(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞膜透過ペプチドおよびホウ素化合物を含む細胞膜透過型ホウ素ペプチドであって、細胞膜透過ペプチドが、アルギニン９〜１３残基が連続したアミノ酸配列からなるペプチドまたはＴＡＴ（配列番号１）であり、ホウ素化合物が、ホウ素フェニルアラニン、またはチオール基、水酸基、カルボキシル基、アミノ基、アミド基、アジド基、ハロゲン基およびリン酸基からなる群より選択されるアミノ酸と結合可能な官能基を有するホウ素クラスターである細胞膜透過型ホウ素ペプチド。
【請求項２】
前記ホウ素化合物が、メルカプトウンデカハイドロドデカボレートである請求項１記載の細胞膜透過型ホウ素ペプチド。
【請求項３】
細胞膜透過ペプチド１分子に対してメルカプトウンデカハイドロドデカボレート１〜８分子を含む請求項２記載の細胞膜透過型ホウ素ペプチド。
【請求項４】
核内に集積されることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞膜透過型ホウ素ペプチド。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の細胞膜透過型ホウ素ペプチドおよび少なくとも１つの薬学的に許容され得る賦形剤を含むホウ素製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がん治療に用いるホウ素中性子捕捉療法（ＢＮＣＴ）における、ホウ素含有化合物に関する。より具体的には、細胞膜透過シグナルペプチドおよびホウ素化合物を含む細胞膜透過型ホウ素ペプチドおよびそれを含むホウ素製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ホウ素中性子捕捉療法（ＢＮＣＴ）とは、ホウ素化合物自体には、毒性や腫瘍抑制効果は無いが、ホウ素を含んだがん細胞に対して中性子を照射すると、細胞内でアルファ崩壊と呼ばれる核分裂反応がおこり、腫瘍を殺傷するというものである。この際の腫瘍殺傷効果は、ホウ素を含んでいる細胞レベルで起こるものであり、正常細胞にホウ素が入っていなければ、がん細胞のみを細胞レベルで殺すことができる次世代のがん治療法である。現在、ホウ素製剤を使用した粒子線癌治療は、臨床研究段階であり、２種類のホウ素製剤が検討されている。それは、１個のホウ素原子に対してアミノ酸のフェニルアラニンが結合したＢＰＡ（ホウ素フェニルアラニン）と１２個のホウ素からなる分子であるＢＳＨ（メルカプトウンデカハイドロドデカボレート）の二剤であり、具体的にはいずれも難治性疾患である悪性脳腫瘍、頭頚部がん、悪性黒色腫などの疾患を対象に行われている。
【０００３】
今後、ＢＮＣＴががん治療として確立されれば、他のがんに対しても行われる可能性は非常に高い。その中において、中性子源とならびホウ素化合物は治療効果を決める上で最も大事な要素である。つまり、ホウ素が細胞に取り込まれていない場合、中性子を照射しても影響は無いため、腫瘍に対して、特に腫瘍細胞の内部にホウ素を導入することは、治療の成果を上げるために最も大事なことである。
【０００４】
また、ＢＮＣＴでは、理論上、ホウ素化合物を選択的にがん細胞内部へ導入することができれば、周囲の正常組織に対しては影響を与えることなく、がん細胞のみを選択的に殺傷することができる。この際、細胞の外延や細胞膜近くにホウ素化合物が留まり、細胞内部へと充分に局在化できなければ、周りの正常組織・細胞にも影響を与えることになる。このため、ホウ素化合物を目的とする細胞内に局在させることも望まれている。
【０００５】
ここで、現在臨床研究で用いられている、ＢＳＨによるＢＮＣＴは、がん組織や悪性腫瘍組織などの腫瘍血管は脆弱な構造であるため、その部分においてホウ素製剤が正常部分と比較して多く漏出することを利用し、その漏出部分に対して中性子照射を行うことによりホウ素中性子補足反応を起こし癌や腫瘍を殺傷するものである。しかしながら、ＢＳＨには細胞膜透過能がないため、細胞と細胞の間の細胞組織間に局在してしまい、がん細胞などに対しての腫瘍殺傷効果が充分に高くないという問題がある。
【０００６】
また、前述のＢＰＡは、メラニンの生成のためにフェニルアラニンやチロシンが細胞中に強く取り込まれることを利用した黒色皮膚がん治療のための薬剤であり、水溶性の向上等の改良がなされている（特許文献１）。ＢＰＡは、分裂する細胞であれば、正常細胞でもがん細胞でも細胞内へと取り込まれるが、腫瘍細胞の方がアミノ酸の取り込みが盛んなため、正常細胞に比較して腫瘍細胞へたくさん取り込まれるという性質を利用している。この方法では、正常細胞にもホウ素製剤が取り込まれてしまうこと、およびがん細胞でも分裂していない細胞には取り込まれないことなどの問題がある。
【０００７】
標的細胞にターゲッティングする試みとしては、ホウ素化合物とホルモン類似体（リガンド）との複合体を用い、該ホルモンに対する細胞内受容体を有する細胞に特異的にターゲッティングする方法（特許文献２）や、腫瘍細胞特異的抗原に結合する抗体を含む結合対を投与し、任意にはその非腫瘍部分における結合対の相補的な構成物とホウ素原子を含む接合体を投与することからなる、腫瘍細胞にホウ素原子をターゲッティングする方法（特許文献３）が試みられている。
【０００８】
さらに、腫瘍細胞中のホウ素の濃度を正常な組織中の濃度に対して高めることを目的として、多孔性のシリコンにホウ素を組み込んだホウ素含有治療用組成物も開示されている（特許文献４）。
【０００９】
薬剤を特異的に体内に送達できるビヒクルとして、ヒアルロン酸および／またはポリエチレングリコールが結合したカチオン化ゼラチンとセンダイウイルス由来のベクターなどのウイルスエンベロープベクターを組み合わせたビヒクルを用いてホウ素含有化合物を封入して使用する方法も報告されている（特許文献５）。この方法では、実際にはほとんど細胞内へ導入されておらず、実用的なものではない。
【００１０】
このように、現在のところ細胞内においても細胞の中心部に存在する核に局在させることができるようなホウ素製剤は一切報告されていない。
