(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
インフラマソームの活性を抑える薬剤をスクリーニングする方法であって、以下の工程を含む方法；
（１）被検物質を、LPS刺激した、開始コドンから1709番目のアデニンがグアニンへ、開始コドンから1043番目のシトシンがチミンへ、または開始コドンから587番目のグアニンがアデニンへ変異した変異型NLRP3を有するiPS細胞由来のマクロファージと接触させる工程、
（２）工程（１）の後のマクロファージからのIL-1βの分泌量を測定する工程、および
（３）工程（２）において測定されたIL-1βの分泌量が、LPS刺激し、被検物質を接触させない前記変異型NLRP3を有するiPS細胞由来のマクロファージからのIL-1βの分泌量よりも小さい場合、該被検物質をインフラマソームの活性を抑える薬剤として選択する工程。
【請求項２】
インフラマソームの活性を抑える薬剤をスクリーニングする方法であって、以下の工程を含む方法；
（１）被検物質を、LPS刺激した、開始コドンから1709番目のアデニンがグアニンへ、開始コドンから1043番目のシトシンがチミンへ、または開始コドンから587番目のグアニンがアデニンへ変異した変異型NLRP3を有するiPS細胞由来のマクロファージと接触させる工程、
（２）工程（１）の後のマクロファージからのIL-1βの分泌量を測定する工程、および
（３）工程（２）において測定された分泌量が、LPS刺激した野生型NLRP3を有するiPS細胞由来のマクロファージにおけるIL-1βの分泌量と同等またはそれ以下であった場合、該被検物質をインフラマソームの活性を抑える薬剤として選択する方法。
【請求項３】
インフラマソームの活性を抑える薬剤をスクリーニングする方法であって、以下の工程を含む方法；
（１）被検物質を、LPS刺激した、開始コドンから1709番目のアデニンがグアニンへ、開始コドンから1043番目のシトシンがチミンへ、または開始コドンから587番目のグアニンがアデニンへ変異した変異型NLRP3を有するiPS細胞由来のマクロファージおよびLPS刺激した野生型NLRP3を有するiPS細胞由来のマクロファージと接触させる工程、
（２）工程（１）の後の各マクロファージからのIL-1βの分泌量を測定する工程、および（３）工程（２）において測定された前記変異型NLRP3を有するiPS細胞由来のマクロファ
ージでのIL-1βの分泌量が、LPS刺激し、被検物質を接触させない前記変異型NLRP3を有するiPS細胞由来のマクロファージからのIL-1βの分泌量よりも小さく、かつ、工程（２）において測定された野生型NLRP3を有するiPS細胞由来のマクロファージでのIL-1βの分泌量が、LPS刺激し、被検物質を接触させない野生型NLRP3を有するiPS細胞由来のマクロファージにおけるIL-1βの分泌量と同等である場合、該被検物質をインフラマソームの活性を抑える薬剤として選択する工程。
【請求項４】
インフラマソームの活性を抑える薬剤をスクリーニングする方法であって、以下の工程を含む方法；
（１）被検物質を、LPS刺激した変異型NLRP3を有するiPS細胞由来のマクロファージと接触させる工程、
（２）工程（１）の後のマクロファージからのIL-8の分泌量を測定する工程、および
（３）工程（２）において測定されたIL-8の分泌量が、LPS刺激し、被検物質を接触させ
ない前記変異型NLRP3を有するiPS細胞由来のマクロファージからのIL-8の分泌量よりも小さい場合、該被検物質をインフラマソームの活性を抑える薬剤として選択する工程。
【請求項５】
インフラマソームの活性を抑える薬剤をスクリーニングする方法であって、以下の工程を含む方法；
（１）被検物質を、LPS刺激した、開始コドンから1709番目のアデニンがグアニンへ、開始コドンから1043番目のシトシンがチミンへ、または開始コドンから587番目のグアニンがアデニンへ変異した変異型NLRP3を有するiPS細胞由来のマクロファージと接触させる工程、
（２）工程（１）の後のマクロファージからのIL-6の分泌量を測定する工程、および
（３）工程（２）において測定されたIL-6の分泌量が、LPS刺激し、被検物質を接触させ
ない前記変異型NLRP3を有するiPS細胞由来のマクロファージからのIL-6の分泌量よりも小さい場合、該被検物質をインフラマソームの活性を抑える薬剤として選択する工程。
【請求項６】
インフラマソームの活性を抑える薬剤をスクリーニングする方法であって、以下の工程を含む方法；
（１）被検物質を、LPS刺激した、開始コドンから1709番目のアデニンがグアニンへ、開始コドンから1043番目のシトシンがチミンへ、または開始コドンから587番目のグアニンがアデニンへ変異した変異型NLRP3を有するiPS細胞由来のマクロファージと接触させる工程、
（２）工程（１）の後にASCが凝集したマクロファージの割合を測定する工程、および
（３）工程（２）において測定された前記割合が、LPS刺激し、被検物質を接触させない
前記変異型NLRP3を有するiPS細胞由来のマクロファージにおけるASCが凝集したマクロファージの割合よりも小さい場合、該被検物質をインフラマソームの活性を抑える薬剤として選択する工程。
【請求項７】
インフラマソームの活性を抑える薬剤をスクリーニングする方法であって、以下の工程を含む方法；
（１）被検物質を、LPS刺激した、開始コドンから1709番目のアデニンがグアニンへ、開始コドンから1043番目のシトシンがチミンへ、または開始コドンから587番目のグアニンがアデニンへ変異した変異型NLRP3を有するiPS細胞由来のマクロファージと接触させる工程、
（２）工程（１）の後にASCが凝集したマクロファージの割合を測定する工程、および
（３）工程（２）において測定された前記割合が、LPS刺激した野生型NLRP3を有するiPS細胞由来のマクロファージにおけるASCが凝集したマクロファージの割合と同等またはそれ以下であった場合、該被検物質をインフラマソームの活性を抑える薬剤として選択する工程。
【請求項８】
インフラマソームの活性を抑える薬剤をスクリーニングする方法であって、以下の工程を含む方法；
（１）被検物質を、LPS刺激した、開始コドンから1709番目のアデニンがグアニンへ、開始コドンから1043番目のシトシンがチミンへ、または開始コドンから587番目のグアニンがアデニンへ変異した変異型NLRP3を有するiPS細胞由来のマクロファージおよびLPS刺激した野生型NLRP3を有するiPS細胞由来のマクロファージと接触させる工程、
（２）工程（１）の後に各マクロファージにおいてASCが凝集したマクロファージの割合
を測定する工程、および
（３）工程（２）において測定された前記変異型NLRP3を有するiPS細胞由来のマクロファージでのASCが凝集したマクロファージの割合が、LPS刺激し、被検物質を接触させない前記変異型NLRP3を有するiPS細胞由来のマクロファージにおけるASCが凝集したマクロファージの割合よりも小さく、かつ、工程（２）で測定された野生型NLRP3を有するiPS細胞由来のマクロファージでのASCが凝集したマクロファージの割合が、LPS刺激し、被検物質を接触させない野生型NLRP3を有するiPS細胞由来のマクロファージにおけるASCが凝集したマクロファージの割合と同等であった場合、該被検物質をインフラマソームの活性を抑える薬剤として選択する工程。
