(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
セルロース系有機物を含む処理対象物を微生物分解処理してメタンを含むバイオガスに変換する少なくともメタン生成菌を含むメタン発酵処理槽を連続式または半バッチ式で４５℃〜６５℃で運転するに際し、前記少なくともメタン生成菌を含むメタン発酵処理槽内に炭素繊維で構成された担体を収容すると共に、嫌気性セルロース分解菌を投入し、前記メタン発酵処理槽内の前記メタン生成菌及び前記嫌気性セルロース分解菌を前記担体上に維持しながら前記運転を行い、前記嫌気性セルロース分解菌が寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２２１７８で寄託されているクロストリジウム  クラリフラバム（Clostridium clariflavum）ＣＬ−１株であることを特徴とするメタン発酵処理を利用したセルロース系有機物の分解処理方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セルロース系有機物の分解処理方法に関する。さらに詳述すると、本発明は、セルロース系有機物を含む廃棄物等を微生物分解処理してメタンガスに変換するメタン発酵処理槽の運転に適用して好適な方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
セルロース系有機物を含む処理対象物を微生物分解処理する方法として、メタン発酵処理槽を利用した方法が知られている。具体的には、メタン発酵処理槽内に生息する嫌気性セルロース分解菌とメタン生成菌の作用によって、さらには他の雑多な微生物群の作用によって、セルロース系有機物をメタンガスに変換する一連の反応をメタン発酵処理槽内で生じさせることによって、セルロース系有機物を含む処理対象物がメタンガスを含むバイオガスに変換される。
【０００３】
ところで、メタン発酵処理槽は、一般的には連続式または半バッチ式で運転される。具体的には、連続的にあるいは一定間隔で処理槽内の発酵液（処理廃液）を流出させると共に、処理対象物（さらには、メタン発酵処理槽内の微生物環境を維持するための栄養源やｐＨ調整剤等）を投入するのが一般的である。しかしながら、このような運転方式でメタン発酵処理槽の運転を行うと、嫌気性セルロース分解菌の菌体密度（濃度）が低下し、セルロース分解効率が低下してしまう。そこで、特許文献１では、メタン発酵槽内の嫌気性セルロース分解菌の菌数をモニタリングしたり、その結果に基づいて別の槽で培養した嫌気性セルロース分解菌を添加したりすることによって、嫌気性セルロース分解菌を一定濃度以上に維持して、メタン発酵処理槽のセルロース分解処理能力を維持するようにしている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００５−２５４１６８号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、特許文献１で提案されている方法のように、メタン発酵槽内の嫌気性セルロース分解菌の菌数をモニタリングしたり、その結果に基づいて別の槽で培養した嫌気性セルロース分解菌を添加したりするのは、初期設備コストの増加とランニングコストの増加に繋がるだけでなく、処理システム全体の運転操作や保守管理の煩雑さも招くこととなり、望ましいこととは言えない。
【０００６】
そこで、本発明は、メタン発酵槽内の嫌気性セルロース分解菌の菌数をモニタリングしたり、その結果に基づいて別の槽で培養した嫌気性セルロース分解菌を添加したりすることなく、より簡易な手法でメタン発酵槽のセルロース分解処理能力を維持することのできる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
かかる課題を解決するため、本願発明者等が鋭意検討を行った結果、本願発明者等が単離に成功した、従来の高温性の嫌気性セルロース分解菌よりもセルロース分解処理能力が顕著に高い新規な高温性の嫌気性セルロース分解菌（クロストリジウム  クラリフラバム（Clostridium clariflavum）ＣＬ−１株）を、微生物を担持する担体として機能する炭素繊維担体と共にメタン発酵槽内に投入することで、メタン発酵槽のセルロース分解処理能力を長期間安定に維持でき、しかもセルロース分解処理とメタン生成を高効率化できることを知見するに至った。
【０００８】
