(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経変性疾患を治療・予防する組成物の製造におけるコロニー刺激因子G-CSF二量体の使用であって、
前記コロニー刺激因子G-CSF二量体は２つのG-CSF-Fc複合体を含み、
前記G-CSF-Fc複合体は、いずれも、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２〜７からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含む、使用。
【請求項２】
前述神経変性疾患は、アルツハイマー病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、脊髄性筋萎縮症、原発性側索硬化症、および脊髓小脳失調症のうちのいずれかであることを特徴とする請求項1に記載の使用。
【請求項３】
前述コロニー刺激因子G-CSFの二量体は、ヒトコロニー刺激因子G-CSF二量体であることを特徴とする請求項1または2に記載の使用。
【請求項４】
前述コロニー刺激因子G-CSFの二量体は、構造が式Ｉで示され、
M1-L-M2   式Ｉ
（式中において、
M1はヒトコロニー刺激因子G-CSFの第一の単量体で、
M2はヒトコロニー刺激因子G-CSFの第二の単量体で、
Lは前述の第一の単量体と第二の単量体の間に位置し、前述第一の単量体と第二の単量体を連結するリンカーである。）
ここで、前述G-CSFの二量体は、G-CSFの単量体の生物活性を保持し、且つ前述第一の単量体および前述第二の単量体のいずれかの2倍以上の血清半減期を有する、
ことを特徴とする請求項1または2に記載の使用。
【請求項５】
活性成分としてコロニー刺激因子G-CSFの二量体を含む、ことを特徴とする神経変性疾患を治療する医薬品であって、
前記コロニー刺激因子G-CSF二量体は２つのG-CSF-Fc複合体を含み、
前記G-CSF-Fc複合体は、いずれも、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２〜７からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含む、医薬品。
【請求項６】
前述神経変性疾患は、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、脊髄性筋萎縮症、原発性側索硬化症、脊髓小脳失調症からなる群から選ばれることを特徴とする請求項5に記載の医薬品。
【請求項７】
前述コロニー刺激因子G-CSFの二量体は、ヒトコロニー刺激因子G-CSF二量体であることを特徴とする請求項5または6に記載の医薬品。
【請求項８】
前述コロニー刺激因子G-CSFの二量体は、構造が式Ｉで示され、
M1-L-M2   式Ｉ
（式中において、
M1はヒトコロニー刺激因子G-CSFの第一の単量体で、
M2はヒトコロニー刺激因子G-CSFの第二の単量体で、
Lは前述の第一の単量体と第二の単量体の間に位置し、前述第一の単量体と第二の単量体を連結するリンカーである。）
ここで、前述G-CSFの二量体は、G-CSFの単量体の生物活性を保持し、且つ前述第一の単量体および前述第二の単量体のいずれかの2倍以上の血清半減期を有する、
ことを特徴とする請求項5または6に記載の医薬品。
【請求項９】
前述神経変性疾患がパーキンソン病である、請求項1に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物および医薬品の技術分野に関する。より具体的に、新規なG-CSF二量体およびその神経変性疾患の治療における用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)は、204個のアミノ酸からなり、且つ30個のアミノ酸のシグナルペプチドを有する糖タンパク質である。成熟したG-CSF蛋白は、細胞外に分泌され、シグナルペプチドを有せず、174個のアミノ酸からなり、分子量が18-20kDaである。人体では、主に単核細胞、繊維芽細胞および内皮細胞によって分泌される。
【０００３】
G-CSFは、生体内で主に以下のような三つの生物学的機能を発揮する。1．好中性顆粒球前駆細胞および骨髄幹細胞に作用する。好中性顆粒球の分化、成長および成熟を促進する。2．成熟した好中性顆粒球を活性化し、免疫反応に関与させる。3．幹細胞因子、Flt-3リガンド、GM-CSFのような他の造血成長因子と共同作用し、GM-CSFが造血機能を発揮する。
【０００４】
G-CSF受容体は、主に、骨髄造血幹細胞Sca+Lin-Th1low、前駆細胞CD34+、および分化した好中性顆粒球前駆細胞(committed granulocyte precursor)や成熟した好中性顆粒球に存在することが実証された。ヒト好中性顆粒球コロニー刺激因子受容体(G-CSF Receptor、G-CSFR)は、単鎖で、G-CSFに高い親和力を有する特異性受容体で、812個のアミノ酸を含有する。
【０００５】
Tamadaらは、G-CSF:G-CSFR複合体の結晶構造を得たが、2.8Å回折分析(PNAS、2008、Vol. 103:3135-3140)を行ったところ、G-CSF:G-CSFR複合体が2:2の比率で存在し、即ち、2つのリガンドと2つの受容体が結合した状態で存在することが示された。それぞれ一つのG-CSF分子が一つの受容体分子と結合し、2つのG-CSFリガンドと結合した受容体が互いに近づいて相互作用によって2:2の二量体を形成する場合、G-CSF受容体のカルボキシ基の末端が下流の信号分子であるJAK2(Janus tyrosine kinase)を活性化する。さらに、JAK2がSTAT3を活性化して転写遺伝子を開始させることによって、細胞の増殖を刺激する。
【０００６】
2003年にSchabitz W.Rらは、組換えヒトG-CSFが虚血動物モデルにおいて神経細胞に対して保護機能を示したことを報告した(Stroke、2003、34:745-751)。2006年に、Shyuらは、急性卒中患者の治療において、5日間連続で毎日に組換えヒトG-CSFを注射したところ、ある程度の治療効果を示したことを報告した(CMAJ、2006、174:927-933)。皮下投与後、ラットの体内におけるG-CSFの半減期が約2時間で、皮下注射で人体に投与する場合、半減期が3.5時間だけであるため、患者に毎日薬物を注射する必要があり、患者の生活品質に影響を与える。
【０００７】
神経変性疾患(neurodegenerative disease)は、大脳および脊髄のニューロン細胞を失った状態で、慢性で進行性の神経系疾患であり、主にアルツハイマー病(Alzhemier’s disease、 AD)、パーキンソン病(Parkinson’s disease、PD)、ハンチントン病(Huntington disease)、筋萎縮性側索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis)、脊髄性筋萎縮症(spinal muscular atrophy)、脊髓小脳失調症(spinal cerebellar ataxias)などを含み、その共同の特徴は、ニューロンの退行性病変およびアポトーシスが生じ、患者の行動異常および機能障害を引き起こし、早死に繋がる神経系疾患であることにある。神経変性疾患の発病機構は、まだ明らかではなく、現在、予防・治療の有効的な方法と医薬品がなく、既存の治療方法は、ヒトの大脳のニューロンが欠けている物質、例えば、レボドパを服用または静脈注射によって補充するものを含むが、レボドパは、PDの自然病変の過程を有効的に抑えることができず、ドーパミン作動性ニューロンの変性速度を影響できず、また不良の副作用、たとえば、オン・オフ現象や運動障害があり、その治療作用も2年ぐらいしか維持できず、長時間の使用はニューロンを損害する恐れがあり、ニューロンのアポトーシスもある。ADの脳内のアセチルコリン不足に対し、コリンエステラーゼ阻害薬でその濃度を上げるが、この方法も同様に疾患の発展をコントロールすることができない。
【０００８】
現在、パーキンソン病を治療する医薬品は、症状を軽減するものが多く、例えばドーパミンの代替物（レボドパまたはドーパミン作動薬）を使用する。中では、レボドパ（L-DOPA）は、ドーパミンの合成前駆体として脳内のドーパミンを補充し、いま一番使われて最も有効なPD治療薬であるが、長時間にこの医薬品を使用すると、治療効果の低下や厳重な副作用が生じやすく、「オン-オフ」現象が起こる恐れがある。さらに、ドーパミン作動性ニューロン細胞の欠失を阻止するのは、PD治療の主な策略の一つでもあり、現在一番研究されているのは、神経栄養因子（neurotrophic factor、GDNF）であるが、臨床試験において、GDNFは薬物効果を示さず、一連の副作用、例えば、吐き気、食欲不振、体重低下などがある（Neurology, 2003, 69:69-73）。G-CSFは、パーキンソン病の治療に使用される報告もあるが、PD動物モデルでも臨床試験でも、G-CSFの投与量が高く、治療作用が遅く、投与頻度が高く、投与周期が長く、患者のコンプライアンスが低下しやすく、患者の使用に非常に不利である。
