(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
イソブタノールを生成するための生合成経路を含む組換え微生物宿主細胞であって、
生合成経路が、アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドにより触媒される基質から生成物への変換を含み、該アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドが、配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有し、かつ、以下の特徴：
（ａ）該ポリペプチドについてのイソブチルアルデヒドに対するＫM値が、配列番号２
６のアミノ酸配列を有する対照ポリペプチドと比べて低いこと；及び
（ｂ）該ポリペプチドについてのイソブチルアルデヒドに対するｋcat／ＫM値が、配列番号２６のアミノ酸配列を有する対照ポリペプチドと比べて高いこと；
のうちの１つ又は両方を有する、組換え微生物宿主細胞。
【請求項２】
アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドが、配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する、請求項１に記載の組換え微生物宿主細胞。
【請求項３】
アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドが配列番号３１のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の組換え微生物宿主細胞。
【請求項４】
アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドが、配列番号１１のヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされる、請求項１に記載の組換え宿主細胞。
【請求項５】
アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドがＮＡＤＨを補因子として選択的に使用する、請求項１に記載の組換え微生物宿主細胞。
【請求項６】
アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドが、少なくとも約１５ｇ／Ｌの濃度のイソブタノールの存在下でイソブチルアルデヒドからイソブタノールへの変換を触媒する、請求項１に記載の組換え微生物宿主細胞。
【請求項７】
請求項１に記載の組換え微生物宿主細胞であって、
イソブタノール生合成経路が、以下のステップ：
（ａ）ピルベートからアセトラクテートへのステップ；
（ｂ）アセトラクテートから２，３−ジヒドロキシイソバレレートへのステップ；
（ｃ）２，３−ジヒドロキシイソバレレートからα−ケトイソバレレートへのステップ；
（ｄ）α−ケトイソバレレートからイソブチルアルデヒドへのステップ；及び
（ｅ）イソブチルアルデヒドからイソブタノールへのステップ；
の各ステップについての基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含み、
ここで、上記微生物宿主細胞がイソブタノールを生成する、上記微生物宿主細胞。
【請求項８】
請求項１に記載の組換え微生物宿主細胞であって、
イソブタノール生合成経路が、以下のステップ：
（ａ）ピルベートからアセトラクテートへのステップ；
（ｂ）アセトラクテートから２，３−ジヒドロキシイソバレレートへのステップ；
（ｃ）２，３−ジヒドロキシイソバレレートからα−ケトイソバレレートへのステップ；
（ｄ）α−ケトイソバレレートからイソブチリルＣｏＡへのステップ；
（ｅ）イソブチリルＣｏＡからイソブチルアルデヒドへのステップ；及び
（ｆ）イソブチルアルデヒドからイソブタノールへのステップ；
の各ステップについての基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含み、
ここで、上記微生物宿主細胞がイソブタノールを生成する、上記微生物宿主細胞。
【請求項９】
請求項１に記載の組換え微生物宿主細胞であって、
イソブタノール生合成経路が、以下のステップ：
（ａ）ピルベートからアセトラクテートへのステップ；
（ｂ）アセトラクテートから２，３−ジヒドロキシイソバレレートへのステップ；
（ｃ）２，３−ジヒドロキシイソバレレートからα−ケトイソバレレートへのステップ；
（ｄ）α−ケトイソバレレートからバリンへのステップ；
（ｅ）バリンからイソブチルアミンへのステップ；
（ｅ）イソブチルアミンからイソブチルアルデヒドへのステップ；及び
（ｆ）イソブチルアルデヒドからイソブタノールへのステップ；
の各ステップについての基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含み、
ここで、上記微生物宿主細胞がイソブタノールを生成する、上記微生物宿主細胞。
【請求項１０】
イソブタノールを生成するための生合成経路と、配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドとを含む組換え微生物宿主細胞。
【請求項１１】
前記アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドが、配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１２】
前記宿主細胞の属が、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、パキソレン属（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ）、ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ザイゴサッカロミセス属（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ガラクトミセス属（Ｇａｌａｃｔｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、トルラスポラ属（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ）、デバリオミセス属（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）、ウィリオプシス属（Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ）、デッケラ属（Ｄｅｋｋｅｒａ）、クロエケラ属（Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ）、メチニコウイア属（Ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｗｉａ）、イサチェンキア属（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）、及びカンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）からなる群から選択される、請求項１又は１０に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１３】
イソブタノールの生産方法であって、
（ａ）イソブタノール生合成経路を含む組換え微生物宿主細胞を準備するステップであって、該イソブタノール生合成経路が、イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの基質から生成物への変換を触媒する異種ポリペプチドを含み、該異種ポリペプチドが配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する、該ステップと、
（ｂ）イソブタノールが生成される条件下で（ａ）のステップで準備した宿主細胞を炭素基質と接触させるステップと、
を含む、上記方法。
【請求項１４】
イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの基質から生成物への変換を触媒する異種ポリペプチドが、配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの基質から生成物への変換を触媒する異種ポリペプチドが、配列番号３１のアミノ酸配列を有する、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、工業微生物学及びアルコール製造の分野に関する。具体的には、本発明は、微生物における人工的に改変した経路を介した低級アルキルアルコールの生産に好適なアルコールデヒドロゲナーゼに関する。より具体的には、本発明は、微生物における人工的に改変した経路を介したブタノール、特にイソブタノールの生産に好適なアルコールデヒドロゲナーゼに関する。
【背景技術】
【０００２】
ブタノールは重要な工業用化学物質であり、燃料添加剤として、プラスチック工業における化学品原料として、並びに食品及び香料工業における食品等級の抽出剤として有用である。毎年１００〜１２０億ポンドのブタノールが石油化学的手段により生産され、この汎用化学製品の需要は今後ますます増大するものと思われる。
【０００３】
イソブタノールの化学的合成方法は公知であり、オキソ合成、一酸化炭素の接触水素化（非特許文献１）及びメタノールのｎ−プロパノールとのゲルベ縮合（非特許文献２）などがある。これらの方法は石油化学品に由来する出発材料を使用し、概してコストが高く、環境に優しいものではない。
【０００４】
イソブタノールは酵母発酵の副産物として生物学的に生成される。イソブタノールは、この真菌群によるアミノ酸の不完全な代謝の結果として形成される「フーゼル油」の一構成成分である。イソブタノールは具体的には、Ｌ−バリンの異化から生成される。いわゆるエールリッヒ経路の酵素類によりＬ−バリンのアミン基が窒素源として取り込まれた後、生じたα−ケト酸が脱炭酸され、イソブタノールに還元される（非特許文献３）。飲料の発酵中に得られるフーゼル油及び／又はその構成成分の収率は、典型的には低い。例えば、ビール発酵で生じるイソブタノールの濃度は１６ｐｐｍ未満であることが報告されている（非特許文献４）。Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，上記により記載されるとおり、外因性のＬ−バリンを発酵混合物に添加するとイソブタノールの収率は上昇し、同文献では、発酵混合物に２０ｇ／Ｌの濃度でＬ−バリンを提供することによって３ｇ／Ｌのイソブタノールの収率が達成されることが報告されている。加えて、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）のアルギン酸カルシウム固定化細胞によるｎ−プロパノール、イソブタノール及びイソアミルアルコールの生成が示されている。Ｌ−Ｌｅｕ、Ｌ−Ｉｌｅ、Ｌ−Ｖａｌ、α−ケトイソカプロン酸（α−ＫＣＡ）、α−ケト酪酸（α−ＫＢＡ）又はα−ケトイソ吉草酸（α−ＫＶＡ）のいずれかを補足した１０％グルコース含有培地が用いられた（非特許文献５）。α−ＫＣＡによりイソブタノールレベルは上昇した。アミノ酸でも対応するアルコールが得られたが、その程度はケト酸より小さかった。成長培地にアミノ酸のロイシン、イソロイシン、及び／又はバリンを窒素源として添加すると、炭水化物からのＣ３〜Ｃ５アルコールの収率が増加することが示された（特許文献１）。
【０００５】
上述の方法は生物学的手段によるイソブタノール生産の可能性を示しているが、工業規模でイソブタノールを生産するには、これらの方法は費用があまりにも高額である。
【０００６】
効率的な生合成方法のためには、最後の工程でイソブチルアルデヒドをイソブタノールに速やかに変換する最適な酵素が求められる。さらに、イソブチルアルデヒドが生成宿主に蓄積すると、通常、望ましくない細胞毒性が生じる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２００５／０４０３９２号パンフレット
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｕｌｌｍａｎｎ’ｓ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，２００３，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨＶｅｒｌａｇ  ＧｍｂＨ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ，Ｖｏｌ．５，ｐｐ．７１６−７１９
【非特許文献２】Ｃａｒｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｃａｔａｌ．Ａ：Ｃｈｅｍ．２２０：２１５−２２０，２００４
【非特許文献３】Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２５７５２−２５７５６，１９９８
【非特許文献４】Ｇａｒｃｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２９：３０３−３０９，１９９４
【非特許文献５】Ｏａｘａｃａ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔａ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１１：５２３−５３２，１９９１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）は、アルデヒドとアルコールとの相互変換を触媒する大規模な酵素群を含むタンパク質ファミリーであり（ｄｅ  Ｓｍｉｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＭＳ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｓ．，８：９６７−９７８，２００８）、種々のアルコール及びアルデヒドに対して様々な特異性を有する。組換え微生物における製品アルコールの形成を触媒するのに好適なＡＤＨ酵素を同定することが必要とされている。また、イソブタノールの高い速度での形成を触媒し得る好適なＡＤＨ酵素であって、イソブチルアルデヒドに対し基質として、及び高レベルのイソブタノールの存在下で特異的親和性を有するＡＤＨ酵素を同定することも必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の一態様は、ポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含む組換え微生物宿主細胞に関し、ここでこのポリペプチドはアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有する。実施形態において、組換え微生物宿主細胞は低級アルキルアルコールを生成するための生合成経路をさらに含み、ここでこの生合成経路は、アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドにより触媒される基質から生成物への変換を含む。実施形態において、ポリペプチドはアルコールデヒドロゲナーゼ活性と、以下の特徴のうちの１つ以上とを有する：（ａ）低級アルキルアルデヒドに対するＫＭ値が、そのポリペプチドについて、配列番号２６のアミノ酸配列を有する対照ポリペプチドと比べて低いこと；（ｂ）そのポリペプチドについての低級アルキルアルコールに対するＫＩ値が、配列番号２６のアミノ酸配列を有する対照ポリペプチドと比べて高いこと；及び（ｃ）そのポリペプチドについての低級アルキルアルデヒドに対するｋｃａｔ／ＫＭ値が、配列番号２６のアミノ酸配列を有する対照ポリペプチドと比べて高いこと。実施形態において、アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドは上掲の特徴の２つ以上を有する。実施形態において、ポリペプチドはＮＡＤＨを補因子として選択的に使用する。実施形態において、アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドは、上掲の特徴の３つを有する。実施形態において、低級アルキルアルコールを生成するための生合成経路は、ブタノール、プロパノール、イソプロパノール、又はエタノール生合成経路である。一実施形態において、低級アルキルアルコールを生成するための生合成経路はブタノール生合成経路である。
【００１１】
従って本発明の一態様は、低級アルキルアルコールを生成するための生合成経路を含む組換え微生物宿主細胞であって、生合成経路が、アルコールデヒドロゲナーゼ活性と、以下の特徴：（ａ）イソブチルアルデヒドに対するＫＭ値が、前記ポリペプチドについて、配列番号２６のアミノ酸配列を有する対照ポリペプチドと比べて低いこと；（ｂ）前記ポリペプチドについてのイソブタノールに対するＫＩ値が、配列番号２６のアミノ酸配列を有する対照ポリペプチドと比べて高いこと；及び（ｃ）前記ポリペプチドについてのイソブチルアルデヒドに対するｋｃａｔ／ＫＭ値が、配列番号２６のアミノ酸配列を有する対照ポリペプチドと比べて高いことの１つ以上、２つ以上、又は全てとを有するポリペプチドにより触媒される基質から生成物への変換を含む、組換え微生物宿主細胞である。実施形態において、低級アルキルアルコールを生成するための生合成経路は、ブタノール、プロパノール、イソプロパノール、又はエタノール生合成経路である。実施形態において、アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号２１、２２、２３、２４、２５、３１、３２、３４、３５、３６、３７、又は３８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する。実施形態において、アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドは配列番号３１のアミノ酸配列を有する。実施形態において、アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号１、２、３、４、５、６、１１、１２、１４、１５、１６、又は１７のヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされる。実施形態において、アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドは、少なくとも約１０ｇ／Ｌ、少なくとも約１５ｇ／Ｌ、又は少なくとも約２０ｇ／Ｌの濃度のイソブタノールの存在下でイソブチルアルデヒドからイソブタノールへの変換を触媒する。
【００１２】
実施形態において、低級アルキルアルコールを生成するための生合成経路は、以下のステップ：（ａ）ピルベートからアセトラクテートへのステップ；（ｂ）アセトラクテートから２，３−ジヒドロキシイソバレレートへのステップ；（ｃ）２，３−ジヒドロキシイソバレレートからα−ケトイソバレレートへのステップ；（ｄ）α−ケトイソバレレートからイソブチルアルデヒドへのステップ；及び（ｅ）イソブチルアルデヒドからイソブタノールへのステップの各ステップについての基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含むイソブタノール生合成経路であり；ここで前記微生物宿主細胞はイソブタノールを生成する。実施形態において、（ａ）ピルベートからアセトラクテートへの基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドは、ＥＣ番号２．２．１．６を有するアセト乳酸シンターゼであり；（ｂ）アセトラクテートから２，３−ジヒドロキシイソバレレートへの基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドは、ＥＣ番号１．１．１８６を有するアセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ（ａｃｅｔｏｈｙｄｒｏｘｙ  ａｃｉｄ  ｉｓｏｍｅｒｏｒｅｄｕｃａｔａｓｅ）であり；（ｃ）２，３−ジヒドロキシイソバレレートからα−ケトイソバレレートへの基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドは、ＥＣ番号４．２．１．９を有するアセトヒドロキシ酸デヒドラターゼであり；及び（ｄ）α−ケトイソバレレートからイソブチルアルデヒドへの基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドは、ＥＣ番号４．１．１．７２を有する分枝鎖α−ケト酸デカルボキシラーゼである。実施形態において、低級アルキルアルコールを生成するための生合成経路は、以下のステップ：（ａ）ピルベートからアセトラクテートへのステップ；（ｂ）アセトラクテートから２，３−ジヒドロキシイソバレレートへのステップ；（ｃ）２，３−ジヒドロキシイソバレレートからα−ケトイソバレレートへのステップ；（ｄ）α−ケトイソバレレートからイソブチリルＣｏＡへのステップ；（ｅ）イソブチリルＣｏＡからイソブチルアルデヒドへのステップ；及び（ｆ）イソブチルアルデヒドからイソブタノールへのステップの各ステップについての基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含むイソブタノール生合成経路であり；ここで前記微生物宿主細胞はイソブタノールを生成する。実施形態において、低級アルキルアルコールを生成するための生合成経路は、以下のステップ：（ａ）ピルベートからアセトラクテートへのステップ；（ｂ）アセトラクテートから２，３−ジヒドロキシイソバレレートへのステップ；（ｃ）２，３−ジヒドロキシイソバレレートからα−ケトイソバレレートへのステップ；（ｄ）α−ケトイソバレレートからバリンへのステップ；（ｅ）バリンからイソブチルアミンへのステップ；（ｅ）イソブチルアミンからイソブチルアルデヒドへのステップ；及び（ｆ）イソブチルアルデヒドからイソブタノールへのステップの各ステップについての基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含むイソブタノール生合成経路であり；ここで前記微生物宿主細胞はイ��ブタノールを生成する。
【００１３】
本明細書にはまた、低級アルキルアルコールを生成するための生合成経路と、配列番号２１、２２、２３、２４、２５、３１、３２、３４、３５、３６、３７、又は３８のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドとを含む組換え微生物宿主細胞も提供される。実施形態において、低級アルキルアルコールを生成するための生合成経路は、以下のステップ：（ａ）ピルベートからα−アセトラクテートへのステップ；（ｂ）α−アセトラクテートからアセトインへのステップ；（ｃ）アセトインから２，３−ブタンジオールへのステップ；（ｄ）２，３−ブタンジオールから２−ブタノンへのステップ；及び（ｅ）２−ブタノンから２−ブタノールへのステップの各ステップについての基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含む２−ブタノール生合成経路であり；ここで前記微生物宿主細胞は２−ブタノールを生成する。実施形態において、（ａ）ピルベートからアセトラクテートへの基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドは、ＥＣ番号２．２．１．６を有するアセト乳酸シンターゼであり；（ｂ）アセトラクテートからアセトインへの基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドは、ＥＣ番号４．１．１．５を有するアセト乳酸デカルボキシラーゼであり；（ｃ）アセトインから２，３−ブタンジオールへの基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドは、ＥＣ番号１．１．１．７６又はＥＣ番号１．１．１．４を有するブタンジオールデヒドロゲナーゼであり；（ｄ）ブタンジオールから２−ブタノンへの基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドは、ＥＣ番号４．２．１．２８を有するブタンジオールデヒドラターゼであり；及び（ｅ）２−ブタノンから２−ブタノールへの基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドは、ＥＣ番号１．１．１．１を有する２−ブタノールデヒドロゲナーゼである。実施形態において、アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号２１、２２、２３、２４、２５、２７、３１、３２、３４、３５、３６、３７、又は３８のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。実施形態において、アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００１４】
実施形態において、低級アルキルアルコールを生成するための生合成経路は、以下のステップ：（ａ）アセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡへのステップ；（ｂ）アセトアセチルＣｏＡから３−ヒドロキシブチリルＣｏＡへのステップ；（ｃ）３−ヒドロキシブチリルＣｏＡからクロトニルＣｏＡへのステップ；（ｄ）クロトニルＣｏＡからブチリルＣｏＡへのステップ；（ｅ）ブチリルＣｏＡからブチルアルデヒドへのステップ；及び（ｆ）ブチルアルデヒドから１−ブタノールへのステップの各ステップについての基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含む１−ブタノール生合成経路であり；ここで前記微生物宿主細胞は１−ブタノールを生成する。実施形態において、（ａ）アセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡへの基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドは、ＥＣ番号２．３．１．９又は２．３．１．１６を有するアセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼであり；（ｂ）アセトアセチルＣｏＡから３−ヒドロキシブチリルＣｏＡへの基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドは、ＥＣ番号１．１．１．３５、１．１．１．３０、１．１．１．１５７、又は１．１．１．３６を有する３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼであり；（ｃ）３−ヒドロキシブチリルＣｏＡからクロトニルＣｏＡへの基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドは、ＥＣ番号４．２．１．１７又は４．２．１．５５を有するクロトナーゼであり；（ｄ）クロトニルＣｏＡからブチリルＣｏＡへの基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドは、ＥＣ番号１．３．１．４４又は１．３．１．３８を有するブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼであり；（ｅ）ブチリルＣｏＡからブチリルアルデヒドへの基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドは、ＥＣ番号１．２．１．５７を有するブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼであり；及び（ｆ）ブチリルアルデヒドから１−ブタノールへの基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドは、１−ブタノールデヒドロゲナーゼである。実施形態において、アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号２１、２２、２３、２４、２５、２７、３１、３２、３４、３５、３６、３７、又は３８のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。実施形態において、アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００１５】
