(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物において変形性関節疾患を診断するための方法であって、
動物から唾液試料を採取するステップと、
ＩＦＮγ、ＩＰ−１０、ＩＬ−２及びＴＳＰからなる群から選択される少なくとも１種の診断物質の、唾液試料中の量を決定するステップと、
唾液試料中の診断物質の量を、変形性関節疾患を患っていない１又は複数の比較対照動物からの唾液試料中の同種の診断物質の対応量と比較するステップと、
を含み、
動物からの唾液試料中の診断物質の量が１又は複数の比較対照動物からの唾液試料中の同種の診断物質の量よりも多い場合に、該動物は変形性関節疾患に罹患しやすい又は罹患していると診断され、
前記動物はイヌ科動物である、
方法。
【請求項２】
診断は、少なくとも２種の診断物質の量を決定することに基づいている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
２種の診断物質はＩＦＮγ及びＩＰ−１０である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
診断は、少なくとも３種の診断物質の量を決定することに基づいている、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
診断は、４種すべての診断物質の量を決定することに基づいている、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
唾液中のＩＦＮγの量が１又は複数の比較対照動物からの唾液試料中のＩＦＮγの量の少なくとも１．２倍であるか、あるいは唾液中のＩＰ−１０の量が１又は複数の比較対照動物からの唾液試料中のＩＰ−１０の量の少なくとも１．４倍であるか、あるいは唾液中のＩＬ−２の量が１又は複数の比較対照動物からの唾液試料中のＩＬ−２の量の少なくとも１．６倍であるか、あるいは唾液中のＴＳＰの量が１又は複数の比較対照動物からの唾液試料中のＴＳＰの量の少なくとも１．８倍である場合に、該動物は変形性関節疾患に罹患しやすい又は罹患していると診断される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
唾液中のＩＦＮγの量が１又は複数の比較対照動物からの唾液試料中のＩＦＮγの量の少なくとも１．２倍であり、かつ唾液中のＩＰ−１０の量が１又は複数の比較対照動物からの唾液試料中のＩＰ−１０の量の少なくとも１．４倍である場合に、該動物は変形性関節疾患に罹患しやすい又は罹患していると診断される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
唾液中のＩＦＮγの量が１又は複数の比較対照動物からの唾液試料中のＩＦＮγの量の少なくとも１．２倍であり、かつ唾液中のＩＰ−１０の量が１又は複数の比較対照動物からの唾液試料中のＩＰ−１０の量の少なくとも１．４倍であり、かつ唾液中のＩＬ−２の量が１又は複数の比較対照動物からの唾液試料中のＩＬ−２の量の少なくとも１．６倍であり、かつ唾液中のＴＳＰの量が１又は複数の比較対照動物からの唾液試料中のＴＳＰの量の少なくとも１．８倍である場合に、該動物は変形性関節疾患に罹患しやすい又は罹患していると診断される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記関節は、平面関節、蝶番関節、顆状関節、鞍関節、球関節、又は車軸関節である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記関節は、膝関節、肘関節、指節間関節、中手指節関節、手首関節、手根中手関節、母指関節、肩関節、股関節、顎関節、又は橈尺関節である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記関節は肩関節である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記関節は股関節である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記動物はイヌである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
動物において変形性関節疾患を診断するための方法であって、
動物から唾液試料を採取するステップと、
