(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
多重特異的な抗体又は多重特異的なその部分であって、可変領域を含み、単一の細胞上の少なくとも２つの細胞表面分子と特異的に結合し、前記抗体は、少なくとも１つの第１のエピトープに対して特異的に結合し、前記抗体のＣＨ３ドメインに存在する少なくとも１つの構造ループ領域の中に少なくとも１つの修飾を有し、前記修飾が、１以上のアミノ酸の置換、削除、及び／又は挿入をもたらし、細胞表面分子と結合できる新規な抗原結合部位を導入する、多重特異的な抗体又は多重特異的なその部分。
【請求項２】
前記構造ループ領域が、少なくとも６つのアミノ酸修飾を有する、請求項１記載の多重特異的な抗体。
【請求項３】
ヒト若しくはマウス由来のＣＨ３の修飾された構造ループ領域が、アミノ酸７〜２１、アミノ酸２５〜３９、アミノ酸４１〜８１、アミノ酸８３〜８５、アミノ酸８９〜１０３又はアミノ酸１０６〜１１７の範囲内に少なくとも１つの修飾を有し、ドメインのアミノ酸位の付番はＩＭＧＴに従う、請求項２に記載の多重特異的な抗体。
【請求項４】
前記抗体が、更に、ＣＨ１、及びＣＨ２からなる群から選択される、少なくとも１つの定常ドメインを有する、請求項１から３のいずれか１項記載の多重特異的な抗体。
【請求項５】
前記抗体が更に、１つ以上の修飾された抗体若しくは未修飾の抗体、又はその部分と組み合わされることにより、組み合わせ抗体が得られる、請求項１から４のいずれか１項記載の多重特異的な抗体。
【請求項６】
請求項１から４のいずれか１つに記載の多重特異的な抗体又は多重特異的なその部分をコードする核酸。
【請求項７】
請求項１から５のいずれか１項記載の多重特異的な抗体を設計するための方法であって、
−  少なくとも１つの第１のエピトープに対して特異的に結合する可変ドメインを含み、少なくとも１つの構造ループ領域を含む抗体をコードする核酸を準備するステップと、
−  前記核酸によってコードされる前記少なくとも１つの構造ループ領域の中の少なくとも１つのヌクレオチド残基を修飾するステップであって、修飾された構造ループ領域はＣＨ３ドメイン内に存在するステップと、
−  発現システム中に修飾された前記核酸を存在させるステップと、
−  修飾された前記抗体を発現させるステップと、
−  発現された、修飾された前記抗体と細胞表面抗原の第２のエピトープとを接触させるステップと、
−  修飾された前記抗体が前記第２のエピトープと特異的に結合するか否かを測定するステップであって、前記第１のエピトープ及び前記第２のエピトープは単一の細胞に存在するステップを有してなる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、単一の細胞の少なくとも２つの細胞表面分子と特異的に結合する、多価免疫グロブリン又はその一部の提供に関する。詳細には、前記免疫グロブリンの少なくとも１つの構造ループ領域中に少なくとも１つの修飾を有し、前記細胞表面分子のエピトープに対する結合を決定し、未修飾の免疫グロブリンは、前記エピトープと顕著に結合しない。
【背景技術】
【０００２】
モノクローナル抗体は、治療用途、診断用途及び分析用途など、様々な用途に利用されている。
【０００３】
抗体の基本的な構造について、例として完全ＩｇＧ１免疫グロブリンを用いて、以下に説明する。同一の２つの重鎖（Ｈ）及び同一の２つの軽鎖（Ｌ）が結合し、Ｙ字形の抗体分子を形成する。重鎖は各々４つのドメインを有する。アミノ末端可変ドメイン（ＶＨ）はＹ字の先端部に存在する。これに続く形で、Ｙ字のステム側に、３つの定常ドメインが存在する（ＣＨ１、ＣＨ２、及びカルボキシ末端側のＣＨ３）。短いストレッチ（スイッチ）が、重鎖可変領域と定常領域を連結する。ヒンジ部が、ＣＨ２及びＣＨ３（Ｆｃ断片）を、抗体の残りの部分（Ｆａｂ断片）と連結する。完全抗体分子のヒンジ部のタンパク質を分解させることにより、１つのＦｃ及び２つの同一のＦａｂ断片を生じさせることができる。軽鎖は２つのドメインから構成され（可変部（ＶＬ）及び定常部（ＣＬ））、スイッチにより分離されている。
【０００４】
ヒンジ領域のジスルフィド結合により、２つの重鎖が連結される。更なるジスルフィド結合によって、軽鎖が重鎖に連結される。Ａｓｎに結合された炭水化物部分は、免疫グロブリンの種類に応じて定常ドメイン中の異なる位置に結合する。ＩｇＧ１の場合、ヒンジ領域中の２つのジスルフィド結合が、Ｃｙｓ２３５及びＣｙｓ２３８のペアにおいて、２つの重鎖を結合させる。軽鎖は、ＣＨ１ドメインのＣｙｓ２２９及びＣＬドメインのＣｙｓ２１４との間の、２つの更なるジスルフィド結合によって重鎖に連結する。炭水化物部分は各ＣＨ２のＡｓｎ３０６に結合し、Ｙのステム部分を顕著に膨張させる。
【０００５】
これらの特徴により、重要な機能が生じる。Ｙの「先端」部に、重鎖及び軽鎖の可変領域（ＶＨ及びＶＬ）が存在し、それらが抗原と反応するために配置されている。この分子の先端は、アミノ酸配列のＮ末端が位置する側である。Ｙのステム部分はいくらか突出しており、能率的にエフェクター機能を媒介する（例えば補体の活性化、及びＦｃ受容体、又はＡＤＣＣ及びＡＤＣＰとの相互作用）。そのＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、エフェクタータンパク質との相互作用を促進するために膨張する。アミノ酸配列におけるＣ末端は先端とは反対側に位置し、Ｙの「ボトム部」と称される。
【０００６】
２種類の軽鎖（ラムダ（λ）及びカッパ（κ）と称される）が抗体中に存在する。一定の免疫グロブリンでは、κ鎖又はλ鎖の両方（いずれか１つでない）を有する。λ又はκ軽鎖を有する抗体との間の機能的な相違は、明らかとされていない。
【０００７】
抗体分子中の各ドメインは、コーンプレス型の逆平行βバレル構造中に、各々強固にパックされた、２つのβシートからなる同様の構造を有する。この保存された構造は、免疫グロブリンフォールディング構造と称される。定常ドメインにおける免疫グロブリンフォールディング構造は、４鎖シートに対してパックされた３鎖シートを有する。上記のフォールディング構造は、各シートのβ鎖間の水素結合によって、内部の逆向きシートの残基間の疎水性結合によって、及びシート間のジスルフィド結合によって安定化されている。３鎖のシートは、鎖Ｃ、Ｆ及びＧを有し、４鎖のシートは鎖Ａ、Ｂ、Ｅ及びＤを有する。ＡからＧの文字は、免疫グロブリンフォールディング構造のアミノ酸配列に沿った、β鎖中の連続的な位置のことを意味する。
【０００８】
可変ドメイン中のフォールディング構造は、４鎖及び５鎖の２つのシート中に整列された、９つのβ鎖を有する。５鎖シートは、構造的に定常ドメインの３鎖シートに対応するが、余分のＣ鎖及びＣ’鎖を有する。残りの鎖（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ）は、定常ドメインの免疫グロブリンフォールディング構造中のそれらの対応する鎖と同じトポロジー及び類似の構造を有する。定常ドメインの場合と同様、ジスルフィド結合は逆向きシート中のＢ鎖とＦ鎖を連結する。
【０００９】
免疫グロブリン中の軽鎖及び重鎖の可変ドメインは、３つの超可変ループ又は相補性決定領域（ＣＤＲｓ）を有する。Ｖドメイン中の３つのＣＤＲｓ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）は、βバレルの一端でクラスターを形成する。ＣＤＲｓは、免疫グロブリンフォールディング構造中のβ鎖Ｂ−Ｃ、Ｃ−Ｃ’１及びＦ−Ｇを連結するループである。ＣＤＲｓ中の残基は各免疫グロブリン分子間で様々に異なり、抗原特異性を各抗体に与える。
【００１０】
抗体分子の先端のＶＬ及びＶＨドメインは密接にパックされ、６つのＣＤＲｓ（各ドメイン３つずつ）が集まり、その結果、抗原との特異的な結合を可能にする表面（又は空腔）を形成する。天然における抗体の抗原結合部位はすなわち、軽鎖可変ドメインのＢ−Ｃ、Ｃ−Ｃ’’及びＦ−Ｇ鎖を連結するループ、並びに重鎖可変ドメインのＢ−Ｃ、Ｃ−Ｃ’’及びＦ−Ｇ鎖を連結するループから構成される。
【００１１】
天然の免疫グロブリンのＣＤＲループでないループ、又はＣＤＲループによって定まる抗原結合ポケットの一部でないループは、抗原結合又はエピトープ結合特異性を有しない。しかしながら、免疫グロブリン分子全体の正しいフォールディング、及び／又はそのエフェクター機能若しくはその他の機能に貢献し、それゆえ、本発明においては構造ループと称される。従来技術では、免疫グロブリン様の足場が既存の抗原結合部位を操作するためにこれまで使用され、それにより新規な結合特性を生じさせることを報告する。しかしながら、従来ではＣＤＲ領域のみが抗原結合のために設計され、換言すれば、免疫グロブリンフォールディング構造の場合、天然の抗原結合部位のみが、その結合親和性又は特異性を変化させるために修飾されていた。報告されているほとんどの文献では、この種の操作された免疫グロブリン（単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）又はＦａｂ断片の形で発現される）の異なるフォーマットに関して記載しており、いずれもファージ粒子の表面にディスプレイされるか又は様々な原核若しくは真核生物の発現システムにおいて可溶性で発現される。
【００１２】
特許文献１（国際出願第ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０５００５９号）では、構造ループ領域中を修飾免疫グロブリンの設計方法が記載され、それにより新規な抗原結合部位を形成させている。この方法は免疫グロブリンに広く適用でき、様々な抗原を標的とする、免疫グロブリンのシリーズを作製する用途に使用できる。しかしながら細胞表面の標的に対する多価結合体は明確に記載されていない。
【００１３】
特許文献２（米国特許出願公開第２００５／２６６０００Ａ１号）では、変異型の重鎖可変フレームワークドメイン（ＶＦＲ）を有するポリペプチドを記載する。ＶＦＲは抗原結合ポケット又は溝の一部であり、抗原と接触できる。ＶＦＲはＣＤＲループ領域の一部であって、ＣＤＲループの側部の可変ドメインに位置し、ＣＤＲループ領域を介して抗原結合を支持する機能を有する。ＶＦＲ以外のフレームワークループは、抗原結合部位の設計上の理由から変異を有していない。
【００１４】
ヒトの癌に関連する細胞表面タンパク質は、単クローン治療のための有効な標的であると考えられる。抗体は、細胞活性化の調整、又は免疫系の補充により、抗腫瘍反応を誘発しうる。若干のｍＡｂｓは標的の架橋結合によってそれらの効果の一部を発揮するが、それにより標的のクラスターを形成し、その結果、細胞シグナルの活性化、阻害又は増幅を生じさせ、最後に細胞周期の停止及び／又は細胞標的のアポトーシスに至らしめる。
【００１５】
リンパ腫細胞系上でほとんど固有の抗増殖活性を有しない若干のＭＡｂｓ（抗ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１及びＣＤ２２抗体）は、それらを四価のホモ二量体として用いることにより、強力な制癌剤に変換されうることが明らかになっている。これらの活性は、エフェクター細胞及び／又は補体の補充によってｉｎ  ｖｉｖｏで強化されると考えられる。治療用ｍＡｂｓの場合に使用する他のストラテジーとしては、細胞障害剤をｍＡｂとカップリングすることが挙げられる。かかるイムノトキシンは細胞表面の標的と結合し、内部移行し、更に細胞を殺傷する薬剤を放出させることができる。内部移行の条件としての標的クラスター形成が必要であると考えられる。
【００１６】
標的分子のクラスタリングを通じて効果を及ぼすｍＡｂｓの効力を強化するため、様々な多価Ａｂフォーマットがデザインされている。全長ＩｇＧの分泌テール部において共有結合させ、重合型のＩｇＭ及びＩｇＡに類似する、四価の抗体分子及び天然のＩｇＭ及びＩｇＧ抗体が考案されている。また、全長のＩｇＧの各Ｈ鎖のＣ末端に、Ｆａｂを追加することにより、他の四価のフォーマットを設計した例も存在する。
【００１７】
腫瘍細胞への浸透性を改善するため、単鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）2断片（各Ｆｖは、ペプチドリンカーにより連結された軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインからなる）を使用した小型の構造を結合させ、多価複合体を形成させた例も存在する。かかる構造体は比較的短い半減期（全長のｍＡｂｓと比較し）であるため、これらのｓｃＦｖ多量体をＩｇＧ  Ｆｃ断片と結合させる対処法が施されている。ｓｃＦｖ及びそれと同様のフォーマットでは、正確な多量体化度での形成を制御することは困難である。すなわち、二量体、三量体、四量体及び多価複合体の形成比率は、その基本的な構造及び発現方法に応じて多様に変化しうる。
【００１８】
多価免疫グロブリンを産生するための周知のフォーマットのいずれも、固有の欠点を有し、それにより免疫原性、ｉｎ  ｖｉｖｏ半減期又は調製に関する問題点を生じさせる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１９】
【特許文献１】国際出願第ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０５００５９号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００５／２６６０００Ａ１号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
上記のニーズに鑑み、従来技術に存在する課題を解決するため、本発明では、細胞標的多価免疫グロブリンの設計を可能にするモジュール式システムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明は、細胞表面分子に対する更なる結合を提供するために修飾された構造ループを介して細胞表面タンパク質と結合する、免疫グロブリンドメインの提供に関し、それにより、細胞表面受容体の架橋を可能にしている。
【００２２】
本発明は、多価免疫グロブリン又はその結合部分の提供に関する。それらは詳細には、前記免疫グロブリンの少なくとも１つの構造ループ領域中に少なくとも１つの修飾を有し、単一の細胞中の少なくとも２つの細胞表面分子と特異的に結合し、単一の細胞上に位置するか又は同種の細胞集団内に存在する、前記細胞表面分子のエピトープ（抗原性特性に関与する構造を含む）に対する結合性を決定し、未修飾の免疫グロブリンは前記エピトープと顕著に結合しない。
【００２３】
本発明に係る多価免疫グロブリンは、１つ以上の修飾免疫グロブリンと、又は未修飾の免疫グロブリン又はその部分と更に結合してもよく、それにより組み合わせ免疫グロブリンが得られる。
【００２４】
好ましくは、構造ループ領域に関するヌクレオチド又はアミノ酸配列中の修飾は、欠失、置換、挿入、又はそれらの組み合わせである。
【００２５】
本発明はまた、本発明の免疫グロブリン又はその一部をコードする核酸、並びに、以下のステップを有してなる、本発明に係る多価免疫グロブリンを設計する方法の提供に関する：
−  少なくとも１つの構造ループ領域を含んでなる免疫グロブリンをコードする核酸を準備するステップと、
−  前記構造ループ領域内の少なくとも１つのヌクレオチド残基を修飾するステップと、
−  発現システム中に上記の修飾された核酸を移すステップと、
−  前記多価免疫グロブリンを発現させるステップと、
−  上記で発現された、多価免疫グロブリンをエピトープと接触させ、前記多価免疫グロブリンが前記エピトープと結合するかどうかを測定するステップ。
【００２６】
更に、例えば腫瘍細胞及び病原感染した細胞の治療などに用いられる、治療用薬剤の調製への、本発明に係る多価免疫グロブリンの使用の提供に関する。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明に係る修飾免疫グロブリンドメインを、そのまま使用するか、又は、全長抗体、Ｆａｂ、単鎖Ｆｖｓ、Ｆａｂ２、低分子抗体などの様々な周知の抗体フォーマット中に組み込んで、細胞表面エピトープ又は受容体に対する更なる結合部位を提供することができる。
【００２８】
具体的には本発明は、抗原のエピトープに特異的に結合する免疫グロブリンの設計方法に関する。構造ループ領域中を修飾することにより、免疫グロブリンの、エピトープとの結合性を適宜設計することができる。好ましい実施形態では、当該免疫グロブリンは、各々異なり、かつ、同じ抗原若しくは異なる抗原に由来するか若しくは擬態する、２つのエピトープと特異的に結合する。
【００２９】
例えば、本発明は免疫グロブリンを設計する方法に関する。当該免疫グロブリンは、少なくとも１つの第１のエピトープに対して特異的に結合し、前記免疫グロブリン中の少なくとも１つの構造ループ領域中に少なくとも１つの修飾を有してなり、前記少なくとも１つのループ領域と、少なくとも１つの第２のエピトープとの特異的な結合を決定し、詳細には未修飾の構造ループ領域（非ＣＤＲドメイン）は前記少なくとも１つの第２のエピトープと特異的に結合しないことを特徴とする。上記方法は、以下のステップからなる：
−  少なくとも１つの第１のエピトープに特異的に結合し、少なくとも１つの構造ループ領域を有する免疫グロブリンをコードする核酸を準備するステップと、
−  前記核酸によってコードされる少なくとも１つの前記ループ領域の少なくとも１つのヌクレオチド残基を修飾するステップと、
−  前記修飾された核酸を発現システム中に移すステップと、
−  前記修飾免疫グロブリンを発現させるステップと、
−  前記少なくとも１つの第２のエピトープと、発現された前記修飾免疫グロブリンとを接触させるステップと、
−  前記修飾免疫グロブリンが第２のエピトープと特異的に結合するか否かを測定するステップ。
【００３０】
本発明に係る方法の特徴としては、好ましくは、前記免疫グロブリンの少なくとも１つの構造ループ領域に少なくとも１つの修飾を行い、それにより細胞表面抗原からなる群から選択される少なくとも１つの分子に対する、前記少なくとも１つのループ領域の特異的な結合が決定され、未修飾の構造ループ領域を有する免疫グロブリンが、前記少なくとも１つの分子と特異的に結合しないことである。
【００３１】