本願発明者等は、上記知見に基づき、さらに種々検討を重ねて本発明を完成するに至った。
【０００９】
即ち、メタン発酵処理を利用した本発明のセルロース系有機物の分解処理方法は、セルロース系有機物を含む処理対象物を微生物分解処理してメタンを含むバイオガスに変換する少なくともメタン生成菌を含むメタン発酵処理槽を連続式または半バッチ式で４５℃〜６５℃で運転するに際し、少なくともメタン生成菌を含むメタン発酵処理槽内に炭素繊維で構成された担体を収容すると共に、嫌気性セルロース分解菌を投入し、メタン発酵処理槽内のメタン生成菌及び嫌気性セルロース分解菌を担体上に維持しながら運転を行うようにしている。嫌気性セルロース分解菌は寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２２１７８で寄託されているクロストリジウム  クラリフラバム（Clostridium clariflavum）ＣＬ−１株である。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、少なくともメタン生成菌を含むメタン発酵槽内に微生物を担持し得る担体と嫌気性セルロース分解菌とを投入するという簡易な操作のみで、メタン発酵槽のセルロース分解処理能力を長期間安定して維持することができ、しかもセルロース分解処理とメタン生成の高効率化が可能となる。したがって、従来のように、メタン発酵槽内の嫌気性セルロース分解菌の菌数をモニタリングしたり、その結果に基づいて別の槽で培養した嫌気性セルロース分解菌を添加したりする必要がなくなるので、セルロース系有機物を含む処理対象物を分解処理するための初期設備コストやランニングコストを抑えることが可能になると共に、処理システム全体の運転操作や保守管理の煩雑さの問題も解消しながら、セルロース分解処理とメタン生成を高効率で実施することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】実施例で用いた装置の構成概略図である。
【図２】ガス発生量の経時変化を示す図である。
【図３】試験終了後の発酵液のＶＦＡ濃度を示す図である。
【図４】想定されるセルロース分解処理機構を示す図である。
【図５】種々のセルロース系有機物を用いた際のＣＬ−１株の菌数の経時変化を示す図である。
【図６】種々の高温性の嫌気性セルロース分解菌を用いた際の菌数の経時変化を示す図である。
【図７】種々の高温性の嫌気性セルロース分解菌を用いた際の懸濁物質量（ＳＳ）の経時変化を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明を実施するための形態について、図面に基づいて詳細に説明する。
【００１６】
本発明のセルロース系有機物の分解処理方法は、セルロース系有機物を含む処理対象物を微生物分解処理してメタンを含むバイオガスに変換するメタン発酵処理槽を運転するに際し、メタン発酵処理槽内に微生物を担持し得る担体を収容すると共に、嫌気性セルロース分解菌を投入するようにしている。
【００１７】
本発明を適用するメタン発酵処理槽は、少なくともメタン生成菌を含むメタン発酵処理槽であれば特に限定されるものではない。
【００１８】
微生物を担持し得る担体としては、高分子ゲル、セラミック及び活性炭などの多孔性担体、織物、不織布等が挙げられるが、特に炭素繊維から構成される担体、例えば炭素繊維織物や炭素繊維不織布が好適である。この場合、特にメタン発酵処理槽のセルロース分解処理能力を維持し易いものとできる。また、担体の空隙率は２５％〜９８％とすることが好適であり、５０％〜９８％とすることがより好適であり、空隙率が９８％とすることがさらに好適である。尚、炭素製の素材は、高い空隙率の確保が容易であり、例えば炭素繊維不織布は、高い空隙率（９８％）を確保し易く、しかも安価に入手でき、本発明に用いて特に好適であると言える。
【００１９】
微生物を担持し得る担体の大きさは、メタン発酵処理槽の処理廃液の流出部から流出されることのない大きさで、且つメタン発酵処理槽内における発酵液の撹拌に影響を及ぼさない大きさであれば特に限定されるものではない。また、形状については、例えば球状や板状が挙げられるが、特に限定されるものではない。
【００２０】
尚、微生物を担持し得る担体をメタン発酵処理槽内に収容する方法は、微生物を担持し得る担体をメタン発酵処理槽内の発酵液（汚泥）と接触させることができれば、特に限定されるものではない。例えば、メタン発酵処理槽内の発酵液に浸漬させることでメタン発酵処理槽内に収容するようにしてもよいし、メタン発酵処理槽の内壁に固定して収容するようにしてもよい。