ＩＦＮγ、ＩＰ−１０、ＩＬ−２及びＴＳＰからなる群から選択される少なくとも１種の診断物質の、唾液試料中の量を決定するステップと、
唾液試料中の診断物質の量を、変形性関節疾患を患っていない１又は複数の比較対照動物からの唾液試料中の同種の診断物質の対応量と比較するステップと、
を含み、
評価対象の動物の唾液中のＩＦＮγの量が１又は複数の比較対照動物の唾液中のＩＦＮγの量の少なくとも１．２倍であるか、あるいは評価対象の動物の唾液中のＩＰ−１０の量が１又は複数の比較対照動物の唾液中のＩＰ−１０の量の少なくとも１．４倍であるか、あるいは評価対象の動物の唾液中のＩＬ−２の量が１又は複数の比較対照動物の唾液中のＩＬ−２の量の少なくとも１．６倍であるか、あるいは評価対象の動物の唾液中のＴＳＰの量が１又は複数の比較対照動物の唾液中のＴＳＰの量の少なくとも１．８倍である場合に、該動物は変形性関節疾患に罹患しやすい又は罹患していると診断され、
前記動物はイヌ科動物である、
方法。
【請求項１５】
動物において変形性関節疾患を診断するための方法であって、
動物から唾液試料を採取するステップと、
ＩＦＮγ、ＩＰ−１０、ＩＬ−２及びＴＳＰからなる群から選択される少なくとも１種の診断物質の、唾液試料中の量を決定するステップと、
唾液試料中の診断物質の量を、変形性関節疾患を患っていない１又は複数の比較対照動物からの唾液試料中の同種の診断物質の対応量と比較するステップと、
を含み、
評価対象の動物におけるＩＦＮγの量が１又は複数の比較対照動物の唾液中のＩＦＮγの量の約１．２〜約２０倍であるか、あるいは評価対象の動物におけるＩＰ−１０の量が１又は複数の比較対照動物の唾液中のＩＰ−１０の量の約１．４〜約２０倍であるか、あるいは評価対象の動物におけるＩＬ−２の量が１又は複数の比較対照動物の唾液中のＩＬ−２の量の約１．６〜約２０倍であるか、あるいは評価対象の動物におけるＴＳＰの量が１又は複数の比較対照動物の唾液中のＴＳＰの量の約１．８〜約２０倍である場合に、該動物は変形性関節疾患に罹患しやすい又は罹患していると診断され、
前記動物はイヌ科動物である、
方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
[0001]本出願は、２０１１年５月１０日出願の米国特許仮出願第６１／５１８７０７号に基づく優先権を主張するものである。その仮出願の開示内容は、ここで参照されることにより本明細書に組み込まれる。
【発明の背景】
【０００２】
発明の分野：
[0002]本発明は概して疾患の診断方法に関し、特に変形性関節疾患の診断方法に関する。
【０００３】
関連技術の説明：
[0003]関節に関連した状態を診断するための方法は当技術分野で知られている。国際公開第２８０４９２２５Ａ１号パンフレットには、試料（例えば関節軟骨細胞試料）中の下垂体ホメオボックス転写因子１（ｐｉｔｘ−１）抑制タンパク質又は複合体（例えば、プロヒビチン又はプロヒビトン）細胞局在を決定することによって骨関節炎を予知する方法が開示されている。米国特許出願公開第２００７０２４８９８６Ａ１号には、未分化関節炎を最近発症した個人が関節リウマチを発症する可能性を予測するための方法であって、一組の臨床パラメータ値を測定し、該パラメータ値を種々のパラメータ値（例えば、Ｃ反応性タンパク質、リウマトイド因子、抗ＣＣＰ抗体の血清レベル、年齢、性別、関節の病訴の局在、朝のこわばりの長さ、並びに圧痛のある及び／又は腫大した関節の数）に関連した所定のリスク値と相関させることによって、予測される関節リウマチ発症リスクを判定する方法が開示されている。米国特許第７００５２７４号には、ヒトにおける関節障害発症リスクの早期発見のための診断方法であって、ミトコンドリア機能の変化の１つ又は複数の指標（例えば、酵素（例えばミトコンドリア酵素）、ＡＴＰ生合成因子、ミトコンドリアの質量、ミトコンドリアの数、ミトコンドリアのＤＮＡ含有量、細胞内カルシウムの上昇及びアポトーシス誘導物質に対する細胞応答、並びにフリーラジカル生成）のレベルを比較することによって診断が行われる方法と、関節障害の治療に有用な治療剤のためのスクリーニングアッセイと、が開示されている。米国特許出願公開第２００４０２４２９８７Ａ１号には、関節の画像から得られるミクロ及びマクロ構造的又は生体力学的なパラメータを得、該パラメータのうちの少なくとも２つ（例えば、マクロ解剖学的パラメータ及び生体力学的パラメータ）を分析することによって、筋骨格系に影響を及ぼす骨又は関節の疾患（例えば骨粗鬆症）を予測する方法が開示されている。他の既知の方法としては、例えば、理学的検査、単純Ｘ線写真検査、コンピュータ体軸断層撮影（ＣＡＴ）、磁気共鳴画像（ＭＲＩ）スキャン、造影Ｘ線検査、及び関節鏡検査が挙げられる。
