(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
全てのＡ型インフルエンザウイルス亜型に対して反応する第一の抗体を用いた第一のサンドイッチ式免疫測定と、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５亜型に対して特異的に反応する第二の抗体を用いた第二のサンドイッチ式免疫測定とを併用してなり、第一の抗体がＡ型インフルエンザウイルスの核タンパクに対する抗体であり、第二の抗体が、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５亜型のヘマグルチニン蛋白に対する抗体であって、インフルエンザウイルスＨ５亜型の強毒株であるA/tn/S.Africa/61、A/swan/Shima/449/83 (24a5b)、A/HongKong/156/97、A/HongKong/483/97、 A/duck/Yokohama/aq-10/2003、 A/chicken/Yamaguchi/7/04、A/Vietnam/1194/04、A/Chicken/Suphanburi/1/04、A/Whooperswan/Mongolia/3/05及びA/Chicken/Ibaraki/1/05の全てに対して反応し、さらに、インフルエンザウイルスＨ５亜型の弱毒株であるA/duck/Mi/54/76、A/duck/HongKong/342/78、A/duck/HongKong/698/79、A/duck/Pennsylvania/10128/84、A/swan/Hokkaido/4/96、A/swan/Hokkaido/51/96、A/swan/Hokkaido/67/96、A/duck/Hokkaido/69/00、A/duck/Hokkaido/447/00、A/duck/Mongolia/54/01、A/duck/Mongolia/500/01、A/duck/Mongolia/596/01及びA/duck/Hokkaido/84/02の全てに対して反応し、さらに、インフルエンザウイルスＨ５亜型以外のインフルエンザウイルスとは反応しないモノクローナル抗体であることを特徴とするＡ型インフルエンザウイルスＨ５亜型の検出法。
【請求項２】
全てのＡ型インフルエンザウイルス亜型に対して反応する第一の抗体、及び、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５亜型に対して特異的に反応する第二の抗体をそれぞれ予め所定位置に固定せしめて形成された第一及び第二の捕捉部位を備える膜担体を用意し、前記第一の抗体が反応する抗原に対して反応する第三の抗体と被験試料との第一の混合液、及び、前記第二の抗体が反応する抗原に対して反応する第四の抗体と前記被験試料との第二の混合液を、それぞれ第一及び第二の捕捉部位に向けて前記膜担体にてクロマト展開せしめるか、または、第三の抗体と第四の抗体と被験試料との混合液を前記捕捉部位の双方に向けて前記膜担体にてクロマト展開せしめ、前記第一の捕捉部位における第一の抗体との反応が陽性であることをもってＡ型インフルエンザウイルスを検出し、さらに第二の捕捉部位における第二の抗体との反応が陽性であることをもってＡ型インフルエンザウイルスＨ５亜型を検出できるようにしたイムノクロマトグラフィー測定法であって、第一の抗体がＡ型インフルエンザウイルスの核タンパクに対する抗体であり、第二の抗体が、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５亜型のヘマグルチニン蛋白に対する抗体であって、インフルエンザウイルスＨ５亜型の強毒株であるA/tn/S.Africa/61、A/swan/Shima/449/83 (24a5b)、A/HongKong/156/97、A/HongKong/483/97、 A/duck/Yokohama/aq-10/2003、A/chicken/Yamaguchi/7/04、A/Vietnam/1194/04、A/Chicken/Suphanburi/1/04、A/Whooperswan/Mongolia/3/05及びA/Chicken/Ibaraki/1/05の全てに対して反応し、さらに、インフルエンザウイルスＨ５亜型の弱毒株であるA/duck/Mi/54/76、A/duck/HongKong/342/78、A/duck/HongKong/698/79、A/duck/Pennsylvania/10128/84、A/swan/Hokkaido/4/96、A/swan/Hokkaido/51/96、A/swan/Hokkaido/67/96、A/duck/Hokkaido/69/00、A/duck/Hokkaido/447/00、A/duck/Mongolia/54/01、A/duck/Mongolia/500/01、A/duck/Mongolia/596/01及びA/duck/Hokkaido/84/02の全てに対して反応し、さらに、インフルエンザウイルスＨ５亜型以外のインフルエンザウイルスとは反応しないモノクローナル抗体であることを特徴とするイムノクロマトグラフィー測定法。
【請求項３】
前記第三及び第四の抗体は金属コロイドまたはラテックスで標識されている請求項２に記載の測定法。
【請求項４】
前記膜担体がニトロセルロース膜である請求項３に記載の測定法。
【請求項５】
全てのＡ型インフルエンザウイルス亜型に対して反応する第一の抗体と、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５亜型に対して特異的に反応する第二の抗体と、前記第一の抗体が反応する抗原に対して反応する第三の抗体と、前記第二の抗体が反応する抗原に対して反応する第四の抗体と、膜担体とを少なくとも備え、前記第一及び第二の抗体はそれぞれ予め膜担体の所定位置に固定されて第一及び第二の捕捉部位を形成し、前記第三及び第四の抗体は適当な標識物質で標識され、かつ、前記第三及び第四の抗体は前記捕捉部位の双方から離隔した位置からそれぞれ第一及び第二の捕捉部位に向けて前記膜担体にてクロマト展開可能なように用意されてなるイムノクロマトグラフィー測定装置であって、第一の抗体がＡ型インフルエンザウイルスの核タンパクに対する抗体であり、第二の抗体が、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５亜型のヘマグルチニン蛋白に対する抗体であって、インフルエンザウイルスＨ５亜型の強毒株であるA/tn/S.Africa/61、A/swan/Shima/449/83 (24a5b)、A/HongKong/156/97、A/HongKong/483/97、 A/duck/Yokohama/aq-10/2003、A/chicken/Yamaguchi/7/04、A/Vietnam/1194/04、A/Chicken/Suphanburi/1/04、A/Whooperswan/Mongolia/3/05及びA/Chicken/Ibaraki/1/05の全てに対して反応し、さらに、インフルエンザウイルスＨ５亜型の弱毒株であるA/duck/Mi/54/76、A/duck/HongKong/342/78、A/duck/HongKong/698/79、A/duck/Pennsylvania/10128/84、A/swan/Hokkaido/4/96、A/swan/Hokkaido/51/96、A/swan/Hokkaido/67/96、A/duck/Hokkaido/69/00、A/duck/Hokkaido/447/00、A/duck/Mongolia/54/01、A/duck/Mongolia/500/01、A/duck/Mongolia/596/01及びA/duck/Hokkaido/84/02の全てに対して反応し、さらに、インフルエンザウイルスＨ５亜型以外のインフルエンザウイルスとは反応しないモノクローナル抗体であることを特徴とするＡ型インフルエンザウイルスＨ５亜型検出用イムノクロマトグラフィー測定装置。
【請求項６】
前記膜担体は、第一の捕捉部位と第二の捕捉部位とを互いに離隔させて備えてなる単一の膜担体からなる請求項５に記載の測定装置。
【請求項７】
前記膜担体は、第一の抗体が固定された第一の膜担体と、第二の抗体が固定された第二の膜担体とからなる請求項５に記載の測定装置。
【請求項８】
前記第三の抗体は前記第一の膜担体上に用意されており、前記第四の抗体は前記第二の膜担体上に用意されている請求項７に記載の測定装置。
【請求項９】
前記第三及び第四の抗体は、それぞれ、前記第一及び第二の膜担体上に配置された含浸部材に含浸されて用意されている請求項８に記載の測定装置。
【請求項１０】
前記第一の膜担体及び前記第二の膜担体は何れも細長形状を備え、両膜担体の含浸部材を互いに所定の間隔をおいて離隔させて相互に並行して配置されている請求項９に記載の測定装置。
【請求項１１】
前記第一の膜担体及び前記第二の膜担体は何れも細長形状を備え、両膜担体の含浸部材を互いに所定の間隔をおいて離隔させて放射方向に又は反対方向に配置されている請求項９に記載の測定装置。
【請求項１２】
第一及び第二の膜担体の双方に連接した含浸部材を備え、該含浸部材には第三の抗体及び第四の抗体が含浸されている請求項７に記載の測定装置。
【請求項１３】
前記第三及び第四の抗体は金属コロイドまたはラテックスで標識されている請求項５に記載の測定装置。
【請求項１４】
前記膜担体がニトロセルロース膜である請求項１３に記載の測定装置。
【請求項１５】
前記膜担体はケース内に収容されてなる請求項５に記載の測定装置。
【請求項１６】
前記第三の抗体及び／又は第四の抗体はケース外又はケース内に収容されている請求項１５に記載の測定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ａ型インフルエンザウイルス感染のうち、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５亜型感染を検出することができる検出法、詳しくは、サンドイッチ式免疫測定法、特に、イムノクロマトグラフィー測定法およびイムノクロマトグラフィー測定装置に関するものであり、高病原性鳥インフルエンザウイルスなどのインフルエンザウイルスＨ５亜型の感染、特に、ヒトにおけるインフルエンザウイルスＨ５Ｎ１亜型感染を迅速かつ簡便に診断するために有用な検出法に関する。
【背景技術】
【０００２】