【００２１】
尚、微生物を担持し得る担体は、メタン発酵処理槽内における発酵液の撹拌に影響を及ぼさない範囲で、できるだけ多く収容することが好適であると考えられるが、少なくとも、
２５０ｍＬの発酵液に対して担体を１０ｃｍ３程度収容すれば、本発明の効果が十分に得られる。
【００２２】
メタン発酵処理槽内に投入する嫌気性セルロース分解菌としては、例えばクロストリジウム（Clostridium）属の嫌気性セルロース分解菌が挙げられるが、嫌気性環境下でセルロース分解処理能力を有する限り、特に限定されるものではなく、公知または新規の嫌気性セルロース分解菌を一種または二種以上、適宜使用することができる。但し、メタン発酵処理槽の運転温度を考慮して、メタン発酵処理槽内に投入する嫌気性セルロース分解菌を選択する必要がある。即ち、メタン発酵処理槽の運転温度が中温（例えば３７℃程度）であればこの運転温度に適した中温性の嫌気性セルロース分解菌が投入され、メタン発酵処理槽の運転温度が高温（例えば５５℃程度）であればこの運転温度に適した高温性の嫌気性セルロース分解菌が投入される。
【００２３】
ここで、メタン発酵処理槽内に投入する嫌気性セルロース分解菌は、セルロース分解処理能力と増殖能力の高いものを用いることが好適である。これにより、メタン発酵処理槽のセルロース分解処理能力をより維持し易いものとできる。例えば、本願発明者等が単離に成功したクロストリジウム  クラリフラバム（Clostridium clariflavum）ＣＬ−１株を用いることが極めて好適である。ＣＬ−１株は、セルロース分解処理能力と増殖能力が極めて高い嫌気性セルロース分解菌であり、本発明に用いて極めて好適である。尚、ＣＬ−１株は、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに２０１１年１０月４日付けで寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２２１７８として寄託されている。ＣＬ−１株は、高温性の嫌気性セルロース分解菌であり、培養至適温度が５５℃であることから、運転温度が４５℃〜６５℃のメタン発酵処理槽に投入することが好ましく、５０℃〜６０℃のメタン発酵処理槽に投入することがより好ましく、５３℃〜５７℃のメタン発酵処理槽に投入することがさらに好ましく、５５℃のメタン発酵処理槽に投入することが最も好ましい。
【００２４】
尚、ＣＬ−１株は、比増殖速度が少なくとも１．２８／日であり、最大到達菌体密度が少なくとも２．６７×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬであり、セルロース分解速度が少なくとも７．１７×１０−１０ｇ／Ｌ／ｃｅｌｌｓ／日である。したがって、以下の（ａ）〜（ｃ）に示す能力を有する嫌気性セルロース分解菌を用いることによって、ＣＬ−１株を用いた場合と同様に、さらにはそれ以上に、メタン発酵処理槽のセルロース分解処理能力を維持し易いものとできると考えられる。
（ａ）比増殖速度：１．２８／日以上
（ｂ）最大到達菌体密度：２．６７×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上
（ｃ）セルロース分解速度：７．１７×１０−１０ｇ／Ｌ／ｃｅｌｌｓ／日以上
【００２５】
嫌気性セルロース分解菌をメタン発酵処理槽内に投入する方法としては、例えば嫌気性セルロース分解菌を含む培養液をメタン発酵処理槽内に投入する方法が挙げられる。この場合、嫌気性セルロース分解菌が最大到達菌体密度に到達している培養液を用いることが好適である。これにより、メタン発酵処理槽内の発酵液（汚泥）を大きく希釈することなく、少量の培養液の添加で多くの嫌気性セルロース分解菌を投入することができる。具体的には、メタン発酵処理槽内の発酵液（汚泥）の容量に対して、１／５〜１／４０程度の容量の培養液を投入することが好適である。これにより、最大到達菌体密度よりも一桁少ない程度の嫌気性セルロース分解菌をメタン発酵処理槽内に投入することができるので、メタン発酵槽内において嫌気性セルロース分解菌をより早期に最大到達菌体密度まで増殖させて、メタン発酵処理槽のセルロース分解処理能力を維持し易いものとできる。但し、嫌気性セルロース分解菌をメタン発酵処理槽内に投入する方法は、この方法に限定されるものではなく、この方法と同様またはそれ以上の嫌気性セルロース分解菌をメタン発酵処理槽内に投入することができる他の方法を適宜採用するようにしても構わない。
