(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
マベガイのADPリボシルトランスフェラーゼ様26kDaタンパク質と選択的に結合するモノクローナル抗体であって、受託番号NITE P-1262で規定されるハイブリドーマ、受託番号NITE P-1263で規定されるハイブリドーマ、又は、受託番号NITE P-1264で規定されるハイブリドーマによって産生される、上記モノクローナル抗体。
【請求項２】
良質の真珠を産するマベガイを選抜する方法であって、
マベガイ試料におけるADPリボシルトランスフェラーゼ様26kDaタンパク質−1とADPリボシルトランスフェラーゼ様26kDaタンパク質−２を、
以下より選択される２以上のモノクローナル抗体を用いて定量することを含む、上記方法：
受託番号NITE P-1262で規定されるハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体；
受託番号NITE P-1263で規定されるハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体；及び
受託番号NITE P-1264で規定されるハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体。
【請求項３】
マベガイ試料が、マベガイ幼生またはマベガイの外套膜、マベガイの外套膜分泌液、もしくはそれらの抽出物を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ADPリボシルトランスフェラーゼ様26kDaタンパク質−1およびADPリボシルトランスフェラーゼ様26kDaタンパク質−2の量の差が２倍以下である場合に、良質の真珠を産するマベガイであると判定することを含む、請求項２又は３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マベガイのART26Pと選択的に結合するモノクローナル抗体およびそれを用いた良質の真珠を産するマベガイの選抜方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
マベガイ（Pinctada penguin）やアコヤガイ（Pinctada fucata）などのいわゆる真珠貝は、真珠生産を目的として養殖が盛んに行われている。
【０００３】
真珠貝が産する真珠の品質（例えば、光沢など）は、個体によって異なることが知られており、良質の真珠を産する個体を選別・生産することが重要視されている。
【０００４】
従来的に、良質の真珠を産する個体を得ることを目的として、良質の真珠を産する親貝をかけ合わせる手法が用いられている。しかしながら、得られた稚貝が真珠を産するようになるまでおよそ６年もの長い年月が必要であること、そしてそのようにして得られた貝が必ずしも良質の真珠を産するとは限らないことから、生産者にとって当該手法は負担が大きく、より効率的な手法の開発が求められている。
【０００５】
真珠は、真珠貝の貝殻内に入り込んだ異物を、貝が貝殻と同じバイオミネラルで被覆することにより形成される。バイオミネラルはタンパク質や多糖などの有機マトリックスとリン酸カルシウムや炭酸カルシウムなどの無機物からなる有機−無機ナノ構造体であり、品質に関わる微細な構造・特性は、主にタンパク質によって制御されると考えられている。
【０００６】
アコヤガイの外套膜に由来するcDNAの網羅的解析により、真珠の特性決定に関わる遺伝子の解析・同定が試みられており、真珠の色調制御に関係する遺伝子が同定されている（特許文献１，２）。
【０００７】
また、本発明者らはこれまでに、マベガイ真珠を構成するバイオミネラルであるアラゴナイトの結晶配向が、真珠の品質（特に、光沢）に深く関与していること、当該結晶配向性にマベガイの外套膜分泌液に由来するADPリボシルトランスフェラーゼ様26kDaタンパク質（以下、「ART26P」と記載）が関与していることを報告した（特許文献３；小川智久ら、「2種のADPリボシルトランスフェラーゼ様タンパク質によるマベガイ真珠アラゴナイト形成制御の分子機構」第33回日本分子生物学会年会・第83回日本生化学会大会 合同大会（BMB2010）2010年12月7日〜10日）。マベガイの外套膜分泌液には、ART26P-1およびART26P-2の２種のART26Pが存在し、ART26P-1は、アラゴナイト結晶の結晶形態を制御し、ART26P-2は、アラゴナイト結晶の結晶核形成（結晶数）を制御すると考えられている。外套膜分泌液中、ART26P-1およびART26P-2の含有比は、結晶配向性と相関がみられ、これら２種のART26Pがアラゴナイトの結晶配向性に深く関与していると考えられている。
しかしながら、当該分野においては、依然として、良質の真珠を産する個体を選別・獲得するための新たな手法の開発が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開2007-236356号公報
【特許文献２】特開2009-254234号公報
【特許文献３】特開2006-314258号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、マベガイのART26Pを選択的に検出可能な手段を提供することを目的とする。
