(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
基材と、前記基材上に設けられた、細胞を培養するための機能性層とを有する細胞培養基材の検査方法であって、
傾斜させた細胞培養基材の機能性層の表面に供給された第１の液滴の転落速度を測定し、得られた第１の液滴の転落速度に基づいて機能性層の状態の良否を判定する第１検査工程と、
機能性層の表面に第２の液滴を供給し、供給した第２の液滴が蒸発する過程における、第２の液滴及び機能性層が接触する接触領域の減少速度を測定し、得られた減少速度に基づいて機能性層の状態の良否を判定する第２検査工程と、
を含む前記細胞培養基材の検査方法。
【請求項２】
第２検査工程で、供給した第２の液滴が蒸発する過程における、第２の液滴の接触角の変化をさらに測定し、
接触角の変化が、接触角が減少する区間と、その後に略一定の接触角を維持する区間と、その後に接触角が再び減少する区間とを含み、
接触領域の減少速度は、前記略一定の接触角を維持する区間における減少速度である請求項１に記載の細胞培養基材の検査方法。
【請求項３】
機能性層が、温度変化により細胞接着性が変化する温度応答性ポリマーを含む請求項１又は２に記載の細胞培養基材の検査方法。
【請求項４】
請求項１に記載の検査方法を実施するための装置であって、
細胞培養基材が配置され、前記細胞培養基材を傾斜させる駆動手段を備えたステージと、
ステージ上に配置された細胞培養基材の機能性層の表面に液滴を供給するための液滴供給手段と、
液滴を蒸発させるための蒸発誘導手段と、
液滴を撮影するための撮像手段と、
撮像手段により撮影した画像に基づき液滴の転落速度を算出する転落速度算出部と、
撮像手段により撮影した画像に基づき液滴の接触領域の減少速度を算出する減少速度算出部と、
を有する細胞培養基材の検査装置。
【請求項５】
請求項２に記載の検査方法を実施するための装置であって、
細胞培養基材が配置され、前記細胞培養基材を傾斜させる駆動手段を備えたステージと、
ステージ上に配置された細胞培養基材の機能性層の表面に液滴を供給するための液滴供給手段と、
液滴を蒸発させるための蒸発誘導手段と、
液滴を撮影するための撮像手段と、
撮像手段により撮影した画像に基づき液滴の転落速度を算出する転落速度算出部と、
撮像手段により撮影した画像に基づき液滴の接触領域の減少速度を算出する減少速度算出部と、
撮像手段により撮影した画像に基づき液滴の接触角を算出する接触角算出部と、
を有する細胞培養基材の検査装置。
【請求項６】
基材と、前記基材上に設けられた、細胞を培養するための機能性層とを有する細胞培養基材を準備する工程と、
準備した細胞培養基材について、請求項１〜３のいずれかに記載の検査方法を実施する工程と、
を有し、
検査の結果、第１検査工程及び第２検査工程の両方において機能性層の状態が良と判定されたものを製品とする細胞培養基材の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、基材上に機能性層を備える細胞培養基材の検査方法及び検査装置、並びにそのような細胞培養基材の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞をシート状に培養し、トリプシン等の酵素を使用せずに例えば温度を低下させるだけで細胞をシート状に回収する「細胞シート工学」という技術が再生医療分野で注目されている。本技術によって得られる細胞シートは、角膜や歯周組織等の再生医療で既に一定の治療効果が確認され、欧州で既に臨床研究や治験が進められている。また、複数の種類の細胞シートを積層させることによる三次元組織モデルの作製や、血管組織を伴う成熟した組織を生体外で作製することも可能であり、本技術をベースにした研究開発や治療が今後ますます期待される。
【０００３】
培養した細胞シートの接着、脱着の制御は、例えば、基材上に固定したポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＰＩＰＡＡｍ）等の機能性層を介して行われる。このポリマーは、主に温度に応答して水和能が変化する材料であり、臨界溶解温度未満の温度では周囲の水に対する親和性が向上し、ポリマーが水を取り込み膨潤して表面に細胞を接着しにくくする性質（細胞非接着性）を示し、同温度以上の温度ではポリマーから水が脱離することでポリマーが収縮し表面に細胞を接着しやすくする性質（細胞接着性）を示すものである。細胞の脱接着性は、上記ＰＩＰＡＡｍの固定化密度や鎖長に影響を受けることが知られており、したがって、細胞の脱接着性の良否を検討するため、機能性層の状態を検査する手法の開発が望まれている。
