(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料処理モジュールであって、
少なくとも１つのＰＣＲ反応バイアルを含むＰＣＲアセンブリと、
流体試料を内部に保持するように構成された試料アセンブリであって、前記ＰＣＲアセンブリに取り付け自在であり、それにより、閉鎖システムを形成するものである、前記試料アセンブリと、
前記ＰＣＲアセンブリに形成され、前記ＰＣＲ反応バイアルおよび前記試料アセンブリと流体連通する配送チャネルと、
前記試料アセンブリ内の前記流体試料の圧力を上昇させるよう構成され、当該流体試料の少なくとも一部を前記配送チャネルを通って前記ＰＣＲ反応バイアルに導く加圧装置と、
前記ＰＣＲ反応バイアルに送達した前記流体試料の流れを制限することでこのＰＣＲ反応バイアルにおける前記流体試料を周囲圧力以上に加圧可能な流動制限装置と
を有する試料処理モジュール。
【請求項２】
請求項１記載の試料処理モジュールにおいて、さらに、
前記ＰＣＲ反応バイアルの下流にこのＰＣＲ反応バイアルと流体連通する通気チャンバを有するものである試料処理モジュール。
【請求項３】
請求項２記載の試料処理モジュールにおいて、前記流動制限装置は、前記通気チャンバと前記ＰＣＲ反応バイアルとの間に配置されたものである試料処理モジュール。
【請求項４】
請求項１記載の試料処理モジュールにおいて、前記流動制限装置は、透過膜である試料処理モジュール。
【請求項５】
請求項１記載の試料処理モジュールにおいて、前記流動制限装置は、バルブである試料処理モジュール。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１０年８月２日付で出願された米国仮特許出願第６１／３６９，９２５号に対して利益を主張するものであり、この参照によりその全体があらゆる目的において本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ：ＰＣＲ）の実施に使用される熱循環装置の分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
分子生物学の分野における重要なツールは、「ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）」として知られるプロセスである。ＰＣＲは、遺伝物質の少量の試料から大量の遺伝物質を生成する。
【０００４】
ＰＣＲプロセスは、通常担体流体に取り込まれたＤＮＡの複製のための成分、すなわち複製すべきＤＮＡ、ならびにＤＮＡを形成すべく組み合わせられる４つのヌクレオチドと、「プライマ」と呼ばれる２つの異なる種類の合成ＤＮＡ（相補的なＤＮＡ鎖の各々について１つ）と、ＤＮＡポリメラーゼと呼ばれる酵素とを含むＰＣＲ反応剤、を含む小さな反応バイアルにおいて実行される。
【０００５】
ＤＮＡは二本鎖である。ＰＣＲプロセスは、ＤＮＡの二本鎖を相補的な一本鎖へと分かれさせる「変性（ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）」と呼ばれる工程によって始まる。これは、通常、ＰＣＲ反応混合物を数秒〜１分超の間の継続時間にわたって摂氏約９４〜約９６度の温度に加熱することによって達成される。
【０００６】
ひとたびＤＮＡが一本鎖に分かれると、混合物は、プライマが混合物中のＤＮＡの対応する一本鎖の各々に結合できるように、摂氏約４５〜約６０度（通常、プライマの溶解温度が約５度下回るように選択される）へと冷却される。この工程は、通常、「アニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）」と呼ばれる。アニーリングの工程は、通常、数秒から最大数分の時間を要する。
【０００７】
次に、反応容器は摂氏約７２〜７３度に加熱される。この温度は、反応混合物中のＤＮＡポリメラーゼが、プライマに核酸を付加することによって一本鎖上にＤＮＡの第２の鎖を構築するように作用する温度であり、これにより、元のＤＮＡ鎖の二本鎖と同一の二本鎖ＤＮＡが形成される。この工程は、一般に「伸長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）」と呼ばれる。前記伸長工程は、通常は、完了に数秒から２、３分を要する。
【０００８】
この一連の３つの工程（「ステージ」と称されることもある）は、１「サイクル」とされる。ＰＣＲの１サイクルが完了すると、反応バイアル中のＤＮＡの量は倍になる。サイクルを繰り返すことで、反応バイアル中のＤＮＡの量はさらに倍になる。通常、プロセスが多数回（例えば、１０〜４０回）繰り返され、多数の同一のＤＮＡ片がもたらされる。２０サイクルを実行することで、元のＤＮＡ試料について１００万を超える複製がもたらされる。３０サイクルを実行することで、元のＤＮＡ試料について１０億を超える複製がもたらされる。「熱循環装置」が、反応容器を所望の時間期間にわたって所望の温度の間で変化させるプロセスを自動化するために使用される。
【０００９】
増幅すべきＤＮＡは生体試料から採取する必要があるが、対象となる特定のＤＮＡを遊離させるためには、生物組織、細胞壁、キャプシドなどを破損させる必要がある。場合によっては、特定のＲＮＡが対象とされるが、増幅にＰＣＲを利用するためにＲＮＡをＤＮＡへと変換しなければならない。
【００１０】
ＰＣＲ反応の管理は、変性の生じる温度範囲が担体流体の沸点に近いときに課題が生じる。例えば、Ｄｅｎｖｅｒなどの都市において見られるような高い標高においては、典型的な担体流体である水が、摂氏９７度で沸騰する。試料を摂氏約９４〜約９６度に加熱することで、水蒸気および／または溶存ガスの気泡の形成が生じる可能性がある。これらの気泡は、ＰＣＲの際に、特に光学式の検出システムに依存するシステムに課題をもたらす。すなわち、光学式の検出システムは、反応容器および試料を通して光信号を投射する。しかしながら、気泡が光信号を少なくとも部分的に遮断し、および／または歪ませ、さらに／あるいは屈折させる可能性があり、結果として信号の品質が低下し、および／または光検出器においてノイズが導入される可能性がある。先行技術の技術的解決策においては、きわめて精密であり、したがってきわめて高価な熱制御装置を使用して沸騰の発生の防止を試みることによってこの問題を解決しようとしたが、多くの場合にあまり成功していない。