【００１１】
一方、細胞膜を通過するシグナルペプチドとして、これまでＨＩＶ−１ Ｔａｔなどのアルギニンを多く含む塩基性ペプチドが知られている。また、アルギニンが複数個連続したアミノ酸配列を有するペプチドが生体膜透過シグナル配列として機能し、細胞膜透過性を有することが報告されている（特許文献６）。
【００１２】
しかしながら、これらのペプチドをホウ素化合物の細胞内への送達に使用するという試みはこれまで一切なされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】特開平８−３２５２７１号公報
【特許文献２】特表平１１−５０５５０４号公報
【特許文献３】特表２０００−５１６２１７号公報
【特許文献４】特表２００６−５１６５９９号公報
【特許文献５】特開２００８−３０８４４０号公報
【特許文献６】特開２００３−２５２８９８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の目的は、細胞膜を透過し細胞内、とりわけ核に局在する細胞膜透過型ホウ素製剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
ホウ素化合物ＢＳＨに細胞膜透過ペプチドと呼ばれるペプチドを用いて修飾を行ったところ、これまで細胞内への導入が困難であったホウ素化合物ＢＳＨを細胞内部に導入することが可能となり、さらには、時間経過によりホウ素化合物が、細胞の中心に局在する核へ集積することを見出し、本発明が完成された。
【００１６】
本発明は、細胞膜透過ペプチドおよびホウ素化合物を含む細胞膜透過型ホウ素ペプチドに関する。
【００１７】
本発明の細胞膜透過型ホウ素ペプチドにおいて、細胞膜透過ペプチドは、アルギニン３〜１３残基が連続したアミノ酸配列からなるペプチド、ＴＡＴ（配列番号１：ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ）、ＨＩＶ−１ Ｒｅｖ（３４−５０）（配列番号２：ＴＲＱＡＲＲＮＲＲＲＲＷＲＥＲＱＲ）、ＦＨＶ Ｃｏａｔ（３５−４９）（配列番号３：ＲＲＲＲＮＲＴＲＲＮＲＲＲＶＲ）、ＢＭＶ Ｇａｇ（７−２５）（配列番号４：ＫＭＴＲＡＱＲＲＡＡＡＲＲＮＲＷＴＡＲ）、ＨＴＬＶ−II Ｒｅｘ（４−１６）（配列番号５：ＴＲＲＱＲＴＲＲＡＲＲＮＲ）、ＣＣＭＶ Ｇａｇ（７−２５）（配列番号６：ＫＬＴＲＡＱＲＲＡＡＡＲＫＮＫＲＮＴＲ）、Ｐ２２ Ｎ（１４−３０）（配列番号７：ＮＡＫＴＲＲＨＥＲＲＲＫＬＡＩＥＲ）、λＮ（１−２２）（配列番号８：ＭＤＡＱＴＲＲＲＥＲＲＡＥＫＱＡＱＷＫＡＡＮ）、φ２１Ｎ（１２−２９）（配列番号９：ＴＡＫＴＲＹＫＡＲＲＡＥＬＩＡＥＲＲ）および酵母ＰＲＰ６（１２９−１４４）（配列番号１０：ＴＲＲＮＫＲＮＲＩＱＥＱＬＮＲＫ）からなる群より選択されることが好ましい。
【００１８】
本発明の細胞膜透過型ホウ素ペプチドにおいて、細胞膜透過ペプチドは、アルギニン９〜１３残基が連続したアミノ酸配列からなるペプチドであることが好ましい。
【００１９】
本発明の細胞膜透過型ホウ素ペプチドにおいて、ホウ素化合物が、アミノ酸と結合可能な官能基を有するホウ素クラスターであることが好ましい。
【００２０】
本発明の細胞膜透過型ホウ素ペプチドにおいて、ホウ素化合物は、メルカプトウンデカハイドロドデカボレートであることがさらに好ましい。
【００２１】
本発明の細胞膜透過型ホウ素ペプチドにおいては、細胞膜透過ペプチド１分子に対してメルカプトウンデカハイドロドデカボレート１〜８分子を含むことができる。
【００２２】
本発明の細胞膜透過型ホウ素ペプチドは、好ましくは核内に集積されることを特徴とする。
【００２３】
本発明の細胞膜透過型ホウ素ペプチドは、少なくとも１つの薬学的に許容され得る賦形剤と組み合わせてホウ素製剤とすることができる。
【発明の効果】
【００２４】
本発明の細胞膜透過型ホウ素ペプチドは、腫瘍組織内に選択的に取り込まれ、２４時間後にも安定に残留し、従来のホウ素製剤と比べて１５〜５０倍もの高濃度のホウ素を腫瘍細胞内に、さらには核内に蓄積させることができる。
【００２５】
また、本発明の細胞膜透過型ホウ素ペプチドは、たとえば、ペプチドとホウ素化合物との間のリンカーにリジンとシステインの組合せを利用することにより、１つの分子で複数個のホウ素化合物を運ぶことが可能であり、効率的にホウ素化合物を細胞の核内に局在させることができる。
【００２６】
本発明の細胞膜透過型ホウ素ペプチドを用いることにより、効率的にホウ素化合物を細胞内、とりわけ核内に集積することができ、実際に従来のホウ素製剤ＢＳＨと比較して、極めて高い腫瘍殺傷効果が得られる。
【００２７】
本発明の細胞膜透過型ホウ素ペプチドを用いることにより、ホウ素製剤が細胞膜周辺に留まる場合と比較して数十倍から数百倍の腫瘍殺傷効果をもたらすことが可能となる。また、さらに細胞の中心部に存在する核に局在させた場合には、さらに腫瘍殺傷効果を誘導することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１Ａ】実施例１（ＢＳＨ−１１Ｒ）および実施例５（ＢＳＨ−ＴＡＴ）を細胞内へ導入し、１２時間後に観察した、（ａ）ヘキストによる核染色、および（ｂ）ＢＳＨを示す共焦点レーザー顕微鏡写真データ（×４００）である。（ｃ）は（ａ）と（ｂ）を重ね合わせたものである。
【図１Ｂ】図１Ａの（ｃ）のスケッチである。ドットがＢＳＨを斜線部が核を示す。
【図２】誘導結合プラズマ発光分光分析データにより定量化した細胞内のホウ素濃度を示すグラフである。
【図３】実施例２（２ＢＳＨ−１１Ｒ）、実施例３（４ＢＳＨ−１１Ｒ）の腫瘍細胞内への導入１２時間後に観察した共焦点レーザー顕微鏡写真データである（×６００）。（ａ）はＢＳＨ、（ｂ）は（ａ）のＢＳＨにｆ−アクチンの染色を重ねたもの、（ｃ）は（ｂ）にヘキストによる核染色を重ねたものである。
【図４Ａ】実施例４（８ＢＳＨ−１１Ｒ）の腫瘍細胞内への導入を経時的に観察した共焦点レーザー顕微鏡写真データである（×６００）。（ａ）がＢＳＨ染色、ヘキストによる核染色およびアクチン染色を重ねたものであり、（ｂ）がＢＳＨのみのデータである。
