(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、および配列番号：３２よりなる群から選択されるアミノ酸配列からなるトランケートされた非−鱗翅目無脊椎動物、非−双翅目無脊椎動物レチノイドＸ受容体リガンド結合ドメインを含むポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、該トランケートされたリガンド結合ドメインが、
（ａ）完全な長さのリガンド結合ドメインのリガンド結合活性に比べ低下したリガンド結合活性、
（ｂ）完全な長さのリガンド結合ドメインのステロイド結合活性に比べ低下したステロイド結合活性、または
（ｃ）完全な長さのリガンド結合ドメインの非−ステロイド結合活性に比べ低下した非−ステロイド結合活性
を有する、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
トランケートされた無脊椎動物レチノイドＸ受容体リガンド結合ドメインを含むポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、該トランケートされたリガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチド配列が、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号１８、配列番号：１９、および配列番号：２０よりなる群から選択される核酸配列からなり、かつ
該トランケートされたリガンド結合ドメインが、
（ａ）完全な長さのリガンド結合ドメインのリガンド結合活性に比べ低下したリガンド結合活性、
（ｂ）完全な長さのリガンド結合ドメインのステロイド結合活性に比べ低下したステロイド結合活性、または
（ｃ）完全な長さのリガンド結合ドメインの非−ステロイド結合活性に比べ低下した非−ステロイド結合活性
を有する、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項２に記載の単離されたポリヌクレオチドによりコードされた単離されたポリペプチド。
【請求項４】
配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１および配列番号：３２よりなる群から選択されるアミノ酸配列からなるトランケートされた無脊椎動物レチノイドＸ受容体リガンド結合ドメインを含む単離されたポリペプチドあって、
該トランケートされたリガンド結合ドメインが、
（ａ）完全な長さのリガンド結合ドメインのリガンド結合活性に比べ低下したリガンド結合活性、
（ｂ）完全な長さのリガンド結合ドメインのステロイド結合活性に比べ低下したステロイド結合活性、または
（ｃ）完全な長さのリガンド結合ドメインの非−ステロイド結合活性に比べ低下した非−ステロイド結合活性
を有する、単離されたポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はバイオテクノロジーまたは遺伝子工学の分野に関する。具体的には、本発明は遺伝子発現の分野に関する。さらに詳しくは、本発明は新規エクジソン受容体／無脊椎動物レチノイドＸ受容体−ベースの誘導性遺伝子発現システムおよびこの誘導性遺伝子発現システムを用いて宿主細胞内で遺伝子の発現を変調する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
種々の刊行物が本明細書中で引用され、その開示は出典明示によりその全体を本明細書の一部とみなす。しかしながら、本明細書中におけるいずれの文献の引用も、かかる文献が本出願に対する「先行技術」として利用できることを認めたものと理解されるべきではない。
【０００３】
遺伝子工学の分野においては、遺伝子発現の正確な制御は、発生および他の生理学的プロセスを研究し、操作し、および制御するための価値があるツールである。遺伝子発現は、多数の特異的蛋白質−蛋白質相互作用に関連する複雑な生物学的プロセスである。遺伝子発現が蛋白質合成における最初の工程として必要なＲＮＡを生産するように遺伝子発現がトリガーされるためには、転写アクチベーターが、遺伝子転写を制御するプロモーターの近くに運ばれなければならない。典型的には、転写アクチベーターそれ自体は、遺伝子のプロモーター領域に存在するＤＮＡ結合部位に結合する少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインを有する蛋白質に関連する。かくして、遺伝子発現が起こるためには、ＤＮＡ結合ドメインおよび該ＤＮＡ結合ドメインから適当な距離をおいて位置するトランス活性化ドメインを含む蛋白質が遺伝子のプロモーター領域中の正しい位置に運ばれなければならない。
【０００４】
伝統的なトランスジェニックアプローチは、細胞型特異的プロモーターを利用して、設計されたトランスジーンの発現を駆動させる。トランスジーンを含有するＤＮＡ構築体が、まず、宿主ゲノムに組み込まれる。転写アクチベーターによってトリガーされると、与えられた細胞型でトランスジーンの発現が起こる。
【０００５】
細胞中での外来性遺伝子の発現を調節する他の手段は誘導性プロモーターを介するものである。そのような誘導性プロモーターの使用の例は、ＰＲ１−ａプロモーター、原核生物リプレッサー−オペレーターシステム、免疫抑制−イムノフィリンシステム、およびステロイドホルモン受容体システムのごとき高等真核生物転写活性化システムを含み、これは後記する。
【０００６】
病原体の攻撃後の全身獲得抵抗性応答（ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ａｃｑｕｉｒｅｄ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）の間に、タバコからのＰＲ１−ａプロモーターが誘導される。ＰＲ１−ａの使用は限定されるであろう。何故ならば、それは、しばしば、内因性物質、ならびに病原体、ＵＶ−Ｂ放射線および汚染物のごとき外来因子に応答するからである。熱ショック、インターフェロンおよび重金属によって誘導されたプロモーターに基づく遺伝子調節システムが記載されてきた（Ｗｕｒｎら、１９８６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：５４１４−５４１８、Ａｒｎｈｅｉｔｅｒら、１９９０、Ｃｅｌｌ  ６２：５１−６１、Ｆｉｌｍｕｓら、１９９２、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０：２７５５０−２７５６０）。しかしながら、これらのシステムは、非−標的遺伝子の発現に対するその効果のため制限を有する。これらのシステムは遺漏性（ｌｅａｋｙ）でもある。
【０００７】
原核生物リプレッサー−オペレーターシステムは細菌リプレッサー蛋白質およびそれらが結合する独自のオペレーターＤＮＡ配列を利用する。細菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｉｌからのテトラサイクリン（「Ｔｅｔ」）およびラクトース（「Ｌａｃ」）リプレッサー−オペレーターシステムが、遺伝子発現を制御するために植物および動物で用いられてきた。Ｔｅｔシステムにおいて、テトラサイクリンはＴｅｔＲリプレッサー蛋白質に結合し、立体配座の変化をもたらし、これはオペレーターからリプレッサー蛋白質を放出させ、その結果、転写が起こる。Ｌａｃシステムでは、ラクトース、またはイソプロピル−ｂ−Ｄ−チオガラクトシドのごとき合成アナログの存在に応答してｌａｃオペロンが活性化される。あいにく、そのようなシステムの使用は、リガンド、すなわち、テトラサイクリンおよびラクトース、の不安定な化学、それらの毒性、それらの天然の存在、または誘導もしくは抑制に比較的高レベル必要であることよって制限される。同様の理由により、動物へのこのようなシステムの使用も制限される。
【０００８】
ＦＫ５０６、ラパマイシンおよびシクロスポリンＡのような免疫抑制分子は、イムノフィリンＦＫＢＰ１２、シクロフィリン等に結合することができる。この情報を用い、単に、ＦＫ５０６を２つの蛋白質の各々の上に置くことによって、またはＦＫ５０６を１つの上に、およびシクロスポリンＡを他の上に置くことによって、任意の２つの蛋白質を一緒に運ぶ一般的戦略が工夫されてきた。次いで、ＦＫ５０６の合成ホモダイマー（ＦＫ１０１２）またはＦＫ５０６−シクロスポリンの融合から得られた化合物（ＦＫＣｓＡ）を用いて、これらの分子の二量体化を誘導することができる（Ｓｐｅｎｃｅｒら、１９９３、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２：１０１９−２４、Ｂｅｌｓｈａｗら、１９９６、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９３：４６０４−７）。ＦＫＢＰ１２に融合したＧａｌ４  ＤＮＡ結合ドメインおよびシクロフィリンに融合したＶＰ１６アクチベータードメイン、ならびにＦＫＣｓＡ化合物を用いて、Ｇａｌ４結合部位を含有するプロモーターの制御下でレポーター遺伝子のヘテロ二量体化および活性化が示された。あいにく、このシステムは、望まない副作用を有しかねない免疫抑制剤を含み、従って、種々の哺乳動物遺伝子のスイッチ適用でのその使用が制限される。
【０００９】
ステロイドホルモン受容体システムのような高等真核生物転写活性化システムも使用されてきた。ステロイドホルモン受容体は核受容体スーパーファミリーのメンバーであり、脊椎動物および無脊椎動物細胞で見出される。あいにく、特に植物および哺乳動物における遺伝子発現の調節のために受容体を活性化するステロイド化合物の使用は、そのような生物における多くの他の元来の生物学的経路におけるその関与のため制限される。そのような困難を克服するために、昆虫エクジソン受容体（ＥｃＲ）を用いる代替システムが開発されている。
【００１０】
昆虫における成長、脱皮および発生はエクジソンステロイドホルモン（脱皮ホルモン）および幼若ホルモンによって調節される（Ｄｈａｄｉａｌｌａら、１９９８、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｅｎｔｏｍｏｌ．４３：５４５−５６９）。昆虫におけるエクジソンに対する分子標的は少なくともエクジソン受容体（ＥｃＲ）およびウルトラスピラクル蛋白質（ＵＳＰ）よりなる。ＥｃＲは、シグニチャーＤＮＡおよびリガンド結合ドメイン、ならびに活性化ドメインによって特徴付けられる核ステロイド受容体スーパーファミリーのメンバーである（Ｋｏｅｌｌｅら、１９９１、Ｃｅｌｌ、６７：５９−７７）。ＥｃＲ受容体はポナステロンＡおよびムリステロンＡのごとき多数のステロイド化合物に対して応答性である。最近、エクジステロイドアゴニスト活性を持つ非−ステロイド化合物が記載されており、これは、Ｒｏｈｍ  ａｎｄ  Ｈａａｓ社によって世界的に販売されている商業的に入手可能な殺虫剤テブフェノジドおよびメトキシフェノジドを含む（国際特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ９６／００６８６号および米国特許第５，５３０，０２８号参照）。両アナログは他の生物に対して例外的な安全性プロフィールを有する。
【００１１】
国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９７／０５３３０号（ＷＯ９７／３８１１７号）およびＰＣＴ／ＵＳ９９／０８３８１号（ＷＯ９９／５８１５５号）は外因性遺伝子の発現を変調する方法を開示しており、ここに、外因性遺伝子およびエクジソン応答エレメントを含むＤＮＡ構築体が、そのためのリガンドの存在下、かつ所望によりサイレントパートナーとして作用することができる受容体の存在下で、エクジソン応答エレメントに結合して遺伝子発現を誘導するエクジソン受容体を含む第２のＤＮＡ構築体によって活性化される。選択されたエクジソン受容体はＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒから単離された。典型的には、そのようなシステムは、最適な活性化を提供するために、サイレントパートナー、好ましくはレチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）の存在を必要とする。哺乳動物細胞では、昆虫エクジソン受容体（ＥｃＲ）は、レチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）とでヘテロ二量体化し、リガンド依存的に標的遺伝子の発現を調節する。国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９８／１４２１５号（ＷＯ９９／０２６８３号）は、蚕Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉから単離されたエクジソン受容体が、外因性ダイマーパートナーの必要性なくして哺乳動物系で機能できることを開示する。
【００１２】
米国特許第５，８８０，３３３号は、トランス活性化ドメインおよびＤＮＡ結合ドメインが２つの異なるハイブリッド蛋白質上に位置する植物で使用されるＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ  ＥｃＲおよびウルトラスピラクル（ＵＳＰ）ヘテロダイマーシステムを開示する。あいにく、このシステムは動物細胞においてレポーター遺伝子発現を誘導するのに効果的ではない（比較として、後記実施例１．２参照）。
【００１３】
これらの場合の各々において、（国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９８／１４２１５号におけるごとく天然ＥｃＲとして、または国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９７／０５３３０号におけるごとく修飾されたＥｃＲいずれかとして）トランス活性化ドメインおよびＤＮＡ結合ドメインが単一の分子に組み込まれ、他のヘテロダイマーパートナー（ＵＳＰまたはＲＸＲいずれか）は、その天然状態で用いられた。
【００１４】
前記ＥｃＲ−ベースの遺伝子調節システムの欠点は、リガンドの不存在下におけるかなりのバックグラウンド活性ならびに植物および動物双方において用いるためのこれらのシステムの非−適用性が挙げられる（米国特許第５，８８０，３３３号参照）。遺伝子発現の変調に頼るほとんどの適用では、これらのＥｃＲ−ベースのシステムは望ましくない。従って、植物ならびに動物双方において外因性遺伝子の発現を正確に変調するための改良されたシステムに対する要望が当該分野に存在する。そのような改良されたシステムは、遺伝子治療、蛋白質および抗体の大規模生産、細胞−ベースの高スループットスクリーニングアッセイ、機能的ゲノミクスおよびトランスジェニック動物における特性（ｔｒａｉｔ）の調節のような適用で有用であろう。単純であり、コンパクトであり、かつ比較的安価で、容易に入手でき、かつ宿主に対して低毒性であるリガンドに依存する改良されたシステムは、生物学的システムを調節するのに有用なことが判明するであろう。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＥＰ９６／００６８６号明細書
【特許文献２】米国特許第５，５３０，０２８号明細書
【特許文献３】国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９７／０５３３０号（ＷＯ９７／３８１１７号）明細書
【特許文献４】国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９９／０８３８１号（ＷＯ９９／５８１５５号）明細書
【特許文献５】国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９８／１４２１５号（ＷＯ９９／０２６８３号）明細書
【特許文献６】米国特許第５，８８０，３３３号明細書
【特許文献７】国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０１／０９０５０号明細書
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Ｗｕｒｎら、１９８６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：５４１４−５４１８
【非特許文献２】Ａｒｎｈｅｉｔｅｒら、１９９０、Ｃｅｌｌ  ６２：５１−６１
【非特許文献３】Ｆｉｌｍｕｓら、１９９２、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０：２７５５０−２７５６０
【非特許文献４】Ｓｐｅｎｃｅｒら、１９９３、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２：１０１９−２４
【非特許文献５】Ｂｅｌｓｈａｗら、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：４６０４−７
【非特許文献６】Ｄｈａｄｉａｌｌａら、１９９８、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｅｎｔｏｍｏｌ．４３：５４５−５６９
【非特許文献７】Ｋｏｅｌｌｅら、１９９１、Ｃｅｌｌ、６７：５９−７７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
最近、出願人は、トランス活性化およびＤＮＡ結合ドメインが、それらを２つの異なる蛋白質上に置くことによって相互に分離されたエクジソン受容体−ベースの誘導性遺伝子発現システムが結果として、リガンドの不存在下においてバックグラウンド活性を大いに低下させ、リガンドの存在下においてバックグラウンドを超えて活性をかなり増加させたことを示した（ここに出典明示してその全体を本明細書の一部としてみなす係属中の出願ＰＣＴ／ＵＳ０１／０９０５０号）。この２−ハイブリッドシステムは、出願ＰＣＴ／ＵＳ９７／０５３３０号およびＰＣＴ／ＵＳ９８／１４２１５号に開示された二つのシステムと比較してかなり改良された誘導性遺伝子発現変調システムである。
【００１８】
出願人らは、以前、双翅目（Ｄｉｐｔｅｒａｎ）（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）または鱗翅目（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ）（Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ  ｆｕｍｉｆｅｒａｎａ）ウルトラスピラクル蛋白質（ＵＳＰ）と協同したエクジソン受容体−ベースの遺伝子発現システムが哺乳動物細胞において構成的に発現され、他方、脊椎動物レチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）と協同したエクジソン受容体−ベースの遺伝子発現システムが哺乳動物細胞で誘導性であることを証明した（係属中の出願ＰＣＴ／ＵＳ０１／０９０５０）。出願人らは、今回、非−双翅目および非−鱗翅目無脊椎動物ＲＸＲホモログが、エクジソン受容体−ベースの誘導性遺伝子発現システムにおいて脊椎動物ＲＸＲと同様に機能することができるという驚くべき発見をなした。本明細書中に記載するごとく、出願人らの新規なエクジソン受容体／無脊椎動物レチノイドＸ受容体−ベースの誘導性遺伝子発現システムが、増大したリガンド感受性およびトランス活性化の大きさによって特徴付けられる、酵母および哺乳動物細胞における改良された誘導性遺伝子発現システムを提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明は、新規なエクジソン受容体／無脊椎動物レチノイドＸ受容体−ベースの誘導性遺伝子発現システム、該新規な誘導性遺伝子発現システムで用いる新規な受容体ポリヌクレオチドおよびポリペプチド、ならびにこの誘導性遺伝子発現システムを用いて宿主細胞内の遺伝子の発現を変調する方法に関する。特に、出願人らの発明は、無脊椎動物レチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）ポリペプチドのリガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチドを含む改良された遺伝子発現変調システムに関する。
【００２０】
具体的には、本発明は、ａ）ｉ）その発現を変調すべき遺伝子と関連した応答エレメントを認識するＤＮＡ−結合ドメイン、およびｉｉ）エクジソン受容体リガンド結合ドメインを含む第１のハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、宿主細胞で発現させることができる第１の遺伝子発現カセット、ならびにｂ）ｉ）トランス活性化ドメイン、およびｉｉ）無脊椎動物レチノイドＸ受容体リガンド結合ドメインを含む第２のハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、宿主細胞で発現させることができる第２の遺伝子発現カセット、を含む遺伝子発現変調システムに関する。
【００２１】
また、本発明は、ａ）ｉ）その発現を変調すべき遺伝子と関連した応答エレメントを認識するＤＮＡ−結合ドメイン、およびｉｉ）無脊椎動物レチノイドＸ受容体リガンド結合ドメインを含む第１のハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、宿主細胞で発現させることができる第１の遺伝子発現カセット、ならびにｂ）ｉ）トランス活性化ドメイン、およびｉｉ）エクジソン受容体リガンド結合ドメインを含む第２のハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、宿主細胞で発現させることができる第２の遺伝子発現カセット、を含む遺伝子発現変調システムに関する。
【００２２】
また、本発明は、さらに、ｃ）ｉ）第１のハイブリッドポリペプチドのＤＮＡ−結合ドメインが結合する応答エレメント、ｉｉ）第２のハイブリッドポリペプチドのトランス活性化ドメインによって活性化されるプロモーター、およびｉｉｉ）その発現を変調すべき遺伝子を含む第３の遺伝子発現カセット、を含む本発明による遺伝子発現変調システムに関する。
【００２３】
また、本発明は、宿主細胞内で発現させることができる遺伝子発現カセットに関し、ここに、該遺伝子発現カセットはｉ）その発現を変調すべき遺伝子と関連した応答エレメントを認識するＤＮＡ−結合ドメイン、またはｉｉ）トランス活性化ドメインのいずれか、および無脊椎動物レチノイドＸ受容体リガンド結合ドメインを含むハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
【００２４】
また、本発明は、ｉ）その発現を変調すべき遺伝子と関連した応答エレメントを認識するＤＮＡ−結合ドメイン、またはｉｉ）トランス活性化ドメインのいずれか、および無脊椎動物レチノイドＸ受容体リガンド結合ドメインを含むハイブリッドポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。
【００２５】
また、本発明は、トランケートされた無脊椎動物ＲＸＲポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドに関し、ここに、トランケーション突然変異は無脊椎動物ＲＸＲポリペプチドのリガンド結合活性またはリガンド感受性に影響する。
【００２６】
また、本発明は、トランケートされた無脊椎動物ＲＸＲポリヌクレオチドおよび二量体化パートナーを含むヘテロダイマーのリガンド感受性を増加させるトランケーション突然変異を含むトランケートされた無脊椎動物ＲＸＲポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。特定の態様において、二量体化パートナーはエクジソン受容体ポリペプチドである。
【００２７】
また、本発明は、出願人らの発明によるポリヌクレオチドによってコードされる単離されたポリペプチドに関する。
【００２８】
また、本発明は、ｉ）その発現を変調すべき遺伝子と関連した応答エレメントを認識するＤＮＡ−結合ドメイン、またはｉｉ）トランス活性化ドメインのいずれか、および無脊椎動物レチノイドＸ受容体リガンド結合ドメインを含む単離されたハイブリッドポリペプチドに関する。
【００２９】
本発明は、トランケーション突然変異を含む単離されたトランケートされた無脊椎動物ＲＸＲポリペプチドに関し、ここに、該無脊椎動物ＲＸＲポリペプチドは本発明によるポリヌクレオチドによってコードされる。
【００３０】
かくして、また、本発明は、当該無脊椎動物ＲＸＲポリペプチドのリガンド結合活性またはリガンド感受性に影響するトランケーション突然変異を含む単離されたトランケートされた無脊椎動物ＲＸＲポリペプチドに関する。
【００３１】
また、本発明は、トランケートされた無脊椎動物ＲＸＲポリペプチドおよび二量体化パートナーを含むヘテロダイマーのリガンド感受性を増加させるトランケーション突然変異を含む単離されたトランケートされた無脊椎動物ＲＸＲポリペプチドに関する。特定の態様において、二量体化パートナーはエクジソン受容体ポリペプチドである。
【００３２】
また、出願人らの発明は、本発明による遺伝子発現変調システムを用いて宿主細胞において遺伝子発現を変調する方法に関する。具体的には、出願人らの発明は、ａ）本発明による遺伝子発現変調システムを宿主細胞に導入し、ｂ）ｉ）遺伝子発現変調システムの第１のハイブリッドポリペプチドからのＤＮＡ結合ドメインが結合するドメインを含む応答エレメント、ｉｉ）遺伝子発現変調システムの第２のハイブリッドポリペプチドのトランス活性化ドメインによって活性化されるプロモーター、およびｉｉｉ）その発現を変調すべき遺伝子を含む遺伝子発現カセットを宿主細胞に導入し、次いで、ｃ）宿主細胞にリガンドを導入する工程を含み、それにより、リガンドの宿主細胞への導入に際して、遺伝子の発現が変調されることを特徴とする、宿主細胞において遺伝子の発現を変調する方法を提供する。
【００３３】
また、出願人らの発明は、遺伝子発現変調システムの第１のハイブリッドポリペプチドからのＤＮＡ結合ドメインが結合するドメインを含む応答エレメント、遺伝子発現変調システムの第２のハイブリッドポリペプチドのトランス活性化ドメインによって活性化されるプロモーター、およびその発現を変調すべき遺伝子を含む遺伝子発現カセットを含む宿主細胞において遺伝子の発現を変調する方法を提供し、ここに、該方法は、ａ）本発明による遺伝子発現変調システムを宿主細胞に導入し、次いで、ｂ）リガンドを宿主細胞に導入する工程を含み、それにより、リガンドの宿主への導入に際して、遺伝子の発現が変調される。
【００３４】
また、出願人らの発明は、本発明による誘導性遺伝子発現システムを含む単離された宿主細胞を提供する。また、本発明は、本発明による遺伝子発現カセット、ポリヌクレオチド、またはポリペプチドを含む単離された宿主細胞に関する。従って、出願人らの発明は、本発明による宿主細胞を含む非−ヒト生物にも関する。
【発明の効果】
【００３５】
