(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１又は２に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、かつシトクロムＰ４５０活性を有するポリペプチドであって、該ポリペプチドが、単環式又は多環式のモノテルペン及びセスキテルペンから選択される少なくとも１つのテルペン化合物を酸化することができることを特徴とする、前記ポリペプチド。
【請求項２】
前記単環式又は多環式のモノテルペン又はセスキテルペンが、環状部分上で置換基として少なくとも１つのメチル基を含むことを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記単環式又は多環式のモノテルペン又はセスキテルペンが、ジザエン、アルファ−セドレン、アルファ−ロンギピネン、アルファ−フネブレン、ツジョセン、バレンセン、ベータ−カミグレン、アロアロマデンドレン、アルファ−ネオクロベン、イソサチベン、レデン、Ｓ−リモネン、アルファ−フムレン、アルファ−グルユネン、アルファ−ピネン、ベータ−フネブレン、Ｒ−リモネン及びベータ−ピネンからなる群から選択されることを特徴とする、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記単環式又は多環式のモノテルペン又はセスキテルペンが、ジザエン、アルファ−セドレン、アルファ−フネブレン、バレンセン及びツジョセンからなる群から選択されることを特徴とする、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項５】
請求項１から４までのいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする核酸。
【請求項６】
配列番号：３、４又はそれらの補体に対して少なくとも９０％同一のヌクレオチド配列を含む、請求項５に記載の核酸。
【請求項７】
請求項５又は６に記載の核酸を含む発現ベクターであって、該ベクターが、ウィルスベクター、バクテリオファージ、又はプラスミドの形である、前記発現ベクター。
【請求項８】
請求項１から６までのいずれか１項に記載の少なくとも１つの核酸を有するために形質転換された、ヒトでない宿主生物又は宿主細胞。
【請求項９】
前記ヒトでない宿主生物が、植物、原核生物又は真菌である、請求項８に記載のヒトでない宿主生物。
【請求項１０】
前記ヒトでない宿主生物が、微生物である、請求項９に記載のヒトでない宿主生物。
【請求項１１】
前記微生物が、細菌又は酵母である、請求項１０に記載のヒトでない宿主生物。
【請求項１２】
前記細菌がＥ．ｃｏｌｉであり、かつ前記酵母がサッカロミセス・セレビジエである、請求項１１に記載のヒトでない宿主生物。
【請求項１３】
植物細胞である、請求項８に記載のヒトでない宿主細胞。
【請求項１４】
少なくとも１つのテルペン化合物を酸化するための方法において、
ａ）該テルペン化合物と請求項１から６までのいずれか１項に記載の少なくとも１つのポリペプチドとを接触すること、
ｂ）場合により、工程ａ）において製造された酸化させたテルペンを単離すること
を含む、前記方法。
【請求項１５】
前記テルペン化合物が、単環式又は多環式のモノテルペン及びセスキテルペンから選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記テルペン化合物が、ジザエン、アルファ−セドレン、アルファ−ロンギピネン、アルファ−フネブレン、ツジョセン、バレンセン、ベータ−カミグレン、アロアロマデンドレン、アルファ−ネオクロベン、イソサチベン、レデン、Ｓ−リモネン、アルファ−フムレン、アルファ−グルユネン、アルファ−ピネン、ベータ−フネブレン、Ｒ−リモネン及びベータ−ピネンからなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記テルペン化合物が、ジザエン、アルファ−セドレン、アルファ−フネブレン、バレンセン及びツジョセンからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、テルペン分子を酸化できるシトクロムＰ４５０の核酸配列及びアミノ酸配列を提供する。本発明のシトクロムＰ４５０と、酸化させることを意図したテルペン分子との接触を含むテルペン分子を酸化する方法も提供する。特に、前記方法は、種々の技術分野、例えば香料及びフレーバーにおいて使用されてよい酸化させたテルペン分子の製造をｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで実施してよい。本発明は、核酸を含む発現ベクターも提供する。ヒトでない宿主生物、又は核酸で形質転換させた細胞も本発明の目的である。
【０００２】
背景技術
テルペンは、ほとんどの生物（微生物、動物及び植物）において見出される。これらの化合物は、５個の炭素単位、いわゆるイソプレン単位から製造され、それらの構造に存在するこれらの単位の数によって分類される。従って、モノテルペン、セスキテルペン及びジテルペンは、それぞれ炭素原子１０個、１５個及び２０個を含むテルペンである。ジテルペンは、例えば、植物界に広く見出され、２５００種を超えるジテルペン構造が記載されている（Ｃｏｎｎｏｌｌｙ ａｎｄ Ｈｉｌｌ， Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ ｔｅｒｐｅｎｏｉｄｓ， １９９１， Ｃｈａｐｍａｎ ＆ Ｈａｌｌ， Ｌｏｎｄｏｎ）。テルペン分子及びそれらの酸化された誘導体は、それらのフレーバー特性及びフレグランス特性並びにそれらの化粧品効果、医薬品効果及び抗菌効果のため、長年の間関心がある。種々の方法、例えば蒸気蒸留又は溶媒抽出によって得られた植物抽出物は、テルペン分子の酸化させた誘導体の源として使用される。代わりに、植物抽出によって見出された又は生合成プロセスによって得られたテルペン分子は、化学的プロセス及び酵素的プロセスを使用して酸化される。
【０００３】
テルペンの酵素的酸化は、しばしば、疎水性基質、例えばテルペン分子の形質転換をより親水性の基質中で触媒化することができるシトクロムＰ４５０（Ｐ４５０）と言われる酵素を含む。シトクロムＰ４５０酵素は、細菌、古細菌及び真核生物中で見出されるヘムタンパク質のスーパーファミリーを形成する。最も一般の活性の１つに、シトクロムＰ４５０は、分子酸素の１つの酸素原子を基質分子に挿入することによってモノオキシゲナーゼとして作用し、一方で、他の酸素原子は水に還元される。
【０００４】
この触媒反応は、分子酸素の活性化のために２つの電子を要求する。真核生物からのＰ４５０は、外部還元剤及び電子源としてＮＡＤＰＨを使用する。２つの電子は、同時にシトクロムＰ４５０活性部位に転移され、この転移は、電子供与体タンパク質、シトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）を要求する。あるＣＰＲは、あるシトクロムＰ４５０に特異的でない。ＣＰＲは、得られた生物におけるいくつかのＰ４５０のための電子供与体タンパク質である。さらに、ある生物からのＣＰＲは、他の生物からのＰ４５０のための電子供与体タンパク質として作用できる。いくつかの場合に、Ｐ４５０は、電子供与体タンパク質として作用でき、又はＣＰＲからＰ４５０への電子輸送の効率を改良できるシトクロムｂ５に結合されてもよい。真核生物細胞において、及び特に植物において、Ｐ４５０及びＣＰＲは、一般に膜結合タンパク質であり、かつ小胞体に関連する。これらのタンパク質は、Ｎ末端膜貫通ヘリックスによって膜に固定される。
【０００５】
多くのＰ４５０は、低い基質特異性を有し、かつ従って、多くの多様な構造、例えば種々のテルペン分子の酸化を触媒化できる。これらの酵素のほとんどは、与えられた基質で特定の位置選択性及び立体選択性を有するが、しかししばしば特定の基質からいくつかの生成物の混合物を製造する。かかるＰ４５０は、通常、分子、例えば生体異物の分解及び解毒において含まれ、かつ一般に、細菌及び動物において見いだせる。一方で、生合成経路において含まれるＰ４５０は、通常、あるタイプの基質についての特異性、並びに位置選択性及び立体選択性を示す。これは、ほとんど植物Ｐ４５０についての場合である。
【０００６】
多数のＰ４５０が自然に、及び特に植物において見いだされる。ある植物ゲノムは、Ｐ４５０についてコードする数百の遺伝子を含みうる。多くの植物Ｐ４５０は、植物において存在する極めて多数のＰ４５０を考慮して特徴付けられるが、ほとんどそれらの機能が知られていないままである。
【０００７】
従って、新たな酵素反応を触媒化することができ、その結果、新たに酸素化化合物の酵素的製造する新たなＰ４５０について、又はより容易に入手できてよい種々の反応タイプを介した、例えば種々の基質から酸素化化合物を製造することについて調査することが所望される。
【０００８】
いくつかのＰ４５０は既に特徴付けられている。特に、本発明のシトクロムＰ４５０と一定のパーセンテージの配列同一性を有するシトクロムＰ４５０は、基質としてテルペン分子を使用することが報告されている。
【０００９】
本発明のＰ４５０に最も近いＰ４５０は、最も近い配列が、本明細書において記載されたアミノ酸配列と６７％の同一性を共にするモロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｏｃｏｌｏｒ）からのＰ４５０（受託番号ＥＥＲ９４１６４）である。
【００１０】
本発明のシトクロムＰ４５０によって製造された酸素化テルペンの中で、いくつかは香料及びフレーバーの分野で非常に有用である。特に、ジザエンのヒドロキシル化によって製造されるクシモル（ｋｈｕｓｉｍｏｌ）は、ベチバー油の鍵となる成分の１つであり、それ自体価値のある付香成分である。本発明のシトクロムＰ４５０を使用するジザエンの酸化は、困難であり高価なプロセスであるベチバーからクシモルを単離するための有利な変法を提供する。我々の知る限り、クシモルの製造のための酵素的プロセスは公知でない。現在まで酵素適合性が公知でない、いくつかの他の価値のある付香成分及びフレーバー成分は、以下に記載されるように、本発明のシトクロムＰ４５０を使用して製造されうる。
【００１１】
本発明のシトクロムＰ４５０によって製造された他の酸素化テルペンは、他の目的、例えば医薬生成物又は農薬生成物のために有用である。従って、本発明のシトクロムＰ４５０は、種々の分野の産業において有用な興味深い特性を有し、かつ野生型から単離することが困難またはさらに不可能であり、生物合成によって製造することが困難または不可能である多様な分子に対する新たな生合成経路を開く。
【００１２】
本発明の目的は、酸素化テルペン、特にクシモルを、経済的な方法で製造するための方法を提供することである。従って、本発明は、わずかな浪費、より良好なエネルギー効率及び資源効率のプロセス、並びに化石燃料に対する減少した依存性を有する、酸素化テルペンを製造するための目的物を有する。さらに、テルペン分子を酸化できる酵素を提供することが目的であり、かかる酸化生成物は、香料成分及び／又はアロマ成分として有用である。
【００１３】
0005993019.tif 000002
【００１４】
発明の詳細
本発明は、経済的な、信頼性のある、再現のある方法で、テルペンを酵素的に酸化するための方法を提供する。
【００１５】
本明細書において意図されているように、本明細書において挙げられた全ての化合物は、図１において示したそれらの式によって定義される。
【００１６】
“シトクロムＰ４５０”または“シトクロムＰ４５０活性を有するポリペプチド”は、テルペン分子の酸化を触媒化して、酸素化化合物、例えばアルコール、アルデヒド、ケトン又はカルボン酸を形成できるポリペプチドとして本発明の目的のために意図される。好ましい一実施態様に従って、シトクロムＰ４５０は、ただ１つの酸素原子をテルペン化合物に付加することによってモノオキシゲナーゼとして作用する。ポリペプチドの、特定のテルペンの酸化を触媒する能力は、実施例８において詳述されるように酵素アッセイを実行することによって単純に確認できる。
【００１７】
本発明に従って、“ポリペプチド”は、本発明の実施態様のいずれかにおいて定義されたようなそれらのシトクロムＰ４５０活性を維持し、かつ配列番号：１又は２の対応するフラグメントと定義されたパーセンテージの同一性を共有する、短縮されたポリペプチドを含むことも意味する。
【００１８】
２つのペプチド配列又はヌクレオチド配列の同一性のパーセンテージは、２つの配列のアライメントが生じる場合に２つの配列において同一であるアミノ酸残基又は核酸残基の数の関数である。同一残基は、アライメントの与えられた位置で２つの配列において同一である残基と定義される。配列同一性のパーセンテージは、本明細書において使用されるように、最も短い配列における残基の合計数によって分ける２つの配列間の同一の残基の数をとり、１００をかけることによって最適なアライメントから算出される。最適なアライメントは、同一性のパーセンテージが最も高い可能性があるアライメントである。ギャップは、１つ又は双方の配列中に、最適なアライメントを得るためにアライメントの１つ以上の位置で導入される。これらのギャップは、同一でない残基として、配列同一性のパーセンテージの計算のために考慮に入れられる。
【００１９】
