(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
化粧品において使用するための炎症応答のモジュレータを特定する方法であって、
（ａ）表皮層及び真皮層を含む第１のエックスビボヒト皮膚サンプルを、候補モジュレータと接触させる工程であって、前記第１のエックスビボヒト皮膚サンプルが、内因性で炎症を起こしたエックスビボヒト皮膚サンプル及び誘導性の炎症を起こしたエックスビボヒト皮膚サンプルからなる群から選択される、工程と、
（ｂ）前記第１のエックスビボヒト皮膚サンプルにおいて炎症のマーカーのレベルを測定する工程と、
（ｃ）対照レベルを提供する工程と、
（ｄ）前記第１のエックスビボヒト皮膚サンプルにおける前記炎症のマーカーの前記レベルが、前記対照レベルと比べた炎症応答の変化に対応するとき、前記候補モジュレータを炎症応答のモジュレータとして特定する工程と、
を含み、
前記内因性で炎症を起こしたエックスビボヒト皮膚サンプルは、いかなる炎症インデューサーによる誘導を伴わずに生じたサンプルであり、
前記誘導性の炎症を起こしたエックスビボヒト皮膚サンプルは、炎症インデューサーによって誘導されたサンプルである、
方法。
【請求項２】
前記対照レベルを提供する工程が、第２のエックスビボヒト皮膚サンプルの前記マーカーの前記レベル炎症を測定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記対照レベルを提供する工程が、第２のエックスビボヒト皮膚サンプルを対照物質と接触させることと、前記炎症のマーカーの前記レベルを測定することと、を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第２のエックスビボヒト皮膚サンプルが、誘導性の炎症を起こしたエックスビボヒト皮膚サンプルであり、前記対照物質が、クロベタゾール及びアピゲニンのうちの少なくとも１つである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記エックスビボヒト皮膚サンプルが、誘導性の炎症を起こしたエックスビボヒト皮膚サンプルであり、炎症が、ＩＬ−１７、ＩＬ−２２、ＩＬ−１β、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される有効量の化合物を、前記エックスビボヒト皮膚サンプルに送達することによって誘導される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
工程（ａ）〜（ｄ）を、異なる候補モジュレータを用いて反復することを更に含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
工程（ａ）〜（ｄ）が、階層化されたスクリーニング方法における第２のアッセイを含み、前記候補モジュレータが、前記第２のアッセイを行う前に、前記階層化されたスクリーニング方法の第１のアッセイを行う結果として選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記炎症のマーカーが、分泌されたサイトカイン、抗菌タンパク質、脂質生合成タンパ質、及び皮膚炎症に応答性の遺伝子に対応するｍＲＮＡからなる群から選択される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記炎症のマーカーが、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、及び腫瘍壊死因子αからなる群から選択される分泌されたサイトカインである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記炎症のマーカーが、Ｓ１００Ａ７及びＤＥＦＢ４からなる群から選択される抗菌タンパク質である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記炎症のマーカーが、セラミドシンターゼ３及び３−ヒドロキシ−３−メチル−グルタリル−ＣｏＡレダクターゼからなる群から選択される脂質生合成タンパク質である、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
工程（ｂ）が、前記エックスビボヒト皮膚サンプルを前記候補モジュレータと接触させた３〜６日後に行われ、
前記候補モジュレータが前記脂質生合成タンパク質の発現を阻害するとき、前記候補モジュレータが、炎症応答のモジュレータとして特定される、
請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
工程（ｂ）が、前記エックスビボヒト皮膚サンプルを前記候補モジュレータと接触させた少なくとも７日後に行われ、
前記候補モジュレータが前記脂質生合成タンパク質の発現を増加させるとき、前記候補モジュレータが、炎症応答のモジュレータとして特定される、
請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記炎症のマーカーが、ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＬ１０、ＩＬ１２、ＴＮＦα、ＫＲＴ１０、ＫＲＴ６Ａ、ＦＬＧ、ＣＡＬＭＬ５、Ｓ１００Ａ７、ＤＥＦＢ４、セラミドシンターゼ３、及びＨＭＧＣＲからなる群から選択される皮膚炎症に応答性の遺伝子に対応するｍＲＮＡである、請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、エックスビボヒト皮膚モデルの使用を含む、皮膚の炎症のモジュレータを特定する方法に関する。本開示は、一般的に、スキンケアの分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は、健康に、及びヒト等の自己認識を持った哺乳動物、自己イメージにとって重要である、哺乳類（例えば、ヒト）身体の複合の、多層となった、大きく、かつ可視の器官である。皮膚は、血管及びリンパ管を有する表皮組織及び真皮結合組織、下皮脂肪組織、並びに下皮の下の弾性の筋膜を含む、多様な細胞種及び構造を含有する、３つの主要な層（即ち、表皮、真皮、及び下皮又は皮下組織）を含む。次に、これらの構造は、ケラチノサイト、メラノサイト、線維芽細胞、内皮細胞、及び脂肪細胞を含む、幾つかの異なる細胞種から構成される。
【０００３】
皮膚は、部分的に、免疫器官として機能して、環境要因に対する障壁として作用し、必要な場合、損傷及び感染から保護するためにそのような要因への炎症応答を組織する。この役割において、皮膚は、マクロファージ、樹状細胞、肥満細胞、及びＴ細胞等の幾つかの種類の免疫細胞を担持するようになる。これらの細胞は、微生物等の異物に対する保護的な免疫監視を提供するだけでなく、それらはまた、皮膚の炎症を調節する因子を含む、ホメオスタシスを維持するための細胞因子を放出する。皮膚炎症を調節することに関与する種々の因子（例えば、インターロイキン）は、湿疹、乾癬、創傷、細菌への曝露、及びフケ等の多様な健康関連の状態に応答してホメオスタシスを促進する。更に、皮膚によって組織される炎症応答は、異なる方式で生じ得る。例えば、炎症誘発性のサイトカインの放出は、皮膚健全性の機械的な侵害が皮膚における炎症を誘導し得るのと同様に、それを誘導し得る。皮膚炎症は、幾つかの方式で生じ得るが、しなしながら、これらの炎症応答は、分子レベル及び生理学的レベルの両方で共通の特質をも共有する。
【０００４】
皮膚関連の炎症が個人の健康、外観、及び自尊心に対して有し得る望ましくない影響を考慮すると、皮膚炎症を調節することによって皮膚の外観を治療する又は改善するために有効である化粧品及び／又は治療剤を特定することにおける継続的な関心が存在する。インビボの皮膚条件をより緻密に模倣することが可能な皮膚モデルは、皮膚炎症のモジュレータを特定する精度を増加させることが予想されるであろう。
【０００５】
皮膚生理学及び薬剤への皮膚応答を研究するモデリング技法は歴史的に、単細胞種又は少数の共に混合された細胞種の培養から、組織等価物の製作、動物モデルの開発まで、多様な特有の技法を含んできた。これらの比較的単純なモデルは、しかしながら、皮膚層全体、又は特定の皮膚細胞種若しくは構造、又はインビボ条件の皮膚で見出される細胞内及び／若しくは細胞間情報伝達をしばしば欠いている。例えば、単細胞種の細胞培養物は、容易に利用可能であるが、皮膚の他の特徴への関連性を欠いており、インビボ皮膚条件では見られない、培養物内での挙動をしばしば呈する。加えて、そのような細胞は、細胞継代及び維持を促進する遺伝子操作によって変化させられ得る。
【０００６】
より複雑な皮膚モデルは動物モデル及び皮膚等価物モデルを含む。追加の複雑性を有する一方で、動物モデルは、ヒト皮膚と比べた遺伝子差異を含む限定を弱点とし得る。動物モデルで得られた結果は、更に、ヒト皮膚組織であれば異なって反応し得るという懸念を抱える。
【０００７】
皮膚等価物モデルは、細胞の相互接続性、浸透性の懸念、及び解剖学的単純さの欠如により限定され得る。皮膚等価物モデルでの幾つかの最近の試みは、器官型ヒト組織等価物として記載され、不活性ポリカーボネートフィルター上で培養されるケラチノサイト等のヒト細胞のインビトロ再構築を含み得る。これらのモデルは、それらの性質により、それらが試験薬剤に対する異常な感受性を引き起こし得る、障壁機能の低減を有し得るという点で限定される。このモデルはまた、（ケラチノサイト及び線維芽細胞、又はケラチノサイト及びメラノサイト等の）恐らく１つ又は２つの細胞種を有するが、内皮細胞又は更にケラチノサイト、線維芽細胞、及びメラノサイトの完全な組み合わせ等の追加の細胞を欠いており、ヒト皮膚より複雑でない場合がある。その上、器官型皮膚等価物モデルは、皮膚応答に影響し得る腺等の正常な皮膚構造もまた欠いている場合がある。
【０００８】
最も複雑な皮膚モデルはヒト皮膚組織サンプルのエックスビボ培養物を含む。そのようなモデルでの幾つかの以前の試みは、培養培地中に直接浮遊している皮膚の小さい生検を含んだ。一過性の培養物は、発明者及び研究者が、エックスビボブタ皮膚移植での試みが７日間に限定されることを示したように、不十分であり得ることが、当該技術分野で知られている（Ｖｉｅｌｈａｂｅｒら、Ｅｘ  ｖｉｖｏ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｋｉｎ  Ｍｏｄｅｌ、米国特許公報第２００９／０２９８１１３号）。エックスビボ皮膚の寿命を改善することにおける試みが追及されており、一例が欧州特許第２  ０１９  ３１６  Ｂ１号に記載される。皮膚細胞の三次元培養もまた試みられてきたが、それらの努力は、培養物内の幹細胞の相対度数、損傷した細胞のレベル、及び老化細胞の程度の点で、成熟したヒト皮膚とは顕著に異なる組成を有する、未熟な胎児細胞を培養することに集中した。総じて、これらの差異は、成熟したインビボ皮膚の培養物とは明確に異なる、３Ｄ培養物を確立する。
【０００９】
更により最近のエックスビボ皮膚モデルは、金属格子上で皮膚外植片を培養する試み（Ｍｉｔｔｓら、Ｅｌａｓｔｉｎ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｓａｍｅ、米国特許公報第２００９／０１１０７０９号）、及び受精した卵巣の卵の絨毛尿膜（ＣＡＭ）への皮膚移植（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎら、Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ａｖｉａｎ−Ｂａｓｅｄ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｇｒａｆｔｓ、米国特許公報第２００９／００６４３４９号）を伴ってきた。そのようなモデルは、しかしながら、一過性の寿命、環境的影響（例えば、栄養素の利用可能性、毒素濃縮、熱）への過度の感受性、及び種の境界にわたって結果を外挿する能力についての前述の限定を受けやすいままである。
【００１０】
皮膚炎症のモジュレータ等の薬剤を特定する取り組みで、インビボ皮膚条件を正確かつ精密に模倣する皮膚モデルを開発することにおける難題を超えて、そのようなモジュレータを特定するための方法は、皮膚モデル及びインビボ皮膚で予測可能な挙動を示す対照を特定しなければならない。その上、誘導性炎症に関連付けられるより大きい炎症応答に依存するスクリーニングのために、増殖の誘導等の許容できない追加の影響を伴わずに有意な炎症応答をもたらすであろうインデューサのレベルを特定することは困難である。例えば、ＩＬ−２２は、細胞増殖のインデューサでもある炎症インデューサである。投薬量及び時間に応じて、そのようなインデューサは、皮膚サンプルにおいて肥厚の過形成応答を刺激して、皮膚サンプルの健全性を進行的に破壊する。更に、炎症性状態が安定化又は正常化することを可能にするように設計されたスクリーニングのために、インデューサ投与（量及び頻度）は、延長された培養期間と適合性がある必要がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許公報第２００９／０２９８１１３号
【特許文献２】欧州特許第２  ０１９  ３１６  Ｂ１号
【特許文献３】米国特許公報第２００９／０１１０７０９号
【特許文献４】米国特許公報第２００９／００６４３４９号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
上述の観察を考慮して、ヒト皮膚炎症が多様な疾患及び障害に関連することは明らかであり、当該技術分野において、皮膚炎症のモジュレータ並びにモジュレータ自体を特定する改善された方法、またそのようなモジュレータを使用して、皮膚炎症に関連する症状を治療する、予防する、若しくは寛解させる、又は単純に皮膚の美容的外観を改善する方法に対する必要性が依然として存在する。また、エックスビボ皮膚サンプル等の炎症のモデリングに使用するのに好適な器官サンプルを、培養物中で長時間、インビボでのそのような物質の挙動から有意に逸脱することなく維持する及び／又は成長させることができる条件を特定するための必要性も存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
開示される発明の主題は、インビボ皮膚環境をより正確にかつ再現可能に反映するエックスビボヒト皮膚モデルを提供することにおいて、当該技術分野における前述の必要性のうちの少なくとも１つを満たす。皮膚炎症のモジュレータを特定する方法におけるヒト皮膚モデルの使用は、スクリーニングアッセイにおけるエラーを低減する、容易に生成されるモデルに依存するという利益を提供する。皮膚のインビボ環境をより正確に反映することによって、このモデルは、偽陽性及び偽陰性の形態のスクリーニング誤認を低減する。このモデル並びに内因性及び／又は誘導性皮膚炎症のモジュレータを特定する、開示される方法を用いると、有効な抗炎症薬の追及は、速度が増加する一方で費用が減少し、健康、美容、及び財政上の利益につながるであろう。
【００１４】
