(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
感覚性ニューロパチー疾患の危険性を有しているまたは前記疾患に罹患している対象の特定を補助する方法であって、配列番号２における位置１３３３、１２６３及び１６９８のうちの少なくとも１つの位置における、ＳＰＴＬＣ２遺伝子の少なくとも１つの核酸変異体の存在を検出することを含み、前記少なくとも１つの核酸変異体の存在により、対象が感覚性ニューロパチー疾患の危険性を有しているかまたは前記疾患に罹患しているかが特定される、方法。
【請求項２】
核酸変異体が、少なくとも１つのヌクレオチドの置換、欠損および／または挿入である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
感覚性ニューロパチー疾患が、ＨＳＡＮ１型、ＨＳＡＮ２型、ＨＳＡＮ３型、ＨＳＡＮ４型およびＨＳＡＮ５型からなる群から選択される遺伝性感覚性自律神経性ニューロパチー疾患である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
少なくとも１つの他の遺伝子における核酸変異体の有無を検出することをさらに含む、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
他の遺伝子が、ＳＰＴＬＣ１、ＲＡＢ７Ａ、ＷＮＫ１／ＨＳＮ２、ＩＫＢＫＡＰ、ＦＡＭ１３４Ｂ、ＮＴＲＫ１、ＮＧＦβおよびＣＣＴ５からなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
核酸変異体の存在の検出が、以下の方法：突然変異スキャンニングのための、ハイブリダイゼーション、シークエンシング、ＰＣＲ、プライマー伸長法、マルチプレックスライゲーション依存性プローブ増幅（ＭＬＰＡ）、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）、制限酵素部位解析または高解像度融解曲線（ＨＲＭ）解析の少なくとも１つによって行われる、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
感覚性ニューロパチー疾患の危険性を有しているまたは前記疾患に罹患している対象を特定するためのキットであって、
（ａ）配列番号２における位置１３３３、１２６３及び１６９８のうちの少なくとも１つの位置における、ＳＰＴＬＣ２遺伝子の１つまたは複数の核酸変異体の有無を検出するための手段、および
（ｂ）ステップ（ａ）の手段で検出された核酸変異体から、対象が感覚性ニューロパチー疾患に関連する兆候の危険性を有しているかまたは前記兆候を有しているかを決定するための手段
を含むキット。
【請求項８】
ステップ（ａ）の手段が、標的ＳＰＴＬＣ２核酸の検出に適した少なくとも１つのオリゴヌクレオチドおよび／または標的ＳＰＴＬＣ２核酸の増幅に適した少なくとも１つのオリゴヌクレオチド対である、請求項７に記載のキット。
【請求項９】
ＳＰＴＬＣ２核酸における１つまたは複数の核酸変異体の存在を検出するための、１５から３０ヌクレオチドからなる単離オリゴヌクレオチドまたはこの相補鎖であって、ここで、前記オリゴヌクレオチドは、配列番号２の位置１３３３、１２６３又は１６９８における置換を含む配列に特異的にハイブリダイズする、オリゴヌクレオチド又はその相補鎖。
【請求項１０】
位置１３３３、１２６３又は１６９８を含む配列番号２の配列に特異的にハイブリダイズする１５から３０ヌクレオチドからなる単離オリゴヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、感覚性ニューロパチー関連疾患の危険性を有しているまたはこれに罹患している対象を特定する方法およびキットに関する。特に本発明は、前記感覚性ニューロパチーを引き起こす、ＳＰＴＬＣ２遺伝子の突然変異を決定することに基づく。
【背景技術】
【０００２】
遺伝性感覚性ニューロパチー（ＨＳＮ）は、３つのカテゴリーに一般に細分される遺伝性末梢性ニューロパチーの一部をなし、運動または感覚末梢神経系の選択的または優勢な関与を示す。最も一般的なバリアントは、シャルコー・マリー・ツース症候群とも称される遺伝性運動感覚性ニューロパチー（ＨＭＳＮ）であり、このバリアントでは、運動神経および感覚神経の両方が影響を受ける（Ｄｙｃｋら１９９３）。末梢運動神経系のみが影響を受ける場合は、このニューロパチーは、遠位型遺伝性運動ニューロパチーとして分類される（Ｈａｒｄｉｎｇ１９９３）。これに対して、感覚機能障害はＨＳＮにおいて一般的である。自律神経系が様々な程度でＨＳＮに関与するので、これらは遺伝性感覚性自律神経性ニューロパチー（ＨＳＡＮ）と称されることが多い（Ｄｙｃｋ１９９３）。
【０００３】
ＨＳＮ／ＨＳＡＮは、臨床的および遺伝的に不均一な障害の一群である。患者は通常、顕著な遠位感覚消失を示し、一部の患者では痛みに対する明らかな無感覚を伴う。顕著な遠位感覚消失は、足および手に慢性の潰瘍をもたらすことが多く、時に、広範な軟部組織感染症、足指および手指の切断または稀に四肢のより近位部の切断さえ要する骨髄炎などの重篤な合併症を引き起こす（Ｄｙｃｋ１９９３）。無汗、発熱、血圧変動および胃腸障害などの自律神経機能障害がある患者もいる。電気生理学的に感覚ニューロンの軸索神経損傷が見つかることが多いが、さらに脱髄がある可能性もある（Ａｕｅｒ−Ｇｒｕｍｂａｃｈら２００３）。
【０００４】
ＨＳＡＮは、常染色体優性（ＡＤ）または常染色体劣性（ＡＲ）の形質として遺伝され得る。孤立性患者も述べられている（Ｄｙｃｋ１９９３、Ａｕｅｒ−Ｇｒｕｍｂａｃｈ２００４）。ＨＳＡＮのＡＤ型は、著しい感覚障害ならびに最小限の自律神経性障害および不定の運動障害を伴って１０歳代または２０歳代に通常現れるが、一方ＡＲ  ＨＳＡＮは、著しい感覚異常および自律神経異常を伴う先天性症候群またはほとんど純粋な自律神経障害のどちらかとして現れる（Ｖｅｒｐｏｏｒｔｅｎら２００６ａ）。
【０００５】
遺伝性感覚性ニューロパチーのＨＳＡＮ  Ｉ−Ｖ型への分類（Ｄｙｃｋ、１９９３）は、発症年齢、遺伝様式および付加的な特徴に基づいて行われた。分子遺伝学的研究によって、少なくとも７つの遺伝子がＨＳＮ／ＨＳＡＮの異なる型に関係していることが示された（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｏｌｇｅｎ．ｕａ．ａｃ．ｂｅ／ＣＭＴＭｕｔａｔｉｏｎｓ／）。２つの遺伝子がＡＤ  ＨＳＡＮと関係していた。セリンパルミトイルトランスフェラーゼ（ＳＰＴ）の長鎖サブユニット１（ＳＰＴＬＣ１）のミスセンス突然変異は、成人発症型感覚性ニューロパチーであるＨＳＡＮ  Ｉ型を罹患している家族および個人において発見された（Ｂｅｊａｏｕｉら２００１、Ｄａｗｋｉｎｓら２００１）。低分子ＧＰＴａｓｅの後期エンドソームタンパク質ＲＡＢ７の突然変異は、ＣＭＴ２Ｂの原因となる（Ｖｅｒｈｏｅｖｅｎら２００３、Ｍｅｇｇｏｕｈら２００６）。ＷＮＫ１／ＨＳＮ２遺伝子（リジン（Ｋ）−１を有さないプロテインキナーゼ／遺伝性感覚性ニューロパチー２型）およびＦＡＭ１３４Ｂの突然変異は、早発性の潰瘍断節性感覚性ニューロパチーであるＡＲ  ＨＳＡＮ  ＩＩ型の原因となる（Ｌａｆｒｅｎｉｅｒｅら２００４、Ｋｕｒｔｈら２００９）。家族性自律神経失調症またはライリー・デイ症候群としても知られるＨＳＡＮ  ＩＩＩ型は、典型的な顕著な自律神経性症状の発現を伴って若年期に現れ、Ｂ細胞におけるκ軽鎖ポリペプチド遺伝子エンハンサーインヒビター、キナーゼ複合体関連タンパク質（ｔｈｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｋａｐｐａ−ｌｉｇｈｔ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｇｅｎｅ  ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｉｎ  Ｂ  ｃｅｌｌｓ，ｋｉｎａｓｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＩＫＢＫＡＰ）の突然変異によって引き起こされる（Ｓｌａｕｇｅｎｈａｕｐｔら２００１）。神経栄養因子チロシンキナーゼ受容体１型（ＮＴＲＫ１）の突然変異は、痛みに対する先天性の無感覚、無汗および精神遅滞（ＣＩＰＡまたはＨＳＡＮ  ＩＶ型）を罹患している家族において報告されている（Ｉｎｄｏら１９９６）。ＣＩＰＡと密接な関連がある表現型であるが、精神発達が正常であり明白な無汗が少ないＨＳＡＮ  Ｖ型は、神経栄養因子β（ＮＧＦＢ）の突然変異によって引き起こされる可能性があり（Ｅｉｎａｒｓｄｏｔｔｉｒら２００４）、ＮＴＲＫ１の突然変異によっても引き起こされる可能性がある（Ｈｏｕｌｄｅｎら２００１、Ｅｉｎａｒｓｄｏｔｔｉｒら２００４）。これら６つのＨＳＡＮ亜型の他に、他と異なる付加的な特徴を有する他の型が存在し、例えば胃食道逆流および咳を伴うＨＳＡＮ（Ｋｏｋら２００３）および痙性対麻痺を伴うＨＳＡＮ（Ｂｏｕｈｏｕｃｈｅら２００６ｂ）が存在する。最近、この最後の型に関する遺伝子がサイトゾルのシャペロニン含有ｔ複合体ペプチド１（ＣＣＴ５）として同定された（Ｂｏｕｈｏｕｃｈｅら２００６ａ）。
【０００６】
近年のＨＳＡＮ型に関する原因遺伝子の同定は、こうした珍しいニューロパチーの病因に対する予備的な洞察を提供したが、基本的な根底にある病理機序はまだ明らかにされていない（Ｖｅｒｈｏｅｖｅｎら２００６）。既存の分類をさらに改善するためにおよびこうした障害の分子基盤に対するより良い洞察を得るために、既知または新規な遺伝的欠陥を有するＨＳＡＮ病の家族および患者に関するさらなる説明が必要とされる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｄｙｃｋら１９９３
【非特許文献２】Ｈａｒｄｉｎｇ１９９３
【非特許文献３】Ｄｙｃｋ１９９３
【非特許文献４】Ａｕｅｒ−Ｇｒｕｍｂａｃｈら２００３
【非特許文献５】Ａｕｅｒ−Ｇｒｕｍｂａｃｈ２００４
【非特許文献６】Ｖｅｒｐｏｏｒｔｅｎら２００６ａ
【非特許文献７】ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｏｌｇｅｎ．ｕａ．ａｃ．ｂｅ／ＣＭＴＭｕｔａｔｉｏｎｓ／
【非特許文献８】Ｂｅｊａｏｕｉら２００１
【非特許文献９】Ｄａｗｋｉｎｓら２００１
【非特許文献１０】Ｖｅｒｈｏｅｖｅｎら２００３
【非特許文献１１】Ｍｅｇｇｏｕｈら２００６
【非特許文献１２】Ｌａｆｒｅｎｉｅｒｅら２００４
