(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルツハイマー病罹患リスクを検出する方法であって、
（ａ）一個体の生物検体中におけるｔａｕタンパク質及びＡβ−４２タンパク質二種類のアルツハイマー病のバイオマーカーと抗アルツハイマー病のバイオマーカー抗体の磁性ナノ粒子が結合し、それぞれ発生する免疫磁気的低下信号（ｉｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ）を体外検出するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で検出されたアルツハイマー病における二種類のバイオマーカーの免疫磁気的低下信号を、それぞれ数１でフィッティングの演算を行うことで、前記生物検体中のアルツハイマー病における二種類のバイオマーカーの個別濃度を取得するステップと、
【数１】
0005847221.tif 000007
数１中、前記ＩＭＲ（％）は前記バイオマーカーの免疫磁気的低下信号、Φは前記アルツハイマー病のバイオマーカーの濃度、フィッティングパラメータＡはバックグラウンドレベル、Ｂは最大値、Φｏは免疫磁気的低下信号が（（Ａ+Ｂ）／２）に等しい場合のバイオマーカー濃度、そしてγはΦをｘ軸としてＩＭＲ（％）をｙ軸とした関係曲線図におけるΦｏデータポイントの傾斜率であり、
（ｃ）ステップ（ｂ）で得られたアルツハイマー病における二種類のバイオマーカーの濃度を乗算した後、前記アルツハイマー病における二種類のバイオマーカーの濃度の積の標準値と比較するステップと、を含み、
このうち前記生物検体中の前記アルツハイマー病における二種類のバイオマーカーの濃度の積が、前記アルツハイマー病における二種類のバイオマーカーの濃度の積の標準値よりも高いとき、前記個体はアルツハイマー病に罹患するリスクが高まっていることを表している、ことを特徴とするアルツハイマー病罹患リスクを検出する方法。
【請求項２】
前記アルツハイマー病における二種類のバイオマーカーの濃度の積の標準値がＲＯＣ（ｒｅｃｅｉｖｅｒ  ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ、受信者動作特性）曲線により決定されたしきい値である、ことを特徴とする請求項１に記載のアルツハイマー病罹患リスクを検出する方法。
【請求項３】
前記しきい値が更に前記受信者動作特性曲線での最大面積により決定される、ことを特徴とする請求項２に記載のアルツハイマー病罹患リスクを検出する方法。
【請求項４】
前記受信者動作特性曲線がアルツハイマー病に罹患した患者グループ及びアルツハイマー病に罹患していない正常グループでの前記アルツハイマー病における二種類のバイオマーカーの濃度の積に基づいて作図されたものである、ことを特徴とする請求項２に記載のアルツハイマー病罹患リスクを検出する方法。
【請求項５】
前記アルツハイマー病がアルツハイマー型認知症である、ことを特徴とする請求項１に記載のアルツハイマー病罹患リスクを検出する方法。
【請求項６】
前記アルツハイマー型認知症にはアルツハイマー病による認知障害が含まれる、ことを特徴とする請求項５に記載のアルツハイマー病罹患リスクを検出する方法。
【請求項７】
前記磁性ナノ粒子の材料がＦｅ３Ｏ４、Ｆｅ２Ｏ３、ＭｎＦｅ２Ｏ４、ＣｏＦｅ２Ｏ４、ＮｉＦｅ２Ｏ４からなる群から選ばれる、ことを特徴とする請求項１に記載のアルツハイマー病罹患リスクを検出する方法。
【請求項８】
前記磁性ナノ粒子の材料がＦｅ３Ｏ４である、ことを特徴とする請求項１に記載のアルツハイマー病罹患リスクを検出する方法。
【請求項９】
前記生物検体が血液検体である、ことを特徴とする請求項１に記載のアルツハイマー病罹患リスクを検出する方法。
【請求項１０】
前記血液検体が血漿である、ことを特徴とする請求項９に記載のアルツハイマー病罹患リスクを検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はアルツハイマーのバイオマーカーであるＡβ−４２タンパク質及びｔａｕタンパク質の濃度の積を免疫磁気的低下で分析して、アルツハイマー病罹患リスクを判断するものに関する。
【背景技術】
【０００２】
世界的な人口の急速な高齢化から、神経退行性疾病が現在深刻な問題となっている。認知症は最も普遍的に存在している神経退行性の疾病である。全世界における多くの地域では６０歳以上の高齢健常者率は５%〜７%であるうえ、２０１０年、全世界で３５，６００，０００人が認知症に罹患しているものと推測される。ＷＨＯでは各国政府、政府機関及びその他利害関係者に対して、認知症による影響は絶えず増加している脅威であると見なすとともに、将来訪れる認知症の脅威に対応すべく、必要なリソースを運用して健康及び社会介護体制を準備しておくよう呼びかけている。
【０００３】
認知症患者の高齢者において、アルツハイマー患者者は５０％〜７０％を占めている。神経画像及び神経認知測定が現在アルツハイマー病を診断する二つの臨床医学の基礎である。確かに認知チェック測定は便利ではあるが、その測定結果は神経退行の程度に左右されるだけでなく、教育レベル、文化、社会経済的地位などの要因に影響される。したがって、神経認知測定結果の取り扱いには慎重にしなければならない、アルツハイマー病を最終的に判断する唯一の情報とすべきではない。ところで神経画像では、その構造的及び機能的データはアルツハイマー病への診断につき客観的な基礎を提供する。例えば、海馬の萎縮は核磁気共鳴画像により質（視覚的数値）又は量（容積法）の方式により発見することができる。アミロイド又はｔａｕタンパク質はポジトロン断層法（ＰＥＴ）にてアルツハイマー患者者の脳内のアミロイド斑及び神経原繊維濃縮体を表示することができる。