【０００４】
[0004]理学的検査及び単純Ｘ線写真検査を用いて動物における関節に関連した状態（例えば変形性関節疾患）を診断するのは一般的である。特に、これらの方法は、種々の動物（イヌ等）において骨関節炎を診断する主要な手段である。しかし、罹患動物は、変形性関節疾患を示唆する明白な跛行又は他の症状を示さないことが多い。残念なことに、このことは、観察可能な臨床徴候は変形性関節疾患（例えば骨関節炎）の推定的な診断を支持するには不十分ということを意味する。さらに、単純Ｘ線写真検査は、最も頻繁に用いられるスクリーニング技術であり、骨の変化は明らかにするが、関節包等の軟組織の変化を示さないことが多く、そのため日常的な診断が難しくなっている。同様に、ＣＡＴ及びＭＲＩスキャンは高価であり、幅広くは利用できないことが多い。造影Ｘ線検査及び関節鏡検査はいくらかの侵襲性を付加する。いく種かの動物（イヌ等）において、これらの追加のモダリティは何らかの制約（例えば麻酔）を常に必要とし、そのため、コスト、複雑さ及びリスクが付加される。既知の方法にはこのような制限があるため、しばしば変形性関節疾患は診断されないままになる。したがって、動物において変形性関節疾患を診断するための新たな方法が必要とされている。
【発明の概要】
【０００５】
[0005]すなわち、本発明の目的は、動物において変形性関節疾患を診断するための方法を提供することである。
【０００６】
[0006]このような目的は、動物において変形性関節疾患を診断するための方法であって、動物から唾液試料を採取することと、ＩＦＮγ、ＩＰ−１０、ＩＬ−２及びＴＳＰからなる群から選択される少なくとも１種の診断物質の、唾液試料中の量を決定することと、唾液試料中の診断物質の量を、変形性関節疾患を患っていない１又は複数の比較対照動物からの唾液試料中の同種の診断物質の対応量と比較することと、動物からの唾液試料中の診断物質の量が１又は複数の比較対照動物からの唾液試料中の同種の診断物質の量よりも多い場合に、該動物は変形性関節疾患に罹患しやすい又は罹患していると診断することと、を含む方法を用いて達成される。
【０００７】
[0007]本発明のさらなる目的、特徴及び利点は当業者には明らかであろう。
【発明の詳細な説明】
【０００８】
定義：
[0008]「動物」とは、変形性関節疾患に罹患しやすい又は罹患しているあらゆる動物を意味する。動物としては、例えば、ヒト、鳥類、ウシ属の動物、イヌ科の動物、ウマ科の動物、ネコ科の動物、ヤギ属の動物、オオカミ、ネズミ科の動物、ヒツジ、ブタが挙げられる。
【０００９】
[0009]「比較対照動物」とは、同一の種及びタイプの動物あるいは２つの異なる時点で評価される一個の動物を意味する。
【００１０】
[0010]「関節」とは、骨であれ軟骨であれ、動物の骨格の２以上の隣接部分間の連結部を意味する。
【００１１】
[0011]「変形性関節疾患」とは、関節の軟骨の炎症、破壊、及び終局的な損失によって引き起こされる疾患又は他の状態を意味する。変形性関節疾患は骨関節炎又は変形性関節症としても知られる。
【００１２】
[0012]「コンパニオンアニマル」とは飼い慣らされた動物を意味し、例えば、イヌ、ネコ、トリ、ウサギ、モルモット、フェレット、ハムスター、マウス、アレチネズミ、プレジャーホース、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ロバ、ブタ、並びに同伴、娯楽、精神的支援、外向けの飾り、及び人間が他種の動物と共有する必要のあるその他のすべての機能のために人間に飼われているより珍しい種の動物が挙げられる。
【００１３】
[0013]本明細書において、範囲内の１つ１つの値を列挙及び記載することを避けるため、範囲は簡略に記載する。範囲の上限値、下限値又は端値として、必要に応じて範囲内の任意の適切な値を選択し得る。
【００１４】