【図４Ｂ】図４Ａの（ａ）中、アクチン染色部分の輪郭および核染色部分（斜線部）のスケッチである。
【図５】誘導結合プラズマ発光分光分析データにより定量化した細胞内のホウ素濃度を示すグラフである。
【図６】脳腫瘍モデルマウスに対して実施例４（８ＢＳＨ−１１Ｒ）をマウス尾静脈より投与した後の６時間および２４時間に観察した共焦点レーザー顕微鏡写真データである。（ａ）はヒトＧＦＡＰによる脳腫瘍染色とヘキストによる核染色、（ｂ）はＢＳＨ、（ｃ）は（ａ）と（ｂ）を重ねたものである。
【図７】脳腫瘍モデルマウスに対して実施例４（８ＢＳＨ−１１Ｒ）をマウス尾静脈より投与した後の６時間に観察した共焦点レーザー顕微鏡写真データである。（ａ）はヒトＧＦＡＰによる脳腫瘍染色とヘキストによる核染色、（ｂ）はＢＳＨ、（ｃ）は（ａ）と（ｂ）を重ねたものである。
【図８】ＷＳＲ−１アッセイによる細胞毒性評価を示すグラフである。
【図９】ホウ素化合物の細胞内分布による核へのエネルギー付与率を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明に使用する「細胞膜透過ペプチド」は、細胞膜を透過し細胞内へ内在化する能力を有するアルギニンに富むアミノ酸配列を有する塩基性ペプチドを意味する。このようなペプチドとしては、細胞膜透過能が知られている既知の塩基性ペプチド、たとえばＴＡＴ（配列番号１）、アルギニン３〜１３残基が連続したアミノ酸配列からなるペプチド、ＨＩＶ−１ Ｒｅｖ（３４−５０）（配列番号２）、ＦＨＶ Ｃｏａｔ（３５−４９）（配列番号３）、ＢＭＶ Ｇａｇ（７−２５）（配列番号４）、ＨＴＬＶ−II Ｒｅｘ（４−１６）（配列番号５）、ＣＣＭＶ Ｇａｇ（７−２５）（配列番号６）、Ｐ２２ Ｎ（１４−３０）（配列番号７）、λＮ（１−２２）（配列番号８）、φ２１Ｎ（１２−２９）（配列番号９）および酵母ＰＲＰ６（１２９−１４４）（配列番号１０）などが挙げられる。これらのペプチドには、もちろん各起源のタンパク質の対応する配列のアミノ酸を１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個伸長したものや、アルギニンやリジンを１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個加えたものも同様に使用することができる。
【００３０】
これらのなかでも、細胞膜透過能の点からＴＡＴ（配列番号１）、アルギニン３〜１３残基が連続したアミノ酸配列からなるペプチド、ＨＩＶ−１ Ｒｅｖ（３４−５０）（配列番号２）、ＦＨＶ Ｃｏａｔ（３５−４９）（配列番号３）、ＢＭＶ Ｇａｇ（７−２５）（配列番号４）、ＨＴＬＶ−II Ｒｅｘ（４−１６）（配列番号５）、ＣＣＭＶ Ｇａｇ（７−２５）（配列番号６）またはＰ２２ Ｎ（１４−３０）（配列番号７）が好ましく、ＴＡＴ（配列番号１）、アルギニン３〜１３残基が連続したアミノ酸配列からなるペプチド、ＨＩＶ−１ Ｒｅｖ（３４−５０）（配列番号２）、ＦＨＶ Ｃｏａｔ（３５−４９）（配列番号３）、ＢＭＶ Ｇａｇ（７−２５）（配列番号４）またはＨＴＬＶ−II Ｒｅｘ（４−１６）（配列番号５）がより好ましい。また、ＴＡＴ（配列番号１）またはアルギニン３〜１３残基が連続したアミノ酸配列からなるペプチドがより効果的に使用でき、核への局在化に優れていることが確認された点からアルギニン３〜１３残基が連続したアミノ酸配列からなるペプチドが最も好ましい。
【００３１】
このアルギニン３〜１３残基が連続したアミノ酸配列からなるペプチドにおいては、連続するアルギニンの残基数が９〜１３が好ましく、１１が最も好ましい。アルギニン残基が２以下または１４以上であると、薬物の導入効率が悪くなる傾向がある。アルギニン３〜１３残基が連続したアミノ酸配列からなるペプチドは、細胞増殖に影響を及ぼすことなく、また細胞障害性も示さないため、安全な薬剤である。
【００３２】
本発明に使用する「ホウ素化合物」としては、従来から粒子線治療に用いられている種々の物を使用することができる。
【００３３】
たとえば、ペプチドと結合させることができる官能基、チオール基、水酸基、カルボキシル基、アミノ基、アミド基、アジド基、ハロゲン基（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉなど）、リン酸基などを有するホウ素含有化合物であれば、本発明の「ホウ素化合物」として使用することができる。そのなかでも、ホウ素原子を一分子に多く含むことからクラスター分子であることが好ましい。具体的なホウ素化合物としては、ＢＰＡ、ＢＳＨなどが挙げられる。
【００３４】
本発明の「細胞膜透過型ホウ素ペプチド」は、前述のホウ素化合物に細胞膜透過ペプチドを付加することにより製造することができる。ここで、本明細書において「付加する」との記載は、ホウ素化合物と細胞膜透過ペプチドとを、共有結合、ペプチド−ペプチドによる疎水性相互作用、イオン性相互作用（イオン結合）、水素結合等により結合させることを意味する。結合の方法は、特に限定されるものではないが、ホウ素化合物および細胞膜透過ペプチドそれぞれの活性を損なわない限り、たとえば、システインなどのアミノ酸や他の化合物を介して行なうことができ、細胞膜透過ペプチドとホウ素化合物の間には、たとえば１〜２０個、または１〜１０個、または１〜３個のアミノ酸残基が挿入されていてもよい。システインを利用する場合には、たとえば反応性のニトロピリジンスルフェニル（ＮＰＹＳ）基などを用いて様々なホウ素化合物を容易にＳ−Ｓ結合により連結することができる。
【００３５】
さらに、ホウ素化合物を結合させるためのシステインと細胞膜透過ペプチドとの間に、リジンなどを介在させることにより、１つのペプチド分子に複数個、たとえば２〜８個のホウ素化合物を結合させることができる。
【００３６】
細胞膜透過ペプチドは、通常の人工合成法、たとえばペプチドの固相合成法などによって、または一般に市販されている人工合成機を用いて、当業者により容易に製造することができる。
