(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（Ｐ２）または（Ｐ３）のオリゴヌクレオチドからなり、前記（Ｐ２）のオリゴヌクレオチドが、配列番号８または配列番号９で示されるオリゴヌクレオチドであり、前記（Ｐ３）のオリゴヌクレオチドが、配列番号１０または配列番号３１で示されるオリゴヌクレオチドであり、５’末端の塩基に蛍光標識物質を有することを特徴とする、疾患関連遺伝子であるＫ−ｒａｓ遺伝子の多型検出用グアニン消光プローブ。
5'-cttgcctacgccaccagctccaactac-3'    （配列番号８）
5'-cttgcctacgccaccagctccaactacca-3'  （配列番号９）
5'-ctcttgcctacgccaccagctccaact-3'    （配列番号１０）
5'-ctcttgcctacgccaccagctccaacttgctggctacgc-3'  （配列番号３１）
【請求項２】
前記多型検出用グアニン消光プローブが、Ｔｍ解析用のプローブである、請求項１記載の多型検出用グアニン消光プローブ。
【請求項３】
請求項１または２記載のＫ−ｒａｓ遺伝子の多型検出用グアニン消光プローブを含むことを特徴とする、疾患関連遺伝子の多型検出用試薬。
【請求項４】
さらに、Ｋ−ｒａｓ遺伝子における検出目的の多型を含む領域を増幅するためのプライマーを含む、請求項３に記載の多型検出用試薬。
【請求項５】
前記プライマーが、配列番号１の塩基配列における塩基番号２２０−２２５を含む領域を増幅するためのプライマーである、請求項４に記載の多型検出用試薬。
【請求項６】
前記プライマーが、
配列番号１１、配列番号１２または配列番号３２に示すオリゴヌクレオチドからなるプライマー、および、
配列番号１３〜１８、配列番号３３または配列番号３４に示すオリゴヌクレオチドからなるプライマーである、請求項４または５に記載の多型検出用試薬。
5'-accttatgtgtgacatgttctaatatagtcacattttc-3'  （配列番号１１）
5'-aaggcctgctgaaaatgactg-3'                （配列番号１２）
5'-ggtactggtggagtatttgatagtgt-3’          （配列番号３２）
5'-ctcttgcctacgccacc-3'                    （配列番号１３）
5'-cactcttgcctacgccacd-3'                  （配列番号１４）
5'-gcactcttgcctacgccad-3'                  （配列番号１５）
5'-caaggcactcttgcctacgca-3'                （配列番号１６）
5'-tcaaggcactcttgcctacgt-3'                （配列番号１７）
5'-ggtcctgcaccagtaatatgca-3'                （配列番号１８）
5'-gaattagctgtatcgtmaaggcactc-3’          （配列番号３３）
5'-cacaaaatgattctgaattagctgtatcg-3’        （配列番号３４）
【請求項７】
前記プライマーが、
配列番号１３に示すオリゴヌクレオチドからなるプライマー、および、
配列番号１４〜１７のいずれかに示すオリゴヌクレオチドからなるプライマーを含む、請求項４から６のいずれか一項に記載の多型検出用試薬。
【請求項８】
さらに、ＢＲＡＦ遺伝子の多型検出用グアニン消光プローブを含み、
前記プローブが、配列番号２における塩基番号２２９の塩基を含む領域にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドからなるプローブである、請求項３から７のいずれか一項に記載の多型検出用試薬。
【請求項９】
前記ＢＲＡＦ遺伝子の多型検出用グアニン消光プローブが、配列番号２７または配列番号３６の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプローブである、請求項８に記載の多型検出用試薬。
5'-ctagctacagagaaatctc-3'  （配列番号２７）
5'-gctacagagaaatctc-3'    （配列番号３６）
【請求項１０】
さらに、ＢＲＡＦ遺伝子における検出目的の多型を含む領域を増幅するためのプライマーを含む、請求項８または９に記載の多型検出用試薬。
【請求項１１】
前記プライマーが、配列番号２の塩基配列における塩基番号２２９番目の塩基を含む領域を増幅するためのプライマーである、請求項１０に記載の多型検出用試薬。
【請求項１２】
前記プライマーが、
配列番号２０または配列番号３８に示すオリゴヌクレオチドからなるプライマー、および、
配列番号２１または配列番号３９に示すオリゴヌクレオチドからなるプライマーである、請求項１０または１１に記載の多型検出用試薬。
5'-cctttacttactacacctcagatatat-3'    （配列番号２０）
5'-tgcttgctctgataggaaaatgagatctac-3'  （配列番号３８）
5'-acaactgttcaaactgatgggac-3'        （配列番号２１）
5'-aaactgatgggacccactccat-3'          （配列番号３９）
【請求項１３】
請求項１または２記載の多型検出用グアニン消光プローブを用いて、疾患関連遺伝子であるＫ−ｒａｓ遺伝子の多型を検出する工程を含むことを特徴とする、疾患関連遺伝子の多型検出方法。
【請求項１４】
下記（Ａ）工程および（Ｂ）工程を含む、請求項１３に記載の多型検出方法。
（Ａ）前記多型を検出する被検核酸と請求項１または２記載の多型検出用グアニン消光プローブとを含む反応系の温度を変化させ、前記被検核酸と前記多型検出用グアニン消光プローブとのハイブリッドの融解状態を示すシグナル値を測定する工程
（Ｂ）前記温度変化に伴う前記シグナル値の変動から、前記被検核酸における前記多型を検出する工程
【請求項１５】
前記反応系が、二種類以上の前記多型検出用グアニン消光プローブを含み、前記二種類以上の多型検出用グアニン消光プローブが、それぞれ、異なる蛍光標識物質を有する、請求項１４に記載の多型検出方法。
【請求項１６】
前記（Ａ）工程において、前記被検核酸が、鋳型核酸からの増幅物である、請求項１４または１５に記載の多型検出方法。
【請求項１７】
さらに、下記（Ｘ）工程を含む、請求項１６に記載の多型検出方法。
（Ｘ）  鋳型核酸から増幅物を生成する工程
【請求項１８】
前記（Ｘ）工程が、前記多型検出用グアニン消光プローブの存在下、前記反応系において、前記鋳型核酸から核酸増幅物を生成する工程であり、
前記（Ａ）工程において、前記（Ｘ）工程における前記反応系の温度を変化させ、前記シグナル値の測定を行う、請求項１７に記載の多型検出方法。
【請求項１９】
前記（Ｘ）工程が、配列番号１の塩基配列における塩基番号２２０−２２５を含む領域を増幅するためのプライマーを使用して、前記増幅物を生成する、請求項１７または１８に記載の多型検出方法。
【請求項２０】
前記プライマーが、
配列番号１１、配列番号１２または配列番号３２に示すオリゴヌクレオチドからなるプライマー、および、
配列番号１３〜１８、配列番号３３または配列番号３４に示すオリゴヌクレオチドからなるプライマーである、請求項１９に記載の多型検出方法。
5'-accttatgtgtgacatgttctaatatagtcacattttc-3'  （配列番号１１）
5'-aaggcctgctgaaaatgactg-3'                （配列番号１２）
5'-ggtactggtggagtatttgatagtgt-3’          （配列番号３２）
5'-ctcttgcctacgccacc-3'                    （配列番号１３）
5'-cactcttgcctacgccacd-3'                  （配列番号１４）
5'-gcactcttgcctacgccad-3'                  （配列番号１５）
5'-caaggcactcttgcctacgca-3'                （配列番号１６）
5'-tcaaggcactcttgcctacgt-3'                （配列番号１７）
5'-ggtcctgcaccagtaatatgca-3'                （配列番号１８）
5'-gaattagctgtatcgtmaaggcactc-3’          （配列番号３３）
5'-cacaaaatgattctgaattagctgtatcg-3’        （配列番号３４）
【請求項２１】
前記プライマーが、
配列番号１３に示すオリゴヌクレオチドからなるプライマー、および、
配列番号１４〜１７のいずれかに示すオリゴヌクレオチドからなるプライマーを含む、請求項１９または２０に記載の多型検出方法。
【請求項２２】
前記疾患関連遺伝子であるＢＲＡＦ遺伝子の多型を、同一の反応系で検出する、請求項１３から２１のいずれか一項に記載の多型検出方法。
【請求項２３】
前記（Ａ）工程が、
前記多型を検出する被検核酸と、請求項１または２記載の多型検出用グアニン消光プローブおよびＢＲＡＦ遺伝子の多型検出用グアニン消光プローブとを含む反応系の温度を変化させ、前記被検核酸と前記各多型検出用グアニン消光プローブとのハイブリッドの融解状態を示すシグナル値を測定する工程である、請求項２２に記載の多型検出方法。
【請求項２４】
前記ＢＲＡＦ遺伝子の多型検出用グアニン消光プローブが、
配列番号２の塩基配列における塩基番号２２９の塩基を含む領域にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドからなるプローブである、請求項２３に記載の多型検出方法。
【請求項２５】
前記ＢＲＡＦ遺伝子の多型検出用グアニン消光プローブが、配列番号２７または配列番号３６の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプローブである、請求項２３または２４に記載の多型検出方法。
5'-ctagctacagagaaatctc-3'  （配列番号２７）
5'-gctacagagaaatctc-3'    （配列番号３６）
【請求項２６】
請求項１または２記載の多型検出用グアニン消光プローブおよび前記ＢＲＡＦ遺伝子の多型検出用グアニン消光プローブが、それぞれ、異なる標識物質を有する標識プローブである、請求項２３から２５のいずれか一項に記載の多型検出方法。
【請求項２７】
前記（Ｘ）工程が、あわせて、配列番号２の塩基配列における塩基番号２２９の塩基を含む領域を増幅するためのプライマーを使用して、前記増幅物を生成する、請求項１９から２６のいずれか一項に記載の多型検出方法。
【請求項２８】
前記プライマーが、
配列番号２０または配列番号３８に示すオリゴヌクレオチドからなるプライマー、および、
配列番号２１または配列番号３９に示すオリゴヌクレオチドからなるプライマーである、請求項２７に記載の多型検出方法。
5'-cctttacttactacacctcagatatat-3'    （配列番号２０）
5'-tgcttgctctgataggaaaatgagatctac-3'  （配列番号３８）
5'-acaactgttcaaactgatgggac-3'        （配列番号２１）
5'-aaactgatgggacccactccat-3'          （配列番号３９）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、疾患関連遺伝子の多型を検出するためのプローブおよびその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＲＡＳタンパク質およびＲＡＦタンパク質は、ＲＡＳ／ＲＡＦ／ＭＡＰＫ経路による細胞内シグナル伝達のカスケードを形成するタンパク質である。前記ＲＡＳ／ＲＡＦ／ＭＡＰＫ経路は、活性型ＲＡＳタンパク質によりＲＡＦタンパク質が活性化され、活性型ＲＡＦタンパク質によりＭＥＫタンパク質が活性化され、さらに、活性型ＭＥＫタンパク質によりＭＡＰＫタンパク質が活性化される。これによって、細胞の増殖および分化等を調節している。【０００３】
前記ＲＡＳタンパク質の一種であるＫ−Ｒａｓタンパク質は、ＧＴＰアーゼ活性を有するＧＤＰ／ＧＴＰ結合タンパク質であり、ヒトでは、第１２染色体上に位置するＫ−ｒａｓ遺伝子によりコードされている。前記Ｋ−ｒａｓ遺伝子は、コドン１２、コドン１３等における変異が知られている（非特許文献１〜３等）。コドン１２の変異は、配列番号１のＫ−ｒａｓ遺伝子の部分配列において、塩基番号２２０の塩基（ｎ）のグアニン（ｇ）から、アデニン（ａ）、シトシン（ｃ）またはチミン（ｔ）への置換、塩基番号２２１の塩基（ｎ）のグアニン（ｇ）から、アデニン（ａ）、シトシン（ｃ）またはチミン（ｔ）への置換がある。コドン１３の変異は、配列番号１のＫ−ｒａｓ遺伝子の塩基配列において、塩基番号２２３の塩基（ｋ）のグアニン（ｇ）から、チミン（ｔ）への置換、塩基番号２２４の塩基（ｒ）のグアニン（ｇ）から、アデニン（ａ）への置換がある。前記コドン１２の変異により、Ｋ−ｒａｓタンパク質の１２番目のグリシン（Ｇ）は、セリン（Ｓ）、アルギニン（Ｒ）、システイン（Ｃ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、アスパラギン（Ｎ）、フェニルアラニン（Ｆ）またはロイシン（Ｌ）に変異する。前記コドン１３の変異により、Ｋ−ｒａｓタンパク質の１３番目のグリシン（Ｇ）は、アスパラギン酸（Ｄ）またはシステイン（Ｃ）に変異する。Ｋ-ｒａｓ遺伝子のコドン１２またはコドン１３の変異は、例えば、大腸癌、膵臓癌等の癌疾患、ＣＦＣ（ｃａｒｄｉｏ−ｆａｃｉｏ−ｃｕｔａｎｅｏｕｓ）等の先天性疾患との関連、抗ＥＧＦＲ抗体薬に対する薬剤耐性との関連が報告されている（非特許文献１〜３等）。したがって、Ｋ−ｒａｓ遺伝子における、これらの変異の有無、すなわち、多型の検出は、例えば、前述の疾患の診断、より効果的な疾患の治療法の選択等に、極めて重要である。【０００４】
また、前記ＲＡＦタンパク質の一種であるＢＲＡＦタンパク質は、セリン−トレオニンキナーゼ活性を有するタンパク質であり、ヒトでは、第７染色体上に位置するＢＲＡＦ遺伝子によりコードされている。前記ＢＲＡＦ遺伝子の変異も、前記Ｋ−ｒａｓ遺伝子と同様に、前述の癌疾患および先天性疾患との関連、薬剤耐性との関連が報告されている（非特許文献１〜３等）。前記ＢＲＡＦ遺伝子の変異は、配列番号２のＢＲＡＦ遺伝子の部分配列における塩基番号２２９の塩基（ｗ）のチミン（ｔ）から、アデニン（ａ）への置換が知られている。前記塩基が野生型（ｔ）の場合、ＢＲＡＦタンパク質の６００番目のアミノ酸はバリン（Ｖ）となり、前記塩基が変異型（ａ）の場合、ＢＲＡＦタンパク質の６００番目のアミノ酸はグルタミン酸（Ｅ）となる。このアミノ酸残基の変異により、腫瘍原性が獲得されると考えられている。したがって、前記Ｋ−ｒａｓ遺伝子に加えて、前記ＢＲＡＦ遺伝子の変異の有無、すなわち、多型を検出することにより、例えば、前述の疾患の診断、より効果的な疾患の治療法の選択等の精度を、さらに向上できる。【０００５】
他方、遺伝子の多型を検出する方法は、様々な方法が報告されており、例えば、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）−ＲＦＬＰ（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法等があげられる。【０００６】