アミノ酸又は核酸の配列同一性のパーセンテージを測定する目的のためのアライメントは、コンピュータプログラム及び例えばウェブ上で入手できる公的に入手可能なコンピュータプログラムを使用する種々の方法で得られてよい。有利には、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/bl2seq/wblast2.cgiで国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ））から入手できるデフォルトパラメータに対するＢＬＡＳＴプログラム（Ｔａｔｉａｎａ ｅｔ ａｌ， ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．， １９９９， １７４：２４７−２５０， １９９９）セットは、ペプチド配列又は核酸配列の最適なアライメントを得るため、及び配列同一性のパーセンテージを算出するために使用されてよい。
【００２０】
本発明の目的の１つは、配列番号：１又は２に対して少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を含み、かつシトクロムＰ４５０活性を有するポリペプチドである。
【００２１】
好ましい一実施態様において、シトクロムＰ４５０活性を有するポリペプチドは、単環式又は多環式のモノテルペン及びセスキテルペンから選択される少なくとも１つのテルペン化合物の酸化を触媒化することができるポリペプチドとして意図される。好ましい一実施態様において、該セスキテルペン又はモノテルペンは、環状部分上に置換基として少なくとも１つのメチル基を含む。より好ましい一実施態様に従って、本発明のシトクロムＰ４５０は、該メチル基を酸化して、第一級アルコールを提供する。
【００２２】
好ましい一実施態様に従って、テルペン化合物は、ジザエン、アルファ−セドレン（ｃｅｄｒｅｎｅ）、アルファ−ロンギピネン（ｌｏｎｇｉｐｉｎｅｎｅ）、アルファ−フネブレン（ｆｕｎｅｂｒｅｎｅ）、ツジョセン（ｔｈｕｊｏｐｓｅｎｅ）、バレンセン（ｖａｌｅｎｃｅｎｅ）、ベータ−カミグレン（ｃｈａｍｉｇｒｅｎｅ）、アロアルマデンドレン（ａｌｌｏａｒｏｍａｄｅｎｄｒｅｎｅ）、アルファ−ネオクロベン（ｎｅｏｃｌｏｖｅｎｅｎｅ）、イソサチベン（ｉｓｏｓａｔｉｖｅｎｅ）、レデン（ｌｅｄｅｎｅ）、ｓ−リモネン（ｌｉｍｏｎｅｎｅ）、アルファ−フムレン（ｈｕｍｕｌｅｎｅ）、アルファ−グルユネン（ｇｕｒｊｕｎｅｎｅ）、アルファ−ピネン（ｐｉｎｅｎｅ）、ベータ−フネブレン、Ｒ−リモネン及びベータ−ピネンからなる群から選択される。より好ましい前記テルペン化合物は、ジザエン、アルファ−セドレン、アルファ−フネブレン、バレンセン及びツジョセンから選択される。最も有利には、前記テルペン化合物はジザエンである。
【００２３】
好ましい一実施態様において、１つの酸素原子を、メチル基に付加して、第一級アルコール、アルデヒド及び／又はカルボン酸を提供する。最も好ましい一実施態様において、ジザエンは、クシモル、ジザナール（ｚｉｚａｎａｌ）及び／又はジザン酸（ｚｉｚａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）に酸化される。
【００２４】
アルデヒド及び／又はカルボン酸が形成される場合に、該アルデヒド及び／又はカルボン酸は、本発明のＰ４５０による、又は他のファミリーからの１つ以上の酵素、例えばアルコールデヒドロゲナーゼ、アルデヒドレダクターゼ、アルデヒドオキシダーゼによって、第一級アルコールのさらなる酸化によって形成される。後者の酵素は、例えば、本発明のポリペプチドを発現できる、あらゆる宿主生物又は宿主細胞に存在する。
【００２５】
好ましい一実施態様に従って、ポリペプチドは、配列番号：１又は２に対して、少なくとも７５％、有利には少なくとも８０％、有利には少なくとも８５％、有利には少なくとも８９％、有利には少なくとも９０％、より有利には少なくとも９５％、及びさらにより有利には少なくとも９８％の同一のアミノ酸配列を含む。より好ましい一実施態様に従って、ポリペプチドは、配列番号：１又は２を含む。さらにより有利には、ポリペプチドは、配列番号：１及び２からなる。
【００２６】
本発明の好ましい一実施態様において、配列は、膜アンカー配列も含む。配列番号：１又は２によって示される配列、又は要求された同一性のパーセンテージを有するそれらの誘導体は、Ｐ４５０活性を提供するポリペプチドの一部である。膜アンカー配列は、酵素の触媒活性中で含まれない。アンカー配列は、膜に結合できる。適したアンカー配列は、ペプチドが発現される生物に依存し、かつ一般のタイプの宿主生物について設計された配列は、当業者に公知である。あらゆる適したアンカー配列を、本発明のポリペプチドと組み合わせて使用してよい。従って、好ましい一実施態様に従って、ポリペプチドは、膜アンカー配列と組み合わせて、配列番号：１又は２を含む。
【００２７】
より有利には、本発明のポリペプチドは、場合により膜アンカー配列と組み合わせて、配列番号：１又は２からなる。
【００２８】
ポリペプチドとアンカー配列とを組み合わせない場合に、かかるポリペプチドは、細胞膜に結合しない。この場合、配列番号：１又は２のポリペプチドは、有利には、細胞質中でのその溶解性を改良するために改質されてよい。
【００２９】
他の好ましい実施態様に従って、ポリペプチドは、遺伝子工学によって得られた配列番号：１又は２の変異体であるアミノ酸配列を含む。他の場合、前記ポリペプチドは、配列番号：３、４又はそれらの補体を改質することによって得られるヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列を含む。より好ましい実施態様に従って、シトクロムＰ４５０活性を有するポリペプチドは、遺伝子工学によって得られた配列番号：１又は２の変異体であるアミノ酸配列、すなわち配列番号：３、４又はそれらの補体のいずれか１つを改質することによって得られるヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列からなる。
【００３０】
以下に記載されているように、本発明の核酸の自然の又は人工の突然変異によって得られた核酸によってコードされたポリペプチドも、本発明に含まれる。
【００３１】
アミノ末端及びカルボキシル末端で追加のペプチド配列の融合から得られるポリペプチド変異体も、本発明のポリペプチドに含まれる。特に、かかる融合は、ポリペプチドの発現を高めることができ、タンパク質の精製において有用であり、ポリペプチドを膜に固定できる方法を改良し、又は所望の環境又は発現システムでポリペプチドの酵素活性を改良する。かかる追加のペプチド配列は、例えばシグナルペプチドであってよい。従って、本発明は、本発明のポリペプチドの変異体、例えば他のオリゴペプチド又はポリペプチドとの融合によって得られたもの、及び／又はシグナルペプチドに連結させたものを含む。他の機能性タンパク質、例えばテルペン生合成経路、有利にはテルペン合成酵素からのタンパク質との融合から得られるポリペプチドも、本発明のポリペプチドに含まれる。ペプチド配列との融合から得られる変異体である本発明のポリペプチドの特に好ましい一例は、本発明のポリペプチド（シトクロムＰ４５０活性を有する）とＣＰＲとの双方を含む融合ポリペプチドである。
【００３２】
他の実施態様に従って、ポリペプチドは、ベチバー（Ｖｅｔｉｖｅｒｉａ ｚｉｚａｎｉｏｉｄｅｓ）（Ｌ．）Ｎａｓｈから単離される。
【００３３】
前記実施態様のいずれかに従ってポリペプチドをコードする核酸は、本発明の目的でもある。
【００３４】
好ましい一実施態様に従って、核酸は、配列番号：３、４又はそれらの補体に対して、少なくとも７０％、有利には少なくとも７５％、有利には少なくとも８０％、有利には少なくとも８５％、有利には少なくとも９０％、有利には少なくとも９３％、より有利には少なくとも９５％、及びさらにより有利には少なくとも９８％の同一のヌクレオチド配列を含む。より好ましい一実施態様に従って、核酸は、配列番号：３、４又はそれらの補体を含む。さらにより好ましい一実施態様に従って、核酸は、場合により膜アンカー配列をコードするヌクレオチド配列と一緒に、配列番号：３、４又はそれらの補体からなる。
【００３５】
他の実施態様に従って、核酸は、ベチバー（Ｌ．）Ｎａｓｈから単離される。
【００３６】
本発明の核酸は、一本鎖形又は二本鎖形（ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ）におけるデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドを含むと定義されてよい。“ヌクレオチド配列”の用語は、別々のフラグメントの形で、又はより大きい核酸の成分としてポリヌクレオチド分子又はオリゴヌクレオチド分子を含むとも解されるべきである。本発明の核酸は、実質的に内因性材料を汚染することを有さないものを含むある単離されたヌクレオチド配列も含む。本発明の核酸は短縮されてよいが、但し、前記のように本発明に含まれるポリペプチドをコードする。
【００３７】
より好ましい一実施態様に従って、前記実施態様のいずれかに従った少なくとも１つの核酸は、配列番号：３、４又はそれらの補体を改質することによって得られるヌクレオチド配列を含む。有利には、前記核酸配列は、配列番号：３、４又はそれらの補体を改質することによって得られるヌクレオチド配列からなる。
【００３８】
配列番号：３、４又はそれらの補体の突然変異によって得られた配列を含む核酸は、本発明に含まれるが、但し、それらを含む配列は、配列番号：３、４又はそれらの補体の対応するフラグメントとの同一性の少なくとも定義されたパーセンテージ共有し、かつそれらは、前記実施態様のいずれかにおいて定義されたように、シトクロムＰ４５０活性を有するポリペプチドをコードする。突然変異は、これらの核酸のあらゆる種類の突然変異、例えば点突然変異、挿入突然変異及び／又はフレームシフト突然変異であってよい。変異体核酸は、そのヌクレオチド配列を特定の発現系に適応するために製造されてよい。例えば、細菌発現系は、アミノ酸が好ましいコドンによってコードされる場合に、ポリペプチドをより効率的に発現することが公知である。遺伝子コードの縮重によって、１つ以上のコドンが、同一のアミノ酸をコードできる場合に、多重ＤＮＡ配列は、同一のポリペプチドについてコードでき、全てのこれらのＤＮＡ配列は、本発明に含まれる。
【００３９】
本発明は、少なくとも１つのテルペン化合物を酸化するための方法も提供し、該方法は、
ａ）シトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）の存在で、該テルペン化合物と本発明の少なくとも１つのポリペプチドとを接触する工程、
ｂ）場合により、工程ａ）において製造された酸化させたテルペンを単離する工程
を含む。
【００４０】
本発明のポリペプチドによって酸化されたテルペン化合物及び本発明のポリペプチド自体は、前記実施態様のいずれかに定義されている。
【００４１】
前記方法を、さらに詳細に説明されるように、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで実施してよい。
【００４２】
前記方法をｉｎ ｖｉｔｒｏで実施する場合に、テルペン化合物と接触されるべき本発明のポリペプチド及びＣＰＲは、標準タンパク質又は酵素抽出技術を使用して、それ発現するあらゆる生物から抽出することによって得られる。宿主生物が単細胞生物又は培地中に本発明のポリペプチドを放出する細胞である場合に、例えば膜アンカーが存在しない場合に、ポリペプチドは、培地から、例えば遠心分離、続いて場合により洗浄工程及び適した緩衝溶液中での再懸濁によって採取されてよい。前記生物又は細胞が、その細胞内でポリペプチドを蓄積する場合に、ポリペプチドは、細胞の破壊又は溶解、及び細胞溶解物からポリペプチドのさらなる抽出によって得られてよい。Ｐ４５０及びＣＰＲが膜アンカー配列、例えば植物における野生型Ｐ４５０及びＣＰＲを含む場合に、それらは、膜に結合され、かつ従って、細胞溶解物の膜分画に位置している。膜分画（ミクロソーム）は、公知の方法を使用する粗細胞溶解物の特異的な遠心分離によって他のタンパク質分画から容易に分離されうる。
【００４３】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ法について、本発明のポリペプチド及びＣＰＲは、独立して、単離された形で又はタンパク質抽出物の一部として提供されてよく、かつ至適ｐＨでの緩衝溶液中で懸濁される。適宜、塩、ＤＴＴ、ＮＡＤＰＨ、ＮＡＤＨ、ＦＡＤ、ＦＭＮ及び他の種類の酵素補因子を、酵素活性を最適化するために添加してよい。適した条件は、以下の実施例においてより詳細に記載されている。
【００４４】
テルペン化合物を、さらに、懸濁液又は溶液に添加し、そして至適温度、例えば１５〜４０℃、有利には２５〜３５℃、より有利には３０℃でインキュベートする。インキュベート後に、製造した酸化させたテルペンを、場合により溶液からポリペプチドを取り出した後に、標準単離方法、例えば溶媒抽出及び蒸留によってインキュベートした溶液から単離してよい。
【００４５】
ＣＰＲは、Ｐ４５０及びテルペン化合物を接触させる間に存在する必要がある。
【００４６】
他の好ましい実施態様に従って、テルペン化合物を酸化する方法を、ｉｎ ｖｉｖｏで実施する。この場合、前記方法の工程ａ）は、テルペン化合物の酸化を促す条件下で酸化させたテルペン化合物の存在で、本発明の少なくとも１つのポリペプチドを発現するために形質転換させたヒトでない宿主生物又は宿主細胞を培養することを含み、該生物又は細胞は、さらにＣＰＲを発現する。
【００４７】
