(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物オプシンを発現するように遺伝子改変された前駆細胞を含む組織培養マトリクスであって、前記前駆細胞が、神経前駆細胞、グリア前駆細胞又は血管前駆細胞を含むマトリクス；
前記組織培養マトリクス中の細胞にパルス光を供与するように配置された光源；および
前記光源に動力を供給して駆動させるパルス発生器を備え、
前記微生物オプシンがチャネルロドプシンであり、
前記組織培養マトリクスが多孔性隔膜を備え、当該多孔性隔膜はポリエチレンテレフタラートからなり、３μｍ〜７μｍの径の孔を有する、装置。
【請求項２】
前記組織培養マトリクスが多孔性隔膜を備え、当該多孔性隔膜は前記組織培養マトリクスからの細胞の移動を防止し、マトリクスの他の部分における凝集を防止するように配置される、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記微生物オプシンがチャネルロドプシン−２である、請求項１に記載の装置。
【請求項４】
活動電位の表示器によって供給される検出光のための光検出器をさらに備える、請求項１に記載の装置。
【請求項５】
前記微生物オプシンが、細胞型に特異的なプロモータに作動可能に結合したヌクレオチド配列によってコードされる、請求項１に記載の装置。
【請求項６】
前記前駆細胞がニューロン前駆細胞であり、前記微生物オプシンがニューロンに特異的なプロモータに作動可能に結合したヌクレオチド配列によってコードされる、請求項１に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連特許文献
本願は、２００８年６月１７日付で提出された「改変組織中における細胞相互作用の制御」という名称の米国仮特許出願第６１／１３２，１６３号および２００８年８月２９日付で提出された「自動化された時間的に正確な光遺伝学的刺激を用いた、胚性幹細胞分化の調節に関わる構成物、方法、および組成物」という名称の米国仮特許出願第６１／０９３，０８６号の米国特許法第１１９条（ｅ）に基づく利益を主張する。基礎となるこれらの仮出願およびそれぞれの添付文書全体を参照により本明細書に取り込む。本特許文書は以下の基礎となる特許文献にも関し、これらの全体を参照により本明細書に取り込む：２００６年７月２４日付で提出された米国特許出願第１１／４５９，６３６号（ＳＴＦＤ．１６９ＰＡ）、２００８年１月９日付で提出された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０５０６２８号（ＳＴＦＤ．１５０ＰＣＴ）、および２００８年８月７日付で提出された米国特許出願第１２／１８７，９２７（ＳＴＦＤ．１６７ＰＡ）（例えば図１〜５に関する説明）。
【０００２】
本発明は、概して細胞および／または組織の成長および発達のための方法、デバイス、およびシステムに関する。
【背景技術】
【０００３】
自然の状態で発達する組織は本来、多細胞型の性質をしている。移植される培養幹細胞は、かなりの部分が、成熟せずにまたは機能的な組織系中に組み込まれずに死滅する。培養細胞は、それらが自然の状態で共存する細胞のそばで発達させると、生存および機能的な組込みの確率が上昇する。多くの場合、生存細胞の数は、ニューロンと共にグリア細胞および内皮細胞または線維芽細胞を成長させることで改善され得る。通常、これは培養中および移植後の両方に当てはまる。
【０００４】
生物体と分離して組織および／または細胞などを成長させる組織培養は、通常、ブロスまたは寒天等の液体、半固体、または固体の成長培地を用いることで促進される。例えば再生医療において固体臓器として移植することが意図される場合、好適なマトリックスが通常要求される。適切な場所に適切な未熟細胞（例えば幹細胞）が存在しても、機能性を有し且つ／または移植可能である組織への発達は自然発生的には起こらない。具体的に、神経組織、例えば脳の場合、環境中の種々の細胞の活性によって、軸索および樹状突起の出芽が形成される。このように、局所的な細胞環境が神経発生の制御に重要である。経験的に、科学者は、海馬細胞の共培養が海馬における神経発生を促進することおよび神経発生を生じさせない環境中で成長した成熟ＮＰＣ（ニューロン前駆細胞）は興奮に反応することができないことを実験により示してきた。これらの細胞は、例えば化学的シグナル、分子的シグナル、および電気的シグナルを介して、互いに連絡する。しばしば化学的または分子的なシグナル伝達は電気的シグナル伝達によって引き起こされ、例えば内分泌細胞は電気刺激された時に成長因子を放出する。このような場合、活性依存的な競争が起こることが多い。例えば、脳の一領域のより活性の高いニューロンは、より活性の低いニューロンが占める領域にまで広がって成長する。逆に、発達中に脳領域中の活性を制限すると機能的欠陥が生じる。電気的シグナル伝達および分子的シグナル伝達は、培養中の細胞が環境中で相互の挙動を制御するための最も一般的なアプローチである。
【０００５】
電気的シグナル伝達は、神経細胞発達の重要な部分であり、内分泌細胞および筋肉細胞などの多くのその他の細胞型の細胞にとっても重要な部分である。ニューロン前駆細胞（ＮＰＣ）に電気パルスを与えると、ＮＰＣは一般的な球様構造から成熟ニューロンへと発達し、それに従い軸索および樹状突起を出芽し、他のニューロンとの電気的結合を確立する。
【０００６】
化学的／分子的シグナル伝達はしばしば、電気的シグナル伝達により引き起こされる。例えば、成体の神経発生およびＮＰＣの成熟は、興奮性の刺激により大幅に強化され、Ｃａｖ１．２／１．３チャネルおよびＮＭＤＡ受容体が関与する。これらのＣａ２＋流入経路は増殖中のＮＰＣ上にあり、これによってＮＰＣは興奮性刺激を直接感知して処理することができる。ＮＰＣ中のＣａ２＋シグナルは、神経発達を促進した遺伝子発現パターンを急速に誘導する。これにより、新しいニューロンのシナプスが活性な神経回路中に組み込まれる。別の例として、電気刺激された時に成長因子を放出する内分泌細胞が挙げられるが、これは、他の分子的シグナルまたは化学的シグナルによっても引き起こされ得る。神経成長因子（ＮＧＦ）は、発達中のニューロンを囲む細胞、例えばグリア細胞によって分泌され、これはニューロンの発達および長期生存に重要である。神経成長因子（ＮＧＦ）は、グリア細胞およびある種のニューロンにより分泌される小タンパク質であり、標的ニューロンの分化および生存を誘導する。ＮＧＦは、その高親和性受容体（ＴｒｋＡ）および低親和性受容体（ＬＮＧＦＲ）に結合してそれらを活性化し、ニューロンの生存および分化を促進する。逆に、ｐｒｏＮＧＦ等のＮＧＦを分子的に修飾することでアポトーシスを惹起することができる。脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）が、線維芽細胞、内皮細胞（例えば毛細血管内の内皮細胞）等の細胞から放出され、軸索および樹状突起の出芽などのニューロンの成長および発達を促進する働きをする。ＢＤＮＦの発現が不足すると、ニューロンの発達が損なわれるだけでなく、毛細血管の発達および内皮細胞自体の生存も損なわれる。ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、およびニューロトロフィン３は、チロシンキナーゼ（ｔｒｋ）受容体ｔｒｋＡ、ｔｒｋＢ、およびｔｒｋＣを有するニューロンに結合する。血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）−Ｄは、血管および／またはリンパ管上の血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）２およびＶＥＧＦＲ３を認識および活性化する血管新生増殖因子のＶＥＧＦファミリーの一員である。例えば、ニューロピリン１（ＮＲＰ−１）は、血管透過性因子／血管内皮増殖因子（ＶＰＦ／ＶＥＧＦ）受容体の１つであり、正常な血管の発達に関わる。
【０００７】
しかし、電気的および化学的／分子的シグナル伝達には制限がある。例えば、電気刺激は、それが活性化する細胞型は不確かである。簡潔に述べると、所定の配置の電場は、影響を与える細胞型に関して比較的選択性が低い。電極は活性ニューロン、グリア、内分泌細胞、筋細胞の挙動、更には刺激領域内の骨の成長にまで無差別に影響を与える。その結果、細胞への電極の物理的近接が、影響を受けるかどうかに関する唯一の最も大きな決定要因となり得る。これらの制限のため、異種細胞で構成される組織中で特定のクラスの細胞に排他的に影響を与えることは一般的に不可能である。
【０００８】
細胞内分子シグナル伝達は、多くの場合細胞型特異的であるものの、必要な成長因子の透過にしばしば抵抗性である物理的にきつく密着した細胞培養環境中で、特に効率的な毛細血管の発達なしに、これを人工的に修飾することは容易でないことが多い。Ｋ＋、ＢＤＮＦ、ＮＧＦ、およびＶＥＧＦなどの化学的および分子的なシグナル伝達作用を有する物質の適切且つ／または理想的な分布は、これらの物質を本来的に産生する細胞を標的細胞に関して自然な空間的配置で用いることで最も良く達成され得る。分子的シグナル伝達はしばしば、供給源である細胞への電気シグナルによって引き起こされるため、そのようなシグナル伝達は環境内の電気的活性が非特異的であることの影響を受ける。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
