(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体において解糖を阻害するための医薬組成物であって、該組成物は、式Ｉ：
【化５２】
0005847085.tif 000070
の化合物を含み、式中、
Ｒ１はヒドロキシルであり、
Ｒ２は、トリフルオロメチルであり、
Ｒ３は、ヒドロキシルであり、
Ｒ４は、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、およびアリール基から選択されるかまたは、
Ｒ１は水素であり、
Ｒ２およびＲ３は、ハロ部分であり、
Ｒ４は、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、およびアリール基から選択され、
ここで、シクロアルキルは、Ｃ１−４アルキル基を介して主構造に結合される、環構造を形成するアルキル基または環状アルキル基を指す、医薬組成物。
【請求項２】
（Ｚ）−３−（２−エチル−ブチル）−５−（４−ヒドロキシ−３−トリフルオロメチル−ベンジリデン）−チアゾリジン−２−４−ジオンを含む、被験体において解糖を阻害するための医薬組成物。
【請求項３】
Ｒ１はヒドロキシルであり、Ｒ２は、トリフルオロメチルであり、Ｒ３は、ヒドロキシルであり、Ｒ４は、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、およびアリール基から選択される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
（Ｚ）−５−（３，４−ジヒドロキシ−５−トリフルオロメチル−ベンジリデン）−３−（１−メチル−シクロヘキシルメチル）−チアゾリジン−２−４−ジオン、（Ｚ）−５−（３，４−ジヒドロキシ−５−トリフルオロメチル−ベンジリデン）−３−（２−エチル−ブチル）−チアゾリジン−２−４−ジオン、（Ｚ）−５−（３，４−ジヒドロキシ−５−トリフルオロメチル−ベンジリデン）−３−（２−エチル−ペンチル）−チアゾリジン−２−４−ジオン、（Ｚ）−５−（３，４−ジヒドロキシ−５−トリフルオロメチル−ベンジリデン）−３−（４−イソプロピル−ベンジル）−チアゾリジン−２−４−ジオン、（Ｚ）−３−（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−５−（３，４−ジヒドロキシ−５−トリフルオロメチル−ベンジリデン）−チアゾリジン−２−４−ジオン、（Ｚ）−５−（３，４−ジヒドロキシ−５−トリフルオロメチル−ベンジリデン）−３−（２−トリフルオロメチル−ベンジル）−チアゾリジン−２−４−ジオン、（Ｚ）−３−シクロヘキシルメチル−５−（３，４−ジヒドロキシ−５−トリフルオロメチル−ベンジリデン）−チアゾリジン−２−４−ジオン、（Ｚ）−３−ベンジル−５−（３，４−ジヒドロキシ−５−トリフルオロメチル−ベンジリデン）−チアゾリジン−２−４−ジオン、（Ｚ）−３−シクロヘプチルメチル−５−（３，４−ジヒドロキシ−５−トリフルオロメチル−ベンジリデン）−チアゾリジン−２−４−ジオン、および（Ｚ）−５−（３，４−ジヒドロキシ−５−トリフルオロメチル−ベンジリデン）−３−イソブチル−チアゾリジン−２−４−ジオンからなる群より選択される化合物を含む、被験体において解糖を阻害するための医薬組成物。
【請求項５】
Ｒ１は水素であり、Ｒ２およびＲ３はハロ部分であり、Ｒ４は、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、およびアリール基から選択される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項６】
（Ｚ）−５−（３，５−ジブロモ−ベンジリデン）−３−（１−メチル−シクロヘキシルメチル）−チアゾリジン−２−４−ジオン、（Ｚ）−５−（３，５−ジブロモ−ベンジリデン）−３−（２−エチル−ブチル）−チアゾリジン−２−４−ジオン、（Ｚ）−５−（３，５−ジブロモ−ベンジリデン）−３−（２−エチル−ペンチル）−チアゾリジン−２−４−ジオン、（Ｚ）−５−（３，５−ジブロモ−ベンジリデン）−３−（４−イソプロピル−ベンジル）−チアゾリジン−２−４−ジオン、（Ｚ）−３−（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−５−（３，５−ジブロモ−ベンジリデン）−チアゾリジン−２−４−ジオン、（Ｚ）−５−（３，５−ジブロモ−ベンジリデン）−３−（２−トリフルオロメチル−ベンジル）−チアゾリジン−２−４−ジオン、（Ｚ）−３−シクロヘキシルメチル−５−（３，５−ジブロモ−ベンジリデン）−チアゾリジン−２−４−ジオン、（Ｚ）−３−ベンジル−５−（３，５−ジブロモ−ベンジリデン）−チアゾリジン−２−４−ジオン、（Ｚ）−３−シクロヘプチルメチル−５−（３，５−ジブロモ−ベンジリデン）−チアゾリジン−２−４−ジオン、および（Ｚ）−５−（３，５−ジブロモ−ベンジリデン）−３−イソブチル−チアゾリジン−２−４−ジオンからなる群より選択される化合物を含む、被験体において解糖を阻害するための医薬組成物。
【請求項７】
