(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的材料の貯蔵のための固体支持体であって、前記固体支持体が少なくとも１つの表面を有しており、前記表面が、前記表面からの生物学的材料の回収率を高める化学物質混合物で被覆されており、前記化学物質混合物が、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）とＴｗｅｅｎ（登録商標）２０、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）とアルブミン、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０とアルブミン、ポリ−２−エチル−２−オキサゾリン（ＰＥＯＸ）とＴｗｅｅｎ（登録商標）２０、ポリ−２−エチル−２−オキサゾリンＰＥＯＸとアルブミン、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）とＴｗｅｅｎ（登録商標）２０、及びポリエチレンイミン（ＰＥＩ）とアルブミンからなる群から選択される混合物である、固体支持体。
【請求項２】
前記固体支持体が、紙、ガラス極細繊維及び膜からなる群から選択される、請求項１記載の固体支持体。
【請求項３】
前記固体支持体が、セルロース紙、又はポリエステル、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリアミド（ナイロン）、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリカーボネート、ニトロセルロース、酢酸セルロース及び酸化アルミニウムからなる群から選択される膜である、請求項１記載の固体支持体。
【請求項４】
固体支持体から生物学的材料を回収する方法であって、
ｉ）請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の固体支持体の表面を、生物学的材料を含有する試料と接触させる工程と、
ｉｉ）前記固体支持体の表面上の試料を乾燥させる工程と、
ｉｉｉ）前記固体支持体を貯蔵する工程と、
ｉｖ）生物学的材料を表面から抽出する工程と
を含む方法。
【請求項５】
工程ｉｉｉ）が、１５〜４０℃の範囲の温度で紙支持体を貯蔵することを含む、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記試料が組織、細胞、血液、血漿、唾液及び尿からなる群から選択される、及び／又は
前記生物学的材料が生体分子、合成的に誘導された生体分子、細胞成分及びバイオ医薬品からなる群から選択される、請求項４又は請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記支持体の少なくとも１つの表面を、前記表面からの生物学的材料の回収率を高める化学物質混合物の溶液で被覆することを含む、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の固体支持体を製造する方法であって、前記化学物質混合物が、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）とＴｗｅｅｎ（登録商標）２０、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）とアルブミン、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０とアルブミン、ポリ−２−エチル−２−オキサゾリン（ＰＥＯＸ）とＴｗｅｅｎ（登録商標）２０、ポリ−２−エチル−２−オキサゾリンＰＥＯＸとアルブミン、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）とＴｗｅｅｎ（登録商標）２０、及びポリエチレンイミン（ＰＥＩ）とアルブミンからなる群から選択される、方法。
【請求項８】
前記固体支持体が紙である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の固体支持体の、その表面からの生物学的材料の回収率を高めるための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、固体支持体に関し、特に、バイオ医薬品のような生物学的材料の貯蔵、回収、さらなる加工処理に使用することができる固体支持体に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの血液の収集及び分析のためのろ紙のような固体支持体の使用は、Ｄｒ．Ｒｏｂｅｒｔ  Ｇｕｔｈｒｉｅがフェニルケトン尿症の検出のために新生児のフェニルアラニンを測定するのに乾燥血液スポット（ＤＢＳ）試料を用いた１９６０年代初期に遡る（Ｍｅｉ，Ｊ．ら，２００１；Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，１３１：１６３１Ｓ−１６３６Ｓ）。この血液を収集するための新たな応用の結果、治療可能な遺伝性代謝異常の検出のための新生児の集団検診が導入された。今やＤＢＳは４０年以上にわたって広範な新生児代謝異常をスクリーニングするために使用されている。
