(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ２自己ペプチドに特異的に結合する単離された抗炎症抗体であって、
ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−９３９２を有するハイブリドーマによって生成される抗体またはＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−９３９３を有するハイブリドーマによって生成される抗体の、重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびに軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む、単離された抗炎症抗体。
【請求項２】
ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−９３９２を有するハイブリドーマによって生成される抗体の、重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびに軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む、請求項１に記載の単離された抗体。
【請求項３】
ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−９３９３を有するハイブリドーマによって生成される抗体の、重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびに軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む、請求項１に記載の単離された抗体。
【請求項４】
前記抗体がヒト、ヒト化またはキメラ抗体、あるいはそれらいずれかの抗体断片である、請求項１に記載の単離された抗体。
【請求項５】
前記抗体がヒト化抗体またはその抗体断片である、請求項４に記載の単離された抗体。
【請求項６】
前記抗体がＦａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片またはｓｃＦｖである、請求項１に記載の単離された抗炎症抗体。
【請求項７】
前記抗体がＩｇＧである、請求項１に記載の単離された抗体。
【請求項８】
ＰＴＡ−９３９２およびＰＴＡ−９３９３からなる群より選択されるＡＴＣＣ寄託番号を有するハイブリドーマによって生成される、請求項１に記載の単離された抗体またはそのヒト化抗体。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の単離された抗体および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
【請求項１０】
有効量の請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗体を患者に投与することを含む、炎症性疾患または障害を治療する方法において使用するための、請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１１】
前記炎症性疾患または障害が虚血／再灌流障害である、請求項１０に記載の抗体。
【請求項１２】
虚血／再灌流が、心筋梗塞、脳卒中または外科的処置の後に生じる、請求項１１に記載の抗体。
【請求項１３】
前記患者が哺乳類である、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１４】
前記哺乳類がヒトである、請求項１３に記載の抗体。
【請求項１５】
ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−９３９２を有するハイブリドーマまたはＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−９３９３を有するハイブリドーマ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
急性炎症反応は、発作および心筋梗塞のような広い範囲の疾患および天然に生じる事象に由来しうる。通常の医学的手法もまた局所的および全身の炎症に至ることがある。炎症を未治療のままにしておくと、酷い組織損失をもたらしかねず、最終的には、多臓器不全および死に至ることもある。障害後の炎症反応との干渉は、組織損失を抑えるための１つの方法でありうる。蓄積されている証拠が、炎症における血清先天性応答または補体系に対する重要な役割が裏付けられる。
【０００２】
近年の研究から、天然抗体の重要な役割および補体の古典的経路が炎症反応に関与していることが示唆されている。虚血／再潅流障害は補体の古典的経路を活性化するクローン的に特異的な天然のＩｇＭによって引き起こされ可能性があることが明らかとなっている（Ｚｈａｎｇら（２００４）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  １０１（１１）：３８８６−３８９１）。このような研究により病原のＩｇＭが同定され、次いで、米国特許第７，４４２，７８３号に記載の天然ＩｇＭを結合する自己ペプチドが同定されることになった。米国特許第７，４４２，７８３号は、腸モデルにおいて虚血後に天然ＩｇＭを結合するための重要なエピトープを表すII型のＮＭＨＣタンパク質（マウスＮＭＨＣ−ＩＩＢのアミノ酸５９２−６０３に相当（Ｎ２自己ペプチド；配列番号：３３））内の保存された領域を記載している。
【０００３】
炎症性疾患または障害は潜在的には生命を脅かし、費用がかかり、かつ毎年非常に多数の人々が発症する。従って、炎症性疾患または障害の効果的な治療が必要である。
【発明の概要】
【０００４】
一態様において、本発明は、単離された抗体、特に、Ｎ２自己ペプチドに結合し且つ炎症を抑制するＩｇＧを特徴とする。前記抗体は補体の活性化を抑制することができ、これによってＮ２自己ペプチドに対する免疫応答が阻害される。他の実施形態において、前記抗体は、配列番号８または２０として示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する。他の実施形態において、前記抗体は、配列番号２または１４として示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を有する。他の実施形態において、前記抗体は、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−９３９２によって生成される。さらに他の実施形態において、前記抗体はＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−９３９３によって生成される。
【０００５】
他の態様において、本発明は抗炎症抗体をエンコードする核酸、前記核酸を発現するベクターおよび宿主細胞を特徴とする。
【０００６】
さらなる態様において、本発明は、本明細書に記載の抗炎症抗体を患者に投与することによってＮ２自己ペプチドに対する免疫応答を抑制する方法を特徴とする。さらなる態様において、本発明は、本明細書に記載の単離された抗炎症抗体を含む薬学的組成物を患者に投与することによって患者の炎症性疾患（例えば虚血／再灌流障害）を治療する方法を特徴とする。
【０００７】
本発明の他の特徴および利点は以下の詳細な記載および特許請求の範囲に基づいて明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１Ａ】マウスＢ細胞ハイブリドーマ１２Ａ６（ＰＴＡ−９３９２）の抗体の重鎖配列および軽鎖配列を示す図である。（Ａ）はＩｇＧ１２Ａ６（または１２Ａ６ＩｇＧ）重鎖核酸配列（配列番号１）および配列番号１の重鎖配列に対応するアミノ酸配列（配列番号２）を示す。フレームワーク領域（ＦＶＷＲ）および相補性決定領域（ＣＤＲ）はヌクレオチドの上方に示す。図１ＡはＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインヌクレオチドならびにエンコードされたアミノ酸配列（それぞれ記載の順に配列番号３〜６および２５〜２６）を示す。（Ｂ）はＩｇＧ１２Ａ６（または１２Ａ６ＩｇＧ）軽鎖核酸配列（配列番号７）および配列番号７の軽鎖核酸配列に対応するアミノ酸配列（配列番号８）を示す。フレームワーク領域（ＦＶＷＲ）および相補性決定領域（ＣＤＲ）はヌクレオチドの上方に示す。図１ＢはＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインヌクレオチドならびにエンコードされたアミノ酸配列（それぞれ記載の順に配列番号９〜１２および２７〜２８）を示す。
【図１Ｂ】マウスＢ細胞ハイブリドーマ１２Ａ６（ＰＴＡ−９３９２）の抗体の重鎖配列および軽鎖配列を示す図である。（Ａ）はＩｇＧ１２Ａ６（または１２Ａ６ＩｇＧ）重鎖核酸配列（配列番号１）および配列番号１の重鎖配列に対応するアミノ酸配列（配列番号２）を示す。フレームワーク領域（ＦＶＷＲ）および相補性決定領域（ＣＤＲ）はヌクレオチドの上方に示す。図１ＡはＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインヌクレオチドならびにエンコードされたアミノ酸配列（それぞれ記載の順に配列番号３〜６および２５〜２６）を示す。（Ｂ）はＩｇＧ１２Ａ６（または１２Ａ６ＩｇＧ）軽鎖核酸配列（配列番号７）および配列番号７の軽鎖核酸配列に対応するアミノ酸配列（配列番号８）を示す。フレームワーク領域（ＦＶＷＲ）および相補性決定領域（ＣＤＲ）はヌクレオチドの上方に示す。図１ＢはＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインヌクレオチドならびにエンコードされたアミノ酸配列（それぞれ記載の順に配列番号９〜１２および２７〜２８）を示す。
【図２Ａ】マウスＢ細胞ハイブリドーマ２１Ｇ６（ＰＴＡ−９３９３）の抗体の重鎖配列および軽鎖配列を示す図である。（Ａ）はＩｇＧ２１Ｇ６（または２１Ｇ６ＩｇＧ）重鎖核酸配列（配列番号１３）および配列番号１３の重鎖配列に対応するアミノ酸配列（配列番号１４）を示す。フレームワーク領域（ＦＶＷＲ）および相補性決定領域（ＣＤＲ）はヌクレオチドの上方に示す。図２ＡはＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインヌクレオチドならびにエンコードされたアミノ酸配列（それぞれ記載の順に配列番号１５〜１８および２９〜３０）を示す。（Ｂ）はＩｇＧ２１Ｇ６（または２１Ｇ６ＩｇＧ）軽鎖核酸配列（配列番号１９）および配列番号１９の軽鎖配列に対応するアミノ酸配列（配列番号２０）を示す。フレームワーク領域（ＦＶＷＲ）および相補性決定領域（ＣＤＲ）はヌクレオチドの上方に示す。図２ＢはＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインヌクレオチドならびにエンコードされたアミノ酸配列（それぞれ記載の順に配列番号２１〜２４および３１〜３２）を示す。
【図２Ｂ】マウスＢ細胞ハイブリドーマ２１Ｇ６（ＰＴＡ−９３９３）の抗体の重鎖配列および軽鎖配列を示す図である。（Ａ）はＩｇＧ２１Ｇ６（または２１Ｇ６ＩｇＧ）重鎖核酸配列（配列番号１３）および配列番号１３の重鎖配列に対応するアミノ酸配列（配列番号１４）を示す。フレームワーク領域（ＦＶＷＲ）および相補性決定領域（ＣＤＲ）はヌクレオチドの上方に示す。図２ＡはＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインヌクレオチドならびにエンコードされたアミノ酸配列（それぞれ記載の順に配列番号１５〜１８および２９〜３０）を示す。（Ｂ）はＩｇＧ２１Ｇ６（または２１Ｇ６ＩｇＧ）軽鎖核酸配列（配列番号１９）および配列番号１９の軽鎖配列に対応するアミノ酸配列（配列番号２０）を示す。フレームワーク領域（ＦＶＷＲ）および相補性決定領域（ＣＤＲ）はヌクレオチドの上方に示す。図２ＢはＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインヌクレオチドならびにエンコードされたアミノ酸配列（それぞれ記載の順に配列番号２１〜２４および３１〜３２）を示す。
【図３】心筋梗塞後の炎症を抑制するマウス抗Ｎ２  ｍＡｂ（抗Ｎ２Ｆ（ａｂ’）２抗体（２１Ｇ６））を示すグラフである。
【図４】ヒトＩｇＭ損傷を阻害するＮ２ペプチドおよび抗Ｎ２  ｍＡｂ（抗Ｎ２Ｆ（ａｂ’）２抗体（２１Ｇ６））を示すグラフである。
【図５】再灌流後の心臓の小血管に放出された抗原への１２Ａ６ハイブリドーマの結合を示すグラフである。
【図６】１２Ａ６のＦａｂ’２断片を２１Ｇ６と比較した、阻害試験の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
４．詳細な説明
４．１．定義
便宜上、明細書、実施例、および添付の請求の範囲で使用されるある種の用語を提供する。特記しない限り、本明細書において用いる全ての技術および科学用語は、本発明が属する当業者によって通常理解されるのと同一の意味を有する。
【００１０】
本明細書において用いる「ある（ａおよびａｎ）」とは、形容詞の文法的目的語の１または１より多いこと（すなわち、少なくとも１）を意味する。その例として、「エレメント（an element）」は、１つのエレメント、または１より多いエレメントを意味する。
【００１１】
「アミノ酸」は、グリシンおよびＤまたはＬ光学異性体を含む天然または合成アミノ酸、およびアミノ酸アナログおよびペプチドミメティックスいずれかを意味するように本明細書において用いる。
【００１２】
「抗体」は、免疫グロブリン分子、および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、抗原結合部位を含有する分子を含む結合性分子を意味するように本明細書において用いる。本発明で有用な免疫グロブリン分子はいずれのクラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、およびＩｇＡ）またはサブクラスのものでもあり得る。天然の抗体および免疫グロブリンは、通常、２つの同一の軽鎖および２つの同一の重鎖から構成される、約１５０，０００ダルトンのヘテロテトラマー糖タンパク質である。各重鎖は可変ドメイン、続いて多数の定常ドメインを１つの端部に有する。各軽鎖は１つの端部の可変ドメインおよびその他の端部の定常ドメインを有する。抗体は、限定されるものではないが、ポリクローナル、モノクローナル、二重特異性、キメラ、部分的にまたは十分にヒト化された抗体、十分にヒト化された抗体（すなわち、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現するトランスジェニックマウスにおいて生成）、ラクダ抗体、および抗イディオタイプ抗体を含む。抗体、または一般には、いずれかの分子は、前記抗体が抗原に優先的に結合し、例えば、もう１つの分子に対して約３０％未満、好ましくは２０％、１０％または１％の交差反応性を有するならば、抗原（または他の分子）に対して「特異的に結合する」。用語「抗体」および「免疫グロブリン」は相互交換的に用いられる。
【００１３】
「抗体断片」は、全長未満である抗体のいずれの誘導体も意味するように本明細書において用いる。例示的な実施形態において、抗体断片は全長抗体の特異的結合活性の少なくとも有意な部分を保有する。抗体断片の例は、限定されるものではないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄｓＦｖダイアボディ、ミニボディ、Ｆｄ断片、および単一鎖抗体を含む。抗体断片はいずれかの手段によって生産することができる。例えば、抗体断片は無傷抗体の断片化によって酵素的にまたは化学的に生産することができ、それは部分的抗体配列をエンコードする遺伝子から組換えにより生産することができ、あるいはそれは全部がまたは一部が合成により生産することができる。抗体断片は、場合によっては、単一鎖抗体断片であり得る。または、断片は、例えば、ジスルフィド結合によって一緒に連結される複数鎖を含むことができる。また、断片は、場合によっては、マルチ分子複合体であり得る。機能的抗体断片は、典型的には、少なくとも約５０のアミノ酸を含み、より典型的には、少なくとも約２００のアミノ酸を含むであろう。
【００１４】
「抗原結合部位」は、軽鎖の可変領域と会合した重鎖の可変ドメインを意味するように本明細書において用いる。
【００１５】
「結合する」または「結合」は、分子の間の検出可能な関係または会合（例えば、生化学的相互作用）を意味するように本明細書において用いる。
【００１６】
「細胞」または「宿主細胞」は、本明細書においては交換可能に用いられる用語である。そのような用語は特定の対象細胞のみならず、そのような細胞の子孫または潜在的子孫をも意味すると理解される。ある修飾が突然変異または環境の影響により後の世代で起こり得るので、そのような子孫は、事実、親細胞と同一でないかもしれないが、本明細書において用いる用語の範囲内に依然として含まれる。
【００１７】
「含む」および「含んでいる」は、包括的なオープンされた意味で用いられ、さらなるエレメントを含むことができることを意味する。
