(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
軸索の変性と関連する疾患の治療に使用するための医薬であって、ニューロンないしその一部におけるＤＬＫの活性又は発現を抑制又は低減し、軸索の変性を抑制する薬剤を含有し、該薬剤が、ＤＬＫに特異的であって、GCACTGAATTGGACAACTCTT(配列番号：１)、GAGTTGTCCAATTCAGTGCTT(配列番号：２)、GGACATCGCCTCCGCTGATTT(配列番号：３)、ATCAGCGGAGGCGATGTCCTT(配列番号：４)、GCAAGACCCGTCACCGAAATT(配列番号：５)、TTTCGGTGACGGGTCTTGCTT(配列番号：６)、GCGGTGTCCTGGTCTACTATT(配列番号：７)、及びTAGTAGACCAGGACACCGCTT(配列番号：８)からなる群から選択される核酸配列を含む小干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)である、医薬。
【請求項２】
ニューロンないしその一部が、小脳顆粒ニューロン、後根神経節ニューロン、皮質ニューロン、交感ニューロン及び海馬ニューロンからなる群から選択されるニューロンであるか又はそのニューロンに含まれる、請求項１に記載の医薬。
【請求項３】
ニューロンのコントロール集団と比較して、ニューロンの集団内の軸索の変性が少なくとも１０％減少する、請求項１に記載の医薬。
【請求項４】
ニューロンないしその一部が、ヒト被検体、神経移植片又は神経移植物に存在するか、又はエクスビボ又はインビトロである、請求項１に記載の医薬。
【請求項５】
前記被検体又は神経移植片若しくは神経移植物が導入される被検体が、(i) 神経系の疾患、(ii) 神経系以外に主な効果を有する治療、状態又は疾患の二次的な神経系の状態、(iii) 物理的、力学的又は化学的な外傷による神経系の損傷、(iv) 疼痛、(v) 眼関連神経変性、(vi) 記憶喪失、及び(vii) 精神的疾患からなる群から選択される疾患又は状態を有するか、又はそれを発達させるリスクにある、請求項４に記載の医薬。
【請求項６】
神経系の前記疾患；神経系以外に主な効果を有する治療、状態又は疾患の二次的な神経系の状態；物理的、力学的又は化学的な外傷による神経系の損傷；疼痛；眼関連神経変性；記憶喪失；又は、精神的疾患の一又は複数の症状又は発症の可能性が少なくとも１０％減少する、請求項５に記載の医薬。
【請求項７】
前記一又は複数の症状は、振戦、運動の遅鈍、運動失調、バランスの喪失、抑鬱、認識機能の低減、短期記憶喪失、長期持続記憶喪失、錯乱、性格の変化、言語障害、感覚の知覚の喪失、触覚に対する感度、四肢の麻痺、筋肉虚弱、筋肉麻痺、筋痙攣、筋れん縮、食習慣の著しい変化、過剰な恐れ又は心配、不眠症、妄想、幻覚、疲労、背痛、胸の疼痛、消化障害、頭痛、迅速な心拍数、めまい、霧視、視力の不安又は喪失領域、変視症、色覚障害、明るい光への曝露後の視覚の機能回復の低減、及び視覚のコントラスト感度の喪失からなる群から選択される、請求項６に記載の医薬。
【請求項８】
疾患又は状態が、
(i) 筋萎縮性側索硬化症(ＡＬＳ)、三叉神経痛、舌咽神経痛、ベル麻痺、重症筋無力症、筋ジストロフィー、進行性筋萎縮、一次側索硬化症(ＰＬＳ)、仮性球麻痺、進行性球麻痺、脊髄筋萎縮、進行性球麻痺、遺伝性筋萎縮、無脊椎椎間板症候群、頸部脊椎症、叢疾患、胸部出口破壊症候群、末梢性神経障害、ポルフィリン症、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病、パーキンソン病、パーキンソンプラス病、多系統萎縮症、進行性核上性麻痺、皮質基底核変性症、レーヴィ小体を有する認知症、前頭側頭型認知症、脱髄性疾患、ギラン-バレー症候群、多発性硬化症、シャルコー・マリー・トゥース病、プリオン病、クロイツフェルト‐ヤコブ病、ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー症候群(ＧＳＳ)、致死性家族性不眠症(ＦＦＩ)、牛海綿様脳症、ピック病、癲癇、及びエイズ認知症複合からなる群から選択される神経系の疾患、
(ii) 慢性疼痛、線維症、脊髄痛、心皮トンネル症候群、癌の疼痛、関節炎、坐骨神経痛、頭痛、手術の疼痛、筋けいれん、背痛、内臓痛、損傷の疼痛、歯痛、神経痛、例えば神経性又は神経障害性の疼痛、神経炎症又は障害、帯状疱疹、椎間板ヘルニア、靱帯損傷及び糖尿病から選択される状態と関連する疼痛、
(iii) 糖尿病、癌、エイズ、肝炎、腎臓機能不全、コロラドダニ熱、ジフテリア、ＨＩＶ感染、ハンセン病、ライム病、結節性多発動脈炎、関節リウマチ、サルコイドーシス、シェーグレン症候群、梅毒、全身性エリテマトーデス又はアミロイドーシスによって生じる末梢性神経障害又は神経痛、
(iv) 中毒性化合物、重金属、工業溶剤、薬剤、化学療法剤、ダプソン、ＨＩＶ薬物、コレステロール低下薬、心臓又は血圧医薬又はメトロニダゾールへの曝露によって生じる神経損傷、
(v) 物理的、力学的又は化学的な外傷によって生じる神経系の損傷、
(vi) 統合失調症、妄想性障害、統合失調感情障害、統合失調症様、共有精神病性障害、精神異常、妄想性人格障害、統合失調型人格障害、境界線人格障害、反社会性人格障害、自己陶酔性人格障害、強迫神経障害、譫妄、認知症、気分障害、双極性障害、抑鬱、ストレス疾患、パニック障害、広場恐怖症、社会的恐怖症、心的外傷後ストレス障害、不安障害及び衝動制御障害からなる群から選択される神経障害、又は、
(vii) 緑内障、格子ジストロフィー、色素性網膜炎、加齢性黄斑変性(ＡＭＤ)、湿性又は乾燥性のＡＭＤと関係する光レセプター変性、他の網膜変性、視神経結晶腔、視覚神経障害及び視覚神経炎からなる群から選択される眼関連の神経変性
である、請求項５に記載の医薬。
【請求項９】
神経系に対する損傷が、熱傷、損傷、手術、事故、乏血、冷温への長期曝露、脳卒中、頭蓋内出血及び脳溢血からなる群から選択されるか、あるいは緑内障が、原発性緑内障、低圧緑内障、原発性閉塞隅角緑内障、急性閉塞隅角緑内障、慢性閉塞隅角緑内障、間欠的閉塞隅角緑内障、慢性開放隅角閉鎖緑内障、色素性緑内障、剥離緑内障、発生上の緑内障、二次的緑内障、水晶体性緑内障、眼内出血の二次的な緑内障、外傷性緑内障、血管新生緑内障、薬物性緑内障、中毒性緑内障、及び眼内腫瘍と関連する緑内障、網膜剥離、眼の重症化学熱傷、及び虹彩萎縮症からなる群から選択される、請求項８に記載の医薬。
【請求項１０】
ニューロンないしその一部の薬剤との接触が、薬剤を含む薬学的組成物を被検体に投与することを含む、請求項５に記載の医薬。
【請求項１１】
静脈内注入、静脈内、腹膜内、脳内、筋肉内、眼内、動脈内、又は病巣内の経路による注射、又は局所的ないし眼への適用のためのものである、請求項１０に記載の医薬。
【請求項１２】
一又は複数の更なる薬学的作用剤を更に含む、請求項１０又は１１に記載の医薬。
【請求項１３】
軸索の変性を阻害するために使用されうる一又は複数の薬剤を具備する薬学的組成物又はキットであって、該薬剤がニューロンないしその一部におけるＤＬＫの活性又は発現を抑制又は低減し、該薬剤が、ＤＬＫに特異的であって、GCACTGAATTGGACAACTCTT(配列番号：１)、GAGTTGTCCAATTCAGTGCTT(配列番号：２)、GGACATCGCCTCCGCTGATTT(配列番号：３)、ATCAGCGGAGGCGATGTCCTT(配列番号：４)、GCAAGACCCGTCACCGAAATT(配列番号：５)、TTTCGGTGACGGGTCTTGCTT(配列番号：６)、GCGGTGTCCTGGTCTACTATT(配列番号：７)、及びTAGTAGACCAGGACACCGCTT(配列番号：８)からなる群から選択される核酸配列を含む小干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)である、薬学的組成物又はキット。
【請求項１４】
一又は複数の薬学的に許容可能な賦形剤又は、軸索の変性を阻害するための方法において組成物又はキットを使用するための指示書を更に具備する、請求項１３に記載の薬学的組成物又はキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に神経学的疾患及び神経系損傷の治療に関する。本発明は、特にニューロン及び軸索の変性を阻害するための、特定の標的タンパク質の活性調節因子の使用及び方法における工程に関する。
【背景技術】
【０００２】
ニューロン又は軸索の変性は、神経系の適切な発達に中心的役割を果たし、例えば、筋萎縮性側索硬化症(ＡＬＳ)、アルツハイマー病及びパーキンソン病を含む多くの神経変性疾患、並びに脳及び脊髄索に対する外傷の特徴である。これらの疾患及び損傷は、患者や介護者に被害が大きく、また大きな財政的な負荷も生じており、年間経費は米国だけで現在数千億ドルを超える。これらの疾患及び状態の現在の治療の多くは満足のいくものではない。このような多くの疾患が年齢に関係しているので、その発症が集団人口統計変化と共に急増していることが、これらの疾患によって生じる問題の緊急性が増している理由である。神経変性疾患及び神経系損傷の治療に対する有効な手法の開発が非常に求められている。
【発明の概要】
【０００３】
本発明は、ニューロンないしその部分(例えばニューロン細胞質体、軸索又は樹状突起)の変性を阻害する方法を提供する。この方法には、(i) ニューロンないしその部分の標的タンパク質の活性又は発現、又は(ii)ニューロンないしその部分のプロセス、を調節する薬剤をニューロンないしその部分に投与することを含む。
本発明の方法において標的とされうるタンパク質の例には、二重ロイシンジッパー保持キナーゼ(ＤＬＫ)、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３β(ＧＳＫ３β)、ｐ３８分裂促進因子活性化プロテインキナーゼ(ｐ３８ ＭＡＰＫ)、β-カテニン、転写第４因子(ＴＣＦ４)、上皮性増殖因子レセプター(ＥＧＦＲ)、ホスホイノシチド３キナーゼ(ＰＩ３Ｋ)、サイクリン依存性キナーゼ５(ｃｄｋ５)、アデニリルシクラーゼ、ｃ−Ｊｕｎ Ｎ末端キナーゼ(ＪＮＫ)、ＢＣＬ２結合Ｘタンパク質(Ｂａｘ)、Ｉｈチャネル、カルシウム／カルモデュリン依存性プロティンキナーゼキナーゼ(ＣａＭＫＫ)、Ｇプロテイン、Ｇプロテインカップリングレセプター、転写第４因子(ＴＣＦ４)、又はβ-カテニンが含まれるが、標的とされるプロセスの例は転写及びタンパク質合成である。
そのニューロンないし部分は、小脳顆粒ニューロン、後根神経節ニューロン、皮質ニューロン、交感神経性ニューロン及び海馬ニューロンからなる群から選択されるニューロンからなるか、又はそのニューロンないであってよい。
【０００４】
薬剤は、例えば、標的タンパク質又は方法のインヒビターであってよい。さらに、薬剤は、例えば、抗体、ポリペプチド、ペプチド、ペプチボディ、核酸分子、小干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)、ポリヌクレオチド、アプタマ、小分子及び多糖類からなる群から選択されてよい。抗体の場合、抗体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体又は抗体断片(例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'又はＦ(ａｂ')２断片)であってよい。小分子の場合、薬剤は、例えば、ＭＧ１３２、ＳＢ４１５２８６、ＧＳＫ３βインヒビターI、ＧＳＫ３βインヒビターVII、ＧＳＫ３βインヒビターVIII、ＧＳＫ３βインヒビターXII、塩化リチウム、ＳＢ２０２１９０、ＳＢ２３９０６３、ＳＢ２３９０６９、ＳＢ２０３５８０、ＳＢ２０３５８０ＨＣｌ、ＡＧ５５６、ＡＧ５５５、ＡＧ４９４、ＰＤ１６８３９３、チロホスチンＢ４４、チロホスチンＢ４２(ＡＧ４９０)、ＬＹ２９４０２２、アニソマイシン、シクロヘキシミド、ロスコビチン、ホルスコリン、ＮＫＨ４７７、アクチノマイシンＤ、ＳＰ６００１２５、Ｂａｘチャネルブロッカー、ＺＤ７２８８、ＳＴＯ-６０９、ボルテゾミブ(bortezomid)、ジスルフィラム、パマピミド(pamapimod)、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ラパチニブジトシラート、塩酸デメクロサイクリン、硫酸ゲンタマイシン、硫酸ネオマイシン、硫酸パロモマイシン、及びこれらの薬学的に許容可能な塩類からなる群から選択される。
ニューロンないしその部分は、被検体、例えばヒト被検体に存在しうる。被検体は、例えば、(i) 神経系の疾患、(ii) 神経系以外に主な効果を有する治療、状態又は疾患の二次的な神経系の状態、(iii) 物理的、力学的又は化学的な外傷による神経系の損傷、(iv) 痛み、(v) 眼関連神経変性、(vi) 記憶喪失、及び(vii) 精神的疾患からなる群から選択される疾患又は症状を有するか、又はそれを発達させるリスクにあってよい。
【０００５】
神経系の疾患の例には、筋萎縮性側索硬化症(ＡＬＳ)、三叉神経痛、舌咽神経痛、ベル麻痺、重症筋無力症、筋ジストロフィー、進行性筋萎縮、原発性側索硬化症(ＰＬＳ)、仮性球麻痺、進行性球麻痺、脊髄筋萎縮、遺伝性筋萎縮、無脊椎椎間板症候群、頸部脊椎症、神経叢疾患、胸部出口破壊症候群、末梢性神経障害、ポルフィリン症(prophyria)、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病、パーキンソン病、パーキンソンプラス病、多系統萎縮症、進行性核上性麻痺、皮膚基底核変性症、レーヴィ小体を有する痴呆、前頭側頭骨痴呆、脱髄性疾患、ギラン-バレー症候群、多発性硬化症、シャルコー−マリー−ツース病、プリオン疾患、クロイツフェルト‐ヤコブ病、ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー症候群(ＧＳＳ)、致死性家族性不眠症(ＦＦＩ)、牛海綿様脳症、ピック病、癲癇及びエイズ認知症複合が含まれる。
疼痛の例には、慢性疼痛、線維症、脊髄痛、心皮トンネル症候群、癌の疼痛、関節炎、座骨神経痛、頭痛、手術の疼痛、筋けいれん、背痛、内臓痛、損傷の疼痛、歯の疼痛、神経痛、例えば神経性又は神経障害性の疼痛、神経炎症又は障害、帯状疱疹、椎間板ヘルニア、靱帯損傷及び糖尿病が含まれる。
【０００６】
神経系以外に主な効果を有する療法、状態又は疾患の二次的な神経系の状態の例には、糖尿病、癌、エイズ、肝炎、腎臓機能不全、コロラドダニ熱、ジフテリア、ＨＩＶ感染、ハンセン病、ライム病、結節性多発動脈炎、関節リウマチ、サルコイドーシス、シェーグレン症候群、梅毒、全身性エリテマトーデス及びアミロイドーシスによって生じる末梢性神経障害又は神経痛が含まれる。
物理的、力学的又は化学的な外傷によって生じる神経系の損傷の例には、中毒性化合物、重金属、工業溶剤、薬剤、化学療法剤、ダプソン、ＨＩＶ薬物、コレステロール低下薬、心臓又は血圧の薬物及びメトロニダゾールへの曝露によって生じる神経損傷が含まれる。他の例には、熱傷、傷、手術、事故、乏血、冷温への長期曝露、脳卒中、頭蓋内出血、脳溢血が含まれる。
【０００７】
精神的疾患の例には、統合失調症、妄想性障害、分裂情動障害、統合失調症様、共有精神病性疾患、精神異常、妄想性人格障害、統合失調症型人格障害、境界線人格障害、反社会性人格障害、自己陶酔型人格障害、強迫神経障害、譫妄、認知症、気分疾患、双極性障害、抑鬱、ストレス障害、パニック障害、広場恐怖症、社会的恐怖症、心的外傷後ストレス障害、不安障害及び衝動制御障害が含まれる。
眼関連神経変性の例には、緑内障、格子ジストロフィー、色素性網膜炎、加齢性黄斑変性(ＡＭＤ)、湿性又は乾燥性のＡＭＤと関係する光レセプター変性、他の網膜変性、視神経結晶腔、視覚神経障害及び視覚神経炎が含まれる。緑内障の例には、原発性緑内障、低眼圧緑内障、原発性閉寒隅角緑内障、急性閉寒隅角緑内障、慢性閉寒隅角緑内障、間欠性閉寒隅角緑内障、慢性開放隅角閉鎖緑内障、色素性緑内障、剥離緑内障、発生上の緑内障、二次的緑内障、水晶体性緑内障、眼内出血の二次的緑内障、外傷性緑内障、血管新生緑内障、薬物誘発性緑内障、中毒性緑内障、及び眼内腫瘍、網膜剥離、眼の重症化学的熱傷及び虹彩萎縮と関係する緑内障が含まれる。
【０００８】
本発明の方法による、ニューロンないしその部分の薬剤との接触には、薬剤を含む薬学的組成物を被検体に投与することを含んでよい。投与は、例えば、静脈内注入；静脈内、腹膜内、脳内、筋肉内、眼内、動脈内、病巣内の経路による注入；又は、局所的又は眼の適用により実行されうる。さらに、本発明の方法は、一又は複数の他の薬学的薬剤を被検体に投与することを含みうる。
他の例では、本発明の方法によって治療されるニューロンないしその部分は、エクスビボ又はインビトロである(例えば神経移植片又は神経移植)。
また、本発明は、ニューロンないしその部分の変性を阻害する際に使用する薬剤の同定方法を含む。これらの方法は、軸索又はニューロンの変性のアッセイにおいて候補薬剤(例えば抗神経成長因子(ＮＧＦ)抗体、血清欠乏／ＫＣｌ減少及び／又はロテノン治療)とニューロンないしその部分を接触させることを伴う。候補薬剤の存在下において、コントロールと比較してニューロンないしその部分の変性の低減が検出された場合、ニューロンないしその部分の変性を阻害する際に使用する薬剤が同定されたことが示される。候補薬剤は、例えば、抗体、ポリペプチド、ペプチド、ペプチボディ、核酸分子、小干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)、ポリヌクレオチド、アプタマー、小分子及び多糖類からなる群から選択されてよい。
【０００９】
また、本発明は、本明細書において記述されるように、ニューロンないしその部分の変性を阻害するために使用されうる一又は複数の薬剤を含有する薬学的組成物及びキットを含む。薬学的組成物及びキットには、例えば、ＭＧ１３２、ＳＢ４１５２８６、ＧＳＫ３βインヒビターI、ＧＳＫ３βインヒビターVII、ＧＳＫ３βインヒビターVIII、ＧＳＫ３βインヒビターXII、塩化リチウム、ＳＢ２０２１９０、ＳＢ２３９０６３、ＳＢ２３９０６９、ＳＢ２０３５８０、ＳＢ２０３５８０ＨＣｌ、ＡＧ５５６、ＡＧ５５５、ＡＧ４９４、ＰＤ１６８３９３、チロホスチンＢ４４、チロホスチンＢ４２(ＡＧ４９０)、ＬＹ２９４０２２、アニソマイシン、シクロヘキシミド、ロスコビチン、ホルスコリン、ＮＫＨ４７７、アクチノマイシンＤ、ＳＰ６００１２５、Ｂａｘチャネルブロッカー、ＺＤ７２８８、ＳＴＯ-６０９、ボルテゾミブ(bortezomid)、ジスルフィラム、パマピミド(pamapimod)、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ラパチニブジトシラート、塩酸デメクロサイクリン、硫酸ゲンタマイシン、硫酸ネオマイシン、硫酸パロモマイシン、及びこれらの薬学的に許容可能な塩類からなる群から選択される一又は複数の薬剤が含まれうる。薬学的組成物及びキットは、一又は複数の薬学的に許容可能な賦形剤を場合によって含んでもよい。さらに、薬学的組成物及びキットは、ニューロンないしその部分の変性を阻害するための方法でのこの組成物及びキットの使用に関する指示を、場合によって含んでもよい。
【００１０】
本発明の方法、組成物及びキットの何れかにおいて、薬剤は、ＤＬＫシグナル伝達インヒビター(例えば、GCACTGAATTGGACAACTCTT(配列番号：１)、GAGTTGTCCAATTCAGTGCTT(配列番号：２)、GGACATCGCCTCCGCTGATTT(配列番号：３)、又はATCAGCGGAGGCGATGTCCTT(配列番号：４)、又はGCAAGACCCGTCACCGAAATT(配列番号：５)、TTTCGGTGACGGGTCTTGCTT(配列番号：６)、GCGGTGTCCTG GTCTACTATT(配列番号：７)、又はTAGTAGACCAGGACACCGCTT(配列番号：８)の配列を望ましくは含むＤＬＫを標的とするｓｉＲＮＡ分子)；抗体、例えば抗体３１７、抗体３１８、抗体３１９、抗体３２０、抗体３２１、抗体３２２、TTGGATGAAGCCATTAGACTA(配列番号：９)のＪＮＫ１配列を標的とするｓｉＲＮＡ分子、ACCTTTAATGGACAACATTAA(配列番号：１０)又はAAGGATTAGCTTTGTATCATA(配列番号：１１)のＪＮＫ２配列を標的とするｓｉＲＮＡ分子、CCCGCATGTGTCTGTATTCAA(配列番号：１２)のＪＮＫ３配列を標的とするｓｉＲＮＡ、ＳＰ６００１２５、ＪＮＫＶインヒビター、ＪＮＫVIIIインヒビター、ＳＣ−２０２６７３、ＳＹ-ＣＣ-４０１、ＳＰ６００１２５、Ａｓ６０１２４５、ＸＧ-１０２、ミリセチン、Ｔ２７８Ａ ＤＬＫ、Ｓ２８１Ａ ＤＬＫ、Ｓ１５２Ａ ＤＬＫ、及びＤＬＫのロイシンジッパードメイン)、ＧＳＫ３インヒビター(例えばＳＢ４１５２８７、ＧＳＫ３βインヒビターI、ＧＳＫ３βインヒビターVII、ＧＳＫ３βインヒビターVIII、ＧＳＫ３βインヒビターXII及び塩化リチウム)、ＥＧＦＲ経路インヒビター(例えばエルロチニブ、チロホスチンＢ４４、チロホスチンＢ４２／ＡＧ４９０、ＡＧ５５５、ＡＧ４９４、ＰＤ１６８３９３、ＳＢ２０３５８０、ＳＢ２３９０６３、ＳＢ２０２１９０、ＳＢ２３９０６９、ＳＴＯ-６０９及びＳＰ６００１２５)又はＧプロテインインヒビター(例えばＳＣＧ２９２６７６及び百日咳毒素)であってよい。
【００１１】
上記何れかの方法において、薬剤の投与により、神経系の障害；神経系以外に主な効果を有する治療、状態又は疾患の二次的な神経系の状態；物理的、力学的又は化学的な外傷によって生じる神経系に対する損傷；疼痛；眼関連神経変性；記憶喪失；又は精神的障害の一又は複数(例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０)の症状の、少なくとも１０％の減少(例えば少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又はさらに１００％の減少)が生じる。このような症状の非限定的な例には、振戦、運動の遅鈍、運動失調、バランスの喪失、抑鬱、認識機能の低減、短期記憶喪失、長期持続記憶喪失、錯乱、性格の変化、言語障害、感覚の知覚の喪失、触覚に対する感度、四肢の麻痺、筋肉虚弱、筋肉麻痺、筋痙攣、筋れん縮、食習慣の著しい変化、過剰な恐れ又は心配、不眠症、妄想、幻覚、疲労、背痛、胸の疼痛、消化障害、頭痛、迅速な心拍数、めまい、霧視、視力の不安又は喪失領域、変視症、色覚障害、明るい光への曝露後の視覚の機能回復の低減、及び視覚のコントラスト感度の喪失が含まれる。
上記何れかの方法において、投与により、神経系の障害；神経系以外に主な効果を有する治療、状態又は疾患の二次的な神経系の状態；物理的、力学的又は化学的な外傷によって生じる神経系に対する損傷；疼痛；眼関連神経変性；記憶喪失；又は精神的障害の可能性が、前記薬剤を投与しない被検体のコントロール集団と比較して、少なくとも１０％の減少(例えば少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又はさらに１００％の減少)が生じる。
【００１２】
また、本発明は、ニューロンないしその部分の変性を活性化するための方法を提供する。この方法には、(i) ニューロンないしその部分の標的タンパク質の活性、又は(ii)ニューロンないしその部分のプロセス、を調節する薬剤をニューロンないしその部分に投与することを含む。標的タンパク質は、例えば、二重ロイシンジッパー保持キナーゼ(ＤＬＫ)、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３β(ＧＳＫ３β)、ｐ３８分裂促進因子活性化プロテインキナーゼ(ｐ３８ ＭＡＰＫ)、上皮性増殖因子レセプター(ＥＧＦＲ)、ホスホイノシチド３キナーゼ(ＰＩ３Ｋ)、サイクリン依存性キナーゼ５(ｃｄｋ５)、アデニリルシクラーゼ、ｃ−Ｊｕｎ Ｎ末端キナーゼ(ＪＮＫ)、ＢＣＬ２結合Ｘタンパク質(Ｂａｘ)、Ｉｈチャネル、カルシウム／カルモデュリン依存性プロティンキナーゼキナーゼ(ＣａＭＫＫ)、Ｇプロテイン、Ｇプロテインカップリングレセプター、転写第４因子(ＴＣＦ４)、又はβ-カテニンからなる群から選択されてよいが、プロセスの例は転写及びタンパク質合成でありうる。さらに、薬剤は、例えば、標的タンパク質又はプロセスの活性化因子であってよい(先に挙げた標的の場合のように、アデニリルシクラーゼを除く)。前記の、ニューロンないしその部分の変性を活性化する方法において、標的タンパク質の調節は、ＧＳＫ３の活性又は発現の増加、β-カテニンの活性又は発現の減少、及び／又はＴＣＦ４の活性又は発現の喪失であってよい。
【００１３】
また、本発明は、ＤＬＫのリン酸化型に特異的に結合する精製された抗体(例えば抗体３１８、抗体３１９、抗体３２０、抗体３２１又は抗体３２２)、及び望ましくはGCACTGAATTGGACAACTCTT(配列番号：１)、GAGTTGTCCAATTCAGTGCTT(配列番号：２)、GGACATCGCCTC CGCTGATTT(配列番号：３)、又はATCAGCGGAGGCGATGTCCTT(配列番号：４)、又はＤＬＫの発現の低減を媒介するGCAAGACCCGTCACCGAAATT(配列番号：５)、TTTCGGTGACGGGTC TTGCTT(配列番号：６)、GCGGTGTCCTGGTCTACTATT(配列番号：７)、又はTAGTAGACCAGGACACCGCTT(配列番号：８)の配列を含む阻害性核酸(例えばｓｉＲＮＡ)を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】抗ＮＧＦ抗体によりニューロンを２０時間処理すると軸索変性が生じることを示す。上列の２つの画像は、抗ＮＧＦ抗体により２時間処理したものと処理していないものについて、Ｔｕｊ１(ニューロン特異的β-チューブリン)抗体にて視覚化したニューロンを示す。下列の２つの画像は、５０μｇ／ｍｌの抗ＮＧＦ抗体のある場合とない場合(コントロール)でインキュベートしたアクチン抗体にて視覚化したニューロンを示す。
【図２】抗ＮＧＦ抗体と共に１、３、６、９、１２又は１６時間培養したニューロンにおける静脈瘤の形成を示す。
【図３】抗ＮＧＦ抗体と１６時間培養した軸索が伸長したミトコンドリアを欠き、静脈瘤にミトコンドリアの蓄積を示すことを示す。
【図４】抗ＮＧＦ抗体と０〜４８時間培養した軸索において、微小管網状組織がアクチン又は神経フィラメント網状組織の前に分解されないことを示す。
【図５】ニューロン細胞質体から切り離される軸索において起こるウォラー変性を示し(上パネル；Raff et al., Science 296(5569): 868-871, 2002)、コントロールと比較して、ウォラー変性遅発(ＷｌｄＳ)変異の病変後に軸索変性の有意な遅延があることを示す(下パネル；Araki et al., Science 305(5686): 1010-1013, 2004)。
【図６】プロテアソームインヒビター及びＧＳＫインヒビターが抗ＮＧＦ抗体ベースのＮＧＦ離脱アッセイにおいて軸索変性を予防することを示す。
【図７】ｐ３８ ＭＡＰＫインヒビター及びアデニリルシクラーゼ活性化因子が抗ＮＧＦ抗体ベースのＮＧＦ離脱アッセイにおいて軸索変性を予防することを示す。
【図８】転写インヒビター及びＥＧＦＲキナーゼインヒビターが抗ＮＧＦ抗体ベースのＮＧＦ離脱アッセイにおいて軸索変性を予防することを示す。
【図９】ＪＮＫインヒビター及びＢａｘチャネルブロッカーが抗ＮＧＦ抗体ベースのＮＧＦ離脱アッセイにおいて軸索変性を予防することを示す。
【図１０】Ｉｈチャネルブロッカー及びＣＡＭＫＫインヒビターが抗ＮＧＦ抗体ベースのＮＧＦ離脱アッセイにおいて軸索変性を予防することを示す。
【図１１】ＮＧＦ離脱時(ｔ＝０)、又は、ＮＧＦ離脱の３、６、９又は１２時間後に添加した、ＧＳＫ３(３０μＭのＳＢ４１５２８６)、ＥＧＦＲキナーゼ(１０μＭのＡＧ５５５)、ｐ３８ ＭＡＰＫ(３０μＭのＳＢ２３９０６３)、ＣＡＭＫＫ(１５μＭのＳＴＯ-６０９)及びＪＮＫ(１０μＭのＳＰ６００１２５)のインヒビターの活性を示すグラフである。
【図１２】細胞体(細胞質体)と軸索の環境が分離されているＣａｍｐｅｎｏｔチャンバを例示する。
【図１３】軸索変性は局所化し、軸索を含むチャンバにおいてＮＧＦ離脱が起こったＣａｍｐｅｎｏｔチャンバ研究においてアポトーシスがなく進行することを示す。変性はチューブリン免疫蛍光法によって視覚化される。
【図１４】図１３に示したＣａｍｐｅｎｏｔチャンバベースのアッセイにおいて細胞質体区画に変性の兆候がないことを示す。
【図１５】３０μＭのＳＢ４１５(ＧＳＫインヒビター；ＧＳＫｉ)又は１５μＭのＡｃｔＤ(転写インヒビター；ＴＸＮｉ)がある場合には、軸索(右パネル)ではなく細胞質体(左パネル)が局所の変性から保護されたことを示す。
【図１６】１０μＭのＡＧ５５５(ＥＧＦＲインヒビター；ＥＧＦＲｉ)又は３０μＭのＳＢ２３９(ｐ３８インヒビター；ｐ３８ｉ)存在下で抗ＮＧＦ抗体に曝すと、細胞質体(左パネル)ではなく軸索(右パネル)が局所の変性から保護されたことを示す。
【図１７】軸索(軸索)又は細胞体環境(細胞)における、１５μＭのアクチノマイシンＤ(ＡｃｔＤ)、３０μＭのＳＢ４１５２８６(ＳＢ４１５)、１０μＭのＡＧ５５５又は３０μＭのＳＢ２３９０６３(ＳＢ２３９)のある場合とない場合(ＤＭＳＯ)で抗ＮＧＦ抗体を軸索環境に添加した、Ｃａｍｐｅｎｏｔチャンバにおける軸索変性の定量化を示すグラフである。
【図１８】本明細書において記述される情報からのデータに基づくモデルである。
【図１９】ＮＧＦがＣａｍｐｅｎｏｔチャンバの軸索区画から除去されている場合に細胞質体が小さく出現することを示す。
【図２０】軸索区画においてＮＧＦを除かれた多くのニューロンはカスパーゼ３の切断が増加しており、核縮合を示すことを示す。(ニューロンの健康は、膜染色剤ＤｉＩの影響を受けうる)。
【図２１】細胞質体又は軸索の区画におけるＮＧＦ離脱開始時(ｔ＝０)及びＮＧＦ離脱の１、３、６、９及び１２時間後のＧＳＫ３活性(リン酸化ＧＳＫ３レベルの減少により測定される)を示すグラフである。
【図２２】細胞質体又は軸索の区画におけるＮＧＦ離脱開始時(ｔ＝０)及びＮＧＦ離脱の１、３、６、９及び１２時間後のＪＮＫ活性(リン酸化ＪＮＫレベルの増加により測定される)を示すグラフである。
【図２３】細胞質体インヒビター(３０μＭのＳＢ４１５(ＧＳＫｉ)及び１５μＭのＡｃｔＤ(ＴＸＮｉ))を細胞質体区画に加えた場合に、静脈瘤を有する多数の軸索並びに断片化した軸索が観察されたことを示す。軸索区画への軸索インヒビター(１０μＭのＡＧ５５５(ＥＧＦＲｉ)及び３０μＭのＳＢ２３９(ｐ３８ｉ))の添加により静脈瘤が少なくなり、軸索は直接断片化されるようであった。
【図２４】より多くの機能的ミトコンドリアがあるが、依然として、ＧＳＫ、ＥＧＦＲ及びｐ３８インヒビターにて処理したＮＧＦ除去ニューロンではミトコンドリアの伸長がなかったことを示す。
【図２５】ＧＳＫインヒビターＳＢ４１５が病変の後の軸索変性を遅延させうることを示す。
【図２６】広域のＮＧＦ離脱の後、１０μＭ又は２５μＭのＧＳＫインヒビターは軸索変性をブロックしたが、細胞死はブロックしなかったことを示す。
【図２７】非トランスジェニックコントロール(ＮＴＧ；左パネル)と比較して、抗ＥＧＦＲ抗体(右パネル)にて染色したＳＯＤ１マウス(Ｔｇ)脊髄の切片ではＥＧＦＲ発現が増加することを示す。
【図２８】ＥＧＦＲはニューロン(運動ニューロン)において正常に発現され、リン酸化ＥＧＦＲ(ｐＥＧＦＲ)のレベルは非トランスジェニックコントロール(非Ｔｇ)と比較してＡＬＳ ＳＯＤ１マウスモデル(ＳＯＤ１-Ｔｇ)において増加することを示す。
【図２９】軸索の数は、非トランスジェニックコントロール(非Ｔｇ)と比較して、ＡＬＳ ＳＯＤ１マウスモデル(ＳＯＤ１-Ｔｇ)において減少すること、そして、ＡＬＳ ＳＯＤ１モデルのリン酸化ＥＧＦＲ(ｐＥＧＦＲ)は一部軸索と共存することを示す。
【図３０】ＪＮＫ(５μＭのＳＰ６００１２５)、ＣａＭＫＫ(５μＭのＳＴＯ-６０９)、ＥＧＦＲ(１μＭ又は１０μＭのＡＧ５５５)、ｐ３８(５μＭのＳＢ２３９０６３)及びＧＳＫ(１０μＭのＳＢ４１５２８６)の小分子インヒビターが小脳顆粒ニューロンを血清欠乏／ＫＣｌ低減から保護することを示す。
【図３１】ＥＧＦＲ、ＧＳＫ、ＣａＭＫＫ、ＪＮＫ及びｐ３８の小分子インヒビターが海馬ニューロンを１０μＭのロテノンから保護することを示す。
【図３２】ＥＧＦＲ、ＧＳＫ、ＣａＭＫＫ、ＪＮＫ及びｐ３８の小分子インヒビターが皮質ニューロンを１０μＭのロテノンから保護することを示す。
【図３３】ＥｒｂＢレセプターが、ＥＧＦＲ(上左パネル)、Ｈｅｒ２(上右パネル)、Ｈｅｒ３(下左パネル)及びＨｅｒ４(下右パネル)に特異的な抗体を用いた免疫細胞化学によって後根神経節ニューロンの軸索に検出されることを示す。
【図３４】ＥＧＦＲが免疫細胞化学を使用して後根神経節ニューロンの軸索において発現されることを示す。
【図３５】後根神経節ニューロンに加えたとき、１００μｇ／ｍＬのＥＧＦが軸索変性を誘導しないこと、そして１００μｇ／ｍＬのＥＧＦの添加により処理したニューロンにおいてＥＲＫのリン酸化が誘導されることを示す。
【図３６】ＥＧＦＲ外部ドメイン(５０μｇ／ｍＬ)が後根神経節ニューロンのＮＧＦ離脱によって誘導される軸索変性をブロックしないことを示す。
【図３７】背面の脊髄移植片において３．４μＭ、１１．１μＭ、３３．３μＭ及び１００μＭのＴａｒｃｅｖａ(登録商標)(エルロチニブ)が変性をブロックすることを示す。
【図３８】二重ロイシンジッパー保持キナーゼ(ＤＬＫ)が軸索変性のＪＮＫから上流で作用することを示す。２９３細胞における野生型ＤＬＫをコードするプラスミドの形質移入により、コントロールプラスミド又はキナーゼデッドＤＬＫ(ＤＬＫ-ＫＤ)をコードするプラスミドをｍｏｃｋ形質移入した細胞と比較して、ＪＮＫ活性化(リン酸化ＪＮＫレベルの増加により測定される)が生じることを示す。後根神経節ニューロンにおけるｓｉＲＮＡによるＤＬＫ発現のノックダウンは、ＮＧＦ離脱により誘導される変性から軸索を保護する。ＤＬＫ ｓｉＲＮＡを使用したＤＬＫ発現のノックダウンは、コントロールｓｉＲＮＡとの比較により、定量的ＰＣＲを使用して確認した(下右パネル)。
【図３９】ＤＬＫシグナル伝達のｓｉＲＮＡノックダウンが局所の軸索変性を遅延させることを示す。
【図４０】位相差顕微鏡法を用いてニューロンを可視化した、ＮＧＦ離脱誘導交感ニューロンの変性に対するＤＬＫノックダウンの影響を評価する実験の結果を表す。
【図４１】ＤＬＫ ｓｉＲＮＡ(ＤＬＫ)を用いたＤＬＫ発現のノックダウンが、コントロールｓｉＲＮＡ(ＮＴ)にて処理したニューロンと比較して、カンプトテシン−及びビンクリスチンが誘導するアポトーシスから交感神経細胞を保護することを示す。