高病原性鳥インフルエンザは、鶏などに高致死性の病原性を示すインフルエンザウイルスによる感染症で、家きんペストとも呼ばれ、わが国では家畜伝染病予防法の法定伝染病に指定されており、世界獣医事務局（ＯＩＥ）ではリストＡ疾病として掲げられている。
【０００３】
今までに高病原性鳥インフルエンザを引き起こしたインフルエンザウイルスはインフルエンザＡ型ウイルスのＨ５亜型及びＨ７亜型のみである。これらの亜型が総て強毒性であるわけではないが、わが国では、強毒性及び弱毒性であるかにかかわらずこれらの亜型に家畜が感染した場合、すべて屠殺処分することとされている。
【０００４】
また人への鳥インフルエンザ感染はＨ５亜型、Ｈ７亜型およびＨ９亜型の感染が報告されている。このうちインフルエンザウイルスが原因で死亡者が報告されているのはＨ５Ｎ１亜型のみである。Ｈ５Ｎ１亜型感染は重篤な肺炎を引き起こし、死に至ることが報告されている。
Ｈ５Ｎ１亜型による高病原性鳥インフルエンザは、１９９７年に香港で流行し、さらに、２００３年から現在までアジアの数カ国で大流行し、人への感染及び死亡例も報告された。
現在、Ｈ５Ｎ１亜型の人への感染は世界規模で問題となっており、Ｈ１Ｎ１亜型、Ｈ３Ｎ２亜型に続く新型インフルエンザとして世界規模で警戒されている。
【０００５】
２００５年１１月１７日のＷＨＯの報告によると、ヒトのインフルエンザＨ５Ｎ１亜型感染確定症例数は１３０例であり、内死亡者は６７例である。２００４年１２月以降、ヒトへの感染確定症例数は急激に増加し、死亡例数も増加している。Ｈ５Ｎ１ウイルスに感染後の死亡率は５１．３％（６７／１３０）である。
上記からも明らかなように、Ｈ５Ｎ１亜型の人への感染が現実となりつつある現在、Ｈ５Ｎ１亜型感染を迅速に発見することは、大規模なインフルエンザ感染拡大を防ぐ上で重要な課題である。また迅速に診断することは治療においても重要である。
【０００６】
鳥における高病原性鳥インフルエンザ診断は、現状では、ウイルス感染が疑われる病鳥から気管スワブまたはクロアカスワブ（総排泄腔スワブ）を採取し、これを発育鶏卵に接種して培養した後、ウイルスを分離する方法により行われている。しかし、この方法は、結果が得られるまでに数日を要し、迅速に結果が求められない点で不利である。また、近年開発された遺伝子検査（PCR法、LAMP法）を用いることにより、結果を得るまでに要する時間は大幅に短縮されるが、かかる遺伝子検査には特別な機器及び技術を要するため、養鶏現場等で検査を行うことは出来ない。
【０００７】
インフルエンザウイルスはヒト上気道、下気道などに感染し、１〜２日の潜伏期をおいた後、発熱（３８〜３９℃）と共に頭痛、腰痛、筋肉痛、全身倦怠、消化器症状などを引き起こす。インフルエンザで最も問題となる合併症は高齢者の肺炎と小児の脳炎・脳症で、特に小児の脳炎・脳症は高熱、意識障害、痙攣を特徴とし、極めて予後が悪いうえに初発症状から中枢神経系症状の発現及び死に至る期間が極めて短いので、迅速な診断と処置が必要である。
【０００８】
従来は、上記のような臨床症状のみでインフルエンザ様疾患として診断されることが多かったが、近年、インフルエンザウイルス抗原を迅速に検出するキットが開発され普及し始めたことから、インフルエンザウイルス感染症として早期に診断することが可能となってきた。このような迅速診断キットとしては、酵素免疫法（ＥＩＡ）やイムノクロマトグラフィー測定法を原理として用いたものが挙げられ、Ａ型インフルエンザウイルスのみを検出するもの、Ａ型とＢ型をまとめて検出するもの、Ａ型とＢ型をそれぞれ検出するものなどがある。
しかしながら現在行われているインフルエンザ抗原検査はＡ型ウイルス全てに共通な核タンパク（ヌクレオプロテイン）に対する抗体を使用している。そのためインフルエンザＡ型ウイルスであるＨ５亜型感染とＨ１Ｎ１またはＨ３Ｎ２亜型感染との鑑別診断ができない。
Ｈ５Ｎ１亜型感染は重篤な肺炎を引き起こし、且つ死亡率が非常に高い。初期診断時にＨ５亜型感染を鑑別診断することは、患者に対する治療方針を立てる上でも重要である。さらに新たな感染を防ぐために患者を早期に隔離するなどの処置を講ずることができ、更なるＨ５Ｎ１亜型感染の拡大を防ぐ上でも重要である。
また、近年開発された遺伝子検査（ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法）を用いることにより、Ｈ５Ｎ１亜型を鑑別して検出することは可能であるが特別な機器及び技術を要するため簡便な方法ではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特表2004-509648号公報
【特許文献２】特開平11-108932号公報
【特許文献３】特開2001-215228号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Hinshaw VSら，「Specific antibody responses and generation of antigenic variants in chickens immunized against a virulent avian influenza virus」，Avian Dis. 1990, 34(1): 80-6
【非特許文献２】Kaverin NVら，「Structure of antigenic sites on the haemagglutinin molecule of H5 avian influenza virus and phenotypic variation escape mutants」，J. Gen. Virol. 2002, 83(pt10): 2497-505
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
このように、インフルエンザウイルスは感染が速く、発見が遅れると広い範囲にわたって急速に蔓延するので、感染をできる限り早期に、且つ、迅速に発見する必要がある。特にＡ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１亜型は重篤な肺炎を引き起こし、死亡率も高い。しかしながら、現在のところ、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５亜型は従来のインフルエンザウイルス抗原検出試薬では他のＡ型インフルエンザウイルス感染と鑑別して検出することはできない。
本発明の目的は、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５亜型を迅速かつ簡便に鑑別診断できる検出試薬、及びそれを用いた検出法、とりわけ、サンドイッチ式免疫測定法、特に、イムノクロマトグラフィー測定法およびイムノクロマトグラフィー測定装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者等は、インフルエンザウイルスＨ５亜型を免疫原としてマウスを免疫して該ウイルスのヘマグルチニン(HA)蛋白に対して特異的に反応する抗体を取得することに成功し、当該抗体を免疫測定法、特にサンドイッチ式免疫測定法、とりわけイムノクロマトグラフィー測定法で使用することにより、インフルエンザウイルスＨ５亜型を特異的に検出し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち、本発明の一局面によれば、全てのＡ型インフルエンザウイルス亜型に対して反応する第一の抗体を用いた第一の免疫測定と、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５亜型に対して特異的に反応する第二の抗体を用いた第二の免疫測定とを併用してなることを特徴とするＡ型インフルエンザウイルスＨ５亜型の検出法が提供される。
【００１４】
この検出法における免疫測定法としては、特に限定されるものではないが、サンドイッチ式免疫測定法、とりわけＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）法、イムノクロマトグラフィー測定法などが好ましい。
したがって、本発明の上記検出法の好ましい実施形態によれば、前記免疫測定法は、前記第一の抗体とこの第一の抗体が反応する抗原に対して反応する第三の抗体とを用いたサンドイッチ式免疫測定法、及び／又は、前記第二の抗体と該第二の抗体が反応する抗原に対して反応する第四の抗体とを用いたサンドイッチ式免疫測定法から構成される。これらのサンドイッチ式免疫測定法は、前記第一の抗体および第二または第四の抗体を担体に固定して実施すると好都合である。この場合、担体として膜担体を使用すると、イムノクロマトグラフィー測定法を実施することができる。
【００１５】
したがって、本発明の更に他の局面によれば、全てのＡ型インフルエンザウイルス亜型に対して反応する第一の抗体、及び、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５亜型に対して特異的に反応する第二の抗体をそれぞれ予め所定位置に固定せしめて形成された第一及び第二の捕捉部位を備える膜担体を用意し、前記第一の抗体が反応する抗原に対して反応する第三の抗体と被験試料との第一の混合液、及び、前記第二の抗体が反応する抗原に対して反応する第四の抗体と前記被験試料との第二の混合液を、それぞれ第一及び第二の捕捉部位に向けて前記膜担体にてクロマト展開せしめるか、または、第三の抗体と第四の抗体と被験試料との混合液を前記捕捉部位の双方に向けて前記膜担体にてクロマト展開せしめ、前記第一の捕捉部位における第一の抗体との反応が陽性であることをもってＡ型インフルエンザウイルスを検出し、さらに第二の捕捉部位における第二の抗体との反応が陽性であることをもってＡ型インフルエンザウイルスＨ５亜型を検出できるようにしたことを特徴とするイムノクロマトグラフィー測定法が提供される。
【００１６】
また、本発明の更に他の局面によれば、全てのＡ型インフルエンザウイルス亜型に対して反応する第一の抗体と、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５亜型に対して特異的に反応する第二の抗体と、前記第一の抗体が反応する抗原に対して反応する第三の抗体と、前記第二の抗体が反応する抗原に対して反応する第四の抗体と、膜担体とを少なくとも備え、前記第一及び第二の抗体はそれぞれ予め膜担体の所定位置に固定されて第一及び第二の捕捉部位を形成し、前記第三及び第四の抗体は適当な標識物質で標識され、かつ、前記第三及び第四の抗体は前記捕捉部位の双方から離隔した位置からそれぞれ第一及び第二の捕捉部位に向けて前記膜担体にてクロマト展開可能なように用意されてなるＡ型インフルエンザウイルスＨ５亜型検出用イムノクロマトグラフィー測定装置が提供される。
