(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）：
【化１】
0005895479.tif 000004
で示されるレスベラトロール誘導体およびその薬学的に許容可能な塩からなる群より選ばれる１種以上の化合物を含有することを特徴とするＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ活性化剤。
【請求項２】
下記式（１）：
【化２】
0005895479.tif 000005
で示されるレスベラトロール誘導体およびその薬学的に許容可能な塩からなる群より選ばれる１種以上の化合物を含有することを特徴とする糖吸収促進剤。
【請求項３】
下記式（１）：
【化３】
0005895479.tif 000006
で示されるレスベラトロール誘導体およびその薬学的に許容可能な塩からなる群より選ばれる１種以上の化合物を含有することを特徴とする糖尿病予防または治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レスベラトロール誘導体を含有するＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）活性化剤に関するものである。また、本発明は、糖吸収促進剤並びに糖尿病予防剤または治療剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
食生活の欧米化が進んだ現代社会において、糖尿病が大きな社会問題となっている。糖尿病は高脂肪、高カロリーな食事による過剰なエネルギー摂取とストレスや運動不足を原因とする疾患であると認識されている。
【０００３】
生活習慣病である糖尿病は、血液中のグルコース濃度が異常上昇する疾患である。厚生労働省の「２００７年国民健康・栄養調査」によると糖尿病患者および予備群は２２１０万人以上に上るとされている。これは日本の成人２割以上にあたり、その対策が急務となっている。世界的にも成人の総人口の３％程度の患者が発生しているといわれており、国際連合では１１月１４日を「世界糖尿病デー」として、その予防・治療・療養を啓発する運動を行っている。
【０００４】
糖尿病の原因がエネルギー摂取量とエネルギー消費量のバランスの偏りによって引き起こされることは多くの実験結果から明らかになっている。エネルギー代謝のバランスが崩れることにより、血糖値を調節するホルモンであるインスリンの枯渇、インスリン分泌量の低下、インスリン感受性の低下が起こり糖尿病を発症する。この問題を改善する１つの方法として体内の代謝機能を向上させ、消費エネルギーを増大させることが挙げられる。消費エネルギーの増大を図ることによって、普段運動をしていない、また少しの運動しか行っていない場合であっても十分な運動を行ったのと同じ効果が得られる運動代替手段として効果が期待される。
【０００５】
ＡＭＰＫは生体内のエネルギー代謝を制御する因子として見出されている（非特許文献１）。ＡＭＰＫは細胞でＡＴＰ濃度の減少とそれに伴うＡＭＰ濃度の上昇を感知してリン酸化され活性型へ変換される。活性化されたＡＭＰＫはＡＴＰ産生促進以外に様々な代謝経路を亢進する。例えば、血液中から細胞内へのグルコースの取り込みを行うグルコース輸送体ＧＬＵＴ４の発現と細胞膜へのトランスロケーションを促進し、糖の吸収を亢進させる。ＡＭＰＫは生体内の主要な代謝経路の活性に関与しており、これを活性化することは代謝の活性化つまり運動代替効果を及ぼすものとされている。
【０００６】
上記のようにＡＭＰＫの活性化の有用性が示されていることから、その活性化を目的とした先行技術がいくつか報告されている。例えば、アディポネクチンのＣ末端領域を有効成分とするＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ活性化剤（特許文献１）、レスベラトロールを有効成分とするＡＭＰＫ活性化剤（特許文献２）、ローズマリーまたはセージ抽出物を有効成分とするＡＭＰＫ活性化剤（特許文献３）、ニンニク、醗酵黒ニンニク、ゴボウ、西洋カボチャ種子、キウイ種子、ギャバ、カッコン、チンピ、オウバク、オウゴン、アガリクス、ガラナ等の植物エキスを有効成分とするＡＭＰＫ活性化剤（特許文献４）、２−８量体のプロシアニジンを有効成分とするＡＭＰＫ活性化剤（特許文献５）等が挙げられる。