【図４２】キナーゼデッドＤＬＫ(ＫＤ)をコードするプラスミドによる交感ニューロンの形質移入が、野生型ＤＬＫをコードするプラスミド(ＤＬＫ)を形質移入したニューロンと比較して、ＮＧＦ離脱が誘導するアポトーシスからニューロンを保護することを示す。
【図４３】実施例１５Ａに記載の抗ｐＤＬＫ抗体の結合特異性を評価する実験の結果を示す。図４３Ａは、ＤＬＫ、優性阻害のＤＬＫの存在下でのＤＬＫ、及びコントロールキナーゼＭＬＫ３に対する本明細書に記載の抗ｐＤＬＫ抗体各々の結合のウエスタンブロット分析を示す。図４３Ｂは、ＤＬＫ(上２つの画像)又はコントロールキナーゼＭＬＫ３(下２つの画像)を形質移入して培養した２９３Ｔ細胞に対する抗ｐＤＬＫ抗体３１８及び３１９の結合の免疫蛍光顕微鏡の画像を示す。図４３Ｃ及び４３Ｄは、ＪＮＫ及びホスホ-ＪＮＫ抗体を使用したウエスタンブロットを示す。
【図４４】疾患の最終段階時(図４３Ａ)及び症状発現時(図４４Ｂ)の野生型及びＳＯＤ１変異マウスの脊髄切片に対する抗ｐＤＬＫ抗体(抗体３１８)の結合を示す。図４４Ｃは、ヒトのアルツハイマー病患者の皮層試料におけるｐＤＬＫ、ｐＪＮＫ及びｐｃＪＵＮレベルのウエスタンブロット分析を表す。
【図４５】実施例１５Ｃ及び実施例１４Ｂに記載のように、交感ニューロン及び後根神経節ニューロンのＮＧＦ離脱ストレス、及び皮質ニューロンのビンクリスチンが誘導するストレスに応答した、ＤＬＫサイレンシングのＪＮＫのリン酸化への影響を評価する実験の結果を表す。
【図４６】実施例１５Ｃに記載のように、ＮＧＦ離脱ストレスに曝したＤＲＧ移植片へのＪＮＫインヒビターの保護効果を示す。
【図４７】実施例１５Ｃに記載のように、ＮＧＦ離脱ストレスにより観察される軸索変性への、ＤＲＧニューロンにおいてＪＮＫ１、ＪＮＫ２、ＪＮＫ３を個々にそしてＪＮＫ２とＪＮＫ３を共にサイレンシングする影響を評価する実験の結果を示す。
【図４８】図４８Ａは、皮質ニューロンの生存へのＤＬＫ ｓｉＲＮＡ及びコントロールｓｉＲＮＡの影響を示す。図４８Ｂは、交感ニューロンの生存へのＤＬＫ ｓｉＲＮＡ及びコントロールｓｉＲＮＡの影響を示す。
【図４９】Ｇ結合タンパク質レセプター(ＳＣＨ２０２６７６；１０μＭ又は１００μＭ)のインヒビターの、ＤＲＧのＮＧＦ離脱が誘導する変性を妨げる能力を示す一組の免疫顕微鏡写真である。
【図５０】ＳＣＨ２０２６７６(０．１μＭ又は１μＭ)の、ＤＲＧのＮＧＦ離脱が誘導する変性を妨げる能力を示す一組の免疫顕微鏡写真である。
【図５１】０．０１μｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬ又は１μｇ／ｍＬの百日咳毒素(Ｇプロテインシグナル伝達のインヒビター)の、ＤＲＧのＮＧＦ離脱が誘導する変性を妨げる能力を示す一組の免疫顕微鏡写真である。
【図５２】活性な変異ＧＳＫ(ＧＳＫ３Ｓ９Ａ)、野生型ＴＣＦ４及び変異不活性ＴＣＦ４の発現の変性への影響を示す、ラット海馬ニューロンの一組の免疫顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
（発明の詳細な説明）
Ａ．定義
「標的」なる用語は、活性に影響を与える薬剤によって調整されるときに、軸索変性を阻害するか又は減少させるタンパク質及び方法(プロセス)を指すために本明細書中で用いられる。活性を阻害する薬剤と接触させると、本明細書に記載の標的の多くは軸索変性を阻害するか又は減少させるが、本発明の標的には活性化されると軸索変性を阻害するか又は減少させるタンパク質及び方法も含まれる。本発明の例示的な標的は以下の通りである。二重ロイシンジッパー保持キナーゼ(ＤＬＫ)、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３β(ＧＳＫ３β)、ｐ３８分裂促進因子活性化プロテインキナーゼ(ｐ３８ ＭＡＰＫ)、上皮性増殖因子レセプター(ＥＧＦＲ)、ホスホイノシチド３キナーゼ(ＰＩ３Ｋ)、サイクリン依存性キナーゼ５(ｃｄｋ５)、アデニリルシクラーゼ、ｃ−Ｊｕｎ Ｎ末端キナーゼ(ＪＮＫ)、ＢＣＬ２結合Ｘタンパク質(Ｂａｘ)、Ｉｈチャネル、カルシウム／カルモデュリン依存性プロティンキナーゼキナーゼ(ＣａＭＫＫ)、Ｇプロテイン、Ｇプロテインカップリングレセプター、転写第４因子(ＴＣＦ４)、β-カテニン、転写及びタンパク質合成。これらの標的のいくつかについての一般的な別名の選別を表１に挙げる。標的には、オルターナティブスプライシング変異体及び対立遺伝子変異体及びアイソフォームといったすべて天然に生じる変異体、並びにこれらの可溶型を含む、天然のヒト配列、及びサル、マウス、ラット及び他の非ヒト哺乳動物の配列のホモログが含まれる。また、例示的な非限定的配列参照も表１に示す。また、本発明に従って、様々な標的アイソフォーム、変異体、ホモログ及び断片の配列を含む他の配列が考慮されてよい。
【００１６】
【表１】
0005851838.tif 000002
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0005851838.tif 000004
0005851838.tif 000005
【００１７】
「単離された」とは、ここで開示された種々のタンパク質を記述するために使用するときは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたタンパク質を意味する。その自然環境の汚染成分とは、タンパク質の使用（例えば治療又は抗体産生における使用）を妨害しうる物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。様々な実施態様において、タンパク質は、(i)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、Ｎ末端あるいは内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分なほど、及び／又は(ii)クーマシーブルーあるいは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥによる均一性が得られるように十分なほど、及び／又は(iii)質量分光分析又はペプチドマッピング技術による均一性が得られるように十分なほど精製される。タンパク質の自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、単離されたタンパク質には、組換え細胞内のインサイツのタンパク質が含まれる。しかしながら、通常は、単離されたタンパク質は少なくとも１つの精製工程により調製される。本明細書中に記載の単離された標的タンパク質（又はその断片）を用いて標的タンパク質に対する本明細書中に記載の抗体を製造することができる。
「単離された」核酸分子は、同定され、対象の核酸の天然源に通常付随している少なくとも１つの汚染核酸分子から分離される核酸分子である。単離された核酸分子は、天然に見出される形態あるいは設定以外のものである。ゆえに、単離された核酸分子は、天然の細胞中に存在する核酸分子とは区別される。しかし、単離された核酸分子は、例えば、核酸分子が天然細胞のものとは異なった染色体位置にある核酸を通常発現する細胞に含まれる核酸分子を含む。単離される核酸分子の例は、天然の環境において近接している５'及び／又は３'隣接配列を欠くものである。
【００１８】
本明細書で用いる「アンタゴニスト」及び「インヒビター」なる用語は、本明細書中に記載の標的の一又は複数の活性を遮断、中和、阻害、無効化、低減及び／又は干渉する、及び／又は一又は複数の標的タンパク質の発現を低減することができる薬剤を指す。それらには、例えば、抗体、ポリペプチド、ペプチド、核酸分子、小干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)及び他の阻害性ＲＮＡ、小分子(例えば小さい無機分子)、多糖類、ポリヌクレオチド、アプタマー及びペプチボディが含まれる。本明細書中に記載の特定の標的のアンタゴニスト又はインヒビター(すなわちアデニリルシクラーゼ以外の標的)は、一般に、本明細書において記述されるように、軸索変性を阻害又は低減する(例えば、インヒビターにて処理していないコントロールと比較して、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又はさらに１００％の低減)。インヒビターは、インヒビターにて処理していない標的タンパク質の発現及び／又は活性と比較して、標的タンパク質の活性及び／又は発現を少なくとも１０％(例えば、少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又はさらに１００％の低減)低減しうる。「ＤＬＫシグナル伝達インヒビター」は、ＤＬＫタンパク質(又はＤＬＫタンパク質をコードする核酸)の活性(例えばキナーゼ活性)又は発現を低減する、及び／又はＤＬＫシグナル伝達経路に関与する一又は複数のタンパク質(例えばＪＮＫ１、ＪＮＫ２、ＪＮＫ３、ｃＪｕｎ(例えばｃＪｕｎ-６３及びｃＪｕｎ-７３)、ＭＫＫ４及びＭＫＫ７)の活性及び／又は発現を低減することができる薬剤である。ＤＬＫシグナル伝達インヒビターの例には、ＤＬＫをコードする核酸(例えば、望ましくはGCACTGAATTGGACAACTCTT(配列番号：１)、GAGTTGTCCAATTCAGTGCTT(配列番号：２)、GGACATCGCCTCCGCTGA TTT(配列番号：３)、又はATCAGCGGAGGCGATGTCCTT(配列番号：４)、又はGCAAGACCCGTCACCGAAATT(配列番号：５)、TTTCGGTGACGGG TCTTGCTT(配列番号：６)、GCGGTGTCCTGGTCTACTATT(配列番号：７)、又はTAGTAGACCAGGACACCGCTT(配列番号：８)の配列)の発現を低減するｓｉＲＮＡ分子、ＪＮＫ1(例えばTTGGATGAAGCCATTAGACTA(配列番号：９)のＪＮＫ1配列を標的とする配列)、ＪＮＫ2(例えばACCTTTAATGGACAA CATTAA(配列番号：１０)又はAAGGATTAGCTTTGTATCATA(配列番号：１１)のＪＮＫ２配列を標的とする配列)、ＪＮＫ３(例えばCCCGCATGTGTCT GTATTCAA(配列番号：１２)のＪＮＫ３配列を標的とする配列)、ｃＪｕｎ(例えば、ｃＪｕｎ-６３及びｃＪｕｎ-７３)、ＭＫＫ４及びＭＫＫ７が含まれる。ＤＬＫインヒビターの他の例には、ＤＬＫタンパク質に結合する抗体(例えば非リン酸化又はリン酸化のＤＬＫを認識する抗体、本明細書に記載の３１７、３１８、３１９、３２０、３２１及び３２２抗体)、ＪＮＫ１、ＪＮＫ２、ＪＮＫ３、ｃＪｕｎ(例えば、ｃＪｕｎ-６３及びｃＪｕｎ-７３)、ＭＫＫ４及び／又はＭＫＫ７；ＪＮＫ活性のインヒビター(例えば、ＳＣ-２０２６７３、ＳＹ-ＣＣ-４０１、ＳＰ６００１２５、ＪＮＫＶインヒビター、ＪＮＫVIIIインヒビター、ＡＳ６０１２４５及びＸＧ-１０２、並びにEMD Biosciencesのカタログ番号４２０１１９、４２０１３０、４２０１３１、４２０１２３、４２０１１６、４２０１１８、４２０１３６、４２０１２９、４２０１３５、４２０１３４、４２０１３３、４２０１４０及び４２０１２８)；ＭＫＫ４活性のインヒビター(例えば国際公開０４／０５８７６４に記述されるミリセチン及びインヒビター)、及びＭＫＫ７活性のインヒビター(例えば米国特許第７１９５８９４号及び国際公開０４／００２５３２に記述されるインヒビター)が含まれる。また、ＤＬＫインヒビターは、ＤＬＫタンパク質の優性阻害型又はキナーゼデッド型(又は、ＤＬＫタンパク質の優性阻害型又はキナーゼデッド型をコードする核酸)、例えばＴ２７８Ａ ＤＬＫ、Ｓ２８１Ａ ＤＬＫ、Ｓ１５２Ａ ＤＬＫ及びＤＬＫのロイシンジッパードメインであってもよい。
【００１９】
インヒビターの他の例は「ＧＳＫ３βインヒビター」である。ＧＳＫ３βインヒビターは、ＧＳＫ３β(又はＧＳＫ３βをコードする核酸)の活性及び／又は発現を低減する、及び／又はＧＳＫ３βを活性化する一又は複数のタンパク質(又は一又は複数のタンパク質をコードする核酸)の活性及び／又は発現、又はＧＳＫ３βの一又は複数の基質の発現又は活性を低減することができる薬剤を指す。ＧＳＫ３βインヒビターの非限定的例には、ＳＢ４１５２８６、ＧＳＫ３βインヒビターI、ＧＳＫ３βインヒビターVII、ＧＳＫ３βインヒビターVIII、ＧＳＫ３βインヒビターXII及び塩化リチウムが含まれる。
インヒビターの他の例は「Ｇプロテインインヒビター」である。Ｇプロテインインヒビターは、一又は複数のＧプロテイン又はＧプロテインカップリングレセプター(ＧＰＣＲ)の活性及び／又は発現(又は、Ｇプロテイン又はＧＰＣＲをコードする一又は複数の核酸の発現)を低減する、及び／又はＧプロテイン又はＧＰＣＲの下流の一又は複数のタンパク質の活性及び／又は発現を低減することができる薬剤を指す。Ｇプロテインインヒビターの非限定的例には、Ｇプロテイン又はＧＰＣＲをコードする核酸の発現レベルを低減するｓｉＲＮＡ分子、Ｇプロテイン又はＧＰＣＲに結合する抗体又はペプチボディ、又はＧプロテイン又はＧＰＣＲの活性を阻害する小分子又はペプチド(例えばＳＣＨ２０２６７６及び百日咳毒素)が含まれる。
【００２０】
インヒビターの他の例は「ＥＧＦＲ経路インヒビター」である。ＥＧＦＲ経路インヒビターは、ＥＧＦＲタンパク質(又は、ＥＧＦＲをコードする核酸)の活性及び／又は発現を低減する、及び／又は細胞においてＥＧＦＲの下流で機能する一又は複数のタンパク質(例えばｐ３８ ＭＡＰＫ、ＣＡＭＫＫ及びＪＮＫ)の活性及び／又は発現を低減することができる薬剤を指す。ＥＧＦＲ経路インヒビターの非限定的な例には、ＥＧＦＲのインヒビター(例えば、エルロチニブ、チロホスチンＢ４４、チロホスチンＢ４２／ＡＧ ４９０、ＡＧ５５５、ＡＧ４９４及びＰＤ１６８３９３)、ｐ３８ ＭＡＰＫのインヒビター(例えば、ＳＢ２０３５８０、ＳＢ２３９０６３、ＳＢ２０２１９０及びＳＢ２３９０６９)、ＣＡＭＫＫのインヒビター(例えば、ＳＴＯ-６０９)、及びＪＮＫのインヒビター(例えば、ＳＰ６００１２５)が含まれる。ＥＧＦＲ経路インヒビターの他の例には、ＥＧＦＲ、ｐ３８ ＭＡＰＫ、ＣＡＭＫＫ及び／又はＪＮＫに結合する抗体及びペプチボディ；及び、細胞においてＥＧＦＲの下流で機能するタンパク質(例えばＥＧＦＲ、ｐ３８ ＭＡＰＫ、ＣＡＭＫＫ及び／又はＪＮＫ)をコードする一又は複数の核酸の発現を低減するｓｉＲＮＡ分子が含まれる。
インヒビターの他の例は「ＣＡＭＫβインヒビター」である。ＣＡＭＫβインヒビターは、ＣＡＭＫβタンパク質(又はＣＡＭＫβをコードする核酸)の活性及び／又は発現を低減する、及び／又は細胞においてＣＡＭＫβの下流で機能する一又は複数のタンパク質の活性及び／又は発現を低減することができる薬剤を指す。ＣＡＭＫβインヒビターの非限定的な例には、ＣＡＭＫβに特異的に結合する抗体及びペプチボディ、及びＣＡＭＫβ又はＣＡＭＫβの下流で機能するタンパク質をコードする一又は複数の核酸の発現を低減するｓｉＲＮＡ分子が含まれる。
【００２１】
インヒビターの他の例は「ｃｄｋ５インヒビター」である。ｃｄｋ５インヒビターは、ｃｄｋ５タンパク質(又はｃｄｋ５をコードする核酸)の活性及び／又は発現を低減する、及び／又は細胞においてｃｄｋ５の下流で機能する一又は複数のタンパク質の活性及び／又は発現を低減することができる薬剤を指す。ｃｄｋ５インヒビターの非限定的な例には、ｃｄｋ５に特異的に結合する抗体及びペプチボディ、及びｃｄｋ５又はｃｄｋ５の下流で機能するタンパク質をコードする一又は複数の核酸の発現を低減するｓｉＲＮＡ分子が含まれる。
インヒビターの他の例は「ＴＣＦ４インヒビター」である。ＴＣＦ４インヒビターは、ＴＣＦ４タンパク質(又はＴＣＦ４をコードする核酸)の活性及び／又は発現を低減する、及び／又はＴＣＦ４タンパク質によって制御される遺伝子の活性及び／又は発現を低減することができる薬剤を指す。ＴＣＦ４インヒビターの非限定的な例には、ＴＣＦ４又はＴＣＦ４によって制御される遺伝子によってコードされるタンパク質に特異的に結合する抗体及びペプチボディ、及びＴＣＦ４をコードする一又は複数の核酸の発現を低減するか又はＴＣＦ４によって制御される遺伝子によってコードされるｍＲＮＡの発現を低減するｓｉＲＮＡ分子が含まれる。
【００２２】
インヒビターの他の例は「β-カテニンインヒビター」である。β-カテニンは、β-カテニンタンパク質(又はβ-カテニンをコードする核酸)の活性及び／又は発現を低減する、及び／又はβ-カテニンタンパク質によって制御される遺伝子の活性及び／又は発現を低減することができる薬剤を指す。β-カテニンの非限定的な例には、β-カテニン又はβ-カテニンによって制御される遺伝子によってコードされるタンパク質に特異的に結合する抗体及びペプチボディ、及びβ-カテニンをコードする一又は複数の核酸の発現を低減するか又はβ-カテニンによって制御される遺伝子によってコードされるｍＲＮＡの発現を低減するｓｉＲＮＡ分子が含まれる。
インヒビターの他の例は「アデニルシクラーゼインヒビター」である。アデニルシクラーゼインヒビターは、アデニルシクラーゼタンパク質(又はアデニルシクラーゼをコードする核酸)の活性及び／又は発現を低減する、及び／又は細胞においてアデニルシクラーゼの下流で機能する一又は複数のタンパク質の活性及び／又は発現を低減することができる薬剤を指す。アデニルシクラーゼインヒビターの非限定的な例には、アデニルシクラーゼに特異的に結合する抗体及びペプチボディ、及びアデニルシクラーゼ又はアデニルシクラーゼの下流で機能するタンパク質をコードする一又は複数の核酸の発現を低減するｓｉＲＮＡ分子が含まれる。アデニルシクラーゼインヒビターの他の例には、アデニルシクラーゼの活性を阻害する小分子(例えばホルスコリン及びＮＫＨ４７７)が含まれる。
【００２３】
本明細書で使用する「アゴニスト」又は「活性化因子」なる用語は、本明細書中に記載の標的の一又は複数の活性を増加させるか又は活性化することができる薬剤を指し、例えば、抗体、ポリペプチド、ペプチド、核酸分子、小干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)又は他の阻害性ＲＮＡ、小分子(例えば小さい無機分子)、多糖類、ポリヌクレオチド、アプタマー及びペプチボディを含む。本明細書中に記載のアデニリルシクラーゼのアゴニスト又は活性化因子は一般に軸索変性を阻害又は低減するが、軸索変性を活性化するために本明細書中に記載される他の特定の標的のアゴニスト又は活性化因子が考慮されうる。
【００２４】
「抗体」という用語は、当分野で理解される最も広義に使用され、例えば、インタクト抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、モノ特異性抗体、少なくとも２つのインタクト抗体から形成される多重特異性抗体(例えば二重特異性抗体)、それらが所望の生物活性を示す限り抗体断片、及びイントラボディを具体的に包含する。
ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味する、すなわち、集団に含まれる個々の抗体が、少量で存在しうる自然に生じる可能性のある突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、一つの抗原性部位又はエピトープに対している。さらに、典型的に異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物と比べて、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。これらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の抗体と混ざらないで合成されうる点で有利である。「モノクローナル」なる修飾は、抗体が実質的に均一な集団から得たものである抗体の特徴を指すものであって、ある特定の方法によって抗体が作製されることを必要とすると解釈されるものではない。例えば、本発明において有用なモノクローナル抗体は、Kohler et al., Nature, 256;495 (1975)によって初めて記載されるハイブリドーマ方法論によって調製されてもよいし、組み換えＤＮＡ法を用いて作製されてもよい(例として米国特許第４８１６５６７号を参照)。また、「モノクローナル抗体」は、例としてClackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)及びMarks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)に記載の技術を用いてファージ抗体ライブラリーから単離されうる。
【００２５】
抗体は、特に「キメラ」抗体を含み、それは特定の種由来又は特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列に相同な又は同一な重鎖及び／又は軽鎖の一部を含むものであり、残りの鎖は、所望の生物学的活性を表す限り、他の種由来又は他の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体、並びにその抗体の断片の対応する配列に相同な又は同一なものである(米国特許第４８１６５６７号；及びMorrison等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984))。ここで対象とするキメラ抗体には、非ヒト霊長類(例えば、旧世界サル、サルなど)由来の可変ドメイン抗原結合配列とヒト定常領域配列を含む霊長類化抗体を含む。
「抗体断片」は、インタクト抗体の一部、好ましくはインタクト抗体の抗原結合又は可変領域を含む。抗体断片の例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ')２、及びＦｖ断片；ダイアボディ(diabodies)；直鎖状抗体；単鎖抗体分子；及び抗体断片から形成された多重特異性抗体を含む。
【００２６】
「多特異性抗体」なる用語は、広義の意味で用いられ、具体的には重鎖可変ドメイン(ＶＨ)及び軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)を含む抗体を包含し、このときＶＨＶＬ単位は多エピトープ特異性(すなわち、一又は複数の生物学的分子上の複数の異なるエピトープに結合することができる)を有するものである。多特異性抗体が２つのエピトープと結合する場合、「二重特異性抗体」と称する。多特異性抗体には、限定するものではないが、完全長抗体、２以上のＶＬ及びＶＨドメインを有する抗体、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、二重特異性ダイアボディ及びトリアボディのような抗体断片、共有的又は非共有的に連結した抗体断片が含まれる。「多エピトープ特異性」は、同じ又は異なる標的(一又は複数)上の２以上の異なるエピトープに特異的に結合する能力を指す。
「インタクトな」抗体は、抗原-結合可変領域、並びに軽鎖定常ドメイン(ＣＬ)及び重鎖定常ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含むものである。定常ドメインは天然配列定常ドメイン(例えば、ヒト天然配列定常ドメイン)又はそれらのアミノ酸配列変異体であってよい。一つの例では、インタクト抗体は一又は複数のエフェクター機能を有する。
【００２７】
非ヒト(例えば齧歯類)の抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。多くの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの高頻度可変領域の残基が、マウス、ラット、ウサギ又は所望の特異性及び親和性を有する非ヒト霊長類のような非ヒト種(ドナー抗体)からの高頻度可変領域の残基によって置換されているヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。例として、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域(ＦＲ)残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、もしくはドナー抗体にも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は抗体の特性をさらに洗練するために行われうる。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいは実質的に全ての高頻度可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいは実質的に全てのＦＲが、ヒト免疫グロブリン配列のものである少なくとも一又は典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むであろう(Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２、Ｆａｂｃ、Ｆｖ)。また、ヒト化抗体は、場合によっては免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部も含む。さらなる詳細については、例としてJones等, Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等, Nature 332:323-329(1988)；及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596(1992)を参照のこと。
【００２８】
ここで使用されるところの「高頻度可変領域」なる用語は、配列内で高度に可変性である、及び／又は構造的に定義されるループを形成する抗体の可変ドメインの領域を指す。高頻度可変領域は、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基(すなわち、軽鎖可変ドメインの残基２４−３４、５０−５６及び８９−９７、及び重鎖可変ドメインの３１−３５、５０−６５及び９５−１０２；Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest,５版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.(1991))及び／又は「高頻度可変ループ」からの残基(すなわち、軽鎖可変ドメインの残基２６−３２、５０−５２及び９１−９６、及び重鎖可変ドメインの２６−３２、５３−５５及び９６−１０１；Chothia及びLesk J.Mol.Biol. 196:901-917 (1987))を含む。いずれの場合でも、可変ドメイン残基は以降に詳細に検討するように、上掲のKabat等に従って番号付けする。「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基はここで定義するように高頻度可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
「親抗体」又は「野生型」抗体は、本明細書中で開示する抗体変異体と比較して一又は複数のアミノ酸配列の変更が無いアミノ酸配列を含む抗体である。ゆえに、一般に親抗体は、抗体変異体の対応する高頻度可変領域のアミノ酸配列とはアミノ酸配列が異なる少なくとも一の高頻度可変領域を有する。親抗体は、天然の配列(すなわち、天然に生じる)抗体(天然に生じる対立変異体を含む)、又は天然に生じる配列の既存のアミノ酸配列修飾(例えば挿入、欠失及び／又は他の変更)を有してもよい。「野生型」、「ＷＴ」、「ｗｔ」、及び「親」ないしは「親の」抗体なる用語は交換可能に用いられてよい。
【００２９】
ここで用いる「抗体変異体」又は「変異抗体」は、親抗体のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有する抗体を指す。一例では、抗体変異体は、天然に見られないアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン又は重鎖可変ドメインを含む。このような変異体は、必然的に親抗体と１００％未満の配列同一性又は類似性がある。ある実施態様では、抗体変異体は、親抗体の重鎖又は軽鎖の可変ドメインの何れかのアミノ酸配列と、およそ７５％から１００％未満、例えばおよそ８０％から１００％未満、およそ８５％から１００％未満、およそ９０％から１００％未満、又はおよそ９５％から１００％未満のアミノ酸配列同一性又は類似性があるアミノ酸配列を有するであろう。抗体変異体は一般に、一又は複数の高頻度可変領域内又は該領域に隣接して一又は複数のアミノ酸変更を有するものである。
「アミノ酸変更」は、既定のアミノ酸配列のアミノ酸配列内の変化を指す。例示的な変更には、挿入、置換及び欠失が含まれる。「アミノ酸置換」とは、既定のアミノ酸配列内の既存のアミノ酸残基の他の異なるアミノ酸残基への置換を指す。
「置換」アミノ酸残基は、アミノ酸配列内の他のアミノ酸残基を置き換える、又は置換するアミノ酸残基を指す。置換残基は天然に生じるアミノ酸残基でも天然に生じないアミノ酸残基であってもよい。
【００３０】
「アミノ酸挿入」とは、既定のアミノ酸配列の中に一又は複数のアミノ酸を取り込ませることを指す。アミノ酸挿入は、ペプチド結合によって結合された２以上のアミノ酸残基を含むペプチドが既定のアミノ酸配列内に導入される場合に「ペプチド挿入」を含みうる。アミノ酸挿入がペプチドの挿入を伴う場合、挿入されたペプチドは、天然に存在しないアミノ酸配列を有するようにランダム突然変異誘発によって生成されてもよい。「高頻度可変領域に隣接する」アミノ酸変更とは、高頻度可変領域のＮ末端及び／又はＣ末端での一又は複数のアミノ酸残基の導入ないしは置換を指し、この挿入ないしは置換アミノ酸残基(一又は複数)の少なくとも一により、対象の高頻度可変領域のＮ末端又はＣ末端のアミノ酸残基とペプチド結合が形成される。
「天然に生じるアミノ酸残基」は遺伝コードによってコードされるものであり、一般に、アラニン(Ａｌａ)；アルギニン(Ａｒｇ)；アスパラギン(Ａｓｎ)；アスパラギン酸(Ａｓｐ)；システイン(Ｃｙｓ)；グルタミン(Ｇｌｎ)；グルタミン酸(Ｇｌｕ)；グリシン(Ｇｌｙ)；ヒスチジン(Ｈｉｓ)；イソロイシン(Ｉｌｅ)：ロイシン(Ｌｅｕ)；リジン(Ｌｙｓ)；メチオニン(Ｍｅｔ)；フェニルアラニン(Ｐｈｅ)；プロリン(Ｐｒｏ)；セリン(Ｓｅｒ)；スレオニン(Ｔｈｒ)；トリプトファン(Ｔｒｐ)；チロシン(Ｔｙｒ)；及び、バリン(Ｖａｌ)からなる群から選択されうる。
【００３１】
本明細書中で示す「非天然に生じる(天然に生じない)アミノ酸残基」は、上記に挙げる天然に生じるアミノ酸残基以外の、ポリペプチド鎖内の隣接したアミノ酸残基(一又は複数)を共有結合することができるアミノ酸残基を指す。非天然に生じるアミノ酸残基の例には、例えば、ノルロイシン、オルニチン、ノルバリン、ホモセリン及び、例えば、Ellman等 Meth. Enzym. 202:301-336 (1991)に記載のものなどの他のアミノ酸残基アナログが含まれる。非天然のアミノ酸残基を産生するためには、Noren 等 Science 244:182 (1989)及び上掲のEllman 等の方法を利用することができる。要するに、これらの方法はインビトロにおけるＲＮＡの転写及び翻訳に先立って非天然に生じるアミノ酸残基にてサプレッサーｔＲＮＡを化学的に活性化することを伴う。
【００３２】
この開示内容の全体にわたって、Kabat, E. A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987) and (1991)の番号付けシステムを参照のこと。これらの概略では、Kabatは、各サブクラスの抗体について多くのアミノ酸配列を挙げており、そのサブクラス内の各々の残基位置について最も共通して生じるアミノ酸を挙げている。Kabatは列挙した配列の各アミノ酸に残基番号を割り当てるための方法を用い、残基に数を割り当てるこの方法は当分野において標準となっている。カバット番号付けスキームはこの記載に従う。本発明の目的を達成するために、カバット概略に含まれない候補抗体アミノ酸配列に残基番号を割り当てるために、一方法として以下の工程を用いる。通常、候補配列は、任意の免疫グロブリン配列又はカバットの任意のコンセンサス配列と整列配置する。整列配置(アラインメント)は、手動で行うか、Ａｌｉｇｎ２プログラムのような一般に是認されたコンピュータプログラムを用いてコンピュータによって行ってもよい。整列配置は、ほとんどのＦａｂ配列に共通するいくつかのアミノ酸残基を用いて促されうる。例えば、軽鎖及び重鎖は、各々典型的に、同じ残基番号を有する２つのシステインを有する。ＶＬドメインでは、２つのシステインは典型的に残基番号２３及び８８であり、ＶＨドメインでは、２つのシステイン残基は典型的に番号２２及び９２である。必ずではないが、フレームワーク残基は一般に、およそ同じ数の残基を有するが、ＣＤＲの大きさは変化しうる。例えば、整列配置されるカバットの配列のＣＤＲより長い候補配列からのＣＤＲの場合、典型的に、助数詞を残基番号に加えて、更なる残基の挿入を表す。例えば、残基３４及び３６についてカバット配列と整列配置するが残基３５と整列配置させるための残基をこれらの間に持たない候補配列では、番号３５は単に残基を割り当てない。
【００３３】
本明細書中で用いる、「高い親和性」を有する抗体とは、ナノモル(ｎＭ)の範囲かそれより良好なＫＤ又は解離定数を有する抗体である。「ナノモル範囲かそれより良好な」ＫＤは、ＸｎＭで表してもよく、このＸはおよそ１０未満の数である。
「繊維状ファージ」なる用語は、その表面上に異種性のポリペプチドをディスプレイすることが可能なウイルス粒子を指し、ｆ1、ｆｄ、Ｐｆ1及びＭ13が挙げられるが、これらに限定されるものではない。繊維状ファージは、テトラサイクリン(例えば「ｆｄ  ｔｅｔ」)などの選択可能なマーカーを含みうる。様々な繊維状ファージディスプレイシステムは当業者に周知である(例えば、Zacher et al. Gene 9: 127-140 (1980)（Smith et al. Science 228: 1315-1317 (1985)；及びParmley and Smith Gene 73: 305-318 (1988)を参照)。
「パニング」なる用語は、標的に対して高親和性及び特異性を有する、抗体などの化合物を保持するファージの同定及び単離に使用されるスクリーニング工程の複数のラウンド（回数）を指すために用いる。
【００３４】