【００１１】
また、気泡は、試料が反応容器へ流入される際、当該試料によって起こる可能性がある乱流中に生じる気泡や、試料が反応容器に導入されるときに反応容器内に閉じ込められる気体のポケットなど、熱循環プロセスの前にも存在しうる。そのような気泡も、熱循環中に生じる気泡と同じ問題を引き起こす。
【００１２】
さらに、流体中に気泡が存在および発生することにより、流体の体積が変化する。これは、気泡の体積の変化が、熱循環中の流体および試料の体積の変化よりもはるかに大きいために生じる。気泡の体積の変化により、流体および流体中のＤＮＡ試料は、反応容器内に流入および反応容器から流出する。このような流体の反応容器への流入および反応容器からの流出により、反応容器内のＤＮＡ試料および／またはＰＣＲ反応剤の濃度が変化し、および／または希薄になる可能性がある。
【００１３】
したがって、信号の品質を向上させるＰＣＲプロセスおよびシステムの必要性が存在する。さらに、試料中の気泡の存在を少なくするＰＣＲシステムの必要性が存在する。
この出願の発明に関連する先行技術文献情報としては、以下のものがある（国際出願日以降国際段階で引用された文献及び他国に国内移行した際に引用された文献を含む）。
（先行技術文献）
（特許文献）
（特許文献１）  米国特許第６，６０５，４７５号明細書
（特許文献２）  米国特許出願公開第２００８／０１９０２２０号明細書
（特許文献３）  米国特許出願公開第２００８／００５６９４８号明細書
（特許文献４）  米国特許出願公開第２００９／０１３０７１９号明細書
（特許文献５）  米国特許出願公開第２００１／００００７５２号明細書
（特許文献６）  米国特許出願公開第２００７／０２３１８５１号明細書
（特許文献７）  米国特許出願公開第２００２／０００１５３９号明細書
（特許文献８）  米国特許出願公開第２００３／００１３１８６号明細書
（特許文献９）  米国特許出願公開第２００４／００４３４７９号明細書
（特許文献１０）  米国特許出願公開第２００４／００４３５０２号明細書
（特許文献１１）  米国特許出願公開第２００４／０１１９９７４号明細書
（特許文献１２）  米国特許出願公開第２００４／０１７８３５７号明細書
（特許文献１３）  米国特許出願公開第２００４／０２１４２００号明細書
（特許文献１４）  米国特許出願公開第２００６／００１９２７４号明細書
（特許文献１５）  米国特許出願公開第２００６／００６８４９９号明細書
（特許文献１６）  米国特許出願公開第２００６／０１８８８９１号明細書
（特許文献１７）  米国特許出願公開第２００７／００３１４９５号明細書
（特許文献１８）  米国特許出願公開第２００８／００５０７８１号明細書
（特許文献１９）  米国特許出願公開第２００８／００８５５４１号明細書
（特許文献２０）  米国特許出願公開第２００８／０２４８５８６号明細書
（特許文献２１）  米国特許出願公開第２００８／０２５４５１７号明細書
（特許文献２２）  米国特許出願公開第２００９／０３２１２５９号明細書
（特許文献２３）  米国特許出願公開第２０１０／００３７６７７号明細書
（特許文献２４）  米国特許出願公開第２０１１／０００９２９１号明細書
（特許文献２５）  米国特許第３，９８３，００６号明細書
（特許文献２６）  米国特許第４，６８６，６０６号明細書
（特許文献２７）  米国特許第４，８１１，２１８号明細書
（特許文献２８）  米国特許第５，５３８，８４８号明細書
（特許文献２９）  米国特許第５，６８１，７４１号明細書
（特許文献３０）  米国特許第５，７５７，０１４号明細書
（特許文献３１）  米国特許第５，８５４，６８４号明細書
（特許文献３２）  米国特許第５，９３５，５２２号明細書
（特許文献３３）  米国特許第５，９３５，５２４号明細書
（特許文献３４）  米国特許第５，９８５，６５１号明細書
（特許文献３５）  米国特許第６，０１５，６７４号明細書
（特許文献３６）  米国特許第６，０２７，６９５号明細書
（特許文献３７）  米国特許第６，１７４，６７０号明細書
（特許文献３８）  米国特許第６，１８０，３７２号明細書
（特許文献３９）  米国特許第６，３０３，２８８号明細書
（特許文献４０）  米国特許第６，３６９，８９３号明細書
（特許文献４１）  米国特許第６，３９５，５０４号明細書
（特許文献４２）  米国特許第６，３９９，３９７号明細書
（特許文献４３）  米国特許第６，５５８，９４７号明細書
（特許文献４４）  米国特許第６，５９７，４５０号明細書
（特許文献４５）  米国特許第６，６５２，８０９号明細書
（特許文献４６）  米国特許第６，８１４，９３４号明細書
（特許文献４７）  米国特許第６，８３８，６８０号明細書
（特許文献４８）  米国特許第６，８５２，９８６号明細書
（特許文献４９）  米国特許第６，８７５，６１９号明細書
（特許文献５０）  米国特許第６，８８１，９６２号明細書
（特許文献５１）  米国特許第６，９１２，０５０号明細書
（特許文献５２）  米国特許第６，９１４，６７７号明細書
（特許文献５３）  米国特許第７，１１９，３４５号明細書
（特許文献５４）  米国特許第７，１２２，７９９号明細書
（特許文献５５）  米国特許第７，３１５，３７６号明細書
（特許文献５６）  米国特許第７，３３２，３４７号明細書
（特許文献５７）  米国特許第７，９３９，３１２号明細書
（特許文献５８）  カナダ特許第１１２５９６７号明細書
（特許文献５９）  中国特許出願公開第１０１２６２９４８号明細書
（特許文献６０）  中国特許出願公開第１０１７１５４２９号明細書
（特許文献６１）  中国特許出願公開第１７２０３３３号明細書
（特許文献６２）  特開２００５−１１７９８７号公報
（特許文献６３）  特開２０１０−３０９２５号公報
（特許文献６４）  国際公開第２００６／１３２６６６号