実施形態において、組換え微生物宿主細胞は、細菌、シアノバクテリア、糸状菌及び酵母からなる群から選択される。実施形態において、宿主細胞は細菌細胞又はシアノバクテリア細胞である。実施形態において、宿主細胞の属は、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、アルスロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、グルコノバクター属（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）、ノカルジア属（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、大腸菌属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、パエニバチルス属（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、及びザントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）からなる群から選択される。実施形態において、本明細書に提供される宿主細胞の属は、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、パキソレン属（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ）、ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ザイゴサッカロミセス属（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ガラクトミセス属（Ｇａｌａｃｔｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、トルラスポラ属（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ）、デバリオミセス属（Ｄｅｂａｙｏｍｙｃｅｓ）、ウィリオプシス属（Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ）、デッケラ属（Ｄｅｋｋｅｒａ）、クロエケラ属（Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ）、メチニコウイア属（Ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｗｉａ）、イサチェンキア属（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）、及びカンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）からなる群から選択される。
【００１６】
本発明の別の態様はイソブタノールの生成方法であり、これは、（ａ）イソブタノール生合成経路を含む組換え微生物宿主細胞を提供するステップであって、この経路が、イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの基質から生成物への変換を触媒する異種ポリペプチドを含み、このポリペプチドが配列番号２１、２２、２３、２４、２５、２７、３１、３２、３４、３５、３６、３７、又は３８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するステップと；（ｂ）イソブタノールが生成される条件下で（ａ）の宿主細胞を炭素基質と接触させるステップとを含む。実施形態において、イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの基質から生成物への変換を触媒する異種ポリペプチドは、配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する。別の態様は２−ブタノールの生成方法であり、これは、（ａ）２−ブタノール生合成経路を含む組換え微生物宿主細胞を提供するステップであって、この経路が、配列番号２１、２２、２３、２４、２５、２７、３１、３２、３４、３５、３６、３７、又は３８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する異種ポリペプチドを含むステップと；（ｂ）２−ブタノールが生成される条件下で（ａ）の宿主細胞を炭素基質と接触させるステップとを含む。実施形態において、異種ポリペプチドは配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する。別の態様は１−ブタノールの生成方法であり、これは、（ａ）１−ブタノール生合成経路を含む組換え微生物宿主細胞を提供するステップであって、この経路が、配列番号２１、２２、２３、２４、２５、２７、３１、３２、３４、３５、３６、３７、又は３８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する異種ポリペプチドを含むステップと；（ｂ）１−ブタノールが生成される条件下で（ａ）の宿主細胞を炭素基質と接触させるステップとを含む。実施形態において、異種ポリペプチドは配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する。
【００１７】
本明細書にはまた、低級アルキルアルコールの生成方法も提供され、これは、（ａ）本明細書に提供される組換え宿主細胞を提供するステップと；（ｂ）低級アルキルアルコールが生成される条件下で発酵培地において前記宿主細胞を発酵性炭素基質と接触させるステップと；（ｃ）前記低級アルキルアルコールを回収するステップとを含む。実施形態において、前記発酵性炭素基質は、単糖類、オリゴ糖類、及び多糖類からなる群から選択される。実施形態において、単糖は、グルコース、ガラクトース、マンノース、ラムノース、キシロース、及びフルクトースからなる群から選択される。実施形態において、前記オリゴ糖は、スクロース、マルトース、及びラクトースからなる群から選択される。実施形態において、多糖は、デンプン、セルロース、及びマルトデキストリンからなる群から選択される。実施形態において、条件は、嫌気性、好気性、又は微好気性である。実施形態において、前記低級アルキルアルコールは、少なくとも約１０ｇ／Ｌ、少なくとも約１５ｇ／Ｌ、又は少なくとも約２０ｇ／Ｌの力価で生成される。実施形態において、前記低級アルキルアルコールは、ブタノール、イソブタノール、プロパノール、イソプロパノール、及びエタノールからなる群から選択される。
【００１８】
実施形態において、イソブタノールが生成される。実施形態において、イソブタノールの生成方法は、（ａ）イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの基質から生成物への変換を触媒し、且つ以下の特徴：（ｉ）低級アルキルアルデヒドのＫＭ値が、そのポリペプチドについて、配列番号２６のアミノ酸配列を有する対照ポリペプチドと比べて低いこと；（ｉｉ）そのポリペプチドについての低級アルキルアルデヒドに対するＫＩ値が、配列番号２６のアミノ酸配列を有する対照ポリペプチドと比べて高いこと；（ｉｉｉ）そのポリペプチドについての低級アルキルアルデヒドに対するｋｃａｔ／ＫＭ値が、配列番号２６のアミノ酸配列を有する対照ポリペプチドと比べて高いことのうちの１つ以上を有する異種ポリペプチドを含む組換え宿主細胞を提供するステップと；（ｂ）イソブタノールが生成される条件下で（ａ）の宿主細胞を炭素基質と接触させるステップとを含む。
【００１９】
実施形態において、１−ブタノールが生成される。実施形態において、１−ブタノールの生成方法は、（ａ）ブチルアルデヒドから１−ブタノールへの基質から生成物への変換を触媒し、且つ以下の特徴：（ｉ）低級アルキルアルデヒドに対するＫＭ値が、そのポリペプチドについて、配列番号２６のアミノ酸配列を有する対照ポリペプチドと比べて低いこと；（ｉｉ）そのポリペプチドについての低級アルキルアルコールに対するＫＩ値が、配列番号２６のアミノ酸配列を有する対照ポリペプチドと比べて高いこと；及び（ｉｉｉ）そのポリペプチドについての低級アルキルアルデヒドに対するｋｃａｔ／ＫＭ値が、配列番号２６のアミノ酸配列を有する対照ポリペプチドと比べて高いことのうちの１つ以上を有する異種ポリペプチドを含む組換え微生物宿主細胞を提供するステップと；（ｂ）１−ブタノールが生成される条件下で（ａ）の宿主細胞を炭素基質と接触させるステップとを含む。
【００２０】
本明細書にはまた、アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有する候補ポリペプチドのスクリーニング方法も提供され、前記方法は、ａ）候補ポリペプチドと、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨからなる群から選択される補因子とを提供するステップと；ｂ）候補ポリペプチドについて低級アルキルアルコールの存在下又は非存在下でＡ３４０ｎｍの経時的な変化を観察するステップと；ｃ）Ａ３４０ｎｍの変化が低下である候補ポリペプチドを選択するステップであって、この低下が、低級アルキルアルコールの存在下における低下と比べて低級アルキルアルコールの非存在下でより速いステップとを含む。実施形態において、本方法はさらに、（ｄ）配列番号２１又は２６のいずれかのアミノ酸配列を有する対照ポリペプチドとＮＡＤＨとを提供するステップと；（ｅ）対照ポリペプチドについて低級アルキルアルコールの存在下又は非存在下でＡ３４０ｎｍの経時的な変化を観察するステップと；（ｆ）（ｅ）で観測された変化を（ｂ）で観測された変化と比較するステップと；（ｇ）低級アルキルアルコールの非存在下におけるＡ３４０ｎｍの低下が対照ポリペプチドについて観測された低下より速い候補ポリペプチドを選択するステップとを含む。実施形態において、本方法はさらに、（ｄ）配列番号２１又は２６のいずれかのアミノ酸配列を有する対照ポリペプチドとＮＡＤＨとを提供するステップと；（ｅ）対照ポリペプチドについて低級アルキルアルコールの存在下又は非存在下でＡ３４０ｎｍの経時的な変化を観察するステップと；（ｆ）（ｅ）で観測された変化を（ｂ）で観測された変化と比較するステップと；（ｇ）低級アルキルアルコールの存在下におけるＡ３４０ｎｍの低下が対照ポリペプチドについて観測された低下より速い候補ポリペプチドを選択するステップとを含む。
【００２１】
本明細書にはまた、イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの変換を触媒するための微生物宿主細胞における配列番号２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、又は４０のアミノ酸配列と少なくとも約８０％の同一性を有するアルコールデヒドロゲナーゼの使用も提供され；ここで前記宿主細胞はイソブタノール生合成経路を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１ａ】イソブタノールの存在下及び非存在下でＡＤＨ候補酵素により触媒された、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈによるイソブチルアルデヒド還元を示す準生理学的経時変化アッセイの結果を示す。酵素活性は、３４０ｎｍでの吸光度変化を追跡することにより計測する。各パネルにおいて、その酵素を除く他の全ての反応物の存在下におけるＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨ単独でのＡ３４０ｎｍを対照として使用した。パネルＡは、アクロモバクター・キシロスオキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）ＳａｄＢについての経時的な３４０ｎｍ吸光度変化を示す。パネルＢは、ウマ肝臓ＡＤＨについての経時的な３４０ｎｍ吸光度変化を示す。
【図１ｂ】イソブタノールの存在下及び非存在下でＡＤＨ候補酵素により触媒された、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈによるイソブチルアルデヒド還元を示す準生理学的経時変化アッセイの結果を示す。酵素活性は、３４０ｎｍでの吸光度変化を追跡することにより計測する。各パネルにおいて、その酵素を除く他の全ての反応物の存在下におけるＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨ単独でのＡ３４０ｎｍを対照として使用した。パネルＣは、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＤＨ６についての経時的な３４０ｎｍ吸光度変化を示す。パネルＤは、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＤＨ７についての経時的な３４０ｎｍ吸光度変化を示す。
【図１ｃ】イソブタノールの存在下及び非存在下でＡＤＨ候補酵素により触媒された、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈによるイソブチルアルデヒド還元を示す準生理学的経時変化アッセイの結果を示す。酵素活性は、３４０ｎｍでの吸光度変化を追跡することにより計測する。各パネルにおいて、その酵素を除く他の全ての反応物の存在下におけるＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨ単独でのＡ３４０ｎｍを対照として使用した。パネルＥは、ベイジエリンキア・インディカ（Ｂｅｉｊｉｅｒｉｃｋｉａ  ｉｎｄｉｃａ）ＡＤＨについての経時的な３４０ｎｍ吸光度変化を示す。パネルＦは、クロストリジウム・ベイジェリンキ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）ＡＤＨについての経時的な３４０ｎｍ吸光度変化を示す。
【図１ｄ】イソブタノールの存在下及び非存在下でＡＤＨ候補酵素により触媒された、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈによるイソブチルアルデヒド還元を示す準生理学的経時変化アッセイの結果を示す。酵素活性は、３４０ｎｍでの吸光度変化を追跡することにより計測する。各パネルにおいて、その酵素を除く他の全ての反応物の存在下におけるＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨ単独でのＡ３４０ｎｍを対照として使用した。パネルＧは、ドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）ＡＤＨについての経時的な３４０ｎｍ吸光度変化を示す。パネルＨは、サームス・エスピー（Ｔｈｅｒｍ．ｓｐ．）ＡＴＮ１  ＡＤＨについての経時的な３４０ｎｍ吸光度変化を示す。
【図２】ウマ肝臓ＡＤＨ及びアクロモバクター・キシロスオキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）ＳａｄＢで観測されたイソブタノール阻害レベルを比較する準生理学的経時変化アッセイの結果を同じ図内に示す。これらのアッセイは、図１について記載したとおりである。
【図３】シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ（１ｋｏｌＡ）（配列番号７９）、ウマ肝臓ＡＤＨ（２ｏｈｘＡ）（配列番号２１）、クロストリジウム・ベイジェリンキ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）ＡＤＨ（１ｐｅｄＡ）（配列番号２９）、パイロコッカス・ホリコシイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）Ｌ−トレオニン（ｔｈｅｒｏｎｉｎｅ）３−デヒドロゲナーゼ（２ｄ８ａＡ）（配列番号８０）、及びアクロモバクター・キシロスオキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）ＳａｄＢ（配列番号２６）のポリペプチド配列のアラインメントである。
【図４】（ｉ）サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）、Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、及びシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）における類似配列についてのタンパク質ＢＬＡＳＴ検索、並びに（ｉｉ）ウマ肝臓ＡＤＨ及びアクロモバクター・キシロスオキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）ＳａｄＢを問い合わせ配列として使用した類似配列についての蛋白質構造データバンク（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ：ＰＤＢ）のタンパク質ＢＬＡＳＴ検索からヒットとして得られたオキシドレダクターゼ酵素の系統樹である。
【図５】アクロモバクター・キシロスオキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）ＳａｄＢを問い合わせ配列として使用したＮＣＢＩの重複のないタンパク質配列データベース（ｎｒ）のタンパク質ＢＬＡＳＴ検索からのヒットのなかで、配列がアクロモバクター・キシロスオキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）ＳａｄＢに対してより近縁関係にあるオキシドレダクターゼ酵素配列の系統樹である。
【図６】例示的なピルベートからのイソブタノールへの生合成経路の図である。
【図７】イソブチルアルデヒドの還元に関連する酵素の特性を表すミカエリス−メンテンプロットを示す。図７Ａは、ＡＤＨ６のイソブタノールに対するＫＩを決定するアッセイの結果を示し、図７Ｂは、ＢｉＡＤＨのイソブタノールに対するＫＩを決定するアッセイの結果を示す。
【図８】図８Ａは、図１について記載したとおりの準生理学的経時変化アッセイの結果を示す。パネルＡは、フェニロバクテリウム・ズシネウム（Ｐｈｅｎｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｚｕｃｉｎｅｕｍ）由来のＡＤＨについての経時的な３４０ｎｍ吸光度変化を示す。パネルＢは、メチロセラ・シルベストリス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｅｌｌａ  ｓｉｌｖｅｓｔｒｉｓ）ＢＬ２についての経時的な３４０ｎｍ吸光度変化を示す。パネルＣは、アシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ）ＡＹＥについての経時的な３４０ｎｍ吸光度変化を示す。
【図９】ｐｄｃ１：：ｉｌｖＤ：：ＦＢＡ−ａｌｓＳ：：ｔｒｘ１  Ａ遺伝子座を示す。ｐｄｃ１−ｔｒｘ１遺伝子間領域におけるａｌｓＳ遺伝子のこの組込みは、ベクター、マーカー遺伝子及びｌｏｘＰ配列が失われているため「スカーレス（ｓｃａｒｌｅｓｓ）」な挿入と考えられる。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本明細書と共に電子的に提出された、且つ参照により本明細書に援用される添付の配列表に提供される以下の配列は、米国特許法施行規則第１．８２１〜１．８２５条（「ヌクレオチド配列及び／又はアミノ酸配列の開示を含む特許出願の要件−配列規則（Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ／ｏｒ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅｓ−ｔｈｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｕｌｅｓ）」）に準拠し、且つ世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）基準ＳＴ．２５（２００９年）並びにＥＰＯ及びＰＣＴの配列表要件（規則５．２及び４９．５（ａの２）、並びに実施細則第２０８条及び付録Ｃ）に従う。ヌクレオチド及びアミノ酸配列データに使用する記号及び形式は、米国特許法施行規則第１．８２２条に定められる規則に準拠する。
【００２４】
配列番号１及び７〜２０は、コドン最適化ポリヌクレオチド配列である。
【００２５】
配列番号２及び３は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のポリヌクレオチド配列である。
【００２６】
配列番号４及び５は、クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）由来のポリヌクレオチド配列である。
【００２７】
配列番号６は、アクロモバクター・キシロスオキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）由来のポリヌクレオチド配列である。
【００２８】
配列番号２１〜４０及び７９〜８０はポリペプチド配列である。
【００２９】
配列番号４１〜５０及び５２〜５７及び５９〜７４及び７７〜７８はプライマーである。
【００３０】
配列番号５１は、ｐＲＳ４２３：：ＴＥＦ（Ｍ４）−ｘｐｋ１＋ＥＮＯ１−ｅｕｔＤプラスミドの配列である。
【００３１】
配列番号５８は、ｐＵＣ１９−ＵＲＡ３：：ｐｄｃ１：：ＴＥＦ（Ｍ４）−ｘｐｋ１：：ｋａｎプラスミドの配列である。
【００３２】
配列番号７５は、ｐＬＨ４６８プラスミドの配列である。
【００３３】
配列番号７６は、ＢｉＡＤＨコード領域（酵母用にコドン最適化）＋５’ＧＰＭ相同プロモーター及び３’ＡＤＨ１相同ターミネーターである。
【００３４】
配列番号８１は、ｐＲＳ４２６：：ＧＰＤ−ｘｐｋ１＋ＡＤＨ−ｅｕｔＤプラスミドの配列である。
【００３５】
本発明の詳細な説明
上記の問題は、本明細書に記載されるとおり、様々な候補ＡＤＨ酵素の評価に好適なスクリーニング戦略を考案及び使用することにより解決される。このスクリーニング戦略を用いて、望ましい特徴を有するＡＤＨ酵素を同定することができる。これらの同定されたＡＤＨ酵素を使用して、イソブタノールなどの低級アルキルアルコールの生物学的生産を増進することができる。また、同定された望ましいＡＤＨ酵素を発現する組換え宿主細胞、及びそれを使用した低級アルキルアルコールの生成方法も提供される。
【００３６】
本発明は、高濃度のイソブタノールの存在下でイソブチルアルデヒドをイソブタノールに速やかに変換する能力に関して多数のアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）酵素をスクリーニングする方法について記載する。また、本発明では、細菌ベイジェリンキア・インディカ・サブスピーシーズ・インディカ（Ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉａ  ｉｎｄｉｃａ  ｓｕｂｓｐｅｃｉｅｓ  ｉｎｄｉｃａ）ＡＴＣＣ  ９０３９に存在する新規ＡＤＨについても記載する。ベイジェリンキア・インディカ（Ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉａ  ｉｎｄｉｃａ）ＡＤＨ酵素は、イソブチルアルデヒド供給源を有する組換え微生物におけるイソブチルアルデヒドからのイソブタノールの生成に使用することができる。
【００３７】
本発明は、数多くの商業的及び工業的需要に対応する。ブタノールは、様々な用途を有する重要な工業的汎用化学製品であり、燃料又は燃料添加剤としてのその可能性は特に重要である。しかしながら、ガソリンと同様のエネルギー含量を有し、且ついかなる化石燃料とも混合できるのは、四炭素アルコールのブタノールのみである。ブタノールは標準的な内燃機関で燃焼させたときにＣＯ２しか生じず、ＳＯ２もＮＯ２もほとんど又は全く生じないため、燃料又は燃料添加剤として好ましい。さらにブタノールは、これまで最も好ましい燃料添加剤とされるエタノールと比べ、腐食性が低い。
【００３８】
ブタノールは、バイオ燃料又は燃料添加剤としてのその有用性に加え、新興の燃料電池工業における水素の配給問題に影響を与える可能性がある。現行の燃料電池は、水素の輸送及び配給に付随する安全上の懸念に悩まされている。ブタノールはその水素含有量に関して容易に改質することができ、及び燃料電池又は車両のいずれに求められる純度でも、既存のガソリンスタンドを介して配給することができる。
【００３９】
本発明ではブタノールは植物由来の炭素源から生成され、標準的な石油化学的ブタノール生産方法に付随する環境への負の影響が回避される。一実施形態において、本発明は、イソブタノール生合成経路の最後の反応、すなわちイソブチルアルデヒドからイソブタノールへの変換におけるフラックスを増加させるＡＤＨ酵素の選択及び同定方法を提供する。一実施形態において、本発明は、１−ブタノール生合成経路の最後の反応、すなわちブチリルアルデヒドから１−ブタノールへの変換におけるフラックスを増加させるＡＤＨ酵素の選択及び同定方法を提供する。一実施形態において、本発明は、２−ブタノール生合成経路の最後の反応、すなわち２−ブタノンから２−ブタノールへの変換におけるフラックスを増加させるＡＤＨ酵素の選択及び同定方法を提供する。特に有用なＡＤＨ酵素は、イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの変換反応におけるフラックスを、既知の対照ＡＤＨ酵素と比較したときより良好に増加させることが可能なものである。本発明はまた、そのように同定されたＡＤＨ酵素を発現する組換え宿主細胞及びその使用方法も提供する。