しかしながら、神経画像にはコストが嵩み、可用性が低い（特に一般的な開業医又は地方の病院）という大きな問題がある。これら欠点が、より実用的なアルツハイマー病診断技術の開発を促すようになっている。分子診断法はアルツハイマー病を体外的に診断するトレンドとなっている。潜在的なバイオマーカーにはアミロイド、ｔａｕタンパク質及びその他誘導体が含まれる。これらバイオマーカーの多くは脳脊髄液中に存在していて、腰椎穿刺は脳脊髄液サンプルを採集するために必要な手順である。しかし脳脊髄液サンプルの抽出の過程は危険でかつ患者の不快感がある。よって大規模な検査で必要なスクーリング方式又は疾病の進行又は薬効を長期的に観察するに必要な複数回のサンプリングには適さない。したがって脳脊髄液ではない別の液体中に存在するバイオマーカーを探し求めるようになった。体液種類において、血液は最も望みがあり、信頼性が高く、便利かつ熟知された臨床サンプルである。しかしながら血液中のバイオマーカー濃度は非常に低く、ｐｇ／ｍｌで表示しなければならないほどである。これら濃度の極めて低いバイオマーカーを検出するには極めて感度の高い分析技術が必要になる。
【０００４】
２００８年には高感度の免疫分析技術が開発されている。この技術は超伝導量子干渉素子（ｓｕｐｅｒｃｏｎｄｕｃｔｉｎｇ ｑｕａｎｔｕｍ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｄｅｖｉｃｅ、ＳＱＵＩＤ）免疫磁気的低下（ｉｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ、ＩＭＲ）分析と呼ばれている。超伝導量子干渉素子を基礎として免疫磁気的低下分析を用いたとき、アミロイド及びｔａｕタンパク質の最低検出濃度が１〜１０ ｐｇ／ｍｌとなることから、血漿中のバイオマーカーを検出することでアルツハイマー病を診断する可能性が出てくる。よって、この研究は超伝導免疫磁気的低下でヒトの血漿中におけるバイオマーカーを分析するという特性にある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、アルツハイマーのバイオマーカーであるＡβ−４２タンパク質及びｔａｕタンパク質の濃度の積を免疫磁気的低下で分析して、アルツハイマー病罹患リスクを判断するアルツハイマー病罹患リスクを検出する方法を提供するところにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ、ＡＤ）罹患リスクの検出システム１０を提供するものであり（図１）、この検出システム１０は、一個体の生物検体中におけるｔａｕタンパク質及びＡβ−４２タンパク質二種類のアルツハイマー病のバイオマーカーと抗アルツハイマー病のバイオマーカー抗体の磁性ナノ粒子が結合し、それぞれ発生する免疫磁気的低下信号（ｉｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ）を検出するための検出手段１１と、前記検出手段１１が検出したアルツハイマー病における二種類のバイオマーカーの免疫磁気的低下信号を受信するとともに、それぞれ関数（以下数１と称す）でフィッティングの演算を行うことで、前記生物検体中のアルツハイマー病における二種類のバイオマーカーの個別濃度を取得するための、前記検出手段１１に接続されている演算手段１２である。
【０００７】
【数１】
0005847221.tif 000002
【０００８】
数１の中、前記ＩＭＲ （ｉｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ、免疫磁気的低下）は前記バイオマーカーの免疫磁気的低下信号、Φはアルツハイマー病のバイオマーカーの濃度、フィッティングパラメータＡはバックグラウンドレベル、Ｂは最大値、Φｏは免疫磁気的低下信号が（（Ａ+Ｂ）／２）に等しい場合のバイオマーカー濃度、そしてγはΦをｘ軸としてＩＭＲ（%）ｙ軸とした関係曲線図におけるΦｏデータポイントの傾斜率である。
【０００９】
前記演算手段１２で得られたアルツハイマー病における二種類のバイオマーカーの濃度を乗算するとともに、前記アルツハイマー病における二種類のバイオマーカーの濃度の積を用いて、前記個体患者のアルツハイマー病のリスク程度を判断するための、前記演算手段１２に接続されている識別手段１３と、を備えている。
【００１０】
具体的な実施例において、前記アルツハイマー病はアルツハイマー型認知症である。好ましい具体的な実施例において、前記アルツハイマー型認知症にはアルツハイマー病による認知障害が含まれる。更に好ましい具体的な実施例において、前記アルツハイマー病による認知障害はアルツハイマー病による軽度の認知障害である。
【００１１】
具体的な実施例において、前記識別手段１３の判断方式は、前記生物検体中のアルツハイマー病における二種類のバイオマーカーの濃度の積を比較するために、受信者動作特性（ｒｅｃｅｉｖｅｒ ｏｐｅｒａｔｉｎｇ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ、ＲＯＣ）曲線でアルツハイマー病における二種類のバイオマーカーの濃度の積の所定しきい値を算出するものである。前記生物検体中のアルツハイマー病における二種類のバイオマーカーの濃度の積が、前記アルツハイマー病における二種類のバイオマーカーの濃度の積の所定しきい値よりも高いとき、この個体はアルツハイマー病に罹患するリスクが高まっていることを表している。好ましい具体的な実施例において、前記アルツハイマー病における二種類のバイオマーカーの濃度の積の所定しきい値は受信者動作特性曲線中から最高感度にて得られた最高特異度により決定されるものであり、しかも前記受信者動作特性曲線はアルツハイマー病に罹患した患者グループ及びアルツハイマー病に罹患していない正常グループにて検出されたアルツハイマー病における二種類のバイオマーカーの濃度の積に基づいて計算されたものである。
