(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＥＣＴ７７４７、ＣＥＣＴ７７４６、ＣＥＣＴ７７７３及びＣＥＣＴ７７７５のいずれかから選択される培養できる抗微生物菌株。
【請求項２】
薬として使用するための、ＣＥＣＴ７７４７、ＣＥＣＴ７７４６、ＣＥＣＴ７７７３及びＣＥＣＴ７７７５またはその組み合わせのいずれかから選択される培養できる抗微生物菌株。
【請求項３】
抗微生物剤として使用するための、ＣＥＣＴ７７４７、ＣＥＣＴ７７４６、ＣＥＣＴ７７７３及びＣＥＣＴ７７７５またはその組み合わせのいずれかから選択される培養できる抗微生物菌株。
【請求項４】
口腔感染症の処置で使用するための、ＣＥＣＴ７７４７、ＣＥＣＴ７７４６、ＣＥＣＴ７７７３及びＣＥＣＴ７７７５またはその組み合わせのいずれかから選択される培養できる抗微生物菌株。
【請求項５】
口腔健康を改善するために設計されたプロバイオティックまたは機能性食品として使用するためのＣＥＣＴ７７４７、ＣＥＣＴ７７４６、ＣＥＣＴ７７７３及びＣＥＣＴ７７７５またはその組み合わせのいずれかから選択される培養できる抗微生物菌株。
【請求項６】
請求項１から５いずれかに記載の少なくとも１つの抗微生物菌株を含む、プロバイオティック／プレバイオティック組成物または機能性食品。
【請求項７】
請求項１から５いずれかに記載の少なくとも１つの抗微生物菌株を含む、医薬組成物。
【請求項８】
請求項１から５いずれかに記載の少なくとも１つの抗微生物菌株を含む、口腔健康のための組成物。
【請求項９】
口腔感染症の処置で使用するための、請求項６に記載のプロバイオティック／プレバイオティック組成物または機能性食品。
【請求項１０】
口腔感染症の処置で使用するための、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
口腔感染症の処置で使用するための、請求項８に記載の口腔健康のための組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はヒトの健康の分野、具体的には、頬と歯の健康の分野に属する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの口腔には何百もの細菌種が生息しており、その大部分は、口腔の生態系の平衡を維持するのに必要な共生種である。しかしながら、そのいくつかは、口腔疾患、主として虫歯および歯周病の進行に重要な役割を果たす（１）。口腔疾患は、ヒトの唾液からの糖タンパク質と微生物によって分泌された多糖類と共に細菌の蓄積によって形成されたバイオフィルムである、歯垢の増殖から始まる（２）。中性またはアルカリ性の歯肉縁下ポケットにある歯肉下の歯垢には、一般的にグラム陰性嫌気性菌が生息しており、この歯垢が歯肉炎と歯周炎の進行の原因である。歯肉縁上の歯垢は歯の表面上に形成され、食事で摂取された糖を発酵させることによって酸を生成してｐＨを低下させる酸産生菌および好酸性菌を含む。ｐＨがあまりにも酸性である場合（一般に５．５未満の値）、歯のエナメル質は脱ミネラル化され破壊される。したがって、これらの細菌は、人口の８０％以上に影響を与える、世界で最も蔓延した感染症であると考えられる虫歯の原因である。（３）。口腔の不健康な状態は、とりわけ、例えば、胃潰瘍、胃癌または心疾患などの他の病理に関係していることもある。
【０００３】
今日現在で口腔の病原体が依然として根絶されていない主な理由の１つは、生態系（無数のレベルの相互作用を持つ数百の種が検知されている）が複雑なため、一方では、潜在的な病原性種を検知することが難しいことと（４）、さらに、コッホの仮説に従っても、病原因子は何ひとつ、古典的な疾患のようには同定されないこともあることから、口腔に生息する微生物群の研究に従事するのが困難であるということである。この事実は、歯周病には、歯周病の進行と悪化に関連付けられたまったく異なる分類群（歯周病原菌のいわゆる「レッドコンプレックス（ｒｅｄ  ｃｏｍｐｌｅｘ）」）に属する少なくとも３つの細菌種が存在する（５）ことで、明白に実証されている。他方では、口腔細菌の大部分は培養することができず（６）、したがって、従来の微生物学的方法は、歯垢に生息する自然の群集の不完全なイメージを与える。しかしながら、メタゲノム技術と次世代シーケンシング技術の最近の伸展のおかげで、細菌そのものを培養する必要なく、複雑な微生物のサンプル（メタゲノム）の全ＤＮＡを分析することによって、細菌群集全体を研究することが可能である。
【０００４】
この点に関して、メタゲノミクスの先駆的な研究は、ＤＮＡが小型プラスミド内でクローン化され、その後、従来のサンガー型シーケンシングを用いるショットガンアプローチを主に介して、腸の生態系に焦点を当ててきた（７、８）。より最近の手法は、大型のフォスミドの末端のシーケンシング（９）と、短い配列の多くをカバーする「イルミナ社」のシーケンシング技術の使用（１０）を含んでいる。口腔と、皮膚、膣、または、呼吸器官のような他の人体生息地の微生物叢に関する研究は、リボソームＲＮＡ増幅産物のシーケンシングに焦点を当てている（１１、１２）。このような研究は、培養に基づいた従来の研究と比較して、これらの微生物群集についての我々の知識に大幅な進歩をもたらしたが、ＰＣＲ増幅におけるバイアス（すなわち、ＰＣＲは、既に知られている細菌にもっとも類似する細菌を検出するだけであり、および、そのことに基づいて、増幅プライマーが使用され、存在する多様性の不完全なイメージを与える）、クローン化のバイアス（多くの遺伝子は宿主細菌に有毒であるためクローン化されず、そのため、この方法では、サンプルの遺伝子保有宿主全体を研究することができない）、および、短い配列の長さ（イルミナ社の技術に用いる配列は、３５−７０のヌクレオチドしか有しておらず、そのため、ほとんどの場合、信頼できる分類学的または機能的なアサイメントを行うことは不可能である）によって、上に記述されたように口腔細菌のほとんどを培養することができない事実と一緒に、微生物の多様性の評価は妨害される。
【０００５】
前述の問題を解決するために、本発明は、４５４−パイロシーケンシングを用いるメタゲノムのＤＮＡの直接シーケンスによる歯垢のメタゲノムの獲得を開示しており、それによって、クローン化とＰＣＲ技術によって課される潜在的なバイアスを取り除き、さらに、異なる健康状態下の口腔細菌の群集の遺伝的レパートリー全体に対するアクセスを与え、得られたメタゲノムで見られるどの細菌種が優れた口腔健康に関連するのかを分析することができる。なぜなら、カリエスに一度も苦しんだことのない個体は、過去に虫歯にかかったことがあるか、現在カリエスに苦しんでいる個体とは異なる細菌叢を示しているからである。本発明で得られた口腔メタゲノムを用いて、口腔サンプル中の細菌の集合体（ｃｏｎｇｌｏｍｅｒａｔｅ）から抗カリエス性の活性を持つ菌株、具体的にはカリエスに一度も苦しんだことのない個体の歯肉縁上の歯垢、すなわちカリエス性細菌の増殖を阻害することができる該菌株の単離、培養および同定を行うことが可能である。
【０００６】
本発明で開示された別の戦略は、カリエスに一度も苦しんでいない個体の歯垢からフォスミド（長いＤＮＡ挿入物、およそ３５−４５ｋｂ）のメタゲノムのライブラリの獲得である。前述のフォスミドライブラリを得ることによって、カリエスに一度も苦しんでいない個体の口腔の中にある細菌によって合成された生物活性の抗カリエス性ペプチドを分離するおよび同定することが可能である。この点に関して、最先端技術は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓがカリエスの主な原因の病原体であることを示していることを前提とすれば（１３）、この疾患に対するほとんどの戦略が前述の微生物に対して向けられたのは驚くべきことではない。これらの戦略は、とりわけ、既知の表面抗原を使用するワクチンの開発、細菌を中和し得る受動免除戦略、Ｓ．ｍｕｔａｎｓのプロバイオティクス菌株との共凝集、およびＳ．ｍｕｔａｎｓに特異的な抑制タンパク質を含んでいる（１４）。他の様々な戦略は様々な特許文献で開示されており、低濃度の酸を生成する様々な菌株、好ましくはＳ．ｍｕｔａｎｓの使用（１５）、高濃度の非病原性細菌を連続的に供給することで病原性の排除をもたらす非病原性細菌と病原性細菌が同じ供給源（例えば栄養素）を使用すること、（１６）、またはカリエス性菌株のより低度な歯に対する付着（１７）が提唱されている。反対に、本発明で開示される生物活性菌株およびペプチドは、カリエス生成菌に対して、抗生物質活性、好ましくは抗カリエス性活性、を単独で有している。他方では、ＷＯ２００４／００７２０９３号公報（１８）は、主としてグラム陰性菌に対して活性な、多くの抗菌剤を示すが、カリエスの主な原因の病原体（Ｓ．ｍｕｔａｎｓおよびＳ．ｓｏｂｒｉｎｕｓ単離株）は、グラム陽性菌である。さらに、ＷＯ２００４／００７２０９３号公報（１８）で開示された抗菌ペプチドを生産するＳ．ｍｉｔｉｓおよびＳ．ｏｒａｌｉｓは、本発明のペプチド及び／又は菌株の場合のように、カリエスを有さない人々の口からではなく、嚢胞性繊維症の患者の喉から単離された。同様に、本発明で示された生物活性ペプチドの場合のように、前記ペプチドの治療上の使用は、カリエスではなく、呼吸器官疾患の治療を目的とする。
【０００７】
この点に関して、本発明で単離され開示される菌株と最先端技術で開示された他の菌株との主な技術的特徴の相違点は、従来の微生物学的手法によって本発明の菌株は培養しても良いという点、遺伝子組み換えの必要がない、口腔感染症、好ましくはカリエスを引き起こす生物に対して阻害活性を示す点、及びカリエスに一度も苦しんだことのない個体から単離された点である。結果的に、本発明で開示される抗カリエス性菌及び生物活性のある抗カリエス性化合物、好ましくはペプチドの両方が、それ自体でプロバイオティクス及び／またはプレバイオティクス組成物として、または例えばカリエス、歯周病などのような口腔感染症の処置に用いられる様々な医薬組成物の一部、あるいは機能性食品として使用され得る。さらに、本発明は少なくともの１種の菌株及び／または少なくとも１つの抗菌化合物、好ましくは上記のペプチドを治療上効果的な量投与する工程、または本発明の少なくともの１種の菌株及び／または少なくとも１つの抗菌化合物、好ましくはペプチドを含むプロバイオティック組成物、医薬組成物、機能性食品の治療上効果的な量を投与する工程を備えた、口腔感染症、好ましくはカリエスを予防する及び／または処置する方法も開示する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】ＷＯ２００４／００７２０９３号公報
【発明の概要】
【０００９】
発明の詳細な説明
口腔疾患の発症と関係する病原菌の増殖を直接阻害する、菌株の同定の最先端技術における既存の困難は、前記口腔内の大量の菌種によって引き起こされる；つまり、それらのすべての中から、直接病原菌種の増殖を阻害する菌株を単離することに関与する困難、すなわちそれらの多くが培養できない種であることが、これまでこの問題を解決することを難しくしていた。
【００１０】
本発明は、カリエスに一度も苦しんだことのない個体の口腔メタゲノムの作製により、この問題を解決する。カリエスに一度も苦しんだことのない前記個体の口腔から得られたサンプルの中にあるＤＮＡ配列から、大量のシーケンシング、できればパイロシーケンシングを使用しての前記メタゲノムの作製は、前記個体の口腔中にある微生物群集の中で頻出する細菌の属及び種を同定することを可能にする。細菌の一部を同定することしかできず、同定されたそれらの比率は手法自体に起因して偏ったものになるので、このサンプル中の各細菌の出現頻度の定量化は、前記培養、クローン化またはＰＣＲ技術を用いていたこれまでは可能ではなかった（特定の種をそれぞれ培養、クローン化または増幅することに主による）。
【００１１】
原則として、本発明はヒトに基づくが、任意の高等哺乳動物、特にペット、家畜、または野生の動物にも適用することができる。典型的な口腔疾患の代表的な疾患として、カリエスに一度も苦しんだことのない個体において各菌種の特徴的なメタゲノムを決定することは有効である。メタゲノムから得られたデータから、健康な個体の口腔内で最も頻出する菌種を一旦同定すると、本発明の以下の工程は、研究中の哺乳動物種のメタゲノムの中で同定した最も頻出する属及び種が生育できるよう、好ましい培地及び好ましい条件下でこれら個体の口腔から得られたサンプルを培養する工程から成る。
【００１２】
上記問題を解決するための第二の代替案は、カリエスに一度も苦しんだことがない個体の口腔内に存在する菌株によって特にここから一緒に分泌されるとともに、カリエス性種の増殖に対する直接の抑制活性を示す化合物、特に活性ペプチドを分離することを試みることから成る。本発明では、直接抑制する能力は、前記病原性菌種のローン培地（ｌａｗｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ）内で、抗生物質作用に起因して阻害ハロを作ることで、完全に増殖を阻害する能力として定義され、抗生物質効果に起因する前記阻害に加えて、菌株と化合物は、前記カリエス性菌株の増殖に最適なｐＨへの変更、歯などへの菌株の付着の妨害のような、他の経路によるカリエス性作用の妨害によって、菌株と化合物の抗菌効果、好ましくは抗カリエス効果を及ぼし得るという事実を除外しない。
【００１３】
この目的のために、本発明は健康な個体から採取された口腔サンプルから始まったが、この代替案では、前記単離された菌株から特に分泌され得る細菌由来の化合物にも着目している。さらに、培養できないために前記戦略では単離できない、化合物を分泌する他の菌株が存在するかもしれない。最後に口腔に生育する菌株の群集からの細菌由来の化合物に加えて、前記口腔は哺乳動物（特にヒト）自体の細胞から分泌された化合物を包含する上に、本発明はこれに基づく。これらの化合物のうちのいくつかには、カリエス性菌の増殖に対する直接の抑制活性があるかもしれない。この目的のために、健康な個体の口腔から得られたサンプルを溶解し、そのＤＮＡを抽出し、前記フラグメントによってフォスミドを構築し、培養できる宿主細胞にクローン化し、病原性のカリエス性菌種の増殖に対する阻害ハロが生成されるか観察するために、カリエス性菌種の培地中でアッセイした。
【００１４】
単離された抑制する菌株および化合物は、口腔のサンプルから得られており、病原性カリエスを生成する（カリエス性）細菌の種に対する活性があり、好ましくは口腔に生息する病原菌の増殖に対するそれらの抑制する能力を考慮すると、単離された菌株及び化合物は原則として他の身体各部において見出され、他の疾患を生み出すあるいは他の疾患に関与することに注目しなければならない。この理由で、本発明の目的は、薬として、具体的には抗微生物剤として、特に抗菌剤として単離された菌株及び化合物の使用である。