【００２６】
本発明のセルロース系有機物の分解処理方法によれば、メタン発酵処理槽内に微生物を担持し得る担体を収容すると共に、嫌気性セルロース分解菌を投入するようにしているので、メタン発酵処理槽を連続式または半バッチ式で運転しても、メタン発酵処理槽内のメタン生成菌とメタン発酵処理槽内に投入された嫌気性セルロース分解菌が担体上で維持され、発酵液の流出に伴うこれら菌体の流出を防ぐことができる。そして、メタン発酵処理槽内のメタン生成菌とメタン発酵処理槽内に投入された嫌気性セルロース分解菌が担体上で維持されることによって、投入された嫌気性セルロース分解菌によるセルロース分解（セルロースの低分子化）と、セルロース分解により生成される有機酸等のメタン生成菌による除去が良好に進行し続けて、高いセルロース分解処理効率を長期に渡って安定に維持することが可能となる。そして、この効果は、従来の嫌気性セルロース分解菌と比較してセルロース分解処理能力と増殖能力が圧倒的に高いＣＬ−１株を用いることで、特に顕著に奏される。
【００２７】
上述の形態は本発明の好適な形態の一例ではあるがこれに限定されるものではなく本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々変形実施可能である。例えば、上述の実施形態では、メタン発酵処理槽内への担体の収容と嫌気性セルロース分解菌の投入を別々に行うようにしていたが、これらを同時に行うようにしてもよい。例えば、微生物を担持し得る担体に、予め嫌気性セルロース分解菌を担持させてから、メタン発酵処理槽内に投入するようにして、メタン発酵処理槽内への担体の収容と嫌気性セルロース分解菌の投入を同時に行うようにしてもよい。
【実施例】
【００２８】
以下に本発明の実施例を説明するが、本発明はこれら実施例に限られるものではない。
【００２９】
（実施例１）
メタン発酵槽内に微生物を担持し得る担体と嫌気性セルロース分解菌とを投入することによる効果について検討した。
【００３０】
１．試験方法
（１)嫌気性セルロース分解菌
本実施例では、嫌気性セルロース分解菌として、クロストリジウム  クラリフラバム  ＣＬ−１株（Clostridium clariflavum CL-1）を用いた。
【００３１】
ＣＬ−１株は、本願発明者等が通電型高温メタン発酵槽の汚泥（沼の汚泥由来）から取得した高温性の嫌気性セルロース分解菌である。尚、通電型高温メタン発酵槽とは、作用極、対極及び参照電極をメタン発酵液に浸漬し、作用極の電位を３電極方式で還元電位に制御しながら５５℃で運転しているメタン発酵槽である。
【００３２】
ＣＬ−１株は、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに２０１１年１０月４日付けで寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２２１７８として寄託されている。
【００３３】
尚、ＣＬ−１株は、以下の形態学的特徴を有していた。
＜ＣＬ−１株の形態学的特徴＞
・培養至適温度  ：５５℃
・細胞形態      ：桿菌（０．７〜０．９μｍ×３．０〜１０μｍ）
・グラム染色    ：陰性
・芽胞形成      ：あり
・コロニー色調  ：淡黄色
【００３４】
また、ＣＬ−１株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号１に示す。相同性検索の結果、ＣＬ−１株は、Clostridium clariflavum EBR45株（DSM19732株）と９９．９％の相同性を示した。このことから、ＣＬ−１株をClostridium clariflavumと同定した。尚、塩基配列解析及び相同性検索については、以下の参考文献１及び２に記載された手法に基づき、ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪのデータベースを用いてＢＬＡＳＴ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi）により実施した（参考文献１：Lane, D. J.: 16S/23S rRNA sequencing. p.115-175. In Stackebrandt, E. and Goodfellow, M. (eds.), Nucleic acid techniques in bacterial systematics. John Wiley & Sons, New York (1991).