【０００７】
前記のようにＡＭＰＫ活性を有する化合物や素材が多数提案されているが、更なる新規素材の開発が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００４−０１６０７４号公報
【特許文献２】特開２００６−２７３８３４号公報
【特許文献３】特開２００８−２０８０８１号公報
【特許文献４】特開２００９−２９８７４２号公報
【特許文献５】特開２０１１−１７８７２８号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，３９（４），ｐ３９８−４０７（２００２）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明者らは、ＡＭＰＫ活性化剤に関する前記の状況を鑑みて、新規なＡＭＰＫ活性化剤の探索をした。その結果、新たに作製したレスベラトロール誘導体類が、レスベラトロールよりも優れたＡＭＰＫ活性化作用を有することに加えて、糖吸収促進作用も有する化合物であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
したがって、本発明は、レスベラトロールに比べて優れたＡＭＰＫ活性化剤を提供することを目的とする。
また、本発明は、レスベラトロールに比べて優れた糖吸収促進剤を提供することを目的とする。
また、本発明は、レスベラトロールに比べて優れた糖尿病予防または治療剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の要旨は、
〔１〕下記式（１）：
【００１３】
【化１】
0005895479.tif 000002
【００１４】
で示されるレスベラトロール誘導体およびその薬学的に許容可能な塩からなる群より選ばれる１種以上の化合物を含有することを特徴とするＡＭＰＫ活性化剤、
〔２〕前記式（１）記載のレスベラトロール誘導体およびその薬学的に許容可能な塩からなる群より選ばれる１種以上の化合物を含有することを特徴とする糖吸収促進剤、
〔３〕前記式（１）記載のレスベラトロール誘導体およびその薬学的に許容可能な塩からなる群より選ばれる１種以上の化合物を含有することを特徴とする糖尿病予防または治療剤
に関する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明のＡＭＰＫ活性化剤は、公知のＡＭＰＫ活性化剤であるレスベラトロールと比べて優れたＡＭＰＫ活性化作用を有していることから、新規のＡＭＰＫ活性化剤として有用である。
また、本発明のＡＭＰＫ活性化剤は、レスベラトロールに比べて細胞の糖吸収作用を活性化することが可能であることから、糖吸収促進剤としても有用であり、このように血糖値の過剰な上昇を防止できることから、糖尿病予防または治療剤としても使用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は実施例１で行ったＵＨＡ４００２のＨＰＬＣのクロマトグラムを示す。Ｒ３は本発明品であるＵＨＡ４００２に該当する。
【図２】図２は実施例２で行った活性型ＡＭＰＫを検出・定量した結果を示す。左から、（１）ＤＭＳＯ、（２）レスベラトロール（Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ）、（３）ＵＨＡ４００２で処理したそれぞれの前駆脂肪細胞中のリン酸化ＡＭＰＫ量をウェスタンブロット解析の結果から定量した結果を示している。なお、上図は、ウェスタンブロットの状態を示しており、下図はそのリン酸化ＡＭＰＫ（活性型ＡＭＰＫ）量を示している。
