(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）生物活性化合物を適用することと組み合わせて、ＣａＣｌ２、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、Ｎａ２ＳＯ４、Ｋ２ＳＯ４、（ＮＨ４）２ＳＯ４、ＭｇＳＯ４、ＫＮＯ３、ＮＨ４ＮＯ３、Ｍｇ（ＮＯ３）２、Ｃａ（ＮＯ３）２、ＫＨ２ＰＯ４、ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される浸透圧ショック物質を含有する潅がい用水でアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）属に由来する植物に水を与えることを含む、第一の刺激段階；
（ｂ）段階（ａ）から生ずる、植物由来の膜小胞を抽出することを含む第二の段階、
を含む、内在性膜輸送タンパク質が豊富な植物細胞膜小胞を獲得するための方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、植物に水を与えることが、両端を含む０．５から６ｄＳ  ｍ−１の間の電気伝導度に達する、２５℃の潅がい用水の平均周辺温度に対して０から１０℃の間の温度変化で行われる、方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法であって、浸透圧ショック物質が、両端を含む１０から８０ｍＭの間までの濃度で潅がい用水に添加される、方法。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか一項に記載の方法であって、生物活性化合物が、ビタミン、フェノール化合物、グルコシノレート、これらの化合物の少なくとも一つが豊富な抽出物、またはこれらの少なくとも二つの組み合わせからなる群から選択される、方法。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか一項に記載の方法であって、生物活性化合物が、両端を含む１から７８時間の間の時間、適用される、方法。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか一項に記載の方法であって、生物活性化合物が、両端を含む５から１００μＭの間の濃度で潅がい用水に適用される、方法。
【請求項７】
請求項１から６のいずれか一項に記載の方法であって、植物が、カブ、クレソン、ラディッシュ、コールラビ、キャベツ、赤キャベツ、ルタバガ、芽キャベツ、カラシ、ブロッコリーの品種、キャベツ（ｂｅｒｚａ）およびカブ菜からなる群から選択される、方法。
【請求項８】
請求項１から７のいずれか一項に記載の方法であって、植物が、ブラッシカ・オレラセア（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ）の品種である、方法。
【請求項９】
請求項１から８のいずれか一項に記載の方法であって、第二の段階において、膜小胞が、根、茎、葉、花序、またはこれらの部分の少なくとも二つの組み合わせから選択される植物部分から抽出される、方法。
【請求項１０】
第二の段階において、膜小胞の抽出が、少なくとも一つのホモジナイザー機械での機械的ホモジナイズの段階を含むことを特徴とする、請求項１から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
第二の段階において、膜小胞を抽出することが、リン酸バッファー、重炭酸バッファー、および酢酸バッファーから選択される保存バッファーへの小胞の再懸濁を含むことを特徴とする、請求項１から１０のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化学および薬理学分野に関し、特に、皮膚科学、薬理学または治療学における適用のための、天然の内在性膜タンパク質が豊富な細胞膜（ｍｅｍｂｒａｎａ  ｐｌａｓｍａｔｉｃａ）小胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
動物細胞では、細胞膜タンパク質（ＭＰ）は、例えば癌研究において、膜タンパク質標的薬剤を作製する、治療的介入の可能性のための戦略的要点を提示する（Ｈａｒｖｅｙ  ｅｔ  ａｌ．  ，  ２００１）。植物細胞では、非生物的（ａｂｉｏｔｉｃｏｓ）および生物的ストレスへの応答を制御するシグナル伝達過程はまた、ＭＰのレベルでも起こる。事実、動物細胞および植物細胞の両方で、ＭＰは、イオンおよび代謝産物輸送、エンドサイト−シス、細胞増殖・・・等などの多数の主要機能を制御する。これら全ての過程は、構造および機能の観点から、幅広い極めて変化しやすいタンパク質を含む。
【０００３】
膜タンパク質の性質におけるこの大きな可変性は、抽出過程の数が広範囲に及び、かつ特異的であることを決定する。それゆえ、幅広い分子量および等電点に加え、膜タンパク質は、それらの疎水性および脂質含有量の可変性の点で異なる。このことは、とりわけ膜の脂質相に埋め込まれた数種の膜貫通ドメインを有するタンパク質の場合、それらを除去および精製することを困難にする。
【０００４】
それゆえ、対象のタンパク質を含有し、かつその機能および特性を維持する膜小胞の使用は、安定性および経済的生産コストの低減の観点から、多くの利点を提供する。
【０００５】
膜を通るほとんど全ての溶質の移動は、輸送特異的分子において多かれ少なかれ特定化される、膜輸送タンパク質により介在される。生命体の異なる細胞の多様性および生理機能が、いくつかまたは他の外部要素を捕らえる能力と広く関連するので、各細胞型に対して、および各特異的な生理学的モーメントに対して、特異的な輸送タンパク質のプールが存在するに違いないと仮定される（Ｌｏｄｉｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５）。この差時的（ｄｉｆｅｒｅｎｃｉａｌ）発現は、これらのタンパク質をコードする遺伝子の差時的転写およびそれらの翻訳により、制御される。