本開示の一態様は、（ａ）表皮層及び真皮層を含むエックスビボヒト皮膚サンプルを、候補モジュレータと接触させる工程であって、このエックスビボヒト皮膚サンプルが、内因性で炎症を起こしたエックスビボヒト皮膚サンプル及び誘導性の炎症を起こしたエックスビボヒト皮膚サンプルからなる群から選択される、工程と、（ｂ）エックスビボヒト皮膚サンプルにおいて炎症の少なくとも１つのマーカーのレベルを測定する工程と、（ｃ）炎症のマーカーの対照レベルと比べたエックスビボヒト皮膚サンプルにおける炎症のマーカーのレベルに基づいて、候補モジュレータを炎症応答のモジュレータとして特定する工程と、を含む、炎症応答のモジュレータを特定する方法を提供する。本方法において使用されるエックスビボヒト皮膚サンプルは、内因性で炎症を起こしたエックスビボヒト皮膚サンプルであっても、炎症が誘導されたエックスビボヒト皮膚サンプルであってもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】炎症インデューサへのエックスビボ皮膚モデルによる応答の例示である。
【図２】炎症インデューサへのエックスビボ皮膚モデルによる応答の例示である。
【図３】炎症インデューサへのエックスビボ皮膚モデルによる応答の例示である。
【図４】炎症インデューサへのエックスビボ皮膚モデルによる応答の例示である。
【図５】炎症インデューサ及び炎症モジュレータへのエックスビボ皮膚モデルによる応答の例示である。
【図６】炎症インデューサへのエックスビボ皮膚モデルによる応答の例示である。
【図７】組織学分析のために得られたエックスビボヒト皮膚のサンプルの顕微鏡写真を示す。
【図８】炎症インデューサ及び炎症モジュレータへのエックスビボ皮膚モデルによる応答の例示である。
【図９】炎症インデューサ及び炎症モジュレータへのエックスビボ皮膚モデルによる応答の例示である。
【図１０】炎症モジュレータへの、異なるドナーから得られたエックスビボ皮膚サンプルによる応答の例示である。
【図１１】炎症インデューサへの、異なるドナーから得られたエックスビボ皮膚サンプルによる応答の例示である。
【図１２】炎症モジュレータへのエックスビボ皮膚モデルによる応答の例示である。
【図１３Ａ】炎症モジュレータへのエックスビボ皮膚モデルによる応答の例示である。
【図１３Ｂ】炎症モジュレータへのエックスビボ皮膚モデルによる応答の例示である。
【図１４】炎症インデューサ及び炎症モジュレータへのエックスビボ皮膚モデルによる応答の例示である。
【図１５】炎症モジュレータへのエックスビボ皮膚モデルによる応答の例示である。
【図１６Ａ】症インデューサへのエックスビボ皮膚モデルによる応答の例示である。
【図１６Ｂ】炎症インデューサへのエックスビボ皮膚モデルによる応答の例示である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本明細書に開示される物質及び方法は、色彩、質感、知覚可能な張り、及び他の皮膚属性の点で皮膚の外観を改善するため、並びにヒト皮膚疾患、障害、又は状態の症状を治療する、予防する、又は寛解させるための、化粧品及び治療薬適用に有用である、ヒト皮膚炎症等のヒト皮膚炎症のモジュレータの特定及び使用への有効で経済的なアプローチを提供する。皮膚炎症のモジュレータを特定するための方法は、ヒト皮膚の表皮層及び真皮層を含むエックスビボヒト皮膚モデルを使用して、炎症に対する調節性制御を保持しながら内因性及び／又は誘導性炎症性状態に適応する方法をもたらし、皮膚炎症のモジュレータの特定への以前のインビトロ及び人工の又は非ヒト皮膚ベースのアプローチよりも、モジュレータのより正確かつ精密な特定につながる。本開示は、インビボの条件に類似した条件下でのエックスビボ皮膚モデルの維持及び／又は成長を可能にする条件の組を特定し、それによってモデルを使用して、当該技術分野で既知のスクリーニングによって達成され得るものよりも高い確信度、信頼性、及び再現性を伴って皮膚炎症のモジュレータを効率的かつ有効に特定することを許容する。
【００１７】
本開示の他の特徴及び利点は、次の詳細な説明から明らかとなるであろう。しかしながら、本開示の趣旨及び範囲内で種々の変更及び修正がこの詳細な説明から当業者に明らかとなるであろうため、詳細な説明及び具体的な実施例は、本開示の具体的な実施形態を示しながらも、例示として与えられるにすぎないことが理解されるべきである。
【００１８】
本明細書におけるヒトエックスビボ皮膚モデルは、表皮層（例えば、ケラチノサイト、メラノサイト、及びランゲルハンス（langerhan）細胞）及び真皮層（例えば、線維芽細胞、血管系（vasulature）、及び常在の免疫細胞）を含み、インビボでヒト皮膚において観察される調節された炎症応答を正確に再現することが可能である。インビボのヒト皮膚の関連性を、代替の細胞及び組織培養アプローチ、非ヒト皮膚モデル、又は合成皮膚モデルよりも正確に模倣するこのモデルの能力は、皮膚炎症のモジュレータについての改善されたスクリーニング方法をもたらす。本明細書における改善されたスクリーニング方法は、典型的に細胞若しくは組織培養物又は非ヒト若しくは合成皮膚モデルを使用する従来のスクリーニングよりも、細胞応答のより完全な像を提供する。結果として、皮膚の多様な疾患、障害、及び状態に対処するのに有用な抗炎症治療薬、予防薬、及び化粧品を特定する努力は、例えば、細胞又は組織培養物中では有望に見えるが、インビボ環境で有効性を欠いている、偽陽性の頻度を低減することによって、低減され、対費用効果がより高まる。本明細書に更に記載されるように、本開示は、エックスビボヒト皮膚モデル、内因性（即ち、基底）若しくは誘導性皮膚炎症のモジュレータについてスクリーニングする又はそれを特定する方法、並びにそれによって特定される化合物及び組成物を提供する。
【００１９】
本開示は、スクリーニング方法、即ち、皮膚における炎症応答のモジュレータを特定するための方法を提供し、本方法は、表皮層及び真皮層を含む培養されたヒトエックスビボ皮膚サンプルを提供する工程と、ヒト皮膚サンプルを、皮膚における炎症応答の少なくとも１つの候補モジュレータと接触させる工程と、炎症の少なくとも１つのマーカーのレベルを測定する工程と、を含む。幾つかの実施形態において、対照が提供されて、候補モジュレータとの接触からもたらされるマーカー発現のレベルを、炎症の阻害等の炎症に対するある特定の効果を有することが知られている対照化合物と接触させられた組織内のそのマーカーの発現のレベルと比較することを可能にする。これらの実施形態における最終ステップは、統計的に有意な差異（ｐ≦０．１０）が、候補モジュレータに曝露された又は対照に曝露されたいずれかの組織内の少なくとも１つマーカーの発現レベル間で観察される場合、候補モジュレータを炎症応答のモジュレータとして特定することである。
【００２０】
本開示はまた、皮膚における炎症応答のモジュレータを特定するための方法も提供し、本方法は、第１及び第２のエックスビボ皮膚サンプルを提供する工程と、第１及び第２の皮膚サンプルを、炎症の少なくとも１つインデューサと接触させることによって、皮膚サンプルにおいて炎症を誘導する、工程と、第２の皮膚サンプルを、対照、例えば、炎症の阻害剤に曝露する工程と、第１及び第２の皮膚サンプルを、皮膚における炎症応答の少なくとも１つの候補モジュレータと接触させる工程と、第１及び第２の皮膚サンプルにおいて炎症の少なくとも１つのマーカーのレベルを測定する工程と、第１の皮膚サンプルにおける炎症のマーカーの発現レベルを、第２の皮膚サンプルにおける発現レベルと比較する工程と、炎症の少なくとも１つのマーカーについての発現レベルが、第１のエックスビボ皮膚サンプルと第２のエックスビボ皮膚サンプルとの間で統計的に有意な様態で（ｐ≦０．１０）異なる場合、候補モジュレータを炎症応答のモジュレータとして特定する工程と、を含む。
【００２１】
エックスビボヒト皮膚モデルを使用して皮膚炎症のモジュレータを特定する方法は、一般的に、エックスビボ皮膚サンプルを皮膚炎症の候補モジュレータと接触させる工程と、結果として生じる炎症マーカーのレベルを測定する工程と、を含む。その上、本開示による方法は、皮膚サンプルを得る工程（例えば、外科手術廃棄物であるドナー組織を得ること）と、サンプルを（例えば、皮下組織を除去することによって）調製する工程と、組織又は器官培養のためにサンプルを調製する工程と、サンプルを、局所的に又は培養培地内で適用される少なくとも１つの候補モジュレータと接触させる工程と、サンプルを一定期間インキュベートする工程（例えば、培養すること）と、少なくとも１つの炎症マーカーのレベル（例えば、遺伝子転写レベル、タンパク質レベル、活性タンパク質レベル）を測定する工程と、を更に含んでもよい。本開示全体を通じて使用される用語を明示的に定義している次の節の後には、エックスビボ皮膚モデルの特徴及び皮膚炎症のモジュレータを特定する方法が更に詳細に記載される節が続く。
【００２２】
用語の定義
「候補モジュレータ」は、炎症のモジュレータとしてのその使用可能性のために選択される任意の合成又は自然発生化学化合物を意味する。候補モジュレータは、精製することも、又は混合物中にあることもできる。候補モジュレータは、小分子、巨大分子、及び重合体を含む。ある特定の実施形態において、候補モジュレータは、コンビナトリアルライブラリに含有される又はそこで生成される、組換え生成された分子であってもよい。ある特定の実施形態において、候補モジュレータは、その構造がコンピュータ又は三次元解析によって設計される分子及び巨大分子であってもよい。「候補モジュレータ」はまた、有機源の粗又は精製抽出物（例えば、動物性抽出物、植物性抽出物、及び微生物溶解物）も含む。本明細書における方法を実施する際に使用するための候補モジュレータは、不活性緩衝液（例えば、食塩水）又は好適な溶剤（例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、メタノール及びエタノール等のアルコール、並びに水及び培養培地等の水溶液）と組み合わされてもよい。
【００２３】
「皮膚科学的に許容される担体」は、ケラチン性組織への局所適用に好適で、良好な審美的特性を有し、皮膚用組成物中の他の構成成分と適合性であり、いかなる望ましくない安全性、つまり毒性に対する懸念も招かない担体を意味する。皮膚科学的に許容される担体は、例えば、単純な溶液（水系又は油系）、固体形態（例えば、ジェル又はスティック）、及びエマルション等の多様な形態であってよい。
【００２４】
「皮膚用組成物」は、ヒトの皮膚並びに／又は毛髪及び爪等の他のケラチン性組織への局所適用に好適な組成物を意味する。
【００２５】
「内因性炎症」は、基底の炎症と同義であり、炎症性状態又は炎症応答を誘導する又は作り出すためのいかなる意図的なヒトの介入も伴わずに、エックスビボヒト皮膚サンプルにおいて生じる、炎症性状態又は炎症応答を意味する。理論に束縛されるものではないが、内因性炎症は、サンプルを調製すること、例えば、宿主生物からの皮膚の物理的若しくは機械的分離及び／又は皮膚サンプルへの皮膚の分割の結果として、エックスビボヒト皮膚サンプルにおいて生じると考えられる。内因性で炎症を起こした細胞、組織、又は器官内の炎症マーカー発現は、誘導性炎症状態下で見られる発現レベルの変化よりも有意により目立たない。
【００２６】
本明細書における「湿度」は、相対湿度を意味する。
【００２７】
「増加」は、基底レベルを上回る、又は対照と比較した増加を意味する。逆に、「減少」は、基底レベルを下回る、又は対照と比較した減少を意味する。
【００２８】
「炎症」は、皮膚によって異質又は異常と知覚される、刺激への皮膚における応答を意味する。皮膚における炎症は、当該技術分野で理解されるであろう、潮紅、疼痛、腫脹、及び熱によって特徴付けられてもよい。炎症は更に、炎症性状態に特有の又は炎症性状態と一貫した発現パターン又はプロファイルを示している細胞、組織、又は器官を意味する。例えば、炎症は、炎症を起こした状態で増加した発現を示す炎症マーカーの発現が亢進する、及び／又は炎症を起こした状態で減少した発現を示す炎症マーカーの発現が低下する、細胞、組織、又は器官を含む。炎症を起こした細胞、組織、又は器官内で増加した発現を示す炎症マーカーの幾つかの非限定的な例としては、ＩＬ−６、ＩＬ−１β、ＩＬ−１α、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、及びＩＬ−８が挙げられる。
【００２９】
「誘導性炎症」は、炎症インデューサの添加によって誘導された、細胞、組織、又は器官の炎症性状態、又は炎症応答を意味する。当該技術分野で既知の又は本明細書に開示される任意の炎症インデューサが、炎症を誘導するために、エックスビボヒト皮膚サンプル等の細胞、組織、又は器官に送達されてもよい。例示の炎症インデューサには、ＩＬ−２２、ＩＬ−１７、ＩＬ−２２及びＩＬ−１７の組み合わせ、並びにＩＬ−１βが含まれる。誘導性炎症応答は、炎症マーカー発現レベルの変化の点で、内因性炎症応答よりも有意により強固である（下記を参照されたい）。
【００３０】
「炎症のインデューサ」は、少なくとも１つの条件の組の下で少なくとも１つの哺乳動物の皮膚において炎症を誘導することが可能な、物理的、化学的、又は生化学的実体である。例示の炎症のインデューサには、皮膚の機械的破壊（例えば、外科手術、皮膚源からの個別的なサンプルを穿孔することによって皮膚を物理的に引き裂くこと）、ＩＬ−１７、ＩＬ−２２、及びＩＬ−１β等の炎症誘発性のサイトカイン、微生物感染、並びに当該技術分野で既知の任意の他の炎症誘発性の分子又は実体（物理的力を含む）が含まれる。
【００３１】
「炎症マーカー」又は「炎症のマーカー」は、炎症を起こしていない細胞、組織、又は器官と対比して、炎症を起こした細胞、組織、又は器官内で発現レベルの変化を示す、発現可能な要素、又はそれによって発現される要素である。幾つかの炎症マーカーは、炎症を起こしていない細胞、組織、又は器官と対比して、炎症を起こした細胞内の発現レベルにおいて統計的に有意な（ｐ≦０．１０）差異を示す。例えば、「炎症のマーカー」は、炎症を起こしていない同様の組織に含有される同種の細胞と比べて、炎症を起こした組織に含有される細胞内で検出可能なほどに異なるレベルで発現される、遺伝子、遺伝子断片、又はコード領域であってもよい。発現は、タンパク質の物理的存在によって、又はタンパク質に特有の何らかの活性によって測定される、ＲＮＡ産生（例えば、ｍＲＮＡ）又はタンパク質産生を伴ってもよい。
【００３２】
「代謝」は、微生物内で起こる任意の化学反応を意味する。代謝には、同化、つまり生体分子の合成（例えば、タンパク質合成及びＤＮＡ複製）、及び異化、つまり生体分子の分解が含まれる。
【００３３】
「皮膚」は、表皮、真皮、及び下皮（即ち、皮下組織）を意味し、また粘膜及び皮膚付属器（adenexa）、特に毛包、毛根、毛球、爪床（ｌｅｃｔｕｌｕｓ）の腹側上皮層、並びに脂腺及び汗腺（エクリン及びアポクリン）も含む。
【００３４】
「スキンケア」は、皮膚の状態の調節及び／又は改善を意味する。スキンケアの非限定的な例としては、皮膚の健康、皮膚の水分補給、及び障壁としての皮膚の機能の改善が挙げられる。
【００３５】
「皮膚モデル」は、表皮及び真皮を含む、ヒト皮膚のモデルを意味する。皮膚モデルは任意に、下皮を含んでもよい。
【００３６】
「局所」は、皮膚又は他のケラチン性組織の表面を意味する。皮膚用組成物には、任意の化粧品、爪、又はスキンケア製品が含まれる。
【００３７】
「ＰＣＲ」は、ポリメラーゼ連鎖反応を意味し、リアルタイムＰＣＲ、定量ＰＣＲ（「ｑＰＣＲ」）、半定量ＰＣＲ、及びこれらの任意の組み合わせを含む。
【００３８】
冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、請求及び／又は記載されているもののうちの１つ以上を意味するものと理解される。
【００３９】
Ｉ．エックスビボ皮膚モデル
ドナー皮膚