幹細胞（成体幹細胞または胚性幹細胞）を用いた培養神経線維の産生を成功させるためには多数の課題がある。これらの課題は、進化の中でずっと維持されている幹細胞成熟の順序およびその一生の初期にこれらの細胞配列間で生じる結合（この結合は細胞配列のその後の発達と共に維持されることもあり、維持されないこともある）に由来する問題を含む。培養繊維を長期間生存させるために、天然であれ人工的であれ、成長中の機能を強化する何らかの方法が必要であろう。
【００１０】
本実験で樹状突起および軸索の本来の発達が側面方向および／またはランダム方向に成長する傾向があることが示されているように、予測可能な方向での樹状突起および軸索の安定した出芽および成長を容易化するという目的に向かって努力が続けられている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
複数の実施例および応用例中で本発明を例示する。その一部を以下に要約する。
【００１２】
ある観点では、本発明は、組織を最適な発達に向けるために、混合組織培養環境内で特定の細胞型の活性を個々および別個に制御する機序および方法を提供することに関する。
【００１３】
本発明のある態様は、軸索および樹状突起に固有の特性を用いて幼若ニューロンの発達制御を促進することに関する。具体例として、樹状突起および軸索は、異なる関連する化学誘引物質、時間的特性（軸索は樹状突起より速く成長する）、物理的サイズ（軸索は樹状突起より長く薄い）を有する。これらの特性は、幼若ニューロンの発達を形成するための手段を提供するであろう。
【００１４】
例示的な一実施形態によれば、生物学的な組織または細胞培養において細胞相互作用を促進する方法は、複数の細胞型の中から選択された型の幹細胞の制御可能な活性化をもたらす。この方法は、選択された型の幹細胞中で微生物オプシンを発現させることで、選択された型の幹細胞を含む組織または細胞培養の領域に微生物オプシンを導入することを含む。その後、光源を幹細胞の近くに設置し、他の型の細胞の成長および発達とは独立した様式で幹細胞の成長および発達を選択的に制御するために、光源を用いて、光を制御可能に作動させ、光源からのパルス照射を選択された型の幹細胞に向ける。
【００１５】
また、本発明によれば、特定の一実施形態は、混合細胞培養環境内における特定の細胞型との個別的な連絡を提供することに関し、これによって、組織発生において個々の型および個々の役割をもつ細胞を管理することができる。これによって、これらの選択された細胞型のそれぞれを、手動またはコンピュータシステムで決定した通りに、要求に応じてそれらの特定の産物を放出するように誘導することができる。このアプローチの目的は、培養または操作されている組織の事実上全ての面を最大限に制御できるようにすることである。
【００１６】
別の特定の実施形態では、所定の空間的・幾何的配置内における組織の人工的成長を提供する。例えば、システムの一方の末端で検知したシグナルを伝播し、対応するシグナルを他方の末端に出力する、電気的に相互に結合されたニューロンの長軸方向に延びたシステム。人工的に産生された神経線維は、例えば損傷を受けたヒトの脳または脊髄中で、ダメージを受けた神経線維の代わりとして働くことができるであろう。
【００１７】
別の特定の実施形態は、脳の一部の内部ペーシング方法に関し、例えば脳の機能低下部分または機能亢進部分が内部ペーシングされ、一方で脳の別の部分を制御部として（例えば、ＤＢＳパルス発生器等の外部制御源の代わりとして）用いる。
【００１８】
更に別の特定の実施形態は、所定の移動範囲内に幹細胞細胞体を囲い込んで保持することに関する。本発明のこの態様は、幹細胞、特に胚性幹細胞がその移植場所から逃れることができ、その結果、それら自身が身体内で癌性腫瘍となり得ることを想定している。
【００１９】
応用例としては、組織培養、および生体内に移植された細胞領域に与えられる連続的な栄養刺激が含まれる。本明細書は、特定の標的細胞型に特別な連絡チャネルを与える光遺伝学的アプローチの応用を詳説する。非標的細胞型は、この特定の波長の光の影響は受けないが、異なる波長またはシグナルに対する感受性を付与されてもよい。これに係る実施形態は特に、脊髄または脳の損傷修復に適した神経組織発達の制御に関する。しかし、発達中の組織内の異なる細胞型を独立に制御する同じ一般的原理は、培養中のまたは生体内に移植された心臓、肝臓、膵臓、腎臓、骨、および身体のその他の組織にも適用される。
【００２０】
本特許にかかる発明の別の態様は、胚性幹細胞への微生物オプシンの使用および導入、並びに迅速な光学要素およびイオン流の光遺伝学的制御を利用して胚性幹細胞分化を非侵襲的に調節するための自動化された新規なシステムを用いる幹細胞工学用途向けの光遺伝学的技術の開発に関する。
【００２１】
更に別の実施形態によれば、本発明は、脳内移植後に、ニューロンを機能化して宿主と一体化させるＣＮＳ（中枢神経系）疾患／行動の治療（例えばパーキンソン病、脳卒中、および脊髄損傷に適用可能）に関する。この目的のために、本発明は、分化細胞を生成し、本来の神経回路中に組み込み、その後、光で選択的に制御する、ＣＮＳ疾患／行動を治療するための幹細胞療法に関する。
【００２２】
本発明の上記した概要は、本発明の説明した各実施形態または全ての実施例を記載することを意図したものではない。添付の図面および以下の詳細な説明で、これらの実施形態を更に具体的に例示する。
【００２３】
以下に記載する本発明の種々の実施形態の詳細な説明を添付の図面と一緒に考慮することで、本発明が更に深く理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】本発明の一実施形態に係る、選択的活性化（例えば刺激または抑制）およびその活性検出のための、組織の成長、発達、活性、および維持中に協同して機能する複数のクラスの細胞型を含むシステムを示す図である。
【図２】本発明の一実施形態に係る、生物学的構成要素および人工的構成要素の仕組、並びに組織培養をマルチチャネルで刺激するための刺激手段を示す図である。
【図３】本発明に係る組織サンプルを培養するためのシステムを示す図である。
【図４】本発明に係る、１つの細胞に複数の形質導入を用い、二次的に影響を受ける第２の細胞型の活性を介した活性フィードバックを示すシステムを示す図である。
【図５】本発明に係る、培養中または移植後の組織発達を管理するのに適したマルチチャネル刺激およびモニタリングシステムを示す図である。
【図６】本発明に係る、発達を促進する、生きた生物中への培養組織の生体内移植および組込みを示す模式図である。
【図７】本発明に係る実施例の結果を示す画像およびチャートである。
【図８】本発明に係る実施例の結果を示す画像およびチャートである。
【図９】本発明に係る実施例の結果を示す画像およびチャートである。
【図１０】本発明に係る実施例の結果を示す画像およびチャートである。
【図１１】本発明に係る実施例の結果を示す画像およびチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明は、種々の修正および変更形態が可能であり、その詳細を例として図面中に示し、詳細に記載する。しかし、それらは記載した特定の実施形態に本発明を限定することを意図するものと理解されるべきではない。逆に、本発明の精神および範囲に含まれる全ての修正、均等物、および変更が本発明に含まれることが意図される。
【００２６】
本発明は、生物学的組織中の胚性幹細胞等の幹細胞の培養およびその成長促進のための方法および装置に関する。本発明は、神経ネットワーク中における幹細胞の成長を扱う仕組および方法における使用に特に適していることが見出された。本発明はそのような生物学的環境に必ずしも限定される必要はないが、これを用いた種々の例の説明を介して、本発明の種々の態様が理解されよう。
【００２７】
本発明の例示的な一実施形態によれば、生物学的な組織または細胞培養中における細胞相互作用を促進するための方法により、組織または細胞培養中に存在してもしなくてもよい複数の細胞型の中から選択された型の幹細胞が制御可能に活性化される。この方法は、選択された型の幹細胞中で微生物オプシンを発現させることで、選択された型の幹細胞を含む組織または細胞培養の領域に微生物オプシンを導入することを含む。その後、光源を幹細胞の近くに置き、他の型の細胞の成長および発達とは独立した様式で幹細胞の成長および発達を選択的に制御するために、この光源を用いて、制御可能に光を作動させて光源からの照射パルスを選択された型の幹細胞に向ける。
【００２８】