【００４０】
特許請求の範囲及び本明細書の解釈には、以下の定義及び略称を使用するものとする。
【００４１】
用語「発明」又は「本発明」は、本明細書で使用されるとき、概して、提出されたとおりの、又は後に補正及び補足されるとおりの特許請求の範囲、又は本明細書に記載される本発明のあらゆる実施形態に適用されることが意図される。
【００４２】
用語「イソブタノール生合成経路」は、ピルベートからイソブタノールを生成する酵素経路を指す。
【００４３】
用語「１−ブタノール生合成経路」は、ピルベートから１−ブタノールを生成する酵素経路を指す。
【００４４】
用語「２−ブタノール生合成経路」は、アセチルＣｏＡから２−ブタノールを生成する酵素経路を指す。
【００４５】
用語「ＮＡＤＨ消費アッセイ」は、アルコールデヒドロゲナーゼ酵素の比活性を決定するための酵素アッセイを指し、この比活性は、Ｒａｃｋｅｒ，Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１８４：３１３−３１９（１９５０）に記載されるとおり、酵素反応の補因子であるＮＡＤＨの化学量論的な消失として計測される。
【００４６】
「ＡＤＨ」は、酵素アルコールデヒドロゲナーゼの略称である。
【００４７】
用語「イソブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ」、「第二級アルコールデヒドロゲナーゼ」、「ブタノールデヒドロゲナーゼ」、「分枝鎖アルコールデヒドロゲナーゼ」、及び「アルコールデヒドロゲナーゼ」は同義的に使用され、ＥＣ番号ＥＣ  １．１．１．１を有する酵素を指し得る（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  １９９２，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）。好ましい分枝鎖アルコールデヒドロゲナーゼはＥＣ番号１．１．１．２６５により知られるが、他のアルコールデヒドロゲナーゼ（具体的には、ＥＣ  １．１．１．１又は１．１．１．２）のもとにも分類され得る。これらの酵素は電子供与体としてＮＡＤＨ（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）及び／又はＮＡＤＰＨを利用する。
【００４８】
本明細書で使用されるとき、「異種」は、通常は宿主生物に見られないが、導入されるか、又はその他の形で修飾されるポリヌクレオチド、遺伝子又はポリペプチドを指す。「異種ポリヌクレオチド」には、対応する天然ポリヌクレオチドと異なる形態で宿主生物に再導入されるか、又はその他の形で修飾される宿主生物由来の天然コード領域、又はその一部、並びに異なる生物由来のコード領域、又はその一部が含まれる。「異種遺伝子」には、対応する天然遺伝子と異なる形態で供給源生物から再導入されるか、又はその他の形で修飾される天然コード領域、又はその一部、並びに異なる生物由来のコード領域が含まれる。例えば異種遺伝子には、天然宿主に再導入される非天然調節領域を含むキメラ遺伝子の一部である天然コード領域が含まれ得る。「異種ポリペプチド」には、対応する天然ポリペプチドと異なる形態で宿主生物に再導入されるか、又はその他の形で修飾される天然ポリペプチド、並びに異なる生物由来のポリペプチドが含まれる。
【００４９】
用語「炭素基質」又は「発酵性炭素基質」は、本発明の宿主生物により代謝されることが可能な炭素源を指す。本発明で使用することのできる炭素源の非限定的な例としては、単糖類、オリゴ糖類、多糖類、及び一炭素基質又はそれらの混合物が挙げられる。
【００５０】
用語「ｋｃａｔ」及び「ＫＭ」及び「ＫＩ」は当業者に公知であり、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ，２ｎｄ  ｅｄ．（Ｆｅｒｓｔ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ：ＮＹ，１９８５；ｐｐ  ９８−１２０）に記載されている。用語「ｋｃａｔ」は「ターンオーバー数」と称されることが多く、単位時間当たりに１つの活性部位につき生成物分子に変換される最大基質分子数、又は酵素が単位時間当たりに代謝回転する回数として定義される。ｋｃａｔ＝Ｖｍａｘ／［Ｅ］、式中［Ｅ］は酵素濃度である（Ｆｅｒｓｔ，上記）。
【００５１】
用語「触媒効率」は、酵素のｋｃａｔ／ＫＭとして定義される。「触媒効率」を用いて酵素の基質に対する特異性が定量化される。
【００５２】
用語「比活性」は酵素単位／ｍｇタンパク質を意味し、ここで酵素単位は、温度、ｐＨ、［Ｓ］等について特定の条件下で形成された生成物のモル／分として定義される。
【００５３】
用語「遅い」、「より遅い」、「より速い」又は「速い」は、酵素活性に言及して使用されるとき、標準と比較した酵素のターンオーバー数に関する。
【００５４】
用語「対照ポリペプチド」は、公知のアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有する公知のポリペプチドを指す。本発明での使用に好適な対照ポリペプチドの非限定的な例としては、アクロモバクター・キシロスオキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）ＳａｄＢ及びウマ肝臓ＡＤＨが挙げられる。
【００５５】
用語「低級アルキルアルコール」は、１〜１０個の炭素原子を有する任意の直鎖又は分枝状の飽和又は不飽和アルコール分子を指す。
【００５６】
用語「低級アルキルアルデヒド」は、１〜１０個の炭素原子を有する任意の直鎖又は分枝状の飽和又は不飽和アルデヒド分子を指す。
【００５７】
用語「ブタノール」は、本明細書で使用されるとき、１−ブタノール、２−ブタノール、イソブタノール、又はそれらの混合物を指す。
【００５８】
用語「低級アルキルアルコールを生成するための生合成経路」は、本明細書で使用されるとき、低級アルキルアルコールを生成する酵素経路を指す。例えば、イソブタノール生合成経路が、参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２００７／００９２９５７号明細書に開示されている。
【００５９】
本明細書で使用されるとき、用語「収率」は、ｇ／ｇ単位での炭素源量当たりの生成物量を指す。収率は、グルコースを炭素源として例証され得る。特に注記されない限り、収率は理論収率のパーセンテージとして表現されることが理解される。微生物又は代謝経路に関連して「理論収率」は、生成物の作製に使用される代謝経路の化学量論により決定されるとおりの、基質総量当たりに生じ得る最大生成物量として定義される。例えば、グルコースからイソプロパノールへの一つの典型的な変換についての理論収率は、０．３３μｇである。従って、グルコースからの２９．７μｇのイソプロパノールの収率は、理論値の９０％又は９０％理論収率として表され得る。本開示ではグルコースを炭素源とする収率が例証されるが、本発明は他の炭素源に適用することができ、収率は使用される炭素源に応じて異なり得ることが理解される。当業者は様々な炭素源に基づき収率を計算することができる。用語「ＮＡＤＨ」は還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを意味する。
【００６０】
用語「ＮＡＤＰＨ」は還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を意味する。
【００６１】
用語「ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ」は、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨのいずれかを指すために用いられる。
【００６２】
本発明で使用されるポリペプチド及びポリヌクレオチド
本発明で使用されるＡＤＨ酵素は、ポリペプチド及びその断片を含む。本明細書で使用されるとき、用語「ポリペプチド」は単数形「ポリペプチド」並びに複数形「ポリペプチド」を包含することが意図され、アミド結合（ペプチド結合としても知られる）により直鎖状に連結された単量体（アミノ酸）から構成される分子に関する。用語「ポリペプチド」は２個以上のアミノ酸の任意の１つ又は複数の鎖を指し、特定の長さの生成物を指すものではない。従って、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、又は２個以上のアミノ酸の１つ若しくは複数の鎖を指して用いられる任意の他の用語は「ポリペプチド」の定義の範囲内に含まれ、用語「ポリペプチド」はこれらの用語のいずれの代わりとしても、又はそのいずれとも同義的に、使用され得る。用語「ポリペプチド」はまた、ポリペプチドの発現後修飾の生成物を指すことも意図され、そのような修飾としては、限定なしに、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護基／ブロック基による誘導体化、タンパク質分解切断、又は天然に存在しないアミノ酸による修飾が挙げられる。
【００６３】
本発明のポリペプチドは、約１０個以上、２０個以上、２５個以上、５０個以上、７５個以上、１００個以上、２００個以上、５００個以上、１，０００個以上、又は２，０００個以上のアミノ酸のサイズであってもよい。ポリペプチドは定義された三次元構造を有し得るが、必ずしもかかる構造を有しなくてもよい。定義された三次元構造を有するポリペプチドは、折り畳まれていると称され、及び定義された三次元構造を有しない、むしろ多数の異なるコンホメーションをとり得るポリペプチドは、折り畳まれていないと称される。
【００６４】
また、本発明のポリペプチドとしては、前述のポリペプチドの誘導体、類似体、又は変異体、及びそれらの任意の組み合わせも含まれる。用語「活性変異体」、「活性断片」、「活性誘導体」、及び「類似体」は本発明のポリペプチドを指し、低級アルキルアルデヒドの還元を触媒することが可能な任意のポリペプチドを含む。本発明のポリペプチドの変異体には、アミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入によって改変されたアミノ酸配列を有するポリペプチドが含まれる。変異体は天然に存在するものであっても、又は天然に存在しないものであってもよい。天然に存在しない変異体は、当該技術分野で公知の突然変異生成技法を用いて産生され得る。変異体ポリペプチドは保存的又は非保存的アミノ酸置換、欠失及び／又は付加を含み得る。本発明のポリペプチドの誘導体は、天然ポリペプチドには見られないさらなる特徴を呈するように改変されているポリペプチドである。例としては融合タンパク質が挙げられる。変異体ポリペプチドはまた、本明細書では「ポリペプチド類似体」とも称され得る。本明細書で使用されるとき、ポリペプチドの「誘導体」は、官能側鎖基の反応によって化学的に誘導体化された１つ以上の残基を有する対象のポリペプチドを指す。「誘導体」としてはまた、２０種の標準アミノ酸の１つ以上の天然に存在するアミノ酸誘導体を含むペプチドも含まれる。例えば、プロリンが４−ヒドロキシプロリンに置換されてもよく；リジンが５−ヒドロキシリジンに置換されてもよく；ヒスチジンが３−メチルヒスチジンに置換されてもよく；セリンがホモセリンに置換されてもよく；及びリジンがオルニチンに置換されてもよい。
【００６５】
「断片」は、親配列と同じ配列だが、それより長さが短いＡＤＨ酵素の固有の部分である。断片は、最大では、定義された配列の全長から１アミノ酸残基を引いたものを含み得る。例えば、断片は５〜１０００個の連続するアミノ酸残基を含み得る。断片は、少なくとも５個、１０個、１５個、１６個、２０個、２５個、３０個、４０個、５０個、６０個、７５個、１００個、１５０個、２５０個又は少なくとも５００個の連続するアミノ酸残基長さであり得る。断片は分子のある特定の領域から優先的に選択され得る。例えばポリペプチド断片は、ある特定の定義された配列で示されるとおりのポリペプチドの最初の１００個又は２００個のアミノ酸から選択されるある特定の長さの連続するアミノ酸を含み得る。明らかにこれらの長さは例示であり、配列表、表、及び図を含め、本明細書により裏付けられる任意の長さが本実施形態により包含され得る。
【００６６】
或いは、遺伝子コードにおける「冗長性」を利用して、これらの同じ又は同様のポリペプチドをコードする組換え変異体を合成又は選択することができる。様々なコドン置換、例えば様々な制限部位を作り出すサイレント変異などが導入され、プラスミド若しくはウイルスベクターへのクローニング又は宿主細胞系における発現が最適化され得る。ポリヌクレオチド配列における突然変異は、ポリペプチドに反映されても、又はそのポリペプチドの任意の部分の特性を修飾するようポリペプチドに付加される他のペプチドのドメインに反映されてもよく、それにより低級アルキルアルデヒドに対するＫＭ、低級アルキルアルコールに対するＫＭ、低級アルキルアルコールに対するＫＩ等の特性を変化させ得る。
【００６７】
好ましくは、アミノ酸「置換」は、あるアミノ酸を、同様の構造的及び／又は化学的特性を有する別のアミノ酸に置き換える結果であり、すなわち保存的アミノ酸置換である。「保存的」アミノ酸置換は、関与する残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、及び／又は両親媒性の類似性に基づき行われ得る。例えば、無極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、及びメチオニンが挙げられ；極性中性アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、及びグルタミンが挙げられ；正電荷を有する（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リジン、及びヒスチジンが挙げられ；及び負電荷を有する（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸及びグルタミン酸が挙げられる。「挿入」又は「欠失」は、好ましくは約１〜約２０アミノ酸、より好ましくは１〜１０アミノ酸の範囲である。許容される変動は、組換えＤＮＡ技法を用いてポリペプチド分子におけるアミノ酸の挿入、欠失、又は置換を系統立てて設け、得られた組換え変異体を活性についてアッセイすることにより、実験的に決定され得る。
【００６８】
本発明の問い合わせアミノ酸配列と少なくとも、例えば９５％「同一」のアミノ酸配列又はポリペプチド配列を有するポリペプチドとは、対象のポリペプチド配列が問い合わせアミノ酸配列の１００個のアミノ酸につき最大５個までのアミノ酸変化を含み得ることを除き、対象のポリペプチドのアミノ酸配列が問い合わせ配列と同じであることが意図される。換言すれば、問い合わせアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るには、対象の配列におけるアミノ酸残基の最大５％までが挿入されているか、欠失しているか、又は別のアミノ酸で置換されていてもよい。これらの参照配列の変化は、参照アミノ酸配列のアミノ末端若しくはカルボキシ末端位置に存在しても、又はそれらの末端位置の間にあるいずれかの箇所に、参照配列の残基間に個別に散在して、若しくは参照配列内の１つ以上の連続する基として存在してもよい。
【００６９】
実際問題として、任意の具体的なポリペプチドが参照ポリペプチドと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるかどうかは、公知のコンピュータプログラムを使用して従来どおり決定することができる。問い合わせ配列（本発明の配列）と対象配列との間の全体としての最良のマッチを決定するための好ましい方法は、大域的配列アラインメントとも称され、Ｂｒｕｔｌａｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｐ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．６：２３７−２４５（１９９０）のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータプログラムを使用して決定され得る。配列アラインメントでは、問い合わせ配列及び対象配列は双方ともヌクレオチド配列であるか、又は双方ともアミノ酸配列であるかのいずれかである。前記大域的配列アラインメントの結果は同一性パーセントである。ＦＡＳＴＤＢアミノ酸アラインメントで使用される好ましいパラメータは以下である：行列＝ＰＡＭ  ０、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝２、ミスマッチペナルティ＝１、結合ペナルティ＝２０、無作為化グループ長さ＝０、カットオフスコア＝１、ウィンドウサイズ＝配列長、ギャップペナルティ＝５、ギャップサイズペナルティ−０．０５、ウィンドウサイズ＝５００又は対象アミノ酸配列の長さのいずれか短い方。
【００７０】
内部の欠失ではなく、Ｎ末端又はＣ末端の欠失のために対象配列が問い合わせ配列より短い場合、結果に対して手動で補正を加えなければならない。これは、ＦＡＳＴＤＢプログラムが大域的同一性パーセントを計算するときに対象配列のＮ末端及びＣ末端トランケーションを考慮しないためである。問い合わせ配列と比べてＮ末端及びＣ末端でトランケートされている対象配列については、対応する対象残基と一致／整列しない、対象配列のＮ末端側及びＣ末端側にある問い合わせ配列の残基の数を、問い合わせ配列の全塩基に対する割合として計算することにより、同一性パーセントが補正される。残基が一致／整列するかどうかは、ＦＡＳＴＤＢ配列アラインメントの結果により決定される。次にこの割合を、上記のＦＡＳＴＤＢプログラムにより特定のパラメータを使用して計算された同一性パーセントから減じると、最終的な同一性パーセントスコアが得られる。この最終的な同一性パーセントスコアが、本発明の目的のために使用されるものである。問い合わせ配列と一致／整列しない、対象配列のＮ末端及びＣ末端までの残基のみが、同一性パーセントスコアを手動で調整する目的で考慮される。すなわち、対象配列の最も端にあるＮ末端残基及びＣ末端残基の外側にある問い合わせ残基位置のみである。
【００７１】
例えば、９０アミノ酸残基の対象配列を１００残基の問い合わせ配列と整列させて同一性パーセントを決定する。対象配列のＮ末端に欠失が存在し、従ってＦＡＳＴＤＢアラインメントはＮ末端における最初の１０残基の一致／整列を示さない。１０個の対をなさない残基は配列の１０％に相当し（Ｎ末端及びＣ末端における一致しない残基の数／問い合わせ配列の残基総数）、そのためＦＡＳＴＤＢプログラムにより計算された同一性パーセントスコアから１０％が減じられる。残りの９０残基が完全に一致したならば、最終的な同一性パーセントは９０％となる。別の例において、９０残基の対象配列を１００残基の問い合わせ配列と比較する。このときは欠失は内部欠失であり、そのため対象配列のＮ末端又はＣ末端に問い合わせ残基と一致／整列しない残基はない。この場合、ＦＡＳＴＤＢにより計算された同一性パーセントが手動で補正されることはない。ここでもまた、手動で補正されるのは、ＦＡＳＴＤＢアラインメントにより示されるとおりの、問い合わせ配列と一致／整列しない、対象配列のＮ末端及びＣ末端の終端部の外側にある残基位置のみである。本発明の目的上、それ以外に手動での補正を行うことはない。
【００７２】
本発明において有用なポリペプチドとしては、表５に示す配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるものが、その活性な変異体、断片、又は誘導体を含めて挙げられる。本発明はまた、保存的アミノ酸置換を有する表５のアミノ酸配列を含むポリペプチドも包含する。
【００７３】
本発明の一実施形態において、本発明の組換え宿主細胞で発現させるアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、及び配列番号４０と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を有する。本発明の別の実施形態において、本発明の組換え宿主細胞で発現させるアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、及び配列番号４０からなる群から選択されるアミノ酸配列、又はその活性な変異体、断片若しくは誘導体を有する。一実施形態において、アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドは、特定の宿主細胞での発現にコドン最適化されたポリヌクレオチドによりコードされる。
【００７４】
本発明の一実施形態において、本発明の組換え宿主細胞で発現させるアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号２２と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、ポリペプチドは配列番号２２のアミノ酸配列又はその活性な変異体、断片若しくは誘導体を含む。
【００７５】
本発明の一実施形態において、本発明の組換え宿主細胞で発現させるアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号２３と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、ポリペプチドは配列番号２３のアミノ酸配列又はその活性な変異体、断片若しくは誘導体を含む。
【００７６】
本発明の一実施形態において、本発明の組換え宿主細胞で発現させるアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号３１と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、ポリペプチドは配列番号３１のアミノ酸配列又はその活性な変異体、断片若しくは誘導体を含む。
【００７７】
本発明の一実施形態において、本発明の組換え宿主細胞で発現させるアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号２９と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、ポリペプチドは配列番号２９のアミノ酸配列又はその活性な変異体、断片若しくは誘導体を含む。
【００７８】
本発明での使用に好適なＡＤＨ酵素及びその断片はポリヌクレオチドによりコードされ得る。用語「ポリヌクレオチド」は、単数形の核酸並びに複数形の核酸を包含することが意図され、単離核酸分子又はコンストラクト、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ウイルス由来のＲＮＡ、又はプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。ポリヌクレオチドは従来型のリン酸ジエステル結合又は非従来型の結合（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）に見られるようなアミド結合）を含み得る。用語「核酸」は、ポリヌクレオチドに存在する任意の１つ以上の核酸セグメント、例えばＤＮＡ又はＲＮＡ断片を指す。本発明に係るポリヌクレオチドには、合成的に産生された分子がさらに含まれる。本発明のポリヌクレオチドは宿主細胞にとって天然であっても、又は異種であってもよい。加えて、ポリヌクレオチド又は核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位、又は転写ターミネーターなどの調節エレメントであってもよく、又はそれを含んでもよい。
【００７９】
本明細書で使用されるとき、「コード領域」又は「ＯＲＦ」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸の一部分である。「終止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ、又はＴＡＡ）はアミノ酸に翻訳されないが、存在する場合にはそれはコード領域の一部であると見なすことができ、しかしながら任意の隣接配列、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、５’及び３’非翻訳領域などは、コード領域の一部ではない。
【００８０】
用語「プロモーター」は、コード配列又は機能性ＲＮＡの発現を制御することが可能なＤＮＡ配列を指す。一般に、コード配列はプロモーター配列の３’側に位置する。プロモーターは全体として天然遺伝子に由来してもよく、又は自然界に見られる種々のプロモーターに由来する異なるエレメントから構成されても、若しくはさらには合成ＤＮＡセグメントを含んでもよい。異なるプロモーターが異なる組織又は細胞型の遺伝子、若しくは異なる発生段階にある遺伝子の発現、又は異なる環境条件若しくは生理学的条件に応答した遺伝子の発現を誘導し得ることは、当業者により理解される。ほとんどの細胞型でほぼ毎回遺伝子を発現させるプロモーターは、一般に「構成的プロモーター」と称される。さらに、ほとんどの場合に調節配列の正確な境界は完全には定義されていないため、異なる長さのＤＮＡ断片が同じプロモーター活性を有し得ることが認識される。
【００８１】
特定の実施形態において、ポリヌクレオチド又は核酸はＤＮＡである。ＤＮＡの場合、核酸を含むポリヌクレオチド（これがポリペプチドをコードする）は通常、１つ以上のコード領域に作動可能に連係されたプロモーター及び／又は他の転写若しくは翻訳制御エレメントを含み得る。作動可能な連係とは、遺伝子産物、例えばポリペプチドのコード領域が１つ以上の調節配列と、遺伝子産物の発現がその調節配列の影響下又は制御下に置かれるように連係しているときである。プロモーター機能が誘導されると所望の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写が起こる場合には、且つ２つのＤＮＡ断片間の連結の性質によって、遺伝子産物の発現を誘導する発現調節配列の能力が妨げられたり、又はＤＮＡ鋳型の転写される能力が妨げられたりすることがない場合には、その２つのＤＮＡ断片（ポリペプチドコード領域と、それと連係したプロモーターなど）は「作動可能に連係」している。従ってプロモーター領域は、当該の核酸の転写にそのプロモーターが影響を及ぼすことが可能であるならば、ポリペプチドをコードする核酸と作動可能に連係していることになる。プロモーター以外の他の転写制御エレメント、例えばエンハンサー、オペレーター、リプレッサー、及び転写終結シグナルが、ポリヌクレオチドと作動可能に連係し得る。好適なプロモーター及び他の転写制御領域は、本明細書に開示される。
【００８２】
様々な翻訳制御エレメントが当業者に公知である。それらとしては、限定はされないが、リボソーム結合部位、翻訳開始コドン及び終止コドン、並びにウイルス系に由来するエレメント（特に内部リボソーム侵入部位、すなわちＩＲＥＳ、ＣＩＴＥ配列とも称される）が挙げられる。
【００８３】