【００１７】
前記膜担体は、第一の捕捉部位と第二の捕捉部位とを互いに離隔させて備えてなる単一の膜担体からなるものであってもよく、または、第一の抗体が固定された第一の膜担体と、第二の抗体が固定された第二の膜担体とからなるものであってもよいが、後者の方が反応特異性に優れているので好ましい。後者の場合、第三の抗体は第一の膜担体上に用意しておき、第四の抗体は第二の膜担体上に用意しておくと、それぞれの膜担体に被験試料を注入するだけで測定が行えるので好都合である。第三及び第四の抗体は、それぞれ、第一及び第二の膜担体上に配置された含浸部材に含浸させて用意しておくと好都合である。別法として、第一及び第二の膜担体の双方に連接した単一の含浸部材を設け、該含浸部材に第三の抗体及び第四の抗体を一緒に含浸させておいてもよい。第一の膜担体及び前記第二の膜担体は何れも細長形状すなわち帯状形状を備えることが好ましく、この場合、本発明の測定装置は、所謂イムノクロマト法テストストリップの形態として提供することができる。
【００１８】
本発明の検出法及び測定方法において、第一の免疫測定は、キャピリア(登録商標）FluA+B（株式会社タウンズ製）などの市販のＡ型及びＢ型インフルエンザ鑑別測定用のイムノクロマト法テストストリップまたはキットを用いて実施でき、上記第一の膜担体としてかかる市販のテストストリップまたはキットを使用しても良い。この場合、第二の免疫測定のために、上記第二の膜担体のみを入手すれば、本発明の検出法及び測定方法を実施することができる。
【００１９】
本発明で使用する上記第一の抗体は、全てのＡ型インフルエンザウイルス亜型に対して反応するであればよいが、好ましくは、インフルエンザウイルスの核タンパクに対する抗体である。第一の抗体は、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよいが、反応特異性の観点から、モノクローナル抗体であることが好ましい。
ポリクローナル抗体は、例えば、配列番号６に記載されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列のうち、エピトープを構成するアミノ酸残基を含む部分に対応するＤＮＡ断片をクローニングし、当該クローン化遺伝子を大腸菌などの宿主で遺伝子工学的に発現させて発現蛋白を抽出および精製し、この精製蛋白を抗原として常法に従って動物を免疫し、その抗血清から取得することができる。
【００２０】
モノクローナル抗体は、例えば、上記と同様に得られた精製蛋白を抗原としてマウスのような動物を免疫したのち、この免疫された動物の脾臓細胞とミエローマ細胞とを細胞融合して得られた融合細胞をＨＡＴ含有培地でセレクトした後に増殖せしめ、増殖せしめた株を前記のようにして得られた精製蛋白を使用して、たとえば、酵素標識免疫法などにより選別することで、取得することができる。また、モノクローナル抗体として、公知のイムノクロマト法テストストリップにおいて用いられているＡ型インフルエンザウイルスの核タンパクに対するモノクローナル抗体を用いてもよい。
【００２１】
本発明で使用する上記第二の抗体は、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５亜型に対して特異的に反応する抗体であり、好ましくは、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５亜型のヘマグルチニン蛋白に対する抗体である。第二の抗体は、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよいが、反応特異性の観点から、モノクローナル抗体であることが好ましい。例えば、インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１型（A/Hong Kong/156/97(H5N1))）のヘマグルチニン蛋白の全アミノ酸配列は、配列番号７に示されるとおり公知である（Science 279 (5349), 393-396 (1998)）。したがって、第二の抗体は、かかるＡ型インフルエンザウイルスＨ５亜型のヘマグルチニン蛋白の全アミノ酸配列からエピトープを構成する領域を選択してＤＮＡをクローニングして発現させ、抽出、精製した精製蛋白を免疫原として第一の抗体に関して上述したと同様の方法で得ることができる。
【００２２】
本発明で使用する好ましい第二の抗体は、配列番号７に示されるヘマグルチニン蛋白のアミノ酸配列の１６８番目のアミノ酸を含むエピトープを認識する抗体、特にモノクローナル抗体（以下、「モノクローナル抗体ＡＡ１６８」ともいう）である。このエピトープは、上記アミノ酸配列の１６８番目のアミノ酸残基を含むその前後の数個のアミノ酸残基から構成されるものと考えられ、通常、当該１６８番目のアミノ酸残基を中心とする６〜１０個のアミノ酸残基から構成されると考えられる。
【００２３】
しかしながら、当該モノクローナル抗体ＡＡ１６８は、蛍光抗体法によれば、インフルエンザウイルスH5弱毒株に対して全般的に反応するが、A/tn/S.Africa/61、A/swan/Shima/449/83 (24a5b)、A/HongKong/156/97、A/HongKong/483/97、 A/duck/Yokohama/aq-10/2003 及びA/chicken/Yamaguchi/7/04からなる群より選ばれた強毒株の少なくとも１つには反応しないか又は弱毒株に対するよりも反応性が弱い。
【００２４】
したがって、本発明で使用する他の好ましい第二の抗体は、インフルエンザウイルスH5亜型であるA/tn/S.Africa/61、A/swan/Shima/449/83 (24a5b)、A/HongKong/156/97、A/HongKong/483/97、 A/duck/Yokohama/aq-10/2003 及びA/chicken/Yamaguchi/7/04の全てに対して反応するモノクローナル抗体（以下、「モノクローナル抗体ＷＳ」ともいう）である。モノクローナル抗体ＷＳは、蛍光抗体法によれば、上記強毒株の全てに対して強く反応する点で、モノクローナル抗体ＡＡ１６８と明確に区別されるものであり、モノクローナル抗体ＡＡ１６８と異なるエピトープを認識するものと考えられる。モノクローナル抗体ＷＳは、広範囲の強毒株及び弱毒株に対して反応するので、インフルエンザウイルスH5亜型を広く検出するのに好適であり、とりわけ、強毒株の検出用に好適である。
【００２５】
なお、モノクローナル抗体ＡＡ１６８及びモノクローナル抗体ＷＳの何れも、インフルエンザウイルスＨ５亜型以外のインフルエンザウイルスとは反応しないものであり、したがって、インフルエンザウイルスＨ５亜型のヘマグルチニン蛋白に対して特異的に反応する抗体である。
【００２６】
本発明において、イムノクロマトグラフィー測定法などのサンドイッチ式免疫測定法で使用する第三の抗体は、第一の抗体が反応する抗原に対して反応する抗体であればよく、該抗原が第一の抗体に対するエピトープを複数備えている場合には第一の抗体と同一の抗体であってもよく、該抗原が他のエピトープを備えている場合には第一の抗体以外の抗体であってもよい。
本発明において、イムノクロマトグラフィー測定法などのサンドイッチ式免疫測定法で使用する第四の抗体は、第二の抗体が反応する抗原に対して反応する抗体であればよく、該抗原が第二の抗体に対するエピトープを複数備えている場合には第二の抗体と同一の抗体であってもよく、該抗原が他のエピトープを備えている場合には第二の抗体以外の抗体であってもよい。
また、第三及び第四の抗体は、それぞれ、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよいが、反応特異性の点から、モノクローナル抗体であることが好ましい。
【００２７】
現在のところ、Ａ型インフルエンザウイルス亜型としてＨ（ヘマグルチニン）蛋白については１６種類、Ｎ（ノイラミダーゼ）蛋白については９種の亜型が知られており、理論上は１６×９＝１４４種の亜型が考えられるが、一般的には、このうち、Ｈ１〜１５亜型の代表例に対して反応する抗体が「全てのＡ型インフルエンザウイルス亜型に対して反応する抗体」と理解されている。したがって、本明細書において、「全てのＡ型インフルエンザウイルス亜型」とは、現在知られているＨ１〜１５亜型の代表例を意味し、具体的には、本明細書の後記表３に挙げられた株を意味する。また、Ａ型インフルエンザウイルスの核タンパクに対する抗体は、Ｂ型及びＣ型インフルエンザウイルスの何れの核タンパクとも交差反応性を示さないものであり、同様に、本発明の第一の抗体も、Ｂ型及びＣ型インフルエンザウイルスの何れの核タンパクとも交差反応性を示さないものである。
また、本明細書において、「抗体との反応が陽性」とは、抗原が抗体と抗原抗体反応することを意味する。
【発明の効果】
【００２８】
本発明によれば、Ａ型インフルエンザウイルス感染という結果だけでなく、更に進んでＡ型インフルエンザウイルスＨ５亜型の感染が特定できるので、ヒト、鳥等のＡ型インフルエンザウイルスＨ５亜型による感染症の診断に広く適用できる。特にヒトの場合、現在ヒトへの感染が確認されているのはＨ５Ｎ１亜型のみであるので、Ｈ５Ｎ１亜型感染の早期の発見、予防、治療に貢献することができる。
【００２９】
本発明の好ましい実施形態によれば、第一の抗体としてＡ型インフルエンザウイルスの核タンパクに対する抗体が使用され、第二の抗体としてＡ型インフルエンザウイルスＨ５亜型のヘマグルチニン蛋白に対する抗体が使用される。この実施形態では、第一の抗体と第二の抗体の検出対象が異なるため、互いの検出感度に影響を及ぼすことがなく、特異性の高い結果を得ることができる。
【００３０】
また、本発明のイムノクロマトグラフィー測定法およびイムノクロマトグラフィー測定装置によれば、特殊な機器及び熟練した技術を必要とすることなく、病院、養鶏現場等において簡便かつ迅速にインフルエンザウイルスＨ５亜型の検出及び該ウイルスによる感染を診断することが可能となる。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本発明のイムノクロマトグラフィー測定法を実施するために使用できる測定装置は、公知のイムノクロマト法テストストリップの構成に準拠して容易に実施できる。以下、その具体例を図面に基づいて説明する。
【００３２】
