(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
基材と、前記基材上に設けられた、細胞を培養するための機能性層とを有する細胞培養基材の評価方法であって、
機能性層の表面に液滴を供給する工程と、
供給した液滴が蒸発する過程における、液滴及び機能性層が接触する接触領域の減少速度を測定する工程と、
を有し、
測定した減少速度に基づいて、機能性層の状態の評価を行う前記細胞培養基材の評価方法。
【請求項２】
供給した液滴が蒸発する過程における、液滴の接触角の変化を測定する工程をさらに有し、
接触角の変化が、接触角が減少する区間と、その後に略一定の接触角を維持する区間と、その後に接触角が再び減少する区間とを含み、接触領域の減少速度は、前記略一定の接触角を維持する区間における減少速度である請求項１に記載の細胞培養基材の評価方法。
【請求項３】
機能性層が、温度変化により細胞接着性が変化する温度応答性ポリマーを含む請求項１又は２に記載の細胞培養基材の評価方法。
【請求項４】
請求項１に記載の評価方法を実施するための装置であって、
細胞培養基材が配置されるステージと、
ステージ上に配置された細胞培養基材の機能性層の表面に液滴を供給するための液滴供給手段と、
液滴を蒸発させるための蒸発誘導手段と、
蒸発する液滴を撮影するための撮像手段と、
撮像手段により撮影した画像に基づき接触領域の減少速度を算出する減少速度算出部と、
を有する細胞培養基材の評価装置。
【請求項５】
請求項２に記載の評価方法を実施するための装置であって、
細胞培養基材が配置されるステージと、
ステージ上に配置された細胞培養基材の機能性層の表面に液滴を供給するための液滴供給手段と、
液滴を蒸発させるための蒸発誘導手段と、
蒸発する液滴を撮影するための撮像手段と、
撮像手段により撮影した画像に基づき接触領域の減少速度を算出する減少速度算出部と、
撮像手段により撮影した画像に基づき液滴の接触角を算出する接触角算出部と、
を有する細胞培養基材の評価装置。
【請求項６】
基材と、前記基材上に設けられた、細胞を培養するための機能性層とを有する細胞培養基材を準備する工程と、
準備した細胞培養基材について、請求項１〜３のいずれかに記載の評価方法を実施する工程と、
を有し、
評価の結果、機能性層の状態が良と判定されたものとを製品とする細胞培養基材の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、基材上に機能性層を備える細胞培養基材の評価方法及び評価装置、並びにそのような細胞培養基材の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞をシート状に培養し、トリプシン等の酵素を使用せずに例えば温度を低下させるだけで細胞をシート状に回収する「細胞シート工学」という技術が再生医療分野で注目されている。本技術によって得られる細胞シートは、角膜や歯周組織等の再生医療で既に一定の治療効果が確認され、欧州で既に臨床研究や治験が進められている。また、複数の種類の細胞シートを積層させることによる三次元組織モデルの作製や、血管組織を伴う成熟した組織を生体外で作製することも可能であり、本技術をベースにした研究開発や治療が今後ますます期待される。
【０００３】
培養した細胞シートの接着、脱着の制御は、例えば、基材上に固定したポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＰＩＰＡＡｍ）等の機能性層を介して行われる。このポリマーは、主に温度に応答して水和能が変化する材料であり、臨界溶解温度未満の温度では周囲の水に対する親和性が向上し、ポリマーが水を取り込み膨潤して表面に細胞を接着しにくくする性質（細胞非接着性）を示し、同温度以上の温度ではポリマーから水が脱離することでポリマーが収縮し表面に細胞を接着しやすくする性質（細胞接着性）を示すものである。細胞の脱接着性は、上記ＰＩＰＡＡｍの固定化密度や鎖長に影響を受けることが知られており、したがって、細胞の脱接着性の良否を検討するため、機能性層の状態を評価する手法の開発が望まれている。
【０００４】