【請求項９】
該インフラマソームの活性を抑える薬剤が、アスベスト肺、アルツハイマー病、2型糖尿
病、アテローム性動脈硬化症、痛風、またはクリオピリン関連周期性発熱症候群の治療剤である、請求項１から８のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項１０】
該変異型NLRP3遺伝子が、開始コドンから1709番目のアデニンがグアニンに変異したNLRP3遺伝子である、請求項４に記載のスクリーニング方法。
【請求項１１】
前記野生型NLRP3を有するiPS細胞由来のマクロファージがATPでさらに刺激される、請求項２、３、７または８に記載のスクリーニング方法。
【請求項１２】
該変異型NLRP3を有するiPS細胞および該野生型NLRP3を有するiPS細胞が同一の個体に由来するiPS細胞である、請求項２、３、７または８に記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はインフラマソームの活性を抑える薬剤をスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アミロイドβ、アスベスト、尿酸結晶、コレステロール結晶、膵島アミロイドポリペプチドのオリゴマーなどが危険シグナルとして引き金となりNLRP3、アダプタータンパク質であるASCおよびカスペース-1を含むインフラマソームと呼ばれる複合体の形成に続くカスペース-1の活性化を経て、IL-1βの産生に至る自然免疫応答が、アルツハイマー病、アスベスト肺、痛風、動脈硬化症、2型糖尿病などの原因の一つと考えられている（非特許文献１〜５）。
【０００３】
一方、CINCA（Chronic Infantile Neurologic Cutaneous and Articular）症候群は自己炎症性症候群の一つで患者の約半数はNLRP3遺伝子にヘテロ変異を有する。この変異NLRP3は恒常的に上記インフラマソームを活性化させることで全身の炎症を生じさせると言われている。
【０００４】
しかしながら、これらの疾患に共通するNLRP3を含有するインフラマソームの活性を抑える薬剤を開発するための適切なスクリーニング系は未だ開発されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Halle A, et al., Nat Immunol. 9:857-65, 2008
【非特許文献２】Dostert C, et al., Science 105: 9035-9040, 2008
【非特許文献３】Peter D, et al., Nature 464: 1357-1361, 2010
【非特許文献４】Martinon F, et al., Nature 440:237-41, 2006
【非特許文献５】Masters SL, et al., Nat Immunol. 11:897-904, 2010
【発明の概要】
【０００６】
本発明の課題はインフラマソームの活性を抑える薬剤を開発するためのスクリーニング方法を提供することである。
【０００７】
本発明者らはCINCA症候群の患者の体細胞へ初期化因子を導入することで、同一の患者から変異型NLRP3を有する人工多能性幹細胞（iPS細胞）と野生型NLRP3を有するiPS細胞を作製した。これらのiPS細胞をマクロファージへ分化誘導し、LPS刺激を行ったところ、変異型NLRP3を有するiPS細胞由来のマクロファージでは野生型のものと比べて、IL-1βの産生量が非常に多いことを確認し、この現象を指標としてインフラマソームを原因とする疾患に対する薬剤のスクリーニング方法が可能であることを明らかとした。
【０００８】
さらに本発明者らは、同様にマクロファージに分化誘導し、LPS刺激を行ったところ、変異型NLRP3を有するiPS細胞由来のマクロファージにおいて、ASCの細胞内での凝集が起きることが確認し、この現象を指標としてインフラマソームを原因とする疾患に対する薬剤のスクリーニング方法が可能であることが明らかとなった。
【０００９】
本発明はこのような知見に基づき完成するに至ったものである。
本発明の一つの態様は、インフラマソームの活性を抑える薬剤をスクリーニングする方法であって、以下の工程を含む方法を提供することである。
（１）被検物質を、LPS刺激した変異型NLRP3を有するiPS細胞由来のマクロファージ
と接触させる工程、
（２）工程（１）の後のマクロファージからのIL-1βの分泌量を測定する工程、および
（３）工程（２）において測定されたIL-1βの分泌量が、LPS刺激し、被検物質を接触させない変異型NLRP3を有するiPS細胞由来のマクロファージからのIL-1βの分泌量よりも小さい場合、該被検物質をインフラマソームの活性を抑える薬剤として選択する工程。
本発明の他の態様は、インフラマソームの活性を抑える薬剤をスクリーニングする方法であって、以下の工程を含む方法を提供することである。
（１）被検物質を、LPS刺激した変異型NLRP3を有するiPS細胞由来のマクロファージと接触させる工程、
（２）工程（１）の後のマクロファージからのIL-1βの分泌量を測定する工程、および
（３）工程（２）において測定された分泌量が、LPS刺激した野生型NLRP3を有するiPS細胞由来のマクロファージにおけるIL-1βの分泌量と同等またはそれ以下であった場合、該被検物質をインフラマソームの活性を抑える薬剤として選択する方法。
本発明の他の態様は、インフラマソームの活性を抑える薬剤をスクリーニングする方法であって、以下の工程を含む方法を提供することである。
（１）被検物質を、LPS刺激した変異型NLRP3を有するiPS細胞由来のマクロファージおよびLPS刺激した野生型NLRP3を有するiPS細胞由来のマクロファージと接触させる工程、
（２）工程（１）の後の各マクロファージからのIL-1βの分泌量を測定する工程、および
（３）工程（２）において測定された変異型NLRP3を有するiPS細胞由来のマクロファージでのIL-1βの分泌量が、LPS刺激し、被検物質を接触させない変異型NLRP3を有するiPS細胞由来のマクロファージからのIL-1βの分泌量よりも小さく、かつ、工程（２）において測定された野生型NLRP3を有するiPS細胞由来のマクロファージでのIL-1βの分泌量が、LPS刺激し、被検物質を接触させない野生型NLRP3を有するiPS細胞由来のマクロファージにおけるIL-1βの分泌量と同等である場合、該被検物質をインフラマソームの活性を抑える薬剤として選択する工程。
本発明の他の態様は、該インフラマソームの活性を抑える薬剤が、アスベスト肺、アルツハイマー病、2型糖尿病、アテローム性動脈硬化症、痛風、またはクリオピリン関連周期性発熱症候群の治療剤である、前記方法を提供することである。
本発明の他の態様は、該変異型NLRP3遺伝子が、1709番目のアデニンがグアニンに変異したNLRP3遺伝子である、前記方法を提供することである。
本発明の他の態様は、前記野生型NLRP3を有するiPS細胞由来のマクロファージがATPでさらに刺激される、前記方法を提供することである。
本発明の他の態様は、該変異型NLRP3を有するiPS細胞および該野生型NLRP3を有するiPS細胞が同一の個体に由来するiPS細胞である、前記方法を提供することである。
本発明の他の態様は、インフラマソームの活性を抑える薬剤をスクリーニングする方法であって、以下の工程を含む方法を提供することである。