本発明はまた、良質の真珠を産するマベガイの選抜方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本願発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、マベガイのART26P-1およびART26P-2の一部を抗原エピトープとして利用して、ART26P-1および／またはART26P-2に選択的に結合可能なモノクローナル抗体を製造できること、これらモノクローナル抗体を用いて、マベガイにおけるART26P-1およびART26P-2を検出・定量することによって、良質の真珠を産するマベガイを同定できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］  マベガイのADPリボシルトランスフェラーゼ様26kDaタンパク質と選択的に結合するモノクローナル抗体。
［２］  ADPリボシルトランスフェラーゼ様26kDaタンパク質−1および／またはADPリボシルトランスフェラーゼ様26kDaタンパク質−2と選択的に結合する、［１］のモノクローナル抗体。
［３］  受託番号NITE P-1262で規定されるハイブリドーマによって産生される、［１］のモノクローナル抗体。
［４］  受託番号NITE P-1263で規定されるハイブリドーマによって産生される、［１］のモノクローナル抗体。
［５］  受託番号NITE P-1264で規定されるハイブリドーマによって産生される、［１］のモノクローナル抗体。
［６］  良質の真珠を産するマベガイを選抜する方法であって、マベガイ試料におけるADPリボシルトランスフェラーゼ様26kDaタンパク質を、マベガイのADPリボシルトランスフェラーゼ様26kDaタンパク質と選択的に結合するモノクローナル抗体を用いて定量することを含む、上記方法。
［７］  マベガイ試料が、マベガイ幼生またはマベガイの外套膜、マベガイの外套膜分泌液、もしくはそれらの抽出物を含む、［６］の方法。
［８］  マベガイ試料におけるADPリボシルトランスフェラーゼ様26kDaタンパク質−1とADPリボシルトランスフェラーゼ様26kDaタンパク質−２を、ADPリボシルトランスフェラーゼ様26kDaタンパク質−1と選択的に結合するモノクローナル抗体、ADPリボシルトランスフェラーゼ様26kDaタンパク質−2と選択的に結合するモノクローナル抗体ならびにADPリボシルトランスフェラーゼ様26kDaタンパク質−1およびADPリボシルトランスフェラーゼ様26kDaタンパク質−2と選択的に結合するモノクローナル抗体からなる群から選択される２以上のモノクローナル抗体を用いて定量することを含む、［６］または［７］の方法。
［９］  ADPリボシルトランスフェラーゼ様26kDaタンパク質−1と選択的に結合するモノクローナル抗体が、受託番号NITE P-1262で規定されるハイブリドーマによって産生される、［８］の方法。
［１０］  ADPリボシルトランスフェラーゼ様26kDaタンパク質−2と選択的に結合するモノクローナル抗体が、受託番号NITE P-1263で規定されるハイブリドーマによって産生される、［８］の方法。
［１１］  ADPリボシルトランスフェラーゼ様26kDaタンパク質−1およびADPリボシルトランスフェラーゼ様26kDaタンパク質−2と選択的に結合するモノクローナル抗体が、受託番号NITE P-1264で規定されるハイブリドーマによって産生される、［８］の方法。
［１２］  ADPリボシルトランスフェラーゼ様26kDaタンパク質−1およびADPリボシルトランスフェラーゼ様26kDaタンパク質−2の量が同程度である場合に、良質の真珠を産するマベガイであると判定することを含む、［８］〜［１１］のいずれかの方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、マベガイのART26Pを選択的に検出可能な手段を提供することができる。
また、本発明によれば、良質の真珠を産するマベガイの選抜方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、ART26P-1(HSC2)、およびART26P-2(HSC3)のアミノ酸配列の比較を示す。四角で囲まれた部位は、両者で異なるアミノ酸残基を示す。太字・下線で示す箇所はADPリボシルトランスフェラーゼ活性部位を示す。
【図２】図２は、２段階陽イオン交換クロマトグラフィーによる精製により得られた、良質および不良質真珠を産するマベガイ外套膜分泌液のART26P-1（HSC2）とART26P-2（HSC3）のクロマトグラムによる比較結果を示す。
【図３】図３は、抗原ペプチド選択的クローンの培養上清のART26P-1およびART26P-2に対する反応性と選択性についての解析結果を示す。（a）クローン番号；（b）各クローンの培養上清のART26P-1に対する反応性；（c）各クローンの培養上清のART26P-2に対する反応性；（d）1-9列はART26P-2に対する選択性；10列はART26P-1に対する選択性。
【図４】図４は、各クローン産生モノクローナル抗体の抗原ペプチドに対する反応性の解析結果を示す。（HSC2）各クローンの培養上清のART26P-1に対する反応性；（HSC3）各クローンの培養上清のART26P-2に対する反応性；（pre LD） 単クローン化前の培養上清。
【図５】図５は、各クローン産生モノクローナル抗体の抗原ペプチドに対する選択性の解析結果を示す。（A）（HSC2/HSC3）各クローンの培養上清のART26P-1に対する選択性；（HSC3）各クローンの培養上清のART26P-2に対する反応性；（B）（HSC3/HSC2）各クローンの培養上清のART26P-2に対する選択性；（HSC2）各クローンの培養上清のART26P-1に対する反応性；（pre LD） 単クローン化前の培養上清。
【図６】図６は、各クローン産生モノクローナル抗体のマベガイの外套膜分泌液より精製したART26P-1（HSC2）およびART26P-2（HSC3）に対する反応性および選択性の解析結果を示す。