【００３７】
たとえば、ペプチド合成において使用する保護ペプチド樹脂担体としては、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂などが挙げられる。
【００３８】
ペプチドの固相合成法において、アミノ酸は、保護基によって分子内のアミノ基を予め保護して用いられる。保護基としては、たとえば、９−フルオレニル−メトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）基などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。なお、アミノ酸は、必要に応じて、側鎖の官能基を当該官能基に応じた保護基により保護して用いることができる。なお、本明細書において、アミノ基や側鎖の官能が保護されているアミノ酸を「保護アミノ酸」という。
【００３９】
縮合には、一般的なペプチド合成に用いられる活性化試薬などが用いられる。縮合の際の反応温度は、ペプチドの合成において一般的な温度であればよい。通常、反応温度は、約−２０℃〜５０℃の範囲から適宜選択される。所望の細胞膜透過ペプチド配列に相当する配列からなるペプチドを合成した後、ホウ素化合物との結合に使用するための官能基を有するアミノ酸、たとえばシステインを縮合させ、ホウ素化合物との結合に使用する官能基を導入することができる。
【００４０】
得られた生成物がその分子内に保護基を有する場合、常法にしたがって、たとえば酸処理、アルカリ処理、触媒の存在下での水素気流中での接触還元などにより行なうことができる。なお、保護基の導入と脱保護に関しては、例えば、グリーンズ・プロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシス第４版〔ペーターＧ．Ｍ．ワッツ（Peter G. M. Wuts）およびテオドラ．Ｗ．グリーン（Theodora W. Greene）, Greene's Protective Groups in Organic Synthesis, 2006〕に記載の方法にしたがって行なうこともできる。
【００４１】
化合物の製造後、必要に応じて、得られた生成物の単離や精製を行なってもよい。生成物の単離や精製は、例えば、逆相高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーによって行なうことができる。
【００４２】
つぎに、得られた官能基を導入した細胞膜透過ペプチドにホウ素化合物を導入し、精製し、目的の細胞膜透過型ホウ素ペプチドを得ることができる。
【００４３】
たとえば、ホウ素化合物がＢＳＨの場合、ペプチドの固相合成によりアミノ酸を１残基ずつカルボキシル末端側から結合させ、所望の細胞膜透過型ペプチド配列を得た後、必要に応じて、リジン残基を導入し、ニトロピリジンスルフェニル（ＮＰＹＳ）基などの反応性の側鎖を有するシステイン残基を対応残基数導入する。その後定法にて脱保護および精製したのち純水、または適当な緩衝液または有機溶媒に溶解し、ＢＳＨと反応させ、ＨＰＬＣなどで反応を追跡し、原料ペプチドの消失を確認したのち、分取用ＨＰＬＣにて目的とする細胞膜透過型ＢＳＨペプチドを得ることができる。
【００４４】
また、本発明の細胞膜透過型ホウ素ペプチドには、有効成分であるホウ素化合物以外に、研究モデルに使用する場合など、細胞内、さらには核内に導入されたことを確認するためのマーカーを含有しても良い。マーカーは、特に限定されるものではなく、たとえば、フルオレセインイソチオシアネート（以下、ＦＩＴＣと略称する）、ローダミンなどの蛍光色素、およびＧＦＰなどの蛍光タンパク質を使用することができる。
【００４５】
さらに、本発明細胞膜透過型ホウ素ペプチドには、有効成分であるホウ素化合物以外に、腫瘍に対する選択性を高めるために、いわゆる腫瘍マーカーを含有させることができる。このような腫瘍マーカーとしては、特に限定されるものではなく、たとえば腫瘍に多く発現しているＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体）やＣＤ１３３（癌幹細胞マーカー）などといった、癌表面に特異的に多く発現しているマーカーに対して結合するペプチド等のリガンドを使用することができる。
【００４６】
本発明の細胞膜透過型ホウ素ペプチドは、適当な薬学的に許容され得る賦形剤、担体、溶媒、ゲル形成剤、酸化防止剤、希釈剤、等張化剤、ｐＨ安定化剤など、本技術分野において通常用いられている添加剤を配合し、ホウ素製剤とすることができる。これらの添加剤は、通常当業者により適宜選択される。このようなホウ素製剤は、溶液、懸濁液、注射剤、カプセル、ゲル、軟膏、クリーム、エマルジョンなど、種々の剤形に調製することができる。つまり、生理食塩水、等張液や一般臨床で用いられる注射液用の添加剤と共に注射剤とすること、カプセル化しての内服薬やゲル化剤や皮膚科薬剤と混ぜて経皮的導入薬剤などとすることも可能である。
【００４７】
本発明の細胞膜透過型ホウ素ペプチドは、経静脈的、経動脈的に投与されることが一般的である。その他、内服薬による投与、筋肉注射による投与、経皮的投与なども有効に使用することができる。
【００４８】
本発明の細胞膜透過型ホウ素ペプチドは、治療に有効な量腫瘍細胞内に蓄積できる濃度および量で投与される。腫瘍組織部において最終的に２５ｐｐｍ以上のホウ素濃度となるように投与することが好ましい。そのような投与量としては、ＢＳＨ８分子を付加した細胞膜透過ペプチドの場合、０．０５〜１ｇ／ｋｇを投与することが好ましい。
【００４９】
以下、実施例によって、本発明の細胞膜透過型ホウ素ペプチドをさらに詳細に説明するが、本発明はその趣旨と適用範囲から逸脱しない限りこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００５０】
実施例１〜４：ＢＳＨ−細胞膜透過ペプチドの製造
（Ａ）保護ペプチド樹脂の構築
