(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
汗抗原組成物と反応し、かつ、該組成物による汗抗原刺激応答細胞からのヒスタミン遊離を抑制することができる抗体またはその抗原結合性断片の製造方法であって、
ヒト汗腺からの分泌物を陰イオン交換カラムクロマトグラフィーにかけ、得られた０〜１．０ＭのＮａＣｌ濃度勾配で０．２５〜０．３ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌの範囲に溶出されるヒスタミン遊離活性画分を逆相カラムクロマトグラフィーにかけ、得られた０．１ｖ／ｖ％ＴＦＡ／蒸留水から０．１ｖ／ｖ％ＴＦＡ／アセトニトリルの濃度勾配で３０〜３５ｖ／ｖ％アセトニトリルの範囲に溶出されるヒスタミン遊離活性画分をゲル濾過カラムクロマトグラフィーにかけ、得られた１５〜６０ｋＤの位置のヒスタミン遊離活性画分を、抗ヒトＣｙｓｔａｔｉｎＡ抗体アフィニティクロマトグラフィーにかけて得られた抗ヒトＣｙｓｔａｔｉｎＡ抗体非吸着画分を抗原として用い、
汗抗原刺激応答細胞からのヒスタミン遊離量を指標にしてハイブリドーマをスクリーニングし、ハイブリドーマから抗体を生産する、抗体またはその抗原結合性断片の製造方法。
【請求項２】
ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１１０またはＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１１１の受託番号のもと寄託されたハイブリドーマから生産される、抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項３】
ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１１０、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１１１またはＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１１２の受託番号のもと寄託されたハイブリドーマから生産される、抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項４】
ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１１３の受託番号のもと寄託されたハイブリドーマから生産される、抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項５】
アトピー性皮膚炎、蕁麻疹、汗疹、および汗疱からなる群から選択される汗抗原が関連する疾患またはその発症リスクの判定を補助する方法であって、請求項２または３に記載の抗体を用いて、被験試料中の汗抗原を検出する工程を含んでなる、方法。
【請求項６】
請求項４に記載の抗体を更に用いる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
請求項２または３に記載の抗体もしくはその抗原結合性断片および／または請求項４に記載の抗体もしくはその抗原結合性断片を含んでなる、アトピー性皮膚炎、蕁麻疹、汗疹、および汗疱からなる群から選択される汗抗原が関連する疾患またはその発症リスクの診断剤または診断用キット。
【請求項８】
請求項２または３に記載の抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項９】
ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１１０、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１１１またはＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１１２の受託番号のもと寄託された請求項８に記載のハイブリドーマ。
【請求項１０】
請求項２または３に記載の抗体またはその抗原結合性断片と組み合わせて、サンドイッチ法を用いて汗抗原組成物を検出することができる、汗抗原特異的抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項１１】
ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１１３の受託番号のもと寄託された請求項１０に記載のハイブリドーマ。
【請求項１２】
請求項２または３に記載の抗体を用いて、被験試料中の汗抗原を検出する工程を含んでなる、アトピー性皮膚炎、蕁麻疹、汗疹、および汗疱からなる群から選択される汗抗原が関連する疾患またはその発症リスクを判定するための指標を検出する方法。
【請求項１３】
請求項４に記載の抗体を更に用いる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
汗抗原組成物と反応し、かつ、該組成物による汗抗原刺激応答細胞からのヒスタミン遊離を抑制することができる抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニング方法であって、
ヒト汗腺からの分泌物を陰イオン交換カラムクロマトグラフィーにかけ、得られた０〜１．０ＭのＮａＣｌ濃度勾配で０．２５〜０．３ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌの範囲に溶出されるヒスタミン遊離活性画分を逆相カラムクロマトグラフィーにかけ、得られた０．１ｖ／ｖ％ＴＦＡ／蒸留水から０．１ｖ／ｖ％ＴＦＡ／アセトニトリルの濃度勾配で３０〜３５ｖ／ｖ％アセトニトリルの範囲に溶出されるヒスタミン遊離活性画分をゲル濾過カラムクロマトグラフィーにかけ、得られた１５〜６０ｋＤの位置のヒスタミン遊離活性画分を、抗ヒトＣｙｓｔａｔｉｎＡ抗体アフィニティクロマトグラフィーにかけて得られた抗ヒトＣｙｓｔａｔｉｎＡ抗体非吸着画分を得る工程、
抗原として前記抗ヒトＣｙｓｔａｔｉｎＡ抗体非吸着画分を用いて抗体を産生するハイブリドーマを得る工程、
汗抗原刺激応答細胞からのヒスタミン遊離量を指標として、ヒスタミン遊離抑制作用を有する抗体を産生するハイブリドーマを選択する工程、
を含んでなる、ハイブリドーマのスクリーニング方法。
【請求項１５】
汗抗原組成物と反応し、かつ、該組成物による汗抗原刺激応答細胞からのヒスタミン遊離を抑制することができる抗体を産生するハイブリドーマの製造方法であって、
ヒト汗腺からの分泌物を陰イオン交換カラムクロマトグラフィーにかけ、得られた０〜１．０ＭのＮａＣｌ濃度勾配で０．２５〜０．３ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌの範囲に溶出されるヒスタミン遊離活性画分を逆相カラムクロマトグラフィーにかけ、得られた０．１ｖ／ｖ％ＴＦＡ／蒸留水から０．１ｖ／ｖ％ＴＦＡ／アセトニトリルの濃度勾配で３０〜３５ｖ／ｖ％アセトニトリルの範囲に溶出されるヒスタミン遊離活性画分をゲル濾過カラムクロマトグラフィーにかけ、得られた１５〜６０ｋＤの位置のヒスタミン遊離活性画分を、抗ヒトＣｙｓｔａｔｉｎＡ抗体アフィニティクロマトグラフィーにかけて得られた抗ヒトＣｙｓｔａｔｉｎＡ抗体非吸着画分を得て、抗原として該抗ヒトＣｙｓｔａｔｉｎＡ抗体非吸着画分を用いて抗体を産生するハイブリドーマを得る、方法であって、
（ｉ）汗抗原刺激応答細胞からのヒスタミン遊離量を指標として、ヒスタミン遊離抑制作用を有する抗体を産生するハイブリドーマを選択する工程；および
（ｉｉ）（ｉ）で得られたハイブリドーマをクローニングする工程
を含んでなる、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、汗抗原組成物に対するモノクローナル抗体に関する。本発明はまた、該抗体を用いる判定方法、並びに該抗体を含んでなる医薬組成物、診断剤、および診断用キットに関する。本発明はさらに、該抗体を生産することができるハイブリドーマ並びに該ハイブリドーマのスクリーニング方法および製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、アトピー性皮膚炎患者は急増しており、皮膚科にかかる患者中のアトピー性皮膚炎患者比率は３０％を越える情況で、主たる皮膚病の一つになっている。アトピー性皮膚炎は、通常の抗原に対しＩｇＥ抗体を産生しやすい遺伝的要因に種々の環境因子が加わることにより引き起こされるアトピー性疾患の一つであり、乳児期から発症し、加齢と共に慢性的に経過し、多くは思春期前に軽快するが、一部の症例は思春期以降も継続し、また思春期以降発症する例もある。成人症例のほとんどは特に難治であり、それ以降の加齢による寛解は期待しがたい。完成した病巣は苔癬化し、掻痒は著しく、しばしば発作的であり、他のアトピー性疾患と一定の関連をもって増悪、軽快を繰り返すというものである。【０００３】
このようなアトピー性皮膚炎の発症機序には明らかにされていない部分が多く、他の皮膚疾患との識別にもいまだ問題があり、治療方法はいまだ確立されていないが、従来より、副腎皮質ホルモン剤の外用、抗ヒスタミン剤、化学伝達物質遊離抑制剤の投薬療法、あるいは食材から卵、牛乳、大豆等を除く食事療法、生活環境からのダニ、真菌（カビ）などの抗原物質の除去などが試みられてきた。しかしながら薬物療法の場合は、薬剤を成長期の子供に、しかも長期にわたって使用することになるため、副作用の点で問題が残る。
また食事療法や環境抗原除去対策では、完全に抗原を除くことは困難であり、精神的負担も大きいという問題点があった。【０００４】
このような状況に鑑み、最近では、分子生物学的な知見を駆使してアトピー性皮膚炎の発症機構を解明しながら、その発生機構の一部を阻害することにより治療効果を上げようとする研究が行われている。例えば、上記したように抗原に対してＩｇＥ抗体を産生することが症状を発生させる機構の一部になっていることに着目し、抗原に対するＩｇＥ抗体の産生を抑制する物質を外用することによって症状を緩和する方法が提案されている（特開平７−１０９２９０号公報、特開平７−１０９２９２号公報、特開平９−１００２３６号公報）。【０００５】
ところで、これまでに、汗に含まれ、かつアトピー性皮膚炎を誘引する抗原物質が報告されている（ＷＯ ０３／０８４９９１ Ａ１、特許第３９８３２６０号、平成１４年度厚生労働科学研究費補助金 免疫アレルギー疾患予防・治療等研究事業の研究報告書（第１分冊ｐ．１０１−１０３，厚生労働省 平成１５年３月発行））。しかし、該抗原物質は同定されておらず、該抗原物質が誘引するヒスタミン遊離活性を抑制する抗体も報告されていない。
【発明の概要】
【０００６】
本発明者らはこれまでに、ヒト汗から調製した組成物を用いて抗体の取得を試みたが、ヒト汗に含まれるヒスタミン遊離活性化物質に結合し、かつ、好塩基球やマスト細胞等からのヒスタミン遊離を抑制するような抗体を得ることはできなかった。
【０００７】
そこで、本発明者らは、ヒスタミン遊離活性を指標として得られたヒト汗腺からの分泌物に含まれる画分をさらに抗ヒトＣｙｓｔａｔｉｎＡ抗体アフィニティクロマトグラフィーにかけて得られた素通り画分（抗ヒトＣｙｓｔａｔｉｎＡ抗体非吸着画分）を抗原として用い、好塩基球からのヒスタミン遊離量を指標としてハイブリドーマのスクリーニングを行うことにより、モノクローナル抗体を作製したところ、該モノクローナル抗体が、汗抗原画分による、アトピー性皮膚炎患者の好塩基球からのヒスタミン遊離を抑制することを見出した（実施例２および実施例６の６−４（３））。また、該抗体を用いることにより、汗抗原組成物を回収することができること（実施例３の３―１）、汗抗原画分を検出することができること（実施例３の３−２、３−３および実施例７）、アトピー性皮膚炎患者血清中の汗抗原特異的ＩｇＥ抗体を検出することができること（実施例４および５）、コリン性蕁麻疹患者血清中の汗抗原特異的ＩｇＥ抗体を検出することができること（実施例８）を見出した。本発明は、これらの知見に基づくものである。
【０００８】
本発明は、汗抗原物質による汗抗原刺激応答細胞からのヒスタミン遊離を抑制することができるモノクローナル抗体を提供することを目的とする。本発明はまた、該抗体を用いる判定方法、並びに該抗体を含んでなる、医薬組成物、診断剤、および診断用キットを提供することを目的とする。本発明はさらに、該抗体を生産することができるハイブリドーマ並びに該ハイブリドーマのスクリーニング方法および製造方法を提供することを目的とする。
【０００９】
本発明によれば、汗抗原組成物と反応し、かつ、該組成物による汗抗原刺激応答細胞からのヒスタミン遊離を抑制することができる抗体またはその機能的断片（以下、「本発明による第一の態様の抗体」という）が提供される。
【００１０】
本発明によれば、本発明による第一の態様の抗体と抗原抗体反応する汗抗原に反応する抗体またはその機能的断片（以下、「本発明による第二の態様の抗体」という）が提供される。（以下、「本発明による第一の態様の抗体」と「本発明による第二の態様の抗体」とを併せて「本発明による抗体」という。）
【００１１】
本発明によれば、汗抗原が関連する疾患またはその発症リスクを判定する方法であって、本発明による第一の態様の抗体を用いて、被検試料中の汗抗原および／または汗抗原に特異的なＩｇＥ抗体を検出する工程を含んでなる方法（以下、「本発明による判定方法」という）が提供される。
