ｈｕ．２９Ｒ、ｃｈ．５Ｒ１、ｒｈ．６７、ｒｈ．５４、ｈｕ．４８Ｒ１、ｈｕ．４８Ｒ２およびｈｕ．４８Ｒ３を含む。例えばＡＡＶ６．１、ＡＡＶ６．２およびＡＡＶ６．１２を含むシングルトン補正ＡＡＶ６は、親のＡＡＶ６配列よりも有意に機能が改善されたことを示した。
【００５１】
特に望ましいタンパク質には、上に確認したヌクレオチド配列によりコードされるＡＡＶキャプシドタンパク質を含む。ＡＡＶキャプシドは、選択的スプライスバリアントである３つのタンパク質、ｖｐ１、ｖｐ２およびｖｐ３からなる。キャプシドタンパク質の他の望ましいフラグメントは、超可変領域（ＨＶＲ）間に位置する定常および可変領域を含む。キャプシドタンパク質の他の望ましいフラグメントには、ＨＶＲ自体を含む。
【００５２】
ＡＡＶ２中の配列の異なる領域を決定するために開発されたアルゴリズムは１２個の超可変領域（ＨＶＲ）を生じ、そのうち５個は４種の以前に記述された可変領域と重複するかもしくはそれらの一部である。［Ｃｈｉｏｒｉｎｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ、７３：１３０９−１９（１９９９）；Ｒｕｔｌｅｄｇｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７２：３０９−３１９］このアルゴリズムおよび／若しくは本明細書に記述されるアライメント技術を使用して、新規ＡＡＶ血清型のＨＶＲを決定する。例えば、該ＨＶＲは以下のとおり配置される。すなわち、ＨＶＲ１、ａａ１４６−１５２；ＨＶＲ２、ａａ１８２−１８６；ＨＶＲ３、ａａ２６２−２６４；ＨＶＲ４、ａａ３８１−３８３；ＨＶＲ５、ａａ４５０−４７４；ＨＶＲ６、ａａ４９０−４９５；ＨＶＲ７、ａａ５００−５０４；ＨＶＲ８、ａａ５１４−５２２；ＨＶＲ９、ａａ５３４−５５５；ＨＶＲ１０、ａａ５８１−５９４；ＨＶＲ１１、ａａ６５８−６６７；およびＨＶＲ１２、ａａ７０５−７１９［番号付け体系は、ＡＡＶ２  ｖｐ１を参照の点として使用するアライメントに基づく］。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｘプログラムをデフォルトの設定で使用して実施した本明細書に提供されるアライメントを使用して、または、他の商業的にもしくは公的に入手可能なアライメントプログラムを本明細書に記述されるようなデフォルトの設定で使用して、当業者は、本発明の新規ＡＡＶキャプシドの対応するフラグメントを容易に決定し得る。
【００５３】
適切には、フラグメントは少なくとも８アミノ酸長である。しかし他の望ましい長さのフラグメントも容易に利用することができる。そのようなフラグメントは組換え的または例えば化学合成によるような他の適切な手段により生産することができる。
【００５４】
本発明はさらに、本明細書に提供される配列情報を使用して同定される他のＡＡＶ配列を提供する。例えば、本明細書に提供される配列を仮定すれば、ゲノム歩行技術（ｇｅｎｏｍｅ  ｗａｌｋｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（Ｓｉｅｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２３：１０８７−１０８８、Ｆｒｉｅｚｎｅｒ−Ｄｅｇｅｎら、１９８６、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：６９７２
−６９８５、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カリフォルニア州パロアルト）を使用して、感染源を単離しうる。ゲノム歩行は、本発明の方法により同定される新規配列に隣接する配列を同定および単離するのにとりわけよく適する。本技術は、本明細書に提供される新規ＡＡＶキャプシドおよびｒｅｐ配列に基づいて新規ＡＡＶの逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）を単離するためにもまた有用である。
【００５５】
新規ＡＡＶアミノ酸配列、ペプチドおよびタンパク質は、本発明のＡＡＶ核酸配列から発現させることができる。さらにこれらのアミノ酸配列は、ペプチドおよびタンパク質は、例えば化学合成により、他の合成技術により、もしくは他の方法を包含する当該技術分野で既知の他の方法により生成することができる。本明細書に提供されるいずれのＡＡＶキャプシドの配列も、多様な技術を使用して容易に生成することができる。
【００５６】
適する製造後術は当業者に公知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，モレキュラークローニング：ア  ラボラトリーマニュアル、コールドスプリングハーバー出版（コールドスプリングハーバー、ニューヨーク）を参照されたい。あるいは、ペプチドは公知の固相ペプチド合成法（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、８５：２１４９（１９６２）；ＳｔｅｗａｒｔとＹｏｕｎｇ、Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｆｒｅｅｍａｎ、サンフランシスコ、１９６９）ｐｐ．２７−６２）によってもまた合成することができる。これらおよび他の適する製造方法は当業者の知識内にあり、そして本発明で制限しない。
【００５７】
本発明の配列、タンパク質およびフラグメントは、組換え製造、化学合成もしくは他の合成手段を包含するいずれの適する手段によっても製造し得る。こうした製造方法は当業者の知識内にありかつ本発明で制限しない。
【００５８】
ＩＩＩ．新規ＡＡＶキャプシドをもつｒＡＡＶの生産
本発明は、シングルトンを同定するための本発明の方法を使用した後、突然変異により生成される新規ＡＡＶキャプシド配列を包含する。本発明はさらに新規ＡＡＶｒｈ．２０、ｒｈ．３２／３３、ｒｈ．３９、ｒｈ．４６、ｒｈ．７３およびｒｈ．７４キャプシド配列［配列番号１〜６］を包含する。
【００５９】
別の観点では、本発明は、異種遺伝子もしくは他の核酸配列の標的細胞への送達において有用なウイルスベクターの生産のためにそれらのフラグメントを包含する本発明の新規ＡＡＶ配列を利用する分子を提供する。
【００６０】
ＡＡＶ配列を含有する本発明の分子は、宿主細胞に送達され得るいかなる遺伝要素（ベクター）、例えば、その上で運搬される配列を移入する裸のＤＮＡ、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、エピソーム、ウイルス以外の送達ベヒクル（例えば脂質に基づく担体）中のタンパク質、ウイルスなども包含する。
【００６１】
選択されたベクターは、トランスフェクション、電気穿孔法、リポソーム送達、膜融合技術、高速ＤＮＡ被覆ペレット、ウイルス感染およびプロトプラスト融合を包含するいずれの適する方法によっても送達し得る。本発明のいずれの態様を構築するのに使用する方法も、核酸操作の当業者に既知であり、そして遺伝子工学、組換え工学および合成技術を包含する。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、モレキュラークローニング、ア  ラボラトリーマニュアル、コールドスプリングハーバー出版、ニューヨーク州コールドスプリングハーバーを参照されたい。
【００６２】
一態様において、本発明のベクターは、とりわけ、本発明のＡＡＶキャプシドもしくはそのフラグメントをコードする配列を含有する。別の態様において、本発明のベクターは
少なくともＡＡＶ  ｒｅｐタンパク質もしくはそのフラグメントをコードする配列を含有する。場合によっては、本発明のベクターはＡＡＶ  ｃａｐおよびｒｅｐタンパク質双方を含有しうる。ＡＡＶ  ｒｅｐおよびｃａｐ双方が提供されるベクターにおいて、ＡＡＶｒｅｐおよびＡＡＶ  ｃａｐ配列は同じクレードのＡＡＶから発し得る。あるいは、本発明は、ｒｅｐ配列がｃａｐ配列を提供しているＡＡＶ供給源と異なるＡＡＶ供給源に由来するベクターを提供する。一態様において、ｒｅｐおよびｃａｐ配列は別個の供給源（例えば別個のベクター、もしくは宿主細胞およびベクター）から発現される。別の態様において、これらのｒｅｐ配列は、異なるＡＡＶ供給源のｃａｐ配列にインフレームで融合されてキメラＡＡＶベクターを形成する。場合によっては、本発明のベクターは本発明のＡＡＶキャプシドにパッケージングされたベクターである。これらのベクター、および本明細書に記述される他のベクターは、ＡＡＶ  ５’ＩＴＲおよびＡＡＶ  ３’ＩＴＲにより挟まれる選択された導入遺伝子を含んでなるミニ遺伝子をさらに含むことができる。
【００６３】
従って一態様において、本明細書に記述されるベクターは、単一のＡＡＶ配列からでありうる無傷のＡＡＶキャプシドをコードする核酸配列を含有する。あるいはこれらのベクターは、異種ＡＡＶもしくはＡＡＶ以外のキャプシドタンパク質（またはそれらのフラグメント）に融合されたシングルトン補正ＡＡＶキャプシドの１もしくは複数のフラグメントを含有する人工的キャプシドをコードする配列を含有する。これらの人工的キャプシドタンパク質は、シングルトン補正キャプシドの連続しない部分もしくは他のＡＡＶのキャプシドから選択される。これらの改変は、選択された発現系において、または別の所望の目的上（例えば向性を変える、すなわち中和抗体のエピトープを変える）、発現、収量を上げ、かつ／または精製を向上させるはずでありうる。
【００６４】
本明細書に記述されるベクター、例えばプラスミドは多様な目的上有用であるが、しかし、ＡＡＶ配列もしくはそれらのフラグメントを含んでなるキャプシドを含有するｒＡＡＶの製造における使用にとりわけ良好に適する。ｒＡＡＶを包含するこれらのベクター、それらの要素、構築および用途は本明細書に詳細に記述される。
【００６５】
一つの観点において、本発明は本発明のＡＡＶキャプシドを有する組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の生成方法を提供する。こうした方法には、本明細書で定義する本発明の新規ＡＡＶキャプシドタンパク質もしくはそのフラグメント；機能的ｒｅｐ遺伝子；少なくともＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）および導入遺伝子から構成されるミニ遺伝子；ならびに該ミニ遺伝子のＡＡＶ９／ＨＵ．１４キャプシドタンパク質中へのパッケージングを可能にするのに十分なヘルパー機能をコードする核酸配列を含有する宿主細胞を培養することが関与する。
【００６６】
ＡＡＶミニ遺伝子をＡＡＶキャプシドにパッケージングするために宿主細胞中で培養されることが必要とされる成分は、宿主細胞にｔｒａｎｓで供給しうる。あるいは、必要とされる成分（例えばミニ遺伝子、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列および／もしくはヘルパー機能）の１もしくは複数は、必要とされる成分の１もしくは複数を含有するように当業者に既知の方法を使用して工作された安定な宿主細胞により提供しうる。最適には、こうした安定な宿主細胞は誘導可能なプロモーターの制御下に必要とされる成分（１もしくは複数）を含有することができる。しかし該必要とされる成分（１もしくは複数）は、構成的プロモーターの制御下にあり得る。適する誘導可能なおよび構成的プロモーターの例は、導入遺伝子との使用に適する調節エレメントの考察で本明細書に提供される。なお別の代替において、選択された安定な宿主細胞は、構成的プロモーターの制御下の選択された成分（１もしくは複数）および１もしくは複数の誘導可能なプロモーターの制御下の他の選択された成分（１もしくは複数）を含有しうる。例えば、２９３細胞（構成的プロモーターの制御下にＥ１ヘルパー機能を含有する）由来であるがしかし誘導可能なプロモーターの制御下にｒｅｐおよび／もしくはｃａｐタンパク質を含有する安定な宿主細胞を生成するこ
とができる。さらに他の安定な宿主細胞を当業者により生成することができる。
【００６７】
本発明のｒＡＡＶを生産するために必要とされるミニ遺伝子、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列およびヘルパー機能は、その上で運搬される配列を移入するいずれかの遺伝要素の形態でパッケージング宿主細胞に送達することができる。選択された遺伝要素は、本明細書に記述されるものを包め、いずれの適する方法により送達し得る。本発明のいずれの態様を構築するのに使用される方法も核酸操作の当業者に既知であり、そして遺伝子工学、組換え工学および合成技術を包む。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、モレキュラークローニング：ア  ラボラトリーマニュアル、コールドスプリングハーバー出版、ニューヨーク州コールドスプリングハーバーを参照されたい。同様に、ｒＡＡＶビリオンの生成方法は公知であり、そして適する方法の選択は本発明に対する制限でない。例えばＫ．Ｆｉｓｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７０：５２０−５３２（１９９３）および米国特許第５，４７８，７４５号明細書を参照されたい。
【００６８】
他に明記されない限り、ＡＡＶ  ＩＴＲおよび本明細書に記載する他の選択されたＡＡＶ成分は、限定するわけではないがＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ９および本発明の他の新規ＡＡＶ配列の１種を包含するいかなるＡＡＶの中からも容易に選択しうる。これらのＩＴＲもしくは他のＡＡＶ成分は、当業者に利用可能な技術を使用してＡＡＶ配列から容易に単離することができる。こうしたＡＡＶは単離しうるか、または学術的、商業的もしくは公的な供給源（例えばバージニア州マナサスのアメリカンタイプカルチャーコレクション）から得ることができる。あるいは、ＡＡＶ配列は、文献、または例えばＧｅｎＢａｎｋ（商標）、ＰｕｂＭｅｄ（商標）などのようなデータベースで入手可能であるような公表された配列を参照することにより、合成もしくは他の適する手段により得ることができる。
【００６９】
Ａ．ミニ遺伝子
ミニ遺伝子は、少なくとも導入遺伝子およびその制御配列（または調節配列）、ならびに５’および３’のＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）から構成される。望ましい一態様において、ＡＡＶ血清型２のＩＴＲを使用する。しかしながら他の適する供給源からのＩＴＲを選択することもできる。キャプシドタンパク質にパッケージングされかつ選択された宿主細胞に送達されるのはこのミニ遺伝子である。
【００７０】
１．導入遺伝子
導入遺伝子は、目的のポリペプチド、タンパク質もしくは他の産物をコードする、導入遺伝子を挟むベクター配列に対し異種の核酸配列である。核酸コーディング配列は、宿主細胞中での導入遺伝子の転写、翻訳および／もしくは発現を可能にする様式で調節成分に操作可能に連結される。
【００７１】
