(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗新生物活性及び抗血管新生活性を有する環状ペプチドであって、アミノ酸配列が、配列表中の配列番号１〜７６の配列として同定されたいずれかの配列からなることを特徴とする、環状ペプチド。
【請求項２】
癌療法のため又は望ましくない細胞増殖関連障害を治療するための医薬、或いは抗血管新生医薬を調製するための、請求項１に記載の環状ペプチドの使用。
【請求項３】
請求項１に記載のペプチドの少なくとも１種と賦形剤又は医薬として適切なビヒクルとを含む、医薬組成物。
【請求項４】
ペプチドが、徐放系及びナノバイオテクノロジーの分野に属する系の一部であることを特徴とする、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記徐放系がリポソームを形成し得る、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記徐放系がミクロスフェアを形成し得る、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記徐放系が、請求項１に記載のペプチドと一緒になって、自己アセンブリ構造を形成し得る、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項８】
半導体粒子、常磁性剤又は超常磁性剤及び放射性同位体からなる群から選択される薬剤をさらに含むことを特徴とする、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項９】
請求項１に記載のペプチドの少なくとも１種と画像化剤とを含み、画像化剤が、蛍光基、非蛍光基、半導体蛍光粒子、常磁性剤又は超常磁性剤及び放射性同位体からなる群から選択されることを特徴とする、癌診断のための化合物。
【請求項１０】
請求項１に記載のペプチドの少なくとも１種を、抗癌薬及びホルモンからなる群から選択される少なくとも１種の治療剤と共に含む医薬組合せ。
【請求項１１】
ペプチドが、共有結合によって治療剤に直接コンジュゲート化されていることを特徴とする、請求項１０に記載の組合せ。
【請求項１２】
ペプチドが、カップリング要素によって治療剤にコンジュゲート化されていることを特徴とする、請求項１０に記載の組合せ。
【請求項１３】
カップリング剤が、アミノ酸残基並びにヒドロカルビル及び置換ヒドロカルビルからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１２に記載の医薬組合せ。
【請求項１４】
請求項１に記載のペプチドの少なくとも１種と、プロジギオシン又はその誘導体とを含む、医薬組合せ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオテクノロジー及び医薬品産業の分野に関し、より正確には、腫瘍学的疾患又は望ましくない細胞増殖が関与する任意の他の病理の診断及び治療法のために意図される環状ペプチドを設計及び取得することに関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は、制御されない細胞の分裂及び成長を特徴とする疾患である。癌細胞は、元の臓器に浸潤し、血流及びリンパを介して遠位臓器へと広がり、そこに定着して成長する能力を獲得する。これは高度に異成分からなるプロセスであるが、全く異なる進化の２００を超える型の癌に共通している。この疾患を発症するには、いくつかの遺伝子が同時に変更される必要がある。これらの特性は全て、悪性疾患の機構を研究及び解明するための複雑性を増し、したがって、癌研究は、広い学際的な分野であり、いくつかの系統の調査を含んでいる。この疾患は、関連する世界中で第二位の死亡原因であり、２０２０年には第一位の死亡原因になると予測されており、心血管疾患よりもさらに命にかかわる（Ｆｏｒｔｅｚａ  Ｆ（２００４）Ａｖａｎｃｅｓ  ｍｅｄｉｃｏｓ  ｄｅ  Ｃｕｂａ．４０：３３）ので重大である。
【０００３】
実際、癌は既に、先進国において第一位の死亡原因であり、発展途上国において第二位の死亡原因である（Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ  Ｇｌｏｂａｌ  Ｂｕｒｄｅｎ  ｏｆ  Ｄｉｓｅａｓｅ：２００４  Ｕｐｄａｔｅ．Ｇｅｎｅｖａ：Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ；２００８）。その発生率は、加齢人口の増加に起因してこのところ上昇しており、癌易発性の生活習慣−運動不足、喫煙及び「欧米風の」食餌に起因して、さらにより頻繁である。
【０００４】
２００８年の、癌を有する生存患者１２．７百万人及び７．６百万人の死亡のＧＬＯＢＯＣＡＮ  ２００８において、それらのうち、患者の５６％及び死亡の６４％が、発展途上国で発生していると概算された（Ｆｅｒｌａｙ  Ｊ，Ｓｈｉｎ  ＨＲ，Ｂｒａｙ  Ｆ，Ｆｏｒｍａｎ  Ｄ，Ｍａｔｈｅｒｓ  ＣＤ，Ｐａｒｋｉｎ  Ｄ．ＧＬＯＢＯＣＡＮ  ２００８，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ  Ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ：ＩＡＲＣ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂａｓｅ  Ｎｏ．１０．Ｌｙｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ：Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｇｅｎｃｙ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ；ｈｔｔｐ：／／ｇｌｏｂｏｃａｎ．ｉａｒｃ．ｆｒ．２０１０から入手可能、８／１７／２０１０にアクセスした）。
【０００５】
既に利用可能であり癌治療のために最適化された細胞傷害薬にも関わらず、遅い診断並びに時宜に応じた適切な治療への限定的なアクセスの組合せにおそらくは起因して、癌生存は発展途上国ではかなり低い傾向がある。近い将来より効果的且つ安全になり、癌治療剤の市場に顕著に広がることができるようになる新世代の抗癌医薬を創出するために、新たな生物学的分子が必要とされている。
【０００６】
近年、効果的であるためには、癌治療は、種々の作用原理、例えば、腫瘍細胞に対する直接的な作用及び腫瘍環境に対する効果を組み合わせる必要があることが広く受け入れられている。これは、これらの特性のそれぞれを個別に有する分子又はこれらの特性の両方を同時に示す分子を組合せることによって達成され得る。疑いなく、薬理学的及び経済学的観点から、この後者の型の分子が有利である。腫瘍への酸素及び栄養分の供給を妨害することを意図した血管新生インヒビターを用いた前臨床試験は、非常に有望な結果を示しており、このインヒビターに対する抵抗性の非存在下で完全又は部分的な腫瘍退縮を達成することが多かった。今日まで、臨床試験における主な成果は、所与の期間にわたる疾患の持続的な補償であった。この目的のために、抗血管新生剤が、他の抗腫瘍剤と併用して補助療法として使用されている。
【０００７】
臨床試験の結果は、血管新生モジュレーターの単一の標的化では、持続的な阻害応答には不十分であるということを示している。確立された治療と比較した場合に、患者の寿命及び生活の質の顕著な増加を達成するために、腫瘍の成長を停止させ及びまた復帰させることが可能なより効果的な抗血管新生剤の需要が増加している。
【０００８】
現在利用可能なペプチドは、治療目的のために使用される無数の薬剤のうちのごく一部を占める。実際、ペプチドの潜在能力は、それらの構造、薬物動態、体内分布、安定性及び臨床適用を改変するための新技術の助けによって改善されている。特に、ペプチドは、それらを改変し、その抗癌効力を増加させるために利用可能な新規方法論に起因して、癌療法における妥当性を獲得している（Ｌｉ，Ｚｈｉ  Ｊ．；Ｃｈｏ，Ｃｈｉ  Ｈ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｅｓｉｇｎ，１６（１０），Ａｐｒｉｌ  ２０１０，ｐｐ．１１８０−１１８９）。
【０００９】
いくつかの研究により、癌の診断及び治療法のためにペプチドを使用することの手ごろ感が示されている。これらのいくつかは開発の後期臨床相にあり、他の新世代が、有望な前臨床結果を伴って近年出現してきている。
【００１０】
上皮成長因子レセプターに結合するように設計された溶解性ペプチドの細胞傷害活性が、いくつかのヒト癌細胞系において実証された。溶解性ペプチドの結合によって生じるコンフォメーション変化が、癌細胞膜への会合の選択性を増加させ、この獲得された相乗作用が、腫瘍細胞の選択的破壊を生じることが証明された。上皮成長因子レセプターに結合する溶解性ペプチドを用いた治療は、Ｋ−ｒａｓ変異を有する、チロシンキナーゼインヒビターに対して抵抗性の癌細胞に対して、インビトロで細胞傷害活性を示した（Ｋｏｈｎｏ，Ｍａｓａｙｕｋｉ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  ４７（５），ｐ．７７３，Ｍａｒ  ２０１１）。
【００１１】
細胞透過性ペプチドが、一般に、癌療法における有効性を増加させるために、オリゴヌクレオチドにカップリングされる。この目的のために、細胞透過性ペプチドは、細胞の核中に同時局在し、また膵臓癌細胞系及び前立腺癌細胞系によるその取り込みが実証されたＯｃｔ６  ＮＬＳのＮ末端に連結されたグルタミン酸ペプチドを含むように設計されている（Ｌｅｗｉｓ，Ｈ  Ｄａｎ．ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０（１），ｐ．７９，Ｏｃｔ  ２０１０）。
【００１２】
天然の抗凝固タンパク質である組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）由来のペプチド断片は、インビボモデルにおいて腫瘍の成長及び血管新生を遮断することができた。さらに、このペプチド断片は、正常なものに対する見かけの影響なしに、腫瘍転移及び新血管の成長を阻害した（ＨＥＭＢＲＯＵＧＨ  Ｔｏｄｄ  Ａ．；ＲＵＩＺ  Ｊｏｓｅ  Ｆ．；ＳＷＥＲＤＬＯＷ  Ｂｏｎｎｉｅ  Ｍ．；ＳＷＡＲＴＺ  Ｇｌｅｎｎ  Ｍ．；ＨＡＭＭＥＲＳ  Ｈａｎｓ  Ｊ．；ＺＨＡＮＧ  Ｌｉ；ＰＬＵＭ  Ｓｔａｃｙ  Ｍ．；ＷＩＬＬＩＡＭＳ  Ｍａｒｋ  Ｓ．；ＳＴＲＩＣＫＬＡＮＤ  Ｄｕｄｌｅｙ  Ｋ．；ＰＲＩＢＬＵＤＡ  Ｖｉｃｔｏｒ  Ｓ．Ｂｌｏｏｄ  Ａ．２００４，ｖｏｌ．１０３，ｎ°９，ｐｐ．３３７４−３３８０）。
【００１３】
種々の腫瘍の画像化及び治療のためのより選択的な薬剤の開発は、癌療法及び診断における最新の傾向である。この意味で、ペプチドは、所定の分子標的に結合するために取得又は設計され得る小さいアミノ酸配列であり、その機能を妨害することが潜在的に可能である。これらの特異的ペプチドは、癌の発症及び進行に必要な特定のシグナルの成分を阻害し得る。
【００１４】
セラリシンは、細菌セラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）ＣＭＩＢ４２０２の主要細胞外タンパク質であり、ヒトにおけるこの微生物の病原性に関連しており、原因となる抗腫瘍特性は、その触媒活性に依存している（Ｗｕ  Ｊｕｎ，Ａｋａｉｋｅ  Ｔ，Ｈａｙａｓｈｉｄａ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．９２：４３９−４５１）。この株（セラチア・マルセセンスＣＭＩＢ４２０２）において、最も豊富な細胞外タンパク質は、セラリシン（ＳＥＲＭＡ）のファミリーに属するｐ５０タンパク質である。このセラリシンのＣ末端非触媒ドメインを含むポリペプチド（ｐ２５と命名される）は、内皮増殖並びに原発性腫瘍及び転移のインビボでの成長の強力なインヒビターであることが公知である（Ａｂｒａｈａｎｔｅｓ−Ｐｅｒｅｚ  ＭＣ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｏｆ  ｓｅｒｒａｌｙｓｉｎｓ”．国際特許出願番号ＷＯ  ２００６／００５２６８）。このポリペプチドは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）において組換え発現した場合、ＣＩＧＢ３７０ｒと称した。
【００１５】
この疾患の発生率の増加に起因して、その目的のために利用可能な複数の薬物があるにもかかわらず、それを必要とする患者における現在の癌療法を置換又は補完するために、より強力な抗腫瘍剤を同定及び取得する大きな需要が存在する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明は、抗腫瘍特性及び抗血管新生特性を有する環状ペプチドを提供することによって、上述の問題の解決に寄与する。本明細書中では、これらのペプチド化合物の設計及び生成が扱われ、いくつかの癌動物モデルにおけるそれらの効力も実証されている。
【００１７】
驚くべきことに、セラチア・マルセセンスｐ２５ポリペプチドの抗腫瘍活性は、セラリシン（Ｓｅｒｒａｌｉｓｉｎｅ）のＮ末端ドメインとＣ末端ドメインとの間の界面に殆ど曝露されない、構造的に制約されたペプチド断片によって再現された。これは、ポリペプチドのその領域における構造的コンフォメーションが、セラリシン中に埋め込まれた、タンパク質自己触媒の間に又は一旦腫瘍タンパク質溶解環境になるとおそらく曝露される、ｐ２５ポリペプチドの最小の機能的に活性な構造単位であることを示唆している。示されたデータにより、本発明の制約されたペプチドが、腫瘍細胞に対する直接的な細胞傷害活性及び抗血管新生活性を有していることがもともと実証され、感染媒介性の腫瘍退縮についての可能性のある機構及び新たなパラダイムが示唆される。
【００１８】
ペプチドは非常に柔軟性のある分子であり、例えば、種々の構造を取り得る。可能性のある構造の１つ又は複数は、特定の生物学的に適切なものであり得る。可能性のある適切なコンフォメーションを決定するために、コンフォメーション空間の単一の領域中にペプチドを制限し、それが関連性のある形態であるかどうかをさらに決定する必要がある。最終的に、それらのコンフォメーションのいくつかをスクリーニングすることによって、生物学的に適切なものを見出すことが可能である。
【００１９】
より正確な合成構造を創出するための新規方法論が存在する。特定の柔軟性を考慮すべきである。即ち、設計された構造があまりに柔軟性がなさすぎる場合、僅かに柔軟性のある構造による調節が可能であることを考慮すると、インビボのその生物学的活性のために設計された特性を有する別の構造を取ることはできない。ペプチドレセプターに充分となるような要件、酵素の活性部位及び広範な種々の他の生物学的プロセスに関するかかる価値ある知識は、合成ペプチドを設計するための適切な技術及び方法論を使用して提供される。
【００２０】
生物学的系においてペプチドが示す特性は、ペプチド構造に依存する。したがって、有用なペプチドを生成するために合理的設計を使用する能力は、分子構造とその生物学的活性との間の特定の関連性を確立するためのそれぞれの技能に依存する。かかる関連性を認識するための技能は、生物学的アッセイ系からだけでなくデータ解釈からも生じる、いくつかの不確実性によって支持されている。関与するより複雑な因子は、ペプチド自体の３次元構造を決定することの困難さである。多くのペプチドは本質的に柔軟性があり、溶液中で広範なコンフォメーションを取る。全ての可能性のあるコンフォメーションのうちどれが観察されたペプチド活性を担うかを検出することに関して問題が存在し、多くのペプチドが、１つより多いコンフォメーションで活性である。コンフォメーション制約の使用は、かかる構造−機能の関連性を解明するために有用である。このペプチドが、非常に特定のコンフォメーション又は活性コンフォメーションのファミリーと密接に似たものに制限される場合、測定された活性は、その構造の影響を直接的に表す。完全に柔軟性のない分子を得ることができない場合でさえ、指示された構造モチーフを有するアナログを設計することによって、特定の生物学的活性をその原因構造に帰すると考えることを始めることができる。