【０００３】
ＤＢＳ試料は、静脈血から、または直接指若しくは踵の穿刺により、膜、ガラス繊維または紙のような固体支持体に全血をスポット状に染み付けることによって収集され、そのためこの方法は末端の診療所から中央検査室への試料の輸送に特に適している。また、乾燥剤と共にファスナー式プラスチックバッグに包装されたＤＢＳは周囲温度で貯蔵・輸送することができ、従ってｉ）コールドチェイン貯蔵及びii）急速な特殊輸送の必要性が回避される。Ｗｈａｔｍａｎ  ９０３  Ｎｅｏｎａｔａｌ  ＳＴＤ紙のような吸収材料に一滴の血液を付けることにより収集されたＤＢＳはＩＡＴＡ  Ｄａｎｇｅｒｏｕｓ  Ｇｏｏｄｓ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ（Ａｄｄｅｎｄｕｍ  II，Ｍａｒ  ２００５）の対象とならない。
【０００４】
新生児のスクリーニング目的でＤＢＳその他の体液を収集、輸送及び貯蔵するために使用される別の固体の紙支持体としては次のものがある。
１．Ａｈｌｓｔｒｏｍ  ２２６
２．Ｍｕｎｋｔｅｌｌ  ＴＦＮ（ＣＥ標識）
３．Ｔｏｙｏ  Ｒｏｓｈｉグレード５４５  Ａｄｖａｎｔｅｃ  Ｔｏｙｏ，Ｔｏｋｙｏ（Ｅｌｖｅｒｓ  Ｌら  ２００７；Ｊ．Ｉｎｈｅｒｉｔ  Ｍｅｄｔａｂ  Ｄｉｓ  ３０，４，６０９参照）。
【０００５】
これらのＷｈａｔｍａｎ  ９０３  Ｎｅｏｎａｔａｌ  ＳＴＤ紙のような紙の全てが木綿リンターからなっている。Ｗｈａｔｍａｎ  ９０３  Ｎｅｏｎａｔａｌ  ＳＴＤ及びＡｈｌｓｔｒｏｍ  ２２６紙はクラスIIの医療デバイスに分類されている。新生児のスクリーニング目的のためのデバイスに開発される可能性がある固体の紙支持体には、Ｍａｃｈｅｒｅｙ  Ｎａｇｅｌ（例えばＭＮ８１８）、Ｒｅｅｖｅ  Ａｎｇｅｌ（例えばＤｏｕｂｌｅリング）及びＨａｈｎｅｍｕｈｌｅ（Ｇｒａｄｅ  ２２９２）により製造されているものがある。
【０００６】
ＤＢＳにかかるコストは一回の試験当たりＵＳ１ドル未満であり、輸送コストは液体方式及び特殊な輸送条件を必要とする血漿と比較して顕著に低減する（Ｊｏｈａｎｎｅｓｓｅｎ，Ａ．ら，２００９；Ｊ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，６４，１１２６−１１２９）。実際のアッセイコストは変わらないし、ＤＢＳからの検体の抽出には集中実験室において余分な実践時間が幾らか必要であるが、ＤＢＳ及び特に固体の紙支持体の利用は核酸、タンパク質等のような生物学的材料の貯蔵及び／又は分析において増大し続けている。加えて、ＤＢＳはまた、候補とされる低分子量の薬剤化合物が試験動物に導入されその血液中の濃度レベルをモニターする創薬プロセスにも利用されている。
【０００７】
近年、バイオテクノロジーで誘導された組換えタンパク質、ペプチド及び抗体系医薬、並びに遺伝子療法のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド及びＤＮＡが主流の治療薬として開発され、今では臨床開発中の化合物のかなりの部分を構成している。これらの薬剤は一般に低分子量医薬化合物と区別するために「バイオテク医薬」又は「バイオ医薬品」といわれている。
【０００８】
バイオテク医薬及び低分子量医薬化合物の薬物代謝及び薬物動態（ＤＭＰＫ）分析は重要である。すなわち、ＤＭＰＫ分析は、候補薬剤がどのように身体に吸収され、代謝され、分泌されるかに対して見通しを提供するので新薬発見にとって極めて重要であるからである。分析は新薬発見段階において日常的に行われ、対象の化合物を動物に投与し、生物学的流体中のその薬剤（又は代謝物質）の濃度を時間の関数として測定する。これにより薬物クリアランス、バイオアベイラビリティ等のような価値のある情報が得られるが、多くの量の時間と資力が必要とされる（Ｂｅａｕｄｅｔｔｅ，Ｐ．ら、２００４；Ｊ．ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｂ  ８０９，１５３−１５８）。
【０００９】