【００１５】
したがって、本発明は、口腔疾患の発症に関与する病原性微生物の増殖に対する抑制能力を持つ、培養できる菌株および化合物（主として生物活性ペプチド）の単離を開示する。本発明の全体にわたって、カリエスの発症は、口腔に典型的な疾患の代表的な疾患として見なされる。しかし、本発明は、口腔の病原性微生物に起因しうる任意の感染症に適用され得る。この理由で、本発明は、好ましくは病原性の微生物（特にカリエスの発症に関係するもの）の増殖に対する抑制能力を持つ菌株および化合物（主として生物活性のペプチド）の分離に着目する。
【００１６】
抗カリエス性能力を持つ培養できる菌株を単離するプロセスは、カリエスに一度も苦しんだことのない個体の口腔に最も頻出する細菌のタイプを決定し、それらのどれがカリエス性細菌の増殖を阻害して良い口腔健康に関与するのかを分析するために、前記個体の口腔メタゲノムを得ることに基づく。前記プロセスは、抗カリエス活性を持つ別々の前記菌株を単離、特徴づけ、培養及びＣＥＣＴ７７４６、ＣＥＣＴ７７４７、ＣＥＣＴ７７７３、ＣＥＣＴ７７７４およびＣＥＣＴ７７７５をスペイン培養細胞系統保存機関（ＣＥＣＴ）に寄託することを可能にした。ＣＥＣＴに寄託された４つの菌株、具体的には、ＣＥＣＴ７７４６、７７４７、７７７３および７７７５の配列相同性分析によって、抗カリエス性活性を示すとともに、同じＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属に属すると結論付けられた：したがって、それらの機能性（抗カリエス活性）および獲得の工程に加えて、前記菌株は前述したようにＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属に属するため、構造と分類の類似性を共有する。
【００１７】
他方では、生物活性の抗カリエス性ペプチドを分離し特徴づけるプロセスは、カリエスに一度も苦しんだことのない個体からフォスミドメタゲノムライブラリを得ることに基づく。前記方法を使用し、培養できない細菌を含むカリエスに一度も苦しんだことのない個体から見つかった細菌とともに、例えばデフェンシン型の抗微生物化合物のような、個体自身によって合成された抗微生物化合物によって抗カリエス能力を持つペプチドをもたらすことを特徴づけることが可能である。例えばＳ．ｍｕｔａｎｓまたはＳ．ｓｏｂｒｉｎｕｓのようなカリエス性細菌の増殖に対しての抑制活性を決定するために前記ペプチドを分析する。
【００１８】
本発明の別の態様は、カリエスに一度も苦しんでいない優れた口腔の健康状態を持つ個体から単離された、異なる具体的な培養できる菌株ＣＥＣＴ７７４６、ＣＥＣＴ７７４７、ＣＥＣＴ７７７３、ＣＥＣＴ７７７４及びＣＥＣＴ７７７５を開示し、該菌株は口腔感染症引き起こす生物、好ましくはカリエス生成微生物に対する抑制活性を示す。カリエスに苦しんでいなかった個体の歯垢に存在する細菌のメタゲノムから、カリエスに一度も苦しんでいない健康な個体内で最も頻出する細菌の属及び種が、既存の細菌のＤＮＡライブラリとの相同性によって同定された。カリエスを持たない個体に最も頻出し、カリエスを持つ個体には存在しないあるいは低い頻度で出現する細菌は、Ｒｏｔｈｉａ属、Ｇｌｏｂｉｃａｔｅｌｌａ属、Ｊｏｈｎｓｏｎｅｌｌａ属、Ｋｉｎｇｅｌｌａ属、Ｃａｒｄｉｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｐｈｏｃｏｅｎｏｂａｃｔｅｒ属、Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ属、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ属、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属およびＡｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ属の内１つの属に属し、最も多く含まれているのはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属である。この点では、本発明の好ましい菌株は、全てＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属に属する菌株ＣＥＣＴ７７４６、ＣＥＣＴ７７４７、ＣＥＣＴ７７７３、およびＣＥＣＴ７７７５である。
【００１９】
本発明で開示された別の態様において、口腔感染症を、好ましくはカリエスをもたらす微生物の増殖を抑制する生物活性化合物、好ましくはペプチドが記載されている。具体的には、口腔感染症をもたらす生物、好ましくはカリエスをもたらす微生物に対する抑制活性を持つ以下の任意のフォスミド挿入物に含まれるＤＮＡ配列（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：５、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：６、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：７、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１３、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１４）にコードされるペプチドが記載されている。
【００２０】
より具体的には、口腔感染症を生み出す生物に対する抑制活性を持つフォスミドの挿入物に含まれるＤＮＡ配列（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：４およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）によってコードされたペプチドは、それらが細菌由来で、バクテリオシンのものと似ていることを特徴としている。同様に、口腔感染症を生み出す生物に対する抑制活性を持つフォスミドの挿入物に含まれるＤＮＡ配列（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：６、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：７、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１３およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）によってコードされたペプチドは、それらがヒト由来で、それらのデフェンシンと似ていることを特徴としている。
【００２１】
より具体的には、本発明は特定の２つのペプチドを開示し、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：８は、そのデフェンシンに似た特徴を備えたヒト由来の抗微生物ペプチドであり；ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：９は、バクテリオシンのものに似た特徴を備えた細菌由来のペプチドである。
【００２２】
さらに、本発明は、例えば口腔衛生のための固形物、粉末（直接の吸収または溶液中）、ペースト状組成物である歯磨き粉、チューインガム、キャンディー、棒（ｂａｒ）等、またはうがい剤、シロップ、飲料などのような口内洗浄溶液、あるいはプロバイオティック及び／またはプレバイオティック食品組成物を開示しており、該組成物は口腔感染症を生み出す生物、好ましくはカリエス生成微生物に対する抑制活性を持つ本発明の菌株及び／または化合物、好ましくはペプチドを備える。本発明の好ましい実施形態において、本発明の菌株及び／またはペプチドは、口腔フローラに対して抗菌活性を示すＬｉｓｔｅｒｉｎｅ（登録商標）タイプのうがい剤に、または市販の組成物に加えられ、前記うがい剤は該組成物に本発明の菌株及び／またはペプチドを加えた場合、口腔感染症を生み出す生物、好ましくはカリエス生成微生物に対する抑制効果が強化される。
【００２３】
本発明の好ましい実施形態は、プロバイオティクス／プレバイオティクスまたは機能性食品であって、口腔感染症をもたらす生物、好ましくはカリエスをもたらす微生物に対する抑制活性を持つ本発明の菌株及び／または化合物、好ましくはペプチドを含む組成物である。プロバイオティクスまたは機能性食品のコンセプトは、限定されないが、栄養剤とともに、ヨーグルトのような日用品、例えばジュース、例えば菓子のような固形食、例えば茶、ハーブ、及びビタミン複合体のようなパラ薬学（ｐａｒａｐｈａｒｍａｃｙ）製品等を含む。
【００２４】
本発明の目的のために、以下の用語を説明する：
口腔感染症：本発明の目的のために、口腔感染症は好ましくはカリエス、歯周炎、歯肉炎および口臭である。
プロバイオティクス：本発明の目的のために、用語プロバイオティックは、食物（ミルク、ヨーグルトなど）、栄養補助食品（カプセル、タブレット、錠剤、粉末などの形状で）または他のものに加えられる、生きている微生物の使用を指し、該微生物は活発なまま存在し、前記プロバイオティックを含む食物または類似の製品を摂取する被験体へ生理学的な効果を発揮する。十分な量を摂取すれば、この場合口腔の健康に有益な効果が得られる。
プレバイオティクス：本発明の目的のために、用語プレバイオティクスは、食物、チューインガム、栄養補助食品または他のものに加えられる物質の使用を指し、該物質は口腔の健康に有益な微生物の構築に及び／または病原細菌の構築を妨げるのに好都合な口腔微生物叢の組成物に効果を発揮する。
メタゲノム：サンプル、個体または生態系の中に存在する、すべての細菌のゲノムを表わす。
微生物叢：人間と共存する微生物または細菌の集合である。
生物活性の抗微生物化合物：生物学的に活性なペプチド、タンパク質、抗生物質、色素など、脊椎動物及び無脊椎動物で見出され、天然の抗生物質として振る舞う化合物であり、固有の免疫応答の一部である。例えばペプチドのようなこれらの化合物のうちのいくつかは、他のものの中で例えばデフェンシン及びカスリシジンのようにヒトによって作られる。それらは細菌、菌類および隠遁した（ｃｌｏｉｓｔｅｒｅｄ）ウイルスに対して活性がある。
バクテリオシン：生成している菌株から近縁である他の種に対して、あるいは生成している菌株から系統的に離れた菌株に対して殺菌特性を持つ細菌によって分泌された生物学的に活性ペプチドである。
フォスミド：宿主細胞、一般に細菌細胞へ容易に導入し得る、及び細菌あるいはヒトＤＮＡ断片を輸送し得る環状ＤＮＡフラグメント。
機能性食品：栄養上の特徴のためだけでなく、健康状態を改善するか、疾患にかかる危険を減らすような特定の機能も満たすよう作成された食物として定義される。この目的のために、ミネラル、ビタミン、脂肪酸、有益な効果を備えた細菌、食物繊維および酸化防止剤など生物学的に活性な化合物が、それに加えられる。
培養できる菌株：培養できる菌株は、標準好気生活または嫌気生活状態下の人工実験培養培地の中で、純粋培養で増殖し、安定した状態で増殖し続けるものであると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】Ａ．Ｓ．ｍｕｔａｎｓのローン培地上に阻害ハロを生成する、カリエスを持たない個体の歯垢からのＤＮＡからのフォスミドを含むＥ．ｃｏｌｉクローンの最初のスクリーニングを示すペトリ皿の写真。Ｂ．Ｓ．ｍｕｔａｎｓのローン培地上に阻害ハロを生成した、カリエスを持たない個体の歯垢からのＤＮＡからのフォスミドを含むＥ．ｃｏｌｉクローンの確認スクリーニングを示すペトリ皿の写真。
【図２】ＢＨＩ（ブレインハートインフュージョン）培地（カリエス発生の阻害剤を加えなかった陽性対照、グラフ内で実線として示す）、及び、本発明の細菌由来のバクテリオシン型の抗微生物ペプチドを含むＳ１２Ｅフォスミドを持つ細胞の、それぞれ１．５−，２．２５−，３．０−，４．５−及び６−ｍｌの培地によって生成された、濃縮した上清の３−１０ｋＤの画分を１００μｌ（点線）、１５０μｌ（破線）、２００μｌ（破線と点線を含む線）、３００μｌ（長鎖線）または４００μｌ（二点長鎖線）で栄養を加えた培地における、カリエス性細菌であるＳ．ｍｕｔａｎｓの増殖曲線。データは、３０分ごとに１９時間取り、３つの試験の平均を示す。グラフのＸ軸は（時間）で時を表し、Ｙ軸は、細菌の培地の吸光度（ＯＤ）を示す。
【図３】ＢＨＩ培地（カリエス発生の阻害剤を加えなかった陽性対照、グラフ内で実線として示す）、及び本発明のヒト由来のデフェンシン型の抗微生物ペプチドを含むＴ５Ａフォスミドを持つ細胞の、それぞれ２−，及び４−ｍｌの培地によって生成された濃縮した上清の０−３ｋＤの画分を５０μｌ（破線）または１００μｌ（点線）を含む培地における、カリエス性細菌であるＳ．ｍｕｔａｎｓの増殖曲線。データは、３０分ごとに１２時間取り、３つの試験の平均を示す。グラフのＸ軸は（時間）で時を表し、Ｙ軸は、細菌の培地の吸光度（ＯＤ）を示す。
【図４】Ｌｉｓｔｅｒｉｎｅ（登録商標）及び細菌由来のＳ１２Ｅ阻害剤存在下のＳ．ｍｕｔａｎｓカリエス性細菌の増殖曲線。データはＢＨＩ培地の３７℃の温度下で１９時間取り、３つの試験の平均を表わす。実線は細菌なしの、陰性対照を表わす。破線は、Ｌｉｓｔｅｒｉｎｅ（登録商標）及びＳ１２Ｅ阻害剤不存在下のＳ．ｍｕｔａｎｓの増殖である陽性対照を表わす。長鎖線は、Ｌｉｓｔｅｒｉｎｅ（登録商標）が１００μｌある状態でのＳ．ｍｕｔａｎｓの増殖を表わす。点線は、Ｓ１２Ｅ阻害剤が１００μｌある状態でのＳ．ｍｕｔａｎｓの増殖を表わす。破線と点線を含む線は、１００μｌのＬｉｓｔｅｒｉｎｅ（登録商標）＋１００μｌのＳ１２Ｅ阻害剤がある状態でのＳ．ｍｕｔａｎｓの増殖を表わす。グラフのＸ軸は（時間）で時を表し、Ｙ軸は、細菌の培地の吸光度（ＯＤ）を示す。
【図５】実験室で化学的に合成され、０．１％ＴＣＡで再懸濁したＳ１２Ｅ阻害剤（本発明の細菌由来のバクテリオシン型抗微生物ペプチド）存在下でのカリエス性細菌であるＳ．ｍｕｔａｎｓの増殖曲線。データは、３つの独立した実験の、３０分ごとに３０時間、３７℃の１００μｌのＢＨＩ培地での６００ｎｍの吸光度として測定されるＳ．ｍｕｔａｎｓの増殖を示す。実線は細菌なしの陰性対照を表わす。黒い四角を備えた線は、ＢＨＩ培地内でのＳ．ｍｕｔａｎｓの増殖を表わす。点線は１０μｌの０．１％ＴＣＡが存在するＢＨＩ培地でのＳ．ｍｕｔａｎｓの増殖である陽性対照を表わす。破線と点線を含む線は、１０μｌの０．１％ＴＣＡに０．３ｍｇのＳ１２Ｅペプチドを再懸濁したものが存在するＢＨＩ培地内でのＳ．ｍｕｔａｎｓの増殖を表わす。破線は、１０μｌの０．１％ＴＣＡに０．０３ｍｇのＳ１２Ｅペプチドを再懸濁したものが存在するＢＨＩ培地内でのＳ．ｍｕｔａｎｓの増殖を表わす。グラフのＸ軸は（時間）で時を表し、Ｙ軸は、細菌の培地の吸光度（ＯＤ）を示す。