【００１２】
具体的な実施例において、前記最高感度の範囲は０．７から１である。他の具体的な実施例において、前記最高特異度の範囲は０．７から１である。
【００１３】
具体的な実施例において、前記演算手段及び識別手段は集積回路内に統合することができる。
【００１４】
他の具体的な実施例において、前記生物検体は血液検体である。好ましい具体的な実施例において、前記血液検体は血漿である。
【００１５】
本発明は、複数の磁性ナノ粒子が溶液中に分散されているアルツハイマー病を検出するための試薬を更に提供するものであり、磁性ナノ粒子の構造には（図２）、磁性核と、磁性核を覆う水溶性物質と、生物検体中のバイオマーカーを識別するために、前記磁性ナノ粒子外側の水溶性物質に結合している抗体と、が含まれる。
【００１６】
具体的な実施例において、前記抗体は抗アルツハイマー病のバイオマーカー抗体である。好ましい具体的な実施例において、前記抗アルツハイマー病のバイオマーカー抗体は抗ｔａｕタンパク質又は抗Ａβ−４２タンパク質の抗体である。
【００１７】
具体的な実施例において、前記磁性核の材料はＦｅ３Ｏ４、Ｆｅ２Ｏ３、ＭｎＦｅ２Ｏ４、ＣｏＦｅ２Ｏ４、ＮｉＦｅ２Ｏ４からなる群から選ばれる。好ましい具体的な実施例において、前記磁性核の材料はＦｅ３Ｏ４である。
【００１８】
他の具体的な実施例において、前記生物検体中のバイオマーカーはｔａｕタンパク質又はＡβ−４２タンパク質であり、前記磁性ナノ粒子上の前記抗体と結合可能である（図３）。
【００１９】
本発明では更にアルツハイマー病を検出する方法を提供するものであり、アルツハイマー病を検出する前記試薬を提供し、生物検体を提供し、前記生物検体と前記試薬とを混合した後、バイオマーカーの免疫磁気的低下信号を測定し、前記生物検体中における前記バイオマーカーの免疫磁気的低下信号の標準曲線を比較する、ことを含む。
【００２０】
具体的な実施例において、前記バイオマーカーの免疫磁気的低下信号の標準曲線はＡβ−４２タンパク質又はｔａｕタンパク質は濃度に伴って変化するうえ、データポイントのピーク免疫磁気的低下信号を含み、好ましい具体的な実施例において、前記バイオマーカーの磁減量信号標準曲線はＩＭＲ（％）−Φ曲線又は特性曲線である。
【００２１】
他の具体的な実施例において、前記バイオマーカーの免疫磁気的低下信号のデータポイントは数１でフィッティングを行う。
【００２２】
数１の中、前記Ａ、 Ｂ、 Φｏ 及びγはフィッティングパラメータ、Ａはバックグラウンドレベル、Ｂは最大値、Φｏは免疫磁気的低下信号が（（Ａ+Ｂ）／２）に等しい場合のバイオマーカー濃度、そしてγはをΦｘ軸としてＩＭＲ（%）はｙ軸をとした関係曲線図におけるΦｏデータポイントの傾斜率であるとともに、前記数１に基づいて前記バイオマーカーのフィッティング曲線を作図するが、前記データは更に受信者動作特性（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ ｏｐｅｒａｔｉｎｇ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ、ＲＯＣ）曲線分析を行うことができる。
【００２３】
本発明はまたアルツハイマー病罹患リスクを検出する方法を提供するものであり、（ａ）一個体の生物検体中におけるｔａｕタンパク質及びＡβ−４２タンパク質二種類のアルツハイマー病のバイオマーカーと抗アルツハイマー病のバイオマーカー抗体の磁性ナノ粒子が結合し、それぞれ発生する免疫磁気的低下信号（ｉｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ）を体外検出するステップと、（ｂ）ステップ（ａ）で検出されたアルツハイマー病における二種類のバイオマーカーの免疫磁気的低下信号を、それぞれ数１でフィッティングの演算を行うことで、前記生物検体中のアルツハイマー病における二種類のバイオマーカーの個別濃度を取得することである。
【００２４】
数１の中、前記ＩＭＲ（％）は前記バイオマーカーの免疫磁気的低下信号、Φは前記アルツハイマー病のバイオマーカーの濃度、フィッティングパラメータＡはバックグラウンドレベル、Ｂは最大値、Φｏは免疫磁気的低下信号が（（Ａ+Ｂ）／２）に等しい場合のバイオマーカー濃度、そしてγはΦをｘ軸としてＩＭＲ（％）をｙ軸とした関係曲線図におけるΦｏデータポイントの傾斜率であり、及び、（ｃ）ステップ（ｂ）で得られたアルツハイマー病における二種類のバイオマーカーの濃度を乗算した後、前記アルツハイマー病における二種類のバイオマーカーの濃度の積の標準値と比較するステップと、を含み、このうち前記生物検体中の前記アルツハイマー病における二種類のバイオマーカーの濃度の積が、前記アルツハイマー病における二種類のバイオマーカーの濃度の積の標準値よりも高いとき、前記個体はアルツハイマー病に罹患するリスクが高まっていることを表している。
【００２５】