【図７】図７は、各クローン産生モノクローナル抗体のマベガイの外套膜分泌液より精製したART26P-1（HSC2）およびART26P-2（HSC3）に対する反応性および選択性の解析結果を示す。(B)は、(A)のC7-4〜C58-2 部分を拡大して表示したもの。選択性（ratio）について、C7-4〜C58-2はART26P-1(HSC2)に対する選択性（HSC2/HSC3）を、C72-4〜C165-2はART26P-2(HSC3)に対する選択性（HSC3/HSC2）をそれぞれ示す。
【図８】図８は、マベガイの外套膜分泌液より得られた26kDaタンパク質画分におけるリン酸化タンパク質の検出結果を示す。(A) Pro-Q（登録商標）ダイアモンド染色による検出結果；(B) リン酸親和性Phos-tag電気泳動法による検出結果。
【図９】図９は、C154-6モノクローナル抗体を用いた免疫組織染色法による、マベガイ浮遊幼生(A)およびD 型幼生(B)のART26P-1およびART26P-2の発現解析結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、マベガイのADPリボシルトランスフェラーゼ様26kDaタンパク質（以下、「ART26P」と記載）と選択的に結合するモノクローナル抗体に関する。「選択的に結合する」とは、標的タンパク質以外のタンパク質と比較して、標的タンパク質に対して高い反応性または結合能を有することを意味する。
【００１５】
本発明において、「モノクローナル抗体」にはその機能的断片も含まれる。「機能的断片」とは、抗体の一部分（部分断片）であって、抗体の抗原への作用を保持するものを意味し、具体的にはF（ab'）2、Fab'、Fab、Fv、ジスルフィド結合Fv、一本鎖Fv（scFv）、およびこれらの重合体等をいう（D.J.King., Applications and Engineering of Monoclonal Antibodies., 1998 T.J.International Ltd）。
【００１６】
ART26Pとは、マベガイの外套膜に発現する、26kDaのタンパク質であり（特開2006-314258号公報）、真珠層中のアラゴナイト結晶の配向性を制御することができる（小川智久ら、「2種のADPリボシルトランスフェラーゼ様タンパク質によるマベガイ真珠アラゴナイト形成制御の分子機構」第33回日本分子生物学会年会・第83回日本生化学会大会 合同大会（BMB2010）2010年12月7日〜10日）。
【００１７】
ART26Pには、ART26P-1とART26P-2の2種が含まれ、両者は22位（Thr/Ile）、55位（Ser/Pro）、96位（Ile/Val）および175位（Thr/Lys）の４アミノ酸残基が異なるだけで、非常に高い配列同一性を有する（図１）。ART26P-1は、アラゴナイト結晶の結晶形態を制御し、ART26P-2は、アラゴナイト結晶の結晶核形成（結晶数）を制御する。ART26P-1とART26P-2の両者により、アラゴナイト結晶の配向性が制御される（小川智久ら、上掲）。なお、本明細書中、「ART26P-1」を「HSC2」と、「ART26P-2」を「HSC3」とそれぞれ記載する場合があるが、これらの用語はそれぞれ相互に互換的に利用することが可能である。
【００１８】
ART26P-1は、以下のアミノ酸配列を含み、好ましくは当該アミノ酸配列からなる。
0005917203.tif 000002
【００１９】
本発明において、「ART26P-1」には、配列番号１で示されるアミノ酸配列において1または数個のアミノ酸の欠失、置換、付加または挿入を有するアミノ酸配列を含み、好ましくは当該アミノ酸配列からなり（ただし、配列番号１における22位、55位、96位および175位のアミノ酸残基は変異しない）、かつアラゴナイト結晶の結晶形態を制御する活性を有するタンパク質も含まれる。ここで「1または数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、10個以内、さらに好ましくは5個以内、特に好ましくは4個以内、あるいは1個または2個である。「アラゴナイト結晶の結晶形態を制御する活性」は、従来公知の手法によって測定することが可能であり、例えば、人工海水（0.5M NaCl, 11mM KCl）に、0.4M NaHCO3、1M CaCl2およびART26P-2と共に、ART26P-1をART26P-2と等量添加して、形成される炭酸カルシウム結晶の結晶形態を分析することによって行うことができる。通常、ART26P-1とART26P-2が等量存在する場合には、形成される炭酸カルシウム結晶は真珠と同じアラゴナイト結晶となる（小川智久ら、上掲）。
【００２０】
また、本発明において、「ART26P-1」には、配列番号１で示されるアミノ酸配列とBLAST(Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information；米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール）等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータ）を用いて計算したときに、90％、95％、99％、またはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくは当該アミノ酸配列からなり（ただし、配列番号１における22位、55位、96位および175位のアミノ酸残基は変異しない）、かつアラゴナイト結晶の結晶形態を制御する活性を有するタンパク質も含まれる。
【００２１】
ART26P-2は、以下のアミノ酸配列を含み、好ましくは当該アミノ酸配列からなる。
