(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリコシル化ＩＬ−１７Ａの活性を阻害するポリペプチドであって、
（ａ）ＧＶＴＬＦＶＡＬＹＤＹ（Ｘ１）（Ｘ２）（Ｘ３）（Ｘ４）（Ｘ５）（Ｘ６）ＤＬＳＦＨＫＧＥＫＦＱＩＬＳＴＨＥＹＥＤＷＷＥＡＲＳＬＴＴＧＥＴＧＹＩＰＳＮＹＶＡＰＶＤＳＩＱ（配列番号１）、ここで
（Ｘ１）がＡ、Ｋ、Ｓ、ＤまたはＥであり、
（Ｘ２）がＮ、Ｑ、Ａ、Ｋ、ＳまたはＲであり、
（Ｘ３）がＨ、Ｋ、Ｒ、ＬまたはＶであり、
（Ｘ４）がＧまたはＳであり、
（Ｘ５）がＨ、Ｑ、Ａ、Ｗ、ＶまたはＮであり、
（Ｘ６）がＲ、ＬまたはＳであり、
前記ポリペプチドが配列番号３〜９のいずれか一つからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなる、および
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列、ここで、同一性決定はアミノ酸位置（Ｘ１）〜（Ｘ６）を除外しており、配列番号１におけるアミノ酸位置３１〜３６中のアミノ酸配列ＳＴＨＥＹＥ（配列番号２）は保存されている、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなるポリペプチド。
【請求項２】
配列番号３〜９のいずれか１つからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなる、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
さらなる化合物と融合した請求項１または２に記載のポリペプチドを含む融合構築物。
【請求項４】
前記さらなる化合物が、薬学的に活性がある化合物、プロドラッグ、薬学的に許容される担体、診断的に活性がある化合物、細胞浸透促進剤、および／または血清中半減期を調節する化合物である、請求項３に記載の融合構築物。
【請求項５】
前記さらなる化合物が、
（ａ）蛍光色素、
（ｂ）感光剤、
（ｃ）放射性核種、
（ｄ）医療イメージング用造影剤、
（ｅ）サイトカイン、
（ｆ）毒性化合物、
（ｇ）ケモカイン、
（ｈ）凝血促進因子、
（ｉ）プロドラッグ活性化用酵素、
（ｊ）アルブミン結合物質、
（ｋ）アルブミン、
（ｌ）ＩｇＧ結合物質、または
（ｍ）ポリエチレングリコール
からなる群から選択される、請求項３に記載の融合構築物。
【請求項６】
前記さらなる化合物が、抗体軽鎖、抗体重鎖、抗体のＦＣドメイン、抗体、またはそれらの組合せからなるか、またはそれらを含む、請求項３に記載の融合構築物。
【請求項７】
請求項１または２に記載のポリペプチドが、前記さらなる化合物のＣ末端の下流に位置する、請求項６に記載の融合構築物。
【請求項８】
前記さらなる化合物が、配列番号１１を含むかまたはそれからなる抗体軽鎖を含むか、またはそれからなる、請求項６または７に記載の融合構築物。
【請求項９】
請求項８に記載の融合構築物の少なくとも１コピー、および配列番号１２の抗体重鎖の少なくとも１コピーを含むか、またはそれらからなる構築物。
【請求項１０】
配列番号１６もしくは１７を含むかまたはそれからなる融合構築物の少なくとも１コピー、および配列番号１２の抗体重鎖の少なくとも１コピーを含むか、またはそれらからなる、請求項９に記載の構築物。
【請求項１１】
配列番号１６もしくは１７を含むかまたはそれからなる融合構築物の２コピー、および配列番号１２の抗体重鎖の２コピーを含むかまたはそれらからなる、請求項１０に記載の構築物。
【請求項１２】
請求項１または２に記載のポリペプチドをコードする核酸分子、または請求項６から８のいずれか一項に記載の融合構築物、または請求項９から１１のいずれか一項に記載の構築物をコードする１つまたは複数の核酸分子。
【請求項１３】
請求項１または２に記載のポリペプチド、請求項３から８のいずれか一項に記載の融合構築物、請求項９から１１のいずれか一項に記載の構築物、請求項１２に記載の核酸分子、またはそれらの任意の組合せを含む、医薬または診断用組成物。
【請求項１４】
炎症性の、自己免疫性のおよび／または骨量減少関連の疾患の治療において使用するための、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記疾患が、関節炎、関節リウマチ、慢性進行性関節炎、反応性関節炎、乾癬性関節炎、腸疾患性関節炎、変形性関節炎、リウマチ性疾患、脊椎関節症、強直性脊椎炎、ライター症候群、過敏症（気道過敏症と皮膚過敏症の両方含む）、アレルギー、全身性エリテマトーデス、炎症性筋肉障害、多発性軟骨炎、強皮症、ヴェグナー肉芽腫、皮膚筋炎、スティーブンジョンソン症候群、慢性活性化肝炎、重症筋無力症、乾癬、特発性スプルー、自己免疫性炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、過敏性大腸症候群、内分泌性眼病、グレーブス病、サルコイドーシス、多発性硬化症、原発性胆汁性肝硬変、若年型糖尿病（Ｉ型糖尿病）、自己免疫性血液障害、溶血性貧血、無形成性貧血、真正赤血球性貧血、特発性血小板減少、ブドウ膜炎（前房および後房）、乾性角結膜炎、角結膜炎春季カタル、間質性肺線維症、糸球体腎炎（ネフローゼ症候群有りおよび無し）、特発性ネフローゼ症候群、微小変化型ネフロパシー、腫瘍、皮膚の炎症性疾患、角膜炎、筋炎、骨部インプラントの弛緩、代謝障害、アテローム性動脈硬化症、糖尿病、脂質異常症、骨量減少、骨関節炎、骨粗しょう症、歯周疾患、閉塞性または炎症性気道疾患喘息、気管支炎、塵肺症、肺気腫、急性および超急性炎症反応、急性感染、敗血症性ショック、エンドトキシンショック、成人型呼吸窮迫症候群、髄膜炎、肺炎、重度の火傷、カヘキシー消耗性症候群、脳血管発作、ヘルペス性間質性角膜炎およびドライアイ疾患からなる群から選択される、請求項１４に記載の使用のための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グリコシル化ＩＬ−１７Ａの活性を阻害するポリペプチドであって、（ａ）ＧＶＴＬＦＶＡＬＹＤＹ（Ｘ１）（Ｘ２）（Ｘ３）（Ｘ４）（Ｘ５）（Ｘ６）ＤＬＳＦＨＫＧＥＫＦＱＩＬＳＴＨＥＹＥＤＷＷＥＡＲＳＬＴＴＧＥＴＧＹＩＰＳＮＹＶＡＰＶＤＳＩＱ（配列番号１）、ここでアミノ酸位置（Ｘ１）〜（Ｘ６）は任意のアミノ酸配列であってよい、および（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列、ここで、同一性決定ではアミノ酸位置（Ｘ１）〜（Ｘ６）を除外しており、配列番号１におけるアミノ酸位置３１〜３６中のアミノ酸配列ＳＴＨＥＹＥ（配列番号２）は保存されている、（ａ）のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなるポリペプチドに関する。本発明はさらに、前記ポリペプチドを含む融合構築物、組成物および医療用途に関する。
【０００２】
本明細書中、特許出願および製造者のマニュアルを含めた幾つかの文書を引用する。これらの文書の開示は、本発明の特許性と関連があるとは考えられないが、その全容は参照により本明細書に組み込まれている。より具体的には、全ての参照文書は、それぞれ個々の文書が参照により組み込まれていることが具体的および個々に示されるのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれている。
【背景技術】
【０００３】
ＣＤ４＋Ｔ細胞は、適応性または先天性免疫系の他の細胞を手助けすることにより、免疫応答の調整において中心的役割を果たす。初期の研究では、２クラスのＣＤ４＋Ｔ細胞（Ｔｈ１およびＴｈ２）が同定された。さらに近年では、ＣＤ４＋Ｔ細胞の新たなサブセット、Ｔｈ１７系統が同定された。Ｔｈ１７細胞は、Ｔｈ１またはＴｈ２免疫によって充分には保護されない細胞外細菌、ならびに数種の真菌および微生物に対する高い宿主防御に特化した、適応性免疫系の一部として進化してきたと思われる。
【０００４】
Ｔｈ１７細胞は、新たなサイトカインファミリー、６メンバー（ＩＬ−１７Ａ〜Ｆ）を含むことが現在知られているＩＬ−１７ファミリーの発見という状況で同定された。（以前ＣＴＬＡ−８と呼ばれていた）ＩＬ−１７は主にＴｈ１７細胞によって発現され、それがこのサイトカインファミリーの基本メンバーであることを示すためにＩＬ−１７Ａと表した。ヒトインターロイキン−１７Ａ（ＩＬ−１７）は、以前に言及されたように（Ｍｉｏｓｓｅｃ  Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６１、８８８〜８９８頁）、ＣＤ４＋Ｔヘルパー１７（ＴＨ１７）細胞系統の定義に重要である、多形質発現、炎症促進性サイトカインである。ＩＬ−１７Ａはホモ二量体分子であり、２３アミノ酸シグナルペプチドの切断後、それはグリコシル化、共有結合ホモ二量体として分泌される（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００２１８１．１；ＵｎｉＰｒｏｔＫ識別子：Ｑ１６５５２；配列番号１０）。Ｆ−エンドグリコシダーゼの消化によって、還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥで哺乳動物細胞により発現されるヒトＩＬ−１７Ａのみかけの分子量が２２から１５ｋＤａに変わり、したがってサイトカインがグリコシル化されることが実証される（Ｆｏｓｓｉｅｚ  Ｆ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｉｎｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６（５〜６）、５４１〜５５１頁）。
【０００５】
慢性炎症プロセスの中心メディエーターとして、および以前はＴｈ１媒介性であると考えられていた数タイプの自己免疫状態における主要病原性エフェクターとしてのＴｈ１７細胞の同定は、新たな治療手法となる見込みである（Ｗｅａｖｅｒ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、２５、８２１〜８５２頁）。実際、炎症促進性サイトカインＩＬ−１７は主にＴｈ１７細胞によって発現され、関節リウマチ（ＲＡ）がある患者の滑液に高レベルで存在し、初期ＲＡ発症と関連があることが示されている。さらに、ＩＬ−１７はＴＮＦ−αおよびＩＬ−１の強力な誘導物質であり、後者は主に罹患患者の骨腐食および非常に痛みを伴う結果の原因である（Ｌｕｂｂｅｒｔｓ  Ｅ．（２００８）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ、４１、８４〜９１頁）。さらに、ＩＬ−１７の不適切または過剰な生成は、骨関節炎、骨部インプラントの弛緩、急性移植片拒絶（Ａｎｔｏｎｙｓａｍｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１６２、５７７〜５８４頁、ｖａｎ  Ｋｏｏｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ、９、１５２６〜１５３４頁）、敗血症、敗血症性またはエンドトキシンショック、アレルギー、喘息（Ｍｏｌｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１０８、４３０〜４３８頁）、骨量減少、乾癬（Ｔｅｕｎｉｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ、１１１、６４５〜６４９頁）、虚血、全身性硬化症（Ｋｕｒａｓａｗａ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ、４３、２４５５〜２４６３頁）、脳血管発作、および他の炎症性障害などの、様々な他の疾患および障害の病状と関係がある。
【０００６】
したがって抗ＩＬ−１７化合物には、ＩＬ−１７の中和が関節炎などの炎症プロセスを低減することを実証した幾つかのｉｎ  ｖｉｖｏ試験と一致する、抗炎症剤、治療手法としての可能性がある。例えば、関節炎初期の免疫処置プロトコール後に始まるＩＬ−１７受容体−ＩｇＧ１−Ｆｃ融合タンパク質による内在ＩＬ−１７の初期の中和は、実験的関節炎の発症を抑制する（Ｌｕｂｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１６７、１００４〜１０１３頁）。さらに、コラーゲン誘導性関節炎の発症後の動物モデルにおける中和抗ＩＬ−１７抗体を用いた治療は、関節炎症、軟骨破壊および骨腐食を低減する（Ｌｕｂｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ、５０、６５０〜６５９頁）。組織学的分析により関節炎症の抑制を確認し、全身ＩＬ−６レベルは抗ＩＬ−１７抗体を用いた治療後に有意に低下した。対照的に、マウスＩＬ−１７を発現するアデノウイルスベクターを使用した全身および局所ＩＬ−１７の過剰発現はコラーゲン誘導性関節炎（ＣＩＡ）の発症を加速させ、その部位における滑液包炎を悪化させた（Ｌｕｂｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１６７、１００４〜１０１３頁、およびＬｕｂｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）、Ｉｎｆｌａｍｍ．Ｒｅｓ．５１、１０２〜１０４頁）。さらに近年、抗ＩＬ−１７抗体の使用により、乾癬、関節リウマチおよび非感染性ブドウ膜炎の臨床症状が改善されたことを実証することができた（Ｌｅｏｎａｒｄｉ  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６６、１１９０〜１１９９頁、Ｈｕｅｂｅｒ  Ｗ．ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．２（５２）：５２ｒａ７２）。
【０００７】
単一特異性物質は、様々な異なる疾患の治療に広く使用されている。大部分の市販の生物製剤は単一特異性であり、したがって１つの標的に相互作用し干渉することができる。しかしながら、複合疾患は多因性であることが多く、疾患メディエーターの余剰または共同作用に関与する。したがって、多重の、異なる病理学的因子および経路の遮断は治療有効性の改善をもたらし得る（Ｋｏｎｔｅｒｍａｎ  Ｒ．Ｅ．（２０１２）ｍＡｂｓ、４：２、１８２〜１９７頁）。
【０００８】
ＩＬ−１７以外の、炎症性疾患、自己免疫および骨量減少関連疾患、特に関節リウマチを含めた様々な形の関節炎の病因に関与するさらなる重要な分子は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）である。幾つかの抗ＴＮＦ治療剤が関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎およびクローン病の治療に承認されており、他の炎症状態に関して臨床試験されている。それぞれ異なる態様の免疫誘導型炎症経路を阻害する（Ｓｃｏｔｔ  Ｄ．Ｌ．（２０１２）Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ、９１（１）、３１〜４３頁中に概説済み）、炎症性関節炎の治療に利用可能な５クラスの生物製剤、（ｉ）ＴＮＦ阻害剤（アダリムマブ、エタネルセプト、インフリキシマブ、セルトリズマブ、ゴリムマブ）、（ｉｉ）インターロイキン−１受容体アンタゴニスト（アナキンラ）、（ｉｉｉ）Ｂ細胞阻害剤（リツキシマブ）、（ｉｖ）Ｔ細胞同時刺激阻害剤（アバタセプト）および（ｖ）インターロイキン−６阻害剤（トシリズマブ）が現在存在する。炎症状態の治療に承認されている他の生物製剤には、カナキヌマブ（抗ＩＬ−１β）およびウステキヌマブ（抗ＩＬ−１２／２３）がある（Ｒｅｉｃｈｅｒｔ  Ｊ．Ｍ．（２０１２）ｍＡｂｓ、４：３、４１３〜４１５頁）。治療用途に設計されたＴＮＦ結合分子もＴａｋ  ａｎｄ  Ｋａｌｄｅｎ（２０１１）（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ、１３、１〜１４頁）中に記載されている。
【０００９】
Ｋｏｅｎｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ、６３；２３２９〜２３３９頁）は、ＴＮＦとＩＬ−１７の間の相互作用は分子機構を誘発し、関節炎の動物モデルにおいて不可逆的軟骨破壊をもたらすことを記載する。さらに、可溶性インターロイキン−１７受容体とＴＮＦ結合タンパク質の組合せが、いずれかの抗サイトカイン治療単独より関節炎の治療において有効であったことが、この筆者らにより発見されている。Ｋｏｅｎｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）の刊行物中に記載されたＴＮＦ結合分子は、二量体結合ＰＥＧ化可溶性ｐ５５ＴＮＦ受容体Ｉである。ＷＯ２０１０／１０２２５１は、ヒトＩＬ−１７およびＴＮＦと結合することができる、第一および第二ポリペプチド鎖を含む結合タンパク質を記載する。両ポリペプチド鎖は、抗体可変ドメインと定常ドメインによって形成される分子構造を有する。幾つかの他の二重特異性および／または多重特異性融合タンパク質が文献中に記載されている（Ｋｏｎｔｅｒｍａｎ  Ｒ．Ｅ．（２０１２）ｍＡｂｓ、４：２、１８２〜１９７頁の概説を参照）。
【００１０】
