(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
胴枯病(head blight disease)に対する抑制活性を有する、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種株、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種株、マイコスファエレラ（Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ）種株、およびバリオボラックス（Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ）種株からなる群から選択される、単離された微生物株であって、ミクロバクテリウム種株はミクロバクテリウム種株ＳＧＩ−０１４−Ｃ０６（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０４７０として寄託）であり；バチルス種株はバチルス種株ＳＧＩ−０１５−Ｆ０３（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０７６０として寄託）またはバチルス種株ＳＧＩ−０１５−Ｈ０６（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０７６１として寄託）であり；マイコスファエレラ種はマイコスファエレラ種株ＳＧＩ−０１０−Ｈ１１（ＮＲＲＬ  ５０４７１として寄託）であり；バリオボラックス種株はバリオボラックス種株ＳＧＩ−０１４−Ｇ０１（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０４６９として寄託）である、単離された微生物株。
【請求項２】
ミクロバクテリウム種株ＳＧＩ−０１４−Ｃ０６が配列番号：１のＤＮＡ配列を含み；バチルス種株ＳＧＩ−０１５−Ｆ０３が配列番号：１３のＤＮＡ配列を含み；バチルス種株ＳＧＩ−０１５−Ｈ０６が配列番号：１４のＤＮＡ配列を含み；マイコスファエレラ種株ＳＧＩ−０１０−Ｈ１１が配列番号：１１に対して少なくとも９５％配列同一性を示すＤＮＡ配列を含み；バリオボラックス種株ＳＧＩ−０１４−Ｇ０１が配列番号：１２のＤＮＡ配列を含む、請求項１に記載の単離された微生物株。
【請求項３】
請求項１に記載の微生物株の生物学的に純粋な培養物。
【請求項４】
請求項１に記載の微生物株の濃縮された培養物。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の微生物株またはその培養物と、ダニ駆除剤、殺菌剤、殺真菌剤、殺虫剤、殺微生物剤、殺線虫剤、駆除剤、および肥料からなる群から選択される農業的に有効な量の化合物または組成物と、を含む、組成物。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の微生物株またはその培養物と、担体と、を含む、組成物。
【請求項７】
前記担体が、農業的に許容される担体である、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記担体が、植物種子である、請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
前記組成物が、エマルジョン、コロイド、細粉、顆粒、ペレット、粉末、スプレー、エマルジョン、および溶液からなる群から選択される製剤として調製される、請求項６に記載の組成物。
【請求項１０】
前記組成物が、種子コーティング製剤である、請求項６に記載の組成物。
【請求項１１】
請求項６に記載の組成物を含むコーティングを有する種子。
【請求項１２】
胴枯病を引き起こす植物病原体の発現を予防、阻害、または処理するための方法であって、成長培地または土壌での宿主植物の成長前または成長と同時に、宿主植物の前記成長培地または土壌で請求項１〜４のいずれか一項に記載の微生物株またはその培養物を成長させることを含む、方法。
【請求項１３】
前記植物病原体が、フザリウム・グラミネアラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
植物の胴枯病の発現を予防、阻害、または処理するための方法であって、前記植物または前記植物の周囲に、有効な量の請求項１〜４のいずれか一項に記載の微生物株またはその培養物を適用することを含む、方法。
【請求項１５】
前記微生物株またはその培養物が、土壌、種子、根、花、葉、前記植物の一部、または前記植物全体に適用される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記植物が、フザリウム・グラミネアラムの影響を受けやすい、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記植物が、小麦植物、トウモロコシ植物、大麦植物、またはオート麦植物である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記微生物株またはその培養物が、前記植物上に内部寄生菌として定着する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の微生物株またはその培養物に人工的に感染した植物である、天然に存在しない植物。
【請求項２０】
請求項１９に記載の天然に存在しない植物の種子、生殖組織、栄養組織、植物部分、または子孫。
【請求項２１】
農業組成物を調製するための方法であって、請求項１〜４のいずれか一項に記載の微生物株またはその培養物を基層中または基層上に播種することと、１ミリリットルまたは１グラム当たり少なくとも１０２〜１０３個の細胞または胞子を得るまで、前記微生物株またはその培養物を１〜３７℃の温度で成長させることと、を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表の組み込み
添付の配列表中の物質は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。「ＳＧＩ１５２０−１ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という名の添付のファイルは、２０１２年７月２４日に作成され、５５キロバイトである。このファイルは、Ｗｉｎｄｏｗ  ＯＳを使用するコンピュータ上のＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｗｏｒｄを用いてアクセスされ得る。
【０００２】
本発明は、植物病原性病害の生物学的制御に関する。具体的には、これは、小麦および大麦等の穀物植物における胴枯病の制御に有用な組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
赤かび病（ｈｅａｄ  ｓｃａｂ）、ばら色かび病（ｐｉｎｋ  ｍｏｌｄ）、白かび病（ｗｈｉｔｅｈｅａｄｓ）、およびツームストーン腐敗病（ｔｏｍｂｓｔｏｎｅ  ｓｃａｂ）としても既知の胴枯病は、世界中、特に米国、欧州、および中国における、小麦、大麦、およびいくつかの他の穀物作物を苦しめる破壊的な病害である。この病害は、流行レベルに達し、インド、ロシア、フランス、ドイツ、および英国を含む世界中の湿潤および半湿潤の穀物栽培地域において、穀類、特に小麦および大麦に多大な被害を与え得る。特に、コムギ腐敗病または胴枯病は、米国においてより多大な損害を与える小麦の病害のうちの一つである。全国的に、この病害は、小麦産業において、何百万ドルもの収率損失をもたらしている。中西部および高地において、コムギ腐敗病は、近年、小麦生産の主な障害である。小麦への攻撃に加えて、胴枯病は、大麦、オート麦、トウモロコシ、および多くの他の穀物にも攻撃し、それらに繁殖する。
【０００４】
この重大な植物病害は、いくつかの植物病原体によるが、主に真菌属フザリウムのいくつかの種によって生じ得る。例えば、小麦における胴枯病の病原は、いくつかの異なるフザリウム種、例えば、フザリウム・クルモラム（Ｆ．ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フザリウム・グラミネアラム（有性世代、ジベレラ・ゼアエ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｚｅａｅ））、フザリウム・アベナセアム（Ｆ．ａｖｅｎａｃｅｕｍ）（有性世代、ジベレラ・アベナセア（Ｇ．ａｖｅｎａｃｅａ）、フザリウム・ポアエ（Ｆ．ｐｏａｅ）、ならびにミクロドキウム・ニバレ（Ｍｉｃｒｏｄｏｃｈｉｕｍ  ｎｉｖａｌｅ）（有性世代、モノグラフェラ・ニバリス（Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｅｌｌａ  ｎｉｖａｌｉｓ））、およびミクロドキウム・マジャス（Ｍｉｃｒｏｄｏｃｈｉｕｍ  ｍａｊｕｓ）等の非フザリウム病原体によるものを含む。米国、欧州、および世界の大半の農学的に重要な地域では、胴枯の主な原因因子は、フザリウム・グラミネアラム（有性世代、厳密にはジベレラ・ゼアエ）である。
【０００５】
これらの病原体は、典型的に、植物残骸上に残存する。これらは、花成中、穀類の穂の小穂に侵入し、損害を与えるため、穀類の穂の穀粒の発達を阻止または部分的に妨害する。結果として、侵入胴枯病原体は、穀類の穂の一部または穀類の穂全体のいずれかを枯らすことができる。いくつかの感染した種子は、成長力が弱く、発芽しないことが多い。発芽する感染した種子は、後の作物植物における株立の不良をもたらす根頭腐敗または根腐敗により、幼苗期の初期に枯れることが多い。健康な幼苗も出芽時に感染する可能性がある。不良な発育不全の株立に加えて、病原体侵襲による収率損失は、条件が病害の発現に好ましい場合、かなり高い可能性がある。
【０００６】
フザリウム属の真菌病原体は、世界中の穀類耕作地域にわたって広がり、特に花成と登熟との間の降雨量が多い地域において、重度の損害をもたらすことが知られている。フザリウム・グラミネアラムが原因因子である場合、この病害は、収率損失に加えて、汚染された穀類の商業価値を低下させるだけでなく、フザリウム感染が穀類にトリコテシンマイコトキシンの蓄積をもたらし、よってヒトおよび家畜の健康も脅かすため、一番の関心事である。トリコテシンは、世界的に穀物の主なマイコトキシン汚染物質であり、曝露レベルが高い場合、非反芻動物において、拒食、嘔吐、下痢、および体重減少をもたらし、他の動物およびヒトに健康の脅威をもたらす。この脅威は、米国におけるフザリウム・グラミネアラム株の毒素生成および成長力増加に向かう近年の変化によって深刻になった。最も頻繁に見られるマイコトキシンは、デオキシニバレノール（ＤＯＮ、ボミトキシンとしても知られる）およびゼアラレノン（ＺＥＡ）である。特にデオキシニバレノールは非常に危険な毒素であり、感染した穀類を摂取したヒトおよび動物において、出血状態等を伴う胃腸障害をもたらし、いくつかの場合では死に至る。デオキシニバレノールは、一般的に、ｐＨの変化および高温に対して安定であるため、解毒は非常に難しい可能性がある。したがって、ある特定のレベルを超えて汚染された穀類は、醸造、加工、または家畜給餌のいずれの形態でも使用することができず、よって多くの場合処分する必要がある。
【０００７】
今まで、様々な戦略が作物植物における胴枯を制御するために展開されてきた。期待できる選択肢は、化学手段、耐性作物品種の開発、ならびに伝統的慣例である輪作および畑の耕作を含む。これらの選択肢の中でも、化学駆除剤は胴枯侵襲の低減にいくぶん有効であり得るが、作物発達の後期、典型的には収穫のたった数週間前の花成期での殺真菌剤の使用に関して、残留の懸念によりその魅力が低減する。別の病害制御の代替手段を示す伝統的な育種および遺伝子操作を使用する耐性品種の開発における進歩も生じている。遺伝子操作の進歩の報告された例としては、植物ホルモン生成の変更または植物ホルモンシグナル伝達経路の操作が挙げられる。近年では、胴枯病に対する耐性の遺伝的基礎の理解において、伝統的な育種分野において相当な進歩がなされ、耐性を付与するいくつかの遺伝子および量的形質遺伝子座（ＱＴＬ）が報告された。しかしながら、胴枯病に対する作物耐性の改善の経過は、主にこの病害を研究するのが困難であるため、遅かった。実際、耐性または感受性に関与するメカニズムについては、現在、比較的ほとんど理解されていない。加えて、この病害の主な原因因子であるフザリウム種の遺伝的多様性は、化学殺真菌剤の有効性および耐性品種がどのくらい耐久性があるかに関する懸念を提起することが多い。結果として、特に現在大規模生産されている全ての小麦品種は、感染しやすいままである。
【０００８】
加えて、胴枯病の制御におけるある程度の成功が、収穫後に原因因子、例えばフザリウム・グラミネアラムに侵襲された作物残さを埋めるために畑を耕す等の伝統的慣例によって期待され得るが、収穫後の畑の従来の耕作は、最小耕作の土壌保全の慣例と一致しない。長距離播種分散および病原体の代替宿主の役割を果たす可能性がある多作の可能性を考慮すれば、輪作は支持できない解決策であることが多い。環境に残留する駆除剤の問題に加えて、駆除剤耐性の報告および穀類中のＤＯＮ含量増加の事例もその使用に対する懸念であり得る。さらに、環境に残留する駆除剤および食品の安全に対する公共および民間の部門における費用および懸念の増加により、この病害制御の代替手段の魅力は低下し、できる限り少ない駆除剤を使用する作物栽培の要求をもたらしている。
【０００９】
要約すれば、胴枯を制御するための技術の開発における相当の進歩にも関わらず、穀類の生産および品質に対するこの破壊的病害の影響の低減は、解決困難な問題のままである。したがって、新しい胴枯制御技術の識別および開発は、多くの穀物作物の生産および品質の改善に不可欠である。これらの問題は、米国だけでなく、アジアおよび欧州を含む全世界において早急な解決を要する。
【００１０】
胴枯病の生物学的制御は、１９９０年半ば以来、かなりの関心を呼んだ。生物学的制御剤（ＢＣＡ）は、現在は非常に数が限られているが、フザリウム等の病原体によって誘発される病害のレベルを実質的に減少させるための環境的に許容される方法であり得る。中でも、世間の支持、他の病害防除手段との適合性、および耐久性は、生物学的に胴枯病を制御するための戦略の開発の支持に有益な要因である。生物学的制御剤は、有機穀物生産において重要な役割を果たす。従来の生産において、そのような薬剤は、化学殺真菌剤がもはや適用できない後の花成期を過ぎた穂の保護を拡大することができる。今まで、生物学的制御の分野においてかなりの進歩が達成されてきた。例えば、胞子を生成する細菌のある特定の株（バチルス種およびシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種等）および酵母（クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種等）は、胴枯病の制御およびマイコトキシン汚染の低減にある程度有望である。しかしながら、これらおよび他の進歩にも関わらず、胴枯病の生物学的制御に使用するための改善された微生物が以前必要である。ＢＣＡは植物病原体のより容認される解決策となり、ＢＣＡ製品は今までよりも大幅に販売されてきたが、今まで胴枯病を生物学的に制御するための戦略および拮抗微生物を開発するための試みはあまりなかった。さらに、フザリウム亜種の生活環および胴枯病の他の原因因子は、病原体が潜在的に異なる発現期の拮抗微生物を使用する生物制御技術の影響を受けやすい可能性があることを示唆する。よって、好ましくは異なる作用様式の新しい生物学的制御剤、ならびに胴枯病の発現を効率的に予防または抑制するのを補助することができる生物制御方法を識別する必要がある。
【発明の概要】
【００１１】
微生物株および培養物を含む組成物が本明細書において提供される。ある特定の株、それらの培養物、およびそれらの組成物は、例えば小麦および他の穀類植物を含む様々な作物植物の胴枯病の制御に有用である。生物学的制御組成物、ならびにそれらを用いて植物病原体または植物病害の発現を予防、阻害、または処理し、かつ植物の収率を保つための方法も提供される。有害な植物病原体を制御するための他の農業的に有効な化合物または組成物と組み合わせて、生物学的制御剤としてそのような組成物を使用するための方法も提供される。
【００１２】
一態様では、本発明は、胴枯病に対して抑制活性を有する単離された微生物株を提供する。本発明のこの態様による微生物株は、ミクロバクテリウム属、バチルス属、マイコスファエレラ属、およびバリオボラックス属からなる群から選択される。いくつかの好ましい実施形態では、微生物株は、マイコスファエレラ種株ＳＧＩ−０１０−Ｈ１１（ＮＲＲＬ  ５０４７１として寄託）、ミクロバクテリウム種株ＳＧＩ−０１４−Ｃ０６（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０４７０として寄託）、ミクロバクテリウム種株ＳＧＩ−００５−Ｇ０８（ＮＲＲＬ＿−＿＿＿＿＿として寄託）、バリオボラックス種株ＳＧＩ−０１４−Ｇ０１（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０４６９として寄託）、バチルス種株ＳＧＩ−０１５−Ｆ０３（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０７６０として寄託）、バチルス種株ＳＧＩ−０１５−Ｈ０６（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０７６１として寄託）、およびそれらのいずれかの殺虫的に活性な変異体から選択される。いくつかの他の好ましい実施形態による微生物株は、配列表のヌクレオチド配列のうちのいずれか一つに対して少なくとも８５％の配列同一性を示すＤＮＡ配列を含み得る。本明細書に開示される微生物株の生物学的に純粋な培養物および濃縮された培養物がさらに提供される。
【００１３】
本発明の別の態様では、本発明の微生物株またはその培養物を含む組成物、ならびにダニ駆除剤、殺菌剤、殺真菌剤、殺虫剤、殺微生物剤、殺線虫剤、駆除剤、および肥料からなる群から選択される農業的に有効な量の化合物または組成物も提供される。この態様のいくつかの実施形態では、組成物は、エマルジョン、コロイド、細粉、顆粒、ペレット、粉末、スプレー、エマルジョン、および溶液からなる群から選択される製剤として調製され得る。いくつかの他の実施形態では、組成物は担体と共に提供され得る。いくつかの好ましい実施形態では、担体は、農業的に許容される担体である。いくつかの特に好ましい実施形態では、担体は植物種子である。他の好ましい実施形態では、組成物は、種子コーティング製剤である。本開示において、本発明による組成物でコーティングされる種子がさらに提供される。
【００１４】
本発明の別の態様では、植物病原体の発現を予防、阻害、または処理するための方法が提供される。本方法は、成長培地または土壌での宿主植物の成長前または成長と同時に、宿主植物の成長培地または土壌において、本発明の微生物株またはその培養物を成長させることを伴う。この態様のいくつかの好ましい実施形態では、植物病原体は胴枯病をもたらす。いくつかの特に好ましい実施形態では、植物病原体は、フザリウム・グラミネアラムである。