、参考文献２：Takai, K. and Horikoshi, K.: Rapid detection and quatification of members of archaeal community by quantitative PCR using fluorogenic probes. Appl. Environ. Microbiol., 66, 5066-5072 (2000).）。
【００３５】
ＣＬ−１株は、１０ｇ／Ｌの標品セルロース（微結晶品、アルファエイサー）を加えた表１に示す基質を５０ｍＬ入れた１００ｍＬ容のガラスバイアル瓶で嫌気的（気相をＮ２：ＣＯ２＝８０：２０のガスで置換）に前培養し、菌数計測結果から定常状態であることを確認したものを以降の試験に供した。 尚、表１中、ＤＭＳＺとはDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturenの略である。
【００３６】
【表１】
0006009190.tif 000002
【００３７】
（２）メタン発酵の接種源
安定したガス生成が見られる高温（５５℃）メタン発酵槽から得た汚泥（沼の底泥由来）を、メタン発酵の接種源として用いた。
【００３８】
（３）試験方法
試験に使用した装置の構成を図１に示す。図１（ａ）が担体有りの装置構成であり、（ｂ）が担体無しの装置構成である。図１に示す装置１は、大まかには、培養容器２、シリコン栓３、撹拌子４、ガスバッグ（アルミニウムガスバッグ、ＧＬサイエンス、２．０Ｌ）６により構成した。ガスバッグ６の管６ａは、容器２内のヘッドスペースに滞留するガスが管６ａを介してガスバッグ６に導かれるように、シリコン栓３に突き刺して配置した。このように構成することで、容器２のヘッドスペース内に発生・滞留するガスを漏れ出させることなくガスバッグ６に回収できるようにした。
【００３９】
容器２は、２５０ｍＬ容のガラス瓶とし、このガラス瓶内に上記（２）のメタン発酵の接種源（汚泥）を５０ｍＬ収容し、表１に示す基質２００ｍＬを添加した後、シリコン栓３で密閉し、気相を窒素ガス置換して嫌気状態とした。尚、この試験においては、表１に示す基質に、標品セルロース（微結晶品、アルファエイサー）を１０ｇ／Ｌ添加したものを用いた。標品セルロースを添加した表１に示す基質の化学的酸素要求量（ＣＯＤｃｒ）は１１．４ｇＣＯＤｃｒ／Ｌであった。
【００４０】
試験条件は、以下の４通りとした。
（ａ）条件１：ＣＬ−１株添加有り、担体有り
（ｂ）条件２：ＣＬ−１株添加有り、担体無し
（ｃ）条件３：ＣＬ−１株添加無し、担体有り
（ｄ）条件４：ＣＬ−１株添加無し、担体無し
【００４１】
ＣＬ−１株を添加した系（条件１及び２）では、試験開始時にＣＬ−１株を３．８×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように添加した。
【００４２】
担体を添加した系（条件１及び３）では、ガラス瓶内にピッチ系の炭素繊維担体（縦７０．０ｍｍ、横３０．０ｍｍ、厚さ２．４ｍｍ、空隙率９８％）８を２枚添加した。つまり、今回の試験系では、２５０ｍＬの発酵液７に対し、炭素繊維担体１０ｃｍ３を用いた。
【００４３】
発酵液７の温度と撹拌子４の回転は、加熱マグネチックスターラー（RT 15 Power、IKA（登録商標）Japan K.K.）１１を用いて５５℃、１００ｒｐｍに制御した。
【００４４】
また、試験開始後、２日に一度（水理学的滞留時間１０日）、ガラス瓶内から５０ｍＬの発酵液７を抜き出し、表１に示した同量の基質を新たに添加した。基質入れ替え時には、０．５ＮのＮａＯＨを用いてｐＨを７．５に調整した。試験は２連で実施し、経時的に試料を採取して分析に供した。尚、水理学的滞留時間が１０日であることから、事前運転をこの３倍の３０日間実施し、ガラス瓶内の発酵液が定常状態となった後に、１８日間の試験を行った。
【００４５】
（４）分析方法