【００１２】
本発明によれば、本発明による抗体と、場合によっては１種以上の薬学的に許容される担体、および／または希釈剤とを含んでなる、汗抗原が関連する疾患の予防または治療に用いられる医薬組成物が提供される。
【００１３】
本発明によれば、汗抗原が関連する疾患の予防剤または治療剤の製造のための、本発明による抗体の使用が提供される。
【００１４】
本発明によれば、予防上または治療上の有効量の本発明による抗体を、ヒトを含む哺乳類に投与することを含んでなる、汗抗原が関連する疾患の予防方法または治療方法が提供される。
【００１５】
本発明によれば、本発明による第一の態様の抗体および／または本発明による第二の態様の抗体を含んでなる、汗抗原が関連する疾患またはその発症リスクの診断剤または診断用キットが提供される。
【００１６】
本発明によれば、汗抗原組成物と反応し、かつ、該組成物による汗抗原刺激応答細胞からのヒスタミン遊離を抑制することができる抗体またはその機能的断片の製造に用いられるハイブリドーマであって、汗抗原刺激応答細胞からのヒスタミン遊離量を指標に選択して得られた、汗抗原特異的抗体を産生するハイブリドーマ（以下、「本発明による第一の態様のハイブリドーマ」という）が提供される。
【００１７】
本発明によれば、本発明による第一の態様の抗体と組み合わせて、サンドイッチ法により汗抗原組成物を検出することができる抗体またはその機能的断片の製造に用いられるハイブリドーマ（以下、「本発明による第二の態様のハイブリドーマ」という）が提供される。
【００１８】
本発明によれば、汗抗原刺激応答細胞からのヒスタミン遊離量を指標として、ヒスタミン遊離抑制作用を有する抗体を産生するハイブリドーマを選択する工程を含んでなる、汗抗原特異的抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニング方法が提供される。
【００１９】
本発明によれば、汗抗原特異的抗体を産生するハイブリドーマの製造方法であって、
（ｉ）汗抗原刺激応答細胞からのヒスタミン遊離量を指標として、ヒスタミン遊離抑制作用を有する抗体を産生するハイブリドーマを選択する工程；および
（ｉｉ）（ｉ）で得られたハイブリドーマをクローニングする工程
を含んでなる方法が提供される。
【００２０】
本発明による抗体は、汗抗原組成物を特異的に感度よく認識することができることから、汗抗原の測定試薬、診断剤等として利用することができる点で有利である。本発明による抗体は、また、プレート等の固相に固着させて使用できることから、汗抗原や汗抗原に特異的なＩｇＥ抗体を、サンドイッチ法等を用いて高感度で検出することが可能となる点で有利である。本発明による判定方法は、患者自身の皮膚を用いる皮内反応試験、プリックテスト等や、患者血球細胞を用いるヒスタミン遊離試験を行うことなく、患者血清を用いることで汗抗原が関連する疾患の診断を行うことができ、簡便な点で有利である。本発明による判定方法は、また、従来アレルギー性疾患（アトピー性皮膚炎やコリン性蕁麻疹等）の診断に用いられていたヒスタミン遊離試験では判定されない患者（ノンレスポンダー）に対しても汗抗原が関連する疾患の診断を行うことができる点で有利である。
【００２１】
また、本発明による抗体は、汗抗原刺激応答細胞からのヒスタミン遊離を抑制することができるため、汗抗原が関連する疾患の予防および治療薬としても利用することができる点で有利である。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、ハイブリドーマ培養上清によるヒスタミン遊離試験の結果を示した図である。
【図２】図２は、ハイブリドーマ精製ＩｇＧによる、患者由来の血球からのヒスタミン遊離試験の結果を示した図である。
【図３】図３は、実施例２で得られたモノクローナル抗体によりヒスタミン遊離活性を有する画分が回収されることを示した図である。
【図４−１】図４−１は、実施例２で得られたモノクローナル抗体によるウェスタンブロット（Ｎａｔｉｖｅ−ポリアクリルアミドゲル（ＮＯＮ−ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ｍｉｎｉ（４〜２０ｗ／ｖ％）ゲル）の結果を示した図である。
【図４−２】図４−２は、実施例２で得られたモノクローナル抗体によるウェスタンブロット（Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥゲル、パジェルＮＰＵ−１５Ｌ（１５ｗ／ｖ％）ゲル）の結果を示した図である。
【図４−３】図４−３は、電気泳動の結果を示した図である。
【図４−４】図４−４は、画分１〜３のヒスタミン遊離試験の結果を示した図である。
【図５】図５は、ＥＬＩＳＡ試験の結果を示した図である。
【図６】図６は、実施例２で得られたモノクローナル抗体を用いたアトピー性皮膚炎の診断結果を示した図である。
【図７】図７は、抗ヒトＩｇＥ抗体を固相に用い、本発明のモノクローナル抗体を標識抗体として用いたＥＬＩＳＡによる汗アレルギー診断結果を示した図である。
【図８】図８は、ｓｍｉｔｈ−２Ｆ（ａｂ’）2を固相化したサンドイッチＥＬＩＳＡ試験によるハイブリドーマ培養上清中モノクローナル抗体検出結果を示した図である。
【図９】図９は、ハイブリドーマ培養上清による患者由来の血球からのヒスタミン遊離試験の結果を示した図である。
【図１０】図１０は、ｓｍｉｔｈ−２Ｆ（ａｂ’）2フラグメントを固相化したサンドイッチＥＬＩＳＡ試験における、実施例６で得られたハイブリドーマ精製モノクローナル抗体の反応性の結果を示した図である。
【図１１】図１１は、実施例６で得られたハイブリドーマ精製モノクローナル抗体による患者由来の血球からのヒスタミン遊離試験の結果を示した図である。
【図１２−１】図１２−１は、本発明で得られたモノクローナル抗体およびｓｍｉｔｈ−２によるサンドイッチＥＬＩＳＡ試験の結果を示した図である。
【図１２−２】図１２−２は、同サンドイッチＥＬＩＳＡを用いたＱＲＸ測定用検量線を示した図である。
【図１３】図１３は、実施例２で得られたモノクローナル抗体を用いたコリン性蕁麻疹患者の汗アレルギー診断結果を示した図である。
【発明の具体的な説明】
【００２３】
［汗抗原組成物］
ヒトの汗には、アレルギー反応を誘導し、アトピー性皮膚炎やコリン性蕁麻疹等の疾患を引き起こすような抗原物質（以下、「汗抗原」ということがある）が含まれる。汗抗原は、これらの患者由来の汗のみならず、健常者由来の汗にも含まれる。
【００２４】
本願明細書において「汗抗原組成物」とは、汗抗原を含んでなる組成物を意味する。
【００２５】
本発明によれば、汗抗原組成物は、本発明による抗体を作製することに用いることができる。
【００２６】
汗抗原組成物は、ヒト汗腺からの分泌物から、ヒスタミン遊離活性画分を分離することにより得ることができる。さらに、得られたヒスタミン遊離活性画分を抗ヒトＣｙｓｔａｔｉｎＡ抗体アフィニティクロマトグラフィーにかけ、素通りした画分（すなわち、抗ヒトＣｙｓｔａｔｉｎＡ抗体非吸着画分）を選択してもよい。
【００２７】
「汗腺からの分泌物」とは、汗または汗に含まれるタンパク質、糖類、脂質、核酸またはそれらの複合体であり、皮膚（顔面、頭頸部、躯幹、上肢等）から得ることができる。また、唾液、涙液、尿からも得ることができる。
【００２８】
「汗腺からの分泌物」は、回収した分泌物をそのまま使用することもできるが、好ましくは、不溶物を除去した濾液等を使用することができる。
【００２９】
不溶物の除去方法としては、フィルター濾過、遠心分離等が挙げられる。好ましくは、フィルター濾過である。
【００３０】
「ヒスタミン遊離活性画分」は、汗抗原刺激応答細胞からのヒスタミンの遊離を誘導する抗原物質が含まれる画分を意味し、汗腺からの分泌物を陰イオン交換カラムクロマトグラフィー、逆相カラムクロマトグラフィー、およびゲル濾過クロマトグラフィーを用いて分離し、ヒスタミン遊離活性を有する画分を選択することにより得ることができる。
【００３１】
「汗抗原刺激応答細胞」は、細胞表面にＩｇＥ受容体を発現する細胞であって、該ＩｇＥ受容体に、汗抗原が結合されたＩｇＥ抗体が結合されることによって生じる汗抗原刺激により活性化され、ヒスタミン等の化学伝達物質を分泌することができる細胞であればよく、例えば、好塩基球、マスト細胞（肥満細胞）、ＩｇＥ受容体遺伝子を発現させて人工的に作製したヒスタミン等の化学伝達物質遊離能を有する細胞株等が挙げられ、好ましくは、好塩基球である。
【００３２】
分離方法は、公知のクロマトグラフィーであれば特に限定されないが、例えば、陰イオン交換カラムクロマトグラフィー、逆相カラムクロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、電気泳動的法等、またはこれらの２以上の組み合わせが挙げられる。
【００３３】
陰イオン交換カラムクロマトグラフィーとしては、例えば、ＭｏｎｏＱ  １０／１００ＧＴ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）等の市販の陰イオン交換カラムが挙げられる。
【００３４】
逆相カラムクロマトグラフィーとしては、例えば、ＳＯＵＲＣＥ  １５ＲＰＣ  ＳＴ４．６／１００（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）等の市販の逆相カラムが挙げられる。
【００３５】
ゲル濾過クロマトグラフィーとしては、例えば、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  ＰＣ  ３．２／３０（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）等の市販のゲルが挙げられる。
【００３６】
好ましくは、陰イオン交換カラムクロマトグラフィー、逆相カラムクロマトグラフィー、およびゲル濾過クロマトグラフィーを組み合わせて使用することができる。
【００３７】
「ヒスタミン遊離活性」は、公知の方法に従って測定することができる。例えば、ヒスタミン量を測定し、全ヒスタミン量に対する遊離ヒスタミン量が３〜９７％の範囲の場合にヒスタミン遊離活性を有すると判定することができる。（Koro, O. et al., J. Allergy Clin. Immunol., 103, 663-670, 1999）。
【００３８】
「抗ヒトＣｙｓｔａｔｉｎＡ抗体アフィニティクロマトグラフィー」は、例えば、クロマトグラフィーハンドブック・アフィニティークロマトグラフィー（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）に記載の方法に従って行うことができる。
【００３９】
抗ヒトＣｙｓｔａｔｉｎＡ抗体固定化担体は、市販のものであってもよいし、公知の方法に従って作製してもよい。
【００４０】
汗抗原組成物は、好ましくは、ヒト自らのＩｇＥ抗体に結合してマスト細胞や好塩基球等の汗抗原刺激応答細胞を活性化し、ヒスタミンを遊離させることができ、かつ抗ヒトＣｙｓｔａｔｉｎＡ抗体に非吸着である。
【００４１】
汗抗原組成物は、好ましくは、下記工程：
（１）フィルター濾過されたヒト汗を陰イオン交換カラムクロマトグラフィー、次に逆相カラムクロマトグラフィー、最後にゲル濾過クロマトグラフィーにかけ、ヒスタミン遊離活性画分を得る工程；および
（２）（１）で得られたヒスタミン遊離活性画分を抗ヒトＣｙｓｔａｔｉｎＡ抗体アフィニティクロマトグラフィーにかける工程
を含んでなる方法により得ることができる。
【００４２】
汗抗原組成物は、好ましい態様で用いることができるが、例えば、等電点電気泳動を行った場合に、等電点４．５〜４．８の範囲に泳動される物質を使用することができる。あるいは、Ｎａｔｉｖｅ−ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動を行った場合に、マーカータンパク質の泳動位置を目安にして、３５ｋＤ〜１００ｋＤの位置に泳動される物質を使用することができる。あるいは、陰イオン交換クロマトグラフィーによって得られる画分をアトピー性皮膚炎疾患患者の好塩基球を用いたヒスタミン遊離試験でスクリーニングした場合に得られる３つのヒスタミン遊離活性ピークの内、２番目および３番目のピーク位置に溶出される物質を、より好ましくは、２番目のピーク位置に溶出される物質を使用することができる。
【００４３】
［抗体］
本発明による第一の態様の抗体は、ヒト汗腺からの分泌物に含まれる汗抗原組成物を特異的に認識することができ、かつ、汗アレルギー患者において、汗抗原による汗抗原刺激応答細胞からのヒスタミン遊離を抑制することができる。
【００４４】
本発明による第一の態様の抗体は、ヒト汗腺からの分泌物に含まれるヒスタミン遊離活性画分に対する抗体とすることができる。
【００４５】
本発明による第一の態様の抗体は、汗抗原刺激応答細胞からのヒスタミン遊離量を指標にしてハイブリドーマを選択することにより得ることができる。
【００４６】
本発明による第二の態様の抗体は、本発明による第一の態様の抗体と抗原抗体反応する汗抗原と抗原抗体反応する抗体とすることができる。
【００４７】
ここで、「抗原抗体反応」とは、抗原とそれに対応する抗体とが選択的に結合する特異的な反応を意味する。
【００４８】