前記ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法は、試料の標的ＤＮＡについて、検出目的の領域をＰＣＲで増幅させ、その増幅物を制限酵素処理し、多型による制限断片長の変化を、サザンハイブリダイゼーションによりタイピングする方法である。遺伝子に目的の変異が存在すると、制限酵素の認識部位が消失するため、切断の有無、すなわち、制限断片長の変化によって、変異の有無を検出できる。【０００７】
しかしながら、前記ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法は、例えば、ＰＣＲの後、得られた増幅物を種々の制限酵素で処理し、解析する必要があり、手間がかかる。また、得られた増幅物の制限酵素処理は、一旦、増幅物を取り出して行う必要がある。このため、１回目の反応で得られた増幅物が飛散し、２回目の別の反応に混入するおそれがある。このような問題から、多型の検出を自動化し難い。【０００８】
このような問題から、近年、多型の検出方法として、Ｔｍ（Ｍｅｌｔｉｎｇ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）解析が注目されている。これは、まず、検出目的の多型を含む領域に相補的なプローブを用いて、被検核酸と前記プローブとのハイブリッド（二本鎖核酸）を形成させる。そして、得られたハイブリッドに加熱処理を施して、温度上昇に伴う前記ハイブリッドの一本鎖核酸への解離（融解）を、吸光度等のシグナル測定により検出する。この検出結果に基づいてＴｍ値を決定することによって、多型を判断する方法である。Ｔｍ値は、ハイブリッドにおける両一本鎖核酸の相補性が高い程高く、相補性が低い程低くなる。そこで、検出対象部位の多型がＸまたはＹの場合、目的の多型（例えば、Ｙ）を含む核酸とそれに１００％相補的なプローブとのハイブリッドについて、予めＴｍ値（評価基準値）を求めておく。続いて、前記被検核酸と前記プローブとのＴｍ値（測定値）を測定する。そして、この測定値が、前記評価基準値と同じであれば、前記被検核酸と前記プローブとはパーフェクトマッチである、すなわち、前記被検核酸の検出対象部位が目的の多型（Ｙ）であると判断できる。他方、前記測定値が前記評価基準値よりも低い場合、前記被検核酸と前記プローブとはミスマッチである、すなわち、前記被検核酸の検出対象部位が他方の多型（Ｘ）であると判断できる。このような方法であれば、例えば、前記プローブを添加したＰＣＲ反応液に温度処理を施し、シグナル測定を行うのみで、多型を検出できる。このため、検出装置の自動化も可能である。【０００９】
しかしながら、このようなＴｍ解析を利用した検出方法は、例えば、一塩基の違いをＴｍ値によって判断しなければならない。また、遺伝子が複数の多型を有する場合、１つのサンプルを解析するにも多大な労力を伴う。このため、多数のサンプルを解析することは、実用的ではないという問題もある。このため、特に、野生型の多型と複数の変異型の多型とが混在している場合等であっても、変異の有無を正確に検出することが求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｃａｎｃｅｒ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ、２０００年１１月、ｐ．１１９３−１１９７
【非特許文献２】Ｊ  Ｍｏｌ  Ｄｉａｇｎ.、２００６年１１月、Ｖｏｌ．８、Ｎｏ．５、ｐ．５４０−５４３
【非特許文献３】Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ.、２００９年１０月７日、Ｖｏｌ．１０１、Ｎｏ．１９、ｐ．１３０８−１３２４（Ｅｐｕｂ：２００９年９月８日）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
このような理由から、Ｋ−ｒａｓ遺伝子の多型の検出は、例えば、前記疾患の診断および治療法の選択において非常に重要である。そこで、本発明は、疾患関連遺伝子であるＫ−ｒａｓ遺伝子について、多型を、簡便且つ優れた信頼性で判別可能な、多型検出用プローブおよびその用途の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
前記目的を達成するために、本発明の多型検出用プローブは、疾患関連遺伝子であるＫ−ｒａｓ遺伝子の多型を検出するためのプローブであって、下記（Ｐ１）、（Ｐ２）、（Ｐ３）、（Ｐ１’）、（Ｐ２’）および（Ｐ３’）の少なくともいずれかのオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする。
（Ｐ１）塩基長が１１〜５０塩基長であり、配列番号１における塩基番号２２０〜２３０を含む塩基配列に相補的な塩基配列からなり、前記塩基番号２３０の塩基に相補的な塩基を、５’末端領域に有するオリゴヌクレオチド
（Ｐ１’）前記（Ｐ１）のオリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（Ｐ２）塩基長が１５〜５０塩基長であり、配列番号１における塩基番号２２０〜２３４を含む塩基配列に相補的な塩基配列からなり、前記塩基番号２３４の塩基に相補的な塩基を、５’末端領域に有するオリゴヌクレオチド
（Ｐ２’）前記（Ｐ２）のオリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（Ｐ３）塩基長が１７〜５０塩基長であり、配列番号１における塩基番号２２０〜２３６を含む塩基配列に相補的な塩基配列からなり、前記塩基番号２３６の塩基に相補的な塩基を、５’末端領域に有するオリゴヌクレオチド
（Ｐ３’）前記（Ｐ３）のオリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド【００１３】
本発明の多型検出用試薬は、疾患関連遺伝子の多型を検出するための試薬であって、本発明のＫ−ｒａｓ遺伝子の多型検出用プローブを含むことを特徴とする。【００１４】
本発明の多型検出方法は、疾患関連遺伝子の多型を検出する方法であって、本発明のＫ−ｒａｓ遺伝子の多型検出用プローブを用いて、疾患関連遺伝子であるＫ−ｒａｓ遺伝子の多型を検出する工程を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の多型検出用プローブによれば、例えば、Ｋ−ｒａｓ遺伝子の多型を、Ｔｍ解析によって、簡便且つ優れた信頼性で判別できる。具体的には、例えば、試料中に、目的の多型が野生型であるＫ−ｒａｓ遺伝子と変異型であるＫ−ｒａｓ遺伝子とが共存している場合でも、本発明の多型検出用プローブを用いたＴｍ解析を行うことで、多型の種類または変異の有無を、簡便且つ優れた信頼性で検出できる。このため、本発明は、野生型のＫ−ｒａｓ遺伝子と変異型のＫ−ｒａｓ遺伝子とを両方含む試料に対して、特に有用である。このように、本発明によれば、Ｋ−ｒａｓ遺伝子の多型を、簡便且つ優れた信頼性で判別できることから、例えば、検出結果を、前述のような疾患の診断および治療法の選択等に反映できる。したがって、本発明は、医療分野等において極めて有用といえる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、本発明の実施例１における、野生型および変異型オリゴヌクレオチドを含む反応液のＴｍ解析の結果を示すグラフである。
【図２】図２は、本発明の実施例２における、野生型および変異型プラスミドを含む反応液のＴｍ解析の結果を示すグラフである。
【図３】図３は、本発明の実施例３における、野生型および変異型プラスミドを含む反応液のＴｍ解析の結果を示すグラフである。
【図４】図４は、本発明の実施例４における、野生型および変異型プラスミドを含む反応液のＴｍ解析の結果を示すグラフである。
【図５】図５は、本発明の実施例４における、野生型および変異型プラスミドを含む反応液のＴｍ解析の結果を示すグラフである。
【図６】図６は、本発明の実施例４における、野生型および変異型プラスミドを含む反応液のＴｍ解析の結果を示すグラフである。
【図７】図７は、本発明の実施例４における、野生型および変異型プラスミドを含む反応液のＴｍ解析の結果を示すグラフである。
【図８】図８は、本発明の実施例５における、臨床検体からのＤＮＡ抽出液を含む反応液のＴｍ解析の結果を示すグラフである。
【図９】図９は、本発明の実施例６における、野生型および変異型プラスミドを含む反応液のＴｍ解析の結果を示すグラフである。
【図１０】図１０は、本発明の実施例６における、野生型および変異型プラスミドを含む反応液のＴｍ解析の結果を示すグラフである。
【図１１】図１１は、本発明の実施例６における、野生型および変異型プラスミドを含む反応液のＴｍ解析の結果を示すグラフである。
【図１２】図１２は、本発明の実施例６における、野生型および変異型プラスミドを含む反応液のＴｍ解析の結果を示すグラフである。
【図１３】図１３は、本発明の実施例７における、野生型および変異型プラスミドを含む反応液のＴｍ解析の結果を示すグラフである。
【図１４】図１４は、本発明の実施例７における、野生型および変異型プラスミドを含む反応液のＴｍ解析の結果を示すグラフである。
【図１５】図１５は、本発明の実施例７における、野生型および変異型プラスミドを含む反応液のＴｍ解析の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明において、Ｋ−ｒａｓ遺伝子における検出目的の多型は、コドン１２およびコドン１３における多型である。具体的には、例えば、配列番号１のＫ−ｒａｓ遺伝子の部分配列において、塩基番号２２０−２２２（ｎｎｔ）のコドン１２の多型、および塩基番号２２３−２２５（ｋｒｃ）のコドン１３の多型である。ｎは、ｇ、ｃ、ｔまたはａであり、ｋは、ｇまたはｔであり、ｒは、ｇまたはａである。コドン１２の野生型の多型は、ｇｇｔであり、コドン１２の変異型の多型は、例えば、ａｇｔ、ｃｇｔ、ｔｇｔ、ｇａｔ、ｇｃｔ、ｇｔｔ、ａａｔ、ｔｔｔまたはｃｔｔの９種類があげられる。コドン１３の野生型の多型は、ｇｇｃであり、コドン１３の変異型の多型は、例えば、ｇａｃまたはｔｇｃがあげられる。Ｋ−ｒａｓ遺伝子において、コドン１２の多型およびコドン１３の多型の少なくとも一方が、変異型であれば、例えば、セツキシマブ等の抗ＥＧＦＲ抗体薬に対する耐性を示し、野生型であれば、耐性を示さないと判断できる。以下に、Ｋ−ｒａｓ遺伝子のセンス鎖における前記塩基番号２２０−２２５のコドン１２の多型およびコドン１３の多型として、野生型（１）および変異型（２〜１３）を例示する。下記配列において、下線部が変異型の塩基である。
野生型１（ＷＴ）                            ｇｇｔｇｇｃ
変異型２（ｃ１２−ＡＧＴ）                  ａｇｔｇｇｃ
３（ｃ１２−ＣＧＴ）                  ｃｇｔｇｇｃ
４（ｃ１２−ＴＧＴ）                  ｔｇｔｇｇｃ
５（ｃ１２−ＧＡＴ）                  ｇａｔｇｇｃ
６（ｃ１２−ＧＣＴ）                  ｇｃｔｇｇｃ
７（ｃ１２−ＧＴＴ）                  ｇｔｔｇｇｃ
８（ｃ１３−ＴＧＣ）                  ｇｇｔｔｇｃ
９（ｃ１３−ＧＡＣ）                  ｇｇｔｇａｃ
１０（ｃ１２−ＡＡＴ）                  ａａｔｇｇｃ
１１（ｃ１２−ＴＴＴ）                  ｔｔｔｇｇｃ
１２（ｃ１２−ＣＴＴ）                  ｃｔｔｇｇｃ
１３（ｃ１２−ＡＧＴ  ｃ１３−ＧＡＣ）  ａｇｔｇａｃ
【００１８】
Ｋ−ｒａｓ遺伝子の塩基配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．ＮＧ＿００７５２４において、５００１番目〜５０６７５番目の領域として登録されている。配列番号１は、Ｋ−ｒａｓ遺伝子の部分配列であり、前記アクセッション番号の塩基配列において、１０３５１番目〜１０８５０番目の領域に相当する。前記コドン１２およびコドン１３の配列は、前記アクセッション番号の塩基配列における１０５７０番目〜１０５７５番目の領域に相当する。
【００１９】
本発明において、以下、コドン１２およびコドン１３のいずれかの塩基が変異型であるＫ−ｒａｓ遺伝子を「変異型Ｋ−ｒａｓ遺伝子」といい、コドン１２およびコドン１３の塩基が野生型であるＫ−ｒａｓ遺伝子を「野生型Ｋ−ｒａｓ遺伝子または正常型Ｋ−ｒａｓ遺伝子」という。
【００２０】
本発明において、前記多型が発生する部位、すなわち、配列番号１の塩基配列（センス鎖）において塩基番号２２０−２２５の塩基、または、その相補配列（アンチセンス鎖）において前記センス鎖の塩基番号２２０−２２５に対応する塩基を、「検出対象部位」という。配列番号１の配列（センス鎖）またはその相補配列（アンチセンス鎖）において、前記検出対象部位を含み、前記多型検出用プローブがハイブリダイズ可能な領域を、「ハイブリダイズ領域または検出対象配列」という。前記検出対象配列の中でも、前記多型検出用プローブとパーフェクトマッチする検出対象配列を「パーフェクトマッチ配列」、前記多型検出用プローブとミスマッチする検出対象配列を「ミスマッチ配列」という。本発明において、パーフェクトマッチは、前記検出対象部位の塩基が前記多型検出用プローブにおける対応塩基と相補的であることを意味し、好ましくは、前記検出対象配列と前記多型検出用プローブとが、完全に相補的であることを意味する。本発明において、ミスマッチは、前記検出対象部位の塩基が前記多型検出用プローブにおける対応塩基と非相補的であることを意味し、好ましくは、前記検出対象配列と前記多型検出用プローブとが、前記検出対象部位を除き、完全に相補的であることを意味する。
【００２１】
本発明において、Ｋ−ｒａｓ遺伝子を増幅させて、得られた増幅物と本発明の多型検出用プローブとをハイブリダイズさせる場合、Ｋ−ｒａｓ遺伝子における増幅領域を、以下、「増幅対象領域」という。前記増幅対象領域は、例えば、Ｋ−ｒａｓ遺伝子のセンス鎖における領域でもよいし、それに対応するアンチセンス鎖における領域でもよいし、両方でもよい。本発明において、センス鎖およびアンチセンス鎖は、例えば、センス鎖の増幅物、アンチセンス鎖の増幅物の意味も含む。
【００２２】
本発明において、塩基配列の末端は、塩基配列の５’側および３’側の最も端の塩基を意味する。５’末端領域は、塩基配列の５’末端から数塩基の領域であり、３’末端領域は、塩基配列の３’末端から数塩基の領域である。前記数塩基は、例えば、末端から１塩基〜１０塩基、１〜４塩基、１〜３塩基、１〜２塩基である。本発明において、塩基配列の末端からＺ番目の塩基（Ｚは正の整数）は、末端の塩基を１番目とした順番であり、例えば、末端から１番目の塩基は、末端の塩基、末端から２番目の塩基は、末端の隣の塩基を意味する。
【００２３】
＜多型検出用プローブ＞
本発明の多型検出用プローブは、前述のように、疾患関連遺伝子であるＫ−ｒａｓ遺伝子の多型を検出するためのプローブであって、下記（Ｐ１）、（Ｐ２）、（Ｐ３）、（Ｐ１’）、（Ｐ２’）および（Ｐ３’）の少なくともいずれかのオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする。
（Ｐ１）塩基長が１１〜５０塩基長であり、配列番号１における塩基番号２２０〜２３０を含む塩基配列に相補的な塩基配列からなり、前記塩基番号２３０の塩基に相補的な塩基を、５’末端領域に有するオリゴヌクレオチド
（Ｐ１’）前記（Ｐ１）のオリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（Ｐ２）塩基長が１５〜５０塩基長であり、配列番号１における塩基番号２２０〜２３４を含む塩基配列に相補的な塩基配列からなり、前記塩基番号２３４の塩基に相補的な塩基を、５’末端領域に有するオリゴヌクレオチド