【０００６】
これらは、脂質マトリックス内に埋没する多数のアルファヘリックスを有する膜貫通タンパク質である。この構造は、高疎水性脂質媒体において崩壊（ｄｉｓｒｕｐｃｉｏｎ）を生ずるであろう、タンパク質疎水性環境を通る経路を含む可能性がある（Ｌｏｄｉｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５）。これらのタンパク質は輸送経路に関与する；それらはＡＴＰ駆動ポンプ、エネルギー代謝依存性の両方として、または受動チャネルとして働く。
【０００７】
これらのタンパク質のいくつかは、水、イオン、ならびにグリセロールおよび尿素、両者共に化粧品に広く用いられる吸湿剤（ａｇｅｎｔｅｓ  ｈｉｇｒｏｓｃｏｐｉｃｏｓ）、のような小分子を輸送することができる。
【０００８】
完全な膜タンパク質が他の細胞の可溶性タンパク質と比較して、微量成分であるという事実は、抽出のさらなる問題である。これまでのところ、脂質二重層に挿入された場合に、これらの機能的タンパク質の抽出は達成された。また、より高収量での細胞膜からの疎水性タンパク質の抽出が、抽出方法を改変することにより達成された（Ｇｅｒｂｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２）。しかしながら、細胞膜小胞の好適な抽出プロトコルと組み合わせた、内在性タンパク質の刺激法（「エリシター（ｅｌｉｃｉｔａｄｏｒ）」とも呼ばれる）は、膜タンパク質を含有する植物小胞の収量を増加させる。
【０００９】
リポソームは、皮膚科医薬分野および化粧品分野における最も革新的な貢献と見なされている。しかしながら、それらの高コスト、それらの変化しやすいリン脂質純度、およびそれらの不安定さに起因して、小胞を含有する界面活性剤は有利な代替物を提示する。さらに、これらの小胞は、物質の輸送体（ｔｒａｎｓｐｏｒｔａｄｏｒｅｓ）として働くことができる内在性膜タンパク質を含有する。
【００１０】
治療用および化粧品用物質のいくつかが、媒体系において用いられている：
【表１】
0006009545.tif 000002
【００１１】
膜小胞の抽出は、ミクロソーム画分の残りから細胞膜画分を分離することができる、二相ポリマー系の使用によって達成される（Ｌａｒｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  ，  １９８７）。そのため、その手順（ｐｒｏｃｅｄｅ）では、冷却ホモジナイゼーションおよびデキストラン／ポリエチレンエチレングリコール中での分離が行われる。
【００１２】
ヒト表皮に存在するアクアポリン（主にＡＱＰ３）の合成の活性化のため、単独で、または他の活性生物との組み合わせで、植物ペプチドが加水分解される：セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）（ＦＲ２９２５３２５）、ヒトツブコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ｍｏｎｏｃｃｏｃｕｍ）（ＦＲ２９２５３２７）、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ  Ｌ．）（ＦＲ２９２５３２６）、リベットコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ｔｕｒｇｉｄｕｍ）（ＦＲ２９２５３２８）、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）（ＦＲ２９２５３３０）、オートムギ（Ａｖｅｎａ  ｓａｔｉｖａ  Ｌ．）（ＦＲ２９２５３２）、ソラマメ（Ｖｉｃｉａ  ｆａｂａ  Ｌ．）（ＦＲ２９２５３３１）が用いられている。ＡＱＰ３は、表皮におけるケラチノサイトの細胞膜に存在し、皮膚を通る水の流れの制御において重要な役割を果たす。それゆえ、これらのアクアポリンは、角質層（ｓｔｒａｔｕｍ  ｃｏｒｎｅｕｍ）の柔軟性および感覚性の質（ｓｅｎｓｏｒｙ  ｑｕａｌｉｔｉｅｓ）を維持する、ハイドロリピッド（ｈｉｄｒｏｌｉｐｉｄｉｃａ）層の形成に関与する、グリセロールを輸送できる。ケラチノサイトにおけるＡＱＰ３の水和および量は、両者共に、皮膚ＡＱＰ３含量の増加が表皮水和を改善するという点に関連する。
【００１３】
しかしながら、皮膚癌がヒトＡＱＰ３を高度に過剰発現するという発見は、皮膚水和を促進する、アクアポリン発現の修飾因子（ｍｏｄｕｌａｄｏｒｅｓ）の使用において警告を示唆する。
【００１４】
アクアポリンの合成を活性化するための成分の使用の代替案は、表皮における水または他の物質の放出において、脂質媒体として用いられるであろう、アクアポリンおよび他の膜タンパク質の両方が豊富な、天然の小胞の使用である。
【００１５】
アクアポリンはまた、水溶性または油性溶液の形状で、局所使用のための医薬製剤を決定し、化粧品製剤内にも組み込まれる（ＦＲ２００１００１３４６３）。しかしながら、他の膜輸送タンパク質、生物活性化合物または吸湿剤も含む、天然起源（植物）の膜小胞の使用は、そのような製剤には含まれておらず、本発明の基礎を含む。
【００１６】
アブラナ科（ｆａｍｉｌｉａ  Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）（アブラナ科（Ｃｒｕｃｉｆｅｒａｅ）またはアブラナ科（ｆａｍｉｌｉａ  ｄｅ  ｌａｓ  ｃｒｕｃｉｆｅｒａｓ）とも呼ばれる）は、最大３５００植物種を含む。いくつかの疫学研究では、ブロッコリー（ブラッシカ・オレラセア（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ））を含むまたはアブラナ科（ｃｒｕｃｉｆｅｒａｓ）が、窒素−硫黄、グルコシノレート、フェノール系天然酸化防止剤（フラボノイド、アントシアニンおよびフェノール酸）、ビタミン（Ｃ、Ｅ、Ａ、Ｋ等）、およびミネラル（窒素、リン、カリウム、カルシウム、鉄、マンガン、マグネシウム、亜鉛、銅、セレン等）のような、生物活性二次代謝産物の豊富な源であることを示している。（Ｆａｈｅｙ  ｅｔ  ａｌ．  ２００１；  Ｍｏｒｅｎｏ  ｅｔ  ａｌ．  ２００６）。