基材上に機能性層を設けた細胞培養基材を評価する従来の方法として、（特許文献１）が知られている。（特許文献１）には、０〜８０℃の温度範囲で水和力が変化するポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド等の温度応答性ポリマーを被覆した細胞培養基材の表面上に、細胞を播種後、４８時間以内に蛋白質加水分解酵素を使わずに温度処理だけで細胞を当該基材表面から剥離して回収し、生細胞と反応する試薬を用いて分光計で定量する、温度応答性細胞培養基材の評価方法が開示されている。培養細胞は、基材表面積当たり１００〜１００００個／ｃｍ２となるように個々の状態で基材表面上に付着していることが必要とされる。すなわち、細胞をシートの状態で回収すると、細胞間接着によって細胞が引っ張られる力の影響が無視できないため、（特許文献１）では個々の状態（まばらな状態）で基材上に播種することにより細胞間接着の影響を排除し、基材と細胞との相互作用のみを反映した結果を得ている。
【０００５】
上記（特許文献１）に記載の評価方法は、細胞培養を実施するため、評価を行うために少なくとも数時間〜数十時間を要するという問題点があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００９−８２１２３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで本発明は、上記従来の状況に鑑み、細胞培養を実施する必要がなく、短時間でＰＩＰＡＡｍ等からなる機能性層の状態を評価することができる方法、及びその方法を実施するための評価装置を提供することを目的とする。また、上記評価方法を利用して、機能性層の状態が良であるような細胞培養基材を製造する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、ＰＩＰＡＡｍ等の、細胞を培養するための機能性層の状態に依存して、その機能性層の表面に供給した液滴の蒸発挙動が異なる点に着目した。そして、液滴が蒸発する過程における液滴と機能性層との接触領域の減少速度を測定し、その速度値を指標として機能性層の状態を評価できることを見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
【０００９】
（１）基材と、前記基材上に設けられた、細胞を培養するための機能性層とを有する細胞培養基材の評価方法であって、
機能性層の表面に液滴を供給する工程と、
供給した液滴が蒸発する過程における、液滴及び機能性層が接触する接触領域の減少速度を測定する工程と、
を有し、
測定した減少速度に基づいて、機能性層の状態の評価を行う前記細胞培養基材の評価方法。
（２）供給した液滴が蒸発する過程における、液滴の接触角の変化を測定する工程をさらに有し、
接触角の変化が、接触角が減少する区間と、その後に略一定の接触角を維持する区間と、その後に接触角が再び減少する区間とを含み、接触領域の減少速度は、前記略一定の接触角を維持する区間における減少速度である上記（１）に記載の細胞培養基材の評価方法。
（３）機能性層が、温度変化により細胞接着性が変化する温度応答性ポリマーを含む上記（１）又は（２）に記載の細胞培養基材の評価方法。
（４）上記（１）に記載の評価方法を実施するための装置であって、
細胞培養基材が配置されるステージと、
ステージ上に配置された細胞培養基材の機能性層の表面に液滴を供給するための液滴供給手段と、
液滴を蒸発させるための蒸発誘導手段と、
蒸発する液滴を撮影するための撮像手段と、
撮像手段により撮影した画像に基づき液滴接触領域の減少速度を算出する減少速度算出部と、
を有する細胞培養基材の評価装置。
（５）上記（２）に記載の評価方法を実施するための装置であって、
細胞培養基材が配置されるステージと、
ステージ上に配置された細胞培養基材の機能性層の表面に液滴を供給するための液滴供給手段と、
液滴を蒸発させるための蒸発誘導手段と、
蒸発する液滴を撮影するための撮像手段と、
撮像手段により撮影した画像に基づき液滴接触領域の減少速度を算出する減少速度算出部と、
撮像手段により撮影した画像に基づき液滴の接触角を算出する接触角算出部と、
を有する細胞培養基材の評価装置。
（６）基材と、前記基材上に設けられた、細胞を培養するための機能性層とを有する細胞培養基材を準備する工程と、
準備した細胞培養基材について、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の評価方法を実施する工程と、
を有し、