【非特許文献１３】Ｋｕｒｔｈら２００９
【非特許文献１４】Ｓｌａｕｇｅｎｈａｕｐｔら２００１
【非特許文献１５】Ｉｎｄｏら１９９６
【非特許文献１６】Ｅｉｎａｒｓｄｏｔｔｉｒら２００４
【非特許文献１７】Ｈｏｕｌｄｅｎら２００１
【非特許文献１８】Ｋｏｋら２００３
【非特許文献１９】Ｂｏｕｈｏｕｃｈｅら２００６ｂ
【非特許文献２０】Ｂｏｕｈｏｕｃｈｅら２００６ａ
【非特許文献２１】Ｖｅｒｈｏｅｖｅｎら２００６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
（発明の要旨）
本発明は、ＳＰＴＬＣ２遺伝子における核酸変異と感覚性ニューロパチーとの間に明確な関連を初めて確認した。したがって、前記新規遺伝子マーカーは、感覚性ニューロパチー関連疾患もしくは障害を発症する危険性に関して信頼できる診断または予測を提供する。こうした遺伝的変異の同定は、治療に対する応答が個体間で変化する理由に関する洞察を提供するだけでなく、改善されたリスク評価および個別化医療の適用を通して、罹患率および死亡率を潜在的に減少させる可能性もある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
したがって、本発明は、感覚性ニューロパチー疾患の危険性を有しているまたはこれに罹患している対象を特定する方法およびキットであって、ＳＰＴＬＣ２遺伝子における少なくとも１つの核酸変異体の有無を検出することを含み、少なくとも１つの核酸変異体の存在が、対象が感覚性ニューロパチー疾患の危険性を有しているかまたはこれに罹患しているかを特定する方法およびキットを提供する。ＳＰＴＬＣ２遺伝子の目的の特異的領域は、ＳＰＴＬＣ２遺伝子のコード領域である。感覚性ニューロパチー疾患は、好ましくは、ＨＳＡＮ１型、ＨＳＡＮ２型、ＨＳＡＮ３型、ＨＳＡＮ４型およびＨＳＡＮ５型からなる群から選択される遺伝性感覚性自律神経性ニューロパチー疾患である。
【００１０】
本発明の方法およびキットは、感覚性ニューロパチー疾患の危険性を有しているまたはこれに罹患している対象を特定するための他の方法と組み合わせて実施され得る。好ましい実施形態において、方法およびキットは、任意の他の遺伝子における核酸変異体または他のマーカーの有無を検出する方法と組み合わせて実施される。
【００１１】
感覚性ニューロパチー関連疾患または障害の診断および／または予測のための任意の検出方法は、本発明の一部を形成する。本発明の核酸変異体の有無を検出するための好ましい方法および手段は、突然変異スキャンニングを目的とする、ハイブリダイゼーション、シークエンシング、ＰＣＲ、プライマー伸長法、ＭＬＰＡ、ＯＬＡ、制限酵素部位解析もしくは高解像度融解曲線解析またはそれらの組み合わせである。
【００１２】
本発明のさらなる実施形態は、感覚性ニューロパチー疾患の危険性を有しているまたはこれに罹患している対象に対する適切な治療または治療剤を選択する方法であって、本発明の方法および適切な治療または治療剤の選択によって感覚性ニューロパチー疾患の状態を判定することおよび適切な治療または治療剤を選択することを含む方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１−１】スフィンゴ脂質のデノボ生合成経路を示す図である。左側：Ｌ−セリンを伴う標準経路、右側Ｌ−アラニンを伴う疾患関連の別経路。Ｌ−セリンの代わりにＬ−アラニンと縮合すると、Ｃ１ヒドロキシル基を欠く代謝産物が生じ、ＳＬ複合体への変換および分解を阻害する。本経路の酵素を緑で示す。ミリオシンおよびフモニシンＢ１は、ＳＰＴ酵素およびＣｅｒＳ酵素をそれぞれ阻害するカビ毒である。ＳＰＴ：セリンパルミトイルトランスフェラーゼ、ＰＬＰ：ピリドキサール−５’−リン酸、ＫＳＡ：３−ケト−スフィンガニン、ＣｅｒＳ：セラミド合成酵素、ＤＥＳ：ジヒドロセラミド不飽和化酵素、ＳＯ：スフィンゴシン、ＳＬ：スフィンゴ脂質。
【図１−２】スフィンゴ脂質のデノボ生合成経路を示す図である。左側：Ｌ−セリンを伴う標準経路、右側Ｌ−アラニンを伴う疾患関連の別経路。Ｌ−セリンの代わりにＬ−アラニンと縮合すると、Ｃ１ヒドロキシル基を欠く代謝産物が生じ、ＳＬ複合体への変換および分解を阻害する。本経路の酵素を緑で示す。ミリオシンおよびフモニシンＢ１は、ＳＰＴ酵素およびＣｅｒＳ酵素をそれぞれ阻害するカビ毒である。ＳＰＴ：セリンパルミトイルトランスフェラーゼ、ＰＬＰ：ピリドキサール−５’−リン酸、ＫＳＡ：３−ケト−スフィンガニン、ＣｅｒＳ：セラミド合成酵素、ＤＥＳ：ジヒドロセラミド不飽和化酵素、ＳＯ：スフィンゴシン、ＳＬ：スフィンゴ脂質。
【図２−１】ＳＰＴＬＣ２のミスセンス突然変異がＨＳＡＮ−Ｉと関係することを示す図である。（Ａ）家族ＣＭＴ−１１１７（発端者を矢印で示す。）およびＣＭＴ−１０４４におけるＧ３８２Ｖ突然変異の配列トレースファイル。（Ｂ）Ｖ３５９Ｍ突然変異を有する孤立性患者ＣＭＴ−７４７．Ｉ：１。（Ｃ）デノボＩ５０４Ｆ突然変異を有する患者ＣＭＴ−６３５．ＩＩ：１。
【図２−２】ＳＰＴＬＣ２のミスセンス突然変異がＨＳＡＮ−Ｉと関係することを示す図である。（Ａ）家族ＣＭＴ−１１１７（発端者を矢印で示す。）およびＣＭＴ−１０４４におけるＧ３８２Ｖ突然変異の配列トレースファイル。（Ｂ）Ｖ３５９Ｍ突然変異を有する孤立性患者ＣＭＴ−７４７．Ｉ：１。（Ｃ）デノボＩ５０４Ｆ突然変異を有する患者ＣＭＴ−６３５．ＩＩ：１。
【図３】生物種間における突然変異の保存および細菌ＳＰＴ酵素の構造図を示す図である。（Ａ）ヒト（ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ））、マウス（ムス・ムスクルス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ））、ラット（ラッツス・ノーウィジアス（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ））、ウシ（ボース・タウルス（Ｂｏｓ  Ｔａｕｒｕｓ））、ゼブラフィッシュ（ダニオ・レリオ（Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ））、ハエ（ドロソフィラ・メラノガスター（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ））、パン酵母（サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））およびＳＰＴ活性を有するグラム陰性菌（スフィンゴモナス・パウシモビリス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓ））由来のＳＰＴＬＣ２相同分子種のＣｌｕｓｔａｌＷによるタンパク質マルチプルアライメント。（Ｂ）スフィンゴモナス・パウシモビリスのＳＰＴホモ二量体（ＰＤＢ  ＩＤ：２ＪＧＴ）のＳＰＴ構造であり、二量体サブユニットを赤および青で示す。強調されたアミノ酸（Ｖ２４６、Ｇ２６８およびＧ３８５）は、ＨＳＡＮ−Ｉ患者で突然変異を起こしたアミノ酸（Ｖ３５９、Ｇ３８２およびＩ５０４）に対応する（パネルＡのアライメントを参照されたい。）。
【図４】ＨＳＡＮ−Ｉ関連ＳＰＴＬＣ２突然変異型のインビトロでのＳＰＴ活性測定を示すグラフである。（Ａ）フモニシンＢ１阻害アッセイ。野生型または突然変異型のＳＰＴＬＣ２を安定に発現しているＨＥＫ２９３細胞のＳＰＴ活性を、フモニシンＢ１処理後のＳＡ蓄積を測定することによって解析する。野生型ＳＰＴＬＣ２の安定な発現は、ＳＰＴ活性を８．５倍増大させる（ｐ＝３．２４Ｅ−５）が、Ｇ３８２Ｖ突然変異型はＳＰＴ活性を増大しない（ｐ＝０．１８）。Ｖ３５９Ｍ突然変異およびＩ５０４Ｆ突然変異は活性を有意に増大する（それぞれｐ＝０．０００６３および０．０００６４）が、野生型ＳＰＴＬＣ２と程度が異なる。ＥＧＦＰをトランスフェクションした細胞は対照として機能した。（Ｂ）放射性ベースのＳＰＴ活性アッセイ。野生型または突然変異型のＳＰＴＬＣ２を安定的に発現しているＨＥＫ２９３細胞のＳＰＴ活性を、１４Ｃ−標識Ｌ−セリンの取り込みをインビトロで測定することによって決定した。野生型ＳＰＴＬＣ２の安定発現はＳＰＴ活性を著しく増大させるが、Ｇ３８２Ｖの発現はＳＰＴ活性を基礎レベルより上には高めない。Ｖ３５９Ｍ突然変異型またはＩ５０４Ｆ突然変異型の発現は、ＳＰＴ活性を上昇させるが、野生型ＳＰＴＬＣ２ほど強烈ではない。右側のバーは、ＳＰＴ阻害剤ミリオシン存在下におけるＳＰＴ活性を示す（負の対照、図１を参照されたい。）。ＣＰＭ：毎分当たりのカウント。＊＊＊Ｐ値＜０．００１、ＳＡ：スフィンガニン。データは、標準偏差を表すエラーバーとともに平均として示す。エラーバーおよび標準偏差は、３回の独立した実験に基づいて計算した。
【図５】異なるＹＣｐｌａｃ１１１＿ＬＣＢ２コンストラクトで相補されたヘテロ接合型ＬＣＢ２／ｌｃｂ２：：ＫａｎＭＸ系統の四分子分離による、Ｓ．セレビシエにおける遺伝的相補性試験を示す図である。フィトスフィンゴシンなしの３７℃のＹＰＤ培地上に４つの等しい大きさのコロニーが出現したことで示されるように、野生型ＬＣＢ２はＬＣＢ２欠損を相補することができる。Ｖ３４６Ｍ（ＳＰＴＬＣ２のＶ３５９Ｍに対応する。）およびＩ４９１Ｆ（ＳＰＴＬＣ２のＩ５０４Ｆに対応する。）のＬＣＢ２突然変異型も内在性のＬＣＢ２の不在を救済する。しかし、Ｇ３６９Ｖ（ＳＰＴＬＣ２のＧ３８２Ｖに対応する。）またはＫ３６６Ｔ（ドミナントネガティブ）突然変異型で形質転換された酵母は、内在性のＬＣＢ２が存在する場合のみコロニーを生じ、このことは、これらの突然変異型がＬＣＢ２欠損を補完できないことを示す。
【図６】ＳＰＴＬＣ２突然変異がＳＰＴの酵素親和性に影響を及ぼすことを示すグラフである。（Ａ）抽出した脂質の酸および塩基加水分解アッセイ後に、野生型または突然変異型のＳＰＴＬＣ２を安定的に発現しているＨＥＫ２９３細胞の１−デオキシ−ＳＡレベルを測定する。野生型ＳＰＴＬＣ２の発現は細胞の１−デオキシ−ＳＡレベルを変化させない（ｐ＝０．５５）が、３つのＨＳＡＮ−Ｉ関連突然変異型全ては、１−デオキシ−ＳＡレベルを有意に上昇させる（Ｖ３５９Ｍに関してｐ＝０．００２５、Ｇ３８２Ｖに関してｐ＝０．０００９３、Ｉ５０４Ｆに関してｐ＝０．０００４８）。（Ｂ）ＨＳＡＮ−Ｉ患者のリンパ芽球様細胞系の１−デオキシ−ＳＡレベル。２人のＨＳＡＮ−Ｉ患者ＣＭＴ−１０４４．Ｉ：２（Ｇ３８２Ｖ突然変異）およびＣＭＴ−６３５．ＩＩ：１（Ｉ５０４Ｆ突然変異）は、ＣＭＴ−６３５．ＩＩ：１の罹患していない両親および血縁関係にない２人の対照個体と比較して、高レベルの１−デオキシ−ＳＡを示す。残念ながら、Ｖ３５９Ｍ突然変異を有する患者ＣＭＴ−７４７．Ｉ：１からはリンパ芽球細胞を得ることができなかった。＊＊＊Ｐ値＜０．００１、ＳＡ：スフィンガニン。データは標準偏差を表すエラーバーとともに平均として示す。エラーバーおよび標準偏差は、３回の独立した実験に基づいて計算した。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