（特許文献６５）  国際公開第２００８／０２７３９８号
（特許文献６６）  国際公開第２００８／０４５４３１号
（特許文献６７）  国際公開第２００８／１４３９５９号
（特許文献６８）  国際公開第２００９／０３７５１８号
（非特許文献）
（非特許文献１）  ＰＣＴ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０４６１５６；ｆｉｌｉｎｇ  ｄａｔｅ  ０８／０１／２０１１；Ｗｅｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．；Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｒｅｐｏｒｔ  ｍａｉｌｅｄ  ０３／０２／２０１２
（非特許文献２）  ＰＣＴ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ＰＣＴ／ＵＳ２００７／１８９４６；ｆｉｌｉｎｇ  ｄａｔｅ  ０８／２８／２００７；Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＬＬＣ；Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｒｅｐｏｒｔ  ｍａｉｌｅｄ  ０９／１７／２００８
（非特許文献３）  ＰＣＴ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ＰＣＴ／ＵＳ０７／２１５６７；ｆｉｌｉｎｇ  ｄａｔｅ  １０／０９／２００７；Ｆ．Ｌ．  Ｓｐａｎｇｌｅｒ，Ｊｒ．；Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＳｅａｒｃｈＲｅｐｏｒｔ  ｍａｉｌｅｄ  ０８／０５／２００８
（非特許文献４）  ＰＣＴ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ＰＣＴ／ＵＳ０７／２１５６７；ｆｉｌｉｎｇ  ｄａｔｅ  １０／０９／２００７；Ｆ．Ｌ．  Ｓｐａｎｇｌｅｒ，Ｊｒ．；Ｗｒｉｔｔｅｎ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｅａｒｃｈｉｎｇ  Ａｕｔｈｏｒｉｔｙ  ｍａｉｌｅｄ  ０８／０５／２００8
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
従来のＰＣＲシステムおよび手順は、研究室設備の使用および熟練した専門家を必要とする。本発明は、研究室設備および熟練した専門家の必要性を軽減でき、熟練した専門家の存在しない現場での用途において使用することさえ可能な方法および装置に関する。
【００１５】
試料アセンブリとＰＣＲアセンブリとを有する典型的な試料処理モジュールが説明される。試料が、使用時において試料アセンブリへと加えられ、次いで試料アセンブリがＰＣＲアセンブリへと接続される。前記試料はＰＣＲアセンブリ内のＰＣＲ反応バイアルへと導入される。前記ＰＣＲ反応バイアルは、試料中に対象のＤＮＡが存在する場合に、試料の処理および当該試料のＤＮＡ増幅をもたらすのに必要なＰＣＲ反応混合物のすべての成分を含んでいる。
【００１６】
本発明の実施形態は、流動制御装置を使用することにより、ＰＣＲ反応バイアルアセンブリ内の試料を周囲圧力を超えて加圧可能な実施形態を含む。前記流動制御装置は、少なくとも１つのＰＣＲ反応バイアルに流体連通している。前記流動制御装置の一実施形態は、少なくとも第１の流体の通過を少なくとも部分的に許容し、少なくとも第２の流体の通過を少なくとも部分的に阻止する透過膜を含む。流動制御装置の他の実施形態は、種々の形式のバルブを含む。
【００１７】
本発明の上記および他の目的、ならびに特徴は、以下の説明および添付の特許請求の範囲によりさらに自明となるものであり、若しくは以下で説明されるとおりの本発明を実施することによって理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
本発明の上述の利点および特徴ならびに他の利点および特徴をさらに明らかにするために、本発明を、添付の図面に示される本発明の具体的な実施形態を参照することによって、さらに詳しく説明する。これらの図面が、本発明の典型的な実施形態だけを示しており、したがって、これらの図面を、本発明の技術的範囲を限定するものと解釈してはならないことを、理解すべきである。本発明を、添付の図面を使用してさらに具体的かつ詳細に描写および説明する。
【図１】図１は、試料処理モジュールの実施形態の斜視図である。
【図２】図２は、試料アセンブリの側面図である。
【図３】図３は、図２の切断線３−３に沿って得た側面断面図である。
【図４】図４は、図２の試料アセンブリおよびスワブの側面図である。
【図５】図５は、図２の試料アセンブリおよびスワブの別の側面図である。
【図６】図６は、ＰＣＲアセンブリの斜視図である。
【図７】図７は、図６のＰＣＲアセンブリの上面図である。
【図８】図８は、図６のＰＣＲアセンブリの側面断面図である。
【図９】図９は、図６のＰＣＲアセンブリの底面図である。
【図１０】図１０は、図１の試料処理モジュールおよび任意選択による付属の構造体の側面図である。
【図１１】図１１は、図６のＰＣＲアセンブリの実施形態の部分断面図である。
【図１２】図１２は、図６のＰＣＲアセンブリのレンズおよび周囲の構成要素の部分上面図である。
【図１３】図１３は、図１２に対応する底面図である。
【図１４】図１４は、ＰＣＲアセンブリの別の実施形態の断面図である。
【図１５】図１５は、図２の切断線３−３に沿って得た試料アセンブリの別の実施形態に側面断面図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
ポリメラーゼ連鎖反応は、試料中の少量の特定の遺伝物質の特定、試料中に存在する遺伝物質の量の測定、または種々の用途に用いるための十分な遺伝物質の生成などといったいくつかの活動のための前段階として用いられる重要なツールである。