ＦｙｎＳＨ３由来ポリペプチドは当技術分野でよく知られており、例えばＧｒａｂｕｌｏｖｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）ＪＢＣ、２８２、３１９６〜３２０４頁、ＷＯ２００８／０２２７５９、Ｂｅｒｔｓｃｈｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ２０（２）５７〜６８頁、およびＧｅｂａｕｅｒ  ａｎｄ  Ｓｋｅｒｒａ（２００９）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ１３：２４５〜２５５頁中に記載されている。用語「フィノマー（Ｆｙｎｏｍｅｒ）」と本明細書で互換的に使用する用語「ＦｙｎＳＨ３由来ポリペプチド」は、ヒトＦｙｎＳＨ３ドメイン由来の非免疫グロブリン由来結合（ポリ）ペプチドを指す（例えば、Ｇｅｂａｕｅｒ  ａｎｄ  Ｓｋｅｒｒａ（２００９）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ１３：２４５〜２５５頁中に記載されたいわゆる足場）。ヒトＦｙｎキナーゼのＳＨ３ドメインは、異なる標的タンパク質と高いアフィニティーおよび特異性で結合する、タンパク質（フィノマーと呼ばれるＦｙｎＳＨ３由来結合タンパク質）を操作するための足場として首尾よく使用された（ＷＯ２００８／０２２７５９、ＷＯ２０１１／０２３６８５、Ｇｒａｂｕｌｏｖｓｋｉ  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ２８２、３１９６〜３２０４頁、Ｂｅｒｔｓｃｈｉｎｇｅｒ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ、２０５７〜６８頁、およびＳｃｈｌａｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）ｍＡｂｓ、４（４）、４９７〜５０頁）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】国際公開第２０１０／１０２２５１号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２００８／０２２７５９号パンフレット
【特許文献３】国際公開第２０１１／０２３６８５号パンフレット
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｍｉｏｓｓｅｃ  Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６１、ｐ．８８８〜８９８
【非特許文献２】Ｆｏｓｓｉｅｚ  Ｆ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｉｎｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６（５〜６）、ｐ．５４１〜５５１
【非特許文献３】Ｗｅａｖｅｒ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、２５、ｐ．８２１〜８５２
【非特許文献４】Ｌｕｂｂｅｒｔｓ  Ｅ．（２００８）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ、４１、ｐ．８４〜９１
【非特許文献５】Ａｎｔｏｎｙｓａｍｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１６２、ｐ．５７７〜５８４
【非特許文献６】ｖａｎ  Ｋｏｏｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ、９、ｐ．１５２６〜１５３４
【非特許文献７】Ｍｏｌｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１０８、ｐ．４３０〜４３８
【非特許文献８】Ｔｅｕｎｉｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ、１１１、ｐ．６４５〜６４９
【非特許文献９】Ｋｕｒａｓａｗａ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ、４３、ｐ．２４５５〜２４６３
【非特許文献１０】Ｌｕｂｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１６７、ｐ．１００４〜１０１３
【非特許文献１１】Ｌｕｂｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ、５０、ｐ．６５０〜６５９
【非特許文献１２】Ｌｕｂｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）、Ｉｎｆｌａｍｍ．Ｒｅｓ．５１、ｐ．１０２〜１０４
【非特許文献１３】Ｌｅｏｎａｒｄｉ  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３６６、ｐ．１１９０〜１１９９
【非特許文献１４】Ｈｕｅｂｅｒ  Ｗ．ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．、２（５２）、５２ｒａ７２
【非特許文献１５】Ｋｏｎｔｅｒｍａｎ  Ｒ．Ｅ．（２０１２）ｍＡｂｓ、４：２、ｐ．１８２〜１９７
【非特許文献１６】Ｓｃｏｔｔ  Ｄ．Ｌ．（２０１２）Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ、９１（１）、ｐ．３１〜４３
【非特許文献１７】Ｒｅｉｃｈｅｒｔ  Ｊ．Ｍ．（２０１２）ｍＡｂｓ、４：３、ｐ．４１３〜４１５
【非特許文献１８】Ｔａｋ  ａｎｄ  Ｋａｌｄｅｎ（２０１１）（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ、１３、ｐ．１〜１４
【非特許文献１９】Ｋｏｅｎｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓａｎｄ  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ、６３、ｐ．２３２９〜２３３９
【非特許文献２０】Ｇｒａｂｕｌｏｖｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）ＪＢＣ、２８２、ｐ．３１９６〜３２０４
【非特許文献２１】Ｂｅｒｔｓｃｈｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ、２０、ｐ．５７〜６８
【非特許文献２２】Ｇｅｂａｕｅｒ  ａｎｄ  Ｓｋｅｒｒａ（２００９）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１３、ｐ．２４５〜２５５
【非特許文献２３】Ｇｒａｂｕｌｏｖｓｋｉ  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２８２、ｐ．３１９６〜３２０４
【非特許文献２４】Ｓｃｈｌａｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）ｍＡｂｓ、４（４）、ｐ．４９７〜５０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
ＷＯ２０１１／０２３６８５は、融合タンパク質、組成物に対応するＩＬ−１７阻害ポリペプチド（「フィノマー」）、およびそれらの医療用途を記載する。これらのＩＬ−１７阻害ポリペプチドは、ＩＬ−１７Ａに対する高い特異性と高いアフィニティーを有する。本発明の根底にある技術的課題は、さらなるＩＬ−１７Ａ阻害ポリペプチド、および特に技術的に改善されたこのようなＩＬ−１７Ａ阻害ポリペプチドの提供である。この技術的課題は、特許請求の範囲内で特徴付けた実施形態により解決される。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
したがって本発明は、第一の実施形態では、グリコシル化ＩＬ−１７Ａの活性を阻害するポリペプチドであって、（ａ）ＧＶＴＬＦＶＡＬＹＤＹ（Ｘ１）（Ｘ２）（Ｘ３）（Ｘ４）（Ｘ５）（Ｘ６）ＤＬＳＦＨＫＧＥＫＦＱＩＬＳＴＨＥＹＥＤＷＷＥＡＲＳＬＴＴＧＥＴＧＹＩＰＳＮＹＶＡＰＶＤＳＩＱ（配列番号１）、ここでアミノ酸位置（Ｘ１）〜（Ｘ６）は任意のアミノ酸配列であってよい、および（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列、ここで、同一性決定はアミノ酸位置（Ｘ１）〜（Ｘ６）を除外しており、ただし配列番号１におけるアミノ酸位置３１〜３６中のアミノ酸配列ＳＴＨＥＹＥ（配列番号２）は保存されている、からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなるポリペプチドに関する。本発明はさらに、前記ポリペプチドを含む融合構築物、組成物および医療用途に関する。
【００１５】
本発明は、第二の実施形態では、グリコシル化ＩＬ−１７Ａと結合し、好ましくはその活性を阻害するポリペプチドであって、（ａ）ＧＶＴＬＦＶＡＬＹＤＹ（Ｘ１）（Ｘ２）（Ｘ３）（Ｘ４）（Ｘ５）（Ｘ６）ＤＬＳＦＨＫＧＥＫＦＱＩＬＳＴＨＥＹＥＤＷＷＥＡＲＳＬＴＴＧＥＴＧＹＩＰＳＮＹＶＡＰＶＤＳＩＱ（配列番号１）、ここで、アミノ酸位置（Ｘ１）〜（Ｘ６）が任意のアミノ酸配列であってよい、および（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列、ここで、同一性決定はアミノ酸位置（Ｘ１）〜（Ｘ６）を除外しており、ただし配列番号１におけるアミノ酸位置３１〜３６中のアミノ酸配列ＳＴＨＥＹＥ（配列番号２）は保存されている、からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなるポリペプチドに関する。本発明はさらに、前記ポリペプチドを含む融合構築物、組成物および医療用途に関する。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下の定義、実施例、好ましい実施形態および個々の実施形態は、本発明の第一の実施形態と第二の実施形態の両方を言及する。
【００１７】
本明細書で使用する用語「ポリペプチド」は、約５０を超えるアミノ酸を含有する単鎖タンパク質またはそれらの断片を含めた、直鎖分子状のアミノ酸を記載する。ポリペプチドは、少なくとも２つの同一であるかまたは異なる分子からなるマルチマー、例えばオリゴマーをさらに形成することができる。このようなマルチマーの対応する高次構造は、それに応じてホモまたはヘテロ二量体、ホモまたはヘテロ三量体などと呼ばれる。さらに、アミノ酸（複数可）および／またはペプチド結合（複数可）が機能的アナログにより置換された、このようなポリペプチドのペプチド模倣体も本発明によって包含される。このような機能的アナログは、セレノシステインなどの、２０遺伝子コードアミノ酸以外の全ての既知のアミノ酸を含む。用語「ポリペプチド」は、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、および当技術分野でよく知られている同様の修飾によって修飾が施された天然修飾ポリペプチドも指す。
【００１８】
グリコシル化ＩＬ−１７Ａとの結合を実質的に保持する本発明のポリペプチドの断片も、本発明によって含まれる。この点において、断片が約５５未満のアミノ酸を含有する限り、高い優先度で、断片が少なくとも３０アミノ酸、少なくとも３５アミノ酸、少なくとも４０アミノ酸、または少なくとも４５アミノ酸を含むことが好ましい。断片中、本明細書において以下で定義するＲＴ−およびｓｒｃ−ループに対応するアミノ酸位置は保持されることがより好ましい。
【００１９】
本明細書で使用する用語「グリコシル化ＩＬ−１７Ａの活性を阻害するポリペプチド」によって、本明細書で前に詳細に記載したグリコシル化ＩＬ−１７Ａの活性を低減または完全に無効にする能力を、ポリペプチドが有することを定義する。この点において、グリコシル化ＩＬ−１７Ａ活性の阻害は、ＩＬ−１７Ｒと呼ばれるＩ型細胞表面受容体（インターロイキン１７受容体）とグリコシル化ＩＬ−１７Ａの結合の阻害を意味することが好ましい。少なくとも３種のＩＬ−１７Ｒの変異体、すなわちＩＬ１７ＲＡ、ＩＬ１７ＲＢ、およびＩＬ１７ＲＣが当技術分野で知られている。この点において、高い優先度で、ポリペプチドは少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％グリコシル化ＩＬ−１７Ａの活性を阻害することがより好ましい。本発明のポリペプチドのグリコシル化ＩＬ−１７Ａの阻害に関するＩＣ５０値が、１０００ｎＭ以下、５００ｎＭ以下、４００ｎＭ以下、３００ｎＭ以下、２００ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、または７５ｎＭ以下であることも高い優先度で好ましい。この点において、本発明のポリペプチドはグリコシル化ＩＬ−１７Ａ活性を特異的に阻害し、したがってグリコシル化ＩＬ−１７Ｂ、ＩＬ−１７Ｃ、ＩＬ−１７Ｄ、ＩＬ−１７ＥまたはＩＬ−１７Ｆなどの他の関連タンパク質は阻害しないことが好ましい。本発明のポリペプチドはグリコシル化ＩＬ−１７Ａの活性を阻害する。ポリペプチドは、グリコシル化および非グリコシル化ＩＬ−１７Ａの活性を阻害することが好ましい。したがって前述の定義は、必要な変更を加えて非グリコシル化ＩＬ−１７Ａの阻害に適用する。
【００２０】
グリコシル化ＩＬ−１７Ａ活性の阻害は、グリコシル化ＩＬ−１７Ａとの結合にも関与することは理解されよう。この点において、グリコシル化ＩＬ−１７Ａとの結合は、グリコシル化ＩＬ−１７Ａの活性の阻害をさらにもたらすことが好ましい。用語「グリコシル化ＩＬ−１７Ａとの結合」は、本発明のポリペプチドまたは断片が、グリコシル化ＩＬ−１７Ａと（ｉｎ  ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｔｒｏで）結合相互作用を形成することを必要とする。本発明のポリペプチドは、１０−７〜１０−１２Ｍ、より好ましくは１０−８〜１０−１２Ｍ、最も好ましくは１０−９〜１０−１２ＭのＫＤでグリコシル化ＩＬ−１７Ａと結合することが好ましい。この点において、本発明のポリペプチドはグリコシル化ＩＬ−１７Ａと特異的に結合し、したがってＩＬ−１７Ｂ、ＩＬ−１７Ｃ、ＩＬ−１７Ｄ、ＩＬ−１７ＥまたはＩＬ−１７Ｆなどの他の関連タンパク質とは結合しないことが好ましい。本発明のポリペプチドはグリコシル化ＩＬ−１７Ａと結合する。ポリペプチドは、グリコシル化および非グリコシル化ＩＬ−１７Ａと結合することが好ましい。したがって前述の定義は、必要な変更を加えて非グリコシル化ＩＬ−１７Ａの結合に適用する。
【００２１】
本明細書で前に引用した配列番号１は、ヒトＦｙｎキナーゼのＳＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号２０、Ｋａｗａｋａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．ａｎｄ  Ｓｅｍｂａ  ｅｔ  ａｌ．ｉｎ  １９８６により報告されたＦｙｎキナーゼのアミノ酸８３〜１４５）に由来する。配列番号２０は、ＧＶＴＬＦＶＡＬＹＤＹＥＡＲＴＥＤＤＬＳＦＨＫＧＥＫＦＱＩＬＮＳＳＥＧＤＷＷＥＡＲＳＬＴＴＧＥＴＧＹＩＰＳＮＹＶＡＰＶＤＳＩＱ（配列番号２０）と読める。前に示した配列番号２０中、ＲＴとｓｒｃループの配列には、それぞれ下線と二重下線を引く（二つ目の下線部「ＮＳＳＥ」が二重下線部である）。Ｇｒａｂｕｌｏｖｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）ＪＢＣ、２８２、３１９６〜３２０４頁はＦｙｎＳＨ３ドメインのＲＴとｓｒｃループにおける突然変異の影響を調べ、疎水性表面と隣接する両ループにおける突然変異により、分子間結合に関与するこのドメインの能力を決定することができたことを実証した。さらにＥＰ２０５４４３２は、ＲＴおよび／またはｓｒｃループ中またはそれに隣接した突然変異は、ＳＨ３ドメインの結合特異性を決定することを示す。ＦｙｎＳＨ３のアミノ酸配列は、人間、マウス、ラットおよびサル（ギボン）の間で完全に保存されている。ニワトリのＦｙｎＳＨ１アミノ酸が、キセノプスラエビス（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）の一種は２アミノ酸位置が、対応するヒトドメインと異なる。他のＳＨ３ドメインと同様に、ＦｙｎＳＨ３は２つのアンチパラレルβシートで構成され、（ＲＴおよびｓｒｃ−ループと呼ばれる）２つの柔軟性ループを含有し他のタンパク質と相互作用する。
【００２２】
より詳細には、配列番号１は配列番号３〜９のアラインメントから生じた配列である（図８参照）。図８から明らかであるように、配列番号１の位置（Ｘ１）〜（Ｘ６）は、配列番号２０のＦｙｎキナーゼＳＨ３ドメインのＲＴ−ループに対応する。この点において、本発明のポリペプチドのアミノ酸位置（Ｘ１）〜（Ｘ６）は、配列ＥＡＲＴＥＤ（配列番号１９）を有していないことが好ましい。図８からさらに明らかであるように、配列番号２０のＦｙｎキナーゼＳＨ３ドメインのｓｒｃ−ループに対応する位置、すなわち配列「ＳＴＨＥＹＥ」（本明細書で前に示したように配列番号１における下線部分）は配列番号３〜９の間で保存されている。ＲＴおよびｓｒｃ−ループ内のアミノ酸位置は、グリコシル化ＩＬ−１７Ａに対する結合特異性を決定する。
【００２３】
本発明によれば、用語「配列同一性百分率（％）」によって、鋳型核酸またはアミノ酸配列の全長を構成するヌクレオチドもしくはアミノ酸残基の数と比較した、２つ以上の一直線に並んだ核酸またはアミノ酸配列の同一ヌクレオチド／アミノ酸のマッチ（「ヒット」）の数を記載する。言い換えると、２つ以上の配列または部分配列に関するアラインメントを使用し、同じ（例えば８５％、９０％もしくは９５％同一である）アミノ酸残基またはヌクレオチドの百分率を決定することができ、このとき（部分）配列を、当技術分野で知られる配列比較アルゴリズムを使用した測定で、比較ウインドウにわたり、または指定領域にわたり最大対応性で比較し一直線に並べ、またはこのとき手作業で一直線に並べ目視で確認する。したがって、配列同一性を決定するため比較する配列は、ヌクレオチドまたはアミノ酸の置換（複数可）、付加（複数可）または欠失（複数可）によって異なる可能性がある。この定義は、試験配列の相補配列にも適用する。