他の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドはＲＮＡ、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態のＲＮＡである。本発明のＲＮＡは一本鎖であっても、又は二本鎖であってもよい。
【００８４】
本発明のポリヌクレオチド及び核酸コード領域は、分泌ペプチド又はシグナルペプチドをコードするさらなるコード領域と連係されてもよく、このようなペプチドは、本発明のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの分泌を誘導する。
【００８５】
本明細書で使用されるとき、用語「形質転換」は、核酸断片が宿主生物のゲノムに移され、その結果遺伝的に安定して受け継がれることを指す。形質転換された核酸断片を含む宿主生物は、「組換え」又は「形質転換」生物と称される。
【００８６】
用語「発現」は、本明細書で使用されるとき、本発明の核酸断片に由来するセンスＲＮＡ（ｍＲＮＡ）又はアンチセンスＲＮＡの転写及び安定した蓄積を指す。発現はまた、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を指すこともある。
【００８７】
用語「プラスミド」、「ベクター」、及び「カセット」は、細胞の中央代謝の一部ではない遺伝子を保有することの多い、通常は環状二本鎖ＤＮＡ断片の形態である染色体外エレメントを指す。かかるエレメントは、任意の供給源に由来する一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡの直鎖状又は環状の自己複製配列、ゲノム組込み配列、ファージ又はヌクレオチド配列であってよく、そこでは多数のヌクレオチド配列がつなぎ合わされ、又は組み換えられることで、プロモーター断片及び選択された遺伝子産物のＤＮＡ配列を適切な３’非翻訳配列と共に細胞に導入することが可能な固有の構造となっている。「形質転換カセット」は、外来遺伝子を含み、且つ外来遺伝子に加えて特定の宿主細胞の形質転換を促進するエレメントを有する特異的ベクターを指す。「発現カセット」は、外来遺伝子を含み、且つ外来遺伝子に加えて外来宿主中での当該遺伝子の発現を増進するエレメントを有する特異的ベクターを指す。
【００８８】
用語「人工的」は、合成の、又は非宿主細胞由来の組成物、例えば化学的に合成されたオリゴヌクレオチドを指す。
【００８９】
本発明の参照ヌクレオチド配列と少なくとも、例えば９５％「同一」のヌクレオチド配列を有する核酸又はポリヌクレオチドとは、そのポリヌクレオチド配列が参照ヌクレオチド配列の１００個のヌクレオチドにつき最大５つまでの点突然変異を含み得ることを除き、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が参照配列と同じであることが意図される。換言すれば、参照ヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るには、参照配列におけるヌクレオチドの最大５％までが欠失しているか、若しくは別のヌクレオチドで置換されていてもよく、又は参照配列における全ヌクレオチドの最大５％までの数のヌクレオチドが参照配列に挿入されていてもよい。
【００９０】
実際問題として、任意の具体的な核酸分子又はポリペプチドが本発明のヌクレオチド配列又はポリペプチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるかどうかは、公知のコンピュータプログラムを使用して従来どおり決定することができる。問い合わせ配列（本発明の配列）と対象配列との間の全体としての最良のマッチを決定するための好ましい方法は、大域的配列アラインメントとも称され、Ｂｒｕｔｌａｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｐ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．６：２３７−２４５（１９９０）のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータプログラムを使用して決定され得る。配列アラインメントでは、問い合わせ配列及び対象配列は双方ともＤＮＡ配列である。ＲＮＡ配列はＵをＴに変換して比較され得る。前記大域的配列アラインメントの結果は同一性パーセントである。同一性パーセントを計算するためにＤＮＡ配列のＦＡＳＴＤＢアラインメントで使用される好ましいパラメータは以下である：行列＝Ｕｎｉｔａｒｙ、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝４、ミスマッチペナルティ＝１、結合ペナルティ−３０、無作為化グループ長さ＝０、カットオフスコア＝１、ギャップペナルティ＝５、ギャップサイズペナルティ＝０．０５、ウィンドウサイズ＝５００又は対象ヌクレオチド配列の長さのいずれか短い方。
【００９１】
内部の欠失ではなく、５’又は３’の欠失のために対象配列が問い合わせ配列より短い場合、結果に対して手動で補正を加えなければならない。これは、ＦＡＳＴＤＢプログラムが同一性パーセントを計算するときに対象配列の５’又は３’トランケーションを考慮しないためである。問い合わせ配列と比べて５’末端又は３’末端でトランケートされている対象配列については、対象配列の５’側又は３’側にある一致／整列しない問い合わせ配列の塩基の数を、問い合わせ配列の全塩基に対する割合として計算することにより、同一性パーセントが補正される。ヌクレオチドが一致／整列するかどうかは、ＦＡＳＴＤＢ配列アラインメントの結果により決定される。次にこの割合を、上記のＦＡＳＴＤＢプログラムにより特定のパラメータを使用して計算された同一性パーセントから減じると、最終的な同一性パーセントスコアが得られる。この補正したスコアが、本発明の目的のために使用されるものである。ＦＡＳＴＤＢアラインメントにより示されるとおりの、問い合わせ配列と一致／整列しない、対象配列の５’塩基又は３’塩基の外側にある塩基のみが、同一性パーセントスコアを手動で調整する目的で計算される。
【００９２】
例えば、９０塩基の対象配列を１００塩基の問い合わせ配列と整列させて同一性パーセントを決定する。対象配列の５’末端に欠失が存在し、従ってＦＡＳＴＤＢアラインメントは５’末端における最初の１０塩基の一致／整列を示さない。１０個の対をなさない塩基は配列の１０％に相当し（５’末端及び３’末端における一致しない塩基の数／問い合わせ配列の塩基総数）、そのためＦＡＳＴＤＢプログラムにより計算された同一性パーセントスコアから１０％が減じられる。残りの９０塩基が完全に一致したならば、最終的な同一性パーセントは９０％となる。別の例において、９０塩基の対象配列を１００塩基の問い合わせ配列と比較する。このときは欠失は内部欠失であり、そのため対象配列の５’又は３’に問い合わせ塩基と一致／整列しない塩基はない。この場合、ＦＡＳＴＤＢにより計算された同一性パーセントが手動で補正されることはない。ここでもまた、手動で補正されるのは、問い合わせ配列と一致／整列しない、対象配列の５’側及び３’側にある塩基のみである。本発明の目的上、それ以外に手動での補正を行うことはない。
【００９３】
本発明において有用なポリヌクレオチドとしては、以下の表４に示されるヌクレオチド配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるものが、活性なアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするその変異体、断片又は誘導体を含めて挙げられる。
【００９４】
用語「活性変異体」、「活性断片」、「活性誘導体」、及び「類似体」は、本発明のポリヌクレオチドを指し、低級アルキルアルデヒドの還元を触媒することが可能なポリペプチドをコードする任意のポリヌクレオチドを含む。本発明のポリヌクレオチドの変異体には、塩基対の置換、欠失、及び／又は挿入によって改変されたヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドが含まれる。変異体は天然に存在するものであっても、又は天然に存在しないものであってもよい。天然に存在しない変異体は、当該技術分野で公知の突然変異生成技術を用いて産生され得る。本発明のポリヌクレオチドの誘導体は、それによってコードされるポリペプチドが天然ポリペプチドには見られないさらなる特徴を呈するように改変されているポリヌクレオチドである。例としては、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。変異体ポリヌクレオチドはまた、本明細書では「ポリヌクレオチド類似体」とも称され得る。本明細書で使用されるときポリヌクレオチドの「誘導体」は、官能側鎖基の反応によって化学的に誘導体化された１つ以上のヌクレオチドを有する対象のポリヌクレオチドを指す。「誘導体」としてはまた、１つ以上の天然に存在するヌクレオチド誘導体を含むポリヌクレオチドも含まれる。例えばシトシンが３−メチルシチジンに置換されてもよく；チミジンがリボチミジンに置換されてもよく；及びシトシンがＮ４−アセチルシチジンに置換されてもよい。
【００９５】
「断片」は、親配列と同じ配列だが、それより長さが短いＡＤＨ酵素をコードするポリヌクレオチドの固有の部分である。断片は、最大では、定義された配列の全長から１個のヌクレオチドを引いたものを含み得る。例えば、断片は５〜１０００個の連続するヌクレオチドを含み得る。プローブ、プライマーとして、又は他の目的に使用される断片は、少なくとも５個、１０個、１５個、１６個、２０個、２５個、３０個、４０個、５０個、６０個、７５個、１００個、１５０個、２５０個又は少なくとも５００個の連続するヌクレオチドであり得る。断片は分子のある特定の領域から優先的に選択され得る。例えば、ポリヌクレオチド断片は、ある特定の定義された配列で示されるとおりのポリヌクレオチドの最初の１００個又は２００個のヌクレオチドから選択されるある特定の長さの連続するヌクレオチドを含み得る。明らかにこれらの長さは例示であり、配列表、表、及び図を含め、本明細書により裏付けられる任意の長さが本実施形態により包含され得る。
【００９６】
本発明の一実施形態において、本発明の組換え宿主細胞での発現に好適なポリヌクレオチド配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、及び配列番号２０と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のヌクレオチド配列を含む。本発明の別の実施形態において、本発明の組換え宿主細胞での発現に好適なポリヌクレオチド配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、及び配列番号２０又はその活性な変異体、断片若しくは誘導体からなる群から選択することができる。一実施形態において、ポリヌクレオチドは特定の宿主細胞での発現にコドン最適化されている。
【００９７】
本発明の一実施形態において、本発明の組換え宿主細胞での発現に好適なポリヌクレオチド配列は、配列番号２と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を有する。別の実施形態において、ポリヌクレオチドは配列番号２のヌクレオチド配列又はその活性な変異体、断片若しくは誘導体を含む。
【００９８】
本発明の一実施形態において、本発明の組換え宿主細胞での発現に好適なポリヌクレオチド配列は、配列番号３と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を有する。別の実施形態において、ポリヌクレオチドは配列番号３のヌクレオチド配列又はその活性な変異体、断片若しくは誘導体を含む。
【００９９】
本発明の一実施形態において、本発明の組換え宿主細胞での発現に好適なポリヌクレオチド配列は、配列番号１１と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を有する。別の実施形態において、ポリヌクレオチドは配列番号１１のヌクレオチド配列又はその活性な変異体、断片若しくは誘導体を含む。
【０１００】
本発明の一実施形態において、本発明の組換え宿主細胞での発現に好適なポリヌクレオチド配列は、配列番号９と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を有する。別の実施形態において、ポリヌクレオチドは配列番号９のヌクレオチド配列又はその活性な変異体、断片若しくは誘導体を含む。
【０１０１】
本明細書で使用されるとき、用語「コドン縮重」は、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列に影響を与えることなくヌクレオチド配列の変動を許容する遺伝子コードの性質を指す。当業者は、所与のアミノ酸を指定するためのヌクレオチドコドンの使用において特定の宿主細胞が示す「コドンバイアス」について、十分に理解している。従って、宿主細胞における発現を改良するために遺伝子を合成するときには、そのコドン使用頻度が宿主細胞の好ましいコドン使用頻度に近くなるように遺伝子を設計することが望ましい。
【０１０２】
本明細書で使用されるとき、用語「コドン最適化されたコード領域」は、少なくとも１つ、又は２つ以上、又は相当数のコドンを、当該の生物の遺伝子でより高頻度に使用される１つ以上のコドンで置き換えることにより、所与の生物の細胞での発現に適合された核酸コード領域を意味する。
【０１０３】
任意のポリペプチド鎖のアミノ酸をコードするコドンを含むヌクレオチド配列に偏りがあることで、遺伝子をコードする配列の変動が許容される。各コドンは３つのヌクレオチドからなり、且つＤＮＡを含むヌクレオチドは４つの特定の塩基に限定されているため、ヌクレオチドの可能な組み合わせは６４通りとなり、そのうち６１通りがアミノ酸をコードする（残りの３つのコドンは、翻訳を終結させるシグナルをコードする）。「遺伝子コード」は、どのコドンがどのアミノ酸をコードするかを示すものであり、本明細書に表１として再掲する。結果として、多くのアミノ酸が２つ以上のコドンによって指定される。例えば、アミノ酸アラニン及びプロリンは４つのトリプレットにより、セリン及びアルギニンは６つのトリプレットによりコードされ、一方、トリプトファン及びメチオニンはただ１つのトリプレットによりコードされる。この縮重により、ＤＮＡによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列が変化することなしにＤＮＡ塩基組成が広範囲にわたり異なることが可能となる。
【０１０４】
【表１】
0005947219.tif 000002
【０１０５】
多くの生物が、成長するペプチド鎖における特定のアミノ酸の挿入をコードするための特定のコドンの使用についてバイアスを示す。生物間でのコドン使用頻度の差であるコドン選択又はコドンバイアスは、遺伝子コードの縮重により得られ、多くの生物の間で十分に実証されている。コドンバイアスはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳効率と相関を有することが多く、次にはその効率が、とりわけ、翻訳されるコドンの特性及び特定の転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用可能性に依存すると考えられている。細胞において特定のｔＲＮＡが優勢であることは、概してペプチド合成で最も高頻度に使用されるコドンを反映するものである。従って、コドン最適化に基づき、所与の生物における最適な遺伝子発現に遺伝子が適合され得る。
【０１０６】
多数の遺伝子配列が広範な種類の動物種、植物種及び微生物種に利用可能であることを所与とすれば、相対的なコドン使用頻度を計算することが可能である。コドン使用表は、例えばｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／で利用可能な「Ｃｏｄｏｎ  Ｕｓａｇｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ」で容易に入手可能であり、これらの表を数多くの方法で適応させることができる。Ｎａｋａｍｕｒａ，  Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８：２９２（２０００）を参照のこと。ＧｅｎＢａｎｋリリース１２８．０［２００２年２月１５日］から計算した酵母についてのコドン使用表を以下に表２として再掲する。この表はｍＲＮＡ命名法を使用し、従ってＤＮＡに見られるチミン（Ｔ）の代わりに、表ではＲＮＡに見られるウラシル（Ｕ）が用いられる。表は、６４個の全コドンについてではなく、各アミノ酸について計算されるように適合されている。
【０１０７】
【表２】
0005947219.tif 000003
【０１０８】
【表３】
0005947219.tif 000004
【０１０９】
【表４】
0005947219.tif 000005
【０１１０】
この、又は同様の表を利用することにより、当業者はそれらの頻度を任意の所与のポリペプチド配列に適用して、ポリペプチドをコードしながらも所与の種に最適なコドンを使用するコドン最適化コード領域の核酸断片を作り出すことができる。
【０１１１】
所与のポリペプチド配列をコードするよう最適化された頻度でコドンを無作為に割り当てることは、アミノ酸毎にコドン頻度を計算し、次にそれらのコドンをポリペプチド配列に無作為に割り当てることにより、手動で行うことができる。加えて、当業者には、様々なアルゴリズム及びコンピュータソフトウェアプログラムが容易に利用可能である。例えば、ＤＮＡｓｔａｒ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩから利用可能なＬａｓｅｒｇｅｎｅ  Ｐａｃｋａｇｅの「ＥｄｉｔＳｅｑ」機能、ＩｎｆｏｒＭａｘ、Ｉｎｃ．，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤから利用可能なＶｅｃｔｏｒＮＴＩ  Ｓｕｉｔｅのバックトランスレーション（ｂａｃｋｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）機能、及びＡｃｃｅｌｒｙｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから利用可能なＧＣＧ−Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅの「バックトランスレート（ｂａｃｋｔｒａｎｓｌａｔｅ）」機能。加えて、コード領域配列をコドン最適化するための様々なリソース、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｎｔｅｌｅｃｈｏｎ．ｃｏｍ／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ／ｂａｃｋｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ．ｐｈｐ？ｌａｎｇ＝ｅｎｇ（２００８年４月１５日にアクセス）の「バックトランスレーション（ｂａｃｋｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）」機能、及びｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｉｎｆｏ．ｐｂｉ．ｎｒｃ．ｃａ：８０９０／ＥＭＢＯＳＳ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌで利用可能な「バックトランセク（ｂａｃｋｔｒａｎｓｅｑ）」機能が公的に利用可能である。所与の頻度に基づきコドンを割り当てるための基本的なアルゴリズムの構築もまた、当業者により基礎的な数学関数を用いて容易に達成することができる。
【０１１２】
コドン最適化コード領域は、「ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｇｅｎｅ  ｄｅｓｉｇｎｅｒ」（ｈｔｔｐ：／／ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ．ｂｉｏｓｃｉ．ｕｍｂｃ．ｅｄｕ／ｃｏｄｏｎ／ｓｇｄ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ）などのソフトウェアパッケージを含め、当業者に公知の様々な方法により設計することができる。
【０１１３】
本明細書で使用される標準的な組換えＤＮＡ技術及び分子クローニング技術は当該技術分野において公知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）（以下「Ｍａｎｉａｔｉｓ」）；及びＳｉｌｈａｖｙ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｉｌｈａｖｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８４）；及びＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，発行元Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９８７）により記載される。
【０１１４】
アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）酵素
アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）は、細胞環境内の様々な経路の一部としてアルデヒドのアルコールとの相互変換を触媒する広範な酵素クラスである。ＡＤＨ酵素は汎用的であり、アミノ酸配列の長さ又はそれらが使用する金属補因子の種類のいずれかに基づき複数のファミリーに分類される。
【０１１５】
様々なＡＤＨ酵素について、タンパク質データバンク（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ：ＰＤＢ）で１５０種を超える構造を利用することができる。これらの酵素は極めて多岐にわたり、種々のＡＤＨが異なるサブユニット組成を有するオリゴマーとして存在する。図４は、ウマ肝臓ＡＤＨ及びアクロモバクター・キシロスオキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）ＳａｄＢに関連するサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）、Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、及びシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）におけるオキシドレダクターゼ酵素の系統発生的な関係を示す。
【０１１６】
図５は、配列上、アクロモバクター・キシロスオキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）ＳａｄＢに対してより近縁関係にある特定のＡＤＨ酵素配列の系統発生的な関係を示す。
【０１１７】
一実施形態において、本発明での使用に好適なＡＤＨ酵素は、低級アルキルアルデヒドから対応する低級アルキルアルコールへの変換に対して極めて高いｋｃａｔを有する。別の実施形態において、使用に好適なＡＤＨ酵素は、低級アルキルアルコールから対応する低級アルキルアルデヒドへの変換に対して極めて低いｋｃａｔを有する。別の実施形態において、使用に好適なＡＤＨ酵素は、低級アルキルアルデヒドに対して低いＫＭを有する。別の実施形態において、好適なＡＤＨ酵素は低級アルキルアルコールに対して高いＫＭを有する。別の実施形態において、好適なＡＤＨ酵素は、還元反応中にＮＡＤＨを補因子として選択的に使用する。別の実施形態において、好適なＡＤＨ酵素は以下の特徴の１つ以上を有する：低級アルキルアルデヒドから対応する低級アルキルアルコールへの変換に対する極めて高いｋｃａｔ；低級アルキルアルコールから対応する低級アルキルアルデヒドへの変換に対する極めて低いｋｃａｔ；低級アルキルアルデヒドに対する低いＫＭ；低級アルキルアルコールに対する高いＫＭ；及び還元反応中の補因子としてのＮＡＤＨの選択的な使用。別の実施形態において、好適なＡＤＨ酵素は低級アルキルアルコールに対して高いＫＩを有する。別の実施形態において、好適なＡＤＨ酵素は上記の特徴の２つ以上を有する。
【０１１８】
一実施形態において、本発明での使用に好適なＡＤＨ酵素は、低級アルキルアルコールの存在下及び非存在下で補因子を対照ポリペプチドより速く酸化する。一実施形態において、対照ポリペプチドは、配列番号２６のアミノ酸配列を有するアクロモバクター・キシロスオキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）ＳａｄＢである。
【０１１９】
別の実施形態において、好適なＡＤＨ酵素は、低級アルキルアルデヒドに対するＫＭが対照ポリペプチドと比べて低い。別の実施形態において、好適なＡＤＨ酵素は、低級アルキルアルデヒドに対するＫＭが対照ポリペプチドと比べて少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％低い。一実施形態において、対照ポリペプチドは、配列番号２６のアミノ酸配列を有するアクロモバクター・キシロスオキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）ＳａｄＢである。一実施形態において、低級アルキルアルデヒドはイソブチルアルデヒドである。
【０１２０】
別の実施形態において、好適なＡＤＨ酵素は、低級アルキルアルコールに対するＫＩが対照ポリペプチドと比べて高い。別の実施形態において、好適なＡＤＨ酵素は、低級アルキルアルコールＫＩが対照ポリペプチドと比べて少なくとも約１０％、５０％、１００％、２００％、３００％、４００％、又は５００％高い。一実施形態において、対照ポリペプチドは、配列番号２６のアミノ酸配列を有するアクロモバクター・キシロスオキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）ＳａｄＢである。一実施形態において、低級アルキルアルコールはイソブタノールである。
【０１２１】
別の実施形態において、好適なＡＤＨ酵素は低級アルキルアルデヒドに対するｋｃａｔ／ＫＭが対照ポリペプチドと比べて高い。別の実施形態において、好適なＡＤＨ酵素はｋｃａｔ／ＫＭが対照ポリペプチドと比べて少なくとも約１０％、５０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、８００％、又は１０００％高い。一実施形態において、対照ポリペプチドは、配列番号２６のアミノ酸配列を有するアクロモバクター・キシロスオキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）ＳａｄＢである。一実施形態において、低級アルキルアルデヒドはイソブチルアルデヒドである。
【０１２２】