本明細書で用いられる用語「免疫グロブリン」とは、免疫グロブリン、又は免疫グロブリンの部分若しくは断片若しくは誘導体のことを指す。すなわち、本発明により修飾される「免疫グロブリンドメインペプチド」（本明細書では、用語「免疫グロブリン」と「抗体」が同義的に用いられる）、並びに、構造ループを有する免疫グロブリン又はそのドメイン若しくは部分、又はかかるドメインの構造ループ（例えばミニドメイン）が包含される。上記免疫グロブリンは、単離されたペプチドとして、又は他のペプチドとの組み合わせ分子として使用できる。場合によっては、単離された分子として、結合又は組み合わせを目的として、特定の修飾された構造ループ若しくは構造ループ領域、又はその部分を使用することが好ましい。「免疫グロブリンドメイン」とは、本明細書では、修飾及び設計により、特異的な結合特性を有しうる免疫グロブリンドメインペプチド又はポリペプチドを包含するものとして、定義される。上記ペプチドは、免疫グロブリンドメイン配列に相応し、好ましくは少なくとも５アミノ酸長、好ましくは少なくとも１０、又は少なくとも５０若しくは１００アミノ酸長であり、少なくとも構造ループ又は構造ループ領域を部分的に構成するか、あるいは当該ドメイン中の非ＣＤＲループ領域を構成する。上記ペプチドは好ましくは、機能を有さないアミノ酸、ハイブリッド若しくはキメラＣＤＲ−領域、又はＣＤＲ様領域、及び／又はＣＤＲ領域の標準的な構造と考えられる挿入物が除外される。上記結合特性は、特異的なエピトープ結合、親和性及び結合活性（アビディティ）に関連する特性である。
【００３２】
本発明に係る免疫グロブリンの誘導体は、本発明の１つ以上の免疫グロブリン及び／又は融合タンパク質のあらゆる組み合わせであり、詳細には、本発明に係る免疫グロブリンのドメイン又はミニドメインは、他の１つ以上のタンパク質（例えば他の免疫グロブリン、リガンド、足場タンパク質、酵素、毒素など）の任意の部位において融合させてもよい。本発明の免疫グロブリンの誘導体はまた、組換え技術又は様々な化学的方法（例えば共有結合、静電的な相互作用、ジスルフィド結合など）によって、他の物質と結合させることにより調製できる。
【００３３】
免疫グロブリンに結合する他の物質は、脂質、炭水化物、核酸、有機及び無機分子（例えばＰＥＧ、プロドラッグ又は薬剤）、又はそれらの任意の組み合わせでもよい。誘導体とは、同じアミノ酸配列を有するが、全部又は部分的に、非天然の又は化学的に合成したアミノ酸で修飾免疫グロブリンである。
【００３４】
本発明に係る設計された分子は、同様にそれ単独のタンパク質としても有用であるが、融合タンパク質又は誘導体としても有用であり、典型的には、大きな抗体構造体又は全長抗体分子の一部として融合してもよく、又は、その一部（例えばＦａｂ断片、Ｆｃ断片、Ｆｖ断片など）であってもよい。二重特異的、三重特異的な分子、あるいは同時により多くの特異性を有する分子の作製を目的として、設計されたタンパク質を使用することができ、それにより、かかる分子の所望の使用条件に従って、同時に結合の多重性を制御し、あらかじめ選択することが可能となる。
【００３５】
本発明の別の態様は、少なくとも１つのループ領域を有する免疫グロブリンに関し、詳細には、前記少なくとも１つのループ領域が、少なくとも１つのアミノ酸修飾からなる少なくとも１つの修飾されたループ領域を形成し、前記少なくとも１つの修飾されたループ領域が、抗原中の少なくとも１つのエピトープと特異的に結合する。
【００３６】
少なくとも１つの修飾された抗体ドメイン（非可変的な配列又は構造ループを介して特定のパートナーと結合する）と、少なくとも１つの他の結合分子（抗体、抗体断片、可溶性の受容体、リガンド若しくは他の修飾された抗体ドメインであってもよい）を結合させた分子であるのが好ましい。
【００３７】
本発明に係る免疫グロブリンによって特異的に認識される結合ペアの一部として機能する分子は、好ましくはタンパク性分子、核酸分子及び炭水化物からなる群から選択される。
【００３８】
修飾免疫グロブリンのループ領域は、特に抗原、タンパク性分子、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、核酸、グリカン、炭水化物、脂質、小さい有機分子、無機分子、又はその組み合わせ又は融合物など、あらゆる種類の結合分子又は構造とも特異的に結合できる。もちろん、上記修飾免疫グロブリンは、少なくとも２つのループ又はループ領域を有してもよく、それにより、当該ループ又はループ領域の各々が異なる分子又はエピトープと特異的に結合することができる。
【００３９】
本発明では、各種の細胞表面抗原に対する抗原結合ドメイン又は抗原結合部位は、ある特定の抗体構造中の構造ループに導入されてもよい。
【００４０】
本発明に係る用語「抗原」とは、免疫グロブリンのＣＤＲループ領域と相互作用するか又は相互作用できることが公知である、分子又は構造のことを意味する。天然抗体に係る従来公知の構造ループ領域は、抗原と相互作用せず、むしろ全体的な構造維持、及び／又はエフェクター分子に対する結合に関与するものである。本発明に係る設計を行うことにより、初めて、当該構造ループは、ＣＤＲループ又はＣＤＲ領域とは無関係に抗原結合ポケットを形成できる。
【００４１】
本発明に係る用語「細胞表面抗原」には、細胞表面上に存在する、抗体構造によって認識されうる全ての抗原、並びにかかる分子の断片が包含される。好適な「細胞表面抗原」とは、免疫学的又は治療的に有用である、又は有用でありうると証明されている抗原であり、特にかかる有用性が前臨床的若しくは臨床的に試験されている抗原のことを指す。それらの細胞表面分子は本発明において特異的な有用性を発揮し、細胞を殺傷する活性を示す。本発明に係る免疫グロブリンの、それらの細胞の少なくとも２つの表面分子に対する結合により、免疫系が細胞崩壊又は細胞死を生じさせ、それにより、ヒト細胞を攻撃するための有力な手段の提供が可能となる。
【００４２】
好ましくは、上記抗原は細胞表面抗原（受容体を含む）から選択され、特に、ｅｒｂＢ受容体チロシンキナーゼ、（限定されないがＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３及びＨＥＲ４など）、ＴＮＦ−受容体スーパーファミリー分子（例えばＡｐｏ−１受容体、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２）、神経成長因子受容体ＮＧＦＲ、ＣＤ４０、Ｔ細胞表面分子、Ｔ細胞受容体、Ｔ細胞抗原ＯＸ４０、ＴＡＣＩ−受容体、ＢＣＭＡ、Ａｐｏ−３、ＤＲ４、ＤＲ５、ＤＲ６おとり受容体（限定されないがＤｃＲ１、ＤｃＲ２、ＣＡＲ１、ＨＶＥＭ、ＧＩＴＲ、ＺＴＮＦＲ−５、ＮＴＲ−Ｉ、ＴＮＦＬ１など）、Ｂ細胞表面抗原（例えばＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２）、抗原又は固形腫瘍又は血液癌細胞マーカー、リンパ腫又は白血病細胞、血小板などの他の血球などが挙げられる。
【００４３】
更なる好ましい実施形態では、上記抗原又は修飾された構造ループ領域に結合する分子は、以下からなる群から選択される：腫瘍関連の抗原、特にＥｐＣＡＭ、腫瘍関連グリコプロテイン−７２（ＴＡＧ−７２）腫瘍関連の抗原ＣＡ１２５、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、高分子量黒色腫関連抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）、ルイスＹ関連炭水化物を発現する腫瘍関連抗原、癌胚抗原（ＣＥＡ）、ＣＥＡＣＡＭ５、ＨＭＦＧ  ＰＥＭ、ムチンＭＵＣ１、ＭＵＣ１８及びサイトケラチン腫瘍関連抗原、細菌抗原、ウイルス抗原、アレルゲン、アレルギー関連分子ＩｇＥ、ｃＫＩＴ及びＦｃ−ε−受容体１、ＩＲｐ６０、ＩＬ−５受容体、ＣＣＲ３、赤血球受容体（ＣＲ１）、ヒト血清アルブミン、マウス血清アルブミン、ネズミ血清アルブミン、新生児Ｆｃ−γ−受容体ＦｃＲｎ、Ｆｃ−γ−受容体Ｆｃ−γＲＩ、Ｆｃ−γ−ＲＩＩ、Ｆｃ−γＲＩＩＩ、Ｆｃ−α受容体、Ｆｃ−ε−受容体、フルオレセイン、リゾチーム、Ｔｏｌｌ様受容体９、エリトロポイエチン、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ４、ＣＤ１１、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３２、ＣＤ３３（ｐ６７タンパク質）、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ１４７、ＧＤ３、ＩＬ−１、ＩＬ−１Ｒ、ＩＬ−２、ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２３、ＬＩＦ、ＯＳＭ、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、ＴＮＦ−α、ＴＮＦβ２、ＴＮＦα、ＴＮＦαβ、ＴＮＦ−Ｒ１、ＴＮＦ−ＲＩＩ、ＦａｓＬ、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＴＲＡＩＬ、ＲＡＮＫＬ、ＴＷＥＡＫ、ＡＰＲＩＬ、ＢＡＦＦ、ＬＩＧＨＴ、ＶＥＧ１、ＯＸ４０Ｌ、ＴＲＡＩＬ受容体−１、Ａ１アデノシン受容体、リンホトキシンΒ受容体、ＴＡＣＩ、ＢＡＦＦ−Ｒ、ＥＰＯ、ＬＦＡ−３、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−３、インテグリンβ１、インテグリンβ２、インテグリンα４／β７、インテグリンα２、インテグリンα３、インテグリンα４、インテグリンα５、インテグリンα６、インテグリンαｖ、αＶβ３インテグリン、ＦＧＦＲ−３、ケラチン生成細胞成長因子、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＲＡＮＫＬ、ＶＬＡ−１、ＶＬＡ−４、Ｌ−セレクチン、抗−Ｉｄ、Ｅ−セレクチン、ＨＬＡ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＴＬＡ−４、Ｔ細胞受容体、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＶＮＲインテグリン、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、エオタキシン１、ＢＬｙＳ（Ｂ−リンパ球刺激因子）、補体Ｃ５、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、ＩｇＧ、因子ＶＩＩ、ＣＢＬ、ＮＣＡ９０、ＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ−１）、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ（ＥｒｂＢ−２）、Ｈｅｒ３（ＥｒｂＢ−３）、Ｈｅｒ４（ＥｒｂＢ４）、組織因子、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、エンドセリン受容体、ＶＬＡ−４、炭水化物（例えば血液型抗原及び関連する炭水化物）、Ｇａｌｉｌｉグリコシル化、ガストリン、ガストリン受容体、腫瘍関連炭水化物、ハプテンＮＰ−キャップ又はＮＩＰ−キャップ、Ｔ細胞受容体α／β、Ｅセレクチン、Ｐ糖タンパク質、ＭＲＰ３、ＭＲＰ５���グルタチオン−Ｓ−転移酵素π（多剤耐性タンパク質）、α−顆粒膜タンパク質（ＧＭＰ）１４０、ジゴキシン、胎盤アルカリホスファターゼ（ＰＬＡＰ）及び精巣ＰＬＡＰ様アルカリホスファターゼ、トランスフェリン受容体、ヘパラナーゼＩ、ヒト心臓ミオシン、グリコプロテインＩＩｂ／ＩＩＩａ（ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ）、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）ｇＨエンベロープグリコプロテイン、ＨＩＶ  ｇｐ１２０、ＨＣＭＶ、呼吸系発疹ウイルスＲＳＶ  Ｆ、ＲＳＶＦ  Ｆｇｐ、ＶＮＲインテグリン、ＨｅｐＢ  ｇｐ１２０、ＣＭＶ、ｇｐＩＩｂＩＩＩａ、ＨＩＶ  ＩＨＢ  ｇｐ１２０  Ｖ３ループ、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）Ｆｇｐ、ヘルペスシンプレックスウイルス（ＨＳＶ）ｇＤグリコプロテイン、ＨＳＶ  ｇＢグリコプロテイン、ＨＣＭＶ  ｇＢエンベロープグリコプロテイン、ウェルシュ菌毒素、並びにそれらの断片。
【００４４】
抗原のサブ構造は「エピトープ」（例えばＢ細胞エピトープ、Ｔ細胞エピトープ）と一般に称さるが、ただしそれらが免疫学的に同等である（すなわち、天然抗体若しくはモノクローナル抗体により認識される）ことを条件とする。本発明に係る用語「エピトープ」とは、本発明の免疫グロブリンの結合ドメインとの、特異的な結合パートナー又は特異的な結合パートナーの一部を完全に形成できる分子構造のことを意味する。
【００４５】
エピトープは、炭水化物、ペプチド、脂肪酸、無機物質若しくはその誘導体、並びにそれらの任意の組み合わせから化学的に調製してもよく、それらに由来してもよい。エピトープがペプチド又はポリペプチドである場合、通常少なくとも３アミノ酸、好ましくは８〜５０アミノ酸、より好ましくは約１０〜２０アミノ酸からなるペプチドである。特にペプチド長に関して上限はなく、ほとんどポリペプチド配列の全長であってもよい。エピトープは、直鎖状であってもよく、高次構造を有するエピトープであってもよい。直鎖状のエピトープは、ポリペプチド鎖の一次配列の単一セグメントからなる。直鎖状エピトープは隣接若しくは重複していてもよい。高次構造を有するエピトープは、ポリペプチドのフォールディングによる三次構造を形成するアミノ酸からなり、当該アミノ酸は、直鎖状配列中で必ずしも互いに隣接する必要はない。
【００４６】
具体的には、エピトープは診断にとり有用な分子の少なくとも一部である（すなわち、サンプル中のエピトープの不在又は存在が、質的又は量的に、疾患若しくは健康状態、製造プロセス中の状況、又は環境及び食品の状況と対応する）。エピトープは、治療にとり有用な分子の少なくとも一部でもよい（すなわち、特異的結合ドメインの標的となり、疾患の過程を変化させる）。
【００４７】
好ましくは、構造ループ中の新規な抗原結合部位は、免疫グロブリン配列（ヌクレオチド配列）中の１つ以上の要素の置換、欠失及び／又は挿入によって導入することができる。
【００４８】
他の本発明の好ましい実施形態では、少なくとも１つのヌクレオチドの修飾により、前記核酸によってコードされる免疫グロブリンのアミノ酸配列の置換、欠失及び／又は挿入が生じる。少なくとも１つのループ領域の修飾により、１つ以上のヌクレオチド又はアミノ酸の置換、欠失及び／又は挿入（好ましくは点突発変異）が生じてもよく、又は全ループ、好ましくは少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５（３０以下）のアミノ酸が交換されてもよい。それにより、かかる修飾された配列は、構造ループ中の保存されたドメイン中に元々含まれないアミノ酸を有してなり、新規に導入されたアミノ酸は天然に生じるが修飾部位においては外来アミノ酸であるか、又は天然に存在するアミノ酸を置換するものとなる。上記外来アミノ酸が特定のアミノ酸のグループ（例えば特定の極性又は疎水性を有するアミノ酸）から選択される場合、本発明の方法によって、ランダムな位置で上記の特定のアミノ酸グループでリッチにされたライブラリを得ることができる。かかるライブラリは、「フォーカスド」ライブラリとも称される。
【００４９】
ランダムに修飾された核酸分子は、本願明細書で定義する繰り返し単位（全ての周知の天然アミノ酸又はそのサブセットをコードする）を有してもよい。修飾された配列を含むライブラリ（アミノ酸の特定のサブセットが修飾のために用いられている）は、「フォーカスド」ライブラリと称される。かかるライブラリのメンバーは、当該修飾部位において当該サブセットのアミノ酸を有する確率が高い（少なくとも２倍、好ましくは少なくとも３倍、又は少なくとも４倍高い）。かかるライブラリはまた、ライブラリのメンバーを少ない数で有してもよく、その結果、実際のライブラリメンバーの数は、理論的なライブラリメンバーの数に達する。場合によっては、フォーカスドライブラリのライブラリメンバーの数は、理論的な番号の１０3倍以上、好ましくは１０2倍以上、最も好ましくは少なくとも１０倍以上である。
【００５０】
本発明に係るライブラリは、特異的なフォーマットを、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％で有するか、又は特異的な抗体フォーマットを主な要素として有する専用のライブラリとして設計してもよい。特異的な抗体フォーマットの使用が好適であり、本発明に係る好適なライブラリとしては、ＶＨライブラリ、ＶＨＨライブラリ、Ｖκライブラリ、Ｖλライブラリ、Ｆａｂライブラリ、ＣＨ１／ＣＬライブラリ及びＣＨ３ライブラリからなる群から選択される。複数の抗体ドメイン、例えばＩｇＧライブラリ又はＦｃライブラリを含む複合分子を含んでなることを特徴とするライブラリが特に好ましい。他の好適なライブラリは、Ｔ細胞受容体を含有し、Ｔ−細胞受容体ライブラリを形成するそれらである。更に好適なライブラリはエピトープライブラリであり、上記融合タンパク質は変異エピトープを有する分子を含んでなり、また、類似する結合性を有するが機能が異なる競争分子の選抜を可能にする。典型的にはＴＮＦαライブラリであり、ＴＮＦα融合タンパク質の三量体が単一の遺伝子パッケージにより発現する。
【００５１】
しかしながら、免疫グロブリンのループ領域に挿入されるアミノ酸の最大数は好ましくは３０以下であり、好ましくは２５、より好ましくは２０アミノ酸以下である。アミノ酸の置換及び挿入は好ましくは、公知技術及び本特許出願にて開示する方法により、全ての可能なアミノ酸、又はランダム化にとり好適なアミノ酸を選択して用い、ランダム若しくはセミランダムに行う。
【００５２】
上記修飾部位は、特異的な単一の構造ループ又は構造ループ領域であってもよい。ループ領域は通常、少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つ又は少なくとも４つのループから構成され、それらは各々隣接し、抗原結合部位又は抗原結合ポケットを形成することにより抗原の結合に関与できる。１つ以上の修飾部位は、１０アミノ酸、好ましくは２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０〜１００アミノ酸の範囲内で、特に構造領域内に存在し、表面又はポケットを形成し、その位置において抗原が当該ループ領域に立体的にアクセスできる。
【００５３】