【００２４】
当業者は、核酸配列を一直線に並べるのに適したプログラムも理解している。ポリペプチド配列の配列同一性百分率は、例えば前に説明したようにプログラム、プログラムＣＬＵＳＴＬＡＷ、ＦＡＳＴＡおよびＢＬＡＳＴを用いて決定することができる。ＢＬＡＳＴプログラム、すなわちＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ  アルゴリズム（Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ｆ．Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｔｈｏｍａｓ  Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ、Ａｌｅｊａｎｄｒｏ  Ａ．Ｓｃｈａｆｆｅｒ、Ｊｉｎｇｈｕｉ  Ｚｈａｎｇ、Ｚｈｅｎｇ  Ｚｈａｎｇ、Ｗｅｂｂ  Ｍｉｌｌｅｒ、ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ（１９９７）、「Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ａｎｄ  ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｐｒｏｇｒａｍｓ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９〜３４０２頁）を使用することが好ましい。
【００２５】
本明細書の前述の（ｂ）項に列挙した配列同一性に関して、配列同一性は少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％であることが高い優先度で好ましい。
【００２６】
本明細書で使用する語句「同一性決定はアミノ酸位置（Ｘ１）〜（Ｘ６）を除外している」は、配列番号１に関する配列同一性の計算はアミノ酸位置（Ｘ１）〜（Ｘ６）を考慮しておらず、配列番号１の残り５８アミノ酸位置に限定されていることを示す。本明細書で使用する状態「ただし配列番号１におけるアミノ酸位置３１〜３６中のアミノ酸配列ＳＴＨＥＹＥ（配列番号２）は保存されている」は、配列番号１のアミノ酸位置３１〜３６にアミノ酸変化を導入することができないことを示す。言い換えると、配列番号１のアミノ酸位置３１〜３６に対応するアミノ酸位置は、本発明の第一の実施形態およびその好ましい実施例の範囲内にある全ポリペプチド中に配列ＳＴＨＥＹＥ（配列番号２）を有する。
【００２７】
この点において、配列番号１のアミノ酸位置３１〜３７に対応するアミノ酸位置は、本発明の第一の実施形態およびその好ましい実施例の範囲内にある全ポリペプチド中に配列ＳＴＨＥＹＥＤ（配列番号１８）を有することが好ましい。言い換えると、本発明の第一の実施形態およびその好ましい実施例に関して、配列番号１のアミノ酸位置３１〜３７中のアミノ酸配列ＳＴＨＥＹＥＤ（配列番号１８）が保存された状態に見合うことが好ましい。
【００２８】
配列番号１における任意のアミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換であることが好ましい。保存的置換は、置換されるアミノ酸と類似した化学的性質を有する別のアミノ酸と一アミノ酸の置換を示す。本明細書で言及する保存的置換は、（ｉ）塩基性アミノ酸と異なる塩基性アミノ酸の置換、（ｉｉ）酸性アミノ酸と異なる酸性アミノ酸の置換、（ｉｉｉ）芳香族アミノ酸と異なる芳香族アミノ酸の置換、（ｉｖ）非極性脂肪族アミノ酸と異なる非極性脂肪族アミノ酸の置換、および（ｖ）極性非荷電アミノ酸と異なる極性非荷電アミノ酸の置換からなる群から選択される置換であることが好ましい。塩基性アミノ酸は、アルギニン、ヒスチジン、およびリシンである。酸性アミノ酸はアスパラギン酸またはグルタミン酸である。芳香族アミノ酸は、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンである。非極性脂肪族アミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、メチオニン、イソロイシンおよびプロリンである。極性非荷電アミノ酸は、セリン、スレオニン、システイン、アスパラギンおよびグルタミンである。保存的アミノ酸置換と対照的に、非保存的アミノ酸置換は、前述の保存的置換（ｉ）〜（ｖ）の範疇にない任意のアミノ酸と一アミノ酸の置換である。
【００２９】
（以前はＣＴＬＡ−８と呼ばれており、それがＩＬ１７ファミリーの基本メンバーであるため本明細書および当技術分野では単に「ＩＬ−１７」または「インターロイキン１７」とも呼ぶ）用語「ＩＬ−１７Ａ」または「インターロイキン１７Ａ」は、活性化記憶Ｔ細胞により生成される強力な炎症促進性サイトカインを表す（Ｇｕｒｎｅｙ  ａｎｄ  Ａｇｇａｒｗａｌ（２００２）、「ＩＬ−１７：ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ  ｍｅｍｂｅｒ  ｏｆ  ａｎ  ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｆａｍｉｌｙ」、Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．７１（１）１〜８頁）。より詳細にはＩＬ−１７Ａは、インターフェロンγと同様に、様々な組織中でケモカイン産生を増大させ炎症部位に単球および好中球を動員することにより、遅延型反応において強力なメディエーターとして作用するサイトカインである。ＩＬ−１７ＡはＴヘルパー細胞により産生され、遅延型反応において破壊的組織損傷をもたらすＩＬ−２３によって誘導される。１ファミリーとしてのインターロイキン１７Ａは、細胞外病原体による免疫系の侵入に応答する炎症促進性サイトカインとして機能し、病原体の細胞マトリックスの破壊を誘導する。インターロイキン１７Ａは、腫瘍壊死因子およびインターロイキン−１と相乗的に作用する。ヒトＩＬ−１７Ａは、好ましくは３５ｋＤａの分子量を有するジスルフィド結合、ホモ二量体、分泌型糖タンパク質である配列番号１０を含むか、またはそれらからなる１５５アミノ酸タンパク質である。ホモ二量体の各サブユニットは約１５〜２０ｋＤａである。ＩＬ−１７Ａの構造は、２３アミノ酸（ａａ）のシグナルペプチド、次にＩＬ−１７ファミリーに特徴的な１３２アミノ酸鎖領域からなる。タンパク質上のＮ結合型グリコシル化部位は、タンパク質精製により２つのバンド、１つが１５ＫＤａおよびもう１つが２０ＫＤａで明らかとなった後に初めて同定された。前述のように、最初に同定されたＩＬ１７は、それがこのサイトカインファミリーの基本メンバーであることを示すためＩＬ−１７Ａと表示された。ＩＬ−１７Ａ以外に、ＩＬ−１７ファミリーのメンバーには、ＩＬ−１７Ｂ、ＩＬ−１７Ｃ、ＩＬ−１７Ｄ、ＩＬ−１７Ｅ（ＩＬ−２５とも呼ばれる）、およびＩＬ−１７Ｆがある。ＩＬ−１７ファミリーは、脊椎動物の進化にわたり高度に保存されてきたと思われる、異なるシグナル伝達系を表すと考えられる。ＩＬ−１７ファミリーの全てのメンバーは、それらの３次元形状に重要な４個の高度に保存されたシステイン残基を伴う類似したタンパク質構造を有するが、それらは如何なる他の既知のサイトカインとも配列類似性を有していない。
【００３０】
本明細書で開示するＩＬ−１７Ａ阻害ポリペプチドは、驚くことに、非グリコシル化ＩＬ−１７Ａおよびグリコシル化ＩＬ−１７Ａに対して高い特異性および高いアフィニティーを有する。特に、本発明の配列番号３〜９は、非グリコシル化ＩＬ−１７Ａと比較して同等の効能で、グリコシル化ＩＬ−１７Ａを完全に阻害することができる（実施例３参照）。これは、ＷＯ２０１１／０２３６８５から知られるＦｙｎＳＨ３由来ＩＬ−１７Ａ結合ポリペプチドと比較して有利な性質である。ＷＯ２０１１／０２３６８５中に記載されたＦｙｎＳＨ３由来ＩＬ−１７Ａ結合ポリペプチドは、高濃度においてさえグリコシル化ＩＬ−１７Ａを完全に阻害せず、および／またはグリコシル化ＩＬ−１７Ａと非グリコシル化ＩＬ−１７Ａの間で阻害効能（ＩＣ５０値）の大きな違いを示す（実施例３および図３参照）。本明細書で前に論じたように、ＩＬ−１７Ａは、ｉｎ  ｖｉｖｏでは、グリコシル化、共有結合ホモ二量体として分泌される。グリコシル化ＩＬ−１７Ａと結合し阻害するという利点を有する、本明細書で開示する新規なＩＬ−１７Ａ結合分子は、したがって、それはグリコシル化タンパク質として主に存在するので、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＩＬ−１７Ａの検出または結合を必要とする用途に非常に適している。このような用途は、例えば、ＩＬ−１７Ａ媒介性疾患の治療および／または予防に関する、診断および医学的治療、好ましくは医薬品の製剤化である。
【００３１】
本明細書中の以下の実施例は、アミノ酸位置（Ｘ１）〜（Ｘ６）に関して列挙するアミノ酸は、グリコシル化ＩＬ−１７Ａ、特に配列番号１０を有するグリコシル化ＩＬ−１７Ａに対して結合特異性をもたらすことを示す。より詳細には、図８中の本発明の配列番号３〜９の配列アラインメントは、アミノ酸位置（Ｘ１）〜（Ｘ６）が、配列番号３〜９中の（Ｘ１）がＡ、Ｋ、Ｓ、ＤまたはＥであり、（Ｘ２）がＮ、Ｑ、Ａ、Ｋ、ＳまたはＲであり、（Ｘ３）がＨ、Ｋ、Ｒ、ＬまたはＶであり、（Ｘ４）がＧまたはＳであり、（Ｘ５）がＨ、Ｑ、Ａ、Ｗ、ＶまたはＮであり、（Ｘ６）がＲ、ＬまたはＳであるものから選択されることを示す。したがって、配列番号３〜９中に存在する（Ｘ１）〜（Ｘ６）に関する具体的なアミノ酸の組合せ以外の、前に定義した（Ｘ１）〜（Ｘ６）から選択される他のアミノ酸配列も、グリコシル化ＩＬ−１７Ａに対して結合特異性をもたらすことを予想することができる。
【００３２】
したがって、本発明の好ましい実施形態では、本発明のポリペプチドのアミノ酸位置（Ｘ１）〜（Ｘ６）は、（Ｘ１）がＡ、Ｋ、Ｓ、ＤまたはＥであり、（Ｘ２）がＮ、Ｑ、Ａ、Ｋ、ＳまたはＲであり、（Ｘ３）がＨ、Ｋ、Ｒ、ＬまたはＶであり、（Ｘ４）がＧまたはＳであり、（Ｘ５）がＨ、Ｑ、Ａ、Ｗ、ＶまたはＮであり、（Ｘ６）がＲ、ＬまたはＳであるものから選択される（配列番号２１参照）。
【００３３】
（Ｘ１）がＡ、Ｋ、Ｓ、ＤまたはＥであり、（Ｘ２）がＮ、Ｑ、Ａ、Ｋ、ＳまたはＲであり、（Ｘ３）がＨ、Ｋ、Ｒ、ＬまたはＶであり、（Ｘ４）がＧまたはＳであり、（Ｘ５）がＨ、Ｑ、Ａ、Ｗ、ＶまたはＮであり、（Ｘ６）がＲ、ＬまたはＳである保存的アミノ酸置換も、本発明によって包含される。
【００３４】
本発明のポリペプチドのアミノ酸位置（Ｘ１）〜（Ｘ６）は、（Ｘ１）がＳまたはＥであり、（Ｘ２）がＡまたはＳであり、（Ｘ３）がＲまたはＶであり、（Ｘ４）がＧまたはＳであり、（Ｘ５）がＱまたはＶであり、（Ｘ６）がＬまたはＳであるものから選択されることが特に好ましい。これらのアミノ酸は、それぞれ配列番号５および７中の位置（Ｘ１）〜（Ｘ６）に対応する。本発明のポリペプチドのアミノ酸位置（Ｘ１）〜（Ｘ６）は、（Ｘ１）がＳであり、（Ｘ２）がＡであり、（Ｘ３）がＲであり、（Ｘ４）がＧであり、（Ｘ５）がＱであり、（Ｘ６）がＬであることが最も好ましい。これらのアミノ酸は配列番号５中の位置（Ｘ１）〜（Ｘ６）に相当する。
【００３５】
第一ポリペプチドの項目（ｂ）によるポリペプチドによれば、アミノ酸位置（Ｘ１）〜（Ｘ６）は、配列番号１（または配列番号３〜９）のアミノ酸配列の間だけでなく、ＦｙｎキナーゼのＳＨ３ドメイン（配列番号２０）の（本発明による配列ＳＴＨＥＹＥ（配列番号２）を有する）ＲＴ−および／またはｓｒｃ−ループ内に存在しない別のアミノ酸位置の間でも異なる可能性がある。これらの位置におけるアミノ酸の違いは、配列番号３〜９の結合特異性には必須ではないと考えられる。したがって、グリコシル化ＩＬ−１７Ａに対する結合特異性に実質的に干渉せずに、これらのアミノ酸位置を置換もしくは欠失することができ、またはさらなるアミノ酸を加えることができる。アミノ酸が置換される場合、保存的置換が好ましい。
【００３６】
より好ましい実施形態では、本発明のポリペプチドは、配列番号３〜９のいずれか１つからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなる。
【００３７】
本明細書中の以下の実施例において示すように、配列番号３〜９は、配列番号１０を有する非グリコシル化およびグリコシル化ＩＬ−１７Ａに結合し阻害することが分かった。より詳細には、驚くことに、配列番号３〜９のＦｙｎＳＨ３由来ＩＬ−１７Ａ結合ポリペプチドは、非グリコシル化ＩＬ−１７Ａと比較して同等の効能で、グリコシル化ＩＬ−１７Ａを完全に阻害することができることが分かった。これは、ＷＯ２０１１／０２３６８５中に記載されたＦｙｎＳＨ３由来ＩＬ−１７Ａ結合ポリペプチドと比較して有利な性質である（実施例３中の比較データ参照）。
【００３８】
配列番号３〜９の間では配列番号５および７が好ましい。配列番号５および７を使用して融合構築物、および本明細書中の実施例４中に記載した構築物を作製した。得られた融合構築物および構築物は、それらは安定性、モノマー性、可溶性があり、優れた生物物理学的性質および薬物様性質を示すので非常に有用であった。さらに、さらなる化合物と配列番号５および７の融合が、グリコシル化ＩＬ−１７Ａとの優れた結合性に影響を与えることはなかった。
【００３９】
よく知られているように、１個、２〜３個もしくはさらに数個のアミノ酸の欠失、付加または置換などのアミノ酸配列のわずかな変化は、ほぼ同じ性質を有する突然変異型の原型タンパク質をもたらす可能性がある。したがって、配列番号３〜９に関しては、配列番号３〜９のいずれか１つと少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、および最も好ましくは少なくとも９８％同一であるが、ただし配列番号１におけるアミノ酸位置３１〜３６中のアミノ酸配列ＳＴＨＥＹＥ（配列番号２）は保存されているアミノ酸配列を含むポリペプチドも本発明によって包含される。アミノ酸が置換される場合、保存的置換が好ましい。
【００４０】
本発明によれば、ＩＬ−１７Ａは、配列番号１０のアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなることがさらに好ましい。
【００４１】
本明細書中の以下の実施例から明らかであるように、配列番号１０を有するヒトＩＬ−１７Ａは、配列番号３〜９を有するポリペプチドを同定するための標的タンパク質として使用されている。配列番号１０の最初の２３アミノ酸はシグナルペプチドである。したがって、本発明のポリペプチドは、配列番号１０のアミノ酸位置２４〜１５５内でグリコシル化ＩＬ−１７Ａと結合することが特に好ましい。
【００４２】
別の実施形態では、本発明は、さらなる化合物と融合した本発明のポリペプチドを含む融合構築物に関する。
【００４３】
本明細書で使用する「融合構築物」は、さらなる化合物と本発明のポリペプチドの融合体を定義する。化合物は、タンパク質性化合物または非タンパク質性化合物のいずれかであってよい。化合物がタンパク質性化合物（例えば、本明細書で以下に記載するサイトカインまたはケモカイン）である場合、融合構築物は融合タンパク質として表すこともできる。本明細書で使用する用語「融合タンパク質」は一般に、別のポリペプチドをコードする２つ以上の遺伝子の接合および発現を介して作製したポリペプチド構築物を対象とする用語である。言い換えると、この融合遺伝子の翻訳によって、各原型ポリペプチド由来の機能性がある一種のポリペプチドが生じる。ポリペプチドは直接融合、またはリンカー、すなわち短鎖ペプチド配列を介して融合することができる。一般に融合タンパク質は、当業者によく知られている組換えＤＮＡ技術（例えば、Ａｌｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ、４ｔｈｅｄ．Ｇａｒｌａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、５１８〜５１９頁）によって人為的に作製される。しかしながら、本発明のポリペプチドおよび融合タンパク質は、簡潔な有機合成戦略、固相支援型合成技法、または市販の自動合成装置などの、多くの従来型およびよく知られている技法のいずれかによって調製することができる。融合タンパク質は、生物学的研究または治療において使用することができる。さらなる化合物としての非タンパク質性化合物の例は、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒなどの有機低分子、または放射性核種である。さらなる非タンパク質性化合物のさらなる具体例は本明細書で以下に論じる。
【００４４】
好ましい実施形態によれば、さらなる化合物は、薬学的に活性がある化合物、プロドラッグ、薬学的に許容される担体、診断的に活性がある化合物、細胞浸透促進剤、および／または血清中半減期を調節する化合物である。
【００４５】
薬学的に活性がある化合物は、対象への投与時に生物学的活性を有し、対象に有益な影響をもたらす化合物である。プロドラッグは、不活性（または不完全活性）型で対象に投与され、後に対象中での代謝プロセスを介して薬学的に活性があるかまたは薬学的に完全に活性がある化合物に転換される化合物である。薬学的に（完全に）活性がある化合物は、本明細書で以下に定義する任意の具体的疾患の治療または予防に適した化合物であることが好ましい。
【００４６】