（１）単一のイムノクロマト法テストストリップを用いる実施形態
イムノクロマト法テストストリップの具体例としては、例えば図１に示されるテストストリップ１０が挙げられる。図１において、数字１は粘着シート、２は含浸部材、３は膜担体、４は捕捉部位、５は吸収用部材、６は試料添加用部材を示している。
図示の例では、膜担体３は、幅5mm、長さ36mmの細長い帯状のニトロセルロース製メンブレンフィルターからなり、同幅の粘着シート１の中程に貼り付けられている。膜担体３には、そのクロマト展開始点側、すなわち図１の左側（以下「上流側」と記す。なお、その逆の側、すなわち図１におけるクロマト展開方向側すなわち右側は以下「下流側」と記す。）の末端から下流側に7.5mmの位置に第一の抗体が固定され、第三の抗体とＡ型インフルエンザウイルスの核タンパク等のウイルス抗原との複合体を捕捉するための第一の捕捉部位４１ａが形成されている。さらに、膜担体３の上流側の末端から下流側に10.5mmの位置に第二の抗体が固定され、第四の抗体とＨ５亜型のヘマグルチニン蛋白等のウイルス抗原との複合体を捕捉するための第二の捕捉部位４１ｂが形成されている。さらに、膜担体３の上流側の末端から下流側に15.0mmの位置に所謂コントロールライン４２が設けられている。このコントロールライン４２は、分析対象物質の存否に係わらず反応が行われたことを確認するためのものであり、通常、前記第三及び／又は第四の抗体と免疫学的に特異的に結合する物質（分析対象物質を除く）を膜担体３に固定化することによって形成することができる。例えば、第三及び／又は第四の抗体としてマウス抗体を用いた場合は、該マウス抗体に対する抗体を用いることができる。
【００３３】
図１の装置では、膜担体３は、ニトロセルロース製メンブレンフィルターを用いているが、被験試料に含まれる分析対象物質をクロマト展開可能で、かつ、捕捉部位４を形成する抗体を固定可能なものであれば、いかなるものであってもよく、他のセルロース類膜、ナイロン膜、ガラス繊維膜なども使用できる。
図１の装置において、第一の抗体としては、全てのＡ型インフルエンザウイルス亜型の核タンパクに対して反応するモノクローナル抗体を用いることが好ましい。第二の抗体としては、Ｈ５亜型に対して特異的に反応するモノクローナル抗体を用いることが好ましい。
【００３４】
図１の装置において、第三の抗体は、第一の抗体が反応する抗原に反応する抗体であり、好ましくは、全てのＡ型インフルエンザウイルス亜型の核タンパクに対して反応する抗体であり、多くの場合、第一の抗体と同一の抗体を用いることができる。また、第四の抗体は、第二の抗体が反応する抗原に反応する抗体であり、例えば、全てのＡ型インフルエンザウイルスＨ５亜型のヘマグルチニン蛋白に対して反応するモノクローナル抗体を用いることができる。多くの場合、第四の抗体は、第二の抗体と同一の抗体とすることができる。
【００３５】
第三及び第四の抗体は、イムノクロマト法テストストリップ１０とは別体の適当な容器内で、被験試料及び展開溶媒と混合して混合液とした後、この混合液を図示のイムノクロマト法テストストリップ１０の試料添加用部材６に注入して膜担体３をクロマト展開させてもよい。しかし、被験試料と展開溶媒とを混合して調製した混合液を試料添加用部材６に注入した時、第三及び第四の抗体が、該混合液と混合して膜担体３へクロマト展開されるように、イムノクロマト法テストストリップ１０と一体化して配置しておくことが好ましい。このために、図１の装置では、第三及び第四の抗体は、適当な標識物質で予め標識された状態で、膜担体３の上流側の端部に連接した含浸部材２に含浸させてイムノクロマト法テストストリップ１０の一部を構成している。すなわち、第三及び第四の抗体は、含浸部材２に混合状態で含浸されている。なお、本明細書において、標識された状態の第三の抗体及び／又は第四の抗体を標識抗体と称することがある。
図示の例では、含浸部材２として、5mm×15mmの帯状のガラス繊維不織布を用いているが、これに限定されるものではなく、例えば、セルロース類布（濾紙、ニトロセルロース膜等）、ポリエチレン、ポリプロピレン等の多孔質プラスチック布類なども使用できる。
【００３６】
第三及び第四の抗体の標識物質としては、使用可能なものであればいかなる物質であってもよく、呈色標識物質、酵素標識物質、放射線標識物質などが挙げられる。
このうち、捕捉部位４での色の変化を肉眼で観察することにより迅速かつ簡便に判定できる点から、呈色標識物質を用いることが好ましい。
呈色標識物質としては、金コロイド、白金コロイド等の金属コロイドの他、赤色および青色などのそれぞれの顔料で着色されたポリスチレンラテックスなどの合成ラテックスや、天然ゴムラテックスなどのラテックスが挙げられ、このうち、金コロイドなどの金属コロイドが特に好ましい。
含浸部材２は、標識抗体の懸濁液を前記ガラス繊維不織布等の部材に含浸せしめ、これを乾燥させることなどによって作製できる。
【００３７】
イムノクロマト法テストストリップ１０は、図１に示されるように、膜担体３を粘着シート１の中程に貼着し、該膜担体３の上流側の末端の上に、含浸部材２の下流側の末端を重ね合わせて連接するとともに、この含浸部材２の上流側部分を粘着シート１に貼着して作成できる。
さらに、図１の装置では、含浸部材２の上面に試料添加用部材６の下流側部分を載置するとともに、該試料添加用部材６の上流側部分を粘着シート１に貼着しており、また、膜担体３の下流側部分の上面に吸収用部材５の上流側部分を載置するとともに、該吸収用部材５の下流側部分を粘着シート１に貼着せしめてイムノクロマト法テストストリップ１０を構成している。
【００３８】
試料添加用部材６としては、例えば、多孔質ポリエチレンおよび多孔質ポリプロピレンなどのような多孔質合成樹脂のシートまたはフィルム、ならびに、濾紙および綿布などのようなセルロース製の紙または織布もしくは不織布を用いることができる。
吸収用部材５は、液体をすみやかに吸収、保持できる材質のものであればよく、綿布、濾紙、およびポリエチレン、ポリプロピレン等からなる多孔質プラスチック不織布等を挙げることができるが、特に濾紙が最適である。
【００３９】
図１のイムノクロマト法テストストリップ１０は、そのまま、ディップスティック形式の測定装置として用いることもでき、別法としては、適当なプラスチックシートで裏打ち又はサンドイッチしたディップスティック形式の測定装置として提供してもよい。好ましくは、図１のイムノクロマト法テストストリップ１０は、試料添加用部材６と捕捉部位４の上方にそれぞれ被験試料注入部と判定部が開口された適当なプラスチック製ケース内に収容された測定装置として提供される。上述のとおり、本発明において、第三及び第四の抗体は、イムノクロマト法テストストリップ１０とは別体の適当な容器内で、被験試料及び展開溶媒と混合して混合液とした後、この混合液をイムノクロマト法テストストリップ１０の試料添加用部材６に注入して膜担体３をクロマト展開させてもよいので、イムノクロマト法テストストリップ１０をケース内に収容させた場合、第三及び第四の抗体は、含浸部材２に含浸させてケース内に収容してもよいし、また、該ケースとは別体の適当な容器内に収容してケース外に収容しておいてもよい。
【００４０】
かくして、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５亜型感染が疑われる患者の生体試料などからなる被験試料を必要に応じて適当な展開溶媒と混合してクロマト展開可能な混合液を得た後、当該混合液を図１に示されるイムノクロマト法テストストリップ１０の試料添加用部材６上に注入すると、該混合液は、該試料添加用部材６を通過して含浸部材２において、標識抗体と混合する。
その際、該混合液中にＡ型インフルエンザウイルスＨ５亜型が存在すれば、抗原抗体反応により該Ｈ５亜型ウイルスのウイルス抗原と第三の抗体との複合体、及び、該ウイルス抗原と第四の抗体との複合体が形成される。
【００４１】
これらの複合体は、膜担体３中をクロマト展開されて捕捉部位４に到達し、第一の捕捉部位４１ａに固定された第一の抗体と抗原抗体反応して捕捉され陽性の結果を呈するとともに、第二の捕捉部位４１ｂに固定された第二の抗体と抗原抗体反応して捕捉され陽性の結果を呈する。これに対し、該混合液中にＨ５亜型以外のＡ型インフルエンザウイルスが存在すれば、第一の捕捉部位４１ａのみにおいて陽性の結果が示され、第二の捕捉部位４１ｂにおいては陰性の結果が示される。したがって、第一及び第二の捕捉部位の結果を総合することで、Ｈ５亜型の感染か、Ｈ５亜型以外のＡ型インフルエンザウイルスの感染かを鑑別判定できる。
陽性か陰性かの判定は、標識物質として金コロイドなどの呈色標識物質が使用されていれば、当該呈色標識物質の集積により第一及び第二の捕捉部位４１ａ，４１ｂが発色するので、直ちに、判定することができる。
【００４２】
被験試料としては、特に制限はないが、例えば、クロアカスワブ、気管スワブ、糞便、鼻腔吸引液、鼻腔ぬぐい液および咽頭ぬぐい液、血液（全血でも、血清でも、血漿でもよい）、唾液、尿、臓器乳剤等が挙げられる。被験試料は、展開溶媒などの適当な希釈液で希釈して膜担体に注入してもよい。
なお、全血を被験試料として用いるときで、特に標識抗体の標識物質として金コロイドなどの呈色標識物質が用いられる場合、前記試料添加用部材に血球捕捉膜部材を配置しておくことが好ましい。血球捕捉膜部材は、前記含浸部材と前記試料添加用部材との間に積層することが好ましい。これにより、赤血球が膜担体に展開されるのが阻止されるので、膜担体の捕捉部位における呈色標識の集積の確認が容易になる。血球捕捉膜部材としては、カルボキシメチルセルロース膜が用いられ、具体的には、アドバンテック東洋株式会社から販売されているイオン交換濾紙ＣＭ（商品名）や、ワットマンジャパン株式会社から販売されているイオン交換セルロースペーパーなどを用いることができる。
【００４３】
（２）２つのイムノクロマト法テストストリップを用いる実施形態
図２の装置は、２本のイムノクロマト法テストストリップ１０及び２０からなるイムノクロマトグラフィー測定装置である。各イムノクロマト法テストストリップ１０及び２０は、捕捉部位４及び標識抗体の構成を除いて図１のイムノクロマト法テストストリップ１０の構成と同様である。図２のイムノクロマト法テストストリップ１０は、膜担体３の上流側の末端から7.5mmの位置に第一の抗体が固定され、第三の抗体と分析対象物質との複合体を捕捉するための第一の捕捉部位４１ａが形成されている点は図１と同様であるが、膜担体３の上流側の末端から10.5mmの位置に抗Ｂ型インフルエンザウイルス抗体が固定され、Ｂ型インフルエンザウイルスを検出する捕捉部位４１ｂが設けられている点で図１と異なる。そして、イムノクロマト法テストストリップ１０の含浸部材２には、標識された第三の抗体及び標識された抗Ｂ型インフルエンザウイルス抗体が、混合状態で標識抗体として含浸されている。ここで、第三の抗体として、多くの場合、第一の抗体と同様の抗体が使用できる。抗Ｂ型インフルエンザウイルス抗体としては、公知のイムノクロマトグラフィー測定装置に使用されている抗体が使用できる。