【００２１】
本発明において、１０が重複する２０ａａの合成ペプチドを使用することによるｐ５０／ｐ２５タンパク質の配列内の機能的部位の物理的マッピング、及び腫瘍細胞に対するインビトロ細胞傷害活性についてのさらなる探索（例２を参照のこと）により、ペプチドＧｌｙ２５５−Ｓｅｒ２７４（Ｎ０６Ｐ８７）が活性であることが示された。それにもかかわらず、このペプチドのインビボ活性は、ｐ２５タンパク質が示すインビボ活性よりも低かった。さらに、ｐ２５に類似したＣＩＧＢ３７０ｒ組換えポリペプチド及びＮ０６Ｐ８７合成ペプチドの両方上の、Ａｌａ−Ａｌａ−ＡｌａトリペプチドによるＧｌｙ２６６−Ａｓｐ２６８セグメントの置換は、両方の分子の生物学的活性を破壊し、このセグメントが抗癌活性に必要であることを示している。さらに、この結果は、それぞれのペプチド上の三重変異のもっともらしい負の影響及び生物学的に活性なタンパク質コンフォメーションにも関わらず、未だ同定されていない（その）レセプター（単数又は複数）との相互作用のために残基Ａｒｇ２６７及びＡｓｐ２６８上の１つ又は複数の側鎖が必要とされることを示唆している。この意味で、トリペプチドの局所的な生物学的に適切な構造がｐ５０の結晶学的構造中のものと類似であると仮定した場合、ＡｌａによるＧｌｙ２６６の置換は、この残基上の主鎖がアラニンアミノ酸を禁じる正のねじれ角をとるので、非常に不利である（図１４）。さらに、例２に示される結果は、Ｇｌｙ２６６−Ａｓｐ２６８断片自体の存在では、生物学的効果を達成するのに不十分であり、他の残基も必要であることを示している。表２に示されるように、配列Ｔｈｒ２６５−Ｔｒｐ２８４を含み、１０残基が線状ペプチドＮ０６Ｐ８７（Ｇｌｙ２５５−Ｓｅｒ２７４）と重複している合成ペプチドＦ０７Ｐ１６は、Ｇｌｙ２６６−Ａｓｐ２６８配列を有しているにもかかわらず、不活性である。
【００２２】
本発明において、ｐ５０タンパク質の３Ｄ構造内のそのセグメントの隠れた性質に起因して、ｐ５０／ｐ２５の抗癌活性を担う機能的部位の一部としてのＧｌｙ２５５−Ｓｅｒ２７４の同定は驚くべきことである。残基Ｔｈｒ２５７、Ｔｙｒ２５８、Ｇｌｙ２５９、Ｐｈｅ２６０、Ｔｈｒ２６５、Ａｒｇ２６７、Ｐｈｅ２６９、Ｌｅｕ２７０及びＴｈｒ２７２を含む、Ｇｌｙ２５５−Ｓｅｒ２７４セグメント上の殆どのアミノ酸は、ｐ５０タンパク質の３Ｄ構造内に完全に又は部分的に遮蔽されている。ターンＡｒｇ２６７−Ｌｅｕ２７０は、タンパク質のＮ末端ドメインとＣ末端ドメインとの間の界面表面の一部である。残基Ａｒｇ２６７及びＡｓｐ２６８は、それぞれＮ末端ドメイン残基Ａｓｐ９８及びＡｒｇ１７１と共に、塩橋（それぞれ、二水素結合（ｄｏｕｂｌｅ  ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｂｒｉｄｇｅ））を形成する。この界面は、Ｃ末端ドメイン中のＰｈｅ２６９残基並びにＮ末端ドメイン中のＡｌａ２３２及びＡｌａ２３３残基が関与するドメイン間疎水性相互作用もまた含む。さらに、ｐ２５はＮ末端ドメインを欠き、そのＧｌｙ２５５−Ｓｅｒ２７４セグメントがより曝露されているので、この部位の隠れた性質は、ｐ５０と比較したｐ２５タンパク質のより高い潜在力と一致している（例３、図５及び表３を参照のこと）。
【００２３】
本発明において、Ｎ０６Ｐ８７ペプチドのコンフォメーションがその生物学的活性に必須であることが示された。その生物学的活性に対するＮ０３Ｐ８７ペプチドコンフォメーションの適切さは、その活性が分子の適切な折り畳みを保障する隣接領域に依存することを示す、例４中の結果によって支持されている。他方、ｐ２５ポリペプチドは、組換え発現された場合及びカルシウムの非存在下での再生後には、活性を示さなかった。したがって、カルシウム原子を欠くポリペプチドに対応する折り畳まれていない調製物は、活性を有さない（カルシウム結合は、適切なタンパク質の折り畳み及び安定化に必要である）。さらに例４において、Ｎ末端において１つのシステイン残基及びＣ末端においてもう１つのシステイン残基を付加することによる、Ｎ０６Ｐ８７ペプチド中のジスルフィド架橋の導入が、ペプチドの生物学的活性の喪失を促進することが示されている（表４中のペプチドＮ０６Ｐ８９、図７）。これらの手段によって導入された環化は、溶液中でペプチドにアクセス可能なコンフォメーション空間を減少させる；それにもかかわらず、環化は、ｐ５０折り畳み構造中のＧｌｙ２５５−Ｓｅｒ２７４セグメントがとるコンフォメーションとは相容れない。タンパク質の結晶学的構造上のＧｌｙ２５５−Ｓｅｒ２７４セグメントのアミン末端とカルボキシル末端との間の距離は２４．４Åの長さであり（図１０Ｅ）、これは、ジスルフィド架橋の立体化学と相容れない（カップリングされたシステイン間のα炭素−α炭素距離は、決して７Åを超えない）。したがって、この改変は、Ｎ０６Ｐ８７中のペプチド鎖の構造的特性における顕著な変更を前提とする。これらの結果及びそのそれぞれの分析は、Ｎ０６Ｐ８７の活性コンフォメーションが、ネイティブｐ２５ポリペプチド中のＧｌｙ２５５−Ｓｅｒ２７４セグメントの活性コンフォメーションと類似し得ることを示唆している。
【００２４】
例２、４及び６に示されるように、ｐ２５ポリペプチドの生物学的活性と類似したペプチドアナログを設計することは実現可能である。本発明において、Ｎ０６Ｐ８７ペプチドの構造に基づいた、ｐ２５ポリペプチドと類似又はさらに良好な効力及び潜在力の値をこれらのペプチドが示すことを可能にする特定の化学基及び／又は構造的制限を導入／置換する手段によって改変された、強力な短い及び中間のサイズのペプチド（９〜２５残基長）のファミリーの設計（表５）が示される。
【００２５】
それらの効力及び潜在力に加えて、本発明の短い及び中間のサイズのペプチドは、ネイティブの完全タンパク質と比較して、抗癌剤としてのいくつかの利点を有する。一般に、分子のサイズは、抗癌剤の薬物動態特性（例えば体内分布）に影響を与える。充分に報告された例は、そのそれぞれの抗体と比較した場合の組換え単鎖抗体（ｒ−ｓｃ−Ｆｖ）であり、前者は、完全抗体には殆どアクセスできない組織及び腫瘍へのより良好なアクセスを示す（Ｃｏｒｔｅｚ−Ｒｅｔａｍｏｚｏ  Ｖ，Ｂａｃｋｍａｎｎ  Ｎ，Ｓｅｎｔｅｒ  ＰＤ，Ｗｅｒｎｅｒｙ  Ｕ，Ｄｅ  Ｂａｅｔｓｅｌｉｅｒ  Ｐ，Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ  Ｓ，Ｒｅｖｅｔｓ  Ｈ；（２００４）．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６４（８）：２８５３−７）。
【００２６】
抗体療法は、固形腫瘍の治療に対して特に限定的な影響を有していた（Ｓｔｅｒｎ  Ｍ，Ｈｅｒｒｍａｎｎ  Ｒ；（２００５）．Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｏｎｃｏｌ  Ｈｅｍａｔｏｌ．５４（１）：１１−２９）。一般に、実験的証拠により、リガンドの薬物動態特性が、そのサイズを減少させることによって改善することが示される（Ｒｅｉｌｌｙ  Ｒ．Ｍ．，Ｓａｎｄｈｕ  Ｊ．，Ａｌｖａｒｅｚ−Ｄｉｅｚ  Ｔ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９５）．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．２８：１２６１４２）。短い及び中間のサイズのペプチド（典型的には１〜３ｋＤａ）は、抗体媒介性の抗癌療法が直面している合併症を少なくとも一部克服できる（Ｌａｄｎｅｒ  Ｒ．Ｃ．，Ｓａｔｏ  Ａ．Ｋ．，Ｇｏｒｚｅｌａｎｙ  Ｊ．，ｄｅ  Ｓｏｕｚａ  Ｍ．（２００４）．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ  ９：５２５５２９）。特に、ペプチドは、より良い腫瘍侵入を示し得、非特異的取り込みを低下させ得、より低い免疫応答を惹起し得る。したがって、本発明のペプチドは、それらのレセプターとの最適化された相互作用のために、及び顕著には効率的な体内分布を保障するために設計される。
【００２７】
通常、最大で２０〜２５残基長までの短い及び中間のサイズのペプチドは、異種タンパク質及び特にｐ２５などの微生物由来の抗原の場合とは異なって、免疫原性が低い。治療剤としてのかかるタンパク質の使用は、患者において免疫応答を生じ得、その後、タンパク質の治療効果を中和し得る抗体が誘導される。この効果は、治療剤の反復使用を必要とする慢性病を治療するのに特に適している。他方、微生物がヒトにとって病原体である場合、集団の一部は中和抗体を発生させており、この中和抗体は治療前に存在しており、必要な治療的用量を増加させ得るというのがもっともらしい。これに関して、Ｇｌｙ２５５−Ｓｅｒ２７４セグメントの分子表面のかなりの部分が、ｐ５０タンパク質のＮ末端ドメインとＣ末端ドメインとの間の界面内でかかわっており、したがって、タンパク質のネイティブ構造において隠れているからである。結果として、得られたＮ０６Ｐ８７ペプチドは、潜在的に免疫原性が低く、即ち、抗ｐ５０タンパク質抗体は、Ｎ０６Ｐ８７ペプチドを認識（中和）するにあたり効率的ではない。したがって、治療的分子の抗原性／免疫原性の可能性に関して、特にそのペプチドが天然タンパク質と類似の生物学的効果を促進することができる場合、完全タンパク質の代わりにペプチドを使用することがより好ましい。
【００２８】
本発明において強力な抗癌剤を設計するための重要な態様は、環状ペプチドの設計を含む、即ち、環状ペプチドは、Ｎ末端及びＣ末端において側鎖及び／又は基中に位置する化学基が関与する共有結合によってカップリングされたアミノ酸を有する。したがって、本明細書中で設計されるペプチドは、これらの分子の構造的柔軟性を顕著に低下させる環化によって、構造的に制約されている。一般に、治療剤としてのペプチドの使用は、いくつかの欠点を負わせる。これは、ペプチド、特に折り畳まれたタンパク質よりも柔軟性がかなり高い短い及び中間のサイズのペプチドの固有の柔軟性の場合に当てはまり、したがって、タンパク質又は他のレセプター巨大分子への結合のためのそのプロセスは、コンフォメーションエントロピーの顕著な喪失に関与する。この事実は、タンパク質−タンパク質相互作用の結合親和性よりも低い結合親和性を通例有する分子に寄与する。ペプチドが示すより低い親和性（及び結果としてより低い潜在力）は、タンパク質−レセプター接触表面が、特にペプチドがネイティブタンパク質の断片を含む場合、タンパク質−レセプター界面と比較して小さいという事実とも関連し得る。これらの理由で、ペプチドの再設計及び化学的改変が、レセプター結合に関するそれらの親和性（及び結果として潜在力）を増加させるために必要である。
【００２９】
抗血管新生効果及び腫瘍細胞に対する直接的な効果を示した、ｐ２５と命名された、感染媒介性の腫瘍退縮モデルから誘導されたポリペプチドが以前に同定されている（国際特許出願番号ＷＯ２００６／００５２６８）。本発明において、ｐ２５ポリペプチドの活性モチーフを模倣し、元の分子と比較していくつかの改善を示すペプチドに基づいたプラットフォームが開発された。細菌起源のネイティブポリペプチドは、癌などの慢性疾患に必要な長期治療を妨げる、その活性を中和し得る免疫応答の可能性のある誘導に起因して、癌を治療するために限定的な回数でしか適用できない。本発明において、その抗癌活性に似ているが腫瘍学的又は望ましくない細胞増殖病理の治療法のための長期投与の間に負の免疫応答を誘導できないｐ２５ポリペプチド中の最小の機能的に活性な単位を同定することによって、感染媒介性の腫瘍退縮から誘導された癌療法に有用な分子を生成することに研究の分野が焦点を当てている理由は、これである。
【課題を解決するための手段】
【００３０】
本発明の顕著な寄与は、感染媒介性の腫瘍退縮から誘導された抗腫瘍タンパク質の最小の機能的に活性な単位を構造的に模倣する、最大２５アミノ酸までのペプチド分子を開発することの実現可能性である。驚くべきことに、これらの小分子は、感染媒介性の腫瘍退縮のパラダイムであると以前にみなされていた免疫媒介性の機構によって腫瘍に対する活性を発揮することはない（Ｐａｇｌｉａ  Ｐ，ｙ  Ｇｕｚｍａｎ  ＣＡ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．１９９８．４６：８８−９２）。さらに、本発明の別の新規態様は、活性領域が、細菌タンパク質の曝露表面上に位置しないが、タンパク質が一旦酵素消化されると表在性となるということに関与している。このプロセスは、腫瘍細胞及び腫瘍関連血管新生に対する強い細胞傷害効果を生じさせる、メタロプロテイナーゼが豊富な腫瘍環境において生じ得る。これは、感染媒介性の腫瘍退縮に以前から帰せられている強力な抗腫瘍活性、癌療法に有用な、１世紀にわたる腫瘍学的治療における新規バイオテクノロジー的成果となり得る分子を予測する研究分野にも寄与し得る。本発明のペプチドは、それらの連続投与を制限し得る中和抗体の存在に関する証拠なしに長期治療においてインビトロ及びインビボで抗腫瘍効力を有することが示されているので、本明細書において、この仮説は妥当であることが実証されている。それらを得るために使用される技術は、拡大縮小が可能である。これらのペプチドの利点は特に以下である：
・種々の組織学的起源由来の腫瘍細胞に対する広いスペクトルの作用。
・腫瘍血管新生に対する直接的作用及び腫瘍細胞に対する直接的作用。
・ｐ５３非依存的な作用機構。
・ヒト転移から単離された細胞に対する細胞傷害効果及び結果としての抗転移効果。
・腫瘍細胞に対してアポトーシスを誘導する、及び増殖するように活性化された細胞に対して特異的である。
・全身経路又は腫瘍内経路のいずれかによる抗腫瘍効果。異種移植された腫瘍における成長速度の低下及び腫瘍保有動物の生存の延長。
・腫瘍セットにおける完全な腫瘍退縮。
・長期にわたる動物における反復注射の間の毒性の欠如。
・元の分子よりも高い分布容量を示す。
・体内分布プロフィールが、種々の病理の悪性腫瘍の治療を支持する。
・経済的に手ごろな生成技術。
・組換え技術によって得られる分子よりも実現可能性が高く、より早い医薬品開発。
【００３１】
本発明の対象は、抗新生物活性及び抗血管新生活性を有する環状ペプチドであって、
ａ）アミノ酸配列
Ｘ１−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｘ２−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｘ３−Ｘ４
［式中、
Ｘ１は、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ及び側鎖がスルフヒドリル官能基、アミノ基若しくはカルボキシル基を含んでいる非天然アミノ酸を含む群から選択されるアミノ酸、又はテトラペプチド、ペンタペプチド及びヘキサペプチドを含む群から選択される配列であり、
Ｘ２は、アミノ酸Ｇｌｙ又はＤ−Ａｌａであり、
Ｘ３は、Ｌｅｕ、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ及び側鎖が官能基スルフヒドリル、アミノ基又はカルボキシル基を含んでいる非天然アミノ酸を含む群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ４は、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ及び側鎖が官能基スルフヒドリル、アミノ基又はカルボキシル基を含んでいる非天然アミノ酸を含む群から選択され得る任意選択のアミノ酸である］
を有するセグメントと、
ｂ）任意選択の、ａ）に記載のセグメントの前にあるＮ末端セグメントであり、アミノ酸配列