診断的に活性がある化合物は、対象への投与時に活性を有し、考えられる疾患または障害の決定または確認を可能にする化合物である。診断的に活性がある化合物の例には、蛍光色素、放射性核種または医療イメージング用造影剤などの検出可能マーカーがある。蛍光色素、放射性核種および医療イメージング用造影剤の具体例は、本明細書で以下に記載する。本発明のポリペプチドと融合した診断的に活性がある化合物は、本明細書で以下に定義しそれらの発端および／または症状（複数可）がＩＬ−１７および／またはＴｈ−１７関連である点において共通である具体的疾患のいずれか１つを、決定または確認するため特に使用することができる。このような疾患の側面は、本発明の診断的に活性がある化合物と融合した本発明のポリペプチドにより検出または確認することができる。
【００４７】
細胞浸透促進剤は、（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて）細胞への本発明のポリペプチドの送達を容易にする化合物である。
【００４８】
血清中半減期を調節する化合物は、特に血液循環器系において、本発明のポリペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を延長することができる化合物である。血清中半減期を調節する成分はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であることが好ましい。
【００４９】
薬学的に許容される担体は、対象への投与時に本発明のポリペプチドの送達および／または有効性を改善する化合物である。適切な薬学的に許容される担体は当技術分野でよく知られており、例えば安定剤、抗酸化剤、ｐＨ調整物質などを含む。
【００５０】
別の好ましい実施形態によれば、本発明のさらなる化合物は、（ａ）蛍光色素、（ｂ）感光剤、（ｃ）放射性核種、（ｄ）医療イメージング用造影剤、（ｅ）サイトカイン、（ｆ）毒性化合物、（ｇ）ケモカイン、（ｈ）凝血促進因子、（ｉ）プロドラッグ活性化用酵素、（ｋ）アルブミン結合物質、（ｌ）アルブミン、（ｍ）ＩｇＧ結合物質、または（ｎ）ポリエチレングリコールからなる群から選択される。
【００５１】
蛍光色素は、Ａｌｅｘａ  ＦｌｕｏｒまたはＣｙ色素から選択される成分であることが好ましい。
【００５２】
感光剤は、光毒性赤色蛍光タンパク質ＫｉｌｌｅｒＲｅｄまたはハエマトポルフィリンであることが好ましい。
【００５３】
放射性核種は、γ線放出アイソトープ、より好ましくは９９ｍＴｃ、１２３Ｉ、１１１ｌｎの群から、および／またはポジトロンエミッター、より好ましくは１８Ｆ、６４Ｃｕ、６８Ｇａ、８６Ｙ、１２４Ｉの群から、および／またはβ線エミッター、より好ましくは１３１Ｉ、９０Ｙ、１７７Ｌｕ、６７Ｃｕの群から、またはα線エミッター、好ましくは２１３Ｂｉ、２１１Ａｔの群のいずれかから選択されることが好ましい。
【００５４】
本明細書で使用する造影剤は、医療イメージングにおいて身体内の構造または流体の造影を強調するために使用する物質である。一般的な造影剤は、Ｘ線減衰および磁気共鳴シグナル強調に基づいて作用する。
【００５５】
サイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−α、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１５、ＬＩ−２４、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１３、ＬＩＦ、ＣＤ８０、Ｂ７０、ＴＮＦβ、ＬＴ−β、ＣＤ−４０リガンド、Ｆａｓ−リガンド、ＴＧＦ−β、ＩＬ−１αおよびＬＩ−１βからなる群から選択されることが好ましい。当技術分野でよく知られているように、サイトカインは免疫系の炎症促進性または抗炎症性応答を助長し得る。したがって、治療する疾患に応じて、炎症促進性または抗炎症性サイトカインいずれかとの融合構築物が好ましい可能性がある。例えば、一般に炎症性疾患の治療には抗炎症性サイトカインを含む融合構築物が好ましく、一方一般に癌の治療には炎症促進性サイトカインを含む融合構築物が好ましい。
【００５６】
毒性化合物は、低分子有機化合物またはポリペプチド、より好ましくはカリケアマイシン、メイタンシノイド、ネオカルジノスタチン、エスペラマイシン、ジネマイシン、ケダルシジン、マジュロペプチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、オーリスタチン、リシン−Ａ鎖、モデクシン、切断型シュードモナスエキソトキシンＡ、ジフテリア毒素および組換えゲロニンからなる群から選択される毒性化合物であることが好ましい。
【００５７】
ケモカインは、ＩＬ−８、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＥＮＡ−７８、ＬＤＧＦ−ＰＢＰ、ＧＣＰ−２、ＰＦ４、Ｍｉｇ、ＩＰ−１０、ＳＤＦ−１α／β、ＢＵＮＺＯ／ＳＴＲＣ３３、Ｉ−ＴＡＣ、ＢＬＣ／ＢＣＡ−１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＭＤＣ、ＴＥＣＫ、ＴＡＲＣ、ＲＡＮＴＥＳ、ＨＣＣ−１、ＨＣＣ−４、ＤＣ−ＣＫ１、ＭＩＰ−３α、ＭＩＰ−３β、ＭＣＰ−１−５、エオタキシン、エオタキシン−２、Ｉ−３０９、ＭＰＩＦ−１、６Ｃｋｉｎｅ、ＣＴＡＣＫ、ＭＥＣ、リンホタクチンおよびフラクタルカインからなる群から選択されることが好ましい。
【００５８】
凝血促進因子は、組織因子（ＴＦ）または癌用凝血促進剤（ＣＰ）であることが好ましい。
【００５９】
プロドラッグ活性化用酵素は、カルボキシペプチダーゼ、グルクロニダーゼおよびグルコシダーゼからなる群から選択される酵素であることが好ましい。
【００６０】
アルブミン結合物質、ＩｇＧ結合物質の例は、Ｇｅｂａｕｅｒ  ａｎｄ  Ｓｋｅｒｒａ（２００９）、１３：２４５〜２５５頁中に記載される。したがって、アルブミン結合物質とＩｇＧ結合物質の好ましい例は、ヒト単鎖Ｉｇドメイン（ダブルアルブミンＤａｂ）、ナノボディ、ストレプトコッカスプロテインＧ由来の天然に存在するアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）、およびＩｇＧと結合するドメインである。このような融合構築物は、例えば患者への投与時に、特に血液循環器系において、本発明のポリペプチドの半減期を増大させる。
【００６１】
別の好ましい実施形態によれば、本発明のさらなる化合物は、抗体軽鎖、抗体重鎖、抗体のＦＣドメイン、抗体、またはそれらの組合せからなるか、またはそれらを含む。
【００６２】
用語「抗体」は、前記ペプチドまたはポリペプチドと特異的に結合する、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単鎖抗体、またはそれらの断片を含み、二重特異性抗体、合成抗体、重鎖と軽鎖以外の抗体断片、例えばＦａｂ、ａＦ（ａｂ２）’、ＦｖまたはｓｃＦｖ断片など、またはこれらのいずれかの化学修飾誘導体も含む。例えば、モノクローナル抗体を、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ２５６（１９７５）、４９５、およびＧａｌｆｒｅ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３（１９８１）、３中に最初に記載された技法により調製することができ、それらは当技術分野で開発された修飾がある免疫処置済み哺乳動物由来の脾臓細胞とマウスミエローマ細胞の融合体を含む。さらに、前述のペプチドに対する抗体またはそれらの断片は、例えばＨａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、ＣＳＨ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、１９８８中に記載された方法を使用することにより得ることができる。前記抗体の誘導体をファージディスプレイ技法によって得るとき、ＢＩＡｃｏｒｅシステムで利用される表面プラズモン共鳴を使用して、本発明のペプチドまたはポリペプチドのエピトープと結合するファージ抗体の有効性を高めることができる（Ｓｃｈｉｅｒ、Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ７（１９９６）、９７〜１０５頁；Ｍａｌｍｂｏｒｇ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ１８３（１９９５）、７〜１３頁）。キメラ抗体の産生は例えばＷＯ８９／０９６２２中に記載される。本発明に従い利用する抗体のさらなる供給源は、いわゆる異種移植片抗体である。マウスにおけるヒト抗体などの異種移植片抗体の産生に関する一般原則は、例えばＷＯ９１／１０７４１、ＷＯ９４／０２６０２、ＷＯ９６／３４０９６およびＷＯ９６／３３７３５中に記載されている。本発明に従い利用する抗体またはそれらの対応する免疫グロブリン鎖（複数可）は、当技術分野で知られる従来技法を使用して、例えばアミノ酸の欠失（複数可）、挿入（複数可）、置換（複数可）、付加（複数可）および／または組換え（複数可）および／または当技術分野で知られる任意の他の修飾（複数可）を、単独または組合せで使用することによって、さらに修飾することができる。免疫グロブリン鎖のアミノ酸配列の基盤をなすＤＮＡ配列に、このような修飾を導入するための方法は当業者によく知られている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９を参照。
【００６３】
用語「モノクローナル」または「ポリクローナル抗体」（Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ、（１９８８）、上記引用文参照）はさらに、それらの結合特異性を保持またはほぼ保持する前記抗体の誘導体に関する。前記誘導体の特に好ましい実施形態は本明細書で以下にさらに示すが、このような抗体の他の好ましい誘導体は、例えばマウスまたはラット可変領域とヒト定常領域を含むキメラ抗体である。
【００６４】
用語「ｓｃＦｖ断片」（単鎖Ｆｖ断片）は当技術分野で充分理解されており、その小さなサイズおよび組換えによりこのような断片が生じる可能性のため好ましい。
【００６５】
抗体はヒト化抗体であってよい。本発明による用語「ヒト化抗体」は、そのタンパク質配列が修飾されヒトにおいて自然に生じる抗体変異体とのその類似性が増大した、非ヒト起源の抗体を意味する。ヒト化抗体の作製は、例えば、ＣＤＲ３および好ましくは全６ＣＤＲなどの（所望の結合性を担う）適切なＣＤＲコードセグメントを、ヒト抗体「足場」に挿入することによって実施することができる。ヒト化抗体を産生するための方法は、例えばＥＰ−Ａ１０２３９４００およびＷＯ９０／０７８６１中に記載されている。
【００６６】
用語「抗体軽鎖」は抗体の小さなポリペプチドサブユニットを表し、一方で用語「抗体重鎖」は抗体の大きなポリペプチドサブユニットを表す。典型的な抗体は、２つの免疫グロブリン（Ｉｇ）重鎖と２つのＩｇ軽鎖で構成される。それぞれの軽鎖は、１つが定常（ＣＬ）ドメインであり１つが抗原との結合に重要な可変ドメイン（ＶＬ）である、２つのタンデム免疫グロブリンドメインで構成される。重鎖は、抗体のクラスまたはアイソタイプを決定する。それぞれの重鎖は、２つの領域、すなわち（同じクラスの全免疫グロブリンで同一であるがクラス間で異なる）定常領域と、異なるＢ細胞間で異なるが同じＢ細胞もしくはＢ細胞クローンにより生成される全免疫グロブリンで同一である可変領域を有する。任意の重鎖の可変ドメインは単一免疫グロブリンドメインで構成される。
【００６７】
抗体の「機能性Ｆｃドメイン」は当業者にはよく知られている用語であり、パパインによる抗体切断に基づき定義される。それらの重鎖の定常領域のアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは数クラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭに分けられ、これらの幾つかはサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２にさらに分けることができる。重鎖定常領域に従い、異なるクラスの免疫グロブリンは、それぞれ［α］、［δ］、［ε］、［γ］および［μ］と呼ばれる。抗体の機能性Ｆｃドメインは、補体活性化、Ｃ１ｑ結合およびＦｃ受容体結合に基づき、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介性細胞障害）およびＣＤＣ（補体依存性細胞障害）に直接関与する。４つのヒトＩｇＧアイソタイプは、異なるアフィニティーで、新生児Ｆｃ受容体、活性化Ｆｃγ受容体、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、およびＦｃγＲＩＩＩａ、阻害受容体ＦｃγＲＩＩｂ、およびＣ１ｑなどの異なる受容体と結合し、非常に異なる活性をもたらす。ヒト抗体のＦｃドメインの活性化および阻害受容体に対するアフィニティーは、操作し改変することができることは知られている（Ｓｔｒｏｈｌ  Ｗ．（２００９）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２０、６８５〜６９１頁参照）。
【００６８】
Ｆｃドメインは、本発明のポリペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を延長することができる１つまたは複数のヒト機能性Ｆｃドメインであり、その幾つかは、例えば本明細書で以下に記載する治療、予防および／または診断用途において、本発明の融合タンパク質のポリペプチド成分の特異的標的結合の部位に、哺乳動物の免疫応答を誘導することが好ましい。このようなヒト機能性Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１抗体のドメインであることがより好ましい。本発明のポリペプチドは、１つまたは複数の機能性ＦｃドメインのＮ末端もしくはＣ末端の片方、または１つまたは複数のＦｃドメインのＮ末端とＣ末端の両方と融合することができる。本発明の融合タンパク質は、１つまたは複数の、好ましくは１つのＦｃドメインの好ましくはＮ末端と少なくとも片側で融合した、本発明のポリペプチドの多量体、好ましくは四量体、三量体もしくは最も好ましくは二量体を含むことが好ましい。
【００６９】
本発明のより好ましい実施形態では、Ｆｃドメインは、活性化もしくは抑制エフェクター機能を有するＩｇＧ１の１つまたは複数の操作型ヒト機能性Ｆｃドメイン、好ましくは抑制エフェクター機能を有するＩｇＧ１の１つまたは複数の操作型ヒト機能性Ｆｃドメイン、およびよりさらに好ましくはＫａｂａｔのＥＵインデックスに従うナンバリングでＬ２３４およびＬ２３５に突然変異があり抑制エフェクター機能を有する、および最も好ましくはＬ２３４ＡおよびＬ２３５Ａに突然変異がある、ＩｇＧ１の１つまたは複数の操作型ヒト機能性Ｆｃドメインである（Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｇ．ａｎｄ  Ｗｕ  Ｔ．Ｔ．（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８、２１４〜２１８頁参照）。
【００７０】
本発明の融合構築物における抗体は、ＴＮＦαと特異的に結合することが好ましい。用語「〜と特異的に結合する」は、無関連タンパク質と本発明の融合構築物の結合に関して観察する平衡結合定数と比較して２倍小さい、好ましくは５倍または１０倍小さい平衡結合定数ＫＤでＴＮＦαと結合する場合を指し、このような無関連タンパク質はＴＮＦファミリーのメンバーではなく、またはＴＮＦβなどのＴＮＦファミリーの異なるメンバーである。
【００７１】
本発明の融合構築物の別の好ましい実施形態によれば、本発明のポリペプチドは、抗体軽鎖、抗体重鎖、抗体のＦＣドメイン、抗体、またはそれらの組合せからなるか、またはそれらを含む、前記さらなる化合物のＣ末端の下流に位置する。
【００７２】
このようなさらなる化合物は直接、またはリンカーを介してポリペプチドに融合することができる。したがって融合構築物は、さらなる化合物のＣ末端に（直接）、より具体的にはＣ末端アミノ酸のカルボキシル基とＮ末端アミノ酸のアミノ基の間のペプチド結合の形成により融合することができ、またはリンカーを介してさらなる化合物鎖のＣ末端に結合させることが可能である。
【００７３】
適切なリンカーは当業者の裁量に任される。本発明によるリンカーは、１〜３０炭素原子を有するアルキル、１〜２０エチレン部分を有するポリエチレングリコール、１〜２０残基を有するポリアラニン、カプロン酸、置換または非置換ポリ−ｐ−フェニレンおよびトリアゾールからなる群から選択されることが好ましい。ペプチドリンカー、より具体的には２〜３０アミノ酸長を有するオリゴペプチドも好ましい。一アミノ酸の使用も意図的に想定される。好ましい長さ範囲は５〜１５アミノ酸である。他の好ましい長さは３、４、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１６、１７、１８、１９または２０アミノ酸である。
【００７４】
特に好ましいのは、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または１００％の、グリシン、セリンおよびアラニンなどの低分子アミノ酸からなるペプチドであるリンカーである。特に好ましいのは、グリシンとセリンのみからなるリンカーである。最も好ましいのは配列番号１３〜１５のリンカーであり、特別好ましいのは配列番号１５の配列からなるペプチドであるリンカーである。
【００７５】
本発明の融合構築物の別の好ましい実施形態によれば、さらなる化合物は、配列番号１１を含むかまたはそれからなる抗体軽鎖を含むか、またはそれからなる。
【００７６】