【００１８】
「コンセンサス」配列は、関連配列のファミリーにおいて最もしばしば起こるアミノ酸（またはヌクレオチド）から形成された配列を意味するように本明細書において用いる（例えば、Ｗｉｎｎａｋｅｒ，  Ｆｒｏｍ  Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ｃｌｏｎｅｓ，  １９８７参照）。タンパク質のファミリーにおいて、コンセンサス配列における各位置は、ファミリーにおいてその位置において最もしばしば起こるアミノ酸によって占められる。２つのアミノ酸が同等の頻度で起こるならば、いずれもコンセンサス配列に含めることができる。「コンセンサスフレームワーク」は、コンセンサス免疫グロブリン配列におけるフレームワーク領域と意味する。
【００１９】
「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が同様な側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられるものである。同様な側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当技術分野において規定されている。これらのファミリーは塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β−分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。したがって、天然免疫グロブリンにおける予測される非必須アミノ酸残基は、好ましくは、同一側鎖ファミリーからのもう１つのアミノ酸残基で置き換えることができる。または、もう１つの実施形態において、飽和突然変異誘発によるなどして、突然変異を天然免疫グロブリンコード配列の全部または一部に沿ってランダムに導入することができ、得られた突然変異体は生物学的活性につきスクリーニングすることができる。
【００２０】
「相互作用」とは、２以上の分子の間の物理的会合、例えば、結合を意味する。相互作用は直接的または間接的であってよい。
【００２１】
「炎症性疾患」は、ミクロ循環における急性または慢性変化、流体の移動、および炎症細胞（例えば、白血球）および補体の流入および活性化を含む機能的および細胞的調整の複雑な組によって引き起こされる、またはそれに寄与する疾患または障害、および含まれる自己免疫疾患を意味するように本明細書において用いられる。そのような疾患および疾患の例は、限定されるものではないが、再灌流障害、虚血障害、発作、自己免疫溶血性貧血、特発性血小板減少症紫斑病、慢性関節リウマチ、腹腔病、過剰−ＩｇＭ免疫不全症、動脈硬化症、冠動脈病、敗血症、心筋炎、脳炎、移植拒絶、肝炎、甲状腺炎（例えば、橋本甲状腺炎、グラーベ病）、骨粗鬆症、多発性筋炎、皮膚筋炎、Ｉ型糖尿病、痛風、皮膚炎、円形脱毛症、全身エリテマトーデス、苔癬硬化症、潰瘍性大腸炎、糖尿病性網膜症、胎盤炎症性疾患、歯周疾患、動脈炎、若年性慢性関節炎（例えば、慢性虹彩毛様体炎、乾癬、骨粗鬆症、真性糖尿病における腎臓障害、喘息、胎盤炎症性疾患、慢性炎症肝臓病、慢性炎症肺病、肺線維症、肝臓線維症、慢性関節リウマチ、慢性炎症肝臓病、慢性炎症肺病、肺線維症、肝臓線維症、クローン病、潰瘍性大腸炎、火傷、および中枢神経系（ＣＮＳ；例えば、多発性硬化症）、胃腸系、皮膚および関連構造、免疫系、肝臓−胆嚢系、または病理が炎症成分で起こり得る身体中のいずれかの部位の他の急性および慢性炎症性疾患を含む。
【００２２】
「単離された」分子、例えば、単離されたＩｇＭとは、天然環境に存在する他の分子から分離されたまたは精製された状態を意味する。
【００２３】
「天然ＩｇＭ」は、哺乳動物（例えば、ヒト）において天然で生じたＩｇＭ抗体を意味するように本明細書において用いる。それらは、個々のモノマーがＩｇＧに似ており、それにより、２つの軽鎖（κまたはλ）および２つの重鎖（μ）を有するペンタマー環構造を有する。さらに、重鎖はさらなるＣＨドメインを含有する。モノマーは、隣接重鎖の間のジスルフィド結合によってペンタマーを形成する。ペンタマー環は、Ｊ鎖および２つの重鎖の間のジスルフィド結合によって閉じられる。その抗原結合部位の多い数のため、ＩｇＧ抗体は抗原の効果的なアグリチネーターである。対象における天然ＩｇＭ抗体の生産はＢ細胞、マクロファージ、および補体系の初期活性化において重要である。ＩｇＭは抗体応答で合成された最初の免疫グロブリンである。ＩｇＭは米国特許第７，４４２，７８３号に記載されており、その内容全体を特定的に本明細書に援用する。
【００２４】
「核酸」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）および、適当な場合、リボ核酸（ＲＮＡ）のようなポリヌクレオチドを意味するように本明細書において用いる。前記用語は、ヌクレオチドアナログから作成されたＲＮＡまたはＤＮＡいずれかの同等体、アナログおよび、記載される実施形態に適用可能であれば、一本鎖（センスまたはアンチセンス）および二本鎖ポリヌクレオチドを含むと理解されるべきである。
【００２５】
「機能的に連結された」は、そのように記載された成分がそれらの意図したようにそれらを機能させるのを可能とする関係にある並置を意味するように本明細書において用いられる。例えば、ＲＮＡポリメラーゼが２つのコード配列を単一のｍＲＮＡに転写し、次いで、これが、双方のコード配列に由来するアミノ酸を有する単一のポリペプチドに翻訳される場合、コード配列はもう１つのコード配列に「機能的に連結している」。コード配列は、発現された配列が最終的に所望のタンパク質を生産するように処理される限り、相互に隣接している必要はない。コード配列に機能的に連結された発現制御配列は、コード配列の発現が発現制御配列に適合する条件下で達成するように連結される。本明細書において用いるように、用語「発現制御配列」は、それが機能的に連結された核酸配列の発現を調節する核酸配列を意味する。発現制御配列が転写を制御し、調節し、適切であれば、核酸配列の翻訳を制御し、調節する場合、発現制御配列は核酸配列に機能的に連結されている。したがって、発現制御配列は適当なプロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、タンパク質コーディング遺伝子の前の開始コドン（すなわち、ＡＴＧ）、イントロン、ｍＲＮＡの適切な翻訳を可能とするようなその遺伝子の正しいリーディングフレームの維持のためのスプライシングシグナル、および停止コドンを含むことができる。用語「制御配列」は、最小限、その存在が発現に影響し得る成分を含むことが意図され、また、その存在が有利であるさらなる成分、例えば、リーダー配列および融合パートナー配列も含むことができる。発現制御配列はプロモーターを含むこともできる。
【００２６】
「患者」、「対象」、または「宿主」は、ヒトまたは非ヒト哺乳動物のいずれかを意味するように本明細書において用いられる。
【００２７】
「ペプチド」は、比較的短い長さ（例えば５０未満のアミノ酸）のアミノ酸のポリマーを意味するように本明細書において用いる。ポリマーは直線状または分岐していてもよく、それは修飾されたアミノ酸を含むことができ、かつそれは非アミノ酸によって分断されていてもよい。前記用語は修飾されたアミノ酸ポリマーも含む；例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または標識成分とのコンジュゲーションのようないずれかの他の操作。
【００２８】
「プロモーター」は、転写を指令するのに十分な最小配列を意味するように本明細書において用いる。また、本発明には、細胞型特異的、組織特異的に制御可能なプロモーター−依存性遺伝子発現をするのに十分であるか、あるいは外部シグナルまたは剤によって誘導可能なプロモーターエレメントも含まれ；そのようなエレメントはポリヌクレオチド配列の５’または３’領域に位置させることができる。構成的および誘導性プロモーターは共に本発明に含まれる（例えば、Ｂｉｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １５３：５１６−５４４，１９８７参照）。例えば、細菌系でクローニングする場合、バクテリオファージのｐＬ、ｐｌａｃ、ｐｔｒｐ、ｐｔａｃ（ｐｔｒｐ−ｌａｃハイブリッドプロモーター）などのような誘導性プロモーターを用いることができる。哺乳動物細胞系でクローニングする場合、哺乳動物細胞のゲノムから（例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳動物ウイルスから（例えば、レトロウイルスロングターミナルリピート；アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）由来するプロモーターを用いることができる。また、組換えＤＮＡまたは合成技術によって生産されたプロモーターを用いて、本発明の核酸配列の転写を提供することもできる。組織特異的調節エレメントを用いることができる。例えば、異なる組織で異なって発現される遺伝子またはウイルスからの調節エレメントも含まれる。
【００２９】
「特異的に結合する」または「免疫特異的に結合する」は、生理学的条件下で比較的安定である複合体を形成する２つの分子の間の相互作用を意味するように本明細書において用いる。前記用語は、例えば、抗体および抗原（例えば、ペプチド）の相互作用を含む種々の分子に言及するように本明細書では用いられる。特異的な結合は、少なくとも約１×１０−６Ｍ、一般には少なくとも約１×１０−７Ｍ、通常、少なくとも約１×１０−８Ｍ、特に少なくとも約１×１０−９Ｍまたは１×１０−１０Ｍ以上の解離定数によって特徴付けることができる。２つの分子が特異的に結合するか否かを決定するための方法は周知であり、例えば、平衡透析、表面プラズモン共鳴などを含む。
【００３０】
「ストリンジェンシーハイブリダイゼーション」または「低ストリンジェンシー、中程度ストリンジェンシー、高ストリンジェンシー、または非常に高いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする」は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄についての条件を記載するように本明細書において用いられる。ハイブリダイゼーション反応を行うためのガイダンスは、参照により組み入れられる、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１−６．３．６に見出すことができる。水性および非水性方法が文献に記載されており、いずれを用いることもできる。本明細書において意味する特異的なハイブリダイゼーション条件は以下のものである。１）約４５℃における６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、続いて、少なくとも５０℃における０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにおける２回の洗浄での低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件（洗浄の温度は低ストリンジェンシー条件では５５℃まで上昇させることができる）；２）約４５℃における６×ＳＳＣ、続いての、６０℃における０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにおける１回または複数回の洗浄における中程度ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件；３）約４５℃における６×ＳＳＣ、続いての、６５℃における０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの１回または複数回の洗浄での高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件；および好ましくは４）非常に高いストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は６５℃における０．５Ｍリン酸ナトリウム、７％ＳＤＳ、続いての、６５℃における０．２×ＳＳＣ、１％ＳＤＳでの１回または複数回の洗浄である。非常に高いストリンジェンシー条件（４）は好ましい条件であって、特記しない限り、用いるべきものである。配列の間における相同性または配列同一性（前記用語は本明細書においては相互交換的に用いる）の計算は以下のように行われる。
【００３１】
２つのアミノ酸配列の、または２つの核酸配列のパーセント同一性を決定するために、配列を最適な比較目的のために整列させる（例えば、ギャップを第一および第二のアミノ酸の一方または双方に導入することができ、あるいは最適な整列および非相同配列のための核酸配列は比較目的では無視することができる）。好ましい実施形態において、比較目的で整列させる参照配列の長さは参照配列の長さの少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、６０％、なおより好ましくは少なくとも７０％、８０％、９０％、１００％である。次いで対応するアミノ酸の位置またはヌクレオチドの位置におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第一の配列中の位置が第二の配列中の対応する位置と同一のアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占められれば、前記分子はその位置において同一である。
【００３２】
２つの配列の間のパーセント同一性は前記配列によって共有される同一位置の数の関数であり、２つの配列の間のパーセント相同性は配列によって共有される保存された位置の数の関数であり、２つの配列の最適な整列のために導入される必要がある、ギャップの数、および各ギャップの長さを考慮に入れる。配列の比較、および２つの配列の間のパーセント同一性および／または相同性の決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。好ましい実施形態において、２つのアミノ酸配列の間のパーセント同一性は、Ｂｌｏｓｓｕｍ  ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、および１６、１４、１２、１０、８、６または４のギャップ重みおよび１、２、３、４、５または６の長さの重みを用い、（延長ｇｃｇ．ｃｏｍを有する世界的なウェブから入手可能な）ＧＣＧソフトウェアパッケージにおけるＧＡＰプログラムに導入されているＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３）を用いて決定される。なおもう１つの好ましい実施形態において、２つのヌクレオチド配列の間のパーセント同一性は、ＮＷＳｇａｐｄｎａ  ＣＭＰマトリックスならびに４０、５０、６０、７０または８０のギャップの重み、１、２、３、４、５または６の長さの重みを用い、（延長ｇｃｇ．ｃｏｍを有する世界的なウェブで入手可能な）ＧＣＧソフトウェアパッケージにおけるＧＡＰプログラムを用いて決定される。パラメーターの特に好ましい組（および特記しない限り用いるべきもの）は、１２のギャップペナルティー、４のギャップ延長ペナルティー、および５のフレームシフトギャップペナルティーを有するＢｌｏｓｓｕｍ  ６２スコアリングマトリックスである。
【００３３】
２つのアミノ酸またはヌクレオチド配列の間のパーセント同一性および／または相同性は、ＰＡＭ１２０重み残基表、１２のギャップ長さペナルティーおよび４のギャップペナルティーを用い、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に取り込まれているＥ．ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒ（（１９８９）  ＣＡＢＩＯＳ，４：１１−１７）のアルゴリズムを用いて決定することができる。
【００３４】
「治療する」は対象における障害または疾患のいずれかの治療、または予防または阻害を意味するように本明細書において用いられ、その例として、（ａ）疾患または障害の素因であり得るが、それを有すると未だ診断されていない対象で疾患または障害が起こるのを妨げること；（ｂ）疾患または障害を阻害し、すなわち、その進行を阻止すること；または（ｃ）疾患または障害を救済すること、または軽減すること、すなわち、緩解を引き起こすことを含む。したがって、本明細書において用いる治療することは、例えば、外科的治療の前に、損傷を防止するための、障害または予防的治療の部位における損傷したまたは障害を受けた組織または細胞の修復および再生を含む。
【００３５】