【０００４】
基材上に機能性層を設けた細胞培養基材を検査する従来の方法として、（特許文献１）が知られている。（特許文献１）には、０〜８０℃の温度範囲で水和力が変化するポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド等の温度応答性ポリマーを被覆した細胞培養基材の表面上に、細胞を播種後、４８時間以内に蛋白質加水分解酵素を使わずに温度処理だけで細胞を当該基材表面から剥離して回収し、生細胞と反応する試薬を用いて分光計で定量する、温度応答性細胞培養基材の評価方法が開示されている。培養細胞は、基材表面積当たり１００〜１００００個／ｃｍ２となるように個々の状態で基材表面上に付着していることが必要とされる。すなわち、細胞をシートの状態で回収すると、細胞間接着によって細胞が引っ張られる力の影響が無視できないため、（特許文献１）では個々の状態（まばらな状態）で基材上に播種することにより細胞間接着の影響を排除し、基材と細胞との相互作用のみを反映した結果を得ている。
【０００５】
上記（特許文献１）に記載の評価方法（検査方法）は、細胞培養を実施するため、検査を行うために少なくとも数時間〜数十時間を要するという問題点があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００９−８２１２３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで本発明は、上記従来の状況に鑑み、細胞培養を実施する必要がなく、短時間でＰＩＰＡＡｍ等からなる機能性層の状態を検査することができる方法、及びその方法を実施するための検査装置を提供することを目的とする。また、上記検査方法を利用して、機能性層の状態が良であるような細胞培養基材を製造する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、ＰＩＰＡＡｍ等の、細胞を培養するための機能性層の状態に依存して、その機能性層の表面に供給した液滴のはじき挙動及び蒸発挙動が異なる点に着目した。そして、機能性層の表面を転落する液滴の速度を測定し、その速度値を指標とする１次スクリーニングを行い、さらに機能性層の表面上で液滴が蒸発する過程における液滴と機能性層との接触領域の減少速度を測定し、その速度値を指標とする２次スクリーニングを行うことによって、機能性層の状態を効率的に検査できることを見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
【０００９】
（１）基材と、前記基材上に設けられた、細胞を培養するための機能性層とを有する細胞培養基材の検査方法であって、
傾斜させた細胞培養基材の機能性層の表面に供給された第１の液滴の転落速度を測定し、得られた第１の液滴の転落速度に基づいて機能性層の状態の良否を判定する第１検査工程と、
機能性層の表面に第２の液滴を供給し、供給した第２の液滴が蒸発する過程における、第２の液滴及び機能性層が接触する接触領域の減少速度を測定し、得られた減少速度に基づいて機能性層の状態の良否を判定する第２検査工程と、
を含む前記細胞培養基材の検査方法。
（２）第２検査工程で、供給した第２の液滴が蒸発する過程における、第２の液滴の接触角の変化をさらに測定し、
接触角の変化が、接触角が減少する区間と、その後に略一定の接触角を維持する区間と、その後に接触角が再び減少する区間とを含み、
接触領域の減少速度は、前記略一定の接触角を維持する区間における減少速度である上記（１）に記載の細胞培養基材の検査方法。
（３）機能性層が、温度変化により細胞接着性が変化する温度応答性ポリマーを含む上記（１）又は（２）に記載の細胞培養基材の検査方法。
（４）上記（１）に記載の検査方法を実施するための装置であって、
細胞培養基材が配置され、前記細胞培養基材を傾斜させる駆動手段を備えたステージと、
ステージ上に配置された細胞培養基材の機能性層の表面に液滴を供給するための液滴供給手段と、
液滴を蒸発させるための蒸発誘導手段と、
液滴を撮影するための撮像手段と、
撮像手段により撮影した画像に基づき液滴の転落速度を算出する転落速度算出部と、
撮像手段により撮影した画像に基づき液滴の接触領域の減少速度を算出する減少速度算出部と、
を有する細胞培養基材の検査装置。
（５）上記（２）に記載の検査方法を実施するための装置であって、
細胞培養基材が配置され、前記細胞培養基材を傾斜させる駆動手段を備えたステージと、
ステージ上に配置された細胞培養基材の機能性層の表面に液滴を供給するための液滴供給手段と、
液滴を蒸発させるための蒸発誘導手段と、
液滴を撮影するための撮像手段と、