配列番号１１は抗ＴＮＦα抗体の軽鎖である。配列番号１１も直接、またはリンカーを介して本発明のポリペプチドに融合することができることは理解されよう。したがって融合構築物は、さらなる化合物のＣ末端に（直接）、より具体的にはＣ末端アミノ酸のカルボキシル基とＮ末端アミノ酸のアミノ基の間のペプチド結合の形成により融合することができ、またはリンカーを介してさらなる化合物鎖のＣ末端に結合させることが可能である。好ましいリンカーは、配列番号１３〜１５からなる群から選択される配列を含むか、またはそれからなり、配列番号１５が最も好ましい。この実施形態による融合構築物の特に好ましい例は配列番号１６または１７を含むか、またはそれからなり、配列番号１６が最も好ましい。
【００７７】
さらなる実施形態では、本発明は、配列番号１１を含むかまたはそれからなる抗体軽鎖、および少なくとも１コピー、好ましくは２コピーの配列番号１２の抗体重鎖を含むか、またはそれらからなる少なくとも１コピー、好ましくは２コピーの融合構築物を含むか、またはそれらからなる構築物に関する。
【００７８】
配列番号１２は抗ＴＮＦα抗体の重鎖である。したがって、この実施形態による構築物は、本発明のグリコシル化ＩＬ−１７Ａと結合したポリペプチド、抗ＴＮＦα抗体の軽鎖（配列番号１１）および抗ＴＮＦα抗体の重鎖（配列番号１２）を少なくとも含み、本発明のグリコシル化ＩＬ−１７Ａと結合したポリペプチドと抗ＴＮＦα抗体の軽鎖が融合体を形成する。本発明の構築物における軽鎖と重鎖のコピー数は同じであることが好ましい。抗体の軽鎖成分は、抗体の重鎖成分と共に存在するとき、ＴＮＦαを認識する抗原結合部位の形成をもたらす。構築物がそれぞれ２コピーの抗ＴＮＦα抗体の軽鎖（配列番号１１）および抗ＴＮＦα抗体の重鎖（配列番号１２）を含む場合、構築物は完全抗ＴＮＦα抗体を含むことが好ましく、この場合前記抗体のそれぞれの軽鎖は本発明のポリペプチドに直接融合する、またはリンカーを介して融合する。このような構築物の好ましい例は実施例４中に記載し、本明細書の以下の表４中に示す。
【００７９】
好ましい実施形態によれば、本発明は、配列番号１６もしくは１７（配列番号１６が好ましい）を含むかまたはそれからなる融合構築物の少なくとも１コピー、好ましくは２コピー、および配列番号１２の抗体重鎖の少なくとも１コピー、好ましくは２コピーを含むか、またはそれらからなる構築物に関する。
【００８０】
この構築物は、配列番号１６もしくは１７（配列番号１６が好ましい）を含むかまたはそれからなる融合構築物の２コピー、および配列番号１２の抗体重鎖の２コピーを含むか、またはそれらからなることが好ましい。このような構築物は、したがって完全抗ＴＮＦα抗体を含むことができる。
【００８１】
本発明の構築物内では、本発明のポリペプチドは、配列番号１１を含むかまたはそれからなる軽鎖のＣ末端下流に位置することが好ましい。
【００８２】
本発明の構築物は、２つの標的分子、すなわち一方でグリコシル化インターロイキン−１７Ａおよび他方でＴＮＦαと同時に結合することができる。この構築物は、本発明のポリペプチドの存在のため、機能性グリコシル化ＩＬ−１７Ａ結合部位を含む。
【００８３】
本発明による構築物は、適切な条件下で、前記融合タンパク質と前記抗体重鎖を１つにすることにより得ることができる。当業者は適切な条件を理解している。適切な条件下でのこのような一体化は、前記融合タンパク質中に含まれる抗体軽鎖と前記抗体重鎖の間の相互作用により誘発される非共有結合体をもたらす。抗体中で一般に見られるジスルフィド結合が、本発明による構築物中に存在することが好ましい。ジスルフィド結合は、典型的にはヒンジ領域の近辺に存在し、２つの重鎖および／または軽鎖と重鎖を結合させる。
【００８４】
本発明はさらに、本発明のポリペプチドをコードする核酸分子、または本発明の融合構築物、または本発明の構築物をコードする１つまたは複数の核酸分子に関する。
【００８５】
本発明の構築物をコードする１つまたは複数の核酸分子は、例えば１つの核酸分子が本発明の融合構築物をコードし他の核酸分子が抗体の重鎖をコードする、２つの核酸分子であってよい。
【００８６】
本発明による核酸分子は、ｃＤＮＡ、およびｍＲＮＡなどのＤＮＡを含む。さらに含まれるのは、センス鎖とアンチセンス鎖両方の、ＤＮＡまたはＲＮＡの合成または半合成誘導体および混合型ポリマーなどの、当技術分野で知られる核酸模倣分子である。当業者により容易に理解されるように、それらは別の非天然または誘導体ヌクレオチド塩基を含有し得る。好ましい実施形態では、ポリヌクレオチドまたは核酸分子（複数可）はＤＮＡである。本発明によるこのような核酸模倣分子または核酸誘導体には、ホスホロチオエート核酸、ホスホロアミデート核酸、２’−Ｏ−メトキシエチルリボ核酸、モルホリノ核酸、ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）およびロックド核酸（ＬＮＡ）がある（例えば、Ｂｒａａｓｃｈ  ａｎｄ  Ｃｏｒｅｙ、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ８、１〜７頁（２００１）参照）。ＬＮＡは、２’−酸素と４’−炭素の間のメチレン結合によってリボース環が制約を受けるＲＮＡ誘導体である。
【００８７】
本発明の目的で、ペプチド核酸（ＰＮＡ）はポリアミドタイプのＤＮＡアナログである。アデニン、グアニン、チミンおよびシトシンの対応する誘導体に関するモノマー単位は（例えばＰｅｒｃｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから）市販されている。ＰＮＡは、ＤＮＡまたはＲＮＡの糖−リン酸骨格の代わりにアミド骨格がある合成ＤＮＡ−模倣体である。結果として、ＤＮＡの構成要素、リン、酸化リン、またはデオキシリボース誘導体などはＰＮＡ中に存在しない。
【００８８】
本発明によるＰＮＡキメラは、１つまたは複数のＰＮＡ部分を含む分子である。キメラ分子の残り部分は、１つまたは複数のＤＮＡ部分（ＰＮＡ−ＤＮＡキメラ）または１つまたは複数の（ポリ）ペプチド部分を含み得る（ペプチド−ＰＮＡキメラ）。本発明によるペプチド−ＤＮＡキメラは、１つまたは複数の（ポリ）ペプチド部分と１つまたは複数のＤＮＡ部分を含む分子である。ＰＮＡ、ペプチドおよびＤＮＡ部分を含む分子も想定される。キメラ分子の一部分の長さは１〜ｎ−１塩基、塩基相当物またはアミノ酸の範囲であってよく、この場合「ｎ」は分子全体の塩基、塩基相当物およびアミノ酸の合計数である。
【００８９】
前に記載したＰＮＡ、（ポリ）ペプチド、ＰＮＡキメラ、およびペプチド−ＤＮＡキメラに関連する用語「誘導体」は、ＰＮＡ、（ポリ）ペプチドおよびＤＮＡと異なる１つまたは複数のさらなる基または置換基を含む分子に関する。当技術分野で知られており、保護基などのこれらの分子の合成、および／または標識および（切断）リンカーなどのこれらの分子に関する適用例に使用する、全ての基または置換基が想定される。
【００９０】
核酸分子が列挙した配列を（有するのではなく）含む実施形態では、５’末端もしくは３’末端の一方または両末端で、追加的ヌクレオチドが特定配列にわたり延長する。これらの追加的配列は異種または相同の性質であってよく、約５０〜５００ヌクレオチドの延長部分を含み得るが、より高い値または低い値が除外されるわけではない。相同的配列の場合、これらの実施形態は完全ゲノムを含まず、一般に５’末端および／または３’末端における約１５００の追加的ヌクレオチドに限られる。
【００９１】
追加的異種配列は、前述の分子のコード配列に作動可能に連結した異種プロモーターを含み得る。したがって、核酸分子はプロモーターに作動可能に連結することが好ましく、Ｔ５プロモーター／ｌａｃオペレーターエレメント、Ｔ７プロモーター／ｌａｃオペレーターエレメントからなる原核生物プロモーターの群から、またはｈＥＦ１−ＨＴＬＶ、ＣＭＶｅｎｈ／ｈＦｅｒＬプロモーターからなる真核生物プロモーターの群から選択されるプロモーターに作動可能に連結することがさらに好ましい。
【００９２】
本発明はさらに、本発明の１つまたは複数の核酸分子を含む１つまたは複数のベクター、および本発明の１つまたは複数の核酸分子または本発明の１つまたは複数のベクターを含む１つまたは複数の宿主細胞に関する。
【００９３】
ベクターおよび単離細胞、特に宿主細胞は、目的、例えば本発明のポリペプチド、融合構築物および／または構築物、および／または例えば遺伝子療法に治療上有用なベクターと宿主細胞の生成に適した、任意の従来型であってよい。当業者は、通常の方法により過剰な負担なしで、多量の従来技術からこれらの核酸分子、ベクターおよび宿主細胞を選択することができ、所望の目的に関するそれら個々の適性を確認することができる。
【００９４】
本発明の１つまたは複数のベクターは、本発明の１つまたは複数の核酸を含むことがさらに好ましく、本発明のポリペプチドまたは融合タンパク質を生成可能であることが好ましい。このようなベクターは、ｐＱＥベクター、ｐＥＴベクター、ｐＦＵＳＥベクター、ｐＵＣベクター、ＹＡＣベクター、ファージミドベクター、ファージベクター、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスなどの遺伝子療法に使用するベクターからなる群から選択されることが好ましい。ベクターの改変技術に関しては、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌ（２００１）、上記引用文を参照のこと。一般にベクターは、１つまたは複数の複製起点（ｏｒｉ）、およびクローニングもしくは発現用の遺伝子系、１つまたは複数の宿主における例えば抗生物質耐性選択用マーカー、および１つまたは複数の発現カセットを含有し得る。適切な複製起点（ｏｒｉ）には、例えばＣｏｌＥ１、ＳＶ４０ウイルスおよびＭ１３複製起点がある。
【００９５】
別の核酸分子との翻訳融合体が生成するように、本発明の１つまたは複数の核酸分子を１つまたは複数のベクターに挿入することもできる。他の核酸分子は抗ＴＮＦα抗体および／またはリンカーの軽鎖および／または重鎖をコードすることが好ましく、その好ましい例は本明細書で前に記載した。
【００９６】
１つまたは複数の宿主細胞は、本発明の１つまたは複数の核酸分子または１つまたは複数のベクターを１つまたは複数の宿主細胞に導入することにより生成することができ、それらの存在は前記核酸分子またはベクターによってコードされるポリペプチドの発現を媒介する。宿主細胞は単離宿主細胞であることが好ましく、これは細胞が生存する生物の状態にないことを意味する。宿主は任意の原核生物または真核生物細胞であってよい。適切な真核生物宿主は、哺乳動物細胞、両生類細胞、魚類細胞、昆虫細胞、真菌細胞または植物細胞であってよい。真核生物細胞は、スポードプテラフルペルダ細胞などの昆虫細胞、サッカロミセスセレビシアエまたはピキアパストリス細胞などの酵母細胞、アスペルギルス細胞などの真菌細胞、または脊椎動物細胞であってよい。後者の点で、細胞はヒト細胞などの哺乳動物細胞であることが好ましい。細胞は細胞株の一部であってよい。
【００９７】
適切な原核生物／細菌は、大腸菌（例えば、大腸菌株ＨＢ１０１、ＤＨ５ａ、ＸＬ１Ｂｌｕｅ、Ｙ１０９０およびＪＭ１０１）、ネズミチフス菌、霊菌、バークホルデリアグルマエ、シュードモナスプチダ、シュードモナスフルオレセンス、シュードモナススタットゼリ、ストレプトミセスリビダンス、乳酸桿菌、マイコバクテリウムスメグマチスまたは枯草菌のような一般にクローニングに使用されるものである。本発明の核酸分子またはベクターで遺伝子操作するのに好ましい宿主細胞の例は大腸菌である。
【００９８】
本発明は、本発明のポリペプチド、本発明の融合構築物、本発明の構築物、本発明の１つまたは複数の核酸分子、本発明の１つまたは複数のベクター、本発明の１つまたは複数の宿主細胞、またはそれらの任意の組合せを含む、医薬または診断用組成物も対象とする。
【００９９】
本明細書中前でより詳細に論じたように、ＩＬ−１７Ａは多くの疾患に関与する。したがって、本発明のポリペプチド、融合構築物、構築物、核酸分子、ベクター、宿主細胞、またはそれらの任意の組合せは医薬品として有用である。前記医薬組成物中、本発明のポリペプチド、融合構築物、構築物、核酸分子、ベクター、宿主細胞、またはそれらの任意の組合せが唯一の活性剤であることが好ましい。医薬組成物は、飼育動物およびペット動物などの哺乳動物に投与することが好ましい。医薬組成物は、ヒトに投与することが最も好ましい。本明細書に記載する医薬組成物は、適切な用量で対象に投与する。
【０１００】
本発明に従い使用するための医薬組成物は、１つまたは複数の生理的担体または賦形剤を使用して、当技術分野で見られる方法に従い従来の形式で製剤化することができる。例えば、Ａｎｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ」、７ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、１９９９を参照。したがって医薬組成物は、経口、非経口、例えば皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、くも膜下、経皮、経粘膜、硬膜下、イオン導入法を介して局所もしくは局部、舌下、吸引スプレー、エアロゾルまたは直腸など、従来の薬学的に許容される賦形剤を場合によっては含む単位剤形で投与することができる。さらに、本発明の診断用組成物は任意の従来法で製造することができる。
【０１０１】
本発明の医薬組成物は、例えば前述の疾患を治療または予防するため、唯一の活性成分として、またはアジュバントとして、他の薬物、例えば免疫抑制もしくは免疫調節剤または他の抗炎症剤と共に、もしくはこれらと組み合わせて投与することができる。例えば、本発明のポリペプチド、融合構築物および構築物は、免疫抑制モノクローナル抗体、例えば白血球受容体、例えばＭＨＣ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ５８、ＣＤ８０、ＣＤ８６またはこれらのリガンドに対するアフィニティーがあるモノクローナル抗体、他の免疫調節化合物、例えばＣＴＬＡ４もしくはその突然変異体の細胞外ドメインの少なくとも一部分、例えば非ＣＴＬＡ４タンパク質配列、例えばＣＴＬＡ４Ｉｇ（例えば、ＡＴＣＣ６８６２９と表す）もしくはその突然変異体と接合したＣＴＬＡ４もしくはその突然変異体の少なくとも細胞外部分を有する組換え結合分子、例えばＬＥＡ２９Ｙ、接着分子阻害剤、例えばＬＦＡ−Ｉアンタゴニスト、ＩＣＡＭ−１もしくは−３アンタゴニスト、ＶＣＡＭ−４アンタゴニストもしくはＶＬＡ−４アンタゴニストと組み合わせて使用することができる。さらに、本発明のポリペプチド、融合構築物および構築物は、ＤＭＡＲＤ（疾患修飾性抗リウマチ薬）、金類塩、スルファサラジン、抗マラリア薬、メトトレキサート、Ｄ−ペニシラミン、アザチオプリン、ミコフェノール酸、シクロスポリンＡ、タクロリムス、シロリムス、ミノサイクリン、レフルノミド、グルココルチコイド、カルシニューリン阻害剤、例えばシクロスポリンＡもしくはＦＫ５０６、リンパ球再循環のモジュレーター、例えばＦＴＹ７２０およびＦＴＹ７２０アナログ、ｍＴＯＲ阻害剤、例えばラパマイシン、４０−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−ラパマイシン、ＣＣＩ７７９、ＡＢＴ５７８、ＡＰ２３５７３もしくはＴＡＦＡ−９３、免疫抑制の特性を有するアスコマイシン、例えばＡＢＴ−２８１、ＡＳＭ９８１など、コルチコステロイド、シクロホスファミド、アザチオプレン、メトトレキサート、レフルノミド、ミゾリビン、ミコフェノール酸、マイコフェノレートモフェチル、１５−デオキシスペルグアリンまたはその免疫抑制ホモログ、アナログもしくは誘導体、または化学療法剤、例えばパクリタキセル、ゲムシタビン、シスプラチン、ドキソルビシンもしくは５−フルオロウラシル、（他の）抗ＴＮＦα作用物質、例えば（好ましくは配列番号１１および／または１２を含む）ＴＮＦαに対するモノクローナル抗体、例えばインフリキシマブ、アダリムマブ、ＣＤＰ８７０、またはＴＮＦ−ＲＩもしくはＴＮＦ−ＲＩＩに対する受容体構築物、例えばエタネルセプト、ＰＥＧ−ＴＮＦ−ＲＩ、炎症促進性サイトカインのブロッカー、ＩＬ−１ブロッカー、例えばアナキンラもしくはＩＬ−１トラップ、ＡＡＬ１６０、ＡＣＺ８８５、ＩＬ−６ブロッカー、プロテアーゼ、例えばメタロプロテアーゼの阻害剤もしくは活性化剤、抗ＩＬ−１５抗体、抗ＩＬ−６抗体、抗ＩＬ−２３抗体、抗ＩＬ−２２抗体、抗ＩＬ−２１抗体、抗ＩＬ−１２抗体、抗ＩＦＮγ抗体、抗ＩＦＮα抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＩＬ−１７抗体、抗ＩｇＧＥ抗体、アスピリンなどのＮＳＡ���Ｄ、または抗感染剤と組み合わせて使用することができる。他の適切な薬物は、ＡＣＥ阻害剤、レニン阻害剤、ＡＤＨ阻害剤、アルドステロン阻害剤、およびアンギオテンシン受容体ブロッカーを含み得る。当然ながら、同時投与に関するこの作用物質の一覧は限定的でも完全でもない。
【０１０２】
一般的観点で、本発明の医薬組成物はＩＬ−１７Ａ媒介性疾患の治療または予防において使用する。
【０１０３】
本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される担体または賦形剤を含むことが好ましい。「薬学的に許容される担体または賦形剤」によって、任意のタイプの無毒固形状、半固形状または液状充填剤、希釈剤、被包性物質または製剤助剤を意味する。薬学的に許容される担体または賦形剤の例は、例えば、Ａｎｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ」、７ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、１９９９中に記載されている。
【０１０４】
本発明の診断用組成物は、例えば異なる細胞、組織または別の適切なサンプル中の、特に配列番号１０のグリコシル化ＩＬ１７Ａにおける、望ましくない生理的グリコシル化ＩＬ１７Ａレベルの検出において有用である。前記検出は、本発明のポリペプチド、融合構築物、構築物、核酸分子、ベクター、宿主細胞、またはそれらの任意の組合せとサンプルの接触、およびサンプル中のグリコシル化ＩＬ１７Ａ、特に配列番号１０のグリコシル化ＩＬ１７Ａの存在の検出を典型的に含む。したがって本発明の診断用組成物は、疾患の発症または病状、および特に本明細書において以下でさらに定義する病状の評価に使用することができる。