本明細書において用いる「ベクター」は、それが機能的に連結されているもう１つの核酸を輸送することができる核酸分子をいい、プラスミド、コスミドまたはウイルスベクターを含むことができる。好ましいベクターの１つのタイプはエピソーム、すなわち、染色体外複製が可能である核酸である。好ましいベクターは、それらが連結された核酸の自律複製および／または発現が可能なものである。ベクターは、それらが機能的に連結された遺伝子の発現を指令することができる。また、ベクターは宿主ＤＮＡに組み込むことができる。本明細書においては、「プラスミド」および「ベクター」は、プラスミド（二本鎖ＤＮＡの環状配置）はベクターの最も普通に用いられる形態であるように相互交換的に用いられる。しかしながら、本発明は、同等な機能を果たし、引き続いて当技術分野において公知になるベクターのそのような他の形態を含むことを意図する。ウイルスベクターは、例えば、複製欠陥レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ関連ウイルスを含む。
【００３６】
４．２  抗炎症抗体
本発明は、部分的には、Ｎ２自己ペプチドに結合し且つ炎症を抑制する抗体の同定に基づく。ある種の抗体は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに受託され、受託番号ＰＴＡ−９３９２  （ＩｇＧ１２Ａ６）またはＰＴＡ−９３９３（ＩｇＧ２１Ｇ６）が与えられたハイブリドーマから得ることができる。
【００３７】
一態様において、本発明は、マウスＮＭＨＣ−ＩＩＢ（５９２−６０３）（ＬＭＫＮＭＤＰＬＮＤＮＶ（Ｎ２；  配列番号３３））のＮ２自己ペプチドを含むアミノ酸配列に特異的に結合する単離された抗体を提供する。他の態様において、前記抗炎症抗体は、ＹＴＮ  ＡＴＧ  ＡＡＲ  ＡＡＹ  ＡＴＧ  ＧＡＹ  ＣＣＮ  ＹＴＮ  ＡＡＹ  ＧＡＹ  ＡＡＹ  ＧＴＮを含む核酸によってエンコードされたアミノ酸配列（配列番号３４）に特異的に結合し（ここで、「Ｒ」はＡまたはＧでありうる塩基、「Ｙ」はＣまたはＴでありうる塩基で、「Ｎ」はＡ，Ｃ，ＧまたはＴでありうる塩基である）、前記抗体が投与される患者において炎症を抑制することができる。
【００３８】
Ｎ２は自己抗原および特には虚血抗原（ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ）、または損傷している虚血組織に発現または露出した抗原である。天然ＩｇＭは損傷組織（特に損傷した虚血状態の組織）に発現または露出したＮ２を認識かつ結合し、これによって古典的経路において補体を活性化することによって炎症を活性化する。本明細書に記載の抗炎症抗体は、自己抗原を結合中の天然ＩｇＭ抗体に抵抗し、ＩｇＭを結合させ補体を活性化するのに利用可能な自己抗原を中和（ｔｉｔｒａｔｉｎｇ  ｏｕｔ）する。本明細書に記載の抗炎症抗体を患者に投与すると、補体の活性化が抑制され、これによって炎症が阻害される。
【００３９】
本発明は、図１および２に示す相補性決定領域（「ＣＤＲ」）」の１以上を含む重鎖可変領域（「ＶＨ」）を有するＮ２自己ペプチドに免疫特異的に結合する抗体を包含する。本発明はまた、図１および２に示すＶＬ相補性決定領域を含む軽鎖可変領域（「ＶＬ」）を有するＮ２自己ペプチドに免疫特異的に結合する抗体も包含する。
【００４０】
ＩｇＧ１２Ａ６（１２Α６  ＩｇＧ）  
ハイブリドーマＰＴＡ−９３９２、ＩｇＧ１２Ａ６（１２Ａ６  ＩｇＧともいう）から生産されたＩｇＧの重鎖可変領域のヌクレオチド配列を図１Ａに示し（配列番号１）、アミノ酸配列も図１Ｂに示す（配列番号２）。重鎖可変領域のＣＤＲ１ドメインは配列番号１（配列番号３で示す）によってエンコードされた配列番号２（配列番号４で示す）に対応し、重鎖可変領域のＣＤＲ２ドメインは配列番号１（配列番号５で示す）の領域によってエンコードされた配列番号２（配列番号６）の領域に対応する。重鎖可変領域のＣＤＲ３ドメインは、図１Ａの配列番号１（配列番号２５で示す）領域によってエンコードされた配列番号２（配列番号２６で示す）の領域に対応する。
【００４１】
ＩｇＧ１２Ａ６の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は図１Ｂに示し（配列番号７）、そのアミノ酸配列は図１Ｂにも示す（配列番号８）。軽鎖可変領域のＣＤＲ１ドメインは配列番号７（配列番号９で示す）によってエンコードされた配列番号８（配列番号１０で示す）に対応し、軽鎖可変領域のＣＤＲ２ドメインは配列番号７（配列番号１１で示す）の領域によってエンコードされた配列番号８（配列番号１２）の領域に対応する。軽鎖可変領域のＣＤＲ３ドメインは、図１Ｂの配列番号７（配列番号２７で示す）領域によってエンコードされた配列番号８（配列番号２８で示す）の領域に対応する。遺伝子暗号の縮重のため、他のヌクレオチド配列は本明細書において列挙したアミノ酸配列をエンコードし得る。
【００４２】
ｃＤＮＡ、ゲノムまたは混合物いずれかからの、しばしば、（修飾された制限部位などを除いた）天然配列における、本発明の核酸組成物は標準的技術に従って突然変異させることができる。コード配列については、これらの突然変異は要望どおりアミノ酸配列に影響し得る。特に、天然Ｖ、Ｄ、Ｊ、定常、スイッチおよび本明細書において記載された他のそのような配列と実質的に同一な、またはそれに由来するヌクレオチド配列が考えられる。
【００４３】
例えば、単離された核酸は、図１Ａに示されたヌクレオチド配列を有するＩｇＧ１２Ａ６（または１２Ａ６  ＩｇＧ）重鎖可変領域ヌクレオチド配列（配列番号１）、または配列番号１に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である配列を含むことができる。核酸分子は配列番号３の重鎖ＣＤＲ１ヌクレオチド配列、またはその一部分を含むことができる。さらに、核酸分子は配列番号５の重鎖ＣＤＲ２ヌクレオチド配列、またはその一部分を含むことができる。また、核酸分子は配列番号２５の重鎖ＣＤＲ２ヌクレオチド配列、またはその一部分を含むことができる。例示的な実施形態において、核酸分子は配列番号３の重鎖ＣＤＲ１ヌクレオチド配列、またはその一部分、配列番号５の重鎖ＣＤＲ２ヌクレオチド配列、またはその一部分、配列番号２５の重鎖ＣＤＲ３ヌクレオチド配列、またはその一部分を含む。本発明の核酸分子は重鎖配列、例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号２５またはその組合せを含むことができ、あるいは配列番号１、３、５または２５に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％および９９％配列同一性を有するヌクレオチドを含むことができる。さらに、本発明の核酸分子は、ストリンジェントな条件、例えば、低、中程度、高または非常に高いストリンジェンシー条件下で配列番号１、３、５または２５にハイブリダイズする重鎖配列を含むことができる。
【００４４】
もう１つの態様において、本発明は、重鎖ポリペプチド、例えば、配列番号２、４、６または２６の重鎖ポリペプチドをエンコードする核酸分子に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％および９９％配列同一性を有する核酸分子を特徴とする。また、本発明は、天然抗体の重鎖可変領域またはその一部分、例えば、配列番号２、４、６または２６の重鎖可変領域をエンコードする核酸配列にハイブリダイズする核酸分子を特徴とする。
【００４５】
もう１つの実施形態において、単離された核酸は、図１Ｂに示すヌクレオチド配列を有するＩｇＧ１２Ａ６（１２Ａ６  ＩｇＧ）軽鎖可変領域ヌクレオチド配列（配列番号７）、または配列番号７に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一である配列をエンコードする。前記核酸分子は配列番号９の軽鎖ＣＤＲ１ヌクレオチド配列、またはその一部分を含むことができる。もう１つの実施形態において、前記核酸分子は配列番号１１の軽鎖ＣＤＲ２ヌクレオチド配列、またはその一部分を含むことができる。別の実施形態において、前記核酸分子は、配列番号２７の軽鎖ＣＤＲ３ヌクレオチド、またはその一部分を含むことができる。例示的な実施形態において、前記核酸分子は配列番号９の軽鎖ＣＤＲ１ヌクレオチド配列、またはその一部分、配列番号１１の軽鎖ＣＤＲ２ヌクレオチド配列、またはその一部分、および配列番号２７の軽鎖ＣＤＲ３ヌクレオチド配列、またはその一部分を含む。本発明の核酸分子は軽鎖配列、例えば、配列番号７、９、１１、２７またはその組合せを含むことができ、あるいは配列番号７、９、１１または２７に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％および９９％配列同一性を有するヌクレオチドを含むことができる。さらなる核酸分子は、ストリンジェントな条件、例えば、低、中程度、高または非常に高いストリンジェンシー条件下で配列番号７、９、１１または２７にハイブリダイズする軽鎖配列を含むことができる。
【００４６】
核酸分子は軽鎖ポリペプチド、例えば、配列番号８、１０、１２または２８の軽鎖ポリペプチドをエンコードする核酸分子に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有することができる。また、本発明は、天然抗体の軽鎖可変領域、またはその一部分、例えば、配列番号８、１０、１２または２８の軽鎖可変領域をエンコードする核酸配列にハイブリダイズする核酸分子を特徴とする。
【００４７】
もう１つの実施形態において、本発明は、配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１ドメインをエンコードする単離された核酸、またはその断片または修飾形態を提供する。この核酸は、ＣＤＲ１領域のみをエンコードすることができるか、あるいは全抗体重鎖可変領域またはその一部分をエンコードすることができる。例えば、核酸は、配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメインを有する重鎖可変領域をエンコードすることができる。なおもう１つの実施形態において、本発明は、配列番号６のアミノ酸を含む重鎖ＣＤＲ２ドメインをエンコードする単離された核酸、またはその断片または修飾形態を提供する。この核酸はＣＤＲ２領域のみをエンコードすることができるか、あるいは全抗体重鎖可変領域またはその断片をエンコードすることができる。例えば、前記核酸は配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを有する軽鎖可変領域をエンコードすることができる。
【００４８】
さらにもう１つの実施形態において、本発明は、配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１ドメインをエンコードする単離された核酸、またはその断片または修飾形態を提供する。この核酸はＣＤＲ１領域のみをエンコードすることができるか、あるいは全抗体軽鎖可変領域をエンコードすることができる。例えば、前記核酸は配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメインを有する軽鎖可変領域をエンコードすることができる。単離された核酸は配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２ドメイン、またはその断片または修飾形態をエンコードすることもできる。この核酸はＣＤＲ２領域のみをエンコードすることができるか、あるいは全抗体軽鎖可変領域をエンコードすることができる。例えば、前記核酸は配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを有する軽鎖可変領域をエンコードすることができる。
【００４９】
重鎖または軽鎖可変領域をエンコードする核酸はネズミまたはヒト起源のものであり得、あるいはネズミおよびヒトアミノ酸配列の組合せを含むことができる。例えば、核酸は配列番号２のＣＤＲ１（配列番号４および／または配列番号２のＣＤＲ２（配列番号６）および／または配列番号２のＣＤＲ３（配列番号２６）を含む重鎖可変領域、およびヒトフレームワーク配列をエンコードすることができる。加えて、前記核酸は配列番号８のＣＤＲ１（配列番号１０）および／または配列番号８のＣＤＲ２（配列番号１２）および／または配列番号２のＣＤＲ３（配列番号２６）を含む軽鎖可変領域、およびヒトフレームワーク配列をエンコードすることができる。本発明は、さらに、前記核酸を含有するベクター、および発現ベクターを含む宿主細胞を含む。
【００５０】
本発明はまた、ＩｇＧ１２Ａ６重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域のポリペプチドおよび断片も特徴とする。本明細書に記載の核酸によってエンコードされるポリペプチドのいずれも本発明の範囲にある。例示的な実施形態において、単離されたポリペプチドは、例えば、配列番号８、１０、１２、２８のアミノ酸配列、またはその断片または組合せ；または配列番号２、４、６、２６またはその断片または組合せを含む。本発明のポリペプチドは、配列番号８、１０、１２、２８、２、４、６または２６とは異なり、少なくとも、２０、１０、５、４、３、２または１以下のアミノ酸を有するポリペプチドを含む。例示的なポリペプチドは、生物学的活性、例えば、Ｎ２自己ペプチドに結合する能力および／または補体の活性化を阻害する能力を保有するポリペプチドである。もう１つの実施形態において、前記ポリペプチドは、軽鎖可変領域、またはその一部分、例えば、配列番号８、１０、１２または２８の軽鎖可変領域ポリペプチドに対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％および９９％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。もう１つの実施形態において、前記ポリペプチドは、重鎖可変領域、またはその一部分、例えば、配列番号２、４、６または２６の重鎖可変領域ポリペプチドに対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％および９９％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。もう１つの実施形態において、本発明は、配列番号８および配列番号２のアミノ酸配列を含み、さらにＩＲＥＳ配列を含むポリペプチドを特徴とする。
【００５１】
本発明の一実施形態において、Ｎ２自己ペプチドに免疫特異的に結合する抗体は、配列番号４のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ１を含む。他の実施形態において、Ｎ２自己ペプチドに免疫特異的に結合する抗体は、配列番号６のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２を含む。他の実施形態において、Ｎ２自己ペプチドに免疫特異的に結合する抗体は、配列番号２６のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３を含む。
【００５２】
他の実施形態において、Ｎ２自己ペプチドに免疫特異的に結合する抗体は、配列番号４のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ１および配列番号６のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２を含む。他の実施形態において、Ｎ２自己ペプチドに免疫特異的に結合する抗体は、配列番号４のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ１および配列番号２６のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３を含む。さらに別の実施形態において、Ｎ２自己ペプチドに免疫特異的に結合する抗体は、配列番号６のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２および配列番号２６のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３を含む。他の実施形態において、Ｎ２自己ペプチドに免疫特異的に結合する抗体は、配列番号４のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２および配列番号２６のアミノ酸を有するＶＨ  ＣＤＲ３を含む。
【００５３】
本発明の一実施形態において、Ｎ２自己ペプチドに免疫特異的に結合する抗体は、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ１を含む。他の実施形態において、Ｎ２自己ペプチドに免疫特異的に結合する抗体は、配列番号１２のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２を含む。他の実施形態において、Ｎ２自己ペプチドに免疫特異的に結合する抗体は、配列番号２８のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３を含む。
【００５４】