本発明で提示する数１は先行文献（Ｃ． Ｃ． Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．、 Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌｅ−ｐａｒｔｉｃｌｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｎ ｔｈｅ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｍｉｘｅｄ−ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ａｌｔｅｒｎａｔｉｎｇ ｃｕｒｒｅｎｔ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｂｉｏ−ｒｅａｇｅｎｔｓ、 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｈｙｓｉｃｓ 、 Ｖｏｌｕｍｅ １１２、 Ｉｓｓｕｅ ２、 ２０１２）にて開示する免疫磁気的低下信号を濃度に変換する公式を参照されたい。当該数１はまず標準的なバイオマーカー濃度及びこれに対応する免疫磁気的低下信号をｘ軸及びｙ軸とした曲線図を作図した後、被検査バイオマーカーを含有しない試薬の免疫磁気的低下信号をバックグラウンドレベル（Ａ）として検出すると同時に、飽和した被検査バイオマーカーを含有する試薬の免疫磁気的低下信号を最大値（Ｂ）として検出するとともに、Ａ及びＢの二つのポイントで当該曲線図にて曲線を作図し、当該曲線上の免疫磁気的低下信号が（（Ａ+Ｂ）／２）等しい場合のバイオマーカー濃度（Φｏ）を見出して、同時に当該Φｏの傾斜率（γ）を計算することで、当該被検査バイオマーカーの濃度（Φ）を求める。
【００２６】
本発明にて前記”ＲＯＣ”とは “受信者動作特性（ｒｅｃｅｉｖｅｒ ｏｐｅｒａｔｉｎｇ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）”を意味するとともに、免疫磁気的低下信号を分析する方法を意味していて、ＲＯＣ分析は試験の診断性能を評価するのに用いることができる。ＲＯＣ図は異なる臨界値の感度及び特異度を試験する図である。ＲＯＣ曲線は２個のサンプルグループ、例えば特定特性を持つ対照又は正常サンプル及び試験又は実験サンプルを区別するのに用いることができる。通常、２個のサンプルにて重なる分布が見られることから、これがこれらの間に実際の差異があるかを確定する好ましいツールとなる。もしＲＯＣ分析の区別のしきい値又は特異度を高く設定すると、前記試験では仮陽性が生じることはなく、つまり２個のサンプルの間の差異を誤って鑑定することはない。しかしながら、この場合、前記試験ではサンプル間に実際の差異がある状況を見逃す可能性があるうえ、これによりある種の病例が鑑定されない可能性がある。もし試験の感度を高めれば、特異度は相対的に下がってしまう。よって、もし試験をより感度良くするとなれば、前記試験では患者グループ中の大部分又は全部を鑑定可能となるもの、より多くの未患者グループ中から疾病を鑑定してしまうことになる。
【００２７】
ＲＯＣ曲線上の各点は感度及びその各々の特異度を表している。ＲＯＣ曲線に基づいて臨界値を選択することができるので、感度及び特異度が許容される値を有する点を鑑定できるとともに、前記点は診断目的用の試験を行うのに用いることができる。使用者が、当業者が容易に理解できる方式でパラメータを修正したとき、本発明中に述べる実施例に対して、各しきい値を選択することでいずれも妥当な感度及び特異度を得ることができる。しかし具体的な状況では、感度及び特異度が約６０％〜９５％に維持されるが、より低い又はより高い値も可能である。
【００２８】
ＲＯＣ曲線の他の有益な特徴とは、曲線下面積（Ａｒｅａ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ Ｃｕｒｖｅ、ＡＵＣ）値が、前記試験で異なるサンプル性質を区別する総合能力を定量化することができ、この状況にて、前記試験でアルツハイマー病に罹患した個体とアルツハイマー病に罹患していない個体とを区別する総合能力を定量化することができるというものである。真陽性がほぼランダムに等しくなる可能性を鑑定する試験では面積が０．５となるＲＯＣ曲線を発生する。完璧な特異度及び感度を有する仮陽性及び仮陰性が発生しない試験の面積は１．００となる。現実の状況では、どのような試験でもこの二つの値の間に収まる。
【００２９】
本発明にて用いられる一つの応用において、アルツハイマー病に罹患している患者と対照個体の血液サンプル中のアルツハイマー病における二種類のバイオマーカー（ｔａｕタンパク質及びＡβ−４２タンパク質）の濃度の積の検出結果に基づいて、ＲＯＣ図を作図することから、アルツハイマー病における二種類のバイオマーカーの濃度の積の試験に対応して異なる臨界値での感度及び特異度の図を生成する。当業者であればＲＯＣ分析の応用を容易に理解して実行することができる。
【００３０】
具体的な実施例において、前記ＲＯＣ曲線は（１−特異度）をＸ軸とし、そして感度をＹ軸として作図を行う。
【００３１】
本文中にて使用する専門用語「感度（ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）」とは生物サンプル中のアルツハイマー病における二種類のバイオマーカー（Ｔａｕタンパク質及びＡβ−４２タンパク質）の濃度の積に基づきアルツハイマー病に罹患した個体を正確に識別したパーセンテージを意味する。つまり、感度＝（真陽性結果）／[（真陽性結果）+（偽陰性結果）]。
【００３２】
本文中にて使用する専門用語「特異度（ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）」とは本発明に基づいて健康者として正確に識別された健康対照グループのパーセンテージを意味する。つまり、特異度＝（真陰性結果）／[（真陰性結果）+（偽陽性結果）]。
【００３３】
具体的な実施例において、前記アルツハイマー病における二種類のバイオマーカーの濃度の積の標準値は受信者動作特性（ｒｅｃｅｉｖｅｒ ｏｐｅｒａｔｉｎｇ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）曲線により決定されたしきい値である。好ましい具体的な実施例において、前記しきい値は前記受信者動作特性曲線中にて最高感度で得られた最高特異度により決定され得られたものである。