「小干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)」なる用語は、遺伝子発現を干渉する小さい二本鎖ＲＮＡを指す。ｓｉＲＮＡは、二本鎖ＲＮＡが相同遺伝子を沈黙(サイレンシング)させる工程であるＲＮＡ干渉のメディエーターである。ｓｉＲＮＡは典型的に、二本鎖を形成するおよそ１５−２５長のヌクレオチドの２つの一本鎖ＲＮＡからなり、一本鎖オーバーハングを含みうる。酵素複合体、例えばポリメラーゼによる二本鎖ＲＮＡのプロセシングにより、二本鎖ＲＮＡの切断が生じ、ｓｉＲＮＡが生成される。ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖はＲＮＡ干渉(ＲＮＡｉ)サイレンシング複合体に用いられ、ｍＲＮＡ切断が導かれ、これによってｍＲＮＡ分解が促される。例えば哺乳動物細胞において特定の遺伝子をｓｉＲＮＡを用いて沈黙させるために、塩基対領域を、無関係なｍＲＮＡに偶然に相補性を持たないように選択する。例えばFire et al., Nature 391:806-811 (1998)及びMcManus et al., Nat. Rev. Genet. 3(10): 737-47 (2002)にあるように、ＲＮＡｉサイレンシング複合体は、当分野において同定されている。
「干渉ＲＮＡ(ＲＮＡｉ)」なる用語は、特定のｍＲＮＡの触媒的分解をもたらす二本鎖ＲＮＡを指すために本明細書において用い、したがって特定の遺伝子の発現を阻害／低減するために用いられうる。
【００３５】
本明細書中で用いる「疾患」なる用語は、通常は、本明細書中に記載の標的のインヒビター(又はアデニリルシクラーゼの場合にはアクチベーター)の有効量によって治療されうる任意の疾患又は疾病を含む、本発明の薬剤又はインヒビターによる治療により利益を得る任意の症状を指す。本明細書中で治療されうる疾患の非限定的な例には以下の本適用のセクションＥに挙げるものが含まれる。
本明細書中で用いる「治療する」、「治療」及び「療法」なる用語は、治癒的な療法、予防的な療法及び防止的な療法を指す。連続的な治療又は投与は、治療を中断することなく一又は複数の日による、少なくとも１日を基準とした治療を指す。間欠的な治療ないしは投与、又は間欠的な様式の治療ないしは投与は、連続的でなく、むしろ実際上周期的である治療を指す。本発明の方法による治療により、疾患又は状態からの完全な軽減又は治癒、ないしは疾患又は状態の一又は複数の症状の一部寛解が生じ得、一時的なものでも永続的なものでもよい。
【００３６】
本明細書中で用いる「軸索変性を予防する」、「ニューロン変性を予防する」、「軸索変性を妨げる」又は「ニューロン変性を妨げる」なる言い回しには、(i) 新規に神経変性疾患を有すると診断された患者又は新たに神経変性疾患を発症するリスクにある患者の軸索又はニューロンの変性を阻害するないしは予防する能力、及び(ii) 神経変性疾患を既に患っている患者又は神経変性疾患の症状を有する患者の更なる軸索又はニューロンの変性を阻害する又は予防する能力が含まれる。軸索又はニューロンの変性の予防には軸索又はニューロンの変性の低減又は阻害が含まれ、これはニューロン又は軸索の変性の完全ないしは一部の予防によって特徴付けられうる。これは、例えば神経機能の分析によって評価することができる。また、上に列挙した用語はインビトロ及びエクスビボの方法も含む。さらに、「ニューロン変性を予防する」及び「ニューロン変性を阻害する」なる言い回しには、ニューロン全体、又はニューロン細胞質体、軸索及び樹状突起といった一部に関する阻害が含まれる。本明細書中に記載の一又は複数の薬剤の投与により、本明細書中に記載の一又は複数の薬剤を摂取していないコントロール被検体又は集団と比較して、被検体又は集団において、神経系の障害；神経系以外に主な効果を有する治療、状態又は疾患の二次的な神経系の状態；物理的、力学的又は化学的な外傷によって生じる神経系に対する損傷、疼痛；眼関連神経変性；記憶喪失；又は精神的障害(例えば振戦、運動の遅鈍、運動失調、バランスの喪失、抑鬱、認識機能の低減、短期記憶喪失、長期持続記憶喪失、錯乱、性格の変化、言語障害、感覚の知覚の喪失、触覚に対する感度、四肢の麻痺、筋肉虚弱、筋肉麻痺、筋痙攣、筋れん縮、食習慣の著しい変化、過剰な恐れ又は心配、不眠症、妄想、幻覚、疲労、背痛、胸の疼痛、消化障害、頭痛、迅速な心拍数、めまい、霧視、視力の不安又は領域喪失、変視症、色覚障害、明るい光への曝露後の視覚の機能回復の低減、及び視覚のコントラスト感度の喪失)の一又は複数(例えば１、２、３、４、５、６、７、８又は９)の症状の、少なくとも１０％の減少(例えば少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又はさらに１００％の減少)が生じうる。本明細書中に記載の一又は複数の薬剤の投与により、本明細書中に記載の一又は複数の薬剤を投与していない被検体又はニューロン集団において変性するニューロン(又は、ニューロン体、軸索又はその樹状突起)の数と比較して、被検体又はニューロン集団において変性するニューロン(又は、ニューロン体、軸索又はその樹状突起)の数の少なくとも１０％の減少(例えば、少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又はさらに１００％の減少)が生じうる。本明細書中に記載の一又は複数の薬剤の投与により、本明細書中に記載の一又は複数の薬剤にて治療していないコントロール被検体又は集団と比較して、被検体又は被検体集団において、神経系の障害；神経系以外に主な効果を有する治療、状態又は疾患の二次的な神経系の状態；物理的、力学的又は化学的な外傷によって生じる神経系に対する損傷、疼痛；眼関連神経変性；記憶喪失；又は精神的障害を発症する可能性の、少なくとも１０％の減少(例えば少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又はさらに１００％の減少)が生じうる。
【００３７】
本明細書中でも用いる「投与する」なる用語は、本明細書中に記載のインヒビターとニューロンないしその部分とを接触させることを指す。これには、ニューロンないしその部分が存在する被検体へのインヒビターの投与、並びにニューロンないしその部分が培養されている培地へのインヒビターの導入が含まれる。  
本明細書中で用いる「ニューロン」なる用語は、中央の細胞質体又は細胞体を含む神経系細胞、及び２つのタイプの伸長又は突起、つまり、大多数の神経系シグナルを通常細胞体に運搬する樹状突起、及び、大多数の神経系シグナルを通常細胞体から標的ニューロン又は筋といったエフェクター細胞に運搬する軸索を意味する。ニューロンは、組織及び臓器から中枢神経系(求心性又は感覚ニューロン)へ情報を伝達し、中枢神経系からエフェクター細胞(遠心性又は運動ニューロン)へシグナルを伝えることができる。介在ニューロンと称する他のニューロンは、中枢神経系(脳及び脊柱)内でニューロンを連結する。本発明による治療に供されうるニューロンのタイプの特定の例には、小脳顆粒ニューロン、後根神経節ニューロン及び皮質ニューロンが含まれる。
【００３８】
本明細書中で用いる「哺乳動物」なる用語は、ヒト、高次非ヒト霊長類、齧歯類、及びウシ、ウマ、イヌ及びネコなどの愛玩動物及び家畜動物を含む、哺乳動物として分類される任意の哺乳動物を指す。本発明のある実施態様では、哺乳動物はヒトである。
【００３９】
一又は複数の更なる治療剤「と併用した」投与には、同時(並列)及びいずれかの順序での連続的な投与が含まれる。
「有効量」は、有益な又は所望の治療的(防止的なものを含む)結果を生じさせるために十分な量である。有効量は、一又は複数の投与で投与されてもよい。
【００４０】
本明細書中で用いる「細胞」、「細胞株」及び「細胞培養物」なる表現は相互に交換可能に用いられ、かかる標記は子孫を含む。よって、「形質転換体」や「形質転換細胞」のような用語には、初代対象細胞と何世代移行したかを問わずそれから由来した培養物とを含む。全ての子孫が、意図的な突然変異あるいは意図せざる突然変異のため、正確に同一のＤＮＡ内容であるわけではないことも理解される。「子孫」なる用語は、最初に形質転換された細胞又は細胞株に続くすべての世代のいずれか及びすべての子孫を指す。最初に形質転換された細胞に対してスクリーニングされたものと同じ機能あるいは生物的活性を有する突然変異子孫も含まれる。
【００４１】
「小分子」は、およそ１０００ダルトン以下、例えばおよそ５００ダルトン以下の分子量を有することを、本明細書において定める。小分子は、有機的でも無機的でもよく、例えば化合物ライブラリ又は天然の供与源から単離してもよく、又は公知の化合物の誘導体化によって得てもよい。  
「アプタマー」は、本明細書中に記載の標的といった標的分子に特異的に結合する三次構造を形成する核酸分子である。アプタマーの生成及び治療的使用は当分野において十分に確立されている(例として米国特許第５４７５０９６号参照)。本発明で使用するアプタマーには、インビボでの分解から安定である修飾されたヌクレオチド(例えば核酸アナログ又は誘導体)が含まれうる。少なくとも、核酸分子は十分な時間をかけてインビボで十分に安定であるように設計され、分解及び／又は除去の前に治療的作用を起こす。非限定的な例として、このようなヌクレオチド類似体は、ホスホロチオネート、ボラノホスフェート、メチルホスホネート及び２'-Ｏ-メチルアナログ及びそのアナログからなる群から選択されてよい。特定の例として、アナログは、２'−デオキシ−２'−フルオロ−ＲＮＡ(２'-Ｆ-ＲＮＡ)であってもよい。
【００４２】
「ペプチボディ」は、免疫グロブリン分子の断片又は一部をコードするアミノ酸配列に連結されるペプチド配列である。ペプチド配列は、限定するものではないがファージディスプレイ技術を含む、特異的結合のための任意の方法によって選択されるランダム化した配列に由来してよい。一実施態様では、選択されたポリペプチドは、免疫グロブリンのＦｃ部分をコードするアミノ酸配列に連結されてよい。ニューロン変性の阻害を引き起こす、本明細書中に記載の標的に特異的に結合し、調節するペプチボディもまた、本発明の方法で有用である。
【００４３】
「薬学的に許容可能な塩」なる用語は、通常の医学見解の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー応答などを伴わずにヒト及び動物の組織と接触させるために好適であり、合理的な利点／危険率に相応するそれらの塩類を指すために本明細書において使われる。薬学的に許容可能な塩類は当分野で周知である。例えば、Berge等は、J. Pharm. Sci. 66: 1-19, 1977において詳細に薬学的に許容可能な塩類を記述している。塩類は、本発明の化合物の最終的な単離及び精製の間にインサイツで調製されるか、又は、適切な有機酸を有する遊離塩基を反応させることによって別々に調製されてよい。代表的な酸性添加塩類には、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩、カンフェルスルホネート、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプトネート、ヘキサン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、沃化水素塩、２-ヒドロキシ-エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、りんご酸塩、マレイン酸塩、マロネート、メタンスルホン酸塩、２-ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチネート、ペルオキソ硫酸塩、３-フェニルプロピオナート、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸、琥珀酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トルエンスルホン酸塩、ウンデカノエート、吉草酸塩類などが含まれる。代表的なアルカリ又はアルカリ土類金属塩には、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム等、並びに、非毒性アンモニウム、第四級アンモニウム、及び、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミン等を含むがこれらに限定されないアミンカチオンが含まれる。 
【００４４】
Ｂ． ニューロン変性のインヒビターを同定し、特徴付けるためのスクリーニングアッセイ
本発明は、先のセクションＡの表１に挙げた標的タンパク質及び活性の特定のモジュレーター(二重ロイシンジッパー保持キナーゼ(ＤＬＫ)、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３β(ＧＳＫ３β)、ｐ３８分裂促進因子活性化プロテインキナーゼ(ｐ３８ ＭＡＰＫ)、上皮性増殖因子レセプター(ＥＧＦＲ)、ホスホイノシチド３キナーゼ(ＰＩ３Ｋ)、サイクリン依存性キナーゼ５(ｃｄｋ５)、アデニリルシクラーゼ、ｃ−Ｊｕｎ Ｎ末端キナーゼ(ＪＮＫ)、ＢＣＬ２結合Ｘタンパク質(Ｂａｘ)、Ｉｈチャネル、カルシウム／カルモデュリン依存性プロティンキナーゼキナーゼ(ＣａＭＫＫ)、Ｇプロテイン、Ｇプロテインカップリングレセプター、転写第４因子(ＴＣＦ４)、又はβ-カテニン、転写及びタンパク質合成)が、ニューロン(例えば軸索)変性の有効なインヒビターであるという発見にある程度基づく。活性化因子であるアデニリルシクラーゼの活性調節因子(モジュレーター)を除き、活性調節因子は標的タンパク質及び活性のインヒビターとして機能する。ニューロン又は軸索変性のインヒビターは、ニューロン又は軸索変性のインヒビターであるので、それぞれの標的に対する効果にかかわらず、本明細書中において「インヒビター」と称する。それらはまた、本明細書において、標的タンパク質の活性又はニューロン又は軸索の活性を調節し、ニューロン又は軸索変性の阻害を引き起こす「薬剤」と称する。
【００４５】
本発明には、本明細書中に記載のインヒビターを用いてニューロン又は軸索変性を阻害する方法が含まれる。下記に詳述するように、この方法は、例えば神経学的疾患又は神経系に対する損傷の治療においてインビボで実施されてよい。また、この方法は、例えばニューロン機能の研究及び神経移植片の又は移植の治療においてインビトロ又はエクスビボで実施されてよい。これらの方法は、本発明で使用するインヒビターの同定及び試験方法の説明の後、以降で詳述する。  
本発明で使われうるインヒビターには、ニューロン又は軸索変性を予防するために本明細書中に記載されるアッセイにおいて示された表２(以降のセクションＣ)に挙げるもの、並びに、本明細書中に記載の標的の他の公知のインヒビター(例として表３を参照)が含まれる。以降にまとめたように、本発明に用いられる他のインヒビターは各々の標的に特異的な標準的なスクリーニング法を使用して同定することができる。また、これらのアッセイを用いて、所望の活性を有することが明らかとなった化合物の誘導体の活性を確認することができ、標準的な医薬品化学手法に従って設計される。インヒビター(又はアデニリルシクラーゼの場合には活性化因子)が特定の標的について活性であることが確認されたあと、インヒビターを、本明細書に記載のように、ニューロン又は軸索変性のモデル、並びに適切な動物モデル系において試験されてよい。
本発明の方法に用いられうる、表１に挙げた標的のインヒビターを同定するため、並びにニューロン又は軸索変性の他のインヒビターを同定し特徴付けるための例示的なアッセイは、以下の通りに簡単にに記述される。
【００４６】
i) ニューロン又は軸索変性のインヒビターのための細胞ベースのインビトロアッセイ
本明細書に記載の標的のインヒビターがニューロン又は軸索変性を阻害することを確認するため、並びにニューロン又は軸索変性の他のインヒビターを同定するためのアッセイは、以降の実施例に詳述しており、以下の通りに簡単に要約する。これらのアッセイには、(i)抗神経成長因子(抗ＮＧＦ)抗体アッセイ、(ii)血清欠乏／塩化カリウム(ＫＣｌ)減少アッセイ、(iii)ロテノン変性アッセイ、及び(iv)ビンクリスチン変性アッセイが含まれる。また、当分野で公知であるニューロン又は軸索変性を評価するための他のアッセイが本発明で使われてよい。
ＮＧＦは、標的ニューロンの分化及び生存に関与する小さい、分泌タンパク質である。ＮＧＦにて培養したニューロンを処理すると軸索が増殖するのに対して、抗ＮＧＦ抗体にて該ニューロンを処理すると軸索変性が生じる。また、抗ＮＧＦ抗体にてニューロンを処理すると、電子顕微鏡によって検出可能であるいくつかの異なる形態学的変化が生じ、これはモニターして候補インヒビターの効果を観察することができる。実施例１にさらに記載され例えば図１−４に図示されるこれらの変化には、静脈瘤形成、伸長したミトコンドリアの喪失、静脈瘤におけるミトコンドリアの蓄積、細胞骨格分解、及び軸索断片化が含まれる。抗ＮＧＦ抗体によって誘導される何れかの形態学的変化を無効にすることがわかっている薬剤を、ニューロン又は軸索変性の候補インヒビターとみなすことができ、これは望ましくは、本明細書に記載のもののような他の系において試験してもよい。
【００４７】
血清欠乏／ＫＣｌ低減アッセイは、マウス(例えばＰ７マウス)脳から単離した小脳顆粒ニューロン(ＣＧＮ)の培養物の使用に基づく。このアッセイにおいて、ニューロンは、ＫＣｌを含む培地中で培養され、より少ないＫＣｌを含む培地(５ｍＭ ＫＣｌを含む基礎培地イーグル)に交換し、ニューロン変性を誘導する。例えばニューロンマーカー(例えば抗クラスIIIβ-チューブリン)にて染色した固定ニューロンの画像を分析することによって検出されうる、ＫＣｌ離脱によるニューロン変性をブロックするか又は低減することがわかっている薬剤を、ニューロン又は軸索変性の候補インヒビターとみなすことができ、これは望ましくは本明細書に記載されるもののような他の系において試験されてよい。
【００４８】
ニューロン又は軸索変性の他のモデルは、ロテノン(２Ｒ,６ａＳ,１２ａＳ)-１,２,６,６ａ,１２,１２ａ−ヘキサヒドロ−２−イソプロぺニル−８,９−ジメトキシクロメノ[３,４-ｂ]フロ(２,３-ｈ)クロメン−６−オン)と培養したニューロンとの接触を含む。この物質はいくつかの植物の根及び幹に天然に生じる農薬及び殺虫剤であり、ミトコンドリアの電子伝達に干渉し、ラットに投与した場合にパーキンソン病様の症状を引き起こす。例えばニューロン特異的βIIIチューブリンに対する抗体にて染色した固定ニューロンの画像を分析することによって検出されうる、ロテノンの存在下で培養したニューロンの変性をブロック又は低減することがわかっている薬剤を、ニューロン又は軸索変性の候補インヒビターとみなすことができ、これは望ましくは本明細書に記載されるもののような他の系において試験されてよい。
ニューロン又は軸索変性の他のモデルは、ビンクリスチンと培養したニューロンとの接触を含む。ビンクリスチンは、チューブリン二量体に結合して、微小管構造の集積を妨げるアルカロイドである。例えばニューロン特異的βIIIチューブリンに対する抗体にて染色した固定ニューロンの画像を分析することによって検出されうる、ビンクリスチンの存在下で培養したニューロンの変性をブロック又は低減することがわかっている薬剤を、ニューロン又は軸索変性の候補インヒビターとみなすことができ、これは望ましくは本明細書に記載されるもののような他の系において試験されてよい。
【００４９】
読み出しがニューロン又は軸索変性の阻害である上記のアッセイに加え、本発明は、読み出しが例えば標的結合又は標的活性である表１に挙げる標的のインヒビターを検出するためのアッセイも使用する。ゆえに、本発明は、表１に挙げる標的のインヒビターのためのスクリーニングアッセイの使用を含み、これは、標的を結合するか又は複合体化するか、又はその活性を干渉する化合物を同定するように設計されてよい。スクリーニングアッセイには、化学ライブラリのハイスループットスクリーニングに従ったアッセイであり、小分子候補薬を同定するために適切なアッセイが含まれる。一般に、結合アッセイ及び活性アッセイが使われる。アッセイは様々な形式で実行されてよく、対象標的に応じて適すると判断される、キナーゼアッセイ、生化学スクリーニングアッセイ、イムノアッセイ、及び細胞ベースのアッセイが含まれるがこれらに限定されない。
【００５０】
結合アッセイにおいて、相互作用は結合であり、形成された複合体は単離されるか、又は反応混合物中で検出される。特別な実施態様では、標的ポリペプチド又は薬剤候補のいずれかが、共有又は非共有結合により固相、例えばマイクロタイタープレートに固定化される。非共有結合は、一般的に、固体表面を標的ポリペプチドの溶液でコーティングし乾燥させることにより達成される。あるいは、固定化すべき標的ポリペプチドに特異的な固定化抗体、例えばモノクローナル抗体を、そのペプチドを固体表面に固着させるために用いることができる。アッセイは、検出可能な標識によってラベル化される非固定化成分を、固定化成分、例えば、固着成分を含むコーティング表面などに添加することにより実施される。反応が完了したとき、未反応成分を例えば洗浄により除去し、固体表面に固着した複合体を検出する。最初の非固定化成分が検出可能な標識を有している場合、表面に固定化された標識の検出は複合体形成が起こったことを示す。最初の非固定化成分が標識を持たない場合は、複合体形成は、例えば、固定化された複合体に特異的に結合する標識抗体によって検出できる。
【００５１】
候補化合物が標的と相互に作用するが標的に結合しないポリペプチドである場合、それぞれのポリペプチドと標的との相互作用は、タンパク質−タンパク質相互作用を検出するための周知の方法によって検定されてもよい。このようなアッセイには、従来の手法、例えば、架橋結合、同時免疫沈降法、及び勾配ないしはクロマトカラムによる同時精製が含まれる。更に、Chevray and Nathans, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 5789-5793 (1991)によって開示されるように、タンパク質−タンパク質相互作用は、Fieldsと共同研究者によって記述される酵母に基づく遺伝システムを用いてモニターすることもできる(Fields and Song, Nature (London), 340:245-246 (1989)；Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:9578-9582 (1991))。酵母菌ＧＡＬ４などの多くの転写活性化因子は、２つの物理的に別個のモジュラードメインからなり、一方はＤＮＡ結合ドメインとして作用し、他方は転写活性化ドメインとして機能する。以前の文献に記載された酵母発現系(一般に「２−ハイブリッドシステム」と呼ばれる)は、この特性の長所を利用して、２つのハイブリッドタンパク質を用い、一方では標的タンパク質がＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインに融合し、他方では、候補となる活性化タンパク質が活性化ドメインに融合している。ＧＡＬ１−ｌａｃＺリポーター遺伝子のＧＡＬ４活性化プロモーターの制御下での発現は、タンパク質-タンパク質相互作用を介したＧＡＬ４活性の再構成に依存する。相互作用するポリペプチドを含むコロニーは、β-ガラクトシダーゼに対する色素生産性基質で検出される。２−ハイブリッド技術を用いた２つの特定のタンパク質間のタンパク質-タンパク質相互作用を同定するための完全なキット(ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲＴＭ)は、Clontechから購入できる。この系は、特定のタンパク質相互作用に含まれるタンパク質ドメインのマッピング、並びにこの相互作用にとって重要なアミノ酸残基の特定にも拡張することができる。
【００５２】
標的と他の細胞内ないしは細胞外成分との相互作用を干渉する化合物は以下のように試験することができる。通常、２つの生成物の相互作用を可能にする標的の相互作用を阻害する候補化合物の能力を試験するために、試験化合物の存在下及び非存在下にて反応を行った。さらに、第３の反応混合物にプラセボを加え、ポジティブコントロールとする。
候補インヒビターのプロテインキナーゼの活性への影響を測定するためのアッセイは当分野で公知であり、一般的に放射性標識されたリン酸塩により読み取られる直接リン酸化アッセイ、基質に対するリン酸化特異的抗体、及びキナーゼ活性、例えばリポーター遺伝子の活性化の下流の結果を測定する細胞ベースのアッセイが含まれる。蛍光偏光法に基づく代替アッセイに加えて、これらの主要な方策はいずれも、小規模又はハイスループットの形式で用い、インヒビターを同定、確認又は特徴付けてよい(例としてFavata et al., J. Biol. Chem. 273:18623-18632, 1998；Parker et al., J. Biomol. Screening 5:77-99, 2000；Singh et al., Comb. Chem. High Throughput Screen 8:319-325, 2005；Garton et al., Meth. Enz. 439: 491-500, 2008；及びKupchko et al., Anal. Biochem. 317:210-217, 2003を参照)。
【００５３】
本明細書において具体的に述べるスクリーニングアッセイは例示のみのためにであることを強調する。スクリーニングしたアンタゴニスト候補(例えば、抗体、ポリペプチド、ペプチド、非ペプチド小有機分子、核酸など)の種類及び特定の標的に応じて選択されうる、当業者に周知な他のアッセイが多く存在し、本発明に用いられうる。
本明細書中に記載のアッセイを用いて、限定するものではないが、化学ライブラリ、天然の生成物ライブラリ(例えば、微生物、動物、植物などの集積)、及びランダムペプチド、オリゴヌクレオチドないしは小有機分子を含む組み合わせライブラリなどの化合物のライブラリをスクリーニングしてもよい。特定の実施態様では、本明細書中のアッセイを用いて、限定するものではないが、ナイーブヒト抗体、組み換え抗体、合成抗体及び半合成抗体のライブラリをスクリーニングする。抗体ライブラリは、例えば、ウイルス粒子当たり平均１の単鎖抗体ないしは抗体断片をディスプレイする一価ライブラリ、及びウイルス粒子当たり平均２以上の抗体ないしは抗体断片をディスプレイする多価ライブラリを含むファージディスプレイライブラリであってもよい。しかしながら、本発明によってスクリーニングされる抗体ライブラリは、ファージディスプレイライブラリに限らない。他のディスプレイ技術には、例えば、リボソーム又はｍＲＮＡディスプレイ(Mattheakis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9022-9026 (1994)；Hanes and Pluckthun, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4937-4942 (1997))、微生物細胞ディスプレイ（例えば細菌ディスプレイ(Georgiou et al., Nature Biotech. 15:29-34 (1997))又は酵母菌ディスプレイ(Kieke et al., Protein Eng. 10: 1303-1310 (1997))、哺乳動物細胞上のディスプレイ、胞子ディスプレイ、レトロウイルスディスプレイなどのウイルスディスプレイ(Urban et al., Nucleic Acids Res. 33: e35 (2005)、タンパク質−ＤＮＡ結合に基づくディスプレイ(Odegrip et al., Proc. Acad. Natl. Sci. USA 101:2806-2810 (2004)；Reiersen et al., Nucleic Acids Res. 33: e10 (2005))、及びミクロビーズディスプレイ(Sepp et al., FEBS Lett. 532:455-458 (2002))が含まれる。
【００５４】
本明細書中の一次結合／相互作用アッセイにおいて得られた結果は、軸索変性のインビトロ及び／又はインビボのアッセイにおいて確認されうる。あるいは、軸索変性のインビトロ及び／又はインビボのアッセイを、本明細書中に記載のインヒビター及びアンタゴニストを同定するために一次アッセイとして用いてもよい。
【００５５】
ii) ニューロン又は軸索変性の動物モデル
本発明に用いられるインビボアッセイには、様々な神経変性疾患の動物モデル、例えば筋萎縮性側索硬化症(ＡＬＳ)、アルツハイマー病、パーキンソン病及び多発性硬化症(例えばマウスの実験的自己免疫性脳炎(ＥＡＥ))の動物モデルが含まれる。さらに、脊髄索及び外傷脳損傷モデルが用いられてもよい。本発明に用いられるインヒビターを特徴付ける際に使用されうるインビボアッセイの非限定的な例を、以下の通りに記述する。
筋萎縮性側索硬化症(ＡＬＳ)の場合、スーパーオキシドジスムターゼ１(ＳＯＤ１)の変異形を発現するトランスジェニックマウスがＡＬＳの表現型及び病理学を反復する(Rosen et al., Nature 362(6415): 59-62, 1993)。ＳＯＤ１マウスに加え、筋萎縮性側索硬化症(ＡＬＳ)のいくつかのマウスモデルが開発され、本発明で用いられうる。これらは、運動ニューロン変性(Ｍｎｄ)、進行性運動神経障害(ｐｍｎ)、ゆらぎ(Bird et al., Acta Neuropathologica 19(1): 39-50, 1971)、及び、ＴＤＰ-４３変異トランスジェニックマウス(Wegorzewska et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., ２００９年１０月１５日にｅ発行)を含む。さらに、イヌモデルが開発され、本発明に用いられうる(遺伝性イヌ脊髄筋萎縮(ＨＣＳＭＡ))。
【００５６】
本発明の方法に用いられるインヒビターを特徴付ける際に使用されうる、パーキンソン病の病因、組織学、生化学及び臨床的特徴を擬態する動物モデルには、レセルピン(ウサギ；Carlsson et al., Nature 180:1200, 1957)；メタンフェタミン(齧歯目及び非ヒト霊長類；Seiden et al., Drug Alcohol Depend 1:215-219, 1975)；６-ＯＨＤＡ(ラット；Perese et al., Brain Res. 494: 285-293, 1989)；ＭＰＴＰ(マウス及び非ヒト霊長類；Langston et al., Ann. Neurol. 46:598-605, 1999)；パラコート／マネブ(マウス；Brooks et al., Brain Res. 823: 1-10, 1999及びTakahashi et al., Res. Commun. Chem. Pathol. Pharmacol. 66:167-170, 1989)；ロテノン(ラット；Betarbet et al., Nat. Neurosci. 3:1301-1306, 2000)；３-ニトロチロシン(マウス；Mihm et al., J. Neurosci. 21: RC149, 2001)；及び、変異型α-シヌクレイン(マウス及びショウジョウバエ；Polymeropoulos et al., Science 276:2045-2047, 1997)モデルが含まれる。
【００５７】
マウス、ハエ、魚及び虫を含む遺伝的に変更された動物は、アルツハイマー病に隠れる病原メカニズムを調べるために用いられている。例えば、β-アミロイドについてのトランスジェニックマウスはアルツハイマー病と一致した記憶障害を発達させる(Gotz et al., Mol. Psychiatry 9:664-683, 2004)。これらのようなモデルが、インヒビターの特徴を表す際に用いられてよい。 
マウス、ラット、スナネズミ、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ及びサルを含むいくつかの動物モデルが当分野で使用され、脳卒中を調べるために用いられる。局所性の脳虚血モデルのほとんどは、中大脳動脈のようなある主要な脳血管の閉塞を伴う(例としてGarcia, Stroke 15:5-14, 1984及びBose et al., Brain Res. 311: 385-391, 1984を参照)。本発明にこれらのいずれのモデルが使われてよい。
【００５８】
Ｃ．ニューロン又は軸索変性のインヒビター
実施例において更に後述するように、以下の表２に挙げる化合物が、ニューロン又は軸索変性のインヒビターとして同定された。表２に挙げた標的及びプロセスを阻害する(又はアデニリルシクラーゼの場合には活性化する)これら化合物並びに他の薬剤(表３参照)は、本発明に従って、ニューロン又は軸索変性を阻害する方法に使用されうる。
【００５９】
【表２−１】
0005851838.tif 000006
【表２−２】
0005851838.tif 000007
【表２−３】
0005851838.tif 000008
【表２−４】
0005851838.tif 000009
【表２−５】
0005851838.tif 000010
【００６０】
【表３−１】
0005851838.tif 000011
【表３−２】
0005851838.tif 000012
【００６１】
Ｄ．ニューロン又は軸索変性の抗体インヒビターの作製
本発明の結合及び活性のアッセイによって同定される抗体は、組換えＤＮＡ技術の技術を含む公知の方法によって製造されうる。
(i) 抗原調製 
場合によって他の分子にコンジュゲートした可溶性抗原ないしはその断片は、抗体を生成するための免疫原として用いられうる。レセプターなどの膜貫通分子のために、その断片(例えばレセプターの細胞外ドメイン)が免疫原として用いられうる。あるいは、膜貫通分子を発現する細胞を免疫源として用いてもよい。このような細胞は、天然の供与源(例えば癌細胞株)から得られてもよいし、膜貫通分子を発現するように組換え体技術によって形質転換されている細胞であってもよい。本発明の標的の例示的な配列を表１に示し、本発明で使用するための抗体の作製のための抗原の調製に使用することができる。抗体を調製するために有用な他の抗原及びその形態は当分野の技術者に明らかであろう。 
【００６２】