Ｘ−５−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｘ−４−Ｘ−３−Ｘ−２−Ｘ−１
［式中、
Ｘ−１は、Ａｓｎ、Ｄ−Ａｓｐ、Ｄ−Ｇｌｕ、Ｄ−Ｇｌｎ及びＤ−Ａｌａを含む群から選択される、ペプチド結合によってａ）に記載のＸ１残基に連結されているアミノ酸であり、ペプチド結合は、ａ）に記載のセグメントのＸ１残基の主鎖上のカルボニル基及びＸ１残基の主鎖上のアミノ基を含んでおり、
Ｘ−２は、Ｐｈｅ、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ及び側鎖が官能基スルフヒドリル、アミノ基又はカルボキシル基を含んでいる非天然アミノ酸を含む群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ−３は、Ｇｌｙ及びＤ−Ａｌａを含む群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ−４は、Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ及び側鎖が官能基スルフヒドリル、アミノ基又はカルボキシル基を含んでいる非天然アミノ酸を含む群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ−５は、Ｇｌｙ及びＤ−Ａｌａを含む群から選択されるアミノ酸である］
を有するセグメントと、
ｃ）任意選択の、ａ）に記載のセグメントの後にあるＣ末端セグメントであって、アミノ酸配列が、Ｔｈｒ−Ｘ＋１Ｘ＋２、Ｔｈｒ−Ｘ＋１−Ｘ＋２−Ｘ＋３及びＴｈｒ−Ｘ＋１−Ｘ＋２−Ｘ＋３−Ｘ＋４
［式中、
Ｘ＋１は、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ及びＡｌａを含む群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ＋２は、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ及び側鎖に官能基スルフヒドリル、アミノ基又はカルボキシル基を含んでいる非天然アミノ酸を含む群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ＋３は、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ及び側鎖に官能基スルフヒドリル、アミノ基又はカルボキシル基を含んでいる非天然アミノ酸を含む群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ＋４は、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ａｓｎ及びＬｙｓを含む群から選択されるアミノ酸である］
を含む群から選択され、
前記Ｃ末端セグメント中のＮ末端Ｔｈｒ残基が、前記Ｎ末端Ｔｈｒ残基の主鎖上のアミノ基及びａ）に記載のセグメントのＸ４残基の主鎖上のカルボニル基を含むペプチド結合によって、ａ）に記載のセグメントに連結されている
セグメントと、
ｄ）少なくとも１つの共有結合であり、ａ）に記載のセグメントのＸ１配列がテトラペプチド、ペンタペプチド又はヘキサペプチドの配列である場合に存在するペプチドのＮ末端のアミノ基及びＣ末端カルボニル基によって形成されるペプチド結合；残基Ｘ１及びＸ４、若しくはＸ−４及びＸ３、若しくはＸ−２及びＸ＋２、若しくはＸ−２及びＸ＋３が、システイン若しくは側鎖がスルフヒドリル基を含んでいる非天然アミノ酸である場合、前記Ｘ１及びＸ４、若しくはＸ−４及びＸ３、若しくはＸ−２及びＸ＋２、若しくはＸ−２及びＸ＋３の側鎖中のスルフヒドリル基を含む共有結合ジスルフィド架橋；残基Ｘ１及びＸ４、若しくはＸ−４及びＸ３、若しくはＸ−２及びＸ＋２、若しくはＸ−２及びＸ＋３がＬｙｓ（又は側鎖がアミノ基を含んでいる非天然アミノ酸）及びＧｌｕ（又はＡｓｐ若しくは側鎖がカルボニル基を含んでいる非天然アミノ酸）である場合、又は前記残基がそれぞれＧｌｕ（又はＡｓｐ若しくは側鎖がカルボニル基を含んでいる非天然アミノ酸）及びＬｙｓ（又は側鎖がアミノ基を含んでいる非天然アミノ酸）である場合、前記Ｘ１及びＸ４、若しくはＸ−４及びＸ３、若しくはＸ−２及びＸ＋２、若しくはＸ−２及びＸ＋３の側鎖上のカルボニル基及びアミノ基を含むアミド結合；並びに前記ペプチドのカルボニル末端基及び残基Ｘ−２の側鎖上のアミノ基を含むアミド結合であって、Ｘ＋２が、前記ペプチドのカルボキシル末端において残基、Ａｓｎアミノ酸であり、Ｘ−２が、アミノ酸Ｌｙｓ又は側鎖がアミノ基を含んでいる非天然アミノ酸である場合に存在する、アミド結合、を含む群から選択される共有結合と
を含むアミノ酸配列を特徴とする上記環状ペプチドである。
【００３２】
本発明の好ましい実施形態において、環状ペプチドは、ペプチドのＮ末端のアミノ基とＣ末端のカルボニル基との間のペプチド結合を含み、ペプチドのＸ１配列はテトラペプチドのアミノ酸配列であり、前記配列は好ましくは、（Ｄ−Ｓｅｒ）−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ、（Ｄ−Ａｌａ）−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ及びＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏを含む群から選択される。
【００３３】
本発明の別の実施形態において、環状ペプチドは、ペプチドのＮ末端残基上のアミノ基とＣ末端残基上のカルボニル基との間のペプチド結合を含み、ペプチドのＸ１配列はペンタペプチドのアミノ酸配列であり、前記配列は好ましくは、Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ、Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−（Ｄ−Ａｌａ）−Ｓｅｒ、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ及びＬｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−（Ｄ−Ａｌａ）−Ｓｅｒを含む群から選択される。
【００３４】
本発明の別の実施形態において、環状ペプチドは、ペプチドのＮ末端上のアミノ基とＣ末端上のカルボニル基との間のペプチド結合を含み、ペプチドのＸ１配列はヘキサペプチドのアミノ酸配列であり、前記配列は好ましくは、Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−（Ｄ−Ａｌａ）−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ、Ａｒｇ−Ｐｒｏ−（Ｄ−Ａｌａ）−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ、Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−（Ｄ−Ａｌａ）−（ＢｍＧｌｎ）−（ＮｍＡｓｎ）−Ｓｅｒ及びＡｒｇ−Ｐｒｏ−（Ｄ−Ａｌａ）−（ＢｍＧｌｎ）−（ＮｍＡｓｎ）−Ｓｅｒを含む群から選択され、式中、ＢｍＧｌｎはアミノ酸Ｌ−ｂ−メチルグルタミンであり、ＮｍＡｓｎはアミノ酸Ｌ−Ｎ−メチルアスパラギンである。
【００３５】
本発明において、環状ペプチドは、アセチル基、ピログルタミン酸アミノ酸に、脂質又はポリマー、好ましくはポリエチレングリコールに共有結合したＮ末端を有し得、前記結合は、直接的に、又はスペーサー基、好ましくはアミノ酸Ｇｌｙを介して確立され得る。さらに、本発明の環状ペプチドは、アミド形態のＣ末端、又は脂質若しくはポリマー、好ましくはポリエチレングリコールに共有結合したＣ末端を有し得、前記結合は、直接的に、又はスペーサー、好ましくはアミノ酸Ｇｌｙを介して確立される。
【００３６】
本発明の別の実施形態において、環状ペプチドは、ペプチドと脂質若しくは任意のポリマー、好ましくはポリエチレングリコールとの間の共有結合を含み得、前記結合は、残基Ｘ１、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ−２、Ｘ−４、Ｘ＋２又はＸ＋３の側鎖上にスルフヒドリル基、アミノ基又はカルボキシル基を含み得、前記Ｘ１、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ−２、Ｘ−４、Ｘ＋２又はＸ＋３残基は、アミノ酸Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ又は側鎖が官能基スルフヒドリル、アミノ基若しくはカルボキシル基を含んでいる非天然アミノ酸である。
【００３７】
本発明の別の実施形態において、環状ペプチドは、Ｘ１、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ−２、Ｘ−４、Ｘ＋２又はＸ＋３残基が、アミノ酸システイン、（２Ｒ）−２−アミノ−３−スルファニルブタン酸、（２Ｒ）−２−アミノ−３−メチル−３−スルファニルブタン酸、（２Ｓ）−２−アミノ−４−スルファニルブタン酸、２−アミノ−５−スルファニル−ペンタン酸、２−アミノ−３−スルファニル−ペンタン酸、２−アミノ−４−メチル−３−スルファニルペンタン酸、２−アミノ−３−メチル−４−スルファニルペンタン酸、２−アミノ−３，４−ジメチル−３−スルファニル−ペンタン酸、２−アミノ−３−エチル−３−スルファニルペンタン酸、（２Ｒ）−２−アミノ−３−メチル−３−スルファニルペンタン酸、（４Ｓ）−４−アミノ−２−メチル−５−スルファニルペンタン酸、（４Ｒ）−４−アミノ−２−メチル−５−スルファニルペンタン酸、（４Ｒ）−４−アミノ−５−スルファニルペンタン酸及び（４Ｓ）−４−アミノ−５−スルファニルペンタン酸を含む群から選択されることを特徴とし得る。
【００３８】
本発明の別の実施形態において、環状ペプチドは、Ｘ１、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ−２、Ｘ−４、Ｘ＋２又はＸ＋３残基が、アミノ酸Ｌｙｓ、２−［ビス（３−アミノプロピル）アミノ］酢酸、（２Ｓ）−２，５−ジアミノペンタン酸、２，２−ジアミノ酢酸、（３Ｓ）−３，４−ジアミノブタン酸、（２Ｒ）−２，４−ジアミノブタン酸、（２Ｓ）−２，４−ジアミノブタン酸、（２Ｓ）−２，３−ジアミノプロパン酸、（２Ｒ）−２，３−ジアミノプロパン酸、２−［（２−アミノエチル）アミノ］酢酸、２−［（３−アミノプロピル）アミノ］酢酸、２−［（４−アミノブチル）アミノ］酢酸、（４Ｓ）−４，８−ジアミノオクタン酸、（２Ｓ）−２−アミノ−３−（４−アミノフェニル）プロパン酸、（２Ｓ）−２−アミノ−３−［４−（２−アミノエトキシ）フェニル］プロパン酸、２−（ピペリジン−４−イルアミノ）酢酸、（２Ｓ）−２−アミノ−４−［（５Ｒ）−２，２−ジメチル−１，３−オキサゾリジン−５−イル］ブタン酸、（２Ｓ）−２−アミノ−６−（メチルアミノ）ヘキサン酸、（２Ｒ，４Ｒ）−４−アミノピロリジン−２−カルボン酸又は（２Ｒ，４Ｓ）−４−アミノピロリジン−２−カルボン酸、２−（４−アミノピペリジン−４−イル）酢酸、４−アミノピペリジン−４−カルボン酸、（２Ｓ，４Ｒ）−４−アミノピロリジン−２−カルボン酸及びイミダゾリジン−２−カルボン酸を含む群から選択されることを特徴とし得る。
【００３９】
本発明の別の好ましい実施形態において、環状ペプチドは、Ｘ１、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ−２、Ｘ−４、Ｘ＋２又はＸ＋３残基が、アミノ酸Ｇｌｕ、Ａｓｐ、３−［（カルボキシメチル）アミノ］プロパン酸、２−［（カルボキシメチル）アミノ］酢酸、３−［（２−カルボキシエチル）アミノ］プロパン酸、（３Ｒ）−３−アミノヘキサン二酸、４−アミノヘプタン二酸、４−アミノピペリジン−１，４−ジカルボン酸、（２Ｓ，４Ｓ）−４−アミノピロリジン−２−カルボン酸、２−［（カルボキシメチル）アミノ］酢酸、（２Ｓ）−２−アミノ−６−［（カルボキシメチル）アミノ］ヘキサン酸、３−［（２−カルボキシエチル）アミノ］プロパン酸、（２Ｓ）−２−アミノヘプタン二酸、（２Ｓ）−２−アミノオクタン二酸、（２Ｒ）−２−アミノ−３−［（２−カルボキシエチル）スルファニル］プロパン酸、（２Ｒ）−２−アミノ−３−［（カルボキシメチル）スルファニル］プロパン酸、４−｛［（２Ｒ）−２−アミノ−２−カルボキシエチル］スルファニル｝ブタン酸及び（２Ｓ）−２−アミノ−３−［４−（カルボキシメトキシ）フェニル］プロパン酸を含む群から選択されることを特徴とし得る。
【００４０】
本発明の特定の実施形態において、抗腫瘍効果及び抗血管新生効果を有する環状ペプチドは、配列番号１〜７６の配列から選択されるアミノ酸配列を有する。
【００４１】
本発明の対象は、癌療法のため又は望ましくない細胞増殖関連障害を治療するための医薬、或いは抗血管新生医薬を調製するための、前記環状ペプチドの使用である。
【００４２】
本発明の別の実施形態は、癌、望ましくない細胞増殖関連障害及び望ましくない血管新生を治療する方法であって、本発明の環状ペプチドの少なくとも１種の有効量を含む医薬組成物を、それを必要とする個体に投与するステップを含む方法を含む。本発明のペプチドの少なくとも１種と賦形剤又は医薬として適切なビヒクルとを含む医薬組成物もまた、本発明の対象である。
【００４３】
本発明はまた、本発明のペプチドの少なくとも１種と画像化剤とを含む、癌診断のための化合物であって、前記画像化剤が、蛍光基、非蛍光基、半導体蛍光粒子、常磁性剤又は超常磁性剤及び放射性同位体を含む群から選択される化合物を提供する。
【００４４】
本発明の別の態様は、本発明のペプチドの少なくとも１種を、抗癌薬及びホルモンなどの少なくとも１種の治療剤と共に含む医薬組合せを含む。本発明の一実施形態では、この組合せにおいて、ペプチドは、共有結合によって治療剤に直接コンジュゲート化されている。別の場合には、ペプチドは、カップリング要素によって治療剤にコンジュゲート化されている。
【００４５】
本発明はまた、本発明のペプチドの少なくとも１種を、プロジギオシン又はその誘導体と組み合わせて含む医薬組合せを含む。かかる組合せを形成する要素は、それを必要とする個体に、医療的治療の過程内で、連続的に又は同時にのいずれかで投与され得る。
【００４６】
多くの医薬は、意図した治療効力を達成するために、非経口経路、例えば、静脈内注射、筋内又は皮下経路によって投与される必要がある。いくつかの治療剤について、徐放性ビヒクルの使用は、薬物の効力及び患者の満足度を増加させ得る。分子の自己アセンブリが、治療剤のカプセル化及び徐放のための材料を操作するために、近年調査されている。ペプチド及びポリマーに基づく自己アセンブリ材料プラットフォームの設計は、大きく進歩している（Ｍｏｎｉｃａ  Ｃ．Ｂｒａｎｃｏ  ａ，ｂ，Ｊｏｅｌ  Ｐ．Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ．Ａｃｔａ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｉａ  ５（２００９）８１７−８３１）。本発明のペプチドのいくつか、例えばＪ０８Ｐ４８は、自己アセンブリを可能にする両親媒性の特性を有しており、したがって、治療分子のための又はナノテクノロジーの分野における徐放系の一部である。したがって、本発明の対象は、癌に対する併用療法のための医薬としてのこれらのペプチドの徐放のためのリポソーム又はミクロスフェアの形態の新規カプセル化製剤である。目的の診断−治療部位のための制御された標的化系との、又は特異的様式でこれらの活性を自身が発揮するナノ粒子化複合体もまたそうである。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】種々の組織学的起源由来の腫瘍細胞に対するＮ０６Ｐ８７ペプチドの細胞傷害活性を示す図である。Ａ：Ｃｏｌｏ  ２０５細胞；Ｂ：ＨＥｐ−２細胞。ＣＩＧＢ３７０ｒポリペプチド及びシスプラチンを、抗腫瘍剤のポジティブコントロールとして使用した。