【００３４】
具体的な実施例において、前記最高感度の範囲は０．７から１である。他の具体的な実施例において、前記最高特異度の範囲は０．７から１である。
【００３５】
具体的な実施例において、前記しきい値は更に前記受信者動作特性曲線での最大面積により決定される。好ましい具体的な実施例において、前記最大面積の範囲は０．７から１である。
【００３６】
本文中にて使用する専門用語「個体（ｓｕｂｊｅｃｔ）」とはほ乳類動物、より好ましくはヒトを意味する。ほ乳類動物にはヒト、霊長類動物、家畜、げっ歯類動物及び愛玩動物が含まれるが、これらに限定されない。
【００３７】
本文中にて使用する専門用語「患者（ｐａｔｉｅｎｔ）」とは進行中又は健康若しくは医療介護及び／若しくは治療が必要な人を意味している。このうち、前記人はこの介護待ち中、この介護を受けている、又はすでにこの介護を受けていた可能性がある。
【００３８】
本文中にて言及びする「健康」、「正常（ｎｏｒｍａｌ）グループ」又は「正常」個体由来のサンプルとは、参酌定性又は定量化した結果、当該該個体はすでに又は医師によりアルツハイマー病に罹患していないと推測されるものを意味する。「正常」個体は通常評価する個体の年齢に符合し、その年齢誤差は５ないし１０年範囲内であるが、年齢が完全に符合するものに限定されない。
【００３９】
具体的な実施例において、前記アルツハイマー病はアルツハイマー型認知症である。好ましい具体的な実施例において、前記アルツハイマー型認知症にはアルツハイマー病による認知障害が含まれる。更に好ましい具体的な実施例において、前記アルツハイマー病による認知障害はアルツハイマー病による軽度の認知障害である。
【００４０】
具体的な実施例において、前記磁性ナノ粒子の材料はＦｅ３Ｏ４、Ｆｅ２Ｏ３、ＭｎＦｅ２Ｏ４、ＣｏＦｅ２Ｏ４、ＮｉＦｅ２Ｏ４からなる群から選ばれる。好ましい具体的な実施例において、前記磁性ナノ粒子の材料はＦｅ３Ｏ４である。
【００４１】
本文中にて使用する専門用語「血液検体」とは自血液から誘導された生物サンプル、好ましくは周辺（又は循環する）血液を意味する。血液検体は全血、血漿又は血清とすることができる。他の具体的な実施例において、前記生物検体は血液検体である。更に好ましい具体的な実施例において、前記血液検体は血漿である。
【発明の効果】
【００４２】
本発明が提供するアルツハイマー病罹患リスクを検出する方法は、その他従来技術と比較して、以下のような長所を備える。
【００４３】
（１）本発明では免疫磁気的低下分析方法により、比較的取得しやすい血液サンプルを被験生物サンプルとして用いるものであり、取得する過程が相対的に危険でかつ不快感のある脳脊髄液サンプルではなく、しかも免疫磁気的低下分析方法では生物サンプル中にてアルツハイマー病におけるバイオマーカー（例えばｔａｕタンパク質及びＡβ−４２タンパク質）の濃度をｐｇ／ｍｌの精度で検出でき、現行の免疫分析技術に比べても、より低く及びより正確な濃度を測定できる。
【００４４】
（２）現在一般的に使用されているアルツハイマー病における単一のバイオマーカーＡβ−４２タンパク質では、アルツハイマー病の判別につきその特異度又は感度が劣り、そしてｔａｕタンパク質は主に脳の損傷によりその濃度は高くなることから、アルツハイマー病を判別することにつき特異性を持つとは言えないが、一方、本発明では当該二種のバイオマーカーの濃度の積によりアルツハイマー病を判断する新たなパラメータとしており、特にアルツハイマー病による軽度の認知障害とアルツハイマー型認知症とを区別する診断において、優れた特異度及び感度を有し、軽度の認知障害期の臨床前のアルツハイマー病を識別するのに役立つ。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】本発明の検出システムの概略図である。
【図２】本発明の検出試薬の概略図である。
【図３】試薬がバイオマーカーに結合ことを検出する概略図である。
【図４】Ａβ−４０ （●）、 Ａβ−４２ （×）及びｔａｕタンパク質（■）が濃度に伴って変化するとともに三回の測定により発生した誤差線を注記した免疫磁気的低下信号である。
【図５】異なる臨床グループ別にて、Ａβー−４０試薬で補助した免疫磁気的低下分析で使用して検出された血漿中のＡβ−４０濃度である。
【図６】異なる臨床グループ別にて、Ａβ−４２試薬で補助した免疫磁気低下分析を使用して検出された血漿中のＡβ−４２濃度である。
【図７】健康対照グループと患者グループ（アルツハイマー病による軽度の認知障害があるグループ（ＡＤによるＭＣＩ）、軽微なアルツハイマー病（軽微ＡＤ）及び中度から重度のアルツハイマー型認知症（中度から重度ＡＤ）を含む）とを区別する受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線である。
【図８】アルツハイマー病による軽度の認知障害があるグループとアルツハイマー型認知症グループとを区別する受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線である。
【図９】異なる臨床グループ別にて、ｔａｕ試薬で補助した免疫磁気的低下分析を使用して検出された血漿中ｔａｕ濃度である。
【図１０】健康対照グループと患者グループ（アルツハイマー病による軽度の認知障害があるグループ（ＡＤによるＭＣＩ）、軽微なアルツハイマー病（軽微ＡＤ）及び中度から重度のアルツハイマー型認知症（中度から重度ＡＤ）を含む）とを区別する受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線である。