【図３】図３は実施例３で行った糖吸収試験の結果を示している。左から、（１）ＤＭＳＯ、（２）レスベラトロール（Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ）、（３）ＵＨＡ４００２で処理したそれぞれの脂肪細胞培養液中のグルコース濃度を定量した結果を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明において、「ＡＭＰＫ活性化剤」とは、ＡＭＰＫのリン酸化を促進することができる薬剤をいう。
また、「糖吸収促進剤」とは、細胞の糖吸収を亢進することができる薬剤をいう。
前記ＡＭＰＫのリン酸化促進作用および細胞の糖吸収作用は、具体的には、後述の実施例に記載の方法により測定することができる。
また、本発明の「糖尿病予防または治療剤」は、ＡＭＰＫのリン酸化を促進し、加えて細胞の糖吸収を亢進することで、血糖値の過剰な上昇を抑制することで、糖尿病の進行を抑えて、糖尿病の発生を抑制することが可能な薬剤をいう。
【００１８】
本発明では、ＡＭＰＫ活性化剤、糖吸収促進剤および糖尿病予防または治療剤の構成は同じであるため、これらをまとめて、本発明のＡＭＰＫ活性化剤等と略する。
【００１９】
本発明のＡＭＰＫ活性化剤等は、下記式（１）：
【００２０】
【化２】
0005895479.tif 000003
【００２１】
で示されるレスベラトロール誘導体およびその薬学的に許容可能な塩からなる群より選ばれる１種以上の化合物を含有することを特徴とする。
【００２２】
前記レスベラトロール誘導体において、炭素−炭素２重結合は、トランスまたはシスであってよく、シス体とトランス体との混合物を含む。
【００２３】
前記レスベラトロール誘導体の薬学的に許容可能な塩としては、例えば、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；マグネシウム塩、カルシウム塩、バリウム塩等のアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩；アルミニウムヒドロキシド塩等の金属ヒドロキシド塩；アルキルアミン塩、ジアルキルアミン塩、トリアルキルアミン塩、アルキレンジアミン塩、シクロアルキルアミン塩、アリールアミン塩、アラルキルアミン塩、複素環式アミン塩等のアミン塩；α−アミノ酸塩、ω−アミノ酸塩等のアミノ酸塩；ペプチド塩またはそれらから誘導される第１級、第２級、第３級若しくは第４級アミン塩等が挙げられる。これらの薬理的に許容し得る塩は、単独でまたは２種以上を混合して用いることができる。
【００２５】
本発明で使用する前記式（１）で示されるレスベラトロール誘導体は、レスベラトロールを原料として、金属塩の存在下で加熱処理して得ることができる。
以下に、前記式（１）で示されるレスベラトロール誘導体の製造方法について具体的に説明する。
【００２６】
前記製造方法では、前駆体としてレスベラトロールを用いる。レスベラトロールにはトランス体とシス体の構造異性体が存在するが、加熱や紫外線によってトランス体とシス体の変換が一部生じる。したがって、レスベラトロールとしては、トランス体でもシス体でも、あるいはトランス体とシス体の混合物であってもよい。レスベラトロールは、ブドウ果皮から抽出・精製した天然由来のものであっても、化学合成された純度の高い化成品であっても良い。天然由来のレスベラトロールを用いる場合は、完全に精製されたものである必要はなく、後述のように所望の生成反応が進み最終的に本発明で用いる前記レスベラトロール誘導体が得られるから、レスベラトロール以外の成分を含む混合物も使用できる。また、レスベラトロールには、塩、エーテル、エステル等の誘導体もあるが、前記製造方法では、これらの誘導体も原料として使用することができる。
ただし、前記レスベラトロール誘導体の回収率の観点からは、レスベラトロール換算で１重量％以上含有された混合物が原料として望ましい。
前記レスベラトロールとしては、ブドウ果皮、ピーナッツ等の原料からの抽出物、凍結乾燥品等を使用してもよい。
【００２７】