【００１７】
植物成分はまた、化粧品工業、例えば、異なる果実、ベリー、およびブロッコリーを含むアブラナ科の野菜の芽またはスプラウトの使用、において、皮膚に関連した、ローション、マッサージクリーム、栄養クリーム、ゲル、アンチエイジング、解毒における適用で、あるいは、疾患の治療に関連して、用いられる。また、ブロッコリーを含む野菜および生物活性化合物は、場合によっては０．１から１０％の野菜抽出固形分重量で存在する、アンチエイジング製剤における添加剤として、粉末、錠剤、カプセルまたは油性沈殿物内に組み込まれる（米国２００９／０３２４５２２）。
【００１８】
これらの生物活性化合物のいくつかは、表皮内への遅延放出（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ  ｌｉｂｅｒａｃｉｏｎ）のための脂質小胞内へ組み込まれ得る。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１９】
【非特許文献１】Ｄｕｍａｓ  ｅｔ  ａｌ．  ２００７．  Ｊ．  Ｄｒｕｇｓ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，  （６  Ｓｕｐｐｌ）：ｓ２０−４．
【非特許文献２】Ｆａｈｅｙ  ｅｔ  ａｌ．  ２００１．Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５６，  ５−５１．
【非特許文献３】Ｇｅｒｂｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．  ２００２．  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  ３０，  ７１−８．
【非特許文献４】Ｈａｒａ−Ｃｈｉｋｕｍａ  ａｎｄ  Ｖｅｒｋｍａｎ．  ２００８ｂ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２８，  ３２６−３３２．
【非特許文献５】Ｈａｒｖｅｙ  ｅｔ  ａｌ．  ２００１．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ５，  １２９−１３６．
【非特許文献６】Ｌａｒｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  １９８７．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１４８，  ５５８−５６８．
【非特許文献７】Ｌｏｄｉｓｈｅｔ  ａｌ．  ２００５．  Ｂｉｏｌｏｇｉａ  ｃｅｌｕｌａｒ  ｙ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ．  Ｂｕｅｎｏｓ  Ａｉｒｅｓ：  Ｍｅｄｉｃａ  Ｐａｎａｍｅｒｉｃａｎａ．  ＩＳＢＮ  ９５０−０６−１９７４−３
【非特許文献８】Ｍｏｒｅｎｏ  ｅｔ  ａｌ．  ２００６．  Ｊ．  ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＡｎａｌｙｓｉｓ  ４１：１５０８−１５２２
【非特許文献９】Ｓｏｕｇｒａｔ    ｅｔ  ａｌ．  ２００２．  Ｊ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１１８，６７８−８５．
【非特許文献１０】Ｊａｉｎ  ＮＫ，  Ｋｈｏｐａｄｅ  ＡＪ，  Ｖｏｒａ  Ｂ．  Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １９９８，  ５４，  １４９−１６５．
【非特許文献１１】Ｍｏｋｈｔａｒ  Ｍ，  Ｓａｍｍｏｕｒ  ＯＡ，  Ｈａｍｍａｄ  ＭＡ，  Ｍｅｇｒａｂ  ＮＡ．  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  ２００８  ３６１，  １０４−１１１．
【非特許文献１２】Ｇｕｐｔａ  Ａ，  Ｐｒａｊａｐａｔｉ  ＳＫ，  Ｂａｌａｍｕｒｕｇａｎ  Ｍ，  Ｓｉｎｇｈ  Ｍ，  Ｂｈａｔｉａ  Ｄ．．  Ｔｒｏｐ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ  ２００７，  ６，  ６８７−６９３．
【非特許文献１３】Ｔｓａｉ  ＹＨ，  Ｆａｎｇ  ＪＹ，  Ｙｕ  ＳＹ，  Ｗｕ  ＰＣ，  Ｈｕａｎｇ  ＹＢ．  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  ２００１，  ２１５，  ９１−９９．
【非特許文献１４】Ａｌｓａｒｒａ  ＩＡ，  Ｂｏｓｅｌａ  ＡＡ，  Ａｈｍｅｄ  ＳＭ，  Ｍａｈｒｏｕｓ  ＧＭ．  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｐｈａｒｍ  ２００５，  ５９，  ４８５−４９０．
【非特許文献１５】Ａｚｅｅｍ  Ａ，  Ｊａｉｎ  Ｎ，  Ｉｑｂａｌ  Ｚ，  Ａｈｍａｄ  ＦＪ，  Ａｑｉｌ  Ｍ，  Ｔａｌｅｇａｏｎｋａｒ  Ｓ．  Ｐｈａｒｍ  ＤｅｖＴｅｃｈｎｏｌ  ２００８，  １３，  １５５−１６３．
【非特許文献１６】Ｔｈａｋｕｒ  Ｒ，  Ａｎｗｅｒ  ＭＫ，  Ｓｈａｍｓ  ＭＳ，  Ａｌｉ  Ａ，  Ｋｈａｒ  ＲＫ，  Ｓｈａｋｅｅｌ  Ｆ，  Ｔａｈａ．  Ｊ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔ  ２００９，  １７，  ４４２−４４９．
【非特許文献１７】Ｖａｒｓｈｏｓａｚ  Ｊ，  Ｐａｒｄａｋｈｔｙ  Ａ，  Ｍｏｈｓｅｎ  Ｓ，  Ｂａｈａｒａｎｃｈｉ  Ｈ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  ２００５，  １２，  ７５−８２．