出願人らは、無脊椎動物レチノイドＸ受容体ポリペプチドを含む新規なエクジソン受容体−ベースの誘導性遺伝子発現システムを開発した。また、出願人らは、無脊椎動物ＲＸＲポリペプチドのトランケーションもまたこの遺伝子発現システム内で機能的であり、およびこれらの突然変異の効果がリガンド結合活性またはリガンド感受性を増加させるかまたは低下させることができ、それはステロイドまたは非−ステロイド特異的であり得ることを示した。かくして、出願人らの発明は、宿主細胞において注目する遺伝子の発現を変調するのに有用なエクジソン受容体／無脊椎動物ＲＸＲ−ベースの誘導性遺伝子発現システムを提供する。特に望ましい態様において、出願人らの発明は、低下したレベルのバックグラウンド遺伝子発現を有し、サブマイクロモル濃度の非−ステロイドリガンドに応答する誘導性遺伝子発現システムを提供する。かくして、出願人らの新規な誘導性遺伝子発現システムおよび宿主細胞において遺伝子の発現を変調する方法におけるその使用は、現在利用できる誘導性発現システムの制限を克服し、当業者に、遺伝子発現を制御する効果的な手段を供する。
【００３６】
本発明は、遺伝子発現レベルの制御が望ましい、遺伝子治療、蛋白質および抗体の大規模生産、細胞−ベースの高スループットスクリーニングアッセイ、機能的ゲノミクス、プロテオミクス、メタボロミクス、およびトランスジェニック生物における特性の調節のごとき適用で有用である。出願人らの発明の利点は、それが、遺伝子発現を調節し、使用者の要求に適合するように発現レベルを適合させる手段を提供することにある。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】図１は、ＧＡＬ４ＣｆＥｃＲＣＤＥＦ、ｐＦＲＬｕｃおよびｐＴＫＲＬプラスミドＤＮＡと共にＮＩＨ３Ｔ３細胞にトランスフェクトされたＶＰ１６ＭｍＲＸＲＤＥＦ、ＶＰ１６ＭｍＲＸＲＥＦ、ＶＰ１６ＬｍＵＳＰおよびＶＰ１６ＣｆＵＳＰ構築体を介するレポーター遺伝子の、非−ステロイドリガンドによるトランス活性化を示す。
【図２】図２は、ＧＡＬ４ＣｆＥｃＲＤＥＦ、ｐＦＲＬｕｃおよびｐＴＫＲＬプラスミドＤＮＡと共にＮＩＨ３Ｔ３細胞にトランスフェクトされたＶＰ１６ＭｍＲＸＲＤＥＦ、ＶＰ１６ＭｍＲＸＲＥＦ、ＶＰ１６ＬｍＵＳＰおよびＶＰ１６ＣｆＵＳＰ構築体を介するレポーター遺伝子の、非−ステロイドリガンドによるトランス活性化を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、６つの脊椎動物ＲＸＲ（図３Ａ）のＥＦドメインのアミノ酸配列のアラインメントを示す。ヘリックス１−１２はＨ１−Ｈ１２で示し、βプリーツシートはＳ１およびＳ２で示す。ＦはＦドメインジャンクションを示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、６つの無脊椎動物ＲＸＲ（図３Ｂ）のＥＦドメインのアミノ酸配列のアラインメントを示す。ヘリックス１−１２はＨ１−Ｈ１２で示し、βプリーツシートはＳ１およびＳ２で示す。ＦはＦドメインジャンクションを示す。
【図４】図４は、非−ステロイドリガンドまたはＰｏｎＡリガンドの存在下における、ＶＰ１６ＭｍＲＸＲＤＥＦ、ｐＦＲＬｕｃおよびｐＴＫＲＬプラスミドＤＮＡと共にＮＩＨ３Ｔ３細胞にトランスフェクトされたＣｆＥｃＲの種々のトランケーション、ＧＡＬ４ＣｆＥｃＲＡ／ＢＣＤＥＦ、ＧＡＬ４ＣｆＥｃＲＣＤＥＦ、ＧＡＬ４ＣｆＥｃＲ１／２ＣＤＥＦ、ＧＡＬ４ＣｆＥｃＲＤＥＦ、ＧＡＬ４ＣｆＥｃＲＥＦ、ＧＡＬ４ＣｆＥｃＲＤＥの発現データを示す。
【図５】図５は、非−ステロイドリガンドまたはＰｏｎＡリガンドの存在下における、ＶＰ１６ＭｍＲＸＲＥＦ、ｐＦＲＬｕｃおよびｐＴＫＲＬプラスミドＤＮＡと共にＮＩＨ３Ｔ３細胞にトランスフェクトされたＣｆＥｃＲの種々のトランケーション、ＧＡＬ４ＣｆＥｃＲＡ／ＢＣＤＥＦ、ＧＡＬ４ＣｆＥｃＲＣＤＥＦ、ＧＡＬ４ＣｆＥｃＲ１／２ＣＤＥＦ、ＧＡＬ４ＣｆＥｃＲＤＥＦ、ＧＡＬ４ＣｆＥｃＲＥＦ、ＧＡＬ４ＣｆＥｃＲＤＥの発現データを示す。
【図６】図６は、非−ステロイドリガンドまたはＰｏｎＡリガンドの存在下における、ＶＰ１６ＬｍＵＳＰＤＥＦ、ｐＦＲＬｕｃおよびｐＴＫＲＬプラスミドＤＮＡと共にＮＩＨ３Ｔ３細胞にトランスフェクトされたＣｆＥｃＲの種々のトランケーション、ＧＡＬ４ＣｆＥｃＲＡ／ＢＣＤＥＦ、ＧＡＬ４ＣｆＥｃＲＣＤＥＦ、ＧＡＬ４ＣｆＥｃＲ１／２ＣＤＥＦ、ＧＡＬ４ＣｆＥｃＲＤＥＦ、ＧＡＬ４ＣｆＥｃＲＥＦ、ＧＡＬ４ＣｆＥｃＲＤＥの発現データを示す。
【図７】図７は、非−ステロイドリガンドまたはＰｏｎＡリガンドの存在下における、ＶＰ１６ＬｍＵＳＰＥＦ、ｐＦＲＬｕｃおよびｐＴＫＲＬプラスミドＤＮＡと共にＮＩＨ３Ｔ３細胞にトランスフェクトされたＣｆＥｃＲの種々のトランケーション、ＧＡＬ４ＣｆＥｃＲＡ／ＢＣＤＥＦ、ＧＡＬ４ＣｆＥｃＲＣＤＥＦ、ＧＡＬ４ＣｆＥｃＲ１／２ＣＤＥＦ、ＧＡＬ４ＣｆＥｃＲＤＥＦ、ＧＡＬ４ＣｆＥｃＲＥＦ、ＧＡＬ４ＣｆＥｃＲＤＥの発現データを示す。
【図８】図８は、非−ステロイドリガンドまたはＰｏｎＡリガンドの存在下における、ＧＡＬ４ＣｆＥｃＲＤＥＦ、ｐＦＲＬｕｃおよびｐＴＫＲＬプラスミドＤＮＡと共にＮＩＨ３Ｔ３細胞にトランスフェクトされた種々のトランケートされたＭｍＲＸＲ／ＬｍＵＳＰ受容体構築体の発現データを示す。
【図９】図９は、非−ステロイド（ＧＳＥ）リガンドまたはＰｏｎＡリガンドの存在下における、ＮＩＨ３Ｔ３細胞での、ＧＡＬ４／ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦおよびｐＦＲＬｕｃと共に、ＶＰ１６に融合されたＣｆＵＳＰ−ＥＦ、ＤｍＵＳＰ−ＥＦ、ＬｍＵＳＰ−ＥＦ、ＭｍＲＸＲα−ＥＦ、ＡｍａＲＸＲ１−ＥＦおよびＡｍａＲＸＲ２−ＥＦリガンド結合ドメインの発現データを示す。
【図１０】図１０は、非−ステロイドリガンドまたはＰｏｎＡリガンドの存在下における、レポータープラスミドｐＦＲＬｕｃを含む安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞におけるＧＡＬ４：ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦ／ＶＰ１６：ＬｍＵＳＰ−ＥＦの発現データを示す。
【図１１】図１１は、非−ステロイドリガンドまたはＰｏｎＡリガンドの存在下における、８ＸＬｅｘＡｏｐＦＲＬｕｃおよびＶＰ１６：ＣＦＵＳＰ−ＥＦ、ＶＰ１６：ＬｍＵＳＰ−ＥＦ、ＶＰ１６：ＭｍＲＸＲα−ＥＦまたはＶＰ１６：ＤｍＵＳＰ−ＥＦと共にＮＩＨ３Ｔ３細胞にトランスフェクトされたＬｅｘＡ：ＣｆＥｃＲ−ＣＤＥＦ受容体構築体の発現データを示す。
【図１２】図１２は、非−ステロイドリガンド存在下において、ＮＩＨ３Ｔ３細胞をＧＡＬ４：ＣｆＥｃＲ−ＣＤＥＦまたはＬｅｘＡ：ＣｆＥｃＲ−ＣＤＥＦ、８ＸＬｅｘＡｏｐＦＲＬｕｃおよびＶＰ１６：ＬｍＵＳＰ−ＥＦまたはＢ４２：ＬｍＵＳＰ−ＥＦの異なる組合せでトランスフェクトした結果を示す。
【図１３】図１３は、非−ステロイド（ＧＳＥ）および９−シス−レチノイン酸（９Ｃｉｓ）の存在下における４８時間での、ＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるｐＦＲＬｕｃによるＧＡＬ４ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦ／ＶＰ１６ＬｍＵＳＰ−ＥＦ遺伝子スイッチのトランス活性化能力に対する９−シス−レチノイン酸の効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
定義
本開示においては、多数の用語および略語が用いられる。以下の定義が設けられ、それは、本発明の範囲および実施を理解するのに助けとなるはずである。
【００３９】
特定の態様において、用語「約」または「ほぼ」は与えられた値または範囲の２０％以内、好ましくは１０％以内、より好ましくは５％以内、なおより好ましくは１％以内を意味する。
【００４０】
用語「実質的に含まない」は、組成物中（ＡおよびＢが属する種のカテゴリーに応じて）少なくとも約７５重量％の蛋白質、ＤＮＡ、ベクターが「Ａ」である場合に、「Ａ」を含む組成物が（ここに、「Ａ」は単一の蛋白質、ＤＮＡ分子、ベクター、組換え宿主細胞等である）が「Ｂ」（ここに、「Ｂ」は１以上の混入蛋白質、ＤＮＡ分子、ベクター等を含む）を実質的に含まないことを意味する。好ましくは、「Ａ」は、組成物においてＡ＋Ｂ種の少なくとも約９０重量％、より好ましくは少なくとも約９９重量％を含む。また、混入物を実質的に含まない組成物が、注目する種の活性または特徴を有する単一分子量の種のみを含有するのも好ましい。
【００４１】
本発明の目的では、用語「単離された」は、その元来の環境（それが天然に存在する環境）から取り出された生物学的物質（核酸または蛋白質）を示す。例えば、植物または動物中にて天然状態で存在するポリヌクレオチドは単離されていないが、それが天然で存在する隣接核酸から分離された同一ポリヌクレオチドは「単離された」と考えられる。用語「精製された」は、他の化合物の存在を排除して、物質が絶対的純粋さを呈する形態で存在することを要しない。それはむしろ相対的な定義である。
【００４２】
ポリヌクレオチドは、少なくとも１桁の大きさ、好ましくは２または３桁、より好ましくは４または５桁の大きさだけ出発物質または天然物質が精製された後に「精製された」状態にあるものである。
【００４３】
「核酸」は、ヌクレオチドと呼ばれるサブユニットが共有結合したものを含んでなる高分子化合物である。核酸はポリリボ核酸（ＲＮＡ）およびポリデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含み、共に一本鎖または二本鎖であり得る。ＤＮＡは限定されるものではないが、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、合成ＤＮＡおよび半合成ＤＮＡを含む。ＤＮＡは直鎖状、環状またはスーパーコイルであり得る。
【００４４】
「核酸分子」とは、一本鎖形態または二本鎖ヘリックスの、リボヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、ウリジンまたはシチジン、「ＲＮＡ分子」）またはデオキシリボヌクレオシド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジンまたはデオキシシチジン、「ＤＮＡ分子」）のリン酸エステルポリマー形態、あるいはホスホロチオエートおよびチオエステルのごときそれらの任意のホスホエステルアナログもいう。二本鎖ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡおよびＲＮＡ−ＲＮＡヘリックスが可能である。用語核酸分子、特にＤＮＡまたはＲＮＡ分子とは、分子の一次および二次構造のみをいい、それをいずれかの特定の三次形態に限定しない。かくして、この用語は、とりわけ、直鎖状または環状ＤＮＡ分子（例えば、制限断片）、プラスミドおよび染色体に見出される二本鎖ＤＮＡを含む。特定の二本鎖ＤＮＡ分子の構造を議論するにおいて、本明細書中では、ＤＮＡの非−転写ストランド（すなわち、ｍＲＮＡに対して相同な配列を有するストランド）に沿って５’から３’への方向の配列のみを与える通常の慣例に従って配列を記載することができる。「組換えＤＮＡ分子」は、分子生物学的操作を受けたＤＮＡ分子である。
【００４５】
用語「断片」は参照核酸に対して減少した長さのヌクレオチド配列を意味し、共通の部分にわたって、参照核酸と同一のヌクレオチド配列を含むと理解されるであろう。本発明に従うそのような核酸断片は、適切には、それが構成要素であるより大きなポリヌクレオチドに含まれ得る。そのような断片は、本発明による核酸の少なくとも６、８、９、１０、１２、１５、１８、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３９、４０、４２、４５、４８、５０、５１、５４、５７、６０、６３、６６、７０、７５、７８、８０、９０、１００、１０５、１２０、１３５、１５０、２００、３００、５００、７２０、９００、１０００または１５００の連続的ヌクレオチドの長さの範囲のオリゴヌクレオチドを含むかあるいはそれよりなる。
【００４６】
本明細書中で用いるごとく「単離された核酸断片」は、所望により合成、非天然または改変ヌクレオチド塩基を含有してもよい、一本鎖または二本鎖であるＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーである。ＤＮＡのポリマーの形態である単離された核酸断片はｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡの１以上のセグメントを含んでなることができる。
【００４７】
「遺伝子」とは、ポリペプチドをコードするヌクレオチドのアセンブリーをいい、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ核酸を含む。また、「遺伝子」とは、コーディング配列に先立つ調節配列（５’非−コーディング配列）およびコーディング配列に続く調節配列（３’非−コーディング配列）を含めた、特定の蛋白質またはポリペプチドを発現する核酸断片をいう。「天然遺伝子」とは、それ自身の調節配列を持つ天然で見出される遺伝子をいう。「キメラ遺伝子」とは、天然では一緒に見出されない調節配列および／またはコーディング配列を含む、天然遺伝子ではないいずれの遺伝子もいう。従って、キメラ遺伝子は、異なる源に由来する調節配列およびコーディング配列、または同一源に由来するが、天然で見出されるものと異なって配列した調節配列およびコーディング配列を含むことができる。キメラ遺伝子は、異なる源に由来するコーディング配列および／または異なる源に由来する調節配列を含むことができる。「内因性遺伝子」とは、生物のゲノムにおけるその天然の位置での天然遺伝子をいう。「外来性」遺伝子または「異種」遺伝子とは、宿主生物に通常は見出されないが、遺伝子導入によって宿主生物に導入された遺伝子をいう。外来性遺伝子は非天然生物に挿入された天然遺伝子、またはキメラ遺伝子を含むことができる。「トランスジーン」は、形質転換手法によってゲノムに導入された遺伝子である。
【００４８】
「異種」ＤＮＡとは、細胞、または細胞の染色体部位に天然では位置しないＤＮＡをいう。好ましくは、異種ＤＮＡは細胞に対して外来性である遺伝子を含む。
【００４９】
用語「ゲノム」は染色体ならびにミトコンドリア、葉緑体およびウイルスＤＮＡまたはＲＮＡを含む。
【００５０】
核酸分子は、当該核酸分子の一本鎖形態が、温度および溶液イオン強度の適当な条件下で他の核酸分子にアニールすることができる場合に、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡのようなもう１つの核酸分子に「ハイブリダイズすることができる」（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、後掲参照）。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件はよく知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（１９８９）、特にその中の第１１章および表１１．１（引用によりその全体を本明細書の一部とみなす）に例示されている。温度およびイオン強度の条件はハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。
【００５１】
ストリンジェンシー条件は、密接に関連する生物から機能性酵素を複製する遺伝子のごとき高度に同様な断片に対して、余り関連の無い生物からの相同配列のごとき中程度に同様な断片につきスクリーニングするように調整することができる。相同核酸についての予備的スクリーニングでは、５５°のＴｍに対応する低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件を用いることができる。例えば、５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、０．２５％ミルク、およびホルムアミド無し、または３０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ。中程度のストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、より高いＴｍ、例えば、５×または６×ＳＣＣにての４０％ホルムアミドに対応する。高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は最高のＴｍ、例えば、５０％ホルムアミド、５×または６×ＳＣＣに対応する。ハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに依存して、塩基間のミスマッチが可能であるが、２つの核酸が相補的配列を含有することを必要とする。
【００５２】
用語「相補的」は、相互にハイブリダイズすることができるヌクレオチド塩基の間の関係を記載するのに用いる。例えばＤＮＡに関しては、アデノシンはチミジンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。従って、本発明は、本明細書中で開示するまたは用いる完全な配列ならびにそれらの実質的に同様な核酸配列に相補的な単離された核酸断片も含む。
【００５３】
特定の態様において、用語「標準ハイブリダイゼーション条件」とは５５℃のＴｍをいい、前記した条件を利用する。好ましい態様において、Ｔｍは６０℃であり、より好ましい態様においては、Ｔｍは６５℃である。
【００５４】
ポスト−ハイブリダイゼーション洗浄もストリンジェンシー条件を決定する。好ましい条件の１つの組は室温にて１５分間の６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで出発し、次いで、４５℃にて３０分間２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳを反復し、次いで、５０℃にて３０分間０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳを２回反復する一連の洗浄を用いる。ストリンジェントな条件のより好ましい組はより高い温度を用い、そこでは、０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳにおける最後の２回の３０分間の洗浄の温度を６０℃に上昇させる以外は洗浄は前記のものと同一である。高度にストリンジェントな条件の他の好ましい組は、６５℃における０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの２回の最終洗浄を用いる。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに依存して塩基の間のミスマッチが可能であるが、ハイブリダイゼーションは、２つの核酸が相補的な配列を含むことを必要とする。
【００５５】
核酸をハイブリダイズさせるための適当なストリンジェンシーは核酸の長さ、相補性の程度、当該分野でよく知られた変数に依存する。２つのヌクレオチド配列の間の同様性または相同性の程度が大きくなれば、それらの配列を有する核酸のハイブリッドについてのＴｍの値は大きくなる。核酸ハイブリダイゼーションの（より高いＴｍに対応する）相対的安定性は以下の順序で減少する。ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡ。長さが１００ヌクレオチドを超えるハイブリッドについては、Ｔｍを計算するための方程式が誘導されている（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前掲、９．５０−０．５１参照）。より短い核酸、すなわち、オリゴヌクレオチドでのハイブリダイゼーションでは、ミスマッチの位置はより重要であり、オリゴヌクレオチドの長さはその特異性を決定する（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前掲、１１．７−１１．８参照）。
【００５６】
１つの態様では、ハイブリダイズ可能な核酸についての長さは少なくとも約１０ヌクレオチドである。ハイブリダイズ可能な核酸についての好ましい最小長さは少なくとも約１５ヌクレオチドであり、より好ましくは少なくとも約２０ヌクレオチドであり、最も好ましくは、該長さは少なくとも３０ヌクレオチドである。さらに、当業者であれば、温度および洗浄溶液の塩の濃度は、プローブの長さといったファクターに従って必要に応じて調整することができる。
【００５７】
用語「プローブ」とは、相補的一本鎖標的核酸とで塩基対を形成して、二本鎖分子を形成することができる一本鎖核酸分子をいう。本明細書中で用いるごとく、用語「オリゴヌクレオチド」とは、ゲノムＤＮＡ分子、ｃＤＮＡ分子、プラスミドＤＮＡまたはｍＲＮＡ分子にハイブリダイズすることができる、一般に少なくとも１８ヌクレオチドの核酸をいう。オリゴヌクレオチドは、例えば、３２Ｐ−ヌクレオチド、またはビオチンのごときラベルが共有結合したヌクレオチドで標識することができる。標識オリゴヌクレオチドをプローブとして用いて、核酸の存在を検出することができる。オリゴヌクレオチド（その一方または双方を標識することができる）を、核酸の全長または断片をクローニングするために、あるいは核酸の存在を検出するためにＰＣＲプライマーとして用いることができる。また、オリゴヌクレオチドを用いて、ＤＮＡ分子とで三重ヘリックスを形成することができる。一般に、好ましくは核酸合成器でオリゴヌクレオチドを合成により調製する。従って、オリゴヌクレオチドは、チオエステル結合などのごとき天然に生じないホスホエステルアナログ結合を有するように調製することができる。
【００５８】
「プライマー」は、適当な条件下でＤＮＡ合成のための開始点として働くことができる、二本鎖核酸領域を生じさせるために標的核酸配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドである。そのようなプライマーはポリメラーゼ連鎖反応で用いることができる。
【００５９】
「ポリメラーゼ連鎖反応」はＰＣＲと略され、酵素により特定の核酸配列を増幅するためのイン・ビトロ方法を意味する。ＰＣＲは、３つの段階：標的分子のストランドを分離するための鋳型核酸の変性、一本鎖ＰＣＲオリゴヌクレオチドのプライマーの鋳型核酸へのアニーリング、およびＤＮＡポリメラーゼによるアニールされたプライマーの伸長を含む各サイクルに伴う一連の繰り返し温度サイクルを含む。ＰＣＲは、標的分子の存在を検出し、および定量的または半定量的条件下で、核酸の出発プール内のその標的分子の相対量を決定する手段を提供する。
【００６０】
「逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応」はＲＴ−ＰＣＲと省略され、ＲＮＡ分子から標的ｃＤＮＡ分子を酵素的に生産し、続いて、前記したごとく標的ｃＤＮＡ分子内で特定の核酸配列の酵素的増幅を行うイン・ビトロ方法を意味する。また、ＲＴ−ＰＣＲは、標的分子の存在を検出し、および定量的または半定量的条件下で、核酸の出発プール内のその標的分子の相対量を決定する手段を提供する。
【００６１】
ＤＮＡの「コーディング配列」は、適当な調節配列の制御下においた場合に、イン・ビトロまたはイン・ビボにて、細胞中にて転写されて、ポリペプチドに翻訳される二本鎖ＤＮＡ配列である。「適当な調節配列」とは、コーディング配列の上流（５’非−コーディング配列）、その中、または下流（３’非−コーディング配列）に位置し、かつ関連するコーディング配列の転写、ＲＮＡプロセッシングもしくは安定性、または翻訳に影響するヌクレオチド配列をいう。調節配列はプロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセッシング部位、エフェクター結合部位およびステム−ループ構造を含むことができる。コーディング配列の境界は、５’（アミノ）末端における開始コドンおよび３’（カルボキシル）末端における翻訳停止コドンによって決定される。コーディング配列は、限定されるものではないが、原核生物配列、ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列さえ含むことができる。もしコーディング配列が真核生物細胞における発現を意図するならば、ポリアデニル化シグナルおよび転写終止配列は、通常、コーディング配列に対して３’側に位置するであろう。
【００６２】
「オープンリーディングフレーム」はＯＲＦと省略され、ＡＴＧまたはＡＵＧのごとき翻訳開始シグナルまたは開始コドン、および終止コドンを含み、かつ潜在的にポリペプチド配列に翻訳されることができるある長さの核酸配列（ＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡいずれか）を意味する。
【００６３】
本明細書中では、用語「ヘッド−対−ヘッド」は、相互に対して２つのポリヌクレオチド配列の向きを記載するために用いる。１つのポリヌクレオチドのコーディングストランドの５’末端が他のポリヌクレオチドのコーディングストランドの５’末端に隣接し、それにより、各ポリヌクレオチドの転写の方向が他のポリヌクレオチドの５’末端から遠ざかるように進行する場合、２つのポリヌクレオチドはヘッド−対−ヘッド向きに位置する。用語「ヘッド−対−ヘッド」は、（５’）−対−（５’）と省略でき、また、記号（←→）または（３’←５’５’→３’）によって示すこともできる。
【００６４】
本明細書中では、用語「テール−対−テール」は、相互に対して２つのポリヌクレオチド配列の向きを記載するのに用いる。１つのポリヌクレオチドのコーディングストランドの３’末端が他のポリヌクレオチドのコーディングストランドの３’末端に隣接し、それにより、各ポリヌクレオチドの転写の向きが他のポリヌクレオチドに向かって進行する場合、２つのポリヌクレオチドはテール−対−テール向きに位置する。用語「テール−対−テール」は（３’）−対−（３’）と省略することができ、また、記号（→←）または（５’→３’３’←５’）によって示すこともできる。
【００６５】
本明細書中では、用語「ヘッド−対−テール」は、相互に対して２つのポリヌクレオチド配列の向きを記載するのに用いる。１つのポリヌクレオチドのコーディングストランドの５’末端が他のポリヌクレオチドのコーディングストランドの３’末端に隣接し、それにより、各ポリヌクレオチドの転写の方向が他のポリヌクレオチドの方向と同一向きに進行する場合、２つのポリヌクレオチドはヘッド−対−テール向きに位置する。用語「ヘッド−対−テール」は（５’）−対−（３’）と省略することができ、また、記号（→→）または（５’→３’５’→３’）によって示すこともできる。
【００６６】
用語「下流」とは参照ヌクレオチド配列に対して３’側に位置するヌクレオチド配列をいう。特に、下流ヌクレオチド配列は、一般に、転写の開始点に続く配列に関する。例えば、遺伝子の翻訳開始コドンは転写の開始部位の下流に位置する。
【００６７】
用語「上流」とは、参照ヌクレオチド配列に対して５’側に位置するヌクレオチド配列をいう。特に、上流ヌクレオチド配列は、一般に、コーディング配列または転写の開始点の５’側に位置する配列に関する。例えば、ほとんどのプロモーターは転写の開始点の上流に位置する。
【００６８】
用語「制限エンドヌクレアーゼ」および「制限酵素」とは、二本鎖ＤＮＡ内の特定のヌクレオチド配列内に結合し、それを切断する酵素をいう。
【００６９】
「相同組換え」とは、他のＤＮＡ分子への外来性ＤＮＡ配列の挿入、例えば、染色体へのベクターの挿入をいう。好ましくは、ベクターは相同組換え用の特定の染色体部位を標的とする。特定の相同組換えでは、ベクターは、染色体の配列に対して相同性である十分に長い領域を含有して、相補的結合および染色体へのベクターの組み込みを可能とするであろう。相同性であるより長い領域、および配列同様性のより大きな程度は、相同組換えの効率を増加させることができる。
【００７０】
