(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Iの化合物、又はその医薬として許容し得る塩若しくは溶媒和物、若しくは医薬として許容し得る塩の溶媒和物：
【化１】
0005947371.tif 000013
。
【請求項２】
医薬として許容し得る担体及び医薬として有効な量の請求項１記載の化合物又はその医薬として許容し得る塩を含む医薬組成物。
【請求項３】
さらなる治療剤を含む、請求項２記載の医薬組成物。
【請求項４】
医薬に使用するための、請求項１記載の化合物若しくはその医薬として許容し得る塩。
【請求項５】
医薬の製造における、請求項１記載の化合物若しくはその医薬として許容し得る塩の使用。
【請求項６】
アレルギー、炎症性病態、自己免疫疾患、増殖性疾患、移植片拒絶、軟骨代謝回転の異常を伴う疾患、先天性軟骨形成異常、及び／又はIL6若しくはインターフェロンの分泌過多に関連する疾患の治療又は予防に使用するための、請求項２若しくは３記載の医薬組成物。
【請求項７】
アレルギー、炎症性病態、自己免疫疾患、増殖性疾患、移植片拒絶、軟骨代謝回転の異常を伴う疾患、先天性軟骨形成異常、及び／又はIL6若しくはインターフェロンの分泌過多に関連する疾患の治療又は予防のための医薬の製造における、請求項１記載の化合物若しくはその医薬として許容し得る塩の使用。
【請求項８】
前記さらなる治療剤が、アレルギー、炎症性病態、自己免疫疾患、増殖性疾患、移植片拒絶、軟骨代謝回転の異常を伴う疾患、先天性軟骨形成異常、及び／又はIL6若しくはインターフェロンの分泌過多に関連する疾患の治療又は予防のための薬剤である、請求項３記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記自己免疫疾患が、COPD、喘息、全身性エリテマトーデス、I型糖尿病、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、若年性特発性関節炎、及び炎症性腸疾患から選択される、請求項６又は８記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記炎症性病態が、関節リウマチ、変形性関節症、喘息、及び炎症性腸疾患から選択される、請求項６又は８記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記自己免疫疾患が、COPD、喘息、全身性エリテマトーデス、I型糖尿病、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、若年性特発性関節炎、及び炎症性腸疾患から選択される、請求項７記載の使用。
【請求項１２】
前記炎症性病態が、関節リウマチ、変形性関節症、喘息、及び炎症性腸疾患から選択される、請求項７記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本願は、米国特許法第119条の定めにより、引用により本明細書に全体として組み込まれている、2011年4月28日に出願された米国仮特許出願第61/479,956号の利益を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、炎症性病態、自己免疫疾患、増殖性疾患、アレルギー、移植片拒絶、軟骨代謝回転の異常を伴う疾患、先天性軟骨形成異常、及び／又はIL6若しくはインターフェロンの分泌過多に関連する疾患に関与するチロシンキナーゼのファミリーであるJAKの阻害剤である化合物に関する。詳細には、本発明の化合物は、JAK1及び／又はJAK2を阻害する。本発明は、本発明の化合物の製造方法、本発明の化合物を含む医薬組成物、炎症性病態、自己免疫疾患、増殖性疾患、アレルギー、移植片拒絶、軟骨代謝回転の異常を伴う疾患、先天性軟骨形成異常、及び／又はIL6若しくはインターフェロンの分泌過多に関連する疾患を含む疾患の、本発明の化合物を投与することによる予防及び／又は治療の方法も提供する。
【０００３】
ヤヌスキナーゼ（JAK）は、膜受容体からSTAT転写因子へサイトカインシグナリングを伝達する細胞質チロシンキナーゼである。4種のJAKファミリーメンバー、JAK1、JAK2、JAK3及びTYK2が記載されている。サイトカインがその受容体に結合すると、JAKファミリーメンバーは、自己リン酸化及び／又は互いにトランスリン酸化し、続いてSTATがリン酸化されて核へ移動し、転写が調節される。JAK-STAT細胞内シグナル伝達は、インターフェロン、ほとんどのインターロイキン、並びにEPO、TPO、GH、OSM、LIF、CNTF、GM-CSF、及びPRLなどの種々のサイトカイン及び内分泌因子の役に立つ（Vainchenker W.らの文献（2008））。
【０００４】
遺伝モデルと小分子JAK阻害剤探索との組合せは、いくつかのJAKの治療上での可能性を明らかにした。JAK3は、免疫抑制の標的としてマウス及びヒト遺伝学で検証されている（O'Shea J.らの文献（2004））。JAK3阻害剤は、当初、臓器移植片拒絶反応への臨床開発の取り組みに成功したが、後に、関節リウマチ（RA）、乾癬、及びクローン病などの他の免疫炎症性の徴候においても臨床開発の取り組みに成功した（http://clinicaltrials.gov/）。
【０００５】
TYK2は、免疫炎症性疾患の潜在的な標的であり、ヒト遺伝学及びマウスノックアウト研究によって検証されている（Levy D.及びLoomis C.の文献（2007））。
【０００６】
JAK1及び／又はJAK2は、免疫炎症性疾患分野における標的である。JAK1及び／又はJAK2は、他のJAKとヘテロ二量体化して、サイトカイン誘導性の炎症促進性シグナルを伝達する。したがって、JAK1及び／又はJAK2の阻害は、IL-6、IL-4、IL-5、IL-12、IL-13、IL-23、又はIFNγなど、JAK1及び／又はJAK2シグナル伝達を利用する病理関連サイトカインによる免疫炎症疾患、並びにJAK媒介性のシグナル伝達により起こされる他の疾患にとって興味深い。
【背景技術】
【０００７】
（発明の背景）
軟骨の変性は、様々な疾患の特徴となっており、その中でも、関節リウマチ及び変形性関節症が最も顕著なものである。関節リウマチ（RA）は、慢性の関節変性疾患であり、関節構造の炎症及び破壊によって特徴付けられる。該疾患を野放しにすると、関節機能性の喪失により相当な身体障害及び疼痛、並びに早死すら招く。したがって、RA治療の目的は、該関節破壊を阻止するために、該疾患の進行を減速するだけでなく、寛解も達成することである。該疾患の予後の厳しさに加えて、RAの高い罹患率（世界中で成人の〜0.8%が罹患している）も、社会経済的影響が大きいことを意味している（RAの概説については、Smolen及びSteinerの文献（2003）；Lee及びWeinblattの文献（2001）；Choy及びPanayiの文献（2001）；O'Dellの文献（2004）、及びFiresteinの文献（2003）を参照されたい。）。
【０００８】
JAK1及びJAK2は、多くのサイトカイン及びホルモンのための細胞内シグナル伝達に関与している。これらのサイトカイン及びホルモンのいずれかに関連する病状は、JAK1及び／又はJAK2阻害剤により改善され得る。そのため、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、若年性特発性関節炎、変形性関節症、喘息、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、組織線維症、好酸球性炎症、食道炎(eosophagitis)、炎症性腸疾患(例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎)、移植片拒絶、移植片対宿主病、乾癬、筋炎、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、若年性特発性関節炎(juvenile ideopathic arthrits)、多発性硬化症(Kopfらの文献、2010)を含む、数種のアレルギー、炎症、及び自己免疫疾患は、本発明に記載される化合物による治療から利益を得る可能性がある。
【０００９】
変形性関節症（OA、又は磨耗性関節炎とも称される）は、最も一般的な形態の関節炎であり、関節軟骨の喪失により特徴付けられ、多くの場合、骨の肥大化及び疼痛と関連する。変形性関節症の広範な概説については、Wielandらの文献（2005）を参照されたい。
【００１０】
変形性関節症は治療が困難である。現在のところ、治癒を得ることはできず、治療は疼痛を緩和すること及び罹患した関節が変形するのを防ぐことに重点をおく。一般的な治療には、非ステロイド性抗炎症薬（NSAID）の使用が含まれる。コンドロイチン及びグルコサミン硫酸塩などの栄養補助食品が、変形性関節症の治療の安全でかつ有効な選択肢として推奨されているが、最近の臨床治験から、両治療が変形性関節症に関連する疼痛を低減させないことが明らかとなった。（Cleggらの文献、2006）。
【００１１】
同化プロセスの刺激、異化プロセスの阻止、又はこれら2つを組み合わせると、軟骨が安定化し、障害の回復さえももたらされる可能性があり、したがって、疾患のさらなる進行を防ぐことができる。変形性関節症疾患の間に出現する関節軟骨病変を矯正するための治療方法が開発されてきたが、そのいずれも、原位置（in situ）及びインビボにおける関節軟骨の再生を媒介することはできていない。まとめると、疾患修飾性の変形性関節症の薬剤は利用できない。
【００１２】
Vandeghinsteらは、その阻害がOAを含む様々な疾患について治療上の関連性を有する可能性がある標的としてJAK1を発見した（WO2005/124342）。マウスのJAK1遺伝子のノックアウトから、JAK1は、発生の間に必須かつ非重複の役割を果たすことが示された：JAK1-/-マウスは生後24時間以内に死亡し、かつリンパ球の発生は著しく損なわれた。さらに、JAK1-/-細胞は、クラスIIサイトカイン受容体を使用するサイトカイン、シグナル伝達にγ-cサブユニットを使用するサイトカイン受容体、及びシグナル伝達にgp130サブユニットを使用するサイトカイン受容体ファミリーに反応しないか、又は反応性が低かった（Rodigらの文献、1998）。
【００１３】
様々な群が、軟骨細胞生物学におけるJAK-STATシグナル伝達に関係している。Liら（2001）は、JAK/STAT及びMAPKシグナル伝達経路の活性化によって、オンコスタチンMが初代軟骨細胞におけるMMP及びTIMP3遺伝子の発現を誘導することを示した。Osakiら（2003）は、軟骨細胞におけるインターフェロン-γ媒介性のII型コラーゲンの阻害がJAK-STATシグナル伝達を含むことを示した。基質構成成分の発現を低下させることによって、並びにコラゲナーゼ及び一酸化窒素（NO）の産生を媒介する誘導型一酸化窒素合成酵素（NOS2）の発現を誘導することによって、IL1-βは軟骨異化反応を誘導する。Oteroら（2005）は、レプチン及びIL1-βが軟骨細胞におけるNO産生又はNOS2 mRNAの発現を相乗的に誘導し、しかも、それがJAK阻害剤によって阻止されることを示した。Legendreら（2003）は、ウシ関節の軟骨細胞において、IL6/IL6受容体が軟骨-特異的基質遺伝子II型コラーゲン、アグリカンコア及びリンクタンパク質の発現低下を誘導し、しかも、これがJAK/STATシグナル伝達によって媒介されることを示した。したがって、これらの観察は、軟骨恒常性維持におけるJAKキナーゼ活性の役割、及びJAKキナーゼ阻害剤に対する治療機会を示唆している。
【００１４】
JAKファミリーメンバーは、骨髄増殖性疾患を含むさらなる病態に関与しており（O'Sullivanらの文献、2007、Mol Immunol. 44(10):2497-506）、該病態におけるJAK2の突然変異が同定されている。これは、JAK、特にJAK2の阻害剤が骨髄増殖性疾患の治療に有用となり得ることも示している。加えて、該JAKファミリー、特にJAK1、JAK2及びJAK3は、ガン、特に白血病、例えば、急性骨髄性白血病（O'Sullivanらの文献、2007、Mol Immunol. 44(10):2497-506；Xiangらの文献、2008、「急性骨髄性白血病患者における体細胞JAK1突然変異の同定（Identification of somatic JAK1 mutations in patients with acute myeloid leukemia）」Blood First Edition Paper, prepublished online 12月26日， 2007；DOI 10.1182/blood-2007-05-090308）及び急性リンパ芽球性白血病（Mullighanらの文献、2009）、又は固形腫瘍、例えば、子宮平滑筋肉腫（Constantinescuらの文献、2007、Trends in Biochemical Sciences 33(3): 122-131）、前立腺ガン（Tamらの文献、2007、British Journal of Cancer, 97, 378-383）に関係している。これらの結果は、JAK、特にJAK1及び／又はJAK2の阻害剤が、ガン（白血病及び固形腫瘍、例えば、子宮平滑筋肉腫、前立腺ガン）の治療にも利用できることを示している。
【００１５】
加えて、キャッスルマン病、多発性骨髄腫、メサンギウム増殖性糸球体腎炎、乾癬及びカポジ肉腫は、サイトカインIL-6の分泌過多に起因する可能性があり、その生物学的作用は細胞内JAK-STATシグナル伝達により媒介される（Tetsuji Naka、Norihiro Nishimoto及びTadamitsu Kishimotoの文献、Arthritis Res 2002, 4 (suppl 3):S233-S242）。この結果は、前記疾患の治療においてJAKの阻害剤の有用性が見出され得ることを示している。
【００１６】
現在の治療は十分なものではなく、したがって、炎症性病態、自己免疫疾患、増殖性疾患、アレルギー、移植片拒絶、軟骨代謝回転の異常を伴う疾患、先天性軟骨形成異常、及び／又はIL6若しくはインターフェロンの分泌過多に関連する疾患、例えば、変形性関節症及び関節リウマチ、特に関節リウマチの治療に有用となり得るさらなる化合物を同定する必要性が残されている。したがって、本発明は、化合物、それらの製造の方法、及び本発明の化合物を好適な医薬担体とともに含む医薬組成物を提供する。本発明は、炎症性病態、自己免疫疾患、増殖性疾患、アレルギー、移植片拒絶、軟骨代謝回転の異常を伴う疾病、先天性軟骨形成異常、及び／又はIL6若しくはインターフェロンの分泌過多に関連する疾病、例えば、変形性関節症及び関節リウマチ、特に関節リウマチの治療のための医薬の製造における本発明の化合物の使用も提供する。
【発明の概要】
【００１７】
本発明は、本発明の化合物がJAKの阻害剤として作用でき、それが、炎症性病態、自己免疫疾患、増殖性疾患、アレルギー、移植片拒絶、軟骨代謝回転の異常を伴う疾病、先天性軟骨形成異常、及び／又はIL6若しくはインターフェロンの分泌過多に関連する疾病の治療のために有用であるという発見に基づいている。具体的な態様において、本発明の化合物は、JAK1及び／又はJAK2の阻害剤である。本発明は、この化合物の製造方法、この化合物を含む医薬組成物、及び本発明の化合物を投与することによる、炎症性病態、自己免疫疾患、増殖性疾患、アレルギー、移植片拒絶、軟骨代謝回転の異常を伴う疾病、先天性軟骨形成異常、及び／又はIL6若しくはインターフェロンの分泌過多に関連する疾病の治療方法も提供する。
【００１８】
したがって、本発明の第一の態様において、提供される本発明の化合物は式(I)によるものである：
【化１】
0005947371.tif 000002
。
【００１９】
特定の実施態様において、本発明の化合物は、JAK1及び／又はJAK2の阻害剤である。
【００２０】
さらなる態様において、本発明は、本発明の化合物、及び医薬用担体、賦形剤又は希釈剤を含む医薬組成物を提供する。さらに、本発明の化合物は、本明細書に開示される医薬組成物及び治療方法に有用であり、製造及び使用されるときに医薬として許容し得るものである。本発明のこの態様において、該医薬組成物は、本発明の化合物と組み合わせた使用に好適なさらなる有効成分をさらに含むことがある。
【００２１】
本発明のさらなる態様において、本発明は、本明細書に列記されるものから選ばれる病態、特に、炎症性病態、自己免疫疾患、増殖性疾患、アレルギー、移植片拒絶、軟骨代謝回転の異常を伴う疾患、先天性軟骨形成異常、及びIL6若しくはインターフェロンの分泌過多に関連する疾患に罹患しやすい又は苦しんでいる哺乳動物の治療又は予防の方法であって、本明細書に記載される有効量の本発明の医薬組成物又は化合物を投与することを含む方法を提供する。特定の実施態様において、該病態は、異常なJAK活性、より特にはJAK1及び／又はJAK2の活性に関連している。
【００２２】
さらなる態様において、本発明は、医薬として使用するための本発明の化合物又は本発明の化合物を含む医薬組成物を提供する。具体的な実施態様において、前記医薬組成物は、さらなる有効成分をさらに含む。
【００２３】
さらなる態様において、本発明は、本明細書に列記されるものから選ばれる病態、特には、炎症性病態、自己免疫疾患、増殖性疾患、アレルギー、移植片拒絶、軟骨代謝回転の異常を伴う疾患、先天性軟骨形成異常、及び／又はIL6若しくはインターフェロンの分泌過多に関連する疾患の治療又は予防に使用するための本発明の化合物を提供する。
【００２４】
さらに別の治療態様の方法において、本発明は、本明細書に列記されているものから選択される、特には、炎症性病態、自己免疫疾患、増殖性疾患、アレルギー、移植片拒絶、軟骨代謝回転の異常を伴う疾病、先天性軟骨形成異常、及び／又はIL6若しくはインターフェロンの分泌過多に関連する疾病に罹患しやすい又は苦しんでいる哺乳動物の治療又は予防の方法を提供し、前記病態の治療又は予防のために、本明細書に記載される本発明の医薬組成物又は化合物を有効量投与することを含む。具体的な実施態様において、該病態は、原因として異常なJAK活性、より特にはJAK1及び／又はJAK2活性に関連している。
【００２５】
さらなる態様において、本発明は、本明細書に列記されるものから選択される病態、特に、炎症性病態、自己免疫疾患、増殖性疾患、アレルギー、移植片拒絶、軟骨代謝回転の異常を伴う疾病、先天性軟骨形成異常、及び／又はIL6若しくはインターフェロンの分泌過多に関連する疾病の治療又は予防に使用するための本発明の化合物を提供する。
【００２６】
追加の態様において、本発明は、本明細書の下記に開示される代表的な合成手順及び経路とともに本発明の化合物の合成方法を提供する。
【００２７】
したがって、本発明の主な目的は、JAKの活性を修飾でき、そのため原因としてそれに関連し得る任意の病態を治療又は予防できる新規の化合物を提供することである。具体的な態様において、本発明の化合物は、JAK1及び／又はJAK2の活性を調節する。
【００２８】
本発明のさらなる目的は、炎症性病態、自己免疫疾患、増殖性疾患、アレルギー、移植片拒絶、軟骨代謝回転の異常を伴う疾患、先天性軟骨形成異常、及び／又はIL6若しくはインターフェロンの分泌過多に関連する疾患などの病態又はその症状を治療又は改善できる化合物を提供することである。
【００２９】
本発明のなおさらなる目的は、炎症性病態、自己免疫疾患、増殖性疾患、アレルギー、移植片拒絶、軟骨代謝回転の異常を伴う疾患、先天性軟骨形成異常、及び／又はIL6若しくはインターフェロンの分泌過多に関連する疾患などの種々の疾病状態の治療又は予防に使用できる医薬組成物を提供することである。具体的な実施態様において、該疾患はJAK1及び／又はJAK2の活性に関連し、特に、炎症性病態、自己免疫疾患、増殖性疾患、アレルギー、移植片拒絶、軟骨代謝回転の異常を伴う疾患、先天性軟骨形成異常、及び／又はIL6若しくはインターフェロンの分泌過多に関連する疾患である。
【００３０】
他の目的及び利点は、次の詳細な説明を考慮することにより、当業者に明らかとなろう。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
（発明の詳細な説明）
（定義）
以下の用語は、それとともに以下に提示される意味を有するものとし、本発明の記載及び意図される範囲を理解するのに有用である。
【００３２】