[0014]本明細書では、文脈上明らかに他の意味に解すべき場合でない限り、単語の単数形は複数形を含み、逆もまた同様である。したがって、“ａ”、“ａｎ”及び“ｔｈｅ”は概してその語の複数形を含む。例えば、“ａ  ｊｏｉｎｔ”又は“ａ  ｍｅｔｈｏｄ”は、その複数形の“ｊｏｉｎｔｓ”又は“ｍｅｔｈｏｄｓ”を含む。同様に、“ｃｏｍｐｒｉｓｅ”、“ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ”及び“ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ”は、排他的ではなく包含的に解釈されるべきである。同様に、“ｉｎｃｌｕｄｅ”、“ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ”及び“ｏｒ”は、文脈上明らかに他の意味に解すべき場合でない限り包含的に解釈されるべきである。
【００１５】
[0015]本明細書に開示される方法、組成物及び他の提案は、本明細書に記載の特定の方法、プロトコール及び試薬に限定されるものではない。なぜならば、当業者には理解されるように、それらは変わり得るものだからである。さらに、本明細書で使用される用語は、専ら特定の実施形態を記載するためのものであり、開示又は請求の範囲を限定するものではない。
【００１６】
[0016]特に断らない限り、本明細書で使用されるすべての技術的・科学的用語、当技術分野の用語、及び頭字語は、本発明の分野又は当該用語が使用される分野の当業者が通常理解するのと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様又は同等のすべての組成物、方法、製品又は他の手段若しくは材料は本発明の実施に際して使用することができるが、本明細書には、好ましい組成物、方法、製品又は他の手段若しくは材料が記載されている。
【００１７】
[0017]本明細書で引用又は参照されたすべての特許、特許出願、出版物、技術的及び／又は学術的論文及び他の文献は、ここで参照されることにより、法律で許容される範囲でその全体が本明細書に組み込まれる。これらの文献についての説明は、単にその主張内容を要約することを意図したものである。そのような特許、特許出願、出版物又は文献又はそれらの任意の一部が関連技術又は先行技術であることを認めるものではない。そのような特許、特許出願、出版物及び他の文献が関連技術又は先行技術であるとのいかなる主張に関しても、その正確性及び妥当性について異議を申し立てる権利は特に留保されている。
【００１８】
発明：
[0018]一態様において、本発明は、動物において変形性関節疾患を診断するための方法を提供する。この方法は、動物から唾液試料を採取することと、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）、インターフェロン誘導タンパク質−１０（ＩＰ−１０）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）及び唾液総タンパク質（ＴＳＰ）からなる群から選択される少なくとも１種の診断物質の、唾液試料中の量を決定することと、唾液試料中の診断物質の量を、変形性関節疾患を患っていない１又は複数の比較対照動物からの唾液試料中の同種の診断物質の対応量と比較することと、動物からの唾液試料中の診断物質の量が１又は複数の比較対照動物からの唾液試料中の同種の診断物質の量よりも多い場合に、該動物は変形性関節疾患に罹患しやすい又は罹患していると診断することと、を含む。
【００１９】
[0019]本発明は、本発明の診断物質が動物の唾液中に存在し、唾液中の該診断物質の量は、変形性関節疾患についての閾値を示す又は予測することによって、変形性関節疾患を診断するための生化学的指標としての役割を果たすという発見に基づいている。本発明は、獣医及び他の臨床医が唾液中のこれらの「バイオマーカー」についての試験を行い、該動物が変形性関節疾患に罹患しやすい又は罹患しているかどうか、及びさらなる診断又は治療の必要性があるかどうかを判定するのを可能にする。さらなる診断又は治療の必要性が明らかになれば、そうしたさらなる診断又は治療のコスト及びリスクが正当化される。
【００２０】
[0020]種々の実施形態では、変形性関節疾患について評価されている動物ではなく、変形性関節疾患を患っていないと判定されている１又は複数の比較対照動物が、少なくとも１種の診断物質について評価され、そのような評価の結果は、１種又は複数種の診断物質について評価されている動物からの結果との比較のためのベースライン値として使用される。好ましい実施形態において、診断物質のベースライン値は、多数の比較対照動物を評価することによって決定される。
【００２１】