前記被験体は癌を有するリスクが高いかまたは癌を有すると診断された、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、２００９年１０月９日に出願された米国仮特許出願第６１／２５０，０４５号および２０１０年２月１６日に出願された米国仮特許出願第６１／３０４，８８１号（これらの両方は、その全体が参考として本明細書に援用される）に対する優先権を主張する。
【０００２】
政府の資金提供
本発明は、助成金第ＣＡ１１２２５０号の下、Ｎａｔｉｏｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈによる政府の支援によって少なくとも部分的に支援された。政府は、本発明に一定の権利を有し得る。
【背景技術】
【０００３】
ロシグリタゾン、ピオグリタゾン、トログリタゾン、シグリタゾンを含むチアゾリジンジオン類（ＴＺＤ）は、核転写因子ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体（ＰＰＡＲ）γのための選択性リガンドである。これらＴＺＤは、グルコースホメオスタシス、脂肪酸の代謝、および脂肪細胞中のトリアシルグリセロール貯蔵に関与するインスリン感受性遺伝子の転写活性化を通して脂肪組織の機能の多くの面を調節することによって、インスリン感受性を向上させる。さらに、ＴＺＤ介在ＰＰＡＲγ活性化は、脂肪細胞に与えるインスリンのゲノム効果を模倣することによって前駆脂肪細胞の分化を促進し、またアジポネクチン、ＩＬ−６およびＴＮＦαのような炎症性サイトカイン、ならびに脂肪細胞およびマクロファージ中の内分泌調節剤のホストの発現を調整することが示されている。これらの有益な効果によって、ＴＺＤは、インスリン抵抗を減らしまた血糖コントロールを支援することによって２型糖尿病のための新しいタイプの経口療法を提供する。
【０００４】
脂肪細胞のように、多くのヒト癌細胞株は高レベルのＰＰＡＲγ発現を示すことが報告されている。これら腫瘍細胞を高用量（≧５０μＭ）のＴＺＤ、特にトログリタゾンおよびシグリタゾンにインビトロで露出させると、細胞サイクルの阻止、アポトーシスおよび／または再分化に至り、ＰＰＡＲγシグナル伝達とＴＺＤの抗腫瘍活性との間の推定の関連が示唆された。Ｇｒｏｍｍｅｓら、Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌ．５、ｐ．４１９−４２９（２００４）。さらに、トログリタゾンのインビトロでの抗癌効果が、脂肪肉腫または前立腺癌の患者を含む少数の臨床症例において実証された。Ｄｅｍｅｔｒｉら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．９６、ｐ．３９５１−３９５６（１９９９）およびＨｉｓａｔａｋｅら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６０、ｐ．５４９４−５４９８（２０００）。蓄積した証拠により、トログリタゾンおよびシグリタゾンは、癌細胞の細胞サイクルの進行および存続を支配する多様なシグナル経路を標的にすることによって、ＰＰＡＲγ非依存の抗腫瘍効果の媒介となることが示される。Ｗｅｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．２７６、ｐ．１１９−１２４（２００９）。
【０００５】
同定された様々な「的外れ」のメカニズムの中で、βカテニン、サイクリンＤ１、Ｓｐ１、アンドロゲン受容体（ＡＲ）、および表皮性成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を含む広範囲の細胞サイクルおよびアポトーシス調節タンパク質の、プロテアソーム分解または転写抑制による、発現に与えるＴＺＤの効果は特に顕著である。この効果は、βカテニン、サイクリンＤ１、およびＳｐ１などの標的タンパク質のβトランスデューシン繰り返し体含有タンパク質（β−ＴｒＣＰ）介在プロテアソーム分解を、このＥ３ユビキチンリガーゼの発現量を上げることによって、活性化させるＴＺＤの能力に起因するという証拠が研究者によって得られている。Ｗｅｉら、Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．７２、ｐ．７２５−７３３（２００７）およびＷｅｉら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２８３、ｐ．２６７５９−２６７７０（２００８）。サイクリンＤ１およびＳｐ１のＴＺＤ誘発β−ＴｒＣＰ介在タンパク質分解の根底にあるメカニズムを調査する過程で、β−ＴｒＣＰ依存の分解もまたグルコース欠乏条件下で生じることが観測された。
【０００６】
癌細胞とは異なり、非悪性細胞はこれらＰＰＡＲγ非依存の抗腫瘍効果に耐性があり、これが新規の抗腫瘍剤の開発への足場としてのＴＺＤの可能性を際立たせている。この前提は、それぞれの親化合物であるトログリタゾンおよびシグリタゾンより高い多様な抗腫瘍効能を示す２つのＰＰＡＲγ不活性誘導体、ＳＴＧ２８およびＯＳＵ−ＣＧ１２、に対して当てはまることが実証された。Ｈｕａｎｇら、Ｊ．Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．４９、ｐ．４６８４−４６８９（２００６）およびＹａｎｇら、Ｊ．Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．５１、ｐ．２１００−２１０７（２００８）。