(ii) ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は、典型的には、関連する抗原とアジュバントを複数回の皮下(sc)又は腹腔内(ip)注射することにより、動物において産生される。それは、免疫化されるべき種において免疫原性であるタンパク質、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、又は大豆トリプシンインヒビターへ、二重官能性又は誘導体形成剤、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル(システイン残基を介する抱合)、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド(リジン残基を介する抱合)、グルタルアルデヒド、及び無水コハク酸、ＳＯＣｌ２、又はＲ及びＲ１が異なるアルキル基であるＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲへ、関連する抗原をコンジュゲートさせるために有用である。
動物を、例えばタンパク質又はコンジュゲート１００μｇ又は５μｇ(それぞれウサギ又はマウスの場合)を完全フロイントアジュバント３容量と併せ、この溶液を複数部位に皮内注射することによって、抗原、免疫原性コンジュゲート、又は誘導体に対して免疫する。１ヶ月後、該動物を、完全フロイントアジュバントに入れた初回量の１／５ないし１／１０のペプチド又はコンジュゲートを用いて複数部位に皮下注射することにより、追加免疫する。７ないし１４日後に動物を採血し、抗体価について血清を検定する。動物は、力価がプラトーに達するまで追加免疫する。動物は、同じ抗原であるが異なるタンパク質にコンジュゲートさせた、及び／又は異なる架橋剤によってコンジュゲートさせたコンジュゲートにより追加免疫されうる。コンジュゲートはまた、タンパク融合として組換え細胞培養中で調製することができる。また、ミョウバンのような凝集化剤が、免疫反応の増強のために好適に使用される。
【００６３】
(iii) モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、Kohler等, Nature, 256:495 (1975)により最初に記載されたハイブリドーマ法、又は組換えＤＮＡ法(例として米国特許第４８１６５６７号を参照)によって作成することができる。
ハイブリドーマ法においては、マウス又はその他の適当な宿主動物、例えばハムスター又はマカクザルを上記のように免疫し、免疫化に用いられたタンパク質と特異的に結合する抗体を産生する、又は産生することのできるリンパ球を導き出す。別法として、リンパ球をインビトロで免疫することもできる。次いで、リンパ球をポリエチレングリコールのような適当な融合剤を用いて骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成させる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59-103頁(Academic Press, 1986))。
このようにして調製されたハイブリドーマ細胞を、融合していない親の骨髄腫細胞の増殖又は生存を阻害する一又は複数の物質を含みうる適当な培地に蒔き、増殖させる。例えば、親の骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ)を欠失するならば、ハイブリドーマのための培地は、典型的には、ＨＧＰＲＴ−欠失細胞の増殖を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを含有するであろう(ＨＡＴ培地)。
【００６４】
好適な骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベルの発現を支援し、ＨＡＴ培地などの培地に対して感受性である細胞である。これらの中でも、使用が考慮される特定の骨髄腫細胞株は、マウス骨髄腫ライン、例えば、ソーク・インスティテュート・セル・ディストリビューション・センター、サンディエゴ、カリフォルニア、ＵＳＡより入手し得るＭＯＰＣ-２１及びＭＰＣ-１１マウス腫瘍、及び、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ロックビル、メリーランド、ＵＳＡより入手し得るＳＰ-２又はＸ６３-Ａｇ８-６５３細胞から誘導されるものである。ヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫株化細胞もまたヒトモノクローナル抗体の産生のために開示されている(Kozbor, J.Immunol., 133:3001 (1984)；Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, 51-63頁、(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987))。
ハイブリドーマ細胞が生育している培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生について検定する。ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降又はインビトロ結合検定、例えばラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)又は酵素結合免疫吸着検定(ＥＬＩＳＡ)によって測定されうる。
【００６５】
所望の特異性、親和性、及び／又は活性な抗体を産生するハイブリドーマ細胞が確定された後、そのクローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法により増殖させることができる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59-103頁(Academic Press, 1986))。この目的に対して好適な培地は、例えば、Ｄ-ＭＥＭ又はＲＰＭＩ-１６４０培地を包含する。また、このハイブリドーマ細胞は、動物の腹水症腫瘍として、インビボで増殖させることができる。
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ-セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析又はアフィニティクロマトグラフィーのような常套的なイムノグロブリン精製法によって、培地、腹水、又は血清から上手く分離される。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、常法を用いて(例えば、モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより)即座に分離されて、配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの供給源となる。ひとたび分離されたならば、ＤＮＡを発現ベクター中に入れ、ついでこれを、この状況以外ではイムノグロブリンタンパク質を産生しない大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、又は骨髄腫細胞のような宿主細胞中に形質移入し、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を獲得することができる。抗体の組み換え産生を以下に詳細に記載する。
【００６６】
更なる実施態様では、抗体又は抗体断片は、例としてMcCafferty等, Nature, 348:552-554 (1990)に記載された技術を使用して産生される抗体ファージライブラリから分離することができる。Clackson等, Nature, 352:624-628 (1991)及び Marks等, J.Mol.Biol., 222:581-597 (1991)は、ファージライブラリを使用したマウス及びヒト抗体の分離を記述している。続く刊行物は、鎖シャフリングによる高親和性(ｎＭ範囲)のヒト抗体の生成(Marks等, Bio/Technology, 10:779-783[1992])、並びに非常に大きなファージライブラリを構築するための方策としてコンビナトリアル感染とインビボ組換え(Waterhouse等, Nuc.Acids.Res., 21:2265-2266[1993])を記述している。従って、これらの技術はモノクローナル抗体の分離に対する伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ法に対する実行可能な別法である。
また、ＤＮＡは、例えば、ヒト重鎖及び軽鎖定常ドメイン(ＣＨ及びＣＬ)のコード配列を、相同的マウス配列に代えて置換することによって(米国特許第４８１６５６７号；Morrison等, Proc.Nat.Acad.Sci., USA, 81:6851(1984))、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全部又は一部を共有結合させることによって修飾することができる。
典型的には、前記の非免疫グロブリンポリペプチドは、抗体の定常ドメインと置き代わることができるか、又は抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインが置換されて、抗原に対する特異性を有する１つの抗原結合部位と異なる抗原に対する特異性を有するもう一つの抗原結合部位とを含むキメラ二価抗体を作り出す。
【００６７】
(iv) ヒト及びヒト化抗体
ヒト化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入される。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。ヒト化は基本的にウィンター(Winter)及び共同研究者［Jones等, Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmann等, Nature, 332:323-327 (1988)；Verhoeyen等, Science, 239:1534-1536 (1988)］の方法に従って、齧歯類ＣＤＲ又はＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置換することにより実施される。よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第４８１６５６７号)である。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかのＣＤＲ残基及び場合によっては幾つかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。
抗原性を低減するには、ヒト化抗体を生成する際に使用するヒトの軽重両方のヒト可変ドメインの選択が非常に重要である。いわゆる「ベストフィット法」では、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列を、既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリ全体に対してスクリーニングする。次に齧歯動物のものと最も近いヒト配列を、ヒト化抗体のヒトフレームワーク(ＦＲ)として受け入れる(Sims等, J. Immunol., 151:2296 (1993)；Chothia等, J. Mol. Biol., 196:901(1987))。他の方法では、軽又は重鎖の特定のサブグループのヒト抗体全てのコンセンサス配列から誘導される特定のフレームワーク領域を使用する。同じフレームワークをいくつかの異なるヒト化抗体に使用できる(Carter等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)；Presta等, J. Immunol., 151:2623(1993))。
【００６８】
更に、抗体を、抗原に対する高親和性や他の好ましい生物学的性質を保持してヒト化することが重要である。この目標を達成するべく、例示的な方法では、親及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析工程を経てヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般的に入手可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推測三次元立体配座構造を図解し、表示するコンピュータプログラムは購入可能である。これら表示を見ることで、候補免疫グロブリン配列の機能における残基のありそうな役割の分析、すなわち候補免疫グログリンの抗原との結合能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、例えば標的抗原に対する親和性が高まるといった、望ましい抗体特性が達成されるように、ＦＲ残基をレシピエント及び移入配列から選択し、組み合わせることができる。一般的に、ＣＤＲ残基は、直接かつ最も実質的に抗原結合性に影響を及ぼしている。
あるいは、現在では、免疫化することで、内因性免疫グロブリンの産生がなく、ヒト抗体の全レパートリーを産生することのできるトランスジェニック動物(例えば、マウス)を作ることが可能である。例えば、キメラ及び生殖細胞系突然変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域(ＪＨ)遺伝子のホモ接合体欠失によって、結果として内因性抗体産生の完全な阻害が起こることが説明されてきた。ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子配列の、このような生殖細胞系突然変異体マウスへの転移によって、結果として抗原投与時にヒト抗体の産生がおこる。Jakobovits等, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 90:2551 (1993)；Jakobovits等, Nature 362:255-258 (1993); Bruggeman等, Year in Immuno., 7:33 (1993)；及びDuchosal等 Nature 355:258 (1992)を参照されたい。また、ヒト抗体はファージディスプレイライブラリからも得られる(Hoogenboom等, J. Mol. Biol., 227:381 (1991)；Marks等, J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)；Vaughan等 Nature Biotech 14:309 (1996))。抗体ファージディスプレイライブラリからのヒト抗体の生成は以下に更に記載する。
【００６９】
(v) 抗体断片
抗体断片を産生するために様々な技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は、無傷の抗体のタンパク分解性消化によって誘導された(例えば、Morimoto等, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)及びBrennan等, Science, 229:81(1985)を参照されたい)。しかし、これらの断片は、現在は組換え宿主細胞により直接産生することができる。例えば、抗体断片は、上で論じた抗体ファージライブラリから単離することができる。別法として、Ｆａｂ'-ＳＨ断片は大腸菌から直接回収することができ、化学的に結合させてＦ(ａｂ')２断片を形成することができる(Carter等, Bio/Technology 10:163-167(1992))。以下の実施例に記載のような他の実施態様では、Ｆ(ａｂ')２は、Ｆ(ａｂ')２分子のアセンブリを促すように、ロイシンジッパーＧＣＮ４を用いて形成される。他のアプローチ法では、Ｆ(ａｂ')２断片を組換え宿主細胞培養から直接分離することができる。抗体断片を生成するのための他の方法は、当業者には明らかであろう。他の実施態様では、選択する抗体は単鎖Ｆｖ断片(ｓｃＦｖ)である。国際公開９３／１６１８５号を参照のこと。
【００７０】
(vi) 多重特異性抗体
多重特異性抗体は、通常異なる抗原に由来する少なくとも２つの異なるエピトープに対する結合特異性を有する。このような分子は通常２つの異なるエピトープを結合するだけであるが(すなわち二重特異性抗体、ＢｓＡｂ)、本明細書中で用いられる場合には三重特異性抗体などの更なる特異性を有する抗体がこの表現に包含される。
二重特異性抗体を作成する方法は当該分野において既知である。完全長二重特異性抗体の伝統的な産生は二つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の同時発現に基づき、ここで二つの鎖は異なる特異性を持っている(Millstein等, Nature, 305:537-539(1983))。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖が無作為に取り揃えられているため、これらのハイブリドーマ(四部雑種)は１０個の異なる抗体分子の可能性ある混合物を産生し、そのうちただ一つが正しい二重特異性構造を有する。通常、アフィニティークロマトグラフィー工程により行われる正しい分子の精製は、かなり煩わしく、生成物収率は低い。同様の方法が国際公開第９３／０８８２９号及びTraunecker等, EMBO J. 10:3655-3659(1991)に開示されている。異なったアプローチ法では、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン(抗原−抗体結合部位)を免疫グロブリン定常ドメイン配列と融合させる。該融合は、少なくともヒンジの一部、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含むイムノグロブリン重鎖定常ドメインを有しうる。軽鎖の結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(ＣＨ１)は、融合の少なくとも一つに存在しうる。免疫グロブリン重鎖の融合、望まれるならば免疫グロブリン軽鎖をコードしているＤＮＡを、別個の発現ベクター中に挿入し、適当な宿主生物に同時トランスフェクトする。これにより、組立に使用される３つのポリペプチド鎖の等しくない比率が抗体の最適な収率をもたらす態様において、３つのポリペプチド断片の相互の割合の調節に大きな(フレキシビリティ)が与えられる。しかし、少なくとも２つのポリペプチド鎖の等しい比率での発現が高収率をもたらすとき、又はその比率があまり影響がないときは、２又は３個全てのポリペプチド鎖のためのコード化配列を一つの発現ベクターに挿入することが可能である。
【００７１】
この手法の一例では、二重特異性抗体は、第一の結合特異性を有する一方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖と他方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖-軽鎖対(第二の結合特異性を提供する)とからなる。二重特異性分子の半分にしか免疫グロブリン軽鎖がないと容易な分離法が提供されるため、この非対称的構造は、所望の二重特異性化合物を不要な免疫グロブリン鎖の組み合わせから分離することを容易にすることが分かった。このアプローチ法は、国際公開第９４／０４６９０号に開示されている。二重特異性抗体を産生する更なる詳細については、例えばSuresh等, Methods in Enzymology, 121:210 (1986)を参照されたい。
国際公開第９６／２７０１１号に記載された他の手法によれば、一対の抗体分子間の界面を操作して組換え細胞培養から回収されるヘテロダイマーのパーセントを最大にすることができる。界面は抗体の定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含んでよい。この方法では、第１抗体分子の界面からの一又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)と置き換えられる。大きな側鎖と同じ又は類似のサイズの相補的「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの(例えばアラニン又はスレオニン)と置き換えることにより第２の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモダイマーのような不要の他の最終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメカニズムが提供される。
【００７２】
二重特異性抗体には、交差結合又は「ヘテロコンジュゲート」抗体が含まれる。例えば、ヘテロコンジュゲートの一抗体はアビジンにカップリングし、他方の抗体はビオチンにカップリングしていてもよい。例えば、このような抗体は、望ましくない細胞へ免疫系細胞を標的化するため(米国特許第４６７６９８０号)、そしてＨＩＶ感染の治療のため(国際公開９１／００３６０、国際公開９２／２００３７３)に提唱されている。ヘテロコンジュゲート抗体は従来のいずれかの交差結合法を用いて作製されてもよい。好適な交差結合剤は当分野で周知であり、多くの交差結合技術と共に米国特許第４６７６９８０号に開示されている。
抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Brennan等, Science, 229:81 (1985) は無傷の抗体をタンパク分解性に切断してＦ(ａｂ')２断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤、亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルフィド形成を防止する。産生されたＦａｂ'断片はついでチオニトロベンゾアート(ＴＮＢ)誘導体に変換される。Ｆａｂ'-ＴＮＢ誘導体の一つをついでメルカプトエチルアミンでの還元によりＦａｂ'-チオールに再変換し、他のＦａｂ'-ＴＮＢ誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。作られた二重特異性抗体は酵素の選択的固定化用の薬剤として使用することができる。
【００７３】
Ｆａｂ'-ＳＨ断片は、大腸菌から直接回収することもできるし、化学的に結合して二重特異性抗体を形成させることもできる。Shalaby等,J.Exp.Med., 175:217-225 (1992)は完全にヒト化された二重特異性抗体Ｆ(ａｂ')２分子の製造を記述している。各Ｆａｂ'断片は大腸菌から別個に分泌され、インビトロで定方向化学共役を受けて二重特異性抗体を形成する。
組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作成し分離する様々な技術もまた記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して生成されている(Kostelny等, J.Immunol. 148(5):1547-1553 (1992))。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの異なった抗体のＦａｂ'部分に結合させる。抗体ホモダイマーをヒンジ領域で還元してモノマーを形成し、ついで再酸化して抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法はまた抗体ホモダイマーの生成に対して使用することができる。Hollinger等, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)により記述された「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体断片を作成する別のメカニズムを提供した。断片は、同一鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするには十分に短いリンカーにより軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)に重鎖可変ドメイン(ＶＨ)を結合してなる。したがって、一つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは他の断片の相補的なＶＬ及びＶＨドメインと強制的に対形成させられ、よって２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ(ｓＦｖ)ダイマーの使用により二重特異性抗体断片を製造する他の方策もまた報告されている(Gruber等, J.Immunol. 152:5368 (1994)を参照のこと)。
二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる(Tutt等 J.Immunol. 147:60(1991)。
【００７４】
(vii) エフェクター機能の操作
本発明に用いられる抗体をエフェクター機能について改変し、抗体の有効性を向上させることは望ましい。例えば、システイン残基をＦｃ領域に導入し、それにより、この領域に鎖間ジスルフィド結合を形成するようにしてもよい。そのようにして生成された同種二量体抗体は、向上したインターナリゼーション能力及び／又は増加した補体媒介細胞殺傷及び抗体−依存細胞性細胞障害性(ＡＤＣＣ)を有する可能性がある。Caron等, J. Exp. Med. 176: 1191-1195 (1992)及びShopes,  B. J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992)参照。また、向上した抗腫瘍活性を持つ同種二量体抗体は、Wolff等, Cancer Research 53: 2560-2565 (1993)に記載されている異種二官能性架橋を用いて調製することができる。あるいは、抗体は、２つのＦｃ領域を有するように加工して、それにより補体溶解及びＡＤＣＣ能力を向上させることもできる(Stevenson等, Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989)参照)。
【００７５】
(viii) 抗体−サルベージレセプター結合エピトープ融合
本発明のある実施態様では、例えば血管脳関門浸透性を増大させるためにインタクト抗体よりも抗体断片を使用することが望ましい。この場合、その血清半減期を増大させるために抗体断片を改変することが望ましい。これは、例えば、抗体断片にサルベージレセプター結合エピトープを組み込むことにより(例えば、抗体断片中の適当な領域の突然変異により、あるいはついで抗体断片の何れかの末端又は中央に、例えばＤＮＡ又はペプチド合成により融合されるペプチドタグ内にエピトープを組み込むことにより)、達成しうる。
サルベージレセプター結合エピトープは、Ｆｃドメインの一又は二のループ由来の一又は複数の任意のアミノ酸残基が抗体断片の類似位置に転移している領域を構成しうる。他の例では、Ｆｃドメインの１又は２のループ由来の３以上の残基が転移し、更に他の例では、エピトープはＦｃ領域の(例えばＩｇＧの)ＣＨ２ドメインから得られ、抗体のＣＨ１、ＣＨ３、又はＶＨ領域、又はそのような領域の一より多くに転移する。あるいは、エピトープは、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインから得られ、抗体断片のＣＬ領域又はＶＬ領域、又はその両方に転移する。
【００７６】
(ix) 抗体の他の共有的修飾
抗体の共有的修飾は本発明の範囲内にある。それらは、適当であれば、化学合成により、又は抗体の酵素的又は化学的切断によりなされうる。抗体の共有的修飾の他のタイプは、選択される側鎖又はＮないしＣ末端の残基と反応できる有機誘導体化剤と抗体の標的とするアミノ酸領域を反応させることにより分子中に導入される。共有的修飾は米国特許第５５３４６１５号に記載されており、これは出典明記によって特別に本明細書中に援用される。抗体の共有結合的修飾の一例は、ポリペプチドを、種々の非タンパク質様ポリマーの一つ、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンへ、米国特許第４６４０８３５号；第４４９６６８９号；第４３０１１４４号；第４６７０４１７号；第４７９１１９２号又は第４１７９３３７号に記載された方法で結合させることを含む。
【００７７】
(x) 合成抗体ファージライブラリからの抗体の産生
更なる実施態様では、本発明は特有のファージディスプレイアプローチ法を使用して新規な抗体を産生し選択する方法を実施してよい。該アプローチ法は、単一フレームワーク鋳型に基づく合成抗体ファージライブラリの産生、可変ドメイン内の十分な多様性の設計、多様化した可変ドメインを有するポリペプチドのディスプレイ、抗原を標的とする高親和性を持つ候補抗体の選択、及び選択された抗体の単離を含む。
ファージディスプレイ法の詳細は例えば国際公開第０３／１０２１５７号に見出すことができ、この開示内容の全体は出典明記によって特別に本明細書中に援用される。
【００７８】
一例では、本発明において使用される抗体ライブラリは抗体可変ドメインの少なくとも一のＣＤＲにおいて溶媒接近可能な及び／又は高度に多様性の位置を変異させることによってつくることができる。ＣＤＲの幾らか又は全てをここに提供した方法を使用して変異させることができる。ある実施態様では、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３中の位置に変異を施して単一のライブラリを形成するか、又はＣＤＲＬ３及びＣＤＲＨ３中の位置に変異を施して単一のライブラリを形成するか、又はＣＤＲＬ３及びＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３中の位置に変異を施して単一のライブラリを形成することにより、多様な抗体ライブラリをつくってよい。
例えばＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３の溶媒接近可能な及び／又は高度に多様性の位置に変異を有する抗体可変ドメインのライブラリをつくることができる。ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３に変異を有する他のライブラリをつくることができる。これらのライブラリは所望の親和性の結合体をつくるために互いに関連させて使用することもできる。例えば、標的抗原への結合についての重鎖ライブラリの一又は複数回の選択後に、軽鎖ライブラリを結合体の親和性を増加させるために更なる選択回数に対して重鎖結合体の集団中に置き換えることができる。
【００７９】
ライブラリは重鎖配列の可変領域のＣＤＲＨ３領域における変異アミノ酸での元のアミノ酸の置換によりつくられる。得られたライブラリは複数の抗体配列を含み得、ここで配列多様性は主として重鎖配列のＣＤＲＨ３領域にある。
一例では、ライブラリはヒト化抗体４Ｄ５配列、又はヒト化抗体４Ｄ５配列のフレームワークアミノ酸の配列の態様でつくり出す。ライブラリはＤＶＫコドンセットによってコードされるアミノ酸で重鎖の少なくとも残基９５−１００ａを置換することによりつくられ、ここでＤＶＫコドンセットはこれらの位置の各一に対して変異アミノ酸セットをコードするために使用されうる。これらの置換をつくるのに有用なオリゴヌクレオチドセットの一例は配列(ＤＶＫ)７を含む。ある実施態様では、ライブラリはＤＶＫとＮＮＫの双方のコドンセットによってコードされるアミノ酸で残基９５−１００ａを置換することによりつくられる。これらの置換をつくるのに有用なオリゴヌクレオチドセットの例は配列(ＤＶＫ)６(ＮＮＫ)を含む。他の実施態様では、ライブラリはＤＶＫとＮＮＫの双方のコドンセットによってコードされるアミノ酸で少なくとも残基９５−１００ａを置換することによりつくられる。これらの置換をつくるのに有用なオリゴヌクレオチドセットの例は配列(ＤＶＫ)５(ＮＮＫ)を含む。これらの置換をつくるのに有用なオリゴヌクレオチドセットの他の例は配列(ＮＮＫ)６を含む。好適なオリゴヌクレオチド配列の他の例はここに記載された基準に従って当業者によって決定することができる。
【００８０】
他の実施態様では、異なったＣＤＲＨ３設計を使用して高親和性結合体を単離し様々なエピトープに対して結合体を単離する。このライブラリにおいて産生されたＣＤＲＨ３の長さの範囲は１１から１３アミノ酸であるが、これとは異なった長さも産生することができる。Ｈ３多様性はＮＮＫ、ＤＶＫ及びＮＶＫコドンセットを使用し、並びにＮ及び／又はＣ末端での多様性をより制限して、拡張することができる。
多様性をＣＤＲＨ１及びＣＤＲＨ２においてまた生じさせることができる。ＣＤＲ-Ｈ１及びＨ２多様性の設計は、過去の設計よりも天然の多様性により密に適合する多様性に焦点を当てる変更をした上で、上述の天然抗体レパートリーを模倣するターゲティング方策に従う。
【００８１】
ＣＤＲＨ３での多様性に対しては、複数のライブラリを、異なった長さのＨ３と別個に構築し、ついで、標的抗原に対する結合体を選択するために組み合わせる。複数のライブラリをプールし、過去に記載され以下に記載されたような固体支持体選別及び溶液選別方法を使用して選別することができる。複数の選別方策を用いることができる。例えば、一つの変異は固体に結合した標的での選別を含み、融合ポリペプチド上に存在しうるタグ(例えば抗ｇＤタグ)の選別が続く。別法として、ライブラリは固体表面に結合した標的で先ず選別することができ、溶出した結合体がついで標的抗原の濃度を減少させた溶液相結合を使用して選別される。異なった選別法を併用することにより高度に発現した配列のみの選択の最小化がもたらされ、多くの異なった高親和性クローンの選択をもたらす。
標的抗原に対する高親和性結合体はライブラリから単離することができる。Ｈ１／Ｈ２領域における多様性の制限は約１０４から１０５倍縮重を減少させ、より多くのＨ３多様性を許容することによりより多くの高親和性結合体をもたらす。ＣＤＲＨ３において異なったタイプの多様性を持つライブラリを利用することにより(例えばＤＶＫ又はＮＶＴを利用して)標的抗原の異なったエピトープに結合しうる結合体の単離をもたらす。
【００８２】
上述のプールされたライブラリから単離された結合体において、軽鎖において制限された多様性を提供することによって親和性を更に改善することができることが発見された。軽鎖多様性はこの実施態様では以下のように生成される。ＣＤＲＬ１においては：アミノ酸位置２８がＲＤＴによってコードされる；アミノ酸位置２９がＲＫＴによってコードされる；アミノ酸位置３０がＲＶＷによってコードされる；アミノ酸位置３１がＡＮＷによってコードされる；アミノ酸位置３２がＴＨＴによってコードされる；場合によっては、アミノ酸位置３３がＣＴＧによってコードされる；ＣＤＲＬ２においては：アミノ酸位置５０がＫＢＧによってコードされる；アミノ酸位置５３がＡＶＣによってコードされる；場合によっては、アミノ酸位置５５がＧＭＡによってコードされる；ＣＤＲＬ３においては：アミノ酸位置９１がＴＭＴ又はＳＲＴ又はその両方によってコードされる；アミノ酸位置９２がＤＭＣによってコードされる；アミノ酸位置９３がＲＶＴによってコードされる；アミノ酸位置９４がＮＨＴによってコードされる；アミノ酸位置９６がＴＷＴ又はＹＫＧ又は両方によってコードされる。
