(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号４）
を含む、又はこれからなる筋機能増強アミノ酸配列を含むペプチドであって、
該ペプチドが親水性モチーフをさらに含み、
該筋機能増強アミノ酸配列がＳ１００Ａ１タンパク質のカルボキシ末端アミノ酸のうちの１８個以下の連続するアミノ酸を含有し、該ペプチドが最大２０個のアミノ酸の全長を有し、該ペプチドが正の変力作用を示す、ペプチド。
【請求項２】
細胞膜に浸透することが可能である、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
筋細胞において収縮能力及び／又はカルシウム循環を増強する能力を示す、請求項１又は２に記載のペプチド。
【請求項４】
不整脈から筋細胞を保護する、筋細胞においてカルシウムスパーク頻度を低減させる、筋細胞の筋小胞体からのカルシウム漏出を防止する及び／若しくはこれを低減させる、アポトーシス細胞死から筋細胞を保護する、血行動態機能を回復させる及び／若しくはこれを増強する、並びに／又は骨格筋細胞において等尺性単収縮力及び／若しくは強縮性単収縮力を増強する及び／若しくはこれを回復させる能力を示す、請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項５】
Ｃ、Ｃ−Ｎ、Ｃ−Ｎ−［Ｎ／Ｄ／Ｅ］、Ｃ−Ｎ−［Ｎ／Ｄ／Ｅ］−［Ｆ／Ｙ］、Ｃ−Ｎ−［Ｎ／Ｄ／Ｅ］−［Ｆ／Ｙ］−Ｆ、Ｃ−Ｎ−［Ｎ／Ｄ／Ｅ］−［Ｆ／Ｙ］−Ｆ−［Ｗ／Ｌ／Ｑ］、Ｃ−Ｎ−［Ｎ／Ｄ／Ｅ］−［Ｆ／Ｙ］−Ｆ−［Ｗ／Ｌ／Ｑ］−Ｅ（配列番号）、Ｃ−Ｎ−［Ｎ／Ｄ／Ｅ］−［Ｆ／Ｙ］−Ｆ−［Ｗ／Ｌ／Ｑ］−Ｅ−［Ｎ／Ｔ］（配列番号）からなる群から選択されるアミノ酸又はアミノ酸配列が、該アミノ酸配列Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号４）のカルボキシ末端と直接連結する、請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項６】
芳香族アミノ酸が該アミノ酸配列Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号４）のアミノ末端と直接連結する、請求項１〜５のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項７】
膜浸透増強モチーフ、１つ又は複数のエピトープタグ、及びペプチド標的化モチーフからなる群から選択される要素のうちの１つ又は複数をさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項８】
マーカー部分をさらに含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項９】
親水性モチーフが、酸性の、塩基性の、及び／又はそうでなくとも負に若しくは正に荷電したアミノ酸を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１０】
親水性モチーフが、親水性アミノ酸モチーフ：
Λ−Λ−Λ−Λ−Θ−Θ
（式中、Λはアスパラギン酸、グルタミン酸、リジン及びアルギニンからそれぞれ独立して選択され、Θはα−ヘリックス遮断因子であり、又はプロリン若しくはグリシンからそれぞれ独立して選択される）を含む、又はこれからなる、請求項１〜９のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１１】
親水性モチーフが、アミノ酸配列：
［Ｄ／Ｅ］−［Ｋ／Ｒ］−［Ｄ／Ｅ］−［Ｄ／Ｅ］−［Ｐ／Ｇ］−［Ｐ／Ｇ］
を含む、又はこれからなる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１２】
アミノ酸配列Ｄ−Ｋ−Ｄ−Ｄ−Ｐ−Ｐ−Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号３７０）、又は前記アミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、又はこれからなる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のペプチド、並びに薬学的に許容可能な添加物、担体及び／又は希釈剤を含む医薬組成物。
【請求項１４】
筋機能障害と関連する障害を治療又は予防するための、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
障害が心筋障害及び／又は骨格筋障害である、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
筋機能障害が筋肉細胞におけるカルシウム循環不全及び／又は収縮能力不全と関連する、請求項１４又は１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
筋肉細胞においてカルシウム循環を増強する及び／若しくはこれを回復させるための、並びに／又は収縮能力を増強する及び／若しくはこれを回復させるためのものである、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
心筋障害が、虚血後収縮機能不全、うっ血性心不全、心原性ショック、敗血症ショック、心筋梗塞、心筋症、心臓弁の機能不全、及び心室障害からなる群から選択される、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
骨格筋障害が、筋ジストロフィー、筋力低下、筋萎縮症、筋炎、セントラルコア病、ネマリン桿状体筋症、中心核筋細管筋症、眼の眼筋麻痺、ミトコンドリア筋症からなる群から選択される、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
筋機能障害と関連する障害を治療又は予防するための医薬組成物の調製のための、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のペプチドの使用。
【請求項２１】
障害が心筋障害及び／又は骨格筋障害である、請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
筋機能障害が筋肉細胞におけるカルシウム循環不全及び／又は収縮能力不全と関連する、請求項２０又は２１に記載の使用。
【請求項２３】
医薬組成物が、筋肉細胞においてカルシウム循環を増強する及び／若しくはこれを回復させるための、並びに／又は収縮能力を増強する及び／若しくはこれを回復させるためのものである、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２４】
心筋障害が、虚血後収縮機能不全、うっ血性心不全、心原性ショック、敗血症ショック、心筋梗塞、心筋症、心臓弁の機能不全、及び心室障害からなる群から選択される、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２５】
骨格筋障害が、筋ジストロフィー、筋力低下、筋萎縮症、筋炎、セントラルコア病、ネマリン桿状体筋症、中心核筋細管筋症、眼の眼筋麻痺、ミトコンドリア筋症からなる群から選択される、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２６】
筋機能障害と関連する障害を治療又は予防剤であって、それを必要とする個体に対して、前記個体の疾患状態を改善するのに十分な量の請求項１〜１２のいずれか一項に記載のペプチド、又は請求項１３〜１９のいずれか一項に記載の医薬組成物を投与することを含む、治療又は予防剤。
【請求項２７】
筋機能障害と関連する障害が心筋障害又は骨格筋障害である、請求項２６に記載の治療又は予防剤。
【請求項２８】
筋機能障害が筋肉細胞におけるカルシウム循環不全及び／又は収縮能力不全と関連する、請求項２６又は２７に記載の治療又は予防剤。
【請求項２９】
筋肉細胞においてカルシウム循環を増強する及び／若しくはこれを回復させるための、並びに／又は収縮能力を増強する及び／若しくはこれを回復させるためのものである、請求項２６〜２８のいずれか一項に記載の治療又は予防剤。
【請求項３０】
心筋障害が、虚血後収縮機能不全、非代償性及び代償性のうっ血性心不全、心原性ショック、敗血症ショック、心筋梗塞、心筋症、心臓弁の機能不全、並びに右心室障害からなる群から選択される、請求項２７〜２９のいずれか一項に記載の治療又は予防剤。
【請求項３１】
骨格筋障害が、筋ジストロフィー、筋力低下、筋萎縮症、筋炎、セントラルコア病、ネマリン桿状体筋症、中心核筋細管筋症、眼の眼筋麻痺、ミトコンドリア筋症からなる群から選択される、請求項２７〜２９のいずれか一項に記載の治療又は予防剤。
【請求項３２】
ペプチド又は医薬組成物を非経口の投与経路を介して投与する、請求項２６〜３１のいずれか一項に記載の治療又は予防剤。
【請求項３３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のペプチド、並びにカテコールアミン、β−アドレナリン受容体作動薬及びβ−アドレナリン受容体遮断薬からなる群から選択される薬物を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、筋症を治療又は予防するために、特に骨格筋障害又は心筋障害を治療又は予防するために使用することができるＳ１００タンパク質由来の筋機能増強アミノ酸配列を含むペプチド、上記ペプチドを含む医薬組成物、及びかかる筋症を治療又は予防する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
筋肉組織は、骨格筋組織、心筋組織及び平滑筋組織に細分類され、脊椎動物の最大の器官と考えることができる。例えば、平均的な成人男性は、４０％〜５０％が骨格筋で構成される。骨格筋及び心筋は横紋筋組織に属し、多くの機能的側面を共有する。例えば、骨格筋細胞及び心筋細胞における興奮収縮連関のプロセスは非常に類似している。筋細胞の膜脱分極により、活性化電位依存性Ｌ型カルシウムチャネルを介した筋細胞の細胞質（筋形質）中へのカルシウムの流入が引き起こされる。細胞質のカルシウム濃度の上昇は、カルシウム誘導性カルシウム放出（ＣＩＣＲ）メカニズムを通じたリアノジン受容体（ＲｙＲ）の活性化により筋小胞体（ＳＲ）からのカルシウム放出を引き起こし、ひいては細胞質のカルシウム濃度のさらなる迅速な上昇を引き起こす。カルシウム分子は、細胞質を通って拡散し、収縮タンパク質、例えば筋細胞の収縮を引き起こすトロポニンＣと結合する。収縮後、カルシウムは、主に筋小胞体／小胞体カルシウムＡＴＰアーゼ（ＳＥＲＣＡ）の作用により、カルシウムの筋小胞体中への再取込みにより細胞質から除去される。これらの事象は骨格筋細胞及び心筋細胞において本質的に同一であるが、関与するタンパク質のアイソフォームにわずかに相違点がある。例えば、ＲｙＲ１は骨格筋細胞において優勢な筋小胞体カルシウム放出チャネルであるが、心筋細胞においてはＲｙＲ２が優勢である。同様に、骨格筋の筋小胞体／小胞体カルシウムＡＴＰアーゼはＳＥＲＣＡ１ａであり、ＳＥＲＣＡ２ａは心筋細胞特異的である。
【０００３】
筋細胞中のカルシウム循環は、多数のタンパク質により調節される。例えば、Ｓ１００タンパク質ファミリー（ＥＦハンドを有する最大のカルシウム結合タンパク質サブファミリー）に属するＳ１００Ａ１は、ＲｙＲカルシウム放出チャネル及びＳＥＲＣＡの両方と相互作用することが報告されている。Ｓ１００Ａ１は、拡張期にＲｙＲを安定化させてカルシウムスパークの頻度を低減させ、収縮期にカルシウム放出を増強する。さらに、Ｓ１００Ａ１は弛緩期にＳＥＲＣＡ活性を増大させ、心筋細胞及び骨格筋細胞において収縮機能を増大させることが見出された。Ｓ１００Ａ１タンパク質由来のカルボキシ末端ペプチドが全長Ｓ１００Ａ１タンパク質の変力効果を模倣することが分かっている（非特許文献１、非特許文献２）。
【０００４】
筋細胞におけるカルシウム循環不全、例えば、収縮時における筋小胞体からのカルシウム放出の低減、異常なカルシウム放出事象、筋小胞体からのカルシウム漏出、又は細胞質からのカルシウム除去の遅延化は、様々な筋症、すなわち筋機能障害と関連する疾患をもたらす。例えば、心不全（cardiac insufficiency）、心室収縮機能不全、不整脈、心不全（heartfailure）、心原性ショック、心筋梗塞、及び心臓弁の機能不全は、心筋細胞におけるカルシウム処理（calciumhandling：カルシウムハンドリング）の調節不全と関連している。同様に、骨格筋線維におけるカルシウム循環不全は、筋ジストロフィーと関連付けられている（非特許文献３）。さらに、筋肉細胞におけるカルシウムシグナル伝達の破壊を引き起こすＲｙＲカルシウム放出チャネルにおける突然変異は、筋症と関連している。特に、８０を超える突然変異が、骨格筋のＲｙＲ１カルシウム放出チャネルにおいて特定されており、悪性高熱症、セントラルコア病又はマルチミニコア病（multi-minicore disease）と関連付けられている。さらに、心室性不整脈及び心臓突然死を引き起こす心筋のＲｙＲ２カルシウム放出チャネルにおける４０を超える突然変異が報告されている（非特許文献４）。
【０００５】
現在のところ、骨格筋障害に利用可能な臨床的な変力療法は存在しない。心筋症の変力治療に現在利用可能な認可された治療薬、例えばグリコシド誘導体、カテコールアミン及びホスホジエステラーゼ阻害剤は、重度の副作用、例えば心拍数の増大、及び生命を脅かす催不整脈能という問題を有する。これらの認可された治療薬の他に、Ｓ１００Ａ１タンパク質が、心不全において心筋のＳ１００Ａ１レベルが減少すること、及び心筋細胞へのＳ１００Ａ１の送達により等尺性収縮の増大、その後筋小胞体中に汲み上げられるカルシウム量の増大がもたらされることが示されたため、心筋症における治療薬として提唱されている。しかしながら、筋症を治療する目的での患者へのＳ１００Ａ１の投与は、遺伝子療法の送達経路、例えばウイルス送達を使用する送達経路（全てのその既知の副作用及び欠点を伴う）を必要とする（非特許文献１、特許文献１及び非特許文献５）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２００８／０５４７１３号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Most P. et al.,2007, Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 293:R568-577
【非特許文献２】Voelkers M. etal., 2007, Cell Calcium 41:135-143
【非特許文献３】Hopf F.W. et al.,2007, Subcell. Biochem. 45:429-64
【非特許文献４】Dulhunty A.F. etal., 2006, J. Muscle Res. Cell Motil. 27:351-365
【非特許文献５】Vinge L.E. etal., 2008, Circ. Res. 102:1458-1470
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、筋症、好ましくは筋肉細胞におけるカルシウム循環の調節不全と関連する筋症の変力治療のための新規の治療薬であって、認可された治療薬において見られる重度の副作用を示さず、遺伝子療法に係る高リスクの送達経路を必要としない治療薬に対する緊急の必要性が存在する。骨格筋疾患に関して、骨格筋細胞の収縮能力を増大させる能力を有し、及び／又は骨格筋細胞におけるカルシウム誘導性アポトーシス細胞死を低減させるいずれかの変力治療薬に対する緊急の必要性が存在する。
【０００９】
本発明者らは驚くべきことに、カルシウム結合タンパク質Ｓ１００由来の本発明によるペプチドが、非経口投与すると変力効果を示し、筋症、例えば心筋障害及び骨格筋障害の治療に有用であり、言及すべき副作用を示さず、遺伝子療法を必要としないことを見出した。例えば、本発明によるペプチドは、正常な心筋及び不全心筋における並びに正常な及び疾患の骨格筋における変力性を増強し及びこれを回復させ、筋小胞体のカルシウム処理を増強し及びこれを回復させ、筋細胞におけるカルシウム誘導性アポトーシス細胞死を防止し、催不整脈性の筋小胞体のカルシウム漏出及び頻脈性不整脈から保護し、心力不全及び頻脈性不整脈からの保護により心臓死を防止する。本発明のペプチドは主要な副作用を伴わずに心筋組織及び骨格筋組織の収縮能力を増強するのに特に有用である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
第１の態様では本発明は、アミノ酸モチーフ：
Φ４−Ｘ−Ψ−Ｌ−［Ｔ／Ａ］−Ψ２
（式中、Φ及びΨはそれぞれ独立して選択される疎水性の非芳香族アミノ酸であり、Ｘは任意のアミノ酸、好ましくは低分子アミノ酸である。Φ４は、Φ−Φ−Φ−Φ−のようにアミノ酸が直列に４個つながり、Ψ２は、Ψ−Ψ−のようにアミノ酸が直列に２個つながることを意味する）を含む、又はこれからなる筋機能増強アミノ酸配列を含むペプチドであって、該筋機能増強アミノ酸配列がＳ１００Ａ１タンパク質、好ましくは任意のＳ１００カルシウム結合タンパク質のカルボキシ末端アミノ酸のうちの１８個以下の連続するアミノ酸を含有し、該ペプチドが最大１００アミノ酸の全長を有し、該ペプチドが正の変力作用を示す、ペプチドを提供する。好ましくは、前記ペプチドは細胞膜に浸透することが可能である。好ましくは、前記ペプチドは筋細胞において収縮能力及び／又はカルシウム循環を増強する能力を示す。好ましい実施の形態では、筋機能増強アミノ酸配列は、アミノ酸配列［Ｖ／Ｉ］−［Ｖ／Ｉ］−［Ｌ／Ｍ］−［Ｖ／Ｉ／Ｍ］−［Ａ／Ｇ／Ｓ］−［Ａ／Ｖ］−Ｌ−［Ｔ／Ａ］−［Ｖ／Ａ／Ｉ］−［Ａ／Ｍ／Ｖ］を含み、これから本質的になり、又はこれからなり、好ましくはアミノ酸配列Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号４）を含む、これから本質的になる、又はこれからなる。上で示したように、筋機能増強アミノ酸配列が、Ｓ１００Ａ１タンパク質のカルボキシ末端アミノ酸のうちの１８個以下の連続するアミノ酸を含有することがこの関連では好ましい。好ましくは、上記ペプチドは、膜浸透増強モチーフ、１つ又は複数のエピトープタグ、親水性モチーフ、及びペプチド標的化モチーフからなる群から選択される要素のうちの１つ又は複数をさらに含み、好ましくは該親水性モチーフは、親水性アミノ酸モチーフΛ４−Θ２（式中、Λはアスパラギン酸、グルタミン酸、リジン及びアルギニンからそれぞれ独立して選択され、Θはα−ヘリックス遮断因子であり、好ましくはプロリン又はグリシンからそれぞれ独立して選択される。Λ４は、Λ−Λ−Λ−Λ−のようにアミノ酸が直列に４個つながり、Θ２は、Θ−Θ−のように因子が直列に２個つながることを意味する。）を含む、これから本質的になる、又はこれからなる。好ましくは親水性モチーフは、アミノ酸配列［Ｄ／Ｅ］−［Ｋ／Ｒ］−［Ｄ／Ｅ］−［Ｄ／Ｅ］−［Ｐ／Ｇ］−［Ｐ／Ｇ］を含み、これから本質的になり、又はこれからなり、より好ましくはアミノ酸配列Ｄ−Ｋ−Ｄ−Ｄ−Ｐ−Ｐ（配列番号３５４）を含む、これから本質的になる、又はこれからなる。特定の好ましい１つの実施の形態では、本発明によるペプチドは、アミノ酸配列Ｄ−Ｋ−Ｄ−Ｄ−Ｐ−Ｐ−Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号３７０）、又は上記アミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、これから本質的になる、又はこれからなる。
【００１１】
第２の態様では、本発明は、医学的使用のための第１の態様のペプチドを提供する。
【００１２】
第３の態様では、本発明は、筋機能障害と関連する障害の治療又は予防における治療上の使用のための第１又は第２の態様のペプチドを提供し、好ましくは該障害は心筋障害及び／又は骨格筋障害であり、好ましくは該筋機能障害は筋肉細胞におけるカルシウム循環不全及び／又は収縮能力不全と関連する。好ましくは、ペプチドは、筋肉細胞においてカルシウム循環を増強する及び／若しくはこれを回復させるための、並びに／又は収縮能力を増強する及び／若しくはこれを回復させるためのものである。心筋障害は虚血後収縮機能不全、うっ血性心不全、心原性ショック、敗血症ショック、心筋梗塞、心筋症、心臓弁の機能不全、及び心室障害からなる群から選択することができ、骨格筋障害は筋ジストロフィー、筋力低下、筋萎縮症、筋炎、セントラルコア病、ネマリン桿状体筋症（nemaline rod myopathy）、中心核筋細管筋症（centronuclearmyotubular myopathy）、眼の眼筋麻痺、ミトコンドリア筋症からなる群から選択することができる。
【００１３】
第４の態様では、本発明は、本発明の第１の態様のペプチド、並びに薬学的に許容可能な添加物、担体及び／又は希釈剤を含む医薬組成物を提供する。好ましい１つの実施の形態では、医薬組成物は、筋機能障害と関連する障害を治療又は予防するためのものである。
【００１４】
第５の態様では、本発明は、筋機能障害と関連する障害を治療又は予防するための医薬組成物の調製のための本発明の第１の態様によるペプチドの使用に関する。
【００１５】
第６の態様では、本発明は、筋機能障害と関連する障害を治療又は予防する方法であって、それを必要とする個体に対して、上記個体の疾患状態を改善するのに十分な量の本発明によるペプチド又は医薬組成物を投与することを含む、方法を提供する。
【００１６】
第７の態様では、本発明は、本発明の第１の態様によるペプチド、並びにカテコールアミン、β−アドレナリン受容体作動薬及びβ−アドレナリン受容体遮断薬からなる群から選択される薬物を含む組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】生物活性リード構造としてのＳ１００Ａ１タンパク質のＣ末端の特性決定を示す図である。図１は、上段に天然ヒトＳ１００Ａ１タンパク質（Ｓ１００Ａ１、９４アミノ酸、配列番号１）の、及び下段にＣ末端側のカルシウム結合ＥＦハンドを欠くアミノ酸７５〜９４を包含する２０ｍｅｒペプチド（Ｓ１００Ａ１−ｃｔペプチド）としてのＳ１００Ａ１のＣ末端（配列番号２）の一次構造を示す。SEQ ID NO:  配列番号protein  タンパク質peptide  ペプチドEF-Hand  ＥＦハンド
【図２】ヒトＳ１００Ａ１の疎水性プロットを示す図である。アミノ酸７５〜９４を包含するＳ１００Ａ１のＣ末端ドメインは、このタンパク質の最も疎水性の高い領域である。本発明者らは、http://www.vivo.colostate.edu/molkit/hydropathy/index.htmlで利用可能な疎水性プロットを利用して、ヒトｓ１００ａ１遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ００６２７１）の公開済のｃＤＮＡ配列を用いてカイト・ドーリトルプロットを行った。０を超えるｙ軸スコアは、疎水性の増大を示す。アミノ酸７５〜９４を含むＳ１００Ａ１のＣ末端に、灰色のバーで印を付す。Kyte-Doolittle Scale (hydrophobicity)  カイト・ドーリトル尺度（疎水性）Hydrophobicity  疎水性C-terminus  Ｃ末端amino acid number  アミノ酸番号window size  ウインドウサイズ
【図３】ヒトＳ１００Ａ１タンパク質の三次構造／四次構造を示す図である。図３ＡはヒトＳ１００Ａ１の三次構造／四次構造を可視化しており、これにより疎水性のＣ末端がホモ二量体タンパク質のそれぞれカルシウム非結合形態及びアポ状態（apo-state）の内側に埋め込まれていることが示される。図３Ｂは、両方のＥＦハンドモチーフに対するカルシウムの結合が、Ｓ１００Ａ１のＣ末端の分子表面への露出を引き起こし、これにより疎水性ドメインがタンパク質−タンパク質相互作用に利用可能となることを示している。したがって、アミノ酸７５〜９４を含むＳ１００Ａ１のＣ末端により、カルシウムが結合し「活性化された」二量体Ｓ１００Ａ１タンパク質における標的タンパク質の結合、及び標的タンパク質の機能／活性の変調が説明されることが示唆された。Ｓ１００Ａ１に対するカルシウムの結合は立体構造変化をもたらし、これによりＣ末端ドメイン（アミノ酸７５〜９４）（点線を付した箱型領域）がタンパク質−タンパク質相互作用に利用可能となる。
【図４】化学的に透過処理した心筋細胞調製物及び骨格筋細胞調製物中におけるヒトＳ１００Ａ１タンパク質及び２０ｍｅｒのＣ末端ペプチドを示す図である。細胞内への到達、並びにＲｙＲ２及びＲｙＲ１の機能の調節が可能となる化学的に透過処理した心筋細胞調製物及び骨格筋細胞調製物中において天然ヒトＳ１００Ａ１タンパク質、及び２０ｍｅｒのＣ末端ペプチドの生物活性が同等であることが、本発明者らにより示された。図４は、ローダミン標識した組換えヒトＳ１００Ａ１タンパク質（Ｍｗ：１０４１５）（図４Ａ／図４Ｂ）、及びＦＩＴＣ標識した２０ｍｅｒの合成Ｓ１００Ａ１  Ｃ末端ペプチド（Ｍｗ：２２５８）（図４Ｃ／図４Ｄ）に関する類似する細胞内結合パターンを示す。ｒｈｏｄ−Ｓ１００Ａ１タンパク質もＦＩＴＣ−Ｓ１００Ａ１  Ｃ末端ペプチド（アミノ酸７５〜９４）も、成体・無傷の心筋細胞の細胞膜を透過することができない。transmission  透過C-terminus  Ｃ末端
【図５】Ｓ１００Ａ１タンパク質が、透過処理した心筋細胞において拡張期のカルシウムスパーク頻度及びＲｙＲ２活性を減少させ（Ａ）、透過処理した骨格筋線維において等尺性単収縮力を増強する（Ｂ）ことを示す図である。Ｓ１００Ａ１タンパク質は、成体・無傷の心筋細胞又は骨格筋線維におけるカルシウム恒常性を変化させない。control  対照protein  タンパク質Events/μm/sec  事象／μｍ／秒sec  秒
【図６】２０ｍｅｒのＳ１００Ａ１  Ｃ末端ペプチド（Ｓ１００Ａ１タンパク質のアミノ酸７５〜９４）が、透過処理した心筋細胞において拡張期のカルシウムスパーク頻度及びＲｙＲ２活性を減少させ（Ａ）、透過処理した骨格筋線維において等尺性単収縮力を増強する（Ｂ）ことを示す図である。しかし、該Ｃ末端ペプチドは、成体・無傷の心筋細胞又は骨格筋線維におけるカルシウム恒常性を変化させない。control  対照Events/μm/sec  事象／μｍ／秒sec  秒
【図７】Ｓ１００Ａ１タンパク質（Ｂ１）、及び２０ｍｅｒのＳ１００Ａ１  Ｃ末端ペプチド（Ｂ３）の両方が、透過処理したマウスＥＤＬ骨格筋線維において等尺性力を増強する同等の生物学的効力を有することを示す図である。Ｂ２及びＢ３により、Ｓ１００Ａ１のＣ末端が単独で変力効果を媒介することが確認される。Ｓ１００Ａ１ペプチド（Ｎ／Ｈ／Ｃ）は、Ｎ末端ペプチド（Ｎ）Ｇ−Ｓ−Ｅ−Ｌ−Ｅ−Ｔ−Ａ−Ｍ−Ｅ−Ｔ−Ｌ−Ｉ−Ｎ−Ｖ−Ｆ（Ｓ１００Ａ１のアミノ酸２〜１６、配列番号３８８）、ヒンジ領域ペプチド（Ｈ）Ｌ−Ｓ−Ｇ−Ｆ−Ｌ−Ｄ−Ａ−Ｑ−Ｋ−Ｄ−Ｖ−Ｄ−Ａ（Ｓ１００Ａ１のアミノ酸４２〜５４、配列番号３８９）及びＣ末端２０ｍｅｒ（Ｃ）（配列番号２）を表す。M. ext. dig. longum  長指伸筋rel. force  相対力arbitrary units  任意単位protein  タンパク質control  対照time(s)  時間（秒）peptide  ペプチド
【図８】正常な及び疾患の心筋細胞における細胞透過性Ｓ１００Ａ１ｃｔ６／１１配列及び細胞内蓄積を示す図である。Ｓ１００Ａ１ｃｔ６／１１はペプチドＤ−Ｋ−Ｄ−Ｄ−Ｐ−Ｐ−Ｙ−Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号３７２）を表し、配列Ｄ−Ｋ−Ｄ−Ｄ−Ｐ−Ｐ（配列番号３５４）は親水性モチーフであり、配列Ｙ−Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号３９０）はヒトＳ１００Ａ１タンパク質のアミノ酸７５〜８５である。Ｓ１００Ａ１ｃｔ６／１１ペプチドは細胞透過性を有し、細胞不透過性の２０ｍｅｒのＣ末端  Ｓ１００Ａ１ペプチドとは対照的に心筋細胞の細胞内空間に蓄積する。図８により、ＦＩＴＣと結合したＳ１００Ａ１ｃｔ６／１１は無傷のラット心室心筋細胞の細胞内空間中で濃縮され、抗Ｓ１００Ａ１免疫蛍光染色により評価した内在性Ｓ１００Ａ１タンパク質（Ｃ）と同様の線状のパターン（Ｂ、１５分間の細胞外曝露後に撮影した共焦点画像）をもたらすが、対照（Ａ）は特定の標識パターンを示さなかったことが示される。transmission  透過Endogenous S100A1  内在性Ｓ１００Ａ１
【図９】電場刺激した単離ラット心室心筋細胞におけるＳ１００Ａ１ｃｔ６／１１の時間及び用量依存性の正の変力効果を示す図である。Ｓ１００Ａ１ｃｔ６／１１は、成体心室心筋細胞におけるウイルスに媒介され心臓を標的とする（cardiac-targeted）トランスジェニックＳ１００Ａ１過剰発現物の用量依存性及び時間依存性の変力効果の両方を模倣する。図９は、電場刺激（２Ｈｚ）した単離ラット心室心筋細胞におけるＳ１００Ａ１ｃｔ６／１１の用量依存性（上パネル）及び時間依存性（下パネル）の正の変力効果の代表的な出力波形を示す。１５分間の細胞外曝露後におけるＳ１００Ａ１ｃｔ６／１１の細胞内蓄積（図８Ｂ）と一致する１０分〜２０分のＳ１００Ａ１ｃｔ６／１１の変力作用の開始に留意されたい。算出されたＥＣ５０％は８７±６ｎＭ  Ｓ１００Ａ１ｃｔ６／１１である。カルシウム過渡応答（transients）を、落射蛍光デジタル化顕微鏡法を利用してＦＵＲＡ２−ＡＭを負荷し電場刺激した心筋細胞において評価した。calcium  カルシウムsec  秒min  分time  時間
【図１０】合成ペプチドＤＫＤＤＰＰ−ＹＶＶＬＶＡ（親水性モチーフと融合したヒトＳ１００Ａ１のアミノ酸７５〜８０、配列番号３８２）も、合成ペプチドＤＫＤＤＰＰ−ＡＡＬＴＶＡ（親水性モチーフと融合したヒトＳ１００Ａ１のアミノ酸８０〜８５、配列番号３８３）も、Ｓ１００Ａ１ｃｔ６／１１の変力効果を模倣又は再現するのに十分ではないことを示す図である。カルシウム過渡応答を、落射蛍光デジタル化顕微鏡法を利用してＦＵＲＡ２−ＡＭを負荷し電場刺激した心筋細胞において評価した（各群ｎ＝６０）。SEQ ID NO:  配列番号Calcium transient amplitude  カルシウム過渡振幅FURA 340/380 ratio counts  ＦＵＲＡ  ３４０／３８０のカウント比control  対照inotropic effect  変力効果