評価の結果、機能性層の状態が良と判定されたものとを製品とする細胞培養基材の製造方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、細胞培養を実施する必要がなく、短時間で細胞培養基材における細胞の脱接着性等を評価することができる。また、細胞の脱接着性に優れる細胞培養基材を効率的に製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明に係る細胞培養基材の評価方法を説明するための図である。
【図２】本発明に係る細胞培養基材の評価方法を説明するための図である。
【図３】本発明に係る細胞培養基材の評価装置の一実施形態を示す図である。
【図４】実施例１における液滴が蒸発する過程での液滴の接触角及び接触半径の変化を測定した結果を示すグラフである。
【図５】実施例２における液滴が蒸発する過程での液滴の接触角及び接触半径の変化を測定した結果を示すグラフである。
【図６】実施例３における液滴が蒸発する過程での液滴の接触角及び接触半径の変化を測定した結果を示すグラフである。
【図７】実施例４における液滴が蒸発する過程での液滴の接触角及び接触半径の変化を測定した結果を示すグラフである。
【図８】実施例１〜４において測定された液滴の接触半径の減少速度を比較したグラフである。
【図９】実施例１〜４において測定された液滴の接触角差を比較したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、図面に基づき本発明を詳細に説明する。まず、本発明の評価対象である細胞培養基材の構成について述べる。
細胞培養基材は、基材上（通常は、基材の片面側）に、細胞を培養するための機能性層を設けて構成される。基材と機能性層の間は、一般には直接密着しているが、必要に応じて、機能性層の固定化を容易にするプライマー層等の中間層が介在していても良い。
【００１３】
細胞培養基材は、細胞及び培地を収容する細胞培養容器の内底面に設置されて使用される。したがって、基材は、細胞培養容器の底板を兼ねていても良いし、底板や側壁等から形成された容器の内底面に、後から基材及び機能性層の積層体を接合させる形態であっても良い。容器に後から接合させる積層体の形態である場合、基材は板状又はフィルム状であり、基材の、機能性層が設けられた側と反対側には、細胞培養容器の底板に接合させるための粘着剤層及び剥離シートを適宜設けることができる。
【００１４】
基材の材料は特に限定されない。具体的には、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ＴＡＣ（トリアセチルセルロース）、ポリイミド（ＰＩ）、ナイロン（Ｎｙ）、低密度ポリエチレン（ＬＤＰＥ）、中密度ポリエチレン（ＭＤＰＥ）、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリフェニレンサルファイド、ポリエーテルサルフォン、ポリエチレンナフタレート、ポリプロピレン、アクリル樹脂等の樹脂材料や、ガラス、石英等の無機材料が挙げられ、樹脂材料が好ましく用いられる。
【００１５】
基材の、機能性層が設けられる側の表面は、易接着処理された表面であることができる。「易接着処理」とは、例えば、ポリエステル、アクリル酸エステル、ポリウレタン、ポリエチレンイミン、シランカップリング剤、ペルフルオロオクタンスルホン酸（ＰＦＯＳ）等の易接着剤による処理を指す。
【００１６】
機能性層を構成する材料としては、細胞を培養することができる機能を有するものであれば特に限定されない。例えば、静電相互作用により細胞との接着性を示す材料として、ポリリジン等の塩基性ポリマー、アミノプロピルトリエトキシシラン、Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリメトキシシラン等の塩基性化合物及びそれらを含む縮合物等が挙げられる。また、生物学的特性により細胞との接着性を示す材料として、フィブロネクチン、ラミニン、テネイシン、ビトロネクチン、ＲＧＤ（アルギニン−グリシン−アスパラギン酸）配列含有ペプチド、ＹＩＧＳＲ（チロシン−イソロイシン−グリシン−セリン−アルギニン）配列含有ペプチド、コラーゲン、アテロコラーゲン、ゼラチン等が挙げられる。
【００１７】