（１）被検物質を、LPS刺激した変異型NLRP3を有するiPS細胞由来のマクロファージと接触させる工程、
（２）工程（１）の後にASCが凝集したマクロファージの割合を測定する工程、および
（３）工程（２）において測定された前記割合が、LPS刺激し、被検物質を接触させない変異型NLRP3を有するiPS細胞由来のマクロファージにおけるASCが凝集したマクロファージの割合よりも小さい場合、該被検物質をインフラマソームの活性を抑える薬剤として選択する工程。
本発明の他の態様は、インフラマソームの活性を抑える薬剤をスクリーニングする方法であって、以下の工程を含む方法を提供することである。
（１）被検物質を、LPS刺激した変異型NLRP3を有するiPS細胞由来のマクロファージと接触させる工程、
（２）工程（１）の後にASCが凝集したマクロファージの割合を測定する工程、および
（３）工程（２）において測定された前記割合が、LPS刺激した野生型NLRP3を有するiPS細胞由来のマクロファージにおけるASCが凝集したマクロファージの割合と同等またはそれ以下であった場合、該被検物質をインフラマソームの活性を抑える薬剤として選択する工程。
本発明の他の態様は、インフラマソームの活性を抑える薬剤をスクリーニングする方法であって、以下の工程を含む方法を提供することである。
（１）被検物質を、LPS刺激した変異型NLRP3を有するiPS細胞由来のマクロファージおよびLPS刺激した野生型NLRP3を有するiPS細胞由来のマクロファージと接触させる工程、
（２）工程（１）の後に各マクロファージにおいてASCが凝集したマクロファージの割合を測定する工程、および
（３）工程（２）において測定された前記変異型NLRP3を有するiPS細胞由来のマクロファージでのASCが凝集したマクロファージの割合が、LPS刺激し、被検物質を接触させない変異型NLRP3を有するiPS細胞由来のマクロファージにおけるASCが凝集したマクロファージの割合よりも小さく、かつ、工程（２）で測定された野生型NLRP3を有するiPS細胞由来のマクロファージでのASCが凝集したマクロファージの割合が、LPS刺激し、被検物質を接触させない野生型NLRP3を有するiPS細胞由来のマクロファージにおけるASCが凝集したマクロファージの割合と同等であった場合、該被検物質をインフラマソームの活性を抑える薬剤として選択する工程。
本発明の他の態様は、該インフラマソームの活性を抑える薬剤が、アスベスト肺、アルツハイマー病、2型糖尿病、アテローム性動脈硬化症、痛風、またはクリオピリン関連周期性発熱症候群の治療剤である、前記方法を提供することである。
本発明の他の態様は、該変異型NLRP3遺伝子が、1709番目のアデニンがグアニンに変異したNLRP3遺伝子である、前記方法を提供することである。
本発明の他の態様は、前記野生型NLRP3を有するiPS細胞由来のマクロファージがATPでさらに刺激される、前記方法を提供することである。
本発明の他の態様は、該変異型NLRP3を有するiPS細胞および該野生型NLRP3を有するiPS細胞が同一の個体に由来するiPS細胞である、前記方法を提供することである。
本発明の他の態様は、変異型NLRP3を有するiPS細胞由来のマクロファージを含む、インフラマソームの活性を抑える薬剤のスクリーニング用キットを提供することである。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、野生型（A）および変異型（B）のiPS細胞におけるNLRP3のExon3の一部のシークエンスの結果を示す。変異型においてNLRP3の1709番の塩基がA/Gであることが示された。
【図２】図２は、野生型（A）および変異型（B）のiPS細胞由来のマクロファージにおける(1)無添加群、(2)LPS添加群および(3)LPSおよびATP添加群におけるIL-1βの分泌量を測定した結果を示す。野生型は、WT-1、WT-2、WT-3の3クローンおよび201B7の結果を示し、変異型は、MT-1、MT-2およびMT-3の3クローンの結果を示す。
【図３】図３は、野生型（A）および変異型（B）のiPS細胞由来のマクロファージにおけるASCに対する染色像（左段）、DAPIでの染色像（中央）およびこれらを合わせた染色像（右段）の結果を示す。変異型においてのみ細胞中にASCの凝集が確認できる。
【図４】図４は、変異型NLRP3遺伝子を有するiPS細胞由来のマクロファージにおける、各濃度のシクロヘキシミド（左）、SC-514（中央）、MG132（右）の存在下での、IL-1β の分泌量を示す。
【図５】図５は、以下の各条件での、iPS細胞由来のマクロファージにおけるIL-1β (A), IL-8 (B) および IL-6 (C)の分泌量を示す。(1) LPS刺激なしおよび薬剤添加なし、（２）LPS 刺激および薬剤添加なし、（３）LPS刺激およびインターロイキン１受容体アンタゴニスト（IL-1Ra）添加、（４）LPS 刺激およびBay11-7028 (Bay11)添加、（５）LPS 刺激およびCA074Me添加、（６）LPS 刺激およびParthenolide (Parth)添加。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、変異型NLRP3を有する人工多能性幹細胞（iPS細胞）および/または野生型NLRP3を有するiPS細胞を分化誘導して得られるマクロファージを用いてインフラマソームの
活性を抑える薬剤をスクリーニングする方法を提供する。ここで、NLRP3とは、NLR family, pyrin domain containing 3であり、５つのバリアントが知られているがそのいずれかであっても良い。本発明においてNLRP3は、NCBIのアクセッション番号のNM_004895（配列番号１）、NM_183395（配列番号２）、NM_001079821（配列番号３）、NM_001127461（配
列番号４）またはNM_001127462（配列番号５）が例示される。ここで、NLRP3の開始コド
ンは、NCBIの上記の各アックセション番号に記載された開始コドンから6塩基下流のコド
ンであることが望ましい。NLRP3は、変異型NLRP3としては、開始コドンから1709番目のアデニンがグアニン（NCBIのアクセッション番号に記載のコーディング領域の場合、開始コドンから1715番目）、開始コドンから1043番目のシトシンがチミン（同様に、1049番目とも表記される）、または開始コドンから587番目のグアニンがアデニン（同様に、593番目とも表記される）へ変異したNLRP3が例示される。好ましくは、1709番目のアデニンがグ
アニンへ変異したNLRP3である。
【００１２】
iPS細胞の製造方法