テルペン化合物及びポリペプチドは、本発明のあらゆる実施態様において定義されている。
【００４８】
かかるプロセスの一実施態様において、酸化させたテルペン化合物を、本発明のポリペプチドを発現する宿主生物又は宿主細胞によって製造する。この場合、テルペン化合物は、非環式テルペン前駆体からの該テルペン化合物の形成を触媒化することができるテルペン合成酵素によって、宿主生物又は宿主細胞中で製造される。前記テルペン合成酵素を、宿主生物又は宿主細胞によって自然に製造してよく、又は宿主生物又は宿主細胞がかかるテルペン合成酵素を発現しない場合に、発現するために形質転換してよい。
【００４９】
代わりの一実施態様において、宿主細胞を使用する場合に、又は宿主生物が微生物である場合に、酸化されるテルペン化合物を、該細胞又は微生物の培地に添加してよい。テルペン化合物は、細胞又は微生物の膜を介して浸透し、従って、該宿主細胞又は宿主微生物によって発現した本発明のポリペプチドとの反応のために利用できる。
【００５０】
より好ましい一実施態様に従って、前記方法は、さらに、工程ａ）の前に、本発明の少なくとも１つの核酸でヒトでない生物又は細胞を形質転換して、該生物又は細胞が本発明の少なくとも１つのポリペプチドを発現する工程を含む。ポリペプチド及び核酸は、前記実施態様のいずれかにおいて定義されている。
【００５１】
ｉｎ ｖｉｖｏ方法の実施は、予めポリペプチドを単離することなく前記方法を実施することができるため、特に有利である。前記反応は、形質転換した生物又は細胞内で直接生じて、ポリペプチドを発現する。
【００５２】
触媒活性のために、Ｐ４５０は、Ｐ４５０活性を再構成するために、ＮＡＤＰＨ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート、還元形）から電子をＰ４５０活性部位に輸送できるＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）と組み合わせて使用されるべきである。ＣＰＲは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでプロセスを実施するために存在すべきである。前記方法をｉｎ ｖｉｖｏで実施する場合に、ＣＰＲは、宿主生物又は宿主細胞中に天然に存在してよく、又はかかる生物又は細胞を、本発明のポリペプチドを発現するための形質転換前に、形質転換と同時に、又は形質転換後に、ＣＰＲを発現するために形質転換してよい。本発明の好ましい一実施態様において、宿主細胞又は宿主生物を、本発明のポリペプチド及びＣＰＲの双方を含む融合ポリペプチドで形質転換する。
【００５３】
他の好ましい実施態様において、ＣＰＲは植物ＣＰＲである。最も有利には、ＣＰＲは、シロイスナズナ（Arabidopsis thaliana）に由来する。
【００５４】
ヒトでない生物又は細胞は、有利には、非環式テルペン前駆体、ゲラニルピロホスフェート、ファルネシルピロホスフェート又はゲラニルゲラニルピロホスフェートの製造の代謝中で含まれるポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子でさらに形質転換されてよい。かかるポリペプチドは、例えばＭＥＰ経路の酵素、ＭＶＡ経路の酵素、及び／又はプレニルトランスフェラーゼを含む。
【００５５】
本発明の実施態様のいずれかにおいて記載された、酸化させたテルペン化合物の存在での、シトクロムＰ４５０活性を有するポリペプチドでの及びＣＰＲでの、又は双方を含む融合ポリペプチドでのヒトでない生物又は細胞の形質転換は、テルペンの酸化について実施するために十分である。それにもかかわらず、非環式テルペン前駆体の及び／又はイソペンテニルジホスフェート（ＩＰＰ）もしくはジメチルアリルジホスフェート（ＤＭＡＰＰ）の製造において含まれる少なくとも１つの酵素でのさらなる形質転換は、酸化させるために利用できるテルペン化合物の量を増加する利点を有する。
【００５６】
前記生物又は細胞は、ポリペプチドを“発現”することを意味するが、但し該宿主生物又は宿主細胞は、該ポリペプチドをコードする核酸を含むために形質添加され、この核酸は、ｍＲＮＡに転写され、そしてポリペプチドが、宿主生物又は宿主細胞中で見出される。“発現”の用語は、“非相同発現”及び“過剰発現”を含み、後者は、形質転換していない生物又は細胞中で測定されるものを超える、及びそれより多いｍＲＮＡ、ポリペプチド及び／又は酵素の活性のレベルをいう。ヒトでない宿主生物又は宿主細胞を形質転換するための適した方法のより詳細な記載は、本発明の特定の目的として、かかる形質転換したヒトでない宿主生物又は宿主細胞について記載された明細書の一部で、及び実施例で以下で記載されている。
【００５７】
生物、例えば微生物を形質転換して、それらがテルペン合成酵素を発現するための方法は、当業者に既に公知である。かかる方法は、例えばジザエン合成酵素、すなわちファルネシルピロホスフェートからのジザエンの製造を触媒化することができる酵素で多様な宿主生物及び細胞の形質転換を記載しているＷＯ ２０１０／１３４００４号において見出せる。
【００５８】
本発明をｉｎ ｖｉｖｏで実施するために、宿主生物又は宿主細胞を、酸化させたテルペンの製造を促す条件下で培養させる。かかる条件は、宿主生物又は宿主細胞の成長を導くあらゆる条件である。有利には、かかる条件は、宿主生物又は宿主細胞の最適な成長のために設計される。従って、宿主がトランスジェニック植物である場合に、最適な成長条件、例えば最適な光条件、水条件及び栄養条件を提供する。宿主が単細胞生物である場合に、酸化させたテルペンの製造を促す条件は、宿主の培地に適した補因子の添加を含んでよい。さらに、培地は、テルペン酸化を最大化するように選択されてよい。最適な培養条件は、当業者に公知であり、本発明に特有でない。適した条件の例は、次の実施例におけるより詳細な方法において記載されている。
【００５９】
本発明のｉｎ ｖｉｖｏでの方法を実施するために適したヒトでない宿主生物は、あらゆるヒトでない多細胞又は単細胞生物であってよい。好ましい一実施態様において、本発明をｉｎ ｖｉｖｏで実施するために使用されるヒトでない宿主生物は、植物、原核生物又は真菌である。あらゆる植物、原核生物又は真菌を使用できる。特に有用な植物は、多量のテルペンを自然に製造するものである。より好ましい一実施態様において、植物は、ナス科（Solanaceae）、イネ科（Poaceae）、アブラナ科（Brassicaceae）、マメ科（Fabaceae）、アオイ科（Malvaceae）、キク科（Asteraceae）又はシソ科（Lamiaceae）から選択される。例えば、前記植物は、タバコ属（Nicotiana）、ナス属（Solanum）、モロコシ属（Sorghum）、アラビドプシス属（Arabidopsis）、アブラナ属（Brassica）（ナタネ（ｒａｐｅ））、ウマゴヤシ属（Medicago）（アルファルファ）、ワタ属（Gossypium）（綿）、ヨモギ属（Artemisia）、サルビア属（Salvia）及びハッカ属（Mentha）から選択される。有利には、前記植物は、タバコ（Nicotiana tabacum）の種に属する。
【００６０】
より好ましい一実施態様において、本発明の方法をｉｎ ｖｉｖｏで実施するために使用されるヒトでない宿主生物は、微生物である。あらゆる微生物を使用できるが、さらにより好ましい実施態様に従って、該微生物は細菌又は真菌である。有利には、前記真菌は酵母である。最も有利には、前記細菌はＥ．ｃｏｌｉであり、かつ前記酵母は、サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）である。
【００６１】
これらの生物のいくつかは、自然に酸化されるテルペンを製造しない。本発明の方法を実施するために適切であるために、これらの生物は、前記テルペンを製造するために形質転換される。それらは、前記で説明されているように、前記実施態様のいずれかに従って記載された核酸での形質転換の前、形質転換と同時、又は形質転換後に、形質転換されてよい。
【００６２】
単離された高次真核細胞を、完全な生物の代わりに、本発明の方法をｉｎ ｖｉｖｏで実施するための宿主としても使用できる。適した真核細胞は、あらゆるヒトでない細胞であってよいが、しかし有利には植物細胞である。
【００６３】
本発明の方法をｉｎ ｖｉｖｏで実施するために適した宿主生物又は宿主細胞を形質転換するための重要な手段は、本発明のあらゆる実施態様に従った核酸を含む発現ベクターである。かかるベクターは、従って、本発明の目的でもある。
【００６４】
本明細書において使用される“発現ベクター”は、制限されることなく、ウィルスベクター、バクテリオファージ及びプラスミドを含む、あらゆる線状又は環状の組換えベクターを含む。当業者は、発現系に従って適したベクターを選択することができる。一実施態様において、発現ベクターは、転写、翻訳、開始及び終止を調節する少なくとも１つの調節配列、例えば転写プロモーター、オペレーター又はエンハンサー、又はｍＲＮＡリボソーム結合部位に操作可能に連結され、及び場合により少なくとも１つの選択マーカーを含む本発明の核酸を含む。ヌクレオチド配列は、調節配列が、本発明の核酸に機能的に関連する場合に、“操作可能に連結”される。
【００６５】
本発明の発現ベクターは、さらに以下で開示されるように、本発明の核酸を含む宿主生物及び細胞中で、遺伝子的に形質転換された宿主生物及び／又は細胞を製造する方法において、並びに本発明のポリペプチドを製造又は作成するための方法において使用される。
【００６６】
本発明のあらゆる実施態様に従って少なくとも１つの核酸を含むために形質転換された、組換えたヒトでない宿主生物及び細胞は、本発明の方法を実施するための非常に有用な手段でもある。かかるヒトでない宿主生物及び細胞は、従って、本発明の他の目的である。好ましい一実施態様において、かかる宿主生物及び細胞は、本発明のあらゆる実施態様に従ってポリペプチドを非相同的に発現又は過剰発現する。
【００６７】
好ましい一実施態様に従って、ヒトでない宿主生物又は宿主細胞は、さらに、前記で記載されたように、Ｐ４５０−レダクターゼ（ＣＰＲ）を発現する。ＣＰＲは、宿主生物又は宿主細胞中に天然に存在してよく、又はかかる生物又は細胞を、本発明のポリペプチドを発現するための形質転換前に、形質転換と同時に、又は形質転換後に、ＣＰＲを発現するために形質転換してよい。本発明の好ましい一実施態様において、宿主細胞又は宿主生物を、本発明のポリペプチド及びＣＰＲの双方を含む融合ポリペプチドを発現するために形質転換する。
【００６８】
他の好ましい一実施態様において、前記生物又は細胞は、酸化されるテルペンを製造することができる。これは、前記生物又は細胞は、前記テルペンの形成を触媒化することができるテルペン合成酵素を発現する場合である。宿主生物又は宿主細胞がかかるテルペン合成酵素を自然に発現しない場合に、Ｐ４５０活性を有するポリペプチドでの形質転換前に、形質転換と同時に、又は形質転換後に、形質転換することができる。
【００６９】
ヒトでない生物又は細胞は、有利には、非環式テルペン前駆体、ゲラニルピロホスフェート、ファルネシルピロフォスフェート又はゲラニルゲラニルピロホスフェートの製造の代謝中で含まれるポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子でさらに形質転換されてよい。かかるポリペプチドは、例えばＭＥＰ経路の酵素、ＭＶＡ経路の酵素、及び／又はプレニルトランスフェラーゼを含む。本発明の実施態様のいずれかにおいて記載された、本発明のポリペプチドでの、及びＣＰＲでの、又は双方を含む融合ポリペプチドでの、テルペン化合物を製造することができるヒトでない生物又は細胞の形質転換は、テルペンの酸化について実施するために十分である。それにもかかわらず、非環式テルペン前駆体の及び／又はイソペンテニルジホスフェート（ＩＰＰ）もしくはジメチルアリルジホスフェート（ＤＭＡＰＰ）の製造において含まれる少なくとも１つの酵素でのさらなる形質転換は、酸化させるために利用できるテルペンの量を増加する利点を有する。
【００７０】
本発明のヒトでない宿主生物及び細胞のタイプは、テルペン化合物を酸化するための方法のあらゆる実施態様において記載されている。
【００７１】
“形質転換させた”の用語は、宿主を遺伝子操作して、前記実施態様のいずれかにおいて要求されたそれぞれの核酸の１つ、２つ又はそれ以上のコピーを含有させたことを意味する。有利には、“形質転換させた”の用語は、形質転換される核酸によってコードしたポリペプチドを非相同的に発現する、及び該ポリペプチドを過剰発現する宿主をいう。従って、一実施態様において、本発明は、形質転換されていない同様の生物よりも高い量でポリペプチドを発現する、形質転換させた生物を提供する。
【００７２】
トランスジェニック宿主生物又は宿主細胞、例えば植物、真菌、原生動物、又は高次真核細胞の培養物の製造について、当業者に公知のいくつかの方法がある。細菌、真菌、酵母、植物及び哺乳動物細胞の宿主との使用に適したクローニングベクター及び発現ベクターは、例えば、Ｐｏｕｗｅｌｓ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， １９８５， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、及び Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２nd ｅｄｉｔｉｏｎ， １９８９， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓにおいて記載されている。特に高次植物及び／又は植物細胞のためのクローニングベクター及び発現ベクターは、当業者に入手可能である。例えば、Ｓｃｈａｒｄｌ ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｅ ６１： １−１１， １９８７を参照。
