(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）：
【化１】
0005849616.tif 000004
で示されるレスベラトロール誘導体およびその薬学的に許容可能な塩からなる群より選ばれる１種以上の化合物を含有することを特徴とする脂肪細胞肥大化抑制剤。
【請求項２】
下記式（１）：
【化２】
0005849616.tif 000005
で示されるレスベラトロール誘導体およびその薬学的に許容可能な塩からなる群より選ばれる１種以上の化合物を含有することを特徴とする抗肥満剤。
【請求項３】
下記式（１）：
【化３】
0005849616.tif 000006
で示されるレスベラトロール誘導体およびその薬学的に許容可能な塩からなる群より選ばれる１種以上の化合物を含有することを特徴とするメタボリックシンドローム予防剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レスベラトロール誘導体を含有する脂肪細胞肥大化抑制剤に関するものである。また、本発明は、抗肥満剤およびメタボリックシンドローム予防剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
食生活の欧米化が進んだ現代社会において、肥満が大きな社会問題となっている。高脂肪、高カロリーな食事による過剰なエネルギー摂取とストレスや運動不足によって引き起こされる肥満は肥満症と呼ばれる疾患であると認識されている。
【０００３】
肥満症は、多くの疾患のリスクを増大させる。例えば、インスリン抵抗性に起因する２型糖尿病や高血圧、動脈硬化や心筋梗塞などの循環器系疾患のリスクを増大させることが知られている。先進国において肥満は医療費の増大を招くことから、その改善に向けた様々な研究がなされている。食事制限や運動は最も効果的な治療方法ではあるが、患者への精神的負担や生活時間の拘束から実現することが難しい人も多く、問題解決には至っていない。
【０００４】
肥満に大きく関わっているのが脂肪細胞である。脂肪細胞は脂肪酸を中性脂肪として細胞内に蓄積する。脂肪細胞は適度な量の中性脂肪が蓄積された状態では、善玉アディポカインであるアディポネクチンやレプチンの分泌やグルコース吸収を亢進し、体の恒常性を維持する重要な働きをする。一方、過剰な中性脂肪が蓄積した状態では、脂肪細胞が肥大化することが知られている。肥大化した脂肪細胞では炎症性サイトカインであるＴＮＦ−αや悪玉アディポカインであるレジスチンの分泌が亢進し、善玉アディポカインの分泌やグルコース吸収が抑制される。この肥大化した脂肪細胞が増えることにより、体内の恒常性が破綻して脂質異常症や糖尿病、動脈硬化など生活習慣病と呼ばれる疾患の原因となる。
【０００５】
肥大化した脂肪細胞は分裂することがこれまでの研究から明らかになっている（非特許文献１）。肥大化脂肪細胞の分裂は肥満を進行させ、体内の恒常性の破綻を亢進する大きな要因となる。また、脂肪細胞の肥大化に関わる遺伝子としてＭＥＳＴ（Ｍｅｓｏｄｅｒｍ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）がある。この遺伝は一般的に脂肪細胞に蓄積する脂肪滴の大きさと遺伝子発現量に正の相関があることが知られており、脂肪滴サイズマーカー遺伝子とされている。また、遺伝性肥満マウスの脂肪細胞においてＭＥＳＴ遺伝子の発現が観察され、さらに脂肪細胞で過剰発現させたトランスジェニックマウスでは、野生型と比較して有意な脂肪細胞の肥大化が観察された（非特許文献２）。現在のところその機構は不明であるが、ＭＥＳＴが脂肪細胞の肥大化に関与していることが示唆されている。
【０００６】
抗肥満作用を目的として脂肪細胞にアプローチすることの有用性はこれまでに多くの研究から明らかになっており、その先行技術も数多く報告されている。例えば、ポリペプチドを有効成分とする脂肪細胞化抑制剤（特許文献１）、新規サイトカインを有効成分とする抗肥満剤（特許文献２）、カロテノイドを有効成分とする脂肪細胞分化抑制剤（特許文献３）、キク科植物に含まれるＢｉｓａｂｏｌｏｌ  ｏｘｉｄｅ−Ａ−β―ｇｌｕｃｏｓｉｄｅを有効成分とする脂肪蓄積阻害剤（特許文献４）、コーヒー生豆の超臨界抽出物を有効成分とするメタボリックシンドローム予防剤（特許文献５）など数多く報告されている。