図１は、組織の成長、発達、活動、および維持中に協同して機能する複数のクラスの細胞型を示す。これらの細胞型は、例えばカラーＬＥＤおよび選択的カラーフィルタを付けたフォトダイオードのアレイを用いて、選択的に刺激または抑制、およびその活性の検出がなされ得る。各ＬＥＤおよびフォトダイオードは、コンピュータに接続された別個のチャネルで制御される。コンピュータコントローラ１００はマルチチャネルドライバ１０１を介して出入力を送受信し、マルチチャネルドライバ１０１は、マルチチャネルケーブル１５０を介して連結されたトランスデューサ（ＬＥＤ１８７、１７７、および１５７並びにフォトダイオード１６７および１４７）を介して各細胞と連絡する。ＬＥＤ１８７は、ＣｈＲ２を介してグリア細胞１８５のイオンチャネルを調節する光１８６を放射する。これにより、神経栄養性化学物質１８４（例えばＢＤＮＦ）が放出され、これがニューロン１２０に受容され、その結果、ニューロン１２０の成長および発達が誘導される。ニューロン１２０は、成長すると、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）等の栄養性化学物質を放出し、これは毛細血管１４５に受容され、毛細血管１４５が一部を形成しているネットワークの成長を促進する。ＬＥＤ１７７は、ニューロン１７５のイオンチャネルを調節する光１７６を放射する。バンドフィルタを備えたフォトダイオード１６７が、活動電位１６４に反応してニューロン１６５から放出される指示薬（電圧色素等）により放射される波長の光１６６を受信する。ＬＥＤ１５７は、線維芽細胞１５５のイオンチャネルを調節する波長の光１５６を放射する。バンドフィルタを備えたフォトダイオード１４７は、指示薬により放射される波長の光１４６、例えばＦｕｒａ−２またはＲＨ１６９１により放射される特有な波長の光を受信する。ニューロン１２０は軸索１２２を有し、軸索１２２はシナプス１２９を介して、軸索１７５を有する第２のニューロン１６５と連絡する。ニューロン１２０は、グリア細胞１８５から代謝支援を受ける。グリア細胞１８５は、毛細血管１４５に接するエンドフィート１８６から栄養を引き出し、エンドフィート１８７を介してニューロン細胞１２０に栄養を届ける。ミクログリア１４０（代表的なサンプルを示す。）は全体に分散されている。増殖中のＮＰＣ上にはＣａ２＋流入経路があるので、ＮＰＣは興奮刺激を直接感知および処理することができる。ＮＰＣ中のＣａ２＋シグナルは、神経発達が促進された遺伝子発現パターンを急速に誘導する。これにより、活動する神経回路に新しいニューロンのシナプスが組み込まれる。別の例として、電気刺激された時に成長因子を放出する内分泌細胞が挙げられるが、これは他の分子的シグナルまたは化学的シグナルによっても引き起こされ得る。発達中のニューロンを囲む細胞、例えばグリア細胞によって神経成長因子（ＮＧＦ）が分泌され、これはニューロンの発達および長期間の生存に重要である。神経成長因子（ＮＧＦ）はグリア細胞および一部のニューロンによって分泌される小タンパク質であり、標的ニューロンの分化および生存を誘導する。ＮＧＦは、その高親和性受容体（ＴｒｋＡ）および低親和性受容体（ＬＮＧＦＲ）に結合してそれらを活性化し、ニューロンの生存および分化を促進する。逆に、ｐｒｏＮＧＦ等のＮＧＦを分子的に修飾することでアポトーシスを惹起することができる。脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）が、線維芽細胞、内皮細胞（例えば毛細血管内の内皮細胞など）等の細胞から放出され、軸索および樹状突起の出芽などのニューロンの成長および発達を促進する働きをする。ＢＤＮＦの発現が不足すると、ニューロンの発達が損なわれるだけでなく、毛細血管の発達および内皮細胞自体の生存も損なわれる。ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、およびニューロトロフィン３は、チロシンキナーゼ（ｔｒｋ）受容体ｔｒｋＡ、ｔｒｋＢ、およびｔｒｋＣを有するニューロンに結合する。血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）−Ｄは、血管および／またはリンパ管上の血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）２およびＶＥＧＦＲ３を認識および活性化する、血管新生増殖因子のＶＥＧＦファミリーの一員である。例えば、ニューロピリン１（ＮＲＰ−１）は、血管透過性因子／血管内皮増殖因子（ＶＰＦ／ＶＥＧＦ）受容体の１つであり、正常な血管の発達に関わる。光遺伝学的方法は、ＢＤＮＦ、ＮＧＦ、ＧＤＮＦ、ＶＥＧＦ等の化合物の放出を引き起こすために用いることができる。
【００２９】
Ｇタンパク質の機能の１つは、細胞に刺激が与えられてからその細胞が反応するまでのプロセスを仲介することであり、例えば、ニューロンに与えられる電気的スパイクのタイミングは、Ｇタンパク質の活性に応じて、興奮性シナプス後電位の発生に変換されることもあり、されないこともある。Ｇタンパク質は種々の下流の介在物質を用いてその役割を果たすことができる。ＢＤＮＦ、ＮＧＦ、ＧＤＮＦ、ＶＥＧＦ等の因子が放出されるように、（光刺激または薬理学的刺激によって）Ｇｘ、Ｇｑ等のＧタンパク質を誘導することができる。Ｇタンパク質の刺激は細胞型特異的に（例えば、基礎となる仮特許出願文書の１または複数に記載されているか、Airan R.D., Thompson K.R., Fenno L.E., Bernstein H., Deisseroth K., Temporally Precise in vivo Control of Intracellular Signaling, Nature, 2009 Apr 23, 458(7241):1025-9, Epub 2009 Mar 18に記載されているように、細胞型特異的な遺伝子ターゲティングおよび光遺伝学的刺激方法を用いる）。これがなされた場合、そのような因子に対する細胞応答レベルの調節および制御は、組織培養、神経回路、動物、または患者内の、選択された細胞型にだけ適用され、その他の隣接する集団には適用されない。Ｇタンパク質は、ドーパミン、ノルエピネフリン、セロトニン、バソプレシン、オキシトシン、並びにその他の神経伝達物質およびホルモンの放出制御にも用いることができる。Ｇタンパク質活性の制御は、それにより細胞分化の制御を可能にし、所定の時間に神経回路がオンまたはオフにされる。
【００３０】
ネットワーク内の細胞活性レベルを外部で読み取る方法は当該技術分野で公知である。Knopfel et al., Optical probing of neuronal circuit dynamics: genetically encoded versus classical fluorescent sensors, Trends Neurosci. 2006 Mar 29, 3:160-6に記載されているように、そのような方法には、Ｆｕｒａ−２、オレゴングリーン４８８ＢＡＰＴＡ−１、Ｘ−Ｒｈｏｄ−５Ｆ等の非タンパク質性カルシウムセンサー；イエローカメレオン３．６、Ｇ−ＣａＭＰ２、Ｃａｍｇａｒｏｏ−２、ＴＮ−Ｌ１５等の遺伝的にコードされたカルシウムセンサー；ジ−４−ＡＮＥＰＰＳ、ＪＰＷ３０２８等の非タンパク質性電位センサー；並びにｈＶＯＳ等のハイブリッド電位センサー；ＦｌａＳｈ、ＳＰＡＲＣ、ＶＳＦＰ１等の遺伝的にコードされたセンサーの使用などがある。更に、当該技術分野で公知の手段により、ＲＨ−１５５等の吸収に基づくカルシウム流測定を利用してもよい。
【００３１】
蛍光色素に連結した抗体を用いた、細胞産物およびそれらを発現する細胞亜集団の発現の読取り値を得る方法。例えば、細胞発達の発達段階を正確に計測するために、ネスチン染色を用いることができる（例えば基礎となる米国仮特許出願第６１／０９３，０８６号参照）。
【００３２】
更に、自動化された画像解析用のソフトウェアおよびシステムを用いて、発達中の細胞のサイズおよび分化の形態の程度の両方を評価し、読み取ることができる。一例として、画像をベースにした細胞動態の解析および画像をベースにした細胞の局在または表現型のスクリーニングを実施する、Ｏｐｅｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ（www.openmicroscopy.org）のＰＥＲＬに基づくＯＭＥサーバプロジェクトに構築された顕微鏡検査システムが挙げられる。ソフトウェアによる読取りの別の例は、ＢＤ  ＩＰＬａｂ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｉｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（メリーランド州ロックビルのＢＤバイオサイエンス社製）によるものである。細胞活性に関する読取りを行うその他の方法は当該技術分野で公知であり、分光測定法（吸収および透過率）、機能的磁気共鳴画像法（ＢＯＬＤ効果の利用等）、および陽電子放射断層撮影法が含まれる。細胞代謝活性の読取りも、二酸化炭素等の気体の存在に対して反応する電子的な化学物質「探知機（ｓｎｉｆｆｅｒ）」によって得ることができる。
【００３３】