【００７３】
宿主生物又は宿主細胞を形質転換してトランスジェニック核酸を有するための方法は、当業者によく知られている。トランスジェニック植物の製造のために、例えば現在の方法は以下を含む：植物プロトプラストのエレクトロポレーション、リポソーム媒介形質転換、アグロバクテリウム媒介形質転換、ポリエチレングリコール媒介形質転換、微粒子銃、植物細胞のマイクロインジェクション、及びウィルスを使用する形質転換。
【００７４】
一実施態様において、形質転換したＤＮＡは、ヒトでない宿主生物及び細胞のクロモソーム中に組込んで、安定な組換えシステムをもたらす。当業者に公知のあらゆるクロモソーム組込み方法は、制限されることなく、レコンビナーゼ媒介カセット変換（ＲＭＣＥ）、ウィルス部位特異的クロモソーム挿入、アデノウィルス及び前核注入を含む、本発明の実施において使用されてよい。
【００７５】
本明細書において前記されているように、ｉｎ ｖｉｔｒｏでテルペン化合物を酸化するための方法を実施するために、本発明のポリペプチドを製造する方法を提供することが非常に有利である。従って、本発明は、
ａ）本発明による少なくとも１つの核酸を含み、かつ本発明の少なくとも１つのポリペプチドを発現又は過剰発現するために形質転換させたヒトでない宿主生物又は宿主細胞を培養すること、
ｂ）工程ａ）において培養したヒトでない宿主生物又は宿主細胞から本発明のポリペプチドを単離すること
を含む、本発明のポリペプチドを製造するための方法を提供する。
【００７６】
好ましい一実施態様に従って、前記方法は、さらに、工程ａ）の前に、本発明による少なくとも１つの核酸でヒトでない宿主生物又は宿主細胞を形質転換して、本発明によるポリペプチドを発現又は過剰発現する工程を含む。
【００７７】
ヒトでない宿主生物又は宿主細胞の形質転換及び培養を、ｉｎ ｖｉｖｏで酸化させたテルペンを製造する方法について前記で記載されたように実施してよい。工程ｂ）を、当業者に公知のあらゆる技術を使用して、生物又は細胞から特定のポリペプチドを単離するために実施してよい。
【００７８】
本明細書において言われる“ポリペプチド変異体”は、式（Ｉ）のテルペン化合物の酸化を触媒化でき、かつ前記実施態様のいずれかに従って配列同一性の十分なパーセンテージを有するポリペプチドを意味する。かかる変異体ポリペプチドは、１つ以上の欠失、挿入又は置換を受ける核酸配列によってコードされる。
【００７９】
変異体は、保存的に置換された配列を含んでよく、得られたアミノ酸残基が、同様の物理化学的特徴を有する残基によって置換されることを意味する。保存的置換の例は、他の残基についてある脂肪族置換基への、例えば他のものからＩＩｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ又はＡｌａへの置換、又は他の残基について極性残基への、例えばＬｙｓとＡｒｇとの、ＧｌｕとＡｓｐとの、又はＧｉｎとＡｓｎとの置換を含む。Ｚｕｂａｙ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ａｄｄｉｓｏｎ− Ｗｅｓｌｅｙ Ｐｕｂ． Ｃｏ．， （１９８３）を参照。かかる置換の効果は、置換スコアマトリックス、例えばＡｌｔｓｃｈｕｌ， （Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１９：５５５−６５， １９９１）において開示されているようなＰＡＭ−１２０、ＰＡＭ−２００、及びＰＡＭ−２５０を使用して算出されうる。他のかかる保存的置換、例えば同様の疎水特性を有する全体領域の置換は、よく知られている。本発明のポリペプチドは、より多様な変異体を生じるために、保存的でない置換を受けてもよいが、但しかかる変異体は、所望されたシトクロムＰ４５０活性を保持する。変異体は、変異体ポリペプチドについてコードする核酸配列中に、ヌクレオチドを欠失及び挿入することによっても製造できる。
【００８０】
本発明のポリペプチドの変異体を、例えば所望された、高められたもしくは低減させた酵素活性、改質した位置化学もしくは立体化学、又は変更させた基質利用もしくは生成物分布、基質についての高められたアフィニティー、１つ以上の所望の化合物の製造のための改良された特異性、酵素反応の高められた速さ、特定の環境（ｐＨ、温度、溶媒等）におけるより高い活性もしくは安定性、又は所望の発現系における改良された発現レベルを得るために使用してよい。変異体又は部位特異的突然変異は、当業者に公知のあらゆる方法によって製造されてよい。野生型のポリペプチドの変異体及び誘導体は、他の又は同一の系列もしくは種の自然に生じる変異体又は変異体のヌクレオチドを単離することによって、又は本発明のポリペプチドについてコードするヌクレオチド配列の人工的にプログラムした突然変異によって得られてよい。野生型のアミノ酸配列の改変を、多数の通常の方法のいずれかによって行ってよい。
【００８１】
本発明のポリペプチドのアミノ末端及びカルボキシル末端での追加のペプチド配列の融合から得られるポリペプチド変異体は、ポリペプチドの発現を高めるために使用されてよく、タンパク質の精製において有用であってよく、又は所望の環境もしくは発現系におけるポリペプチドの酵素活性を改良してよい。かかる追加のペプチド配列は、例えばシグナルペプチドであってよい。従って、本発明は、本発明のポリペプチドの変異体、例えば他のオリゴペプチド又はポリペプチドとの融合によって得られたもの、及び／又はシグナルペプチドに連結させたものを含む。
【００８２】
従って、一実施態様において、本発明は、テルペン化合物の酸化を触媒化することができる変異体ポリペプチドを製造するための方法を提供し、該方法は、
（ａ）前記実施態様のいずれかに従って核酸を選択する工程、
（ｂ）選択した核酸を改質して、少なくとも１つの突然変異体核酸を得る工程、
（ｃ）宿主細胞又は単細胞生物を突然変異体核酸で形質転換して、突然変異体核酸配列によってコードされたポリペプチドを発現する工程、
（ｄ）少なくとも１つの改質されたシトクロムＰ４５０活性についてポリペプチドをスクリーニングする工程、
（ｅ）場合により、ポリペプチドが所望の変異体シトクロムＰ４５０活性を有さない場合に、プロセス工程（ａ）〜（ｄ）を、所望の変異体シトクロムＰ４５０活性を有するポリペプチドが得られるまで繰り返す工程、
（ｆ）場合により、所望の変異体シトクロムＰ４５０活性を有するポリペプチドが、工程（ｄ）において同定された場合に、工程（ｃ）において得られた対応する突然変異体核酸を単離する工程
を含む。
【００８３】
工程（ｂ）において、多数の突然変異核酸配列を、例えばランダム突然変異、部位特異的突然変異、又はＤＮＡシャッフリングによって製造してよい。遺伝子シャッフリングの詳細な手法は、Ｓｔｅｍｍｅｒ、ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ ｂｙ ｒａｎｄｏｍ ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅａｓｓｅｍｂｌｙ ： ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．， １９９４， ９１（２２）： １０７４７−１０７５において見いだせる。要するに、ＤＮＡシャッフリングは、組換えのために選択された少なくとも２つの核酸を含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの公知の配列のランダム組換えのプロセスを言う。例えば、突然変異は、野生型配列のフラグメントにライゲーションできる制限部位に置かれる突然変異配列を含むオリゴヌクレオチドを合成することによって特定の座で導入されてよい。ライゲーションに続いて、得られた再構築した配列が、所望のアミノ酸の挿入、置換又は欠失を有する類似体をコードされる。代わりに、オリゴヌクレオチド指定部位特異的突然変異法を実施して、予め決定したコドンを置換、欠失又は挿入によって改変できる、改変した遺伝子を提供してよい。
【００８４】
従って、配列番号：３、４又はそれらの補体を含むポリペプチドをコードする核酸を、シトクロムＰ４５０をコードするあらゆる他の核酸で組換えてよく、例えばベチバー（Ｌ．）Ｎａｓｈを除いた生物から単離される。従って、例えば本発明の実施例において開示されているような標準法に従って宿主細胞を形質転換するためにしようされてよい突然変異核酸が得られてよく、かつ分離されてよい。
【００８５】
工程（ｄ）において、工程（ｃ）において得られたポリペプチドを、少なくとも１つの改質されたシトクロムＰ４５０活性についてスクリーニングする。発現させたポリペプチドをスクリーニングしてよい所望の改質されたシトクロムＰ４５０活性の例は、ＫM値又はＶmax値によって測定されてよい高められた又は低減された酵素活性、改質された位置化学又は立体化学、及び改変された基質利用率又は生成物分布を含む。酵素活性のスクリーニングを、当業者によく知られている方法及び本発明の実施例において開示されている方法に従って実施してよい。
【００８６】
工程（ｅ）は、プロセス工程（ａ）〜（ｄ）の繰り返しを提供し、有利には並行に実施してよい。従って、著しい数の突然変異核酸を製造するために、多くの宿主細胞は、高められた数のポリペプチドの続くスクリーニングを可能にする、同時の種々の突然変異核酸で形質転換してよい。所望の変異体ポリペプチドを得る機会は、従って、当業者の自由で増加させてよい。
【００８７】
本明細書において挙げられた全ての文献は、挙げられた文献に関連する方法及び／又は材料を開示及び記載する参照をもって本明細書に組込まれたものとする。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】挙げられた化合物の構造を示す図。
【図２】定義したテルペンヒドロキシラーゼ活性（先行技術）を有する選択したＰ４５０モノオキシゲナーゼのアミノ酸配列のアライメントを示す図。全てのＰ４５０酵素において見出された観察された領域に下線を引く。テルペンヒドロキシラーゼ特異性オリゴヌクレオチドを設計するために使用された６つの領域に矢印で下線を引く。矢印の方向は、オリゴヌクレオチドの配向を示す。
【図３】Ｅ．ｃｏｌｉにおける改良された非相同発現のために２つのベチバーＰ４５０において導入されたＮ−末端（膜アンカー）改質を示す図。
【図４】ＶｚＰ５２１−１１組換えタンパク質で得られた代表的なＣＯ−示差スペクトルを示す図。
【図５】２シストロン性構造におけるＰ４５０とＣＰＲとの間のスペーサー領域の配列を示す図。Ｐ４５０の終わりでの、及びＣＰＲの開始でのＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【図６】ベチバーＰ４５０ ＶｚＰ５２１−１６及びアラビドプシス属からのＣＰＲ（ｔｃＡＴＲ１）を発現するＥ．ｃｏｌｉでの（＋）−ジザエンの生物変換のＧＣＭＳ分析を示す図。Ａ． 合計イオンクロマトグラム。Ｂ． 基質（１）、及び対応する化合物の同一性及び構造を有する生成物（２〜４）の質量スペクトル。
【図７】ジザエンの酵素的酸化の連続工程を示す図。
【図８】ベチバーＰ４５０によるいくつかのテルペン分子の生物変換のＧＣＭＳ分析の合計イオンクロマトグラムを示す図。基質に対応するピークを示し、生成物の分子量を示す。
【図９】生成物を同定したいくつかのテルペン分子のベチバーＰ４５０による生物変換を示す図。
【図１０】ベチバーＰ４５０、ＣＰＲ及びジザエン合成酵素のＥ．ｃｏｌｉにおける同時発現のために設計された人工オペロンの構造を示す図。
【図１１】非相同メバロン酸経路を使用するＦＰＰの製造のための酵素と一緒に、（＋）−ジザエン合成酵素、ベチバーＰ４５０ ＶｚＰ５２１−１６−１及びアラビドプシス属ＣＰＲを発現するＥ．ｃｏｌｉ細胞によって製造されたセスキテルペンのＧＣＭＳ分析の合計イオンクロマトグラムを示す図。
【００８９】
本発明の特定の実施態様又は実施例
本発明を、次の実施例の方法によってさらに詳細に記載する。
【００９０】
実施例１
ＲＮＡ抽出及びｃＤＮＡライブラリー構築
ベチバー（Ｖｅｔｉｖｅｒｉａ ｚｉｚａｎｉｏｉｄｅｓ （Ｌ．） Ｎａｓｈ）植物を、苗床（Ｔｈｅ Ａｕｓｔｒａｌ Ｐｌａｎｔｓ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｌｅｓ Ａｖｉｒｏｎｓ， Ｔｈｅ Ｒｅｕｎｉｏｎ Ｉｓｌａｎｄ， Ｆｒａｎｃｅ）から得た。植物を、温室（Ｌｕｌｌｉｅｒ Ａｇｒｏｎｏｍｙ ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｔａｔｉｏｎ， Ｇｅｎｅｖａ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）においてポットで栽培し、そして６ヶ月から１年の茂みを分けることによって栄養繁殖した。根の収穫のために、植物を、ポットから取り出し、そして水道水で洗った。
【００９１】