当該分野で知られたいくつかの方法を用いて、本発明によるポリヌクレオチドを増幅させることができる。一旦適当な宿主系および増殖条件が確立されれば、組換え発現ベクターを増幅させ、定量的に調製することができる。本明細書中に記載するごとく、用いることができる発現ベクターは、限定されるものではないが、少数の名前を挙げれば、以下のベクターまたはその誘導体：ワクシニアウイルスまたはアデノウイルスのごときヒトまたは動物ウイルス、バキュロウイルスのごとき昆虫ウイルス、酵母ベクター、バクテリオファージベクター（例えば、ラムダ）、ならびにプラスミドおよびコスミドＤＮＡベクターを含む。
【００７１】
「ベクター」は、核酸の宿主細胞へのクローニングおよび／または導入のためのいずれかの手段である。ベクターは、他のＤＮＡセグメントを結合させて、結合したセグメントの複製を行うことができるレプリコンであり得る。「レプリコン」は、イン・ビボでＤＮＡ複製の自律ユニットとして機能する、すなわち、それ自身の制御下で複製することができるいずれかの遺伝的エレメント（例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、染色体、ウイルス）である。用語「ベクター」は、イン・ビトロ、エクス・ビボまたはイン・ビボにて核酸を細胞に導入するためのウイルスおよび非ウイルス手段の両方を含む。当該分野で知られた非常に多数のベクターを用いて、核酸を操作し、応答エレメントおよびプロモーターを遺伝子に組み込むなどすることができる。可能なベクターは、例えば、ラムダ誘導体といったバクテリオファージ、またはｐＢＲ３２２もしくはｐＵＣプラスミド誘導体といったプラスミド、またはＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターなどの、例えばプラスミドまたは修飾ウイルスを含む。例えば、適当なベクターへの応答エレメントおよびプロモーターに対応するＤＮＡ断片の挿入は、相補的粘着末端を有する選択されたベクターへ適当なＤＮＡ断片を連結することによって達成することができる。別法として、ＤＮＡ分子の末端は酵素的に修飾することができるか、またはヌクレオチド配列（リンカー）をＤＮＡ末端に連結することによっていずれの部位も生じさせることができる。そのようなベクターは、マーカーを細胞ゲノムに組み込んだ細胞の選択を供する選択マーカー遺伝子を含有するように作成することができる。そのようなマーカーは、マーカーによってコードされた蛋白質を組み込み、それを発現する宿主細胞の同定および／または選択を可能とする。
【００７２】
ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、細胞、ならびに生きた動物対象における広く種々の遺伝子送達適用で用いられてきた。用いることができるウイルスベクターは、限定されるものではないが、レトロウイルス、アデノ−随伴ウイルス、ポックス、バキュロウイルス、ワクシニア、単純ヘルペス、エプスタイン−バール、アデノウイルス、ジェミニウイルスおよびカウリモウイルスベクターを含む。非−ウイルスベクターはプラスミド、リポソーム、荷電脂質（サイトフェクチン）、ＤＮＡ−蛋白質複合体、およびバイオポリマーを含む。核酸に加え、ベクターは、１以上の調節領域、および／または核酸導入の結果（いずれの組織への導入、発現の持続など）を選択し、測定し、およびモニターするのに有用な選択マーカーを含むこともできる。
【００７３】
用語「プラスミド」とは、細胞の中心的代謝の一部ではなく、通常、環状二本鎖ＤＮＡ分子の形態である、遺伝子をしばしば運ぶ染色体外エレメントをいう。そのようなエレメントは任意の源に由来する、一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡの自律複製配列、ゲノム組み込み配列、ファージまたはヌクレオチド配列（直鎖状、環状またはスーパーコイル）であってよく、ここに、多数のヌクレオチド配列が、適当な３’非翻訳配列と共にプロモーター断片および選択された遺伝子産物についてのＤＮＡ配列を細胞に導入することができる独自の構築物に合体または組み換えられている。
【００７４】
「クローニングベクター」は、他の核酸セグメントを結合させて、結合されたセグメントの複製を行うことができる、プラスミド、ファージまたはコスミドのごとき、順次複製する核酸、好ましくは、ＤＮＡの単位長さであって、複製起点を含む「レプリコン」である。クローニングベクターは１つの細胞型で複製することができ、もう１つにおいて発現することができる（「シャトルベクター」）。
【００７５】
ベクターは、当該分野で知られた方法、例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション（リソソーム融合）、遺伝子銃の使用、またはＤＮＡベクタートランスポーターによって、所望の宿主細胞に導入されることができる（例えば、Ｗｕら、１９９２、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：９６３−９６７、ＷｕおよびＷｕ、１９８８、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１４６２１−１４６２４、およびＨａｒｔｍｕｔら、１９９０年３月１５日に出願されたカナダ特許出願第２，０１２，３１１号参照）。
【００７６】
また、本発明によるポリヌクレオチドはリポフェクションによってイン・ビボによって導入することもできる。過去１０年間、イン・ビトロでの核酸のカプセル化およびトランスフェクションのためのリポソームの使用が増大してきた。リポソーム−媒介トランスフェクションが遭遇する困難および危険を制限するように設計された合成カチオン脂質を用いて、マーカーをコードする遺伝子のイン・ビボトランスフェクション用のリポソームを調製することができる（Ｆｅｌｇｎｅｒら、１９８７、ＰＮＡＳ８４：７４１３、Ｍａｃｋｅｙら、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：８０２７−８０３１、およびＵｌｍｅｒら、１９９３、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：１７４５−１７４８）。カチオン脂質の使用は負に荷電した核酸のカプセル化を促進し、また、負に荷電した細胞膜との融合も促進することができる（ＦｅｌｇｎｅｒおよびＲｉｎｇｏｌｄ、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３７：３８７−３８８）。核酸のトランスファーのための特に有用な脂質化合物および組成物は国際特許公開ＷＯ９５／１８８６３号およびＷＯ９６／１７８２３号、および米国特許第５，４５９，１２７号に記載されている。外来性遺伝子をイン・ビボで特定の器官に導入するためのリポフェクションの使用はある現実的な利点を有する。特定の細胞へのリポソームの分子標的化は利点の１つの領域を表す。トランスフェクションを特定の細胞型に向けるのは、膵臓、肝臓、腎臓および脳のごとき細胞異種性を持つ組織において特に好ましいであろうことが明らかである。脂質は、標的化の目的で他の分子に化学的にカップリングさせることができる（Ｍａｃｋｅｙら、１９８８、前掲）。標的化されたペプチド、例えば、ホルモンもしくは神経伝達物質、および抗体のような蛋白質、または非−ペプチド分子を化学的にリポソームにカップリングさせることができよう。
【００７７】
また、カチオンオリゴペプチド（例えばＷＯ９５／２１９３１号）、ＤＮＡ結合蛋白質に由来するペプチド（例えば、ＷＯ９６／２５５０８号）、またはカチオンポリマー（例えばＷＯ９５／２１９３１号）のごとき他の分子も、イン・ビボにて核酸のトランスフェクションを容易とするのに有用である。
【００７８】
また、裸のＤＮＡプラスミドとしてイン・ビボにてベクターに導入することも可能である（米国特許第５，６９３，６２２号、第５，５８９，４６６号および第５，５８０，８５９号参照）。また、受容体−媒介ＤＮＡ送達アプローチも用いることができる（Ｃｕｒｉｅｌら、１９９２、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．３：１４７−１５４、ならびにＷｕおよびＷｕ、１９８７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２）。
【００７９】
用語「トランスフェクション」は、細胞による外来性または異種ＲＮＡまたはＤＮＡの取り込みを意味する。外来性または異種ＲＮＡまたはＤＮＡが細胞内部に導入された場合、細胞はそのようなＲＮＡまたはＤＮＡによって「トランスフェクトされている」。トランスフェクトされたＲＮＡまたはＤＮＡが表現型の変化をもたらす場合、細胞は外来性または異種ＲＮＡまたはＤＮＡによって「形質転換されている」。形質転換ＲＮＡまたはＤＮＡは染色体ＤＮＡに（共有結合的に）組み込まれ、細胞のゲノムを形成する。
【００８０】
「形質転換」とは、宿主の生物のゲノムへの核酸断片の導入をいい、その結果、遺伝的に安定な遺伝がもたらされる。形質転換された核酸断片を含有する宿主生物を「トランスジェニック」または「組換え」または「形質転換された」生物という。
【００８１】
用語「遺伝子領域」とは、ポリペプチドをコードする遺伝子を含む核酸分子またはヌクレオチド配列の領域をいう。
【００８２】
加えて、本発明によるポリヌクレオチドを含む組換えベクターは、その増幅またはその発現が求められる細胞宿主における複製用の１以上の起点、マーカーまたは選択マーカーを含むことができる。
【００８３】
用語「選択マーカー」は、同定因子、マーカー遺伝子の効果、すなわち、抗生物質に対する抵抗性、除草剤に対する抵抗性、比色マーカー、酵素、蛍光マーカーなどに基づいて選択することができる因子を意味し、通常は、抗生物質または化学的抵抗性遺伝子であり、ここに、該効果を用いて、注目する核酸の遺伝を追跡し、および／または注目する核酸を受け継いだ細胞または生物を同定する。当該分野で知られ、用いられる選択マーカー遺伝子の例は、アンピシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ヒグロマイシン、ビアラフォス除草剤、スルホンアミドなどに対する抵抗性を供する遺伝子、および表現型マーカーとして用いられる遺伝子、すなわち、アントシアニン調節遺伝子、イソペンタニルトランスフェラーゼ遺伝子などを含む。
【００８４】
用語「レポーター遺伝子」は、レポーター遺伝子の効果に基づいて同定することができる同定因子をコードする核酸を意味し、ここに、該効果を用いて、注目する核酸の遺伝を追跡し、注目する核酸を受け継いだ細胞または生物を同定し、および／または遺伝子発現の誘導または転写を測定する。当該分野で知られ、用いられるレポーター遺伝子の例はルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、β−グルクロニダーゼ（Ｇｕｓ）などを含む。選択マーカー遺伝子はレポーター遺伝子と考えることもできる。
【００８５】
「プロモーター」とは、コーディング配列または機能的ＲＮＡの発現を制御することができるＤＮＡ配列をいう。一般に、コーディング配列はプロモーター配列の３’側に位置する。プロモーターは天然遺伝子からその全体が由来してもよく、あるいは天然で見出される異なるプロモーターに由来する異なるエレメントから構成されてよく、あるいは合成ＤＮＡセグメントを含んでなるものでさえよい。異なるプロモーターは、異なる組織または細胞型において、または発生の異なる段階において、または異なる環境または生理学的条件に応答して、遺伝子の発現を指令することができることは当業者に理解される。遺伝子をほとんどの機会、ほとんどの細胞型で発現させるプロモーターは通常「構成的プロモーター」といわれる。遺伝子を特定の細胞型で発現させるプロモーターは、通常、「細胞−特異的プロモーター」または「組織−特異的プロモーター」といわれる。遺伝子を発生または細胞分化の特定の段階で発現させるプロモーターは、通常、「発生−特異的プロモーター」または「細胞分化−特異的プロモーター」といわれる。当該プロモーターを誘導する物質、生物学的分子、化学物質、リガンド、光などでの細胞の暴露または処理に続いて誘導され、遺伝子を発現させるプロモーターは、通常、「誘導性プロモーター」または「調節性プロモーター」といわれる。ほとんどの場合、調節配列の精密な境界は完全には画定されていないので、異なる長さのＤＮＡ断片が同一のプロモーター活性を有することができることはさらに認識されている。
【００８６】
「プロモーター配列」は、細胞中でＲＮＡポリメラーゼに結合し、下流（３’方向）のコーディング配列の転写を開始させることができるＤＮＡ調節領域である。本発明を定義する目的では、プロモーター配列は、転写開始部位によってその３’末端において境があり、上流（５’方向）に伸びて、バックグラウンドを超えて検出可能なレベルで転写を開始させるのに必要な最少数の塩基またはエレメントを含む。プロモーター配列内には、（例えば、ヌクレアーゼＳ１でのマッピングによって便宜に画定される）転写開始部位、ならびにＲＮＡポリメラーゼの結合を担う蛋白質結合ドメイン（コンセンサス配列）が見出されるであろう。
【００８７】
コーディング配列は、ＲＮＡポリメラーゼがコーディング配列をｍＲＮＡに転写し、次いで、それが（もしコーディング配列がイントロンを含むならば）トランス−ＲＮＡスプライシングされ、コーディング配列によってコードされた蛋白質に翻訳される場合、細胞中での転写および翻訳制御配列の「制御下」にある。
【００８８】
「転写および翻訳制御配列」は、宿主細胞におけるコーディング配列の発現を供する、プロモーター、エンハンサー、ターミネーターなどのごときＤＮＡ調節配列である。真核生物細胞においては、ポリアデニル化シグナルは制御配列である。
【００８９】
用語「応答エレメント」は、第１のキメラ遺伝子のＤＮＡ−結合ドメインとの相互作用を介して媒介されたプロモーターに対する応答性を付与する１以上のシス−作用性ＤＮＡエレメントを意味する。このＤＮＡエレメントはその配列が回文構造（完全または不完全）であるか、あるいは可変数のヌクレオチドによって分離された配列モチーフまたはハーフ部位よりなることからできる。該ハーフ部位は同様または同一であり、直接または逆転反復いずれかとして、あるいは単一ハーフ部位またはタンデムな隣接ハーフ部位のマルチマーとして配列できる。応答エレメントは、当該応答エレメントが組み込まれる細胞または生物の性質に応じて異なる生物から単離された最小プロモーターを含むことができる。第１のハイブリッド蛋白質のＤＮＡ結合ドメインは、リガンドの存在下または不存在下で、応答エレメントのＤＮＡ配列に結合して、この応答エレメントの調節下で下流の遺伝子の転写を開始または抑制する。天然エクジソン受容体の応答エレメントについてのＤＮＡ配列の例はＲＲＧＧ／ＴＴＣＡＮＴＧＡＣ／ＡＣＹＹ（Ｃｈｅｒｂａｓ  Ｌ．ら、（１９９１）、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．５、１２０−１３１参照）、ＡＧＧＴＣＡＮ（ｎ）ＡＧＧＴＣＡ（ここに、Ｎ（ｎ）は１以上のスペーサーヌクレオチドであり得る）（Ｄ’Ａｖｉｎｏ  ＰＰ．ら、（１９９５）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  １１３、１−９）、およびＧＧＧＴＴＧＡＡＴＧＡＡＴＴＴ（Ａｎｔｏｎｉｅｗｓｋｉ  Ｃ．ら、（１９９４）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１４、４４６５−４４７４）を含む。
【００９０】
用語「作動可能に連結した」とは、一方の機能が他方によって影響されるような、単一核酸断片に対する核酸配列の関連をいう。例えば、プロモーターがコーディング配列の発現に影響できる（すなわち、コーディング配列がプロモーターの転写制御下にある）場合、プロモーターはコーディング配列に作動可能に連結している。コーディング配列はセンスまたはアンチセンス向きに調節配列に作動可能に連結することができる。
【００９１】
本明細書中で用いるごとく、用語「発現」とは、核酸またはポリヌクレオチドに由来するセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定な蓄積をいう。また、発現はｍＲＮＡの蛋白質またはポリペプチドへの翻訳もいうこともできる。
【００９２】
用語「カセット」、「発現カセット」および「遺伝子発現カセット」とは、特定の制限部位において、あるいは相同組換えによって、核酸またはポリヌクレオチドに挿入することができるＤＮＡのセグメントをいう。ＤＮＡのセグメントは注目するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、カセットおよび制限部位は、転写および翻訳のために適切なリーディングフレームにてカセットの挿入を確実とするように設計される。「形質転換カセット」とは、注目するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、当該ポリヌクレオチドに加えて、特定の宿主細胞の形質転換を容易とするエレメントを有する特定のベクターをいう。本発明のカセット、発現カセット、遺伝子発現カセットおよび形質転換カセットは、宿主細胞における注目するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの増強された発現を可能とするエレメントも含むことができる。これらのエレメントは、限定されるものではないが、プロモーター、最小プロモーター、エンハンサー、応答エレメント、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列などを含むことができる。
【００９３】
本発明の目的では、用語「遺伝子スイッチ」とは、プロモーターと関連した応答エレメント、および１以上のリガンドの存在下で、応答エレメントおよびプロモーターが組み込まれる遺伝子の発現を変調するＥｃＲベースのシステムの組合せをいう。
【００９４】
用語「変調する」は、核酸または遺伝子の発現を誘導し、減少させ、または阻害し、その結果、蛋白質またはポリペプチド生産をそれぞれ誘導し、減少させまたは阻害すること意味する。
【００９５】
本発明によるプラスミドまたはベクターは、さらに、宿主細胞において遺伝子の発現を駆動するのに適当な少なくとも１つのプロモーターを含むことができる。用語「発現ベクター」は、宿主への形質転換に続いて挿入された核酸配列の発現を可能とするように設計されたベクター、プラスミドまたはビヒクルを意味する。クローン化遺伝子、すなわち、挿入された核酸配列は、通常、プロモーター、最小プロモーター、エンハンサーなどのごとき制御エレメントの制御下におかれる。所望の宿主細胞において核酸の発現を駆動するのに有用な開始制御領域またはプロモーターは数多くあり、当業者によく知られている。これらの遺伝子を駆動することができる実質的にいずれのプロモーターも本発明で適当であり、限定されるものではないが、ウイルスプロモーター、細菌プロモーター、動物プロモーター、哺乳動物プロモーター、合成プロモーター、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、発生特異的プロモーター、誘導性プロモーター、光調節プロモーター、ＣＹＣ１、ＨＩＳ３、ＧＡＬ１、ＧＡＬ４、ＧＡＬ１０、ＡＤＨ１、ＰＧＫ、ＰＨＯ５、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣ１、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＥＮＯ、ＴＰＩ、（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓにおける発現で有用な）アルカリホスファターゼプロモーター、（Ｐｉｃｈｉａにおける発現で有用な）ＡＯＸ１プロモーター、（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  Ｃｏｉｌにおける発現で有用な）β−ラクタマーゼ、ｌａｃ、ａｒａ、ｔｅｔ、ｔｒｐ、ｌＰＬ、ｌＰＲ、Ｔ７、ｔａｃおよびｔｒｃプロモーター、光調節−プロモーターを含み、当該分野で知られた動物および哺乳動物プロモーターは、限定されるものではないが、ＳＶ４０早期（ＳＶ４０ｅ）プロモーター領域、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）の３’ロングターミナルリピート（ＬＴＲ）に含まれたプロモーター、アデノウイルス（Ａｄ）のＥ１Ａのプロモーターまたは主要後期プロモーター（ＭＬＰ）遺伝子、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）早期プロモーター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーター、伸長因子１アルファ（ＥＦ１）プロモーター、ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、ユビキチン（Ｕｂｃ）プロモーター、アルブミンプロモーター、マウスメタロチオネイン−Ｌプロモーターの調節配列および転写制御領域、ユビキタスプロモーター（ＨＰＲＴ、ビメンチン、α−アクチン、チューブリンなど）、中間フィラメント（デスミン、ニューロフィラメント、ケラチン、ＧＦＡＰなど）のプロモーター、（ＭＤＲ、ＣＦＴＲまたは第ＶＩＩＩ型因子などの）治療遺伝子のプロモーター、病因または病気関連−プロモーター、および組織特異性を呈しトランスジェニック動物で利用されてきたプロモーターで、例えば膵臓腺房細胞で活性なエラスターゼＩ遺伝子制御領域、膵臓ベータ細胞で活性なインスリン遺伝子制御領域、リンパ細胞で活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域、精巣、乳房、リンパ系および肥満細胞で活性なマウス乳癌ウイルス制御領域、肝臓で活性なアルブミン遺伝子、Ａｐｏ  ＡＩおよびＡｐｏ  ＡＩＩ制御領域、肝臓で活性なアルファ−フェト蛋白質遺伝子制御領域、肝臓で活性なアルファ１−アンチトリプシン遺��子制御領域、骨髄系細胞で活性なベータ−グロビン遺伝子制御領域、脳中の稀突起神経膠細胞で活性なミエリン塩基性蛋白質遺伝子制御領域、骨格筋で活性なミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域および視床下部で活性なゴナドトロピン放出ホルモン遺伝子制御領域；ピルベートキナーゼプロモーター、ビリンプロモーター、脂肪酸結合腸蛋白質のプロモーター、平滑筋細胞α−アクチンのプロモーターなどを含む。加えて、これらの発現配列は、エンハンサーまたは調節配列などの付加によって修飾することもできる。
【００９６】
本発明の態様で用いることができるエンハンサーは、限定されるものではないが、ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー、伸長因子１（ＥＦ１）エンハンサー、酵母エンハンサー、ウイルス遺伝子エンハンサーなどを含む。
【００９７】
終止制御領域、すなわち、ターミネーターまたはポリアデニル化配列もまた好ましい宿主本来の種々の遺伝子に由来することができる。所望により、終止部位は必要ではないが、もし含まれれば最も好ましい。本発明の好ましい態様において、終止制御領域は合成配列、合成ポリアデニル化シグナル、ＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル、ウイルスターミネーター配列などを含むことができるか、またはそれに由来することができる。
【００９８】
用語「３’非−コーディング配列」または「３’非翻訳領域（ＵＴＲ）」とは、コーディング配列の下流（３’側）に位置するＤＮＡ配列をいい、それは、ポリアデニル化［ポリ（Ａ）］認識配列およびｍＲＮＡプロセッシングまたは遺伝子発現に影響することができる調節シグナルをコードする他の配列を含むことができる。ポリアデニル化シグナルは、通常、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニル酸トラクトの付加に影響することによって特徴付けられる。
【００９９】
「調節領域」は、第２の核酸配列の発現を調節する核酸配列を意味する。調節領域は、特定の核酸（相同領域）を発現することを天然で担う配列を含むことをできるか、あるいは異なる蛋白質または合成蛋白質（異種領域）でさえ発現することを担う異なる起源の配列を含むことができる。特に、該配列が原核生物、真核生物またはウイルス遺伝子の配列であり得るか、または特異的もしくは非特異的に、かつ誘導または非誘導様式で遺伝子の転写を刺激または抑制する誘導配列であり得る。調節領域は複製起点、ＲＮＡスプライス部位、プロモーター、エンハンサー、転写終止配列、およびポリペプチドを標的細胞の分泌経路へと向かわせるシグナル配列を含む。
【０１００】
「異種源」からの調節領域は、発現された核酸と天然では関連しない調節領域である。異種調節領域内には、異なる種からの調節領域、異なる遺伝子からの調節領域、ハイブリッド調節配列および天然では生じないが当業者によって設計される調節配列が含まれる。
【０１０１】
「ＲＮＡ転写体」とは、ＤＮＡ配列のＲＮＡポリメラーゼ−触媒転写から得られる産物をいう。ＲＮＡ転写体がＤＮＡ配列の完全な相補的コピーである場合、それは一次転写体といい、あるいはそれは一次転写体の転写後プロセッシングに由来するＲＮＡ配列であってよく、これは成熟ＲＮＡという。「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」とは、イントロンが無く、細胞によって蛋白質に翻訳することができるＲＮＡをいう。「ｃＤＮＡ」とは、ｍＲＮＡに相補的であり、それに由来する二本鎖ＤＮＡをいう。「センス」ＲＮＡとは、ｍＲＮＡを含み、従って、細胞によって蛋白質に翻訳することができるＲＮＡ転写体をいう。「アンチセンスＲＮＡ」とは、標的一次転写体またはｍＲＮＡの全てまたは一部に相補的であって、標的遺伝子の発現をブロックするＲＮＡ転写体をいう。アンチセンスＲＮＡの相補性は特定の遺伝子転写体のいずれかの部分、すなわち、５’非−コーディング配列、３’非−コーディング配列、またはコーディング配列におけるものであり得る。「機能的ＲＮＡ」とは、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡ、または翻訳されていないが、細胞プロセスに対して影響を有する他のＲＮＡをいう。
【０１０２】
「ポリペプチド」は、共有結合したアミノ酸残基を含んでなるポリマー化合物である。アミノ酸は以下の構造式を有する。
【０１０３】
【化１】
0005887301.tif 000002
【０１０４】
アミノ酸は側鎖Ｒに基づいて７つの群に分類される：（１）脂肪族側鎖、（２）ヒドロキシル（ＯＨ）基を含む側鎖、（３）硫黄原子を含む側鎖、（４）酸性基またはアミド基を含む側鎖、（５）塩基性基を含む側鎖、（６）芳香族環を含む側鎖、および（７）側鎖がアミノ基に融合したイミノ酸、プロリン。本発明のポリペプチドは、好ましくは、少なくとも約１４のアミノ酸を含む。
【０１０５】
「蛋白質」は、生きた細胞において構造的または機能的役割を行うポリペプチドである。
【０１０６】
「単離されたポリペプチド」または「単離された蛋白質」とは、通常はその天然状態においてそれと関連する化合物（例えば、他の蛋白質またはポリペプチド、核酸、炭水化物、脂質）を実質的に含まないポリペプチドまたは蛋白質である。「単離された」とは、他の化合物との人工的または合成的混合物、または生物学的活性に干渉せず、かつ例えば、不完全な精製、安定化剤の添加、または医薬上許容される製剤への調合のため存在し得る不純物の存在を排除することを意味しない。