その中でも、細胞を培養後、基材から細胞を脱着させるため、あるいは細胞をシート状に回収するために細胞培養基材を利用する場合には、機能性層として、所定の刺激により細胞接着性が変化する機能を有するものを採用することができる。例えば、刺激を加えることにより細胞接着性から細胞非接着性へと変化する刺激応答性ポリマーを含むことができる。刺激応答性ポリマーとしては、温度応答性ポリマー、ｐＨ応答性ポリマー、イオン応答性ポリマー、光応答性ポリマー等を挙げることができ、作製しようとする細胞シートに適したものを適宜選択することができる。特に、温度応答性ポリマーが、温度変化により細胞接着性が変化し、刺激の付与が容易であることから好ましい。
【００１８】
温度応答性ポリマーとして、例えば、細胞を培養する温度では細胞接着性を示し、作製した細胞シートを剥離する時の温度では細胞非接着性を示すものを用いると良い。具体的には、臨界溶解温度未満の温度では周囲の水に対する親和性が向上し、ポリマーが水を取り込んで膨潤して表面に細胞を接着しにくくする性質（細胞非接着性）を示し、同温度以上の温度ではポリマーから水が脱離することでポリマーが収縮して表面に細胞を接着しやすくする性質（細胞接着性）を示すものを用いると良い。このような臨界溶解温度は、下限臨界溶解温度と呼ばれる。下限臨界溶解温度Ｔが０℃〜８０℃、さらに好ましくは０℃〜５０℃である温度応答性ポリマーを用いると良い。Ｔが０℃〜８０℃であると、細胞を安定的に培養できるからである。
【００１９】
好適な温度応答性ポリマーとしては、アクリル系ポリマー又はメタクリル系ポリマーが挙げられる。より具体的には、例えばポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（Ｔ＝３２℃）、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド（Ｔ＝２１℃）、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド（Ｔ＝３２℃）、ポリ−Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド（Ｔ＝約３５℃）、ポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド（Ｔ＝約２８℃）、ポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド（Ｔ＝約３５℃）、及びポリ−Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド（Ｔ＝３２℃）等が挙げられる。
【００２０】
これらのポリマーを形成するためのモノマーとしては、放射線照射によって重合し得るモノマーを用いることができる。モノマーとしては例えば、（メタ）アクリルアミド化合物、Ｎ−（もしくはＮ，Ｎ−ジ）アルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体、環状基を有する（メタ）アクリルアミド誘導体、及びビニルエーテル誘導体等が挙げられ、これらの１種以上を使用することができる。モノマーが一種類単独で使用された場合、基材上に形成されるポリマーはホモポリマーとなり、モノマーが複数種一緒に使用された場合、基材上に形成されるポリマーはヘテロポリマーとなるが、本発明においてはいずれの形態も適用可能である。
【００２１】
また、増殖細胞の種類によってＴを調節する必要がある場合や、機能性層の親水・疎水性のバランスを調整する必要がある場合等には、上記以外の他のモノマー類をさらに加えて共重合しても良い。さらに、上記ポリマーとその他のポリマーとのグラフト又はブロック共重合体、あるいは上記ポリマーと他のポリマーとの混合物を用いて機能性層を構成しても良い。また、ポリマー本来の性質が損なわれない範囲で架橋することも可能である。
【００２２】
温度応答性ポリマー等を含む機能性層は、従来知られた手法を適宜採用して基材上に形成することができる。例えば、重合により目的の刺激応答性ポリマーを形成するモノマーと、該モノマーを溶解しうる有機溶媒と含む塗布用組成物を調製し、これを慣用の塗布方法に従って、基材の表面に塗布して塗膜を形成し、次に、該塗膜に放射線照射等の適当な手段により塗膜中のモノマーを重合してポリマーを形成するとともに、基材の表面とポリマーとの間にグラフト化反応を生じさせることにより形成することができる。
【００２３】
機能性層の膜厚は、例えば、０．５ｎｍ〜３００ｎｍの範囲内とすると良く、特に１ｎｍ〜１００ｎｍの範囲内であることが好ましいが、これに限定されるものではない。