ＲＮＡの抽出のために、いくつかの植物からの根を刈り取った：若い植物（繁殖後４〜６ヶ月）、よく発達した密な根系を有する年数を経た植物（繁殖後１〜２年）、及びポットから取り出して２４〜３６時間後の室温で乾燥した若い植物。その根を、植物の気部から切断し、液体窒素で凍結した。その根を、最初に、ワーリングブレンダー（Ｗａｒｉｎｇ Ｂｌｅｎｄｏｒ （Ｗａｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｔｏｒｒｉｎｇｔｏｎ， ＵＳＡ））を使用して液体窒素中で大まかに切り刻み、そして乳鉢及び乳棒を使用して微粉まで研磨した。合計ＲＮＡを、Ｋｏｌｏｓｏｖａ ｅｔ ａｌ （Ｋｏｌｏｓｏｖａ Ｎ， Ｍｉｌｌｅｒ Ｂ， Ｒａｌｐｈ Ｓ， Ｅｌｌｉｓ ＢＥ， Ｄｏｕｇｌａｓ Ｃ， Ｒｉｔｌａｎｄ Ｋ， ａｎｄ Ｂｏｈｌｍａｎｎ Ｊ， Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈ−ｑｕａｌｉｔｙ ＲＮＡ ｆｒｏｍ ｇｙｍｎｏｓｐｅｒｍ ａｎｄ ａｎｇｉｏｓｐｅｒｍ ｔｒｅｅｓ． Ｊ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， ３６（５）， ８２１−４， ２００４）において記載された方法に従って抽出し、続いて改質した。抽出緩衝液の２０ｍｌの容量を、研磨した組織の２グラムについて使用し、そして抽出緩衝液を、ＰＶＰ（ポリビニルピロリドン、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の２％（ｗ／ｖ）で懸濁した。ＣＴＡＢ（セチルトリメチルアンモニウムブロミド、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）抽出のために、核酸ペレットを、２ｍｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８、１ｍＭ ＥＤＴＡ）中で再懸濁し、そして抽出を２ｍｌの５Ｍ ＮａＣｌ及び１ｍｌの１０％ ＣＴＡＢで実施した。イソプロパノール沈澱のために、核酸ペレットを５００μｌのＴＥ中で溶解した。最終ＲＮＡペレットを５０μｌの水で再懸濁した。
【００９２】
アダプター連結二重鎖ｃＤＮＡライブラリーを、１μｇのｍＲＮＡから、ＭａｒａｔｈｏｎTM ｃＤＮＡ増幅キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ Ｅｕｒｏｐｅ）を使用して、製造者のプロトコルに従って製造した。
【００９３】
実施例２
Ｐ４５０特異性オリゴヌクレオチドの設計
テルペンヒドロキシラーゼ活性を有する植物Ｐ４５０についてオリゴヌクレオチドの設計特異性を設計するために、Ｐ４５０をヒドロキシル化する公知のテルペンからのアミノ酸配列を選択した：スペアミントからのリモネン６−ヒドロキシラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＤ４４１５０）、ペパーミントからの２つのリモネン３−ヒドロキシラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＤ４４１５２及びＡＡＤ４４１５１）、タバコからのエピ−アリストロチェンヒドロキシラーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＫ６２３４３）、ヒヨシアムス・ムチクス（Hyoscyamus muticus）からのプレムナスピロジエノキシゲナーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢＳ００３９３）、スコッチスペアミントからの２つのリモネンヒドロキシラーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＱ１８７０７及びＡＡＱ１８７０８）、タバコからのジテルペンヒドロキシラーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＤ４７８３２）並びにＣＹＰ７１Ｄ科からの２つの種類、ジャガイモからのＣｙｐ７１Ｄ４（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＣＡＣ２４７１１）及びチャコポテト（chaco potato）からのＣＹＰ７１Ｄ６（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｐ９３５３０）。その配列を、ＣｌｕｓｔａｌＷプログラム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ， Ｊ．Ｄ．， Ｈｉｇｇｉｎｓ， Ｄ．Ｇ． ａｎｄ Ｇｉｂｓｏｎ， Ｔ．Ｊ． （１９９４）； ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ： ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｔｈｒｏｕｇｈ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｗｅｉｇｈｔｉｎｇ， ｐｏｓｉｔｉｏｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｉｅｓ ａｎｄ ｗｅｉｇｈｔ ｍａｔｒｉｘ ｃｈｏｉｃｅ； Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２２， ４６７３−４６８０）で整列させた。アライメントを図２において示す。
【００９４】
相同のＰ４５０ ｃＤＮＡのフラグメントのＰＣＲ増幅のために使用されるオリゴヌクレオチドを設計するために、保存領域をこのアライメント中で選択した。パラメータ、例えば全ての配列にわたるアミノ酸の保存及び低いコドン縮重を有するアミノ酸の存在率を、これらの領域の選択で検討した。さらに、植物ゲノムが多くの異なる代謝で含まれる多数のＰ４５０を含むため、全てのＰ４５０に共通する機能に関する領域を故意に避けた。これらの領域は、例えば、そのチオレート側鎖によってヘム鉄を共有結合する完全な保存システイン残基に隣接のヘム結合ドメイン（本アライメントにおけるＰＦＧｘＧＲＲＩＣＰＧモチーフ）、いわゆる、レドックスパートナータンパク質との相互反応で及びヘムタンパク質関連の安定化においておそらく含まれる‘メアンダー’（本アライメントにおけるＦｘＰＥＲＦモチーフ）、及びヘムの末端鎖上で活性部位（モチーフ）に位置し、プロトン輸送及び酸素活性において含まれるＩヘリックス領域（（Ａ／Ｇ）ＧＴＥＴＳＳ）を含んだ。そして、植物テルペンモノオキシゲナーゼの特徴を推定する６つの保存された領域を選択した（図１において矢印で下線を引いた）。
【００９５】
３’縮重コア及び５％コンセンサスクランプを含むハイブリッドプライマーを、コンセンサス縮重ハイブリッドオリゴヌクレオチドプライマー（Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ−Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ Ｈｙｂｒｉｄ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｒｉｍｅｒｓ （ＣＯＤＥＨＯＰ））ストラテジー（Ｒｏｓｅ Ｔ．Ｍ．， Ｓｃｈｕｌｔｚ Ｅ．Ｒ．， Ｈｅｎｉｋｏｆｆ Ｊ．Ｇ， Ｐｉｅｔｒｏｋｏｖｓｋｉ Ｓ．， ＭｃＣａｌｌｕｍ ＣＭ．， ａｎｄ Ｎｅｎｉｋｏｆｆ Ｓ．； １９９８； Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ−ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｈｙｂｒｉｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｒｉｍｅｒｓ ｆｏｒ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｓｔａｎｔｌｙ ｒｅｌａｔｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ； Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２６（７）， １６２８−１６３５）に従って、及びhttp://blocks.fhcrc.org/blocks/codehop.htmlで入手できるコンピュータプログラムのオンラインインターフェースを使用して、これらの領域から設計した。オリゴヌクレオチドを設計して、１９２の最大縮重度及び６０〜６４℃のアニーリング温度を有する１１〜１５塩基の縮重したコアを有した。このアプローチを使用して、３つのセンスプライマー（Ｐ４５０−Ｔｅｒｐ−Ｆ１〜Ｆ３（配列番号：５〜７））及び４つのアンチセンスプライマー（Ｐ４５０−Ｔｅｒｐ−Ｒ１〜Ｒ４（配列番号：８〜１１）を、図１（表１）において示した６つの保存させた領域から設計した。
【００９６】
表１． テルペンヒドロキシラーゼ特異性オリゴヌクレオチド。それぞれのプライマーの縮重させたコアの配列は、より下の場合に示され、コンセンサスクランプはより上の場合に示される。ヌクレオチド配列は、順方向プライマーについて５’から３’末端を、逆方向プライマーについて３’から５’末端で示される。ヌクレオチド配列における縮重は、ＩＵＰＡＣのある文字コードを使用して示される。
【００９７】
【表１】
0005993019.tif 000003
【００９８】
実施例３
ベチバーＰ４５０ ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅
実施例２において記載されたプライマーを、ベチバーｃＤＮＡライブラリーから、Ｐ４５０ ｃＤＮＡフラグメントのＰＣＲによる増幅のために使用した。ＰＣＲを、Ａｄｖａｎｔａｇｅ（登録商標）２ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｍｉｘ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ Ｅｕｒｏｐｅ）を使用して実施した。それぞれのＰＣＲ混合物は、５０μＬの合計容量で、５μＬのＡｄｖａｎｔａｇｅ（登録商標）２ ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ、２００μＭのｄＮＴＰ、２００ｎＭのそれぞれのオリゴヌクレオチドプライマー、５μＬの２００倍希釈ｃＤＮＡ、１μＬのＡｄｖａｎｔａｇｅ（登録商標）２ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｍｉｘを含んだ。次の条件を、増幅のために使用した：
−  ９４℃で３分の変性
−  以下
・９４℃で１分の変性
・最初のサイクルについて６５℃で、及びそれぞれ次のサイクルで６４℃で１分のアニーリング
・７２℃で２分の伸長
を１５サイクル
−  以下
・９４℃で１分の変性
・５８℃で１分のアニーリング
・７２℃で２分の伸長
を２０サイクル
−  最終的に７２℃で１０分の伸長。
【００９９】
種々のＰＣＲを、テルペンヒドロキシラーゼ特異性のセンスプライマー及びアンチセンスプライマーの可能な組合せで実施した。期待したサイズを有するアンプリコンを、ＴＯＰＯ ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用してｐＣＲ（登録商標）２．１−ＴＯＰＯベクター中にクローンし、挿入をＤＮＡ配列に受けさせ、そしてその配列を、ＢＬＡＳＴＸアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．Ｆ．， Ｇｉｓｈ， Ｗ．， Ｍｉｌｌｅｒ， Ｗ．， Ｍｙｅｒｓ， Ｅ．Ｗ．， ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ， ＤＪ． （１９９０） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５， ４０３−４１０）を使用するＧｅｎＢａｎｋ非重複タンパク質データベース（ＮＣＢＩ）に対して比較した。
【０１００】
プライマーのいくつかの組合せ（Ｐ４５０−ｔｅｒｐ−Ｆ１（配列番号：５）とＰ４５０−ｔｅｒｐ−Ｒ２（配列番号：９）、Ｐ４５０−ｔｅｒｐ−Ｆ３（配列番号：７）とＰ４５０−ｔｅｒｐ−Ｒ３（配列番号：１０）、及びＰ４５０−ｔｅｒｐ−Ｆ１（配列番号：５）とＰ４５０−ｔｅｒｐ−Ｒ４（配列番号：１１））は、期待したサイズを有し、かつＰ４５０活性に対して相同性を示すＤＮＡフラグメントを提供した。特徴化されたテルペンモノオキシゲナーゼと相同性を示すフラグメントのみが、保持された（配列決定されたフラグメントの約５０％）。選択したＤＮＡ配列を、整列し、そして１１６７−ｂｐコンセンサスＤＮＡ配列（ＣＡ５２１（配列番号：１２）を推定した。ＣＡ５２１から推定したアミノ酸配列は、公知の植物テルペンモノオキシゲナーゼと４５％高い同一性を示した。
【０１０１】