通例薬剤スクリーニングプログラムで実施されるＤＭＰＫ分析に伴う主要な問題は、分析に先立って血液試料における安定性及び保全性を維持するのに適した貯蔵媒体が明らかにないことである。現行の方法では、投薬した動物から決まった時間に採取した血漿又は全血が使用される。しかしながら、この方法は、分析プロセスの障害となる時間がかかる手順を必要とすることを含めて幾つかの欠点がある。加えて、経時変化実験のために個々の動物から多数回血を抜くことは限定的である。これにより、スループットが限定され、動物の使用が増大し、その結果少しのリード化合物しか推進することができない。
【００１０】
ＤＢＳに必要とされる血液量が小さいため、幾つかの動物からの複雑な採血ではなく一匹の動物から連続して血液試料を採取することが可能になり、このためＤＭＰＫ並びに薬物動態学的データ及び評価の質が大幅に改良される。ＤＢＳに必要とされる低下した血液量（通例スポット当たり１５〜２０μｌ）の「３Ｒ」（低減、洗練、及び交換）に関する倫理上の利益は前臨床的医薬開発において明白である。試験動物の数は大幅に低減することができる。加えて、小児科用の医薬の安全性評価の一部として当局により要求されることが増大している若年性毒性研究において非末端血液試料採取が可能である。規制の動物毒物学研究の別の利点はデータの質の上昇である。
【００１１】
従って、薬物動態研究において大量の血液試料の迅速な分析の必要性が増大しているので、ＤＢＳは魅力的な選択肢となっている。紙がＤＢＳのための固体支持体として機能するためには、紙は、満足な機械的性質と、対象の生物学的材料を貯蔵後にさらなる加工処理及び／又は分析に付すことができるように安定な状態に保持することができる能力とを併せ持つのが望ましい。ＤＭＰＫ分析に使われるかかる紙の例は、９０３  Ｎｅｏｎａｔａｌ試料収集紙といわれるもの、並びに例えば米国特許第５７５１２６号及び同第５９３９２５９号に記載されているＦＴＡ及びＦＴＡ  Ｅｌｕｔｅといわれる紙である。
【００１２】
ＤＭＰＫ分析に使われる別の固体紙支持体として以下のものがある。
【００１３】
１．Ａｈｌｓｔｒｏｍグレード２２６紙：
臨床研究での薬物動態の測定における乾燥血漿スポットの使用：定量的生物分析方法の検証。Ｂａｒｆｉｅｌｄ，Ｍ．ら，（２０１１），Ａｎａｌ．，Ｃｈｅｍ．，８３，１１８−１２４。
【００１４】
２．標準化されたろ紙：
妊娠中のラモトリジン及びオキスカルバゼピンの組合せの薬剤モニタリング。Ｗｅｇｎｅｒ，Ｉ．ら，（２０１０），Ｅｐｉｌｅｐｓｉａ，５１，２５００−２５０２。
【００１５】
３．Ｗｈａｔｍａｎ  ９０３、ＦＴＡ（ＤＭＰＫ−Ａ）及びＦＴＡ  Ｅｌｕｔｅ（ＤＭＰＫ−Ｂ）：
様々なセルロース系基材上の乾燥血液スポット試料の重量及び外観に対する影響。Ｄｅｎｎｉｆｆ，Ｐ．ら，（２０１０），Ｂｉｏａｎａｌｙｓｉｓ，２，１１，１８１７−２２。
【００１６】
４．Ｗｈａｔｍａｎ  ＤＭＰＫ−Ａ、−Ｂ、−Ｃ：
ペプチドエキセンジン−４の定量的評価に対するＤＢＳの応用；ＵＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる血漿及びＤＢＳ法の比較。Ｋｅｈｌｅｒ，Ｒ．ら，（２０１０），２，８，１４６１−１４６８。
【００１７】
５．Ａｈｌｓｔｒｏｍグレード２３７紙：
液体抽出に基づくシーリング表面試料採取用プローブのＤＢＳ及びマウス全身の薄い組織切片の質量分光分析のための応用。Ｖａｎ  Ｂｅｒｋｅｌ，Ｇ．ら，（２００９），Ａｎａｌ．，Ｃｈｅｍ．，２００９，８１，２１，９１４６−９１５２。
【００１８】
６．Ｗｈａｔｍａｎ  ＦＴＡ血液スポットカード：
臨床研究における薬物動態の測定のための試料収集技術としての乾燥血液スポット：定量的生物分析方法の検証のための検討。Ｓｐｏｏｎｅｒ，Ｎ．ら，（２００９），Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ．８１，１５５７−６３。
【００１９】
７．Ｗｈａｔｍａｎ  ＦＴＡ  Ｅｌｕｔｅ  Ｍｉｃｒｏカード：
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによるヒト全血中のデキストロメトルファン及びその代謝物質デキストロファンの測定のための乾燥血液スポット技術の研究。Ｌｉａｎｇ，Ｘ．ら，（２００９），Ｊ．Ｃｈｒｏｍ  Ｂ，Ａｎａｌ．Ｔｅｃｈ  Ｂｉｏｍｅｄ  ＆  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ，８７７，７９９−８０６。
【００２０】
８．Ｗｈａｔｍａｎろ紙カード：