別の実施形態において、好適なＡＤＨ酵素は上記の特徴の２つ以上を有する。別の実施形態において、好適なＡＤＨ酵素は上記の特徴の３つ以上を有する。別の実施形態において、好適なＡＤＨ酵素は上記の特徴の４つ全てを有する。一実施形態において、好適なＡＤＨ酵素はＮＡＤＨを補因子として選択的に使用する。
【０１２３】
一実施形態において、本発明での使用に好適なＡＤＨ酵素は、宿主細胞の生理学的条件で最適に還元反応を触媒する。別の実施形態において、本発明での使用に好適なＡＤＨ酵素は、約ｐＨ４から約ｐＨ９まで最適に還元反応を触媒する。別の実施形態において、本発明での使用に好適なＡＤＨ酵素は、約ｐＨ５から約ｐＨ８まで最適に還元反応を触媒する。別の実施形態において、本発明での使用に好適なＡＤＨ酵素は、約ｐＨ６から約ｐＨ７まで最適に還元反応を触媒する。別の実施形態において、本発明での使用に好適なＡＤＨ酵素は、約ｐＨ６．５から約ｐＨ７まで最適に還元反応を触媒する。別の実施形態において、本発明での使用に好適なＡＤＨ酵素は、約ｐＨ４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、又は９で最適に還元反応を触媒する。別の実施形態において、本発明での使用に好適なＡＤＨ酵素は、約ｐＨ７で最適に還元反応を触媒する。
【０１２４】
一実施形態において、本発明での使用に好適なＡＤＨ酵素は、最高約７０℃まで最適に還元反応を触媒する。別の実施形態において、好適なＡＤＨ酵素は、約１０℃、１５℃、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、又は７０℃で最適に還元反応を触媒する。別の実施形態において、好適なＡＤＨ酵素は、約３０℃で最適に還元反応を触媒する。
【０１２５】
一実施形態において、本発明での使用に好適なＡＤＨ酵素は、最大約５０ｇ／Ｌまでの濃度の低級アルキルアルコールの存在下でアルデヒドからアルコールへの変換を触媒する。別の実施形態において、好適なＡＤＨ酵素は、少なくとも約１０ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、２５ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、３５ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、４５ｇ／Ｌ、又は５０ｇ／Ｌの濃度の低級アルキルアルコールの存在下でアルデヒドからアルコールへの変換を触媒する。別の実施形態において、好適なＡＤＨ酵素は、少なくとも約２０ｇ／Ｌの濃度の低級アルキルアルコールの存在下でアルデヒドからアルコールへの変換を触媒する。いくつかの実施形態において、低級アルキルアルコールはブタノールである。いくつかの実施形態において、低級アルキルアルデヒドはイソブチルアルデヒドであり、低級アルキルアルコールはイソブタノールである。
【０１２６】
ＡＤＨ酵素発現用の組換え宿主細胞
本発明の一態様は、上記に概説した活性を有するＡＤＨ酵素を発現する組換え宿主細胞に関する。本発明で使用される宿主細胞の非限定的な例としては、細菌、シアノバクテリア、糸状菌及び酵母が挙げられる。
【０１２７】
一実施形態において、本発明の組換え宿主細胞は細菌細胞又はシアノバクテリア細胞である。別の実施形態において、組換え宿主細胞は、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、アルスロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、グルコノバクター属（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）、ノカルジア属（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、大腸菌属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、パエニバチルス属（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、及びザントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、組換え宿主細胞は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、又はＬ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）である。
【０１２８】
別の実施形態において、本発明の組換え宿主細胞は糸状菌細胞又は酵母細胞である。別の実施形態において、組換え宿主細胞は、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、パキソレン属（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ）、ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ザイゴサッカロミセス属（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ガラクトミセス属（Ｇａｌａｃｔｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、トルラスポラ属（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ）、デバリオミセス属（Ｄｅｂａｙｏｍｙｃｅｓ）、ウィリオプシス属（Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ）、デッケラ属（Ｄｅｋｋｅｒａ）、クロエケラ属（Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ）、メチニコウイア属（Ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｗｉａ）、イサチェンキア属（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）、及びカンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）からなる群から選択される。
【０１２９】
一実施形態において、本発明の組換え宿主細胞は、理論値の約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、又は９０％より高い収率で低級アルキルアルコールを生成する。一実施形態において、本発明の組換え宿主細胞は、理論値の約２５％より高い収率で低級アルキルアルコールを生成する。別の実施形態において、本発明の組換え宿主細胞は、理論値の約４０％より高い収率で低級アルキルアルコールを生成する。別の実施形態において、本発明の組換え宿主細胞は、理論値の約５０％より高い収率で低級アルキルアルコールを生成する。別の実施形態において、本発明の組換え宿主細胞は、理論値の約７５％より高い収率で低級アルキルアルコールを生成する。別の実施形態において、本発明の組換え宿主細胞は、理論値の約９０％より高い収率で低級アルキルアルコールを生成する。いくつかの実施形態において、低級アルキルアルコールはブタノールである。いくつかの実施形態において、低級アルキルアルコールはイソブタノールである。
【０１３０】
本発明の組換え宿主細胞により生成される低級アルキルアルコールの非限定的な例としては、ブタノール、プロパノール、イソプロパノール、及びエタノールが挙げられる。一実施形態において、本発明の組換え宿主細胞はイソブタノールを生成する。別の実施形態において、本発明の組換え宿主細胞はエタノールを生成しない。
【０１３１】
米国特許出願公開第２００７／００９２９５７  Ａ１号明細書は、イソブタノール（２−メチルプロパン−１−オール）を生成するための組換え微生物の改変を開示する。米国特許出願公開第２００８／０１８２３０８  Ａ１号明細書は、１−ブタノールを生成するための組換え微生物の改変を開示する。米国特許出願公開第２００７／０２５９４１０  Ａ１号明細書及び同第２００７／０２９２９２７  Ａ１号明細書は、２−ブタノールを生成するための組換え微生物の改変を開示する。イソブタノール及び２−ブタノールの生合成については複数の経路が記載されている。３つ全ての生成物について記載される全ての経路で、最後のステップは、ブタノールデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素による、より酸化された部分のアルコール部分への還元である。これらの文献に開示される方法は、本発明の組換え宿主細胞の改変に用いることができる。これらの文献に提供される情報は、本明細書によって全体として参照により援用される。
【０１３２】
実施形態において、組換え微生物宿主細胞はイソブタノールを生成する。実施形態において、組換え微生物宿主細胞は、ピルベートからアセトラクテートへの変換；アセトラクテートから２，３−ジヒドロキシイソバレレートへの変換；２，３−ジヒドロキシイソバレレートからα−ケトイソバレレートへの変換；α−ケトイソバレレートからイソブチルアルデヒドへの変換、及びイソブチルアルデヒドからイソブタノールへの変換からなる群から選択される基質から生成物への変換を触媒する酵素をコードする少なくとも２つの異種ポリヌクレオチドを含む。実施形態において、組換え微生物宿主細胞は、ピルベートからアセトラクテートへの変換；アセトラクテートから２，３−ジヒドロキシイソバレレートへの変換；２，３−ジヒドロキシイソバレレートからα−ケトイソバレレートへの変換；α−ケトイソバレレートからイソブチルアルデヒドへの変換、及びイソブチルアルデヒドからイソブタノールへの変換からなる群から選択される基質から生成物への変換を触媒する酵素をコードする少なくとも３つの異種ポリヌクレオチドを含む。実施形態において、組換え微生物宿主細胞は、ピルベートからアセトラクテートへの変換；アセトラクテートから２，３−ジヒドロキシイソバレレートへの変換；２，３−ジヒドロキシイソバレレートからα−ケトイソバレレートへの変換；α−ケトイソバレレートからイソブチルアルデヒドへの変換、及びイソブチルアルデヒドからイソブタノールへの変換からなる群から選択される基質から生成物への変換を触媒する酵素をコードする少なくとも４つの異種ポリヌクレオチドを含む。実施形態において、組換え微生物宿主細胞は、ピルベートからアセトラクテートへの変換；アセトラクテートから２，３−ジヒドロキシイソバレレートへの変換；２，３−ジヒドロキシイソバレレートからα−ケトイソバレレートへの変換；α−ケトイソバレレートからイソブチルアルデヒドへの変換、及びイソブチルアルデヒドからイソブタノールへの変換を触媒する酵素をコードする異種ポリヌクレオチドを含む。実施形態において、（ａ）ピルベートからアセトラクテートへの基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドは、ＥＣ番号２．２．１．６を有するアセト乳酸シンターゼであり；（ｂ）アセトラクテートから２，３−ジヒドロキシイソバレレートへの基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドは、ＥＣ番号１．１．１８６を有するアセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ（ａｃｅｔｏｈｙｄｒｏｘｙ  ａｃｉｄ  ｉｓｏｍｅｒｏｒｅｄｕｃａｔａｓｅ）であり；（ｃ）２，３−ジヒドロキシイソバレレートからα−ケトイソバレレートへの基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドは、ＥＣ番号４．２．１．９を有するアセトヒドロキシ酸デヒドラターゼであり；及び（ｄ）α−ケトイソバレレートからイソブチルアルデヒドへの基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドは、ＥＣ番号４．１．１．７２を有する分枝鎖α−ケト酸デカルボキシラーゼである。
【０１３３】
実施形態において、組換え微生物宿主細胞は、ピルベートからα−アセトラクテートへの変換；α−アセトラクテートからアセトインへの変換；アセトインから２，３−ブタンジオールへの変換；２，３−ブタンジオールから２−ブタノンへの変換；及び２−ブタノンから２−ブタノールへの変換からなる群から選択される基質から生成物への変換を触媒する酵素をコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドをさらに含み；ここで前記微生物宿主細胞は２−ブタノールを生成する。実施形態において、（ａ）ピルベートからアセトラクテートへの基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドは、ＥＣ番号２．２．１．６を有するアセト乳酸シンターゼであり；（ｂ）アセトラクテートからアセトインへの基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドは、ＥＣ番号４．１．１．５を有するアセト乳酸デカルボキシラーゼであり；（ｃ）アセトインから２，３−ブタンジオールへの基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドは、ＥＣ番号１．１．１．７６又はＥＣ番号１．１．１．４を有するブタンジオールデヒドロゲナーゼであり；（ｄ）ブタンジオールから２−ブタノンへの基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドは、ＥＣ番号４．２．１．２８を有するブタンジオールデヒドラターゼである。実施形態において、（ｅ）２−ブタノンから２−ブタノールへの基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドは、ＥＣ番号１．１．１．１を有する２−ブタノールデヒドロゲナーゼである。
【０１３４】
実施形態において、組換え微生物宿主細胞は、アセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡへの変換；アセトアセチルＣｏＡから３−ヒドロキシブチリルＣｏＡへの変換；３−ヒドロキシブチリルＣｏＡからクロトニルＣｏＡへの変換；クロトニルＣｏＡからブチリルＣｏＡへの変換；ブチリルＣｏＡからブチルアルデヒドへの変換；ブチルアルデヒドから１−ブタノールへの変換からなる群から選択される基質から生成物への変換を触媒する酵素をコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドをさらに含み；ここで前記微生物宿主細胞は１−ブタノールを生成する。実施形態において、（ａ）アセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡへの基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドは、ＥＣ番号２．３．１．９又は２．３．１．１６を有するアセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼであり；（ｂ）アセトアセチルＣｏＡから３−ヒドロキシブチリルＣｏＡへの基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドは、ＥＣ番号１．１．１．３５、１．１．１．３０、１．１．１．１５７、又は１．１．１．３６を有する３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼであり；（ｃ）３−ヒドロキシブチリルＣｏＡからクロトニルＣｏＡへの基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドは、ＥＣ番号４．２．１．１７又は４．２．１．５５を有するクロトナーゼであり；（ｄ）クロトニルＣｏＡからブチリルＣｏＡへの基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドは、ＥＣ番号１．３．１．４４又は１．３．１．３８を有するブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼであり；（ｅ）ブチリルＣｏＡからブチリルアルデヒドへの基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドは、ＥＣ番号１．２．１．５７を有するブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼである。実施形態において、（ｆ）ブチリルアルデヒドから１−ブタノールへの基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドは、ＥＣ番号１．１．１．１を有する１−ブタノールデヒドロゲナーゼである。
【０１３５】
いくつかの実施形態において、組換え微生物宿主細胞は、イソブタノール経路への炭素フローを改善する少なくとも１つの修飾をさらに含む。いくつかの実施形態において、組換え微生物宿主細胞は、１−ブタノール経路への炭素フローを改善する少なくとも１つの修飾をさらに含む。いくつかの実施形態において、組換え微生物宿主細胞は、２−ブタノール経路への炭素フローを改善する少なくとも１つの修飾をさらに含む。
【０１３６】
低級アルキルアルコールの生成方法
本発明の別の態様は、低級アルキルアルコールの生成方法に関する。これらの方法は、主に本発明の組換え宿主細胞を用いる。一実施形態において、本発明の方法は、上記に考察されるとおりの組換え宿主細胞を提供するステップと、低級アルキルアルコールが生成される条件下で発酵培地において組換え宿主細胞を発酵性炭素基質と接触させるステップと、低級アルキルアルコールを回収するステップとを含む。
【０１３７】
炭素基質としては、限定はされないが、単糖類（フルクトース、グルコース、マンノース、ラムノース、キシロース又はガラクトースなど）、オリゴ糖類（ラクトース、マルトース、又はスクロースなど）、多糖類、例えばデンプン、マルトデキストリン、若しくはセルロースなど又はそれらの混合物、並びに乳清透過液、コーンスティープリカー、シュガービート廃糖蜜、及び大麦モルトなどの再生可能原料由来の未精製混合物を挙げることができる。他の炭素基質としては、エタノール、ラクテート、スクシネート、又はグリセロールを挙げることができる。
【０１３８】
加えて、炭素基質はまた、一炭素基質、例えば二酸化炭素、又は主要な生化学的中間体への代謝変換が実証されているメタノールであってもよい。一炭素及び二炭素基質に加え、メチロトローフ生物もまた、メチルアミン、グルコサミン、及び代謝活性のための様々なアミノ酸などの数多くの他の炭素含有化合物を利用することが知られている。例えば、メチロトローフ酵母は、メチルアミンからの炭素を利用してトレハロース又はグリセロールを形成することが知られている（Ｂｅｌｌｉｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂ．Ｇｒｏｗｔｈ  Ｃ１  Ｃｏｍｐｄ．，［Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］，７ｔｈ（１９９３），４１５  ３２，編者：Ｍｕｒｒｅｌｌ，Ｊ．Ｃｏｌｌｉｎ；Ｋｅｌｌｙ，Ｄｏｎ  Ｐ．発行者：Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ，Ａｎｄｏｖｅｒ，ＵＫ）。同様に、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）の様々な種がアラニン又はオレイン酸を代謝する（Ｓｕｌｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５３：４８５−４８９（１９９０））。従って本発明において利用される炭素源は、広範な種類の炭素含有基質を包含し得るとともに、生物の選択によってのみ制限されるであろうことが企図される。
【０１３９】
上述の炭素基質及びその混合物は全て、本発明において好適であることが企図されるが、好ましい炭素基質はグルコース、フルクトース、及びスクロースであり、又はそれらがキシロース及び／又はアラビノースなどのＣ５糖類と混合されたもの（Ｃ５糖類を使用するように修飾された酵母細胞用）である。スクロースは、サトウキビ、サトウダイコン、キャッサバ、スイートソルガム、及びそれらの混合物などの再生可能な糖類源から得られ得る。グルコース及びデキストロースは、トウモロコシ、小麦、ライ麦、大麦、オート麦、及びそれらの混合物などの穀類を含め、デンプンベースの原料の糖化を介して再生可能な穀類源から得られ得る。加えて、発酵性糖が、例えば参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２００７／００３１９１８  Ａ１号明細書に記載されるとおり、前処理及び糖化の過程を介して再生可能なセルロース系又はリグノセルロース系バイオマスから得られ得る。バイオマスは任意のセルロース系又はリグノセルロース系材料を指し、セルロースを含む材料、及び場合によりヘミセルロース、リグニン、デンプン、オリゴ糖類及び／又は単糖類をさらに含む材料が含まれる。バイオマスはまた、タンパク質及び／又は脂質などのさらなる成分も含み得る。バイオマスは単一の供給源に由来してもよく、又はバイオマスは２つ以上の供給源に由来する混合物を含むこともできる；例えばバイオマスは、トウモロコシ穂軸とトウモロコシ茎葉との混合物、又は草と葉との混合物を含み得る。バイオマスとしては、限定はされないが、バイオエネルギー作物、農業残渣、都市固形廃棄物、産業固形廃棄物、製紙スラッジ、庭ごみ、木くず及び林業廃棄物が挙げられる。バイオマスの例としては、限定はされないが、トウモロコシ穀粒、トウモロコシ穂軸、作物残渣、例えばトウモロコシ皮、トウモロコシ茎葉、草、小麦、小麦わら、大麦、大麦わら、乾草、稲わら、スイッチグラス、古紙、サトウキビバガス、モロコシ、大豆、穀類の製粉から得られる成分、樹木、枝、根、葉、木片、おが屑、潅木及び低木、野菜類、果実類、花、家畜糞尿、及びそれらの混合物が挙げられる。
【０１４０】
炭素基質は、宿主細胞の成長及び繁殖に好適な任意の培地に提供され得る。使用することのできる培地の非限定的な例としては、Ｍ１２２Ｃ、ＭＯＰＳ、ＳＯＢ、ＴＳＹ、ＹＭＧ、ＹＰＤ、２ＸＹＴ、ＬＢ、Ｍ１７、又はＭ９最少培地が挙げられる。使用することのできる培地の他の例としては、リン酸カリウム及び／又はリン酸ナトリウムを含有する溶液が挙げられる。好適な培地は、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨが補足され得る。
【０１４１】
低級アルキルアルコールを生成するための発酵条件は、使用される宿主細胞に応じて異なり得る。一実施形態において、低級アルキルアルコールの生成方法は嫌気性条件下で実施される。一実施形態において、低級アルキルアルコールの生成方法は好気性条件下で実施される。一実施形態において、低級アルキルアルコールの生成方法は微好気性条件下で実施される。
【０１４２】
一実施形態において、低級アルキルアルコールの生成方法は、少なくとも約２０ｇ／Ｌの低級アルキルアルコールの力価をもたらす。別の実施形態において、低級アルキルアルコールの生成方法は、少なくとも約３０ｇ／Ｌの低級アルキルアルコールの力価をもたらす。別の実施形態において、低級アルキルアルコールの生成方法は、約１０ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、２５ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、３５ｇ／Ｌ又は４０ｇ／Ｌの低級アルキルアルコールの力価をもたらす。
【０１４３】
本発明の方法により生成される低級アルキルアルコールの非限定的な例としては、ブタノール、イソブタノール、プロパノール、イソプロパノール、及びエタノールが挙げられる。一実施形態では、イソブタノールが生成される。
【０１４４】
実施形態において、イソブタノールが生成される。実施形態において、イソブタノールの生成方法は以下を含む：
【０１４５】
（ａ）イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの基質から生成物への変換を触媒し、且つ以下の特徴の１つ以上を有する異種ポリペプチドを含む組換え宿主細胞を提供するステップ：
【０１４６】
（ｉ）低級アルキルアルデヒドのＫＭ値が、そのポリペプチドについて、配列番号２６のアミノ酸配列を有する対照ポリペプチドと比べて低いこと；
【０１４７】
（ｉｉ）そのポリペプチドについての低級アルキルアルデヒドに対するＫＩ値が、配列番号２６のアミノ酸配列を有する対照ポリペプチドと比べて高いこと；
【０１４８】
（ｉｉｉ）そのポリペプチドについての低級アルキルアルデヒドに対するｋｃａｔ／ＫＭ値が、配列番号２６のアミノ酸配列を有する対照ポリペプチドと比べて高いこと；及び
【０１４９】
（ｂ）イソブタノールが生成される条件下で（ａ）の宿主細胞を炭素基質と接触させるステップ。
【０１５０】
実施形態において、２−ブタノールが生成される。実施形態において、２−ブタノールの生成方法は以下を含む：
【０１５１】
（ａ）２−ブタノンから２−ブタノールへの基質から生成物への変換を触媒し、且つ以下の特徴の１つ以上を有する異種ポリペプチドを含む組換え微生物宿主細胞を提供するステップ：
【０１５２】
（ｉ）低級アルキルアルデヒドに対するＫＭ値が、そのポリペプチドについて、配列番号２６のアミノ酸配列を有する対照ポリペプチドと比べて低いこと；
【０１５３】
（ｉｉ）そのポリペプチドについての低級アルキルアルコールに対するＫＩ値が、配列番号２６のアミノ酸配列を有する対照ポリペプチドと比べて高いこと；及び
【０１５４】
（ｉｉｉ）そのポリペプチドについての低級アルキルアルデヒドに対するｋｃａｔ／ＫＭ値が、配列番号２６のアミノ酸配列を有する対照ポリペプチドと比べて高いこと；及び
【０１５５】
（ｂ）２−ブタノールが生成される条件下で（ａ）の宿主細胞を炭素基質と接触させるステップ。
【０１５６】
実施形態において、１−ブタノールが生成される。実施形態において、１−ブタノールの生成方法は以下を含む：
【０１５７】
（ａ）ブチルアルデヒドから１−ブタノールへの基質から生成物への変換を触媒し、且つ以下の特徴の１つ以上を有する異種ポリペプチドを含む組換え微生物宿主細胞を提供するステップ：
【０１５８】
（ｉ）低級アルキルアルデヒドに対するＫＭ値が、そのポリペプチドについて、配列番号２６のアミノ酸配列を有する対照ポリペプチドと比べて低いこと；
【０１５９】
（ｉｉ）そのポリペプチドについての低級アルキルアルコールに対するＫＩ値が、配列番号２６のアミノ酸配列を有する対照ポリペプチドと比べて高いこと；及び
【０１６０】
（ｉｉｉ）そのポリペプチドについての低級アルキルアルデヒドに対するｋｃａｔ／Ｋ
Ｍ値が、配列番号２６のアミノ酸配列を有する対照ポリペプチドと比べて高いこと；及び
【０１６１】
（ｂ）１−ブタノールが生成される条件下で（ａ）の宿主細胞を炭素基質と接触させるステップ。
【０１６２】
生合成経路