【００１５】
本発明のまた別の態様では、植物の胴枯病の発現を予防、阻害、または処理するための方法が提供される。本方法は、植物または植物の周囲に、有効な量の本発明の微生物株またはその培養物を適用することを伴う。一実施形態では、そのような胴枯病は、真菌フザリウム・グラミネアラムによって生じる。この態様のいくつかの実施形態では、微生物株またはその培養物は、土壌、種子、根、花、葉、植物の一部、または植物全体に適用される。好ましい実施形態では、植物は、フザリウム・グラミネアラムの影響を受けやすい。いくつかの他の好ましい実施形態では、植物は、小麦植物、トウモロコシ植物、大麦植物、またはオート麦植物である。別の好ましい実施形態では、本発明の微生物株またはその培養物は、植物上に内部寄生菌として定着する。
【００１６】
本発明の別のさらなる態様は、天然に存在しない植物を提供する。天然に存在しない植物は、本発明の微生物株またはその培養物で人工的に感染する。この態様のいくつかの好ましい実施形態では、天然に存在しない植物の種子、生殖組織、栄養組織、植物部分、および子孫がさらに提供される。
【００１７】
本発明のまた別の態様は、農業組成物を調製するための方法を提供する。本方法は、本発明による微生物株またはその培養物を基層中または基層の上に播種し、１ミリリットルもしくは１グラム当たり少なくとも１０２〜１０３個の細胞または胞子を得るまで、１〜３７℃の温度で成長させることを伴う。
【００１８】
本発明のこれらおよび他の目的ならびに特徴は、以下の発明を実施するための形態および特許請求の範囲からより完全に明らかになるであろう。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
一部の定義
特に定義されない限り、本明細書で使用される技術、表記、および他の科学的用語または専門用語の全用語は、本発明が関連する当業者に一般に理解される意味を有することが意図される。いくつかの場合では、一般に理解される意味の用語は、本明細書において明確さおよび／または即時参照のために定義され、本明細書におけるそのような定義の包含は、当該技術分野において一般的に理解されるものに対する実質的な相違を表すものと必ずしも解釈されないものとする。本明細書に記載または参照される技術および手順の多くは、当業者に十分に理解され、従来の方法を使用して一般的に採用される。
【００２０】
単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、特に文脈に明確に記載されない限り複数の参照を含む。例えば、用語「細胞（ａ  ｃｅｌｌ）」は、一つ以上の細胞を含み、その混合物を含む。
【００２１】
表現「拮抗微生物」および「微生物拮抗薬」は、本明細書において、対象株が統計的に有意なレベルで未処理対照を超える胴枯病の阻害の程度を示すことを意味することが意図される微生物に関して、互換的に使用される。
【００２２】
抗生物質：本明細書で使用される、用語「抗生物質」とは、微生物の成長を止めるまたは阻害することができる任意の物質を指す。抗生物質は、次の１）微生物、２）合成プロセス、または３）半合成プロセスのうちのいずれか一つ以上によって生成され得る。抗生物質は、揮発性有機化合物を分泌する微生物であり得る。さらに、抗生物質は、微生物によって分泌される揮発性有機化合物であり得る。
【００２３】
殺菌：本明細書で使用される、用語「殺菌」とは、組成物または物質が細菌の死滅率を増加させる、または細菌の成長速度を阻害する能力を指す。細菌の成長速度の阻害は、一般的に、経時的な生細菌細胞の減少として定量化され得る。
【００２４】
生物学的制御：本明細書で使用される、用語「生物学的制御」およびその省略形「生物制御（ｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌ）」とは、ヒト以外の少なくとも二次生物の使用による病原体もしくは昆虫または任意の他の望ましくない生物の制御として定義される。生物学的制御の既知のメカニズムの例は、根の表面上の空間に対して真菌を打ち負かすことにより根の腐食を制御する微生物、または病原体の成長を阻害する、もしくはそれを死滅させるかのいずれかである微生物の使用である。生物学的制御の文脈における「宿主植物」は、病原体によって生じる病害の影響を受けやすい植物である。真菌種等の生物をその天然環境から単離する文脈において、「宿主植物」は、真菌の成長を支持する植物、例えば真菌が内部寄生菌である種の植物である。
【００２５】
本明細書で使用される、「穀物」は、胴枯病の影響を受けやすい可能性がある任意の穀物種を指すことが意図される。影響を受けやすいことが報告されている穀物は、小麦、大麦、オート麦、およびライ麦を含むが、この病害がかなりの経済問題を提示する二つの作物は小麦および大麦である。
【００２６】
「有効な量」とは、有益な結果または望ましい結果に影響を及ぼすのに十分な量を指す。病害防除、処理、阻害、または保護に関して、有効な量は、標的感染または病害状態の進行を抑制する、安定させる、反転させる、低下させる、または遅延させるのに十分な量である。そのようなものとして、表現「有効な量」は、本明細書において、未処理の対照に生じるものに対して病原体の発現レベルおよび／または病原性病害のレベルにおける減少を得るために必要である拮抗処理のその量に関して使用される。典型的には、所与の拮抗処理の有効な量は、処理の好適な条件下の未処理の対照に生じる病害のレベルおよび／または病原体発現のレベルに対して、少なくとも２０％、またはより典型的には３０〜４０％、より典型的には５０〜６０％、さらにより典型的には７０〜８０％、さらにより典型的には９０〜９５％の減少を提供する。有効な量は、一回以上の投与で投与され得る。液体製剤の実際の適用量は、通常、最低約１×１０３〜約１×１０１０生細胞／ｍＬ、好ましくは約１×１０６〜約５×１０９生細胞／ｍＬと変動する。大半の条件下で、下の実施例に記載される本発明の拮抗微生物株は、実質的に植物組織の少なくとも約５０％の均一の接触を達成するであろう適用様式を仮定すると、約１×１０６〜１×１０９生細胞／ｍＬの範囲の適用量で最適に有効であろう。拮抗薬が固形製剤として適用される場合、適用量は、前述の液体処理の速度によって得られるのと同様に、植物組織表面の単位面積当たり同等数の生細胞をもたらすように制御されるべきである。典型的には、本発明の生物学的制御剤は、１０６ＣＦＵ／ｇ（１グラム当たりのコロニー形成単位）を上回る、好ましくは１０７ＣＦＵ／ｇを上回る、より好ましくは１０８ＣＦＵ／ｇ、最も好ましくは１０９ＣＦＵ／ｇの濃度で送達されるとき、生物学的に有効である。
【００２７】
さらに、微生物に関して本明細書で使用される、表現「有効な微生物拮抗薬」は、本明細書において、対象微生物株が統計的に有意なレベルで未処理対照を超える胴枯病の阻害の程度を示すことを意味することが意図される。典型的には、有効な微生物拮抗薬は、好適な処理条件下の未処理の対照に生じる病害のレベルおよび／または病原体発現のレベルに対して、少なくとも２０％、またはより典型的には３０〜４０％、より典型的には５０〜６０％、さらにより典型的には７０〜８０％、さらにより典型的には９０〜９５％の減少をもたらす能力を有する。
【００２８】
組成物：「組成物」は、駆除剤等の、活性剤と、不活性（例えば検出可能な薬剤もしくは標識または液体担体）もしくは活性の少なくとも別の化合物、担体、もしくは組成物との組み合わせを意味することが意図される。
【００２９】
単離された微生物株、単離された培養物、生物学的に純粋な培養物、および濃縮された培養物：本明細書で使用される、微生物（例えば、細菌また微小真菌（ｍｉｃｒｏｆｕｎｇｕｓ））に適用される用語「単離された」とは、天然に生じる環境から取り除かれたおよび／または精製された微生物を指す。そのようなものとして、本明細書で使用される、微生物の「単離された株」は、その自然環境から取り除かれたおよび／または生成された株である。よって、「単離された微生物」は、天然に存在する環境に存在するものを含まない。さらに、用語「単離された」は、微生物が精製された程度を必ずしも反映しない。微生物の株の「実質的に純粋な培養物」とは、微生物の所望の株または複数の株以外の他の微生物を実質的に含まない培養物を指す。換言すれば、微生物の株の実質的に純粋な培養物は、微生物の汚染物質ならびに望ましくない化学汚染物質を含む可能性がある他の汚染物質を実質的に含まない。さらに、本明細書で使用される、「生物学的に純粋」な株は、通常、自然界に関連する物質から分離された株を意味することが意図される。他の株、または通常自然界に見られない化合物もしくは物質に関連する株でも「生物学的に純粋」と定義されることに留意する。特定の株の単一培養物は、勿論、「生物学的に純粋」である。本明細書で使用される、単離された微生物株の用語「濃縮された培養物」とは、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％を超える単離された株を含む微生物培養物を指す。
【００３０】
本明細書で使用される、「内部寄生菌」は、明らかな病害をもたらすことなく、その生涯の少なくとも一部を植物内で過ごす内部共生体である。内部寄生菌は、垂直（親から子孫に直接）または水平（個体から関係のない個体に）のいずれかで伝播され得る。垂直伝播される真菌の内部寄生菌は、典型的に無性であり、宿主の種子に侵入する真菌の菌糸を介して母系植物から子孫に伝播する。細菌の内部寄生菌も種子から幼苗に垂直に移動することができる（Ｆｅｒｒｅｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。逆に、水平伝播される内部寄生菌は、典型的に有性であり、風および／または昆虫ベクターによって広がることができる胞子を介して伝播する。作物植物の内部寄生菌は、病害および昆虫侵襲の両方を制御する、ならびに植物成長を促進するその能力に関して大きな関心を集めている。
【００３１】
機能同等タンパク質：本明細書で使用される、「機能同等タンパク質」は、少なくとも一つの共通の特性を有するそれらのタンパク質を説明する。そのような特性は、配列類似性、生化学活性、転写パターン類似性、および表現型活性を含む。典型的には、機能同等タンパク質は、ある程度の配列類似性または少なくとも一つの生化学を共有する。この定義内で、ホモログ、オルソログ、パラログ、およびアナログは機能同等であると考えられる。加えて、機能同等タンパク質は、一般的に、少なくとも一つの生化学および／または表現型活性を共有する。機能同等タンパク質は、類似するが、必ずしも同じ程度ではない同一の特性を生じさせる。典型的に、機能同等タンパク質は、同等物のうちの一つによる定量的測定値が他の少なくとも２０％、より典型的には他の３０〜４０％、より典型的には他の５０〜６０％、さらにより典型的には他の７０〜８０％、さらにより典型的には他の９０〜９５％、さらにより典型的には他の９８〜１００％である場合、同じ特性を有する。
【００３２】
殺真菌性：本明細書で使用される、「殺真菌性」とは、組成物または物質が真菌の成長速度を減少させる、または真菌の死滅率を増加させる能力を指す。
【００３３】
フザリウム菌：本発明の目的のため、用語フザリウム菌の使用は、この生物の有性（有性世代）時代および無性（無性世代）時代の両方を含むことが意図され、またそれぞれ、完全真菌期および不完全真菌期とも称されることを理解する。例えば、フザリウム・グラミネアラムの無性世代期は、胴枯病の原因因子であるジベレラ・ゼアエである。この病害は、典型的に、花穂または種子穂がこの真菌の不完全形態によって生成された分生子または完全形態によって生成された子嚢胞子で播種されるときに生じる。
【００３４】
突然変異体：本明細書で使用される、微生物に関する用語「突然変異体」または「変異体」とは、所望の生物活性が親株によって発現されるものと類似する親株の修飾体を指す。例えばミクロバクテリウムの場合、「親株」は、本明細書において、突然変異誘発前の元のミクロバクテリウム株と定義される。突然変異体または変異体は、ヒトの介入なしに自然界で生じ得る。これらは、当業者に既知の様々な方法および組成物で処理することにより得ることもできる。例えば、親株は、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソソグアニジン、エチルメタンスルホン等の化学物質で、またはγ、Ｘ線、もしくはＵＶ照射を用いた照射によって、あるいは当該技術分野の実施者に周知の他の手段によって処理され得る。
【００３５】
殺線虫性：本明細書で使用される、用語「殺線虫性」とは、物質または組成物が線虫の死滅率を増加させる、または線虫の成長速度を阻害する能力を指す。
【００３６】
病原体：本明細書で使用される、用語「病原体」は、植物または動物において、病害を引き起こすことができる藻類、クモ類、細菌、真菌、昆虫、線虫、寄生植物、酵母、原生動物、またはウイルス等の生物を指す。本明細書で使用される、用語「植物病原体」とは、植物に感染する病原性生物を指す。
【００３７】
パーセント同一性のパーセンテージ：本明細書で使用される、「配列同一性のパーセンテージ」は、二つの配列間の局所整列の長さによって定義される比較枠に対して、二つの局所的に最適に整列された配列を比較することによって決定される。比較枠におけるアミノ酸配列は、二つの配列の最適な整列の参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して、付加または欠失（例えばギャップまたはオーバーハング）を含み得る。二つの配列間の局所整列は、整列を実施するために使用されるアルゴリズム（例えばＢＬＡＳＴ）による基準により十分に類似すると判断される各配列のセグメントのみを含む。パーセンテージ同一性は、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列で生じて、一致位置の数をもたらす位置の数を決定し、一致位置の数を、比較枠の位置の総数で割り、結果を１００で乗じることによって決定される。比較のための配列の最適な整列は、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｄ．ＡＰＬ．Ｍａｔｈ．２：４８２の局所相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３，１９７０）の局所相同性整列アルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２４４４，１９８８）の類似性検索法によって、これらのアルゴリズム（ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＴ、ＳＩＭ、ＢＬＡＳＴＺ）の発見的実施によって、または検証によって行うことができる。二つの配列が比較のために識別されたことを考慮すると、それらの最適な整列を決定するために、好ましくはＧＡＰおよびＢＥＳＴＦＩＴが採用される。典型的に、ギャップ荷重については５．００、そしてギャップ荷重長さについては０．３０のデフォルト値が使用される。ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列間の用語「実質的な配列同一性」とは、プログラムを使用して、参照配列と比較して、少なくとも５０％の配列同一性、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、および最も好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する配列を含むポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。
【００３８】
問い合わせ核酸およびアミノ酸配列は、公共または登録データベースに存在する対象核酸またはアミノ酸配列に対して検索され得る。そのような検索は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ  ｖ  ２．１８）プログラムを使用して行うことができる。ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴプログラムは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのインターネット上（ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）で入手可能である。典型的に、ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴの次のパラメータを使用することができる：「デフォルト」に設定されたフィルタオプション、「ＢＬＯＳＵＭ６２」に設定された比較マトリックス、「Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ：１１、Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ：１”」に設定されたギャップコスト、３に設定された語長、１ｅ−３に設定された期待値（Ｅ閾値）、および５０％の問い合わせ配列長に設定された局所整列の最小長。配列同一性および類似性は、ＧｅｎｏｍｅＱｕｅｓｔ（商標）ソフトウェア（Ｇｅｎｅ−ＩＴ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ  Ｍａｓｓ．ＵＳＡ）を使用して決定することもできる。
【００３９】
本明細書で使用される、用語「駆除性」とは、物質または組成物が害虫、すなわち、望ましくない生物の成長速度を減少させる、または害虫の死滅率を増加させる能力を指す。
【００４０】
植物病原体に対する生物学的制御剤の「抑制活性」とは、薬剤が病原体自体の発現、または病原体によって生じた感染もしくは病害状態の進行を抑制する、阻害する、安定させる、反転させる、低下させる、または遅延させる能力を意味する。
【００４１】
変異体：微生物に関して、本明細書で使用される、「変異体」は、特徴が遺伝に基づく（遺伝性）親株に対して、少なくとも一つのヌクレオチド配列変化または識別可能な異なる特徴を有する一方で、それが属する種の識別特性を有する株である。例えば、殺真菌活性を有するミクロバクテリウム種ＳＧＩ−ＳＧＩ−０１４−Ｃ０６株に関して、識別可能な特徴は、１）フザリウム・グラミネアラムおよびその有性世代であるジベレラ・ゼアエの成長を抑制する能力、２）胴枯病の発現を抑制する能力、３）ミクロバクテリウム種ＳＧＩ−０１４−Ｃ０６のハウスキーピング遺伝子に対して９５％を超える、９６％を超える、９７％を超える、９８％を超える、または９９％を超える配列同一性を有するハウスキーピング遺伝子を有することを含み、変異体をミクロバクテリウム種ＳＧＩ−０１４−Ｃ０６であると確認するために使用され得る。
【００４２】