導入遺伝子配列の組成は、生じるベクターが投入されるであろう使用に依存する。例えば、１つの型の導入遺伝子配列には、発現に際して検出可能なシグナルを生じるレポーター配列を包含する。こうしたレポーター遺伝子には、限定するわけではないがそれに向けられた高親和性抗体が存在するかもしくは通例の手段により製造され得るβ−ラクタマーゼ、β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、アルカリホスファターゼ、チミジンキナーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、強化ＧＦＰ（ＥＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、例えばＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８を包含する膜結合タンパク質、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質および当該技術分野で公知の他のもの、ならびにとりわけヘマグルチニンもしくはＭｙｃからの抗原タグドメインに適切に融合された膜結合タンパク質を含んでなる融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を包含する。
【００７２】
これらのコーディング配列は、それらの発現を駆動する調節エレメントと会合される場合に、酵素、Ｘ線撮影、比色、蛍光もしくは他の分光学的アッセイ、蛍光標示式細胞分取アッセイ、ならびに酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）および免疫組織化学を包含する免疫学的アッセイを包含する通例の手段により検出可能なシグナルを提供する。例えば、マーカー配列がＬａｃＺ遺伝子である場合、該シグナルを運搬するベクターの存在はベータ−ガラクトシダーゼ活性についてのアッセイにより検出される。導入遺伝子が緑色結合タンパク質もしくはルシフェラーゼである場合、該シグナルを運搬するベクターは、ルミノメーターで色もしくは光の産生により視覚的に測定しうる。
【００７３】
しかしながら望ましくは、導入遺伝子はタンパク質、ペプチド、ＲＮＡ、酵素、ドミナントネガティブ変異体もしくは触媒的ＲＮＡのような生物学および医学で有用である産物をコードするマーカー以外の配列である。所望のＲＮＡ分子は、ｔＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、触媒的ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、小分子ヘアピン型ＲＮＡ、トランス−スプライシングＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡを包含する。有用なＲＮＡ配列の一例は、処置した動物で標的とされた核酸配列の発現を阻害もしくは消失させる配列である。典型的には、適する標的配列は腫瘍学的標的およびウイルス性疾患を包含する。こうした標的の例については、以下の免疫原に関する章にて同定される腫瘍学的標的およびウイルスを参照されたい。
【００７４】
導入遺伝子は、正常な遺伝子が正常レベルより少なく発現されている欠損、または機能的遺伝子産物が発現されない欠損を包含しうる遺伝子欠損を是正もしくは改善するのに使用することができる。あるいは、導入遺伝子は、該細胞型もしくは宿主中で本来発現されない産物を細胞に提供しうる。好ましい型の導入遺伝子配列は、宿主細胞中で発現される治療用タンパク質もしくはポリペプチドをコードする。さらに本発明は、複数の導入遺伝子を使用することを包含する。特定の状況では、１タンパク質の各サブユニットをコードするために、または異なるペプチドもしくはタンパク質をコードするために異なる導入遺伝子を使用することができる。これはタンパク質サブユニットをコードするＤＮＡのサイズが大きい場合、例えば免疫グロブリン、血小板由来増殖因子もしくはジストロフィンタンパク質に望ましい。細胞が多サブユニットタンパク質を産生するためには、異なるサブユニットのそれぞれを含有する組換えウイルスに細胞を感染させる。あるいはタンパク質の異なるサブユニットを同じ導入遺伝子によりコードすることができる。この場合、単一の導入遺伝子がサブユニットのそれぞれをコードするＤＮＡを含み、各サブユニットのＤＮＡは配列内リボザイム進入部（ＩＲＥＳ）により分離される。これは、サブユニットのそれぞれをコードするＤＮＡのサイズが小さい、例えばサブユニットおよびＩＲＥＳをコードするＤＮＡのサイズの合計が５キロ塩基対未満である場合に望ましい。ＩＲＥＳに対する一代替として、ＤＮＡは、翻訳後反応（ｅｖｅｎｔ）で自己切断する２Ａペプチドをコードする配列により分離し得る。例えば、Ｍ．Ｌ．Ｄｏｎｎｅｌｌｙら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、７８（Ｐｔ  １）：１３−２１（１９９７年１月）；Ｆｕｒｌｅｒ，Ｓ．ら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、８（１１）：８６４−８７３（２００１年６月）；Ｋｌｕｍｐ  Ｈ．ら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、８（１０）：８１１−８１７（２００１年５月）を参照されたい。この２ＡペプチドはＩＲＥＳより有意により小さく、空間が制限要因である使用にそれを良好に適するようにする。さらにしばしば、導入遺伝子が大きく多サブユニットよりなるか、または２種の導入遺伝子を共送達する場合、所望の導入遺伝子（１種もしくは複数）またはサブユニットを運搬するｒＡＡＶを同時投与して、それらをｉｎ  ｖｉｖｏで鎖状体化させて単一のベクターゲノムを形成させる。こうした一態様において、第一のＡＡＶは単一の導入遺伝子を発現する発現カセットを運搬することができ、そして第二のＡＡＶは、宿主細胞中での共発現のための異なる導入遺伝子を発現する発現カセットを運搬することができる。しかし選択された導入遺伝子は、いかなる生物学的活性産物もしくは他の産物、例えば研究に所望の産物もコードすることができる。
【００７５】
適する導入遺伝子は当業者により容易に選択されうる。導入遺伝子の選択は本発明の制限であると考えられない。
【００７６】
２．調節要素
ミニ遺伝子について上で同定された主要素に加え、ベクターは該プラスミドベクターでトランスフェクトしたか、もしくは本発明により生産したウイルスに感染させた細胞中での導入遺伝子の転写、翻訳および／もしくは発現を可能にする様式で導入遺伝子に操作可能に連結されている通例の調節領域も包含する。本明細書で使用される「操作可能に連結されている」配列は、目的の遺伝子と連続する発現制御配列、およびｔｒａｎｓでもしくは離れて作用して目的の遺伝子を制御する発現制御配列の双方を包含する。
【００７７】
発現制御配列は、適切な転写開始、終止、プロモーターおよびエンハンサー配列；スプライシングおよびポリアデニル化（ポリＡ）シグナルのような効率的ＲＮＡプロセシングシグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を高める配列（すなわちコザックコンセンサス配列）；タンパク質の安定性を高める配列；ならびに、所望の場合はコードされる産物の分泌を高める配列を包含する。生来、構成的、誘導可能および／もしくは組織特異的であるプロモーターを包含する多数の発現制御配列が当該技術分野で知られ、しかも利用することができる。
【００７８】
構成的プロモーターの例は、限定するわけではないがレトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（場合によってはＲＳＶエンハンサーを伴う）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（場合によってはＣＭＶエンハンサーを伴う）［例えばＢｏｓｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ、４１：５２１−５３０（１９８５）を参照されたい］、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸還元酵素プロモーター、β−アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、およびＥＦ１プロモーター［インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）］を包含する。誘導可能なプロモーターは遺伝子発現の調節を可能にし、そして外的に供給される化合物、温度のような環境因子、または特定の生理学的状態（例えば急性期、細胞の特定の分化状態、もしくは複製細胞のみの中）の存在により調節し得る。誘導可能なプロモーターおよび誘導可能な系は、限定するわけではないがインビトロジェン、クローンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）およびアライド（Ａｒｉａｄ）を含む多様な商業的供給元から入手可能である。多くの他の系が記載され、そして当業者により容易に選択され得る。外的に供給される化合物により調節される誘導可能なプロモーターの例は、亜鉛で誘導可能なヒツジメタロチオニン（ＭＴ）プロモーター、デキサメサゾン（Ｄｅｘ）で誘導可能なマウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター系［国際特許公開第ＷＯ  ９８／１００８８号明細書］；エクジソン昆虫プロモーター［Ｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３：３３４６−３３５１（１９９６）］、テトラサイクリンで抑制可能な系［Ｇｏｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：５５４７−５５５１（１９９２）］、テトラサイクリンで誘導可能な系［Ｇｏｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６８：１７６６−１７６９（１９９５）、またＨａｒｖｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、２：５１２−５１８（１９９８）も参照されたい］、ＲＵ４８６で誘導可能な系［Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１５：２３９−２４３（１９９７）およびＷａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、４：４３２−４４１（１９９７）］、ならびにラパマイシンで誘導可能な系［Ｍａｇａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１００：２８６５−２８７２（１９９７）］を包含する。この内容で有用でありうる他の型の誘導可能なプロモーターは、特定の生理学的状態（例えば温度、急性期、細胞の特定の分化状態、もしくは複製細胞のみの中）により調節されるものである。
【００７９】
別の態様において、導入遺伝子の本来のプロモーターを使用することができる。本来のプロモーターは、導入遺伝子の発現が本来の発現を模倣すべきであることが望ましい場合に好ましくなり得る。本来のプロモーターは、導入遺伝子の発現が一時的にもしくは発達的に、または組織特異的様式で、あるいは特定の転写刺激に応答して調節されなければならない場合に使用され得る。さらなる態様では、エンハンサー要素、ポリアデニル化部位もしくはコザックコンセンサス配列のような他の本来の発現調節領域を、本来の発現を模倣するのにもまた使用しうる。
【００８０】
導入遺伝子の別の態様は、組織特異的プロモーターに操作可能に連結された遺伝子を包含する。例えば、骨格筋中での発現が望ましい場合は筋中で活性なプロモーターを使用すべきである。これらは、骨格β−アクチン、ミオシン軽鎖２Ａ、ジストロフィン、筋クレアチンキナーゼをコードする遺伝子からのプロモーター、ならびに天然に存在するプロモーターよりも高い活性をもつ合成の筋プロモーターを包含する（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１７：２４１−２４５（１９９９）を参照されたい）。組織特異的であるプロモーターの例は、とりわけ、肝（アルブミン、Ｍｉｙａｔａｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７１：５１２４−３２（１９９７）；Ｂ型肝炎ウイルスコアプロモーター、Ｓａｎｄｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、３：１００２−９（１９９６）；α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、Ａｒｂｕｔｈｎｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、７：１５０３−１４（１９９６））、骨オステオカルシン（Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．、２４：１８５−９６（１９９７））；骨シアロタンパク質（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．、１１：６５４−６４（１９９６））、リンパ球（ＣＤ２、Ｈａｎｓａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６１：１０６３−８（１９９８）；免疫グロブリン重鎖；Ｔ細胞受容体鎖）、神経特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター（Ａｎｄｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．、１３：５０３−１５（１９９３））、神経細糸軽鎖遺伝子（Ｐｉｃｃｉｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：５６１１−５（１９９１））、およびニューロン特異的ｖｇｆ遺伝子（Ｐｉｃｃｉｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，、Ｎｅｕｒｏｎ、１５：３７３−８４（１９９５））のような神経について既知である。
【００８１】
場合によっては、治療上有用な導入遺伝子を運搬するプラスミドは選択可能なマーカーもまた含んでもよく、またはレポーター遺伝子はとりわけジェネチシン、ハイグロマイシン若しくはピューリマイシン耐性をコードする配列を含むことができる。アンピシリン耐性のような、こうした選択可能なレポーターもしくはマーカー遺伝子（好ましくは本発明の方法によりレスキューされるためにウイルスゲノムの外側に配置される）を、細菌細胞中のプラスミドの存在を知らせるために使用し得る。該プラスミドの他成分には複製起点を含んでもよい。これらおよび他のプロモーターおよびベクター要素の選択は通例であり、そして多くのこうした配列が利用可能である［例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，およびその中で引用される参考文献を参照されたい］。
【００８２】
導入遺伝子、プロモーター／エンハンサー、ならびに５’および３’のＡＡＶ  ＩＴＲの組み合わせは、言及の容易さのため本明細書で「ミニ遺伝子」と称される。本発明の教示とともに提供されるこうしたミニ遺伝子の設計は、通常の技術を用いることによりなし得る。
【００８３】
３．パッケージング宿主細胞へのミニ遺伝子の送達
ミニ遺伝子は、宿主細胞に送達される任意の適するベクター、例えばプラスミド上で運搬されることができる。本発明で有用なプラスミドは、それらが複製および場合によっては原核生物細胞、哺乳動物細胞、もしくは双方への組込みに適するように工作することが