定義
本発明は、特定の実施形態に関しておよび特定の図面を参照して説明されるが、本発明はこれらに限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。特許請求の範囲における如何なる参照符号も範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。説明する図面は概略的なものに過ぎず、限定的でない。図面において、いくつかの要素のサイズは説明のため誇張されており、正確な縮尺で示されていない可能性がある。本明細書および特許請求の範囲において「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語が使用される場合、これは他の要素またはステップを排除するものではない。単数名詞に言及する際、不定冠詞または定冠詞、例えば「１つ（ａ）」または「１つ（ａｎ）」、「その（ｔｈｅ）」が使用される場合、何か他に特記されていない限り、これはその名詞の複数形を含む。
【００１５】
本明細書で別段定義しない限り、本発明に関連して使用される科学技術の用語およびフレーズは、当業者に一般に理解される意味を持つものとする。さらに、文脈によって別段必要とされない限り、単数形の用語は複数形の用語を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。一般に、本明細書に記載される生化学、酵素学、分子細胞生物学、微生物学、遺伝学およびタンパク質核酸化学ならびにハイブリダイゼーションに関連して用いられる用語およびこれらの技術は、当技術分野において周知であり一般に使用されているものである。本発明の方法および技術は、別段示されない限り、当技術分野において周知の従来の方法に従って、ならびに本明細書の全体にわたって引用され議論される種々の一般的な参考文献およびより特定の参考文献に記載されるように、一般に実施される。例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋらＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９９２、および２００２までの補遺）；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９９０）；ＴａｙｌｏｒおよびＤｒｉｃｋａｍｅｒ、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ（２００３）；Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍａｎｕａｌ、Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．、Ｆｒｅｅｈｏｌｄ，ＮＪ；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ａ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、第Ｌ巻  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ（１９７６）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ａ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、第π巻、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ（１９７６）を参照されたい。
【００１６】
本明細書で使用する場合、「ポリペプチド」、「タンパク質」、「ペプチド」という用語は互換的に使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を指し、コード化アミノ酸および非コード化アミノ酸、化学的もしくは生化学的に修飾されたまたは誘導体化されたアミノ酸ならびに修飾されたペプチド骨格を有するポリペプチドを含むことができる。
【００１７】
本明細書で使用する場合、「核酸」、「ポリヌクレオチド」、「ポリ核酸」という用語は互換的に使用され、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドのどちらかまたはそれらの類似体である任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドは任意の三次元構造を有してもよく、既知または未知の任意の機能を果たすことができる。ポリヌクレオチドの非限定例には、遺伝子、遺伝子断片、エキソン、イントロン、伝令ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、制御領域、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブおよびプライマーが含まれる。核酸分子は、直鎖状でも環状でもよい。約１００ヌクレオチドの長さまでの核酸は、しばしばオリゴヌクレオチドとも称される。
【００１８】
本明細書で使用する場合、「対立遺伝子」という用語は、特定の染色体上の位置（遺伝子座）における遺伝子またはＤＮＡ配列のいくつかの選択的形態（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｆｏｒｍｓ）のうちの１つである。各常染色体の遺伝子座において、１個体は父親から遺伝したものと母親から遺伝したものの２つの対立遺伝子を有する。「遺伝子型」という用語は、全体または特定の遺伝子座のどちらかの１個体の遺伝子構成を意味する。
【００１９】
本明細書で使用する場合、「ホモ接合型」という用語は、２つの同一対立遺伝子を遺伝子座に有することを指す。「ヘテロ接合型」という用語は、異なる対立遺伝子を遺伝子座に有することを指す。
【００２０】
本明細書で使用する場合、「障害」および「疾患」という用語は互換的に使用される。
【００２１】
詳細な説明
膨大な数にのぼる患者における既知のＨＳＡＮ遺伝子の系統的スクリーニングでは、発端者の１９％でのみ病原性突然変異が認められた（Ｒｏｔｔｈｉｅｒら２００９）。このことは、他の疾患関連遺伝子の関与を示唆する。大規模なＨＳＡＮコホートにおいて一連の機能的候補遺伝子をスクリーニングすることによって、本発明者らは、典型的なＨＳＡＮ  Ｉ型の表現型を呈する４人の発端患者において、スフィンゴ脂質のデノボ生合成経路の最初の酵素であり律速酵素であるセリンパルミトイルトランスフェラーゼ（ＳＰＴ）のＳＰＴＬＣ２サブユニット中に３つのヘテロ接合型ミスセンス突然変異を同定した。ＳＰＴＬＣ２はＨＳＡＮ  Ｉ型の原因から以前に除外されていたので（Ｄａｗｋｉｎｓら２００２）、このことは特に驚くべきことである。さらに、これらの突然変異は部分的なＳＰＴ活性の喪失から完全なＳＰＴ活性の喪失まで引き起こし、神経毒性代謝産物である１−デオキシスフィンガニン形成の原因となる。したがって、本発見はＨＳＡＮ関連疾患の遺伝的異質性を拡大し、ＳＰＴの欠損を伴うＨＳＡＮニューロパチーの群を増大させる。
【００２２】
したがって、第一の態様によれば、本発明は、感覚性ニューロパチー疾患の危険性を有しているまたはこれに罹患している対象を特定する方法であって、ＳＰＴＬＣ２遺伝子またはそれらの一部において少なくとも１つの核酸変異体の有無を検出することを含み、少なくとも１つの核酸変異体の存在が、対象は感覚性ニューロパチー疾患の危険性を有しているかまたはこれに罹患しているかを特定する方法に関する。
【００２３】
本明細書で使用する場合、「ＳＰＴＬＣ２遺伝子」という用語は、セリンパルミトイルトランスフェラーゼ（ＳＰＴ）の第２サブユニットをコードする遺伝子を指す。ＳＰＴ酵素はマルチサブユニット構造であり、ＳＰＴＬＣ１とＳＰＴＬＣ２またはＳＰＴＬＣ３のどちらかとの二量体サブユニットからなる（Ｈｏｒｎｅｍａｎｎら２００７）。ＳＰＴ酵素は小胞体（ＥＲ）に付随し、そこでＳＰＴ酵素はピリジキサール（ｐｙｒｉｄｉｘａｌ）−５’リン酸（ＰＬＰ）依存性のＬ−セリンとパルミトイルＣｏＡとの縮合を触媒する。これは、スフィンゴ脂質のデノボ生合成における最初のステップであり律速ステップである（図１も参照されたい。）。スフィンゴ脂質は全ての真核細胞の必須成分であり、真核細胞においてスフィンゴ脂質は膜構造および細胞内シグナル伝達において重要な役割を果たす。
【００２４】
本発明で示す核酸およびタンパク質の参照配列は、当業者に周知であるように、ＧｅｎｅＢａｎｋ（ＮＣＢＩ）から取得され、それらの各受託番号によって示される。配列変異の記載に関する用語の更新は、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｖａｒｉａｔｉｏｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙのウェブサイト上で頻繁に提供される。したがって、コーディングＤＮＡおよびＲＮＡの参照配列のヌクレオチドナンバリングは以下の通りである。ヌクレオチド＋１はＡＴＧ翻訳開始コドンのＡであり、ヌクレオチド０は存在せず、ＡＴＧ翻訳開始コドンのヌクレオチド５’は−１である。ゲノムの場合は「ｇ．」が、またはｃＤＮＡ参照配列が使用される場合は「ｃ．」がヌクレオチド番号の前に付く。置換は「＞」で表される。同様に、タンパク質参照配列が使用される場合は「ｐ」がアミノ酸番号の前に付く。
【００２５】
ヒトＳＰＴＬＣ２遺伝子（セリンパルミトイルトランスフェラーゼ長鎖サブユニット２）は、１４番染色体の座位１４ｑ２４．３に位置し、１２のエキソンを含む。ヒトＳＰＴＬＣ２の参照核酸配列はＮＣ＿００００１４．８（ｇＤＮＡ；バージョン：ＮＣ＿００００１４．８  ＧＩ：２２４５８９８０５；リージョン：相補鎖（７７９７３２６９−７８０８３１０９）；配列番号１）またはＮＭ＿００４８６３（ｃＤＮＡ；バージョン：ＮＭ＿００４８６３．２  ＧＩ：３１８８１６４６；配列番号２）である。ヒトＳＰＴＬＣ２遺伝子にコードされる参照タンパク質配列はＮＰ＿００４８５４（バージョン：ＮＰ＿００４８５４．１  ＧＩ：４７５８６６８；配列番号３）である。