本発明による第二の態様の抗体は、本発明による第一の態様の抗体と汗抗原組成物とを使用したサンドイッチ法を利用してハイブリドーマを選択することにより得ることができる。
【００４９】
本発明による抗体には、汗抗原組成物をマウス等の哺乳動物に免疫して得られるポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体（本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体も含む）、遺伝子組換え技術を用いて製造されるキメラ抗体およびヒト化抗体、並びにヒト抗体産生トランスジェニック動物等を用いて製造されるヒト抗体が含まれる。
【００５０】
本発明による抗体を医薬としてヒトに投与する場合は、副作用低減の観点から、ヒト抗体が望ましい。
【００５１】
「ヒト抗体」とは、すべての領域がヒト由来の抗体である。本発明によるヒト抗体は、当業者に周知の方法を用いて作製することができる（例えば、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）不死化法（Watson et al., 1983. J Immunol 130, 2442-2447）、ファージディスプレイ法（Marks et al., 1991. J Mol Biol 222, 581-597、Bardas et al., 1992. Proc Natl Acad Sci USA 89, 4457-4461）、完全ヒト抗体産生ハイブリドーマ法（特開２００７−０００１４１号公報）等を参照することができる）。
【００５２】
「ヒト化抗体」は、マウス抗体の抗原結合部位（ＣＤＲ；相補性決定領域）の遺伝子配列だけをヒト抗体遺伝子に移植（ＣＤＲグラフティング）した抗体である。本発明によるヒト化抗体は、当業者に周知の方法を用いて作製することができる（例えば、マウス抗体の抗原結合部位であるＣＤＲとＦＲ（フレームワーク領域）の幾らかのアミノ酸残基をヒト抗体に移植させたヒト化抗体の製造法（Owens et al., 1994. J Immunol Methods 168, 149-165）等を参照することができる）。
【００５３】
「キメラ抗体」は、ある種の抗体の可変領域とそれとは異種の抗体の定常領域とを連結した抗体である。具体的には、抗原をマウスに免役し、そのマウスモノクローナル抗体の遺伝子から抗原と結合する抗体可変部（Ｖ領域）を切り出し、ヒト骨髄由来の抗体定常部（Ｃ領域）遺伝子と結合して作製することができる。本発明によるキメラ抗体は、当業者に周知の方法を用いて作製することができる（例えば、Boulianne et al., 1984. Nature 312, 643-646、Morrison et al., 1984. Proc Natl Acad Sci USA 81, 6851-6855、Walls et al., 1993. Nucleic acid Research 21, 2921-2929、Norderhung et al., 1997. J Immunol Methods 204, 77-78、Persic et al., 1997. Gene 187, 9-18、McLean et al., 2000. Mol Immunol 37, 837-845等を参照することができる）。
【００５４】
本発明によるモノクローナル抗体は、当業者に周知の方法を用いて作製することができる。例えば、抗原を免疫した哺乳動物由来のリンパ球と、哺乳動物由来のミエローマ細胞との細胞融合により形成されるハイブリドーマにより産生させることができる。
【００５５】
免疫抗原としては、上記の汗抗原組成物を用いることができる。抗原は、キャリアタンパク質との複合体として用いてもよい。汗抗原組成物とキャリアタンパク質とは化学的に結合させることができる。化学的な結合の様式は特に限定されないが、共有結合が好ましい。キャリアタンパク質としては、例えば、ＢＳＡ、ＫＬＨ等が挙げられるが、好ましくは、ＫＬＨである。
【００５６】
リンパ球およびミエローマ細胞は、哺乳動物由来である限りにおいて特に限定されず、哺乳動物としては、例えばブタ、ウシ、マウス、ラット等が挙げられるが、好ましくは、マウスである。
【００５７】
免疫は、免疫抗原を哺乳動物に足蹠注射することにより行うことができる。注射方法はこれに限らず、皮下注射、腹腔内注射、静脈注射でも良い。通常、免疫は数回に分けて行うが、免疫はアジュバントと共に投与することが好ましい。アジュバントとしては、ミョウバン、結核死菌、核酸、完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント等、アジュバント効果が期待できるもので有れば限定されることはない。
【００５８】
細胞融合は公知の方法に従って実施することができる（Nature, 256, 495(1975)）。例えば、マウスを最終免疫した後に、当該マウスのリンパ節或は脾臓から得られるリンパ球と、ミエローマ細胞等の腫瘍細胞株の細胞（通常、マウスのＢＡＬＢ／ｃ由来のＰ３−ＮＳ−１／１−Ａｇ４−１、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３  Ｕ１）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−６５３、ＳＰ２／０−Ａｇ１４等）を用いて行うことができる。
【００５９】
抗体産生ハイブリドーマは、例えば、下記に例示する方法により選択と単クローン化を行うことにより得ることができる。
【００６０】
本発明による第一の態様の抗体は、汗抗原組成物に反応し、かつ該組成物による汗抗原刺激応答細胞からのヒスタミン遊離を抑制することができる。従って、抗体産生ハイブリドーマの選択は、ハイブリドーマにより生産される抗体が、汗抗原刺激応答細胞からのヒスタミン遊離を抑制することができるか否かを判定することにより行うことができる。
【００６１】
汗抗原刺激応答細胞からのヒスタミン遊離を抑制することができるか否かは、公知の方法に従って、汗抗原刺激応答細胞からのヒスタミン遊離量を測定することにより確認することができる。
【００６２】
被験抗体の存在下におけるヒスタミン遊離量が、該抗体の非存在下におけるヒスタミン遊離量を下回る場合に、具体的には、９５％以下、好ましくは９０％、より好ましくは８５％、さらに好ましくは８０％、さらにより好ましくは７５％、特に好ましくは７０％、特により好ましくは６５％、最も好ましくは６０％以下となった場合に、ヒスタミン遊離活性が抑制されたと判定することができる。
【００６３】
本発明による第二の態様の抗体は、本発明による第一の態様の抗体と組み合わせて、サンドイッチ法により汗抗原組成物を検出することができる。従って、抗体産生ハイブリドーマの選択は、ハイブリドーマにより生産される抗体が、本発明による第一の態様の抗体と抗原抗体反応する汗抗原と抗原抗体反応することができるか否かを判定することにより行うことができる。
【００６４】
本発明による第一の態様の抗体と抗原抗体反応する汗抗原と抗原抗体反応することができるか否かは、サンドイッチ法による免疫学的検出方法等の公知の方法に従って確認することができる。
【００６５】
免疫学的分析方法において、被験抗体を用いた場合の信号量（例えば、蛍光強度、発色強度等）が、被験抗体を用いない場合の信号量を上回る場合に、具体的には、１．１倍以上、好ましくは１．５倍、より好ましくは２倍以上となった場合に、本発明による第一の態様の抗体と抗原抗体反応する汗抗原と抗原抗体反応すると判定することができる。
【００６６】
抗体産生ハイブリドーマの選択は、２次スクリーニングとして、ハイブリドーマの増殖の盛んな細胞培養上清から種々の分析法（例えばＲＩＡ法、プラーク法、凝集反応法、ＥＬＩＳＡ法、フローサイトメトリー法、組織染色法、ウェスタンブロッティング法等）により本発明による汗抗原組成物に対して反応する目的の抗体を産生するハイブリドーマを選択することにより行うことができる。
【００６７】
得られたハイブリドーマについてはクローニングを行って、単一クローンを得てもよい。
【００６８】
クローニングの方法としてはＦＡＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｅｒ）もしくは、一般によく用いられる限界希釈法等が挙げられる。例えば、限界希釈法では９６ウェルプレートの１ウェルあたり細胞が１個以下になるように行うことが好ましい。どの方法を用いてもクローニングは２回繰返し行うことが好ましく、単一クローンとすることが好ましい。このようにして得られた単一クローンを、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養する方法、ｉｎ  ｖｉｖｏで培養（腹水化）する方法等により培養することにより、モノクローナル抗体を産生させることができる。
【００６９】
モノクローナル抗体の精製は、公知の方法を用いればよく、例えば、得られた培養液から、塩析、イオン交換、ゲル濾過、アフィニティクロマトグラフィー、電気泳動等の生化学的一般的手法を適宜組み合わせることにより、分離、精製することができる。
【００７０】
本発明による抗体の免疫グロブリンクラスおよびそのサブクラスは特に限定されないが、免疫グロブリンクラスはＩｇＭ又はＩｇＧであることが好ましい。さらに免疫グロブリンクラスがＩｇＧの場合、そのサブクラスはＩｇＧ２ａ又はＩｇＧ１であることがより好ましい。
【００７１】
本発明によるポリクローナル抗体は、当業者に周知の方法を用いて作製することができる。例えば、抗原を免疫した哺乳動物の血清から得ることができる。
【００７２】
本発明による「機能的断片」とは、抗体の一部分（部分断片）であって、ヒト汗腺からの分泌物に含まれる汗抗原を特異的に認識するものを意味する。具体的には、Ｆ（ａｂ’）２化抗体、Ｆａｂ化抗体、短鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ（Ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）及びミニボディ（Ｍｉｎｉｂｏｄｉｅｓ）などが挙げられる。
【００７３】
本発明による第一の態様の抗体の好ましい例としては、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１１０のもと受託されたハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体（ｓｍｉｔｈ−１抗体）、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１１１のもと受託されたハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体（ｓｍｉｔｈ−２抗体）、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１１２の受託番号のもと寄託されたハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体（ｓｍｉｔｈ−８抗体）が挙げられる。
【００７４】
本発明による第二の態様の抗体の好ましい例としては、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１１３の受託番号のもと寄託されたハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体（ａｄａｍ−1抗体）が挙げられる。
【００７５】
本発明による抗体は、好ましくは、モノクローナル抗体である。
【００７６】
［判定方法］
本発明による抗体を使用することにより、汗抗原および／または汗抗原に特異的なＩｇＥ抗体を検出することができる。従って、本発明によれば、本発明による抗体を用いて、被験試料中の汗抗原および／または汗抗原に特異的なＩｇＥ抗体を検出することにより、汗抗原が関連する疾患またはその発症リスクを判定することができる。
【００７７】
ここで、「汗抗原が関連する疾患を判定する」とは、汗抗原が関連する疾患の症状（徴候）を呈している対象者が、汗抗原が原因でその疾患に罹っているか否かを判定することを意味する。
【００７８】
また、「汗抗原が関連する疾患の発症リスクを判定する」とは、汗抗原が関連する疾患の症状（徴候）を呈していない対象者が、汗抗原が関連する疾患を発症するリスクを有するか否かを判定することを意味する。
【００７９】
生体試料における汗抗原の存在は、汗抗原が関連する疾患またはその発症のリスクの指標（特には、汗抗原が関連する疾患の発症のリスクの指標）となる。実施例３、６および７によれば、本発明による抗体を用いることにより汗抗原を検出できることが確認された。
【００８０】
従って、本発明によれば、汗抗原を検出することにより、対象者（特に、汗抗原に感受性が高い対象者）が、汗抗原が関連する疾患の患者である、または汗抗原が関連する疾患を発症するリスクがある（特には、汗抗原が関連する疾患の発症のリスクがある）と判定することができる。本発明によれば、また、対象者（特に、汗抗原に感受性が高い対象者）の体表または体内において汗抗原を検出することにより、対象者において汗抗原の局在や分布およびその濃度を解析することができることから、汗抗原除去等の汗抗原が関連する疾患に対する治療計画や予防対策を立てることができる。