【図６】実験室で化学的に合成され、超純水で再懸濁したＳ１２Ｅ阻害剤（本発明の細菌由来のバクテリオシン型抗微生物ペプチド）存在下でのカリエス性細菌であるＳ．ｍｕｔａｎｓ（Ａ）及びＳ．ｓｏｂｒｉｎｕｓ（Ｂ）の増殖曲線。データは、３０分ごとに４８時間、３７℃の２００μｌのＢＨＩ培地での６００ｎｍの吸光度として測定されるＳ．ｍｕｔａｎｓの増殖を、３つの独立した実験の平均として示す。グラフＡ及びグラフＢの両方で、実線は細菌なしの陰性対照を表わす。点線は、ＢＨＩ培地内でのＳ．ｍｕｔａｎｓ（Ａ）またはＳ．ｓｏｂｒｉｎｕｓ（Ｂ）の増殖を表わす。破線は、水が存在するＢＨＩ培地内でのＳ．ｍｕｔａｎｓ（Ａ）またはＳ．ｓｏｂｒｉｎｕｓ（Ｂ）の増殖である陽性対照を表わす。黒の四角線は、超純水に０．２３ｍｇの本発明のＳ１２Ｅペプチドを再懸濁したものが存在するＢＨＩ培地内でのＳ．ｍｕｔａｎｓ（Ａ）またはＳ．ｓｏｂｒｉｎｕｓ（Ｂ）の増殖を表わす。黒のダイヤ線は、超純水に０．０４７ｍｇの本発明のＳ１２Ｅペプチドを再懸濁したものが存在するＢＨＩ培地内でのＳ．ｍｕｔａｎｓ（Ａ）またはＳ．ｓｏｂｒｉｎｕｓ（Ｂ）の増殖を表わす。黒の三角線は、超純水に０．０９４ｍｇの本発明のＳ１２Ｅペプチドを再懸濁したものが存在するＢＨＩ培地内でのＳ．ｍｕｔａｎｓ（Ａ）またはＳ．ｓｏｂｒｉｎｕｓ（Ｂ）の増殖を表わす。グラフのＸ軸は（時間）で時を表し、Ｙ軸は、細菌の培地の吸光度（ＯＤ）を示す。
【図７】実験室で化学的に合成され、超純水で再懸濁した４μｇ，４０μｇ及び８０μｇの本発明のＴ５Ａ阻害剤存在下でのカリエス性細菌であるＳ．ｍｕｔａｎｓの増殖曲線。データは、３０分ごとに４４時間、３７℃の２００μｌのＢＨＩ培地での６００ｎｍの吸光度として測定されるＳ．ｍｕｔａｎｓの増殖を、３つの独立した実験の平均として示す。実線は細菌なしの陰性対照を表わす。破線は、水が存在するＢＨＩ培地内でのＳ．ｍｕｔａｎｓの増殖である陽性対照を表わす。黒の四角線は、１μｌの本発明のＴ５Ａペプチド（ヒト由来のデフェンシン型抗微生物ペプチド）が存在するＢＨＩ培地内でのＳ．ｍｕｔａｎｓの増殖を表わす。黒のダイヤ線は、１０μｌの本発明のＴ５Ａペプチドが存在するＢＨＩ培地内でのＳ．ｍｕｔａｎｓの増殖を表わす。黒の三角線は、２０μｌの本発明のＴ５Ａペプチドが存在するＢＨＩ培地内でのＳ．ｍｕｔａｎｓの増殖を表わす。グラフのＸ軸は（時間）で時を表し、Ｙ軸は、細菌の培地の吸光度（ＯＤ）を示す。
【図８】本発明のヒト由来のデフェンシン型抗微生物ペプチドをコードする、ポリヌクレオチド配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３を含むＷ４Ｄフォスミドを持つＥ．ｃｏｌｉ細菌細胞の培地が生成した上清を、１０倍濃縮し、分子量に応じて分離したものが存在する液体培地中での、カリエス性細菌であるＳ．ｍｕｔａｎｓの増殖曲線。データは３０分ごとに２４時間取り、３つの試験の平均を表わす。対照として、グラフには、形質転換されていないＥ．ｃｏｌｉｅｐｉ３００細菌培地の濃縮した上清がある状態でのＳ．ｍｕｔａｎｓの増殖曲線が示される。グラフのＸ軸は（時間）で時を表し、Ｙ軸は、細菌の培地の吸光度（ＯＤ）を示す。
【図９】本発明のヒト由来のデフェンシン型抗微生物ペプチドをコードする、ポリヌクレオチド配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４を含むＴ５Ｈフォスミドを持つＥ．ｃｏｌｉ細菌細胞の培地が生成した上清を、１０倍濃縮し、分子量に応じて分離したものが存在する液体培地中での、カリエス性細菌であるＳ．ｍｕｔａｎｓの増殖曲線。データは３０分ごとに２４時間取り、３つの試験の平均を表わす。対照として、グラフには、形質転換されていないＥ．ｃｏｌｉｅｐｉ３００細菌培地の濃縮した上清がある状態でのＳ．ｍｕｔａｎｓの増殖曲線が示される。グラフのＸ軸は（時間）で時を表し、Ｙ軸は、細菌の培地の吸光度（ＯＤ）を示す。
【図１０】本発明のヒト由来のデフェンシン型抗微生物ペプチドをコードする、ポリヌクレオチド配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６を含むＡ５Ｄ１１フォスミドを持つＥ．ｃｏｌｉ細菌細胞の培地が生成した上清を、１０倍濃縮し、分子量に応じて分離したものが存在する液体培地中での、カリエス性細菌であるＳ．ｍｕｔａｎｓの増殖曲線。データは３０分ごとに２４時間取り、３つの試験の平均を表わす。対照として、グラフには、形質転換されていないＥ．ｃｏｌｉｅｐｉ３００細菌培地の濃縮した上清がある状態でのＳ．ｍｕｔａｎｓの増殖曲線が示される。グラフのＸ軸は（時間）で時を表し、Ｙ軸は、細菌の培地の吸光度（ＯＤ）を示す。
【図１１】本発明のヒト由来のデフェンシン型抗微生物ペプチドをコードする、ポリヌクレオチド配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７を含むＡ４Ｈ１１フォスミドを持つＥ．ｃｏｌｉ細菌細胞の培地が生成した上清を、１０倍濃縮し、分子量に応じて分離したものが存在する液体培地中での、カリエス性細菌であるＳ．ｍｕｔａｎｓの増殖曲線。データは３０分ごとに２４時間取り、３つの試験の平均を表わす。対照として、グラフには、形質転換されていないＥ．ｃｏｌｉｅｐｉ３００細菌培地の濃縮した上清がある状態でのＳ．ｍｕｔａｎｓの増殖曲線が示される。グラフのＸ軸は（時間）で時を表し、Ｙ軸は、細菌の培地の吸光度（ＯＤ）を示す。
【図１２】本発明で開示された菌株であるＣＥＣＴ７７４６（Ａ），ＣＥＣＴ７７４７（Ｂ），ＣＥＣＴ７７７３（Ｃ），ＣＥＣＴ７７７４（Ｄ）及びＣＥＣＴ７７７５（Ｅ）単離株の存在下でのＳ．ｍｕｔａｎｓのローン培地での増殖阻害を示すペトリ皿の写真。
【図１３】本発明で開示した菌株であるＣＥＣＴ７７４６（Ａ），ＣＥＣＴ７７４７（Ｂ）及びＣＥＣＴ７７７５（Ｃ）単離株の存在下でのＳ．ｓｏｂｒｉｎｕｓのローン培地での増殖阻害を示すペトリ皿の写真。
【図１４】ＣＥＣＴ７７４６（Ａ）及びＣＥＣＴ７７４７（Ｂ）菌株が定常期である培地から得られた上清を１０倍濃縮し、分子量に応じて分離したものが存在するＢＨＩ培地中での、カリエス性細菌であるＳ．ｍｕｔａｎｓの増殖曲線。データは１５分ごとに２０時間取り、４つの試験の平均を表わす。ａｎｔｂと記された線は、抗生物質クロラムフェニコールによる処置（陽性対照）を表わす。グラフのＸ軸は（時間）で時を表し、Ｙ軸は、細菌の培地の吸光度（ＯＤ）を示す。
【図１５】ＣＥＣＴ７７４６菌株が定常期（ｅｓｔ）及び指数増殖期（ＥＸＰ）である培地から得られた上清を１０倍濃縮し、分子量に応じて分離したものが存在するＢＨＩ培地中での、カリエス性細菌であるＳ．ｍｕｔａｎｓの増殖曲線。データは１５分ごとに２４時間取り、４つの試験の平均を表わす。ｃｌｏｒｆと記された線は、抗生物質クロラムフェニコールによる処置（陽性対照）を表わす。グラフのＸ軸は（時間）で時を表し、Ｙ軸は、細菌の培地の吸光度（ＯＤ）を示す。
【図１６】１０分間１００℃の処置をかけたＣＥＣＴ  ７７４６（Ａ）及びＣＥＣＴ７７４７（Ｂ）株の培地から得られた上清を１０倍濃縮し、３ｋＤａより小さいものが存在するＢＨＩ培地中での、カリエス性細菌であるＳ．ｍｕｔａｎｓの増殖曲線。データは１５分ごとに２４時間取り、４つの試験の平均を表わす。グラフのＸ軸は（時間）で時を表し、Ｙ軸は、細菌の培地の吸光度（ＯＤ）を示す。
【図１７】好気生活下及び嫌気生活下におけるＣＥＣＴ７７４６（写真の中で４６として示す），ＣＥＣＴ７７４７（写真の中で４７として示す）菌株の培地の上清存在下でのＳ．ｍｕｔａｎｓのローン培地での増殖阻害を示すペトリ皿の写真。
【図１８】菌株ＣＥＣＴ７７４６およびＣＥＣＴ７７４７、あるいはそれぞれの上清がそこへ加えられた（効果を表す）、好気生活下及び嫌気生活下の人工歯モデルでのヒト唾液の培養からのバイオフィルムによって生産された、ｍＭで表される乳酸の濃度。詳細については、実施例１５を参照する。使用された陰性対照はＣ７．１菌株であり、これは、カリエスをもたない個体から得られたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｔｉｓ／ｏｒａｌｉｓ／ｉｎｆａｎｔｉｓグループに属する単離株であるが、カリエス性菌種の増殖を阻害するものを生成しない。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明の目的は、ＣＥＣＴ７７４６、ＣＥＣＴ７７４７、ＣＥＣＴ７７７３、ＣＥＣＴ７７７４およびＣＥＣＴ７７７５のいずれかから選択される培養できる抗微生物菌株である。好ましい実施形態において、本発明の菌株は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属に属し、ＣＥＣＴ７７４６，ＣＥＣＴ７７４７，ＣＥＣＴ７７７３またはＣＥＣＴ７７７５から選択されることを特徴としている。別の好ましい実施形態において、本発明で開示された抗微生物細菌株は、口腔感染症をもたらす生物、好ましくはカリエス性生物の増殖に対して阻害活性を示す。好ましい実施形態において、本発明の菌株は、歯を占有するように競争的に増殖することに加えて、それらがカリエス性細菌の増殖に対する阻害物質を生産することができることを特徴としている。
【００２７】
本発明の別の目的は、薬として使用するための、ＣＥＣＴ７７４６、ＣＥＣＴ７７４７、ＣＥＣＴ７７７３、ＣＥＣＴ７７７４およびＣＥＣＴ７７７５またはその組み合わせのいずれかから選択される培養できる抗微生物菌株に関する。好ましい実施形態において、本発明で開示された抗微生物菌株は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属に属し、ＣＥＣＴ７７４６，ＣＥＣＴ７７４７，ＣＥＣＴ７７７３またはＣＥＣＴ７７７５から選択されることを特徴としている。
【００２８】
本発明の別の目的は、薬の調製におけるＣＥＣＴ７７４６、ＣＥＣＴ７７４７、ＣＥＣＴ７７７３、ＣＥＣＴ７７７４およびＣＥＣＴ７７７５またはその組み合わせのいずれかから選択される培養できる抗微生物菌株の少なくとも１つの使用に関する。好ましい実施形態において、前記使用は、前記菌株がＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属に属することを特徴とし、ＣＥＣＴ７７４６，ＣＥＣＴ７７４７，ＣＥＣＴ７７７３またはＣＥＣＴ７７７５から選択される抗微生物菌株であることを特徴としている。
【００２９】
本発明の別の目的は、抗微生物剤、好ましくは抗菌剤として使用するためのＣＥＣＴ７７４６、ＣＥＣＴ７７４７、ＣＥＣＴ７７７３、ＣＥＣＴ７７７４およびＣＥＣＴ７７７５またはその組み合わせのいずれかから選択された培養できる抗微生物菌株に関する。好ましい実施形態において、抗微生物菌株は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属に属し、ＣＥＣＴ７７４６，ＣＥＣＴ７７４７，ＣＥＣＴ７７７３またはＣＥＣＴ７７７５から選択されることを特徴としている。
【００３０】
本発明の別の目的は、抗微生物組成物、好ましくは抗菌組成物の調製におけるＣＥＣＴ７７４６、ＣＥＣＴ７７４７、ＣＥＣＴ７７７３、ＣＥＣＴ７７７４およびＣＥＣＴ７７７５またはその組み合わせのいずれかから選択された培養できる抗微生物菌株の少なくとも１つの使用に関する。好ましい実施形態において、前記使用は、前記菌株がＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属に属することを特徴とし、ＣＥＣＴ７７４６，ＣＥＣＴ７７４７，ＣＥＣＴ７７７３またはＣＥＣＴ７７７５から選択される抗微生物菌株であることを特徴としている。
【００３１】
本発明の別の目的は、口腔感染症の処置、好ましくはカリエスの処置で使用するためのＣＥＣＴ７７４６、ＣＥＣＴ７７４７、ＣＥＣＴ７７７３、ＣＥＣＴ７７７４およびＣＥＣＴ７７７５またはその組み合わせのいずれかから選択された培養できる抗微生物菌株に関する。好ましい実施形態において、本発明の抗微生物菌株は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属に属し、ＣＥＣＴ７７４６，ＣＥＣＴ７７４７，ＣＥＣＴ７７７３またはＣＥＣＴ７７７５から選択されることを特徴としている。
【００３２】
本発明の別の目的は、口腔感染症の処置、好ましくはカリエスの処置のために設計された組成物の調製における、ＣＥＣＴ７７４６、ＣＥＣＴ７７４７、ＣＥＣＴ７７７３、ＣＥＣＴ７７７４およびＣＥＣＴ７７７５またはその組み合わせのいずれかから選択される培養できる抗微生物菌株の少なくとも１つの使用に関する。好ましい実施形態において、本発明の菌株の使用は、培養できる菌株がＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属に属し、ＣＥＣＴ７７４６，ＣＥＣＴ７７４７，ＣＥＣＴ７７７３またはＣＥＣＴ７７７５から選択されることを特徴としている。
【００３３】
本発明の別の目的は、口腔健康を改善するために、好ましくはカリエスを予防するために設計されたプロバイオティックまたは機能性食品として使用するためのＣＥＣＴ７７４６、ＣＥＣＴ７７４７、ＣＥＣＴ７７７３、ＣＥＣＴ７７７４およびＣＥＣＴ７７７５またはその組み合わせのいずれかから選択される培養できる抗微生物菌株に関する。好ましい実施形態において、本発明の菌株は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属に属し、ＣＥＣＴ７７４６，ＣＥＣＴ７７４７，ＣＥＣＴ７７７３またはＣＥＣＴ７７７５から選択されることを特徴としている。
【００３４】
本発明の別の目的は、口腔健康を改善するために、好ましくはカリエスを予防するために設計されたプロバイオティックまたは機能性食品の調製におけるＣＥＣＴ７７４６、ＣＥＣＴ７７４７、ＣＥＣＴ７７７３、ＣＥＣＴ７７７４およびＣＥＣＴ７７７５のまたはその組み合わせのいずれかから選択される培養できる抗微生物菌株の少なくとも１つの使用に関する。好ましい実施形態において、本発明の菌株は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属に属し、ＣＥＣＴ７７４６，ＣＥＣＴ７７４７，ＣＥＣＴ７７７３またはＣＥＣＴ７７７５から選択されることを特徴としている。
【００３５】
本発明で開示された別の目的は、本発明の全体にわたって言及されるように、少なくとも１つの培養できる抗微生物菌株と、前記菌株から分泌された抗カリエス性の物質、化合物または分子を含む、プロバイオティック／プレバイオティック組成物または機能性食品に関する。
【００３６】