【００２６】
本発明で使用する場合、「核酸変異体」または「多型」または「変異体」という用語は、ＳＰＴＬＣ２遺伝子のある位置の核酸配列が１つまたは複数の参照核酸配列に対して異なっていることを意味する。最も単純な核酸多型は一ヌクレオチドに係わる多型、すなわち一塩基多型またはＳＮＰである。核酸多型には、１つまたは複数の参照核酸の一次ヌクレオチド配列に対する、調査中核酸の一次ヌクレオチド配列における任意の数の連続したおよび／または非連続の差異がさらに含まれる。「多形位置」または「位置」という用語は、核酸多型が生じる核酸の位置を指す。少なくとも１つのこうした多型を含む核酸配列は、「多形核酸配列」、「多形ポリヌクレオチド」、「多形配列」などと称される。多型または核酸変異体は、挿入、欠損、置換、タンデムリピートまたは類似のものであり得る。
【００２７】
本明細書で使用する場合、例えば遺伝子マーカーの「有無の検出」というフレーズは、疾患の発生に関係する関連遺伝事象が存在するかしないかを決定することを指す。実際には、特定の事象の非存在と存在の両方がマーカーとして機能することができる。したがって、核酸変異体の存在の検出への言及は、試料中の変異体の有無のどちらかに基づいて、マーカーが存在するかどうかを決定することを一般に包含する。さらにこれには、マーカーが試料中に存在しないという可能性のある知見、すなわち核酸変異体の非存在（または存在）の決定も含まれる。いずれの場合でも、マーカーの存在の決定はまた間接的に行うことができ、例えば核酸変異体の存在が疾患と関連して場合、このマーカーの存在は、核酸変異体を含まない対応する対立遺伝子がホモ接合的に存在することを決定することで行うこともできる。同様に、ＳＮＰの存在を検出するための対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブは、ＳＮＰが存在しない対立遺伝子に対して特異的でもよい。
【００２８】
特定の実施形態では、本発明は、ＳＰＴＬＣ２遺伝子型がＳＰＴＬＣ２遺伝子の少なくとも１つの変異型対立遺伝子（ヘテロ接合型）を有する、本発明による方法に関する。さらなる実施形態では、本発明の方法は、ＳＰＴＬＣ２遺伝子型がＳＰＴＬＣ２遺伝子の２つの変異型または野生型対立遺伝子（ホモ接合型）を有する、本発明による方法に関する。
【００２９】
本発明の方法は、対象、好ましくはヒトにおける感覚性ニューロパチー関連疾患または障害の診断および／または予測に特に適する。感覚性ニューロパチー関連疾患には、これに限定されないが、遺伝性感覚性ニューロパチー（ＨＳＮ）が含まれ、これは他に遺伝性感覚性自律神経性ニューロパチー（ＨＳＡＮ）と呼ばれ、ＨＳＡＮ１型、ＨＳＡＮ２型、ＨＳＡＮ３型、ＨＳＡＮ４型、およびＨＳＡＮ５型にさらに分類され得る（背景技術を参照されたい。）。本発明の方法によって、感覚性ニューロパチー障害の発症の危険性が決定され得る。本発明の方法が実施される「対象」は、感覚性ニューロパチーの診断／予測／危険性を決定することが必要な任意の対象でよい。対象は、（これらに限定されないが）雌ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、サル、ウサギ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ハムスター、ゼブラフィッシュ、パファーフィッシュ（フグ）、ハエ、虫またはＣ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）などの非ヒト対象でもよい。より好ましくは対象は霊長類である。さらにより好ましくは対象はヒトである。
【００３０】
さらなる実施形態では、本発明の方法は、ＳＰＴＬＣ２遺伝子の１つまたは複数の核酸変異体が０、１または２コピーで存在するか、より具体的にはＳＰＴＬＣ２遺伝子の核酸変異体が一方または両方の対立遺伝子に存在するかを測定するステップを含む。
【００３１】
上記方法の別の実施形態では、核酸変異体の有無はＳＰＴＬＣ２遺伝子またはそれらの一部において検出することができる。本文脈内において、「それらの一部」は、目的の領域、すなわち核酸変異体を含むＳＰＴＬＣ２遺伝子領域を指す。より具体的には、「それらの一部」は、５’ＵＴＲ、プロモーター領域、エキソン１、イントロン１、エキソン２、イントロン２、エキソン３、イントロン３、エキソン４、イントロン４、エキソン５、イントロン５、エキソン６、イントロン６、エキソン７、イントロン７、エキソン８、イントロン８、エキソン９、イントロン９、エキソン１０、イントロン１０、エキソン１１、イントロン１１、エキソン１２および／またはイントロン１２を指す。好ましくは多型は、ＳＰＴＬＣ２遺伝子のプロモーター領域および／またはコード領域、例えばＳＰＴＬＣ２遺伝子のエキソンのうちの少なくとも１つに位置する。典型的には、核酸変異体は、これらに限定されないが、少なくとも１つのヌクレオチドの置換、欠損、挿入、重複、転座および／または反転である。
【００３２】
本発明は、ｃＤＮＡ配列（配列番号２）において確認され得るように、ＳＰＴＬＣ２遺伝子のコード領域内に位置する任意の多型に特に関する。より具体的には、核酸変異体は、これらに限定されないが、ｃＤＮＡ配列の位置１１４５、１０７５または１５１０を含めたＳＰＴＬＣ２遺伝子のコード領域の少なくとも１つの位置で検出される。より特定すると、核酸変異体はｃ．１１４５Ｇ＞Ｔであり、これはＧ３８２Ｖのアミノ酸変化をもたらす。または、核酸変異体はｃ．１０７５Ｇ＞Ａであり、これはＶ３５９Ｍのアミノ酸変化をもたらす。または、核酸変異体はｃ．１５１０Ａ＞Ｔであり、これはＩ５０４Ｆのアミノ酸変化をもたらす。
【００３３】
本明細書で使用する場合、「野生型」配列という用語は「参照」配列と類似しており、両用語は本明細書で互換的に使用される。例えば野生型ヒトＳＰＴＬＣ２遺伝子に対する参照配列は、ＮＣ＿００００１４（ｇＤＮＡ；バージョン：ＮＣ＿００００１４．８  ＧＩ：２２４５８９８０５；配列番号１）で特定されるようなゲノムＤＮＡ配列またはＮＭ＿００４８６３（ｃＤＮＡ；バージョン：ＮＭ＿００４８６３．２  ＧＩ：３１８８１６４６；配列番号２）で特定されるようなコード配列を含むｃＤＮＡ配列でもよい。例えば、対立遺伝子は参照配列（複数可）にあるような標準のものでもよいし、構造的または非構造的変異体などの変異体でもよい。野生型ヒトＳＰＴＬＣ２タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号３で特定される。
【００３４】
本明細書に記載の核酸変異体の有無を検出するのに用いられてもよい多数の解析手法があることは当業者に明らかである。任意の有核細胞由来の核酸は、こうしたアッセイ技術の出発点として用いることができ、当業者に周知の標準的な核酸調製手法によって単離することができる。対立遺伝子変異を検出するための多くの現行方法がＮｏｌｌａｕら（１９９７）によってならびに標準的な教科書、例えば、「Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ」Ｕ．Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９６、および「ＰＣＲ」、第２版」Ｎｅｗｔｏｎ＆Ｇｒａｈａｍ、ＢＩＯＳ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ、１９９７に概説されている（参照により本明細書に組み込む。）。
【００３５】
本発明の方法は、インビボまたはインビトロで行うことができる。しかし、対象から得た生物試料中のＳＰＴＬＣ２遺伝子の核酸変異体をインビトロで検出することが好ましい。「生物試料」という用語は組織試料または体液試料を意味する。組織試料には、これらに限定されないが、口腔細胞、脳試料、皮膚試料、器官試料、胎盤組織または胎児細胞が含まれる。「体液」という用語は、これらに限定されないが、血液、血漿、血清、リンパ液、滑液、羊水、尿、唾液または脳脊髄液を含めた、体内に存在する全ての液体を指す。生物試料は、必要ならば、例えばホモジナイズまたは抽出による前処理にかけることにより得ることもできる。こうした前処理は、前処理される生物試料に応じて、当業者によって適切に選択される。
【００３６】
生物試料から調製される所期の配列を含む核酸は、ＤＮＡ（例えばｇＤＮＡもしくはｃＤＮＡ）またはＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）から調製することができる。試料からの核酸の遊離、濃縮および単離は、当技術分野で既知の任意の方法によって行うことができる。現在、Ｑｉａｇｅｎ（Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の血液試料から核酸単離用のＱＩＡａｍｐ  Ｂｌｏｏｄキット、または「Ｈｉｇｈ  ｐｕｒｅ  ＰＣＲ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎキット」（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、またはＤＮＡ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（ＰｕｒｅＧｅｎｅ、Ｇｅｎｔｒａ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＵＳ）などの様々な市販のキットが入手可能である。生物試料からＤＮＡまたはＲＮＡを単離するための他の周知の手法もまた利用可能である（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、Ａｕｓｕｂｅｌら、２００３）。
【００３７】
評価するには核酸量が少ないまたは不十分である場合は、核酸を増幅することができる。こうした増幅手法は、例えばポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応法（ＬＣＲ）、核酸配列ベース増幅法（ＮＡＳＢＡ）、鎖置換増幅法、ローリングサークル増幅法、Ｔ７ポリメラーゼ増幅法および逆転写ポリメラーゼ反応法（ＲＴ−ＰＣＲ）を含めた、当技術分野で既知の増幅方法で達成することができる。
【００３８】