0005917203.tif 000003
【００２２】
本発明において、「ART26P-2」には、配列番号２で示されるアミノ酸配列において1または数個のアミノ酸の欠失、置換、付加または挿入を有するアミノ酸配列を含み、好ましくは当該アミノ酸配列からなり（ただし、配列番号２における22位、55位、96位および175位のアミノ酸残基は変異しない）、かつアラゴナイト結晶の結晶数を制御する活性を有するタンパク質も含まれる。ここで「1または数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、10個以内、さらに好ましくは5個以内、特に好ましくは4個以内、あるいは1個または2個である。「アラゴナイト結晶の結晶数を制御する活性」は、従来公知の手法によって測定することが可能であり、例えば、人工海水（0.5M NaCl, 11mM KCl）に、0.4M NaHCO3および1M CaCl2と共に、ART26P-2を添加して、ART26P-2の存在下における、炭酸カルシウム結晶の結晶数を測定することによって行うことができる。通常、ART26P-2濃度が高いほど、炭酸カルシウム結晶の結晶数は増大する（小川智久ら、上掲）。
【００２３】
また、本発明において、「ART26P-2」には、配列番号２で示されるアミノ酸配列とBLASTを用いて計算したときに、90％、95％、99％、またはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくは当該アミノ酸配列からなり（ただし、配列番号２における22位、55位、96位および175位のアミノ酸残基は変異しない）、かつアラゴナイト結晶の結晶数を制御する活性を有するタンパク質も含まれる。ここで、「同一性」とは、上記のとおりである。
【００２４】
本発明のモノクローナル抗体は、ART26P-1および／またはART26P-2と選択的に結合する。
本発明のモノクローナル抗体は、公知慣用の手法によって製造することが可能であり、下記の作業工程を包含する。
【００２５】
すなわち、(1)免疫原として使用する、抗原エピトープの作製、(2)抗原を動物に注射することにより免疫した後、血液を採取しその抗体価を検定し、抗体価が十分高くなった動物より、抗体産生細胞を調製する工程、(3)抗体産生細胞と骨髄腫細胞（以下、「ミエローマ」と記載）とを細胞融合させハイブリドーマを調製し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマを選別する工程、ならびに(4)ハイブリドーマの培養によりモノクローナル抗体を調製する工程、等である。
【００２６】
以下、本発明のモノクローナル抗体の作製法を上記工程に沿って詳述するが、当該抗体の作製法はこれに制限されない。
【００２７】
(1)抗原の調製
抗原エピトープは、上記アミノ酸配列から予測される二次構造、構造既知のタンパク質とのマルチプルアラインメントから予測した二次構造、溶媒との接触率、Flexibility（柔軟性）、surfaceprobability（表面への露出のしやすさ）、Antigenecity（抗原性）Hydrophilicity（親水性）およびDipole（極性）などを考慮して、さらに他のタンパク質との配列同一性がないかまたは低い領域から選択され得る。このような抗原エピトープとしては、配列番号１または２における、22位、55位、96位または175位のアミノ酸残基を含む、6個、7個、8個、9個、10個またはそれ以上の連続したアミノ酸からなる領域が挙げられるが、これに限定はされない。例えば、配列番号１における50〜59位のアミノ酸残基からなるポリペプチド、配列番号２における50〜59位のアミノ酸残基からなるポリペプチドなどを、好適に用いることができる（これに限定はされない）。
【００２８】
抗原エピトープとなるポリペプチドは、固相ペプチド合成法や液相ペプチド合成法など公知の手法を用いて合成することができる。合成されたポリペプチドは、精製後、必要に応じて、キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）やアルブミンなどのキャリアタンパク質と結合させても良い。
【００２９】
(2)抗体産生細胞の調製
上記(1)で得られた抗原と、フロインドの完全もしくは不完全アジュバント、またはカリミョウバンのような助剤とを混合し、免疫原として宿主動物に接種する。宿主動物としては、例えば、マウス、ウサギ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタなど（これらに限定はされない）を好適に用いることができる。免疫原は、皮下注射、腹腔内注射、静脈内注射、皮内注射、筋肉内注射、足蹠注射などによって、宿主動物に投与することができる。
【００３０】
免疫は、一回、または、適当な間隔で（好ましくは3日間から1週間間隔で）複数回繰返し行なうことができる。その後、免疫した動物の血清中の、抗原に対する抗体価を測定し、抗体価が十分高くなった動物を選抜する。
【００３１】
抗体価の測定には、放射性同位元素免疫定量法、固相酵素免疫定量法（以下「ELISA法」という）、蛍光抗体法、受身血球凝集反応法など、抗体価の測定に一般的に用いられる種々の方法を利用することができる。ELISA法は、検出感度、迅速性、正確性、および操作の自動化の可能性などの観点から、特に好適である。
【００３２】
抗体産生細胞としては、抗体価が十分高くなった動物の脾、リンパ節、骨髄、扁桃、末梢血、またはこれらを適宜組み合わせたものなどに由来する、形質細胞、およびその前駆細胞であるリンパ球を使用することができる。
【００３３】
(3)ハイブリドーマの作製