【０００７】
このように脂肪細胞へのアプローチによる抗肥満効果の有用性から、このような活性を有する化合物や素材が多数提案されているが、更なる新規素材の開発が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開平０６−２７７０６５号公報
【特許文献２】特許第２７５２８１９号公報
【特許文献３】特開２００３−０９５９３０号公報
【特許文献４】特開２００６−２１３６４８号公報
【特許文献５】特開２０１１−０５７５６１号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｏｒｙ，３０，ｐ６３−７６（１９９７）
【非特許文献２】肥満研究 ｖｏｌ．１２  Ｎｏ．１  （２００６）ｐ８０−８１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明者らは、抗肥満剤に関する前記の状況を鑑みて、新規な抗肥満剤の探索をした。その結果、新たに作製したレスベラトロール誘導体類が優れた脂肪細胞肥大化抑制作用を有する化合物であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
したがって、本発明は、レスベラトロールに比べて優れた脂肪細胞肥大化抑制剤を提供することを目的とする。
また、本発明は、レスベラトロールに比べて優れた抗肥満剤を提供すること、さらには、レスベラトロールに比べて優れたメタボリックシンドローム予防剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の要旨は、
〔１〕下記式（１）：
【００１３】
【化１】
0005849616.tif 000002
【００１４】
で示されるレスベラトロール誘導体およびその薬学的に許容可能な塩からなる群より選ばれる１種以上の化合物を含有することを特徴とする脂肪細胞肥大化抑制剤、
〔２〕前記式（１）記載のレスベラトロール誘導体およびその薬学的に許容可能な塩からなる群より選ばれる１種以上の化合物を含有することを特徴とする抗肥満剤、
〔３〕前記式（１）記載のレスベラトロール誘導体およびその薬学的に許容可能な塩からなる群より選ばれる１種以上の化合物を含有することを特徴とするメタボリックシンドローム予防剤
に関する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の脂肪細胞肥大化抑制剤は、レスベラトロールと比較し、優れた脂肪細胞肥大化抑制作用を有していることから、新規の脂肪細胞肥大化抑制剤として有用である。
また、本発明の脂肪細胞肥大化抑制剤は、脂肪細胞の肥大化を抑制することで、肥満の発生を防止できることから、抗肥満剤としても使用でき、さらに、内蔵脂肪が原因となって生じるメタボリックシンドロームを予防できることからメタボリックシンドローム予防剤として使用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は実施例１で行ったＵＨＡ４００３のＨＰＬＣのクロマトグラムを示す。Ｒ４は本発明品であるＵＨＡ４００３に該当する。
【図２】図２は実施例２で行ったリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析の結果を示す。左から、（１）ＤＭＳＯ、（２）レスベラトロール（Ｒｅｓｖｒａｔｒｏｌ）、（３）ＵＨＡ４００３で処理した脂肪細胞中のＭＥＳＴ遺伝子の発現量を定量した結果を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明において、「脂肪細胞肥大化抑制剤」とは、脂肪滴の過剰な蓄積を抑制し、脂肪細胞の肥大化を抑制することができる薬剤をいう。
脂肪細胞肥大化抑制作用は、具体的には、後述の実施例に記載の方法により測定し、レスベラトロールの作用と対比することで確認することができる。