【０１０７】
本発明によるポリペプチドの「断片」は、そのアミノ酸配列が参照ポリペプチドの配列よりも短く、かつこれらの参照ポリペプチドに関する全部分にわたり、同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドを意味すると理解されるであろう。そのような断片は、適切には、それらがその一部であるより大きなポリペプチドに含まれることができる。本発明によるポリペプチドのそのような断片は、少なくとも２、３、４、５、６、８、１０、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２５、２６、３０、３５、４０、４５、５０、１００、２００、２４０または３００のアミノ酸の長さを有することができる。
【０１０８】
ポリペプチドまたは蛋白質の「変種」は、ポリペプチドまたは蛋白質に由来し、かつ当該ポリペプチドまたは蛋白質の少なくとも１つの生物学的特性を保持する全てのアナログ、断片、誘導体または突然変異体である。ポリペプチドまたは蛋白質の異なる変種は天然に存在することができる。これらの変種は、蛋白質をコードする構造遺伝子のヌクレオチド配列の差によって特徴付けられる対立遺伝子変種であってもよく、あるいはディファレンシャルスプライシング（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ）または翻訳後修飾を含むことができる。当業者は、単一または複数のアミノ酸置換、欠失、付加または置き換えを有する変種を生じさせることができる。これらの変種は、とりわけ、（ａ）１以上のアミノ酸残基が保存的または非−保存的アミノ酸で置き換えられた変種、（ｂ）１以上のアミノ酸がポリペプチドまたは蛋白質に付加された変種、（ｃ）１以上のアミノ酸が置換基を含む変種、および（ｄ）ポリペプチドまたは蛋白質が血清アルブミンのごとき他のポリペプチドと融合した変種を含むことができる。遺伝的（抑制、欠失、突然変異等）、化学的および酵素的技術を含めた、これらの変種を得るための技術は当業者に知られている。変種ポリペプチドは、好ましくは、少なくとも約１４のアミノ酸を含む。
【０１０９】
「異種蛋白質」とは、細胞中で天然では生じない蛋白質をいう。
【０１１０】
「成熟蛋白質」とは、翻訳後に加工されたポリペプチド；すなわち、それから、一次翻訳産物中に存在する任意のプレまたはプロペプチドが除去されたものをいう。「前駆体」蛋白質とは、ｍＲＮＡの翻訳の一次産物をいう；すなわち、プレおよびプロペプチドが依然として存在する。プレおよびプロペプチドは、限定されるものではないが、細胞内局在シグナル（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｓｉｇｎａｌ）であり得る。
【０１１１】
用語「シグナルペプチド」とは分泌される成熟蛋白質に先行するアミノ末端ポリペプチドをいう。シグナルペプチドは切断され、従って、成熟蛋白質には存在しない。シグナルペプチドは、分泌された蛋白質を細胞膜を横切るように向け、移動させる機能を有する。シグナルペプチドはシグナル蛋白質ともいう。
【０１１２】
「シグナル配列」は、細胞の表面に発現されるべき蛋白質のコーディング配列の始めに含まれる。この配列は成熟ポリペプチドに対してＮ−末端側にあり、宿主細胞に指令してポリペプチドを移動させるシグナルペプチドをコードする。用語「移動（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）シグナル配列」は、ここでは、この種類のシグナル配列をいうのに用いられる。移動シグナル配列は真核生物および原核生物に対して天然の種々の蛋白質と関連することが分かっており、しばしば、双方のタイプの生物で機能できる。
【０１１３】
用語「相同性」とは、２つのポリヌクレオチドまたは２つのポリペプチド部分の間の同一性のパーセントをいう。１つの部分からの配列およびもう１つからの配列の間の対応性は、当該分野で知られた技術によって決定することができる。例えば、相同性は、配列情報を整列させ、かつ容易に入手できるコンピュータプログラムを用いることによって、２つのポリペプチド分子の間の配列情報の直接的比較によって決定することができる。別法として、相同性は、相同領域の間で安定な二重鎖を形成する条件下でのポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション、続いての、一本鎖特異的ヌクレアーゼでの消化および消化された断片のサイズ測定によって決定することができる。
【０１１４】
本明細書中で用いるごとく、全てのその文法の形式およびスペリングの変化における用語「相同な」とは、スーパーファミリー（例えば、免疫グロブリンスーパーファミリー）からの蛋白質および異なる種からの相同蛋白質（例えば、ミオシン軽鎖等）を含めた、「共通の進化起源」を保有する蛋白質の間の関係をいう（Ｒｅｅｃｋら、１９８７、Ｃｅｌｌ  ５０：６６７）。そのような蛋白質（およびそのコードする遺伝子）は、その高い配列同様性の程度によって反映される配列相同性を有する。しかしながら、通常の用法および本出願においては、用後「相同な」は、「高度に」のごとき副詞で修飾された場合、配列同様性を言うことができ、共通の進化起源をいわない。
【０１１５】
従って、全てのその文法的形式における用語「配列同様性」とは、共通の進化起源を有しても有さなくてもよい蛋白質の核酸もしくはアミノ酸配列の間の同一性または対応性の程度をいう（Ｒｅｅｃｋら、１９８７、Ｃｅｌｌ  ５０：６６７参照）。
【０１１６】
特定の態様においては、ヌクレオチドの少なくとも約５０％（好ましくは少なくとも約７５％、最も好ましくは少なくとも約９０または９５％）がＤＮＡ配列の画定された長さにわたってマッチする場合、２つのＤＮＡ配列は「実質的に相同」または「実質的に同様」である。実質的に相同な配列は、配列データバンクで入手できる標準的なソフトウェアを用いて配列を比較することによって、あるいは、その特定のシステムにつき画定された、例えば、ストリンジェントな条件下でのサザンハイブリダイゼーション実験において同定することができる。適当なハイブリダイゼーション条件の画定は当業者の技量内のものである。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、前掲参照。
【０１１７】
本明細書中で用いるごとく「実質的に同様な」とは、１以上のヌクレオチド塩基の変化の結果、１以上のアミノ酸が置換されるが、ＤＮＡ配列によってコードされる蛋白質の機能的特性には影響しない核酸断片をいう。また、「実質的に同様な」とは、１以上のヌクレオチド塩基の変化が、アンチセンスまたは共抑制技術による遺伝子発現の改変を媒介する核酸断片の能力に影響しない核酸断片もいう。また、「実質的に同様な」とは、得られた転写体の機能的特性に実質的に影響しない１以上のヌクレオチド塩基の欠失または挿入のごとき本発明の核酸断片の修飾もいう。従って、本発明は特定の具体的配列以上のものを含むことが理解される。提案された修飾の各々は、コードされた産物の生物学的活性の保持の測定と同様に、十分に当業者のルーチン的技量内のものである。
【０１１８】
さらに、当業者であれば、本発明に含まれる実質的に同様な配列は、ストリンジェントな条件（０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃、および洗浄２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、続いての０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）下で、本明細書中に例示した配列にハイブリダイズするそれらの能力によって、画定されることを認識するであろう。本発明の実質的に同様な核酸断片は、そのＤＮＡ配列が本明細書に報告した核酸断片のＤＮＡ配列と少なくとも７０％同一であるものである。本発明の実質的に好ましい核酸断片は、そのＤＮＡ配列が、ここに報告した核酸断片のＤＮＡ配列と少なくとも８０％同一である核酸断片である。より好ましい核酸断片は、ここに報告する核酸断片のＤＮＡ配列に少なくとも９０％同一である。なおより好ましいのは、ここに報告する核酸断片のＤＮＡ配列に対して少なくとも９５％同一である核酸断片である。
【０１１９】
約４０％を超えるアミノ酸が同一であるか、あるいは６０％を超えて同様である（機能的に同一である）場合に、２つのアミノ酸配列は「実施的に相同」または「実質的に同様」である。好ましくは、同様または相同な配列は、例えば、ＧＣＧ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ＧＣＧ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ  ７、Ｍａｄｉｓｏｎ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）パイルアッププログラムを用いるアラインメントによって同定される。
【０１２０】
用語「に対応する」は、ここでは、正確な位置が同様性または相同性が測定される分子と同一であるかまたは異なるかを問わず、同様なまたは相同な配列をいうのに用いられる。核酸またはアミノ酸配列アラインメントはスペースを含むことができる。かくして、用語「に対応する」とは、配列同様性をいい、アミノ酸残基またはヌクレオチド塩基のナンバリングをいわない。
【０１２１】
アミノ酸またはヌクレオチド配列の「実質的部分」は、当業者による配列の手動評価によるか、またはＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、（１９９３）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０、また  ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／参照）のごときアルゴリズムを用いるコンピューター自動配列比較および同定によって、そのポリペプチドまたは遺伝子を推定的に同定するのに十分なポリペプチドのアミノ酸配列または遺伝子のヌクレオチド配列を含む。一般に、１０以上の連続アミノ酸または３０以上のヌクレオチドの配列が、ポリペプチドまたは核酸配列が既知の蛋白質または遺伝子に相同であるかを推定的に同定するのに必要である。さらに、ヌクレオチド配列に関しては、２０−３０の連続ヌクレオチドを含む遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブを、遺伝子同定（例えば、サザンハイブリダイゼーション）および単離（例えば、細菌コロニーまたはバクテリオファージプラークのイン・サイチュハイブリダイゼーション）の配列−依存的方法で用いることができる。加えて、１２−１５塩基の短いオリゴヌクレオチドをＰＣＲにおける増幅プライマーとして用いて、プライマーを含む特定の核酸断片を得ることができる。従って、ヌクレオチド配列の「実質的部分」は、該配列を含む核酸断片を特異的に同定しおよび／または単離するのに十分な配列を含む。
【０１２２】
当該分野で知られたごとく、用語「同一性パーセント」は、配列を比較することによって決定されるごとく、２以上のポリペプチド配列または２以上のポリヌクレオチド配列の間の関係である。当該分野においては、「同一性」とは、ポリペプチドまたポリヌクレオチド配列の間の配列関連性の程度を意味し、この場合には、かかる配列のストリングの間のマッチによって決定され得る。「同一性」および「同様性」は、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編）Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）、Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ、Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ、Ｐａｒｔ  Ｉ（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ（１９９４）、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．編）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８７）、およびＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ、Ｊ．編）Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９１）に記載されたものを含めた公知の方法によって容易に計算することができるが、これに限定されるものではない。同一性を決定するための好ましい方法は、テストする配列の間で最良のマッチを与えるように設計される。同一性および同様性を決定する方法は、公に入手可能なコンピュータプログラムに編修されている。配列アラインメントおよび同一性パーセントの計算は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティックスコンピューティングスイートのＭｅｇａｌｉｇｎプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いて行うことができる。配列の多重アラインメントは、デフォルトパラメーター（ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０）を備えたアラインメントのＣｌｕｓｔａｌ方法（ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１−１５３）を用いて行うことができる。Ｃｌｕｓａｔｌ方法を用いる対様式のアラインメントについてのデフォルトパラメーターを選択することができる：ＫＴＵＰＬＥ  １、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝５。
【０１２３】
用語「配列分析ソフトウェア」とは、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の分析で有用ないずれのコンピューターアルゴリズムまたはソフトウェアプログラムをいう。「配列分析ソフトウェア」は、商業的に入手できるか、あるいは独立して開発することができる。典型的な配列分析ソフトウェアは、限定されるものではないが、プログラムのＧＣＧスイート（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ，Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０））、およびＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．１２２８  Ｓ．Ｐａｒｋ  Ｓｔ．Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ  ５３７１５  ＵＳＡ）を含むであろう。本出願の文脈内では配列分析ソフトウェアを分析に用いる場合、特に断りのない限り、分析の結果は参照されたプログラムの「デフォルト値」に基づくであろうことが理解されるであろう。本明細書中で用いる「デフォルト値」とは、最初に初期化した時に最初にソフトウェアにロードされた値またはパラメーターのいずれの組も意味するであろう。
【０１２４】
「合成遺伝子」は、当業者に知られた手法を用いて化学的に合成されたオリゴヌクレオチドビルディングブロックから組み立てることができる。これらのビルディングブロックを連結し、アニールして、遺伝子セグメントを形成させ、次いで、これを酵素的に組み立てて全遺伝子を構築する。ＤＮＡの配列に関連する「化学的に合成された」とは、構成要素ヌクレオチドがイン・ビトロで組み立てられたことを意味する。ＤＮＡの手動化学合成はよく確立された手法を用いて達成することができるか、あるいは多数の商業的に入手可能なマシーンのうちの１つを用いて自動化学合成を行うことができる。従って、遺伝子は、宿主細胞のコドンバイアスを反映するヌクレオチド配列の最適化に基づく最適遺伝子発現となるように仕立てることができる。もし、コドン利用が宿主に好都合なコドンに偏るならば、当業者であれば首尾よい遺伝子発現の確率を認識するであろう。好ましいコドンの決定は、配列の情報が入手可能な場合には、宿主細胞に由来する遺伝子の調査に基づくことができる。
【０１２５】
本発明の遺伝子発現変調システム
出願人らは、以前、トランス活性化およびＤＮＡ結合ドメインを２つの異なる蛋白質上に置くことによってそれらを分離する結果、リガンドの不存在下でバックグラウンド活性が大いに低下し、リガンドの存在下でバックグラウンドを超えて活性がかなり増加することを示した（係属中の出願ＰＣＴ／ＵＳ０１／０９０５０）。この２−ハイブリッドシステムは、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９７／０５３３０およびＰＣＴ／ＵＳ９８／１４２１５に開示された２つのシステムと比較してかなり改良された誘導性遺伝子発現変調システムである。２−ハイブリッドシステムは、ＤＮＡ結合ドメインが遺伝子上のＤＮＡ結合部位に結合した場合、トランス活性化ドメインがより効果的にプロモーターを活性化するように、ＤＮＡ結合ドメインに対して転写活性化ドメインをより好都合な位置に運ぶ相互作用蛋白質の対の能力を開発する（例えば、米国特許第５，２８３，１７３号参照）。簡単に述べれば、２−ハイブリッド遺伝子発現システムは２つの遺伝子発現カセットを含み、第１のカセットは核受容体ポリペプチドに融合したＤＮＡ結合ドメインをコードし、第２のカセットは異なる核受容体ポリペプチドに融合したトランス活性化ドメインをコードする。リガンドの存在下において、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとの相互作用は、ＤＮＡ結合ドメインをトランス活性化ドメインに効果的に連結させる。ＤＮＡ結合およびトランス活性化ドメインは２つの異なる分子上に存在するので、リガンドの不存在下におけるバックグラウンド活性は大いに低下する。
【０１２６】
２−ハイブリッドエクジソン受容体−ベースの遺伝子発現変調システムはヘテロダイマーおよびホモダイマーのいずれであってもよい。機能的ＥｃＲ複合体は、一般に、ステロイド受容体ファミリーの、種々の昆虫から得られたエクジソン受容体蛋白質、およびウルトラスピラクル（ＵＳＰ）蛋白質またはＵＳＰの脊椎動物ホモログ、レチノイドＸ受容体蛋白質の２つのメンバーよりなるヘテロダイマー蛋白質複合体をいう（Ｙａｏら（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６６、４７６−４７９、Ｙａｏら、（１９９２）ｃｅｌｌ  ７１、６３−７２）。しかしながら、該複合体は後記するごとくホモダイマーであってもよい。また、機能的エクジステロイド受容体複合体はイムノフィリンのごときさらなる蛋白質を含んでもよい。また、（ＤＨＲ３８またはベータＦＴＺ−１のごとき）転写因子として知られたステロイド受容体ファミリー蛋白質のさらなるメンバーは、ＥｃＲ、ＵＳＰおよび／またはＲＸＲにつき、リガンド依存的または非依存的パートナーであってもよい。加えて、一般に（アダプターまたはメディエーターとも言われる）コアクチベーターとしても知られた蛋白質のごとき他の補因子も必要であろう。これらの蛋白質は配列特異的にＤＮＡには結合せず、基礎的転写に関与しない。それらは、クロマチン構造に影響することによって、またはアクチベーター−開始複合体相互作用を媒介することによって、アクチベーターのＤＮＡ−結合の刺激を含めた種々のメカニズムを通じて転写活性化に対してその効果を発揮することができる。そのようなコアクチベーターの例はＲＩＰ１４０、ＴＩＦ１、ＲＡＰ４６／Ｂａｇ−１、ＡＲＡ７０、ＳＲＣ−１／ＮＣｏＡ−１、ＴＩＦ２／ＧＲＩＰ／ＮＣｏＡ−２、ＡＣＴＲ／ＡＩＢ１／ＲＡＣ３／ｐＣＩＰならびに乱交雑（ｐｒｏｍｉｓｃｏｕｓ）コアクチベーターＣ応答エレメントＢ結合蛋白質、ＣＢＰ／ｐ３００を含む（レビューについては、Ｇｌａｓｓら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．９：２２２−２３２、１９９７参照）。また、（リプレッサー、サイレンサーまたはサイレンシングメディエーターとしても知られている）一般にコリプレッサーとしても知られた蛋白質補因子が、リガンドの不存在下において転写活性化を効果的に阻害するのに必要であろう。これらのコリプレッサーは非リガンド化エクジソン受容体と相互作用して、応答エレメントにおける活性をサイレントとすることができる。現在の証拠は、リガンドの結合が受容体の立体配座を変化させ、その結果、コリプレッサーが放出され、前記したコアクチベーターが動員され、それにより、それらのサイレンシング活性がなくなることを示唆する。コリプレッサーの例はＮ−ＣｏＲおよびＳＭＲＴを含む（レビューについては、Ｈｏｒｗｉｔｚら、Ｍｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１０：１１６７−１１７７、１９９６参照）。これらの補因子は細胞または生物内で内因性であってよく、あるいはトランスジーンとして外因的に添加して、調節または未調節様式にて発現させてもよい。また、エクジソン受容体蛋白質、ＵＳＰまたはＲＸＲのホモダイマー複合体はある状況下で機能的であり得る。
【０１２７】
エクジソン受容体複合体は、典型的には、核受容体スーパーファミリーのメンバーである蛋白質を含み、ここに、全てのメンバーは、一般に、アミノ−末端トランス活性化ドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン（「ＤＢＤ」）、およびヒンジ領域によってＤＢＤから分離されたリガンド結合ドメイン（「ＬＢＤ」）の存在によって特徴付けられる。本明細書中で用いるごとく、用語「ＤＮＡ結合ドメイン」は、ＤＮＡ結合ドメインが特定の応答エレメントと関連するように機能する限り、ＤＮＡ結合蛋白質の全長までのＤＮＡ結合蛋白質の最小ポリペプチド配列を含む。また、核受容体スーパーファミリーのメンバーは４つまたは５つのドメイン：Ａ／Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびあるメンバーではＦの存在によって特徴付けられる（米国特許第４，９８１，７８４号およびＥｖａｎｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：８８９−８９５（１９８８）参照）。「Ａ／Ｂ」ドメインはトランス活性化ドメインに相当し、「Ｃ」はＤＮＡ結合ドメインに対応し、「Ｄ」はヒンジ領域に相当し、および「Ｅ」はリガンド結合ドメインに相当する。該ファミリーのいくつかのメンバーは、「Ｆ」に対応するＬＢＤのカルボキシ−末端側にもう１つのトランス活性化ドメインを有することもできる。
【０１２８】
ＤＢＤは、エクジソン受容体エレメントに対する特異性を付与する、２つのアミノ酸モチーフ、Ｐ−ボックスおよびＤ−ボックスの間の２つのシステイン亜鉛フィンガーの存在によって特徴付けられる。これらのドメインは天然であるか、修飾されているか、または異種受容体蛋白質の異なるドメインのキメラのいずれかであり得る。また、ステロイド受容体ファミリーのサブセットのように、このＥｃＲ受容体は、ヘテロ二量体化特性を担うあまりよくは画定されていない領域も保有する。ＥｃＲ、ＵＳＰおよびＲＸＲのドメインは本来モジュールであるので、ＬＢＤ、ＤＢＤおよびトランス活性化ドメインは相互に交換することができる。
【０１２９】
エクジソン受容体複合体からの成分を組み込む遺伝子スイッチシステムが知られている。しかしながら、これらの既知のシステムにおいては、ＥｃＲを用いる場合は常に、それは、同一分子上で天然もしくは修飾されたＤＮＡ結合ドメインおよびトランス活性化ドメインに関連する。ＵＳＰまたはＲＸＲは、典型的には、サイレントパートナーとして用いられる。出願人らは、以前、ＤＮＡ結合ドメインおよびトランス活性化ドメインが同一分子上にある場合、リガンドの不存在下におけるバックグラウンド活性は高く、およびそのような活性は、ＤＮＡ結合ドメインおよびトランス活性化ドメインが異なる分子上、すなわち、ヘテロダイマーまたはホモダイマー複合体の２つのパートナーの各々の上にある場合に劇的に低下することを示した（ＰＣＴ／ＵＳ０１／０９０５０参照）。また、この２−ハイブリッドシステムは、ステロイドリガンド、例えば、ポナステロンＡ（「ＰｏｎＡ」）またはムリステロンＡ（「ＭｕｒＡ」）と比較した場合、非−ステロイドリガンド、例えば、ジアシルヒドラジンに対して改良された感受性を供する。すなわち、ステロイドと比較した場合、非−ステロイドリガンドはより低い濃度においてより高い活性を供する。加えて、ＥｃＲ遺伝子スイッチに基づくトランス活性化はしばしば細胞系依存性であるので、スイッチングシステムを仕立てて、各適用についての最大トランス活性化能力を得るのはより容易である。さらに、２−ハイブリッドシステムは非修飾ＲＸＲをスイッチングパートナーとして用いる場合にしばしば起こるＲＸＲの過剰発現によるいくつかの副作用を回避する。２−ハイブリッドシステムの特定の態様において、ＥｃＲまたはＲＸＲの天然ＤＮＡ結合およびトランス活性化ドメインが排除され、その結果、これらのハイブリッド分子は、細胞に存在する他のステロイドホルモン受容体と相互作用するチャンスが少なくなり、その結果、副作用は低下する。
【０１３０】
出願人らは、以前、双翅目（ミバエ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）または鱗翅目（ハマキガ  Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ  ｆｕｍｉｆｅｒａｎａ）ウルトラスピラクル蛋白質（ＵＳＰ）と協同したエクジソン受容体が哺乳動物細胞において構成的に発現されるのに対し、脊椎動物レチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）と協同したエクジソン受容体が哺乳動物細胞で誘導性であることを示した（係属中の出願ＰＣＴ／ＵＳ０１／０９０５０）。出願人らは、今回、Ｌｏｃｕｓｔａ  ｍｉｇｒａｔｏｒｉａのウルトラスピラクル蛋白質（「ＬｍＵＳＰ」）およびマダニ  Ａｍｂｌｙｏｍｍａ  ａｍｅｒｉｃａｎｕｍのＲＸＲホモログ１およびＲＸＲホモログ２（各々、「ＡｍａＲＸＲ１」および「ＡｍａＲＸＲ２」）が、誘導性エクジソン受容体−ベースの誘導性遺伝子発現システムにおいて脊椎動物レチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）と同様に機能することができるという驚くべき発見をなした。かくして、ＬｍＵＳＰ、ＡｍａＲＸＲ１、ＡｍａＲＸＲ２、および非−双翅目、非−鱗翅目ホモログ（限定されるものではないが、シオマネキ  Ｃｅｌｕｃａ  ｐｕｇｉｌａｔｏｒ  ＲＸＲホモログ（「ＣｐＲＸＲ」）、甲虫  Ｔｅｎｅｂｒｉｏ  ｍｏｌｉｔｏｒ  ＲＸＲホモログ（「ＴｍＲＸＲ」）、ミツバチ  Ａｐｉｓ  ｍｅｌｌｉｆｅｒａ  ＲＸＲホモログ（「ＡｍＲＸＲ」）、およびアブラムシ  Ｍｙｚｕｓ  ｐｅｒｓｉｃａｅ  ＲＸＲホモログ（「ＭｐＲＸＲ」）（これらの全てをここでは集合的に無脊椎動物ＲＸＲと言う）を含める）をエクジソン受容体−ベースの誘導性遺伝子発現システムにおいて脊椎動物ＲＸＲに代えて置き換えることができるという出願人らの知見は、予期せぬかつ驚くべきものとしてみなすことができる。本明細書中に記載するごとく、出願人らの新規なエクジソン受容体／無脊椎動物ＲＸＲ−ベースの誘導性遺伝子発現システムは、増大したリガンド感受性およびトランス活性化の大きさによって特徴付けられる酵母および哺乳動物細胞における改良された誘導性遺伝子発現システムを提供する。