本発明で用いるiPS細胞は、ある特定の核初期化物質を、DNAまたはタンパク質の形態で体細胞に導入することまたは薬剤によって当該核初期化物質の内在性のmRNAおよびタンパク質の発現を上昇させることによって作製することができる（K. Takahashi and S. Yamanaka (2006) Cell, 126: 663-676、K. Takahashi et al. (2007) Cell, 131: 861-872、J. Yu et al. (2007) Science, 318: 1917-1920、M. Nakagawa et al. (2008) Nat. Biotechnol., 26: 101-106、国際公開WO 2007/069666および国際公開WO 2010/068955）。核初期化物質は、ES細胞に特異的に発現している遺伝子またはES細胞の未分化維持に重要な役割を果たす遺伝子もしくはその遺伝子産物であればよく、特に限定されないが、例えば、Oct3/4, Klf4, Klf1, Klf2, Klf5, Sox2, Sox1, Sox3, Sox15, Sox17, Sox18, c-Myc, L-Myc, N-Myc, TERT, SV40 Large T antigen, HPV16 E6, HPV16 E7, Bmil, Lin28, Lin28b,
Nanog, EsrrbまたはEsrrgが例示される。これらの初期化物質は、iPS細胞樹立の際には、組み合わされて使用されてもよい。例えば、上記初期化物質を、少なくとも1つ、2つもしくは3つ含む組み合わせであり、好ましくは4つを含む組み合わせである。
【００１３】
上記の各核初期化物質のマウスおよびヒトcDNAのヌクレオチド配列並びに当該cDNAにコードされるタンパク質のアミノ酸配列情報は、WO 2007/069666に記載のNCBI accession numbersを参照すること、またL-Myc、Lin28、Lin28b、EsrrbおよびEsrrgのマウスおよびヒトのcDNA配列およびアミノ酸配列情報については、それぞれ下記NCBI accession numbersを参照することにより取得できる。当業者は、当該cDNA配列またはアミノ酸配列情報に基づいて、常法により所望の核初期化物質を調製することができる。
遺伝子名    マウス          ヒト      
L-Myc       NM_008506       NM_001033081
Lin28       NM_145833       NM_024674
Lin28b      NM_001031772    NM_001004317
Esrrb       NM_011934       NM_004452
Esrrg       NM_011935       NM_001438
【００１４】
これらの核初期化物質は、タンパク質の形態で、例えばリポフェクション、細胞膜透過性ペプチドとの結合、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入してもよいし、あるいは、DNAの形態で、例えば、ウイルス、プラスミド、人工染色体などのベクター、リポフェクション、リポソーム、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入することができる。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター（以上、Cell, 126, pp.663-676, 2006; Cell, 131, pp.861-872, 2007; Science, 318, pp.1917-1920, 2007）、アデノウイルスベクター(Science, 322, 945-949, 2008)、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスベクター（Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85, 348-62, 2009）などが例示される。また、人工染色体ベクターとしては、例えばヒト人工染色体(HAC)、酵母人工染色体(YAC)、細菌人工染色体(BAC、PAC)などが含まれる。プラスミドとしては、哺乳動物細胞用プラスミドを使用しうる(Science, 322:949-953, 2008)。ベクターには、核初期化物質が発現可能なように、プロモーター、エンハンサー、リボゾーム結合配列、ターミネーター、ポリアデニル化サイトなどの制御配列を含むことができる。使用されるプロモーターとしては、例えばEF1αプロモーター、CAGプロモーター、SRαプロモーター、SV40プロモーター、LTRプロモーター、CMV（サイトメガロウイルス）プロモーター、RSV（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター、MoMuLV（モロニーマウス白血病ウイルス）LTR、HSV-TK（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）プロモーターなどが用いられる。なかでも、EF1αプロモーター、CAGプロモーター、MoMuLV LTR、CMVプロモーター、SRαプロモーターなどが挙げられる。さらに、必要に応じて、薬剤耐性遺伝子(例えばカナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子など)、チミジンキナーゼ遺伝子、ジフテリアトキシン遺伝子などの選択マーカー配列、緑色蛍光タンパク質(GFP)、βグルクロニダーゼ(GUS)、FLAGなどのレポーター遺伝子配列などを含むことができる。また、上記ベクターには、体細胞への導入後、核初期化物質をコードする遺伝子もしくはプロモーターとそれに結合する核初期化物質をコードする遺伝子を共に切除するために、それらの前後にLoxP配列を有してもよい。別の好ましい一実施態様においては、トランスポゾンを用いて染色体に導入遺伝子を組み込んだ後に、プラスミドベクターもしくはアデノウイルスベクターを用いて細胞に転移酵素を作用させ、導入遺伝子を完全に染色体から除去する方法が用いられ得る。好ましいトランスポゾンとしては、例えば、鱗翅目昆虫由来のトランスポゾンであるpiggyBac等が挙げられる（Kaji, K. et al., (2009), Nature, 458: 771-775、Woltjen
et al., (2009), Nature, 458: 766-770  、WO 2010/012077）。さらに、ベクターには、染色体への組み込みがなくとも複製されて、エピソーマルに存在するように、リンパ指向性ヘルペスウイルス（lymphotrophic herpes virus）、BKウイルスおよび牛乳頭腫（Bovine papillomavirus）の起点とその複製に係る配列を含んでいてもよい。例えば、EBNA-1およびoriPもしくはLarge TおよびSV40ori配列を含むことが挙げられる（WO 2009/115295、WO 2009/157201およびWO 2009/149233）。また、複数の核初期化物質を同時に導入するために、ポリシストロニックに発現させる発現ベクターを用いてもよい。ポリシストロニックに発現させるためには、遺伝子をコードする配列の間は、IRESまたは口蹄病ウイルス（FMDV）2Aコード領域により結合されていてもよい（Science, 322:949-953, 2008およびWO 2009/0920422009/152529）。
【００１５】