また、本発明の「抗肥満剤」は、脂肪細胞の肥大化を抑制することで、肥満の進行を抑えて、肥満の発生を抑制することが可能な薬剤をいう。
また、本発明の「メタボリックシンドローム予防剤」は、脂肪細胞の肥大化を抑制することで、内蔵型肥満が原因で発生するメタボリックシンドロームの発生を予防することが可能な薬剤をいう。
本発明では、脂肪細胞肥大化抑制剤、抗肥満剤およびメタボリックシンドローム予防剤の構成は同じであるため、これらをまとめて、本発明の脂肪細胞肥大化抑制剤等と略する。
【００１８】
本発明の脂肪細胞肥大化抑制剤等は、下記式（１）：
【００１９】
【化２】
0005849616.tif 000003
で示されるレスベラトロール誘導体およびその薬学的に許容可能な塩からなる群より選ばれる１種以上の化合物を含有することを特徴とする。
【００２０】
前記レスベラトロール誘導体において、炭素−炭素２重結合は、トランスまたはシスであってよく、シス体とトランス体との混合物を含む。
【００２１】
前記レスベラトロール誘導体の薬学的に許容可能な塩としては、例えば、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩； マグネシウム塩、カルシウム塩、バリウム塩等のアルカリ土類金属塩； アルミニウム塩；アルミニウムヒドロキシド塩等の金属ヒドロキシド塩； アルキルアミン塩、ジアルキルアミン塩、トリアルキルアミン塩、アルキレンジアミン塩、シクロアルキルアミン塩、アリールアミン塩、アラルキルアミン塩、複素環式アミン塩等のアミン塩； α−アミノ酸塩、ω−アミノ酸塩等のアミノ酸塩；ペプチド塩またはそれらから誘導される第１級、第２級、第３級若しくは第４級アミン塩等が挙げられる。これらの薬理的に許容し得る塩は、単独でまたは２種以上を混合して用いることができる。
【００２３】
本発明で使用する前記式（１）で示されるレスベラトロール誘導体は、レスベラトロールを原料として、金属塩の存在下で加熱処理して得ることができる。
以下に、前記式（１）で示されるレスベラトロール誘導体の製造方法について具体的に説明する。
【００２４】
前記製造方法では、前駆体としてレスベラトロールを用いる。レスベラトロールにはトランス体とシス体の構造異性体が存在するが、加熱や紫外線によってトランス体とシス体の変換が一部生じる。したがって、レスベラトロールとしては、トランス体でもシス体でも、あるいはトランス体とシス体の混合物であってもよい。レスベラトロールは、ブドウ果皮から抽出・精製した天然由来のものであっても、化学合成された純度の高い化成品であっても良い。天然由来のレスベラトロールを用いる場合は、完全に精製されたものである必要はなく、後述のように所望の生成反応が進み最終的に本発明で用いる前記レスベラトロール誘導体が得られるから、レスベラトロール以外の成分を含む混合物も使用できる。また、レスベラトロールには、塩、エーテル、エステル等の誘導体もあるが、前記製造方法では、これらの誘導体も原料として使用することができる。
ただし、前記レスベラトロール誘導体の回収率の観点からは、レスベラトロール換算で１重量％以上含有された混合物が原料として望ましい。
前記レスベラトロールとしては、ブドウ果皮、ピーナッツ等の原料からの抽出物、凍結乾燥品等を使用してもよい。
【００２５】
本発明では、レスベラトロールを適切な溶媒に溶解させる。この際、溶媒が水のみであれば、レスベラトロールの溶解度が著しく低いために、水と有機溶媒の混合液や、有機溶媒のみに溶解させればよい。水と有機溶媒の配合比や、有機溶媒の種類については特に制限はなく、レスベラトロールが十分に溶解すれば良い。中でも、メタノールやエタノールのみの溶媒や、水とメタノール、水とエタノール等の混合液を使用することが、安全性やコスト面から好ましい。新規レスベラトロール誘導体を含む反応後組成物に対して最終的な精製を十分に適用せずにその組成物を食品に使用する場合には、安全性や法規面から溶媒としてエタノールや含水エタノールを使用することが望ましい。