本明細書において使用するのに好適なドナー皮膚は、外科手術廃棄物（例えば、ヒト皮膚）及び畜殺場（例えば、ブタを含む、家畜）等の、任意の好適な源から得られてもよい。幾つかの実施形態において、エックスビボ皮膚は、機械的分離によって幾つかのサンプルへと分割されてもよい。必要とはされないが、皮膚の比較的脂肪質の皮下組織層は、剥離又は切断によって等の、当該技術分野で既知の任意の手段によって除去されてもよく、この除去は、通常、皮膚を、直径が数ミリメートルほどにも小さいサイズを含む、任意のサイズであり得る個別的なサンプルに分割する前に遂行される。皮下組織層の除去は、培養の間、残りの皮膚組織（即ち、表皮及び真皮）内への培地の吸収を改善し得、それによって炎症の候補モジュレータの局所送達又は培地送達のいずれにも好適である皮膚モデルを提供する。皮膚サンプルが０．５ｃｍ2〜ｃｍ2の範囲であるとき、複数のサンプルを同じ皮膚源から得ることができ、これにより、異なる候補モジュレータ間の又は候補モジュレータと対照との間の比較試験が可能となる。
【００４０】
好適な対照には、下に記載される、皮膚炎症の既知の阻害剤によって提供される陽性対照、及び不活性化合物（即ち、皮膚炎症に影響を及ぼさないことが知られている化合物）等の陰性対照を含むか、又は皮膚サンプルに接触させられる化合物を全く含まない。
【００４１】
皮膚サンプル培養
ヒト生物学等の真核生物学の調査は、しばしば、エックスビボ物質に依存する。頻繁に、エックスビボ生体物質は、培養物中で継続的に成長する特性を示す、不死化細胞種である。一次細胞培養物は、細胞の限定された継代を弱点とし得、これが次に、着手可能な研究を限定する。不死化細胞株を使用する欠点は、インビボ環境でのほとんどの健康な真核細胞が長期的成長を示さず、しばしば、長時間維持することさえもできないため、これらの細胞がインビボ挙動を正確に反映しない場合があるということである。
【００４２】
インビボ条件をより緻密に反映するシステムの利点を得るために、本明細書に開示されるエックスビボ皮膚サンプルを、それらの成長及び維持に影響を及ぼす可変要素の大規模な研究に供した。理論上、３７℃のヒトの体温が、温度の点で本方法をインビボ条件に最も近づけるであろうが、そのような比較的高い温度で、エックスビボ細胞、組織、及び器官は、より低い温度におけるよりも、生存性をより急速に喪失する傾向がある。その上、本明細書に開示されるように、エックスビボヒト皮膚モデルを使用して皮膚炎症のモジュレータを特定する方法は、炎症応答がインビボ環境における場合のように持続及び調節されていることを確実にするために、しばしば、４〜６日間、又はそれよりも長い培養を要する。そのような期間にわたって、エックスビボ生体物質は、しばしば、生存性を喪失し、分解し始める。例えば、ＩＬ−２２等の既知の炎症性モジュレータによって誘導される炎症性状態もまた、エックスビボ皮膚モデルを、増加した細胞増殖の危険にさらして、炎症マーカー発現レベルに対する効果を正確に評価する能力を交絡し、妨げる。驚くべきことに、湿度を制御することが、エックスビボ皮膚の生存性に対する温度及び時間効果に影響を及ぼすことが発見されている。特に、約５０％の皮膚モデル維持／培養の相対湿度を提供することが、幾つかの事例において炎症に対する効果を実証するために必要とされ得る４〜６日間の経過にわたって、生存性の望ましくない喪失を伴わずに３７℃までの温度の上昇を許容することが予想外に発見されている。
【００４３】
本モデルにおいて使用するのに好適なエックスビボ皮膚サンプルは、例えば、任意に血清（例えば、１０％ウシ胎児血清）を補充したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）等の、好適な培養培地、又は真核細胞若しくは組織を細胞するための当該技術分野で既知の任意の他の好適な培地中で、培養又は維持されてもよい。皮膚サンプルの温度は、インビボ温度（例えば、３７℃）に対応するように選択されてもよいが、所望に応じて変動させられてもよい。例えば、脂質代謝遺伝子、遺伝子断片、又はコード領域を炎症マーカーとして使用するとき、アッセイ持続時間は、１０日間を超えてもよい。この実施例において、エックスビボ皮膚サンプルの温度を最初の４〜６日間にわたって３７℃で維持し、アッセイ期間の残りの期間にわたって３３℃で維持することが望ましい場合がある。
【００４４】
エックスビボ皮膚サンプルは、好適な容器（例えば、マルチウェルプレート）中で、真皮を湿潤に及び表皮を乾燥して保つために、等浸透圧性溶液上で真皮側を下にして培養されてもよい。加えて又は別法として、エックスビボ皮膚は、非浸透圧性（非等張性）溶液中に配置する（即ち、部分的に又は完全に浸漬させる）ことができる。等浸透圧性（又は等張性）溶液の好適な例は、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）であるが、任意の好適な等価物が使用されてもよい。溶液は、抗真菌又は抗菌試薬を含んでもよい。エックスビボ組織培養条件（例えば、時間、温度及び／又は）湿度）は、本エックスビボ皮膚モデル及び対応するスクリーニング方法の性能に影響を及ぼし得る要因である。
【００４５】
湿度
エックスビボ組織の寿命は、好適な湿度を選択することによって改善することができる。典型的な真核細胞及び組織培養は、約９５％湿度の環境でインキュベートされる。エックスビボヒト皮膚サンプルを支持するのに必要とされる条件についての幾つかの研究を通じて、器官培養の湿度を低下させることが、インビボ挙動からの有意な外見上の逸脱を伴わずに、３７℃で皮膚サンプルの長期的維持及び／又は成長を可能にするであろうことが発見された。下記の実施例において実証されるように、湿度を約５０％まで低減することは、特にそのようなサンプルが少なくとも１０日間インキュベートされたとき、エックスビボ皮膚サンプルの生存性の著しい増加をもたらした。好適な湿度を選択することによって、エックスビボ皮膚サンプルを、湿度を低減することにより更により高い温度で培養し、かつ依然としてエックスビボ皮膚モデルの生存性及び／又は一貫した遺伝子調節を維持することが可能であり得る。
【００４６】
時間
本明細書におけるエックスビボ皮膚サンプルのためのインキュベーションの時間は、数時間から１０日間以上まで異なり得る。大規模なスクリーニングの取り組みのために、短いインキュベーション時間が有益であり得る。エックスビボ皮膚サンプルは、生体物質が培養条件に順応し、炎症応答のモジュレータに応答性であるのと同様に炎症応答のインデューサに応答性となるのに十分な時間にわたって、インキュベートされるべきである。エックスビボ皮膚サンプルは、しばしば、培地中で少なくとも数時間インキュベートされる。少なくとも幾つかのマーカー遺伝子の発現パターンが、少なくとも４、若しくは少なくとも７、若しくは少なくとも１０日間、又は少なくとも１９日間インキュベートされたサンプルを必要とし得ることから、１０日間を超えて存続する皮膚サンプルを有することが望ましい。マーカー遺伝子は、当然のことながら、炎症を起こしていない組織の細胞と対比して、炎症を起こした組織の細胞内で異なる発現パターンを示す。炎症の指標となるために数日間を必要とするか、又はその期間にわたって炎症の指標であり続ける、いずれかの例示のマーカー遺伝子には、セラミドシンターゼ３及びＨＭＧ補酵素Ａ受容体（ＨＭＧＣＲ）等の、脂質代謝に関与する遺伝子産物をコードする遺伝子が含まれる。
【００４７】
温度
インビボ皮膚のような挙動を示し、したがって皮膚炎症のモジュレータを特定するためのより効率的で費用効果の高いシステムを提供するであろう、エックスビボ皮膚モデルを確立することの１つの難題は、温度である。３７℃のインビボ温度は、この比較的高い温度が、より低い温度よりもインビボ挙動のより急速な喪失につながって、皮膚サンプルが異常な生理的応答をより迅速に示すため、このモデルシステムに単純に課することができない。従来のエックスビボ皮膚モデルにおいて、エックスビボ皮膚サンプルの成長及び維持を可能にするために約３３℃の温度を維持することは珍しくないが、この温度は、インビボ条件とは異なる生理的環境をもたらす。故に、アッセイの少なくとも一部分又は更には全てに対して、インビボ条件により近い温度（例えば、３７℃）を維持することが望ましいであろう。インビボ条件とより緻密に整合した条件を確立するために、幾つかの環境特性が変動させられてもよい。驚くべきことに、湿度をおよそ５０％まで低下させることが、３７℃でエックスビボ皮膚培養物の成長及び維持を延長する一助となる。ほとんどのエックスビボヒト皮膚サンプルが３７℃で培養及び／又は維持されることが望ましい場合があるが、そのような皮膚サンプルのためのインキュベーション温度は、使用されている皮膚炎症のモジュレータを特定する方法の詳細に応じて、３７℃から変動し得る（例えば、３７℃〜３３℃）ことが企図される。
【００４８】
ＩＩ．炎症のモジュレータを特定する方法
本明細書に開示される炎症のモジュレータを特定する方法には、候補モジュレータを皮膚における炎症応答のモジュレータとして特定するための、階層化されたスクリーニング戦略に組み入れた方法が含まれる。例えば、第１階層のスクリーニングは、候補抗炎症化合物を特定するためのインシリコの取り組みを伴い得、続いて第２階層としてインビトロの細胞ベースのアッセイが行われる。本エックスビボヒト皮膚モデルの使用を含む、皮膚炎症のモジュレータを特定する方法は次いで、モジュレータを特定するための第３階層として、多階層化されたアプローチに組み込まれてもよい。
【００４９】
これらの特定方法の幾つかの実施形態は、培養された皮膚サンプルを提供する工程であって、この皮膚サンプルが表皮層及び真皮層を含む工程と、皮膚サンプルを少なくとも１つの候補モジュレータと接触させる工程と、転写プロファイルを皮膚サンプルから生成する工程であって、この転写プロファイルがＳ１００Ａ７、ＩＬ８、ＩＬ６、ＤＥＦＢ４、ＫＲＴ１０、ＫＲＴ６Ａ、ＴＮＦ（ＴＮＦ−α）、ＦＬＧ、ＣＡＬＭＬ５、セラミドシンターゼ３、及びＨＭＧＣＲからなる群から選択される少なくとも２つのマーカー遺伝子の転写レベルを含む工程と、マーカー遺伝子のうちの少なくとも１つの発現レベルが対照転写プロファイルにおけるその発現レベルとは異なるとき、候補モジュレータを皮膚における炎症応答のモジュレータとして特定する工程と、を含んでもよい。幾つかの実施形態において、皮膚サンプルは、ヒト由来である。
【００５０】
本明細書における方法は、拡張性があり、それ故、高処理アッセイ形式を含む、多様なアッセイ形式において使用するのに好適である。本方法は、最小で直径が数ミリメートルの種々のサイズのエックスビボ皮膚サンプル（例えば、ヒト皮膚サンプル）を使用して、任意の幾つかの候補モジュレータと共に行うことができる。比較的小さいエックスビボ皮膚サンプルを使用することは、化学（例えば、小分子）ライブラリにおいて見い出されるであろう候補モジュレータ等の、多数の候補モジュレータを探索するように設計されたスクリーニング方法におけるマルチウェルプレートの使用と適合性である。結果的に、本明細書におけるスクリーニング方法は、薬剤を炎症性皮膚応答のモジュレータとして特定するために使用されてもよく、本方法は、（ａ）培養された第１の皮膚サンプルを提供する工程であって、この第１の皮膚サンプルが表皮層及び真皮層を含む工程と、（ｂ）第１の皮膚サンプルを少なくとも１つの候補モジュレータと接触させる工程と、（ｃ）転写プロファイルを第１の皮膚サンプルから生成する工程であって、この転写プロファイルがＳ１００Ａ７、ＩＬ８、ＩＬ６、ＤＥＦＢ４、ＫＲＴ１０、ＫＲＴ６Ａ、ＴＮＦ（ＴＮＦ−α）、ＦＬＧ、ＣＡＬＭＬ５、セラミドシンターゼ３、及びＨＭＧＣＲからなる群から選択される少なくとも２つのマーカー遺伝子の転写レベルを含む工程と、（ｄ）Ｓ１００Ａ７、ＩＬ８、ＩＬ６、ＤＥＦＢ４、ＫＲＴ１０、ＫＲＴ６Ａ、ＴＮＦ（ＴＮＦ−α）、ＦＬＧ、ＣＡＬＭＬ５、セラミドシンターゼ３、及びＨＭＧＣＲからなる群から選択される少なくとも２つの遺伝子が、発現レベルにおいて、無処理の対照皮膚サンプルにおける同じ遺伝子とは異なるとき、少なくとも１つの候補モジュレータを皮膚における炎症応答のモジュレータとして特定する工程と（ｅ）ステップ（ａ）〜（ｄ）を反復して、皮膚における炎症応答の少なくとも１つモジュレータを特定する工程であって、この第１の皮膚サンプル及び候補モジュレータが各反復につき異なる工程と、を含む。
【００５１】
候補モジュレータは、それが、少なくとも１つの炎症マーカーの発現レベルの検出可能な変化をもたらす場合、炎症応答のモジュレータとして特定され得る。本明細書に開示される方法の例示の実施形態において、モジュレータとして特定される候補モジュレータは、ＩＬ−８又はＩＬ−６等の炎症マーカーの検出可能な下方調節、即ち、発現レベルの減少につながるであろう。１つを超える炎症マーカーの発現を監視する方法は、いずれかの結果としてもたらされる、皮膚炎症のモジュレータとしての候補モジュレータの特定における確信を増加させ得る。加えて、候補モジュレータの皮膚炎症のモジュレータとしての特定における確信は、皮膚炎症のモジュレータを特定するために使用された皮膚サンプル、又は同じ源からの他の皮膚サンプルが、例えば、クロベタゾール等の炎症の既知の阻害剤を使用して、それが１つ以上の炎症マーカーの発現に対して予想される阻害効果を提供することを確認することによって、適切に調節できることを裏付けることによって増加され得る。
【００５２】
本開示は、候補モジュレータを、皮膚（例えば、ヒト皮膚）における炎症応答の阻害剤として特定するためのスクリーニング方法を提供し、本方法は、（ａ）培養された第１の皮膚サンプルを提供する工程であって、この第１の皮膚サンプルが表皮層及び真皮層を含む工程と、（ｂ）第１の皮膚サンプルを少なくとも１つの候補モジュレータと接触させる工程と、（ｃ）第１の皮膚サンプルについての転写プロファイルを生成する工程であって、この転写プロファイルがＳ１００Ａ７、ＩＬ８、ＩＬ６、ＤＥＦＢ４、ＫＲＴ１０、ＫＲＴ６Ａ、ＴＮＦ（ＴＮＦ−α）、ＦＬＧ、ＣＡＬＭＬ５、セラミドシンターゼ３、及びＨＭＧＣＲからなる群から選択される少なくとも２つのマーカー遺伝子の転写レベルを含む、工程と、（ｄ）第２の皮膚サンプルを、Ｓ１００Ａ７、ＩＬ８、ＩＬ６、ＤＥＦＢ４、ＫＲＴ１０、ＫＲＴ６Ａ、ＴＮＦ（ＴＮＦ−α）、ＦＬＧ、ＣＡＬＭＬ５、セラミドシンターゼ３、及びＨＭＧＣＲからなる群から選択される少なくとも２つのマーカー遺伝子の転写レベルにおける変化（例えば、増加又は減少）を誘導する陽性対照薬剤と接触させる工程であって、この変化が皮膚における炎症応答の阻害と一貫している工程と、（ｅ）第２の皮膚サンプルについての陽性対照転写プロファイルを生成する工程と、（ｆ）（ｃ）において生成された転写プロファイルが、（ｅ）において生成された陽性対照転写プロファイルと指向的に同様であるとき、少なくとも１つの候補モジュレータを、皮膚における炎症応答を阻害するのに有効であると特定する工程と、を含む。
【００５３】
ＩＩＩ．炎症の候補モジュレータ
炎症の候補モジュレータは、小分子、生体分子、及び化学的重合体を含む、任意の生化学又は化学化合物であり得る。候補モジュレータは、任意のサイズの化合物ライブラリにおいて組織化されてもよく、起源が合成であっても、又は化合物若しくはより複合の構造としての天然源に由来してもよい。その上、候補モジュレータは、合理的薬物設計プログラム等の合理的設計の取り組みから生じる化合物であってもよく、そのような取り組みがコンピュータベースであるか否かに関わらない。本明細書における候補モジュレータの構造又は機能に対して明示的に課される限定以外には、何の限定も企図されない。故に、皮膚モジュレータを特定するための方法において使用することができる、物理的物質を含む任意の化合物又は物質、並びに化学及び／又は生化学分子及びより複合の構造が、候補モジュレータとして企図される。