【００２４】
次に、本発明の細胞培養基材の評価方法及び評価装置について述べる。本発明の評価方法は、機能性層の表面に液滴を供給する工程と、供給した液滴が蒸発する過程における、液滴及び機能性層が接触する接触領域の減少速度を測定する工程とを有することを特徴とする。
【００２５】
具体的には、まず、図１及び図２に示すように、基材１０及び機能性層２０を含む細胞培養基材１における機能性層２０の表面に液滴Ｌを供給する。そして、細胞培養基材１を介して間接的に液滴Ｌを加熱するか、又は液滴Ｌを直接的に加熱する方法、あるいは雰囲気の圧力を低下させる方法等の適宜方法により液滴Ｌを蒸発させ、その蒸発過程における液滴Ｌと機能性層２０との接触領域の減少をＣＣＤカメラ等の撮像手段により観測する。本発明者らは、このとき、液滴Ｌと機能性層２０との接触領域の減少速度が機能性層２０の状態を反映することから、減少速度の値に基づいて機能性層２０の状態を評価可能であることを見出した。なお、液滴Ｌと機能性層２０との接触領域を示す値としては、例えば、液滴Ｌを上方から観測したときの液滴Ｌが占める領域の面積値を採用することができる。あるいは、液滴Ｌは機能性層２０上において水平方向に等方的に広がり、上方から見て円形状であるとみなせるため、接触領域の面積値と対応する接触半径ｒ等、領域の面積値に対応する値の変化速度をもって接触領域の減少速度としても良い。なお、液滴Ｌとしては通常水が用いられるが、場合によりアルコール等の他の液体を用いても良い。具体的には、エタノール、イソプロピルアルコール、メタノール等を使用することができる。また、液滴Ｌを加熱する場合の温度は、測定効率との兼ね合いで適宜設定される。例えば、液滴Ｌが水である場合には通常３０℃〜６０℃程度とすることが好ましい。より好ましくは４０℃〜５０℃程度である。
【００２６】
図１に示すように、例えば機能性層２０がポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＰＩＰＡＡｍ）等の温度応答性ポリマーを含み、且つその固定化量が少ない場合には、機能性層２０の表面の疎水性が相対的に高くなり、その場合、液滴Ｌと機能性層２０との間の相互作用の影響は小さくなるため、液滴Ｌはその形状を維持しながら（相似形を保ちつつ）図１の（ａ）〜（ｃ）のように蒸発し、接触領域に対応する接触半径ｒはなだらかに、すなわち小さい速度で減少することとなる。一方、図２に示すように、例えば機能性層２０がＰＩＰＡＡｍ等の温度応答性ポリマーを含み、且つその固定化量が多い場合には、機能性層２０の表面の疎水性は相対的に低くなる（親水性が高くなる）。その場合、液滴Ｌと機能性層２０との間の相互作用の影響が大きくなるため、液滴Ｌは、蒸発過程の初期において、接触半径ｒを維持したまま接触角θのみが減少する（図２の（ａ）から（ｂ）の過程）。その後、さらに液滴Ｌの蒸発が進むと、液滴Ｌと機能性層２０との間に働く相互作用の力が液滴Ｌの表面張力に抗しきれなくなり、接触角θがほとんど変化しないまま、接触領域に対応する接触半径ｒが急速に、すなわち大きい速度で減少することとなる（図２の（ｂ）から（ｃ）の過程）。なお、上記の説明並びに図１及び図２は、液滴Ｌと機能性層２０との相互作用が弱い場合及び強い場合の傾向を誇張して示したものであり、実際には接触半径ｒ及び接触角θの変化は複合的に進行する。
【００２７】
さらに、液滴Ｌが蒸発する過程における、液滴Ｌの接触角θの変化を測定した場合には、蒸発過程の初期段階で接触角が減少する区間と、その後に略一定の接触角を維持する区間と、その後に接触角が再び減少する区間とを経て蒸発が進行することが多い。このように異なる挙動を示す複数の区間を経て蒸発する理由は定かではないが、液滴Ｌと機能性層２０との間の相互作用による力、液滴Ｌの表面張力、重力等が総合的に作用する結果と考えられる。この場合、機能性層２０の状態の評価の基礎とする接触領域の減少速度の値として、略一定の接触角を維持する区間における接触領域の減少速度を採用することが好ましい。ここで、略一定とは、前後の区間における接触角の変化率の絶対値に比べ、接触角の変化率の絶対値が相対的に小さく一定とみなせる状態を指す。この区間は、蒸発による液滴Ｌの容量減少の影響が少なく、液滴Ｌ及び機能性層２０の相互作用（すなわち評価対象である機能性層の状態）と接触領域の減少速度との相関が最も良いと考えられるからである。無論、上記の３つの区間が明確に観測されない場合や、より簡易的な評価を行う場合等には、蒸発過程の全体にわたる接触領域の平均減少速度等、別の手法により算出した減少速度を基に評価を行っても良い。