【００８１】
汗抗原が関連する疾患を罹患しているまたは罹患するおそれのあるヒトの生体試料には、正常なヒトに比べて、ヒスタミン遊離活性画分に特異的なＩｇＥ抗体が多く含まれる。従って、生体試料における汗抗原に特異的なＩｇＥ抗体の存在は、汗抗原が関連する疾患またはその発症のリスクの指標となる。実施例４および５によれば、本発明による第一の態様の抗体を用いることにより汗抗原に特異的なＩｇＥ抗体を検出できることが確認された。
【００８２】
従って、本発明によれば、汗抗原に特異的なＩｇＥ抗体を検出することにより、対象者が汗抗原が関連する疾患の患者である、または汗抗原が関連する疾患を発症するリスクがあると判定することができる。本発明によれば、また、汗抗原に特異的なＩｇＥ抗体を検出して、基準値と比較することにより、対象者が汗抗原に対して感受性が高いと判定することができる。
【００８３】
本発明による判定方法は、汗抗原の検出と汗抗原に特異的なＩｇＥ抗体の検出とを組み合わせて実施することもできる。
【００８４】
本発明において用いられる検出の手段としては、被験試料における汗抗原および／または汗抗原に特異的なＩｇＥ抗体を検出できる方法であれば特に限定されず、例えば、抗原抗体反応法が挙げられる。例えば、汗抗原の検出は、汗抗原が関連する疾患に罹患しているまたは罹患するおそれのあるヒトを含む哺乳類から被験試料を採取し、採取した試料と本発明による抗体とを接触させ、抗原抗体反応が検出されるか否かを判断することによって実施することができる。また、汗抗原に特異的なＩｇＥ抗体の検出は、汗抗原が関連する疾患に罹患しているまたは罹患するおそれのあるヒトを含む哺乳類から被験試料を採取し、採取した試料と、汗抗原および本発明による抗体とを接触させ、抗原抗体反応が検出されるか否かを判断することによって実施することができる。
【００８５】
「被験試料」は、検出しようとする対象者（被験者）の体表または体内から採取して得ることができる。「被験試料」は、汗抗原および／または汗抗原に特異的なＩｇＥ抗体を含むか、含む可能性を有する試料であれば特に限定されないが、例えば、被験者の尿、血液、血漿、血清等の体液、汗、鼻汁、涙等の分泌物、細胞、組織、臓器、または細胞の培養物（例えば培養上清等を含む）等が挙げられ、好ましくは、血液、汗である。または、これらに由来する精製物、抽出物、標本等であってもよい。
【００８６】
本発明による第一の態様の方法において、抗原抗体反応を利用した汗抗原の検出は、例えば、下記工程により実施することができる：
（ａ）被験試料と、本発明による抗体とを接触させる工程； および
（ｂ）抗原抗体複合体を検出する工程。
【００８７】
より具体的には、下記工程により実施することができる：
（ａ−１）被験試料と、本発明による第一の態様の抗体とを接触させる工程； および／または
（ａ−２）被験試料と、本発明による第二の態様の抗体とを接触させる工程； および
（ｂ）抗原抗体複合体を検出する工程。
【００８８】
本発明による第二の態様の方法において、抗原抗体反応を利用した汗抗原に特異的なＩｇＥ抗体の検出は、例えば、下記工程により実施することができる：
（ａ’）被験試料と、本発明による抗体と、汗抗原とを接触させる工程； および
（ｂ’）抗原抗体複合体を検出する工程。
【００８９】
より具体的には、下記工程により実施することができる：
（ａ’−１）被験試料と、汗抗原を接触させる工程； 
（ａ’−２）工程（ａ’−１）において生成された第一の抗原抗体複合体と、本発明による抗体とを接触させる工程； および
（ｂ’ −１）工程（ａ’−２）において生成された第二の抗原抗体複合体を検出する工程。
【００９０】
あるいは、下記工程により実施することができる：
（ａ’−Ｉ）本発明による抗体と汗抗原とを接触させる工程； 
（ａ’−ＩＩ）工程（ａ’−Ｉ）において生成された第一の抗原抗体複合体と、被験試料とを接触させる工程； および
（ｂ’ −Ｉ）工程（ａ’−ＩＩ）において生成された第二の抗原抗体複合体を検出する工程。
【００９１】
抗原抗体反応の検出方法は当業者に周知であり、例えば、免疫学的方法により、被験試料中の汗抗原および／または汗抗原に特異的なＩｇＥ抗体を検出することができる。組織標本を生体試料として用いる場合は、通常の免疫組織染色法などを用いることができる。体液または培養上清等を生体試料として用いる場合は、ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、サンドイッチ法、競合法、プラーク法、凝集反応法、フローサイトメトリー法、ウェスタンブロッティング法などを用いることができる。
【００９２】
免疫組織染色法は、例えば、汗抗原および標識化抗体を用いる直接法、該抗体に対する抗体が標識化されたものを用いる間接法などにより行うことができる。標識化剤としては螢光物質、放射性物質、酵素、金属、色素など公知の標識物質を使用することができる。
【００９３】
サンドイッチ法においては、例えば、本発明による抗体をプレート等の固相に固着させて１次抗体として用いることができる。あるいは、標識して２次抗体として用いることもできる。１次抗体と２次抗体は、両方ともモノクローナル抗体を用いることができる。あるいは、いずれか一方をポリクローナル抗体とすることもできる。
【００９４】
ＥＬＩＳＡ法においては、例えば、汗抗原に特異的なＩｇＥ抗体を検出する場合、本発明による抗体を固相化し、これに汗抗原を反応させ、さらにアトピー性皮膚炎患者の血清を反応させ、抗ヒトＩｇＥ抗体で検出することにより、アトピー性皮膚炎患者血清中の汗抗原に特異的なＩｇＥを検出することができる。あるいは、抗ＩｇＥ抗体をプレート等の固相に固着させ、これにアトピー性皮膚炎患者の血清を反応させ、さらに汗抗原を反応させ、本発明による抗体で検出することにより、アトピー性皮膚炎患者血清中の汗抗原に特異的なＩｇＥを検出することができる。抗ヒトＩｇＥ抗体の代わりに抗ヒトＩｇＧ抗体を用いれば、汗抗原に特異的なＩｇＧを検出することができる。
【００９５】
本発明による第一の態様の方法によれば、抗原抗体複合体が検出された被検者（特に、汗抗原に感受性が高い被検者）は、汗抗原が検出されたと評価されるため、汗抗原が関連する疾患の患者である、あるいは汗抗原が関連する疾患を発症するリスクがあると診断または判定することができる。特に、アトピー性皮膚炎については、患者の約８０％が汗アレルギーであることが報告されていることから（Hide M, et al. Acta Derm Venereol ２００２；８２；３３５−３４０）、本発明による判定方法によれば、アトピー性皮膚炎様症状を呈する対象者について、汗抗原に起因するアトピー性皮膚炎の患者であるか否かを高精度で判定することができる点で有利である。
【００９６】
本発明による第二の態様の方法によれば、抗原抗体複合体が検出された被検者は、汗抗原に特異的ＩｇＥ抗体が検出されたと評価されるため、汗抗原が関連する疾患の患者である、あるいは汗抗原が関連する疾患を発症するリスクがあると診断または判定することができる。本発明による第二の態様の方法によれば、ヒスタミン遊離試験の結果によらず、汗抗原に特異的ＩｇＥ抗体が検出されるか否かで、汗抗原が関連する疾患の患者である、あるいは汗抗原が関連する疾患を発症するリスクがあると診断または判定することができる点で有利である。
【００９７】
本発明によれば、汗抗原に特異的なＩｇＥ抗体の検出は、本発明による抗体のヒスタミン遊離抑制作用を利用することにより、生物学的な検出に応用することができる。
【００９８】
本発明によれば、汗抗原の検出は、免疫組織化学染色法等の方法と組み合わせることにより、汗抗原の局在や分布の解析に応用することができる。
【００９９】
本発明によれば、汗抗原の検出は、定量的な検出であってもよく、定性的な検出であってもよい。定量的な検出である場合、試料中に存在する汗抗原組成物濃度は、例えば予め既知濃度の汗抗原組成物標準液を用いて汗抗原組成物濃度と検出結果との関係について検量線を作成し、汗抗原組成物濃度が未知の試料についての検出結果と前記検量線とを照らし合わせることにより行うことができる。
【０１００】
本発明によれば、本発明において用いられる検出手段を使用する、汗抗原および／または汗抗原に特異的なＩｇＥ抗体の検出方法が提供される。
【０１０１】
［抗体の用途および医薬組成物］
汗抗原が関連する疾患
アレルギー性皮膚炎等の汗抗原が関連する疾患の患者を含むヒトの汗には、汗抗原が含まれることが知られている。白血球の細胞表面上のレセプター（ＩｇＥレセプター）がＩｇＥ抗体を介して、該抗原によって架橋されると、ヒスタミンをはじめとする化学伝達物質が放出され、アレルギーが引き起こされる。従って、抗原と該抗原に特異的なＩｇＥとの結合を阻害することにより、化学伝達物質の放出を抑制することができれば、これらの化学伝達物質に起因するアレルギー疾患を緩和、軽減または治療することができる。後記実施例に示されるように、本発明による抗体は、汗抗原によって引き起こされるアトピー性皮膚炎患者の好塩基球からのヒスタミン遊離を抑制することが確認された（実施例２および実施例６の６−４））。従って、本発明による抗体は、汗抗原が関連する疾患の予防または治療に有用である。
【０１０２】
本発明による抗体は、好ましくは、本発明による第一の態様の抗体である。
【０１０３】
汗抗原が関連する疾患は、汗に含まれる抗原物質により誘引される疾患を意味し、アトピー性皮膚炎、蕁麻疹（例えば、コリン性蕁麻疹等）、汗疹、汗疱、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、喘息等が挙げられる。好ましくは、アトピー性皮膚炎または蕁麻疹である。
【０１０４】
本願明細書において、「予防」とは、疾患の素因を有するが、未だ発症していない対象者において、発症のリスクを低減させることを意味する。本発明において「予防」の対象となる者としては、汗抗原が関連する疾患の症状（徴候）を呈していない者であって、血清中の汗抗原特異的なＩｇＥ抗体の濃度が正常値よりも高いか、あるいは体液中に汗抗原の存在が認められる者が挙げられ、このような対象者は本発明による判定方法等により特定することができる。
【０１０５】
本願明細書において、「治療」とは、患者、特にヒトの疾患の任意の治療を意味し、疾患の症状を改善ないし緩和させることも含む。ここで、「症状を改善ないし緩和させる」とは、汗抗原が関連する疾患の重症度を軽減する、すなわち、患者の症状をより軽症へと変化させることを意味する。軽症への変化は、痒みや皮疹等の臨床学的症状または血液や皮膚組織等を材料とする臨床検査における異常所見の減少もしくは消失により示される。
【０１０６】
本発明において「治療」の対象となる者としては、汗抗原が関連する疾患の症状（徴候）を呈している者であって、血清中の汗抗原特異的なＩｇＥ抗体の濃度が正常値よりも高いか、あるいは体液中に汗抗原の存在が認められる者が挙げられ、このような対象者も本発明による判定方法等により特定することができる。
【０１０７】
本発明において「汗抗原が関連する疾患の症状（徴候）」としては、例えば、アトピー性皮膚炎であれば、痒み、発汗後の皮疹の悪化等、蕁麻疹であれば、体温上昇や精神的緊張等の発汗刺激による膨疹、痒み、痛み感覚の出現等、汗疹であれば、紅斑、丘疹等、汗疱であれば、掌蹠の水疱、落屑等、アレルギー性鼻炎であれば、鼻汁、くしゃみ、鼻づまり等、アレルギー性結膜炎であれば、眼瞼、結膜の痒み、充血、流涙等、喘息であれば、喘鳴、呼吸困難、咳嗽等が挙げられる。
【０１０８】
本発明によれば、汗抗原が関連する疾患の予防剤または治療剤の製造のための、本発明による抗体の使用が提供される。
【０１０９】
本発明によれば、予防上または治療上の有効量の本発明による抗体を、ヒトを含む哺乳類に投与することを含んでなる、汗抗原が関連する疾患の予防方法または治療方法が提供される。
【０１１０】
汗抗原が関連する疾患の診断剤
後記実施例において示されるように、本発明による抗体は、汗抗原組成物を検出することができる（実施例３、６および７）。生体試料における汗抗原の存在は、汗抗原が関連する疾患またはその発症のリスクの指標となる。また、本発明による抗体は、汗抗原組成物に特異的なＩｇＥ抗体を検出することができる（実施例４および５）。生体試料における汗抗原に特異的なＩｇＥ抗体の存在は、汗抗原が関連する疾患またはその発症のリスクの指標となる。従って、本発明による抗体は、汗抗原が関連する疾患またはその発症リスクの診断に有用である。
【０１１１】
本発明によれば、本発明による抗体を用いて、生体試料中の汗抗原特異的ＩｇＥ抗体を検出することを含んでなる、汗抗原が関連する疾患またはその発症リスクの診断方法が提供される。
【０１１２】
本発明による診断方法は、汗抗原が関連する疾患に罹患しているまたは罹患するおそれのあるヒトを含む哺乳類から被検試料を採取し、採取した試料と本発明による抗体とを接触させ、汗抗原および／または汗抗原に特異的なＩｇＥ抗体が検出されるか否かを判断することによって実施することができる。本発明による診断方法において、汗抗原や汗抗原に特異的なＩｇＥ抗体は、本発明による検出方法に従って検出することができる。本発明による診断方法は、本発明による判定方法に従って、判定（診断）することができる。
【０１１３】
診断用キット
本発明によれば、本発明による第一の態様の抗体および／または本発明による第二の態様の抗体を少なくとも含んでなる、汗抗原が関連する疾患またはその発症リスクの診断用キットが提供される。