核初期化に際して、iPS細胞の誘導効率を高めるために、上記の因子の他に、例えば、ヒストンデアセチラーゼ（HDAC）阻害剤[例えば、バルプロ酸 (VPA)(Nat. Biotechnol., 26(7): 795-797 (2008))、トリコスタチンA、酪酸ナトリウム、MC 1293、M344等の低分子阻害剤、HDACに対するsiRNAおよびshRNA（例、HDAC1 siRNA Smartpool(登録商標) (Millipore)、HuSH 29mer shRNA Constructs against HDAC1 (OriGene)等）等の核酸性発現阻害剤など］、DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば5’-azacytidine）（Nat. Biotechnol., 26(7): 795-797 (2008))、G9aヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤［例えば、BIX-01294 (Cell Stem Cell, 2: 525-528 (2008))等の低分子阻害剤、G9aに対するsiRNAおよびshRNA（例、G9a siRNA(human) (Santa Cruz Biotechnology)等）等の核酸性発
現阻害剤など］、L-channel calcium agonist (例えばBayk8644) (Cell Stem Cell, 3, 568-574 (2008))、p53阻害剤（例えばp53に対するsiRNAおよびshRNA）(Cell Stem Cell, 3, 475-479 (2008))、Wnt Signaling activator（例えばsoluble Wnt3a）（Cell Stem Cell, 3, 132-135 (2008)）、LIFまたはbFGFなどの増殖因子、ALK5阻害剤（例えば、SB431542）（Nat. Methods, 6: 805-8 (2009)）、mitogen-activated protein kinase signaling阻害剤、glycogen synthase kinase-3阻害剤（PloS Biology, 6(10), 2237-2247 (2008))、miR-291-3p、miR-294、miR-295などのmiRNA (R.L. Judson et al., Nat. Biotech., 27:459-461 (2009))、等を使用することができる。
【００１６】
薬剤によって核初期化物質の内在性のタンパク質の発現を上昇させる方法における薬剤としては、6-bromoindirubin-3'-oxime、indirubin-5-nitro-3'-oxime、valproic acid、2-(3-(6-methylpyridin-2-yl)-lH-pyrazol-4-yl)-1,5-naphthyridine、1-(4-methylphenyl)-2-(4,5,6,7-tetrahydro-2-imino-3(2H)-benzothiazolyl)ethanone HBr(pifithrin-alpha)、prostaglandin J2および prostaglandin E2等が例示される（WO 2010/068955）。
【００１７】
iPS細胞誘導のための培養培地としては、例えば(1) 10〜15％FBSを含有するDMEM、DMEM/F12またはDME培地（これらの培地にはさらに、LIF、penicillin/streptomycin、puromycin、L-グルタミン、非必須アミノ酸類、β-メルカプトエタノールなどを適宜含むことができる。）、(2) bFGFまたはSCFを含有するES細胞培養用培地、例えばマウスES細胞培養用培地(例えばTX-WES培地、トロンボＸ社)または霊長類ES細胞培養用培地（例えば霊長類（ヒト＆サル）ES細胞用培地（リプロセル、京都、日本）、mTeSR-1）、などが含まれる。
【００１８】
培養法の例としては、たとえば、37℃、5％CO2存在下にて、10％FBS含有DMEMまたはDMEM/F12培地中で体細胞と核初期化物質 (DNAまたはタンパク質) を接触させ約4〜7日間培養し、その後、細胞をフィーダー細胞 (たとえば、マイトマイシンC処理STO細胞、SNL細胞等) 上にまきなおし、体細胞と核初期化物質の接触から約10日後からbFGF含有霊長類ES細胞培養用培地で培養し、該接触から約30〜約45日またはそれ以上ののちにES細胞様コロニーを生じさせることができる。また、iPS細胞の誘導効率を高めるために、5-10％と低い酸素濃度の条件下で培養してもよい。
【００１９】
あるいは、その代替培養法として、フィーダー細胞 (たとえば、マイトマイシンC処理STO細胞、SNL細胞等) 上で10％FBS含有DMEM培地（これにはさらに、LIF、ペニシリン/ストレプトマイシン、ピューロマイシン、L-グルタミン、非必須アミノ酸類、β-メルカプトエタノールなどを適宜含むことができる。）で培養し、約25〜約30日またはそれ以上ののちにES様コロニーを生じさせることができる。
【００２０】
上記培養の間には、培養開始2日目以降から毎日1回新鮮な培地と培地交換を行う。また、核初期化に使用する体細胞の細胞数は、限定されないが、培養ディッシュ100cm2あたり約5×103〜約5×106細胞の範囲である。
【００２１】
マーカー遺伝子として薬剤耐性遺伝子を含む遺伝子を用いた場合は、対応する薬剤を含む培地（選択培地）で培養を行うことによりマーカー遺伝子発現細胞を選択することができる。またマーカー遺伝子が蛍光タンパク質遺伝子の場合は蛍光顕微鏡で観察することによって、発光酵素遺伝子の場合は発光基質を加えることによって、また発色酵素遺伝子の場合は発色基質を加えることによって、マーカー遺伝子発現細胞を検出することができる。
【００２２】
本明細書中で使用する「体細胞」は、例えば、角質化する上皮細胞（例、角質化表皮細胞）、粘膜上皮細胞（例、舌表層の上皮細胞）、外分泌腺上皮細胞（例、乳腺細胞）、ホ
ルモン分泌細胞（例、副腎髄質細胞）、代謝・貯蔵用の細胞（例、肝細胞）、境界面を構成する内腔上皮細胞（例、I型肺胞細胞）、内鎖管の内腔上皮細胞（例、血管内皮細胞）、運搬能をもつ繊毛のある細胞（例、気道上皮細胞）、細胞外マトリックス分泌用細胞（例、線維芽細胞）、収縮性細胞（例、平滑筋細胞）、血液と免疫系の細胞（例、Tリンパ球）、感覚に関する細胞（例、桿細胞）、自律神経系ニューロン（例、コリン作動性ニューロン）、感覚器と末梢ニューロンの支持細胞（例、随伴細胞）、中枢神経系の神経細胞とグリア細胞（例、星状グリア細胞）、色素細胞（例、網膜色素上皮細胞）、およびそれらの前駆細胞 (組織前駆細胞) が例示される。また、体細胞は、細胞の分化の程度に特に制限はなく、未分化な前駆細胞 (体性幹細胞も含む) であっても、最終分化した成熟細胞であっても、同様に本発明における体細胞の起源として使用することができる。ここで未分化な前駆細胞としては、たとえば神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）が挙げられる。
【００２３】
本発明において、体細胞は同一の個体からNLRP3の変異を有する体細胞とNLRP3の変異を有さない体細胞が得られることが望ましい。好ましくは、CINCA（Chronic Infantile Neurologic Cutaneous and Articular）症候群の患者から樹立したiPS細胞である。
【００２４】
変異型NLRP3は、由来となる体細胞が初めから有していても良く、iPS細胞樹立後に、相同組換え法を用いてNLRP3へ変異を加えてもよい。相同組換え法は当業者に周知の方法を用いて行う事ができる。
【００２５】
マクロファージへの分化誘導方法