本発明を記載する場合、化合物、そのような化合物を含む医薬組成物、並びにそのような化合物及び組成物を使用する方法を含み得るが、以下の用語は、存在する場合、他に示さない限り、以下の意味を有する。本明細書に記載される場合、以下に定義される部分はいずれも多様な置換基で置換できること、及びそれぞれの定義が以下に記載されるそれらの範囲内でこのような置換部分を含むものとすることも理解されたい。他に明記しない限り、用語「置換された」とは、以下に記載されるように定義できよう。本明細書に使用される場合、用語「基」及び「ラジカル」が交換可能であるとみなし得ることをさらに理解されたい。
【００３３】
冠詞「a」及び「an」は、本明細書において、1又は2つ以上(すなわち、少なくとも1つ)の該冠詞の文法上の対象を言及するのに使用できる。例として、「アナログ（an analogue）」は、1つのアナログ又は2つ以上のアナログを意味する。
【００３４】
本明細書では、「JAK」という用語は、膜受容体からのサイトカインシグナル伝達をSTAT転写因子に伝達する細胞質チロシンキナーゼであるヤヌスキナーゼ(JAK)のファミリーに関連する。4種のJAKファミリーメンバー、JAK1、JAK2、JAK3、及びTYK2が記載され、JAKという用語は、文脈が示すとおり、JAKファミリーメンバー全てをまとめて意味することも、1つ以上のJAKファミリーメンバーを意味することもある。
【００３５】
「アルコキシ」は、R26がC1-8アルキルである基-OR26を意味する。特定のアルコキシ基は、メトキシ、エトキシ、n-プロポキシ、イソプロポキシ、n-ブトキシ、tert-ブトキシ、sec-ブトキシ、n-ペントキシ、n-ヘキソキシ、及び1,2-ジメチルブトキシである。特定のアルコキシ基は、低級アルコキシ、すなわち1〜6つの炭素原子を有するアルコキシである。さらに特定のアルコキシ基は1〜4つの炭素原子を有する。
【００３６】
「アルキル」は、1〜20個の炭素原子を有する直鎖又は分岐鎖の脂肪族炭化水素を意味する。特定のアルキルは1〜8つの炭素原子を有する。より特定すると、1〜6つの炭素原子を有する低級アルキルである。さらに特定の基は、1〜4つの炭素原子を有する。例示的な直鎖基には、メチル、エチル、n-プロピル、及びn-ブチルがある。分岐は、メチル、エチル、プロピル、又はブチルなどの1つ以上の低級アルキル基が、直鎖状アルキル鎖に結合していることを意味し、例示的な分岐鎖基にはイソプロピル、iso-ブチル、t-ブチル、及びイソアミルがある。
【００３７】
「アリール」は、親芳香族環系の単一の炭素原子から1つの水素原子を除去して誘導される一価芳香族炭化水素基を意味する。特に、アリールは、明示された数の環原子を有する、単環式又は多環式(polyyclic)の芳香族環構造を意味する。具体的には、該用語は、6〜10の環員を含む基を含む。アリール基が単環式環系である場合、それは優先的には6つの炭素原子を含む。詳細には、アリール基には、フェニル、ナフチル、インデニル、及びテトラヒドロナフチルがある。
【００３８】
「置換された」は、1個以上の水素原子が、それぞれ独立に、同一又は異なった置換基（複数可）により置き換えられていることを意味する。
【００３９】
「医薬として許容し得る」とは、連邦政府若しくは州政府の監督機関又は米国以外の国の対応機関により承認されたか又は承認され得ることを意味するか、あるいは、動物、より具体的にはヒトにおける使用のための米国薬局方又は他の公認された薬局方に収載されていることを意味する。
【００４０】
「医薬として許容し得る塩」とは、医薬として許容することができ、かつ親化合物の所望の薬理活性を有する、本発明の化合物の塩をいう。詳細には、そのような塩は無毒性であり、無機又は有機の酸付加塩及び塩基付加塩であり得る。具体的には、そのような塩には下記がある：(1)塩化水素酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などの無機酸で形成された酸付加塩；酢酸、プロピオン酸、ヘキサン酸、シクロペンタンプロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、乳酸、マロン酸、コハク酸、リンゴ酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、3-(4-ヒドロキシベンゾイル)安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、1,2-エタン-ジスルホン酸、2-ヒドロキシエタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、4-クロロベンゼンスルホン酸、2-ナフタレンスルホン酸、4-トルエンスルホン酸、カンファスルホン酸、4-メチルビシクロ[2.2.2]-オクト-2-エン-1-カルボン酸、グルコヘプトン酸、3-フェニルプロピオン酸、トリメチル酢酸、三級ブチル酢酸、ラウリル硫酸、グルコン酸、グルタミン酸、ヒドロキシナフトエ酸、サリチル酸、ステアリン酸、ムコン酸などの有機酸で形成された酸付加塩；又は、(2)親化合物に存在する酸性プロトンが、金属イオン、例えば、アルカリ金属イオン、アルカリ土類イオン、又はアルミニウムイオンにより置換されるか；又はエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、N-メチルグルカミンなどの有機塩基と配位する場合に形成された塩。塩は、単なる例として、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アンモニウム、テトラアルキルアンモニウムなどをさらに含み、化合物が塩基性官能性を含む場合、塩酸塩、臭化水素酸塩、酒石酸塩、メシル酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、シュウ酸塩などの無毒の有機又は無機酸の塩をさらに含む。用語「医薬として許容し得るカチオン」とは、酸性官能基の許容し得るカチオン性対イオンをいう。そのようなカチオンは、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アンモニウム、テトラアルキルアンモニウムカチオンなどにより例示される。
【００４１】
「医薬として許容し得るビヒクル」とは、本発明の化合物とともに投与される希釈剤、補助剤、賦形剤、又は担体をいう。
【００４２】
「プロドラッグ」は、開裂可能な基を有し、加溶媒分解により又は生理学的条件下で、インビボで医薬として活性のある本発明の化合物になる、本発明の化合物の誘導体を含む化合物を意味する。そのような例には、コリンエステル誘導体など、N-アルキルモルホリンエステルなどがあるが、これらに限定されない。
【００４３】
「溶媒和物」とは、通常、加溶媒分解反応によって溶媒と会合する化合物の形態をいう。この物理的会合には水素結合がある。従来型の溶媒には、水、エタノール、酢酸などがある。本発明の化合物は、例えば結晶形で調製でき、溶媒和できるか又は水和できる。適切な溶媒和物には、水和物などの医薬として許容し得る溶媒和物があり、化学量論的溶媒和物及び非化学量論的溶媒和物の両方もさらに含まれる。特定の例において、溶媒和物は、例えば1以上の溶媒分子が結晶質固体の結晶格子に取り込まれている場合に単離できる。「溶媒和物」は、液相及び単離可能な溶媒和物の両方を包含する。代表的な溶媒和物には、水和物、エタノラート及びメタノラートがある。
【００４４】
「対象」はヒトを含む。「ヒト」、「患者」及び「対象」という用語は、本明細書において交換可能に使用される。
【００４５】
「治療上有効な量」とは、疾患を治療するために対象へ投与される場合に、該疾患のそのような治療を発効させるのに十分である化合物の量を意味する。「治療上有効な量」は、化合物、疾患及びその重症性、並びに治療される対象の年齢、体重などに応じて変化し得る。
【００４６】
「予防する（preventing）」又は「予防（prevention）」とは、疾患又は障害を得るか又はかかるリスクの低減を意味する（すなわち該疾患の臨床症状のうちの少なくとも1つを、疾患原因物質に曝露されている可能性がある対象、又は疾患の発症に先立って該疾患に罹りやすい対象において起こさせない）。
【００４７】
用語「予防（prophylaxis）」は「予防（prevention）」に関連し、その目的が疾患を治療又は治癒することよりも予防することにある処置又は手段をいう。予防処置の非限定的な例には、ワクチンの投与；例えば不動化に起因する血栓症のリスクのある入院患者に対する低分子量ヘパリンの投与；及び、マラリアが風土性である、又はマラリアになるリスクが高い地理的領域への訪問に先立つクロロキンなどの抗マラリア薬の投与があり得る。
【００４８】
任意の疾患又は障害の「治療する（treating）」又は「治療（treatment）」とは、一実施態様において、疾患又は障害を回復させること（すなわち、該疾患を抑止するか又はその臨床症状のうちの少なくとも1つの徴候、程度、又は重症度を減少させる）をいう。別の実施態様において、「治療する」又は「治療」とは、少なくとも1つの肉体的パラメーターを回復させることをいい、これは対象によって認識できない場合もある。さらに別の実施態様において、「治療する」又は「治療」とは、肉体的に、(例えば、認識可能な症状の安定化)、生理的に、(例えば、肉体的パラメーターの安定化)、又はその両方のいずれかで、疾患又は障害を調節することをいう。さらなる実施態様において、「治療する」又は「治療」とは、疾患の進行を減速させることに関する。
【００４９】
本明細書では、用語「アレルギー」は、アレルギー性気道疾患(例えば、喘息、鼻炎)、副鼻腔炎、湿疹、及び蕁麻疹性丘疹、並びに食物アレルギー又は昆虫毒に対するアレルギーを含む免疫系の過敏性障害により特徴付けられる一群の病態を意味する。
【００５０】
本明細書では、「炎症性病態（複数可）」という用語は、関節リウマチ、変形性関節症、若年性特発性関節炎、乾癬、乾癬性関節炎、アレルギー性気道疾患（例えば、喘息、鼻炎）、炎症性腸疾患（例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎）、エンドトキシン誘導性疾病状態（例えば、バイパス手術後の合併症又は例えば、慢性心不全の原因となる慢性的なエンドトキシン状態）、及び関節の軟骨などの軟骨に関する関連疾患を含む病態の群をいう。特に該用語は、関節リウマチ、変形性関節症、アレルギー性気道疾患（例えば、喘息）、及び炎症性腸疾患をいう。
【００５１】
本明細書では、「自己免疫疾患（複数可）」は、COPDなどの病態を含む閉塞性気道疾患、喘息（例えば、内因性喘息、外因性喘息、塵埃性喘息（dust asthma）、小児喘息）、特に慢性又は難治性喘息（例えば、遅発型喘息及び気道過敏）、気管支喘息を含む気管支炎、全身性エリテマトーデス（SLE）、皮膚エリテマトーデス、ループス腎炎、皮膚筋炎、シェーグレン症候群、多発性硬化症、乾癬、ドライアイ疾患、I型糖尿病及びそれと関連する合併症、アトピー性湿疹（アトピー性皮膚炎）、接触性皮膚炎及びさらなる湿疹性皮膚炎、炎症性腸疾患（例えば、クローン病及び潰瘍性大腸炎）、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、若年性特発性関節炎、アテローム硬化症、並びに筋萎縮性側索硬化症を含む疾患の群をいう。特に、該用語は、COPD、喘息、全身性エリテマトーデス、I型糖尿病、及び炎症性腸疾患を意味する。
【００５２】
本明細書では、「増殖性疾患（複数可）」という用語は、ガン（例えば、子宮平滑筋肉腫又は前立腺ガン）、骨髄増殖性疾患（例えば、真性多血症、本態性血小板血症、及び骨髄線維症）、白血病（例えば、急性骨髄性白血病、急性及び慢性リンパ芽球性白血病）、多発性骨髄腫、乾癬、再狭窄、強皮症、又は線維症などの病態をいう。特に、該用語は、ガン、白血病、多発性骨髄腫、及び乾癬をいう。
【００５３】
本明細書では、「ガン」という用語は、皮膚又は体内臓器、例えば、限定はされないが、乳房、前立腺、肺、腎臓、膵臓、胃又は腸の細胞の悪性又は良性の増殖をいう。ガンは、隣接する組織に浸潤し、例えば、骨、肝臓、肺又は脳など遠位の臓器に広がる（転移する）傾向がある。本明細書では、ガンという用語は、限定はされないが、メラノーマ、リンパ腫、白血病、線維肉腫、横紋筋肉腫、及びマスト細胞腫などの転移性腫瘍(rumour)細胞型、並びに限定はされないが、結腸直腸ガン、前立腺ガン、小細胞肺ガン及び非小細胞肺ガン、乳ガン、膵ガン、膀胱ガン、腎ガン、胃ガン、神経膠芽腫、原発性肝ガン、卵巣ガン、前立腺ガン、及び子宮平滑筋肉腫などの組織細胞腫型の両方を含む。
【００５４】
本明細書では、「白血病」という用語は、血液及び造血器官の腫瘍性疾患をいう。そのような疾患は、宿主を感染及び出血しやすい状態にさせる、骨髄及び免疫系の機能障害を引き起こし得る。特に、白血病という用語は、急性骨髄性白血病（AML）及び急性リンパ芽球性白血病（ALL）及び慢性リンパ芽球性白血病(CLL)をいう。
【００５５】
本明細書では、「移植片拒絶」という用語は、例えば、膵島、幹細胞、骨髄、皮膚、筋肉、角膜組織、神経細胞組織、心臓、肺、心肺の組み合わせ、腎臓、肝臓、腸、膵臓、気管、又は食道など、細胞、組織又は固形臓器の同種又は異種移植片の急性又は慢性の拒絶反応、又は移植片対宿主病をいう。
【００５６】
本明細書では、「軟骨代謝回転の異常を伴う疾患」という用語は、変形性関節症、乾癬性関節炎、若年性関節リウマチ、痛風関節炎、化膿性又は感染性関節炎、反応性関節炎、反射性交感神経性ジストロフィー、疼痛性ジストロフィー、ティーツェ症候群又は肋骨軟骨炎、線維筋痛症、骨軟骨炎、神経性又はニューロパチー性関節炎、関節症、地方性変形性骨軟骨関節症（osteoarthritis deformans endemica）などの風土病型関節炎、ムセレニ病（Mseleni disease）及びハンディゴデュ病（Handigodu disease）；線維筋痛症に起因する変性、全身性エリテマトーデス、強皮症及び強直性脊椎炎などの病態を含む。
【００５７】
本明細書では、「先天性軟骨形成異常（複数可）」という用語は、遺伝性軟骨溶解、軟骨異形成症、及び偽性軟骨異形成症などの病態、特に、限定はされないが、小耳症、無耳症、骨幹端軟骨異形成症、及び関連の疾患を含む。
【００５８】
本明細書では、「IL6の分泌過多に関連する疾患（複数可）」という用語は、キャッスルマン病、多発性骨髄腫、乾癬、カポジ肉腫、及び／又はメサンギウム増殖性糸球体腎炎などの病態を含む。
【００５９】
本明細書では、インターフェロンの分泌過多に関連する疾患（複数可）という用語は、全身性エリテマトーデス及び皮膚エリテマトーデス、ループル腎炎、皮膚筋炎、シェーグレン症候群、乾癬、関節リウマチなどの病態を含む。
【００６０】
「本発明の化合物」及び等価な表現は、本明細書に記載された式の化合物を包含することを意味し、文脈が許す場合、その表現は、生物活性を有する代謝物、医薬として許容し得る塩及びその溶媒和物、例えば、水和物、並びに該医薬として許容し得る塩の溶媒和物を含む。同様に、中間体への言及は、それら自体が特許請求されているか否かに関わらず、文脈が許す場合、それらの塩及び溶媒和物を包含することを意味する。
【００６１】
限定はされないが、例えばC1-8アルキルなどの範囲が本明細書において言及される場合、ある範囲の引用が、前記範囲の各要素の表示であると考えられるものとする。
【００６２】
本発明の化合物の他の誘導体は、それらの酸形態及び酸誘導体形態の両方で活性を有するが、該酸感受性形態では多くの場合、哺乳動物における溶解性、組織適合性、又は遅延放出の利点を付与する(Bundgard, H.の文献、「プロドラッグの設計（Design of Prodrugs）」,pp. 7-9, 21-24, Elsevier, Amsterdam 1985参照)。プロドラッグには、当業者には周知である酸誘導体、例えば、親の酸と好適なアルコールとの反応により製造されるエステル、又は、親の酸化合物と置換若しくは非置換のアミンとの反応により製造されるアミド、又は酸無水物、又は混合無水物がある。本発明の化合物から出ている酸性基から誘導される単純な脂肪族又は芳香族のエステル、アミド、及び無水物は、特に有用なプロドラッグである。いくつかの場合において、(アシルオキシ)アルキルエステル又は((アルコキシカルボニル)オキシ)アルキルエステルなどの二重エステルタイプのプロドラッグの製造が望ましい。そのような特定のプロドラッグは、本発明の化合物のC1〜C8アルキル、C2-8アルケニル、アリール、C7-12置換アリール、及びC7-12アリールアルキルエステルである。
【００６３】
本明細書では、「同位体異形」という用語は、そのような化合物を構成する1以上の原子で非天然の同位体比率を含む化合物をいう。例えば、化合物の「同位体異形」は、例えば、重水素(2H又はD)、炭素-13(13C)、窒素-15(15N)などの1以上の非放射性同位体を含むことができる。そのような同位体的置換がなされる化合物において、以下の原子は存在する場合、例えば、任意の水素が2H/Dとなり、任意の炭素が13Cとなり、又は任意の窒素が15Nとなり、かつそのような原子の存在及び配置が当分野の技術内で決定できるように変わり得ることが理解されよう。同様に、本発明は、放射性同位体を有する同位体異形の製造を含むことができ、例えば、得られた化合物を、薬剤及び／又は基質組織分布研究に使用する場合がある。放射性同位体トリチウム、すなわち3H、及び炭素-14、すなわち14Cは、それらの取込みが容易であり、かつ検出手段が整っているという観点から本目的に特に有用である。さらに、化合物は11C、18F、15O、及び13Nなどの陽電子放出同位体で置換されて調製することができ、基質受容体占有率を検討するため陽電子放射型断層撮影法(PET)研究において有用であり得るだろう。
【００６４】
本明細書に提供される化合物の全ての同位体異形は、放射性であるか否かに関わらず、本発明の範囲内に包含されるものとする。
【００６５】
同じ分子式を有するが、それらの原子の結合の性質若しくは順序又は空間におけるそれらの原子の配列が異なる化合物が「異性体」と呼ばれることを理解されたい。空間におけるそれらの原子の配列が異なる異性体は、「立体異性体」と呼ばれる。
【００６６】
互いの鏡像でない立体異性体は「ジアステレオマー」と呼ばれ、互いの重ね合わせることのできない鏡像である立体異性体は「エナンチオマー」と呼ばれる。化合物が不斉中心を持つ場合、例えば、それは4つの異なる基に結合し、一組のエナンチオマーが存在し得る。エナンチオマーは、その不斉中心の絶対配置により特徴付けることができ、カーン及びプレローグのR-及びS-配置規則により、又は該分子が偏光面を回転させる向きにより表され、右旋性又は左旋性(すなわち、それぞれ(+)又は(-)-異性体)と称される。キラルな化合物は、個々のエナンチオマー又はその混合物のいずれかで存在し得る。等比率のエナンチオマーを含む混合物は「ラセミ混合物」と呼ばれる。
【００６７】
「互変異性体」とは、特定の化合物構造の交換可能な形態であり、かつ水素原子及び電子の配置において異なる化合物をいう。したがって、2つの構造は、π電子及び原子(通常、H)の動きを介して平衡となり得る。例えば、エノール及びケトンは、酸又は塩基のいずれかを用いた処理により迅速に相互変換されるので、互変異性体である。互変異性の別の例には、フェニルニトロメタンのアシ-及びニトロ-形態があり、これらは酸又は塩基の処理により同様に形成される。
【００６８】
互変異性形態は、目的とする化合物の最適な化学反応性及び生物活性の実現に関連し得る。
【００６９】
特記されない限り、明細書及び請求項中の特定の化合物の説明及び呼称は、個別のエナンチオマー及び、ラセミであろうとそうでなかろうと、その混合物の両方を含むものとする。立体化学の決定及び立体異性体の分離の方法は、当分野に周知である。
【００７０】
（化合物）
本発明は、本発明の化合物がJAKの阻害剤であり、それが、炎症性病態、自己免疫疾患、増殖性疾患、アレルギー、移植片拒絶、軟骨代謝回転の異常を伴う疾患、先天性軟骨形成異常、及び／又はIL6若しくはインターフェロンの分泌過多に関連する疾患の治療に有用になり得るという確認に基づいている。本発明は、本発明の化合物の製造方法、本発明の化合物を含む医薬組成物、並びに炎症性病態、自己免疫疾患、増殖性疾患、アレルギー、移植片拒絶、軟骨代謝回転の異常を伴う疾患、先天性軟骨形成異常、及び／又はIL6若しくはインターフェロンの分泌過多に関連する疾患を、本発明の化合物を投与することにより治療する方法も提供する。具体的な実施態様において、本発明の化合物はJAK1及び／又はJAK2の阻害剤である。