[0021]他の実施形態では、少なくとも１種の診断物質の量が１個体の動物について該動物の一生にわたって多様な時点で決定され、その結果は、該動物が変形性関節疾患に罹患しやすい又は罹患しているかどうかを判定するために使用される。例えば、少なくとも１種の診断物質の量がその動物の年齢とともに増加する場合には、該動物は変形性関節疾患に罹患しやすい又は罹患していると診断され得る。好ましい実施形態において、動物は定期的に評価され、診断物質についての結果が記録される。次いで、その後の評価により、１種又は複数種の診断物質の量が前回の評価以来増加していることが示される場合には、該動物は変形性関節疾患に罹患しやすい又は罹患していると診断される。
【００２２】
[0022]一実施形態では、評価対象の動物の唾液中のＩＦＮγの量が１又は複数の比較対照動物の唾液中のＩＦＮγの量の少なくとも１．２倍である場合に、該動物は変形性関節疾患に罹患しやすい又は罹患していると判定される。種々の実施形態において、評価対象の動物におけるＩＦＮγの量は１又は複数の比較対照動物の唾液中のＩＦＮγの量の約１．２〜約２０倍である。
【００２３】
[0023]他の一実施形態では、評価対象の動物の唾液中のＩＰ−１０の量が１又は複数の比較対照動物の唾液中のＩＰ−１０の量の少なくとも１．４倍である場合に、該動物は変形性関節疾患に罹患しやすい又は罹患していると判定される。種々の実施形態において、評価対象の動物におけるＩＰ−１０の量は１又は複数の比較対照動物の唾液中のＩＰ−１０の量の約１．４〜約２０倍である。
【００２４】
[0024]さらなる一実施形態では、評価対象の動物の唾液中のＩＬ−２の量が１又は複数の比較対照動物の唾液中のＩＬ−２の量の少なくとも１．６倍である場合に、該動物は変形性関節疾患に罹患しやすい又は罹患していると判定される。種々の実施形態において、評価対象の動物におけるＩＬ−２の量は１又は複数の比較対照動物の唾液中のＩＬ−２の量の約１．６〜約２０倍である。
【００２５】
[0025]他の一実施形態では、評価対象の動物の唾液中のＴＳＰの量が１又は複数の比較対照動物の唾液中のＴＳＰの量の少なくとも１．８倍である場合に、該動物は変形性関節疾患に罹患しやすい又は罹患していると判定される。種々の実施形態において、評価対象の動物におけるＴＳＰの量は１又は複数の比較対照動物の唾液中のＴＳＰの量の約１．８〜約２０倍である。
【００２６】
[0026]診断物質のうちの１種の使用は変形性関節疾患を診断するのに十分であるが、そのような診断物質のうちの少なくとも２種の使用は本発明の範囲に包含され、多くの場合に好ましい。一実施形態において診断は２種の診断物質に基づいており、他の実施形態では３種の診断物質、他の実施形態では４種すべての診断物質に基づいている。診断物質は、任意の組合せで診断のために評価及び使用され得る。好ましい一実施形態において、診断は２種の診断物質、すなわちＩＦＮγ及びＩＰ−１０に基づいている。他の好ましい一実施形態において、診断は４種すべての診断物質に基づいている。
【００２７】
[0027]本発明の方法を用いて、障害を受けやすいあらゆる関節を診断することができる。典型的な関節としては、例えば、平面関節（Ａｒｔｈｒｏｄｉａ）、蝶番関節（Ｇｉｎｇｌｙｍｕｓ）、顆状関節（Ｃｏｎｄｙｌａｒｔｈｒｏｓｉｓ）、鞍関節（Ａｒｔｉｃｕｌｕｓ  ｓｅｌｌａｒｉｓ）、球関節（Ｅｎａｒｔｈｒｏｓｉｓ）、及び車軸関節（Ｔｒｏｃｈｏｉｄｅｓ）が挙げられる。具体的な関節としては、例えば、膝関節、肘関節、指節間関節、中手指節関節、手首関節、手根中手関節、母指関節、肩関節、股関節、顎関節、及び橈尺関節が挙げられる。肩関節及び股関節は変形性関節疾患に特に罹りやすい。
【００２８】
[0028]種々の実施形態において、動物はヒト又はコンパニオンアニマルである。好ましくは、コンパニオンアニマルはイヌ科動物（例えばイヌ）又はネコ科動物（例えばネコ）である。
【００２９】
[0029]動物から唾液を採取するための方法は当業者に知られており、例えば、遊びとして動物と経口で触れ合う玩具又は同様の器具を用いて、又は単に綿棒若しくは同様の器具を用いて唾液試料は採取される。そのような器具は、例えば、Ｏｒａｌ  Ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ  Ａｓｓｅｍｂｌｙというタイトルの米国特許仮出願第６１／４５５１５２号に開示されている。
【００３０】