ペプチド自動合成機（４３３Ａ、アプライドバイオシステム（Applied Biosystems）社製）を用いて添付のソフトにしたがい、固相合成法により１個ずつアミノ酸をカルボキシル末端側から結合させＢｏｃ−Ｃｙｓ（Ｎｐｙｓ）−［Ａｒｇ（Ｐｂｆ）］11−樹脂の合成を定法にて行なった。
【００５１】
Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡ Ｒｅｓｉｎ（０．３４ｍｍｏｌ／ｇ、０．２５ｍｍｏｌ）を出発樹脂担体として使用し、通常の９−フルオレニル−メトキシカルボニル（以下、Ｆｍｏｃ−と略称する）ペプチド合成法に使われる各Ｆｍｏｃ−アミノ酸誘導体を原料として、配列にしたがって逐次ペプチド鎖の延長を行った。Ｆｍｏｃ−アミノ酸誘導体を上記ペプチド合成機の反応容器にセットし、合成機に添付されているソフトウェアにしたがって、活性化剤として、１−［ビスジメチルアミノメチレン］−１Ｈ−ベンゾトリアゾリウム−３−オキシド−ヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）とＮ−メチルピロリドンに溶解して反応槽に加えて縮合反応させた。得られた樹脂をピペリジン含有Ｎ−メチルピロリドン中で緩やかに攪拌してＦｍｏｃ基を除いて次のアミノ酸誘導体の縮合に進めた。
【００５２】
使用したＦｍｏｃアミノ酸誘導体は、側鎖に官能基のあるＦｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（Ｎｐｙｓ）を用いた。
【００５３】
配列にしたがって、逐次Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）を延長して最終Ａｒｇ（Ｐｂｆ）残基の縮合後、最後にＢｏｃ−Ｃｙｓ（Ｎｐｙｓ）を水溶性カルボジイミドを用いて縮合し、相当するＢｏｃ−Ｃｙｓ（Ｎｐｙｓ）−［Ａｒｇ（Ｐｂｆ）］11−Ｒｉｎｋ  Ａｍｉｄｅ  ＭＢＨＡ保護ペプチド樹脂を得た。引き続き脱保護、精製処理を行った。
【００５４】
（Ｂ）脱保護と樹脂からの切り出し
得られた保護ペプチド樹脂をトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を用いる定法のＴＦＡ／トリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）／Ｈ2Ｏ（９５／２．５／２．５、ｖ／ｖ）脱保護条件で、室温にて２時間処理し、Ｎｙｐｓ以外の脱保護と樹脂からのペプチドの切り離しを同時におこなった。反応液から担体樹脂をろ別した後、ＴＦＡを留去した。残渣にエーテルを加えて得られるＣｙｓ（Ｎｐｙｓ）−Ａｒｇ11−ＮＨ2粗生成物の沈殿をろ取し、ＨＰＬＣおよび質量分析にて生成を確認したのち、つぎのＢＳＨとのジスルフィド形成反応に供した。
【００５５】
（Ｃ）Ｃｙｓ（ＢＳＨ）−Ａｒｇ11−ＮＨ2（ＢＳＨ−１１Ｒ）の合成
（Ｂ）で得られた、Ｃｙｓ（Ｎｐｙｓ）−［Ａｒｇ］11−ＮＨ2（７７．９ｍｇ）を純水（２４ｍｌ）に溶解し、ＢＳＨ（Ｎａ2Ｂ12Ｈ11ＳＨ；４．２ｍｇ、０．８３当量／ＮＨ2）をアルゴン気流中で室温にて攪拌しながら添加した。一昼夜反応後、反応溶液を直接分取精製に供した。
【００５６】
得られた粗生成物をＨＰＬＣ分取装置（ＬＣ−８Ａ−１、島津製作所製、カラム：ＯＤＳ３０×２５０ｍｍ）を用いて０．１％トリフルオロ酢酸を含む水−アセトニトリルの系で分取精製し、目的のペプチド誘導体の分画を得、アセトニトリルを留去した後、凍結乾燥粉末とし、目的物であるＢＳＨのペプチド誘導体（ＢＳＨ−１１Ｒと略称する）５６ｍｇをトリフルオロ酢酸塩として得た（純度９２．８％）。構造は質量分析にて確認した。
Ｃｙｓ（ＢＳＨ）−Ａｒｇ11−ＮＨ2
分子量：２００１．３７  Ｃ69Ｈ152Ｂ12Ｎ46Ｏ12Ｓ2
ＭＳ：m/z 668.4([M+3H]3+ 668.13), m/z 706.5([M+TFA+3H]3+ 706.14), m/z 782.3([M+3TFA+3H]3+ 782.16)
【００５７】
（Ｄ）［Ｃｙｓ（ＢＳＨ）］8−Ｌｙｓ7−Ａｒｇ11−ＮＨ2（８ＢＳＨ−１１Ｒ）の合成
枝分かれしたＢｏｃ−［Ｃｙｓ（Ｎｐｙｓ）］ｍ−（Ｌｙｓ）ｎ−Ａｒｇ11（表１）保護ペプチド樹脂の構築は、前記（Ａ）のＡｒｇ11保護ペプチドの構築後、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）を適宜順次繰り返し縮合させ、さらにＢｏｃ−Ｃｙｓ（Ｎｐｙｓ）を定法に従って縮合させることにより表１に示すような枝分かれ構造を有するペプチドの合成を行った。
【００５８】
【表１】
0006009154.tif 000002
【００５９】
上記（ｂ）と同様に脱保護と樹脂からの切り出しを行ない、［Ｃｙｓ（Ｎｐｙｓ）］8−Ｌｙｓ7−Ａｒｇ11−ＮＨ2を得た。
【００６０】
得られた［Ｃｙｓ（Ｎｐｙｓ）］8−Ｌｙｓ7−Ａｒｇ11−ＮＨ2（６１．８ｍｇ）を純水（３ｍｌ）、ＭｅＯＨ（１．５ｍｌ）に溶解し、ＢＳＨ（１９．８ｍｇ、０．９当量／ＮＨ2）をアルゴン気流中で室温にて攪拌しながら加えて反応させた。５．５時間の反応後、反応溶液を直接、分取精製に供した。
【００６１】
上記（ｂ）と同様に分取精製し、目的物であるＢＳＨのペプチド誘導体（８ＢＳＨ−１１Ｒと略称する）１５．８ｍｇをトリフルオロ酢酸塩として得た（純度９７．８％）。構造は質量分析にて確認した。
［Ｃｙｓ（ＢＳＨ）］8−Ｌｙｓ7−Ａｒｇ11−ＮＨ2
分子量：４７７１．９５  Ｃ132Ｈ355Ｂ96Ｎ67Ｏ26Ｓ16
ＭＳ：m/z 1591.8([M+3H]3+ 1591.7), m/z 398.9([M+12H]12+ 398.7), m/z 486.9([M+5TFA+11H]11+ 486.7), m/z 648.8([M+15TFA+10H]10+ 649.3)
【００６２】
（Ｅ）［Ｃｙｓ（ＢＳＨ）］2−Ｌｙｓ−Ａｒｇ11−ＮＨ2（２ＢＳＨ−１１Ｒ）の合成
縮合させるリジンを１つとし、Ｎｐｙｓ−Ｃｙｓを２つ付けた保護ペプチドを製造、使用した以外は前記（Ｄ）と同様にして合成、精製し目的物であるＢＳＨのペプチド誘導体（２ＢＳＨ−１１Ｒ）を得た（純度９４．５％）。