【０１１４】
本発明のキットによれば、生体試料中に存在する汗抗原および／または汗抗原特異的ＩｇＥ抗体を指標として、汗抗原が関連する疾患に罹患しているか否かを診断することができる。本発明のキットによれば、また、生体試料中に存在する汗抗原および／または汗抗原特異的ＩｇＥ抗体を指標として、汗抗原が関連する疾患の発症リスクを有するか否かを診断することができる。
【０１１５】
本発明による抗体は、例えば、溶液に溶解された形態や、固相化された形態で提供されてもよい。
【０１１６】
本発明による抗体は、酵素等により標識されたものであってもよい。
【０１１７】
本発明によるキットは、抗原抗体反応を検出することにより、汗抗原および／または汗抗原特異的ＩｇＥ抗体の存在を検出する。
【０１１８】
従って、本発明によるキットは、所望により、抗原抗体反応を実施するための種々の試薬、例えば１次抗体、２次抗体、反応バッファー、洗浄液、反応基質、汗抗原標準液、説明書、器具等を含むものであってもよい。
【０１１９】
医薬組成物
本発明による医薬組成物は、本発明による抗体を有効成分として用い、好ましくは、精製した抗体と任意の成分、例えば、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、またはリン酸塩緩衝液などを含有する組成物の形態で使用しても良い。
【０１２０】
本発明による抗体の投与形態は、特に制限されず、経口投与、非経口投与（例えば静脈注射、筋肉注射、皮下投与、直腸投与、経皮投与、局所投与）のいずれかの投与経路でヒトを含む哺乳類に投与することができるが、非経口投与、特に経皮投与、が好ましい。
【０１２１】
経口投与および非経口投与のための剤形およびその製造方法は当業者に周知であり、本発明による抗体を、薬学的に許容される坦体などと混合等することにより、常法に従って製造することができる。
【０１２２】
薬学上許容される担体としては、例えば、製剤分野において常用され、かつ本発明による抗体と反応しない物質が用いられる。薬学上許容される担体には、例えば、通常用いられる安定化剤、防腐剤、等張化剤等を使用することができる。
【０１２３】
非経口投与のための剤型は、注射用製剤（例えば、点滴注射剤、静脈注射剤、筋肉注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤）、外用剤（例えば、湿布剤、噴霧剤、エアゾール剤、塗布剤）、坐剤吸入剤、眼剤、眼軟膏剤、点鼻剤、点耳剤、リポソーム剤等が挙げられるが、好ましくは、外用剤である。
【０１２４】
医薬組成物の投与量は、患者の年齢、体重、性別、一般的な健康状態、疾患の程度および投与する抗体の成分により多様である。例えば、本発明による医薬組成物を、経皮投与する場合には、成人１人当たり１日０．０１〜５０００ｍｇ／ｋｇ（体重）、好ましくは０．１〜１０００ｍｇ／ｋｇ（体重）の抗体を投与することができる。実際に用いられる投与法は、臨床医師の判断により大幅に変動することもあり、上記の投与範囲から逸脱することがある。
【０１２５】
本発明による診断剤は、合目的な任意の手段を用いて調製することができる。
【０１２６】
［汗抗原特異的抗体産生ハイブリドーマ］
本発明による第一の態様のハイブリドーマは、本発明による第一の態様の抗体を生産することができる。
【０１２７】
本発明によれば、汗抗原組成物を免疫することによって得られるリンパ球とミエローマ細胞を融合して得られたハイブリドーマから、汗抗原刺激応答細胞からのヒスタミン遊離量を指標にして、目的の抗体を産生するハイブリドーマを選択することができる。
【０１２８】
本発明による第一の態様のハイブリドーマは、本発明によるスクリーニング方法によって選別することができる。
【０１２９】
本発明による第一の態様のハイブリドーマは、本発明による製造方法によって製造することができる。
【０１３０】
本発明によれば、平成１９年１１月１６日付で、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託された受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１１０（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１４３９より移管）であるハイブリドーマ（Ｍｏｕｓｅ−Ｍｏｕｓｅ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ｓｍｉｔｈ−１）が提供される。
【０１３１】
また、平成１９年１１月１６日付で、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託された受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１１１（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１４４０より移管）であるハイブリドーマ（Ｍｏｕｓｅ−Ｍｏｕｓｅ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ｓｍｉｔｈ−２）が提供される。
【０１３２】
さらに、平成２０年１０月１日付で、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託された受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１１２（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１６９７より移管）であるハイブリドーマ（Ｍｏｕｓｅ−Ｍｏｕｓｅ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ｓｍｉｔｈ−８）が提供される。
【０１３３】
本発明による第二の態様のハイブリドーマは、本発明による第二の態様の抗体を生産することができる。
【０１３４】
本発明によれば、汗抗原組成物を免疫することによって得られるリンパ球とミエローマ細胞を融合して得られたハイブリドーマから、本発明による第一の態様の抗体と結合する汗抗原組成物との結合能を指標にして、目的の抗体を産生するハイブリドーマを選択することができる。
【０１３５】
本発明によれば、平成２０年１０月１日付で、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託された受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１１３（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１６９６より移管）であるハイブリドーマ（Ｍｏｕｓｅ−Ｍｏｕｓｅ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ａｄａｍ−１）が提供される。
【０１３６】
本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）汗抗原組成物と反応し、かつ、該組成物の、汗抗原刺激応答細胞からのヒスタミン遊離活性を抑制することができる抗体またはその機能的断片。
（２）ヒト汗腺からの分泌物に含まれるヒスタミン遊離活性画分を抗原として用いて得られた、（１）の抗体またはその機能的断片。
（３）ヒト汗腺からの分泌物に含まれるヒスタミン遊離活性画分を、抗ヒトＣｙｓｔａｔｉｎＡ抗体アフィニティクロマトグラフィーにかけて得られた抗ヒトＣｙｓｔａｔｉｎＡ抗体非吸着画分を抗原として用いて得られた、（１）の抗体またはその機能的断片。
（４）汗抗原刺激応答細胞からのヒスタミン遊離量を指標にしてスクリーニングされるハイブリドーマから生産される、（１）〜（３）の抗体またはその機能的断片。
（５）ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１１０またはＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１１１として寄託されたハイブリドーマから生産される、（１）〜（４）の抗体またはその機能的断片。
（６）抗体がモノクローナル抗体である、（１）〜（５）のいずれか一項に記載の抗体またはその機能的断片。
（７）汗抗原が関連する疾患またはその発症リスクを判定する方法であって、（１）〜（６）の抗体を用いて、被験試料中の汗抗原または汗抗原に特異的なＩｇＥ抗体を検出する工程を含んでなる、方法。
（８）汗抗原が関連する疾患が、アトピー性皮膚炎、蕁麻疹、汗疹、汗疱、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、および喘息からなる群から選択される、（７）の判定方法。
（９）（１）〜（６）の抗体またはその機能的断片と、場合によっては１種以上の薬学的に許容される担体、および／または希釈剤とを含んでなる、汗抗原が関連する疾患の予防または治療に用いられる医薬組成物。
（１０）汗抗原が関連する疾患が、アトピー性皮膚炎、蕁麻疹、汗疹、汗疱、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、および喘息からなる群から選択される、（９）の医薬組成物。
（１１）（１）〜（６）の抗体またはその機能的断片を含んでなる、汗抗原が関連する疾患の診断剤または診断用キット。
（１２）汗抗原が関連する疾患が、アトピー性皮膚炎、蕁麻疹、汗疹、汗疱、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、喘息からなる群から選択される、（１１）の診断剤または診断用キット。
（１３）汗抗原組成物と反応し、かつ、該組成物の、汗抗原刺激応答細胞からのヒスタミン遊離活性を抑制することができる抗体またはその機能的断片の製造に用いられるハイブリドーマであって、汗抗原刺激応答細胞からのヒスタミン遊離量を指標に選択して得られた、汗抗原特異的抗体を産生するハイブリドーマ。
（１４）ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１１０またはＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１１１の受託番号のもと寄託された（１３）のハイブリドーマ。
（１５）汗抗原刺激応答細胞からのヒスタミン遊離量を指標として、ヒスタミン遊離活性抑制作用を有する抗体を産生するハイブリドーマを選択する工程を含んでなる、汗抗原特異的抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニング方法。
（１６）汗抗原特異的抗体を産生するハイブリドーマの製造方法であって、
（ｉ）汗抗原刺激応答細胞からのヒスタミン遊離量を指標として、ヒスタミン遊離活性抑制作用を有する抗体を産生するハイブリドーマを選択する工程；および
（ｉｉ）（ｉ）で得られたハイブリドーマをクローニングする工程
を含んでなる、方法。
【実施例】
【０１３７】
以下、実施例を示してこの出願の発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、この出願の発明は以下の例によって限定されるものではない。【０１３８】
[実施例１]  抗ヒトＣｙｓｔａｔｉｎＡカラム非吸着の精製画分の調製
１−１． 濃縮汗の調製
ヒトの汗を、１００μｍと７０μｍのメッシュフィルター（Ｎｙｌｏｎ製Ｃｅｌｌ  Ｓｔｒａｉｎｅｒ、Ｆａｌｃｏｎ）を通して不溶物を除去した後、さらに０．２２μｍフィルター（Ｂｏｔｔｅｌｅ  Ｔｏｐ  Ｆｉｌｔｅｒ、１Ｌ、Ｃｏｒｎｉｎｇ）で沈殿物を除去した。フィルター濾過済みの汗４Ｌを限外濾過（３０００Ｍ．Ｗ．ｃｕｔ）で１５０ｍＬ程度に濃縮して、汗抗原精製のための材料とした。【０１３９】
１−２．陰イオン交換カラムによる分離
あらかじめ１０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で平衡化させた陰イオン交換カラムＭｏｎｏＱ  １０／１００  ＧＴ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）に、ｐＨ８．０に調製した濃縮汗７５ｍＬをロードし、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中、０〜１．０ＭのＮａＣｌ濃度勾配により溶出した。精製用クロマト装置としてはＡＫＴＡ  ｅｘｐｌｏｒｅｒ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）を用いた。【０１４０】
ヒスタミン遊離活性を誘引する物質を含む画分を選択するために、各フラクションについて、アトピー性皮膚炎患者の好塩基球を用いたヒスタミン遊離試験を行った。【０１４１】
まず、適当に希釈した各フラクションと、５ｍｍｏｌ／Ｌ  グルコース、０．０３ｗ／ｖ％ＨＳＡ、２ｍｍｏｌ／Ｌ  ＣａＣｌ２、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ２を含むＨＥＰＥＳバッファー中に調製したアトピー性皮膚炎患者の好塩基球画分を１：１で混和し、３７℃で４０分インキュベートした。遠心分離で上清と沈渣血球に分け、それぞれに０．２ｍｏｌ／Ｌ過塩素酸を加えて変性させた後、遠心分離によって得られた上清中のヒスタミン濃度をＨＰＬＣ（シマヅＬＣ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）で測定した。全ヒスタミン量に対する上清のヒスタミン量の割合をヒスタミン遊離活性とした。【０１４２】