従って、本分野では、より有効的な神経変性疾患の治療薬の開発が切望されている。
【発明の概要】
【０００９】
本発明の目的は、より有効的な神経変性疾患の治療薬およびその製造方法ならびに用途である。
【００１０】
本発明の第一は、神経変性疾患を治療・予防する組成物の製造におけるコロニー刺激因子G-CSFの二量体の用途を提供する。
【００１１】
前述神経変性疾患は、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、脊髄性筋萎縮症、原発性側索硬化症、脊髓小脳失調症からなる群から選ばれる。
【００１２】
前述コロニー刺激因子G-CSFの二量体は、ヒトコロニー刺激因子G-CSFの二量体である。
【００１３】
本発明によれば、前述コロニー刺激因子G-CSFの二量体は、構造が式Ｉで示される。
M1-L-M2   式Ｉ
（式中において、
M1はヒトコロニー刺激因子G-CSFの第一の単量体で、
M2はヒトコロニー刺激因子G-CSFの第二の単量体で、
Lは前述の第一の単量体と第二の単量体の間に位置し、前述第一の単量体と第二の単量体を連結するリンカーである。）
ここで、前述G-CSFの二量体は、G-CSFの単量体の生物活性を保持し、且つ前述第一の単量体および前述第二の単量体のいずれかの2倍以上の血清半減期を有する。
【００１４】
さらに、前述のリンカーLは、
(ｉ)  3〜50個のアミノ酸からなる短鎖ペプチドと、
(ｉｉ)  式ＩＩで示されるポリペプチドと、
-Z-Y-Z-     式ＩＩ
（式中において、
Yは担体タンパク質で、
Zはなし、または1〜30個のアミノ酸の短鎖ペプチドで、
「-」は、化学結合または共役結合で、好ましくは、「-」は、ペプチド結合である。）
からなる群から選ばれる。
【００１５】
もう一つの好適な例において、前述ヒトコロニー刺激因子G-CSFの二量体は、アミノ酸配列がSEQ ID NO:1で示される。
【００１６】
もう一つの好適な例において、前述の第一の単量体と第二の単量体は、同じものである。前述の第一の単量体と第二の単量体は、アミノ酸配列がSEQ ID NO:8で示される。
【００１７】
本発明によれば、前述ヒトコロニー刺激因子G-CSFの二量体は、アミノ酸が2つのG-CSF-Fc複合体（G-CSF-Fc複合体はFc断片のついたG-CSF単量体である。）からなる。好ましくは、前述G-CSF-Fc複合体は、アミノ酸配列がSEQ ID NO:2〜7で示される。
【００１８】
もう一つの好適な例において、前述コロニー刺激因子G-CSFの二量体は、以下の工程によって製造される。
（a）G-CSF-Fc複合体をコードする、SEQ ID NO:10またはSEQ ID NO:9で示されるようなDNA配列を含有する発現ベクターで哺乳動物細胞をトランスフォームする工程、
（b）前述哺乳動物細胞を培養し、G-CSF-Fc複合体とG-CSF二量体を発現させる工程、および
（c）前述G-CSF二量体を分離して精製する工程。
ここで、前述G-CSF二量体は、2つのG-CSF-Fc複合体を含み、前述G-CSF-Fc複合体は、アミノ酸配列がSEQ ID NO:2〜7で示される。
【００１９】
本発明によれば、前述組成物は、医薬品組成物、保健品組成物または食品組成物である。
前述の医薬品組成物は、固体製剤または液体製剤である。
前述の医薬品組成物は、0.01-99wt％のコロニー刺激因子G-CSFの二量体と、薬理学的に許容される賦形剤または担体を含む。
前述の賦形剤または担体は、セルロースおよびその誘導体、ゼラチン、タルク、固体潤滑剤、硫酸カルシウム、植物油、多価アルコール、乳化剤、湿潤剤、着色剤、調味剤、安定剤、酸化防止剤、防腐剤、発熱性物質除去蒸留水からなる群から選ばれる。
【００２０】
もう一つの好適な例において、前述のG-CSF二量体を含む医薬品は、線条体におけるドーパミンの濃度の向上、ドーパミン作動性神経線維の欠失の防止、および/または、ドーパミン作動性ニューロンの欠失の防止に用いられる。
【００２１】
本発明の第二は、活性成分としてコロニー刺激因子G-CSFの二量体を含む、神経変性疾患の治療薬を提供する。
【００２２】
前述神経変性疾患は、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、脊髄性筋萎縮症、原発性側索硬化症、脊髓小脳失調症からなる群から選ばれる。
【００２３】
前述コロニー刺激因子G-CSFの二量体は、ヒトコロニー刺激因子G-CSFの二量体である。
【００２４】
前述の医薬品は、0.01-99wt％のヒトコロニー刺激因子G-CSFの二量体と、残量の薬理学的に許容される賦形剤または担体を含む。
【００２５】
前述コロニー刺激因子G-CSFの二量体は、構造が式Ｉで示される。
M1-L-M2   式Ｉ
（式中において、
M1はヒトコロニー刺激因子G-CSFの第一の単量体で、
M2はヒトコロニー刺激因子G-CSFの第二の単量体で、
Lは前述の第一の単量体と第二の単量体の間に位置し、前述第一の単量体と第二の単量体を連結するリンカーである。）
ここで、前述G-CSFの二量体は、G-CSFの単量体の生物活性を保持し、且つ前述第一の単量体および前述第二の単量体のいずれかの2倍以上の血清半減期を有する。
【００２６】
本発明の第三は、
治療が必要な対象にコロニー刺激因子G-CSFの二量体を投与する工程を含む、
神経変性疾患の治療方法を提供する。
【００２７】
前述神経変性疾患は、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、脊髄性筋萎縮症、原発性側索硬化症、脊髓小脳失調症からなる群から選ばれる。
【００２８】
もう一つの好適な例において、前述の対象は、哺乳動物（例えばヒト）を含む。
【００２９】
本発明は、G-CSF二量体分子を使用することで、PDモデル動物の線条体におけるドーパミンの濃度を顕著に向上させ、ドーパミン作動性神経線維の欠失を顕著に抑制し、PDモデル動物の黒質におけるドーパミン作動性ニューロンの数を顕著に向上させ、ドーパミン作動性ニューロンの機能を上げることができる。また、G-CSF二量体分子は、ADモデルラットの学習記憶能力を顕著に改善し、ニューロンを守り、海馬区域のニューロン細胞のアポトーシスを減少し、認知症の症状を軽減することができる。本発明の二量体のG-CSFの血清半減期が長くなり、有効的にニューロンの欠失を阻止することで、より有効的に神経変性疾患を治療することができる。
【００３０】
もちろん、本発明の範囲内において、本発明の上述の各技術特徴および下述（例えば実施例）の具体的に記述された各技術特徴は互いに組合せ、新しい、又は好ましい技術方案を構成できることが理解される。紙数に限りがあるため、ここで逐一説明しない。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図1は、本発明の一種のG-CSFの二量体の概略図を示す。ここで、「-」は連結ペプチドを、G-CSFの楕円形はG-CSFの単量体を示す。
【図２ａ】図2aと図2bは、本発明の一種のG-CSFの二量体の概略図を示す。ここで、「-」はアミノ酸の連結ペプチドを、G-CSFの楕円形はG-CSFの単量体を、図2aにおける「C」と標記される楕円形は担体タンパク質を示し、且つG-CSFが担体タンパク質のN-末端に位置し、図2bに二つのFcがジスルフィド結合でペアリングすることを示す。
【図２ｂ】図2aと図2bは、本発明の一種のG-CSFの二量体の概略図を示す。ここで、「-」はアミノ酸の連結ペプチドを、G-CSFの楕円形はG-CSFの単量体を、図2aにおける「C」と標記される楕円形は担体タンパク質を示し、且つG-CSFが担体タンパク質のN-末端に位置し、図2bに二つのFcがジスルフィド結合でペアリングすることを示す。
【図３ａ】図3aと図3bは、本発明の一種のG-CSFの二量体の概略図を示す。ここで、「-」はアミノ酸の連結ペプチドを、G-CSFの楕円形はG-CSFの単量体を、図3aにおける「C」と標記される楕円形は担体タンパク質を示し、且つG-CSFが担体タンパク質のC-末端に位置し、図3bに二つのFcがジスルフィド結合でペアリングすることを示す。
【図３ｂ】図3aと図3bは、本発明の一種のG-CSFの二量体の概略図を示す。ここで、「-」はアミノ酸の連結ペプチドを、G-CSFの楕円形はG-CSFの単量体を、図3aにおける「C」と標記される楕円形は担体タンパク質を示し、且つG-CSFが担体タンパク質のC-末端に位置し、図3bに二つのFcがジスルフィド結合でペアリングすることを示す。
【図４】図4は、マウスの線条体におけるドーパミン濃度の変化を示す。
【図５Ａ】図5Aは、マウスの線条体のTH陽性神経線維の免疫組織化学の染色図を示す。
【図５Ｂ】図5Bは、マウスの線条体のTH陽性神経線維の免疫組織化学の光学密度値を示す。