【００８３】
他の実施態様では、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３領域に多様性を持つライブラリ又はライブラリ群が作製される。この実施態様では、ＣＤＲＨ３における多様性は様々な長さのＨ３領域を用い、主にコドンセットＸＹＺ及びＮＮＫ又はＮＮＳを用いてつくり出される。ライブラリは個々のオリゴヌクレオチドを使用して形成しプールすることができ、又はオリゴヌクレオチドをプールしてライブラリのサブセットを形成することができる。この実施態様のライブラリは固体に結合した標的に対して選別することができる。多重選別から単離されたクローンをＥＬＩＳＡアッセイを使用して特異性及び親和性についてスクリーニングすることができる。特異性については、クローンを所望の標的抗原並びに他の非標的抗原に対してスクリーニングすることができる。標的ＮＲＰ１抗原に対する結合体をついで溶液結合競合ＥＬＩＳＡアッセイ又はスポット競合アッセイでの親和性についてスクリーニングすることができる。高親和性結合体は上に記載したようにして調製されたＸＹＺコドンセットを使用してライブラリから単離することができる。これらの結合体は抗体又は抗原結合断片として細胞培養物中に高収量で直ぐに産生されうる。
ある実施態様では、ＣＤＲＨ３領域の長さに大なる多様性を持つライブラリを作成することが望まれる場合がある。例えば、約７から１９アミノ酸の範囲のＣＤＲＨ３領域を持つライブラリを作成することが望ましい場合がある。
【００８４】
これらの実施態様のライブラリから単離された高親和性結合体は細菌及び真核生物細胞培養で高収量で直ぐに産生される。ベクターはｇＤタグ、ウイルスコートタンパク質成分配列のような配列を直ぐに除去し、及び／又は定常領域配列に加えて完全長抗体又は抗原結合断片を高収量で生産するように設計することができる。
ＣＤＲＨ３での変異を持つライブラリを、例えばＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、ＣＤＲＨ１及び／又はＣＤＲＨ２のような他のＣＤＲの変異型を含むライブラリと組み合わせることができる。よって、例えば、一実施態様では、ＣＤＲＨ３ライブラリは予め定まったコドンセットを使用して位置２８、２９、３０、３１、及び／又は３２に変異アミノ酸を持つヒト化４Ｄ５抗体配列の形態において作りだしたＣＤＲＬ３ライブラリと組み合わせられる。他の実施態様では、ＣＤＲＨ３に対する変異のライブラリは変異ＣＤＲＨ１及び／又はＣＤＲＨ２重鎖可変ドメインを含むライブラリと組み合わせることができる。一実施態様では、ＣＤＲＨ１ライブラリは位置２８、３０、３１、３２及び３３に変異アミノ酸を持つヒト化抗体４Ｄ５配列を用いてつくり出される。ＣＤＲＨ２ライブラリは予め定まったコドンセットを使用して位置５０、５２、５３、５４、５６及び５８に変異アミノ酸を持つヒト化抗体４Ｄ５の配列を用いてつくり出すことができる。
【００８５】
(xi) 抗体変異体
ファージライブラリから生成される新規の抗体は、さらに修飾して、親抗体よりも改善した物理学的、化学的及び／又は生物学的特性を有する抗体変異体を生成することができる。使用するアッセイが生物学的活性アッセイである場合、抗体変異体は、選択したアッセイにおいて、該アッセイにおける親抗体の生物学的活性よりも少なくともおよそ１０倍良好な、少なくともおよそ２０倍良好な、少なくともおよそ５０倍良好な、時には少なくともおよそ１００倍又は２００倍良好な生物学的活性を有しうる。例えば、抗標的抗体変異体は、親抗体の結合親和性より、少なくともおよそ１０倍強力な、少なくともおよそ２０倍強力な、少なくともおよそ５０倍強力な、時には少なくともおよそ１００倍又は２００倍強力な、標的に対する結合親和性を有してよい。
【００８６】
抗体変異体を産生するためには、親抗体の高頻度可変領域の一又は複数中に一又は複数のアミノ酸修飾(例えば置換)が導入される。別法として、又は加えて、フレームワーク領域残基の一又は複数の修飾(例えば置換)を親抗体に導入することができ、これらにより第二の哺乳動物種由来の抗原に対する抗体変異体の結合親和性が改善される。修飾するためのフレームワーク領域残基の例には、抗原に非共有的に結合するもの(Amit等, Science 233:747-753 (1986))；ＣＤＲと相互作用し／そのコンホメーションに影響を及ぼすもの(Chothia等 J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))；及び／又はＶＬ−ＶＨ界面に関与するもの(欧州特許第２３９４００号Ｂ１)が含まれる。ある実施態様では、そのようなフレームワーク領域残基の一又は複数の修飾により第二の哺乳動物種由来の抗原に対する抗原の結合親和性が向上する。例えば、約１から約５のフレームワーク残基を本発明のこの実施態様において修飾することができる。しばしば、これは、高頻度可変領域が何ら改変されていない場合でさえ、前臨床試験に使用するのに適した抗体変異体を生じるのに十分でありうる。しかしながら、通常は、抗体は更なる高頻度可変領域の改変を含む。
【００８７】
改変される高頻度可変領域残基は、特に親抗体の出発結合親和性が、無作為に生産された抗体変異体を直ぐにスクリーニングすることができるものである場合には、無作為に変化させることができる。
そのような抗体変異体を産生するための一つの有用な方法は、「アラニンスキャンニング突然変異誘発法」(Cunningham及びWells Science 244:1081-1085 (1989))と呼ばれる。ここで、高頻度可変領域残基の一又は複数が、第二の哺乳動物種由来の抗原とのアミノ酸の相互作用に影響を及ぼすためにアラニン又はポリアラニンによって置換される。ついで置換に対する機能的感受性を示す高頻度可変領域残基は、置換部位において又はそれに対して更なる又は他の置換を導入することにより洗練される。従って、アミノ酸配列変異を導入する部位は予め決定されるが、変異の種類自体は予め決める必要はない。このようにして産生されるａｌａ変異体をここに記載したその生物活性についてスクリーニングされる。
通常は、「好ましい置換」の項目名で以下に示されているもののような保存的置換で始める。そのような置換が生物活性(例えば結合親和性)の変化を生じるならば、表４において「例示的置換」と命名され、又はアミノ酸クラスを参照して以下に更に記載されるより実質的な変化が導入され、産物がスクリーニングされる。
【００８８】
0005851838.tif 000013
【００８９】
抗体の生物学的性質の更により実質的な修飾は、(ａ)置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又は螺旋コンホメーション、(ｂ)標的部位の分子の電荷又は疎水性、又は(ｃ)側鎖の嵩を維持して、それらの効果において有意に異なる置換基を選択することにより達成される。天然に生じる残基は共通の側鎖特性に基づいてグループ分けすることができる：
(１)疎水性：ノルロイシン, met, ala, val, leu, ile；
(２)中性の親水性：cys, ser, thr；
(３)酸性：asp, glu；
(４)塩基性：his, lys, arg；
(５)鎖配向に影響する残基：gly, pro；及び
(６)芳香族：trp, tyr, phe。
【００９０】
非保存的置換は、これらのクラスの一つのメンバーを他のクラスと交換することを必要とする。
他の実施態様では、修飾のために選択された部位がファージディスプレイを使用して亜親和性成熟される(上を参照)。
【００９１】
アミノ酸配列変異体をコードしている核酸分子は当該分野で知られている様々な方法により調製される。これらの方法は、限定されるものではないが、親抗体の先に調製された変異体又は非変異体型のオリゴヌクレオチド媒介(又は部位特異的)突然変異誘発(例えばKunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488 (1985)を参照)、ＰＣＲ突然変異誘発、及びカセット突然変異誘発を含む。
ある実施態様では、抗体変異体は単一の高頻度可変領域残基が置換されたものである。他の実施態様では、親抗体の高頻度可変領域残基の２又はそれ以上が置換され、例えば約２から約１０の高頻度可変領域置換である。
【００９２】
通常、改善された生物学的性質を有する抗体変異体は親抗体の重鎖又は軽鎖の何れかの可変ドメインのアミノ酸配列と少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性又は類似性を有するアミノ酸配列を有する。この配列に対する同一性又は類似性は、配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入し最大の配列同一性パーセントを達成した後に親抗体残基と同一(つまり同じ残基)又は類似(つまり共通の側鎖特性に基づく同じグループのアミノ酸残基、上を参照)である候補配列におけるアミノ酸残基のパーセントとしてここで定義される。可変ドメインの外側の抗体配列中へのＮ末端、Ｃ末端、又は内部の伸展、欠失、又は挿入は何れも配列同一性又は類似性に影響を及ぼすものとはみなされない。
抗体変異体の産生後に、親抗体に対するその分子の生物活性が決定される。上に述べたように、これは抗体の結合親和性及び／又は他の生物活性を決定することを含みうる。本発明の好適な実施態様では、抗体変異体のパネルを調製し、抗原ないしその断片に対する結合親和性についてスクリーニングする。この最初のスクリーニングから選択される抗体変異体の一又は複数は場合によっては一又は複数の更なる生物活性アッセイにかけて、結合親和性が向上した抗体変異体が例えば前臨床研究に確かに有用であることが確認される。
【００９３】
このように選択された抗体変異体は、しばしば抗体の意図される用途に応じて更なる修飾を受けることができる。そのような修飾は以下に詳細を記載したもののようなアミノ酸配列の更なる改変、異種ポリペプチドに対する融合及び／又は共有的修飾を含む。アミノ酸配列改変については例示的な修飾を上に詳細に説明した。例えば、抗体変異体の正しいコンホメーションを維持することに関与しない任意のシステイン残基はまた一般にはセリンで置換して、分子の酸化安定性を改善し異常な架橋を防止することができる。逆に、システイン結合を抗体に加えてその安定性をかいぜんすることができる(特に抗体がＦｖ断片のような抗体断片である場合)。他のタイプのアミノ酸変異体は改変されたグリコシル化パターンを有する。これは抗体に見出される一又は複数の糖鎖部分を欠失させ、及び／又は抗体中に存在していない一又は複数のグリコシル化部位を加えることによって達成することができる。抗体のグリコシル化は典型的にはＮ結合又はＯ結合の何れかである。Ｎ結合とはアスパラギン残基の側鎖への糖鎖部分の付着を意味する。トリペプチド配列アスパラギン-Ｘ-セリン及びアスパラギン-Ｘ-スレオニン(ここで、Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸である)がアスパラギン側鎖への糖鎖部分の酵素的付着に対する認識配列である。よって、ポリペプチドにおいてこれらのトリペプチド配列の何れかが存在すると潜在的なグリコシル化部位をつくる。Ｏ結合グリコシル化はヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリン又はスレオニン(但し５-ヒドロキシプロリン又は５-ヒドロキシリジンもまた使用できる)への糖Ｎ-アセチルガラクトサミン、ガラクトース、又はキシロースの一つの付着を意味する。抗体へのグリコシル化部位の付加は、それが上述のトリペプチド配列(Ｎ結合グリコシル化部位に対する)の一又は複数を含むようにアミノ酸配列を改変することにより簡便に達成される。改変はまた元の抗体の配列への一又は複数のセリン又はスレオニン残基の付加又は置換によって行うこともできる(Ｏ結合グリコシル化部位の場合)。
【００９４】
(xii) 抗体の組換え製造
抗体の組換え製造のために、それをコードする核酸が単離され、さらなるクローニング(ＤＮＡの増幅)又は発現のために、複製可能なベクター中に挿入される。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは直ぐに単離され、従来の手法を用いて(例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドを使用することによって)配列決定される。多くのベクターが公的に入手可能である。ベクター成分には、一般に、これらに制限されるものではないが、次のものの一又は複数が含まれる：シグナル配列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列である(例えば米国特許第５５３４６１５号に記載されており、出典明記によって特別に本明細書中に援用される)。
【００９５】
ここに記載のベクター中のＤＮＡをクローニングあるいは発現させるために適切な宿主細胞は、上述の原核生物、酵母、又は高等真核生物細胞である。この目的にとって適切な原核生物は、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、例えばエシェリチアのような腸内菌科、例えば大腸菌、エンテロバクター、エルウィニア(Erwinia)、クレブシエラ、プロテウス、サルモネラ、例えばネズミチフス菌、セラチア属、例えばセラチア・マルセスキャンス及び赤痢菌属、並びに桿菌、例えば枯草菌及びバシリ・リチェフォルミス(licheniformis)(例えば、１９８９年４月１２日に公開された ＤＤ２６６７１０に開示されたバシリ・リチェニフォルミス４１Ｐ)、シュードモナス属、例えば緑膿菌及びストレプトマイセス属を含む。一つの例示的な大腸菌クローニング宿主は大腸菌２９４(ＡＴＣＣ３１４４６)であるが、他の大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ１７７６(ＡＴＣＣ３１５３７)及び大腸菌Ｗ３１１０(ＡＴＣＣ２７３２５)のような株も好適である。これらの例は限定するものではなく例示的なものである。
【００９６】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、抗体をコードするベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシア、又は一般的なパン酵母は下等真核生物宿主微生物のなかで最も一般的に用いられる。しかしながら、多数の他の属、種及び菌株も、一般的に入手可能でここで使用できる、例えば、シゾサッカロマイセスポンベ；クルイベロマイセス宿主、例えばＫ.ラクティス、Ｋ．フラギリス(ＡＴＣＣ１２４２４)、Ｋ.ブルガリカス(ＡＴＣＣ１６０４５)、Ｋ．ウィッケラミイ(ＡＴＣＣ２４１７８)、Ｋ.ワルチイ(ＡＴＣＣ５６５００)、Ｋ．ドロソフィラルム(ＡＴＣＣ３６９０６)、Ｋ．サーモトレランス、及びＫ．マルキシアナス；ヤローウィア(ＥＰ４０２２２６)；ピチアパストリス(ＥＰ１８３０７０)；カンジダ；トリコデルマ・リーシア(ＥＰ２４４２３４)；アカパンカビ；シュワニオマイセス、例えばシュワニオマイセスオクシデンタリス；及び糸状真菌、例えばパンカビ属、アオカビ属、トリポクラジウム、及びコウジカビ属宿主、例えば偽巣性コウジ菌及びクロカビが使用できる。
【００９７】
グリコシル化抗体の発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物から誘導される。無脊椎動物細胞の例としては植物及び昆虫細胞が含まれる。多数のバキュロウィルス株及び変異体及び対応する許容可能な昆虫宿主細胞、例えばスポドプテラ・フルギペルダ(毛虫)、アエデス・アエジプティ(蚊)、アエデス・アルボピクトゥス(蚊)、ドゥロソフィラ・メラノガスター(ショウジョウバエ)、及びボンビクス・モリが同定されている。トランスフェクションのための種々のウィルス株、例えば、オートグラファ・カリフォルニカＮＰＶのＬ-１変異体とボンビクス・モリ ＮＰＶのＢｍ-５株が公に利用でき、そのようなウィルスは本発明においてここに記載したウィルスとして使用でき、特にスポドプテラ・フルギペルダ細胞の形質転換に使用できる。綿花、コーン、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマト、及びタバコのような植物細胞培養を宿主として利用することができる。
【００９８】
しかしながら、脊椎動物細胞におけるものが最も興味深く、培養(組織培養)中での脊椎動物細胞の増殖は常套的な手順になっている。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株 (ＣＯＳ-７, ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１)；ヒト胚腎臓株(２９３又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された２９３細胞、Graham等, J. Gen Virol., 36:59 (1977))；ハムスター乳児腎細胞(ＢＨＫ, ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０)；チャイニーズハムスター卵巣細胞／-ＤＨＦＲ(ＣＨＯ, Urlaub等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980))；マウスのセルトリ細胞(ＴＭ４, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980))；サルの腎細胞 (ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０)；アフリカミドリザルの腎細胞(ＶＥＲＯ-７６, ＡＴＣＣ ＣＲＬ-１５８７)；ヒト子宮頸癌細胞 (ＨＥＬＡ, ＡＴＣＣ ＣＣＬ２)；イヌ腎細胞 (ＭＤＣＫ, ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４)；バッファローラット肝細胞 (ＢＲＬ３Ａ, ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４４２)；ヒト肺細胞 (Ｗ１３８, ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５)；ヒト肝細胞 (Ｈｅｐ Ｇ２, ＨＢ８０６５)；マウス乳房腫瘍細胞 (ＭＭＴ０６０５６２, ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１)；ＴＲＩ細胞(Mather等, Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982))；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝癌株(ＨｅｐＧ２)である。
宿主細胞は、抗体生産のために上述の発現又はクローニングベクターで形質転換され、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードしている遺伝子を増幅するために適切に修飾された常套的栄養培地で培養される。
【００９９】
本発明に使用する抗体を産生するために用いられる宿主細胞は種々の培地において培養することができる。市販培地の例としては、ハム(Ｈａｍ)のＦ１０(シグマ)、最小必須培地((ＭＥＭ),(シグマ)、ＲＰＭＩ-１６４０(シグマ)及びダルベッコの改良イーグル培地((ＤＭＥＭ),シグマ)が宿主細胞の培養に好適である。また、Ham等, Meth. Enz. 58:44 (1979)、Barnes等, Anal. Biochem. 102:255 (1980)、米国特許第４７６７７０４号；同４６５７８６６号；同４９２７７６２号；同４５６０６５５号；又は同５１２２４６９号；国際公開第９０／０３４３０号；国際公開第８７／００１９５号；又は米国再発行特許第３０９８５号に記載された何れの培地も宿主細胞に対する培地として使用できる。これらの培地には何れもホルモン及び／又は他の成長因子(例えばインシュリン、トランスフェリン、又は表皮成長因子)、塩類(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩)、バッファー(例えばＨＥＰＥＳ)、ヌクレオチド(例えばアデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えば、ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮTM薬)、微量元素(最終濃度がマイクロモル範囲で通常存在する無機化合物として定義される)及びグルコース又は等価なエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃度で含むことができる。培養条件、例えば温度、ｐＨ等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について過去に用いられているものであり、当業者には明らかであろう。
【０１００】
組換え技術を用いる場合、抗体は細胞内、細胞膜周辺腔に生成され、又は培地内に直接分泌される。抗体が細胞内に生成された場合、第１の工程として、宿主細胞か溶解された細胞の何れにしても、粒子状の細片が、例えば遠心分離又は限外濾過によって除去される。抗体が培地に分泌された場合は、そのような発現系からの上清を、一般的には先ず市販のタンパク質濃縮フィルター、例えばＡｍｉｃｏｎ又はＰｅｌｌｉｃｏｎの限外濾過装置を用いて濃縮する。ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤を上記の任意の工程に含めて、タンパク質分解を阻害してもよく、また抗生物質を含めて外来性の汚染物の成長を防止してもよい。
細胞から調製した抗体組成物は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及びアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製できる。アフィニティーリガンドとしてのプロテインＡの適合性は、抗体中に存在する免疫グロブリンＦｃ領域の種及びアイソタイプに依存する。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２、又はγ４重鎖に基づく抗体の精製に用いることができる(Lindmark等, J. immunol. Meth. 62: 1-13 (1983))。プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプ及びヒトγ３に推奨されている(Guss等, EMBO J. 5: 16571575 (1986))。アフィニティーリガンドが結合されるマトリクスはアガロースであることが最も多いが、他の材料も使用可能である。孔制御ガラスやポリ(スチレンジビニル)ベンゼン等の機械的に安定なマトリクスは、アガロースで達成できるものより早い流速及び短い処理時間を可能にする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸＴＭ樹脂(J.T. Baker, Phillipsburg, NJ)が精製に有用である。イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンでのクロマトグラフィー、アニオン又はカチオン交換樹脂上でのＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭクロマトグラフィー(ポリアスパラギン酸カラム)、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿法も、回収される多価抗体に応じて利用可能である。
【０１０１】
Ｅ． ニューロン又は軸索変性のインヒビターの使用 
本明細書中に記載のスクリーニングアッセイにおいて同定されるか又は特徴付けられるインヒビター(例えば、上記の特定のインヒビター)などの本明細書中に記載の標的のインヒビターは、ニューロン又は軸索変性を阻害する方法において使用されうる。したがって、インヒビターは、例えば、(i) 神経系の疾患(例えば神経変性疾患)、(ii) 神経系以外に主な効果を有する治療、状態又は疾患の二次的な神経系の状態、(iii) 物理的、力学的又は化学的な外傷による神経系の損傷、(iv) 痛み、(v) 眼関連神経変性、(vi) 記憶喪失、及び(vii) 精神的疾患の治療に有用である。これらの疾患、状態及び障害のいくつかの非限定的な例を以下に示す。
本発明に従って予防又は治療されうる神経変性疾患及び状態の例には、筋萎縮性側索硬化症(ＡＬＳ)、三叉神経痛、舌咽神経痛、ベル麻痺、重症筋無力症、筋ジストロフィー、進行性筋萎縮、一次側索硬化症(ＰＬＳ)、仮性球麻痺、進行性球麻痺、脊髄筋萎縮、進行性球麻痺、遺伝性筋萎縮、無脊椎椎間板症候群(例えばヘルニア性、破裂性、脱出性椎間板症候群)、頸部脊椎症、叢疾患、胸部出口破壊症候群、末梢性神経障害、ポルフィリン症、軽度認知障害、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病、パーキンソン病、パーキンソンプラス病(例えば他系統萎縮症、進行性核上性麻痺及び皮質基底核変性症)、レーヴィ小体を有する認知症、前頭側頭型認知症、脱髄性疾患(例えばギラン-バー症候群及び多発性硬化症)、シャルコー・マリー・トゥース病(ＣＭＴ；別名、遺伝性運動及び感覚神経障害(ＨＭＳＮ)、遺伝性感覚運動神経障害(ＨＳＭＮ)、及び腓骨筋萎縮症)、プリオン病(例えばクロイツフェルト‐ヤコブ病、ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー症候群(ＧＳＳ)、致死性家族性不眠症(ＦＦＩ)、及び牛海綿様脳症(ＢＳＥ、一般に狂牛病として知られる))、ピック病、癲癇、及びエイズ認知症複合(別名、ＨＩＶ認知症、ＨＩＶ脳症及びＨＩＶ関連認知症)が含まれる。
【０１０２】
また、本発明の方法は、眼関連神経変性及び関連疾患及び状態、例えば緑内障、格子ジストロフィー、色素性網膜炎、加齢性黄斑変性(ＡＭＤ)、湿性又は乾燥性のＡＭＤと関係する光レセプター変性、他の網膜変性、視神経結晶腔、視覚神経障害及び視覚神経炎の予防及び治療に使用されうる。本発明によって予防又は治療されうる異なるタイプの緑内障の非限定的な例には、原発性緑内障(別名、原発性開放隅角緑内障、慢性開放隅角緑内障、慢性単純緑内障及び緑内障単式)、低圧緑内障、原発性閉寒隅角緑内障(別名、原発性閉塞隅角緑内障、狭隅角緑内障、瞳孔遮断緑内障及び急性うっ血性緑内障)、急性閉寒隅角緑内障、慢性閉寒隅角緑内障、間欠的な閉寒隅角緑内障、慢性開放隅角閉鎖緑内障、色素性緑内障、剥離緑内障(別名、偽落屑緑内障又は莢膜緑内障)、発達性緑内障(例えば原発性先天性緑内障及び小児緑内障)、二次性緑内障(例えば炎症性緑内障(例えばブドウ膜炎及びフックス異虹彩色性虹彩毛様体炎))、水晶体性緑内障(例えば成熟した白内障を有する閉寒隅角緑内障、水晶体包の断裂に対して二次的な水晶体過敏性緑内障、水晶体毒性の網状組織遮断物による水晶体緑内障、及びレンズの亜脱臼)、眼内出血の二次的な緑内障(例えば、前房出血及び溶血性緑内障、別名、溶血緑内障)、外傷性緑内障(例えば、隅角後退緑内障、前房隅角に対する外傷性後退、術後緑内障、無水晶体瞳孔遮断及び毛様体遮断緑内障)、血管新生緑内障、薬物性緑内障(例えば、副腎皮質ステロイド誘導性緑内障及びα-キモトリプシン緑内障)、毒性緑内障、及び眼内腫瘍と関連する緑内障、網膜剥離、眼の重症化学熱傷、及び虹彩萎縮症が含まれる。
【０１０３】
本発明の方法によって治療されうるタイプの疼痛の例には、以下の状態と関係しているものが含まれる：慢性疼痛、線維症、脊髄痛、心皮トンネル症候群、癌の疼痛、関節炎、座骨神経痛、頭痛、手術の疼痛、筋けいれん、背痛、内臓痛、損傷の疼痛、歯痛、神経痛、例えば神経性又は神経障害性の疼痛、神経炎症又は障害、帯状疱疹、椎間板ヘルニア、靱帯損傷及び糖尿病。
神経系以外に主な作用を有する特定の状態及び疾患により神経系への障害が引き起こされ得、これらは本発明の方法によって治療されうる。このような状態の例には、例えば、糖尿病、癌、エイズ、肝炎、腎臓機能不全、コロラドダニ熱、ジフテリア、ＨＩＶ感染、ハンセン病、ライム病、結節性多発動脈炎、関節リウマチ、サルコイドーシス、シェーグレン症候群、梅毒、全身性エリテマトーデス及びアミロイドーシスによって生じる末梢性神経障害及び神経痛が含まれる。
【０１０４】
さらに、本発明の方法は、重金属(例えば鉛、ヒ素及び水銀)及び工業溶剤を含む毒性化合物、並びに化学療法剤(例えばビンクリスチン及びシスプラチン)、ダプソン、ＨＩＶ薬物(例えばジドブジン、ジダノシン、スタブジン、ザルシタビン、リトナビル及びアンプレナビル)、コレステロール低下薬(例えばロバスタチン、インダパミド及びゲムフィブロジル)、心臓又は血圧薬物(例えばアミオダロン、ヒドララジン、ペルヘキシリン)及びメトロニダゾールを含む薬剤への曝露によって生じる、によって生じる神経損傷、例えば末梢性神経障害の治療に使用することができる。
また、本発明の方法は、物理的、力学的又は化学的な外傷によって生じる神経系の損傷を治療するために用いられうる。よって、この方法は、物理的な損傷(例えば熱傷、傷、手術及び事故と関連する)、乏血、低温への長期曝露(例えば凍傷)、並びに例えば脳卒中又は頭蓋内出血(例えば脳溢血)による中枢神経系への損傷によって生じる末梢神経損傷の治療に用いられうる。
【０１０５】
さらに、本発明の方法は、記憶喪失、例えば加齢性記憶喪失の予防又は治療に用いられうる。喪失によって影響を受けているために本発明によって治療されうるタイプの記憶には、偶発性記憶、意味論的な記憶、短期記憶、及び長期持続記憶が含まれる。本発明によって治療されうる、記憶喪失と関係している疾患及び状態の例には、軽度認知障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、化学療法、ストレス、脳卒中、及び外傷性脳損傷(例えば脳震盪)が含まれる。
また、本発明の方法は、例えば、統合失調症、妄想性障害、統合失調感情障害、統合失調症様、共有精神病性障害、精神異常、妄想性人格障害、統合失調型人格障害、境界線人格障害、反社会性人格障害、自己陶酔性人格障害、強迫神経障害、譫妄、認知症、気分障害、双極性障害、抑鬱、ストレス疾患、パニック障害、広場恐怖症、社会的恐怖症、心的外傷後ストレス障害、不安障害及び衝動制御障害(例えば盗癖、ギャンブル依存症、放火癖及び抜毛癖)を含む精神医学的な疾患の治療に用いられうる。
【０１０６】
上記のインビボ方法に加え、本発明の方法は、エクスビボで神経を治療するために用いられ得、それは神経移植片又は神経移植において有用となりうる。ゆえに、本明細書中に記載のインヒビターは、インビトロで神経細胞を培養するために使用される、培養液の構成成分として有用となりうる。
本明細書中に記載のインヒビターの治療用製剤は、所望の純度を有するインヒビター(小分子又は抗体など)を、任意の生理的に許容される担体、賦形剤又は安定剤(例えばRemington's Pharmaceutical Sciences (18th edition), ed. A. Gennaro, 1990, Mack Publishing Co., Easton, PAを参照)と混合することによって、凍結乾燥されたケーキ又は水溶液の形で保存するために調製される。許容範囲内の担体、賦形剤又は安定剤は、使用する用量及び濃度においてレシピエントに非中毒性であり、これらには、バッファ、例えばリン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸；アスコルビン酸を含む抗酸化剤、ＢＨＡ及びＢＨＴ；低分子量(およそ１０未満の残基)のポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン、アミノ酸、例として、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジン；単糖、二糖及び他の炭水化物、例としてグルコース、マンノース又はデキストリン；ＥＤＴＡなどのキレート剤；糖アルコール、例えばマンニトール又はソルビトール；塩形成対イオン、例えばナトリウム；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えばツイーン、プルロニック又はＰＥＧが含まれる。
【０１０７】
インビボ投与のために使用される化合物は、無菌でなければならない。これは、凍結乾燥及び還元の前又は後に、濾過滅菌メンブランによる濾過によって容易に達成される。治療組成物は、無菌のアクセスポートを有する容器、例えば皮下注射針によって突き刺し可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルに入れられてもよい。
インヒビターは、場合によって、関連の疾患又は状態の治療において有用であることが公知な他の薬剤(一又は複数)と組み合わせるか又はこれと合わせて投与されうる。ゆえに、ＡＬＳの治療では、例えば、インヒビターは、リルゾール(Ｒｉｌｕｔｅｋ)、ミノサイクリン、インスリン様増殖因子１(ＩＧＦ-１)及び／又はメチルコバラミンと組み合わせて投与されてよい。他の例では、パーキンソン病の治療では、インヒビターは、Ｌドーパ、ドーパミンアゴニスト(例えばブロモクリプチン、ペルゴリド、プラミペキソール、ロピニロール、カベルゴリン、アポモルヒネ及びリスリド)、ドーパデカルボキシラーゼインヒビター(例えばレボドパ、ベンセラジド及びカルビドーパ)、及び／又はＭＡＯ−Ｂインヒビター(例えばセレギリン及びラサギリン)と共に投与されてよい。更なる実施例において、アルツハイマー病の治療では、インヒビターは、アセチルコリンエステラーゼインヒビター(例えばドネペジル、ガランタミン及びリバスチグミン)及び／又はＮＭＤＡレセプターアンタゴニスト(例えばメマンチン)と共に投与されてよい。併用療法は、当業者によって適切であると決定されるように、同じ又は異なる手段によって、同時的又は経時的な投与を伴ってよい。また、本発明には本明細書中に記載の組合せを含む薬学的組成物及びキットが含まれる。
【０１０８】