【図１１】アルツハイマー病による軽度の認知障害があるグループとアルツハイマー型認知症グループとを区別する受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線である。
【図１２】異なる臨床グループ別にて、免疫磁気的低下分析所で検出した血漿中のＡβ−４２及びｔａｕタンパク質濃度の積である。
【図１３】健康対照グループと患者グループ（アルツハイマー病による軽度の認知障害があるグループ（ＡＤによるＭＣＩ）、軽微なアルツハイマー病（軽微ＡＤ）及び中度から重度のアルツハイマー型認知症（中度から重度ＡＤ）を含む）とを区別する受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線である。
【図１４】アルツハイマー病による軽度の認知障害があるグループとアルツハイマー型認知症グループとを区別する受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線である。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
本発明の技術的思想はアルツハイマー病における二種類のバイオマーカーｔａｕタンパク質及びＡβ−４２タンパク質の濃度の積を利用して、アルツハイマー病に罹患するリスクを判別するところにある。この技術的思想によれば、本発明は上記及び下記の説明を含むが、これに限定されない。実施形態を以下の範例のように示す。
【００４７】
臨床認知症評価法（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｍｅｎｔｉａ Ｒａｔｉｎｇ Ｓｃａｌｅ、ＣＤＲ）で評価された軽微（ＣＤＲ ０．５）、中度（ＣＤＲ １）から重度（ＣＤＲ ３）までとレベルの異なるアルツハイマー型認知症に罹患している６１名の患者及び６６名の健康対照グループの血漿から収集されて、アミロイド及びｔａｕタンパク質に対する超伝導免疫磁気的低下分析を行った。認知症に罹患している全ての患者は米国国立老化研究所及びアルツハイマー病協会が２０１１年にアルツハイマー病の可能性があると発表するについての診断ガイドラインに符合する。対照グループの被験者は軽度の認知障害のグループ実験中の健康な志願者から選出されたものである。
【００４８】
アルツハイマー病の前駆症状期では、患者には通常軽度の認知障害（ｍｉｌｄ ｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ、ＭＣＩ）がある。毎年、軽度の認知障害からアルツハイマー病に移行する比率は１０％前後であり、かつ三年内に３０％ないし５０％の軽度の認知障害患者が認知症に移行する。大脳アミロイド陽性の軽度の認知障害患者のサブグループにおいて、その三年間の累積移行率は８２％にまで上昇する。アルツハイマー型認知症について行う可能な予防措置を実施するためには、バイオマーカー分析によりアルツハイマー病に起因する軽度の認知障害をいち早く診断しなければならない。よって、超伝導免疫磁気的低下分析はアルツハイマー病に起因する軽度の認知障害の２４名の患者の血漿中のアミロイド及びｔａｕタンパク質の測定に用いられる。アルツハイマー病に起因する軽度の認知障害の診断も米国国立老化研究所及びアルツハイマー病協会が発表した診断ガイドラインのアドバイスに従う。アルツハイマー病に起因する軽度の認知障害を診断するために、本発明では正式な知能テストを使用するとともに、年齢及び教育レベルに符合する対照グループのスケールスコアの４％以下（１．５標準差未満）をしきい値とする。今回の研究において、本発明では、血漿中のアミロイド及びｔａｕタンパク質分析結果から、健康対照グループ、アルツハイマー病に起因する軽度の認知障害以及びアルツハイマー型認知症と判別するに足りるパラメータを探し出すことに的を絞った。
【００４９】
全ての被験者又はその主たる介護者はいずれも今回の研究調査に参加する前に告知同意書に署名している。
【００５０】
実験の詳細
【００５１】
三種類の試薬（ＭＦ−ＡＢ０−００６０、 ＭＦ−ＡＢ２−００６０、 ＭＦ−ＴＡＵ−００６０、 ＭａｇＱｕ）はそれぞれＡβ−４０、Ａβ−４２及びｔａｕタンパク質バイオマーカーを分析するのに用いられる。各々の試薬はいずれもｐＨ値７．２であるリン酸系緩衝液（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ ｂｕｆｆｅｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ、ＰＢＳ）中の磁性ナノ粒子である。Ａβ−４０（ｓｃ−５３８２２、 Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、Ａβ−４２（４３７９００、 Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びｔａｕタンパク質（Ｔａｕ−４４１、 Ｓｉｇｍａ）につき特異性を持つ抗体をそれぞれ磁性ナノ粒子上に定着した後に、三種類の試薬の調製が完了する。抗体機能化された磁性ナノ粒子は、平均半径が５０から６０ｎｍである。各々の試薬の磁性濃度は１２ｍｇ−鉄／ｍｇである。
【００５２】
免疫磁気的低下信号を測定する試薬及び被験サンプル容量は表１中に示す。各々の混合物は主に超伝導量子干渉素子で構成された交流電磁導率計（ＸａｃＰｒｏ−Ｓ、 ＭａｇＱｕ）に配置されることで、混合物の経時的に変化する交流電磁化率を検出する。抗体功能化した後の磁性ナノ粒子とターゲットであるバイオマーカーとが結合することにより混合物の交流電磁化率が低下する。磁化率の下降が免疫磁気的低下信号である。
【００５３】
【表１】