撮像手段により撮影した画像に基づき液滴の転落速度を算出する転落速度算出部と、
撮像手段により撮影した画像に基づき液滴の接触領域の減少速度を算出する減少速度算出部と、
撮像手段により撮影した画像に基づき液滴の接触角を算出する接触角算出部と、
を有する細胞培養基材の検査装置。
（６）基材と、前記基材上に設けられた、細胞を培養するための機能性層とを有する細胞培養基材を準備する工程と、
準備した細胞培養基材について、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の検査方法を実施する工程と、
を有し、
検査の結果、第１検査工程及び第２検査工程の両方において機能性層の状態が良と判定されたものを製品とする細胞培養基材の製造方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、細胞培養を実施する必要がなく、短時間で細胞培養基材における細胞の脱接着性等を検査することができ、細胞培養基材を量産する場合の品質管理を迅速に行うことができる。また、細胞の脱接着性に優れる細胞培養基材を効率的に製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の検査方法における第１検査工程を説明するための図である。
【図２】本発明の検査方法における第２検査工程を説明するための図である。
【図３】本発明の検査方法における第２検査工程を説明するための図である。
【図４】本発明に係る細胞培養基材の検査装置の一実施形態を示す図である。
【図５】実施例１における液滴が蒸発する過程での液滴の接触角及び接触半径の変化を示すグラフである。
【図６】実施例２における液滴が蒸発する過程での液滴の接触角及び接触半径の変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、図面に基づき本発明を詳細に説明する。まず、本発明の検査対象である細胞培養基材の構成について述べる。
細胞培養基材は、基材上（通常は、基材の片面側）に、細胞を培養するための機能性層を設けて構成される。基材と機能性層の間は、一般には直接密着しているが、必要に応じて、機能性層の固定化を容易にするプライマー層等の中間層が介在していても良い。
【００１３】
細胞培養基材は、細胞及び培地を収容する細胞培養容器の内底面に設置されて使用される。したがって、基材は、細胞培養容器の底板を兼ねていても良いし、底板や側壁等から形成された容器の内底面に、後から基材及び機能性層の積層体を接合させる形態であっても良い。容器に後から接合させる積層体の形態である場合、基材は板状又はフィルム状であり、基材の、機能性層が設けられた側と反対側には、細胞培養容器の底板に接合させるための粘着剤層及び剥離シートを適宜設けることができる。
【００１４】
基材の材料は特に限定されない。具体的には、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ＴＡＣ（トリアセチルセルロース）、ポリイミド（ＰＩ）、ナイロン（Ｎｙ）、低密度ポリエチレン（ＬＤＰＥ）、中密度ポリエチレン（ＭＤＰＥ）、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリフェニレンサルファイド、ポリエーテルサルフォン、ポリエチレンナフタレート、ポリプロピレン、アクリル樹脂等の樹脂材料や、ガラス、石英等の無機材料が挙げられ、樹脂材料が好ましく用いられる。
【００１５】
基材の、機能性層が設けられる側の表面は、易接着処理された表面であることができる。「易接着処理」とは、例えば、ポリエステル、アクリル酸エステル、ポリウレタン、ポリエチレンイミン、シランカップリング剤、ペルフルオロオクタンスルホン酸（ＰＦＯＳ）等の易接着剤による処理を指す。
【００１６】
機能性層を構成する材料としては、細胞を培養することができる機能を有するものであれば特に限定されない。例えば、静電相互作用により細胞との接着性を示す材料として、ポリリジン等の塩基性ポリマー、アミノプロピルトリエトキシシラン、Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリメトキシシラン等の塩基性化合物及びそれらを含む縮合物等が挙げられる。また、生物学的特性により細胞との接着性を示す材料として、フィブロネクチン、ラミニン、テネイシン、ビトロネクチン、ＲＧＤ（アルギニン−グリシン−アスパラギン酸）配列含有ペプチド、ＹＩＧＳＲ（チロシン−イソロイシン−グリシン−セリン−アルギニン）配列含有ペプチド、コラーゲン、アテロコラーゲン、ゼラチン等が挙げられる。
【００１７】