できる。これらのプラスミド（もしくは５’ＡＡＶ  ＩＴＲ−異種分子−３’ＡＡＶ  ＩＴＲを運搬する他のベクター）は、真核生物および／もしくは原核生物中でのミニ遺伝子ならびにこれらの系の選択マーカーの複製を可能にする配列を含有する。選択可能なマーカーもしくはレポーター遺伝子は、とりわけ、ジェネチシン、ハイグロマイシンもしくはピューリマイシン耐性をコードする配列を含むことができる。該プラスミドは、アンピシリン耐性のような、細菌細胞中のベクターの存在を知らせるために使用し得るある種の選択可能なレポーターもしくはマーカー遺伝子もまた含んでよい。プラスミドの他成分は複製起点、およびエプスタイン−バーウイルスの核抗原を使用するアンプリコン系のようなアンプリコンを含むことができる。このアンプリコン系もしくは他の類似のアンプリコン成分は、細胞中での高コピーのエピソーム複製を可能にする。好ましくは、ミニ遺伝子を運搬する分子を細胞にトランスフェクトし、それはそこで一過性に存在し得る。あるいはミニ遺伝子（５’ＡＡＶ  ＩＴＲ−異種分子−３’ＡＡＶ  ＩＴＲを運搬する）は、染色体にもしくはエピソームとしてのいずれかで宿主細胞のゲノムに安定に組込まれ得る。特定の態様において、ミニ遺伝子は、場合によっては頭から頭、頭から尾もしくは尾から尾の鎖状体で複数コピーで存在することができる。適するトランスフェクション技術は既知であり、そして宿主細胞にミニ遺伝子を送達するために容易に利用することができる。
【００８４】
一般に、ミニ遺伝子を含んでなるベクターをトランスフェクションにより送達する場合、該ベクターは、約５μｇから約１００μｇまでのＤＮＡ、約１０μｇないし約５０μｇのＤＮＡの量で、約１×１０4細胞ないし約１×１０13細胞、もしくは約１×１０5細胞に送達する。しかしながら、宿主細胞に対するベクターＤＮＡの相対量は、選択したベクター、送達方法および選択した宿主細胞のような因子を考慮に入れて当業者により調節され得る。
【００８５】
Ｂ．ＲｅｐおよびＣａｐ配列
ミニ遺伝子に加え、宿主細胞は宿主細胞中での本発明の新規ＡＡＶキャプシドタンパク質（もしくはそのフラグメントを含んでなるキャプシドタンパク質）の発現を駆動する配列、およびミニ遺伝子中で見出されるＡＡＶ  ＩＴＲの供給源もしくは交差相補する供給源と同一の供給源のｒｅｐ配列を含有する。ＡＡＶのｃａｐおよびｒｅｐ配列は、上記ＡＡＶ供給源から独立に得ることができ、そして、上記の当業者に既知のいずれかの様式で宿主細胞に導入することができる。加えてＡＡＶベクターをシュードタイピングする場合、必須なｒｅｐタンパク質のそれぞれをコードする配列を異なるＡＡＶ供給源（例えばＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９）により供給しうる。例えば、ｒｅｐ７８／６８配列はＡＡＶ２に由来することができ、一方、ｒｅｐ５２／４０配列はＡＡＶ８に由来するものでよい。
【００８６】
一態様において、宿主細胞は、上記のもののような適切なプロモーターの制御下にキャプシドタンパク質を安定に含有する。この態様において最も望ましくは、キャプシドタンパク質が誘導可能なプロモーターの制御下で発現される。別の態様では、キャプシドタンパク質はｔｒａｎｓで宿主細胞に供給される。宿主細胞にｔｒａｎｓで送達される場合、キャプシドタンパク質は、選択されたキャプシドタンパク質の宿主細胞中での発現を指図するのに必要な配列を含有するプラスミドを介して送達され得る。最も望ましくは、宿主細胞にｔｒａｎｓで送達される場合、キャプシドタンパク質を運搬するプラスミドはｒＡＡＶをパッケージングするのに必要とされる他の配列、例えばｒｅｐ配列もまた運搬する。
【００８７】
別の態様において、宿主細胞は、上記のもののような適するプロモーターの制御下にｒｅｐ配列を安定に含有する。この態様において最も望ましくは、必須のｒｅｐタンパク質が誘導可能なプロモーターの制御下に発現される。別の態様では、ｒｅｐタンパク質はｔｒａｎｓで宿主細胞に供給される。宿主細胞にｔｒａｎｓで送達される場合、ｒｅｐタン
パク質は、選択されたｒｅｐタンパク質の宿主細胞中での発現を指図するのに必要な配列を含有するプラスミドを介して送達され得る。最も望ましくは、宿主細胞にｔｒａｎｓで送達される場合、キャプシドタンパク質を運搬するプラスミドはｒＡＡＶをパッケージングするのに必要とされる他の配列、例えばｒｅｐおよびｃａｐ配列もまた運搬する。
【００８８】
このように一態様において、ｒｅｐおよびｃａｐ配列は、単一の核酸分子上で宿主細胞にトランスフェクトされることができ、そして該細胞中で１個のエピソームとして安定に存在しうる。別の態様において、ｒｅｐおよびｃａｐ配列は細胞の染色体中に安定に組み込まれる。別の態様は、宿主細胞中で一過性に発現されるｒｅｐおよびｃａｐ配列を有する。例えばこうしたトランスフェクションのための有用な核酸分子は、５’から３’へ、プロモーター、プロモーターとｒｅｐ遺伝子配列の開始部位との間に挿入された任意のスペーサー、ＡＡＶ  ｒｅｐ遺伝子配列、およびＡＡＶ  ｃａｐ遺伝子配列を含んでなる。
【００８９】
場合によっては、ｒｅｐおよび／もしくはｃａｐ配列は、宿主細胞中に導入されるべきである他のＤＮＡ配列を含有する１ベクター上で供給することができる。例えば、ベクターはミニ遺伝子を含んでなるｒＡＡＶ構築物を含有し得る。ベクターは、ヘルパー機能をコードする遺伝子、例えばアデノウイルスタンパク質Ｅ１、Ｅ２ａおよびＥ４  ＯＲＦ６、ならびにＶＡＩ  ＲＮＡの遺伝子の１種もしくはそれより多くを含むことができる。
【００９０】
好ましくは、本構築物で使用されるプロモーターは、当業者に既知の、または上で検討した構成的、誘導可能なもしくは本来のプロモーターのいずれでよい。一態様において、ＡＡＶ  Ｐ５プロモーター配列を使用する。これらの配列のいずれかを提供するためのＡＡＶの選択は本発明を制限しない。
【００９１】
別の好ましい態様において、ｒｅｐのプロモーターは、導入遺伝子の調節要素に関して上で検討したような誘導可能なプロモーターである。ｒｅｐ発現のための１種の好ましいプロモーターはＴ７プロモーターである。Ｔ７プロモーターにより調節されるｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子を含んでなるベクターを、Ｔ７ポリメラーゼを構成的にもしくは誘導可能にのいずれかで発現する細胞にトランスフェクトもしくは形質転換する。１９９８年３月１２日公開の国際公開第９８／１００８８号パンフレットを参照されたい。
【００９２】
スペーサーはベクターの設計における任意の一要素である。スペーサーは、プロモーターとｒｅｐ遺伝子のＡＴＧ開始部位との間に挿入されるＤＮＡ配列である。スペーサーは任意の所望の設計を有してもよい。すなわち、それはヌクレオチドの無作為の配列でよく、あるいはそれはマーカー遺伝子のような遺伝子産物をコードしてもよい。スペーサーは開始／終止およびポリＡ部位を典型的に組み込む遺伝子を含有し得る。スペーサーは、原核生物もしくは真核生物に由来する非コーディングＤＮＡ配列、反復非コーディング配列、転写制御を伴わないコーティング配列もしくは転写制御を伴うコーディング配列でよい。スペーサー配列の２種の例示的供給源はファージラダー配列もしくは酵母ラダー配列であり、それらは例えばとりわけギブコ（Ｇｉｂｃｏ）もしくはインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から市販されている。スペーサーは、ｒｅｐ５２、ｒｅｐ４０およびｃａｐ遺伝子産物を正常レベルで発現されるままにしてｒｅｐ７８およびｒｅｐ６８遺伝子産物の発現を低下させるのに十分ないかなるサイズノものであってもよい。スペーサーの長さは、従って約１０ｂｐ〜約１０．０ｋｂｐまで、好ましくは約１００ｂｐ〜約８．０ｋｂｐの範囲の範囲にわたることができる。組換えの可能性を低下させるため、スペーサーは、好ましくは長さ２ｋｂｐ未満であるが；しかしながら、本発明はそのように制限されない。
【００９３】
ｒｅｐおよびｃａｐを提供する分子（１もしくは複数）は宿主細胞中に一過性に存在しうる（すなわちトランスフェクションにより）が、ｒｅｐおよびｃａｐタンパク質の一方
もしくは双方およびそれらの発現を制御するプロモーター（１もしくは複数）が、例えばエピソームとして、もしくは宿主細胞の染色体中への組み込みにより宿主細胞中で安定に発現されることが好ましい。本発明の態様を構築するために使用される方法は、上記参考文献に記載されるもののような通例の遺伝子工学もしくは組換え工学技術である。本明細は本明細書に提供される情報を使用して特定の構築物の具体的に説明する例を提供する一方、当業者は、スペーサー、Ｐ５プロモーター、および少なくとも１個の翻訳開始および終止シグナルを包含する他のエレメントの選択、ならびにポリアデニル化部位の任意の付加を使用して、他の適する構築物を選択し、そして設計することができる。
【００９４】
本発明の別の態様において、ｒｅｐもしくはｃａｐタンパク質は宿主細胞により安定に提供されうる。
【００９５】
Ｃ．ヘルパー機能
パッケージング宿主細胞は、本発明のｒＡＡＶをパッケージングするためにヘルパー機能をもまた必要とする。場合によっては、これらの機能はヘルペスウイルスにより供給され得る。最も望ましくは、必要なヘルパー機能は、上記されたものおよび／もしくはアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）、バージニア州マナサス（米国）を包含する多様な供給元から入手可能であるようなヒトもしくは非ヒトの霊長類のアデノウイルス源からそれぞれ提供される。現在好ましい一態様では、宿主細胞は、Ｅ１ａ遺伝子産物、Ｅ１ｂ遺伝子産物、Ｅ２ａ遺伝子産物、および／もしくはＥ４  ＯＲＦ６遺伝子産物が提供されかつ／もしくは含有する。宿主細胞はＶＡＩ  ＲＮＡのような他のアデノウイルス遺伝子を含有しうるが、しかしこれらの遺伝子は必要とされない。好ましい一態様において、他のアデノウイルス遺伝子もしくは遺伝子機能は宿主細胞中に存在しない。
【００９６】
「Ｅ１ａ遺伝子産物を発現するアデノウイルスＤＮＡ」により、それはＥ１ａもしくはいずれかの機能的Ｅ１ａ部分をコードするいかなるアデノウイルス配列も意味している。Ｅ２ａ遺伝子産物を発現するアデノウイルスＤＮＡおよびＥ４  ＯＲＦ６遺伝子産物を発現するアデノウイルスＤＮＡが同様に定義される。アデノウイルス遺伝子もしくはその機能的部分のいかなる対立遺伝子もしくは他の修飾もまた包含される。こうした修飾は、アデノウイルスの機能を何らかの様式で高めるための通例の遺伝子工学もしくは変異原性技術を用いて意図的に導入することができ、ならびにそれらの天然に存在する対立遺伝子バリアントでありうる。これらのアデノウイルス遺伝子の機能を達成するようにＤＮＡを操作するためのこうした修飾および方法は当業者に既知である。
【００９７】
アデノウイルスＥ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａおよび／もしくはＥ４ＯＲＦ６遺伝子産物、ならびにいずれかの他の所望のヘルパー機能は、細胞中でのそれらの発現を可能にするいずれの手段を使用しても提供し得る。これらの産物をコードする配列のそれぞれは別個のベクター上にありうるか、または１もしくは複数の遺伝子が同じベクター上にありうる。ベクターは、プラスミド、コスミドおよびウイルスを包含する当該技術分野で既知もしくは上で開示されたいずれかのベクターでありうる。ベクターの宿主細胞中への導入は、とりわけ、トランスフェクション、感染、電気穿孔法、リポソーム送達、膜融合技術、高速ＤＮＡ被覆ペレット、ウイルス感染およびプロトプラスト融合を包含する当該技術分野で既知もしくは上で開示されたところのいずれの手段によっても達成しうる。アデノウイルス遺伝子の１もしくは複数が宿主細胞のゲノム中に安定に組み込まれうるか、エピソームとして安定に発現されうるか、もしくは一過性に発現されうる。遺伝子産物は全部、エピソーム上で一過性に発現されうるか、もしくは安定に組込まれうるか、または遺伝子産物のいくつかが安定に発現されうる一方で他者が一過性に発現される。さらに、アデノウイルス遺伝子のそれぞれのプロモーターは、構成的プロモーター、誘導可能なプロモーターもしくは本来のアデノウイルスプロモーターから独立に選択しうる。プロモーターは、生物体もしくは細胞の特定の生理学的状態（すなわち分化状態により、または複製もしくは静
止期細胞で）により、あるいは例えば外的に添加した因子により調節することができる。
【００９８】
Ｄ．宿主細胞およびパッケージング細胞株
宿主細胞それ自体は、原核生物（例えば細菌）細胞、ならびに昆虫細胞、酵母細胞および哺乳動物細胞を含む真核生物細胞を包含する任意の生物学的生物体からも選択し得る。とりわけ望ましい宿主細胞は、限定するわけではないがＡ５４９、ＷＥＨ１、３Ｔ３、１０Ｔ１／２、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ、ＣＯＳ  １、ＣＯＳ  ７、ＢＳＣ  １、ＢＳＣ  ４０、ＢＭＴ  １０、ＶＥＲＯ、ＷＩ３８、ＨｅＬａ、２９３細胞（機能的アデノウイルスＥ１を発現する）、Ｓａｏｓ、Ｃ２Ｃ１２、Ｌ細胞、ＨＴ１０８０、ＨｅｐＧ２、ならびにヒト、サル、マウス、ラット、ウサギおよびハムスターを含む哺乳動物由来の初代線維芽細胞、肝細胞および筋芽細胞のような細胞を含む任意の哺乳動物種のなかから選択する。細胞を提供する哺乳動物種の選択は本発明を限定せず；また、哺乳動物細胞の型、すなわち繊維芽細胞、肝細胞、腫瘍細胞など限定しない。使用される細胞に対する要件は、それがＥ１、Ｅ２ａおよび／もしくはＥ４  ＯＲＦ６以外のいかなるアデノウイルス遺伝子も運搬せず；それがｒＡＡＶの産生の間に汚染するウイルスの相同的組換えをもたらし得るいかなる他のウイルス遺伝子も含有せず；そしてそれがＤＮＡの感染もしくはトランスフェクションおよびトランスフェクトされたＤＮＡの発現が可能であることである。好ましい態様では、宿主細胞は細胞中でｒｅｐおよびｃａｐが安定にトランスフェクトされているものである。
【００９９】
本発明で有用な一つの宿主細胞は、ｒｅｐおよびｃａｐをコードする配列で安定に形質転換され、かつアデノウイルスＥ１、Ｅ２ａおよびＥ４ＯＲＦ６  ＤＮＡならびに上記のミニ遺伝子を運搬する構築物でトランスフェクトされている宿主細胞である。Ｂ−５０（国際公開第９９／１５６８５号パンフレット）もしくは米国特許第５，６５８，７８５号明細書に記述されるもののような安定なｒｅｐおよび／もしくはｃａｐを発現する細胞株もまた同様に使用し得る。別の所望の宿主細胞は、Ｅ４  ＯＲＦ６を発現するのに十分である最少のアデノウイルスＤＮＡを含有する。なお他の細胞株を、本発明の新規シングルトン補正ＡＡＶｃａｐ配列を使用して構築することができる。
【０１００】
本発明の宿主細胞の調製は選択されたＤＮＡ配列の集成のような技術が関与する。この集成は慣習的技術を利用して達成しうる。こうした技術は、公知でありかつ上で引用されたＳａｍｂｒｏｏｋらに記載されるｃＤＮＡおよびゲノムクローニング、ポリメラーゼ連鎖反応と組合せたアデノウイルスおよびＡＡＶゲノムのオーバーラップオリゴヌクレオチド配列の使用、合成の方法、ならびに所望のヌクレオチド配列を提供する任意の他の適切な方法を包含する。
【０１０１】
宿主細胞中への（プラスミドもしくはウイルスとしての）分子の導入は、当業者に既知かつ本明細書を通じて検討される技術を使用してもまた達成しうる。好ましい態様において、標準的トランスフェクション技術、例えばＣａＰＯ4トランスフェクションもしくは電気穿孔法、および／またはヒト胎児由来腎臓細胞株ＨＥＫ２９３（ｔｒａｎｓに作用するＥ１タンパク質を提供する機能的アデノウイルスＥ１遺伝子を含有するヒト腎細胞株）のような細胞株中へのハイブリッドアデノウイルス／ＡＡＶベクターによる感染を使用する。
【０１０２】