【００４４】
図２のイムノクロマト法テストストリップ２０は、膜担体３の上流側の末端から9.0mmの位置に第二の抗体が固定され、第四の抗体と分析対象物質との複合体を捕捉するための第二の捕捉部位４１ｃが形成されている点で図１のイムノクロマト法テストストリップ１０と異なる。そして、イムノクロマト法テストストリップ２０の含浸部材２には、標識された第四の抗体が、標識抗体として含浸されている。ここで、第四の抗体として、多くの場合、第二の抗体と同様の抗体を使用できる。
【００４５】
かくして、図１を参照して上記したと同様の方法で被験試料を含む混合液を得た後、当該混合液を図２に示されるイムノクロマト法テストストリップ１０及び２０のそれぞれの試料添加用部材６上に注入すると、該混合液は、該試料添加用部材６を通過して含浸部材２において、標識抗体と混合する。
その際、該混合液中にＡ型インフルエンザウイルスＨ５亜型が存在すれば、イムノクロマト法テストストリップ１０においては、抗原抗体反応により該Ｈ５亜型ウイルス抗原と第三の抗体との複合体が形成される。この複合体は、膜担体３中をクロマト展開されて捕捉部位４１に到達し、第一の捕捉部位４１ａに固定された第一の抗体と抗原抗体反応して捕捉され陽性の結果を呈するが、捕捉部位４１ｂに固定された抗Ｂ型インフルエンザウイルス抗体には捕捉されず陰性の結果を呈する。イムノクロマト法テストストリップ２０においては、該Ｈ５亜型ウイルス抗原と第四の抗体との複合体が形成され、該複合体は膜担体３中をクロマト展開されて第二の捕捉部位４１ｃに到達し、そこに固定された第二の抗体と抗原抗体反応して捕捉され陽性の結果を呈する。
【００４６】
これに対し、該混合液中にＨ５亜型以外のＡ型インフルエンザウイルスが存在すれば、イムノクロマト法テストストリップ１０においては、抗原抗体反応によりそのウイルス抗原と第三の抗体との複合体が形成される。この複合体は、膜担体３中をクロマト展開されて捕捉部位４に到達し、第一の捕捉部位４１ａに固定された第一の抗体と抗原抗体反応して捕捉され陽性の結果を呈するが、捕捉部位４１ｂに固定された抗Ｂ型インフルエンザウイルス抗体には捕捉されず陰性の結果を呈する。イムノクロマト法テストストリップ２０においては、該ウイルス抗原と第四の抗体との複合体は形成されず、両者はそれぞれ単独に膜担体３中をクロマト展開されて第二の捕捉部位４１ｃに到達するが、そこに固定された第二の抗体に捕捉されず、陰性の結果を呈する。
【００４７】
また、該混合液中にＢ型インフルエンザウイルスが存在すれば、イムノクロマト法テストストリップ１０においては、抗原抗体反応によりそのウイルス抗原と抗Ｂ型インフルエンザウイルス抗体との複合体が形成される。この複合体は、膜担体３中をクロマト展開されて捕捉部位４に到達し、捕捉部位４１ｂに固定された抗Ｂ型インフルエンザウイルス抗体と抗原抗体反応して捕捉され陽性の結果を呈するが、第一の捕捉部位４１ａに固定された第一の抗体には捕捉されず陰性の結果を呈する。イムノクロマト法テストストリップ２０においては、該ウイルス抗原と第四の抗体との複合体が形成されず、両者はそれぞれ単独に膜担体３中をクロマト展開されて第二の捕捉部位４１ｃに到達するが、そこに固定された第二の抗体に捕捉されず陰性の結果を呈する。
したがって、第一の捕捉部位４１ａ、第二の捕捉部位４１ｃ及び捕捉部位４１ｂにおける結果をもって、Ｈ５亜型の感染か、Ｈ５亜型以外のＡ型インフルエンザウイルスの感染か、Ｂ型インフルエンザウイルスの感染かを鑑別判定できる。
【００４８】
図２の装置は、２つのイムノクロマト法テストストリップ１０及び２０を少なくとも備えていればよく、２つのストリップが１つのケースに収容されたものであっても、各ストリップが数本ずつ各ケースに収容され、使用時に１つずつ取り出して使用するような形態のものであってもよい。前者の場合、１つのケース中に、イムノクロマト法テストストリップ１０及び２０の両膜担体の含浸部材を互いに所定の間隔をおいて離隔させ、両膜担体を相互に並行して配置させた一体製品としてもよい。
なお、図２のイムノクロマト法テストストリップ１０としては、キャピリア(登録商標）FluA+B（株式会社タウンズ製）などの市販のＡ型及びＢ型インフルエンザ鑑別測定用のイムノクロマト法テストストリップまたはキットをそのまま用いることもできる。したがって、かかる市販のテストストリップまたはキットと併用して本発明の検出法又は測定法を実施できるように、図２のイムノクロマト法テストストリップ２０のみを単品で供給することもできる。
【００４９】
図３の装置は、イムノクロマト法テストストリップ１０及び２０が共通する単一の含浸部材２及び試料添加用部材６を備える以外、図２の構成と同様の構成を備えている。すなわち、イムノクロマト法テストストリップ１０及び２０の両膜担体３は、互いに隣接してほぼ平行に配置され、上流側の末端に幅広の（幅約１２ｍｍ）の単一の含浸部材２が両膜単体３にまたがって連接されている。この含浸部材２には、それぞれ標識された第三の抗体と第四の抗体と抗Ｂ型インフルエンザウイルス抗体とが混合状態で、上記と同様にクロマト展開可能なように含浸されている。
【００５０】
かくして、図２を参照して上記したと同様の方法で被験試料を含む混合液を得た後、当該混合液を図３に示されるイムノクロマト法テストストリップ１０及び２０に共通の試料添加用部材６上に注入すると、該混合液は、該試料添加用部材６を通過して含浸部材２において、標識抗体と混合する。
その際、該混合液中にＡ型インフルエンザウイルスＨ５亜型が存在すれば、イムノクロマト法テストストリップ１０においては、図２と同様に第一の捕捉部位４１ａにおいて陽性の結果を呈し、捕捉部位４１ｂでは陰性の結果を呈する。イムノクロマト法テストストリップ２０においては、該Ｈ５亜型ウイルス抗原と標識抗体との複合体が、第二の捕捉部位４１ｃに固定された第二の抗体に捕捉されて陽性の結果を呈する。
該混合液中にＨ５亜型以外のＡ型インフルエンザウイルスが存在すれば、図２と同様に、イムノクロマト法テストストリップ１０においては、第一の捕捉部位４１で陽性の結果を呈するが、捕捉部位４１ｂでは陰性の結果を呈する。イムノクロマト法テストストリップ２０においては、該ウイルス抗原と標識抗体との複合体が形成されないため、両者は単独に膜担体３中をクロマト展開されて第二の捕捉部位４１ｃに到達するが、そこに固定された第二の抗体に捕捉されず、陰性の結果を呈する。
【００５１】
また、該混合液中にＢ型インフルエンザウイルスが存在すれば、図２と同様に、イムノクロマト法テストストリップ１０においては、捕捉部位４１ｂで陽性の結果を呈するが、第一の捕捉部位４１ａで陰性の結果を呈する。イムノクロマト法テストストリップ２０においては、図２と同様に、第二の捕捉部位４１ｃにおいて陰性の結果を呈する。
したがって、前記第一の捕捉部位４１ａ、第二の捕捉部位４１ｃ及び捕捉部位４１ｂにおける結果をもって、Ｈ５亜型の感染か、Ｈ５亜型以外のＡ型インフルエンザウイルスの感染か、Ｂ型インフルエンザウイルスの感染かを鑑別判定できる。
図３の装置は、適当なケースに収容した形態のものであってもよい。
【００５２】
図４の装置は、イムノクロマト法テストストリップ１０及び２０が共通する単一の粘着シート１及び単一の試料添加用部材６を備える以外、図２の構成と同様の構成を備えている。すなわち、イムノクロマト法テストストリップ１０及び２０の両膜担体３は、相互に反対向きにほぼ一直線状に配置されている。具体的には、イムノクロマト法テストストリップ１０及び２０は、両者の含浸部材２の上流側端部が適当な間隔をおいて相互に対向するようにすなわち反対方向に一直線上に配置されており、単一の試料添加用部材６が両含浸部材２の間にまたがって連接するように配置されている。別法として、イムノクロマト法テストストリップ１０及び２０の両膜担体が互いに角度を為して延在するように、放射方向に配置してもよい。
かくして、図２を参照して上記したと同様の方法で被験試料を含む混合液を得た後、当該混合液を図４に示されるイムノクロマト法テストストリップ１０及び２０に共通の試料添加用部材６上に注入すると、該混合液は、該試料添加用部材６を通過して両テストストリップ１０及び２０の含浸部材２において、標識抗体と混合する。そして、図２と同様に、前記第一の捕捉部位４１ａ、第二の捕捉部位４１ｃ及び捕捉部位４１ｂにおける結果をもって、Ｈ５亜型の感染か、Ｈ５亜型以外のＡ型インフルエンザウイルスの感染か、Ｂ型インフルエンザウイルスの感染かを鑑別判定できる。
【００５３】
図４の装置は、適当なケースに収容した形態のものであってもよい。
図４の装置の変形として、粘着シート１及び試料添加用部材６の他に、含浸部材２をテストストリップ１０及び２０に共通のものとしてもよい。この場合、図３の態様に準じて標識抗体を含浸部材に含浸させることができる。
図４の装置は、上記被験試料を含む混合液がテストストリップ１０及び２０に均等に浸透するので、測定感度が向上するため好都合である。
【実施例】
【００５４】
下記の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこの実施例に限定されるものではない。
【００５５】
実施例１（A型およびB型インフルエンザウイルスの組換え核タンパク（ＮＰ）遺伝子のクローニング）
インフルエンザウイルスA型であるA/Puerto Rico/8/34（H1N1）およびインフルエンザウイルスB型であるB/Lee/40を発育鶏卵に接種し、培養した。数日後に漿尿液を採取しウイルスを得た。このウイルスにRNA抽出試薬（TRIzol Reagent, Invitrogen）を加え、それぞれのウイルスRNAを抽出した。抽出したRNAから逆転写反応を行いNP遺伝子のcDNAを作製した。逆転写反応に用いたプライマーとしてUni 12 Primer : 5’-AGCAAAAGCAGG-3’（配列番号１）を用いた。
【００５６】