核酸およびポリペプチドに関して、用語「変異体」は、本明細書において、参照ポリペプチドまたはポリヌクレオチドと比較して、それぞれ、そのアミノ酸または核酸配列において、いくつかの相違を有し、合成により、または天然に発生した、ポリペプチド、タンパク質、またはポリヌクレオチド分子を意味するように使用される。例えば、これらの相違は、参照ポリペプチドまたはポリペプチドにおける置換、挿入、欠失、またはそのような変更の任意の所望の組み合わせを含む。ポリペプチドおよびタンパク質変異体は、さらに、電荷および／または翻訳後修飾（グリコシル化、メチル化、リン酸化等）における変化からなることができる。
【００４３】
本明細書に言及される全ての刊行物および特許出願は、各個々の刊行物または特許出願が参照により組み込まれるように具体的かつ個々に示されるのと同じ程度に参照により本明細書に組み込まれる。
【００４４】
任意の参照が先行技術を構成するという承認は行われない。参照文献の考察は、それらの著者が主張するものを記述するものであり、出願者が引用される文献の正確性および妥当性を問題にする権利を保有する。いくつかの先行技術の刊行物が本明細書に記述されるが、この参照は、これらの文献のいずれかが当該技術分野における共通の一般知識の一部を形成するという承認とはならないことを明確に理解する。
【００４５】
分類識別方法
微生物は、直接顕微鏡分析（サンプル中の全細胞は検査上で同じに見える）、染色特性、単純な分子分析（単純な制限断片長多型（ＲＦＬＰ）決定等）などに基づき区別され得ることが多い。本開示の実施例２〜３に記載されるそのような分類分析法の例示的な例に加えて、微生物の分類識別は最大いくつかの異なるレベルの分析を伴うことができ、各分析は生物の異なる特性に基づき得る。そのような分類分析は、核酸に基づく分析（例えば、個々の特定の遺伝子の分析であって、それらの存在もしくはそれらの正確な配列、または特定の遺伝子もしくは遺伝子のファミリーの発現のいずれかに関する、分析）、タンパク質に基づく分析（例えば、直接的もしくは間接的酵素アッセイを使用する機能レベルで、またはイムノ検出法を使用する構造レベルで）などを含み得る。
【００４６】
ａ．核酸に基づく分析：当業者は、多種多様の核酸に基づく技法が既知であり、所与の微生物の分類識別を得るのに有用であり得ることを理解する。これらの技法は、遺伝子配列により細胞を識別する、または特定の遺伝子もしくは遺伝子ファミリーを有する細胞を識別するために使用され得る。分類研究に有用な一般的な遺伝子ファミリーは、１６Ｓ遺伝子ファミリー、アクチン遺伝子ファミリー、およびリコンビナーゼＡ（ｒｅｃＡ）遺伝子ファミリーを含む。これらの方法は、典型的に、非常に少ない数の細胞から遺伝子を増幅し、配列決定することを含み、したがって、希釈懸濁液から細胞およびそのＤＮＡを濃縮する問題を克服することが多い。用語「核酸増幅」とは、一般的に、サンプルまたは検体における核酸分子のコピーの数を増加させる技法を指す。核酸増幅に有用な技法は、当該技術分野において周知である。核酸増幅の例は、対象から収集した生体サンプルが、プライマーの、サンプル中の核酸テンプレートとのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、一対のオリゴヌクレオチドプライマーと接触するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。プライマーは、好適な条件下で伸長され、テンプレートから解離され、次に再アニールされ、伸長され、解離されて、核酸のコピーの数を増幅する。生体外増幅法の他の例としては、鎖置換増幅、転写を含まない等温増幅、修復連鎖反応増幅、リガーゼ連鎖反応、ギャップ充填リガーゼ連鎖反応増幅、共役リガーゼ検出、およびＰＣＲ、ならびにＲＮＡ転写を含まない増幅が挙げられる。
【００４７】
本明細書に提供される例示的な例のプライマー（例えば実施例２〜３および配列表を参照）に加えて、プライマーは、微生物の個々の種または系統発生群に関して、日常的にも設計されており、新しいものが絶えず設計されている。そのような厳密な標的プライマーは、関心の微生物のみを特異的にスクリーニングおよび／または識別するために、本明細書に記載される方法を用いて使用され得る。
【００４８】
核酸プライマーを調製し、使用するための方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ＣＳＨＬ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９）、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄ．）（Ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９８）に記載される。増幅プライマー対は、プライマー（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ．）等のその目的を対象としたコンピュータプログラムを使用することにより、既知の配列から導くことができる。当業者は、特定のプローブまたはプライマーの特異性がその長さと共に増加することを理解する。よって、例えば、ｒＲＮＡをコードするヌクレオチドの３０個の連続するヌクレオチドまたはその隣接領域を含むプライマーは、１５個のヌクレオチドのみの対応するプライマーより高い特異性で標的配列にアニールする。よって、より大きい特異性を得るために、１６Ｓ  ｒＲＮＡ等の標的ヌクレオチド配列の少なくとも２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０以上の連続するヌクレオチドを含むプローブおよびプライマーが選択され得る。
【００４９】
核酸適用に有用な核酸を調製するための一般的な技法（例えばＰＣＲ）は、フェノール／クロロホルム抽出または市場で入手可能である多くのＤＮＡ抽出キットのうちの一つの使用を含む。ＤＮＡが増幅され得る別の方法は、核酸増幅反応ミックスに細胞を直接添加すること、および細胞を溶解し、ＤＮＡを解放する増幅の変性ステップに依存することによる。
【００５０】
核酸増幅反応の生成物は、電気泳動、制限エンドヌクレアーゼ開裂パターン、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションもしくはライゲーション、および／または核酸配列決定を含む、当業者に周知である標準技法のうちの一つ以上によってさらに特徴付けされ得る。ハイブリダイゼーション技法が細胞識別の目的に使用される場合、蛍光標識、放射活性標識、および非放射活性標識を含む様々なプローブ標識方法が有用であり得る。核酸配列決定技法が使用されるとき、ＤＤＢＪ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬデータベースを含むが、これらに限定されない様々なデータベースの既知配列を使用して、増幅した核酸分子のヌクレオチド配列の相同性検索を行うことができる。
【００５１】
ｂ．タンパク質に基づく分析：核酸の分析に加えて、微生物は、特定のタンパク質の存在（または不在）に直接基づき、分類上特徴付けされ、識別され得る。そのような分析は、例えば、酵素アッセイを通して、もしくは共培養生物の応答による、または単なる特定のタンパク質の存在による（例えば、原位置での免疫蛍光抗体染色等の免疫方法を使用して決定され得る）、特定されたタンパク質の活性に基づき得る。
【００５２】
酵素アッセイ：例として、蛍光または発色基質アナログは、成長培地（マイクロタイタープレート培養物）の中に含まれ、その後インキュベーション、反応生成物のスクリーニングが続き、それによって培養物をその酵素活性に基づき識別する。
【００５３】
共培養応答：本発明のいくつかの実施形態では、微生物単離株により坦持される酵素の活性は、共培養生物（例えばリポーター生物等）の応答（または応答の程度）に基づきアッセイされ得る。
【００５４】
様々な方法は、少なくとも一つの抗体もしくは抗体由来分子を微生物の分子、より具体的には分子のエピトープに結合することにより、供給源環境から選択され、単離された微生物を識別するためにも使用することができる。
【００５５】
抗微生物タンパク質抗体は、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ  （Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ＣＳＨＬ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８）を含む、いくつかの文章に記載される標準的な手順を使用して生成され得る。特定の薬剤が実質的に所望の微生物のタンパク質のみに結合するかの決定は、日常的な手順を使用するか、またはそれを適応させることによって容易に行うことができる。好適な生体外アッセイの一つは、は、ウエスタンブロット手順（Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ＣＳＨＬ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８）を含む、多くの標準的な文章に記載される）を使用する。
【００５６】
抗体の短い断片（抗体由来分子、例えば、ＦＡｂｓ、Ｆｖｓ、および単鎖Ｆｖｓ（ＳＣＦｖｓ））も特異的結合剤として機能することができる。これらの断片を作製する方法は日常的である。
【００５７】
本発明のアレイ上で細胞に結合する抗体の検出は、標準的な手順、例えば、検出可能なシグナル、例えば蛍光または発光シグナルを提供するＥＬＩＳＡアッセイを使用して行うことができる。
【００５８】
本発明の単離された培養物
本開示の実施例のセクションでより詳細に記載されるように、出願者は、いくつかの農学的に有益な新規微生物、例えば胴枯病の有効な抑制因子を発見した。具体的には、これらの新規拮抗微生物は、胴枯の重症度を低減し、小麦の胴枯病の主な原因因子であるフザリウム・グラミネアラムの成長の阻害に有効である。微生物拮抗薬は、米国のいくつかの場所から収集した野生植物サンプルから得た約５，０００の微生物株の中から識別された。拮抗微生物の最初の選択は、微生物が、生体外拮抗アッセイにおいて、フザリウム・グラミネアラム病原体およびその有性世代ジベレラ・ゼアエの発現を抑制する能力に基づいた。選択された微生物拮抗薬は、次に、小麦幼苗の温室研究において生物アッセイされ、これは、幼苗に微生物株を播種し、続いて、微生物株が真菌侵襲の重症度を低減させる能力および種子収率を保つその能力について、フザリウム・グラミネアラム胞子の播種を繰り返すことを伴う。この様式で選択された拮抗微生物は、温室試験において、胴枯の重症度を低減させるのに有効であることが分かった。
【００５９】
分類分析は、本開示に記載される拮抗微生物のそれぞれが、細菌属ミクロバクテリウム、細菌属バチルス、細菌属バリオボラックス、または真菌属マイコスファエレラのいずれかと密接に関連することをさらに決定した。
【００６０】
ミクロバクテリアセア（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）族のタイプ属であるミクロバクテリウム属は、一般的に、最初は乳酸生成細菌の初期の研究中に単離されたグラム陽性、非胞子形成、ロッド形状の細菌に対応すると考えられる。ミクロバクテリウム属のメンバーは、本来、大部分がその顕著な耐熱性、乳製品における存在、およびグルコースからの少量のＬ（＋）乳酸の生成を特徴とする。種が密着したペプチドグリカン型を特徴とするミクロバクテリアセア族の他の属とは対照的に、ミクロバクテリウムの種は、ペプチド間架橋またはＢ型ペプチドグリカンの位置３のいずれかに、オルニチンまたはリジンを保有する。イソプレノイドキノン（ＭＫ−１１、ＭＫ−１２、ＭＫ−１３）、極性脂質、脂肪酸、およびＤＮＡの塩基組成物等の他の化学分類性質において、この属のメンバーは、ミクロバクテリアセアの他の属に見られる通常の範囲の多様性を示す。ミクロバクテリウムおよびオウレオバクテリウム（Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の二つの細菌属は、ある分類研究により統一され得る。今まで、ミクロバクテリウム属のメンバーは、土壌、乳製品、植物虫こぶ、昆虫、または臨床検体を含む広範囲の生育地から単離された少なくとも３３種を含む。それらの生態学、系統発生学、分類学、培養方法、および長期保存条件の様々な態様は、近年、Ｅｖｔｕｓｈｅｎｋｏ  ａｎｄ  Ｔａｋｅｕｃｈｉ（２００６）によって要約された。当業者は、ミクロバクテリウム属の微生物が、大部分がＥｖｔｕｓｈｅｎｋｏ  ａｎｄ  Ｔａｋｅｕｃｈｉ（２００６）に記載される細胞壁ペプチドグリカンの化学分類分析および比較１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列分析ならびに本明細書に引用される参照文献を含む上述の分類識別技法のいずれかによって、ならびに本開示の実施例２〜３に記載されるものによって分類学上識別され得ることを容易に理解する。下により詳細に論じるように、今までに、いくつかの天然に存在する微生物が胴枯病に対して拮抗活性を有すると報告されてきた。しかしながら、本発明以前に、そのような拮抗活性を有するマイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属の微生物を記載する報告はない。さらに、本発明以前に、本発明者は、胴枯病の原因病原体の発現の予防、阻害、または処理に生物制御剤としてマイコバクテリウム属の細菌株を使用するいずれの方法またはプロセスに気付かなかった。
【００６１】
バチルス属は、グラム陽性／可変性、胞子形成、ロッド形状の細菌の属である。シュードモナスまたはビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）等の微生物学の初期の歴史に関連する他の属と同様、２６６種近くのバチルス属のメンバーが遍在的に発見され、最も大きな１６Ｓ多様性および環境多様性の属のうちの一つであると広く考えられている。バチルス種は、絶対好気性菌または通性嫌気性菌、および酵素カタラーゼの試験陽性であり得る。自然界において遍在的なバチルスは、自由生活性および病原性の種の両方を含む。ストレスの多い環境条件下で、細胞は長期間潜伏することができる楕円内生胞子を生成する。これらの特性は本来属を定義したが、そのような種の全てが密接に関係せず、多くは他の属に移動された。実際、いくつかの研究は属の系統発生の再構築を試みた。大半の多様性を網羅したバチルスに特化した研究は、属を、ネスト化属（ｎｅｓｔｅｄ  ｇｅｎｅｒａ）パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、ブレビバチルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、ゲオバチルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、マリニバチルス（Ｍａｒｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、およびバルジバチルス（Ｖｉｒｇｉｂａｃｉｌｌｕｓ）を含む１０の群に分ける、１６ＳおよびＩＴＳ領域を使用した、Ｘｕ  ａｎｄ  Ｃｏｔｅ［Ｉｎｔｌ．Ｊ．ｏｆ  Ｓｙｓｔ．Ｅｖｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５３（３）：６９５−７０４；２００３］による。しかしながら、より最近の研究によると、バチルス属は、特に１６Ｓおよび２３Ｓの両方に非常に多数のネスト化分類群を含み、バチルス・コアウイレンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｈｕｉｌｅｎｓｉｓ）およびその他（例えば、Ｙａｒｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｙｓｔ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３１（４）：２４１−２５０，２００８、Ｙａｒｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｙｓｔ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３３（６）：２９１−２９９，２０１０］により、ラクトバチルス目（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ）（乳酸菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）等）に側系統的であると考えられる。現在の分類基準による炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、バチルス・セレウス（Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・マイコイデス（Ｂ．ｍｙｃｏｉｄｅｓ）、バチルス・シュードマイコイデス（Ｂ．ｐｓｅｕｄｏｍｙｃｏｉｄｅｓ）、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、およびバチルス・ウェイヘンステファネンシス（Ｂ．ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎｅｎｓｉｓ）によって形成される特定の単系統の一つは、単一種（９７％以内の１６Ｓ同一性）であるべきだが、医学上の理由により、それらは別個の種と考えられる。本開示の実施例２〜３に記載される分類分析法に加えて、バチルス種の系統発生および分類分析は、Ｘｕ  ａｎｄ  Ｃｏｔｅ（２００３）、Ｙａｒｄａ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）、Ｙａｒｄａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）に詳細に論じられるものを含む、様々な技法によって実施することができる。
【００６２】