図２ａは、生物学的構成要素と人工的構成要素の仕組および改変組織培養マトリックス内の組織培養をマルチチャネルで刺激するための刺激手段を示す。パルス発生器２０１は、ＬＥＤ２２５およびＬＥＤ２２６を駆動し、これらのＬＥＤはそれぞれ異なるスペクトルおよびパラメータを発光し、一方で動力２２４およびアース２２３は、必要な電流フローを与える。例えば、ＬＥＤ２２５は青色光を５０Ｈｚで放射し、ＬＥＤ２２６は黄色光を１００Ｈｚで放射する。図１に示す電子部は図解のために単純化されている。実際には、別個のチャネルを実現するために別個に作動する複数のパルス発生器が用いられ、以降の図に示すように、これらのチャネルはシステムに入る読取りデータに応じて独立して作動することができる。ニューロン前駆細胞（ＮＰＣ、神経幹細胞）２０５、グリア前駆細胞（ＧＰＣ、グリア幹細胞）２０６、および血管前駆細胞（ＶＰＣ、血管幹細胞）２０７を細胞成長培地２０８に添加する。全てが封入用多孔性膜２１６内に維持され、多孔性膜２１０に接触し、取り付けられた多孔性膜２０４によって封がされる。膜細孔２１０を有する多孔性隔膜２０９は、改変マトリックスの外に細胞が移動するのを阻止する役目を果たし、改変マトリックスのその他の部分における凝集を防ぐ。多孔性膜２０９は、ポリエチレンテレフタラート多孔性膜等の材料から構成されていてもよい。通常、細孔２１０の直径は約３〜７μである。このようなサイズの細孔２１０は通常、幹細胞本体（細胞体）が通過するには小さすぎるが、樹状突起および軸索が通過するには十分な大きさである。多孔性膜２０９は、軸索および樹状突起の成長前および成長中の細胞移動を制限する（上、下、上下、または周囲の）固着層（ａｎｃｈｏｒｉｎｇ  ｌａｙｅｒ）として機能し、移植前に培養装置から細胞を取り出すための簡便な手段を提供する。改変マトリックスに隣接する別個の区画で、細胞成長培地２１２にＮＰＣ２１１が添加され、更なるグリア前駆細胞および血管前駆細胞２０７を添加することができる。多孔性隔膜２１３は、先の多孔性膜２１０同様、マトリックスのこの区画を封じ込め、移動または凝集を防ぐ役目をする。その後に続く区画で、細胞成長培地２１５にＮＰＣ２１４が再度添加され、上記で指定した更なる細胞型が再度添加される。膜細孔２１７を有する封入用多孔性膜２１６が上記改変マトリックス全体を封入する。封入用多孔性膜２１６は、ポリエチレンテレフタラート多孔性膜等の材料から構成されていてもよい。通常、細孔２１７の直径は約３〜７μである。このようなサイズの細孔２１７は通常、幹細胞本体（細胞体）が通過するには小さすぎるが、樹状突起および軸索が通過するには十分な大きさである。これらの細孔２１７はまた、生理学的ガス交換並びに発光膜２１６の外部に位置する微小血管構造およびグリア細胞からの栄養素の流入を許す。細胞および培地区画２１８、２１９、２２０、２２１は、上記の区分化された細胞群と同様であり、同様に移動または凝集を防ぐ役目を果たす。
【００３４】
当該技術分野で公知の特定の条件下で、種々の系列の種々の細胞が、種々の産物または成長因子のいずれかを産生するように誘導することができる。例えば、ニューロン自体が、ＢＤＮＦを分泌することができ、また、内胚葉由来細胞が通常しているように胃ホルモン（血管作用性小腸ペプチド（ＶＩＰ）またはソマトスタチン（somatastatin）等）も分泌することができる。別の実施形態では、神経幹細胞または多能性幹細胞または誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ）（Takahahi et al., Yu et al.）を、より分化した対応する細胞の代わりに用いることができ、一部は例えばニューロン系の発達経路を獲得し、他の一部は例えば血管系の発達経路を取り得る。
【００３５】
図２Ｂは、本発明に従って成長させた細胞または組織を用いて、脳または身体の２つの部分、それぞれ領域２６０および領域２７０が、どのようにして機能的に結合または再結合され得るかを一般的な様式で示している。脳の場合、領域２６０および２７０は、その間の本来の結合が例えば脳血管障害によって切断された２個の脳核を表すものであってもよい。脊髄損傷の場合、領域２６０および２７０はそれぞれ、脳および以前に麻痺した筋肉を表すすものであってもよい。末梢神経の場合、２６０および２７０はそれぞれ、脊髄ガングリオンおよび求心路遮断された手を表すものであってもよい。心筋症の場合、領域２６０および２７０はそれぞれ、迷走神経および新たに再生した心臓組織を表すものであってもよい。細胞２６５は、神経細胞、グリア細胞、および血管細胞、または前駆（幹）細胞であってもよく、多孔性ポリエチレンテレフタラート膜等の人工マトリックス材料２６６によってその場所に保持されている。パルス発生器２８０がＬＥＤ２８５に動力を供給して、細胞２６５に照射される光が放射される。
【００３６】
本発明に基づき、図３ａおよび３ｂは、多数の組織サンプルを効率的に培養するためのシステムを示す。そのより具体的な実施例で、図３ａのシステムは、並行して多数の組織サンプルを効率的に培養するためのハイスループット多層システムである。図３ａは、本発明に適したマルチチャネルエミッタ−検出器ユニットを示す。マルチチャネルエミッタ−検出器ユニット３００は、ＬＥＤ３１５、フォトトランジスタ３２５、フォトトランジスタ３３５、ＬＥＤ３４5、およびＬＥＤ３５5を備え、細胞３１０、３２０、３３０、３４０、および３５０を含む組織培養ウェル３０５の上に配置される。ＬＥＤ３１５は、Ｘ型細胞３１０に受容される特定の波長域の光３１６を照射する。ＬＥＤ３４５は、Ｙ型細胞３５０に受容される特定の波長域の光３４６を照射する。ＬＥＤ３５５は、Ｚ型細胞３４０に受容される特定の波長域の光３５６を照射する。フォトトランジスタ３２５は、Ｖ型細胞３２０が放射する特定の波長域の光３２６を受信する。フォトトランジスタ３３５は、Ｗ型細胞３３０が放射する特定の波長域の光３３６を受信する。一実施形態では、細胞型Ｖがニューロン、細胞型Ｗがアストロサイト、細胞型Ｘがアストロサイト、細胞型Ｙが線維芽細胞、細胞型Ｚが膵臓ベータ細胞であってもよい。本制御方法を適用できる細胞型の多様性を強調するために、細胞型は変数Ｖ、Ｗ、Ｘ、Ｙ、Ｚを用いて示す。更に、これらの変数のいずれも、別の変数で表されるものと同じ型であってもよい。例えば、Ｖ型細胞がＸ型細胞と同一であってもよい。
【００３７】
図３ｂは、本発明に係る、並行して多数の組織サンプルを効率的に培養するためのハイスループットマルチウェルインキュベーション制御システムを示す。図３Ａ中、環境制御チャンバー３９０は、培養プレートアクチュエータ３８０および培養プレート３６５を含み、培養プレートのそれぞれは組織培養ウェル３７０（代表例）を含む。マルチチャネルエミッタ／検出器ユニット３６０（代表例）は、図３ａのマルチチャネル発光器／検出器ユニット３００と同様のものであり、発光器／検出器３６０は並べて配置され、そのそれぞれがコンピュータ３７５によって制御される。各マルチチャネル発光器／検出器ユニット３６０は、刺激を送り、ウェル３７０中の発達組織から、刺激からのフィードバックを含む読取りを受信する。刺激の指令および読取り値はコンピュータ３７５によってそれぞれ送信および受信される。コンピュータ３７５により協同するヒータ３９１、加湿器／ガス混合制御装置３９２、およびサーモスタット３９３によって適切な環境条件が維持される。
【００３８】
図４は、１つの細胞への複数の形質導入の使用を示し、二次的に影響を受ける第２の細胞型の活性に仲介される活性フィードバックを示す。遺伝子４０２は、例えばＣｈＲ２がニューロン中で光感受性を与えるように、宿主細胞に光感受性を付与する。遺伝子４１２は、細胞が特定の生理学的プロセスを受けた時に、細胞に光を放出させる。例えば、Knopfel et al. 2006に記載されている蛍光剤は、ニューロンが脱分極した時にニューロンに光を放出させる。その他の例としては、特定のホルモン（例えばＢＤＮＦ）または神経伝達物質を受容した時に発光する物質、あるいは、ＶＥＧＦ等の特定の物質を分泌した時に光を放つ物質が含まれ得る。遺伝子プロモーター４０１は遺伝子４０２を活性化するように作用し、遺伝子プロモーター４１１は遺伝子４１２を活性化するように作用する。この活性化の結果４０５として、細胞４２０は、図３に示す電子制御シグナルによって決定されるＬＥＤ４２０から放射される波長域の光４２１に生理的に反応する。この光への反応は、自己認識反応（ｓｅｌｆ−ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）４２１（例えば、軸索および樹状突起の発達増大）および外的に認識できる反応（ｅｘｔｅｒｎａｌｌｙ  ｒｅｃｏｇｎｉｚａｂｌｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）（４２５）、例えば血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の放出、または隣接する発達中の神経細胞における軸索および樹状突起の発達促進であってもよい。外的に認識できる反応４２５は、細胞４３０により受容されるものとして示しており、その結果、細胞４３０は自己認識反応（ｓｅｌｆ−ｒｅｃｏｇｎｉｚａｂｌｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）４３１および波長域４４１の光を発生する。この光放射は当然、別の形態の外的に認識できる反応（ｅｘｔｅｒｎａｌｌｙ  ｒｅｃｏｇｎｉｚａｂｌｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）である。波長域４４１の光はフォトダイオード４４０に受信され、図３の説明で詳述したように電子的検出シグナルを発生する。