（Ｐ２’）前記（Ｐ２）のオリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（Ｐ３）塩基長が１７〜５０塩基長であり、配列番号１における塩基番号２２０〜２３６を含む塩基配列に相補的な塩基配列からなり、前記塩基番号２３６の塩基に相補的な塩基を、５’末端領域に有するオリゴヌクレオチド
（Ｐ３’）前記（Ｐ３）のオリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
【００２４】
本発明の多型検出用プローブを、以下、Ｋ−ｒａｓ用プローブともいう。前記（Ｐ１）および（Ｐ１’）のオリゴヌクレオチドの塩基長は、１１〜５０塩基長であり、好ましくは、１３〜３０塩基長であり、より好ましくは、１５〜２０塩基長である。前記（Ｐ２）および（Ｐ２’）のオリゴヌクレオチドの塩基長は、１５〜５０塩基長であり、好ましくは、１５〜３０塩基長であり、より好ましくは、１５〜２０塩基長である。前記（Ｐ３）および（Ｐ３’）のオリゴヌクレオチドの塩基長は、１７〜５０塩基長であり、好ましくは、１７〜３０塩基長であり、より好ましくは、１７〜２０塩基長である。
【００２５】
本発明の多型検出用プローブは、配列番号１のＫ−ｒａｓ遺伝子の部分配列において、塩基番号２２０−２２２（ｎｎｔ）のコドン１２の多型および塩基番号２２３−２２５（ｋｒｃ）のコドン１３の多型を検出するためのプローブである。具体的に、本発明の多型検出用プローブは、例えば、配列番号１の塩基配列において、塩基番号２２０の塩基（ｎ）の多型（ｇ／ａ、ｇ／ｃ、ｇ／ｔ）、塩基番号２２１の塩基（ｎ）の多型（ｇ／ａ、ｇ／ｃ、ｇ／ｔ）、塩基番号２２３の塩基（ｋ）の多型（ｇ／ｔ）または塩基番号２２４番目の塩基（ｒ）の多型（ｇ／ａ）を検出するためのプローブである。配列番号１の塩基番号２２０−２２５の配列「ｎｎｔｋｒｃ」において、ｎは、グアニン（ｇ）、アデニン（ａ）、シトシン（ｃ）またはチミン（ｔ）であり、ｋは、グアニン（ｇ）またはチミン（ｔ）であり、ｒは、グアニン（ｇ）またはアデニン（ａ）である。前記配列「ｎｎｔｋｒｃ」は、例えば、前述の多型（野生型１および変異型２〜１３）の配列があげられる。
【００２６】
前記（Ｐ１）、（Ｐ２）および（Ｐ３）のオリゴヌクレオチドは、例えば、Ｋ−ｒａｓ遺伝子のセンス鎖と相補的であり、前記センス鎖とのハイブリダイゼーションにより、多型を確認できる。前記（Ｐ１）、（Ｐ２）および（Ｐ３）のオリゴヌクレオチドは、配列番号１において、塩基番号２２０−２２５の塩基配列（５’−ｎｎｔｋｒｃ−３’）に相補的な塩基配列（５’−ｇｙｍａｎｎ−３’）を含むことが好ましい。前記「ｎｎｔｋｒｃ」は、例えば、前述の野生型１および変異型２〜１３の配列があげられる。前記「ｎｎｔｋｒｃ」に相補的な「ｇｙｍａｎｎ」の配列において、ｙは、シトシン（ｃ）またはチミン（ｔ）であり、ｍは、シトシン（ｃ）またはアデニン（ａ）であり、ｎは、グアニン（ｇ）、アデニン（ａ）、シトシン（ｃ）またはチミン（ｔ）である（以下、同様）。
【００２７】
前記（Ｐ１）、（Ｐ２）および（Ｐ３）のオリゴヌクレオチドは、「ｇｙｍａｎｎ」として、例えば、「ｇｃｃａｃｃ」の配列を有することが好ましい。この配列を有する場合、Ｋ−ｒａｓ遺伝子において、コドン１２およびコドン１３の野生型の配列にパーフェクトマッチする。したがって、例えば、Ｋ−ｒａｓ遺伝子のコドン１２およびコドン１３の配列とパーフェクトマッチか否かによって、Ｋ−ｒａｓ遺伝子の多型を検出できる。具体的には、例えば、Ｋ−ｒａｓ遺伝子の多型が、野生型であるか変異型であるかを検出でき、変異型については、一塩基変異か、二塩基変異かを検出できる。以下、この配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプローブを、野生型プローブという。
【００２８】
前記（Ｐ１）、（Ｐ２）および（Ｐ３）のオリゴヌクレオチドは、「ｇｙｍａｎｎ」として、例えば、「ｇｃｃａｃｔ」、「ｇｃｃａｃｇ」、「ｇｃｃａｃａ」、「ｇｃｃａｔｃ」、「ｇｃｃａｇｃ」、「ｇｃｃａａｃ」、「ｇｃａａｃｃ」、「ｇｔｃａｃｃ」、「ｇｃｃａｔｔ」、「ｇｃｃａａａ」、「ｇｃｃａａｇ」、「ｇｔｃａｃｔ」の配列を有してもよい。これらの配列を有する場合、それぞれ順に、Ｋ−ｒａｓ遺伝子におけるコドン１２および１３の変異型２〜１３の配列に、パーフェクトマッチする。したがって、Ｋ−ｒａｓ遺伝子のコドン１２およびコドン１３の変異型２〜１３の配列とパーフェクトマッチか否かによって、Ｋ−ｒａｓ遺伝子の多型を検出できる。以下、これらの配列のいずれかを有するオリゴヌクレオチドを含むプローブを、変異型プローブという。
【００２９】
前記（Ｐ１）のオリゴヌクレオチドは、前記塩基番号２３０の塩基に相補的な塩基を、５’末端領域に有し、好ましくは、５’末端から数えて１〜４番目の位置、より好ましくは、１〜３番目、特に好ましくは１番目（５’末端）または２番目に有する。前記（Ｐ２）のオリゴヌクレオチドは、前記塩基番号２３４の塩基に相補的な塩基を、５’末端領域に有し、好ましくは、５’末端から数えて１〜４番目の位置、より好ましくは、１〜３番目、特に好ましくは１番目（５’末端）または２番目に有する。前記（Ｐ３）のオリゴヌクレオチドは、前記塩基番号２３６の塩基に相補的な塩基を、５’末端領域に有し、好ましくは、５’末端から数えて１〜４番目の位置、より好ましくは、１〜３番目、特に好ましくは１番目（５’末端）または２番目に有する。
【００３０】
前記（Ｐ１）のオリゴヌクレオチドは、例えば、配列番号３のオリゴヌクレオチドがあげられ、前記（Ｐ２）のオリゴヌクレオチドは、例えば、配列番号４、５または２９のオリゴヌクレオチドがあげられ、前記（Ｐ３）のオリゴヌクレオチドは、例えば、配列番号６のオリゴヌクレオチドがあげられる。配列番号３、４、５、６、２９の塩基配列において、下線部のｇｙｍａｎｎは、配列番号１に示すＫ−ｒａｓ遺伝子の検出対象部位ｎｎｔｋｒｃに相補的な配列である。この中でも、配列番号６のオリゴヌクレオチドを含むプローブが好ましい。
5'-cctacgymannagctccaactac-3'        （配列番号３）
5'-cttgcctacgymannagctccaactac-3'    （配列番号４）
5'-cttgcctacgymannagctccaactacca-3'  （配列番号５）
5'-cttgcctacgymann-3'                （配列番号２９）
5'-ctcttgcctacgymannagctccaact-3'    （配列番号６）
【００３１】
前記（Ｐ１）、（Ｐ２）および（Ｐ３）のオリゴヌクレオチドにおいて、前記ｇｙｍａｎｎは、前述のように、例えば、「ｇｃｃａｃｃ」、「ｇｃｃａｃｔ」、「ｇｃｃａｃｇ」、「ｇｃｃａｃａ」、「ｇｃｃａｔｃ」、「ｇｃｃａｇｃ」、「ｇｃｃａａｃ」、「ｇｃａａｃｃ」、「ｇｔｃａｃｃ」、「ｇｃｃａｔｔ」、「ｇｃｃａａａ」、「ｇｃｃａａｇ」および「ｇｔｃａｃｔ」の少なくともいずれかである。
【００３２】
前記配列番号３のオリゴヌクレオチドは、例えば、配列番号７のオリゴヌクレオチドがあげられ、前記配列番号４のオリゴヌクレオチドは、例えば、配列番号８のオリゴヌクレオチドがあげられ、前記配列番号５のオリゴヌクレオチドは、例えば、配列番号９のオリゴヌクレオチドがあげられ、前記配列番号６のオリゴヌクレオチドは、例えば、配列番号１０のオリゴヌクレオチドがあげられる。各塩基配列において、下線部のｇｃｃａｃｃは、野生型Ｋ−ｒａｓ遺伝子のセンス鎖における検出対象部位に相補的であり、野生型プローブとして使用できる。前記配列番号２９のオリゴヌクレオチドは、例えば、配列番号３０のオリゴヌクレオチドがあげられ、下線部のｇｔｃａｃｃは、コドン１３の変異型９に相補的であり、変異型プローブとして使用できる。また、前記配列番号１０の３’末端領域に付加配列（大文字の領域）を持つ、配列番号３１のオリゴヌクレオチドを使用してもよい。この中でも、配列番号１０または配列番号３１のオリゴヌクレオチドを含むプローブが好ましい。
5'-cctacgccaccagctccaactac-3'        （配列番号７）
5'-cttgcctacgccaccagctccaactac-3'    （配列番号８）
5'-cttgcctacgccaccagctccaactacca-3'  （配列番号９）
5'-ctcttgcctacgccaccagctccaact-3'    （配列番号１０）
5'-ctcttgcctacgccaccagctccaactTGCTGGCTACGC-3'  （配列番号３１）
5'-cttgcctacgtcacc-3'                （配列番号３０）
【００３３】
前記（Ｐ１’）、（Ｐ２’）および（Ｐ３’）のオリゴヌクレオチドは、前述のように、それぞれ、前記（Ｐ１）、（Ｐ２）および（Ｐ３）のオリゴヌクレオチドに相補的である。前記（Ｐ１’）〜（Ｐ３’）のオリゴヌクレオチドは、例えば、以下のようにいうこともできる。
（Ｐ１’）塩基長が１１〜５０塩基長であり、配列番号１における塩基番号２２０〜２３０を含む塩基配列からなり、前記塩基番号２３０の塩基を、３’末端領域に有するオリゴヌクレオチド
（Ｐ２’）塩基長が１５〜５０塩基長であり、配列番号１における塩基番号２２０〜２３４を含む塩基配列からなり、前記塩基番号２３４の塩基を、３’末端領域に有するオリゴヌクレオチド
（Ｐ３’）塩基長が１７〜５０塩基長であり、配列番号１における塩基番号２２０〜２３６を含む塩基配列からなり、前記塩基番号２３６の塩基を、３’末端領域に有するオリゴヌクレオチド
【００３４】
前記（Ｐ１’）、（Ｐ２’）および（Ｐ３’）のオリゴヌクレオチドは、Ｋ−ｒａｓ遺伝子のセンス鎖と相同的であり、前記アンチセンス鎖とのハイブリダイゼーションにより、多型を確認できる。前記（Ｐ１’）、（Ｐ２’）および（Ｐ３’）のオリゴヌクレオチドにおいて、前記アンチセンス鎖の検出対象部位の塩基配列（ｇｙｍａｎｎ）に相補的な塩基配列は、ｎｎｔｋｒｃで表される。前記配列「ｎｎｔｋｒｃ」は、前述の通りである。前記配列が野生型の場合、この配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプローブを、野生型プローブといい。前記配列が変異型の場合、この配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプローブを、変異型プローブという。
【００３５】
前記（Ｐ１’）のオリゴヌクレオチドは、前記塩基番号２３０の塩基を、３’末端領域に有し、好ましくは、３’末端から数えて１〜４番目の位置、より好ましくは、１〜３番目、特に好ましくは１番目（３’末端）または２番目に有する。前記（Ｐ２’）のオリゴヌクレオチドは、前記塩基番号２３４の塩基を、３’末端領域に有し、好ましくは、３’末端から数えて１〜４番目の位置、より好ましくは、１〜３番目、特に好ましくは１番目（３’末端）または２番目に有する。前記（Ｐ３’）のオリゴヌクレオチドは、前記塩基番号２３６の塩基を、３’末端領域に有し、好ましくは、３’末端から数えて１〜４番目の位置、より好ましくは、１〜３番目、特に好ましくは１番目（３’末端）または２番目に有する。
【００３６】
本発明の多型検出用プローブは、例えば、前記オリゴヌクレオチドを含むプローブでもよいし、前記オリゴヌクレオチドからなるプローブでもよい。前者の場合、例えば、さらに付加配列を有してもよい。前記（Ｐ１）〜（Ｐ３）のオリゴヌクレオチドは、例えば、その３’末端に前記付加配列を有することが好ましく、前記付加配列を有するオリゴヌクレオチドは、例えば、前述した配列番号３１のオリゴヌクレオチドがあげられる。前記（Ｐ１’）〜（Ｐ３’）のオリゴヌクレオチドは、例えば、その５’末端に前記付加配列を有することが好ましい。前記（Ｐ１）〜（Ｐ３）の付加配列は、例えば、センス鎖と非相補的な配列が好ましく、前記（Ｐ１’）〜（Ｐ３’）の付加配列は、例えば、センス鎖と非相同的な配列が好ましく、塩基長は、例えば、１〜３０塩基が好ましい。
【００３７】
本発明の多型検出用プローブは、例えば、前記（Ｐ１）〜（Ｐ３）のオリゴヌクレオチドが、前記検出対象部位に対応する塩基部位と、塩基番号２３０、２３４、２３６の塩基に相補的な塩基以外で、１個または数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、前記検出対象配列にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドでもよい。また、本発明の多型検出用プローブは、例えば、前記（Ｐ１’）〜（Ｐ３’）のオリゴヌクレオチドが、前記検出対象部位に対応する塩基部位と、塩基番号２３０、２３４、２３６の塩基以外で、１個または数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、前記検出対象配列にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドでもよい。
【００３８】
これらのプローブは、例えば、いずれか１種類を使用してもよいし、２種類以上を併用してもよい。２種類以上を併用する場合、例えば、野生型プローブと、変異型プローブとを併用することが好ましい。これによって、野生型か変異型かを検出するだけでなく、さらに、変異型の特定も可能となる。
【００３９】
本発明の多型検出用プローブは、標識物質を有する標識プローブであることが好ましく、例えば、前述のオリゴヌクレオチドが、前記標識物質で標識化（修飾）されていることが好ましい。前記オリゴヌクレオチドにおいて、前記標識物質により標識化される部位は、特に制限されず、例えば、５’末端領域または３’末端領域であることが好ましく、より好ましくは５’末端または３’末端である。後述するように、前記オリゴヌクレオチドにおいて、前記標識物質により標識化される塩基は、例えば、シトシン（ｃ）またはグアニン（ｇ）が好ましい。前記標識物質は、例えば、塩基を直接標識化してもよいし、前記塩基を間接的に標識化してもよい。後者の場合、例えば、前記塩基を含むヌクレオチド残基のいずれかの部位を標識することによって、前記塩基を間接的に標識化できる。前述の（Ｐ１）〜（Ｐ３）のオリゴヌクレオチドは、例えば、５’末端のシトシン（ｃ）が、前記標識物質で標識化されていることが好ましく、前記（Ｐ１’）〜（Ｐ３’）のオリゴヌクレオチドは、例えば、３’末端のグアニン（ｇ）が、前記標識物質で標識化されていることが好ましい。
【００４０】
前記（Ｐ１）、（Ｐ２）および（Ｐ３）のオリゴヌクレオチドは、５’末端領域に、前記標識物質を有することが好ましく、具体的には、例えば、５’末端から数えて１〜４番目の塩基の位置に、前記標識物質を有することが好ましく、より好ましくは、５’末端から数えて１〜３番目の塩基、特に好ましくは、５’末端から数えて２番目または５’末端の塩基である。前記（Ｐ１）のオリゴヌクレオチドは、例えば、前記塩基番号２２７〜２３３のいずれかの塩基に相補的な塩基が、前記標識物質を有することが好ましく、より好ましくは前記塩基番号２３０の塩基に相補的な塩基が、前記標識物質を有することが好ましい。前記（Ｐ２）のオリゴヌクレオチドは、例えば、前記塩基番号２３１〜２３７のいずれかの塩基に相補的な塩基が、前記標識物質を有することが好ましく、より好ましくは前記塩基番号２３４の塩基に相補的な塩基が、前記標識物質を有することが好ましい。前記（Ｐ３）のオリゴヌクレオチドは、例えば、前記塩基番号２３３〜２３９のいずれかの塩基に相補的な塩基が、前記標識物質を有することが好ましく、より好ましくは前記塩基番号２３６の塩基に相補的な塩基が、前記標識物質を有することが好ましい。
【００４１】