【００２８】
液滴Ｌの量は、液滴Ｌの蒸発過程を適切に観測できれば良く特に限定されない。例えば、１μＬ〜１ｍＬ程度とすることができる。複数の細胞培養基材を評価する場合は、供給する液滴Ｌは細胞培養基材間で同一の量とすることが好ましい。
【００２９】
以上の評価方法を細胞培養基材の製造工程において利用することにより、機能性層の状態（固定化量、細胞の脱接着性）が良好な細胞培養基材を効率的に製造することができる。具体的には、例えば、予めいくつかの細胞培養基材を用いて細胞培養を行い、その細胞培養結果と接触領域の減少速度との相関を調べて減少速度の好適な範囲（又は閾値）を求めておき、それ以降に量産される他の細胞培養基材の減少速度の値が上記の好適な範囲（又は閾値）に含まれるか否かをもって製品の良否の判定作業を行うことができる。この場合、細胞培養基材の量産工程においては、評価のために従来のような細胞培養を実施しないため、極めて短時間で評価を行うことができ、細胞培養基材の量産工程の大幅な効率化を図ることができる。一例として、基材がポリスチレンからなり、機能性層が温度応答性ポリマーであるポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＰＩＰＡＡｍ）を含み、機能性層の表面に１μＬの水を供給し４０℃で蒸発させる場合、略一定の接触角を維持する区間における接触半径ｒの減少速度が０．０１５μｍ／ｍｓｅｃ〜０．０２０μｍ／ｍｓｅｃの範囲内であれば、ＰＩＰＡＡｍの固定化量及び細胞の脱接着性の観点から、機能性層の状態が良好であると判定することができる。
【００３０】
図３に、上述の評価方法を実施するための装置の一実施形態を示す。この評価装置は、細胞培養基材１が配置されるステージ１１と、ステージ１１上に配置された細胞培養基材１の機能性層の表面に液滴Ｌを供給するためのシリンジ等の液滴供給手段１２と、液滴Ｌを蒸発させるための蒸発誘導手段１３と、蒸発する液滴Ｌを撮影するための撮像手段１４と、それらの撮像手段により撮影した画像に基づき接触領域の減少速度を算出する減少速度算出部１５ａとを有している。蒸発過程における液滴Ｌの接触角の変化も測定する場合には、撮影した画像に基づき液滴Ｌの接触角を算出する接触角算出部１５ｂをさらに備えることができる。蒸発誘導手段１３としては、液滴Ｌを間接的又は直接的に加熱するためのヒーターや、雰囲気の圧力を低下させるための真空ポンプ等が挙げられる。
【００３１】
ステージ１１上の細胞培養基材１は、拡散板１７を通過させた光源１６からの光で照明される。撮像手段１４は、蒸発する液滴を捉えることができれば良く、具体的にはＣＣＤ等を備える高速度カメラが好適に用いられる。図３に示すようにステージ１１の側方から液滴Ｌを撮影し、液滴Ｌの接触半径ｒの減少速度を測定することができるが、その他、ステージ１１の上方又は下方に撮像手段を設置して液滴Ｌを平面的に観測し、液滴Ｌの接触領域の面積を測定しても良い。撮像手段１４がステージ１１の側方にある場合には、接触領域の減少速度と液滴Ｌの接触角とを１つの撮像手段で同時に計測可能となり、装置の構成が簡便なものとなる。また、液滴供給手段１２は、設定した量の液滴Ｌを滴下できるよう設定されている。さらに、減少速度算出部１５ａ及び接触角算出部１５ｂは、撮像手段により取得される画像を解析し、接触領域の減少速度及び接触角を算出する機能を有している。
【実施例】
【００３２】
次に、実施例に基づき本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００３３】
（実施例１）
・細胞培養基材の製造
ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（アルドリッチ社）を２％含み、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドを、最終モノマー濃度が３０重量％となるようにイソプロピルアルコール（ＩＰＡ）に溶解させて溶液を調製した。続いて、基材として細胞培養用ポリスチレン製の円形ディッシュ（製品名：ＴＣＰＳ、ベクトンディッキンソン社製）を用い、この円形ディッシュの内側底面に前記のＮ−イソプロピルアクリルアミド溶液をコーティングし、電子線照射装置を用いて電子線照射を行い、円形ディッシュの内側底面にポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＰＩＰＡＡｍ）からなる機能性層をグラフト重合により形成した。その後、円形ディッシュを５℃のイオン交換水を用いて洗浄し、乾燥して細胞培養基材を得た。