得られるレスベラトロールを含有する溶液中のレスベラトロールの濃度について特に制限はないが、それぞれの濃度が高いほど、溶媒使用量が少ない等のメリットもあるため、レスベラトロールの濃度は各々の溶媒に対しレスベラトロールがそれぞれ飽和する濃度近くが好ましい。
また、レスベラトロールは前記溶液中において生成反応前に完全に溶解していなくともよい。
【００２６】
次に、前記レスベラトロールを含有する溶液（以下、レスベラトロール含有溶液）のｐＨを８未満に調整することが好ましい。調整方法として、例えば、レスベラトロール含有溶液を調製した後にｐＨ調整剤を添加してｐＨを調整しても良いし、前記溶液の調製時に前もって溶媒のｐＨを調整しておいても良い。レスベラトロール含有溶液の反応開始時のｐＨは８．０以上であれば、他の反応や目的化合物の分解も一方で生じるために、生成される前記レスベラトロール誘導体の回収量が低下する。したがって、反応開始時のｐＨは３以上８未満が望ましい。
【００２７】
本発明では、前記レスベラトロール含有溶液中に金属塩を添加する。前記金属塩としては、酸性塩、塩基性塩、正塩のいずれでもよく、また、単塩、複塩、錯塩のいずれでもよい。さらに、金属塩は１種類であっても、複数種類の混合物であってもよい。金属塩の例としては、食品添加物として認可されているものが安全性の面で好ましい。例えば、食品に添加することが認められているマグネシウム塩、カルシウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、亜鉛塩、銅塩等が挙げられる。
また、前記金属塩の混合物としては、例えば、ミネラルプレミックス（田辺製薬株式会社、グルコン酸亜鉛、クエン酸鉄アンモニウム、乳酸カルシウム、グルコン酸銅、リン酸マグネシウムを主成分としたミネラル混合物）のように金属塩を数種類含む物質が挙げられる。また、複数の金属塩を含む混合物として、ミネラルウォーターも挙げることができる。
なお、前記金属塩の含有量としては、前記レスベラトロール誘導体を生成可能な量であればよく、特に限定はない。
【００２８】
次に、金属塩存在下で、レスベラトロール含有溶液を加熱処理する。この加熱処理により、新規レスベラトロール誘導体の生成反応を行う。生成反応を効率的に進ませるために、レスベラトロール含有溶液の加熱温度は１１０℃以上に調整することが好ましい。また、使用する溶媒の沸点から考え、加圧加温が望ましい。例えば、開放容器にレスベラトロール含有溶液を入れ、溶媒の沸点を超える高温で前記容器を加温する、密閉容器にレスベラトロール含有溶液を入れて前記容器を加温する、レトルト装置やオートクレーブを用いて加圧加温する等、少なくとも部分的に溶液温度が１１０℃以上に達するように加熱することが好ましい。回収効率面から、溶液温度が均一に１１０℃〜１５０℃になることが、さらに好ましい。加熱時間も加熱温度と同様に限られたものではなく、効率的に目的の反応が進行する時間条件とすればよい。特に、加熱時間は加熱温度との兼ね合いによるものであり、加熱温度に応じた加熱時間にすることが望ましい。例えば、１３０℃付近で加熱する場合は、５分〜１２０分の加熱時間が望ましい。また、加熱は、一度でも良いし、複数回に分けて繰り返し加熱しても良い。複数回に分けて加熱する場合、蒸発した溶媒を補うために溶媒を新たに追加して行うことが好ましい。
【００２９】
前記加熱処理によるレスベラトロール誘導体の生成反応の終了は、例えば、ＨＰＬＣによる成分分析によりレスベラトロール誘導体の生成量を確認して判断すればよい。
【００３０】
得られる反応液中には、本発明で用いるレスベラトロール誘導体が含有されている。
また、安全な原料のみを用いた工程でレスベラトロール誘導体を製造した場合には、前記レスベラトロール誘導体を含む混合物の状態で食品、医薬品または医薬部外品に使用することが可能である。例えば、天然由来のレスベラトロールを含水エタノール溶媒に溶解し、ミネラルウォーターやミネラルプレミックスを添加して加熱処理した場合には、得られる反応液を食品原料の一つとして使用することが可能である。
【００３１】