【非特許文献１８】Ｉｗａｉ  Ｈ，  Ｆｕｋａｓａｖａ  Ｊ，  Ｓｕｚｕｋｉ  Ｔ．  Ｉｎｔ  Ｊ  ＣｏｓｍｅｔＳｃｉ  １９９８，  ２０（２），  ８７−１０２．
【非特許文献１９】Ｂｒｉｎｏｎ  Ｌ，  Ｇｅｉｇｅｒ  Ｓ，  Ａｌａｒｄ  Ｖ，  Ｄｏｕｃｅｔ  Ｊ，  Ｔｒａｎｃｈａｎｔ  ＪＦ，  Ｃｏｕａｒｒａｚｅ  Ｇ．  Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｒｅｌｅａｓｅ．  １９９９，  ６０，  ６７−７６．
【非特許文献２０】Ｃｉｏｃａ，  Ｇ．，  Ｊａｍｅｓ，  Ａ．Ｈ．，  Ｍａｎｕｅｌ，  Ｌ．Ｔ．，  Ｈｅｒｓｔｅｉｎ，  Ｍ．，  Ｗａｌｔｅｒ，  Ｐ．：  ＵＳ４９９９３４８  （１９９１）．
【発明の概要】
【００２０】
発明の説明
本発明は、薬理学的または治療学的使用のための、天然の生物活性化合物、吸湿剤または化学物質などの、他の物質を次々に含有できる、アクアポリンおよび他の膜輸送タンパク質が豊富な植物細胞膜小胞（アブラナ属（ｂｒａｓｓｉｃａ）に由来する）を獲得する手順に言及する。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明の第一の態様は、植物由来膜の溶質および水透過性と関連する内在性膜タンパク質の量を増加させるための方法に関する。
【００２２】
本発明の第二の態様は、異なる用途のための有効量の膜タンパク質を含む、上述の方法により産生される膜小胞に言及する。
【００２３】
第三の態様は、表皮内への水または他の物質の送達／放出を可能にする、細胞膜小胞の応用分野に言及する。
【００２４】
具体的には、第一の態様において、本発明は：
−植物に、非生物的ストレスおよび生物活性化合物の両方の組み合わせ処理を適用する、刺激（または誘発（ｅｌｉｃｉｔａｃｉｏｎ））の第一の段階。
−膜小胞抽出を含む第二の段階。
を含む、内在性膜輸送タンパク質が豊富な植物細胞膜小胞を獲得するための方法に言及する。
【００２５】
以下、植物小胞において、アクアポリンおよび他の膜輸送タンパク質を豊富にする手順を、「本発明の手順」と命名する。
【００２６】
好ましくは、本発明の手順は、全植物における、または、膜小胞抽出のための起源植物物質（ｍａｔｅｒｉａｌ  ｖｅｇｅｔａｌ  ｄｅ  ｐａｒｔｉｄａ）として用いられるであろう、葉、茎、根および花序（ｉｎｆｌｏｒｅｓｃｅｎｃｉａ）、もしくはそれらの任意の組み合わせなどの植物の一部分における、膜タンパク質増加を含む、刺激の方法を含む。
【００２７】
それゆえ、小胞抽出は、異なる野菜、好ましくは、アブラナ科（ｆａｍｉｌｉａ  Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）（アブラナ科（Ｃｒｕｃｉｆｅｒａｅ）としても知られる）、アブラナ科（ｆａｍｉｌｉａ  ｄｅ  ｌａｓ  ｃｒｕｃｉｆｅｒａｓ）、およびより好ましくはブラシカ種（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｓｐｐ．）に由来する、全植物、または、根、茎、葉、花序もしくはこれらの部分の可能な組み合わせから選択される植物の一部分から獲得できる。それゆえ、一つの好ましい実施形態は、植物がアブラナ科（ｆａｍｉｌｉａ  Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）に属する場合の本発明の手順である。
【００２８】
野菜は、カブ、クレソン、ラディッシュ、コールラビ、キャベツ、ロンバルダキャベツ（赤キャベツとも呼ばれる）、ルタバガ（ｒｕｔａｂａｇａ）、芽キャベツ（ｃｏｌｅｓ  ｄｅ  Ｂｒｕｓｅｌａｓ）、カラシ、キャベツ（ｒｅｐｏｌｌｏ）異なる品種のブロッコリー（ブロッコリーニ（ｂｒｏｃｏｌｉｎｉ）、ブロッコリー、ロマネスコブロッコリー（ｂｒｏｃｏｌｉ  ｒｏｍａｎｅｓｃｏ）、白もしくは紫のブロッコリー等）、ならびに、キャベツ（ｂｅｒｚａ）、カブ菜、フダンソウ、キクヂシャ、ホウレンソウ、ビート、レタス、セージ、タマネギ、ニンニクなどの他の園芸植物から選択され、かつ、それらの健康を促進する植物性化学物質（ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ）および栄養素のいずれかを含有してもよい。より好ましくは、野菜は、カブ、クレソン、コールラビ、キャベツ、ロンバルダキャベツ、ルタバガ、芽キャベツ、カラシ、キャベツ（ｒｅｐｏｌｌｏ）、キャベツ（ｂｅｒｚａ）、カブ菜、レタス、ホウレンソウ、フダンソウ、キクヂシャ、セージ、タマネギおよびニンニクからなる群から選択される。さらにより好ましい一つの実施形態において、植物はブロッコリーである。
【００２９】
本発明において、ブロッコリーは、任意の品種のブラッシカ・オレラセア（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ）［イタリカ・グループ］として理解され、その内在性アクアポリン発現を増加させるであろう、制御された農学条件によりミネラルが豊富な培地が豊富であってもよい、任意のタイプの生育および環境条件の中で成長する。
【００３０】
本発明の手順は、生物活性化合物、ビタミン、フェノール化合物、グルコシノレート、これらの化合物の少なくとも一つ、またはそれらの少なくとも二つの組み合わせが豊富な抽出物を介する刺激を含む。好ましい一つの実現において、生物活性化合物の適用時間は両端を含む１から７８時間の間で変化する。好ましくは、潅がい用水中で達する濃度は両端を含む５から１００μＭの間で変化する。
【００３１】