【図１１】Ｓ１００パラログＡ４及びＢ由来のアミノ酸７５〜８５を包含するペプチドがＳ１００Ａ１ｃｔ６／１１に媒介される変力性を模倣するのに十分ではないことを示す図である。合成ペプチドＤＫＤＤＰＰ−ＹＣＶＦＬＳＣＩＡＭＭ（親水性モチーフと融合したＳ１００Ａ４のアミノ酸７５〜８５、配列番号３８６）及びＤＫＤＤＰＰ−ＦＭＡＦＶＡＭＶＴＴＡ（親水性モチーフと融合したＳ１００Ｂのアミノ酸７５〜８５、配列番号３８７）の両方が、Ｓ１００Ａ１ｃｔ６／１１の変力作用を再現することができない。（Ａ）は、Ｓ１００Ａ４ｃｔもＳ１００Ｂｃｔも基本条件（左パネル）及びβ−ＡＲ刺激条件（右パネル）下でＳ１００Ａ１ｃｔ６／１１の変力効果を模倣しないことを示す。（Ｂ）は、ＤＫＤＤＰＰ（配列番号３５４）と結合したＳ１００Ａ１（上）、Ｓ１００Ａ４（中央）及びＳ１００Ｂ（下）由来のアミノ酸７５〜８５からなるペプチドの一次配列アライメントを示す。Ｓ１００Ａ１ｃｔとＳ１００Ａ４ｃｔとＳ１００Ｂｃｔとの間における同一のアミノ酸に下線を付す。（各群の細胞数ｎ＝６０、＊Ｐ＜０．０５（対照、Ｓ１００Ａ４ｃｔ及びＳ１００Ｂｃｔに対して）、２方向（2-way）ＡＮＯＶＡ）。１０−９Ｉｓｏは１０−９Ｍのイソプロテレノールを意味する。Calcium transient amplitude  カルシウム過渡振幅FURA 340/380 ratio count  ＦＵＲＡ  ３４０／３８０のカウント比control  対照SEQ ID NO:  配列番号
【図１２】Ｓ１００Ａ１ｃｔ６／１１の変力効果が筋小胞体（ＳＲ）のカルシウム含有量の制御及び調節と関連することを示す図である。Ｓ１００Ａ１ｃｔ６／１１の変力効果は、成体心室心筋細胞におけるウイルスに媒介され心臓を標的とするトランスジェニックＳ１００Ａ１過剰発現物を利用する天然ヒトＳ１００Ａ１タンパク質の効果と同様にＳＲのカルシウム負荷の増強により伝達される。図１２は、ＳＲのカルシウムの完全な放出がもたらされるようにｉｎ  ｖｉｔｒｏで１０ｍＭのカフェインに曝した電場刺激（２Ｈｚ）した対照（黒色、左の出力波形）の及びＳ１００Ａ１ｃｔ６／１１（１０００ｎＭ、薄灰色、右の出力波形）で処理した心室心筋細胞の代表的な出力波形を示す。カフェインに誘起されるカルシウム過渡応答の振幅は、ＳＲのカルシウム含有量の間接的な尺度の役割を果たし、Ｓ１００Ａ１ｃｔ６／１１で処理した心筋細胞においてより大きい。これらのデータにより、Ｓ１００Ａ１ｃｔ６／１１の変力効果がＳＲのカルシウムの貯蔵及び含有量の制御及び増強と関連することが示される。Calcium amplitude  カルシウム振幅FURA 340/380 ratio, 0.15 arbitrary units  ＦＵＲＡ  ３４０／３８０比、０．１５任意単位control  対照caffeine  カフェイン
【図１３】心筋細胞におけるＳ１００Ａ１ｃｔ６／１１の正の変力効果がそれぞれβ−アドレナリン刺激及びシグナル伝達に対して相加的及び無関係であることを示す図である。（Ａ）はリン酸化部位特異的抗体を利用する代表的なウェスタンブロットを示し、これにより、Ｓ１００Ａ１ｃｔ６／１１が、基本条件及びβ−アドレナリン受容体（βＡＲ）刺激下で筋小胞体（ホスホランバン、ＰＬＢ）及びサルコメア（トロポニンＩ、ＴｎＩ）標的においてｃＡＭＰ依存性キナーゼ（ＰＫＡ）活性を含むβＡＲシグナル伝達を増加させることも変化させることもないことが明らかとなる。これを支持して、図１３Ｂは、Ｓ１００Ａ１ｃｔ６／１１の変力効果が、落射蛍光デジタル化顕微鏡法を利用してＦＵＲＡ２−ＡＭを負荷し電場刺激した心筋細胞において評価するとβＡＲ刺激下で相加的であり保存されることを示す。βＡＲ−ＰＫＡ軸の主要な変力効果がＰＬＢ−ｓｅｒ１６のリン酸化の増強により伝達されることに留意されたい。Ｓ１００Ａ１ｃｔ６／１１はこのメカニズムを伴うことも変化させることもなく、これによりβＡＲ刺激に対するその相加的な変力効果が説明される。（各群の細胞数ｎ＝６０、＊Ｐ＜０．０５（対照に対して）、２方向ＡＮＯＶＡ）。１０−９Ｉｓｏは１０−９Ｍのイソプロテレノールを意味する。control  対照Calcium transient amplitude  カルシウム過渡振幅FURA 340/380 ratio counts  ＦＵＲＡ  ３４０／３８０のカウント比
【図１４】Ｓ１００Ａ１ｃｔ６／１１が心室心筋細胞において拡張期のＲｙＲ２の機能を制御し、生理学的な拡張期のＳＲのカルシウムスパーク頻度を変調させることを示す図である。Ｓ１００Ａ１ｃｔ６／１１は、無傷の心室心筋細胞において拡張期のＳＲのカルシウムスパーク頻度を変調させ、透過処理した心室心筋細胞において細胞不透過性の天然Ｓ１００Ａ１タンパク質及び２０ｍｅｒのＳ１００Ａ１  Ｃ末端ドメインペプチドの効果を模倣する。図１４Ａは、Ｆｌｕｏ−３ＡＭを負荷した対照の及びＳ１００Ａ１ｃｔ６／１１で処理した静止状態のラット心室心筋細胞におけるカルシウムスパークの代表的な共焦点出力波形を示す。図１４Ｂ〜図１４Ｄは、Ｓ１００Ａ１ｃｔ６／１１が拡張期のＳＲのカルシウムスパーク頻度及び振幅を示差的に制御することを示す。１００ｎＭのＳ１００Ａ１ｃｔ６／１１は基本条件下でカルシウムスパーク頻度を減少させるが、その１０倍の濃度（１０００ｎＭ）のＳ１００Ａ１ｃｔ６／１１は、カルシウムスパーク頻度を増大させる（各群の細胞数ｎ＝６０、２方向ＡＮＯＶＡ）。control  対照Events/μm/sec  事象／μｍ／秒
【図１５】Ｓ１００Ａ１ｃｔ６／１１の変力効果を伝達する分子メカニズムが、それぞれ不整脈誘発性のストア過負荷誘導性カルシウム放出（ＳＯＩＣＲ）及びカルシウム波から心筋細胞を同時に保護することを示す図である。不整脈発生による心臓突然死に関する重大な病理機序であるＳＯＩＣＲを、Isner及びその共同研究者らにより以前に公開されたプロトコル（Venetucci etal., 2007, Circ Res 100:105-111）を利用してｉｎ  ｖｉｔｒｏで誘起させた。図１５Ａは、Venetucci et al., 2007, Circ Res 100:105-111により記載されたようにＳＯＩＣＲを引き起こす（βＡＲ刺激＋０．５ｍＭのカフェイン）条件下でその頻度及び空間的特徴が劇的に増大する（中央）、Ｆｌｕｏ−３ＡＭを負荷した対照心筋細胞（左）におけるカルシウムスパークの代表的な共焦点出力波形を示す。１０００ｎＭのＳ１００Ａ１ｃｔ６／１１での処理により、ＳＲのカルシウム漏出が効果的にアンタゴナイズされる（図１５Ａ、右）ことに留意されたい。図１５Ｂは、イソプロテレノール／カフェインの存在下における異常なカルシウムスパークの頻度及び空間的特徴を正常化するＳ１００Ａ１ｃｔ６／１１の治療効果の統計解析結果を明らかにするものである。図１５Ｃは、１００ｎＭ及び１０００ｎＭのＳ１００Ａ１ｃｔ６／１１により完全に防止されるβＡＲ刺激＋０．５ｍＭのカフェインの存在下におけるＳＯＩＣＲに誘発されるカルシウム波を示す対照心筋細胞の代表的な出力波形を用いて、Ｓ１００Ａ１ｃｔ６／１１の強力な抗不整脈効果を示す。ＳＯＩＣＲ及びその後のカルシウム波が致死性の心室性不整脈及び心臓突然死に関する分子基板であることを考慮すると、これらの実験は、心筋細胞における変力性をカルシウム誘導性の不整脈からの保護と関連付けるＳ１００Ａ１ｃｔ６／１１の特有の分子プロファイルを明らかにする（各群の細胞数ｎ＝６０、２方向ＡＮＯＶＡ）。Ｓ１００Ａ１ｃｔ６／１１の保護効果が、ＳＲのカルシウム負荷の増強により心筋細胞において変力作用を発揮する濃度（１００ｎＭ及び１０００ｎＭ）（図９）で効果的であることに留意することが重要である。したがって、ＳＲのカルシウム再隔離（resequestration）に対するそれ自身の増強効果に関わらず、Ｓ１００Ａ１ｃｔ６／１１はβＡＲに誘発されるＳＯＩＣＲを効果的にアンタゴナイズし、変力作用を抗不整脈効力と関連付ける特有の分子プロファイルを強調する。Ｓ１００Ａ１ｃｔ６／１１と同様に（Akin）、ウイルスに媒介されるＳ１００Ａ１過剰発現物も、漏れやすい（leaky）ＲｙＲ２を有する成体心室心筋細胞においてβＡＲに誘発される不整脈誘発性のＳＲのカルシウム漏出を防止し、これにより細胞透過性のＳ１００Ａ１ｃｔ６／１１が過剰発現したＳ１００Ａ１タンパク質の抗不整脈効果を模倣することが示された。Isoproterenol  イソプロテレノールcaffeine  カフェインcontrol  対照normal diastolic Ca  正常な拡張期ＣａEvents/μm/sec  事象／μｍ／秒
【図１６】Ｓ１００Ａ１ｃｔ６／１１の変力効果を伝達する分子メカニズムが、ＳＲのカルシウム漏出の防止によりアポトーシス細胞死から心筋細胞を同時に保護することを示す図である。Ｓ１００Ａ１ｃｔ６／１１は、長期のカフェイン曝露により内腔のカルシウムに感作された漏れやすいＲｙＲ２を有する成体心室心筋細胞をアポトーシス細胞死から保護する。図１６Ａは、カフェインに曝露した対照の及びＳ１００Ａ１ｃｔ６／１１で処理した心筋細胞の代表的な画像を示す。黒色の矢印は、漏れやすいＲｙＲ２により促進された、ＳＲのカルシウム漏出により誘導されたアポトーシスによる死細胞を強調している。統計解析により、Ｓ１００Ａ１ｃｔ６／１１処理群においてアポトーシス性心筋細胞が有意に低いことが明らかとなった。図１６Ｂは、２つの独立した実験の代表的なＤＮＡゲル電気泳動の結果を示し、対照の心筋細胞にはラダリングしたＤＮＡが見られるが、Ｓ１００Ａ１ｃｔ６／１１で処理した心筋細胞には見られずアポトーシスの防止を示している。caffeine  カフェインcontrol  対照Dead cells/total cells ratio norm. to K0  Ｋ０に対して正規化した（norm.）死細胞／総細胞の比
【図１７】Ｓ１００Ａ１ｃｔ６／１１がヒト血清中における切断及び分解に抵抗性を有し、ｉｎ  ｖｉｖｏでの応用及び長期の生物学的有効性を可能とすることを示す図である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＳ１００Ａ１ｃｔ６／１１と混合した（spiked）ヒト血清（１μＭ）がＳ１００Ａ１ｃｔ６／１１を３時間まで切断しないことが示され、これによりｉｎ  ｖｉｖｏ投与のための必要条件としての血清中での高い安定性、及び長期の生物学的有効性が示される。図１７Ａ〜図１７Ｄは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで１μＭのＳ１００Ａ１ｃｔ６／１１と混合したヒト血清試料の種々の時点におけるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析の代表的な出力波形を示す。図１７Ａ〜図１７ＤによりＳ１００Ａ１ｃｔ６／１１の切断及び分解が起きないことが明らかとなり、プロテアーゼが豊富な環境における高い安定性が示されることに留意されたい。min  分
【図１８】Ｓ１００Ａ１ｃｔ６／１１が、基本条件及びβＡＲ刺激条件下で収縮能力の増強をもたらす有意なｉｎ  ｖｉｖｏでの血行動態効果を発揮することを示す図である。２２５ｎｇのＳ１００Ａ１ｃｔ６／１１の静脈内（ｉ．ｖ．）単回適用を受けた麻酔した成体Ｃ５７／Ｂ６雄性マウス（ＢＷ３０ｇ）（四角）が、３時間持続する左心室の収縮能力の増強を示し（左パネル）、これはイソプロテレノールのｉ．ｖ．適用（２５０ｐｇ）に対して（対照動物のベタ塗りのひし形と比較して）保存され相加的であった。ｉｎ  ｖｉｖｏでの効果は基本条件及びβＡＲ刺激条件下でのＳ１００Ａ１ｃｔ６／１１のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの作用を反映していることに留意されたい。ｉｎ  ｖｉｖｏでのＳ１００Ａ１ｃｔ６／１１の変力効果は、心拍数及びβＡＲ刺激に対するその応答性と無関係であった（右パネル）。Ｓ１００Ａ１ｃｔ６／１１は、腹腔内使用及び皮下使用の後の開始の遅延化にも効果的である。図１８は、Ｓ１００Ａ１ｃｔ６／１１をｉ．ｖ．注射した後の麻酔したマウスにおいて左心室のカテーテル処置（catherization）により評価される基本収縮能力の有意な増強を示す。機能獲得はβＡＲ刺激下で保存され、心拍数と無関係であった（各群の動物数ｎ＝７、＊Ｐ＜０．０５（対応する対照動物に対して）、２方向ＡＮＯＶＡ）。LV contractile performance  ＬＶの収縮能力Control  対照min  分Heart rate  心拍数beats/min  拍動数／分
【図１９】Ｓ１００Ａ１ｃｔ６／１１がβ１ＡＲ遮断薬メトプロロールへの応答に効果的である顕著なｉｎ  ｖｉｖｏでの血行動態効果を発揮することを示す図である。メトプロロール（６２．５μｇ）の腹腔内（ｉ．ｐ．）投与の１５分後に２２５ｎｇのＳ１００Ａ１ｃｔ６／１１の静脈内（ｉ．ｖ．）単回適用を受けた麻酔した成体Ｃ５７／Ｂ６雄性マウス（ＢＷ３０ｇ）が、ＥＣＧの異常を伴わずに同様の心拍数の遅延化を示した（図１９）が、Ｓ１００Ａ１ｃｔ６／１１に媒介される機能獲得を保存していた（図２０）。図１９は、メトプロロールに応答した伝導異常を伴わずに同様の心拍数の遅延化を伴う、対照の（ｉ．ｖ．ビヒクル処理）及びＳ１００Ａ１ｃｔ６／１１でｉ．ｖ．処理したマウスにおける代表的な遠隔測定ＥＣＧ記録（DSI systems、Ｅｉｎｔｈｏｖｅｎ  ｌｅａｄ  ＩＩ）を示す。control  対照awake  覚醒Metoprolol  メトプロロールmin  分
【図２０】麻酔したマウスにおいてβ１ＡＲ遮断薬メトプロロールの存在下でＳ１００Ａ１ｃｔ６／１１の変力有効性が保存されることを示す図（左パネル）である。Ｓ１００Ａ１ｃｔ６／１１がメトプロロールの負の変力効果をアンタゴナイズするが負の変時効果をアンタゴナイズせず（右パネル）、これにより心機能不全に対するＳ１００Ａ１ｃｔ６／１１及びメトプロロールの併用療法の実現可能性が強調されることに留意されたい（各群の動物数ｎ＝７、＊Ｐ＜０．０５（対応する対照動物に対して）、２方向ＡＮＯＶＡ）。LV contractile performance  ＬＶの収縮能力min  分Metoprolol  メトプロロールHeart rate  心拍数beats/min  拍動数／分Control  対照
【図２１】Ｓ１００Ａ１ｃｔ６／１１が実験的マウス心不全モデルにおいて血行動態機能を回復させるｉｎ  ｖｉｖｏでの有意な治療効果を発揮することを示す図である。虚血後収縮機能不全を有する成体Ｃ５７／Ｂ６雄性／雌性マウス（ＢＷ３０ｇ）の２週間、毎日の２２５ｎｇのＳ１００Ａ１ｃｔ６／１１でのｉ．ｐ．処理により、心機能及び生存性の有意な改善がもたらされる。図２１Ａは、シリアル心エコー検査により評価した、収縮機能不全を有するマウスの左心室機能を回復させる心不全のＳ１００Ａ１ｃｔ６／１１による２週間のｉ．ｐ．処理の治療効果を示す。図２１Ｂは、Ｓ１００Ａ１ｃｔ６／１１で処理した心不全マウスにおける収縮能力の改善が生存性の有意な改善につながることを示す。（Ａ、各群の動物数ｎ＝１０；Ｂ、各群の動物数１８、＊Ｐ＜０．０５（ＭＩ前に対して）、＋Ｐ＜０．０１（対照心不全動物に対して）、２方向ＡＮＯＶＡ）。control (vehicle i.p.)  対照（ビヒクルｉ．ｐ．投与）pre-MI  ＭＩ前7d post-MI  ＭＩの７日後14d post-MI  ＭＩの１４日後% death in HF mice 2 weeks after myocardialischemia  心筋虚血の２週間後のＨＦマウスの死亡率（％）control  対照
【図２２】Ｓ１００Ａ１ｃｔ６／１１が、実験的心不全動物モデルにおいて不全心筋におけるアポトーシス細胞死を防止するｉｎ  ｖｉｖｏでの有意な治療効果を発揮することを示す図である。虚血後収縮機能不全を有する成体Ｃ５７／Ｂ６雄性／雌性マウス（ＢＷ３０ｇ）の２週間、毎日の２２５ｎｇのＳ１００Ａ１ｃｔ６／１１でのｉ．ｐ．処理により、不全心臓におけるアポトーシスの有意な減弱がもたらされた。ｉｎ  ｖｉｖｏでの効果が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの心筋細胞におけるＳ１００Ａ１ｃｔ６／１１の抗アポトーシス作用を反映していることに留意されたい。図２２は、心不全（ＨＦ）対照の及びＳ１００Ａ１ｃｔ６／１１で処理した（２週間のｉ．ｐ．処理）不全心臓の代表的なＴＵＮＥＬ染色結果を示し、ここで緑色の核は、ＦＩＴＣと結合したプローブにより標識されたＤＮＡ鎖の切断を示す。Ｓ１００Ａ１ｃｔ６／１１で処理した不全心臓が示すアポトーシス核はより少ない（中央のパネル）ことに留意されたい。統計解析により、生存性に対する全体的な治療効果に寄与するＳ１００Ａ１ｃｔ６／１１で処理した不全心臓におけるアポトーシスの有意な低減が明らかとなった（各群の動物数ｎ＝６、＊Ｐ＜０．０１（対照心臓に対して）、２方向ＡＮＯＶＡ）。control  対照TUNEL positive nuclei/HPF  ＴＵＮＥＬ陽性核／ＨＰＦ
【図２３】Ｓ１００Ａ１ｃｔ６／１１がβＡＲに誘発される致死性の心室性頻脈性不整脈から心不全マウスを保護するｉｎ  ｖｉｖｏでの顕著な治療効果を発揮することを示す図である。虚血後収縮機能不全を有する成体Ｃ５７／Ｂ６雄性／雌性マウス（ＢＷ３０ｇ）の２週間、毎日の２２５ｎｇのＳ１００Ａ１ｃｔ６／１１でのｉ．ｐ．処理が、カフェインによりカルシウムに感作された漏れやすいＲｙＲ２チャネルを有する心臓におけるβＡＲに誘発される心室細動から保護する。心不全マウスにおける催不整脈プロトコルは、Wayne Chen及び共同研究者らにより以前に公開されたプロトコル（Xiao etal., 2007, JBC 282:34828-34838）を修正したものとした。図２３は、致死性の心室細動の突発を引き起こすエピネフリン／カフェインのｉ．ｐ．注射に曝露した心不全対照の及びＳ１００Ａ１ｃｔ６／１１で処理したマウス（２週間のｉ．ｐ．処理）における代表的なＥＣＧ出力波形を示す（左パネル）。対照心不全マウスが８０％の死亡率を示したのに対してＳ１００Ａ１ｃｔ６／１１処理群では致死性の心室細動が１０匹の動物のうち２匹のみでしか起こらなかったことに留意されたい（コンティンジェンシーをフィッシャーの正確確率検定により検定した）。control  対照Epinephrin  エピネフリンCaffeine  カフェイン% HF mice with VF after epinephrin/caffeineinjection  エピネフリン／カフェイン注射後におけるＶＦを有するＨＦマウス（％）
【図２４】Ｓ１００Ａ１ｃｔ６／１１が正常な及び疾患の骨格筋において等尺性単収縮力を有意に増強することを示す図である。１２週齢のＣ５７／Ｂ６雄性マウスから単離した無傷の長指伸筋（extensor digitorum longum）（ＥＤＬ）骨格筋をＳ１００Ａ１ｃｔ６／１１（１μＭ）と共に４５分間インキュベーションすることにより、本発明者らにより以前に公開されたような筋単離及び等尺性張力測定についての方法（Most et al., 2003, J. Biol. Chem. 278:26356-26364）を適用する図２４Ａに示すように、比等尺性単収縮力及び比強縮性単収縮力の有意な増強がもたらされた。強縮トレイン（Tetanictrain）を１２５Ｈｚで１７５ミリ秒適用し、安定な力のプラトーに到達させた。さらに、以前に記載された（Most et al., 2006, Circulation 114:1258-1268）ように本発明者らにより作製された心筋梗塞後心不全マウスが、図２４Ｂに示すように２週間のＳ１００Ａ１ｃｔ６／１１のｉ．ｐ．処理（２２５ｎｇ、毎日の注射）後に骨格筋機能の改善を示した。心不全患者における主要な臨床症状、例えば疲労及び運動能力の低下は骨格筋機能の低下により引き起こされ、心拍出量と直接関連しないため、このことは重要な知見である。図２４Ａは、Ｓ１００Ａ１ｃｔ６／１１の細胞外適用（０．１μＭ〜１μＭ）により、ＥＤＬの等尺性単収縮力及び強縮性単収縮力が用量依存的に有意に増強されることを示す。図２３Ｂは、心不全マウスにおけるＳ１００Ａ１ｃｔ６／１１の全身（ｉ．ｐ．）投与により、骨格筋機能不全が減衰し、収縮能力が有意に改善することを示す（各群の筋肉／動物の数ｎ＝５、＊Ｐ＜０．０５（対応する対照に対して）、＋Ｐ＜０．０１（対照に対して）、２方向ＡＮＯＶＡ）。EDL (normal mice)/extracellular S100A1ct 6/11application  ＥＤＬ（正常なマウス）／Ｓ１００Ａ１ｃｔ６／１１の細胞外適用Specific isometric twitch force  比等尺性単収縮力control  対照Specific tetanic force  比強縮性単収縮力EDL (HF mice)/systemic i.p. S100A1ct 6/11application  ＥＤＬ（ＨＦマウス）／Ｓ１００Ａ１ｃｔ６／１１の全身（ｉ．ｐ．）適用
【図２５】電場刺激（１Ｈｚ）した単離ラット心室心筋細胞におけるカルシウム過渡振幅に対するＳ１００Ａ１ペプチドＮ−７５〜８５−Ｃ（配列番号１に示されるヒトＳ１００Ａ１タンパク質のアミノ酸７５〜８５）、Ｎ−７６〜８５−Ｃ（配列番号１に示されるヒトＳ１００Ａ１タンパク質のアミノ酸７６〜８５）、Ｎ−７７〜８５−Ｃ（配列番号１に示されるヒトＳ１００Ａ１タンパク質のアミノ酸７７〜８５）、Ｎ−７８〜８５−Ｃ（配列番号１に示されるヒトＳ１００Ａ１タンパク質のアミノ酸７８〜８５）、Ｎ−７９〜８５−Ｃ（配列番号１に示されるヒトＳ１００Ａ１タンパク質のアミノ酸７９〜８５）の効果を示す図である。Ｎ−７５〜８５−Ｃ及びＮ−７６〜８５−Ｃがカルシウム過渡応答の増強において同様の効力を有することに留意されたい。Ｎ末端アミノ酸のいかなるさらなる欠失もペプチドの変力効果を消失させる。ｎは３つの異なる調製物由来の試験した細胞の数に等しい。＊Ｐ＜０．０５（リンカー及びビヒクルに対して）、ＡＮＯＶＡ。Calcium transient amplitude in FURA2 AMloaded cells  ＦＵＲＡ２  ＡＭを負荷した細胞におけるカルシウム過渡振幅340/380 ratio counts  ３４０／３８０のカウント比Control  対照linker  リンカーvehicle  ビヒクル
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明を以下で詳細に説明する前に、本明細書中で説明する特定の方法論、プロトコル及び試薬は変動し得るので、本発明はこれらに限定されないと理解すべきである。本明細書中で使用される専門用語は、特定の実施形態を説明するためのものにすぎず、添付した特許請求の範囲のみによって限定される本発明の範囲を限定することは意図されないことも理解すべきである。他に規定のない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語及び科学用語は、当業者により一般的に理解される意味と同じ意味を有する。
【００１９】
以下では、本発明の要素を記載する。これらの要素を特定の実施形態と共に列挙するが、任意の様式及び任意の数でこれらを組み合わせて、さらなる実施形態を作り出すことができることを理解すべきである。様々に記載される実施例及び好ましい実施形態を、明示的に記載される実施形態にのみ本発明を限定するものと解釈すべきではない。この記載を、明示的に記載される実施形態を任意の数の開示される及び／又は好ましい要素と組み合わせた実施形態を支持及び包含するものと理解すべきである。さらに、本出願において記載される全ての要素の任意の置換及び組合せが、文脈上他に示されぬ限り、本出願の記載により開示されるものと考えるべきである。例えば、本発明によるペプチドの一実施形態において筋機能増強アミノ酸配列がアミノ酸モチーフ［Ｖ／Ｉ］−［Ｖ／Ｉ］−［Ｌ／Ｍ］−［Ｖ／Ｉ／Ｍ］−［Ａ／Ｇ／Ｓ］−［Ａ／Ｖ］−Ｌ−［Ｔ／Ａ］−［Ｖ／Ａ／Ｉ］−［Ａ／Ｍ／Ｖ］を含み、これから本質的になり、又はこれからなり、別の実施形態において親水性モチーフが親水性アミノ酸モチーフΛ４−Θ２（ここで、Λ及びΘは以下で本明細書中で規定されるようなものであり、親水性モチーフは好ましくは筋機能増強アミノ酸配列に含まれるアミノ酸モチーフのアミノ末端と直接連結する）を含む、これから本質的になる、又はこれからなる場合、アミノ酸配列Λ４−Θ２−［Ｖ／Ｉ］−［Ｖ／Ｉ］−［Ｌ／Ｍ］−［Ｖ／Ｉ／Ｍ］−［Ａ／Ｇ／Ｓ］−［Ａ／Ｖ］−Ｌ−［Ｔ／Ａ］−［Ｖ／Ａ／Ｉ］−［Ａ／Ｍ／Ｖ］を含むペプチドは本発明によるペプチドの一実施形態である。
【００２０】
好ましくは、本明細書中で使用される用語は、"Amultilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)",H.G.W. Leuenberger, B. Nagel and H. Koelbl, Eds., Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland,(1995)に記載されているように規定される。
【００２１】
本発明を実施するために、特に明示のない限り、当該技術分野の文献（例えばMolecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, J.Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor1989を参照されたい）において説明される、従来の化学、生化学、細胞生物学の方法及び組換えＤＮＡ法を利用する。さらに、当該技術分野の文献（例えばPractical Methods in Cardiovascular Research, S. Dhein et al. eds.,Springer Verlag Berlin Heidelberg, 2005を参照されたい）でも説明される従来の臨床心臓病学の方法を利用する。
【００２２】
以下の本明細書及び添付の特許請求の範囲を通じて、文脈上他に必要な場合以外は、「を含む（comprise）」という単語、並びに「を含む（comprises）」及び「を含む（comprising）」等の変化形は、記載された整数若しくは工程又は整数若しくは工程の群を包含することを示唆するが、任意の他の整数若しくは工程又は整数若しくは工程の群を除外することを示唆しないと理解される。本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用されるように、単数形「a」、「an」及び「the」は、その内容（content）が明らかに他の指示を与えるものでない限り、複数の指示対象を含む。
【００２３】
複数の文書が、本明細書の文章を通じて引用される。本明細書中で引用される文書（全ての特許、特許出願、科学的刊行物、製造業者の仕様書、取扱説明書等を含む）の各々が、上記のものであるか又は下記のものであるかに関わらず、その全体が参照により本明細書に援用される。本明細書のどの記載も、本発明が従来の発明に基づくこのような開示に先行する権利を有しないことを認めるものと解釈すべきではない。
【００２４】
本発明による「ペプチド」は、天然のものであっても又は天然のアミノ酸残基の誘導体であってもよく、好ましくはペプチド結合を介して連結されるアミノ酸残基の鎖を表し、ここで該ペプチドは１００個以下のアミノ酸残基又はアミノ酸残基の誘導体からなる。「アミノ酸」という用語は、天然のアミノ酸、及びアミノ酸誘導体を包含する。本発明との関連では「低分子アミノ酸」は好ましくは、１２５ダルトン未満の分子量を有するアミノ酸である。好ましくは、本発明との関連では低分子アミノ酸は、アミノ酸グリシン、アラニン、セリン、システイン、トレオニン及びバリン、又はその誘導体からなる群から選択される。本発明との関連では疎水性の非芳香族アミノ酸は好ましくは、０．５より高い、より好ましくは１．０より高い、さらにより好ましくは１．５より高いカイト・ドーリトルのヒドロパシーインデックスを有し、芳香族ではない任意のアミノ酸である。好ましくは、本発明との関連では疎水性の非芳香族アミノ酸は、アミノ酸アラニン（カイト・ドーリトルのヒドロパシーインデックス１．８）、メチオニン（カイト・ドーリトルのヒドロパシーインデックス１．９）、イソロイシン（カイト・ドーリトルのヒドロパシーインデックス４．５）、ロイシン（カイト・ドーリトルのヒドロパシーインデックス３．８）及びバリン（カイト・ドーリトルのヒドロパシーインデックス４．２）、又は上で規定されるようなカイト・ドーリトルのヒドロパシーインデックスを有するその誘導体からなる群から選択される。
【００２５】
本発明との関連では「筋肉」は、好ましくは横紋筋組織、又は横紋筋組織由来の筋肉細胞、例えば骨格筋細胞／骨格筋組織並びに心筋細胞及び心筋組織を意味する。
【００２６】
本発明によれば、「筋機能増強アミノ酸配列」という用語は、任意の筋肉固有の（specific）機能を増強する及び／又はこれを回復させること、例えば筋肉細胞及び筋肉組織の、好ましくは横紋筋組織の、最も好ましくは心筋細胞及び骨格筋細胞及び心筋組織及び骨格筋組織の収縮能力を増強することが可能であるアミノ酸配列を表す。適切な筋機能は筋肉細胞内における機能的なカルシウム処理に密接に依存すると考えられるため、「筋機能増強アミノ酸配列」という用語は、筋肉細胞、好ましくは骨格筋細胞及び／又は心筋細胞におけるカルシウム処理／循環、好ましくは筋小胞体のカルシウム処理／循環を増強する及び／又はこれを回復させることが可能であるアミノ酸配列も表す。筋細胞における収縮能力を、例えばビデオエッジ検出（video-edge-detection）（ＶＥＤ）技法を使用して電場刺激した単一の心筋細胞の収縮性を評価することにより、直接測定することができる（Most et al., 2004, J. Clin. Invest. 114:1550-1563（１５６１頁））。カルシウム処理を、蛍光カルシウム指示薬を使用してカルシウム過渡応答を評価することにより決定することができる（Most et al., 2004, J. Clin. Invest. 114:1550-1563（１５６１頁））。
【００２７】
本発明との関連では「を増強すること（enhancing）」（例えば筋機能、収縮能力及び／又はカルシウム処理を増強すること）という用語は、特定の機能を、該機能が正常であるか又は不完全であるか、すなわち筋肉細胞が健常であるか又は疾患状態であるかどうかと無関係に増大させる／増強することを意味する。好ましくは、「を増強すること」は、特定の機能を、対照の設定と比較して少なくとも１５％、好ましくは少なくとも２５％、好ましくは少なくとも３５％、より好ましくは少なくとも４５％、最も好ましくは少なくとも５０％増強することを意味する。好ましくは対照の設定は、健常患者、又は健常患者の群の平均の筋機能、収縮能力及び／又はカルシウム処理である。
【００２８】