【図６Ａ】図6Aは、マウスの黒質緻密部のTH陽性ニューロンの免疫組織化学の染色図を示す。
【図６Ｂ】図6Bは、マウスの黒質緻密部のTH陽性細胞の計数分析結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本発明者らは、幅広く深く研究したところ、初めて、一種のG-CSFの二量体を製造し、且つ本発明のG-CSF二量体によって、体内の半減期を長くし、医薬品の動態学を改善し、注射頻度を減少し、体内における医薬品の活性を顕著に向上させ、神経変性疾患の症状を軽減し、神経変性疾患の回復を促進することができることを意外に見出した。これに基づき、本発明を完成させた。
【００３３】
＜G-CSF二量体＞
本発明のG-CSF二量体は、構造が式Ｉで示される。
M1-L-M2   式Ｉ
（式中において、
M1はヒトコロニー刺激因子G-CSFの第一の単量体で、
M2はヒトコロニー刺激因子G-CSFの第二の単量体で、
Lは前述の第一の単量体と第二の単量体の間に位置し、前述第一の単量体と第二の単量体を連結するリンカーである。）
ここで、前述G-CSFの二量体は、G-CSFの単量体の生物活性を保持し、且つ前述第一の単量体および前述第二の単量体のいずれかの2倍以上の血清半減期を有する。
【００３４】
前述の生物活性は、
（a）好中性顆粒球前駆細胞および骨髄幹細胞に作用することによって、好中性顆粒球の分化、成長および成熟を促進すること、
(b)  成熟した好中性顆粒球を活性化し、免疫反応に関与させること、
を含む。
【００３５】
もう一つの実施形態において、前述の第一の単量体と第二の単量体は、同じもので、前述の第一の単量体と第二の単量体は、アミノ酸配列がSEQ ID NO:8で示される。
【００３６】
もう一つの実施形態において、前述のリンカーLは、
(ｉ)  3〜50個のアミノ酸からなる短鎖ペプチドと、
(ｉｉ)  式ＩＩで示されるポリペプチドと、
-Z-Y-Z-     式ＩＩ
（式中において、
Yは担体タンパク質で、
Zはなし、または1〜30個のアミノ酸の短鎖ペプチドで、
「-」は、化学結合または共役結合で、好ましくは、「-」は、ペプチド結合である。）
からなる群から選ばれる。
【００３７】
G-CSF二量体の代表的な構造は、図1-3に示されるようである。ここで、担体タンパク質は、ヒトIgG(1,2,3,4)のFc断片、又はヒトアルブミン(albumin)を含むが、これらに限定されない。
【００３８】
G-CSFは、担体タンパク質のC-末端にも、担体タンパク質のN-末端にも位置してもよい。
【００３９】
ここで用いられるように、用語の「連結ぺプチド」(linker)とは、G-CSF単量体同士の間で連結作用をする短鎖ペプチドである。連結ぺプチドの長さは、特に限定されない。連結ぺプチドの長さは、通常、5〜50個のアミノ酸である。通常、G-CSF単量体同士の間で形成される正確な折り畳みおよび配座に影響しないか、顕著に影響しない。連結ぺプチドの例として、以下のものを含むが、これらに限定されない。
【００４０】
好ましくは、前述の連結ぺプチドは、以下のアミノ酸配列から選ばれる。
(a)  疎水性アミノ酸であるGlyとProからなる、3〜15個のアミノ酸の配列、例えばGly-Pro-Gly-Pro-Gly-Pro、または、GlyとSerからなる、3〜20個のアミノ酸の配列、例えばGSGG。
(b)  多回クローニングサイトでコードされるアミノ酸配列。このような配列は、通常、5〜20個、好ましくは10〜20個のアミノ酸で、その例として、TGLQPTRGIDDITSPVDを含むが、これらに限定されない。
(c)  G-CSF単量体以外のタンパク質由来のアミノ酸配列、例えばIgGまたはアルブミン由来のアミノ酸配列。
(d)  (a)、(b)および(c)の組合せで形成されるアミノ酸配列。
【００４１】
好ましい連結ぺプチドの一つは、GSGGGSGGGGSGGGGS（SEQ ID NO:1における175-190個目)である。
好ましい連結ぺプチドの一つは、ASTKGP（SEQ ID NO:4における175-180個目)である。
【００４２】
また、融合タンパク質のN末端またはC末端に、さらにG-CSF単量体の活性に影響しない他のアミノ酸配列を付加してもよい。これらの付加されるアミノ酸配列は、発現(例えばシグナルペプチド)、精製(例えば6×His配列)、出芽酵母のα-因子のシグナルペプチドの切断部位(Glu-Lys-Arg)、又は融合タンパク質の活性の促進に有利であることが好ましい。
【００４３】
＜配列の説明＞
SEQ ID NO:1は、G-CSF二量体の配列の一つで、構造が図1に示され、ここで、1-174個目はG-CSF単量体で、175-190個目は連結ぺプチドで、191-364個目はもう一つのG-CSF単量体である。
SEQ ID NO:2は、G-CSF二量体のFc断片のついたG-CSF単量体の配列で、ここで、1-174個目はG-CSF単量体で、175-190個目は連結ぺプチドで、191-418個目はヒトIgG2のFc断片である。図2に示すように、二つのFc断片のついたG-CSF単量体は、Fcのジスルフィド結合のペアリング作用で二量体を構成する。
SEQ ID NO:3は、G-CSF二量体のFc断片のついたG-CSF単量体の配列で、ここで、245-418個目はG-CSF単量体で、229-244個目は連結ぺプチドで、1-228個目はヒトIgG2のFc断片である。二つのFc断片を含むG-CSFの単量体は、Fcのジスルフィド結合のペアリング作用で二量体を構成する。
SEQ ID NO:4は、G-CSF二量体のFc断片のついたG-CSF単量体の配列で、ここで、1-174個目はG-CSF単量体で、175-180個目は連結ぺプチドで、181-403個目はヒトIgG2のFc断片である。二つのFc断片を含むG-CSFの単量体は、Fcのジスルフィド結合のペアリング作用で二量体を構成する。
SEQ ID NO:5は、G-CSF二量体のFc断片のついたG-CSF単量体の配列で、ここで、230-403個目はG-CSFで、224-229個目は連結ぺプチドで、1-223個目はヒトIgG2のFc断片である。二つのFc断片を含むG-CSFの単量体は、Fcのジスルフィド結合のペアリング作用で二量体を構成する。
SEQ ID NO:6は、G-CSF二量体のFc断片のついたG-CSF単量体の配列で、ここで、1-174個目はG-CSFで、175-190個目は連結ぺプチドで、191-413個目はヒトIgG2のFc断片である。二つのFc断片を含むG-CSFの単量体は、Fcのジスルフィド結合のペアリング作用で二量体を構成する。
SEQ ID NO:7は、G-CSF二量体のFc断片のついたG-CSF単量体の配列で、ここで、240-413個目はG-CSFで、224-239個目は連結ぺプチドで、1-223個目はヒトIgG2のFc断片である。二つのFc断片を含むG-CSFの単量体は、Fcのジスルフィド結合のペアリング作用で二量体を構成する。
SEQ ID NO:9は、SEQ ID NO:2のcDNA配列である。
SEQ ID NO:10は、SEQ ID NO:6のcDNA配列である。
【００４４】
本発明によって提供されるG-CSF二量体は、同じモルのG-CSF分子濃度条件で（G-CSF二量体濃度が0.1〜1000ng/mL、好ましくは1〜100ng/mLで、G-CSF単量体濃度が0.04〜400ng/mL、好ましくは0.4〜40ng/mLである。）、G-CSF単量体と比較すると、MPP+に誘導されたPC12細胞の保護作用がより顕著で、より強いドーパミン作動性ニューロンSTAT3を活性化する生物学活性を有し、MPTPに誘導された動物行動学的異常をより顕著に改善し、MPTPに誘導された動物線条体のドーパミンの濃度を顕著に向上させ、MPTPに誘導されたドーパミン作動性ニューロンの大量喪失を顕著に抑制し、より強い海馬ニューロンSTAT3の生物学活性を有し、Aβ誘導によるPC12細胞のアポトーシスを抑制し、ADモデル動物の学習記憶能力を改善することができる。
【００４５】
＜製造方法＞
本発明のG-CSF二量体または融合タンパク質をコードするDNA配列は、全部人工合成としてもよい。PCR増幅または合成の方法でG-CSFの第一の単量体及び/又はG-CSFの第二の単量体のコードDNA配列を得た後、これらを連結し、本発明の融合タンパク質をコードするDNA配列を形成してもよい。
【００４６】
宿主細胞の発現量を向上させるため、遺伝子の転写および翻訳に不利の配列がなくなるように、G-CSF二量体のコード配列を改造し、例えば宿主細胞のコドンバイアスを利用してもよい。本発明の一つの実施例において、哺乳動物細胞のコドンバイアスを利用し、コンピューターDNAソフトでG-CSF二量体遺伝子を検出し、イントロンの切断部位、転写終止配列を含む遺伝子における転写および翻訳に不利の配列を除去してもよい。
【００４７】
本発明の新規な融合タンパク質をコードするDNA配列を得た後、それを適切な発現ベクターに導入し、さらに適切な宿主細胞に導入する。最後に、形質転換された宿主細胞を培養し、分離、精製で本発明の新規な融合タンパク質を得る。
ここで用いられるように、用語の「ベクター」は、プラスミド、コスミド、発現ベクター、クローンベクター、ウイルスベクターなどを含む。
【００４８】
本発明において、本分野で既知の各種のベクター、例えば市販のベクター担体が用いられる。例えば、市販のベクターを使用し、本発明の新規な融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を作業できるように発現調節配列に連結することで、タンパク質発現ベクターを形成することができる。
【００４９】
ここで用いられるように、「作業できるように連結する」とは、直鎖DNA配列のある部分が同一の直鎖DNA配列の他の部分の活性に影響することができることである。例えば、シグナルペプチドDNAを前駆体として発現させてポリペプチドの分泌に関与させると、シグナルペプチド(分泌リーダー配列)DNAが作業できるようにポリペプチドDNAに連結することができる。プロモーター調節配列の転写の場合、作業できるようにコード配列に連結する。リボソーム結合部位が翻訳可能な位置に置かれる場合、作業できるようにコード配列に連結する。通常、「作業できるように連結する」とは、互いに近いことで、分泌リーダー配列にとって、読み枠において隣接することである。
【００５０】
本発明において、用語の「宿主細胞」は、原核細胞と真核細胞を含む。常用の原核宿主細胞の例として、大腸菌、枯草菌などを含む。常用の真核宿主細胞として、酵母細胞、昆虫細胞や哺乳動物細胞などを含む。当該宿主細胞は、真核細胞が好ましく、哺乳動物細胞がより好ましい。
【００５１】
形質転換された宿主細胞を得た後、本発明の融合タンパク質の発現に適する条件でこの細胞を培養することによって、融合タンパク質を発現させることができる。その後、発現された融合タンパク質を分離する。
【００５２】
一つの実施例において、本発明のG-CSF二量体の製造方法は、
（a）G-CSF-Fc複合体をコードする、SEQ ID NO:10またはSEQ ID NO:9で示されるようなDNA配列を含有する発現ベクターで哺乳動物の細胞をトランスフォームする工程、
（b）前述哺乳動物細胞を培養し、G-CSF-Fc複合体とG-CSF二量体を発現させる工程、および
(c)  前述G-CSF二量体を分離して精製する工程。
を含む。
ここで、前述G-CSF二量体は、2つのG-CSF-Fc複合体を含み、前述G-CSF-Fc複合体は、アミノ酸配列がSEQ ID NO:2〜7で示される。
【００５３】
＜医薬品組成物および使用方法＞
本発明のG-CSF二量体は、優れた血清半減期を有するため、本発明のG-CSF二量体および主な活性成分として本発明のG-CSF二量体を含む医薬品組成物は、神経損傷疾患の治療、およびニューロンの保護に有用である。ここで、前述の神経損傷疾患は、パーキンソン病(PD)、アルツハイマー病(AD)、ハンチントン病(HD)、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、脊髄性筋萎縮症(SMA)、原発性側索硬化症(PLS)、脊髓小脳失調症(SCA)からなる群から選ばれる。
【００５４】
本発明に係る疾患は、神経退行性病変を伴う疾患を含み、神経疾患は、色々な原因によって、また色々な部位または神経に現れるが、本発明の治療薬による損傷神経そのものの修復および機能の改善は、本発明の治療薬が異なる種類の神経変性疾患の治療や改善に有効であることを示す。本発明で言う神経疾患は、パーキンソン病(PD)、アルツハイマー病(AD)、ハンチントン病(HD)、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、脊髄性筋萎縮症(SMA)、原発性側索硬化症(PLS)、脊髓小脳失調症(SCA)、脊髄小脳変性、脳硬化、線条体黒質変性、脊髄性筋萎縮（SMA）、フリードライヒ運動失調、アミロイドーシス、亜急性脊髄視神経症(SMON)を含むが、これらに限定されず、また、これらの疾患を治療する方法、およびこれらの疾患を治療する治療薬の生産における用途に関する。
【００５５】
適切な使用方法によって本発明の治療薬を適切な使用部位に使用し、使用部位の選択は、治療する疾患や症状で決まる。例えば、主に大脳変性を伴う疾患に対し、本発明の治療薬を大脳に、局所性の線条体変性を有する疾患に対し、薬物を線条体に、全身性神経変性を有する疾患に対し、全身に使用してもよい。好ましい使用方法は、注射のような適切な方法である。好ましくは、本発明の薬物を神経変性が生じた部位に使用し、また動脈、静脈または皮下注射をする。
【００５６】
本発明の医薬品組成物は、安全有効量の範囲内の本発明のG-CSF二量体と薬理的に許容される賦形剤または担体を含む。ここで、「安全有効量」とは、化合物の量が病状の顕著な改善に充分で、重度な副作用が生じないことを指す。安全有効量は、治療対象の年齢、病状、治療段階などの具体的な状況によって確定される。通常、医薬品組成物は、1〜1000mgの本発明のG-CSF二量体/製剤、好ましくは0.05〜300mgの本発明のG-CSF二量体/製剤、より好ましくは0.3〜200mgの本発明のG-CSF二量体/製剤を含む。
【００５７】
「薬学的に許容される賦形剤または担体」とは、ヒトに適用でき、且つ十分な純度および充分に低い毒性を持たなければならない、一種または複数種の相溶性固体または液体フィラーまたはゲル物質を指す。ここで、「相溶性」とは、組成物における各成分が本発明の化合物と、またその同士の間で配合することができ、化合物の効果を顕著に低下させないことを指す。薬学的に許容される賦形剤または担体の一部の例として、セルロースおよびその誘導体(例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースナトリウム、セルロースアセテートなど)、ゼラチン、タルク、固体潤滑剤(例えばステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム)、硫酸カルシウム、植物油(例えば大豆油、ゴマ油、落花生油、オリーブオイルなど)、多価アルコール(例えばプロピレングリコール、グリセリン、マンニトール、ソルビトールなど)、乳化剤(例えばツイン（登録商標）)、湿潤剤(例えばドデシル硫酸ナトリウム)、着色剤、調味剤、安定剤、酸化防止剤、防腐剤、発熱性物質除去蒸留水などがある。
【００５８】
本発明のG-CSF二量体を使用する場合、経口、直腸、胃腸外(静脈内、筋肉内または皮下)、局部で投与することができる。経口投与に用いられる固体剤型は、カプセル剤、錠剤、丸剤、散剤および顆粒剤を含む。これらの固体剤型において、活性化合物は通常、少なくとも一種の不活性賦形剤(又は担体)、たとえばクエン酸ナトリウム又はリン酸二カルシウムと混合されるが、或いは、(a)フィラー又は相溶剤、例えば、でん粉、乳糖、ショ糖、グルコース、マンニトールやケイ酸、(b)バインダー、例えば、ヒドロメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ショ糖やアラビアゴム、(c)保湿剤、例えば、グリセリン、(d)崩壊剤、例えば、寒天、炭酸カルシウム、馬鈴薯澱粉やタピオカ澱粉、アルギン酸、ある複合ケイ酸塩や炭酸ナトリウム、(e)溶液遅延剤、例えばパラフィン、(f)吸収促進剤、例えば、アンモニウム化合物、(g)湿潤剤、例えばセタノール、グリセリンモノステアレート、(h)吸着剤、例えば、カオリン、また(i)潤滑剤、例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ドデシル硫酸ナトリウム、又はこれらの混合物、のような成分と混合される。カプセル剤、錠剤および丸剤において、剤形に緩衝剤を含んでもよい。固体剤型、例えば錠剤、ピル、カプセル剤、丸剤や顆粒剤は、コーディングやシェル剤、例えば、腸衣および他の本分野で公知の材料で製造することができる。不透明剤を含んでもよく、且つこのような組成物において、活性物または化合物の放出は遅延の様態で消化管のある部分で放出してもよい。使用できる包埋成分の実例として、重合物質やワックス系物質が挙げられる。必要な場合、活性化合部も上述賦形剤のうちの一種または複数種とマイクロカプセルの様態に形成してもよい。
【００５９】
経口投与に用いられる液体剤型は、薬学的に許容される乳液、溶液、懸濁液、シロップまたはチンキ剤を含む。活性化合物の他、液体剤型は、本分野で通常使用される不活性希釈剤、例えば、水または他の溶媒、相溶剤及び乳化剤、例えば、エタノール、イソプロパノール、炭酸エチル、酢酸エチル、プロピレングリコール、1,3-ブタンジオール、ジメチルホルムアミドおよび油、特に、綿実油、落花生油、コーン油、オリーブ油、ヒマシ油やゴマ油またはこれらの物質の混合物などを含んでもよい。
これらの不活性希釈剤の他、組成物は助剤、例えば、湿潤剤、乳化剤、懸濁剤、甘味料、矯味剤や香料を含んでもよい。