当業者は、本発明の新規ＡＡＶ配列をこれらおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏもしくはｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子送達のための他のウイルスベクター系での使用に容易に適合させ得ることを理解するであろう。同様に、当業者は、多様なｒＡＡＶおよびｒＡＡＶ以外のベクター系での使用のために本発明のＡＡＶゲノムの他のフラグメントを容易に選択することができる。こうしたベクター系は、例えば、とりわけ例えばレンチウイルス、レトロウイルス、ポックスウイルス、ワクシニアウイルスおよびアデノウイルス系を包含
しうる。これらのベクター系の選択は本発明を制限しない。
【０１０３】
従って、本発明はさらに、本発明の新規ＡＡＶの核酸およびアミノ酸配列を使用して生成されるベクターを提供する。こうしたベクターは、治療的分子の送達およびワクチン処方での使用のためを包含する多様な目的上有用である。本発明の新規ＡＡＶのキャプシドを含有する組換えＡＡＶが治療的分子の送達にとりわけ望ましい。これら、もしくは本発明の新規ＡＡＶ配列を含有する他のベクター構築物を、ワクチン処方、例えばサイトカインの同時送達、もしくは免疫原それ自体の送達に使用しうる。
【０１０４】
ＩＶ．組換えウイルスおよびそれらの用途
本明細書に記載される技術を使用して、当業者は本発明のＡＡＶのキャプシドを有する、または本発明のＡＡＶの１もしくは複数のフラグメントを含有するキャプシドを有するｒＡＡＶを生成することができる。一態様において、シングルトン補正ＡＡＶからの完全長のキャプシドを利用し得る。
【０１０５】
Ａ．ウイルスの送達
別の観点では、本発明は、本発明のシングルトン補正ＡＡＶ（もしくはその機能的フラグメント）を用いて生成した組換えウイルスベクターで選択された宿主細胞をトランスフェクトもしくは感染させることが関与する、宿主への導入遺伝子の送達方法を提供する。送達方法は当業者に公知でありかつ本発明を制限しない。
【０１０６】
望ましい一態様において、本発明は宿主への導入遺伝子のＡＡＶに媒介される送達方法を提供する。本方法は、選択された導入遺伝子の発現を指図する配列の制御下に選択された導入遺伝子およびキャプシドの修飾されたタンパク質を含有する組換えウイルスベクターで、選択された宿主細胞をトランスフェクトもしくは感染させることが関与する。
【０１０７】
場合によっては、宿主からのサンプルを、選択されたＡＡＶ供給源（例えば血清型）に対する抗体の存在について最初にアッセイしてもよい。中和抗体を検出するための多様なアッセイ形式が当業者に公知である。このようなアッセイの選択は本発明を制限しない。例えば、Ｆｉｓｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．，３（３）：３０６−３１２（１９９７年３月）およびＷ．Ｃ．Ｍａｎｎｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、９：４７７−４８５（１９９８年３月１日）を参照されたい。このアッセイの結果を使用して、特定の供給源のキャプシドタンパク質を含有するどのＡＡＶベクターが送達に好ましいかを、例えばそのキャプシド供給源に特異的な中和抗体の不存在により決定することができる。
【０１０８】
本方法の一つの観点において、本発明のＡＡＶキャプシドタンパク質を含むベクターの送達は、異なるＡＡＶキャプシドタンパク質を含むベクターを介する遺伝子の送達に先行して、もしくはその後に続いてもよい。従って、ｒＡＡＶベクターを介する遺伝子送達を、選択された宿主細胞への反復遺伝子送達に使用しうる。望ましくは、その後投与されるｒＡＡＶベクターは第一のｒＡＡＶベクターと同じ導入遺伝子を運搬するが、しかしその後投与されるベクターは第一のベクターと異なる供給源（および好ましくは異なる血清型）のキャプシドタンパク質を含有する。例えば、第一のベクターがシングルトン補正キャプシドタンパク質を有する場合、その後投与されるベクターは他のＡＡＶのなかから、場合によっては別の血清型もしくは別のクレードから選択されるキャプシドタンパク質を有することができる。
【０１０９】
場合によっては、複数のｒＡＡＶベクターを使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏで鎖状体化して単一のベクターゲノムを形成するｒＡＡＶベクターの同時投与により大型の導入遺伝子もしくは複数の導入遺伝子を送達することができる。こうした一態様において、第一のＡＡ
Ｖは単一導入遺伝子（もしくはその１サブユニット）を発現する発現カセットを運搬することができ、そして、第二のＡＡＶは宿主細胞中での同時発現のため第二の導入遺伝子（もしくは異なるサブユニット）を発現する発現カセットを運搬しうる。第一のＡＡＶは多シストロン性の構築物の第一の一片（例えばプロモーターおよび導入遺伝子もしくはサブユニット）である発現カセットを運搬することができ、そして第二のＡＡＶは多シストロン性の構築物の第二の一片（例えば導入遺伝子もしくはサブユニットおよびポリＡ配列）である発現カセットを運搬しうる。多シストロン性の構築物のこれら二片がｉｎ  ｖｉｖｏで鎖状体化して、第一および第二のＡＡＶにより送達される導入遺伝子を共発現する単一のベクターゲノムを形成する。こうした態様では、第一の発現カセットを運搬するｒＡＡＶベクターおよび第二の発現カセットを運搬するｒＡＡＶベクターを単一の製薬学的組成物中で送達し得る。他の態様では、２以上のｒＡＡＶベクターが実質的に同時にまたは互いに直前もしくは後に投与しできる別個の製薬学的組成物として送達される。
【０１１０】
上記の組換えベクターは、公表された方法に従って宿主細胞に送達することができる。好ましくは生理学的に適合性の担体に懸濁したｒＡＡＶを、ヒトもしくは非ヒトの哺乳動物患者に投与し得る。適する担体は、移入ウイルスが向けられる適応症を鑑みて当業者により容易に選択され得る。例えば、一つの適する担体には、多様な緩衝溶液とともに配合できる生理的食塩水を包含する（例えばリン酸緩衝生理的食塩水）。他の例示的担体は、滅菌生理的食塩水、乳糖、ショ糖、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、寒天、ペクチン、ラッカセイ油、ゴマ油および水を包含する。担体の選択は本発明を制限しない。
【０１１１】
場合によっては本発明の組成物は、ｒＡＡＶおよび担体（１もしくは複数）に加え、保存剤もしくは化学的安定剤のような他の通例の製薬学的成分を含有してもよい。適する例示的保存剤はクロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化イオウ、没食子酸プロピル、パラベン類、エチルバニリン、グリセリン、フェノールおよびパラクロロフェノールを包含する。適する化学的安定剤はゼラチンおよびアルブミンを包含する。
【０１１２】
該ベクターは、細胞をトランスフェクトしかつ過度の有害な影響を伴わずにもしくは医学分野の当業者により決定され得る医学的に許容され得る生理学的効果を伴い治療上の利益を提供するのに十分なレベルの遺伝子導入および発現を提供するのに十分な量で投与される。慣習的および製薬学的に許容され得る投与経路には、限定するわけではないが所望の器官（例えば肝（場合によっては肝動脈を介して）もしくは肺）への直接送達、経口、吸入、鼻内、気管内、動脈内、眼内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内および他の非経口投与経路を挙げることができる。投与経路は所望の場合に組み合わせてもよい。
【０１１３】
ウイルスベクターの投薬用量は、主として処置されている状態、患者の齢、体重および健康状態のような因子に依存することができ、そして従って患者間で変動することができる。例えばウイルスベクターの治療上有効なヒトへの投薬用量は、一般に、約１×１０9から１×１０16までのゲノムウイルスベクターの濃度を含有する約０．１ｍＬから約１００ｍＬまでの溶液の範囲にある。大型の器官（例えば肝、筋、心および肺）への送達に好ましいヒト投薬用量は、約１ないし１００ｍＬの容量で１ｋｇあたり約５×１０10ないし５×１０13ＡＡＶゲノムでありうる。眼への送達に好ましい投薬用量は、約０．１ｍＬないし１ｍＬの容量で約５×１０9ないし５×１０12ゲノムコピーである。投薬用量は、いかなる副作用に対して治療上の利益の均衡を調節することができ、そしてこうした投薬量は組換えベクターを使用する治療的応用に依存して変動してよい。導入遺伝子の発現のレベルをモニターして、ウイルスベクター、好ましくはミニ遺伝子を含有するＡＡＶベクターをもたらす投薬頻度を決定することができる。場合によっては、治療の目的上記載されるものに類似の投薬用量計画を、本発明の組成物を使用する免疫感作に利用できる。
【０１１４】
本発明のＡＡＶ含有ベクターによる送達のための治療的生成物および免疫原性生成物の例を下に提供する。これらのベクターは、本明細書に記載する多様な治療もしくはワクチン処方に使用できる。加えて、これらのベクターは所望の治療および／もしくはワクチン処方中で１もしくは複数の他のベクターもしくは有効成分と組合せで送達してもよい。
【０１１５】
Ｂ．治療的導入遺伝子
導入遺伝子によりコードされる有用な治療用生成物には、限定するわけではないがインスリン、グルカゴン、成長ホルモン（ＧＨ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体化ホルモン（ＬＨ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、アンジオポエチン、アンジオスタチン、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インスリン成長因子ＩおよびＩＩ（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）、ＴＧＦα、アクチビン、インヒビンを包含するトランスフォーミング成長因子αスーパーファミリーのいずれか１種、もしくは骨形成タンパク質（ＢＭＰ）ＢＭＰ１〜１５のいずれか、成長因子のヘレグルイン／ニューレグリン／ＡＲＩＡ／ｎｅｕ分化因子（ＮＤＦ）ファミリーのいずれか１種、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィンＮＴ−３およびＮＴ−４／５、絨毛様神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アグリン、セマフォリン／コラプシンのファミリーのいずれか１種、ネトリン−１およびネトリン−２、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、エフリン、ノギン、ソニックヘッジホッグならびにチロシン加水分解酵素を制限なしに包含するホルモンならびに増殖および分化因子を包含する。
【０１１６】
他の有用な導入遺伝子産物は、限定するわけではないがトロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン（ＩＬ）ＩＬ−１からＩＬ−２５（例えばＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１２およびＩＬ−１８を包含する）、単球化学遊走物質タンパク質、白血病阻害因子、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、Ｆａｓリガンド、腫瘍壊死因子αおよびβ、インターフェロンα、βおよびγ、幹細胞因子、ｆｌｋ−２／ｆｌｔ３リガンドのようなサイトカインおよびリンホカインを包含する免疫系を調節するタンパク質を含む。免疫系により産生される遺伝子産物もまた本発明で有用である。これらには、限定するわけではないが免疫グロブリンＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥ、キメラ免疫グロブリン、ヒト化抗体、一本鎖抗体、Ｔ細胞受容体、キメラＴ細胞受容体、一本鎖Ｔ細胞受容体、クラスＩおよびクラスＩＩ  ＭＨＣ分子、ならびに工作された免疫グロブリンおよびＭＨＣ分子を含む。また有用な遺伝子産物は、補体調節タンパク質、膜補助因子タンパク質（ＭＣＰ）、崩壊促進因子（ＤＡＦ）、ＣＲ１、ＣＦ２およびＣＤ５９のような補体調節タンパク質も含む。
【０１１７】
さらに他の有用な遺伝子産物は、ホルモン、成長因子、サイトカイン、リンホカイン、調節タンパク質および免疫系タンパク質の受容体のいずれか１種を包含する。本発明は、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）受容体、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）受容体およびスカベンジャー受容体を包含するコレステロール調節および／または脂質調節のための受容体を包含する。また本発明は、グルココルチコイド受容体およびエストロゲン受容体、ビタミンＤ受容体ならびに他の核受容体を包含するステロイドホルモン受容体スーパーファミリーのメンバーのような遺伝子産物も包含する。加えて、有用な遺伝子産物は、ｊｕｎ、ｆｏｓ、ｍａｘ、ｍａｄ、血清応答因子（ＳＲＦ）、ＡＰ−１、ＡＰ２、ｍｙｂ、ＭｙｏＤおよびミオゲニン、ＥＴＳボックス含有タンパク質、ＴＦＥ３、Ｅ２Ｆ、ＡＴＦ１、ＡＴＦ２、ＡＴＦ３、ＡＴＦ４、ＺＦ５、ＮＦＡＴ、ＣＲＥＢ、ＨＮＦ−４、Ｃ／ＥＢＰ、ＳＰ１、ＣＣＡＡＴボックス結合タンパク質、インターフェロン調節因子（ＩＲＦ−１）、ウィルムス腫瘍タンパク質、ＥＴＳ
結合タンパク質、ＳＴＡＴ、ＧＡＴＡボックス結合タンパク質、例えばＧＡＴＡ−３、ならびに翼状らせんタンパク質のフォークヘッドファミリーのような転写因子を包含する。
【０１１８】
他の有用な遺伝子産物は、カルバモイル合成酵素１、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギノコハク酸合成酵素、アルギノコハク酸リアーゼ、アルギナーゼ、フマリルアセト酢酸加水分解酵素、フェニルアラニン水酸化酵素、α−１アンチトリプシン、グルコース−６−ホスファターゼ、ポルフォビリノーゲン脱アミノ酵素、シスタチオンβ−合成酵素、分枝状鎖ケト酸脱炭酸酵素、アルブミン、イソバレリル−ｃｏＡ脱水素酵素、プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ、メチルマロニルＣｏＡムターゼ、グルタリルＣｏＡ脱水素酵素、インスリン、β−グルコシダーゼ、ピルビン酸カルボキシレート、肝ホスホリラーゼ、ホスホリラーゼキナーゼ、グリシン脱炭酸酵素、Ｈ−プロテイン、Ｔ−プロテイン、嚢胞性線維症膜貫通調節因子（ＣＦＴＲ）配列、およびジストロフィン遺伝子産物［例えばミニもしくはミクロジストロフィン］を包含する。なお他の有用な遺伝子産物は、酵素の不足した活性から生じる多様な状態に有用である酵素補充療法で有用でとなり得るような酵素を包含する。例えば、マンノース−６−リン酸を含有する酵素は、リソゾーム蓄積症（例えば適する遺伝子はβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）をコードするものを包含する）の治療で利用することができる。
【０１１９】