得られたA/Puerto Rico/8/34およびB/Lee/40のNP遺伝子cDNAよりポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法を用いてNP遺伝子を増幅した。プライマーとしてA/Puerto Rico/8/34においては、sense primer: 5’-GGAATTCCATATGGCGTCCCAAGGCACC-3’（配列番号２）およびantisense primer: 5’-CCGCTCGAGTTAATTGTCGTACTCCTCTGC-3’（配列番号３）を用いた。またB/Lee/40においては、sense primer: 5’-CGGGATCCATATGTCCAACATGGATATTG-3’（配列番号４）およびantisense primer: 5’-CCGCTCGAGTTAATAATCGAGGTCATCATA-3’（配列番号５）を用いた。用いたプライマーはベクターpET15bに組み込むためにupper primerとlower primerにそれぞれNde IとXho Iサイトを付加した。
得られたPCR産物の一部をDNA電気泳動で増幅を確認した後、それぞれの増幅産物を制限酵素NdeIおよびXbaIにて切断し、同じ制限酵素で切断したベクターpET15bに挿入した。
【００５７】
実施例２（組換え核タンパク（NP蛋白）の発現と精製）
目的遺伝子が挿入された実施例1のベクターpET15bでE.coli BL21CodonPlusを形質転換し、アンピシリン選択培地上で培養し、コロニーを得た。アンピシリン(100μg/ml)とクロラムフェニコール(25μg/ml)を含むL-Broth中にて一晩培養を行った後、アンピシリン(100μg/ml)を含むL-brothに培養液を加えた。37℃にて3時間の培養を行った後、1 M IPTGを最終濃度1 mMになるように添加し組換えNP蛋白の発現を誘導した。IPTGによるタンパク質の発現はSDS-PAGEにて確認した。
遠心分離により回収した菌体を可溶化バッファーに懸濁させた。さらにPMSFおよびリゾチーム処理を行い完全に溶菌させた。得られた溶液の遠心上清から組換えNP蛋白をNi-NTA樹脂を用いたカラムに通し精製した。この精製蛋白をPBSに対して透析し、目的の組換えNP蛋白とした。
【００５８】
実施例３（モノクローナル抗体の作製）
実施例２で得られたA型インフルエンザウイルス組換えNP蛋白（FluA NP）およびB型インフルエンザウイルス組換えNP蛋白（FluB NP）を抗原として、FluA NPおよびFluB NPに対するモノクローナル抗体（抗FluA NP抗体および抗FluB NP抗体）を作出した。モノクローナル抗体の作出は常法に従って行った。それぞれ100μgの組換えNP蛋白と等量のAdjuvant Complete Freund（Difco）を混合して、マウス（BALB/c、5週齢、日本SLC）に3回免疫し、その脾臓細胞を細胞融合に用いた。
細胞融合には、マウスの骨髄腫細胞であるSp2/0-Ag14細胞（Shulmanら、1978）を用いた。細胞の培養には、Dulbecco’s Modified Eagle Medium（Gibco）にL-グルタミン0.3mg/ml、ペニシリンGカリウム100単位/ml、硫酸ストレプトマイシン100μg/ml、Gentacin 40μg/mlを添加し（DMEM）、これに牛胎児血清（JRH）を10%となるように加えた培養液を用いた。
【００５９】
細胞融合は、免疫マウスの脾臓細胞とSp2/0-Ag14細胞を混合し、そこにPolyethylene glycol solution（Sigma）を添加することにより行った。細胞融合はHAT-DMEM（0.1mM Sodium Hypoxanthine、0.4μM Aminopeterinおよび0.016mM Tymidine（Gibco）を含む血清加DMEM）で培養し、抗FluA NP抗体のスクリーニングには、不活化したInfluenza Virus, Type A (H1N1)を固相化したプレートを用いた酵素結合抗体法（ELISA）により培養上清中の抗体産生を確認した。また抗FluB NP抗体のスクリーニングには不活化したInfluenza B virusを固相化したプレートを用い、同様の方法にて培養上清中の抗体産生を確認した。
【００６０】
抗体産生陽性の細胞をHT-DMEM［0.1mM Sodium Hypoxanthineおよび0.016mM Thymidine（Gibco）を含む血清加DMEM］で培養し、さらに血清加DMEMで培養を続けた。ELISA法により抗体産生能の高い細胞を選択しクローニングした。クローニングした細胞は、2,6,10,14-Tetramethylpentadecane（Sigma）を接種しておいたマウス（BALB/c、リタイア、日本SLC）に腹腔内接種し、腹水を採取した。さらに、常法によりプロテインG吸着体を用いたIgG精製を行い、モノクローナル抗体を得た。作出したモノクローナル抗体のアイソタイプは、Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Reagents（Sigma）を用いてELISAで同定した。
【００６１】
最終的にFluA NPに対するモノクローナル抗体産生細胞3クローンF/169、B/347及びF/211が得られた。このうち、抗体産生細胞F/211は、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１亜型に対して反応しないため、以下、抗体産生細胞F/169及びB/347を用いた。FluB NPに対するモノクローナル抗体産生細胞が4クローン得られ、以下、F/171のみを用いた。
【００６２】
実施例４（抗インフルエンザウイルスH5亜型モノクローナル抗体の作出）
インフルエンザウイルスH5亜型であるA/duck/Pennsylvania/10128/84(H5N2)株を11日齢の孵化鶏卵の羊膜腔に接種し、培養した。数日後に羊水を採取しウイルスを得た。
得られたウイルスを抗原として、当該ウイルスに対するモノクローナル抗体を作出した。モノクローナル抗体の作出は常法に従っておこなった。
すなわち、100μgのウイルス抗原と等量のAdjuvant Complete Freund (Difco)を混合して、マウス（BALB/c、5週齢、日本SLC）に3回免疫し、その脾臓細胞を細胞融合に用いた。細胞融合には、マウスの骨髄腫細胞であるSp2/0-Ag14細胞（Shulmanら、1978）を用いた。
【００６３】
得られた融合細胞をＨＡＴ含有培地でセレクトした後に増殖せしめ、増殖せしめた融合細胞から、インフルエンザウイルスＨ５亜型の上記株と反応するモノクローナル抗体産生細胞を最終的に15クローン得た。
作出した15クローンのモノクローナル抗体と各種インフルエンザウイルスH5亜型との反応性を蛍光抗体法により確認し、結果を表1に示した。なお、蛍光抗体法は下記手順に従った。
【００６４】
蛍光抗体法
イヌ腎臓由来株化細胞（Madin-Darby canine kidney cell : MDCK細胞）を用いて蛍光抗体法を行った。MDCK細胞の培養にはイーグル最小必須培地（日水製薬）に56℃で30分間加熱非動化した10% Bovine calf serum（Roche）、0.3mg/ml L-グルタミン、100単位/mLペニシリンGカリウム、100μg/ml硫酸ストレプトマイシンを加えた後、炭酸水素ナトリウムでpHを調整した培地を用いた。
蛍光抗体法はOffice International Des Epizooties (2000)の方法に従った。Lab-Tek II Chamber Slide System (Nunc)に単層を形成させたMDCK細胞に104 TCID50/mlでウイルスを接種し、35℃で8時間培養後、培養上清を除去し、感染細胞をPBSで1回洗浄した。細胞を20分間100%冷アセトン（和光純薬）に浸し固定した後、乾燥させた。モノクローナル抗体を含むマウス腹水、もしくは培養上清を抗体希釈液（1% BSA及び0.05% Tween20を含むPBS）で800倍に希釈し、これを1次抗体液として添加し、室温で1時間反応させた。PBSで1回洗浄後、抗体希釈液で1000倍に希釈したFluerescence-conjugated Goat IgG Fraction to Mouse IgG (ICN Biomedicals)を2次抗体液として添加し、室温で1時間反応させた。PBSで1回洗浄後、細胞を封入剤（Glycerol for fluerescence microscopy (Merck) と0.5M 炭酸重炭酸バッファー(pH9.5)を比率3:1で混合したもの）で封入した後、蛍光顕微鏡（Axiovert 200, ZEISS）を用い、FITC Filter (Chroma) で観察した。判定は目視により核および細胞質に緑色の特異的な細胞内蛍光を確認することで陽性（＋）と判定した。
【００６５】
【表１】
0005849065.tif 000002
【００６６】
表１において、A/duck/Mi/54/76 (H5N3)、A/duck/HongKong/342/78 (H5N2)、A/duck/HongKong/698/79 (H5N3)、A/duck/Pennsylvania/10128/84 (H5N2)、A/swan/Hokkaido/4/96 (H5N3)、A/swan/Hokkaido/51/96 (H5N3)、A/swan/Hok/kaido/67/96 (H5N3)、A/duck/Hokkaido/69/00 (H5N3)、A/duck/Hokkaido/447/00 (H5N3)、A/duck/Mongolia/54/01 (H5N2)、A/duck/Mongolia/500/01 (H5N3)、A/duck/Mongolia/596/01 (H5N3)及びA/duck/Hokkaido/84/02 (H5N3)の１３種はインフルエンザウイルスH5弱毒株であり、A/tn/S.Africa/61 (H5N3)、A/swan/Shima/449/83 (24a5b) (H5N3)、A/HongKong/156/97 (H5N1)、A/HongKong/483/97 (H5N1)、 A/duck/Yokohama/aq-10/2003 (H5N1) 及びA/chicken/Yamaguchi/7/04 (H5N1)の６種はインフルエンザウイルスH5強毒株である。
なお、表１において、A/duck/Mongolia/500/01(H5N3)及びA/duck/Mongolia/596/01(H5N3)は、それぞれ、A/duck/Mongolia/3/01(H5N3)及びA/duck/Mongolia/10/01(H5N3)と同等であることが知られている。