本発明との関連では「を回復させること（restoring）」（例えば筋機能、収縮能力及び／又はカルシウム処理を回復させること）という用語は好ましくは、不完全な機能を、その正常な機能の少なくとも５０％まで、好ましくはその正常な機能の少なくとも６０％まで、好ましくはその正常な機能の少なくとも７０％まで、より好ましくはその正常な機能の少なくとも８０％まで、より好ましくはその正常な機能の少なくとも８５％まで、さらにより好ましくはその正常な機能の少なくとも９０％まで、さらにより好ましくはその正常な機能の少なくとも９５％まで、最も好ましくはその正常な機能の少なくとも１００％まで戻すことを意味し、ここで「正常な機能」は、いずれの筋疾患にも罹患していない個体由来の筋肉細胞により示されるその機能の平均値を意味する。例えば、左心室のカテーテル処置において力の発生を左心室における血圧上昇の一次導関数＋ｄｐ／ｄｔ［ｍｍＨｇ／秒］により評価し、心エコー検査において収縮能力をＭ−Ｍｏｄｅでの短縮率（ＦＳ％）、又は駆出率の算出値（ＥＦ％）により評価し（Most et al., 2004, J. Clin. Invest. 114: 1550-1563、Most et al., 2006, Circulation 114, 1258-1268、オンラインでの補遺における材料及び方法）、ＶＥＤにおいて収縮性を短縮率（ＦＳ％）及び収縮速度（μｍ／秒）により評価する。カルシウム循環は単一細胞でのみ評価することができ、較正される場合、ｎＭの遊離カルシウム濃度単位で測定される。およそ、麻酔したマウスにおける「正常な」＋ｄｐ／ｄｔは５０００ｍｍＨｇ／秒〜８０００ｍｍＨｇ／秒の範囲であることがあり、エコー検査の「正常な」ＥＦ％は６０％〜８０％、ＦＳ％は４０％〜７０％であり、「正常な」細胞のＦＳ％は５％〜１２％の範囲であることがあり、較正したカルシウム過渡応答は２００ｎＭ〜４００ｎＭの範囲であることがある。
【００２９】
作用剤との関連での「変力作用」という用語は、上記作用剤が筋肉の種類に関係なく筋肉収縮力に影響を及ぼすことを意味する。「正の変力作用」は筋肉収縮力を増大させることを意味し、「負の変力作用」は筋肉収縮力を減少させることを意味する。本発明のペプチドは、好ましくはｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏで、正の変力作用を示す。作用剤の、例えば本発明のペプチドの変力効果は、例えば試験対象の作用剤／ペプチドの存在下及び非存在下において刺激した筋細胞におけるカルシウム過渡応答を決定することにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで容易に決定することができる。例えば、カルシウム過渡応答を、落射蛍光デジタル化顕微鏡法を利用してＦＵＲＡ２−ＡＭを負荷し電場刺激した心筋細胞において評価することができる（Most et al., 2004, J. Clin. Invest. 114: 1550-1563（１５６１頁））。Ｆｌｕｏカルシウム指示薬ファミリーの成員、又はＲｈｏｄ−２ＡＭのような任意の蛍光カルシウム指示薬を、ＦＵＲＡ−２ＡＭの代わりに使用することができる。根本的な原理（principal）は同じである。代替的には、パッチクランプ処理した（patch-clamped）単離心筋細胞におけるカルシウム過渡応答測定（Kettlewell/Mostet al., 2005, J. Mol. Cell. Cardiol., 200: 900-910（９０１頁））を使用することもできる。ペプチドの正の変力効果を、例えばペプチドを投与して及び投与せずに麻酔したマウスにおける左心室のカテーテル処置により収縮能力を決定することにより、ｉｎ  ｖｉｖｏで試験することもできる。通常、この実験においては、収縮性を、最大の左心室の血圧上昇の一次導関数（＋ｄｐ／ｄｔｍａｘ）として記載する（Most et al., 2004, J. Clin. Invest. 114: 1550-1563、Most et al., 2006, Circulation 114;1258-1268）。代替的には、心エコー検査（Most et al., 2006, Circulation 114; 1258-1268）を使用することができる。
【００３０】
本発明との関連では「カルシウム循環を増強する及び／又はこれを回復させること」という用語は、筋細胞におけるカルシウム循環、好ましくは筋小胞体のカルシウム循環を、正常状態／非病的状態下において改善させる、又は病的状態下（すなわちカルシウム循環が不完全である場合）においてこれを上で記載したような正常な機能まで回復させることを意味する。カルシウム循環不全は、筋小胞体におけるカルシウム含有量の低減、興奮収縮連関時における筋小胞体からのカルシウムの放出の低減、静止状態の筋肉細胞における筋小胞体からのカルシウム漏出（例えば漏れやすいＲｙＲ筋小胞体カルシウム放出チャネルによる）、カルシウムスパーク頻度の増大、又は収縮後における筋小胞体及び／若しくはミトコンドリア中へのカルシウムの再取込みの低減／遅延化（例えば機能障害を有する若しくは機能しない筋小胞体／小胞体カルシウムＡＴＰアーゼ（ＳＥＲＣＡ）による）の結果として起こるものであり得る。したがって本発明によれば、カルシウム循環を、好ましくは、上記パラメータを改善させること、例えば、筋小胞体のカルシウム含有量を増大させること、興奮収縮連関時における筋小胞体からのカルシウムの放出を増大させること、静止状態の筋肉細胞において筋小胞体からのカルシウム漏出を低減させること、カルシウムスパーク頻度を低減させること、及び／又は筋小胞体若しくはミトコンドリア中へのカルシウムの再取込みを改善させることにより、増強する又はこれを回復させることができる。この理論に拘束されるものではないが、カルシウム循環不全は、筋肉細胞の収縮能力不全、例えば収縮機能不全に関する主要な理由の１つであると考えられる。したがって、カルシウム循環を増強する又はこれを回復させることは、収縮能力も増強する及び／又はこれを回復させると考えられる。
【００３１】
本発明との関連では「収縮能力」という用語は、筋肉収縮、例えば筋肉収縮力又は筋肉収縮時機（timing）と関連する任意の機能を包含する。骨格筋の場合には、強縮性収縮も、「収縮能力」という用語の範囲内に入る。「収縮能力不全」は、正常な／健常な筋肉細胞又は筋肉組織に関する平均値と比較した場合の収縮機能不全を表す。例えば、筋肉細胞又は筋肉組織の収縮能力は、例えば、所与の筋肉細胞又は筋肉組織の収縮力が正常な／健常な筋肉細胞又は筋肉組織に関する平均値から少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、最も好ましくは少なくとも５０％逸脱する場合、不完全であると考えられ、ここで「逸脱する」という用語は正常な平均値未満の値を、又は正常な平均値より高い値を表すことができ、好ましくは該用語は正常な平均値未満の値を表す。例えば、意識のあるヒトに関しては、心エコー検査による５０％未満の心臓のＥＦ％は、心不全の開始と考えられる。正常なヒト心臓の意識下（conscious）ＥＦ％はおよそ６５％〜７０％である。好ましくは、「収縮能力を増強する及び／又はこれを回復させること」という用語は、筋肉細胞又は筋肉組織、好ましくは骨格筋細胞若しくは骨格筋組織又は心筋細胞若しくは心筋組織の収縮力の増大、及び筋肉細胞収縮の不完全な時機の修正を意味する。この関連では、「不完全な時機」という用語は、適切に時機制御されない（inappropriately timed）筋肉収縮事象、例えば心筋における不整脈、又は骨格筋組織の振戦若しくは単収縮を表す。
【００３２】
本発明によるペプチドとの関連では「抗不整脈能（Anti-arrhythmic potential）」は、ペプチドが、筋細胞における、好ましくは心筋細胞及び心臓組織における適切に時機制御されない筋肉収縮、すなわち不整脈事象を低減させることが可能であることを意味する。本発明のペプチドは好ましくは、例えば致死性の心室性不整脈により不整脈発生による心臓突然死の基礎となる重大な病理機序である、不整脈誘発性のストア過負荷誘導性カルシウム放出（ＳＯＩＣＲ）から心筋細胞を保護する。好ましい一実施形態では、本発明によるペプチドは、心筋細胞における不整脈、好ましくはカルシウム誘導性不整脈からの保護と変力作用を関連付ける。当業者は、ペプチドが抗不整脈効力を示すかどうかを、例えば試験対象のペプチドが心筋細胞、好ましくは内腔のカルシウムに感作された漏れやすいＲｙＲ２を有する心室心筋細胞をβＡＲに誘発される催不整脈性のＳＯＩＣＲ及びカルシウム波から保護することが可能であるかどうかを評価することにより、容易に決定することができる。例えば、正常な心室心筋細胞を、潜在的に抗不整脈効力を示すペプチドの存在下及び非存在下において１０−７Ｍのイソプロテレノール及び０．５ｍＭのカフェインで処理し、拡張期のカルシウム濃度に関してモニタリングすることができる。不全心筋細胞において、１０−７Ｍのイソプロテレノール、又は等効果のカテコールアミン（例えばドブタミン、ノルアドレナリン、アドレナリン）単独での処理を使用して、カルシウム処理との関連での不整脈誘発性の分子変化を明らかにすることができる。加えて、適切な等効果用量の、β−アドレナリン受容体の下流にあるセカンドメッセンジャーである環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）を増強する他の作用剤、例えばホスホジエステラーゼ阻害剤（ロリプラム、エノキシモン）を、カフェインの存在下又は非存在下において使用することができる。ＳＯＩＣＲを、蛍光カルシウム指示薬を負荷した静止状態の心筋細胞における共焦点顕微鏡によるカルシウム波及びカルシウムスパーク測定により（Voelkers et al., 2007, Cell Calcium 41:135-143（１３６頁））、又は落射蛍光顕微鏡法により蛍光カルシウム指示薬を負荷し電場刺激した（Most et al., 2004, J. Clin. Invest. 114:1550-1563）及びパッチクランプ処理した（Kettlewell et al., 2005, J. Mol. Cell. Cardiol. 39:900-910（９０１頁））心筋細胞における拡張期のカルシウム波／放出として特定することができる。代替的には、ＳＯＩＣＲ及びカルシウム波の同等物（equivalents）、例えば遅延又は早期後収縮を、ＶＥＤにより、電場刺激した心筋細胞における拡張期収縮により評価することができる（Most et al., 2004, J. Clin. Invest. 114:1550-1563）。
【００３３】
本発明との関連では、「Ｓ１００タンパク質のカルボキシ末端アミノ酸」という用語は好ましくは、Ｓ１００タンパク質のカルボキシ末端の２０アミノ酸を、例えば配列番号１に示されるアミノ酸配列のアミノ酸７５〜９４、すなわちアミノ酸配列Ｙ−Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ−Ｃ−Ｎ−Ｎ−Ｆ−Ｆ−Ｗ−Ｅ−Ｎ−Ｓ（配列番号２）を、より好ましくはＳ１００タンパク質のカルボキシ末端の２５アミノ酸を、最も好ましくはＳ１００タンパク質のカルボキシ末端の３０アミノ酸を表す。
【００３４】
本発明によるペプチドとの関連では「細胞膜に浸透することが可能な」という用語は、ペプチドが無傷の細胞の細胞膜を横断することができることを意味し、ここで好ましくは該細胞は、脊椎動物の細胞、より好ましくは哺乳動物の細胞、例えばマウス、ラット、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ又はウマ等の細胞、最も好ましくはヒトの細胞である。好ましくは、本発明との関連では細胞は、筋肉細胞、好ましくは骨格筋細胞又は心筋細胞である。したがって、最も好ましくは本発明との関連では細胞は、哺乳動物の筋肉細胞である。当業者は、例えば、上記ペプチドを例えば放射性マーカー又は蛍光マーカーで標識すること、及び標識したペプチドを無傷の細胞、好ましくは哺乳動物の筋肉細胞、例えばラット心室心筋細胞と共にインキュベートすること、及び細胞内において、例えば無傷の細胞の細胞質中において標識したペプチドを、例えば蛍光顕微鏡法により検出することができるかどうかを評価することにより、ペプチドが細胞膜に浸透することが可能であるかどうかを容易に評価することができる（Most et al., 2005, J. Cell Sci. 118:421-431（４２２頁）、Voelkers et al., 2007, Cell Calcium 41:135-143（１３６頁））。
【００３５】
本発明との関連ではＳ１００カルシウム結合タンパク質は好ましくは、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ａ１、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ｚ、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ｔ、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ｓ及びＳ１００タンパク質α鎖からなる群から選択される。最も好ましくは、本発明との関連ではＳ１００カルシウム結合タンパク質は、Ｓ１００Ａ１である。本発明との関連ではＳ１００カルシウム結合タンパク質は、任意の種のもの、例えばヒト又は他の霊長類、マウス若しくはラット等のＳ１００タンパク質であってもよく、好ましくはヒト起源のものである。Ｓ１００カルシウム結合タンパク質の好ましい例は、以下のＧｅｎＢａｎｋ又はＲｅｆ  Ｓｅｑのアクセッション番号：ＸＰ＿００１４９４９２０．１、ＸＰ＿００１３６５０５７．１、ＸＰ＿００１１４０１４４、ＸＰ＿５１３８２０．２、ＸＰ＿００１１１１０５２．１、ＣＡＩ１９６７４．１、ＸＰ＿５３７２６５．１、ＮＰ＿００１０９２５１２．１、ＮＰ＿００６２６２．１、ＮＰ＿００１１２７３１９．１、ＡＡＢ２０５３９．２、ＮＰ＿００１００７６３７．１、ＮＰ＿０３５４３９．１、ＸＰ＿００２１９６０２９．１、ＸＰ＿００１３３２６９２．１、ＮＰ＿００１０８２８２０．１、ＸＰ＿００１５０４０００．２、ＮＰ＿５７０１２８．２、ＸＰ＿５２６８８７．２、ＸＰ＿２２６７１０．１、ＸＰ＿６０７１５４．２、ＸＰ＿８５３２１９．１、ＮＰ＿００１０７４６２８．１、ＮＰ＿００１０１３５１３．１、ＡＡＮ６３５２７．１、ＡＣＩ６８０６０．１及びＸＰ＿００１３４４５７５．２により利用可能なものである。
【００３６】
本発明との関連では疾患又は障害「を治療すること」という用語は、疾患の原因が除去されるかどうかとは無関係に疾患状態が改善される、すなわち疾患を有する個体が治癒する、又はその症状のみが減弱することを意味する。したがって、本発明によるペプチドは筋肉細胞においてカルシウム循環／処理を安定化させる及び／又はこれを回復させること、並びにそれにより上記細胞の収縮能力を改善させることによりその治療効果を発揮すると考えられるけれども、このペプチドを、カルシウム循環不全により引き起こされるものではない筋疾患の治療のために使用することもできる。例えば、骨格筋障害の症状、例えば筋力低下（筋肉細胞におけるカルシウム循環不全により引き起こされるものではない、又はこれと関連するものではない）も、本発明によるペプチドにより減弱する。
【００３７】
本発明との関連では「個体」という用語は好ましくは、動物患者、好ましくは心筋障害若しくは骨格筋障害に罹患している、又はその両方に罹患している動物患者を表す。動物患者は、好ましくは脊椎動物患者、より好ましくは哺乳動物患者、例えば家畜、例えばマウス、ラット、ネコ、モルモット、ウサギ、イヌ、ブタ、ウシ又はウマである。最も好ましくは動物患者はヒト患者であり、「個体」という用語は、筋障害に、好ましくは心筋障害及び／又は骨格筋障害に罹患しているヒト患者を表す。本発明によるペプチドの機能的特質の評価との関連では、「個体」という用語は好ましくは、実験動物、例えばマウス、ラット、ウサギ又は霊長類を表し、最も好ましくはこの関連では上記用語は、心不全動物モデル、例えば心筋梗塞後マウスモデル又は心筋梗塞後ラットモデルを表す（マウス：Most et al., 2006, Circulation 114:1258-1268（補遺）；ラット：Most et al., 2004, J. Clin. Invest. 114:1550-1563）。
【００３８】
第１の態様では、本発明は、アミノ酸モチーフ：
Φ４−Ｘ−Ψ−Ｌ−［Ｔ／Ａ］−Ψ２
（式中、Φ及びΨはそれぞれ独立して選択される疎水性の非芳香族アミノ酸であり、Ｘは任意のアミノ酸、好ましくは低分子アミノ酸である）を含む、これから本質的になる、又はこれからなる筋機能増強アミノ酸配列を含むペプチドであって、該筋機能増強アミノ酸配列がＳ１００カルシウム結合タンパク質Ａ１のカルボキシ末端アミノ酸のうちの１８個以下の連続するアミノ酸、例えば１８個以下、１７個以下、１６個以下、１５個以下、１４個以下、１３個以下、１２個以下、１１個以下又は１０個以下の連続するアミノ酸を含有し、該ペプチドが最大１００アミノ酸、例えば最大１００アミノ酸、９５アミノ酸、９０アミノ酸、８５アミノ酸、８０アミノ酸、７５アミノ酸、７０アミノ酸、６５アミノ酸、６０アミノ酸、５５アミノ酸、５０アミノ酸、４５アミノ酸、４０アミノ酸、３５アミノ酸、３０アミノ酸、２５アミノ酸、２０アミノ酸、１９アミノ酸、１８アミノ酸、１７アミノ酸、１６アミノ酸、１５アミノ酸、１４アミノ酸、１３アミノ酸、１２アミノ酸、１１アミノ酸又は１０アミノ酸の全長を有し、該ペプチドが正の変力作用を示す、ペプチドを提供する。Ｌはアミノ酸ロイシンを、Ｔはアミノ酸トレオニンを、Ａはアミノ酸アラニンを表す。好ましい一実施形態では、本発明のペプチドは、１０アミノ酸〜８０アミノ酸の、より好ましくは１０アミノ酸〜７０アミノ酸の、より好ましくは１０アミノ酸〜６０アミノ酸の、より好ましくは１０アミノ酸〜５０アミノ酸の、さらにより好ましくは１０アミノ酸〜４０アミノ酸の、さらにより好ましくは１０アミノ酸〜３０アミノ酸の長さを有し、最も好ましくはペプチドは、１０アミノ酸〜２０アミノ酸の長さを有する。好ましい一実施形態では、ペプチドは、１５アミノ酸長又は１６アミノ酸長である。
【００３９】
好ましくは、筋機能増強アミノ酸配列を除く本発明によるペプチドは、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ａ１のカルボキシ末端アミノ酸と、好ましくはＳ１００カルシウム結合タンパク質Ａ１、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ｚ、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ｔ、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ｓ及びＳ１００タンパク質α鎖からなる群から選択されるＳ１００カルシウム結合タンパク質と顕著に異なり、最も好ましくは任意のＳ１００カルシウム結合タンパク質のカルボキシ末端と顕著に異なる。より好ましくは、筋機能増強アミノ酸配列を除く本発明によるペプチドは、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ａ１のアミノ酸配列と、好ましくはＳ１００カルシウム結合タンパク質Ａ１、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ｚ、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ｔ、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ｓ及びＳ１００タンパク質α鎖からなる群から選択されるＳ１００カルシウム結合タンパク質と顕著に異なり、最も好ましくは任意のＳ１００カルシウム結合タンパク質のアミノ酸配列と顕著に異なる。「顕著に異なる」という用語は、アミノ酸配列が少なくとも８０％異なり、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは１００％異なることを意味する。配列における差異を、ポリペプチド配列を整列させることにより評価することができる。かかるアライメントツールは当業者に既知であり、例えばワールドワイドウェブで（例えば、標準的な設定（好ましくはＡｌｉｇｎに関してはＥＭＢＯＳＳ：：ｎｅｅｄｌｅ、Ｍａｔｒｉｘ：Ｂｌｏｓｕｍ６２、Ｇａｐ  Ｏｐｅｎ  １０．０、Ｇａｐ  Ｅｘｔｅｎｄ  ０．５）を使用するＣｌｕｓｔａｌＷ（www.ebi.ac.uk/clustalw）又はＡｌｉｇｎ（http://www.ebi.ac.uk/emboss/align/ index.html）のように）取得することができる。２つ以上のポリペプチド配列における残基は、最良の配列アライメントにおいて整列される残基が互いに異なる場合、互いに異なるとされる。２つのポリペプチドの間の「最良の配列アライメント」は、整列される同一の残基の数が最大となるアライメントと定義される。
【００４０】
本発明によるペプチドの好ましい一実施形態では、筋機能増強アミノ酸配列は、アミノ酸モチーフ：
［Ｙ／Ｆ／Ｗ］−Φ４−Ｘ−Ψ−Ｌ−［Ｔ／Ａ］−Ψ２
（式中、Φ及びΨはそれぞれ独立して選択される疎水性の非芳香族アミノ酸であり、Ｘは任意のアミノ酸、好ましくは低分子アミノ酸である）を含む、これから本質的になる、又はこれからなる。疎水性の非芳香族アミノ酸、及び低分子アミノ酸は、上で規定されるようなものである。
【００４１】
好ましい一実施形態では、本発明によるペプチドの筋機能増強アミノ酸配列は、αヘリックス構造を形成する。
【００４２】
特に好ましい一実施形態では、本発明のペプチドは、細胞膜、好ましくは脊椎動物の細胞膜、さらにより好ましくは哺乳動物の細胞膜、さらにより好ましくは哺乳動物の筋肉細胞膜、最も好ましくは哺乳動物の骨格筋細胞膜、及び哺乳動物の心筋細胞膜に浸透することが可能である。好ましくは、本発明のペプチドは、生理学的環境中で、例えば培養培地（例えば、哺乳動物の組織培養用の）中で、及び／又は体液中で、例えば血液中で、上で規定されるような細胞膜に浸透することが可能である。したがって、最も好ましくは、本発明のペプチドは、非経口の投与経路により、例えば静脈内注射により投与される場合、ｉｎ  ｖｉｖｏで細胞膜に浸透することが可能である。
【００４３】
好ましい一実施形態では、本発明によるペプチドは、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ａ１、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ｚ、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ｔ、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ｓ及びＳ１００タンパク質α鎖からなる群から選択されるＳ１００カルシウム結合タンパク質のカルボキシ末端アミノ酸のうちの１８個以下、１７個以下、１６個以下、１５個以下、１４個以下、１３個以下、１２個以下、１１個以下又は１０個以下の連続するアミノ酸を含有し、ここで該Ｓ１００カルシウム結合タンパク質は好ましくはヒト起源のもの、最も好ましくは任意の種のものである。したがって、好ましくは本発明によるペプチドは、好ましくは、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ａ１のカルボキシ末端アミノ酸のうちの１８個以下、１７個以下、１６個以下、１５個以下、１４個以下、１３個以下、１２個以下、１１個以下又は１０個以下の連続するアミノ酸を含有し、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ｚのカルボキシ末端アミノ酸のうちの１８個以下、１７個以下、１６個以下、１５個以下、１４個以下、１３個以下、１２個以下、１１個以下又は１０個以下の連続するアミノ酸を含有し、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ｔのカルボキシ末端アミノ酸のうちの１８個以下、１７個以下、１６個以下、１５個以下、１４個以下、１３個以下、１２個以下、１１個以下又は１０個以下の連続するアミノ酸を含有し、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ｓのカルボキシ末端アミノ酸のうちの１８個以下、１７個以下、１６個以下、１５個以下、１４個以下、１３個以下、１２個以下、１１個以下又は１０個以下の連続するアミノ酸を含有し、Ｓ１００タンパク質α鎖のカルボキシ末端アミノ酸のうちの１８個以下、１７個以下、１６個以下、１５個以下、１４個以下、１３個以下、１２個以下、１１個以下又は１０個以下の連続するアミノ酸を含有し、該Ｓ１００カルシウム結合タンパク質は好ましくはヒト起源のもの、最も好ましくは任意の種のものである。最も好ましい一実施形態では、本発明のペプチドは、好ましくはヒト起源の、より好ましくは任意の種の任意のＳ１００カルシウム結合タンパク質のカルボキシ末端アミノ酸のうちの１８個以下、１７個以下、１６個以下、１５個以下、１４個以下、１３個以下、１２個以下、１１個以下又は１０個以下の連続するアミノ酸を含有する。特に、本発明によるペプチドは、配列Ｙ−Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ−Ｃ−Ｎ−Ｎ−Ｆ−Ｆ−Ｗ−Ｅ−Ｎ−Ｓ（配列番号２）、すなわち配列番号１に示されるアミノ酸配列のアミノ酸７５〜９４を含まない、又はこれからならない。
【００４４】
特定の好ましい一実施形態では、本発明のペプチドは、筋細胞において、好ましくは骨格筋細胞又は心筋細胞において収縮能力及び／又はカルシウム循環を増強する能力を示す。
【００４５】
特に好ましい一実施形態では、本発明のペプチドは、筋細胞に対する、好ましくは心筋細胞に対する抗不整脈能を示し、したがって好ましくは、不整脈から、好ましくはカテコールアミンに誘発される不整脈から、好ましくは心臓突然死の原因であることが多い心室性不整脈から筋細胞及び心臓組織を保護することが可能である。好ましくは、本発明のペプチドは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏで抗不整脈能を示す。好ましくは、本発明のペプチドは、致死性の心室性頻脈性不整脈から、好ましくはβ−アドレナリン受容体（βＡＲ）に誘発される致死性の心室性頻脈性不整脈から、好ましくはカテコールアミンに誘発される致死性の心室性頻脈性不整脈から個体を保護する能力を示す。好ましくは、非経口の投与経路を介してペプチドが投与される場合、ｉｎ  ｖｉｖｏで抗不整脈能が観察される。ペプチドの抗不整脈能を、例えばペプチドが上で記載したようなＳＯＩＣＲから心筋細胞を保護するかどうかを検証することにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価することができる。ペプチドの抗不整脈能を、例えば心不全動物モデルにおいて、例えば心筋梗塞後マウスモデルにおいてβＡＲに誘発される頻脈性不整脈によりもたらされる死亡率に対するペプチドでの処理の効果を検証することにより、ｉｎ  ｖｉｖｏで評価することができる（Most et al., 2006, Circulation 114:1258-1268、補遺）。例えばペプチドを、好ましくは非経口的に、例えば腹腔内に、静脈内に、又は皮下に、数日間、例えば６日間、７日間、８日間若しくは９日間、最大数週間、例えば２週間、３週間又は４週間、好ましくは２週間毎日、又は隔日で、虚血後収縮機能不全を有するマウスに投与することができる。致死性の心室性頻脈性不整脈を、ペプチドでの或る特定の期間の処理後に、例えば７日後、８日後、９日後、１０日後に、又は２週間後に、カフェイン（例えば１００ｍｇ／ｋｇ〜１４０ｍｇ／ｋｇの範囲の濃度の、好ましくは１２０ｍｇ／ｋｇの濃度の）と組み合わせたエピネフリン（例えば１．５ｍｇ／ｋｇ〜２．５ｍｇ／ｋｇの範囲の濃度の、好ましくは２ｍｇ／ｋｇの濃度の）の投与により、動物において誘発することができる。致死性の心室細動を、遠隔測定ＥＣＧによりモニタリングすることができる（例えばXiao et al., 2007, J. Biol. Chem. 282:34828-34838を参照されたい）。
【００４６】
別の好ましい実施形態では、本発明のペプチドは、筋細胞、例えば骨格筋細胞及び心筋細胞において、好ましくは心筋細胞においてカルシウムスパーク頻度を低減させる能力を有する。好ましくは、本発明のペプチドは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでカルシウムスパーク頻度を低減させる能力を示す。好ましくは、非経口の投与経路を介してペプチドが投与される場合、ｉｎ  ｖｉｖｏでの効果が観察される。この関連では「を低減させること（Reducing）」は好ましくは、ペプチドで処理した筋細胞におけるカルシウムスパーク頻度が、ペプチドで処理していない対照筋細胞と比較して少なくとも１５％、より好ましくは少なくとも２５％、さらにより好ましくは少なくとも３０％、最も好ましくは少なくとも４０％低減することを意味する。好ましくは、この能力は、心筋細胞に適用されるペプチドの濃度に依存する。好ましくは、本発明のペプチドは、無傷の心筋細胞が存在する液体に添加される場合、該無傷の心筋細胞においてカルシウムスパーク頻度を低減させる能力を有する。例えば、本発明のペプチドは好ましくは、５０ｎＭ〜５００ｎＭの範囲の濃度で心筋細胞の培地に添加される場合、好ましくは５０ｎＭ〜２５０ｎＭの範囲の濃度で適用される場合、より好ましくは７５ｎＭ〜１５０ｎＭの範囲の濃度で適用される場合、最も好ましくは１００ｎＭで適用される場合、静止状態の心筋細胞において、例えば培養した静止状態のラット心室心筋細胞において、カルシウムスパーク頻度を低減させるが、６００ｎＭ以上の濃度で、好ましくは７００ｎＭ以上の濃度で、より好ましくは８００ｎＭ以上の濃度で、さらにより好ましくは９００ｎＭ以上の濃度で、最も好ましくは１０００ｎＭ以上の濃度で適用される場合、カルシウムスパーク頻度を増大させる（Voelkers M. et al., 2007, Cell Calcium 41:135-143）。したがって、当業者は、ペプチドがカルシウムスパーク頻度を低減させる能力を有するかどうかを容易に決定することができる。特に好ましい一実施形態では、本発明のペプチドは、上で記載したように抗不整脈能、及びカルシウムスパーク頻度を低減させる能力を示す。
【００４７】