他の実施形態において、Ｎ２自己ペプチドに免疫特異的に結合する抗体は、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ１および配列番号１２のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２を含む。他の実施形態において、他の実施形態において、Ｎ２自己ペプチドに免疫特異的に結合する抗体は、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ１および配列番号２８のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３を含む。他の実施形態において、Ｎ２自己ペプチドに免疫特異的に結合する抗体は、配列番号１２のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２および配列番号２８のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３を含む。さらに別の実施形態において、さらに別の実施形態において、Ｎ２自己ペプチドに免疫特異的に結合する抗体は、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２、および配列番号２８のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３を含む。
【００５５】
本発明はまた、図１および２に示した１以上のＶＨ  ＣＤＲおよび１以上のＶＬ  ＣＤＲを含む抗体も提供する。特に、本発明は、ＶＨ  ＣＤＲ１およびＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ１およびＶＬ  ＣＤＲ２、ＶＨ  ＣＤＲ１およびＶＬ  ＣＤＲ３、ＶＨ  ＣＤＲ２およびＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２およびＶＬ  ＣＤＲ２、およびＶＨ  ＣＤＲ２およびＶＬ  ＣＤＲ３、ＶＨ  ＣＤＲ３およびＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ３およびＶＬ  ＣＤＲ２、ＶＨ  ＣＤＲ３およびＶＬ  ＣＤＲ３、または  ａｎｙ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｔｈｅｒｅｏｆ  ｏｆ  ｔｈｅ図１および２に示したＶＨ  ＣＤＲおよびＶＬ  ＣＤＲのそれらの任意の組み合わせを含む抗体を提供する。
【００５６】
一実施形態において、本発明の抗体は、配列番号４のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ１および配列番号１０のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ１を含む。他の実施形態において、本発明の抗体は、配列番号４のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ１および配列番号１２のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２を含む。他の実施形態において、本発明の抗体は、配列番号４のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ１および配列番号２８のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３を含む。
【００５７】
他の実施形態において、本発明の抗体は、配列番号６のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２および配列番号１０のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ１を含む。他の実施形態において、本発明の抗体は、配列番号６のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２および配列番号１２のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２を含む。他の実施形態において、他の実施形態において、本発明の抗体は、配列番号６のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２および配列番号２８のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３を含む。
【００５８】
他の実施形態において、本発明の抗体は、配列番号１４のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３および配列番号１０のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ１を含む。他の実施形態において、本発明の抗体は、配列番号２６のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３および配列番号１２のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２を含む。好ましい実施形態において、本発明の抗体は、配列番号１４のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３および配列番号２８のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３を含む。
【００５９】
ＩｇＧ２１Ｇ６（２１Ｇ６  ＩｇＧ）
ハイブリドーマＰＴＡ−９３９３、ＩｇＧ２１Ｇ６（２１Ｇ６  ＩｇＧともいう）から生産されたＩｇＧの重鎖可変領域のヌクレオチド配列を図２Ａに示し（配列番号１３）、アミノ酸配列も図２Ａに示す（配列番号１４）。重鎖可変領域のＣＤＲ１ドメインは配列番号１３（配列番号１５で示す）によってエンコードされた配列番号１４（配列番号１６で示す）に対応し、重鎖可変領域のＣＤＲ２ドメインは配列番号１３（配列番号１７で示す）の領域によってエンコードされた配列番号１４（配列番号１８で示す）の領域に対応する。重鎖可変領域のＣＤＲ３ドメインは配列番号１３（配列番号２９で示す）の領域によってエンコードされた配列番号１４（配列番号３０で示す）の領域に対応する。
【００６０】
ＩｇＧ２１Ｇ６の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は図２Ｂに示し（配列番号１９）、そのアミノ酸配列も図２Ｂに示す（配列番号２０）。軽鎖可変領域のＣＤＲ１ドメインは配列番号１９（配列番号２１で示す）によってエンコードされた配列番号２０（配列番号２２で示す）に対応し、軽鎖可変領域のＣＤＲ２ドメインは配列番号１９（配列番号２３で示す）の領域によってエンコードされた配列番号２０（配列番号２４）の領域に対応する。軽鎖可変領域のＣＤＲ３ドメインは、配列番号１９（配列番号３１で示す）領域によってエンコードされた配列番号２０（配列番号３２で示す）の領域に対応する。  遺伝子暗号の縮重のため、他のヌクレオチド配列は本明細書において列挙したアミノ酸配列をエンコードし得る。
【００６１】
ｃＤＮＡ、ゲノムまたは混合物いずれかからの、しばしば、（修飾された制限部位などを除いた）天然配列における、本発明の核酸組成物は標準的技術に従って突然変異させることができる。コード配列については、これらの突然変異は要望どおりアミノ酸配列に影響し得る。特に、天然Ｖ、Ｄ、Ｊ、定常、スイッチおよび本明細書において記載された他のそのような配列と実質的に同一な、またはそれに由来するヌクレオチド配列が考えられる。
【００６２】
例えば、単離された核酸は、図２Ａに示したＩｇＧ２１Ｇ６（または２１Ｇ６  ＩｇＧ）重鎖可変領域ヌクレオチド配列（配列番号１３）、または配列番号１３に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％一致する配列を含むことができる。ある実施形態では、配列番号１３の位置１９〜２１にあるヌクレオチドは、ＴＣＴ，ＴＣＣ，ＴＣＡ，ＴＣＧ，ＣＣＴ，ＣＣＣ，ＣＣＡ，ＣＣＧ，ＡＧＴおよびＡＧＣからなる群より選択される。核酸分子は配列番号１５の重鎖ＣＤＲ１ヌクレオチド配列、またはその一部分を含むことができる。さらに、前記核酸分子は配列番号１７の重鎖ＣＤＲ２ヌクレオチド配列、またはその一部分を含むことができる。また、前記核酸分子は配列番号２９の重鎖ＣＤＲ３ヌクレオチド配列、またはその一部分を含むことができる。例示的な実施形態において、核酸分子は配列番号１５の重鎖ＣＤＲ１ヌクレオチド配列、またはその一部分、配列番号１７の重鎖ＣＤＲ２ヌクレオチド配列、またはその一部分、配列番号２９の重鎖ＣＤＲ３ヌクレオチド配列、またはその一部分を含む。本発明の核酸分子は重鎖配列、例えば、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号２９またはその組合せを含むことができ、あるいは配列番号１３、１５、１７または２９に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％および９９％配列同一性を有するヌクレオチドを含むことができる。さらに、本発明の核酸分子は、ストリンジェントな条件、例えば、低、中程度、高または非常に高いストリンジェンシー条件下で配列番号１３、１５、１７または２９にハイブリダイズする重鎖配列を含むことができる。
【００６３】
もう１つの実施形態において、本発明は、重鎖ポリペプチド、例えば、配列番号１４，１６，１８または２３の重鎖ポリペプチドをエンコードする核酸分子に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％および９９％配列同一性を有する核酸分子を特徴とする。ある実施形態では、配列番号１４の位置７のアミノ酸配列はセリンまたはプロリンを含む。本発明はまた、抗体の重鎖可変領域またはその一部分、例えば、配列番号１４，１６，１８または３０の重鎖可変領域をエンコードする核酸配列にハイブリダイズする核酸分子も特徴とする。
【００６４】
もう１つの実施形態において、単離された核酸は、図２Ｂに示すヌクレオチド配列を有するＩｇＧ２１Ｇ６（２１Ｇ６  ＩｇＧ）軽鎖可変領域ヌクレオチド配列（配列番号１９）、または配列番号１９に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一である配列をエンコードする。前記核酸分子は配列番号２１の軽鎖ＣＤＲ１ヌクレオチド配列、またはその一部分を含むことができる。もう１つの実施形態において、前記核酸分子は配列番号２３の軽鎖ＣＤＲ２ヌクレオチド配列、またはその部分を含むことができる。別の実施形態において、前記核酸分子は、配列番号３１の軽鎖ＣＤＲ３ヌクレオチド、またはその一部分を含むことができる。例示的な実施形態において、前記核酸分子は配列番号２１の軽鎖ＣＤＲ１ヌクレオチド配列、またはその一部分、配列番号２３の軽鎖ＣＤＲ２ヌクレオチド配列、および配列番号３１の軽鎖ＣＤＲ３ヌクレオチド配列、またはその一部分を含む。本発明の核酸分子は軽鎖配列、例えば、配列番号１９，２１，２３，３１またはその組合せを含むことができ、あるいは配列番号１９，２１，２３または３１に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％および９９％配列同一性を有するヌクレオチドを含むことができる。さらなる核酸分子は、ストリンジェントな条件、例えば、低、中程度、高または非常に高いストリンジェンシー条件下で配列番号１９，２１，２３，３１にハイブリダイズする軽鎖配列を含むことができる。
【００６５】
核酸分子は軽鎖ポリペプチド、例えば、配列番号２０，２２，２４または３２の軽鎖ポリペプチドをエンコードする核酸分子に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有することができる。また、本発明は、天然抗体の軽鎖可変領域、またはその一部分、例えば、配列番号２０，２２，２４または３２の軽鎖可変領域をエンコードする核酸配列にハイブリダイズする核酸分子を特徴とする。
【００６６】
もう１つの実施形態において、本発明は、配列番号１６のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１ドメインをエンコードする単離された核酸、またはその断片または修飾形態を提供する。この核酸は、ＣＤＲ１領域のみをエンコードすることができるか、あるいは全抗体重鎖可変領域またはその一部分をエンコードすることができる。例えば、核酸は、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメインを有する重鎖可変領域をエンコードすることができる。さらにもう１つの実施形態において、本発明は、配列番号３０のアミノ酸を含む重鎖ＣＤＲ３ドメインをエンコードする単離された核酸、またはその断片または修飾形態を提供する。この核酸はＣＤＲ２領域のみをエンコードすることができるか、あるいは全抗体重鎖可変領域またはその断片をエンコードすることができる。例えば、前記核酸は配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを有する軽鎖可変領域をエンコードすることができる。
【００６７】
さらにもう１つの実施形態において、本発明は、配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１ドメインをエンコードする単離された核酸、またはその断片または修飾形態を提供する。この核酸はＣＤＲ１領域のみをエンコードすることができるか、あるいは全抗体軽鎖可変領域をエンコードすることができる。例えば、前記核酸は配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメインを有する軽鎖可変領域をエンコードすることができる。単離された核酸は配列番号３２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３ドメイン、またはその断片または修飾形態をエンコードすることもできる。この核酸はＣＤＲ２領域のみをエンコードすることができるか、あるいは抗体軽鎖可変領域全体をエンコードすることができる。例えば、前記核酸は配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを有する軽鎖可変領域をエンコードすることができる。
【００６８】
重鎖または軽鎖可変領域をエンコードする核酸はネズミまたはヒト起源のものであり得、あるいはネズミおよびヒトアミノ酸配列の組合せを含むことができる。例えば、核酸は配列番号１４のＣＤＲ１（配列番号１６）および／または配列番号１４のＣＤＲ２（配列番号１８）および／または配列番号１４のＣＤＲ３（配列番号３０）を含む重鎖可変領域、およびヒトフレームワーク配列をエンコードすることができる。さらに、前記核酸は配列番号２０のＣＤＲ１（配列番号２２）および／または配列番号２０のＣＤＲ２（配列番号２４）および／または配列番号２０のＣＤＲ３（配列番号３２）を含む軽鎖可変領域、およびヒトフレームワーク配列をエンコードすることができる。本発明は、さらに、前記核酸を含有するベクター、および発現ベクターを含む宿主細胞を含む。
【００６９】
本発明はまた、ＩｇＧ２１Ｇ６重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域のポリペプチドおよび断片も特徴とする。本明細書に記載の核酸によってエンコードされるポリペプチドのいずれも本発明の範囲にある。例示的な実施形態において、単離されたポリペプチドは、例えば、配列番号２０，２２，２４または３２のアミノ酸配列、またはその断片または組合せ；または配列番号１４，１６，１８または３０またはその断片または組合せを含む。本発明のポリペプチドは、配列番号２０，２２，２４，３２，１４，１６，１８または３０とは異なり少なくとも、２０、１０、５、４、３、２または１以下のアミノ酸を有するポリペプチドを含む。例示的なポリペプチドは、生物学的活性、例えば、Ｎ２自己ペプチドに結合する能力および／または補体の活性化を阻害する能力および／または炎症を抑制する能力を保有するポリペプチドである。もう１つの実施形態において、前記ポリペプチドは、軽鎖可変領域、またはその一部分、例えば、配列番号２０，２２，２４または３２の軽鎖可変領域ポリペプチドに対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％および９９％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。もう１つの実施形態において、前記ポリペプチドは、重鎖可変領域、またはその一部分、例えば、配列番号１４，１６，１８または３０の重鎖可変領域ポリペプチドに対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％および９９％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。もう１つの実施形態において、本発明は、配列番号２０および配列番号１４のアミノ酸配列を含み、さらにＩＲＥＳ配列を含むポリペプチドを特徴とする。
【００７０】