その中でも、細胞を培養後、基材から細胞を脱着させるため、あるいは細胞をシート状に回収するために細胞培養基材を利用する場合には、機能性層として、所定の刺激により細胞接着性が変化する機能を有するものを採用することができる。例えば、刺激を加えることにより細胞接着性から細胞非接着性へと変化する刺激応答性ポリマーを含むことができる。刺激応答性ポリマーとしては、温度応答性ポリマー、ｐＨ応答性ポリマー、イオン応答性ポリマー、光応答性ポリマー等を挙げることができ、作製しようとする細胞シートに適したものを適宜選択することができる。特に、温度応答性ポリマーが、温度変化により細胞接着性が変化し、刺激の付与が容易であることから好ましい。
【００１８】
温度応答性ポリマーとして、例えば、細胞を培養する温度では細胞接着性を示し、作製した細胞シートを剥離する時の温度では細胞非接着性を示すものを用いると良い。具体的には、臨界溶解温度未満の温度では周囲の水に対する親和性が向上し、ポリマーが水を取り込んで膨潤して表面に細胞を接着しにくくする性質（細胞非接着性）を示し、同温度以上の温度ではポリマーから水が脱離することでポリマーが収縮して表面に細胞を接着しやすくする性質（細胞接着性）を示すものを用いると良い。このような臨界溶解温度は、下限臨界溶解温度と呼ばれる。下限臨界溶解温度Ｔが０℃〜８０℃、さらに好ましくは０℃〜５０℃である温度応答性ポリマーを用いると良い。Ｔが０℃〜８０℃であると、細胞を安定的に培養できるからである。
【００１９】
好適な温度応答性ポリマーとしては、アクリル系ポリマー又はメタクリル系ポリマーが挙げられる。より具体的には、例えばポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（Ｔ＝３２℃）、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド（Ｔ＝２１℃）、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド（Ｔ＝３２℃）、ポリ−Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド（Ｔ＝約３５℃）、ポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド（Ｔ＝約２８℃）、ポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド（Ｔ＝約３５℃）、及びポリ−Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド（Ｔ＝３２℃）等が挙げられる。
【００２０】
これらのポリマーを形成するためのモノマーとしては、放射線照射によって重合し得るモノマーを用いることができる。モノマーとしては例えば、（メタ）アクリルアミド化合物、Ｎ−（もしくはＮ，Ｎ−ジ）アルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体、環状基を有する（メタ）アクリルアミド誘導体、及びビニルエーテル誘導体等が挙げられ、これらの１種以上を使用することができる。モノマーが一種類単独で使用された場合、基材上に形成されるポリマーはホモポリマーとなり、モノマーが複数種一緒に使用された場合、基材上に形成されるポリマーはヘテロポリマーとなるが、本発明においてはいずれの形態も適用可能である。
【００２１】
また、増殖細胞の種類によってＴを調節する必要がある場合や、機能性層の親水・疎水性のバランスを調整する必要がある場合等には、上記以外の他のモノマー類をさらに加えて共重合しても良い。さらに、上記ポリマーとその他のポリマーとのグラフト又はブロック共重合体、あるいは上記ポリマーと他のポリマーとの混合物を用いて機能性層を構成しても良い。また、ポリマー本来の性質が損なわれない範囲で架橋することも可能である。
【００２２】
温度応答性ポリマー等を含む機能性層は、従来知られた手法を適宜採用して基材上に形成することができる。例えば、重合により目的の刺激応答性ポリマーを形成するモノマーと、該モノマーを溶解しうる有機溶媒と含む塗布用組成物を調製し、これを慣用の塗布方法に従って、基材の表面に塗布して塗膜を形成し、次に、該塗膜に放射線照射等の適当な手段により塗膜中のモノマーを重合してポリマーを形成するとともに、基材の表面とポリマーとの間にグラフト化反応を生じさせることにより形成することができる。
【００２３】
機能性層の膜厚は、例えば、０．５ｎｍ〜３００ｎｍの範囲内とすると良く、特に１ｎｍ〜１００ｎｍの範囲内であることが好ましいが、これに限定されるものではない。
【００２４】