１−ブタノール生合成経路（Ｄｏｎａｌｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許出願公開第２００８０１８２３０８Ａ１号明細書、参照により本明細書に援用される）、２−ブタノール生合成経路（Ｄｏｎａｌｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許出願公開第２００７０２５９４１０Ａ１号明細書及び同第２００７０２９２９２７号明細書、及び同第２００９０１５５８７０号明細書、全て参照により本明細書に援用される）、及びイソブタノール生合成経路（Ｍａｇｇｉｏ−Ｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許出願公開第２００７００９２９５７号明細書、参照により本明細書に援用される）を発現する組換え微生物生成宿主は、当該技術分野において記載がなされている。それらには、指示される基質から生成物への変換の触媒能を有する特定の好適なタンパク質が記載され、及び当該技術分野では他の好適なタンパク質が記載されている。当業者は、かかる経路ステップの活性を有するポリペプチドを様々な供給源から単離することができ、本明細書に開示される組換え宿主細胞に使用し得ることを理解するであろう。例えば、米国特許出願公開第２００８０２６１２３０号明細書及び同第２００９０１６３３７６号明細書、同第２０１００１９７５１９号明細書、及び米国特許出願第１２／８９３０７７号明細書は、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼについて記載し；米国特許出願公開第２００７００９２９５７号明細書及び同第２０１０００８１１５４号明細書は、好適なジヒドロキシ酸デヒドラターゼについて記載している。
【０１６３】
当業者は、本開示から学ぶことで、公的に利用可能な配列を利用して、本明細書に提供される宿主細胞における関連経路を構築することができるであろう。加えて当業者は、本開示から学ぶことで、他の好適なイソブタノール経路、１−ブタノール経路、又は２−ブタノール経路を理解するであろう。
【０１６４】
イソブタノール生合成経路
イソブタノールは、炭水化物源から組換え微生物によって様々な生合成経路を介して生成され得る。ピルベートをイソブタノールに変換する好適な経路には、図６に示す４つの完全な反応経路が含まれる。好適なイソブタノール経路（図６、ステップａ〜ｅ）は、以下の基質から生成物への変換を含む：
【０１６５】
ａ）例えばアセト乳酸シンターゼにより触媒されるとおりの、ピルベートからアセトラクテートへの変換、
【０１６６】
ｂ）例えばアセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼにより触媒されるとおりの、アセトラクテートから２，３−ジヒドロキシイソバレレートへの変換、
【０１６７】
ｃ）例えばアセトヒドロキシ酸デヒドラターゼにより触媒されるとおりの、２，３−ジヒドロキシイソバレレートからα−ケトイソバレレートへの変換、
【０１６８】
ｄ）例えば分枝鎖ケト酸デカルボキシラーゼにより触媒されるとおりの、α−ケトイソバレレートからイソブチルアルデヒドへの変換、及び
【０１６９】
ｅ）例えば分枝鎖アルコールデヒドロゲナーゼにより触媒されるとおりの、イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの変換。
【０１７０】
ピルベートからイソブタノールへの変換に好適な別の経路は、以下の基質から生成物への変換を含む（図６、ステップａ、ｂ、ｃ、ｆ、ｇ、ｅ）：
【０１７１】
ａ）例えばアセト乳酸シンターゼにより触媒されるとおりの、ピルベートからアセトラクテートへの変換、
【０１７２】
ｂ）例えばアセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼにより触媒されるとおりの、アセトラクテートから２，３−ジヒドロキシイソバレレートへの変換、
【０１７３】
ｃ）例えばアセトヒドロキシ酸デヒドラターゼにより触媒されるとおりの、２，３−ジヒドロキシイソバレレートからα−ケトイソバレレートへの変換、
【０１７４】
ｆ）例えば分枝鎖ケト酸デヒドロゲナーゼにより触媒されるとおりの、α−ケトイソバレレートからイソブチリルＣｏＡへの変換、
【０１７５】
ｇ）例えばアシル化アルデヒドデヒドロゲナーゼにより触媒されるとおりの、イソブチリルＣｏＡからイソブチルアルデヒドへの変換、及び
【０１７６】
ｅ）例えば分枝鎖アルコールデヒドロゲナーゼにより触媒されるとおりの、イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの変換。
【０１７７】
この経路の最初の３ステップ（ａ、ｂ、ｃ）は、上記に記載されるものと同じである。
【０１７８】
ピルベートからイソブタノールへの変換に好適な別の経路は、以下の基質から生成物への変換を含む（図６、ステップａ、ｂ、ｃ、ｈ、ｉ、ｊ、ｅ）：
【０１７９】
ａ）例えばアセト乳酸シンターゼにより触媒されるとおりの、ピルベートからアセトラクテートへの変換、
【０１８０】
ｂ）例えばアセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼにより触媒されるとおりの、アセトラクテートから２，３−ジヒドロキシイソバレレートへの変換、
【０１８１】
ｃ）例えばアセトヒドロキシ酸デヒドラターゼにより触媒されるとおりの、２，３−ジヒドロキシイソバレレートからα−ケトイソバレレートへの変換、
【０１８２】
ｈ）例えばバリンデヒドロゲナーゼ又はトランスアミナーゼにより触媒されるとおりの、α−ケトイソバレレートからバリンへの変換、
【０１８３】
ｉ）例えばバリンデカルボキシラーゼにより触媒されるとおりの、バリンからイソブチルアミンへの変換、
【０１８４】
ｊ）例えばω−トランスアミナーゼにより触媒されるとおりの、イソブチルアミンからイソブチルアルデヒドへの変換、及び
【０１８５】
ｅ）例えば分枝鎖アルコールデヒドロゲナーゼにより触媒されるとおりの、イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの変換。
【０１８６】
この経路の最初の３ステップ（ａ、ｂ、ｃ）は、上記に記載されるものと同じである。
【０１８７】
第４の好適なイソブタノール生合成経路は、図６にステップｋ、ｇ、ｅとして示す基質から生成物への変換を含む。
【０１８８】
１−ブタノール生合成経路
１−ブタノールの生成に好適な生合成経路の一例が、米国特許出願公開第２００８／０１８２３０８  Ａ１号明細書に開示される。この文献に開示されるとおり、開示される１−ブタノール生合成経路のステップは以下の変換を含む：
【０１８９】
−例えばアセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼにより触媒されるとおりの、アセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡへの変換；
【０１９０】
−例えば３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼにより触媒されるとおりの、アセトアセチルＣｏＡから３−ヒドロキシブチリルＣｏＡへの変換；
【０１９１】
−例えばクロトナーゼにより触媒されるとおりの、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡからクロトニルＣｏＡへの変換；
【０１９２】
−例えばブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼにより触媒されるとおりの、クロトニルＣｏＡからブチリルＣｏＡへの変換；
【０１９３】
−例えばブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼにより触媒されるとおりの、ブチリルＣｏＡからブチルアルデヒドへの変換；及び
【０１９４】
−例えばブタノールデヒドロゲナーゼにより触媒されるとおりの、ブチルアルデヒドから１−ブタノールへの変換。
【０１９５】
２−ブタノール生合成経路
２−ブタノールの生成に好適な生合成経路の一例が、Ｄｏｎａｌｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．により米国特許出願公開第２００７０２５９４１０Ａ１号明細書及び同第２００７０２９２９２７Ａ１号明細書、並びに国際公開第２００７／１３０５２１号パンフレット（これらは全て、参照により本明細書に援用される）に記載されている。好適な２−ブタノール生合成経路のステップは、以下の基質から生成物への変換を含む：
【０１９６】
ａ）ピルベートからα−アセトラクテートへの変換、例えばアセト乳酸シンターゼにより触媒され得る；
【０１９７】
ｂ）α−アセトラクテートからアセトインへの変換、例えばアセト乳酸デカルボキシラーゼにより触媒され得る；
【０１９８】
ｃ）アセトインから２，３−ブタンジオールへの変換、例えばブタンジオールデヒドロゲナーゼにより触媒され得る；
【０１９９】
ｄ）２，３−ブタンジオールから２−ブタノンへの変換、例えばブタンジオールデヒドラターゼにより触媒され得る；及び
【０２００】
ｅ）２−ブタノンから２−ブタノールへの変換、例えば２−ブタノールデヒドロゲナーゼにより触媒され得る。
【０２０１】
追加的な修飾
本明細書に提供される細胞において有用であり得る追加的な修飾として、米国特許出願公開第２００９０３０５３６３号明細書（参照により本明細書に援用される）に記載されるとおりの、ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性及び／又はグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を還元する修飾、米国特許出願公開第２０１００１２０１０５号明細書（参照により本明細書に援用される）に記載されるとおりの、エントナー・ドゥドロフ経路又は還元等価物の平衡を介した炭素フラックスの増加をもたらす宿主細胞に対する修飾が挙げられる。その活性にＦｅ−Ｓクラスターの結合を必要とする異種タンパク質の活性が増加した酵母株が、米国特許出願公開第２０１０００８１１７９号明細書（参照により本明細書に援用される）に記載されている。他の修飾としては、米国仮特許出願第６１／２９０，６３９号明細書に記載される、二元的役割のヘキソキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする内因性ポリヌクレオチドにおける修飾、米国仮特許出願第６１／３８０５６３号明細書に記載される、ピルビン酸を利用する生合成経路のステップを触媒するポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドの組込み（参照される仮出願は、双方とも全体として参照により本明細書に援用される）が挙げられる。本明細書の実施形態に好適であり得るさらなる修飾が、米国特許出願第１２／８９３０８９号明細書に記載される。
【０２０２】
加えて、Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響を及ぼすポリペプチドをコードする内因性遺伝子に、少なくとも１つの欠失、突然変異、及び／又は置換を含む宿主細胞が、米国仮特許出願第６１／３０５３３３号明細書（参照により本明細書に援用される）に記載され、並びにホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含む宿主細胞、及びホスホトランスアセチラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含む宿主細胞が、米国仮特許出願第６１／３５６３７９号明細書に記載される。
【０２０３】
高活性ＡＤＨ酵素の同定及び単離
本発明は、イソブタノール生産用に改変した宿主生物におけるイソブチルアルデヒドからイソブタノールへの変換に関して戦略を考案し、及び優れた特性を有するいくつかのＡＤＨ酵素を同定することに関する。ＡＤＨ候補選択の過程には、自然界に存在する酵素における検索が関わる。酵素の同定は、その性質、すなわち好ましい基質としてアルデヒドを利用し、且つそのアルデヒドをそれぞれのアルコールへと、文献例により実証されるとおりの、対応するアルデヒド基質に対する適度に高いｋｃａｔ値及び／又は低いＫＭ値で変換する性質に基づき行われる。一組の候補が同定されると、この戦略には、その一組を用いて近縁関係にある相同体をバイオインフォマティクス解析により分離することが関わる。従って一実施形態において、本発明のスクリーニング方法は、候補ＡＤＨ酵素に対してバイオインフォマティクス又は文献検索を行うステップを含む。一実施形態において、バイオインフォマティクス探索には系統発生解析が用いられる。
【０２０４】
候補遺伝子のタンパク質をコードするＤＮＡ配列は、宿主生物から直接増幅されるか、或いは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの宿主細胞における発現用にコドン最適化された合成遺伝子として入手される。本明細書で利用される様々なＡＤＨ候補を表３に掲載する。
【０２０５】
【表５】
0005947219.tif 000006
【０２０６】
本発明は表３に掲載するＡＤＨ酵素に限定されない。これらの候補との配列相同性に基づきさらなる候補を同定することができ、又はこれらの配列から突然変異生成及び／又はタンパク質進化によって候補を誘導することができる。好適なＡＤＨ酵素には、本明細書
に提供される配列と少なくとも約９５％の同一性を有するＡＤＨ酵素が含まれる。
【０２０７】
表４及び表５は、表３に提供する候補ＡＤＨ酵素の、それぞれポリヌクレオチド配列（配列番号２、３、４、５、及び６を除いては大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）での発現用にコドン最適化されている）及びポリペプチド配列を提供する。
【０２０８】
【表６】
0005947219.tif 000007
【０２０９】
【表７】
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【０２１０】
【表８】
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【０２１１】
【表９】
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【０２１２】
【表１０】
0005947219.tif 000011
【０２１３】
【表１１】
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【０２１４】
【表１２】
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【０２１５】
【表１３】
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【０２１６】
【表１４】
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【０２１７】
【表１５】
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【０２１８】
【表１６】
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【０２１９】
一実施形態において、アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有する候補ポリペプチドのスクリーニング方法は以下を含む：
【０２２０】
（ａ）低級アルキルアルコールの存在下又は非存在下で候補ポリペプチドについての低級アルキルアルデヒドによる補因子酸化速度を計測するステップ；及び
【０２２１】
（ｂ）低級アルキルアルコールの存在下又は非存在下で対照ポリペプチドより速く補因
子を酸化する候補ポリペプチドのみを選択するステップ。一実施形態において、（ｂ）は、低級アルキルアルコールの存在下又は非存在下のいずれにおいても対照ポリペプチドより速く補因子を酸化する候補ポリペプチドのみを選択することを含む。一実施形態において、補因子はＮＡＤＨである。別の実施形態において、補因子はＮＡＤＰＨである。さらに別の実施形態において、対照ポリペプチドは配列番号２１のアミノ酸配列を有するＨＬＡＤＨである。さらに別の実施形態において、対照ポリペプチドは、配列番号２６のアミノ酸配列を有するアクロモバクター・キシロスオキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）ＳａｄＢである。別の実施形態において、ステップ（ａ）はＡ３４０ｎｍの変化を観察することを含む。
【０２２２】
別の実施形態において、アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有する候補ポリペプチドのスクリーニング方法は以下を含む：
【０２２３】
（ａ）候補ポリペプチドについての以下の値の１つ以上を計測するステップ：
【０２２４】
（ｉ）低級アルキルアルデヒドに対するＫＭ値；
【０２２５】
（ｉｉ）低級アルキルアルコールに対するＫＩ値；及び
【０２２６】
（ｉｉｉ）ｋｃａｔ／ＫＭ；及び
【０２２７】
（ｂ）以下の特徴の１つ以上を有する候補ポリペプチドのみを選択するステップ：
【０２２８】
（ｉ）低級アルキルアルデヒドに対するＫＭ値が対照ポリペプチドと比べて低い；
【０２２９】
（ｉｉ）低級アルキルアルコールに対するＫＩ値が対照ポリペプチドと比べて高い；及び
【０２３０】
（ｉｉｉ）低級アルキルアルデヒドに対するｋｃａｔ／ＫＭ値が対照ポリペプチドより高い。
【０２３１】
さらに別の実施形態において、対照ポリペプチドは、配列番号２６のアミノ酸配列を有するアクロモバクター・キシロスオキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）ＳａｄＢである。別の実施形態において、選択される候補ポリペプチドは上記の特徴の２つ以上を有する。別の実施形態において、選択される候補ポリペプチドは上記の特徴の３つ以上を有する。別の実施形態において、選択される候補ポリペプチドはＮＡＤＨを補因子として選択的に使用する。
【０２３２】
本発明の一実施形態において、本発明のスクリーニング方法での使用に好適なポリヌクレオチド配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、及び配列番号２０と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のヌクレオチド配列を含む。本発明の別の実施形態において、本発明のスクリーニング方法での使用に好適なポリヌクレオチド配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、及び配列番号２０又はその活性な変異体、断片若しくは誘導体からなる群から選択することができる。一実施形態において、ポリヌクレオチドは、特定の宿主細胞での発現用にコドン最適化されている。
【０２３３】
本発明の一実施形態において、本発明のスクリーニング方法での使用に好適な候補ポリペプチドは、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、及び配列番号４０と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を有する。本発明の別の実施形態において、本発明のスクリーニング方法での使用に好適な候補ポリペプチドは、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、及び配列番号４０、又はその活性な変異体、断片若しくは誘導体からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。一実施形態において、本発明のスクリーニング方法での使用に好適な候補ポリペプチドは、特定の宿主細胞での発現用にコドン最適化されている。
【０２３４】
本発明の一実施形態において、本発明のスクリーニング方法での使用に好適なポリヌクレオチド配列は、配列番号２と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を有する。別の実施形態において、ポリヌクレオチドは配列番号２のヌクレオチド配列又はその活性な変異体、断片若しくは誘導体を含む。
【０２３５】
本発明の一実施形態において、本スクリーニング方法で使用される候補ポリペプチドは、配列番号２２と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、候補ポリペプチドは、配列番号２２のアミノ酸配列又はその活性な変異体、断片若しくは誘導体を含む。
【０２３６】
本発明の一実施形態において、本スクリーニング方法での使用に好適なポリヌクレオチド配列は、配列番号３と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を有する。別の実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号３のヌクレオチド配列又はその活性な変異体、断片若しくは誘導体を含む。
【０２３７】
本発明の一実施形態において、本スクリーニング方法で使用される候補ポリペプチドは、配列番号２３と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、候補ポリペプチドは、配列番号２３のアミノ酸配列又はその活性な変異体、断片若しくは誘導体を含む。
【０２３８】
本発明の一実施形態において、本スクリーニング方法で使用されるポリヌクレオチド配列は、配列番号１１と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を有する。別の実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号１１のヌクレオチド配列又はその活性な変異体、断片若しくは誘導体を含む。
【０２３９】
本発明の一実施形態において、本スクリーニング方法で使用される候補ポリペプチドは、配列番号３１と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、候補ポリペプチドは、配列番号３１のアミノ酸配列又はその活性な変異体、断片若しくは誘導体を含む。
【０２４０】
本発明の一実施形態において、本スクリーニング方法で使用されるポリヌクレオチド配列は、配列番号９と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を有する。別の実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号９のヌクレオチド配列又はその活性な変異体、断片若しくは誘導体を含む。
【０２４１】
本発明の一実施形態において、本スクリーニング方法で使用される候補ポリペプチドは、配列番号２９と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、候補ポリペプチドは、配列番号２９のアミノ酸配列又はその活性な変異体、断片若しくは誘導体を含む。
【０２４２】
別の実施形態において、候補ポリペプチドのスクリーニング方法から、最高約７０℃までの温度でアルデヒドからアルコールへの変換の触媒能を有する選択された候補ポリペプチドが得られる。別の実施形態において、スクリーニング方法から、約１０℃、１５℃、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、又は７０℃の温度でアルデヒドからアルコールへの変換の触媒能を有する選択された候補ポリペプチドが得られる。別の実施形態において、スクリーニング方法から、約３０℃の温度でアルデヒドからアルコールへの変換の触媒能を有する選択された候補ポリペプチドが得られる。
【０２４３】
別の実施形態において、候補ポリペプチドのスクリーニング方法から、約４〜約９のｐＨでアルデヒドからアルコールへの変換の触媒能を有する選択された候補ポリペプチドが得られる。別の実施形態において、スクリーニング方法から、約５〜約８のｐＨでアルデヒドからアルコールへの変換の触媒能を有する選択された候補ポリペプチドが得られる。別の実施形態において、スクリーニング方法から、約６〜約７のｐＨでアルデヒドからアルコールへの変換の触媒能を有する選択された候補ポリペプチドが得られる。別の実施形態において、スクリーニング方法から、約６．５〜約７のｐＨでアルデヒドからアルコールへの変換の触媒能を有する選択された候補ポリペプチドが得られる。別の実施形態において、スクリーニング方法から、約４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、又は９のｐＨでアルデヒドからアルコールへの変換の触媒能を有する選択された候補ポリペプチドが得られる。別の実施形態において、スクリーニング方法から、約７のｐＨでアルデヒドからアルコールへの変換の触媒能を有する選択された候補ポリペプチドが得られる。
【０２４４】
別の実施形態において、候補ポリペプチドのスクリーニング方法から、最大約５０ｇ／Ｌまでの濃度の低級アルキルアルコールの存在下でアルデヒドからアルコールへの変換を触媒することのできる選択された候補ポリペプチドが得られる。別の実施形態において、スクリーニング方法から、約１０ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、２５ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、３５ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、４５ｇ／Ｌ、又は５０ｇ／Ｌの濃度でアルデヒドからアルコールへの変換の触媒能を有する選択された候補ポリペプチドが得られる。別の実施形態において、スクリーニング方法から、少なくとも約２０ｇ／Ｌの濃度でアルデヒドからアルコールへの変換を触媒能を有する選択された候補ポリペプチドが得られる。
【０２４５】
本発明のスクリーニング方法で使用することのできる低級アルキルアルコールの非限定的な例としては、ブタノール、イソブタノール、プロパノール、イソプロパノール、及びエタノールが挙げられる。一実施形態において、スクリーニング方法で使用される低級アルキルアルコールはイソブタノールである。
【０２４６】
特に定義されない限り、本明細書で使用される科学技術用語は全て、本発明が属する技術分野の当業者が一般的に理解するのと同じ意味を有する。対立がある場合、定義を含む本願が優先される。また、別途文脈により必要とされない限り、単数形の用語は複数を含むものとし、及び複数形の用語は単数を含むものとする。本明細書で言及される全ての刊行物、特許及び他の参考文献は、あらゆる目的から全体として参照により援用される。
【実施例】
【０２４７】
本発明は、以下の実施例にさらに定義される。これらの実施例は本発明の実施形態を示しているが、例示として提供されるに過ぎないことは理解されなければならない。上記の考察及びこれらの実施例から、当業者は本発明の本質的な特徴を確認することができ、及びその趣旨及び範囲から逸脱することなく、本発明を様々な使用及び条件に適合させるためその様々な変更及び改良を実施することができる。
【０２４８】
一般的方法