[0030]唾液中の診断物質の量を決定するための方法は当技術分野でよく知られている。唾液中の本発明の診断物質の濃度の測定（例えばＥＬＩＳＡ試験）のために、当業者は、手動又は自動の種々の化学分析装置を商業的に入手することができる。そのような方法の例は本明細書の実施例に示されている。
【実施例】
【００３１】
[0031]本発明は以下の実施例によりさらに説明することができるが、これらの実施例は、特に断らない限り、単に例示のためのものであり、本発明の範囲を限定するものではないことは理解されよう。
【００３２】
実施例１：
[0032]唾液採取：
サリベッテ（Ｓａｌｉｖｅｔｔｅ）（登録商標）（ＳＡＲＳＴＥＤＴ，Ｇｅｒｍａｎｙ）という市販の唾液採取器具を用いてイヌから唾液を採取した。イヌの口を開き、サリベッテ（登録商標）綿棒を口の中に挿入し、それを動物に約３０〜４５秒間噛ませた。次いで、サリベッテ（登録商標）を取り出し、サリベッテ（登録商標）採取チューブに移した。採取チューブを１０００ｇで２分間回転させることによって唾液を直ちに単離した。最後に、採取チューブの底部先端に収集された唾液試料を新しいマイクロチューブに移し、マイクロチューブをさらなる解析用に−８０℃で直ちに凍結させた。
【００３３】
[0033]イヌ科動物サイトカイン解析：
Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製のＬｕｍｉｎｅｘ多重イヌ科動物サイトカインパネル（カタログ番号ＣＣＹＴＯ−９０Ｋ）を用いて１４種のサイトカインを測定した。製造業者の標準的な手順に従った。すべての唾液試料を使用直前に微量遠心機中、１４０００ｇで２分間回転させた。次いで、上清を新しいマイクロチューブに注意深く移し、Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ａｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  カタログ番号Ｌ−ＡＢ）で１〜３倍で希釈した。Ｃａｎｉｎｅ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  １及び２（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  カタログ番号ＬＣＣ−６０９０）並びに標準物質（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  カタログ番号ＬＣＣ−８０９０）とともに、個々の試料を（製造業者により提供された）予め湿らせた９６ウェルフィルタープレート上に載せた。これらのプレートを製造業者のマニュアルの指示通りに処理した。唾液試料を、１４種のサイトカイン／ケモカイン（ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮγ、ＫＣ、ＩＰ−１０、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＭＣＰ−１、及びＴＮＦα）に対する抗体で固定化されたビーズと混合し、ｌａｂタイタープレートシェーカー（Ｌａｂ−Ｌｉｎｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  モデル番号４６２５）上で強く振盪させながら４℃で一晩インキュベートした。その翌日、プレートをＬｕｍｉｎｅｘ  Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ（カタログ番号Ｌ−Ｗｂ）で洗浄した後に、プレートにＣａｎｉｎｅ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（カタログ番号ＬＣＣ−１０９０）を添加した。次いで、プレートを封止し、タイタープレートシェーカー上で強く振盪させながら室温で１時間インキュベートした。その後、ストレプトアビジン−フィコエリトリン（カタログ番号Ｌ−ＳＡＰＥ３）をプレートに添加し、プレートを（製造業者により提供された）蓋で覆い、光への曝露を防いだ。次いで、覆われたプレートを強く撹拌しながらさらに３０分間インキュベートした。インキュベーション後、プレートをＬｕｍｉｎｅｘ  Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒで洗浄して、ウェル内のビーズをＬｕｍｉｎｅｘシース液に再懸濁し、Ｌｕｍｉｎｅｘ１００ＩＳリーダー上で読み取った。Ｌｕｍｉｎｅｘ  ｘＰＯＮＥＮＴというソフトウェア（バージョン３．１．８７１．０）によって唾液試料のサイトカイン濃度を算出した。