【０００７】
チアゾリジンジオンに対する別の可能な標的としては、アデノシン一リン酸活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）がある。細胞および全身体両レベルでのエネルギーホメオスタシスおよびインスリン感受性の調節におけるＡＭＰＫの機能的な役割が知られている。運動、細胞ストレス、およびアジポカインなどの刺激に応答して、この細胞燃料感知酵素は、栄養素摂取およびエネルギー代謝を制御する多数の下流シグナル経路を介して、グルコースおよび脂肪酸摂取、脂肪酸の酸化、およびミトコンドリア発生の刺激、ならびにグリコーゲン合成の阻害を含む、一連の代謝変化を誘発してエネルギー消費の均衡を保つ。もっと最近では、蓄積された証拠により、ＡＭＰＫと癌細胞の成長および存続との間の関連が、結節硬化症錯体２、すなわちラパマイシンの標的の哺乳類相同体（ｍＴＯＲ）を阻害することによってタンパク質合成を負に調節する腫瘍抑制因子を活性化するその能力に照らして、示唆されている。Ｉｎｏｋｉら、Ｃｅｌｌ、１１５、５７７−５９０（２００３）。機構的な見地からは、ＡＭＰＫは、成長因子シグナル伝達をｍＴＯＲの負調節を介して細胞代謝と統合させる。加えて、ＡＭＰＫは、マクロファージ中の炎症性サイトカイン、特にインターロイキン（ＩＬ）−６の産出を阻害することにより、炎症応答を抑制すると報告されている。Ｌｉｈｎら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２９２、３６−４１（２００８）。合わせて、これらの知見により、ＡＭＰＫは２型糖尿病、代謝症候群、および癌の処置のための治療上適切な標的を表すことが示唆される。
【０００８】
癌細胞は、それらの微環境で細胞代謝を好気的解糖に移行させ、いわゆるワールブルク効果を提供することによって、成長上の利点を得る。Ｓａｍｕｄｉｏら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６９、ｐ．２１６３−２１６６（２００９）。ワールブルク効果とは、ほとんどの癌細胞は大抵、ほとんどの正常な細胞のようにミトコンドリア中のピルビン酸塩の酸化によってではなく、シトソル中の乳酸発酵を伴う解糖によってエネルギーを産生するという所見である。これは、酸素が豊富な場合でも起きる。ワールブルク効果は、癌中のミトコンドリアへの損傷の結果、腫瘍内の低酸素環境への適応、または癌遺伝子がミトコンドリアをこれらが細胞のアポトーシスプログラムに関与しているという理由でシャットダウンする結果であり得る。
【０００９】
従って、好気的解糖を標的にして悪性対正常細胞の分化感受性を解糖阻害へと活用することは、癌治療にとって有用な方法である。好気的解糖を標的にすることはまた、糖尿病の処置または寿命増加などの他の目的のためにも使用することができる。癌療法のための好気的解糖の使用例としては、様々な自然発生のまたは化学的に誘導された腫瘍動物モデルにおける発癌を抑制する場合の食事カロリー制限のインビボにおける有効性がある。非特許文献１Ｊｉａｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、６８、ｐ．５４９２−５４９９（２００８）；非特許文献２Ｈｕｒｓｔｉｎｇら、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｍｅｄ、５４、ｐ．１３１−１５２（２００３）；非特許文献３Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｍａｍｍａｒｙ  Ｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌ  Ｎｅｏｐｌａｓｉａ、８、ｐ．１３３−１４２（２００３）；および非特許文献４Ｂｅｒｒｉｇａｎら、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ、２３、ｐ．８１７−８２２（２００２）参照。
【００１０】
レスベラトロル（Ｂａｕｒら、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．５、ｐ．４９３−５０６（２００６）およびＣｕｃｃｉｏｌｌａら、Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ、６、ｐ．２４９５−２５１０（２００７））または２−デオキシグルコース（Ｚｈｕら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６５、ｐ．７０２３（２００５））などの様々な化合物を用いた発癌抑制についての情報もまた利用可能である。エネルギー制限模倣剤、２−デオキシグルコースおよびレスベラトロルは、それぞれグルコース代謝および摂取を阻害することによってエネルギー制限の有益な効果を模倣するこれらの能力により幅広い注目を集めている。しかし、これらの薬剤を治療に適用することは、これらのインビトロにおける効能が比較的弱いことにより制限されてきた。新規のエネルギー制限模倣剤、特に、高い効能を示す模倣剤が、癌、代謝障害、または他の異常解糖を伴う症状の処置に使用するために依然として必要である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｊｉａｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、（２００８）６８、ｐ．５４９２−５４９９