【図２】非小細胞肺癌細胞系Ａ５４９（Ａ）及び結腸癌細胞系（Ｂ）に対するＮ０６Ｐ８７の細胞傷害活性を示す図である。ライブラリーの他のペプチドは、Ａ５４９細胞系の増殖に対する影響を評価したときには、活性を示さなかった。
【図３】ヒト腫瘍細胞系Ｍ１４（Ａ）及びＬｓ１７４Ｔ（Ｂ）に対する、研究対象ライブラリー由来のいくつかのペプチドの活性を評価するためのアッセイを示す図である。両方のアッセイにおいて、ＣＩＧＢ３７０ｒポリペプチドをポジティブコントロールとして使用した。
【図４】黒色腫細胞系Ｍ１４に対するＥ０７Ｐ０４ペプチドの細胞傷害活性を示す図である。ＣＩＧＢ３７０ｒポリペプチドをアッセイのポジティブコントロールとして使用した。
【図５】ネイティブタンパク質（１ｓｒｐ）と比較した、主要セラチアプロテアーゼのＮ末端（１ｓｒｐＮ）ドメイン及びＣ末端（１ｓｒｐＣ）ドメインの表面の露出度（ａｃｃｅｓｉｂｉｌｉｔｙ）計算を示す図である。
【図６】２０アミノ酸（ａａ）のリーダーペプチドＮ０６Ｐ８７に隣接する配列を示す図である。
【図７】ヒト黒色腫細胞に対する細胞傷害活性を示す図である。リーダーペプチドＮ０６Ｐ８７は、５０μＭの濃度で細胞増殖を阻害することができる唯一のペプチドであった。
【図８】元の分子と比較した、ｐ２５ポリペプチド由来の線状ペプチドＮ０６Ｐ８７の抗腫瘍能の評価を示す図である。投与スケジュール（Ａ）；腫瘍体積を測定することによって評価した抗腫瘍効果（Ｂ）；及び接種マウスの生存によって評価した抗腫瘍効果（Ｃ）。使用したモデル：ＮＩＨ胸腺欠損マウス中に移植されたヒト結腸癌Ｌｓ１７４Ｔ細胞系。
【図９】セグメントＧｌｙ２５５−Ｓｅｒ２７４（Ｎ０６Ｐ８７線状ペプチド）上の機能的領域の規定を示す図である。ペプチドの一次的セグメントは、二次的なＮ末端セグメント及びＣ末端セグメントが隣接する中心領域である。
【図１０】ｐ５０タンパク質のＧｌｙ２５５−Ｓｅｒ２７４セグメントから設計した、本発明の環状ペプチドＪ０８Ｐ４８ｓ−ｓ、Ａ０８Ｐ２８ｓ−ｓ、Ａ０８Ｐ２５ｓ−ｓ、Ｊ０８Ｐ４６ｓ−ｓ及び線状ペプチドＮ０６Ｐ８７のモデリングを示す図である。パターンとしてｐ５０タンパク質の結晶学的構造を使用することによって、ＭＯＤＥＬＬＥＲソフトウェアの助けでモデルを得た。ＭＯＤＩＰ法によって以前に同定された位置においてジスルフィド架橋を導入した。ペプチドのＮ末端とＣ末端との間の距離を示す、Ａ：ｐ５０タンパク質上のＧｌｙ２５５−Ｓｅｒ２７４セグメントの３次元（３Ｄ）構造に従う、Ｎ０６Ｐ８７（線状ペプチド）のモデリング；Ｂ：Ｊ０８Ｐ４８ｓ−ｓペプチドのモデリング；Ｃ：Ａ０８Ｐ２８ｓ−ｓペプチドのモデリング；Ｄ：Ａ０８Ｐ２５ｓ−ｓペプチドのモデリング；Ｅ：Ｊ０８Ｐ４６ｓ−ｓペプチドのモデリング。
【図１１】表５中の環状ペプチド３３の構造モデリングを示す図である。リシン７は、カルボニル末端基とアミド結合を形成する。
【図１２】表５中の環状ペプチド６９の構造モデリングの立体視画像を示す図である。一次的セグメントＡｓｎ２６４−Ｓｅｒ２７１は、ヘキサペプチドコネクターＡｒｇ−Ｐｒｏ−（ｄＡｌａ）−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｓｅｒによって環化されている。残基ｄＡｌａはＤ−Ａｌａ立体異性体である。
【図１３】表５上の環状ペプチド７６の構造モデリングの立体視画像を示す図である。一次的セグメントＡｓｎ２６４−Ｓｅｒ２７１は、ペンタペプチドコネクターＡｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ（下線付き残基）によって環化されている。
【図１４】ｐ５０タンパク質のセグメントＧｌｙ２５５−Ｓｅｒ２７４の３Ｄ構造に対応するラマチャンドランダイアグラムを示す図である。
【図１５】本発明の設計された環状ペプチドについての化学構造の概略図を示す図である。線は共有結合の存在を示す。ペプチドの２つの残基を接続する場合、線は、それらの残基が環化されていること、即ち、共有結合していることを示す。ペプチドの配列の上に位置する線は、主鎖の環化に対応し、下に位置する線は、少なくとも１つの側鎖が関与する環化のための結合を示す。線がＸｉ残基に向けられている場合、これは、共有結合がＸｉ残基の側鎖によって生成されていることを意味する。線が２つの残基間のダッシュ記号において始まっている場合、これは、それぞれダッシュ記号の後ろ又は前の残基のアミノ基又はカルボニル基が共有結合に関与していることを意味する。Ｘ１の前のダッシュ記号を指している線は、Ｘ１残基のアミノ基を含むアミド共有結合を示しており、この場合、ペプチドは二次的Ｎ末端を有さない。Ｘ４及びＸ＋２の後ろの線は、Ｘ４及びＸ＋２のカルボニル基を含む共有結合を示し、Ｘ４の後ろの二次的Ｃ末端の非存在をさらに示しており、且つその残基がＸ＋２の後ろのペプチドのカルボキシル末端であることを示している。中括弧内に、共有結合に関与する基及び結合の型：アミド結合又はジスルフィド架橋を示しており、ペプチドコネクターに好ましい配列もまた示している。ペプチド配列上の影付の領域は、本発明において規定される機能的セグメントのＮ末端からＣ末端までの順序を示す：（ａ）二次的末端セグメント、（ｂ）一次的セグメント及び（ｃ）二次的Ｃ末端セグメント。三角形Ｐは、ポリマー又は他の化学基に共有結合することによって改変され得る部位を示しており、かかる改変は、関与する主鎖上の残基又は基が環化結合に関与しない場合に実現可能である。ペプチドは、１つ又は複数の環化結合、並びに１つ又は複数のポリマー改変及び／若しくは化学基を有し得る。置換位置Ｘ−４、Ｘ−２、Ｘ１、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ＋２及びＸ＋３をおそらく占有する、図中で言及されるアミノ酸アナログは、側鎖がアミノ基又はカルボキシル基又はスルフヒドリル基を含んでいるアミノ酸である。
【図１６】ｐ２５ポリペプチド由来の最適化環状ペプチドが、治療した動物の生存を増加させることを示す図である。皮下ＴＣ−１腫瘍を有する動物に、単一用量の８０μＭを腫瘍内経路（ｉ．ｔ．）で注射した。各群は、異なるペプチド又はＣＩＧＢ３７０ｒポリペプチド若しくは賦形剤を受けた。生存を全ての群について示す。
【図１７】ｐ２５ポリペプチド由来の最適化環状ペプチドが、投与経路に関係なく治療した動物の生存を増加させることを示す図である。皮下ＴＣ−１腫瘍を有する動物に、単一用量の８０μＭを腫瘍内（ｉ．ｔ．）経路又は腹腔内（ｉ．ｐ．）経路で注射した。各群は、異なるペプチド又はＣＩＧＢ３７０ｒポリペプチド若しくは賦形剤を受けた。生存を全ての群について示す。
【図１８】種々の組織学的起源由来のヒト腫瘍細胞系に対するＪ０８Ｐ４８ｓ−ｓのインビトロ生物学的活性を示す図である。
【図１９】ｐ２５ポリペプチド由来の最適化環状ペプチドが、線状ペプチドで治療した動物において抗腫瘍活性及び生存を増加させること、及びその活性が、ＣＩＧＢ３７０ｒポリペプチドの活性と類似していることを示す図である。（Ａ）投与スケジュール；（Ｂ）腫瘍体積を測定することによって評価した抗腫瘍効果（Ｂ）；及び接種マウスの生存によって評価した抗腫瘍効果（Ｃ）。モデル：ＮＩＨ胸腺欠損マウス中に移植されたヒト結腸癌Ｌｓ１７４Ｔ。
【図２０】マトリゲル中の内皮細胞の細胞分化に対する、本発明の２種の環状ペプチドの影響を示す図である。ＨＭＥＣ細胞を、本発明の２種の環状ペプチド又は賦形剤の存在下で、活性化条件（１０ｎｇ／ｍＬ  ＥＧＦ、１μｇ／ｍＬ  ヒドロコルチゾン）下で培養した。これらのペプチドは、増殖のために活性化された内皮細胞による管状構造の形成を阻害でき、これはペプチドの抗血管新生活性を証明しているが、賦形剤はかかる管状構造の形成を許した。
【図２１】その自己アセンブリに有利な条件下での、本発明の環状ペプチドの顕微鏡写真を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
例及びデータは、医薬上の潜在的可能性が証明された（Ａｂｒａｈａｎｔｅｓ−Ｐｅｒｅｚ  ＭＣ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｏｆ  ｓｅｒｒａｌｙｓｉｎｓ”．国際特許出願番号ＷＯ  ２００６／００５２６８）、ｐ２５と命名されたＰＲＺＮ＿ＳＥＲＭＡセラリシン（Ｂｒａｕｎａｇｅｌ  ＳＣ，ａｎｄ  Ｂｅｎｅｄｉｋ  ＭＪ（１９９０）．Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２２：４４６−４５１）のＣ末端に対応するポリペプチドの線状合成ペプチドのライブラリー及び三次構造から出発して環状ペプチドを得ることに関するいくつかの態様及び特性を示す。
【００４９】
以下に示す例は、これらのペプチド由来の最適化された分子及び／又は誘導体の使用を含む、本発明の化合物及び／又は方法に関する。当該分野の以前の状況と比較して、本明細書中に示される化合物及び方法は、驚くべき挑戦的な予測を提供する。本発明の有用性は、医薬品分野においてこれらの化合物を使用することによって示される。これらの化合物は、当該技術分野における当業者が知る他の化合物と比較して、利点を有する。
【実施例】
【００５０】
（例１）ｐ２５ポリペプチド由来の線状ペプチドのライブラリーの設計及び合成。
ｐ２５ポリペプチドの最小の機能的に活性な単位を同定することを目的とし（Ａｂｒａｈａｎｔｅｓ−Ｐｅｒｅｚ  ＭＣ  ｙ  ｃｏｌ．，“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｏｆ  ｓｅｒｒａｌｙｓｉｎｓ”．国際特許出願番号ＷＯ  ２００６／００５２６８）、癌治療のための改善された薬理学的特性及び薬力学的特性を有する領域から新たな分子を生成するために、１０が重複した２０アミノ酸（ａａ）の線状ペプチドを設計した。これは、１０〜２０ａａの一次配列中に含まれる活性領域の同定を示している。表１は、合成及び精製された各ペプチドの一次配列、その生成コード及びその分子量を示す。最終ペプチド調製物の分子量は、質量分析によって確認した。
【表１】
0006032854.tif 000002
【００５１】
Ｆｍｏｃ／ｔＢｕストラテジー（Ｂａｒａｎｙ，Ｇ．ａｎｄ  Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｒ．Ｂ．Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．９９（１９７７）７３６３−７３６５）を使用して、Ｆｍｏｃ−ＡＭ−ＭＢＨＡ樹脂上の固相においてペプチドを合成した。アミノ酸を、ＤＩＣ／ＨＯＢｔ媒介性の活性化法によってカップリングさせ、カップリング反応の完全性をニンヒドリンアッセイによって確認した（Ｋａｉｓｅｒ，Ｅ．，Ｃｏｌｅｓｃｏｔｔ，Ｒ．Ｌ．，Ｂｏｓｓｉｎｇｅｒ，Ｃ．Ｄ．，Ｃｏｏｋ，Ｐ．Ｉ．Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．３４（１９７０）５９５−５９８）。ペプチドを、ＴＦＡ／ＥＤＴ／Ｈ２Ｏ／ＴＩＳ（９４％／２．５％／２．５％／１％）溶液を用いて樹脂から脱離させ、さらに、エーテル沈殿させ、７２時間凍結乾燥させた。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）による酸化を介してジスルフィド架橋を形成することによって環化を達成し（Ａｎｄｒｅｕ，Ｄ．，Ａｌｂｅｒｉｃｉｏ，Ｆ．，Ｓｏｌｅ，Ｎ．Ａ．，Ｍｕｎｓｏｎ，Ｍ．Ｃ．，Ｆｅｒｒｅｒ，Ｍ．ａｎｄ  Ｂａｒａｎｙ，Ｇ．，Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ，Ｍ．Ｗ．ａｎｄ  Ｄｕｎｎ，Ｂ．Ｍ．（Ｅｄｓ），Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，１９９４，ｐｐ．９１−１６９）、ペプチドを、ＲＰ−ＨＰＬＣによってさらに精製した。収集した画分を、分析的ＲＰ−ＨＰＬＣによって独立して分析し、各ペプチドの最終調製物を、９９％を超える純度を示すそれぞれの画分全てをプールすることによって形成した。
【００５２】
（例２）腫瘍細胞に対するインビトロの細胞傷害活性に基づいた、ｐ２５ポリペプチド由来の合成ペプチドのライブラリーからの一次配列の選択。
腫瘍細胞に対する、ｐ２５ポリペプチド由来の合成ペプチドライブラリーの細胞傷害活性を、スルホローダミンＢ（ＳＲＢ）法（Ｓｋｅｈａｎ  Ｐ，Ｓｔｏｒｅｎｇ  Ｒ，Ｓｃｕｄｉｅｒｏ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８２：１１０７−１１１２；Ｍｏｎｋｓ  Ａ，Ｓｃｕｄｉｅｒｏ  Ｄ，Ｓｋｅｈａｎ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）．Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８３：７５７−６６；Ｔｅｓｅｉ  Ａ，Ｕｌｉｖｉ  Ｐ，Ｆａｂｂｒｉ  Ｆ，ｅｔ  ａｌ．，（２００５）．Ｊ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．３：７）によって決定した。ネガティブコントロール細胞を、実験サンプルと同じ容量のビヒクル上で培養した。「ｘ−ｙ」曲線（用量反応）を、ネガティブコントロール細胞に対して比較した生存細胞のパーセントを用いて確立し、以下のパラメータを概算した：５０％成長阻害（ＧＩ５０）；総成長阻害（ＴＧＩ）；及び５０％の細胞死を引き起こす濃度である致死濃度５０（ＬＣ５０）（Ｂｏｙｄ  ＭＲ，Ｐａｕｌｌ  ＫＤ，ａｎｄ  Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ  ＬＲ（１９９２）“Ｄａｔａ  ｄｉｓｐｌａｙ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ＮＣＩ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｏｒｉｅｎｔｅｄ  インビトロ  Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｓｃｒｅｅｎ，ｉｎ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇｓ：Ｍｏｄｅｌｓ  ａｎｄ  Ｃｏｎｃｅｐｔ  ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ”（Ｂａｌｅｒｉｏｔｅ  ＦＡ，Ｃｏｒｂｅｔｔ  ＴＨ  ａｎｄ  Ｂａｋｅｒ  ＬＨ  ｅｄｓ）ｐｐ  １１−３４，Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉａ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｂｏｓｔｏｎ）。
【００５３】
用量依存的様式で細胞増殖の５０％を阻害でき、研究した細胞系の少なくとも１つにおいて、１００μＭを下回るＧＩ５０値を示すことができる全てのペプチドを、細胞傷害性ペプチドとみなした。使用したヒト腫瘍細胞系は以下であった：ＨＥｐ−２（喉頭癌腫）、Ａ５４９（肺上皮腺癌）、Ｍ１４（黒色腫）、Ｃｏｌｏ  ２０５（結腸腺癌）、Ｌｓ１７４Ｔ（結腸腺癌）、ＬｎＣＡＰ（前立腺癌腫）、ＰＣ−３（前立腺癌腫）及びＨ１２５（非小細胞肺腺癌）。このペプチドスクリーニングの結果を表２に示す。設計されたペプチドの一次配列、その生成に使用したコード、及びヒト腫瘍細胞に対するそれぞれの細胞傷害能が示される。
【表２】
0006032854.tif 000003
【００５４】
ペプチドＧＤＴＶＹＧＦＮＳＮＴＧＲＤＦＬＳＴＴＳ−アミド（コードＮ０６Ｐ８７／Ｊ０７Ｐ７３）は、いくつかの腫瘍細胞系についてポジティブ（＋）であったが、ヒト黒色腫Ｍ１４細胞系に対して活性を示したのはペプチドＮＡＳＳＮＶＴＤＬＳＶＮＩＧＧＨＱＡＰＤ−アミド（コードＥ０２Ｐ０４）だけであった。残りのペプチドはネガティブ（−）とみなした。
【００５５】