さらにまた、生物活性化合物の適用と共に、より好ましくは温度が両端を含む１５から３５℃の間である、植物に用いられる潅がい溶液への浸透圧ストレス物質の添加を含む、非生物的ストレス、好ましくは、潅がい用水の電気伝導度（ＥＣ）を改変すること、に供される。言い換えると、生物活性化合物は、両端を含む０．５から６ｄＳ  ｍ−１の範囲で、植物潅がい用水の電気伝導度（ＥＣ）が既に増加されていた場合に、さらに適用される。それは、溶液の電気伝導度が温度１度上昇ごとに約２％増加するので、好ましくは潅がいタンクにおいて異なる温度範囲と組み合わされる１０から８０ｍＭの間の濃度で、好ましくは０から１０℃の間、２５℃の平均周辺温度のあたりで、浸透圧ストレス物質の添加（ｍＭ濃度で）後に達成された。好ましい実現において、浸透圧ストレス物質は：ＣａＣｌ２、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、Ｎａ２ＳＯ４、Ｋ２ＳＯ４、（ＮＨ４）２ＳＯ４、ＭｇＳＯ４、ＫＮＯ３、ＮＨ４ＮＯ３、Ｍｇ（ＮＯ３）２、Ｃａ（ＮＯ３）２、ＫＨ２ＰＯ４、ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４、マンニトール、ソルビトール、ポリエチレングリコール、およびこれらの化合物の組み合わせから選択される。
【００３２】
小胞抽出は、先行技術文献リストに組み込まれるＬａｒｓｓｏｎら、１９８７年の技術に従って実行された。しかしながら、その方法には、低コストおよびより短い抽出時間のため、工程を工業的規模とする、いくつかの改変を含めた。それゆえ、真空ろ過および手動のホモジナイゼーションの代わりに、自動機械式ホモジナイゼーションを備えるホモジナイザーシステム、冷却下（４−１０℃）、速度および時間の様々な組み合わせを備える、ポリトロン型または機械式ミキサー（Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘ）が採用された。言い換えると、このことは、本発明の方法の第二の段階が、少なくとも一つのホモジナイザーによる機械式ホモジナイゼーションの段階を含み、膜小胞の抽出に言及したことを意味する。ホモジナイゼーション速度は、１０００−４０００ｒｐｍの速度で０から１分の最初の時間経過で、０から５０００ｒｐｍへ変化し、かつ、３０００−５０００ｒｐｍの速度で０から２５秒の第二のホモジナイゼーション段階であった。また、保存バッファーは、皮膚を通って吸収される、公開されている抽出方法で記載される、ＰＩＰＥＳバッファーなど、ヒト健康に毒性または有害を引き起こし得るそれらの化合物を除去するために、改変され、かつ、以下の別のバッファーで置換された：同じ濃度およびｐＨの、重炭酸バッファー、リン酸バッファーおよび酢酸バッファー。それゆえ、本発明による膜小胞の抽出は、抽出された小胞を、リン酸、重炭酸および酢酸バッファー中に再懸濁することを含む。
【００３３】
本発明の第二の態様は、有効量の膜輸送タンパク質を含む、上述の条件により獲得された、膜小胞に言及する。
【００３４】
本発明において、「有効量」とは、ヒトおよび動物の両方に対して、水和／健康レベルで有効性を有するのに十分な、かつ皮膚科学的、薬理学的または治療学的目的に適用可能な、本発明の方法により獲得された小胞内の膜タンパク質の量として理解される。
【００３５】
本発明の第三の態様は、工業的および商業的目的のための、膜輸送タンパク質が豊富な膜小胞の使用に言及する、それらが、水、生物活性物質、吸湿剤、塩、および抗体または化粧用途もしくは治療用途のための任意の製剤などの他の化学物質の放出／送達のための、天然の担体／媒体であり得るためである。すなわち、これらの小胞は、さらなる物質、好ましくは天然の生物活性化合物、吸湿剤、化学物質、またはこれらの物質の任意の可能な組み合わせを、そこに組み込み、皮膚科学的、薬理学的または治療学的目的に適用可能であり得る。
【００３６】
病態生理学的過程の治療において、薬物送達は、ある濃度でその作用部位に薬物が到達するように実行されることが望ましい。リポソームは、生分解性およびエンドサイトーシス感受性であるという利益を有する、薬物およびとりわけ糖タンパク質のベクターとして用いられている。
【００３７】
リポソームは、脂溶性または両親媒性の、様々な吸湿性の作用物質を捕らえることができる、水性部分（ｃｏｍｐａｒｔｉｍｅｎｔｏｓ  ａｃｕｏｓｏｓ）を備えた、同心のリン脂質二重層によって構成された微少な小胞である。
【００３８】
それゆえ、本発明は、局所適用または治療用途のための、特異的物質放出のための、輸送システムまたはベクターとしての植物細胞膜小胞の使用に言及する。
【００３９】
これらの小胞は、その構造に、膜タンパク質を介して輸送され得る、水、イオン、およびアンモニア、低分子量糖、グルコシノレート、尿素およびグリセロール（水和剤）などの他の物質の放出ができるようにする、それゆえ、化粧品または皮膚科学、水和または差し込みの治療、やけどおよび他の傷のために使用する、膜輸送タンパク質を含む。
【００４０】
さらにまた、本発明は、化粧品製剤においてそれらを使用する、抗酸化能力を備える、植物由来の生物活性物質（ビタミンＣ、グルコシノレート、またはフェノール化合物）を含有する、膜小胞の使用に言及する。
【００４１】
本発明の別の態様は、有効量の膜輸送内在性タンパク質を含み、液体製剤または飲料（乳またはジュースなどの液状食品）において、少なくとも一つの上述の生物活性化合物の担体および安定剤として作用する、本発明の方法により獲得される小胞に言及する。本発明において、以下の本発明の手順で獲得される小胞は、実施例５に示されるように、液体製剤において、グルコシノレートなどの生物活性化合物の安定性を増加させたことが発見された。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】ウェスタンブロッティングによる免疫検出。細胞膜タンパク質（アクアポリン）に対するシグナル強度が、対照植物および本発明の刺激方法（誘発（ｅｌｉｃｉｔａｃｉｏｎ））に暴露された植物において示された。
【図２】吸湿剤の有無での小胞の水和の比較。適用される小胞中の細胞膜タンパク質濃度は、２μｇ  μＬ−１であった。■  吸湿剤有りの小胞適用。◆  吸湿剤無しの小胞適用。▲  小胞無しの吸湿剤の直接適用。