抽出および／または増幅手法を行った後に、標的配列における特定の核酸変異体の有無を検出することができる。核酸配列の一塩基異常を検出するための多数の方法が当技術分野で周知である。本発明は、標的配列を検出するのに用いる、本明細書で開示する如何なる特定の方法によっても限定されない。こうした方法の例はＧｕｔ（２００１）およびＳｙｖａｎｅｎ（２００１）で述べられており、ならびにこれらに限定されないが、突然変異スキャンニングを目的とする、逆ドットブロット、ラインプローブアッセイ（ＬｉＰＡ）、ｇｅｎｅＣｈｉｐ（商標）マイクロアレイ、動的対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション（ＤＡＳＨ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）プローブとロックド核酸（ＬＮＡ）プローブ、ＴａｑＭａｎ（商標）（５’ヌクレアーゼアッセイ）およびモレキュラービーコンなどのハイブリダイゼーション法；インターカレート色素、ＦＲＥＴプライマーおよびＡｌｐｈａｓｃｒｅｅｎ（商標）などの対立遺伝子特異的ＰＣＲ法；ＡＲＭＳ、キネティックＰＣＲ、ＳＮＰｓｔｒｅａｍ（商標）、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｂｉｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（商標）（ＧＢＡ）、マルチプレックスミニシークエンシング、ＳＮａＰｓｈｏｔ、パイロシークエンシング、ＭａｓｓＥｘｔｅｎｄ、ＭａｓｓＡｒｒａｙ、Ｇｏｏｄａｓｓａｙ、マイクロアレイミニシークエンシング（ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｍｉｎｉｓｅｑ）、ＡＰＥＸ（アレイ化プライマー伸長法（ａｒｒａｙｅｄ  ｐｒｉｍｅｒ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ））、配列特異的プライミング（ＳＳＰ）、マイクロアレイプライマー伸長法、タグアレイ、コード化ミクロスフェア（ｃｏｄｅｄ  ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ）、鋳型特異的取り込み（ｔｅｍｐｌａｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）（ＴＤＩ）、蛍光偏光法などのプライマー伸長法；比色定量ＯＬＡ、配列コード化ＯＬＡ、マルチプレックスライゲーション依存性プローブ増幅（ＭＬＰＡ）、マイクロアレイライゲーション、リガーゼ連鎖反応、パドロックプローブおよびローリングサークル増幅などのオリゴヌクレオチドライゲーション法；制限酵素部位解析（ＲＦＬＰ）およびＩｎｖａｄｅｒ（商標）アッセイなどのエンドヌクレアーゼ切断法；高解像度融解（ＨＲＭ）解析を含む。好ましい実施形態では、核酸変異体の有無の検出は、突然変異スキャンニングを目的とする、ＤＮＡハイブリダイゼーションもしくはＲＮＡハイブリダイゼーション、シークエンシング、ＰＣＲ、プライマー伸長法、ＭＬＰＡ、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）、制限酵素部位解析または高解像度融解（ＨＲＭ）解析またはこれらの組み合わせによって測定される。したがって、本発明の方法は、試料から核酸を単離するステップおよび／または増幅ステップを場合によって含む。
【００３９】
本発明はまた、ＳＰＴＬＣ２遺伝子の核酸変異体および／または野生型配列を増幅および／または検出するための単離オリゴヌクレオチド、すなわちプライマーおよびプローブも提供する。ＳＰＴＬＣ２遺伝子の野生型配列は、そのゲノムＤＮＡ配列（配列番号１）またはｃＤＮＡ配列（配列番号２）で特定される。標的核酸に特異的にハイブリダイズするこうしたプライマーまたはプローブは、少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５ヌクレオチドからなり、４０ヌクレオチドまで、３０ヌクレオチドまで、またはより好都合には２５ヌクレオチドまでの長さなどの任意の好都合な長さのものであり、例えば、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチドの長さなどである。一般にこうしたプライマーまたはプローブは、ＳＰＴＬＣ２遺伝子の対応する野生型または変異型遺伝子座に対して完全に相補的なヌクレオチド配列を含む。しかし、オリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブの特定能力が過度に影響を受けない条件で、必要に応じて、１つまたは複数のヌクレオチドが付加されてもよく、または１つまたは複数のミスマッチが導入されてもよい。
【００４０】
遺伝子座における野生型または変異型対立遺伝子のどちらかを特異的に認識および増幅するように設計されたオリゴヌクレオチドプライマー（またはプライマー対）は対立遺伝子特異的プライマー（またはプライマー対）と称される。同じことが、対立遺伝子特異的プローブ、すなわち野生型または変異型対立遺伝子のどちらかに特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブについても当てはまる。
【００４１】
特異的な長さおよび配列のプローブおよびプライマーは、所要の核酸標的の複雑さならびに温度およびイオン強度などの反応条件によって決まる。一般に、ハイブリダイゼーション条件は、当技術分野で既知のようなストリンジェントとする。「ストリンジェント」は、ヌクレオチド配列が関連配列または非特異的配列に結合することができる条件を指す。例えば、高温度およびより低塩は、非特異的結合または低融解温度による結合を解消するようにストリンジェンシーを高める。
【００４２】
本発明のプライマーまたはプローブは、検出を容易にするために１つまたは複数の標識を有することができる。標識の性質は本発明にとって重要ではなく、蛍光性、化学発光性、酵素性、放射性、化学性または他のものでもよく、但し、標識がオリゴヌクレオチドの正確なハイブリダイズを妨げないものとする。
【００４３】
好ましい実施形態では、プライマーおよびプローブは、１０から３０ヌクレオチド、好ましくは１５から３０または１５から２５ヌクレオチドからなり、ＳＰＴＬＣ２遺伝子の一部とハイブリッドを特異的に形成することができ、１）配列番号１または２によって代表される配列とストリンジェント条件下でハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドまたはそれらの相補体、２）配列が配列番号１または２によって代表される配列と８０、８５または９０％が同一であるオリゴヌクレオチドまたはそれらの相補体、および３）１つまたは複数のヌクレオチドが置換、欠損、挿入または付加などの変異を受けた、配列番号１または２によって代表される配列とストリンジェント条件下でハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドまたはそれらの相補体からなる群から選択される、少なくとも１つまたは複数である。
【００４４】
より具体的には、本発明は、配列番号１または２における１つまたは複数の核酸変異体の存在を検出するための１０から３０ヌクレオチド、好ましくは１５から３０または１５から２５ヌクレオチドからなる、単離オリゴヌクレオチドまたは相補鎖に関する。より特定すると、核酸変異体は、配列番号２の位置１１４５、１０７５または１５１０に位置する。
【００４５】
ＳＰＴＬＣ２遺伝子に位置する多型はまた、単離ＳＰＴＬＣ２タンパク質において、前記タンパク質をシークエンシングしてアミノ酸変化の有無を決定することによってインビトロで検出することもできる。アミノ酸変化は、当技術分野で既知の任意の従来の方法、例えば、質量分光、ゲル電気泳動、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分光、ＥＬＩＳＡ、プロテインアレイ、分子量測定または等電点分画電気泳動によって検出することもできる。
【００４６】
いずれのヒト遺伝子も本発明の方法を用いて試験することができる。特定された異なる遺伝子マーカーのうち、さらに重要な危険因子は、１つまたは複数の以下の遺伝子の多型または核酸変異である（Ｒｏｔｔｈｉｅｒら２００９）：ＳＰＴＬＣ１（例えばＢｅｊａｏｕｉら２００１、Ｄａｗｋｉｎｓら２００１）、ＲＡＢ７Ａ（例えばＶｅｒｈｏｅｖｅｎら２００３、Ｍｅｇｇｏｕｈら２００６）、ＷＮＫ１／ＨＳＮ２（例えばＬａｆｒｅｎｉｅｒｅら２００４）、ＩＫＢＫＡＰ（例えばＳｌａｕｇｅｎｈａｕｐｔら２００１）、ＦＡＭ１３４Ｂ（例えばＫｕｒｔｈら２００９）、ＮＴＲＫ１（例えばＩｎｄｏら１９９６）、ＮＧＦβ（例えばＥｉｎａｒｓｄｏｔｔｉｒら２００４、Ｈｏｕｌｄｅｎら２００１）、ＣＣＴ５（例えばＢｏｕｈｏｕｃｈｅら２００６ａ）またはＳＣＮ９Ａ（例えばＣｏｘら２００６）。
【００４７】
さらなる実施形態では、本発明の方法はまた、治療剤が感覚性ニューロパチー疾患の危険性を有しているまたはこれに罹患している患者に適し得るか、およびどの治療剤がこうした患者に適し得るかを決定することに使用することもできる。治療剤は、疾患を予防または治療するのに使用することができる。本明細書で使用する場合、「疾患を予防すること」という用語は、疾患の発症を抑制または逆行させること、疾患の初期徴候を抑制または逆行させること、疾患の臨床症状の出現を抑制することを意味する。本明細書で使用する場合、「疾患を治療すること」という用語には、疾患を実質的に抑制すること、疾患の進行を実質的に遅延または逆行させること、疾患の臨床症状を実質的に改善することまたは疾患の臨床症状の出現を実質的に予防することが含まれる。
【００４８】
本発明の別の態様は、本明細書に記載の方法において使用するための診断キットに関する。より特定すると、本発明は、感覚性ニューロパチー疾患の危険性を有している、これに罹患している危険性を有しているまたはこれに罹患している対象を特定するためのキットを包含する。このキットは、前記対象のＳＰＴＬＣ２遺伝子における核酸変異体の検出に基づくことができる。したがって、本発明のキットはＳＰＴＬＣ２遺伝子の核酸変異体を選択的に検出する試薬を備える。
【００４９】
ＳＰＴＬＣ２遺伝子の核酸変異体の検出に基づくキットは以下を備えることができる：
（ａ）前記対象のＳＰＴＬＣ２遺伝子において１つまたは複数の核酸変異体の有無を検出するための手段または試薬、および
（ｂ）場合によって、対象が感覚性ニューロパチー疾患の危険性を有しているかまたはこれに罹患しているかを、ステップ（ａ）の手段によって検出された核酸変異体から決定するための手段。
【００５０】