前記（Ｐ１’）、（Ｐ２’）および（Ｐ３’）のオリゴヌクレオチドは、３’末端領域に、前記標識物質を有することが好ましく、具体的には、例えば、３’末端から数えて１〜４番目の塩基の位置に、前記標識物質を有することが好ましく、より好ましくは、３’末端から数えて１〜３番目の塩基、特に好ましくは、３’末端から数えて２番目または３’末端の塩基である。前記（Ｐ１’）のオリゴヌクレオチドは、例えば、前記塩基番号２２７〜２３３のいずれかの塩基が、前記標識物質を有することが好ましく、より好ましくは前記塩基番号２３０の塩基が、前記標識物質を有することが好ましい。前記（Ｐ２’）のオリゴヌクレオチドは、例えば、前記塩基番号２３１〜２３７のいずれかの塩基が、前記標識物質を有することが好ましく、より好ましくは前記塩基番号２３４の塩基が、前記標識物質を有することが好ましい。前記（Ｐ３’）のオリゴヌクレオチドは、例えば、前記塩基番号２３３〜２３９のいずれかの塩基が、前記標識物質を有することが好ましく、より好ましくは前記塩基番号２３６の塩基が、前記標識物質を有することが好ましい。
【００４２】
前記標識物質は、特に制限されず、例えば、前記標識プローブが単独であるか、ハイブリッドを形成しているかによって、シグナルを発するものが好ましい。前記シグナルの種類は、特に制限されず、例えば、蛍光、呈色等があげられる。前記シグナルが蛍光の場合、シグナル値は、例えば、蛍光強度があげられる。前記シグナルが呈色の場合、前記シグナル値は、例えば、反射率、吸光度、透過率等があげられる。前記シグナルは、例えば、前記標識物質から直接発せられてもよいし、間接的に発せられてもよい。
【００４３】
前記標識物質は、特に制限されず、例えば、蛍光団等の蛍光物質等があげられる。前記蛍光物質は、例えば、フルオレセイン、リン光体、ローダミン、ポリメチン色素誘導体等があげられ、市販の蛍光物質は、例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ（登録商標、モレキュラープローブ社製）、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ（登録商標、モレキュラープローブ社製）、ＦｌｕｏｒｅＰｒｉｍｅ（商品名、アマシャムファルマシア社製）、Ｆｌｕｏｒｅｄｉｔｅ（商品名、ミリポア社製）、ＦＡＭ（登録商標、ＡＢＩ社製）、Ｃｙ３およびＣｙ５（商品名、アマシャムファルマシア社製）、ＴＡＭＲＡ（登録商標、モレキュラープローブ社製）等があげられる。前記蛍光物質の検出条件は、特に制限されず、例えば、使用する蛍光物質の種類により適宜決定できる。例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅは、検出波長４５０〜４８０ｎｍ、ＴＡＭＲＡは、検出波長５８５〜７００ｎｍ、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬは、検出波長５１５〜５５５ｎｍで検出できる。このようなプローブを使用すれば、例えば、シグナルとして蛍光を検出し、シグナル値として蛍光強度を測定することにより、蛍光強度の変動から、ハイブリダイズと解離とを容易に確認できる。
【００４４】
前記標識プローブは、例えば、単独でシグナルを示し、且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識プローブ、または、単独でシグナルを示さず、且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識プローブであることが好ましい。前記標識物質が蛍光物質の場合、前記標識プローブは、例えば、前記蛍光物質で標識化され、単独で蛍光を示し、且つハイブリッド形成により蛍光が減少（例えば、消光）するプローブが好ましい。このような現象は、一般に、蛍光消光現象（Quenching  phenomenon）と呼ばれる。この現象を利用したプローブは、一般に、蛍光消光プローブと呼ばれる。中でも、前記蛍光消光プローブは、例えば、オリゴヌクレオチドの３’末端もしくは５’末端が前記蛍光物質で標識化されていることが好ましく、標識化される前記末端の塩基は、シトシン（ｃ）またはグアニン（ｇ）であることが好ましい。前記末端の塩基がシトシン（ｃ）の場合、前記蛍光消光プローブは、例えば、被検核酸とハイブリッドを形成した際、前記被検核酸における、標識化された末端のシトシン（ｃ）と対をなす塩基または前記対をなす塩基から１〜３塩基離れた塩基がグアニン（ｇ）となるように、前記蛍光消光プローブの塩基配列を設計することが好ましい。前記対をなす塩基から一塩基離れた塩基は、前記対をなす塩基の隣の塩基を意味する。このようなプローブは、一般的にグアニン消光プローブと呼ばれ、いわゆるＱＰｒｏｂｅ（登録商標）として知られている。このようなグアニン消光プローブが前記被検核酸にハイブリダイズすると、例えば、前記蛍光物質で標識化された末端のシトシン（ｃ）が、前記被検核酸におけるグアニン（ｇ）に近づくことによって、前記蛍光物質の蛍光が弱くなる、すなわち、蛍光強度が減少するという現象を示す。このようなプローブを使用すれば、蛍光強度の変動により、ハイブリダイズと解離とを容易に確認できる。同様に、前記末端の塩基がグアニン（ｇ）の場合、前記蛍光消光プローブは、例えば、前記被検核酸とハイブリッドを形成した際、前記被検核酸における、標識化された末端のグアニン（ｇ）と対をなす塩基または前記対をなす塩基から１〜３塩基離れた塩基がシトシン（ｃ）となるように、前記蛍光消光プローブの塩基配列を設計することが好ましい。
【００４５】
本発明の多型検出用プローブは、例えば、３’末端にリン酸基が付加されてもよい。後述するように、被検核酸は、例えば、ＰＣＲ等の核酸増幅法によって調製でき、この際、本発明の多型検出用プローブを核酸増幅反応の反応系に共存させることができる。このような場合、前記多型検出用プローブの３’末端にリン酸基を付加させておけば、前記多型検出用プローブ自体が前記核酸増幅反応によって伸長することを十分に防止できる。３’末端に前述のような標識物質を付加することによっても、同様の効果が得られる。
【００４６】
本発明の多型検出用プローブを用いた多型の検出において、検出方法は何ら制限されず、前記検出対象配列とプローブとのハイブリダイズを利用する方法であればよい。前記多型の検出方法として、以下に、本発明の多型検出方法を説明する。
【００４７】
＜多型検出方法＞
本発明の多型検出方法は、前述のように、本発明のＫ−ｒａｓ遺伝子の多型検出用プローブを用いて、Ｋ−ｒａｓ遺伝子の多型を検出する工程を含むことを特徴とする、疾患関連遺伝子の多型検出方法である。
【００４８】
本発明の多型検出方法は、例えば、下記（Ａ）工程および（Ｂ）工程を含むことが好ましい。
（Ａ）前記多型を検出する被検核酸と本発明の多型検出用プローブとを含む反応系の温度を変化させ、前記被検核酸と前記多型検出用プローブとのハイブリッドの融解状態を示すシグナル値を測定する工程
（Ｂ）前記温度変化に伴う前記シグナル値の変動から、前記被検核酸における前記多型を検出する工程
【００４９】
本発明の多型検出方法は、本発明の多型検出用プローブを使用することが特徴であって、その他の構成や条件等は、以下の記載に制限されない。本発明の多型検出用プローブは、前述のように標識プローブが好ましい。本発明において、前記反応系は、例えば、反応液である。
【００５０】
本発明において、前記被検核酸は、一本鎖核酸でもよいし、二本鎖核酸でもよい。前記被検核酸が前記二本鎖核酸の場合、例えば、後述するように、前記（Ａ）工程において、前記反応系を加熱して、二本鎖の前記被検核酸を解離させる工程を含むことが好ましい。前記二本鎖核酸を一本鎖核酸に解離することによって、本発明の多型検出用プローブと前記一本鎖核酸とがハイブリダイズする。
【００５１】
本発明において、前記被検核酸は、例えば、試料中に元来含まれる核酸でもよいし、前記核酸の増幅物でもよい。後者は、例えば、検出精度を向上できることから好ましく、前記増幅物は、例えば、前記試料中の前記核酸を鋳型核酸として、核酸増幅法により増幅させることで調製できる。前記増幅物は、例えば、前記試料中のＤＮＡを鋳型とした増幅物でもよいし、前記試料中のＲＮＡから合成したｃＤＮＡを鋳型とした増幅物でもよい。前記試料中のＲＮＡは、例えば、トータルＲＮＡ、ｍＲＮＡ等のＲＮＡがあげられ、前記ｃＤＮＡは、例えば、前記ＲＮＡから、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ＰＣＲ）により合成できる。
【００５２】
本発明の多型検出方法は、例えば、前記被検核酸が前記増幅物の場合、例えば、さらに、下記（Ｘ）工程を含んでもよい。前記（Ｘ）工程は、例えば、前記（Ａ）工程に先立って行うことが好ましい。また、前記（Ｘ）工程は、例えば、前記多型検出用プローブの存在下、前記反応系において、前記鋳型核酸から前記増幅物を生成する工程でもよい。
（Ｘ）  鋳型核酸から前記増幅物を生成する工程
【００５３】
前記（Ａ）工程において、前記多型検出用プローブは、例えば、前記反応系に含まれていればよく、その添加のタイミングは、特に制限されない。前記被検核酸が前記増幅物の場合、前記（Ａ）工程における前記反応系は、例えば、前記（Ｘ）工程で得られた前記増幅物と前記多型検出用プローブとを用いて、新たに調製してもよいし、前記（Ｘ）工程における前記増幅反応の反応系でもよい。後者の場合、前記多型検出用プローブは、例えば、前記（Ｘ）工程の前または途中に、前記増幅反応の反応系に添加されてもよく、前記（Ｘ）工程の後、前記増幅反応の反応系に添加されてもよい。
【００５４】
前記核酸増幅法は、特に制限されず、例えば、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法等があげられ、中でも、ＰＣＲ法が好ましい。前記核酸増幅法の条件は、特に制限されず、従来公知の方法により行える。
【００５５】
前記鋳型核酸からの前記増幅物の生成には、Ｋ−ｒａｓ遺伝子における検出目的の多型を含む領域を増幅するためのプライマー（以下、「Ｋ−ｒａｓ用プライマー」ともいう）を使用することが好ましい。前記プライマーの配列は、特に制限されず、例えば、前記検出対象部位を含む検出対象配列を増幅できればよく、前記検出対象配列およびその周辺配列等に応じて、従来公知の方法により適宜設定できる。前記プライマーの長さは、特に制限されず、一般的な長さに設定でき、例えば、１０〜４０塩基長があげられる。
【００５６】
前記Ｋ−ｒａｓ用プライマーは、例えば、遺伝子のセンス鎖を増幅するフォワードプライマー（以下、「Ｆプライマー」ともいう）およびアンチセンス鎖を増幅するリバースプライマー（以下、「Ｒプライマー」ともいう）のいずれか一方を使用できるが、両者を一対とするプライマーセットを使用することが好ましい。以下に、ＦプライマーおよびＲプライマーを例示するが、これらは一例であって、本発明を制限するものではない。
【００５７】
（Ｆプライマー）
Ｆ１
5'-accttatgtgtgacatgttctaatatagtcacattttc-3'  （配列番号１１）
Ｆ２
5'-aaggcctgctgaaaatgactg-3'                （配列番号１２）
Ｆ１−ＬＰ
5'-ggtactggtggagtatttgatagtgt-3’          （配列番号３２）
（Ｒプライマー）
Ｒ２
5'-ggtcctgcaccagtaatatgca-3'                （配列番号１８）
Ｒ１−ＬＰ
5'-gaattagctgtatcgtmaaggcactc-3’          （配列番号３３）
ｍ＝ｃまたはａ
Ｒ３−ＬＰ
5'-cacaaaatgattctgaattagctgtatcg-3’        （配列番号３４）
【００５８】
また、ＦプライマーおよびＲプライマーは、例えば、コドン１２およびコドン１３の全配列または部分配列を含む領域にアニーリング可能に設計されたプライマーでもよい。この場合、コドン１２およびコドン１３の配列は、例えば、野生型に設定できるが、変異型に設定することが好ましい。これによって、例えば、変異型Ｋ−ｒａｓ遺伝子が微量の場合でも、前記変異型の検出対象配列を効率よく増幅できる。以下に、Ｒプライマーを例示するが、これらは一例であって、本発明を制限するものではない。下記配列において、下線部が、コドン１２およびコドン１３の全配列（ｎｎｔｋｒｃ）または部分配列に相補的な配列であり、大文字の塩基が、変異型の多型に相補的な塩基である。下記Ｒ−ＷＴプライマーは、全配列ｎｎｔｋｒｃであるｇｇｔｇｇｃに相補的な配列を有し、野生型の標的部位を増幅するプライマーである。下記Ｒ−ｃ１２−ＸＧＴ、Ｒ−ｃ１２−ＧＸＴおよびＲ−ｃ１３−ＴＧＣは、それぞれ、変異型の標的部位を増幅するプライマーである。下記Ｒ−ｃ１２−ＸＧＴは、全配列ｎｎｔｋｒｃであるｎｇｔｇｇｃに相補的な配列を有する。下記Ｒ−ｃ１２−ＧＸＴは、部分配列ｎｔｋｒｃであるｎｔｇｇｃに相補的な配列を有する。下記Ｒ−ｃ１３−ＴＧＣは、コドン１３の全配列ｋｒｃであるｔｇｃに相補的な配列を有する。下記Ｒ−ｃ１３−ＧＡＣは、コドン１３の部分配列ｒｃであるａｃに相補的な配列を有する。
【００５９】
（Ｒプライマー）
Ｒ−ＷＴ
5'-ctcttgcctacgccacc-3'                    （配列番号１３）
Ｒ−ｃ１２−ＸＧＴ
5'-cactcttgcctacgccacD-3'                  （配列番号１４）
Ｄ＝ｔ、ｇまたはａ
Ｒ−ｃ１２−ＧＸＴ
5'-gcactcttgcctacgccaD-3'                  （配列番号１５）
Ｄ＝ｔ、ｇまたはａ
Ｒ−ｃ１３−ＴＧＣ
5'-caaggcactcttgcctacgcA-3'                （配列番号１６）
Ｒ−ｃ１３−ＧＡＣ
5'-tcaaggcactcttgcctacgT-3'                （配列番号１７）
【００６０】
本発明において、前記プライマーの組み合わせは、特に制限されず、例えば、ＦプライマーとＲプライマーとを一対のプライマーセットとして使用することが好ましい。さらに、ＦプライマーまたはＲプライマーの少なくとも一方について、野生型の検出対象領域を増幅するプライマーと、変異型の検出対象領域を増幅するプライマーとを併用することが好ましい。具体的には、Ｆプライマーと、野生型の検出対象領域を増幅するＲプライマーと、変異型の検出対象領域を増幅するＲプライマーとを、組み合わせて使用することが好ましい。前記野生型の検出対象領域を増幅するプライマーを、野生型プライマー、前記変異型の検出対象領域を増幅するプライマーを、変異型プライマーともいう。このように、前記野生型プライマーと変異型プライマーとの併用により、例えば、変異型Ｋ−ｒａｓ遺伝子が微量の場合にも、変異型の検出対象領域を高精度に検出できる。前記ＦプライマーとＲプライマーとの組み合わせは、例えば、Ｆ１プライマーおよびＦ２プライマーのいずれか一方と、Ｒ−ＷＴプライマーと、前記Ｒ−ｃ１２−ＸＧＴプライマーと、前記Ｒ−ｃ１２−ＧＸＴプライマーとの組み合わせ、または、Ｆ１プライマーおよびＦ２プライマーのいずれか一方と、Ｒ−ＷＴプライマーと、前記Ｒ−ｃ１３−ＴＧＣプライマーと、前記Ｒ−ｃ１３−ＧＡＣプライマーとの組み合わせ等があげられる。また、例えば、Ｆ１−ＬＰプライマー（配列番号３２）と、Ｒ１−ＬＰプライマー（配列番号３３）またはＲ３−ＬＰ（配列番号３４）との組み合わせも好ましい。
【００６１】
前記反応系において、前記プライマーの添加割合は、特に制限されず、例えば、１種類のプライマーについて、例えば、０．１〜２μｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは、０．２５〜１．５μｍｏｌ／Ｌであり、特に好ましくは、０．５〜１μｍｏｌ／Ｌである。ＦプライマーとＲプライマーとを使用する場合、前記Ｆプライマー（Ｆ）とＲプライマー（Ｒ）との添加割合（モル比Ｆ：Ｒ）は、特に制限されず、例えば、１：０．２５〜１：４が好ましく、より好ましくは、１：０．５〜１：２である。
【００６２】