バリオボラックス属は、本来、バリオボラックス・パラドキサス（Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ  ｐａｒａｄｏｘｕｓ）として、アルカリゲネス・パラドキサス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｐａｒａｄｏｘｕｓ）の再分類（Ｗｉｌｌｅｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）によって作り出され、これは、この属のタイプ種と広く考えられている。バリオボラックス・パラドキサスは、新規生分解剤ならびに微生物／微生物および微生物／植物相互作用のモデルとして広く研究されてきた。他の種は、バリオボラックス・ドクドネンシス（Ｖ．ｄｏｋｄｏｎｅｎｓｉｓ）、バリオボラックス・ソリ（Ｖ．  ｓｏｌｉ）（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）、およびバリオボラックス・ボロニカムラン（Ｖ．ｂｏｒｏｎｉｃｕｍｕｌａｎｓ）（Ｍｉｗａ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）を含む。バリオボラックス種は、異化的に非常に多様であり、多くの生分解において、他の細菌種と相互に有益に相互作用し、したがって、生態的な重要性および高い応用可能性を有する。例えば、土壌のメタン資化は、バリオボラックス・パラドキサス株と一緒に共培養されるときにのみメタン（強力な温室ガス）に高親和性を示し、この特徴は、通常、実験培養物では観察されない。同様に、バリオボラックスの近親種は、光合成共同体「クロロクロマチウム・アグレガツム（Ｃｈｌｏｒｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ  ａｇｇｒｅｇａｔｕｍ）」内で、中心的な非光合成パートナーであることが分かった。バリオボラックス属のいくつかの種は、他の細菌の伝達に干渉する能力も有する。バリオボラックス属のまたいくつかの他の種は、様々な生態系において、他の生物相（例えば植物）と密接に相互作用することができる。さらに、植物根のすぐ外側の領域および／または植物内部に生存するいくつかのバリオボラックス種は、一般的に、ファイトレメディエーションに利益をもたらすエチレンレベルの低下を介した植物成長の促進、菌体数感知制御された病原の抑制、および重金属に対する耐性の増加を可能にすることが報告されてきた。本開示の実施例２〜３に記載される分類分析法に加えて、バリオボラックス種の系統発生および分類分析は、本明細書の他の箇所で詳細に論じられるものを含む、様々な技法によって実施することができる。
【００６３】
マイコスファエレラは、２，０００を超える種名を有する非常に大きな真菌属であり、少なくとも５００種が４０を超える無性世代属に関連する（特に、セルコスポラ（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ）、シュードセルコスポラ（Ｐｓｅｕｄｏｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ）、セプトリア（Ｓｅｐｔｏｒｉａ）、ラムラリア（Ｒａｍｕｌａｒｉａ）等）。加えて、数千の無性世代は、有性世代に欠ける。マイコスファエレラの属は、病原体、腐生菌、内部寄生菌、または共生的群衆である種を含む。それらの生態学、植物発生、分類学、培養方法、および長期保存条件の様々な態様が近年報告された（例えば  Ｃｒｏｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｅｒｓｏｏｎｉａ，２３：１１９−１４６，２００９を参照）。当業者は、マイコスファエレラ属の微生物が上述の分類技法のいずれか、またはそれらの組み合わせによって分類学的に識別され得ることを容易に理解する。最も一般的な技法は、例えば、Ｃｒｏｕｓ  ｅｔ  ａｌ，  Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｍｙｃｏｌｏｇｙ，５５：２３５−２５３，２００６、Ｃｒｏｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００９、上記、Ｇｏｏｄｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ９１：６４８−６５８，２００１、および本開示の実施例２〜３に記載されるものに記載される１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列および内部転写スペーサー領域を使用する比較配列分析を含む。
【００６４】
生物材料の寄託
胴枯病に対して抑制活性を有すると識別された微生物株の精製された培養物は、特許手続の目的に関するブダペスト条約およびそれに従う規制により（ブダペスト条約）、１８１５  Ｎ．Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｔｒｅｅｔ，Ｐｅｏｒｉａ，ＩＬ  ６１６０４，ＵＳＡ（ＮＲＲＬ）に位置する農業研究サービス培養物保存機関（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に寄託された。これらの寄託の受託番号は次の通りである。
【表１】
0006009564.tif 000002
【００６５】
微生物株は、培養物へのアクセスが、本特許出願の継続中、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．１４および３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１２２の下、それに対して権利を有すると特許商標局の長官によって認められた者に利用可能であることを確実にする条件により寄託された。寄託物は、寄託された株の実質的に純粋な培養物を示す。寄託物は、本出願の対応物またはその後代が出願される国の外国特許法の定めるところにより利用可能である。しかしながら、寄託物の利用可能性は、政府の指令によって付与される特許権の緩和において本発明を実践する権利を構成するものではないことを理解するべきである。
【００６６】
本発明の好ましい微生物は、寄託された株の識別特性の全て、特に本明細書に記載される胴枯病の発現を抑制することができ、本明細書に記載されるフザリウム・グラミネアラム病原菌およびその有性世代のジベレラ・ゼアエの発現を抑制することができる識別特性を有する。特に、本発明の好ましい微生物は、上述の寄託された微生物およびその変異体を指す。
【００６７】
微生物組成物
単離された微生物株またはその培養物を含む本発明の微生物組成物は、静置培養物、全培養物、細胞の保存貯蔵物、菌糸体および／もしくは菌糸（特にグリセロール貯蔵物）、寒天片、グリセロール／水中の保存された寒天プラグ、凍結乾燥貯蔵物、および濾紙もしくは穀類種子上に乾燥させた凍結乾燥物（ｌｙｏｐｈｉｌｉｓａｔｅ）または菌糸体等の乾燥貯蔵物を含むがこれらに限定されない様々な形態であり得る。本明細書の他の箇所で定義されるように、本開示および当該技術分野において使用される、「単離された培養物」または文法上の等価物は、培養物と呼ばれるものが、培養液、ペレット、剥離物、乾燥サンプル、凍結乾燥物（ｌｙｏｐｈｉｌａｔｅ）、または切片（例えば菌糸もしくは菌糸体）、あるいは単一タイプの生物を含むプレート、紙、フィルタ、マトリックス、ストロー、ピペット、もしくはピペットチップ、繊維、針、ゲル、スワブ、チューブ、バイアル、粒子等の支持体、容器、または培地であることを意味することを理解する。本発明において、微生物拮抗薬である単離された培養物は、培養液、または微生物の剥離物、ペレット、乾燥調製物、凍結乾燥物（ｌｙｏｐｈｉｌａｔｅ）、もしくは切片、あるいは他の生物の不在下で微生物を含む支持体、容器、または培地である。
【００６８】
本開示は、本発明の少なくとも一つの単離された微生物株、またはその培養物、および担体を含む組成物をさらに提供する。担体は、安定性、湿潤性、分散性（ｄｉｓｐｅｒｓａｂｉｌｉｔｙ）等の増加等の、様々な性質を付与する多くの担体のうちのいずれか一つ以上であり得る。非イオン性もしくはイオン性界面活性剤またはそれらの組み合わせであり得る天然または合成の界面活性剤等の湿潤剤は、本発明の組成物に含まれ得る。油中水型エマルジョンは、本発明の少なくとも一つの単離された微生物を含む組成物を製剤化するためにも使用され得る（例えば米国特許第７，４８５，４５１号を参照、参照により本明細書に組み込まれる）。調製され得る好適な製剤は、水和剤、顆粒、ゲル、寒天片、もしくはペレット、増粘剤等、マイクロカプセル封入された粒子等、水性流動物、水性懸濁液、油中水型エマルジョン等の液体を含む。製剤は、穀類、豆果製品（例えば挽いた穀類もしくは豆、穀類もしくは豆に由来するブロスまたは小麦粉）、デンプン、糖、または油を含み得る。担体は、農業用担体であり得る。ある特定の好ましい実施形態では、担体は種子であり、組成物は種子上に適用またはコーティングすることができ、種子を飽和させる。
【００６９】
いくつかの実施形態では、農業用担体は、土壌または植物成長培地であり得る。使用することができる他の農業用担体は、水、肥料、植物系油、保湿剤、またはそれらの組み合わせを含む。あるいは、農業用担体は、顆粒、ペレット、または懸濁剤を含む、珪藻土、壌土、シリカ、アルギン酸塩、粘土、ベントナイト、バーミキュライト、綿かす、他の植物、および動物製品、または組み合わせ等の固形であり得る。ペスタ（ｐｅｓｔａ）（小麦粉およびカオリン粘土）、壌土中の寒天もしくは小麦粉系ペレット、砂、または粘土等の、前述の成分のいずれかの混合物も担体として想定される。製剤は、大麦、米、または種子、植物部分、サトウキビバガス、穀類加工処理からの外皮もしくは茎、粉砕植物物質（例えば、「庭のゴミ」）、または建設現場廃物からの木材、おがくず、または紙、布地、もしくは木材のリサイクルによる小さい繊維等の他の生物物質等の、培養された生物の食物源を含み得る。他の好適な製剤は当業者に既知である。
【００７０】
例えば溶液または懸濁液の液体形態では、微生物は、水または水溶液中に混合または懸濁され得る。好適な液体希釈剤または担体は、水、水溶液、石油蒸留物、または他の液体担体を含む。
【００７１】
固形組成物は、ピート、小麦、糠、バーミキュライト、粘土、タルク、ベントナイト、珪藻土、フラー土、低温殺菌された土壌等、適切に分けられた固形担体中に、またはそれらの上に拮抗薬微生物を分散することによって調製され得る。そのような製剤が水和剤として使用される場合、非イオン性、アニオン性、両性、またはカチオン性の分散剤および乳化剤等の生体適合性分散剤が使用され得る。
【００７２】
好ましい実施形態では、本明細書において想定される組成物は、微生物の拮抗薬として作用するのに十分な量で使用されるとき、植物、特に小麦、大麦、オート麦、およびトウモロコシ等の穀物植物に対する胴枯病による攻撃を阻止する。他の生物制御剤と同様に、これらの組成物は、典型的に植物を焼いたり、傷めたりしないため、高い安全域を有する。
【００７３】
本開示にわたって非常に詳細に記載されるように、胴枯病の制御は、本発明の微生物組成物のうちの一つ以上を宿主植物または宿主植物の一部に適用することによってもたらされ得る。組成物は、胴枯のレベルを未処理の対照のものに対して相対的に低下させるのに有効な量で適用され得る。活性成分は、穀物植物に適用されるとき、標的植物病原体の植物病原体の発現を阻害するのに十分な濃度で使用される。当業者には明らかであるように、有効濃度は、（ａ）植物または農業製品の種類、（ｂ）植物または農業製品の生理学的状態、（ｃ）植物または農業製品に影響を及ぼす病原体の濃度、（ｄ）植物または農業製品に対する病害（ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎｊｕｒｙ）の種類、（ｅ）気象条件（例えば温度、湿度）、および（ｆ）植物病害の段階等の要因により変動し得る。本発明によると、典型的な濃度は、担体の１×１０２ＣＦＵ／ｍＬより高いものである。好ましい濃度は、約１×１０６〜約１×１０８ＣＦＵ／ｍＬの範囲の濃度等、約１×１０４〜約１×１０９ＣＦＵ／ｍＬの範囲である。より好ましい濃度は、担体の１グラム当たり（乾燥製剤）または担体の１ミリリットル当たり（液体化合物）約３５〜約１５０ｍｇの乾燥微生物質量のものである。固形製剤では、適用量は、前述の液体処理の速度によって得られるのと同様に、植物組織表面の単位面積当たり同等数の生細胞をもたらすように制御されるべきである。典型的には、本発明の生物学的制御剤は、１０６ＣＦＵ／ｇ（１グラム当たりのコロニー形成単位）を上回る、好ましくは１０７ＣＦＵ／ｇを上回る、より好ましくは１０８ＣＦＵ／ｇ、最も好ましくは１０９ＣＦＵ／ｇの濃度で送達されるとき、生物学的に有効である。
【００７４】
いくつかの実施形態では、本発明の微生物組成物における生物学的制御剤のうちの一つ以上の量は、最終製剤ならびに利用される植物もしくは種子の大きさまたは種類により変動し得る。好ましくは、微生物組成物中の一つ以上の生物学的制御剤は、全製剤中約２ｗ／ｗ／％〜約８０ｗ／ｗ％で存在する。より好ましくは、組成物に採用される一つ以上の生物学的制御剤は、全製剤の重量の約５ｗ／ｗ％〜約６５ｗ／ｗ％、最も好ましくは約１０ｗ／ｗ％〜約６０ｗ／ｗ％である。
【００７５】
当業者によって理解されるように、本発明の微生物組成物は、散布、コーティング、注入、擦る、転動、浸漬、噴霧、もしくははけ塗り等の様々な従来の方法、または処理される小麦植物または他の穀物を著しく傷めない任意の他の適切な技法を使用して、小麦植物または他の穀物に適用され得る。噴霧法が特に好ましい。
【００７６】
典型的に、本発明の組成物は化学的に不活性であり、よって、それらは噴霧計画の実質的にいずれの他の成分と適合性がある。それらは、例えば除草剤、殺線虫剤、殺真菌剤、殺虫剤等の生体適合性の駆除活性剤と組み合わせて使用することもできる。それらは、肥料、植物成長調節剤等の植物成長に影響を及ぼす物質と組み合わせて使用することもできるが、但し、そのような化合物または物質は生体適合性であることを条件とする。
【００７７】
これらの製剤から調製されるその商業的に入手可能な製剤および使用形態において駆除剤または殺真菌剤として使用されるとき、本発明による活性微生物拮抗薬および組成物は、さらに共力剤との混合物の形態で存在することができる。共力剤は、添加される共力剤にとってそれ自体活性である必要がなく、活性組成物の活性が増加される化合物である。
【００７８】
これらの製剤から調製される駆除剤としてその商業的に入手可能な製剤および使用形態において使用されるとき、本発明による活性微生物拮抗薬および組成物は、さらに、植物の生育地、植物の一部の表面上、または植物組織に適用した後、活性組成物の分解を減少させる阻害剤との混合物の形態で存在し得る。
【００７９】
本発明による活性微生物拮抗薬および組成物は、そのようなものとして、またはそれらの製剤において、例えば、作用のスペクトルを広げるために、またはこのような方法で耐性の発達を阻止するために、既知のダニ駆除剤、殺菌剤、殺真菌剤、殺虫剤、殺微生物剤、殺線虫剤、駆除剤、またはそれらの組み合わせとの混合物として使用することもできる。多くの場合では、相乗効果の結果、すなわち混合物の活性は、個々の構成成分の活性を超えることができる。肥料、成長調節剤、毒性緩和剤（ｓａｆｅｎｅｒ）および／または情報物質等の他の既知の活性化合物との混合物も想定される。
【００８０】
本発明の好ましい実施形態では、組成物は少なくとも一つの化学または生物駆除剤をさらに含むことができる。組成物に採用される少なくとも一つの化学または生物駆除剤の量は、最終製剤ならびに処理される植物および種子の大きさにより変動し得る。好ましくは、採用される少なくとも一つの化学または生物駆除剤は、全製剤に基づき、約０．１ｗ／ｗ％〜約８０ｗ／ｗ％である。より好ましくは、少なくとも一つの化学または生物駆除剤は、約１ｗ／ｗ％〜約６０ｗ／ｗ％、最も好ましくは約１０ｗ／ｗ％〜約５０ｗ／ｗ％の量で存在する。
【００８１】
様々な駆除剤が当業者に明らかであり、使用することができる。代表的な化学駆除剤は、カルバミン酸塩、有機リン酸塩、有機塩素、およびピレスロイド（ｐｒｅｔｈｒｏｉｄ）クラスのものを含む。これらに限定されないが、ベノミル、ホウ砂、キャプタホル、キャプタン、クロロタロニル（ｃｈｏｒｏｔｈａｌｏｎｉｌ）、銅を含む製剤、ジクロン、ジクロラン、ヨウ素、亜鉛を含む製剤等の化学制御剤、これらに限定されないが、ブラストサイジン（ｂｌａｓｔｉｄｉｄｉｎ）、シモキサニル、フェナリモル、フルシラゾール、フォルペット、イマザリル、イプロジオン（ｉｐｏｒｄｉｏｎｅ）、マネブ、マンコゼブ（ｍａｎｏｃｏｚｅｂ）、メタラキシル、オキシカルボキシン、ミクロブタニル、オキシテトラサイクリン、ＰＣＮＢ、ペンタクロロフェノール、プロクロラズ、プロピコナゾール、キノメチオネート、亜ヒ酸ナトリウム、ナトリウムＤＮＯＣ、次亜塩素酸ナトリウム、フェニルフェネートナトリウム、ストレプトマイシン、硫黄、テブコナゾール、ターブトラゾール（ｔｅｒｂｕｔｒａｚｏｌｅ）、チアベンダゾール（ｔｈｉａｂｅｎｄａｚｏｌｅｌ）、チオファネート−メチル、トリアジメホン、トリシクラゾール、トリホリン、バリダマイシン（ｖａｌｉｄｉｍｙｃｉｎ）、ビンクロゾリン、ジネブ、およびジラム等のエルゴステロール生合成を阻害する殺真菌剤も含まれる。様々な殺虫剤化合物は、本発明の組成物に有用であり得、これに限定されないが、米国特許出願第２０１１００３３４３２Ａ１号に引用されるものを含む。
【００８２】
本発明の微生物組成物は、好ましくは、少なくとも一つの生物学的駆除剤を含む。本明細書で使用するのに好適であり、植物病原性病害を予防するための本発明による微生物組成物に含まれ得る代表的な生物駆除剤は、微生物、動物、細菌、真菌、遺伝物質、植物、および生存生物の天然生成物を含む。これらの組成物において、本発明の微生物は、さらなる生物との製剤化前に単離される。例えば、これらに限定されないが、アンペロマイセス（Ａｍｐｅｌｏｍｙｃｅｓ）、アウレオバシジウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、バチルス、ボーベリア（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ケトミウム（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ）、コルディセプス（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、デバリオマイセス（Ｄａｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、エクソフィリア（Ｅｘｏｐｈｉｌｉａ）、グリオクラジウム（Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ）、マリアンナエア（Ｍａｒｉａｎｎａｅａ）、ペシロマイセス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、パエニバチルス、パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、シュードモナス、スポロボロマイセス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）、タラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、およびトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の種等の微生物は、本発明の拮抗微生物を含む組成物に提供され得、ムスコドル（Ｍｕｓｃｏｄｏｒ）属の真菌株は特に好ましい。米国特許第７，５１８，０４０号、米国特許第７，６０１，３４６号、米国特許第６，３１２，９４０号に開示される微生物拮抗薬との組み合わせの本発明による微生物組成物の使用も特に好ましい。
【００８３】