発酵液中の揮発性脂肪酸（蟻酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸）（VFA）濃度は、TSKgel OApak-A/Pカラム（東ソー製）を使用して、高速液体クロマトグラフィー（GL-7400、GLサイエンス製）を用いて測定した。ＳＳとＣＯＤｃｒは、工業排水試験法（JIS K0102）に記載の手順に従って測定した。ガス発生量は、ガス袋内のガス量を水上置換法により測定した。ガス袋内のガス中のメタン、二酸化炭素、水素組成は、Active Carbonカラム（GLサイエンス製）を使用して、ガスクロマトグラフィー（GL-390B、GLサイエンス製）を用いて測定した。
【００４６】
２．試験結果
（１）ガス発生量と組成
ガス発生量の経時変化を図２に示す。いずれの条件においてもガス発生量は安定しており、メタン発酵槽が定常状態となっていることが確認された。
【００４７】
また、条件１、２、３、４における平均ガス発生量は、それぞれ３７２、５９、１９７、７２ｍＬ／Ｌ／日であった。担体添加条件におけるＣＬ−１株の添加効果（条件１及び３の比較）を見ると、ＣＬ−１株を添加した系の方が、ガス発生量が多いことが示された。一方、担体無しの条件において、条件２及び４ではガス発生量は同等で、担体添加の場合よりもガス発生量は少なかった。
【００４８】
次に、発生ガス中のガス組成を表２に示す。担体添加条件においては、発生ガス中の約６０％がメタンであり、残りの約４０％が二酸化炭素であった。担体無しの条件２及び４ではメタンの発生はほとんど無く、３３．８−３７．９％の水素発生があり、残りは二酸化炭素であった。ＣＬ−１株の添加の有無によるガス組成の違いは見られなかった。
【表２】
0006009190.tif 000003
【００４９】
（２）ＶＦＡ濃度
試験終了後の発酵液のＶＦＡ濃度を図３に示す。ＣＬ−１株の添加の有無にかかわらず、担体を添加した系ではＶＦＡ濃度が低かった（１．０−１．１ｍＭ）。一方、担体無しの条件２及び４ではＶＦＡの蓄積が見られた（１８．７−１９．０ｍＭ）。ＶＦＡの成分はいずれの場合も酢酸が主であり、その他には酪酸と蟻酸が生じていた。
【００５０】
（３）ＣＯＤｃｒ濃度とＳＳ濃度
試験終了後のＣＯＤｃｒ濃度とＳＳ濃度を表３に示す。ＣＯＤｃｒ濃度は固形性画分と可溶性画分の両方を含む有機物濃度と相関があるため、ＣＯＤｃｒの除去率は有機物除去の指標となる。つまり、ＣＯＤｃｒの除去率が高い程、固形性セルロースに由来する有機物の除去率が高いことを意味する。ＳＳ濃度は固形性セルロース濃度と相関があるため、ＳＳの除去率は固形性セルロースの可溶化の指標となる。つまり、ＳＳ除去率が高い程、固形性セルロースの分解率が高いことを意味する。担体添加条件におけるＣＯＤｃｒの除去率は、ＣＬ−１株を添加した条件１では５７．０％、ＣＬ−１株を添加していない条件３では４２．０％であり、ＣＬ−１株を添加した系の方がＣＯＤｃｒの除去率は高かった。一方、担体無しの条件において、条件２及び４ではＣＯＤｃｒの除去率はいずれも低く（９．１−１３．０％）、ＣＬ−１株の添加によるＣＯＤｃｒ除去率の違いは無かった。条件１、２、３、４におけるＳＳ除去率は、それぞれ７９．７、４２．３、８０．０、４４．０％であった。担体添加条件（条件１及び３）の方が、担体無しよりもＳＳ除去率が高かったが、ＣＬ−１株の添加の有無によるＳＳ除去率の違いは無かった。
【００５１】
【表３】
0006009190.tif 000004
【００５２】
（４）ＣＬ−１株と担体の添加によるセルロース分解の高効率化の機構に関する検討
メタン発酵槽へのＣＬ−１株の添加効果に関して、想定されるメカニズムを図４に示す。担体添加条件における条件１と条件３では、ＳＳ除去率に違いは無かったことから、固形性セルロースの可溶化は同程度であると考えられた。一方、ＣＯＤｃｒ除去率については、条件３よりも条件１の方が高かったが、これは、ＣＬ−１株の添加によりセルロース系有機物の低分子化が進み、生産物である有機酸等が増え、これらがメタン生成菌によって除去されたためと考えられた。また、条件１の方が条件３よりもメタンガスの発生量が多かったが、この理由はより多い有機酸をメタンガスに転換できたためと考えられた。条件１及び条件３において、ＶＦＡ濃度がいずれも低かったこともこのことを裏付けている。それに対して、担体添加無しの場合（条件２及び条件４）は、ＣＬ−１株の添加効果が見られなかった。担体無しの場合では、基質の入れ替えに伴って、添加したＣＬ−１株が系外に流出したことがその理由として考えられた。
【００５３】