本発明では、レスベラトロールを適切な溶媒に溶解させる。この際、溶媒が水のみであれば、レスベラトロールの溶解度が著しく低いために、水と有機溶媒の混合液や、有機溶媒のみに溶解させればよい。水と有機溶媒の配合比や、有機溶媒の種類については特に制限はなく、レスベラトロールが十分に溶解すれば良い。中でも、メタノールやエタノールのみの溶媒や、水とメタノール、水とエタノール等の混合液を使用することが、安全性やコスト面から好ましい。新規レスベラトロール誘導体を含む反応後組成物に対して最終的な精製を十分に適用せずにその組成物を食品に使用する場合には、安全性や法規面から溶媒としてエタノールや含水エタノールを使用することが望ましい。
【００２８】
前記のようにして得られるレスベラトロールを含有する溶液中のレスベラトロールの濃度について特に制限はないが、それぞれの濃度が高いほど、溶媒使用量が少ない等のメリットもあるため、レスベラトロールの濃度は各々の溶媒に対しレスベラトロールがそれぞれ飽和する濃度近くが好ましい。
また、レスベラトロールは前記溶液中において生成反応前に完全に溶解していなくともよい。
【００２９】
次に、前記レスベラトロールを含有する溶液（以下、レスベラトロール含有溶液）のｐＨを８以上に調整することが好ましい。調整方法として、例えば、レスベラトロール含有溶液を調製した後にｐＨ調整剤を添加してｐＨを調整しても良いし、前記溶液の調製時に前もって溶媒のｐＨを調整しておいても良い。レスベラトロール含有溶液の反応開始時のｐＨは８．０以上であれば、効率的に後述の反応が進むので好ましく、ｐＨ１３．０を越えると反応と同時に、他の反応や目的化合物の分解も一方で生じるために最終的なレスベラトロール重合化合物類の回収量が低下する。したがって、反応開始時のｐＨは８以上１３未満が望ましい。
【００３０】
本発明では、前記レスベラトロール含有溶液中に金属塩を添加する。前記金属塩としては、酸性塩、塩基性塩、正塩のいずれでもよく、また、単塩、複塩、錯塩のいずれでもよい。さらに、金属塩は１種類であっても、複数種類の混合物であってもよい。金属塩の例としては、食品添加物として認可されているものが安全性の面で好ましい。例えば、食品に添加することが認められているマグネシウム塩、カルシウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、亜鉛塩、銅塩等が挙げられる。
また、前記金属塩の混合物としては、例えば、ミネラルプレミックス（田辺製薬株式会社、グルコン酸亜鉛、クエン酸鉄アンモニウム、乳酸カルシウム、グルコン酸銅、リン酸マグネシウムを主成分としたミネラル混合物）のように金属塩を数種類含む物質が挙げられる。また、複数の金属塩を含む混合物として、ミネラルウォーターも挙げることができる。
なお、前記金属塩の含有量としては、前記レスベラトロール誘導体を生成可能な量であればよく、特に限定はない。
【００３１】
次に、金属塩存在下で、レスベラトロール含有溶液を加熱処理する。この加熱処理により、新規レスベラトロール誘導体の生成反応を行う。生成反応を効率的に進ませるために、レスベラトロール含有溶液の加熱温度は１１０℃以上に調整することが好ましい。また、使用する溶媒の沸点から考え、加圧加熱が望ましい。例えば、開放容器にレスベラトロール含有溶液を入れ、溶媒の沸点を超える高温で前記容器を加熱する、密閉容器にレスベラトロール含有溶液を入れて前記容器を加熱する、レトルト装置やオートクレーブを用いて加圧加熱する等、少なくとも部分的に溶液温度が１１０℃以上に達するように加熱することが好ましい。回収効率面から、溶液温度が均一に１１０℃〜１５０℃になることが、さらに好ましい。加熱時間も加熱温度と同様に限られたものではなく、効率的に目的の反応が進行する時間条件とすればよい。特に、加熱時間は加熱温度との兼ね合いによるものであり、加熱温度に応じた加熱時間にすることが望ましい。例えば、１３０℃付近で加熱する場合は、５分〜１２０分の加熱時間が望ましい。また、加熱は、一度でも良いし、複数回に分けて繰り返し加熱しても良い。複数回に分けて加熱する場合、蒸発した溶媒を補うために溶媒を新たに追加して行うことが好ましい。
【００３２】
前記加熱処理によるレスベラトロール誘導体の生成反応の終了は、例えば、ＨＰＬＣによる成分分析によりレスベラトロール誘導体の生成量を確認して判断すればよい。