本発明の一実施形態において、Ｎ２自己ペプチドに免疫特異的に結合する抗体は、配列番号１６のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ１を含む。他の実施形態において、Ｎ２自己ペプチドに免疫特異的に結合する抗体は、配列番号１８のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２を含む。  他の実施形態において、Ｎ２自己ペプチドに免疫特異的に結合する抗体は、配列番号３０のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３を含む。
【００７１】
他の実施形態において、Ｎ２自己ペプチドに免疫特異的に結合する抗体は、配列番号１６のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ１および配列番号１８のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２を含む。他の実施形態において、Ｎ２自己ペプチドに免疫特異的に結合する抗体は、配列番号１６のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ１および配列番号３０のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３を含む。さらに別の実施形態において、Ｎ２自己ペプチドに免疫特異的に結合する抗体は、配列番号１８のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２および配列番号３０のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３を含む。他の実施形態において、Ｎ２自己ペプチドに免疫特異的に結合する抗体は、配列番号１６のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号１８のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２および配列番号３０のアミノ酸を有するＶＨ  ＣＤＲ３を含む。
【００７２】
本発明の一実施形態において、Ｎ２自己ペプチドに免疫特異的に結合する抗体は、配列番号２２のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ１を含む。他の実施形態において、Ｎ２自己ペプチドに免疫特異的に結合する抗体は、配列番号２４のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２を含む。他の実施形態において、Ｎ２自己ペプチドに免疫特異的に結合する抗体は、配列番号３２のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３を含む。
【００７３】
他の実施形態において、Ｎ２自己ペプチドに免疫特異的に結合する抗体は、配列番号２２のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ１および配列番号２４のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２を含む。他の実施形態において、他の実施形態において、Ｎ２自己ペプチドに免疫特異的に結合する抗体は、配列番号２２のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ１および配列番号３２のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３を含む。他の実施形態において、Ｎ２自己ペプチドに免疫特異的に結合する抗体は、配列番号２４のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２および配列番号３２のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３を含む。さらに別の実施形態において、さらに別の実施形態において、Ｎ２自己ペプチドに免疫特異的に結合する抗体は、配列番号２２のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号２４のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２、および配列番号３２のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３を含む。
【００７４】
一実施形態において、本発明の抗体は、配列番号１６のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ１および配列番号２２のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ１を含む。他の実施形態において、本発明の抗体は、配列番号１６のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ１および配列番号２４のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２を含む。他の実施形態において、本発明の抗体は、配列番号１６のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ１および配列番号３２のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３を含む。
【００７５】
他の実施形態において、本発明の抗体は、配列番号１８のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２および配列番号２２のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ１を含む。他の実施形態において、本発明の抗体は、配列番号１８のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２および配列番号２４のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２を含む。他の実施形態において、他の実施形態において、本発明の抗体は、配列番号１８のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２および配列番号３２のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３を含む。
【００７６】
他の実施形態において、本発明の抗体は、配列番号３０のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３および配列番号２２のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ１を含む。他の実施形態において、本発明の抗体は、配列番号３０のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３および配列番号２４のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２を含む。好ましい実施形態において、本発明の抗体は、配列番号３０のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３および配列番号３２のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３を含む。
【００７７】
４．３  修飾された抗炎症抗体
本明細書に記載の性質を有するその他の抗Ｎ２抗炎症抗体を生成することもできる。抗体の生成方法は当該分野では周知であり、修飾された抗Ｎ２抗炎症抗体の生成に用いてもよい。
【００７８】
ある実施形態において、重鎖および軽鎖のＶ領域ドメインは同一ポリペプチド上で発現させ、フレキシブルなリンカーによって接合して、単回鎖Ｆｖ断片を形成し、ｓｃＦＶ遺伝子を引き続いて所望の発現ベクターまたはファージゲノムにクローン化することができる。ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら．，Ｎａｔｕｒｅ  （１９９０）３４８：５５２−５５４に一般的に記載されているように、フレキシブルな（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３リンカー（配列番号３５）によって接合された抗体の完全なＶＨおよびＶＬドメインを用いて、一本鎖抗体を生産することができ、これはディスプレイパッケージを抗原親和性に基づいて分離可能とすることができる。抗原と免疫反応性の単離されたｓｃＦＶ抗体を、引き続いて、本方法で用いるために医薬製剤に処方することができる。
【００７９】
本発明の抗体は、可変領域、またはその一部分、例えば、相補性決定領域（ＣＤＲ）が非ヒト生物、例えば、ラットまたはマウスにおいて創製されるものであり得る。キメラ、ＣＤＲ−グラフテッド、およびヒト化抗体は本発明内のものである。非ヒト生物、例えば、ラットまたはマウスで創製され、次いで、例えば、可変フレームワークまたは定常領域において修飾されて、ヒトにおける抗原性を低下させた抗体は本発明の範囲内のものである。抗体が少なくとも１つの抗原結合部分を有する限り、いずれの修飾も本発明の範囲内のものである。
【００８０】
キメラ抗体（例えば、マウス−ヒトモノクローナル抗体）は当技術分野において知られた組換えＤＮＡ技術によって産生することができる。例えば、ネズミ（または他の種）のモノクローナル抗体分子のＦｃ定常領域をエンコードする遺伝子を制限酵素で消化して、ネズミＦｃをエンコードする領域を除去し、ヒトＦｃ定常領域をエンコードする遺伝子の同等部分を置換する（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，国際特許公開ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９；Ａｋｉｒａ，ｅｔ  ａｌ．，欧州特許出願１８４，１８７；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｍ．，欧州特許出願１７１，４９６；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，欧州特許出願１７３，４９４；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，国際出願ＷＯ  ８６／０１５３３；Ｃａｂｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第４，８１６，５６７号；Ｃａｂｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，欧州特許出願１２５，０２３；Ｂｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１−１０４３）；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）ＰＮＡＳ  ８４：３４３９−３４４３；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：３５２１−３５２６；Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）ＰＮＡＳ  ８４：２１４−２１８；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．４７：９９９−１００５；Ｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８５）  Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４４６−４４９；およびＳｈａｗ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８０：１５５３−１５５９参照）。
【００８１】
キメラ抗体は、抗体結合に直接的には関与しないＦｖ可変領域の配列を、ヒトＦｖ可変領域からの同等な配列で置き換えることによってさらにヒト化することができる。ヒト化抗体を創製するための一般的な方法は、その全ての内容を参照により本明細書に組み入れる、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２−１２０７、Ｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ４：２１４、およびＱｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，の米国特許第５，５８５，０８９号、米国特許第５，６９３，７６１号および米国特許第５，６９３，７６２号によって提供される。これらの方法は、重鎖または軽鎖の少なくとも１つからの免疫グロブリンＦｖ可変領域の全てまたは一部をエンコードする核酸配列を単離し、操作し、および発現させることを含む。そのような核酸の源は当業者に周知であり、例えば、７Ｅ３、抗ＧＰＩＩｂＩＩＩａ抗体生産ハイブリドーマから得ることができる。次いで、キメラ抗体をエンコードする組換えＤＮＡ、またはその断片を適当な発現ベクターにクローン化することができる。または、適当なヒト化抗体をＣＤＲ置換によって生産することができる。米国特許第５，２２５，５３９号；Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６  Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５５２−５２５；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４；およびＢｅｉｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：４０５３−４０６０。
【００８２】
ヒト化またはＣＤＲ−グラフテッド抗体はＣＤＲ−グラフティングまたはＣＤＲ置換によって生産することができ、ここに、免疫グロブリン鎖の１、２または全てのＣＤＲは置き換えることができる。例えば、その全ての内容を明示的に参照により本明細書に組み入れる、米国特許第５，２２５，５３９号；Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．１９８６  Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５５２−５２５；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．１９８８  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４；Ｂｅｉｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９８８  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：４０５３−４０６０；Ｗｉｎｔｅｒの米国特許第５，２２５，５３９号参照。Ｗｉｎｔｅｒは、本発明のヒト化抗体を調製するのに用いることができるＣＤＲ−グラフティング方法を記載する（その内容をここに明示的に引用して援用する、１９８７年３月２６日に出願されたＵＫ特許出願ＧＢ２１８８６３８Ａ；Ｗｉｎｔｅｒの米国特許第５，２２５，５３９号）。
【００８３】
ヒト化またはＣＤＲ−グラフテッド抗体は、ドナーＣＤＲで置換された（免疫グロブリン重鎖および／または軽鎖の）、少なくとも１つまたは２つであるが、一般的には全ての受容体ＣＤＲを有するであろう。好ましくは、ドナーはげっ歯類抗体、例えば、ラットまたはマウス抗体であり、受容体はヒトフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークであろう。典型的には、ＣＤＲを提供する免疫グロブリンは「ドナー」と呼ばれ、フレームワークを提供する免疫グロブリンは「アクセプター」と呼ばれる。１つの実施形態において、ドナー免疫グロブリンは非ヒト（例えば、げっ歯類）である。アクセプターフレームワークは天然に生じる（例えば、ヒト）フレームワークまたはコンセンサスフレームワーク、またはそれに対して約８５％以上、好ましくは９０％、９５％、９９％以上同一の配列であり得る。
【００８４】
特定の抗体のＣＤＲの全ては非ヒトＣＤＲの少なくとも一部で置き換えることができ、あるいはＣＤＲのいくつかのみを非ヒトＣＤＲで置き換えることができる。ヒト化抗体のＦｃ受容体への結合に必要なＣＤＲの数を置き換えるのが必要なのに過ぎない。
【００８５】
また、特定のアミノ酸が置換され、欠失され、または付加されたキメラおよびヒト化抗体は本発明の範囲内にある。特に、好ましいヒト化抗体は、抗原への結合を改良するようにフレームワーク領域においてアミノ酸置換を有する。例えば、ヒト化抗体は、ドナーフレームワーク残基と、または受容体フレームワーク残基以外のもう１つのアミノ酸と同一であるフレームワーク残基を有するであろう。もう１つの例として、マウスＣＤＲを有するヒト化抗体において、ヒトフレームワーク領域に位置したアミノ酸は、マウス抗体における対応する位置に位置するアミノ酸で置き換えることができる。ヒト化抗体の別の例には、マウス可変領域を有するがヒトＦｃ領域を有するようには修飾されないマウスモノクローナル抗体である。そのような置換は、いくつかの場合においてヒト化抗体の抗原への結合を改良することが公知である。