【００３４】
[0034]サブスタンスＰ  ＥＬＩＳＡ：
イヌ科動物の唾液を市販のＥＬＩＳＡキット−Ｐａｒａｍｅｔｅｒ  Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ  Ａｓｓａｙ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，カタログ番号ＫＧＥ００７）で解析した。このアッセイのために、すべてのイヌ科動物唾液試料を（キットに含まれていた）Ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ  Ｄｉｌｕｅｎｔ  ＲＤ５−４５に２０倍で希釈した。（キットに含まれていた）標準物質及び検出抗体をキットの指示通りに同一の希釈液中で調製する。これが競合ＥＬＩＳＡである。３時間のインキュベーション中に、試料中又は標準物質中のサブスタンスＰ（ＳＰ）は、マウス抗サブスタンスＰ（ＳＰ）抗体上の結合部位に関して、一定量のホースラディッシュペルオキシダーゼ−標識化サブスタンスＰ（ＨＲＰ−ＳＰ）と競争することになる。３時間のインキュベーション後、結合していない／過剰なＳＰ−ＨＲＰを洗い流し、結合したＳＰ及びＳＰ−ＨＲＰのみが、抗体を予めコーティングした９６ウェルプレート（キットに含まれている。）に、プレートにコーティングされている抗体とマウス抗ＳＰ抗体との間の相互作用によって結合することができた。最後に、色素原（テトラメチルベンジジン）溶液を９６ウェルプレートに添加した。結合したＳＰではなく、結合したＳＰ−ＨＲＰのみが、この色素原基質と反応して青色を呈する。この反応を２Ｎの硫酸で停止させた後に、プレートリーダー（Ｂｉｏ−ＴＥＫ  ＰｏｗｅｒＷａｖｅ  Ｘ）によって４５０ｎｍの波長で光学濃度（ＯＤ）を測定した。試料中のＳＰの濃度はＯＤに反比例する。このＳＰの濃度を、連続的に希釈したＳＰ標準溶液によって作製された標準曲線から、ＫＣ  Ｊｕｎｉｏｒという名のソフトウェア（バージョン１．４１）を用いて算出した。
【００３５】
[0035]ＩｇＡ  ＥＬＩＳＡ：
市販のイヌ科動物ＥＬＩＳＡキット（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，カタログ番号Ｅ４０−１０４）を用いて唾液ＩｇＡを解析した。すべての抗体及び標準物質はキットに含まれていた。下記のように、一般的なＥＬＩＳＡバッファーを、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した化学物質を用いて内部で調製するか、又は他の会社から直接購入した。
（１）コーティングバッファー，０．０５Ｍ  炭酸塩−炭酸水素塩，ｐＨ９．６
（２）洗浄溶液，５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，０．１４Ｍ  ＮａＣｌ，０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０，ｐＨ８．０
（３）ブロッキング溶液，５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，０．１４Ｍ  ＮａＣｌ，１％  ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ），ｐＨ８．０
（４）試料／結合体希釈液，５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，０．１４Ｍ  ＮａＣｌ，１％  ＢＳＡ，０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０
（４）酵素基質ＴＭＢ，既成の溶液ＳｕｒｅＢｌｕｅ（商標）（ＫＰＬ，カタログ番号５２−００−０３）
（５）停止溶液，４Ｎ  硫酸溶液
【００３６】