【図３】ブロッコリー根および葉由来の細胞膜小胞における、総グリコシノレート安定性（ｎ＝３）。
【図４】化粧品製剤におけるブロッコリー根由来の細胞膜小胞の機能性。サンプル調製後５日目、１ヶ月目、および６ヶ月目で測定された。
【図５】細胞層上のスクラッピングによる創傷治癒アッセイの表示。１：細胞無しの空スペースを作製するための均一な細胞スクレイピングの実施。２：１で生成された空スペース内への細胞の遊走。３：１で生成された空スペースの細胞侵入。
【図６】グルコシノレートを備える小胞存在下でインキュベートされたヒトケラチノサイト（ＨａＣａＴ）による、細胞治癒アッセイの進展。画像は、細胞層を除去した後、およびグルコシノレートを備える小胞の存在下で、０時間（左）、８時間（中央）および１６時間（右）のインキュベーション後に撮影された。
【図７】ヒトケラチノサイト（ＨａＣａＴ）を欠く細胞占有領域（ａｒｅａ  ｄｅ  ｏｃｕｐａｃｉｏｎ  ｃｅｌｕｌａｒ）対グルコシノレートを含有する小胞の存在下でのインキュベーション時間（時間）。直線の傾きは、μｍ２／ｈで表される領域占有率を示す。
【図８】根由来の細胞膜小胞の有無でのＨａＣａＴ細胞生育の比較（ｎ＝３）。
【図９】様々な濃度のグルコシノレートを含有する小胞の存在下、８００  Ｊ／ｍ２のＵＶＢで処置され、７２時間インキュベートされた、ヒトケラチノサイト（ＨａＣａＴ）の生存パーセンテージ。抽出濃度に依存する細胞における保護効果が観察された。
【図１０】グルコシノレートを含有するブロッコリー小胞と比較した、葉および根に由来する細胞膜小胞の混合物の上清における、グルコシノレートのＢ１６細胞の細胞毒性溶液（ｎ＝３）。
【実施例】
【００４３】
以下の実施例は、本発明の小胞の調製および用途の例示であり、決して、範囲を限定するものとして解釈されない。
【実施例１】
【００４４】
実施例１．植物膜タンパク質の刺激方法（図１）
本発明の方法は、ブロッコリー栽培において２４時間５０μＭの濃度で潅がい用水に添加された、生物活性化合物、シニグリンなどの脂肪族グリコシレートによる刺激を含む。化合物添加の前に、潅がい用水の電気伝導度（ＥＣ）が改変され、４０ｍＭ  ＫＣｌなどの浸透圧ストレス物質の適用の後、６ｄＳ  ｍ−１に増加した。タンパク質抽出はポリトロンを用いて葉組織（２０ｇ）から自動で実施し、ホモジナイゼーションの第一段階では４０００ｒｐｍで１５秒間、第二段階では５０００ｒｐｍで２０秒であった。５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳおよび０．５Ｍ（ｐＨ  ７．５）マンニトールを含有する抽出バッファー、このバッファーに、次いで１ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、５ｍＭアスコルビン酸および０．６％（ｗ／ｖ）不溶性ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、１０％グリセロールおよび５ｍＭ  β−グリセロールリン酸を添加した。ホモジネートを４℃で、２０分間、１０．０００ｇで遠心し、上清を回収し、４℃で３５分間、５５．０００ｒｐｍで遠心した。沈殿物をバッファー（０．３Ｍマンニトール、５ｍＭ重炭酸塩バッファー、ｐＨ７．０−８．０）に再懸濁した。
【００４５】
懸濁液を、二重相６．０％（ｗ／ｖ）デキストランＴ５００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ），  ６．０％（ｗ／ｖ  ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）３３５０（Ｓｉｇｍａ）、３ｍＭ  ＫＣｌ、５  ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．８）および０．３３Ｍマンニトールまたはスクロースを備えるポリマー系へ添加した。相系を４℃で５分間、４０００ｇで遠心した。細胞膜を回収する上相を、新たなバッファー中（０．３３Ｍスクロースを有する、ｐＨ８．３の１０ｍＭ重炭酸塩バッファーである保存バッファー中）に希釈した。
【実施例２】
【００４６】
実施例２．アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）栽培品種からの抽出効率
細胞膜小胞抽出の収量が、他の栽培品種に関してアブラナについて評価された。表１には、異なる植物に関する膜小胞のタンパク質含有量が示される。刺激の後に成長するアブラナは、大量の細胞膜タンパク質をもたらした。表は、μｇ  μＬ−１で表されるタンパク質の量を示す。開始植物物質（ｓｔａｒｔｉｎｇ  ｐｌａｎｔ  ｍａｔｅｒｉａｌ）の量がより高かったため、サトウダイコン（Ｂｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）から単離した小胞でさえ、他の栽培品種について得られたものよりも、本方法の収量がより高い。またさらに、機械的抽出が性能の低下を含んでことを考慮して、タンパク質レベルは産業レベルで計ることができる方法論の適用によって、大多数の植物上に残る。
【００４７】
表１．植物小胞＊中に存在する細胞膜タンパク質（本発明の対象）の濃度の比較。濃度は植物刺激および機械的抽出の後に得られた。
【表２】
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【００４８】
表２はブロッコリー（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ  ｖａｒ  Ｉｔａｌｉｃａ）において、ＨＰＬＣ−ＭＳ−ＭＳによって同定された膜タンパク質のリストを示す。
【００４９】
表２．３種の異なるエンドプロテアーゼでの消化後、ブロッコリー（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ  ｖａｒ  Ｉｔａｌｉｃａ）由来の、細胞膜小胞において同定された、膜輸送タンパク質。