【００３９】
図５は、培養またはインビボ／移植における組織発達を管理するのに適したマルチチャネルの刺激・モニタリングシステムを示す。主要サブユニットは、コンピュータ５０２によって制御される、マルチチャネルパルス出力発生器５０４およびマルチチャネル検出シグナル受信機５５０である。マルチチャネルパルス出力発生器５０４は、装置の出力部に選択的にシグナルを送信する。シグナルがチャネル１の出力５０５からチャネル１のスイッチングトランジスタ５１０を介してパルスされると、動力５０１がチャネル１のＬＥＤ５１２に与えられる。同様に、シグナルがチャネル２の出力５０６からチャネル２のスイッチングトランジスタ５２２を介してパルスされると、チャネル２のＬＥＤ５２２が点灯される。同様に、シグナルがチャネル３の出力５０７からチャネル３のスイッチングトランジスタ５３０を介してパルスされると、チャネル３のＬＥＤ５３２が点灯される。マルチチャネル検出シグナル入力５５０は、組織培養領域または移植領域をモニターするセンサーからシグナルを受信する。チャネル４の入力５５１は、チャネル４のフォトダイオード５６１が作動されたときにチャネル４のフォトダイオード５６１からのシグナルを受信する。同様に、チャネル５の入力５５２は、チャネル５のフォトダイオード５６２が作動されたときにチャネル５のフォトダイオード５６２からのシグナルを受信する。同様に、チャネル６の入力５５３は、チャネル６のフォトダイオード５６３が作動されたときにチャネル６のフォトダイオード５６３からのシグナルを受信する。上記回路機構は、動力５０１とアース５０８の間で作動する。コンピュータ５０２は、パルス出力発生器５０４を介して刺激シグナルを送信するための、およびマルチチャネルシグナル検出受信機５５０によって受信されたシグナルのパターンに応じてこれらのシグナルを修正するための知識ベース、アルゴリズム、またはプロトコールを含む。
【００４０】
図６は、本発明により発達を促進する、生きた生物への培養組織の生体内移植および組込みを模式的に示した図である。図中にこの目的のための２個の装置、２次元グリッドアレイ６６０（エミッタおよび検出器のアレイ）および３次元多面深部エミッタ・検出器プローブ６５０を示す。グリッドアレイ６６０はリード６６５を有し、プローブアレイ６５０はリード６５５を有する。インターベンションゾーン６３０は、組織の修復または発達が必要な指定部位である。インターベンション部位６３０は、脳６００のダメージを受けているか他の点で不全な領域でもよく、そこに未成熟細胞が移植される。あるいは、元々これらの領域のものであるか天然の手段によってこれらの領域に輸送された細胞が、グリッドアレイ６６０またはプローブアレイ６５０からの刺激に反応性であってもよい。グリッドアレイ６６０は、脳６００表面上の発達中の組織の挙動を管理するのに最適であり、一方、プローブアレイ６５０は、組織発達の表面下領域に到達するのに最適である。別の実施形態では、６００は、身体の脳以外の別の臓器を代わりに表してもよい。両方のインターベンションゾーン６３０に示されているのは、Ｉ型細胞６２０および６４０（移植されたもの）並びにＩＩ型細胞６２５および６４５（移植されたものまたは天然のもの）である。別の実施形態では、個別的な連絡チャネルは、非天然の化学物質または分子性物質であり得る。例えば、ニューロンは、ニューロンに影響を与える機能を本来有しない任意の分子に感受性にされてよい。これは、例えばこの任意に選択された分子の受容体の遺伝子を挿入し、この受容体がその細胞型の所望の出力機能に機能的に連結されることで達成してもよい。この新規な形態では、この任意の分子が培養中に添加されるたびに細胞が反応する。ニューロンの例では、ニューロンは活動電位を発火するか、過分極される。環境中の他の型の細胞はいずれも選択された分子に感受性でないので、アストロサイトおよび内皮細胞は反応しない。
【００４１】
本発明の別の態様は、迅速な光学要素およびイオン流の光遺伝学的制御を利用して胚性幹細胞分化を非侵襲的に調節するための新規な自動化されたシステムを用いる幹細胞工学用途向けの光遺伝学的技術を開発するための、胚性幹細胞への微生物オプシンの使用および導入に関する。
【００４２】
実験に基づく一実施形態では、マウス胚性幹細胞（ＥＳＣ）にＣｈＲ２−ＹＦＰを安定的に形質導入し、ＦＡＣＳで精製した。得られたＣｈＲ２−ＥＳＣに青色光パルスを照射すると、強い内向き電流が生じた。これらの標識ＥＳＣは、機能的成熟ニューロンへの分化能を保持しており、このことは、電位依存性ナトリウム流、活動電位、速い興奮性シナプス伝達の存在、および成熟ニューロンタンパク質の発現並びに形態により評価した。光刺激と自動化されたイメージングとを一緒に行う特別仕様のロボットステージおよび環境チャンバーで高速光スイッチングを用いて、ニューロン分化の最初の５日間ＣｈＲ２−ＥＳＣを光刺激すると、神経マーカーの発現増大が誘導された。これらのデータは、幹細胞分化の非侵襲的制御から、移植細胞が組織およびネットワークの機能に特定の寄与を与えるかどうかの評価にまでにわたる、インビトロおよびインビボの両方における長期的且つ時間的に正確な胚性幹細胞の非侵襲的な光制御のためのＣｈＲ２技術の潜在的用途を示している。
【００４３】
単独または本明細書に開示する別の態様との組合せで有用な本発明の別の態様として、光遺伝学的技術（例えば本明細書に記載したような）を用いて、特定の細胞型に選択的に影響を与え、標的細胞型に光感受性を付与し、その他の細胞型は光に非感受性のままにしておいてもよい。これにより、そのような系は種々の細胞型間で効果的に分化する。この点で、ＣｈＲ２またはＮｐＨＲ等のオプシンをコードする部分にすぐ隣接して細胞型特異的プロモーター遺伝子配列を有するウイルスベクターを作出することで、１つの細胞型の発達を他の細胞型から区別することができる。具体例として、ＧＦＡＰプロモーターを用いてグリア細胞を、シナプシンＩプロモーターでニューロン全般を、ＣａＭＫ−２アルファプロモーターで興奮性ニューロンを、ＶＧＡＴプロモーターで抑制性ニューロンを、ＴＩＥ−１プロモーターで内皮細胞を、ネスチンプロモーターで前駆細胞を含む幹細胞を標的にしてもよい。
【００４４】
実験結果
【００４５】
ＣｈＲ２を用いたマウスＥＳＣの形質導入
幹細胞中における光遺伝学の可能性を評価するために、ＥＦｌａプロモーター制御下のレンチウイルスＣｈＲ２−ＹＦＰ−コンストラクトをマウスＥＳＣに形質導入し、ＹＦＰ蛍光強度に基づいて上位５％を選んだ後、本発明者らは、得られたＣｈＲ２−ＹＦＰ−ＥＳＣの集団倍加時間および生存能力に非形質導入ＥＳＣ（図示せず）と比べて有意な差がないことを見出し、共焦点顕微鏡により、ＥＳＣ集団中において、強い均一な発現レベルのＣｈＲ２−ＹＦＰが膜局在していることを実証した。ＣｈＲ２−ＥＳＣは胚性幹細胞マーカーＳＳＥＡ１およびＯｃｔ４を発現し続け（データ示さず）、非形質導入対照細胞と同じように未分化状態を維持していた。電気生理学的には、ＣｈＲ２−ＥＳＣは典型的な外向き整流性の受動的流れを示し、青色光（４７０ｎｍ、パルス時間５００ｍｓ）を照射すると内向きの光電流が惹起された（図７ａ、７ｂ）。定常状態の光電流はほとんど不活化を示さなかったのに対し、ピーク光電流は、以前にニューロン３０で示されているのと同様な動態の不活化および回復を示した（図７ｃ）。
【００４６】
ＣｈＲ２等の微生物オプシンは、入射する青色フォトンを吸収してタンパク質のコンホメーション変化をゲート制御するために発色団（オールトランスレチナール）を必要とする。神経生物学向けの微生物オプシン開発中に、驚くべきことに、哺乳動物のニューロン（無脊椎動物のニューロンではない）には化学的補因子を何も添加しなくてもＣｈＲ２が機能するのに十分な内因性レチノイドが含まれているようであるということが見出された。光遺伝学が幹細胞工学の有用なツールになる場合、インビトロおよびインビボの両方においてレチノイド等の外来性化学物質に依存する程度を幹細胞中で決定することが重要であろう。上記のインビトロ実験ではレチノイドは添加しなかった。外来性レチノイドに対する依存性または独立性を更にインビボで決定するために、５×１０５のＣｈＲ２−ＹＦＰ発現ＥＳＣを健常ラットの皮質に定位的に注入した。移植から１週間後、動物を屠殺し、急性スライス中で、ＹＦＰ蛍光によって移植細胞を確認することができた。移植されたＣｈＲ２−ＥＳＣが依然として光刺激に対する反応性を有しているかどうかを調べるため、パッチクランプ記録を行い、ピーク電流の典型的な不活化および定常状態電流の安定性を示す青色光照射後の内向き電流を明らかにした（図７ｄ）。これらのデータを合わせると、光遺伝学的インターベンションが、哺乳動物ＥＳ細胞中で、効果的で許容性が高く、外来性の化学的補因子に依存しないものであり得ることが示される。
【００４７】
ＣｈＲ２−ＥＳＣの分化