【０１０５】
本明細書で前に記載した本発明の一実施形態では、本発明のポリペプチドは、蛍光色素、感光剤、放射性核種、または医療イメージング用造影剤と結合する。このような融合構築物は診断用途に特に適している。
【０１０６】
本発明の診断用組成物は唯一の活性剤として投与することができ、または例えば、診断用組成物を使用し対象内の望ましくない生理的グリコシル化ＩＬ１７Ａレベルの部位を確認する場合、他の作用物質と組み合わせて投与することができる。一般的観点で、本発明の診断用組成物はＩＬ−１７Ａ媒介性疾患の診断において使用される。
【０１０７】
本発明の診断用および医薬組成物の用量は、当然ながら、本発明の個々のポリペプチド、融合構築物、構築物、１つまたは複数の核酸分子、１つまたは複数のベクター、１つまたは複数の宿主細胞、またはそれらの任意の組合せ、個別患者群もしくは患者、さらなる診断用もしくは医用活性化合物の任意選択的存在、ならびに診断もしくは治療する疾患の性質および重症度に応じて変わる。しかしながら、本発明の診断用または医薬組成物は、体重１ｋｇ当たり約０．０１ｍｇ〜約２０ｍｇ、好ましくは体重１ｋｇ当たり約０．１ｍｇ〜約５ｍｇの用量で使用することが現在好ましい。診断用または医薬組成物を２回以上投与して、例えば診断用組成物の場合は疾患の過程をモニタリングすることができ、または医薬組成物の場合は治療を延長することができる。診断用または医薬組成物の投与の頻度は、１日１回〜約３カ月毎に１回、好ましくは約２週間毎に１回〜約１０週間毎に１回、より好ましくは４〜８週間毎に１回の範囲内であることが好ましい。好ましい投薬レジメンは、１カ月に１回から２〜３カ月毎に１回、またはより低い頻度の本発明の診断用または医薬組成物の投与を含む。
【０１０８】
本発明の好ましい実施形態では、前記医薬組成物を炎症性、自己免疫性および／または骨量減少関連疾患の治療法において使用する。
【０１０９】
本発明のより好ましい実施形態では、疾患は、関節炎、好ましくは関節リウマチ、慢性進行性関節炎、反応性関節炎、乾癬性関節炎、腸疾患性関節炎および変形性関節炎、リウマチ性疾患、脊椎関節症、強直性脊椎炎、ライター症候群、過敏症（気道過敏症と皮膚過敏症の両方含む）、アレルギー、全身性エリテマトーデス、炎症性筋肉障害、多発性軟骨炎、強皮症、ヴェグナー肉芽腫、皮膚筋炎、スティーブンジョンソン症候群、慢性活性化肝炎、重症筋無力症、乾癬、特発性スプルー、自己免疫性炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、過敏性大腸症候群、内分泌性眼病、グレーブス病、サルコイドーシス、多発性硬化症、原発性胆汁性肝硬変、若年型糖尿病（Ｉ型糖尿病）、自己免疫性血液障害、溶血性貧血、無形成性貧血、真正赤血球性貧血、特発性血小板減少、ブドウ膜炎（前房および後房）、乾性角結膜炎、角結膜炎春季カタル、間質性肺線維症、糸球体腎炎（ネフローゼ症候群有りおよび無し）、特発性ネフローゼ症候群または微小変化型ネフロパシー、腫瘍、皮膚の炎症性疾患、角膜炎、筋炎、骨部インプラントの弛緩、代謝障害、アテローム性動脈硬化症、糖尿病、および脂質異常症、骨量減少、骨関節炎、骨粗しょう症、歯周疾患、閉塞性または炎症性気道疾患喘息、気管支炎、塵肺症、肺気腫、急性および超急性炎症反応、急性感染、敗血症性ショック、エンドトキシンショック、成人型呼吸窮迫症候群、髄膜炎、肺炎、重度の火傷、カヘキシー消耗性症候群、脳血管発作、ヘルペス性間質性角膜炎およびドライアイ疾患からなる群から選択される。
【０１１０】
全ての前述の疾患は、それらの発端および／または症状（複数可）がＩＬ−１７Ａおよび／またはＴｈ−１７関連である点において共通する。
【図面の簡単な説明】
【０１１１】
【図１】図１は、本発明のＩＬ−１７Ａ結合ポリペプチド：（Ａ）１Ｌ３−Ｂ０９（配列番号３）、（Ｂ）１１Ｌ０−Ｃ６（配列番号４）、（Ｃ）１１Ｌ５−Ｂ０６（配列番号５）、（Ｄ）１１Ｌ６−Ｆ０３（配列番号６）、（Ｅ）１１Ｌ９−Ｃ０９（配列番号７）、（Ｆ）１１Ｌ１０−Ａ０５（配列番号８）、（Ｇ）１１Ｌ１１−Ａ０９（配列番号９）のサイズ排除クロマトグラム（ＳＥＣ）を示す図である。
【図２】図２は、本発明のＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドによるグリコシル化および非グリコシル化ＩＬ−１７Ａの用量依存的ｉｎ  ｖｉｔｒｏ阻害の結果を示す図である。Ａ）１Ｌ３−Ｂ０９（配列番号３）、（Ｂ）１１Ｌ０−Ｃ６（配列番号４）、（Ｃ）１１Ｌ５−Ｂ０６（配列番号５）、（Ｄ）１１Ｌ６−Ｆ０３（配列番号６）、（Ｅ）１１Ｌ９−Ｃ０９（配列番号７）、（Ｆ）１１Ｌ１０−Ａ０５（配列番号８）。
【図３】図３は、ＷＯ２０１１／０２３６８５中に記載されたＦｙｎＳＨ３由来結合物質によるグリコシル化および非グリコシル化ＩＬ−１７Ａの用量依存的ｉｎ  ｖｉｔｒｏ阻害の結果を示す図である。（Ａ）ＦｙｎＳＨ３由来ＩＬ−１７結合物質２Ｃ１（ＷＯ２０１１／０２３６８５中に記載された配列番号１０７）。（Ｂ）ＦｙｎＳＨ３由来ＩＬ−１７結合物質Ａ１＿２（「Ａ１」）（ＷＯ２０１１／０２３６８５中に記載された配列番号５３）。（Ｃ）ＦｙｎＳＨ３由来ＩＬ−１７結合物質Ｂ１＿２（「Ｂ１」）（ＷＯ２０１１／０２３６８５中に記載された配列番号３９）。
【図４】図４は、本発明の二重特異性ＩＬ−１７Ａ／ＴＮＦα結合ポリペプチドのサイズ排除クロマトグラム（ＳＥＣ）を示す図である。（Ａ）ＬＣ１１Ｌ５−Ｂ０６（それぞれ配列番号１２と１６の配列からなる重鎖と軽鎖を有する（本発明による）二重特異性構築物）、および（Ｂ）ＬＣ１１Ｌ９−Ｃ０９（それぞれ配列番号１２と１７の配列からなる重鎖と軽鎖を有する（本発明による）二重特異性構築物）。
【図５】図５は、二重特異性抗ＩＬ−１７Ａ／ＴＮＦα融合タンパク質によるＩＬ−１７ＡとＴＮＦαの同時阻害を示す図である。２００ｐＭのＴＮＦαと４００ｐＭのＩＬ−１７ＡでＨＴ−２９細胞を刺激した後の、上清中のＧｒｏ−αＥＬＩＳＡレベルを示す。示した濃度のＬＣ１１Ｌ５−Ｂ０６（配列番号１２（重鎖）と１６（軽鎖融合体））（図５．Ａ）またはＬＣ１１Ｌ９−Ｃ０９（配列番号１２（重鎖）と１７（軽鎖融合体））（図５．Ｂ）を加えた後、ＩＬ−１７ＡとＴＮＦαの用量依存的阻害を観察することができる。Ｇｒｏ−αレベルは、高濃度の阻害剤で低下するからである。対照として、細胞は単一サイトカイン（ＩＬ−１７ＡまたはＴＮＦα）または培地のみで処理した。三連の平均値を示し、エラーバーは標準偏差（ＳＤ）を表す。
【図６】図６は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのヒトＩＬ−１７ＡとＴＮＦαの阻害を示す図である。（Ａ）および（Ｂ）：マウスに（「ＬＣ−Ｂ０６」で表す）ＬＣ１１Ｌ５−Ｂ０６（配列番号１２（重鎖）と１６（軽鎖融合体）を静脈内（ｉ．ｖ．）注射し、次にヒトＩＬ−１７Ａ（ｈＩＬ−１７Ａ）（Ａ）またはヒトＴＮＦα（ｈＴＮＦα）（Ｂ）を皮下注射した。示したサイトカインの投与後２時間で、マウスから血液サンプルを採取し、ＥＬＩＳＡによりＫＣレベルを検出した。抗ＴＮＦα抗体（図６．Ｂ）（「ａＴＮＦαｍＡｂ」）またはＰＢＳのいずれかの静脈内注射を施したマウスも示す。対照として、（サイトカイン刺激無しでＰＢＳのみで（静脈内）処理したマウスの）基底ＫＣレベルを示す。（Ｃ）および（Ｄ）：マウスに（「ＬＣ−Ｃ０９」で表す）ＬＣ１１Ｌ９−Ｃ０９（配列番号１２（重鎖）と１７（軽鎖融合体）を静脈内（ｉ．ｖ．）注射し、次にＩＬ−１７Ａ（Ｃ）またはＴＮＦα（Ｄ）を皮下注射した。示したサイトカインの投与後２時間で、マウスから血液サンプルを採取し、ＥＬＩＳＡによりＫＣレベルを検出した。抗ＴＮＦα抗体（図６．Ｄ）（「ａＴＮＦαｍＡｂ」）またはＰＢＳのいずれかの静脈内注射を施したマウスも示す。対照として、（サイトカイン刺激無しでＰＢＳのみで（静脈内）処理したマウスの）基底ＫＣレベルを示す。群当たり５匹のマウスの平均ＫＣレベルを示す（±ＳＥＭ）。
【図７】図７は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスへの一回静脈内注射後の異なる時間地点での（Ａ）ＬＣ１１Ｌ５−Ｂ０６（配列番号１２（重鎖）と１６（軽鎖融合体））および（Ｂ）ＬＣ１１Ｌ９−Ｃ０９（配列番号１２（重鎖）と１７（軽鎖融合体））の血清中濃度を示す図である。血清中濃度は、捕捉剤として（括弧内に示す）ＴＮＦαとＩＬ−１７Ａの両方を使用してＥＬＩＳＡによって決定した。最終時間地点（２４時間〜１６８時間）は消失半減期を計算するため使用した。５マウスの平均血清中濃度を時間に対してプロットし、エラーバーは標準偏差（ＳＤ）を表す。
【図８】図８は、配列番号３〜９および２０の配列アラインメントを示す図である。配列番号３〜９は、図８から明らかであるように本出願の実施例中の内部表示にも対応する。
【図９】図９は、本発明のＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチド１１Ｌ１１−Ａ０９（配列番号９）によるグリコシル化および非グリコシル化ＩＬ−１７Ａの用量依存的ｉｎ  ｖｉｔｒｏ阻害の結果を示す図である。
【図１０】図１０は、二重特異性抗ＩＬ−１７Ａ／ＴＮＦα融合タンパク質ＬＣ１１Ｌ５−Ｂ０６およびＬＣ１１Ｌ９−Ｃ０９によるＩＬ−１７Ａの阻害を示す図である。ＩＬ−１７ＡおよびＩＬ−１β（「ＩＬ−１７Ａ／ＩＬ−１β」）でＮＨＤＦ細胞を刺激した後の、細胞培養上清中のＩＬ−６ＥＬＩＳＡレベルを示す。示した濃度のＬＣ１１Ｌ５−Ｂ０６（配列番号１２（重鎖）と１６（軽鎖融合体））またはＬＣ１１Ｌ９−Ｃ０９（配列番号１２（重鎖）と１７（軽鎖融合体））を加えた後、ＩＬ−１７Ａ媒介性ＩＬ−６放出の用量依存的阻害を観察した。対照実験では、細胞は単一サイトカイン（「ＩＬ−１７Ａ」または「ＩＬ−１β」）または細胞培養培地のみ（「培地」）で処理した。三連の平均値を示し、エラーバーは標準偏差（ＳＤ）を表す。
【図１１】図１１は、サンドイッチＥＬＩＳＡおよび直接ＥＬＩＳＡ法を示す図である。（左）サンドイッチＥＬＩＳＡを実施してインタクトなＬＣ１１Ｌ５−Ｂ０６およびＬＣ１１Ｌ９−Ｃ０９分子を検出した。ビオチン化ＴＮＦを、ニュートラビジンコーティングマイクロタイター９６ウエルプレートのウエル中に固定した。ＬＣ１１Ｌ５−Ｂ０６またはＬＣ１１Ｌ９−Ｃ０９を含有する血漿をウエルに加えた。検出用にジゴキシゲニン標識ＩＬ−１７Ａ、次に基質処理および発色用に抗ジゴキシゲニン抗体ＨＲＰコンジュゲートを使用した。（右）直接ＥＬＩＳＡを実施して特異的ＴＮＦ結合を検出した。ビオチン化ＴＮＦを、ニュートラビジンコーティングマイクロタイター９６ウエルプレートのウエル中に固定した。ＬＣ１１Ｌ５−Ｂ０６またはＬＣ１１Ｌ９−Ｃ０９を含有する血漿をウエルに加えた。結合したＬＣ１１Ｌ５−Ｂ０６またはＬＣ１１Ｌ９−Ｃ０９は、基質処理および発色用の抗ヒトＩｇＧ抗体ＨＲＰコンジュゲートを使用して検出した。
【図１２】図１２は、カニクイザルへの一回静脈内注射後の異なる時間地点での（Ａ）ＬＣ１１Ｌ５−Ｂ０６（配列番号１２（重鎖）と１６（軽鎖融合体））および（Ｂ）ＬＣ１１Ｌ９−Ｃ０９（配列番号１２（重鎖）と１７（軽鎖融合体））の血漿中濃度を示す図である。血漿中濃度は、捕捉剤としてＴＮＦαおよびジゴキシゲニン標識ＩＬ−１７Ａ、次に基質処理および発色用に抗ジゴキシゲニン抗体ＨＲＰコンジュゲートを使用してサンドイッチＥＬＩＳＡによって決定した。３匹のカニクイザルの平均血漿中濃度を時間に対してプロットし、エラーバーは標準偏差（ＳＤ）を表す。
【図１３】図１３は、サンドイッチＥＬＩＳＡおよび直接ＥＬＩＳＡにより決定したカニクイザルにおけるＬＣ１１Ｌ５−Ｂ０６（Ａ）またはＬＣ１１Ｌ９−Ｃ０９（Ｂ）の血漿中濃度を示す図である。血漿中濃度は両タンパク質に関して比較可能であり、ＬＣ１１Ｌ５−Ｂ０６およびＬＣ１１Ｌ９−Ｃ０９は少なくとも２２０時間カニクイザルにおいて安定状態であることを示す。
【０１１２】
実施例によって本発明を例示する。
【実施例１】
【０１１３】
本発明のＦｙｎＳＨ３由来ポリペプチドは、モノクローナル溶解物ＥＬＩＳＡにより測定してＩＬ−１７Ａと結合する。
【０１１４】
方法
Ｓｃｈｌａｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｃｈｌａｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）ｍＡｂｓ、４（４）、４９７〜５０頁）中に記載されたフィノマーファージライブラリーを使用し、ＩＬ−１７Ａに特異的なＦｙｎ−ＳＨ３由来結合タンパク質を、抗原として組換えＩＬ−１７Ａ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、および選択技術として標準ファージディスプレイ（Ｇｒａｂｕｌｏｖｓｋｉ  Ｄ．ｅｔ  ａｌ．、（２００７）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ２８２、３１９６〜３２０４頁、Ｖｉｔｉ、Ｆ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３２６、４８０〜５０５頁）を使用して単離した。ｎ−ｓｒｃ−ループ配列「ＳＴＨＥＹＥ」（配列番号２）を有する本発明のＦｙｎＳＨ３由来ポリペプチド１Ｌ３−Ｂ０９（配列番号３）は選択プロセス中に増大した。１Ｌ３−Ｂ０９（配列番号３）はＩＬ−１７Ａと結合し（実施例２参照）、驚くことに非グリコシル化ＩＬ−１７Ａと同程度にグリコシル化ＩＬ−１７Ａを阻害することが分かった（実施例３参照）。高いアフィニティーを有するＦｙｎＳＨ３由来ＩＬ−１７Ａ結合物質を得るため、１Ｌ３−Ｂ０９（配列番号３）はアフィニティー成熟の鋳型として使用した。ｎ−ｓｒｃ−ループ配列「ＳＴＨＥＹＥ」（配列番号２）は一定に保ち、ランダムＲＴ−ループレパートリー（配列番号１において（Ｘ１）（Ｘ２）（Ｘ３）（Ｘ４）（Ｘ５）（Ｘ６）として表す６アミノ酸残基）と組み合わせた。アフィニティー成熟ライブラリー作製のプロセスは、ランダムＲＴ−ループを有する原型ライブラリー（Ｓｃｈｌａｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）ｍＡｂｓ、４（４）、４９７〜５０頁中の「ライブラリー０」）のクローニングに関して記載されたものとほぼ同じであった。
【０１１５】
原型およびアフィニティー成熟選択後、増大したＦｙｎＳＨ３由来ポリペプチドは、溶解物ＥＬＩＳＡによりＩＬ−１７Ａとの結合に関してスクリーニングした。Ｇｒａｂｕｌｏｖｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｇｒａｂｕｌｏｖｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．、（２００７）ＪＢＣ、２８２、３１９６〜３２０４頁）中に記載されたように、ＦｙｎＳＨ３由来結合タンパク質をコードするＤＮＡを細菌用発現ベクターｐＱＥ１２（Ｑｉａｇｅｎ）にクローニングし、その結果生成した構築物はＣ末端ｍｙｃヘキサヒスチジンタグを有していた。ポリペプチドは９６ウエル形式で大腸菌のサイトゾルにおいて発現させ、ウエル当たり２００μｌの透明溶解物をＢｅｒｔｓｃｈｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｅｒｔｓｃｈｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ２０（２）、５７〜６８頁）中に記載されたように調製した。簡単に言うと、形質転換細菌コロニーを寒天培地プレートから採取し、１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび０．１％（ｗ／ｖ）グルコースを含有する２００μｌ２ｘＹＴ培地中、丸底９６ウエルプレート（Ｎｕｎｃ、カタログ番号１６３３２０）において増殖させた。タンパク質の発現は、１ｍＭのＩＰＴＧ（Ａｐｐｌｉｃｈｅｍ、ドイツ）を加えることにより、２００ｒ．ｐ．ｍ．で３７℃における３時間の増殖後に誘導した。タンパク質はロータリーシェーカー内で一晩発現させた（２００ｒ．ｐ．ｍ．、３０℃）。その後、９６ウエルプレートは１８００ｇで１０分間遠心分離し、上清は廃棄した。細菌ペレットは、１ｍｇ／ｍｌのリソザイムを含有する２００μｌ溶解バッファー（５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ８．０）に再懸濁し、氷上に３０分間放置した。後に、細菌細胞は水浴中での超音波処理によって溶かし（１０秒間６バースト）、次いで１８００ｇで１０分間遠心分離した。モノクローナル細菌溶解物をＥＬＩＳＡに使用し、ビオチン化ＩＬ−１７Ａ（研究室内でＨＥＫＥＢＮＡ細胞で生成、ビオチン化は製造者の説明書に従いＮＨＳ−ＰＥＯ４−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ）で実施）をストレプトアビジンコーティングウエル（ＳｔｒｅｐｔａＷｅｌｌｓ、Ｈｉｇｈ  Ｂｉｎｄ、Ｒｏｃｈｅ）に固定し、２％ミルク（Ｒａｐｉｌａｉｔ、Ｍｉｇｒｏｓ、スイス）を含むＰＢＳでブロッキングした後、６μｇ／ｍｌ抗ｍｙｃ抗体９Ｅ１０を含有する４％ミルク（最終濃度３μｇ／ｍｌ）を含む５０μｌのＰＢＳ、および５０μｌの細菌溶解物を適用した。１時間のインキュベーションおよび洗浄後、抗マウスＨＲＰ抗体コンジュゲート（Ｓｉｇｍａ）を用いて、結合したＦｙｎＳＨ３由来ポリペプチドを検出した。ペルオキシダーゼ活性の検出はＢＭブルーＰＯＤ基質（Ｒｏｃｈｅ）を加えることにより行い、１ＭのＨ２ＳＯ４を加えることにより反応を停止させた。特異的結合物質のＤＮＡ配列はＤＮＡ配列決定によって検証した。