［Ｃｙｓ（ＢＳＨ）］2−Ｌｙｓ−Ａｒｇ11−ＮＨ2
分子量：２３９４．１  Ｃ78Ｈ177Ｂ24Ｎ49Ｏ14Ｓ4
ＭＳ：m/z 398.9([M+12H]12+ 398.7)
【００６３】
（Ｆ）［Ｃｙｓ（ＢＳＨ）］4−Ｌｙｓ3−Ａｒｇ11−ＮＨ2（４ＢＳＨ−１１Ｒ）の合成
縮合させるリジンを２つとし、Ｎｐｙｓ−Ｃｙｓを４つ付けた保護ペプチドを製造、使用した以外は前記（Ｄ）と同様にして合成、精製し目的物であるＢＳＨのペプチド誘導体（２ＢＳＨ−１１Ｒ）を得た（純度９２．８％）。
［Ｃｙｓ（ＢＳＨ）］4−Ｌｙｓ3−Ａｒｇ11−ＮＨ2
分子量：３１８１．４  Ｃ98Ｈ231Ｂ48Ｎ55Ｏ18Ｓ8
ＭＳ：m/z 399.4([M+8H]8+ 398.7), m/z 376.2([M+5TFA+10H]10+ 376.1)
【００６４】
実施例５：Ｃｙｓ（ＢＨＳ）−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＮＨ2（ＢＳＨ−ＴＡＴ）の製造
（Ａ）保護ペプチド樹脂の構築
ペプチド自動合成機（４３３Ａ、アプライドバイオシステム（Applied Biosystems）社製）を用いて添付のソフトにしたがい、固相合成法により１個ずつアミノ酸をカルボキシル末端側から結合させ保護ペプチド樹脂の合成を定法にて行なった。
【００６５】
Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡ Ｒｅｓｉｎ（０．３６ｍｍｏｌ／ｇ、０．２５ｍｍｏｌ）を出発樹脂担体として使用し、通常Ｆｍｏｃ−ペプチド合成法に使われる各Ｆｍｏｃ−アミノ酸誘導体を原料として、配列にしたがって逐次ペプチド鎖の延長を行った。Ｆｍｏｃ−アミノ酸誘導体を上記ペプチド合成機の反応容器にセットし、合成機に添付されているソフトウェアにしたがって、活性化剤として、ＨＢＴＵ、ＨＯＢｔとＮ−メチルピロリドンに溶解して反応槽に加えて縮合反応させた。得られた樹脂をピペリジン含有Ｎ−メチルピロリドン中で緩やかに攪拌してＦｍｏｃ基を除いて次のアミノ酸誘導体の縮合に進めた。
【００６６】
使用したＦｍｏｃアミノ酸誘導体は、側鎖に官能基のあるＦｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ＯＢｕｔ）、Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（Ｎｐｙｓ）を用いた。
【００６７】
配列にしたがって、逐次Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）から延長して最終Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（Ｎｐｙｓ）を水溶性カルボジイミドを用いて縮合し、相当するＢｏｃ−Ｃｙｓ（Ｎｐｙｓ）−Ｔｙｒ（ＯＢｕｔ）−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡ保護ペプチド樹脂を得た。引き続き脱保護、精製処理を行った。
【００６８】
（Ｂ）脱保護と樹脂からの切り出し
前記実施例１〜４の（Ｂ）と同様の方法により脱保護と樹脂からの切り出しを行なった。
【００６９】
（Ｃ）Ｃｙｓ（ＢＳＨ）−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＮＨ2（ＢＳＨ−ＴＡＴ）の合成
（Ｂ）で得られた、Ｃｙｓ（Ｎｐｙｓ）−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＮＨ2（８０ｍｇ）と、純水（４ｍｌ）、ＢＳＨ／２Ｎａ（８．３ｍｇ、０．９当量）を使用した以外は、実施例１〜４の（Ｃ）と同様の方法により、目的物であるＢＳＨのＴＡＴペプチド誘導体（ＢＳＨ−ＴＡＴと略称する）７０ｍｇをトリフルオロ酢酸塩として得た（純度９９．９％）。構造は質量分析にて確認した。
Ｃｙｓ（ＢＳＨ）−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＮＨ2
分子量：１８２６．３  Ｃ67Ｈ136Ｂ12Ｎ34Ｏ12Ｓ2
ＭＳ：m/z 610.0([M+3H]3+ 609.8), m/z 457.9([M+4H]4+ 4457.6), m/z 648.0([M+TFA+3H]3+ 647.8)
【００７０】
比較例１：Ｃｙｓ（ＢＳＨ）−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ（ＢＳＨ−ＮＬＳ）の製造
（Ａ）保護ペプチド樹脂の構築
ペプチド自動合成機（４３３Ａ、アプライドバイオシステム（Applied Biosystems）社製）を用いて添付のソフトにしたがい、固相合成法により１個ずつアミノ酸をカルボキシル末端側から結合させ保護ペプチド樹脂の合成を定法にて行なった。
【００７１】
Ｂｏｃ−Ｖａｌ−ＰＡＭ Ｒｅｓｉｎ（０．５ｍｍｏｌ／ｇ、０．５ｍｍｏｌ）を出発樹脂担体として使用し、通常ｔ−ブトキシカルボニル（以下Ｂｏｃ−）ペプチド合成法に使われる各Ｂｏｃ−アミノ酸誘導体を原料として、配列にしたがって逐次ペプチド鎖の延長を行った。Ｂｏｃ−アミノ酸誘導体を上記ペプチド合成機の反応容器にセットし、合成機に添付されているソフトウェアにしたがって、活性化剤として、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ＨＯＢｔとＮ−メチルピロリドンに溶解して反応槽に加えて縮合反応させた。得られた樹脂をプログラムにしたがってトリフルオロ酢酸処理によりＢｏｃ基を除いて次のアミノ酸誘導体の縮合に進めた。
【００７２】
使用したＢｏｃアミノ酸誘導体は、側鎖に官能基のあるＢｏｃ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）、Ｂｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｃｌ−Ｚ）、Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（Ｎｐｙｓ）を用いた。