細胞内のＣａ２＋は、幹細胞およびその子孫、特に神経の分化系列において、分化および生存の主要な仲介物質である。ＣｈＲ２はそれ自体は、細胞中にＣａ２＋をすぐに流入させる非選択的陽イオンチャネルである。光で惹起されるＣａ２＋流入の更なる経路としては、ＣｈＲ２により誘導される膜電位変化による電位依存性Ｃａ２＋チャネル（ＶＧＣＣ）の活性化が含まれる。特に、本発明者らは、マウスＥＳ細胞が、ＲＴＰＣＲおよび免疫反応性による評価で４種類の主要なＶＧＣＣを発現しており（図８ａ、８ｂ）、細胞が神経細胞系列に分化して過分極膜電位が発生するとこの光活性化Ｃａ２＋流入の補助的機序がますます強力になり得ることを見出した。しかし、ＣｈＲ２自体に公知のＣａ２＋流は、幹細胞のプロセスを光制御できる可能性を示唆していた。
【００４８】
本発明者らは、レチノイン酸を用いた神経分化プロトコールを用いて、ＣｈＲ２−ＥＳＣが神経系列に分化できることを初めて確認した（図８ｃ）。分化８日目に、細胞の４０±１０％が神経系列マーカーネスチンを発現した。１４日目までに、β−３−チューブリン陽性ＥＳＣ由来未熟ニューロンの密なネットワークを検出することができ、その後、成熟ニューロン細胞骨格タンパク質ＭＡＰ２および小胞グルタミン酸輸送体ＩＩ（ｖＧｌｕｔＩＩ）が発現した。２８日目までに、得られたＣｈＲ２−ＥＳＣ由来ニューロンは、成熟ニューロンの形態、ナトリウム流、活動電位、および興奮性シナプス後電流を示し、これは興奮性シナプス伝達グルタミン酸受容体アンタゴニストＣＮＱＸおよびＤ−ＡＰ５によってブロックすることができた（図９ａ〜ｄ）。
【００４９】
神経分化の光調節
ＥＳ細胞から代わりの組織を派生させる際の課題の１つは、細胞型を特定して表現型を固定（ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｃｏｎｓｏｌｉｄａｔｉｏｎ）するプロセスであり、したがってパターン形成および分化刺激にも、多くの日数がかかり、よって、光遺伝学的刺激が適用可能であるためには、光遺伝学的刺激は長期間送達可能である必要がある。この問題に適うシステムの設計には、幹細胞分化に必要なシグナル伝達イベントの正確な組合せおよびタイミングについての知見が限定的であるため、研究室でセルライン、条件、および「分化空間」の迅速な光学的マッピングを可能にするには原則的にマルチウェルの形態が望ましいことを考慮することも重要である。そこで、本発明者らは、複数の目的領域（ＲＯＩ）に正確に再度アクセスし、規定したパターンで長期間光刺激するように設計された、自動マルチウェル光遺伝学的刺激アプローチを開発した（図１０ａ）。
【００５０】
マルチウェルプレート中のＲＯＩは、カスタムＧＵＩ中でユーザ定義され、ロボットステージによって素早く再現可能にアクセスされるように、それらの位置を保存した（図１０ａ）。刺激パラメータ（興奮刺激用フィルタの波長、光スイッチパルス期間、および興奮刺激の頻度／デューティサイクル）は、顕微鏡用ステージの３つの空間次元を制御し且つミリ秒未満の精度で光を送達するための回転検流計を用いたＤＧ−４光スイッチの作動を制御するソフトウェアをベースにした機器によって構築されたパラメータに従って設定した（図１０ａ）。顕微鏡自体は、気候制御されたプレキシガラス製チャンバーに囲まれており、チャンバー中では、温度およびＣＯ２レベルの両方が厳密に制御されており、光刺激と並行して時間的に正確なイメージングを行うことができる（図１０ａ）。胚性幹細胞を、標準的なインキュベータ中ではなくこの環境中で何週間にもわたり培養および光刺激することで、本発明者らは、制御された再現可能な方法で胚性幹細胞の分化に対する光遺伝学的刺激の影響を研究することができた。
【００５１】
典型的な実験では、ＥＳＣを、１００，０００細胞／ｍｌの密度および１ｍｌ／ウェルで２４ウェルプレートに播種した。マルチウェルプレート方式の利点を直接利用するために、特定のウェルに未処理ＥＳＣを播種し、別のウェルにＣｈＲ２−ＹＦＰ  ＥＳＣを播種した。更に、特定のウェルが光刺激を受けるようにプログラムした。最後に、様々な組合せで、グループ内の異なるウェルに異なる濃度の分化因子（例えば、０、１、または２．５μＭの神経系列因子レチノイン酸）を加えた。このようにすることで、装置または照射に関連する非特異的影響を制御しながら分化空間を効率的にマッピングすることができる。１０倍の対物レンズを用いて６０分毎に送達される青色光（４７０ｎｍ、１５Ｈｚ、１０秒）で５日間細胞を刺激した。８時間ごとのコマ撮り撮影を用いて細胞の生存および形態をモニターし（図１０ｂ）、また、これにより、同じＲＯＩに正確に再度アクセスする能力について、自動化された装置の精度および正確さも実証された。
【００５２】
ＥＳＣ分化に対する作用の速い光刺激の影響を確認するために、刺激（図８ｃ）完了後に細胞を同時にアッセイした。神経マーカーネスチンの免疫染色後に共焦点分析により蛍光ヒストグラムを作成し、ＤＡＰＩを用いた細胞核のイメージングと共にこれを用い、神経系列の分化を定量した。図１１ａおよび１１ｂは、１つのＲＯＩの２つの典型的な共焦点Ｚスタックの３Ｄ投射を示し、ＤＡＰＩ（青）およびネスチン（赤）の両方の蛍光が示されている。光刺激された細胞は一貫して、ネスチンに対する免疫反応性が非刺激細胞（図１１ａ）よりも高く（図１１ｂ）、一方、興味深いことに、レチノイン酸（ＲＡ）非存在下では光刺激は影響を与えなかった（図１１ｃ）。この影響を定量するために、本発明者らは、各条件中の全ウェルにわたって全ＲＯＩの蛍光強度ヒストグラムを作成した（１条件当たり１５０枚を超える共焦点画像）。これらの強度ヒストグラムから、刺激されたＣｈＲ２−ＥＳＣと刺激されなかったＣｈＲ２−ＥＳＣにかなりの差があることが明らかになった（図１１ｄ〜ｈ；ｐ＜０．０１、コルモゴロフ・スミルノフ検定）。本発明者らは次に、光刺激された未修飾（「未処理」）ＥＳＣおよび光刺激されたＣｈＲ２−ＹＦＰ  ＥＳＣのネスチン分布（それぞれ図１１ｇおよび図１１ｅ）が同じ分布に由来するサンプルを表し得る可能性を検定するために実験を行い、上記の実験と同様に自動光刺激を繰り返した後の盲検解析から、この仮説が棄却できることを見出した（ｐ＜０．００１；両側Ｋ−Ｓ、Ｚ＝５．４３；図１１ｅ、ｇは、ＣｈＲ２−ＹＦＰ細胞中において観察された高レベルの光誘導ネスチン発現の増加を示している）。各条件において平均ネスチン蛍光強度を計算し、全条件について、光刺激細胞と非光刺激細胞を比較したところ、２．５μＭのＲＡとインキュベートしたＣｈＲ２−ＹＦＰ  ＥＳＣだけが、平均ネスチン発現量の光遺伝学的に誘導される有意な増加を示した（ｐ＜０．０１、両側ｔ検定；図１１ｆ、１１ｈ）。１μＭのＲＡ存在下では、光刺激環境で有意ではないがネスチンの発現が多くなる傾向が観察されたが、０μＭのＲＡ中では、光刺激の影響は全く観察されなかった（例えば図１１ｃ）。
【００５３】
したがって、本発明は、幹細胞工学への光学的制御技術の応用を提示し、光依存性の陽イオンチャネルであるチャネルロドプシン２をマウス胚性幹細胞中で正常に発現および作動させることで、光遺伝学的アプローチの可能性を実証する。本発明者らは、ＣｈＲ２−ＹＦＰ  ＥＳＣが、生存可能であり、未分化状態を維持していること、および分化して電気生理学的に成熟したニューロンとなる能力を維持していることを見出した。更に、青色光をパルス照射することで、ＥＳＣ中で正確且つ強力な陽イオン流が惹起され、インビトロまたはインタクトな脳組織内で化学的補因子を添加することなく再現可能で予測可能なイオン流の制御が可能になった。本発明者らは、自動化されたマルチウェルの光遺伝学的刺激ツールを開発することで、組合せ的実験において高い時空間的精度でより長期間にわたって光刺激を送達することに成功し、２．５μＭのＲＡ存在下において光遺伝学的刺激が神経の分化系列の進行を調節できることを見出した。
【００５４】
基礎となる仮出願文書との関連で具体的に記載したように、分裂細胞中で神経分化プロセスを調節するための別の研究において脱分極が報告されており、実際、ｉｎ  ｓｉｔｕで、増殖中のCＮＳ前駆細胞において脱分極およびカルシウム波の両方が観察された。例えば、初期のＣＮＳの発達において、Momose-Sato et al.は自然発生的な脱分極波を実証しており、Kriegsteinとその同僚は皮質前駆細胞におけるカルシウム波を観察している。同様に、有糸分裂後ニューロンでも、脱分極はＣＮＳの発達において更なる重要な役割を果たしており、脊椎の発達とシナプス可塑性に影響を与えている。本発明に関連して、初期の発達において膜脱分極イベントの影響を仲介する具体的なシグナル伝達カスケードは未だ明らかにされていないが、Ｃａ２＋およびＣａ２＋チャネルが重要な役割を果たしているであろうし、ＣｈＲ２がこれらの機序の動員に非常に適していると現在考えられている。新規な証拠から、胚の初期段階にＶＧＣＣが発現することが示されており、本発明の態様によれば、これにより、ＣｈＲ２は、自身の光活性化型Ｃａ２＋流を介してだけでなく、分化細胞が成熟する際に元々あるＶＧＣＣを活性化することによっても、Ｃａ２＋依存性細胞プロセスを動員することができる。他の態様によれば、心臓細胞などのＥＳＣから生じる系列もＣａ２＋で調節され、ヒトＥＳＣの長期間の脱分極が血液内皮分化を促進することも報告されている。これら全ての場合において、本発明者らが光遺伝学的調節のＲＡによるゲート開閉で観察したように、脱分極またはＣａ２＋流入は、他のパターン形成因子および系列特異的分化因子の作用である。