【００３３】
得られる反応液中には、本発明で用いるレスベラトロール誘導体が含有されている。
また、安全な原料のみを用いた工程でレスベラトロール誘導体を製造した場合には、前記レスベラトロール誘導体を含む混合物の状態で食品、医薬品または医薬部外品に使用することが可能である。例えば、天然由来のレスベラトロールを含水エタノール溶媒に溶解し、ミネラルウォーターやミネラルプレミックスを添加して加熱処理した場合には、得られる反応液を食品原料の一つとして使用することが可能である。
【００３４】
また、風味面での改良やさらなる高機能化を望む場合は、前記反応液を濃縮してレスベラトロール誘導体の濃度を高める、あるいは前記反応液を精製しレスベラトロール誘導体の純品を得ることができる。濃縮、精製は、公知の方法で実施可能である。例えば、クロロホルム、酢酸エチル、エタノール、メタノール等を用いた溶媒抽出法や炭酸ガスによる超臨界抽出法等で抽出してレスベラトロール誘導体を濃縮できる。また、カラムクロマトグラフィーを利用して濃縮や精製を施すことも可能である。再結晶法や限外ろ過膜等の膜処理法も適用可能である。
【００３５】
また、前記反応液から式（１）で表されるレスベラトロール誘導体を分離して回収する場合には、カラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ等を用いてもよい。
【００３６】
前記濃縮物や精製物を、必要に応じて、減圧乾燥や凍結乾燥して溶媒除去することで、粉末状のレスベラトロール誘導体を得ることができる。
【００３７】
また、得られたレスベラトロール誘導体は、必要に応じて、当該分野で公知の方法により、レスベラトロール誘導体の塩としたり、レスベラトロール誘導体のヒドロキシ基をエーテル化またはエステル化してもよい。
【００３８】
前記のレスベラトロール誘導体はいずれも、レスベラトロールにはない優れたＡＭＰＫ活性化作用、糖吸収促進作用を有する。
したがって、本発明は、前記レスベラトロール誘導体を有効成分として含有するＡＭＰＫ活性化剤、糖吸収促進剤、糖尿病予防剤、糖尿病治療剤を提供することができる。
【００３９】
次に本発明を実施例に基いて詳細に説明するが、本発明はかかる実施例にのみ限定されるものではない。
【実施例】
【００４０】
（実施例１：ＵＨＡ４００２の生成および単離・精製）
トランス−レスベラトロール（東京化成）７００ｍｇをエタノール１４ｍＬに溶解し、２．５％ＮａＨＣＯ3水溶液を１４ｍＬ加えて、レスベラトロール含有溶液（ｐＨ９．９）を得た。このレスベラトロール含有溶液をオートクレーブ（三洋電機（株）、「ＳＡＮＹＯ  ＬＡＢＯ  ＡＵＴＯＣＬＡＶＥ」、以下同じ）にて１３０℃、２０分間加熱した。次いで、１回目のオートクレーブ処理にて得られた反応溶液に、エタノール１４ｍＬと５．０％ＮａＨＣＯ3水溶液を１４ｍＬ加え、再度、オートクレーブにて１３０℃、２０分間加熱した。得られた反応溶液のうち１ｍＬをメタノールにて５０ｍＬにメスアップし、このうちの１０μＬをＨＰＬＣにより分析した。その結果を図１に示す。
【００４１】
ＨＰＬＣ分析は以下条件にて行った。
カラム：逆相用カラム「Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ（登録商標）Ｃ−３０−ＵＧ−５」（４．６ｍｍｉ．ｄ．×２５０ｍｍ）
移動相：Ａ・・・Ｈ2Ｏ（０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）），  Ｂ・・・アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）
流速：１ｍＬ／ｍｉｎ
注入：１０μＬ
検出：２５４ｎｍ
勾配（容量％）：８０％Ａ／２０％Ｂから２０％Ａ／８０％Ｂまで３０分間、２０％Ａ／８０％Ｂから１００％Ｂまで５分間、１００％Ｂで１０分間（全て直線）
【００４２】
図１に示すように、反応後溶液のクロマトグラムでは、複数のピークが確認され、原料であるレスベラトロールのピークとは相違しているＲ１〜Ｒ４のピークのうち、Ｒ３のピークに含まれる化合物をＵＨＡ４００２と命名した。