本発明で開示される別のものは、本発明の全体にわたって言及されるように、少なくとも１つの培養できる抗微生物菌株、または前記菌株から分泌された抗カリエス性の物質、化合物または分子を含む、医薬組成物または口腔健康のために設計された組成物に関する。
【００３７】
本発明で開示される別の目的は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８を含む抗微生物化合物または以下の配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４のいずれかを含むＤＮＡ配列によってコードされる抗微生物化合物に関する。
【００３８】
本発明で開示される別の目的は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８から成る抗微生物化合物または以下の配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４のいずれかから成るＤＮＡ配列によってコードされる抗微生物化合物に関する。本発明の好ましい実施形態において、上記抗微生物化合物は口腔感染症をもたらす生物、好ましくはカリエス性生物の増殖に対する阻害活性を示す。他の好ましい実施形態において、前記抗微生物化合物はペプチドである。
【００３９】
本発明の別の目的は、薬としての使用するための前段落で言及された抗微生物化合物またはその組み合わせに関する。
【００４０】
本発明で開示された別の目的は、薬の調製における前段落で言及された上記抗微生物化合物またはその組み合わせの少なくとも１つの使用に関する。
【００４１】
本発明の別の目的は、抗微生物組成物、好ましくは抗菌組成物の調製で使用するための上記抗微生物化合物またはその組み合わせに関する。
【００４２】
本発明で開示される別の目的は、抗微生物組成物、好ましくは抗菌組成物の調製における上記の抗微生物化合物またはその組み合わせの少なくとも１つの使用に関する。
【００４３】
本発明の別の目的は、口腔感染症の処置、好ましくはカリエスの処置で使用するための上記抗微生物化合物またはその組み合わせに関する。
【００４４】
本発明で開示される別の目的は、口腔感染症の処置のために設計された組成物、好ましくはカリエスの処置のために設計された組成物の調製における上記抗微生物化合物またはその組み合わせの少なくとも１つの使用に関する。
【００４５】
本発明の別の目的は、口腔健康を改善するために、好ましくはカリエスを予防するために設計されたプレビオティックまたは機能性食品として使用するための本発明の上記の抗微生物化合物に関する。
【００４６】
本発明に開示される別の目的は、口腔健康を改善するために、好ましくはカリエスを予防するために設計されたプレビオティックまたは機能性食品の調製における上記抗微生物化合物またはその組み合わせの少なくとも１つの使用に関する。
【００４７】
本発明に開示される別の目的は、本発明の全体にわたって記載されるような少なくとも１つの抗微生物化合物を含むプロバイオティック／プレバイオティック組成物または機能性食品に関する。
【００４８】
本発明に開示される別の目的は、本発明の全体にわたって記載されるような少なくとも１つの抗微生物化合物を含む医薬組成物または口腔健康のための組成物に関する。
【００４９】
本発明で開示される別の目的は、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９を含む抗微生物化合物または以下の配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５のいずれかを含むＤＮＡ配列によってコードされる抗微生物化合物に関する。
【００５０】
本発明で開示される別の目的は、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９から成る抗微生物化合物または以下の配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５のいずれかから成るＤＮＡ配列によってコードされる抗微生物化合物に関する。好ましい実施形態において、前記抗微生物化合物は口腔感染症をもたらす生物、好ましくはカリエス性生物の増殖に対する阻害活性を示す。他の好ましい実施形態において、上記抗微生物化合物はペプチドであることを特徴としている。他の好ましい実施形態において、上記抗微生物化合物は、口腔内の酸、好ましくは乳酸の生成を阻害することを特徴としている。
【００５１】
本発明で開示される別のものは、薬として使用するための上記抗微生物化合物またはその組み合わせに関する。
【００５２】
本発明で開示された別の目的は、薬の調製における前段落で言及された抗微生物化合物またはその組み合わせの少なくとも１つの使用に関する。
【００５３】
本発明の別の目的は、抗微生物組成物、好ましくは抗菌組成物の調製で使用するための上記抗微生物化合物またはその組み合わせに関する。
【００５４】
本発明の別の目的は、抗微生物組成物、好ましくは抗菌組成物の調製における上記抗微生物化合物またはその組み合わせの少なくとも１つの使用に関する。
【００５５】
本発明の別の目的は、口腔感染症の処置、好ましくはカリエスの処置で使用するための上記抗微生物化合物またはその組み合わせに関する。
【００５６】
本発明で開示される別の目的は、口腔感染症の処置のために設計された組成物、好ましくは抗カリエス組成物の調製における上記抗微生物化合物またはその組み合わせの少なくとも１つの使用に関する。
【００５７】
本発明の別の目的は、口腔健康を改善するために、好ましくはカリエスを予防するために設計されたプレバイオオティックまたは機能性食品として使用するための上記少なくとも１つの抗微生物化合物またはその組み合わせに関する。
【００５８】
本発明に開示される別の目的は、口腔健康を改善するために、好ましくはカリエスを予防するために設計されたプレバイオオティックまたは機能性食品の調製における上記少なくとも１つの抗微生物化合物またはその組み合わせの使用に関する。
【００５９】
本発明に開示される別のものは、本発明の全体にわたって記載されるような抗微生物化合物を少なくとも１つ含むプロバイオティック／プレバイオティック組成物または機能性食品に関する。
【００６０】
本発明に開示される別の目的は、本明細書で記載されるような少なくとも１つの抗微生物化合物を含む、医薬組成物または口腔健康のための組成物に関する。
【００６１】
本発明に開示される別の目的は、口腔感染症をもたらす生物、より好ましくはカリエス性生物の増殖に対する阻害活性を好ましくは持つ培養できる抗微生物菌株を単離するプロセスに関し、該プロセスは、
ａ）カリエスに苦しんでいない個体の歯肉縁上の歯垢からサンプルを得る工程、
ｂ）適切な増殖条件下の適切な培地にサンプルを植え、及びカリエスに一度も苦しんだことのない個体で最も頻出するサンプルの細菌を単離する工程、
ｃ）カリエス性細菌の増殖培地中で、単離された菌株を培養して、適切な培養時間後に増殖に対して阻害ハロを示す菌株を選択する工程を含むことを特徴としている。
【００６２】
好ましい実施形態において、上記プロセスは、工程ｂ）において、カリエスに一度も苦しんだことのない個体で最も頻出する細菌は、それぞれの菌種の割合を評価することを可能にする技術であるメタゲノムのパイロシーケンシングによって評価することを特徴としている。別の好ましい実施形態において、上記プロセスは、工程ｃ）において、菌株は好ましくは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属，Ｒｏｔｈｉａ属，Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属，Ｇｌｏｂｉｃａｔｅｌｌａ属，Ｊｏｈｎｓｏｎｅｌｌａ属，Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ属，Ｋｉｎｇｅｌｌａ属，Ｃａｒｄｉｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属，Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ属，Ｐｈｏｃｏｅｎｏｂａｃｔｅｒ属及びＡｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ属から選択されることを特徴としている。具体的には、該菌株は、ＣＥＣＴ７７４６、ＣＥＣＴ７７４７、ＣＥＣＴ７７７３、ＣＥＣＴ７７７４およびＣＥＣＴ７７７５から選択される。より具体的には、該菌株は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属に属し、好ましくは以下の種Ｓ．ｓａｎｇｕｉｓ，Ｓ．ｏｒａｌｉｓ，Ｓ．ｍｉｔｉｓ，Ｓ．ｉｎｆａｎｔｉｓまたはこれら４種を含むＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属のサブグループに属する記載されていない新しい種に属する細菌から選択される。より具体的には、少なくとも１つの抗微生物菌株がＣＥＣＴ７７４６，ＣＥＣＴ７７４７，ＣＥＣＴ７７７３またはＣＥＣＴ７７７５から選択される。
【００６３】
本発明で開示される別の目的は、感染症、好ましくは口腔感染症、より好ましくはカリエスを予防する及び／または処置するための方法に関し、該方法は、口腔に常に生息する病原微生物、好ましくはカリエス性微生物の増殖を阻害するのに効果的な量の本発明に記載の少なくとも１つの培養できる抗微生物菌株、または前記菌株を含む本発明に記載のプロバイオティック／プレバイオティック組成物または機能性食品、あるいは前記菌株を含む本発明に記載の医薬組成物または口腔健康のための組成物、を投与する工程を含むことを特徴としている。
【００６４】
本発明の別の目的は、口腔感染症をもたらす生物、より好ましくはカリエス性生物の増殖に対して阻害活性を好ましくは持つ抗微生物化合物を獲得するプロセスに関し、該プロセスは、
ａ）カリエスに一度も苦しんだことのない個体の歯肉縁上の歯垢からサンプルを得る工程、
ｂ）前記サンプルを溶解し、完全なゲノムＤＮＡを前記サンプルから抽出する工程、
ｃ）抽出されたＤＮＡの残りから、ベクター、好ましくはプラスミドまたはフォスミドのメタゲノムライブラリを調製する工程であって、前記ベクターは宿主細胞に挿入され、かつ前記ベクターが運ぶ、抽出されたＤＮＡを宿主細胞において発現することができる、工程、
ｄ）宿主細胞にベクターを挿入する工程、
ｅ）ベクターを含む宿主細胞のクローンを、カリエス生成微生物を持つ培地に植え、適切な培養時間後に増殖阻害ハロを示すクローンを選択する工程、
ｆ）阻害活性を示したクローンのベクターのＤＮＡをシーケンシングし、前記ＤＮＡがコードする化合物を合成及び／または精製する工程を含むことを特徴としている。
好ましい実施形態において、上記プロセスは、抽出されたＤＮＡが少なくとも３００μｇ／ｍｌであることを特徴としている。別の好ましい実施形態において、前記プロセスは、ＤＮＡ抽出プロセスの後に、好ましくは３５乃至４５ｋｂの範囲内のサイズのＤＮＡを含むフォスミドが構築されることを特徴としている。別の好ましい実施形態において、前記フォスミドは１ｋｂより小さいサイズのＤＮＡを含む。別の好ましい実施形態において、前記プロセスはフォスミドを挿入する宿主細胞がＥ．ｃｏｌｉであることを特徴としている。
【００６５】
別の好ましい実施形態において、前記プロセスはＤＮＡインサートを持つフォスミドを含むクローンが植えられる微生物の培地は、カリエス性細菌、好ましくはＳ．ｍｕｔａｎｓまたはＳ．ｓｏｂｒｉｎｕｓの培地であることを特徴とする。別の好ましい実施形態において、前記プロセスはフォスミドのＤＮＡ配列がＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：５、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：６、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：７、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１３、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１４またはそれらの組み合わせを含む配列から選択されることを特徴とする。別の好ましい実施形態において、前記プロセスはフォスミドのＤＮＡ配列がＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：５、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：６、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：７、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１３、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１４またはそれらの組み合わせから成る配列から選択されるものから成ることを特徴とする。
【００６６】
別の好ましい実施形態において、前記プロセスは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９から選択される配列を含む少なくとも１つの抗微生物ペプチドあるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４のいずれかを含むＤＮＡ配列によってコードされる抗微生物化合物を獲得することを特徴とする。別の好ましい実施形態において、前記プロセスは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９から選択される配列から成る少なくとも１つの抗微生物ペプチドあるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４のいずれかから成るＤＮＡ配列によってコードされる抗微生物化合物を獲得することを特徴とする。
【００６７】
別の好ましい実施形態において、フォスミドのＤＮＡ配列であるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４、及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９を持つ抗微生物ペプチドは細菌由来であり、好ましくはバクテリオシンである。別の好ましい実施形態において、フォスミドのＤＮＡ配列であるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５はヒト由来であり、好ましくはデフェンシン／カセリシジンである。
【００６８】