別の好ましい実施形態では、本発明のペプチドは、アポトーシス細胞死から、好ましくはカルシウム誘導性アポトーシス細胞死から、好ましくは筋小胞体のカルシウム漏出に誘発されるアポトーシス細胞死から筋細胞、好ましくは骨格筋細胞及び／又は心筋細胞を保護する。したがって、好ましくは、本発明のペプチドは、抗アポトーシス能を示す。好ましくは、本発明のペプチドは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでこの抗アポトーシス効果を示す。好ましくは、本発明のペプチドは、ｉｎ  ｖｉｖｏで不全心筋におけるアポトーシス細胞死を防止する、すなわちｉｎ  ｖｉｖｏでアポトーシス細胞死から不全心筋における心筋細胞を保護する。好ましくは、非経口の投与経路を介してペプチドが投与される場合、ｉｎ  ｖｉｖｏでの保護効果が観察される。この関連では「を保護すること（Protecting）」は、本発明によるペプチドで処理した細胞におけるアポトーシス細胞死の程度が、対照群と比較して少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、さらにより好ましくは少なくとも５０％、最も好ましくは少なくとも６０％低減することを意味する。当業者は、例えばペプチドの存在下及び非存在下において長期のカフェイン曝露により内腔のカルシウムに感作された漏れやすいＲｙＲカルシウム放出チャネルを有する筋細胞における、好ましくは心室心筋細胞におけるアポトーシスの程度を観察することにより、この特質に関してｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験することができる。アポトーシスの指標は例えば、例えばＤＮＡラダリングにより検証することができる断片化ゲノム（Liu et al., 2005, Circulation 111:90-96）、シトクロムｃ放出又はカスパーゼ３活性である（Most et al., 2003, J. Biol. Chem. 278:48404-48412）。ペプチドの抗アポトーシス効果を、実験的心不全動物モデルにおいてｉｎ  ｖｉｖｏで評価することができる。例えば、虚血後収縮機能不全を有するマウスを、ペプチドで処理することができ、処理したマウス及び対照のマウスの心臓組織を、アポトーシス心筋細胞の程度に関して評価することができる。ペプチドを、好ましくは非経口的に、例えば腹腔内に、静脈内に、又は皮下に、数日間、例えば６日間、７日間、８日間若しくは９日間、最大数週間、例えば２週間、３週間又は４週間、好ましくは２週間毎日、又は隔日で、投与することができる。アポトーシス細胞の程度を、ＴｎＩ及びＣＤ３１について対比染色した（TnI and CD31 counterstained）心臓組織切片のＴＵＮＥＬ染色により評価することができる（Most et al., 2006, Circulation 114:1258-1268）。特に好ましい一実施形態では、本発明のペプチドは、上で記載したように抗不整脈能を示し、アポトーシス細胞死から筋細胞を保護する。
【００４８】
別の好ましい実施形態では、本発明のペプチドは、好ましくは静止状態の筋細胞、例えば骨格筋細胞及び心筋細胞において筋小胞体からのカルシウム漏出を防止する及び／又はこれを低減させる能力を有する。好ましくは、本発明のペプチドは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでこの効果を示す。好ましくは、非経口の投与経路を介してペプチドが投与される場合、このｉｎ  ｖｉｖｏでの効果が観察される。この理論に拘束されるものではないが、本発明のペプチドは、その閉じた立体構造においてＲｙＲ筋小胞体カルシウム放出チャネルを安定化させ、それによりこれらのチャネルからのカルシウム漏出を低減させると考えられる（Most et al., 2006, Circulation 114:1258-1268、Voelkers M. et al., 2007, Cell Calcium 41:135-143）。特に好ましい一実施形態では、本発明のペプチドは、上で記載したように抗不整脈能を示し、カルシウム漏出を防止する及び／又はこれを低減させる。
【００４９】
別の好ましい実施形態では、本発明のペプチドは、ｉｎ  ｖｉｖｏで血行動態機能を回復させる能力を示す。好ましくは、本発明のペプチドは、心不全、例えば心筋梗塞時又は心筋梗塞後における心不全に罹患している個体において血行動態機能を回復させる。好ましくは、非経口の投与経路を介してペプチドが投与される場合、この効果が観察される。当業者は、例えば実験的マウス心不全モデルを使用することにより、この機能に関してペプチドを容易に試験することができる。例えば、当業者は、ペプチドを投与して及び投与せずに虚血後収縮機能不全を有するマウスにおける心機能及び生存率を決定することができる。ペプチドを、好ましくは非経口的に、例えば腹腔内に、静脈内に、又は皮下に、数日間、例えば６日間、７日間、８日間若しくは９日間、最大数週間、例えば２週間、３週間又は４週間、好ましくは２週間毎日、又は隔日で、投与することができる。実験動物の左心室機能を、シリアル心エコー検査により評価することができる（Most et al., 2003, J. Bio. Chem. 278; 33809-33817、Most et al., 2006, Circulation 114:1258-1268）。好ましくは、本発明のペプチドは、抗不整脈効力、及びｉｎ  ｖｉｖｏで血行動態機能を回復させる能力を示す。
【００５０】
別の好ましい実施形態では、本発明のペプチドは、骨格筋組織、例えば骨格筋線維において等尺性単収縮力及び／又は強縮性単収縮力を増強する。好ましくは、本発明のペプチドは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでこの効果を示す。好ましくは、非経口の投与経路を介してペプチドが投与される場合、このｉｎ  ｖｉｖｏでの効果が観察される。当業者は、例えばペプチド処理した及び処理していない無傷の筋肉又は筋線維、例えば実験動物から単離した無傷の長指伸筋骨格筋における等尺性張力測定により、所与のペプチドに対してこの機能を容易に評価することができる。例えば、単離した筋肉を、或る特定の期間、例えば３０分間〜６０分間、好ましくは４５分間、種々の濃度の、例えば５００ｎＭ〜４μＭの範囲の濃度の、好ましくは１μＭの濃度のペプチドと共にインキュベートすることができる。単離した筋肉をその後、強縮トレイン（例えば１２５Ｈｚで１７５ミリ秒間適用される）で刺激することができ、等尺性張力を測定することができる（Weisleder et al., 2006, J. Cell Biol. 174:639-654）。好ましくは、等尺性単収縮力及び／又は強縮性単収縮力に対する増強効果は、ペプチド（好ましくはこのペプチドは非経口投与されたものである）で全身的に処理された実験動物から単離した筋線維に対しても観察される。したがって、好ましい一実施形態では、本発明のペプチドは、全身的に、好ましくは非経口的に、例えば腹腔内に、静脈内に、又は皮下に投与される場合、骨格筋機能不全を減衰させ、ｉｎ  ｖｉｖｏで骨格筋細胞において収縮能力を増強する。特に好ましい一実施形態では、本発明のペプチドは、上で記載された、骨格筋細胞において等尺性単収縮力及び強縮性単収縮力を増強する能力、心筋細胞において収縮能力を増大させる能力、並びに抗不整脈能を示す。
【００５１】
特に好ましい一実施形態では、本発明のペプチドは、上記の機能、すなわち骨格筋細胞及び／又は骨格筋線維における、抗不整脈能、抗アポトーシス能、カルシウムスパーク頻度を低減させる能力、筋小胞体からのカルシウム漏出を防止する及び／又はこれを低減させる能力、好ましくは心不全に罹患している個体において、血行動態機能を回復させる能力、並びに等尺性単収縮力及び／又は強縮性単収縮力を増強する能力のうちの２つ以上、例えば２つ、３つ、４つ又は５つ、好ましくは全てを示す。好ましくは、上記機能を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏで観察することができる。好ましくは、非経口の投与経路を介してペプチドが投与される場合、上記ｉｎ  ｖｉｖｏでの効果を観察することができる。
【００５２】
本発明によるペプチドの好ましい一実施形態では、Φはアラニン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン及びバリンからなるアミノ酸の群からそれぞれ独立して選択され、好ましくはΦはメチオニン、イソロイシン、ロイシン及びバリンからそれぞれ独立して選択される。
【００５３】
本発明によるペプチドの別の好ましい実施形態では、Ψはアラニン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン及びバリンからなるアミノ酸の群からそれぞれ独立して選択され、好ましくはΨはアラニン、メチオニン、イソロイシン及びバリンからそれぞれ独立して選択される。本発明によるペプチドの特に好ましい一実施形態では、Φはメチオニン、イソロイシン、ロイシン及びバリンからそれぞれ独立して選択され、Ψはアラニン、メチオニン、イソロイシン及びバリンからそれぞれ独立して選択される。
【００５４】
本発明によるペプチドの別の好ましい実施形態では、Ｘは低分子アミノ酸であり、ここで該低分子アミノ酸は好ましくはプロリンではない。好ましくは、Ｘはグリシン、アラニン、セリン、システイン、トレオニン及びバリンからなるアミノ酸の群から選択され、より好ましくはＸはグリシン、アラニン及びセリンからなる群から選択される。本発明によるペプチドの特に好ましい一実施形態では、Φはメチオニン、イソロイシン、ロイシン及びバリンからそれぞれ独立して選択され、Ψはアラニン、メチオニン、イソロイシン及びバリンからそれぞれ独立して選択され、Ｘはグリシン、アラニン、セリン、システイン、トレオニン及びバリンから、好ましくはグリシン、アラニン及びセリンから選択される。
【００５５】
本発明によるペプチドの特に好ましい一実施形態では、筋機能増強アミノ酸配列は、アミノ酸配列［Ｖ／Ｉ］−［Ｖ／Ｉ］−［Ｌ／Ｍ］−［Ｖ／Ｉ／Ｍ］−［Ａ／Ｇ／Ｓ］−［Ａ／Ｖ］−Ｌ−［Ｔ／Ａ］−［Ｖ／Ａ／Ｉ］−［Ａ／Ｍ／Ｖ］を含む、これから本質的になる、又はこれからなる。このことは、アミノ酸モチーフが好ましくは配列［Ｖ／Ｉ］−［Ｖ／Ｉ］−［Ｌ／Ｍ］−［Ｖ／Ｉ／Ｍ］−［Ａ／Ｇ／Ｓ］−［Ａ／Ｖ］−Ｌ−［Ｔ／Ａ］−［Ｖ／Ａ／Ｉ］−［Ａ／Ｍ／Ｖ］であることを意味する。
【００５６】
本発明によるペプチドの特に好ましい一実施形態では、筋機能増強アミノ酸配列は、アミノ酸配列Ｖ１−Ｖ２−Ｌ３−Ｖ４−Ａ５−Ａ６−Ｌ７−Ｔ８−Ｖ９−Ａ１０（配列番号３）（式中、Ｖ１及びＶ２は独立してイソロイシンにより置換されてもよく、好ましくはＶ１は置換されず、Ｌ３はメチオニンにより置換されてもよいが好ましくは置換されず、Ｖ４はイソロイシン又はメチオニンにより、好ましくはイソロイシンにより置換されてもよく、Ａ５はグリシン又はセリンにより、好ましくはセリンにより置換されてもよく、Ａ６はバリンにより置換されてもよく、Ｔ８はアラニンにより置換されてもよく、Ｖ９はアラニン又はイソロイシンにより、好ましくはアラニンにより置換されてもよく、Ａ１０はメチオニン又はバリンにより置換されてもよいが好ましくは置換されない）を含み、又はこれからなり、アミノ酸配列Ｖ１−Ｖ２−Ｌ３−Ｖ４−Ａ５−Ａ６−Ｌ７−Ｔ８−Ｖ９−Ａ１０のうちの好ましくは最大５個、好ましくは最大４個、より好ましくは最大３個、さらにより好ましくは最大２個、最も好ましくは最大１個のアミノ酸が上で記載したように別のアミノ酸で置換される。本発明によるペプチドの好ましい一実施形態では、上で記載したような最も好ましいアミノ酸配列、すなわちＶ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号４）において、最大３個、例えば１個、２個又は３個のアミノ酸が置換される。
【００５７】
本発明によるペプチドの特に好ましい一実施形態では、筋機能増強アミノ酸配列は、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号４）、Ｉ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号５）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号６）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号７）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｉ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号８）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｍ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号９）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号１０）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号１１）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号１２）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ａ（配列番号１３）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ａ（配列番号１４）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ａ（配列番号１５）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｍ（配列番号１６）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｖ（配列番号１７）、Ｉ−Ｉ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号１８）、Ｉ−Ｖ−Ｍ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号１９）、Ｉ−Ｖ−Ｌ−Ｉ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号２０）、Ｉ−Ｖ−Ｌ−Ｍ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号２１）、Ｉ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号２２）、Ｉ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号２３）、Ｉ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号２４）、Ｉ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ａ（配列番号２５）、Ｉ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ａ（配列番号２６）、Ｉ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ａ（配列番号２７）、Ｉ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｍ（配列番号２８）、Ｉ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｖ（配列番号２９）、Ｖ−Ｉ−Ｍ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号３０）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｉ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号３１）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｍ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号３２）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｖ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号３３）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｖ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号３４）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号３５）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ａ（配列番号３６）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ａ（配列番号３７）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ａ（配列番号３８）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｍ（配列番号３９）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｖ（配列番号４０）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｉ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号４１）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｍ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号４２）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｖ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号４３）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｖ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号４４）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｖ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号４５）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ａ（配列番号４６）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ａ（配列番号４７）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ａ（配列番号４８）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｍ（配列番号４９）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｖ（配列番号５０）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｉ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号５１）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｉ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号５２）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｉ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号５３）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｉ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ａ（配列番号５４）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｉ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ａ（配列番号５５）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｉ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ａ（配列番号５６）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｉ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｍ（配列番号５７）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｉ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｖ（配列番号５８）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｍ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号５９）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｍ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号６０）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｍ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号６１）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｍ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ａ（配列番号６２）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｍ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ａ（配列番号６３）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｍ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ａ（配列番号６４）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｍ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｍ（配列番号６５）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｍ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｖ（配列番号６６）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｇ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号６７）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ａ（配列番号６８）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ａ（配列番号６９）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ａ（配列番号７０）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｍ（配列番号７１）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｖ（配列番号７２）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｓ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号７３）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ａ（配列番号７４）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ａ（配列番号７５）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ａ（配列番号７６）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｍ（配列番号７７）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｖ（配列番号７８）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ａ（配列番号７９）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ａ（配列番号８０）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ａ（配列番号８１）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｍ（配列番号８２）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｖ（配列番号８３）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ａ−Ａ（配列番号８４）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｉ−Ａ（配列番号８５）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ｍ（配列番号８６）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ｖ（配列番号８７）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ｍ（配列番号８８）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ｖ（配列番号８９）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ｍ（配列番号９０）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ｖ（配列番号９１）、Ｉ−Ｉ−Ｍ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号９２）、Ｉ−Ｉ−Ｌ−Ｉ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号９３）、Ｉ−Ｉ−Ｌ−Ｍ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号９４）、Ｉ−Ｉ−Ｌ−Ｖ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号９５）、Ｉ−Ｉ−Ｌ−Ｖ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号９６）、Ｉ−Ｉ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号９７）、Ｉ−Ｉ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ａ（配列番号９８）、Ｉ−Ｉ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ａ（配列番号９９）、Ｉ−Ｉ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ａ（配列番号１００）、Ｉ−Ｉ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｍ（配列番号１０１）、Ｉ−Ｉ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｖ（配列番号１０２）、Ｉ−Ｖ−Ｍ−Ｉ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号１０３）、Ｉ−Ｖ−Ｍ−Ｍ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号１０４）、Ｉ−Ｖ−Ｍ−Ｖ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号１０５）、Ｉ−Ｖ−Ｍ−Ｖ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号１０６）、Ｉ−Ｖ−Ｍ−Ｖ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号１０７）、Ｉ−Ｖ−Ｍ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ａ（配列番号１０８）、Ｉ−Ｖ−Ｍ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ａ（配列番号１０９）、Ｉ−Ｖ−Ｍ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ａ（配列番号１１０）、Ｉ−Ｖ−Ｍ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｍ（配列番号１１１）、Ｉ−Ｖ−Ｍ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｖ（配列番号１１２）、Ｉ−Ｖ−Ｌ−Ｉ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号１１３）、Ｉ−Ｖ−Ｌ−Ｉ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号１１４）、Ｉ−Ｖ−Ｌ−Ｉ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号１１５）、Ｉ−Ｖ−Ｌ−Ｉ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ａ（配列番号１１６）、Ｉ−Ｖ−Ｌ−Ｉ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ａ（配列番号１１７）、Ｉ−Ｖ−Ｌ−Ｉ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ａ（配列番号１１８）、Ｉ−Ｖ−Ｌ−Ｉ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｍ（配列番号１１９）、Ｉ−Ｖ−Ｌ−Ｉ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｖ（配列番号１２０）、Ｉ−Ｖ−Ｌ−Ｍ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号１２１）、Ｉ−Ｖ−Ｌ−Ｍ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号１２２）、Ｉ−Ｖ−Ｌ−Ｍ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号１２３）、Ｉ−Ｖ−Ｌ−Ｍ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ａ（配列番号１２４）、Ｉ−Ｖ−Ｌ−Ｍ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ａ（配列番号１２５）、Ｉ−Ｖ−Ｌ−Ｍ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ａ（配列番号１２６）、Ｉ−Ｖ−Ｌ−Ｍ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｍ（配列番号１２７）、Ｉ−Ｖ−Ｌ−Ｍ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｖ（配列番号１２８）、Ｉ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｇ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号１２９）、Ｉ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ａ（配列番号１３０）、Ｉ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ａ（配列番号１３１）、Ｉ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ａ（配列番号１３２）、Ｉ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｍ（配列番号１３３）、Ｉ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｖ（配列番号１３４）、Ｉ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｓ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号１３５）、Ｉ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ａ（配列番号１３６）、Ｉ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ａ（配列番号１３７）、Ｉ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ａ（配列番号１３８）、Ｉ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｍ（配列番号１３９）、Ｉ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｖ（配列番号１４０）、Ｉ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ａ（配列番号１４１）、Ｉ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ａ（配列番号１４２）、Ｉ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ａ（配列番号１４３）、Ｉ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｍ（配列番号１４４）、Ｉ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｖ（配列番号１４５）、Ｉ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ａ−Ａ（配列番号１４６）、Ｉ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｉ−Ａ（配列番号１４７）、Ｉ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ｍ（配列番号１４８）、Ｉ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ｖ（配列番号１４９）、Ｉ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ｍ（配列番号１５０）、Ｉ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ｖ（配列番号１５１）、Ｉ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ｍ（配列番号１５２）、Ｉ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ｖ（配列番号１５３）、Ｖ−Ｉ−Ｍ−Ｉ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号１５４）、Ｖ−Ｉ−Ｍ−Ｍ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号１５５）、Ｖ−Ｉ−Ｍ−Ｖ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号１５６）、Ｖ−Ｉ−Ｍ−Ｖ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号１５７）、Ｖ−Ｉ−Ｍ−Ｖ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号１５８）、Ｖ−Ｉ−Ｍ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ａ（配列番号１５９）、Ｖ−Ｉ−Ｍ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ａ（配列番号１６０）、Ｖ−Ｉ−Ｍ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ａ（配列番号１６１）、Ｖ−Ｉ−Ｍ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｍ（配列番号１６２）、Ｖ−Ｉ−Ｍ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｖ（配列番号１６３）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｉ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号１６４）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｉ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号１６５）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｉ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号１６６）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｉ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ａ（配列番号１６７）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｉ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ａ（配列番号１６８）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｉ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ａ（配列番号１６９）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｉ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｍ（配列番号１７０）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｉ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｖ（配列番号１７１）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｍ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号１７２）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｍ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号１７３）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｍ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号１７４）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｍ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ａ（配列番号１７５）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｍ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ａ（配列番号１７６）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｍ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ａ（配列番号１７７）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｍ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｍ（配列番号１７８）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｍ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｖ（配列番号１７９）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｖ−Ｇ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号１８０）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｖ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ａ（配列番号１８１）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｖ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ａ（配列
番号１８２）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｖ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ａ（配列番号１８３）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｖ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｍ（配列番号１８４）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｖ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｖ（配列番号１８５）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｖ−Ｓ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号１８６）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｖ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ａ（配列番号１８７）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｖ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ａ（配列番号１８８）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｖ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ａ（配列番号１８９）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｖ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｍ（配列番号１９０）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｖ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｖ（配列番号１９１）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ａ（配列番号１９２）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ａ（配列番号１９３）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ａ（配列番号１９４）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｍ（配列番号１９５）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｖ（配列番号１９６）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ａ−Ａ（配列番号１９７）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｉ−Ａ（配列番号１９８）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ｍ（配列番号１９９）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ｖ（配列番号２００）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ｍ（配列番号２０１）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ｖ（配列番号２０２）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ｍ（配列番号２０３）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ｖ（配列番号２０４）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｉ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号２０５）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｉ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号２０６）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｉ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号２０７）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｉ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ａ（配列番号２０８）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｉ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ａ（配列番号２０９）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｉ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ａ（配列番号２１０）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｉ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｍ（配列番号２１１）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｉ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｖ（配列番号２１２）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｍ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号２１３）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｍ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号２１４）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｍ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号２１５）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｍ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ａ（配列番号２１６）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｍ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ａ（配列番号２１７）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｍ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ａ（配列番号２１８）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｍ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｍ（配列番号２１９）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｍ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｖ（配列番号２２０）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｖ−Ｇ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号２２１）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｖ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ａ（配列番号２２２）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｖ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ａ（配列番号２２３）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｖ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ａ（配列番号２２４）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｖ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｍ（配列番号２２５）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｖ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｖ（配列番号２２６）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｖ−Ｓ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号２２７）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｖ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ａ（配列番号２２８）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｖ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ａ（配列番号２２９）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｖ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ａ（配列番号２３０）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｖ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｍ（配列番号２３１）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｖ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｖ（配列番号２３２）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｖ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ａ（配列番号２３３）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｖ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ａ（配列番号２３４）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｖ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ａ（配列番号２３５）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｖ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｍ（配列番号２３６）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｖ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｖ（配列番号２３７）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ａ−Ａ（配列番号２３８）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｉ−Ａ（配列番号２３９）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ｍ（配列番号２４０）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ｖ（配列番号２４１）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ｍ（配列番号２４２）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ｖ（配列番号２４３）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ｍ（配列番号２４４）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ｖ（配列番号２４５）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｉ−Ｇ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号２４６）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｉ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ａ（配列番号２４７）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｉ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ａ（配列番号２４８）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｉ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ａ（配列番号２４９）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｉ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｍ（配列番号２５０）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｉ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｖ（配列番号２５１）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｉ−Ｓ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号２５２）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｉ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ａ（配列番号２５３）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｉ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ａ（配列番号２５４）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｉ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ａ（配列番号２５５）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｉ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｍ（配列番号２５６）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｉ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｖ（配列番号２５７）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｉ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ａ（配列番号２５８）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｉ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ａ（配列番号２５９）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｉ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ａ（配列番号２６０）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｉ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｍ（配列番号２６１）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｉ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｖ（配列番号２６２）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｉ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ａ−Ａ（配列番号２６３）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｉ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｉ−Ａ（配列番号２６４）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｉ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ｍ（配列番号２６５）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｉ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ｖ（配列番号２６６）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｉ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ｍ（配列番号２６７）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｉ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ｖ（配列番号２６８）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｉ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ｍ（配列番号２６９）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｉ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ｖ（配列番号２７０）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｍ−Ｇ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号２７１）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｍ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ａ（配列番号２７２）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｍ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ａ（配列番号２７３）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｍ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ａ（配列番号２７４）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｍ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｍ（配列番号２７５）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｍ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｖ（配列番号２７６）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｍ−Ｓ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号２７７）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｍ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ａ（配列番号２７８）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｍ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ａ（配列番号２７９）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｍ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ａ（配列番号２８０）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｍ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｍ（配列番号２８１）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｍ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｖ（配列番号２８２）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｍ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ａ（配列番号２８３）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｍ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ａ（配列番号２８４）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｍ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ａ（配列番号２８５）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｍ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｍ（配列番号２８６）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｍ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｖ（配列番号２８７）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｍ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ａ−Ａ（配列番号２８８）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｍ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｉ−Ａ（配列番号２８９）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｍ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ｍ（配列番号２９０）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｍ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ｖ（配列番号２９１）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｍ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ｍ（配列番号２９２）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｍ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ｖ（配列番号２９３）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｍ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ｍ（配列番号２９４）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｍ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ｖ（配列番号２９５）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｇ−Ｖ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ａ（配列番号２９６）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｇ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ａ（配列番号２９７）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｇ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ａ（配列番号２９８）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｇ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｍ（配列番号２９９）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｇ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｖ（配列番号３００）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ａ−Ａ（配列番号３０１）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｉ−Ａ（配列番号３０２）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ｍ（配列番号３０３）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ｖ（配列番号３０４）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ｍ（配列番号３０５）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ｖ（配列番号３０６）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ｍ（配列番号３０７）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ｖ（配列番号３０８）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｓ−Ｖ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ａ（配列番号３０９）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｓ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ａ（配列番号３１０）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｓ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ａ（配列番号３１１）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｓ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｍ（配列番号３１２）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｓ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｖ（配列番号３１３）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ａ−Ａ（配列番号３１４）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｉ−Ａ（配列番号３１５）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ｍ（配列番号３１６）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ａ−Ｖ（配列番号３１７）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ｍ（配列番号３１８）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ｖ（配列番号３１９）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ｍ（配列番号３２０）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ｖ（配列番号３２１）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ａ−Ａ−Ａ（配列番号３２２）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ａ−Ｉ−Ａ（配列番号３２３）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ｍ（配列番号３２４）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ｖ（配列番号３２５）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ｍ（配列番号３２６）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ｖ（配列番号３２７）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ｍ（配列番号３２８）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ｖ（配列番号３２９）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ａ−Ｍ（配列番号３３０）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ａ−Ｖ（配列番号３３１）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｉ−Ｍ（配列番号３３２）及びＶ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｉ−Ｖ（配列番号３３３）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、又はこれからなる。これらのアミノ酸配列は、本発明によるペプチドに含まれるアミノ酸モチーフの好ましい特定の実施形態である。別の実施形態では、筋機能増強アミノ酸配列は、上記のアミノ酸配列、すなわち配列番号４〜配列番号３３３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、又はこれからなり、上記アミノ酸配列はさらに、そのＮ末端に直接結合したチロシン残基を有する、又はこれを含む。したがって、例えば好ましい一実施形態では、筋機能増強アミノ酸配列は、アミノ酸配列Ｙ−Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号３９０）、すなわちそのアミノ末端と直接結合したチロシンを有する配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む、又はこれからなる。
【００５８】
本発明によるペプチドの特に好ましい別の実施形態では、筋機能増強アミノ酸配列は、アミノ酸配列Ｖ−［Ｖ／Ｉ］−Ｌ−［Ｖ／Ｉ］−［Ａ／Ｓ］−［Ａ／Ｖ］−Ｌ−［Ｔ／Ａ］−［Ｖ／Ａ］−Ａ（配列番号３７４）を含み、これから本質的になり、又はこれからなり、好ましい配列はＶ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号４）であり、好ましくは最大４個、より好ましくは最大３個、さらにより好ましくは最大２個、最も好ましくは最大１個のアミノ酸が上で記載したように置換される。したがって、本発明によるペプチドの特に好ましい一実施形態では、アミノ酸モチーフはアミノ酸配列Ｖ−［Ｖ／Ｉ］−Ｌ−［Ｖ／Ｉ］−［Ａ／Ｓ］−［Ａ／Ｖ］−Ｌ−［Ｔ／Ａ］−［Ｖ／Ａ］−Ａ（配列番号３７４）からなり、好ましい配列はＶ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号４）であり、好ましくは最大４個、より好ましくは最大３個、さらにより好ましくは最大２個、最も好ましくは最大１個のアミノ酸が上で記載したように別のアミノ酸で置換される。
【００５９】
本発明によるペプチドの好ましい一実施形態では、筋機能増強アミノ酸配列は、アミノ酸配列Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号４）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号６）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号７）、Ｉ−Ｉ−Ｌ−Ｖ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号９５）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｉ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ａ−Ａ（配列番号２６３）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｖ−Ｓ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号１８６）、Ｉ−Ｉ−Ｌ−Ｍ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号３３４）及びＶ−Ｖ−Ｍ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｖ（配列番号５０）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、これから本質的になる、又はこれからなる。これらのアミノ酸配列は、本発明によるペプチドに含まれるアミノ酸モチーフの特に好ましい特定の実施形態である。
【００６０】
本発明によるペプチドの別の実施形態では、Ｃ、Ｃ−Ｎ、Ｃ−Ｎ−［Ｎ／Ｄ／Ｅ］、Ｃ−Ｎ−［Ｎ／Ｄ／Ｅ］−［Ｆ／Ｙ］、Ｃ−Ｎ−［Ｎ／Ｄ／Ｅ］−［Ｆ／Ｙ］−Ｆ、Ｃ−Ｎ−［Ｎ／Ｄ／Ｅ］−［Ｆ／Ｙ］−Ｆ−［Ｗ／Ｌ／Ｑ］、Ｃ−Ｎ−［Ｎ／Ｄ／Ｅ］−［Ｆ／Ｙ］−Ｆ−［Ｗ／Ｌ／Ｑ］−Ｅ（配列番号３７５）、Ｃ−Ｎ−［Ｎ／Ｄ／Ｅ］−［Ｆ／Ｙ］−Ｆ−［Ｗ／Ｌ／Ｑ］−Ｅ−［Ｎ／Ｔ］（配列番号３７６）からなる群から選択される、好ましくはＣ、Ｃ−Ｎ、Ｃ−Ｎ−Ｎ、Ｃ−Ｎ−Ｎ−Ｆ（配列番号３３５）、Ｃ−Ｎ−Ｎ−Ｆ−Ｆ（配列番号３３６）、Ｃ−Ｎ−Ｎ−Ｆ−Ｆ−Ｗ（配列番号３３７）、Ｃ−Ｎ−Ｎ−Ｆ−Ｆ−Ｗ−Ｅ（配列番号３３８）及びＣ−Ｎ−Ｎ−Ｆ−Ｆ−Ｗ−Ｅ−Ｎ（配列番号３３９）からなる群から選択されるアミノ酸又はアミノ酸配列が、アミノ酸モチーフのカルボキシ末端と直接連結する。本発明によるペプチドの好ましい一実施形態では、筋機能増強アミノ酸配列は、［Ｖ／Ｉ］−［Ｖ／Ｉ］−［Ｌ／Ｍ］−［Ｖ／Ｉ／Ｍ］−［Ａ／Ｇ／Ｓ］−［Ａ／Ｖ］−Ｌ−［Ｔ／Ａ］−［Ｖ／Ａ／Ｉ］−［Ａ／Ｍ／Ｖ］−Ｃ、［Ｖ／Ｉ］−［Ｖ／Ｉ］−［Ｌ／Ｍ］−［Ｖ／Ｉ／Ｍ］−［Ａ／Ｇ／Ｓ］−［Ａ／Ｖ］−Ｌ−［Ｔ／Ａ］−［Ｖ／Ａ／Ｉ］−［Ａ／Ｍ／Ｖ］−Ｃ−Ｎ、［Ｖ／Ｉ］−［Ｖ／Ｉ］−［Ｌ／Ｍ］−［Ｖ／Ｉ／Ｍ］−［Ａ／Ｇ／Ｓ］−［Ａ／Ｖ］−Ｌ−［Ｔ／Ａ］−［Ｖ／Ａ／Ｉ］−［Ａ／Ｍ／Ｖ］−Ｃ−Ｎ−［Ｎ／Ｄ／Ｅ］、［Ｖ／Ｉ］−［Ｖ／Ｉ］−［Ｌ／Ｍ］−［Ｖ／Ｉ／Ｍ］−［Ａ／Ｇ／Ｓ］−［Ａ／Ｖ］−Ｌ−［Ｔ／Ａ］−［Ｖ／Ａ／Ｉ］−［Ａ／Ｍ／Ｖ］−Ｃ−Ｎ−［Ｎ／Ｄ／Ｅ］−［Ｆ／Ｙ］、［Ｖ／Ｉ］−［Ｖ／Ｉ］−［Ｌ／Ｍ］−［Ｖ／Ｉ／Ｍ］−［Ａ／Ｇ／Ｓ］−［Ａ／Ｖ］−Ｌ−［Ｔ／Ａ］−［Ｖ／Ａ／Ｉ］−［Ａ／Ｍ／Ｖ］−Ｃ−Ｎ−［Ｎ／Ｄ／Ｅ］−［Ｆ／Ｙ］−Ｆ（配列番号３７７）、［Ｖ／Ｉ］−［Ｖ／Ｉ］−［Ｌ／Ｍ］−［Ｖ／Ｉ／Ｍ］−［Ａ／Ｇ／Ｓ］−［Ａ／Ｖ］−Ｌ−［Ｔ／Ａ］−［Ｖ／Ａ／Ｉ］−［Ａ／Ｍ／Ｖ］−Ｃ−Ｎ−［Ｎ／Ｄ／Ｅ］−［Ｆ／Ｙ］−Ｆ−［Ｗ／Ｌ／Ｑ］（配列番号３７８）、［Ｖ／Ｉ］−［Ｖ／Ｉ］−［Ｌ／Ｍ］−［Ｖ／Ｉ／Ｍ］−［Ａ／Ｇ／Ｓ］−［Ａ／Ｖ］−Ｌ−［Ｔ／Ａ］−［Ｖ／Ａ／Ｉ］−［Ａ／Ｍ／Ｖ］−Ｃ−Ｎ−［Ｎ／Ｄ／Ｅ］−［Ｆ／Ｙ］−Ｆ−［Ｗ／Ｌ／Ｑ］−Ｅ（配列番号３７９）及び［Ｖ／Ｉ］−［Ｖ／Ｉ］−［Ｌ／Ｍ］−［Ｖ／Ｉ／Ｍ］−［Ａ／Ｇ／Ｓ］−［Ａ／Ｖ］−Ｌ−［Ｔ／Ａ］−［Ｖ／Ａ／Ｉ］−［Ａ／Ｍ／Ｖ］−Ｃ−Ｎ−［Ｎ／Ｄ／Ｅ］−［Ｆ／Ｙ］−Ｆ−［Ｗ／Ｌ／Ｑ］−Ｅ−［Ｎ／Ｔ］（配列番号３８０）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、これから本質的になる、又はこれからなる。
【００６１】
好ましくは、筋機能増強アミノ酸配列は、上で記載した群から選択されるアミノ酸又はアミノ酸配列がそのカルボキシ末端と直接連結する、上で具体的に開示されたアミノ酸配列、すなわち具体的に開示されたアミノ酸モチーフのアミノ酸配列のいずれかを含む、又はこれからなる。例えば、好ましくは筋機能増強アミノ酸配列は、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ−Ｃ（配列番号３４０）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ−Ｃ−Ｎ（配列番号３４１）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ−Ｃ−Ｎ−Ｎ（配列番号３４２）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ−Ｃ−Ｎ−Ｎ−Ｆ（配列番号３４３）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ−Ｃ−Ｎ−Ｎ−Ｆ−Ｆ（配列番号３４４）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ−Ｃ−Ｎ−Ｎ−Ｆ−Ｆ−Ｗ（配列番号３４５）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ−Ｃ−Ｎ−Ｎ−Ｆ−Ｆ−Ｗ−Ｅ（配列番号３４６）及びＶ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ−Ｃ−Ｎ−Ｎ−Ｆ−Ｆ−Ｗ−Ｅ−Ｎ（配列番号３４７）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、又はこれからなる。
【００６２】
本発明によるペプチドの別の実施形態では、芳香族アミノ酸、好ましくはチロシン、フェニルアラニン又はトリプトファン、より好ましくはチロシン又はフェニルアラニン、最も好ましくはチロシンが、アミノ酸モチーフのアミノ末端と直接連結する。好ましくは、筋機能増強アミノ酸配列は、チロシンによりそのアミノ末端で伸長された上で具体的に開示されたアミノ酸配列のうちの１つを含む、又はこれからなる。
【００６３】
別の好ましい実施形態では、本発明のペプチドは、膜浸透増強モチーフ、１つ又は複数のエピトープタグ、親水性モチーフ、及びペプチド標的化モチーフからなる群から選択される要素のうちの１つ又は複数、例えば１つ、２つ、３つ又は４つをさらに含む。
【００６４】
膜浸透増強モチーフは、上で記載したように膜に浸透することが可能である任意のアミノ酸配列、例えば細胞浸透ペプチド（ＣＣＰ）であり得る。上記膜浸透増強モチーフは、該膜浸透増強モチーフが上記高分子と結合した場合、通常は細胞膜を横断する能力を有しない他の高分子、例えばペプチド、タンパク質又は核酸が無傷の細胞膜に浸透することを可能とし得る。かかる膜浸透増強モチーフは、タンパク質形質導入ドメイン由来のものであってもよく、両親媒性ペプチドであってもよく、又は任意の他の浸透ペプチドであってもよい。例えば、膜浸透増強モチーフは、ＨＩＶ  Ｔａｔペプチド、例えばＧ−Ｒ−Ｋ−Ｋ−Ｒ−Ｒ−Ｑ−Ｒ−Ｒ−Ｒ（配列番号３４８）、ペネトラチンペプチド、例えばＲ−Ｑ−Ｉ−Ｋ−Ｉ−Ｗ−Ｆ−Ｑ−Ｎ−Ｒ−Ｒ−Ｍ−Ｋ−Ｗ−Ｋ−Ｋ（配列番号３４９）若しくはＫ−Ｋ−Ｗ−Ｋ−Ｍ−Ｒ−Ｒ−Ｎ−Ｑ−Ｆ−Ｗ−Ｖ−Ｋ−Ｖ−Ｑ−Ｒ−Ｇ（配列番号３５０）、トランスポータンペプチド、例えばＧ−Ｗ−Ｔ−Ｌ−Ｎ−Ｓ−Ａ−Ｇ−Ｙ−Ｌ−Ｌ−Ｇ−Ｋ−Ｉ−Ｎ−Ｌ−Ｋ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｋ−Ｋ−Ｉ−Ｌ（配列番号３５１）、ＭＰＧ／Ｐｅｐファミリーの成員のペプチド、例えばＧ−Ａ−Ｌ−Ｆ−Ｌ−Ｇ−Ｆ−Ｌ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｓ−Ｔ−Ｍ−Ｇ−Ａ−Ｗ−Ｓ−Ｑ−Ｐ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｒ−Ｋ−Ｖ（配列番号３５２）若しくはＫ−Ｅ−Ｔ−Ｗ−Ｗ−Ｅ−Ｔ−Ｗ−Ｗ−Ｔ−Ｅ−Ｗ−Ｓ−Ｑ−Ｐ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｒ−Ｋ−Ｖ（配列番号３５３）、又はアルギニンリッチペプチド等由来のものであり得る（Deshayes et al., 2005, Cell. Mol. Life Sci. 62:1839-1849）。かかる膜浸透増強モチーフは、本発明によるペプチド内において、筋機能増強アミノ酸配列に対してアミノ末端に又はカルボキシ末端に位置し得る。さらに、本発明によるペプチドは２つ以上の膜浸透増強モチーフを含んでいてもよく、例えば本発明によるペプチドは２つ、３つ、４つ又は５つのかかるモチーフを含有していてもよい。
【００６５】
エピトープは、抗体が結合する分子の一部分である。本発明との関連では、エピトープは好ましくは、ペプチドタグ、例えばヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、ＦＬＡＧタグ、ｍｙｃタグ又はポリＨｉｓタグである。かかるエピトープタグを使用して、例えば本発明のペプチドが細胞膜に浸透する、すなわち細胞膜を横断するかどうかを決定するために、細胞内において本発明のペプチドを探索する（locate）ことができ、該タグを、上記ペプチドと共にインキュベートした無傷の細胞の内部で見出すことができる。
【００６６】
特定の好ましい一実施形態では、本発明によるペプチドは、親水性モチーフをさらに含む。好ましい一実施形態では、上記親水性モチーフは、酸性の、塩基性の、及び／又はそうでなくとも負に若しくは正に荷電したアミノ酸を含む。特定の本発明によるペプチドの好ましい一実施形態では、親水性モチーフは、アミノ酸モチーフΛ４−Θ２（式中、Λはアスパラギン酸、グルタミン酸、リジン及びアルギニンからそれぞれ独立して選択され、Θはα−ヘリックス遮断因子、好ましくはプロリン又はグリシンである）を含む、又はこれからなる。好ましくは、親水性モチーフは、［Ｄ／Ｅ］−［Ｄ／Ｅ］−［Ｄ／Ｅ］−［Ｄ／Ｅ］−［Ｐ／Ｇ］−［Ｐ／Ｇ］、［Ｋ／Ｒ］−［Ｄ／Ｅ］−［Ｄ／Ｅ］−［Ｄ／Ｅ］−［Ｐ／Ｇ］−［Ｐ／Ｇ］、［Ｄ／Ｅ］−［Ｋ／Ｒ］−［Ｄ／Ｅ］−［Ｄ／Ｅ］−［Ｐ／Ｇ］−［Ｐ／Ｇ］、［Ｄ／Ｅ］−［Ｄ／Ｅ］−［Ｋ／Ｒ］−［Ｄ／Ｅ］−［Ｐ／Ｇ］−［Ｐ／Ｇ］、［Ｄ／Ｅ］−［Ｄ／Ｅ］−［Ｄ／Ｅ］−［Ｋ／Ｒ］−［Ｐ／Ｇ］−［Ｐ／Ｇ］、［Ｋ／Ｒ］−［Ｋ／Ｒ］−［Ｄ／Ｅ］−［Ｄ／Ｅ］−［Ｐ／Ｇ］−［Ｐ／Ｇ］、［Ｋ／Ｒ］−［Ｄ／Ｅ］−［Ｋ／Ｒ］−［Ｄ／Ｅ］−［Ｐ／Ｇ］−［Ｐ／Ｇ］、［Ｋ／Ｒ］−［Ｄ／Ｅ］−［Ｄ／Ｅ］−［Ｋ／Ｒ］−［Ｐ／Ｇ］−［Ｐ／Ｇ］、［Ｄ／Ｅ］−［Ｋ／Ｒ］−［Ｋ／Ｒ］−［Ｄ／Ｅ］−［Ｐ／Ｇ］−［Ｐ／Ｇ］、［Ｄ／Ｅ］−［Ｋ／Ｒ］−［Ｄ／Ｅ］−［Ｋ／Ｒ］−［Ｐ／Ｇ］−［Ｐ／Ｇ］、［Ｄ／Ｅ］−［Ｄ／Ｅ］−［Ｋ／Ｒ］−［Ｋ／Ｒ］−［Ｐ／Ｇ］−［Ｐ／Ｇ］、［Ｋ／Ｒ］−［Ｋ／Ｒ］−［Ｋ／Ｒ］−［Ｄ／Ｅ］−［Ｐ／Ｇ］−［Ｐ／Ｇ］、［Ｋ／Ｒ］−［Ｋ／Ｒ］−［Ｄ／Ｅ］−［Ｋ／Ｒ］−［Ｐ／Ｇ］−［Ｐ／Ｇ］、［Ｋ／Ｒ］−［Ｄ／Ｅ］−［Ｋ／Ｒ］−［Ｋ／Ｒ］−［Ｐ／Ｇ］−［Ｐ／Ｇ］、［Ｄ／Ｅ］−［Ｋ／Ｒ］−［Ｋ／Ｒ］−［Ｋ／Ｒ］−［Ｐ／Ｇ］−［Ｐ／Ｇ］及び［Ｋ／Ｒ］−［Ｋ／Ｒ］−［Ｋ／Ｒ］−［Ｋ／Ｒ］−［Ｐ／Ｇ］−［Ｐ／Ｇ］からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、又はこれからなる。好ましくは、親水性モチーフは、アミノ酸配列［Ｄ／Ｅ］−［Ｋ／Ｒ］−［Ｄ／Ｅ］−［Ｄ／Ｅ］−［Ｐ／Ｇ］−［Ｐ／Ｇ］を含む、又はこれからなる。より好ましくは、親水性モチーフは、Ｄ−Ｋ−Ｄ−Ｄ−Ｐ−Ｐ（配列番号３５４）、Ｅ−Ｋ−Ｄ−Ｄ−Ｐ−Ｐ（配列番号３５５）、Ｄ−Ｒ−Ｄ−Ｄ−Ｐ−Ｐ（配列番号３５６）、Ｄ−Ｋ−Ｅ−Ｄ−Ｐ−Ｐ（配列番号３５７）、Ｄ−Ｋ−Ｄ−Ｅ−Ｐ−Ｐ（配列番号３５８）、Ｅ−Ｒ−Ｄ−Ｄ−Ｐ−Ｐ（配列番号３５９）、Ｅ−Ｋ−Ｅ−Ｄ−Ｐ−Ｐ（配列番号３６０）、Ｅ−Ｋ−Ｄ−Ｅ−Ｐ−Ｐ（配列番号３６１）、Ｄ−Ｒ−Ｅ−Ｄ−Ｐ−Ｐ（配列番号３６２）、Ｄ−Ｒ−Ｄ−Ｅ−Ｐ−Ｐ（配列番号３６３）、Ｄ−Ｋ−Ｅ−Ｅ−Ｐ−Ｐ（配列番号３６４）、Ｅ−Ｒ−Ｅ−Ｄ−Ｐ−Ｐ（配列番号３６５）、Ｅ−Ｒ−Ｄ−Ｅ−Ｐ−Ｐ（配列番号３６６）、Ｄ−Ｒ−Ｅ−Ｅ−Ｐ−Ｐ（配列番号３６７）、Ｅ−Ｋ−Ｅ−Ｅ−Ｐ−Ｐ（配列番号３６８）及びＥ−Ｒ−Ｅ−Ｅ−Ｐ−Ｐ（配列番号３６９）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、又はこれからなる（上記配列におけるＰ−Ｐは、Ｇ−Ｇに交換してもよい）。最も好ましくは、親水性モチーフは、アミノ��配列Ｄ−Ｋ−Ｄ−Ｄ−Ｐ−Ｐ（配列番号３５４）を含む、又はこれからなる（上記配列におけるＰ−ＰもＧ−Ｇであってもよい）。好ましくは親水性モチーフは、本発明によるペプチド内において、筋機能増強アミノ酸配列に対してアミノ末端に位置するが、筋機能増強アミノ酸配列に対してカルボキシ末端に位置していてもよい。特に好ましい一実施形態では、親水性モチーフは、筋機能増強アミノ酸配列のアミノ末端と直接連結し、好ましくはアミノ酸モチーフのアミノ末端と直接連結する。