上記少なくとも１つのループ領域は、好ましくはランダム、セミランダム、又は特に部位特異的なランダム突然変異導入によって変異又は修飾がなされているのが好ましく、それにより得られるライブラリに欠失、置換若しくはランダムな挿入が構造ループ内に付与される。あるいは好適な方法を適宜組み合わせてもよい。あらゆる周知の突然変異導入方法を使用できるが、中でもカセット突然変異導入が好ましい。これらの方法は、本発明の免疫グロブリンの所望の位置でアミノ酸修飾を行うために使用できる。若干の場合において、例えば、いずれかの変異可能なアミノ酸、好適なアミノ酸をランダムに適宜選択してループ配列をランダム化してもよく、あるいは、簡便な規則を使用してアミノ酸変異を導入する。例えば、全ての残基を特定のアミノ酸（例えばアラニン、アミノ酸若しくはアラニンスキャンと呼ばれる）に変異させるのが好ましい。かかる方法を、より高いレベルでの配列多様性をスクリーニングするための選抜方法を採用する、より高度なエンジニアリング方法と組み合わせてもよい。
【００５４】
本発明に係る好適な方法は、免疫グロブリン、免疫グロブリンドメイン又はその一部をコードする、ランダムに修飾された核酸分子を用いる方法であり、当該分子は、配列５’−ＮＮＳ−３’、５’−ＮＮＮ−３’、５’−ＮＮＢ−３’又は５’−ＮＮＫ−３’を有し、構造ループをコードする領域内の、少なくとも１つのヌクレオチド反復ユニットを有してなる。若干の実施形態では、上記修飾された核酸は、ＴＭＴ、ＷＭＴ、ＢＭＴ、ＲＭＣ、ＲＭＧ、ＭＲＴ、ＳＲＣ、ＫＭＴ、ＲＳＴ、ＹＭＴ、ＭＫＣ、ＲＳＡ、ＲＲＣ、ＮＮＫ、ＮＮＮ、ＮＮＳ又はいかなるそれらの組み合わせ（そのコードはＩＵＰＡＣによる）からなる群から選択されるヌクレオチドコドンを有してなる。
【００５５】
核酸分子の修飾は、核酸のより大きな部分に合成オリゴヌクレオチドを導入すること、又は、完全な核酸分子のｄｅ  ｎｏｖｏ合成によって実施できる。核酸の合成はトリヌクレオチドのビルディングブロックを用いて実施でき、それにより、アミノ酸のサブセットがコードされる場合、ナンセンス配列が組合わされる数を減少させることができる（例えばＹａｎｅｚら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（２００４）３２：ｅｌ５８、
Ｖｉｒｎｅｋａｓら、ｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９４）２２：５６００−５６０７）。
【００５６】
ランダムに修飾された上記核酸分子は、全ての周知の天然アミノ酸をコードする上記の繰り返し単位を有してもよい。
【００５７】
従来技術において周知のように、特異的な結合特性及び親和性を有するタンパク質の同定及び単離に使用できる様々な選抜技術が存在し、例えば様々なディスプレイ技術（例えばファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、細胞表面ディスプレイなど、後述する）が挙げられる。変異型抗体の生産及びスクリーニングのための方法は、従来技術において周知である。抗体に関する分子生物学、発現、精製及びスクリーニングのための一般方法は、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｄｕｅｂｅｌ＆Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，２００１、及びＨａｙｈｕｒｓｔ＆Ｇｅｏｒｇｉｏｕ，２００１，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  ５：６８３−６８９、及びＭａｙｎａｒｄ＆Ｇｅｏｒｇｉｏｕ，２０００，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｅｎｇ  ２：３３９−７６に記載されている。
【００５８】
本発明に係る「構造ループ」又は「非ＣＤＲループ」とは、以下のとおり理解される：すなわち免疫グロブリンは「いわゆる免疫グロブリンフォールド」と呼ばれるドメインから構成される。本質的には、逆平行βシートがループに結合し、圧縮型の逆平行βバレルを形成する。可変ドメインにおいて、ドメインのループのいくつかは、基本的に抗体の特異性（抗体の天然の結合部位を介した抗原に対する結合）に関与する。これらのループはＣＤＲループと呼ばれる。ＣＤＲループは、ＣＤＲループ領域の中で位置し、若干の場合において、ＣＤＲループに可変フレームワークドメイン（「ＶＦＲ」と呼ばれる）が隣接する。ＶＦＲが抗体の抗原結合ポケットに関与することが知られ、それは通常、主にＣＤＲループにより決定される。すなわち、それらのＶＦＲはＣＤＲループ領域の一部として考慮されるため、本発明への使用は適切でない。ＣＤＲループ領域内の、又はＣＤＲループの最も近位側のＶＦＲとは反対に、可変ドメイン内の他のＶＦＲの使用は、本発明において特に適切である。それらは、ＣＤＲループ領域の反対側に、又は可変的な免疫グロブリンドメインのＣ末端側に位置するＶＦＲの構造ループである。
【００５９】
抗体ドメインの他の全てのループはむしろ、分子の構造及び／又はエフェクター機能に関与する。これらのループは「構造ループ」又は非ＣＤＲループとして本願明細書において定義され、それはＣＤＲループ領域の中のいかなるＶＦＲも除外する。
【００６０】
修飾免疫グロブリンをコードする核酸分子（また明細書の全体にわたって免疫グロブリン断片又は誘導体も含まれる）を宿主細胞にクローニングし、発現させ、それらの結合特性をアッセイできる。これらは周知の手順を使用して実施でき、本発明で使用できる様々な方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ  Ｅｄ）、（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００１）、及びＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ）に記載されている。本発明の修飾免疫グロブリンをコードする核酸を発現ベクターに組み込み、前記免疫グロブリンを発現させることができる。発現ベクターには典型的には、免疫グロブリンの遺伝子が使用可能な状態で結合され、更に、それと機能的な関係を有する態様で制御配列、選抜可能な標識、いかなる融合パートナー、及び／又は更なるエレメントが配置されている。本発明の修飾免疫グロブリンは、修飾免疫グロブリンの発現を誘導しうる適当な条件下で、修飾免疫グロブリンをコードする核酸を含む核酸（好ましくは発現ベクター）で形質転換された宿主細胞を培養することによって調製できる。外生の核酸分子を宿主に導入する方法は公知技術で、使用する宿主に応じて変化する。また、当然ながら修飾免疫グロブリンの発現に、無細胞発現システムを使用してもよい。
【００６１】
「発現システム」という用語は、コード配列と、操作可能に結合した所望の制御配列とを含む核酸分子のことを指し、これらの配列によって形質転換又はトランスフェクションされた宿主は、コードされたタンパク質を産生できる。形質転換を遂行するため、発現システムをベクター中に導入してもよいが、同様のＤＮＡを宿主の染色体に導入してもよい。
【００６２】
本発明の好ましい実施形態では、上記発現システムはベクターを有してなる。必要に応じて、公知技術のいかなる発現ベクターを使用してもよい。
【００６３】
修飾免疫グロブリンは、好ましくは宿主中、好ましくは細菌、酵母、植物細胞、動物細胞、又は植物若しくは動物体内で発現させる。
【００６４】
多種多様な適当な宿主細胞を、修飾免疫グロブリンの発現に使用でき、限定されないが例えば哺乳動物細胞（動物細胞）又は植物細胞、バクテリア（例えば枯草菌、大腸菌）昆虫細胞及び酵母（例えばＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などが使用できる。例えば、本発明で使用できる様々な細胞系は、ＡＴＣＣ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅカタログ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手可能な）に記載されている。更に、動植物を、本発明に係る免疫グロブリンの発現のための宿主として使用できる。発現用又はトランスフェクション用のベクター若しくはカセットは、使用する宿主に従って選択できる。
【００６５】
当然ながら、無細胞タンパク質発現システムを使用してもよい。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳タンパク質発現プラットフォーム（充分な量のタンパク質を産生する）は無細胞タンパク質発現において多くの効果を発揮し、細胞ベースの発現システムにおいて典型的に存在する面倒な上流及び下流の工程（例えば宿主細胞の形質転換、培養又は溶解）の必要がない。
【００６６】
本発明の好ましい実施形態では、修飾免疫グロブリンは、発現後に精製又は分離される。修飾免疫グロブリンは、当業者に公知の様々な方法で分離又は精製できる。標準的な精製方法としては、クロマトグラフィ技術が挙げられ、例えば親和性クロマトグラフィ、イオン交換又は疎水性クロマトグラフィ、電気泳動、免疫学的、沈殿、透析、濾過、濃縮及びクロマトフォーカス技術が挙げられる。精製は通常、特異的な融合パートナーを用いて行われる。例えば、ＧＳＴ融合タンパクの場合、抗体はグルタチオン樹脂を使用して精製でき、Ｈｉｓ−タグの場合、Ｎｉ2+親和性クロマトグラフィを使用し、ｆｌａｇ−タグの場合、固定した抗ｆｌａｇ抗体を使用する。適切な精製技術の一般的なガイダンスは、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，３．ｓｕｐ．ｒｄ  Ｅｄ．，Ｓｃｏｐｅｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−  Ｖｅｒｌａｇ，ＮＹ，１９９４を参照。当然ながら、宿主の表面に本発明に係る修飾免疫グロブリンを発現させることも可能であり、特に細菌、昆虫又は酵母細胞の表面、又は、ファージ又はウイルスの表面に発現させてもよい。
【００６７】
修飾免疫グロブリンは、限定されないがｉｎ  ｖｉｔｒｏ分析、ｉｎ  ｖｉｖｏ及び細胞ベースの分析及び選抜技術などの、様々な方法を使用して選抜できる。オートメーション及びハイスループットスクリーニング技術を、スクリーニング手順に利用してもよい。スクリーニングでは融合パートナー又はラベルを使用してもよく、例えば酵素、イムノラベル、アイソトープラベル又は小分子ラベル（例えば蛍光若しくは比色色素若しくは発光分子）を使用してもよい。
【００６８】
好ましい実施形態では、免疫グロブリンの機能的及び／又は生物物理学的特性を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいてスクリーニングされる。好ましい実施形態では、抗体は、機能（例えばその標的に対する結合親和性、又は触媒作用を及ぼす能力）を基に選抜される。
【００６９】
アッセイでは、発色、蛍光、発光又はアイソトープラベルを含むがこれに限らない様々な検出方法を使用できる。
【００７０】
周知のように、スクリーニング方法のサブセットは、ライブラリの好ましいメンバーを選抜するものである。上記方法は本願明細書では「選抜方法」と称し、これらの方法では本発明の修飾免疫グロブリンのスクリーニングのために使用できる。免疫グロブリンライブラリが選抜方法を使用してスクリーニングされるとき、ライブラリ中の好適な（すなわち幾つかの選抜基準を満たす）メンバーのみが選抜され、分離され、及び／又は観察される。明らかなように、最も適当な変異型だけが観察されるため、かかる方法は、ライブラリメンバーの合理性を個々に検定する方法によってスクリーニングできるものより大きなライブラリのスクリーニングが可能となる。選抜は、いかなる方法、技術又は融合パートナー（共有結合又は非共有結合的）によっても行うことができる。免疫グロブリンの発現型はその遺伝子型と連結し、すなわち、抗体の機能は、それをコードする核酸と連結している。例えば、選抜方法としてのファージディスプレイの使用は、遺伝子ＩＩＩタンパク質へのライブラリメンバーの融合によって可能となる。このようにして、また、若干の基準（例えば免疫グロブリンの標的に対する結合親和性）を満たす修飾免疫グロブリンの選抜又は単離においては、それをコードする核酸の選抜又は分離が行われる。一旦分離されると、修飾免疫グロブリンをコードする遺伝子を更に増幅できる。この単離及び増幅のプロセスはパニングと呼ばれ、繰り返すことができ、それによりライブラリ中の良好な抗体変異体を増加させることができる。結合する核酸の塩基配列決定により、最終的な遺伝子同定が可能となる。
【００７１】
様々な選抜方法が公知であり、本発明において免疫グロブリンライブラリのスクリーニング技術において使用できる。かかる技術としては、限定されないが、ファージディスプレイ（Ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｋａｙら、，１９９６，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．，１９９６；Ｌｏｗ−ｍａｎら、，１９９１，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：１０８３２−１０８３８；Ｓｍｉｔｈ，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１３１５−１３１７）、及びその変形方法（例えば選択的ファージ感染）、（Ｍａｌｍｂｏｒｇら、，１９９７，Ｊ  ＭｏＩ  Ｂｉｏｌ  ２７３：５４４−５５１），選択的感染ファージ（Ｋｒｅｂｂｅｒら、，１９９７，Ｊ  ＭｏＩ  Ｂｉｏｌ  ２６８：６１９−６３０）、及び遅延感染性パニング（Ｂｅｎｈａｒら、，２０００，Ｊ  ＭｏＩ  Ｂｉｏｌ  ３０１：８９３−９０４）、細胞表面ディスプレイ（Ｗｉｔｒｒｕｐ，２００１，ＣｕｒｒＯｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１２：３９５−３９９）、例えば細菌ディスプレイ（Ｇｅｏｒｇｉｏｕら、，１９９７，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １５：２９−３４；Ｇｅｏｒｇｉｏｕら、，１９９３，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １１：６−１０；Ｌｅｅら、，２０００，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １８：６４５−６４８；Ｊｕｎら、，１９９８，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １６：５７６−８０）、酵母（Ｂｏｄｅｒ＆Ｗｉｔｔｒｕｐ，２０００，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ３２８：４３０−４４；Ｂｏｄｅｒ＆Ｗｉｔｔｒｕｐ，１９９７，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １５：５５３−５５７）、及び哺乳動物細胞（Ｗｈｉｔｅｈｏｒｎら、，１９９５，Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：１２１５−１２１９）、並びにｉｎ  ｖｉｔｒｏディスプレイ技術（Ａｍｓｔｕｔｚら、，２００１，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ’  １２：４００−４０５）、例えばポリソームディスプレイ（Ｍａｔｔｈｅａｋｉｓら、，１９９４，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９１：９０２２−９０２６）、リボソームディスプレイ（Ｈａｎｅｓら、，１９９７，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９４：４９３７−４９４２）、ｍＲＮＡディスプレイ（Ｒｏｂｅｒｔｓ＆Ｓｚｏｓｔａｋ，１９９７，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９４：１２２９７−１２３０２；Ｎｅｍｏｔｏら、，１９９７，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ４１４：４０５−４０８）、及びリボソーム不活化ディスプレイシステム（Ｚｈｏｕら、，２００２，Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １２４，５３８−５４３）などが挙げられる。
【００７２】
本発明で使用できる他の選抜方法には、ディスプレイに依存しない方法も含まれ、例えばペリプラズム発現及びサイトメトリによるスクリーニングなどのｉｎ  ｖｉｖｏ方法（Ｃｈｅｎら、，２００１，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １９：５３７−５４２）、抗体フラグメント相補性アッセイ（Ｊｏｈｎｓｓｏｎ＆Ｖａｒｓｈａｖｓｋｉｙ，１９９４，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９１：１０３４０−１０３４４；  Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒら、，１９９８，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９５：１２１４１−１２１４６）、酵母ツーハイブリッド法（Ｆｉｅｌｄｓ＆Ｓｏｎｇ，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ  ３４０：２４５−２４６）選抜モード（Ｖｉｓｉｎｔｉｎその他、１９９９、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９６：１１７２３−１１７２８）などが挙げられる。代替的な実施形態では、発現ベクター上の特異的な配列と結合する融合パートナーによって選抜が可能となり、すなわち、融合パートナー及び付随するＦｃ変異型のライブラリメンバーを、共有結合又は非共有結合的に、それらをコードする核酸と結合させることを特徴とする。
【００７３】
代替的な実施形態では、抗体の発現が細胞の成長、再生又は生存にとり有利である場合、ｉｎ  ｖｉｖｏ選抜を実施できる。
【００７４】