【００２０】
従来の熱循環装置には、いくつかの形態がある。最も一般的な熱循環装置は、大型の中実な熱伝導性のブロックに配置された複数の試料バイアルを利用する。各々のバイアルに、増幅が所望される試料ＤＮＡ（以下では、「テンプレートＤＮＡ」と称することもある）およびポリメラーゼ連鎖反応に必要な化学成分が、手作業で入れられる。ＰＣＲプロセスの各工程が、試験室において熟練した専門家によって実行される。
【００２１】
図１を参照すると、本発明はＰＣＲプロセスを簡略化する試料処理モジュール２０を提供する。当該試料処理モジュールの種々の態様は、２００７年１２月１７日付で出願され、本出願と同時係属中の「ＰＣＲ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｍｏｄｕｌｅ」と題する米国特許出願第１１／９５８，３３２号に開示されており、当該出願は、この参照によりその全体があらゆる目的において本明細書に組み込まれる。試料処理モジュール２０は、試料アセンブリ２２とＰＣＲアセンブリ２４とを有している。試料アセンブリ２２は、生体試料、テンプレートＤＮＡ、またはテンプレートＲＮＡの収集および任意選択による処理のために使用される。ＰＣＲアセンブリ２４は、テンプレートＤＮＡのＰＣＲ増幅の実行に使用される。
【００２２】
図２は、ＰＣＲアセンブリ２４に取り付けられる前の試料アセンブリ２２の側面図である。図２の切断線３−３に沿って得た試料アセンブリ２２の断面図においてより容易に見て取ることができるとおり、図３は円筒形状の内部空洞２８を含む本体部２６を有する試料アセンブリ２２を示す。当該本体部２６は、生体物質の試料あるいはテンプレートＤＮＡまたはＲＮＡを含む担体流体などの溶液を受け入れる開放端部３１を有する。試料アセンブリ２２には、キャップ側ねじ山３３を有する着脱式ねじキャップ３４が有利に提供され、当該キャップ側ねじ山３３は、前記試料アセンブリ２２の本体部２６上の対応する本体側ねじ山２７と螺合する。これにより、空洞２８は使用前の汚染から保護され、一旦試料が前記空洞２８に配置された後で、前記試料アセンブリ２２が前記ＰＣＲアセンブリ２４に固定される前段階で内容物が保護される。当然ながら、摩擦嵌合、シール、留め金（ｃｌａｓｐ）、ラッチなど、前記本体部２６を前記キャップ３４および前記ＰＣＲアセンブリ２４に嵌合させる他の方法も使用可能であり、いずれも本発明の技術的範囲に包含される。空洞２８の上方端部は跳ね防止構造３６を有することができる。
【００２３】
空洞２８の下方端部は可動な栓３０によってシールされており、この可動な栓３０の上端部には前記空洞の内容物の漏出を防止するシール３２が取り付けられている。前記可動な栓３０は、当該可動な栓３０を軸３９に沿って前記空洞２８に対して出し入れする線形アクチュエータ３８に機械的に接続される。いくつかの実施形態においては、線形アクチュエータは、利用者がプランジャ（図示せず）を押すなどして手動で駆動される。他の実施形態においては、線形アクチュエータ３８は、移動信号を生成して当該線形アクチュエータ３８に送信するコントローラ３５に接続される。前記線形アクチュエータ３８は、さまざまな種類の電気モータ、ねじ回し、および同等のシステムのいずれかを有してもよい。前記コントローラ３５は、記載された動作を実行するように書き込まれたプログラムを有する汎用のコンピュータであってよく、および／または特定の命令を含むコンピュータまたはチップであってよい。選択的に、前記コントローラ３５は、移動の距離を線形アクチュエータ３８による可動な栓３０の移動速度に関して計算することが可能な所定の時間後に、前記移動信号の送信を停止し、および／または停止信号を送信する。
【００２４】
選択的に、前記試料アセンブリ２２および／または前記ＰＣＲアセンブリ２４（図８）に動作可能に連結された圧力センサ４１が前記コントローラ３５に接続される。前記圧力センサ４１は、前記空洞２８および／またはＰＣＲ反応バイアル５６（図８）などのＰＣＲアセンブリ２４の１若しくはそれ以上の領域の圧力を反映する圧力信号を生成し、当該圧力信号をコントローラ３５に送信するように構成される。前記コントローラ３５は圧力信号に応答して、前記線形アクチュエータ３８に対して移動信号の送信を停止、および／または前記線形アクチュエータ３８に停止信号を送信する。選択的に、線形アクチュエータ３８によって可動な栓３０に加えられる力を検出し、この力を表す力信号を生成するように構成された力計測器４３が、コントローラ３５に接続される。力計測器の実施形態は、電気式、電気機械式、および機械式のスイッチ、ならびに選択された力または目標の力を満たした場合に状態を変化させる２値デバイスを含む。前記力計測器４３は、力信号をコントローラ３５に送信する。前記コントローラ３５は力信号に応答して線形アクチュエータ３８に対して移動信号の送信を停止し、および／または線形アクチュエータ３８に停止信号を送信する。
【００２５】
可動な栓３０の代わりに、図１５に示した試料アセンブリ１２２の別の実施形態は、試料アセンブリ１２２の本体部１２６に組み込まれ、あるいは機械的に接続された柔軟性のある膜または嚢体１３２を有する。前記柔軟性のある膜１３２は、試料アセンブリ１２２の空洞１２８の内側に向かって撓み、それにより、後述するように、試料を前記ＰＣＲアセンブリ２４内に移動させる点で、可動な栓３０と同様に機能する。前記柔軟性のある膜１３２の使用について考えられる利点は、前記本体部２６に対して前記可動な栓３０が提供するシールと比べ、当該柔軟性のある膜１３２は、前記本体部１２６と結合する境界において高い圧力により生じる漏出の危険性を低減させる点である。線形アクチュエータ３８の代わりとして、前記柔軟性のある膜１３２を空気の圧力、または前記柔軟性のある膜１３２に加えられる他の力を使用して内側に撓ませることができる。
【００２６】