【００７１】
したがって、本発明の第一の態様において、本発明の化合物は式(I)によるものである：
【化２】
0005947371.tif 000003
。
【００７２】
一実施態様において、本発明の化合物は同位体異形ではない。
【００７３】
一態様において、本発明の化合物は遊離塩基として存在する。
【００７４】
一態様において、本発明の化合物は医薬として許容し得る塩である。
【００７５】
一態様において、本発明の化合物は該化合物の溶媒和物である。
【００７６】
一態様において、本発明の化合物は、化合物の医薬として許容し得る塩の溶媒和物である。
【００７７】
特定の態様において、本発明は、本発明の化合物のプロドラッグ及び誘導体を提供する。プロドラッグは本発明の化合物の誘導体であって、代謝的に開裂可能な基を有し、加溶媒分解により、又は生理学的条件下で、インビボで医薬として活性のある本発明の化合物になるものである。そのような例には、コリンエステル誘導体など、N-アルキルモルホリンエステルなどがあるが、これらに限定されない。
【００７８】
本発明の化合物の他の誘導体は、その酸及び酸誘導体形態の両方で活性を有するが、酸感受性形態が、哺乳類生物における溶解度、組織適合性、又は遅延放出の利点を与えることが多い(Bundgard, H.の文献、「プロドラッグの設計(Design of Prodrugs）」pp. 7-9, 21-24, Elsevier, Amsterdam 1985参照)。プロドラッグには、当業者に周知である酸誘導体、例えば、親の酸と好適なアルコールとの反応により製造されるエステル、又は親の酸化合物と置換又は非置換のアミンとの反応により製造されるアミド、又は酸無水物若しくは混合無水物がある。本発明の化合物から出ている酸性基から誘導された単純な脂肪族又は芳香族のエステル、アミド、及び無水物は、好ましいプロドラッグである。いくつかの場合において、(アシルオキシ)アルキルエステル又は((アルコキシカルボニル)オキシ)アルキルエステルなどの二重エステルタイプのプロドラッグの製造が望ましい。特に有用なものは、本発明の化合物のC1〜C8アルキル、C2-8アルケニル、アリール、C7-12置換アリール、及びC7-12アリールアルキルエステルである。
【００７９】
本発明の化合物は、JAKの新規な阻害剤である。特に、該化合物は、JAK1及び／又はJAK2の強力な阻害剤であるが、それは、より低い効力でTYK2及びJAK3を阻害し得る。
【００８０】
（医薬組成物）
医薬として使用される場合、本発明の化合物は、典型的には医薬組成物の形態で投与される。そのような組成物は、医薬分野において周知の様式で製造でき、少なくとも1種の活性化合物を含むことができる。通常、本発明の化合物は、医薬として有効な量で投与される。実際に投与される化合物の量は、典型的には、治療される状態、選択した投与経路、実際に投与される化合物、個々の患者の年齢、体重及び反応、患者の症状の重症度などを含む関連した状況に照らして、医師により決定される。
【００８１】
本発明の医薬組成物は、経口経路、直腸経路、経皮経路、皮下経路、関節内経路、静脈経路、筋肉内経路、及び鼻腔内経路を含む様々な経路により投与できる。意図された送達経路に応じて、本発明の化合物は、好ましくは、注射可能若しくは経口組成物として、又は全て経皮投与のための塗剤として、ローション剤として、若しくはパッチとして、製剤化される。
【００８２】
経口投与用組成物は、バルク溶液若しくは懸濁液、又はバルク粉末の形態をとり得る。しかしながら、より一般的には、本組成物は、正確な投与を容易にする単位投与形態で提供される。「単位投与形態」という用語は、ヒトの対象及び他の哺乳動物への単位投与量として適切な物理的に個別の単位をいい、各単位は適当な医薬用賦形剤、ビヒクル、又は担体とともに、所望の治療効果を提供するように算出された既定量の活性物質を含む。固体組成物の場合、典型的な単位投与形態には、液体組成物が予め充填され予め計量されたアンプル若しくはシリンジ又は丸剤、錠剤、カプセル等などを含む。そのような組成物において、本発明の化合物は、通常、微量成分(約0.1〜約50重量％又は好ましくは約1〜約40重量％)であり、その残りは様々なビヒクル又は担体及び所望の投与形態を形成するのを補助する加工助剤である。
【００８３】
経口投与に適した液体形態には、緩衝液、懸濁剤及び分配剤、着色剤、香料などとともに好適な水性又は非水性の溶媒を含むことができる。固体形態は、例えば、以下の成分のいずれか、又は類似の性質の化合物を含むことができる：微結晶性セルロース、トラガカントガム又はゼラチンなどの結合剤；デンプン又はラクトースなどの賦形剤、アルギン酸、プリモゲル、又はコーンスターチなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤；コロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤；スクロース又はサッカリンなどの甘味剤；又は、ハッカ、サリチル酸メチル、又はオレンジ香料などの香料。
【００８４】
注射可能組成物は、典型的には、当該技術分野において公知の注射可能な無菌の食塩水若しくはリン酸緩衝食塩水又は他の注射可能な担体に基づく。前記のように、そのような組成物における活性化合物は、典型的には微量成分であり、多くの場合、約0.05〜10重量％であり、その残りは注射可能な担体などである。
【００８５】
経皮組成物は、典型的には、一般に約0.01〜約20重量％、好ましくは約0.1〜約20重量％、好ましくは約0.1〜約10重量％、より好ましくは約0.5〜約15重量％にわたる量で有効成分（複数可）を含む、局所用軟膏又はクリームとして製剤化される。軟膏として製剤化される場合、有効成分は、典型的には、パラフィン性又は水混和性の軟膏基剤のいずれかと混合される。あるいは、有効成分は、例えば水中油クリーム基剤とともにクリームに配合できる。そのような経皮製剤は当該技術分野において周知であり、有効成分又は製剤の真皮浸透の安定性を促進するために一般的には添加成分を含む。そのような公知の経皮製剤及び成分の全ては、本発明の範囲内に含まれる。
【００８６】
本発明の化合物は、経皮装置により投与することもできる。したがって、経皮投与は、リザーバー型若しくは多孔膜型いずれかのパッチ又は固体マトリクス多様体を使用して達成できる。
【００８７】
経口投与可能な、注射可能な、又は局所的に投与可能な組成物のための上記成分は、代表的なものにすぎない。他の材料並びに加工技術などは、「レミントンの薬学（Remington's Pharmaceutical Sciences）」、第17版、1985, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvaniaのパート8に記載され、これは引用により本明細書に組み込まれる。
【００８８】
本発明の化合物は、徐放性形態で、又は徐放性製剤送達系から投与することもできる。代表的な徐放物質の説明は、レミントンの薬学に見出すことができる。
【００８９】
以下の製剤例は、本発明に従って製造できる代表的な医薬組成物を表す。しかし、本発明は、以下の医薬組成物に限定されない。
【００９０】
（製剤1-錠剤）
本発明の化合物は乾燥粉末として、乾燥ゼラチン結合剤とおよそ1:2の重量比で混合できる。微量のステアリン酸マグネシウムを滑沢剤として加えてよい。該混合物は、錠剤成形機で240〜270mgの錠剤(錠剤当たり80〜90mgの活性アミド化合物)に成形することができる。
【００９１】
（製剤2-カプセル剤）
本発明の化合物は乾燥粉末として、デンプン希釈剤とおよそ1:1の重量比で混合できる。該混合物は、250mgのカプセル(カプセル当たり125mgの活性アミド化合物)に充填できる。
【００９２】
（製剤3-液剤）
本発明の化合物(125mg)は、スクロース(1.75g)及びキサンタンガム(4mg)と混合でき、その結果として生じる混合物は混合され、No.10メッシュU.S.シーブに通され、その後、微結晶性セルロース及びカルボキシメチルセルロースナトリウム(11：89、50mg)の予め製造した水溶液と混合できる。安息香酸ナトリウム(10mg)、香料及び着色料を水で希釈して、撹拌しながら加えてよい。次いで、撹拌しながら、十分な水を加えることができる。次いで、十分な水を添加し、5mLの総容積にすることができる。
【００９３】
（製剤4-錠剤）
本発明の化合物は乾燥粉末として、乾燥ゼラチン結合剤とおよそ1:2の重量比で混合できる。微量のステアリン酸マグネシウムを、滑沢剤として加えてよい。該混合物は、錠剤成形機で450〜900mgの錠剤(150〜300mgの活性アミド化合物)に成形することができる。
【００９４】
（製剤5-注射製剤）
本発明の化合物は、緩衝化無菌食塩水の注射可能水性媒体中、およそ5mg/mLの濃度に、溶解又は懸濁できる。
【００９５】
（製剤6-局所製剤）
ステアリルアルコール(250g)及び白色ワセリン(250g)を約75℃で溶かすことができ、その後、水(約370g)に溶かした本発明の化合物(50g)、メチルパラベン(0.25g)、プロピルパラベン(0.15g)、ラウリル硫酸ナトリウム(10g)、及びプロピレングリコール(120g)の混合物を添加でき、その結果生じた混合物を凝結するまで撹拌してよい。
【００９６】
（治療の方法）
本発明の化合物は、原因としてJAKの異常な活性に関連するか又はそれに起因する、哺乳動物の病態の治療又は予防のための治療剤として使用できる。特に、該病態は、JAK1及び／又はJAK2の異常な活性に関連している。
【００９７】
したがって、本発明の化合物及び医薬組成物は、ヒトを含む哺乳動物の炎症性病態、自己免疫疾患、増殖性疾患、アレルギー、移植片拒絶、軟骨代謝回転の障害を伴う疾患、先天性軟骨形成異常、及びIL6又はインターフェロンの分泌過多に関連する疾患の治療又は予防のための治療剤として役立つ。
【００９８】
一態様において、本発明は、医薬として使用するための本発明の化合物又は本発明の化合物を含む医薬組成物を提供する。
【００９９】
治療態様の方法において、本発明は、アレルギー反応を起こしやすいか、又はアレルギー反応に苦しんでいる哺乳動物の治療又は予防の方法を提供する。具体的な実施態様において、本発明は、アレルギー性気道疾患、、副鼻腔炎、湿疹及び／又は蕁麻疹性丘疹、食物アレルギー、又は昆虫毒に対するアレルギーの治療又は予防の方法を提供する。
【０１００】
他の態様において、本発明は、アレルギー反応の治療又は予防に使用するための本発明の化合物を提供する。具体的な実施態様において、本発明は、アレルギー性気道疾患、副鼻腔炎、湿疹及び／又は蕁麻疹性丘疹、食物アレルギー又は昆虫毒に対するアレルギーの治療又は予防の方法を提供する。
【０１０１】
治療態様の追加の方法において、本発明は、炎症性病態に罹患しやすい又は苦しんでいる哺乳動物の治療又は予防の方法を提供する。該方法は、前記病態の治療又は予防のために、本明細書に記載される1種以上の本発明の医薬組成物又は化合物を有効量投与することを含む。具体的な実施態様において、該炎症性病態は、関節リウマチ、変形性関節症、アレルギー性気道疾患（例えば、喘息）、及び炎症性腸疾患から選択される。
【０１０２】
他の態様において、本発明は、炎症性病態の治療又は予防に使用するための本発明の化合物を提供する。具体的な実施態様において、該炎症性病態は、関節リウマチ、変形性関節症、アレルギー性気道疾患（例えば、喘息）、及び炎症性腸疾患から選択される。
【０１０３】
治療態様の追加の方法において、本発明は、自己免疫疾患に罹患しやすい又は苦しんでいる哺乳動物の治療又は予防の方法を提供する。該方法は、前記病態の治療又は予防のために、本明細書に記載される本発明の1種以上の医薬組成物又は化合物を有効量投与することを含む。具体的な実施態様において、該自己免疫疾患は、COPD、喘息、全身性エリテマトーデス、I型糖尿病、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、若年性特発性関節炎、及び炎症性腸疾患から選択される。
【０１０４】
他の態様において、本発明は、自己免疫疾患の治療又は予防に使用するための本発明の化合物を提供する。具体的な実施態様において、該自己免疫疾患は、COPD、喘息、全身性エリテマトーデス、I型糖尿病、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、若年性特発性関節炎、及び炎症性腸疾患から選択される。より具体的な実施態様において、該自己免疫疾患は、全身性エリテマトーデスである。
【０１０５】
治療態様のさらなる方法において、本発明は、増殖性疾患、特にガン（例えば、子宮平滑筋肉腫又は前立腺ガンなどの固形腫瘍）、白血病（例えば、AML、ALL、又はCLL）、多発性骨髄腫及び／又は乾癬に罹患しやすい又は苦しんでいる哺乳動物の治療又は予防の方法を提供する。
【０１０６】
他の態様において、本発明は、増殖性疾患、特にガン（例えば、子宮平滑筋肉腫又は前立腺ガンなどの固形腫瘍）、白血病（例えば、AML、ALL、又はCLL）、多発性骨髄腫及び／又は乾癬の治療又は予防に使用するための本発明の化合物を提供する。
【０１０７】
治療態様のさらなる方法において、本発明は、移植片拒絶に罹患しやすい又は苦しんでいる哺乳動物の治療又は予防の方法を提供する。具体的な実施態様において、本発明は、臓器移植片拒絶を治療又は予防する方法を提供する。
【０１０８】
他の態様において、本発明は、移植片拒絶の治療又は予防に使用するための本発明の化合物を提供する。具体的な実施態様において、本発明は臓器移植片拒絶を治療又は予防する方法を提供する。
【０１０９】
治療態様の方法において、本発明は、軟骨代謝回転の異常を伴う疾患に罹患しやすい又は苦しんでいる哺乳動物の治療又は予防の方法であって、本明細書に記載される、治療上有効な量の本発明の化合物又は1種以上の医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。
【０１１０】
他の態様において、本発明は、軟骨代謝回転の異常を伴う疾患の治療又は予防に使用するための本発明の化合物を提供する。
【０１１１】
本発明は、先天性軟骨形成異常を治療又は予防する方法であって、本明細書に記載される、有効量の1種以上の本発明の医薬組成物又は化合物を投与することを含む方法を提供する。
【０１１２】
他の態様において、本発明は、先天性軟骨形成異常の治療又は予防に使用するための本発明の化合物を提供する。
【０１１３】
治療態様のさらなる方法において、本発明は、IL6の分泌過多に関連する疾患、特にキャッスルマン病又はメサンギウム増殖性糸球体腎炎に罹患しやすい又は苦しんでいる哺乳動物を治療又は予防する方法を提供する。
【０１１４】
他の態様において、本発明は、IL6の分泌過多に関連する疾患、特にキャッスルマン病又はメサンギウム増殖性糸球体腎炎の治療又は予防に使用するための本発明の化合物を提供する。
【０１１５】
治療態様のさらなる方法において、本発明は、インターフェロンの分泌過多に関連する疾患、特に、全身性及び皮膚エリテマトーデス、ループス腎炎、皮膚筋炎、シェーグレン症候群、乾癬、関節リウマチに罹患しやすい又は苦しんでいる哺乳動物の治療又は予防の方法を提供する。
【０１１６】
他の態様において、本発明は、インターフェロンの分泌過多に関連する疾患、特に全身性及び皮膚エリテマトーデス、ループス腎炎、皮膚筋炎、シェーグレン症候群、乾癬、関節リウマチの治療又は予防に使用するための本発明の化合物を提供する。
【０１１７】
本発明のさらなる態様として、特に上述の病態及び疾患の治療又は予防における医薬品として使用するための本発明の化合物が提供される。また、上述の病態及び疾患の1つを治療又は予防するための医薬の製造における本化合物の使用も本明細書に提供される。
【０１１８】
本方法の特定の療法は、炎症を伴う疾患、特に、関節リウマチ、変形性関節症、アレルギー性気道疾患（例えば、喘息）、及び炎症性腸疾患に苦しんでいる対象に、該対象における炎症のレベルを低下させ、かつ好ましくは、前記炎症の原因であるプロセスを終結させるのに十分な時間、有効量の本発明の化合物を投与することを含む。本方法の特別な実施態様は、関節リウマチの進行に苦しんでいる又は罹患しやすい対象患者に、前記患者の関節における炎症をそれぞれ低下させ若しくは予防し、かつ好ましくは、前記炎症の原因であるプロセスを終結させるのに十分な時間、有効量の本発明の化合物を投与することを含む。
【０１１９】
本方法のさらに特別な療法は、軟骨又は関節の破壊（例えば、関節リウマチ及び／又は変形性関節症）によって特徴付けられる疾病状態に苦しんでいる対象に、前記破壊の原因である永続的なプロセスを低下させ、かつ好ましくは終結させるのに十分な時間、有効量の本発明の化合物を投与することを含む。該方法の特別な実施態様は、変形性関節症の進行に苦しんでいる又は罹患しやすい対象患者に、前記患者の関節における軟骨破壊をそれぞれ低下させるか又は予防し、かつ好ましくは前記破壊の原因である永続的プロセスを終結させるのに十分な時間、有効量の本発明の化合物を投与することを含む。特別な実施態様において、前記化合物は、軟骨同化特性及び／又は抗異化特性を示すことがある。
【０１２０】
注入用量レベルは、約1〜約120時間及び特に24〜96時間の間全てについて、約0.1mg/kg/時〜少なくとも10mg/kg/時にわたる。また、約0.1mg/kg〜約10mg/kg又はこれを超える予充填ボーラスを、妥当な定常状態レベルを達成するために投与することもできる。最大の全用量は、40〜80kgのヒト患者について約2g/日を超えるとは予想されない。
【０１２１】
長期の変性状態などの状態の予防及び／又は治療について、治療のための療法は、通常、数ヶ月又は数年にわたるため、患者の便宜及び許容度のために経口投与が好ましい。経口投与では、1日あたり1〜5回、特に2〜4回、典型的には3回の経口投与が代表的な療法である。これらの投与様式を利用して、各投与量は、個別の投与量をそれぞれ、約0.1〜約10mg/kg、特に約1〜約5mg/kgで提供することによって、約0.01〜約20mg/kgの本発明の化合物を提供する。
【０１２２】
経皮用量は、一般に、注入用量を使用して達成されるのと同等又はそれよりも低い血中濃度を提供するように選択される。
【０１２３】
病態の発症を予防するために使用する場合、本発明の化合物は、典型的には医師の助言に従い、かつその管理下で、上記の投与量レベルにて、該病態にかかる危険性のある患者に投与される。特定の病態にかかる危険性のある患者は、一般に、該病態の家族歴を有する者、又は遺伝的試験若しくはスクリーニングにより、特に該病態にかかりやすいと同定された者を含む。
【０１２４】
本発明の化合物は、単一の活性薬剤として投与することができるか、又は同じ若しくは類似の治療活性を示し、かつ併用投与に安全かつ有効であることが判断された他の化合物を含む他の治療剤との組合せで投与することもできる。具体的な実施態様において、2種の(又はそれより多い)薬剤の同時投与は、使用されるそれぞれの用量を顕著に減少させることができ、それによって、見られる副作用を低減させる。
【０１２５】
一実施態様において、本発明の化合物又は本発明の化合物を含む医薬組成物は、医薬として投与される。具体的な実施態様において、前記医薬組成物は追加的にさらなる有効成分を含む。
【０１２６】
一実施態様において、本発明の化合物は、炎症を伴う疾患の治療及び／又は予防のための別の治療薬と同時投与され；特定の薬剤には、免疫調節性薬剤、例えば、アザチオプリン、コルチコステロイド（例えば、プレドニゾロン又はデキサメタゾン）、シクロホスファミド、シクロスポリンA、タクロリムス、ミコフェノール酸モフェチル、ムロモナブ-CD3（OKT-3、例えば、Orthoclone（登録商標））、ATG、アスピリン、アセトアミノフェン、イブプロフェン、ナプロキセン、及びピロキシカムを含むが、これらに限定されない。
【０１２７】
一実施態様において、本発明の化合物は、関節炎（例えば、関節リウマチ）の治療及び／又は予防のための別の治療薬と同時投与され；特定の薬剤には、鎮痛薬、非ステロイド性抗炎症薬(NSAID)、ステロイド、合成DMARD(例えば、限定はされないが、メトトレキサート、レフルノミド、スルファサラジン、オーラノフィン、金チオリンゴ酸ナトリウム、ペニシラミン、クロロキン、ヒドロキシクロロキン、アザチオプリン、トファシチニブ、フォスタマチニブ、及びシクロスポリン)、及び生物学的DMARD(例えば、限定はされないが、インフリキシマブ、エタネルセプト、アダリムマブ、リツキシマブ、及びアバタセプト)を含むが、これらに限定されない。