【０１３１】
特に、出願人らは、本明細書中において、無脊椎動物ＲＸＲリガンド結合ドメインを含む新規な２−ハイブリッドシステムを記載する。この新規な遺伝子発現システムは、無脊椎動物ウルトラスピラクル蛋白質／ＲＸＲホモログが、酵母および哺乳動物細胞において誘導性ＥｃＲ−ベースの誘導性遺伝子発現システムの構成要素として機能できることを初めて示す。本明細書中に議論するごとく、この知見は予期せぬかつ驚くべきことである。
【０１３２】
具体的には、出願人らの発明は、ａ）宿主細胞で発現させることができる第１の遺伝子発現カセット、ここに、該第１の遺伝子発現カセットは、ｉ）その発現を変調させるべき遺伝子と関連した応答エレメントを認識するＤＮＡ−結合ドメイン、およびｉｉ）エクジソン受容体リガンド結合ドメイン、を含む第１のハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、およびｂ）宿主細胞で発現させることができる第２の遺伝子発現カセット、ここに、該第２の遺伝子発現カセットはｉ）トランス活性化ドメイン、およびｉｉ）無脊椎動物レチノイドＸ受容体リガンド結合ドメイン、を含む第２のハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、を含む遺伝子発現変調システムに関する。
【０１３３】
また、本発明は、ａ）宿主細胞で発現させることができる第１の遺伝子発現カセット、ここに、該第１の遺伝子発現カセットはｉ）その発現を変調すべき遺伝子と関連した応答エレメントを認識するＤＮＡ−結合ドメイン、およびｉｉ）無脊椎動物レチノイドＸ受容体リガンド結合ドメイン、を含む第１のハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、およびｂ）宿主細胞で発現させることができる第２の遺伝子発現カセット、ここに、該第２の遺伝子発現カセットは、ｉ）トランス活性化ドメイン、およびｉｉ）エクジソン受容体リガンド結合ドメイン、を含む第２のハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、を含む遺伝子発現変調システムに関する。
【０１３４】
また、本発明は、さらに、ｃ）ｉ）それに第１のハイブリッドポリペプチドのＤＮＡ−結合ドメインが結合する応答エレメント、ｉｉ）第２のハイブリッドポリペプチドのトランス活性化ドメインによって活性化されるプロモーター、およびｉｉｉ）その発現を変調すべき遺伝子、を含む第３の遺伝子発現カセットを含む本発明の遺伝子発現変調システムに関する。
【０１３５】
特定の態様において、その発現を変調すべき遺伝子は宿主細胞に関して相同遺伝子である。他の特定の態様において、その発現を変調すべき遺伝子は宿主細胞に関して異種遺伝子である。
【０１３６】
ＥｃＲおよび無脊椎動物ＲＸＲのリガンド結合ドメインと組み合わせた場合に、今度は、遺伝子に連結した応答エレメントに結合する後記本発明で使用するリガンドは、遺伝子の発現の外部一時的調節のための手段を提供する。本発明の種々の構成要素が相互に結合する、（すなわち、例えば、リガンドが受容体に、第１のハイブリッドポリペプチドが応答エレメントに、第２のハイブリッドポリペプチドがプロモーターに等）結合メカニズムまたは順序は臨界的でない。ＥｃＲおよび無脊椎動物ＲＸＲのリガンド結合ドメインへのリガンドの結合は、遺伝子の発現または抑制を可能とする。このメカニズムは、ＥｃＲまたは無脊椎動物ＲＸＲへのリガンド結合、および活性ホモダイマー複合体の結果としての形成（例えば、ＥｃＲ＋ＥｃＲまたは無脊椎動物ＲＸＲ＋無脊椎動物ＲＸＲ）の可能性を排除しない。好ましくは、１以上の受容体ドメインが変化し、キメラまたはハイブリッド遺伝子スイッチを生じる。典型的には、３つのドメイン、ＤＢＤ、ＬＢＤおよびトランス活性化ドメインの内の１以上は、ハイブリッド遺伝子および得られるハイブリッド蛋白質が、トランス活性化活性、リガンドの相補的結合、および特定の応答エレメントの認識につき選択された宿主細胞または生物において最適化されるように、他のドメインの源とは異なる源から選択することができる。加えて、応答エレメントそれ自体は、酵母からのＧＡＬ−４蛋白質（Ｓａｄｏｗｓｋｉら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ、３３５：５６３−５６４参照）もしくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉからのＬｅｘＡ蛋白質（ＢｒｅｎｔおよびＰｔａｓｈｎｅ（１９８５）、Ｃｅｌｌ、４３：７２９−７３６）をはじめとする他のＤＮＡ結合蛋白質ドメインについての応答エレメントで、または特定の相互作用（例えば、Ｋｉｍら（１９９７）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９４：３６１６−３６２０参照）のために設計され、修飾されおよび選択された蛋白質との標的化相互作用につき特異的な合成応答エレメントで、修飾または置換されることができ、ハイブリッド受容体を適応させる。２−ハイブリッドシステムの他の利点は、それが、所望の最終目的に従って遺伝子発現を駆動するのに用いるプロモーターの選択を可能とすることである。そのような二重制御は、特に、細胞毒性蛋白質が生産される場合に、遺伝子治療の領域で特に重要であり得る。何故ならば、発現のタイミングならびに発現が起こる細胞の双方を制御することができるからである。適当なプロモーターに作動可能に連結した遺伝子を対象の細胞に導入すると、外因性遺伝子の発現が本発明のシステムの存在によって制御される。プロモーターは構成的にまたは誘導的に調節することができるか、あるいは組織−特異的（すなわち、特定のタイプの細胞でのみ発現される）または生物のある発生段階に特異的であり得る。
【０１３７】
本発明の遺伝子発現カセット
本発明の新規なＥｃＲ／無脊椎動物ＲＸＲ−ベースの誘導性遺伝子発現システムは、宿主細胞で発現させることができる遺伝子発現カセットを含み、ここに、該遺伝子発現カセットは、各々、ハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。かくして、出願人らの発明は、本発明の遺伝子発現システムで用いられる新規な遺伝子発現カセットも提供する。
【０１３８】
具体的には、本発明は、ハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子発現カセットを提供する。特に、本発明は宿主細胞で発現させることができる遺伝子発現カセットを提供し、ここに、該遺伝子発現カセットは、ｉ）応答エレメントを認識するＤＮＡ−結合ドメイン、またはｉｉ）トランス活性化ドメインのいずれか、およびエクジソン受容体リガンド結合ドメインまたは無脊椎動物レチノイドＸ受容体リガンド結合ドメインを含むハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
【０１３９】
特定の態様において、遺伝子発現カセットは、応答エレメントを認識するＤＮＡ−結合ドメインおよびＥＣＲリガンド結合ドメインを含むハイブリッドポリペプチドをコードする。
【０１４０】
他の特定の態様において、遺伝子発現カセットは、応答エレメントを認識するＤＮＡ−結合ドメインおよび無脊椎動物ＲＸＲリガンド結合ドメインを含むハイブリッドポリペプチドをコードする。
【０１４１】
他の特定の態様において、遺伝子発現カセットは、トランス活性化ドメインおよびＥｃＲリガンド結合ドメインを含むハイブリッドポリペプチドをコードする。
【０１４２】
他の特定の態様において、遺伝子発現カセットは、トランス活性化ドメインおよび無脊椎動物ＲＸＲリガンド結合ドメインを含むハイブリッドポリペプチドをコードする。
【０１４３】
好ましい態様において、リガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）はＥｃＲ  ＬＢＤ、無脊椎動物ＲＸＲ  ＬＢＤ、または関連するステロイド／甲状腺ホルモン核受容体ファミリーメンバーＬＢＤ、またはそれらのアナログ、組合せもしくは修飾体である。特定の態様において、ＬＢＤはＥｃＲまたは無脊椎動物ＲＸＲからのものである。他の特定の態様において、ＬＢＤはトランケートされたＥｃＲ  ＬＢＤまたはトランケートされた無脊椎動物ＲＸＲ  ＬＢＤからのものである。トランケーション突然変異は、限定されるものではないが、制限エンドヌクレアーゼ消化／欠失、ＰＣＲ−媒介／オリゴヌクレオチド−指向性欠失、化学的突然変異誘発、ＤＮＡストランド破壊などを含めた当該分野で用いられるいずれの方法によってなすこともできる。
【０１４４】
ＥｃＲは、好ましくは、節足動物（Ａｒｔｈｒｏｐｏｄ）網から選択された無脊椎動物ＥｃＲであり得る。好ましくは、ＥｃＲは鱗翅目ＥｃＲ、双翅目ＥｃＲ、直翅目（Ｏｒｔｈｏｐｔｅｒａｎ）ＥｃＲ、同翅目（Ｈｏｍｏｐｔｅｒａｎ）ＥｃＲおよび半翅目（Ｈｅｍｉｐｔｅｒａｎ）ＥｃＲよりなる群から選択される。より好ましくは、用いるＥｃＲはハマキガ  Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ  ｆｕｍｉｆｅｒａｎａ（トウヒシントメハマキ）ＥｃＲ（「ＣｆＥｃＲ」）、甲虫  Ｔｅｎｅｂｒｉｏ  ｍｏｌｉｔｏｒ（チャイロコメノゴミムシダマシ）ＥｃＲ（「ＴｍＥｃＲ」）、Ｍａｎｄｕｃａ  ｓｅｘｔａ（タバコスズメガ）ＥｃＲ（「ＭｓＥｃＲ」）、Ｈｅｌｉｏｔｈｉｅｓ  ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ（オオタバコガ）ＥｃＲ（「ＨｖＥｃＲ」）、ユスリカ  Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ  ｔｅｎｔａｎｓ（キミドリユスリカ）ＥｃＲ（「ＣｔＥｃＲ」）、カイコガ  Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  ＥｃＲ（「ＢｍＥｃＲ」）、ミバエ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（キイロショウジョウバエ）ＥｃＲ（「ＤｍＥｃＲ」）カ  Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ（ネッタイシマカ）ＥｃＲ（「ＡａＥｃＲ」）、クロバエ  Ｌｕｃｉｌｉａ  ｃａｐｉｔａｔａ（「ＬｃＥｃＲ」）、クロバエ  Ｌｕｃｉｌｉａ  ｃｕｐｒｉｎａ（ヒツジキンバエ）ＥｃＲ（「ＬｕｃＥｃＲ」）、地中海ミバエ  Ｃｅｒａｔｉｔｉｓ  ｃａｐｉｔａｔａ（チチュウカイミバエ）ＥｃＲ（「ＣｃＥｃＲ」）、バッタ  Ｌｏｃｕｓｔａ  ｍｉｇｒａｔｏｒｉａ（トノサマバッタ）ＥｃＲ（「ＬｍＥｃＲ」）、アブラムシ  Ｍｙｚｕｓ  ｐｅｒｓｉｃａｅ（モモアカアブラムシ）ＥｃＲ（「ＭｐＥｃＲ」）、シオマネキ  Ｃｅｌｕｃａ  ｐｕｇｉｌａｔｏｒ  ＥｃＲ（「ＣｐＥｃＲ」）、マダニ  Ａｍｂｌｙｏｍｍａ  ａｍｅｒｉｃａｎｕｍ  ＥｃＲ（「ＡｍａＥｃＲ」）、コナジラミ  Ｂａｍｅｃｉａ  ａｒｇｅｎｔｉｆｏｌｉ（シルバーリーフコナジラミ）ＥｃＲ（「ＢａＥｃＲ」）、配列番号：５７）またはヨコバイ  Ｎｅｐｈｏｔｅｔｉｘ  ｃｉｎｃｔｉｃｅｐｓ  ＥｃＲ（「ＮｃＥｃＲ」、配列番号：５８）である。最も好ましくは、ＬＢＤはハマキガ（Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ  ｆｕｍｉｆｅｒａｎａ）ＥＣＲ（「ＣｆＥｃＲ」）、ミバエ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ  ＥｃＲ（「ＤｍＥｃＲ」）、コナジラミ  Ｂａｍｅｃｉａ  ａｒｇｅｎｔｉｆｏｌｉ  ＥｃＲ（「ＢａＥｃＲ」）、ヨコバイ  Ｎｅｐｈｏｔｅｔｉｘ  ｃｉｎｃｔｉｃｅｐｓ  ＥｃＲ（「ＮｃＥｃＲ」）、甲虫  Ｔｅｎｅｂｒｉｏ  ｍｏｌｉｔｏｒ  ＥｃＲ（「ＴｍＥｃＲ」）、またはマダニ  Ａｍｂｌｙｏｍｍａ  ａｍｅｒｉｃａｎｕｍ  ＥｃＲ（「ＡｍａＥｃＲ」）からのものである。
【０１４５】
特定の態様においてＬＢＤはトランケートされたＥＣＲポリペプチドからのものである。ＥｃＲポリペプチドのトランケーションの結果、少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０または２６５のアミノ酸が欠失される。好ましくはＥｃＲポリペプチドのトランケーションの結果、少なくとも部分的なポリペプチドドメインが欠失される。より好ましくは、ＥｃＲポリペプチドのトランケーションの結果、少なくとも全ポリペプチドドメインが欠失される。特定の態様において、ＥｃＲポリペプチドのトランケーションの結果、少なくともＡ／Ｂドメイン、Ｃ−ドメイン、Ｄ−ドメイン、Ｆ−ドメイン、Ａ／Ｂ／Ｃ−ドメイン、Ａ／Ｂ／１／２−Ｃ−ドメイン、Ａ／Ｂ／Ｃ／Ｄ−ドメイン、Ａ／Ｂ／Ｃ／Ｄ／Ｆ−ドメイン、Ａ／Ｂ／Ｆ−ドメイン、Ａ／Ｂ／Ｃ／Ｆ−ドメイン、部分的Ｅドメイン、または部分的Ｆドメインが欠失される。いくつかの完全なおよび／または部分的なドメイン欠失の組合わせも行うことができる。
【０１４６】
１つの態様において、エクジソン受容体リガンド結合ドメインは配列番号：２（ＤｍＥｃＲ−ＥＦ）、配列番号：３（ＣｆＥｃＲ−ＤＥ）および配列番号：４（ＤｍＥｃＲ−ＤＥ）よりなる群から選択される核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。好ましい態様において、エクジソン受容体リガンド結合ドメインは配列番号：１（ＣｆＥｃＲ−ＥＦ）、配列番号：５３（ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦ）および配列番号：４５（ＣｆＥｃＲ−ＣＤＥＦ）よりなる群から選択される核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。
【０１４７】
１つの態様において、エクジソン受容体リガンド結合ドメインは配列番号：６（ＤｍＥｃＲ−ＥＦ）、配列番号：７（ＣｆＥｃＲ−ＤＥ）および配列番号：８（ＤｍＥｃＲ−ＤＥ）よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。好ましい態様において、エクジソン受容体リガンド結合ドメインは配列番号：５（ＣｆＥｃＲ−ＥＦ）、配列番号：４３（ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦ）および配列番号：５９（ＣｆＥｃＲ−ＣＤＥＦ）よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０１４８】
好ましくは、無脊椎動物ＲＸＲポリペプチドはバッタ  Ｌｏｃｕｓｔａ  ｍｉｇｒａｔｏｒｉａウルトラスピラクルポリペプチド（「ＬｍＵＳＰ」）、マダニ  Ａｍｂｌｙｏｍｍａ  ａｍｅｒｉｃａｎｕｍ  ＲＸＲホモログ１（「ＡｍａＲＸＲ１」）、マダニ  Ａｍｂｌｙｏｍｍａ  ａｍｅｒｉｃａｎｕｍ  ＲＸＲホモログ２（「ＡｍａＲＸＲ２」）、シオマネキ  Ｃｅｌｕｃａ  ｐｕｇｉｌａｔｏｒ  ＲＸＲホモログ（「ＣｐＲＸＲ」）、甲虫  Ｔｅｎｅｂｒｉｏ  ｍｏｌｉｔｏｒ  ＲＸＲホモログ（「ＴｍＲＸＲ」）、ミツバチ  Ａｐｉｓ  ｍｅｌｌｉｆｅｒａ  ＲＸＲホモログ（「ＡｍＲＸＲ」）、アブラムシ  Ｍｙｚｕｓ  ｐｅｒｓｉｃａｅ  ＲＸＲホモログ（「ＭｐＲＸＲ」）、または非−双翅目／非−鱗翅目ＲＸＲホモログである。
【０１４９】
特定の態様において、ＬＢＤはトランケートされた無脊椎動物ＲＸＲからのものである。無脊椎動物ＲＸＲポリペプチドのトランケーションの結果、少なくとも１、２、３、４、５、６、８、１０、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２５、２６、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５または２４０のアミノ酸が欠失する。好ましくは、無脊椎動物ＲＸＲポリペプチドのトランケーションの結果、少なくとも部分的ポリペプチドドメインが欠失される。より好ましくは、無脊椎動物ＲＸＲポリペプチドのトランケーションの結果、少なくとも全ポリペプチドドメインが欠失する。特定の態様において、無脊椎動物ＲＸＲポリペプチドのトランケーションの結果、少なくとも部分的Ｅ−ドメイン、完全なＥ−ドメイン、部分的Ｆ−ドメイン、完全なＦ−ドメイン、ＥＦ−ドメインヘリックス１、ＥＦ−ドメインヘリックス２、ＥＦ−ドメインヘリックス３、ＥＦ−ドメインヘリックス４、ＥＦ−ドメインヘリックス５、ＥＦ−ドメインヘリックス６、ＥＦ−ドメインヘリックス７、ＥＦ−ドメインヘリックス８、ＥＦ−ドメインヘリックス９、ＥＦ−ドメインヘリックス１０、ＥＦ−ドメインヘリックス１１、ＥＦ−ドメインヘリックス１２、ＥＦ−ドメインβ−プリーツシート（ｐｌｅａｔｅｄ  ｓｈｅｅｔ）、Ａ／Ｂ−ドメイン、Ｃ−ドメイン、Ｄ−ドメイン、Ａ／Ｂ／Ｃ−ドメイン、Ａ／Ｂ／１／２−Ｃ−ドメイン、Ａ／Ｂ／Ｃ／Ｄ−ドメイン、Ａ／Ｂ／Ｃ／Ｄ／Ｆ−ドメイン、Ａ／Ｂ／Ｆ−ドメイン、またはＡ／Ｂ／Ｃ／Ｆ−ドメインが欠失される。いくつかの完全なおよび／または部分的ドメイン欠失の組合せも行うことができる。
【０１５０】
好ましい態様において、無脊椎動物ＲＸＲリガンド結合ドメインは配列番号：９（ＬｍＵＳＰ−ＥＦ）、配列番号：１０（ＡｍａＲＸＲ１−ＥＦ）、配列番号：１１（ＡｍａＲＸＲ２−ＥＦ）、配列番号：１２（ＣｐＲＸＲ−ＥＦ）、配列番号：１３（ＴｍＲＸＲ−ＥＦ）、配列番号：１４（ＡｍＲＸＲ−ＥＦ）、配列番号：１５（ＬｍＵＳＰ−ＥＦ、ＢａｍＨＩ−欠失）、配列番号：１６（ＡｍａＲＸＲ１−ＥＦ、ＢａｍＨＩ−欠失）、配列番号：１７（ＡｍａＲＸＲ２−ＥＦ、ＢａｍＨＩ−欠失）、配列番号：１８（ＣｐＲＸＲ−ＥＦ、ＢａｍＨＩ−欠失）、配列番号：１９（ＴｍＲＸＲ−ＥＦ、ＢａｍＨＩ−欠失）および配列番号：２０（ＡｍＲＸＲ−ＥＦ、ＢａｍＨＩ−欠失）よりなる群から選択される核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。
【０１５１】
他の好ましい態様において、無脊椎動物ＲＸＲリガンド結合ドメインは配列番号：２１（ＬｍＵＳＰ−ＥＦ）、配列番号：２２（ＡｍａＲＸＲ１−ＥＦ）、配列番号：２３（ＡｍａＲＸＲ２−ＥＦ）、配列番号：２４（ＣｐＲＸＲ−ＥＦ）、配列番号：２５（ＴｍＲＸＲ−ＥＦ）、配列番号：２６（ＡｍＲＸＲ−ＥＦ）、配列番号：２７（ＬｍＵＳＰ−ＥＦ、ＢａｍＨＩ−欠失）、配列番号：２８（ＡｍａＲＸＲ１−ＥＦ、ＢａｍＨＩ−欠失）、配列番号：２９（ＡｍａＲＸＲ２−ＥＦ、ＢａｍＨＩ−欠失）、配列番号：３０（ＣｐＲＸＲ−ＥＦ、ＢａｍＨＩ−欠失）、配列番号：３１（ＴｍＲＸＲ−ＥＦ、ＢａｍＨＩ−欠失）および配列番号：３２（ＡｍＲＸＲ−ＥＦ、ＢａｍＨＩ−欠失）よりなる群から選択されるポリペプチド配列を含む。
【０１５２】
本発明の目的では、ＥｃＲおよび無脊椎動物ＲＸＲは合成およびキメラＥＣＲおよび無脊椎ＲＸＲならびにそれらのホモログを含む。
【０１５３】
ＤＮＡ結合ドメインは合成およびキメラＤＮＡ結合ドメイン、またはそのアナログ、組合せもしくは修飾体を含めた公知の応答エレメントを持ついずれのＤＮＡ結合ドメインでもあり得る。好ましくは、ＤＢＤはＧＡＬ４  ＤＢＤ、ＬｅｘＡ  ＤＢＤ、転写因子ＤＢＤ、ステロイド／甲状腺ホルモン核受容体スーパーファミリーメンバーＤＢＤ、細菌ＬａｃＺ  ＤＢＤ、または酵母ｐｕｔ  ＤＢＤである。より好ましくは、ＤＢＤはＧＡＬ４  ＤＢＤ［配列番号：３３（ポリヌクレオチド）または配列番号：３４（ポリペプチド）］またはＬｅｘＡ  ＤＢＤ［配列番号：３５（ポリヌクレオチド）または配列番号：３６（ポリペプチド）］である。
【０１５４】
トランス活性化ドメイン（「ＡＤ」または「ＴＡ」と略する）はいずれのステロイド／甲状腺ホルモン核受容体ＡＤ、合成またはキメラＡＤ、ポリグルタミンＡＤ、塩基性または酸性アミノ酸ＡＤ、ＶＰ１６  ＡＤ、ＧＡＬ４  ＡＤ、ＮＦ−κＢ  ＡＤ、ＢＰ６４  ＡＤ、Ｂ４２酸性活性化ドメイン（Ｂ４２ＡＤ）、またはそのアナログ、組合せまたは修飾体であってもよい。特定の態様において、ＡＤは合成またはキメラＡＤであるか、またはＶＰ１６、ＧＡＬ４、ＮＦ−κＢ、またはＢ４２酸性活性化ドメインＡＤから得られる。好ましくは、ＡＤはＶＰ１６  ＡＤ［配列番号：３７（ポリヌクレオチド）または配列番号：３８（ポリペプチド）］またはＢ４２  ＡＤ［配列番号：３９（ポリヌクレオチド）または配列番号：４０（ポリペプチド）］である。
【０１５５】
好ましい態様において、遺伝子発現カセットは、ＧＡＬ４  ＤＢＤ（配列番号：３３）およびＬｅｘＡ  ＤＢＤ（配列番号：３５）よりなる群から選択される核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるＤＮＡ−結合ドメイン、および配列番号：１、配列番号：５３および配列番号：４５よりなる群から選択される核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるＥｃＲリガンド結合ドメインを含むハイブリッドポリペプチドをコードする。
【０１５６】
他の好ましい態様において、遺伝子発現カセットは、ＧＡＬ４  ＤＢＤ（配列番号：３４）およびＬｅｘＡ  ＤＢＤ（配列番号：３６）よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＤＮＡ−結合ドメイン、および配列番号：５、配列番号：４３および配列番号：５９よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＥｃＲリガンド結合ドメインを含むハイブリッドポリペプチドをコードする。
【０１５７】
他の好ましい態様において、遺伝子発現カセットは、ＧＡＬ４  ＤＢＤ（配列番号：３３）またはＬｅｘＡ  ＤＢＤ（配列番号：３５）よりなる群から選択される核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるＤＮＡ−結合ドメイン、および配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９および配列番号：２０よりなる群から選択される核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる無脊椎動物ＲＸＲリガンド結合ドメインを含むハイブリッドポリペプチドをコードする。
【０１５８】
他の好ましい態様において、遺伝子発現カセットは、ＧＡＬ４  ＤＢＤ（配列番号：３４）およびＬｅｘＡ  ＤＢＤ（配列番号：３６）よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＤＮＡ−結合ドメイン、および配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、および配列番号：３２よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む無脊椎動物ＲＸＲリガンド結合ドメインを含むハイブリッドポリペプチドをコードする。
【０１５９】
他の好ましい態様において、遺伝子発現カセットは、配列番号：３７または配列番号：３９の核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるトランス活性化ドメイン、および配列番号：１、配列番号：５３、および配列番号：４５よりなる群から選択される核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるＥｃＲリガンド結合ドメインを含むハイブリッドポリペプチドをコードする。
【０１６０】
他の好ましい態様において、遺伝子発現カセットは、配列番号：３８または配列番号：４０のアミノ酸配列を含むトランス活性化ドメイン、および配列番号：５、配列番号：４３、および配列番号：５９よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＥｃＲリガンド結合ドメインを含むハイブリッドポリペプチドをコードする。
【０１６１】
他の好ましい態様において、遺伝子発現カセットは、配列番号：３７または配列番号：３９の核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるトランス活性化ドメイン、および配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９および配列番号：２０よりなる群から選択される核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる無脊椎動物ＲＸＲリガンド結合ドメインを含むハイブリッドポリペプチドをコードする。
【０１６２】
他の好ましい態様において、遺伝子発現カセットは、配列番号：３８または配列番号：４０のアミノ酸配列を含むトランス活性化ドメイン、および配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、および配列番号：３２よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む無脊椎動物ＲＸＲリガンド結合ドメインを含むハイブリッドポリペプチドをコードする。
【０１６３】
応答エレメント（「ＲＥ」）は、公知のＤＮＡ結合ドメインを持ついずれの応答エレメント、またはそのアナログ、組合せまたは修飾体であってもよい。単一ＲＥを用いることができるか、あるいは複数ＲＥ（同一ＲＥの複数コピーまたは２以上の異なるＲＥいずれか）を本発明で用いることができる。特定の態様において、ＲＥはＧＡＬ４からのＲＥ（「ＧＡＬ４ＲＥ」）、ＬｅｘＡからのＲＥ、ステロイド／甲状腺ホルモン核受容体ＲＥ、または合成ＤＮＡ結合ドメインを認識する合成ＲＥである。好ましくは、ＲＥは配列番号：４１のポリヌクレオチド配列を含むＧＡＬ４ＲＥ、または配列番号：４２のポリヌクレオチド配列を含むＬｅｘＡ  ＲＥ（オペロン、「ｏｐ」）（「２ＸＬｅｘＡｏｐＲＥ」）である。好ましくは、第１のハイブリッド蛋白質はトランス活性化ドメインを実質的に含まず、第２のハイブリッド蛋白質はＤＮＡ結合ドメインを実質的に含まない。本発明の目的では、「実質的に含まない」とは、問題の蛋白質が、活性化または結合活性を供するのに十分な問題のドメインの配列を含まないことを意味する。
【０１６４】
かくして、また、本発明はｉ）それにＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドが結合するドメインを含む応答エレメント、ｉｉ）トランス活性化ドメインを含むポリペプチドによって活性化されるプロモーター、およびｉｉｉ）その発現を変調すべき遺伝子を含む遺伝子発現カセットに関する。
【０１６５】
出願人らの遺伝子発現カセットで用いる注目する遺伝子は内因性遺伝子または異種遺伝子であってもよい。所望の遺伝子または蛋白質についての核酸またはアミノ酸配列の情報は多くの公的アクセスデータベースのうちの一つ、例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ、ＥＭＢＬ、Ｓｗｉｓｓ−ＰｒｏｔおよびＰＩＲにおいて、または多くの生物学関連雑誌刊行物において見出すことができる。かくして、当業者であれば、実質的に全ての公知の遺伝子についての核酸配列の情報にアクセスできる。従って、そのような情報を用いて、本明細書中に記載した出願人らの方法で用いる遺伝子発現カセット内に注目する遺伝子を挿入するための所望の構築体を構築することができる。
【０１６６】