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【００５４】
本発明にて、異なる濃度のＡβ−４０／Ａβ−４２／ｔａｕタンパク質を含む溶液はすでに調製されていた。これら溶液は免疫磁気的低下信号和とＡβ−４０、Ａβ−４２及びｔａｕタンパク質との関係を確立する被験サンプルとされる。そしてこれら関係値は特性曲線とされる。続いて、Ａβ−４０、Ａβ−４２及びｔａｕタンパク質に対応するヒト血漿での免疫磁気的低下信号が検出されるとともに、この特性曲線でＡβ−４０、Ａβ−４２及びｔａｕタンパク質の濃度に変換する。 ６６名の健康対照者（健康対照グループ、ＨＣ）、軽度の認知障害（ＭＣＩ）に罹患した２４名の患者（アルツハイマー病による軽度の認知障害があるグループ）、アルツハイマー病による軽微な認知症に罹患した３１名の患者及びアルツハイマー病による中度から重度の認知症に罹患した３０名の患者（アルツハイマー型認知症グループ、ＡＤＤ）の人口統計学上の特徴を表２中に示す。
【００５５】
【表２】
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【００５６】
ＨＣ：健康対照グループ、ＭＣＩ：アルツハイマー病による軽度の認知障害、ＡＤＤ：軽微から重度（ＣＤＲが０．５から３）認知症のアルツハイマー型認知症。
【００５７】
結果と討論
【００５８】
図４に示すものはＡβ−４０、Ａβ−４２及びｔａｕタンパク質がリン酸系緩衝液（ＰＢＳ）中で濃度に伴って変化するとともに含データポイントのピーク免疫磁気的低下信号を含み、つまりＩＭＲ（％）−Φ曲線又は特性曲線である。仮定のバイオマーカーに対して、そのデータポイントはロジック数１でフィッティングを行うことができる。
【００５９】
数１の中、Ａ、 Ｂ、 Φｏ 及びγはフィッティングパラメータ、フィッティングパラメータＡはバックグラウンドレベル、Ｂは最大値、Φｏは免疫磁気的低下信号が（（Ａ+Ｂ）／２）に等しい場合のバイオマーカー濃度、およびγはΦをｘ軸としてＩＭＲ（％）とｙ軸とした関係曲線図におけるΦｏデータポイントの傾斜率である。フィッティングデータポイントを数１に代入することで、これらが表３に示されるＡβ−４０、Ａβ−４２及びｔａｕタンパク質に対応するフィッティングパラメータが見つかる。フィッティング曲線は図４中にて実線形式で作図されている。ここで、Ａβ−４０、Ａβ−４２及びｔａｕタンパク質分析の最低検出限界がｐｇ／ｍｌにまで下げることが可能であることが明らかになっている。
【００６０】
【表３】
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【００６１】
ヒト血漿中のＡβ−４０濃度ΦＡβ−４０は超伝導免疫磁気的低下分析により測定される。その結果を図５中に示す。Ａβ−４０濃度ΦＡβ−４０は、健康対照グループ、アルツハイマー病による軽度の認知障害、アルツハイマー病による軽微な認知症及びアルツハイマー病による中度から重度の認知症との間に顕著な差異はなかった。この結果は血漿中のＡβ−４０が軽度の認知障害又はアルツハイマー病的バイオマーカーを診断するのに用いることができるものではないことを示唆している。アルツハイマー型認知症患者の脳脊髓液中のＡβ−４０濃度も使用可能なバイオマーカーではない。
【００６２】
ところでＡβ−４２が血漿中で検出された濃度を図６中に示す。健康対照グループのＡβ−４２濃度はアルツハイマー病による軽度の認知障害患者及びアルツハイマー型認知症グループと比べても低めである。この観察はすでに報告のある一般的な酵素免疫分析法（ＥＬＩＳＡ）で測定した脳脊髓液サンプル中のＡβ−４２濃度が下降するという結果と反対である。数倍の対比が生じた原因としては、例えばアルツハイマー病患者の脳血管障壁のアミロイド及び脳以外の血漿アミロイド由来の透過能力について変化したことが考えられる。また以前報告のある血漿中のＡβ−４２濃度が降下する又は変わらないという研究結果と異なる原因としては、試薬中の磁性四酸化三鉄ナノ粒子の鉄キレートにより血漿中のＡβ−４２のペプチドがマルチマー化できないことに由来することが考えられる。よって、免疫磁気的低下分析で測定されたＡβ−４２濃度は本発明における軽度の認知障害グループ及びアルツハイマー型認知症グループでは高めである。
【００６３】
本発明の診断上での特性をより詳細に示すために、アルツハイマー病による軽度の認知障害、軽微なアルツハイマー病及び中度から重度のアルツハイマー病が一つのグループに統合されるとともに、患者グループとして定義されている。受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線分析を図７に示しており、健康対照グループと患者グループとの間のＡβ−４２濃度しきい値は１６．３３ ｐｇ／ｍｌであり、図６中にて破線で示している。図７中にて、Ａβ−４２濃度にて健康対照グループとアルツハイマー病による軽度の認知障害及び認知症からなる患者グループとを区別する感度及び特異度はそれぞれ０．９１及び０．８８である。アルツハイマー病による軽度の認知障害患者とアルツハイマー病による認知症患者とを区別するための感度及び特異度も更に見られる。図８中の受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線は感度及び特異度をそれぞれ０．６９及び０．６８であることを示し、かつ図６中にて点線で示すしきい値は１７．６５ ｐｇ／ｍｌである。全てのしきい値、感度及び特異度の結果はいずれも表４中に示す。
【００６４】
【表４】
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【００６５】