前記（Ａ）工程において、前記被検核酸に対する本発明の多型検出用プローブの添加割合（モル比）は、特に制限されず、検出シグナルを十分に確保できることから、１倍以下が好ましい。この際、前記被検核酸は、例えば、パーフェクトマッチ配列を有するパーフェクトマッチ核酸とミスマッチ配列を有するミスマッチ核酸との合計でもよいし、パーフェクトマッチ配列を含む増幅物とミスマッチ配列を含む増幅物との合計でもよい。なお、被検核酸におけるパーフェクトマッチ核酸の割合は、通常、不明であるが、結果的に、前記多型検出用プローブの添加割合（モル比）は、パーフェクトマッチ核酸（パーフェクトマッチ配列を含む増幅物）に対して１０倍以下となることが好ましく、より好ましくは５倍以下、さらに好ましくは３倍以下である。その下限は特に制限されず、例えば、０．００１倍以上であり、好ましくは０．０１倍以上であり、より好ましくは０．１倍以上である。前記被検核酸に対する本発明の多型検出用プローブの添加割合は、例えば、二本鎖核酸に対するモル比でもよいし、一本鎖核酸に対するモル比でもよい。
【００６３】
前記反応系における本発明の多型検出用プローブの添加割合は、特に制限されず、例えば、１種類の前記多型検出用プローブにつき、１０〜１０００ｎｍｏｌ／Ｌの範囲となるように添加することが好ましく、より好ましくは２０〜５００ｎｍｏｌ／Ｌである。例えば、十分なシグナル値を確保できることから、前記反応液において、前記被検核酸に対する前記多型検出用プローブのモル比は、例えば、１倍以下が好ましい。前記被検核酸に対する前記多型検出用プローブの添加割合は、例えば、二本鎖核酸に対するモル比でもよいし、一本鎖核酸に対するモル比でもよい。
【００６４】
本発明の多型検出方法を適用する試料は、特に制限されず、生体試料があげられる。前記生体試料の具体例は、例えば、大腸、直腸、膵臓等の組織、全血、白血球細胞等の血球、口腔粘膜等の口腔内細胞、爪や毛髪等の体細胞、生殖細胞、喀痰、羊水、パラフィン包埋組織、尿、胃液、胃洗浄液等があげられる。本発明において、前記試料の採取方法、前記試料からの被検核酸の調製方法等は、特に制限されず、従来公知の方法が採用できる。
【００６５】
本発明の多型検出方法は、前述のような、いわゆるＴｍ解析（融解曲線解析ともいう）に利用できる。ここで、Ｔｍ解析におけるＴｍ値について説明する。例えば、二本鎖ＤＮＡを含む溶液を加熱していくと、２６０ｎｍにおける吸光度が上昇する。これは、二本鎖ＤＮＡにおける両鎖間の水素結合が加熱によってほどけ、一本鎖ＤＮＡに解離（ＤＮＡの融解）することが原因である。そして、全ての二本鎖ＤＮＡが解離して一本鎖ＤＮＡになると、その吸光度は加熱開始時の吸光度（二本鎖ＤＮＡのみの吸光度）の約１．５倍程度を示し、これによって融解が完了したと判断できる。この現象に基づき、融解温度Ｔｍは、一般に、吸光度が、吸光度全上昇分の５０％に達した時の温度と定義される。
【００６６】
前記（Ａ）工程において、前記被検核酸と前記多型検出用プローブとのハイブリッドの融解状態を示すシグナルの測定は、前述した、２６０ｎｍにおける吸光度測定でもよいが、標識物質のシグナル測定でもよい。具体的には、前記多型検出用プローブとして、前述したように、前記標識物質で標識化された標識プローブを使用し、前記標識物質のシグナル測定を行うことが好ましい。前記標識プローブは、例えば、単独でシグナルを示し、且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識プローブ、または、単独でシグナルを示さず、且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識プローブがあげられる。前者のようなプローブであれば、前記増幅物とハイブリッド（二本鎖ＤＮＡ）を形成している際にはシグナルを示さず、加熱により前記増幅物から前記プローブが解離するとシグナルを示す。後者のプローブであれば、前記増幅物とハイブリッド（二本鎖ＤＮＡ）を形成することによってシグナルを示し、加熱により前記増幅物から前記プローブが遊離するとシグナルが減少（消失）する。したがって、前記標識物質のシグナルを検出することによって、前記２６０ｎｍにおける吸光度測定と同様に、ハイブリッドの融解の進行の検出ならびにＴｍ値の決定等を行える。前記標識物質のシグナル検出は、例えば、前記標識物質のシグナルに特有の条件で検出すればよく、前記条件は、例えば、励起波長、検出波長等があげられる。前記標識プローブならびに前記標識物質については、前述のとおりである。
【００６７】
前記（Ｂ）工程において、シグナル値の変動からの前記多型の検出は、従来の方法により行うことができる。具体例としては、例えば、前記シグナル値の変動を、前記多型検出用プローブと変異型の検出対象配列とのハイブリッドの変動および／または前記多型検出用プローブと野生型の検出対象配列とのハイブリッドの変動と比較し、多型が変異型か野生型かを判断できる。つまり、変異型と同様であれば変異型、野生型と同様であれば野生型と判断できる。また、例えば、前記シグナルの変動からＴｍ値を求め、Ｔｍ値の比較により、多型を判断できる。まず、前記シグナル値の変動から、Ｔｍ値を求める。つぎに、測定した前記Ｔｍ値を、予め求めた、野生型の検出対象配列についてのＴｍｗｔ値および／または変異型の検出対象配列についてのＴｍｍｔ値と比較する。そして、測定したＴｍ値が、野生型の検出対象配列についてのＴｍ値ｗｔと同じまたは同程度であれば野生型、Ｔｍｗｔ値よりも低いならば変異型、前記変異型の検出対象配列についてのＴｍｍｔ値と同じまたは同程度であれば変異型、Ｔｍｍｔ値よりも低いならば野生型と判断できる。同程度とは、例えば、±３℃程度である。
【００６８】
次に、本発明の多型検出方法について、一例をあげて説明する。本例は、本発明の多型検出用プローブとして、蛍光物質で標識された標識プローブを使用し、前記多型検出用プローブの存在下、鋳型核酸からの増幅を行い、得られた増幅物を、前記被検核酸とする例である。本発明の多型検出方法は、本発明の多型検出用プローブを使用すること自体が特徴であり、その他の工程や条件については何ら制限されない。
【００６９】
まず、前記生体試料からゲノムＤＮＡを単離する。前記生体試料からのゲノムＤＮＡの単離は、従来公知の方法によって行える。具体的には、例えば、市販のゲノムＤＮＡ単離キット（商品名GFX  Genomic  Blood  DNA  Purification  kit；ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）等が使用できる。
【００７０】
次に、単離したゲノムＤＮＡを含む試料に標識プローブを添加して、反応液を調製する。前記標識プローブは、例えば、前述のように、ＱＰｒｏｂｅ（登録商標）が好ましい。
【００７１】
前記標識プローブは、例えば、単離したゲノムＤＮＡを含む試料に添加してもよいし、溶媒中でゲノムＤＮＡと混合してもよい。前記溶媒は、特に制限されず、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ等の緩衝液、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４、グリセロール等を含む溶媒、ＰＣＲ用の反応液等の核酸増幅用反応液等、従来公知のものがあげられる。
【００７２】
前記標識プローブの添加のタイミングは、特に制限されず、例えば、核酸増幅反応の前、途中または後に添加できる。中でも、例えば、前記標識プローブの添加のために前記反応液を外部環境に露出する必要がなく、また、前記核酸増幅反応とシグナル値の測定とを、連続的に行うことが可能であるため、前記核酸増幅反応前に前記反応液に、前記標識プローブを添加することが好ましい。この場合、前記標識プローブは、前述のように、その３’末端が標識物質またはリン酸基で修飾されていることが好ましい。
【００７３】
続いて、単離したゲノムＤＮＡを鋳型として、前記標識プローブの存在下、ＰＣＲ等の核酸増幅法によって、検出目的の多型が発生する検出対象部位を含む配列を増幅させる。以下、核酸増幅法としてＰＣＲを例にあげて、本発明を説明するが、これには制限されない。ＰＣＲの条件は、特に制限されず、従来公知の方法により行える。
【００７４】
具体的には、前記ゲノムＤＮＡ、前記標識プローブおよび前記プライマーを含む前記反応液について、ＰＣＲを行う。この反応液の組成は、特に制限されず、当業者であれば適宜設定でき、例えば、前記ゲノムＤＮＡ、前記標識プローブおよび前記プライマーの他に、ＤＮＡポリメラーゼ等のポリメラーゼ、ヌクレオシド三リン酸、緩衝液、各種触媒等を含んでもよい。前記反応液における前記標識プローブおよび前記プライマーの添加割合は、特に制限されず、例えば、それぞれ前述の範囲があげられる。
【００７５】
前記ＤＮＡポリメラーゼは、特に制限されず、例えば、従来公知の耐熱性細菌由来のポリメラーゼが使用できる。具体例は、テルムス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）由来ＤＮＡポリメラーゼ（米国特許第４，８８９，８１８号および同第５，０７９，３５２号）（商品名Ｔａｑポリメラーゼ）、テルムス・テルモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来ＤＮＡポリメラーゼ（ＷＯ  ９１／０９９５０）（ｒＴｔｈ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）、ピロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）由来ＤＮＡポリメラーゼ（ＷＯ  ９２／９６８９）（Ｐｆｕ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ：Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅｓ社製）、テルモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）由来ポリメラーゼ（ＥＰ−Ａ  ４５５  ４３０（商標Ｖｅｎｔ）：Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）等が商業的に入手可能であり、中でも、テルムス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）由来の耐熱性ポリメラーゼが好ましい。
【００７６】
前記反応液におけるＤＮＡポリメラーゼの添加割合は、特に制限されず、例えば、１〜１００Ｕ／ｍＬであり、好ましくは、５〜５０Ｕ／ｍＬであり、より好ましくは、２０〜４０Ｕ／ｍＬである。ＤＮＡポリメラーゼの活性単位（Ｕ）は、一般に、活性化サケ精子ＤＮＡを鋳型プライマーとして、活性測定用反応液中、７４℃で、３０分間に１０ｎｍｏｌの全ヌクレオチドを酸不溶性沈殿物に取り込む活性が１Ｕである。前記活性測定用反応液の組成は、例えば、２５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＴＡＰＳ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ９．３、２５℃）、５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＫＣｌ、２ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ２、１ｍｍｏｌ／Ｌメルカプトエタノール、２００μｍｏｌ／Ｌ  ｄＡＴＰ、２００μｍｏｌ／Ｌ  ｄＧＴＰ、２００μｍｏｌ／Ｌ  ｄＴＴＰ、１００μｍｏｌ／Ｌ「α−３２Ｐ」ｄＣＴＰ、０．２５ｍｇ／ｍＬ活性化サケ精子ＤＮＡである。
【００７７】
前記ヌクレオシド三リン酸は、通常、ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、および、ｄＴＴＰまたはｄＵＴＰ）があげられる。前記反応液中のｄＮＴＰの添加割合は、特に制限されず、例えば、０．０１〜１ｍｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは、０．０５〜０．５ｍｍｏｌ／Ｌであり、より好ましくは、０．１〜０．３ｍｍｏｌ／Ｌである。
【００７８】
前記緩衝液は、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＣＡＰＳ等があげられ、市販のＰＣＲ用緩衝液や市販のＰＣＲキットの緩衝液等が使用できる。
【００７９】
前記反応液は、さらに、ヘパリン、ベタイン、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４、グリセロール等を含んでもよく、これらの添加割合は、例えば、ＰＣＲ反応を阻害しない範囲で設定すればよい。
【００８０】
前記反応液の全体積は、特に制限されず、例えば、サーマルサイクラー等の使用する機器等に応じて適宜設定でき、通常、１〜５００μＬであり、好ましくは、１０〜１００μＬである。
【００８１】
つぎに、ＰＣＲを行う。前記ＰＣＲのサイクル条件は、特に制限されず、例えば、（１）被検核酸である二本鎖ＤＮＡの一本鎖ＤＮＡへの解離、（２）前記一本鎖ＤＮＡへのプライマーのアニーリング、（３）ポリメラーゼ反応による前記プライマーの伸長は、それぞれ下記表１の条件が例示できる。サイクル数も特に制限されず、下記（１）〜（３）の３ステップを１サイクルとして、例えば、３０サイクル以上が好ましい。前記サイクル数の合計の上限は、特に制限されず、例えば、１００サイクル以下、好ましくは７０サイクル以下、より好ましくは、５０サイクル以下である。各ステップの温度変化は、例えば、サーマルサイクラー等を用いて自動的に制御すればよい。
【００８２】
【表１】
0005917144.tif 000002
【００８３】
前記反応液における標識プローブの添加割合は、特に制限されず、例えば、前記標識プローブを１０〜１０００ｎｍｏｌ／Ｌの範囲となるように添加することが好ましく、より好ましくは２０〜５００ｎｍｏｌ／Ｌである。例えば、十分なシグナル値を確保できることから、前記反応液において、前記被検核酸に対する前記標識プローブのモル比は、例えば、１倍以下が好ましい。前記被検核酸に対する前記標識プローブの添加割合は、例えば、二本鎖核酸に対するモル比でもよいし、一本鎖核酸に対するモル比でもよい。
【００８４】
次に、得られた増幅物（二本鎖ＤＮＡ）の解離、および、解離により得られた一本鎖ＤＮＡと前記標識プローブとのハイブリダイズを行う。これは、例えば、前記標識プローブの存在下、前記反応液の温度を変化させることで行える。この場合、前述のように、予め前記標識プローブを添加した前記反応液について、増幅反応を行った後、前記反応液を温度変化させることが好ましい。
【００８５】
前記解離工程における加熱温度は、二本鎖の前記増幅物を一本鎖に解離できる温度であれば特に制限されず、例えば、８５〜９５℃である。加熱時間も特に制限されず、通常、１秒〜１０分であり、好ましくは１秒〜５分である。
【００８６】
解離した一本鎖ＤＮＡと前記標識プローブとのハイブリダイズは、例えば、前記解離工程の後、前記解離工程における加熱温度を降下させることによって行える。温度条件は、例えば、４０〜５０℃である。前記温度での処理時間は、特に制限されず、例えば、１〜６００秒である。
【００８７】
そして、前記反応液の温度を変化させ、前記増幅物と前記標識プローブとのハイブリッドの融解状態を示すシグナル値を測定する。具体的には、例えば、前記反応液（前記一本鎖ＤＮＡと前記標識プローブとのハイブリッド）を加熱し、温度上昇に伴うシグナル値の変動を測定する。前述のように、グアニン消光プローブ、すなわち、末端のシトシン（ｃ）が標識化されたプローブを使用した場合、一本鎖ＤＮＡとハイブリダイズした状態では、蛍光が減少（または消光）し、解離した状態では、蛍光を発する。したがって、例えば、蛍光が減少（または消光）しているハイブリッドを徐々に加熱し、温度上昇に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。