出願人らの遺伝子発現カセットで用いる注目する遺伝子としては、限定されるものではないが、疾患、病気、障害、機能不全、遺伝的欠陥を扱うのに使用され得る；例えば、モノクローナル抗体、酵素、プロテアーゼ、サイトカイン、インターフェロン、インスリン、エリスロポエチン、血液凝固因子、他の血液因子もしくは成分、遺伝子治療用のウイルスベクター、ワクチン用のウイルス、薬物発見用の、機能的ゲノミクス用の、ならびにプロテオミクスの分析用および適用用の標的などをはじめとする治療上望ましいポリペプチドまたは産物をコードする遺伝子が挙げられる。
【０１６７】
本発明のポリヌクレオチド
本発明の新規なエクジソン受容体／無脊椎動物レチノイドＸ受容体ベースの誘導性遺伝子発現システムは、ａ）ＤＮＡ結合ドメインまたはトランス活性化ドメイン、およびｂ）ＥｃＲリガンド結合ドメインまたは無脊椎動物ＲＸＲリガンド結合ドメインを含むハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子発現カセットを含む。これらの遺伝子発現カセット、それらが含むポリヌクレオチド、およびそれらがコードするハイブリッドポリペプチドは、宿主細胞内で遺伝子の発現を変調するためのＥｃＲ−ベースの遺伝子発現システムの構成要素として有用である。
【０１６８】
かくして、本発明は、ａ）本発明のＤＮＡ結合ドメインまたはトランス活性化ドメイン、およびｂ）本発明のＥｃＲリガンド結合ドメインまたは無脊椎動物ＲＸＲリガンド結合ドメインを含むハイブリッドポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【０１６９】
また、本発明は、本発明によるトランケーション突然変異を含むトランケートされたＥｃＲまたはトランケートされた無脊椎動物ＲＸＲポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。具体的には、本発明は、宿主細胞において遺伝子発現を変調するのに有用な、リガンド結合活性またはリガンド感受性に影響するトランケーション突然変異を含むＥｃＲまたは無脊椎動物ＲＸＲポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。
【０１７０】
特定の態様において、単離されたトランケートされたＥｃＲポリヌクレオチドは配列番号：１、配列番号：５３および配列番号：４５よりなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
【０１７１】
他の特定の態様において、単離されたトランケートされたＥｃＲポリヌクレオチドは、配列番号：５、配列番号：４３および配列番号：５９よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含むトランケートされたエクジソン受容体ポリペプチドをコードする。
【０１７２】
他の特定の態様において、本発明による単離されたトランケートされた無脊椎動物ＲＸＲポリヌクレオチドは、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９および配列番号：２０よりなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
【０１７３】
他の特定の態様において、本発明による単離されたトランケートされた無脊椎動物ＲＸＲポリヌクレオチドは、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１および配列番号：３２よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含むトランケートされた無脊椎動物ＲＸＲポリペプチドをコードする。
【０１７４】
特に、本発明はトランケーション突然変異を含む無脊椎動物ＲＸＲポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドに関し、ここに、該突然変異は無脊椎動物ＲＸＲポリペプチドのリガンド結合活性またはリガンド感受性を低下させる。特定の態様において、本発明は、無脊椎動物ＲＸＲポリペプチドのステロイド結合活性またはステロイド感受性を低下させるトランケーション突然変異を含む無脊椎動物ＲＸＲポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。
【０１７５】
他の特定の態様において、本発明は、無脊椎動物ＲＸＲポリペプチドの非−ステロイド結合活性または非−ステロイド感受性を低下させるトランケーション突然変異を含む無脊椎動物ＲＸＲポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。
【０１７６】
また、本発明は、トランケーション突然変異を含む無脊椎動物ＲＸＲポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドに関し、ここに、該突然変異は無脊椎動物ＲＸＲポリペプチドのリガンド結合活性またはリガンド感受性を増強させる。特定の態様において、本発明は、無脊椎動物ＲＸＲポリペプチドのステロイド結合活性またはステロイド感受性を増強させるトランケーション突然変異を含む無脊椎動物ＲＸＲポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。
【０１７７】
他の特定の態様において、本発明は、無脊椎動物ＲＸＲポリペプチドの非−ステロイド結合活性または非−ステロイド感受性を増強させるトランケーション突然変異を含む無脊椎動物ＲＸＲポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。
【０１７８】
また、本発明は、突然変異した無脊椎動物レチノイドＸ受容体ポリペプチドおよび二量体化パートナーを含むヘテロダイマーのリガンド感受性を増加させるトランケーション突然変異を含む無脊椎動物レチノイドＸ受容体ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。好ましくは、ヘテロダイマーのリガンド感受性を増加させるトランケーション突然変異を含む無脊椎動物レチノイドＸ受容体ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドは、配列番号：９（ＬｍＵＳＰ−ＥＦ）、配列番号：１０（ＡｍａＲＸＲ１−ＥＦ）、配列番号：１１（ＡｍａＲＸＲ２−ＥＦ）、配列番号：１２（ＣｐＲＸＲ−ＥＦ）、配列番号：１３（ＴｍＲＸＲ−ＥＦ）、および配列番号：１４（ＡｍＲＸＲ−ＥＦ）よりなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。特定の態様において、二量体化パートナーはエクジソン受容体ポリペプチドである。好ましくは、二量体化パートナーはトランケートされたＥｃＲポリペプチドである。より好ましくは、二量体化パートナーは、ドメインＡ／Ｂが欠失されたＥｃＲポリペプチドである。なおより好ましくは、二量体化パートナーは配列番号：５（ＣｆＥｃＲ−ＥＦ）、配列番号：４３（ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦ）または配列番号：５９（ＣｆＥｃＲ−ＣＤＥＦ）のアミノ酸配列を含むＥｃＲポリペプチドである。
【０１７９】
本発明のポリペプチド
本発明の新規なエクジソン受容体／無脊椎動物レチノイドＸ受容体−ベースの誘導性遺伝子発現システムは、ａ）ＤＮＡ結合ドメインまたはトランス活性化ドメイン、およびｂ）ＥｃＲリガンド結合ドメインまたは無脊椎動物ＲＸＲリガンド結合ドメインを含むハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子発現カセットを含む。これらの遺伝子発現カセット、それらが含むポリヌクレオチド、およびそれらがコードするハイブリッドポリペプチドは、宿主細胞内で遺伝子の発現を変調するためのＥｃＲ−ベースの遺伝子発現システムの構成要素として有用である。
【０１８０】
かくして、本発明は、ａ）本発明によるＤＮＡ結合ドメインまたはトランス活性化ドメイン、およびｂ）本発明によるＥｃＲリガンド結合ドメインまたは無脊椎動物ＲＸＲリガンド結合ドメインを含むハイブリッドポリペプチドにも関する。
【０１８１】
また、本発明は、本発明によるトランケーション突然変異を含む単離されたトランケートされたＥｃＲまたは単離されたトランケートされた無脊椎動物ＲＸＲポリペプチドに関する。具体的には、本発明は、リガンド結合活性またはリガンド感受性に影響するトランケーション突然変異を含む単離されたトランケートされたＥｃＲまたは単離されたトランケートされた無脊椎動物ＲＸＲポリペプチドに関する。
【０１８２】
特定の態様において、単離されたトランケートされたＥｃＲポリペプチドは、配列番号：１、配列番号：５３および配列番号：４５よりなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。
【０１８３】
他の特定の態様において、単離されたトランケートされたＥｃＲポリペプチドは、配列番号：５、配列番号：４３および配列番号：５９よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０１８４】
他の特定の態様において、単離されたトランケートされた無脊椎動物ＲＸＲポリペプチドは、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９および配列番号：２０よりなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。
【０１８５】
他の特定の態様において、単離されたトランケートされた無脊椎動物ＲＸＲポリペプチドは、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、および配列番号：３２よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０１８６】
本発明は無脊椎動物ＲＸＲポリペプチドのリガンド結合活性またはリガンド感受性を低下させるトランケーション突然変異を含む単離された無脊椎動物ＲＸＲポリペプチドに関し、ここに、該ポリペプチドは配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、および配列番号：２０よりなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。
【０１８７】
かくして、本発明は無脊椎動物ＲＸＲポリペプチドのリガンド結合活性またはリガンド感受性を低下させるトランケーション突然変異を含む単離された無脊椎動物ＲＸＲポリペプチドに関し、ここに、該ポリペプチドは配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、および配列番号：３２よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０１８８】
特定の態様において、本発明は無脊椎動物ＲＸＲポリペプチドのステロイド結合活性またはステロイド感受性を低下させるトランケーション突然変異を含む単離された無脊椎動物ＲＸＲポリペプチドに関する。
【０１８９】
他の特定の態様において、本発明は無脊椎動物ＲＸＲポリペプチドの非−ステロイド結合活性または非−ステロイド感受性を低下させるトランケーション突然変異を含む単離された無脊椎動物ＲＸＲポリペプチドに関する。
【０１９０】
加えて、本発明は無脊椎動物ＲＸＲポリペプチドのリガンド結合活性またはリガンド感受性を増強するトランケーション突然変異を含む単離された無脊椎動物ＲＸＲポリペプチドに関する。
【０１９１】
本発明は無脊椎動物ＲＸＲポリペプチドのリガンド結合活性またはリガンド感受性を増強するトランケーション突然変異を含む単離された無脊椎動物ＲＸＲポリペプチドに関する。特定の態様において、本発明は無脊椎動物ＲＸＲポリペプチドのステロイド結合活性またはステロイド感受性を増強するトランケーション突然変異を含む単離された無脊椎動物ＲＸＲポリペプチドに関する。
【０１９２】
他の特定の態様において、本発明は無脊椎動物ＲＸＲポリペプチドの非−ステロイド結合活性または非−ステロイド感受性を増強するトランケーション突然変異を含む単離された無脊椎動物ＲＸＲポリペプチドに関する。
【０１９３】
また、本発明は突然変異した無脊椎動物レチノイドＸ受容体ポリペプチドおよび二量体化パートナーを含むヘテロダイマーのリガンド感受性を増加させるトランケーション突然変異を含む単離された無脊椎動物レチノイドＸ受容体ポリペプチドに関する。好ましくは、ヘテロダイマーのリガンド感受性を増加させるトランケーション突然変異を含む単離された無脊椎動物レチノイドＸ受容体ポリペプチドは、配列番号：９（ＬｍＵＳＰ−ＥＦ）、配列番号：１０（ＡｍａＲＸＲ１−ＥＦ）、配列番号：１１（ＡｍａＲＸＲ２−ＥＦ）、配列番号：１２（ＣｐＲＸＲ−ＥＦ）、配列番号：１３（ＴｍＲＸＲ−ＥＦ）、および配列番号：１４（ＡｍＲＸＲ−ＥＦ）よりなる群から選択される核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。より好ましくは、ヘテロダイマーのリガンド感受性を増加させるトランケーション突然変異を含む無脊椎動物レチノイドＸ受容体ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドは、配列番号：２１（ＬｍＵＳＰ−ＥＦ）、配列番号：２２（ＡｍａＲＸＲ１−ＥＦ）、配列番号：２３（ＡｍａＲＸＲ２−ＥＦ）、配列番号：２４（ＣｐＲＸＲ−ＥＦ）、配列番号：２５（ＴｍＲＸＲ−ＥＦ）、および配列番号：２６（ＡｍＲＸＲ−ＥＦ）よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０１９４】
特定の態様において、二量体化パートナーはエクジソン受容体ポリペプチドである。好ましくは、二量体化パートナーは、トランケートされたＥｃＲポリペプチドである。より好ましくは、二量体化パートナーは、ドメインＡ／Ｂが欠失されたＥｃＲポリペプチドである。なおより好ましくは、二量体化パートナーは、配列番号：５（ＣｆＥｃＲ−ＥＦ）、配列番号：４３（ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦ）、または配列番号：５９（ＣｆＥｃＲ−ＣＤＥＦ）のアミノ酸配列を含むＥｃＲポリペプチドである。
【０１９５】
本発明の遺伝子発現を変調する方法
また、出願人らの発明は本発明による遺伝子発現変調システムを用いて宿主細胞において遺伝子発現を変調する方法に関する。具体的には、出願人らの発明は、ａ）本発明による遺伝子発現変調システムを宿主細胞に導入し、次いで、ｂ）リガンドを宿主細胞に導入する工程を含み、ここに、変調すべき遺伝子はｉ）第１のハイブリッドポリペプチドのＤＮＡ結合ドメインによって認識されるドメインを含む応答エレメント、ｉｉ）第２のハイブリッドポリペプチドのトランス活性化ドメインによって活性化されるプロモーター、およびｉｉｉ）その発現を変調すべき遺伝子を含む遺伝子発現カセットの構成要素であり、それにより、リガンドの宿主細胞への導入に際して、遺伝子の発現が変調されることを特徴とする宿主細胞において遺伝子の発現を変調する方法を提供する。
【０１９６】
また、本発明は、ａ）本発明による遺伝子発現変調システムを宿主細胞に導入し、ｂ）ｉ）第１のハイブリッドポリペプチドからのＤＮＡ結合ドメインによって認識されるドメインを含む応答エレメント、ｉｉ）第２のハイブリッドポリペプチドのトランス活性化ドメインによって活性化されるプロモーター、およびｉｉｉ）その発現を変調すべき遺伝子を含む遺伝子発現カセットを宿主細胞に導入し、さらに、ｃ）リガンドを宿主細胞に導入する工程を含み、それによりリガンドの宿主細胞への導入に際して、遺伝子の発現が変調されることを特徴とする宿主細胞において遺伝子の発現を変調する方法を提供する。
【０１９７】
出願人らの方法を用いる宿主細胞における発現用の注目される遺伝子は内因性遺伝子または異種遺伝子であってよい。所望の遺伝子または蛋白質についての核酸またはアミノ酸配列の情報は、多くの公的アクセスデータベースのうちの１つ、例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ、ＥＭＢＬ、Ｓｗｉｓｓ−ＰｒｏｔおよびＰＩＲにおいて、または多くの生物学関連雑誌刊行物に見出すことができる。かくして、当業者であれば、実質的に全ての公知の遺伝子についての核酸配列情報にアクセスすることができる。従って、そのような情報を用いて、本明細書中に記載した出願人らの方法で用いる遺伝子発現カセット内への注目する遺伝子の挿入のための所望の構築体を構築することができる。
【０１９８】
出願人らの方法を用いる宿主細胞での発現用の注目する遺伝子の例は、限定されるものではないが、疾患、病気、障害、機能不全、遺伝的欠陥を扱うのに使用され得る；例えば、モノクローナル抗体、酵素、プロテアーゼ、サイトカイン、インターフェロン、インスリン、エリスロポエチン、血液凝固因子、他の血液因子もしくは成分；遺伝子治療用のウイルスベクター、ワクチン用のウイルス、薬物発見用、機能的ゲノミクス、ならびにプロテオミクスの分析および適用の標的などのような治療上望ましいポリペプチドまたは産物をコードする遺伝子が挙げられる。
【０１９９】
許容されるリガンドは、リガンドの存在下における応答エレメントへの２−ハイブリッドシステムのＤＮＡ結合ドメインの結合の結果、遺伝子の発現が不活化または抑制される場合に、遺伝子の発現を変調するいずれのものでもある。好ましいリガンドは、ポナステロン、ムリステロンＡ、９−シス−レチノイン酸、レチノイン酸の合成アナログ、米国特許第６，０１３，８３６号、第５，１１７，０５７号、第５，５３０，０２８号および第５，３７８，７２６号に開示されたもののごときＮ，Ｎ’−ジアシルヒドラジン、欧州出願第４６１，８０９号に開示されたもののごときジベンゾイルアルキルシアノヒドラジン、米国特許第５，２２５，４４３号に開示されたもののごときＮ−アルキル−Ｎ，Ｎ’−ジアロイルヒドラジン、欧州出願第２３４，９９４号に開示されたもののごときＮ−アシル−Ｎ−アルキルカルボニルヒドラジン、米国特許第４，９８５，４６１号に開示されたもののごときＮ−アロイル−Ｎ−アルキル−Ｎ’−アロイルヒドラジン（その各々は引用して本明細書の一部とみなす）および３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシ−Ｎ−イソブチル−ベンズアミド、８−Ｏ−アセチルハルパジド等を含めた他の同様の物質を含む。
【０２００】
好ましい態様において、遺伝子の発現を変調する出願人らの方法で用いるリガンドは式：
【化２】
0005887301.tif 000003
の化合物である。
【０２０１】
式中、Ｅは第三級炭素を含有する（Ｃ４−Ｃ６）アルキルまたは第三級炭素を含有するシアノ（Ｃ３−Ｃ５）アルキルであり；
Ｒ１は、Ｈ、Ｍｅ、Ｅｔ、ｉ−Ｐｒ、Ｆ、ホルミル、ＣＦ３、ＣＨＦ２、ＣＨＣｌ２、ＣＨ２Ｆ、ＣＨ２Ｃｌ、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２ＯＭｅ、ＣＨ２ＣＮ、ＣＮ、Ｃ０ＣＨ、１−プロピニル、２−プロピニル、ビニル、ＯＨ、ＯＭｅ、ＯＥｔ、シクロプロピル、ＣＦ２ＣＦ３、ＣＨ＝ＣＨＣＮ、アリル、アジド、ＳＣＮまたはＳＣＨＦ２であり；
Ｒ２はＨ、Ｍｅ、Ｅｔ、ｎ−Ｐｒ、ｉ−Ｐｒ、ホルミル、ＣＦ３、ＣＨＦ２、ＣＨＣｌ２、ＣＨ２Ｆ、ＣＨ２Ｃｌ、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２ＯＭｅ、ＣＨ２ＣＮ、ＣＮ、Ｃ０ＣＨ、１−プロピニル、２−プロピニル、ビニル、Ａｃ、Ｆ、Ｃｌ、ＯＨ、ＯＭｅ、ＯＥｔ、Ｏ−ｎ−Ｐｒ、ＯＡｃ、ＮＭｅ２、ＮＥｔ２、ＳＭｅ、ＳＥｔ、ＳＯＣＦ３、ＯＣＦ２ＣＦ２Ｈ、ＣＯＥｔ、シクロプロピル、ＣＦ２ＣＦ３、ＣＨ＝ＣＨＣＮ、アリル、アジド、ＯＣＦ３、ＯＣＨＦ２、Ｏ−ｉ−Ｐｒ、ＳＣＮ、ＳＣＨＦ２、ＳＯＭｅ、ＮＨ−ＣＮであるか、またはＲ３、ならびにＲ２およびＲ３が結合したフェニル炭素と一緒になって、エチレンジオキシ、フェニル炭素に隣接する酸素を持つジヒドロフリル環、もしくはフェニル炭素に隣接する酸素を持つジヒドロピリル環を形成し；
Ｒ３はＨ、Ｅｔであるか、またはＲ２、ならびにＲ２およびＲ３が結合したフェニル炭素と一緒になってエチレンジオキシ、フェニル炭素に隣接する酸素を持つジヒドロフリル環、もしくはフェニル炭素に隣接する酸素を持つジヒドロピリル環を形成し；
Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は独立してＨ、Ｍｅ、Ｅｔ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ホルミル、ＣＦ３、ＣＨＦ２、ＣＨＣｌ２、ＣＨ２Ｆ、ＣＨ２Ｃｌ、ＣＨ２ＯＨ、ＣＮ、Ｃ０ＣＨ、１−プロピニル、２−プロピニル、ビニル、ＯＭｅ、ＯＥｔ、ＳＭｅまたはＳＥｔである。
【０２０２】
他の好ましい態様において、遺伝子の発現を変調する出願人らの方法において前記した第１のリガンドに加えて第２のリガンドを用いることができ、ここに、該第２のリガンドは９−シス−レチノイン酸またはレチノイン酸の合成アナログである。
【０２０３】
出願人らの発明は原核生物および真核生物宿主細胞における遺伝子発現の変調を提供する。かくして、本発明は、細菌細胞、真菌細胞、酵母細胞、動物細胞、および哺乳動物細胞よりなる群から選択される宿主細胞において遺伝子発現を変調する方法にも関する。好ましくは、宿主細胞は、酵母細胞、ハムスター細胞、マウス細胞、サル細胞またはヒト細胞である。
【０２０４】
トランスジェニック宿主細胞における発現は、限定されるものではないが、治療用ポリペプチド、経路中間体；宿主細胞を用いる以前は可能でなかった新しい生成物の合成用の宿主細胞にすでに存在する経路の変調；細胞ベースのアッセイ；機能的ゲノミクスアッセイ、バイオ治療蛋白質の生産、プロテオミクスアッセイ等を含めた注目する種々のポリペプチドの発現で有用でり得る。加えて、遺伝子産物は、宿主のより高い成長率を付与し、または別の成長様式を利用できるようにするのに有用である。
【０２０５】
本発明の宿主細胞および非−ヒト生物
前記したごとく、本発明の遺伝子発現変調システムを用いて、宿主細胞において遺伝子発現を変調することができる。トランスジェニック宿主細胞における発現は種々の注目する遺伝子の発現で有用であろう。かくして、出願人らの発明は、本発明による遺伝子発現システムを含む単離された宿主細胞を提供する。また、本発明は、本発明による遺伝子発現カセットを含む単離された宿主細胞を提供する。また、出願人らの発明は、本発明によるポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含む単離された宿主細胞を提供する。単離された宿主細胞は原核生物または真核生物宿主細胞であってよい。
【０２０６】
好ましくは、宿主細胞は、細菌細胞、真菌細胞、酵母細胞、動物細胞および哺乳動物細胞よりなる群から選択される。好ましい宿主細胞の例は、限定されるものではないが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａのごとき真菌または酵母種、またはＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ、Ａｎａｂａｅｎａ、Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ、ＭｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍおよびＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ属におけるもののごとき細菌種、動物および哺乳動物宿主細胞を含む。
【０２０７】
特定の態様において宿主細胞は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、ＰｉｃｈｉａおよびＣａｎｄｉｄａ宿主細胞よりなる群から選択される酵母細胞である。
【０２０８】
他の特定の態様において宿主細胞は、ハムスター細胞である。
【０２０９】
他の特定の態様において宿主細胞は、マウス（ｍｕｒｉｎｅ）細胞である。
【０２１０】
他の特定の態様において宿主細胞は、サル細胞である。
【０２１１】
他の特定の態様において宿主細胞は、ヒト細胞である。
【０２１２】
宿主細胞形質転換は、当該分野でよく知られており、限定されるものではないが、エレクトロポレーション、ウィルス感染、プラスミド／ベクタートランスフェクション、非−ウィルスベクター媒介トランスフェクション、粒子衝撃等を含めた種々の方法によって達成することができる。所望の遺伝子産物の発現は、適当な条件下で形質転換された宿主細胞を培養し、形質転換された遺伝子の発現を誘導することを含む。原核生物および真核生物細胞における培養条件および遺伝子発現プロトコルは当該分野でよく知られている（実施例の一般的方法セクション参照）。細胞を回収することができ、遺伝子産物を遺伝子産物に特異的なプロトコルに従って単離することができる。
【０２１３】
加えて、挿入されたポリヌクレオチドの発現を変調し、または所望の特異的な様式でポリペプチド産物を修飾し加工する宿主細胞を選択することができる。異なる宿主細胞は、蛋白質の翻訳および翻訳後プロセッシングおよび修飾［例えば、グリコシル化、（例えば、シグナル配列の）切断］について特徴的かつ特異的なメカニズムを有する。適当な細胞系または宿主系を選択して、発現された外来性蛋白質の所望の修飾およびプロセッシングを確実とすることができる。例えば、細菌システムにおける発現を用いて、非−グリコシル化コア蛋白質産物を生じさせることができる。しかしながら、細菌で発現されたポリペプチドは適切には折り畳まれないであろう。酵母における発現は、グリコシル化産物を生じさせることができる。真核生物細胞における発現は異種蛋白質の「天然」グリコシル化および折り畳みの可能性を増加させることができる。さらに、哺乳動物細胞における発現はポリペプチドの活性を復元するかまたは構成するためのツールを提供することができる。さらに、異なるベクター／宿主発現システムは蛋白質分解切断のごときプロセッシング反応に異なる程度影響することができる。
【０２１４】
また、出願人らの発明は、本発明による単離された宿主細胞を含む非−ヒト生物に関する。好ましくは、非−ヒト生物は、細菌、真菌、酵母、動物および哺乳動物よりなる群から選択される。より好ましくは、非−ヒト生物は、酵母、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ヤギ、ブタ、ウマ、ヒツジ、サルまたはチンパンジーである。
【０２１５】
特定の態様において、非−ヒト生物は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、ＰｉｃｈｉａおよびＣａｎｄｉｄａよりなる群から選択される酵母である。
【０２１６】
他の特定の態様において、非−ヒト生物は、Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓマウスである。
【０２１７】
遺伝子発現／転写の測定
本発明の出願人らの方法の１つの有用な測定は、ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡ種の同一性および存在量を含めた細胞の転写状態の測定である。そのような測定は、いくつかの現存する遺伝子発現技術のうちのいずれかによってｃＤＮＡの存在量を測定することによって簡便に行われる。
【０２１８】