また、風味面での改良やさらなる高機能化を望む場合は、前記反応液を濃縮してレスベラトロール誘導体の濃度を高める、あるいは前記反応液を精製しレスベラトロール誘導体の純品を得ることができる。濃縮、精製は、公知の方法で実施可能である。例えば、クロロホルム、酢酸エチル、エタノール、メタノール等を用いた溶媒抽出法や炭酸ガスによる超臨界抽出法等で抽出してレスベラトロール誘導体を濃縮できる。また、カラムクロマトグラフィーを利用して濃縮や精製を施すことも可能である。再結晶法や限外ろ過膜等の膜処理法も適用可能である。
【００３２】
また、前記反応液から式（１）で表されるレスベラトロール誘導体を分離して回収する場合には、カラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ等を用いてもよい。
【００３３】
前記濃縮物や精製物を、必要に応じて、減圧乾燥や凍結乾燥して溶媒除去することで、粉末状のレスベラトロール誘導体を得ることができる。
【００３４】
また、得られたレスベラトロール誘導体は、必要に応じて、当該分野で公知の方法により、レスベラトロール誘導体の塩としたり、レスベラトロール誘導体のヒドロキシ基をエーテル化またはエステル化してもよい。
【００３５】
前記のレスベラトロール誘導体はいずれも、レスベラトロールにはない優れた脂肪細胞肥大化抑制作用を有する。
したがって、本発明は、前記レスベラトロール誘導体を有効成分として含有する脂肪細胞肥大化抑制剤、抗肥満剤、メタボリックシンドローム予防剤を提供することができる。
【００３６】
次に本発明を実施例に基いて詳細に説明するが、本発明はかかる実施例にのみ限定されるものではない。
【実施例】
【００３７】
（実施例１：ＵＨＡ４００３の生成および単離・精製）
トランス−レスベラトロール（東京化成）７００ｍｇをエタノール１４ｍｌに溶解し、２．５％ＮａＨＣＯ3水溶液を１４ｍｌ加えて、レスベラトロール含有溶液（ｐＨ９．９）を得た。このレスベラトロール含有溶液をオートクレーブ（三洋電機（株）、「ＳＡＮＹＯ  ＬＡＢＯ  ＡＵＴＯＣＬＡＶＥ」、以下同じ）にて１３０℃、２０分間加熱した。次いで、１回目のオートクレーブ処理にて得られた反応溶液に、エタノール１４ｍｌと５．０％ＮａＨＣＯ3水溶液を１４ｍｌ加え、再度、オートクレーブにて１３０℃、２０分間加熱した。得られた反応溶液のうち１ｍＬをメタノールにて５０ｍｌにメスアップし、このうちの１０μｌをＨＰＬＣにより分析した。その結果を図１に示す。
【００３８】
ＨＰＬＣ分析は以下条件にて行った。
カラム：逆相用カラム「Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ（登録商標）Ｃ−３０−ＵＧ−５」（４．６ｍｍｉ．ｄ．×２５０ｍｍ）
移動相：Ａ・・・Ｈ2Ｏ（０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）），  Ｂ・・・アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
注入：１０μｌ
検出：２５４ｎｍ
勾配（容量％）：８０％Ａ／２０％Ｂから２０％Ａ／８０％Ｂまで３０分間、２０％Ａ／８０％Ｂから１００％Ｂまで５分間、１００％Ｂで１０分間（全て直線）
【００３９】
図１に示すように、反応後溶液のクロマトグラムでは、複数のピークが確認され、原料であるレスベラトロールのピークとは相違しているＲ１〜Ｒ４のピークのうち、Ｒ４のピークに含まれる化合物をＵＨＡ４００３と命名した。
【００４０】
Ｒ４のピークに含まれるＵＨＡ４００３を分取ＨＰＬＣにより精製し、常法により乾燥したところ、褐色粉末状の物質であった。
【００４１】
なお、ＵＨＡ４００３の分子量を高分解能ＦＡＢ−ＭＳ（Ｆａｓｔ Ａｔｏｍ Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ−Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）にてそれぞれ測定したところ、４３９．４７６５であり、理論値との比較から、以下の分子式を得た。
理論値Ｃ２８Ｈ２３Ｏ５（Ｍ＋Ｈ）+ ：４３９．４７９２
分子式Ｃ28Ｈ22Ｏ5
【００４２】