完全長配列を、ｃＤＮＡ末端の迅速増幅（ＲＡＣＥ）の技術で得た。ＭａｒａｔｈｏｎTM ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ Ｅｕｒｏｐｅ）を全てのＲＡＣＥ実験のために使用した。典型的なＲＡＣＥ反応混合物は、５０μｌの最終容量で、５μｌのＡｄｖａｎｔａｇｅ（登録商標）２ ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ Ｅｕｒｏｐｅ）、２００μＭのそれぞれのｄＮＴＰ、１μｌのＡｄｖａｎｔａｇｅ（登録商標）２ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｍｉｘ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ Ｅｕｒｏｐｅ）、２００μＭのアダプター特異的プライマー、２００μＭのｃＤＮＡ特異的プライマー、及び５μｌの２００倍希釈したアダプター結合ベチバー根ｃＤＮＡを含む。増幅を、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ Ｇｒａｄｉａｎｔ ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒで実施した。熱サイクル条件は以下であった：９４℃で１分、９４℃で３０秒及び７２℃で３分を５サイクル、９４℃で３０秒及び７０℃で３分を５サイクル、９４℃で３０秒及び６８℃で３分を２０サイクル。適宜、増幅の二回目を、ネストオリゴヌクレオチドを使用して実施した。期待したサイズを有するアンプリコンを、ｐＣＲ（登録商標）２．１−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中にクローンし、そして挿入をＤＮＡ配列に受けさせ、そしてその配列を、ＢＬＡＳＴＸアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．Ｆ．， Ｇｉｓｈ， Ｗ．， Ｍｉｌｌｅｒ， Ｗ．， Ｍｙｅｒｓ， Ｅ．Ｗ．， ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ， Ｄ．Ｊ． （１９９０） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５， ４０３−４１０）を使用するＧｅｎＢａｎｋ非重複タンパク質データベース（ＮＣＢＩ）に対して比較した。
【０１０２】
ＣＡ−５２１末端の増幅のために、センスオリゴヌクレオチド及びアンチセンスオリゴヌクレオチドを、ＰＣＲを生じるＤＮＡフラグメントから推定し、そして３’ＲＡＣＥ及び５’ＲＡＣＥ：ＣＡ５２１−Ｆ１（配列番号：１３）、ＣＡ５２１−Ｆ２（配列番号：１４）、ＣＡ５２１−Ｒ１（配列番号：１５）及びＣＡ５２１−Ｒ２（配列番号：１６）において使用した。センスオリゴヌクレオチドを使用して、ＣＡ５２１フラグメントと１７６個の同一の残基のオーバーラップを有する、５００ｂｐフラグメント（ＣＡ６３５（配列番号：１７））を得た。このＣＡ６３５フラグメントは、終止コドンを含む追加の１３８ｂｐコード領域、続いて３’の翻訳されていない領域を含んだ。５’ＲＡＣＥは、５’末端で欠測２４３ｂｐコード領域を含む４２６ｂｐフラグメント（ＣＡ８８４（配列番号：１８））を提供した。
【０１０３】
オリゴヌクレオチドを、再構築された完全長配列の開始領域及び終止領域、ＣＡ５２１−開始（配列番号：１９）、ＣＡ５２１−終止（配列番号：２０）から設計し、完全長ｃＤＮＡの増幅のためのプライマーとして使用した。この増幅を、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）を使用して、５μｌのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ１０Ｘ緩衝液、２００μＭのそれぞれのｄＮＴＰ、０．４μＭのそれぞれのプライマー、２．９単位のＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ及び２．５μｌの２００倍希釈したベチバーｃＤＮＡを含む５０μｌの最終容量で、実施した。熱サイクル条件は以下であった：９５℃で１．５分；９５℃で４５秒及び６４℃で３０秒及び７２℃で４分を３０サイクル；並びに７２℃で１０分。ＰＣＲ生成物を、ＴＯＰＯ ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用してｐＣＲ（登録商標）２．１−ＴＯＰＯベクター中にクローンし、ＤＮＡ配列を調整した。いくつかのクローンの配列から、９３％の配列同一性を有する２つの別個のＤＮＡ配列（ＶｚＰ５２１−１１（配列番号：２１）及びＶｚＰ５２１−１６（配列番号：２２））を保持した。それぞれ５１３及び５１４残基から構成される推定されたアミノ酸配列は、８９％の同一性を有した。配列データベースにおいて最も近い適合を有するＶｚＰ５２１−１１（配列番号：２３）及びＶｚＰ５２１−１６（配列番号：２４）のアミノ酸配列の同一性を以下に挙げる。
【０１０４】
【表２】
0005993019.tif 000004
【０１０５】
最も近い一般に入手でき、かつ機能的に特徴化されたタンパク質とのアミノ酸配列同一性を以下の表において挙げる：
【表３】
0005993019.tif 000005
【０１０６】
ポリペプチドＶｚＰ５２１−１１（配列番号：２３）及びＶｚＰ５２１−１６（配列番号：２４）は、膜アンカーである部分及び触媒化Ｐ４５０活性の原因である活性領域を含む。ＶＺＰ５２１−１１及びＶｚＰ５２１−１６の活性部位を、それぞれ配列番号：１及び２において示す。これらの活性配列についてコードする核酸配列を、それぞれ配列番号：３及び４において示す。
【０１０７】
実施例４
細菌におけるベチバーＰ４５０の非相同発現
真核生物Ｐ４５０モノオキシゲナーゼにおいて、タンパク質のＮ末端配列は、これらの酵素の膜局在化のために必須な膜アンカーを構成する。プロリンが豊富な領域（５２１−１１（配列番号：２３）及び５２１−１６（配列番号：２４）におけるＰＰＧＰ）によって範囲を設定されたタンパク質のこの部分は、酵素活性の特異性の調整に必須ではない。従って、この領域は、触媒活性に対して効果を有さない、欠失、挿入又は突然変異によって改質されてよい。しかしながら、植物Ｐ４５０を含む、真核生物Ｐ４５０のＮ末端領域の特異的改質は、微生物において発現させる場合に、検出された組換えタンパク質のレベルに対してポジティブな効果を有することが示されている（Ｈａｌｋｉｅｒ ｅｔ ａｌ （１９９５） Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． ３２２， ３６９−３７７； Ｈａｕｄｅｎｓｃｈｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ （２０００） Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． ３７９， １２７−１３６）。従って、これらの以前の観察に基づいて、Ｐ４５０の膜アンカー領域ＶｚＰ５２１−１１及びＶｚＰ５２１−１６を、再設計して、図３において示した改質を導入した。
【０１０８】
改質したｃＤＮＡを以下のようにＰＣＲによって得た。膜アンカータンパク質に対応する最初のフラグメントをプライマーＰｆｕｓ−ＮｄｅＩ（配列番号：２５）及び鋳型として５２１＿ｆｕｓ＿ｒ（配列番号：２６）（プラスミドＰ２−２−４８（Ｈａｕｄｅｎｓｃｈｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ （２０００） Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． ３７９， １２７−１３６）と）を使用して増幅した。２つの他のフラグメントを、プライマー５２１−ｆｕｓ−ｆ（配列番号：２７）及び５２１−Ｈｉｎｄ（配列番号：２８）、並びに鋳型としてＶｚＰ５２１−１１（配列番号：２１）又はＶｚＰ５２１−１６（配列番号：２２）ｃＤＮＡを使用して増幅させた。ＰＣＲの二回目を、鋳型として最初のＰＣＲ生成物、及び２つの後者のＰＣＲ生成物のいずれか、並びにプライマーとしてＰｆｕｓ−ＮｄｅＩ（配列番号：２５）及び５２１−Ｈｉｎｄ（配列番号：２８）を使用して実施した。全てのＰＣＲを、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）で、５μｌのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ１０Ｘ緩衝液、２００μＭのそれぞれのｄＮＴＰ、０．４μＭのそれぞれのプライマー、２．９単位のＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ及び２．５μｌの２００倍希釈したベチバーｃＤＮＡを含む５０μｌの最終容量で、実施した。熱サイクル条件は以下であった：９５℃で１．５分；９５℃で４５秒及び６４℃で３０秒及び７２℃で４分を３０サイクル；並びに７２℃で１０分の最終工程。２つのＰＣＲ生成物、ＶｚＰ５２１−１１−１（配列番号：３７）及びＶｚＰ５２１−１６−１（配列番号：３８）を、ＮｄｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素で消化し、そしてそれぞれＮ末端で改質されたＶｚＰ５２１−１１及びＶｚＰ５２１−１６ Ｐ４５０（ＶｚＰ５２１−１１−１（配列番号：３５）及びＶｚＰ５２１−１６−１（配列番号：３６）アミノ酸配列）を含む、プラスミドｐＣＷ−２１８−５２１−１１及びｐＣＷ−２１８−５２１−１６を提供するｐＣＷｏｒｉ発現プラスミド（Ｂａｒｎｅｓ Ｈ．Ｊ （１９９６） Ｍｅｔｈｏｄ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２７２， ３−１４）中に連結した。
【０１０９】
非相同発現のために、ＪＭ１０９ Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を、２１８−５２１−１１又は２１８−５２１−１６発現プラスミドで形質転換させる。形質転換体の単コロニーを使用して、５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む５ｍＬのＬＢ培地に培養物を植えた。細胞を、１０〜１２時間３７℃で育てる。そして、培養物を使用して、５０μｇ／ｍＬのアンピシリン及び１ｍＭチアミンＨＣＬを補った２５０ｍＬのＴＢ培地（Ｔｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ）に植えた。その培養物を、２８℃で３〜４時間、穏やかな撹拌（２００ｒｐｍ）でインキュベートし、７５ｍｇ／Ｌのδ−アミノレブリン酸（ｓｉｇｍａ）及び１ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド）を添加し、そしてその培養物を、２８℃で２４〜４８時間２００ｒｐｍの撹拌で維持した。
【０１１０】
Ｐ４５０酵素の発現を、Ｅ．ｃｏｌｉタンパク質画分中でＣＯ結合スペクトル（Ｏｍｕｒａ， Ｔ． ＆ Ｓａｔｏ， Ｒ． （１９６４） ／． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２３９， ２３７９−２３８７）を測定することによって、質的に及び量的に評価できる。タンパク質抽出のために、細胞を遠心分離（１０分、５０００ｇ、４℃）し、そして３５ｍＬの氷冷緩衝液１（１００ｍＭ トリス−ＨＣｌ ｐＨ７．５、２０％グリセロール、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ）中で再懸濁した。水中で、０．３ｍｇ／ｍｌのリゾチーム（鶏の卵白から、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）のある容量を添加し、その懸濁液を、撹拌しながら１０〜１５分４℃で置いた。その懸濁液を、１０分７０００ｇで遠心分離し、そしてそのペレットを２０ｍＬの緩衝液２（２５ｍＭ ＫＰＯ4 ｐＨ７．４、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１ｍＭ ＤＴＴ、２０％グリセロール）中で再懸濁した。その懸濁液を、−８０℃で１サイクルの凍結融解を受けさせ、０．５ｍＭ ＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフルオリド、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加し、そしてその懸濁液を３回、２０分間超音波破砕させた。その懸濁液を、１０分１００００ｇで（細胞の残骸を取り除くために）遠心分離し、そしてその上澄みを回収し、２時間１０００００ｇで遠心分離した。そのペレット（膜タンパク質画分）を、２〜３ｍｌの緩衝液３（５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ ｐＨ７．４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０％グリセロール）中で再懸濁した。ＣＯスペクトルを測定するために、そのタンパク質画分を、２ｍＬの最終容量まで緩衝液３で希釈（１／１０）した。亜ジチオン酸ナトリウム（Ｎａ2Ｓ2Ｏ4）のいくつかの結晶を添加し、その試料を、２つのキュベットに分け、そして基準線を３７０〜５００ｎｍで記録した。そして試料キュベットを、一酸化炭素で飽和させ、そして種々のスペクトルを記録した。Ｐ４５０酵素の濃度を、９１ｍＭ-1・ｃｍ-1の減少したＣＯ複合体についての伸長率（Ｏｍｕｒａ， Ｔ． ＆ Ｓａｔｏ， Ｒ． （１９６４） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２３９， ２３７９−２３８７）を使用して、４５０ｎｍでのピークの幅から評価できる。
【０１１１】
この方法に従って、４５０ｎｍでの最大吸光度を有する典型的なＣＯスペクトルを、Ｐ４５０酵素への固有の折りたたみについて証明する、組換えＶｚＰ５２１−１１−１（配列番号：３５）及びＶｚＰ５２１−１６−１（配列番号：３６）タンパク質について測定した（図４）。