【０１２８】
一実施態様において、本発明の化合物は、増殖性疾患の治療及び／又は予防のための別の治療薬と同時投与され；特定の薬剤には、メトトレキサート、ロイコボリン、アドリアマイシン、プレニゾン、ブレオマイシン、シクロホスファミド、5-フルオロウラシル、パクリタキセル、ドセタキセル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ドキソルビシン、タモキシフェン、トレミフェン、酢酸メゲストロール、アナストロゾール、ゴセレリン、抗-HER2モノクローナル抗体（例えば、Herceptin（商標））、カペシタビン、塩酸ラロキシフェン、EGFR阻害剤（例えば、lressa（登録商標）、Tarceva（商標）、Erbitux（商標））、VEGF阻害剤（例えば、Avastin（商標））、プロテアソーム阻害剤（例えば、Velcade（商標））、Glivec（登録商標）及びhsp90阻害剤（例えば、17-AAG）を含むが、これらに限定されない。加えて、本発明の化合物は、限定はされないが、放射線療法又は外科手術を含む他の治療法と組合せて投与することができる。具体的な実施態様において、該増殖性疾患は、ガン、骨髄増殖性疾患、又は白血病から選択される。
【０１２９】
一実施態様において、本発明の化合物は、自己免疫疾患の治療及び／又は予防のための別の治療薬と同時投与され；特定の薬剤には、グルココルチコイド、細胞分裂阻害剤（例えば、プリンアナログ）、アルキル化剤（例えば、ナイトロジェンマスタード（シクロホスファミド）、ニトロソウレア、白金化合物、その他）、代謝拮抗薬（例えば、メトトレキサート、アザチオプリン及びメルカプトプリン）、細胞毒性抗生物質（例えば、ダクチノマイシンアントラサイクリン系薬剤、マイトマイシンC、ブレオマイシン及びミトラマイシン）、抗体（例えば、抗-CD20、抗-CD25、又は抗-CD3（OTK3）モノクローナル抗体、Atgam（登録商標）及びThymoglobuline（登録商標））、シクロスポリン、タクロリムス、ラパマイシン（シロリムス）、インターフェロン（例えば、IFN-β）、TNF結合タンパク質（例えば、インフリキシマブ（Remicade（商標））、エタネルセプト（Enbrel（商標））、又はアダリムマブ（Humira（商標）））、ミコフェノレート、フィンゴリモド、及びミリオシンを含むが、これらに限定されない。
【０１３０】
一実施態様において、本発明の化合物は、移植片拒絶反応の治療及び／又は予防のための別の治療薬と同時投与され；特定の薬剤には、カルシニューリン阻害剤（例えば、シクロスポリン又はタクロリムス（FK506））、mTOR阻害剤（例えば、シロリムス、エベロリムス）、抗増殖剤（例えば、アザチオプリン、ミコフェノール酸）、副腎皮質ステロイド（例えば、プレドニゾロン、ヒドロコルチゾン）、抗体（例えば、モノクローナル抗-IL-2Rα受容体抗体、バシリキシマブ、ダクリズマブ）、ポリクローナル抗T細胞抗体（例えば、抗胸腺細胞グロブリン（ATG）、抗リンパ球グロブリン（ALG））を含むが、これらに限定されない。
【０１３１】
一実施態様において、本発明の化合物は、喘息及び／又は鼻炎及び／又はCOPDの治療及び／又は予防のための別の治療薬と同時投与され；特定の薬剤には、β2-アドレナリン受容体刺激薬（例えば、サルブタモール、レバルブテロール、テルブタリン、及びビトルテロール）、エピネフリン（吸入又は錠剤）、抗コリン薬（例えば、臭化イプラトロピウム）、グルココルチコイド（経口又は吸入）、長時間作用性β2-刺激薬（例えば、サルメテロール、ホルモテロール、バンブテロール、及び徐放性経口アルブテロール）、吸入ステロイド薬と長時間作用性気管支拡張薬との組合せ（例えば、フルチカゾン／サルメテロール、ブデソニド／ホルモテロール）、ロイコトリエン拮抗薬及び合成阻害剤（例えば、モンテルカスト、ザフィルルカスト、及びジロートン）、メディエーター放出の阻害剤（例えば、クロモグリケート及びケトチフェン）、IgE応答の生体調節因子（例えば、オマリズマブ）、抗ヒスタミン剤（例えば、セテリジン、シンナリジン、フェキソフェナジン）、及び血管収縮薬（例えば、オキシメタゾリン、キシロメタゾリン、ナファゾリン、及びトラマゾリン）を含むが、これらに限定されない。
【０１３２】
加えて、本発明の化合物は、喘息及び／又はCOPDの緊急治療と組合せて投与することができ、そのような治療には、酸素又はヘリオックス投与、サルブタモール又はテルブタリン噴霧（抗コリン薬（例えば、イプラトロピウム）と任意に併用）、全身性ステロイド薬（経口又は静脈内、例えば、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、又はヒドロコルチゾン）、静脈内サルブタモール、非特異的β-刺激薬、注射又は吸入（例えば、エピネフリン、イソエタリン、イソプロテレノール、メタプロテレノール）、抗コリン薬（静脈内又は噴霧、例えば、グリコピロレート、アトロピン、イプラトロピウム）、メチルキサンチン（テオフィリン、アミノフィリン、バミフィリン）、気管支拡張性効果を有する吸入麻酔（例えば、イソフルラン、ハロタン、エンフルラン）、ケタミン、及び静脈内硫酸マグネシウムを含む。
【０１３３】
一実施態様において、本発明の化合物は、炎症性腸疾患(IBD)の治療及び／又は予防のための別の治療薬と同時投与され、特定の薬剤には、グルココルチコイド（例えば、プレドニゾン、ブデソニド）、合成疾患修飾性免疫調節薬（例えば、メトトレキサート、レフルノミド、スルファサラジン、メサラジン、アザチオプリン、6-メルカプトプリン、及びシクロスポリン）及び生物学的疾患修飾性免疫調節薬（インフリキシマブ、アダリムマブ、リツキシマブ及びアバタセプト）を含むが、これらに限定されない。
【０１３４】
一実施態様において、本発明の化合物は、SLEの治療及び／又は予防のための別の治療薬と同時投与され、特定の薬剤には、疾患修飾性抗リウマチ薬（DMARD）、例えば、抗マラリア薬（例えば、プラキニル、ヒドロキシクロロキン）、免疫抑制剤（例えば、メトトレキサート及びアザチオプリン）、シクロホスファミド及びミコフェノール酸；免疫抑制薬及び鎮痛薬、例えば、非ステロイド性抗炎症薬、アヘン剤（例えば、デキストロプロポキシフェン及びココダモール）、オピオイド（例えば、ヒドロコドン、オキシコドン、MSコンチン又はメサドン）及びフェンタニルデュラゲシク経皮吸収パッチを含むが、これらに限定されない。
【０１３５】
一実施態様において、本発明の化合物は、乾癬の治療及び／又は予防のための別の治療薬と同時投与され、特定の薬剤には、コールタール、ジトラノール（アントラリン）、デスオキシメタゾン（Topicort（商標））などの副腎皮質ステロイド、フルオシノニド、ビタミンD3アナログ（例えば、カルシポトリオール）、アルガン油、及びレチノイド（エトレチナート、アシトレチン、タザロテン）を含有する浴溶液、保湿剤、薬用クリーム、及び軟膏剤などの局所的治療薬、メトトレキサート、シクロスポリン、レチノイド、チオグアニン、ヒドロキシウレア、スルファサラジン、ミコフェノール酸モフェチル、アザチオプリン、タクロリムス、フマル酸エステルなどの全身治療薬、又はAmevive（商標）、Enbrel（商標）、Humira（商標）、Remicade（商標）、Raptiva（商標）、及びウステキヌマブ（IL-12及びIL-23遮断薬）などの生物製剤を含むが、これらに限定されない。加えて、本発明の化合物は、限定はされないが、光線療法又は光化学療法（例えば、ソラレン長波長紫外線治療（PUVA））を含む他の治療法と組合せて投与することができる。
【０１３６】
一実施態様において、本発明の化合物は、アレルギー反応の治療及び／又は予防のための他の治療剤と同時投与されるが、特定の薬剤には、抗ヒスタミン剤(例えば、セチリジン、ジフェンヒドラミン、フェキソフェナジン、レボセチリジン）、糖質コルチコイド（例えば、プレドニゾン、ベタメタゾン、ベクロメタゾン、デキサメタゾン）、エピネフリン、テオフィリン、又は抗ロイコトリエン剤（例えば、モンテルカスト又はザフィルルカスト）、抗コリン剤、及び充血緩和剤があるが、これらに限定されない。
【０１３７】
当業者に明らかであるように、同時投与とは、同じ治療計画の一部として2種以上の治療薬を患者に送達する任意の手段を含むものである。2種以上の薬剤は単一製剤、すなわち単一の医薬組成物で同時に投与できるが、これは必須ではない。該薬剤は、異なる製剤で、かつ異なる時間に、投与してもよい。
【０１３８】
（全般的合成手順）
（全般）
本発明の化合物は、以下の全般的方法及び手順を利用して容易に利用できる出発物質から製造できる。典型的又は好ましいプロセス条件(すなわち、反応温度、時間、反応物のモル比、溶媒、圧力など)が与えられる場合、他のプロセス条件も他に明記しない限り利用できることは理解されるであろう。最適な反応条件は、使用する特定の反応物又は溶媒により変わり得るが、そのような条件は、通例の最適化手順によって当業者により決定できる。
【０１３９】
さらに、当業者には明らかであるように、特定の官能基が望ましくない反応を受けるのを防ぐために、従来型の保護基が必要となることがある。特定の官能基のための好適な保護基、並びに保護及び脱保護のための適当な条件の選択は、当該分野において周知である。例えば、多数の保護基並びにそれらの導入及び除去は、T. W. Greene及びP. G. M. Wutsの文献、「有機合成における保護基（Protecting Groups in Organic Synthesis）」、第2版、Wiley, New York, 1991及びその中で引用された文献に記載されている。
【０１４０】
以下の方法は、先に定義された本発明の化合物及び比較例の製造に関して詳細に提示されている。本発明の化合物は、公知又は市販の出発物質及び試薬から、有機合成の分野の当業者により製造できる。
【０１４１】
全ての試薬は市販の等級であり、他に明記しない限り、さらに精製せずに入手したままで使用した。市販の無水溶媒を、不活性雰囲気下で実施される反応に使用した。他に特に明記しない限り、試薬等級溶媒を他の全ての場合において使用した。カラムクロマトグラフィーをシリカゲル60（35〜70μm）で実施した。薄層クロマトグラフィーは、予め被覆してあるシリカゲルF-254プレート（0.25mm厚）を使用して実施した。1H NMRスペクトルは、Bruker社製DPX 400核磁気共鳴分光計（400MHz）で記録した。1H NMRスペクトルの化学シフト（δ）は、内部標準としてのテトラメチルシラン（δ0.00）又は適切な残留溶媒ピーク、すなわちCHCl3（δ7.27）に対して百万分率(ppm)で報告される。多重度は、シングレット（s）、ダブレット（d）、トリプレット（t）、カルテット（q）、マルチプレット（m）及びブロード（br）として与えられる。結合定数（J）は、Hzで与えられる。エレクトロスプレーMSスペクトルは、MicromassプラットフォームLC/MSスペクトロメータで得られた。LCMS分析に使用したカラム: Hichrom、Kromasil Eternity、2.5μm C18、150×4.6mm、Waters Xbridge 5μm C18 (2)、250×4.6mm (整理番号86003117)、Waters Xterra MS 5μm C18、100×4.6mm (Plus guard cartridge) (整理番号 186000486)、Gemini-NX 3μm C18 100×3.0 mm (整理番号00D-4453-Y0)、Phenomenex Luna 5μm C18 (2)、100×4.6mm. (Plus guard cartridge) (整理番号00D-4252-E0)、Kinetixフューズドコア2.7μm C18 100×4.6 mm (整理番号00D-4462-E0)、Supelco、Ascentis（登録商標）Express C18 (整理番号53829-U)、又はHichrom Halo C18、2.7μm C18、150×4.6mm (整理番号92814-702)。LC-MSは、UV検出器Waters 2996を備え、HPLC Waters 2795に接続したWaters Micromass ZQで記録した。LCは、UV検出器Agilent G1315Aに接続したHPLC Agilent 1100でも実施した。分取HPLC：Waters社製XBridge Prep C18 5μm ODB 19mm ID×100mm L（部品番号186002978）。全ての方法は、MeCN/H2O勾配を使用している。H2Oは、0.1%TFA又は0.1%NH3のいずれかを含有する。
【０１４２】
（実験セクションにおいて使用する省略形のリスト）
【表１】
0005947371.tif 000004
【０１４３】
（本発明の化合物の合成製造）
本発明の化合物は、以下のスキームに従って製造できる。
（化合物1:N-4-(3-フルオロ-4-((4-(メチルスルホニル)ピペラジン-1-イル)メチル)フェニル)ピラゾロ[1,5-a]ピリジン-2-イル)アセトアミド）
【化３】
0005947371.tif 000005
【０１４４】
（工程i):3-ブロモ-2-シアノメチルピリジン(中間体1)）
乾燥THF(100mL)を-78℃に冷却し、n-ブチルリチウム(ヘキサン中2.5M;23mL、58mmol)を加えた。温度を-60℃未満に維持しながら、アセトニトリル(3.3mL、64mmol)を滴加した。白色沈殿物が形成し、該反応混合物を-78℃で45分間攪拌した。2,3-ジブロモピリジン(2.0g、8.4mmol)の乾燥THF(10mL)溶液を滴加し、該反応混合物を-78℃で1.5時間撹拌し、次いで放置して室温に温めた。該反応を、水の滴下によりクエンチした。水性液をDCM(×3)で抽出し、合わせた有機液をブラインで洗浄し、乾燥させ(MgSO4)、真空中で濃縮した。(3-ブロモ-ピリジン-2-イル)-アセトニトリル(中間体1)をフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製した。
【０１４５】
（工程ii)2-(3-ブロモ-ピリジン-2-イル)-N-ヒドロキシ-アセトアミジン（中間体2））
ヒドロキシルアミン塩酸塩(924mg、13.3mmol)、水(4mL)、NaHCO3(1.12g、13.3mmol)、3-ブロモ-2-シアノメチルピリジン(中間体1)(1.31g、6.65mmol)、及びエタノール(14mL)の激しく撹拌している混合物を5時間還流加熱した。該反応混合物を室温に放冷し、エタノールを真空中で除去し、白色固体を濾過により回収し、水(3×10mL)で洗浄した。濡れた固体を真空中40℃で1時間乾燥させると、2-(3-ブロモ-ピリジン-2-イル)-N-ヒドロキシ-アセトアミジンを固体として与えた（中間体2）。
【０１４６】
（工程iii):3-ブロモ-2-(5-メチル-[1,2,4]オキサジアゾール-3-イルメチル)-ピリジン（中間体3））
工程ii)で得た2-(3-ブロモ-ピリジン-2-イル)-N-ヒドロキシ-アセトアミジン(1.24g、5.39mmol)及び無水酢酸(552mg、5.41mmol)の混合物を、20℃の乾燥THF(10mL)中で1.5時間撹拌した。該反応混合物を真空中で濃縮し、残渣を、2MのNa2CO3(10mL)とDCM(10mL)の20℃の二層系中で10分間激しく撹拌した。生じた白色沈殿物を濾過により回収し、水(2×5mL)及びDCM(2×5mL)で洗浄し、次いで真空中40℃で1時間乾燥させると、O-アセチルアミドキシムを粉末として与えた。
【０１４７】
得られたO-アセチルアミドキシム(610mg、2.24mmol)及びK2CO3(1.56g、11.3mmol)を、60℃のCHCl3(6mL)中で41時間激しく撹拌した。水(5mL)及びさらなるCHCl3(5mL)を、激しく撹拌しながら該混合物に加えた。層を分け、有機抽出物を真空中で濃縮した。粗製3-ブロモ-2-(5-メチル-[1,2,4]オキサジアゾール-3-イルメチル)-ピリジンを黄色の液体として得たが、これをさらに精製せずに後の反応に使用した(中間体3）。
【０１４８】
（工程iv):3-(4-ブロモ-ピラゾロ[1,5-a]ピリジン-2-イル)-アセトアミド（中間体4））
工程iii)で得られた3-ブロモ-2-(5-メチル-[1,2,4]オキサジアゾール-3-イルメチル)-ピリジン(663mg、2.61mmol)を、密封チューブ中で、トルエン(5.2mL)中で150℃で41時間撹拌した。該反応混合物を室温に放冷し、トルエンを真空中で除去し、残渣をカラムクロマトグラフィー(勾配: DCM中0-10% MeOH)により精製した。得られた固体をジエチルエーテルによりトリチュレートすると、3-(4-ブロモ-ピラゾロ[1,5-a]ピリジン-2-イル)-アセトアミド(中間体4)を固体として与えた。
【０１４９】
（工程(v):1-(4-ブロモ-2-フルオロ-ベンジル)-4-メタンスルホニル-ピペラジン（中間体5））
4-ブロモ-2-フルオロベンジルブロミド(30.4g、114mmol、1当量)、1-メチルスルホニルピペラジン(20.0g、114mmol、1当量)、及びK2CO3(31.6g、228mmol、2当量)のアセトニトリル(500mL)中の混合物を40℃で18時間撹拌した。該反応混合物を室温に放冷し、該混合物をセライトに通して濾過し、EtOAcで洗浄した。濾液を真空中で濃縮すると、目的アミンを与えた。
【０１５０】
4-ブロモ-2-フルオロベンジルブロミド(30.4g、114mmol、1当量)、1-メチルスルホニルピペラジン(20.0g、114mmol、1当量)、及びK2CO3(31.6g、228mmol、2当量)のアセトニトリル(500mL)中の混合物を40℃で18時間撹拌した。該反応混合物を室温に放冷し、該混合物をセライトに通して濾過し、EtOAcで洗浄した。濾液を真空中で濃縮すると、1-(4-ブロモ-2-フルオロ-ベンジル)-4-メタンスルホニル-ピペラジン（中間体5）を与えた。
【０１５１】
（工程(vi):1-[2-フルオロ-4-(4,4,5,5-テトラメチル-[1,3,2]ジオキサボロラン-2-イル)-ベンジル]-4-メタンスルホニル-ピペラジン（中間体6））
アリールブロミド(20.0g、57mmol、1当量)、ビス(ピナコラト)ジボロン(16.0g、63mmol、1.1当量)、PdCl2(dppf)(2.3g、2.9mmol、0.05当量)、及び酢酸カリウム(6.2g、63mmol、1.1当量)の脱気したジオキサン(200mL)中の混合物を、窒素下、密封チューブ中で、90℃で18時間撹拌した。反応混合物を室温に放冷し、該混合物をシリカの栓に通して濾過し、DCMで洗浄した。濾液を真空中で濃縮した。残渣をイソヘキサンと混合し、生成物が結晶化するまでジエチルエーテルを加えた。生成物を、濾過により固体として回収した。
【０１５２】
或いは、アリールブロミド(309g、879.7mmol,)、ビス(ピナコラト)ジボロン(245.7g、967.7mmol)、PdCl2(dppf)(35.9g、43.9mmol)、及び酢酸カリウム(94.9g、967.7mmol)の脱気したジオキサン(3L)中の混合物を、窒素下、100℃で6時間撹拌した。該反応混合物を室温に放冷し、該混合物をシリカの栓に通して濾過し、DCMで洗浄した。濾液を真空中で濃縮した。DCM及びヘキサン(2L)を、粘性の残渣に加えると、その間に生成物が沈殿した。該懸濁液を濾過すると、所望の化合物を与えた。
【０１５３】
（工程(vii):N-4-(3-フルオロ-4-((4-(メチルスルホニル)ピペラジン-1-イル)メチル)フェニル)ピラゾロ[1,5-a]ピリジン-2-イル)アセトアミド(化合物1)）
3つの方法を利用した。
（工程(vii):第1の方法）
1-[2-フルオロ-4-(4,4,5,5-テトラメチル-[1,3,2]ジオキサボロラン-2-イル)-ベンジル]-4-メタンスルホニル-ピペラジン(26.4g、66mmol、1.1当量)を、アリールブロミド(16.0g、63mmol、1当量)の1,4-ジオキサン/水(540mL、4:1;v/v)溶液に加えた。Na2CO3(13.4g、126mmol、2.0当量)及びPd(dppf)Cl2(2.6g、3mmol、0.05当量)(dppf=1,1'-ビス(ジフェニルホスフィノ)フェロセン)を、該脱気した溶液に加えた。生じた混合物を100℃で2時間加熱した。該反応混合物をEtOAcで抽出し、MgSO4で乾燥させ、真空中で濃縮した。分取HPLCにより精製すると、目的化合物を与えた。