【００５４】
ＩＶ．対照−炎症の既知の阻害剤
本明細書に開示される皮膚炎症のモジュレータを特定する方法の効率及び経費節減を最大限にするために、エックスビボ皮膚サンプルは、インビボ皮膚の挙動を可能な限り緻密にたどる挙動を呈するべきである。本方法の目的のために、哺乳動物における皮膚炎症の重要な特性は、炎症応答が調節可能である（調節できる）ことである。多様な炎症の既知の阻害剤を使用して、本明細書における方法において炎症を阻害してもよい。既知の炎症阻害剤の幾つかの非限定的な例としては、クロベタゾール、１，１０−フェナントロリン、アピゲニン、βメタゾン、ヒドロコルチゾン、ケトプロフェン、アーラトン、ジンクピリチオン（ＺＰＴ）、及び硫化セレンが挙げられる。少なくとも幾つかの既知の炎症阻害剤は、エックスビボ皮膚サンプルにおいて、内因性炎症及び誘導性炎症の両方（例えば、クロベタゾール）を阻害することができる一方で、幾つかは、内因性炎症（例えば、アピゲニン）又は誘導性炎症（例えば、ＺＰＴ）を他方の種類の炎症よりも有効に阻害することにおいて、選択性を示す。幾つかの実施形態において、テトライソパルミチン酸アスコルビルエステル（ＩＮＣＩ名称：アスコルビン酸テトラヘキシルデシル）形態でのビタミンＣの安定化型である、ＢＶ−ＯＳＣ等の、他の化合物を使用して、炎症を阻害してもよい。
【００５５】
ＩＶ．炎症のインデューサ
炎症のいずれの既知の阻害剤も、エックスビボ皮膚サンプルにおいて炎症のモジュレータを特定するための、本明細書における方法において使用するのに好適であり得る。幾つかの既知の炎症インデューサは、炎症誘発性のサイトカインであり、全てのそのような分子が開示される方法の範囲内に含まれる。そのようなサイトカインの特定の例は、インターロイキン１７（ＩＬ−１７）、インターロイキン２２（／ＩＬ−２２）、及びインターロイキン１β（ＩＬ−１β又はＩＬ−１β）である。また、ＩＬ−１７及びＩＬ−２２の組み合わせを含む、炎症誘発性のサイトカイン等の既知の阻害剤の組み合わせも明示的に企図される。
【００５６】
Ｖ．炎症のマーカー
本明細書に開示されるヒトエックスビボ皮膚モデル、並びに本エックスビボ皮膚モデルを使用する、皮膚炎症のモジュレータを特定するための方法は、より正確に、ヒト皮膚のインビボ挙動及び生理学を反映する。皮膚炎症のモジュレータを特定する本方法は、任意の既知の炎症マーカー遺伝子又はコードされたタンパク質の使用を企図する。幾つかの好適な炎症マーカー遺伝子には、分泌されたサイトカイン、抗菌タンパク質、脂質生合成タンパク質、及び本明細書に明示的に開示される炎症マーカーによって表される遺伝子／タンパク質の種類をコードする遺伝子（及びコードされた産物）が含まれるが、これらに限定されない。例示の炎症マーカーには、発現レベルが、炎症を起こした状態と炎症を起こしていない状態との間で異なるという点で、炎症に関連することが知られている、マーカー遺伝子の次のカテゴリが含まれる。ＩＬ１Ａ、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ５、ＩＬ７、ＩＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１２、ＩＬ１７Ａ、ＩＬ１７Ｃ、ＩＬ１７Ｆ，ＩＬ１９、ＩＬ２１、ＩＬ２３、ＩＬ２７、ＩＬ３１、及びＩＬ３３等であるが、これらに限定されないインターロイキンが企図され、ＩＬ１０ＲＡ、ＩＬ１０ＲＢ、ＩＬ１Ｒ１、ＩＬ５ＲＡ（ＣＤ１２５）、及びＩＬ９Ｒを含むが、これらに限定されないインターロイキン受容体も同様に企図される。また、Ｃ５、Ｅｏｔａｘｉｎ、ＭＣＰ−４、ＴＡＲＣ、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−３Ａ、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２３、ＭＩＰ−１Ｂ、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−２、ＣＸ３ＣＬ１、ＩＬ８ＲＡ、ＩＮＰ１０、Ｌ８ＲＢ、及びＣＸＣＬ３を含むが、これらに限定されないケモカイン、並びにＣＣＬ１３（ＭＣＰ−４）、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ８、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＸＣＲ１、及びＣＸＣＲ２を含むが、これらに限定されないケモカイン受容体も本開示によって理解される。加えて、ＭＣＰ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦＳＦ５、ＭＣＳＦ、ＧＣＳＦ、ＴＮＦＳＦ６、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＧ、ＴＮＦＢ、ＭＩＦ、ＮＡＭＰＴ、ＴＮＦ、ＴＲＡＩＬ、ＩＦＮＡ１、ＩＦＮＧ、及びＴＮＦ等であるが、これらに限定されない他のサイトカイン、並びにＣＤ４、ＣＤ４０、ＴＮＦＳＦ５、ＦＡＳＬＧ、ＪＡＫ２、ＪＮＫ１、ＮＦκＢ１、ＲＡＧ１、ＳＴＡＴ１、ｓ１００ファミリー、及びβデフェンシンを含むが、これらに限定されない炎症に関与する他の遺伝子も企図される。
【００５７】
幾つかの実施形態において、皮膚炎症のモジュレータを特定する方法は、Ｓ１００Ａ７、ＩＬ８、ＩＬ６、ＤＥＦＢ４、ＫＲＴ１０、ＫＲＴ６Ａ、ＴＮＦ（ＴＮＦ−α）、ＦＬＧ、ＣＡＬＭＬ５、セラミドシンターゼ３、及びＨＭＧＣＲからなる群から選択される少なくとも１つマーカーの発現レベル（複数可）を測定するであろう。炎症性状態で変化した発現を示すことに加えて、これらのマーカーは、エックスビボ皮膚モデルの状態を評価することにおいて有用な情報を提供することが当該技術分野で認識されている。例えば、ケラチン遺伝子（ＫＲＴ１０及びＫＲＴ６Ａ）並びにＦＬＧ（フィラグリン）遺伝子は、炎症を起こした状態と炎症を起こしていない状態との間の様々な発現に加えて、細胞増殖の測定を提供することが知られている。β−デフェンシン及びＳ１００Ａ７（Ｐｓｏｒｉａｓｉｎ）は、感染と戦うことにおいて有用な抗菌性ペプチドを発現する。β−デフェンシン及びＳ１００Ａ７の発現は、炎症に対して組織保護応答を示す。ＩＬ−８は、免疫応答に関与する白血球の走化性を誘導することによって炎症応答の主要なメディエーターとしての役目を果たす、ケモカインとして一般的に認識されている。ＩＬ−６は、Ｔ細胞及びマクロファージによって分泌されて、炎症に寄与する免疫応答を刺激する。ＴＮＦは、タンパク質を含む急性期応答に関与する急性期タンパク質であることが知られており、そのタンパク質のレベルは、炎症応答中に異なる。カルモジュリン様遺伝子５（「ＣＡＬＭＬ５」）は、皮膚において発現され、炎症を媒介する一助となる。ＣＡＬＭＬ５の発現は、ＩＬ−２２等のある特定の炎症性サイトカインによって調節されることが知られている。セラミドシンターゼ３は、感染及び炎症につながり得る皮膚障壁機能の破壊を回避するのに必要とされると考えられている。抗炎症特性を有することが知られている幾つかのスタチンのための標的である、ＨＭＧＣＲは、炎症応答を生成するための生化学プロセスの一部である、イソプレノイドの合成における律速段階に触媒作用を引き起こす。
【００５８】
更に詳細に、本開示は、候補モジュレータを皮膚における炎症応答のモジュレータとして特定するためのスクリーニング方法を提供し、本方法は、培養されたヒト皮膚組織サンプルを提供する工程であって、この皮膚サンプルが表皮層及び真皮層を含む、工程と、皮膚サンプルを少なくとも１つの候補モジュレータと接触させることと、試験転写プロファイルを皮膚サンプルから生成する工程であって、この試験転写プロファイルがＳ１００Ａ７、ＩＬ８、ＩＬ６、ＤＥＦＢ４、ＫＲＴ１０、ＫＲＴ６Ａ、ＴＮＦ（ＴＮＦ−α）、ＦＬＧ、ＣＡＬＭＬ５、セラミドシンターゼ３、及びＨＭＧＣＲからなる群から選択される少なくとも２つのマーカー遺伝子の転写レベルを含む工程と、試験転写プロファイルが、マーカー遺伝子のうちの少なくとも１つのレベルに関して対照転写プロファイルとは異なるとき、少なくとも１つの候補モジュレータを皮膚における炎症応答のモジュレータとして特定する工程と、を含む。
【００５９】
本明細書に記載される方法及びモデルは、完全な若しくは部分的なヒト皮膚組織サンプルからの、又はそのようなサンプルから取り出された単細胞種からの、ＲＮＡ又はタンパク質の分析を伴い得る。真皮及び表皮層を除去し、別々に又は共に分析することができる。培地中に分泌された又は全組織から抽出された、いずれかのタンパク質レベルは、標準のタンパク質分析技法（例えば、ウエスタンプロット及びＥＬＩＳＡ）を介して分析されてもよい。転写プロファイルは、ヒト皮膚組織サンプル（単数又は複数）を、そのような個々の細胞、層、又は複数の細胞、層、部分（又は全体）から生成することができる。遺伝子発現測定は、任意の好適なプロファイリング技術を使用して行われてもよい。例えば、目的とする遺伝子のｍＲＮＡ発現は、マイクロアレイ技法を使用して決定されてもよい。使用可能な他の新たな技術としては、ＮｅｘｔＧｅｎ配列決定法を用いるＲＮＡ−Ｓｅｑ又は全トランスクリプトームの配列決定が挙げられる。本明細書で使用する「マイクロアレイ」という用語は、生体サンプルの遺伝子発現プロファイリングを可能にする基板上の核酸、オリゴヌクレオチド、タンパク質、小分子、大分子、及び／又はそれらの組み合わせのあらゆる順序配列を広く指す。マイクロアレイは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ．、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｉｎｃ．、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．、及び他の製造業者から入手可能である。
【００６０】
種々の非限定的な実施例において、化合物を皮膚炎症の有効なモジュレータとして特定することは、遺伝子のパネルを分析して、炎症マーカー遺伝子を特定すること、及び特定された炎症マーカー遺伝子の発現が、候補モジュレータに応答して転写レベルで異なるかどうかを評価することを伴い得る。転写の評価は、無処理の対照（例えば、実験的に処理されていない器官、組織、又は細胞サンプル）と比較して改善され得ることが認識される。実験物質としての同じ源からの対照物質もまた、そのような評価の強みを増大させ得る。候補モジュレータが有効であるという決定はまた、反復ウェル又は試験の、統計的試験及び／又は統計的有意性も伴い得る。例えば、反復は、３、５、若しくは１０又はそれよりも多いサンプルサイズ（ｎ）を伴い得る。更に、ｍＲＮＡレベルの統計的有意性は、０．１、０．０５、０．０１、０．００１以下に設定することができるか、又は代替のレベルで設定することができる。ｍＲＮＡ抽出及びＰＣＲ分析の非限定的な例が、実施例３に提供される。
【００６１】
ＶＩ．炎症の種類
本明細書における方法は、エックスビボヒト皮膚サンプルの内因性炎症及び／又はエックスビボヒト皮膚サンプルの誘導性炎症を利用して、炎症のモジュレータを特定してもよい。内因性炎症は、生物から物理的に取り出され、かつ／又は個々のサンプルへと分離された皮膚サンプルにおいて生じ、炎症の既知の原因である皮膚創傷に類似させられてもよい。分子レベルで、内因性炎症は、比較的特徴付けられていない。対照的に、誘導性炎症は、使用されている炎症のインデューサに関連する分子経路を伴うので、分子レベルで、内因性炎症よりも大きな程度に特徴付けられている炎症のより具体的な形態と見なすことができる。炎症のインデューサに曝露されたエックスビボ皮膚サンプルはまた、内因性炎症も示し得るが、誘導性炎症応答のはるかにより大きい規模により、エックスビボ皮膚サンプルの誘導性炎症応答を測定又は監視することが可能となる。
【００６２】
幾つかの実施形態は、急性炎症によって特徴付けられる皮膚状態のエックスビボモデルを提供し、このモデルが培養培地中で培養された皮膚サンプル（例えば、ヒト皮膚）を含み、この皮膚サンプルが表皮及び真皮層を有し、培養培地中、約３０℃〜約４０℃で、約５０％〜約９０％の相対湿度で、約４日間〜約１０日間の一定期間にわたって培養されており、皮膚サンプルの急性炎症は、皮膚サンプルをＩＬ−１βと接触させることによってもたらされる。
【００６３】
具体的な実施形態は、慢性炎症によって特徴付けられる皮膚の状態のエックスビボモデルを提供し、このモデルが培養培地中で培養されたヒト皮膚サンプルを含み、このヒト皮膚サンプルが表皮及び真皮層を有し、培養培地中、約３０℃〜約４０℃で、約５０％〜約９０％の相対湿度で、約４日間〜約１０日間の一定期間にわたって培養されており、皮膚サンプルの慢性炎症は、皮膚サンプルをＩＬ−１７及びＩＬ−２２と接触させることによってもたらされる。
【００６４】
ＶＩＩ．スクリーニング方法
前に考察されたように、ヒトドナー組織サンプルは、外科手術廃棄物組織に由来し得、膜上で培養され得るか、又は皮下脂肪層を含むか若しくは皮下脂肪層が除去されたサンプルを含むかのいずれかである。ヒトドナー組織サンプルが少なくとも第１及び第２のヒトドナー組織サンプルへと分割される場合の実施形態において、皮下脂肪層は、分割前に除去され得る。組織分割サンプルのうちの幾つかは、陽性対照を投薬されてもよく、分割された組織サンプルのうちの幾つかは、１つ以上の候補モジュレータを投薬されてもよく、分割された組織サンプルのうちの幾つかは、無処理の比較対象として使用されてもよい（陽性対照又は目的とする候補モジュレータのいずれでも処理されていないことを意味する）。
【００６５】
本開示による方法は、反復使用に応じやすく、即ち、本方法を複数回、並行して（即ち、同時に、高処理形式で）又は順次に（即ち、経時的に）行なって、化学ライブラリにおいて見出されるであろう候補等の多くの候補を評価しても、又は特定の候補モジュレータを用いた結果を裏付けてもよい。炎症のモジュレータを特定する方法は、複数回、同じ又は異なるドナー、例えば、ヒトドナーからの皮膚サンプルを用いて行うことができる。各反復がまた異なる候補モジュレータを伴ってもよい。複数の候補モジュレータがスクリーニングされてもよい。幾つかの実施形態において、約５、１０、２５、５０、１００、２００、４００、８００超、及び／又は約１０００、２５００、５０００、１００００、２００００、若しくは５００００未満の候補モジュレータがスクリーニングされてもよい。幾つかの実施形態において、異なるドナーからのエックスビボ組織を使用してスクリーニングされた候補モジュレータのうちの２、４、６、１０、２５、５０、１００、２００、５００個又はそれよりも多い個数の効果を互いに比較して、どの候補モジュレータが、互い又は陽性対照と比べて、所望の美容的又は治療的抗炎症効果を提供するための目的となる遺伝子の最も良好な調節を提供するかを特定してもよい。
【００６６】
幾つかの実施形態において、エックスビボ皮膚組織は、目的とする少なくとも１つの候補モジュレータ又は陽性対照と接触させられる。候補モジュレータ又は陽性対照は、局所的に又は好適な成長培地を介して、適用されてもよい。局所適用の場合、エックスビボ皮膚組織は、物質の日々の適用前に、（例えば、いかなる液体培地もサンプルから除去するために）乾燥させられてもよい。エックスビボ皮膚組織は、細胞代謝速度に基づいて物質供給されてもよい。供給は１日に多数回、毎日、１日おき、又は（２、３、又はそれ以上等の）多週期間中の特定の日であり得る。供給は、３７℃で維持される培養物の場合には毎日の供給、３３℃で維持される培養の場合には１日おき等、培養物の温度に応じて変動し得る。