次に、本発明の細胞培養基材の検査方法及び検査装置について述べる。本発明の検査方法は、傾斜させた細胞培養基材の機能性層の表面に供給された第１の液滴の転落速度を測定する第１検査工程と、機能性層の表面に第２の液滴を供給し、供給した第２の液滴が蒸発する過程における、第２の液滴及び機能性層が接触する接触領域の減少速度を測定する第２検査工程とを有することを特徴とする。
【００２５】
まず、第１検査工程について説明する。第１検査工程では、図１に示すように、基材１０及び機能性層２０を含む細胞培養基材１を角度αで傾斜させ、その傾斜させた機能性層２０の表面に、第１の液滴Ｌ１を供給する。第１の液滴Ｌ１は機能性層２０上を転落するため、その時の転落速度をカメラ等の撮像手段を用いて測定する。なお、第１の液滴Ｌ１としては通常水が用いられるが、場合によりアルコール等の他の液体を用いても良い。具体的には、エタノール、イソプロピルアルコール、メタノール等を使用することができる。転落速度の値は、機能性層２０を構成するポリマーの固定化量等、機能性層の状態に依存する。すなわち、例えば機能性層２０が温度応答性ポリマーから構成される場合には、基材に対するポリマーの固定化量が大きくなるほど転落速度は遅くなるため、転落速度の値から固定化量の大小を知ることができる。
【００２６】
図１において、第１の液滴Ｌ１の量は、適切な転落速度の値が得られれば良く特に限定されない。例えば、１μＬ〜１ｍＬ程度とすることができる。また、細胞培養基材１を傾斜させる角度αは、測定される転落速度が適度な値になるよう適宜調節される。具体的には、１°〜９０°とすることができる。
【００２７】
次に、細胞培養基材１について第２検査工程を実施する。第２検査工程では、まず、図２及び図３に示すように、細胞培養基材１における機能性層２０の表面に第２の液滴Ｌ２を供給する。そして、細胞培養基材１を介して間接的に第２の液滴Ｌ２を加熱するか、又は第２の液滴Ｌ２を直接的に加熱する方法、あるいは雰囲気の圧力を低下させる方法等の適宜方法により第２の液滴Ｌ２を蒸発させ、その蒸発過程における第２の液滴Ｌ２と機能性層２０との接触領域の減少をＣＣＤカメラ等の撮像手段により観測する。本発明者は、このとき、第２の液滴Ｌ２と機能性層２０との接触領域の減少速度が機能性層２０の状態を反映することから、減少速度の値に基づいて機能性層２０の状態の良否を判定可能であることを見出した。なお、第２の液滴Ｌ２と機能性層２０との接触領域を示す値としては、例えば、第２の液滴Ｌ２を上方から観測したときの第２の液滴Ｌ２が占める領域の面積値を採用することができる。あるいは、第２の液滴Ｌ２は機能性層２０上において水平方向に等方的に広がり、上方から見て円形状であるとみなせるため、接触領域の面積値と対応する接触半径ｒ等、領域の面積値に対応する値の変化速度をもって接触領域の減少速度としても良い。なお、第２の液滴Ｌ２は、第１の液滴Ｌ１と同種の液体であっても異なる液体であっても良く、通常水が用いられるが、場合によりアルコール等の他の液体を用いても良い。具体的には、エタノール、イソプロピルアルコール、メタノール等を使用することができる。また、第２の液滴Ｌ２を加熱する場合の温度は、測定効率との兼ね合いで適宜設定される。例えば、第２の液滴Ｌ２が水である場合には通常３０℃〜６０℃程度とすることが好ましい。より好ましくは４０℃〜５０℃程度である。
【００２８】
図２に示すように、例えば機能性層２０がポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＰＩＰＡＡｍ）等の温度応答性ポリマーを含み、且つその固定化量が少ない場合には、機能性層２０の表面の疎水性が相対的に高くなり、その場合、第２の液滴Ｌ２と機能性層２０との間の相互作用の影響は小さくなるため、第２の液滴Ｌ２はその形状を維持しながら（相似形を保ちつつ）図２の（ａ）〜（ｃ）のように蒸発し、接触領域に対応する接触半径ｒはなだらかに、すなわち小さい速度で減少することとなる。一方、図３に示すように、例えば機能性層２０がＰＩＰＡＡｍ等の温度応答性ポリマーを含み、且つその固定化量が多い場合には、機能性層２０の表面の疎水性は相対的に低くなる（親水性が高くなる）。その場合、第２の液滴Ｌ２と機能性層２０との間の相互作用の影響が大きくなるため、第２の液滴Ｌ２は、蒸発過程の初期において、接触半径ｒを維持したまま接触角θのみが減少する（図３の（ａ）から（ｂ）の過程）。その後、さらに第２の液滴Ｌ２の蒸発が進むと、第２の液滴Ｌ２と機能性層２０との間に働く相互作用の力が第２の液滴Ｌ２の表面張力に抗しきれなくなり、接触角θがほとんど変化しないまま、接触領域に対応する接触半径ｒが急速に、すなわち大きい速度で減少することとなる（図３の（ｂ）から（ｃ）の過程）。なお、上記の説明並びに図２及び図３は、第２の液滴Ｌ２と機能性層２０との相互作用が弱い場合及び強い場合の傾向を誇張して示したものであり、実際には接触半径ｒ及び接触角θの変化は複合的に進行する。