【００６７】
表１から、クローンNo.25, 40, 48, 64, A25, B168及びD31は、上記蛍光抗体法において、表１に示される１３種の弱毒株及び６種の強毒株の全てに対して反応するものであることがわかる。これに対し、クローンNo.145, B220, 3, A27, B9, A310 B29及びB59は、上記蛍光抗体法において、表１に示される１３種の弱毒株の全てに対して反応するが、６種の強毒株の少なくとも一つに対しては反応しないか又は弱毒株よりも反応性が低いことがわかる。
【００６８】
表1に示した15クローンより12種のクローンNo.3, A27, B29, 25, 40, 48, A25, 64, D31, B9, A310及びB168を選定し（なお、3種のクローンNo.3、A27及びB29については、以下、それぞれ、クローン3/3、A27/1及びB29/1と表記する）、これら12種のクローンのアイソタイプ及びA/duck/Pennsylvania/10128/84(H5N2)株を固相化抗原に用いたELISA法における力価を調べ、その結果を表2に示した。なお、表2中、Mabはクローンの種類を示し、Isotypeはモノクローナル抗体のイムノグロブリンアイソタイプを示し、ELISA titerはA/duck/Pennsylvania/10128/84(H5N2)株に対するELISA法による力価を示す。作出したモノクローナル抗体のアイソタイプは、Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Reagents（Sigma）を用いてELISAで同定した。
【００６９】
【表２】
0005849065.tif 000003
【００７０】
また、上記選定した１２種のクローンについて、インフルエンザウイルスＨ５亜型以外のインフルエンザウイルスとの反応性をELISA法により確認し、結果を表３に示した。なお、表３の結果は１２種のクローンに共通である。
【００７１】
【表３】
0005849065.tif 000004
【００７２】
表３から明らかなように、上記１２種のクローンはインフルエンザウイルスＨ５亜型以外のインフルエンザウイルスとは反応せず、したがって、インフルエンザウイルスＨ５亜型と特異的に反応するものであることがわかった。
また、上記クローンのうち、クローン3/3、A27/1及びB29/1から得られたモノクローナル抗体とA/duck/Pennsylvania/10128/84(H5N2)株とを混合して11日齢の孵化鶏卵の羊膜腔に接種し、培養し、数日後に羊水を採取しウイルスを得た。得られたウイルスは、上記モノクローナル抗体の選択圧がかかっているため、上記モノクローナル抗体が結合する部位に変異を生じている可能性が高い。
【００７３】
そこで、得られたウイルスのヘマグルチニン遺伝子をシークエンスし、そのアミノ酸配列を配列番号７の配列と比較したところ、前者のアミノ酸配列は、配列番号７のアミノ酸配列の１６８番目のアミノ酸残基が変異していることがわかった。
したがって、上記３種のクローン3/3、A27/1及びB29/1は、インフルエンザウイルスH5亜型のヘマグルチニン蛋白に特異的に結合するものであり、さらには、配列番号７の１６８番目のアミノ酸残基を含むエピトープを認識するものであることが示された。
【００７４】
実施例５（イムノクロマトグラフィー測定装置の作製）
（１）抗FluA NP抗体、抗FluB NP抗体および抗H5抗体の調製
実施例３で得られた抗FluA NP抗体産生細胞F/169およびB/347のそれぞれを、マウス腹腔に接種し、抗FluA NP抗体を含んだ腹水を得た。また、実施例３で得られた抗FluB NP抗体産生クローンF/171をマウス腹腔に接種し、抗FluB NP抗体を含んだ腹水を得た。さらに実施例４で得られた１２種の抗H5抗体産生細胞のそれぞれを、マウス腹腔に接種し、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５亜型に対して特異的に反応する抗体（以下、「抗H5抗体」）を含んだ腹水を得た。さらに、常法によりプロテインG吸着体を用いたIgG精製を行い、それぞれの抗体を得た。
【００７５】
（2）金コロイド溶液の調製
加熱によって沸騰させた超純水99mlに、1%（v/w）塩化金酸水溶液1mlを加え、さらに、その１分後に1%（v/w）クエン酸ナトリウム水溶液1.5mlを加えて加熱し5分間沸騰させた後、室温に放置して冷却した。次いで、この溶液に200mM炭酸カリウム水溶液を加えてpH9.0に調製し、これに超純水を加えて全量を100mlとして金コロイド溶液を得た。
【００７６】
（3）金コロイド標識抗体溶液の調製
上記（1）にて得られた抗体産生細胞B347由来の抗FluA NP抗体（以下、抗FluA NP抗体B347）、抗体産生細胞F/171由来の抗FluB NP抗体（以下、抗FluB NP抗体F/171）および１２種の抗体産生細胞由来の抗H5抗体を下記の手順でそれぞれ金コロイド標識した。
抗FluA NP抗体の蛋白換算重量3μｇと上記（2）の金コロイド溶液1mlとを混合し、室温で2分間静置してこの抗体のことごとくを金コロイド粒子表面に結合させた後、金コロイド溶液における最終濃度が1%になるように10%BSA水溶液を加え、この金コロイド粒子の残余の表面をことごとくこのBSAでブロックして、金コロイド標識抗FluA NP抗体溶液を調製した。この溶液を遠心分離（5600XG、30分間）して金コロイド標識抗体を沈殿せしめ、上清液を除いて金コロイド標識抗体を得た。この金コロイド標識抗体を10%サッカロース・1%BSA・0.5%トリトン（Triton）-X100を含有する50mMトリス塩酸緩衝液（pH7.4）に懸濁して金コロイド標識抗FluA NP抗体溶液を調製した。また抗FluB NP抗体の蛋白換算重量1μｇを上記方法にて金コロイド粒子表面に結合させ金コロイド標識抗FluB NP抗体溶液を調製した。さらに抗H5抗体の蛋白換算重量1μｇを上記方法にて金コロイド粒子表面に結合させ金コロイド標識抗H5抗体溶液を調製した。
【００７７】
（4）イムノクロマトグラフィー測定装置の作製
図４に示されるイムノクロマト法テストストリップを下記の手順で作製した。
（4-1）膜担体の第一の捕捉部位の形成
幅5mm、長さ36mmの細長い帯状のニトロセルロース膜を膜担体３として用意した。
抗FluA NP抗体B347、1.0mg/mlが含有されてなる溶液0.5μlを、この膜担体３における上流側の末端から5.0mmの位置にライン状に塗布して、これを室温で乾燥させ、Ａ型インフルエンザウイルス抗原と標識抗体との複合体の捕捉部位４１ａ（第一の捕捉部位）を形成した。また、抗FluB NP抗体F/171、1.0mg/mlが含有されてなる溶液0.5μlを、この膜担体３の上流側の末端から8.0mmの位置にライン状に塗布して、これを室温で乾燥し、B型インフルエンザウイルス抗原と標識抗体との複合体の捕捉部位４１ｂを形成した。
【００７８】
（4-2）膜担体の第二の捕捉部位の形成
上記（4-1）で用いた膜担体と同様の膜担体３をもう一つ用意した。
上記（１）で得られた抗H5抗体1.0mg/mlが含有されてなる溶液0.5μlを、この膜担体３の上流側の末端から5.0mmの位置にライン状に塗布して、これを室温で乾燥し、インフルエンザウイルスH5亜型と標識抗体との複合体の捕捉部位４１ｃ（第二の捕捉部位）とした。
【００７９】
（4-3）金コロイド標識抗体含浸部材の作製
5mmX15mmの帯状のガラス繊維不織布に、上記（３）で得られた金コロイド標識抗FluA NP抗体溶液および金コロイド標識抗FluB NP抗体溶液を混合した溶液37.5μｌを含浸せしめ、これを室温で乾燥させて金コロイド標識抗FluA NP抗体および抗FluB NP抗体含浸部材とした。また別の5mmX15mmの帯状のガラス繊維不織布に、上記（３）で得られた金コロイド標識抗H5抗体溶液37.5μｌを含浸せしめ、これを室温で乾燥させて金コロイド標識抗H5抗体含浸部材とした。前者の標識抗体含浸部材をテストストリップ１０の含浸部材２として用い、後者の標識抗体含浸部材をテストストリップ２０の含浸部材２として用い、上記（４−１）で得られた膜担体をテストストリップ１０の膜担体３として用い、上記（４−２）で得られた膜担体をテストストリップ２０の膜担体３として用い、その他、各テストストリップの試料添加用部材６として綿布を、吸収用部材５として濾紙を用いて、図４と同様の配置のイムノクロマトグラフィー測定装置を作製した。
【００８０】
実施例６（インフルエンザウイルスH5亜型に対する反応性試験）
実施例５にて作製したイムノクロマトグラフィー測定装置（第二の捕捉部位に固定する抗H5抗体としてB29/1を用い、金コロイド標識抗体の抗H5抗体としてA27/1を用いた）を使用し、インフルエンザウイルスH5亜型に対する反応性試験を実施した。試験は、インフルエンザウイルスH5亜型、A/duck/Miyagi/54/76 (H5N3)、A/duck/Hong Kong/342/78 (H5N2)、A/duck/Hong Kong/698/79、A/swan/Hokkaido/4/96 (H5N3)、A/swan/Hokkaido/67/96 (H5N3)、A/swan/Hokkaido/51/96 (H5N3)、A/duck/Hokkaido/69/00 (H5N3)、A/duck/Hokkaido/447/00 (H5N3)、A/duck/Mongolia/54/01 (H5N2)、A/duck/Mongolia/596/00 (H5N3)、A/duck/Mongolia/500/01 (H5N3)、A/duck/Hokkaido/84/02 (H5N3)を検体希釈液にて調製し被験試料とした。そして、被験試料100μlを実施例５にて得られたイムノクロマトグラフィー測定装置の試料添加用部材６にマイクロピペットで滴下してクロマト展開し、室温で15分放置後、第二の捕捉部位４１ｃで捕捉されたウイルス抗原と金コロイド標識抗体との複合体の捕捉量を肉眼で観察した。捕捉量は、その量に比例して増減する赤紫色の呈色度合いを肉眼で、−（着色なし）、±（微弱な着色）、＋（明確な着色）、＋＋（より明確な着色）、＋＋＋（顕著な着色）の5段階に区分して判定した。結果を表４に示した。
【００８１】
【表４】
0005849065.tif 000005
【００８２】
表４から明らかなように試験に供したインフルエンザウイルスH5亜型に対して高い反応性を示した。よってインフルエンザウイルスH5亜型を検出できることがわかった。