【００８８】
前記蛍光強度の変動を測定する際の温度範囲は、特に制限されない。前記開始温度は、例えば、室温〜８５℃であり、好ましくは、２５〜７０℃であり、終了温度は、例えば、４０〜１０５℃である。また、温度の上昇速度は、特に制限されず、例えば、０．１〜２０℃／秒であり、好ましくは、０．３〜５℃／秒である。
【００８９】
次に、前記シグナル値の変動を解析してＴｍ値を決定する。具体的には、得られた蛍光強度から、各温度における単位時間当たりの蛍光強度変化量（−ｄ蛍光強度増加量／ｄｔ）を算出し、最も低い値を示す温度をＴｍ値として決定できる。単位時間当たりの蛍光強度変化量（ｄ蛍光強度増加量／ｄｔ）の最も高い点をＴｍ値として決定することもできる。前記標識プローブとして、蛍光消光プローブではなく、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示すプローブを使用した場合には、反対に、蛍光強度の減少量を測定すればよい。また、例えば、前記標識プローブとして、検出波長の異なる標識物質を標識した複数のプローブを用いて、前記検出波長ごとに、前記シグナル値の変動を解析してもよい。
【００９０】
前記Ｔｍ値は、例えば、従来公知のＭＥＬＴＣＡＬＣソフトウエア（http://www.meltcalc.com/）等により算出でき、最近接塩基対法（Nearest  Neighbor  Method）によって決定することもできる。
【００９１】
そして、前記Ｔｍ値から、前記検出対象配列において、配列番号１に示すＫ−ｒａｓ遺伝子の塩基配列における塩基番号２２０、２２１、２２３または２２４の塩基が、前記野生型であるか、前記変異型であるかを決定する。前記Ｔｍ解析において、完全に相補であるハイブリッド（マッチ）は、一塩基または数塩基が異なるハイブリッド（ミスマッチ）よりも、解離を示すＴｍ値が高くなるという結果が得られる。したがって、予め、前記標識プローブについて、完全に相補であるハイブリッドのＴｍ値と、一塩基または数塩基が異なるハイブリッドのＴｍ値とを決定しておくことにより、前記検出対象配列の塩基が、前記野生型であるか、前記変異型を含むかを決定できる。前述のように、前記野生型プローブおよび変異型プローブを併用すれば、完全に相補であるハイブリッドのＴｍ値を示したのが、いずれのプローブであるかによって、前記多型の種類も決定できる。
【００９２】
本発明は、前述のように、前記多型検出用プローブを含む反応系の温度を上昇させて（ハイブリッドを加熱して）、温度上昇に伴うシグナル変動を測定する方法に代えて、例えば、ハイブリッド形成時におけるシグナル変動の測定を行ってもよい。すなわち、前記多型検出用プローブを含む反応系の温度を降下させてハイブリッドを形成する際に、前記温度降下に伴うシグナル変動を測定してもよい。
【００９３】
具体例として、単独でシグナルを示し、且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識プローブ（例えば、グアニン消光プローブ）を使用した場合、一本鎖ＤＮＡと前記標識プローブとが解離している状態では蛍光を発しているが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、前記蛍光が減少（または消光）する。したがって、例えば、前記反応液の温度を徐々に降下させて、温度下降に伴う蛍光強度の減少を測定すればよい。他方、単独でシグナルを示さず、且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識プローブを使用した場合、前記一本鎖ＤＮＡと前記標識プローブとが解離している状態では蛍光を発していないが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、蛍光を発するようになる。したがって、例えば、前記反応液の温度を徐々に降下させて、温度下降に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。
【００９４】
本発明の多型検出方法は、例えば、Ｋ−ｒａｓ遺伝子の多型を検出するための本発明の多型検出用プローブと、他の遺伝子の多型を検出するためのプローブとを併用できる。本発明の多型検出用プローブと、その他の遺伝子を検出するためのプローブとの併用によって、同一の一つの反応系において、Ｋ−ｒａｓ遺伝子を含む２種類以上の遺伝子の多型を検出できる。前記他の遺伝子は、例えば、Ｋ−ｒａｓ遺伝子と同様の疾患関連遺伝子であるＢＲＡＦ遺伝子があげられる。これによって、疾患に関連するＫ−ｒａｓ遺伝子とＢＲＡＦ遺伝子との多型を、検出できる。前述の疾患において、Ｋ−ｒａｓ遺伝子多型が野生型、ＢＲＡＦ遺伝子多型が変異型である臨床例が報告されている。したがって、Ｋ−ｒａｓ遺伝子に加えて、ＢＲＡＦ遺伝子における変異の有無（多型）を検出することにより、例えば、前述の疾患の診断、より効果的な疾患の治療法の選択等の精度を、さらに向上できる。
【００９５】
ＢＲＡＦ遺伝子における検出目的の多型は、例えば、配列番号２のＢＲＡＦ遺伝子の部分配列において、塩基番号２２９の塩基（ｗ）が、野生型は、チミン（ｔ）であり、変異型は、アデニン（ａ）である。前記塩基が野生型（ｔ）の場合、ＢＲＡＦタンパク質の６００番目のアミノ酸はバリン（Ｖ）となり、前記塩基が変異型（ａ）の場合、ＢＲＡＦタンパク質の６００番目のアミノ酸はグルタミン酸（Ｅ）となる。ＢＲＡＦ遺伝子が、前述のような変異型であれば、例えば、前述の疾患および薬剤耐性の可能性があると判断できる。
【００９６】
ＢＲＡＦ遺伝子の塩基配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．ＮＧ＿００７８７３において、５００１番目〜１９５７５３番目の領域として登録されている。配列番号２に示す塩基配列は、ＢＲＡＦ遺伝子の部分配列であり、前記アクセッション番号の塩基配列において、塩基番号１７６２０１〜１７６７００の領域に相当する。また、前記検出部位は、前記アクセッション番号の塩基配列における塩基番号１７６４２９の塩基に相当する。配列番号２に示す塩基配列において、ｗは、アデニンまたはチミンである。
【００９７】
以下、配列番号２に示す塩基配列において、塩基番号２２９の塩基（ｗ）が変異型ａであるＢＲＡＦ遺伝子を「変異型ＢＲＡＦ遺伝子」といい、塩基番号２２９の塩基（ｗ）が野生型であるＢＲＡＦ遺伝子を「野生型ＢＲＡＦ遺伝子または正常型ＢＲＡＦ遺伝子」という。
【００９８】
ＢＲＡＦ遺伝子の多型を検出するためのプローブを、以下、「ＢＲＡＦ用プローブ」ともいう。前記ＢＲＡＦ用プローブは、特に制限されず、例えば、下記（Ｐ４）および（Ｐ４’）の少なくともいずれかのオリゴヌクレオチドを含むプローブがあげられる。
（Ｐ４）塩基長が９〜５０塩基長であり、配列番号２における塩基番号２２９〜２３７を含む塩基配列からなり、前記塩基番号２３７を３’末端領域に有するオリゴヌクレオチド
（Ｐ４’）前記（Ｐ４）のオリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
【００９９】
前記（Ｐ４）および（Ｐ４’）のオリゴヌクレオチドの塩基長は、９〜５０塩基長であり、好ましくは１０〜５０塩基長であり、より好ましくは、１３〜３０塩基長であり、さらに好ましくは、１５〜２０塩基長である。
【０１００】
前記（Ｐ４）のオリゴヌクレオチドは、例えば、ＢＲＡＦ遺伝子のセンス鎖と相同的であり、アンチセンス鎖とのハイブリダイゼーションにより、多型を確認できる。
【０１０１】
前記（Ｐ４）のオリゴヌクレオチドは、前記塩基番号２３７の塩基を、３’末端領域に有し、好ましくは、３’末端から数えて１〜４番目の位置、より好ましくは、１〜３番目、特に好ましくは１番目（３’末端）または２番目に有する。
【０１０２】
前記（Ｐ４）のオリゴヌクレオチドは、例えば、配列番号１９または配列番号３５のオリゴヌクレオチドがあげられる。配列番号１９および配列番号３５の塩基配列において、下線部のｗは、配列番号２に示すＢＲＡＦ遺伝子の検出対象部位ｗに相同的な塩基である。配列番号１９および配列番号３５において、ｗがａであれば（配列番号２７および配列番号３６）、変異型ＢＲＡＦ遺伝子の検出対象配列とパーフェクトマッチする。このようなプローブを、変異型プローブともいう。また、配列番号１９および配列番号３５において、ｗがｔであれば（配列番号２８および配列番号３７）、野生型ＢＲＡＦ遺伝子の検出対象配列とパーフェクトマッチする。このようなプローブを、野生型プローブともいう。したがって、ＢＲＡＦ遺伝子の検出対象配列とパーフェクトマッチか否かによって、ＢＲＡＦ遺伝子の多型が、野生型であるか変異型であるかを検出できる。これらは、前記ＢＲＡＦ用プローブの一例であって、本発明を制限するものではない。
（ＢＲＡＦ用プローブ）
5'-ctagctacagwgaaatctc-3'                （配列番号１９）
5'-ctagctacagagaaatctc-3'                （配列番号２７）
5'-ctagctacagtgaaatctc-3'                （配列番号２８）
5'-gctacagwgaaatctc-3'                    （配列番号３５）
5'-gctacagagaaatctc-3'                    （配列番号３６）
5'-gctacagtgaaatctc-3'                    （配列番号３７）
【０１０３】
前記（Ｐ４’）のオリゴヌクレオチドは、前述のように、前記（Ｐ４）のオリゴヌクレオチドに相補的である。前記（Ｐ４’）のオリゴヌクレオチドは、例えば、以下のようにいうこともできる。
（Ｐ４’）塩基長が９〜５０塩基長であり、配列番号２における塩基番号２２９〜２３７を含む塩基配列に相補的な塩基配列からなり、前記塩基番号２３７の塩基に相補的な塩基を５’末端領域に有するオリゴヌクレオチド
【０１０４】
前記（Ｐ４’）のオリゴヌクレオチドは、ＢＲＡＦ遺伝子のセンス鎖と相補的であり、前記センス鎖とのハイブリダイゼーションにより、多型を確認できる。前記（Ｐ４’）のオリゴヌクレオチドにおいて、前記センス鎖の検出対象部位の塩基配列（ｗ）に相補的な塩基配列は、（ｗ）で表され、ａまたはｔである。
【０１０５】
前記（Ｐ４’）のオリゴヌクレオチドは、前記塩基番号２３７の塩基に相補的な塩基を、５’末端領域に有し、好ましくは、５’末端から数えて１〜４番目の位置、より好ましくは、１〜３番目、特に好ましくは１番目（５’末端）または２番目に有する。
【０１０６】
前記ＢＲＡＦの多型検出用プローブは、例えば、前記オリゴヌクレオチドを含むプローブでもよいし、前記オリゴヌクレオチドからなるプローブでもよい。
【０１０７】
前記ＢＲＡＦの多型検出用プローブは、例えば、標識物質を有する標識プローブであることが好ましく、前記標識物質は、前述の通りである。
【０１０８】
前記（Ｐ４）のオリゴヌクレオチドは、３’末端領域に、前記標識物質を有することが好ましく、具体的には、例えば、３’末端から数えて１〜４番目の塩基の位置に、前記標識物質を有することが好ましく、より好ましくは、３’末端から数えて１〜３番目の塩基、特に好ましくは、３’末端から数えて２番目または３’末端の塩基である。前記（Ｐ４）のオリゴヌクレオチドは、例えば、前記塩基番号２３４〜２４０のいずれかの塩基が、前記標識物質を有することが好ましく、より好ましくは前記塩基番号２３７の塩基が、前記標識物質を有することが好ましい。
【０１０９】
前記（Ｐ４’）のオリゴヌクレオチドは、５’末端領域に、前記標識物質を有することが好ましく、具体的には、例えば、５’末端から数えて１〜４番目の塩基の位置に、前記標識物質を有することが好ましく、より好ましくは、５’末端から数えて１〜３番目の塩基、特に好ましくは、５’末端から数えて２番目または５’末端の塩基である。前記（Ｐ４’）のオリゴヌクレオチドは、例えば、前記塩基番号２３４〜２４０のいずれかの塩基に相補的な塩基が、前記標識物質を有することが好ましく、より好ましくは前記塩基番号２３７の塩基に相補的な塩基が、前記標識物質を有することが好ましい。
【０１１０】
本発明において、Ｋ−ｒａｓ用プローブと、ＢＲＡＦ用プローブとの組み合わせは、特に制限されず、例えば、配列番号７〜配列番号１０、配列番号３０および配列番号３１のいずれかに示すオリゴヌクレオチドを含むＫ−ｒａｓ用の野生型プローブと、配列番号２７または配列番号３６に示すオリゴヌクレオチドを含むＢＲＡＦ用の変異型プローブとの組み合わせ等があげられる。
【０１１１】
一つの反応系に２種類以上のプローブを添加する場合、各プローブは、それぞれ異なる検出条件の標識物質で標識化されていることが好ましい。これによって、検出条件を変えるのみで、同じ反応系を用いて、２種類以上の多型を簡便に検出できる。
【０１１２】
具体的に、前記（Ａ）工程が、前記多型を検出する被検核酸と、前記Ｋ−ｒａｓ用プローブおよび前記ＢＲＡＦ用プローブとを含む反応系の温度を変化させ、前記被検核酸と前記各多型検出用プローブとのハイブリッドの融解状態を示すシグナル値を測定する工程であることが好ましい。前記ＢＲＡＦ用プローブは、例えば、前述の通りである。
【０１１３】
本発明において、前記被検核酸は、前述のように、前記鋳型核酸から前記増幅物を生成する工程、すなわち前記（Ｘ）工程を含んでもよい。前記鋳型核酸からの前記増幅物の生成は、例えば、Ｋ−ｒａｓ用のプライマーの他に、ＢＲＡＦ遺伝子における検出目的の多型を含む配列を増幅するためのプライマー（以下、「ＢＲＡＦ用プライマー」ともいう）を使用することが好ましい。すなわち、配列番号２の塩基配列における塩基番号２２９の塩基を含む領域を増幅するためのプライマーを使用して、増幅物を生成することが好ましい。前記プライマーの配列は、特に制限されず、例えば、前記検出対象部位を含む検出対象配列を増幅できればよく、前記検出対象配列およびその周辺配列等に応じて、従来公知の方法により適宜設定できる。前記プライマーの長さは、特に制限されず、前述の長さがあげられる。前記ＢＲＡＦ用プライマーは、例えば、前記Ｋ−ｒａｓ用プライマーを使用する際に併用すればよい。
【０１１４】
前記ＢＲＡＦ用プライマーは、例えば、遺伝子のセンス鎖を増幅するフォワードプライマー（Ｆプライマー）およびアンチセンス鎖を増幅するリバースプライマー（Ｒプライマー）のいずれか一方を使用できるが、両者を一対とするプライマーセットを使用することが好ましい。以下に、前記ＦプライマーおよびＲプライマーを例示するが、これらは一例であって、本発明を制限するものではない。前記ＢＲＡＦ用プライマーは、例えば、配列番号３８のプライマーと配列番号３９のプライマーとの組み合わせが好ましい。
【０１１５】
（ＢＲＡＦ用プライマー）
Ｆプライマー
5'-cctttacttactacacctcagatatat-3'    （配列番号２０）
Ｆ３プライマー
5'-tgcttgctctgataggaaaatgagatctac-3'  （配列番号３８）
Ｒプライマー
5'-acaactgttcaaactgatgggac-3'        （配列番号２１）
Ｒ５プライマー
5'-aaactgatgggacccactccat-3'        （配列番号３９）
【０１１６】
前記ＢＲＡＦ用プローブおよび前記ＢＲＡＦ用プライマーの添加割合は、特に制限されず、例えば、Ｋ−ｒａｓ用プローブおよびＫ−ｒａｓ用プライマーと同様に使用できる。
【０１１７】
＜多型検出用試薬＞
本発明の多型検出用試薬は、本発明の多型検出用プローブを含むことを特徴とする、疾患関連遺伝子の多型検出用試薬である。本発明においては、前述の本発明の多型検出用プローブを含むことが特徴であって、その他の構成や条件は何ら制限されない。本発明の多型検出用試薬は、例えば、Ｋ−ｒａｓ遺伝子の多型の検出に使用するプローブキットともいえる。