【０１５４】
（工程(vii):第２の方法）
上記工程(ii)で得た1-[2-フルオロ-4-(4,4,5,5-テトラメチル-[1,3,2]ジオキサボロラン-2-イル)-ベンジル]-4-メタンスルホニル-ピペラジン(7.5g、18mmol、1当量)を、アリールブロミド(4.5g、18mmol、1当量)の1,4-ジオキサン/水(150mL、4:1;v/v)溶液に加えた。Na2CO3(3.8g、36mmol、2.0当量)及びPd(dppf)Cl2(0.7g、0.9mmol、5%)(dppf=1,1'-ビス(ジフェニルホスフィノ)フェロセン)を、該脱気した溶液に加えた。生じた混合物を100℃で2時間加熱した。２つの反応混合物を合わせ、溶媒を真空中で除去した。残渣をDCM及び水と混合し、不溶性物質を濾過により除いた(不溶性物質は残しておき、後に、精製の前に有機残渣と再び合わせた)。水層を分離し、DCM(×3)で抽出した。合わせた有機液を乾燥させ(MgSO4)、真空中で濃縮した。この残渣を、先に回収した不溶性物質と合わせ、シリカに吸着させた。カラムクロマトグラフィー(勾配:EtOAc中0-5%MeOH)又は分取HPLCにより精製すると、目的物を茶色の固体として与えた。該茶色の固体をエタノールと混合し、該懸濁液を還流加熱した。該混合物を室温に放冷し、さらに氷浴で冷却した。目的物質を濾過により回収し、真空中で乾燥させた。
【０１５５】
（工程(vii):第3の方法）
1-N-(4-ブロモ-ピラゾロ[1,5-a]ピリジン-2-イル)-アセトアミド(149g、0.586mol)及びNa2CO3(124g、1.172mol)の室温の1,4-ジオキサン(2L)/水(0.5L)の溶媒混合物中の混合物をN2により脱気した。この混合物に、ボロン酸エステル(270g、1.15当量)及びPdCl2(dppf)(24g、5mol%)を加えた。反応器のジャケットを100℃に加熱し、N2による脱気を停止し、該混合物を加熱しながら45分間攪拌した。UPLCにより、ボロン酸エステルの完全な消費が明らかになった。追加量のボロン酸エステル(10g、0.05当量)を加え、撹拌を100℃でさらに30分間続けた。UPLCにより、完全な転化及び期待される生成物の単一ピークが明らかになった。溶媒体積を減圧下で0.5Lまで減らし、生じた懸濁液を一晩4℃のままにした。水(0.5L)を該懸濁液に加え、30分間撹拌し、濾過した。生じたケーキを水(0.5L)で洗浄し、吸引下で1時間乾燥させた。該ケーキをペトリ皿に移し(425g)、空気中で一晩乾燥させると、粗製の所望の化合物を得た。該粉末をシリカゲルの栓の上に置き、DCM/MeOH(9:1混合物)で洗浄した。第1のフラクション(2.5L)を濃縮乾固させると、樹脂状固体を与えたが、廃棄した。第2のフラクション(DCM/MeOH9:1混合物10L、5:1混合物10L、及び3:1混合物3L)を濃縮乾固させると、所望の生成物を与えた。該固体をEtOH(1.1L)に懸濁させ、還流加熱し、30分間攪拌し、5℃に冷却し、30分間攪拌し、濾過した。ケーキを冷EtOH(300mL)で洗浄し、ペトリ皿に移すと、期待される生成物を与えた。
【０１５６】
本明細書に先に記載された合成方法に従って製造された本発明の化合物を以下の表Iに記載し、本発明の化合物のNMRスペクトルデータを表IIに与える。
【０１５７】
【表２】
0005947371.tif 000006
【０１５８】
【表３】
0005947371.tif 000007
【実施例】
【０１５９】
（生物学的実施例）
（実施例1:インビトロアッセイ）
（1.1  JAK1阻害アッセイ）
（1.1.1  JAK1アッセイポリGT基質）
組換えヒトJAK1触媒ドメイン（アミノ酸866-1154；カタログ番号PV4774）をInvitrogen社から購入する。ポリプロピレン製96ウェルプレート（Greiner社製、V字底）において、25ngのJAK1を6.25μgのポリGT基質（Sigma社製、カタログ番号P0275）とともに、被験化合物又はビヒクル（DMSO、最終濃度1%）を含有する5μLとともに、又はなしで、総量25μLのキナーゼ反応緩衝液（15mMのHepes pH7.5、0.01%のTween20、10mMのMgCl2、2μMの非放射性ATP、0.25μCiの33P-γ-ATP（Perkin Elmer社製、カタログ番号NEG602K001MC）最終濃度）中でインキュベートする。30℃で75分後、25μL/ウェルの150mMリン酸を添加して反応を停止させる。該終結したキナーゼ反応物の全てを、セルハーベスター（Perkin Elmer社製）を使用して、予洗い（75mMのリン酸）した96ウェルフィルタープレート（Perkin Elmer社製、カタログ番号6005177）に移す。プレートを1ウェルあたり300μLの75mMリン酸溶液で6回洗浄し、該プレートの底を密閉する。40μL/ウェルのMicroscint-20を添加し、該プレートの上部を密閉し、Topcount（Perkin Elmer社製）を使用して読み取りを行った。キナーゼ活性は、ビヒクルの存在下で得られたカウント毎分（cpm）から、陽性対照阻害剤（10μMのスタウロスポリン）の存在下で得られたcpmを引くことによって算出する。この活性を阻害する被験化合物の能力は、以下のように決定する。
【０１６０】
阻害率＝((被験化合物が存在する試料について測定されたcpm−陽性対照阻害剤を有する試料について測定されたcpm)/(ビヒクルの存在下で測定されたcpm−陽性対照阻害剤を有する試料について測定されたcpm))×100である。
【０１６１】
JAK1アッセイにおける用量−反応効果の試験、及び化合物についてのIC50の算出を可能にする、化合物についての用量希釈系列を調製する。化合物を20μMの濃度で試験し、続いて、1/3の段階希釈で、1%DMSOの最終濃度で8点（20μM-6.67μM-2.22μM-740nM-247nM-82nM-27nM-9nM）で試験する。化合物の効力が大きい場合、より希釈したものを調製する、及び／又は最大濃度をより低下させる（例えば、5μM、1μM）。
【０１６２】
（1.1.2  JAK1 Ulight-JAK1ペプチドアッセイ）
組換えヒトJAK1(触媒ドメイン、アミノ酸866-1154;カタログ番号PV4774)をInvitrogen社から購入した。白色384 Optiプレート(Perkin Elmer社製、カタログ番号6007290)において、1ngのJAK1を20nMのUlight-JAK1(tyr1023)ペプチド(Perkin Elmer社製、カタログ番号TRF0121)とともに、被験物質又はビヒクル(DMSO、最終濃度1%)を含む4μLとともに、又はなしで、総体積20μLのキナーゼ反応緩衝液(25mM MOPS pH6.8、0.01% Brij-35、5mM MgCl2、2mM DTT、7μM ATP)中でインキュベートした。室温で60分後、20μL/ウェルの検出混合物(1×検出緩衝液(Perkin Elmer社製、カタログ番号CR97-100C)、0.5nMユウロピウム-抗-ホスホチロシン(PT66)(Perkin Elmer社製、カタログ番号AD0068)、10mM EDTA)を加えて、反応を停止させた。読み取りは、320nmで励起させてEnvisionを使用し、615nmで発光を測定して実施する(Perkin Elmer社)。キナーゼ活性は、ビヒクル存在下で得られた相対蛍光単位(RFU)から陽性対照阻害剤(10μMスタウロスポリン)の存在下で得られたRFUを引くことにより計算した。被験化合物がこの活性を阻害する能力を下記のとおり決定した:
【０１６３】
阻害率=((被験化合物が存在する試料で測定されたRFU-陽性対照阻害剤を含む試料で測定されたRFU)／(ビヒクルの存在下で測定されたRFU-陽性対照阻害剤を含む試料で測定されたRFU))×100である。
【０１６４】
JAK1アッセイにおける用量反応効果の試験及び化合物のIC50の計算を可能にする、化合物についての用量希釈系列を調製した。化合物を通常20μMの濃度で試験し、続いて、1/5の段階希釈で、1%DMSOの最終濃度で10点で試験する。化合物の効力が大きい場合、より希釈したものを調製する、及び／又は最大濃度をより低下させる（例えば、5μM、1μM）。データは、アッセイで得た平均IC50±平均の標準誤差として表す。
【０１６５】
JAK1に対する本発明の化合物の活性を、上述のアッセイに従って決定すると、8.18、11.5、7.71、35.2、及び7.85nMのIC50値を与えた。
【０１６６】
（1.2  JAK1  Ki決定アッセイ）
Kiの決定のため、異なる量の化合物を酵素と混合し、酵素反応をATP濃度の関数として追跡する。Km対化合物濃度の二重逆数プロット（ラインウィーバー・バークプロット）により、Kiを決定する。1ngのJAK1（Invitrogen社製、PV4774）をアッセイに使用する。基質は、20nM Ulight-JAK-1(Tyr1023)Peptide（Perkin Elmer社製、TRF0121）である。反応は、25mM MOPS pH 6.8、0.01%、Brij-35、2mM DTT、5mM MgCl2中で、ATP及び化合物の濃度を変えながら実施する。リン酸化された基質を、1.1.2で記載されたユウロピウム標識抗ホスホチロシン抗体PT66（Perkin Elmer社製、AD0068）を使用して測定する。読み取りは、envision（Perkin Elmer社製）で、320nmでの励起並びにそれに次ぐ615nm及び665nmでの発光で実施する。
【０１６７】
（1.2  JAK2阻害アッセイ）
（1.2.1  JAK2アッセイポリGT基質）
組換えヒトJAK2触媒ドメイン（アミノ酸808-1132；カタログ番号PV4210）をInvitrogen社から購入する。ポリプロピレン製96ウェルプレート（Greiner社製、V字底）において、0.05mUのJAK2を2.5μgのポリGT基質（Sigma社製、カタログ番号P0275）とともに、被験化合物又はビヒクル（DMSO、最終濃度1%）を含有する5μLとともに、又はなしで、総量25μLのキナーゼ反応緩衝液（10mMのMOPS pH7.5、0.5mMのEDTA、0.01%のBrij-35、及び1mMのDTT、15mMのMgAc、1μMの非放射性ATP、0.25μCiの33P-γ-ATP（Perkin Elmer社製、カタログ番号NEG602K001MC）最終濃度）中でインキュベートする。30℃で90分後、25μL/ウェルの150mMリン酸を添加して反応を停止させる。該終結したキナーゼ反応物の全てを、セルハーベスター（Perkin Elmer社製）を使用して、予洗い（75mMのリン酸）した96ウェルフィルタープレート（Perkin Elmer社製、カタログ番号6005177）に移す。プレートを1ウェルあたり300μLの75mMリン酸溶液で6回洗浄し、該プレートの底を密閉する。40μL/ウェルのMicroscint-20を添加し、該プレートの上部を密閉し、Topcount（Perkin Elmer社製）を使用して読み取りを行う。キナーゼ活性は、ビヒクルの存在下で得られたカウント毎分（cpm）から、陽性対照阻害剤（10μMのスタウロスポリン）の存在下で得られたcpmを引くことによって算出する。この活性を阻害する被験化合物の能力は、以下のように決定する。
【０１６８】
阻害率＝((被験化合物が存在する試料について測定されたcpm−陽性対照阻害剤を有する試料について測定されたcpm)/(ビヒクルの存在下で測定されたcpm−陽性対照阻害剤を有する試料について測定されたcpm))×100である。
【０１６９】
JAK2アッセイにおける用量−反応効果の試験、及び各化合物についてのIC50の算出を可能にする、各化合物についての用量希釈系列を調製する。化合物を20μMの濃度で試験し、続いて、1/3の段階希釈で、1%DMSOの最終濃度で8点（20μM-6.67μM-2.22μM-740nM-247nM-82nM-27nM-9nM）で試験する。化合物系列の効力が大きい場合、より希釈したものを調製する、及び／又は最大濃度をより低下させる（例えば、5μM、1μM）。
【０１７０】
（1.2.2  JAK2 Ulight-JAK1ペプチドアッセイ）
組換えヒトJAK2 (触媒ドメイン、アミノ酸 866-1154;カタログ番号PV4210)をInvitrogen社から購入した。白色384 Optiプレート(Perkin Elmer社製、カタログ番号6007290)において、0.0125mUのJAK2を25 nMのUlight-JAK1(tyr1023)ペプチド(Perkin Elmer社製、カタログ番号TRF0121)とともに、被験物質又はビヒクル(DMSO、最終濃度1%)を含む4μLとともに、又はなしで、総体積20μLのキナーゼ反応緩衝液(25mM HEPES pH7.0、0.01% Triton X-100、7.5mM MgCl2、2mM DTT、7.5μM ATP)中でインキュベートした。室温で60分後、20 μL/ウェルの検出混合物(1×検出緩衝液(Perkin Elmer社製、カタログ番号CR97-100C)、0.5nM ユウロピウム-抗-ホスホチロシン(PT66) (Perkin Elmer社製、カタログ番号AD0068)、10 mM EDTA)を加えて、反応を停止させた。読み取りは、320nmでの励起によりEnvisionを使用し、615nmで発光を測定して実施する(Perkin Elmer社)。キナーゼ活性は、ビヒクル存在下で得られた相対蛍光単位(RFU)から陽性対照阻害剤(10μMスタウロスポリン)の存在下で得られたRFUを引くことにより計算した。被験化合物がこの活性を阻害する能力を下記のとおり決定した:
【０１７１】
阻害率=((被験化合物が存在する試料で測定されたRFU-陽性対照阻害剤を含む試料で測定された RFU)／(ビヒクルの存在下で測定されたRFU-陽性対照阻害剤を含む試料で測定された RFU))×100である。
【０１７２】
JAK2アッセイにおける用量反応効果の試験及び化合物のIC50の計算を可能にする、化合物についての用量希釈系列を調製する。化合物を20μMの濃度で試験し、続いて、1/5の段階希釈で、1%DMSOの最終濃度で10点で試験する。化合物の効力が大きい場合、より希釈したものを調製する、及び／又は最大濃度をより低下させる（例えば、5μM、1μM）。データは、アッセイで得た平均IC50±平均の標準誤差として表す。
【０１７３】
JAK2に対する本発明の化合物の活性を、上述のアッセイに従って決定すると、17.3、11.3、9.57、26、及び18.2nMのIC50値を与えた。
【０１７４】
（1.4  JAK2 Kd/Ki決定アッセイ）
（1.4.1.  JAK2 Ki決定アッセイ）
Kiの決定のために、様々な量の化合物を酵素と混合し、酵素反応を、ATP濃度の関数として追跡する。Kiを、Km対化合物濃度の二重逆数プロット(ラインウィーバー・バークプロット)により決定する。0.0125mUのJAK1 (Invitrogen社製、PV4210)をアッセイに使用する。基質は、25nM Ulight-JAK-1 (Tyr1023)Peptide (Perkin Elmer社製、TRF0121)である。ATP及び化合物の濃度を変えながら、25mM HEPES pH7.0、0.01% Triton X-100、7.5mM MgCl2、2mM DTT中で反応を実施する。リン酸化された基質を、1.2.2に記載されたユウロピウム-標識抗-ホスホチロシン抗体PT66 (Perkin Elmer社製、AD0068)を使用して測定する。読み取りは、320nmでの励起並びにそれに次ぐ615nm及び665nmでの発光によりenvision (Perkin Elmer社製)で実施した。
【０１７５】
（1.4.2  JAK2 Kd決定アッセイ）
JAK2（Invitrogen社製、PV4210）を、最終濃度2.5 nMで使用する。結合実験を、50mM Hepes pH 7.5、0.01% Brij-35、10mM MgCl2、1mM EGTA中で、25nMキナーゼトレーサー236（Invitrogen社製、PV5592）及び2 nM ユウロピウム-抗-GST（Invitrogen社製、PV5594）を使用し、化合物の濃度を変えながら実施する。製造元の手順に従ってトレーサーの検出を実施する。
【０１７６】
（1.5  JAK3阻害アッセイ）
組換えヒトJAK3触媒ドメイン（アミノ酸795-1124；カタログ番号08-046）をCarna Biosciences社から購入した。ポリプロピレン製96ウェルプレート（Greiner社製、V字底）において、0.5ngのJAK3タンパク質を2.5μgのポリGT基質（Sigma社製、カタログ番号P0275）とともに、被験化合物又はビヒクル（DMSO、最終濃度1%）を含有する5μLとともに、又はなしで、総量25μLのキナーゼ反応緩衝液（25mMのTris pH7.5、0.5mMのEGTA、10mMのMgCl2、2.5mMのDTT、0.5mMのNa3VO4、5mMのb-グリセロールホスフェート、0.01%のTriton X-100、1μMの非放射性ATP、0.25μCiの33P-γ-ATP（Perkin Elmer社製、カタログ番号NEG602K001MC）最終濃度）中でインキュベートした。30℃で45分後、25μL/ウェルの150mMリン酸を添加して反応を停止させた。該終結したキナーゼ反応物の全てを、セルハーベスター（Perkin Elmer社製）を使用して、予洗い（75mMのリン酸）した96ウェルフィルタープレート（Perkin Elmer社製、カタログ番号6005177）に移した。プレートを1ウェルあたり300μLの75mMリン酸溶液で6回洗浄し、該プレートの底を密閉した。40μL/ウェルのMicroscint-20を添加し、該プレートの上部を密閉し、Topcount（Perkin Elmer社製）を使用して読み取りを行った。キナーゼ活性は、ビヒクルの存在下で得られたカウント毎分（cpm）から、陽性対照阻害剤（10μMのスタウロスポリン）の存在下で得られたcpmを引くことによって算出した。この活性を阻害する被験化合物の能力は、以下のように決定した。
【０１７７】
阻害率＝((被験化合物が存在する試料について測定されたcpm−陽性対照阻害剤を有する試料について測定されたcpm)/(ビヒクルの存在下で測定されたcpm−陽性対照阻害剤を有する試料について測定されたcpm))×100である。
【０１７８】
JAK3アッセイにおける用量−反応効果の試験、及び化合物についてのIC50の算出を可能にする、化合物についての用量希釈系列を調製した。化合物を20μMの濃度で試験し、続いて、1/5の段階希釈で、1%DMSOの最終濃度で10点で試験した。化合物の効力が大きい場合、より希釈したものを調製する、及び／又は最大濃度をより低下させた（例えば、5μM、1μM）。
【０１７９】
JAK3に対する本発明の化合物の活性を、上述のアッセイに従って決定すると、271、299、213、及び428nMのIC50値を与えた。
【０１８０】
（1.6  JAK3 Ki決定アッセイ）
Kiの決定のため、様々な量の化合物を酵素と混合し、酵素反応をATP濃度の関数として追跡する。Km対化合物濃度の二重逆数プロット（ラインウィーバー・バークプロット）により、Kiを決定する。JAK3（Carna Biosciences社製、08-046）を最終濃度20 ng/mlで使用した。基質は、ポリ(Glu,Tyr)ナトリウム塩(4:1)、MW 20000〜50000（Sigma社製、P0275）であった。反応は、25mM Tris pH 7.5、0.01% Triton X-100、0.5mM EGTA、2.5mM DTT、0.5mM Na3VO4、5mM b-グリセロールホスフェート、10mM MgCl2中で、ATP及び化合物の濃度を変えながら実施し、150 mMのリン酸の添加により停止させた。基質ポリGTに取り込まれたリン酸の測定は、試料をフィルタープレートに載せ（Perkin Elmer社製ハーべスター使用）、その後洗浄して実施した。ポリGT中に取り込まれた33Pは、フィルタープレート（Perkin Elmer社製）へのシンチレーション液体の添加後にTopcountシンチレーションカウンターで測定する。
【０１８１】
例えば、このアッセイで試験すると、本発明の化合物は227nMのKi値を与えた。
【０１８２】
（1.7  TYK2阻害アッセイ）