【００５５】
最近の研究で体細胞からの多能性幹細胞（ｉＰＳ）の誘導が示され、再生医療における幹細胞の供給源の可能性が大きく広がったが、選択的で感受性の高い幹細胞分化および制御のためのツールが現在必要とされていることが更に明確になった。成長因子および有機化合物等の広範に適用される刺激は、幹細胞ニッチの非分裂構成要素並びに幹細胞およびその子孫を含む存在する全細胞に影響を与えるが、典型的な分化環境に存在する非常に多様な細胞の全てにこれらの成長因子が同じ所望の効果を与えるとは考えられない。増殖中の細胞またはアストロサイト等のニッチ構成要素に光制御をターゲティングすることで、細胞内シグナル伝達の光遺伝学的制御は、所望の細胞型を選択的に制御することを可能にする。
【００５６】
実際、この光特異性の原理は、ｉｎ  ｓｉｔｕの完全に分化した幹細胞子孫の選択的制御にも拡大される。侵襲性が最小限な光ファイバーを用いた戦略によって、完全に無傷の行動下の哺乳動物中に光遺伝学が用いられるようになった。移植された細胞は、最終段階の表現型固定を誘導するためおよび幹細胞を用いた再生医療の主な目標である宿主神経回路中への完全な組込みのために、電気的活性を必要とし得る。
【００５７】
従来の電気刺激または薬物と比べて、ＣｈＲ２の遺伝学的ターゲティングは、移植ＥＳＣおよびその子孫において特異的且つ可逆的に正確な量の活性を誘導することを可能にし、これは更に、ＣｈＲ２を機能させるために生体内に化学的補因子を添加する必要がない。最後に、移植細胞だけを光学的に誘導することは、行動の読取りまたはｆＭＲＩのような非侵襲性のイメージング読取り法（および金属電極に由来するシグナル干渉という深刻な問題がないこと）と共に、例えばパーキンソン病の、ネットワーク活性および回路動態の修復における移植細胞の具体的寄与をイメージングおよび調整するためのドアを開く。これらのアプローチ等を用いて、光遺伝学的技術を、幹細胞生物学および再生医療における有用なツールとして適用することができる。
【００５８】
実験方法
【００５９】
マウス胚性幹細胞の培養
フィーダー細胞（ＣＲＬ−１５０３、ＡＴＣＣ）、１５％ウシ胎児血清（ギブコ社製）、１５ｎｇ／ｍｌの白血病抑制因子（ＬＩＦ；シグマ−アルドリッチ社製）、０．１ｍＭの２−メルカプトエタノール（シグマ−アルドリッチ社製）、および１％のペニシリン−ストレプトマイシン（シグマ−アルドリッチ社製）で馴化した培地を含むＤＭＥＭ培地（ＡＴＣＣ）中でマウス胚性幹細胞（ＣＲＬ−１９３４、米国マナッサス、ＡＴＣＣ）を増殖させた。２０ｍｌの培地を用いて、３７℃および５％ＣＯ２にて、３日ごとに継代しながら７５ｃｍ２の細胞培養フラスコ（ファルコン社製）中で細胞を培養した。浮遊液中の未分化細胞のみを実験に用いた。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ギブコ社、インビトロジェン社）中で洗浄した後、ノイバウアー計数器を用いて細胞を計数した。トリパンブルー溶液（０．４％；シグマ−アルドリッチ社製）で染色することで生存率を決定した。
【００６０】
ＣｈＲ２を用いたＥＳＣの形質導入
以前に記載したように、ＥＦ−１−アルファプロモーターの制御下にＣｈＲ２−ＥＹＦＰ融合遺伝子を有するレンチウイルスを作製した。ウイルスを、超遠心で濃縮し、元の体積の１／１０００になるようにＰＢＳに再分散させた。次いで、濃縮ウイルスをＥＳＣと一緒に２４時間インキュベートし、形質導入から１週間後に蛍光顕微鏡を用いて形質導入効率を評価した。高度且つ均一に発現しているＣｈＲ２−ＥＳＣコロニーを得るために、ＦＡＣＳを用いて細胞を分別し、上位５％のＹＦＰ発現細胞からなる亜集団を回収した。
【００６１】
胚性幹細胞のニューロン分化
以前記載した方法に変更を加えて、ニューロンへの分化を行った。胚様体段階にあるＥＳＣを完全ＥＳＣ培地（上記参照）に入れ、マトリゲルコートディッシュに蒔いた。２４時間後、ＬＩＦを含まず、５μＭのレチノイン酸を含むＥＳＣ培地に培地を交換し、５日間、培地を隔日で交換した。分化の第２工程として、Ｎ２サプリメント、ＳＨＨ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＦＧＦ−８ｂ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、およびアスコルビン酸（２００μＭ、シグマ社製）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２から構成される神経伸長（ｎｅｕｒａｌ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）培地を用いて細胞を７日間インキュベートし、２日ごとに交換した。その後、Ｎ２およびアスコルビン酸を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２中で細胞を培養した。
【００６２】
培養細胞の免疫組織化学的染色
４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳを用いて室温で３０分間細胞を固定した。０．１Ｍのグリシン／ＰＢＳで細胞を３回洗浄して固定を停止した。細胞を透過処理し、３０分間ブロッキング（４％ＢＳＡ／０．４％サポニン／ＰＢＳ）し、一次抗体溶液中で４℃にて一晩インキュベートした。細胞を４回洗浄し、二次抗体と共に室温で２時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、最終洗浄工程でＤＡＰI（１：５０，０００）を添加した。抗クエンチング剤入りＦｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔを用いてカバースリップをマウントした。一次抗体は、マウス抗ＳＳＥＡ１（ケミコン社製、１：３００）、マウス抗ネスチン（ケミコン社製、１：２００）、ニワトリ抗βｉｌｌチューブリン（ケミコン社製、１：２００）、マウス抗ＭＡＰ２ａｂ（シグマ社製、１：５００）、ウサギ抗ｖＧｌｕｔ２（ケミコン社製、１：２００）、およびウサギ抗ａｌＣ、同ａ１Ｄ、同ａ１Ｇ、および同ａ１Ｈ（全てＡｌｏｍｏｎｅ  ｌａｂｓ社製；１：２００）を用いた。Ｃｙ３またはＣｙ５をコンジュゲートした、ロバ抗マウス、ロバ抗ニワトリ、およびロバ抗ウサギ二次抗体（ジャクソン社（Ｊａｃｋｓｏｎ）製）を全て１：２００で用いた。
【００６３】
ＲＴ−ＰＣＲ
細胞をホモジナイザー（インビトロジェン社製）でホモジナイズした。Ｍｉｃｒｏ−ｔｏ−Ｍｉｄｉ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社製）を用いてＲＮＡを分離した。ＲＴ−ＰＣＲの前に、ＲＮＡサンプルを、ＤＮａｓｅＩ（インビトロジェン社製）で前処理し、メーカーのプロトコールに従って逆転写を行った。逆転写酵素を含まない陰性対照では配列は増幅されなかった。マウス海馬の全ＲＮＡをクロンテック社から購入し、得られたｃＤＮＡを陽性対照とした。ＰＣＲ分析では、以下のように、Ｌ型およびＴ型のＶＧＣＣファミリーの両方に由来するそれぞれ２個のサブユニットのコード領域を標的としたプライマ−を用いた：Ｌ型ａ１Ｃフォワードプライマー：ＧＴＧＧＴＴＡＧＣＧＴＧＴＣＣＣＴＣＡＴ、リバースプライマー：ＧＴＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＡＧＡＧＡＧＣ；Ｌ型ａ１Ｄフォワードプライマー：ＡＡＴＧＧＣＡＣＧＧＡＡＴＧＴＡＧＧＡＧ、リバースプライマー：ＧＡＣＧＡＡＡＡＡＴＧＡＧＣＣＡＡＧＧＡ；Ｔ型ａ１Ｇフォワードプライマー：ＣＴＧＡＧＣＧＧＡＴＣＴＴＣＣＴＡＡＣＧ、リバースプライマー：ＴＧＡＡＡＡＡＧＧＣＡＣＡＧＣＡＧＡＴＧ；Ｔ型ａ１Ｈフォワードプライマー：ＴＧＧＧＡＡＣＧＴＧＣＴＴＣＴＴＣＴＣＴ、リバースプライマー： ＴＧＧＧＣＡＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＡＧＴＡ；ハウスキーピング遺伝子（アクチン）フォワードプライマー：ＧＧＣＡＴＴＧＴＧＡＴＧＧＡＣＴＣＣＧＧ、リバースプライマー：ＴＧＣＣＡＣＡＧＧＡＴＴＣＣＡＴＡＣＣＣ。２９３ＦＴ腎細胞は、予想された通り、これらのチャネルサブユニットを発現せず（図８ａ）、アクチン並びにＬ型およびＴ型サブユニットのＰＣＲ産物をクローニングおよびシークエンスし配列の確認を行った。
【００６４】
ＥＳＣの長期間光刺激