【００７３】
配列にしたがって、逐次Ｂｏｃ−Ｖａｌ樹脂から延長して最終Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（Ｎｐｙｓ）まで縮合し、相当するＢｏｃ−Ｃｙｓ（Ｎｐｙｓ）−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ（Ｃｌ−Ｚ）−Ｌｙｓ（Ｃｌ−Ｚ）−Ｌｙｓ（Ｃｌ−Ｚ）−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｌｙｓ（Ｃｌ−Ｚ）−Ｖａｌ−保護ペプチド樹脂を得た。引き続き脱保護、精製処理を行った。
【００７４】
（Ｂ）脱保護と樹脂からの切り出し
得られた保護ペプチド樹脂を無水フッ化水素を用いる定法のＨＦ−ｐＣｒｅｓｏｌｅ（８：２、ｖ／ｖ）脱保護条件で、−２〜−５℃で１時間処理し、Ｎｙｐｓ以外の脱保護と樹脂からのペプチドの切り離しを同時におこなった。反応液から担体樹脂をろ別した後、ＨＦを留去した。残渣にエーテルを加えて得られるＣｙｓ（Ｎｐｙｓ）−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−ＮＨ2粗生成物の沈殿をろ取し、ＨＰＬＣおよび質量分析にて生成を確認したのち、つぎのＢＳＨとのジスルフィド形成反応に供した。
【００７５】
（Ｃ）Ｃｙｓ（ＢＳＨ）−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ（ＢＳＨ−ＮＬＳ）の合成
（Ｂ）で得られた、Ｃｙｓ（Ｎｐｙｓ）−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ（１１４ｍｇ）を純水（４ｍｌ）に溶解し、ＢＳＨ／２Ｎａ（１５ｍｇ、０．９当量）をアルゴン気流中で室温にて攪拌しながら加え反応させた。一昼夜反応後、反応溶液を直接分取精製に供した。
【００７６】
得られた粗生成物をＨＰＬＣ分取装置（ＬＣ−８Ａ−１、島津製作所製、カラム：ＯＤＳ３０×２５０ｍｍ）を用いて０．１％トリフルオロ酢酸を含む水−アセトニトリルの系で分取精製し、目的のペプチド誘導体の分画を得、アセトニトリルを留去した後、凍結乾燥粉末とし、目的物であるＢＳＨのＮＬＳペプチド誘導体（ＢＳＨ−ＮＬＳと略称する）２３ｍｇ（１０％）をトリフルオロ酢酸塩として得た（純度９９．９％）。構造は質量分析にて確認した。
Ｃｙｓ（ＢＳＨ）−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−ＮＨ2
分子量：１１４８．６  Ｃ43Ｈ93Ｂ12Ｎ15Ｏ9Ｓ2
ＭＳ：m/z 576.1([M+2H]2+ 575.3)
【００７７】
試験例１：細胞内へのＢＳＨ導入
６０ｍｍディッシュにて培養したヒト神経膠芽腫細胞株（Ｕ８７ delta ＥＧＦＲ）１×１０6個細胞に対して終濃度がそれぞれ０．０１、０．１、１および１０μＭとなるように、ＢＳＨ、実施例１（ＢＳＨ−１１Ｒ）、実施例５（ＢＳＨ−ＴＡＴ）および比較例１（ＢＳＨ−ＮＬＳ：陰性対照）のホウ素ペプチド（各群ｎ＝６）をそれぞれ培養上清中に添加し、３７度、恒温槽で培養した。添加後１２時間に免疫染色を行なった。同時に核染色も行い、さらに導入されたＢＳＨを抗マウスＢＳＨ抗体にて染色し、共焦点レーザー顕微鏡にて観察した。
【００７８】
濃度１μＭでの結果を図１Ａに示す。（ａ）はヘキストによる核１の染色（青）、（ｂ）はホウ素化合物２の染色（赤）のグレースケールデータである。（ａ）と（ｂ）を（ｃ）の重ね合わせ図と見比べ、さらに図１Ｂを参照すると分かるように、実施例１および５のホウ素ペプチドの多くは細胞内へと導入された。細胞内導入能をもたないＮＬＳを付けた比較例１のホウ素ペプチドは、細胞内に導入されなかった。これにより実施例１および５の本発明の細胞膜透過型ホウ素ペプチドは、細胞内にＢＳＨを局在化できることが証明された。つまり、従来のＢＳＨとは異なり、細胞内でホウ素中性子捕捉反応を呈し、非常に高い抗腫瘍効果をもたらすことが期待できる。
【００７９】
また、各群における添加後１２時間での細胞内に導入されたホウ素濃度を、ＩＣＰ−ＡＥＳ（誘導結合プラズマ発光分光分析装置）にて測定した。
結果を図２に示す。ＢＳＨのみおよび比較例１（ＢＳＨ−ＮＬＳ）では、細胞膜に接着しているホウ素を検出していると考えられる。したがって、ＢＳＨのみ、比較例１（ＢＳＨ−ＮＬＳ）では、濃度を上げても、１０〜２０ｎｇ10Ｂ／１０6cellsにとどまっていたが、細胞膜透過作用を有する１１ＲおよびＴＡＴを付けた群、すなわち実施例１および実施例５においては、１０μＭで適用した場合、細胞内ホウ素濃度は、１５０〜２２０ｎｇ10Ｂ／１０6cellsという値になった。
【００８０】
以上より、実施例１（ＢＳＨ−１１Ｒ）および実施例５（ＢＳＨ−ＴＡＴ）は、通常のＢＳＨと比較して１０倍以上の細胞内導入量を示し（図２）、導入されたＢＳＨはすべて細胞内に局在していた（図１Ａおよび図１Ｂ）。
【００８１】
試験例２：ペプチド１分子中のＢＳＨの分子数の影響
実施例２〜４（２ＢＳＨ−１１Ｒ、４ＢＳＨ−１１Ｒ、８ＢＳＨ−１１Ｒ）のホウ素ペプチドを、６０ｍｍディッシュにて培養したヒト神経膠芽腫細胞株（Ｕ８７ delta ＥＧＦＲ）１×１０6個細胞に対して終濃度が０．１、１、１０μＭとなるように投与した。添加後１２時間で共焦点レーザー顕微鏡にて観察した（図３（濃度１μＭ群））。実施例４については、添加後、０．５、３、６および２４時間と経時的に観察した（図４Ａ（濃度１μＭ群））。
【００８２】