次に、前記ＵＨＡ４００３を核磁気共鳴（ＮＭＲ）測定に供し、１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲおよび各種２次元ＮＭＲデータの解析から、前記ＵＨＡ４００３が前記式（１）で表される構造を有することを確認した。
【００４３】
（実施例２  ＭＥＳＴ遺伝子発現量の定量）
ＭＥＳＴ遺伝子の発現量を評価するために、３Ｔ３―Ｌ１細胞（マウス由来脂肪前駆細胞）を用いて評価を行った。
【００４４】
試料にはレスベラトロール、本発明品であるＵＨＡ４００３の２種類を用いた。各試料をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、和光純薬工業（株）社製）に２ｍＭの濃度で溶解させて試験に使用した。
【００４５】
培養は、１０％ウシ胎児血清（Ｆｏｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ：ＦＢＳ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社製）、１％アンチバイオティック−アンチマイコティック（Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ、ギブコ（ＧＩＢＣＯ）社製）を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ社製）を用いていった。試験に使用する脂肪細胞は定法に従って調整した。つまり、細胞培養用６ｗｅｌｌディッシュ（日本ＢＤ社製）に３Ｔ３Ｌ１細胞を５×１０4ｃｅｌｌｓ／ｍＬで２ｍＬ播種して３７℃、５％ＣＯ2条件下で４８時間培養し、１００％コンフルエントしたものを毎日培地交換しながらさらに４８時間培養した。その後、培地をＡｄｉｐｏＩｎｄｕｃｅｒ  Ｒｅａｇｅｎｔ（タカラバイオ社製）付属のインスリン、デキサメタゾン、イソブチルメチルキサンチンをそれぞれ１％、０．５％、０．１％添加した分化用ＤＭＥＭ２ｍＬに交換し、３７℃、５％ＣＯ2条件下で４８時間分化・培養したものを使用した。
【００４６】
試験は以下のように行った。分化させた脂肪細胞の培地を、インスリン１％を含むＤＭＥＭ（維持培地）に交換し、これに各試料を１０μＬ（終濃度１０μＭ）添加し、２日おきに培地交換（化合物含有維持培地）しながら７日間培養した。なお、溶媒であるＤＭＳＯのみを０．５％添加したものをコントロールとした。
【００４７】
培養終了後、細胞よりＲＮＡ抽出キット「ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）ＲＮＡ  II」（タカラバイオ（株）社製）を用いて全量ＲＮＡを抽出・精製した。得られたＲＮＡを２ステップリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ用逆転写試薬「ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＲＴ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ」（タカラバイオ（株）社製）の取扱説明書に準じて逆転写反応を行った。つまり５×Ｐｒｉｍｅｓｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  ４μＬ、全量ＲＮＡ  １μｇを混合し、ＲＮａｓｅ  Ｆｒｅｅ  ｄＨ2Ｏで２０μＬに調製した。ＰＣＲ用サーマルサイクラー「ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００」（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ（株）社製）を使用して｛３７℃  １５分  →  ８５℃  ５秒｝×１サイクルのプログラムにて逆転写反応を行った。逆転写反応液をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ用希釈試薬「ＥＡＳＹ  Ｄｉｌｕｔｉｏｎ」（タカラバイオ（株）社製）にて１０倍希釈した希釈液をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析に使用した。