核酸アレイ技術は異なるｍＲＮＡ発現を決定するための有用な技術である。そのような技術は、例えば、オリゴヌクレオチドチップおよびＤＮＡマイクロアレイを含む。これらの技術は、固体支持体に固定化し、細胞、組織または生物全体から抽出された全ｍＲＮＡプールから調製され、ｃＤＮＡに変換されたプローブにハイブリダイズする異なる遺伝子またはｃＤＮＡに対応するＤＮＡ断片またはオリゴヌクレオチドに頼る。オリゴヌクレオチドチップは、フォトリソグラフィー技術を用いて基材上で合成されたオリゴヌクレオチドのアレイである。１７００までの遺伝子につき分析できるチップが製造されている。ＤＮＡマイクロアレイは、ＤＮＡ試料、典型的には、機械的に顕微鏡スライドグラス上にプリントされるＰＣＲ産物のアレイである。各遺伝子は、全長または部分長標的ＤＮＡ配列によって分析される。１０，０００までの遺伝子についてのマイクロアレイが、今日、ルーチン的に、商業生産されている。これらの２つの技術の間の主な差は、オリゴヌクレオチドチップが、典型的には、短いＤＮＡ分子の分別を可能とする２５−量体オリゴヌクレオチドを利用するのに対し、マイクロアレイのより大きなＤＮＡ標的、ほぼ１０００塩基対が複雑なＤＮＡ混合物を分別するにおいてより大きな感受性を供することができることである。
【０２１９】
本発明の出願人らの方法の他の有用な測定は、当該分野でよく知られたプロセスを用いて細胞に存在する構成蛋白質種の存在量を測定することによって細胞の翻訳状態を測定するものである。
【０２２０】
種々の生理学的機能に関連する遺伝子の同定が望まれる場合、細胞増殖、アポトーシス、老化、分化、接着、特定の分子への結合、他の細胞への結合、細胞組織化、器官形成、細胞内輸送、輸送促進、エネルギー変換、代謝、筋肉形成、神経形成および／または造血のごとき機能における変化を測定されるアッセイを使用することができる。
【０２２１】
加えて、選択マーカーまたはレポーター遺伝子発現を用いて、出願人らの発明を用いて遺伝子発現変調を測定することができる。
【０２２２】
遺伝子発現の産物を検出する他の方法は当該分野でよく知られており、サザンブロット（ＤＮＡ検出）、ドットまたはスロットブロット（ＤＮＡ、ＲＮＡ）、ノーザンブロット（ＲＮＡ）、ＲＴ−ＰＣＲ（ＲＮＡ）、ウェスタンブロット（ポリペプチド検出）およびＥＬＩＳＡ（ポリペプチド）分析を含む。余り好ましくはないが、標識された蛋白質を用いて、それにハイブリダイズする特定の核酸配列を検出することができる。
【０２２３】
ある場合には、核酸配列の量を増幅する必要がある。これは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）、リガーゼ連鎖反応（「ＬＣＲ」）、ストランドディスプレイスメント増幅（「ＳＤＡ」）、転写−ベースの増幅等を含めた多数の適当な方法のうち１以上を用いて行うことができる。ＰＣＲは公知の技術に従って行われ、ここに、例えば、オリゴヌクレオチドプライマーの１つの対を用い（１つのプライマーは検出すべき特定の配列の１つのストランド（鋳型）にハイブリダイズする）、ハイブリダイズする条件下、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの存在下で核酸試料を処理する。プライマーは、それにハイブリダイズする特定の配列の各鋳型ストランドに十分に相補的なものである。各プライマーの伸長産物を合成し、それは、それがハイブリダイズする核酸鋳型ストランドに相補的である。また、各プライマーから合成された伸長産物は、同一プライマーを用いる伸長産物のさらなる合成用の鋳型としても働くことができる。伸長産物の十分な数のラウンドの合成に従い、試料を前記したごとく分析して、検出すべき配列または複数配列が存在するかを評価することができる。
【０２２４】
本発明の例として掲げる以下の非限定的実施例を参照して本発明はよく理解することができる。
【０２２５】
実施例
一般的方法
本明細書中で用いる標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は当該分野でよく知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）（Ｍａｎｉａｔｉｓ）によって、およびＴ．Ｊ．Ｓｉｌｈａｖｙ、Ｍ．Ｌ．Ｂｅｎｎａｎ、およびＬ．Ｗ．Ｅｎｑｕｉｓｔ、Ｅｘｐｅｒｉｍａｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８４）によって、およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８７）によって記載されている。
【０２２６】
細菌培養の維持および増殖に適した材料および方法は当該分野でよく知られている。以下の実施例で用いるのに適した技術は、Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（Ｐｈｉｌｌｉｐｐ  Ｇｅｒｈａｒｄｔ、Ｒ．Ｇ．Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ、Ｒａｌｐｈ  Ｎ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ、Ｅｕｇｅｎｅ  Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ、Ｗｉｌｌｉｓ  Ａ．Ｗｏｏｄ、Ｎｏｅｌ  Ｒ．ＫｒｉｅｇおよびＧ．Ｂｒｉｇｇｓ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ編）、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ．（１９９４）、またはＴｈｏｍａｓ  Ｄ．ＢｒｏｃｋによるＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ中：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第２版、Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ、ＭＡ（１９８９）に記載されているのを見出すことができる。宿主細胞増殖および維持で用いた全ての試薬、制限酵素および材料は、特に断りのない限り、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）、ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ）、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）、またはＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から入手した。
【０２２７】
遺伝子配列の操作は、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ  Ｉｎｃ．（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）から入手可能なプログラムのスイートを用いて達成することができる。ＧＣＧプログラム「Ｐｉｌｅｕｐ」を用いる場合、１２のギャップ創製デフォルト値、および４のギャップ伸長デフォルト値を用いることができる。ＣＧＣ「Ｇａｐ」または「Ｂｅｓｔｆｉｔ」プログラムを用いる場合、５０のデフォルトギャップ創製ペナルティーおよび３のデフォルトギャップ伸長ペナルティーを用いることができる。ＧＣＧプログラムパラメーターがこれらまたはいずれかの他のＧＣＧプログラムで迅速化されないいずれの場合においても、デフォルト値を用いることができる。
【０２２８】
略語の意味は以下の通りである：「ｈ」は時間を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｄ」は日を意味し、「μｌ」はマイクロリットルを意味し、「ｍｌ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「μＭ」はマイクロモラーを意味し、「ｍＭ」はミリモラーを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｍｇ」はミリグラムを意味し、「Ａ」はアデニンまたはアデノシンを意味し、「Ｔ」はチミンまたはチミジンを意味し、「Ｇ」はグアニンまたはグアノシンを意味し、「Ｃ」はシチジンまたはシトシンを意味し、「ｘｇ」は重力の倍数を意味し、「ｎｔ」はヌクレオチドを意味し、「ａａ」はアミノ酸を意味し、「ｂｐ」は塩基対を意味し、「ｋｂ」はキロベースを意味し、「ｋ」はキロを意味し、「μ」はマイクロを意味し、および「℃」は摂氏度を意味する。
【実施例１】
【０２２９】
出願人らのＥｃＲ／無脊椎動物ＲＸＲ−ベースの誘導性遺伝子変調システムは、遺伝子治療、宿主細胞における注目する蛋白質の発現、トランスジェニック生物の生産、および細胞−ベースのアッセイを含めた種々の適用で有用である。哺乳動物細胞を含めた種々の細胞バックグラウンドにおいて、無脊椎動物ＥｃＲは脊椎動物ＲＸＲとヘテロ二量体化し、リガンドの結合に際して、エクジソン応答エレメントの制御下で遺伝子をトランス活性化する。出願人らは、無脊椎動物ＲＸＲが脊椎動物ＲＸＲに代えて置き換えることができ、酵母および動物細胞適用のための新規な誘導性遺伝子発現システムを提供するという驚くべき発見を成した。この実施例は、本発明のＥｃＲ−ベースの誘導性遺伝子発現システムで用いるいくつかの遺伝子発現カセットの構築を記載する。
【０２３０】
出願人らは、ハマキガ  Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ  ｆｕｍｉｆｅｒａｎａ  ＥｃＲ（「ＣｆＥｃＲ」）、Ｃ．ｆｕｍｉｆｅｒａｎａウルトラスピラクル（「ＣｆＵＳＰ」）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ  ＵＳＰ（「ＤｍＵＳＰ」）、マウス  Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓレチノイドＸ受容体α（「ＭｍＲＸＲα」）、バッタ  Ｌｏｃｕｓｔａ  ｍｉｇｒａｔｏｒｉａ  ＵＳＰ（「ＬｍＵＳＰ」）、脊椎動物ＲＸＲの無脊椎動物ホモログ、Ａｍｂｌｙｏｍｍａ  ａｍｅｒｉｃａｎｕｍ  ＲＸＲホモログ１（「ＡｍａＲＸＲ１」）、脊椎動物ＲＸＲの無脊椎動物ホモログ、およびＡｍｂｌｙｏｍｍａ  ａｍｅｒｉｃａｎｕｍ  ＲＸＲホモログ２（「ＡｍａＲＸＲ２」）、脊椎動物ＲＸＲの無脊椎動物ホモログ、に基づくいくつかのＥｃＲ−ベースの遺伝子発現カセットを構築した。調製された受容体構築体は、ＥｃＲ、脊椎動物ＲＸＲ、無脊椎動物ＵＳＰ、または無脊椎動物ＲＸＲいずれかのリガンド結合ドメイン、およびＧＡＬ４またはＬｅｘＡ  ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）あるいはＶＰ１６またはＢ４２酸性アクチベータートランス活性化ドメイン（ＡＤ）を含む。レポーター構築体は、各々、それにＧａｌ４  ＤＢＤまたはＬｅｘＡ  ＤＢＤが結合するＧＡＬ４応答エレメントまたはＬｅｘＡ応答エレメントのいずれかを含む合成プロモーター構築対に作動可能に連結したレポーター遺伝子、ルシフェラーゼまたはＬａｃＺを含む。これらの受容体およびレポーター構築体の種々の組み合わせを、実施例に２−９（後記）に記載したごとく哺乳動物細胞にコトランスフェクトした。
【０２３１】
遺伝子発現カセット：エクジソン受容体−ベースの遺伝子発現カセット（スイッチ）は、当該分野で利用可能な標準的クローニング方法を用いて以下のごとくに構築した。以下に、ここに記載する実施例で用いる各スイッチの調製および組成を簡単に記載する。
【０２３２】
１．１−ＧＡＬ４ＣｆＥｃＲ−ＣＤＥＦ／ＶＰ１６ＭｍＲＸＲα−ＤＥＦ：ハマキガ  Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ  ｆｕｍｉｆｅｒａｎａ  ＥＣＲのＣ、Ｄ、ＥおよびＦドメイン（「ＣｆＥｃＲ−ＣＤＥＦ」、配列番号：４５）をＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメイン（「Ｇａｌ４ＤＮＡＢＤ」または「Ｇａｌ４ＤＢＤ」、配列番号：３３）に融合させ、ＳＶ４０ｅプロモーター（配列番号：４６）の制御下に置いた。マウス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）ＲＸＲαからのＤＥＦドメイン（「ＭｍＲＸＲα−ＤＥＦ」、配列番号：４７）をＶＰ１６からのトランス活性化ドメイン（「ＶＰ１６ＡＤ」、配列番号：３７）に融合させ、ＳＶ４０ｅプロモーター（配列番号：４６）の制御下に置いた。５つのコンセンサスＧＡＬ４応答エレメント結合部位（「５ＸＧＡＬ４ＲＥ」、配列番号：４１を含むＧＡＬ４ＲＥの５コピーを含む）を合成Ｅ１ｂ最小プロモーター（配列番号：４８）に融合させ、ルシフェラーゼ遺伝子（配列番号：４９）の上流に置いた。
【０２３３】
１．２−ＧＡＬ４ＣｆＥｃＲ−ＣＤＥＦ／ＶＰ１６ＭｍＲＸＲα−ＥＦ：ＭｍＲＸＲα−ＤＥＦをＭｍＲＸＲα−ＥＦ（配列番号：５０）で置き換える以外は、この構築体はスイッチ１．１と同様にして調製した。
【０２３４】
１．３−ＧＡＬ４ＣｆＥｃＲ−ＣＤＥＦ／ＶＰ１６ＣｆＵＳＰ−ＤＥＦ：ＭｍＲＸＲα−ＤＥＦをハマキガＵＳＰからのＤ、ＥおよびＦドメイン（「ＣｆＵＳＰ−ＤＥＦ」、配列番号：５１）で置き換える以外は、前記スイッチ１．１と同様にしてこの構築体を調製した。本実施例で用いた構築体は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ  ＵＳＰではなくＣｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ  ｆｕｍｉｆｅｒａｎａ  ＵＳＰを利用した以外は、米国特許第５，８８０，３３３号に開示されたものと同様である。
【０２３５】
１．４−ＧＡＬ４ＣｆＥｃＲ−ＣＤＥＦ／ＶＰ１６ＬｍＵＳＰ−ＤＥＦ：ＭｍＲＸＲα−ＤＥＦをＬｏｃｕｓｔａ  ｍｉｇｒａｔｏｒｉａウルトラスピラクルのＤ、ＥおよびＦドメイン（「ＬｍＵＳＰ−ＤＥＦ」、配列番号：５２）で置き換える以外は、この構築体は前記スイッチ１．１と同様にして調製した。
【０２３６】
１．５−ＧＡＬ４ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦ／ＶＰ１６ＭｍＲＸＲα−ＤＥＦ：ＣｆＥｃＲ−ＣＤＥＦをＣｆＥｃＲ−ＤＥＦ（配列番号：５３）で置き換える以外は、この構築体はスイッチ１．１と同様にして調製した。
【０２３７】
１．６−ＧＡＬ４ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦ／ＶＰ１６ＭｍＲＸＲα−ＥＦ：ＭｍＲＸＲα−ＤＥＦをＭｍＲＸＲα−ＥＦ（配列番号：５０）で置き換える以外は、この構築体はスイッチ１．５と同様にして調製した。
【０２３８】
１．７−ＧＡＬ４ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦ／ＶＰ１６ＣｆＵＳＰ−ＤＥＦ：ＭｍＲＸＲα−ＤＥＦをハマキガＣ．ｆｕｍｉｆｅｒａｎａ  ＵＳＰからのＤ、ＥおよびＦドメイン（「ＣｆＵＳＰ−ＤＥＦ」、配列番号：５１）で置き換える以外は、この構築体は前記スイッチ１．５と同様にして調製した。
【０２３９】
１．８−ＧＡＬ４ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦ／ＶＰ１６ＬｍＵＳＰ−ＤＥＦ：ＭｍＲＸＲα−ＤＥＦをＬｏｃｕｓｔａ  ｍｉｇｒａｔｏｒｉａウルトラスピラクルのＤ、ＥおよびＦドメイン（「ＬｍＵＳＰ−ＤＥＦ」、配列番号：５２）で置き換える以外は、この構築体は前記スイッチ１．５と同様にして調製した。
【０２４０】
１．９−Ｇａｌ４ＣｆＥｃＲ−Ａ／ＢＣＤＥＦ／ＶＰ１６ＬｍＵＳＰ−ＤＥＦ：ハマキガ  Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ  ｆｕｍｉｆｅｒａｎａ  ＥｃＲ全長（「ＣｆＥｃＲ−Ａ／ＢＣＤＥＦ」、配列番号：５４）をＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメイン（「Ｇａｌ４ＤＮＡＢＤ」または「Ｇａｌ４ＤＢＤ」、配列番号：３３）に融合させ、ＳＶ４０ｅプロモーター（配列番号：４６）の制御下に置いた。Ｌｏｃｕｓｔａ  ｍｉｇｒａｔｏｒｉａウルトラスピラクルからのＤＥＦドメイン（「ＬｍＵＳＰ−ＤＥＦ」、配列番号：５２）をＶＰ１６からのトランス活性化ドメイン（「ＶＰ１６ＡＤ」、配列番号：３７）に融合させ、ＳＶ４０ｅプロモーター（配列番号：４６）の制御下に置いた。５つのコンセンサスＧＡＬ４応答エレメント結合部位（「５ＸＧＡＬ４ＲＥ」、配列番号：４１を含むＧＡＬ４ＲＥの５コピーを含む）を合成Ｅ１ｂ最小プロモーター（配列番号：４８）に融合させ、ルシフェラーゼ遺伝子（配列番号：４９）の上流に置いた。
【０２４１】
１．１０−Ｇａｌ４ＣｆＥｃＲ−１／２ＣＤＥＦ／ＶＰ１６ＬｍＵＳＰ−ＤＥＦ：ＣｆＥｃＲ−Ａ／ＢＣＤＥＦをＣｆＥｃＲ−１／２ＣＤＥＦ（配列番号：５５）で置き換える以外は、この構築体はスイッチ１．９と同様にして調製した。
【０２４２】
１．１１−Ｇａｌ４ＣｆＥｃＲ−ＣＤＥＦ／ＶＰ１６ＬｍＵＳＰ−ＤＥＦ：ＣｆＥｃＲ−Ａ／ＢＣＤＥＦをＣｆＥｃＲ−ＣＤＥＦ（配列番号：４５）で置き換える以外は、この構築体はスイッチ１．９と同様にして調製した。
【０２４３】
１．１２−Ｇａｌ４ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦ／ＶＰ１６ＬｍＵＳＰ−ＤＥＦ：ＣｆＥｃＲ−Ａ／ＢＣＤＥＦをＣｆＥｃＲ−ＤＥＦ（配列番号：５３）で置き換える以外は、この構築体はスイッチ１．９と同様にして調製した。
【０２４４】
１．１３−Ｇａｌ４ＣｆＥｃＲ−ＥＦ／ＶＰ１６ＬｍＵＳＰ−ＤＥＦ：ＣｆＥｃＲ−Ａ／ＢＣＤＥＦをＣｆＥｃＲ−ＥＦ（配列番号：１）で置き換える以外は、この構築体はスイッチ１．９と同様にして調製した。
【０２４５】
１．１４−Ｇａｌ４ＣｆＥｃＲ−ＤＥ／ＶＰ１６ＬｍＵＳＰ−ＤＥＦ：ＣｆＥｃＲ−ＣＤＥＦをＣｆＥｃＲ−ＤＥ（配列番号：３）で置き換える以外は、この構築体はスイッチ１．９と同様にして調製した。
【０２４６】
１．１５−Ｇａｌ４ＣｆＥｃＲ−Ａ／ＢＣＤＥＦ／ＶＰ１６ＬｍＵＳＰ−ＥＦ：ハマキガ  Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ  ｆｕｍｉｆｅｒａｎａ  ＥｃＲ全長（「ＣｆＥｃＲ−Ａ／ＢＣＤＥＦ」、配列番号：５４）をＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメイン（「Ｇａｌ４ＤＮＡＢＤ」または「Ｇａｌ４ＤＢＤ」、配列番号：３３）に融合させ、ＳＶ４０ｅプロモーター（配列番号：４６）の制御下に置いた。Ｌｏｃｕｓｔａ  ｍｉｇｒａｔｏｒｉａウルトラスピラクルからのＥＦドメイン（「ＬｍＵＳＰ−ＥＦ」、配列番号：９）をＶＰ１６からのトランス活性化ドメイン（「ＶＰ１６ＡＤ」、配列番号：３７）に融合させ、ＳＶ４０ｅプロモーター（配列番号：４６）の制御下に置いた。５つのコンセンサスＧＡＬ４応答エレメント結合部位（「５ＸＧＡＬ４ＲＥ」、配列番号：４１を含むＧＡＬ４ＲＥの５コピーを含む）を合成Ｅ１ｂ最小プロモーター（配列番号：４８）に融合させ、ルシフェラーゼ遺伝子（配列番号：４９）の上流に置いた。
【０２４７】
１．１６−Ｇａｌ４ＣｆＥｃＲ−１／２ＣＤＥＦ／ＶＰ１６ＬｍＵＳＰ−ＥＦ：ＣｆＥｃＲ−Ａ／ＢＣＤＥＦをＣｆＥｃＲ−１／２ＣＤＥＦ（配列番号：５５）で置き換える以外は、この構築体はスイッチ１．１５と同様にして調製した。
【０２４８】
１．１７−Ｇａｌ４ＣｆＥｃＲ−ＣＤＥＦ／ＶＰ１６ＬｍＵＳＰ−ＥＦ：ＣｆＥｃＲ−Ａ／ＢＣＤＥＦをＣｆＥｃＲ−ＣＤＥＦ（配列番号：４５）で置き換える以外は、この構築体はスイッチ１．１５と同様にして調製した。
【０２４９】
１．１８−Ｇａｌ４ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦ／ＶＰ１６ＬｍＵＳＰ−ＥＦ：ＣｆＥｃＲ−Ａ／ＢＣＤＥＦをＣｆＥｃＲ−ＤＥＦ（配列番号：５３）で置き換える以外は、この構築体はスイッチ１．１５と同様にして調製した。
【０２５０】
１．１９−Ｇａｌ４ＣｆＥｃＲ−ＥＦ／ＶＰ１６ＬｍＵＳＰ−ＥＦ：ＣｆＥｃＲ−Ａ／ＢＣＤＥＦをＣｆＥｃＲ−ＥＦ（配列番号：１）で置き換える以外は、この構築体はスイッチ１．１５と同様にして調製した。
【０２５１】
１．２０−Ｇａｌ４ＣｆＥｃＲ−ＤＥ／ＶＰ１６ＬｍＵＳＰ−ＥＦ：ＣｆＥｃＲ−ＣＤＥＦをＣｆＥｃＲ−ＤＥ（配列番号：３）で置き換える以外は、この構築体はスイッチ１．１５と同様にして調製した。
【０２５２】
１．２１−Ｇａｌ４ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦ／ＶＰ１６ＡｍａＲＸＲ１−ＥＦ：ＬｍＵＳＰ−ＥＦをマダニ  Ａｍｂｌｙｏｍｍａ  ａｍｅｒｉｃａｎｕｍ  ＲＸＲホモログ１のＥおよびＦドメイン（「ＡｍａＲＸＲ１−ＥＦ」、配列番号：１０）で置き換える以外は、この構築体はスイッチ１．１８と同様にして調製した。
【０２５３】
１．２２−Ｇａｌ４ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦ／ＶＰ１６ＡｍａＲＸＲ２−ＥＦ：ＡｍａＲＸＲ１−ＥＦをマダニ  Ａｍｂｌｙｏｍｍａ  ａｍｅｒｉｃａｎｕｍ  ＲＸＲホモログ２のＥおよびＦドメイン（「ＡｍａＲＸＲ２−ＥＦ」、配列番号：１１）で置き換える以外は、この構築体はスイッチ１．２１と同様にして調製した。
【０２５４】
１．２３−ＬｅｘＡＣｆＥｃＲ−ＣＤＥＦ／ＶＰ１６ＣｆＵＳＰ−ＥＦ：ハマキガ  Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ  ｆｕｍｉｆｅｒａｎａ  ＥｃＲからのＣ、Ｄ、ＥおよびＦドメイン（「ＣｆＥｃＲ−ＣＤＥＦ」、配列番号：４５）をＬｅｘＡ  ＤＮＡ結合ドメイン（「ＬｅｘＡＤＮＡＢＤ」または「ＬｅｘＡＤＢＤ」、配列番号：３５）に融合させ、ＳＶ４０ｅプロモーター（配列番号：４６）の制御下に置いた。ハマキガＣ．ｆｕｍｉｆｅｒａｎａ  ＵＳＰからのＥおよびＦドメイン（「ＣｆＵＳＰ−ＥＦ」、配列番号：５６）をＶＰ１６からのトランス活性化ドメイン（「ＶＰ１６ＡＤ」、配列番号：３７）に融合させ、ＳＶ４０ｅプロモーター（配列番号：４６）の制御下に置いた。８つのコンセンサスＬｅｘＡ応答エレメント結合部位（「８ＸＬｅｘＡｏｐ」、配列番号：４２を含むＬｅｘＡ応答エレメント結合部位の４コピーを含む）を合成Ｅ１ｂ最小プロモーター（配列番号：４８）に融合させ、ルシフェラーゼ遺伝子（配列番号：４９）の上流に置いた。
【０２５５】
１．２４−ＬｅｘＡＣｆＥｃＲ−ＣＤＥＦ／ＶＰ１６ＬｍＵＳＰ−ＥＦ：ＣｆＵＳＰ−ＥＦをＬｍＵＳＰ−ＥＦ（配列番号：９）で置き換える以外は、この構築体はスイッチ１．２３と同様にして調製した。
【０２５６】
１．２５−ＬｅｘＡＣｆＥｃＲ−ＣＤＥＦ／ＶＰ１６ＭｍＲＸＲα−ＥＦ：ＣｆＵＳＰ−ＥＦをＭｍＲＸＲα−ＥＦ（配列番号：５０）で置き換える以外は、この構築体はスイッチ１．２３と同様にして調製した。
【０２５７】
１．２６−ＬｅｘＡＣｆＥｃＲ−ＣＤＥＦ／ＶＰ１６ＤｍＵＳＰ−ＥＦ：ＣｆＵＳＰ−ＥＦをＤｍＵＳＰ−ＥＦの対応するＥＦドメイン（配列番号：６０）で置き換える以外は、この構築体はスイッチ１．２３と同様にして調製した。
【０２５８】
１．２７−Ｇａｌ４ＣｆＥｃＲ−ＣＤＥＦ／Ｂ４２ＬｍＵＳＰ−ＥＦ：ハマキガ  Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ  ｆｕｍｉｆｅｒａｎａ  ＥｃＲからのＣ、Ｄ、ＥおよびＦドメイン（「ＣｆＥｃＲ−ＣＤＥＦ」、配列番号：４５）をＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメイン（「ＧＡＬ４ＤＮＡＢＤ」または「ＧＡＬ４ＤＢＤ」、配列番号：３３）に融合させ、ＳＶ４０ｅプロモーター（配列番号：４６）の制御下に置いた。バッタ  Ｌｏｃｕｓｔａ  ｍｉｇｒａｔｏｒｉａ  ＵＳＰからのＥおよびＦドメイン（「ＬｍＵＳＰ−ＥＦ」、配列番号：９）をＢ４２からのトランス活性化ドメイン（「Ｂ４２ＡＤ」、配列番号：３９）に融合させ、ＳＶ４０ｅプロモーター（配列番号：４６）の制御下に置いた。５つのコンセンサスＧＡＬ４応答エレメント結合部位（「５ＸＧＡＬ４ＲＥ」、配列番号：４１を含むＧＡＬ４ＲＥの５コピーを含む）を合成Ｅ１ｂ最小プロモーター（配列番号：４８）に融合させ、ルシフェラーゼ遺伝子（配列番号：４９）の上流に置いた。
【０２５９】
１．２８−ＬｅｘＡＣｆＥｃＲ−ＣＤＥＦ／Ｂ４２ＬｍＵＳＰ−ＥＦ：ＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメインをＬｅｘＡ  ＤＮＡ結合ドメイン（配列番号：３５）で置き換える以外は、この構築体はスイッチ１．２７と同様にして調製した。
【０２６０】
１．２９−ＧＡＬ４ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦ／ＶＰ１６ＤｍＵＳＰ−ＥＦ：ＣｆＵＳＰ−ＤＥＦをＤｍＵＳＰ−ＥＦの対応するＥＦドメイン（配列番号：６０）で置き換える以外は、この構築体はスイッチ１．７と同様にして調製した。
【０２６１】
１．３０−ＧＡＬ４ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦ／ＶＰ１６ＣｆＵＳＰ−ＥＦ：ＣｆＵＳＰ−ＤＥＦをＣｆＵＳＰ−ＥＦ（配列番号：５６）で置き換える以外は、この構築体はスイッチ１．７と同様にして調製した。
【実施例２】
【０２６２】
２−ハイブリッドスイッチ様式において、ＣｆＥｃＲと協同したＣｆＵＳＰおよびＤｍＵＳＰは酵母および哺乳動物細胞双方において構成的に活性である。他方、ＣｆＥｃＲと協同した脊椎動物ＲＸＲは哺乳動物細胞においてリガンド依存性トランスアクチベーターである。出願人らは、マウスＮＩＨ３Ｔ３細胞中にて２−ハイブリッド様式の無脊椎動物ＲＸＲ、ＬｍＵＳＰをテストして、それが哺乳動物細胞においてＵＳＰとして（構成的に）または脊椎動物ＲＸＲとして（誘導的に）機能するかを判断した。Ｇａｌ４：ＣｆＥｃＲ−ＣＤＥＦ（図１）またはＧａｌ４：ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦ（図２）をＶＰ１６：ＭｍＲＸＲ−ＤＥＦ、ＶＰ１６：ＭｍＲＸＲ−ＥＦ、ＶＰ１６：ＬｍＵＳＰ−ＤＥＦ、またはＶＰ１６：ＣｆＵＳＰ−ＥＦと対にし、哺乳動物細胞において分析した。簡単に述べれば、トランスフェクトされたＮＩＨ３Ｔ３細胞中でのレポーター遺伝子発現の用量依存性誘導において２つの異なるリガンド：ステロイドリガンド（ポナステロンＡ、「ＰｏｎＡ」）および非−ステロイドリガンド［Ｎ−（２−エチル−３−メトキシベンゾイル）−Ｎ’−（３，５−ジメチルベンゾイル）−Ｎ’−ｔｅｒｔ−ブチルヒドラジン］を用い、遺伝子誘導能力（誘導の大きさ）およびリガンドの特異性および感受性を調べた。レポーター遺伝子発現活性をリガンド添加後４８時間にアッセイした。細胞の培養および維持についての標準的な方法は以下の通りであった。
【０２６３】