ハードウェアインタフェースの主要な要素には、（ａ）Ｏａｓｉｓ４ｉコントローラ（オブジェクティブイメージング社（Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ）製）（ｘ−ｙ−ｚの３軸および焦点を制御するためのハードウェア）（http://ww.objectiveimaging.com/Download/OI_Download.htm（Ｏａｓｉｓ４ｉコントローラ用のソフトウェア開発キット（ＳＤＫ））、（ｂ）ＤＧ４超高速波長切替器（Ｕｌｔｒａ  Ｈｉｇｈ  Ｓｐｅｅｄ  ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ  ｓｗｉｔｃｈｅｒ）（サッター社（Ｓｕｔｔｅｒ）製）、（ｃ）Ｒｅｔｉｇａ  ＳＲＶ  Ｃａｍｅｒａ（Ｑイメージング社製）、および（ｄ）ＡＨＭ（Ａｂｓｔｒａｃｔ  Ｈａｒｄｗａｒｅ  Ｍｏｄｅｌ）コントローラで制御されたＬｅｉｃａ  ＤＭ６０００顕微鏡が含まれる。パラレルポートは、ＤＬＰＯＲＴＩＯライブラリファイル（www.driverlinx.com/DownLoad/DIPortIO.htm（パラレルポートを制御するためのＤｌｌ））およびＱＣａｍ  ＳＤＫ（Ｖｅｒ．５．１．１．１４）（http://ww.qimaging.com/support/downloads/（Ｒｅｔｉｇａ  ＳＲＶ／Ｅｘｉ  Ｃａｍｅｒａを制御するためのＳＤＫ）を用いて設定したカメラパラメータ（ゲイン、露光）を用いて制御する。Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  Ｌｉｂｒａｒｙ（ＭＦＣ；Ｖｅｒ．８．０）を用いて、光遺伝学的刺激装置に接続するためのカスタムソフトウェアユーザインタフェースを開発し、要求に応じて利用できるようにした。簡潔に述べると、Ｏａｓｉｓ４ｉコントローラを用いて、刺激および／またはイメージングする目的領域（例えば、胚様体またはマルチウェルプレート中の小さいウェル）を選択し、ＭＦＣインタフェースを用いてそれらの位置を保存する。次いで、刺激パラメータ（興奮刺激用フィルタの波長、興奮性パルス期間、並びに興奮刺激の頻度およびデューティサイクル）をカスタムＧＵＩ中で設定する。刺激空間をマッピングできるように、各目的領域を、異なる刺激パターンを受容して何日にも及ぶ刺激およびイメージングが行われるように、容易にプログラムすることができる。同様に、領域および露出当たりの画像数、ゲイン、励起フィルタ、並びにエミッションフィルタを含むイメージングのパラメータも選択された領域向けに変更することもできる。
【００６５】
２４ウェルプレートのマトリゲル（ＢＤ社）コートカバースリップ上に、完全ＥＳＣ培地中１００，０００細胞／ウェルの密度で未分化細胞を播種した。同じプレート上の異なるウェル中で野生型ＥＳＣおよびＣｈＲ２発現ＥＳＣの両方を用いた。播種の２４時間後に、完全ＥＳＣ培地、ＬＩＦおよびフィーダー細胞由来の馴化培地（分化培地）のどちらも含まないＥＳＣ培地、１μＭのレチノイン酸（ＲＡ）（シグマ社製）を含む分化培地、並びに２．５μＭのＲＡを含む分化培地を含む種々の実験条件に培地を変換した。前述したツールを用いて光刺激を行った（図４）。各ウェルにつき最大３０個までの目的領域（ＲＯＩ）を決定し、カバースリップ上の細胞含有領域が全て確実に刺激されるようにした。ＲＯＩに、１０倍の対物レンズ（ＮＡ  ０．３）を用いて、青色光（４７０ｎｍ）パルスを１０秒間、１５Ｈｚで５日間休みなく連続して照射した。選択されたＲＯＩの顕微鏡写真が８時間ごとに撮影されるようにプログラムした。実験の最後に、カバースリップをプレートから取り、パラホルムアルデヒドですぐに固定し、前述したように染色した。マウントしたスライドを暗号化した番号で同僚がラベルし、共焦点分析を行う研究者に処置条件が分からないようにした。
【００６６】
共焦点顕微鏡観察および画像解析
ライカ社製ＳＰ２共焦点顕微鏡および４０倍の油浸対物レンズ（ＮＡ  ０．７５）を用いて共焦点イメージングを行った。ＤＡＰ１の励起には４０２ｎｍのダイオードレーザを用いた。Ｃｙ５−ネスチンは６３３ｎｍのＨｅＮｅレーザを用いて励起した。カバースリップ当たり６個のＲＯＩを解析用にランダム且つ盲検的に選択し、１０２４×１０２４の８ビット共焦点画像を得た。各ＲＯＩについて、ｚの刻み幅０．９８μｍで８〜１２個のｘ−ｙ面からなるｚスタックを収集することで、ＲＯＩ中に存在する全細胞を含めた。ＩｍａｇｅＪ（米国、ＮＩＨ）ソフトウェアを用いてデータ解析を行い、非盲検にした後、各条件（例えばＣｈＲ２−ＥＳＣ、光刺激あり、２．５μｍ  ＲＡ）の全カバースリップの全ＲＯＩの共焦点画像を１つのｚスタックに変換した。ＤＡＰｌおよびネスチンのチャネルについて、蛍光強度ヒストグラムを算出した。細胞数を反映するＤＡＰ１ヒストグラムからネスチンのヒストグラムの標準化をすることができた。全ネスチンボクセル数をこのＤＡＰｌ係数で割った。ＳＰＳＳ（米国、シカゴ）ソフトウェアを用いて統計分析を行った。ヒストグラムを統計的に比較するためにパラメータによらないコルモゴルフ・スミルノフ検定を行い、平均値を比較するためにｔ検定を用いて統計的有意性を計算した。
【００６７】
定位的細胞移植
ラット（雄のウィスター系、２５０〜３５０ｇ）をこれらの実験の対象とした。動物の管理および本発明者らの動物の実験操作の全ての状況は、アメリカ国立衛生研究所の指針に厳密に従い、スタンフォード動物実験委員会のメンバーの承認を受けた。腹腔内投与（ラット体重１ｋｇ当たり９０ｍｇのケタミンおよび５ｍｇのキシラジン）によりラットに麻酔をかけた。細胞移植のために、運動皮質の上に１ｍｍの開頭切開部を穿孔した。５０ｋ細胞／μＬの密度でＰＢＳに懸濁したＣｈＲ２−ＥＹＦＰ融合タンパク質を発現するＥＳＣ１μＬをラット運動皮質（ＡＰ＋１．５ｍｍ、ＭＬ＋１．５ｍｍ、ＤＶ＋１．５ｍｍ）に注入した（２６ｇのハミルトンシリンジ）。注入は１０分間行い、更に１０分間留置した後、シリンジを引き抜き、１週間後に電気生理学的実験を行った。
【００６８】
電気生理学
急性スライスの電気生理学的実験のために、細胞移植の１週間後、氷冷した切断用緩衝液（６４ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのＮａＨＣＯ３、１０ｍＭのグルコース、１２０ｍＭのスクロース、２．５ｍＭのＫＣｌ、１．２５ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、０．５ｍＭのＣａＣｌ２、および７ｍＭのＭｇＣｌ２、９５％Ｏ２／５％ＣＯ２で平衡化）中でビブラトーム（ＶＴ１０００  Ｓ、ライカ社製）を用いて２５０μｍの皮質スライスを調製した。切断用緩衝液における３２〜３５℃で３０分間の回復期の後、スライスをゆっくりと取り出し、正立顕微鏡（ＤＭ  ＬＦＳＡ、ライカ社製）上にマウントした記録チャンバーに移し、カーボン化ＡＣＳＦ（１２４ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＫＣｌ、２６ｍＭのＮａＨＣＯ３、１．２５ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、２．４ｍＭのＣａＣｌ２、１．３ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのグルコース）で３〜５ｍｌ／分の速度で連続的に灌流し、９５％Ｏ２／５％ＣＯ２で換気した。２０倍の０．５ＮＡ水浸対物レンズおよびＹＦＰフィルタセットを備えた正立蛍光顕微鏡（ＤＭ  ＬＦＳＡ、ライカ社製）上でＣｈＲ２−ＹＦＰ−ＥＳＣを確認した。ＣＣＤカメラ（Ｒｅｔｉｇａ  Ｅｘｉ、Ｑイメージング社製）を用いてＱイメージングソフトウェアにより画像を記録した。以前に記載したように、ＮａＣｌを１２５ｍＭ、ＫＣｌを２ｍＭ、ＣａＣｌ２を３ｍＭ、ＭｇＣｌ２を１ｍＭ、グルコースを３０ｍＭ、およびＨＥＰＥＳを２５ｍＭで含むタイロード液（ＮａＯＨでｐＨ７．３に調整）中で培養ＣｈＲ２−ＹＦＰ  ＥＳＣの電気生理学的記録を行った。Ａｘｏｎ  Ｍｕｌｔｉｃｌａｍｐ  ７００Ｂ（アクソン・インスツルメンツ社（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）製）増幅器を用いて、ホールセルパッチクランプ法で膜電流を測定した。ピペット液は、９７ｍＭのグルコン酸カリウム、３８ｍＭのＫＣｌ、６ｍＭのＮａＣｌ、０．３５ｍＭのＡＴＰナトリウム、４ｍＭのＡＴＰマグネシウム、０．３５ｍＭのＥＧＴＡ、７ｍＭのホスホクレアチン、および２０ｍＭのＨＥＰＥＳから構成される（ＫＯＨでｐＨ７．２５に調整）。ピペット抵抗は４〜８ＭΩであった。ホールセルの配置ができたときに膜電位を記録した。本発明者らは、ｐＣｌａｍｐ９取得ソフトウェア（アクソン・インスツルメンツ社製）、３００Ｗのキセノンランプを備えたＤＧ−４高速光スイッチ（サッター・インスツルメンツ社製）、およびＧＦＰフィルタセット（励起フィルタＨＱ４７０／４０倍、二色性Ｑ４９５ＬＰ；クロマ社（Ｃｈｒｏｍａ）製）を用いて、ＣｈＲ２活性化のための青色光を送達した。２０倍の対物レンズを通した青色光の出力密度は、電力計（ニューポート社製）による測定で８〜１２ｍＷ／ｍｍ２であった。実験は全て室温（２２〜２４℃）で行った。
【００６９】
上記の種々の実施形態は、単なる例として記載したものであり、本発明を限定するものと解釈されるべきではない。上記の説明および図解に基づき、本明細書中に図解および記載した例示的な実施形態および応用例に厳密に従わずに本発明に種々の修正および変更がなされ得ることが当業者には容易に理解されよう。そのような修正および変更は、添付の特許請求の範囲に記載する本発明の真の精神および範囲から逸脱しない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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