【００６７】
本明細書に開示される候補モジュレータを特定する方法はまた、他のスクリーニング方法と組み合わされて、階層化されたスクリーニングプロセスを提供し得る。階層は、１レベル当たりの複雑性の増加に関連付けられる。各階層は、追加のデータを提供するので、有望な候補モジュレータにより正確に焦点を置くための結論を導くことができる。したがって、より高い階層は、有効である確率がより高い、より少ない数の候補モジュレータと関連付けられる。階層は、幾つかの実施形態において、次のように進む：酵素アッセイ、細胞ベースの培養、インビトロアッセイ、本開示によるエックスビボ皮膚アッセイ、及び任意にインビボ皮膚アッセイ。最初の階層は、より高い出力でより迅速に完了することができる一方で、高次の階層は、追加の時間がかかり、かつ処理能力がより低い。各層の徹底的な分析は、候補モジュレータの成功の確率を増加させる最終的なデータを提供する。
【００６８】
ＶＩＩＩ．化粧品組成物
皮膚炎症と闘う種々の化粧品組成物を提供することの望ましさから、本明細書に記載される方法及びモデルのうちの１つ以上によって特定される皮膚炎症の候補モジュレータは、皮膚への局所適用に好適な化粧品組成物へと調合される。ある特定の実施形態において、化粧品組成物は、皮膚科学的に許容される担体、候補モジュレータ、及び提供されている特定の化粧品組成物に一般的に含まれる種類の１つ以上の任意の成分を含んでもよい。
【００６９】
皮膚科学的に許容可能な担体は、ヒト皮膚組織に接触して使用するために安全であるべきである。好適な担体は、水及び／又は水混和性溶剤を含んでもよい。化粧用スキンケア組成物は、約１重量％〜約９５重量％の水及び／又は水混和性溶剤を含んでもよい。組成物は、約１％、３％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、又は８５％〜約９０％、８５％，８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、又は５％の水及び／又は水混和性溶剤を含んでもよい。好適な水混和性溶剤には、一価アルコール、二価アルコール、多価アルコール、グリセロール、グリコール、ポリエチレングリコール等のポリアルキレングリコール、及びこれらの混合物が含まれる。他の好適な溶剤には、エタノール、プロパノール、ブタノール、イソプロパノール等の低級脂肪族アルコール；１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール、ブタンジオール、ペンタンジオール、ヘキサンジオール、ヘプタンジオール、デカンジオールなどのジオール；グリセリン；水、及び、これらの混合物が含まれる。ある特定の実施形態において、パーソナルケア組成物は、水、ジオール、グリセリン、又はこれらの組み合わせを含む。スキンケア組成物がエマルションの形態であるとき、水及び／又は水混和性溶剤は、典型的には、水相と関連する担体である。
【００７０】
好適な担体としては、油も挙げられる。スキンケア組成物は、約１重量％〜約９５重量％の１つ以上の油を含んでもよい。組成物は、約０．１％、０．５％、１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％，８０％、８５％、又は９０％〜約９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、又は３％の１つ以上の油を含んでもよい。油を使用して、水又は水混和性溶剤に好適ではない物質を可溶化、分散、又は担持してもよい。好適な油としては、シリコーン、炭化水素、エステル、アミド、エーテル、及びこれらの混合物が挙げられる。油は室温で流体であり得る。油は、揮発性又は不揮発性であってもよい。「不揮発性」とは、２５℃で約２７Ｐａ（０．２ｍｍ  Ｈｇ）以下の蒸気圧を示す物質、及び／又は１気圧で少なくとも約３００℃の沸点を有する物質を意味する。「揮発性」とは、物質が２０℃で少なくとも約０．２水銀柱ｍｍの蒸気圧を示すことを意味する。揮発性油は、重くてベトベトしたフィルムが望ましくない場合に、より軽い感触をもたらすために使用され得る。スキンケア組成物がエマルションの形態であるとき、油は、典型的に油相に関連するキャリアである。
【００７１】
スキンケア組成物は、乳化剤を含んでもよい。乳化剤は、組成物がエマルションの形態にある時、又は不混和性物質が混合されている場合、特に好適である。スキンケア組成物は、約０．０５％、０．１％、０．２％、０．３％、０．５％、又は１％〜約２０％、１０％、５％、３％、２％、又は１％の乳化剤を含んでもよい。乳化剤は、非イオン性、アニオン性、又はカチオン性であり得る。乳化剤の例は、当該技術分野で知られており、幾つかが、米国特許第３，７５５，５６０号、米国特許第４，４２１，７６９号、及びＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎの「Ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒｓ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ」（２０１０年版、Ｍ．Ｃ．Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．により出版）に開示される。他の好適な乳化剤は、Ｐｅｒｓｏｎａｌ  Ｃａｒｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  ＣｏｕｎｃｉｌのＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ａｎｄ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ（２００６年、第１３版）において、「Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ−Ｅｍｕｌｓｉｆｙｉｎｇ  Ａｇｅｎｔｓ」の機能カテゴリの下に更に記載される。これらの参考文献の各々における乳化剤の識別は、参照により本明細書に組み込まれる。直鎖又は分枝鎖タイプのシリコーン乳化剤もまた、使用され得る。特に有用なポリエーテル修飾シリコーンとしては、Ｓｈｉｎ  ＥｔｓｕのＫＦ−６０１１、ＫＦ−６０１２、ＫＦ−６０１３、ＫＦ−６０１５、ＫＦ−６０１５、ＫＦ−６０１７、ＫＦ−６０４３、ＫＦ−６０２８、及びＫＦ−６０３８が挙げられる。また、特に有用なのは、Ｓｈｉｎ  ＥｔｓｕのＫＦ−６１００、ＫＦ−６１０４、及びＫＦ−６１０５を含むポリグリセロール化直鎖又は分岐鎖シロキサン乳化剤である。乳化剤としては、乳化シリコーンエラストマーも挙げられる。
【００７２】
スキンケア組成物は、一般的に、当該技術分野で既知の、化粧品組成物（又は治療用組成物）及び特に局所適用組成物を作製する方法によって調製されてもよい。そのような方法は、通常、加熱、冷却、真空の適用等を用いて又は用いずに、成分を１つ以上のステップで混合して比較的均一な状態にするものであり得る。エマルションは、最初に極性の水相物質を非極性の脂肪相物質とは別個に混合し、次いで２つの相を適宜組み合わせて、所望の連続層を得ることによって調製されてもよい。本組成物は、治療期間の間十分な量の組成物を保存するようにサイズ設定されたパッケージ中で提供されてもよい。パッケージのサイズ、形状、及び設計は異なってもよい。ある特定のパッケージの例が、米国特許第Ｄ５７０，７０７号、同第Ｄ３９１，１６２号、同第Ｄ５１６，４３６号、同第Ｄ５３５，１９１号、同第Ｄ５４２，６６０号、同第Ｄ５４７，１９３号、同第Ｄ５４７，６６１号、同第Ｄ５５８，５９１号、同第Ｄ５６３，２２１号、同第２００９／００１７０８０号、同第２００７／０２０５２２６号、及び同第２００７／００４０３０６号に記載されており、これらは参照により本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【００７３】
以下は、本明細書に記載される方法及びモデルの種々の態様の非限定的な実施例である。実施例は、その多くの変形が可能であるので、例示目的のみのために与えられ、本発明の限定として解釈されるべきでない。
【００７４】
（実施例１）
エックスビボ皮膚サンプル調製
この実施例は、本明細書に開示される方法に従って使用するためのエックスビボ皮膚サンプルを調製する際に使用される、物質及び方法を記載する。開示されるスクリーニング方法において使用するためのエックスビボ皮膚サンプルの調製に使用される物質は、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）及びＧｌｕｔａｍａｘ、抗生物質及び抗真菌剤、１Ｘリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、１５０×１５ｍｍ滅菌培養皿、滅菌ゲージ４×４、使い捨て安全外科用メス、４ｍｍ使い捨て生検パンチ、６ウェル細胞培養インサート、消毒済みピンセット、綿棒、６ウェル培養皿、罫線付き消毒済みまな板（１２×１２）、スクレーパーハンドル、組織凍結培地、生検カセット、凍結組織凍結容器、１０％ホルマリン、固定組織用の輸送用容器、及びバイオハザード／鋭利物容器を、含んだ。培地をエックスビボ皮膚の到着前に調製した。皮膚は滅菌培養皿中の滅菌ＤＭＥＭ浸漬ガーゼ上で真皮（脂肪）側を下にして到着した。培養皿はテープで閉じられ、バイオハザードジップロック袋に入れられ、二次容器内の氷のう上にあった。
【００７５】
到着すると、皮膚をバッグから取り出し、３Ｘ  ＤＭＥＭ培地（３Ｘは、抗生物質及び抗真菌剤の濃度を指す）中に浸漬し、４℃で１時間保管した。１時間後、皮膚を３Ｘ  ＤＭＥＭから取り出し、滅菌１Ｘ  ＰＢＳですすいだ。皮膚を１Ｘ  ＤＭＥＭに浸漬したガーゼを含有する清潔な培養皿に入れた。サンプルを到着の同日に培養物中に入れた。しかしながら、必要な場合、エックスビボ皮膚サンプルを４℃で一晩保管することができる。
【００７６】
培養物の調製では、以下のことを行った。まな板上で、表皮が下になり、皮下組織（脂肪）が露出されるように、皮膚をひっくり返した。滅菌鋸歯状鉗子で皮膚の１つの角部を慎重につかみ、皮膚に対して４５°の角度に保持した刃で脂肪を削り取ることにより、使い捨て外科用メスで脂肪を除去した。脂肪を除去した後、スクレーパーを直定規ガイドのように用いて外科的端を外科用メスで切り落とし、皮膚はそこに保持した。スクレーパーをガイドとして用いて、皮膚を、幅を測定するために定規を用いて１．２５ｃｍ（格子上の２×２角）幅の条片に切った。この条片を１Ｘ  ＰＢＳを含有する１００ｍｍ培養皿中ですすいだ。条片を１．２５ｃｍ2角に切り分け、それらを３０分後に培養物中に入れるまで、１００ｍｍ培養皿中、１Ｘ  ＤＭＥＭ浸漬ガーゼ上に配置した。
【００７７】
（実施例２）
培養エックスビボ皮膚サンプル
６ウェルプレートの各ウェル中、２．５ｍＬの培地又は処理（例えば、候補モジュレータ、炎症インデューサ、及び／又は炎症の阻害剤）を伴う培地を含む、培養プレートを調製した。１つのＭｉｌｌｉｃｅｌｌ培養インサートを各ウェルに添加し、１００μＬの１ｘＤＭＥＭを各インサート膜の中心に置いた。皮膚組織の角を無作為に選択し、膜上の培地の上の、インサートの各々の中に配置した（１インサート当たり１片の皮膚）。プレートを、培地を毎日新たに交換しながら３３℃で保管した。対照として、ベースライン組織測定値を余剰の廃棄物から集めた（急速凍結のために低温を使用した）。ベースライン生検試料採集は、ＭＴＴ比色分析アッセイ（下に記載される）用に２つの４ｍｍパンチを含み、このうち１つの４ｍｍパンチをＯＣＴ組織化合物中で急速凍結し、１つの４ｍｍパンチを１０％ホルマリン中に固定し、パラフィン包埋に回した。炎症マーカー遺伝子の発現測定を、ＰＣＲ及び目的とする遺伝子（複数可）の既知の配列に適切なプライマーを使用して行った。
【００７８】
エックスビボ皮膚モデルの培養及び処理は、ｎ＝５の反復実験を含んだ。実験処理の前に、化合物（例えば、候補モジュレータ、炎症インデューサ、又は炎症のサプレッサ）を適切な溶剤（ＰＢＳ、培地、アルコール、及びＤＭＳＯを含む）中に可溶化した。適切な希釈液を処理のために作製し、１日につき１プレート当たり１５ｍＬの培地を使用し、このうち細胞培養インサート下で１ウェル当たり２．５ｍＬの培地を用いた。培地を事前に温め、実験中毎日交換した。培地を吸引し、１ウェル当たり２．５ｍＬのレベルで新鮮な温めた培地と置換した。幾つかの実施形態において、培地の一部又は全てを交換前に収集し、分泌されたタンパク質について分析してもよい。
【００７９】
エックスビボ皮膚培養の生存性を、実験全体を通じて評価し、組織のサンプルをｍＲＮＡ分析用に収集した。ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム臭化物）比色分析アッセイを利用して、細胞生存性を評価した。サンプル回収のために低温を使用した。
【００８０】
ＭＴＴプレートに事前に標識を付け、ＤＭＥＭ中の１ｍｇ／ｍＬ  ＭＴＴ  ６００μＬを各ウェルに添加した。全てのサンプルは４ｍｍ生検であった。サンプルは、（アルコールで事前に清浄した）クラフトまな板上で生検パンチ（例えば、Ｓｋｌａｒ  ４ｍｍ生検パンチ）及びハンマーを使用して得てもよく、これにより、数回の分析にわたって組織の１つの処理片からおよそ均等サイズのサンプルを分配することが可能となる。この実施例において、ＲＮＡの２つのパンチ及びＭＴＴの１つのパンチを一般的に採った。追加のパンチも同様にタンパク質エンドポイント等の他の測定用に採ってもよい。全ての必要なパンチを取るために、マット上で一度に１つの処理群について作業して、生検を取るためにハンマーを軽くたたいた。２つのパンチをスクリューキャップ管に入れ、液体窒素中で急速凍結した。ＭＴＴプレート中の１ウェル当たり、１つのパンチを配置した。１つの処理群当たり、サンプル全てを収集した時間は、５分間であった。全ての群がプロセスされると、ＭＴＴプレートをインキュベーターに２４時間配置した。ウェルプレート（２ｍＬの深さ）に１サンプル当たり１ｍＬのイソプロパノールを提供した。１ウェル当たり１つのサンプルを置き、そのウェルを密閉し、標識を付した。プレートを４℃で３日間の抽出に供した。
【００８１】
ＭＴＴプレートを以下の様態で読み取った。９６ウェル透明平底プレート（任意の細胞培養プレートを使用することができるが）を使用した。深いウェルプレート中でイソプロパノールを混合し、その後、１５０μＬの各サンプルを新たな９６ウェルプレート中に移した。ＧＥＮ５ソフトウェアを用いるＥＰＯＣＨプレートリーダーを使用し、使用する吸光度エンドポイント（例えば、５６２ｎｍ）を選択した。プレートをリーダーに入れ、読み取った。データを操作及び使用のためにエクセルシートにエクスポートした。
【００８２】
（実施例３）
エックスビボ皮膚を評価するために使用される方法及び物質
分泌されたサイトカインのＥＬＩＳＡ測定。
この方法を使用して、Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（「ＭＳＤ」）の標準ＥＬＩＳＡビーズアッセイプロトコル及びＭＳＤのサイトカイン特異的試薬を用いて、サイトカインの存在を測定することができる。組織に物質供給する前に培養培地を毎日収集し、アッセイするまでおよそ−８０℃で凍結保管する。アッセイ前に、標準物を調製し、希釈過程を実行して分析のために適切な希釈を確立する。サンプルを抗サイトカインビーズと共に３時間インキュベートし、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｂｉｏｐｌｅｘ  １００計器を使用して実行する。