活性化合物の他、懸濁液は、懸濁剤、例えば、エトキシ化イソオクタデカノール、ポリオキシエチレンソルビトールやソルビタンエステル、微晶質セルロース、メトキシアルミニウムや寒天またはこれらの物質の混合物などを含んでもよい。
【００６０】
胃腸外注射用組成物は、生理的に許容される無菌の水含有または無水溶液、分散液、懸濁液や乳液、及び再溶解して無菌の注射可能な溶液または分散液にするための無菌粉末を含む。適切な水含有または非水性担体、希釈剤、溶媒または賦形剤は、水、エタノール、多価アルコールおよびその適切な混合物を含む。
【００６１】
局部投与のための本発明のG-CSF二量体の剤型は、軟膏剤、散剤、湿布剤、噴霧剤や吸入剤を含む。活性成分は、無菌条件で生理学的に許容される担体および任意の防腐剤、緩衝剤、または必要よって駆出剤と一緒に混合される。
【００６２】
本発明のG-CSF二量体は、単独で投与してもよいし、或いは他の薬学的に許容される化合物と併用して投与してもよい。
【００６３】
医薬品組成物を使用する場合、安全な有効量の本発明のG-CSF二量体を治療の必要のある哺乳動物(例えばヒト)に使用し、使用の際の用量は薬学上で効果があるとされる投与量で、体重60kgのヒトの場合、毎回の投与量は、通常0.01〜300mg、好ましくは0.5〜100mgである。勿論、具体的な投与量は、さらに投与の様態、患者の健康状況などの要素を考えるべきで、すべて熟練の医者の技能範囲以内である。
【００６４】
本発明の主な利点は以下の通りである。
1．より長い体内における生物半減期。
2．PDモデル動物の線条体におけるドーパミンの濃度を顕著に向上させ、PDモデル動物の線条体におけるドーパミン作動性神経線維の欠失および黒質におけるドーパミン作動性ニューロンの欠失を顕著に抑制し、ドーパミン作動性ニューロンの機能を上げる。
3．海馬区域のニューロン細胞のアポトーシスを顕著に減少し、ADモデル動物の学習記憶能力を改善する。
4．神経変性疾患に顕著な神経保護作用を有し、有効的に神経変性疾患を治療する。
【００６５】
以下、具体的な実施例によって、さらに本発明を説明する。これらの実施例は本発明を説明するために用いられるものだけで、本発明の範囲の制限にはならないと理解されるものである。下述実施例で具体的な条件が示されていない実験方法は、通常、例えばSambrookら、「モレキュラー・クローニング：研究室マニュアル」(ニューヨーク、コールド・スプリング・ハーバー研究所出版社、1989) に記載の条件などの通常の条件に、或いは、メーカーのお薦めの条件に従う。
【００６６】
＜実施例1：G-CSF二量体の製造＞
本発明のG-CSF二量体は、SEQ ID NO:1で構成し、またはSEQ ID NO:2-7から選ばれるG-CSF-Fc複合体から図1-3の二量体を形成する。製造方法は以下の通りである。
【００６７】
a．G-CSF二量体発現細胞株の構築
全遺伝子で合成されたG-CSF-Fc複合体のcDNA配列（SEQ ID NO:10またはSEQ ID NO:9に示すように）を使用し、ヒトG-CSF単量体の遺伝子とIgG2のFc遺伝子断片を連結し、5’にHindIII部位および哺乳動物細胞の発現に必要なエレメント、例えばKozak配列やシグナルペプチドを、3’にEcoRI部位を導入し、pUC19プラスミドにクローンし、pG-CSF-Fcと名づけ、E.coli  TG1を形質転換した。pUC19プラスミドをHind IIIとEcoRIの酵素で切断し、約1400bpのG-CSF-IgG2Fｃ断片を回収し、Hind IIIとEcoRIの酵素で切断したpcDNA3(Invitrogen)発現プラスミドと連結し、発現プラスミドpEX-G-CSF-Fcを構築した。発現プラスミドpEX-G-CSF-Fcを直鎖化し、精製し、エレクトロポレーションでCHO細胞を形質転換し、スクリーニングし、ELISA法で発現量を検出し、蛋白質生産量の高い細胞株を選択し、細胞を冷凍保存し、細胞ライブラリーを調製した。
【００６８】
上述の方法でSEQ ID NO:2-7をコードするcDNA配列を含む発現プラスミドを構築し、直鎖化を経てCHO細胞にトランスフェクションし、G-CSF二量体を発現し、ELISA法で発現量を検出し、蛋白質生産量の高い細胞株を選択し、細胞ライブラリーを調製した。
【００６９】
b．細胞規模培養
細胞ライブラリーから一種の細胞(〜 1×107 細胞/ml)を取り、10cmのシャーレで戻させ、10mLの基礎培地で培養し、37℃、5％ CO2で24時間培養した。
種の増幅：10mLの培養物を30〜40mLの培地に継代し、細胞の濃度が1.0〜1.5×106細胞/mLで、且つ生存率≧90％の時点で、段階的に300〜400mLの培地に拡大し、振とうフラスコに置いて37℃、5％ CO2で培養し、回転数が120rpmであった。
細胞タンクにおける増幅（3L-10L）：細胞の濃度が1.0〜3.0×106細胞/mLで、且つ生存率≧90％の時点で、300〜400mLの培養物を3-10Lの細胞タンクに接種して培養し、培地のpHを6.8にし、溶解酸素が約50％で、回転数が65-100rpmであった。
細胞タンクによる生産（30L-100L）：3-10Lの細胞タンクにおける細胞の濃度が1.0〜3.0×106細胞/mLで、且つ生存率≧90％の時点で、3-10Lの細胞タンクにおける培養物を30-100Lの細胞タンクに接種して培養し、培地のpHを6.8にし、溶解酸素が約50％で、回転数が65-100rpmで、12-48時間培養してから培地におけるグルコース濃度（<1g/L）をコントロールし、補充培養を行った。
【００７０】
c．G-CSF二量体の分離と精製
細胞タンクにおける培養が終わった後、細胞上清（G-CSF-Fc複合体、G-CSF二量体、G-CSF-Fc多量体および代謝物を含む。）を収集し、収集後細胞上清をろ過、多段ゲルクロマトグラフィーで精製した。例えば、rProtein A Sepharose FF (GE Healthcare、cat#17-1279-04)で捕獲し、50 mM  クエン酸/クエン酸ナトリウム、0.2M NaCl、pH 3.7-3.8の緩衝液で溶離し、純度>90％のG-CSF二量体を得た後、Capto Adhereクロマトグラフィーを使用し、50 mM NaAc/HAC、0.2 M NaCl、pH 4.5-5.0の緩衝液で溶離し、さらにSP Sepharose FF (GE Heathcare Cat #17-0729-04)を使用し、10mM PB (pH 6.0±0.1)緩衝液で平衡を取り、10mM PB、0.2M NaCl (pH 7.2±0.1)で溶離し、溶離液が低pHによるウイルス除去、ろ過などを経て、最終的にG-CSF二量体を得た。
【００７１】
分離・精製されたG-CSF二量体の純度> 95％(逆相HPLC分析による)で、分子量が47±5Kd（還元型SDS-PAGE分析による）で、O-グリコシル化は全分子量の2-10％を占め、等電点が5.8-6.8で、紫外吸収スペクトルは280nmであった。G-CSF二量体は、体外でM-NFS-60細胞のSTAT3を活性化し、M-NFS-60細胞の増殖を促進した（ED50：0.1-10ng/mL）。
【００７２】
＜実施例2：G-CSF二量体の体内における半減期＞
ラットに1回100 μg/kgでG-CSF二量体（二量体が2つのSEQ ID NO:3に示すようなG-CSF-Fc複合体からなる）を注射し、薬物動態学のパラメーターは下述表1に示す（n=6）。単量体G-CSFは、ラットにおける半減期が約2時間である。
【００７３】
【表１】
0005947891.tif 000002
【００７４】
＜実施例3：G-CSF二量体の人体内における薬物動態学＞
24人の健康の被験者を無作為にそれぞれ30、60、120、240ug/kg投与量群の4群に分け、G-CSF二量体（二量体が2つのSEQ ID NO:6に示すようなG-CSF-Fc複合体からなる）の投与量がそれぞれ30、60、120、240ug/kgで、1回で投与し、投与後0.5、1、2、4、8、16、24、36、48、72、96時間、6(120時間)、7、9、11、13および15日目で、採血して血清を分離して-70℃の冷蔵庫に冷凍保存した。ELISA法で血中薬物濃度(ELISA, Quantikine human G-CSF ELISA kit, R&D System, Inc. Minneapolis, Min, Cat:PDCS50)を検出した。検出結果は、ノンコンパートメントモデルで薬物動態学のパラメーター(ソフトウェアWinNonlin v 5.2、Pharsight Corporation、USA)を使用し、結果を下述表2に示す。
【００７５】
【表２】
0005947891.tif 000003
【００７６】
さらに、この臨床研究において、G-CSF二量体は、優れた安全性と耐性を示した。
【００７７】
＜実施例4：G-CSF二量体のMPP+に誘導されたPC12細胞の神経毒性に対する保護作用＞
PC12細胞は、ラットのクロム親和性細胞腫の細胞系で、体外培養でドーパミンを合成・代謝・伝達することができ、体外モデルとして活性を有する化合物を選択することが可能である。