試料アセンブリ２２に、溶液、あるいは乾燥させた成分、試薬、デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）などのベース化学物質、などをあらかじめ入れておくことができ、若しくは試料アセンブリ２２を使用まで空の状態で用意することができる。ＰＣＲ試料処理モジュール２０と共に使用するためにテンプレートＤＮＡを試料アセンブリ２２に配置してもよいが、試料アセンブリ２２では、完全な状態の生体試料が利用できると考えられる。図４および５は、例えば患者の喉から生体試料を採取するために使用されたスワブ３８の使用を示している。スワブ先端部４０は、脆弱部分４２においてスワブ３８から分離され、これにより、前記試料アセンブリ２２の空洞２８に落下する。次いで、２００７年１２月１７日付で出願され、本出願と同時係属中の「Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ＲＮＡ」と題するの米国特許出願第１１／９５８，２９９号（その開示の全体が、この参照によって、あらゆる目的において本明細書に組み込まれる）の方法および装置に従って、前記試料アセンブリ２２に超音波処理が行われ、生体試料からＤＮＡおよびＲＮＡが抽出される。
【００２７】
図６〜９および図１１〜１３は、図１のＰＣＲアセンブリ２４の種々の図を示している。前記ＰＣＲアセンブリ２４は、図３に最も良く示されている試料アセンブリ２２の開放端部３１と、本体側ねじ山２７と嵌合するインターフェイス４４とを有する。図８に最も良く示されているように、Ｏリングおよびゴムガスケットなどのシール要素４６が、ＰＣＲアセンブリ２４と試料アセンブリ２２との間のシールとして機能するように設けられている。
【００２８】
前記インターフェイス４４および前記試料アセンブリ２２は、前記試料アセンブリ２２が前記ＰＣＲアセンブリ２４に固定された後、前記試料アセンブリ２２の取り外しを防止する、図９に示されるロック構造４８を有することが好ましく、これにより、その後、前記試料処理モジュール２０の利用者または取扱者に対して試料アセンブリの内容物が露出されることが防止される。このような機能は、有毒物質を取り扱う場合に特に望ましい。前記ロック構造４８は、例えば、前記試料アセンブリ２２のフランジ５０（図５を参照）と連結するラチェット切り欠き部を選択的に含み、これにより、前記試料アセンブリ２２のＰＣＲアセンブリ２４に対する密閉された取り付けが可能となるが、その後、前記試料アセンブリ２２の前記ＰＣＲアセンブリ２４からの取り外しが阻止される。
【００２９】
前記ＰＣＲアセンブリ２４の流体導管４７は、前記試料アセンブリ２２の空洞２８に収容された流体および試料の移動経路を提供する。フィルタ５２が前記流体導管４７上に設けられ、固体物質が前記試料アセンブリ２２から前記ＰＣＲアセンブリ２４の流体配送チャネル５４に通過することを防止する。換言すると、前記試料アセンブリ２２の空洞２８に収容された増幅すべきテンプレートＤＮＡを含む溶液は、前記可動な栓３０を空洞２８内上方に上昇させることにより、前記フィルタ５２を通過して前記配送チャネル５４に推進され、当該溶液は前記空洞２８から配送チャネル５４に排出される。前記配送チャネル５４は、試料溶液を前記試料アセンブリ２２から１若しくはそれ以上のＰＣＲ反応バイアル５６に送達する。図示のＰＣＲアセンブリ２４は、２つのＰＣＲ反応バイアル５６の使用を示しており、各々のＰＣＲ反応バイアル５６に、参照番号５４ａで示されている前記配送チャネル５４の分岐点を介して試料が提供される。
【００３０】
試料処理モジュール２０は、潜在的に有害な物質の放出を防止するために、前記試料アセンブリ２２が前記ＰＣＲアセンブリ２４に取り付けられた後に定位置に恒久的に固定されることが好ましい。これにより、前記可動な栓が空洞２８内を前進するにつれて、全体的な体積が減少する、包囲された非通気の空間が提供されるため、前記試料アセンブリ２２から前記ＰＣＲ反応バイアル４５への溶液の流れを妨げることなく体積の減少に対応するように機能し、かつ前記ＰＣＲ反応バイアル５６において形成される気泡の通気の場所としても機能する１若しくはそれ以上の空気チャンバーを設けることが好ましい。図示の実施形態では、この目的のために、通気チャネル６０を通じてＰＣＲ反応バイアル５６に連通しているが、それ以外はシールされている通気チャンバー５８を利用する。
【００３１】
図６〜９は、各々のＰＣＲ反応バイアル５６について別々の通気チャンバー５８を使用することを示しているが、これは必須ではなく、他の構成も通気チャンバー５８と同じ機能を提供することができることを理解すべきである。例えば、後述されるように、図１４に示されるＰＣＲアセンブリ１２４の実施形態は、選択的に通気チャンバーを完全に省略し、気体を大気に直接放出できる構造を有する。
【００３２】
各々のＰＣＲ反応バイアル５６は、試料アセンブリ２２から供給されるテンプレートＤＮＡの増幅に必要な種々の構成要素（以下では、「ＰＣＲ反応混合物」と称する）を含む凍結乾燥ビーズ６２を収容することが好ましい。前記凍結乾燥ビーズ６２内のＰＣＲ反応混合物は、テンプレートＤＮＡの増幅に必要なプライマ、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、および任意の他の必要な成分を含む。より好都合な場合、またはＰＣＲ反応混合物の種々の成分を使用まで互いに分離させておく必要がある場合には、２つ以上の凍結乾燥ビーズ６２を提供してもよい。
【００３３】
ＰＣＲ反応混合物は、増幅すべきテンプレートＤＮＡに応じて異なる。ＰＣＲアセンブリ２４は、フォームファクタ（ｆｏｒｍ  ｆａｃｔｏｒ）が予め搭載された状態で提供されるため、当該予め搭載されたＰＣＲアセンブリを識別するラベルを取り付ける必要がある。図８および９は、無線識別（ｒａｄｉｏ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＲＦＩＤ）ラベル６４の使用を示しており、当該ＲＦＩＤラベル６４は、また、試料モジュールと共に用いられる熱循環装置に情報を提供するために使用することができる。前記コントローラ３５によって使用される動作条件およびプロトコルなど、最適な動作条件およびプロトコルは、テンプレートＤＮＡまたはＰＣＲ反応混合物の成分に応じて異なる可能性があるため、前記ＲＦＩＤ識別情報を、前記ＰＣＲ反応混合物の内容物にとって最適な目標温度およびサイクル回数などのパラメータに関する命令を含む熱循環装置のプログラムの選択にも使用することができる。