上記の組合せに加えて、本発明に含まれる他の組合せは、異なる神経系領域の変性のインヒビターの組合せである。ゆえに、本発明には、(i) ニューロン細胞質体の変性を阻害して、(ii) 軸索変性を阻害する薬剤の組合せが含まれる。更に後述するように、ＧＳＫ及び転写のインヒビターはニューロン細胞質体の変性を予防することが明らかとされたのに対して、ＥＧＦＲ及びｐ３８ ＭＡＰＫのインヒビターは軸索の変性を予防する。ゆえに、本発明には、ＧＳＫ及びＥＧＦＲ(及び／又はｐ３８ ＭＡＰＫ)のインヒビターの組合せ、転写阻害剤及びＥＧＦＲ(及び／又はｐ３８ ＭＡＰＫ)の組合せ、及び、さらに、二重ロイシンジッパー保持キナーゼ(ＤＬＫ)、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３β(ＧＳＫ３β)、ｐ３８ ＭＡＰＫ、ＥＧＦＲ、ホスホイノシチド３キナーゼ(ＰＩ３Ｋ)、サイクリン依存性キナーゼ５(ｃｄｋ５)、アデニリルシクラーゼ、ｃ−Ｊｕｎ Ｎ末端キナーゼ(ＪＮＫ)、ＢＣＬ２結合Ｘタンパク質(Ｂａｘ)、Ｉｈチャネル、カルシウム／カルモデュリン依存性プロティンキナーゼキナーゼ(ＣａＭＫＫ)、Ｇプロテイン、Ｇプロテインカップリングレセプター、転写第４因子(ＴＣＦ４)、又はβ-カテニンの組合せが含まれる。これらの組合せに使用するインヒビターは、本明細書中に記載の何れかのもの又はこれら標的の他のインヒビターでありうる。
【０１０９】
インヒビターの投与経路は既知の方法に従って、例えば静脈内、腹腔内、大脳内、筋肉内、眼球内、動脈内又は病巣内経路による注射又は注入、局所投与、又は後述する徐放系によって選択される。
脳内使用では、ボーラス注入が許容されるが、化合物はＣＮＳの流体リザーバへの注入によって連続的に投与されてよい。インヒビターは、脳の室に投与されるか、そうでなければＣＮＳ又は髄液内に導入されうる。留置カテーテル及びポンプのような連続投与手段を用いて投与されてもよいし、徐放性媒介物の移植、例えば脳内移植によって投与されてもよい。より詳しくは、インヒビターは、慢性的に植設されたカニューレにより注入されてもよいし、浸透圧性ミニポンプを活用して慢性的に注入されてもよい。小さい管を介してタンパク質を脳室に供給する皮下ポンプは有用である。非常に高性能のポンプが皮膚により補充されてもよく、それらの運搬速度は外科的介入なしで設置されうる。全体的に移植されたドラッグデリバリーシステムを介する皮下ポンプ装置又は連続的な脳室内注入を伴う好適な投与プロトコール又はデリバリーシステムの例は、ドーパミン、ドーパミンアゴニスト及びコリン作動性アゴニストのアルツハイマー病患者及びパーキンソン病の動物モデルへの投与のために用いられるものである。これはHarbaugh, J. Neural Transm. Suppl., 24:271 (1987)；及びDeYebenes, et al., Mov. Disord. 2:143 (1987)に記載されている。
【０１１０】
徐放性調製物の適切な例には、マイクロカプセル又はフィルム等の、成形品の形態である半透性ポリマーマトリックスが含まれる。徐放性マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド(米国特許第３７７３９１９号、欧州特許第５８４８１号)、Ｌ-グルタミン酸とγエチル-Ｌ-グルタメートのコポリマー(Sidman等, Biopolymers 22:547 (1983))、ポリ(２-ヒドロキシエチル-メタクリレート(Langer, et al., 1981, J. Biomed. Mater. Res. 15: 167；Langer, 1982, Chem. Tech. 12:98)、エチレン酢酸ビニル（上掲のLanger等）又はポリ-Ｄ-(-)-３-ヒドロキシ酪酸(欧州特許第１３３９８８号Ａ)が含まれる。また、徐放性組成物には、当然知られている方法によって調製されうるリポソーマルに取り込まれた組成物が含まれる(Epstein, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 82: 3688 (1985)；Hwang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030 (1980)；米国特許第４４８５０４５号及び同第４５４４５４５号；及び欧州特許第１０２３２４号Ａ)。通常、リポソームは、小さい(およそ２００〜８００オングストローム)単層タイプであり、その中の脂質内容物は最適な治療法のために調製された選択割合であるおよそ３０ｍｏｌ％コレステロールより大きい。
【０１１１】
治療に使用される活性化合物の有効量は、例えば、治療の目的、投与の手段及び患者の状態に依存するであろう。したがって、用量の力価を測定し、最適な治療効果を得るために必要とされるように投与経路を修飾することが治療者に必要であろう。代表的な１日の用量は、前述の因子に応じて、例えばおよそ１μｇ／ｋｇから最高１００ｍｇ／ｋｇ以上(例えば、およそ１μｇ／ｋｇから１ｍｇ／ｋｇ、およそ１μｇ／ｋｇからおよそ５ｍｇ／ｋｇ、およそ１ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇ、およそ５ｍｇ／ｋｇからおよそ２００ｍｇ／ｋｇ、およそ５０ｍｇ／ｋｇからおよそ１５０ｍｇ／ｋｇ、およそ１００ｍｇ／ｋｇからおよそ５００ｍｇ／ｋｇ、およそ１００ｍｇ／ｋｇからおよそ４００ｍｇ／ｋｇ、及びおよそ２００ｍｇ／ｋｇからおよそ４００ｍｇ／ｋｇ)であってよい。典型的には、臨床医は、治療される疾患又は状態の一又は複数の症状が改善、場合によっては除去する用量に達するまで、活性なインヒビターを投与するであろう。この治療の進行は従来のアッセイによって容易にモニターされる。本明細書中に記載の一又は複数の薬剤は、併せて、又は異なる時間に(例えば、１つの薬剤が第二薬剤の投与の前に投与される)投与されてよい。一又は複数の薬剤は、異なる技術を用いて被検体に投与されうる(例えば、１つの薬剤は経口投与され、２つ目の薬剤は筋肉内投与又は鼻腔内に投与される)。一又は複数の薬剤は、一又は複数の薬剤が被検体において同時に薬理的な効果を有するように投与されてよい。あるいは、一又は複数の薬剤は、初めに投与された薬剤の薬理活性が、一又は複数の２番目に投与された薬剤(例えば１、２、３、４つの第二投与薬剤)の投与の前に生じるように投与されてよい。 
【０１１２】
本発明の抗体(及び補助治療薬)は、非経口的、皮下、腹膜内、肺内、鼻腔内、そして、必要に応じて局所の治療のために、病巣内投与を含む任意の好適な手段によって投与することができる。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹膜内及び皮下的な投与を含む。加えて、抗体を、特に抗体の用量を減少して、パルス注入によって投与してもよい。投与が短期のものであるか長期のものであるかにある程度依存して、任意の好適な経路、例えば、静脈内又は皮下注射などの注射によって投与することができる。
【０１１３】
抗体の調製及び投与において、本発明に用いられる抗体の結合標的の位置を考慮することができる。結合標的が細胞内分子である場合、本発明の特定の実施態様では、結合標的が位置する細胞に導入される抗体又はその抗原結合断片が提供される。一実施態様では、本発明の抗体は、細胞内に細胞内抗体として発現させることができる。本明細書で使用する「細胞内抗体(intrabody)」という用語は、Marasco, Gene Therapy 4: 11-15 (1997)；Kontermann, Methods 34: 163-170 (2004)；米国特許第６００４９４０号及び同第６３２９１７３号；米国公開特許第２００３／０１０４４０２号及び国際公開第２００３／０７７９４５号に記載のように、標的分子に特異的に結合することができる、細胞内で発現される抗体又はその抗原結合タンパク質を指す。細胞内抗体の細胞内発現は、標的細胞内に、所望の抗体をコードする核酸又はその抗原結合タンパク質(当該抗体又は抗原結合断片をコードする遺伝子に通常関連付けられる野生型リーダー配列及び分泌性シグナルを欠いている)を導入することにより達成することができる。細胞に核酸を導入するための何らかの標準的方法を使用することができ、これらの方法には、限定するものではないが、微量注入、弾道的注入、電気泳動、リン酸カルシウム沈降、リポソーム、及び対象の核酸を有するレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス及びワクシニアベクターによる形質移入が含まれる。本発明の抗ＲＥＬＴ抗体の全部又は一部をコードする一以上の核酸を標的細胞に送達することにより、ＲＥＬＴに細胞内で結合し、一以上のＲＥＬＴ媒介性細胞経路を調節できる、一以上の細胞内抗体を発現させることができる。
別の実施態様では、内部移行する抗体が提供される。抗体は、細胞内への抗体の送達を増強する特定の特徴を有することができるか、又はそのような特徴を有するように修飾することができる。これを達成する技術は従来技術に既知である。例えば、抗体のカチオン化は、細胞内へのその取り込みを容易にすることが知られている(例えば、米国特許第６７０３０１９号参照)。リポフェクション又はリポソームも、細胞内に抗体を送達するために使用することができる。抗体断片を使用する場合、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最小の抑制性断片が一般に有利である。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、標的のタンパク質配列に対する結合能を有するペプチド分子を設計することができる。このようなペプチドは、化学的に合成することができる、及び／又は組換えＤＮＡ技術によって製造することができる。例えば、Marasco等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993)を参照されたい。
【０１１４】
標的細胞への修飾因子ポリペプチドの移入は、従来技術に既知の方法によって増強することができる。例えば、ＨＩＶ  Ｔａｔ又はアンテナペディアホメオドメインタンパク質由来の配列のような特定の配列は、細胞膜全体に異種タンパク質の効率的な取り込みを導くことができる。例えば、Chen等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999), 96:4325-4329参照。
結合標的が脳に位置する場合、本発明の特定の実施態様は、血液脳関門を横切る抗体又はその抗原結合断片を提供する。特定の神経変性疾患は、血液脳関門の透過性の増大に関連しており、これにより抗体又は抗原結合断片を脳に容易に導入できる。血液脳関門が完全に保持されているとき、そこに分子を搬送するための複数の従来技術に既知の手法が存在し、それらには、限定するものではないが、物理的方法、脂質に基づく方法、及びレセプターとチャネルに基づく方法が含まれる。
【０１１５】
血液脳関門に抗体又は抗原結合断片を搬送する物理的方法には、限定するものではないが、血液脳関門を完全に包囲すること、又は血液脳関門に開口部を形成することが含まれる。包囲法には、限定するものではないが、脳への直接注入(例えば、Papanastassiou等, Gene Therapy 9: 398-406 (2002))、間質性注入／対流強化送達(例えば、Bobo等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 2076-2080 (1994)参照)、及び脳への送達装置の移植(例えば、Gill等, Nature Med. 9: 589-595 (2003)；及びGliadel WafersTM, Guildford Pharmaceutical参照)が含まれる。関門に開口を形成する方法には、限定するものではないが、超音波(例えば、米国特許出願公開第２００４／００３８０８６号参照)、浸透圧(例えば、高浸透圧性マンニトールの投与による(Neuwelt, E. A., Implication of the Blood-Brain Barrier and its Manipulation, Vols 1 & 2, Plenum Press, N.Y. (1989)))、例えば、ブラジキニン又はパーミアライザーＡ−７による透過性化(例えば、米国特許第５１１２５９６号、同第５２６８１６４号、同第５５０６２０６号、及び同第５６８６４１６号参照)、及び抗体又は抗原結合断片をコードする遺伝子を含むベクターによる血液脳関門にまたがるニューロンの形質移入(例えば、米国特許出願公開第２００３／００８３２９９号)が含まれる。
血液脳関門に抗体又は抗原結合断片を搬送する脂質に基づく方法には、限定されるものではないが、血液脳関門の血液内皮上のレセプターに結合する抗体結合断片に連結されるリポソームに抗体又は抗原結合断片を封入すること(例えば、米国特許出願公開第２００２／００２５３１３号参照)、及び低密度リポプロテイン粒子(例えば、米国特許出願公開第２００４／０２０４３５４号参照)、又はアポリポタンパク質Ｅ(例えば、米国特許出願公開第２００４／０１３１６９２号参照)中の抗体又は抗原結合断片をコーティングすることが含まれる。
【０１１６】
血液脳関門に抗体又は抗原結合断片を搬送するレセプター及びチャネルに基づく方法には、限定するものではないが、グリココルチコイド遮断薬を用いて血液脳関門の透過性を増大させること(例えば、米国特許出願公開第２００２／００６５２５９号、同第２００３／０１６２６９５号、及び同第２００５／０１２４５３３号参照)、カリウムチャネルを活性化させること(例えば、米国特許出願公開第２００５／００８９４７３号参照)、ＡＢＣ薬の搬送を抑制すること(例えば、米国特許出願公開第２００３／００７３７１３号参照)、抗体をトランスフェリンでコーティングし、一以上のトランスフェリンレセプターの活性を調節すること(例えば、米国特許出願公開第２００３／０１２９１８６号参照)、及び抗体のカチオン化(例えば、米国特許第５００４６９７号参照)が含まれる。
本発明に使用する抗体組成物は、医学的実用性に合わせた様式で調製し、１回分に分けて、投与される。ここで考慮する要因は、治療する特定の疾患、治療する特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、疾患の原因、薬剤の運搬部位、投与の方法、投与の日程計画、及び医師が知る他の因子を含む。必要ではないが場合によっては、問題の疾患を予防するか又は治療するために一般に用いられる一つ以上の作用剤と抗体とを調製する。そのような他の作用剤の有効量は、製剤中の本発明の抗体の量、疾患の型又は治療、及び上記の他の因子に依存する。これらは、一般的に、ここに記載されるものと同じ用量及び投与経路で、又はここに記載される用量の１〜９９％で、或いは経験的／臨床的に適切と判断される任意の用量及任意の投与経路で用いられる。
【０１１７】
疾患の予防又は治療のために、抗体の好適な用量は(単独で用いる場合、又は他の作用剤と組み合わせて用いる場合)、治療する疾患のタイプ、抗体のタイプ、疾患の重症度及び経過、抗体を予防目的で投与するか治療目的で投与するか、以前の治療法、患者の病歴及び抗体への応答性、及び担当医師の判断に依存するであろう。抗体は一時的又は一連の治療にわたって好適に患者に投与される。疾患のタイプ及び重症度に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ(例えば０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ)の抗体を、例えば一以上の分割投与又は連続注入による患者投与の初期候補用量とすることができる。ある典型的な１日量は、上記の要因に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であろう。症状に応じて、数日間以上にわたる繰り返し投与は、通常、所望の疾患症状の抑制が得られるまで持続する。抗体の用量の例は、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲であろう。ゆえに、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇの一以上の用量を(又はそれらを組み合わせて)患者に投与してもよい。このような用量は、間欠的に、例えば週ごと又は３週ごとに投与してもよい(例えば患者に約２〜約２０、例えば約６用量の抗体が投与される)。初期のより高い負荷投与量の後、一以上のより低い用量を投与してもよい。例示的用量療法は、約４ｍｇ／ｋｇの初期負荷投与量の後、約２ｍｇ／ｋｇの毎週の維持用量抗体を投与することを含む。しかしながら、他の投与計画が有効かもしれない。この治療の進行は、従来技術及びアッセイにより容易にモニターすることができる。
【０１１８】
Ｆ．ニューロン又は軸索変性の活性化
また、本発明は、ニューロン又は軸索変性を活性化するか又は増やす方法を含む。これは、先の表２に挙げた一又は複数の標的の活性化因子又はアゴニストの使用によって達成されうる(アデニリルシクラーゼを除いては、インヒビターはニューロン又は軸索変性を活性化するために用いられうる)。ゆえに、二重ロイシンジッパー保持キナーゼ(ＤＬＫ)、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３β(ＧＳＫ３β)、ｐ３８分裂促進因子活性化プロテインキナーゼ(ｐ３８ ＭＡＰＫ)、上皮性増殖因子レセプター(ＥＧＦＲ)、ホスホイノシチド３キナーゼ(ＰＩ３Ｋ)、サイクリン依存性キナーゼ５(Ｃｄｋ５)、ｃ−Ｊｕｎ Ｎ末端キナーゼ(ＪＮＫ)、ＢＣＬ２結合Ｘタンパク質(Ｂａｘ)、Ｉｈチャネル、及びカルシウム／カルモデュリン依存性プロテインキナーゼキナーゼ(ＣａＭＫＫ)のアゴニストが、軸索変性を活性化するか又は増やす方法で使われうる。本明細書において記述されるように、このようなアゴニストは、軸索変性のアッセイにおいて同定されるか又は特徴付けされうる。ゆえに、例えば、候補アゴニストは、神経成長因子の存在下でニューロンが培養される培地に存在し、変性に対するその作用を評価されうる。ニューロン又は軸索変性のアゴニストは、癲癇及び自閉症を含む疾患又は状態、並びに軸索剪定及び変性の天然のプロセスを欠いていることに特徴を有する任意の疾患又は状態の予防及び治療に使用されうる。アゴニストは、先のセクションＥに記載のものなどの方法を用いて調製され、前記治療が必要な被検体に投与されてよい。
【０１１９】
Ｇ．製造品
本発明の他の態様では、上記の疾患又は症状の治療又は予防に有用な物質を含む製造品（例えば薬学的組成物又はキット）が提供される。該製造品は容器と該容器上又は該容器に付随するラベル又はパッケージ挿入物を具備する。好適な容器には、例えば、ビン、バイアル、シリンジ等々が含まれる。容器は、様々な材料、例えばガラス又はプラスチックから形成されうる。容器は、症状を治療又は予防するのに有効な組成物を収容し、滅菌アクセスポートを有しうる(例えば、容器は皮下注射針が貫通可能なストッパーを有するバイアル又は静脈内投与溶液バッグでありうる)。組成物中の少なくとも一つの活性剤は本発明のインヒビターである。ラベル又はパッケージ挿入物は、組成物が選択された症状の治療に使用されることを示す。更に、製造品は、(a)本発明のインヒビターを含有する組成物を中に収容する第一の容器；と(b)更なる治療薬を含有する組成物を中に収容する第二の容器とを具備しうる。本発明のこの実施態様における製造品は、組成物を特定の症状の治療に使用することができることを示しているパッケージ挿入物を更に具備する。あるいは、もしくは付加的に、製造品は、薬学的に許容されるバッファー、例えば注射用の静菌水(ＢＷＦＩ)、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー液及びデキストロース溶液を含む第二の(又は第三の)容器を更に具備してもよい。更に、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業上及び使用者の見地から望ましい他の材料を含んでもよい。
【０１２０】
本発明の更なる詳細は、以下の非限定的実施例で例示される。
【実施例】
【０１２１】
Ｈ．実施例
上記のように、ニューロン又は軸索変性は、多くの神経変性疾患の一般的な形質であって、神経系への損傷又は外傷の結果としても起こる。しかしながら、この活性なプロセスを制御するメカニズムは、理解され始めたばかりである。ニューロン又は軸索変性の異なるモデルを用いた研究に基づいて、疾患又は損傷の性質に応じて、異なるメカニズムがこの方法に関与するようである。ニューロン又は軸索変性を制御する現象の特徴を更に表すために、ニューロン又は軸索変性のモデルにおいて公知のシグナル伝達経路を標的とする小分子化合物のライブラリがスクリーニングされた。複数のシグナル伝達経路がニューロン又は軸索変性に必要であることが同定された。特に、多くのキナーゼがニューロン又は軸索変性のメディエーターとして確認され、さらにメカニズムの研究は軸索又は細胞質体区画に対する異なるキナーゼの機能に集中していた。また、これらの経路は、同種の結果を有する他の変性パラダイムで調べられ、ニューロン又は軸索の自滅が引き起こされる一般的な分子メカニズムが提唱された。これらの実験を以下の実施例に記載する。
【０１２２】
実施例１  
ニューロン又は軸索変性のモデル
本明細書中に記載するように、ニューロン又は軸索変性のインヒビターを同定し特徴付けするために使用されうるアッセイの記載について先に説明したニューロン又は軸索変性のモデルを、抗ＮＧＦ抗体、血清欠乏／ＫＣｌ低減及びロテノン治療アッセイを含む、下記の実施例において使用した。
上述の通り、ＮＧＦにて培養した神経を処理すると軸索の増殖が生じるのに対して、抗ＮＧＦ抗体による該神経の処理により軸索変性が生じる(図１)。抗ＮＧＦ抗体によるニューロンの処理は、電子顕微鏡によって検出可能であるいくつかの異なる形態学的変化を引き起こす。例えば、静脈瘤は軸索断片化の前に抗ＮＧＦ抗体と共に培養した神経において形成され、場合によって、破裂したようであった(図２)。他の例では、抗ＮＧＦ抗体と共に培養した軸索はミトコンドリアの伸長を欠いており、静脈瘤でのミトコンドリアの蓄積を示したことから、軸索内輸送が遮断されることが示唆される。数時間の軸索断片化の間、有意な数のミトコンドリアが以前として活性であった(図３)。更なる実施例は細胞骨格分解に関する。軸索切断の後、微小管網状組織は、アクチン及び神経フィラメント網状組織の前に分解する。それに対して、ＮＧＦ離脱モデルでは、微小管網状組織は、アクチン又は神経フィラメント網状組織の前に分解されなかった(図４)。
軸索変性の他のモデルはウォラー変性であり、この変性は細胞質体から切り離す軸索内の病変の発生によって誘導される(図５)(例としてRaff et al., Science 296(5569): 868-871, 2002を参照)。ウォラー変性遅延(ＷｌｄＳ)変異体において、野生型コントロールと比較して軸索変性は有意に遅延した(図５；Araki et al., Science 305(5686): 1010-1013, 2004)。ＷｌｄＳ変異体の効果は、軸索の自滅メカニズムの存在に裏付けられており、それはＷｌｄＳ変異体において減弱している。ＷｌｄＳは、ＮＧＦ離脱の後で軸索を保護したが、アポトーシスを妨げなかった。
抗ＮＧＦ抗体、血清欠乏／ＫＣＬ低減及びロテノン処理アッセイに関する付加的情報は、実施例２−４(抗ＮＧＦ抗体)、７(血清欠乏／ＫＣｌ低減)、８及び９(ロテノン処理)に示す。
【０１２３】
実施例２  
ニューロン又は軸索変性のインヒビターのスクリーニング
実施例１において上記した抗ＮＧＦ抗体モデルを、ニューロン又は軸索変性のインヒビターのためのスクリーニングに用いた。４００以上の小分子(Tocris Bioscience)のライブラリを試験し、ある場合には、抗ＮＧＦ抗体の存在下で観察される変性をどれが調節しているかを調べた。
【０１２４】
方法及び材料
マウスＥ１３.５胚を切開し、Ｌ１５培地(Invitrogen)に播いた。脊髄は、接着したＤＲＧをもつ胚から切り出した。接着したＤＲＧを有する脊髄は、氷上のＬ１５培地＋５％ヤギ血清(Gibco)に置いた。ＤＲＧはタングステン針を使用して取り除き、残りの脊髄は処分した。８ウェルスライドにＮ３−Ｆ１２溶液(２３ｍｌのハムＦ１２、１ｍｌのＮ３サプリメント及び１ｍｌの１Ｍ グルコース)を満たし、２５ｎｇ／ｍｌのＮＧＦ(Roche)を添加した。(Ｎ３サプリメントはＮ３ １００倍濃縮物の希釈により作製し、以下の順序で、以下の成分を混合することによって作製した：１０.０２ ｍｌの全容量に対して、５.０ ｍｌ ハンクス緩衝生理食塩溶液(ＨＢＳＳ；Ｃａ, Ｍｇフリー；Invitrogen)、１.０ｍｌ ウシ血清アルブミン(ＨＢＳＳ中に１０ｍｇ／ｍｌ＝１５０μｍ)、２.０ｍｌ トランスフェリン(Ｔ１１４７−１Ｇ、ヒト、ＨＢＳＳ中に１００ｍｇ／ｍｌ＝１.１ｍＭ)、１.０ ｍｌ 亜セレン酸ナトリウム(Ｓ９１３３-１ＭＧ、ＨＢＳＳ中に０.０１ｍｇ／ｍｌ＝５８μＭ)、０.４ｍｌ プトレシンジヒドロクロライド(Ｐ５７８０−５Ｇ、ＨＢＳＳ中に８０ｍｇ／ｍｌ＝５００ｍＭ)、０.２ｍｌ プロゲステロン(Ｐ８７８３−５Ｇ、無水エタノール中０.１２５ｍｇ／ｍｌ＝４００μＭ)、０.０２ｍｌ コルチコステロン(Ｃ２５０５−５００ＭＧ、無水エタノール中２ｍｇ／ｍｌ＝５.８ ｍＭ)、０.１ｍｌ トリヨードチロニン, ナトリウム塩(Ｔ６３９７−１００ＭＧ、０.０１Ｎ ＮａＯＨ中０.２ｍｇ／ｍｌ＝３００ μＭ)、０.４ｍｌ インスリン(Ｉ６６３４−２５０ＭＧ、ウシ膵臓、２４１Ｕ/ｍｇ、２０ｍＭ ＨＣｌ中２５ｍｇ／ｍｌ＝４.４ ｍＭ)、(−２０℃で保存可能)。Ｎ３サプリメント貯蔵液は、以下を組み合わせることによって作製した：４０ｍｌの全容量に対して、１０ｍｌ Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ(１００倍、Gibco)、１０ｍｌのグルタミン(２００ｍＭ、Gibco)、１０ｍｌのＭＥＭビタミン(１００倍、Gibco)、１０ｍｌのＮ３濃縮物(１００倍、上記参照)。混合物は０．２２μｍフィルターを使用してフィルター滅菌し、１〜２ｍｌの一定量を−２０℃に保存した)。
【０１２５】
ＤＲＧを半分に分け、８-チャンバスライドの各ウェルの中央に配置した(ＢＤ  Ｂｉｏｃｏａｔ  ＰＤＬ／ラミニンコートガラス、Becton Dickinson)。ＤＲＧは、５〜１０分間、室温でスライドに付着させ、３７℃で終夜インキュベートした。選択したインヒビターは、１００μＭ(上列)又は１０μＭ(下列)の濃度で添加し、１時間後に抗ＮＧＦ抗体を加えた。抗ＮＧＦ抗体は、２５μｇ／ｍｌの濃度で、スライドの右半分(４つのウェル)に加えた。３７℃で２０時間インキュベートした後、スライドは、２５０μｌの培養培地に２５０μｌの固定溶液を直接添加することによって、３０％スクロース／８％パラホルムアルデヒド(ＰＦＡ)にて固定した。(３０％スクロース／８％ＰＦＡ溶液を作るために、以下の成分を、撹拌棒：２５０ｍｌの１６％ＰＦＡ(cat# 15710-S、Electron Microscopy Sciences)、５０ｍｌの１０×ＰＢＳ ｐＨ７．４及び１５０ｇのスクロースを含む６００ｍｌのビーカーに加えた。溶液は溶解するまで低温で混合し、次いで６〜８滴の１Ｍ ＮａＯＨを加えて７．４のｐＨとした。次いで、メスシリンダーに水を加えて体積を５００ｍｌにした。溶液はを十分に混合し、一定量に置き、凍らせた)。スライドを３０分間固定し、ＰＢＳにて１回洗浄した。すべての細胞を、アクチン染色(Ａｌｅｘａ−５６８コンジュゲートファロイジン；１：４０；Invitrogen)、膜色素(ＤｉＯ；１：２００；Invitrogen)、及びＤＮＡ染色(Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８；１：１００００；Invitrogen)を含む０．１％トリトン及び１％ヤギ血清にて室温で２時間かけて標識した。染色液を取り除き、スライドをＰＢＳにて１回洗浄し、１３０μｌのマウント培地(フルオロマウントＧ；Electron Microscopy Sciences)及び２４×６０ｍｍのナンバー１カバーグラス(ＶＷＲ)にて覆った。
【０１２６】
結果
これらの実験において、コントロールニューロン(アクチン染色によって視覚化される)がＮＧＦ離脱により有意な変性を受けた。これに対して、特定の小分子がある場合には、軸索完全性はＮＧＦ離脱によっても維持された。図６−１０は、プロテアソームインヒビター及びＧＳＫインヒビター(図６)、ｐ３８ ＭＡＰＫインヒビター及びアデニリルシクラーゼ活性化因子(図７)、転写インヒビター及びＥＧＦＲキナーゼインヒビター(図８)、ＪＮＫインヒビター及びＢａｘチャネルブロッカー(図９)）、及びＩｈチャネルブロッカー及びＣａＭＫＫインヒビター(図１０)についての実験の結果を示す。神経変性に対して保護することがわかっている特定の化合物と対応する標的の例を表５に示す。これは、いくつかの化合物について生じた所見についての注釈を含む欄を更に含むこと以外は、先の表２と類似している。
【０１２７】
【表５】
0005851838.tif 000014
【０１２８】
実施例３  
増殖因子離脱後の添加のタイミングに関するインヒビターの特徴づけ
ＮＧＦ離脱後の様々な時点で添加したインヒビターの活性を評価するために調査を実施した。特に、候補キナーゼが阻害され軸索変性が止まる開始ＮＧＦ欠乏の後の最新の時間-点を決定するために実験を行った。
【０１２９】
方法及び材料
この研究において使用する一次細胞は、Charles RiverのＣＤ−１ Ｅ１３の後根神経節(ＤＲＧ)とした。細胞は、Ｎ３／Ｆ１２(＋２５ｎｇ／ｍｌのＮＧＦ)培地中で維持した(ハムＦ１２(２３ｍｌ)、Ｎ３サプリメント(１ｍｌ)、グルコース(１ｍｌの１Ｍ グルコース貯蔵液)、２５ｎｇ／ｍｌの神経成長因子２．５Ｓ、マウス(Roche 11362348001)を含むハムＦ１２(貯蔵液：５０μｇ／ｍｌ、−８０℃)使用前にフィルター滅菌する)。また、実験は、ＢＤ  Ｂｉｏｃｏａｔ  ＰＤＬ／ラミニンコートグラス８ウェルチャンバスライド(ＢＤ３５４６８８)と、２４×６０ｍｍのナンバー１カバーグラス(ＶＷＲ ４８３９３ １０６)を使用した。  
胚をＬ１５培地に切開した(切開ツールは７０％イソプロパノールに浸し、皿は氷上に置いた：脊髄に対して１０ｃｍ皿(１皿につき４つの胚)及び１つの６ｃｍ皿)。Ｅ１３．５脊髄をＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳに抽出した。１２８より多いＤＲＧを脊髄から分離し、タングステン針にて半分に分けた。８ウェルスライドに２５０μｌのＮ３／Ｆ１２(２５ｎｇ／ｍｌのＮＧＦ)を満たした。切断したＤＲＧ(１ウェルにつきおよそ４)を５μｌ体積にした。室温でおよそ１０分間接着させ、次いでＤＲＧを３７℃で終夜インキュベートした。以下の条件を用いてインヒビターを試験した。２５μｇ／ｍｌの抗ＮＧＦ抗体を２２時間目に加えた。インヒビターは、抗ＮＧＦ添加のＴ＝０、１、３、６、９及び１２時間後に加えた(１．２５μｌのインヒビター添加；−２０℃にした質量混合物からの５μｌ一定分量；１２μｌのＤＭＳＯ中１８μｌ；２４μｌのＤＭＳＯ中６μｌ；１２μｌのＤＭＳＯ中１８μｌ；２１μｌのＤＭＳＯ中９μｌ；２４μｌのＤＭＳＯ中６μｌ)。インヒビターの添加と軽い振盪によって混合した。コントロールは＋／−抗ＮＧＦ(＋１．２５μｌのＤＭＳＯ)とし、実験は重複して行った。
２５時間後に、２５０μｌの３０％スクロース／８％ＰＦＡを２５０μｌの培養培地に添加して、３０分間置いた。スライドは１×ＰＢＳにて洗浄した(停止：４℃)。免疫蛍光法は以下の通りに実行した。初めに、５％ＢＳＡ／０．２％トリトンに室温で３０分間置いてブロックを行った。一次抗体(Ｔｕｊ１(１：１０００))は、４℃の２％ＢＳＡ中で終夜、スライドと共にインキュベートした。スライドは、１×ＰＢＳにて洗浄し、二次抗体(ヤギ抗マウス４８８；１：２００)を添加した。スライドは、二次抗体と共に暗所にて室温で１時間インキュベートした。スライドは、１：１００００のＨｏｅｓｃｈｔを含むＰＢＳ中で１０分間洗浄し、ガラスコープランドのＰＢＳで５分間洗浄し、タオルに押しつけてやや乾燥させ、２００μｌのフルオロマウントＧにてカバーガラスをかけ、４℃に保存した。画像はすべて同じ環境(すなわち露出時間)とした。さらに、変性の速度は、細胞質体からの軸索の分離に基づいて評価した。
【０１３０】
結果
これらの試験は、ＮＧＦ離脱の数時間(３、６、９及び１２時間)後に加えた場合であってもインヒビターが保護に働くことを示す(図１１)。軸索スコアは、１から１０のスケールの軸索正常状態のスコアである(０＝抗ＮＧＦコントロール様；１０＝ＮＧＦコントロール様；５＝０時間に添加したキナーゼインヒビター様。これらの試験に使用したインヒビターを表６に挙げる。
【表６】
0005851838.tif 000015
【０１３１】
実施例４
局在した変性に関する化合物の特徴づけ
Ｃａｍｐｅｎｏｔチャンバを用いて、実施例２に記載の軸索変性を阻害することが同定された化合物をさらに分析した。Ｃａｍｐｅｎｏｔチャンバにより、細胞質体と軸索の環境を分離し、局在化した変性の誘導を促した(図１２及び例としてZweifel et al., Nat. Rev. Neurosci. 6(8): 615-625, 2005を参照)。このようなチャンバでは、軸索変性は局所化し、アポトーシスなしで進行する(図１３及び１４)。
【０１３２】
材料及び方法
テフロンデバイダー(Tyler Research)は、水で洗浄し、残りの油脂分を拭き取ることによって清浄化した。次いでデバイダーをＮｏｃｈｒｏｍｉｘ(Godax Laboratories)／硫酸に終夜浸し、蒸留して加圧滅菌処理した水(ＳＱ水)で５回すすぎ、３０分間沸騰させ、その後使用前に空気乾燥した。
マウスラミニン(５μｇ／ｍｌを含む濾過滅菌水；Invitrogen)をＰＤＬコート３５ｍｍ皿(BD Biosciences)に添加し、３７℃で１時間インキュベートした後に、ＳＱ水で２回すすいだ。皿は、吸引乾燥し、次いでラミナーフローフードにおいて１５分間空気乾燥した。その後調製した皿をピンレーキ(Tyler Research)にて切り目をつけた。ＮＧＦを含む５０μｌのＮＢＭ＋ＭＣ溶液は結果として生じたスコアトラック全体に適用した(溶液は以下の通りに作製した：１７５０ｍｇのメチルセルロースを４８０ｍｌのＮｅｕｒｏｂａｓａｌ(Invitrogen)と組合せ、４．５ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン、７．５ｍｌのＬ−グルタミン、１０ｍｌのＢ−２７無血清サプリメント(Invitrogen)を加え、溶液を室温で１時間、４℃で終夜、更に室温で１時間混合した。その後溶液をフィルター滅菌し、使用前に５０ｎｇ／ｍｌのＮＧＦ(Roche)を加えた)。高い真空グリース(ＶＷＲ)は、切開範囲下の各テフロンデバイダーに加えた。ラミニンコートＰＤＬ皿を逆さにし、テフロンデバイダーに落とし、トラックを含まない領域にようじを用いて圧力を加えた。皿を３７℃で１時間インキュベートした。５００μｌのＮＢＭ＋ＭＣ(５０ｎｇ／ｍｌのＮＧＦ)溶液を各々の横の区画に加え、油障壁を中心細胞溝の前に加えた。