【００７８】
実験は、PC12細胞を40000個/ウェルで96ウェルプレートに接種し、培地成分は、DMEM、10％ウマ血清+5％FCS、1％ Penicillin-Streptomycinであった。30〜3000μmの最終濃度までMPP+(Sigma)を入れ、0.4ng/mL、4ng/mL、40ng/mLまでG-CSFを、1ng/mL、10ng/mL、100ng/mLまでG-CSF二量体をそれぞれ入れた。24時間培養した後、蛍光細胞生存分析(Fluorimetric cell viability assay)を行った。結果から、MPP+処理後、PC12細胞の生存率は、MPP濃度の向上に従って低下し、同じMPP作用濃度の場合、同じモルG-CSF分子濃度で、G-CSF二量体のPC12細胞に対する保護作用がG-CSF単量体よりも優れることが示された。
【００７９】
PC12細胞を40000個/ウェルで96ウェルプレートに接種し、培地成分は、DMEM、10％ウマ血清+5％FCS、1％ Penicillin-Streptomycinであった。1〜100μmの最終濃度までMPP+(Sigma)を入れ、0.4 ng/mL、4 ng/mL、40ng/mLまでG-CSF単量体を、1 ng/mL、10 ng/mL、100ng/mLまでG-CSF二量体をそれぞれ入れた。24時間培養した後、免疫組織化学でチロシンヒドロキシラーゼ（TH）を検出し、黒質TH陽性細胞を計数した。結果から、G-CSF二量体処理群では、黒質TH陽性細胞数がG-CSF処理群よりも顕著に多かったことが示された。同じモルG-CSF分子濃度条件で、G-CSF二量体のPC12細胞に対する保護作用がG-CSF単量体よりも顕著に優れた。
【００８０】
G-CSF単量体とG-CSF二量体（SEQ ID NO:2-7に示すような配列から選ばれるG-CSF-Fc複合体からなるG-CSF二量体）の分子量比は約1:5で、1モルのG-CSF二量体は、2モルのG-CSF単量体分子を含むため、同じモルのG-CSF分子の場合、G-CSF単量体とG-CSF二量体の質量比は約1:2.5で、即ち、0.4ng/mLのG-CSF単量体に含まれるG-CSF分子のモル濃度は1ng/mLのG-CSF二量体に含まれるG-CSF分子のモル濃度に相当し、4ng/mLのG-CSF単量体に含まれるG-CSF分子のモル濃度は10ng/mLのG-CSF二量体に含まれるG-CSF分子のモル濃度に相当し、40ng/mLのG-CSF単量体に含まれるG-CSF分子のモル濃度は100ng/mLのG-CSF二量体に含まれるG-CSF分子のモル濃度に相当する。
【００８１】
＜実施例5：G-CSF二量体のドーパミン作動性ニューロン細胞のSTAT3に対する活性化作用＞
妊娠14日のSDラットの胎児の全脳を取って冷却しておいたD-Hanks液に入れ、解剖顕微鏡で黒質を取り、1mm3の大きさに切り、10mLの0.125％トリプシンを入れ、且つ37℃のインキュベーターで15min消化し、さらに組織を冷却しておいたDMEM＋10％FBSの入った遠心管に移して最終消化を行い、ピペットで数回吹き、静置後上清を取ってもう一つの遠心管内に入れた。上述工程を2〜3回繰り返した。無血清ニューロン基礎培地neurobasal(invitrogen、製品番号：21103049)+無血清添加剤B27(invitrogen、製品番号：17504044)で8日培養し、2日おきに液を換えた。8日目に培養し、それぞれ異なる濃度のG-CSF二量体（G-CSF-D）とG-CSF単量体（G-CSF二量体の最終濃度：1、10、100ng/mL、G-CSFの最終濃度：0.4、4、40ng/mL）でニューロンを15分間処理した（Schneider Aら.J Clin Invest 2005, 115(8):2083-2098）。培地を完全に吸い出し、細胞をPBSで2回洗浄し、細胞溶解液のマニュアルで細胞を溶解した。細胞溶解液（Cell Signaling Technology、製品番号：9803、主要成分：20 mM Tris-HCl (pH 7.5)、150 mM NaCl、1 mM Na2EDTA、1 mM EGTA、1％ Triton、2.5 mM sodium pyrophosphate、1 mM beta-glycerophosphate、1 mM Na3VO4、1 μg/ml leupeptin、1 mM PMSF）を氷上で細胞を20分間溶解し、細胞をかき取った。細胞溶解液を収集し、12000rpm、4℃で10分間遠心した。上清を吸い取り、蛋白質の濃度を測定した。別に100μlの上清を取ってSTAT3 [pY705] ELISAキット(invitrogen、製品番号：KH00481)でSTATのリン酸化レベルの変化を検出した。
【００８２】
同じモル数のG-CSF分子濃度で、G-CSF二量体（G-CSF-D）とG-CSF単量体を比較すると、二量体のG-CSFはより強いドーパミン作動性ニューロンSTAT3を活性化する生物学活性を有する。
【００８３】
＜実施例6：G-CSF二量体のMPTPに誘導された動物PDモデルに対する治療作用＞
1-メチル-4-フェニル-1,2,3,6-エトラヒドロピリジン（MPTP）は、ドーパミン作動性ニューロンを特異に損傷し、黒質におけるドーパミン作動性ニューロンを大量に欠失させ、パーキンソン病に似た症状を出すことができる。
【００８４】
実験は、オス、20〜22g、12〜14週のC57/BL6Jマウスを選び、動物を室温24±2℃の環境で飼い、明-暗12時間循環交代を維持し、充分な飼料を与え、自由に水を飲ませた。
50匹のマウスを無作為にそれぞれ10匹ずつ溶媒対照群、MPTPモデル群、MPTP+G-CSF  40μg/kg群、MPTP+GCSF-D  40μg/kg群、MPTP+GCSF-D  100μg/kg群の5群に分け、ここで、GCSF-DはSEQ ID NO:2-7に示すような配列から選ばれるG-CSF-Fc複合体からなるG-CSF二量体である。
MPTPは30mg/kgの投与量で腹腔注射し、5日間連続投与し、1日回復した後（7日目から）、MPTP+G-CSF  40μg/kg群は、G-CSFを40μg/kgで皮下注射し、G-CSFを毎日1回、5日間連続、即ち、7〜11日目で、MPTP+GCSF-D  40μg/kg群は、40μg/kgで皮下注射し、7、9日目にそれぞれGCSF-Dを1回、MPTP+GCSF-D  100μg/kg群は、100μg/kgで皮下注射し、7、9日目にそれぞれGCSF-Dを1回、溶媒対照群は、等体積の生理食塩水を投与した。
12日目に、動物に以下の評価を行った。
【００８５】
a．PDマウスの行動学評価
本実験では、MPTPの最後の投与後10日目に行動学測定を行った。方法：ポール試験（pole test）でPDにおける典型的な行動学症状である動作緩慢(Matsuuraら, 1997; Arakiら, 2001; Katoら, 2004)を測定した。 
マウスを頭が上のように軽く粗いポールのトップに置いた（直径8mm、高さ55cm）。マウスが頭が上の状態から完全下に向いたまでの時間をT-turn(time to turn)と記録し、マウスが下への運動から四肢がすべてポールの底についたまでの時間をT-LA(locomotion activity time)と記録し、30sを超えた場合30sと記録した。すべてのマウスに対して5回測定を繰り返して平均値を取った。
【００８６】
結果から、G-CSF二量体は、MPTPに誘導されたマウスの行動学異常を顕著に改善することができ、且つ、同じモルのG-CSF分子の濃度で、G-CSF二量体はG-CSFよりも優れた効果を示した。
【００８７】
b．線条体におけるドーパミンの濃度の検出
方法：マウスを断頭し、線条体を取って重量を量った後、1.5mlの遠心管に入れ、すぐ砕氷に置いた。サンプル10mgあたりに300 μlの氷水浴中のサンプル処理液を入れた（0.2M過塩素酸、0.2mM二亜硫酸ナトリウム、0.01％EDTA-2Na、同時に内部標準として0.3μM DHBAを含有する）。以上の混合液を超音儀で超音波粉砕し、さらにそれを4℃、10000gで20 min遠心した。その上清液を取って0.22μMの水相ろ膜でろ過し、高速液相クロマトグラフィーで線条体におけるドーパミンの濃度を検出した。
【００８８】
結果から、G-CSF二量体は、MPTPに誘導されたマウスの線条体におけるドーパミンの濃度を顕著に向上させることができ、且つ、同じモルのG-CSF分子の濃度で、G-CSF二量体はG-CSFよりも優れた効果を示し、顕著に異なった。
【００８９】
c．黒質におけるドーパミン作動性ニューロンの様子の観察