図１及び２は、Ｃｏｌｏ  ２０５、ＨＥｐ−２、Ａ５４９及びＬｓ１７４Ｔ細胞系からの、多様な組織学的起源のヒト腫瘍細胞の増殖を阻害するＮ０６Ｐ８７の潜在的可能性を示している。ＧＩ５０は、全ての場合について１００μＭを下回った。ＨＥｐ−２喉頭癌腫の場合、２バッチのシスプラチンをポジティブコントロールとして使用した。これは、喉頭癌治療の市場において入手可能な第一選択の製品である。このアッセイにおいて、その有用性を、この型の病理及びまたアッセイの妥当性において実証した。
【００５６】
ヒトＭ１４及びＬｓ１７４Ｔ腫瘍細胞系に対する、表１中のライブラリー由来のいくつかのペプチドの効果の評価からの結果を、図３中に示す。このパネルのペプチドは、アッセイした細胞系に対して細胞増殖を阻害することができなかった。
【００５７】
図４に示すように、Ｎ０６Ｐ８７ペプチドにわたる領域に加えて、Ｅ０７Ｐ０４ペプチドがコードする２０ａａ領域（表１）は細胞傷害活性を示したが、それはＭ１４細胞系に対してだけであって、１００μＭより高いＧＩ５０であった。
【００５８】
表２は、腫瘍細胞に対する細胞傷害活性についてのペプチドスクリーニングの結果を全てまとめており、セラリシンＰＲＺＮ＿ＳＥＲＭＡのＣ末端ドメイン上のＧｌｙ２５５−Ｓｅｒ２７４領域を含み、ｐ２５ポリペプチドのＮ末端領域に位置するＧＤＴＶＹＧＦＮＳＮＴＧＲＤＦＬＳＴＴＳ−アミドペプチドが、多様な組織学的起源の腫瘍細胞系に対して活性であり、元のｐ２５分子が示す広いスペクトルの細胞傷害活性を再現することを証明している。これらは全て、本明細書中で細胞傷害性であると同定されたペプチドが、癌に対する薬理学的適用のためにさらに最適化される、ｐ２５ポリペプチド上の最小の構造的に活性な配列とみなされ得ることを示唆している。
【００５９】
（例３）ｐ５０タンパク質残基の溶液中での曝露に対する、Ｎ末端ドメイン除去の影響
セラリシン（例えば、セラリシンＰＲＺＮ＿ＳＥＲＭＡ）のＣ末端領域が、自己触媒、臭化シアンによる化学的消化によってタンパク質のＮ末端から切断されると、又は大腸菌においてＣ末端を発現させることによって、腫瘍細胞に対する細胞傷害活性の殆どを担うことが、周知である（国際特許出願番号ＷＯ  ２００６／００５２６８）。セラリシンのＣ末端領域中の最小の機能的に活性な単位は、タンパク質のＮ末端から分離されると、腫瘍細胞に対する露出度を促進していることが示唆された。したがって、ネイティブタンパク質のＮ末端とＣ末端とを開裂させた後にその溶媒露出表面を媒介するタンパク質残基を同定すること、また、Ｇｌｙ２５５−Ｓｅｒ２７４（Ｎ０６Ｐ８７）ペプチドがかかる残基を有するか否かを実証することを決定した。この仮説を試験するために、露出度計算を、主要セラチアプロテアーゼのＮ末端及びＣ末端の表面について行った（Ｈａｍａｄａ  Ｋ，Ｈａｔａ  Ｙ，Ｋａｔｓｕｙａ  Ｙ，Ｈｉｒａｍａｔｓｕ  Ｈ，Ｆｕｊｉｗａｒａ  Ｔ，Ｋａｔｓｕｂｅ  Ｙ．（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１９：８４４−８５１）。
【００６０】
セラチアプロテアーゼのタンパク質分解消化が両方の分子を生成するとアクセス可能となるＮ末端ドメイン及びＣ末端ドメインの内側部分におけるアミノ酸領域を同定した。残基についての露出表面計算を、ＤＳＳＰソフトウェアを用いて行った（Ｋａｂｓｃｈ  Ｗ，Ｓａｎｄｅｒ  Ｃ．１９８３．Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２２：２５７７−２６３７）。残基についての露出度値はオングストローム（Å２）で示した。図５に示すように、露出度値における主要な差異は、主要セラチアプロテアーゼのＮ末端タンパク質分解ドメイン中のＣ末端領域に位置するアミノ酸（Ｇｌｎ２１０、Ｐｈｅ２１１、Ａｓｎ２２６、Ｈｉｓ２２９、Ｌｅｕ２３６、Ｉｌｅ２３９、Ｓｅｒ２５１）及びＣ末端非タンパク質分解ドメイン中のＮ末端領域（Ｔｈｒ２５２、Ｐｈｅ２６９、Ｉｌｅ２８０、Ｔｒｐ２８４、Ａｒｇ３０２及びＰｈｅ３１０）に対応していた。露出度値における最も有意な変化を示す残基を表３に示す。
【表３】
0006032854.tif 000004
【００６１】
ネイティブタンパク質（１ｒｐ）と比較した、セラチアの主要プロテアーゼのＮ末端（１ｓｒｐＮ）及びＣ末端（１ｓｒｐＣ）の表面の露出度計算。残基を、曝露における差異の値に従って順序付けた（順序の欄）。増加した曝露についての最も高い値を示す６４個の残基を示している。
【００６２】
残基対Ａｓｐ９８及びＡｒｇ２６７、並びにＡｓｐ２２５及びＬｙｓ３１７は、Ｎ末端ドメインとＣ末端ドメインとの間の２つのジスルフィド架橋を確立している。さらに、これらの残基は、露出度値における７８．２Å２の平均的な差異を示す。主要セラチアプロテアーゼのタンパク質分解性Ｎ末端及び非タンパク質分解性Ｃ末端についての露出度値における平均的な差異は、それぞれ５．１±１５．４Å２及び７．１±２０．１Å２であった。他の適切な位置は、Ｉｌｅ２２、Ａｓｎ３２、Ｇｌｎ９４及びＡｒｇ１７１であった。これまでのところ、これらの残基に帰せられた生物学的活性は存在しない。
【００６３】
対照的に、Ｎ末端タンパク質分解性ドメイン中のαヘリックスＥに位置する活性部位残基（Ｈｉｓ１７６、Ｇｌｕ１７７及びＨｉｓ１８０）も、亜鉛結合モチーフＨＥＸＸＨＸＸＧＸＸＨ中に含まれるＧｌｙ１８３残基及びＨｉｓ１８６残基も、それぞれの露出度値において変化を示さなかった。これらのデータは、実験結果と一致しており、ｐ５０タンパク質（セラリシンのファミリーに属する）の細胞傷害活性が、そのタンパク質分解活性に依存しておらず、タンパク質分解性ドメインから一旦切断されるとその溶媒露出度を増加させる非タンパク質分解性Ｃ末端領域に関連していることを、効率的に実証している。他方、Ｇｌｙ２５５−Ｓｅｒ２７４セグメント（ペプチドＮ０６Ｐ８７）は、特に最も高い１４の値の中で、曝露における最も高い増加を示す残基のうちの３つの残基（Ａｒｇ２６７、Ａｓｐ２６８及びＰｈｅ２６９）を有しており（表３）、これは、抗腫瘍活性を担うｐ２５タンパク質内の構造的に機能的な単位としてのこのセグメントの見かけの役割をさらに支持している。
【００６４】
（例４）Ｎ０６Ｐ８７ペプチドのＧｌｙ２５５−Ｓｅｒ２７４セグメントに対する改変
例１で示されたペプチドライブラリーは、ｐ２５ポリペプチドのＮ末端から開始して、１０ａａが重複した２０ａａ長のセグメントを含んでいる。この設計は、スクリーニングの細胞傷害活性対象に関する１０ａａの線状領域を同定することを目的として確立した。しかし、重複した１０ａａは、別の背景（図６、ペプチドＥ０７Ｐ０６及びＦ０７Ｐ１６）において、細胞傷害活性を示さなかったＮ０６Ｐ８７（表２）に含まれた。このことは、Ｇｌｙ２５５−Ｓｅｒ２７４領域を含む２０ａａ（ペプチドＮ０６Ｐ８７）が、腫瘍細胞との相互作用のためのモチーフの正しい曝露又は活性部位に隣接する二次的相互作用のための適切な位置を確立するため、潜在的なレセプターに結合するそれらの親和性及び／或いは特異性をこの手段によって増加させるために必要であることを示唆している。この基準を考慮して、細胞傷害活性  対  腫瘍細胞に対する可能な影響を評価するため、及びさらなる最適化のためのＮ０６Ｐ８７ペプチドの部分的特徴付けのために、改変を有するペプチドを設計及び合成した。かかる改変は、Ｎ０６Ｐ８７ペプチドのＣ末端におけるカルボキシル基によるアミド基の置換、及びペプチドの両方の末端において１つのシステインを挿入することによるＮ０６Ｐ８７ペプチドの環化を含んだ。得られたペプチド及びその分子量を表４に示す。
【表４】
0006032854.tif 000005
【００６５】
ペプチドＮ０６Ｐ８９（Ｎ末端及びＣ末端の両方に位置する２つのシステインによって環化されたもの）がＭ１４ヒト黒色腫腫瘍細胞において細胞増殖を阻害できないことが、表７中に示されている。このことは、Ｎ０６Ｐ８７ペプチド配列上の他の位置にさらなる制約が加えられる必要性を示唆しており、ｐ２５ポリペプチドの推定構造上にこの領域が有する三次構造を模倣する合理性を支持している。同じ図７において、目的のペプチド領域について期待される細胞傷害能を達成するために、Ｃ末端（例えば、アミド基又は他の改変）を遮断する必要性もまた示されている。
【００６６】
（例５）リーダーペプチドの製剤化は、その細胞傷害活性を増加させない
腫瘍細胞におけるその細胞傷害活性に対する、リーダーペプチドを含むいくつかの非経口製剤の緩衝液条件、ｐＨ及び添加剤の影響を評価するための研究を実施した。評価した緩衝液は以下であった：グリシン、ホスフェート、シトレート、及び酸性から高度に塩基性までの広範なｐＨ値を含む他の緩衝液。非経口製剤に使用する範囲内のいくつかの添加剤、例えば、グリシン、スクロース、デキストラン、グルタミン酸ナトリウム、ソルビトール、シクロデキストリン、ＰＥＧ、ＥＤＴＡ、非イオン性界面活性剤などもまた評価した。これらの添加剤で製剤化したＮ０６Ｐ８７ペプチドは、多様な組織学的起源由来の腫瘍細胞におけるその細胞傷害活性について増加を示さなかった。
【００６７】
（例６）線状ペプチドＮ０６Ｐ８７のインビボ活性
胸腺欠損マウスにおけるＬｓ１７４Ｔ結腸癌腫瘍モデルを使用して、ヒト腫瘍モデルに対する、ＣＩＧＢ３７０ｒポリペプチドと比較した線状Ｇｌｙ２５５−Ｓｅｒ２７４セグメント（ペプチドＮ０６Ｐ８７）の潜在的な影響を評価した。ヒト腫瘍細胞を皮下経路によって投与し、目的の分子又はビヒクルを、腫瘍内経路で投与した（１００μＬ）。１３日後、腫瘍が移植されて触診可能になった時点で、目的の分子の投与スケジュールを開始した（図８Ａ）。ペプチドＮ０６Ｐ８７を、スケールダウンした用量で投与した：４８時間毎の６００μＭの２回の投与、その後の４８時間毎の３３０μＭの４回の投与、及び最後に７２時間毎の９０μＭの４回の投与。ＣＩＧＢ３７０ｒペプチドは、４週間にわたり週に１回投与した。
【００６８】
治療開始の３５日後、有意な差異が、Ｎ０６Ｐ８７及びビヒクルで治療した群において、腫瘍体積において検出された（ｐ＜０．００１）（図８Ｂ）。さらに、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉの事後検定を用いた片側検定ＡＮＯＶＡによって検出されるように、ＣＩＧＢ３７０ｒで治療した群とビヒクルを受けた群との間に、高度に有意な差異（ｐ＜０．０００１）が存在した。両方の分子を受けた群間にも、高度に有意な差異が存在した（ｐ＜０．０００１）。
【００６９】
図８Ｃは、これらの分子で治療した又はビヒクルを受けた動物における生存を示す。両方の分子が、ビヒクルを受けた群と比較して、治療した動物において生存を有意に増加させることができた（Ｌｏｇｒａｎｋ検定：ｐ＜０．０５）。それにもかかわらず、Ｎ０６Ｐ８７ペプチドの場合、Ｔ／Ｃ比（ここで、Ｔは、治療した動物の平均生存であり、Ｃはビヒクルだけを受けた動物の平均生存である）は１１７％であった。このことは、Ｔ／Ｃ比が少なくとも１２０％でなければならない、ヒトにおける癌療法のために潜在的に有用な分子としてこの線状ペプチドが適格ではないことを示した。ＣＩＧＢ３７０ｒポリペプチドの場合、ヒト癌治療剤として潜在的に有用な分子から予測される挙動を有する、１４２％のＴ／Ｃ比を示した。
【００７０】
このペプチドは、Ｔ／Ｃ比を３５日目（全ての動物がまだ生存していた最後の日）に腫瘍体積を参照して計算した場合でさえ適格でなく、７２％のＴ／Ｃ比を示し、同じパラメータは、ＣＩＧＢ３７０ｒポリペプチドについては３５％であった。この場合、Ｔ／Ｃ比は、４０〜５０％を下回る範囲の場合、顕著に活性な化合物を特徴付ける（Ｍａｒｉｅ  Ｓｕｇｇｉｔｔ  ａｎｄ  Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｃ．Ｂｉｂｂｙ．５０  Ｙｅａｒｓ  ｏｆ  Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ：Ｅｍｐｉｒｉｃａｌ  ｔｏ  Ｔａｒｇｅｔ−Ｄｒｉｖｅｎ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２００５．Ｖｏｌ．１１，９７１−９８１．）。このことにより、ＣＩＧＢ３７０ｒポリペプチドによって達成される生存と類似の長期生存のために、及びさらなる治療的使用を支持するために、同定されるペプチド配列がさらなる最適化を必要とすることが示された。
【００７１】
（例７）Ｎ０６Ｐ８７ペプチド上の機能的な残基／領域を規定する
例２及び４に示される実験結果により、ｐ５０タンパク質の３次元構造分析（例３及びセクション「発明の概要」）と合わせて、ペプチドの構造−機能関係に対する影響に従ってＮ０６Ｐ８７ペプチドの化学構造における３つのセグメント又は独特の領域を規定することが可能である：結合及び／又は構造的支持のための、ａ）一次的結合領域（中心ループ）；ｂ）Ｃ末端における二次的結合領域；及びｃ）二次的Ｎ末端領域。これは、図９に模式的に示される。
【００７２】
中心ループは、その生物学的活性に必須なＧｌｙ２６６−Ａｓｐ２６８セグメント、並びにｐ２５及びｐ５０の両方においてその曝露を増加させるＰｈｅ２６９残基及びＬｅｕ２７０残基を含んでいる。Ｃ末端領域は、ｐ５０タンパク質中で伸展したコンフォメーションをとるループである。例４に示されるように、このセグメント上の残基は、見かけ上レセプターとの相互作用に関与し、一方でＮ０６Ｐ８７ペプチドのＣ末端アミド基は、カルボキシル基によって置換され、生物学的活性の喪失を生じる。かかる改変は、新たな局所的陽性電荷の導入を示唆しており、ペプチド中の水素結合ドナー基の喪失もまた示唆している。この領域は、構造的役割を果たし得るということもあり得る：ａ）Ｌｅｕ２７０は、中心ループにおいて、Ｐｈｅ２６９、Ｔｙｒ２５９、及びＡｒｇ２６７の脂肪族側鎖との疎水性相互作用を確立する；ｂ）Ｔｈｒ２７２は、Ｎ末端領域上のＰｈｅ２６１との疎水性接触を確立する；及びｃ）Ｓｅｒ２７１は、中心ループ上の残基と共に３つの水素結合を形成し、Ｓｅｒ２７１アミノ基は、Ａｒｇ２６７カルボニル基についての水素結合のドナーであり、Ｓｅｒ２７１の側鎖上のＯＧ基は、Ａｒｇ２６７カルボニルについてのドナーでもあり、Ｔｈｒ２６５側鎖についてのＯＨ基のアクセプターでもある。Ｎ末端セグメントは構造的役割を果たす：Ａｓｎ２６４残基のＮＤ２側鎖及びＯＤ１側鎖の原子、Ａｓｎ２６４についてのアミノドナー（主鎖）としての残基Ｖａｌ２５８のカルボニル基（アクセプター）及びＳｅｒ２６３のＯＧ原子との、Ａｓｐ２５６（カルボニル基）及びＶａｌ２５８（アミノ基）の主鎖水素結合。
【００７３】
（例８）導入又は構造的制約、環化、側鎖結合及び／又は非天然アミノ酸
本発明の強力な抗癌薬を設計するための重要な態様は、環状であるように設計された、即ち、側鎖並びに／又はアミノ末端及びカルボキシル末端上の化学基が関与する共有結合によってカップリングされたアミノ酸を含むように設計された、ペプチドを含む。したがって、本明細書中で設計されたペプチドは、これらの分子の構造的柔軟性を顕著に減少させる環化によって、構造的に制約されている。一般に、治療剤としてのペプチドの使用には、多数の不利益がある。ペプチド；特に、折り畳まれたタンパク質よりも柔軟性が高い、短い及び中間のサイズのペプチドの、固有の柔軟性の場合が当てはまる。これが、タンパク質又は任意の他のレセプター巨大分子に結合するためのプロセスが、コンフォメーションエントロピーのより高度な喪失によって通常制限されている理由である。この事実は、タンパク質−タンパク質相互作用よりも低い結合親和性を通例示すこれらの分子に寄与している。ペプチドが示すより低い親和性（及び結果としてより低い潜在力）は、ペプチド−レセプター接触表面が、特にペプチドがネイティブタンパク質のセグメントを含む場合、タンパク質−レセプター界面に必要な表面と比較してより小さいという事実にも関連し得る。これらの理由のために、一般に、レセプター結合に関するそれらの親和性（及び結果として潜在力）を増加させるために、ペプチドを再設計し、化学的に改変する必要がある。
【００７４】