【表３−１】
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【表３−２】
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【表３−３】
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【表４】
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【表５】
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【実施例３】
【００５０】
実施例３．皮膚での小胞の水和試験
皮膚が水分喪失の極値を有する５名のボランティアでアッセイを実行した。実施例１に記載の保存バッファー中、２μｇ  μＬ−１の濃度での純小胞で、方法を実施した。吸湿剤有りまたは無しでの小胞間の比較研究を行った。吸湿剤を参照としてとった。手の甲の皮膚で２４時間ごとに測定した。三日目に処置を停止した。
【実施例４】
【００５１】
実施例４．ボランティアによる皮膚水和試験
１５名のボランティアで試験を実行した。目に近い顔の皮膚に小胞を適用した。２０および０．２μｇ  μＬ−１の濃度で、実施例１に記載の保存バッファー（ｐＨ６）中に希釈した小胞を用いて、実験を行った。吸湿剤としてグリセロールを小胞へ添加した（０．０２％）。一日あたり二回適用した。２セットの実験を展開した、短時間（０時間、１０分、１時間、２時間）適用および長時間（０日、２日、５日および７日）適用。結果を表３および４に示す。
【００５２】
表３．タンパク質濃度として表される、濃縮量および希釈量（２０ｙ  ０．２μｇ・μＬ−１）での、ブロッコリー葉から抽出された小胞が豊富な溶液、および吸湿剤としてグリセロールの適用後の、顔面皮膚からの水分喪失の減少パーセンテージ。試験は、短期間、１５名のボランティアにおいて行われた。
【表６】
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【００５３】
表４．タンパク質濃度として表される、濃縮量および希釈量（２０ｙ  ０．２μｇ・μＬ−１）での、ブロッコリー葉から抽出された小胞が豊富な溶液、および吸湿剤としてグリセロールの適用後の、顔面皮膚からの水分喪失の減少パーセンテージ。試験は、長期間、１５名のボランティアにおいて行われた。
【表７】
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【実施例５】
【００５４】
実施例５．小胞におけるグリコシノレートの安定性
膜タンパク質が豊富な（０．３ｍｇ  ｍｌ−１タンパク質）ブロッコリー植物由来の根および葉膜小胞を、ブロッコリー種子から得られたグリコシノレートが豊富である抽出物と混合した。ブロッコリーの種子はあらかじめ洗浄され、消毒され、１００℃で２４時間、オーブンで乾燥された。種子を７０％メタノール（ｖ／ｖ）でホモジナイズして、ピューレ状のホモジネートを得た。撹拌しながら２０分間、７０℃で試料を加熱した。次いで、それらを１５分間遠心し（１７，５００ｇ、４°Ｃにて）、Ｎ２で揮発させた。最後に試料を超純水ミリＱ中に再懸濁し、０．４５μｍメッシュ（ポリエーテルサルフォン（ｐｏｌｉｅｔｅｒｓｕｌｆａｎｏ）のＭｉｌｌｅｘ  ＨＶ１３、ミリポア）を通してろ過した。グルコシノレートを備える小胞の混合物を超遠心し、小胞内に含まれない残存グリコシノレートを除去した。小胞を初期量に再懸濁した。上清は対照と考えられた。結果を図３に示す。
【実施例６】
【００５５】
実施例６．化粧品製剤における小胞安定性
脂肪を含まない化粧品製剤および０．１％のプロテオグリカンをベースとする溶液中の顔面血清成分。この製品は、０．０２％濃度の、ブロッコリー根からの膜小胞抽出物の添加に基づいていた。結果は、光散乱ストップトフロー法による、浸透圧変化に対する小胞応答の安定性を測定することにより、決定した。光散乱における小胞量の動態はλｅｘ＝５１５ｎｍ、９０°に調節した。ストップトフロー分光光度計ＳＦＭ３にて、２０℃で測定を実施した。同一の培地で溶液を希釈した。低浸透圧ショックは、小胞の一時的な開口に関連した膜希釈を引き起こし、その後、小胞外溶液内の平衡を保った。Ｋは収縮の速度に関連する指数関数的な定数である。
【００５６】
結果を図４に示す。
【実施例７】
【００５７】
実施例７．培養ケラチノサイト（ＨａＣａＴ）における低細胞毒性。ＭＴＴアッセイによる細胞生存率。
ＨａＣａＴ細胞株（ＡＴＣＣ、メリーランド州、ロックビルから）を、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、１％（ｖ／ｖ）ペニシリン−ストレプトマイシン（それぞれ、０．１ｍｇ／ｍｌおよび１００Ｕ／ｍｌ）添加ＤＭＥＭ培地にて、加湿環境におけるＣＯ２（５％  ｖ／ｖ）、３７℃で、２４時間、生育させた。細胞は、製造業者の推奨に従って三日ごとにトリプシン処理し、実施されるアッセイの種類によって、６ウェルまたは９６ウェルに配置した。
【００５８】
ＭＴＴアッセイは、細胞生存率を決定する、簡便、定量的かつ信頼できる方法として用いられた。試薬ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド）は、生存細胞のミトコンドリアにおいてホルマザン結晶へと還元される。グルコシノレートを備える小胞存在下で、７２時間、細胞をインキュベートした後、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＭＴＴと、３−４時間、３７℃および５％  ＣＯ２で、インキュベートした。培地が除去された後、１００μｌのＤＭＳＯが、水に不溶性であるホルマザン血漿を溶解するために添加された。プレートを１５分間振盪し、プレートリーダーを用いて５７０ｎｍで吸光度を定量した（ＳＰＥＣＴＲＯｓｔａｒ  Ｏｍｅｇａ、ドイツ、オッフェンブルク、ＢＭＧ  ＬａｂＴｅｃｈ  ＧｍｂＨ）。グルコシノレートを備える小胞を含有する抽出物について、１０ｍｇ  ｍｌ−１のタンパク質濃度まで、細胞毒性は観察されなかった。