【００８６】
また、本明細書に記載の抗体にアミノ酸の置換、除去または添加を行って炎症を抑制または阻害することもできる。例えば、ＩｇＧ定常部の２９７位のアスパラギンをアラニン（Ｎ２９７Ａ）で置換してグリコシル化を抑制して、補体を活性化しＦｃ受容体を結合する能力を活性化することもできる（例えば、Ｌｅａｔｈｅｒｂａｒｒｏｗ  ＲＪ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９８５）  Ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ａ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ  ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ２ａ：  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ＣＩ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｙｔｅ  Ｆｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．（英語からの翻訳）  Ｍｏ  Ｉ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２２（４）：４０７−４１５；  Ｔａｏ  ＭＨ  ＆  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ＳＬ  （１９８９）  Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｍｏｕｓｅ−ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ．  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ  ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｒｅｇｉｏｎ．  （英語からの翻訳）  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４３（８）：２５９５−２６０１；  ａｎｄ  Ｋａｂａｔ  （１９８７）  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ  （Ｉｎ：  ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓを参照されたい）。これら参照物の内容を本明細書に明示的に援用する。
【００８７】
本発明の抗体断片は、当業者に公知の慣用的手法を用いて得られる。例えば、抗体のペプシンでの消化により、Ｆ（ａｂ’）２断片および複数の小さな断片が生じる。抗体のメルカプトエタノール還元により、個々の重鎖および軽鎖が生じる。抗体のパパインでの消化により、個々のＦａｂ断片およびＦｃ断片が生じる。
【００８８】
本発明はまた、抗炎症抗体を生成する方法も特徴とする。前記方法には、例えば、非保存領域、ドメインまたは本明細書に開示の残基の１以上を置換または除去することによって抗体の配列を変えること、および変えられたポリペプチドについて、Ｎ２への結合および補体活性化の阻害を調べることを含む。
【００８９】
ある実施形態において、修飾された抗体は、配列番号８の少なくともＣＤＲ１領域（配列番号１０）、またはその抗原結合部分、および／または配列番号８の少なくともＣＤＲ２領域（配列番号１２）、またはその抗原結合部分を含むことができる。もう１つの実施形態において、修飾された抗体は、配列番号２の少なくともＣＤＲ１領域（配列番号４）、またはその抗原結合部分、および／または配列番号２の少なくともＣＤＲ２領域（配列番号６）、またはその抗原結合部分を含むことができる。例示的な実施形態において、修飾された抗体は、配列番号８のＣＤＲ１領域（配列番号１０）および配列番号８のＣＤＲ２領域（配列番号１２）またはその抗原結合部分を含む。もう１つの例示的な実施形態において、修飾された抗体は、配列番号２のＣＤＲ１領域（配列番号４）および配列番号２のＣＤＲ２領域（配列番号６）またはその抗原結合部分を含む。また、修飾された抗体は、配列番号８のＣＤＲ１領域（配列番号１０）および配列番号８のＣＤＲ２領域（配列番号１２）を含むことができ、修飾された抗体は、配列番号２のＣＤＲ１領域（配列番号４）、および配列番号２のＣＤＲ２領域（配列番号６）またはその抗原結合部分を含む。
【００９０】
ある実施形態において、修飾された抗体は、配列番号２０の少なくともＣＤＲ１領域（配列番号２２）、またはその抗原結合部分、および／または配列番号２０の少なくともＣＤＲ２領域（配列番号２４）、またはその抗原結合部分を含むことができる。修飾された抗体は、配列番号１４の少なくともＣＤＲ１領域（配列番号１６）、またはその抗原結合部分、および／または配列番号１４の少なくともＣＤＲ２領域（配列番号１８）、またはその抗原結合部分を含むことができる。例示的な実施形態において、修飾された抗体は、配列番号２０のＣＤＲ１領域（配列番号２２）および配列番号２０のＣＤＲ２領域（配列番号２４）またはその抗原結合部分を含む。また、修飾された抗体は、配列番号８のＣＤＲ１領域（配列番号１０）および配列番号８のＣＤＲ２領域（配列番号１２）を含むことができ、修飾された抗体は、配列番号２のＣＤＲ１領域（配列番号４）、および配列番号２のＣＤＲ２領域（配列番号６）またはその抗原結合部分を含む。もう１つの例示的な実施形態において、修飾された抗体は、配列番号１４のＣＤＲ１領域（配列番号１６）および配列番号１４のＣＤＲ２領域（配列番号１８）またはその抗原結合部分を含む。修飾された抗体はまた配列番号２０（配列番号２２）のＣＤＲ１領域および配列番号２０  （配列番号２４）のＣＤＲ２領域も含み得、修飾された抗体は、配列番号１４（配列番号１６）のＣＤＲ１領域および配列番号１４（配列番号１８）のＣＤＲ２領域またはそれらの抗原結合部位を含み得る。
【００９１】
もう１つの実施形態において、修飾された抗体は、配列番号２の少なくともＣＤＲ１領域（配列番号４）、またはその抗原結合部分、および／または配列番号２の少なくともＣＤＲ２領域（配列番号６）、またはその抗原結合部分を含むことができる。例示的な実施形態において、修飾された抗体は、配列番号８のＣＤＲ１領域（配列番号１０）および配列番号８のＣＤＲ２領域（配列番号１２）またはその抗原結合部分を含む。もう１つの例示的な実施形態において、修飾された抗体は、配列番号２のＣＤＲ１領域（配列番号４）および配列番号２のＣＤＲ２領域（配列番号６）またはその抗原結合部分を含む。また、修飾された抗体は、配列番号８のＣＤＲ１領域（配列番号１０）および配列番号８のＣＤＲ２領域（配列番号１２）を含むことができ、修飾された抗体は、配列番号２のＣＤＲ１領域（配列番号４）、および配列番号２のＣＤＲ２領域（配列番号６）またはその抗原結合部分を含む。
【００９２】
修飾された抗体は、受託番号ＰＴＡ−９３９２またはＰＴＡ−９３９３を有するＡＴＣＣに受託されたハイブリドーマによって生じた抗体の結合親和性と同様な、例えば、それよりも大きな、それよりも小さな、またはそれと同等なＮ２自己抗原に対する結合親和性を有するヒト抗体であり得る。もう１つの実施形態において、抗体は非ヒト抗体、例えば、ウシ、ヤギ、マウス、ラット、ヒツジ、ブタ、またはウサギであり得る。例示的な実施形態において、非ヒト抗体はネズミ抗体である。また、抗体は組換え抗体であり得る。例示的な実施形態において、抗体はヒト化抗体である。修飾された抗体はＩｇＧ抗体であり得る。もう１つの実施形態において、単離された抗体は、寄託番号ＰＴＡ−９３９２またはＰＴＡ−９３９３を有するＡＴＣＣに受託されたハイブリドーマによって生じた免疫グロブリンと同一の抗原特異性を保有する。ある実施形態において、前記抗体はアクセッション番号ＰＴＡ−９３９２またはＰＴＡ−９３９３を有するＡＴＣＣに受託されたハイブリドーマによって生じた抗体と同一の抗原特異性を保有する（ここで、前記抗体はヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体またはそれらの断片である）。
【００９３】
抗体を修飾して、例えば、溶解性を増大させ、および／または精製、同定、検出および／または構造的特徴付けを容易とすることができる。例示的な修飾は、例えば、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、プロテインＡ、プロテインＧ、カルモジュリン結合ペプチド、チオレドキシン、マルトース結合タンパク質、ＨＡ、ｍｙｃ、ポリ−アルギニン、ポリ−Ｈｉｓ、ポリ−Ｈｉｓ−ＡｓｐまたはＦＬＡＧ融合タンパク質およびタグの付加を含む。種々の実施形態において、抗体は一つまたは複数の異種融合を含むことができる。例えば、ペプチドは同一融合ドメインの複数コピーを含有することができるか、あるいは２以上の異なるドメインに対する融合を含むことができる。前記融合はペプチドのＮ末端において、前記ペプチドのＣ末端において、あるいは前記ペプチドのＮおよびＣ末端の双方において起こることができる。また、リンカー配列を本発明のペプチドおよび融合ドメインの間に含めて、融合タンパク質の構築を容易とし、あるいはタンパク質発現、または融合タンパク質の構造的拘束を最適化するのは本発明の範囲内のものである。もう１つの実施形態において、ペプチドは、融合ペプチドおよび本発明のペプチドの間にプロテアーゼ切断部位を含有して、タンパク質発現の後に、またはその後にタグを除去するように構築することができる。適当なエンドプロテアーゼの例は、例えば、Ｘａ因子およびＴＥＶプロテアーゼを含む。
【００９４】
融合遺伝子を作成する技術は周知である。本質的に、異なるポリペプチド配列をエンコードする種々のＤＮＡ断片の接合は、連結用の平滑末端またはスタガー末端、適当な末端を提供するための制限酵素消化、適切には粘着末端のフィリングイン、望ましくない接合を回避するためのアルカリ性ホスファターゼ処理、および酵素的連結を使用して、慣用的技術に従って行われる。もう１つの実施形態において、融合遺伝子は、自動ＤＮＡシンセサイザーを含む慣用的技術によって合成することができる。または、遺伝子断片のＰＣＲ増幅は、２つの連続的遺伝子断片の間に相補的突出を生起させ、引き続いてアニールしてキメラ遺伝子配列を創製することができるアンカープライマーを用いて行うことができる（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ：１９９２参照）。
【００９５】
抗体はポリマーへの結合に基づいて化学的に修飾することができる。プライマーは、典型的には、それが付着する抗体が生理学的環境のような水性環境中で沈殿しないように水溶性である。ポリマーは、重合度を制御することができるように、アシル化のための活性エステル、またはアルキル化のためのアルデヒドのような単回の反応性基を有することができる。好ましい反応性アルデヒドは耐水性であるポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、またはそのモノＣ１−Ｃ１０アルコキシまたはアリールオキシ誘導体である（米国特許第５，２５２，７１４号参照）。ポリマーは分岐または非分岐であってよい。好ましくは、最終産物の調製の治療的使用のために、ポリマーは薬学的に許容されるものであろう。水溶性ポリマー、またはその混合物は、所望であれば、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、デキストラン、セルロース、または他の炭水化物ベースのポリマー、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキサイド／エチレンオキサイドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）およびポリビニルアルコールからなる群より選択することができる。
【００９６】
４．４  抗体の調製法
細胞培養アッセイおよび動物実験から得られたデータは、ヒトで用いるある範囲の用量を処方するのに用いることができる。抗体の用量は、好ましくは、ほとんどまたは全く毒性がないＥＤ５０を含むある範囲の循環濃度内にある。用量は、使用する投与形態および利用する投与経路に依存してこの範囲内で変化し得る。本発明の方法で用いるいずれの抗体についても、治療的有効用量は細胞培養アッセイからまず見積もることができる。用量は動物モデルで処方して、細胞培養で決定されたＩＣ５０（すなわち、兆候の半最大阻害を達成するテスト化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成することができる。そのような情報を用いて、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定することができる。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定することができる。
【００９７】
もう１つの実施形態において、抗体の単回ボーラスを、組織障害に先立って、それと同時に、またはそれに引き続いて投与する。典型的には、単回用量注射は組織障害後数時間、数日または数週間であろう。本発明は、抗炎症抗体が再灌流障害を抑制または阻止するという知見に部分的には基づく。単回単位投与送達は障害の部位に直ぐ隣接させることができるか、あるいは例えば、障害の部位へ排出する、またはそこへ流れる容器に対するものとすることができる。
【００９８】
抗炎症抗体は、最初に、標的器官または組織の損傷の時点に先立った時点において投与する。これは、再灌流障害の履歴を有する対象、または外科的治療を受けようとしている対象のような、再灌流障害の危険性があると決定される対象において有用なアプローチであろう。
【００９９】
なおもう１つの実施形態において、抗炎症抗体の単回ボーラスに続いて、連続的注入またはさらなる単回ボーラス送達として抗炎症抗体を引き続いて投与する。抗炎症抗体は数時間、数日、数週間、数ヶ月または数年の期間にわたって順次に暴露させて投与することができる。加えて、さらなる治療剤を、抗炎症抗体の投与に先立って、または引き続いて組み合わせて投与することができると考えられる。抗炎症抗体とともに投与することができる他の治療剤は、限定されるものではないが、抗凝集剤および補体阻害剤を含む。
【０１００】
本抗炎症抗体は薬学的に許容される担体中にて提供することができるか、あるいは全身および局所または局所化された投与を含む種々の投与様式のために処方することができる。技術および処方は、一般的には、Ｒｅｍｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｍｅａｄｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡに見出すことができる。ある実施形態において、前記抗体は経粘膜または経皮送達のために提供される。そのような投与のために、浸透すべきバリアーに対して適切な浸透剤をポリペプチドとともに処方で用いる。そのような浸透剤は一般には当技術分野において公知であり、例えば、経粘膜投与では、胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体を含む。加えて、洗剤を用いて浸透を容易とすることができる。経粘膜投与は鼻スプレーを介して、または坐薬を用いて行うことができる。局所投与では、本発明の組成物は当技術分野において一般的に公知の軟膏、膏薬、ゲルまたはクリームに処方される。
【０１０１】
本発明の薬学的組成物は、抗炎症抗体を担体、賦形剤および添加剤または補助剤を用いて、対象への投与に適した形態にすることによって調製される。頻繁に使用される担体または補助剤は炭酸マグネシウム、二酸化チタン、ラクトース、マンニトールおよび他の糖、タルク、乳タンパク質、ゼラチン、澱粉、ビタミン、セルロースおよびその誘導体、動物および植物油、ポリエチレングリコール、ならびに滅菌水、アルコール、グリセロールおよび多価アルコールのような溶媒を含む。静脈内ビヒクルは流体および栄養補給剤を含む。保存剤は抗微生物剤、抗酸化剤、キレート化剤および不活性ガスを含む。他の薬学的に許容される担体は、例えば、、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  １５ｔｈ  ｅｄ．Ｅａｓｔｏｎ：Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，１４０５−１４１２，１４６１−１４８７（１９７５）およびＴｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ  ＸＩＶ．，１４ｔｈ  ｅｄ．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ：Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  （１９７５）に記載された、水性溶液、非毒性賦形剤（塩を含む）、保存剤、緩衝液などを含み、その内容は参照により本明細書に組み入れられる。薬学的組成物の種々の成分のｐＨおよび正確な濃度は当技術分野においてルーチン的技量に従って調整される。Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（７ｔｈ  ｅｄ．）参照。