なお他の有用な遺伝子産物は、血友病Ｂ（第ＩＸ因子を包含する）および血友病Ａ（第ＶＩＩＩ因子およびヘテロ二量体のＬ鎖およびＨ鎖およびＢ欠損ドメインのようなそのバリアントを包含する；米国特許第６，２００，５６０号および同第６，２２１，３４９号明細書）を包含する血友病の処置に使用されるものを含む。第ＶＩＩＩ因子遺伝子は２３５１アミノ酸をコードし、そして該タンパク質は６ドメインを有し、アミノから末端のカルボキシ末端までＡ１−Ａ２−Ｂ−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２と呼称される［Ｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ、３１２：３３０（１９８４）；Ｖｅｈａｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：３３７（１９８４）；およびＴｏｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ、３４２：３３７（１９８４）］。ヒト第ＶＩＩＩ因子は細胞内でプロセシングされて、Ａ１、Ａ２およびＢドメインを含有するＨ鎖ならびにＡ３、Ｃ１およびＣ２ドメインを含有するＬ鎖を主として含んでなるヘテロ二量体を生じる。一本鎖ポリペプチドおよびヘテロ二量体の双方が、Ｂドメインを遊離しかつＡ１およびＡ２ドメインよりなるＨ鎖をもたらすＡ２ドメインとＢドメインの間のトロンビン切断により活性化されるまで、不活性前駆体として血漿中を循環する。Ｂドメインは活性化された凝血原の形態のタンパク質では除去されている。加えて、本来のタンパク質中でＢドメインを挟む２本のポリペプチド鎖（「ａ」および「ｂ」）は二価のカルシウム陽イオンに結合している。
【０１２０】
いくつかの態様において、ミニ遺伝子は１０アミノ酸のシグナル配列をコードする第ＶＩＩＩ因子Ｈ鎖の最初の５７塩基対、ならびにヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニル化配列を含んでなる。代替の態様において、ミニ遺伝子はＡ１およびＡ２ドメイン、ならびにＢドメインのＮ末端からの５アミノ酸および／もしくはＢドメインのＣ末端の８５アミノ酸、ならびにＡ３、Ｃ１およびＣ２ドメインをさらに含んでなる。さらに他の態様において、第ＶＩＩＩ因子Ｈ鎖およびＬ鎖をコードする核酸が、Ｂドメインの１４アミノ酸をコードする４２核酸により分離される単一のミニ遺伝子で提供される［米国特許第６，２００，５６０号明細書］。
【０１２１】
本明細書で使用される治療上有効な量は、個体の血液が凝固するのにかかる時間を短縮するのに十分な量の第ＶＩＩＩ因子を産生するＡＡＶベクターの量である。一般に、正常レベルの第ＶＩＩＩ因子の１％未満を有する重症の血友病患者は、非血友病患者についてのおよそ１０分に比較して６０分より長い全血凝固時間を有する。
【０１２２】
本発明はいかなる特定の第ＶＩＩＩ因子配列にも制限されない。多くの天然のおよび組
換えの形態の第ＶＩＩＩ因子が単離かつ生成されている。天然に存在するおよび組換えの形態の第ＶＩＩ因子の例は、米国特許第５，５６３，０４５号、同第５，４５１，５２１号、同第５，４２２，２６０号、同第５，００４，８０３号、同第４，７５７，００６号、同第５，６６１，００８号、同第５，７８９，２０３号、同第５，６８１，７４６号、同第５，５９５，８８６号、同第５，０４５，４５５号、同第５，６６８，１０８号、同第５，６３３，１５０号、同第５，６９３，４９９号、同第５，５８７，３１０号、同第５，１７１，８４４号、同第５，１４９，６３７号、同第５，１１２，９５０号、同第４，８８６，８７６号明細書；国際公開第９４／１１５０３号、同第８７／０７１４４号、同第９２／１６５５７号、同第９１／０９１２２号、同第９７／０３１９５号、同第９６／２１０３５号および同第９１／０７４９０号パンフレット；欧州特許出願第ＥＰ  ０  ６７２  １３８号、同第ＥＰ  ０  ２７０  ６１８号、同第ＥＰ  ０  １８２  ４４８号、同第ＥＰ  ０  １６２  ０６７号、同第ＥＰ  ０  ７８６  ４７４号、同第ＥＰ  ０  ５３３  ８６２号、同第ＥＰ  ０  ５０６  ７５７号、同第ＥＰ  ０  ８７４  ０５７号、同第ＥＰ  ０  ７９５  ０２１号、同第ＥＰ  ０  ６７０  ３３２号、同第ＥＰ  ０  ５００  ７３４号、同第ＥＰ  ０  ２３２  １１２号および同第ＥＰ  ０  １６０  ４５７号明細書；Ｓａｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＸＸｔｈ  Ｉｎｔ．Ｃｏｎｇｒｅｓｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｗｏｒｌｄ  Ｆｅｄ．Ｏｆ  Ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ（１９９２）、ならびにＬｉｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２３２：１９（１９９５）を含む特許および学術文献に見出し得る。
【０１２３】
上述された第ＶＩＩＩ因子をコードする核酸配列は、組換えの方法を使用して、または該配列を包含することが既知のベクターから誘導することにより得ることができる。さらに、所望の配列は、フェノール抽出およびｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡのＰＣＲのような標準的技術を使用して、それを含有する細胞および組織から直接単離することができる［例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌを参照されたい］。ヌクレオチド配列はまた、クローン化されるよりはむしろ合成で製造し得る。完全な配列は、標準的方法により製造したオーバーラップオリゴヌクレオチドから集成し得、そして完全なコーディング配列に集成し得る［例えば、Ｅｄｇｅ、Ｎａｔｕｒｅ  ２９２：７５７（１９８１）；Ｎａｍｂａｒｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２３：１２９９（１９８４）；およびＪａｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：６３１１（１９８４）を参照されたい。
【０１２４】
さらに、本発明はヒト第ＶＩＩＩ因子に制限されない。事実、本発明は限定するわけではないがコンパニオンアニマル（例えばイヌ、ネコおよびウマ）、家畜（例えばウシ、ヤギおよびヒツジ）、実験動物、海棲哺乳類、大型のネコなどを挙げることができるヒト以外の動物からの第ＶＩＩＩ因子を包含することを意図している。
【０１２５】
ＡＡＶベクターは、それ自体生物学的に活性でないがそれでもなお個体に投与される場合に血液凝固時間を改良もしくは復帰させる第ＶＩＩＩ因子のフラグメントをコードする核酸を含有することができる。例えば上で検討したように、第ＶＩＩＩ因子タンパク質は２個のポリペプチド鎖、すなわちプロセシングの間に切断されるＢドメインにより分離されたＨ鎖およびＬ鎖を含んでなる。本発明により示されるとおり、第ＶＩＩＩ因子の重および軽鎖でレシピエント細胞を同時形質導入することは、生物学的に活性の第ＶＩＩＩ因子の発現に至る。大部分の血友病患者は該鎖の一方（例えば重もしくは軽鎖）のみに突然変異もしくは欠失を含有するため、患者において欠損の鎖のみを投与して他方の鎖を供給することが可能でありうる。
【０１２６】
他の有用な遺伝子産物は、挿入、欠失もしくはアミノ酸置換を含有する自然に存在しないアミノ酸配列を有するキメラもしくはハイブリッドポリペプチドのような自然に存在しないポリペプチドを含む。例えば、一本鎖の工作された免疫グロブリンはある種の免疫無防備状態の患者で有用であり得る。他の型の天然に存在しない遺伝子配列は、アンチセン
ス分子、および標的の過剰発現を低下させるのに使用し得るリボザイムのような触媒的核酸を包含する。
【０１２７】
遺伝子の発現の低下および／もしくは調節は、癌および乾癬がそうであるように、過剰増殖する細胞を特徴とする過剰増殖状態の処置にとりわけ望ましい。標的ポリペプチドは、正常細胞と比較して過剰増殖細胞中で排他的にもしくはより高レベルで産生されるポリペプチドを包含する。標的抗原は、ｍｙｂ、ｍｙｃ、ｆｙｎのような癌遺伝子、ならびに転位遺伝子ｂｃｒ／ａｂｌ、ｒａｓ、ｓｒｃ、Ｐ５３、ｎｅｕ、ｔｒｋおよびＥＧＲＦによりコードされるポリペプチドを包含する。標的抗原としての癌遺伝子産物に加え、抗癌処置および保護的レジメンの標的ポリペプチドは、Ｂ細胞リンパ腫により作成される抗体の可変領域およびＴ細胞リンパ腫のＴ細胞受容体の可変領域を包含し、それらは、いくつかの態様において自己免疫疾患の標的抗原としてもまた使用される。モノクローナル抗体１７−１Ａにより認識されるポリペプチドおよび葉酸結合ポリペプチドを包含する、腫瘍細胞中でより高レベルで見出されるポリペプチドのような、他の腫瘍関連ポリペプチドを標的ポリペプチドとして使用することができる。
【０１２８】
他の適する治療的ポリペプチドおよびタンパク質は、細胞受容体および「自己」に向けられた抗体を産生する細胞を包含する自己免疫と関連する標的に対する広範囲にわたる保護免疫応答を与えることにより、自己免疫疾患および障害に罹患している個体を処置するのに有用でありうるものを包含する。Ｔ細胞媒介性の自己免疫疾患は、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、シェーグレン症候群、サルコイドーシス、インスリン依存型糖尿病（ＩＤＤＭ）、自己免疫性甲状腺炎、反応性関節炎、強直性脊椎炎、強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、乾癬、脈管炎、ヴェーゲナー肉芽腫症、クローン病および潰瘍性大腸炎を包含する。これらの疾患のそれぞれは、内因性抗原に結合しかつ自己免疫疾患に関連する炎症カスケードを開始するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を特徴とする。
【０１２９】
Ｃ．免疫原性導入遺伝子
適当には、本発明のＡＡＶベクターは、該ベクター内に含有されるＡＡＶ配列に対する免疫応答の生成を回避する。しかしこれらのベクターは、それにもかかわらず、該ベクターにより運搬される導入遺伝子の発現して選択された抗原に対する免疫応答を誘導できるようにする様式で配合することができる。例えば免疫応答を促進するため、導入遺伝子は構成的プロモーターから発現させることができ、ベクターは本明細書に記述されるとおり免疫増強し（ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ）得、かつ／もしくは該ベクターを変性組織に置くことができる。
【０１３０】
適する免疫原性導入遺伝子の例は多様なウイルス科から選択されるものを包含する。免疫応答が望ましいとみられる所望のウイルス科の例は、一般的な風邪の症例の約５０％の原因であるライノウイルス属を包含するピコルナウイルス科；ポリオウイルス、コックサッキーウイルス、エコーウイルスおよびＡ型肝炎ウイルスのようなヒトエンテロウイルスを包含するエンテロウイルス属；ならびに主としてヒト以外の動物での口蹄疫の原因であるアプトウイルス属を包含する。ウイルスのピコルナウイルス科内で、標的抗原はＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４およびＶＰＧを包含する。他のウイルス科はアストロウイルスおよびカルシウイルス科を包含する。カルシウイルス科は、流行性胃腸炎の重要な原因病原体であるノーウォーク群のウイルスを包含する。ヒトおよびヒト以外の動物で免疫応答を誘導するための抗原の標的設定での使用に望ましいさらに別のウイルス科は、シンドビスウイルス、ロスリバーウイルス、ならびにベネズエラ、東部および西部ウマ脳炎ウイルスを包含するアルファウイルス属、ならびに風疹ウイルスを包含するルビウイルス属を包含するトガウイルス科である。フラビウイルス科は、デング熱、黄熱病、日本脳炎、セントルイス脳炎およびダニ媒介脳炎ウイルスを包含する。他の標的抗原は、Ｃ型肝炎ウイルス、または感染性気管支炎ウイルス（家禽）、ブタ伝染性胃腸ウイルス（ブタ）、ブタヘ
マグルチナチン（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｎ）脳脊髄炎ウイルス（ブタ）、ネコ感染性腹膜炎ウイルス（ネコ）、ネコ腸コロナウイルス（ネコ）、イヌコロナウイルス（イヌ）のような多数のヒト以外のウイルス、ならびに、一般的な風邪および／または非Ａ、ＢもしくはＣ型肝炎を引き起こすことがありかつ重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）の推定の原因を包含するヒト呼吸器コロナウイルスを包含するコロナウイルス科から生成しうる。コロナウイルス科内で、標的抗原は、Ｅ１（Ｍすなわちマトリックスタンパク質ともまた呼ばれる）、Ｅ２（Ｓすなわちスパイクタンパク質ともまた呼ばれる）、Ｅ３（ＨＥすなわちヘマグルチン−エルテロース（ｅｌｔｅｒｏｓｅ）ともまた呼ばれる）糖タンパク質（全部のコロナウイルスに存在するわけではない）、またはＮ（ヌクレオキャプシド）を包含する。さらに他の抗原はアルテリウイルス科およびラブドウイルス科を標的としうる。ラブドウイルス科は、ベシクロウイルス属（例えば水疱性口内炎ウイルス）および一般的なリッサウイルス（例えば狂犬病）を包含する。ラブドウイルス科内で、適する抗原はＧタンパク質もしくはＮタンパク質に由来しうる。マルブルクおよびエボラウイルスのような出血性熱ウイルスを包含するフィロウイルス科が抗原の適する供給源となりうる。パラミクソウイルス科は、パラインフルエンザウイルス１型、パラインフルエンザウイルス３型、ウシパラインフルエンザウイルス３型、ルブラウイルス（流行性耳下腺炎ウイルス、パラインフルエンザウイルス２型、パラインフルエンザウイルス４型、ニューカッスル病ウイルス（ニワトリ）、牛疫、麻疹およびイヌジステンパーを包含するモルビリウイルス、ならびにＲＳウイルスを包含するニューモウイルスを包含する。インフルエンザウイルスはオルトミクソウイルス科内で分類され、そして抗原の適する供給源である（例えばＨＡタンパク質、Ｎ１タンパク質）。ブニヤウイルス科は、ブニヤウイルス（カリフォルニア脳炎、ラクロス）、フレボウイルス（ケニヤ出血熱）、ハンタウイルス（プレマラはヘマハギン（ｈｅｍａｈａｇｉｎ）熱ウイルスである）、ナイロウイルス（ナイロビ羊病）属および多様な割り当てられていないブンガウイルス（ｂｕｎｇａｖｉｒｕｓｅ）含む。アレナウイルス科はＬＣＭおよびラッサ熱ウイルスに対する抗原の供給源を提供する。抗原の別の供給源はボルナウイルス科である。レオウイルス科は、レオウイルス、ロタウイルス（小児で急性胃腸炎を引き起こす）、オルビウイルスおよびクルチウイルス（ｃｕｌｔｉｖｉｒｕｓ）（コロラドダニ熱、レボンボ（ヒト）、ウマ脳症、ブルータング）属を包含する。レトロウイルス科は、ネコ白血病ウイルス、ＨＴＬＶＩおよびＨＴＬＶＩＩ、レンチビリナル（ｌｅｎｔｉｖｉｒｉｎａｌ）（ＨＩＶ、サル免疫不全ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、ウマ感染性貧血ウイルスおよびスプマビリナル（ｓｐｕｍａｖｉｒｉｎａｌ）を包含する）のようなヒトおよび家畜の疾患を包含するオンコウイルス（ｏｎｃｏｖｉｒｉｎａｌ）亜科を包含する。
【０１３１】