より好ましくは、キットは、ＳＰＴＬＣ２遺伝子のコード領域における１つまたは複数の核酸変異体の有無を検出するための手段を備える。本発明の好ましい実施形態では、キットは以下を備える：
（ａ）以下の位置、すなわちｃＤＮＡ配列（配列番号２）で特定され得るようなＳＰＴＬＣ２遺伝子のコード領域の１１４５、１０７５または１５１０の１箇所または複数個所において、核酸変異体の有無を検出するための手段または試薬、および
（ｂ）場合によって、対象が感覚性ニューロパチー疾患の危険性を有しているかまたはこれに罹患しているかを、ステップ（ａ）の手段によって検出された核酸変異体から決定するための手段。
【００５１】
特定の実施形態では、前記キットのステップ（ａ）の手段または試薬は、これらに限定されないが以下を含むことができる：
（ｉ）適切な場合には、生物試料中に存在する標的ＳＰＴＬＣ２ポリ核酸を得るおよび／またはそれらのヌクレオチド配列を得るための手段、
（ｉｉ）標的ＳＰＴＬＣ２核酸の検出に適した少なくとも１つのオリゴヌクレオチドおよび／または標的ＳＰＴＬＣ２ポリ核酸の増幅に適した少なくとも１つのオリゴヌクレオチド対、
（ｉｉｉ）適切な場合には、核酸を変性させるための薬剤、
（ｉｖ）適切な場合には、二本鎖または一本鎖の核酸分子を修飾することができる酵素、
（ｖ）適切な場合には、ハイブリダイゼーション緩衝液または前記緩衝液を作製するのに必要な成分、
（ｖｉ）適切な場合には、洗浄液または前記溶液を作製するのに必要な成分、
（ｖｉｉ）適切な場合には、部分的または完全に変性したポリ核酸を検出するための手段および／または前記ハイブリダイゼーションにおいて形成されたハイブリッドを検出するための手段および／または核酸の酵素的修飾を検出するための手段、
（ｖｉｉｉ）適切な場合には、固形担体上の既知の位置にオリゴヌクレオチドを結合させる手段。
【００５２】
好ましい実施形態では、前記キットのステップ（ａ）の手段または試薬は、標的ＳＰＴＬＣ２核酸の検出に適した少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブを含む。特定の実施形態では、標的ＳＰＴＬＣ２核酸はコード領域またはそれらの一部に位置する。さらにより特定すると、標的ＳＰＴＬＣ２核酸は、ＳＰＴＬＣ２遺伝子のｃＤＮＡの位置１１４５、１０７５および／または１５１０に位置する。示された位置は、野生型ヌクレオチドまたはそれらの核酸変異体のいずれかを有する。場合によって、ステップ（ａ）の手段または試薬は、標的ＳＰＴＬＣ２ポリ核酸の増幅に適した少なくとも１つのプライマー対も含む。より具体的には、標的ポリ核酸はＳＰＴＬＣ２遺伝子のコード領域またはそれらの一部である。さらにより特定すると、標的ＳＰＴＬＣ２ポリ核酸は、ＳＰＴＬＣ２遺伝子のｃＤＮＡの位置１１４５、１０７５および／または１５１０を含む。示された位置は、野生型ヌクレオチドまたはそれらの核酸変異体のいずれかを有する。
【００５３】
「ハイブリダイゼーション緩衝液」という用語は、オリゴヌクレオチドと試料中に存在するポリ核酸または増幅産物との間のハイブリダイゼーション反応を適切なストリンジェンシー条件下で可能にする緩衝液を意味する。「洗浄液」という用語は、適切なストリンジェンシー条件下で、形成したハイブリッドの洗浄を可能にする溶液を意味する。
【００５４】
キットに関する特定の実施形態では、ＳＰＴＬＣ２遺伝子において核酸変異体の有無を検出するための手段は、マルチプレックスアッセイを含む。
【００５５】
ステップ（ａ）の手段で検出されたＳＰＴＬＣ２遺伝子の核酸変異体から、対象が感覚性ニューロパチー疾患の危険性を有しているかまたはこれに罹患しているかを決定するための前記キットのステップ（ｂ）の手段には、感覚性ニューロパチー疾患に対する危険性またはこれの存在を与えるＳＰＴＬＣ２核酸変異体またはハプロタイプを示す、一般に「素因危険性アルゴリズム（ｐｒｅｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｒｉｓｋ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）」と称される表、チャートまたは類似物が含まれる。本明細書で使用する場合、「チャート」という用語は、関連情報を含むグラフ表示、視覚資料、図表、図面、グラフ、シート、地図などを指す。危険性の決定は、手作業でまたはコンピューターを使用して行うことができる。
【００５６】
本発明のキットは、感覚性ニューロパチー疾患に関して、核酸変異体の有無の検出のための前記手段または試薬に加えて、他の危険因子、例えば、ある遺伝子の核酸変異体を検出するための手段を備えることができる。好ましい実施形態では、キットは、ＳＰＴＬＣ１、ＲＡＢ７Ａ、ＷＮＫ１／ＨＳＮ２、ＩＫＢＫＡＰ、ＦＡＭ１３４Ｂ、ＮＴＲＫ１、ＮＧＦβ、ＣＣＴ５またはＳＣＮ９Ａからなる群から選択される遺伝子の少なくとも１つの遺伝子型またはこれらにおける核酸変異体を検出するための手段、好ましくはプローブをさらに備える。
【００５７】
以下の例は、本発明のさらなる理解を促進させることを意図する。本発明は、例示した実施形態を参照して本明細書で説明されるが、本発明は、本明細書に限定されないことを理解されたい。当業者および本明細書の教示にアクセスする者は、それらの範囲内においてさらなる変形および実施形態を認識するものとする。したがって、本発明は本明細書に添付した特許請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【００５８】
［実施例１］
ＳＰＴＬＣ２の突然変異はＨＳＡＮ−Ｉに関係する
ＳＰＴＬＣ２（染色体座位１４ｑ２４．３）のコード配列およびイントロン−エキソン境界部位を、以前にスクリーニングされ、他の既知ＨＳＡＮ遺伝子（ＳＰＴＬＣ１、ＲＡＢ７Ａ、ＷＮＫ１／ＨＳＮ２の全コード領域、ＦＡＭ１３４Ｂ、ＮＴＲＫ１、ＮＧＦＢおよびＣＣＴ５）における突然変異について陰性であると分かった（Ｒｏｔｔｈｉｅｒら２００９、Ｋｕｒｔｈら２００９）７８人のＨＳＡＮ罹患患者において解析した。本出願人らは、４人の発端患者において３つのヘテロ接合型ミスセンス突然変異を同定し、その人たちに関する臨床的および電気生理学的な情報を表１および表２にまとめる。この突然変異は３００人のヨーロッパ人対照個体には存在しなかった。
【００５９】
ｃ．１１４５Ｇ＞Ｔ配列変異（ｐ．Ｇ３８２Ｖ）は２家族（ＣＭＴ−１０４４およびＣＭＴ−１１１７、図２ａ）で発見された。家族ＣＭＴ−１１１７の発端者では、３８歳で進行性の遠位感覚消失および下肢の遠位筋衰弱が現れた。臨床症状は、家族ＣＭＴ−１０４４の一員と類似していた。さらに、この患者は、手足に感覚不全を経験しており、親指の骨髄炎を発症していた。ハプロタイプ解析により、これらの家族は血縁関係にないことが分かった（データ非表示）。
【００６０】
第２のヘテロ接合型突然変異（ｃ．１０７５Ｇ＞Ａ、ｐ．Ｖ３５９Ｍ）は孤立性患者（ＣＭＴ−７４７．Ｉ：１、図２ｂ）で発見された。この患者は、足指切断を必要とする足部潰瘍を伴う遠位型感覚機能障害発症後にＨＳＡＮと診断された。運動または自律神経障害の徴候は認められなかった。
【００６１】
第３の突然変異（ｃ．１５１０Ａ＞Ｔ、ｐ．Ｉ５０４Ｆ）は、潰瘍、骨髄炎および無汗を併発した非定型の早発性感覚運動性ニューロパチーを呈した患者ＣＭＴ−６３５．ＩＩ：１に見つかった、ヘテロ接合型のデノボ突然変異である（図２ｃ）。親子鑑定を行って親子関係を確認した。
【００６２】
優性軸索感覚運動性ニューロパチーが現れている全ての患者において、神経伝導検査を実施した。この診断は、患者ＣＭＴ−７４７．Ｉ：１における腓腹神経生検によって裏付けられた（表１および表２）。
【００６３】
ＳＰＴＬＣ３（染色体座位２０ｐ１２．１、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１８３２７）のコード領域またはイントロン−エキソン境界部位において、疾患に関連する配列変異体は特定されなかった。
【００６４】
［実施例２］
ＳＰＴＬＣ２突然変異はＳＰＴ活性の低下に関係する
ＳＰＴＬＣ２の３つの突然変異全ては、それらが機能的に重要であり得ることを示す高度に保存されたアミノ酸（図３ａ）を標的にする。本出願人らは、安定的にトランスフェクトされたＦｌｐ−ｉｎ  ＨＥＫ２９３細胞において、これらの突然変異がＳＰＴ活性に与える影響の試験に着手した。Ｆｌｐ−ｉｎシステムは、特異的なゲノム位置における導入遺伝子１コピーの安定的挿入を確実なものにする。この方法で、異なる導入遺伝子の適度なおよび等しい発現が得られる。ＳＰＴ下流にあるスフィンゴ脂質のデノボ生合成経路を阻害するカビ毒であるフモニシンＢ１（Ｗａｎｇら１９９１）（図１）で細胞を２４時間処理した。ＳＰＴによるパルミトイルＣｏＡとセリンとの縮合がこの生合成経路の律速ステップであるため、結果として生じるスフィンガニン（ＳＡ）の蓄積は、標準的なＳＰＴ活性（Ｌ−セリンの取り込み）を反映する。野生型（ｗｔ）ＳＰＴＬＣ２の安定発現は、ＧＦＰを安定的に発現している対照細胞と比較して、ＳＡ蓄積を８倍増大させた。これは、野生型ＳＰＴＬＣ２の過剰発現がより高いＳＰＴ活性を実際に導くという以前の報告（Ｈｏｒｎｅｍａｎｎら２００６）に一致する。これに反して、Ｇ３８２Ｖ突然変異型の安定発現は、基礎レベルより上にＳＡ蓄積を増大させなかった。Ｖ３５９Ｍ発現細胞およびＩ５０４Ｆ発現細胞は、ＳＡ蓄積の増大を示したが、野生型ＳＰＴＬＣ２発現細胞よりずっと不明瞭であった（図４ａ）。したがって、これら３つの突然変異は、部分的なＳＰＴ活性の喪失から完全なＳＰＴ活性の喪失までをもたらす。
【００６５】
標準ＳＰＴ活性への影響を代替的な放射性ベースのインビトロアッセイによって確認した。全脂質を野生型または突然変異型のＳＰＴＬＣ２を安定的に発現しているＨＥＫ２９３細胞から抽出し、１４Ｃ標識Ｌ−セリン、ＰＬＰおよびパルミトイルＣｏＡとインキュベートし、その後放射性標識されたセリンの取り込みを測定した（図４ｂ）。結果は先のアッセイの結果と似ていた。野生型ＳＰＴＬＣ２の安定発現は、ＳＰＴ活性を著しく増加させたが、Ｇ３８２Ｖの発現は基礎レベルより上にＳＰＴ活性を高めなかった。Ｖ３５９Ｍ突然変異型またはＩ５０４Ｆ突然変異型の発現は、ＳＰＴ活性を上昇させたが、野生型ＳＰＴＬＣ２と程度が異なった。Ｖ３５９Ｍ発現細胞およびＩ５０４Ｆ発現細胞のＳＰＴ活性の相対的な増大は、フモニシンＢ１阻害アッセイのものよりも明白であった（図４ａ）。この違いは、先のアッセイ中に細胞培養培地に存在するセリン濃縮と比較して、後のインビトロアッセイで使用したセリンの濃縮がより高いことで説明することができる。