【０１０２】
薬学的組成物は投与単位にて好ましくは調製され、投与される。固体投与単位は錠剤、カプセルおよび坐薬であり、例えば、アルギネートベースのｐＨ依存性放出ゲルキャップを含む。対象の治療では、化合物の活性、投与の方法、障害の性質および重症度、対象の年齢および体重に応じて、異なる日用量が必要である。しかしながら、ある状況下では、より高いまたはより低い日用量が適切であろう。日用量の投与は、個々の投与単位の形態での単一投与によって、またはいくつかのより小さな投与単位によって、および特定の間隔での小分けされた用量の複数投与によって行うことができる。
【０１０３】
本発明による薬学的組成物は治療上有効量にて局所または全身投与することができる。この使用のための有効な量は、勿論、疾患の重症度、および対象の体重および一般的状態に依存するであろう。前記したように、インビトロで用いる用量は、薬学的組成物のインサイチュー投与で有用な量において有用なガイダンスを提供することができ、動物モデルを用いて、特定の障害の治療のための有効な用量を決定することができる。種々の考慮は、例えば、その各々を参照により本明細書に組み入れる、Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９：１５２７，（１９９０）；Ｇｉｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）（１９９０）に記載されている。
【０１０４】
１つの実施形態において、本発明は、抗体結合ペプチドをそのような治療を必要とする対象に投与するのに有用な薬学的組成物を提供する。本発明の薬学的組成物の「投与」は、当業者に公知のいずれの手段によって達成することもできる。好ましくは、「対象」とは哺乳動物、最も好ましくはヒトを意味する。
【０１０５】
抗炎症抗体は非経口、腸、注射、迅速注入、鼻咽頭吸収、皮膚吸収、直腸および経口投与することができる。非経口投与用の薬学的に許容される担体製剤は滅菌または水性もしくは非水性溶液、懸濁液およびエマルジョンを含む。非水性溶媒の例はプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、およびオレイン酸エチルのような注射可能な有機エステルである。閉塞包帯用の担体を用いて、皮膚の透過性を増加させ、抗原の吸収を増強させることができる。経口投与用の液体投与形態は、一般には、液体投与形態を含有するリポソーム溶液を含む。適当な固体または液体医薬製剤形態は、例えば、顆粒、粉末、錠剤、被覆錠剤、（ミクロ）カプセル、坐薬、シロップ、エマルジョン、懸濁液、クリーム、エアロゾル、点剤、またはアンプル形態の注射溶液、および活性化合物が遅延放出される製剤、その製剤において、崩壊剤、結合剤、コーティング剤、膨張剤、滑沢剤、香味料、甘味剤のような賦形剤および添加剤および／または補助剤、および精製水のような当技術分野において通常使用される不活性希釈剤を含有するエリキシルである。疾患または障害が胃腸障害である場合、経口処方または坐薬処方が好ましい。
【０１０６】
滅菌注射溶液は、必要な量（例えば、約１０μｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ）の抗体結合ペプチドを適当な溶媒に取り込み、次いで、滅菌濾過によるなどして滅菌することによって調製することができる。さらに、粉末は、凍結乾燥または真空乾燥のような標準的技術によって調製することができる。
【０１０７】
もう１つの実施形態において、抗炎症抗体は、ＧＩ管中での徐放のための、または活性の意図する部位への長期活性剤放出特徴を有する標的器官移植のための徐放特徴用の生分解性担体で調製される。生分解性ポリマーは、例えば、エチレンビニルアセテート、ポリアンヒドリド、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ酢酸を含む。リポソーム処方を用いることもできる。
【０１０８】
抗炎症抗体を送達するもう１つの手段は、抗体結合ペプチドを修復を必要とする部位または組織へ至急送るものを宿主細胞に送達することによる。または、細胞は、三次元構造に形成された生体適合性生分解性または非生分解性スポンジ（例えば、コラーゲン、または他の細胞外マトリックス物質）、コットン、ポリグリコール酸、ネコ腸縫合、セルロース、ゼラチン、デキストラン、ポリアミド、ポリエステル、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリアクリレート、ポリビニル、ポリカルボネート、ポリテトラフルオロエチレン、またはニトロセルロース化合物を含む種々の送達ビヒクルと共に送達される（例えば、その開示は参照により本明細書に組み入れられる、Ｎａｕｇｈｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．に対する米国特許第５，８５８，７２１号参照）。
【０１０９】
有効成分に適合するいずれの投与経路を用いることもできる。好ましいのは、皮下、筋肉内または静脈内注射のような非経口投与である。投与すべき有効成分の用量は、患者の年齢、体重および個々の応答にしたがって、医薬処方に基づいて依存する。
【０１１０】
患者のための非重み付け一日量は約２．５〜５．０ｍｇ／Ｋｇの間、例えば、約２．５〜３．０ｍｇ／Ｋｇ、約３．０〜３．５ｍｇ／Ｋｇ、約３．５〜４．０ｍｇ／Ｋｇ、約４．０〜４．５ｍｇ／Ｋｇ、および約４．５〜５．０ｍｇ／Ｋｇであり得る。
【０１１１】
非経口投与用の薬学的組成物は、有効成分および適当なビヒクルを含む注射可能形態に調製することができる。非経口投与用のビヒクルは当技術分野において周知であり、例えば、水、生理食塩水、リンゲル液および／またはデキストロースを含む。ビヒクルは、医薬製剤の安定性および等張性を維持するために少量の賦形剤を含有することができる。引用した溶液の調製は通常の様式に従って行うことができる。
【０１１２】
本発明を特定な実施形態を参照して記載してきたが、前記記載の内容は、特許請求の範囲の意味および目的を超えることなく当業者によって行うことができる、保存的アミノ酸置換をはじめとする全ての修飾および置換を含む。組成物は、所望であれば、有効成分を含有する一つまたは複数の単位投与形態を含有することができるパックまたはディスペンサーデバイスにて供することができる。パックは、例えば、ブリスターパックのような、金属またはプラスチックホイルを含むことができる。パックまたはディスペンサーデバイスには投与用の指令書を伴うことができる。
【０１１３】
４．５  抗炎症抗体で治療することができる疾患および疾患
抗炎症抗体は、天然ＩｇＧ抗体の結合によってトリガーされる多数の炎症性疾患および疾患を治療するのに用いることができる。例えば、抗炎症抗体を用いて、再灌流障害、虚血障害、発作、自己免疫溶血性貧血、特発性血小板減少症紫斑病、慢性関節リウマチ、腹腔病、高ＩｇＧ免疫不全症、動脈硬化症、冠動脈病、敗血症、心筋炎、脳炎、移植拒絶、肝炎、甲状腺炎（例えば、橋本甲状腺炎、グラーベ病）、骨粗鬆症、多発性筋炎、皮膚筋炎、Ｉ型糖尿病、痛風、皮膚炎、円形脱毛症、全身エリテマトーデス、苔癬硬化症、潰瘍性大腸炎、糖尿病性網膜症、胎盤炎症性疾患、歯周疾患、動脈炎、若年性慢性関節炎（例えば、慢性虹彩毛様体炎）、乾癬、骨粗鬆症、真性糖尿病における腎臓障害、喘息、胎盤炎症性疾患、慢性炎症肝臓病、慢性炎症肺病、肺線維症、肝臓線維症、慢性関節リウマチ、慢性炎症肝臓病、慢性炎症肺病、肺線維症、肝臓線維症、クローン病、潰瘍性大腸炎、火傷障害（または熱障害）、および中枢神経系（ＣＮＳ；例えば、多発性硬化症）、胃腸系、皮膚および関連構造、免疫系、肝臓−胆嚢系、または病理が炎症成分で起こり得る身体中のいずれかの部位の他の急性および慢性炎症性疾患のような炎症性疾患または障害を治療することができる。したがって、本明細書では、本明細書に記載の抗炎症抗体を患者に投与することによって患者の虚血性抗原に対する免疫応答の活性化を抑制する方法を記載する。
【０１１４】
さらなる態様では、本発明は、本明細書に記載の抗炎症抗体を含む薬学的組成物を患者に投与することによって、例えば虚血／再灌流障害といった患者の炎症性疾患または障害を治療する方法を特徴とする。
【０１１５】
再灌流または虚血障害のような炎症疾患は、例えば、発作または心筋梗塞として天然に生じるエピソード後に起こり得る。再灌流または虚血障害は外科的手法の間におよび／または後にも起こり得る。障害を引き起こし得る例示的な外科的手法は血管形成術、ステンティング手法、アトローム切除術およびバイパス外科治療からなる群より選択される血管−腐食性技術を含む。例示的な実施形態において、再灌流または虚血障害は心臓のような心血管組織で起こる。
【０１１６】
加えて、天然ＩｇＧ抗体の結合によってトリガーされる疾患または疾患は、病原免疫グロブリン（例えば、本明細書において記載されたＢ−１細胞）を生産する天然または病原性ＩｇＧおよび／またはＢ細胞を対象から除去し、または不活化し、それにより、対象に存在する病原免疫グロブリンおよび／またはＢ細胞の量を減少させることによって、対象において治療または予防することができる。
【０１１７】
本明細書において記載された方法は、病原免疫グロブリン、例えば、本明細書において記載された病原性ＩｇＧ、および／または病原性ＩｇＧを産生するＢ−細胞（例えば、本明細書において記載されたＢ−１細胞）を対象から除去し、または不活化し、それにより、対象に存在する病原免疫グロブリンおよび／またはＢ細胞の量を減少させることを含むことができる。
【０１１８】
１つの実施形態において、前記除去または不活化工程はエクスビボで行われる。病原免疫グロブリンまたはＢ細胞は血液灌流によって除去することができる。または、Ｂ細胞は、Ｂ細胞特異的抗体（例えば、抗Ｂ−１抗体または抗ＣＤ５抗体または抗ＣＤ１１Ｇ／ＣＤ１８）を用いて除去することができる。病原免疫グロブリン、例えば、ＩｇＧは、対象からの血液を固定化抗原（例えば、虚血特異性抗原）または固定化抗イディオタイプ抗体と接触させることによって除去することができる。病原免疫グロブリンの除去または不活化工程は、抗イディオタイプ抗体を対象に投与することによって行うことができる。もう１つの実施形態において、Ｂ細胞の除去または不活化工程は、トキシン、例えば、リシンまたはジフテリアトキシンにカップリングされたＢ細胞標的化部位（例えば、抗体または抗原）を対象に投与することによって行われる。前記対象は哺乳動物、例えば、げっ歯類（例えば、マウス）または霊長類（例えば、ヒト）である。例示的な実施形態において、対象は、例えば、発作としての天然に生じるエピソードに続いて再灌流または虚血障害を維持し、除去工程は、天然に生じるエピソードの後数分、１〜５時間、５〜１０時間、１０〜２０時間、１日〜５日以内に行われる。もう１つの例示的な実施形態において、再灌流または虚血障害は心血管組織、例えば、心臓で起こり、再灌流または虚血障害は、外科的手法に先立って、その間および／または後に病原免疫グロブリンおよび／またはＢ細胞を対象から除去することによって予防しおよび／または減少させる。例えば、除去工程は、外科的手法に少なくとも１〜５時間、５〜１０時間、１０〜２０時間、または１、２または３日先立って行うことができる。また、除去工程は、外科的手法の間におよび後に適当な時間間隔で継続することもできる。
【実施例】
【０１１９】
一般的に記載してきた本発明は以下の実施例を参照することによってより容易に理解でき、これは本発明のある局面および実施形態の説明の目的のためだけに含めるものであり、断じて本発明を限定する意図のものではない。
【０１２０】
実施例１：虚血／再灌流障害の機序
本実施例は、補体系が欠乏したマウスが虚血／再灌流障害に対して耐性であったことを示す。
虚血／再灌流障害の機序を調べるために、補体Ｃ３が欠乏したマウスを後足モデルで処理した。Ｃ３−／−マウスを、透過性指数のほぼ５０％低下に基づいて障害から部分的に保護した（Ｗｅｉｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５７−１８６４参照）。したがって、補体Ｃ３はこのマウスモデルにおいて十分な障害の誘導に必須である。
【０１２１】
Ｗｅｉｓｅｒらの実験はどのようにして補体が活性化されたかを同定しなかった。血清補体系は少なくとも３つの区別される経路、古典的、レクチンまたは代替経路によって活性化することができる。いずれの経路が関与するかを知ることは重要である。というのは、それは障害についてのメカニズムを示唆するからである。例えば、古典的経路は免疫グロブリンのＩｇＭおよびＩｇＧイソタイプによって、または血清認識タンパク質Ｃ−反応性タンパク質によって非常に効果的に活性化される。他方、レクチン経路はマンナン結合レクチン（ＭＢＬ）によるマンナンのような特異的炭水化物の認識に従って活性化される（Ｅｐｓｔｅｉｎら、（１９９６）  Ｉｍｍｕｎｏｌ８，２９−３５）。双方の経路において、補体Ｃ４は、中枢補体Ｃ３の切断を触媒するＣ２との酵素複合体を形成するにおいて必要である。対照的に、代替経路は、Ｃ３のその活性形態（Ｃ３ｂ）変換への自然発生的に導き、および外来性または自己−組織への付着を活性化する。前記経路は密接に調節される。というのは、全ての宿主細胞はＣ３コンベルターゼを不活化し、または置き換えることによって、補体経路の増幅の阻害剤を発現するからである（Ｍｕｌｌｅｒ−Ｅｂｅｒｈａｒｄ，Ｈ．Ｊ．，（１９８８）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５７，３２１−３４７）。関与する経路を決定するための１つのアプローチはＣ４が欠乏したマウスの使用であり、すなわち、古典的またはレクチン経路を介してＣ３コンベルターゼを形成することができない。後足モデルにおけるＣ３またはＣ４いずれか欠乏したマウスと野生型（ＷＴ）対照との比較により、Ｃ４もまた十分な障害の誘導に必要であることが明らかとなった（Ｗｅｉｓｅｒら、前記）。この知見は、それが抗体またはＭＢＬが関与し得ることを示唆するので重要であった。
【０１２２】
実施例２：天然ＩｇＭは虚血再灌流（Ｉ／Ｒ）障害を媒介する
本実施例は、免疫グロブリンが欠乏したマウスが虚血／再灌流障害に対して耐性であったことを示す。
抗体がＩ／Ｒ障害の媒介に関与したかを判断するために、免疫グロブリンを全く欠乏するマウス、ＲＡＧ２−／−（レコンビナーゼ活性化遺伝子−２欠乏）を、腸モデルにおいて補体欠乏動物と共に特徴付けた。重要なことには、ＲＡＧ−２−（−マウスは、補体欠乏動物で観察されたのと同様なレベルまで保護された（Ｗｅｉｓｅｒら、前記）。ＲＡＧ２−／−動物は成熟リンパ球もまた失っているので、病原効果が抗体依存性であると判断するのは重要であった（Ｓｈｉｎｋａｉら（１９９２）  Ｃｅｌｌ  ６８，８５５−８６７）。障害が血清抗体によって媒介されたことを確認するために、欠乏マウスを正常マウス血清（Ｗｅｉｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，前記）または精製されたＩｇＭ（Ｗｉｌｌｉａｍｓら（１９９９）Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ  ８６；９３８−４２）いずれかで再構築した。双方の場合に、再構築されたＲＡＧ−２−／−マウスはもはや保護されず、障害が回復した。後者の実験において、腸障害のモデルをこのモデルで用い、障害は主として補体によって媒介されると考えられる。
【０１２３】
これらの結果の解釈は、虚血の間に、ネオ抗原が内皮細胞表面で発現されるかまたは露出されるかのいずれかであるということである。循環ＩｇＭは新しい決定基を認識し、補体の古典的経路に結合し、それを活性化するように見える。抗原の性質は公知ではないが、ＩｇＧよりはむしろＩｇＭが、補体の活性化に対して主な原因であるように見える。というのは、プールされたＩｇＧでの欠乏マウスの再構築はマウスにおいて障害を有意には回復しなかったからである。代わりの仮説は、改変された内皮表面を認識し、新しい抗原部位を暴露する低レベルの補体活性化を誘導するＭＢＬ経路のようなもう１つの初期事象があり、前記経路はＩｇＭの欠乏によって増幅されるというものである。
【０１２４】
実施例３：病原性ＩｇＭはＢ−１細胞の産物である