【００４８】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析は定法に従って行った。解析には「ＥＣＯ  Ｒｅａｌｔｉｍｅ  ＲＴ―ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ」（イルミナ（株）製）を使用した。プライマーには、ＭＥＳＴフォワードプライマー；（プライマーＩＤ：ＭＡ０７９８７４―Ｆ）、ＭＥＳＴリバースプライマー；（プライマーＩＤ：ＭＡ０７９８７４―Ｒ）を使用した。細胞内遺伝子の内部標準はβ−アクチンとし、そのプライマーとして、ＡＣＴＢフォワードプライマー；（プライマーＩＤ：ＭＡ０５０３６８−Ｆ）、ＡＣＴＢリバースプライマー；（プライマーＩＤ：ＭＡ０５０３６８−Ｒ）（いずれもタカラバイオ（株）社製）を使用した。反応にはリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ試薬「ＳＹＢＲ（登録商標）Ｐｒｅｍｉｘ  ＥＸ  ｔａｑ  II」（Ｔｌｉ  ＲＮａｓｅＨ  Ｐｌｕｓ）（タカラバイオ（株）社製）を使用した。反応液は４８ウェルＰＣＲプレート（イルミナ（株）製）中に２×ＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  ＥＸ  ｔａｑ  II（Ｔｌｉ  ＲＮａｓｅＨ  Ｐｌｕｓ）５μＬ、フォワードプライマー（５０μＭ）０．０８μＬ、リバースプライマー（５０μＭ）０．０８μＬ、逆転写反応液  ２μＬ、ｄＨ2Ｏ  ２．８４μＬ（総量１０μＬ）を混合して[９５℃  ３０秒  →  ｛９５℃  １５秒  →  ６０℃  １分｝×４０サイクル  →  ９５℃  １５秒  →  ５５℃  １５秒  →  ９５℃  １５秒]のプログラムにてＰＣＲ反応を行った。
【００４９】
得られた各細胞中のβ−アクチンとレプチンのＣｔ値（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  Ｃｙｃｌｅ：一定の増幅量（閾値）に達するサイクル数）からレプチン発現量の相対値を算出した。結果を図２に示した。
【００５０】
図２の結果より、ＵＨＡ４００３においてレスベラトロールと比較し、優れたＭＥＳＴ遺伝子発現抑制作用が確認された。
このようにＵＨＡ４００３は、ＭＥＳＴ遺伝子発現抑制作用を有することから、脂肪細胞に蓄積する脂肪滴の肥大化を抑える可能性が示唆された。
【００５１】
（実施例３  脂肪細胞肥大化抑制作用の評価）
脂肪細胞の肥大化抑制作用を評価するために３Ｔ３−Ｌ１細胞を用いた評価を行った。
【００５２】
試料にはレスベラトロール、本発明品であるＵＨＡ４００３の２種類を用いた。各試料をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、和光純薬工業（株）社製）に４ｍＭの濃度で溶解させて試験に使用した。細胞培養方法および試料添加方法は実施例２に準じて行った。
培養終了後、化合物を添加した細胞を顕微鏡視野下で評価を行った。
その結果、ＵＨＡ４００３を用いた場合には、ＤＭＳＯの場合と比べて３Ｔ３−Ｌ１細胞にある脂肪滴の微細化が観察され、また、３Ｔ３−Ｌ１細胞から分化した脂肪細胞の肥大も抑制されていた。なお、ＵＨＡ４００３におけるこれらの現象は、レスベラトロールを用いた場合には見られなかった。
【００５３】
また、ＵＨＡ４００３は、前記のように脂肪細胞の肥大化を抑制できることから、この脂肪細胞の肥大化が原因として発生する肥満を抑える抗肥満剤、さらに内蔵脂肪の肥満化が原因となって生じるメタボリックシンドロームの予防に用いるメタボリックシンドローム予防剤としても有用である。
なお、実施例３に記載されるような３Ｔ３−Ｌ１細胞を用いる評価系で抗肥満剤の効果を確認することは前記特許文献２、メタボリックシンドローム予防剤の効果を確認することは前記特許文献５に記載されている。
【図１】
0005849616.tif 000007
【図２】
0005849616.tif 000008