乾燥血液スポットにおける２５−ヒドロキシビタミンＤ２及び２５−ヒドロキシビタミンＤ３の測定のための液体クロマトグラフィー／タンデム質量分光分析方法：糖尿病及び心血管代謝のリスクのスクリーニングに対する潜在的補助剤。Ｎｅｗｍａｎ，Ｍ．ら，（２００９），Ｊ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｓｃｉ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈ．３，１５６−１６２。
【００２１】
９．Ｔｏｙｏ  Ｒｏｓｈｉ  Ｎｏ．５４５ろ紙（Ａｄｖａｎｔｅｃ  Ｔｏｙｏ，Ｔｏｋｙｏ）：
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いた低出産体重児のＤＢＳ中の１７α−ヒドロキシプレグネノロン及び１７α−ヒドロキシフロゲステロンの同時測定。Ｈｉｇａｓｈｉ，Ｔ．ら，（２００８），Ｊ．Ｐｈａｒｍ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，４８，１，１７７−１８２。
【００２２】
１０．Ｗｈａｔｍａｎ試料収集紙ＢＦＣ  １８０：
乾燥血液スポットを用いた血液中のモルヒネ及び６−アセチルモルヒネの測定。Ｇａｒｃｉａ−Ｂｏｙ，Ｒ．ら，（２００８），Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ，３０，６，７３３−７３９。
【００２３】
１１．Ｗｈａｔｍａｎろ紙（カタログｎｏ．１０５３５０９７）：
タンデム型質量分光分析と結合したカチオン交換クロマトグラフィーを用いたいろいろなヒトの生物学的マトリックス中のカチオン性抗−マラリヤ剤メチレンブルーの定量化。Ｂｕｒｈｅｎｎｅ，Ｊ．ら，（２００８），Ｊ．Ｃｈｒｏｍ  Ｂ，Ａｎａｌ．Ｔｅｃｈ  Ｂｉｏｍｅｄ  ＆  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ，８６３，２７３−２８２。
【００２４】
１２．Ｗｈａｔｍａｎ  ３ＭＭ：
ステロイド薬理学における試料収集及び輸送のためのろ紙の使用。Ｈｏｗｅ，Ｃ．ら，（１９９７），Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ．４３，１４０８−１５。
【００２５】
１３．Ｗｈａｔｍａｎ  ＦＴＡ、ＦＴＡ  Ｅｌｕｔｅ、ＤＭＰＫ−Ａ、Ｂ、Ｃ、Ａｈｌｓｔｒｏｍ  ２２６  −
ＳＣＡＰＴＭ  ＤＢＳシステム及びカラム−スイッチングＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いた乾燥血液スポットにおけるＴａｍｉｆｌｕ（登録商標）及び活性な代謝物質の測定。Ｈｅｉｎｉｇ，Ｋ．ら，Ｆ．Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ。（参照）。
【００２６】
ＤＭＰＫの目的用のデバイスに開発される可能性がある固体の紙支持体には、Ｍｕｎｋｔｅｌｌ  ＴＦＮグレード、Ｔｏｙｏ  Ｒｏｓｈｉグレード５４５、Ｍａｃｈｅｒｅｙ  Ｎａｇｅｌ（例えばＭＮ８１８）、Ｒｅｅｖｅ  Ａｎｇｅｌ（例えばＤｏｕｂｌｅリング）及びＨａｈｎｅｍｕｈｌｅ  Ｇｒａｄｅ  ２２９２）がある。
【００２７】
効果的な下流の処理及び分析のために、対象の検体（例えば内因性タンパク質又はバイオテク薬剤）は、高スループット処理可能な比較的簡単な技術を用いて固体の紙支持体から抽出するのが容易でなければならない。
【００２８】
ＤＢＳと内因性タンパク質の検出との組合せが科学文献に記載されている。例えば、・胞性線維症（ＣＦ）のバイオマーカーである免疫反応性トリプシン（ＩＴ）に関して、ＤＢＳからの内因性ＩＴのＣＦスクリーニングのための使用について最初の報告がＲｙｌｅｙらにより１９８１年に公表された（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．３４，９０６−９１０）。それ以来、ＩＴは、新生児のＤＢＳを用いたＣＦの指示薬として広く使用されている。幾つかの商業組織がこの用途向けのＦＤＡにより承認されたイムノアッセイキットを供給している。多くが単に「ペーパーイン」アプローチを利用しており、ＤＢＳを含有する紙パンチを直接イムノアッセイにかけ、対象の検体をその場で抽出する。最近（Ｌｉｎｄａｕ−Ｓｈｅｐａｒｄ  ＆  Ｐａｓｓ，２０１０，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍ．５６，４４５−４５０）、ＩＴが２つの異なるアイソフォームで存在することが立証された。これらの著者は、ＩＴのこれら２つの異なるアイソフォームを用いたＣＦの診断のための懸濁液（又はペーパーイン）アレイに基づくイムノアッセイの開発を報告した。これらのタンパク質に基づく研究は全てコートされてないＧｕｔｈｒｉｅカード（Ｗｈａｔｍａｎ  ９０３紙）で行われた。