ＨＩＶおよびＳＩＶに関して、多くの適切な抗原が記載され、そして容易に選択され得る。適切なＨＩＶおよびＳＩＶ抗原の例には、限定するわけではないが、ｇａｇ、ｐｏｌ、Ｖｉｆ、Ｖｐｘ、ＶＰＲ、Ｅｎｖ、ＴａｔおよびＲｅｖタンパク質ならびにそれらの種々のフラグメントを含む。例えばエンベロープ（ｅｎｖ）タンパク質の適切なフラグメントには、例えばｇｐ４１、ｇｐ１４０およびｇｐ１２０を含む。さらにこれらおよび他のＨＩＶおよびＳＩＶ抗原に対する種々の修飾が記載された。この目的に適する抗原は当業者には既知である。例えば他のタンパク質の中でもｇａｇ、ｐｏｌ、ＶｉｆおよびＶｐｒ、Ｅｎｖ、ＴａｔおよびＲｅｖをコードする配列を選択することができる。例えば米国特許第５，９７２，５９６号明細書に記載されている修飾されたｇａｇタンパク質を参照にされたい。またＤ．Ｈ．Ｂａｒｏｕｃｈ，ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｖｉｏｌ．，７５（５）：２４６２−２４６７（２００１年３月）、およびＲ．Ｒ．Ａｍａｒａ，ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９２：６９−７４（２００１年４月６日）に記載されているＨＩＶおよびＳＩＶタンパク質を参照されたい。これらのタンパク質またはそのサブユニットは、単独で、または別のベクターを介してもしくは単一ベクターから組み合わせて送達され得る。
【０１３２】
パボーバウイルス科は、ポリオーマウイルス亜科（ＢＫＵおよびＪＣＵウイルス）なら
びにパピローマウイルス亜科（癌もしくは乳頭腫の悪性の進行と関連する）を包含する。アデノウイルス科は呼吸器疾患および／もしくは腸炎を引き起こすウイルス（ＥＸ、ＡＤ７、ＡＲＤ、Ｏ．Ｂ．）を包含する。パルボウイルス科はネコパルボウイルス（ネコ腸炎）、ネコ汎白血球減少症ウイルス、イヌパルボウイルスおよびブタパルボウイルスを包含する。ヘルペスウイルス科は、シンプレックスウイルス（ＨＳＶＩ、ＨＳＶＩＩ）、ワリセロウイルス（偽性狂犬病、帯状疱疹）属を包含するアルファヘルペスウイルス亜科、およびサイトメガロウイルス属（ＨＣＭＶ、ムロメガロウイルス）を包含するベータヘルペスウイルス亜科、ならびにリンホクリプトウイルス、ＥＢＶ（バーキットリンパ腫）、６Ａ、６Ｂおよび７型ヒトヘルペスウイルス、カポシ肉腫関連のヘルペスウイルスならびにセルコピテシン（ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｉｎｅ）ヘルペスウイルス（Ｂウイルス）、感染性鼻気管炎、マレック病ウイルスならびにラディノウイルス属を包含するガンマヘルペスウイルス亜科を包含する。ポックスウイルス科は、オルトポックスウイルス（大疱瘡（天然痘）およびワクシニア（牛痘））、パラポックスウイルス、アビポックスウイルス、カプリポックスウイルス、レポリポックスウイルス、スイポックスウイルス属を包含するチョルドポックスウイルス亜科、ならびにエントモポックスウイルス亜科を包含する。ヘパドナウイルス科はＢ型肝炎ウイルスを包含する。抗原の適する供給源となりうる１種の分類されないウイルスは、Ｄ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルスおよびプリオンである。抗原の供給源となる別のウイルスはニパンウイルスである。なお他のウイルス供給源は、トリ伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスおよびブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルスを包含しうる。アルファウイルス科はウマ動脈炎ウイルスおよび多様な脳炎ウイルスを包含する。
【０１３３】
本発明は、ヒトおよびヒト以外の脊椎動物を感染させる細菌、真菌、寄生性微生物もしくは多細胞寄生生物を包含する他の病原体に対しヒトもしくはヒト以外の動物を免疫するのに有用であるか、または癌細胞もしくは腫瘍細胞からである免疫原もまた包含しうる。細菌性病原体の例は、病原性グラム陽性球菌は肺炎球菌；ブドウ球菌（およびそれにより産生されるトキシン、例えばエンテロトキシンＢ）；ならびに連鎖球菌を包含するを包含する。病原性のグラム陰性球菌は、髄膜炎菌；淋菌を包含する。病原性の腸グラム陰性桿菌は、腸内細菌科；シュードモナス、アシネトバクテリア（ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｉａ）およびエイケネラ（ｅｉｋｅｎｅｌｌａ）；類鼻疽；サルモネラ（ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）；シゲラ（ｓｈｉｇｅｌｌａ）；ヘモフィルス（ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）；モラクセラ（ｍｏｒａｘｅｌｌａ）；軟性下疳菌（Ｈ．ｄｕｃｒｅｙｉ）（軟性下疳を引き起こす）、ブルセラ（ｂｒｕｃｅｌｌａ）種（ブルセラ症）；野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）（野兎病を引き起こす）；ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ）（ペスト）および他のエルジニア（ｙｅｒｓｉｎｉａ）（パスツレラ）；ストレプトバチルス  モニリフォルミス（ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）およびスピリルムを包含し；グラム陽性桿菌はリステリア  モノシトゲネス（ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）；エリジペロスリックス  ルシパチエ（ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）；ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）（ジフテリア）；コレラ；炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）（炭疽）；ドノヴァン症（鼠径部肉芽腫）；およびバルトネラ症を包含する。病原性嫌気性細菌により引き起こされる疾患は、破傷風；ボツリヌス中毒（クロストリズム  ボツリヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）およびそのトキシン）；ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）およびそのεトキシン；他のクロストリジウム属；結核；らい；ならびに他のミコバクテリアを包含する。病原性のスピロヘータ疾患は梅毒；トレポネーマ症；イチゴ腫、ピンタおよび風土病性梅毒；ならびにレプトスピラ症を包含する。より高病原性の細菌および病原性真菌により引き起こされる他の感染症は、鼻疽（バークホルデリア  マレイ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｍａｌｌｅｉ））；放線菌症；ノカルジア症；クリプトコックス症、ブラストミセス症、ヒストプラスマ症およびコクシジオイデス真菌症；カンジ
ダ症、アスペルギルス症およびムコール症；スポロトリクス症；パラコクシジオイデス真菌症、ペトリエリジオーシス（ｐｅｔｒｉｅｌｌｉｄｉｏｓｉｓ）、トルロプシス症、菌腫およびクロモミコーシス；ならびに皮膚糸状菌症を包含する。リケッチア感染症は、発疹チフス、ロッキー山熱、Ｑ熱（コクシエラ  ブルネティ（Ｃｏｘｉｅｌｌａ  ｂｕｒｎｅｔｔｉ））およびリケッチア痘を包含する。マイコプラスマおよびクラミジア感染症の例は：マイコプラスマ肺炎；性病性リンパ肉芽腫；オウム病；および周産期クラミジア感染症を包含する。病原性真核生物は病原性原生動物および蠕虫を包含し、また、それらにより生じられる感染症は：アメーバ症；マラリア；リーシュマニア；トリパノソーマ症；トキソプラスマ症；ニューモシスチス  カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ）；Ｔｒｉｃｈａｎｓ；トキソプラスマ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）；バベシア症；ジアルジア症；旋毛虫症；フィラリア症；住血吸虫症；線虫；吸虫（ｔｒｅｍａｔｏｄｅｓ）すなわち吸虫（ｆｌｕｋｅｓ）；および条虫（ｃｅｓｔｏｄｅ）（条虫（ｔａｐｅｗｏｒｍ））感染症を包含する。
【０１３４】
これらの生物体および／もしくはそれらにより産生されるトキシンの多くは、生物学的攻撃での使用のための潜在性を有する作用物質として疾病対策センター（Ｃｅｎｔｅｒｓ
ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ）［（ＣＤＣ）、米国保健省の部門］により同定された。例えば、これらの生物学製剤のいくつかは、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）（炭疽）、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）およびそのトキシン（ボツリヌス中毒）、ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ）（ペスト）、大疱瘡（天然痘）、野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）（野兎病）、ならびにウイルス性出血熱［フィロウイルス（例えばエボラ、マルブルク］、ならびにアレナウイルス［例えばラッサ、マチュポ］）（それらの全部は現在カテゴリーＡの作用物質に分類されている）；コクシエラ  ブルネティ（Ｃｏｘｉｅｌｌａ  ｂｕｒｎｅｔｔｉ）（Ｑ熱）；ブルセラ属（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）の種（ブルセラ症）、バークホルデリア  マレイ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｍａｌｌｅｉ）（鼻疽）、バークホルデリア  シュードマレイ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ）（類鼻疽）、トウゴマ（Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ）およびそのトキシン（リシントキシン）、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）およびそのトキシン（イプシロン  トキシン）、ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）の種およびそれらのトキシン（エンテロトキシンＢ）、オウム病クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ）（オウム病）、水の安全性に対する脅威（例えばコレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、クリトスポリジウム  パルブム（Ｃｒｙｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ））、発疹チフス（発疹チフスリケッチア（Ｒｉｃｈｅｔｔｓｉａ  ｐｏｗａｚｅｋｋｉ））、ならびにウイルス性脳炎（アルファウイルス、例えばベネズエラウマ脳炎；東部ウマ脳炎；西部ウマ脳炎）；（それらの全部は現在カテゴリーＢの作用物質として分類されている）；ならびにニパンウイルスおよびハンタウイルス（現在カテゴリーＣの作用物質として分類されている）を包含する。加えて、そのように分類されるかもしくは異なって分類される他の生物体が、将来同定かつ／もしくはこうした目的上使用されうる。本明細書に記述されるウイルスベクターおよび他の構築物が、これらの生物学的剤への感染症もしくはそれらとの他の有害反応を予防かつ／もしくは処置することができるこれらの生物体、ウイルス、それらのトキシンもしくは他の副生成物からの抗原を送達するのに有用であることが容易に理解されるであろう。
【０１３５】
Ｔ細胞の可変領域に対する免疫原を送達するための本発明のベクターの投与はそれらのＴ細胞を排除するためのＣＴＬを含む免疫応答を導き出す。慢性関節リウマチ（ＲＡ）において、該疾患に関与するＴＣＲの数個の特異的可変領域が特徴づけられている。これらのＴＣＲはＶ−３、Ｖ−１４、Ｖ−１７およびＶ−１７を含む。従って、これらのポリペプチドの少なくとも１種をコードする核酸配列の送達は、ＲＡに関与するＴ細胞を標的とすることができる免疫応答を導き出すことができる。多発性硬化症（ＭＳ）において、該
疾患に関与するＴＣＲの数個の特異的可変領域が特徴づけられている。これらのＴＣＲはＶ−７およびＶ−１０を包含する。従ってこれらのポリペプチドの少なくとも１種をコードする核酸配列の送達は、ＭＳに関与するＴ細胞を標的とすることができる免疫応答を導き出すことができる。強皮症において、該疾患に関与するＴＣＲの数個の特異的可変領域が特徴づけられている。これらのＴＣＲはＶ−６、Ｖ−８、Ｖ−１４およびＶ−１６、Ｖ−３Ｃ、Ｖ−７、Ｖ−１４、Ｖ−１５、Ｖ−１６、Ｖ−２８およびＶ−１２を含む。従って、これらのポリペプチドの少なくとも１種をコードする核酸分子の送達は、強皮症に関与するＴ細胞を標的とすることができる免疫応答を導き出すことができる。
【０１３６】
従って本発明のｒＡＡＶ由来の組換えウイルスベクターは、生物体が１もしくは複数のＡＡＶ供給源に対する中和抗体を有する場合であっても、選択した導入遺伝子を選択した宿主細胞にｉｎ  ｖｉｖｏもしくはｅｘ  ｖｉｖｏで送達し得る効率的な遺伝子移入ベヒクルを提供する。一態様において、ｒＡＡＶおよび細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで混合し；感染した細胞を慣習的方法論を使用して培養し；そして形質導入された細胞を患者に再注入する。
【０１３７】
これらの組成物は、保護免疫を誘導することを包含する治療的目的上および免疫感作のための遺伝子送達にとりわけ良く適する。本発明のＡＡＶおよびそれを含有する組成物は、「免疫原性分子の連続的アデノウイルスおよびＡＡＶ媒介型送達（Ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ａｎｄ  ＡＡＶ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）」について２００４年４月２８日に出願された共有する米国特許出願第６０／５６５，９３６号明細書に記載されているもののような免疫感作処方に使用されることもできる。
【０１３８】
さらに本発明の組成物は所望の遺伝子産物のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの産生にもまた使用することができる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ産生のため、所望の産物（例えばタンパク質）は、所望の産物をコードする分子を含有するｒＡＡＶでの宿主細胞のトランスフェクション、および発現を可能にする条件下で細胞培養物を培養することの後に所望の培養物から得ることができる。発現された産物をその後、所望のとおり精製かつ単離し得る。適するトランスフェクション、細胞培養、精製および単離技術は当業者に既知である。
【図面の簡単な説明】
【０１３９】
【図１】シングルトン補正ＡＡＶベクターのインビトロ２９３形質導入を具体的に説明するグラフである。シングルトン補正は、存在する場合、ベクター名前の後に突然変異を行った番号を示すための番号で示される。
【図２】２Ａ〜２Ｃは、１０1〜１０4の範囲の感染多重度で２９３細胞についてのＡＡＶベクターの力価を具体的に説明する線グラフであり、図２Ａでは親のｒｈ．８とシングルトン補正ｒｈ．８（ｒｈ．８Ｒ）との間の比較を、親のｒｈ．３７と修飾ｒｈ．３７との間の比較を（図２Ｂ）、そして図２ＣではＡＡＶ２とＡＡＶ８との間の比較を表す。対照として、ＡＡＶ２およびＡＡＶ２／８  ｅＧＦＰ発現ベクターの類似滴定を提示する。ｅＧＦＰ陽性細胞のパーセント（％）をＹ−軸で提示し、そしてフローサイトメトリーでアッセイした。