「誘導型進化」方法と言われる選抜のサブセット方法は、選抜の間、好ましい配列の交雑又は繁殖が行われ、しばしば新しい突然変異の取り込みも行われる。当業者に周知のように、誘導型進化方法は、ライブラリ中の最も好ましい配列の同定を容易に可能とし、スクリーニングされる配列の多様性を増加させることができる。様々な誘導型進化方法が公知であり、本発明において変異抗体のスクリーニング技術として使用でき、限定されないが例えばＤＮＡシャッフリング（国際公開第００／４２５６１Ａ３号、国際公開第０１／７０９４７Ａ３号）、エキソンシャッフリング（米国特許第６３６５３７７号；Ｋｏｌｋｍａｎ＆Ｓｔｅｉｎｍｅｒ，２００１，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １９：４２３−４２８）、ファミリーシャッフリング（Ｃｒａｍｅｒｉら、，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ３９１：２８８−２９１；米国特許第６３７６２４６号）、ＲＡＣＨＩＴＴ．ＴＭ．（Ｃｏｃｏら、２００１，Ｎａｔ  Ｂｉｏ−ｔｅｃｈｎｏｌ  １９：３５４−３５９；国際公開第０２／０６４６９号）、ＳＴＥＰ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ組み換えのランダムプライミング（Ｚｈａｏ．ら、１９９８，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １６：２５８−２６１；Ｓｈａｏら、，１９９８，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２６：６８１−６８３）、エキソヌクレアーゼによる遺伝子アセンブリ（米国特許第６３５２８４２号；米国特許第６３６１９７４号）、遺伝子部位飽和変異導入（商標）（米国特許第６３５８７０９号）、遺伝子リアセンブリ（商標）（米国特許第６３５８７０９号）、ＳＣＲＡＴＣＨＹ（Ｌｕｔｚら、，２００１，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８：１１２４８−１１２５３）、ＤＮＡ断片化方法（Ｋｉｋｕｃｈｉら、，Ｇｅｎｅ  ２３６：１５９−１６７）、一本鎖ＤＮＡシャッフリング（Ｋｉｋｕｃｈｉら、，２０００，Ｇｅｎｅ  ２４３：１３３−１３７）、及びＡＭＥシステム（商標）進化抗体エンジニアリング技術（応用分子進化）（米国特許第５８２４５１４号、米国特許第５８１７４８３号、米国特許第５８１４４７６号、米国特許第５７６３１９２号、米国特許第５７２３３２３号）などが挙げられる。
【００７５】
本発明の好ましい実施形態では、分子に対する修飾免疫グロブリンの特異的な結合は、以下からなる群から選択される結合アッセイにより測定される：免疫学的アッセイ、好ましくは酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、表面プラスモン共鳴アッセイ、飽和転送差核磁気共鳴分光アッセイ、転送ＮＯＥ（ｔｒＮＯＥ）核磁気共鳴分光アッセイ、競争的アッセイ、組織結合アッセイ、生細胞結合アッセイ及び細胞抽出アッセイ。
【００７６】
当該結合アッセイは、限定されないが、以下のような公知の様々な方法を用いて実施することができる：ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）及びＢＲＥＴ（生物発光共鳴エネルギー移動）−ベースのアッセイ、ΑｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（ＴＭ）（増幅蛍光近接ホモジニアスアッセイ）、シンチレーション近接アッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノソルベントアッセイ）、ＳＰＲ（表層プラスモン共鳴、別名「ＢＩＡＣＯＲＥ」（ＴＭ））、等温滴定熱量測定、示差走査熱量測定、ゲル電気泳動、及びクロマトグラフィなどのゲル濾過。これらの、また他の方法では、一部の融合パートナー又はラベルを利用できる。
【００７７】
修飾免疫グロブリンは、好ましくは以下からなる群から選択されるラベル又はリポーター分子とコンジュゲートしている：有機分子、酵素ラベル、放射性ラベル、着色ラベル、蛍光ラベル、発色ラベル、発光ラベル、ハプテン、ジゴキシゲニン、ビオチン、金属複合体、金属、コロイド状金及びそれらの混合物。ラベル又はリポーター分子にコンジュゲートした修飾免疫グロブリンは、例えば診断で使用できる。
【００７８】
修飾免疫グロブリンを他の分子にコンジュゲートさせることにより、例えば結合アッセイ（例えばＥＬＩＳＡ）や結合試験において前記コンジュゲートを単純に検出することができる。
【００７９】
好ましい実施形態では、変異抗体を、１つ以上の細胞ベース若しくはｉｎ  ｖｉｖｏアッセイを使用してスクリーニングする。かかるアッセイでは典型的には、精製若しくは未精製の修飾免疫グロブリンを外因的に添加し、細胞を、個々の免疫グロブリン又はライブラリに属する免疫グロブリンのプールに暴露する。しかしこれらのアッセイは典型的には、常にではないが免疫グロブリンの機能に基づく。すなわち、その標的と結合し、若干の生化学応答を媒介する抗体の能力（例えばエフェクター機能、リガンド／受容体結合阻害、アポトーシスなど）である。かかるアッセイでは、抗体に対する細胞の応答（例えば細胞生存、細胞死、細胞形態の変化）又は転写活性化（例えば天然遺伝子又はリポーター遺伝子の細胞発現）をモニターすることが必要な場合もある。例えば、かかるアッセイでは、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ又はＣＤＣを引き出す変異抗体の能力を測定できる。幾つかのアッセイでは、標的細胞以外にも、例えば血清補体、又はエフェクター細胞（例えば末梢血単球（ＰＢＭＣｓ）、ＮＫ細胞、大食細胞など）などの細胞若しくは構成要素を添加する必要がある場合もある。かかる更なる細胞は、いかなる生物体（好ましくはヒト、マウス、ネズミ、ウサギ及びサル）から調製してもよい。免疫グロブリンは標的を発現する特異的な細胞系のアポトーシスを引き起こすことができ、又は、アッセイに加えられた免疫細胞による標的細胞への攻撃を媒介できる。細胞死又は生存度のモニタリング方法は公知技術で、色素、免疫化学的手段、細胞化学的手段及び放射性物質の使用に基づくものが挙げられる。例えば、カスパーゼ染色アッセイはアポトーシスの測定を可能とし、放射性基質若しくはａｌａｍａｒ  ｂｌｕｅのような蛍光色素の取り込み若しくは放出により、細胞増殖若しくは活性化をモニターすることが可能となる。好ましい実施形態では、ＤＥＬＦＩＡＲＴ  ＥｕＴＤＡベースの細胞毒性アッセイ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、ＭＡ）を使用できる。あるいは、死細胞若しくは傷害性標的細胞を、１つ以上の天然の細胞内構成要素（例えば乳酸脱水素酵素）の放出を測定することによってモニターしてもよい。転写活性化は、細胞ベースのアッセイにおいて、機能をアッセイする方法として有用でありうる。この場合、上方制御されうる天然遺伝子又は免疫グロブリンをアッセイすることにより、反応をモニターできる。例えば、特異的なインターロイキンの放出を測定するか、あるいはリポーター構築物を測定してもよい。細胞ベースのアッセイでは、修飾免疫グロブリンの存在への応答としての、細胞の形態的な変化の測定を行ってもよい。かかるアッセイのための細胞タイプは原核生物でも真核生物でもよく、従来技術において周知である様々な細胞系を使用できる。あるいは、細胞ベースのスクリーニングは、変異型をコードする核酸によって形質転換又はトランスフェクションされた細胞を使用して実施してもよい。すなわち、変異抗体を外因的に細胞に添加するのではない。例えば、一実施形態では、細胞ベースのスクリーニングは、細胞表面ディスプレイを利用する。細胞表面における修飾免疫グロブリンのディスプレイを可能にする融合パートナーを使用してもよい（Ｗｉｔｒｒｕｐ，２００���，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１２：３９５−３９９）。
【００８０】
好ましい実施形態では、修飾免疫グロブリンの免疫原性は、１つ以上の細胞ベースのアッセイを使用して実験的に測定できる。好ましい実施形態では、ｅｘ  ｖｉｖｏでのＴ−細胞活性化アッセイを用いて、実験的に免疫原性を定量する。この方法では、マッチするドナーからの抗原提示細胞及び天然のＴ細胞は、１回以上、ペプチド又は目的の全長抗体の曝露を受ける。更に、例えばサイトカインの産生をモニターするか又はトリチル化されたチミジンの取り込みを測定するなど、多くの方法を使用してＴ細胞活性化を検出できる。最も好ましい実施形態では、インターフェロンγ産生を、Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイ（Ｓｃｈｍｉｔｔｅｌ  ｅｔ．ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，２４：１７−２４）によりモニターする。
【００８１】
本発明の修飾免疫グロブリンの生物学的特性は、ｅｘ  ｖｉｖｏによる細胞、組織及び全生物体を用いた実験により特徴づけることが可能である。周知のように、限定されないがマウス、ネズミ、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ及びサルなどの動物において、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて薬剤を試験し、それにより当該薬の、治療への有効性を疾患又は疾患モデルと比較し、あるいは薬物動態学、薬力学、毒性及び他の特性を測定することが可能となる。当該動物は疾患モデルと称することもある。当該治療は、ヌードマウス、ＳＣＩＤマウス、異種移植片マウス及びトランスジェニックマウス（ノックイン及びノックアウトを含む）などのマウスを用いて通常試験される。かかる実験により、当該抗体を治療薬として使用する際における、適当な半減期、エフェクター機能、アポトーシス活性、細胞障害若しくは細胞溶解活性などの、使用可能性を決定するために有用なデータが提供されうる。いかなる生物体（好ましくは哺乳類）も、試験に使用できる。例えばサルは、ヒト（霊長類）に対するそれらの遺伝子の類似性のため、適切な治療のモデルであり、ゆえに、本発明の修飾免疫グロブリンの有効性、毒性、薬物動態学、薬力学、半減期又は他の特性を試験するために使用できる。ヒトにおける臨床試験は、薬剤として承認を受けるために最終的に必要とされ、また当然ながら、これらの試験も本発明に包含される。すなわち、本発明の修飾免疫グロブリンは、それらの治療有効性、毒性、免疫原性、薬物動態学及び／又は他の臨床特性を決定するため、ヒトにおける試験にも使用できる。特に少なくとも２つの表層抗原を通じて１つの細胞と結合（好ましくは少なくとも３つの構造架橋結合標的細胞の結合）する本発明に係る多価免疫グロブリンは、アポトーシス誘導的であると考えられ、細胞ターゲティング及び架橋結合の際にアポトーシス活性を発揮する。多価結合は結合パートナーの比較的大きい会合を提供し、またそれは架橋結合と呼ばれ、アポトーシスの必要条件である。
【００８２】
本発明の修飾免疫グロブリンの使用により、広範囲にわたる抗体製品の応用が可能となる。一実施形態では、本発明の変異抗体は、治療又は予防に使用でき、例えば能動的又は受動的免疫療法、調製、産業的若しくはアッセイ用途、診断用途、工業用化合物又は試験用試薬など（好ましくは治療用途）への応用が可能である。修飾免疫グロブリン又は変異抗体の使用により、モノクローナル若しくはポリクローナル抗体の合成が可能となる。好ましい実施形態では、本発明の修飾免疫グロブリンを用いて、標的抗原を運ぶ標的細胞（例えば癌細胞）を捕捉するか又は殺傷する。代替的な実施形態では、本発明の修飾免疫グロブリンを用いて、標的抗原をブロック、アンタゴナイズ又はアゴナイズし、例えばサイトカイン又はサイトカイン受容体をアンタゴナイズする。
【００８３】
交替に好適な実施形態では、本発明の修飾免疫グロブリンを用いて、成長因子又は成長因子受容体をブロック、アンタゴナイズ又はアゴナイズし、それにより標的抗原を運ぶか又は必要とする標的細胞の殺傷が可能となる。
【００８４】
好適な代替的実施形態では、本発明の修飾免疫グロブリンを用いて、酵素及び酵素基質をブロック、アンタゴナイズ又はアゴナイズする。
【００８５】
本発明の修飾免疫グロブリンは好ましくは、能動的又は受動的免疫治療の際、様々な治療に使用できる。
【００８６】
特に本発明に係る、又は本発明に係る方法によって入手できる免疫グロブリンを用いて、能動免疫のためのワクチンの調製が可能となる。これによって、上記免疫グロブリンをワクチン調製用の抗原性物質として使用でき、又はワクチン調製の際に、ｅｘ  ｖｉｖｏ若しくはｉｎ  ｖｉｖｏでの抗原性構造の捕捉等に用いられる。
【００８７】
好ましい実施形態では、修飾免疫グロブリンを有する抗体を患者に投与して、特異性障害を治療する。本発明のための「患者」は、ヒト及び他の動物（好ましくは哺乳類及び最も好ましくはヒト）を指す。本願明細書における「特異性障害」とは、本発明の修飾免疫グロブリンからなる医薬組成物の投与により改善されうる障害のことを意味する。
【００８８】
一実施形態では、本発明に係る修飾免疫グロブリンは、患者に投与される唯一の治療的有効成分である。あるいは、本発明に係る修飾免疫グロブリンは、１つ以上の他の治療薬と組み合わせて投与してもよく、かかるものとしては限定されないが、細胞障害剤、化学療法剤、サイトカイン、成長抑制剤、抗ホルモン剤、キナーゼ阻害剤、抗血管新生剤、心臓保護剤又は他の治療薬が挙げられる。上記修飾免疫グロブリンは、１つ以上の他の治療に付随して投与してもよい。例えば、本発明の変異抗体を、化学療法、放射線療法、又は化学療法及び放射線療法の両方において、患者に投与できる。一実施形態では、本発明の修飾免疫グロブリンは、１つ以上の抗体（本発明の変異抗体を含有してもよく又は含有しなくてもよい）との組み合わせで投与してもよい。本発明の他の実施形態では、本発明の修飾免疫グロブリン及び１つ以上の他の制癌治療を用いて、癌細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで治療してもよい。かかるｅｘ  ｖｉｖｏな治療は、骨髄移植、及び特に自家骨髄移植において有用であると考えられる。本発明の抗体が更に他の治療技術（例えば手術）と組み合わせて使用できることは当然である。
【００８９】
様々な他の治療薬を、本発明の修飾免疫グロブリンと組み合わせて投与することができる。一実施形態では、上記修飾免疫グロブリンを、抗血管新生剤（血管の形成をブロックするか、ある程度阻害する化合物）と共に投与する。抗血管形成因子とは、例えば、成長因子又は成長因子受容体に結合することにより、脈管形成を促進しうる、小分子又はタンパク質（例えば抗体、Ｆｃ融合分子又はサイトカイン）である。本願明細書において、好適な抗血管新生因子とは、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）と結合する抗体である。代替の実施形態では、上記修飾免疫グロブリンは、適応免疫反応を誘発するか又は強化する治療薬（例えばＣＴＬＡ−４を標的とする抗体）と共に投与される。代替的な実施形態では、修飾免疫グロブリンはチロシンキナーゼ阻害剤（ある程度チロシンキナーゼのチロシンキナーゼ活性を阻害する分子）と共に投与される。代替の実施形態では、本発明の修飾免疫グロブリンは、サイトカインと共に投与される。本明細書で用いられる「サイトカイン」とは、１つの細胞集団から放出され、細胞間メディエータ（ケモカインなど）として他の細胞において機能する、タンパク質の総称を意味する。
【００９０】
医薬組成物とは、本発明に係る修飾免疫グロブリン及び１つ以上の治療的活性薬剤を処方したものである。本発明の変異抗体を含有する安定な製剤は、所望の純度の前記免疫グロブリンと、任意の薬理学的に許容できる担体、賦形剤又は安定化剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．，１９８０）を混合することによって調製され、保存の際には凍結乾燥又は水溶液の形で調製される。ｉｎ  ｖｉｖｏ投与のために使用される製剤は、好ましくは無菌状態である。これは滅菌フィルター又は他の方法による濾過によって容易に実施できる。本願明細書に開示される修飾免疫グロブリンと他の治療的有効成分は、免疫リポソームとして製剤化でき、及び／又はマイクロカプセル中に封入できる
【００９１】
本発明の修飾免疫グロブリンを含有する医薬組成物の投与は、好ましくは滅菌水中の溶液などの形で、限定されないが以下のような様々な形態で実施できる：経口的、皮下、静脈注射、鼻腔内、耳内、経真皮、経粘膜、腹膜内、筋肉注射、局所投与（例えばゲル、塗剤、ローション剤、クリームなど）、肺内（例えばＡｒａｄｉｇｍから市販されているＡＥＲｘTMインハレーション技術又はＩｎｈａｌｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓから市販されているＩｎｈａｎｃｅTM肺内輸送システム）、経膣、非経口、直腸内又は眼内投与。
【００９２】
本発明で使用する「特異的に結合する」という用語は、異質な分子集団の中から、関心の同族リガンドのみと結合する反応のことを指す。すなわち、所定の抗体は、所定の条件（例えば免疫グロブリンの場合、イムノアッセイ条件）下で、その特異的な「標的」と結合し、一方サンプル中に存在する他の分子とは顕著な量において結合しない。抗体のＣＤＲｓと同様、修飾された構造ループ領域は、抗原、構造又は分子と結合するタンパク質部分であり、それ自体抗原ではない。
【００９３】
本発明の別の態様は、少なくとも１つの修飾を前記免疫グロブリンの構造ループ領域に有し、抗原のエピトープに対する前記免疫グロブリンの結合を決定する、免疫グロブリン又はそれを含有する医薬品の製造方法に関する。未修飾の免疫グロブリンは前記エピトープと顕著に結合しない。上記方法は、以下のステップからなる、
−  少なくとも１つのループ領域を有する免疫グロブリンをコードする核酸を準備するステップと、
−  少なくとも１つの前記ループ領域の少なくとも１つのヌクレオチド残基を修飾するステップと、
−  発現システム中に前記修飾された核酸を存在させるステップと、
−  前記修飾免疫グロブリンを発現させるステップと、
−  発現された修飾免疫グロブリンとエピトープとを接触させるステップと、
−  前記修飾免疫グロブリンが前記エピトープと結合するか否かを測定するステップと、
−  前記エピトープに結合する修飾免疫グロブリンを準備し、任意にそれを医薬品として調製するステップ。
【００９４】