【実施例８】
【００５９】
実施例８．ヒトケラチノサイトのスクレイピングによる細胞マットでの治癒アッセイ（創傷治癒アッセイ）
引っかき（ｓｃｒａｔｃｈ）による細胞単層での治癒アッセイは、細胞極性、細胞外マトリックスリモデリングおよび異なる細胞種の細胞移動を決定するために使用される技術である。試験は、ハンドルによって直接、または接着された（ｄｅｐｏｓｉｔ）細胞の生育を妨げる、規定された範囲の挿入による、コンフルエントな細胞層（ｌａｗｎ）へ均一な引っかき（ｓｃｒａｔｃｈ）の実施、および細胞から約１ｍｍの「通路（ｃｏｒｒｉｄｏｒ）」を作成することを含む。空きスペースへの細胞の侵入は、細胞型に依存して、数時間から数日かかった。ラックおよび明視野顕微鏡を用いて、単位時間当たりの領域を測定する（１５分のフレーム間隔で、２４時間のビデオを作成する）ことにより、曲線の傾きの決定を介して、細胞が空きスペースへ侵入する速度を決定した。
【００６０】
プロトコル：５×１０５細胞／ｍｌのヒトケラチノサイトの細胞懸濁液を、適切なインサートを含有するウェル内に、ウェル当たり３５０００細胞の密度で、３５ｍｍプレートに播種した。細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、１％（ｖ／ｖ）ペニシリン−ストレプトマイシン（それぞれ、０．１ｍｇ／ｍｌおよび１００  Ｕ／ｍｌ）添加ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にて、加湿環境におけるＣＯ２（５％  ｖ／ｖ）、３７℃で、２４時間、インキュベートし、次いでインサートを除去した。細胞無しの空間で、２４時間、１５分ごとに写真を撮影して、顕微鏡で細胞生育の進行が観察され、確認された。次いで、時間に対して侵入した細胞によって領域を示し（μｍ２）、図７のような生育曲線を提供した。対照にて得られた曲線の傾きと比較して、実施例３で調製されたグルコシノレートを備える小胞（０．３ｍｇ  ｍｌ−１タンパク質）の存在下で得られた曲線の傾きでは、μｍ２／ｈまたはａ＝２．４  ｘ  １０５（領域占有速度（ｖｅｌｏｃｉｄａｄ  ｄｅ  ｏｃｕｐａｃｉｏｎ  ｄｅ  ａｒｅａ））であった。結果は、１１±１％の、小胞を含有する細胞の領域を占有する速度の増加（ｎ＝３）であり、その治癒能力を示した。
【実施例９】
【００６１】
実施例９．ヒトケラチノサイトの増殖アッセイによる皮膚治癒の決定
表皮細胞の治癒力を決定するために、ヒトケラチノサイト（ＨａＣａＴ）に置いて増殖アッセイを実施した。ケラチノサイトを、５％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２０ｍｇ  ｍｌ−１ゲンタマイシン、３５０μｇ  ｍｌ−１フンギゾンを添加した、ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＨ７．４にて培養した。０．１％の濃度で膜タンパク質が豊富な小胞をケラチノサイトに添加し、ＭＴＴによって増殖を決定した。結果が図８に示される。
【実施例１０】
【００６２】
実施例１０．ＵＶ照射によって誘発された損傷に対するヒトケラチノサイト（ＨａＣａＴ）の増殖
ＨａＣａＴ細胞株（ＡＴＣＣ、メリーランド州、ロックビルから）を、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、１％（ｖ／ｖ）ペニシリン−ストレプトマイシン（それぞれ、０．１ｍｇ／ｍｌおよび１００Ｕ／ｍｌ）添加ＤＭＥＭ培地にて、加湿環境におけるＣＯ２（５％  ｖ／ｖ）、３７℃で、２４時間、生育させた。細胞は、製造業者の推奨に従って三日ごとにトリプシン処理し、９６ウェルプレートに播種された。処理のため、細胞は播種後２４時間の、プレート上で維持された。細胞が７０−９０％のコンフルエンシーに達した時、ＰＢＳで洗浄し、様々な濃度の試験される抽出物を含有するＰＢＳの薄い層で処理した。次いで、プレートをＵＶ照射システム（バイオ−リンク  クロスリンカー  ＢＬＸ−Ｅ３１２）を用いてＵＶＢ光源（８００  Ｊ／ｍ２）で処理した。次いで、ＰＢＳバッファーを新鮮培地で置き換え、７２時間インキュベートした。７２時間、新鮮培地で細胞をインキュベートした後、ＰＢＳで洗浄し、３７℃および５％  ＣＯ２で、３−４時間、ＭＴＴでインキュベートした。培地を除去し、１ウェル当たり１００μｌのＤＭＳＯを添加して、水に不溶性であるホルマザン結晶を溶解した。プレートを１５分間振盪させ、プレートリーダーを用いて５７０ｎｍで、吸光度を測定した（ＳＰＥＣＴＲＯｓｔａｒ  Ｏｍｅｇａ、ドイツ、オッフェンブルク、ＢＭＧ  ＬａｂＴｅｃｈ  ＧｍｂＨ）。結果が図９に示される。
【実施例１１】
【００６３】
実施例１１．マウスＢ１６メラノーマにおける細胞毒性。ＭＴＴアッセイによる細胞生存率。
高転移能を有する細胞株、Ｂ１６（ＡＴＣＣ、メリーランド州、ロックビルから）を播種し、１０％ウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００Ｕペニシリンおよび１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＨ７．４で培養した。播種された細胞を、湿潤オーブン（ｅｓｔｕｆａ  ｈｕｍｅｄａ）で３７℃、５％  ＣＯ２で維持した。２４時間のインキュベーションの後、培養培地を、０．５％の濃度で、実施例３に記載されるように調製されたグルコシノレート小胞を含有する新たな上清で置き換えた。
【００６４】
細胞生存率を前記アッセイおよび乳酸デヒドロゲナーゼ活性のトリパンブルー排除アッセイにより測定した（図１０）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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