【０１１６】
結果
ＩＬ−１７Ａと結合したＥＬＩＳＡ陽性ＦｙｎＳＨ３由来ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列表中に添付したように配列番号３〜９で表す。
【実施例２】
【０１１７】
本発明のＦｙｎＳＨ３由来ポリペプチドは、高いアフィニティーでグリコシル化ヒトＩＬ−１７Ａと結合する。
【０１１８】
この実施例は、ＦｙｎＳＨ３由来ＩＬ−１７Ａ結合ポリペプチドの発現収量、ならびにサイズ排除クロマトグラフィーおよび表面プラズモン共鳴実験によるこれらのポリペプチドの特徴付けを示す。
【０１１９】
方法
ａ）ＦｙｎＳＨ３由来ＩＬ−１７Ａ結合ポリペプチドの発現収量
Ｇｒａｂｕｌｏｖｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｇｒａｂｕｌｏｖｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．、（２００７）ＪＢＣ、２８２、３１９６〜３２０４頁）中に記載されたように、ＦｙｎＳＨ３由来ＩＬ−１７Ａ結合ポリペプチドをＴＧ１大腸菌のサイトゾルにおいて発現させ精製した。
【０１２０】
ｂ）サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）
親ＦｙｎＳＨ３由来ＩＬ−１７Ａ結合ポリペプチド１Ｌ３−Ｂ０９（配列番号３）に関して、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ショートカラム（５／１５０）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してＡＫＴＡ  ＦＰＬＣシステムで実施した。アフィニティー成熟クローン１１Ｌ０−Ｃ６（配列番号４）、１１Ｌ５−Ｂ０６（配列番号５）、１１Ｌ６−Ｆ０３（配列番号６）、１１Ｌ９−Ｃ０９（配列番号７）、１１Ｌ１０−Ａ０５（配列番号８）および１１Ｌ１１−Ａ０９（配列番号９）のＳＥＣは、ＳＥＣ−３カラム（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用し、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ１２００  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ  Ｓｅｒｉｅｓ  ＨＰＬＣ装置で実施した。
【０１２１】
ｃ）アフィニティー測定
アフィニティー測定はＢＩＡｃｏｒｅＴ２００装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して実施した。グリコシル化ＩＬ−１７Ａ（研究室内で、ＨＥＫＥＢＮＡ細胞で生成）とモノマーＦｙｎＳＨ３由来ＩＬ−１７Ａ結合ポリペプチドの間の相互作用分析用に、Ｓｅｒｉｅｓ  Ｓ  ＣＭ５チップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、アミンカップリングキット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用し２０００ＲＵＩＬ−１７Ａを固定して使用した。ランニングバッファーは、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳであった。３０μｌ／分の流量および異なる濃度のＦｙｎＳＨ３由来ＩＬ−１７Ａ結合ポリペプチドの注入で相互作用を測定した。相互作用の全てのキネティックデータは、ＢＩＡｃｏｒｅＴ２００評価ソフトウエアを使用して評価した。
【０１２２】
結果
ａ）発現収量
本発明のモノマーＦｙｎＳＨ３由来ＩＬ−１７Ａ結合ポリペプチドに関する発現収量は、振とうフラスコ内の非最適条件下での細菌培養物の１４〜５７ｍｇ／Ｌの範囲であった（表１）。
【０１２３】
【表１】
0006009678.tif 000002
【０１２４】
ｂ）サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）プロファイルは、全ての構築物は主に単一モノマーピークとして溶出したことを実証した（図１）。
【０１２５】
ｃ）アフィニティー測定
結合性をＢＩＡｃｏｒｅチップでのリアルタイム相互作用分析によって分析し、選択したＩＬ−１７Ａ結合ポリペプチドに関する以下の解離定数（ＫＤ）が明らかになった。
【０１２６】
【表２】
0006009678.tif 000003
【実施例３】
【０１２７】
本発明のＦｙｎＳＨ３由来ポリペプチドはグリコシル化ＩＬ−１７Ａを阻害する
【０１２８】
親クローン１Ｌ３−Ｂ０９、ならびにＩＬ−１７Ａと高いアフィニティーを有する本発明の５つのアフィニティー成熟ＦｙｎＳＨ３由来ポリペプチド（１１Ｌ０−Ｃ６（配列番号４）、１１Ｌ５−Ｂ０６（配列番号５）、１１Ｌ６−Ｆ０３（配列番号６）、１１Ｌ９−Ｃ０９（配列番号７）、１１Ｌ１０−Ａ０５（配列番号８））を、ＩＬ−１７Ａを阻害するそれらの能力に関して試験した。ＩＬ−１７ＡとＴＮＦαは、線維芽細胞において用量依存的にＩＬ−６の生成を誘導する。示したＦｙｎＳＨ３由来ＩＬ−１７Ａ結合ポリペプチドの阻害活性は、様々な濃度の本発明のＦｙｎＳＨ３由来ＩＬ−１７Ａ結合ポリペプチドの有無の下において、組換えグリコシル化ＩＬ−１７Ａ（研究室内、ＨＥＫＥＢＮＡ細胞で生成）および組換えＴＮＦα（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でヒト皮膚線維芽細胞を刺激することによって試験した。細胞培養上清を２４時間の刺激後に採取し、上清中のＩＬ−６濃度をＥＬＩＳＡにより測定した。結果は、ＩＬ−１７Ａ結合ポリペプチドが、グリコシル化ＩＬ−１７Ａを特異的に阻害することができたことを示す。
【０１２９】
方法
エンドトキシン除去のため、タンパク質溶液をＡｃｒｏｄｉｓｃ  Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｅ膜（ＶＷＲ）で３回濾過した。濾過後、本発明の阻害性ＦｙｎＳＨ３由来ＩＬ−１７Ａ結合ポリペプチドを含有するタンパク質溶液のエンドトキシンレベルは、Ｌｉｍｕｌｕｓ ａｍｅｂｏｃｙｔｅ  ｌｙｓａｔｅ（ＬＡＬ）試験（ＰＹＲＯＧＥＮＴ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｔｅｓｔ  Ｇｅｌ  Ｃｌｏｔ  ＬＡＬアッセイ（Ｌｏｎｚａ））により測定して０．１ＥＵ／ｍｌ未満であった。
【０１３０】
約３９００の正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ、ＮＨＤＦ−ｃ、Ｃ１２３００）を含有する細胞懸濁液１００μｌをウエル毎に分配し（９６ウエルプレート、ＴＰＰまたはＣｏｒｎｉｎｇ）、３７℃で２４時間培養した（培地：線維芽細胞増殖培地Ｃ−２３０１０、ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ）。上清を吸引し、異なる濃度の本発明のＦｙｎＳＨ３由来ＩＬ−１７Ａ結合ポリペプチドとＩＬ−１７ＡおよびＴＮＦα含有培地を混合した後（それぞれ最終濃度１ｎｇ／ｍｌと５０ｐｇ／ｍｌ）、対応する溶液１００μｌをウエル毎に加えた。対照として、ＰＢＳをＩＬ−１７Ａ／ＴＮＦα含有培地（陽性対照＝「阻害剤含まず」）、および一種サイトカインＩＬ−１７ＡまたはＴＮＦαのみを含む培地と混合した（後者は「ＴＮＦα対照」ウエルである）。陰性対照として、ＰＢＳを培地のみと混合した。比較用に、同じ条件を使用し非グリコシル化ＩＬ−１７Ａ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）も使用してアッセイを実施した。３７℃で２４時間のインキュベーション後、ＥＬＩＳＡにおいて、製造者の説明書に従いＩＬ−６ＥＬＩＳＡキットを使用し（ＩＬ−６ＥＬＩＳＡキット、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、上清のＩＬ−６濃度を測定した。阻害の百分率をプロットし、ＩＣ５０値はソフトウエアＰｒｉｓｍ５を使用して計算した。
【０１３１】
ＩＬ−１７Ａ阻害の百分率は以下の式で決定した：
阻害率（％）=１００−｛（Ａ４５０-６５０ｎｍ（サンプル）−Ａ４５０-６５０ｎｍ（ＴＮＦα対照））／（Ａ４５０-６５０ｎｍ（陽性対照）−Ａ４５０-６５０ｎｍ（ＴＮＦα対照））×１００｝
【０１３２】
結果
正常ヒト皮膚線維芽細胞をＩＬ−１７Ａ／ＴＮＦα、および異なる濃度の示した本発明のＦｙｎＳＨ３由来ＩＬ−１７Ａ結合ポリペプチドとインキュベートした。本発明のＦｙｎＳＨ３由来ポリペプチドが、グリコシル化ＩＬ−１７Ａを阻害したことを観察した。ＩＣ５０値を表３中に示す。図２は、グリコシル化ＩＬ−１７Ａと非グリコシル化ＩＬ−１７Ａ両方を阻害する、本発明の示したＦｙｎＳＨ３由来ＩＬ−１７Ａ結合ポリペプチドの用量依存的阻害曲線を示す。驚くことに、本発明中に記載するＦｙｎＳＨ３由来ＩＬ−１７Ａ結合ポリペプチドは、非グリコシル化ＩＬ−１７Ａと比較して同等の効能でグリコシル化ＩＬ−１７Ａを完全に阻害することができることが分かった。これは、以前に発明された（ＷＯ２０１１／０２３６８５）ＦｙｎＳＨ３由来ＩＬ−１７Ａ結合ポリペプチドと比較して有利な特性である。図３は、高濃度でさえグリコシル化ＩＬ−１７Ａを完全に阻害せず、および／またはグリコシル化ＩＬ−１７Ａと非グリコシル化ＩＬ−１７Ａの間で阻害効能（ＩＣ５０値）の大きな違いを示す、３例のＷＯ２０１１／０２３６８５中に記載されたＦｙｎＳＨ３由来ＩＬ−１７Ａ結合ポリペプチド（ＦｙｎＳＨ３由来ＩＬ−１７結合物質２Ｃ１（ＷＯ２０１１／０２３６８５中に記載された配列番号１０７）、ＦｙｎＳＨ３由来ＩＬ−１７結合物質Ａ１＿２（ＷＯ２０１１／０２３６８５中に記載された配列番号５３）およびＦｙｎＳＨ３由来ＩＬ−１７結合物質Ｂ１＿２（「Ｂ１」）（ＷＯ２０１１／０２３６８５中に記載された配列番号３９）を示す（図３参照）。
【０１３３】
【表３】
0006009678.tif 000004
【実施例４】
【０１３４】
二重特異性抗ＩＬ−１７Ａ／ＴＮＦα抗体−ＦｙｎＳＨ３由来ＩＬ−１７Ａ結合ポリペプチド融合体の発現および精製収量
【０１３５】
ＦｙｎＳＨ３由来ＩＬ−１７Ａ結合ポリペプチド（１１Ｌ５−Ｂ０６（配列番号５）および１１Ｌ９−Ｃ０９（配列番号７））を、１５アミノ酸リンカー（リンカー、配列番号１５）を介して抗ＴＮＦα抗体（配列番号１１）の軽鎖のＣ末端に遺伝子融合させた。ＬＣ１１Ｌ５−Ｂ０６（それぞれ配列番号１２と１６の配列からなる重鎖と軽鎖を有する（本発明による）二重特異性構築物）、およびＬＣ１１Ｌ９−Ｃ０９（それぞれ配列番号１２と１７の配列からなる重鎖と軽鎖を有する（本発明による二重特異性構築物）という名称の、生成した二重特異性抗ＩＬ−１７Ａ／ＴＮＦα構築物をＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ＣＨＯ−Ｓ細胞に一過的にトランスフェクトし、無血清／無動物成分培地で６〜１０日間発現させた。タンパク質は、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー（Ｍａｂ  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅカラム；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、およびＡＫＴＡ  Ｐｕｒｉｆｉｅｒ装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ；Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  Ｇ２００、３０／１００ＧＬカラム；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって上清から精製した。濃度は２８０ｎｍでの吸光度測定によって決定した。収量は表４中に列挙する。
【０１３６】
【表４】
0006009678.tif 000005
【０１３７】
精製後、ＡＫＴＡ  ＦＰＬＣシステムとＳｕｐｅｒｄｅｘ  Ｇ２００、３０／１００ＧＬカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してサイズ排除クロマトグラフィーを実施した。精製後のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）プロファイルは、両方の融合タンパク質は単一モノマーピークとして溶出したことを実証し、これらの融合タンパク質は優れた生物物理学的特性を有することを示した（図４）。
【実施例５】
【０１３８】
ヒトおよびカニクイザルのＩＬ−１７ＡおよびＴＮＦαに対する抗体−ＦｙｎＳＨ３由来ＩＬ−１７Ａ結合ポリペプチド融合体のアフィニティー測定
【０１３９】
ＩＬ−１７Ａ（ヒトおよびカニクイザル）ならびにＴＮＦα（ヒトおよびカニクイザル）に対するＬＣ１１Ｌ５−Ｂ０６およびＬＣ１１Ｌ９−Ｃ０９のアフィニティーを、ＢＩＡｃｏｒｅＴ２００装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して測定した。Ｓｅｒｉｅｓ  Ｓ  ＣＭ５チップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、８０００ＲＵヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃ特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）でコーティングした。ランニングバッファーは、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳであった。３０μｌ／分の流量で約４００〜５００ＲＵのＬＣ１１Ｌ５−Ｂ０６またはＬＣ１１Ｌ９−Ｃ０９の捕捉、次に３０μｌ／分の流量で異なる濃度の抗原の注入により相互作用を測定した。相互作用の全てのキネティックデータは、ＢＩＡｃｏｒｅＴ２００評価ソフトウエアを使用して評価した。ヒト抗原に対するアフィニティーは表５中に列挙し、カニクイザル抗原に対するアフィニティーは表６中に列挙する。
【０１４０】
【表５】
0006009678.tif 000006
【０１４１】
【表６】
0006009678.tif 000007
【実施例６】
【０１４２】
ＬＣ１１Ｌ５−Ｂ０６およびＬＣ１１Ｌ９−Ｃ０９はＩＬ−１７ＡとＴＮＦαを同時に阻害する
【０１４３】
ＩＬ−１７ＡとＴＮＦαは、ＨＴ−２９細胞（ヒト結腸直腸腺癌細胞株）において用量依存的にＧｒｏ−αの生成を誘導する。示した構築物（ＬＣ１１Ｌ５−Ｂ０６およびＬＣ１１Ｌ９−Ｃ０９）の阻害活性は、様々な濃度のＬＣ１１Ｌ５−Ｂ０６およびＬＣ１１Ｌ９−Ｃ０９の有無の下において、グリコシル化ＩＬ−１７ＡとＴＮＦαでＨＴ−２９細胞（ヒト結腸直腸腺癌細胞株）を刺激することにより試験した。細胞培養上清は刺激の４８時間後に採取し、ＥＬＩＳＡでＧｒｏ−αに関してアッセイした。
【０１４４】
方法
ＬＣ１１Ｌ５−Ｂ０６またはＬＣ１１Ｌ９−Ｃ０９を、アッセイ培地（１０％ＦＢＳを補充したＭａＣｏｙ´ｓ  ５Ａ培地（ＧＩＢＣＯ））に希釈した。それぞれ示した濃度の５０μｌを、それぞれ４００ｐＭと２００ｐＭの最終濃度でＩＬ−１７Ａ（研究室内、ＨＥＫＥＢＮＡ細胞で生成）およびＴＮＦα（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含有する５０μｌのアッセイ培地と混合した。対照として、阻害剤を含まない培地を調製した。さらに、一種サイトカインのみを含む培地またはサイトカインを含まない培地を調製した。１時間のインキュベーション後、約２０，０００のＨＴ−２９細胞（ＡＴＣＣ、＃ＨＴＢ−３８）を含有する１００μｌの細胞懸濁液を溶液に加え、ウエル毎に分配し（９６ウエルプレート、ＴＰＰまたはＣｏｒｎｉｎｇ）、３７℃および５％ＣＯ２で４８時間培養した。３７℃で４８時間のインキュベーション後、上清を除去し、製造者の説明書に従いＥＬＩＳＡによりＧｒｏ−α濃度を測定した（Ｇｒｏ−αＥＬＩＳＡキット、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）。
【０１４５】
結果
図５は、ＩＬ−１７Ａ、ＴＮＦα、およびこれらの組合せで刺激した後のＨＴ−２９細胞上清中の（ＥＬＩＳＡシグナルとして示す）Ｇｒｏ−α濃度を示す。図５中に示すように、二重特異性構築物ＬＣ１１Ｌ５−Ｂ０６およびＬＣ１１Ｌ９−Ｃ０９は、ＩＬ−１７ＡとＴＮＦαを用量依存的および同時に阻害することができた。得られた見かけのＩＣ５０値（表７）は、本発明の二重特異性化合物が、高い効能でＩＬ−１７ＡとＴＮＦαを阻害することができることを実証する。
【０１４６】
【表７】
0006009678.tif 000008
【実施例７】
【０１４７】
ＬＣ１１Ｌ５−Ｂ０６およびＬＣ１１Ｌ９−Ｃ０９はｉｎ  ｖｉｖｏでＩＬ−１７ＡおよびＴＮＦαを阻害する
【０１４８】
ｉｎ  ｖｉｖｏでＩＬ−１７ＡおよびＴＮＦαを阻害するＬＣ１１Ｌ５−Ｂ０６およびＬＣ１１Ｌ９−Ｃ０９の能力を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて急性炎症モデルを使用して決定した。ヒトＩＬ−１７Ａは、マウスＩＬ−１７Ａ受容体に結合し刺激する。マウスに注射すると、ＩＬ−１７ＡはケモカインＫＣ（ＣＸＣＬ１）の多大な増加を引き起こし、それは注射したマウスの血清および洗浄液において１〜４時間以内に検出可能である。同様の観察がヒトＴＮＦαの注射でも見られ、それもマウスへの注射時にＫＣ血清中レベルの有意な増加をもたらす。
【０１４９】
方法