組成物において本発明の微生物拮抗薬および組成物と組み合わせることができる真菌の例としては、ムスコドル種、アスシェロソニア・アレイロディス（Ａｓｃｈｅｒｓｏｎｉａ  ａｌｅｙｒｏｄｉｓ）、ボーベリア・バシアナ（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ  ｂａｓｓｉａｎａ）（「ホワイトムスカリン」）、ボーベリア・ブロンニアティ（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ  ｂｒｏｎｇｎｉａｒｔｉｉ）、クラドスポリウム・ヘルバラム（Ｃｈｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｈｅｒｂａｒｕｍ）、コルディセプス・クラブラタ（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ  ｃｌａｖｕｌａｔａ）、コルディセプス・エントモリザ（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ  ｅｎｔｏｍｏｒｒｈｉｚａ）、コルディセプス・ファシス（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ  ｆａｃｉｓ）、コルディセプス・グラシリス（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）、コルディセプス・メロランサエ（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ  ｍｅｌｏｌａｎｔｈａｅ）、コルディセプス・ミリタリス（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ  ｍｉｌｉｔａｒｉｓ）、コルディセプス・ミルメコフィラ（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ  ｍｙｒｍｅｃｏｐｈｉｌａ）、コルディセプス・ラベネリ（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ  ｒａｖｅｎｅｌｉｉ）、コルディセプス・シネンシス（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、コルディセプス・スフェコセファラ（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ  ｓｐｈｅｃｏｃｅｐｈａｌａ）、コルディセプス・サブセシリス（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ  ｓｕｂｓｅｓｓｉｌｉｓ）、コルディセプス・ユニラテラリス（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ  ｕｎｉｌａｔｅｒａｌｉｓ）、コルディセプス・ヴァリアビリス（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）、コルディセプス・ワシントネンシス（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ  ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎｅｎｓｉｓ）、クリシノマイセス・クラボスポラス（Ｃｕｌｉｃｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｃｌａｖｏｓｐｏｒｕｓ）、エントモファガ・グリリ（Ｅｎｔｏｍｏｐｈａｇａ  ｇｒｙｌｌｉ）、エントモファガ・マイマイガ（Ｅｎｔｏｍｏｐｈａｇａ  ｍａｉｍａｉｇａ）、エントモファガ・ムスカエ（Ｅｎｔｏｍｏｐｈａｇａ  ｍｕｓｃａｅ）、エントモファガ・プラキシブリ（Ｅｎｔｏｍｏｐｈａｇａ  ｐｒａｘｉｂｕｌｌｉ）、エントモファガ・プルテラエ（Ｅｎｔｏｍｏｐｈｔｈｏｒａ  ｐｌｕｔｅｌｌａｅ）、フザリウム・ラテリチウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｌａｔｅｒｉｔｉｕｍ）、ヒルステラ・シトリホルミス（Ｈｉｒｓｕｔｅｌｌａ  ｃｉｔｒｉｆｏｒｍｉｓ）、ヒルステラ・トンプソニ（Ｈｉｒｓｕｔｅｌｌａ  ｔｈｏｍｐｓｏｎｉ）、メタリジウム・アニソプリアエ（Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ  ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ）（「グリーンムスカリン」）、メタリジウム・フラボビリデ（Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ  ｆｌａｖｉｒｉｄｅ）、ムスコドル・アルバス（Ｍｕｓｃｏｄｏｒ  ａｌｂｕｓ）、ネオザイジテスフロリダナ（Ｎｅｏｚｙｇｉｔｅｓｆｌｏｒｉｄａｎａ）、ノムラエア・リレイ（Ｎｏｍｕｒａｅａ  ｒｉｌｅｙｉ）、ペシロマイセス・ファリノサス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ  ｆａｒｉｎｏｓｕｓ）、ペシロマイセス・フモソロセウス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ  ｆｕｍｏｓｏｒｏｓｅｕｓ）、パンドラ・ネオアフィジス（Ｐａｎｄｏｒａ  ｎｅｏａｐｈｉｄｉｓ）、トリポクラジウム・シリンドロスポラム（Ｔｏ���ｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ  ｃｙｌｉｎｄｒｏｓｐｏｒｕｍ）、ベルチシリウム・レカニイ（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｌｅｃａｎｉｉ）、ズープトラ・ラディカンス（Ｚｏｏｐｈｔｈｏｒａ  ｒａｄｉｃａｎｓ）、およびラッカリア・バイカラー（Ｌａｃｃａｒｉａ  ｂｉｃｏｌｏｒ）等の菌根（ｍｙｃｏｒｒｈｉｚａｌ）種が挙げられるが、これらに限定されない。他の真菌駆除種は、当業者に明らかである。
【００８４】
本発明は、土壌（すなわち畝間）、植物の一部（すなわち潅注）、または種まき前の種子上（すなわち種子コーティングまたは粉衣）のいずれかに有効な量で様々な常用製剤のいずれかを適用することによる、植物を処理する方法も提供する。常用製剤は、溶液、乳化性濃縮物、水和剤、懸濁液濃縮物、可溶性粉末、顆粒、懸濁液−エマルジョン濃縮物、活性化合物に含浸された天然および合成の物質、およびポリマー物質中の非常に微細な制御放出カプセルを含む。本発明のある特定の実施形態では、生物学的制御組成物は、使用可能な製剤または使用時に一緒に混合されるかのいずれかで利用可能である粉末に製剤化される。いずれかの実施形態では、粉末は、種まき前または種まき時に土壌に混合され得る。代替的実施形態では、生物学的制御剤または昆虫制御剤のいずれかのうちの一つ、または両方は、処理時に一緒に混合される液体製剤である。当業者は、本発明の組成物の有効な量が組成物の最終製剤ならびに処理される植物の大きさまたは種子の大きさに依存することを理解する。
【００８５】
最終製剤および適用方法により、一つ以上の好適な添加剤も本発明の組成物に導入され得る。カルボキシメチルセルロース等の接着剤、ならびにガム、アラビア、キチン、ポリビニルアルコール、およびポリ酢酸ビニル等の粉末、顆粒、またはラテックスの形態の天然および合成ポリマー、ならびにセファリンおよびレシチン等の天然リン脂質、ならびに合成リン脂質が本発明の組成物に添加され得る。
【００８６】
好ましい実施形態では、微生物組成物は、単一の安定した溶液、またはエマルジョン、または懸濁液に製剤化される。溶液に関して、活性化学化合物（すなわち害虫駆除剤）は、典型的に、生物学的制御剤が添加される前に溶剤に溶解される。好適な液体溶剤は、キシレン、トルエン、またはアルキルナフタレン等の石油系芳香族、シクロヘキサンまたはパラフィン等の脂肪族炭化水素、例えば石油留分、鉱物油、および植物油、ブタノールまたはグリコールならびにそのエーテルおよびエステル等のアルコール、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、またはシクロヘキサノン等のケトン、ジメチルホルムアミドおよびジメチルスルホキシド等の強極性溶剤を含む。エマルジョンまたは懸濁液に関して、液体培地は水である。一実施形態では、化学制御剤および生物学的制御剤は、別個の液体に懸濁され、適用時に混合される。懸濁液の好ましい実施形態では、昆虫制御剤および生物製剤は、少なくとも二年の貯蔵寿命を示す使用可能な製剤に組み合わされる。使用中、液体は、作物の定植時に噴霧されるか、または微粒化噴霧として葉に、または畝間に適用され得る。液体組成物は、種子の発芽前に土壌に、または点滴灌漑、スプリンクラー、土壌注入、または土壌潅注を含むがこれらに限定されない、当該技術分野において既知の様々な技法を利用することによって、根と接触する土壌に直接導入され得る。
【００８７】
任意に、クエン酸およびアスコルビン酸等のアルカリおよびアルカリ土類金属塩および有機酸、ならびに塩酸または硫酸等の無機酸を含む安定剤および緩衝剤が添加され得る。殺生物剤も添加され得、ホルムアルデヒドまたはホルムアルデヒド放出剤およびｐ−ヒドロキシ安息香酸等の安息香酸の誘導体を含むことができる。
【００８８】
種子コーティング製剤
いくつかの特に好ましい実施形態では、本発明の生物制御組成物は、種子処理剤として製剤化される。種子処理剤は、好ましくは、少なくとも一つの昆虫制御剤と、少なくとも一つの生物学的制御剤とを含む。種子は、種子処理製品を種子に正確に、安全に、かつ効率的に適用するように特異的に設計され、製造される処理適用器具の使用を通して、混合、噴霧、またはそれらの組み合わせの従来の方法を使用して、本明細書に開示される一層以上の生物制御組成物で実質的に均質にコーティングされ得ることが想定される。そのような器具は、回転式塗布機、ドラム式塗布機、流動床技法、噴流床、回転ミスト、またはそれらの組み合わせ等の様々な種類のコーティング技術を使用する。本発明のもの等の液体種子処理剤は、スプレーパターンを通って移動するとき、種子処理剤を種子上に均一に分散させる回転「アトマイザー」ディスクまたはスプレーノズルのいずれかを介して適用され得る。好ましくは、種子は、次に、さらなる処理剤の分散および乾燥を達成するために、さらなる期間の間、混合または混転される。発芽および出芽の均一性を増加させるために本発明の組成物でコーティングされる前に、種子はプライミングされても、プライミングされなくてもよい。代替的実施形態では、乾燥粉末製剤が移動種子上に計られ、完全に分散されるまで混合され得る。
【００８９】
本発明の別の態様は、対象微生物組成物で処理された種子を提供する。一実施形態は、本発明による微生物組成物でコーティングされた表面積の少なくとも一部を有する種子を提供する。具体的な実施形態では、微生物処理された種子は、一個の種子当たり約１０６〜約１０９の胞子濃度または微生物細胞濃度を有する。種子は、例えば一個の種子当たり１０１０、１０１１、または１０１２胞子等の、一個の種子当たりより多くの胞子または微生物細胞を有することもできる。微生物胞子および／または細胞は種子上に自由にコーティングされるか、または好ましくは、種子上にコーティングされる前に液体または固形組成物に製剤化され得る。例えば、微生物を含む固形組成物は、固形担体が胞子または細胞懸濁液で含浸されるまで、固形担体を胞子の懸濁液と混合することにより調製される。次に、この混合物は、所望の粒子を得るために乾燥させることができる。
【００９０】
いくつかの他の実施形態では、本発明の固形または液体生物制御組成物は、活性炭、栄養素（肥料）、ならびに発芽および製品の質またはそれらの組み合わせを改善することができる他の薬剤等の選択的除草剤の有害作用から種子を保護することができる機能剤をさらに含むことが想定される。
【００９１】
当該技術分野において既知である種子コーティング法および組成物は、本発明の実施形態のうちの一つの追加によって修飾されるとき、特に有用であり得る。そのようなコーティング法およびそれを適用するための装置は、例えば米国特許第５，９１８，４１３号、同第５，５５４，４４５号、同第５，３８９，３９９号、同第４，７５９，９４５号、および同第４，４６５，０１７号に開示される。様々な種子被覆組成物は、例えば、中でも米国特許出願第２０１１００３３４３２号、同第２０１００１５４２９９号、米国特許第５，９３９，３５６号、同第５，８７６，７３９号、同第５，８４９，３２０号、同第５，７９１，０８４号、同第５，６６１，１０３号、同第５，５８０，５４４号、同第５，３２８，９４２号、同第４，７３５，０１５号、同第４，６３４，５８７号、同第４，３７２，０８０号、同第４，３３９，４５６号、および同第４，２４５，４３２号に開示される。
【００９２】
様々な添加剤が本発明の組成物を含む種子処理製剤に添加することができる。結合剤が添加され得、好ましくは、コーティングされる種子に植物毒性作用がない天然または合成であり得る接着剤ポリマーから構成されるものを含む。結合剤は、ポリ酢酸ビニル、ポリ酢酸ビニルコポリマー、エチレン酢酸ビニル（ＥＶＡ）コポリマー、ポリビニルアルコール、ポリビニルアルコールコポリマー、セルロース（エチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、およびカルボキシメチルセルロースを含む）、ポリビニルピロリドン、多糖類（デンプン、修飾されたデンプン、デキストリン、マルトデキストリン、アルギン酸塩、およびキトサンを含む）、脂肪、油類、タンパク質（ゼラチンおよびゼインを含む）、アラビアガム、セラック、塩化ビニリデン、および塩化ビニリデンコポリマー、リグノスルホン酸カルシウム、アクリル系コポリマー、ポリビニルアクリレート、ポリエチレンオキシド、アクリルアミドポリマーおよびコポリマー、ポリヒドロキシエチルアクリレート、メチルアクリルアミドモノマー、ならびにポリクロロプレンから選択され得る。
【００９３】
ニトロソ、ニトロ、アゾ（モノアゾ、ビスアゾ、およびポリアゾを含む）、アクリジン、アトラキノン、アジン、ジフェニルメタン、インダミン、インドフェノール、メチン、オキサジン、フタロシアニン、チアジン、チアゾール、トリアリールメタン、キサンテンに分類される有機発色団を含む、様々な着色剤のいずれかを採用することができる。添加することができる他の添加剤は、鉄、マンガン、ホウ素、銅、コバルト、モリブデン、および亜鉛の塩等の微量の栄養素を含む。ポリマーまたは他の細粉制御剤は、種子の表面上の処理を保つために適用され得る。
【００９４】
いくつかの特定の実施形態では、微生物の細胞または胞子に加えて、コーティング剤は、接着層をさらに含むことができる。接着剤は、非毒性、生分解性、および接着性でなければならない。そのような物質の例としては、ポリ酢酸ビニル、ポリ酢酸ビニルコポリマー、ポリビニルアルコール、ポリビニルアルコールコポリマー、セルロース（メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、およびヒドロキシメチルプロピルセルロース等）、デキストリン、アルギン酸塩、糖類、糖蜜、ポリビニルピロリドン、多糖類、タンパク質、脂肪、油類、アラビアガム、ゼラチン、シロップ、およびデンプンが挙げられるが、これらに限定されない。さらなる例は、例えば米国特許第７，２１３，３６７号および米国特許出願第２０１００１８９６９３号に見出すことができる。
【００９５】
接着剤、分散剤、界面活性剤、および栄養素、ならびに緩衝成分等の様々な添加剤も種子処理製剤に含まれ得る。他の従来の種子処理添加剤は、コーティング剤、湿潤剤、緩衝剤、および多糖類を含むが、これらに限定されない。水、固形、または乾燥粉末等の少なくとも一つの農業的に許容される担体が種子処理製剤に添加され得る。乾燥粉末は、炭酸カルシウム、セッコウ、バーミキュライト、タルク、腐植土、活性炭、および様々なリン化合物等の、様々な物質に由来し得る。
【００９６】
いくつかの実施形態では、種子コーティング組成物は、活性成分が種子上へのその適用を容易にするために混合される有機もしくは無機の天然または合成の成分である少なくとも一つの充填剤を含むことができる。好ましくは、充填剤は、粘土、天然もしくは合成の珪酸塩、シリカ、樹脂、ワックス、固形肥料（例えばアンモニウム塩）、天然土壌鉱物（カオリン、粘土、タルク、石灰、石英、アタパルジャイト、モンモリロン石、ベントナイト、または珪藻土等）、または合成鉱物（シリカ、アルミナ、または珪酸塩等、特に珪酸アルミニウムもしくは珪酸マグネシウム）等の不活性固形である。
【００９７】
種子処理製剤は、次の成分の一つ以上をさらに含むことができる：他の駆除剤（地下でのみ作用する化合物を含む）、殺真菌剤（キャプタン、チラム、メタラキシル、フルジオキソニル、オキサジキシル、およびこれらの物質のそれぞれの異性体等）、除草剤（グリホサート、カルバメート、チオカルバメート、アセトアミド、トリアジン、ジニトロアニリン、グリセロールエーテル、ピリダジノン、ウラシル、フェノキシ、尿素、および安息香酸から選択される化合物を含む）、除草毒性緩和剤（ベンゾキサジン、ベンズヒドリル誘導体、Ν，Ν−ジアリルジクロロアセトアミド、様々なジハロアシル、オキサゾリジニル、およびチアゾリジニル化合物、エタノン、ナフタル酸無水化合物、ならびにオキシム誘導体等）、肥料、ならびに生物制御剤（リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属、バチルス属、シュードモナス属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、トリコデルマ属、グロムス（Ｇｌｏｍｕｓ）属、グリオクラジウム属、および菌根真菌属からの他の天然に存在する、または組換え型細菌および真菌）。これらの成分は、種子の別個の層として添加されるか、または別の方法としては、本発明の種子コーティング組成物の一部として添加され得る。
【００９８】
好ましくは、種子処理に使用される新規組成物または他の成分の量は、種子の発芽を阻害する、または種子に植物毒性の損害をもたらしてはならない。
【００９９】
微生物処理された種子は、被覆を保護するためにフィルム保護膜でさらに包まれてもよい。そのような保護膜は当該技術分野において既知であり、流動床およびドラムフィルムコーティング法を使用して適用され得る。
【０１００】
原理的には、発芽することができ、線虫および／または病原性真菌による攻撃の影響を受けやすい植物を形成するあらゆる植物種子が、本発明により処理することができる。好適な種子は、穀物、コーヒー、アブラナ属の作物、繊維作物、花、果実、豆果、油料作物、木、塊茎作物、野菜、ならびに単子葉の他の植物、および双子葉種のものを含む。好ましくは、豆、ニンジン、トウモロコシ、綿、草類、レタス、ピーナッツ、胡椒、ジャガイモ、菜種、米、ライ麦、サトウモロコシ、大豆、てん菜、ヒマワリ、タバコ、およびトマトの種子を含むが、これらに限定されない作物種子がコーティングされる。最も好ましくは、大麦または小麦（春小麦または冬小麦）の種子が本発明の組成物でコーティングされる。
【０１０１】