【０１３３】
フリーＥ１３.５脊髄をマウス胚から切開し、ＮＢＭ＋ＭＣ(２５ｎｇ／ｍｌのＮＧＦ)溶液に置いた。ＤＲＧは、タングステン針にて脊髄から分離したた。ＮＢＭ＋ＭＣ潤滑Ｐ２００ピペットを用いて、１．５ｍｌのチューブにＤＲＧを移した。ＤＲＧは、３０秒間の卓上遠心機にてペレット状にした。上清を破棄し、０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡ(冷温)を加えた。ペレットは、ピペットにて可溶化し、一定の撹拌(６５０回転数／分)にて１５分間３７℃でインキュベートした。試料を再び遠心分離し、上清を破棄した。ペレットは、温めたＮＢＭ＋ＭＣ(５０ｎｇ／ｍｌのＮＧＦ)溶液に再懸濁し、加熱したガラスピペットにて２０回粉末にし、火で穴を開けたガラスピペットにて更に２０回粉末にした。試料は再び遠心分離し、結果として生じたペレットを０．５ｍｌのＮＢＭ＋ＭＣ(５０ｎｇ／ｍｌのＮＧＦ)溶液に再懸濁した。細胞は、２．５×１０６細胞／ｍｌの終濃度に希釈した。細胞懸濁液は、２２ゲージ針を有する１ｍｌのシリンジに詰めた。Ｃａｍｐｅｎｏｔデバイダーの中心溝は、シリンジを用いて満たした(少なくとも５０μｌの体積にする)。Ｃａｍｐｅｎｏｔチャンバーは３７℃で終夜インキュベートした。２．５ｍｌのＮＧＦ＋ＭＣ(５０ｎｇ／ｍｌのＮＧＦ)溶液を中心区画に加え、油分ゲートを取り除いた。２．５ｍｌのＮＢＭ＋ＭＣ培地(２５ｎｇ／ｍｌのＮＧＦを含む)にて３日経過後、外側の培地(細胞質体区画)を置き換えた。５日の培養後、１つの遠位区画を、温めたＮＢＭ＋ＭＣ(ＮＧＦなし)溶液にて３回洗浄した。３回の洗浄の後、５００μｌのＮＢＭ＋ＭＣ(ＮＧＦなし)溶液を、０．５％ＤＭＳＯ又はインヒビターと組み合わせて軸索区画に加えた。細胞質体区画は、０．５％ＤＭＳＯ又はインヒビターを含む２．５ｍｌのＮＢＭ＋ＭＣ培地(２５ｎｇ／ｍｌのＮＧＦを含む)に置き換えた。
２８時間の抗ＮＧＦ抗体処理の後、８％ＰＦＡ／３０％スクロース(上記参照)を１：１の希釈で培養培地に加え、３０分間インキュベートした。添加して初めの１５分経ったときにテフロンデバイダーを取り除いた。システムは、免疫染色の前に２．５ｍｌのＰＢＳにて１回洗浄した。ニューロンは、５％ＢＳＡ／０．２％トリトンを含むＰＢＳに３０分間置いてブロックした。一次抗体Ｔｕｊ１(Covance)を、２％ＢＳＡを含むＰＢＳに最終希釈１：１０００で加え、４℃で終夜インキュベートした。皿はＰＢＳにて１回洗浄した。二次抗体(Ａｌｅｘａ４８８ヤギ抗マウス抗体(Invitrogen))を、２％ＢＳＡを含むＰＢＳに最終希釈１：２００で加え、室温で１時間インキュベートした。皿はＰＢＳにて二回洗浄し、２２×２２ｍｍのカバーグラス(ＶＷＲ)を３５０μｌのフルオロマウントＧ(Electron Microscopy Sciences)と共に加えた。蛍光顕微鏡を用いてニューロンを可視化した。
【０１３４】
結果
上述の通り、Ｅ１３.５ ＤＲＧを単離し、Ｃａｍｐｅｎｏｔチャンバ中で５日間生育させた。５０μｇ／ｍｌの抗ＮＧＦを実験上の軸索区画に加え、インヒビターを、軸索区画(ＮＧＦ抗体あり)又は細胞体区画に加え、軸索を２８時間変性させた。他の軸索区画をコントロールとしてＮＧＦ中で維持した。図１５及び１６に示すように、細胞質体をＳＢ４１５(ＧＳＫｉ)又はＡｃｔＤ(転写インヒビター)に曝した場合、又は、軸索をＡＧ５５５(ＥＧＦＲｉ)又はＳＢ２３９(ｐ３８ｉ)に曝した場合に、ＮＧＦを奪った軸索は変性しなかった。それに対して、ＮＧＦ欠乏軸索区画のＳＢ４１５(ＧＳＫｉ)又はＡｃｔＤ(転写インヒビター)、又は細胞体区画のＡＧ５５５(ＥＧＦＲｉ)又はＳＢ２３９(ｐ３８ｉ)処理は変性を妨げなかったことから、局所の軸索変性におけるシグナル伝達が失われている軸索部分に限定していないことが示唆される。細胞質体及び軸索に適用した場合、いくつかのインヒビターが最も有効である。これらの結果の定量化を図１７に示す。表７は、Ｃａｍｐｅｎｏｔチャンバーからの軸索変性データの概要を示す。
【０１３５】
【表７】
0005851838.tif 000016
(注記：表７のＩＣ５０情報は発行された試料からのものであり、いくつかの値は神経系でない細胞種により生成した)
ａ−Cross et al., J. Neurochem. 77(1): 94-102, 2001；小脳顆粒ニューロンのインビトロペプチドアッセイによる総ＧＳＫ-３活性。
ｂ−Fry et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95(20): 12022-12027, 1998；ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞におけるヘレグリン誘導性チロシンリン酸化。
ｃ−Bose et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103(26): 9773-9778, 2006；３Ｔ３−Ｈｅｒ２細胞におけるタンパク質チロシンリン酸化。
ｄ−Barone et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 296(2): 312-321, 2001；ヒト単球におけるＬＰＳ誘導性ＴＮＦα産生。
ｅ−Tokumitsu et al., J. Biol. Chem. 277(18): 15813-15818, 2002；形質移入したＨｅＬａ細胞におけるイオノマイシン刺激後のＣａＭＫＫ活性。
【０１３６】
上記したスクリーンからのデータに基づくモデルを図１８に示す。予備的研究から、ＮＧＦが軸索区画から除去された場合に細胞体が小さくなり(図１９)、ＮＧＦを局所的に欠乏したニューロンの多くがカスパーゼ３陽性に切断され、核凝縮を示したこと(図２０)が示された。更なる研究により、ＧＳＫ3(図２１)及びＪＮＫ(図２２)活性がＮＧＦ離脱の６時間後にピークに達することが示される。
【０１３７】
実施例５
ニューロン変性の特定の表現型に関する化合物の特徴づけ
細胞質体に適用した細胞質体インヒビターとして先に同定された化合物(ＳＢ４１５(ＧＳＫｉ)及びＡｃｔＤ(転写インヒビター))、及び軸索に適用した軸索インヒビターとして同定された化合物(ＡＧ５５５(ＥＧＦＲｉ)及びＳＢ２３９(ｐ３８ｉ))により、上記したＣａｍｐｅｎｏｔチャンバアッセイを使用した静脈瘤の形成に関して局所的に欠乏した軸索が観察された。静脈瘤を有する多数の軸索、並びに断片化した軸索は、細胞質体インヒビターによって観察された(図２３)。軸索インヒビターは僅かな静脈瘤を示し、軸索はそれらインヒビター(図２３)による処理に応じて断片化へ進行したようであった。これらの所見は、ＥＧＦＲ及びｐ３８が静脈瘤の形成の上流にありうることを示す。ミトコンドリア機能不全及び軸索内輸送の遮断を、ＧＳＫ、ＥＧＦＲ及びｐ３８インヒビターによって調べた。図２４に示すように、機能的ミトコンドリアが観察されたが、いずれも伸長していなかった。
また、細胞質体によるシグナル伝達が起こらない軸索変性パラダイムにおいてＧＳＫを阻害することも調べた。５０μＭのＳＢ４１５が病変後の変性をわずかに遅延させたので、ＧＳＫ３を阻害することは、主に軸索の微小管網状組織の安定化によって軸索への直接効果を有する。この効果により、全体的なＮＧＦ離脱の後に観察される軸索変性が遅延するようであるが、細胞質体におけるＧＳＫ３ｂの役割はより重要であるようである(図２５)。加えて、ＧＳＫインヒビターが軸索変性を遮断したが、細胞死を遮断しなかったので、全体的なＮＧＦ離脱の後の軸索保護は、ニューロンの死におけるＧＳＫの役割とは無関係であるようである(図２６)。
【０１３８】
実施例６
患者の末梢性神経障害の予防
Ｔａｒｃｅｖａ(登録商標)(エルロチニブ)はＥＧＦＲキナーゼインヒビターである。パクリタキセル及び他の化学療法剤による患者の治療は末梢性神経障害を引き起こすことが知られている(Wilkes, Semin. Oncol. Nurs. 23(3): 162-173, 2007に概説される)。Ｔａｒｃｅｖａ(登録商標)とパクリタキセルの組合せで治療した患者は、プラセボ＋パクリタキセル群と比較して、有意に少ない末梢神経障害を示した(ｐ＝０.０１２；フィッシャー直接検定)(１６．３％に対して患者２６．４％；登録した初めの４００人の患者；一般的な有害事象の分析)。
【０１３９】
実施例７  
筋萎縮性側索硬化症(ＡＬＳ)モデルにおけるＥＧＦＲキナーゼレベルの分析
筋萎縮性側索硬化症(「ＡＬＳ」)は重度の障害であり、致死的な神経変性疾患である。このの病理学は運動ニューロンの喪失に特徴がある。スーパーオキシドジスムターゼ(「ＳＯＤ」)遺伝子の変異(ＳＯＤ(Ｇ９３Ａ))を含むＡＬＳのマウスモデルに類似の病理が生じる。ＥＧＦレセプターのリン酸化は軸索の変性と関係している。ＥＧＦＲレベルはＳＯＤ(Ｇ９３Ａ)マウスにおいて変更しており、リン酸化したＥＧＦＲレベルがＳＯＤ(Ｇ９３Ａ)マウスにおいても変更しているか否かを決定するために実験を行った。
末端ＳＯＤ(Ｇ９３Ａ)及び非トランスジェニック同腹仔からの脊髄をスライドへ低温切開し(２０μｍ厚)、−８０℃に保存した。スライドは室温に解凍し、１回のすすぎにつき５分かけてＰＢＳに２回水和した。スライドは、過酸化水素(ＰＢＳ中０．３％)中で５分間ブロックし、次いで１回のすすぎにつき５分かけてＰＢＳにて２回すすいだ。スライドは、１回の洗浄につき１０分かけ、ＰＢＳ-Ｔ(０．１％トリトンＸ１００を含むＰＢＳ)で２回洗浄した。スライドは、５％ＢＳＡ及び０．３％トリトンＸ１００を含むＰＢＳに、室温でおよそ１時間かけてブロックした。ウサギモノクローナル抗リン酸化ＥＧＦＲ一次抗体(Novus Biologicals)は、１％ＢＳＡ及び０．３％トリトンＸ１００を含むＰＢＳに１:５００に希釈し、４℃で終夜スライドと共にインキュベートした。スライドは、１回の洗浄につき１０分かけて、ＰＢＳ−Ｔに４回洗浄した。ビオチン化ヤギ抗ウサギ二次抗体(Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ)は、１％ＢＳＡ及び０．３％トリトンＸ１００を含むＰＢＳに１:３００に希釈し、３０分〜１時間スライドと共にインキュベートした。スライドは、１回の洗浄につき５分かけて、ＰＢＳ−Ｔに４回洗浄した。洗浄したスライドは、アビジン-ビオチン複合体溶液(Vector Laboratories)中で室温で３０分間インキュベートした。スライドは、１回の洗浄につき５分かけて、ＰＢＳ−Ｔに４回洗浄した。次いでスライドを、所望の強度になるまでペルオキシダーゼ基質(ジアミノベンジジン(ＤＡＢ)；Sigma)と共にインキュベートした。スライドを水ですすぎ、カバースライドをかけて観察した。
ＥＧＦＲ抗体で染色した脊髄索の切片を示す図２７及び２８に示すように、リン酸化ＥＧＦＲレベルは、コントロールマウスと比較してＳＯＤマウスにおいて増加した。この所見は、ＥＧＦＲキナーゼ阻害がインビボのＡＬＳ治療において有益となりうることを示す。
【０１４０】
また、ＳＯＤ１試料の免疫組織化学研究を行った。スライドを室温に暖め、ＩｍｍＥｄｇｅペンで外形を描き、室温でのＰＢＳによる２回の１０分間洗浄により水和し、室温でＰＢＳＴｘにて２回の１０分間洗浄を行った。抗体ブロックは、室温で１〜２時間実行した(５％ＢＳＡ、０．３％Ｔｘを含むＰＢＳ；(２５ｍｇのＢＳＡを含む５００ｍｌのＰＢＳ＋１．５ｍｌの１０％Ｔｘ))。試料は、１％ＢＳＡ、０．３％Ｔｘを含むＰＢＳ(ＮＦ(マウス、Millipore) １：２００；ＳＭＩ３２(マウス、Covance) １：３００))中で、一次抗体と共に４℃で終夜インキュベートした。試料は、一次抗体インキュベートの後に、室温で、ＰＢＳＴｘ(０．１％)にて４回の１０分洗浄を行った。二次抗体を適用し(Molecular Probes、Ａｌｅｘａコンジュゲート；Ｄロバ抗マウスＡｌｅｘａ-４８８；１％ＢＳＡ、０．３％Ｔｘを含むＰＢＳに１：５００希釈)、試料を室温で２時間インキュベートした。試料は、二次抗体のインキュベートの後に、ＰＢＳＴｘにて２０分間で２回、ＰＢＳにて１０分間で２回洗浄した。場合によって、ＰＢＳ中１：１００００でＤＡＰＩを適用することによって２回目の洗浄の間に核対比染色を行った。Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄマウント培地(Vector Labs)にて標本をマウントした。
図２９は、ＳＯＤ ＡＬＳモデルの軸索に残っているｐＥＧＦＲを示す。図に示すように、軸索数は、ＳＯＤ１-ｔｇ脊髄において減少しており、ｐＥＧＦＲは一部ＳＯＤ１-ｔｇ動物の軸索と共局在している。ゆえに、軸索は、非トランスジェニックコントロールと比較して、ＳＯＤ１トランスジェニックマウスにおいて失われており、残りの軸索の多くはｐＥＧＦＲに免疫反応性がある。
【０１４１】
実施例８
血清欠乏／ＫＣｌ減少が誘導した変性からの小脳顆粒ニューロンの保護
キナーゼインヒビター(ＧＳＫ３、ＪＮＫ、ＥＧＦＲ、ｐ３８及びＣａＭＫＫのインヒビター)は、血清欠乏／ＫＣｌ低減後の培養した小脳顆粒ニューロン(ＣＧＮ)を保護する能力について試験した。簡単に言うと、Ｐ７マウス脳から単離したＣＧＮを、血清及びカリウムを含む培地(２９ｍＭ ＫＣｌ及び１０％ＦＢＳを含む基礎培地イーグルス)にて、ＰＤＬ−及びラミニンコート９６ウェル組織培養皿上で３７℃で培養した。２４時間の培養の後に、細胞を、単独又は表８に示す様々な小分子インヒビターと組み合わせて、「欠乏」培地(５ｍＭ ＫＣｌを含む基礎培地イーグルス)に交換した。更に２４時間培養した後に、ニューロンを４％パラホルムアルデヒドにて固定し、神経系マーカー(抗クラスIIIβ-チューブリン、Covance)で染色した。撮像は、ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ自動化撮像システム(Molecular Devices)を使用して実行した。使用するプレート設定を表８にまとめる。
【０１４２】
【表８】
0005851838.tif 000017
ＪＮＫインヒビター＝ＳＰ６００１２５
ＣＡＭＫＫインヒビター＝ＳＴＯ-６０９
ＥＧＦＲインヒビター＝ＡＧ５５５
Ｐ３８インヒビター＝ＳＢ２３９０６３
ＧＳＫ３インヒビター＝ＳＢ４１５２８６
カラム１−６：細胞密度＝５×１０４／ウェル
カラム７−１２：細胞密度＝２．５×１０４／ウェル
図３０に示すように、キナーゼインヒビターは、変性からＣＧＮを保護する際に有効であることが明らかとなり、これはＤＲＧについての実施例２及び３に見られる所見と類似していた。
【０１４３】
実施例９
ロテノンが誘導した変性からの海馬ニューロンの保護
キナーゼインヒビター(ＧＳＫ３、ＪＮＫ、ＥＧＦＲ、ｐ３８及びＣａＭＫＫのインヒビター)を、ロテノンに依存する変性から海馬ニューロンを保護する能力について試験した。アッセイは以下の通りに実施した。まず、海馬ニューロンを切開した。簡単にいうと、麻酔した妊娠ラットからＥ１８−Ｅ１９胚を取り出し、冷温ＨＢＳＳ(上記参照)を含むペトリ皿に置き、新鮮な冷温ＨＢＳＳで洗浄した。胚は嚢から取り出し、新鮮な冷温ＨＢＳＳに置き、脳を単離して、標準的な技術を使用して新鮮な冷温ＨＢＳＳに置いた。海馬及び皮質を各々の胚から単離し、脳は矢状に半分に切り、半球を分離した。残りの小脳／脳幹、嗅球、非皮質腹側性基底組織及び髄膜を取り出した。残りの組織から海馬を取り出し、氷上の１．５ｍｌチューブへ移した。皮質組織は、氷上の異なる１．５ｍｌチューブへ移した。できるだけ多くのＨＢＳＳを取り除き、１％トリプシン(Hyclone)／０．１％ＤＮＡ分解酵素(Sigma)を含むＨＢＳＳを各チューブの残りの組織に加えた。組織は、先端熱加工したピペットを使用して各々分割した。組織は、２分毎にチューブをタッピングしながら３７℃で１０分間インキュベートした。溶液をできる限り組織から取り除き、組織はそれぞれ０．０５％ＤＮＡ分解酵素(Sigma)溶液にて洗浄した。試料は、(１)２／３孔の先端熱加工ピペットと(２)１／３孔の先端熱加工ピペットをそれぞれ用いて、０．０５％ＤＮＡ分解酵素(Sigma)におよそ２０回粉末加工した。試料を５分静置し、その後上清を回収し(デブリは沈み、上清をピペットにて取り出した)、細胞を血球計数器にて計数した。
【０１４４】
単離した海馬ニューロンにヌクレオフェクションを行った。簡単にいうと、所望の細胞数(１回のヌクレオフェクションにつき０．５〜１×１０６細胞)を遠心分離によって単離した。できるだけ多くの上清溶液を取り除き、各チューブからのペレット状の細胞を２０μｌの室温ヌクレオフェクション溶液(Amaxa)に再懸濁した。各々の再懸濁物を予め分注したβ-アクチン−ＧＦＰ「ｐＣＡＧＧＳ−ＡＦＰ」ＤＮＡ(1実行につき４００ｎｇ)に加え、ゆっくりとタッピングした。混合物は９６ウェルシャトルプレートのヌクレオキュベットウェルに移し、プレートはヌクレオフェクター装置に挿入した。ニューロンは、予め設定したＡｍａｘａプログラム（ＣＵ１１０）を使用してヌクレオフェクションした。ヌクレオフェクションの直後に、１００μｌの予め暖めたＣＮＢＭ(１０ｍｌのＢ２７(無血清サプリメント；Invitrogen)、５ｍｌの１００×Ｐｅｎ-Ｓｔｒｅｐ、５ｍｌの１００×Ｇｌｕｔａｍａｘ、４８０ｍｌのＮＢＭ(神経基礎培地(neurobasal medium)；Invitrogen))を加え、その後細胞を、７００００細胞／ウェルの密度で８ウェルＰＤＬコートチャンバスライドに播いた。ニューロンは、３〜５日毎に培地を交換しながら、ロテノン添加の前の５〜１４日間生育させた。
１０μＭのロテノン(ＤＭＳＯに再懸濁；ＶＷＲ)を、ベヒクル又は実験的化合物の有無の下でニューロンに加えた。ロテノン添加の１７〜１８時間後に、ニューロンは、４％パラホルムアルデヒド／１５％スクロースの溶液に室温で４０分間かけて固定した。ニューロンはＰＢＳにて１回洗浄し、マウス抗Ｔｕｊ１抗体(Covance)を１：１０００(ＰＢＳ、０．１％トリトンＸ−１００、２％ヤギ血清中)の希釈で加え、４℃で終夜インキュベートした。ニューロンはＰＢＳにて４回洗浄し、Ａｌｅｘａ-５６８(Alexa)をコンジュゲートしたヤギ抗マウス抗体を１：２００(ＰＢＳ、２％ヤギ血清中)の希釈で加え、３０分置いた。ニューロンは、ＰＢＳにて更に４回洗浄し、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄマウント培地(Vector Labs)のスライド上にマウントした。すべてのニューロンはＴｕｊ１にて視覚化し、個々のニューロンはＧＦＰにて視覚化した。
図３１に示すように、キナーゼインヒビターは、ロテノン依存性の変性から海馬ニューロンを保護することが明らかとなった。皮質ニューロンを用いて類似の研究を行ったところ、キナーゼインヒビターによって皮質ニューロンもまたロテノン依存性の変性から保護されることが示された(図３２)。
【０１４５】
実施例１０
軸索上のＥｒｂＢレセプターの視覚化
軸索上のＥｒｂＢレセプター発現を視覚化するために、画面情報のためにＤＲＧを上記のように培養した。２４時間成育させた後、１：１の比率で培養培地に８％ＰＦＡ／３０％スクロースを加えて３０分置いて細胞を固定し、ＰＢＳにて１回洗浄した。固定した細胞を、５％ＢＳＡ及び０．２％トリトンＸ１００を含むＰＢＳ中で３０分間インキュベートし、次いで以下の抗体と共に２％ＢＳＡを含むＰＢＳ中で４℃で終夜インキュベートした：(１) ５０μｇ／ｍｌの抗ＥＧＦＲ(Ｄ１-５、Genentech)、(２) １：５００の抗ＥｒｂＢ２(Abcam)、(３) ２４μｇ／ｍｌの抗ＥｒｂＢ３(５７．８８、Genentech)、及び(４) １：５００のＥｒｂＢ４(Abcam)。細胞はＰＢＳにて１回洗浄した後、蛍光標識がコンジュゲートした二次抗体(１：２００、Invitrogen)と共に室温で３０分間インキュベートし、ヘキスト３３２５８(１μｇ／ｍｌ、Invitrogen)を含むＰＢＳにて１回、その後最終的にＰＢＳにて洗浄し、２５０μｌのフルオロマウントＧ (Electron Microscopy Sciences)にてカバーガラスをかけた。図３３に示すように、免疫細胞化学法によってＥｒｂＢが軸索に検出される。
【０１４６】
実施例１１
ＥＧＦＲリガンドによる軸索上に発現したＥＧＦＲの特徴づけ
ＥＧＦを含むリガンドによってＥＧＦＲの活性化の効果を評価するために実験を行った。
材料及び方法
後根神経節(ＤＲＧ)イムノブロットを以下の通りに調製した。実験に使用する主な細胞は、チャールズリバー社のＣＤ−１ Ｅ１３後根神経節(ＤＲＧ)とした。細胞は、Ｎ３／Ｆ１２(＋２５ｎｇ／ｍｌのＮＧＦ)培地(ハムＦ１２(２３ｍｌ)、Ｎ３サプリメント(１ｍｌ)、グルコース(１ｍｌの１Ｍ グルコース貯蔵液)、２５ｎｇ／ｍｌの神経成長因子２．５Ｓ, マウス(Roche11362348001)を含むハムＦ１２(貯蔵液：５０μｇ／ｍｌ−８０℃)、これは使用前にフィルター滅菌した)に維持した。また、実験には、トリトン溶解バッファ(２０ｍＭ トリスｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％トリトン-Ｘ１００、１００×ホスファターゼインヒビター反応混液Ｉ(新鮮なものを添加)、１００×ホスファターゼインヒビター反応混液ＩＩ(新鮮なものを添加)、１錠／１０ｍｌのプロテアーゼインヒビター錠(新鮮なものを添加))を使用した。
０日目にＤＲＧ移植片を調製した。胚をＬ１５培地に切開した(切開ツールは７０％イソプロパノールに浸し、皿は氷上に置いた：脊髄に対して１０ｃｍ皿(１皿につき４つの胚)及び１つの６ｃｍ皿)。Ｅ１３．５脊髄をＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳに抽出した。５×２０のＤＲＧを脊髄から分離した。８ウェルスライドに２５０μｌのＮ３／Ｆ１２(２５ｎｇ／ｍｌのＮＧＦ)＋７μＭ シトシンアラビノシドを満たした。およそ２０のＤＲＧを各ウェルに置き(合計５)、室温でおよそ１０分間接着させた。２日目に、培地をＮ３／Ｆ１２＋２５μｇ／ｍｌ ＮＧＦに交換した。３日目に、ＥｒｂＢリガンド(１０００×；１００μｇ／ｍｌ；ＳＱ水に１：１０に希釈)を加えて３０分から１時間置き(ＳＱ水(コントロール)；ＥＧＦ(ＥｒｂＢ１)；ニューレグリン-１(ＥｒｂＢ３)；β-セルリン(ＥｒｂＢ１／４)；エピレグリン(ＥｒｂＢ１／４)；抗ＮＧＦ(２５μｇ／ｍｌ))、スライドをわずかに振とうした。
【０１４７】
ピペット先端部による培地の吸引によってイムノブロッティングを行い、氷冷の無菌ＰＢＳにて２回洗浄し、ピペット先端部又はキムワイプにて吸引してすべてのＰＢＳを除去した。細胞は、氷上で４０μｌのトリトン溶解バッファにて溶解した。溶解物を回収し、４℃で３０分間回転させ、最高速度で５分間回転させ、上清を得た(停止：−８０℃)。およそ２０μｌの試料を流した。試料は、１×ＳＤＳ試料バッファ及びＮｕＰＡＧＥ還元剤(１０×)を加えて調製し、溶解物は沸騰させた。標準物質(１μｌ ＭＷＭ；１μｌ及び２μｌの脊髄溶解物)を用いた１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ(１２０ボルト)にて試料を分画した(２つのメンブレンについて実施)。ゲルはｉＢｌｏｔプログラム３(ニトロセルロース)を使用してブロットし、ブロットは９８ｋＤａで切った。上部メンブレンは、５％ＢＳＡを含むＴＢＳＴ中で１時間かけてブロックした。一次抗体は、２ｍｌの５％ＢＳＡを含むＴＢＳＴ中に１時間置いた(Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ抗Ｐ-チロシンＨＲＰコンジュゲート(ＰＹ２０) １：１００００)。ブロットは、ＴＢＳＴにて５分間、３回洗浄し、ＥＣＬにて反応させた。下部メンブレンは、５％ミルクを含むＰＢＳ中で１時間ブロックした。一次抗体は、減圧バッグ中で２ｍｌの５％ＢＳＡを含むＴＢＳＴ中に４℃で２日間置いた。使用した抗体は、ＣＳ抗Ｐ−Ｅｒｋウサギ(４２／４４ｋＤａ)１：１０００；Ｃ抗ＴＵＪ1ウサギ(５５ｋＤａ) １：５０００(異なるメンブレン上)及びＳＣ抗Ｅｒｋ１ウサギ(４２／４４ｋＤａ) １：１０００(異なるメンブレン上)。ブロットは、ＴＢＳＴにて５分間、３回洗浄した。二次抗体を１０ｍｌの５％ミルクを含むＴＢＳＴに１：５０００で加え、室温で１時間インキュベートした(Ｒｅｄ(６８０)抗ウサギ)。ブロットは、ＴＢＳＴにて５分間、３回洗浄し、オデュッセイアにてＰＢＳ中でスキャンした。陰性／計数直観値を最小化するバックグラウンド方法及び標準物質バンドを選択することによって定量化を行った；すなわち、上部／下部、右／左、ユーザー定義(ユーザー定義)。濃度標準物質の強度が低ければ低いほど、陰性値は小さい。
【０１４８】
結果
これらの実験の目的は、ＥＧＦによるＥＧＦＲの活性化が変性を起こすために十分か否かを観察することである。図３４に示すように、ＥＧＦＲは軸索に発現される。図３５は、ＮＧＦに維持されるニューロンに添加したＮＧＦによって変性が生じないことを示す。これらのアッセイに用いた神経系培養物においてＥＧＦがＥＧＦＲ／ＥｒｂＢを活性化することができることを確認するために、ＥＲＫ活性化を評価した(ＥＲＫはＥＧＦＲの下流の標的である)。図３５のグラフに示すように、ウエスタンブロットによって決定されたように、ＥＧＦの添加によりＥＲＫ活性が増加した。これらのデータは、ＥＧＦＲを活性化することが変性を起こさせるために十分でないことを示す。
【０１４９】
実施例１２  
ＥＧＦＲ外部ドメインを用いた軸索上に発現したＥＧＦＲの特徴付け
ＥＧＦＲの活性化に対するＥＧＦＲ外部ドメインの効果を評価するために実験を行った。
材料及び方法
これらの研究に使用する材料には、ＢＤ Ｂｉｏｃｏａｔ ＰＤＬ／ラミニンコートガラス８ウェルチャンバスライド(BD354688) ；Ｌ１５培地(Invitrogen 11415114)；ウシ血清のアルブミン(ＢＳＡ)(Sigma A7906-500g)；ウシ胎児血清(Sigma F2442-100ml)；Ｎ３サプリメント(上記参照)；フルオロマウントＧ(Electron Microscopy Sciences 17984-25)；２４×６０ｍｍナンバー１カバーグラス(VWR48393 106)；モノクローナル抗神経系クラスIIIβ-チューブリン(Covance MMS-435P)；神経成長因子２．５Ｓ, マウス(Roche 11362348001)を含むハムＦ１２；及び、トリトンＸ-１００(Sigma T8787-100ml)が含まれる。これらの実験に使用する溶液には、２５ｍｌのＮ３／Ｆ１２培地(２３ｍｌのハムＦ１２；１ｍｌのＮ３サプリメント；１ｍｌの１Ｍ グルコース；２５ｎｇ／ｍｌのＮＧＦ)及び３０％スクロース／８％ＰＦＡ(上記参照)が含まれる。
外部ドメイン(R&D Systems)は、フィルター滅菌した０．１％ＢＳＡに１ｍｇ／ｍｌで再懸濁した。マウスＥ１３.５胚を切り出し、Ｌ１５培地に置いた。ピンセットを使用して、胚の腹側部を開き、臓器を取り出し、肋骨を切り離し、脊髄をＤＲＧが接着したまま切り出した。接着したＤＲＧを有する脊髄は、氷上のＬ１５培地＋５％ヤギ血清に置いた。ＤＲＧはタングステン針で取り出し、残りの脊髄を処分した。８ウェルスライドをＮ３-Ｆ１２＋２５ｎｇ／ｍｌのＮＧＦで満たした。ＤＲＧを半分に切断した。切断したＤＲＧは８-チャンバスライドの各ウェルの中心に置き、ＤＲＧは室温で５〜１０分間接着させた。外部ドメインは、上列の終濃度５０μｇ／ｍｌで加えた。スライドは、３７℃でのインキュベーターに終夜置いた。外部ドメインは、終濃度５０μｇ／ｍｌで、下列に加えた。抗ＮＧＦ抗体は、２５μｇ／ｍｌの濃度でウェルに加えた。ポジティブコントロールとしてＥＧＦＲインヒビターＡＧ５５５は１０μＭの濃度で加えた。
２４時間の抗ＮＧＦ抗体処置の後、８％ＰＦＡ／３０％スクロースを１:１の希釈で培養培地に直接加え、３０分置いた。初めの１５分後にテフロンデバイダーを取り外し、スライドをＰＢＳにて１回洗浄した。
スライドは、５％ＢＳＡ／０．２％トリトン中で３０分かけてブロックし、２％ＢＳＡ中で一次抗体(Ｔｕｊ１(１:１,０００))と共に終夜インキュベートした。スライドはＰＢＳにて１回洗浄し、二次抗体(ヤギ抗マウス４８８；１:２００)を加えた。スライドは、室温で１時間インキュベートし、ＰＢＳにて２回洗浄し、２５０μｌのフルオロマウントＧにてカバーガラスをかけ、４℃で保存した。
【０１５０】
結果
ＥＧＦに加え、ＥＧＦＲを活性化しうる多くのリガンドがある。変性の間のＥＧＦＲ活性化がリガンド依存性であるか否かを試験するために、R&D SystemsからのＥＧＦＲ外部ドメインを５０μｇ／ｍｌの濃度で加えた。この濃度は、ＥＧＦＲを活性化しうる任意の遊離リガンドを結合するために十分であると思われる。抗ＮＧＦ添加の２４時間前又は添加と同時に加えたＥＧＦＲ外部ドメインは、変性をブロックしない。このことから、変性中のＥＧＦＲ活性化はおそらくリガンド非依存性であることが示唆される。
【０１５１】
実施例１３
背面の脊髄(ＤＳＣ)移植片は神経変性の他のモデルである。ＤＳＣは一定の日数にわたって軸索を延ばすが、ＤＳＣが生存因子の添加によってレスキューされない場合、それらは最終的に変性する。図３７に示すように、Ｔａｒｃｅｖａ(登録商標)(Erlotinib)はこの変性プログラムを遅延させうる。
【０１５２】
実施例１４
Ａ．二重ロイシンジッパー含有キナーゼの阻害
材料と方法
２９３細胞株中におけるＤＬＫの形質移入
２９３細胞を６ウェルプレートの３つのウェル中に３０％のコンフルエンスで播種した。細胞に、野生型ＤＬＫを発現するＤＮＡコンストラクトであるコントロールプラスミドＤＮＡか、あるいは一方が野生型ＤＬＫを発現し、他方がスレオニン２７７をアラニンに変異させた（Ｔ２７８Ａ）ＤＬＫを発現する二つのプラスミドの何れかを形質移入し、活性を伴わないタンパク質の形態をつくり出した（Fugene 6, Roche）。形質移入から２４時間後に、細胞をＰＢＳで洗浄し、各プレートを擦り落とし、エッペンドルフ管に移した。ついで、細胞を遠沈させ、過剰の培地を除去した。ペレット状細胞を、２０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のトリトンＸ−１００中に溶解させ、３０分間、４℃に置いた。ついで、試料を遠心させて不溶性粒子を除去し、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイ（Promega）でタンパク質濃度を試験した。
【０１５３】
試料を、１０％のポリアクリルアミドゲル（Invitrogen）に流し、ｉＢｌｏｔ装置（Invitrogen）を製造者の仕様に従って使用して移した。ブロットを、５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＴＢＳＴ（トリス緩衝生理食塩水＋１％のＴｗｅｅｎ２０）中で１時間ブロックした。ブロック後、ＴＢＳＴ＋１％ＢＳＡ中のＪＮＫ（Cell Signaling Technologies）又はＪＮＫのリン酸化型（Cell Signaling Technologies）に対して産生された一次抗体において一晩インキュベートした。インキュベーション後、ブロットをＴＢＳＴで３回洗浄し、ついで、ＨＲＰ結合抗ウサギ二次抗体と共に室温で１時間インキュベートした。ブロットをもう一度３回洗浄した後、ＥＣＬ（Promega）と共に１分間、インキュベートした。ついで、ブロットをフィルムに露光させ、分析した。
【０１５４】
ＤＬＫ ｓｉＲＮＡ後のＤＲＧにおける分解
マウスＥ１３．５胎仔を解剖し、Ｌ１５培地（Invitrogen）中に配した。脊髄を、ＤＲＧが付着した胎仔から解体した。ＤＲＧが付着した脊髄を氷上のＬ１５培地＋５％ヤギ血清（Gibco）中に配した。ＤＲＧをタングステン針を使用して除去し、残りの脊髄を処分した。８ウェルのスライドに、２５ｎｇ／ｍｌのＮＧＦ（Roche）を添加したＮ３−Ｆ１２溶液（２３ｍｌのハムのＦ１２、１ｍｌのＮ３サプリメント、及び１ｍｌの１Ｍグルコース）を満たした。Ｎ３サプリメントは、次の成分を次の順で混合することによって作製したＮ３の１００Ｘ濃縮物の希釈により作製した：５．０ｍｌのハンクの緩衝生理食塩水（ＨＢＳＳ；非含有Ｃａ，Ｍｇ；Invitrogen）、１．０ｍｌのウシ血清アルブミン（ＨＢＳＳ中１０ｍｇ／ｍｌ＝１５０μｍ）、２．０ｍｌのトランスフェリン（Ｔ１１４７−１Ｇ，ヒト，ＨＢＳＳ中１００ｍｇ／ｍｌ＝１．１ｍＭ）、１．０ｍｌの亜セレン酸ナトリウム（Ｓ９１３３−１ＭＧ，ＨＢＳＳ中０．０１ｍｇ／ｍｌ＝５８μＭ）、０．４ｍｌのプトレシン二塩酸塩（Ｐ５７８０−５Ｇ，ＨＢＳＳ中８０ｍｇ／ｍｌ＝５００ｍＭ）、０．２ｍｌのプロゲステロン（Ｐ８７８３−５Ｇ，無水エタノール中０．１２５ｍｇ／ｍｌ＝４００μＭ）、０．０２ｍｌのコルチコステロン（Ｃ２５０５−５００ＭＧ，無水エタノール中２ｍｇ／ｍｌ＝５．８ｍＭ）、０．１ｍｌのトリヨードチオニン・ナトリウム塩（Ｔ６３９７−１００ＭＧ，０．０１ＮのＮａＯＨ中０．２ｍｇ／ｍｌ＝３００μＭ）、０．４ｍｌのインスリン（Ｉ６６３４−２５０ＭＧ、ウシ膵臓、２４１Ｕ／ｍｇ、２０ｍＭのＨＣｌ中２５ｍｇ／ｍｌ＝４．４ｍＭ）で、１０．０２ｍｌの全体積（−２０℃で保存可能）。Ｎ３サプリメント原液は、次のものを組み合わせることによって作製した：１０ｍｌのＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（１００Ｘ，Ｇｉｂｃｏ）、１０ｍｌのグルタミン（２００ｍＭ，Ｇｉｂｃｏ）、１０ｍｌのＭＥＭビタミン（１００Ｘ，Ｇｉｂｃｏ）、１０ｍｌのＮ３濃縮物（１００Ｘ，上記を参照）で、４０ｍｌの全体積。混合物を、０．２２μｍのフィルターを使用して濾過殺菌し、１−２ｍｌのアリコートを−２０℃で保存した。
【０１５５】