なお、ヒスタミン量の測定は文献（ Koro, O. et al., J. Allergy Clin. Immunol., 103, 663-670, 1999）記載の方法に従った。【０１４３】
その結果、他の画分に比べヒスタミン遊離活性が高かった０．２５〜０．３ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌの塩濃度範囲で溶出される画分をヒスタミン遊離活性を示す画分として回収した。【０１４４】
１−３．逆相カラムによる分離
実施例１−２で得られた画分１８ｍＬを純水で１０倍希釈して最終濃度０．１ｖ／ｖ％のＴＦＡを添加した。これを、逆相カラム（ＳＯＵＲＣＥ  １５ＲＰＣ  ＳＴ  ４．６／１００（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）  にロードし、０．１ｖ／ｖ％ＴＦＡ／蒸留水から０．１ｖ／ｖ％ＴＦＡ／アセトニトリルの濃度勾配で溶出した。精製用クロマト装置としてはＡＫＴＡ  ｅｘｐｌｏｒｅｒ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）を用いた。【０１４５】
溶出した各フラクションのＴＦＡおよびアセトニトリルを揮発させた後、実施例１−２と同様にヒスタミン遊離試験を行った。【０１４６】
その結果、他の画分に比べヒスタミン遊離活性が高かった約３０〜３５ｖ／ｖ％アセトニトリルの範囲を、ヒスタミン遊離活性を示す画分として回収した（４ｍＬ）。【０１４７】
１−４．ゲル濾過クロマトによる分離
実施例１−３で得られた画分は、凍結乾燥後、ＰＢＳに再溶解してＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  ＰＣ  ３．２／３０（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）にロードし、ＰＢＳ（−）で分画溶出した。精製用クロマト装置としてはＳｍａｒｔ  ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）を用いた。【０１４８】
溶出した各フラクションについて、実施例１−２と同様にヒスタミン遊離試験を行った。【０１４９】
その結果、溶出位置１５〜６０ｋＤの範囲を、ヒスタミン遊離活性を示す画分として回収し（１．２ｍＬ）、以後これをＱＲＸ画分とした。【０１５０】
１−５．ＣｙｓｔａｔｉｎＡの除去
抗ヒトＣｙｓｔａｔｉｎＡ抗体（Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）１ｍＬから０．９ｍＬを、ＰＢＳ（−）に対して透析  （３５００ＭＷＣＯ）した後、２ｍＬのＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）ゲルに添加して３時間ゆるやかに撹拌しながら反応させて、抗ヒトＣｙｓｔａｔｉｎＡ抗体固定化担体を作製した。抗体固定化の操作は添付の操作マニュアルに従った。このアフィニティ担体を小カラム（１．８ｍＬ）に充填し、約３倍量のＰＢＳ（−）で洗浄・平衡化した後、実施例１−４で得られた画分０．５ｍＬをカラムにかけ、素通り画分を回収し、これを目的の抗原画分とした。【０１５１】
なお、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、回収された画分からはほとんどのＣｙｓｔａｔｉｎＡが除去されていることを確認した。【０１５２】
[実施例２]  モノクローナル抗体の作製
２−１．マウスの免疫
実施例１で調製した抗原画分を遠心濃縮器（Ｐａｌｌ社；Ｎａｎｏｓｅｐ；３０００ＭＷＣＯ）を用いて５０μＬまで濃縮し、その２０μＬを同量のＦｒｅｕｎｄ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  と混合して８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスの後足蹠に注射して免疫した。７日後および１９日後にＦｒｅｕｎｄ  Ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ａｄｊｕｖａｎｔを用いて同量の汗抗原を追加免疫した。３回目の追加免疫の３日後に膝窩リンパ節を回収し細胞融合の材料とした。【０１５３】
２−２．細胞融合
最終免疫の３日後に、免疫マウスから摘出した膝窩リンパ節から、ＲＰＭＩ培地を用いてリンパ節細胞の浮遊液を調製した。得られた細胞９．９×１０７個と１．９８×１０７  個のマウスミエローマ細胞株（Ｐ３Ｕ１）とを混合し、遠沈後、電気細胞融合機（島津製作所；ＳＳＨ−２  ｓｏｍａｔｉｃ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚｅｒ、ＣＣＣ−１  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  ｃｅｌｌ  ｃｏｍｐｒｅｓｓ）を用いて細胞融合を行った。融合後の細胞を１０ｖ／ｖ％牛胎児血清およびヒポキサンチン１００μｍｏｌ／Ｌ、アミノプテリン０．４μｍｏｌ／Ｌ、チミジン１６μｍｏｌ／Ｌを含む完全ＲＰＭＩ培地（ＨＡＴ培地）４２０ｍＬに浮遊させ、９６穴マイクロ培養プレート２１枚の各ウェルに、０．２ｍＬずつ接種し、５ｖ／ｖ％炭酸ガスの存在下、３７℃で培養した。培養開始後１０日以内に全てのウェルからハイブリドーマのコロニーが出現した。【０１５４】
２−３．ハイブリドーマの選択
培養ウェル中のハイブリドーマを完全ＲＰＭＩ培地で培養し、その培養上清中の特異抗体産生の有無を次のようにして検出した。【０１５５】
（１）ハイブリドーマ培養上清中のＩｇＧ測定
アッセイ用９６穴マイクロ培養プレートのウェルにヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（シグマ社；Ｍ４２８０）を４μｇ／ｍＬの濃度で５０μＬ添加し固定した。０．０５ｖ／ｖ％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（−）洗浄液でウェルを３回洗浄した後、３ｗ／ｖ％スキムミルク／ＰＢＳ（−）を２５０μＬを添加してブロッキングを行った。このウェルに０．５ｗ／ｖ％スキムミルク／ＰＢＳ（−）で５倍希釈した培養上清（５０μＬ）を加えて反応させた。洗浄後、５０００倍希釈のパーオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（シグマ社；Ａ２５５４）５０μＬを添加しウェルに結合したＩｇＧと反応させた。洗浄後、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）−Ｈ２Ｏ２発色液（和光純薬）１００μＬを添加し２０分程度反応させて、マイクロプレートリーダーで４９０ｎｍの吸光度を測定した。【０１５６】
（２）ヒスタミン遊離活性の抑制の測定
ＩｇＧ産生の認められたウェル（１４０ウェル）の培養上清４０μＬと実施例１−４で調製したＱＲＸ画分の３０００倍希釈溶液１０μＬを混和して、３７℃、３０分間プレインキュベートした。これに、アトピー性皮膚炎患者の末梢血液から調製した好塩基球５０μＬ添加して、実施例１−２に記載の方法によるヒスタミン遊離試験を行った。【０１５７】
その結果、６つのウェルの培養上清が、ＱＲＸ画分によるヒスタミン遊離を抑制することが確認された（図１）。【０１５８】
選択したハイブリドーマを、限界希釈法によりＢＡＬＢ／ｃマウスの胸腺細胞をＦｅｅｄｅｒ細胞として用いてクローニングした。クローニングの操作は最低２回以上行った。得られた６つのハイブリドーマから生産される抗体をそれぞれｓｍｉｔｈ−１〜ｓｍｉｔｈ−６とした。【０１５９】
２−４．モノクローナル抗体の精製
クローニング後の細胞は、無血清培地（ＳＦＭ）への馴化を行った後、ＣＥＬＬｉｎｅ  ＣＬ−３５０（ＢＤ  バイオサイエンス）フラスコにより大量培養した。得られた培養上清を遠心分離機（１０，０００ＲＰＭ）にかけて不溶物を除いた後、ＰＢＳ（−）で２倍に希釈してＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）２ｍＬカラムに通した。カラム洗浄液としてＰＢＳ（−）を用いて、ＯＤ２８０ｎｍの吸光度がほぼ０になるまで洗浄した。その後、０．２ｍｏｌ／Ｌ  Ｇｌｙ−ＨＣｌ（ｐＨ２．５）を用いてＩｇＧを溶出した。得られたモノクローナル抗体については２８０ｎｍでの吸光度からＩｇＧとしてのタンパク濃度を計算した。【０１６０】
精製抗体（１０μｇ／ｍＬ）について、実施例１−２記載の方法を用いてヒスタミン遊離活性を調べた。【０１６１】
その結果、いずれの抗体も、ＱＲＸ画分によるアトピー性皮膚炎患者（Ａ患者およびＢ患者）の好塩基球からのヒスタミン遊離を抑制した（図２）。【０１６２】
得られたハイブリドーマは、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１１０またはＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１１１のもと独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託された。【０１６３】
[実施例３]  モノクローナル抗体とのＱＲＸ画分の反応
３−１．モノクローナル抗体による汗抗原の精製
モノクローナル抗体を固定化したアフィニティ担体を用いて汗抗原サンプルからヒスタミン遊離活性を持つ物質の精製を行った。【０１６４】
精製モノクローナル抗体（ｓｍｉｔｈ−１〜ｓｍｉｔｈ−６）をＰＢＳ（−）に対して透析（３５００ＭＷＣＯ）し、各々０．５ｍｇ相当の抗体を０．７ｍＬのＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）ゲルに添加して３時間ゆるやかに撹拌しながら反応させた。これに０．１ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）を添加して活性基をブロッキングした後、同緩衝液および０．１ｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）により洗浄した。この操作は添付の操作マニュアルに従った。最終的に十分量のＰＢＳ（−）で洗浄・平衡化して抗汗抗原モノクローナル抗体固定化担体を作製した。【０１６５】
この担体５０μＬをサンプルチューブに入れ、これに実施例１−４で調製したＱＲＸ画分を添加して２０分間振盪後遠心分離で得た沈殿（抗体固定化担体）をＰＢＳ（−）で洗浄した。このサイクルでＱＲＸ量を４μＬ、２０μＬ、１００μＬと増加させながら３サイクルの処理を行った。最終的に得られた沈殿を十分量のＰＢＳ（−）で洗浄した後、１２０μＬの０．１ｍｏｌ／ＬＧｌｙ−ＨＣｌ（ｐＨ２．５）を添加して５分間溶出操作を行った。これを遠心分離して得られた上清１００μＬをリン酸緩衝液で中和した後、ＰＢＳ（−）で平行化した脱塩カラム（ＮＡＰ−５；ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）で緩衝液をＰＢＳ（−）に交換した。こうして調製した溶出液のアトピー性皮膚炎患者血球からのヒスタミン遊離活性を調べた。【０１６６】
その結果、いずれの担体を用いた場合も、溶出液中にヒスタミン遊離活性が認められた。従って、実施例２で得られたモノクローナル抗体を用いて、ヒスタミン遊離活性を有する物質を回収できることが確認された（図３）。【０１６７】
３−２．Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ  ゲル電気泳動及びＷｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇにおける汗抗原の検出
実施例２で得られたモノクローナル抗体を用いたＷｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇによる汗抗原の検出を試みた。【０１６８】