好ましい実施形態では、本発明に係る免疫グロブリンは、二重特異的な抗体又は二重特異的な単鎖抗体である。更に好適には、当該免疫グロブリンは二重特異的なドメイン、又はミニドメインを含むその一部を有してなる。
【００９５】
特に本発明は、少なくとも１つの第１の分子に特異的に結合する多重特異的免疫グロブリン、又はそれを含有する医薬品の製造方法に関する。当該免疫グロブリンは、前記免疫グロブリンの少なくとも１つの構造ループ領域中に少なくとも１つの修飾を有し、前記少なくとも１つのループ領域が、少なくとも１つの第２の分子に特異的に結合するか否かを決定する。それらは例えば、アレルゲン、腫瘍関連の抗原、自己抗原、酵素、細菌抗原、菌類の抗原、原生動物の抗原及びウィルス抗原からなる群から選抜される抗原であり、未修飾の構造ループ領域を含有する免疫グロブリンでは、前記少なくとも１つの第２の分子と特異的に結合しない。上記方法は、以下のステップからなる、
−  少なくとも１つの構造ループ領域を有し、少なくとも１つの第１の分子に特異的に結合する免疫グロブリンをコードする核酸を準備するステップと、
−  前記核酸によってコードされる少なくとも１つの前記ループ領域中の少なくとも１つのヌクレオチド残基を修飾するステップと、
−  発現システム中に前記修飾された核酸を存在させるステップと、
−  前記修飾免疫グロブリンを発現させるステップと、
−  発現された修飾免疫グロブリンと前記少なくとも１つの第２の分子とを接触させるステップと、
−  前記修飾免疫グロブリンが第２の分子と特異的に結合するか否かを測定するステップと、
−  前記少なくとも１つの第２の分子に特異的に結合する修飾免疫グロブリンを準備し、任意に医薬品として調製するステップ。
【００９６】
特異的な結合ペアのメンバーを複数特異性にするためのエンジニアリングを行うことが好適である（Ｋｕｆｅｒら、（２００４）Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｖｏｌ．２２  ｐ２３８−２４４）。
【００９７】
多重特異的な抗体を調製するための多数の試み（例えば二重特異的、モノクローナル抗体又は抗体断片）が行われてきた。２つの異なるポリペプチド鎖（重鎖及び軽鎖）で構成されている二重特異的な抗体の産生の１つの課題は、１つの細胞中で４つの異なる鎖（２つの重鎖及び２つの軽鎖）を発現させる必要であることであり、それは分子の多くの様々な組み合わせを生じさせるため、混合物から、所望の二重特異的な分子を分離させる必要がある。それらの類似性のため、これらの分子の分離は困難かつ高コストである。かかる不必要な組み合わせの発生を最小化するために、多くの方法が使用されてきた（Ｃａｒｔｅｒ（２００１）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，ｖｏｌ  ２４８，ｐ７−１５）。
【００９８】
１つの解決法は、２つの特性を有する１つのポリペプチド鎖の産生（例えば２つのｓｃＦｖｓを各々結合させるか、又はいわゆる二重特異性抗体の産生）である。かかる分子は、天然分子のフォールディング構造からは大きく異なることが示されており（Ｌｅ−ＧａＩｌら、（２００４）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｖｏｌ  １７  ｐａｇｅｓ  ３５７−３６６）、文字どおり調製が困難である。
【００９９】
二重特異的な抗体の設計における他の課題としては、親抗体がそれらのそれぞれの結合パートナー（例えばＩｇＧ）に対する二価的な結合を示す場合であっても、得られる二重特異的な抗体が、それぞれの結合パートナーの各々に対しては一価であるという事実が挙げられる。
【０１００】
本発明の好適な多重特異的分子は、これらの課題を解決する。１つのポリペプチド鎖としての二重特異的な分子の発現が可能であり（２つの特異的結合を示す修飾されたＩｇドメイン、実施例を参照）、それは２つの抗体ポリペプチド鎖の発現よりも実施が容易である（Ｃａｂｉｌｌｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：３２７３−３２７７（１９８４））。
【０１０１】
それはまた、抗体様分子（２つのポリペプチド鎖からなるホモ二量体若しくはヘテロ二量体）として調製することもできる。すなわち、第２の特性が分子の非可変的な部分に位置するため、２つの異なる重鎖又は異なる軽鎖を準備する必要がない。すなわち、２つの鎖の間違った組み合わせの可能性がない。
【０１０２】
本発明の抗体は重鎖及び軽鎖からなり、それらは共に、第１の特異性により特異的な結合パートナーと結合する可変領域を形成する。第２の特異性は、重鎖若しくは軽鎖の構造ループのいずれかの修飾されたループにより形成できる。結合部位は、複数の非ＣＤＲループにより形成されてもよく、それらは構造的に隣接していてもよく、重鎖上若しくは軽鎖上、又は両方の鎖上に存在してもよい。
【０１０３】
修飾された抗体又は誘導体は、全長抗体又は抗体断片（例えばＦａｂ、ＣＨ１−ＣＨ２、ＣＨ２−ＣＨ３、Ｆｃ（ヒンジ部位の有無を問わない）であってもよい。
【０１０４】
デザイン次第で、それは同じ若しくは異なる結合パートナーに、一価的、又は多価的に結合してもよく、又は異なる結合パートナーごとに異なる価数で結合してもよい。
【０１０５】
重鎖及び軽鎖の非ＣＤＲドメイン中に、特異的な結合部位の選抜及び設計が可能な、多くのループが存在するため、上記の課題のない２つ以上の特性を有する抗体誘導体を設計することが可能となる。
【０１０６】
１つのポリペプチド鎖内の特異的な結合ドメインを、ペプチドリンカーの有無にかかわらず、連結してもよい。
【０１０７】
本発明の免疫グロブリン中の修飾された構造ループ領域は、前記免疫グロブリンの定常及び／又は可変ドメイン中に存在してもよい。修飾された構造ループが定常ドメイン中に存在する場合、それは好ましくはＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４、Ｉｇｋ−Ｃ、Ｉｇｌ−Ｃ又はそれらの部分中に存在する。
【０１０８】
本発明の好ましい実施形態では、免疫グロブリンは、ヒト若しくはマウス由来である。
【０１０９】
修飾免疫グロブリンは様々な用途（特に医薬組成物）に使用できるため、上記免疫グロブリンは好ましくはヒト若しくはマウス由来である。当然ながら、修飾免疫グロブリンはヒト化若しくはキメラ免疫グロブリンでもよい。
【０１１０】
他の本発明の好ましい実施形態では、ヒト免疫グロブリンは、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４及びＩｇＭからなる群から選択される。
【０１１１】
マウス免疫グロブリンは好ましくは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ、ＩｇＧ２Ｃ、ＩｇＧ３及びＩｇＭからなる群から選択される。
【０１１２】
修飾免疫グロブリンは、上記の同定された免疫グロブリンクラスのうちの１つに由来してもよく、その後で構造的に変化させてもよい。
【０１１３】
免疫グロブリンは、好ましくは免疫グロブリンの重鎖及び／又は軽鎖、又はその一部を有してなる。本発明では好ましくはヘテロ二量体若しくはホモ二量体分子であるが、モノマー免疫グロブリンであってもよい。
【０１１４】
修飾免疫グロブリンは、重鎖及び／又は軽鎖を有してもよく、また少なくとも１つの可変及び／又は定常ドメインを有してもよい。
【０１１５】
本発明に係る免疫グロブリンには、免疫グロブリンの好ましくは少なくとも１つの定常及び／又は少なくとも１つの可変ドメイン、又はミニドメインを含むその一部を有してなる。
【０１１６】
定常ドメインとは、免疫グロブリン分子の定常部分を構成する免疫グロブリンフォールディング構造単位であり、定常ドメイン（例えばＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４、Ｃｋ、Ｃｌ）と称されることもある。
【０１１７】
可変ドメインとは、免疫グロブリンの可変部分を構成する免疫グロブリンフォールディング構造単位であり、可変ドメイン（例えばＶｈ、Ｖｋ、Ｖｌ、Ｖｄ）と称されることもある。
【０１１８】
本発明に係る好適な免疫グロブリンは、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４、Ｉｇｋ−Ｃ、Ｉｇｌ−Ｃ又はそれらの部分、又はそれらの組み合わせ（ミニドメインを含む）からなる群から選択される定常ドメイン、及び少なくとも１つのループ領域からなり、前記少なくとも１つのループ領域が、少なくとも１つの修飾されたループ領域を形成する少なくとも１つのアミノ酸修飾を有することを特徴とし、前記少なくとも１つの修飾されたループ領域が、抗原の少なくとも１つのエピトープと特異的に結合する。
【０１１９】
本発明に係る修飾免疫グロブリンは、１つ以上の定常ドメイン（例えば少なくとも２、３、４、５、６、１０のドメイン）を有してなってもよい。複数のドメインが修飾免疫グロブリンに存在する場合、これらのドメインは同じタイプであってもよく、又は異なるタイプ（ＣＨ１−ＣＨ１−ＣＨ２、ＣＨ３−ＣＨ３、Ｆｃドメインを例えば（ＣＨ２）２−（ＣＨ３）２）であってもよい。当然ながら、各々のドメイン並び順はいかなる順（例えばＣＨ１−ＣＨ３−ＣＨ２、ＣＨ４−ＣＨ１−ＣＨ３−ＣＨ２）であってもよい。
【０１２０】
他の本発明の好ましい実施形態では、上記のＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４の修飾されたループ領域は、アミノ酸７〜２１、アミノ酸２５〜３９、アミノ酸４１〜８１、アミノ酸８３〜８５、アミノ酸８９〜１０３及びアミノ酸１０６〜１１７を有してなる。
【０１２２】
ヒト起源のＩｇｋ−Ｃ及びＩｇｌ−Ｃのループ領域は、好ましくはアミノ酸８〜１８、アミノ酸２７〜３５、アミノ酸４２〜７８、アミノ酸８３〜８５、アミノ酸９２〜１００、アミノ酸１０８〜１１７及びアミノ酸１２３〜１２６を有してなる。
【０１２３】
マウス由来のＩｇｋ−Ｃ及びＩｇｌ−Ｃのループ領域は、好ましくはアミノ酸８〜２０、アミノ酸２６〜３６、アミノ酸４３〜７９、アミノ酸８３〜８５、アミノ酸９０〜１０１、アミノ酸１０８〜１１６及びアミノ酸１２２〜１２５を有してなる。
【０１２４】
特定の実施形態では、本発明に係る免疫グロブリンは、ＶＨ、Ｖκ、Ｖλ、ＶＨＨ及びそれらの組み合わせからなる群から選択される可変ドメイン中に修飾を有してもよい。より詳細には、それらはアミノ酸７〜２１、アミノ酸２５〜３９、アミノ酸４１〜８１、アミノ酸８３〜８５、アミノ酸８９〜１０３又はアミノ酸１０６〜１１７の範囲内に少なくとも１つの修飾を有する（ドメイン中のアミノ酸位の付番はＩＭＧＴに従う）。
【０１２５】
本発明に係る他の好適な免疫グロブリンは、重鎖若しくは軽鎖の可変ドメイン、又はミニドメインを含むその一部と、少なくとも１つのループ領域（好ましくは構造ループ領域）を有してなり、前記少なくとも１つのループ領域が、少なくとも１つの修飾されたループ領域を形成する少なくとも１つのアミノ酸修飾を有することを特徴とし、前記少なくとも１つの修飾されたループ領域が、抗原の少なくとも１つのエピトープと特異的に結合する。
【０１２６】
代替的な実施形態では、本発明に係る免疫グロブリンは、ヒト起源のＶＨ又はＶκ又はＶλのループ領域が、アミノ酸８〜２０、アミノ酸４４〜５０、アミノ酸６７〜７６及びアミノ酸８９〜１０１の範囲内に、最も好ましくはアミノ酸位１２〜１７、アミノ酸位４５〜５０、アミノ酸位６９〜７５及びアミノ酸位９３〜９８に少なくとも１つの修飾を有することを特徴とする（ドメイン中のアミノ酸位の付番はＩＭＧＴに従う）。
【０１２７】
ヒト起源の免疫グロブリンの可変ドメインの構造ループ領域は、本発明に係る修飾のために選抜されうる部分として、好ましくはアミノ酸８〜２０、アミノ酸４４〜５０、アミノ酸６７〜７６及びアミノ酸８９〜１０１を有してなる。
【０１２８】
本発明の好ましい実施形態では、マウス由来の免疫グロブリンの可変ドメイン中の構造ループ領域は、本発明に係る修飾のために選抜されうる部分として、アミノ酸６〜２０、アミノ酸４４〜５２、アミノ酸６７〜７６及びアミノ酸９２〜１０１を有してなる。
【０１２９】
本発明に係る免疫グロブリンは、好ましくはラクダ由来である。ラクダ由来の抗体は１つの重鎖だけからなり、軽鎖及び重鎖からなる通常の抗体と同等の抗原親和性を有する。したがって、ラクダ抗体は例えばヒト抗体と比較して非常に小さく、ゆえに高密度の組織を透過して抗原に達することができる（大分子のタンパク質では不可能である）。更にラクダの重鎖抗体は、比較的取扱が単純であり、高い親和性及び特異性を有し、活性部位に到達して相互作用することができるため、臨床的に有益な化合物の設計、製造及び使用において、一般の抗体に勝る優位性を示す。
【０１３０】
ラクダ又はラクダ科動物由来の免疫グロブリンは好ましくは、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３からなる群から選択される少なくとも１つの定常ドメインを有してなる。本発明の好ましい実施形態では、ラクダの免疫グロブリンのＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３のループ領域は、アミノ酸８〜２０、アミノ酸２４〜３９、アミノ酸４２〜７８、アミノ酸８２〜８５、アミノ酸９１〜１０３及びアミノ酸１０８〜１１７を有してなる。
【０１３１】
より具体的には、マウス由来のＶＨの免疫グロブリンループ領域は、アミノ酸６〜２０、アミノ酸４４〜５２、アミノ酸６７〜７６及びアミノ酸９２〜１０１の範囲内で少なくとも１つの修飾を有してなる（ドメイン中のアミノ酸位の付番はＩＭＧＴに従う）。ラクダ科の動物由来のＶＨＨの修飾されたループ領域は好ましくは、アミノ酸７〜１８、アミノ酸４３〜５５、アミノ酸６８〜７５及びアミノ酸９１〜１０１の範囲内で少なくとも１つの修飾を有してなる（ドメイン中のアミノ酸位の付番はＩＭＧＴに従う）。
【０１３２】
それぞれの免疫グロブリンの上記の同定されたアミノ酸ドメインは、本発明に係る修飾目的に適していることが示されたループ領域である。
【０１３３】
本発明の更に別の態様は、以下のステップを有してなる、分子を特異的に結合させる、及び／又は検出する方法に関する：
（ａ）前記分子を含むと考えられる試験サンプルと、本発明に係る修飾免疫グロブリン又は本発明に係る方法により得られる修飾免疫グロブリンとを接触させるステップと、
（ｂ）特異的な免疫グロブリン／分子複合体の形成を検出するステップ。
【０１３４】
本発明の別の態様は、以下のステップからなる、分子を特異的に分離する方法に関する：
（ａ）前記分子を含有するサンプルと、本発明に係る修飾免疫グロブリン又は本発明に係る方法により得られる修飾免疫グロブリンとを接触させるステップと、
（ｂ）形成された特異的な免疫グロブリン／分子複合体を分離するステップと、
（ｃ）任意に前記分子を前記複合体から分離するステップ。
【０１３５】
本発明に係る免疫グロブリンは、分子をサンプルから特異的に分離するために使用できる。多重特異的免疫グロブリンが用いられる場合、複数の分子をサンプルから分離できる。かかる方法に上記修飾免疫グロブリンを使用することは、例えば、固定された結合パートナー（すなわち修飾免疫グロブリン）を一定量で有する均一な表面を有するマトリックスの調製が可能となるため、特に有利であり、それは分離された分子と結合することもできる。それに対して、単一の特異的結合パートナーを用いる場合、１つの結合パートナーはマトリックスに同じ効率で結合しないため、均一なマトリックスの調製が困難である。
【０１３６】
本発明の別の態様は、以下のステップを有してなる、標的への化合物のターゲッティング方法に関する：
（ａ）前記化合物と特異的に結合できる、本発明に係る修飾免疫グロブリンを又は本発明に係る方法により得られる修飾免疫グロブリン接触させるステップと、
（ｂ）標的に免疫グロブリン／化合物複合体を輸送するステップ。
【０１３７】
本発明に係る修飾免疫グロブリンは、ＣＤＲｓ及び／又は修飾ループ領域と結合した、少なくとも１つの化合物を標的に輸送するために使用できる。かかる免疫グロブリンを用いることにより、疾患の治療の経過で、好適な標的部位に、治療用の物質をターゲッティングできる。
【０１３８】
本発明の別の態様は、タンパク質ライブラリの調製のための、本発明に係る免疫グロブリンの、又は本発明に係る方法で得られる免疫グロブリンの使用に関する。本発明に係る更なるライブラリは、様々なタンパク質又は融合タンパク質、遺伝子パッケージを含むのみならず、タンパク質、核酸、リボソーム、細胞、ウイルス、ファージの前駆物質、並びに、タンパク質をコードする情報及び／又はタンパク質自体を発現させる他のディスプレイシステムも包含する。
【０１３９】
本発明の別の態様は、本発明に係る免疫グロブリンを含有するか、又は本発明に係る方法により得られるタンパク質ライブラリに関する。
【０１４０】
前記ライブラリを構築する好適な方法は、上記、及び実施例に記載されている。本発明に係るライブラリは、様々な分子に対する免疫グロブリンの結合を同定するために使用できる。
【０１４１】
特に本発明は、本発明に係る免疫グロブリンを含有するか、又は本発明に係る方法により得られるタンパク質ライブラリの、免疫グロブリン誘導体の設計のための使用に関する。
【０１４２】
既存の免疫グロブリンを、少なくとも１つの修飾ループ、特に１つ以上の構造ループを有する、少なくとも１０、好ましくは１００、好ましくは１０００、より好ましくは１００００、より好ましくは１０００００、最も好ましくは１００００００以上の変異型ドメイン又はミニドメインからなる、各ドメインのタンパク質ライブラリを用いて、いかなるドメイン又はミニドメインに対して抗原結合部位を導入して変異させることができる。ライブラリのメンバーの数はより多数であってもよく、大部分の場合では１０ｅ１２の数であり、若干のディスプレイシステム（リボソームディスプレイ）では更に多い場合もある。
【０１４３】
ライブラリは更に、抗原との特異的な結合に関してスクリーニングされる。所望の特性に関する分子評価の後、選抜されたドメイン又はミニドメインを、遺伝子工学的方法によって元の免疫グロブリンにクローニングし、それにより野生型ドメインの置換を行う。あるいは、ループ領域のみをコードするか、又は変異アミノ酸のみをコードするＤＮＡを交換することにより、特異的な抗原との更なる結合部位を有する免疫グロブリンを得ることもできる。
【０１４４】