【００８３】
ｍＲＮＡプロセシング及び純度評価
ｍＲＮＡの凍結調製及び抽出のために、以下の装置を得、準備した：２ｍＬ丸底管に１ｍＬのＴＲＩＺＯＬ及び各サンプルにつき５ｍｍのステンレススチールビーズを準備した。ドライアイスバケツを得、液体窒素をそのバケツに入れた。生検パンチをドライアイス上に維持し、サンプルを凍結したままにした。凍結袋及びｃｏｖａｒｉｓ  ｃｒｙｏｐｒｅｐをサンプルの凍結破砕において使用した。サンプルを凍結破砕するために、生検を凍結袋（サンプル当たり２つ）に入れ、液体窒素中に浸し、その後、ｃｒｙｏｐｒｅｐ（設定４）に入れた。サンプル袋を取り出し、窒素中に再び浸した。平坦なディスクを除去し、ＴＲＩＺＯＬを有する対応する２ｍＬ管に入れた。ディスクをＴＲＩＺＯＬ中で凍結したまま維持した。管を閉じ、急速凍結し、管全体を液体窒素中に配置した。このプロセスを全てのサンプルで反復した後、サンプルを箱の中に配置し、更なるプロセシングに必要になるまで−８０℃で保管した。
【００８４】
サンプルを解凍する前に、ＰＬＧ  Ｈｅａｖｙ管を、１２，０００ｒｐｍで２分間、事前にスピンすることによって準備した。サンプルを含有する凍結丸底管を融解した。サンプルを３，０００ｒｐｍで３分間、ビーズ破砕した。サンプルを次いで１２，０００ｒｐｍで１０分間、遠心分離した。この時間の間、１．５ｍＬ管中に２００μＬクロロホルムを含有する管を準備した。ＴＲＩＺＯＬ上清を採り、クロロホルムを含有する管に添加し、次いで１５秒間ボルテックスした。総計１．２ｍＬの上清及びクロロホルムをＰＬＧ管に添加した。サンプルを１２，０００ｒｐｍで１０分間、遠心分離した。水相をＰＬＧ管から２ｍＬ深さのウェルへと取り出し、各々２４個の組を同じプレート中に収集して各添加の合間に４℃で保管した。
【００８５】
次に、Ｍａｇｍａｘ磁気ビーズＲＮＡ抽出を行った。水相を含有するＤｅｅｐｗｅｌｌプレートを、解凍した。ｍＲＮＡ抽出のために、当該技術分野で既知の及び／又はｍＲＮＡ抽出試薬の供給業者によって推奨される手順に従って、単離されたｍＲＮＡを得た。プレートをＭａｇｍａｘ用に準備すると、適切なプロトコルを選択し、プレートをロードした。３５分間の実行サイクルを行い、プレートを除去した。溶離プレートをホイルで密閉し、蓋をホイルの上に置いた。ＲＮＡを必要になるまで−８０℃で保管した。
【００８６】
ＮａｎｏＤｒｏｐ定量及び純度評価を、ＥＰＯＣＨプレートリーダー及びＧｅｎ５ソフトウェアを使用して、単離されたｍＲＮＡに対して行った。読み取り値を、３μＬのサンプルを使用して取得し、ソフトウェアによりデータをＥｘｃｅｌに自動的にエクスポートした。
【００８７】
上記の実施例は、特定の方法を利用して、ｍＲＮＡをプロセス及び分析したが、当業者であれば、任意の同様の手順を利用してもよいことを認識するであろう。
【００８８】
ＲＮＡ定量ゲルプロトコル
ＲＮＡ定量ゲルを、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｃｈｉｐ  ＲＮＡ−Ｎａｎｏを使用して調製した。試薬を１０分間、室温まで温めた。５５０μＬのＡｇｉｌｅｎｔ  Ｒｅｄ（ゲル）をフィルターカラムに移し、１，５００ｇで１０分間、室温で遠心分離した。Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｌｕｅ（色素）を１０秒間、ボルテックスした。６５μＬのフィルターを通したゲルを管の中に移し、１μＬ  Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｌｕｅ（色素）を添加し、その管を１３，０００ｇで１０分間、遠心分離した。次に、Ａｇｉｌｅｎｔチップを９μＬのゲル−色素混合物と共にプライミングステーションにロードした。プライミングステーションを３０秒間閉じ、続いてプランジャを引いた。プライミングステーションの残りの２Ｇウェルに９μＬのゲル−色素混合物をロードした。ウェルに以下をロードした：各ウェル中に５μＬのＡｇｉｌｅｎｔ  Ｇｒｅｅｎ、ラダーウェルに１μＬのＡｇｉｌｅｎｔ  Ｙｅｌｌｏｗ（Ｎａｎｏ  Ｌａｄｄｅｒ）、及びサンプルウェルに１μＬのサンプル。チップ振とう器中でボルテックスを１分間行い、その時間の後、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ａｎａｌｙｚｅｒを製造業者の仕様書に従って使用した。
【００８９】
ｃＤＮＡ合成
ｃＤＮＡをｍＲＮＡサンプルから合成した。ｃＤＮＡ反応物を、最初にマスターミックス、次いでサンプル及び水を用いて、０．２ｍＬのＰＣＲストリップ管中で調製した。管をサーマルサイクラー中に配置し、製造業者によって推奨されるｃＤＮＡサーマルサイクリングプロトコルに従った。サンプルは必要になるまで−２０℃で保管した。
【００９０】
ＰＣＲ設定
炎症マーカー遺伝子の発現レベルを、ＲＯＸを用いるＱｕａｎｔａ  Ｐｅｒｆｅｃｔａ  Ｓｙｂｒ  Ｇｒｅｅｎマスターミックスを使用したＰＣＲによって決定した。ＰＣＲプレートにプロジェクト番号を付した。ＰＣＲに必要なプライマーを全てのプレートに事前に入れた。試薬を混合し、反応混合物を室温のプレート中、１ウェル当たり２０μＬでプレートにわたってアリコートした。プレートを１２×８のパターンで準備、即ち、プレートの縦列別に８個のサンプル及び横列別に１２個の遺伝子を用いた。ＰＣＲ分析は、ＳｔｅｐＯｎｅソフトウェアを利用した。
【００９１】
（実施例４）
エックスビボ皮膚サンプルにおける炎症のインデューサ
炎症誘発性のサイトカイン等の種々の既知の炎症のインデューサを、エックスビボ皮膚モデルシステムを使用して試験した。ＩＬ−１７、ＩＬ−２２、ＩＬ−１β、及びこれらの組み合わせを含む、種々の炎症誘発性のサイトカインは、エックスビボ皮膚サンプルにおいて炎症を誘導することが示された。
【００９２】
エックスビボ皮膚サンプルを本明細書に記載されるように得、調製し、培養した。炎症は正常化するのに典型的に４〜６日間かかるため、炎症インデューサ曝露の種々のスケジュールを探索して、調節できる炎症の存在、及びその調節を検証するのに十分な期間（例えば、４〜６日間）にわたって持続する炎症性状態につながるであろうスケジュールを特定した。これらの研究により、ヒトエックスビボ皮膚サンプルの培養の各々最初の４日間に炎症インデューサの添加を行うこととなった。結果的に、サンプルを４日間、ＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍＬ）と接触させたか、又は無処理のまま残した。ＴＮＦ−α発現及びＩＬ−６発現を、８日間の実験の各日に、培地中に存在するバイオマーカーの量を決定することによって監視した。
【００９３】
図１及び２は、エックスビボ皮膚サンプルを１０ｎｇ／ｍＬでＩＬ−１βに曝露した結果を例示する。図１に見られるように、ＩＬ−１βは、ＴＮＦ−α発現の約６５ｐｇ／ｍＬから約１２０ｐｇ／ｍＬへの増加を誘導し、これはＩＬ−１βの炎症のインデューサとしての役割と一貫していた。図２に見られるように、８日間の実験の最初の４日間にわたって１０ｎｇ／ｍＬで投与されたＩＬ−１βは、ＩＬ−６発現の平均約８．２ｎｇ／ｍＬから１２．３ｎｇ／ｍＬの高さまでの増加（これは炎症応答に対応する）をもたらした。
【００９４】
ＩＬ−１βの効果の別の研究を、本明細書に記載されるように得、調製し、培養したエックスビボ皮膚サンプルに対して行ったが、サイトカイン分泌の調節の代わりに遺伝子発現変化について分析した。皮膚サンプルを１００ｐｇ／ｍＬのＩＬ−１βに曝露し、３つの炎症マーカー遺伝子ＩＬ−８、ＩＬ−６、及びＴＮＦ−αの発現の変化倍率を１０日間の時間経過にわたって決定した。この研究の結果が図３に例示され、図３に例示されるように、３つの主要な炎症性マーカーの遺伝子発現レベルの上方調節が、本エックスビボ皮膚モデルにおけるＩＬ−１βの炎症性効果を裏付ける。ＩＬ−８についての変化倍率は、１日又は２４時間後に３．２８、２日後に２．５８、３日後に７．８８、４日後に５．４７、６日後に２．４２、及び１０日後に９．０２であった。ＴＮＦ−αについては、発現の変化倍率は、１日後に−１．２１、２日後に１．３４、３日後に１．３７、４日後に２．６７、６日後に−１．２９、及び１０日後に１．１９であった。
【００９５】
この実施例において報告された研究は、ＩＬ−１βがエックスビボ皮膚モデルにおいて炎症インデューサとして機能することを確立するが、炎症マーカー遺伝子発現によって明らかとなる誘導のレベルは、経時的に異なることが見出された。この変動にもかかわらず、下記の実施例に開示される研究は、炎症の幾つかの阻害剤が内因性皮膚炎症に特異的であり得（例えば、アピゲニン）、幾つかの阻害剤が誘導性炎症に特異的であり（例えば、ＺＰＴ）、一方で他の阻害剤が両方の種類の炎症を阻害することにおいて良好に機能する（例えば、クロベタゾール）ことを実証しているため、ＩＬ−１βは、本明細書における方法で炎症の好適なインデューサに留まる。本明細書で１種類を超える炎症が実証されていることを考慮して、また炎症が幾つかの方式で異なる原因から生じ得ることを理解すると、ＩＬ−１βが、炎症応答を作り出すために特定の原因を有する又は特定の経路を使用する皮膚炎症に対して選択的である、炎症のモジュレータを特定するための方法において特に有用であろうことが企図される。
【００９６】
（実施例５）
エックスビボ皮膚モデルシステムにおいて使用するためのＩＬ−１７及びＩＬ−２２の検査
ＩＬ−１７及びＩＬ−２２を、エックスビボ皮膚サンプルの細胞内の炎症誘導効果について検査した。ＩＬ−１７及びＩＬ−２２の両方が、特に組み合わされると、エックスビボ皮膚サンプルにおいて炎症を誘導することが見出された。これらの分子が皮膚細胞に対して有する効果をより十分に理解するため、及び皮膚炎症のモジュレータを特定するための開示の方法において使用する量を最適化するために、これらのサイトカインの追加の研究を行った。
【００９７】
１つのアッセイにおいて、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１７及びＩＬ−２２の各々を、本明細書に記載されるように得、調製し、培養したエックスビボ皮膚サンプルに添加した。第２のアッセイにおいて、２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１７及びＩＬ−２２の各々を、本明細書に記載されるように得、調製し、培養したエックスビボ皮膚サンプルに添加した。３つの炎症マーカー遺伝子、即ち、ＩＬ−８、ＩＬ−６、及びＴＮＦ−αの発現の調節倍率を１０日間の時間経過にわたって決定し、無処理の対照と比較した。結果が図４に例示される。
【００９８】
図４に例示されるように、ＩＬ−１７は、ＩＬ−２２と組み合わされて、主要な炎症性マーカーの遺伝子発現の適切な上方調節を実証した。ＩＬ−１７／ＩＬ−２２による炎症の誘導後の調節倍率の変化は、１日目に２．１９、２日目に３．９５、３日目に２．８１、４日目に６．７５、６日目に５．６６、及び１０日目に３．４４であった。ＩＬ−１７／ＩＬ−２２による炎症の誘導に起因し得るＴＮＦ−α発現レベルの変化倍率は、１日目に−１．０３、２日目に１．４４、３日目に１．２、４日目に２．３０、６日目に−１．３９、及び１０日目に−１．９９であった。実験を、炎症を誘導するために、２０ｎｇ／ｍＬを用いてＩＬ−１７及びＩＬ−２２の各々について反復した。ＩＬ−８発現についての結果は、無処理の対照と比べた発現の調節倍率の点で、１日目に４．２８、２日目に４．３２、３日目に５．０１、４日目に１３．７３、６日目に４．４３、及び１０日目に６．０１であった。ＴＮＦ−αについては、経時的な発現の変化倍率は、１日目に−１．１７、２日目に１．５１、３日目に１．７３、４日目に２．０６、６日目に−２．０６、及び１０日目に−３．７３であった。興味深いことに、組み合わせたＩＬ−１７／ＩＬ−２２炎症インデューサは、ＩＬ−８に対して強力な上方調節効果を有したが、ＴＮＦ−αに対しては有意により弱い効果を有した。本実験の１０日間の時間経過内でのＩＬ−８上方調節（及びＴＮＦ−α発現レベル）における外見上のプラトーは顕著であり、これはエックスビボ皮膚サンプルが、外因性炎症のインデューサの存在下にあるときでさえ、炎症性プロセスの調節の対象のままであることを示している。
【００９９】
エックスビボ皮膚モデルに単独で又は組み合わせて適用された、炎症インデューサ評価を行って、炎症マーカー遺伝子発現（ＩＬ−８）に対する効果を決定した。エックスビボ皮膚サンプルを、本明細書の他の箇所に記載されるように得、調製し、培養し、結果を４日目に得た。処理されたサンプルを、無処理のエックスビボ皮膚サンプル又はＤＭＳＯビヒクルのみで処理されたエックスビボ皮膚サンプルと比較した。この実験の結果が図５に例示される。
【０１００】
図５に例示されるように、エックスビボ組織によるＩＬ−８の培地中への分泌は、ＩＬ−１７及びＩＬ−１７＋ＩＬ−２２処理により増加する。抗炎症ステロイドであるクロベタゾールは、内因性（創傷により誘発）及び誘導される（サイトカインにより誘発）炎症の両方を適切に阻害する。無処理のエックスビボ皮膚サンプルは、約５，８００ｐｇ／ｍＬをもたらし、一方で０．０１％  ＤＭＳＯの形態でのビヒクルに曝露された皮膚サンプルは、約８，０００ｐｇ／ｍＬのＩＬ−８を発現した。さもなければ無処理のサンプルを１０μＭのクロベタゾールと接触させると、約４００ｐｇ／ｍＬのＩＬ−８の発現をもたらした。２００ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１７に曝露された皮膚サンプルは、約１２，５００ｐｇ／ｍＬのＩＬ−８を発現し、一方で２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−２２のみに曝露されたサンプルは、約５，５００ｐｇ／ｍＬのＩＬ−８を発現した。皮膚サンプルを、組み合わせた２００ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１７及び２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−２２に曝露すると、約１３，６００ｐｇ／ｍＬのＩＬ−８発現をもたらした。２００ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１７及び２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−２２に曝露された別の皮膚サンプルをまた、１０μＭのクロベタゾールにも曝露し、それは約４，４００ｐｇ／ｍＬのＩＬ−８を発現した。図５はまた、炎症マーカー遺伝子発現の大部分がＩＬ−１７誘導に起因し得るように見える一方で、組み合わせたＩＬ−１７／ＩＬ−２２誘導が、ＩＬ−８炎症マーカー遺伝子の発現レベルによって測定するとき、更により顕著な炎症応答をもたらしたことも例示する。
【０１０１】
別の実験において、エックスビボ皮膚サンプルを、当該技術分野で表皮増殖及びβ−デフェンシン発現レベルを増加させることが知られている、ＩＬ−２２の３つの濃度のうちの１つに曝露した。用量応答曲線を、無処理のエックスビボ皮膚サンプルと比べた、２つの炎症マーカー遺伝子、即ち、ＤＥＦＢ４及びＫＲＴ１０の発現レベルについて生成した。結果が図６及び７に例示される。