【００３４】
ＰＣＲは、リアルタイムに基づいて監視および制御することが好ましい。図７は、ＰＣＲ反応バイアル５６の内容物の直接的な目視観察を補助するために、レンズ６６を設けることを示している。図１０は、前記ＰＣＲ反応混合物の蛍光成分を励起するために使用される光学的励起源６８、および蛍光発光をレンズ６６を介して監視する受光装置７０の使用を示している。本出願と同時係属中の「Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ」と題する米国特許出願公開第２００６／０１５２７２７号（この参照により、その全体があらゆる目的において組み込まれる）は、ＰＣＲアセンブリ２４と共に使用するために実装することが可能な蛍光検出システムのさらなる詳細を含んでいる。本出願と同時係属中の「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ  ｆｏｒ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ」と題する米国特許出願公開第２００６／０１８８８９号（この参照により、その全体があらゆる目的において組み込まれる）は、光学検出システムからのリアルタイムの情報を用いたＰＣＲの制御に関する情報を提供している。
【００３５】
上述のように、前記反応バイアル５６を充填する際および／または熱循環プロセス中（特に、試料および担体流体の蒸気圧が変性プロセスが生じる温度に近く、試料の意図しない沸騰の恐れが大きくなる場合）に、試料および担体流体において気泡が形成される可能性がある。例えば、理想的な変性温度は、通常、摂氏約９４度〜摂氏約９６度である。しかしながら、例えばコロラド州Ｄｅｎｖｅｒの標高にある都市での水の沸点は、摂氏約９７度である。したがって、ＤｅｎｖｅｒにおいてＰＣＲ反応中の試料の意図せぬ沸騰の発生を回避するためには、きわめて正確であり、したがって高価な熱制御システムの使用が必要である。加えて、前記担体流体が溶存ガスを溶液中に保持する能力が熱循環の加熱段階において低下するため、熱循環プロセス中に、溶存ガスの気泡が溶液から生じる可能性がある。さらに、流体における気泡の存在および発生によって流体の体積が変化する。これは、熱循環中の気泡の体積の変化が、流体および試料の体積の変化よりもはるかに大きいために生じる。気泡の体積の変化により、流体および流体中のＤＮＡ試料は、反応容器内に流入および反応容器から流出する。そのような流体の反応容器への流入および反応容器からの流出により、反応容器内のＤＮＡ試料および／またはＰＣＲ反応剤の濃度が変化し、および／または希薄になる可能性がある。
【００３６】
これらの気泡が、ＰＣＲ反応を起こす試料の正確な複製および分析に、いくつかの困難を引き起こす可能性がある。第１に、気泡がレンズ６６の下方に形成されることが多く、これらの気泡によって受光装置７０による読み取りが不正確になる可能性があることが、明らかになっている。
【００３７】
気泡の発生後に気泡によって生じうる影響を管理または軽減するために、図１１〜１３は、気泡をレンズから遠ざかるように方向付けて読み取りの精度に影響が及ばないようにするのに有用なレンズ６６および関連構造の構成を示している。図１１は、反応バイアル５６の上方に位置するＰＣＲアセンブリの構造に形成された角度の付いた部分８０の使用を示している。この角度の付いた部分８０は、気泡を前記レンズ６６の下方領域から遠ざける方向に案内し、さらに、通気チャンバー５８に連通する接続用通気チャネル６０に向かって案内するように機能する。図１１および１３の両方を参照することによって最も良く理解されるとおり、涙滴形状の空洞８２を使用することで、通気チャネル６０に向かう気泡の案内がさらに促進される。
【００３８】
前記角度の付いた部分８０は、気泡の形成後に気泡をレンズ６６から遠ざかる方向に導きかつ案内するように機能する一方で、まず第一には、生じる気泡の数を少なくすることが望まれる。さらに、気泡の形成後の個々の気泡の体積を小さくすることが望まれる。そのようにすることで、生じた気泡を導き、あるいは案内する角度の付いた部分８０の効果を向上させることが可能である。
【００３９】
本出願の出願人は、任意選択による流動制御装置５７（図６および８）を反応バイアル５６の下流かつ反応バイアル５６と通気チャンバー５８との間に有することを発見した。一実施形態においては、図６および８の流動制御装置５７は、熱、レーザ、音波などによる溶接によって前記ＰＣＲアセンブリ２４にシールされた透過膜である。図６および８に示した実施形態においては、各々の透過膜５７は、関連する通気チャンバー５８の長さおよび幅と実質的に同じ長さおよび幅である。当然ながら、前記透過膜５７の寸法は必要に応じて選択できることを理解されたい。さらに、前記透過膜の位置は、通気チャネル６０の内径の内側など、異なる位置に配置することができる。
【００４０】
別の実施形態においては、図１１に示されるとおり、透過膜１５７は、反応バイアル５６の壁５５の少なくとも一部分を形成する。前記透過膜１５７が壁５５の一部分を形成する実施形態の利点は、充填および／または加圧のプロセス中に、ＰＣＲ試薬、試料、および／または担体流体が反応バイアル５６から流出したり、あるいは希釈されたりすることを防止できる点にある。さらに、溶液から発生する気泡は当該透過膜を通過して前記通気チャネル６０に向かう。
【００４１】
透過膜５７の実施形態の特性は、それが選択的に透過性である点にある。すなわち、透過膜５７は、水蒸気、ならびに試料および担体流体の溶液から現れる元々は溶存していた気体など、選択された流体について透過性である。同時に、透過膜は、水、担体流体、および他の液体などの他の流体の流れが透過膜５７を通過することを妨げ、および／または防止する。結果として、気体が透過膜５７を通って通気チャンバー５８に流れることができる一方で、試料および担体流体は反応バイアル５６（および、透過膜５７の位置によっては通気チャネル６０）に保持される。