本発明において、ペプチド環化は好ましくは、以下によって導入される：ａ）Ｌｙｓの側鎖とＡｓｐ／Ｇｌｕの側鎖との間のアミド結合（表５中のペプチド５〜１６、１９〜２２、４０〜４３）又はＬｙｓの側鎖とカルボキシル末端基との間のアミド結合（ペプチド３２）；及びｂ）ジスルフィド架橋を導入すること（ペプチド１〜４、１７〜１８、２３〜３１、３３〜３９、４４〜５０）。表５は、代表的ペプチドの配列を示す。
【表５−１】
0006032854.tif 000006
【表５−２】
0006032854.tif 000007
【表６】
0006032854.tif 000008
【表７】
0006032854.tif 000009
【００７５】
全ての場合において、設計されたペプチドの構造中に導入された構造的制約は、分子の生物学的に活性なコンフォメーションと適合する必要がある。したがって、本発明の環化の設計は、側鎖（置換位置）によって連結されるアミノ酸の置換／導入のための配列上の潜在的な位置及び導入されるアミノ酸（単数又は複数）（連結残基）の型（単数又は複数）の選択の両方を含む。ペプチド上の置換位置に対応する残基間距離は、選択された連結残基の立体化学性質と適合する必要がある。例えば、ジスルフィド架橋を導入する特定の場合において、そのα炭素間距離が活性コンフォメーションにおいて７Åより大きい又は３．８Åより小さい残基は、潜在的な置換位置とはみなされない（Ｖａｒｄｈａｎ  Ｓ．Ｄａｎｉ，Ｃ．Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ  ａｎｄ  Ｒａｇｈａｖａｎ  Ｖａｒａｄａｒａｊａｎ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｖｏｌ．１６  ｎｏ．３  ｐｐ．１８７−１９３，２００３）。同様に、３．６Åと４．７Åとの間のβ炭素間距離を有する位置が、好ましいとみなされる。置換位置における立体化学の記述子、例えばα炭素及びβ炭素は、残基間の共有結合が一旦確立されると、好都合な非共有相互作用（ファンデルワールス）の存在を示す、好都合な値をとるのに充分な連結残基の側鎖におけるねじれ角を支持するはずである。
【００７６】
本発明のジスルフィド架橋（システインによる）によって環化されたペプチドの設計のために、以下の工程を検討した：ａ）ジスルフィド架橋によって連結されたシステインによって置換することが可能な、Ｎ０６Ｐ８７ペプチドの潜在的な置換位置対の選択、ｂ）改変ペプチドの３次元構造モデリング／モデルの最小化されたエネルギー、及びｃ）モデルのエネルギー及び／又は立体化学品質パラメータの評価。Ｎ０６Ｐ８７ペプチド上のシステインのための置換位置を、タンパク質ジスルフィド架橋を設計するために開発されたソフトウェアであるＭＯＤＩＰ（Ｖａｒｄｈａｎ  Ｓ．Ｄａｎｉ，Ｃ．Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ  ａｎｄ  Ｒａｇｈａｖａｎ  Ｖａｒａｄａｒａｊａｎ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｖｏｌ．１６  ｎｏ．３  ｐｐ．１８７−１９３，２００３）を使用して選択した。この方法は、α炭素及びβ炭素についての原子間距離に依存する実験上のエネルギーを使用して、また、ねじれ角χ１、χ２、χＳＳ、χ１’及びχ２’についての値を使用して、潜在的なジスルフィド架橋にスコアを割り当てる（Ｒ．Ｓｏｗｄｈａｍｉｎｉ，Ｎ．Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎ，Ｂ．Ｓｈｏｉｃｈｅｔ，Ｄ．Ｖ．Ｓａｎｔｉ，Ｃ．Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ  ａｎｄ  Ｐ．Ｂａｌａｒａｍ（１９８９）．Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇｎｇ．，３，９５−１０３）。潜在的なジスルフィド架橋について計算されたエネルギー値に依存して、ＭＯＤＩＰは、Ａ（理想的な立体化学）、Ｂ（適切な幾何学のものであるが、立体化学上のねじれを有する）又はＣ（ジスルフィド架橋の形成を可能にするのに充分に近接している）の品質スコアを割り当て、Ａは最も高い品質を示し、Ｃは最も低い品質を示す。設計されたペプチドの３Ｄ構造モデルは、分子モデリングソフトウェアを使用して得たが、（好ましくは）核磁気共鳴によって得ることができる。本発明において、ＭＯＤＥＬＬＥＲソフトウェア（Ｓａｌｉ  Ａ，Ｂｌｕｎｄｅｌｌ  ＴＬ，１９９３，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２３４：７７９−８１５）及びＷＨＡＴＩＦ（Ｖｒｉｅｎｄ  Ｇ，１９９０，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｇｒａｐｈ．８（１）：５２−６，２９）を使用して、ペプチドをモデリングした。
【００７７】
ｐ５０の結晶学的構造を、この分析のための出発点として使用した−ファイルＰＤＢ  １ＳＲＰ。セクション「発明の概要」において以前に考察したように、実験データは、Ｎ０６Ｐ８７ペプチドの生物学的に活性なコンフォメーションが、ｐ５０／ｐ２５タンパク質中のＧｌｙ２５５−Ｓｅｒ２７４断片がとるコンフォメーションと類似していることを示唆している。表８は、このセグメント中の潜在的な置換位置の予測に関する結果を示している。
【表８】
0006032854.tif 000010
【００７８】
対２〜４は、ネイティブ構造から予測され、Ａ及びＢの品質スコアを示すが、対１は、Ｔ１９残基上に僅かなコンフォメーション変化を必要とするので、得られたジスルフィド架橋はより低い品質を有する。したがって、本発明は、ジスルフィド架橋を確立するための好都合なコンフォメーションの採用に有利になるような、Ｔ１９→Ｇ置換又はＴ１９→Ａ置換を含むペプチドを含む。Ｇｌｙの置換は、局所的柔軟性を増加させることができ、架橋の形成を助けるカルボキシル末端におけるコンフォメーション変化を好む。表５中のペプチド４の構造について得られたモデル（モデル−６９、−３８のφ−ψねじれ角）に従って残基１９について予測されたものなので、らせん形コンフォメーションを採用するこの残基の好都合な傾向を考慮すると、Ａｌａの置換が適切である。Ａｌａの導入は、Ｔ１９→Ｇ置換と比較して、折り畳み及び／又はレセプター結合の間の立体配置エントロピーのより低い喪失を特徴とする。図１０は、表８に示されるＭＯＤＩＰ予測から設計された一群の環状ペプチドについてのモデルを示す。
【００７９】
ジスルフィド架橋を設計するために使用される同じ置換位置は、Ｌｙｓ残基及びＡｓｐ／Ｇｌｕ残基のようなアミド結合を形成する連結残基を有する環状ペプチドの設計にも適している。連結残基のα炭素を連結する原子の数は、この場合、ジスルフィド架橋中に存在する原子の数よりも大きいので、ペプチドの設計におけるそれらの導入を決定する立体化学的制限はあまり制限的ではなく、したがって、ＭＯＤＩＰで予測された置換位置もまた、一次的アプローチとして適切である。所与の結合について対又は残基が一旦選択されると、得られたペプチドはモデル化され、エネルギー的に評価される（及び／又は立体化学パラメータに従って品質が評価される）。表５中のペプチド３３は、同様のプロトコールによって設計したものであり、このペプチドは、Ｌｙｓ７と末端カルボニル基との間にアミド結合を含んでいる（図１１）。
【００８０】
本発明において好ましい別の環化方法は、ペプチドのＮ末端のアミノ基とＣ末端のカルボニル基との間の共有結合の導入を含む。ペプチド結合の立体化学制限は、ペプチドの生物学的活性と適合性の構造をとることを容易にするａａコネクターを導入することを必要とする。例えば、ペプチド単位のＣＡ間に存在する３．９Åの距離と比較して、連結されるｐ２５／ｐ５０タンパク質の３Ｄ構造中の「アンカー」残基のα炭素間の距離（ｄＣＡ−ＣＡ）が大きいほど、必要なコネクター残基の数（Ｎｃｏｎ）は多くなる。それぞれの距離的制限に充分な２つのアンカー残基間に適切なコネクター残基が導入されていない場合、ペプチドは、実験的に観察されたコンフォメーションをとることができない可能性が高く、生物学的活性に対してネガティブな影響を有する可能性が非常に高い。コネクター残基は、以下のプロトコールに従って設計した：
Ｉ．接続するＮ０６Ｐ８７ペプチド残基の選択：３Ｄ構造における隣接残基、好ましくは、一次的結合のセグメント中にも一次的セグメント中にも含まれていないもの；
ＩＩ．必要とされるコネクター残基の最小数の同定：Ｎｃｏｎ＞ｄＣＡ−ＣＡ／３．９；
ＩＩＩ．アンカリング残基の選択：接続するＮ０６Ｐ８７ペプチド残基及び隣接残基、２〜３残基が両方の末端において選択される；
ＩＶ．断片末端における２〜３残基の主鎖構造が、アンカリング残基の構造と類似するような方法での、非冗長３Ｄタンパク質構造データベースにおける、Ｎ残基（Ｎｃｏｎ＋４＞Ｎ＞Ｎｃｏｎ＋６）のセグメントについての検索；
Ｖ．コネクターセグメントの配列及び構造の選択：工程ＩＶにおいて観察された最も一般的なコネクターセグメントの構造が選択され、選択のパラメータは、それぞれの位置において各アミノ酸について計算される、即ち、アミノ酸出現の数と、データベース中のアミノ酸の相対的な豊富さに従って予測された値との間の比率。最も高い優先パラメータを示すアミノ酸（１つ又はいくつか）が、各位置について選択される。最も高い値の優先パラメータの基準に従って、コネクターセグメントに隣接する残基を改変することが可能である。正のねじれ角を有する位置が関与する場合、Ｄ−立体異性体を導入することが可能である。必要な構造に適切な主鎖上のコンフォメーションをとる残基の構造的傾向を増加させるために、他の非天然アミノ酸（例えば、β−及びＮ−メチル化アミノ酸）を導入することも可能である。
【００８１】
これらのペプチドは、Ｎ末端とＣ末端との間のアミド結合によって環化されるので、配列の巡回置換は、同一のペプチドを含む。本発明の一例において、ペプチドは、Ｎ０６Ｐ８７ペプチドについて規定された一次的結合セグメントに基づいて設計され、このセグメントは、一般配列Ｚ１Ｚ２Ｘ３Ｘ４（又はそれぞれＸ３Ｘ４及びＺ１Ｚ２、表５中のペプチド６４）のテトラペプチド（２つのジペプチド）によって接続される。これらのペプチドは、最大１１個のアミノ酸を含む。本発明のコネクター配列はまた、その残基が正のねじれ角をとる位置において、Ｄ−ａａを含み得る（表５中のペプチド６５及び６６）。コネクターテトラペプチドの配列は、好ましくはｄＳｅｒ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ（表５及び中のペプチド６５、ｄＳはＤ−Ｓｅｒ立体異性体である）であるが排他的ではないものの、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ（表５中のペプチド７１）又はｄＡｌａ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ（表５中のペプチド７０、ｄＡｌａはＤ−Ａｌａ立体異性体である）でもあり得る。
【００８２】
別の例証において、本発明のペプチドは、テトラペプチドによって接続された、ｐ５０ポリペプチドのＡｓｎ２６２−Ｓｅｒ２７１セグメントに対応する配列を含む。得られたペプチドは１４残基を有する。テトラペプチドコネクターの好ましい配列は、Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ（表５中のペプチド７２）であり得るが排他的ではなく、或いは、Ａｒｇ−Ｐｒｏ−（ｄＡｌａ）−Ｇｌｎ（ペプチド６９、図１２を参照のこと）又はＡｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ（表５中のペプチド７３）又はＴｈｒ−Ｐｒｏ−（ｄＡｌａ）−Ｇｌｎ（表５中のペプチド６８）であり得るが、排他的ではない。したがって、これらのペプチドの配列は、配列が好ましくは（Ｔｈｒ又はＡｒｇ）−Ｐｒｏ−（Ｇｌｙ又はｄＡｌａ）−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｓｅｒであるコネクターヘキサペプチドによって環化されたセグメントＡｓｎ２６４−Ｓｅｒ２７１と記載され得る。或いは、ヘキサペプチドコネクター中の残基４及び５は、それぞれアミノ酸ＢｍＧｌｎ及びＮｍＡｓｎであり得、ここでＢｍＧｌｎ及びＮｍＡｓｎは、それぞれ、アミノ酸Ｌ−ｂ−メチルグルタミン（β炭素上でメチル化されたＬ−グルタミン）及びＬ−ｎ−メチルアスパラギン（Ｎ−メチル  Ｌ−アスパラギン）である。βメチル化アミノ酸は、伸長されたコンフォメーション（β様構造）をとる傾向がより高く、Ｎ−メチル化は、ポリプロリン様構造をとる傾向が高く、この構造は、コネクターセグメントの設計のために記載されたプロトコール（工程Ｉ〜ＩＶ）によって得られるペプチドのモデル構造において、残基４及び５がとる構造である。
【００８３】
本発明の別の例証は、その配列がトリペプチドによって接続されたｐ５０のＡｓｎ２６２−Ｓｅｒ２７１セグメント（又は、同様にペンタペプチドによって接続されたセグメントＡｓｎ２６４−Ｓｅｒ２７１）に対応するペプチドに存する。トリペプチドコネクターは好ましくは、配列（Ａｒｇ又はＬｙｓ）−（Ａｒｇ又はＬｙｓ）−Ｐｒｏ（表５中のペプチド７６〜７７、図１３）を有するが排他的ではなく、それぞれのペンタペプチドコネクターは、配列（Ａｒｇ又はＬｙｓ）−（Ａｒｇ又はＬｙｓ）−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｓｅｒを有する。
【００８４】
（例９）立体異性体
構造的安定性を増加させる目的で、及び結論として、ペプチドの親和性／潜在力を増加させる目的で、本発明で検討した改変は、そのそれぞれの立体異性体（Ｄ−アミノ酸、Ｄ−ａａ）による、元のＮ０６Ｐ８７配列中の天然Ｌ−アミノ酸の置換を含む。Ｄ−ａａは、好都合な正のねじれ角をとるので、置換するＮ０６Ｐ８７残基候補は、ネイティブタンパク質の構造（及び／又はペプチドの構造モデル）においてかかるねじれ角をとる残基である。図１４は、ｐ５０のＧｌｙ２５５−Ｓｅｒ２７４セグメントの３Ｄ構造に対応するラマチャンドランダイアグラムを示す。Ｒｏｏｍａｎ及びＷｏｄａｋ（Ｒｏｏｍａｎ  ＭＪ，Ｋｏｃｈｅｒ  ＪＰ，Ｗｏｄａｋ  ＳＪ．１９９１．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２２１（３）：９６１−７９）のラマチャンドランダイアグラム領域定義の規定の助けにより、残基Ｎ８及びＧ１２は、Ｌ領域（反時計回り回転のらせん形領域）中に位置付けられ、Ｇ６は、伸長したコンフォメーションＥ領域（Ｇ６のφ値及びψ値もまた、残りのＬ−アミノ酸を禁じている）中に位置付けられる。したがって、Ｄ−ＡｌａによるＮ８、Ｇ１２及びＧ６の置換は、かかる主鎖コンフォメーションをとる及び／又は立体配置エントロピーの折り畳み／結合関連の喪失を減少させる、この残基の傾向を考慮すると好都合である。残基Ｌ−Ｇｌｕ、Ｌ−Ｇｌｎ及びＬ−Ａｓｐは、これらの残基がタンパク質ループ中に位置している場合、らせん形コンフォメーション（時計回りの回転）をとる傾向が非常に高いので（Ｓｗｉｎｄｅｌｌｓ  ＭＢ，ＭａｃＡｒｔｈｕｒ  ＭＷ，Ｔｈｏｒｎｔｏｎ  ＪＭ．１９９５．Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ．２（７）：５９６−６０３）、類推により、Ｄ−Ｇｌｕ、Ｄ−Ｇｌｎ及びＤ−Ａｓｐは、反時計回り回転のらせん形コンフォメーションをとる傾向がある（Ｎ８残基の場合）。ペプチド１７、２３、２５、２７〜３１、４５〜５１（表５）は、以前に言及された基準に従って設計された、１つ〜３つのＤ−ａａを有する。本発明のペプチドの構造におけるＤ−ａａの導入もまた、コンフォメーションに対して、したがって親和性に対して好都合な影響を有し、２つの主要な理由に基づいてインビボのタンパク質分解に対するそれらの抵抗性を増加させることによって、ペプチドの薬物動態特性に正に寄与する：ａ）血清エンドプロテアーゼは立体特異的基質を消化するので、直接的影響；及びｂ）ペプチドのより低い柔軟性により、ペプチドは、タンパク質分解的消化の影響を受けにくくなる。