[0036]標準的なサンドイッチＥＬＩＳＡ法に従った。９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを、コーティングバッファー中で新たに作製した抗イヌ科動物ＩｇＡ抗体溶液で１時間コーティングし、次いで、洗浄溶液でプレートを洗浄し、ブロッキング溶液を添加して、３０分間インキュベートした。その後、このプレートのウェルに、予め希釈した試料又は標準溶液を添加した。大部分の唾液試料は試料／結合体希釈液に１対５０００で希釈し、測定ＩｇＡ濃度が標準曲線のダイナミックレンジの外にあった場合に調整を行った。１時間のインキュベーション及びさらに１回の洗浄ステップの後に、このプレートに（試料／結合体希釈液に希釈した）ＨＲＰ結合検出抗体溶液を添加し、１時間インキュベートした。洗浄後、酵素基質ＴＭＢを添加することによってプレートの比色定量の発色を開始させた。（適切な濃青色が出現するまでの）１０〜１５分間の発色後、停止液を添加することによって呈色反応を停止させた。最後まで、このプレートのＯＤをプレートリーダー（Ｂｉｏ−ＴＥＫ  ＰｏｗｅｒＷａｖｅ  Ｘ）によって４５０ｎｍで測定した。ＫＣ  Ｊｕｎｉｏｒソフトウェア（バージョン１．４１）を用いて試料中のＩｇＡの濃度を算出した。
【００３７】
[0037]市販のＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号２３２２５）をマニュアルの指示通りに使用して、唾液総タンパク質測定値を決定した。蒸留及び脱イオン化した水中で、（０〜２ｍｇ／ｍｌの）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）標準品の希釈系列をキット中のＢＳＡ標準ストックから調製した。次いで、唾液試料を、検出されたタンパク質濃度がＢＳＡ標準曲線に適合するように適切な倍率まで希釈した。個々の試料についての正しい希釈率を見つけるために何回か要することもある。その後、新しいプラスチック試験チューブ内で、ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ａ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，カタログ番号２３２２１）及び試薬Ｂ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，カタログ番号２３２２４）を５０対１（ｖ／ｖ）でボルテックスによりよく混合させた。その後、希釈した試料又はＢＳＡ標準品を透明な底のプラスチック９６ウェルプレートのウェルに添加し、次いで、試薬Ａ及びＢの混合物をこれらのウェルに添加して、プレートを室温で３０分間インキュベートした。インキュベーション中に、試薬Ｂ中の硫酸銅五水和物が試料中のタンパク質と反応してＣｕ２＋がＣｕ１＋に還元され、次いで、試薬Ａ中のビシンコニン酸（ＢＣＡ）が、還元された（第一銅）陽イオンと反応して紫色の溶液を生成した。これは、タンパク質濃度の上昇とともに、５６２ｎｍにおいて強い直線状の吸光度を示す。試料及び標準物質を含んだプレートを、プレートリーダー（Ｂｉｏ−ＴＥＫ  ＰｏｗｅｒＷａｖｅ  Ｘ）上で５６２ｎｍの波長で読み取ることができる。ＫＣＪｕｎｉｏｒソフトウェア（バージョン１．４１）を用いて該試料中の唾液総タンパク質の濃度を算出した。
【００３８】
[0038]統計解析：
解析ソフトウェアパッケージ「Ｒ」（ｗｗｗ．ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ）を用いて、この試験で生成されたすべてのデータについてＳｔｕｄｅｎｔのＴ検定を行った。２群間の統計的に有意な差を個々の唾液バイオマーカーについて調査した。これらの結果を表１及び表２に示す。表１及び表２を参照すると、変形性関節疾患を有する動物とそれを有しない動物との間でＩＦＮγ、ＩＰ−１０、ＩＬ−２、及び唾液総タンパク質が有意に異なることがデータにより示されている。したがって、これらの物質は、動物において変形性関節疾患のバイオマーカーとして役割を果たす。
【００３９】
【表１−１】
0006018626.tif 000002
【表１−２】
0006018626.tif 000003
【表１−３】
0006018626.tif 000004
【００４０】
【表２】
0006018626.tif 000005
【００４１】
[0039]本明細書では、本発明の代表的な好適な実施形態が開示されている。特定の用語が使用されているが、それらは単に一般的かつ説明的な意味で使用したものであり、限定を意図したものではない。本発明の範囲は特許請求の範囲に記載の通りである。上述の教示内容に照らせば、本発明の多くの修正及び改変が可能であることは明らかである。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲内で、特に記載されている以外の形態でも実施可能であることが理解されよう。