通常、セルロース分解を効率的に行うためにはセルロース分解菌を常にメタン発酵槽内に保つ必要があるが、担体無しの場合（条件２と４）に見られたように、発酵槽を運転しているとその濃度が低下し、セルロース分解効率が低下してしまう。これに対し、条件１の場合には、スタート時の一度だけＣＬ−１株を添加することで、担体添加の効果によりＣＬ−１株をメタン発酵槽内に維持でき、セルロース分解とメタン生成の高効率化を達成できることが明らかとなった。以上のことから、嫌気性セルロール分解菌と微生物を担持し得る担体をメタン発酵処理槽内に添加することによって、嫌気性セルロース分解菌とメタン生成菌を担体上に維持して、メタン発酵処理槽におけるセルロース系有機物の分解処理を長期間安定して効率よく実施できることが明らかとなった。
【００５４】
（実施例２）
ＣＬ−１株の増殖能力とセルロース分解処理能力について検討した。
【００５５】
まず、種々のセルロース系有機物を用いた際のＣＬ−１株の菌数の経時変化について検討した。
【００５６】
１０ｇ／Ｌの種々の有機物を加えた表１に示す組成の液体培地１０ｍＬを２０ｍＬ容のガラスバイアル瓶に収容し、ＣＬ−１株を７．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように添加して、５５℃で嫌気的（Ｎ２：ＣＯ２＝８０：２０）に７日間の回分培養を行い、経時的に試料を採取して菌数計測を実施した。菌数計測は、サンプリングした培養液を顕微鏡観察（×４００、ニコン）により実施した。
【００５７】
添加した有機物は、以下の通りとした。
＜セルロース系有機物＞
・標品セルロース（微結晶品、アルファエイサー）
・標品セロビオース（Ｄ（＋）−セロビオース、Ｗａｋｏ）
・ろ紙（アドバンテック、ｔｙｐｅ５Ａ、２０ｍｍ×２０ｍｍ）
・稲わら
・トマト残渣（トマトの葉と茎を乾燥したもの）
＜その他の有機物＞
・酵母エキス（Ｂａｃｔｏ）
・グルコース（Ｄ（＋）−グルコース、Ｗａｋｏ）
【００５８】
結果を図５に示す。セルロース系有機物ではない酵母エキス及びグルコースを用いた場合には、菌数の増加は見られなかったが、セルロース系有機物である標品セルロース、標品セロビオース、ろ紙、稲わら、トマト残渣を用いた場合には、時間と共に菌数の増加が見られた。尚、標品セルロース、標品セロビオース、ろ紙、稲わらを用いた場合の最終到達菌数は７．３×１０８〜９．７×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬであった。トマト残渣を用いた場合には、１．０×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬと若干低下したものの、ＣＬ−１株がセルロース系有機物を利用して良好に増殖することが判明した。
【００５９】
次に、以下に示す公知の高温性の嫌気性セルロース分解菌と、ＣＬ−１株の能力を比較する試験を実施した。具体的には、１０ｇ／Ｌの標品セルロースを加えた表１に示す液体培地を１０ｍＬ入れた２０ｍＬ容のバイアル瓶に、以下に示す４種の標準株と、ＣＬ−１株を７．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるようにそれぞれ添加して、５５℃で嫌気的（Ｎ２：ＣＯ２＝８０：２０）に３０日間の回分培養を行った。経時的に試料を採取して、菌数計測と液体培地中の懸濁物質量（ＳＳ）測定を実施した。
【００６０】
＜標準株＞
・Clostridium caenicola NBRC 102590株（文献１）
・Clostridium clariflavum NBRC 101661株（文献１）
・Clostridium thermocellum NBRC 103400株（文献２）
・Clostridium straminisolvens NBRC 103399株（文献３）
文献１：Shiratori H, et al.：Int J Syst Evol Microbiol. 59: 1764-1770 (2010)
文献２：Viljoen JA, et al.：J Agric Sci. 16: 1-17 (1926)
文献３：Kato S, et al.：Int J Syst Evol Microbiol. 54: 2043-2047 (2004)
【００６１】