【００８５】
（例１０）ペプチド末端及び／又はポリマーへのコンジュゲート化の遮断
ペプチドは、インビボでのより低い平均半減期（より小さいサイズ、腎排除）、最も高い柔軟性を特徴とし、これはまた、タンパク質分解に対する感受性の増加、したがってより低いバイオアベイラビリティを暗示している。したがって、ペプチドにおける化学的改変の導入は、そのバイオアベイラビリティを改善するために推奨され得る。本発明は、好ましくは、他の改変、例えば側鎖を排除することなしにペプチド末端を改変することによる、ポリエチレングリコール鎖（単数又は複数）（ＰＥＧＳ）を用いて共有結合的に改変されたペプチドの設計を含む。本発明のペグ化ペプチドの例は、表５に示される（ペプチド６２及び６３）。したがって、本発明のペグ化ペプチドは、タンパク質分解に対する抵抗性のより良好なプロフィール、低下した腎濾過、抗原との相互作用及び引き続くその活性の中和のより低い可能性、並びに抗原性及び免疫原性の低下、を示す。
【００８６】
ペグ化は、小分子の循環時間を増加させ、迅速に排出される小さいペプチドは、放射性標識された場合に高頻度に腎毒性を有すると報告されている（Ｂｌｕｍｅｎｔｈａｌ  Ｒ．Ｄ．，Ｓｈａｒｋｅｙ  Ｒ．Ｍ．，Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ  Ｄ．Ｍ．Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ  Ｄ．Ｍ．ｅｄｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，２９５−３１４，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ  １９９５．）。ペグ化は、インターフェロン及び抗体などの合成薬を改変するために使用されている。本発明は、ペプチド−レセプター結合に関するより高い結合力を可能にする線状又は分枝鎖ＰＥＧＳを使用してマルチマー構造を設計する手段による、ペプチドの提示を含む。
【００８７】
ペグ化は、ペプチドの見かけの分子サイズを増加させ、腎濾過速度を低下させる（Ｋｎａｕｆ  Ｍ．Ｊ．，Ｂｅｌｌ  Ｄ．Ｐ．，Ｈｉｒｔｚｅｒ  Ｐ．，Ｌｕｏ  Ｚ．Ｐ．，Ｙｏｕｎｇ  Ｊ．Ｄ．，Ｋａｔｒｅ  Ｎ．Ｖ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３：１５０６４−１５０７０，１９８８；Ｂｅｈｒ  Ｔ．Ｍ．，Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ  Ｄ．Ｍ．，Ｂｅｃｋｅｒ  Ｗ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．，２５：２０１−２１２，１９９８）。本発明のペプチドは、分子の糸球体濾過を大幅に低下させるために、５０ｋＤａ以上の値までその分子サイズを増加させるＰＥＧによって改変されることが好ましい。
【００８８】
循環時間を増加させることに加えて、ペグ化は、治療的分子の抗原性及びタンパク質分解に対する感受性を低下させ（Ｄｅｌｇａｄｏ  Ｃ．，Ｆｒａｎｃｉｓ  Ｇ．Ｅ．，Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｄ．Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．，９：２４９−３０４，１９９２．）、抗新生物薬について高度に望ましい特性であるその溶解度及び血管透過性の増加を誘導する（Ｆｒａｎｃｉｓ  Ｇ．Ｅ．，Ｄｅｌｇａｄｏ  Ｃ．，Ｆｉｓｈｅｒ  Ｄ．，Ｍａｌｉｋ  Ｆ．，Ａｇｒａｗａｌ  Ａ．Ｋ．Ｊ．Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔ．，３：３２１−３４０，１９９６）。
【００８９】
血液、腎臓及び肝臓中にはいくつかのエキソペプチダーゼが存在し（Ｗｅｒｌｅ  Ｍ，Ｂｅｒｎｋｏｐ−Ｓｃｈｎｒｃｈ  Ａ．Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ．２００６  Ｊｕｎ；３０（４）：３５１−６７）、したがって、ペプチドのＮ末端及びＣ末端の改変は、そのタンパク質分解安定性を顕著に増加させ得る。Ｎ−アセチル化は、本発明において推奨される改変であり、Ｎ末端におけるピログルタミン酸の導入、又はＤ−立体異性体アミノ酸などもまた推奨される。
【００９０】
本発明のペプチドは、殆どがＣアミド化（Ｃ末端においてアミド）されており、これがカルボキシペプチダーゼ抵抗性をペプチドに提供する。
【００９１】
Ｎ末端及び／又はＣ末端の改変は、ペグ化であってもよく、これは、サイズの増加及び抗原性／免疫原性の低下に関連する、その関連した及び以前に言及された特性に加えて、末端改変によるプロテアーゼ、特にエキソペプチダーゼに対する抵抗性を増加させる。その上、ＰＥＧＳの付加は、タンパク質分解酵素に対する立体障害によって、一般に（エンド及びエキソ）タンパク質分解に対する抵抗性の増加を誘導する。この目的のために、線状又は分枝鎖のいずれかのＰＥＧＳが使用される。
【００９２】
環化はまた、以前に記載されたＮ末端とＣ末端との間の共有結合を形成することによって（表５中のペプチド６４〜６６、６８〜６９）、又は一方の末端と側鎖との共有結合によって（表５中のペプチド３２〜３３）、エキソペプチダーゼタンパク質分解に対してペプチドを保護する。エキソペプチダーゼに対する抵抗性は、Ｄ−ａａによって末端アミノ酸を置換することによっても達成される（表５中のペプチド６７）。
【００９３】
ＰＥＧによる改変に対する代替として、天然に存在する高度に親水性で生体分解性のポリマーであり、ヒトにはレセプターが存在せず、プロテアーゼに対する抵抗性（血漿安定化）及び半減期を増加させ得る、Ｎ−アセチルノイラミン酸（シアル酸）へのコンジュゲート化もまた可能である（Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ  Ｇ，Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ  Ａ，Ｍｉｔａｌ  Ｍ，ＭｃＣｏｒｍａｃｋ  Ｂ（２０００）Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ５７：１９６４−１９６９；Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ  ＡＩ，Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ  Ｇ（１９９７）Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １３４１：２６−３４）。本発明のペプチドの別の妥当な改変は、脂肪酸によるＮ末端置換又は脂質化を含む（表５中のペプチド５２〜５３）。このストラテジーは、エキソペプチダーゼによるタンパク質分解に対するペプチドの抵抗性を増加させ、膜とペプチドとの相互作用を促進する。脂質の性質に依存して、特定の膜ドメインとの相互作用が好まれ得、ペプチドの薬理学的作用のレセプター標的上に豊富なドメイン中のペプチドの蓄積を促進する。脂質化はまた、より良い薬物動態特性及び薬力学的特性の超分子構造（ミセル、凝集体、粒子、小胞）の形成を好む。
【００９４】
（例１１）本発明のペプチドの化学構造の説明
図１５は、本発明のペプチドの化学構造の一般表示を示す。設計はまず、具現化例７に規定された一次的セグメントに基礎を置く。一般に、ペプチド配列Ａｓｎ２６４−Ｌｅｕ２７０が、異なる構造的背景において曝露され、それらは全て、ペプチドの主鎖及び／又は側鎖が関与する環化によって、異なる程度の制約を含む。環化は、異なる化学的性質の結合：アミド結合又はジスルフィド結合によって確立されるが、置換位置は、環状側鎖の残基及び側鎖自体によって占められ、本発明において同定されたｐ５０／ｐ２５タンパク質の機能的部位の構造及び局所分布を再現するために注意深く選択される。具体的な解法は、一次的セグメントの構造と適合するコンフォメーションをとる高い構造的傾向を有するアンカー部位及びコネクター配列を選択することによって実施される主鎖の環化に存する。二次的セグメントもまた、主に環状側鎖を有する置換位置を支持するために、任意選択で使用される。さらに、二次的セグメントは、ｐ５０／２５の機能的部位の局所分布に従って、潜在的なレセプターと相互作用するためのさらなる接触表面を提供し得る。一例は、Ｃ末端二次的セグメントの位置Ｘ＋３及びＸ＋４において正の電荷及び／又は水素結合ドナーを有する残基を含めることを含む。ペプチドは、図１５に示される１つ又は複数の環を含み得るが、単一環のみが表５中に示される例として含まれる。本発明のペプチドは、環化又は任意の他の化学的改変のための置換位置を占めることを目的として、側鎖がアミノ基、カルボキシル基又はスルフヒドリル基を含んでいる非天然又は特別なａａを含み得る。一次的セグメント又は二次的セグメントのいずれかについて正のねじれ角をとることが可能なポリペプチド鎖位置において、Ｄ−ａａ立体異性体を含むこともできる。さらに、本発明のペプチドは、ポリマー、例えばＰＥＧ及び／又は他の化学基への共有結合によって改変され得る。かかる改変は、環化された側鎖によって占められない限り、末端及び／又は置換位置の側鎖において行われ得る。
【００９５】
表５中のペプチド１、２、３及び４（それらの合成の間にコードされ、それぞれ以下として精製される：Ａ０８Ｐ２５ｓ−ｓ、Ａ０８Ｐ２８ｓ−ｓ、Ｊ０８Ｐ４６ｓ−ｓ及びＪ０８Ｐ４８ｓ−ｓ）は、種々のサイズ、二次的セグメント有り又は無し、及び主要な置換位置を含む、本発明のペプチドの重要な態様をカバーする具現化例である。これらのペプチドは、インビボ腫瘍モデルにおいてそれらの効果を実証するために選択した：ｐ２５ポリペプチド中の細胞傷害活性を有する隠れたペプチド断片の構造シミュレーションにより、最大２０ａａまでのペプチド分子が生成され、このペプチド分子は、有利には癌療法において使用される、ｐ２５の抗腫瘍活性を効果的に再現する。
【００９６】
（例１２）同系及び異種移植腫瘍モデルにおける最適化環状ペプチドの抗腫瘍活性の評価
ｐ２５ポリペプチドの活性領域の構造を模倣する本発明の新規ファミリーの環状ペプチドの抗腫瘍活性を評価することを目的として、このファミリーの異なる環化バリアント及び挿入バリアントを含む４つのペプチドモデルを選択した。これは、表５中のペプチド１、２、３及び４（それぞれ、Ａ０８Ｐ２５ｓ−ｓ、Ａ０８Ｐ２８ｓ−ｓ、Ｊ０８Ｐ４６ｓ−ｓ及びＪ０８Ｐ４８ｓ−ｓとして、活性アッセイについてコード化される）であった。ポジティブコントロール群として、ＣＩＧＢ３７０ｒポリペプチドで治療した群を使用した。
【００９７】
６〜８週齢の、体重２２ｇのＣ５７ＢＬ／６雌性マウスは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ（ＣＥＮＰＡＬＡＢ，Ｈａｖａｎａ，Ｃｕｂａ）により提供されたものであり、Ｂｉｏｔｅｒｉｕｍ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＣＩＧＢ）において、病原体なしの条件下で収容した。実験は、実験動物の適切な取り扱い及び世話についての規則に従って実施した。腫瘍体積を各場合について測定し（以下の式によって概算した：体積＝ａ２×（ｂ／２）、式中、ａは腫瘍の幅であり、ｂは腫瘍の長さである）、動物の生存を評価した。
【００９８】
生存を、Ｌｏｇｒａｎｋ検定によって群間で比較した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ４．０ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）の助けによって統計的パラメータを得た。
【００９９】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、５００００個のＴＣ−１細胞を、皮下経路（ｓ．ｃ．）によって右側腹に注射した。腫瘍が検出可能になった時点で、マウスを、研究対象のペプチドによる治療を評価するため、異なる投与経路による治療を評価するために、治療群にランダム化した。腫瘍保有動物は１日おきに８０μＭの対象ペプチドの６回の投与を受け、コントロールとしてはビヒクルだけを受けた。５匹のマウスを各群について使用した。動物を、病原体なしの条件下で収容し、手順を、実験動物の取り扱い及び世話のための良好な実践に従って実施した。
【０１００】
生存は、ビヒクルを受けた群と比較して、治療群全てにおいて統計的に有意であった。図１６は３つのブロックを示している：１）それぞれペプチドＪ０８Ｐ４８ｓ−ｓ及びＣＩＧＢ３７０ｒで治療した群を含む、最も高い生存のブロックであって、それらの間には統計的に有意な差異は存在しない；２）それぞれペプチドＡ０８Ｐ２８ｓ−ｓ、Ａ０８Ｐ２５ｓ−ｓ及びＪ０８Ｐ４６ｓ−ｓで治療した群を含む、中程度の生存のブロックであって、それらの間には統計的に有意な差異は存在せず、ブロック１とは異なっている；及び３）ネガティブコントロール群。これらの結果は、このモデルにおいて評価されたペプチドに代表される、本明細書中に記載される新規ファミリーのペプチドが、元のポリペプチドについて記載された活性を達成できることを実証している。
【０１０１】
腫瘍内経路に加えて、このＴＣ−１モデルでは、腹腔内経路など、ペプチドについての他の投与経路を調査した。図１７は、両方の経路によって投与した場合に、環状ペプチド（例えば、Ｊ０８Ｐ４８ｓ−ｓペプチド）が、ＣＩＧＢ３７０ｒポリペプチドについてこのモデルで観察された効果を再現することを示している。これは、遠位の固形腫瘍を治療する本発明の環状ペプチドの有効性を実証している。
【０１０２】
図１９に示される用量及びスケジュールを用いて、線状セグメントＧｌｙ２５５−Ｓｅｒ２７４（ペプチドＮ０６Ｐ８７）及び本発明の２つの他のモデル環状ペプチドの効果を、胸腺欠損ＮＩＨマウス中のＬｓ１７４Ｔヒト結腸癌モデルにおけるＣＩＧＢ３７０ｒポリペプチドの効果と比較した。１３日後、腫瘍が移植され触診可能になったところで、生体分子を投与し始めた（図１９Ａ）。ペプチドを、スケールダウンした用量で投与した：４８時間毎の６００μＭの２回の投与、その後の４８時間毎の３３０μＭの４回の投与、及び最後に７２時間毎の９０μＭの４回の投与。ＣＩＧＢ３７０ｒは、４週間にわたり週に１回投与した。
【０１０３】
この場合、線状ペプチドとは異なって、図１９に示される環状ペプチドは、ビヒクルを受けた群及び線状Ｎ０６Ｐ８７ペプチドと比較して、治療した動物の生存を有意に増加させることができた（Ｌｏｇｒａｎｋ検定：ｐ＜０．０５）。平均腫瘍体積（図１９Ｂ）に関連したＴ／Ｃ値は、Ａ０８Ｐ２５ｓ−ｓ、Ｊ０８Ｐ４８ｓ−ｓ、ＣＩＧＢ３７０ｒ及びＮ０６Ｐ８７ペプチドについて、それぞれ３５％、３５％、３７％及び７２％であった。これらの結果は、ｐ２５の抗腫瘍活性部位の３次元構造を模倣する本発明の環状ペプチドが、抗新生物治療の開発に有用であることを実証している。本発明のペプチドは、ネイティブタンパク質と比較して、いくつかの薬物動態的及び薬力学的利点を示す。
【０１０４】
（例１３）本発明の環状ペプチドの、多様な組織学的起源のヒト腫瘍細胞系に対する広い作用スペクトル
本発明のペプチドを、スルホローダミンＢ法（Ｓｋｅｈａｎ  Ｐ，Ｓｔｏｒｅｎｇ  Ｒ，Ｓｃｕｄｉｅｒｏ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）“Ｎｅｗ  ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ−ｄｒｕｇ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ”．Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８２：１１０７−１１１２）を使用して、多様な組織学的起源の種々のヒト腫瘍細胞系について評価した。