本発明の別の態様では、本発明の微生物の内部寄生菌を、内部寄生菌微生物を含まない穀物植物内に人工的に導入することによって生み出された新規穀物植物も提供される。この態様のいくつかの実施形態では、穀物植物内に導入された微生物の内部寄生菌は、胴枯病または胴枯病の原因因子に対して抑制活性を有する内部寄生菌拮抗薬であり得る。さらに、穀物植物内に導入された内部寄生菌拮抗薬は、真菌株ＳＧＩ−０１０−Ｈ１１であり得る。前に見出された微生物内部寄生菌を穀草種内に導入するのに有効な様々な方法は、当該技術分野において既知である。そのような方法の例は、中でも米国特許出願第２００３０１９５１１７Ａ１号、米国特許出願第２００１００３２３４３Ａ１号、および米国特許第７，０８４，３３１号に記載されるものを含む。前述の方法の多くは、本発明の新規穀物植物の作製に有用であり得ることは、当業者には明らかであろう。
【０１０２】
人工感染後、単離された内部寄生菌拮抗薬のＤＮＡはＰＣＲによって増幅され、拮抗薬は増幅されたＤＮＡのホモロジー検索を行うことによって確認されることが好ましい。さらに、識別可能な手段を発現する外来遺伝子が上述の内部寄生菌拮抗薬内に導入され、植物に感染している上述の内部寄生菌拮抗薬のコロニー形成の存在が、外来遺伝子を使用して、上記の識別可能な手段によって確認されることが好ましい。
【０１０３】
本発明による生物制御組成物の調製
微生物拮抗薬の培養物は、当該技術分野において既知の標準的な静的乾燥および液体発酵法を使用して、本発明の生物制御組成物に使用するために調製され得る。成長は、一般的に、生物反応器中で達成される。
【０１０４】
生物反応器とは、生物学的に活性環境を支持する任意の装置またはシステムを指す。本明細書に記載される、生物反応器は、本発明の微生物拮抗薬を含む微生物が成長できる槽である。生物反応器は、微生物を成長させるための任意の適切な形状または大きさであり得る。生物反応器は、大きさおよび規模が１０ｍＬからリットル、そして立方メートルの範囲であり得、当該技術分野において既知であり、使用されるステンレススチールまたは任意の他の適切な材料から作製され得る。生物反応器は、バッチ型生物反応器、供給バッチ型または連続型生物反応器（例えば連続攪拌反応器）であり得る。例えば、生物反応器は、細菌を成長させ、回収するための微生物学の分野において既知であり、使用されるケモスタットであり得る。生物反応器は、任意の市販業者から得ることができる（Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｄｅｓｉｇｎ，Ａｓｅｎｊｏ＆Ｍｅｒｃｈｕｋ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９９５も参照）。
【０１０５】
小規模運転に関して、例えば新しいプロセスを試験し、開発するため、および連続運転に変換できないプロセスに関しては、バッチ生物反応器が使用され得る。
【０１０６】
生物反応器中で成長させる微生物を浮遊または固定させることができる。生物反応器中での成長は、一般的に、成長に適切な温度およびｐＨでの好気条件下である。本発明の生物に関して、細胞成長は、５〜３７℃の温度で達成することができ、好ましい温度は、１５〜３０℃、１５〜２８℃、２０〜３０℃、または１５〜２５℃の範囲である。栄養素培地のｐＨは４．０〜９．０の間で変動し得るが、好ましい運転範囲は、通常、ｐＨ４．０〜７．０または４．５〜６．５、またはｐＨ５．０〜６．０のわずかに酸性から中性である。典型的に、最大細胞収率は、播種後２０〜７２時間で得られる。
【０１０７】
本発明の拮抗薬の培養の最適条件は、勿論、特定の株による。しかしながら、選択プロセスに適用される条件および大半の微生物の一般要件に基づき、当業者は、不可欠な栄養素および条件を決定することができるであろう。微生物拮抗薬は、典型的に、微生物によって吸収され、十分な細胞成長を支持する炭素、窒素、および無機塩の供給源を含む培地上の好気性液体培養物中で成長するであろう。好ましい炭素源はグルコース等のヘキソースであるが、アミノ酸等の容易に吸収される他の供給源を代用することができる。多くの無機およびタンパク質物質が成長プロセスで窒素源として使用され得る。好ましい窒素源はアミノ酸および尿素であるが、他としては、ガス状アンモニア、硝酸塩およびアンモニウムの無機塩、ビタミン、プリン、ピリミジン、酵母抽出物、牛肉抽出物、プロテオースペプトン、大豆ミール、カゼインの加水分解産物、蒸留器の溶解物等を含む。中でも栄養素培地内に組み込まれ得る無機鉱物は、カルシウム、亜鉛、鉄、マンガン、マグネシウム、銅、コバルト、カリウム、ナトリウム、モリブデン酸塩、リン酸塩、硫酸塩、塩化物、法酸塩等のイオンをもたらすことができる通常の塩である。これらに限定されないが、真菌の拮抗薬に関してはジャガイモのデキストロース液体培地、細菌株に関してはＲ２Ａブロスプレミックスの使用が好ましい。
【０１０８】
本開示を通して、様々な情報源が参照され、そして参照により組み込まれる。情報源は、例えば、科学雑誌の論文、特許文献、テキストブック、およびワールドワイドウェブブラウザー非活動ページアドレスを含む。そのような情報源に対する参照は、単に、出願時の一般的な技術水準を提供する目的のためである。情報源のそれぞれおよび一つ一つの内容および教示は、本発明の実施形態を構成し、使用するために、当業者に依存され、使用され得るが、特定の情報源におけるいずれの考察および論評は、そのような論評が当該分野における一般的な見解であると広く受け入れられている承認と決して考えられるべきではない。
【０１０９】
本明細書に記載される一般的な方法の考察は、単に例示の目的のためである。他の代替的方法および実施形態は、本開示の再考察により当業者には明らかであり、本明細書の趣旨および範囲内に含まれるものとする。
【０１１０】
次の実施例は、例示のために提示され、本発明を制限しないことも理解するべきである。
【実施例１】
【０１１１】
胴枯病の原因因子であるフザリウム・グラミネアラムおよびジベレラ・ゼアエの発現を抑制することができる拮抗微生物の発見
本実施例は、胴枯病の原因因子に対して、特にフザリウム・グラミネアラムに対して抑制活性を有する微生物の株を単離するために、Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｉｎｃ．で内部的に開発された、候補微生物を収集し、スクリーニングする高処理プロセスを説明する。新しい微生物拮抗株は、全米各地のいくつかの場所から収集した植物組織サンプルから単離された。細菌株ＳＧＩ−０１４−Ｃ０６、ＳＧＩ−０１４−Ｇ０１、ＳＧＩ−０１５−Ｆ０３、およびＳＧＩ−０１５−Ｈ０６は、Ｊｕｌｉａｎ，ＣＡ近くのＥａｇｌｅ  Ｐｅａｋ  Ｐｒｅｓｅｒｖｅから収集した植物根組織から単離した。真菌株ＳＧＩ−０１０−Ｈ１１および細菌株ＳＧＩ−００５−Ｇ０８は、Ｓａｎ  Ｅｌｉｊｏ  Ｌａｇｏｏｎ，Ｅｎｃｉｎｉｔａｓ，ＣＡから収集した二つの異なる植物サンプルの茎部組織から単離した。
【０１１２】
微生物は次のように単離された。細菌株の単離に関して、植物根組織は超音波処理され、２×ＹＴ（酵母抽出物およびトリプトン）およびＮを含まない寒天培地プレート上で段階希釈を受けた。次に、形態特性に基づき個々のコロニーを選択し、液体ブロス培地中で個別に培養した。真菌の単離に関して、植物組織は、最初に、７０％のエタノール中に浸漬し、短時間炎に通すことによって表面減菌された。次に、組織を切り裂き、ジャガイモのデキストロース寒天（ＰＤＡ）培地上に配置し、続いて室温でインキュベートした。菌糸体の成長が観察された後、菌糸体成長のセグメントを別のＰＤＡプレートに移した。微生物の株を単離し、精製し、細菌株に関しては１５％のグリセロール中、真菌株に関しては乾燥大麦種子上で、−８０℃で保存した。
【０１１３】
上述のように単離された微生物の株は、その後、若干の修正を伴うが米国特許出願第２０１２０１０７９１５Ａ１号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載される高処理スクリーニング手順により、ジャガイモデキストロース寒天（ＰＤＡ）成長培地を含む寒天プレート上で実施された生体外拮抗作用試験において、フザリウム・グラミネアラムの菌糸体成長を抑制するそれらの能力についてアッセイされた。簡潔に、微生物の単離された株を、２４時間、五分の一の強さのトリプチソイブロス寒天（ＴＳＢＡ／５）上で成長させた。フザリウム・グラミネアラムＮＲＲＬ−５８８３の分生子接種材料は、真菌の活発的に成長するコロニーを菌糸傾斜させ、菌糸鎖をＰＤＡ寒天培地に移すことによって生成された。１２時間／日光周期を使用して、２５℃で７日間、プレートをインキュベートした後、弱リン酸緩衝液（０．００４％のリン酸緩衝液、ｐＨ７．２、０．０１９％のＭｇＣｌ２を含む）を使用して、ＰＤＡプレートから分生子を洗浄した。次に、弱リン酸緩衝液（１×１０５分生子／ｍｌ）中のフザリウム・グラミネアラムの分生子の懸濁液を寒天表面上に直ぐに広げ、次にプレートを４８〜７２時間、２５℃でインキュベートした。拮抗作用試験を開始するために、単離された微生物株の細胞を、プレートの周縁内部に等間隔で点播種した。五日後、可視的に明らかに菌糸体成長を欠いた領域が微生物コロニーの周縁の周りに存在したとき、抗生作用陽性として記録された。
【０１１４】
４，０００を超える微生物株が単離され、上述の手順によってアッセイされた。それらのうち、六つの株が、ＰＤＡ培地上のフザリウム・グラミネアラムＮＲＲＬ−５８８３の菌糸体成長を大幅に抑制することが分かった。これらの新しい微生物拮抗薬は、ＳＧＩ−００５−Ｇ０８、ＳＧＩ−０１０−Ｈ１１、ＳＧＩ−０１４−Ｃ０６、ＳＧＩ−０１４−Ｇ０１、ＳＧＩ−０１５−Ｆ０３、およびＳＧＩ−０１５−Ｈ０６として識別される。
【０１１５】
拮抗作用試験は、フザリウム・グラミネアラムの有性世代種である真菌病原体ジベレラ・ゼアエの成長を抑制するその能力に関する、新しい微生物拮抗薬に対しても実施された。全ての手順は、このアッセイで試験された病原体株が真菌ジベレラ・ゼアエの病原性株であったことを除き、上述のものと同じであった。これらの六つの微生物拮抗薬のうち、ＳＧＩ−０１０−Ｈ１１、ＳＧＩ−０１４−Ｃ０６、ＳＧＩ−０１５−Ｆ０３、およびＳＧＩ−０１５−Ｈ０６の四つの株が、ジベレラ・ゼアエの菌糸体成長を大幅に抑制することが分かった。
【実施例２】
【０１１６】
ＤＮＡ抽出、配列決定、および分類
真菌細胞溶解およびＩＴＳ−５．８Ｓ  ｒＤＮＡ配列情報の取得
真菌バイオマスは、５０μｌの２×溶解緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣＬ、ｐＨ８．０、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０、１％ＳＤＳ、４００μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ）を含む９６ウェルＰＣＲマイクロプレートに移された。溶解条件は次の通りである：５５℃で６０分間、９４℃で４分間。溶解生成物のアリコートは、ＰＣＲ増幅のテンプレートＤＮＡの供給源として使用された。ＩＴＳ−５．８Ｓ  ｒＤＮＡ配列は、Ｍ１３−ＩＴＳ１（配列番号１５）およびＩＴＳ４  Ｍ１３尾状（配列番号１６）の二つのプライマーを使用して、ＰＣＲを介して増幅された。
【０１１７】
ＩＴＳ−５．８Ｓ  ｒＤＮＡ領域の増幅に関して、各ＰＣＲ混合物は、真菌溶解反応からの４μｌ、０．２μΜの各プライマー（ＩＴＳ１／ＩＴＳ４）、６％  Ｔｗｅｅｎ−２０、および１０μｌの２×ＩｍｍｏＭｉｘ（Ｂｉｏｌｉｎｅ  ＵＳＡ  Ｉｎｃ，Ｔａｕｎｔｏｎ，ＭＡ）を含む２０−μｌの最終容積反応物中で調製された。ＰＣＲ条件は次の通りである：９４℃で１０分間、９４℃で３０秒、５２℃で３０秒、７２℃で７５秒を３０サイクル、７２℃で１０分間。２−μｌのＰＣＲ生成物のアリコートは、１．０％アガロースゲルにかけられ、予想された大きさの単一バンドを確認した。陽性バンドは、サンガー配列決定のために、Ｍ１３プライマーを使用して、順方向および逆方向に送られた。真菌株ＳＧＩ−０１０−Ｈ１１の５．８Ｓ遺伝子間領域（ＩＴＳ）の配列は、配列番号１１として配列表に提供される。５．８Ｓ遺伝子間領域（ＩＴＳ）の決定されたヌクレオチド配列のホモロジー検索は、ＤＤＢＪ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬデータベースを使用して行われた。引き続き、ＣｌｕｓｔａｌＷ系統樹構築プログラムを使用して、本明細書に記載される単離された真菌拮抗薬ＳＧＩ−０１０−Ｈ１１、単離された真菌拮抗薬ＳＧＩ−０１０−Ｈ１１に対して高い配列相同性を示す属および種の微生物、ならびに他の多種多様の微生物の属および種の間で、５．８Ｓ遺伝子間領域（ＩＴＳ）のヌクレオチド配列の系統発生関係が分析された。真菌株ＳＧＩ−０１０−Ｈ１１は、５．８Ｓ  ＩＴＳ配列がマイコスファエレラセアエに対して明らかな関連性を示すマイコスファエレラ・パンクチフォルミス（Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ  ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ  ＥＵ３４３１８２）およびラムラリア・プラテンシス（Ｒａｍｕｌａｒｉａ  ｐｒａｔｅｎｓｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ  ＥＵ０１９２８４）に対して、そのＩＴＳ−５．８Ｓ  ｒＤＮＡ配列が約９７％類似することに基づき、マイコスファエレラセアエのファミリーに関係すると考えられる。
【０１１８】
細菌細胞溶解および１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列情報の取得
細胞懸濁液の２０−μｌのアリコートは、２０μｌの２×溶解緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣＬ、ｐＨ８．０、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０、１％ＳＤＳ、４００μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ）を含む９６ウェルＰＣＲマイクロプレートに移された。溶解条件は次の通りである：５５℃で３０分間、９４℃で４分間。溶解生成物のアリコートは、ＰＣＲ増幅のテンプレートＤＮＡの供給源として使用された。１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列は、Ｍ１３−２７Ｆ（配列番号１７）および１４９２Ｒ  Ｍ１３尾状（配列番号１８）のプライマーを使用して、ＰＣＲを介して増幅された。
【０１１９】
１６Ｓ  ｒＲＮＡ領域の増幅に関して、各ＰＣＲ混合物は、細菌溶解反応からの４μｌ、２μΜの各プライマー（２７Ｆ／１４９２Ｒ）、６％Ｔｗｅｅｎ−２０、および１０μｌの２×ＩｍｍｏＭｉｘ（Ｂｉｏｌｉｎｅ  ＵＳＡ  Ｉｎｃ．Ｔａｕｎｔｏｎ，ＭＡ）を含む２０−μｌの最終容積反応物中で調製された。ＰＣＲ条件は次の通りである：９４℃で１０分間、９４℃で３０秒、５２℃で３０秒、７２℃で７５秒を３０サイクル、７２℃で１０分間。２−μｌのＰＣＲ生成物のアリコートは、１．０％アガロースゲルにかけられ、予想された大きさの単一バンドを確認した。陽性バンドは、サンガー配列決定のために、Ｍ１３プライマーを使用して、順方向および逆方向に送られた。細菌株ＳＧＩ−０１４−Ｃ０６、ＳＧＩ−００５−Ｇ０８、ＳＧＩ−０１４−Ｇ０１、ＳＧＩ−０１５−Ｆ０３、およびＳＧＩ−０１５−Ｈ０６の１６Ｓ  ｒＲＮＡの配列は、長さが約１．４キロバイトであり、それぞれ、配列番号１、１０、１２、１３、および１４として配列表に提供される。決定されたヌクレオチド配列のホモロジー検索は、ＤＤＢＪ／ＧｅｎＢａｎｋＥＭＢＬデータベースを使用して行われた。引き続き、ＣｌｕｓｔａｌＷ系統樹構築プログラムを使用して、本明細書に記載される単離された細菌拮抗薬、単離された細菌拮抗薬に対して高い配列相同性を示す属および種の細菌、ならびに他の多種多様の細菌の属および種の間で、１６  ｒＲＮＡ遺伝子のヌクレオチド配列の系統発生関係が分析された。配列同一性および類似性は、ＧｅｎｏｍｅＱｕｅｓｔ（登録商標）ソフトウェア（Ｇｅｎｅ−ＩＴ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ  Ｍａｓｓ．ＵＳＡ）を使用して決定することもできる。配列分析結果は、細菌単離株ＳＧＩ−０１４−Ｇ０１が、１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列がバリオボラックス種に対して明らかな関連性を示すバリオボラックス種Ｒ−２１９３８（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＪ７８６７９９）およびバリオボラックス・パラドキサス（Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ  ｐａｒａｄｏｘｕｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ  ＧＵＩ  ８６１０９）を含むいくつかのバリオボラックス種に対して、その１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列が約９９％類似することに基づき、バリオボラックスの属に関係すると考えられ得ることを明らかにした。さらに、配列分析結果は、二つの細菌単離株ＳＧＩ−０１５−Ｆ０３およびＳＧＩ−０１５−Ｈ０６が、そのそれぞれの１６Ｓ配列がいくつかのバチルス亜種に対して＞９９％類似することに基づき、バシラセアエ（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）のファミリーに関係すると考えられ得ることも明らかにした。
【０１２０】
配列分析結果は、二つの細菌単離株ＳＧＩ−０１４−Ｃ０６およびＳＧＩ−０５５−Ｇ０８が、そのそれぞれの１６Ｓ配列がいくつかのミクロバクテリウム亜種に対して＞９９％類似することに基づき、ミクロバクテリアセアのファミリーに関係すると考えられ得ることを明らかにした。特に、ＳＧＩ−０１４−Ｃ０６の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の１４３０−ｎｔ配列（配列番号１）は、全１４３０−ｎｔ長にわたって、ミクロバクテリウム・オキシダンス（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｏｘｙｄａｎｓ）株ＤＳＭ２０５７８およびいくつかの他のミクロバクテリウム種株（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ配列Ｙ１７２２７．１、ＦＪ２００４０６、ＥＵ０８６８００、およびＥＵ７１４３３５）の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子と同一である。
【０１２１】