【００２９】
さらに、第２の液滴Ｌ２が蒸発する過程における、第２の液滴Ｌ２の接触角θの変化を測定した場合には、蒸発過程の初期段階で接触角が減少する区間と、その後に略一定の接触角を維持する区間と、その後に接触角が再び減少する区間とを経て蒸発が進行することが多い。このように異なる挙動を示す複数の区間を経て蒸発する理由は定かではないが、第２の液滴Ｌ２と機能性層２０との間の相互作用による力、第２の液滴Ｌ２の表面張力、重力等が総合的に作用する結果と考えられる。この場合、機能性層２０の状態の判定の基礎とする接触領域の減少速度の値として、略一定の接触角を維持する区間における接触領域の減少速度を採用することが好ましい。ここで、略一定とは、前後の区間における接触角の変化率の絶対値に比べ、接触角の変化率の絶対値が相対的に小さく一定とみなせる状態を指す。この区間は、蒸発による第２の液滴Ｌ２の容量減少の影響が少なく、第２の液滴Ｌ２及び機能性層２０の相互作用（すなわち検査対象である機能性層の状態）と接触領域の減少速度との相関が最も良いと考えられるからである。無論、上記の３つの区間が明確に観測されない場合や、より簡易的な検査を行う場合等には、蒸発過程の全体にわたる接触領域の平均減少速度等、別の手法により算出した減少速度を基に検査を行っても良い。
【００３０】
第２の液滴Ｌ２の量は、第２の液滴Ｌ２の蒸発過程を適切に観測できれば良く特に限定されない。例えば、１μＬ〜１ｍＬ程度とすることができる。複数の細胞培養基材を検査する場合は、供給する第２の液滴Ｌ２は細胞培養基材間で同一の量とすることが好ましい。
【００３１】
以上の検査方法を細胞培養基材の製造工程において利用することにより、機能性層の状態（固定化量、細胞の脱接着性）が良好な細胞培養基材を効率的に製造することができる。具体的には、例えば、予めいくつかの細胞培養基材を用いて細胞培養を行い、その細胞培養結果と第１検査工程により得られる転落速度及び第２検査工程により得られる接触領域の減少速度との相関を調べて転落速度及び減少速度の好適な範囲（又は閾値）を求めておき、それ以降に量産される他の細胞培養基材の転落速度及び減少速度の値が、第１検査工程及び第２検査工程の両方の好適な範囲（又は閾値）に含まれるか否かをもって製品の良否の判定作業を行うことができる。この場合、細胞培養基材の量産工程においては、検査のために従来のような細胞培養を実施しないため、極めて短時間で検査を行うことができ、細胞培養基材の量産工程の大幅な効率化を図ることができる。一例として、基材がポリスチレンからなり、機能性層が温度応答性ポリマーであるポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＰＩＰＡＡｍ）を含む細胞培養基材の場合、第１検査工程において、ＰＩＰＡＡｍの下限臨界溶解温度未満である２５℃の条件下、６０°の角度に傾斜させた細胞培養基材の機能性層上を転落する液滴の転落速度が０．５×１０−４ｍｍ／ｍｓｅｃ〜１．０×１０−３ｍｍ／ｍｓｅｃの範囲内であり、且つ、第２検査工程において、機能性層の表面に１μＬの水を供給し４０℃で蒸発させる場合に、略一定の接触角を維持する区間における接触半径ｒの減少速度が０．０１５μｍ／ｍｓｅｃ〜０．０２０μｍ／ｍｓｅｃの範囲内であれば、ＰＩＰＡＡｍの固定化量及び細胞の脱接着性の観点から、機能性層の状態が良好であると判定することができる。
【００３２】
なお、通常、第２検査工程の方が第１検査工程に比べて機能性層２０の状態の良否を精度良く判定可能である。したがって、細胞培養基材を量産する場合には、まず製造した細胞培養基材の全量について第１検査工程を実施し、第１検査工程において機能性層の状態が良と判定されたものだけを選抜して第２検査工程を実施することにより、大量の細胞培養基材を効率良く検査することができるため好ましい。しかし、これに限定されるものではなく、製造した細胞培養基材の全量について第１検査工程及び第２検査工程の双方を実施しても良く、また、第２検査工程の後に第１検査工程を行っても良い。この場合、第１検査工程及び第２検査工程のそれぞれから得られる結果を総合的に比較・分析して機能性層の状態の良否を判定することができる。
【００３３】