組換えヒトTYK2触媒ドメイン（アミノ酸871-1187；カタログ番号08-147）をCarna biosciences社から購入した。ポリプロピレン製96ウェルプレート（Greiner社製、V字底）において、4ngのTYK2を12.5μgのポリGT基質（Sigma社製、カタログ番号P0275）とともに、被験化合物又はビヒクル（DMSO、最終濃度1%）を含有する5μLとともに、又はなしで、総量25μLのキナーゼ反応緩衝液（25mMのHepes pH7.2、50mMのNaCl、0.5mMのEDTA、１mMのDTT、5mMのMnCl2、10mMのMgCl2、0.1%のBrij-35、0.1μMの非放射性ATP、0.125μCiの33P-γ-ATP (Perkin Elmer社製、カタログ番号NEG602K001MC)最終濃度）中でインキュベートした。30℃で90分後、25μL/ウェルの150mMリン酸を添加して反応を停止させた。該終結したキナーゼ反応物の全てを、セルハーベスター（Perkin Elmer社製）を使用して、予洗い（75mMのリン酸）した96ウェルフィルタープレート（Perkin Elmer社製、カタログ番号6005177）に移した。プレートを1ウェルあたり300μLの75mMリン酸溶液で6回洗浄し、該プレートの底を密閉した。40μL/ウェルのMicroscint-20を添加し、該プレートの上部を密閉し、Topcount（Perkin Elmer社製）を使用して読み取りを行った。キナーゼ活性は、ビヒクルの存在下で得られたカウント毎分（cpm）から、陽性対照阻害剤（10μMのスタウロスポリン）の存在下で得られたcpmを引くことによって算出した。この活性を阻害する被験化合物の能力は以下のように決定した。
【０１８３】
阻害率＝((被験化合物が存在する試料について測定されたcpm−陽性対照阻害剤を有する試料について測定されたcpm)/(ビヒクルの存在下で測定されたcpm−陽性対照阻害剤を有する試料について測定されたcpm))×100である。
【０１８４】
TYK2アッセイにおける用量−反応効果の試験、及び各化合物についてのIC50の算出を可能にする、化合物についての用量希釈系列を調製した。各化合物を通常20μMの濃度で試験し、続いて、1/3の段階希釈で、1%DMSOの最終濃度で8点（20μM-6.67μM-2.22μM-740nM-247nM-82nM-27nM-9nM）で試験した。化合物系列の効力が大きい場合、より希釈したものを調製する、及び／又は最大濃度をより低下させた（例えば、5μM、1μM）。
【０１８５】
TYK2に対する本発明の化合物の活性を、上述のアッセイに従って決定すると、167、135、119、及び157nMのIC50値を与えた。
【０１８６】
（1.8  TYK2 Kd/Ki決定アッセイ）
（1.8.1  TYK2 Ki決定アッセイ）
Kiの決定のために、様々な量の化合物を酵素と混合し、酵素反応をATP濃度の関数として追跡する。Kiは、Km対化合物濃度の二重逆数プロット(ラインウィーバー・バークプロット)により決定する。TYK2 (Carna Biosciences社製、08-147)を最終濃度160 ng/mlで使用した。基質はポリ(Glu,Tyr)ナトリウム塩(4:1) 、MW 20000〜50000(Sigma社製、P0275)であった。反応を、25 mMのHepes pH 7.2、50 mMのNaCl、0.5mMのEDTA、1mMのDTT、5mMのMnCl2、10mMのMgCl2、0.1% Brij-35中で、ATP及び化合物の濃度を変えながら実施し、150mMのリン酸を加えて停止させた。基質ポリGTに取り込まれたホスフェートの測定は、試料をフィルタープレート(Perkin Elmer社製ハーベスター使用)に載せ、次いで洗浄して実施した。フィルタープレート(Perkin Elmer社製)にシンチレーション液体を加えた後で、ポリGT中の取り込まれた33Pを、Topcount シンチレーションカウンターで測定する。
【０１８７】
例えば、このアッセイで試験すると、本発明の化合物はKi=110nMを与えた。
【０１８８】
(1.8.2  TYK2 Kd決定アッセイ）
TYK2（Carna Biosciences社製、08-147）を最終濃度50nMで使用する。結合実験を、50mM Hepes pH 7.5、0.01% Brij-35、10mM MgCl2、1mM EGTA中で、15nMのキナーゼトレーサー236（Invitrogen社製、PV5592）及び10nMのユウロピウム-抗-GST（Invitrogen社製、PV5594）を使用して、化合物の濃度を変えながら実施する。トレーサーの検出は、製造元の手順に従って実施する。
【０１８９】
（実施例2  細胞アッセイ）
（2.1  JAK-STATシグナル伝達アッセイ）
HeLa細胞を、10%の熱失活したウシ胎児血清、100U/mLのペニシリン、及び100μg/mLのストレプトマイシンを含有するダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）中に維持した。トランスフェクションのために70%コンフルエンスでHeLa細胞を使用した。87μLの細胞培地中20,000個の細胞を、96ウェルプレートフォーマットにおいて、1ウェルあたり0.32μLのJet-PEI（Polyplus社製）をトランスフェクション試薬として使用して、40ngのpSTAT1(2)-ルシフェラーゼレポーター（Panomics社製）、内部標準レポーターとして8ngのLacZレポーター、及び52ngのpBSKで一過性にトランスフェクションさせた。37℃、5%CO2で一晩インキュベートした後、トランスフェクション培地を除去した。81μLのDMEM＋1.5%の熱失活したウシ胎児血清を添加した。10倍濃縮した9μLの化合物を60分間添加し、次いで、最終濃度33ng/mLの10μLのヒトOSM（Peprotech社製）を添加した。
【０１９０】
化合物を20μMから開始して、1/3段階希釈し、0.2%DMSOの最終濃度で全8用量（20μM-6.6μM-2.2μM-740nM-250nM-82nM-27nM-9nM）で二連で試験した。
【０１９１】
37℃、5%CO2で一晩インキュベートした後、100μLの溶解緩衝液/ウェル（PBS、0.9mMのCaCl2、0.5mMのMgCl2、10%のトレハロース、0.05%のTergitol NP9、0.3%のBSA）を加えて細胞を溶解した。
【０１９２】
40μLの細胞溶解物を使用して、180μLのβGal溶液（30μlのONPG 4mg/mL＋150μLのβ-ガラクトシダーゼ緩衝液（0.06MのNa2HPO4、0.04MのNaH2PO4、1mMのMgCl2））を20分間添加することによりβ-ガラクトシダーゼ活性を読み取った。50μLのNa2CO3 1Mの添加によって該反応を停止させた。405nmで吸光度を読み取った。
【０１９３】
ルシフェラーゼ活性を、製造元（Perkin Elmer社）による説明どおりに、40μLの細胞溶解物＋40μlのSteadylite（登録商標）を使用してEnvison（Perkin Elmer社製）で測定した。
【０１９４】
OSM省略を陽性対照（100%阻害）として使用した。陰性対照として、0.5%のDMSO（0%阻害）を使用した。陽性及び陰性対照を使用して、z'及び「阻害率」（PIN）値を算出した。
【０１９５】
阻害率＝((ビヒクル存在下で測定された蛍光−被験化合物が存在する試料について測定された蛍光)/(ビヒクルの存在下で測定された蛍光−トリガーなしの試料について測定された蛍光))×100である。
【０１９６】
用量−反応において、試験した化合物についてPIN値をプロットし、EC50値を算出した。
【０１９７】
JAK-STATに対する本発明の化合物の活性を、上述のアッセイに従って決定すると、970nMのIC50値を与えた。
【０１９８】
（実施例2.2  OSM/IL-1βシグナル伝達アッセイ）
OSM及びIL-1βは、ヒト軟骨肉腫株化細胞系SW1353において、MMP13レベル値を相乗的に上方制御することが示される。該細胞を96ウェルプレートにおいて、37℃、5%CO2でインキュベートした10%（v/v）のFBS及び1%のペニシリン/ストレプトマイシン（InVitrogen社製）を含有するDMEM（Invitrogen社製）の容量120μL中、15,000細胞/ウェルで播種する。細胞を、15μLのOSM及びIL-1βでトリガーする1時間前に2%のDMSOを有するM199培地中で15μLの化合物とともにプレインキュベートし、25ng/mLのOSM及び1ng/mLのIL-1βとして、トリガーした48時間後に条件培地でMMP13レベルを測定する。抗体捕獲活性アッセイを利用してMMP13活性を測定する。この目的のために、384ウェルプレート（NUNC社製、460518、MaxiSorb black）を35μLの1.5μg/mL抗ヒトMMP13抗体（R&D Systems社製、MAB511）溶液で24時間4℃で被覆する。該ウェルをPBS＋0.05%Tweenで2回洗浄した後、残りの結合部位を100μLのPBS中5%の脱脂粉乳（Santa Cruz社製、sc-2325、Blotto）で24時間4℃でブロックする。次に、該ウェルをPBS＋0.05%Tweenで2回洗浄し、100倍希釈したブロッキング緩衝液中の、MMP13を含む培養上清の1/10希釈液を35μL添加し、室温で4時間インキュベートする。次に、該ウェルをPBS＋0.05% Tweenで2回洗浄し、続いて、35μLの1.5mM 4-アミノフェニル水銀アセタート（APMA）（Sigma社製、A9563）溶液を添加し、37℃で1時間インキュベートすることによってMMP13を活性化した。該ウェルをPBS＋0.05%Tweenで再度洗浄し、35μLのMMP13基質（Biomol社製、P-126、OmniMMP蛍光発生基質）を添加する。37℃で24時間のインキュベーションの後、転化した基質の蛍光をPerkin Elmer社製Wallac EnVision2102マルチラベルリーダー（励起波長：320nm、発光波長：405nm）で測定する。
【０１９９】
阻害率＝((ビヒクル存在下で測定された蛍光−被験化合物が存在する試料について測定された蛍光)/(ビヒクルの存在下で測定された蛍光−トリガーなしの試料について測定された蛍光))×100である。
【０２００】
（実施例2.3  PBL増殖アッセイ）
ヒト末梢血リンパ球（PBL）をIL-2で刺激し、BrdU取り込みアッセイを使用して増殖を測定する。まず、PHAを用いてPBLを72時間刺激してIL-2受容体を誘発し、24時間絶食させて細胞増殖を停止させ、続いて、さらに72時間（24時間のBrdU標識化を含む）IL-2刺激を行う。細胞を被験化合物とともにIL-2添加の1時間前にプレインキュベートする。10%(v/v)FBSを含有するRPMI1640で細胞を培養する。
【０２０１】
（実施例2.4  全血アッセイ(WBA)）
（2.4.1  IFNα刺激プロトコール）
被験化合物がインビボでJAK1又はJAK2依存性シグナル伝達経路を阻害する効力を予測するため、生理学的に関連あるインビトロモデルを、ヒトの全血を使用して開発した。WBAアッセイにおいて、インフォームドコンセントを与えたヒトの志願者から採取された血液を化合物によりエクスビボで処理し（1時間）、次いで、インターフェロンα（IFNα、JAK1依存性経路）により30分間、又は顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF、JAK2依存性経路）により2時間のいずれかで刺激する。
【０２０２】
（2.4.1.1  ホスホ-STAT1アッセイ）
IFNα刺激に関して、白血球抽出物中でのINFαによるシグナル伝達性転写因子1のリン酸化(pSTAT1)の増加をpSTAT1 ELISAアッセイを利用して測定する。インターフェロンα(IFNα)トリガリングの後のシグナル伝達性転写因子1(STAT1)のリン酸化はJAK1-媒介性事象である。ホスホ-STAT1アッセイは、細胞抽出物におけるホスホ-STAT1レベルの測定に利用するが、化合物がJAK1-依存性シグナル伝達経路を阻害する能力を評価するために開発されている。
【０２０３】
インフォームドコンセントを与えたヒトの志願者から採取されたヒトの全血を、化合物によりエクスビボで処理し（1時間）、次いで、IFNαにより30分間刺激する。白血球抽出物におけるINFαによるSTAT1のリン酸化の増加を、ホスホ-STAT1 ELISAを利用して測定した。
【０２０４】
ACK溶解緩衝液は、0.15 M NH4Cl、10 mM KHCO3、0.1 mM EDTAからなる。該緩衝液のpHは7.3である。
【０２０５】
10×細胞溶解緩衝濃縮液（Cell Signaling社製、PathScan Phospho-STAT1 (Tyr701) sandwich ELISAキットの一部）を、水で10倍に希釈する。使用前にプロテイナーゼ阻害剤を該緩衝液に加える。
【０２０６】
20μgのIFNαを40μLのH2Oに溶かして、500μg/mLのストック溶液を得る。ストック溶液を-20℃で保存する。
【０２０７】
化合物の3倍の希釈系列をDMSOで調製する（最高濃度：10 mM）。その後、化合物をさらに培地で希釈する（希釈係数は、所望の最終化合物濃度による）。
【０２０８】
（2.4.1.1.1  化合物と血液とのインキュベーション及びIFNαによる刺激）
ヒトの血液をヘパリン処理したチューブに集める。血液を392μLのアリコートに分ける。その後、4μLの化合物希釈液を各アリコートに加え、血液試料を37℃で1時間インキュベートする。IFNαストック溶液をRPMI培地で1000倍に希釈し、500 ng/mLの使用液を得る。4μLの500 ng/mL使用液を血液試料に加える（最終濃度IFNα：5ng/ml）。該試料を37℃で30分間インキュベートする。
【０２０９】
（2.4.1.1.2  細胞抽出物の調製）
刺激期間の最後に、7.6 mLのACK緩衝液を血液試料に加え、赤血球を溶解させる。チューブを5回反転させて試料を混合し、反応物を氷上で5分間インキュベートする。RBCの溶解は、このインキュベーションの間に明らかであるはずである。300g、4℃で7分間の遠心分離により細胞をペレットにし、上清を除く。10 mLの1×PBSを各チューブに加え、細胞ペレットを再懸濁化する。試料を300g、4℃で7分間再び遠心分離する。上清を除き、ペレットを500μLの1×PBSで再懸濁化する。次いで、細胞懸濁液をきれいな1.5 mL微量遠心チューブに移す。700g、4℃で5分間での遠心分離により細胞をペレットにする。上清を除き、ペレットを150μLの細胞溶解緩衝液に溶かす。試料を氷上で15分間インキュベートする。その後、試料を、さらに処理するまで-80℃で保存する。
【０２１０】
（2.4.1.1.3  ELISAによるSTAT1リン酸化の測定）
Cell Signaling社製のPathscan Phospho-STAT1 (Tyr701) Sandwich ELISAキット（カタログ番号7234）を使用して、ホスホ-STAT1レベルを測定する。
【０２１１】
細胞抽出物を氷上で解凍する。チューブを16,000g、4℃で5分間遠心分離し、清澄化された溶解物を採取する。その間に、キットのマイクロウェルストリップを室温に平衡化し、20×洗浄緩衝液を水で希釈して洗浄緩衝液を調製する。試料を、試料希釈液で2倍に希釈し、100μLをマイクロウェルストリップに加える。ストリップを4℃で一晩インキュベートする。
【０２１２】
翌日、ウェルを洗浄緩衝液により3回洗浄する。100μLの検出抗体をウェルに加える。ストリップを37℃で1時間インキュベートした。次いで、ウェルを洗浄緩衝液で再び3回洗浄する。100μLのHRP結合二次抗体を各ウェルに加え、試料を37℃でインキュベートする。30分後、ウェルを再び3回洗浄し、100μLのTMB基質を全てのウェルに加える。試料が青くなる場合、100μLのSTOP溶液を加えて反応を停止させる。吸光度を450 nmで測定する。
【０２１３】
（2.4.1.2  データ分析）
細胞抽出物におけるIFNαによるホスホSTAT1誘導の阻害を、化合物濃度に対してプロットし、Graphpadソフトウェアを利用してIC50値を算出する。R2が0.8より大きく、ヒルスロープが3より小さい場合にデータを保持する。
【０２１４】
（2.4.1.3  IL-8 ELISA）
GM-CSF刺激に関して、血漿中のインターロイキン-8(IL-8)レベルの増加をIL-8 ELISA アッセイを利用して測定する。顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)-誘導インターロイキン8(IL-8)発現は、JAK2-媒介性事象である。IL-8 ELISAは、血漿試料中のIL-8レベルの測定に使用できるが、化合物がJAK2-依存性シグナル伝達経路を阻害する能力を評価するために開発された。
【０２１５】
インフォームドコンセントを与えたヒトの志願者から採取されたヒトの全血を化合物によりエクスビボで処理し（1時間）、次いでGM-CSFで2時間刺激する。血漿中のIL-8レベルの増加を、IL-8 ELISAアッセイを利用して測定する。
【０２１６】
10μgのGM-CSFを100μLのH2Oに溶かし、100μg/mLのストック溶液を得る。ストック溶液を-20℃で保存する。
【０２１７】
被験化合物の3倍の希釈系列をDMSO中に調製する（最高濃度；10 mM）。次いで、化合物を培地でさらに希釈する（希釈率は、所望の最終化合物濃度による）。
【０２１８】
（2.4.1.3.1  血液の化合物とのインキュベーション及びGM-CSFによる刺激）
ヒトの血液をヘパリン処理したチューブに集める。血液を245μLのアリコートに分ける。その後、2.5μLの被験化合物希釈液を各アリコートに加え、血液試料を37℃で1時間インキュベートする。GM-CSFストック溶液をRPMI培地で100倍に希釈し、1μg/mLの使用液を得る。2.5μLの1μg/mL使用液を血液試料に加える（最終濃度GM-CSF：10 ng/ml）。該試料を37℃で2時間インキュベートする。
【０２１９】
（2.4.1.3.2  血漿試料の調製）
試料を1,000g、4℃で15分間遠心分離する。100μLの血漿を採取し、さらに使用するまで-80℃で保存する。
【０２２０】
（2.4.1.3.3  ELISAによるIL-8レベルの測定）
R&D Systems社製のHuman IL-8 Chemiluminescent Immunoassayキット（カタログ番号：Q8000B）を使用してIL-8レベルを測定する。
【０２２１】
洗浄緩衝液は、10×洗浄緩衝液をH2Oに希釈して調製する。使用グロ試薬は、1部のGlo Reagent 1を2部のGlo Reagent Bに、使用の15分から4時間前に添加して調製する。
【０２２２】
100μLのアッセイ希釈液RD1-86を各ウェルに加える。その後、50μLの試料（血漿）を加える。ELISAプレートを室温で2時間500rpmでインキュベートする。全てのウェルを洗浄緩衝液で4回洗浄し、200μLのIL-8コンジュゲートを各ウェルに加える。室温で3時間インキュベートした後、ウェルを洗浄緩衝液で4回洗浄し、100μLの使用グロ試薬を各ウェルに加える。ELISAプレートを室温で5分間インキュベートする（遮光する）。発光を測定する（0.5秒／ウェル読み取り時間）。
【０２２３】
（2.4.2  IL-6刺激プロトコール）
さらに、フローサイトメトリー分析を実施して、ヒトの全血を利用してエクスビボで、JAK2を上回るJAK1への化合物選択性を確立する。したがって、インフォームドコンセントを与えたヒトの志願者から血液を採取する。次いで、血液を穏やかに揺らしながら37℃で30分間平衡化し、エッペンドルフチューブに小分けする。化合物を異なる濃度で加え、穏やかに揺らしながら37℃で30分間インキュベートし、次いで、穏やかに揺らしながら20分間37℃で、JAK1依存性経路刺激にはインターロイキン6 (IL-6)により、又はJAK2依存性経路刺激にはGM-CSFにより刺激する。次いで、FACS分析を利用して、ホスホ-STAT1及びホスホ-STAT5を評価する。
【０２２４】
（2.4.2.1  ホスホ-STAT1アッセイ）
白血球におけるシグナル伝達性転写因子1(pSTAT1)リン酸化のIL-6刺激性の増加には、インフォームドコンセントを与えたヒトの志願者から採取されたヒトの全血をエクスビボで化合物により30分間処理し、その後IL-6により20分間刺激する。リンパ球におけるIL-6によるSTAT1のリン酸化の増加を、抗ホスホ-STAT1抗体を利用して、FACSにより測定する。