【００６６】
［実施例３］
Ｓ．セレビシエにおいてＳＰＴＬＣ２突然変異型はインビボＳＰＴ活性に異なる影響を与える
インビボで標準ＳＰＴ活性の喪失を確証するために、本出願人らは、対応する酵母の突然変異型を（図３Ａ）、ヘテロ接合型ＬＣＢ２欠損酵母系統（ＬＣＢ２はＳＰＴＬＣ２のＳ．セレビシエ相同分子種である。ＬＣＢ２配列に対するＧｅｎＢａｎｋ受託番号はＮＭ＿００１１８０３７０である。）で発現させ、内在性ＬＣＢ２を有するまたは有さない２つの一倍体胞子を得るために、四分子分析を行った。期待された通り、４つの胞子全ては、これらが野生型または突然変異型のＬＣＢ２を発現したかどうかに関係なく、許容温度である１８℃で生育した。制限温度（３７℃）では、（残存）ＳＰＴ活性を有する胞子は生育可能であるが、ＬＣＢ２を有さないまたは機能しないＬＣＢ２を有する胞子は、フィトスフィンゴ脂質を産生し生育するために、フィトスフィンゴシンの外部添加に依存する（Ｄｕｎｎら２０００）。フィトスフィンゴシンなしで４つの等しい大きさのコロニーが出現したこと（図５）から明らかであるように、野生型ＬＣＢ２はＬＣＢ２の欠損を相補することができた。これとは対照的であるが、ドミナントネガティブであるＬＣＢ２のＫ３６６Ｔ突然変異（Ｇａｂｌｅら２００２）と類似して、Ｇ３６９Ｖ突然変異（ＳＰＴＬＣ２のＧ３８２Ｖに対応する。）を発現している酵母胞子は、内在性のＬＣＢ２が存在する時のみコロニーを生じた。このことは、この突然変異型がＬＣＢ２欠損を相補できないことを示す。Ｖ３４６Ｍ突然変異型およびＩ４９１Ｆ突然変異型（ＳＰＴＬＣ２のＶ３５９ＭおよびＩ５０４Ｆにそれぞれ対応する。）によってもたらされた残存活性は、３７℃での成長を回復するのに十分であった。これは、本出願人らの生化学的なデータと一致する。
【００６７】
［実施例４］
突然変異型ＳＰＴはそのアミノ酸基質に対して曖昧性を示す
最近の報告によって、ＨＳＡＮ−ＩのＳＰＴＬＣ１突然変異はＳＰＴ酵素の基質特異性に影響することが示されている。すなわち、突然変異型ＳＰＴは、別の基質としてＬ−アラニンおよびそれほどではないがグリシンを代謝することができる。これは、非定型および神経毒性のスフィンゴイド塩基代謝産物１−デオキシ−ＳＡおよび１−デオキシメチル−ＳＡの形成をもたらす（Ｚｉｔｏｍｅｒら２００９、Ｐｅｎｎｏら２０１０）。末梢神経におけるこれらの代謝産物の蓄積はＨＳＡＮ−Ｉの根本原因であるとみなされていた（Ｐｅｎｎｏら２０１０）。ＳＰＴＬＣ２突然変異がＳＰＴの酵素親和性に対して同様に影響を及ぼし、代替代謝産物の同様の蓄積を起こすかどうかを試験するために、突然変異型を発現しているＨＥＫ２９３細胞のスフィンゴイド塩基プロファイルを解析した。野生型ＳＰＴＬＣ２を安定的に発現している細胞において、１−デオキシ−ＳＡの量は対照細胞と類似しており（図６ａ）、このことは、ＳＰＴ活性の増大それ自体は基質特異性を変化させないことを示す。これに反して、突然変異体の発現は、対照細胞と比較して２０倍までの高い１−デオキシ−ＳＡレベルをもたらし、最高レベルはＧ３８２ＶまたはＩ５０４Ｆの突然変異型酵素を安定的に発現しているＨＥＫ細胞であった。ＨＥＫ細胞およびリンパ芽球細胞の両方における１−デオキシメチル−ＳＡ発生レベルは検出限界を下回った。
【００６８】
ＨＥＫ細胞で得られた結果がＨＳＡＮ−Ｉ患者の状況を反映するかどうかを確認するために、それぞれＧ３８２Ｖ突然変異およびＩ５０４Ｆ突然変異を有する２人のＨＳＡＮ−Ｉ患者由来のリンパ芽球細胞系の１−デオキシ−ＳＡレベルを測定した。両細胞系統において、罹患していない家族構成員または血縁関係にない健常対照個体と比較した場合、１−デオキシ−ＳＡの蓄積が観察された（図６ｂ）。この発見は、本出願人らのインビトロでの結果に一致し、さらに重要なことに、１−デオキシ−ＳＡの蓄積は生理的に関連し得ることを示す。
【００６９】
実施例の材料および方法
対象
本試験のために、一群の７８人の遺伝性の潰瘍断節性感覚性ニューロパチー患者を選択した。組み入れ基準はＲｏｔｔｈｉｅｒら２００９で既に述べられている。このコホートは、臨床的特徴および異なる遺伝様式において大きな変動を示すが、全ての患者は進行性の遠位型感覚機能障害を共有する。本試験に組み入れる前に、全ての患者または彼らの法定代理人から治療担当医師によってインフォームドコンセントを得た。
【００７０】
突然変異解析
ＤＮＡ試料は全て、全ゲノム増幅キット「ＧｅｎｏｍｉＰｈｉ  Ｖ２  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎキット」（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して増幅した。ＳＰＴＬＣ２およびＳＰＴＬＣ３のエキソンの１００ｂｐ上流および１００ｂｐ下流までのコード領域およびエキソン−イントロン境界部位を、Ｐｒｉｍｅｒ３およびＳＮＰｂｏｘソフトウェアツール（ＲｏｚｅｎおよびＳｋａｌｅｔｓｋｙ２０００、Ｗｅｃｋｘら２００４）を用いて設計したオリゴヌクレオチドプライマーを使用してＰＣＲで増幅した。プライマー配列を表３および表４に列挙する。突然変異スクリーニングは、ＢｉｇＤｙｅ（登録商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、精製ＰＣＲ断片のダイレクトＤＮＡシークエンシングによって行い、ＡＢＩ３７３０ｘｌ  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で分離した。得られた配列を整列させ、ｎｏｖｏＳＮＰ（Ｗｅｃｋｘら２００５）およびＳｅｑＭａｎ（商標）ＩＩプログラムを用いて解析した。配列変異体は、最初のＤＮＡ試料に関する再ＰＣＲおよび両方向のシークエンシングによって確認した。
【００７１】
親子関係は、ゲノム全体にわたって分布している非常に有益な１５のショートタンデムリピート（ＳＴＲ）（ＡＴＡ３８Ａ０５、Ｄ１Ｓ１６４６、Ｄ１Ｓ１６５３、Ｄ１Ｓ１３６０、Ｄ２Ｓ２２５６、Ｄ３Ｓ３０３７、Ｄ４Ｓ２３８２、Ｄ４Ｓ３２４０、Ｄ７Ｓ５０９、Ｄ８Ｓ１７５９、Ｄ９Ｓ１１１８、Ｄ１２Ｓ１０５６、Ｄ１２Ｓ２０８２、Ｄ１６Ｓ２６１９およびＧＡＴＡ１５２Ｈ０４）を使用して試験した。ＳＴＲをＰＣＲで増幅して、ＰＣＲ断片をＡＢＩ３７３０ｘｌ  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒにかけた。遺伝子型はＬｏｃａｌ  Ｇｅｎｏｔｙｐｅ  Ｖｉｅｗｅｒを使用して解析した。
【００７２】
クローニング
ＳＰＴＬＣ２ｃＤＮＡ（ＮＭ＿００４８６３．２）を増幅し、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）エントリーベクターｐＤＯＮＲ２２１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に以下のプライマーを使用してクローニングした。
ＳＰＴＬＣ２＿ａｔｔｂ１：  ５’−ｇｇｇａｃａａｇｔｔｔｇｔａｃａａａａａａｇｃａｇｇｃｔａｔｇｃｇｇｃｃｇｇａｇｃｃｃｇｇａｇｇｃｔｇｃｔ−３’  （配列番号４）；および
ＳＰＴＬＣ２＿ａｔｔｂ２：  ５’−ｇｇｇｇａｃｃａｃｔｔｔｇｔａｃａａｇａａａｇｃｔｇｇｇｔｃｃｇｔｃｔｔｃｔｇｔｔｔｃｔｔｃａｔａｃｇｔｃ−３’  （配列番号５）
ＳＰＴＬＣ２突然変異は、以下のプライマーを使用して部位特異的突然変異誘発によって導入した。
ＳＰＴＬＣ２＿Ｖ３５９Ｍ＿ｆｗ：  ５’−ｃｃａｃａｇｇｃｃｇｇｇｇｔａｔｇｇｔｇｇａｇｔａｃ−３’  （配列番号６）
ＳＰＴＬＣ２＿Ｖ３５９Ｍ＿ｒｖ：  ５’−ｇｔａｃｔｃｃａｃｃａｔａｃｃｃｃｇｇｃｃｔｇｔｇｇ−３’  （配列番号７）
ＳＰＴＬＣ２＿Ｇ３８２Ｖ＿ｆｗ：  ５’−ｇａａｃｇｔｔｃａｃａａａｇａｇｔｔｔｔｇｔｔｇｃｔｔｃｔｇｇａｇｇａｔａｔａｔｔｇｇ−３’  （配列番号８）
ＳＰＴＬＣ２＿Ｇ３８２Ｖ＿ｒｖ：  ５’−ｃｃａａｔａｔａｔｃｃｔｃｃａｇａａｇｃａａｃａａａａｃｔｃｔｔｔｇｔｇａａｃｇｔｔｃ−３’  （配列番号９）
ＳＰＴＬＣ２＿Ｉ５０４Ｆ＿ｆｗ：  ５’−ｔｔｃｃｔｇｃｃａｃｃｃｃａａｔｔｔｔｔｇａｇｔｃｃａｇａｇｃｃ−３’  （配列番号１０）
ＳＰＴＬＣ２＿Ｉ５０４Ｆ＿ｒｖ：  ５’−ｇｇｃｔｃｔｇｇａｃｔｃａａａａａｔｔｇｇｇｇｔｇｇｃａｇｇａａ−３’  （配列番号１１）
【００７３】
コンストラクトをデスティネーションベクターｐＥＦ５／ＦＲＴ／Ｖ５−ＤＥＳＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に組換え、ｃＤＮＡをＣ末端のＶ５−タグと融合させた。全てのコンストラクトはシークエンシングによって確認した。適切な細胞系統をＦｌｐ−ｉｎ宿主細胞系統ＨＥＫ２９３を使用して製造業者の指示（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従って作出した。
【００７４】
それ自身のプロモーター（開始コドンの７００ｂｐ上流）および自身のターミネーター（終止コドンの４５０ｂｐ下流）とともに酵母ＬＣＢ２遺伝子を、ＬＥＵ２遺伝子を内部に持つＹＣｐｌａｃ１１１プラスミドベクターにクローニングした。以下のプライマーを使用して部位特異的突然変異誘発で突然変異およびＨＡ−タグを導入した。
ＬＣＢ２＿ＨＡ＿ｆｗ：５’−ｇｃｃａｃｔａｃｃｔｇａｇｃｃｃｇｔｔｇｔｃａｇｃｇｔａｇｔｃｔｇｇｇａｃｇｔｃｇｔａｔｇｇｇｔａａｇｃｇｔａｇｔｃｔｇｇｇａ  ｃｇｔｃｇｔａｔｇｇｇｔａａｇｃｇｔａｇｔｃｔｇｇｇａｃｇｔｃｇｔａｔｇｇｇｔａｇａｃａｃｃｃｃｔｃｃｔｔａｔｔａｃａｔｔｔｃ−３’  （配列番号１２）
ＬＣＢ２＿ＨＡ＿ｒｖ：５’−ｇａａａｔｇｔａａｔａａｇｇａｇｇｇｇｔｇｔｃｔａｃｃｃａｔａｃｇａｃｇｔｃｃｃａｇａｃｔａｃｇｃｔｔａｃｃｃａｔａｃｇａｃｇｔ  ｃｃｃａｇａｃｔａｃｇｃｔｔａｃｃｃａｔａｃｇａｃｇｔｃｃｃａｇａｃｔａｃｇｃｔｇａｃａａｃｇｇｇｃｔｃａｇｇｔａｇｔｇｇｃ−３’  （配列番号１３）
ＬＣＢ２＿Ｖ３４６Ｍ＿ｆｗ：  ５’−ｇｃｃｃａａｃｔｇｇｔｃｇｃｇｇｔａｔｇｔｇｔｇａａａｔａｔｔｔｇｇｃｇ−３’  （配列番号１４）
ＬＣＢ２＿Ｖ３４６Ｍ＿ｒｖ：  ５’−ｃｇｃｃａａａｔａｔｔｔｃａｃａｃａｔａｃｃｇｃｇａｃｃａｇｔｔｇｇｇｃ−３’（配列番号１５）
ＬＣＢ２＿Ｇ３６９Ｖ＿ｆｗ：  ５’−ｇｔａｃｔｔｔｃａｃｔａａｇｔｃｇｔｔｔｇｔｔｇｃｔｇｃｔｇｇｔｇｇｔｔａｃａｔｔｇ−３’  （配列番号１６）
ＬＣＢ２＿Ｇ３６９Ｖ＿ｒｖ：  ５’−ｃａａｔｇｔａａｃｃａｃｃａｇｃａｇｃａａｃａａａｃｇａｃｔｔａｇｔｇａａａｇｔａｃ−３’（配列番号１７）