本発明で開示される別の目的は、感染症、好ましくは口腔感染症、より好ましくはカリエスを予防する及び／または処置するための方法に関し、該方法は、口腔に常に生息する病原微生物、好ましくはカリエス性微生物の増殖を阻害するのに効果的な量の本発明にわたって記載される少なくとも１つの抗微生物化合物、または本発明に記載の少なくとも１つの抗微生物化合物を含むプロバイオティック／プレバイオティック組成物または機能性食品、あるいは本発明に記載の少なくとも１つの抗微生物化合物を含む医薬組成物または口腔健康のための組成物、を投与する工程を含むことを特徴としている。
【００６９】
ブダペスト条約に従った微生物の寄託
本発明に使用した微生物は、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｖａｌｅｎｃｉａ，  Ｃａｍｐｕｓ  Ｂｕｒｊａｓｓｏｔ，  Ｂｕｒｊａｓｓｏｔ  ４６１００（Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｓｐａｉｎ）にあるスペイン培養細胞系統保存機関に以下の寄託番号を持って寄託した。
・ＣＥＣＴ７７４６：２０１０年６月７日に寄託したＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属の菌株。
・ＣＥＣＴ７７４７：２０１０年６月７日に寄託したＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属の菌株。
・ＣＥＣＴ７７７３：２０１０年７月２２日に寄託したＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属の菌株。
・ＣＥＣＴ７７７４：２０１０年７月２２日に寄託したＲｏｔｈｉａ属の菌株。
・ＣＥＣＴ７７７５：２０１０年７月２２日に寄託したＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属の菌株。
【００７０】
以下にリストされる実施例の目的は、請求の範囲を限定することなく本発明を例示することである。
【００７１】
実施例１．歯肉縁上の歯垢のメタゲノムの獲得
最初に、歯肉縁上の歯垢のサンプルを、インフォームドコンセントに署名した後、カリエスに一度も苦しんでいないボランティアから採取しおよび比較のために以前カリエスに苦しんだことのあるボランティア、及びカリエスに苦しんでおり、前記カリエスの病変を呈しているボランティアから採取した。サンプルを得るプロセスは、バレンシア自治政府保険管理局の臨床調査倫理委員会（ＧＳＰ−ＣＳＩＳＰ）によって承認された。各ボランティアの口内の健康状態は、世界保健機関（ＷＨＯ）による口腔の健康の研究に関する推奨および分類（ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ）に従った歯医者によって評価された。サンプルは無菌のプローブを使用して得た。ボランティアは、サンプルを採取する２４時間前から歯を磨かないように指示された。
【００７２】
歯垢中の微生物の多様性を研究し、そのメタゲノムを得るために、各個体のすべての歯の表面の歯垢から集められた材料を混合し、その後溶解し、各歯垢の全てのＤＮＡを得た。ＭａｓｔｅｒＰｕｒｅ（商標）Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＤＮＡ及びＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、メーカーの使用説明書に従って、溶解する工程の中でリゾチームによる処理（１ｍｇ／ｍｌを３７℃で３０分間）を加え、ＤＮＡを抽出した。ＤＮＡ濃度をＮａｎｏＤｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で測定し、選択されたサンプルは好ましくは３００μｇ／ｍｌより大きいＤＮＡ濃度でなければならず、合計の量が少なくとも５μｇなければならない（装置の感度の閾値及びパイロシーケンシングを伴うプロセスのため）。さらに、ボランティアの歯垢から抽出されたゲノムＤＮＡの完全性を確認するためにＤＮＡサンプルをアガロース・ゲルで泳動した。続いて、前記抽出されたＤＮＡのパイロシーケンシングを、ＧＳ  ＦＬＸ−Ｔｉｔａｎｉｕｍ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて行った。パイロシーケンシングは、直径１μｍ以下の球体にＤＮＡを固定することを可能にするアダプターを末端に加えることで、圧力下の窒素を用い、約５００−８００ヌクレオチドの断片へとＤＮＡを断片化することから成る。前記球体は、各球体と一体化したＤＮＡを増幅するエマルジョンＰＣＲ（ｅｍＰＣＲ）を行うために、マイクロリアクターとして作用する特定の油に導入される。
【００７３】
ＤＮＡを増幅した球体の集積の後、パイロシーケンシングが行われるＧＳ  ＦＬＸ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）内のチタンプレートに溶液を置く。この反応は、ルシフェラーゼのような酵素一式による光線中にヌクレオチドを加えることでポリメラーゼから放出される各ピロリン酸塩分子の形質転換から成る。この光線は加えたヌクレオチドの数に比例し、こうして高感度チャンバーが光のパルスを、相当するＤＮＡ配列に変換する（１９）。前記ＤＮＡの平均の長さは４２５ｐｂであった。所定の配列のリードの数がサンプル中のその頻度にのみ関連するように、４５４−パイロシーケンシング技術によって人工的に複製された、組織的に発生した配列は、「４５４  Ｒｅｐｌｉｃａｒ  Ｆｉｌｔｅｒ」（２０）を通して最終データセットから削除した。
【００７４】
メタゲノム中のヒトＤＮＡの量は歯肉縁上の歯垢サンプル中の０．５−４０％の範囲内にあり（表１）、Ｍｅｇａｂｌａｓｔを用いてヒトゲノムデータベースを使用して同定され、最終データから削除した。
【００７５】
【表１】
0005921546.tif 000002
【００７６】
続いて、平均４２５ｐｂのＤＮＡは、メタゲノムの大部分の機能アサイメントを可能にする（表２）。さらに、前記リードのアセンブリにより、５ｋｐｂより大きい１１０３のアセンブリ「コンティグ」、１０ｋｐｂより大きい３５４のアセンブリを生産する。各６つの口腔サンプルの平均１２９．５Ｍｐｂの、高品質なフィルター処理した配列を得た（１００ｐｂより大きく、９０％を超えるヌクレオチドが９９．９９％の正確さを持っていた：パイロシーケンシングのヌクレオチドリードが正確である可能性、すなわち９９．９９％の正確さは、誤っているのはほんの０．０１％のヌクレオチドだけであることを意味する（シーケンシングのエラー））。カリエス病変を備えた２つのサンプルにおいて、シーケンスの約７０％がヒトＤＮＡに属し、この場合高品質のフィルターされたリードの平均３２．５Ｍｐｂが得られた。
【００７７】
【表２】
0005921546.tif 000003
【００７８】
実施例２．歯肉縁上の歯垢のフォスミドメタゲノムライブラリの構築
パイロシーケンシングのプロセスで使用されなかった、研究に含まれていた健康なボランティアの歯肉縁上の歯垢から抽出した無傷のＤＮＡのサンプルを使用し、前記ボランティアの歯垢のフォスミド（好ましくは３５−４５ｋｂの間の長さを持つインサート）のメタゲノムライブラリを構築し、このためにＥｐｉＦＯＳ（商標）Ｆｏｓｍｉｄ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をメーカーの取扱説明書に従って使用した。簡単に言えば、本発明のメタゲノムライブラリを構築するプロセスの好ましい代替案として、フォスミドは宿主、好ましくは大腸菌に挿入される。上記で説明したように、メーカーの取扱説明書にいくつかの変更、例えばライゲーションの時間を増やすこと（２０℃の水浴で１２時間）、パルスフィールドゲルから抽出したＤＮＡではなく挿入の為にＤＮＡ全体を用いること、抽出したＤＮＡの破損を最小限にするためのＤＮＡ抽出プロセスをわずかに変更すること（切ったピペットチップを使用すること、ボルテックスを避けること、ＤＮＡを濃縮するためのＣｅｎｔｒｉｃｏｍ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用すること）を加えたものに従って、ＥｐｉＦＯＳ（商標）Ｆｏｓｍｉｄ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を用いてライブラリを調製した。
【００７９】
Ｅ．ｃｏｌｉ宿主へのＤＮＡの挿入は、フォスミドをラムダファージ粒子にパッケージングし、その後Ｅ．ｃｏｌｉのＥｐｉ３００Ｔ１Ｒに感染させることで行った。パッケージング中に、ライゲーション産物を、１ｍｌファージバッファーの中に３０℃で３時間ウイルスと接触するよう放置した。感染は、ウイルス粒子がＥ．ｃｏｌｉ株と接触するよう３７℃で３０分間放置することで行った。（無菌スティックを用いて単一コロニーを取ることができるのに十分離した）プレート上での最適なコロニー濃度を選択するために、混合物の異なる希釈液を、クロラムフェニコールを持つＬＢ寒天培地で培養することで、事前にタイタレーションを行った。
【００８０】
続いて、各コロニーを、９６穴Ｅｌｉｓａプレートのクロラムフェニコール入りＬＢ液体培地の中に接種し、保管する前にもう一度増殖させた。クローンは、氷の結晶ができることを防ぎ細胞の完全な状態を保つために、９６ウェルＥｌｉｓａ型プレート（Ｎｕｎｃ）の１９％グリセロールの中で−８０℃で保管した。フォスミドは、その間での組み換えプロセスを防止するために、マルチプルコピーを誘導しないまま冷凍した。
【００８１】
別々のフォスミドインサートを持つ別々のＥ．ｃｏｌｉクローンを、その後Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓまたはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｏｂｒｉｎｕｓのようなカリエス性細菌の培地に植えた。それらのクローンは、前記培地において植えた地点の周りに阻害ハロを示すかどうかで選択される。得られたクローンを、様々な利用可能な公共の配列データベースを基礎として、各フォスミドに含まれるＤＮＡの配列相同性を使って同定した。各フォスミドのＤＮＡ配列を得るために、ＱＩＡＧＥＮから市販されているｍｉｄｉｐｒｅｐキットを使うことで抽出し、ベクターＤＮＡからフォスミド全てのＤＮＡを分離し、直接パイロシーケンシングを行った。このようにして、それぞれのＯＲＦを得てその後コードされたペプチドを得る。
【００８２】
実施例３．ヒト口腔メタゲノムの多様性の分析
カリエスを持つ個体及び健康な個体からの歯肉縁上の歯垢のメタゲノムを、本発明で記載したプロセスを経て一旦得て、前記口腔メタゲノムの多様性を以下の３つの技術を用いて分析した：
【００８３】
１６Ｓ  ｒＲＮＡの分析を用いた分類学的アサイメント：ＲＤＰデータベース（リボソームデータプロジェクト）に対するＢＬＡＳＴＮによる類似性検索（２６）を用いて、各メタゲノムから得られたリードから、１６ＳｒＲＮＡ配列を抽出した。２００ｐｂ以下のサイズの配列は削除した。配列の系統発生学的アサイメントは、８０％の信頼閾値でＲＤＰＣｌａｓｓｉｆｉｅｒ（２７）を用いて行った。
【００８４】
遺伝子分類アサイメント：全てのＯＲＦの分類学的アサイメントを、ＭＥＧＡＮソフトウェア（２８）に記載された特徴によって、最小共通祖先（ＬＣＡ）アルゴリズムを基礎として行った。各配列のＬＣＡを得るために、ＢＬＡＳＴｘデータベースを、必須ＮＣＢＩデータベース（ＮＲ）からの非真核生物の配列を含むもう一つの専用データベースに対して用いて相同性検索を行った。各配列のリードについて、少なくとも９０％の一致を示す結果を持つもののみのＬＣＡの取得を検討した。
【００８５】
リードの分類学的アサイメント（ＰｈｙＭＭ）：前記分類学的アサイメントを、ヌクレオチドの相同性及び組成の両方によって配列のアサイメントを組み合わせるＰｈｙｍｍＢＬ（２９）を使用して行い、この目的のために隠れマルコフモデルを使用した。利用可能な完全ゲノムを、細菌と古細菌の全てのゲノムを含む（２０１０年３月時点）ＮＣＢＩデータベース（ＲｅｆＳｅｑ）と同様に、ヒト口腔微生物叢データベース（ＨＯＭＤ）（３０）から得て、分類学的構築モデル及びＰｈｙｍｍＢＬを用いたホモロジー検索を実行するために設計された部分的なデータベースを構築するために使用した。この分析では、分類学的同一性を予測するために、２００ｐｂより大きい配列のみを使用した。前記リードの長さを使用し、ＰｈｙｍｍＢＬによる検索の綱レベルの正確さは、７５％より大きいと評価された。全ての分類学的、機能的な結果は、続く分析のためにＭｙＳＱＬデータベースにおいて分析した。
【００８６】
これらの３つの方法を使用して得られた結果は、直接シーケンスしたメタゲノムにおける少数の１６Ｓ遺伝子は、クローニングまたはＰＣＲ技術によるバイアスなしに、口腔メタゲノムに存在する主な分類学的グループであると記載するのに十分であることを示している。
【００８７】
試験したサンプルから、健康な個体と病気の個体の間の興味深い違いが観察された。３つの方法によって示された傾向は、桿菌及びガンマプロテオバクテリアの分類学的グループが健康な個体で最も一般的であったのに対し、クロストリジウム及びバクテロイドのような典型的に嫌気性の分類群が病気の被験体のサンプルでより頻出したことであった。ベータプロテオバクテリア（主にナイセリア）及びＴＭ７門（依然として明確な名前がなく、培養できるメンバーがこれまでのところいない）にアサインされたリードは、病気の個体のサンプルに非常に低い割合で存在し、よって健康な条件に関連しているかもしれない。
【００８８】
１６ＳリボソームＲＮＡの分類アサイメントに基づいたメタゲノム間の対応分析は、口腔の健康が良くない個体のサンプルは同じ群をなす傾向があるのに対し、健康な個体では様々な細菌コンソーシアが見出されたことを示した。今回のメタゲノムの研究によって、本発明は、前記Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属及びＲｏｔｈｉａ属、より好ましくはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、がカリエスのない被験体において一般的な属であることを実証した。この理由から、抗カリエス活性を持つことがあり得る、カリエスに一度も苦しんだことのない個体からの歯肉縁上の歯垢のサンプルから選択する場合、該選択は前記Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属及びＲｏｔｈｉａ属、より好ましくはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属に属する種を探索することを目標とした（培地、培養パラメータ、細菌の顕微鏡での形態、コロニーの形態など）。