前述のように得られたiPS細胞から、マクロファージを製造するため、次の工程を含む分化誘導方法を用いることができる；
（1）OP9細胞上でiPS細胞を培養する工程、
（2）血管芽細胞マーカーを指標として分離精製する工程、
（3）分離した細胞をOP9細胞上で培養する工程、および
（4）マクロファージのマーカーを指標として分離精製する工程。
【００２６】
本発明におけるマクロファージは、例えば、CD11b、CD14、またはCD68のいずれかもしくは全てを発現している細胞であり、好ましくは、CD14を発現している細胞である。また、血管芽細胞マーカーとして、CD34、KDRまたはTRA-1-85などが例示される。
【００２７】
（1）の工程の前に、iPS細胞は任意の方法で解離させることができる。ここで、解離の方法としては、力学的、プロテアーゼ活性とコラゲナーゼ活性を有する解離溶液（例えば、Accutase(TM)、Accumax(TM)および霊長類ES細胞用細胞剥離液（リプロセル）が挙げられる）またはコラゲナーゼ活性のみを有する分離液を用いても良い。
【００２８】
また、工程（1）および工程（3）における、コーティング剤としては、例えば、マトリゲル（BD）、Ｉ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、またはエンタクチン、およびこれらの組み合わせが挙げられる。
【００２９】
マクロファージを製造するための培地は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、IMDM培地、Medium 199培地、Eagle’s Minimum Essential Medium (EMEM)培地、αMEM培地、Doulbecco’s modified Eagle’s Medium (DMEM)培地、Ham’s F12培地、RPMI 1640培地、Fischer’s培地、およびこれらの混合培地などが包含される。好ましくは、αMEM培地である。さらに、培地には、血清が含有されていてもよいし、あるいは無血清でもよい。必要に応じて、例えば、アルブミン、トランスフェリン、Knockout Serum Replacement(KSR)(ES細胞培養時のFBSの血清代替物)、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、2-メルカプトエタノ
ール、3’-チオールグリセロールなどの1つ以上の血清代替物を含んでもよいし、脂質、アミノ酸、L-グルタミン、Glutamax（Invitrogen）、非必須アミノ酸、ビタミン、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、N2サプリメント（Invitrogen）、B27サプリメント（Invitrogen）、およびVEGF、幹細胞因子（SCF）、IL-3、トロンボポエチン（TPO)、FLT-3リガンド（FL）またはマクロファージコロニー刺激因子（M-CSF）が例示されるサイトカイン等を1つ以上含有しうる。好ましい培地として、工程（1）では、10% FCSおよびVEGFを含有するαMEMが例示され、工程（3）では、10% FCS、SCF、IL-3、TPO、FLおよびM-CSFを含有するαMEMが例示される。
【００３０】
培養温度は、以下に限定されないが、約30〜40℃、好ましくは約37℃であり、CO2含有空気の雰囲気下で培養が行われ、CO2濃度は、好ましくは約2〜5％である。培養時間は、特に限定されないが、例えば工程（1）は、5日から15日間であり、より好ましくは10日間であり、工程（3）は、10日間から20日間であり、より好ましくは16日間である。
【００３１】
血管芽細胞マーカー陽性細胞またはマクロファージマーカー陽性細胞は、各マーカーの抗体により染色した細胞からフローサイトメーターまたは該抗体を有する磁気ビーズ等を用いて、当業者に周知の方法により分離精製することができる。
【００３２】
スクリーニング方法
本発明は、インフラマソームの活性を抑える薬剤のスクリーニング方法を提供する。本発明におけるインフラマソームとは、NLRP3、ASCおよびカスペース-１から成る複合体を意味する。インフラマソームの活性化とは、特に限定されないが、例えば、前記複合体形成を介するカスペース-1の活性化を意味する。
【００３３】
本発明において、インフラマソームの活性を抑える薬剤とは、インフラマソームの活性化を起因とする疾患の治療薬もしくは予防薬として用いることができ、インフラマソームの活性化を起因とする疾患としては、特に限定されないが、アスベスト肺、アルツハイマー病、2型糖尿病、アテローム性動脈硬化症、痛風、およびクリオピリン関連周期性発熱症候群が例示される。
【００３４】
インフラマソームの活性は野生型NLRP3遺伝子を有するiPS細胞由来のマクロファージではLPS刺激で増加しないが、インフラマソームの活性は変異型NLRP3遺伝子を有するiPS細胞由来のマクロファージではLPS刺激で増加する。
よって、上述した方法で得られた変異型NLRP3を有するiPS細胞由来のマクロファージを用いる場合、以下の工程によってインフラマソームの活性を抑える薬剤のスクリーニングを行うことができる：
（１-１）被検物質を、LPS刺激した変異型NLRP3を有するiPS細胞由来のマクロファージと接触させる工程、
（１-２）工程（１−１）の後に該マクロファージからのIL-1βの分泌量を測定する工程、および
（１-３）工程（１−２）で測定されたIL-1βの分泌量が、LPS刺激し、被検物質を接触させない変異型NLRP3を有するiPS細胞由来のマクロファージからのIL-1βの分泌量よりも小さい場合、該被検物質をインフラマソームの活性を抑える薬剤として選択する工程。
【００３５】
ここで、LPS刺激は、該マクロファージの培養液にLPSを添加することで行われる。LPS刺激に加えさらにATPにより刺激を行ってもよい。刺激の時間は特に限定されないが、LPSの場合2時間から24時間が例示され、ATPの場合は10分から1時間が例示される。
【００３６】
本発明において、IL-1βの分泌量は、該マクロファージの培養上清を用いて測定することが可能であり、免疫学的測定法が例示される。免疫学的測定法は例えば、ラジオイムノ
アッセイ、エンザイムイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ、発光イムノアッセイ、免疫沈降法、免疫比濁法、ウエスタンブロット、免疫拡散法などを挙げることができるが、好ましくはエンザイムイムノアッセイであり、特に好ましいのは酵素結合免疫吸着定量法(enzyme-linked immunosorbent assay：ELISA)（例えば、sandwich ELISA）である。
【００３７】
他の態様として、インフラマソームの活性を抑える薬剤のスクリーニング方法として、以下の工程を含む方法が例示される；
（２-１）被検物質を、LPS刺激した変異型NLRP3を有するiPS細胞由来のマクロファージと接触させる工程、
（２-２）工程（２−１）の後にASCが凝集したマクロファージの割合を測定する工程、および
（２-３）工程（２−２）で測定された割合が、LPS刺激した野生型NLRP3を有するiPS細胞由来のマクロファージにおけるASCが凝集したマクロファージの割合よりも小さい場合、該被検物質をインフラマソームの活性を抑える薬剤として選択する工程。
【００３８】