方法：10％抱水クロラールで麻酔し、4％パラホルムアルデヒドで灌流した後、脳を取った。4％パラホルムアルデヒドで24時間固定し、さらにサンプルを10％、20％、30％のショ糖溶液に移してサンプルが底に沈殿するまで勾配脱水し、-20℃で冷凍スライサーで中脳と線条体の部位の冠状切片を作り、マウスの切片の厚さが20μmであった。THはドーパミン作動性ニューロンの特異的標識である。第一抗体は、モノクローナルマウス抗TH(1:1000, CHEMICON)で、線条体と中脳の部位の脳切片と共に4℃で一晩インキュベートし、PBSで3回洗浄した後、ビオチン化第二抗体で室温で1時間インキュベートした。SABC複合体を室温で1時間インキュベートした。DAB呈色を行い、エタノールで勾配脱水し、キシレンで透明にし、中性樹脂で封じた。黒質TH陽性細胞を計数し、線条体TH陽性染色の光学密度をスキャンした。
【００９０】
結果から、G-CSF二量体は、MPTPに誘導されたドーパミン作動性ニューロンの大量欠失を顕著に防止することができ、且つ、同じモルのG-CSF分子の濃度で、G-CSF二量体はG-CSFよりも優れた効果を示し、顕著に異なった。
【００９１】
＜実施例7：G-CSF二量体の海馬のニューロン細胞のSTAT3に対する活性化作用＞
妊娠17日のSDラットの胎児の全脳を取って冷却しておいたD-Hanks液に入れ、解剖顕微鏡で海馬を取った。1mm3の大きさに切り、10mLの0.125％トリプシンを入れ、且つ37℃のインキュベーターで15min消化し、さらに組織を冷却しておいたDMEM＋10％FBSの入った遠心管に移して最終消化を行い、ピペットで数回吹き、静置後上清を取ってもう一つの遠心管内に入れた。上述工程を2〜3回繰り返した。無血清ニューロン基礎培地neurobasal(invitrogen、製品番号：21103049)+無血清添加剤B27(invitrogen、製品番号：17504044)で8日培養し、2日おきに液を換えた。8日目に培養し、それぞれ異なる濃度のG-CSF二量体（SEQ ID NO:2-7に示すような配列から選ばれるG-CSF-Fc複合体からなる）とG-CSF（G-CSF二量体の最終濃度：1、10、100ng/mL、G-CSF単量体の最終濃度：0.4、4、40ng/mL）でニューロンを15分間処理した（Schneider Aら.J Clin Invest 2005, 115(8):2083-2098）。培地を完全に吸い出し、細胞をPBSで2回洗浄し、細胞溶解液のマニュアルで細胞を溶解した。細胞溶解液（Cell Signaling Technology、製品番号：9803、主要成分：20 mM Tris-HCl (pH 7.5)、150 mM NaCl、1 mM Na2EDTA、1 mM EGTA、1％ Triton、2.5 mM sodium pyrophosphate、1 mM beta-glycerophosphate、1 mM Na3VO4、1 μg/ml leupeptin、1 mM PMSF）を氷上で細胞を20分間溶解し、細胞をかき取った。細胞溶解液を収集し、12000rpm、4℃で10分間遠心した。上清を吸い取り、蛋白質の濃度を測定した。別に100μlの上清を取ってSTAT3 [pY705] ELISAキット(invitrogen、製品番号：KH00481)でSTATのリン酸化レベルの変化を検出した。
【００９２】
同じモル数のG-CSF分子濃度で、G-CSF二量体（G-CSF-D）とG-CSF単量体を比較すると、二量体のG-CSFはより強い海馬ニューロンSTAT3を活性化する生物学活性を有する。
【００９３】
＜実施例8：G-CSF二量体のAβに誘導されたPC12細胞のアポトーシスに対する保護作用＞
PC12細胞は、神経因子（NGF）で誘導された後、突出が現れ、神経細胞の特性を有し、Aβ（βアミロイド）によるPC12細胞のアポトーシスは体外でADモデルを模擬することができる。
【００９４】
PC12細胞を基礎培地(DMEM、10％FCS、1％ Penicillin- Streptomycin)で培養し、トリプシンで消化し、再び50ng/mLのNGFを含有する培地に懸濁させ、細胞濃度を2×104細胞/ウェルに調整して96ウェルプレートに入れ、37℃、5％CO2インキュベーターで24時間培養した。最終濃度が1-100μmol/LになるようにAβを入れ、それぞれ異なる濃度のG-CSF単量体とG-CSF-D（G-CSF-DはSEQ ID NO:2-7に示すような配列から選ばれるG-CSF-Fc複合体からなるG-CSF二量体）で処理し、G-CSF単量体の最終濃度はそれぞれ0.4、4、40ng/mLで、G-CSF-Dの最終濃度はそれぞれ1、10、100ng/mLで、モデルウェルに等体積のPBSを入れ、陰性対照ウェルにAβを入れず、24時間培養を続けた。Hochest染色で細胞形態を観察し、またはMTT法でPC12細胞の増殖を検出した。
【００９５】
陰性対照ウェルと比較すると、モデルウェルのPC12細胞の細胞核の蛍光染色は顕著に不均一で、アポトーシスによる緻密染色の高蛍光細胞核が見られ、G-CSF単量体とG-CSF二量体で処理されたPC12細胞の細胞核蛍光染色が均一で、顕著な緻密染色の高蛍光細胞核が見られなかった。G-CSF二量体は、NGF分化後Aβに誘導されたPC12細胞のアポトーシスを抑制し、神経細胞を保護することができる。
【００９６】
＜実施例9：G-CSF二量体のAβに誘導された動物ADモデルに対する治療作用＞
オス、180〜220gのSDラットを室温24±2℃の環境で飼い、明-暗12時間循環交代を維持し、充分な飼料を与え、自由に水を飲ませた。
50匹のマウスを無作為にそれぞれ10匹ずつ溶媒対照群、Aβモデル群、Aβ+G-CSF  40μg/kg群、Aβ+GCSF-D  40μg/kg群、Aβ+GCSF-D  100μg/kg群の6群に分けた。ここで、GCSF-DはSEQ ID NO:2-7に示すような配列から選ばれるG-CSF-Fc複合体からなるものである。
実験ラットは、1％ペントバルビタールトンナトリウム（40mg/kg）で麻酔した後、頭部を固定し、皮膚を消毒し、頭蓋の中線に沿って2cm切り口を入れ、骨膜を分離して頭骨を露出させ、大泉門から後ろに3.0mm、中線の左右でそれぞれ2.2mm開き、歯科ドリルで頭蓋骨に穴を開け、垂直に微量サンプラー針2.8mmを入れ、モデル群と各薬物処理群では5μl
Aβ1-40(βアミロイド)(2μg/μl)溶液を注入し、偽手術群では5ulの生理食塩水を注射した。
動物モデルを構築した後3日目に投与を開始し、Aβ+G-CSF  40μg/kg群は、G-CSFを40μg/kgで皮下注射し、G-CSFを毎日1回、5日間連続で、Aβ+GCSF-D  40μg/kg群は、40μg/kgで皮下注射し、3、5日目にそれぞれGCSF-Dを1回、Aβ+GCSF-D  100μg/kg群は、100μg/kgで皮下注射し、3、5日目にそれぞれGCSF-Dを1回、溶媒対照群は、等体積の生理食塩水を投与した。
10日目にMorris水迷宮で行動学測定を行った。
【００９７】
行動学測定が終わった後、10％抱水クロラールで麻酔し、4％パラホルムアルデヒドで灌流した後、脳を取った。4％パラホルムアルデヒドで24時間固定し、さらにサンプルを10％、20％、30％のショ糖溶液に移してサンプルが底に沈殿するまで勾配脱水し、-20℃で冷凍スライサーで海馬の部位の冠状切片を作り、切片の厚さが20μmであった。NeuN（ニューロン核抗原）はニューロンの特異的標識物で、第一抗体は海馬の部位の脳切片と共に4℃で一晩インキュベートし、PBSで3回洗浄した後、ビオチン化第二抗体で室温で1時間インキュベートした。 SABC複合体を室温で1時間インキュベートした。DAB呈色を行い、エタノールで勾配脱水し、キシレンで透明にし、中性樹脂で封じた。海馬NeuN陽性細胞を計数した。
【００９８】
G-CSF処理群とG-CSF二量体処理群は、いずれもモデルラットの学習強化と再現能力を改善することができる。偽手術群と比較すると、モデル群では、ラットの海馬区域のNeuN陽性ニューロンの細胞数が低下した。モデル群と比較すると、G-CSF処理群とG-CSF二量体処理群は、いずれもNeuN陽性ニューロンの細胞数が向上し、G-CSF単量体処理群と比較すると、G-CSF二量体処理群(100μg/kg)では、NeuN陽性ニューロンの細胞数が顕著に向上した。
【００９９】
＜実施例10：G-CSF二量体のMPTPに誘導されたPD動物モデルに対する治療作用＞
1-メチル-4-フェニル-1,2,3,6-エトラヒドロピリジン（MPTP）は、ドーパミン作動性ニューロンを特異に損傷し、黒質におけるドーパミン作動性ニューロンを大量に欠失させることで、パーキンソン病（PD）に似た症状が現れる。チロシンヒドロキシラーゼ（TH）は、ドーパミン作動性ニューロンの特異的標識で、黒質におけるドーパミン作動性ニューロンの数を定量に検出することができる。
【０１００】
実験は、オス、22〜30g、12〜14週のC57/BL6Jマウスを選び、無作為に4群を分け、それぞれは以下の各群である。
MPTP+GCSF-D  30μg/kg群：30mg/kgの投与量でMPTPを腹腔注射し、5日間連続投与し、1日回復した後（即ち7日目から）30μg/kgでG-CSF-Dを皮下注射し、7、9、11日目にそれぞれG-CSF-Dを1回投与した。