【００２９】
ヒト免疫不全（ＨＩＶ）スクリーニングの開始以来、妊娠中の母親の血液中の内因性の抗−ＨＩＶ抗体の血清学的検出のために１２０万を超えるＤＢＳ試験が行われている。
【００３０】
これらの研究により、ｉ）対象の血液及び関連するタンパク質の長期貯蔵に関する懸念は根拠がないこと、及び、ii）ＤＢＳ内のヘムの存在はアッセイ性能に干渉しない、ということが確かめられた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００３１】
【特許文献１】米国特許第６０８６７４８号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３２】
従って、ｉ）内因性部分及びii）生物製剤又はバイオテク薬剤を含む生物学的材料のための簡単で安定な貯蔵媒体を提供し、さらなる処理の際にその生物学的材料の高い収率又は回収率を与える固体支持体を製造することが望ましい。本発明は、これらのニーズに関連し、固体支持体、特に固体の紙支持体上にＤＢＳとして貯蔵された生物学的な試料からのバイオ医薬品のような生物学的材料の回収レベルを高める方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００３３】
定義
本明細書で使用する用語「生物学的材料」は、以下に定義するような「生体分子」、「合成により誘導された生体分子」、「バイオ医薬品」又は「細胞成分」を意味する。
ｉ）生体分子は、タンパク質、多糖、及び核酸のような大きいポリマー性分子、並びに一次代謝産物、二次代謝産物、及び天然物のような小さい低分子量分子を含めて、生存生物により生産されるあらゆる有機分子である。
ii）合成により誘導された生体分子は、組換えＤＮＡ技術を用いて生成されるか、又は他の非生存インビトロ方法により化学的に合成された上記ｉ）に定義した「生体分子」である。
iii）バイオ医薬品（又は「バイオテク医薬」）は、バイオテクノロジーで誘導された組換えタンパク質、ペプチド若しくは抗体系医薬、又は遺伝子療法用のアンチセンスオリゴヌクレオチド、タンパク質核酸（ＰＮＡ）若しくはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である。
iv）細胞成分は、独特な高度に組織化された物質又は細胞、従って生存生物を構成する物質である。例としては、膜、オルガネラ、タンパク質、及び核酸がある。大部分の細胞成分は細胞自身内に位置するが、中には生物の細胞外領域に存在するものもある。
【００３４】
本発明の概要
本発明の第１の態様では、少なくとも１つの表面からの生物学的材料の回収率を高める化学物質混合物で被覆された前記表面を有する固体支持体が提供され、化学物質混合物は、ビニルポリマーと非イオン性洗剤、ビニルポリマーとタンパク質、非イオン性合成ポリマーと非イオン性洗剤、非イオン性合成ポリマーとタンパク質、ポリエーテルイミン（ＰＥＩ）と非イオン性洗剤、非イオン性洗剤とタンパク質、及びポリエーテルイミン（ＰＥＩ）とタンパク質からなる群から選択される混合物である。
【００３５】
ある態様では、固体支持体は紙、ガラス極細繊維及び膜からなる群から選択される。
【００３６】
好ましくは支持体は紙、より好ましくはセルロース紙である。
【００３７】
別の態様では、固体支持体は、ポリエステル、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリアミド（ナイロン）、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリカーボネート、ニトロセルロース、酢酸セルロース及び酸化アルミニウムからなる群から選択される膜である。
【００３８】
さらに別の態様では、ビニルポリマーはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）である。
【００３９】
別の態様では、非イオン性洗剤はＴｗｅｅｎ  ２０である。
【００４０】
別の態様では、タンパク質はアルブミンである。
【００４１】
ある態様では、非イオン性合成ポリマーはポリ−２−エチル−２−オキサゾリン（ＰＥＯＸ）である。
【００４２】
別の態様では、化学物質混合物はポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）とＴｗｅｅｎ  ２０である。
【００４３】
別の態様では、化学物質混合物はポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）とアルブミンである。
【００４４】