【００４２】
選択的に、前記膜５７および膜の他の実施形態は、図６に示されるように、透過膜５７の両側に圧力差が存在する場合に生じる透過膜５７の膨らみまたは撓みを最小化または軽減するための枠組みまたは構造５９を有する。前記透過膜５７の撓みは、抑制されない場合、通気チャンバー５８および通気チャンバー５８の上流の空間（すなわち、反応バイアル５６および関連の流体チャネル）の相対体積にひずみまたは変化を生じさせかねない。すなわち、前記透過膜５７が膨らむにつれて、より多くの担体流体および試料が反応バイアル５６を通って流れ、より多くのＰＣＲ試薬を反応バイアル５６から通気チャネル６０に押し流す可能性がある。そのような相対体積の変化により、所定の圧力を得るために、より高いまたはより低い流体の圧力を必要とし、結果として予想よりもより多くのまたはより少ない流体が必要となる可能性がある。したがって、リブまたは格子などの枠組みまたは支持構造５９が、選択的に透過膜あるいは透過膜５７の片面または両面に挿入される。前記支持構造５９は、透過膜５７の両側に圧力差があるとき、前記透過膜５７の撓みに抵抗する。いくつかの実施形態においては、前記透過膜５７は、物理的な構造５９よりもむしろ、透過膜の弾性および剛性を改善する荷重支持繊維および他の同様の強化物からなるマトリックス（ｍａｔｒｉｘ）を任意選択で有する。
【００４３】
流動制御装置の他の実施形態は、図１２に示されるように、通気チャネル６０に位置するバルブ６７であり、選択的には、流体配送チャネル５４に位置するバルブ６９である。バルブを部分的におよび／または完全に開き、さらには選択的に閉じるために、利用者により、あるいはコントローラ３５からの指令のもとで、バルブを選択的に動作させることができる。さらに詳しく後述されるように、気体が通気チャンバー５８に放出された後でバルブ６７を閉じることによって、周囲圧力を上回る圧力を前記反応バイアル５６内の試料に加えることができる。バルブの実施形態は、エラストマ要素から作られたバルブを含む。
【００４４】
前記流動制御装置により、前記反応バイアル５６に収容された試料および担体流体に圧力を加えることが可能となる。すなわち、前記反応バイアル５６の内部の圧力を、約大気圧／周囲圧力から、周囲圧力を約８０ポンド／平方インチ（ｐｓｉ）上回る圧力（いくつかの実施形態においては、さらに高い圧力）までなど、周囲圧力よりも高く保つことができる。他の実施形態においては、前記流動制御装置は、反応バイアルの内部の圧力を周囲圧力よりも約１５ｐｓｉ〜約６０ｐｓｉ高い圧力に維持する能力を提供する。
【００４５】
前記透過膜５７を有する流動制御装置の実施形態においては、圧力が以下の方法で提供される。上述のように、前記可動な栓３０が直線的に移動されることにより、試料および付随の担体流体が前記流体配送チャネル５４を通って反応バイアル５６に流入し、前記通気チャネル６０を通って透過膜５７に達するように駆動する。試料および担体流体内の気体、空気、および他の気泡は透過膜を通過するが、一方、試料および担体流体は前記透過膜５７に対して押し付けられる。前記可動な栓３０をさらに前進させることで、反応バイアル５６の内部に周囲を上回る圧力を生成できる。上述のように、前記試料アセンブリ２２および／または前記反応バイアル５６における力信号または圧力信号に応答して、前記可動な栓３０の移動をコントローラによって制御することができる。換言すると、前記流体を透過膜５７に対して押圧させることは、すべての気体は透過膜５７を透過して通気チャンバー５８に流入したと考えられるため、所定の体積または量の試料および担体流体が反応バイアル５６に流入したことを検出するための方法として機能する。この状態が生じ、流体が前記透過膜５７に到達して透過膜を通過できない状態となるとき、検出可能な圧力の上昇が急激に生じる。圧力の上昇がきわめて突然である場合もあり、これは、前記ＰＣＲアセンブリ２４がＰＣＲ反応の実行に向けて適切に満たされたことを示す。このように、圧力の上昇は、部分的に、試料および担体流体が透過膜５７に到達したことを検出するための方法として機能する。
【００４６】
試料および担体流体を透過膜５７に対して押圧させる他の利点は、測定される圧力および／または力の安定性が、漏れを検出する方法として機能する点にある。すなわち、前記可動な栓３０において測定される圧力および／または力が減少する場合、流体が前記試料アセンブリ２２および前記ＰＣＲアセンブリ２４の少なくとも一方から流出させる漏れを示す指標と考えられる。そのような指標により、利用者が原因を調査し、新たな試料を準備し、および／または特に試験対象の試料が有害である場合は、他の予備的手段を取ることが可能となる。
【００４７】
さらに、前記通気チャンバー５８の体積を部分的に調節して、前記反応バイアル５６内の所望の圧力、および前記通気チャンバー５８内に流入する気体によって生じる前記通気チャンバー５８の圧力を得ることができる。すなわち、いくつかの実施形態においては、前記通気チャンバー５８の体積は、前記試料アセンブリ２２の前記空洞２８および前記反応バイアル５６の寸法、前記通気チャンバー５８および前記反応バイアル５６において得るべき所望の圧力または所定の圧力、試料および担体流体の種類、ならびに反応容器において生じる反応の関数である。前記通気チャンバー５８および前記反応バイアル５６の体積ならびに使用時の各々の圧力を調整することによって、前記透過膜５７の両側の圧力差を管理および最適化し、前記透過膜５７の効果を向上させ、圧力差が前記透過膜５７の設計限界を超えないことを確実にすることができる。
【００４８】
いくつかの実施形態においては、前記通気チャンバー５８の体積は十分に小さいため、上述した前記通気チャンバー５８への気体の流入によって十分な背圧が生じ、前記透過膜５７または前記バルブ６７などの流動制御装置の必要性がなくなる。そのような実施形態においては、前記通気チャネル６０が上向き屈曲して通気チャンバー５８に入るように当該通気チャンバー５８は設計され、Ｕ字管の静圧効果を生み出す。前記Ｕ字管は、前記通気チャンバー５８に達した後の気体が前記反応バイアル５６に戻ることを防止する。