【０１１８】
前記多型検出用試薬は、例えば、前記多型検出用プローブを１種類含んでもよいし、２種類以上含んでもよい。具体的には、Ｋ−ｒａｓ用の野生型プローブおよび変異型プローブのうち、いずれか１種類でもよいし、２種類以上でもよい。
【０１１９】
本発明の多型検出用試薬は、さらに、Ｋ−ｒａｓ遺伝子における検出目的部位を含む領域を増幅するためのプライマーやプライマーセットを含んでもよい。プライマーは、例えば、前述のものがあげられる。
【０１２０】
本発明の多型検出用試薬は、さらに、ＢＲＡＦ遺伝子における検出目的部位を含む領域を増幅するためのプライマーやプライマーセットを含んでもよい。プライマーは、例えば、前述のものがあげられる。
【０１２１】
本発明の多型検出用試薬は、この他にも、例えば、核酸増幅反応に必要な成分を含んでもよい。具体例は、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ等のポリメラーゼ、ヌクレオシド三リン酸、緩衝液、各種触媒等があげられる。本発明の多型検出用試薬は、検出試薬キットでもよく、さらに、使用説明書を含んでもよい。
【０１２２】
つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、下記実施例により制限されない。
【実施例】
【０１２３】
［実施例１］
本例では、野生型オリゴヌクレオチドまたは変異型オリゴヌクレオチドの存在下、Ｔｍ解析を行い、Ｋ−ｒａｓ遺伝子の多型を検出した。【０１２４】
Ｋ−ｒａｓ遺伝子の部分配列として、野生型コドン１２および野生型コドン１３を有するオリゴヌクレオチド（配列番号２２）、および、変異型コドン１２または変異型コドン１３を有するオリゴヌクレオチド（配列番号２３〜配列番号２６）を準備した。下記配列番号２２〜配列番号２６において、下線部が、コドン１２およびコドン１３に該当し、大文字の塩基が、変異型の多型を示す。【０１２５】
ＷＴ（配列番号２２）
5'-aacttgtggtagttggagctggtggcgtaggcaagagtgccttgacgata-3'
ｃ１２−ＴＧＴ（配列番号２３）
5'-aacttgtggtagttggagctTgtggcgtaggcaagagtgccttgacgata-3'
ｃ１２−ＧＡＴ（配列番号２４）
5'-aacttgtggtagttggagctgAtggcgtaggcaagagtgccttgacgata-3'
ｃ１３−ＧＡＣ（配列番号２５）
5'-aacttgtggtagttggagctggtgAcgtaggcaagagtgccttgacgata-3'
ｃ１２−ＡＡＴ（配列番号２６）
5'-aacttgtggtagttggagctAAtggcgtaggcaagagtgccttgacgata-3'【０１２６】
前記オリゴヌクレオチドを、それぞれ、１０μｍｏｌ／Ｌに調整した。下記表２の反応液について、全自動ＳＮＰｓ検査装置（商品名ｉ−ｄｅｎｓｙ（登録商標）、アークレイ社製）を用いて、Ｔｍ解析を行った。前記Ｔｍ解析は、前記反応液を９５℃１秒および４０℃６０秒で処理後、温度の上昇速度を１℃／３秒として、４０℃から９５℃に加熱していき、検出波長５８５〜７００ｎｍにおける、経時的な蛍光強度の変化を測定することにより行った。【０１２７】
【表２】
0005917144.tif 000003
【０１２８】
前記プローブとして、以下の野生型プローブ１を使用した。下記プローブは、野生型Ｋ−ｒａｓ遺伝子のセンス鎖における検出対象配列にパーフェクトマッチするプローブであり、前記配列において、下線部の塩基が、野生型コドン１２および野生型コドン１３に相補的な配列である。前記プローブ１は、５’末端を、蛍光物質ＴＡＭＲＡで標識化し、３’末端を、リン酸化した。
5'-(TAMRA)-cctacgccaccagctccaactac-P-3'  （配列番号７）【０１２９】
これらの結果を図１に示す。図１は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフである。図１において、（Ａ）はＷＴ、（Ｂ）はｃ１２−ＴＧＴ、（Ｃ）はｃ１２−ＧＡＴ、（Ｄ）はｃ１３−ＧＡＣ、（Ｅ）はｃ１２−ＡＡＴの結果である。横軸は、測定時の温度（℃）を示し、縦軸は、蛍光強度の変化を示し、単位は、蛍光強度変化量の微分値である「ｄ蛍光強度変化量／ｄｔ」（ｄＦ/ｄｔ）とした。前記プローブとのＴｍ値は、ＷＴが７３℃、ｃ１２−ＴＧＴ、ｃ１２−ＧＡＴおよびｃ１３−ＧＡＣが６５℃であり、ｃ１２−ＡＡＴが６０℃である。【０１３０】
図１（Ａ）に示すように、ＷＴは、７３℃でピークが確認された。そして、図１（Ｂ）〜（Ｄ）に示すように、コドン１２またはコドン１３において、ＷＴとは１塩基異なるｃ１２−ＴＧＴ、ｃ１２−ＧＡＴおよびｃ１３−ＧＡＣは、それぞれ、６５℃でピークが確認された。さらに、図１（Ｅ）に示すように、コドン１２において、ＷＴとは２塩基異なるｃ１２−ＡＡＴは、６０℃でピークが確認された。このように、本実施例の野生型プローブを用いれば、例えば、野生型Ｋ−ｒａｓ遺伝子と複数の変異型Ｋ−ｒａｓ遺伝子とが混在する場合であっても、野生型と変異型とを区別して、多型を検出可能であることがわかった。また、変異型の多型について、１塩基ミスマッチの変異型と２塩基ミスマッチの変異型とを区別して、検出可能であることがわかった。【０１３１】
［実施例２］
本例では、野生型プラスミドと、変異型プラスミドとの共存下で、Ｔｍ解析を行い、Ｋ−ｒａｓ遺伝子の多型を検出した。【０１３２】
Ｋ−ｒａｓ遺伝子の部分配列（配列番号１における３０番目〜３４９番目）として、野生型コドン１２および野生型コドン１３を有するオリゴヌクレオチドが挿入された野生型プラスミド（ＷＴ）、変異型コドン１２および野生型コドン１３を有するオリゴヌクレオチドが挿入された２種類の変異型プラスミド（ｃ１２−ＴＧＴおよびｃ１２−ＧＡＴ）を準備した。前記野生型プラスミド（ＷＴ）において、コドン１２およびコドン１３の配列は、「ｇｇｔｇｇｃ」である。変異型プラスミド（ｃ１２−ＴＧＴ）において、コドン１２およびコドン１３の配列は、「Ｔｇｔｇｇｃ」であり、大文字の塩基が変異型の多型である。変異型プラスミド（ｃ１２−ＧＡＴ）において、コドン１２およびコドン１３の配列は、「ｇＡｔｇｇｃ」であり、大文字の塩基が変異型の多型である。これらのプラスミドを、以下に示す所定の割合で混合し、５種類のプラスミド試料を調製した。プラスミド試料は、１μＬあたり、２×１０４コピー／μＬとした。【０１３３】
【表３】
0005917144.tif 000004
【０１３４】
下記表４のＰＣＲ反応液２５μＬについて、全自動ＳＮＰｓ検査装置（商品名ｉ−ｄｅｎｓｙ（登録商標）、アークレイ社製）を用いて、ＰＣＲおよびＴｍ解析を行った。前記ＰＣＲは、９５℃で６０秒の後、９５℃５秒および６４℃１５秒を１サイクルとして５０サイクル繰り返した。そして、続けて、実施例１と同じ条件で、Ｔｍ解析を行った。【０１３５】
【表４】
0005917144.tif 000005
【０１３６】
前記Ｆプライマーおよび各種Ｒプライマーの配列を以下に示す。Ｒ−ｃ１２−ＸＧＴの配列において、下線部は、コドン１２およびコドン１３の配列に相当し、Ｒ−ｃ１２−ＧＸＴの配列において、下線部は、コドン１２およびコドン１３の５’末端側２塩基の配列に相当する。Ｒ−ｃ１２−ＸＧＴおよびＲ−ｃ１２−ＧＸＴは、それぞれ、Ｄがｔ、ｇまたはａである３種類のオリゴヌクレオチドの混合物（縮重プライマー）とした。
Ｆ１プライマー（配列番号１１）
5'-accttatgtgtgacatgttctaatatagtcacattttc-3'
Ｒ−ＷＴプライマー（配列番号１３）
5'-ctcttgcctacgccacc-3'
Ｒ−ｃ１２−ＸＧＴ
5'-cactcttgcctacgccacD-3'                （配列番号１４）
Ｄ＝ｔ、ｇまたはａ
Ｒ−ｃ１２−ＧＸＴ
5'-gcactcttgcctacgccaD-3'                （配列番号１５）
Ｄ＝ｔ、ｇまたはａ【０１３７】
前記プローブとして、以下の野生型プローブ２を使用した。下記プローブは、野生型のＫ−ｒａｓ遺伝子のセンス鎖における検出対象配列にパーフェクトマッチするプローブであり、前記配列において、下線部の塩基が、野生型コドン１２および野生型コドン１３に相補的な配列である。前記プローブ２は、５’末端を、蛍光色素ＴＡＭＲＡで標識化し、３’末端を、リン酸化した。
5'-(TAMRA)-cctgcctacgccaccagctccaactac-P-3'  （配列番号８）【０１３８】
これらの結果を図２に示す。図２は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフである。図２において、（Ａ）はＷＴ  １００％、（Ｂ）はｃ１２−ＴＧＴ  ３％、（Ｃ）はｃ１２−ＴＧＴ  １００％、（Ｄ）はｃ１２−ＧＡＴ  １％、（Ｅ）はｃ１２−ＧＡＴ  １００％の結果である。図２において、横軸は、測定時の温度（℃）を示し、縦軸は、蛍光強度の変化を示し、単位は、蛍光強度変化量の微分値である「ｄ蛍光強度変化量／ｄｔ」（ｄＦ/ｄｔ）とした。前記プローブとのＴｍ値は、ＷＴが７５℃、ｃ１２−ＴＧＴが６８℃、ｃ１２−ＧＡＴが６９℃である。【０１３９】
図２において、（Ａ）に示すように、ＷＴ  １００％は、ＷＴのＴｍ値でのみピークが確認され、（Ｃ）に示すように、ｃ１２−ＴＧＴ  １００％は、ｃ１２−ＴＧＴのＴｍ値でのみピークが確認され、（Ｅ）に示すように、ｃ１２−ＧＡＴ  １００％は、ｃ１２−ＧＡＴのＴｍ値でのみピークが確認された。一方、野生型プラスミドと変異型プラスミドとを混合した試料では、２つのＴｍ値でピークが確認された。すなわち、図２（Ｂ）に示すように、ｃ１２−ＴＧＴ  ３％は、ＷＴのＴｍ値近傍と、ｃ１２−ＴＧＴのＴｍ値近傍の両方で、ピークが確認された。また、図２（Ｄ）に示すように、ｃ１２−ＧＡＴ  １％は、ＷＴのＴｍ値近傍と、ｃ１２−ＧＡＴのＴｍ値近傍の両方で、ピークが確認された。このように、本実施例の野生型プローブ、野生型Ｆプライマー、野生型Ｒプライマーおよび変異型Ｒプライマーを用いれば、野性型と微量の変異型の多型とが混在する場合であっても、野生型と変異型とを区別して、多型を検出可能であることがわかった。【０１４０】
［実施例３］
本例では、野生型プラスミドと、変異型プラスミドとの共存下で、Ｔｍ解析を行い、Ｋ−ｒａｓ遺伝子の多型を検出した。【０１４１】
Ｋ−ｒａｓ遺伝子の部分配列（配列番号１における３０番目〜３４９番目）として、野生型コドン１２および野生型コドン１３を有するオリゴヌクレオチドが挿入された野生型プラスミド（ＷＴ）、野生型コドン１２および変異型コドン１３を有するオリゴヌクレオチドが挿入された変異型プラスミド（ｃ１３−ＧＡＣ）を準備した。前記野生型プラスミド（ＷＴ）は、前記実施例２と同様である。変異型プラスミド（ｃ１３−ＧＡＣ）において、コドン１２およびコドン１３の配列は、「ｇｇｔｇＡｃ」であり、大文字の塩基が変異型の多型である。これらのプラスミドを、以下に示す所定の割合で混合し、３種類のプラスミド試料を調製した。プラスミド試料は、１μＬあたり、２×１０４コピー／μＬとした。【０１４２】
【表５】
0005917144.tif 000006
【０１４３】
下記表６のＰＣＲ反応液２５μＬを用いた以外は、前記実施例２と同様にして、ＰＣＲおよびＴｍ解析を行った。【０１４４】
【表６】
0005917144.tif 000007
【０１４５】
前記Ｆ１プライマーは、前記実施例２と同じプライマーを使用した。前記各種Ｒプライマーの配列を以下に示す。
Ｒ−ＷＴプライマー（配列番号１３）
5'-ctcttgcctacgccacc-3'
Ｒ−ｃ１３−ＴＧＣプライマー（配列番号１６）
5'-caaggcactcttgcctacgca-3'
Ｒ−ｃ１３−ＧＡＣプライマー（配列番号１７）
5'-tcaaggcactcttgcctacgt-3'【０１４６】
前記プローブとして、以下の野生型プローブ３を使用した。下記プローブは、野生型のＫ−ｒａｓ遺伝子のセンス鎖における検出対象配列にパーフェクトマッチするプローブであり、前記配列において、下線部の塩基が、野生型コドン１２および野生型コドン１３に相補的な配列である。前記プローブ３は、５’末端を、蛍光色素ＴＡＭＲＡで標識化し、３’末端を、リン酸化した。
5'-(TAMRA)-cctgcctacgccaccagctccaactacca-P-3'  （配列番号９）【０１４７】
これらの結果を図３に示す。図３は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフである。図３において、（Ａ）はＷＴ  １００％、（Ｂ）はｃ１３−ＧＡＣ  ３％、（Ｃ）はｃ１３−ＧＡＣ  １００％の結果である。図３において、横軸は、測定時の温度（℃）を示し、縦軸は、蛍光強度の変化を示し、単位は、蛍光強度変化量の微分値である「ｄ蛍光強度変化量／ｄｔ」（ｄＦ/ｄｔ）とした。前記プローブとのＴｍ値は、ＷＴが７７℃、ｃ１３−ＧＡＣが７２℃である。【０１４８】
図３において、（Ａ）に示すように、ＷＴ  １００％は、ＷＴのＴｍ値でのみピークが確認され、（Ｃ）に示すように、ｃ１３−ＧＡＣ  １００％は、ｃ１３−ＧＡＣのＴｍ値でのみピークが確認された。一方、図３（Ｂ）に示すように、野生型プラスミドおよび変異型プラスミドを含むｃ１３−ＧＡＣ  ３％は、ＷＴのＴｍ値と、ｃ１３−ＧＡＣのＴｍ値の両方で、ピークが確認された。このように、本実施例の野生型プローブ、野生型Ｆプライマー、野生型Ｒプライマーおよび変異型Ｒプライマーを用いれば、野性型と微量の変異型の多型とが混在する場合であっても、野生型と変異型とを区別して、多型を検出可能であることがわかった。【０１４９】
［実施例４］
本例では、野生型プラスミドと、変異型プラスミドとの共存下で、Ｔｍ解析を行い、Ｋ−ｒａｓ遺伝子およびＢＲＡＦ遺伝子の多型を検出した。【０１５０】
Ｋ−ｒａｓ遺伝子の部分配列（配列番号１における３０番目〜３４９番目）として、下記表に示すコドン１２およびコドン１３を有するオリゴヌクレオチドが挿入された、ｋｒａｓプラスミドを準備した。コドン１２およびコドン１３が野生型であるｋｒａｓプラスミドを、野生型プラスミド（ｋｒａｓ−ｗｔ）とした。コドン１２およびコドン１３の少なくとも一方が変異型多型を有するｋｒａｓプラスミドを、変異型プラスミド（ｋｒａｓ−ｍｔ）とし、変異型多型に応じて、「ｋｒａｓ−ｍｔ２」〜「ｋｒａｓ−ｍｔ１３」の１２種類を準備した。下記表のコドン１２およびコドン１３において、大文字の塩基が変異型の多型である。【０１５１】
また、ＢＲＡＦ遺伝子の部分配列（配列番号２における５１番目〜３５０番目）として、検出部位が下記表に示す塩基であるオリゴヌクレオチドが挿入された、ｂｒａｆプラスミドを準備した。検出部位が野生型であるオリゴヌクレオチドが挿入されたプラスミドを、野生型プラスミド（ｂｒａｆ−ｗｔ）、検出部位が変異型であるオリゴヌクレオチドを変異型プラスミド（ｂｒａｆ−ｍｔ）とした。下記表における塩基は、配列番号２に示す塩基配列において、２２９番目の塩基（ｗ）である。下記表において、大文字の塩基が変異型の多型である。【０１５２】
【表７】
0005917144.tif 000008
【０１５３】
前記ｋｒａｓプラスミドおよびｂｒａｆプラスミドを、以下に示す所定の割合で混合し、１４種類のプラスミド試料を調製した。プラスミド試料は、１μＬあたり、１×１０４コピー／μＬとした。
【０１５４】
【表８】
0005917144.tif 000009
【０１５５】