本実施例で用いられる標準的な組換えＤＮＡ技術及び分子クローニング技術は当該技術分野において公知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，１９８９，本明細書ではＭａｎｉａｔｉｓと称する）及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，発行元Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９８７）により記載されている。
【０２４９】
細菌培養物の維持及び成長に好適な材料及び方法は、当該技術分野において公知である。以下の例での使用に好適な技法は、Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（Ｐｈｉｌｌｉｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ．，１９９４）のなかに、又はＴｈｏｍａｓ  Ｄ．  Ｂｒｏｃｋにより（Ｂｒｏｃｋ，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ（１９８９）のなかに記載されるとおりのものが見出され得る。細菌細胞の維持及び成長に使用される全ての試薬、制限酵素及び材料は、特記しない限り、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、ＢＤ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ＨｉＭｅｄｉａ（Ｍｕｍｂａｉ，Ｉｎｄｉａ）、ＳＤ  Ｆｉｎｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｉｎｄｉａ）、又はタカラバイオ株式会社（日本国滋賀県）から入手した。
【０２５０】
略称の意味は以下のとおりである：「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｈ」は時間を意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味し、「ｕＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「ｍｇ／ｍＬ」はミリグラム毎ミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味し、「ｍＭ」はミリモル濃度を意味し、「Ｍ」はモル濃度を意味し、「ｍｍｏｌ」はミリモルを意味し、「μモル」はマイクロモルを意味し、「ｋｇ」はキログラムを意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、及び「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「ＰＣＲ」はポリメラーゼ連鎖反応を意味し、「ＯＤ」は光学濃度を意味し、「ＯＤ６００」は６００ｎｍの波長で計測される光学濃度を意味し、「ｋＤａ」はキロダルトンを意味し、「ｇ」はまた重力定数を意味することもあり、「ｂｐ」は塩基対を意味し、「ｋｂｐ」はキロ塩基対を意味し、「ｋｂ」はキロベースを意味し、「％」はパーセントを意味し、「％ｗ／ｖ」は重量／体積パーセントを意味し、「％ｖ／ｖ」は重量／重量パーセントを意味し、「ＨＰＬＣ」は高速液体クロマトグラフィーを意味し、「ｇ／Ｌ」はグラム毎リットルを意味し、「μｇ／Ｌ」はマイクログラム毎リットルを意味し、「ｎｇ／μＬ」はナノグラム毎マイクロリットルを意味し、「ｐｍｏｌ／μＬ」はピコモル毎マイクロリットルを意味し、「ＲＰＭ」は毎分回転数を意味し、「μｍｏｌ／分／ｍｇ」はマイクロモル毎分毎ミリグラムを意味し、「ｗ／ｖ」は体積当たり重量を意味し、「ｖ／ｖ」は重量当たり重量を意味する。
【０２５１】
実施例１
可能性のあるスクリーニング用イソブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼの選択
この例は、効率的なイソブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼを同定するためのいくつかのＡＤＨ候補酵素の選択基準について記載する。文献のエビデンスに基づき、分析用にクロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）ブタノールデヒドロゲナーゼＡ及びＢ（ＢｄｈＡ及びＢｄｈＢ）を選択した。１−ブタノールを含有する培地上で環境スラッジ試料を濃縮することにより、アクロモバクター・キシロスオキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）を選択した。次に生物を培養して、ブタノールデヒドロゲナーゼ活性を含むタンパク質画分の精製に使用し、それに続いて米国特許出願公開第２００９−０２６９８２３  Ａ１号明細書に記載されるとおり、第二級アルコールデヒドロゲナーゼＢ（ＳａｄＢ）に対応する遺伝子をクローニングした。ウマ肝臓ＡＤＨ酵素（ＨＬＡＤＨ）は市販されており、及びそれはイソブタノール酸化活性を有することが、Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．によりＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：７７９２（１９９３）に報告された。
【０２５２】
イソブタノール生成経路に理想的なイソブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ候補の望ましい特性は上記に記載した。
【０２５３】
広範な文献検索により、イソブチルアルデヒド若しくは他の密接な関係を有するアルデヒドに対して高いｋｃａｔ値及び／又は低いＫＭ値を有するか、又はイソブタノール若しくは他の密接な関係を有するアルコールに対してより低いｋｃａｔ及び／又はより高いＫＭを有するかのいずれかである候補ＡＤＨ酵素が同定された。ウマ肝臓ＡＤＨ、アクロモバクター・キシロスオキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）ＳａｄＢ、及びサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＤＨ６を問い合わせ配列としてそれぞれ使用して、ＮＣＢＩにおいて重複のないタンパク質配列データベース（ｎｒ）に対するタンパク質ＢＬＡＳＴ検索を実施した。全てのＢＬＡＳＴヒットを収集して組み合わせ、そこから互いに９５％より高い配列同一性を有する配列を除いた。残りの一組の９５％−重複のない配列から多重配列アラインメント（ＭＳＡ）を作成し、そのＭＳＡから近隣結合法を用いて系統樹を生成し
た。同様に、複数の選択したＡＤＨ酵素についてＭＳＡ及び系統樹を個別に生成し、各酵素の近縁関係にある相同体を同定し、ここでアラインメントは、標的酵素を問い合わせ配列として使用して得られたＢＬＡＳＴヒットのみからなった。それらの酵素には、アクロモバクター・キシロスオキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）ＳａｄＢ、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＤＨ６、及びサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＤＨ７が含まれた。これらの分析に基づき、能力評価用のいくつかの候補を選択した（表３）。
【０２５４】
実施例２
クローニング、タンパク質発現及び精製、並びに好適なイソブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼのスクリーニング
この例は、過剰発現／精製用のＡＤＨ遺伝子コンストラクトの調製及び経時変化アッセイを用いた酵素活性の計測について記載する。ウマ肝臓ＡＤＨ（ＨＬＡＤＨ；Ａ−６１２８）をＳｉｇｍａから購入した。アクロモバクター・キシロスオキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）ＳａｄＢ（ＳａｄＢ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＤＨ６（ＳｃＡＤＨ６）及びＡＤＨ７（ＳｃＡＤＨ７）、赤痢アメーバ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）ＡＤＨ１（ＥｈＡＤＨ１）、ウシ（Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ）アルデヒドレダクターゼ（ＢｔＡＲＤ）、ベイジェリンキア・インディカ・サブエスピー・インディカ（Ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉａ  ｉｎｄｉｃａ  ｓｕｂｓｐ．Ｉｎｄｉｃａ）ＡＴＣＣ  ９０３９（ＢｉＡＤＨ）、クロストリジウム・ベイジェリンキ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）ＡＤＨ（ＣｂＡＤＨ）、ラナ・ペレジ（Ｒａｎａ  ｐｅｒｅｚｉ）ＡＤＨ８（ＲｐＡＤＨ８）、ドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）ＡＤＨ１（ＲｎＡＤＨ１）、サーマス・エスピー（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｐ．）ＡＴＮ１  ＡＤＨ（ＴＡＤＨ）、フェニロバクテリウム・ズシネウム（Ｐｈｅｎｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｚｕｃｉｎｅｕｍ）ＨＬＫ１  ＡＤＨ（ＰｚＡＤＨ）、メチロセラ・シルベストリス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｅｌｌａ  ｓｉｌｖｅｓｔｒｉｓ）ＢＬ２  ＡＤＨ（ＭｓＡＤＨ）、アシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ）ＡＹＥ  ＡＤＨ（ＡｂＡＤＨ）、ゲオバチルス・エスピー（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＷＣＨ７０  ＡＤＨ（ＧｂＡＤＨ）、バンデルワルトジマ・ポリスポラ（Ｖａｎｄｅｒｗａｌｔｏｚｙｍａ  ｐｏｌｙｓｐｏｒａ）ＤＳＭ  ７０２９４  ＡＤＨ（ＶｐＡＤＨ）、ムコール・シルシネロイデス（Ｍｕｃｏｒ  ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ）ＡＤＨ（ＭｃＡＤＨ）、及びロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＰＲ４  ＡＤＨ（ＲｅＡＤＨ）が、タンパク質発現及び精製用にサブクローンを調製する候補であった。
【０２５５】
ＡＤＨ候補を発現するプラスミドコンストラクトの構築
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）での発現用にコドンを最適化した後、ＥｈＡＤＨ１、ＢｔＡＲＤ、ＣｂＡＤＨ、ＢｉＡＤＨ、及びＲｐＡＤＨ８の遺伝子コード領域をＤＮＡ  ２．０（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）により合成し、ＲｎＡＤＨ１、ＴＡＤＨ、ＰｚＡＤＨ、ＭｓＡＤＨ、ＡｂＡＤＨ、ＧｂＡＤＨ、ＶｐＡＤＨ、ＭｃＡＤＨ、及びＲｅＡＤＨの遺伝子コード領域をＧＥＮＥＡＲＴ  ＡＧ（独国）により合成した。これらの候補のアミノ酸配列はＧｅｎｂａｎｋタンパク質データベースから入手し、コドン最適化のためＤＮＡ  ２．０又はＧｅｎｅａｒｔ  ＡＧに提供した。各コード領域には、コード配列の５’末端及び３’末端でそれぞれＸｈｏＩ部位及びＫｐｎＩ部位が隣接した。これらのコンストラクトをクローニングし、ＤＮＡ  ２．０のベクターｐＪ２０１又はＧｅｎｅａｒｔのｐＭＡベクターのいずれかに供給した。
【０２５６】
プラスミドを化学的にコンピテントなＴＯＰ１０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換し、それらの形質転換体を、２５ｍｇ／ｍｌカナマイシン又は１００ｍｇ／ｍｌアンピシリンのいずれかを含有する液体ＬＢ培地において成長させることにより増幅した。一晩培養物（３７℃で成長させた）から精製したプラスミドをＸｈｏＩ（ＮＥＢ；Ｒ０１４６）及びＫｐｎＩ（ＮＥＢ；Ｒ０１４２）で制限処理し、タカラバイオ株式会社からのＤＮＡライゲーションキット  バージョン２．１（６０２２）を使用して、ベクターｐＢＡＤＨｉｓＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｖ４３００１）においてＮ末端ヘキサヒスチジンタグとインフレームで対応する部位にライゲートした。
【０２５７】
ライゲーション産物を化学的にコンピテントなＴＯＰ１０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃ４０４０−５０）に形質転換した。形質転換細胞を、ＬＢ培地＋１００ｍｇ／ｍＬアンピシリンを含有するプレートにストリーキングした。ＡＤＨ挿入物を含有するクローンをＸｈｏＩ／ＫｐｎＩでの制限消化により確認した。正しい挿入物を有するプラスミドは、いずれの場合も予想される１．２ｋｂｐバンドを含んだ。クローニングした配列をＤＮＡ配列決定により確認した。得られたクローンは、それぞれｐＢＡＤＨｉｓＡ：：ＥｈＡＤＨ１、ｐＢＡＤＨｉｓＡ：：ＢｔＡＲＤ、ｐＢＡＤＨｉｓＡ：：ＣｂＡＤＨ、ｐＢＡＤＨｉｓＡ：：ＢｉＡＤＨ、ｐＢＡＤＨｉｓＡ：：ＲｐＡＤＨ８、ｐＢＡＤＨｉｓＡ：：ＲｎＡＤＨ１、ｐＢＡＤＨｉｓＡ：：ＴＡＤＨ、ｐＢＡＤＨｉｓＡ：：ＰｚＡＤＨ、ｐＢＡＤＨｉｓＡ：：ＭｓＡＤＨ、ｐＢＡＤＨｉｓＡ：：ＡｂＡＤＨ、ｐＢＡＤＨｉｓＡ：：ＧｂＡＤＨ、ｐＢＡＤＨｉｓＡ：：ＶｐＡＤＨ、ｐＢＡＤＨｉｓＡ：：ＭｃＡＤＨ、及びｐＢＡＤＨｉｓＡ：：ＲｅＡＤＨと命名した。
【０２５８】
先に調べた酵素ＳａｄＢを、製品マニュアルに記載される手順に従いｐＴｒｃ９９ａ：：ＳａｄＢからプライマーＳａｄＢＸｈｏＩ−ｆ（ＣＣＡＴＧＧＡＡＴＣＴＣＧＡＧＡＴＧＡＡＡＧＣＴＣＴＧＧＴＴＴＡＣＣ、配列番号４１）及びＳａｄＢＫｐｎＩ−ｒ（ＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧＴＡＣＣＧＡＧＣＴＣＧＡＡＴＴＣ、配列番号４２）を使用してＫＯＤポリメラーゼ酵素（Ｎｏｖａｇｅｎ）でＰＣＲ増幅し、それぞれ５’末端及び３’末端にＸｈｏＩ部位及びＫｐｎＩ部位を導入した。アガロースゲル電気泳動によりＰＣＲ産物を確認した後、１．２ｋｂのＰＣＲ産物をＸｈｏＩ及びＫｐｎＩで制限処理し、他の候補遺伝子に関して上記に記載したとおりｐＢＡＤＨｉｓＡにクローニングした。ＳｃＡＤＨ６及びＳｃＡＤＨ７の遺伝子の各々を、ＳｃＡＤＨ６についてはプライマーＡＤＨ６＿ＸｈｏＩ＿ｆ（ＣＡＡＧＡＡＡＡＣＴＣＧＡＧＡＴＣＡＴＧＴＣＴＴＡＴＣＣＴＧＡＧ、配列番号４３）及びＡＤＨ６＿ＫｐｎＩ＿ｒ（ＧＡＧＣＴＴＧＧＴＡＣＣＣＴＡＧＴＣＴＧＡＡＡＡＴＴＣＴＴＴＧ、配列番号４４）を使用して、及びＳｃＡＤＨ７についてはＡＤＨ７＿ＸｈｏＩ＿ｆ（ＣＴＧＡＡＡＡＡＣＴＣＧＡＧＡＡＡＡＡＡＡＴＧＣＴＴＴＡＣＣＣ、配列番号４５）及びＡＤＨ７＿ＫｐｎＩ＿ｒ（ＧＡＡＡＡＡＴＡＴＴＡＧＧＴＡＣＣＴＡＧＡＣＴＡＴＴＴＡＴＧＧ、配列番号４６）を使用して、酵母野生型ＢＹ４７４１株（ＡＴＣＣ  ２０１３８８）の１００ｎｇのゲノムＤＮＡから増幅した。戦略及びＰＣＲ条件はＳａｄＢの増幅と同じであった。次に遺伝子を、上記に記載する手順に従いｐＢＡＤＨｉｓＡのＸｈｏＩ部位及びＫｐｎＩ部位にクローニングした。ＳａｄＢ、ＳｃＡＤＨ６及びＳｃＡＤＨ７を含むプラスミドを、それぞれｐＢＡＤＨｉｓＡ：：ＳａｄＢ、ｐＢＡＤＨｉｓＡ：：ＳｃＡＤＨ６及びｐＢＡＤＨｉｓＡ：：ＳｃＡＤＨ７と名付けた。
【０２５９】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における組換えＡＤＨの発現
示されるデータについては、ＡＤＨ酵素の過剰発現にＢＬ２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；２３０２４０）又は私有の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株のいずれかを用いた。しかしながら、市販の株、例えばＢＬ２１−ｃｏｄｏｎ  ｐｌｕｓが、ＡＤＨ酵素の過剰発現に好適であると考えられる。
【０２６０】
Ｔｏｐ１０形質転換体の３ｍＬの一晩培養物から、Ｑｉａｐｒｅｐ  ｓｐｉｎ  ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ  ＣＡ；２７１０６）を製造者の指示に従い使用して、ＡＤＨ遺伝子を含む発現プラスミド（ｐＢＡＤＨｉｓＡプラスミド）を調製した。１ｎｇの各プラスミドをＢＬ２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ又は私有の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）エレクトロコンピテント細胞のいずれかに、製造者の指示に従いＢｉｏ  ＲＡＤ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用して形質転換した。それらの形質転換細胞を、ＬＢ培地＋各１００μｇ／ｍＬのアンピシリン及びスペクチノマイシンを含有する寒天プレートに播いた。プレートを３７℃で一晩インキュベートした。これらのプレートからのコロニーを、３７℃で各１００μｇ／ｍＬのアンピシリン及びスペクチノマイシンを含有する３．０ｍＬのＬＢ培地に、２５０ｒｐｍで振盪しながら接種した。これらのスターター培養物（一晩成長させた）からの細胞を使用して１：１０００希釈で１−Ｌ培地を接種した。培養物が約０．８のＯＤに達した後、細胞を０．０２％アラビノースで誘導した。誘導は２５０ｒｐｍで振盪しながら一晩３７℃で実施した。次に、細胞を４℃で１０分間、４０００ｇで遠心することにより回収した。細胞を、完全なＥＤＴＡ不含プロテアーゼ阻害薬カクテル錠剤（Ｒｏｃｈｅ；１１８７３５８０００１）及び１ｍｇ／ｍｌのリゾチームの存在下に４℃で３０分間ロッカーに置くことにより、４０ｍｌのＢｕｇＢｕｓｔｅｒマスターミックス（Ｎｏｖａｇｅｎ；７１４５６−４）で処理して溶解した。細胞残屑を４℃で２０分間、１６，０００ｇで遠心することにより取り除いた。
【０２６１】
ブラッドフォード色素濃縮物（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用するブラッドフォードアッセイにより、試料中の総タンパク質濃度を計測した。試料及びタンパク質標準（ウシ血清アルブミン、ＢＳＡ）を、製造者のプロトコルに従い個別のキュベット（１ｍＬ反応物）又は９６ウェルマイクロプレートのいずれかにセットアップした。Ｃａｒｙ  １００  Ｂｉｏ紫外可視分光光度計（Ｖａｒｉａｎ，Ｉｎｃ．）又はＳｐｅｃｔｒａＭａｘプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）のいずれかを使用して計測した５９５ｎｍでの吸光度の値から、タンパク質濃度を計算した。
【０２６２】
ＡＤＨ酵素の精製及び活性アッセイ
上記に記載する手順に従い１リットル培養物から調製した無細胞抽出物を直接使用して、発現した様々なＡＤＨ酵素をＩＭＡＣ（固定化金属アフィニティークロマトグラフィー）アフィニティークロマトグラフィーによって５ｍＬ  ＨｉｓＴｒａｐ  ＦＦカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；１７５２５５−０１）で精製した。手順全体はＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ  １０  Ｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；１８−１１４５−０５）ＦＰＬＣシステムを使用して実施した。抽出物を３０ｍＭのイミダゾールと混合し、ＨｉｓＴｒａｐカラムに負荷した。負荷後、３０ｍＭイミダゾールを含む５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８．０（約１０〜２０カラム容量）でカラムを洗浄し、未結合のタンパク質及び非特異的に結合したタンパク質を除去した。次に３０ｍＭ〜５００ｍＭイミダゾール勾配により２０カラム容量でＡＤＨタンパク質を溶出した。ピーク画分を１０％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；ＮＰ０３０１）においてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＸＣｅｌｌ  ＳｕｒｅＬｏｃｋ  Ｍｉｎｉ−Ｇｅｌ装置（ＥＩ０００１）を使用して電気泳動した。クーマシー染色及び脱染を行うと、それらの画分は９５％超の純度であり、ＡＤＨタンパク質のみを含むことを確かめることができた。活性アッセイを実施して精製したタンパク質が活性であることを確認した。
【０２６３】
ルーチンの実施技法として粗抽出物及び精製タンパク質をブタノール酸化活性についてアッセイすることで、全精製過程にわたり組換えタンパク質が活性であることを確認した。還元方向では、補因子としてのＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨ及び過剰のイソブチルアルデヒド基質（４０ｍＭ）を用いてイソブチルアルデヒド還元アッセイを実施した。いずれの場合も酵素活性は、Ｃａｒｙ  Ｂｉｏ  １００紫外可視分光光度計（Ｖａｒｉａｎ  Ｉｎｃ．）を使用して、反応でＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨが消費されるのか（吸光度が低下する）、それとも生成されるのか（吸光度が上昇する）に応じて３４０ｎｍ吸光度の低下又は上昇を追うことにより、１ｍｌ反応物において３０℃で１分間計測した。アルコール酸化活性はｐＨ８．８の５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液で実施し、アルデヒド還元反応はｐＨ７．０の１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液でアッセイした。酵素及び補因子のストックは、実施する反応の性質に応じてそれぞれのｐＨの反応緩衝液に希釈した。緩衝液又は私有の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株（ＡＤＨプラスミド無し）から調製した細胞抽出物のいずれかを、それぞれ精製タンパク質及び無細胞抽出物を含むアッセイの陰性対照として使用した。
【０２６４】
最初の実験では、ＥｈＡＤＨ１及びＲｐＡＤＨ８でのタンパク質発現のレベルが不十分であった。続く活性アッセイでは、これらの酵素を発現する細胞抽出物においてＡＤＨ活性を検出することができなかった。同様に当初、ＢｔＡＲＤは良好なレベルのタンパク質発現を示し、タンパク質を均一になるまで精製することができたが、このアッセイに使用した条件下では検出可能な活性を有しなかった。当業者は、これらの候補に対して発現及びアッセイ条件をさらに最適化し得るものと考えられる。データを提供する他の酵素では、いずれも十分な量の活性タンパク質を精製することができた。それらの酵素全てで、イソブチルアルデヒド還元反応（上述の手順にあるとおり）においてＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨのいずれかを補因子として使用して補因子の特異性を計測した。いずれの場合も、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨのいずれかを補因子として使用したときの活性の数値には、他の形態の補因子に対応する数値と比べて少なくとも１０倍の差が認められた。表６は、一部のＡＤＨ酵素の補因子選択を要約する。
【０２６５】
【表１７】
0005947219.tif 000018
【０２６６】
準生理学的経時変化アッセイを用いた精製ＡＤＨ候補のスクリーニング
様々なＡＤＨ候補を特徴付けて比較する理想的な方法は、完全な一組の反応速度定数、すなわちアルデヒド還元及びアルコール酸化についてのｋｃａｔ値、イソブチルアルデヒド、イソブタノール、ＮＡＤ（Ｐ）及びＮＡＤ（Ｐ）Ｈに対するＫＭ値、及びイソブチルアルデヒド及びイソブタノールに対するＫＩ値を計算して比較することであり得る。多数の候補を詳細に特徴付けるとなれば、多大な時間、労力及び費用をかけることが必要となる。従って、いくつかの候補の迅速で効率的な比較を可能にする定性的アッセイを開発した。様々な酵素の能力を比較する準生理学的アッセイを設計した。こうしたアッセイは、全ての反応を一定量の各酵素で開始することを伴う。この場合、１ｕｇの各酵素を使用して、イソブチルアルデヒド及びＮＡＤＨをそれぞれ１ｍＭ及び２００μＭの濃度で含む反応を開始した。各反応の経時変化は、反応が平衡に向かって進むときの３４０ｎｍ吸光度の低下を計測することにより、１０分間追跡した。高いｋｃａｔの酵素は、低いｋｃａｔの酵素と比べて反応を平衡に向かってより速く駆動し得る。並行アッセイもまた、同じ条件下で、但し３２１ｍＭのイソブタノール（２４ｇ／Ｌ）を反応に含めて実施した。この濃度のイソブタノールにより比較的阻害されない酵素は、イソブタノールが存在しない場合の経時変化に近似した経時変化を有し得る。図１は、これらのアッセイにおいてＡＤＨ
候補酵素が示した経時変化を比較する。
【０２６７】
図１に提供される結果に基づけば、ベイジェリンキア・インディカ（Ｂｅｉｊｅｒｉｃｋｉａ  ｉｎｄｉｃａ）ＡＤＨがイソブチルアルデヒド還元反応に対して最も高いｋｃａｔを有する可能性があり、及び反応においてイソブタノールにより受ける阻害はＡＤＨ６が最も小さい可能性があると推測される。
【０２６８】
実施例３
イソブチルアルデヒドに対するｋｃａｔが高く、且つＫＭが低いベイジェリンキア・インディカ（Ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉａ  ｉｎｄｉｃａ）ＡＤＨの同定