【００８９】
ＬＣＡ及びＰｈｙｍｍＢＬアプローチの有意な適用の一つは、著しく一致したほとんどのリードのほとんどは分類学的由来にアサインされた、もっと言えば可能な機能にアサインされるということである。分類と機能を関連づけることによって、細菌グループがそれぞれ果たすであろう生態学的または代謝学的作用の役割を予想することが可能になった。ＣＯＧ（オルソローガスグループのクラスタ）機能別分類システムを使用することで、カテゴリーは平等に分配されていないこと、及び特定の細菌グループが特定の機能を行うのに特に適していることが観察されるだろう。例えば、防御機構に関与する遺伝子（例えば、制限エンドヌクレアーゼ及び薬剤放出ポンプ）の大部分は桿菌がコードしており、カリエスのない人々で多くのストレプトコッカスが存在することに合わせて、桿菌によってこれらの細菌がヒトの病原体への天然の阻害剤の潜在的な生産者になり得て、口腔感染症の処置のための補充療法戦略において可能であるということを予測することができる。
【００９０】
実施例４．ヒト口腔メタゲノム内に存在する微生物の個体数および豊富度の分析
伝統的な培養技術及び先駆的な分子の研究に基づいた最初の研究は、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の増幅およびクローニングを含み、口腔内に約５００の様々な種の多様性があると予想した（６）。現代の技術（次世代シーケンシング、ＮＧＳ）を使用することで、操作的分類単位（ＯＴＵ）は、４０００及び１９０００の間であると見積もられた。ＯＴＵは、与えられた閾値よりも低い類似性を持つ１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の配列は、異なる種に属するという事実を考慮に入れた、ＤＮＡ配列に基づいた種の数の予想値である。使用される閾値は、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の標準である、９７％の配列同一性である；したがって、類似性が９７％以上であれば、同じ種であると考慮されるが、それが９７％未満であれば、それは恐らく異なる種である。３人の健康な被験体のより長いパイロシーケンシングのリード（２５０ｐｂ）は、一人当たり約６００ＯＴＵであると予想し、最近のプロジェクトはサンガー型シーケンシング（２２）を用いた１６Ｓ  ｒＲＮＡ増幅産物のほぼ全長を持つ１１４４７の増幅産物をシーケンスしようと試み、その結果１０人の個体で３００ＯＴＵ以下と予想値が下がった。
【００９１】
微生物の多様性の我々の予想は、サンガーシーケンシングリード（６，２２）を使って得られたものと近かったが、我々のメタゲノムデータから抽出された１６ＳｒＲＮＡリードによって、ＰＣＲ増幅では以前に検出されなかった１８６の新しいＯＴＵを同定した。希薄曲線（ｒａｒｅｆａｃｔｉｏｎ）（サンプリングのストレスが増加するに従う種の数の飽和）および表１で記載したように、様々な多様性指標（特にＳｈａｎｎｏｎ，  Ｓｉｍｐｓｏｎ，  及びＣｈａｏ１指標）は、４２５４のｒＲＮＡリードに基づいて、歯垢サンプルに対して７３−１２０の属が見積もられることを示す（表１及び表２）。カリエス病変を持つ２つのサンプルは低い多様性を示す傾向があるが、多様性に関しては、様々な健康状態であるボランティアのサンプル間でのはっきりとした違いは観察されなかった。
【００９２】
メタゲノム内の選択された種の存在を定量化する効果的なツールは、配列動員（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ）である。参考細菌ゲノムに対するある特定の同一性閾値よりも著しく一致した個々のメタゲノムのリードを、サンプル中のその生物の豊富さに依存する密度で変化するグラフを描く際に「動員」した。示されたヌクレオチドの同一性の平均が９４％より大きい場合、同じ種からのリードから動員されたであろう。
【００９３】
今までのところ、Ｎｕｃｍｅｒ及びＰｒｏｍｅｒ  ｖ  ３．０６アルゴリズムを使って我々のメタゲノムと利用可能な１１１７ゲノムを比べると、我々のサンプル中のこれらの種の豊富度を見積もることができた。驚いたことに、Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ属及びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｎｇｕｉｓに関連する細菌がカリエスなしの人々においてもっとも豊富であり、これは健康の個体における口腔内のこれらの種のより大きなＰＣＲ増幅頻度と一致する。Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属もまた、健康な個体のサンプル中で頻度が高かった。さらに、少数の分類群が通常各メタゲノムで優占することを動員グラフは示しており、これは口腔内に多くの多様な細菌が存在するが、少数の分類群は、ほとんどの細菌細胞を含みことを指している。
【００９４】
実施例５．口腔生態系内の機能的な多様性
本発明で分析された個体の口腔生態系の一部である生物の機能的な多様性を分析するために、得られたメタゲノムのシーケンスのリードをすべて、保存ドメインデータベース（ＣＤＤ）（２４）、サブシステムに基づいたアノテーションシステム（ＳＥＥＤ）およびＴｉｇｒＦａｍｓプロファイル（２５）の様々なデータベースと比較した。
【００９５】
リードの機能的なアサイメントに基づくサンプルの対応分析（ＣｏＡ）は、３つの機能別分類システム（ＣＤＤ、ＳＥＥＤおよびＴｉｇｒＦａｍｓ）に同様のグループ化パターンを提供した。病気の被験体（カリエスを有する）からのサンプルは共に群をなし、これは類似の機能グループがこれらのメタゲノムにコードされていることを示し、カリエスに一度も苦しんでない個体からのサンプルは、わずかなカリエスを示す個体とともに、別々に分類される。大人の腸の微生物叢に対して口腔メタゲノムの機能的アサイメントを比較すると、口腔内サンプルはともに分類され、これはコードされた機能の相対的な頻度という意味で、腸と口が２つの異なる生態系であることを示す。本発明は、腸の微生物叢で大きな比率を占める（ｏｖｅｒ−ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄ）機能の単位がある一方で、口腔サンプルで大きな比率を占めるその他の機能の単位があることを明示している。
【００９６】
口腔サンプルでは、個体は健康状態に基づいて分類される。応用の見地から、多くの機能別カテゴリーがカリエスのない個体からのサンプル内で過剰に表わされることに注目すると面白い。これらは、グラム陰性菌の競争に関与するＤＮＡ捕捉遺伝子を含み、その他はリン脂質の代謝、フルクトース及びマンノース誘導性ホスホトランスフェラーゼシステム、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｇａレギュロン、混合有機酸発酵、菌体密度感知遺伝子及びバクテリオシン型抗微生物ペプチドに関与するそれ以外の遺伝子を含む。生物活性化合物である前記バクテリオシンは、潜在的な抗カリエス剤であり、よって本発明は、カリエスに一度も苦しんでいない個体の歯垢は、新規抗微生物物質及び潜在的な抗カリエス物質の遺伝子の貯水池であることを明示する。
【００９７】
実施例６．カリエス性Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ培地における本発明のフォスミドライブラリで得られたクローンの阻害アッセイ
一度もカリエスに苦しんでいない個体からの歯肉縁上の歯垢のフォスミドライブラリが一旦得られると、異なるフォスミドインサートを持つＥ．ｃｏｌｉの異なるクローンを、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓまたはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｏｂｒｉｎｕｓなどのカリエス性細菌の培地に植えた。一度もカリエスに苦しんでいないボランティアのフォスミドメタゲノムライブラリのレプリカを、誘導剤（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してマルチプルコピーに予め誘導したライブラリ中の各プレートの９６クローンの増殖を各ペトリ皿が担保（ｈｏｓｔ）できるように、Ｎｕｎｃ９６ピンレポリケーターを使用して前記プレートにピンで植えた。この単純なスクリーニングを使用し、何千ものクローンの抗収率活性アッセイ（ｈｉｇｈ−ｙｉｅｌｄ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｓｓａｙ）を限られた時間の中で行い、カリエス性微生物の上で阻害ハロを生成するクローンを選択する（図１）。
【００９８】
これらフォスミドのＤＮＡ配列またはインサートは、本発明の実施例２で説明したように、寒天の中に広がり、歯のカリエスを引き起こすそれらの細菌の増殖を防ぐ分泌物質を潜在的に生成するものである。続いて、第二の活性スクリーニングを、偽陽性を取り除くために陽性クローンで行った（図１Ｂ）。利用可能な配列についての様々な公共のデータベースに対して各フォスミドに含まれるＤＮＡ配列の相同性を用いて、得られたクローンを同定した。
【００９９】
各フォスミドからＤＮＡ配列を得るために、ＱＩＡＧＥＮからのｍｉｄｉｐｒｅｐ  ｋｉｔを使用してベクターＤＮＡから分離し、直接シーケンシングを行うことでＤＮＡ全体を抽出した。市販のＰＣＣ１Ｆｏｓベクターのリバース（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）及びＴ７プライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）を使用した伝統的なサンガー技術を使って２０のフォスミドの端の配列を決定した。配列を決定した２０のフォスミドのうち、４つの配列が、細菌のＤＮＡとの相同性（３０％−９８％）を示し、５つの他の配列が、ヒトＤＮＡとの９９％−１００％の相同性を示した。したがって、阻害能力を示すフォスミドの端の配列の内４つは細菌由来で、５つはヒト由来である。これら二つの場合（一つが細菌であり、一つがヒト）、インサートはとても短い長さであると判明したので、二つの端の配列は重複し、インサートの全長が得られる。このプロセスを用いて完全に配列を決定できたヒト由来のインサートは２４４ヌクレオチドあり（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、細菌のインサートは６６６ヌクレオチドあった（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）。
【０１００】
他の７つのインサートの配列は、パイロシーケンシングから得て、２−５のフォスミドを持つグループを用いてＤＮＡをＧｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  ＦＬＸ  ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）及び組み合わせることによって１／１６または１／８プレートの中で得た。得られた配列を、標準パラメータを使用したＮｅｗｂｌｅｒ  ｐｒｏｇｒａｍｍｅ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて組み合わせ、得られたアセンブリは、以前得られたインサートの端の配列に基づいて対応するフォスミドに関連付けられる。９つのインサートの特徴を表３に示す。
【０１０１】
【表３】
0005921546.tif 000004
【０１０２】
実施例７．短いＳ１２Ｅ及びＴ５Ａフォスミド内の抗微生物ペプチドの同定
実施例６に述べられているように、一旦７つのフォスミドの配列が得られたならば、２つの短い長さのＤＮＡインサートのＤＮＡ配列を分析して、３’−５’および５’−３’方向にコードされたＯＲＦをすべて得た。これらのＯＲＦのうち、我々はリボソーム結合配列を含み（Ｅ．ｃｏｌｉの１６Ｓの３’末端に相補的な配列を持つ）、それゆえに効果的に翻訳されるもの、及びシグナルペプチドが存在するため（ＳＩＧＮＡＬ−ＩＰソフトウェアを使って同定する）あるいは標準的ではない分泌経路（ＳＥＣＲＥＴＯＭＥ−Ｐソフトウェアを使って同定する）のいずれかによって分泌できるものを選択した。前記方法を使って、ヒト由来のフォスミド（Ｔ５Ａ）から、わずか２６アミノ酸の長さ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）の候補のＯＲＦを、細菌由来のフォスミド（Ｓ１２Ｅ）から、３９アミノ酸の長さ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）のもう一つの候補のＯＲＦを得た。もっと言えば、これらの遺伝子は、抗微生物ペプチドの特徴を持つアミノ酸組成を示し、さらにヒト由来のＴ５Ａの場合、ジスルフィド架橋を形成できる二つのシステインの存在を確認した。このことは、これらの短い配列及びこれらの正味の正電荷とともに、これらの遺伝子が生物活性の抗微生物ペプチドであることを示唆する。
【０１０３】
続いて、前記ペプチドを精製した。この目的のために、前記ペプチドを分子量に基づいて分泌された他の生成物から分離した。従って、マルチプルコピーに誘導された１５ｍｌの各クローンをブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ）培地で培養し、細胞を遠心し、上清を回収し、細菌の残存物を取り除くために０．２−マイクロンの孔径のＭｉｌｌｉｐｏｒｅフィルターを通してろ過した。分泌された生成物を含むこの上清をＡｍｉｃｏｎ  １０−ｋＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅフィルターでもう一度ろ過し、ろ液をＡｍｉｃｏｎ  ３−ｋＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅフィルターでもう一度ろ過し、このように１ｍｌの容積に対して３から１０ｋＤの間の画分を得た。３ｋＤよりも小さいサイズの画分（０−３ｋＤ）を冷たい条件下でｓｐｅｅｄ−ｖａｃの中で１ｍｌに濃縮した。
【０１０４】
続いて、それぞれ３−１０ｋＤ及び０−３ｋＤであるこれらの２つの画分の５０−，１００−及び１５０−μｌをＳ．ｍｕｔａｎｓの液体培地及びＳ．ｓｏｂｒｉｎｕｓの液体培地に加え、吸光度を４８穴Ｆｌｕｏｓｔａｒルミノメーター内で、各処置を３重に行い、３０分ごとに１２−１９時間測定した。図２及び３でみられるように、カリエス性細菌の増殖曲線は、ヒト由来のデフェンシン型の抗微生物ペプチドの場合（図３）、３ｋＤよりも小さい画分がカリエス性細菌の容量依存性の阻害効果を有し、細菌由来のバクテリオシン型抗微生物ペプチドの場合、３−１０ｋＤ画分がカリエス性細菌の容量依存性の阻害効果を有すること（図２）を示し、各フォスミドのアミノ酸配列に基づいた予想される分子量と一致した。
【０１０５】
実施例８．カリエス性細菌に対する本発明の生物活性ペプチドの阻害活性の比較アッセイ
バクテリオシンの阻害効果を、市販の競合品と比較するために、液体ＢＨＩ培地内で同様のＳ．ｍｕｔａｎｓ増殖実験を、前述の実施例で記載したように、ただし今回はａ）１００μｌの市場での口内洗浄液の主力製品の一つ（抗歯垢剤及び口内消毒剤であるＬｉｓｔｅｒｉｎｅ（登録商標））、ｂ）バクテリオシンを含むＳ１２Ｅクローンの１００μｌの濃縮した上清（前述の実施例で説明されたように））及びｃ）１００μｌのＬｉｓｔｅｒｉｎｅ（登録商標）＋バクテリオシンを含むＳ１２Ｅクローンの１００μｌの上清を加えて行った。Ｓ．ｍｕｔａｎｓの増殖に対するこの濃度１００μｌでのバクテリオシンの阻害効果は、この菌種への市販製品の阻害効果よりも大きく（図４）、さらにバクテリオシンを市販製品に加えることで、前記製品のＳ．ｍｕｔａｎｓに対する阻害効果が著しく向上することを前記図４で観察できる。
【０１０６】
実施例９．化学的に合成されたＳ１２Ｅ及びＴ５Ａペプチドのカリエス性活性の分析
単離した二つの阻害ペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８及び９）の化学的な合成を、固相合成法（３２及び３３）によって行った。ＳＰＰＳ（固相ペプチド合成）によるペプチド合成は、合成的に実験室でペプチド及びタンパク質を作成するために使用される最も一般的な方法で、細菌内で発現するのが難しい天然ペプチドの合成、天然ではないアミノ酸の結合またはペプチド修飾（例えばジスルフィド架橋の形成）を可能にする。
【０１０７】
ヒト由来のペプチドの場合、保護基であるＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（ｔｒｔ）−ＯＨは−ＳＨ基を保護するために使用され、−ＳＨ基は非常によく反応し、このペプチドにおいて比較的頻出した。ペプチドは球体に共有結合することでＮ末端アミノ基を遊離させたままにし、単一のＮ保護されたアミノ酸に結合する。この結合の次に、Ｎ保護されたアミノ酸を脱保護し洗浄した。結合、洗浄、脱保護および洗浄のサイクルを繰り返すと、ペプチド鎖が構築される。ペプチドが完成したら、試薬（この場合無水のフッ化水素）の追加によってペプチドが放出される。合成されたペプチドが正確なペプチドで不純物を包含していないことを確認することを目指した品質管理を、質量分析とＨＰＬＣを用いて行った。
【０１０８】
同定されたペプチドが、カリエス性細菌に対する阻害活性を担うものであることを裏付けるために、Ｓ１２Ｅ（細菌由来のバクテリオシン）、およびＴ５Ａ（デフェンシンと似た構造を持つヒト由来のペプチド）化学的に合成し、前記ペプチドをそれぞれ４ｍｇ、８０％以上の純度で得た。それらを、０．１％のトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）中に全て再懸濁し、前述の化学的に合成された化合物によってＳ．ｍｕｔａｎｓの液体培地での阻害をテストするために設計した試験を行った。
【０１０９】
細菌由来のバクテリオシン型Ｓ１２Ｅペプチドの場合、Ｓ．ｍｕｔａｎｓの培地に対する阻害活性が特に高濃度で確認された（図５）。続いて、純度が９５％以上のより多くのＳ１２Ｅペプチドを化学的に合成し、前述で得られた阻害効果がＴＣＡによるものではなく、化学的に合成されたＳ１２Ｅペプチド自体によることを示すために、前記ペプチドを超純水に再懸濁した。高純度の化学的に合成されたＳ１２Ｅペプチドを備えたＳ．ｍｕｔａｎｓおよびＳ．ｓｏｂｒｉｎｕｓの培地の処置が、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ（図６Ａ）およびＳ．ｓｏｂｒｉｎｕｓ（図６Ｂ）の両方のカリエス性細菌への用量依存的な阻害効果を生むことが、もう一度見出された。
【０１１０】
Ｔ５Ａペプチド（ヒト由来、デフェンシン型）の場合、最初は阻害効果が見出されなかった。このペプチドは、ヒト抗微生物ペプチドにおいて典型的に存在する２つのシステインを含むいくつかの反応しやすいアミノ酸を有し、２つのシステイン間のジスルフィド架橋は多くの場合ペプチドが活性するために必要であるということがわかる。この理由から、前記ペプチドをもう一度合成し、システイン３と１２の間にジスルフィド架橋を、合成の間反応しやすいアミノ酸を保護する。これらの修飾の後、このペプチドが様々な濃度でカリエス性細菌Ｓ．ｍｕｔａｎｓの増殖を阻害できること、最大のペプチド濃度である８０μｇのペプチドを加えた時増殖を完全に阻害できることが確認された。
【０１１１】
実施例１０．長いフォスミド内での阻害遺伝子の同定
その他の潜在的な抗微生物化合物について、阻害ハロを生成する全てのフォスミドからＤＮＡを分離し、その端とインサートの全長の配列を決定した（表３）。これは、抗微生物化合物（抗微生物ペプチドだけではなく）を生成する細菌の一覧と同時に、これらをコードするヒトゲノムの領域の一覧を得ることを可能にした。対応するクローンが生成した濃縮された上清（前述の実施例で示したように）の０−３ｋＤａ，３−１０ｋＤａ，１０−１００ｋＤａ及び＞１００ｋＤａの画分をＳ．ｍｕｔａｎｓの液体培地に加えることで、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ培地上で阻害実験を行った。これらの実験は、阻害を引き起こすサイズ画分が、Ｔ９Ｂ及びＴ４Ｈ細菌フォスミドとＷ４Ｄ（図８），Ｔ５Ｈ（図９），Ａ５Ｄ１１（図１０）及びＡ４Ｈ１１（図１１）ヒトフォスミドの０−３ｋＤａ画分、及びＴ１Ｆ細菌フォスミドの３−１０ｋＤａ画分であることを明らかにした。したがって、これらの結果は、小さなサイズのペプチド、すなわち０−３ｋＤａまたは３−１０ｋＤａの間の大きさを備えたペプチドによって阻害が生み出されることをもう一度示しており、この結果はそれらがバクテリオシン型またはヒトデフェンシン／カセリシジンの抗細菌ペプチドであるという事実と一致している。
【０１１２】
同様に、これらの大きさ（すなわち０−３ｋＤａ、場合によってまたは３−１０ｋＤａ）を備えたペプチドをコードするＯＲＦの探索を、前記フォスミドの配列上で行い、リボソーム結合配列を持つ遺伝子、シグナルペプチドが存在する遺伝子及び抗菌ペプチドのそれと類似のアミノ酸を使用する遺伝子及び／または他の既知の抗菌ペプチドのそれと類似の配列を持つ遺伝子及び／または疎水性の及び／または正味の正電荷の配列を持つ遺伝子が、阻害剤をコードする遺伝子である可能性がある候補として選択された。
【０１１３】
実施例１１．抗カリエス細菌の同定
カリエスに一度も苦しんでいない少数の成人人口の存在は、カリエス性細菌（２３）に対する潜在的なアンタゴニスト効果を備えた菌種の存在の示唆へと導いた。健康な個体から得られた無毒な単離株との病原性菌株の細菌置換（ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）は、咽頭感染症を防ぐことが十分に証明されており、腸及び他のヒトの生態系の感染症を防ぐために設計されたプロバイオティックに基づいている。健康な被験体の口腔微生物叢に対してカリエス性細菌のメタゲノムを動員することで、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ及びＳ  ｓｏｂｒｉｎｕｓが完全に存在しないことを示す。驚いたことに、カリエス性細菌が検出されないのは、健康な個体で最も豊富な属であるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属（主にＳ．  ｓａｎｇｕｉｓと類似のもの）、Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ属及びＮｅｉｓｓｅｒｉａ属の他の種の非常に強い動員を伴う時であった。
【０１１４】
これら優占属の単離株がカリエス性細菌とのアンタゴニスト相互作用に関与している可能性を考え、歯垢の新鮮なサンプルを１０人の健康な個体（メタゲノム配列を得た２人の健康な個体を含む）から採取し、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属，Ｒｏｔｈｉａ属及びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属に最適な増殖条件下（特に血液寒天培地、チョコレート寒天培地、ブルセラ寒天培地及びＴＳＡ培地中で、好気生活条件下及び嫌気性容器の中で）で培養するのに使用した。顕微鏡検査に続いて、双球菌及び連鎖球菌を選択し（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属，Ｒｏｔｈｉａ属及びＮｅｉｓｓｅｒｉａ属の種を見つける可能性を最大限にするため）、２４９の単離株のセットを得た。
【０１１５】
Ｓ．ｍｕｔａｎｓおよびＳ．ｓｏｂｒｉｎｕｓと同じ培地中で増殖することができたものは、前述のカリエス性細菌がある状態でローン培地に移した。この単純なスクリーニングによって、阻害ハロを持つ１６の株を同定した（図１２および１３）。１６ＳｒＲＮＡのＰＣＲ技術及びシーケンシングを用いて、ほとんどの前記株が、Ｓ．ｏｒａｌｉｓ，Ｓ．ｍｉｔｉｓ及びＳ．ｓａｎｇｕｉｓ種あるいは他の関連する種と９６％−９９％の配列同一性を示す、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属の種に属すると同定され、Ｒｏｔｈｉａ種でも１６Ｓ遺伝子でＲ．ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ種と１００％配列同一性を持つと同定された。Ｓ．ｍｕｔａｎｓ及び／又はＳ．ｓｏｂｒｉｎｕｓに対する阻害ハロを示した株は、割り当てられた番号ＣＥＣＴ７７４６、ＣＥＣＴ７７４７、ＣＥＣＴ７７７３、ＣＥＣＴ７７７４およびＣＥＣＴ７７７５として、ＣＥＣＴに寄託した。前に議論したように、ＣＥＣＴ７７４６、ＣＥＣＴ７７４７、ＣＥＣＴ７７７３およびＣＥＣＴ７７７５菌株は、同じＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属に属し、したがってそれらを得る方法に加えて、同じ細菌の属に属するので、構造・分類の類似性を共有する。
【０１１６】
具体的には、１６Ｓリボソーム遺伝子配列に基づいて、細菌の属であるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属に属する前述の株は、Ｓ．ｍｉｔｉｓ（ＣＥＣＴ７７４６およびＣＥＣＴ７７７５）種およびＳ．ｏｒａｌｉｓ（ＣＥＣＴ７７４７およびＣＥＣＴ７７７９）種に似ている。株ＣＥＣＴ７７４６および７７４７の完全なゲノムの配列決定することで、これらがＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属の新しい種であり（実施例１２参照）、異なる個体から来たにも関わらずこれらは姉妹株であり、さらにＳ．ｍｉｔｉｓ／ｏｒａｌｉｓ／ｉｎｆａｎｔｉｓの種クラスタに属することを明らかにする。ＣＥＣＴに寄託した別の菌株は、ＣＥＣＴ７７７４番で、Ｒｏｔｈｉａ属に属し、より明確にはＲ．ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ種に属する。カリエス性種（Ｓ．ｍｕｔａｎｓまたはＳ．ｓｏｂｒｉｎｕｓ）の培地に対する阻害ハロは、図１２及び１３でそれぞれ観察される。
【０１１７】
実施例１２．菌株ＣＥＣＴ７７４６及びＣＥＣＴ７７４７の特徴づけ
菌株ＣＥＣＴ７７４６及びＣＥＣＴ７７４７の特徴づけを様々な技術を用いて行った。最初に、これらの２つの菌株の完全なゲノムを、ショットガン（７、８）及びペアーエンドパイロシーケンシングを用いて得た；これらの２つの末端の間の既知の長さが配列のアセンブリを助けるように、後者は、約３０００のヌクレオチドのフラグメントへとＤＮＡを破壊し、各末端からおよそ２００のヌクレオチドの配列を決定することから成る。
【０１１８】
各菌株ＣＥＣＴ７７４６及びＣＥＣＴ７７４７の完全なゲノムを得るために、我々は、前記菌株の各培地からサンプルを採取することから始めた；具体的には、ショットガンシステム（７，８）を用いた、Ｒｏｃｈｅ（Ｔｉｔａｎｉｕｍ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）からのＧＳ−ＦＬＸパイロシーケンサーを用いて、４分の１の培養プレートをパイロシーケンス実験のために使用し、ペアーエンドシステムを用いて、別の４分の１の培養プレートをパイロシーケンス実験のために使用した。両方のシステムを用いて各菌株について得られた配列量は次の通りである：
菌株７７４６
ショットガンタイプ：合計１６５，１０５，９２１のヌクレオチドを備えた４４１．５４９のリード。
ペアーエンドタイプ：合計３２，７２１，６２２のヌクレオチドを備えた１８７．５３０のリード。
菌株７７４７
ショットガンタイプ：合計５，７１１，９９８のヌクレオチドを備えた２８．０２１のリード。
ペアーエンドタイプ：合計５１，５０１，５１０のヌクレオチドを備えた３０５．８２６のリード。
【０１１９】
各菌株の予想されたゲノムサイズは約２．１Ｍｂであった。菌株ＣＥＣＴ７７４６については、５００ｐｂよりも大きいアセンブリの大きさは、２，１２２，０８７ｐｂである。菌株ＣＥＣＴ７７４７の場合には、５００ｐｂよりも大きいコンティグの大きさは、１，９５３，９８９ｐｂである。
【０１２０】
発明者が標準的なパラメータで適用したＮｅｗｂｌｅｒソフトウェア（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、配列をフィルター処理し、アセンブリすることで、菌株ＣＥＣＴ７７４６の５００ｐｂよりも大きい合計１０９のアセンブリ、及び菌株ＣＥＣＴ７７４７の合計５１のコンティグを得た。続いて、前記ゲノムを自動的にアノテートすることで、前記菌株ＣＥＣＴ７７４６及びＣＥＣＴ７７４７の完全なゲノム配列を得た。
【０１２１】
菌株ＣＥＣＴ７７４６及びＣＥＣＴ７７４７の完全なゲノムを一旦得ると、細菌の系統樹を作成する際に最も普及している、１６Ｓ及び２３ＳｒＲＮＡ遺伝子の完全な配列に基づいて得られた系統樹を基に、前記分離株を分類学的にアサインした。
【０１２２】