MPTP+GCSF-D  100μg/kg群：30mg/kgの投与量でMPTPを腹腔注射し、5日間連続投与し、1日回復した後（即ち7日目から）100μg/kgでG-CSF-Dを皮下注射し、7、9、11日目にそれぞれG-CSF-Dを1回投与した。
MPTPモデル群：30mg/kgの投与量でMPTPを腹腔注射し、5日間連続投与し、動物を1日回復させた後、7日目から等体積の溶媒（0.5％マウス血清/PBS）を投与した。
正常対照群：等体積の生理食塩水を5日間連続投与し、動物を1日回復させた後、7日目から等体積の溶媒（0.5％マウス血清/PBS）を投与した。
前述G-CSF二量体（G-CSF-D）は2つのSEQ ID NO:6に示すような配列のG-CSF-Fcからなる。
12日目に、動物を殺処分し、線条体におけるドーパミン濃度を検出し、線条体におけるドーパミン作動性神経線維と黒質におけるドーパミン作動性ニューロンの様子を観察した。
【０１０１】
a．線条体におけるドーパミンの濃度の検出
方法：マウスを断頭し、線条体を取って重量を量った後、1.5mlの遠心管に入れ、すぐ砕氷に置いた。サンプル10mgあたりに300 μlの氷水浴中のサンプル処理液を入れた（0.2M過塩素酸、0.2mM二亜硫酸ナトリウム、0.01％EDTA-2Na、同時に内部標準として0.3μM DHBAを含有する）。以上の混合液を超音儀で超音波粉砕し、さらにそれを4℃、10000gで20 min遠心した。その上清液を取って0.22μMの水相ろ膜でろ過し、高速液相クロマトグラフィーで線条体におけるドーパミンの濃度を検出した。
【０１０２】
結果は、図4に示すように、マウスに連続5日でMPTPを注射した後、線条体におけるドーパミン濃度が大幅に低下し、G-CSF二量体で治療すると、投与量に依頼して線条体におけるドーパミン濃度を上げることができる。
【０１０３】
結果から、正常対照群と比較すると、MPTPは、線条体におけるドーパミン濃度を大幅に低下させることができることが示された（### p＜0.001）。G-CSF二量体は、MPTPに誘導されたマウスの線条体におけるドーパミンの含有量の低下を顕著に抑制し、線条体におけるドーパミン濃度を上げることができる。そして、G-CSF二量体投与群は、投与量依頼性を示し、MPTPモデル群と比較すると、いずれも顕著に異なる（* p＜0.05）。
【０１０４】
b．線条体におけるドーパミン作動性神経線維および黒質におけるドーパミン作動性ニューロンの様子の観察
方法：10％抱水クロラールで麻酔し、4％パラホルムアルデヒドで灌流した後、脳を取った。4％パラホルムアルデヒドで24時間固定し、さらにサンプルを10％、20％、30％のショ糖溶液に移してサンプルが底に沈殿するまで勾配脱水し、-20℃で冷凍スライサーで中脳と線条体の部位の冠状切片を作り、マウスの切片の厚さが20μmで、TH免疫組織化学分析を行った。第一抗体は、モノクローナルマウス抗TH抗体(1:1000、Sigma)で、線条体と中脳の部位の脳切片と共に4℃で一晩インキュベートし、PBSで3回洗浄した後、ビオチン化第二抗体（ヒツジ抗マウス）で室温で1時間インキュベートした。SABC複合体を室温で1時間インキュベートした。DAB呈色を行い、エタノールで勾配脱水し、キシレンで透明にし、中性樹脂で封じた。線条体TH陽性染色の光学密度のスキャン、黒質緻密部TH陽性細胞の計数などの測定を行った。
結果は、図5A、図5B、図6Aおよび図6Bに示された通りである。
【０１０５】
図5Aは、マウスの線条体のTH陽性神経線維の免疫組織化学の染色図を示す。マウスに連続5日でMPTPを注射した後、線条体TH陽性神経線維の密度が低下し、G-CSF二量体で治療すると、投与量に依頼してTH陽性神経線維の数を増やすことができ、G-CSF二量体がMPTPに誘導されたドーパミン作動性神経線維の欠失に対して顕著な保護作用を有することが見られる。
【０１０６】
図5Bは、マウスの線条体のTH陽性神経線維の免疫組織化学の光学密度値を示す。結果から、MPTPは線条体TH陽性神経線維の密度の大幅な低下を引き起こすことができることが示された（### p＜0.001）。G-CSF二量体は、MPTPに誘導された線条体TH陽性神経線維の密度の低下を顕著に抑制することができる。G-CSF二量体投与群は、投与量依頼性を示し、MPTPモデル群と比較すると、いずれも顕著に異なる（* p＜0.05）。
【０１０７】
図6Aは、マウスの黒質緻密部のTH陽性ニューロンの免疫組織化学の染色図を示す。マウスに連続5日でMPTPを注射した後、黒質緻密部TH陽性ニューロンが大量に喪失し、G-CSF二量体で治療すると、TH陽性ニューロンの数を回復させることができ、G-CSF二量体がMPTPに誘導されたドーパミン作動性ニューロンの大量欠失に対して顕著な保護作用を有することが見られる。
【０１０８】
図6Bは、マウスの黒質緻密部のTH陽性細胞の計数分析結果を示す。正常対照群と比較すると、マウスに連続5日でMPTPを注射した後、黒質緻密部TH陽性ニューロンの数が顕著に低下し（### p＜0.001）、正常対照群の49％程度で、MPTPが黒質におけるドーパミン作動性ニューロンの大量の喪失を引き起こすことが示された。G-CSF二量体群では、MPTPに誘導された黒質緻密部TH陽性ニューロンの数の喪失を顕著に抑制することができ、投与量に依頼して黒質TH陽性細胞数を増やすことができる。G-CSF二量体投与群は投与量依頼性を示し、MPTPモデル群と比較すると、いずれも顕著に異なり（*** p＜0.001）、G-CSF二量体30μg/kg投与量群では、黒質におけるTH陽性ドーパミンニューロンが正常対照群の86％程度で、G-CSF二量体100μg/kg投与量群では、黒質におけるTH陽性ドーパミンニューロンが正常対照群の99％程度で、正常対照群のレベルに相当する。
【０１０９】
G-CSF二量体は、MPTPに誘導されたドーパミン作動性神経線維の喪失を顕著に保護することができ、さらにMPTPに誘導されたドーパミン作動性ニューロンの大量の喪失を顕著に保護することができる。
【０１１０】
＜比較例1：G-CSF単量体のMPTPに誘導されたPD動物モデルに対する治療作用＞
実験方法（US7723302を参照）:マウスに30mg/kgでMPTPを腹腔注射し、連続5日で投与し、PDマウスモデルを得た。動物を1日回復させた後、250 μg/kg G-CSF（Neupogen、Amgen）を投与し、連続7日で投与し、最後の投与後（即ち投与終了後）の異なる時刻で黒質緻密部TH陽性ドーパミン作動性ニューロンの数を観察した。
モデル群：1回目の投与前の黒質緻密部TH陽性ドーパミン作動性ニューロンの数。
正常群：MPTPを注射しなかったマウス。
投与終了後1、7、14日目に黒質緻密部TH陽性ドーパミン作動性ニューロンは大体それぞれ正常群の70％、80％、77％に回復した。
【０１１１】
検討：
実施例10に記載されるように、本発明のG-CSF二量体は、毎回30 μg/kgまたは100 μg/kgの投与量で、間欠的に3回投与した後、投与終了後の1日目に、30 μg/kg群、100 μg/kg群では、黒質におけるTH陽性ドーパミン作動性ニューロンは大体それぞれ正常対照群の86％、99％に回復した。特に、100 μg/kg群では、投与終了後の1日目に、TH陽性ドーパミン作動性ニューロンはほとんど正常対照群のレベルに回復した。
比較例1では、250 μg/kgの投与量のG-CSFで連続7日投与しても、投与終了後の1日目に、TH陽性ドーパミン作動性ニューロンは正常群の70％にしか回復しなかった。
合計投与量から見ると、G-CSF二量体100 μg/kg群の合計投与量が300μgで、比較例1では、G-CSF単量体の合計投与量が1750μgである。
G-CSF単量体のモル分子濃度から見ると、G-CSF単量体とG-CSF二量体の分子量比が約1:5であるため、本発明のG-CSF二量体100 μg/kg群では、G-CSF単量体のモル分子濃度は比較例1の1/15だけである。
【０１１２】
本発明に係るG-CSF二量体を使用すると、治療過程で、投与量がより低く、治療効果がより優れて早く、且つ投与頻度が低く、患者のコンプライアンスの向上に非常に有利であることがわかった。
【０１１３】
各文献がそれぞれ単独に引用されるように、本発明に係るすべての文献は本出願で参考として引用する。また、本発明の上記の内容を読み終わった後、この分野の技術者が本発明を各種の変動や修正をすることができるが、それらの等価の様態のものは本発明の請求の範囲に含まれることが理解されるべきである。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４】
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【図５Ｂ】
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【図６Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図６Ａ】
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