【図３】ＡＡＶ配列の系統発生樹であり、これはそれらの系統発生的関係およびクレードを示す。
【図４】４Ａ〜４Ｌは、ＡＡＶ２［配列番号７］、ｃｙ．５［配列番号８］、ｒｈ．１０［配列番号９］、ｒｈ．１３［配列番号１０］、ＡＡＶ１［配列番号１１］、ＡＡＶ３［配列番号１２］、ＡＡＶ６［配列番号１３］、ＡＡＶ７［配列番号１４］、ＡＡＶ８［配列番号１５］、ｈｕ．１３［配列番号１６］、ｈｕ．２６［配列番号１７］、ｈｕ．３７［配列番号１８］、ｈｕ．５３［配列番号１９］、ｒｈ．３９［配列番号２０］、ｒｈ．４３［配列番号２１］およびｒｈ．４６［配列番号２２］のキャプシドタンパク質（ｖｐ１）の核酸配列のアライメントである。
【図５】５Ａ〜５Ｄは、ＡＡＶ２［配列番号２３］、ｃｙ．５［配列番号２４］、ｒｈ．１０［配列番号２５］、ｒｈ．１３［配列番号２６］、ＡＡＶ１［配列番号２７］、ＡＡＶ３［配列番号２８］、ＡＡＶ６［配列番号２９］、ＡＡＶ７［配列番号３０］、ＡＡＶ８［配列番号３１］、ｈｕ．１３［配列番号３２］、ｈｕ．２６［配列番号３３］、ｈｕ．３７［配列番号３４］、ｈｕ．５３［配列番号３５］、ｒｈ．３９［配列番号３６］、ｒｈ．４３［配列番号３７］およびｒｈ．４６［配列番号３８］のキャプシドタンパク質（ｖｐ１）のアミノ酸配列のアライメントである。
【図６】６Ａ〜６Ｂは、ｒｈ．１３［配列番号２６］、ｒｈ．２［配列番号３９］、ｒｈ．８［配列番号４１］、ｈｕ．２９［配列番号４２］およびｒｈ．６４［配列番号４３］のキャプシドタンパク質（ｖｐ１）のアミノ酸配列のアライメントである。
【０１４０】
以下の実施例は本発明のいくつかの観点および態様を具体的に説明する。
【実施例】
【０１４１】
実施例１
本発明の方法に従い、各クレードＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦ（ＡＡＶ９により表される）の代表を含む配列のライブラリーと並べて配置した時、ＡＡＶ配列はシングルトンを有すると同定された。以下の表はキャプシド配列および保存された配列に改変されるべきシングルトンを具体的に説明する。特定の突然変異に関して、シングルトンに＊が続き、その後、それを置き換えるアミノ酸残基が続く。他の突然変異に関しては、シングルトンにそのアミノ酸位、そしてそれに置き換わる残基が続く。
【０１４２】
アミノ酸の番号付けは、これらＡＡＶキャプシドの各々について公開された配列に基づく。例えばＧ．Ｇａｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８（１２）６３８１−６３８８（２００４年６月）および国際公開第２００４／０４２３９７号パンフレット［その中の全配列はＧｅｎＢａｎｋに寄託された］、および２００４年９月３０日に出願された国際公開第２００５／０３３３２１号パンフレット（引用により本明細書に編入する）を参照にされたい。
【０１４３】
例えば以下の表を参照にして、命名法は以下のように読むべきである。Ｃｙ５Ｒ１は配列番号２４のアミノ酸配列を指し、これはアミノ酸残基１３位にアスパラギン酸（Ｄ）を含むように修飾された；ｃｙ５は自然なアミノ酸配列の残基番号１３にグリシンを有する。Ｃｙ５Ｒ２は配列番号２４のアミノ酸配列を指し、これはアミノ酸１３位にアスパラギン酸（Ｄ）を（自然な配列ではグリシン）、そしてアミノ酸４０３位にアスパラギンを（自然な配列ではアスパラギン酸）含むように修飾された。Ｃｙ５Ｒ３は配列番号２４のアミノ酸配列を有し、これはＣｙ５Ｒ２と同じ修飾を有するように修飾され、そしてさらに１５８位のリシン（天然ではアスパラギン）および１６１位のグルタミン（天然ではプロリン）が修飾された。この情報を与えれば、当業者は以下の表に挙げる他のシングルトン修飾を容易に決定することができる。
【０１４４】
【表１】
0006039632.tif 000002
【０１４５】
【表２】
0006039632.tif 000003
【０１４６】
実施例２
予備実験では、５個のクローンを選択して本発明のシングルトン法を試験した。以下の表は、５個のクローンの表現型の記載を提供する。予想されるシングルトンの数を、クレードおよび血清型分類と共に与える。
【０１４７】
パッケージング表現型は、それらの力価が１×１０11ＧＣより低い場合に不十分と、１×１０12ＧＣより低い場合に低いと、そして１×１０13ＧＣより低い場合に良好と、より高い場合には優れていると考える。
【０１４８】
遺伝子導入の表現型は、ＣＢ．Ａ１ＡＴ遺伝子発現により確立され、そして以下のように示した；“＋＋＋”は標的組織のためのリード候補よりも良い、“＋＋”、“＋”および“−”は、リード候補のＡ１ＡＴ血清レベルよりもそれぞれ５０％より良く、１０〜５０％の間、または１０％より低い（筋肉：ＡＡＶ１、肝臓：ＡＡＶ８、肺：ＡＡＶ９）。“ｎ／ａ”は、ベクターがインビボの遺伝子導入実験について十分なレベルで生産できなかったことを示した。
【０１４９】
シングルトン補正のクローニングは、以下のようになった。元のパッケージングプラス
ミドから、部位特異的突然変異誘発法を行った。それに続いて、ベクターの骨格完全性をＰｓｔＩ消化によりアッセイし、そしてシングルトンの補正をシークエンシングにより確認した。次いでＥＧＦＰ発現ベクターは、親のシングルトン含有ベクター、ＡＡＶ２およびＡＡＶ２／８陽性対照、および陰性対照としてパッケージングプラスミドが存在しない生産を平行して１２ウェル形式で３連で生産された。３回の凍結後に回収した等容量の溶解物を、２９３細胞でインキュベーションした。ｅＧＦＰ発現は、フローサイトメトリーにより形質導入から７２時間後に監視した。
【０１５０】
クローンｒｈ．３７、ｒｈ．２、ｃｈ．５、ｒｈ．１３およびｒｈ．８のシングルトン残基の部位特異的突然変異誘発法を行った。これらの特定の配列を選択して、これまでに記録された種々の表現型を表した。
【０１５１】
【表３】
0006039632.tif 000004
【０１５２】
ベクター発現における増加は、５個のクローンのうちの４個で認められた。この増加は、以前には低いパッケージング収量を有することが示されたｒｈ．３７およびｒｈ．２ベクターで最も劇的であった。これらのベクターに関して、生産的粒子が検出に十分なレベルで生産された。ベクターｒｈ．８およびｒｈ．１３は、形質導入に増加を示した。
【０１５３】
シングルトン突然変異の形質導入対パッケージングおよび集成に及ぼす効果を識別するために、小規模ベクター調製物を作成し、そしてＤｎａｓｅ耐性粒子を定量的ＰＣＲにより滴定した。ｒｈ．３７について、ベクター生産について２−ｌｏｇの増加が観察された。ｒｈ．８は力価において中程度の５倍増加を示し、一方ｒｈ．１３は等しく機能した。シングルトン補正クローンのすべての力価は、ＡＡＶ２およびＡＡＶ２／８生産と比べて許容され得る範囲内であり、そして大規模調製に拡大した時、ｒｈ．２は力価についてアッセイしなかった。
【０１５４】
引き続きシングルトン交換の効果は、細胞あたり等しい粒子数を用いた形質導入の設定でインビトロにて監視した。２９３細胞での滴定は、ｒｈ．８およびｒｈ．１３について行った。形質導入効率における中程度の増加は、すべてのＭＯＩで記載された。
【０１５５】
この５クローンの最初のサブセットから、３つが細胞を生産的に形質導入した。２つのクローンはこの設定でいかなるｅＧＦＰ発現も生じることができなかった。これはほとんどシングルトンの取り組みにより予測できなかったベクターのパッケージングにおける欠失によるらしい。
【０１５６】
本発明の方法を利用してＡＡＶクローンｈｕ．４６、Ｐ１５６Ｓ  Ｒ３６２Ｃ  Ｓ３９３Ｆ  Ａ６７６の４つの予想されるシングルトンの位置を補正した。しかしこれらの修飾はレスキューできたＡＡＶを生じず、ｈｕ．４６配列に別の種類の致命的間違えを示した。
【０１５７】
実施例３−改変されたキャプシドを持つウイルスベクターのインビトロ分析
本発明の方法を使用して、ｒｈ．６４およびｈｕ．２９のキャプシドタンパク質を改変し、次いで改変されたキャプシドを持つウイルスベクターを、実施例２およびＧ．Ｇａｏ
ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９，１１８５４−９（２００２年９月３日）に記載されているようなシュードタイピングを使用して構築した。
【０１５８】
簡単に説明すると、強化された緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）を発現するベクターを使用して、ヒト内皮腎臓細胞（２９３細胞）中のベクターのインビトロ形質導入効率を調査した。これらの２９３細胞は、ｗｔＡｄ５で短時間プレインキュベーションした後、１０4ＧＣ／細胞のシュードタイプＡＡＶＣＭＶｅＧＦＰ粒子の存在下でインキュベーションした。１０，０００個の全細胞あたりｅＧＦＰ陽性細胞数が、５細胞／１０Ｋの検出限界でＦＡＣＳ分析により測定された。
【０１５９】
本発明によるＲｈ．６４キャプシドの修飾は、Ｒ６９７Ｗ交換後に１００倍以上高い効率であった修飾ｒｈ．６４粒子をもたらした。引き続きＶ６８６Ｅの突然変異は、パッケージング能に２倍の増加をもたらした。
【０１６０】
本発明に従いＨｕ．２９キャプシドの修飾は、Ｇ３９６Ｅと交換することにより欠損パッケージング能からレスキューされた修飾ｒｈ．６４ビリオンを与えた。生産に１０００倍以上の増加が観察された。
【０１６１】
発現において改善を示した２０を超える多くの修飾ＡＡＶビリオンには、ＡＡＶ６．１、ｈｕ．４８Ｒ１、ｈｕ．４８Ｒ２、ｈｕ．４４Ｒ２、ｈｕ．４４Ｒ３、ｒｈ．４８．２、ｒｈ．４８．２、ｒｈ４８．２．１を含む。
【０１６２】
実施例４−インビボ遺伝子導入の応用に及ぼすシングルトン効果
シングルトン変異体の効果は、インビボの設定で試験した。Ｃ５７Ｂ／６マウスでの遺伝子導入実験は、本発明の方法に従い修飾したベクター数で開始した。特定の応用については現在のリード候補に対して筋肉を対象とした、および肝臓を対象とした実験を開始し、そしてべンチマークで試験した。
【０１６３】
ヒトα−アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）はベクター中の感受性および定量的レポーター遺伝子として選択し、そしてＣＭＶ−強化ニワトリβ−アクチンプロモーターの制御下で発現した。ＣＢプロモーターの採用により、高レベルの組織非特異的および構成的Ａ１ＡＴ遺伝子導入が達成でき、そして同じベクター調製物の使用が任意の目的組織における遺伝子導入実験に可能となる。
【０１６４】
筋肉は最初の標的組織として選択した。４０の異なる新規ベクター（２４種のクローンに基づき、各々が各シングルトン変異体（１もしくは複数）を持つ）を、Ｃ５７Ｂ／６マウスの後脚に筋肉内注射した。すべての実験は、ＣＢ．Ａ１ＡＴ導入遺伝子カセットを用いて１×１０11ＧＣ／動物で行った。ベクターは、各時点でマウスあたり、およびクレード群あたりの等容量（５０μｌ）のアリコートに分けた。各個別の実験は、筋肉を標的化した遺伝子導入について、ベンチマークとして役立つ代表的な血清型であるＡＡＶ２／８およびＡＡＶ２／１を含む対照群を含め、１もしくは２つのクレードから成った。導入遺伝子発現は、注射後７、１４、２８および６３日に検出し、そして特異的ｈＡ１ＡＴ  ＥＬＩＳＡにより評価される。
【０１６５】
幾つかの単離物およびシングルトン補正変更体について、門脈内（ｉｎｔｒａｐｏｒｔａｌ）肝臓対象化注入後のそれらの性能に関するデータを作成した。予備的結果は、補正クローンの大部分が元の単離物と等しいか、またはそれより良いことを示す。１つの特定
のクローン、すなわちｃｙ．５について、シングルトン補正は筋肉の遺伝子導入に対して有益な効果と思われる。４つのシングルトン補正を持つクローンｃｙ．５Ｒ４は、元の単離物によりすでに現されているまずまずの筋肉向性に対して遺伝子導入効率を改善した。ｃｙ．５Ｒ４の性能は、ベンチマーク対照ＡＡＶ２／１およびＡＡＶ２／７に等しいか、またはわずかに良い。
【０１６６】
さらなる評価には、以前に低すぎる力価を生じた単離物、ｒｈ．６４が１つのシングルトンの補正後に筋肉で極めて良い性能を果たした。ｒｈ．６４Ｒ１はｒｈ６４．２より良く機能し、そして最も近縁の血清型ＡＡＶ２／８だけでなくＡＡＶ２／７により達成されるレベルより高いｈＡ１ＡＴレベルを与えた。
【０１６７】
他の実験では、マウスにベクターをクレードに基づく群で注射した。１×１０11ＧＣ／マウスに、ＣＢ．ｈＡ１ＡＴを発現するベクターを投与した。ｈＡ１ＡＴの血清レベルは、特異的ｈＡ１ＡＴ  ＥＬＩＳＡにより測定された。
【０１６８】
シングルトンがインビボ遺伝子導入に及ぼす効果は、単離物および標的組織に依存するようである。幾つかの興味深い考察がなされた。
【０１６９】
特定のシングルトンクローンについて、効果は筋肉および肝臓（例えばｒｈ．２、ｒｈ．１３またはｃｙ．５）で量的に同様であった。単離物ｈｕ．４８およびｒｈ．４８は、回復したシングルトンの数が増えると筋肉中の発現も増加した。
【０１７０】
ｒｈ．６４およびＡＡＶ６のような他のクローンは、特定の発現プロファイルを示す。例えば単離物ｈｕ．４８Ｒ２は、ｈｕ．４８Ｒ３と比べた時、約１０倍低い効率でパッケージするが、ｈｕ．４８Ｒ３は筋肉に約５倍低い効率で形質導入する。ＡＡＶ６は２つのシングルトンを含む。両方がパッケージングに中程度の効果を有し、そして合わせるとそれらはＡＡＶ６パッケージングをベンチマークレベルまでもっていく。インビトロで、親のクローンおよび異なるクローンの間に認識できる差異はほとんどない。インビボでは、筋肉でＡＡＶ６．１およびＡＡＶ６．１．２は低下した遺伝子導入を示すが、ＡＡＶ６．２は中程度の増加を示す。
【０１７１】
実施例５−肺および肝臓におけるシングルトン補正ＡＡＶの評価
シングルトン残基の回復によりパッケージングおよび遺伝子導入効率について至適化されたＡＡＶベクターは、さらに肺および肝臓で評価された。このデータはシングルトンを含有しないもの、またはシングルトン残基が保存されたアミノ酸に変換されたものと同定された両ベクターについて示される。
【０１７２】
Ａ．ｐｉ２、ｒｈ３２．３３、ＡＡＶ２／９、ＡＡＶ２／５、ｒｈ．２Ｒ、ｃｈ５Ｒにより媒介される気管内注射後に、肺へのＣＢ．Ａ１ＡＴ  ＡＡＶ遺伝子導入の評価
幾つかのＡＡＶキャプシドが、それらの肺を標的とする能力について比較される。ｈＡ１ＡＴレベルを血清で測定した。評価したＡＡＶは、シングルトン無し（ｐｉ２、ｒｈ３２．３３、ＡＡＶ２／９、ＡＡＶ２／５、ｒｈ．２Ｒ、ｃｈ５Ｒ）か、または１つのシングルトン残基（ｒｈ．２、ｒｈ８）を含むかのいずれかである。ＡＡＶ２／５およびＡＡＶ２／９をベンチマークとして表す。
【０１７３】
遺伝子導入実験は、上記のキャプシド中、ＣＢ．Ａ１ＡＴ発現カセット（すなわちＡＡＶ２  ５’ＩＴＲ、ニワトリβ−アクチンプロモーター（ＣＢ）、ヒトα１−アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）、ＡＡＶ２３’ＩＴＲ）またはＣＢ．ｎＬａｃＺ発現カセット（すなわちＡＡＶ２,５’ＩＴＲ、核局在化β−ガラクトシダーゼ（ｎＬａｃＺ）、ＡＡＶ２３’ＩＴＲ）のいずれかを持つベクターを使用して、Ｃ５７Ｂ／６マウス（オス、１群あた
り５）で行った。簡単に説明すると、５０μＬのこれらシングルトン補正またはシングルトン無しのベクターを、Ａ１ＡＴを持つベクターおよびｎＬａｃＺ（１×１０11ゲノムコピー（ＧＣ））を持つベクターと気管内に同時点滴した（１×１０11ＧＣ））。
【０１７４】