菌数の経時変化を図６に示す。いずれの菌株においても、最初は時間の経過に伴って菌数が増加し、１０日目以降はほぼ一定値となった。３０日後の菌数を比較すると、ＣＬ−１株では４．９×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、Clostridium straminisolvens NBRC 103399株では２．２×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬであったが、他の菌株では、１．７×１０７〜４．３×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬと菌数が一桁少なかった。これらの結果から、ＣＬ−１株とClostridium straminisolvens NBRC 103399株では、他の高温性の嫌気性セルロース分解菌と比較して、良好な増殖を示すことが明らかとなった。
【００６２】
次に、固形性セルロース濃度と相関を持つＳＳ濃度の経時変化を図７に示す。Clostridium caenicola NBRC 102590株、Clostridium clariflavum NBRC 101661株、Clostridium thermocellum NBRC 103400株では、３０日後のＳＳ除去率は５．７〜１７．４％と低く、Clostridium straminisolvens NBRC 103399株では６６．６％であったが、ＣＬ−１株については９５．９％と際だって高い値となった。また、菌数の増加傾向とＳＳ除去率の傾向は一致していた。
【００６３】
以上の結果から、ＣＬ−１株は、従来の高温性の嫌気性セルロース分解菌と比較して際立って優れたセルロース分解能力を有していることが明らかとなった。
【００６４】
尚、ＣＬ−１株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列（配列表の配列番号１を参照）は、Clostridium clariflavum EBR45株（DSM19732株）の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列と、９９．９％の相同性を示したものの、Clostridium clariflavum EBR45株（DSM19732株）とオリジナルの株が同一であるClostridium clariflavum NBRC 101661株（文献１）と比較して、圧倒的に優れた増殖能力及びセルロース分解処理能力を有していることが明らかとなった。つまり、ＣＬ−１株は、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列については従来の嫌気性セルロース分解菌と近似したものであるが、増殖能力とセルロース分解能力から見れば全く異なるものである。つまり、ＣＬ−１株は、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列からは計れない従来菌との大きな機能的差異を有している。
【００６５】
実施例２に示す実験結果から、ＣＬ−１株の能力を具体的に数値で示すと以下のようになる。
＜比増殖速度＞
１．２８／日（図６の２４〜４８時間の菌数の差から算出、４８〜７２時間の場合の比増殖速度は２．３０／日）
＜最大到達菌体密度＞
２．６７×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ（図６の７２時間後の値）
＜セルロース分解速度＞
１．９４×１０−９ｇ／Ｌ／ｃｅｌｌｓ／日（図７の０〜１８日目のＳＳ濃度の減少速度。但し、０〜９日目で計算すると２．００×１０−９ｇ／Ｌ／ｃｅｌｌｓ／日、９〜１８日目で計算すると７．１７×１０−１０ｇ／Ｌ／ｃｅｌｌｓ／日）
【００６６】
したがって、ＣＬ−１株以外の嫌気性セルロース分解菌を用いた場合であっても、その比増殖速度が１．２８／日以上であり、最大到達菌体密度が２．６７×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上であり、セルロース分解速度が７．１７×１０−１０ｇ／Ｌ／ｃｅｌｌｓ／日以上（より好適には１．９４×１０−９ｇ／Ｌ／ｃｅｌｌｓ／日以上）である嫌気性セルロース分解菌を用いることで、ＣＬ−１株を用いた場合と同様あるいはそれ以上の効果が奏され得るものと考えられる。
【符号の説明】
【００６７】
８  担体
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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