【０１１２】
実施例５
細菌における植物Ｐ４５０レダクターゼの非相同発現
植物Ｐ４５０の活性を再構築するために、第二の膜タンパク質の存在が必須である。このタンパク質、Ｐ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）は、ＮＡＤＰＨ（ニコチンアデニンジヌクレオチドホスフェート、還元形）からの電子のＰ４５０活性部位への輸送中に含まれる。ある植物からのＣＰＲは、他の植物からのＰ４５０酵素の活性を補うことができることが示されている（Ｊｅｎｓｅｎ ａｎｄ Ｍｏｌｌｅｒ （２０１０） Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｓｉｔｒｙ ７１， １３２−１４１）。
【０１１３】
いくつかのＣＰＲコードヌクレオチド配列は、種々の植物源から報告されている。例えば、２つの別個のＣＰＲ、ＡＴＲ１及びＡＴＲ２（ＮＣＢＩ受託番号ＣＡＡ４６８１４．１及びＣＡＡ４６８１５）は、シロイスナズナにおいて同定されている（Ｕｒｂａｎ ｅｔ ａｌ （１９９７） ／． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２（３１） １９１７６−１９１８６）。これらのＣＰＲは、種々の植物種からのいくつかのＰ４５０酵素を補うことが示されている。短縮された形のＡＴＲ１（１７個のＮ−末端アミノ酸欠失）についてコードするｃＤＮＡ（配列ｔｃＡＴＲ１−ｏｐｔ（配列番号：２９）を、Ｅ．ｃｏｌｉでの発現のために最適なコドン使用頻度（ＤＮＡ ２．０、Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用し合成し、かつそれぞれ５’末端及び３’末端でＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩ制限酵素を含んだ。このｃＤＮＡを、プラスミドｐＪ２０６−ｔｃＡＴＲ１−ｏｐｔを提供するｐＪ２０６プラスミド（ＤＮＡ ２．０、Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、ＣＡ、ＵＳＡ）中に連結した。その挿入物を、ｐＪ２０６−ｔｃＡＴＲ１−ｏｐｔプラスミドからＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩ制限酵素で消化し、そしてプラスミドｐＡＣＹＣ−ｔｃＡＴＲ１−ｏｐｔを提供するｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１発現プラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍｅｒｃｋ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）の対応する制限部位を連結した。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞におけるＣＰＲの機能的発現を、シトクロムＣの酵素還元に従って評価できる。プラスミドｐＡＣＹＣ−ｔｃＡＴＲ１−ｏｐｔを使用して、Ｂ１２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ）又はＪＭ１０９（ＤＥ３）（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を形質転換した。培養条件、タンパク質発現及び細胞を有さないタンパク質製造を、実施例４において記載したように行った。そのタンパク質を、５μＭのＦＡＤ、５μＭのＦＭＮ、４０ｍＭシトクロムＣ（ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、１ｍＭ ＭｇＣｌ2で懸濁した１ｍＬのトリス ｐＨ７．４で希釈した。反応を、０．１２ｍｍｏｌのＮＡＤＰＨ（Ｓｉｇｍａ）の添加により開始した。シトクロムＣの還元を、０．５〜２分にわたってＯＤ５５０ｎｍの増加を測定することによって記録した。レダクターゼ特異的活性（ｍＵｎｉｔｓ／μＬで）を、次の式：（ＯＤ最終−ＯＤ開始）／２１／時間（秒）／容量（μＬ）Ｘ６００００（ｍＵｎｉｔｓ／μＬで）を使用して算出した。組換えＡＴＲ１で測定した典型的な活性は、７〜１０ｍＵｎｉｔｓ／ｍＬの範囲であった。
【０１１４】
実施例６
２つのプラスミドを使用するＰ４５０及びＰ４５０レダクターゼの同時発現
植物Ｐ４５０を使用する細胞全体の生体内変化のために、単一の宿主細胞におけるＰ４５０及びＣＰＲタンパク質の同時発現を要求する。この同時発現を、２つのプラスミドを使用して得ることができる。例えばＢＬ２１ ＳｔａｒTM（ＤＥ３） Ｅ．ｃｏｌｉ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を、プラスミドｐＡＣＹＣ−ｔｃＡＴＲ１−ｏｐｔ及びプラスミドｐＣＷ−２１８−５２１−１１又はｐＣＷ−２１８−５２１−１６で同時形質転換させた。形質転換させた細胞を、カルベニシリン（５０μｇ／ｍｌ）及びクロラムフェニコール（３４μｇ／ｍｌ）ＬＢアガロースプレート上で選択した。単コロニーを使用して、同一の抗生物質で補った５ｍＬの液体ＬＢ培地をインキュベートした。その培養物を３７℃で一昼夜インキュベートした。翌日、同一の抗生物質で補った２〜２５０ｍＬのＴＢ培地及び１ｍＭチアミンＨＣＬを一昼夜培養物の０．２ｍＬに植えた。３７℃での培養の６時間後に、その培養物を２８℃まで冷却させ、そして１ｍＭのＩＰＴＧ及び７５ｍｇ／Ｌのδ−アミノレブリン酸を添加した。その培養を２４〜３６時間維持した。タンパク質分画を、実施例４において記載したように製造し、組換えＰ４５０及びＣＰＲの発現を、それぞれ実施例４及び５において記載した手法を使用して評価した。
【０１１５】
実施例７
１つのプラスミドを使用するＰ４５０及びＰ４５０レダクターゼの同時発現
ベチバーＰ４５０についてエンコードするｃＤＮＡ及びＣＰＲについてコードするｃＤＮＡを含む２シストロン性構成物を有する発現プラスミドを製造した。その構成物を、２つのコード領域間に、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）を含むスペーサー配列を挿入するために設計した。
【０１１６】
Ｅ．ｃｏｌｉ至適コドン使用頻度（ＤＮＡ ２．０、Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、ＣＡ、ＵＳＡ）で合成したｔｃＡＴＲ１−ｏｐｔ ｃＤＮＡ（配列番号：２９）を、開始コドン、スペーサー配列（配列番号：３０）及びＲＢＳ配列を含む３０ｂｐ 伸長の前に、５’末端に付加して改質した。ｔｃＡＴＲ１−ｏｐｔ ｃＤＮＡを、２３９０−ＣＰＲ−Ｆ２（配列番号：３１）及び２３９０−ＣＰＲ−Ｒ２ｂ（配列番号：３２）を使用して、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）を使用して、５μｌのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ１０Ｘ緩衝液、２００μＭのそれぞれのｄＮＴＰ、０．４μＭのそれぞれのプライマー、２．９単位のＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ及び２．５μｌの５０ｎｇのｐＪ２０６−ｔｃＡＴＲ１−ｏｐｔプラスミドを含む５０μｌの最終容量で、増幅した。熱サイクル条件は以下であった：９５℃で１．５分；９５℃で４５秒及び６０℃で３０秒及び７２℃で４分を３０サイクル；並びに７２℃で１０分。アガロースゲル上での精製後に、ＰＣＲ生成物を、ＨｉｎｄＩＩＩによって消化したｐＣＷ−２１８−５２１−１１及びｐＣＷ−２１８−５２１−１６プラスミド中で、製造者の使用説明書に従って、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｄｒｙ−Ｄｏｗｎ ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ Ｅｕｒｏｐｅ）を使用して連結した。得られた２つのプラスミドｐＣＷ−２３９１−５２１−１１及びｐＣＷ−２３９２−５２１−１６は、それぞれｔｃＡＴＲｌ−ｏｐｔ配列に続くＶｚＰ５２１−１１−１及びＶｚＰ５２１−１６−１配列からなる２シストロン性構成物を含む。
【０１１７】
Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を、これらの２つのプラスミドの１つで形質転換し、そして膜タンパク質画分を、実施例４において記載されたように製造した。Ｐ４５０及びＣＰＲ発現を、実施例４及び５において記載したように、ＣＯ結合スペクトル及びＮＡＤＰＨ還元アッセイに従って証明した。
【０１１８】
実施例８
ベチバーＰ４５０及びＣＰＲを発現するＥ．ｃｏｌｉの全細胞を使用するジザエンからクシモルへの生物変換
（＋）−ジザエンの酸化を、ベチバーＰ４５０及びＣＰＲを発現するＥ．ｃｏｌｉの全細胞を使用して実施できる（生物変換）。ジザエンを、特許ＷＯ ２０１０／１３４００４号において記載された方法に従って遺伝子操作したＥ．ｃｏｌｉ細胞を使用して、及び配列受託番号ＨＩ９３１３６９を有するセスキテルペン合成酵素を使用して製造した。
【０１１９】
簡単に、ＢＬ２１ＳｔａｒTM（ＤＥ３）Ｅ．ｃｏｌｉ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｔｄ）を、プラスミドｐＡＣＹＣ−４５０６及びプラスミドｐＥＴＤｕｅｔ−ＶｚＺＳ−ｏｐｔで形質転換した。プラスミドｐＡＣＹＣ−４５０６は、メバロン酸をＦＰＰに変換する生合成経路の５つの酵素：メバロン酸キナーゼ（ＭｖａＫ１）、ホスホメバロン酸キナーゼ（ＭｖａＫ２）、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＭｖａＤ）、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ｉｄｉ）及びファルネシル二リン酸合成酵素（ＦＰＳ）についてコードする遺伝子を含む。このプラスミドを構築するために、ＦＰＳ遺伝子を、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅゲノムＤＮＡから増幅し、そしてｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１の最初の多重クローン部位（ＭＣＳ）中で連結し、そしてＭｖａＫ１、ＭｖａＫ２、ＭｖａＤ及びｉｄｉについての遺伝子をコードするオペロンを、肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）（ＡＴＣＣ ＢＡＡ−３３４）のゲノムＤＮＡから増幅し、そして第二のＭＣＳ中に連結した。ｐＥＴＤｕｅｔ−ＶｚＺＳ−ｏｐｔは、ベチバー（＋）−ジザエン合成酵素のコドン最適化版を含む（ＷＯ ２０１０／１３４００４号の配列番号：１１において記載されている）。
【０１２０】
形質転換した細胞の単コロニーを使用して、カルベニシリン（５０ｍｇ／ｍｌ）及びクロラムフェニコール（３４ｍｇ／ｍｌ）で補った５ｍＬのＬＢ培地をインキュベートした。培養物を３７℃で一昼夜インキュベートした。翌日、同一の抗生物質で補った１ＬのＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）培地に、１／１００容量の一昼夜培養物を植えた。３７℃で６時間のインキュベート後に、培養物を２８℃まで冷却し、そして１ｍＭのＩＰＴＧ、１ｇ／ｍＬの濃度で０．５Ｎ ＮａＯＨ中でメバロノラクトン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を溶解し３０分３７℃で溶液をインキュベートすることによって製造した２ｇ／Ｌのメバロン酸、及び１００ｇ／ＬのＡｍｂｅｒｌｉｔｅTMＸＡＤTM−４樹脂（Ｒｈｏｍ ａｎｄ Ｈａａｓ）を培養物に添加した。４８時間のインキュベート後に、樹脂を回収し、水で洗浄し、ジエチルエーテルの３容量で溶出した。その溶媒を回収し、そしてその生成物を、シリカゲルによって、溶媒としてｎ−ヘキサンを使用してフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。（＋）−ジザエンを含む画分をプールし、蒸留によって溶媒を取り出し、そして残りを、酸化アッセイのための基材として使用した。
【０１２１】
Ｅ．ｃｏｌｉ細胞（ＢＬ２１ＳｔａｒTM（ＤＥ３）Ｅ．ｃｏｌｉ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｔｄ）又はＪＭ１０９（ＤＥ３）（Ｐｒｏｍｅｇａ））を、プラスミドｐＣＷ−２３９１−５２１−１１又はｐＣＷ−２３９２−５２１−１６で形質転換し、又は細胞を、プラスミドｐＣＷ−２１８−５２１−１１又はｐＣＷ−２１８−５２１−１６及びｐＡＣＹＣ−ｔｃＡＴＲ１−ｏｐｔで同時形質転換し、そして３％グリセロールで補ったＴＢ培地、又は１％グルコースで補ったＬＢ培地中で育てた。培養物を、１の光学密度に達するまで３７℃でインキュベートした。そして培養物を、２８℃にし、１ｍＭのＩＰＴＧ及び７４μｇ／ｍｌのδ−アミノレブリン酸を添加し、そしてその培養物を２４時間インキュベートした。
【０１２２】