ハイブリドーマの作製に利用し得るミエローマ細胞としては、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ヒトなどの哺乳動物に由来する自己抗体産生能のない細胞が挙げられる。例えば、8-アザグアニン耐性マウス由来の公知の株化細胞、例えばP3X63Ag8U.1(P3U1)、P3/NSI/1-Ag4-1(NS-1)、Sp2/O-Ag14(SP-2)、P3X63Ag8.653(653)、P3X63Ag8(X63)など（これらに限定されない）を好適に使用することができる。
【００３４】
ミエローマ細胞と抗体産生細胞との融合は、ポリエチレングリコール（PEG）のような適当な融合試薬を用いて行うことができる（Kohler. G. and Milstein, C.、Methods Enzymol.（1981）73, 3-46）。さらに融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を添加してもよい。また、エレクトロポレーション法により融合することもできる。抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞数比は任意に設定することができる。例えば、ミエローマ細胞に対して抗体産生細胞を１〜10倍とすることができる。
【００３５】
融合処理した細胞は、用いたミエローマ細胞に応じた選択用培地（例えば、ミエローマ細胞が、8-アザグアニン耐性株である場合、HAT含有培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含む培地）中で培養することによって、ハイブリドーマのみを効率的に選択することができる。
【００３６】
得られたハイブリドーマの培養上清の一部を採取し、上記(2)と同様の方法で抗体価を測定することにより、目的の抗体を産生するハイブリドーマを選抜することができる。
【００３７】
このようにして作製される目的のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保存することが可能である。
【００３８】
(4)ハイブリドーマ培養によるモノクローナル抗体の調製
モノクローナル抗体は、一般的な手法によって回収することができる。すなわち、上記(3)で樹立したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法として、通常の細胞培養法または腹水形成法などを利用することができる。細胞培養法においては、ハイブリドーマを正常培地中、通常の培養条件で培養し、その培養上清から抗体を取得する。腹水形成法の場合は、ミエローマ細胞由来の哺乳動物と同種系動物の腹腔内にハイブリドーマを投与し、ハイブリドーマを大量に増殖させる。その後、抗体を含む腹水または血清を採取する。
【００３９】
上記抗体の採取方法において、抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜選択して、またはこれらを組み合わせることにより、精製されたモノクローナル抗体を得ることができる。
【００４０】
本発明のモノクローナル抗体として、例えば2012年2月29日付で、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２丁目５番地８）に寄託したハイブリドーマ（C58-2、C165-2、C154-6）が産生するモノクローナル抗体3種類が挙げられる。以下に3種類のハイブリドーマの識別のための表示及び受託番号を示す。
C58-2 NITE P-1262
C165-2 NITE P-1263
C154-6 NITE P-1264
【００４１】
また、本発明のモノクローナル抗体は、遺伝子組換え技術を用いて製造することも可能である。すなわち、上記(3)で樹立したハイブリドーマから、抗体遺伝子を取得し、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入して産生させることができる。
【００４２】
より詳細には、本発明の抗体を産生するハイブリドーマから、抗体の可変領域（Ｖ領域）をコードするmRNAを公知の方法で単離し、得られたmRNAから逆転写酵素を用いて抗体Ｖ領域のcDNAを公知の方法で合成する。得られた抗体のＶ領域をコードするDNAを、抗体定常領域（Ｃ領域）をコードするDNAを含有する発現ベクターへ組み込む。この際、抗体遺伝子をプロモーター等の制御下で発現可能に発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより、宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させる。抗体遺伝子の発現は、抗体重鎖（Ｈ鎖）または軽鎖（Ｌ鎖）をコードするDNAを別々に発現ベクターに組み込んで宿主細胞を同時形質転換させてもよいし、あるいはＨ鎖およびＬ鎖をコードするDNAを単一の発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換させてもよい。
【００４３】
宿主細胞としては、大腸菌や酵母などの微生物、CHO、COS、HEK293、NIH3T3などの動物細胞、Sf9、Sf21などの昆虫細胞、植物細胞など（これらに限定されない）、遺伝子組換え技術において一般的に用いられるものが挙げられる。
【００４４】
本発明のモノクローナル抗体は、必要に応じて標識されていても良い。標識には、例えば蛍光団、酵素、放射性同位元素などが利用できる。
【００４５】