【００６７】
したがって本発明の特定の好ましい一実施形態では、ペプチドは、アミノ酸配列Λ４−Θ２−Φ４−Ｘ−Ψ−Ｌ−［Ｔ／Ａ］−Ψ２（式中、Λはアスパラギン酸、グルタミン酸、リジン及びアルギニンからそれぞれ独立して選択され、Θはα−ヘリックス遮断因子であり、好ましくはプロリン又はグリシンからそれぞれ独立して選択され、Φ及びΨはそれぞれ独立して選択される疎水性の非芳香族アミノ酸であり、好ましくはΦはメチオニン、イソロイシン、ロイシン及びバリンからそれぞれ独立して選択され、Ψはそれぞれ好ましくはアラニン、メチオニン、イソロイシン及びバリンから選択され、Ｘは任意のアミノ酸、好ましくは低分子アミノ酸であり、好ましくはグリシン、アラニン、セリン、システイン、トレオニン及びバリンから選択され、より好ましくはグリシン、アラニン及びセリンから選択される）を含む、これから本質的になる、好ましくはこれからなる。好ましくは上記ペプチドは、上で規定された機能的特徴、すなわち骨格筋細胞及び／又は骨格筋線維における、抗不整脈能、抗アポトーシス能、カルシウムスパーク頻度を低減させる能力、筋小胞体からのカルシウム漏出を防止する及び／又はこれを低減させる能力、好ましくは心不全に罹患している個体において、血行動態機能を回復させる能力、並びに等尺性単収縮力及び／又は強縮性単収縮力を増強する能力のうちの１つ又は複数、例えば１つ、２つ、３つ、４つ又は５つ、好ましくは全てを示す。好ましくは、上記機能を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏで観察することができる。好ましくは、非経口の投与経路を介してペプチドが投与される場合、上記ｉｎ  ｖｉｖｏでの効果を観察することができる。
【００６８】
さらにより好ましい一実施形態では、本発明によるペプチドは、アミノ酸配列Λ４−Θ２−［Ｖ／Ｉ］−［Ｖ／Ｉ］−［Ｌ／Ｍ］−［Ｖ／Ｉ／Ｍ］−［Ａ／Ｇ／Ｓ］−［Ａ／Ｖ］−Ｌ−［Ｔ／Ａ］−［Ｖ／Ａ／Ｉ］−［Ａ／Ｍ／Ｖ］、（式中、Λはアスパラギン酸、グルタミン酸、リジン及びアルギニンからそれぞれ独立して選択され、Θはα−ヘリックス遮断因子、好ましくはプロリン又はグリシンである）を含む、好ましくはこれからなる。好ましくは上記ペプチドは、上で規定された機能的特徴、すなわち骨格筋細胞及び／又は骨格筋線維における、抗不整脈能、抗アポトーシス能、カルシウムスパーク頻度を低減させる能力、筋小胞体からのカルシウム漏出を防止する及び／又はこれを低減させる能力、好ましくは心不全に罹患している個体において、血行動態機能を回復させる能力、並びに等尺性単収縮力及び／又は強縮性単収縮力を増強する能力のうちの１つ又は複数、例えば１つ、２つ、３つ、４つ又は５つ、好ましくは全てを示す。好ましくは、上記機能を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏで観察することができる。好ましくは、非経口の投与経路を介してペプチドが投与される場合、上記ｉｎ  ｖｉｖｏでの効果を観察することができる。
【００６９】
さらにより好ましい一実施形態では、本発明によるペプチドは、アミノ酸配列［Ｄ／Ｅ］−［Ｋ／Ｒ］−［Ｄ／Ｅ］−［Ｄ／Ｅ］−［Ｐ／Ｇ］−［Ｐ／Ｇ］−［Ｖ／Ｉ］−［Ｖ／Ｉ］−［Ｌ／Ｍ］−［Ｖ／Ｉ／Ｍ］−［Ａ／Ｇ／Ｓ］−［Ａ／Ｖ］−Ｌ−［Ｔ／Ａ］−［Ｖ／Ａ／Ｉ］−［Ａ／Ｍ／Ｖ］を含む、好ましくはこれからなる。好ましくは上記ペプチドは、上で規定された機能的特徴、すなわち骨格筋細胞及び／又は骨格筋線維における、抗不整脈能、抗アポトーシス能、カルシウムスパーク頻度を低減させる能力、筋小胞体からのカルシウム漏出を防止する及び／又はこれを低減させる能力、好ましくは心不全に罹患している個体において、血行動態機能を回復させる能力、並びに等尺性単収縮力及び／又は強縮性単収縮力を増強する能力のうちの１つ又は複数、例えば１つ、２つ、３つ、４つ又は５つ、好ましくは全てを示す。好ましくは、上記機能を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏで観察することができる。好ましくは、非経口の投与経路を介してペプチドが投与される場合、上記ｉｎ  ｖｉｖｏでの効果を観察することができる。
【００７０】
さらにより好ましい一実施形態では、本発明によるペプチドは、アミノ酸配列［Ｄ／Ｅ］−［Ｋ／Ｒ］−［Ｄ／Ｅ］−［Ｄ／Ｅ］−Ｐ−Ｐ−Ｖ−［Ｖ／Ｉ］−Ｌ−［Ｖ／Ｉ］−［Ａ／Ｓ］−［Ａ／Ｖ］−Ｌ−［Ｔ／Ａ］−［Ｖ／Ａ］−Ａ（配列番号３８１）を含む、好ましくはこれからなる。好ましくは上記ペプチドは、上で規定された機能的特徴、すなわち骨格筋細胞及び／又は骨格筋線維における、抗不整脈能、抗アポトーシス能、カルシウムスパーク頻度を低減させる能力、筋小胞体からのカルシウム漏出を防止する及び／又はこれを低減させる能力、好ましくは心不全に罹患している個体において、血行動態機能を回復させる能力、並びに等尺性単収縮力及び／又は強縮性単収縮力を増強する能力のうちの１つ又は複数、例えば１つ、２つ、３つ、４つ又は５つ、好ましくは全てを示す。好ましくは、上記機能を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏで観察することができる。好ましくは、非経口の投与経路を介してペプチドが投与される場合、上記ｉｎ  ｖｉｖｏでの効果を観察することができる。
【００７１】
最も好ましい一実施形態では、本発明によるペプチドは、アミノ酸配列Ｄ１−Ｋ２−Ｄ３−Ｄ４−Ｐ５−Ｐ６−Ｖ７−Ｖ８−Ｌ９−Ｖ１０−Ａ１１−Ａ１２−Ｌ１３−Ｔ１４−Ｖ１５−Ａ１６（配列番号３７０）、又は配列番号３７０に示されるアミノ酸配列、すなわちＤ１−Ｋ２−Ｄ３−Ｄ４−Ｐ５−Ｐ６−Ｖ７−Ｖ８−Ｌ９−Ｖ１０−Ａ１１−Ａ１２−Ｌ１３−Ｔ１４−Ｖ１５−Ａ１６と好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、これから本質的になる、好ましくはこれからなる。好ましくは、アミノ酸置換は上で記載したようなものであり、例えばＤ１はグルタミン酸、アルギニン又はリジンにより、好ましくはグルタミン酸により置換されてもよく、Ｋ２はアルギニン、グルタミン酸又はアスパラギン酸により、好ましくはアルギニンにより置換されてもよく、Ｄ３はグルタミン酸、アルギニン又はリジンにより、好ましくはグルタミン酸により置換されてもよく、Ｄ４はグルタミン酸、アルギニン又はリジンにより、好ましくはグルタミン酸により置換されてもよく、Ｐ５及びＰ６は独立してグリシンにより置換されてもよく、Ｖ７及びＶ８は独立してイソロイシンにより置換されてもよく、好ましくはＶ７は置換されず、Ｌ９はメチオニンにより置換されてもよいが好ましくは置換されず、Ｖ１０はイソロイシン又はメチオニンにより、好ましくはイソロイシンにより置換されてもよく、Ａ１１はグリシン又はセリンにより、好ましくはセリンにより置換されてもよく、Ａ１２はバリンにより置換されてもよく、Ｔ１４はアラニンにより置換されてもよく、Ｖ１５はアラニン又はイソロイシンにより、好ましくはアラニンにより置換されてもよく、Ａ１６はメチオニン又はバリンにより置換されてもよいが好ましくは置換されない。好ましくは上記ペプチドは、上で規定された機能的特徴、すなわち骨格筋細胞及び／又は骨格筋線維における、抗不整脈能、抗アポトーシス能、カルシウムスパーク頻度を低減させる能力、筋小胞体からのカルシウム漏出を防止する及び／又はこれを低減させる能力、好ましくは心不全に罹患している個体において、血行動態機能を回復させる能力、並びに等尺性単収縮力及び／又は強縮性単収縮力を増強する能力のうちの１つ又は複数、例えば１つ、２つ、３つ、４つ又は５つ、好ましくは全てを示す。好ましくは、上記機能を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏで観察することができる。好ましくは、非経口の投与経路を介してペプチドが投与される場合、上記ｉｎ  ｖｉｖｏでの効果を観察することができる。したがって、好ましい一実施形態では、本発明によるペプチドは、上で記載したようにアミノ酸残基が置換されてもよいアミノ酸配列Ｄ１−Ｋ２−Ｄ３−Ｄ４−Ｐ５−Ｐ６−Ｖ７−Ｖ８−Ｌ９−Ｖ１０−Ａ１１−Ａ１２−Ｌ１３−Ｔ１４−Ｖ１５−Ａ１６（配列番号３７１）を含み、これから本質的になり、好ましくはこれからなり、好ましくは該アミノ酸配列は配列番号３７０に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の同一性を有し、上記の機能のうちの好ましくは１つ又は複数、好ましくは全てを観察することができ、最も好ましくは該ペプチドは細胞透過性を有する。
【００７２】
別の好ましい実施形態では、本発明によるペプチドは、アミノ酸配列Ｄ１−Ｋ２−Ｄ３−Ｄ４−Ｐ５−Ｐ６−Ｙ７−Ｖ８−Ｖ９−Ｌ１０−Ｖ１１−Ａ１２−Ａ１３−Ｌ１４−Ｔ１５−Ｖ１６−Ａ１７（配列番号３７２）、又は配列番号３７２に示されるアミノ酸配列、すなわちＤ１−Ｋ２−Ｄ３−Ｄ４−Ｐ５−Ｐ６−Ｙ７−Ｖ８−Ｖ９−Ｌ１０−Ｖ１１−Ａ１２−Ａ１３−Ｌ１４−Ｔ１５−Ｖ１６−Ａ１７と好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、これから本質的になる、好ましくはこれからなる。好ましくは、アミノ酸置換は上で記載したようなものであり、例えばＤ１はグルタミン酸、アルギニン又はリジンにより、好ましくはグルタミン酸により置換されてもよく、Ｋ２はアルギニン、グルタミン酸又はアスパラギン酸により、好ましくはアルギニンにより置換されてもよく、Ｄ３はグルタミン酸、アルギニン又はリジンにより、好ましくはグルタミン酸により置換されてもよく、Ｄ４はグルタミン酸、アルギニン又はリジンにより、好ましくはグルタミン酸により置換されてもよく、Ｐ５及びＰ６は独立してグリシンにより置換されてもよく、Ｙ７はフェニルアラニンまたはトリプトファンにより、好ましくはフェニルアラニンにより置換されてもよく、Ｖ８及びＶ９は独立してイソロイシンにより置換されてもよく、好ましくはＶ８は置換されず、Ｌ１０はメチオニンにより置換されてもよいが好ましくは置換されず、Ｖ１１はイソロイシン又はメチオニンにより、好ましくはイソロイシンにより置換されてもよく、Ａ１２はグリシン又はセリンにより、好ましくはセリンにより置換されてもよく、Ａ１３はバリンにより置換されてもよく、Ｔ１５はアラニンにより置換されてもよく、Ｖ１６はアラニン又はイソロイシンにより、好ましくはアラニンにより置換されてもよく、Ａ１７はメチオニン又はバリンにより置換されてもよいが好ましくは置換されない。好ましくは上記ペプチドは、上で規定された機能的特徴、すなわち骨格筋細胞及び／又は骨格筋線維における、抗不整脈能、抗アポトーシス能、カルシウムスパーク頻度を低減させる能力、筋小胞体からのカルシウム漏出を防止する及び／又はこれを低減させる能力、好ましくは心不全に罹患している個体において、血行動態機能を回復させる能力、並びに等尺性単収縮力及び／又は強縮性単収縮力を増強する能力のうちの１つ又は複数、例えば１つ、２つ、３つ、４つ又は５つ、好ましくは全てを示す。好ましくは、上記機能を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏで観察することができる。好ましくは、非経口の投与経路を介してペプチドが投与される場合、上記ｉｎ  ｖｉｖｏでの効果を観察することができる。したがって、好ましい一実施形態では、本発明によるペプチドは、上で記載したようにアミノ酸残基が置換されてもよいアミノ酸配列Ｄ１−Ｋ２−Ｄ３−Ｄ４−Ｐ５−Ｐ６−Ｙ７−Ｖ８−Ｖ９−Ｌ１０−Ｖ１１−Ａ１２−Ａ１３−Ｌ１４−Ｔ１５−Ｖ１６−Ａ１７（配列番号３７３）を含み、これから本質的になり、好ましくはこれからなり、好ましくは該アミノ酸配列は配列番号３７２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の同一性を有し、上記の機能のうちの好ましくは１つ又は複数、好ましくは全てを観察することができ、最も好ましくは該ペプチドは細胞透過性を有する。
【００７３】
本発明との関連ではペプチド標的化モチーフは、ｉｎ  ｖｉｖｏでペプチドを特定の器官又は特定の細胞に対して標的化するのに好適な任意の部分であり得る。例えば、ペプチド標的化モチーフは、或る特定の細胞又は或る特定の器官に特異的な特定の受容体と特異的に結合するペプチドであり得る。好ましくは、本発明によるペプチド内におけるペプチド標的化モチーフの存在により、該ペプチドが全身投与された患者における細胞又は器官の特異的な標的化が可能となる。
【００７４】
別の実施形態では、本発明のペプチドは、マーカー部分をさらに含む。本発明との関連ではマーカー部分は、ペプチドを直接検出することを可能とする任意の部分、例えば蛍光標識、例えばフルオレセイン（例えばフルオレセインイソチオシアネートＦＩＴＣ）、ローダミン（例えば、テトラメチルローダミンＴＡＭＲＡ、又はそのイソチオシアネート誘導体ＴＲＩＴＣ、スルホローダミン１０１、及びそのスルホニルクロリド形態であるテキサスレッド（商標）、及びローダミンレッド）、又はアレクサフルオル（登録商標）色素、放射標識、例えば放射標識したアミノ酸又はビオチンであり得る。一実施形態では、本発明のペプチドは、親水性モチーフ、好ましくはＤ−Ｋ−Ｄ−Ｄ−Ｐ−Ｐ（配列番号３５４）、及びマーカー部分、好ましくはＦＩＴＣ又はローダミンを含み、好ましくは筋機能増強アミノ酸配列はＶ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号４）であり、好ましくは親水性モチーフは筋機能増強アミノ酸配列のアミノ末端と直接連結する。
【００７５】
当業者は、本発明によるペプチドを製造する方法を十分に認識する。例えば、ペプチドを、例えば液相ペプチド合成若しくは固相ペプチド合成により、化学的に合成することができ、又はペプチドを、組換えＤＮＡ技法、及び細胞発現系、例えば細菌（例えば大腸菌）細胞、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳動物の細胞等、若しくはｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現系を使用して遺伝子工学的に製造することができる。
【００７６】
第２の態様では、本発明は、医学的使用のための本発明の第１の態様によるペプチドを提供する。
【００７７】
第３の態様では、本発明は、筋機能障害と関連する障害、例えば筋症の治療及び／又は予防に関する治療上の使用のための本発明の第１及び第２の態様によるペプチドを提供する。好ましくは、上記障害は、心筋障害及び／又は骨格筋障害である。障害は、後天性又は先天性のものであり得る。この関連では、「後天性の（acquired）」という用語は、医学的状態、すなわち障害が、胎生期後に（post-fetally）発症したことを意味する。本発明との関連ではかかる後天性障害は心筋梗塞であり得る。後天性骨格筋障害の一例は筋炎である。先天性障害は、遺伝学的異常、形態形成の誤り、又は染色体異常の結果として起こり得る成長中の胎児に対する欠陥を含む。遺伝学的疾患又は障害は、人生の後半まで現れない又は認識されないことがあるが、全て先天性のものである。本発明との関連では先天性障害は例えば、ネマリン筋症、筋細管筋症又は中心核筋症である。さらに本発明との関連では、心筋障害又は骨格筋障害は、急性又は慢性のものであり得る。例えば、急性心筋障害は急性心不全であり、急性骨格筋障害は横紋筋融解症である。慢性骨格筋障害は例えば皮膚筋炎である。慢性心筋疾患は例えば慢性心不全である。
【００７８】
本発明の第３の態様の好ましい一実施形態では、筋機能障害は、筋肉細胞における、好ましくは骨格筋細胞又は心筋細胞におけるカルシウム循環不全及び／又は収縮能力不全と関連する。好ましくは、ペプチドは、筋肉細胞においてカルシウム循環を増強する及び／若しくはこれを回復させるための、並びに／又は収縮能力を増強する及び／若しくはこれを回復させるためのものである。筋細胞におけるカルシウム循環不全は、筋小胞体におけるカルシウム含有量の低減、興奮収縮連関時における筋小胞体からのカルシウムの放出の低減、筋小胞体からのカルシウム漏出（例えば漏れやすいＲｙＲ筋小胞体カルシウム放出チャネルによる）、カルシウムスパーク頻度の増大、又は収縮後における筋小胞体及び／若しくはミトコンドリア中へのカルシウムの再取込みの低減若しくは遅延化（例えば機能障害を有する若しくは機能しない筋小胞体／小胞体カルシウムＡＴＰアーゼ（ＳＥＲＣＡ）による）の結果として起こるものであり得る。この理論に拘束されるものではないが、カルシウム循環不全は、筋肉細胞の収縮能力不全、例えば収縮機能不全に関する主要な理由の１つであると考えられる。したがって、カルシウム循環を増強する又はこれを回復させることは、収縮能力も増強する及び／又はこれを回復させると考えられる。ほとんど全ての心筋障害／疾患及び骨格筋障害／疾患は、それぞれの筋肉細胞の収縮機能不全の結果として起こるものである。例えば心不整脈においては、心筋収縮が正確に時機制御されない。このことは、致死的な結果をもたらし得る。骨格筋障害のほとんどでは、収縮能力が低減し、例えば様々な種類のジストロフィーにおけるもののような、筋力低下の結果をもたらす。本発明の第１の態様によるペプチドは、筋細胞におけるカルシウム循環を増強する及び／又はこれを回復させることが可能であり、それにより収縮能力を増強する及び／又はこれを回復させると考えられる。しかしながら、本発明のペプチドが、筋機能障害と関連する障害（該筋機能障害はカルシウム循環不全と関連する）を治療するのに好適なだけでなく、カルシウム処理の機能障害に基づくものでない筋疾患を治療するのにも好適であることが強調される。これらの疾患においては本発明のペプチドは、症状、例えば筋力低下を軽減することができる。
【００７９】
本発明の第２及び第３の態様の好ましい一実施形態では、ペプチドは、不整脈から、好ましくはカテコールアミンに誘発される不整脈から筋細胞、好ましくは骨格筋細胞及び／又は心筋細胞、より好ましくは心臓組織を保護するための、好ましくは心室性不整脈から、好ましくは致死性の心室性頻脈性不整脈から、したがって好ましくは心臓突然死から個体を保護するためのものである。好ましくは上記機能は、好ましくはペプチドを非経口的に適用する場合に、ｉｎ  ｖｉｖｏで示され、遺伝子療法を必要としない。
【００８０】
本発明の第２及び第３の態様のさらに好ましい一実施形態では、ペプチドは、筋細胞において、好ましくは骨格筋細胞及び／若しくは心筋細胞においてカルシウムスパーク頻度を低減させるための、並びに／又は筋細胞、好ましくは骨格筋細胞及び／若しくは心筋細胞の筋小胞体からのカルシウム漏出を防止する及び／若しくはこれを低減させるためのものである。好ましくは上記機能は、好ましくはペプチドを非経口的に適用する場合に、ｉｎ  ｖｉｖｏで示され、遺伝子療法を必要としない。
【００８１】
本発明の第２及び第３の態様のさらに好ましい一実施形態では、ペプチドは、筋肉細胞の、好ましくは骨格筋細胞及び／又は心筋細胞の筋小胞体からのカルシウム漏出を防止する又はこれを低減させるためのものである。好ましくは、ペプチドは、漏れやすいＲｙＲ筋小胞体カルシウム放出チャネルによる筋小胞体からのカルシウム漏出を防止する又はこれを低減させるためのものである。好ましくは上記機能は、好ましくはペプチドを非経口的に適用する場合に、ｉｎ  ｖｉｖｏで示され、遺伝子療法を必要としない。
【００８２】
本発明の第２及び第３の態様の別の好ましい実施形態では、ペプチドは、アポトーシス細胞死から、好ましくはカルシウム誘導性アポトーシス細胞死から、好ましくは筋小胞体のカルシウム漏出に誘発されるアポトーシス細胞死から筋細胞、好ましくは骨格筋細胞及び／又は心筋細胞を保護するためのものである。好ましくは、ペプチドは、不全心筋におけるアポトーシス細胞死を防止する、すなわち不全心筋におけるアポトーシス細胞死から心筋細胞を保護するためのものである。好ましくは上記機能は、好ましくはペプチドを非経口的に適用する場合に、ｉｎ  ｖｉｖｏで示され、遺伝子療法を必要としない。
【００８３】
本発明の第２及び第３の態様の特に好ましい別の実施形態では、ペプチドは、血行動態機能、例えば心機能、例えば心筋細胞の収縮能力を回復させる及び／又はこれを増強するためのものであり、好ましくはペプチドは、心不全に、例えば心筋梗塞に罹患している又は罹患したことがある個体において血行動態機能を回復させる及び／又はこれを増強するためのものである。好ましくは上記機能は、ペプチドを非経口的に適用する場合に、ｉｎ  ｖｉｖｏで示され、遺伝子療法を必要としない。
【００８４】
本発明の第２及び第３の態様の別の好ましい実施形態では、ペプチドは、骨格筋細胞において収縮能力を増強する及び／又はこれを回復させるための、好ましくは骨格筋細胞において、好ましくは骨格筋組織において等尺性単収縮力及び／又は強縮性単収縮力を増強する及び／又はこれを回復させるためのものである。等尺性単収縮力は筋肉の短縮を伴わない張力の発生であり、強縮性単収縮力は最大の等尺性力の発生であり、通常、単収縮は５０Ｈｚ超の刺激でマージし（merge）始める。好ましくは上記機能は、好ましくはペプチドを非経口的に適用する場合に、ｉｎ  ｖｉｖｏで示され、遺伝子療法を必要としない。
【００８５】
本発明の第１の態様における本発明によるペプチドの特定の実施形態の機能的特徴に関する開示が、本発明の第２及び第３の態様にも適用されることが強調される。
【００８６】
本発明の第３の態様の好ましい一実施形態では、心筋障害は、虚血後収縮機能不全、好ましくは虚血後右心室収縮機能不全及び／又は虚血後左心室収縮機能不全、うっ血性心不全、好ましくは代償性及び／又は非代償性うっ血性心不全、心原性ショック、敗血症ショック、心筋梗塞、心筋症、心臓弁の機能不全、並びに心室障害、例えば急性又は慢性の右心室障害からなる群から選択される。
【００８７】
本発明の第３の態様の好ましい一実施形態では、骨格筋障害は、筋ジストロフィー、筋力低下、筋萎縮症、筋炎、セントラルコア病、ネマリン（桿状体）筋症、中心核筋症、筋細管筋症、中心核筋細管筋症、眼の眼筋麻痺、及びミトコンドリア筋症からなる群から選択される。筋ジストロフィーは、ベッカー型筋ジストロフィー、先天性筋ジストロフィー、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、遠位型筋ジストロフィー、エメリ・ドレフュス型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、筋強直性筋ジストロフィー及び眼咽頭型筋ジストロフィーからなる群から選択することができる。筋炎は、骨化性筋炎、線維筋炎、特発性炎症性筋症（例えば皮膚筋炎、多発性筋炎及び封入体筋炎）及び化膿性筋炎からなる群から選択することができる。
【００８８】
第４の態様では、本発明は、第１の態様のペプチド、又はその薬学的に許容可能な塩、並びに薬学的に許容可能な添加物、担体及び／又は希釈剤を含む医薬組成物を提供する。
【００８９】
「薬学的に許容可能な塩」という用語は、本発明のペプチドの塩を表す。好適な薬学的に許容可能な塩は、例えば、本発明のペプチドの溶液を、薬学的に許容可能な酸（例えば塩酸、硫酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酢酸、安息香酸、クエン酸、酒石酸、炭酸又はリン酸）の溶液と混合することにより形成することができる酸付加塩を含む。さらに、ペプチドが酸性分子部分を保有する場合には、その好適な薬学的に許容可能な塩は、アルカリ金属塩（例えばナトリウム塩又はカリウム塩）；アルカリ土類金属塩（例えばカルシウム塩又はマグネシウム塩）；及び好適な有機リガンド（例えばハロゲン化物イオン、水酸化物イオン、カルボン酸イオン、硫酸イオン、リン酸イオン、硝酸イオン、アルキルスルホン酸イオン及びアリールスルホン酸イオン等の対陰イオンを使用して形成した、アンモニウム陽イオン、四級アンモニウム陽イオン及びアミン陽イオン）で形成される塩を含み得る。薬学的に許容可能な塩の例示的な例は、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重炭酸塩、重硫酸塩、重酒石酸塩、ホウ酸塩、臭化物塩、酪酸塩、エデト酸カルシウム、カンファー酸塩（camphorate）、カンファースルホン酸塩（camphorsulfonate）、カンシル酸塩、炭酸塩、塩化物塩、クエン酸塩、クラブラン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、二塩酸塩、ドデシル硫酸塩、エデト酸塩、エジシル酸塩、エストール酸塩（estolate）、エシル酸塩（esylate）、エタンスルホン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルセプト酸塩、グルコヘプトン酸塩、グルコン酸塩、グルタミン酸塩、グリセロリン酸塩、グリコリルアルサニル酸塩（glycolylarsanilate）、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、ヘキシルレゾルシン酸塩（hexylresorcinate）、ヒドラバミン（hydrabamine）、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシ−エタンスルホン酸塩、ヒドロキシナフトエ酸塩、ヨウ化物塩、イソチオン酸塩（isothionate）、乳酸塩、ラクトビオン酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、マンデル酸塩、メシル酸塩、メタンスルホン酸塩、メチル硫酸塩、ムチン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ナプシル酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、Ｎ−メチルグルカミンアンモニウム塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パモ酸塩（エンボン酸塩（embonate））、パルミチン酸塩、パントテン酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩／二リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、ポリガラクツロン酸塩、プロピオン酸塩、サリチル酸塩、ステアリン酸塩、硫酸塩、塩基性酢酸塩、コハク酸塩、タンニン酸塩、酒石酸塩、テオクル酸塩、トシル酸塩、トリエチオジド（triethiodide）、ウンデカン酸塩、吉草酸塩等を含むがこれらに限定されない（例えば、S. M. Berge et al., "Pharmaceutical Salts", J. Pharm. Sci.,66, pp. 1-19（1977）を参照されたい）。
【００９０】
本明細書中で使用される場合の「添加物」という用語は、例えば担体、結合剤、滑剤、増粘剤、界面活性剤、保存料、乳化剤、緩衝液、香料又は着色料等の、活性成分ではない、医薬製剤中の全ての物質を示すことが意図される。
【００９１】
好ましい一実施形態では、本発明の医薬組成物は、本発明の第３の態様における本発明のペプチドに関して上で記載したような筋機能障害と関連する障害を治療又は予防するためのものである。
【００９２】
別の好ましい実施形態では、本発明の医薬組成物は、本発明の第３の態様における本発明によるペプチドに関して上で記載したように、不整脈から筋細胞を保護する、心室性不整脈から、好ましくは致死性の心室性頻脈性不整脈から、したがって好ましくは心臓突然死から個体を保護するための、筋細胞においてカルシウムスパーク頻度を低減させるための、筋細胞の筋小胞体からのカルシウム漏出を防止する及び／若しくはこれを低減させるための、アポトーシス細胞死から筋細胞を保護する、好ましくは不全心筋におけるアポトーシス細胞死から心筋細胞を保護するための、血行動態機能を回復させる及び／若しくはこれを増強する、好ましくは心不全に罹患している個体において血行動態機能を増強するための、並びに／又は骨格筋細胞において収縮能力を増強する及び／若しくはこれを回復させるための、好ましくは骨格筋細胞において等尺性単収縮力及び／若しくは強縮性単収縮力を増強する及び／若しくはこれを回復させるためのものである。
【００９３】
本発明の対象となる医薬組成物を、当業者に既知の様々な方法で製剤化することができる。例えば、本発明の医薬組成物は、液体形態で、例えば溶液、乳濁液又は懸濁液の形態であり得る。好ましくは、本発明の医薬組成物を、非経口投与用に、好ましくは静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、経皮投与、肺内投与、腹腔内投与、心臓内投与用に、又は粘膜を介した投与用に、好ましくは静脈内投与、皮下投与若しくは腹腔内投与用に製剤化する。好ましくは、本発明の医薬組成物は、他の物質、例えば溶液を血液と等張にするのに十分な塩又はグルコースを含有し得る無菌水溶液の形態である。水溶液は好適には、必要に応じて、緩衝化（好ましくは３〜９のｐＨまで、より好ましくは５〜７のｐＨまで）するべきである。
【００９４】
医薬組成物は、好ましくは単位投与形態である。かかる形態では、医薬組成物は、適切な量の活性成分を含有する単位用量に細分類される。単位投与形態は包装された調製物であってもよく、該包装は例えばバイアル又はアンプルのように分離した量の医薬組成物を含有する。
【００９５】