図３において、（ａ）はＢＳＨ２（緑）、（ｂ）は（ａ）のＢＳＨ（緑）にｆ−アクチン３（赤）の染色を重ねたもの、（ｃ）は（ｂ）にヘキストによる核１の染色（青）を重ねたもののグレースケールデータである。図３の（ａ）と（ｂ）および（ｃ）を見比べることにより、実施例２および３では、添加後１２時間でいずれも細胞内へと導入され核へと強く局在していたことがわかる。また、図４Ａにおいて、（ａ）がＢＳＨ２染色（緑）、ヘキストによる核１染色（青）およびアクチン３染色（赤）を重ねたもののグレースケールデータであり、（ｂ）がＢＳＨ２染色（緑）のみのグレースケールデータである。図４Ａの（ａ）のアクチンによる細胞輪郭と核を示すスケッチを示す図４Ｂを参考に（ａ）および（ｂ）を見比べると、添加の０．５時間後には細胞質へと導入され、この時点では核へはあまり導入されていないが、その後、３時間後には核へと局在化したことがわかる。つまり、導入されたＢＳＨは、経時的に細胞質より核へと局在していき、最終的には多くのＢＳＨが核へと局在している。
【００８３】
試験例１と同様に、濃度１０μＭで適用した場合の細胞内のホウ素濃度を比較すると、細胞外膜へ接着しているＢＳＨは、１０〜２０ｎｇ10Ｂ／１０6cells、実施例２（２ＢＳＨ−１１Ｒ）は２５０〜３５０ｎｇ10Ｂ／１０6cells、実施例３（４ＢＳＨ−１１Ｒ）は５００〜６００ｎｇ10Ｂ／１０6cells、実施例４（８ＢＳＨ−１１Ｒ）は５０００ｎｇ10Ｂ／１０6cellsと高度の集積を認めた（図５）。
【００８４】
試験例３：
ヌードマウス（雌性、８〜１０週齢、清水実験材料）に対してヒト神経膠芽腫細胞株Ｕ８７デルタＥＧＦＲを３×１０5個、ブレグマより外側２ｍｍ、前方１ｍｍ、深さ３ｍｍの位置に定位的に細胞移植し、１４日後にマウス尾静脈より８ＢＳＨ−１１Ｒ（３．５ｍｇの８ＢＳＨ−１１Ｒを含むＰＢＳ２００μＬ）を投与し、６時間後および２４時間後に脳組織を摘出し、免疫染色を行い８ＢＳＨ−１１Ｒの局在をみたところ、腫瘍組織および腫瘍細胞への特異的な集積を認めた（図６）。図６において、（ａ）はヒトＧＦＡＰによる脳腫瘍染色（赤）とヘキストによる核染色（青）、（ｂ）はＢＳＨ（緑）、（ｃ）は（ａ）と（ｂ）を重ねたものであり、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を見比べると、投与後６時間で腫瘍組織へと集積していたホウ素化合物ＢＳＨは、２４時間経過しても、腫瘍組織および腫瘍細胞内に留まっていた。
【００８５】
８ＢＳＨ−１１Ｒ投与６時間後の免疫染色した腫瘍中心部、腫瘍周縁部および正常部を比較した共焦点レーザー顕微鏡写真データを図７に示す。図７（ａ）がヒトＧＦＡＰによる脳腫瘍染色（赤）とヘキストによる核染色（青）、（ｂ）はＢＳＨ（緑）、（ｃ）は（ａ）と（ｂ）を重ねたものである。（ｂ）において、明るく見えるところがＢＳＨの導入された部分であり、（ａ）と見比べ（ｃ）を参照すると、腫瘍中心部においてＢＳＨが細胞質に多く局在し、腫瘍周縁部では核へと局在していることが良く観察される。正常部においては、ＢＳＨはほとんど存在せず、腫瘍組織特異的に送達されたことが確認される。
【００８６】
試験例４：細胞毒性評価
コンフルエント状態まで培養したヒト神経膠芽腫細胞株（Ｕ８７ delta ＥＧＦＲ）を回収し、９６ウェルプレートに１０００細胞／ウェルで撒いた。翌日、ホウ素製剤を終濃度１０μＭ、１００μＭになるようにそれぞれに加えた。投与後、１、２、３、４日後に各プレートに対して、Cell Proliferation Reagent (WST-1)（ロッシュ社）を１０μｌ／ウェルで加えた。３７℃で１時間インキュベートしたのち、MICROPLATE READER（MTP-300、コロナ電気）で各サンプルの吸光度（４５０ｎｍおよび６９０ｎｍ）を測定した。
【００８７】
結果を図８に示す。比較例１、実施例１および実施例５のいずれのホウ素製剤にも、細胞に対する明らかな毒性は認められない。
【００８８】
参考例１：細胞内局在による細胞の核へのエネルギー付与率の違い
細胞内でのホウ素分布が、核へのエネルギー付与率にどのような影響を与えるかを、シミュレーションにより解析した。
【００８９】
シミュレーションの条件は、つぎのとおりである。
（１）核内に対するホウ素１０と中性子との反応による直接エネルギー付与のみを考える。
（２）細胞は半径５μｍの球と仮定する。
（３）核も球とし、その中心は細胞の中心と一致すると仮定する。
（４）細胞膜、核膜の実効厚さ（ホウ素が分布する厚さ）は、０．１μｍと仮定する。
（５）熱中性子フルエンスを１．００Ｅ＋１３（ｃｍ-2）、平均ホウ素濃度を１（ｐｐｍ）とする。このとき、平均吸収線量は０７４３（Ｇｙ）となる。
（６）核膜については、半径２μｍ、２．５μｍ、３μｍの３通りについてシミュレーションを行なった。
【００９０】
結果は、細胞全体に均一にＢ１０が分布している場合、細胞核でのエネルギー付与は、細胞全体のエネルギー付与の５．４％（核半径２μｍ）、１０．９（核半径２．５μｍ）、１９．４％（核半径３μｍ）となり、核の体積に応じたものである。一方、核内や核膜に分布している場合、細胞全体でみれば同じ線量でも核でのエネルギー付与は均一に分布している場合に比べて非常に大きいことが分かる。均一分布の場合の核へのエネルギー付与を１００％とした場合の各分布条件での核へのエネルギー付与率を図９に示す。このグラフにおいて、たとえば、核半径２μｍの場合、細胞膜のみに分布する群を１とすると、核のみに分布する群は、５７．６倍の核へのエネルギー付与が起こり、核へのダメージも同様に５７．６倍となる（図９）。
【符号の説明】
【００９１】
１  核
２  ＢＳＨ
３  アクチン
【配列表フリーテキスト】
【００９２】
配列番号１１：ランダムなアミノ酸配列を有するＮＬＳペプチド
【図１Ｂ】
0006009154.tif 000003
【図２】
0006009154.tif 000004
【図４Ｂ】
0006009154.tif 000005
【図５】
0006009154.tif 000006
【図８】
0006009154.tif 000007
【図９】
0006009154.tif 000008
【図１Ａ】
0006009154.tif 000009
【図３】
0006009154.tif 000010
【図４Ａ】
0006009154.tif 000011
【図６】
0006009154.tif 000012
【図７】
0006009154.tif 000013
【配列表】
0006009154000001.app