【０１０２】
図６に例示されるように、ＤＥＦＢ４は、２ｎｇ／ｍＬのＩＬ−２２において０．００、２０ｎｇ／ｍＬにおいて約３．００、及び２００ｎｇ／ｍＬにおいて約２０．００で発現され、これはＩＬ−２２濃度とＤＥＦＢ４発現レベルとの間の正の相関を確立している。ＫＲＴ１０については、倍率発現レベルは、２ｎｇ／ｍＬのＩＬ−２２に対して約０．００、２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−２２に対して約−３．００、及び２００ｎｇ／ｍＬのＩＬ−２２に対して約−１８．００であった。故に、エックスビボ皮膚モデルの処理は、抗菌防御タンパク質ＤＥＦＢ４（βデフェンシン）の遺伝子の発現を適切に上方調節し、表皮増殖の指標であることが知られている、Ｋｅｒｒａｔｉｎ  １０遺伝子発現（分化のマーカー）を下方調節した。
【０１０３】
図７は、組織学分析のために得た２つのサンプルの顕微鏡写真を示す。第１のサンプルを、無処理のエックスビボ皮膚サンプルから収集して（即ち、生検を行なった）から２４時間分析し、第２のサンプルを、エックスビボ皮膚サンプルから、この皮膚サンプルを２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−２２で処理した６日後に収集した（即ち、生検を行なった）。図７に見ることができるように、第２のサンプルは明確に、第１のサンプルと比べて増殖性の基底層を示す。故に、組織学分析は、ＩＬ−２２がエックスビボ皮膚細胞増殖に影響を及ぼすことを示す。上記の分析を拡大して、３つの追加の炎症マーカー遺伝子を調べると、ＩＬ−１７（２００ｎｇ／ｍＬ）及びＩＬ−２２（２０ｎｇ／ｍＬ）の組み合わせが一貫して、ＩＬ−８に加えてＳ１００Ａ７、ＩＬ−６、及びＤＥＦＢ４を含んだこれらのマーカー遺伝子の上方調節を誘導したことが示された。また、マーカー遺伝子発現の低減によって測定するとき、１０μＭのクロベタゾールの炎症を阻害することにおける効果も一貫していた。特に、Ｓ１００Ａ７は、無処理の皮膚サンプルと比べて約３４倍誘導され、このうちクロベタゾールが無処理の対照と比べて発現の約２６倍の増加をもたらした。ＩＬ−８については、誘導は、約１６倍であり、クロベタゾールは、それを約３倍まで低減した。ＩＬ−６については、誘導は、約６倍であり、クロベタゾールは、対照値と比べてその値を約０．３倍まで阻害した。ＤＥＦＢ４については、誘導は、約８００倍であり、クロベタゾールは、対照と比べてその増加を約２００倍まで低減した。故に、ＩＬ−１７／ＩＬ−２２誘導性炎症応答は、４つの炎症マーカー遺伝子、即ち、ＩＬ−８、ＩＬ−６、Ｓ１００Ａ７、及びＤＥＦＢ４の各々の発現を測定することによって検出された。加えて、実験は、クロベタゾール投与からもたらされる炎症の阻害がこれらの４つの炎症マーカー遺伝子の各々の発現レベルを測定することによって検出され得ることを示した。
【０１０４】
実験を再び拡大して、９つの炎症マーカー遺伝子を含めた。前述の実験及び本明細書に記載される他の実験と同様に、エックスビボ皮膚サンプルを本明細書に記載されるように得、調製し、培養した。各皮膚サンプルを次いで、炎症応答の組み合わせたインデューサとしてのＩＬ−１７（２００ｎｇ／ｍＬ）及びＩＬ−２２（２０ｎｇ／ｍＬ）に曝露し、このうち幾つかのサンプルを炎症の阻害剤としての１０μＭのクロベタゾールに更に曝露したが、他のサンプルは曝露しなかった。９つの炎症マーカー遺伝子の各々に対するこれらの条件の効果を、無処理の対照と比べて評価した。結果が調節倍率データとして図８に例示される。
【０１０５】
図８に例示されるように、抗炎症ステロイドであるクロベタゾールは、内因性及びＩＬ−１７＋ＩＬ−２２誘発性炎症の両方において、主要な炎症性マーカーの遺伝子発現を適切に阻害する。
【０１０６】
別の実験を、最適な炎症インデューサ濃度を特定するように設計した。実験は、様々な濃度のＩＬ−１７、ＩＬ−２２、又はＩＬ−１７及びＩＬ−２２の組み合わせと接触させられたエックスビボ皮膚組織サンプル、続いて炎症の一連のマーカーの遺伝子発現の測定に基づいて構築された、濃度曲線の生成をもたらした。エックスビボ皮膚組織サンプルを本明細書に記載されるように得、調製し、培養した。これらのエックスビボ皮膚サンプルを次いで上述の炎症のインデューサと共にインキュベートし、炎症のマーカーの発現レベルを決定し、炎症のインデューサと接触させられなかった対照エックスビボ皮膚組織サンプルと比較した。結果が下の表１に提供される。
【０１０７】
【表１】
0006039807.tif 000002
*ｐ≦０．０５
【０１０８】
結果は、ＩＬ−１７、ＩＬ−２２、又はＩＬ−１７／ＩＬ−２２のレベルが有意に変動し得るが（例えば、１０倍以上）、依然としてＩＬ−６及びＩＬ−８の有意な上方調節を生成することを示した。例えば、ＩＬ−１７は、２ｎｇ／ｍＬ〜２００ｎｇ／ｍＬの範囲でＳ１００Ａ７の発現を誘導した。
【０１０９】
この実施例は、本明細書における方法に使用されるＩＬ−１７及びＩＬ−２２の濃度が実験の必要性に応じて選択されてもよいことを実証する。例えば、個々に又は組み合わせて使用される、ＩＬ−１７及び／又はＩＬ−２２の好適な濃度は、各々２〜２００ｎｇ／ｍＬの間であってもよい。
【０１１０】
（実施例６）
炎症の阻害剤−エックスビボ皮膚サンプルにおける内因性又は誘導性炎症
クロベタゾールがエックスビボ皮膚サンプルにおいて内因性及び誘導性炎症を阻害し、それが炎症応答を調節する皮膚組織及び細胞の能力を破壊しないことを示すデータが、本明細書に開示される。故に、炎症の他の既知の阻害剤の、炎症を起こしたエックスビボ皮膚サンプルに対する効果を比較するための実験を行った。
【０１１１】
エックスビボ皮膚サンプルを本明細書の他の箇所に記載されるように得、調製し、培養した。個々のエックスビボ皮膚サンプルを次いで、無処理のまま残して内因性炎症をもたらしたか、又は炎症のインデューサとしてのＩＬ−１７及びＩＬ−２２の組み合わせに曝露した。発現レベルを３日目に決定した。この実験の結果が図９に例示される。
【０１１２】
図９に見ることができるように、１μｇ／ｃｍ2皮膚表面のクロベタゾールの局所適用に曝露された無処理の皮膚サンプルは、ＩＬ−８炎症マーカー遺伝子の発現の約１，２００ｐｇ／ｍＬから約２００ｐｇ／ｍＬへの低減をもたらした。０．４μｇ／ｃｍ2ジンクピリチオン（ＺＰＴ）でクロベタゾールを置換すると、約２，０００ｐｇ／ｍＬのＩＬ−８発現をもたらした。ＩＬ−１７／ＩＬ−２２誘導性炎症に供された皮膚サンプルは、約３，８００ｐｇ／ｍＬのＩＬ−８発現を発現し、一方で１ｐｇ／ｃｍ2の局所クロベタゾールの更なる添加は、ＩＬ−８発現を約１，１００ｐｇ／ｃｍ2に低減し、別個に、０．４μｇ／ｃｍ2の局所ＺＰＴの添加は、約２，３００ｐｇ／ｍＬのＩＬ−８をもたらした。これらの結果は、クロベタゾールが、ＩＬ−１７＋ＩＬ−２２を用いても用いなくてもＩＬ−８分泌を阻害することを実証する。ＺＰＴは、３日間の処理で、誘導性炎症（Ｉｌ−１７＋ＩＬ−２２）モデルにおいて分泌を低減するが、内因性炎症においては低減しない。故に、エックスビボ皮膚モデルは、炎症の阻害の異なる機構間の識別が可能である。
【０１１３】
エックスビボ皮膚サンプルの誘導性炎症応答に対するクロベタゾールの効果をまた、ＩＬ−８に加えて炎症マーカー遺伝子ＩＬ−６、Ｓ１１００Ａ７、及びＤＥＦＢ４の発現を測定することによって評価した。エックスビボ皮膚サンプルを上述のように得、調製し、培養した。炎症を、ＩＬ−１７（２００ｎｇ／ｍＬ）及びＩＬ−２２（２０ｎｇ／ｍＬ）の組み合わせを送達することによって誘導した。誘導性炎症応答に対する１０μＭのクロベタゾールの効果を、炎症マーカー遺伝子としてのＩＬ−８、ＩＬ−６、Ｓ１００Ａ７、及びＤＥＦＢ４の発現レベルを測定することによって評価した。結果は、４つの炎症マーカー遺伝子の各々に対して、クロベタゾールが、ＩＬ−１７／ＩＬ−２２の組み合わせによって誘導される炎症性状態において見られる発現レベルを有意に低減したことを示した。ＩＬ−６については、阻害は、インデューサ及びクロベタゾールの存在下での発現レベルが、無処理の皮膚細胞（即ち、インデューサの組み合わせ又は阻害剤に曝露されなかった細胞）におけるＩＬ−６発現レベルよりも低くなるほどに強力であった。この実験の結果が図８に例示される。
【０１１４】
クロベタゾールを対照（即ち、炎症応答を阻害する陽性対照）として使用する別の研究を、異なるドナーから得られたヒトエックスビボ皮膚サンプルを使用して行って、異なるドナーからのエックスビボ皮膚サンプルにおいて炎症応答を調節する能力を評価した。５つの異なるヒトドナーからのエックスビボ皮膚サンプルを、実施例１に記載されるように調製し、実施例２に記載されるように培養した。２つの炎症マーカー遺伝子であるＩＬ−８及びＩＬ−６の発現レベルを、内因性で炎症を起こした皮膚サンプルにおいて測定し、これらの炎症マーカー遺伝子についての発現レベルを、１０μＭのクロベタゾールでの皮膚サンプルの処理後のそれらのレベルと比較した。５つの皮膚ドナーの各々についてのＩＬ−８及びＩＬ−６の分泌における調節倍率を測定した。結果が図１０に例示される。
【０１１５】
図１０に例示されるように、１０μＭのクロベタゾールに曝露された５つのエックスビボ皮膚サンプルの各々におけるＩＬ−８の発現は、−２．７２、−２．７２、−３．６８、−３．８９、及び−１．７６であった。１０μＭのクロベタゾールに曝露された５つのエックスビボ皮膚サンプルの各々におけるＩＬ−６の発現は、−３．２８、−３．５５、−８．６９、−５．７０、及び−２．２０であった。故に、１０μＭのクロベタゾールは確実に、５つの異なるドナーからのエックスビボ皮膚サンプルにおいて、２つの炎症マーカー遺伝子ＩＬ−８及びＩＬ−６の各々の統計的に有意な阻害を誘導した。
【０１１６】
同様に、図１１は、５つの異なるドナーから得られたヒトエックスビボ皮膚サンプルを、２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１７及び２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−２２で処理した結果を例示する。図１１に見ることができるように、ＩＬ−１７＋１Ｌ−２２での処理は、異なるドナーからのエックスビボ皮膚サンプルにおいて、バイオマーカー遺伝子の拡大された組の同様の調節倍率を実証する。
【０１１７】
現在までの調査は、皮膚源、又はドナーを変化させたときのヒトエックスビボ皮膚サンプルの８０％超において、クロベタゾールが炎症応答を阻害し、ＩＬ−１７＋ＩＬ−２２が炎症応答を誘発するという予想につながっている。源に関わらず、ヒトエックスビボ皮膚サンプルにおいて、クロベタゾールは、炎症応答のモジュレータを特定するために信頼性の高い対照であり、ＩＬ−１７＋ＩＬ−２２は、炎症を誘導するために信頼性の高い対照である。この点で、エックスビボ皮膚サンプルは、インビボ皮膚としての挙動を示し続ける。クロベタゾール及びＩＬ−１７＋ＩＬ−２２は、有用な陽性対照であるだけでなく、データは、両者が、ドナー物質にわたって、所与のエックスビボ組織サンプルにおいて炎症を阻害又は誘発する能力に対する対照として機能するのに広く有効であることを示す。そのような対照は、本モデルを抗炎症スクリーンとして使用するために重要である。データは更に、異なるドナーからの皮膚サンプルが大方調節でき、クロベタゾールが広範なドナー物質にわたって機能する少なくとも１つの阻害性陽性対照であるという点で、ヒトエックスビボ皮膚モデルの強固な性質及びこのモデルを使用する皮膚炎症のモジュレータを特定する方法に寄与する。Ｉｌ−１７＋ＩＬ−２２は、様々なドナー物質にわたって機能する、炎症の少なくとも１つの誘発物質である。これらの有用な対照の特定により、炎症のモジュレータを特定する方法は、予想される内因性及び／又は誘導性炎症応答を示さない、及び／又は対照（例えば、皮膚炎症の阻害剤）に適切に応答しない任意のまれなサンプルを容易に特定し、そのようなサンプルを使用して得られる任意の結果に注意深く対処することができるという確信をもって、任意のヒト皮膚サンプルに対して実施することができる。
【０１１８】
別の研究は、追加の炎症の阻害剤として硫化セレンを調べ、ＩＬ−８分泌の低減に対する、クロベタゾールと比べたこの阻害剤の効果を検査した。別個の炎症を起こした皮膚サンプルを０．０４μＭ、０．２μＭ、１μＭ、５μＭ、及び２５μＭの濃度の硫化セレンに曝露し、１つの皮膚サンプルを１０μＭのクロベタゾールに曝露した。結果が図１２に例示される。
【０１１９】
図１２に例示されるように、硫化セレンは、エックスビボ皮膚サンプルにおける内因性炎症の阻害の用量応答を実証する。特に、０．０４〜２５μＭの硫化セレン濃度は、ＩＬ−８の減少した分泌レベルをもたらした。これらの結果は、硫化セレンを炎症の阻害剤として用いて、炎症マーカーとしてＳ１００Ａ７、ＩＬ−８、及びＩＬ−６に依存する根拠を提供する。
【０１２０】
好適な炎症阻害剤の基盤を依然として更に広げるために、クロベタゾールの今しがた確立された阻害性効果と比べた１，１０−フェナントロリンの効果を評価するための実験を行った。エックスビボ皮膚サンプルを上述のように得、プロセスし、培養した。ＩＬ−８を炎症マーカー遺伝子として使用して、皮膚サンプルにおける内因性炎症サンプルの発現に対する効果を、炎症阻害剤としての１０μＭのクロベタゾール又は１．２μｇ／ｍＬの１，１０−フェナントロリンの別個の局所適用の存在下での発現レベルと比較した。この実験の結果が図１３Ａ及び１３Ｂに例示される。
【０１２１】
図１３Ａから見ることができるように、３日目時点の結果は、内因性で炎症を起こした皮膚サンプルにおいてＩＬ−８が約２，６００ｐｇ／ｍＬで分泌され、一方でクロベタゾールの添加がＩＬ−８分泌を約３００ｐｇ／ｍＬまで阻害し、１，１０フェナントロリンがＩＬ−８分泌を約９００ｐｇ／ｍＬまで阻害したことを示した。故に、１，１０−フェナントロリン及びクロベタゾールは、ＩＬ−８の分泌を阻害するように機能したが、１，１０−フェナントロリンは、クロベタゾールよりも弱い阻害剤として機能し得た。結果は、１，１０−フェナントロリンが、クロベタゾール、アピゲニン、及び他の阻害剤と同様に、エックスビボ皮膚サンプルにおける内因性炎症を阻害することを確立する。
【０１２２】
図１３Ｂは、ＩＬ−８、ＩＬ−６、Ｓ１００Ａ７、及びＤＥＦＢ４の遺伝子発現に及ぼす、クロベタゾール及び１，１０−フェナントロリンの影響を例示する。図１３Ｂに見ることができるように、３日目時点の結果は、１０μＭのクロベタゾールがＩＬ−８、ＩＬ−６、及びＳ１００Ａ７の発現を阻害したことを示し、１．２μｇ／ｍＬの１，１０−フェナントロリンがＩＬ−８、ＩＬ−６、Ｓ１００Ａ７、及びＤＥＦＢ４の発現を阻害したことを示す。故に、１，１０フェナントロリン及びクロベタゾールは、局所的に７２時間適用されるとき、エックスビボ皮膚モデルにおいて炎症を抑制することができ、これは本モデルが培地適用及び局所適用による活性のために使用され得ることを示唆する。
【０１２３】
故に、クロベタゾール、１，１０−フェナントロリン、並びにアピゲニン、ＺＰＴ、硫化セレン、アーラトン、βメタゾン、ケトプロフェン、及びヒドロコルチゾン等の本明細書に開示される他の炎症の阻害剤は、本開示による方法において、陽性対照として使用するために企図され、これらの化合物が、本明細書において特定される少なくとも１つの炎症マーカー遺伝子（例えば、ＩＬ−８、ＩＬ−６、Ｓ１００Ａ７、ＤＥＦＢ４、ＫＲＴ１０、ＫＲＴ６Ａ、ＴＮＦ−α、ＦＬＧ、ＣＡＬＭＬ５、セラミドシンターゼ３、及びＨＭＧＣＲ）の発現及び／又は分泌レベルによって測定するとき、エックスビボ皮膚サンプルにおける炎症を阻害することによって陽性対照として機能する。