遠心濃縮器（Ｐａｌｌ社；Ｎａｎｏｓｅｐ；３０００ＭＷＣＯ）を用いて１０倍濃縮したＱＲＸ画分の１０μＬと５μＬのサンプルバッファーおよび１μＬ  の５ｗ／ｖ％  Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ  Ｇ−２５０（Ｎａｔｉｖｅ  ＰＡＧＥ用；Ｎａｔｉｖｅ  ＰＡＧＥ  ｓａｍｐｌｅ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ；  ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）と混合し、８５℃１０分インキュベートした。同じ処理を施したものを６レーン分調製し、Ｎａｔｉｖｅ−ポリアクリルアミドゲル（ＮＯＮ−ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ｍｉｎｉ（４〜２０ｗ／ｖ％）ゲル；ＴＥＦＣＯ製）で電気泳動した。泳動後のゲルについて、ドライブロッティングシステム（ｉＢｌｏｔ；  ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を用いて通常の方法によりニトロセルロースメンブレン（ｉＢｌｏｔ  Ｇｅｌ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｓｔａｃｋｓ  Ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ，  Ｒｅｇｕｌａｒ：ＩＢ３０１０−０１）にブロッティングした。得られたメンブレンを１０ｗ／ｖ％スキムミルク／ＰＢＳ（−）中でブロッキング（室温、２時間）した。このメンブレンを各レーンに相当するストリップ状にカットし、それぞれを実施例２で得られたモノクローナル抗体溶液（ｓｍｉｔｈ−１〜６、５〜１０μｇ／ｍＬ）中に入れて４℃にて一晩反応させた。Ｔ−ＴＢＳ（０．０５ｖ／ｖ％Ｔｗｅｅｎ２０入りＴＢＳ）で３回洗浄した後、二次抗体としてｘ２０００希釈のＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）と室温で２時間反応させた。Ｔ−ＴＢＳで３回洗浄後、ＥＣＬ発光検出試薬（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）でバンドを検出した。【０１６９】
その結果、ｓｍｉｔｈ−２、ｓｍｉｔｈ−３、ｓｍｉｔｈ−４、ｓｍｉｔｈ−５ではマーカータンパクのバンド位置である６６ｋＤの位置の下方に抗原のバンドが検出されたが、ｓｍｉｔｈ−１およびｓｍｉｔｈ−６では検出されなかった（図４−１）。【０１７０】
また、ゲル密度の異なるＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥゲル（１５ｗ／ｖ％ゲル、パジェルＮＰＵ−１５Ｌ；Ａｔｔｏ製）を用いて同様にＷｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇによる抗原の検出を試みた。  抗体はｓｍｉｔｈ−２を用いた（図４−２）。【０１７１】
次いで、ヒスタミン遊離活性を持つ抗原画分のＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ電気泳動における分布を調べた。上記と同様の操作で調製したＱＲＸ試料をＮａｔｉｖｅ−ポリアクリルアミドゲル（パジェルＮＰＵ−１５Ｌ；Ａｔｔｏ製）の８つのウェルに入れて電気泳動した（図４−３）。泳動後、図に示した範囲でゲルを３つの画分（画分１〜３）に切り出してそれぞれさらに細かくカットした後、透析チューブ（排除限界３０００ダルトン）に移し、泳動バッファー（２５ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ／１９２ｍｍｏｌ／Ｌグリシン）中で電気泳動（１００Ｖ、４０分間）的に透析チューブ内に溶出させた。溶出液の緩衝液を脱塩カラム（ＮＡＰ−１０；ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）でＰＢＳに置換し、その抗原活性をヒスタミン遊離試験によって測定した。【０１７２】
その結果、本発明の抗体ｓｍｉｔｈ−２によるＷｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇで検出されるバンドの位置とほぼ同じ位置の画分１のゲルでヒスタミン遊離活性が認められた（図４−４）。【０１７３】
３−３．抗汗抗原抗体を用いるＥＬＩＳＡによる汗抗原の検出
（１）抗血清の調製
ＱＲＸ画分４０μＬとＦｒｅｕｎｄ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ａｄｊｕｖａｎｔを混合してエマルジョン化し、その１０μＬずつをマウス足蹠に注射して免疫した。免疫は９ヶ月の間に同様の方法で４回行い、最終的に採血して抗血清とした。【０１７４】
（２）ｓｍｉｔｈ−２のＦ（ａｂ’）２フラグメントの調製
２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）中で透析したｓｍｉｔｈ−２（１．５ｍｇ／ｍＬ）の１ｍＬに対して、同緩衝液で洗浄したペプシン固定化ゲル（Ｐｉｅｒｃｅ社製）５０ｖ／ｖ％懸濁液０．２５ｍＬを添加して、３７℃で５時間反応させた。反応後、遠心分離によって上清を回収した。ゲルに同緩衝液２００μＬを加えて再懸濁した後、再度遠心分離して得た洗浄液と合わせて約１．１ｍＬの酵素消化物を得た。これに３ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．８）を１．１ｍＬ加えてｐＨを調整した。これを１．５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０５ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．８）で平衡化したＰｒｏｔｅｉｎ  Ａカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）にかけ、１．５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む０．０５ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．８）で洗浄した。溶出は０．２ｍｏｌ／Ｌグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２．５）を用いた。溶出液の２８０ｎｍにおける吸光度をモニターしながら、素通り（および洗浄）部分のタンパク質ピークを集めてＦ（ａｂ’）２フラグメントとした。得られたＦ（ａｂ’）２フラグメントに未消化のＩｇＧが含まれていないことはＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動によって確認した。【０１７５】
（３）ＥＬＩＳＡ試験
ＥＬＩＳＡ用９６穴マイクロプレートの各ウェルに５０μＬのＦ（ａｂ’）２（１．５μｇ／ｍＬ−ＰＢＳ）を入れ室温で２時間静置してウェル表面上に固定した。３ｗ／ｖ％ＢＳＡ／ＰＢＳでブロッキングした後、４倍希釈系列にＰＢＳによって希釈したＱＲＸ画分５０μＬを入れて２時間室温で反応させた。Ｔ−ＰＢＳ（０．０５ｖ／ｖ％Ｔｗｅｅｎ２０入りＰＢＳ（−））で洗浄後、これに（１）の抗血清（７５倍希釈／０．２ｗ／ｖ％ＢＳＡ／ＰＢＳ）５０μＬを加えて１時間室温で反応させた。Ｔ−ＰＢＳで洗浄後、０．２ｗ／ｖ％ＢＳＡ  ＰＢＳで３０００倍に希釈したパーオキシダーゼ標識ヤギ抗−マウスＩｇＧ（Ｆｃ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ：Ｓｉｇｍａ社）５０μＬを入れて１時間室温で反応させた。反応後Ｔ−ＰＢＳで洗浄し、ｏ−フェニレンジアミン発色試薬（和光純薬社製）および過酸化水素を１００μＬ注入して発色させた。１ｍｏｌ／Ｌ硫酸を１００μＬ注入添加することで発色反応を停止させた後、マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ｍｏｄｅｌ  Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ  Ｐｌｕｓ，  Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用いてその４９０ｎｍにおける吸光度を測定した。対照実験には非免疫マウスの血清を用いた。【０１７６】
その結果、ｓｍｉｔｈ−２のＦ（ａｂ’）２を固相に用いたサンドイッチＥＬＩＳＡにより、汗抗原を特異的に検出できることが確認された（図５）。【０１７７】
［実施例４］  患者血清中の抗汗抗原特異的ＩｇＥ抗体の測定（１）
アトピー性皮膚炎患者の血清中には汗抗原特異的ＩｇＥ抗体が存在することが報告されている（Experimental Dermatology 15: 283-290, 2006）。そこで、被験者の血清中の汗抗原特異的ＩｇＥ抗体を本発明のモノクローナル抗体を用いて検出する汗アレルギーの診断方法を検討した。【０１７８】
ｓｍｉｔｈ−２抗体（２．５μｇ／ｍＬ−ＰＢＳ（−））５０μＬをＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに入れ一夜４℃で静置して固相化した。１ｗ／ｖ％ＢＳＡ−ＰＢＳ（−）でブロッキングした後、これに５０倍希釈のＱＲＸ画分５０μＬを反応させて固相化された抗体に反応させて固定した。Ｔ−ＰＢＳで洗浄後、１ｗ／ｖ％ＢＳＡ−ＰＢＳ（−）で１０倍希釈した被験者血清（アトピー性皮膚炎患者および健常者血清）５０μＬ入れて９０分間室温で反応させた。Ｔ−ＰＢＳで洗浄後、０．２ｗ／ｖ％ＢＳＡ−ＰＢＳで５０００倍に希釈したパーオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＥ抗体（Ｂｅｔｙｌ社）５０μＬを入れて１時間室温で反応させた。反応後Ｔ−ＰＢＳで洗浄し、ｏ−フェニレンジアミン発色試薬（和光純薬社製）および過酸化水素を１００μＬ注入して発色させた。１００μＬの２Ｎ硫酸を注入添加することで発色反応を停止させた後、マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ｍｏｄｅｌ  Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ  Ｐｌｕｓ；Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用いてその４９０ｎｍにおける吸光度を測定した。【０１７９】
その結果、アトピー性皮膚炎患者の１１人中（Ａ〜Ｋ）９人で抗汗抗原ＩｇＥ抗体が検出され、健常者３人中（Ｌ〜Ｎ）３人では該当するＩｇＥは認められなかった（図６）。この検査法を用いれば、ヒスタミン遊離試験等を行わなくとも、微量の血清のみを用いて汗アレルギーの検査を行うことが可能となる（図６）。【０１８０】
［実施例５］  患者血清中の抗汗抗原特異的ＩｇＥ抗体の測定（２）
血清中の全ＩｇＥを選択的にアッセイプレート上に捕集固定し、これに汗抗原ＱＲＸ画分を反応させた上で、本発明のモノクローナル抗体をＱＲＸ画分に反応させて汗抗原特異的に反応するＩｇＥを検出する系を構築した。【０１８１】
ヒトＩｇＥ測定キット（Ｂｅｔｙｌ社）のヤギ抗ヒトＩｇＥ抗体（１００倍希釈）溶液５０μＬをＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに入れ、ミキサー上で室温１時間振盪して固相化した。１ｗ／ｖ％ＢＳＡ−ＰＢＳ（−）でブロッキングした後、これに１ｗ／ｖ％ＢＳＡ−ＰＢＳ（−）で５倍および５０倍希釈した被験者血清（アトピー性皮膚炎患者、コリン性蕁麻疹患者、および健常者血清）５０μＬを入れて１時間室温で反応させた。Ｔ−ＰＢＳで洗浄後、５０倍希釈のＱＲＸ画分５０μＬを反応させた。Ｔ−ＰＢＳで洗浄後、０．２ｗ／ｖ％ＢＳＡ−ＰＢＳ中５μｇ／ｍＬに実施例６―（１）で調製したビオチン標識ｓｍｉｔｈ−２抗体希釈液を室温で１時間反応させた。次いで、０．２ｗ／ｖ％ＢＳＡ−ＰＢＳで１５００倍に希釈したパーオキシダーゼ標識ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（Ｚｙｍｅｄ 社）５０μＬを入れて１時間室温で反応させた。反応後Ｔ−ＰＢＳで洗浄し、１００μＬのｏ−フェニレンジアミン発色試薬（和光純薬社）および過酸化水素を添加して発色させた。１００μＬの１ｍｏｌ／Ｌ硫酸を添加することで発色反応を停止させた後、マイクロプレートリーダ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ｍｏｄｅｌ  Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ  Ｐｌｕｓ；Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用いてその４９０ｎｍにおける吸光度を測定した。【０１８２】
その結果、ＩｇＧ等の影響を受けずに汗抗原特異的ＩｇＥを検出することができた（図７）。【０１８３】
ここで、患者Ａ〜Ｃは、アトピー性皮膚炎患者ではあるが、ヒスタミン遊離試験ではヒスタミン遊離が認められず、いわゆる、ノンレスポンダーであると考えられる。しかし、患者Ｃの血清では汗抗原特異的ＩｇＥ抗体が確認されたことから、患者Ｃは汗抗原に過敏性を示し、発汗等によりアトピー性皮膚炎が発症または増悪していると判定することができる。このように、本発明による判定方法は、ヒスタミン遊離試験に代わる、または補完する判定方法として利用することができる。【０１８４】
[実施例６]  サンドイッチＥＬＩＳＡに使用可能なモノクローナル抗体の作製
６−１．マウスの免疫
実施例１−４で調製したＱＲＸ画分５００μＬを遠心濃縮器（Ｐａｌｌ社；Ｎａｎｏｓｅｐ；３０００ＭＷＣＯ）を用いて５０μＬまで濃縮し、その１５μＬに１０μＬのＰＢＳ（−）を加え、これを２５μＬのアジュバント  ＴｉｔｅｒＭＡＸ  Ｇｏｌｄ（ＴｉｔｅｒＭＡＸ社）と混合して８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスの後足蹠に注射して免疫した。１５日後に同様に追加免疫した。この追加免疫の３日後に膝窩リンパ節を回収し、ｓｍｉｔｈ−２抗体およびＱＲＸ抗原を用いて抗体産生細胞の選択を行った。【０１８５】