【０２２５】
5×Lyse/Fix緩衝液（BD PhosFlow社製、カタログ番号558049）を蒸留水で5倍に希釈し、37℃に予熱する。残りの希釈したLyse/Fix緩衝液を廃棄する。
【０２２６】
10μgのrhIL-6（R&D Systems社製、カタログ番号206-IL）を、1mlのPBS 0.1% BSAに溶かし、10μg/mlのストック溶液を得る。ストック溶液を小分けし、-80℃で保存する。
【０２２７】
化合物の3倍の希釈系列をDMSO中に調製する（10 mMストック溶液）。対照処理試料には化合物の代わりにDMSOを与えた。試料は全て1%の最終DMSO濃度でインキュベートする。
【０２２８】
（2.4.2.1.1  血液の化合物とのインキュベーション及びIL-6による刺激）
ヒトの血液をヘパリン処理したチューブに集める。血液を148.5μLのアリコートに分ける。その後、1.5μLの被験化合物希釈液を各血液アリコートに加え、血液試料を穏やかに揺らしながら37℃で30分間インキュベートする。IL-6ストック溶液（1.5μl）を血液試料に加え（最終濃度10ng/ml）、該試料を穏やかに揺らしながら37℃で20分間インキュベートする。
【０２２９】
（2.4.2.1.2  白血球調製及びCD4標識付け）
刺激期間の最後に、赤血球を溶解し白血球を固定するために、3mlの1×予熱されたLyse/Fix緩衝液を直ちに血液試料に加え、手短にボルテックスにかけ、水浴中で37℃で15分間インキュベートし、次いでさらに使用するまで-80℃で凍結する。
【０２３０】
以下の工程のために、チューブを37℃でおよそ20分間解凍し、400xgで4℃で5分間遠心分離する。細胞ペレットを3mlの冷1×PBSで洗浄し、遠心分離後、細胞ペレットを100μlの3%BSA含有PBSに再懸濁化する。FITC-結合抗-CD4抗体又は対照のFITC-結合アイソタイプ抗体を加え、暗所にて室温で20分間インキュベートする。
【０２３１】
（2.4.2.1.3  細胞透過処理及び抗ホスホ-STAT1抗体による標識付け）
細胞を1×PBSにより洗浄した後、細胞ペレットを100μlの氷冷1×PBSに再懸濁化し、900μlの氷冷100%メタノールを加える。次いで、細胞を、透過処理のために4℃で30分間インキュベートする。
【０２３２】
次いで、透過処理された細胞を1×3% BSA含有PBSにより洗浄し、最後に、80μlの1×3% BSA含有PBXに再懸濁化する。
【０２３３】
20μLのPEマウス抗-STAT1(pY701)又はPEマウスIgG2aκアイソタイプ対照抗体（BD Biosciences社製、それぞれカタログ番号612564及び559319）を加え、混合し、次いで、暗所にて4℃で30分間インキュベートする。
【０２３４】
次いで、細胞を1×PBSで1回洗浄し、FACSCanto IIフローサイトメーター（BD Biosciences社製）で分析する。
【０２３５】
（2.4.2.1.4  FACSCanto IIによる蛍光分析）
50,000の総事象を計数し、ホスホ-STAT1陽性細胞を、リンパ球ゲートにおいてCD4+細胞のゲーティングの後測定する。データを、FACSDivaソフトウェアを利用して分析し、IL-6刺激の阻害率を、CD4+細胞上のホスホ-STAT1に陽性な細胞のパーセンテージに計算する。
【０２３６】
（2.4.2.2  ホスホ-STAT5アッセイ）
白血球におけるシグナル伝達性転写因子5 (pSTAT5)リン酸化のGM-CSF-刺激性の増加には、インフォームドコンセントを与えたヒトの志願者から採取されたヒトの全血をエクスビボで化合物により30分間処理し、次いで20分間GM-CSFにより刺激する。単球におけるGM-CSFによるSTAT5のリン酸化の増加を、抗ホスホ-STAT5抗体を利用してFACSにより測定する。
【０２３７】
5×Lyse/Fix緩衝液（BD PhosFlow社製、カタログ番号558049）を蒸留水で5倍に希釈し、37℃に予熱する。残りの希釈したLyse/Fix緩衝液を廃棄する。
【０２３８】
10μgのrhGM-CSF（AbCys S.A.社製、カタログ番号P300-03）を100μlのPBS 0.1% BSAに溶かし、100μg/mlのストック溶液を得る。ストック溶液を小分けして-80℃で保存する。
【０２３９】
化合物の3倍希釈系列をDMSO中に調製する（10 mMストック溶液）。対照処理試料には、被験化合物なしでDMSOを与える。試料を全て、1%の最終DMSO濃度でインキュベートする。
【０２４０】
（2.4.2.2.1  化合物と血液とのインキュベーション及びGM-CSFによる刺激）
ヒトの血液をヘパリン処理したチューブに集める。血液を148.5μlのアリコートに分ける。次いで、1.5μlの化合物希釈液を各アリコートに加え、血液試料を穏やかに揺らしながら37℃で30分間インキュベートする。GM-CSFストック溶液(1.5μl)を血液試料に加え（最終濃度20pg/ml）、試料を穏やかに揺らしながら37℃で20分間インキュベートする。
【０２４１】
（2.4.2.2.2  白血球調製及びCD14標識付け）
刺激期間の最後に、赤血球を溶解し白血球を固定するために、3mlの1×予熱されたLyse/Fix緩衝液を直ちに血液試料に加え、手短にボルテックスにかけ、水浴中で37℃で15分間インキュベートし、次いで、さらに使用するまで-80℃で凍結する。
【０２４２】
以下の工程のために、チューブを37℃でおよそ20分間解凍し、400xgで4℃で5分間遠心分離する。細胞ペレットを3mlの冷1×PBSで洗浄し、遠心分離後、細胞ペレットを100μlの3% BSA含有PBSに再懸濁化する。FITCマウス抗-CD14抗体（BD Biosciences社製、カタログ番号345784）又は対照FITCマウスIgG2bκアイソタイプ抗体（BD Biosciences社製、カタログ番号555057）を加え、暗所にて室温で20分間インキュベートする。
【０２４３】
（2.4.2.2.3  細胞透過処理及び抗ホスホ-STAT5抗体による標識付け）
細胞を1×PBSで洗浄した後、細胞ペレットを100μlの氷冷1×PBSに再懸濁化し、900μlの氷冷100%メタノールを加える。次いで、細胞を、透過処理のために、4℃で30分間インキュベートする。
【０２４４】
次いで、透過処理された細胞を1×3%BSA含有PBSで洗浄し、最後に80μlの1×3% BSA含有PBXに再懸濁化する。
【０２４５】
20μLのPEマウス抗-STAT5(pY694)又はPEマウスIgG1κアイソタイプ対照抗体（BD Biosciences社製、それぞれカタログ番号612567及び554680）を加え、混合し、次いで暗所にて4℃で30分間インキュベートする。
【０２４６】
次いで、細胞を1×PBSで1回洗浄し、FACSCanto IIフローサイトメーター（BD Biosciences社製）で分析する。
【０２４７】
（2.4.2.2.4  FACSCanto IIによる蛍光分析）
50,000の総事象を計数し、ホスホ-STAT5陽性細胞を、CD14+細胞のゲーティングの後測定する。データを、FACSDivaソフトウェアを利用して分析し、CD14+細胞上のホスホ-STAT5に陽性な細胞のパーセンテージに対して計算されたGM-CSF刺激の阻害率に相当する。
【０２４８】
（実施例3  インビボモデル）
（実施例3.1  CIAモデル）
（3.1.1  材料）
完全フロイントアジュバント（CFA）及び不完全フロイントアジュバント（IFA）をDifco社から購入する。ウシII型コラーゲン（CII）、リポ多糖（LPS）及びエンブレル（登録商標）をそれぞれ、Chondrex社（Isle d'Abeau、フランス）、Sigma社（P4252、L'Isle d'Abeau、フランス）、Whyett（25mg注射可能シリンジ、フランス)、Acros Organics社（カリフォルニア州パロアルト）から入手する。使用した他の全ての試薬は試薬等級のものであり、全ての溶媒は分析用のものである。
【０２４９】
（3.1.2  動物）
Dark Agoutiラット（雄、7〜8週齢）をHarlan Laboratories社（Maison-Alfort、フランス）から入手する。ラットを12時間の明暗サイクル（0700-1900）におく。温度を22℃に維持し、餌及び水を適宜与える。
【０２５０】
（3.1.3  コラーゲン誘発関節炎（CIA））
実験の前日に、CII溶液（2mg/mL）を0.05Mの酢酸を用いて調製し、4℃で保管する。免疫化の直前に、等量のアジュバント（IFA）及びCIIを氷水浴において、予冷却したガラス瓶中でホモジナイザーにより混合する。乳濁液が形成されない場合は、さらなるアジュバント及びホモジナイズの延長が必要となる場合がある。1日目に0.2mLの乳濁液を各ラットの尾の根元に皮内注射し、9日目に第2の追加免疫の皮内注射（CFA 0.1mLの生理食塩水中2mg/mLのCII溶液）を行う。この免疫化法は既報の方法（Simsらの文献、(2004)；Jouらの文献、2005）を変更したものである。
【０２５１】
（3.1.4  研究設計）
化合物の治療効果をラットCIAモデルで試験する。ラットを無作為に、均等な群に分け、各群は10匹のラットを含んでいた。全てのラットを1日目に免疫化し、9日目に追加免疫する。治療量を16日目〜30日目まで与え続ける。陰性対照群をビヒクル（MC 0.5%）で処理し、陽性対照群をエンブレル（登録商標）（10mg/kg、3×週、皮下注射）で処理する。対象とする化合物を通常3用量、例えば、3、10、30mg/kg、経口で試験する。
【０２５２】
（3.1.5  関節炎の臨床評価）
関節炎をKhachigianの文献2006、Linらの文献2007及びNishidaらの文献2004の方法に従い得点付けする。4足それぞれの腫脹を以下のように関節炎スコアによってランク付けする：0−症状なし；1−軽度だが、足首又は手首などの1種の関節の明確な紅化及び腫脹、又は罹患した指の数にかかわらず個々の指に限られた明らかな紅化及び腫脹；2−2種以上の関節の中等度の紅化及び腫脹；3−指を含む足全体の重度の紅化及び腫脹；4−多数の関節が関与する極度に炎症を起こした肢（動物あたりの最大の累積臨床関節炎スコアは16）（Nishidaらの文献2004）。
【０２５３】
複数の研究のメタ分析を可能にするため、臨床スコア値を以下のとおり規格化する。
【０２５４】
臨床スコアのAUC（AUCスコア）：個々のラットに対して、1日から14日の曲線下面積(AUC)を計算する。各動物のAUCを、その動物のデータが得られた研究におけるビヒクルに対して得られた平均AUCで割り、100をかける（すなわち、AUCを、研究あたりの平均ビヒクルAUCのパーセンテージとして表した）。
【０２５５】
1日から14日までの臨床スコアの増加（エンドポイントスコア）：各動物の臨床スコアの差を、その動物のデータが得られた研究におけるビヒクルに対して得られた平均臨床スコアの差で割り、100をかける（すなわち、差を、研究あたりビヒクルの平均臨床スコアの差のパーセンテージとして表す）。
【０２５６】
（3.1.6  関節炎発症後の体重の変化（％））
臨床的に、体重減少は関節炎と関連している（Sheltonらの文献、2005；Argilesらの文献、1998；Rallの文献、2004；Walsmithらの文献2004）。したがって、関節炎発症後の体重の変化は、ラットモデルにおける治療術の効果を評価する非特異的なエンドポイントとして利用できる。関節炎発症後の体重の変化(%)を以下のように計算する。
【０２５７】
【数１】
0005947371.tif 000008
【０２５８】
【数２】
0005947371.tif 000009
【０２５９】
（3.1.7  放射線学）
個々の動物の後足のX線写真を撮影する。無作為のブラインド・アイデンティティ番号を、写真のそれぞれに割り当て、以下の放射線学的ラーセンのスコアシステムを用いて2人の独立したスコアラーにより骨びらんの重症度をランク付けする：0−無傷の骨の外郭及び正常な関節腔を有する正常状態；1−1又は2の外側中足骨に軽微な骨びらんが見られる軽度の異常；2−3から5の外側中足骨に骨びらんがみられる明確な初期の異常；3−全ての外側中足骨並びに1又は2の内側中足骨に明らかな骨びらんが見られる中等度破壊性異常；4−全ての中足骨に明らかな骨びらんが見られ、かつ少なくとも1の内側中足骨関節が完全に侵食され、骨の関節外郭のいくらかが部分的に残されている重度破壊性異常；5−骨の外郭を有さないムチランス型異常。このスコア付けシステムは、Salveminiらの文献、2001；Bushらの文献、2002；Simsらの文献、2004；Jouらの文献、2005の変形である。
【０２６０】
（3.1.8  組織学）
放射線学的分析の後、マウスの後足を10%リン酸-緩衝ホルマリン（pH7.4）に固定し、微細組織診のための急速骨脱灰剤（Laboratories Eurobio社製）によって脱灰しパラフィンに包埋する。関節炎の関節の詳細な評価を確実に行うために、少なくとも4つの連続切片（5μm厚）を切り出し、各系列の切片の間を100μmとする。該切片をヘマトキシリン及びエオシン（H＆E）で染色する。滑膜の炎症、並びに骨及び軟骨損傷の組織学的実験を、二重盲検手順を利用して行う。各足において、4点スケールを用いて4つのパラメーターを評価する。該パラメーターは、細胞浸潤、パンヌス重症度、軟骨侵食、及び骨びらんとする。したがって、以下のようにスコア付けを行う：1−正常、2−軽度、3−中等度、4−顕著。4つのスコアを総合し、さらなるスコア、つまり「RA総計スコア」として表す。
【０２６１】
（3.1.9  踵骨（踵の骨）のマイクロ-コンピュータ断層撮影法（μCT）分析）
RAに見られる骨破壊は特に皮質骨で生じ、μCT分析により明らかとなり得る（Sims NAらの文献、Arthritis Rheum. 50 (2004) 2338-2346:「ゾレドロン酸による破骨細胞の標的化はコラーゲン誘導性関節炎における骨破壊を予防する(Targeting osteoclasts with zoledronic acid prevents bone destruction in collagen-induced arthritis)」；Oste Lらの文献、ECTC Montreal 2007「マイクロCT形態計測によりマウスのCIAモデルにおける骨の構築の乱れを測定するハイスループット法(A high throughput method of measuring bone architectural disturbance in a murine CIA model by micro-CT morphometry)」）。踵骨の走査及び3Dボリューム再構築後に、骨破壊を、インシリコで骨の縦軸に対して垂直に単離されたスライドあたりに存在する分離した対象の数として測定する。骨がより破壊されているほど、より多くの分離対象が測定される。踵骨に沿って均一に分布した1000の切片（約10.8μmの間隔）を分析する。
【０２６２】
（3.1.10  定常状態PK）
7日又は11日に、抗凝血剤としてのヘパリンリチウムとともに血液試料を後方眼窩洞(retro-orbital sinus)で下記の時点で採取する：投与前、1、3、及び6時間。全血試料を遠心分離し、生じた血漿試料を分析未決のまま-20℃で保存する。各被験化合物の血漿濃度を、質量分光法がポジティブエレクトロスプレーモードで運転されるLC-MS/MS法により測定する。Winnonlin（登録商標）（Pharsight（登録商標）、アメリカ合衆国）を使用して薬物動態学的パラメーターを計算し、投与前の血漿レベルが24時間血漿レベルと等しいと仮定する。
【０２６３】
（3.1.11  結果）
本発明の化合物は、0.1mg/kgの投与量で、規格化された臨床スコア値（AUCとして計算又は1日から14日への差として）に統計的に有意な向上を示した。
【０２６４】
（実施例3.2  敗血症ショックモデル）
リポ多糖（LPS）の注射は、可溶性腫瘍壊死因子（TNF-α）の末梢への急速な放出を誘導する。このモデルを使用して、インビボでのTNF放出の有望な遮断薬を分析する。
【０２６５】
1群あたり6匹の雌のBALB/cJマウス（20g）を、一度の意図された投与、経口投与で処理する。30分後、LPS（15μg/kg；大腸菌血清型0111:B4）を腹腔内に注射する。90分後、マウスを安楽死させ、血液を回収する。循環しているTNFαのレベルを、市販のELISAキットを使用して測定する。デキサメタゾン（5μg/kg）を参照抗炎症化合物として使用する。
【０２６６】
（実施例3.3  MABモデル）
MABモデルは、治療法によるRA様炎症応答の調節の迅速な評価を可能にする（Kachigian LMの文献、Nature Protocols (2006) 2512-2516：「コラーゲン抗体誘発性関節炎（Collagen antibody-induced arthritis）」）。DBA/Jマウスに、II型コラーゲンに対するmAbカクテルを静脈内注射する。1日後、化合物処理を開始する（ビヒクル：10% (v/v) HPβCD）。3日後、マウスに腹腔内LPS注射（50μg/マウス）を施し、速やかな炎症の発症を起こさせる。該mAb注射の10日後まで、化合物処理を続ける。足の腫脹の測定及び各足の臨床スコアの記録によって、炎症を読み取る。四肢の累積的臨床関節炎スコアを提示して炎症の重症度を示す。4が最も重症の炎症である0〜4のスケールを使用して、スコア付けシステムを各肢に適用する。
0  症状なし
1  軽度だが、足首又は手首などの1種の関節の明確な紅化及び腫脹、又は罹患した指の数にかかわらず個々の指に限られた明らかな紅化及び腫脹
2  2種以上の関節の中等度の紅化及び腫脹
3  指を含む足全体の重度の紅化及び腫脹
4  多数の関節が関与する極度に炎症を起こした肢。
【０２６７】
（実施例3.4  オンコロジーモデル）
JAK2誘導性の骨髄増殖性疾患に対する小分子の有効性を検証するためのインビボモデルは、Wernigらの文献、Cancer Cell 13, 311, 2008、及びGeronらの文献、Cancer Cell 13, 321, 2008に記載されている。
【０２６８】
（実施例3.5  マウスIBDモデル）
IBDに対する小分子の有効性を検証するためのインビトロ及びインビボのモデルは、Wirtzらの文献、2007に記載されている。
【０２６９】
（実施例3.6  マウス喘息モデル）
喘息に対する小分子の有効性を検証するためのインビトロ及びインビボのモデルは、Nialsらの文献、2008；Ipらの文献、2006；Pernisらの文献、2002；Kudlaczらの文献、2008に記載されている。
【０２７０】
（実施例4：薬物動態学、DMPK、及び毒性アッセイ）
（実施例4.1  熱力学的溶解性）
1mg/mLの被験化合物の溶液を、ガラス小瓶において室温で、0.2Mのリン酸緩衝液pH7.4又は0.1Mのクエン酸緩衝液pH3.0に調製する。
【０２７１】
該試料をローテータードライブSTR4（Stuart Scientific社製、Bibby社製）において、速度3.0、室温で24時間回転させる。
【０２７２】
24時間後、800μLの試料をエッペンドルフチューブに移し、14000rpmで5分間遠心分離する。次いで、200μLの試料の上清をMultiscreen（登録商標）溶解度用プレート（Millipore社製、MSSLBPC50）に移し、該上清を真空マニホールドを用いて、清潔なGreiner社製ポリプロピレンV字底96ウェルプレート（カタログ番号651201）に濾過する（25.4-30.5cmHg）。5μLの濾液を、検量線を有するプレート（Greiner社製、カタログ番号651201）で、インキュベートに使用するのと同じ緩衝液95μL（20倍）に希釈する。
【０２７３】
該化合物の検量線をDMSO中で新たに作成する。10mMのDMSOストック溶液から開始して、DMSOに2倍に希釈し（5000μM）、次いで、19.5μMまでDMSOでさらに希釈する。次いで、5000μMからの希釈系列3μlを、97μlのアセトニトリル-緩衝液混合物（50/50）に移す。最終濃度の範囲は2.5〜150μMである。
【０２７４】
該プレートをシーリングマット（MA96RD-04S、Kinesis, Cambs, PE19, 8YX, UK）で密閉し、分子の適切な質量を決定するためにQuanoptimizeを使用して最適条件下で、室温でLCMS（Waters社製、ZQ1525）にて試料を測定する。
【０２７５】