【０１０５】
図１８は、例として、用量反応効果を示す、評価した細胞系に対する広い作用スペクトルのペプチドを示す。これは、これらの新規分子が、多様な組織学的起源の悪性腫瘍、例えば：とりわけ、喉頭癌腫（ＨＥｐ−２）、小細胞肺癌（Ｈ８２）、非小細胞肺癌（Ｈ１２５）、子宮頚部癌（ＨｅＬａ、Ｃａｓｋｉ）及び神経膠腫（Ｕ８７）を治療するのに有用であることを実証している。
【０１０６】
（例１４）マトリゲルにおける管状構造形成の阻害
最近、国際的な科学コミュニティは、特に、血管新生を阻害するために、腫瘍細胞に対する直接的な作用（腫瘍細胞の増殖を阻害する又は腫瘍細胞の死を引き起こす）を、腫瘍環境に対する作用と組合せることによって、組合せが癌療法に重要であることを充分証明した。この理由のために、マトリゲル上でのヒト脈管構造由来内皮細胞（ＨＭＥＣ）による内皮細胞ストランドの形成を評価する方法によって、本発明のペプチドの抗血管新生活性を評価した（Ｃｒｕｍ  Ｒ，Ｓｚａｂｏ  Ｓ，Ｆｏｌｋｍａｎ  Ｊ．（１９８５）．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２３０：１３７５−８）。図２０は、本発明の環状ペプチドが使用される濃度に依存して管状構造の形成を阻害する能力を示しており、それらの抗血管新生活性を示している。
【０１０７】
（例１５）セラチア・マルセセンス由来の環状ペプチドに基づく、自己アセンブリ特性を有するペプチド構造
本発明のペプチドは、ペプチドの表面上の疎水性パッチ及び親水性パッチの分配によって提供される両親媒性の特徴を有する。疎水性パッチは、ｐ５０タンパク質の３Ｄ構造上のその構造に似た、残基Ｔｙｒ２５９、Ｐｈｅ２６９及びＬｅｕ２７０の側鎖によって主に形成される。残りの表面は、主に極性残基又は荷電残基によって形成される。この両親媒性の特徴により、図２１の顕微鏡写真に示されるように、ペプチドは、ナノメートル規模及び／又はマイクロメートル規模の超分子凝集体を形成させる。ペプチドの凝集は、主鎖及び側鎖のセグメントが関与する分子間水素結合の形成によってさらに媒介され得る。本発明のペプチドのＮ末端及びＣ末端の二次的セグメントの伸長構造は、癌療法、例えば、併用療法並びにナノバイオテクノロジー及び徐放系の分野における新規適用のために、特定の製剤化条件下である型の凝集を好み得る（Ｍｏｎｉｃａ  Ｃ．Ｂｒａｎｃｏ，Ｊｏｅｌ  Ｐ．Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ．Ａｃｔａ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｉａ  ５（２００９）８１７−８３１）。
【０１０８】
（例１６）腫瘍細胞に対して相乗的な細胞傷害効果を示す、プロジギオシンと組み合わせた抗腫瘍及び抗血管新生環状ペプチド
セラチア・マルセセンスＣＭＩＢ４２０２から単離されたプロジギオシン（Ａｂｒａｈａｎｔｅｓ−Ｐｅｒｅｚ  ＭＣ，Ｒｅｙｅｓ−Ｇｏｎｚａｌｅｚ  Ｊ，Ｖｅｌｉｚ  Ｒｉｏｓ  Ｇ，ｅｔ  ａｌ．，（２００６）Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｗｉｔｈ  ｐｒｏｄｉｇｉｏｓｉｎ  ｏｂｔａｉｎｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ  ｈａｖｅ  ｂｏｔｈ  ｂｒｏａｄ  ａｎｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｎ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ．１８：１７２−８１）を、適切な製剤化によって、又は直接的化学合成若しくは単一分子間の化学反応のいずれかによる共有結合によって、本発明の環状ペプチドと組合せた。環状ペプチド、例えばＡ０８Ｐ２５ｓ−ｓ、Ａ０８Ｐ２８ｓ−ｓ、Ｊ０８Ｐ４６ｓ−ｓ及びＪ０８Ｐ４８ｓ−ｓは、ＳＲＢ法（Ｓｋｅｈａｎ  Ｐ，Ｓｔｏｒｅｎｇ  Ｒ，Ｓｃｕｄｉｅｒｏ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）“Ｎｅｗ  ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ−ｄｒｕｇ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ”．Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８２：１１０７−１１１２）によって評価された、異なるヒト腫瘍細胞系（例えば、Ａ５４９、Ａ３７５、ＰＣ−３、Ｕ８７など）に対するプロジギオシンの細胞傷害活性を増強し、ｎｍ範囲のＧＩ５０を示し、少なくとも１オーダーの大きさで、初代線維芽細胞に対するプロジギオシンの作用から生じる細胞傷害活性を減少させた。これは、両方の分子の作用機構が互いに異なっており、したがって、これらの分子を組合せると、癌療法において有利な結果が得ることができることを示唆している。
【０１０９】
（例１７）ポリ乳酸−ｃｏ−グリコール酸（ＰＬＧＡ）のファミリーのポリマーを用いてカプセル化された、抗腫瘍及び抗血管新生環状ペプチドの医薬組成物を得る
本発明のペプチドの薬物動態及び体内分布を改変するために、各特定の場合について望ましい腫瘍学的治療適応に従って、ＰＬＧＡミクロスフェア中のポリマーを伴うこれらの環状ペプチドのカプセル化を調査した。この目的のために、ジクロロメタン中に１ｇのポリマーを溶解することによって、１０％（ｗ／ｖ）で乳酸及びグリコール酸５０：５０のコポリマーを含む溶液を調製した。１ミリリットルのポリマー溶液を、２０ｍｇ／ｍＬ〜４０ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度で、本発明のペプチドの少なくとも１種、例えば、Ａ０８Ｐ２５ｓ−ｓ、Ａ０８Ｐ２８ｓ−ｓ、Ｊ０８Ｐ４６ｓ−ｓ及びＪ０８Ｐ４８ｓ−ｓペプチドを含む水溶液２００μＬと混合した。この混合物を、チップ超音波を使用して、３０秒間超音波処理した。得られた乳濁液を、４０ｍＬの１％ポリビニルアルコール上に注ぎ、Ｕｌｔｒａｔｕｒｒａｘ  Ｔ８ホモジナイザーにおける１４０００ｒｐｍでの２相の撹拌によって、第二の乳濁液（ｗ／ｏ／ｗ）を得た。二重の乳濁液を、１４０ｍＬの０．１％ポリビニルアルコール３００００〜７００００上に注ぎ、３００ｒｐｍでホモジナイザー中にて１時間撹拌して、ジクロロメタンを蒸発させた。最後に、ミクロスフェアを濾過によって収集し、各５０ｍＬの蒸留水で５回洗浄し、凍結乾燥機中で凍結／乾燥させた。乾燥ミクロスフェアを、適用まで４℃で保存した。
【０１１０】
賦形剤と共に環状ペプチド、例えばＡ０８Ｐ２５ｓ−ｓ、Ａ０８Ｐ２８ｓ−ｓ、Ｊ０８Ｐ４６ｓ−ｓ、Ｊ０８Ｐ４８ｓ−ｓを含むミクロスフェアを、内部水相中にＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７（１０ｍｇ）及びＮａＣｌ（０．５ｍｇ）を添加したこと以外、記載したように得た。両方の型のミクロスフェアを、移植されたヒト黒色腫Ａ３７５腫瘍を有する胸腺欠損マウスにおいて腫瘍の近傍に皮下投与した。腫瘍が２００ｍｍ３を上回る体積に達したときに単一の用量を投与して、腫瘍体積について１０％よりも低く生存について１７０％よりも高いＴ／Ｃ比について、複数の投与（４週間にわたり週に３回）後に得られる結果と類似の結果を達成した。
【０１１１】
（例１８）抗腫瘍及び抗血管新生環状ペプチドを充填した従来型のリポソームを得る
１０ｍｇ／ｍＬの濃度のホスファチジルコリンを、５０ｍＬの丸底フラスコ中で無水エタノール中に溶解した。受容器の壁に乾燥層が形成されるまで、脂質を、室温でロトエバポレーション（ｒｏｔｏｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ）によって乾燥させた。本発明中に記載された環状ペプチドの少なくとも１種、例えば、Ａ０８Ｐ２５ｓ−ｓ、Ａ０８Ｐ２８ｓ−ｓ、Ｊ０８Ｐ４６ｓ−ｓ及びＪ０８Ｐ４８ｓ−ｓをリポソーム中にカプセル化することを目的として、乾燥脂質層を、上で言及したペプチドの少なくとも１種を含む緩衝化溶液を用いた均質化によって水和させた。リポソームのサイズを低下させるために、リポソームが約１００ｎｍのサイズになるまで、上記ペプチドを充填したリポソームを含む調製物を、直径が平均１００ｎｍの孔を有するポリカーボネート膜を通した連続的な押し出し工程に供した。
【０１１２】
遊離ペプチドを、４℃で４０分間にわたり１０００００×ｇで懸濁物を遠心分離することによって、ペプチド充填リポソームから分離した。上清を清潔なバイアル中に収集し、沈殿物をリン酸緩衝食塩水溶液でｐＨ７．２で再懸濁した。同じ条件での２回目の遠心分離の後、得られた上清を清潔なバイアル中に収集し、最初の遠心分離上清と混合した。沈殿物（本発明の環状ペプチドが充填されたリポソーム）を、リン酸緩衝食塩水溶液中にｐＨ７．２で再懸濁した。この最終的な沈殿を、使用するまで４℃で保存した。本発明のペプチドの少なくとも１種を充填したリポソームを、ＴＣ−１腫瘍を有するマウスに単一用量として投与したところ、カプセル化されていないペプチドの複数の投与後に得られた結果が再現された（例１２を参照のこと）。
【０１１３】
（例１９）金属イオンに結合する能力があり、特定の臓器に薬物を方向付ける、抗腫瘍及び抗血管新生環状ペプチド
本発明のペプチドのアミノ酸組成物は、その生物学的特性に影響を与えることなく医薬品としてそれらを使用するために、放射性金属及び常磁性金属などの金属イオンに結合する能力を提供する。
【０１１４】
ペプチド−金属イオン複合体は、上記例で示された部位において、種々の物理化学的手順によって生成できる。放射性金属の中で、本発明者らは、Ｔｃ、Ｒｅ、Ａｕ、Ａｇ、Ｐｄ、Ａｓ、Ｃｕ、Ｈｇ及びＲｕの同位体を見出すことができた。金属イオンとペプチドとの間の反応の生成物は、ＴＣ−１腫瘍を有する動物モデル（Ｃ５７ＢＬ／６マウス）において、多様な組織学的起源の腫瘍及び転移を特異的に標的化することが実証された、両方の分子間の複合体である。これらの複合体は、生理学的に正常な組織及び臓器によるその取り込みを最小化する、非常に特異的な様式で癌の診断及び治療剤として使用され得る。
【０１１５】
癌の診断及び治療法のための放射性同位体と本発明のペプチドとの複合体の場合、放射性同位体は、例えば９９Ｔｃ及び１３１Ｉであり得る。本発明において説明するように、金属に結合したペプチドは、直接又は他の担体分子とコンジュゲート化して、投与のために使用され得る。
【０１１６】
本発明のペプチドを、正常な組織及び臓器と比較して腫瘍内蓄積を達成するために腫瘍に直接標的化するために、例８に従ってポリエチレングリコールと共有結合させたペプチド、例えば、Ａ０８Ｐ２５ｓ−ｓ、Ａ０８Ｐ２８ｓ−ｓ、Ｊ０８Ｐ４６ｓ−ｓ及びＪ０８Ｐ４８ｓ−ｓによって形成された複合体を合成した。これらの複合体を、酸化鉄ナノ粒子を用いてさらに製剤化して、その主要成分が本発明の抗腫瘍環状ペプチド、ポリマー分子及び酸化鉄ナノ粒子である、磁性ナノ粒子化ベクター複合体を生成した。腫瘍体積が２００ｍｍ３を上回った時点で、ＴＣ−１皮下腫瘍（動物の右側腹に位置する）を有するＣ５７ＢＬ／６マウスに、この複合体を（マウス尾静脈によって）静脈内投与した。外部磁場を腫瘍領域に局所的に適用し、複合体を、血流を介して輸送させ、腫瘍に濃縮させた（Ｌｕｂｂｅ  ＡＳ，Ｂｅｒｇｅｍａｎｎ  Ｃ，Ａｌｅｘｉｏｕ  Ｃ．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｒｓ  ｗｉｔｈ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｄｒｕｇｓ．Ｉｎ：Ｐａｇｅ  Ｍ，ｅｄｉｔｏｒ．Ｃａｎｃｅｒ  ｄｒｕｇ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：ｔｕｍｏｒ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｔｏｔｏｗａ  ＮＪ：Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ；２００３．ｐｐ．３７９−８８）。例１２に示されたものと類似の投与スケジュール及び用量をコントロール群として使用し、ネガティブコントロール群は、抗腫瘍ペプチドなしでビヒクルのみを受けた。抗腫瘍ペプチドを運搬するナノ粒子化磁性ベクターで治療した群における抗腫瘍効果は、ポジティブコントロールよりも早期に腫瘍体積を減少させることが実証され（ｐ＜０．０５）、生存は、残りの群よりも有意に高かった（ｐ＜０．０５）。これらの結果は、より高い量の治療分子を腫瘍に濃縮させる能力に基づいて、本発明の環状ペプチドについて記載された治療効果を達成するこの技術の潜在能力を実証した。
【０１１７】
（例２０）抗腫瘍及び抗血管新生環状ペプチドを従来の細胞分裂阻害剤と組合せたときの相乗効果
従来の細胞分裂阻害剤の群と個別に組合せた場合の、本発明のペプチド（例えば、Ａ０８Ｐ２５ｓ−ｓ、Ａ０８Ｐ２８ｓ−ｓ、Ｊ０８Ｐ４６ｓ−ｓ、Ｊ０８Ｐ４８ｓ−ｓ）の抗新生物効果の相乗作用を、以下の実験条件下で評価した。Ａ５４９細胞（非小細胞肺癌細胞）を、２００〜１２．５μＭの濃度範囲で、以前に言及したペプチドのうち１種の存在下で、９６ウェルプレート中で培養した。同時に、この研究のために選択した少なくとも１種の細胞分裂阻害剤（シスプラチン、パクリタキセル、５−フルオロウラシル、ビンクリスチン、ドキソルビシン、シクロホスファミド、マイトマイシンＣ、イマチニブ、ベルケイド、イレッサ）を、１〜２０００ｎＭの濃度範囲で添加し、インキュベーションを７２時間延長した。その時点で、細胞の生存率を、ＭＴＴ法によって明らかにした。最後に、吸光度を、全ての場合について５７０ｎｍで測定し、それぞれの用量反応曲線をプロットした。各細胞分裂阻害剤についての細胞増殖の５０％を低下させる用量値（ＩＣ５０）は、それらを本発明のペプチドの少なくとも１種と同時に組合せた場合、１オーダー又は２オーダーの大きさで低下した。これらのアッセイの結果は、本発明において言及された細胞分裂阻害化合物と共に本発明の環状ペプチドを含む医薬組成物の抗新生物効果の増強を実証している。
【０１１８】
（例２１）癌の動物モデルにおける医薬組合せの抗腫瘍効果の増強
この目的のために、５×１０６のＡ５４９細胞を、６〜８週齢のヌードマウス（Ｂａｌｂ／Ｃマウス）において背側領域で皮下経路によって接種した。１０日後、腫瘍が検出可能になった時点で（約３０ｍｍ３）、本発明の医薬組合せを投与した。例１２に示されたのと同じスケジュール及び用量で、適切なビヒクル中に製剤化された本発明の環状ペプチドの少なくとも１種（例えば、Ａ０８Ｐ２５ｓ−ｓ、Ａ０８Ｐ２８ｓ−ｓ、Ｊ０８Ｐ４６ｓ−ｓ及びＪ０８Ｐ４８ｓ−ｓ）を含む組合せの構成成分を腹腔内経路によって投与した。シスプラチン、シクロホスファミド及びマイトマイシンＣなどの細胞分裂阻害剤を、体重１ｋｇ当たり１ｍｇで、同じ治療頻度で、腹腔内の毎日投与によって同時に提供した。細胞分裂阻害剤は、ペプチドと同じビヒクル中に溶解した。最後に、腫瘍塊の体積を測定し、インビボ抗新生物効果を評価するために、時間に対してプロットした。結果により、本発明の医薬組合せが抗腫瘍効果の増強を生じ、両方の成分が同時に投与されたときに腫瘍塊の完全な退縮を促進することが示された。プラセボ群と比較して、腫瘍の成長の顕著な阻害及びまた動物生存における顕著な増加が観察された。これらは全て、癌の適切な予測的前臨床モデルにおいて得られた結果と一致して、本発明の医薬組合せの構成成分間の相乗作用もまたインビボで有効であることを実証している。
【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１４】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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