【００４３】
Ｒ３のピークに含まれるＵＨＡ４００２を分取ＨＰＬＣにより精製し、常法により乾燥したところ、褐色粉末状の物質であった。
【００４４】
なお、ＵＨＡ４００２の分子量を高分解能ＦＡＢ−ＭＳ（高速原子衝撃質量分析）にてそれぞれ測定したところ、４３９．４８０３であり、理論値との比較から、以下の分子式を得た。
理論値Ｃ２８Ｈ２３Ｏ５（Ｍ＋Ｈ）+ ：４３９．４７９２
分子式Ｃ28Ｈ22Ｏ5
【００４５】
次に、前記ＵＨＡ４００２を核磁気共鳴（ＮＭＲ）測定に供し、１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲおよび各種２次元ＮＭＲデータの解析から、前記ＵＨＡ４００２が前記式（１）で表される構造を有することを確認した。
【００４６】
（実施例２  活性型ＡＭＰＫの定量）
活性型ＡＭＰＫの発現量を評価するために、３Ｔ３−Ｌ１細胞（マウス由来脂肪前駆細胞）を用いて評価を行った。
【００４７】
試料にはレスベラトロール、本発明品であるＵＨＡ４００２の２種類を用いた。各試料をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、和光純薬工業（株）社製）に２０μＭの濃度で溶解させて試験に使用した。
【００４８】
培養は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ：バイオロジカル・インダストリーズ社製）、１％アンチバイオティック−アンチマイコティック（ギブコ（ＧＩＢＣＯ）社製）を含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、シグマ（Ｓｉｇｍａ）社製）を用いていった。試験に使用する前駆脂肪細胞は定法に従って調整した。つまり、細胞培養用６ｗｅｌｌディッシュ（日本ＢＤ社製）に３Ｔ３Ｌ１細胞を５×１０4ｃｅｌｌｓ／ｍＬで２ｍＬ播種して３７℃、５％ＣＯ2条件下で４８時間培養し、１００％コンフルエントしたものを使用した。
【００４９】
試験は以下のように行った。培養した前駆脂肪細胞に各試料を１０μＬ（終濃度０．１μＭ）添加して１０分間処理した。溶媒であるＤＭＳＯのみを０．５％添加したものをコントロールとした。
【００５０】
処理後、細胞にＲＩＰＡバッファー（シグマ社製）１００μＬを添加し、タンパク質を抽出した。抽出後、タンパク質濃度をＤｃプロテインアッセイ（バイオ・ラッド・ラボラトリーズ（株）製）を用いてタンパク質濃度を測定した。
ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動に供するタンパク質サンプルは、タンパク質２０μｇ相当に１／５量のＬａｅｍｍｌｉサンプルバッファー（１０％ドデシル硫酸ナトリウム、１００ｍＭジチオトレイトール、３０％グリセロール、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８）を添加して９６℃で５分間加熱変性させたものを使用した。ゲルには「ミニプロティアンＴＧＸ７．５％Ｇｅｌ」（バイオ・ラッド・ラボラトリーズ（株）製）を使用した。
変性させたタンパク質サンプルを全量ゲルに供し、２００Ｖ、３０分間電気泳動した。
電気泳動後、セミドライ式ブロッティング装置「ＴＲＡＮＳ−ＢＬＯＴ  Ｓ−Ｄ  ＳＥＭＩ−ＤＲＹ  ＴＲＡＮＳＦＥＲ  ＣＥＬＬ」（商品名、バイオ・ラッド・ラボラトリーズ（株）製）でＰＶＤＦ膜（ミリポア（株）社製）に転写し、５％スキムミルクでブロッティングした。ここから、「Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＡＭＰＫα（Ｔｈｒ１７２）（４０Ｈ９）Ｒａｂｂｉｔ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ」（一次抗体、ＣＳＴジャパン（株）製）、「Ａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ，ＨＲＰ−ｌｉｎｋｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ」（二次抗体、ＣＳＴジャパン（株）製）を用いた抗体反応によって活性型ＡＭＰＫ（ｐ−ＡＭＰＫ）の検出を行った。