下記表９のＰＣＲ反応液５０μＬについて、全自動ＳＮＰｓ検査装置（商品名ｉ−ｄｅｎｓｙ（登録商標）、アークレイ社製）を用いて、ＰＣＲおよびＴｍ解析を行った。前記ＰＣＲは、９５℃で３０秒の後、９５℃１秒および５８℃１５秒を１サイクルとして５０サイクル繰り返した。そして、前記Ｔｍ解析は、前記反応液を９５℃１秒および４０℃６０秒で処理後、温度の上昇速度を１℃／３秒として、４０℃から８５℃に加熱していき、検出波長５２０〜５５５ｎｍ（ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ）および５８５〜７００ｎｍ（ＴＡＭＲＡ）における、経時的な蛍光強度の変化を測定することにより行った。【０１５６】
【表９】
0005917144.tif 000010
【０１５７】
前記Ｋ−ｒａｓ用プライマーおよびＢＲＡＦ用プライマーの配列を以下に示す。
（Ｋ−ｒａｓ用プライマー）
Ｆ２プライマー
5'-aaggcctgctgaaaatgactg-3'        （配列番号１２）
Ｒ２プライマー
5'-ggtcctgcaccagtaatatgca-3'        （配列番号１８）
（ＢＲＡＦ用プライマー）
Ｆプライマー
5'-cctttacttactacacctcagatatat-3'  （配列番号２０）
Ｒプライマー
5'-acaactgttcaaactgatgggac-3'      （配列番号２１）【０１５８】
前記Ｋ−ｒａｓ用プローブおよびＢＲＡＦ用プローブの配列を以下に示す。Ｋ−ｒａｓ用プローブは、Ｋ−ｒａｓ遺伝子のセンス鎖にハイブリダイズ可能な配列であり、前記配列において、大文字の塩基が、配列番号１における２２０−２２５番目の塩基（ｎｎｔｋｒｃ）に相補的である。前記Ｋ−ｒａｓ用プローブは、５’末端を、蛍光物質ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬで標識化し、３’末端をリン酸化した。前記ＢＲＡＦ用プローブは、ＢＲＡＦ遺伝子のアンチセンス鎖にハイブリダイズ可能な配列であり、前記配列において、大文字の塩基が、配列番号２における２２９番目の塩基（ｗ）に対応する。前記ＢＲＡＦ用プローブは、３’末端を、蛍光物質ＴＡＭＲＡで標識化した。
（Ｋ−ｒａｓ用プローブ）
5'-(BODIPY  FL)-ctcttgcctacGCCACCagctccaact-P-3'  （配列番号１０）
（ＢＲＡＦ用プローブ）
5'-ctagctacagAgaaatctc-(TAMRA)-3'                （配列番号２７）【０１５９】
これらの結果を図４〜図７に示す。図４〜図７は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフである。図４は、ＷＴ  １００％、ｋｒａｓ−ｍｔ２  １０％、ｋｒａｓ−ｍｔ３  １０％、図５は、ｋｒａｓ−ｍｔ４  １０％、ｋｒａｓ−ｍｔ５  １０％、ｋｒａｓ−ｍｔ６  １０％、図６は、ｋｒａｓ−ｍｔ７  １０％、ｋｒａｓ−ｍｔ８  １０％、ｋｒａｓ−ｍｔ９  １０％、ｋｒａｓ−ｍｔ１０  １０％、図７は、ｋｒａｓ−ｍｔ１１  １０％、ｋｒａｓ−ｍｔ１２  １０％、ｋｒａｓ−ｍｔ１３  １０％、ｂｒａｆ−ｍｔ  １０％の結果である。各図において、横軸は、測定時の温度（℃）を示し、縦軸は、蛍光強度の変化を示し、単位は、蛍光強度変化量の微分値である「ｄ蛍光強度変化量／ｄｔ」（ｄＦ/ｄｔ）とした。前記Ｋ−ｒａｓ用プローブとのＴｍ値は、ｋｒａｓ−ｗｔが７３℃、ｋｒａｓ−ｍｔ２が６７℃、ｋｒａｓ−ｍｔ３が６６℃、ｋｒａｓ−ｍｔ４が６７℃、ｋｒａｓ−ｍｔ５が６７℃、ｋｒａｓ−ｍｔ６が６６℃、ｋｒａｓ−ｍｔ７が６７℃、ｋｒａｓ−ｍｔ８が６６℃、ｋｒａｓ−ｍｔ９が６７℃、ｋｒａｓ−ｍｔ１０が６２℃、ｋｒａｓ−ｍｔ１１が６２℃、ｋｒａｓ−ｍｔ１２が６２℃、ｋｒａｓ−ｍｔ１３が６０℃であり、前記ＢＲＡＦ用プローブとのＴｍ値は、ｂｒａｆ−ｗｔが５１℃、ｂｒａｆ−ｍｔが５７℃である。【０１６０】
図４に示すように、ＷＴ  １００％の試料については、ｋｒａｓ−ｗｔおよびｂｒａｆ−ｗｔのＴｍ値でのみピークが確認された。一方、図４〜図７に示すように、野生型プラスミドおよび変異型プラスミドを含む各種プラスミド試料は、ｋｒａｓ−ｗｔ、ｋｒａｓ−ｍｔおよびｂｒａｆ−ｗｔのＴｍ値近傍の合計３ヵ所、または、ｋｒａｓ−ｗｔ、ｂｒａｆ−ｗｔおよびｂｒａｆ−ｍｔのＴｍ値近傍の合計３ヵ所で、ピークが確認された。このように、本実施例のｋ−ｒａｓ用プローブと、ＢＲＡＦ用プローブとを併用すれば、一つの反応液において、ｋ−ｒａｓ遺伝子とＢＲＡＦ遺伝子の多型を検出可能であることがわかった。【０１６１】
［実施例５］
本例では、パラフィン包埋切片臨床検体から得たＤＮＡ抽出液について、Ｔｍ解析を行い、Ｋ−ｒａｓ遺伝子およびＢＲＡＦ遺伝子の多型を検出した。【０１６２】
パラフィン包埋切片臨床検体から、ＤＮＡ抽出キット（商品名ＴａＫａＲａＤＥＸＰＡＴ（登録商標）、製品コード９０９１、タカラバイオ社製）を用い、ＤＮＡ抽出液を得た。【０１６３】
下記表１０のＰＣＲ反応液５０μＬについて、全自動ＳＮＰｓ検査装置（商品名ｉ−ｄｅｎｓｙ（登録商標）、アークレイ社製）を用いて、ＰＣＲおよびＴｍ解析を行った。前記ＰＣＲは、９５℃で６０秒の後、９５℃１秒および６２℃１５秒を１サイクルとして５０サイクル繰り返した。そして、前記Ｔｍ解析は、前記反応液を９５℃１秒および４０℃６０秒で処理後、温度の上昇速度を１℃／３秒として、４０℃から８５℃に加熱していき、検出波長５２０〜５５５ｎｍ（ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ）および５８５〜７００ｎｍ（ＴＡＭＲＡ）における、経時的な蛍光強度の変化を測定することにより行った。【０１６４】
【表１０】
0005917144.tif 000011
【０１６５】
前記Ｋ−ｒａｓ用プライマーは、前記実施例４と同じプライマーを使用した。前記ＢＲＡＦ用プライマーの配列を以下に示す。
（ＢＲＡＦ用プライマー）
Ｆ３プライマー
5'-tgcttgctctgataggaaaatgagatctac-3'  （配列番号３８）
Ｒ５プライマー
5'-aaactgatgggacccactccat-3'          （配列番号３９）【０１６６】
前記Ｋ−ｒａｓ用プローブは、前記実施例４と同じプローブを使用した。前記ＢＲＡＦ用プローブの配列を以下に示す。前記配列において、大文字の塩基が、配列番号２における２２９番目の塩基（ｗ）に対応する。前記ＢＲＡＦ用プローブは、３’末端を、蛍光物質ＴＡＭＲＡで標識化した。
（ＢＲＡＦ用プローブ）
5'-gctacagAgaaatctc-(TAMRA)-3'            （配列番号３６）【０１６７】
これらの結果を図８に示す。図８は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフである。図８において、（Ａ）は、Ｋ−ｒａｓ遺伝子、（Ｂ）は、ＢＲＡＦ遺伝子の結果である。横軸は、測定時の温度（℃）を示し、縦軸は、蛍光強度の変化を示し、単位は、蛍光強度変化量の微分値である「ｄ蛍光強度変化量／ｄｔ」（ｄＦ/ｄｔ）とした。前記Ｋ−ｒａｓ用プローブとのＴｍ値は、野生型が７３℃前後であり、前記ＢＲＡＦ用プローブとのＴｍ値は、野生型が５２℃、変異型が４５℃である。【０１６８】
図８（Ａ）に示すように、Ｋ−ｒａｓ遺伝子については、２つのピークが見られたことから、野生型配列および変異型配列が含まれることがわかった。また、図８（Ｂ）に示すように、ＢＲＡＦ遺伝子については、野生型のＴｍ値のみでピークが確認されたことから、野生型であることがわかった。パラフィン包埋臨床検体から回収したＤＮＡ抽出液には、夾雑物が混入していたり、鋳型ＤＮＡの断片化が予想されたが、本例によれば、各遺伝子のピークを明確に検出することができた。【０１６９】
［実施例６］
本例では、野生型プラスミドと、変異型プラスミドとの共存下で、Ｔｍ解析を行い、Ｋ−ｒａｓ遺伝子の多型を検出した。【０１７０】
前記実施例４の表８において、ｂｒａｆプラスミドを含まない以外は、同様にして、ｋｒａｓプラスミドを混合して、プラスミド試料を調製した。前記プラスミド試料は、１μＬあたり、７５コピー／μＬとした。【０１７１】
下記表１１のＰＣＲ反応液５０μＬについて、全自動ＳＮＰｓ検査装置（商品名ｉ−ｄｅｎｓｙ（登録商標）、アークレイ社製）を用いて、ＰＣＲおよびＴｍ解析を行った。前記ＰＣＲは、９５℃で６０秒の後、９５℃１秒および５８℃１５秒を１サイクルとして５０サイクル繰り返した。そして、前記Ｔｍ解析は、前記反応液を９５℃１秒および４０℃６０秒で処理後、温度の上昇速度を１℃／３秒として、４０℃から８５℃に加熱していき、検出波長５２０〜５５５ｎｍ（ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ）における、経時的な蛍光強度の変化を測定することにより行った。【０１７２】
【表１１】
0005917144.tif 000012
【０１７３】
前記Ｆ１−ＬＰプライマーおよび前記Ｒ１−ＬＰプライマーの配列を以下に示す。Ｒ１−ＬＰプライマーは、ｍがｃまたはａである２種類のオリゴヌクレオチドの混合物（縮重プライマー）とした。
Ｆ１−ＬＰプライマー（配列番号３２）
5'-ggtactggtggagtatttgatagtgt-3’
Ｒ１−ＬＰプライマー（配列番号３３）
5'-gaattagctgtatcgtmaaggcactc-3’
ｍ＝ｃまたはａ【０１７４】
前記プローブとして、下記配列の野生型プローブ６を使用した。前記配列において、下線部の塩基が、野生型コドン１２および野生型コドン１３に相補的な配列である。前記プローブ６は、５’末端を、蛍光物質ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬで標識化し、３’末端を、リン酸化した。
5'-(BODIPY  FL)-ctcttgcctacgccaccagctccaacttgctggctacgc-P-3'  （配列番号３１）【０１７５】
これらの結果を図９〜図１２に示す。図９〜図１２は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフである。図９は、ＷＴ  １００％、ｋｒａｓ−ｍｔ２  １０％、ｋｒａｓ−ｍｔ３  １０％、図１０は、ｋｒａｓ−ｍｔ４  １０％、ｋｒａｓ−ｍｔ５  １０％、ｋｒａｓ−ｍｔ６  １０％、図１１は、ｋｒａｓ−ｍｔ７  １０％、ｋｒａｓ−ｍｔ８  １０％、ｋｒａｓ−ｍｔ９  １０％、図１２は、ｋｒａｓ−ｍｔ１０  １０％、ｋｒａｓ−ｍｔ１１  １０％、ｋｒａｓ−ｍｔ１２  １０％、ｋｒａｓ−ｍｔ１３  １０％の結果である。各図において、横軸は、測定時の温度（℃）を示し、縦軸は、蛍光強度の変化を示し、単位は、蛍光強度変化量の微分値である「ｄ蛍光強度変化量／ｄｔ」（ｄＦ/ｄｔ）とした。前記Ｋ−ｒａｓ用プローブとのＴｍ値は、ｋｒａｓ−ｗｔが７２℃、ｋｒａｓ−ｍｔ２が６６℃、ｋｒａｓ−ｍｔ３が６６℃、ｋｒａｓ−ｍｔ４が６６℃、ｋｒａｓ−ｍｔ５が６６℃、ｋｒａｓ−ｍｔ６が６５℃、ｋｒａｓ−ｍｔ７が６６℃、ｋｒａｓ−ｍｔ８が６６℃、ｋｒａｓ−ｍｔ９が６６℃、ｋｒａｓ−ｍｔ１０が６２℃、ｋｒａｓ−ｍｔ１１が６１℃、ｋｒａｓ−ｍｔ１２が６０℃、ｋｒａｓ−ｍｔ１３が５９℃である。【０１７６】
図９に示すように、ＷＴ  １００％の試料については、ｋｒａｓ−ｗｔのＴｍ値でのみピークが確認された。一方、図９〜図１２に示すように、野生型プラスミドおよび変異型プラスミドを含む各種プラスミド試料は、ｋｒａｓ−ｗｔのＴｍ値近傍、ｋｒａｓ−ｍｔのＴｍ値近傍の合計２ヵ所で、ピークが確認された。このように、本実施例の野生型プローブを用いれば、野性型と微量の変異型の多型とが混在する場合であっても、野生型と変異型とを区別して、多型を検出可能であることがわかった。【０１７７】
［実施例７］
本例では、野生型プラスミドと、変異型プラスミドとの共存下で、Ｔｍ解析を行い、Ｋ−ｒａｓ遺伝子の多型を検出した。プラスミド試料は、前記実施例６と同じプラスミド試料のＷＴとｍｔ２〜９を使用した。【０１７８】
下記表１２のＰＣＲ反応液５０μＬについて、全自動ＳＮＰｓ検査装置（商品名ｉ−ｄｅｎｓｙ（登録商標）、アークレイ社製）を用いて、ＰＣＲおよびＴｍ解析を行った。前記ＰＣＲは、９５℃で６０秒の後、９５℃１秒および５７．５℃１５秒を１サイクルとして５０サイクル繰り返した。そして、前記Ｔｍ解析は、前記反応液を９５℃１秒および４０℃６０秒で処理後、温度の上昇速度を１℃／３秒として、４０℃から６５℃に加熱していき、検出波長５８５〜７００ｎｍ（ＴＡＭＲＡ）における、経時的な蛍光強度の変化を測定することにより行った。【０１７９】
【表１２】
0005917144.tif 000013
【０１８０】
前記Ｆ１−ＬＰプライマーは、前記実施例６と同じプライマーを使用した。前記Ｒ３−ＬＰプライマーの配列を以下に示す。
Ｒ３−ＬＰプライマー（配列番号３４）
5'-cacaaaatgattctgaattagctgtatcg-3’【０１８１】
前記プローブとして、下記配列の変異型プローブ７を使用した。前記配列において、下線部の塩基が、野生型コドン１２および変異型コドン１３（ｇａｃ）に相補的な配列である。前記プローブ７は、５’末端を、蛍光物質ＴＡＭＲＡで標識化し、３’末端を、リン酸化した。
5'-(TAMRA)-cttgcctacgtcacc-P-3'            （配列番号３０）【０１８２】
これらの結果を図１３〜図１５に示す。図１３〜図１５は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフである。図１３は、ＷＴ  １００％、ｋｒａｓ−ｍｔ２  １０％、ｋｒａｓ−ｍｔ３  １０％、図１４は、ｋｒａｓ−ｍｔ４  １０％、ｋｒａｓ−ｍｔ５  １０％、ｋｒａｓ−ｍｔ６  １０％、図１５は、ｋｒａｓ−ｍｔ７  １０％、ｋｒａｓ−ｍｔ８  １０％、ｋｒａｓ−ｍｔ９  １０％の結果である。各図において、横軸は、測定時の温度（℃）を示し、縦軸は、蛍光強度の変化を示し、単位は、蛍光強度変化量の微分値である「ｄ蛍光強度変化量／ｄｔ」（ｄＦ/ｄｔ）とした。前記プローブとのＴｍ値は、ｋｒａｓ−ｗｔが５４℃、ｋｒａｓ−ｍｔ２が５３℃、ｋｒａｓ−ｍｔ３が５３．５℃、ｋｒａｓ−ｍｔ４が５３℃、ｋｒａｓ−ｍｔ５が５３℃、ｋｒａｓ−ｍｔ６が５３℃、ｋｒａｓ−ｍｔ７が５３℃、ｋｒａｓ−ｍｔ８が５３℃、ｋｒａｓ−ｍｔ９が５７℃である。【０１８３】
図１３〜図１５に示すように、ｋｒａｓ−ｍｔ９  １０％の試料は、５７℃付近で大きな一つのピークが確認された。ｋｒａｓ−ｗｔおよび他の変異型の試料は、いずれも、５３〜５４℃付近で小さなピークが確認されたにすぎなかった。このように、野生型の試料と、野生型と変異型１〜８とを含む試料で、ピークが見られないことから、本実施例のプローブによれば、変異型９を、ピークの位置で区別し、検出することができる。
【産業上の利用可能性】
【０１８４】
以上のように、本発明の多型検出用プローブによれば、例えば、Ｋ−ｒａｓ遺伝子の多型を、Ｔｍ解析によって、簡便且つ優れた信頼性で判別できる。具体的には、例えば、試料中に、目的の多型が野生型であるＫ−ｒａｓ遺伝子と変異型であるＫ−ｒａｓ遺伝子とが共存している場合でも、本発明の多型検出用プローブを用いたＴｍ解析を行うことで、変異の有無を、簡便且つ優れた信頼性で検出できる。このため、本発明は、野生型のＫ−ｒａｓ遺伝子と変異型のＫ−ｒａｓ遺伝子とを両方含む試料に対して、特に有用である。このように、本発明によれば、Ｋ−ｒａｓ遺伝子の多型を、簡便且つ優れた信頼性で判別できることから、例えば、検出結果を、前述のような疾患の診断および治療法の選択等に反映することもできる。したがって、本発明は、医療分野等において極めて有用といえる。
【図１】
0005917144.tif 000014
【図２】
0005917144.tif 000015
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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