ある態様では、化学物質混合物はＴｗｅｅｎ  ２０とアルブミンである。別の態様では、化学物質混合物はポリ−２−エチル−２−オキサゾリン（ＰＥＯＸ）とＴｗｅｅｎ  ２０である。
【００４５】
別の態様では、化学物質混合物はポリ−２−エチル−２−オキサゾリンＰＥＯＸとアルブミンである。
【００４６】
ある態様では、化学物質混合物はポリエーテルイミン（ＰＥＩ）とＴｗｅｅｎ  ２０である。
【００４７】
別の態様では、化学物質混合物はポリエーテルイミン（ＰＥＩ）とアルブミンである。
【００４８】
別の態様では、支持体は紙、例えばセルロース紙である。セルロース紙の例としては９０３  Ｎｅｏｎａｔａｌ  ＳＴＤカードがある。
【００４９】
本発明の第２の態様では、
ｉ）上記のような固体支持体の表面を、生物学的材料を含有する試料と接触させ、
ii）前記固体支持体の表面上の試料を乾燥させ、
iii）固体支持体を貯蔵し、
iv）前記表面から生物学的材料を抽出する
工程を含む、固体支持体から生物学的材料を回収する方法が提供される。
【００５０】
ある態様では、工程iii）は、紙支持体を１５〜４０℃の範囲の温度で貯蔵することを含む。好ましくは、温度は２０〜３０℃の範囲である。別の態様では、紙支持体は生物学的材料の熱的安定性に応じてより低い温度で貯蔵される。
【００５１】
試料の性質は生物学的材料の起源に依存する。例えば、起源は、限定されることはないがウイルス、細菌、植物及び動物を始めとするある範囲の生物学的生物に由来し得る。好ましくは、起源は哺乳類又はヒト被験者である。哺乳類及びヒトの起源の場合、試料は組織、細胞、血液、血漿、唾液及び尿からなる群から選択され得る。
【００５２】
別の態様では、生物学的材料は生体分子、合成的に誘導された生体分子、細胞成分及びバイオ医薬品からなる群から選択される。
【００５３】
本発明の第３の態様では、上記のような固体支持体を作成する方法が提供され、この方法は、支持体の少なくとも１つの表面を、この表面からの生物学的材料の回収率を高める化学物質混合物の溶液で被覆することを含んでおり、化学物質混合物は、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）とＴｗｅｅｎ  ２０、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）とアルブミン、Ｔｗｅｅｎ  ２０とアルブミン、ポリ−２−エチル−２−オキサゾリン（ＰＥＯＸ）とＴｗｅｅｎ  ２０、ポリ−２−エチル−２−オキサゾリンＰＥＯＸとアルブミン、ポリエーテルイミン（ＰＥＩ）とＴｗｅｅｎ  ２０、及びポリエーテルイミン（ＰＥＩ）とアルブミンからなる群から選択される混合物である。
【００５４】
ある態様では、固体支持体は紙、好ましくは９０３  Ｎｅｏｎａｔａｌ  ＳＴＤ紙のようなセルロース紙である。
【００５５】
本発明の第３の態様では、上記のような固体支持体の、その表面からの生物学的材料の回収率を高めるための使用が提供される。
【００５６】
ある態様では、生物学的材料はバイオ医薬品である。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】図１は、様々な紙マトリックスに適用した乾燥血液スポットからの外因的に加えたＩＬ−２の回収率を表す。
【図２】図２は、様々な化学物質で被覆された９０３  Ｎｅｏｎａｔａｌ  ＳＴＤ紙に適用した乾燥血液スポットからの外因的に加えたＩＬ−２の回収率を表す。
【図３】図３は、いろいろな化学物質の組合せ対で被覆された９０３  Ｎｅｏｎａｔａｌ  ＳＴＤ紙に適用した乾燥血液スポットからの外因的に加えたＩＬ−２の回収率を表す。
【発明を実施するための形態】
【００５８】
組換えＩＬ−２±キャリヤ（Ｒ  ＆  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ。それぞれ、Ｃａｔ．２０２−ＩＬ−ＣＦ−１０μｇ；ロットＡＥ４３０９１１２及びＣａｔ．２０２−ＩＬ−１０μｇ；ロットＡＥ４３０９０８１）を、カルシウム及びマグネシウムを含まないＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ＰＢＳ（ＰＡＡ。Ｃａｔ．Ｈ１５−００２、ロットＨ００２０８−０６７３）、ＥＤＴＡ−抗凝固剤処理したヒト、ウサギ又はウマの血液（ＴＣＳ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に５０ｐｇ又は１００ｐｇ／μｌで溶解した。
【００５９】