蛍光団としては、例えば、フレオロレセインとその誘導体、ローダミンとその誘導体、ダンシルクロリドとその誘導体、ウンベリフェロンなどが挙げられる。酵素としては、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコースオキシダーゼ、乳酸脱水素酵素、アミラーゼなどが挙げられる。放射性同位元素としては、例えば、ヨウ素（131I、125I、123I、121I）、リン（32P）、イオウ（35S）、金属類（例えば68Ga、67Ga、68Ge、54Mn、99Mo、99Tc、133Xeなど）、トリチウムなどが挙げられる。
【００４６】
その他、標識には例えば、NADH-、FMNH2-、アクリジニウムエステル、ルミノールなどの発光物質、ルシフェラーゼ、ルシフェリンなどの生物発光物質、磁性体、導電性物質などが含まれる。また、アビジン−ビオチン系またはストレプトアビジン−ビオチン系を利用することも可能であり、この場合、本発明のモノクローナル抗体に例えばビオチンを結合することもできる。
【００４７】
本発明のモノクローナル抗体は、良質の真珠を産生するマベガイの選抜方法にて利用することができる。
良質真珠を産するマベガイと不良質真珠を産するマベガイとでは、外套膜分泌液中に含まれるART26P-1およびART26P-2の比率が明確に異なっており（図２）（小川智久ら、上掲）、当該比率を指標にて、マベガイが良質真珠を産するものであるか否か判断することができる。
【００４８】
すなわち、上記ART26P-1と選択的に結合するモノクローナル抗体およびART26P-2と選択的に結合するモノクローナル抗体を用いて、マベガイ試料中に含まれるART26P-1およびART26P-2を検出・定量することによって、良質真珠を産するマベガイを選択的に選抜することが可能である。
【００４９】
マベガイ試料としては、ART26P-1およびART26P-2を含むものであれば特に限定されず、マベガイ、マベガイ幼生またはそれらの器官、組織、体液、分泌物もしくは抽出物などを含むものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５０】
ART26P-1およびART26P-2の検出・定量は、タンパク質の検出・定量に用いられる一般的な免疫学的手法により行うことができる。例えば、マベガイ試料を、上記ART26P-1および／またはART26P-2と選択的に結合するモノクローナル抗体を使用するELISA法、ウェスタンブロット法など（これらに限定はされない）に付すことにより実施できる。
【００５１】
例えばELISA法によれば、以下に記載するような手順により行うことができる。まず、上記試料を、ELISA用プレート等の固相表面に吸着させ、抗原と無関係なタンパク質でブロッキングした後、ART26P-1および／またはART26P-2と選択的に結合するモノクローナル抗体を接触させ、試料中のART26P-1および／またはART26P-2に結合させる。洗浄後（必要に応じてさらに二次抗体を反応させた後）、ART26P-1および／またはART26P-2に結合している抗体をそれぞれ検出・定量する。あるいは、当該方法に代えて、ART26P-1および／またはART26P-2と選択的に結合するモノクローナル抗体を固相表面に吸着させ、試料を接触させた後、抗体に結合しているART26P-1および／またはART26P-2を別の抗体で検出・定量する方法（サンドイッチ法）なども使用できる。
【００５２】
図２より明らかなとおり、良質真珠を産するマベガイにおけるART26P-1およびART26P-2の比率は同程度であるのに対して、不良質真珠を産するマベガイのART26P-1およびART26P-2の比率はいずれかの比率（例えば、ART26P-2）が顕著に大きい（例えば、他方の3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、またはそれ以上の量を含む）。したがって、外套膜分泌液中に含まれるART26P-1およびART26P-2を上記方法によって検出・定量を行い、両者が同程度に含まれるマベガイを同定することによって、良質真珠を産するマベガイを効率的に選抜することができる。ここで「同程度」とは、およそ2倍以下、1.5倍以下、またはおよそ1倍以内の差異を意味する。
【００５３】
外套膜分泌液より抽出されたタンパク質は、タンパク質の検出・定量のための免疫学的手法に付す前に、必要に応じて、脱リン酸化処理を施しても良い。脱リン酸化処理により、タンパク質（好ましくは、ART26P-1）上のリン酸化部位（例えば、55位のSer残基）が脱リン酸化され、抗体の当該タンパク質に対する反応性または結合能が向上し得る。
【００５４】
本発明のモノクローナル抗体を用いたマベガイの選抜方法は、様々な成長段階にあるマベガイに対して適用可能であり、幼生段階（例えば、桑実型浮遊細胞段階およびD型幼生段階）にあるマベガイに対しても適用可能である。
【００５５】
幼生段階にあるマベガイについては、例えば、本発明のモノクローナル抗体を利用するフローサイトメトリー解析により、将来的に良質真珠を産生し得るものを選抜できる。例えば、幼生段階にあるマベガイを蛍光標識したART26P-1および／またはART26P-2と選択的に結合するモノクローナル抗体と接触させた後、フローサイトメーターを用いて個々の幼生に結合する抗体が発する蛍光を検出・定量することによってART26P-1およびART26P-2の量を測定し、両者が同程度に含まれる幼生のみを選択的に分取することができる。
【００５６】
本発明のART26Pと選択的に結合するモノクローナル抗体は、マベガイの外套膜分泌液中に含まれるART26P-1およびART26P-2と選択的に結合することができる。本発明のモノクローナル抗体は、マベガイの外套膜中に含まれるART26P-1およびART26P-2の検出・定量を可能とし、良質真珠を産生し得るマベガイを簡便かつ効率的に選抜することができる。本発明は、真珠生産の分野において、大いに貢献することが期待される。