【０１２４】
（実施例７）
内因性及び誘導性炎症の阻害剤
前述の実施例は、とりわけ、クロベタゾールが、エックスビボ皮膚モデルにおいて内因性及び誘導性炎症の阻害剤として良好に機能することを確立した。実験を、本明細書に開示される他の炎症阻害剤によって阻害される炎症の種類を特徴付けるように設計した。当初は、応答がエックスビボ皮膚モデルにおいて作り出されるときに、所与の阻害剤が内因性炎症か、誘導性炎症か、それとも両方の種類の炎症を阻害するかは明確でなかった。この知識は、炎症の種類と阻害剤との間のいずれのミスマッチも回避され得るという点で、炎症のモジュレータを特定するための方法の設計を補助することが予想された。加えて、この情報は、特定の種類の炎症に対して有効なモジュレータの特定への、より状態に合わせたアプローチを容易にすることが予想された。
【０１２５】
皮膚サンプルを上述のように得、調製し、培養した。ＩＬ−８を炎症マーカーとして使用し、皮膚サンプルを、発現レベルを決定する前に４日間インキュベートした。この実験の結果が図１４に例示される。
【０１２６】
図１４に見ることができるように、内因性で炎症を起こした（即ち、無処理の）皮膚サンプルは、４日目時点で１０４５ｐｇ／ｍＬのＩＬ−８を発現した。他の個々の皮膚サンプルをＩＬ−１７（２００ｎｇ／ｍＬ）＋ＩＬ−２２（２０ｎｇ／ｍＬ）に曝露して炎症を誘導し、それらは４日目時点で１７９８ｐｇ／ｍＬのＩＬ−８を発現した。他の皮膚サンプルには誘導を行なわなかったが、それらを２５μＭのアピゲニンで炎症阻害剤に曝露して１０６ｐｇ／ｍＬのＩＬ−８（４日目）をもたらしたか（４日目）、又は１０μＭのクロベタゾールで５０ｐｇ／ｍＬのＩＬ−８を発現させた（４日目）。更に他の皮膚サンプルを、ＩＬ−１７（２００ｎｇ／ｍＬ）／ＩＬ−２２（２０ｎｇ／ｍＬ）投与によって炎症応答を作り出すように誘導し、別個で誘導された皮膚サンプルを次いで、２５μＭのアピゲニン［１２７６ｐｇ／ｍＬのＩＬ−８］、又は１０μＭのクロベタゾール［６５ｐｇ／ｍＬのＩＬ−８］のうちのいずれか１つにより阻害した。角括弧で提供される各条件に対する値は、ＩＬ−８発現についての４日目に得られた結果である。結果は、クロベタゾールが、エックスビボ皮膚サンプルにおいて、内因性及び誘導性炎症の両方の阻害剤として有効に機能することを裏付ける。アピゲニンは、内因性炎症を阻害することにおいて有効に機能するが、誘導性炎症を阻害することにおいて有効に機能するようには見えず、これは内因性炎症を選択的に阻害するツールを提供している。逆に、ＺＰＴが内因性炎症を有意に阻害しないが、ＩＬ−１７．ＩＬ−２２誘導性炎症は阻害することが以前に実証されており、これにより本エックスビボ皮膚モデルが、皮膚において誘導性炎症応答を優先的に阻害するためのツールを提供し得ることが示唆される。
【０１２７】
様々な種類の炎症（内因性及び誘導性）、炎症の種々の阻害剤、及び種々の炎症マーカー遺伝子を伴う上述の実験は、エックスビボ皮膚モデルが、皮膚炎症のモジュレータを特定する方法を行う際に有用であることを結論付ける、確かな根拠を提供する。この確信は、次の実施例に記載される実験の設計につながり、その実施例では、炎症阻害剤の数及び炎症マーカー遺伝子の数を両方とも増加させて、エックスビボ皮膚モデル及び皮膚炎症のモジュレータを特定する方法におけるその使用の強度を評価した。
【０１２８】
（実施例８）
炎症マーカー遺伝子
皮膚炎症のモジュレータを特定する方法、及びそのようなモジュレータを特定するためのエックスビボ皮膚モデルの使用は、皮膚細胞及び組織内の炎症応答を監視する能力に依存する。炎症性状態に応答性であることが見出された、選択される遺伝子、即ち、炎症を起こした組織内の細胞において、炎症を起こした組織の一部でないその同じ細胞又はより現実的には同じ種類の細胞における発現とは検出可能に異なる発現レベルを有する遺伝子についての発現レベルの使用が、本明細書に開示される。本明細書に開示される実験に基づいて、次の炎症マーカー遺伝子の組が特定されてきた：ＩＬ−８、ＩＬ−６、Ｓ１００Ａ７、ＤＥＦＢ４、ＫＲＴ１０、ＫＲＴ６Ａ、ＴＮＦ−α、ＦＬＧ、ＣＡＬＭＬ５、セラミドシンターゼ３、及びＨＭＧＣＲ。発現レベルは、転写ＲＮＡ、総タンパク質産生、又は少なくとも１つのタンパク質活性の測定を伴い得る。
【０１２９】
５つの炎症阻害剤のうちの１つに曝露された内因性で炎症を起こしたエックスビボ皮膚サンプルにおいて、ＩＬ−８、ＩＬ−６、Ｓ１００Ａ７、ＤＥＦＢ４、ＫＲＴ１０、ＫＲＴ６Ａ、ＦＬＧ、及びＣＡＬＭＬ５の発現レベルを検査するための実験を行った。炎症阻害剤は、１０μＭのクロベタゾール、０．６ｎＭのβメタゾン、０．０８μＭのヒドロコルチゾン、３０μＭのケトプロフェン、及び３５μＭのアーラトンであった。結果は、全ての炎症阻害剤がＩＬ−８、ＩＬ−６、ＤＥＦＢ４、ＫＲＴ６Ａ、及びＴＮＦ−αの発現を阻害することを示した。対照的に、１つを除く全てがＫＲＴ１０の発現を誘導した。残りの炎症マーカー遺伝子については、阻害剤効果は異なったが、ステロイド系の群の間のこの傾向は一貫していた。クロベタゾールがＳ１００Ａ７発現を阻害した一方で、他の４つの阻害剤は、このマーカー遺伝子の発現を誘導した。ＦＬＧについては、ケトプロフェン、及びアーラトンがわずかに発現を阻害した一方で、残りの阻害剤は、発現を低減した。ＣＡＬＭＬ５については、ケトプロフェンを除く全ての阻害剤が発現を誘導し、このうちケトプロフェンは発現を若干阻害した。データを分析し、ＩＬ−８及びＩＬ−６阻害レベルに基づいて炎症阻害剤の順位序列を導き、ここでクロベタゾールが最も有効な阻害剤であり、その後にβメタゾン、ヒドロコルチゾン、ケトプロフェン、及びアーラトンが続いた。無処理のエックスビボ皮膚サンプルと比べた炎症マーカー遺伝子の発現の変化倍率の点で、結果が図１５に例示される。
【０１３０】
図１５に例示されるように、本エックスビボ皮膚モデルは、種々のステロイド系及び非ステロイド系抗炎症化合物の有効性の順位序列が可能である。最も強力な抗炎症化合物であるクロベタゾールは、３つのマーカー（即ち、ＩＬ−６、ＩＬ−８、及びＴＮＦａ）の最も大きい低減を示し、その後にそれよりも強固でないステロイドであるβメタゾン、ヒドロコルチゾン、及びケトプロフェンが続く。最後尾は、アーラトン（arletone）であり、それは幾らかの阻害を示す。
【０１３１】
この研究は、インビトロアッセイ及びインビボ条件から十分に除去されたシステムに依存する生理学的測定への他のアプローチへの過度の信頼と酷似して、過度に単純化されたアッセイシステムへの信頼が、誤った又は誤解を招くような結果をもたらし得ることを示す。炎症マーカー遺伝子（即ち、ＩＬ−８、ＩＬ−６、Ｓ１００Ａ７、ＤＥＦＢ４、ＫＲＴ１０、ＫＲＴ６Ａ、ＴＮＦ−α、ＦＬＧ、ＣＡＬＭＬ５、セラミドシンターゼ３、及びＨＭＧＣＲ）のパネルからの１つを超える遺伝子の使用は、誤った結果又は異例を最小限にするであろう強固なアッセイ設計をもたらし、開発されてきた効率的で費用効果の高いアプローチにもかかわらず結果における確信増加につながる。クロベタゾール、１，１０−フェナントロリン、アピゲニン、ＺＰＴ、硫化セレン、アーラトン、βメタゾン、ケトプロフェン、及びヒドロコルチゾン等の、幾つかの既知の阻害剤のうちの１つ以上の陽性対照としての使用は、本開示による方法を更に強力にする。陽性対照を使用する際に、本開示の方法は、候補モジュレータの性能の判断をするためのベンチマークを提供し、１つを超える陽性対照の使用が、特定の陽性対照（即ち、既知の炎症阻害剤）から異なって１つの遺伝子の発現に影響を及ぼし得るモジュレータを特定する手段として企図される。
【０１３２】
（実施例９）
炎症マーカー遺伝子としての脂質代謝遺伝子の使用
脂質代謝に関与する遺伝子をまた、それらがエックスビボ皮膚モデルシステムにおける皮膚炎症に対する有用なマーカーであり得るかどうかを決定するために検査した。本明細書に開示される炎症インデューサのうちの３つ、即ち、ＩＬ−１７、ＩＬ−２２、及びＩＬ−１βを使用して、エックスビボ皮膚サンプルにおける炎症を誘導し、２つの脂質代謝遺伝子の発現レベルを１０日間の時間経過にわたって測定した。
【０１３３】
エックスビボ皮膚サンプルを本明細書に記載されるように得、調製し、培養した。セラミドシンターゼ３及びＨＭＧ補酵素Ａ受容体（ＨＭＧＣＲ）の発現レベルを１、２、３、４、６、及び１０日目時点で測定した。エックスビボ皮膚サンプルを、ＩＬ−１７／ＩＬ−２２の組み合わせ又はＩＬ−１βの送達のいずれかを行うことによって、炎症応答を作り出すように誘導した。セラミドシンターゼ３発現研究のために、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１７及びＩＬ２２の各々を１つの実験に使用し、２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１７及びＩＬ２２の各々を、第２の実験に使用した。炎症の誘導のために使用されたＩＬ−１β濃度は、別個の実験において１０ｐｇ／ｍＬ及び１００ｐｇ／ｍＬであった。セラミドシンターゼ３実験の結果が図１６Ａに例示される。図１６Ａに見ることができるように、ＩＬ−１７／ＩＬ−２２での誘導は、約３〜７日目からのセラミドシンターゼ３の発現における上方調節をもたらし、続いて発現の下方調節がその後に起こり、１０日目時点で無処理の対照と比べて約０．５倍の下方調節をもたらし、このうち若干より大きい下方調節が２０ｎｇ／ｍＬ濃度の各インデューサの使用からもたらされた。対照的に、ＩＬ−１β誘導は、約３日目までセラミドシンターゼ３の比較的平坦な発現レベルにつながったが、その時点で、遺伝子発現の徐々の進行性の上方調節が生じ、１０日目時点で１０ｐｇ／ｍＬ及び１００ｐｇ／ｍＬの両方のＩＬ−１βについて、発現の約１．５倍の増加により最高潮に達した。同様であるが、セラミドシンターゼ３発現の検出可能により大きい上方調節が、１００ｐｇ／ｍＬのＩＬ−１βによって誘導される発現と比べて、１０ｐｇ／ｍＬのＩＬ−１βに応答して生じた。
【０１３４】
ＨＭＧＣＲを炎症マーカー遺伝子として用いて、類似した実験を行った。本明細書に記載されるように実験のために操作したエックスビボ皮膚サンプルを、２０ｐｇ／ｍＬのＩＬ−１７及びＩＬ−２２の各々に曝露し、１０日間の実験の１、２、３、４、６、及び１０日目時点でＨＭＧＣＲ発現を測定した。結果が図１６Ｂに例示される。図１６Ｂに見ることができるように、ＨＭＧＣＲ発現は、３〜６日目の間で上方調節され、無処理の対照と比べて約６倍の発現でピークに達したが、６日目以降、発現は下方調節され、１０日目に無処理の対照と比べて約０．４５倍の発現レベルで終わった。インデューサとしての１００ｐｇ／ｍＬのＩＬ−１βの投与は、経時的に同様の発現パターンをもたらし、ＨＭＧＣＲ発現が３〜６日目にわたって上方調節されたが、その後下方調節されて、無処理の対照と比べて約０．８倍の発現で終了した。脂質代謝遺伝子を炎症マーカー遺伝子として使用する利点を評価するこれらの実験は、脂質代謝遺伝子が、異なる炎症インデューサによって誘導される炎症性状態に曝露されるとき、反復可能な発現パターンを呈するという結論につながる。より長期的な発現パターンは、下方調節の発現パターンの一つであるが、このより長期的な下方調節の一貫性は、これらの遺伝子を、炎症性状態において一貫して上方調節されるマーカー遺伝子と同程度に価値のあるものとする。結果として、セラミドシンターゼ３及びＨＭＧＣＲ等の脂質代謝遺伝子は、好適な炎症マーカー遺伝子である。本開示の種々の態様が記載され、本開示の実施形態が提示されてきた。一般論として、エックスビボヒト皮膚モデル及び皮膚炎症のモジュレータを特定する方法は、（とりわけ）次のうちの１つ以上を含んでもよい：内因性炎症のマーカーを測定し、候補モジュレータが適用された後の炎症のレベルにおける差異を比較する工程；陽性対照を皮膚に適用し、その効果を、適用された候補モジュレータと対比して比較する工程；クロベタゾール、１，１０フェナントロリン（phenathroline）、アーラトン、βメタゾン、ヒドロコルチゾン、及びケトプロフェン等の、炎症の阻害剤である陽性対照を使用する工程；候補モジュレータを局所的に又は培地中で適用する工程；（この炎症のマーカーは、分泌されたサイトカイン、保護的抗菌タンパク質、皮膚炎症に関連する１つ以上の遺伝子に対応するｍＲＮＡ、又は皮膚炎症に応答して調節される遺伝子の転写プロファイルを含む）；ＩＬ−６、ＩＬ−８、腫瘍壊死因子α、Ｓ１００Ａ７、ＤＥＦＢ４、ＫＲＴ１０、ＫＲＴ６Ａ、ＦＬＧ、ＣＡＬＭＬ５、セラミドシンターゼ３、及びＨＭＧＣＲ、並びにこれらの組み合わせ等の例示の炎症マーカー遺伝子（又はそれらのタンパク質発現産物）を使用する工程；発現レベルが、皮膚サンプルを得た又は皮膚培養物を開始した９６〜２４０時間後に決定される、内因性炎症を伴う方法を用いる工程；皮膚培養物を３０〜４０℃の間で、５０〜９０％の湿度で３〜１０日間にわたって維持する工程；炎症がＩＬ−１β、ＩＬ−１７、及びＩＬ−２２等のインデューサによって誘導又は誘発される、方法を使用する工程；皮膚を４〜１０℃で保管する工程；並びにエックスビボ皮膚モデルを使用して、例えば、潮紅、紅潮、斑点等を低減することによって皮膚を美容的に改善すること、又は湿疹、乾癬、創傷、細菌への曝露、及びフケ等の多様な皮膚疾患、障害、若しくは状態のうちのいずれかを治療的に治療することにおいて有用な、炎症のモジュレータを特定する、工程。
【０１３５】
本明細書に開示した寸法及び値は、記載された正確な数値に厳密に限定されるものと理解されるべきではない。むしろ、特に断らないかぎり、そのような寸法のそれぞれは、記載された値及びその値の周辺の機能的に同等の範囲の両方を意味するものとする。例えば、「４０ｍｍ」として開示される寸法は、「約４０ｍｍ」を意味することを意図する。
【０１３６】
任意の相互参照又は関連特許若しくは関連出願を包含する本明細書に引用される全ての文献は、明確に除外ないしは別の方法で限定されない限り、その全てを本明細書中に参照により組み込まれる。特に、本出願は、米国仮特許第６１／６８３，４５２号の利益を主張するものであり、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いずれの文献の引用も、こうした文献が本願で開示又は特許請求される全ての発明に対する先行技術であることを容認するものではなく、また、こうした文献が、単独で、あるいは他の全ての参照文献とのあらゆる組み合わせにおいて、こうした発明のいずれかを教示、示唆又は開示していることを容認するものでもない。更に、本文書において、用語の任意の意味又は定義の範囲が、参考として組み込まれた文書中の同様の用語の任意の意味又は定義と矛盾する場合には、本文書中で用語に割り当てられる意味又は定義に準拠するものとする。
【０１３７】
本発明の特定の実施形態が例示され記載されてきたが、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく他の様々な変更及び修正を実施できることが、当業者には自明であろう。したがって、本発明の範囲内にあるそのようなすべての変更及び修正を添付の特許請求の範囲で扱うものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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