部分試料（０、５０又は１００ｐｇのＩＬ−２を含有する１μｌ）を次のＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅろ紙に塗布適用した。９０３  Ｎｅｏｎａｔａｌ  ＳＴＤカード、Ｃａｔ．１０５３８０６９、ロット６８３３９０９  Ｗ０８２；ＤＭＰＫ−Ａカード、Ｃａｔ．ＷＢ１２９２４１、ロットＦＴ６８４７５０９；ＤＭＰＫ−Ｂカード、Ｃａｔ．ＷＢ１２９２４２、ロットＦＥ６８４７６０９及びＤＭＰＫ−Ｃカード、Ｃａｔ．ＷＢ１２９２４３、ロットＦＥ６８４７００９。試料を周囲温度及び湿度で一晩乾燥させた。
【００６０】
適当な大きさのＨａｒｒｉｓ  Ｕｎｉ−ｃｏｒｅパンチ（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ．Ｚ７０８８６０−２５ｅａ、ロット３１１０）を用いて各々の紙タイプからパンチ（直径３ｍｍ）を抜き出した。ヒトＩＬ−２  Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡ（Ｒ  ＆  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ．Ｄ０２５０、ロット２７３２７５）から得られたＩＬ−２マイクロプレートの個々のウェルに単一のパンチを入れた。これらのプレートはＩＬ−２に対するマウスモノクローナル抗体が被覆されている。Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅキットと共に供給されたアッセイ緩衝液（１００μｌ）を用いてＩＬ−２タンパク質を紙パンチから溶出した。その後の工程は全て、「ペーパーイン」方法を用いて、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅキットと共に供給された指示書に従って行った（紙パンチを直接アッセイ緩衝液に入れ、直接その場で検体を溶出する）。アッセイの完了時Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  Ａｓｃｅｎｔを用いてマイクロプレートの光学密度を４５０ｎｍでモニターした。ＩＬ−２の回収率は既知のＩＬ−２濃度の標準曲線に対して値を比較することで決定した。個々の実験毎に新たなＩＬ−２標準曲線を作成した。
【００６１】
追加の実験では、９０３  Ｎｅｏｎａｔａｌ  ＳＴＤカードを幾つかの化学物質溶液（以下に記載する）中に飽和浸漬した後にこれらのカードにＩＬ−２を添加した血液を加えた。幾つかの例では、紙を、これらの化学物質の幾つかを含有する混合溶液中にも飽和浸漬して、化学物質が乾燥血液スポットからのＩＬ−２の回収に対して相加又は相乗効果を示すか否かを決定した。
【００６２】
使用した化学物質
化学物質及びその出所のリストは次の通り。
ポリビニルアルコール（Ｓｉｇｍａ；Ｃａｔ．Ｐ８１３６、ロット０３９ｋ０１４７）
ポリエチレンイミン、水中５０％（Ｆｌｕｋａ；Ｃａｔ．Ｐ３１４３、ロット２９ｋ１４９２）
ポリビニルピロリドン、水中１％（Ｓｉｇｍａ；Ｃａｔ．ＰＶＰ４０−１００ｍｇ、ロット１１ｐｋ００９７）
イヌリン、水中１％（Ｓｉｇｍａ；Ｃａｔ．Ｉ２２５５−１００ｇ、ロット０７９Ｆ７１１０）
ポリ−２−エチル−２−オキサゾリン、水中１％（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃａｔ．３７２８４６、ロット３０４９８ＰＪ）
Ｔｗｅｅｎ  ２０、水中１％（Ｓｉｇｍａ，Ｃａｔ．Ｐ７９４９−１００ｍｌ、ロット１０９ｋ０１０２１）
α−β−トレハロース、１０ｍｇ／ｍｌ（Ｓｉｇｍａ，Ｃａｔ．Ｔ０２９９−５０ｍｇ、ロット１２８ｋ１３３７）
アルブミン、水中１％（Ｓｉｇｍａ、ＣａｔＡ２１５３−１０ｇ、ロット０４９ｋ１５８６）
ウシ乳カゼイン、水中１％（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ．Ｃ５８９０−５００ｇ、ロット０８９ｋ０１７９）
ポリエチレングリコール１０００、水中１％（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｋａ、Ｃａｔ．８１１８９、ロット１１９８９６９）
ポリエチレングリコール２００、水中１％（Ｆｌｕｋａ、Ｃａｔ．８１１５０、ロット１３８４５５０）。
【００６３】
実験結果
ＩＬ−２をＥＤＴＡ−抗凝固剤処理した血液に溶解したとき、９０３及びＤＭＰＫ−Ｃカードは４５〜５５％のサイトカイン回収率を促進したが、ＤＭＰＫ−Ａ及びＢカードからは２〜３％しか回収されなかった（表１及び図１参照）。９０３及びＤＭＰＫ−Ｃカードは基本的な原紙であり、化学物質を浸漬も被覆もしてないが、ＤＭＰＫ−Ａ及びＢカードはそれぞれタンパク質、微生物及び細胞の変性及び不活性化を促進する化学物質の独特の混合物で被覆されている。ＤＭＰＫ−Ａ及びＢカードは核酸の貯蔵を促進するように設計されている。従って、ＤＭＰＫ−Ａ及びＢカードを用いて観察された低いＩＬ−２の回収率レベルは、実際、これらの変性試薬の存在及び使用したＥＬＩＳＡに基づく抗体検出系を反映している可能性がある。ＥＬＩＳＡ検出系では溶出されるＩＬ−２が生来の完全な構造を示すことが必要である。