【実施例】
【００５７】
本発明を以下の実施例によってさらに具体的に説明する。しかし、本発明は、この実施例によって制限されないものとする。
【００５８】
実施例１：ART26P-1またはART26P-2に選択的に結合可能なモノクローナル抗体の作製
（１）モノクローナル抗体作製用抗原ペプチドのデザインと合成
ART26P-1とART26P-2について、両者を識別可能なモノクローナル抗体を作製するため、両者で異なるアミノ酸残基をターゲットとした抗原ペプチドを検索し（図１）、50位から59位に相当する領域を抗原ペプチドとして選択した。
ART26P-1(HSC2) 50-59：
SKLKSSDDLA（配列番号３）；
ART26P-2(HSC3) 50-59：
SKLKSPDDLA（配列番号４）
（下線はそれぞれで異なるアミノ酸残基を示す）
キャリアとの結合用に末端にシステインを付加した以下のペプチド：
HSC2 50-59C：
SKLKSSDDLAC（配列番号５）；
HSC3 50-59C：
SKLKSPDDLAC（配列番号６）
をFmoc法の固相合成法により合成し、精製・単離して、抗原ペプチドとして以下の実験に用いた。
【００５９】
（２）抗原ペプチドを用いたマウスへの免疫およびハイブリドーマ作製
上記（１）にて合成した抗原ペプチドにC末端のシステイン残基を介してキャリアタンパク質（KLH:キーホールリンペットヘモシアニン）を結合した後、1mg/mlの抗原をアジュバント（complete adjubant (FREUND)）と等量混合し、100μlをマウス（各４匹）に接種して免疫した。経時的に抗体価の測定を行い、そ径リンパ節等の摘出時期を判断した。
【００６０】
続いて、免疫したマウスから肥大したそ径リンパ節を摘出し、細胞を回収した。ミエローマ細胞(P3U1)と混和し、遠心後ペレットに融合剤としてポリエチレングリコール（PEG）を加え、細胞融合を行った。RPMI培地（シグマ社）で洗浄後、FBS-HAT培地（シグマ社）に懸濁し、96穴プレートに播種した。ハイブリドーマのコロニー形成確認後、96穴プレートから培養上清をサンプリングし、以下の一次スクリーニングに用いた。
【００６１】
（３）ハイブリドーマの一次スクリーニング
各ハイブリドーマ培養上清の抗原ペプチドに対する反応性および選択性を指標に一次スクリーニングを行った。
【００６２】
一次スクリーニングはELISA法により実施した。各抗原ペプチド（HSC2 50-59CまたはHSC3 50-59C）を希釈後、感作用プレートに50μL/well（1μgペプチド/ml）ずつ分注し、4℃で一昼夜静置した。抗原溶液を除去し、Blocking Buffer (MBL社)を静置した。続いて、上記（２）にてサンプリングした各ハイブリドーマの培養上清を50μL/wellずつ加え、室温にて、60分間反応させた。PBSで3回洗浄後、ヤギ抗マウスIgG-POD標識(10,000倍希釈)を50μL/wellずつ加え、室温で60分間反応させた。続いて、PBSで3回洗浄後、発色、反応停止し、測定波長450nmで吸光度を測定した。
【００６３】
吸光度0.2を判定基準とし、HSC2 50-59C抗原ペプチドを吸着させたプレートにおける吸光度が0.2以上であり、かつ、HSC3 50-59C抗原ペプチドを吸着させたプレートにおける吸光度が0.2以下である場合には、HSC2 50-59C抗原ペプチド選択的クローンであると判定し、逆に、HSC2 50-59C抗原ペプチドを吸着させたプレートにおける吸光度が0.2以下であり、かつ、HSC3 50-59C抗原ペプチドを吸着させたプレートにおける吸光度が0.2以上である場合には、HSC3 50-59C抗原ペプチド選択的クローンであると判定した。
【００６４】
結果として、HSC2 50-59C抗原ペプチド選択的クローンが８サンプル、HSC3 50-59C抗原ペプチドに対する選択的クローンが68サンプル得られた。
【００６５】
次に、マベガイの外套膜分泌液より2段階の陽イオンクロマトグラフィーにより精製したART26P-1およびART26P-2に対する、一次スクリーニングによって得られたハイブリドーマの培養上清の反応性および選択性を調べた。マベガイ外套膜分泌液（脱塩、凍結乾燥物）をPOROS HSカラム（10mmD x 50mm）pH6.5 で５ピーク画分（HSA HSB HSC HSD HSE）に分取し、このうちピークHSC画分をさらにPOROS Sカラム（10mmD x 50mm）pH7.0で精製し、HSC1〜HSC5の５ピーク画分を得た（図２参照）。ART26P-1およびART26P-2は、それぞれHSC2およびHSC3ピークから得られた。マベガイ外套膜分泌液より精製したART26P-1およびART26P-2をもちいて、ELISA法により検討した。精製したART26P-1およびART26P-2を抗原として用いた以外は、上記一次スクリーニングと同様の手法を用いて行った。
【００６６】
結果として、上記HSC2 50-59C抗原ペプチド選択的クローンのうちの3種を選択し（C7, C44およびC58と命名）、HSC3 50-59C抗原ペプチド選択的クローンのうちの4種を選択し（C72, C126, C154およびC165と命名）（図３）、以下の単クローン化に用いた。
【００６７】
（４）ART26P-1およびART26P-2選択的モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの単クローン化と評価