マウス（Ｃ５７ＢＬ／６、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）に、無エンドトキシンＰＢＳに希釈した阻害剤ＬＣ１１Ｌ５−Ｂ０６（２ｍｇ／ｋｇ）、ＬＣ１１Ｌ９−Ｃ０９（２ｍｇ／ｋｇ）、またはＴＮＦ阻害の対照として市販の抗ＴＮＦα抗体（２ｍｇ／ｋｇ）（アダリムマブ（ＨＵＭＩＲＡ（登録商標））を静脈内注射した（群当たり５マウス）。阻害剤の静脈内注射後３．５時間で、（マウス当たり３μｇのＩＬ−１７Ａおよびマウス当たり０．２５μｇのＴＮＦαの）皮下注射によりヒトＩＬ−１７ＡまたはヒトＴＮＦαでＫＣ発現を刺激した。２時間後、血清サンプリング用に血液を回収し、製造者の説明書に従い市販のＫＣ  ＥＬＩＳＡキットを使用してＫＣ濃度を測定した（ＱｕａｎｔｉｋｉｎｅマウスＫＣイムノアッセイ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）。
【０１５０】
結果
マウスにヒトＩＬ−１７ＡまたはＴＮＦαを皮下注射した後、動物はＫＣと呼ばれるケモカインを過剰発現する。マウス血清中の高いＫＣレベルはＥＬＩＳＡにより測定することができる。本発明のＦｙｎＳＨ３由来ポリペプチド融合体（ＬＣ１１Ｌ５−Ｂ０６およびＬＣ１１Ｌ９−Ｃ０９）ならびに対照抗ＴＮＦα抗体（図６．Ｂおよび６．Ｄ）の事前の静脈内注射は、ｉｎ  ｖｉｖｏでＫＣの増加を妨げた。図６は、（「ＬＣ−Ｂ０６」で表す）ＬＣ１１Ｌ５−Ｂ０６および（「ＬＣ−Ｂ０９」で表す）ＬＣ１１Ｌ９−Ｃ０９の強力な阻害性を示す。
【実施例８】
【０１５１】
ＬＣ１１Ｌ５−Ｂ０６およびＬＣ１１Ｌ９−Ｃ０９はｉｎ  ｖｉｖｏで抗体様ＰＫプロファイルを示す
【０１５２】
本発明の融合タンパク質ＬＣ１１Ｌ５−Ｂ０６およびＬＣ１１Ｌ９−Ｃ０９のｉｎ  ｖｉｖｏでの薬物動態性は、一回静脈内注射後に異なる時間地点で得たマウス血清において、ＥＬＩＳＡによる濃度の測定により決定した。
【０１５３】
方法
ＬＣ１１Ｌ５−Ｂ０６およびＬＣ１１Ｌ９−Ｃ０９を５匹のマウス（Ｃ５７ＢＬ／６、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）に１０ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内注射した。１０分、６、２４、４８、９６、１２０、１４４および１６８時間後、約２０μｌの血液をキャピラリーＭｉｃｒｏｖｅｔｔｅＣＢ３００（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）を用いて伏在静脈から採取した。血液サンプルは９５００×ｇで１０分間遠心分離し、ＥＬＩＳＡ分析を実施するまで血清は−２０℃で保存した。既知の濃度で希釈系を使用して、ＬＣ１１Ｌ５−Ｂ０６およびＬＣ１１Ｌ９−Ｃ０９の血清中濃度を、捕捉剤としてＴＮＦαとＩＬ−１７Ａの両方を使用するＥＬＩＳＡにより決定した：５０μｌのビオチン化ＩＬ−１７Ａ（１２０ｎＭ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、製造者の説明書に従いＥＺ−リンクＮＨＳ−ＰＧＥ４−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用してビオチン化）または５０μｌのビオチン化ＴＮＦα（１０ｎＭ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、製造者の説明書に従いＥＺ−リンクＮＨＳ−ＰＧＥ４−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用してビオチン化）をストレプトアビジンコーティングウエル（Ｒｅａｃｔｉｂｉｎｄ  Ｐｉｅｒｃｅ）に加え、２００μｌのＰＢＳ、４％ミルク（Ｒａｐｉｌａｉｔ、Ｍｉｇｒｏｓ、スイス）でブロッキングした後、５０μｌの希釈血清サンプル（ＰＢＳ、４％ミルク中）を加えた。１時間のインキュベーションおよびＰＢＳでの洗浄後、結合した抗体フィノマー融合タンパク質はプロテインＡ−ＨＲＰコンジュゲート（Ｓｉｇｍａ）で検出した。ペルオキシダーゼ活性はＱｕａｎｔａＲｅｄ化学蛍光増大ＨＲＰ基質（Ｐｉｅｒｃｅ）の添加により検出した。蛍光強度は５４４ｎｍ（励起）および５９０ｎｍ（発光）で１〜５分後に測定した。異なる時間地点において血清で測定したＬＣ１１Ｌ５−Ｂ０６およびＬＣ１１Ｌ９−Ｃ０９の濃度、および（片対数スケールでプロットした）消失相の、結果として得られた勾配ｋから、式ｔ１／２＝ｌｎ２／−ｋを使用して半減期を計算した。
【０１５４】
結果
ＬＣ１１Ｌ５−Ｂ０６およびＬＣ１１Ｌ９−Ｃ０９の血清中濃度を図７中に示す。消失相（β相、時間地点２４時間〜１６８時間）から測定した半減期は、両融合タンパク質に関して４．９日〜９．６日の範囲であり（表８参照）、これはマウスに注射する標準抗体治療剤に関して報告された半減期の値と同じ範囲内にある。これらのデータは、ＬＣ１１Ｌ５−Ｂ０６およびＬＣ１１Ｌ９−Ｃ０９が、ＩｇＧ様ｉｎ  ｖｉｖｏＰＫ特性を有することを示している。
【０１５５】
【表８】
0006009678.tif 000009
【実施例９】
【０１５６】
本発明のＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチド１１Ｌ１１−Ａ０９はグリコシル化ＩＬ−１７Ａを阻害する
【０１５７】
フィノマー１１Ｌ１１−Ａ０９（配列番号９）を、ＩＬ−１７Ａを阻害する能力に関して試験した。
【０１５８】
方法
実験条件は、本発明の他のＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチド（配列番号３〜８）に関して実施例３中に記載したのと同じである。
【０１５９】
結果
正常ヒト皮膚線維芽細胞をＩＬ−１７Ａ／ＴＮＦα、および異なる濃度の本発明のＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチド１１Ｌ１１−Ａ０９（配列番号９）とインキュベートした。１１Ｌ１１−Ａ０９（配列番号９）が、６６ｎＭのＩＣ５０値でグリコシル化ＩＬ−１７Ａを阻害したことを観察した（表９）。図９は、同等な効能および有効性でグリコシル化ＩＬ−１７Ａと非グリコシル化ＩＬ−１７Ａの両方を阻害する、本発明のＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチド１１Ｌ１１−Ａ０９（配列番号９）の用量依存的阻害曲線を示す。
【０１６０】
【表９】
0006009678.tif 000010
【実施例１０】
【０１６１】
ＬＣ１１Ｌ５−Ｂ０６およびＬＣ１１Ｌ９−Ｃ０９は高い効能でグリコシル化ＩＬ−１７Ａを阻害する
【０１６２】
この実施例は、グリコシル化ＩＬ−１７Ａを特異的に阻害する、本発明のＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドの能力をさらに実証する。二重特異性抗ＩＬ−１７Ａ／ＴＮＦα構築物、ＬＣ１１Ｌ５−Ｂ０６（それぞれ配列番号１２と１６の配列からなる重鎖と軽鎖を有する（本発明による）二重特異性構築物）、およびＬＣ１１Ｌ９−Ｃ０９（それぞれ配列番号１２と１７の配列からなる重鎖と軽鎖を有する（本発明による）二重特異性構築物）を、実施例４中に記載したように発現させ精製した。ＬＣ１１Ｌ５−Ｂ０６およびＬＣ１１Ｌ９−Ｃ０９の阻害活性は、組換えグリコシル化ＩＬ−１７Ａ（研究室内、ＨＥＫＥＢＮＡ細胞で生成）および組換えＴＮＦα（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）で正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ細胞）を刺激して、様々な濃度のＬＣ１１Ｌ５−Ｂ０６またはＬＣ１１Ｌ９−Ｃ０９の有無の下においてＩＬ−６を生成することにより試験した。細胞培養上清を刺激の１６〜２４時間後に除去し、上清中のＩＬ−６濃度をＥＬＩＳＡにより測定した。結果は、本発明のＩＬ−１７Ａ結合ポリペプチドを含む融合タンパク質が、グリコシル化ＩＬ−１７Ａを特異的に阻害することができたことを示す。
【０１６３】
方法
約３９００の正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ、ＮＨＤＦ−ｃ、Ｃ１２３００）を含有する細胞懸濁液１００μｌをウエル毎に分配し（９６ウエルプレート、ＴＰＰ）、３７℃／５％ＣＯ２で２４時間培養した（培地：線維芽細胞増殖培地Ｃ−２３０１０、ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ）。上清を吸引し、（図１０中に示す最終濃度の）異なる濃度のＬＣ１１Ｌ５−Ｂ０６またはＬＣ１１Ｌ９−Ｃ０９とＩＬ−１７ＡおよびＩＬ−１β含有培地（最終濃度ＩＬ−１７Ａ：６４ｐＭ、ＩＬ−１β：１０ｆＭ）を混合した後、対応する溶液１００μｌを細胞に加えた（三連）。対照実験では、ＰＢＳをＩＬ−１７Ａ／ＩＬ−１β含有培地（「ＩＬ−１７Ａ／ＩＬ−１β」、）および一種サイトカイン「ＩＬ−１７Ａ」または「ＩＬ−１β」のみを含む培地と混合した（後者は「ＩＬ−１７Ａ」および「ＩＬ−１β」対照ウエルである）。陰性対照として、ＰＢＳを培地のみと混合した（「培地」）。３７℃／５％ＣＯ２で１６〜２４時間のインキュベーション後、製造者の説明書に従いＩＬ−６ＥＬＩＳＡキットを使用し（ＩＬ−６ＥＬＩＳＡキット、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、上清中のＩＬ−６濃度を測定した。ＩＣ５０値の計算用に阻害率を決定し、ＩＣ５０値はソフトウエアＰｒｉｓｍ５を使用して計算した。
【０１６４】
ＩＬ−１７Ａ阻害の百分率は以下の式で決定した：
阻害率（％）＝１００−{（（Ａ４５０-６５０ｎｍ（サンプル）−Ａ４５０-６５０ｎｍ（ＩＬ−１β））／（Ａ４５０-６５０ｎｍ（ＩＬ−１７Ａ／ＩＬ−１β）−Ａ４５０-６５０ｎｍ（ＩＬ−１β）））×１００}
【０１６５】
結果
図１０は、ＮＨＤＦ細胞の上清におけるＩＬ−６濃度の測定に関して得たＥＬＩＳＡ値（吸光度）を示す。図１０中に示すように、二重特異性構築物ＬＣ１１Ｌ５−Ｂ０６およびＬＣ１１Ｌ９−Ｃ０９は用量依存的にＩＬ−１７Ａ媒介性ＩＬ−６生成を阻害することができ、それらがグリコシル化ＩＬ−１７Ａを特異的に阻害することができたことを実証した。予想通り、ＩＬ−１β誘導型ＩＬ−６放出を阻害することはできなかった。ＩＬ−１７Ａ阻害に関して得たＩＣ５０値（表１０）は、本発明の二重特異性化合物が高い効能でＩＬ−１７Ａを阻害することができることを示す。
【０１６６】
【表１０】
0006009678.tif 000011
【実施例１１】
【０１６７】
ＬＣ１１Ｌ５−Ｂ０６およびＬＣ１１Ｌ９−Ｃ０９はｉｎ  ｖｉｖｏでは安定状態でありカニクイザルでは長い半減期を示す
【０１６８】
本発明の融合タンパク質ＬＣ１１Ｌ５−Ｂ０６およびＬＣ１１Ｌ９−Ｃ０９の薬物動態性を、一回静脈内注射後の異なる時間地点での、カニクイザルにおけるそれらの濃度の測定により決定した。既知の濃度のＬＣ１１Ｌ５−Ｂ０６およびＬＣ１１Ｌ９−Ｃ０９を用いた希釈系を使用し、血清中濃度は「サンドイッチＥＬＩＳＡ」を使用して決定し、完全な機能性およびインタクトな二重特異性分子ＬＣ１１Ｌ５−Ｂ０６およびＬＣ１１Ｌ９−Ｃ０９の測定のみを確実にした。ＬＣ１１Ｌ５−Ｂ０６およびＬＣ１１Ｌ９−Ｃ０９がインタクトな状態であること、および本発明のＦｙｎＳＨ３由来ポリペプチドがｉｎ  ｖｉｖｏで（カニクイザルにおいて）抗体から切断されないことをさらに実証するため、融合タンパク質の抗体成分のみを検出する別のアッセイを開発した（「直接ＥＬＩＳＡ」）。この２つのＥＬＩＳＡ検出法は図１１中に例示する。
【０１６９】
方法
二重特異性抗ＩＬ−１７Ａ／ＴＮＦα構築物、ＬＣ１１Ｌ５−Ｂ０６（それぞれ配列番号１２と１６の配列からなる重鎖と軽鎖を有する（本発明による）二重特異性構築物）、およびＬＣ１１Ｌ９−Ｃ０９（それぞれ配列番号１２と１７の配列からなる重鎖と軽鎖を有する（本発明による）二重特異性構築物）を、実施例４中に記載したように発現させ精製した。ＬＣ１１Ｌ５−Ｂ０６およびＬＣ１１Ｌ９−Ｃ０９を、３ｍｇ／ｋｇの用量で３匹のオスのカニクイザルに静脈内注射した。投与終了後示した時間地点で末梢静脈から血液を採取した（サンプル当たり０．６ｍｌの回収容積）。ＥＤＴＡ溶液（７．５％）を抗凝血薬として使用した。血液回収後、サンプルは１２００ｇで１０分間４℃において遠心分離し、血漿はＥＬＩＳＡにより分析するまで−８０℃で保存した。
【０１７０】
「サンドイッチＥＬＩＳＡ」。ニュートラビジンコーティングウエル（Ｂｉｏｍａｔ  ＭＣＰ４４−１１）を、３００ｒｐｍに設定した軽い回転軌道振とう下で、室温（ＲＴ）において６０分間１５０μｌ／ウエルのブロッキングバッファー（１×ＰＢＳ−５％ＢＳＡ）でブロッキングした。ウエルは２００μｌ／ウエルの洗浄バッファー（１×ＰＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄し、次いで軽い振とう下で室温において６０分間、アッセイバッファー（１×ＰＢＳ−１％ＢＳＡ）に希釈した０．２μｇ／ｍｌのビオチン化ＴＮＦα（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、製造者の説明書に従いＡＮＰ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのビオチン標識キットを使用してビオチン化）を含有する１００μｌ／ウエル溶液とインキュベートした。２００μｌ／ウエルの洗浄バッファーで３回洗浄した後、アッセイバッファーに１：４希釈したサンプルをウエルに分配し（１００μｌ／ウエル）、軽い振とう下で１時間インキュベートした。アッセイバッファーに希釈した６４ｎｇ／ｍｌのジゴキシゲニル化ＩＬ−１７Ａ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、供給者の勧めるプロトコールに従いＳｏｌｕｌｉｎｋから購入したジゴキシゲニン標識キットを使用してジゴキシゲニンで標識）を含有する１００μｌ／ウエルの溶液を加える前に、プレートは洗浄バッファーで３回洗浄した（２００μｌ／ウエル）。軽い振とう下において、室温で１時間のさらなるインキュベーションを次いで実施した。洗浄バッファーでの３回の洗浄後（２００μｌ／ウエル）、アッセイバッファーに１：１００００希釈した１００μｌ／ウエルの抗ジゴキシゲニンＨＲＰコンジュゲート抗体（Ｒｏｃｈｅ）とプレートをインキュベートした。３００ｒｐｍで６０分間室温においてインキュベーションを実施した。プレートは洗浄バッファーで３回洗浄し（２００μｌ／ウエル）、１００μｌ／ウエルのＴＭＢ（Ｓｉｇｍａ）をすぐに加え、暗所内で室温において５〜１０分間インキュベートした。停止溶液のアリコート（１００μｌ／ウエル）をそれぞれのウエルに最後に加え、酵素反応を停止させた。Ｖｉｃｔｏｒ２Ｖ（Ｗａｌｌａｃ  Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）マイクロタイタープレートリーダーを使用し、４５０ｎｍで光学濃度を測定した。
【０１７１】
「直接ＥＬＩＳＡ」。ニュートラビジンコーティング９６ウエル（Ｂｉｏｍａｔ  ＭＣＰ４４−１１）を、３００ｒｐｍに設定した軽い回転軌道振とう下で、室温において６０分間１５０μｌ／ウエルのブロッキングバッファー（１×ＰＢＳ−５％ＢＳＡ）でブロッキングした。ウエルは２００μｌ／ウエルの洗浄バッファー（１×ＰＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄し、次いで軽い振とう下で室温において６０分間、アッセイバッファー（１×ＰＢＳ−１％ＢＳＡ）に希釈した０．２μｇ／ｍｌのビオチン化ＴＮＦαを含有する１００μｌ／ウエル溶液とインキュベートした。２００μｌ／ウエルの洗浄バッファーで３回洗浄した後、アッセイバッファーに１：４希釈したサンプルをウエルに分配し（１００μｌ／ウエル）、軽い振とう下で１時間インキュベートした。アッセイバッファーに希釈した４４ｎｇ／ｍＬのＨＲＰコンジュゲート抗ヒトＩｇＧサル吸着抗体（ＡＢＣａｍ）を含有する１００μｌ／ウエルの溶液を加える前に、プレートは洗浄バッファーで３回洗浄した（２００μｌ／ウエル）。軽い振とう下において、室温で１時間のさらなるインキュベーションを次いで実施した。プレートは洗浄バッファーで３回洗浄し（２００μｌ／ウエル）、１００μｌ／ウエルのＴＭＢ（Ｓｉｇｍａ）をすぐに加え、暗所内で室温において５〜１０分間インキュベートした。停止溶液のアリコート（１００μｌ／ウエル）をそれぞれのウエルに最後に加え、酵素反応を停止させた。Ｖｉｃｔｏｒ２Ｖ（Ｗａｌｌａｃ  Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）マイクロタイタープレートリーダーを使用し、４５０ｎｍで光学濃度を測定した。
【０１７２】
ＬＣ１１Ｌ５−Ｂ０６およびＬＣ１１Ｌ９−Ｃ０９に関する薬物動態分析は、Ｗａｔｓｏｎパッケージ（ｖ．７．４、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用しＥＬＩＳＡ法により測定した血漿中濃度で実施した。
【０１７３】
結果
ＬＣ１１Ｌ５−Ｂ０６およびＬＣ１１Ｌ９−Ｃ０９の血漿中濃度は図１２中に示す。両化合物は、標準モノクローナル抗体治療剤に関して典型的に報告された、血液からの低いクリアランスおよび数日間の消失半減期をカニクイザルにおいて示した。重要なことに、２つの異なるＥＬＩＳＡ法を使用して得た血漿中濃度は非常に類似しており、ＬＣ１１Ｌ５−Ｂ０６およびＬＣ１１Ｌ９−Ｃ０９がｉｎ  ｖｉｖｏでは少なくとも２２０時間安定状態であること、およびＦｙｎＳＨ３由来ポリペプチドがカニクイザルでは抗体から切断されないことが証明される（図１３）。
【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【配列表】
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