ニューロンを３７℃で３０分間、０．０５％のトリプシン−ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）を使用してトリプシン処理をし、遠沈し、カウントした。二十万の細胞を、ＤＬＫ ｓｉＲＮＡ（ｐｒｏｇｒａｍ ＤＣ１００）の４００ｎｇのコントロールと共にＡｍａｘａ９６ウェルのニュークレオフェクター（ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ）を使用して電気穿孔し、ついで８チャンバースライド（ＢＤバイオコートＰＤＬ／ラミニン被覆ガラス,Becton Dickinson）の二つのウェル上に等しく分割させた。ニューロンを室温で５−１０分間、スライドに付着させた後、３７℃で３日間、インキュベートした。ついで、抗ＮＧＦ抗体を、２５μｇ／ｍｌの濃度でスライドの右半分（４ウェル）に加えた。３７℃で２０時間のインキュベーション後、２５０μｌの固定液を直接２５０μｌの培養培地に加えることによって、スライドを、３０％スクロース／８％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定した。（３０％スクロース／８％ＰＦＡ溶液を作製するために、次の成分を攪拌棒を含む６００ｍｌビーカーに加えた：２５０ｍｌの１６％ＰＦＡ（カタログ番号１５７１０−Ｓ， Electron Microscopy Sciences）、５０ｍｌの１０×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、及び１５０ｇのスクロース。溶液は溶解するまで低熱下で混合した。ついで、６−８滴の１ＭのＮａＯＨを加えてｐＨを７．４にした。ついで、メスシリンダー中で水を用いて体積を５００ｍｌにした。溶液を十分に混合し、アリコートに配し、凍結させた）。
【０１５６】
スライドを３０分固定し、ついでＰＢＳで３回洗浄した。全ての細胞を、４℃で一晩ニューロン特異的βチューブリン抗体（２％ＢＳＡ中Ｔｕｊ１（１：１０００）、０．１％トリトン）で標識した。一次抗体を除去し、スライドをＰＢＳで３回洗浄した。スライドを１時間の間、ヤギＡｌｅｘａ４８８抗ウサギ二次抗体（１：５００）と共にインキュベートした後、ＰＢＳで３回洗浄し、ついで、１３０μｌの封入剤（Fluoromount G; Electron Microscopy Sciences）及び２４×６０ｍｍの第１番カバースガラス（ＶＷＲ）を用いてカバーガラスをした。
【０１５７】
ＤＬＫのための定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）
Ｅ１３．５ＤＲＧを解体し、コントロールｓｉＲＮＡ又はＤＬＫに対して産生されたｓｉＲＮＡを用いて電気穿孔し、５日間、上述のようにして培養した。ついで、ニューロンからのＲＮＡを、製造者のプロトコルに従って、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙミニキットによってＰｕｒｉｆｙ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡを使用して単離した。コントロール及びＤＬＫ ｓｉＲＮＡで処理した細胞からの１０ｎｇの全ＲＮＡをＤＬＫ及びＧＡＰＤＨ（コントロール）に特異的なＤＮＡプライマー（ＣＡＴＣＡＴＣＴＧＧＧＴＧＴＧＧＧＡＡＧ（順方向プライマー）及びＡＧＴＴＧＣＡＧＣＡＴＧＡＧＧＧＣＡＴＴＣ（逆方向プライマー）；配列番号：１６及び１７）を使用する定量的ＰＣＲ実験（Qiagen Quantifect SYBR Green RT-PCR）において３通り実施した。増幅曲線を分析し、各試料の相対的ＲＮＡ濃度をコントロールに対して計算した。
【０１５８】
結果
これらの実験の結果を図３８に示す。野生型ＤＬＫをコードするプラスミドでの２９３細胞の一過性形質移入は、ＪＮＫのリン酸化と活性化を生じ、ＤＬＫがシグナル伝達カスケードにおけるＪＮＫの上流のキナーゼであることを示している。キナーゼデッドＤＬＫをコードするプラスミドの同時形質移入は、ＪＮＫリン酸化のレベルを低減させた。ｓｉＲＮＡを介してのＤＬＫ発現のノックダウンは、下流のキナーゼＪＮＫの阻害がするように、ニューロンの分解からの保護を生じせしめた。ＤＬＫ（Dharmicon）に対して産生されたｓｉＲＮＡを形質移入した培養ニューロンを使用する実験において、コントロールｓｉＲＮＡ（アクチン染色によって可視化）を形質移入したニューロンは、ＴｕＪＩ染色によって可視化されたＮＧＦ離脱時に有意な分解を受けた（図３８及び３９）。これに対して、ＤＬＫに対して標的化されたｓｉＲＮＡを形質移入したニューロンでは、ＮＧＦ離脱時に軸索一体性が維持された。これらの実験におけるＤＬＫ発現のノックダウンは、ＤＬＫに特異的なプライマーを用いた定量的ＰＣＲを使用して確認した。
【０１５９】
Ｂ．ＤＬＫノックダウンは毒素誘発性ニューロン細胞死に対して保護する
ＤＬＫ阻害の上で観察された保護作用が、毒素暴露のような他の侵襲によって引き起こされる軸索変性／ニューロンアポトーシスに対してより一般的に保護性であるかどうかを評価するために実験を実施した。単離されたニューロンを、ＤＬＫに特異的なｓｉＲＮＡの存在下又は不存在下で有糸分裂阻害剤ビンクリスチンに暴露させた。
【０１６０】
皮質ニューロンを、次の手順を使用して単離した。髄膜が欠けたラットＥ１８皮質を氷冷ニューロベーザル(neurobasal)培地(Invitrogen)中に切開した。皮質を、３７℃で３０分、０．１％トリプシン／ＰＢＳ（Worthington）の最終濃度において解離させた。０．１％の最終濃度のＤＮａｓｅ（Roche）をチューブに加え、組織を室温で１分間、インキュベートした。組織を温かいニューロベーザル培地で一回洗浄し、チューブ内で安定にさせた後、２％のＢ２７サプリメント（Invitrogen）を含む１ｍＬのニューロベーザルを加えた。組織をＰ１０００ピペット（Rainin）を用いて倍散によって解離させた。細胞をカウントし、幾つかの実験では、Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ９６ウェルニュークレオフェクター（Amaxa）を使用してｓｉＲＮＡを形質移入した。
【０１６１】
ｓｉＲＮＡ実験のために、細胞を６又は８ウェルチャンバー又は９６ウェルポリ−Ｄ−リジン被覆皿（BD Biosciences）にそれぞれ２×１０６細胞／ウェル、１．２５−２×１０５細胞／ウェル、又は１×１０４細胞／ウェルの播種細胞密度（電気穿孔法に通常伴う幾らかの細胞死を許容する密度）で播種した。ニューロンを２０μｌのニュークレオフェクション溶液（Amaxa）及び６００ｎｇのｓｉＲＮＡ（Qiagen又はDharmacon）と混合した。遺伝子サイレンシングを播種後３−４日で定量逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）によってアッセイした。簡潔に述べると、ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙミニキット（Qiagen）を使用して形質移入ニューロンから単離した。１０ｎｇのＲＮＡを含む各反応を、ＤＬＫ−、ＪＮＫ１−、ＪＮＫ２−、又はＪＮＫ３−特異的プライマーと共にＱｕａｎｔｉｆｅｃｔ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＲＴ−ＰＣＲキット（Qiagen）を使用して３通り実施した。ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨのためのプライマーをコントロールとして使用した。（すべてのプライマーはＱｉａｇｅｎから購入した。）増幅曲線を、ΔＣＴを使用して各試料中の相対的ＲＮＡ濃度に対して分析した。
【０１６２】
３−４日間、播種した皮質ニューロンを３００ｎＭのビンクリスチン依存性（微小管不安定化剤）で６−７２時間処理した。ＮＧＦ離脱誘発アポトーシス及び変性を、最終処理後４−３６時間の間にアッセイした。アポトーシス及び変性を、ＭＴＴアッセイと乳酸デヒドロゲナーゼアッセイの双方を使用してアッセイした。ＭＴＴ（３−(４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド）アッセイは、ミトコンドリア機能に基づき細胞生存率を測定する。ＭＴＴを、全体で培養体積の１０分の１、各ウェルに添加し、３７℃で５％のＣＯ２と共に９０−１２０分間、インキュベートした。ＭＴＴ含有培養培地を吸引し、細胞を、等体積の可溶化溶液（１０％のトリトンＸ−１００，１滴のＨＣｌ，５０ｍＬのイソプロパノール）中に再懸濁させた。分光光度計を使用して、吸光度（５７０及び６９０ｎｍ）を読み取った。アッセイ中における細胞死の量を評価するために、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）レベルを、ＣｙｔｏＴｏｘ非放射性ＬＤＨアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してアッセイした。異なった処理条件からの５０ｍＬの培地を製造者の指示に従って使用した。ＭＴＴ及びＬＤＨアッセイの双方に対して、細胞生存／細胞死をポジティブコントロールに対して正規化した。
【０１６３】
結果を表９に示す。上述のＤＬＫノックダウン、ＮＧＦ離脱実験において過去に観察されているように、ＤＬＫ発現のノックダウンは、二つの異なったアッセイ系においてビンクリスチン誘発ニューロン死に対してまた保護性であった。この知見は、ＤＬＫノックダウンが、多くの異なったニューロンタイプにおけるストレス誘発ニューロン細胞死に対して一般に保護性でありうることを示している。
【表９】
0005851838.tif 000018
【０１６４】
Ｃ．交感ニューロンにおけるＤＬＫ調節の効果
前記分析は、ＤＬＫ阻害が皮質ニューロン及び後根神経節ニューロンにおける毒素誘発性又は増殖因子飢餓誘発性軸索変性／アポトーシスに対して保護性であることを証明している。更なる実験を、これらの誘発によって通常誘発される交感ニューロンを保護するＤＬＫ阻害の能力を評価するために実施した。
【０１６５】
交感頸神経節を出生後１日の スプラーグドーリーラット（Charles River Labs）から解体し、５％のウシ胎仔血清（Invitrogen）と共にＵｌｔｒａｃｕｌｔｕｒｅ培地（Lonza）を含む皿に集めた。神経節を無血清Ｕｌｔｒａｃｕｌｔｕｒｅ培地で２回洗浄し、０．１％の最終濃度のトリプシン（Worthington）を加え、３７℃で３０分間組織と共にインキュベートした。ＰＢＳ中１パーセントのＤＮａｓｅ（Roche）溶液を神経節に加え、室温で１−２分間インキュベートした。神経節をＵｌｔｒａｃｕｌｔｕｒｅで洗浄し、チューブの底に沈殿させた。全ての洗浄培地を取り除き、Ｕｌｔｒａｃｕｌｔｕｒｅ、５％のラット血清、１%のペニシリン-ストレプトマイシン、１％のグルタマックス、７μＭのシトシンアラビノシド（Sigma）、及び５０ｎｇ／ｍＬの神経成長因子（2.5S, Cedarlane Laboratory）を含む１ｍＬのプレーティング培地をチューブに加えた。神経節をピペット(Rainin)を使用して倍散によって解離させた。細胞スラリーを０．４５ｍｍの細胞ストレイナー（Falcon）で濾過し、細胞数をカウントした。交感ニューロンを５０００−７５００細胞／ウェル（９６ウェル皿）、２０００００細胞／ウェル（６ウェルプレート）、又は１０００００細胞／ウェル（８ウェルチャンバースライド）の密度で播種し、５％のＯ２中３７℃で４−５日間増殖させた。一日おきにニューロンに、５−１０ｎｇ／ｍＬのＮＧＦを含む新鮮なプレーティング培地を供給した。
【０１６６】
ＮＧＦ離脱アッセイを、実施例１４Ａに記載のようにして実施した。ビンクリスチン処理、ＭＴＴアッセイ、及びＬＤＨアッセイを、実施例１４Ｂに記載されているようにして実施した。
【０１６７】
レンチウイルス実験を、２つのレンチウイルスベクター：ＧＣＭＶ−ＭＣＳ−ＩＲＥＳ−ｅＧＦＰ及びＧＣＭＶ−ＭＣＳ−ＩＲＥＳ−ｄｓＲｅｄを使用して実施した。双方のベクターは、構造的ウイルス遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｒｅｖ、ｔａｔ、ｖｐｒ、ｖｉｆ、ｖｐｕ、及びｎｅｆを欠くＨＩＶ１株である。加えて、組込み後に５’ＬＴＲ／プロモーターを自己不活性化にするプロモーター／エンハンサー配列の部分的な欠失が３’ＬＴＲ内にある。双方のベクターにトランス状態で提供される遺伝子は構造的ウイルスタンパク質Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｒｅｖ、及びＴａｔ（プラスミドＤｅｌｔａ８．９を回する）及びエンベロープタンパク質ＶＳＶ−Ｇである。これらのプラスミドは同時形質移入によってＨＥＫ２９３−Ｔ細胞中に導入され、ウイルス粒子を産生するのに必要とされる異なったウイルスタンパク質を一過性に発現する。野生型又は病原性レンチウイルスを産生する潜在性は、それが３つのプラスミドの間で複数の組換え事象を必要とするので、極めて低い。また、病原性因子（ｖｐｒ、ｖｉｆ、ｖｐｕ、及びｎｅｆ）は双方のベクターから完全に欠失されている。
【０１６８】
５μｇ／ｍＬのポリブレンを含む細胞培養培地中にウイルスを添加することによって播種のときに直ぐ又は播種後３−５日にニューロンを感染させた。次の日に、ウイルス含有培地を取り除き、新鮮培地と交感する。細胞に実験前の４８時間の間、ウイルスを発現させた。
【０１６９】
皮質ニューロン及びＤＲＧに対するＤＬＫノックダウンの保護作用と同様に、ＤＬＫのノックダウンは交感ニューロンをＮＧＦ離脱誘発アポトーシス（図４０Ａ−４０Ｂ及び表１０）及び毒素誘発アポトーシス（図４１及び表１１）から交感ニューロンを保護した。
【表１０】
0005851838.tif 000019
【表１１】
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【０１７０】
顕著なことには、過剰のキナーゼデッドＤＬＫの導入は、交感ニューロンにおけるＮＧＦ離脱誘発アポトーシスに対して同様に保護性であった（図４２及び表１２）。
【表１２】
0005851838.tif 000021
【０１７１】
この知見は、２９３細胞中に導入されたキナーゼデッドＤＬＫがその細胞中のＪＮＫリン酸化を阻害した点で実施例１５の知見と一致していた。一つの非限定的な可能性は、キナーゼデッドＤＬＫが正常なＤＬＫ二量体化及び自己リン酸化を防止しうることである。この知見は、ＤＬＫ発現の減少を通じてか又はキナーゼ活性を欠くＤＬＫ変異体の導入を通じてかの何れかでのＤＬＫのＪＮＫリン酸化能の阻害が、毒素暴露又は増殖因子離脱に応答する軸索変性及びアポトーシスに対して多くのタイプのニューロンを保護することを示唆している。
【０１７２】
実施例１５
ＤＬＫのＲＮＡサイレンシング及びキナーゼデッドＤＬＫの導入が、培養ニューロンのＮＧＦ離脱トリガー又は毒素誘発性変性にライしてそれぞれ保護性であったことを決定したので、ニューロン変性経路におけるＤＬＫの役割を同定するために更なる実験を実施した。ＤＬＫは、複数系列キナーゼ（ＭＬＫ）ファミリーにおけるＭＡＰキナーゼキナーゼキナーゼである。ＭＬＫファミリーの他のメンバーと異なり、ＤＬＫの発現は神経系に限られている（Gallo等, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3(9):663-672, 2002；Bisson等, Cell Cycle 7(7):909-916, 2008；Holzman等, J. Bio. Chem. 269(49):30808-30817, 1994）。ＤＬＫは、ある条件下でアポトーシス／炎症を生じるＪＮＫ１−３  及びｃＪｕｎを活性化するシグナル伝達経路のメンバーである。増加したJNK/cJun活性は、患者試料の検査又は疾患の動物モデルでの実験を通して、パーキンソン病、緑内障、アルツハイマー病、ＡＬＳ、卒中、及びハンチントン病を含む様々な神経性疾患に関連している（Oo等, J. Neurochem. 72(2):557-564, 1999；Ries等, J. Neurochem. 107(6):1578-1588, 2008；Vlug等, Eur. J. Neurosci. 22(8):1881-1894, 2005；Morfini等, Nat. Neurosci. 12(7):864-781, 2009；Perrin等, Exp. Neurol. 215(1):191-200, 2009；Levkovitch-Verbin等, Eye Res. 80(5):663-670, 2005；Tezel等, Brain Res. 996(2):202-212, 2004；Kuan等, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100(25):15184-15189, 2003；Yang等, Nature 389(6653):865-870, 1997；Hunot等, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101(2):665-670, 2004；Thakur等, J. Neurosci. Res. 85(8):1668-1673, 2007）。神経疾患とのＤＬＫの潜在的な相関と一又は複数のＪＮＫ／ｃＪｕｎ活性化経路の関与を調査した。
【０１７３】
Ａ．リン酸化ＤＬＫに特異的な抗体
ＤＬＫはＭＡＰキナーゼであり、他のＭＡＰキナーゼのように、それはその活性化状態では活性化ループ内でリン酸化されている。活性化ＤＬＫと休止（非活性化）ＤＬＫを直ぐに区別することができるために、ＤＬＫのリン酸化型（「ｐ−ＤＬＫ」）に特異的である抗体を産生させた。これをなすために、活性部位の特定の残基を、リン酸化され得ないアラニンに変異させた。ついで、これらのコンストラクトを、実施例１４のパートＡ（上記）に記載のものと同じプロトコルを使用して２９３細胞中に形質移入し、下流キナーゼＪＮＫをリン酸化するその能力について試験した（図４３Ｃ）。この分析は、スレオニン２７８（Ｔ２７８）及びセリン２８１（Ｓ２８１）が活性のために必要とされたことを確認した。ウサギにおいて標準的なインビボ免疫化技術を使用してこれらの残基を含むＤＬＫタンパク質の活性化ループ中のペプチドに対して抗体を産生した。免疫化に使用されたペプチド配列は、抗体３１７及び３１８ではＣＫＥＬＳＤＫＳｐＴＫＭｐＳＦＡＧ（配列番号：１３）、抗体３１９及び３２０に対してはＫＭｐＳＦＡＧＴＶＡＷＭＡＫＫＣ（配列番号：１４）、抗体３２１及び３２２に対してはＣＧＴＳＫＥＬＳＤＫＳｐＴＫＭ（配列番号：１５）であった。手順は、選択性を生じさせるためにリン酸化及び未リン酸化ペプチドのカラムでの精製を含む「ｐ−部位」プロトコルを使用してＹｅｎｚｙｍで実施した。６匹の免疫化ウサギからポリクローナル抗体を単離し、ＤＬＫ及びｐ−ＤＬＫへの結合についてスクリーニングした。
【０１７４】
得られたポリクローナル抗体の６つにウェスタンブロット及び免疫組織化学分析を施してｐ−ＤＬＫを検出するその能力を決定し、それを非リン酸化ＤＬＫ又は他のリン酸化キナーゼ及びリン酸化ＭＬＫ３と区別した。培養細胞に対して、培地を除去し、細胞を氷冷ＰＢＳで一回洗浄した。.細胞を冷ＰＢＳに掻き取り、氷上のエッペンドルフ管に移した。細胞を素早くペレット状にし、過剰なバッファーを除去した。ペレットはドライアイスで即座に凍結させて−８０℃で保存するか、又はホスファターゼ（Sigma P5726及びP2850）及びプロテアーゼ阻害剤（Roche 11836153001）を含む新鮮な溶解バッファー（２０ｍＭのトリス、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のトリトンＸ−１００）に直ぐに溶解させた。細胞を４℃で３０分、回転板で溶解した。タンパク質濃度はＢＣＡアッセイ（Pierce）を使用して決定した。
【０１７５】
タンパク質可溶化液を試料バッファー（Invitrogen）と混合し、５分間沸騰させた後、変性４−１２％勾配ゲル（Invitrogen）に充填した。 試料をニトロセルロース（Invitrogen）に移し、５％ミルク／ＴＢＳＴブロッキング溶液（トリス緩衝生理食塩水＋０．０５％のトリトンＸ−１００）で１時間ブロックした。ブロットを、振とうプラットフォームで４℃で一晩、５％ＢＳＡを含むＴＢＳＴ中、１：１０００の希釈でホスホ−ＤＬＫ抗体と共にインキュベートした。ブロットをＴＢＳＴで５分間、３回洗浄し、ウサギ二次西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗体（Jackson Labs, １：５０００）と共に室温で１−２時間、インキュベートした。膜をＴＢＳＴで３回洗浄し、Ｗｅｓｔｄｕｒａ化学発光基質（Pierce）で発色させた。
【０１７６】
２９３Ｔ細胞を、免疫染色のための１２ウェル培養皿に含まれるカバーガラス上に播種した。ついで、細胞に、過去に記載されたようにしてｍＤＬＫかｍＭＬＫ３の何れかを形質移入し、ついで、形質移入後２４時間、４％ＰＦＡ、３０％スクロースで固定した。細胞をブロックし、５％ＢＳＡ、０．３％トリトンＸ−１００で１時間、透過処理し、ついで、１％ＢＳＡ中１：５００濃度で一次抗体と共に一晩インキュベートした。ついで、細胞をＰＢＳで穏やかに３回すすぎ、Ａｌｅｘａ４８８抗ウサギ二次抗体と１時間結合させた。この工程に３回のＰＢＳ洗浄と、核を染色するためのＤＡＰＩ（１：５０００）を含む最終洗浄が続く。ついで、カバーガラスを培養物から注意して取り上げ、細胞を含む表面をスライドの方に向けてスライド上に取り付け、スライドを、蛍光顕微鏡を使用して可視化した。
【０１７７】
抗体３１８、３１９、３２０、３２１、及び３２２はそれぞれｐ−ＤＬＫ及びｐ−ＤＬＫ／ＤＮ−ＤＬＫを検出し、リン酸化ＭＬＫ３に対して結合がない（抗体３１８及び３１９）か又は非常に限られている（抗体３２０、３２１、及び３２２）（図４３Ａ）。これに対して、抗体３１７は３種全てのタンパク質を認識した。抗体３１８及び３１９が、ｐ−ＤＬＫに対して最も強い結合性を示し、最小のｐ−ＭＬＫ３結合でカップルし、よって、更なる分析に使用した。
【０１７８】
抗体はまた免疫組織化学によって測定して、細胞の文脈においてｐ−ＤＬＫに特異的に結合できる。双方の抗体３１８及び３１９がＤＬＫ形質移入２９３Ｔ細胞を染色し、ＭＬＫ３形質移入２９３Ｔ細胞では有意に減少した結合が観察された（図４３Ｂ）。この結合は、キナーゼ活性の略完全な欠如を生じる変異を有するＤＬＫ変異体を形質移入した２９３細胞において有意に減少している（図４３Ｃ）。ＤＬＫは、他の混合系統キナーゼのように、異種系において形質移入される場合、二量体化し自己リン酸化すると考えられるので、これらのデータはＤＬＫのリン酸化形態を確かに認識していることを更に確証する。
【０１７９】
Ｂ．皮質ニューロンのビンクリスチン誘発性変性中におけるＤＬＫの活性化
上述のようにして産生された抗体をついで試験して、ＤＬＫのリン酸化及び活性が、ビンクリスチンでストレスを受けた皮質ニューロンにおいて増加したかどうかを評価した。これは、ＤＬＫ活性のノックダウンが生存を促進したので、予想されていた。上述のようにして増殖され、ビンクリスチンで１時間処理された場合、リン酸化ＤＬＫのレベルは、抗体３１８、３１９、及び３２０を使用してウェスタンブロット（上述のものと同じプロトコル）によって分析したときコントロール培養物と比較して上昇していた（図４３Ｄ）。これは、リン酸化ＤＬＫのレベルは活性と相関し、ニューロンストレスの条件下で増加することの更なる確証を提供した。
【０１８０】
Ｃ．神経疾患モデルにおけるＤＬＫの発現及び活性
免疫組織化学アッセイを次のようにして実施した。ＳＯＤ１トランスジェニック動物を４％のパラホルムアルデヒドを用いて灌流し、脊髄を脊柱から注意して除去し、４℃で一晩、後固定した。ついで、脊髄を３０％スクロース／ＰＢＳ中で平衡にした後、凍結切片化のためにＯＣＴに包埋した。冠状切片（２０μｍ厚）を切り取り、冷スライドに取り付け、−８０℃に維持した。切片をＰＢＳ中で水和させ、Ｈ２Ｏ２（ＰＢＳ中０．３％）を用いて１０分間内因性ペルオキシダーゼ活性についてブロックし、ついで、ＰＢＳＴ（０．１％のトリトンＸ−１００）で２回すすいだ。切片をＰＢＳ中の５％のＢＳＡ、０．３％のトリトンＸ−１００で１時間ブロックし、ついで、ＰＢＳ中１％のＢＳＡ、０．３％のトリトンＸ−１００のｐ−ＤＬＫ中の一次抗体と共に４℃でインキュベートした。スライドをＰＢＳＴ中で３回洗浄し、ついで、１％のＢＳＡ、０．３％のトリトンＸ−１００を含むＰＢＳ中のビオチン化二次抗体（１：３００）で１時間、標識した。スライドをＰＢＳＴですすいだ後、アビジンＤＨ含有ＡＢＳ試薬(Vector labs)と共に３０分インキュベートし、最後に１０−１５分間、暗所でペルオキシダーゼ基質（３０％のＨ２Ｏ２を使用の直前に添加した１０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．６中に０．０５％のジアミノベンジジン）においてインキュベートした。反応を、水ですすぐことによって停止させ、切片をガラススライドに取り付け、ガラスカバーをした。アルツハイマーの患者の組織はＵＳ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌから購入した。アルツハイマーの患者の海馬からの組織可溶化液及び及び年齢が一致したコントロールをこの分析に使用した。分析は、上述のものと同じプロトコルを使用してウェスタンブロットによって実施した。
【０１８１】
図４４Ａの結果は、リン酸化ＤＬＫ（ｐ−ＤＬＫ）のレベルが疾患の後期課程において野生型マウスに対してＡＬＳのＳＯＤ１マウスにおいて高度に上昇したことを証明している。ｐ−ＤＬＫの証拠は、これらの動物におけるＡＬＳ様症状の発症の前である１４週と早い組織試料において明らかであった（図４４Ｂ）。
【０１８２】
同様の結果がヒトアルツハイマー患者の試料においても観察された。アルツハイマー病患者の皮質試料におけるｐ−ＤＬＫのレベルはコントロール試料に対して増加した（図４４Ｃ）。リン酸化ＪＮＫのレベル及びリン酸化ｃＪｕｎ６３レベルはまたコントロール試料に対してアルツハイマー病患者において増加した（図４４Ｃ）。よって、ＤＬＫは、症状の発症前と疾患の終期の双方でＡＬＳの認められたマウスモデルで、またヒトアルツハイマー患者からの皮質試料において活性化されている。
【０１８３】
Ｄ．観察されたＤＬＫ阻害作用に寄与するシグナル伝達
１．ＤＬＫサイレンシングの分子効果
実施例１４において上で証明したように、ＤＬＫサイレンシングは、毒素暴露又は増殖因子離脱に応答してニューロンを分解から保護し、ＤＬＫキナーゼ活性はＪＮＫリン酸化に直接的又は間接的に関与している。ＮＧＦ離脱ストレス及び毒素依存性ストレス条件下でのＪＮＫ及びｃＪｕｎの発現及び活性を評価するために実験を実施した。ＤＬＫの発現を減少（ｓｉＲＮＡ）させるために、また免疫ブロットのために使用される実験プロトコールは、上述のものと同じであった。
【０１８４】
ＤＬＫのサイレンシングは、ＤＲＧ又は皮質ニューロンにおけるベースラインＪＮＫタンパク質レベル又はＪＮＫ活性を変化させなかった（図４５）。しかしながら、ＤＬＫノックダウンは、皮質ニューロン、ＤＲＧ、及び交感神経節ニューロンにおけるＮＧＦ離脱かビンクリスチン依存性ストレスの何れかの後にｐ−ｃＪｕｎレベルを減少させた（図４５）。ＤＬＫノックダウンは、また、皮質ニューロン及びＤＲＧにおけるＮＧＦ離脱かビンクリスチン依存性ストレスの何れかの後にｐ−ＪＮＫレベルを減少させた（図４５）。ｐ−ＪＮＫ抗体はＪＮＫ１、ＪＮＫ２、及びＪＮＫ３の各々のリン酸化型を認識することに留意されなければならない。ＪＮＫ１リン酸化は、ストレス誘発又はｃＪｕｎのリン酸化とは相関しない。ＤＬＫノックダウンは、ＪＮＫ２及びＪＮＫ３のストレス誘発リン酸化を停止させる。これらのデータにおけるコントロール試料において観察されたバックグラウンドシグナルは、ベースラインリン酸化ＪＮＫ１による可能性がある。該結果は、ＤＬＫサイレンシング又は他の阻害がＪＮＫ又はｃＪｕｎの分解を生じせしめないが、その分子のストレス誘発リン酸化の度合いは少ない（よって活性化は欠如している）ことを示している。
【０１８５】
ＤＬＫ阻害が、ＪＮＫ２及びＪＮＫ３のリン酸化の制限を通じて変性からニューロンを保護するならば、ＪＮＫ２又はＪＮＫ３のインヒビターがまた細胞死及び軸索変性からニューロンを保護すべきである。ＮＧＦ離脱依存性変性に対してニューロンを保護する直接のＪＮＫ阻害の能力をまた評価した。ＤＲＧ外植片を、上述のＮＧＦ離脱アッセイでの評価の前に、抗ＮＧＦ及びパン−ＪＮＫインヒビターＪＮＫＶ又はＪＮＫＶＩＩＩの何れかで処理した。双方のインヒビターは、ＮＧＦ依存性変性からＤＲＧ外植片を保護することができた（図４６）：ＪＮＫＶ（Calbiochem）が５μＭの濃度で最も保護性であり、ＪＮＫＶＩＩＩ（Calbiochem）が４μＭの濃度でしかりであった。
【０１８６】
どのＪＮＫ（一又は複数）が観察された保護作用に関与していたかを特定するために、上述のものと同じ方法を使用して更なるノックダウン実験を実施した。ＪＮＫ１だけに特異的なサイレンシングＲＮＡはパン−ＪＮＫインヒビターで観察された作用を複製することはできなかった（図４７）。ＪＮＫ２又はＪＮＫ３単独のための阻害ＲＮＡｓ（ｓｉＲＮＡｓ）は、ＮＧＦ離脱時に軸索変性からＤＲＧを保護することができなかった（図４７）。最も効果的な保護は、ＪＮＫ２及びＪＮＫ３の双方のサイレンシングの存在下で観察されたが、この保護でさえ、ｓｉＤＬＫ単独とは同じ度合いではなかった（図４７）。
【０１８７】
ＪＮＫ１は、軸索維持及びシナプス成熟の原因であることが知られている構成的に活性な分子である一方、ＪＮＫ２及びＪＮＫ３は、ストレス誘発性であり、ｃＪｕｎ活性化及びアポトーシス／軸索変性に関与していることが知られている（Coffey等, J. Neurosci. 22(11):4335-4345, 2002；Coffey等, J. Neurosci. 20(20):7602-7613, 2000）。ＤＬＫ阻害がＪＮＫ１／２／３阻害よりも大きな神経保護作用を生じるという事実は、ＤＬＫが、ＪＮＫ／ｃＪＵＮ経路におけるその役割に加えて、ニューロン増殖及び／又は生存の一又は複数の機序に対して阻害性であることを強く示唆している。
【０１８８】
Ｅ．ＤＬＫの栄養作用
過去の研究では、ＤＬＫのドミナントネガティブキナーゼデッド変異型（Ｋ１５２Ａ）が黒質緻密部のドーパミン作動性ニューロンにおいて栄養作用を生じせしめる一方、ロイシンジッパードメインのみを含むＤＬＫのドミナントネガティブ型はそのような作用を生じせしめないことが示唆されている（Chen等, J. Neurosci. 28(3):672-680, 2008）。しかしながら、特に、この研究における栄養は、感染ニューロンと非感染ニューロン間の何らかの機能的又は形態的差よりもむしろ特定のマーカーを発現するＤＬＫ（Ｋ１５２Ａ）感染ニューロンの増加数によって定義された。従って、ＤＬＫサイレンシングの影響が皮質ニューロン及びＤＲＧにおいて研究された。これらの研究に使用されたプロトコルは、上述のものと同じであった。
【０１８９】
ＤＬＫノックダウンは、皮質ニューロン及び交感ニューロンの双方において明白な栄養作用を有することが示された（観察された細胞数の増加）（図４８Ａ及び４８Ｂ）。すなわち、ＤＲＧ、皮質、及び交感ニューロンは、ＤＬＫに対して産生されたｓｉＲＮＡで処理されたときに培養において増加した増殖／生存を示した（観察された増殖の増加）（表１３）。
【表１３】
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【０１９０】
ニューロン増殖におけるＤＬＫの役割を更に調べるために、樹状突起に特異的に局在化される微小管結合タンパク質であるＭＡＰ２のレベルを測定した。培養ニューロン中のＭＡＰ２の発現は、ニューロン成熟及び発現を反映しており、増殖促進条件下でしばしば増加する。ニューロンにおけるＤＬＫのドミナントネガティブロイシンジッパー型かＤＬＫのドミナントネガティブキナーゼデッド型の何れかを使用してのＤＬＫ活性の阻害はＭＡＰ２タンパク質生産の誘導を生じた。ＭＡＰ２発現の誘導は、ニューロン増殖及び成熟が起こっていることを示し、更に、ＤＬＫノックダウンがニューロンに対する機能的栄養作用を確かに有していることを確証する。
【０１９１】
実施例１６
本明細書に記載するアッセイにより、ニューロンの変性を減少させるＧプロテイン及びＧプロテインカップリングレセプター(ＧＰＣＲ)のいくつかのインヒビターが同定された。Ｇプロテインの役割及び変性経路のＧＰＣＲを検査するために、ＤＲＧにおいて実験を行った。これらの実験に使用する実験上のプロトコールは、実施例１４に記述のものと同様である。百日咳毒素及びＳＣＨ２０２６７６はTocris Bioscienceから購入した。
データは、Ｇプロテインカップリングレセプターに結合するアゴニスト及びアンタゴニストを阻害するスルフヒドリル−反応化合物であるＳＣＨ２０２６７６が、ＤＲＧにおけるＮＧＦ離脱誘導性の変性を減少させることを示す(図４９及び５０)。また、Ｇプロテインシグナル伝達の他のインヒビターである百日咳毒素も、ＮＧＦ離脱後のニューロンにおける変性を減少させる(図５１)。これらのデータは、Ｇプロテイン及びＧプロテインカップリングレセプターがニューロン変性に役割があることを示す。
【０１９２】
実施例１７
本明細書に記載するアッセイにおいて同定され、変性経路において役割を有する他の細胞標的は、β-カテニンシグナル伝達経路及びその下流の標的のメンバー(例えば転写第４因子、ＴＣＦ４)である。ニューロン変性におけるβ-カテニン及びＴＣＦ４をの役割を確認するために、海馬ニューロンにおいて実験を行った。これらの実験に使用する実験上のプロトコールは、実施例１４に記載したものと同様である。
データは、β-カテニンの欠失を生じうる構造的に活性なＧＳＫ３の発現がニューロン生存度の低減を仲介することを示す(図５２；上右パネル)。また、ＴＣＦ４の優性ネガティブ型の発現は、ニューロン生存度の減少を仲介する(図５２、下右パネル)。これらのデータは、β-カテニンシグナル伝達経路がニューロン生存度の維持に重要であることを示す。β-カテニンシグナル伝達経路を標的とするインヒビターを用いて、ニューロン変性を促すことができる(例えば、β-カテニン発現のインヒビター及びＴＣＦ４活性のインヒビター)。逆に、活性化因子又はβ-カテニン及びＴＣＦ４シグナル伝達は、軸索変性及び神経細胞死を妨げうる。
【０１９３】
本明細書中に引用するすべての出版物及び特許は、あたかも各々独立した出版物又は特許が特別にかつ個別に出典明記によって援用されているのと同程度に出典明記によって本明細書中に援用される。「ａ」及び「ｔｈｅ」といった本明細書中の単数形の使用は、明らかな記載がない限りその複数形の示唆を除外するものではない。本発明は理解を明確にするために図と実施例によりいくらか詳細に記載したが、添付の特許請求の範囲の精神及び範囲を逸脱しないで、特定の変形や修正がなされうることは、本発明の教示の範囲にある当業者に容易に理解されることであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【配列表】
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