１６Ｓと２３ＳｒＲＮＡ遺伝子の配列を一緒に結合することによって、４，０００のヌクレオチドよりも大きい、単一のフラグメントを得、これまでに配列が決定されたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ種の同じフラグメントを一緒に並べた（ａｌｉｇｎ）。配列を、１６Ｓ及び２３Ｓ遺伝子を別々に並べ、ＭＡＦＦＴフリーコンピューターソフトウェアを用いてその配列を一列に並べ、続いて、前述のアラインメントを一緒に結合する。その後、そのアラインメントを、ＧＢｌｏｃｋｓフリーコンピューターソフトウェアを用いて精製することで、保存された情報価値のある位置を選択する。５００の繰り返し（ｒｅｐｅａｔｓ）を用いたｍａｘｉｍｕｍ  ｖｅｒｉｓｉｍｉｌｉｔｕｄｅ  ｍｅｔｈｏｄを利用する、ＲＡｘＭＬプログラムを使用して、前記系統樹を得る。得られた系統樹は、異なる個人に由来し、さらに種のＳ．ｍｉｔｉｓ／ｏｒａｌｉｓ／ｉｎｆａｎｔｉｓクラスタに属するにも関わらず、両方の菌株が姉妹株であることを示し、系統樹のトポロジーは、両方の菌株が新しく、記載されていなかった種に属する菌株であることを示す。
【０１２３】
前記２つの菌株が、異なる種に属するかどうかを決定するために、ＡＮＩ（平均ヌクレオチド同一性）を使用した。配列が決定された株のゲノムを比較する場合、ヌクレオチドのレベルで同じ種の相同遺伝子間の類似性の平均は、９５％よりも大きい（３４及び３５）。実際に、分類学者は、この９５％のＡＮＩ値を、別々の細菌の単離株が異なる種に属する限界として認めており、また、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション値（３６）において古典的な７０％の閾値の代わりとして認めている。Ｊ−ｓｐｅｃｉｅｓフリーコンピューターソフトウェアを用いて本発明のＣＥＣＴ７７４６及びＣＥＣＴ７７４７の２つの配列が決定された菌株の間のＡＮＩ値を決定し、配列が決定された残りのＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉは、２つの菌株が今のところ、記載されていなかった新たな種に属していることを示した。本発明ＣＥＣＴ７７４６の菌株の場合、９５％の閾値より高い類似性を有する菌株はなく、本発明ＣＥＣＴ７７４７の菌株の場合、配列が決定された別の菌株、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  Ｍ１４３のみが、前記閾値を超える。前記菌株Ｍ１４３は、ゲノムのドラフト配列があるにも関わらず、種として分類的に記載されていない。ＡＮＩを計算するために使用した結果は、Ｍｕｍｍｅｒ及びＢｌａｓｔ（３６）の２つの異なる方法論を用いて得られ、両方の方法論はほとんど同一の結果を示した。
【０１２４】
実施例１３．本発明で開示されているＣＥＣＴ  ７７４６及びＣＥＣＴ  ７７４７菌株の培地から得られる上清が存在する中でのカリエス性細菌である、Ｓ．ｍｕｔａｎｓの阻害アッセイ
本発明の２つの菌株、ＣＥＣＴ  ７７４６及び７７４７を３７℃の温度で、ＢＨＩ培地内で増殖させ、その次に、指数増殖期と定常期に、培地の上清を集め、０．２ミクロンのフィルターに通して濾過し、任意の細菌の残留物を除去した。続いて、本発明で示される、前の実施例で述べたように、１００、１０及び３ｋＤａ（Ａｍｉｃｏｎ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の孔サイズを備えた膜を用いて、遠心分離することで、前述の上清をもう一度濾過した。
【０１２５】
Ｓ．ｍｕｔａｎｓの細菌培地の増殖の阻害をもたらす、増殖の定常期で回収した各菌株ＣＥＣＴ７７４６及び７７４７から得られた上清の画分を、試験菌株、ＣＥＣＴ７７４６（図１４Ａ）及びＣＥＣＴ７７４７（図１４Ｂ）の両方のために、３ｋＤａよりも小さなサイズの画分に濃縮した。前記結果は、カリエス性種に対する特定の殺菌効果を示す、前記菌株により合成された阻害物質が、バクテリオシンの場合のように、好ましくは、３ｋＤａ未満の小さなサイズでなければならないことを表す。
【０１２６】
これに対して、増殖の指数増殖期に回収した本発明のＣＥＣＴ７７４６及び７７４７の菌株の培地の上清のサンプルで、同じ実験を行った際には、Ｓ．ｍｕｔａｎｓの細菌培地の増殖の阻害は観察されなかったが（図１５）、このことは、本発明の菌株の細菌増殖の定常期においてのみ、阻害剤が生成されることを示す。
【０１２７】
３ｋＤａよりも小さい、定常期で得られた上清を濃縮したサンプルを、１０分間１００℃の温度にさらした際、Ｓ．ｍｕｔａｎｓの培地上での前記上清の阻害活性が維持され、むしろ増加したことが確認された（図１６）。これらの結果は、小さいサイズであるバクテリオシンが極めて熱に安定であって、その集合体を熱ショックによって溶解させた後の方が培地中により溶出し、むしろ抗菌効果を増加させることから、阻害剤がバクテリオシンであって、その他のタイプのペプチドでないという事実と一致する。
【０１２８】
続いて、Ｓ．ｍｕｔａｎｓの培地に対する阻害アッセイを、本発明ＣＥＣＴ７７４６及びＣＥＣＴ７７４７の菌株の培地から得られた上清で、ただし、前記カリエス性のバクテリアの培地の接種の濃度と増殖温度を修正して行うことにより、前記修正が本発明の菌株の上清の阻害活性に何らかの効果があるか否かを確認した。
【０１２９】
最初に、培養プレートにＳ．ｍｕｔａｎｓカリエス性細菌を植え、また、２４時間が経過した後、本発明の菌株を同じ培養プレート内に植えた。時間が経過した後、阻害ハロは観察されなかった。これに対して、培養プレートに両方の菌株を同時に植えた時、我々が以前に示したように、Ｓ．ｍｕｔａｎｓの増殖の阻害が観察された。本発明ＣＥＣＴ７７４６及び７７４７の菌株を最初に植え、２４時間後、Ｓ．ｍｕｔａｎｓの菌株を植えた時、Ｓ．ｍｕｔａｎｓの培地の増殖の最も大きな阻害が観察され、このことは、カリエス性細菌の増殖前に阻害剤又は阻害物質がより高い濃度で存在することを示し、さらに、前記細菌の存在は、本発明の菌株による阻害剤の生成を活性化させるのに必要ではないことを示す。
【０１３０】
続いて、定常期の液体培地に、最初に本発明の菌株を一滴の培地で植え、次にＳ．ｍｕｔａｎｓの異なる温度：３０℃、３３℃及び３６℃でのタペストリー培養（ｔａｐｅｓｔｒｙ  ｃｕｌｔｕｒｅ）により、カリエス性細菌の増殖に対する阻害実験を、固形培地の中で行った。Ｓ．ｍｕｔａｎｓの増殖の阻害は、３０℃の温度で観察されなかったが、３３℃で観察され、それは実際、３６℃で得られたＳ．ｍｕｔａｎｓの増殖の阻害より大きかった。
【０１３１】
実施例１４．好気生活と嫌気生活の条件下で、本発明ＣＥＣＴ７７４６及びＣＥＣＴ７７４７の菌株の培地から得られた上清の存在する中で培養された、カリエス性細菌である、Ｓ．ｍｕｔａｎｓに対する阻害アッセイ
カリエス性細菌の増殖に対する本発明の菌株の阻害作用が、好気生活又は嫌気生活によって修正されるか否かを決定するために、固体のＢＨＩ培地に、嫌気ジャー内で１２時間、定常期において、液体培地で、本発明の菌株を一滴の培地で最初に植え、次に３７℃でＳ．ｍｕｔａｎｓのタペストリー培養（ｔａｐｅｓｔｒｙ  ｃｕｌｔｕｒｅ）、又は３７℃でＳ．ｍｕｔａｎｓを一滴の培地で植えることにより、阻害試験を行った。
【０１３２】
両方の実験の結果は、嫌気条件で、特に菌株ＣＥＣＴ７７４６において、Ｓ．ｍｕｔａｎｓの成長の阻害が非常に低いことを示した（図１７）。したがって、前述の結果は、本発明の菌株が、カリエス性細菌に及ぼした阻害が歯垢の形成の好気的な段階の間、すなわち、歯垢の接着及び歯の上のバイオフィルムの最初の形成の期間中に、より有効であることを実証する。
【０１３３】
実施例１５．人工歯モデルにおけるそのバイオフィルム上の細菌の菌株ＣＥＣＴ７７４６及びＣＥＣＴ７７４７並びにそれらの上清の抗カリエス性効果
本発明で開示された菌株の抗カリエス性効果を実証するために、酸の生成に対する阻害アッセイを、人工歯モデルにおけるバイオフィルム上で菌株ＣＥＣＴ７７４６及びＣＥＣＴ７７４７で行った。前記実験を、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｄｅｎｔｉｓｔｒｙ  Ａｍｓｔｅｒｄａｍ（ＡＣＴＡ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）のＡｃｔｉｖｅ  Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  バイオフィルムモデル上で行った。前記バイオフィルムモデルは、Ｅｘｔｅｒｋａｔｅ  ＲＡ  ｅｔ  ａｌ．（３７）に記載された。簡潔には、プロバイオティック菌株が存在する又は存在しない、あるいはその上清が存在する又は存在しない、高い割合のＳ．ｍｕｔａｎｓ（４％より高い）を有するボランティアのヒトの唾液を、ヒドロキシアパタイトディスク又はガラスディスクに接種する。本アッセイでは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｔｉｓ／ｏｒａｌｉｓ／ｉｎｆａｎｔｉｓグループの種に属し、カリエスを有さない個体から得た、カリエス性種の増殖の阻害をもたらさないため陰性対照としてふるまう、分離株Ｃ７．１とともに、本発明で開示された菌株ＣＥＣＴ７７４６及び７７４７を試験する。
【０１３４】
ヒトの唾液を、−８０℃で保管する。プロバイオティック菌株ＣＥＣＴ７７４６及び７７４７、ならびに対照菌株Ｃ７．１を、およそ４×１０８ｃｆｕ（Ｃｏｌｏｎｙ−Ｆｏｒｍｉｎｇ  Ｕｎｉｔｓ）の培養密度が得られるまで、スクロースを備えたＢＨＩ培養培地で、１２時間増殖させる。続いて、唾液サンプルを、本発明のプロバイオティック菌株（ＣＥＣＴ７７４６又は７７４７）の接種菌液と、又は対照菌株（Ｃ７．１）の接種菌液と５０％で混合し、グラスディスク上に適用した。
【０１３５】
好気生活及び嫌気生活の下で、調整済の人工唾液培地（３８）内で、バイオフィルムを４８時間形成し、一旦形成すると、酸の生成を測定するために、０．２％のグルコースを包含しているシステインペプトン水（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＵＳＡ）中で、３７℃の温度で３時間インキュベートする。このインキュベーション期間に菌株は酸を生成し、それを発色反応を用いて測定する：バクテリアの代謝を止めるために、前記バイオフィルムをエッペンドルフチューブに移し、８０℃の温度で５分間インキュベートする。Ｐｈａｍ  ＬＣ  ｅｔ  ａｌ．（３８）によって開示されているプロトコルに従って、Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｍａｘ  Ｍ２分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，  ＵＳＡ）を用いた比色アッセイを用いて、Ｌ−乳酸の量を酵素的に決定する。
【０１３６】
対照菌株（Ｃ７．１）と同時に、本発明の菌株（ＣＥＣＴ７７４６及び７７４７）の上清による酸の生成の阻害を分析するために、まず、前記菌株の培地の上清を得た。この目的のために、前記菌株の培地を、１２時間ＢＨＩ培地内で増殖させた。続いて、細菌細胞を、遠心分離と、その後に続く０．２ミクロンの大きさを備えた孔を通した濾過によって除去した。培地を、Ａｍｉｃｏｎ  １００−、１０−、及び３−ｋＤａ  Ｕｌｔｒａ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通して濾過する。３ｋＤａより小さい画分を、ロタバパー内でのその体積の半分に濃縮し、５０％で唾液サンプルと混合した；続いて、プロバイオティクスの場合のように、酸の産生を測定できるようにするために、バイオフィルムを４８時間形成し、０．２％のグルコースを包含するＢｕｆｆｅｒｅｄ  Ｐｅｐｔｏｎｅ  Ｗａｔｅｒ培養培地（３８）内で３時間インキュベートする。
【０１３７】
それぞれの処置を、好気生活及び嫌気生活の下で、４重に繰り返す。分析した実験グループは次のとおりであった：
１．  唾液接種菌液で形成したバイオフィルム。
２．  唾液接種菌液＋ＣＥＣＴ７７４６で形成したバイオフィルム。
３．  菌株ＣＥＣＴ７７４６で形成したバイオフィルム。
４．  唾液接種菌液＋ＣＥＣＴ７７４７で形成したバイオフィルム。
５．  負荷ＣＥＣＴ７７４７で形成したバイオフィルム。
６．  唾液接種菌液＋非阻害Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ菌株（菌株Ｃ７．１）で形成したバイオフィルム。
７．  唾液接種菌液＋活発な阻害物質を包含した菌株ＣＥＣＴ７７４６の上清で形成したバイオフィルム。
８．  唾液接種菌液＋活発な阻害物質を包含した菌株ＣＥＣＴ７７４７の上清で形成したバイオフィルム。
９．  唾液接種菌液＋非阻害菌株（菌株Ｃ７．１）の上清で形成したバイオフィルム。
１０．  非阻害Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ菌株（菌株Ｃ７．１）で形成したバイオフィルム。
【０１３８】
結果を図１８に表し、それは、菌株ＣＥＣＴ７７４６（実験グループ３）又はＣＥＣＴ７７４７（実験グループ５）単独で形成された単一特異的なバイオフィルムが、唾液単独で形成された単一特異的なバオイフィルム（実験グループ１）よりも著しく低い量の酸を生成することを示す。参照値としてヒトの唾液（実験グループ１）をとると、菌株ＣＥＣＴ７７４７（実験グループ８）の上清は、好気生活と嫌気生活の両方の下で、酸の生成を著しく減少させたが、他方で、菌株ＣＥＣＴ７７４６（実験グループ７）の上清は、嫌気生活の下でのみ、バイオフィルムによって生成される酸の量を減少させた。菌株ＣＥＣＴ７７４７のバイオフィルムへの追加は、好気生活と嫌気生活の両方の下で、酸の生成を減少させ、他方で、菌株ＣＥＣＴ７７４６のバイオフィルムへの追加は、好気生活の下でのみ、減少を引き起こした。
【０１３９】
特に菌株ＣＥＣＴ７７４７及びその上清の場合には、微生物が食物として摂取された糖を発酵させる際に、後者が微生物による酸の生成によって形成されるので、酸の減少は、歯のカリエスの処置及び予防には非常に適切である。酸性ｐＨは明確にエナメルを脱ミネラル化し、カリエスを生成するものであるため、ｍｕｔａｎｓのグループに由来するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉだけでない、任意の酸生成の種が、潜在的にカリエス性であり得る（２）。したがって、酸生成における減少は、プロバイオティック菌株又はその上清による処置の効果全体が酸の減少であり、その結果として、カリエスの進行のより低い可能性を示すものである。
【０１４０】
【表４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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