１２および２０日に２０の採血を行い、そしてＡ１ＡＴの血清レベルを測定した（ｎｇＡＡＴ／ｍＬ血清）。データは１×１０11ＧＣの気管内（ＩＴ）注射後、ｒｈ．２からｒｈ．２Ｒに関する肺でのヒトα１−アンチトリプシン発現の劇的増加が示された。加えて、シングルトン残基を含まない種々のＡＡＶベクターを評価した。すべてのベクターは肺で許容され得るレべルの発現を示した。
【０１７５】
Ｂ．ＡＡＶ２／５およびＡＡＶ２／９と比較したＡＡＶ６シングルトンベクターの評価
ＡＡＶ６シングルトン補正クローンを評価した。修飾したＡＡＶ６（ＡＡＶ６．２）は本発明のシングルトン補正法、および本明細書に記載するシュードタイピング技法を使用して調製した。実施例５に記載するように調製したＡ１ＡＴおよびＬａｃＺ発現カセットを持つＡＡＶ６．２粒子は、鼻内（１×１０11ＧＣ）および気管内に同時注射した。ＡＡＴ発現は血清および気管支肺胞液（ＢＡＬ）でＥＬＩＳＡにより評価した。発現レベルは全タンパク質について標準化した。ＬａｃＺ発現は、肺ホモジネートからのβ−ガラクトシダーゼについてＥＬＩＳＡにより測定した。検視を２１日に行った。
【０１７６】
これらのベクターは、Ｃ５７Ｂ１／６マウス（オス、ｎ＝８／群）を含む実験で、ＡＡＶ２／６（現在、肺への遺伝子導入について臨床的な候補）、ＡＡＶ２／５およびＡＡＶ２／９と比較した。
【０１７７】
ＡＡＶ６．２は、血清Ａ１ＡＴ排出においてＡＡＶ６を上回る統計的に有意な改善を示した。またＡＡＶ６．２は、ＡＡＶ２／９およびＡＡＶ２／５を含む他のベクターに比べて高レベルのＡ１ＡＴレベルを示した。ＢＡＬにおける軽度の改善が、肺ホモジネート中のＬａｃＺ発現のように記録された。しかし動物の変動に対して大型な動物により、ＬａｃＺ定量から結論を引き出せなかった。
【０１７８】
ＡＡＶ遺伝子発現の局在化を評価する場合、ＡＡＶ２／６に比べてＡＡＶ２／６．２群で核に局在化したＬａｃＺに関する優れた染色が観察された。これらは嚢胞性線維症のような疾患の主要な標的である肺気道上皮で、ＡＡＶ２／６およびＡＡＶ２／５に優る改善が特記された。
【０１７９】
Ｃ．Ｃ５７Ｂｌ／６マウスを対象としたクレードＢおよびクレードＣのＡＡＶメンバーを用いたＡＡＶ．ＣＢ．Ａ１ＡＴ（１×１０11ＧＣ）の門脈内（ｉｖ）注射
使用したすべてのベクターは、単離物（ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２、ｈｕ．１３、ｈｕ．５１、ｈｕ．１１、ｈｕ．５３）から、または突然変異（ｈｕ．２９Ｒ）のいずれによってもシングルトン残基が存在しない。すべてのベクターはベンチマークとしてＡＡＶ２／８（クレードＥ）と比較する。
【０１８０】
Ｄ．クレードＥのＡＡＶメンバーの静脈内注射。ｒｈ．６４Ｒ１、ｒｈ．６４Ｒ２、ｒｈ．２Ｒは、シングルトンが最適化されている。すべての他のベクターにはシングルトンが無い。
【０１８１】
ＡＡＶクレードＢおよびＣのメンバーからの発現は、ｈｕ．２９Ｒ（シングルトンが最適化されたクローン）を含むすべてのメンバーについて類似から等価であることが分かった。この特定のクローンはｈｕ．２９からのパッケージング能力で再構成され、そして今、ウイルスファミリーの他のメンバーと類似の遺伝子導入機能性を表す。
【０１８２】
評価したクレードＥベクターについて、自然にシングルトンを含まないか、またはシングルトン残基について補正したいずれかのすべてのベクターは、肝臓に向けた遺伝子導入について現在最高の物、ＡＡＶ２／８に順じた範囲で機能する。特にＡＡＶｒｈ６４Ｒ１およびｒｈ．６４Ｒ２は興味深い。パッケージングが欠損していることがわかったｒｈ．６４は、１つ（ｒｈ．６４Ｒ１）または２つ（ｒｈ．６４Ｒ２）のシングルトンの転換後に、肝臓に向けられた遺伝子導入において等しく良く機能する。ｒｈ．２について、シングルトン補正は遺伝子送達において劇的な１０倍以上の増加に対応する。
【０１８３】
本発明の主な特徴および態様は次のとおりである：
【０１８４】
態様１：親のＡＡＶのパッケージング収量、形質導入効率および／または遺伝子導入効率を上げる方法であって、
（ａ）親のＡＡＶキャプシド配列をアライメントにおいて機能的ＡＡＶ配列のライブラリーと比較し；
（ｂ）親のＡＡＶキャプシド中の少なくとも１つのシングルトンを同定し、該シングルトンは、並置された機能的ＡＡＶキャプシド配列の対応する位置のアミノ酸が完全に保存されている親のＡＡＶキャプシド中の該位置の可変アミノ酸であり：
（ｃ）シングルトンを、機能的ＡＡＶキャプシド配列中の対応する該位置に位置するアミノ酸に改変する、
工程を含んで成る上記方法。
【０１８５】
態様２：並置された機能的ＡＡＶキャプシド配列が、並置されたｖｐ１配列の完全長にわたり少なくとも８５％同一である少なくとも４つのＡＡＶ配列を含んでなり、そして少なくとも２つの異なるＡＡＶクレードに由来するＡＡＶ配列を含む、態様１に記載の方法。
【０１８６】
態様３：ライブラリーが各クレードに由来する少なくとも２つのＡＡＶ配列を含んでなる態様１に記載の方法。
【０１８７】
態様４：並置されたＡＡＶキャプシド配列のライブラリーが、少なくとも３つの異なるクレードに由来するＡＡＶ配列を含んでなる態様１に記載の方法。
【０１８８】
態様５：並置されたＡＡＶキャプシド配列のライブラリーが、少なくとも３〜１００のＡＡＶ配列を含んでなる態様１に記載の方法。
【０１８９】
態様６：並置されたＡＡＶキャプシド配列のライブラリーが、少なくとも６〜５０のＡＡＶ配列を含んでなる態様１に記載の方法。
【０１９０】
態様７：ライブラリーが少なくとも１２のＡＡＶ配列を含んでなる態様６に記載の方法。
【０１９１】
態様８：親のＡＡＶが複数のシングルトンを含む態様１に記載の方法。
【０１９２】
態様９：親のＡＡＶが２〜４のシングルトンを含む態様８に記載の方法。
【０１９３】
態様１０：工程（ｃ）が異なるシングルトンで繰り返される態様８に記載の方法。
【０１９４】
態様１１：標的ＡＡＶが可変アミノ酸のコドンの部位特異的突然変異誘発法により改変される、態様１に記載の方法。
【０１９５】
態様１２：部位特異的突然変異誘発法がプラスミド骨格上で運ばれる標的ＡＡＶについて行われる態様１１に記載方法。
【０１９６】
態様１３：改変したＡＡＶをＡＡ粒子にパッケージングする工程をさらに含んでなる態様１に記載の方法。
【０１９７】
態様１４：ＡＡＶ粒子が標的ＡＡＶに比べて上昇したパッケージング効率を有する態様１３に記載の方法。
【０１９８】
態様１５：ＡＡＶ粒子が標的ＡＡＶに比べて上昇した形質導入効率を有する態様１３に記載の方法。
【０１９９】
態様１６：ＡＡＶ粒子が標的ＡＡＶに比べて上昇した遺伝子導入効率を有する態様１３に記載の方法。
【０２００】
態様１７：態様１に記載の方法に従い改変されているＡＡＶキャプシドを含んでなるウイルスベクター。
【０２０１】
態様１８：配列番号１のアミノ酸配列を有するｒｈ２０、またはそれに少なくとも９７％の同一性を有する配列；
配列番号２のアミノ酸配列を有するｒｈ３２／３３、またはそれに少なくとも９７％の同一性を有する配列；
配列番号３のアミノ酸配列を有するｒｈ３９、またはそれに少なくとも９７％の同一性を有する配列；
配列番号４のアミノ酸配列を有するｒｈ４６、またはそれに少なくとも９７％の同一性を有する配列；
配列番号５のアミノ酸配列を有するｒｈ７３、またはそれに少なくとも９７％の同一性を有する配列；
配列番号６のアミノ酸配列を有するｒｈ７４、またはそれに少なくとも９７％の同一性を有する配列；
からなる群から選択されるＡＡＶキャプシドを含んでなるベクター。
【０２０２】
態様１９：上記ウイルスベクターが遺伝子産物をコードする導入遺伝子を、宿主細胞中で該産物の発現を支配する調節配列の制御下に持つ態様１８に記載のウイルスベクター。
【０２０３】
態様２０：天然ではリシンであるアミノ酸残基５３１位にグルタミン酸を有することにより修飾された配列番号２９のアミノ酸配列を有するＡＡＶ６．１：
天然ではフェニルアラニンであるアミノ酸残基１２９位にロイシンを有することにより修飾された配列番号２９のアミノ酸配列を有するアミノ酸を有するＡＡＶ６．２：
天然ではフェニルアラニンであるアミノ酸残基１２９位にリシンを、そして天然ではロイシンであるアミノ酸残基５３１位にグルタミン酸を有することにより修飾された配列番号２９のアミノ酸配列を有するＡＡＶ６．１．２；
からなる群から選択されるアデノ随伴キャプシドタンパク質を有する修飾ウイルスベクター。
【０２０４】
態様２１：天然ではアスパラギン酸であるアミノ酸残基５３１位にグルタミン酸を有するように修飾される配列番号４１のアミノ酸配列を有するｒｈ．８Ｒ；
天然ではリシンであるアミノ酸残基２１７位にグルタミン酸を有するように修飾される配列番号４４のアミノ酸配列を有するｒｈ．４８．１；
天然ではセリンであるアミノ酸残基３０４位にアスパラギンを有するように修飾される配列番号４４のアミノ酸配列を有するｒｈ．４８．２；
天然ではリシンであるアミノ酸残基２１７位にグルタミン酸を、そして天然ではセリン
であるアミノ酸残基３０４位にアスパラギンを有するように修飾される配列番号４４のアミノ酸配列を有するｒｈ．４８．１．２；
天然ではグルタミン酸であるアミノ酸残基１３７位にリシンを有するように修飾される配列番号４５のアミノ酸配列を有するｈｕ．４４Ｒ１；
天然ではグルタミン酸であるアミノ酸残基１３７位にリシンを、そして天然ではプロリンであるアミノ酸４４６位にロイシンを有するように修飾される配列番号４５のアミノ酸配列を有するｈｕ．４４Ｒ２；
天然ではグルタミン酸であるアミノ酸残基１３７位にリシンを、そして天然ではプロリンであるアミノ酸４４６位にロイシンを、そして天然ではグリシンであるアミノ酸６０９位にアスパラギン酸を有するように修飾される配列番号４５のアミノ酸配列を有するｈｕ．４４Ｒ３；
天然ではグリシンであるアミノ酸３９６位にグルタミン酸を有するように修飾される配列番号４２のアミノ酸配列を有するｈｕ．２９Ｒ；
天然ではグリシンであるアミノ酸残基２７７位にセリンを含むように修飾された配列番号５０のアミノ酸配列を有するｈｕ．４８Ｒ１；
天然ではグリシンであるアミノ酸残基２７７位にセリンを含み、そして天然ではグルタミン酸であるアミノ酸残基３２２位にリシンを含むように修飾された配列番号５０のアミノ酸配列を有するｈｕ．４８Ｒ２；
天然ではグリシンであるアミノ酸残基２７７位にセリンを含み、そして天然ではグルタミン酸であるアミノ酸残基３２２位にリシンを含み、そして天然ではセリンであるアミノ酸残基５５２位にアスパラギンを含むように修飾された配列番号５０のアミノ酸配列を有するｈｕ．４８Ｒ３；
からなる群から選択される修飾されたアデノ随伴キャプシドを有するウイルスベクター。
【０２０５】
態様２２：遺伝子産物を宿主細胞に送達するための薬剤の調製における態様１７ないし２１のいずれかに記載のウイルスベクターの使用。
【０２０６】
態様２３：態様１７ないし２１のいずれかに記載のウイルスベクターを個体に送達することを含んでなる、個体に遺伝子産物を送達する方法。
【０２０７】
態様２４：配列番号１のアミノ酸配列を有するｒｈ２０；
配列番号２のアミノ酸配列を有するｒｈ３２／３３；
配列番号３のアミノ酸配列を有するｒｈ３９；
配列番号４のアミノ酸配列を有するｒｈ４６；
配列番号５のアミノ酸配列を有するｒｈ７３；
配列番号６のアミノ酸配列を有するｒｈ７４；
天然ではバリンであるアミノ酸残基４０４位にメチオニンを有することにより修飾された配列番号４９のアミノ酸配列を有するｒｈ５４；
天然ではリシンであるアミノ酸残基５３１位にグルタミン酸を有することにより修飾された配列番号２９のアミノ酸配列を有するＡＡＶ６．１；
天然ではフェニルアラニンであるアミノ酸残基１２９位にロイシンを有することにより修飾された配列番号２９のアミノ酸配列を有するアミノ酸を有するＡＡＶ６．２；
天然ではフェニルアラニンであるアミノ酸残基１２９位にリシンを、そして天然ではロイシンであるアミノ酸残基５３１位にグルタミン酸を有することにより修飾された配列番号２９のアミノ酸配列を有するＡＡＶ６．１．２；
天然ではアスパラギン酸であるアミノ酸残基５３１位にグルタミン酸を有するように修飾される配列番号４１のアミノ酸配列を有するｒｈ．８Ｒ；
天然ではリシンであるアミノ酸残基２１７位にグルタミン酸を有するように修飾される配列番号４４のアミノ酸配列を有するｒｈ．４８．１；
天然ではセリンであるアミノ酸残基３０４位にアスパラギンを有するように修飾される
配列番号４４のアミノ酸配列を有するｒｈ．４８．２；
天然ではリシンであるアミノ酸残基２１７位にグルタミン酸を、そして天然ではセリンであるアミノ酸残基３０４位にアスパラギンを有するように修飾される配列番号４４のアミノ酸配列を有するｒｈ．４８．１．２；
天然ではグルタミン酸であるアミノ酸残基１３７位にリシンを有するように修飾される配列番号４５のアミノ酸配列を有するｈｕ．４４Ｒ１；
天然ではグルタミン酸であるアミノ酸残基１３７位にリシンを、そして天然ではプロリンであるアミノ酸残基４４６位にロイシンを有するように修飾される配列番号４５のアミノ酸配列を有するｈｕ．４４Ｒ２；
天然ではグルタミン酸であるアミノ酸残基１３７位にリシンを、そして天然ではプロリンであるアミノ酸４４６位にロイシンを、そして天然ではグリシンであるアミノ酸６０９位にアスパラギン酸を有するように修飾される配列番号４５のアミノ酸配列を有するｈｕ．４４Ｒ３；
天然ではグリシンであるアミノ酸３９６位にグルタミン酸を有するように修飾される配列番号４２のアミノ酸配列を有するｈｕ．２９Ｒ；
天然ではグリシンであるアミノ酸残基２７７位にセリンを含むように修飾された配列番号５０のアミノ酸配列を有するｈｕ．４８Ｒ１；
天然ではグリシンであるアミノ酸残基２７７位にセリンを含み、そして天然ではグルタミン酸であるアミノ酸残基３２２位にリシンを含むように修飾された配列番号５０のアミノ酸配列を有するｈｕ．４８Ｒ２；および
天然ではグリシンであるアミノ酸残基２７７位にセリンを含み、そして天然ではグルタミン酸であるアミノ酸残基３２２位にリシンを含み、そして天然ではセリンであるアミノ酸残基５５２位にアスパラギンを含むように修飾された配列番号５０のアミノ酸配列を有するｈｕ．４８Ｒ３；
からなる群から選択されるＡＡＶ配列をコードする核酸配列を含んでなる核酸分子。
【図１】
0006039632.tif 000005
【図２Ａ−２Ｃ】
0006039632.tif 000006
【図３】
0006039632.tif 000007
【図４Ａ】
0006039632.tif 000008
【図４Ｂ】
0006039632.tif 000009
【図４Ｃ】
0006039632.tif 000010
【図４Ｄ】
0006039632.tif 000011
【図４Ｅ】
0006039632.tif 000012
【図４Ｆ】
0006039632.tif 000013
【図４Ｇ】
0006039632.tif 000014
【図４Ｈ】
0006039632.tif 000015
【図４Ｉ】
0006039632.tif 000016
【図４Ｊ】
0006039632.tif 000017
【図４Ｋ】
0006039632.tif 000018
【図４Ｌ】
0006039632.tif 000019
【図５Ａ】
0006039632.tif 000020
【図５Ｂ】
0006039632.tif 000021
【図５Ｃ】
0006039632.tif 000022
【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
0006039632.tif 000025
【配列表】
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