ＡＤＨ酵素の反応速度定数を計算して比較することにより、イソブタノール生成用に人工的に改変した経路の最終ステップにおけるイソブチルアルデヒドからイソブタノールへの変換に最も望ましい特性を有する候補ＡＤＨ酵素を同定した。上記に記載するアッセイからの初速度を使用して、反応速度定数を決定するためのアッセイを実施した。ＮＡＤＨの減少は消費されるアルデヒドと相関し得る（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｂｙ  Ｖｏｅｔ  ａｎｄ  Ｖｏｅｔ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）。しかしながら、反応に使用される所与の酵素の量は０．１〜５μｇの範囲であった。所与の酵素の濃度は、１分間の時間経過にわたり初速度の計測をもたらす濃度であった。各酵素について、広範囲の基質濃度でミカエリス・メンテンプロットを生成した。ＫＭの概算を求め、それに基づき、そのＫＭ値の０．５〜１０倍の範囲の基質濃度を用いるようにアッセイを設計し直して、適切な反応速度定数を得ることができるようにした。イソブチルアルデヒド（イソブタナール）還元反応を、２００μＭのＮＡＤＨを含有する１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．０において３０℃で実施した。イソブタノールに対するＫＩを計算するときには、反応において様々な濃度のイソブタノールの存在下で（概して０〜５３５ｍＭ）同じ反応を実施した（例えば図７を参照のこと）。イソブタノール基質との反応は、７．５ｍＭのＮＡＤを含有する５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８．８において３０℃で実施した。ＳｉｇｍａＰｌｏｔ  １１（Ｓｙｓｔａｔ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．）の酵素反応速度モジュール（バージョン１．３）を使用してデータをミカエリス−メンテン式にフィットさせ、反応速度定数を計算した。指示されるＡＤＨ酵素について得られた反応速度定数を表７に示す。ｋｃａｔ／ＫＭはｋｃａｔ及びＫＭの個別の数値から得られるもので、実験的に決定される値ではない。ＳａｄＢについての同じパラメータと比較したときの各候補酵素のＫＭ、ＫＩ、及びｋｃａｔ／ＫＭの比を表９に示す。
【０２６９】
【表１８】
0005947219.tif 000019
【０２７０】
表７で星印を付した酵素については、個別の酵素調製物で少なくとも３アッセイを実施した。他の全ての数値は１つのアッセイからの値であるか、或いは同じ酵素試料で実施した２つのアッセイからの平均値である。
【０２７１】
ベイジェリンキア・インディカ（Ｂｅｉｊｅｒｉｃｋｉａ  ｉｎｄｉｃａ）ＡＤＨ（ＢｉＡＤＨ）のデータは最も高いｋｃａｔの数値及び適度に高いｋｃａｔ／ＫＭを示し、好ましい。酵素ＲｎＡＤＨ１はイソブチルアルデヒドに対するＫＭ値が低いと見られ、結果的に高い触媒効率を有し得る。しかしながらＫＭ値が低いと、分光光度アッセイによるそのＫＭ値の正確な決定が妨げられる。しかしイソブチルアルデヒドの細胞内定常状態レベルがそのＫＭ値を超過する場合、イソブタノール生成宿主における酵素の能力はｋｃａｔによってさらに制限され得る。ＢｉＡＤＨをＳａｄＢと比較すると、イソブチルアルデヒド還元に対するＢｉＡＤＨの触媒効率はＳａｄＢと比べて約１２倍高く、しかしながらＢｉＡＤＨはＳａｄＢよりイソブタノールに対する感度が高い。ヌクレオチド補因子に関して、ＳａｄＢはＢｉＡＤＨと比較したときＮＡＤＨに対するＫＭ値がより低い。ＳｃＡＤＨ６はイソブタノールに対するＫＩ値が高いことから、この酵素は生体内で、イソブタノール生成宿主に予想される濃度のイソブタノールの存在に制限されずに機能する可能性があることが示唆される。これまでに分析した候補のなかで、イソブタノールの酸化に対する触媒効率はＳａｄＢが最小であり（ｋｃａｔ／ＫＭ＝０．０８３）、それにＢｉＡＤＨ（１．９１）及びＨＬＡＤＨ（１２．５）が続く。
【０２７２】
実施例４
実施例２に記載されるものなどの方法に従い７つのさらなる候補ＡＤＨ酵素を合成し、発現させてアッセイした。指示されるＡＤＨ酵素（フェニロバクテリウム・ズシネウム（Ｐｈｅｎｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｚｕｃｉｎｅｕｍ）ＨＬＫ１  ＡＤＨ（ＰｚＡＤＨ）、メチロセラ・シルベストリス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｅｌｌａ  ｓｉｌｖｅｓｔｒｉｓ）ＢＬ２  ＡＤＨ（ＭｓＡＤＨ）、アシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ）ＡＹＥ  ＡＤＨ（ＡｂＡＤＨ）、ゲオバチルス・エスピー（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＷＣＨ７０  ＡＤＨ（ＧｂＡＤＨ）、及びムコール・シルシネロイデス（Ｍｕｃｏｒ  ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ）ＡＤＨ（ＭｃＡＤＨ））について得られた反応速度定数を表８に示す。ＳａｄＢについての同じパラメータと比較したときの各候補酵素についてのＫＭ、ＫＩ、及びｋｃａｔ／ＫＭの比較を、ＳａｄＢについて決定された値（表７）に対する割合として表９に示す。１００未満の割合は、ＳａｄＢについて決定された値より低い値を示す；１００より高い割合は、ＳａｄＢについて決定された値より高い値を示す。これらのアッセイにおいて、ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＰＲ４  ＡＤＨ（ＲｅＡＤＨ）では発現がなく、バンデルワルトジマ・ポリスポラ（Ｖａｎｄｅｒｗａｌｔｏｚｙｍａ  ｐｏｌｙｓｐｏｒａ）ＤＳＭ  ７０２９４  ＡＤＨ（ＶｐＡＤＨ）では検出可能な活性がなかった。
【０２７３】
【表１９】
0005947219.tif 000020
【０２７４】
【表２０】
0005947219.tif 000021
【０２７５】
実施例５
Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＰＮＹ２２１１株の構築
２０１０年９月７日に出願された米国仮特許出願第６１／３８０，５６３号明細書及び以下の段落に記載されるとおり、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＰＮＹ１５０７株からいくつかのステップでＰＮＹ２２１１を構築した。最初にこの株を、ホスホケトラーゼ（ｐｈｏｓｏｐｈｏｋｅｔｏｌａｓｅ）遺伝子を含むように修飾した。ホスホケトラーゼ遺伝子カセット及び組込み株の構築は、２０１０年６月１８日に出願された米国仮特許出願第６１／３５６，３７９号明細書に過去に記載がある。次に、過去に米国仮特許出願第６１／３０８，５６３号明細書に記載された組込みベクターを使用して、この株にアセト乳酸シンターゼ遺伝子（ａｌｓＳ）を加えた。最後に、相同組換えを使用してホスホケトラーゼ遺伝子及び組込みベクター配列を除去すると、ｐｄｃ１Δ：：ｉｌｖＤ（過去に記載された、米国仮特許出願第６１／３０８，５６３号明細書におけるＰＤＣ１  ＯＲＦの欠失／挿入）と染色体ＸＩＩの天然ＴＲＸ１遺伝子との間の遺伝子間領域にａｌｓＳのスカーレスな挿入が得られた。ＰＮＹ２２１１の得られた遺伝子型は、ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δ  ｐｄｃ６Δ  ｐｄｃ１Δ：：Ｐ［ＰＤＣ１］−ＤＨＡＤ｜ｉｌｖＤ＿Ｓｍ−ＰＤＣ１ｔ−Ｐ［ＦＢＡ１］−ＡＬＳ｜ａｌｓＳ＿Ｂｓ−ＣＹＣ１ｔ  ｐｄｃ５Δ：：Ｐ［ＰＤＣ５］−ＡＤＨ｜ｓａｄＢ＿Ａｘ−ＰＤＣ５ｔ  ｇｐｄ２Δ：：ｌｏｘＰ  ｆｒａ２Δ  ａｄｈ１Δ：：ＵＡＳ（ＰＧＫ１）Ｐ［ＦＢＡ１］−ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）−ＡＤＨ１ｔである。
【０２７６】
ホスホケトラーゼ遺伝子カセットを相同組換えによりＰＮＹ１５０７に導入した。組込みコンストラクトは以下のとおり生成した。プラスミドｐＲＳ４２３：：ＣＵＰ１−ａｌｓＳ＋ＦＢＡ−ｂｕｄＡ（米国特許出願公開第２００９／０３０５３６３  Ａ１号明細書に記載されるとおり）をＮｏｔＩ及びＸｍａＩで消化して１．８ｋｂのＦＢＡ−ｂｕｄＡ配列を除去し、クレノウ断片で処理後、ベクターを再度ライゲートした。次に、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）のＤＮＡ合成及びベクター構築サービスによりＣＵＰ１プロモーターをＴＥＦ１プロモーター変異体（Ｎｅｖｏｉｇｔ  ｅｔ  ａｌ．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７２（８）：５２６６−５２７３（２００６）により記載されるＭ４変異体）で置換した。得られたプラスミドｐＲＳ４２３：：ＴＥＦ（Ｍ４）−ａｌｓＳをＳｔｕＩ及びＭｌｕＩで切断し（ａｌｓＳ遺伝子の一部とＣＹＣ１ターミネーターとを含む１．６ｋｂ部分を除去する）、ｐＲＳ４２６：：ＧＰＤ−ｘｐｋ１＋ＡＤＨ−ｅｕｔＤ（配列番号８１；プラスミドは米国仮特許出願第６１／３５６，３７９号明細書に記載される）からプライマーＮ１１７６及びＮ１１７７（それぞれ配列番号４７及び４８）で生成した４ｋｂのＰＣＲ産物及び酵母ゲノムＤＮＡ（ＥＮＯ１プロモーター領域）からプライマーＮ８２２及びＮ１１７８（それぞれ配列番号４９及び５０）で生成した０．８ｋｂのＰＣＲ産物ＤＮＡと合わせ、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＢＹ４７４１株（ＡＴＣＣ＃  ２０１３８８；ギャップ修復クローニング法、Ｍａ  ａｎｄ  Ｂｏｔｓｔｅｉｎを参照のこと）に形質転換した。形質転換体は、ヒスチジン不含の合成完全培地に細胞を播くことにより得た。予想されたプラスミド（ｐＲＳ４２３：：ＴＥＦ（Ｍ４）−ｘｐｋ１＋ＥＮＯ１−ｅｕｔＤ、配列番号５１）が適切に構築されたことを、ＰＣＲによりプライマーＮ８２１及びＮ１１１５（それぞれ配列番号５２及び５３）を使用して、及び制限消化（ＢｇｌＩ）により確認した。続いて２つのクローンを配列決定した。３．１ｋｂのＴＥＦ（Ｍ４）−ｘｐｋ１遺伝子をＳａｃＩ及びＮｏｔＩで消化することにより単離し、米国仮特許出願第６１／３５６，３７９号明細書（クローンＡ、ＡｆｌＩＩで切断）に記載されるｐＵＣ１９−ＵＲＡ３：：ｉｌｖＤ−ＴＲＸ１ベクターにクローニングした。クローニング断片をクレノウ断片で処理してライゲーション用の平滑末端を生成した。ライゲーション反応物を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｓｔｂｌ３細胞に形質転換し、アンピシリン耐性について選択した。ＴＥＦ（Ｍ４）−ｘｐｋ１を、ＰＣＲによりプライマーＮ１１１０及びＮ１１１４（それぞれ配列番号５４及び５５）を用いて確認した。ベクターをＡｆｌＩＩで直鎖化し、クレノウ断片で処理した。米国仮特許出願第６１／３５６，３７９号明細書に記載される１．８ｋｂのＫｐｎＩ−ＨｉｎｃＩＩジェネティシン耐性カセットをクレノウ断片処理後にライゲーションによりクローニングした。ライゲーション反応物を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｓｔｂｌ３細胞に形質転換し、アンピシリン耐性について選択した。ジェネティシンカセットの挿入を、ＰＣＲによりプライマーＮ１６���ＳｅｑＦ５及びＢＫ４６８（それぞれ配列番号５６及び５７）を用いて確認した。プラスミド配列は配列番号５８（ｐＵＣ１９−ＵＲＡ３：：ｐｄｃ１：：ＴＥＦ（Ｍ４）−ｘｐｋ１：：ｋａｎ）として提供される。
【０２７７】
得られた組込みカセット（ｐｄｃ１：：ＴＥＦ（Ｍ４）−ｘｐｋ１：：ＫａｎＭＸ：：ＴＲＸ１）を単離し（ＡｓｃＩ及びＮａｅＩ消化により、ゲル精製した５．３ｋｂバンドが生じた）、Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ酵母形質転換キット（カタログ番号Ｔ２００１）を使用してＰＮＹ１５０７に形質転換した。ＹＰＥ＋５０μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８に播くことにより形質転換体を選択した。予想された遺伝子座に組み込まれたことを、ＰＣＲによりプライマーＮ８８６及びＮ１２１４（それぞれ配列番号５９及び６０）を用いて確認した。次に、ＣｒｅリコンビナーゼをコードするプラスミドｐＲＳ４２３：：ＧＡＬ１ｐ−Ｃｒｅを使用してｌｏｘＰ隣接ＫａｎＭＸカセットを除去した（ベクター及び方法は米国仮特許出願第６１／３０８，５６３号明細書に記載される）。カセットが適切に取り除かれたことをＰＣＲによりプライマーｏＢＰ５１２及びＮ１６０ＳｅｑＦ５（それぞれ配列番号６１及び６２）を用いて確認した。最後に、米国仮特許出願第６１／３０８，５６３号明細書（ｐＵＣ１９−ｋａｎ：：ｐｄｃ１：：ＦＢＡ−ａｌｓＳ：：ＴＲＸ１、クローンＡ）に記載されるａｌｓＳ組込みプラスミドを、取り込まれたジェネティシン選択マーカーを使用してこの株に形質転換した。２つの組込み体を、プラスミドｐＹＺ０９０ΔａｌｓＳ及びｐＢＰ９１５（米国仮特許出願第６１／３０８，５６３号明細書に記載されるプラスミド、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ」２００５．Ａｍｂｅｒｇ，Ｂｕｒｋｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒａｔｈｅｒｎのプロトコル＃２を用いて形質転換される）で形質転換し、グルコース含有培地における成長及びイソブタノール生成を評価することにより（成長方法及びイソブタノールの計測方法は、米国仮特許出願第６１／３０８，５６３号明細書及び米国特許出願公開第２００７／００９２９５７  Ａ１号明細書に記載される）、アセト乳酸シンターゼ活性について試験した。２つのクローンのうちの一方は陽性であり、ＰＮＹ２２１８と命名した。プラスミドｐＹＺ０９０ΔａｌｓＳ及びｐＢＰ９１５を含むＰＮＹ２２１８の単離物をＰＮＹ２２０９と命名した。
【０２７８】
ＰＮＹ２２１８をＣｒｅリコンビナーゼで処理し、得られたクローンを、ＰＣＲによりプライマーＮ８８６及びＮ１６０ＳｅｑＲ５（それぞれ配列番号５９及び５６）を用いてｘｐｋ１遺伝子及びｐＵＣ１９組込みベクター配列の喪失についてスクリーニングした。これにより、ｘｐｋ１の上流のＤＮＡ及び組込みベクターの挿入中に導入された相同ＤＮＡの組換え後、ｐｄｃ１−ＴＲＸ１遺伝子間領域には組み込まれたａｌｓＳ遺伝子のみが残った（ベクター、マーカー遺伝子及びｌｏｘＰ配列は失われるため「スカーレス」挿入、図９を参照のこと）。この組換えは任意の点で行うことができたが、ベクターの組込みはジェネティシン選択がなくとも安定しているように見え、組換えイベントはＣｒｅリコンビナーゼの導入後にのみ観察された。一つのクローンをＰＮＹ２２１１と命名した。
【０２７９】
実施例６
サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＰＮＹ１５４０株の構築
この例の目的は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＰＮＹ１５４０株のＰＮＹ２２１１株からの構築について記載することである。この株はＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ（ＣＢＳ  ８３４０；Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ）Ｆｕｎｇａｌ  Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｒｙ  Ｃｅｎｔｒｅ，オランダ）から得たもので、上記の実施例５に記載される。ＰＮＹ１５４０はアクロモバクター・キシロスオキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）由来の、ＰＮＹ２２１１のＰＤＣ５遺伝子座に組み込まれていたｓａｄＢ遺伝子の欠失を含む。この欠失はコード配列全体が完全に取り除かれたもので、標的遺伝子の上流及び下流の相同性領域及び形質転換体選択用のＵＲＡ３遺伝子を含むＰＣＲ断片による相同組換えにより設けられた。ＵＲＡ３遺伝子を相同組換えにより取り除き、スカーレス欠失を作成した。
【０２８０】
スカーレス欠失手順はＡｋａｄａ  ｅｔ  ａｌ．２００６  Ｙｅａｓｔ  ｖ２３  ｐ３９９から構成した。スカーレス欠失用のＰＣＲカセットは、オーバーラッピングＰＣＲによって４つの断片Ａ−Ｂ−Ｕ−Ｃを組み合わせることにより作製した。ＰＣＲカセットは、天然ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ  ＵＲＡ３遺伝子からなる選択可能／逆選択可能なマーカーＵＲＡ３（断片Ｕ）を、プロモーター（ＵＲＡ３遺伝子の上流２５０ｂｐ）及びターミネーター（ＵＲＡ３遺伝子の下流１５０ｂｐ）と共に含んだ。各５００ｂｐ長の断片Ａ及びＣは、標的遺伝子の直ちに上流の５００ｂｐ（断片Ａ）及び標的遺伝子の３’の５００ｂｐ（断片Ｃ）に対応した。断片Ａ及びＣを使用して相同組換えによりカセットを染色体に組み込んだ。断片Ｂ（２５４ｂｐ長）は標的遺伝子の直ちに下流の配列に対応し、カセットを染色体に組み込むと断片Ｂに対応する配列のダイレクトリピートが作成されたことで、断片Ｂを使用して相同組換えにより染色体からＵＲＡ３マーカー及び断片Ｃを切り出した。ＰＣＲ産物のＡＢＵＣカセットを使用して、相同組換えによりＵＲＡ３マーカーをまず染色体に組込み、次にその染色体から切り出した。最初の組込みで３’の５００ｂｐを除く遺伝子が欠失した。切り出しにより、遺伝子の３’の５００ｂｐ領域もまた欠失した。
【０２８１】
ｓａｄＢ欠失
スカーレスｓａｄＢ欠失のためのＰＣＲカセット用の４つの断片は、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ；Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を使用し、及び断片Ｕの鋳型としてＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７ＤゲノムＤＮＡを、且つ断片Ａ、Ｂ、及びＣの鋳型としてＰＮＹ１５０３ゲノムＤＮＡを使用して増幅した。ゲノムＤＮＡはＧｅｎｔｒａ  Ｐｕｒｅｇｅｎｅ  Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ；Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）で調製した。ｓａｄＢ断片Ａは、プライマーｏＢＰ５４０（配列番号６３）、及びｓａｄＢ断片Ｂの５’末端と相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ８３５（配列番号６４）で増幅した。ｓａｄＢ断片Ｂは、ｓａｄＢ断片Ａの３’末端と相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ８３６（配列番号６５）、及びｓａｄＢ断片Ｕの５’末端と相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ８３７（配列番号６６）で増幅した。ｓａｄＢ断片Ｕは、ｓａｄＢ断片Ｂの３’末端と相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ８３８（配列番号６７）、及びｓａｄＢ断片Ｃの５’末端と相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ８３９（配列番号６８）で増幅した。ｓａｄＢ断片Ｃは、ｓａｄＢ断片Ｕの３’末端と相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ８４０（配列番号６９）、及びプライマーｏＢＰ８４１（配列番号７０）で増幅した。ＰＣＲ産物をＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。オーバーラッピングＰＣＲによりｓａｄＢ断片ＡとｓａｄＢ断片Ｂとを混合し、プライマーｏＢＰ５４０（配列番号６３）及びｏＢＰ８３７（配列番号６６）で増幅して、ｓａｄＢ断片ＡＢを作成した。オーバーラッピングＰＣＲによりｓａｄＢ断片ＵとｓａｄＢ断片Ｃとを混合し、プライマーｏＢＰ８３８（配列番号６７）及びｏＢＰ８４１（配列番号７０）で増幅して、ｓａｄＢ断片ＵＣを作成した。得られたＰＣＲ産物を、アガロースゲルと、続いてゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。オーバーラッピングＰＣＲによりｓａｄＢ断片ＡＢとｓａｄＢ断片ＵＣとを混合し、プライマーｏＢＰ５４０（配列番号６３）及びｏＢＰ８４１（配列番号７０）で増幅して、ｓａｄＢ  ＡＢＵＣカセットを作成した。ＰＣＲ産物をＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。
【０２８２】
ＰＮＹ２２１１のコンピテント細胞を作製し、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩキット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ；Ｏｒａｎｇｅ，ＣＡ）を使用してｓａｄＢ  ＡＢＵＣ  ＰＣＲカセットで形質転換した。形質転換混合物を３０℃の１％エタノールを補足したウラシル不含合成完全培地に播いた。ｓａｄＢノックアウトを含む形質転換体を、プライマーＵｒａ３−ｅｎｄ（配列番号７１）及びｏＢＰ５４１（配列番号７２）を用いたＰＣＲによりスクリーニングした。正しい形質転換体をＹＰＥ（１％エタノール）で成長させ、３０℃の５−フルオロ−オロチン酸（０．１％）を含む合成完全培地に播いて、ＵＲＡ３マーカーを欠く単離物を選択した。ＹｅａＳｔａｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）で調製したゲノムＤＮＡを使用して、欠失及びマーカーの除去をプライマーｏＢＰ５４０（配列番号６３）及びｏＢＰ５４１（配列番号７２）を用いるＰＣＲにより確認した。欠失したｓａｄＢコード配列に特異的なプライマーのｏＢＰ５３０（配列番号７３）及びｏＢＰ５３１（配列番号７４）を使用したネガティブＰＣＲの結果により、単離物にｓａｄＢ遺伝子が存在しないことが実証された。正しい単離物をＰＮＹ１５４０株（ＢＰ１７４６）として選択した。
【０２８３】
実施例７
Ｂ．インディカ（Ｂ．ｉｎｄｉｃａ）ＡＤＨをコードする遺伝子を保有する酵母シャトルベクター及び陰性対照ベクターの構築
米国特許出願公開第２００９／０３０５３６３  Ａ１号明細書に記載されるとおりのプラスミドｐＬＨ４６８（配列番号７５）は、イソブタノール生成経路の一部を含む酵素（ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ、αＫＩＶデカルボキシラーゼ及びイソブタノールデヒドロゲナーゼ）をコードする３つのキメラ遺伝子を保有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）／酵母シャトルベクターである。ギャップ修復クローニング法を用いて既存のイソブタノールデヒドロゲナーゼ遺伝子をＢ．インディカ（Ｂ．ｉｎｄｉｃａ）ＡＤＨに置き換えた。最初に、好適な５’及び３’隣接配列を含むＢ．インディカ（Ｂ．ｉｎｄｉｃａ）ＡＤＨコード領域を、酵母コドン最適化を伴うＤＮＡ合成（ＤＮＡ２．０、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）によって得た。この配列は提供される（配列番号７６）。ベクターｐＬＨ４６８をＢｓｕ３６Ｉで直鎖化し、Ｂ．インディカ（Ｂ．ｉｎｄｉｃａ）ＡＤＨ（供給業者のクローニングベクターからＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで放出される）と共に酵母ＢＹ４７４１株に形質転換した。形質転換体をヒスチジン不含合成完全培地（Ｔｅｋｎｏｖａ  カタログ番号Ｃ３０２０）に播いた。いくつかの形質転換体からＺｙｍｏｐｒｅｐ（商標）酵母プラスミドミニプレップキット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  カタログ番号Ｄ２００４）を使用してプラスミドを調製した。ＰＣＲ（プライマーＮ１０９２及びＮ１０９３、配列番号７７及び７８による）及び制限酵素消化（ＫｐｎＩによる）を用いてＢｉＡＤＨが意図した位置に組み込まれたことを確認した。このプラスミドをｐＬＨ４６８：：ＢｉＡＤＨと称する。
【０２８４】
ｐＬＨ４６８から元のイソブタノールデヒドロゲナーゼ遺伝子（ｈＡＤＨ）のほとんどを除去した第２のベクターを構築した。これは、Ｂｓｕ３６Ｉ及びＰａｃＩで消化して８０８ｂｐ断片を放出し、ＤＮＡの末端にクレノウ断片を埋め込み、及びベクターに再度ライゲートすることにより行った。ライゲーション反応物を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｓｔｂｌ３細胞に形質転換した。ｈＡＤＨ遺伝子が失われたことを、単離プラスミドクローン（ｃｏｎｅ）をＥｃｏＲＩ消化して確認した。一つの成功したクローンを、以下の実施例８に記載する実験用に選択した。このプラスミドをｐＬＨ４６８ΔｈＡＤＨと称する。
【０２８５】
実施例８
ＢｉＡＤＨを保有するイソブタノロゲン（Ｉｓｏｂｕｔａｎｏｌｏｇｅｎ）株は対照株と比べてより良好なグルコース依存性成長、より高いグルコース消費並びにより高いイソブタノール力価及び収率を示す。
プラスミドｐＬＨ４６８：：ＢｉＡＤＨ及びｐＬＨ４６８ΔｈＡＤＨを、各々、第２のイソブタノール経路プラスミド（ｐＹＺ０９０ΔａｌｓＳ、米国仮特許出願第６１／３８０，５６３号明細書）と共にＰＮＹ１５４０に形質転換した。形質転換物を、１％エタノールを炭素源として含むヒスチジン及びウラシル不含合成完全培地に播いた。いくつかの形質転換体を新鮮なプレートにパッチした。４８時間後、パッチ（各株から３つ）を使用して、０．３％グルコース及び０．３％エタノールを炭素源として含む合成完全培地（ヒスチジン及びウラシル不含）を接種した。２４時間後、この培地での成長は、双方の株の全てのレプリケートについて同様であった。次に培養物を、２％グルコース及び０．０５％エタノールを炭素源として含む合成完全培地（ヒスチジン及びウラシル不含）に継代培養した。培養物（開始時の６００ｎｍ光学濃度（ＯＤ）は０．２であった、培養容量は１２５ｍｌの密栓フラスコ中に２０ｍｌであった）を４８時間インキュベートした。ＨＰＬＣ分析のための試料を継代培養時及びさらに４８時間後に回収した。最終ＯＤもまた決定した。ＢｉＡＤＨ株の４８時間平均ＯＤは３．３（±０．１）であり、それに対してＡＤＨ無し対照は２．３７（±０．０７）であった。従ってＢｉＡＤＨを含めると、この条件下ではＯＤが３９％上昇した。同様に、グルコース消費（継代培養の直後に回収した試料と比較してＨＰＬＣにより評価される）は６９％上昇した（８１±１ｍＭ、それに対して４７．９±０．６ｍＭ）。以下の表に示すとおり、イソブタノール力価は４倍高く、及びモル収率（すなわち消費されたグルコース１モル当たりのイソブタノールの収率）は２倍であった。ＡＤＨ無し対照株では、イソブタノール経路からの多量の炭素がイソブチレートとして蓄積したことから、アルデヒドデヒドロゲナーゼがイソブチルアルデヒドに作用したことが示される。
【０２８６】
【表２１】
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【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図１ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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