図４に、上述の検査方法を実施するための装置の一実施形態を示す。この検査装置は、同一の装置を用いて第１検査工程（図４上）及び第２検査工程（図４下）を実施する例を示しており、細胞培養基材１が配置されるステージ１１と、ステージ１１上に配置された細胞培養基材１の機能性層の表面に液滴を供給するためのシリンジ等の液滴供給手段１３と、液滴を蒸発させるための蒸発誘導手段１４と、液滴を撮影するための撮像手段１５ａ、１５ｂと、それらの撮像手段により撮影した画像に基づき液滴の転落速度を算出する転落速度算出部１６ａ及び接触領域の減少速度を算出する減少速度算出部１６ｂとを有している。蒸発過程における液滴の接触角の変化も測定する場合には、撮影した画像に基づき液滴の接触角を算出する接触角算出部１６ｃをさらに備えることができる。ステージ１１はモーター等から構成される駆動手段１２を備え、第１検査工程において駆動手段１２によりステージ１１を所定の角度になるよう傾斜させ、液滴供給手段１３から液滴Ｌ１を供給して測定を行う。そして、第２検査工程を実施する際に駆動手段１２によりステージ１１を水平に制御し、液滴供給手段１３から液滴Ｌ２を供給して測定を行う。蒸発誘導手段１４としては、液滴Ｌ２を間接的又は直接的に加熱するためのヒーターや、雰囲気の圧力を低下させるための真空ポンプ等が挙げられる。
【００３４】
ステージ１１上の細胞培養基材１は、拡散板１８を通過させた光源１７からの光で照明される。撮像手段１５ａ、１５ｂは、蒸発する液滴を捉えることができれば良く、具体的にはＣＣＤ等を備える高速度カメラが好適に用いられる。図４に示すようにステージ１１の上方及び側方から液滴を撮影し、液滴の転落速度及び接触領域の面積の減少速度等を測定することができるが、その他、ステージ１１の下方に撮像手段を設置して液滴を平面的に観測したり、側方のみに撮像手段を設置しても良い。撮像手段がステージ１１の側方のみにある場合には、液滴の転落速度、接触領域の減少速度（接触半径の減少速度）及び液滴の接触角を１つの撮像手段で計測可能となり、装置の構成が簡便なものとなる。また、液滴供給手段１３は、設定した量の液滴Ｌ１、Ｌ２を滴下できるよう設定されている。さらに、転落速度算出部１６ａ、減少速度算出部１６ｂ及び接触角算出部１６ｃは、撮像手段により取得される画像を解析し、液滴の転落速度、接触領域の減少速度及び接触角を算出する機能を有している。
【００３５】
なお、上記の例は、同一の装置を用いて第１検査工程及び第２検査工程を実施する場合であるが、これに限定されず、第１検査工程及び第２検査工程を別々の装置により実施しても良い。別々の装置を用いる場合、第１検査工程を行う検査装置においては蒸発誘導手段１４、減少速度算出部１６ｂ及び接触角算出部１６ｃ等を適宜省略することができ、第２検査工程を行う検査装置においては駆動手段１２及び転落速度算出部１６ａ等を適宜省略することができる。
【実施例】
【００３６】
次に、実施例及び比較例に基づき本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００３７】
・細胞培養基材の製造
ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（アルドリッチ社）を２％含み、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドを、最終モノマー濃度がそれぞれ３０重量％、３５重量％及び４０重量％となるようにイソプロピルアルコール（ＩＰＡ）に溶解させて３種類の溶液を調製した。続いて、基材としてポリスチレンフィルムシート（ＰＳ）（ＤＩＣ社製）を用い、このＰＳ上に前記の３種類のＮ−イソプロピルアクリルアミド溶液をコーティングし、電子線照射装置（岩崎電気社製）を用いて電子線照射を行い、ＰＳ表面にポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＰＩＰＡＡｍ）からなる機能性層をグラフト重合により形成した。ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドが結合したＰＳを、５℃のイオン交換水を用いて洗浄し、その後乾燥して３種類の細胞培養基材を得た。３０重量％、３５重量％及び４０重量％のモノマー濃度に対応する細胞培養基材をそれぞれ実施例１〜３とする。また、比較例１として、ＰＳのみからなるシートについて実施例１〜３と同様の測定を行った。
【００３８】
・第１検査工程
接触角測定装置ＤＭ−５０１（商品名、協和界面科学社製）のステージに実施例１〜３の細胞培養基材及び比較例１のＰＳシートを順に載置し、ヒーター温度をポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドの下限臨界溶解温度（Ｔ＝３２℃）未満である２５℃、ステージの傾斜角を６０°に設定した。続いて、マイクロシリンジにより実施例１〜３の細胞培養基材及び比較例のＰＳシートの表面に純水を１μＬ滴下した。滴下後、転落する液滴の側方からＣＣＤカメラで測定間隔１００ｍｓｅｃの条件で撮影し、液滴の前方端の変位から液滴の転落速度を算出した。測定結果を表１に示す。