上記（３）で得られたHSC2 50-59C抗原ペプチド選択的クローンC7, C44およびC58に由来する6種の単クローン化ハイブリドーマを得（C7-4, 5, 7, 8; C44-5;およびC58-2と命名）、HSC3 50-59C抗原ペプチド選択的クローンC72, C126, C154およびC165に由来する12種の単クローン化ハイブリドーマを得（C72-4, 5, 8; C126-2, 3, 6, 7; C154-2, 4, 6, 8;およびC165-2と命名）、それぞれのクローン産生モノクローナル抗体のHSC2 50-59C抗原ペプチドおよびHSC3 50-59C抗原ペプチドに対する反応性と選択性を、上記と同様にELISA法により調べた。
【００６８】
その結果、HSC2 50-59C抗原ペプチドに対してはC7-8およびC58-2の培養上清が高い反応性と選択性を示し、HSC3 50-59C抗原ペプチドに対してはC154-2, C154-4およびC154-6の培養上清が高い選択性を示した（図４，５）。
【００６９】
続いて、マベガイの外套膜分泌液より精製したART26P-1およびART26P-2に対する各クローン産生モノクローナル抗体の反応性および選択性を、上記と同様にELISA法により調べた。
【００７０】
その結果、ART26P-1に対して、C58-2の培養上清が選択性で最も高い値を示し、ART26P-2に対して、C165-2の培養上清が最も高い選択性を示した(図６，７)。この結果より、ART26P-1選択的クローンとしてC58-2を、ART26P-2選択的クローンとしてC165-2を得た。またさらに、ART26P-1とART26P-2の両者を認識することが可能なクローンとしてC154-6を選択した。
【００７１】
（５）モノクローナル抗体の精製
上記（４）で得られた各モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの上清10mlから、プロテインGをリガンドとしたアフィニティークロマトグラフィー（カラム: HiTrap protein G 1 ml）により、各モノクローナル抗体を精製した。アフィニティークロマトグラフィーに際しては、各モノクローナル抗体を20 mM リン酸緩衝液(pH 7.2)を用いてカラムに吸着させ、20 mMリン酸緩衝液(pH 7.2)でさらに洗浄後、グリシン緩衝液(pH2.7)により溶出した。溶出後、1M TrisHCl(pH7.5)により溶出液を中性にしたのち、限外濾過濃縮操作によりリン酸緩衝液（PBS）に置換した。得られたモノクローナル抗体のハイブリドーマ上清10ml当り収量は、それぞれ
C58-2モノクローナル抗体(ART26P-1と選択的に結合する), 1.77 mg
C165-2モノクローナル抗体(ART26P-2と選択的に結合する)， 1.86 mg
C154-6モノクローナル抗体(ART26P-1および2と選択的に結合する) 1.96 mg
であった。
【００７２】
実施例２：ART26Pのリン酸化状態の検討
マベガイの外套膜分泌液より精製した26kDaタンパク質をSDSポリアクリルアミドゲルにて電気泳動後、Pro-Q（登録商標）ダイアモンド染色（Life Technologies Corporation）を製造元のプロトコルに従って使用し、リン酸化タンパク質の検出を行った。
結果、26kDaタンパク質が染色されることから（図８（Ａ））、当該タンパク質がリン酸化されていることが判明した。
【００７３】
続いて、マベガイの外套膜分泌液より精製したART26P-1およびART26P-2をリン酸親和性Phos-tag電気泳動法（生化学、第82巻、第9号，pp.857-862, 2010）によって分析したところ、ART26P-1およびART26P-2について共にリン酸化に伴うゲルシフトが観察された（図８（Ｂ））。
【００７４】
上記実施例１で得られたC58-2モノクローナル抗体は、HSC2 50-59C抗原ペプチドに対しては高い反応性を示すものの、マベガイの外套膜分泌液より精製したART26P-1に対する反応性はそれほど高くない（図３，４）。一方、C165-2モノクローナル抗体は、抗原ペプチドであるHSC3 50-59C抗原ペプチドに対しても、マベガイの外套膜分泌液より精製したART26P-2に対しても高い反応性を示した。この違いは、抗原ペプチドに対応する領域のリン酸化状態の違いにあり、ART26P-1の55位のSer残基はリン酸化修飾を受けていることが示す。
【００７５】
したがって、ART26P-1およびART26P-2（特に、ART26P-1）の検出・定量に際しては、これらタンパク質を予め脱リン酸化処理（例えば、フォスファターゼなど酵素処理やフッ化水素酸処理）に付すことによって、モノクローナル抗体の反応性を高め、検出・定量の効率を高めることができる。
【００７６】
実施例３：マベガイ幼生選別法:フローサイトメーターによる定量法
上記実施例１で得られたC154-6モノクローナル抗体を用いて、マベガイの浮遊幼生およびD型幼生の免疫組織染色を行った。C154-6モノクローナル抗体を１次抗体、Alexa488コンジュゲート抗マウスIgGヤギ抗体を２次抗体として用いて免疫組織染色を行い、蛍光顕微鏡にて検出した。
結果、ART26P-1またはART26P-2が、桑実型浮遊細胞およびD型幼生の外套膜部分に発現していることがわかった（図９）。
【００７７】
したがって、上記実施例１で得られたモノクローナル抗体を用いて、幼生個体におけるART26P-1および／またはART26P-2の検出・定量が可能であり、フローサイトメーターを用いた、ART26P-1およびART26P-2発現個体の選別が可能であることを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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