【００８３】
実施例７（Ａ型インフルエンザウイルス各種亜型との反応性試験）
実施例５にて作製したイムノクロマトグラフィー測定装置（インフルエンザA型およびB型判定部位とH5亜型判定部位を有するイムノクロマトキットで、第二の捕捉部位に固定する抗H5抗体としてB29/1を用い、金コロイド標識抗体の抗H5抗体としてA27/1を用いた）を使用し、Ａ型インフルエンザウイルス15種類の亜型に対する反応性試験を実施した。試験はインフルエンザウイルスA型を発育鶏卵にて増殖させ得た漿尿液を用い、検体希釈液で調製して被験試料とした。そして、被験試料150μlを実施例５で得られたイムノクロマトグラフィー測定装置の試料添加用部材６にマイクロピペットで滴下してクロマト展開し、室温で15分放置後、第一の捕捉部位４１ａおよび第二の捕捉部位４１ｃで捕捉されたウイルス抗原と金コロイド標識抗体との複合体の捕捉量を肉眼で観察した。捕捉量は実施例６と同様の基準にて判定した。
【００８４】
なお、A型インフルエンザウイルス亜型として、A/duck/Tottori/723/80  (H1N1)、A/duck/Hokkaido/17/01  (H2N2)、A/duck/Mongolia/4/03  (H3N8)、A/duck/Czech/56  (H4N6)、A/duck/Pennsylvania/10128/83  (H5N2)、A/Hong Kong/156/97  (H5N1)、A/Hong Kong/483/97  (H5N1)、A/turey/Massachusetts/3740/65  (H6N2)、A/seal/Massachusetts/1/80  (H7N7)、A/turey/Ontario/67  (H8N4)、A/turey/Wisconsin/66  (H9N2)、A/chicken/Germany/N/49  (H10N7)、A/duck/England/56  (H11N6)、A/duck/Alberta/60/76  (H12N5)、A/gull/Maryland/704/77  (H13N6)、A/mallard/Astrakhan/263/82  (H14N5)、A/duck/Australia/341/83  (H15N8)を試験に供した。結果を表５に示す。
【００８５】
表５から明らかなように、第一の捕捉部位４１ａにおいては試験に供したウイルス株全てにおいて顕著な呈色が確認された。また、捕捉部位４１ｂにおいてはいずれのウイルス亜型においても呈色は見られなかった。一方、第二の捕捉部位４１ｃにおいては試験に供したH5株においてのみ明らかな呈色が確認され、他の亜型においては呈色は確認されなかった。従って、本発明の実施例５記載のイムノクロマトグラフィー測定装置は、核タンパクを検出する第一の捕捉部位４１ａにおいては全てのインフルエンザウイルスA型に対して反応性を示し、ヘマグルチニン蛋白を検出する第二の捕捉部位４１ｃにおいてはインフルエンザウイルスH5亜型に対してのみ反応することが示された。両捕捉部位４１ａ及び４１ｃの判定部位を総合することにより、インフルエンザウイルスH5亜型を高い特異性で確実に検出することが可能となった。
【００８６】
【表５】
0005849065.tif 000006
【００８７】
実施例８（モノクローナル抗体ＡＡ１６８を用いたインフルエンザウイルスＨ５弱毒株検出）
実施例５にて作製したイムノクロマトグラフィー測定装置において、第二の捕捉部位に固定する抗H5抗体及び金コロイド標識抗体の抗H5抗体として表６記載の組合せを用いた全５種類の測定装置を用意した。
そして、A/duck/Pennsylvania/10128/84(H5N2)株(HA価：512)を検体希釈液で希釈して２．５μｇ／ｍＬに調整し、被験試料とした。そして、被験試料100μlを上記測定装置のテストストリップの試料添加用部材６にマイクロピペットで滴下してクロマト展開し、室温で15分放置後、第二の捕捉部位４１ｃで捕捉されたA/duck/Pennsylvania/10128/84 (H5N2)株と金コロイド標識抗体との複合体の捕捉量を肉眼で観察した。捕捉量は、その量に比例して増減する赤紫色の呈色度合いを肉眼で、−（着色なし）、±（微弱な着色）、＋（明確な着色）、＋＋（顕著な着色）の４段階（但し、ｗは弱めを示す）に区分して判定した。対照として、検体希釈液100μlを同様にクロマト展開し呈色度合いを観察した。その結果を表６に示した。
【００８８】
【表６】
0005849065.tif 000007
【００８９】
表６から明らかなように、表６の何れの組合せの場合でも、インフルエンザウイルスＨ５亜型を検出できることがわかった。
【００９０】
実施例９（各種抗H5抗体を用いた反応性試験）
実施例５にて作製したイムノクロマトグラフィー測定装置において、第二の捕捉部位に固定する抗H5抗体及び金コロイド標識抗体の抗H5抗体として表７記載の組合せを用いた全１４４種類の測定装置を用意した。なお、表７中、第二の捕捉部位に固定された抗体はメンブレン固相化抗体と表記している。
インフルエンザウイルスH5強毒株であるA/Chicken/Yamaguchi/7/04（H5N1）株（HA価：1024HA）を検体希釈液で625倍に希釈して被験試料とした。そして、被験試料100μlを上記測定装置のテストストリップの試料添加用部材６にマイクロピペットで滴下してクロマト展開し、室温で15分放置後、第二の捕捉部位４１ｃで捕捉されたA/Chicken/Yamaguchi/7/04（H5N1）株と金コロイド標識抗体との複合体の捕捉量を肉眼で観察した。捕捉量は、その量に比例して増減する赤紫色の呈色度合いを肉眼で−（着色なし）、±（微弱な着色）、＋（明確な着色）の３段階に区分して判定した。対照として、検体希釈液100μlを同様にクロマト展開し呈色度合いを観察した。その結果を表７に示した。
【００９１】
【表７】
0005849065.tif 000008
【００９２】
表７から明らかなように、クローン64, A25, 25, 48の４種がインフルエンザウイルスH5強毒株の検出に好適であることがわかった。なお、クローンA27及びA310については、表１の結果において少なくとも１つのインフルエンザウイルスH5強毒株に対して反応しないので、インフルエンザウイルスH5強毒株の検出には好ましくないと思われる。
【００９３】
実施例１０（モノクローナル抗体ＷＳを用いたインフルエンザウイルスＨ５強毒株検出）
実施例５にて作製したイムノクロマトグラフィー測定装置（第二の捕捉部位に固定する抗H5抗体としてNo.64を用い、金コロイド標識抗体の抗H5抗体としてNo.64を用いた）を使用し、インフルエンザウイルスH5強毒株に対する反応性試験を実施した。インフルエンザウイルスH５亜型の原液として、A/Vietnam/1194/04 (H5N1)、A/Chicken/Suphanburi/1/04 (H5N1)、A/Chicken/Yamaguchi/7/04 (H5N1)、A/Whooperswan/Mongolia/3/05 (H5N1)、A/HongKong/483/97 (H5N1)、 A/Chicken/Ibaraki/1/05 (H5N2) 及びA/Swan/Hokkaido/51/96 (H5N3)を用い、対照としてA/Chicken/Italy/99 (H7N1) 及びA/Chicken/Netherlands/03 (H7N7)を用いた。
そして、被験試料100μlを上記測定装置のテストストリップの試料添加用部材６にマイクロピペットで滴下してクロマト展開し、室温で15分放置後、第一の捕捉部位４１a及び第二の捕捉部位４１ｃで捕捉された各ウイルス株と金コロイド標識抗体との複合体の捕捉量を肉眼で観察した。捕捉量は、その量に比例して増減する赤紫色の呈色度合いを肉眼で−（着色なし）、±（微弱な着色）、＋（明確な着色）、＋＋（より明確な着色）、＋＋＋（顕著な着色）の5段階に区分して判定した。
結果を表８に示した。表８から明らかなように、両抗H5抗体としてNo.64を用いたイムノクロマトキットは、対照としたインフルエンザウイルスH7亜型に対しては反応性を示さなかったが、インフルエンザウイルスH5強毒株及び弱毒株と良好に反応し、とりわけ、インフルエンザウイルスH5強毒株の検出に好適であることが示された。
【００９４】
【表８】
0005849065.tif 000009
【産業上の利用可能性】
【００９５】
本発明は、全てのＡ型インフルエンザウイルス亜型に対して反応する第一の抗体、及び、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５亜型に対して特異的に反応する第二の抗体を用い、第一の抗体との反応が陽性で且つ第二の抗体との反応が陽性である抗原を免疫測定法によって検出することからなるＡ型インフルエンザウイルスＨ５亜型の検出法、特に、サンドイッチ式免疫測定法、イムノクロマトグラフィー測定法および測定装置を提供するものであり、インフルエンザウイルスＨ５亜型に属するウイルスを特異的に簡単な方法で迅速に検出できるので、当該ウイルスに起因するヒト、鳥等の疾病を迅速かつ簡便に診断するために有用である。
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】ａは１本のイムノクロマト法テストストリップから構成された本発明のイムノクロマトグラフィー測定装置の具体例を示す平面図、ｂはａで示された装置の縦断面図。
【図２】２本のイムノクロマト法テストストリップから構成された本発明のイムノクロマトグラフィー測定装置の具体例を示す平面図。
【図３】２本のイムノクロマト法テストストリップから構成された本発明のイムノクロマトグラフィー測定装置の他の具体例を示す平面図。
【図４】ａは２本のイムノクロマト法テストストリップから構成された本発明のイムノクロマトグラフィー測定装置の更に別の具体例を示す平面図、ｂはａで示された装置の縦断面図。
【符号の説明】
【００９７】
１  粘着シート
２  含浸部材
３  膜担体
４  捕捉部位
４２  コントロールライン
５  吸収用部材
６  試料添加用部材
１０  イムノクロマト法テストストリップ
２０  イムノクロマト法テストストリップ
【図１】
0005849065.tif 000010
【図２】
0005849065.tif 000011
【図３】
0005849065.tif 000012
【図４】
0005849065.tif 000013
【配列表】
0005849065000001.app