本発明において、ASCとは、apoptosis-associated speck-like protein containing a CARDであり、PYCARDとも称される蛋白質である。ASCをコードする遺伝子は、NCBIのアクセッション番号NM_013258またはNM_145182等のバリアントがあるが、特にこれらに限定されない。
【００３９】
本発明においてASCの凝集とは、ASCが細胞内に広く分布せず、局所的に寄り集まった塊になることを意味し、好ましくは、抗ASC抗体を用いて細胞を免疫染色した際に、他の箇所に比して強く染色されることで判断することができる。好ましい凝集は、図３B左段に例示される。
【００４０】
本発明において、ASCが凝集したマクロファージの割合とは、単位数のマクロファージあたり（例えば10000個のマクロファージあたり）のASCの凝集を有するマクロファージの数もしくは培養皿中のASCの凝集を有するマクロファージの数であってもよい。ASCの凝集は1個のマクロファージに１つの凝集であっても、複数の凝集であってもよい。
【００４１】
他の態様として、インフラマソームの活性を抑える薬剤のスクリーニング方法として、以下の工程を含む方法が例示される；
（３-１）被検物質を、LPS刺激した変異型NLRP3を有するiPS細胞由来のマクロファージと接触させる工程、
（３-２）工程（３−１）の後に該マクロファージからのIL-1βの分泌量を測定する工程、および
（３-３）工程（３−２）で測定された前記分泌量が、LPS刺激した野生型NLRP3を有するiPS細胞由来のマクロファージにおけるIL-1βの分泌量と同等又はそれ以下であった場合、該被検物質をインフラマソームの活性を抑える薬剤として選択する工程。
または、
（４-１）被検物質を、LPS刺激した変異型NLRP3を有するiPS細胞由来のマクロファージと接触させる工程、
（４-２）工程（４−１）の後にASCが凝集したマクロファージの割合を計測する工程、および
（４-３）工程（４−２）で測定された前記割合が、LPS刺激した野生型NLRP3を有するiPS細胞由来のマクロファージにおけるASCが凝集したマクロファージの割合と同等又はそれ以下であった場合、該被検物質をインフラマソームの活性を抑える薬剤として選択する工程。
【００４２】
ここで、「同等」とは、値が厳密に同じである場合だけでなく、測定された値について
、誤差が好ましくは約±5%の範囲、より好ましくは約±1%の範囲存在する場合を含む。
【００４３】
本発明において、LPS刺激した野生型NLRP3を有するiPS細胞由来のマクロファージは、さらにATPによる刺激を加えた後、IL-1βの分泌量を測定しても良い。
【００４４】
他の態様として、インフラマソームの活性を抑える薬剤のスクリーニング方法として、以下の工程を含む方法が例示される；
（５-１）被検物質を、LPS刺激した変異型NLRP3を有するiPS細胞由来のマクロファージおよびLPS刺激した野生型NLRP3を有するiPS細胞由来のマクロファージと接触させる工程、
（５-２）工程（５−１）の後に各マクロファージからのIL-1βの分泌量を測定する工程、および
（５-３）工程（５−２）で測定された前記変異型NLRP3を有するiPS細胞由来のマクロファージでのIL-1βの分泌量が、LPS刺激し、被検物質を接触させない前記変異型NLRP3を有するiPS細胞由来のマクロファージでのIL-1βの分泌量よりも小さく、かつ工程（５−２）で測定された前記野生型NLRP3を有するiPS細胞由来のマクロファージでのIL-1βの分泌量が、LPS刺激し、被検物質を接触させない野生型NLRP3を有するiPS細胞由来のマクロファージでのIL-1βの分泌量と同等であった場合、該被検物質をインフラマソームの活性を抑える薬剤として選択する工程。
または、
（６-１）被検物質を、LPS刺激した変異型NLRP3を有するiPS細胞由来のマクロファージおよびLPS刺激した野生型NLRP3を有するiPS細胞由来のマクロファージと接触させる工程、
（６-２）工程（６−１）の後に各マクロファージにおいてASCが凝集したマクロファージの割合を測定する工程、および
（６-３）工程（６−２）で測定された前記変異型NLRP3を有するiPS細胞由来のマクロファージでのASCが凝集したマクロファージの割合が、LPS刺激し、被検物質を接触させない前記変異型NLRP3を有するiPS細胞由来のマクロファージでのASCが凝集したマクロファージの割合よりも小さく、かつ、工程（６−２）で測定された前記野生型NLRP3を有するiPS細胞由来のマクロファージでのASCが凝集したマクロファージの割合が、LPS刺激し、被検物質を接触させない前記野生型NLRP3を有するiPS細胞由来のマクロファージでのASCが凝集したマクロファージの割合と同等であった場合、該被検物質をインフラマソームの活性を抑える薬剤として選択する方法。
【００４５】
本発明のスクリーニング方法においては、任意の被検物質を用いることができ、例えば、細胞抽出物、細胞培養上清、微生物発酵産物、海洋生物由来の抽出物、植物抽出物、精製タンパク質又は粗タンパク質、ペプチド、非ペプチド化合物、合成低分子化合物、及び天然化合物が例示される。本発明において、被検物質はまた、（1）生物学的ライブラリ法、（2）デコンヴォルーションを用いる合成ライブラリ法、（3）「1ビーズ1化合物（one-bead one-compound）」ライブラリ法、及び（4）アフィニティクロマトグラフィ選別を使用する合成ライブラリ法を含む当技術分野で公知のコンビナトリアルライブラリ法における多くのアプローチのいずれかを使用して得ることができる。アフィニティクロマトグラフィ選別を使用する生物学的ライブラリ法はペプチドライブラリに限定されるが、その他の4つのアプローチはペプチド、非ペプチドオリゴマー、又は化合物の低分子化合物ライブラリに適用できる（Lam (1997) Anticancer Drug Des. 12: 145-67）。分子ライブラリの合成方法の例は、当技術分野において見出され得る（DeWitt et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6909-13; Erb et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 11422-6; Zuckermann et al. (1994) J. Med. Chem. 37: 2678-85; Cho et al. (1993)
Science 261: 1303-5; Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2059;
Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2061; Gallop et al. (1994)
J. Med. Chem. 37: 1233-51）。化合物ライブラリは、溶液（Houghten (1992) Bio/Techniques 13: 412-21を参照のこと）又はビーズ（Lam (1991) Nature 354: 82-4）、チップ
（Fodor (1993) Nature 364: 555-6）、細菌（米国特許第5,223,409号）、胞子（米国特許第5,571,698号、同第5,403,484号、及び同第5,223,409号）、プラスミド（Cull et al.