【００６４】
【表１】
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表１−様々な紙タイプに適用した乾燥血液スポットからの外因的に加えたＩＬ−２の回収率。ｐ値は各紙タイプに対する±キャリヤを比較する。キャリヤの存在はＩＬ−２の回収率に有意な影響を示さなかった（ｐ値＞０．０５）。
【００６５】
サイトカインをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に溶解したときには使用した紙タイプに関わらずＩＬ−２の回収は観察されなかった（データは示さない）。加えたＩＬ−２が存在しないときに観察されたＩＬ−２回収レベルは本質的にバックグランドレベルと同等であったが、これはＥＤＴＡ−抗凝固剤処理した血液が含有する内因性のＩＬ−２は無視できる量であることを示している（データは示さない）。
【００６６】
幾つかの化学物質を用いて、９０３  Ｎｅｏｎａｔａｌ  ＳＴＤカードを飽和浸漬した。そのうちの幾つかは浸漬してない紙と比較して高まったＩＬ−２レベルの回収を促進するように見えた（ｐ値＜０．０５）。９０３  Ｎｅｏｎａｔａｌ  ＳＴＤカードで（表２及び図２）、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−２−エチル−２−オキサゾリン、Ｔｗｅｅｎ  ２０、α−β−トレハロース、アルブミン及びカゼインのような化学物質は対応する浸漬してない紙で観察された〜４５％と比較して＞５５％の増大した平均ＩＬ−２回収率を促進した。
【００６７】
【表２】
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表２−様々な化学物質を被覆した９０３  Ｎｅｏｎａｔａｌ  ＳＴＤ紙に適用した乾燥血液スポットからの外因的に加えたＩＬ−２の回収率。この表は２つの独立した実験（ｎ＝６）から誘導される。ｐ値は浸漬した紙から誘導された値を浸漬してない９０３紙から誘導された値と比較する。
【００６８】
２つの異なる化学物質の組合せによる９０３  Ｎｅｏｎａｔａｌ  ＳＴＤ紙の飽和浸漬はＩＬ−２回収レベルの点で相加効果を示した。例えば、表２は、Ｔｗｅｅｎ  ２０及びアルブミンで被覆した９０３  Ｎｅｏｎａｔａｌ  ＳＴＤ紙の回収率がそれぞれ６７％及び７４％であることを示している。これらの値は等価な浸漬してない９０３紙よりそれぞれ２２％及び２９％大きい。表３は、外因的に加えたＩＬ−２を含有する乾燥血液スポットを両方の化学物質に浸漬した９０３  Ｎｅｏｎａｔａｌ  ＳＴＤ紙に適用したときのサイトカイン回収率を示す。Ｔｗｅｅｎ  ２０／アルブミンを被覆した紙の回収率の値は９２％であり、これは対応する浸漬してない紙と比較して〜４０％の増大を表している。
【００６９】
９０３紙を以下の化学物質の組合せ、すなわちポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）とＴｗｅｅｎ  ２０、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）とアルブミン、Ｔｗｅｅｎ  ２０とアルブミン、ポリ−２−エチル−２−オキサゾリン（ＰｅＯＸ）とＴｗｅｅｎ  ２０、ポリ−２−エチル−２−オキサゾリン（ＰｅＯＸ）とアルブミン、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）とＴｗｅｅｎ  ２０、及びポリエチレンイミン（ＰＥＩ）とアルブミンに浸漬したとき大きく増大したＩＬ−２の回収率（ｐ値＜０．０５）が観察された。
【００７０】
【表３】
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表３−化学物質の対の組合せで被覆された９０３  Ｎｅｏｎａｔａｌ  ＳＴＤ紙に適用した乾燥血液スポットからの外因的に加えたＩＬ−２の回収率（ｎ＝４）。
【００７１】
本発明の好ましい具体的な実施形態について説明して来たが、当業者には理解されるように、本発明は、例示の目的のみで示した限定するものではない記載した実施形態以外にも実施することができる。本発明は後続の特許請求の範囲によってのみ制限される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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