該試料を、LCMSにおいて1ml/分の流量で分析する。溶媒Aは15mMのアンモニアであり、溶媒Bはアセトニトリルである。該試料を、Waters社製のXBridge C18 3.5μM（2.1×30mm）カラムを用いてポジティブイオンスプレー下で操作する。溶媒勾配は、総実行時間2分であり、5% B〜95% Bの範囲である。
【０２７６】
ピーク面積を、Masslynxソフトウェアパッケージを用いて分析し、試料のピーク面積を検量線に対してプロットして、該化合物の溶解度を得る。
【０２７７】
溶解度値をμM又はμg/mLで報告する。
【０２７８】
（実施例4.2  水溶性）
（4.2.1  水溶性2%DMSO手順）
10mMのDMSO中のストック溶液から開始して、化合物の段階希釈をDMSOで調製する。該希釈系列を、96NUNC Maxisorbプレート平底（カタログ番号442404）に移し、室温の0.2Mのリン酸緩衝液pH7.4又は0.1Mのクエン酸緩衝液pH3.0を添加する。
【０２７９】
最終濃度は、5回の同じ希釈工程で、200μM〜2.5μMの範囲にある。最終DMSO濃度は2%を超えない。200μMのピレンを各96ウェルプレートの角点に添加し、顕微鏡のZ軸の補正のための参照点とする。
【０２８０】
該アッセイプレートを密閉し、230rpmで振盪しながら37℃で1時間インキュベートする。次いで、該プレートを白色光顕微鏡下で走査し、濃度あたりの沈殿の個々の写真を得る。該沈殿を分析し、数値に変換して、これをグラフ上にプロットする。該化合物が完全に溶解したように見える最初の濃度は下記に報告する濃度であるが、しかし、本当の濃度は、この濃度と1つ上の希釈段階との間のどこかにあるだろう。
【０２８１】
この手順により測定した溶解度値をμg/mLで報告する。
【０２８２】
(4.2.2  水溶性3%DMSO手順）
10mMのDMSO中のストック溶液から開始して、化合物の段階希釈をDMSOで調製する。該希釈系列を、96NUNC Maxisorbプレート平底（カタログ番号442404）に移し、室温の0.1Mのリン酸緩衝液pH7.4又は0.1Mのクエン酸緩衝液pH3.0を添加する。
【０２８３】
最終濃度は、5回の同じ希釈工程で、300μM〜18.75μMの範囲にあるだろう。最終DMSO濃度は3%を超えない。200μMのピレンを各96ウェルプレートの角点に添加し、顕微鏡のZ軸の補正のための参照点とする。
【０２８４】
該アッセイプレートを密閉し、230rpmで振盪しながら37℃で1時間インキュベートする。次いで、該プレートを白色光顕微鏡下で走査し、濃度あたりの沈殿の個々の写真を得る。該沈殿を分析し、ソフトウェアツールにより数値に変換して、これをグラフ上にプロットできる。該化合物が完全に溶解したように見える最初の濃度は報告した濃度であるが、しかし、本当の濃度は、この濃度と1つ上の希釈段階との間のどこかにある。
【０２８５】
この手順により測定した溶解度値をμg/mLで報告する。
【０２８６】
（実施例4.3  血漿タンパク質結合（平衡透析））
DMSO中の化合物の10mMストック溶液を、DMSOで5倍に希釈する。この溶液を、新たに解凍したヒト、ラット、マウス又はイヌの血漿（BioReclamation社製）で、最終濃度10μM及びDMSO最終濃度0.5%にさらに希釈する（PP-Masterblock 96ウェル（Greiner社製、カタログ番号780285）において1094.5μLの血漿中5.5μL）。
【０２８７】
インサート（ThermoScientific社製、カタログ番号89809）を有するPierce Red Deviceプレートを準備し、緩衝液チャンバーを750μLのPBSで満たし、かつ血漿チャンバーを500μLの添加血漿(spiked plasma)で満たす。該プレートを230rpmで振盪しながら、37℃で4時間インキュベートする。インキュベーション後、両チャンバーの120μLを、96ウェル丸底、PPディープウェルプレート（Nunc社製、カタログ番号278743）中の360μLのアセトニトリルに移し、アルミ箔の蓋で密閉する。該試料を混合し、30分間氷上に置く。次いで、このプレートを1200rcf、4℃で30分遠心分離し、該上澄みをLCMSでの分析用に96V字底PPプレート（Greiner社製、651201）に移す。
【０２８８】
該プレートを、Kinesis, Cambs, PE19 8YX, UKのシーリングマット（MA96RD-04S）で密閉し、分子の適切な質量を決定するためにQuanoptimizeを使用して最適条件下で、室温でLCMS（Waters社製、ZQ1525）にて試料を測定する。
【０２８９】
該試料を、LCMSで1ml/分の流量で分析する。溶媒Aは15mMのアンモニアであり、溶媒Bはアセトニトリルである。該試料を、Waters社製のXBridge C18 3.5μM（2.1×30mm）カラムを用いてポジティブイオンスプレー下で操作する。溶媒勾配は、総実行時間2分であり、5% B〜95% Bの範囲である。
【０２９０】
緩衝液チャンバー及び血漿チャンバー中の化合物のピーク面積は、100%の化合物であると考えられる。血漿への結合率を、これらの結果から導き、血漿への結合率として報告する。
【０２９１】
PBS中の最終試験濃度の化合物の溶解度を顕微鏡で調査して、沈殿が見られるか否かを示す。
【０２９２】
（実施例4.4  ミクロソーム安定性）
（4.4.1  ミクロソーム安定性1時間インキュベーション手順）
DMSO中の化合物の10mMストック溶液を、96ディープウェルプレート（Greiner社製、カタログ番号780285）において182mMのリン酸緩衝液pH7.4で1000倍に希釈し、37℃でプレインキュベートする。
【０２９３】
40μLの脱イオン水をポリプロピレン製マトリックス2Dバーコード標識化した保存チューブ（Thermo Scientific社製）のウェルに添加し、37℃でプレインキュベートする。
【０２９４】
グルコース-6-リン酸脱水素酵素（G6PDH）作業溶液を182mMのリン酸緩衝液pH7.4で調製し、使用前に氷上に置く。MgCl2、グルコース-6-リン酸及びNADP+を含む補因子を脱イオン水で調製し、使用前に氷上に置く。
【０２９５】
対象とする種（ヒト、マウス、ラット、イヌ）の肝ミクロソーム（Xenotech社）、前述のG6PDH、及び補因子を含む最終作業溶液を調製し、この混合物を室温で20分以内でインキュベートする。
【０２９６】
30μLの予熱した化合物希釈液を、マトリックスチューブ中の予熱した水40μLに添加し、30μLのミクロソーム混合物を添加する。最終反応濃度は、化合物3μM、ミクロソーム1mg、GDPDH 0.4U/mL、MgCl2 3.3mM、グルコース-6-リン酸3.3mM及びNADP+ 1.3mMである。
【０２９７】
ゼロ時間での化合物の残存率を測定するために、ミクロソーム混合物の添加前に、MeOH又はACNを該ウェルに添加する（1:1）。該プレートをMatrix Sepra seals（商標）（Matrix社、カタログ番号4464）で密閉し、数秒間振盪して、確実に全ての成分の混合が行われるようにする。
【０２９８】
停止ししなかった試料を、37℃、300rpmでインキュベートし、1時間のインキュベート後、該反応をMeOH又はACNで停止する（1:1）。
【０２９９】
該反応の停止後、試料を混合し、氷上に30分間置いてタンパク質を沈殿させる。次いで、該プレートを1200rcf、4℃で30分間遠心分離し、LCMSでの分析用に上澄みを96V字底PPプレート（Greiner社、651201）に移す。
【０３００】
これらのプレートを、Kinesis, Cambs, PE19 8YX, UKのシーリングマット（MA96RD-04S）で密閉し、親分子の適切な質量を決定するためにQuanoptimizeを使用して最適条件下で、室温でLCMS（Waters社製、ZQ1525）にて試料を測定する。
【０３０１】
該試料を、LCMSにおいて1ml/分の流量で分析する。溶媒Aは15mMのアンモニアであり、溶媒Bは、使用した停止溶液に応じてメタノール又はアセトニトリルである。該試料を、Waters社のXBridge C18 3.5μM（2.1×30mm）カラムを用いてポジティブイオンスプレー下で操作する。溶媒勾配は、総実行時間2分であり、5% B〜95% Bの範囲である。
【０３０２】
ゼロ時間での親化合物のピーク面積を100%の残存とする。1時間のインキュベーション後の残存率をゼロ時間から算出し、残存率として算出する。緩衝液中の最終試験濃度の化合物の溶解度を顕微鏡で調査し、結果を報告する。
【０３０３】
ミクロソーム安定性のデータを、60分後に残存している化合物の総量の割合として表す。
【０３０４】
（4.4.2.ミクロソーム安定性30分インキュベーション手順）
DMSO中の化合物の10mMストック溶液を、96ディープウェルプレート（Greiner社製、カタログ番号780285）において105mMのリン酸緩衝液pH7.4で6μMに希釈し、37℃で予熱する。
【０３０５】
700U/mlのグルコース-6-リン酸脱水素酵素（G6PDH、Roche社製、10127671001）作業溶液を105mMのリン酸緩衝液pH7.4で1:700の比で希釈する。0.528MのMgCl2.6H2O（Sigma社製, M2670)、0.528Mのグルコース-6-リン酸(Sigma社製, G-7879)及び0.208MのNADP+(Sigma社製, N-0505)を含む補因子混合物を、105mMのリン酸緩衝液pH7.4で1:8の比で希釈する。
【０３０６】
対象とする種（ヒト、マウス、ラット、イヌなど）の1mg/ml肝ミクロソーム（供給業者Xenotech社）、0.8U/mlのG6PDH、及び補因子混合物(6.6mMのMgCl2、6.6mMのグルコース-6-リン酸塩、2.6mMのNADP+）を含む最終作業溶液を調製する。この混合物を室温で15分、しかし決して20分を超えずにインキュベートする。
【０３０７】
プレインキュベーションの後に、化合物希釈液及びミクロソームを含む混合物を等量加え、300 rpmで30分間インキュベートする。0分の時点で、ミクロソーム混合物を加える前に、2体積のメタノールを化合物希釈液に加える。インキュベーションの間の最終濃度は以下のとおりである：3μMの被験化合物又は対照化合物、0.5 mg/mlのミクロソーム、0.4U/mlのG6PDH、3.3mMのMgCl2、3.3mMのグルコース-6-リン酸塩、及び1.3mMのNaDP+。
【０３０８】
30分のインキュベーションの後、反応を2体積のメタノールで停止させる。
【０３０９】
両時点で、試料を混合し、遠心分離し、上清をLC-MS/MSでの分析用に採取する。残存化合物のパーセンテージを決定するために、装置の反応(すなわちピーク高さ)を、ゼロ時点試料（100%として）に参照する。標準化合物プロパノロール及びベラパミルをアッセイデザインに含める。
【０３１０】
ミクロソーム安定性のデータを、30分後に残存する化合物の総量に対するパーセンテージとして表す。
【０３１１】
（実施例4.5  Caco2透過性）
2方向Caco-2アッセイを下記のように行う。Caco-2細胞を欧州細胞カルチャーコレクション（ECACC、カタログ86010202）から入手し、24ウェルトランスウェルプレート（Fisher社、TKT-545-020B）での21日間の細胞培養後に使用する。
【０３１２】
DMEM＋GlutaMAXI＋1%のNEAA＋10%のFBS（FetalClone II）＋1%のPen/Strepからなる播種培地に2×105細胞/ウェルを播種する。培地は2〜3日毎に交換する。
【０３１３】
被験化合物及び参照化合物（プロプラノロール及びローダミン123又はビンブラスチン、全てSigma社から購入した）を、25mMのHEPES（pH7.4）を含有するハンクス平衡塩類溶液で調製し、0.25%の最終DMSO濃度を有する10μMの濃度で、トランスウェルプレートアセンブリの頂端側チャンバー（125μL）又は基底側チャンバー（600μL）のいずれかに加える。
【０３１４】
50μMのルシファーイエロー（Sigma社製）を全ウェルのドナー緩衝液に添加し、ルシファーイエローの透過を監視することによって細胞層の一体性を評価する。ルシファーイエロー（LY）は親油性バリアを自由に透過することができないので、LY輸送の程度が高いと該細胞層の一体性が乏しいことを示唆する。
【０３１５】
オービタルシェーカーで150rpmで振盪しながら37℃で1時間インキュベーションした後、頂端側(A)及び基底側(B)の両チャンバーから70μLのアリコートを取り出し、96ウェルプレートにて、分析用内部標準（0.5μMのカルバマゼピン）を含有する、100μLの50:50 アセトニトリル:水の溶液に添加する。
【０３１６】
基底側及び頂端側から得た液体150μLを含む新たな96ウェルプレートで、Spectramax Gemini XS（励起426nm及び発光538nm）を用いてルシファーイエローを測定する。
【０３１７】
試料中の化合物濃度を高速液体クロマトグラフィー/質量分析計（LC-MS/MS）により測定する。
【０３１８】
見掛けの透過度（Papp）の値を以下の関係から算出する：
Papp＝[化合物]受容体最終×V受容体/([化合物]供与体初期×V供与体)/Tinc×V供与体/表面積×60×10-6cm/秒
V＝チャンバー容積
Tinc＝インキュベーション時間
表面積＝0.33cm2。
【０３１９】
Papp B＞A/Papp A＞Bの比を用いて、頂端細胞表面からの能動的な流出の指標としての流出率を算出する。
【０３２０】
下記のアッセイ許容基準を使用する：
プロプラノロール：Papp（A＞B）値≧20（×10-6cm/秒）
ローダミン123又はビンブラスチン：Papp（A＞B）値＜5（×10-6cm/秒）流出率≧5を伴う
ルシファーイエロー透過度：≦100nm/秒。
【０３２１】
（実施例4.6  齧歯類における薬物動態学的研究）
（4.6.1  動物）
Sprague-Dawleyラット（雄、5〜6週齢）をJanvier社（フランス）から得る。ラットを治療の前に少なくとも7日間順化させ、12時間明暗サイクル(0700-1900)においた。温度をおよそ22℃に保ち、餌及び水を適宜与える。被験化合物の投与2日前に、ラットに手術をしてイソフルラン麻酔のもとで頸静脈にカテーテルを入れる。手術後、ラットを個別の部屋に入れる。経口投与の前に少なくとも16時間及び後に6時間ラットを断食させる。水は適宜与える。
【０３２２】
（4.6.2  薬物動態学的研究）
化合物を、経静脈経路用にはPEG200/生理食塩水(60/40)に、経口経路用には、0.5%メチルセルロース及び10%ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリンpH3に製剤する。被験化合物を、5 mg/kgで単一の食道経管栄養法として5 ml/kgの投薬体積で経口投与し、ボーラスとして尾静脈により1 mg/kgで5 mL/kgの投薬体積で経静脈投与する。各群は3匹のラットからなった。下記の時点に抗凝血剤としてのヘパリンリチウムとともに血液試料を頸静脈から採取する：0.05、0.25、0.5、1、3、5、及び8時間（経静脈経路）、並びに0.25、0.5、1、3、5、8、及び24時間（経口経路）。全血試料を5000 rpmで10分間遠心分離し、生じた血漿試料を分析未決のまま-20℃で保存する。
【０３２３】
（4.6.3  血漿中の化合物レベルの定量化）
各被験化合物の血漿濃度を、質量分析計がポジティブエレクトロスプレーモードで運転しているLC-MS/MS法により測定する。
【０３２４】
（4.6.4  薬物動態学的パラメーターの決定）
薬物動態学的パラメーターを、Winnonlin（登録商標）（Pharsight（登録商標）、アメリカ合衆国）を使用して計算できる。
【０３２５】
（実施例4.7  7日間ラット毒性研究）
被験化合物を用いた7日間経口毒性研究を、Sprague-Dawley系の雄のラットで行い、それらの毒性及び毒物動態を、5mL/kg/日の一定の投与体積で、経管栄養法による100、300及び500mg/kg/日の一日量で評価する。
【０３２６】
被験化合物を精製水中30%(v/v)のHPβCDに製剤する。各群は、5匹の主要な雄のラット並びに3匹の毒物動態のためのサテライト動物を含む。第4群に、30%(v/v)HPβCD水溶液のみを、同じ頻度、投与体積で、かつ同じ投与経路により与え、ビヒクル対照群として役割を果たした。
【０３２７】
該研究の目標は、確認される有害事象のない最低用量（最大無毒性量-NOAEL）を決定することである。
【０３２８】
（実施例4.8  肝細胞安定性）
肝細胞における代謝クリアランスを評価するモデルは、McGinnityらの文献Drug Metabolism and Disposition 2008, 32, 11, 1247に記載されている。
【０３２９】
（実施例4.9  QT延長の傾向）
QT延長の可能性は、hERGパッチクランプアッセイにおいて評価する。
【０３３０】
（従来の全細胞パッチクランプ）
全細胞パッチクランプ記録は、Pulse v8.77ソフトウェア(HEKA社)により制御されたEPC10増幅器を利用して実施する。直列抵抗は典型的には10 MΩ未満であり、60%超補償されており、記録はリーク減算されない。電極は、GC150TFピペットガラス(Harvard社)製である。
【０３３１】
外部浴溶液は、135 mM NaCl、5 mM KCl、1.8 mM CaCl2、5 mM グルコース、10 mM HEPES, pH 7.4を含む。
【０３３２】
内部パッチピペット溶液は、100mMグルコン酸カリウム、20 mM KCl、1mM CaCl2、1 mM MgCl2、5mM Na2ATP、2mM グルタチオン、11 mM EGTA、10 mM HEPES、pH 7.2を含む。
【０３３３】
Biologic MEV-9/EVH-9迅速潅流システムを利用して、薬物を潅流させる。
【０３３４】
記録は全てhERGチャネルを安定に発現しているHEK293細胞で行う。細胞を、2本の白金ロッド（Goodfellow社製）を用い、記録チャンバーに固定された12 mmの円形カバースリップ(German glass、Bellco社)上に培養する。hERG電流を、活性化パルスを用いて+40 mVに1000ミリ秒間惹起し、次いでテール電流パルスにより2000ミリ秒間-50 mVにし、保持電位は-80 mVである。パルスを20秒ごとに印加し、実験は全て室温で行う。
【０３３５】
（引用文献）
【化４】
0005947371.tif 000010
0005947371.tif 000011
0005947371.tif 000012
【０３３６】
本明細書に引用された、特許及び特許出願を含むがこれらに限定されない刊行物は全て、個々の刊行物が完全に記載されているかのように引用により本明細書に組み込まれるように具体的かつ個別的に示されているかのように、引用により本明細書に組み込まれる。
【０３３７】
上記記載が本質的に例示的で説明的であり、本発明及びその好ましい実施態様を説明するものであることを、当業者は理解するだろう。上記記載から、本発明の組成物及び方法における様々な改良及び変更を当業者は思いつくだろうが、それらは本発明の趣旨から逸脱せずになすことができる。添付の特許請求の範囲内にあるそのような改良は全て、本件出願に含まれるものとする。
【０３３８】
様々な化合物の示差的な細胞浸透能などの因子がインビトロ生化学アッセイにおける化合物活性と細胞アッセイにおける化合物活性との間の相違に関与し得ることを理解されたい。
【０３３９】
本件出願に与えられ、かつ記載される本発明の化合物の化学名の少なくともいくつかは、市販の化学命名ソフトウェアプログラムを使用して自動的に生成された場合があり、独立に検証していない場合がある。この機能を実行する代表的なプログラムには、Open Eye Software社により販売されるLexichem命名ツール及びMDL社により販売されるAutonom Softwareツールがある。示された化学名と表された構造とが異なる場合、表された構造が基準となる。
【０３４０】
本明細書に示された化学構造は、ChemDraw（登録商標）又はISIS（登録商標）/DRAWのいずれかを使用して作成された。本明細書の構造における炭素、酸素又は窒素原子に現れている任意の開放原子価は、水素原子の存在を示す。構造中にキラル中心が存在するが、該キラル中心について具体的な立体化学が示されない場合、該キラル構造と関連する両方の鏡像異性体が該構造により包含される。