特に、単離され、実施例１に記載される拮抗作用アッセイにおけるフザリウム発現を抑制する能力について試験された何千もの微生物株の中で、既知のミクロバクテリウム亜種に対するその１６Ｓ配列の配列類似性に基づき、合計８８株が後にミクロバクテリウム種として識別された。しかしながら、出願者は、ＳＧＩ−０１４−Ｃ０６およびＳＧＩ−０５５−Ｇ０８の二つのみがフザリウム・グラミネアラムに対して抑制活性を保有するミクロバクテリウム株であったことを見出した。今までに、上に論じるように、いくつかの天然に存在する微生物が胴枯病に対して拮抗活性を有すると報告されてきた。しかしながら、本発明以前に、そのような拮抗活性を有するマイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属の微生物を記載する報告はない。さらに、本発明以前に、本発明者は、胴枯病の原因病原体の発現の予防、阻害、または処理に生物制御剤としてマイコバクテリウム属の細菌株を使用するいずれの方法またはプロセスに気付かなかった。
【実施例３】
【０１２２】
単離株ＳＧＩ−０１４−Ｃ０６からのハウスキーピング遺伝子の配列分析
２７種のミクロバクテリウム属のからのいくつかのハウスキーピング遺伝子の系統発生研究がＲｉｃｈｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｙｓｔ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３０：１０２−１０８，２００７）によって報告された。この研究は、系統分類に関する１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列分析の利点は卓越しているが、単一の分類学的パラメータにのみ重点を置くことによって系統的結論を導くべきではないと結論付けた。上記に開示される、ＳＧＩ−０１４−Ｃ０６の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１）は、Ｒｉｃｈｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）の研究に含まれたミクロバクテリウム・オキシダンス株ＤＳＭ  ２０５７８（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｙｌ７２２７．１）の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のヌクレオチド配列を含むいくつかのミクロバクテリウム種株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子と同一である。出願者は、次に、ＤＮＡジャイレースサブ単位Ｂ（ｇｙｒＢ）、ＲＮＡ−ポリメラーゼサブ単位Ｂ（ｒｐｏＢ）、リコンビナーゼＡ（ｒｅｃＡ）、およびポリリン酸キナーゼ（ｐｐｋ）である、単離株ＳＧＩ−０１４−Ｃ０６の四つのハウスキーピング遺伝子に対して系統発生的分析を実施した。この目的に向かって、単離株ＳＧＩ−０１４−Ｃ０６の全ゲノムは、ＰＣＴ特許出願第ＷＯ２０１０１１５１５６Ａ２号に記載される手順を使用して、ショットガン配列決定され、組み立てられ、注釈が付けられた。ゲノムＤＮＡは、ＳＧＩ−０１４−Ｃ０６の新しい培養物から調製された。細胞ペレットは、製造者の推奨プロトコルに従い、ＭＯ  ＢＩＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．のＵｌｔｒａＣｌｅａｎ（登録商標）Ｍｅｇａ  Ｓｏｉｌ  ＤＮＡ単離キット（カタログ番号１２９００−１０）を使用して、高分子量ＤＮＡ抽出のために使用された。次に、ＳＧＩ−０１４−Ｃ０６からのゲノムＤＮＡは、ショットガン４５４−ピロシーケンス用に調製された。ゲノムＤＮＡ（７．５μｇ）は、長い単一読取用に推奨プロトコル（４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に従い、ライブラリ構築のために使用された。配列は、二回のＧＳ  ＦＬＸ  チタンシリーズ配列決定作業によって生成された。
【０１２３】
単離株ＳＧＩ−０１４−Ｃ０６の四つのハウスキーピング遺伝子ｇｙｒＢ、ｒｐｏＢ、ｒｅｃＡ、およびｐｐｋの配列が配列表に提供される。決定されたヌクレオチド配列のホモロジー検索は、ＤＤＢＪ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬデータベースを使用して行われた。配列同一性および類似性は、ＧｅｎｏｍｅＱｕｅｓｔ（登録商標）ソフトウェア（Ｇｅｎｅ−ＩＴ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ  Ｍａｓｓ．ＵＳＡ）を使用して決定することもできる。以下により詳細に論じられるように、ハウスキーピング遺伝子の配列分析の結果は、本開示に記載される単離株ＳＧＩ−０１４−Ｃ０６が新規細菌株であり、ミクロバクテリアセアのファミリーに関係すると考えられ得ることを明らかにした。
【０１２４】
ＳＧＩ−０１４−Ｃ０６のｇｙｒＢ遺伝子のポリヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＰ０１２０５２を有するミクロバクテリウム・テスタセウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｅｓｔａｃｅｕｍ）のｇｙｒＢ遺伝子と最大配列同一性を有する（９３６／２１７２ヌクレオチド整列に対して８２．６９％）。ミクロバクテリウム・オキシダンス株ＤＳＭ２０５７８（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＭＩ  ８１４９３；Ｒｉｃｈｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）のｇｙｒＢ遺伝子と比較したとき、二つの遺伝子間の配列相同性は、ヌクレオチドレベルで約６２％同一であり、アミノ酸レベルで約３７％同一であった。
【０１２５】
ＳＧＩ−０１４−Ｃ０６のｒｐｏＢ遺伝子のポリヌクレオチド配列は、ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ＡＭ１８１５８２を有するミクロバクテリウム・マリティピカム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍａｒｉｔｙｐｉｃｕｍ）のｒｐｏＢ遺伝子と最大配列同一性を有する（１０９３／３５０４ヌクレオチド整列に対して９６．９８％）。ミクロバクテリウム・オキシダンス株ＤＳＭ２０５７８（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＭ１８１５８３；Ｒｉｃｈｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）のｒｐｏＢ遺伝子と比較したとき、二つの遺伝子間の配列相同性は、ヌクレオチドレベルで約９６％同一であり、アミノ酸レベルで９９％同一であった。
【０１２６】
ＳＧＩ−０１４−Ｃ０６のｒｅｃＡ遺伝子のポリヌクレオチド配列は、受託番号ＡＰ０１２０５２を有するミクロバクテリウム・テスタセウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｅｓｔａｃｅｕｍ）のｒｅｃＡ遺伝子と最大配列同一性を有する（９６２／１１８８ヌクレオチド整列に対して８５．４５％）。ミクロバクテリウム・オキシダンス株ＤＳＭ２０５７８（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＭＩ  ８１５２７；Ｒｉｃｈｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）のｒｅｃＡ遺伝子と比較したとき、二つの遺伝子間の配列相同性は、ヌクレオチドレベルで約９２％同一であり、アミノ酸レベルで１００％同一であった。
【０１２７】
ＳＧＩ−０１４−Ｃ０６のｐｐｋ遺伝子のポリヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＭ１８１５５４を有するミクロバクテリウム・ルテオラム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｕｔｅｏｌｕｍ）のｐｐｋ遺伝子と最大配列同一性を有する（１３８０／２１７５ヌクレオチド整列に対して９１．３８％）。ミクロバクテリウム・オキシダンス株ＤＳＭ２０５７８（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＭＩ  ８１５５６；Ｒｉｃｈｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）のｐｐｋ遺伝子と比較したとき、二つの遺伝子間の配列相同性は、ヌクレオチドレベルで約９１％同一であり、アミノ酸レベルで約９８％同一であった。
【実施例４】
【０１２８】
微生物拮抗薬ミクロバクテリウム種（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０４７０）、マイコスファエレラ（Ｍｖｃｏｐｈａｅｒｅｌｌａ）種（ＮＲＲＬ  ５０４７１）、および
バリオボラックス種（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０４６９）を使用するフザリウム・グラミネアラム感染からの小麦の保護
実施例１に記載される拮抗作用スクリーニングにおける抗生作用に対して陽性と分かった微生物株は、微生物株の細胞が影響を受けやすい穀物品種の種子上に直接適用され、続いてフザリウム・グラミネアラムの分生子胞子で播種される植物系バイオアッセイを通してさらに評価された。微生物株を十分な濁度に成長させ、水に希釈した。２グラムの影響を受けやすい小麦品種の小麦種子（Ｈａｎｋ；ＷｅｓｔＢｒｅｄ  ＬＬＣ，Ｂｏｚｅｍａｎ，ＭＴ）を、低温殺菌した土壌培地を含む１リットルの鉢に蒔いた。蒔いた後、２０ｍＬの微生物培養希釈物を蒔いた種子の上に移した。１４時間の光周期を用いた蛍光灯下の温室条件で小麦種子を発芽させた。小麦が花成し始めたとき、小麦の胴は噴霧によりフザリウム・グラミネアラムＮＲＲＬ５８８３分生子胞子に曝露された。分生子胞子は、０．０１％のＴｗｅｅｎ２０を含む水をプレート上に注ぎ、胞子を懸濁液中にこすり落とすことによって、５日経ったＰＤＡプレートから収集された。胞子を噴霧した後、感染させるため、小麦植物は、３日間、１００％の湿度のミストチャンバに移された。処理は、次の通りであった。
【０１２９】
１．  未処理：微生物または化学真菌剤処理なし＋フザリウム曝露。
【０１３０】
２．  非感染：微生物または化学殺真菌剤処理なし、フザリウム曝露なし。
【０１３１】
３．  ＳＧＩ−０１０−Ｈｌ１：真菌処理＋フザリウム曝露。
【０１３２】
４．  ＳＧＩ−０１４−ＧＯ１：細菌処理＋フザリウム曝露。
【０１３３】
５．  ＳＧＩ−０１４−Ｃ０６：細菌処理＋フザリウム曝露。
【０１３４】
感染２０日後、散水を止め、収穫前に小麦植物を３週間乾燥させた。個々の小麦胴を収穫し、収集した。病害の重症度は、胴枯病の症状を示すそれぞれの胴に関して決定された。病害の重症度は、病害小穂の数を胴当たりの小穂の総数で割ることにより計算された。結果（表２）は、同じ条件で成長させた「未処理」対照と比較したとき、試験された三つの微生物拮抗薬ＳＧＩ−０１４−Ｃ０６（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０４７０）、ＳＧＩ−０１０−Ｈ１１（ＮＲＲＬ  ５０４７１）、およびＳＧＩ−０１４−Ｇ０１（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０４６９）のそれぞれで処理された小麦植物が非常に低い重症度およびフザリウム・グラミネアラム感染の発生率を有したことを明らかにした（Ｐ＜０．０５）。
【０１３５】
各胴からの種子は手で収穫され、種子の質量を量った。処理のそれぞれにおける鉢毎の平均種子重量が計算された。表３に報告されるように、微生物拮抗薬のそれぞれは、胴枯病感染によってもたらされる収率損失を大幅に減少させることが分かった。
【表２】
0006009564.tif 000003
【表３】
0006009564.tif 000004
【実施例５】
【０１３６】
小麦幼苗における微生物拮抗薬によるフザリウム・グラミネアラムの成長阻害
拮抗作用プレートアッセイにおいてフザリウム・グラミネアラムに対して抑制活性を保有することが分かった微生物株は、小麦における胴枯病の発生率を減少させるその能力についてさらに検証された。影響を受けやすい小麦品種の種子（Ｈａｎｋ；ＷｅｓｔＢｒｅｄ  ＬＬＣ，Ｂｏｚｅｍａｎ，ＭＴ）を、直径２０ｃｍのプラスチックの鉢にそれぞれ低温殺菌された土壌培地を含む１リットルの鉢に蒔いた。微生物細胞懸濁液は次のように調製された。２ＹＴまたは類似する成長培地のブロス培養物は、単離菌グリセロールストックまたは画線プレートから播種された。典型的には、培養は、培養物を後期指数増殖期に到達させる成長チャンバ、温室、または畑で使用する４８〜７２時間前に開始された。より長い倍加時間を有する単離菌は、さらに前もって開始された。培養物は、２００ｒｐｍで、回転振とう器上で、３０℃でインキュベートされた。成長後、細胞は、４℃で１５分間、１０，０００×ｇでペレット化され、１０ｍＭのＭｇＳＯ４緩衝液（ｐＨ７．０）に再懸濁された。細胞密度は、各単離菌に関してＣＦＵ／ｍＬ（１ミリリットル当たりの細胞性能単位）で基準化された。典型的に、各単離菌について約１０９ＣＦＵ／ｍＬの懸濁液が調製され、氷上の播種部位に移された。播種は、これらの細胞懸濁液１／２０を灌漑用水中に５×１０７ＣＦＵ／ｍＬの最終密度に希釈することによって実施された。１−Ｌの鉢試験に関して、２０ｍＬのこの希釈細胞懸濁液を、各同型鉢の表面上に均一に分配した。マイクロ試験鉢に関して、細胞懸濁液は希釈されず、１ｍＬの各１０９ＣＦＵ／ｍＬ懸濁液を、埋めた種子の上の土壌潅注として各同型鉢の表面上に直接ピペットで入れた。種子および植物は、１４時間の明の光周期で、室温の温室で維持された。
【０１３７】
フザリウム・グラミネアラム株ＮＲＲＬ−５８８３の菌糸体を、一定の光の下で５日間、ＰＤＡプレート上で成長させた。菌糸および分生子は、数ｍＬの滅菌水（０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０）をプレート上に注ぎ、減菌へらで寒天表面をこすることによって収集された。接種材料中の胞子の濃度は、約２×１０５胞子／ｍＬであったが、菌糸断片濃度は決定されなかった。
【０１３８】
フザリウム・グラミネアラムでの播種は、種子から芽が出た後に開始され、一晩おきに１０日間続けられた。フザリウム・グラミネアラムの接種材料は、１鉢当たり約３０ｍＬで、噴霧器で適用された。各播種直後、植物はオーバーヘッド霧吹きで吹き付けられた。化学殺真菌剤が使用されるとき、殺真菌剤（Ｂａｎｎｅｒ  Ｍａｘｘ，Ｓｙｎｇｅｎｔａ）は、２ｍＬの殺真菌剤ストックを１Ｌの蒸留水で希釈することにより調製され、１鉢当たり約３０ｍＬで、噴霧器で適用した。
【０１３９】
胴枯病は、植物組織の１グラム当たりのフザリウムコロニー形成単位（ＣＦＵ／ｇ）の数によって決定される、フザリウム侵襲の重症度によって評価された。全ての処理は、四つの同型鉢の４ブロックで実施された。処理は次の通りであった。
【０１４０】
１．  未処理：微生物または化学殺真菌剤処理なし＋フザリウム曝露。
【０１４１】
２．  非感染：微生物または化学殺真菌剤処理なし、フザリウム曝露なし。
【０１４２】
３．  殺真菌剤：化学殺真菌剤処理＋フザリウム曝露。
【０１４３】
４．  ＳＧＩ−Ｑ１０−Ｈ１１：真菌処理＋フザリウム曝露。
【０１４４】
５．  ＳＧＩ−Ｑ１４−Ｇ０１：細菌処理＋フザリウム曝露。
【０１４５】
６．  ＳＧＩ−Ｑ１４−Ｃ０６：細菌処理＋フザリウム曝露。
【０１４６】
表４に報告されるように、結果は、三つ全ての微生物処理が感染した対照と比較してＦＨＢ重症度において大幅な減少を提供したことを明らかにした。特に、二つの微生物拮抗薬ＳＧＩ−０１４−Ｃ０６およびＳＧＩ−０１０−Ｈ１１は、同じ条件で成長させた未処理対照と比較したとき、フザリウム・グラミネアラムによる小麦植物の感染を大幅に低減した。二つの微生物ＳＧＩ−０１４−Ｃ０６およびＳＧＩ−０１０−Ｈ１１のそれぞれによってもたらされたフザリウム感染からの小麦植物の保護は、市販の化学殺真菌剤によってもたらされる保護と統計的に同等であった。微生物ＳＧＩ−０１４−Ｇ０１が適用されたとき、観察されたフザリウム感染からの小麦植物の保護は、それほど明白ではなく、その有効性は同型鉢の間で非常に変動した。
【表４】
0006009564.tif 000005
【実施例６】
【０１４７】
微生物拮抗薬の成長および保管
マイコスファエレラ種：純粋な培養物として単離した真菌を保管するために、いくつかの方法が使用され、そのうちの一つは濾紙法であった。真菌をＰＤＡ上でも成長させ、次に１５％のグリセロールを含有するバイアル中に設置された小さい矩形に切り分け、−７０℃で保管した。真菌はまた、グリセロールではなく蒸留水を用いて、類似する方法で４℃でも保管された。しかしながら、保管の好ましい方法のうちの一つは、−８０℃での侵襲された減菌の大麦種子上であった。
【０１４８】
バチルス種、ミクロバクテリウム種、およびバリオボラックス種：単離された細菌は純粋な培養物として保管された。細菌コロニーは、Ｒ２Ａブロス液体培地（Ｔｅｃｋｎｏｖａ）を含むバイアルに移され、２日間２５０ｒｐｍで振とうさせながら、３０℃で成長させた。次に、培養物を、１５％のグリセロールを含むバイアル中に移し、−８０℃で保管した。
【実施例７】
【０１４９】
胞子生成および種子コーティング処理
胞子生成：典型的な胞子生成手順では、１リットルの２×ＹＴ成長培地（１６ｇ／Ｌトリプトン、１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、５ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ）は、５ｍＬの初期培養物またはペトリ皿剥離物で播種され、２２５ｒｐｍに設定された回転振とう器中で、３０℃で一晩インキュベートされた。遠心分離によって細菌細胞をペレット化し、ＰＢＳ緩衝液（８ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、０．２ｇ／Ｌ  ＫＣｌ、１．４４ｇ／Ｌ  Ｎａ２  ＨＰＯ４、０．２４ｇのＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４）で一回洗浄した。細胞をＣＤＳＭ培地（Ｈａｇｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，４３８−４４１，１９８４）に懸濁し、回転振とう器中で、３０℃でさらに４日間成長させた。細菌培養物中の胞子形成は、全培養物が可視的に浮動性胞子で覆われるまで、位相差顕微鏡を使用して毎日観察された。インキュベーション時間は、典型的に、種により４日未満から６日を超えた。位相差顕微鏡下で、内生胞子が、明るい白色の偏球として細胞内で検出された。１０，０００×ｇで１５分間遠心分離することによって、細菌胞子をペレット化し、減菌ｄＨ２０で二回洗浄し、必要に応じて５０ｍＬまで濃縮し、直ぐに使用するか、後に使用するために冷蔵するかのいずれかであり得る。胞子濃度はＯＤ６００で測定された。この手順は、典型的に、少なくとも２０００ＯＤの細菌胞子を生成した。