また一次抗体に「ＡＭＰＫα  Ｒａｂｂｉｔ  Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ」（ＣＳＴジャパン（株）製）を用いて総ＡＭＰＫ量を確認した。検出されたバンドを画像解析ソフト「Ｉｍａｇｅ  Ｊ」を用いてバンド強度の算出を行った。これらの結果を図２に示した。
【００５１】
図２の結果より、ＵＨＡ４００２においてレスベラトロールと比較し、優れたＡＭＰＫ活性化作用が確認された。
このようにＵＨＡ４００２は、ＡＭＰＫ活性化作用を有することから、糖吸収促進作用を有することが示唆された。
【００５２】
（実施例３  糖吸収促進作用の評価）
糖吸収促進作用を評価するために３Ｔ３−Ｌ１細胞を用いた評価を行った。
【００５３】
試料にはレスベラトロール、本発明品であるＵＨＡ４００２の２種類を用いた。各試料をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、和光純薬工業（株）社製）に１００μＭの濃度で溶解させて試験に使用した。
【００５４】
３Ｔ３−Ｌ１の培養は実施例２と同様に行った。
１００％コンフルエントした３Ｔ３-Ｌ１を毎日培地交換しながらさらに４８時間培養し、培地を「ＡｄｉｐｏＩｎｄｕｃｅｒ  Ｒｅａｇｅｎｔ」（商品名、タカラバイオ（株）社製）付属のインスリン、デキサメタゾン、イソブチルメチルキサンチンをそれぞれ１％、０．５％、０．１％添加した分化用ＤＭＥＭ２ｍＬに交換して４８時間分化誘導を行った。
その後インスリン１％を含むＤＭＥＭ（維持培地）に交換して１週間培養した。
【００５５】
培養後、ＤＭＥＭ培地に交換し、各試料１０μＬ（終濃度０．５μＭ）添加して２日間培養した。培養終了後、培地上清を回収し、培地中のグルコース濃度を「Ｇｌｕｃｏｓｅ  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔ」（商品名、バイオ・ビジョン（Ｂｉｏ  Ｖｉｓｉｏｎ）社製）を用いて定量した。
【００５６】
方法はキット付属のプロトコールに準じて行った。具体的には、回収した培地をグルコースアッセイバッファーで１００倍した。この希釈サンプルを９６ウェルマイクロプレートに５０μＬずつ添加し、これに「リアクションミックス（Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘ）」（商品名、４６μＬ  グルコースアッセイバッファー、２μＬ  グルコースエンザイムミックス、２μＬ  グルコースサブストレートミックス）５０μＬを混合し、室温、暗所で３０分間反応させた。反応後、プレートリーダー（「ＢＩＯ−ＲＡＤ  Ｍｏｄｅｌ  ６８０」、バイオ・ラッド・ラボラトリーズ（株）製）を用いて測定波長４５０ｎｍの吸光度測定を行った。グルコース濃度はグルコーススタンダードを用いた検量線から算出した。結果は図３に示した。
【００５７】
その結果、ＵＨＡ４００２で処理した場合には、ＤＭＳＯおよびレスベラトロールの場合と比べて３Ｔ３−Ｌ１細胞培養液中のグルコース濃度が有意に低下していた。
【００５８】
ＵＨＡ４００２は、前記のようにＡＭＰＫ活性促進作用、糖吸収促進作用がともにレスベラトロールに比べて優れていることから、血糖値の上昇に伴い発症する糖尿病を予防および治療する糖尿病予防および治療剤としても有用であると考えられる。
【００５９】
また、実施例２、３において、ＵＨＡ４００２で処理した各細胞を観察したところ、いずれも実験前後で特に大きな変化は見られなかった。したがって、ＵＨＡ４００２は、細胞毒性が低く、安全性にも優れていると考えられる。
【図１】
0005895479.tif 000007
【図２】
0005895479.tif 000008
【図３】
0005895479.tif 000009