変異を有し、抗原特異的な構造ループを配置する部位の選択は、元の免疫グロブリンの構造、及び更なる結合部位を配置する目的に依存する。例えば、元の分子が、エフェクター機能を妨害することのない、更なる抗原結合部位を挿入することを必要とする、全長免疫グロブリンである場合、修飾されるループは、Ｆｃ−エフェクター分子との天然の結合パートナーであるＣＨ２及びＣＨ３から離れているドメインから選抜される。元の免疫グロブリンがＦａｂ断片である場合、軽鎖若しくは重鎖の定常ドメイン、又はそれぞれの可変ドメイン中のループの修飾が可能である。ライブラリを構築するために、１つ以上のドメインにおける１つ以上の構造ループ中に突然変異を有する元の変異体分子のライブラリを調製でき。完全な変異オリジナル分子による選抜により、幾つかの効果が得られる。変異免疫グロブリンが示す他の特性をも試験した場合に、修飾された構造ループとの抗原の結合を元に選抜することにより、立体配置的に有利な修飾を有することが解るからである。特にＦｃライブラリが好適であり、例えばＣ末端のループ領域に結合部位を有するものが好適である。
【０１４５】
変異ドメイン又はミニドメインのタンパク質ライブラリのサイズ条件（すなわち変異型タンパク質数）又はドメインに融合させる分子は、その目的に依存する。一般に、新たに抗原結合部位を形成させるためのライブラリは、修飾された構造ループから構成されている、既存の設計された抗原結合部位を更に修飾する（例えば抗原の親和性を強化、又は感度を向上させるため）ために用いられるライブラリより大きいことが必要である。
【０１４６】
本発明はまた、免疫グロブリンライブラリ又は核酸ライブラリに関する。それらは、複数の免疫グロブリン（例えば定常又は可変ドメイン、ミニドメイン及び／又はミニドメインに含まれる少なくとも１つの構造ループ領域からなる）、又はそれらをコードする核酸分子を有してなる。上記ライブラリは異なる修飾を有するメンバーを有し、それらの複数は、少なくとも１つの構造ループ領域中に修飾を有するとして定義される。上記核酸ライブラリは好ましくは、少なくとも１つの異なるアミノ酸を得る（１つのアミノ酸置換を生じさせる）ために、ヌクレオチド配列中に少なくとも１０の異なるメンバー、より好ましくは少なくとも１００、より好ましくは１０００又は１００００の異なるメンバー（例えばランダム化ストラテジー又はコンビナトリアル技術でデザイン）を有してなる。更に多くのメンバー、例えば少なくとも１００００００又は少なくとも１０００００００を有するのも好ましい。
【０１４７】
本発明の更なる態様は、本発明に係る、少なくとも２つのライブラリから選抜される２つの異なる免疫グロブリン、ドメイン又はミニドメインの組み合わせにより、多重特異性免疫グロブリンを調製することに関する。これらの選択された特異的な免疫グロブリンを、各々他の分子と（建築用ブロックと同様に）組み合わせて、ドメイン又はミニドメインの最適配列を設計し、所望の特性を得ることができる。例えば、Ｆｃをベースとする分子を単独で用いてもよく、あるいは抗原結合特性を利用して、他の結合のモティーフのための担体として、又は定常若しくは可変ドメインを有する免疫グロブリンを造るための建築用ブロックとして使用でき、あるいは、好ましくは２、３又は４つの抗原結合部位を有する定常ドメインのみと組み合わせてもよい（例えば多重結合Ｆｃ分子）。
【０１４８】
更に、本発明に係る１つ以上の修飾免疫グロブリンを、タンパク質構造の崩壊を生じさせることなく、タンパク質中の様々な又は全部の部位に導入することもできる。かかる「ドメインシャッフリング」テクニックによって、所望の特性に基づき再度選抜されうる新規なライブラリが構築できる。
【０１４９】
好ましくは、本発明に係る免疫グロブリンはミニドメインを含む少なくとも２つの免疫グロブリンドメイン又はその一部を有してなり、各ドメインは少なくとも１つの抗原結合部位を有する。
【０１５０】
更に好適には、本発明による免疫グロブリン又はその一部は、免疫グロブリンの定常部の少なくとも１つのドメイン、及び／又は可変領域の少なくとも１つのドメインからなるミニドメインを有してなる。すなわち、可変ドメイン（例えばＣ末端領域において修飾される）又は修飾されたＣＨ１ドメイン（たとえば修飾されたＣＨ１ミニドメイン）に連結する可変ドメインが、好ましい実施形態として挙げられる。
【０１５１】
好適なライブラリは、免疫グロブリンのドメイン、ミニドメイン又はその誘導体からなる群から選択される、本発明に係る免疫グロブリンを有してなる。
【０１５２】
本発明の好ましい実施形態は、少なくとも１つの免疫グロブリンドメイン及び本発明にの方法により修飾した構造ループ領域を有してなる、抗原との結合分子（抗原結合分子）であり、それは抗原との結合に用いられ、前記結合分子は抗体の可変ドメインを有さない。それは、抗体活性の調節に使用できる他の部分を有してもよい（例えば天然若しくは修飾されたエフェクター領域（配列））が、しかしながら、それは抗体の「天然の」結合ドメイン（すなわち可変ドメイン又はＣＤＲループ（ＣＤＲドメイン中のＶＦＲループを含む））を、それらの天然の位置において欠いている。本発明に係るこれらの抗原結合分子は、当該分子に関する上記の効果を有するが、ＣＤＲループによって媒介される抗体の特異的な結合活性は有さず、一方、構造ループ領域中に新しく導入された特異的な結合活性を有する。
【０１５３】
好ましくは、本発明に係るこれらの抗原結合分子は、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４、Ｉｇｋ−Ｃ、Ｉｇｌ−Ｃ及びこれらの組み合わせ（前記組み合わせは少なくとも２つ、好ましくは少なくとも４つ、特に好ましくは少なくとも６つの定常ドメイン）、並びに、本発明により修飾された少なくとも１つの構造ループ又はループ領域を有してなる。好ましくは、これらの構造ループ領域は、本発明の方法で修飾された構造ループ領域、又は、かかる２つの定常ドメインの間に天然に存在する構造ループを介して連結されてもよい。本発明に係るこれらの抗原結合分子の実施態様は、本発明の方法により、構造ループ中に、少なくとも１つの修飾を有する抗体のＦｃドメインからなる。また、本発明にかかる抗原結合分子においては、ランダム化技術によって（すなわちランダム化技術によってループ中の１つ以上のアミノ酸残基を置換すること）、又はランダムに生成されたインサートをかかる構造ループ中に導入することによって、構造ループ中に新しい抗原結合部位を導入してもよい。その他の好適な方法としては、コンビナトリアル技術の使用が挙げられる。好ましくは、修飾された構造ループ中の抗原結合部位は、適切なライブラリから選抜される。
【０１５４】
他の態様では、本発明は、未修飾の免疫グロブリンとは異質の、１つ以上の構造ループに導入された特性を示す抗原結合部位を有する、修飾免疫グロブリンに関する。「異質の」という用語は、当該抗原が、免疫グロブリンの特異的なＣＤＲ結合ドメイン又は他の天然若しくは固有の結合ドメインにより認識されないことを意味する。免疫グロブリンの天然の結合パートナーでなく、異質の結合パートナーとはすなわち、構造ループ中に新しく形成された抗原結合部位に結合するものであってもよい。これは、天然の結合パートナー（例えばＦｃ受容体又は免疫系のエフェクター）が、未修飾の免疫グロブリンとは異質の抗原結合部位と結合するとは考えられないことを意味する。
【０１５５】
本発明に係る好適な免疫グロブリンは、少なくとも２つの抗原結合部位、第１のエピトープに対する第１の結合部位、及び第２のエピトープに対する第２の結合部位を有してなる。
【０１５６】
好適な実施形態では、本発明の免疫グロブリンは、少なくとも２つのループ領域、第１のエピトープに結合する第１のループ領域、及び第２のエピトープに結合する第２のループ領域を有してなる。少なくとも第１のループ領域又は少なくとの第２のループ領域のいずれか、又はそれらの両方の構造ループを有してなるのが好ましい。本発明に係る免疫グロブリンは、従来技術において機能的であることが公知の断片を有し、それは本発明において必須の要素、すなわち本発明により修飾された構造ループ又はループ領域を有してなる。
【０１５７】
本発明に係る好適な免疫グロブリンは、未修飾のドメインと少なくとも５０％の相同性を有するドメインを有してなる。
【０１５８】
「相同性」という用語は、ポリペプチドがそれらの一次若しくは二次若しくは三次構造において、対応する位置で同じ若しくは保存された残基を有することを意味する。当該用語はまた、相応するポリペプチドをコードする２つ以上のヌクレオチド配列にも適用される。
【０１５９】
「相同な免疫グロブリンドメイン」とは、本願明細書に開示される免疫グロブリンドメインであって、本発明に係る、全長の天然配列を有する免疫グロブリンドメイン配列、又は全長の免疫グロブリンドメイン配列の他のいかなる断片と、少なくとも約５０％のアミノ酸配列同一性を有する免疫グロブリンドメインのことを意味する。好ましくは、相同な免疫グロブリンドメインとは、少なくとも約５０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは少なくとも５５％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約６５％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約７５％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を、天然の免疫グロブリンドメイン配列、あるいは本願明細書において開示される他の全長免疫グロブリンドメイン配列の断片の配列と共有する免疫グロブリンドメインのことを指す。
【０１６０】
本願明細書において同定される免疫グロブリンドメイン配列に関する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」とは、特異的な免疫グロブリンドメイン配列中のアミノ酸残基と同一な、候補配列のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。それは、配列をアラインして、必要に応じてギャップを導入することにより、最大のパーセント配列同一性となるようにしたものであり、但し保存的な置換は配列同一性の一部としてはカウントしないことに留意すべきである。アミノ酸配列同一性パーセントの決定のためのアラインメントは、従来技術に公知の様々な方法により実施可能であり、一般公開されているコンピュータソフトウェア（例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア）を使用して行われる。当業者はアラインメントを測定するために適当なパラメータを決定できる。例えば、比較される配列の全長にわたり最大限のアラインメントを可能とする、必要なあらゆるアルゴリズムなどである。
【０１６１】
後述するように、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２コンピュータプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２６６：４６０−４８０（１９９６））を用いてアミノ酸配列同一性パーセント（％）の数値を得ることができる。大部分のＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２サーチパラメータは、デフォルト値に設定される。デフォルト値にセットされないそれら（すなわち可調パラメータ）は、以下の値に設定される：
ｏｖｅｒｌａｐ  ｓｐａｎ＝１、
ｏｖｅｒｌａｐ  ｆｒａｃｔｉｏｎ＝０．１２５、
ｗｏｒｄ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ（Ｔ）＝１１、
及びｓｃｏｒｉｎｇ  ｍａｔｒｉｘ＝ＢＬＯＳＵＭ６２。
ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２を使用するとき、アミノ酸配列同一性％は、以下の（ａ）／（ｂ）により算出される：
（ａ）天然の免疫グロブリンドメインに由来する、目的の配列を有する免疫グロブリンドメインのアミノ酸配列と、目的の比較用アミノ酸配列（すなわち、目的の免疫グロブリンドメインと比較するための配列。未修飾の免疫グロブリンドメインであってもよい）との間で一致する同一アミノ酸残基の数（ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２として定義される）；
（ｂ）目的の免疫グロブリンドメイン中の非ランダム化部分のアミノ酸残基の総数。例えば「アミノ酸配列Ａを含んでなり、アミノ酸配列Ｂと少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチド」というときは、アミノ酸配列Ａが、目的の比較用アミノ酸配列であり、アミノ酸配列Ｂが、目的の免疫グロブリンドメインのアミノ酸配列である。
【０１６２】
本発明の別の態様は、（ａ）免疫グロブリンとは異質の抗原結合部位を有して、それが１つ以上の構造ループに導入されている修飾免疫グロブリンと、（ｂ）前記抗原のエピトープを有する結合分子と、を含んでなる、結合パートナーのキットに関する。
【０１６３】
本発明に係るこのキットのかかる結合分子は、本発明に係る修飾免疫グロブリンの結合特性を同定するための捕捉用試薬として使用できる。本発明に係るこのキットの結合分子を用いて、本発明に係る修飾免疫グロブリンの力価を測定できる。
【０１６４】
本発明で定められる力価とは、修飾された分子のその抗原に対する結合特性のことを指す。当該結合は、品質管理目的で用いる場合は、特異性及び／又は親和性及び／又は選択性に関して、量的に及び／又は質的に測定できる。
【０１６５】
修飾により得られる本発明に係る分子の結合特性は、標準的な技術（例えば親和性成熟）によって更に調整できる。それにより、抗原結合部位の内部又はその周囲のヌクレオチド配列は更に、結合特性を調整するために置換される。
【０１６６】
更に、本発明に係るキットには、構造ループ中に異なる修飾を有する、少なくとも１０、好ましくは少なくとも１００、より好ましくは少なくとも１０００、より好ましくは少なくとも１００００、特に好ましくは少なくとも１０００００の免疫グロブリンからなるライブラリから、本発明に係る適当な力価を有する修飾免疫グロブリンを選抜することにより得られる結合分子を用いるのが好ましい。
【０１６７】
実施例では、鍵となる特徴の１つとして、抗体（例えば抗原結合）の望ましい機能に通常関与しない免疫グロブリンドメイン又は領域を設計することが挙げられることを示している。すなわち、ＣＤＲループに隣接するループを含む、抗体のＣＤＲドメイン以外のドメインを修飾することにより、その抗原結合機能が維持される。免疫グロブリンドメインの特異的なフォールディング構造が、構造的にＣＤＲｓに類似するが、位置及び配列において異なるドメインにおけるランダムな突然変異導入が可能になることが明らかとなった。本発明により同定されるドメインは、ＣＤＲｓと同様、免疫グロブリンフォールディング構造のβ鎖と連結しているループ領域である。
【０１６８】
詳細には、本願明細書においては、突然変異（例えばヒトのＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインのβ鎖ＡＢ及びＥＦを連結するループのランダム突然変異）の導入により、特にＴｏｌｌ様受容体９−ペプチド（ＴＬＲ−９）又は鶏卵リゾチームのいずれかに結合する変異するＣＨ３ドメインが選抜された。それらは、ヒトのＩｇＧ１のＣＨ３ドメインによって、通常認識されず、結合しないペプチド及びタンパク質である。導入された突然変異には、野生型配列中の選択されたアミノ酸残基鎖がランダムに選ばれた残基と交換されている突然変異が含まれる。またそれらは、上記のループへの更なるアミノ酸残基の挿入を含む。
【０１６９】
類推するに、いかなる種類の免疫グロブリンからの、及びいかなる種からの免疫グロブリンからの免疫グロブリンドメインも、この種の設計を行うことができる。更に本発明では、目標とされる特異的なループを操作できるのみならず、免疫グロブリンドメイン中のβ鎖を連結するいかなるループも同様に操作できる。
【０１７０】
いかなる生物体からの、いかなる種類の免疫グロブリンから設計された免疫グロブリンドメインも、本発明により、シングルドメインとして、又はより大きな分子の一部として調製できる。例えば、それらは全長の免疫グロブリンの一部であってもよく、したがって、６つのＣＤＲｓにより形成されるその「通常の」抗原結合ドメイン、及び新規に設計された抗原結合ドメインを有する。このように、多重特異性、例えば二重特異性の免疫グロブリンを調製できる。設計された免疫グロブリンドメインは、いかなる融合タンパク質の一部であってもよい。これらの設計された免疫グロブリンドメインの使用は、広義には免疫グロブリンの使用の分野である。
【０１７１】
別途示される場合を除き、免疫グロブリンのアミノ酸配列の全ての番号付けはＩＭＧＴ付番に従う（ＩＭＧＴ，ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ＠ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ、ｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ；Ｌｅｆｒａｎｃら、，１９９９，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２７：２０９−２１２、Ｒｕｉｚら、，２０００  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８：２１９−２２１、Ｌｅｆｒａｎｃら、，２００１，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２９：２０７−  ２０９、Ｌｅｆｒａｎｃら、，２００３，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：３０７−３１０、Ｌｅｆｒａｎｃら、，２００５，Ｄｅｖ  Ｃｏｍｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２９：１８５−２０３）。
【０１７２】
配列１
【表１】
0005924751.tif 000002
配列２
【表２】
0005924751.tif 000003
配列３
【表３】
0005924751.tif 000004
配列４
【表４】
0005924751.tif 000005
配列５
【表５】
0005924751.tif 000006
配列６
【表６】
0005924751.tif 000007
配列７
【表７】
0005924751.tif 000008
配列８
【表８】
0005924751.tif 000009