【００３９】
【表１】
0005849806.tif 000002
【００４０】
比較例１における液滴の前方端の変位量は、等速直線運動からのずれが比較的大きかった。これは、ＰＳシート固有の表面の凹凸等の影響によるものと推定される。一方、モノマー濃度が高いほど、液滴の変位量のずれは小さくなった。これは、モノマー濃度が高くなることでＰＩＰＡＡｍの固定化量が上がり、基材表面をＰＩＰＡＡｍが被覆する割合が高まったためと考えられる。また、表１に示すように、モノマー濃度（ＰＩＰＡＡｍの固定化量）が高いほど、転落速度は低下することが分かった。したがって、第１検査工程により、ＰＩＰＡＡｍの被覆の有無、及びモノマー濃度の大小を判定することができる。しかしながら、実施例１及び実施例２には転落速度に明確な差が見られなかったので、これらの細胞培養基材を区別するべく、次の第２検査工程を実施した。
【００４１】
・第２検査工程
実施例１及び実施例２の細胞培養基材を、接触角測定装置ＤＭ−５０１（商品名、協和界面科学社製）の水平なステージに載置し、ヒーター温度をポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドの下限臨界溶解温度（Ｔ＝３２℃）以上である４０℃に設定した。続いて、マイクロシリンジにより機能性層の表面に純水を１μＬ滴下した。滴下後、液滴を側方からＣＣＤカメラで測定間隔５０００ｍｓｅｃの条件で撮影し、ソフトウェアＦＡＭＡＳ（商品名、協和界面科学社製）により液滴の接触半径及び接触角を算出した。測定結果を図５及び図６に示す。
【００４２】
図５及び図６に示すように、実施例１及び実施例２はいずれも、測定開始後、接触角が減少する区間（区間１）で接触半径は略一定の値を維持し、略一定の接触角を維持する区間（区間２）で接触半径は減少し、接触角が再び減少する区間（区間３）で接触半径はさらに減少するという特徴が見られた。区間２における接触半径の変化から接触半径の減少速度を算出し、また、測定開始時点における接触角（静的接触角）と区間２における略一定の接触角（平均値）との差Δθを算出し、それらの結果を表２に示す。
【００４３】
【表２】
0005849806.tif 000003
【００４４】
表２に示すように、実施例１及び実施例２の細胞培養基材は、接触半径の減少速度、接触角差ともに顕著な差が見られた。実施例２の細胞培養基材は、実施例１に比べてＰＩＰＡＡｍの固定化量が多く、液滴Ｌと機能性層との相互作用が強いため、実施例２では接触角θがより小さくなるまで接触半径が維持され、測定開始時点での静的接触角と区間２での略一定の接触角との差Δθが大きくなったものと考えられる。
【００４５】
次に、実施例１〜３で作製した細胞培養基材を内側底面に設置したシャーレに、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地を満たし、３ＴＳ  Ｓｗｉｓｓ  Ａｌｂｉｎｏ細胞を６．２５×１０３ｃｅｌｌ／ｃｍ２の条件で播種した。３７℃下で１８時間培養した後に、２０℃の低温インキュベーターに移し、３０分間のインキュベート後、剥離して浮遊した細胞の様子を観察した。その結果、実施例３の細胞培養基材では細胞の剥離性（脱着性）が最も良好であった。実施例１及び２の細胞培養基材では細胞が一部剥離しなかったが、実施例２の剥離性が比較的優れていた。これらの結果から、液滴の転落速度を指標とする１次スクリーニングを行い、液滴が蒸発する過程における液滴接触領域の減少速度及び接触角差を指標とする２次スクリーニングを行うことによって、細胞の脱接着性が良好な細胞培養基材を効率的に製造することができることが分かった。
【符号の説明】
【００４６】
１    細胞培養基材
１０  基材
１１  ステージ
１２  駆動手段
１３  液滴供給手段
１４  蒸発誘導手段
１５ａ、１５ｂ  撮像手段
１６ａ  転落速度算出部
１６ｂ  減少速度算出部
１６ｃ  接触角算出部
１７  光源
１８  拡散板
２０  機能性層
Ｌ１  第１の液滴
Ｌ２  第１の液滴
ａ    前方端
ｂ    後方端
ｒ    接触半径
α    傾斜角度
θ    接触角
【図１】
0005849806.tif 000004
【図２】
0005849806.tif 000005
【図３】
0005849806.tif 000006
【図４】
0005849806.tif 000007
【図５】
0005849806.tif 000008
【図６】
0005849806.tif 000009