循環ＩｇＭの大部分は天然抗体、すなわち、再編成された生殖系遺伝子の産物を表すと考えられるため、リンパ球のＢ−１画分の欠乏を担うマウスもまた保護される可能性がある。Ｂ−１細胞は、それらが低レベルのＩｇＤおよびＣＤ２３を発現し、大部分が細胞表面タンパク質ＣＤ５を発現する点でより慣用的なＢ−２細胞とは区別される表現型を有する（Ｈａｒｄｙら（１９９４）  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．：１３７，９１；Ｋａｎｔｏｒら（１９９３）  Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１，５０１−５３８，１９９３）。Ｂ−１細胞は、マウスにおける低下した循環、末梢リンパ節および脾臓における制限された頻度によってやはり区別され、主として、腹腔内に主として局所化される。病原性ＩｇＭの源としてのＢ−１細胞についての役割を調べるために、抗体欠乏マウス（ＲＡＧ−２−／−）を５×１０５腹腔Ｂ−１細胞で復元し、処理前ほぼ３０日休息させた。循環ＩｇＭレベルは養子免疫伝達後１ヶ月以内に正常な範囲近くに到達する。腸虚血モデルにおけるＢ−１細胞復元マウスの特徴付けにより、Ｂ−１細胞は病原性ＩｇＭの主な源であったことが確認された（Ｗｉｌｌｉａｍｓら（１９９９）前記参照）。これは重要な観察であった。なぜならば、Ｂ−１細胞天然抗体のレパートリーは、慣用的Ｂ−２細胞について予測されるよりもかなり限定されているからである。したがって、病原性抗体は生殖系の産物を表す可能性がある。
【０１２５】
実施例４：Ｃｒ２−／−マウスは虚血再灌流障害から保護される
Ｃｒ２−／−ノックアウトマウスの初期特徴付けは、Ｂ−１ａまたはＣＤ５＋Ｂ−１細胞の頻度のほぼ５０％低下を明らかにした（Ａｈｅａｒｎら（１９９６）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ４：２５１−２６２）。Ｃｒ２−欠乏マウスのもう１つの株の特徴付けは同様な低下を同定しなかったが（Ｍｏｌｉｎａら（１９９６）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ  ９３，３３５７−３３６１）。ＣＤ５＋細胞の頻度の差が株のバックグラウンドまたは環境の差の変動によるか否かは公知ではない。Ｃｒ２−／−マウスにおけるＢ−１ａ細胞の低下した頻度にかかわらず、ＩｇＭの循環レベルは正常な範囲内にあった。これらの知見は、ＩｇＭのレパートリーがＣｒ２−欠乏動物において異なることを示唆した。この仮説を検定するために、腸Ｉ／Ｒモデルにおけるマウスを特徴付けた。驚くべきことに、Ｃｒ２−／−マウスは補体−抗体欠乏マウスとして同等に保護された（図３）。腸モデルにおける処理後５日間の期間にわたる生存の比較は、Ｃｒ２−欠乏動物と比較したＷＴの死亡率の有意な増加を示した。増加した死亡率と合致して、障害の劇的な低下が、処理したＷＴまたはＣｒ２−／−欠乏マウスから収穫された組織切片で観察された。
【０１２６】
腸の粘膜層に対する広範な障害が、プールされたＩｇＭまたはＢ−１細胞で復元されたＷＴマウスまたはＣｒ２−／−マウスで観察された。対照的に、処理されたＣｒ２−／−マウスから単離された組織切片は偽対照のそれと同様であった。したがって、ＩｇＭの正常な循環レベルにもかかわらず、Ｃｒ２−欠乏マウスは障害から保護された。これらの結果は、病原性抗体の源としてのＢ−１細胞の重要性を確認するのみならず、補体系は天然抗体のレパートリーの形成または維持に幾分関与することを示唆する。例えば、補体はＢ−１細胞の陽性選択に関与し得る。
【０１２７】
実施例５：病原性ＩｇＭの同定
この実施例は、正常なＢ−１細胞からの特異的なハイブリドーマクローンの創製、および病原性ＩｇＭを精製する１つのクローンの同定を記載する。病原性ＩｇＭは、抗体欠乏マウスに対する障害をｉｎ  ｖｉｖｏで回復することが示された。
【０１２８】
補体受容体ＣＤ２１／ＣＤ３５の欠乏を担うマウスにおける実験は、前記マウスが病原性抗体を失っていることを明らかとした。この知見は予期せぬものであった。なぜならば、それらはその血液中に正常なレベルのＩｇＭを有するからである。これらの知見は、Ｂ−１細胞といわれるＢ細胞の特別な集団が病原性ＩｇＭを分泌することを担うという仮説に導く。例えば、正常なマウスからのＢ−１細胞での受容体欠乏マウス（Ｃｒ２−／−）の移植は障害を回復させ、Ｂ−１細胞の重要性が確認される。特異的抗体または障害を担う抗体を同定するために、ハイブリドーマクローンのパネルを、正常なマウスから収穫された腹腔Ｂ−１細胞の豊富化されたプールから構築した。腹腔細胞の豊富化された画分からハイブリドーマを調製するための一般的アプローチは、ＩＬ−１０で７日早く処理し、引き続いて、磁性ビーズでの陰性選択によってＣＤ２３陰性Ｂ細胞につき豊富化されたマウスから腹腔細胞を収穫することを含む。豊富化されたＢ細胞は、ＩｇＭ、Ｍａｃ−１およびＣＤ２３特異的Ｍａｂでの染色に続いてのＦＡＣＳによって分析される。豊富化された集団は、２４時間のＬＰＳとの培養によってさらに活性化される。活性化された細胞は、ＰＥＧの存在下で融合パートナーミエローマ細胞とハイブリダイズさせ、ＨＡＴ−選択培地で増殖させる。ハイブリドーマは、ＥＬＩＳＡによってＩｇＭ分泌クローンにつきスクリーニングし、陽性細胞はＩｇＭの精製のために拡大培養する。
【０１２９】
２２のＩｇＭ−分泌ハイブリドーマクローンを、クローンの各々からの同等量のＩｇＭ産物をプールすることによって分析した。プールされたＩｇＭでの抗体欠乏マウスの処理は、血清からのプールされたＩｇＭで見られたのと同様な障害を回復した。この知見により、病原性ＩｇＭは生じた２２のハイブリドーマの中にあったことが確認された。プールを２つの画分、すなわち、１〜１１および１２〜２２、および２つの画分での処理マウスに分けることによって、病原性抗体は、クローン＃２２を誘導したプールと共に分画されることが見出された。最後に、マウスをクローン１７または２２いずれかで復元した。クローン２２は障害を回復し、他方、他のクローンはそうしなかった。
【０１３０】
実施例６：Ｂ−１細胞選択への補体の関与
２つの異なるモデルがＢ−１細胞の発生を説明するために提唱されている。系列仮説は、Ｂ−１細胞が区別される集団として初期胎児生命で発生することを提唱する（Ｋａｎｔｏｒら（１９９３）前記）。あるいは、Ｂ−１細胞は、慣用的Ｂ細胞として同一先祖から発生するが、それらの環境、すなわち、抗原との遭遇に応じて、それらはＢ−１に発生し、またはＢ−２細胞表現型を保有する（Ｗｏｒｔｉｓ，Ｈ．Ｈ．（１９９２）  Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８，２３５；Ｃｌａｒｋｅ，Ｊ．（１９９８）  Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７，１３２５−１３３４）。それらの起源にかかわらず、Ｂ−１細胞はＢ−２細胞と同一の頻度で成人骨髄から補充されず、およびそれらの表現型は初期胎児肝臓Ｂ細胞または新生骨髄（ＢＭ）細胞のそれとより同様であることが公知である。初期起源と合致して、それらのレパートリーはより近位のＶＨ遺伝子の発現に偏る傾向があり、Ｎ−ヌクレオチドの付加は制限されている（Ｇｕら（１９９０）  ＥＭＢＯ  Ｊ９，２１３３；Ｆｅｅｎｅｙ  Ｊ．（１９９０）  Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７２，１３７７）。成人ＢＭ幹細胞による低下した補充を仮定すれば、Ｂ−１細胞は自己−更新され、抗原刺激はそれらの更新、拡大または初期選択においてさえ重要であろうことは合理的に見える（Ｈａｙａｋａｗａら（１９８６）  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６，１３１３）。事実、慣用的モデルに固有なことには、Ｂ−１細胞は抗原選択されなければならない。
【０１３１】
Ｂ−１細胞の陽性選択についてのＢ−細胞受容体（ＢＣＲ）シグナリング要件を裏付ける証拠は、ＢＣＲシグナリングを改変する突然変異を担うマウスから来る。例えば、ＣＤ１９、ｖａｖ、またはＢｔｋを通じてのＢＣＲシグナリングが損なわれると、Ｂ−１細胞の発生に劇的に影響する。対照的には、ＣＤ２２−またはＳＨＩＰ−１欠乏マウスのような陰性選択の喪失はＢ−１細胞頻度の増加に至り得る（Ｏ’Ｋｅｅｆｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４，７９８−８０１；Ｓｈｕｌｔｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）  Ｃｅｌｌ  ７３，１４４５）。２つの区別されるＩｇ導入遺伝子ＶＨ１２（Ｂ−１細胞表現型）またはＶＨＢ１−８（Ｂ−２細胞表現型）を担うマウスでの最近のエレガントな実験はＢ−１細胞が自己抗原によって陽性的に選択されるという観察を支持する。例えば、ＶＨ１２単独、またはＢ１−８と共にＶＨ１２を発現するＢ細胞はＢ−１細胞の表現型を発達させた。他方、Ｂ１−８導入遺伝子のみを発現したＢ細胞はあったとしても少数が同定された。したがって、これらの結果は、トランスジェニックＢ細胞と自己−ＰｔＣとの遭遇の結果、ＶＨ１２を発現するものが拡大されることを示唆した。Ｂ−１細胞の選択はＨａｒｄｙ  ｅｔ  ａｌ．によって最近報告された（（１９９４）  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１３７，９１）。これらのモデルにおいて、Ｔｈｙ１．１に対して特異的な免疫グロブリン導入遺伝子を発現するＢ細胞が選択され、同族抗原を発現するマウスにおいて拡大された。対照的に、導入遺伝子＋Ｂ−１細胞は、代替アロタイプＴｈｙ１．２を発現したマウスでは見出されなかった。
【０１３２】
補体はどこでＢ−１細胞発生にフィットするか？Ｂ−１ａ細胞頻度の総じての低下、およびＩ／Ｒ障害に関与するＩｇＭを発現するＢ−１細胞のより特異的な喪失は、Ｂ−１ａ細胞の陽性選択または維持いずれかにおけるＣＤ２１／ＣＤ３５についての役割を示唆する。補体に対する１つの可能な役割は、それが同族抗原との遭遇に際してＢＣＲシグナリングを増強することである。ＣＤ２１／ＣＤ３５欠乏マウスの生化学的実験および分析は、慣用的Ｂ細胞の活性化および生存における共受容体シグナリングの重要性を示す（Ｃａｒｒｏｌｌ，Ｍ．Ｃ．，（１９９８）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６，５４５−５６８；Ｆｅａｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）  Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３，１２７−１４９）。Ｂ−１細胞が、同様に、共受容体シグナリングを利用して、ＢＣＲシグナルを増強させるようである。例えば、細菌はホスホリルコリンのような典型的なＢ−１細胞抗原を発現し、補体リガンドＣ３ｄでの細菌のコーティングはＢＣＲでの共受容体の架橋を促進するであろうことは不合理ではない。したがって、より低濃度で発現された抗原は、同族Ｂ−細胞がそれを認識し、拡大するか、または陽性に選択されるためには、補体増強を必要とするであろう。補体受容体についてのもう１つの役割は、リンパ系区画内の小胞樹状細胞（ＦＤＣ）へ抗原を局所化するにおけるものである。しかしながら、Ｂ−１細胞の主な集団は腹腔組織を占めるので、それらがリンパ系構造内でＦＤＣに遭遇するかは明らかでない。Ｂ−１細胞が陽性選択を受ける現実の部位または複数部位が公知ではない。それらは初期胎児発生において、または新生ＢＭにおいて同族抗原に遭遇するに違いない可能性がある。これが当てはまれば、これらの区画内の間質細胞上の補体受容体は、Ｂ細胞への提示のために抗原に結合することが予測される。補体受容体は発生の双方の段階に参画する可能性がある。第一に、それらは初期陽性選択における抗原シグナリングを増強するであろう。第二に、選択されたＢ−１細胞が末梢部位で補充されるにつれ、補体受容体はＢＣＲシグナリングの増強に再度関与するであろう。
【０１３３】
腹腔Ｂ−１リンパ球の陽性選択における補体および補体受容体についての提案された役割には、補体−リガンド被覆抗原（自己−および非自己）の相互作用があり、その作用の結果、細胞表面でＣＤ２１／ＣＤ１９共受容体ＢＣＲの共連結が生じ、シグナリングおよび陽性選択が増強されることになる。
【０１３４】
実施例７：  １２Ａ６ハイブリドーマおよび２１Ｇ６ハイブリドーマ
マウスハイブリドーマのパネルを調製して非筋ミオシンＩＩ重鎖のＮ２領域を同定した。かくして、担体タンパク質（ＫＬＨ）に結合したＮ２ペプチド（Ａｃ−ＬＭＫ  ＭＤＰＬＮＤＮＶ（配列番号３３））をマウスに免疫付与した。マウスおよびヒトではこの領域（Ｎ２）は高度に保存され、同一であった。２種のハイブリドーマを選択してさらに同定し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでもｉｎ  ｖｉｖｏでもＮ２ペプチドを結合することを明らかにした。重要なことは、マウス心筋梗塞モデルでは、一方のハイブリドーマを１００μｇのＦａｂ’２断片で事前処理（Ｆｃ片を除去）すると、虚血／再灌流障害は阻害される。１２Ａ６はＩｇＧ２ｂアイソタイプである。そのＶＨはＤＨ：ＤＳＰ２／ＤＦＬ１６．１と対になった生殖細胞系３６０９．１１．１６９配列にうおいて最も密接にマッチし、その軽鎖はＪＫ１を有するＶκ８−２７である。２１Ｇ６はＩｇＧ１イソタイプであり、そのＶＨはＪ５５８．３５；ＤＨ：ＤＳＰ２．６／ＤＳＰ２．４／ＤＳＰ２．３およびＪＨ：ＪＨ３とマッチする。その軽鎖はＶκｈｆ２４およびＪＫ４である。
【０１３５】
マウス抗Ｎ２  ｍＡｂは心筋梗塞後の炎症を抑制する。Ｂ６マウスを１時間のＬＡＤ閉塞に供した後、２４時間再灌流した。閉塞（１５分）前、生食水または１５０μｇの抗Ｎ２Ｆ（ａｂ’）２抗体（２１Ｇ６）をマウスに静注した。再灌流後、血清トロポニンＩ値（Ａ）およびマウスのＩｇＭ沈着（Ｂ）を分析し、ステューデントのｔ検定を用いてそれぞれの統計学的有意差を評価した（図３）。
【０１３６】
Ｎ２ペプチドおよび抗Ｎ２  ｍＡｂはヒトＩｇＭによる傷害を阻止する。図４は（Ａ）ＲＡＧ−１−／−マウスを１時間のＬＡＤ閉塞に供した後、２４時間再灌流したものを示す。閉塞（１５分）前、生食水または２００μｇのＮ２ペプチドと一緒に、１０例のドナーからプールした４００μｇのｈＩｇＭをマウスに静注した。エバンスブルーおよびＴＴＣにより心筋部分を染色した。心筋梗塞面積を左室のリスク領域（ＡＡＲ）の梗塞割合として表した。（ＢおよびＣ）ＲＡＧ−１−／−マウスを（Ａ）で処置し、ｈＩｇＭ沈着（Ｂ）または血清トロポニンＩ値（Ｃ）を分析した。（Ｄ）ＲＡＧ−１−／−マウスを１時間のＬＡＤ閉塞に供し、２４時間再灌流した。閉塞（１５分）前、生殖水または１５０μｇの抗Ｎ２Ｆ（ａｂ’）２抗体（２１Ｇ６）と一緒に４００μｇのｈＩｇＭをマウスに静注し、心筋部分を（Ａ）と同様に分析した。（Ｅ）ＲＡＧ−１−／−マウスを（Ｄ）と同様に処置し、ｈＩｇＭ沈着を分析した。全パネルについて、ステューデントのｔ検定を用いて統計学的有意差を評価した。
【０１３７】
実施例８：１２Ａ６ハイブリドーマ抗体はｉｎ  ｖｉｖｏでＮ２自己ペプチドに結合する
抗Ｎ２抗体の特異性。６０分間のＬＡＤ閉塞および３０分間の再灌流前にＢ６マウスに蛍光標識した抗Ｎ２抗体（１２Ａ６）および抗ＣＤ３１抗体を静注した。治療後、心を摘出、固定し共焦点顕微鏡によって分析した。リスク領域（左室）を非リスク領域（右室）と比較した。図５には個々の抗体染色の量およびリスク領域および非リスク領域における合成像を示す。抗Ｎ２抗体により処置したＢ６マウスにおける血清トロポニンＩ値の効果。１時間のＬＡＤ閉塞および２４時間の再灌流前に生食水、１２Ａ６Ｆ（ａｂ’）２（１５０μｇ）または２１Ｇ６Ｆ（ａｂ’）２（１５０μｇ）をＢ６マウスに静注した。再灌流２４時間後、血清トロポニンＩ値を測定した。結果を図６に示す。
【０１３８】
参照による援用
本明細書において言及した全ての刊行物、特許および特許出願は、参照により本明細書に、あたかも各個々の刊行物または特許が参照により具体的かつ個々に一体化されることを示すようにその全体が組み入れられる。コンフリクトする場合、本明細書中のいずれの定義も含む本出願が支配する。
【０１３９】
また、参照によりその全体が組み入れられるのは、いずれものポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列であり、これは、延長ｔｉｇｒ．ｏｒｇを伴う世界的ウェブでのＴｈｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＴＩＧＲ）、または延長ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを伴う世界的ウェブでのＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）によって維持されるもののような公のデータベースへのエントリーに関連するアクセッション番号を参照する。
【０１４０】
均等物
当業者であれば、通常の実験程度を用いれば、本明細書において記載された発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識し、それを確認することができるであろう。そのような均等物は特許請求の範囲に含まれることを意図する。
【図１Ａ】
0006018917.tif 000002
【図１Ｂ】
0006018917.tif 000003
【図２Ａ】
0006018917.tif 000004
【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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