細胞を、指数成長相で採取し、遠心分離し、そして５％グリセロール又は３％グルコースで補ったリン酸カリウム緩衝液５０ｍＭ ｐＨ７．０の０．５容量中で再懸濁した。基質（（＋）−ジザエン）を、１０ｍｇのＴｗｅｅｎ（登録商標）２０（ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、１０ｍｇの消泡剤（Ｅｒｏｌ ＤＦ、ＰＭＣ Ｏｕｖｒｉｅ、Ｌｅｓｑｕｉｎ、Ｆｒａｎｃｅ）、２０ｍｇの（＋）−ジザエン及び１ｍｌの水から構成される混合物として０．５ｍｇ／ｍｌの最終濃度で添加した。変換を、穏やかな撹拌で２０℃で２４時間行った。培養液を酢酸エチルの２容量で抽出し、そして抽出物を、Ａｇｉｌｅｎｔ ５９７５に連結したＡｇｉｌｅｎｔ ６８９０ Ｓｅｒｉｅｓ ＧＣシステム上でＧＣＭＳによって分析した。ＧＣを、３０ｍ ＳＰＢ−１キャピラリーカラム（Ｓｕｐｅｌｃｏ、Ｂｅｌｉｅｆ ｏｎｔｅ、ＰＡ）によって０．２５ｍｍ内部直径で満たした。キャリヤーガスは、１ｍＬ／分の一定流でＨｅであった。開始炉温度は、５０℃（１分保持）、続いて１０℃／分〜３００℃／分の勾配であった。生成物の同定は、質量スペクトル及び保持指数の、確実な基準及び内部データベースとの比較に基づいた。
【０１２３】
これらの条件において、（＋）−ジザエンの酸化を、ＶｚＰ５２１−１１−１及びＶｚＰ５２１−１６−１組換えタンパク質を含む細胞で観察した。３つの生成物を観察し、そしてＧＣＭＳ分析によって同定した：（＋）−ジザエンの連続酸化から得られるクシモル、ジザナール、及びジザン酸。ＶｚＰ５２１−１１−１及びＶｚＰ５２１−１６２−１酵素は、従って（＋）−ジザエンのクシモルへの酸化を触媒化する。クシモルのジザナール及びジザン酸へのさらなる酸化を、組換えＰ４５０によって、又は内因性Ｅ．ｃｏｌｉ酵素活性によって触媒化できる（図７）。
【０１２４】
実施例９
ベチバーＰ４５０及びＣＰＲを発現するＥ．ｃｏｌｉの全細胞を使用する他のモノテルペン及びセスキテルペン分子の生物変換
ベチバーＰ４５０及びＣＰＲを発現するＥ．ｃｏｌｉ細胞を製造し、育て、そして生物変換を、実施例８において記載したリン酸カリウム緩衝液中で得た細胞を使用して実施した。
【０１２５】
アッセイを、いくつかのテルペン分子で実施し、そして酸素化テルペン分子の形成を、実施例８において記載したＧＣＭＳ分析を使用して評価した。（＋）−ジザエンに加えて、生物変換を次の分子で観察した：（＋）−リモネン、（−）−リモネン、アルファ−ピネン、アルファ−セドレン、アルファ−ロンギピネン、アルファ−フネブレン、ツジョセン、バレンセン、ベータ−カミグレン、アロアルマデンドレン、アルファ−ネオクロベン、イソサチベン、レデン、アルファ−フムレン、アルファ−グルユネン、ガンマ−グルユネン、ベータ−フネブレン、アルファ−コパエン（ｃｏｐａｅｎｅ）、アルファ−グルユネン及びベータ−ピネン。これらの分子の構造を図１において示す。これらの生物変換のＧＣＭＳ分析からのクロマトグラムの例を図８において示す。試験した基質のいくつかについて、生成物を同定でき、かつ図９において示す。
【０１２６】
実施例１０
ベチバーＰ４５０を使用する化合物のｉｎ ｖｉｔｒｏ酸化
ベチバーからのＰ４５０を使用するセスキテルペンの酸化を、細胞溶解物又は部分的に生成したタンパク質を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏでも実施できる。
【０１２７】
Ｅ．ｃｏｌｉ細胞（ＢＬ２１ＳｔａｒTM（ＤＥ３）Ｅ．ｃｏｌｉ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｔｄ）又はＪＭ１０９（ＤＥ３）（Ｐｒｏｍｅｇａ））を、プラスミドｐＣＷ−２３９１−５２１−１１又はｐＣＷ−２３９２−５２１−１６で形質転換し、又は細胞を、プラスミドｐＣＷ−２１８−５２１−１１又はｐＣＷ−２１８−５２１−１６及びｐＡＣＹＣ−ｔｃＡＴＲ１−ｏｐｔで同時形質転換した。細胞培養条件、タンパク質発現及び膜タンパク質製造を、実施例４及びにおいて記載したように行った。これらのタンパク質画分を、（＋）−ジザエン又は実施例９において挙げたテルペン分子のｉｎ ｖｉｔｒｏでの変換のために使用した。典型的なアッセイを、２０〜５０μＬのタンパク質、０．４ｍｇのＮＡＤＰＨ（Ｓｉｇｍａ）、５μＭのＦＡＤ（フラビンアデニンジヌクレオチド、Ｓｉｇｍａ）、５μＭのＦＭＮ（フラビンモノヌクレオチド、Ｓｉｇｍａ）、１００ｍＭトリス緩衝液ｐＨ７．４の１ｍＬの合計容量中で０．０５ｍｇの（＋）−ジザエンから構成した。いくつかのアッセイにおいて、ＮＡＤＰＨ再構築系を添加し、そして２５ｍＭのグルコース６−ホスフェート（Ｓｉｇｍａ）及び６ｍＵｎｉｔｓのグルコース６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ）からなった。アッセイを、２〜１２時間３０℃でインキュベートした。そして試料を、酢酸エチルの１容量で２回抽出し、そして実施例８において記載されたようにＧＣＭＳによって分析した。
【０１２８】
このアプローチを使用して、同一の生成物を、実施例８及び９において記載されたような全体のＥ．ｃｏｌｉ細胞を使用した場合に得た。
【０１２９】
実施例１１
遺伝子操作した細胞におけるクシモルのｉｎ ｖｉｖｏ製造
（＋）−ジザエンの酸化生成物を、遺伝子操作したＥ．ｃｏｌｉ細胞中でも実施して、炭素源、例えばグルコース又はグリセロールからセスキテルペンを製造できる。プラスミドを、Ｐ４５０、Ｐ４５０レダクターゼ及びテルペン合成酵素から構成されるオペロンを含むｐＣＷｏｒｉ（Ｂａｒｎｅｓ Ｈ．Ｊ （１９９６） Ｍｅｔｈｏｄ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２７２， ３−１４）プラスミドから製造した。そして、２つのプラスミドを、ｐＣＷ−２３９１−５２１−１１又はｐＣＷ−２３９２−５２１−１６におけるＣＰＲ配列の終止コドンの後に、ＲＢＳ配列及び（＋）−ジザエン合成酵素（ＶｚＺＳ）についてコードする最適化配列を挿入することによって製造した。
【０１３０】
ＶｚＺＳを、プライマー２４０１−ＶｚＺＳ−Ｆ（配列番号：３３）及び２４０１−ＶｚＺＳ−Ｒ（配列番号：３４）を使用して、ｐＥＴＤｕｅｔ−ＶｚＺＳ−ｏｐｔプラスミド（ＷＯ ２０１０／１３４００４号において記載されている）から増幅した。ＰＣＲを、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）を使用して、５μｌのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ１０Ｘ緩衝液、２００μＭのそれぞれのｄＮＴＰ、０．４μＭのそれぞれのプライマー、２．９単位のＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ及び５０ｎｇの鋳型を含む５０μｌの最終容量で実施した。熱サイクル条件は以下であった：９５℃で１．５分；９５℃で４５秒及び６０℃で３０秒及び７２℃で４分を３０サイクル；並びに７２℃で１０分。ＰＣＲ生成物を精製し、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏｒＩ制限酵素で消化したｐＣＷ−２３９１−５２１−１１又はｐＣＷ−２３９２−５２１−１６プラスミド中で連結した。このライゲーションを、製造者の使用説明書に従って、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｄｒｙ−Ｄｏｗｎ ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ Ｅｕｒｏｐｅ）を使用して実施した。得られたプラスミドｐＣＷ−２４０１−５２１−１１及びｐＣＷ−２４０２−５２１−１６は、それぞれＶｚＰ５２１−１１−１又はＶｚＰ５２１−１６−１配列、ｔｃＡＴＲｌ−ｏｐｔ配列（Ｐ４５０レダクターゼ）及びＶｚＺＳ配列（（＋）−ジザエン合成酵素）からなる挿入部を含む（図１０）。
【０１３１】
他の発現プラスミドを、完全なメバロン酸経路のための酵素をコードする遺伝子からなる２つのオペロンを含んで製造した。大腸菌アセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼ（ａｔｏＢ）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）ＨＭＧ−ＣｏＡ合成酵素（ｍｖａＳ）、黄色ブドウ球菌ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ（ｍｖａＡ）及びサッカロミセス・セレビジエＦＰＰ合成酵素（ＥＲＧ２０）遺伝子からなる第一の合成オペロンを、化学的に合成（（ＤＮＡ２．０、Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、ＣＡ、ＵＳＡ）し、そしてＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩで消化したｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を連結して、ｐＡＣＹＣ−２９２５８を得た。このプラスミドの遺伝子は、アセチル−ＣｏＡからメバロン酸塩への変換に必要な酵素について、及びＦＰＰ合成酵素についてコードする。第二オペロンは、メバロン酸塩のＩＰＰ及びＤＭＡＰＰへの変換に必要な４つの酵素についてコードする遺伝子を含み、以下のプライマーを使用してプラスミドｐＡＣＹＣ−４５０６（実施例８）を増幅した：５’−ＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＡＣＡＡＡＡＡＡＡＡＧＴＴＧＧＴＧＴＣＧＧＴＣＡＧＧ−３’（順方向）及び５’−ＣＴＴＴＡＣＣＡＧＡＣＴＣＧＡＧＴＴＡＣＧＣＣＴＴＴＴＴＣＡＴＣＴＧＡＴＣＣＴＴＴＧＣ−３’（逆方向）。得られたアンプリコンを、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ２．０ Ｄｒｙ−Ｄｏｗｎ ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して、ＮｄｅＩ−ＸｈｏＩで消化したｐＡＣＹＣ−２９２５８中にクローンし、ｐＡＣＹＣ−２９２５８−４５０６ベクターを提供した。
【０１３２】
ＯｖｅｒＥｘｐｒｅｓｓTMＣ４３（ＤＥ３）Ｅ．ｃｏｌｉ細胞（Ｌｕｃｉｇｅｎ（登録商標）Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を、プラスミドｐＡＣＹＣ−２９２５８−４５０６及びプラスミドｐＣＷ−２４０１−５２１−１１、又はプラスミドｐＣＷ−２４０２−５２１−１６で同時形質添加させた。形質転換した細胞の単コロニーを使用して、カルベニシリン（１００ｍｇ／ｍｌ）及びクロラムフェニコール（１７ｍｇ／ｍｌ）で補った５ｍＬのＬＢ培地をインキュベートした。その培養物を、３７℃で一昼夜培養し、それを使用して、２ｇ／Ｌの酵母抽出物、３％グリセロール、１０μＭのＦｅＳＯ4、１００μｇ／ｍｌのカルベニシリン及び１７μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールで補ったＭ９培地に植えた。その培養物を、６時間３７℃でインキュベートし、２５℃まで冷却し、そして０，１ｍＭのＩＰＴＧ、７４μｇ／ｍｌのδ−アミノレブリン酸及び１／１０容量のドデカンを添加した。４８時間後に、その培養物を、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル（ＭＴＢＥ）の２容量で抽出し、そしてその抽出物を、最初に８０℃に設定し、１分保持し、１０℃／分〜３００℃の勾配である炉温度を除いて、実施例８において記載したＧＣＭＳによって分析した。
【０１３３】
セスキテルペン（＋）−ジザエン及び誘導されたアルコール及びアルデヒド（クシモル及びジザナール）を検出した。ジザン酸も少量の生成物として見出された（図１１）。この実験は、遺伝子操作した細胞において、セスキテルペン（＋）−ジザエンが製造され、かつ非相同Ｐ４５０及びＣＰＲ錯体によって酸化されたことを示す。
【０１３４】
この実施例は、本発明によるポリペプチドを発現するために形質転換させたＥ．ｃｏｌｉ細胞が、Ｐ４５０レダクターゼとの組合せで使用する条件で、テルペン化合物、例えばジザエンを酸化することができることを示す。形質転換させたＥ．ｃｏｌｉ細胞での他の酵素は、かかる酸化に必須でない。実際に酸化テルペンも、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞をシトクロムＰ４５０で形質転換させた場合に、レダクターゼ及びテルペン合成酵素を製造するが、低量である。形質転換させたＥ．ｃｏｌｉ細胞を有するかかる他の酵素を、シトクロムＰ４５０について基質として使用できるテルペンの量を増加する特有の目的のために添加する。
【図１】
0005993019.tif 000006
【図２−１】
0005993019.tif 000007
【図２−２】
0005993019.tif 000008
【図３】
0005993019.tif 000009
【図４】
0005993019.tif 000010
【図５】
0005993019.tif 000011
【図６】
0005993019.tif 000012
【図７】
0005993019.tif 000013
【図８】
0005993019.tif 000014
【図９】
0005993019.tif 000015
【図１０】
0005993019.tif 000016
【図１１】
0005993019.tif 000017
【配列表】
0005993019000001.app