６−２．抗体産生細胞の選択
細胞培養用６ウェルプレートの６ウェルをＰＢＳ（−）で洗浄した後、実施例３−３（２）で調製したｓｍｉｔｈ−２のＦ（ａｂ’）２フラグメント（１０μｇ／ｍＬ−ＰＢＳ）溶液の１．３３ｍＬを各ウェルに添加し、４℃で１６時間、ゆるやかに撹拌した。ＰＢＳ（−）、次いで１ｖ／ｖ％ＦＣＳ（牛胎児血清）を含むＰＢＳ（−）で洗浄した後、約３０倍希釈のＱＲＸ画分の１．３３ｍＬをウェルに添加、２時間室温で振盪することで、プレート上のｓｍｉｔｈ−２のＦ（ａｂ’）２フラグメントに反応させて固定した。【０１８６】
免疫マウスから摘出した膝窩リンパ節から、５ｖ／ｖ％ＦＣＳ（牛胎児血清）を含むＰＢＳ（−）を用いて細胞を調製し、該細胞をウェル当り１．１ｘ１０７個／１．３３ｍＬの濃度でプレートに添加した。時々プレートをゆるやかに撹拌しながら室温で約９０分間反応させた。反応終了後、１ｖ／ｖ％ＦＣＳ（牛胎児血清）を含むＰＢＳ（−）でプレート表面上を数回洗浄し吸着していない細胞を除去した。最後にウェル当り１．５ｍＬの完全ＲＰＭＩ培地を加えて、５ｖ／ｖ％炭酸ガスの存在下、３７℃で１時間培養した。その後、ピペッティングおよびラバーポリスマンを用いて、プレート面に吸着していた７ｘ１０６個の細胞を回収した。【０１８７】
６−３．細胞融合
回収した７ｘ１０６個の細胞と１．７５ｘ１０６個のマウスミエローマ細胞株（Ｐ３Ｕ１）とを用いて実施例２−２に記載の方法により細胞融合を行った。融合後の細胞を、最終濃度で１０倍希釈濃度のＢｒｉｃｌｏｎｅ（Ａｒｃｈｐｏｒｔ社）を含む１０ｖ／ｖ％牛胎児血清ＲＰＭＩ完全培地２０ｍＬに浮遊させ、９６穴マイクロ培養プレートの１８７ウェルに１００μＬずつ撒き、５ｖ／ｖ％炭酸ガスの存在下、３７℃で培養した。翌日、ウェル当り同量の通常の２倍濃度ＨＡＴを含むＲＰＭＩ完全培地を添加した。培養開始後８日後に全てのウェルからハイブリドーマのコロニーが出現した。【０１８８】
６−４．ハイブリドーマの選択
培養ウェル中のハイブリドーマを完全ＲＰＭＩ培地で培養し、その培養上清中の特異抗体産生の有無を次のようにして検出した。【０１８９】
（１）ハイブリドーマ培養上清中のＩｇＧ測定
実施例２−３に記載の方法に従って、各ウェルのＩｇＧ量の測定を行ない、４９０ｎｍでの吸光度が０．５以上の発色が認められるウェルを選択した。【０１９０】
（２）ｓｍｉｔｈ−２のＦ（ａｂ’）２フラグメントおよびＱＲＸ画分を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡによるモノクローナル抗体産生細胞の選択
実施例３−３（２）の方法で調製したｓｍｉｔｈ−２のＦ（ａｂ’）２フラグメント（５μｇ／ｍＬ−ＰＢＳ（−））５０μＬをＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに入れ、１時間静置して固相化した。１ｗ／ｖ％ＢＳＡ−ＰＢＳ（−）でブロッキングした後、これに２５倍希釈のＱＲＸ画分５０μＬを反応させ、固相化された抗体に反応させてＱＲＸを固定した。Ｔ−ＰＢＳで洗浄後、実施例６−４（１）でＩｇＧ産生が認められたウェルの培養上清約４０μLを添加して１時間反応させた。０．２ｗ／ｖ％ＢＳＡを含むＰＢＳで２０００倍に希釈したパーオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ：Ｓｉｇｍａ社）５０μＬを入れて１時間室温で反応させた。反応後、Ｔ−ＰＢＳで洗浄し、ｏ−フェニレンジアミン発色試薬（和光純薬社）および過酸化水素を１００μＬ注入して発色させた。２Ｎ硫酸を１００μＬ注入添加することで発色反応を停止させた後、マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ｍｏｄｅｌ  Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ  Ｐｌｕｓ，  Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いてその４９０ｎｍにおける吸光度を測定した。【０１９１】
その結果、最終的に４つのウェル（♯１−３７、♯２−１５、♯３−１２、♯３−６４）の培養上清がこのサンドイッチＥＬＩＳＡで陽性となった（図８）。陽性ウェル中のハイブリドーマを、ＢＡＬＢ／ｃマウスの胸腺細胞をＦｅｅｄｅｒ細胞として用いた限界希釈法によりクローニングした。クローニング後、同様のＥＬＩＳＡ法により、２つのウェル由来のハイブリドーマからサンドイッチＥＬＩＳＡに使用可能な抗体産生クローンを得た。この２つのハイブリドーマから産生される抗体を、それぞれａｄａｍ−１、ａｄａｍ−２とした。【０１９２】
（３）ヒスタミン遊離抑制活性測定によるモノクローナル抗体産生細胞の選択
実施例６−４（１）でＩｇＧ産生の認められたウェルの培養上清４０μＬとＱＲＸ画分の３０００倍希釈溶液１０μＬを混和して、３７℃、３０分間プレインキュベートした。これに、アトピー性皮膚炎患者の末梢血液から調製した好塩基球細胞溶液５０μＬを添加して、実施例２−３（２）に記載された測定を実施した。【０１９３】
その結果、５つのウェル（♯１−５７、♯２−１６、♯２−３３、♯３−１２、♯３−３１）の培養上清が、ＱＲＸ画分によるヒスタミン遊離を抑制した（図９）。これら５つのウェル中のハイブリドーマを、限界希釈法によりクローニングした後、ヒスタミン遊離抑制活性を再測定した。その結果、最終的に３つのウェル由来のクローンを得た。この３つのハイブリドーマから産生される抗体をそれぞれ、ｓｍｉｔｈ−７、ｓｍｉｔｈ−８、ｓｍｉｔｈ−９とした。【０１９４】
（４）モノクローナル抗体の性質
実施例６−４（２）で得られたモノクローナル抗体ａｄａｍ−１〜２および実施例６−４（３）で得られたモノクローナル抗体ｓｍｉｔｈ−７〜９を、実施例２−４に記載された方法で精製し、それぞれの活性を調べた。【０１９５】
精製抗体（６．２５μｇ／ｍＬ）について、実施例６−４（２）に記載の方法を用いてサンドイッチＥＬＩＳＡを行った。【０１９６】
その結果、ａｄａｍ−１〜２抗体は、サンドイッチＥＬＩＳＡで陽性を示した（図１０）。これにより、汗抗原組成物の検出において、ａｄａｍ−１〜２抗体はｓｍｉｔｈ−２のＦ（ａｂ’）２フラグメントと組み合わせて、サンドイッチ法により汗抗原組成物を検出できることが確認された。また、ｓｍｉｔｈ−７〜９抗体も、サンドイッチＥＬＩＳＡでわずかに陽性を示した（図１０）。これにより、汗抗原組成物の検出において、ｓｍｉｔｈ−７〜９抗体はｓｍｉｔｈ−２のＦ（ａｂ’）２フラグメントと組み合わせて、サンドイッチ法により汗抗原組成物を検出できることが確認された。【０１９７】
次に、最終濃度で５０、１０、２μｇ／ｍＬに調製した精製抗体を用いて、実施例２−３（２）に記載の方法を用いてヒスタミン遊離抑制活性を調べた。【０１９８】
その結果、いずれのモノクローナル抗体でも用量依存的なヒスタミン遊離阻害活性が認められた（図１１）。また、他のアトピー性皮膚炎患者２名の好塩基球を用いたヒスタミン遊離試験においても、遊離阻害活性の強弱はあるものの同様の結果を示した。【０１９９】
[実施例７]  抗汗抗原抗体を用いるＥＬＩＳＡによる汗抗原の検出
実施例３−３では、固相化抗体としてｓｍｉｔｈ−２のＦ（ａｂ’）２フラグメントを用い、サンドイッチ用抗体としてはＱＲＸ抗原画分で免疫して得たマウスの血清を用いて汗抗原検出のためのＥＬＩＳＡ試験を行った。そこで、マウス血清の代わりに実施例６−４（２）で作製したモノクローナル抗体を用いることにより、より安定したＥＬＩＳＡ系の構築を試みた。【０２００】
（１）ビオチン標識モノクローナル抗体の調製
精製抗体（ａｄａｍ−１〜２およびｓｍｉｔｈ−２、７〜９）を０．１ｍｇ／０．２ｍＬとなるようにＰＢＳ（−）で調製し、最終濃度で１０ｍｍｏｌ／Ｌとなるように、Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ社）を加え、室温で１時間反応させた。１ｍｏｌ／Ｌモノエタノールアミンの２μＬを添加して反応を停止した後、ＰＢＳ（−）で平衡化したＮＡＰ−５（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）にかけて、ビオチン化試薬等を除去した。【０２０１】
（２）汗抗原検出用サンドイッチＥＬＩＳＡ系の構築
ＥＬＩＳＡ用９６穴マイクロプレートの各ウェルに５０μＬのモノクローナル抗体（ａｄａｍ−１〜２およびｓｍｉｔｈ−２、７〜９；５μｇ／ｍＬ−ＰＢＳ）を入れ、室温で２時間静置してウェル表面上に抗体を固定した。１ｗ／ｖ％ＢＳＡ／ＰＢＳでブロッキングした後、ＰＢＳ（−）中で５０倍希釈したＱＲＸ画分５０μＬを加えて、１時間室温で反応させた。Ｔ−ＰＢＳ（０．０５ｖ／ｖ％Ｔｗｅｅｎ２０入りＰＢＳ（−））で洗浄後、これに（１）で調製したビオチン標識モノクローナル抗体（１０μｇ／ｍＬ−０．２ｗ／ｖ％ＢＳＡ／ＰＢＳ）の５０μＬを加え、室温で１時間反応させた。Ｔ−ＰＢＳで洗浄後、０．２ｗ／ｖ％ＢＳＡを含有するＰＢＳで１５００倍に希釈したパーオキシダーゼ標識ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（Ｚｙｍｅｄ 社）を５０μＬ加え、室温で１時間反応させた。反応後Ｔ−ＰＢＳで洗浄し、ｏ−フェニレンジアミン発色試薬（和光純薬社）および過酸化水素を１００μＬ注入して発色させた。１ｍｏｌ／Ｌ硫酸を１００μＬ注入添加することで発色反応を停止させた後、マイクロプレートリーダ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ｍｏｄｅｌ  Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ  Ｐｌｕｓ，  Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いて、その４９０ｎｍにおける吸光度を測定した。【０２０２】
その結果、いずれの組み合わせにおいても汗抗原を特異的に検出できることが確認された（図１２−１）。特に、ｓｍｉｔｈ−８固相化−ビオチン標識ａｄａｍ−１、ｓｍｉｔｈ−９固相化−ビオチン標識ａｄａｍ−１、ａｄａｍ−１固相化−ビオチン標識ｓｍｉｔｈ−２、またはｓｍｉｔｈ−８固相化−ビオチン標識ｓｍｉｔｈ−２の組み合わせの場合に高感度で汗抗原を検出できることが確認された（図１２-１）。この内のｓｍｉｔｈ−８を固相化抗体とし、ａｄａｍ−１をビオチン標識抗体とする組み合わせにおける汗抗原の測定の結果を図１２−２に示す。【０２０３】
［実施例８］  コリン性蕁麻疹患者血清中の抗汗抗原特異的ＩｇＥ抗体の測定
アトピー性皮膚炎患者と同様、コリン性蕁麻疹患者のうち、６０％以上の患者の血清中に汗抗原特異的ＩｇＥ抗体が存在する（Takahagi S, et al., Br J Dermatol, 2008）。そこで、被験者の血清中の汗抗原特異的ＩｇＥ抗体を本発明によるモノクローナル抗体を用いて検出する汗アレルギーの診断方法を検討した。【０２０４】
実施例４に記載した方法と同様の操作によって行った。
ｓｍｉｔｈ−２抗体（５μｇ／ｍＬ−ＰＢＳ（−））５０μＬをＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに入れ、室温で２時間静置して固相化した。１ｗ／ｖ％ＢＳＡ−ＰＢＳ（−）でブロッキングした後、これに５０倍希釈のＱＲＸ画分５０μＬを添加し、ミキサー上で１時間撹拌しながら固相化された抗体に反応させて固定した。Ｔ−ＰＢＳで洗浄後、１ｗ／ｖ％ＢＳＡ−ＰＢＳ（−）で５倍および５０倍希釈した被験者血清（コリン性蕁麻疹患者および健常者血清）５０μＬを入れて９０分間室温で反応させた。Ｔ−ＰＢＳで洗浄後、０．２ｗ／ｖ％ＢＳＡ−ＰＢＳで５０００倍に希釈したパーオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＥ抗体（Ｂｅｔｙｌ社）５０μＬを入れて１時間室温で反応させた。反応後Ｔ−ＰＢＳで洗浄し、ｏ−フェニレンジアミン発色試薬（和光純薬社）および過酸化水素を１００μＬ注入して発色させた。１００μＬ  の１ｍｏｌ／Ｌ硫酸を注入添加することで発色反応を停止させた後、マイクロプレートリーダ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ｍｏｄｅｌ  Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ  Ｐｌｕｓ；Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いてその４９０ｎｍにおける吸光度を測定した。【０２０５】
その結果、コリン性蕁麻疹患者でも抗汗抗原ＩｇＥ抗体が検出された（患者６、患者７）。しかし、健常者では該当するＩｇＥは認められなかった（図１３）。この検査法を用いることにより、ヒスタミン遊離試験等を行わなくとも、微量の血清のみを用いてコリン性蕁麻疹患者について汗アレルギーの検査を行うことが可能となることが確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３】
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