ＬＣＢ２＿  Ｉ４９１Ｆ＿ｆｗ：  ５’−ｃｔｔａｔｃｃｔｇｃｔａｃｔｃｃｇｃｔｇｔｔｔｇａａｔｃａａｇａｇｔａａｇａｔｔｃｔｇ−３’（配列番号１８）
ＬＣＢ２＿Ｉ４９１Ｆ＿ｒｖ：  ５’−ｃａｇａａｔｃｔｔａｃｔｃｔｔｇａｔｔｃａａａｃａｇｃｇｇａｇｔａｇｃａｇｇａｔａａｇ−３’（配列番号１９）
ＬＣＢ２＿Ｋ３６６Ｔ＿ｆｗ：  ５’−ｃｔａａｔｇｇｇｔａｃｔｔｔｃａｃｔａｃｔｔｃｇｔｔｔｇｇｔｇｃｔｇｃｔｇｇｔｇ−３’（配列番号２０）
ＬＣＢ２＿Ｋ３６６Ｔ＿ｒｖ：  ５’−ｃａｃｃａｇｃａｇｃａｃｃａａａｃｇａａｇｔａｇｔｇａａａｇｔａｃｃｃａｔｔａｇ−３’（配列番号２１）
【００７５】
細胞培養の材料および条件
ＨＥＫ２９３Ｆｌｐ−ｉｎ細胞を１０％ウシ胎仔血清、Ｌ−グルタミンおよびペニシリン／ストレプトマイシンを追加したＤＭＥＭ中で３７℃および５％ＣＯ２で培養した。リンパ芽球様細胞系を１０％ウシ胎仔血清、Ｌ−グルタミン、ピルビン酸ナトリウムおよびペニシリン／ストレプトマイシンを追加したＲＰＭＩで３７℃および５％ＣＯ２で培養した。細胞培養培地および追加物は全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから得た。
【００７６】
リンパ芽球様細胞系
全血液試料を１５ｍｌのフィコールパックと混合し、１０分間遠心分離した。洗浄後、リンパ球をエプスタインバールウイルスで形質転換し、３７℃で２時間インキュベートした。遠心分離後、１％フィトヘマグルチニンを加えた４ｍｌのＲＰＭＩ完全培地にペレットを再懸濁させた。細胞を２４ウェルプレートに播種して、３７℃および５％ＣＯ２で最低３日間インキュベートした。細胞を分割し、必要に応じて新鮮な培地を補充した。
【００７７】
酵母相補性アッセイ
野生型または突然変異型のＬＣＢ２を含有するＹＣｐｌａｃ１１１コンストラクトを、カナマイシン抵抗性遺伝子でＬＣＢ２が置換されたヘテロ接合型ＬＣＢ２欠損系統（ＢＹ４７４３）に形質転換し（Ｇｉｅｔｚら２００７）、胞子形成させた。得られた四分子を分離してＬＣＢ２の内在性の発現を欠く一倍体胞子を獲得し、フィトスフィンゴシン（１５μＭ、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄ）および０．１％テルギトールを有するＹＰＤ培地で２６℃で生育させた。２日後、異なる生育培地、すなわち１８℃および３７℃（酵母ＳＰＴ突然変異型は温度感受性生育の表現型を有する［Ｄｕｎｎら２０００］。）のＹＰＤ培地、ロイシンなしの合成最少培地（形質転換された胞子の選抜を可能にする。）およびジェネテシン（ＬＣＢ２欠損胞子の選抜）を有するＹＰＤ培地にレプリカ培養を行った。各コンストラクトに関して、少なくとも６つの四分子を解析した。別段の指定がない限り、培地および追加物はＳｉｇｍａから得た。
【００７８】
ＲＮＡ単離およびｍＲＮＡ解析
全ｍＲＮＡをＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。Ｔｕｒｂｏ  ＤＮＡ  ｆｒｅｅキット（Ａｍｂｉｏｎ）を使用してＤＮＡ不活化を行い、ｃＤＮＡ合成をＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ＲＴ−ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて行った。ＳＰＴＬＣ２の発現（内在性およびコンストラクト）を以下のプライマーの組み合わせを使用して解析した。
ＳＰＴＬＣ２＿Ｆｗ：５’−ｇａｇｔｃｃａｇａｇｃｃａｇｇｔｔｔｔｇ−３’（配列番号２２）、および
ＳＰＴＬＣ２＿３’ＵＴＲ＿Ｒｖ：５’−ｃｔｇａｇｇｇａｇｃａｃｃａａａａａｇ−３’（配列番号２３）（内在性のＳＰＴＬＣ２発現用）、または
Ｖ５＿Ｒｖ：５’−ｇａｇａｇｇｇｔｔａｇｇｇａｔａｇｇｃｔｔａｃ−３’（配列番号２４）（ＳＰＴＬＣ２コンストラクト用）。
【００７９】
リアルタイムｑＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）反応は、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）中で１０ｎｇのｃＤＮＡを用いて３重で行い、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７９００  ＨＴ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にかけた。プライマーは、特異性および増幅効率について確認した。ＲＴ−ｑＰＣＲデータをＶａｎｄｅｓｏｍｐｅｌｅら２００２によって述べられた方法に従って標準化した。相対発現レベルを使用してフモニシンＢ１阻害アッセイ、インビトロＳＰＴ活性アッセイおよび１−デオキシ−ＳＡ定量化のデータを標準化した。
【００８０】
フモニシンＢ１阻害アッセイ
本アッセイは、Ｐｅｎｎｏら２０１０に記載されているように行った。手短に述べると、細胞が指数関数的に生育する培地にフモニシンＢ１（Ｓｉｇｍａ）を１０μｇ／ｍｌの終濃度で添加した。負の対照として、ＳＰＴ阻害剤のミリオシン（１０μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）をフモニシンＢ１とともに添加した。フモニシンＢ１を添加してから２４時間後に、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、回収して、計数した（Ｃｏｕｌｔｅｒ（登録商標）Ｚ２、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）。次に、この細胞を塩基性条件下で脂質抽出にかけた（以下を参照されたい。）。スフィンゴイド塩基をＬＣ−ＭＳによって定量化した。合成Ｃ１７スフィンゴシン（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ）を内部抽出標準として各試料に添加した。
【００８１】
インビトロ放射性ベースのＳＰＴ活性アッセイ
ＳＰＴ活性をＲｕｔｔｉら２００９に記載の放射活性ベースのアッセイを使用して測定した。手短に述べると、４００μｇの全細胞可溶化物、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）、０．５ｍＭのＬ−セリン、０．０５ｍＭのパルミトイルＣｏＡ、２０μＭのピリドキサール−５’−リン酸、０．２％のショ糖モノラウレート（ｓｕｃｒｏｓｅ  ｍｏｎｏｌａｕｒｅａｔｅ）（全てＳｉｇｍａ）および０．１μＣｉのＬ−［Ｕ−１４Ｃ］セリン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を混合し、３７℃でインキュベートした。対照反応において、ＳＰＴ活性はミリオシン（４０μＭ、Ｓｉｇｍａ）の添加によって特異的に阻害された。６０分後に反応を終了し、Ｒｉｌｅｙら１９９９の方法に従って脂質を抽出した（以下を参照されたい。）。
【００８２】
脂質抽出および加水分解
全脂質をＲｉｌｅｙら１９９９の方法に従って細胞または血漿から抽出した。酸加水分解については、乾燥脂質を２００μｌのメタノールＨＣｌ（メタノール中に１Ｎ  ＨＣｌ／１０Ｍ水を入れたもの）に再懸濁させ、１２−１５時間６５℃で保った。この溶液を４０μｌのＫＯＨ（５Ｍ）を添加して中和し、続いて以下のように実施した塩基加水分解にかけた。０．５ｍｌの抽出緩衝液（メタノール中に０．１２５Ｍ  ＫＯＨを入れたもの４容量＋クロロホルム１容量）をこの溶液に加えた。続いて、０．５ｍｌのクロロホルム、０．５ｍｌのアルカリ水および１００μｌの２Ｍアンモニアをこの順番で加えた。液相を遠心分離（１２．０００ｇ、５分）で分離させた。上相を吸引し、下相をアルカリ水で２回洗浄した。最後に、脂質をＮ２下でクロロホルム相の蒸発によって乾燥させ、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）解析にかけた。
【００８３】
抽出した脂質を５６．７％メタノール−３３．３％エタノール−１０％水中に可溶化し、オルトフタルアルデヒドで誘導体化した。この脂質をＣ１８カラム（Ｕｐｔｉｓｐｅｒｅ  １２０Ａ、５μｍ、１２５×２ｍｍ、Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ、Ｆｒａｎｃｅ）蛍光検出器（ＨＰ１０４６Ａ、Ｈｅｗｌｅｔ  Ｐａｃｋａｒｄ）で分離して、続いてＭＳ検出器（ＬＣＭＳ−２０１０Ａ、Ｓｈｉｍａｄｚｕ）で検出した。ＡＰＣＩ（大気圧化学イオン化）を使用してイオン化した。非天然Ｃ１７スフィンゴシン（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ）を内部標準として使用した。保持時間は以下の通りである。Ｃ１７ＳＯ（内部標準）：６分、スフィンゴシン：７．５分、１−デオキシスフィンゴシン：９分、１−デオキシメチルスフィンゴシン：１０．５分、スフィンガニン：１０．５分、１−デオキシメチルスフィンガニン：１３分、１−デオキシスフィンガニン：１３．５分。ＭＳデータは、ＬＣＭＳ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）およびＭＳ  Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ  ｖ．１１（ＡＣＤ  Ｌａｂｓ）を使用して解析した。
【００８４】
統計
両側の対のないスチューデントのｔ検定を使用して統計解析を行った。エラーバー（標準偏差）およびＰ値（スチューデントのｔ検定）を３回の独立した実験に基づいて計算した。
【００８５】
【表１】
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【００８６】
【表２】
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【００８７】
【表３】
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【００８８】
【表４】
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【００８９】
【表５】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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