【００３４】
・細胞培養基材の評価
製造した細胞培養基材を、接触角測定装置ＤＭ−５０１（商品名、協和界面科学社製）のステージに載置し、ヒーター温度をポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドの下限臨界溶解温度（Ｔ＝３２℃）以上である４０℃に設定した。続いて、マイクロシリンジにより機能性層の表面に純水を１μＬ滴下した。滴下後、液滴を側方からＣＣＤカメラで測定間隔５０００ｍｓｅｃの条件で撮影し、ソフトウェアＦＡＭＡＳ（商品名、協和界面科学社製）により液滴の接触半径及び接触角を算出した。測定結果を図４に示す。
【００３５】
（実施例２）
最終モノマー濃度が３５重量％となるように溶解させた溶液を用いて機能性層を形成した以外は、上記実施例１と同様にして液滴の接触半径及び接触角を算出した。測定結果を図５に示す。
【００３６】
（実施例３）
最終モノマー濃度が４０重量％となるように溶解させた溶液を用いて機能性層を形成した以外は、上記実施例１と同様にして液滴の接触半径及び接触角を算出した。測定結果を図６に示す。
【００３７】
（実施例４）
細胞培養基材として、細胞培養用のポリスチレン製円形ディッシュ（商品名：ＴＣＰＳ、ベクトンディッキンソン社製）を用いた。上記実施例１と同様にして、液滴の接触半径及び接触角を算出した。測定結果を図７に示す。
【００３８】
図４〜７に示すように、実施例１〜４はいずれも、測定開始後、接触角が減少する区間（区間１）で接触半径は略一定の値を維持し、略一定の接触角を維持する区間（区間２）で接触半径は減少し、接触角が再び減少する区間（区間３）で接触半径はさらに減少するという特徴が見られた。区間２における接触半径の変化から接触半径の減少速度を算出し、その結果を図８に示す。また、測定開始時点における接触角（静的接触角）と区間２における略一定の接触角（平均値）との差Δθを算出し、その結果を図９に示す。
【００３９】
図８及び図９の結果より、実施例１〜４の細胞培養基材は、接触半径の減少速度、接触角差ともに顕著な差が見られた。特に、ＰＩＰＡＡｍの固定化量のみが異なる実施例１〜３の細胞培養基材を明確に区別することができた。実施例３の細胞培養基材は、実施例１及び２に比べてＰＩＰＡＡｍの固定化量が多く、液滴Ｌと機能性層との相互作用が強いため、実施例３では接触角θがより小さくなるまで接触半径が維持され、測定開始時点での静的接触角と区間２での略一定の接触角との差Δθが大きくなったものと考えられる。
【００４０】
次に、実施例１〜４で作製した細胞培養基材に、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地を満たし、３ＴＳ  Ｓｗｉｓｓ  Ａｌｂｉｎｏ細胞を６．２５×１０３ｃｅｌｌ／ｃｍ２の条件で播種した。３７℃下で１８時間培養した後に、２０℃の低温インキュベーターに移し、３０分間のインキュベート後、剥離して浮遊した細胞の様子を観察した。その結果、実施例３の細胞培養基材では細胞の剥離性（脱着性）が良好であったのに対し、実施例１及び２の細胞培養基材では細胞が一部剥離せず、剥離性が良好といえるものではなかった。実施例４の細胞培養基材では全く細胞が剥離していなかった。これらの結果から、液滴が蒸発する過程における液滴接触領域の減少速度及び接触角差を指標として、細胞の脱接着性が良好な細胞培養基材を効率的に製造することができることが分かった。
【符号の説明】
【００４１】
１    細胞培養基材
１０  基材
１１  ステージ
１２  液滴供給手段
１３  蒸発誘導手段
１４  撮像手段
１５ａ  減少速度算出部
１５ｂ  接触角算出部
１６  光源
１７  拡散板
２０  機能性層
Ｌ    液滴
ｒ    接触半径
θ    接触角
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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