【００４９】
周囲圧力を上回る圧力を反応バイアル５６の試料および担体流体に加えることで、いくつかの利点がもたらされる。例えば、前記反応バイアル５６の試料に圧力を加えることで、試料および担体流体の沸点が高くなる。すなわち、すでに述べたコロラド州Ｄｅｎｖｅｒの例では、加圧されない試料は、摂氏約９４度〜摂氏約９６度という所定の変性温度にきわめて近い摂氏約９７度で沸騰する。一方で、加圧された試料は、圧力に応じてより高い温度で沸騰し、ときには摂氏９７度を大きく上回る温度で沸騰する。すなわち、沸点が所望の変性温度から大きく離れて高くなるため、きわめて正確であり、その結果きわめて高価な温度制御方法を使用せずに済ませることが可能になる。そのようにすることで、通常であれば沸騰によって意図せずに生じ、あるいは溶液から現れる可能性がある気泡が、生じることがなく、したがって上述のとおりの気泡が光学走査システムに関して引き起こす問題が回避される。
【００５０】
開示された加圧可能なカートリッジを生成する他の利点は、試料および担体流体をより高い圧力に保つことで、存在する気泡のサイズが小さくなり、熱循環プロセスにおいて生じるそれらの気泡の体積の変化が小さくなる点にある。上述のように、気泡の体積の変化により、試料および担体流体を変化する気泡の体積によって反応バイアルに移動および反応バイアルから移動させうるポンプ作用が生じる。したがって、圧力を使用して気泡の体積を最小にすることで、前記反応バイアル５６のＰＣＲ試薬の希釈を引き起す可能性があるこのポンプ作用が軽減される。さらに、気泡の体積が小さくなることで、気泡が光学走査システムに及ぼす影響も小さくなる。すなわち、気泡が小さいほど、上述のとおりの蛍光検出システムにおいて使用される光信号におけるノイズが少なくなる。
【００５１】
さらに別の利点は、選択的に前記反応バイアル５６が薄いプラスチックで形成され、熱循環プロセスにおいて前記反応バイアル５６および内部の試料を加熱および冷却するために使用される加熱／冷却ブロックとの良好な接触を確実にするテーパを有するように形成される点にある。試料および担体流体を前記反応バイアル５６内でより高い圧力に保持することで、前記反応バイアル５６の薄いプラスチックの壁５５（図１１）がわずかに膨らみ、加熱／冷却ブロックによりぴったりと押し付けられ、結果として熱の伝達および熱循環プロセスの効率が向上する。
【００５２】
図１０は、試料アセンブリに組み合わせられる音波トランスデューサ７２の任意選択での使用を示している。本出願と同時係属中の２００７年１２月１７日付で出願された「Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ＲＮＡ」と題するの米国特許出願第１１／９５８，２９９号は、音波エネルギを使用して生体物質からＤＮＡまたはＲＮＡを解放するための方法および装置を開示している（当該出願は、この参照によりその全体があらゆる目的において組み込まれる）。
【００５３】
すでに述べたように、ＰＣＲプロセスは、ＤＮＡについて作用する。ＤＮＡよりもむしろＲＮＡを検出することが必要な場合には、ＰＣＲの利用が可能となる前に、まずはＲＮＡをＤＮＡに変換しなければならない。本出願と所有者が同一である２００７年４月９日付で出願された「Ｒａｐｉｄ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ＰＣＲ」と題するの米国特許出願第１１／７３３，０３５号（この参照により、その全体が本明細書に組み込まれる）は、テンプレートＲＮＡからのテンプレートｃＤＮＡの形成に使用するための方法および装置を開示し、このプロセスのための適切な成分をＰＣＲ反応混合物に取り入れ、ＰＣＲに先立って転写の工程を実行することをさらに開示している。
【００５４】
試料およびＰＣＲ反応混合物を所望のＰＣＲ目標温度にするために、任意の適切な熱循環装置を使用することができるが、現時点においては、本出願と同時に出願され、本出願と同時係属中の「Ｒａｐｉｄ  Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ」と題する米国特許出願第１１／６９７，９１７号（この参照により、その全体が本明細書に組み込まれる）に開示されている形式の熱循環装置を使用することが好ましい。
【００５５】
本発明の方法および装置は、任意の所望の試料数、可搬性の要件、使用されうるＰＣＲ検出アセンブリの種類、利用される化学成分、処理条件および工程、ならびに本明細書の教示に照らして当業者にとって明らかである他の特徴に鑑みて最適化することができる幅広くさまざまなフォームファクタによって試料を取り扱うことを可能にする。
【００５６】
本発明の例示的な実施形態の種々の態様を説明するために使用した図面は、そのような例示的な実施形態の図式的および概略的な表現であり、本発明を限定するものではなく、必ずしも比例尺で示されているわけではないことを理解されたい。さらに、以上の説明において述べた具体的な詳細は、本発明の完全な理解をもたらすために提示されているにすぎず、本発明をそれらの具体的な詳細を備えずに実施でき、あるいは別の詳細を備えて実施できることは、当業者にとって明らかであろう。多くの点で、ＰＣＲおよび熱循環装置の周知の態様は、本発明を不必要に分かりにくくすることがないよう、特に詳しくは説明されていない。
【００５７】
本発明を、本発明の技術的要旨または基本的特徴から逸脱することなく、他の特定の形態にて具現化することが可能である。上述の実施形態は、あらゆる点で、あくまでも例示として理解されるべきであり、上述の実施形態を、本発明を限定するものとして理解すべきではない。したがって、本発明の技術的範囲は、以上の説明よりもむしろ、添付の特許請求の範囲によって示される。特許請求の範囲の意味および均等の範囲に包含されるすべての変更は、特許請求の範囲の技術的範囲に含まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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