配列９
【表９】
0005924751.tif 000010
配列１０
【表１０】
0005924751.tif 000011
配列１１
【表１１】
0005924751.tif 000012
配列１２
【表１２】
0005924751.tif 000013
配列１３
【表１３】
0005924751.tif 000014
配列１４
【表１４】
0005924751.tif 000015
配列１５
【表１５】
0005924751.tif 000016
【０１７３】
実施例１：ＣＨ３ライブラリ及びファージ表面ディスプレイの構築
結晶構造のＩｇＧ１  Ｆｃ断片（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｄａｔａｂａｓｅにおいてエントリー１ＯＱＯ．ｐｄｂとして公知）を、変異ＣＨ３ドメインのデザインの補助に用いた。ＣＨ３ライブラリの構築の根拠として用いた配列を、配列番号１に示す。この配列において、第１のアミノ酸は、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎデータベースエントリーｌｏｑｏ．ｐｄｂ．の鎖Ａのプロリン３４３に対応する。ｌｏｑｏ．ｐｄｂに含まれる最後の残基は、配列番号１のセリン１０２である。ｌｏｑｏ．ｐｄｂの構造の詳細なアッセイ、及び、β鎖を連結するループを形成している残基の視覚による確認の後残基１７、１８及び１９をランダム化するを決定し、それはβ鎖ＡＢを連結しているループの一部であり、７１、７２、７３、７６及び７７も同様であり、それは配列番号１のβ鎖ＥＦを連結しているループの一部である。デザインされた遺伝子は、一連のＰＣＲ反応に、更に得られるＰＣＲ産物のライゲーションによって得た。ライゲーションを容易にするために、配列番号１のためのヌクレオチド配列コードのコドンの幾つかを、アミノ酸配列（サイレント突然変異）を変えることのない制限部位を生じさせるために修飾した。ｐＨＥＮ１（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９１  Ａｕｇ  １１；１９（１５）：４１３３−７．Ｍｕｌｔｉ−ｓｕｂｕｎｉｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｏｆ  ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｐｈａｇｅ：ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｆａｂ）  ｈｅａｖｙ  ａｎｄ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎｓ．Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ＨＲ，Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ＡＤ，Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＫＳ，Ｃｈｉｓｗｅｌｌ  ＤＪ，Ｈｕｄｓｏｎ  Ｐ，Ｗｉｎｔｅｒ  Ｇ．）への、ｐｅｌＢ分泌シグナルとのインフレームでのクローニングベクターへの挿入のために、Ｍｅｔ−Ａｌａをコードする余分のヌクレオチド残基を、配列の５’末端に連結し、Ｎｃｏｌ制限部位を設けた。ランダム化された残基の場合、全ての２０の天然アミノ酸をコードするが、３つの停止コドン中２つを回避するコドンＮＮＳ（ＩＵＰＡＣコード、ＳがＣ又はＧを意味する）を選択した。デザインされた配列を、配列番号２のヌクレオチド配列として及び配列番号３のアミノ酸配列として示す。配列番号３の文字Ｘは、ランダム化されたアミノ酸残基を意味する。変異ＣＨ３ドメインの組立のために使用するＰＣＲプライマの配列を、配列番号４から９に示す。
【０１７４】
ヒトモノクローナル抗体３Ｄ６の重鎖のｃＤＮＡ（Ｆｅｌｇｅｎｈａｕｅｒ  Ｍ，Ｋｏｈｌ  Ｊ，Ｒｕｅｋｅｒ  Ｆ．Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃＤＮＡｓ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｖ−ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｈ−  ａｎｄ  Ｌ−ｃｈａｉｎｓ  ｏｆ  ａ  ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏ−ｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｔｏ  ＨＩＶ−１−ｇｐ４１．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９０  Ａｕｇ  ２５；  １８  （１６）：４９２７．）を、ＰＣＲ反応のテンプレートとして用いた。３つのＰＣＲ産物を、それぞれＳａｄ及び／又はＨｉｎｄＩＩＩにより切断し、一緒にライゲーションした。ライゲーション生成物をＮｃｏｌ及びＮｏｔＩによって、更に切断し、表層ディスプレイファージミドベクターｐＨｅｎ１（事前にＮｃｏｌ及びＮｏｔｌにより切断）にライゲーションした。多くの選抜されたクローンが、制限アッセイ及びＤＮＡ塩基配列決定により計画どおりに制御され、正しく挿入されたランダム化された配列を含む、インサートを含むことが明らかとなった。ファージ調製の次の工程においては、標準プロトコルに従い行った。簡潔には、ライゲーション混合物を、エレクトロポーレーションによってＥ．ｃｏｌｉ  ＴＧ１細胞に導入して形質転換した。その後、ファージ粒子を、ヘルパー・ファージＭ１３−ＫＯ７を用いてＥ．ｃｏｌｉ  ＴＧ１細胞からレスキューした。ファージ粒子は更に２つのステップで、ＰＥＧ／ＮａＣｌを用いて培養上清から沈殿させ、水に分解させ、パニングによる選抜のために用いたか、又は−８０℃で保存した。
【０１７５】
実施例２：ＣＨ３＋３ライブラリの構築
ＣＨ３ライブラリと同様に、このライブラリを構築し、クローニングした。構築物のアミノ酸配列を配列番号１０に示し、対応するヌクレオチド配列を配列番号１１に示し、構築のために使用するプライマを配列番号４から７、配列番号９及び配列番号１２に示す。
【０１７６】
実施例３：ＣＨ３＋５ライブラリの構築
ＣＨ３ライブラリと同様に、このライブラリを構築し、クローニングした。構築物のアミノ酸配列を配列番号１３に示し、対応するヌクレオチド配列を配列番号１４に示し、構築のために使用するプライマを配列番号４から７、配列番号９及び配列番号１５に示す。
【０１７７】
実施例４：ＣＨ１ライブラリの構築
ヒトのＩｇＧ１  ＣＨ１ライブラリにおいて、Ｓｅｒ９３、Ｓｅｒ９４、Ｓｅｒ９５、Ｇｌｙ９８、Ｔｈｒ９９及びＧｌｎ１００をランダム化し、更に３つのランダムな残基を、部位特異的ランダムな突然変異導入した。Ｌｅｕ９６は変異しなかった。他のヒトのＩｇＧ１  ＣＨ１ライブラリにおいて、Ｐｒｏ９２、Ｓｅｒ９３、Ｓｅｒ９４、Ｓｅｒ９５、Ｌｅｕ９６、Ｔｈｒ１０１、Ｇｌｙ９８、Ｔｈｒ９９及びＧｌｎ１００をランダム化し、更に３つのランダムな残基を、部位特異的ランダムな突然変異導入した。ファージミドベクターｐＨＥＮｌのＮｃｏｌ及びＮｏｔｌ制限酵素部位を用いて、ライブラリをコードする遺伝子を、Ｎ末端でｐｅｌＢリーダーとインフレームで、Ｃ末端でｆｄファージ由来のタンパク質ＩＩＩとインフレームでクローニングした。特異的結合クローンのファージ粒子の調製、パニング及び選抜は、標準的方法を使用して実施した。
【０１７８】
ライブラリ配列：
【表１６】
0005924751.tif 000017
【表１７】
0005924751.tif 000018
【０１７９】
実施例４：ＣＬライブラリの構築
ヒトのＩｇＧ１  ＣＬライブラリにおいて、Ｓｅｒ９２、Ｌｙｓ９３、Ａｌａ９４、Ａｓｐ９５、Ｇｌｕ９７、Ｌｙｓ９８及びＨｉｓ９９をランダム化し、Ｓｅｒ１６とＧｌｙ１７の間に、更に３つのランダムな残基を、部位特異的ランダムな突然変異導入した。ファージミドベクターｐＨＥＮｌのＮｃｏｌ及びＮｏｔｌ制限酵素部位を用いて、ライブラリをコードする遺伝子を、Ｎ末端でｐｅｌＢリーダーとインフレームで、Ｃ末端でｆｄファージ由来のタンパク質ＩＩＩとインフレームでクローニングした。特異的結合クローンのファージ粒子の調製、パニング及び選抜は、標準的方法を使用して実施した。
【表１８】
0005924751.tif 000019
【０１８０】
実施例５：ＲｐＩ１０−Ｌペプチド上における、ＣＨ３−ファージライブラリのパニング
３つのパニングラウンドを実施した。マレイミド活性化プレート（Ｐｉｅｒｃｅ社製）は合成ペプチドＲｐ１０−Ｌでコーティングされ、Ｂ細胞分子標識ＣＤ２０（Ｐｅｒｏｓａら、Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．（２００５）５１：６７２−８３）のミモトープ（ｍｉｍｏｔｏｐｅ）を発現する。その推定アミノ酸配列は以下の通りである：ＩＴＰＷＰＨＷＬＥＲＳＳ。以下の溶液の２００μｌをウェルに添加した：ＰＢＳ（ｐＨ＝７．２）以下の濃度のペプチドを溶解させる：−１回目のパニングラウンド：１００μｇ／ｍｌ−２回目のパニングラウンド：１００μｇ／ｍｌ−３回目のパニングラウンド：５０μｇ／ｍｌ。
【０１８１】
４℃で一晩培養し、更に室温で２時間、ウェルあたり２００μｌのＰＢＳ（１０μｇ／ｍｌのシステイン−ＨＣ１）でブロッキングした。
【０１８２】
表層ディスプレイファージライブラリ（ライブラリＣＨ３、ＣＨ３＋３，ＣＨ３＋５及びＣＨ３＋７からの等濃度のファージを含む）を更に、２００μｌのファージ懸濁液及び２％のＢＳＡ−ＰＢＳを添加し、振とうさせながら４５分間インキュベートし、更に室温で振とうさせずに９０分インキュベートし、結合ペプチドと反応させた。
【０１８３】
未結合ファージ粒子を、以下の通りに洗浄除去した：−１パニングラウンドの後：１５×２００μｌ  Ｔ−ＰＢＳ、５×２００μｌ  Ｔ−ＰＢＳ；−１パニングラウンドの後：１５×２００μｌ  Ｔ−ＰＢＳ、１０×２００μｌ  Ｔ−ＰＢＳ；−１パニングラウンドの後：２０×２００μｌ  Ｔ−ＰＢＳ、２０×２００μｌ  Ｔ−ＰＢＳ。
【０１８４】
結合した粒子の溶出は、培養ウェルあたり０．１Ｍのグリシン（ｐＨ＝２．２）を２００μｌ添加し、室温で３０分間振とうすることにより実施した。その後、ファージ懸濁液を６０μｌ  ２Ｍトリス−ベースの添加によって中和し、更に、０．５ｍｌの抽出したファージと、１０ｍｌの指数的に成長する培養液とを混合し、３７℃で３０分間培養することにより、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＴＧ１細胞をトランスフェクションした。最後に、感染したバクテリアを、１％のブドウ糖及び１００μｇ／ｍｌアンピシリンを有するＴＹＥ培地で平板培養し、３０℃で一晩インキュベートした。
【０１８５】
Ｒｐ１０−Ｌペプチド上の、ＣＨ３−ファージライブラリのパニングの結果
【０１８６】
ファージのタイター
【表１９】
0005924751.tif 000020
【０１８７】
実施例６：可溶性発現のための、選抜されたクローンのクローニング
形質転換したＣＨ３ドメイン−コード配列（抽出したファージ粒子内に含まれる）をＰＣＲによりバッチ増幅した。Ｎｃｏｌ及びＮｏｔｌによる制限酵素処理の後、それらをｐＮＯＴＢＡＤ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製ベクターｐＢＡＤ、後にＮｏｔ１部位を挿入）に挿入した。Ｅ．ｃｏｌｌ  Ｅ１０４への形質変換の後、細胞を、１％のブドウ糖及び１００μｇ／ｍｌアンピシリンを有するＴＹＥ培地で３０℃で選抜した。
【０１８８】
選抜されたクローンの可溶性発現及びスクリーニング
【０１８９】
４×９６のアンピシリン耐性コロニーを、３０℃で一晩、シェーカ上のマイクロタイタプレート上で、２００μｌのアンピシリンを有する２×ＹＴ媒体で培養した。それらを更に、０．１％の最終濃度でＬ−アラビノースを添加して誘導した。更に一晩培養の後、細胞を、室温で２０００回転／分で１５分間遠心分離して回収し、それらのペリプラズムタンパク質を、１００μｌ  Ｎａ−ホウ酸塩バッファ（１６０ｍＭのＮａ−ホウ酸塩、２００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ＝８．０）に再懸濁液し、少なくとも６時間インキュベートすることにより放出させた。
【０１９０】
スクリーニングの際、４枚のマレイミドプレートを、５０μｇ／ｍｌのペプチドＲｐ１０−Ｌ（４℃で一晩、ＰＢＳ（ｐＨ＝７．２）中で溶解）の１００μｇ／ｍｌ溶液を用いてコーティングした。プレートを更に、室温で２時間、ウェルあたり２００μｌのＰＢＳ（１０μｇ／ｍｌシステイン−ＨＣｌ）でブロッキングした。
【０１９１】
放出されたペリプラズムタンパク質を更に、５０μｌの溶解物及び５０μｌの２％  ＢＳＡ−ＰＢＳを添加し、更に室温で一晩培養することによって、結合したペプチドと反応させた。
【０１９２】
Ｈｉｓタグタンパク質の結合は、テトラ−ｈｉｓ（ＱＩＡｇｅｎ）に対する抗体をウェルあたり１００μｌ添加し、９０分間インキュベートし、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで１：１０００に希釈し、ヤギ抗マウス抗体（ＨＲＰラベル（Ｓｉｇｍａ社製））をウェルあたり１００μｌ添加し、９０分間インキュベートし、１％のＢＳＡ−ＰＢＳで１：１０００に希釈することにより解析した。基質ＯＰＤ（３ｍｇ／ｍｌ）のＮａ−クエン酸塩／リン酸塩バッファ（ｐＨ＝４．５）中溶液、及び０．４μｌ／ｍｌのＨ2Ｏ2の添加の後、シグナルを観察した。１００μｌの１．２５Ｍ  Ｈ2ＳＯ4を添加して反応を停止させた。
【０１９３】
クローンあたりの、単一ウェルにおけるＲｐ１０−Ｌの結合のスクリーニング結果
【表２０】
0005924751.tif 000021
【０１９４】
バックグラウンド反応
【表２１】
0005924751.tif 000022
【０１９５】
一晩３０℃で、陽性シグナルを現しているクローンを、アンピシリンを有する２０ｍｌの２×ＹＴ培地で培養した。更に、それらを新しい培地に１：２０で植継ぎ、３０℃で３時間後、それらを０．１％のＬ−アラビノースの最終濃度により誘導し、１６℃で一晩組換えＣＨ３−ドメインを発現させた。発現細胞のペリプラズムを、更に少なくとも６時間１ｍｌのＮａ−ホウ酸塩バッファ（ＰＨ＝Ｓ−Ｏ）中に溶解させた。ペリプラズム抽出物をＲｐ１０−Ｌペプチドと反応させ、その結合を上記の通りに正確に現させた。
【０１９６】
Ｒｐ１０−Ｌの結合のスクリーニング結果
【表２２】
0005924751.tif 000023
【０１９７】
ｐＥＴ２７ｂの可溶性発現のための、選抜されたクローンのクローニング
【０１９８】
形質転換したＣＨ３ドメイン−コード配列（Ｒｐ１０−Ｌへの結合に関する顕著なシグナルを生じさせるクローン内に含まれる）をＰＣＲにより増幅した。Ｎｃｏｌ及びＮｏｔ１による制限酵素処理の後、それらをｐＥＴ２７ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）に挿入した。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）への形質転換の後、転換細胞を、１％のブドウ糖及び５０μｇ／ｍｌカナマイシンを有するＴＹＥ培地で３０℃で選抜した。
【０１９９】
陽性シグナルを現すクローンを、２％のブドウ糖及びカナマイシンを有する２０ｍｌのＭ９ＺＢ培地で３０℃で一晩培養した。更に、それらを新しい培地に１：２０で植継ぎ、３０℃で３時間後、それらをブドウ糖の代わりに１％のグリセリン、カナマイシン及び１ｍＭ  ＩＰＴＧを含有する培地で誘導し、１６℃で一晩、組換えＣＨ３−ドメインを発現させた。発現細胞のペリプラズムを、更に少なくとも６時間、１ｍｌのＮａ−ホウ酸塩バッファ（ｐＨ＝８．０）中に溶解させた。ペリプラズム抽出液を、ウエスタンブロッティング及び抗テトラ−ｈｉｓ抗体（ＱＩＡｇｅｎ）による検出により、組換えタンパク質の存在をアッセイした。
【０２００】
ヌクレオチド配列及びＣＤ−２０結合クローンの推定されたタンパク質配列
【表２３】
0005924751.tif 000024
※変異残基の第２グループへの２ヌクレオチドの挿入により、依然として存在するＲ及びＷ（第２及び第３の変異残基のグループを分離する）の間にＧ残基が挿入された。
【０２０１】
ＣＤ２０に特異的なＣＨ３＋３ライブラリクローンＤ８３（ＩＭＧＴ付番）のタンパク質配列
【表２４】
0005924751.tif 000025
【０２０２】
ＦＡＣＳを用いた、ＣＤ−２０（細胞上に発現）の結合のアッセイ
【０２０３】
約１０5のダウディ細胞をＰＢＳで洗浄し（８００回転／分、５分、室温）、１％ＢＳＡ−ＰＢＳ中の組換えＣＨ３ドメインを氷上で２時間結合させた。細胞をＰＢＳで再度洗浄し、氷上で３０分間、１％のＢＳＡ−ＰＢＳで希釈した抗ペンタＨｉｓ−Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ４８８抗体（ＱＩＡｇｅｎ社製）２μｇ／ｍｌと反応させた。洗浄後、細胞をＦＡＣＳでアッセイした。非標識の細胞、野生型ＣＨ３ドメイン及びＫ５６２細胞株をコントロールとして用いた。
【０２０４】
実施例７：ＣＨ１−変異体タンパク質と結合するＣＤ２０抗原の単離
３つのパニングラウンドを実施した。マレイミド活性化プレート（Ｐｉｅｒｃｅ社製）は合成ペプチドでコーティングされ、Ｂ細胞分子標識ＣＤ２０のミモトープ（ｍｉｍｏｔｏｐｅ）を発現する。以下の溶液の２００μｌをウェルに添加した：
ＰＢＳ（ｐＨ＝７．２）以下の濃度のペプチドを溶解させる：
−１回目のパニングラウンド：１００μｇ／ｍｌ
−２回目のパニングラウンド：１００μｇ／ｍｌ
−３回目のパニングラウンド：５０μｇ／ｍｌ。
【０２０５】
４℃で一晩培養し、更に室温で２時間、ウェルあたり２００μｌのＰＢＳ（１０μｇ／ｍｌのシステイン−ＨＣ１）でブロッキングした。
【０２０６】
表層ディスプレイファージライブラリ（ライブラリＣＨ１を表す）を更に、２００μｌのファージ懸濁液及び２％のＢＳＡ−ＰＢＳを添加し、振とうさせながら４５分間インキュベートし、更に室温で振とうさせずに９０分インキュベートし、結合ペプチドと反応させた。
【０２０７】
未結合ファージ粒子を、以下の通りに洗浄除去した：
−１パニングラウンドの後：１０×２００μｌ  Ｔ−ＰＢＳ、５×２００μｌ  Ｔ−ＰＢＳ；
−１パニングラウンドの後：１５×２００μｌ  Ｔ−ＰＢＳ、１０×２００μｌ  Ｔ−ＰＢＳ；