トランスフェクション：実施例１で概説した種々のスイッチ構築体、特にスイッチ１．１−１．８に対応するＤＮＡをマウスＮＩＨ３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ）に以下のごとくトランスフェクトした。細胞が５０％密集に到達すると、それを回収し、各々、１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）を含有する２．５、１．０または０．５ｍｌの増殖培地中で、各々、１２５，０００、５０，０００または２５，０００細胞にて６−、１２−または２４−ウェルプレートで平板培養した。翌日、細胞を増殖培地ですすぎ、４時間トランスフェクトした。Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．）は、３Ｔ３細胞につき最良のトランスフェクション試薬であることが判明した。１２−ウェルプレートについては、４μｌのＳｕｐｅｒｆｅｃｔ（商標）を１００μｌの増殖培地と混合した。分析すべき１．０μｇのレポーター構築体および０．２５μｇの受容体対の各受容体構築体をトランスフェクションミックスに添加した。チミジンキナーゼ（ＴＫ）構成的プロモーターに作動可能に連結し、それの制御下に置かれたＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ遺伝子を含む第２のレポーター構築体を添加し［ｐＴＫＲＬ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、０．１μｇ／トランスフェクションミックス］、標準化で用いた。トランスフェクションミックスの内容物を攪拌ミキサーで混合し、室温にて３０分間放置した。インキュベーションの最後に、トランスフェクションミックスを、４００μｌの増殖培地中に維持した細胞に添加した。細胞を３７℃および５％ＣＯ２に４時間維持した。インキュベーションの最後に、２０％ＦＢＳおよびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、対照）または０．１、１、５、１０および５０μＭのＰｏｎＡステロイドリガンドまたはＮ−（２−エチル−３−メトキシベンゾイル）Ｎ’−（３，５−ジメチルベンゾイル）−Ｎ’−ｔｅｒｔ−ブチルヒドラジン非−ステロイドリガンドのＤＭＳＯ溶液いずれかを含有する５００μｌの増殖培地を添加し、細胞を３７℃および５％ＣＯ２に４８時間維持した。細胞を回収し、レポーター活性をアッセイした。全ての試薬を６ウェルプレートでは２倍にし、２４−ウェルプレートでは半分に減少させた以外は、同一手法を６および２４ウェルプレートで行った。
【０２６４】
リガンド：ステロイドリガンド、ポナステロンＡ（ＰｏｎＡ）はＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙから購入した。非−ステロイドリガンド、Ｎ−（２−エチル−３−メトキシベンゾイル）−Ｎ’−（３，５−ジメチルベンゾイル）−Ｎ’−ｔ−ブチルヒドラジン（ＧＳ（商標）−Ｅ非−ステロイドリガンド）はＲｏｈｍ  ａｎｄ  Ｈａａｓ  Ｃｏｍｐａｎｙで合成された合成安定エクジステロイドリガンドである。全てのリガンドはＤＭＳＯに溶解させ、ＤＭＳＯの最終濃度を対照および処理双方において０．１％に維持した。
【０２６５】
レポーターアッセイ：リガンド添加から４８時間後、細胞を回収した。１２５、２５０または５００μｌの受動溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからのＤｕａｌ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（商標）レポーターアッセイシステムの一部）を、各々、２４−または１２−または６−ウェルプレートの各ウェルに添加した。プレートをロータリーシェーカー上に１５分間置いた。２０μｌの溶解物をアッセイした。製造業者の指示に従い、Ｐｒｏｍｅｇａ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからのＤｕａｌ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（商標）レポーターアッセイシステムを用い、ルシフェラーゼ活性を測定した。製造業者の指示に従い、ＴＲＯＰＩＸからのＧａｌａｃｔｏ−Ｓｔａｒ（商標）アッセイキットを用い、β−ガラクトシダーゼを測定した。Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼを標準として用い、全てのルシフェラーゼおよびβ−ガラクトシダーゼ活性を標準化した。リガンド処理細胞における標準化された相対的光単位（「ＲＬＵ」）をＤＭＳＯ処理細胞（未処理対照）における標準化されたＲＬＵで割ることによって、活性の倍数を計算した。
【０２６６】
結果：図１および２に示されるごとく、ＣｆＥｃＲと協同したＬｍＵＳＰは、哺乳動物細胞においてリガンド−誘導性遺伝子発現システムとして機能する。この結果は、ＣｆＥｃＲと協同したＣｆＵＳＰおよびＤｍＵＳＰでの出願人らの以前の実験が構成的発現活性を示したため、驚くべきことである（ＣｆＵＳＰの結果についてはＰＣＴ／ＵＳ０１／０９０５０出願および図１および２参照、ＤｍＵＳＰの結果は示さず）。加えて、ＬｍＵＳＰはＣｆＥｃＲパートナーとしての脊椎動物ＲＸＲよりも良好に働いた。特に、感受性、すなわち、トランス活性化に必要なリガンドの濃度、およびトランス活性化の大きさの双方は、脊椎動物ＲＸＲと比較してＬｍＵＳＰで増加した。かくして、出願人らは、初めて、無脊椎動物ＲＸＲが、哺乳動物細胞において誘導性遺伝子発現システムでのエクジソン受容体と協同して効果的に機能できることを証明した。このＥｃＲ／無脊椎動物ＲＸＲ誘導性遺伝子発現システムはＥｃＲ／脊椎動物ＲＸＲ遺伝子発現システムをこえる改良である。というのは、トランス活性化に必要なリガンドはより少なく、トランス活性化の増大したレベルを達成することができるからである。
【０２６７】
本明細書中に記載した出願人らの発見に基づき、当業者であれば、双翅目ＲＸＲホモログ（例えばＤｍＵＳＰ）および鱗翅目ＲＸＲホモログ（例えばＣｆＵＳＰ）を例外として、他の無脊椎動物ＲＸＲおよびそれらのホモログも、出願人らのＥＣＲ／無脊椎動物ＲＸＲ−ベースの誘導性遺伝子発現システムで機能することができることを予測できるであろう。加えて、当業者であれば、出願人らの新規な誘導生遺伝子発現システムは酵母細胞において遺伝子発現を変調するように働くこともできることを予測できる。双翅目ＲＸＲホモログ／および鱗翅目ＲＸＲホモログ／ＥｃＲ遺伝子発現システムは、それらが哺乳動物細胞においてどのようにして機能するかと同様に、酵母細胞において構成的に機能し（データは示さず）、かつ出願人らはここに非−双翅目および非−鱗翅目無脊椎動物ＲＸＲは哺乳動物細胞においてＥｃＲと協同して誘導的に機能することを示したので、ＥｃＲ／無脊椎動物ＲＸＲ−ベースの遺伝子発現システムは酵母細胞において誘導的に機能すると予測される。かくして、本発明のＥｃＲ／無脊椎動物ＲＸＲ誘導性遺伝子発現システムは、遺伝子発現レベルの変調が酵母および哺乳動物細胞双方において望まれる適用で有用である。さらに、本発明が他の細胞でも働くことを予測しない理由はない。
【実施例３】
【０２６８】
本実施例は、全長またはトランケートされたＥｃＲ、脊椎動物ＲＸＲおよび無脊椎動物ＲＸＲポリペプチドを含む脊椎動物ＲＸＲおよび無脊椎動物ＲＸＲ−ベースの２−ハイブリッド遺伝子発現システムの比較を記載する。１２の異なる脊椎動物および無脊椎動物ＲＸＲのＥＦドメインを比較するアミノ酸配列のアラインメントを図３ＡおよびＢに示す。後記するごとく、出願人らは、ＶＰ１６活性化ドメインに融合したＭｍＲＸＲα−ＥＦ（脊椎動物ＲＸＲ）、ＬｍＵＳＰ−ＥＦ（無脊椎動物ＲＸＲ）、ＡｍａＲＸＲ１−ＥＦ（無脊椎動物ＲＸＲ）およびＡｍａＲＸＲ２−ＥＦ（無脊椎動物ＲＸＲ）を含む異なるＧＡＬ４／ＣｆＥｃＲ−ベースのスイッチを比較して、ａ）リガンドの存在下で最大誘導、ｂ）リガンドの不存在下で最小バックグラウンド、ｃ）リガンド濃度に対する高い感受性、および／またはｄ）哺乳動物細胞におけるリガンドおよび受容体間の最小クロス−トークを持つスイッチを与える受容体を同定した。
【０２６９】
簡単に述べれば、前記実施例１に記載したように、全長ＥｃＲおよびＡ／Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦドメインのジャンクションにおいてトランケーション突然変異によって創製されたトランケートされたＥｃＲがＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメインをコードするポリヌクレオチド（配列番号：３３）に融合した。ＶＰ１６活性化ドメインをコードするポリヌクレオチド（配列番号：３７）を、実施例１に記載したごとく、ＭｍＲＸＲα、ＬｍＵＳＰ、ＡｍａＲＸＲ１およびＡｍａＲＸＲ２のＥおよびＦドメインに融合した。得られたハイブリッドＥｃＲ／脊椎動物または無脊椎動物ＲＸＲをコードする遺伝子発現カセットを、対様式比較にて、ＮＩＨ３Ｔ３細胞でアッセイした。ルシフェラーゼポリペプチドをコードするプラスミドｐＦＲＬＵＣ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）をレポーター遺伝子構築体として用い、構成的ＴＫプロモーターの制御下でＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼポリペプチドをコードするｐＴＫＲＬ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、前記したごとくトランスフェクションを標準化した。トランスフェクトされた細胞を０、１、５または２５μＭの非−ステロイド、Ｎ−（２−エチル−３−メトキシベンゾイル）−Ｎ’−（３，５−ジメチルベンゾイル）−Ｎ’−ｔｅｒｔ−ブチルヒドラジンまたはステロイド、ＰｏｎＡの存在下で４８時間増殖させた。細胞を回収し、溶解させ、ルシフェラーゼレポーター活性を細胞溶解物において測定した。全フライルシフェラーゼ相対光単位が提示される。各バーの頂部の数字は、その処理についての最大誘導倍数である。分析は三連で行い、平均ルシフェラーゼカウント［全相対光単位（ＲＬＵ）］を前記したごとく測定した。
【０２７０】
図４−７に示すごとく、ＣｆＥｃＲ−ＣＤＥＦはいずれの他のＣｆＥｃＲトランケーションよりも良好に働く。特に、Ｇａｌ４ＣｆＥｃＲ−ＣＤＥＦは、ＶＰ１６ＬｍＵＳＰ−ＥＦを用いるＧａｌ４ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦよりも良好な誘導を示した。ＬｍＵＳＰ−ＤＥＦと組み合わせたＣｆＥｃＲのＥＦドメインは、非常に低い非誘導レベルと共にかなり良好な誘導レベルを示した。特許および刊行物に記載されたＥｃＲ−ＥＦドメインのほとんどはＤ、ＥおよびＦドメイン（約３００アミノ酸）を含む。この特別のトランケーションは２３０のアミノ酸を含むに過ぎず、ヘテロ二量体化ではＬｍＵＳＰのＤドメインに頼るであろう。
【０２７１】
テストしたＬｍＵＳＰのトランケーションのすべてのうち、出願人らの結果は、ＶＰ１６ＬｍＵＳＰ−ＥＦハイブリッド受容体ポリペプチドがＧａｌ４ＣｆＥｃＲ−ベースのハイブリッドポリペプチドにつき最良のパートナーであり、ＧＡＬ４ＣｆＥｃＲＣＤＥＦ／ＶＰ１６ＬｍＵＳＰ−ＥＦ（スイッチ１．１７）はいずれの他の受容体組合せよりも良好に働き、ステロイドよりも非−ステロイドに対してより感受性であることを示す（図６および７）。一般に、ＣｆＥｃＲ／ＬｍＵＳＰ−ベースのスイッチは、ステロイドＰｏｎＡに対するよりも、非−ステロイドＮ−（２−エチル−３−メトキシベンゾイル）−Ｎ’−（３，５−ジメチルベンゾイル）−Ｎ’−ｔｅｒｔ−ブチルヒドラジンに対してより感受性であった。かくして、ＬｍＵＳＰのＥＦドメインは十分であり、ＣｆＥｃＲ構築体と協同して、この受容体のＤＥＦドメインよりも良好に働く。
【０２７２】
出願人らの結果は、ＭｍＲＸＲαおよびＬｍＵＳＰの誘導の大きさおよび倍数が、ＬｍＵＳＰが少なくとも１０倍、リガンドに対する感受性を改良する以外は同様であることを示す。かくして、ＥｃＲ／無脊椎動物システムはＥｃＲ／脊椎動物システムをこえる改良である。
【実施例４】
【０２７３】
本実施例は、リガンド結合活性またはリガンド感受性、いずれか、または双方に影響するトランケートされたＥｃＲまたはＲＸＲ受容体ポリペプチドをコードする遺伝子発現カセットの出願人のさらなる分析を記載する。簡単に述べれば、実施例１に記載したごとく構築した２−ハイブリッド受容体対の１１の異なる組合せをＮＩＨ３Ｔ３細胞での単一の実験でさらに分析した。これらの１１の受容体対組合せおよびそれらの対応する試料番号を表１に示す。
【０２７４】
【表１】
0005887301.tif 000004
【０２７５】
レポータープラスミドｐＦＲＬｕｃと共に前記受容体構築体の対を前記したごとく構築し、前記したごとくＮＩＨ３Ｔ３細胞にトランスフェクトした。１１のＣｆＥｃＲトランケーション受容体組合せを２つの群に複製し、いずれかのステロイド（図８のＸ−軸上の奇数）または非−ステロイド（図８のＸ−軸上の偶数）いずれかで処理した。特に、細胞を、０、１、５または２５μＭのＰｏｎＡ（ステロイド）またはＮ−（２−エチル−３−メトキシベンゾイル）−Ｎ’−（３，５−ジメチルベンゾイル）−Ｎ’−ｔｅｒｔ−ブチルヒドラジン（非−ステロイド）リガンドを含有する培地で培養した。レポーター遺伝子活性を測定し、合計ＲＬＵが示される。各バーの頂部の数は、その処理についての最大誘導倍数であり、三連の平均である。
【０２７６】
図８に示すごとく、ＣｆＥｃＲ−ＣＤＥＦ／ＬｍＵＳＰ−ＥＦ受容体組合せ（カラム１５および１６）は、合計ＲＬＵおよび誘導倍数双方について最良の様式であった。この結果は、実施例３で前記した出願人らの結果と合致する。また、これらの１１の受容体対組合せをヒト肺ガン細胞系Ａ５４９（ＡＴＣＣ）でアッセイし、同様の結果が観測された（データは示さず）。
【実施例５】
【０２７７】
本実施例は、本発明のＥｃＲ／無脊椎動物ＲＸＲ−ベースの誘導性遺伝子発現システム内で用いるさらなる無脊椎動物レチノイドＸ受容体ホモログの出願人らの分析を記載する。簡単に述べれば、ＧＡＬ４／ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦ遺伝子発現カセットおよびＶＰ１６ＡｍａＲＸＲ１−ＥＦまたはＶＰ１６ＡｍａＲＸＲ２−ＥＦを含む２−ハイブリッド受容体遺伝子スイッチを実施例１に記載したごとく構築した。これらのＡｍａＲＸＲ１−およびＡｍａＲＸＲ２−ベースの遺伝子スイッチ（実施例１のスイッチ１．２１および１．２２）を、ＮＩＨ３Ｔ３細胞にてｐＦＲＬｕｃと共にＶＰ１６ＭｍＲＸＲα−ＥＦ（スイッチ１．６）、ＶＰ１６ＬｍＵＳＰ−ＥＦ（スイッチ１．１８）、ＶＰ１６ＤｍＵＳＰ−ＥＦ（スイッチ１．２９）およびＶＰ１６ＣｆＵＳＰ−ＥＦ（スイッチ１．３０）を含むＧＡＬ４／ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦ遺伝子スイッチと比較した。
【０２７８】
レポータープラスミドｐＦＲＬｕｃと共に前記受容体構築体対を前記したごとく構築し、前記したごとくＮＩＨ３Ｔ３細胞にトランスフェクトした。これらの６つのＣｆＥｃＲ−ＤＥＦ受容体−ベースの遺伝子スイッチのトランス活性化能力を、０、０．２、１または１０μＭのＰｏｎＡ（ステロイド）または０、０．４、０．２、１または１０μＭの非−ステロイドリガンドＮ−（２−エチル−３−メトキシベンゾイル）−Ｎ’−（３，５−ジメチルベンゾイル）−Ｎ’−ｔｅｒｔ−ブチルヒドラジンの存在下でトランスフェクトされた細胞で測定した。レポーター遺伝子活性を測定し、合計ＲＬＵを示す。各バーの頂部の数はその処理についての最大誘導倍数であり三連の平均である。
【０２７９】
図９に示すごとく、ＡｍａＲＸＲ１−ＥＦおよびＡｍａＲＸＲ２−ＥＦベースのスイッチは共に脊椎動物ＭｍＲＸＲα−ＥＦベースのスイッチよりも良好に働き、これは、これらの非−双翅目、非−鱗翅目無脊椎動物ＲＸＲホモログもまた本発明のＥｃＲ／無脊椎動物ＲＸＲ−ベースの誘導性遺伝子発現システムで機能することができるのを示唆する。かくして、無脊椎動物ＲＸＲ（ＬｍＵＳＰ）が脊椎動物ＲＸＲを置き換えることができるという出願人らの驚くべき発見およびさらなる無脊椎動物種ＲＸＲに関する本実施例で得られた知見に基づき、当業者であれば、他の無脊椎動物種、非−双翅目および非−鱗翅目ＲＸＲホモログが出願人らの遺伝子発現システムで働くことであろうことを予測することができる。
【実施例６】
【０２８０】
本実施例は、本発明によるＥｃＲ／無脊椎動物ＲＸＲ−ベースの遺伝子発現変調システムを含む宿主細胞の構築を記載する。ＧＡＬ４：ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦ／ＶＰ１６：ＬｍＵＳＰ−ＥＦ（実施例１に記載するごとく調製したスイッチ１．１８）を発現する安定な細胞を作成するために、出願人らは、ハイブリッドＧＡＬ４：ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦおよびＶＰ１６：ＬｍＵＳＰ−ＥＦポリペプチドをコードする遺伝子発現カセットを、安定にトランスフェクトされたレポータープラスミドｐＦＲＬｕｃを含むチャイニーズハムスター卵巣ＣＨＯ細胞にトランスフェクトした。簡単に述べれば、ＣＨＯ細胞が６０−８０％密集に到達すると、それを回収し、各々、１０％胎児ウシ血清を含有する２．５、１．０または０．５ｍｌの増殖培地中、２５０，０００、１００，０００または５０，０００細胞にて６−または１２−または２４−ウェルプレートで平板培養した。翌日、細胞を増殖培地ですすぎ、４時間トランスフェクトした。ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（商標）２０００（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．）は、これらの細胞のための最良のトランスフェクション試薬であることが判明した。１２−ウェルプレートでは、４μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（商標）２０００を１００μｌの増殖培地と混合した。１．０μｇのレポーター構築体および０．２５μｇの各受容体構築体ＧＡＬ４：ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦおよびＶＰ１６：ＬｍＵＳＰ−ＥＦをトランスフェクションミックスに添加した。第２のレポーター構築体を添加し（０．１μｇ／トランスフェクションミックス）、これは、チミジンキナーゼ（ＴＫ）構成的プロモーターに作動可能に連結し、その制御下に置かれたＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ遺伝子を含んでなり、標準化に用いた。トランスフェクションミックスの内容物を攪拌ミキサーで混合し、室温で３０分間放置した。インキュベーションの最後に、トランスフェクションミックスを、４００μｌの増殖倍地中に維持した細胞に添加した。細胞を３７℃および５％ＣＯ２に４時間維持した。インキュベーションの最後に、２０％ＦＢＳ、およびＤＭＳＯ（対照）または適当なリガンドのＤＭＳＯ溶液いずれかを含有する５００μｌの増殖培地を添加し、細胞を３７℃および５％ＣＯ２に２４−４８時間維持した。細胞を回収し、レポーター活性をアッセイした。全ての試薬を６ウェルプレートでは倍にし、２４−ウェルプレートでは半分まで低下させた以外は、同一手法を６および２４ウェルプレートで同様に行った。
【０２８１】
０、１、５または２５μＭのＰｏｎＡステロイドリガンドまたはＧＳ（商標）−Ｅ非−ステロイドリガンドの存在下で、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞を４８時間増殖させた。細胞を回収し、溶解させ、レポーター活性を測定した。全フライルシフェラーゼ相対光単位（ＲＬＵ）が提示される。バーの頂部の数は、各処理についての最大誘導倍数に対応する。細胞のバルク集団を、抗生物質ネオマイシンに対する抵抗性につき選択した（ＶＰ１６：ＬｍＵＳＰ／ＶＰ１６：ＲＸＲ構築体は、組み込まれたネオマイシン抵抗性遺伝子を有する）。各集団からのいくつかのクローンをエンドポイント希釈によって単離した。安定にトランスフェクトされたＧＡＬ４：ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦ／ＶＰ１６：ＬｍＵＳＰ−ＥＦ細胞の３つのクローンを分析した（図１０、クローン１Ａ２、２つの他のクローンに対するデータは示さず）。
【０２８２】
分析された３つのクローンのうち、ＧＡＬ４：ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦ／ＶＰ１６：ＬｍＵＳＰ−ＥＦ安定クローン１Ａ２は、非−ステロイドリガンドの存在下では最高の誘導倍数（１６２倍）、およびステロイドＰｏｎＡの存在下で４２倍の誘導倍数を呈した（図１０参照）。
【実施例７】
【０２８３】
本実施例は、本発明のＥｃＲ／無脊椎動物ＲＸＲ遺伝子発現変調システムの他の態様の開発を記載する。具体的には、出願人らは、本発明の遺伝子発現変調システムで用いるＬｅｘＡ  ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）ベースの−ＥｃＲ／無脊椎動物ＲＸＲ遺伝子スイッチを構築した。この態様は、ＧＡＬ４ＤＢＤ−ベースのスイッチに対する代替スイッチとして有用であり得、また、複数スイッチ様式で用いることができる。ＬｅｘＡ  ＤＢＤが酵母および植物発現システムで用いられてきたのに対し、出願人らは、哺乳動物適用におけるその使用に気づいていない。
【０２８４】
簡単に述べれば、ＣｆＥｃＲ−ＣＤＥＦドメイン（配列番号：４５）に融合したＬｅｘＡ  ＤＮＡ結合ドメイン（配列番号：３５）を含む遺伝子発現カセットを実施例１に記載したごとく調製した。ＬｅｘＡ：ＣｆＥｃＲ−ＣＤＥＦ遺伝子発現カセットが、ＶＰ１６：ＭｍＲＸＲα−ＥＦ、ＶＰ１６：ＣｆＵＳＰ−ＥＦ、ＶＰ１６：ＤｍＵＳＰ−ＥＦ、またはＶＰ１６：ＬｍＵＳＰ−ＥＦ遺伝子発現カセット、ならびに８ＸＬｅｘＡオペレーター（ＬｅｘＡ応答エレメントの４コピー、配列番号：４２）、最小プロモーター（合成Ｅ１ｂ最小プロモーター配列番号：４８）、およびルシフェラーゼ遺伝子（配列番号：４９）を含むレポーター構築体（８ｏｐＦＲＬｕｃ）と共にマウスＮＩＨ３Ｔ３細胞にトランスフェクトされた。０、０．１、１、５、１０および５０μＭのＧＳ（商標）−Ｅ非−ステロイドリガンドまたはＰｏｎＡステロイドリガンドの存在下にて、トランスフェクトされた細胞を前記したごとく４８時間培養した。細胞を回収し、溶解し、レポーター活性を測定し、全相対光単位（ＲＬＵ）を図１１に提示する。各バーの頂部の数は各処理の最大誘導倍数に対応する。
【０２８５】
ＬｅｘＡ：ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦ構築体は、調べた全てのパートナーと共にこれらの哺乳動物細胞でよく機能した（図１１参照）。誘導倍数は、出願人らのＧＡＬ４システムで観察されたものに匹敵する（図４参照）。８ｏｐＦＲＬｕｃレポーター（対照）は、これらの細胞において非常に低い活性を示した。図１１に掲げた結果は、ＬｅｘＡ  ＤＮＡ結合ドメインが出願人らの２−ハイブリッドシステムでよく機能することを示し、これは、ＤＮＡ結合ドメインがこれらの遺伝子発現カセットにおいてポータブルであることを示す。
【実施例８】
【０２８６】
本実施例は、本発明のＥｃＲ／無脊椎動物ＲＸＲ遺伝子発現変調システムの他の態様の開発を記載する。具体的には、出願人らは、トランス活性化ドメインとしてＢ４２酸性アクチベータードメインを含む本発明の遺伝子変調システムで用いる遺伝子発現カセットを構築した。Ｂ４２酸性アクチベータードメイン（「Ｂ４２ＡＤ」、Ｇｙｕｒｉｓら（１９９３）Ｃｅｌｌ  ７５：７９１−８０３）は酵母においてトランスアクチベーターとしてよく働き、出願人らが今回示したように、哺乳動物細胞においてよく働く。Ｂ４２酸性アクチベータードメインは、ＶＰ１６トランス活性化ドメインの代替物として本発明の遺伝子発現カセットで用いることができる。
【０２８７】
簡単に述べれば、出願人らは、実施例１に記載するごとく、ＬｍＵＳＰ−ＥＦドメイン（配列番号：９）をコードするポリヌクレオチドに融合したＢ４２ＡＤ（配列番号：３９）をコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子発現カセットを構築した。ＧＡＬ４：ＣｆＥｃＲ−ＣＤＥＦまたはＬｅｘＡ：ＣｆＥｃＲ−ＣＤＥＦ遺伝子発現カセットいずれかと協同して、このＢ４２ＡＤ：ＬｍＵＳＰ−ＥＦ遺伝子発現カセットを、マウスＮＩＨ３Ｔ３細胞で評価し、ＶＰ１６：ＬｍＵＳＰ−ＥＦ−ベースのスイッチと比較した。全ての遺伝子発現カセットは実施例１に記載するごとく調製した。適当なレポーター構築体をＮＩＨ３Ｔ３細胞にトランスフェクトした。０、０．１、１、５、１０および５０μＭのＧＳ（商標）−Ｅ非−ステロイドリガンドの存在下でトランスフェクトした細胞を前記したごとく４８時間培養した。レポーター活性を合計ＲＬＵとしてプロットする（図１２参照）。バーの頂部の数は、その組合せにつき観察された最大誘導倍数に対応する。
【０２８８】
結果は、Ｂ４２酸性活性化ドメインが出願人らの２−ハイブリッドシステムにおけるＶＰ１６トランス活性化ドメインと同様によく働くことを示し、これは、トランス活性化ドメインもまたこれらの遺伝子発現カセットにおいてポータブルであることを示す。
【実施例９】
【０２８９】
本実施例は、本発明のＥｃＲ／無脊椎動物ＲＸＲ−ベースの誘導性遺伝子発現変調システムを含む宿主細胞への第２のリガンドの導入の効果を示す。特に、出願人らは、非−ステロイド（ＧＳＥ）の存在下における、４８時間での、ＮＩＨ３Ｔ３細胞における、ｐＦＲＬｕｃと共にＧＡＬ４ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦ／ＶＰ１６ＬｍＵＳＰ−ＥＦ（スイッチ１．１８）遺伝子スイッチのトランス活性化ポテンシャルにおける９−シス−レチノイン酸の効果を測定した。
【０２９０】
簡単に述べれば、ＧＡＬ４ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦ、ｐＦＲＬｕｃおよびＶＰ１６ＬｍＵＳＰ−ＥＦをＮＩＨ３Ｔ３細胞にトランスフェクトし、トランスフェクトされた細胞を０、０．０４、０．２、１、５および２５μＭの非−ステロイドリガンド（ＧＳＥ）および０、１、５および２５μＭの９−シス−レチノイン酸（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）で処理した。リガンド添加から４８時間後、レポーター活性を測定した。
【０２９１】
図１３に示すごとく、レチノイン酸の存在は非−ステロイドリガンドに対するＣｆＥｃＲ−ＤＥＦの感受性を増加させた。１μＭ以下の非−ステロイドリガンド濃度においては、９−シス−レチノイン酸の不存在下では非常に小さな誘導しかないが、非−ステロイドに加えて１μＭの９−シス−レチノイン酸を添加した場合、誘導は大いに増加する。
【図１】
0005887301.tif 000005
【図２】
0005887301.tif 000006
【図３Ａ】
0005887301.tif 000007
【図３Ｂ】
0005887301.tif 000008
【図４】
0005887301.tif 000009
【図５】
0005887301.tif 000010
【図６】
0005887301.tif 000011
【図７】
0005887301.tif 000012
【図８】
0005887301.tif 000013
【図９】
0005887301.tif 000014
【図１０】
0005887301.tif 000015
【図１１】
0005887301.tif 000016
【図１２】
0005887301.tif 000017
【図１３】
0005887301.tif 000018
【配列表】
0005887301000001.app