(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1865-9）若しくはファージ（Scott and Smith
(1990) Science 249: 386-90; Devlin (1990) Science 249: 404-6; Cwirla et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6378-82; Felici (1991) J. Mol. Biol. 222: 301-10; 米国特許出願第2002103360号）として作製され得る。
【００４６】
薬剤のスクリーニング用キット
本発明は、インフラマソームの活性を抑える薬剤をスクリーニングするためのキットを提供する。本キットには、上述した細胞、試薬および培養液を含み得る。本キットには、さらに分化誘導の手順を記載した書面や説明書を含んでもよい。
【実施例】
【００４７】
iPS細胞の樹立
Takahashi, K. et al., Cell, 131: 861-872 (2007)に記載の方法により、ヒトOCT3/4、ヒトSOX2、ヒトKLF4、ヒトc-MYCを発現するレトロウイルスを用いて、Chronic Infantile Neurologic, Cutaneous, Articular syndrome (CINCA 症候群)の患者から同意を得て生検した皮膚から樹立した線維芽細胞より6クローンのiPS細胞を樹立した。ここでCINCA 症候群モザイク患者であったため、この樹立したiPS細胞は同一の患者から得られたにも関わらず、3つのクローンはNLRP3が野生型であり、残りのクローンは、片アリルにおいて1709番目のアデニンがグアニンに変異した変異型であった（図１）。
【００４８】
マクロファージへの分化誘導方法
上記の方法により得られたiPS細胞をCTK solution（Suemori, H et al., Biochem Biophys Res Commun, 35: 926-932 (2006)）を用いて剥離し、ゼラチンコートディッシュを用いて、60分間37℃で静置してフィーダー細胞を取り除いた後、OP9細胞(Nishikawa, S.I. et al, Development 125, 1747-1757 (1998))上に播種した。この時培地として、10％FCS、antibiotics-antimycoticおよび10ng/mlのVEGFを含有するαMEMを用いた。培養開始から10日後、トリプシンを用いて細胞を剥離し、FACSを用いてTra-1-85陽性/CD34陽性/KDR陽性細胞を分離回収し、OP9細胞上に播種した。この時培地として、10％FCS、antibiotics-antimycotic、50ng/mlのhSCF、50ng/mlのIL-3、10ng/mlのTPO、50ng/mlのFLおよび50ng/mlのM-CSFを含有するαMEMを用いた。続いて、分離回収から16日後にAccumaxを用いて細胞を剥離し、Magnetic activated cell sortingによりCD14陽性細胞を精製した。6クローンのiPS細胞より得られたCD14陽性細胞をiPS細胞由来のマクロファージとして用い、NLRP3が野生型の3つのマクロファージをそれぞれWT-1、WT-2およびWT-3と命名し、NLRP3が変異型の3つのマクロファージをそれぞれMT-1、MT-2およびMT-3命名した。また、対照としてTakahashi, K. et al., Cell, 131: 861-872 (2007)に記載の201Ｂ7から同様の方法で対照マクロファージを得た（201B7）。
【００４９】
IL-1β産生量の測定
10%FSC含有のRPMI培地中の上記の方法により得られたiPS細胞由来のマクロファージを、（１）無添加群、（２）1μg/mlのLPS（Lipopolysaccharide）を添加して24時間培養した群および（３）1μg/mlのLPS（Lipopolysaccharide）を添加して24時間培養後、さらに1mMのATP（Adenosine triphosphate）を30分添加して培養した群の3群に分け、各培養上清を回収した。回収した培養上清をHuman Th1/Th2 11plex Kit（BMS）を用いて、添付のプロトコールに従って、Flow cytometryによりIL-1βの濃度を測定した（図２）。各群3度同様に測定を行った。その結果、NLRP3野生型に比べ変異型由来のマクロファージにおいて、LPS刺激のみでIL-1βがより多く分泌されることが確認された。この時ATPの刺激では特に変化しなかった。
【００５０】
ASC細胞内分布について
NLRP3変異型由来のマクロファージを1μg/mlのLPS（Lipopolysaccharide）を添加して24時間培養後、さらに1mMのATP（Adenosine triphosphate）を30分添加して培養し、ASC（Apoptotic speck-like protein containing a CARD）の細胞内分布を測定するため抗ASC抗体を用いて免疫染色を行った。その結果、LPSおよびATP刺激群において、NLRP3、ASCおよびCaspase1から成るインフラマソームの活性化の指標であるASCの凝集を提示する細胞が多く見られた（図３B）。一方、LPSおよびATP刺激をしていないNLRP3野生型由来のマクロファージでは、ASCが細胞内全体に分布し、ASCの凝集は見られなかった（図３A）。以上より、NLRP3変異型iPS細胞由来のマクロファージではLPSおよびATP刺激によりインフラマソームが活性化されていることが確認された。
【００５１】
薬効の評価
上記のようにiPS細胞から誘導されたマクロファージMT-1に、各濃度のシクロヘキシミド（CHX）（Sigma）、SC-514 (Tocris)またはMG132 (Calbiochem)を添加して2時間培養した。次いで、培地を各薬剤とLPS(1μg/ml)を含む培地に交換してさらに４時間培養した後、Human Th1/Th2 11plex Kit を用いてIL-1βの分泌量を調べた（図４）。その結果、コントロールとして使用されたCHXと同様、NF-κB阻害剤SC-514 およびMG132がIL-1β の分泌を濃度依存的に阻害することがわかった。
【００５２】
上記のようにiPS細胞から誘導されたマクロファージMT-1に、100ng/mlのインターロイキン１受容体アンタゴニスト(IL-1Ra) (R&D Systems)、12μMのBay11-7028 (Sigma)、50μMのCA074Me (Calbiochem) または10μMのParthenolide (Parth)を添加して2時間培養した。次いで、培地を各薬剤とLPS(1μg/ml)を含む培地に交換してさらに４時間培養した後、Human Th1/Th2 11plex Kit を用いてIL-1β（図５A）、IL-8（図５B）、IL-6（図５C）の分泌量を調べた（図４）。その結果、３つのタイプのインターロイキンはIL-1Raの添加では変化しなかったが、３つのタイプのインターロイキンの分泌量はBay11-7028 および Parthによって阻害された。一方、CA074Me は特異的にIL-1βの分泌量を阻害した。これらの結果は、CINCA症候群患者に由来するiPS細胞から誘導されたマクロファージを用いることによって薬剤の効果が評価できることを示している。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明の方法は、アスベスト肺、アルツハイマー病、2型糖尿病、アテローム性動脈硬化症、痛風またはクリオピリン関連周期性発熱症候群の治療薬などの薬剤のスクリーニングに有用である。
【００５４】
本明細書において、試験物質は薬剤候補化合物として供することも可能である。
【００５５】
本発明を好ましい態様を強調して説明してきたが、好ましい態様が変更され得ることは当業者にとって自明であろう。例えば、スクリーニングされた薬剤候補化合物を、他の化合物と組み合わせて或いは合成することにより特定薬剤を得ることも可能である。
本発明は、本発明が本明細書に詳細に記載された以外の方法で実施され得ることを意図する。従って、本発明は添付の「請求の範囲」の精神及び範囲に包含されるすべての変更を含むものである。
【００５６】
ここで述べられた特許及び特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、ここに引用されたことによって、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図１】
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【図３】
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