【０１５０】
特に、本発明のいくつかの細菌株、例えばバチルス種ＳＧＩ−０１５−Ｆ０３は、多量の一晩初期培養物（約１５ｍＬ）を１リットルの２×ＳＧ成長培地に単純に播種し、続いて、２２５ｒｐｍに設定された回転振とう器中で、適切な温度で４日間インキュベートすることにより、インキュベーション４日後に大量の胞子を都合良く生成することができた。２×ＳＧ成長培地の処方は次の通りであった：１６ｇ／Ｌ栄養素ブロス、０．２５ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ４、２．０ｇ／Ｌ  ＫＣｌ、０．１５ｇ／Ｌ  ＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ、０．０２５ｇ／Ｌ  ＭｎＣｌ２．２Ｈ２Ｏ、０．２８ｍｇ／Ｌ  ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．０ｇ／Ｌデキストロース。
【０１５１】
小麦およびトウモロコシの種子の種子コーティング処理：小規模の種子処理実験は、若干の修正を伴い、Ｓｕｄｉｓｈａ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）に記載される手順に従い行われた。典型的には、６グラムのアラビアガムの粉末（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）を、５０ｍＬのＦａｌｃｏｎチューブ中の３６ｍＬの水に添加し、これを後にホイールミキサーを使用して均質に混合することよって、バイオポリマー原液を作製した。大量のコーティング種子が必要とされる場合には、混合のために攪拌プレートが使用された。
【０１５２】
栄養細胞が使用されたとき、活発に成長する微生物細胞の混濁培養物は、ＰＢＳで洗浄され、約５．０のＯＤ６００に調節された。あるいは、微生物の胞子懸濁液が上述のように調製された。細菌胞子および／または栄養細胞は、上述のように調製された約３２ｍＬのアラビアガムバイオポリマー原液中に十分に懸濁され、得られた懸濁液は、１Ｌの瓶中で十分に混合された。約４００ｇの種子（小麦またはトウモロコシのいずれか）が瓶に添加され、ガム／細胞懸濁液の均一な分布を確実にするために激しく振とうされるか、ボルテックスにかけられた。次に、コーティングされた種子は、べとつかなくなるまで、一般的に、周期的に混合しながら３〜６時間、層流フード中で乾燥させるために、減菌のプラスチック秤量ボード全体に広げられた。場合によっては、胞子でコーティングされた種子を一晩乾燥させる。しかしながら、栄養培養物でコーティングされた種子は、典型的に、完全に乾燥する前に保管された。種子コーティング製剤に使用される微生物に対して周期的に実施される生死判別試験は、微生物が少なくとも３ヶ月間生存することを示した。コーティングされた種子の発芽率は、対照のコーティングされない種子と本質的に同一であると決定された。
【実施例８】
【０１５３】
小麦におけるフザリウム胴枯病の発現に対する微生物種子処理の効果
実施例８に記載される手順により、ＦＨＢの影響を受けやすい小麦品種（ＲＢ０７）の種子を、微生物ＳＧＩ−０１４−Ｃ０６、ＳＧＩ−０１５−Ｆ０３、およびＳＧＩ−０１５−Ｈ０６のそれぞれでコーティングした。その後、コーティングされた種子を、低温殺菌された土壌培地［（Ｍｅｔｒｏｍｉｘ−Ｍｉｘ  ２００、Ｓｃｏｔｔｓ−Ｓｉｅｒｒａ  Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｍａｒｙｓｖｉｌｌｅ，ＯＨ、および３グラムの肥料１４−１４−１４（Ｎ−Ｐ−Ｋ）］を含む１リットルの鉢に蒔いた。鉢当たり７〜８の植物を鉢に蒔き、その後、３葉期で鉢当たり五つの植物に間引きした。乱塊法で１処理あたり鉢五つに鉢を配分した。次に、コーティングされた種子を、１日当たり１６時間の照明の蛍光照明下、温室条件で発芽させた。小麦花成（開花）の開始時に、小麦の胴は、１００，０００胞子／ｍＬの濃度でフザリウム・グラミネアラムＮＲＲＬ  ５８８３巨大分生子胞子を噴霧することによって曝露された。胞子を噴霧した後、感染させるため、小麦植物は、３日間、１００％の湿度の露チャンバ（ｄｅｗ  ｃｈａｍｂｅｒ）に移された。処理は次の通りであった。
【０１５４】
１．  未処理：微生物または化学殺真菌剤処理なし＋フザリウム曝露。
【０１５５】
２．  ＳＧＩ−０１４−Ｃ０６：細菌種子処理＋フザリウム曝露。
【０１５６】
３．  ＳＳＧＩ−０１５−Ｆ０３：細菌種子処理＋フザリウム曝露。
【０１５７】
４．  ＳＧＩ−０１５−Ｈ０６：細菌種子処理＋フザリウム曝露。
【０１５８】
胴枯病の重症度は、感染１０日後および２１日後に可視的に評価された。病害の重症度は、胴枯病の症状を示す各穂に関して決定され、症状を示す小穂のパーセンテージとして、すなわち、ＦＨＢの症状を示す小穂の数を小穂の総数で割ることにより計算された。結果（表５）は、同じ条件で成長させた「未処理」対照と比較したとき、試験された三つの微生物の拮抗薬ＳＧＩ−０１４−Ｃ０６、ＳＧＩ−０１５−Ｆ０３、およびＳＧＩ−０１５−Ｈ０６のそれぞれでコーティングされた小麦種子が非常に低い重症度のフザリウム・グラミネアラム感染を有したことを明らかにした（Ｐ＜０．０５）。
【表５】
0006009564.tif 000006
【実施例９】
【０１５９】
温室試験における小麦の胴枯病の生体制御
微生物ＳＧＩ−０１４−Ｃ０６、ＳＧＩ−０１５−Ｆ０３、およびＳＧＩ−０１５−Ｈ０６のそれぞれは、大規模な温室試験でさらに試験された。試験は、Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｉｎｃ．に位置する「植物成長格納室」（ＰＧＣＲ）で行われ、次の対照処理を含んだ：感染対照、非感染対照、ならびに四つの市販の殺真菌剤基準。基準化学殺真菌剤は、２ｍｌ／Ｌの濃度のＢａｎｎｅｒ  ＭＡＸＸ（登録商標）（Ｓｙｎｇｅｎｔａ）、および３ｍｌ／Ｌの濃度のＰｒｏｓａｒｏ（登録商標）（Ｂａｙｅｒ  ＣｒｏｐＳｃｉｅｎｃｅ）であり、それぞれ、製造者の推奨に従い、葉面噴霧として適用された。基準生物学的殺真菌剤は、Ａｃｔｉｎｏｖａｔｅ（登録商標）（Ｎａｔｕｒａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）およびＲｈｉｚｏ  Ｖｉｔａｌ（登録商標）（ＡＢｉＴＥＰ  ＧｍｂＨ）であり、それぞれ、製造者によって推奨される取扱説明書により、土壌潅注として適用された。
【０１６０】
微生物処理剤が調製され、土壌潅注または種子コーティングのいずれかとして適用された。微生物処理剤が土壌潅注として適用される場合、微生物のそれぞれの細胞懸濁液は、種子をさらに成長培地で覆う前に、種子に個別に適用された。この目的のため、新しく調製された培養物は、成長培地を取り除くためにペレット化され１０ｍＭの硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）緩衝液に再懸濁された。次に、鉢当たり約１０９個の細胞の総細胞数で、種子全体に均一に２０ミリリットルをピペットで入れ、分配することにより、細胞懸濁液を添加した。微生物処理剤が種子コーティング剤として適用される場合、微生物細胞／胞子は、本質的に、上記の実施例８に記載されるように調製された。コーティングされた種子は、細胞懸濁液をアラビアガム溶液に組み込み、後に種子に適用されるべとついたコーティング混合物を形成することにより生成された。次に、微生物種子コーティング剤を乾燥させて、微生物細胞／胞子を封入する硬いが水溶性のバイオポリマーを形成する。目標は、少なくとも１０６〜１０７個の生細胞／種子の範囲の細胞力価に到達することであった。この温室試験実験では、種子コーティング剤は、種子を蒔く１日前に調製された。
【０１６１】
各処理は、完全乱塊法（ＲＣＢＤ）で、成長室の側面に沿って２列に配分された３段ラック上に位置付けられた四つの複製物を有した。ラックには、鉢の表面で測定される、平均８００μモルの光強度で発生する蛍光灯（Ａｇｒｏｓｕｎ，５８５０Ｋ）が装備された。各同型は、半フラットに含まれる四つの１リットルの鉢からなった。鉢は、アラビドプシス成長培地（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ）ＡＩＳ（Ｌｅｈｌｅ  Ｓｅｅｄｓ）に対する砂（Ｗａｓｈｅｄ  Ｃｏａｒｓｅ）が３：１の割合（ｖ／ｖ）からなる合成成長培地で充填された。各鉢において、２グラムの春小麦種子（Ｈａｎｋ，ＷｅｓｔＢｒｅｄ）が成長培地の表面上にまき散らされた。鉢は、その底に約２ｃｍの水を維持することにより、底から水をやり、発芽および成長について観察された。
【０１６２】
花成時（Ｆｅｅｋｅｓ  １０．５．１）に、フザリウム・グラミネアラム分生子胞子懸濁液で噴霧することにより小麦の胴を感染させた。この温室試験実験に関して、真菌胞子は、均質化されたフザリウム・グラミネアラム株ＮＲＲＬ５８８３の菌糸体を大きなＰＤＡプレート上で平板培養し、続いて一定の光下で、室温で５日間インキュベートすることにより調製された。次に、真菌胞子は、プレートを硫酸マグネシウム緩衝液（１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ２０）で浸水させ、減菌へらで寒天表面をやさしくこすり落とすことにより収集された。胞子濃度が調節され、加圧式手動噴霧器で１胴当たり約５０，０００個の分生子胞子が適用された。成長室の相対湿度は、再度平常にする前に、感染を可能にするために、３日間、９０％に増加された。小麦の種子ができたら、水やりを止め、小麦の胴を完全に乾燥させた。個々の小麦胴を収穫し、収集した。病害の重症度は、胴枯病の症状を示すそれぞれの小麦の胴に関して決定された。病害の重症度は、病害小穂の数を胴当たりの小穂の総数で割ることにより計算された。結果（表６）は、同じ条件で成長させた「未処理」対照と比較したとき、試験された三つの微生物の拮抗薬ＳＧＩ−０１４−Ｃ０６、ＳＧＩ−０１５−Ｆ０３、およびＳＧＩ−０１５−Ｈ０６のそれぞれで処理された小麦植物が非常に低い重症度およびフザリウム・グラミネアラム感染の発生率を有したことを明らかにした（Ｐ＜０．０５）。
【表６】
0006009564.tif 000007
【０１６３】
種子の収率を決定するために、小麦の胴を手で個別に脱穀し、種子を収集し、もみ殻および他のくずを取り除き、数え、計量した。総種子収率は、処理のそれぞれの１６の鉢によって生成された総種子質量として決定された。表７に報告されるように、試験された三つの微生物拮抗薬のそれぞれは種子収率を大幅に保護する、すなわち、胴枯病感染によって生じる収率損失は大幅に減少したことが分かった。
【表７】
0006009564.tif 000008
【０１６４】
よって、試験された微生物のそれぞれでの小麦植物の処理は、フザリウム感染によって生じる収率損失に対して小麦植物を大幅に保護する。特に、ＳＧＩ−０１４−Ｃ０６またはＳＧＩ−０１５−Ｆ０３のいずれかで処理された小麦植物は、非感染対照と比較したとき、総種子収率の大幅な改善、すなわち、それぞれ、１１０％および１２０％を示した。対照的に、基準殺真菌剤Ａｃｔｉｎｏｖａｔｅ（登録商標）、ＲｈｉｚｏＶｉｔａｌ（登録商標）、およびＰｒｏｓａｒｉｏ（登録商標）は、フザリウム胴枯病感染によって生じる収率損失から処理された小麦植物を大幅に保護するようには思われなかった。
【実施例１０】
【０１６５】
畑条件下での小麦胴枯病の生物制御
病原体フザリウム・グラミネアラムに対して抑制活性を有する微生物拮抗薬が発見され、実施例４〜９に記載される生体外拮抗作用アッセイおよび温室研究における胴枯病は、全米の異なる地理的位置で、一連の野外実験においてさらに評価される。いくつかの実験は、コムギ腐敗病の微生物学的制御に使用される、自然病害感染が生じる農業地帯で行われる。試験に使用される小麦の種類は、フザリウム・グラミネアラムに影響を受けやすい種類である。一般的に、各処理をされた小麦植物は、長さが約３メートルの１２列のプロットに蒔かれた。列間の間隔は約２０ｃｍである。各実験の処理されたプロットは、乱塊法で配分された。胴枯病の重症度および発生率の減少に本発明の微生物拮抗薬を含む様々な水和剤組成物の有効性も評価される。これらの実験では、微生物拮抗薬は、個別に、または組み合せのいずれかで評価される。
【０１６６】
これらの試験では、微生物拮抗薬は、微生物懸濁液が花成小麦胴上に直接適用される様々な種子コーティング処理および／または野外試験で評価される。実験のそれぞれにおいて、微生物は同型プロットにおいて評価される。実施例４〜９に記載される拮抗薬、病原体、および植物生産方法が、これらの実験において使用され得る。
【０１６７】
種子コーティング処理−上記の実施例７に記載される種子コーティング法に加えて、当該技術分野において既知の様々な技法および種子コーティング製剤は、Ｆｅｒｎａｎｄｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）、Ｂｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）、およびＫｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）により先に説明されるもの等、小麦種子を微生物拮抗薬で処理するように展開され得る。一般に、小麦種子は、発芽を促進するために、予め湿潤され、室温で保管される。発芽した種子は、蒔かれる前に微生物懸濁液に浸漬され得る。病原体の胞子は、細菌播種前または後のいずれかに播種することができる。実施例４および５に記載される拮抗薬、病原体、ならびに
植物生産法は、これらの種子処理に使用され得る。
【０１６８】
病害重症度および収率評価−拮抗薬は、様々な方法および手順、典型的には、例えばＳｃｈｉｓｌｅｒ，Ｐｌａｎｔ  Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｖｏｌ  ８６（１２），１３５０−１３５６，２００２、Ｓｃｈｉｓｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌ，３９：４９７−５０６，２００６、およびＫｈａｎ  ａｎｄ  Ｄｏｏｈａｎ，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌ，４８：４２−４７，２００９に記載されるものを使用することにより、花成期の小麦および大麦の胴枯病に対するその抑制活性に関する温室および野外評価において、さらなる評価を受ける。そのような実験のうちの一つでは、ジベレラ・ゼアエの播種は、Ｋｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌ，２９：２４５−２５５，２００４）によって説明される、減菌のイエローデントコーン上で調製された。完全にコロニー形成された微生物株の液体培養物（４８時間培養）は、リン酸緩衝液で４分の１の強さに希釈された。拮抗薬処理に値するｍＬ当たりの最終ＣＦＵは、１×１０９ＣＦＵ／ｍＬ〜６×１０９ＣＦＵ／ｍＬである。次に、処理懸濁液は、ＣＯ２バックパック噴霧器を使用して、花成小麦胴に適用される。処理は、典型的に、拮抗薬細胞のＵＶ分解の可能性を最小にするために、日没後に適用される。乱塊法で配分される同型は１処理当たり五つである。第１の対照処理は、緩衝液で処理された植物からなる。第２の対照は、未処理植物からなる。胴枯病および発生率の野外評価は、植物の発達が乳熟中期〜糊熟期に達した時、１同型あたり６０胴（すなわち３００胴／処理）を評価することによって行われた。穀類が完熟期に達したとき、小麦胴は手で収穫され、Ａｌｍａｃｏ単植および胴脱穀機（Ａｌｍａｃｏ，ＩＡ）を使用して脱穀される。各同型列から得た穀類サンプルは、１００穀粒重量に関して評価される。病害の重症度、発生率、および１００穀粒重量のデータは、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用して分析される。
【０１６９】
個別に、または組み合わせのいずれかで本発明の微生物拮抗薬を含む組成物は、病害の発生率を大幅に減少させることが分かった。これらの結果は、これらの活性微生物剤を使用する生物学的制御手段が小麦植物等の穀物植物の胴枯病の防除に重要な役割を果たすことができることを示す。
【実施例１１】
【０１７０】
天然に生じない品種の開発および育種プログラム
本発明の内部寄生菌微生物は、特に米国特許出願第２００３０１９５１１７Ａ１号、米国特許出願第２００１００３２３４３Ａ１、および米国特許第７，０８４，３３１号に記載されるものを含む、当該技術分野において既知のものに類似する手順を使用して、改善された農業特性を有する植物−内部寄生菌の組み合わせを作り出すために、そのような内部寄生菌微生物を欠く様々な遺伝子型および地理学的起源の穀類を含む作物植物に導入される。よって、所与の合成植物−内部寄生菌の組み合わせは、農業利益をもたらす相利共生の組み合わせを形成し、維持するその能力に基づく育種／品種開発プログラムにおいて作り出され、選択され得る。組み合わせの農業特性の評定は、そのような育種プログラムにおいても利用することができる。これらの特性は、特に干ばつに対する耐性、バイオマス蓄積、昆虫侵襲に対する耐性、家畜に対する旨味（例えば草食動物）、再生産の容易性、および種子収率を含むが、これらに限定されない。そのような組み合わせは、麦角アルカロイドレベル、ロリン（ｌｏｌｉｎｅ）レベル、ペラミンレベル、またはロリトレムレベルを含む、害虫および雑草に毒性である微生物代謝物の蓄積レベルの点で異なり、一方で、他の特徴の中でも昆虫摂食または侵襲に対する耐性、非生物学的ストレスに対する耐性、家畜に対する旨味、バイオマス蓄積、再生産の容易性、および種子収率を含む、作物植物の所望の農業特性を表し得る。
【０１７１】
本発明のいくつかの実施形態が説明されてきた。それにもかかわらず、本明細書に記載される実施形態の要素が組み合わされて、さらなる実施形態を作り出すことができ、様々な修正が本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく行うことができることを理解する。したがって、他の実施形態、代替物、および等価物は、本明細書に記載され、主張される本発明の範囲内である。
【０１７２】
本明細書内の見出しは、単に読者に対する利便性のためであり、本発明またはその実施形態の範囲を決して制限しない。
【０１７３】
本明細書に言及される全ての刊行物および特許出願は、各個々の刊行物または特許出願が参照により組み込まれるように具体的に個々に示されるのと同じ程度に参照により本明細書に組み込まれる。
【配列表】
0006009564000001.app