ＨＣ：健康対照グループ、ＭＣＩ：アルツハイマー病による軽度の認知障害、ＡＤＤ：軽微から重度（ＣＤＲは０．５から３）認知症のアルツハイマー型認知症を含む、ＡＤＤとＭＣＩとを統合して患者とする。
【００６６】
図９に示すものは異なる臨床グループ中の血漿ｔａｕタンパク質濃度Φｔａｕである。健康対照グループと患者グループとの間にて２３．８９ ｐｇ／ｍｌという明確なしきい値が見つかる。図１０中の特異度及び感度はそれぞれ０．９７及び０．９１である。２３．８９ ｐｇ／ｍｌであるｔａｕタンパク質濃度しきい値は図９中にて破線で示している。血漿中のｔａｕタンパク質濃度は軽度の認知障害グループ及びアルツハイマー型認知症グループ中にて上昇しているが、このような結果とこれまでの脳脊髓液中のｔａｕタンパク質濃度が上昇するという数回の研究報告と同じである。患者グループにて、アルツハイマー病による軽度の認知障害があるグループ及び認知症グループの間の受信者動作特性（ｒｅｃｅｉｖｅｒ ｏｐｅｒａｔｉｎｇ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ、ＲＯＣ）曲線が更に分析される。前記曲線を図１１中に示す。感度は０．７４、特異度は０．７９、且つしきい値は３７．９３ ｐｇ／ｍｌである。アルツハイマー病による軽度の認知障害があるグループ及び認知症グループの間の３７．９３ ｐｇ／ｍｌであるしきい値は図９中にて点線で示している。
【００６７】
図６及び図９中の結果では、血漿中のＡβ−４２及びｔａｕタンパク質が軽度の認知障害患者又はアルツハイマー病患者を識別する上で高感度及び高特異度が現れていることを示しているが、現在の文献又は研究では当該Ａβ−４２タンパク質は間違いなくアルツハイマー病性の診断につき特異性が高いものの、ｔａｕタンパク質はアルツハイマー病性の診断につき特異性を持たないことを示しており、そしてｔａｕタンパク質は患者の脳部に損傷があるだけでも、当該ｔａｕタンパク質の濃度は上昇するため、当該ｔａｕタンパク質の濃度はアルツハイマー病の重度程度を診断するには適さない。
【００６８】
したがって、アルツハイマー病による軽度の認知障害とアルツハイマー型認知症とを区別する上でより好ましいパラメータが必要となる。患者グループ中のＡβ−４２及びｔａｕタンパク質濃度は健康対照グループよりも高いことから、Ａβ−４２及びｔａｕタンパク質濃度の積をアルツハイマー型認知症とアルツハイマー病による軽度の認知障害との区別を改善する潜在的な診断パラメータとすることを合理的に提示することができる。図１２中に示すものはアルツハイマー病による軽度の認知障害があるグループ、アルツハイマー型認知症グループ（軽度のアルツハイマー病及び中度から重度のアルツハイマー病を含む）及び健康対照グループのＡβ−４２及びｔａｕタンパク質濃度の積である。受信者動作特性（ＲＯＣ）分析により、アルツハイマー病による軽度の認知障害とアルツハイマー型認知症とを区別するための感度が０．７７であり且つ特異度が０．８３であるしきい値６４２．５８（ｐｇ／ｍｌ）２が得られる。Ａβ−４２及びｔａｕタンパク質濃度の積はＡβ−４２又はｔａｕタンパク質という単一の濃度よりも、アルツハイマー病による軽度の認知障害及びアルツハイマー型認知症の鑑別診断を行うことがより可能になる。濃度の積は高い精度を備えるとともに患者グループの診断の改善に用いることができる。受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線分析では０．９６の感度及び０．９７の特異度が発生するうえ、図１４中に示すしきい値が４５５．４９（ｐｇ／ｍｌ）２となっている。図１２から図１４には、血漿中のＡβ−４２及びｔａｕタンパク質濃度の積がＡβ−４２又はｔａｕタンパク質という単一のバイオマーカーよりも更に確かで有力な診断パラメータであるという事実が示されている。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
例えばＡβ−４２又はｔａｕタンパク質などの単一のバイオマーカーの代わりに、血漿中のＡβ−４２及びｔａｕタンパク質濃度の積でアルツハイマー病を診断する感度及び特異度を改善しており、この濃度の積ではアルツハイマー病による軽度の認知障害とアルツハイマー型認知症とを区別することが可能となり、その感度は０．７７であり且つ特異度が０．８３となっている。精度以外にも、本発明で開示する方式では非脳脊髓液である血漿を分析サンプルとして使用するというアドバンテージを備えている。超伝導免疫磁気的低下分析を使用することで、分析上での安全性及び使用可能性を明らかに改善している。したがって、血漿バイオマーカーの超伝導免疫磁気的低下分析は効果的な診断補助であって、アルツハイマー型認知症を検知するのみならず、軽度の認知障害期にある臨床前アルツハイマー病を識別することが可能となる。
【符号の説明】
【００７０】
１０      アルツハイマー病発症リスクの検出システム
１１      検出手段
１２      演算手段
１３      識別手段
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
0005847221.tif 000011
【図５】
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【図６】
0005847221.tif 000013
【図７】
0005847221.tif 000014
【図８】
0005847221.tif 000015
【図９】
0005847221.tif 000016
【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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