第５の態様では、本発明は、筋機能障害と関連する障害を治療又は予防するための医薬組成物の調製のための本発明の第１の態様によるペプチドの使用を提供し、ここで上記障害は好ましくは本発明の第３の態様において上で記載したようなものである。好ましい一実施形態では、ペプチドの使用は、本発明の第３の態様における本発明によるペプチドに関して上で記載したように、不整脈から筋細胞を保護する、心室性不整脈から、好ましくは致死性の心室性頻脈性不整脈から、したがって好ましくは心臓突然死から個体を保護するための、筋細胞においてカルシウムスパーク頻度を低減させるための、筋細胞の筋小胞体からのカルシウム漏出を防止する及び／若しくはこれを低減させるための、アポトーシス細胞死から筋細胞を保護する、好ましくは不全心筋におけるアポトーシス細胞死から心筋細胞を保護するための、心不全に罹患している個体において血行動態機能を回復させる及び／若しくはこれを増強するための、並びに／又は骨格筋細胞において収縮能力を増強する及び／若しくはこれを回復させるための、好ましくは骨格筋細胞において等尺性単収縮力及び／若しくは強縮性単収縮力を増強する及び／若しくはこれを回復させるための医薬組成物の調製のためのものである。本発明の第５の態様の好ましい一実施形態では、該使用は、筋障害、好ましくは骨格筋障害及び／又は心筋障害と関連する疾患状態を改善するための医薬組成物の調製のためのものであり、ここで「疾患状態を改善する」という用語は、本発明の第６の態様に関して定義されるようなものである。
【００９６】
第６の態様では、本発明は、筋機能障害と関連する障害を治療又は予防する方法であって、それを必要とする個体に対して、上記個体、好ましくは患者の疾患状態を改善するのに十分な量の本発明の第１の態様のペプチド、又は本発明の第４の態様の医薬組成物を投与することを含む、方法を提供する。この関連では「疾患状態を改善する」は、例えば、ペプチド若しくは医薬組成物が患者に投与された後、或る特定の期間の後に個体が改善の主観的感覚を有すること、又は本発明のペプチド若しくは医薬組成物での治療後に疾患の筋肉の機能が測定可能な程度まで改善されていることを意味する。例えば、収縮能力、例えば筋肉組織、例えば疾患の心筋又は疾患の骨格筋の収縮力が、正常な収縮機能の平均値から５０％逸脱していた場合、治療後に、上記筋肉組織の収縮能力が、対応する健常な筋肉組織の正常な収縮機能の平均値から５０％未満、例えば４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満逸脱していれば、又は全く逸脱していなければ、治療により疾患状態が改善される。収縮能力は、健常な心臓組織の平均的な心機能と比較して改善することもある。「それを必要とする個体」という用語は好ましくは、上で規定されるような動物患者を、より好ましくは哺乳動物患者を、最も好ましくはヒト患者を表す。
【００９７】
筋機能障害と関連する障害は好ましくは、本発明の第３の態様に関して規定されるようなものである。
【００９８】
好ましい一実施形態では、本発明の第６の態様による方法は、本発明の第３の態様における本発明によるペプチドに関して上で記載したように、不整脈から筋細胞を保護する、心室性不整脈から、好ましくは致死性の心室性頻脈性不整脈から、したがって好ましくは心臓突然死から個体を保護するための、筋細胞においてカルシウムスパーク頻度を低減させるための、筋細胞の筋小胞体からのカルシウム漏出を防止する及び／若しくはこれを低減させるための、アポトーシス細胞死から筋細胞を保護する、好ましくは不全心筋におけるアポトーシス細胞死から心筋細胞を保護するための、心不全に罹患している個体において血行動態機能を回復させる及び／若しくはこれを増強するための、並びに／又は骨格筋細胞において収縮能力を増強する及び／若しくはこれを回復させるための、好ましくは骨格筋細胞において等尺性単収縮力及び／若しくは強縮性単収縮力を増強する及び／若しくはこれを回復させるためのものである。
【００９９】
本発明の第５及び第６の態様において記載されるように筋機能障害と関連する障害を治療又は予防するために、本発明によるペプチド又は医薬組成物を、動物患者、好ましくは哺乳動物患者、好ましくはヒト患者に対して、好ましくは非経口の投与経路を介して、例えば静脈内に、筋肉内に、皮下に、経皮的に、肺内に、腹腔内に、心臓内に、又は粘膜を介して、好ましくは静脈内に、皮下に、若しくは腹腔内に投与することができる。投与は、点滴若しくは古典的な注射によるもの、例えばカニューレを使用するもの、又は無針注射技法によるものであり得る。
【０１００】
第７の態様では、本発明は、筋機能障害と関連する疾患、好ましくは骨格筋疾患、より好ましくは心筋疾患を治療又は予防するために通常投与される別の薬物と組み合わせて本発明の第１の態様によるペプチドを含む、これから本質的になる、又はこれからなる組成物を提供する。好ましくは、上記組成物は、１つ又は複数の薬学的に許容可能な希釈剤、担体及び／又は添加物も含み得る医薬組成物である。好ましい一実施形態では、上記薬物は、好ましくは心筋細胞に対して、催不整脈能を示す。本発明のこの態様の好ましい一実施形態では、本発明によるペプチドは、上記薬物の催不整脈能を低減させる。好ましくは上記薬物は、カテコールアミン、例えば直接β−模倣剤（mimetics）、例えば内因性若しくは合成のカテコールアミン、又は間接β−模倣剤、例えばホスホジエステラーゼ阻害剤β−模倣剤、又はＲｙＲ２のカルシウム感受性を増強する別の作用剤、例えばカフェイン、又は類似の化学物質、例えばプリンアルカロイド若しくはジメチルキサンチンである。本発明の第７の態様の好ましい一実施形態では、上記薬物は、カテコールアミン、β−アドレナリン受容体作動薬及びβ−アドレナリン受容体遮断薬からなる群から（form）選択される。一実施形態では、上記薬物は、カテコールアミン、例えばドブタミン、ノルアドレナリン、アドレナリン、ドーパミン又はイソプレナリン、好ましくはドブタミン、ノルアドレナリン又はアドレナリンである。別の実施形態では、上記薬物は、β−アドレナリン受容体作動薬、例えばイソプロテレノール、サルブタモール、フェノテロール、ホルモテロール、メタプロテレノール、サルメテロール、テルブタリン、クレンブテロール、アルブタミン、ベフノロール、ブロモアセチルアルプレノロールメンタン（bromoacetylalprenololmenthane）、ブロキサテロール、シマテロール、シラゾリン、デノパミン、エピネフリン、エチレフリン、ヘキソプレナリン、ヒゲナミン、イソエタリン、イソクスプリン、マブテロール、メトキシフェナミン、ニリドリン、オキシフェドリン、ピルブテロール、プレナルテロール、プロカテロール、ラクトパミン、レプロテロール、リミテロール、リトドリン、トレトキノール、トルブテロール（tolubuterol）、キサモテロール、ジルパテロール（zilpaterol）又はジンテロール、好ましくはイソプロテレノール、サルブタモール、フェノテロール、ホルモテロール、メタプロテレノール、サルメテロール、テルブタリン、クレンブテロール、より好ましくはイソプロテレノールである。別の実施形態では、上記薬物は、β−アドレナリン受容体遮断薬、例えばメトプロロール、アテノロール、ビソプロロール、ネビボロール、エスモロール、ベタキソロール、アセブトロール、セリプロロール、ブプラノロール、プロプラノロール、チモロール、カルベジロール、ソタロール、ピンドロール、オクスプレノロール又はアルプレノロール、好ましくはメトプロロール、アテノロール、ビソプロロール、ネビボロール、エスモロール又はベタキソロール、最も好ましくはメトプロロールである。本発明の第７の態様による組成物は、本発明の第１の態様によるペプチドと組み合わせて、同じ分類の又は異なる分類の１つ又は複数の、例えば１つ、２つ、３つ又は４つ��異なる薬物を含み得る。
【０１０１】
本発明者らは驚くべきことに、本発明によるペプチドが本明細書全体を通じて記載したような筋機能障害と関連する障害を治療又は予防するために有用であること、本発明によるペプチドが薬物、例えばカテコールアミン、β−アドレナリン受容体作動薬又はβ−アドレナリン受容体遮断薬の催不整脈能をそれらの有益な効果を打ち消すことなく低減させる能力を有すること、及び上記ペプチドのこれらの治療効果が、ペプチドが非経口的に、好ましくは静脈内、腹腔内又は皮下の投与経路を介して投与される場合であっても発揮され、遺伝子療法による遺伝子改変を必要とせず、主な副作用を引き起こすことがないことを見出した。
【実施例】
【０１０２】
実施例は、本発明をさらに説明するために設計され、より良い理解に役立つ。実施例は、本発明の範囲を限定するものと解釈されるものでは決してない。
【０１０３】
実施例１：透過処理した心筋細胞及び骨格筋線維に対するＳ１００Ａ１タンパク質、及びＳ１００Ａ１のＣ末端の２０ｍｅｒペプチドの変力効果。
成体ウサギ心室心筋細胞を、以前に記載されたように４匹の異なる動物から単離し（Loughrey C.M. et al., 2004, J. Physiol. 556:919-934）、β−エスチン（０．１ｍｇ／ｍｌ）を使用して透過処理した。透過処理した細胞を、ローダミン標識したヒトＳ１００Ａ１タンパク質（０．１μＭ）、又は親水性リンカーと融合したＦＩＴＣ標識したＳ１００Ａ１のＣ末端の２０ｍｅｒペプチド（０．１μＭ）（Ｄ−Ｋ−Ｄ−Ｄ−Ｐ−Ｐ（配列番号３５４）と融合したヒトＳ１００Ａ１のアミノ酸７５〜９４）と共に１分間インキュベートした。細胞を、Ｂｉｏ−Ｒａｄ２０００レーザー走査型共焦点顕微鏡（ＬＳＣＭ）を使用してモニタリングした。リアノジン染色パターンに類似する線状の染色パターンを観察することができる（図４）。
【０１０４】
さらに、Ｓ１００Ａ１タンパク質、又は親水性リンカーと融合したＳ１００Ａ１のＣ末端の２０ｍｅｒペプチドで処理した透過処理した細胞においてＣａ２＋スパーク頻度を評価し、全長タンパク質及びＣ末端断片の両方が、透過処理した心筋細胞においてカルシウムスパーク頻度を減少させることが示された（図５及び図６）。単離した心筋細胞を、擬似（mock）細胞内溶液で灌流し、β−エスチン（０．１ｍｇ／ｍｌ）を使用して透過処理した。灌流溶液中に存在するＦｌｕｏ−３遊離酸（１０μＭ）を４８８ｎｍ（Ｋｒレーザー）で励起させ、×６０−１．２ＮＡの水浸型対物レンズを備えた倒立顕微鏡の落射蛍光光学系（epifluorescence optics）を適用して５１５ｎｍ超で測定した。ラインスキャンモードにおいて２ミリ秒／ラインで蛍光を取得した。ピクセル寸法は０．３μｍであった（５１２ピクセル／スキャン；ズーム＝１．４）。スキャンするレーザーラインを、長軸と平行に配向させ、確実に核領域がスキャンラインに含まれないようにするために、細胞の外縁及び核（単数／複数）からおよそ等距離となるように配置した。この出力波形を遊離カルシウム濃度（［Ｃａ２＋］）に変換することができるように、各Ｃａ２＋スパーク測定期間の終了時に、１０ｍＭのＥＧＴＡを組み込んだ一連の較正溶液を使用した。Ｃａ２＋スパークに関する全ての実験において、試験溶液中の［Ｃａ２＋］は１４５ｎＭ〜１６０ｎＭであった。Ｆｌｕｏ−３を含有する溶液において記録されたＣａ２＋スパークを、自動化検出及び測定アルゴリズムを使用して定量化した。全てのＣａ２＋スパーク測定を、細胞の透過処理後７分〜８分以内に行った。この時間を標準化して、可溶性タンパク質の損失を最小限に抑えた。Ｓ１００Ａ１タンパク質又はＳ１００Ａ１−ｃｔペプチドを、重力供給型灌流システムを使用して擬似溶液中に適用した。効果を、Ｓ１００Ａ１を添加していない擬似溶液で灌流した透過処理した対照心筋細胞と比較した。各動物由来の最大４個の異なる細胞をＣａ２＋スパーク測定に対して使用した。
【０１０５】
筋線維調製及び実験溶液。全ての動物を、ハイデルベルク大学の動物実験委員会（animal care committee）の指針に従って取り扱った。雄性ＢＡＬＢ／ｃマウス（３ヶ月齢〜６ヶ月齢）を二酸化炭素の過剰投与により屠殺し、以前に記載された（Fink R.H. and Stephenson D.G., 1987, Pflugers Arch. Eur. J. Physiol.409:374-380、Makabe M. etal., 1996, Pflugers Arch. Eur. J. Physiol. 432: 717-726）ように筋線維調製を実施した。ＥＤＬ（長指伸筋）又はヒラメ筋を単離し、２つ〜４つの単線維（直径８０μｍ〜１５０μｍ及び長さ３ｍｍ〜４ｍｍ）を含有する小線維束をパラフィン油中で切り出した。線維調製物を、力変換ピン（force transducer pin）（ＡＥ８０１、Senso-Noras、Horton, Norway）とマイクロメートル加減ネジ（micrometer-adjustablescrew）との間に接着した（glued）。全ての実験を室温（２３℃〜２５℃）で実施した。全ての溶液をｐＨ７．０に調整した。遊離イオン濃度を、G. L. Smith（Glasgow, Scotland）からのコンピュータプログラムＲＥＡＣＴ（バージョン２．０）を用いて算出した。表Ｉは実験に使用した溶液の濃度を示す。
【０１０６】
表１
総濃度（角括弧内のものは遊離濃度）
ＬＲ、低弛緩溶液；ＨＲ、高弛緩溶液；ＨＡ、高活性化溶液；ＳＫ、スキニング（skinning）溶液；ＬＳ、ローディング（loading）溶液。
【表１】
0005847073.tif 000002
【０１０７】
高弛緩溶液及び高活性化溶液は遊離のＣａ２＋を緩衝するために５０ｍＭのＥＧＴＡを含有するものであったが、低弛緩溶液は、０．５ｍＭのＥＧＴＡ、及び４９．５ｍＭの１，６−ジアミノヘキサン−Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ−四酢酸（ＨＤＴＡ）（ＥＧＴＡと対照的に、Ｃａ２＋に対する親和性が非常に低い）を含有するものであった。スキニング溶液は、低弛緩溶液に対する５０μｇ／ｍｌのサポニンの添加により得られる。放出溶液は、５ｍＭのカフェインを添加した低弛緩溶液からなるものであった。ローディング溶液は、遊離のＣａ２＋を０．４μＭ（ｐＣａ６．４）までクランプするために５０ｍＭのＥＧＴＡを含有するものであった。ｐＣａ−力の関係を測定するための溶液を、高弛緩溶液を適切量の高活性化溶液、及び添加された５ｍＭのカフェインと混合することにより得た。全ての実験を、ストリップチャートレコーダーを使用して記録し、同時に、Axon InstrumentsのＤｉｇｉｄａｔａ  １２００インターフェースボード（boardand interface）（Ａｘｏｔａｐｅソフトウェア、バージョン２．０を使用する）によりデジタル変換した。筋線維調製及び力測定に関しては、Weisleder N. et al., 2006, J. Cell Biol. 174:639-645も参照されたい。
【０１０８】
骨格筋線維におけるＣａ２＋誘導性等尺性単収縮力及びＣａ２＋過渡応答の評価。
全長Ｓ１００Ａ１タンパク質及びＣ末端断片の両方が、透過処理したマウス骨格筋線維において等尺性単収縮力を増強する効力を有することが示された（図７）。ヘリウム−ネオンレーザーの回折パターンを使用してサルコメア長を２．６μｍ±０．１μｍに調整しつつ、筋線維をスキニング溶液中で５分間スキニングした。ＳＲをローディング溶液（ｐＣａ６．４）により１分間ローディングする前に、線維を、放出溶液及び高弛緩溶液中に短時間浸漬し、その後低弛緩溶液中で２分間平衡化した。その後、調製物を高弛緩溶液中に１秒間、さらに低弛緩溶液中に２分間浸した。初期の力の過渡応答が静止時の（resting）力のレベルに戻るまで、線維を５ｍＭのカフェインを含有する放出溶液に曝露した。最大の力は、ｐＣａ４．２８の高活性化溶液及び５ｍＭのカフェイン下で測定された。その後線維を、Ｃａ２＋を緩衝するための高弛緩溶液中で１分間弛緩させた。幾つかの対照過渡応答を記録した後、線維をＳ１００Ａ１タンパク質又はＳ１００Ａ１ペプチド混合物（Ｎ／Ｈ／Ｃ）又はＣ末端２０ｍｅｒに単独で曝露し、実験を上で概説したように繰り返した。Ｓ１００Ａ１タンパク質又はペプチドを、放出前及び放出時に低弛緩溶液に、並びに高活性化溶液に添加した。Ｓ１００Ａ１処置（０．００１μＭ〜１０μＭ）への応答におけるｐＣａ−力の関係を、６つの異なるＣａ２＋濃度（ＥＤＬ、ｐＣａ９．０７、５．９１、５．７２、５．４９、５．１７及び４．２８）（各々が５ｍＭのカフェインを含有する）で測定した。ＥＣ５０及びヒル係数を、ヒル型フィッティング（Hilltype fit）から得た。ＥＣ５０値は、収縮装置のＣａ２＋感受性の尺度としての、最大値の半分の等尺性力の活性化に必要とされるＣａ２＋濃度を示す。ヒル係数は、シグモイド曲線の最大の峻度の指標を与える。相関係数を、フィッティングの精度を決定するために算出した。力の過渡応答を、以前に記載されたようにＣａ２＋の指標としての個々のｐＣａ２＋−力の関係を使用すること、及び力の過渡応答の各点を対応する遊離Ｃａ２＋レベルへと変換すること（reversing）により、対応する遊離Ｃａ２＋過渡応答へと変換した。Ｃａ２＋調節タンパク質の感受性、及び対応する力の発生により直接、遊離の筋原線維Ｃａ２＋の尺度が得られるという事実に基づき、ｐＣａ−力の関係は、遊離Ｃａ２＋と力とを関連付ける。したがって、ＳＲからのＣａ２＋放出に由来するかなり緩やかな力の過渡応答を見掛けのＣａ２＋過渡応答へと変換するｐＣａ−力の関係を、バイオアッセイとして使用することができる。
【０１０９】
実施例２：Ｓ１００Ａ１ｃｔ６／１１ペプチドの細胞透過性
ローダミン標識したＳ１００Ａ１タンパク質も、親水性モチーフ、例えばＤ−Ｋ−Ｄ−Ｄ−Ｐ−Ｐ（配列番号３５４）を有する又は有しないＦＩＴＣ標識したＳ１００Ａ１のＣ末端  ２０ｍｅｒペプチドも、成体・無傷の心筋細胞の細胞膜に浸透することができない。しかしながら、本発明者らは驚くべきことに、Ｓ１００Ａ１ｃｔ６／１１と称する配列Ｄ−Ｋ−Ｄ−Ｄ−Ｐ−Ｐ−Ｙ−Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号３７２）を有するペプチドが細胞透過性を有することを見出した。ＦＩＴＣ標識したＳ１００Ａ１ｃｔ６／１１を無傷のラット心室心筋細胞と共に１５分間インキュベートした後、細胞を共焦点レーザー走査型顕微鏡法を使用してモニタリングした。内在性Ｓ１００Ａ１タンパク質を、従来の免疫蛍光プロトコルを使用して染色した。ＦＩＴＣ標識したＳ１００Ａ１ｃｔ６／１１の細胞内染色パターンは、内在性Ｓ１００Ａ１の細胞内染色パターンに類似している（図８）。
【０１１０】
実施例３：心筋細胞におけるＳ１００Ａ１ｃｔ６／１１ペプチドの機能的特性決定
Ｓ１００Ａ１ｃｔ６／１１ペプチドの機能的特性決定のために行った全ての実験を、無傷の、すなわち透過処理していない心筋細胞（cardiomyocates）に対して行った。Ｓ１００Ａ１ｃｔ６／１１ペプチドは刺激した単離心室心筋細胞に対して正の変力効果を発揮する（図９）が、その断片（図１０）、又はＳ１００Ａ４若しくはＳ１００Ｂのカルボキシ末端由来の対応するペプチド（図１１）はこの能力を示さないことが示された。カルシウム過渡応答を、落射蛍光デジタル化顕微鏡法を利用してＦＵＲＡ２−ＡＭを負荷し電場刺激した心筋細胞において評価し、筋小胞体のカルシウム負荷を決定した（図１２）。
【０１１１】
心筋細胞におけるＣａ２＋過渡応答、及びＳＲのＣａ２＋負荷の較正及び測定。
マウス心室心筋細胞の細胞内Ｃａ２＋過渡応答を、以前に記載された（Remppis A. et al., 2002, Basic Res. Cardiol. 97: I/56-I/62）ように較正及び測定した。簡潔に述べると、単離した細胞を、ＨＥＰＥＳ改変培地１９９（Ｍ１９９）（Sigma）中で洗浄し、２μＭのＦｕｒａ２−ＡＭを含む１ｍｌのＭ１９９（２ｍＭ［Ｃａ２＋］ｅ）中で室温で２０分間インキュベートした。較正及び蛍光測定を、モノクロメータ（Ｐｏｌｙｃｈｒｏｍｅ  ＩＩ、T.I.L.L. Photonics GmbH、Germany）と接続されたＵＶフィルタを備えたオリンパス株式会社の倒立（inverse）顕微鏡（Ｉ×７０）を使用して実施した。細胞を、１Ｈｚで電気刺激し、３４０ｎｍ／３８０ｎｍで励起させた。蛍光放出を、５１０ｎｍで検出し、デジタル化し、T.I.L.L.のＶＩＳＩＯＮソフトウェア（バージョン３．３）で解析した。５つの連続する定常状態の過渡応答由来のベースラインデータを、過渡振幅（Ｃａ２＋振幅（ｎＭ））、ピークとなる時間（ミリ秒）、及び５０％低下する時間（ミリ秒）の解析のために平均化した。５０個の細胞に対するＦｕｒａ２−ＡＭを負荷したマウス心室筋細胞に関する較正により最小の比（Ｒｍｉｎ）０．３８±０．０５、及び最大の比（Ｒｍａｘ）３．３６±０．２１が得られ、β及びＫｄはそれぞれ５．２１±０．２４ｎＭ及び２３６±２９ｎＭの量と評価された。遊離細胞内Ｃａ２＋濃度［Ｃａ２＋］ｉを、Grynkiewicz et al.の式（Grynkiewicz G. et al.,1985, J. Biol. Chem. 260:3440-3450）により算出した。Ｃａ２＋過渡応答を、１Ｈｚの電気刺激及び２ｍＭ［Ｃａ２＋］e（Ｍ１９９中）下において、ベースラインで及び段階的に増大するイソプロテレノール濃度（１０−９Ｍ〜１０−５Ｍ）に対して調査した。ＳＲのＣａ２＋負荷を、標準カフェインパルスプロトコルを使用して評価した。２分の電気刺激（１Ｈｚ）の後、筋細胞を、カフェイン（１０ｍＭ）を含む０Ｎａ＋／０Ｃａ２＋溶液に急遽曝露した。カフェイン誘導性Ｃａ２＋過渡応答のピークを、ＳＲのＣａ２＋負荷の指標として使用した。
【０１１２】
筋細胞収縮パラメータ。
単離した心室筋細胞の収縮性研究を、ビデオエッジ検出システム（Crescent Electronics、Sandy, UT）を用いて、近年記載された（Most P. et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 98:13889-13894）ように行った。簡潔に述べると、筋細胞をＭ１９９中、室温で、１Ｈｚで電気刺激して収縮させた。エッジ検出の測定値を、基本条件下及び漸増イソプロテレノール濃度（１０−９Ｍ〜１０−５Ｍ）下で取得した。５つの連続する定常状態の単収縮のデータを、細胞の短縮率（％ＣＳ（％））、短縮速度（−ｄＬ／ｄｔ（μｍ／ｓ））及び再伸長速度（＋ｄＬ／ｄｔ（μｍ／ｓ））の解析のために平均化した。
【０１１３】
実施例４：Ｓ１００Ａ１ｃｔ６／１１は、β−アドレナリン受容体シグナル伝達を変化させず、不整脈誘発性のストア過負荷誘導性カルシウム放出（ＳＯＩＣＲ）から心筋細胞を保護する
Ｓ１００Ａ１ｃｔ６／１１の変力効果は、β−アドレナリン刺激に対して相加的でありかつこれと独立している（図１３）。心室心筋細胞を上で記載したように単離し、カルシウム過渡振幅を、イソプロテレノールの存在下及び非存在下で、並びにＳ１００Ａ１ｃｔ６／１１ペプチドの存在下又は非存在下で、それぞれ評価した。
【０１１４】
さらに、Ｓ１００Ａ１ｃｔ６／１１ペプチドは、不整脈誘発性のストア過負荷誘導性カルシウム放出（ＳＯＩＣＲ）から心筋細胞を保護する（図１５）。カルシウムスパークを、Ventucci et al., 2007, Circ. Res. 100:105-111に記載されたように、対照及びβＡＲ（１０−７Ｍのイソプロテレノール＋０．５ｍＭのカフェイン）条件下で、Ｆｌｕｏ−３ＡＭを負荷した心筋細胞において評価した。Ｓ１００Ａ１ｃｔ６／１１の保護効果は、ＳＲのカルシウム負荷の増強により心筋細胞において変力作用を発揮する濃度（１００ｎＭ及び１０００ｎＭ）で効果的であることに留意することが重要である。したがって、ＳＲのＣａ再隔離に対するそれ自身の増強効果に関わらず、Ｓ１００Ａ１ｃｔ６／１１はβＡＲに誘発されるＳＯＩＣＲを効果的にアンタゴナイズし、変力作用を抗不整脈効力と関連付ける特有の分子プロファイルを強調する。
【０１１５】
実施例５：正常な心臓及び疾患心臓におけるＳ１００Ａ１ｃｔ６／１１ペプチドの機能的特性決定。
Ｓ１００Ａ１ｃｔ６／１１ペプチドは、基本条件及びβＡＲ刺激条件下で収縮能力の増強をもたらす有意なｉｎ  ｖｉｖｏでの血行動態効果を発揮する（図１８）。これらの血行動態効果は、β１ＡＲ遮断薬メトプロロールへの応答に効果的である（図１９及び図２０）。さらに、Ｓ１００Ａ１ｃｔ６／１１ペプチドは、実験的心不全マウスモデルにおいて血行動態機能を回復させ（図２１）、上記マウスモデルにおいて不全心筋におけるアポトーシス細胞死を防止する（図２２）ｉｎ  ｖｉｖｏでの有意な治療効果を発揮する。さらに、Ｓ１００Ａ１ｃｔ６／１１ペプチドは、βＡＲに誘発される致死性の心室性頻脈性不整脈から心不全マウスを保護する（図２３）。
【０１１６】
経胸壁心エコー検査。
２次元誘導（guided）Ｍ−モード及びドップラー心エコー検査を、以前に記載された（Kohoutet al., 2001, Circulation 104:2485-2491）ように、覚醒マウスにおいてＨＤＩ５０００心エコー検査装置（ATL、Bothell, WA）を使用して実施した。３回の独立した心エコー検査の測定値を、両方のモードで取得した。収縮終期の左室腔直径（ＬＶＥＳＤ）、及び拡張終期の左室腔直径（ＬＶＥＤＤ）、心室中隔厚（ＩＶＳｔｈ）、拡張終期の左室後壁厚（ＬＶＰｔｈ）、並びにＬＶ短縮率（ＦＳ％）を、乳頭筋のレベルで短軸Ｍ−モードビュー（M-modeview）において決定した。ＦＳ％＝［（ＬＶＥＤＤ−ＬＶＥＳＤ）／ＬＶＥＤＤ］×１００（％）。ＬＶ駆出時間（ＬＶＥＴ）、及び大動脈弁ドップラー測定から取得した心拍数（ｂｐｍ）を使用して、心拍数で補正した円周方向線維短縮の平均速度を評価した：平均Ｖｃｆｃ＝ＦＳ％／ＥＴ×√６０／ｂｐｍ×１０（周（circ）／秒）。
【０１１７】
心臓カテーテル処置及び血行動態評価。
自発呼吸する軽く麻酔した（anesthesized）マウス（トリブロモエタノール／アミレン水和物；アバチン；２．５％（ｗｔ／ｖｏｌ）、８μｌ／ｇ（ＩＰ））における経胸壁２次元心エコー検査（ＴＴＥ）を、偽マウス及び梗塞マウスの両方において１２ＭＨｚプローブを用いて行った。ＭモードでのＴＴＥを、外科処置の前後（７日及び２８日）に傍胸骨の短軸において実施して、ＬＶ直径及び引き続き短縮率（ＦＳ％＝［（ＬＶＥＤＤ−ＬＶＥＳＤ）／ＬＶＥＤＤ］×１００））を評価した。同じ麻酔下で、１．４フレンチマイクロマノメータが先端に付いたカテーテル（ＳＰＣ−３２０、Millar instruments, Inc.）を、右頚動脈中に挿入した後、ＬＶ中まで進めた。心拍数（回／分）、ＬＶ拡張終期圧（ＬＶＥＤＰ）、並びにＬＶ圧の最大一次導関数（ＬＶ  ＋ｄｐ／ｄｔｍａｘ）及び最小一次導関数（ＬＶ  ｄｐ／ｄｔｍｉｎ）を含む血行動態解析を行った。
【０１１８】
心筋の組織病理学検査及びアポトーシス
ＬＶ組織を、凍結して切り出し（cryosectioned）（５μｍ）、ヘマトキシリン−エオシン（ＨＥ）で染色して、ＬＶの遠隔の非梗塞性領域において筋細胞の幅を測定し、ＮＩＨ画像ソフトウェア（ＩｍａｇｅＪ１．３４、http:/rsb.info.nih.gov/ij）を使用して、長軸方向に切り出した筋細胞において核のレベルでの評価基準を取得した。末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介性ｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）染色を、製造業者のプロトコル（Roche、１１６８４７９５００１）に従って実施した。遠隔領域におけるＴＵＮＥＬ陽性心筋細胞核の数を、オリンパス株式会社のＩ×７０倒立顕微鏡（T.I.L.L. Ｖｉｓｉｏｎソフトウェア、バージョン３．３）を用いて計測し、同じ切片においてＨＥ染色により特定された１０５個の総核数当たりの数値に正規化した。心臓起源の細胞又は物体（bodies）を特定するために、切片を、心臓特異的抗トロポニンＣ抗体（SantaCruz、ｓｃ−８１１７、希釈率１：５０）、及びロバ抗ヤギアレクサフルオル５６８（MolecularProbes、１：１００）の対応する対で二重染色した（データは示していない）。心筋組織におけるカスパーゼ３活性を、カスパーゼ−Ｇｌｏアッセイキット（Promega）を使用して測定した。簡潔に述べると、発光前（proluminescent）基質がカスパーゼ３により切断される。カスパーゼによる切断の後、ルシフェラーゼに対する基質（アミノルシフェリン）が放出され、ルシフェラーゼ反応、及び発光シグナルの産生をもたらす。心臓組織由来の細胞質抽出物を、プロテアーゼ阻害剤混合物（１錠／５ｍｌ）（Roche；ＭｉｎｉコンプリートＥＤＴＡフリープロテアーゼ阻害剤）を含有する低張抽出緩衝液（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＥＧＴＡ）中における均質化により調製した後、遠心分離した（１５分、１３，０００ｒｐｍ、４℃）。上清のタンパク質濃度を、抽出緩衝液により１ｍｇ／ｍｌに調整し、−８０℃で保存した。等体積の試薬、及び１０μｇ／ｍｌの細胞質タンパク質を、白色の壁を有する９６ウェルプレートに添加し、室温で１時間インキュベートした。各試料の発光を、プレートリーディングルミノメーターにおいて三連で測定した。
【０１１９】
不整脈誘発プロトコルは、Wayne Chen及び共同研究者らにより以前に公開されたプロトコル（Xiao etal., 2007, J. Biol. Chem. 282:34828-34838）から修正したものである。
【０１２０】
実施例６：正常な骨格筋におけるＳ１００Ａ１ｃｔ６／１１ペプチドの機能的特性決定
Ｓ１００Ａ１ｃｔ６／１１ペプチドは、正常な及び疾患の骨格筋において等尺性単収縮力を有意に増強する（図２４）。骨格筋線維における等尺性単収縮力を評価するのに使用したプロトコルを、実施例１に記載している。Ｓ１００Ａ１ｃｔ６／１１ペプチドの実験のために、無傷の（透過処理していない）長指伸筋（ＥＤＬ）骨格筋線維を使用した。単離した筋線維の単収縮力は、ペプチドを単離した筋線維と共にインキュベートしたかどうか（図２４Ａ）、又は筋線維を単離する前にペプチドを全身投与したかどうか（図２４Ｂ）に関係なく、Ｓ１００Ａ１ｃｔ６／１１処理により増強された。
【０１２１】
実施例７：Ｓ１００Ａ１ｃｔ６／１１ペプチドの変力効果は、より短いペプチドによっても発揮される。
親水性リンカー（Ｄ−Ｋ−Ｄ−Ｄ−Ｐ−Ｐ、配列番号３５４）と融合したヒトＳ１００Ａ１のアミノ酸７６〜８５からなるペプチドは、Ｓ１００Ａ１ｃｔ６／１１ペプチドと同じ変力機能を発揮する（図２５）。カルシウム過渡振幅を評価するためのプロトコルを、上に記載している。リンカー単独、ビヒクル単独、又はアミノ酸７６以降の（more than）アミノ酸を欠くアミノ末端欠失ペプチドは、変力効果を示さない。この実験により、７５位のチロシンがＳ１００Ａ１ｃｔ６／１１ペプチドの変力機能及び細胞透過性のために必須ではないことが実証される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【配列表】
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