−１パニングラウンドの後：２０×２００μｌ  Ｔ−ＰＢＳ、２０×２００μｌ  Ｔ−ＰＢＳ。
【０２０８】
結合した粒子の溶出は、培養ウェルあたり０．１Ｍのグリシン（ｐＨ＝２．２）を２００μｌ添加し、室温で３０分間振とうすることにより実施した。その後、ファージ懸濁液を６０μｌ  ２Ｍトリス−ベースの添加によって中和し、更に、０．５ｍｌの抽出したファージと、１０ｍｌの指数的に成長する培養液とを混合し、３７℃で３０分間培養することにより、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＴＧ１細胞をトランスフェクションした。最後に、感染したバクテリアを、１％のブドウ糖及び１００μｇ／ｍｌアンピシリンを有するＴＹＥ培地で平板培養し、３０℃で一晩インキュベートした。
【０２０９】
Ｒｐ１０−Ｌペプチド上の、ＣＨ１−ファージライブラリのパニングの結果
【０２１０】
ファージのタイター
【表２５】
0005924751.tif 000026
【０２１１】
可溶性発現のための、選抜されたクローンのクローニング
【０２１２】
形質転換したＣＨ１ドメイン−コード配列（抽出したファージ粒子内に含まれる）をＰＣＲによりバッチ増幅した。Ｎｃｏｌ及びＮｏｔｌによる制限酵素処理の後、それらをｐＮＯＴＢＡＤ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製ベクターｐＢＡＤ、後にＮｏｔ１部位を挿入）に挿入した。Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｅ１０４への形質変換の後、細胞を、１％のブドウ糖及び１００μｇ／ｍｌアンピシリンを有するＴＹＥ培地で３０℃で選抜した。
【０２１３】
選抜されたクローンの可溶性発現及びスクリーニング
【０２１４】
４×９６のアンピシリン耐性コロニーを、３０℃で一晩、シェーカ上のマイクロタイタプレート上で、２００μｌのアンピシリンを有する２×ＹＴ媒体で培養した。それらを更に、０．１％の最終濃度でＬ−アラビノースを添加して誘導した。更に一晩培養の後、細胞を、室温で２０００回転／分で１５分間遠心分離して回収し、それらのペリプラズムタンパク質を、１００μｌ  Ｎａ−ホウ酸塩バッファ（１６０ｍＭのＮａ−ホウ酸塩、２００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ＝８．０）に再懸濁液し、少なくとも６時間インキュベートすることにより放出させた。
【０２１５】
スクリーニングの際、４枚のマレイミドプレートを、５０μｇ／ｍｌのペプチドＲｐ１０−Ｌ（４℃で一晩、ＰＢＳ（ｐＨ＝７．２）中で溶解）の１００μｇ／ｍｌ溶液を用いてコーティングした。プレートを更に、室温で２時間、ウェルあたり２００μｌのＰＢＳ（１０μｇ／ｍｌシステイン−ＨＣｌ）でブロッキングした。
【０２１６】
放出されたペリプラズムタンパク質を更に、５０μｌの溶解物及び５０μｌの２％  ＢＳＡ−ＰＢＳを添加し、更に室温で一晩培養することによって、結合したペプチドと反応させた。Ｈｉｓタグタンパク質の結合は、テトラ−ｈｉｓ（ＱＩＡｇｅｎ）に対する抗体をウェルあたり１００μｌ添加し、９０分間インキュベートし、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで１：１０００に希釈し、ヤギ抗マウス抗体（ＨＲＰラベル（Ｓｉｇｍａ社製））をウェルあたり１００μｌ添加し、９０分間インキュベートし、１％のＢＳＡ−ＰＢＳで１：１０００に希釈することにより解析した。基質ＯＰＤ（３ｍｇ／ｍｌ）のＮａ−クエン酸塩／リン酸塩バッファ（ｐＨ＝４．５）中溶液、及び０．４μｌ／ｍｌのＨ2Ｏ2の添加の後、シグナルを観察した。１００μｌの１．２５Ｍ  Ｈ2ＳＯ4を添加して反応を停止させた。
【０２１７】
クローンあたりの、単一ウェルにおけるＲｐ１０−Ｌの結合のスクリーニング結果
【表２６】
0005924751.tif 000027
【０２１８】
バックグラウンド反応
【表２７】
0005924751.tif 000028
【０２１９】
一晩３０℃で、陽性シグナルを現しているクローンを、アンピシリンを有する２０ｍｌの２×ＹＴ培地で培養した。更に、それらを新しい培地に１：２０で植継ぎ、３０℃で３時間後、それらを０．１％のＬ−アラビノースの最終濃度により誘導し、１６℃で一晩組換えＣＨ３−ドメインを発現させた。発現細胞のペリプラズムを、更に少なくとも６時間１ｍｌのＮａ−ホウ酸塩バッファ（ＰＨ＝Ｓ−Ｏ）中に溶解させた。ペリプラズム抽出物をＲｐ１０−Ｌペプチドと反応させ、その結合を上記の通りに正確に現させた。
【０２２０】
Ｒｐ１０−Ｌの結合のアッセイ結果
【表２８】
0005924751.tif 000029
【０２２１】
ｐＥＴ２７ｂの可溶性発現のための、選抜されたクローンのクローニング
【０２２２】
形質転換したＣＨ１ドメイン−コード配列（Ｒｐ１０−Ｌへの結合に関する顕著なシグナルを生じさせるクローン内に含まれる）をＰＣＲにより増幅した。Ｎｃｏｌ及びＮｏｔ１による制限酵素処理の後、それらをｐＥＴ２７ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）に挿入した。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）への形質転換の後、転換細胞を、１％のブドウ糖及び５０μｇ／ｍｌカナマイシンを有するＴＹＥ培地で３０℃で選抜した。
【０２２３】
陽性シグナルを現すクローンを、２％のブドウ糖及びカナマイシンを有する２０ｍｌのＭ９ＺＢ培地で３０℃で一晩培養した。更に、それらを新しい培地に１：２０で植継ぎ、３０℃で３時間後、それらをブドウ糖の代わりに１％のグリセリン、カナマイシン及び１ｍＭ  ＩＰＴＧを含有する培地で誘導し、１６℃で一晩、組換えＣＨ１−ドメインを発現させた。発現細胞のペリプラズムを、更に少なくとも６時間、１ｍｌのＮａ−ホウ酸塩バッファ（ｐＨ＝８．０）中に溶解させた。ペリプラズム抽出液を、ウエスタンブロッティング及び抗テトラ−ｈｉｓ抗体（ＱＩＡｇｅｎ）による検出により、組換えタンパク質の存在をアッセイした。
【０２２４】
ＣＤ２０に特異的なＣＨ１  ＳＭＩＤ（クローンＣ４５）の配列
【表２９】
0005924751.tif 000030
【０２２５】
ＦＡＣＳを用いた、ＣＤ−２０（細胞上に発現）の結合のアッセイ
【０２２６】
約１０5のダウディ細胞をＰＢＳで洗浄し（８００回転／分、５分、室温）、１％ＢＳＡ−ＰＢＳ中の組換えＣＨ３ドメインを氷上で２時間結合させた。細胞をＰＢＳで再度洗浄し、氷上で３０分間、１％のＢＳＡ−ＰＢＳで希釈した抗ペンタＨｉｓ−Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ４８８抗体（ＱＩＡｇｅｎ社製）２μｇ／ｍｌと反応させた。洗浄後、細胞をＦＡＣＳでアッセイした。非標識の細胞、野生型ＣＨ１ドメイン及びＫ５６２細胞株をコントロールとして用いた。
【０２２７】
実施例８：ＣＬ−変異体タンパク質と結合するＣＤ２０抗原の単離
３つのパニングラウンドを実施した。マレイミド活性化プレート（Ｐｉｅｒｃｅ社製）は合成ペプチドでコーティングされ、Ｂ細胞分子標識ＣＤ２０のミモトープ（ｍｉｍｏｔｏｐｅ）を発現する。以下の溶液の２００μｌをウェルに添加した：ＰＢＳ（ｐＨ＝７．２）以下の濃度のペプチドを溶解させる：−１回目のパニングラウンド：１００μｇ／ｍｌ−２回目のパニングラウンド：１００μｇ／ｍｌ−３回目のパニングラウンド：５０μｇ／ｍｌ。
【０２２８】
４℃で一晩培養し、更に室温で２時間、ウェルあたり２００μｌのＰＢＳ（１０μｇ／ｍｌのシステイン−ＨＣ１）でブロッキングした。
【０２２９】
表層ディスプレイファージライブラリ（ライブラリＣＬを表す）を更に、２００μｌのファージ懸濁液及び２％のＢＳＡ−ＰＢＳを添加し、振とうさせながら４５分間インキュベートし、更に室温で振とうさせずに９０分インキュベートし、結合ペプチドと反応させた。
【０２３０】
未結合ファージ粒子を、以下の通りに洗浄除去した：
−１パニングラウンドの後：１０×２００μｌ  Ｔ−ＰＢＳ、５×２００μｌ  Ｔ−ＰＢＳ；
−１パニングラウンドの後：１５×２００μｌ  Ｔ−ＰＢＳ、１０×２００μｌ  Ｔ−ＰＢＳ；
−１パニングラウンドの後：２０×２００μｌ  Ｔ−ＰＢＳ、２０×２００μｌ  Ｔ−ＰＢＳ。
【０２３１】
結合した粒子の溶出は、培養ウェルあたり０．１Ｍのグリシン（ｐＨ＝２．２）を２００μｌ添加し、室温で３０分間振とうすることにより実施した。その後、ファージ懸濁液を６０μｌ  ２Ｍトリス−ベースの添加によって中和し、更に、０．５ｍｌの抽出したファージと、１０ｍｌの指数的に成長する培養液とを混合し、３７℃で３０分間培養することにより、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＴＧ１細胞をトランスフェクションした。最後に、感染したバクテリアを、１％のブドウ糖及び１００μｇ／ｍｌアンピシリンを有するＴＹＥ培地で平板培養し、３０℃で一晩インキュベートした。
【０２３２】
Ｒｐ１０−Ｌペプチド上の、ＣＬ−ファージライブラリのパニングの結果
【０２３３】
ファージのタイター
【表３０】
0005924751.tif 000031
【０２３４】
可溶性発現のための、選抜されたクローンのクローニング
【０２３５】
形質転換したＣＨ１ドメイン−コード配列（抽出したファージ粒子内に含まれる）をＰＣＲによりバッチ増幅した。Ｎｃｏｌ及びＮｏｔｌによる制限酵素処理の後、それらをｐＮＯＴＢＡＤ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製ベクターｐＢＡＤ、後にＮｏｔ１部位を挿入）に挿入した。Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｅ１０４への形質変換の後、細胞を、１％のブドウ糖及び１００μｇ／ｍｌアンピシリンを有するＴＹＥ培地で３０℃で選抜した。
【０２３６】
選抜されたクローンの可溶性発現及びスクリーニング
【０２３７】
４×９６のアンピシリン耐性コロニーを、３０℃で一晩、シェーカ上のマイクロタイタプレート上で、２００μｌのアンピシリンを有する２×ＹＴ媒体で培養した。それらを更に、０．１％の最終濃度でＬ−アラビノースを添加して誘導した。更に一晩培養の後、細胞を、室温で２０００回転／分で１５分間遠心分離して回収し、それらのペリプラズムタンパク質を、１００μｌ  Ｎａ−ホウ酸塩バッファ（１６０ｍＭのＮａ−ホウ酸塩、２００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ＝８．０）に再懸濁液し、少なくとも６時間インキュベートすることにより放出させた。
【０２３８】
スクリーニングの際、４枚のマレイミドプレートを、５０μｇ／ｍｌのペプチドＲｐ１０−Ｌ（４℃で一晩、ＰＢＳ（ｐＨ＝７．２）中で溶解）の１００μｇ／ｍｌ溶液を用いてコーティングした。プレートを更に、室温で２時間、ウェルあたり２００μｌのＰＢＳ（１０μｇ／ｍｌシステイン−ＨＣｌ）でブロッキングした。
【０２３９】
放出されたペリプラズムタンパク質を更に、５０μｌの溶解物及び５０μｌの２％  ＢＳＡ−ＰＢＳを添加し、更に室温で一晩培養することによって、結合したペプチドと反応させた。
【０２４０】
Ｈｉｓタグタンパク質の結合は、テトラ−ｈｉｓ（ＱＩＡｇｅｎ）に対する抗体をウェルあたり１００μｌ添加し、９０分間インキュベートし、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで１：１０００に希釈し、ヤギ抗マウス抗体（ＨＲＰラベル（Ｓｉｇｍａ社製））をウェルあたり１００μｌ添加し、９０分間インキュベートし、１％のＢＳＡ−ＰＢＳで１：１０００に希釈することにより解析した。基質ＯＰＤ（３ｍｇ／ｍｌ）のＮａ−クエン酸塩／リン酸塩バッファ（ｐＨ＝４．５）中溶液、及び０．４μｌ／ｍｌのＨ2Ｏ2の添加の後、シグナルを観察した。１００μｌの１．２５Ｍ  Ｈ2ＳＯ4を添加して反応を停止させた。
【０２４１】
クローンあたりの、単一ウェルにおけるＲｐ１０−Ｌの結合のスクリーニング結果
【表３１】
0005924751.tif 000032
【０２４２】
バックグラウンド反応
【表３２】
0005924751.tif 000033
【０２４３】
一晩３０℃で、陽性シグナルを現しているクローンを、アンピシリンを有する２０ｍｌの２×ＹＴ培地で培養した。更に、それらを新しい培地に１：２０で植継ぎ、３０℃で３時間後、それらを０．１％のＬ−アラビノースの最終濃度により誘導し、１６℃で一晩組換えＣＬ−ドメインを発現させた。発現細胞のペリプラズムを、更に少なくとも６時間１ｍｌのＮａ−ホウ酸塩バッファ（ＰＨ＝Ｓ−Ｏ）中に溶解させた。ペリプラズム抽出物をＲｐ１０−Ｌペプチドと反応させ、その結合を上記の通りに正確に現させた。
【０２４４】
Ｒｐ１０−Ｌの結合のアッセイ結果
【表３３】
0005924751.tif 000034
【０２４５】
ｐＥＴ２７ｂの可溶性発現のための、選抜されたクローンのクローニング
【０２４６】
形質転換したＣＨ１ドメイン−コード配列（Ｒｐ１０−Ｌへの結合に関する顕著なシグナルを生じさせるクローン内に含まれる）をＰＣＲにより増幅した。Ｎｃｏｌ及びＮｏｔ１による制限酵素処理の後、それらをｐＥＴ２７ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）に挿入した。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）への形質転換の後、転換細胞を、１％のブドウ糖及び５０μｇ／ｍｌカナマイシンを有するＴＹＥ培地で３０℃で選抜した。
【０２４７】
陽性シグナルを現すクローンを、２％のブドウ糖及びカナマイシンを有する２０ｍｌのＭ９ＺＢ培地で３０℃で一晩培養した。更に、それらを新しい培地に１：２０で植継ぎ、３０℃で３時間後、それらをブドウ糖の代わりに１％のグリセリン、カナマイシン及び１ｍＭ  ＩＰＴＧを含有する培地で誘導し、１６℃で一晩、組換えＣＬ−ドメインを発現させた。発現細胞のペリプラズムを、更に少なくとも６時間、１ｍｌのＮａ−ホウ酸塩バッファ（ｐＨ＝８．０）中に溶解させた。ペリプラズム抽出液を、ウエスタンブロッティング及び抗テトラ−ｈｉｓ抗体（ＱＩＡｇｅｎ）による検出により、組換えタンパク質の存在をアッセイした。
【０２４８】
実施例９：インテグリン−結合Ｆｃａｂのクローニング、発現及び評価
元来環状ペプチドであるＣＲＧＤＣＬは、最初、Ｋｏｉｖｕｎｅｎその他によって１９９３年、繊維状ファージにおいて発現する６−アミノ酸ペプチドライブラリから単離され（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９３  Ｓｅｐ  ２５、２６８（２７）：２０２０５−１０）、ＲＧＤを発現するファージのαvβ1インテグリンへの結合、又はフィブロネクチンへのαvβ1発現細胞の結合を阻害することが示されている。上記ペプチドはまた、αvβ1、αvβ3及びαvβ5インテグリンにより媒介される細胞接着を阻害することが知られている。
【０２４９】
本発明において、配列ＧＣＲＧＤＣＬをヒトＩｇＧ１のＣＨ３ドメインの構造ループ（「ＥＦ」ループ）に挿入した。この際、残基Ａｓｐ９２及びＬｙｓ９３（ＩＭＧＴ付番）を、それぞれＧＩｙ及びＬｅｕに変異させ、５つの残基ＣＲＧＤＣを標準的なクローニング技術を用いてこれらの変異残基９２及び９３の間に挿入し、インテグリン−結合ＲＧＤのモティーフを有するループを作成した。インサートのＣ末端に、上記配列を、ベクターのマルチクローニング部位とインフレームで融合させ、ＨＳＶ−タグ及びＨｉｓ−タグを組換えタンパク質のＣ末端に結合するように構築した。この組換えタンパク質Ｆｃａｂ−ＲＧＤ４を、短ＲＧＤ４と称する。Ｆｃａｂ−ＲＧＤ４をコードするＤＮＡ配列及びアミノ酸配列への翻訳配列を以下に示す。
【表３４】
0005924751.tif 000035
【０２５０】
Ｆｃａｂ−ＲＧＤ４及びＦｃａｂ−ｗｔをコードする配列をそれぞれ、従来公知のクローニング技術によって、哺乳類の発現ベクターｐＣＥＰ４に導入した。ＨＥＫ２９３細胞を、これらの発現プラスミドでトランジェントにトランスフェクションし、Ｆｃａｂを含有する培地を３日後及び１週後に回収した。Ｆｃａｂｓを、プロテインＡ柱、カラムからの酸溶出、及びその直後の中和により精製した。ＦｃａｂｓをＰＢＳで透析し、ヒトαvβ3インテグリン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社製）に対する結合を、ＥＬＩＳＡで試験した。
【０２５１】
インテグリンＥＬＩＳＡの際、ＰＢＳの１μｇ／ｍｌのヒトαｖβ３インテグリンを、Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート上で一晩コーティングし、１ｍＭのＣａ2+を含有する、ＰＢＳ中のＢＳＡ溶液で１時間ブロッキングした。Ｆｃａｂ−ＲＧＤ４及びＦｃａｂ−ｗｔをそれぞれ、１０μｇ／ｍｌの精製タンパク質を基に調製した様々な希釈系列と１時間結合させた。結合したＦｃａｂｓを、ＨＲＰ標識プロテインＡ及び基質としてのＴＭＢにより検出した。インテグリンに対するＲＧＤ４の結合（赤いライン）は、１０μｇ／ｍｌから０．１６μｇ／ｍｌのタンパク質濃度において、顕著なシグナルであることを示す。負のコントロールとして、ＲＧＤ４は、インテグリンがない場合にはプレートと結合せず（灰色のライン）、またＦｃａｂ−ｗｔは、インテグリンコートしたプレートと結合しなかった（緑のライン）。市販のマウス抗ヒトαvβ3インテグリンｍＡｂ  ＬＭ６０９の結合を、正のコントロールとした（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社製、ブルーライン）。
【表３５】
0005924751.tif 000036
【０２５２】
表：ヒトαvβ3インテグリンに対する、ＲＧＤ４及びＬＭ６０９の結合を示すＥＬＩＳＡデータ。最初のカラムに示す様々なタンパク質濃度において試験し、それぞれの列の、４５０ｎｍのシグナルが得られた。得られるＨＥＫで産生されプロテインＡで精製されたＦｃａｂ−ＲＧＤ４の、インテグリンに対する結合値を第２のカラムに示し、第３のカラムに負のコントロールであるＦｃａｂ−ｗｔを示し、Ｆｃａｂ−ＲＧＤ４コーティングしたブランクのコントロールを第４のカラムに示す。マウス抗αvβ3インテグリンｍＡｂ  ＬＭ６０９の結合値を最後のカラムに示す。
【配列表】
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