【非特許文献２】Ｈｕｒｓｔｉｎｇら、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｍｅｄ、（２００３）５４、ｐ．１３１−１５２
【非特許文献３】Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｍａｍｍａｒｙ  Ｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌ  Ｎｅｏｐｌａｓｉａ、（２００３）８、ｐ．１３３−１４２
【非特許文献４】Ｂｅｒｒｉｇａｎら、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ、（２００２）２３、ｐ．８１７−８２２
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、チアゾリジンジオン誘導体を含む医薬組成物を被験体に投与することを包含する、被験体において解糖を阻害する方法を提供する。チアゾリジンジオン誘導体は、解糖を阻害するこれらの能力の結果として、グルコース飢餓により得られるものに類似したエネルギー制限の形態を表す、新規のクラスのエネルギー制限模倣剤を表す。チアゾリジンジオン誘導体を用いて被験体において解糖を阻害する方法は、腫瘍の解糖代謝を阻害することで被験体での癌の処置または防止を行うために使用することができ、また癌と診断されていない被験体を含む被験体の寿命を延ばすために使用することができる。本方法に有用なチアゾリジンジオン誘導体はさらに、本明細書にて提供される式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶによって定義される。
【００１３】
本発明はまた、有効量のチアゾリジンジオン誘導体を提供することによってアデノシン一リン酸活性化プロテインキナーゼを活性化する方法を提供する。さらに、ＡＭＰＫの活性化はＩＬ−６発現の阻害に至るため、本発明はまた、チアゾリジンジオン誘導体を含む医薬組成物を被験体に投与することによって被験体においてＩＬ−６発現を阻害する方法を提供する。ＡＭＰＫを活性化するためのおよびＩＬ−６発現を阻害するための適切なチアゾリジンジオン誘導体としては、式Ｉ、ＩＩＩ、およびＩＶの特定の実施形態によって定義されるものが含まれる。
【００１４】
本発明は以下の図面を参照することにより、より容易に理解され得る。
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
被験体において解糖を阻害する方法であって、該方法は、式Ｉ：
【化５２】
0005847085.tif 000002
の化合物を含む医薬組成物を該被験体に投与することを包含し、式中、
Ｒ１は水素またはヒドロキシルであり、
Ｒ２およびＲ３は、水素、ヒドロキシル、ハロ、アミノ、メチル、メトキシ、エチル、エトキシ、ニトロ、アミノスルホニル、トリフルオロメチルスルホニル、およびハロアルキル部分から選択され、
Ｒ４は、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、およびアリール基から選択される、方法。
（項目２）
Ｒ１はヒドロキシルである、項目１に記載の方法。
（項目３）
Ｒ２はトリフルオロメチルである、項目２に記載の方法。
（項目４）
Ｒ３は水素である、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記化合物は、（Ｚ）−５−（４−ヒドロキシ−３−トリフルオロメチル−ベンジリデン）−３−（１−メチル−シクロヘキシルメチル）−チアゾリジン−２−４−ジオンまたは（Ｚ）−３−（２−エチル−ブチル）−５−（４−ヒドロキシ−３−トリフルオロメチル−ベンジリデン）−チアゾリジン−２−４−ジオンである、項目４に記載の方法。
（項目６）
Ｒ３はヒドロキシルである、項目３に記載の方法。
（項目７）
前記化合物は、（Ｚ）−５−（３，４−ジヒドロキシ−５−トリフルオロメチル−ベンジリデン）−３−（１−メチル−シクロヘキシルメチル）−チアゾリジン−２−４−ジオン、（Ｚ）−５−（３，４−ジヒドロキシ−５−トリフルオロメチル−ベンジリデン）−３−（２−エチル−ブチル）−チアゾリジン−２−４−ジオン、（Ｚ）−５−（３，４−ジヒドロキシ−５−トリフルオロメチル−ベンジリデン）−３−（２−エチル−ペンチル）−チアゾリジン−２−４−ジオン、（Ｚ）−５−（３，４−ジヒドロキシ−５−トリフルオロメチル−ベンジリデン）−３−（４−イソプロピル−ベンジル）−チアゾリジン−２−４−ジオン、（Ｚ）−３−（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−５−（３，４−ジヒドロキシ−５−トリフルオロメチル−ベンジリデン）−チアゾリジン−２−４−ジオン、（Ｚ）−５−（３，４−ジヒドロキシ−５−トリフルオロメチル−ベンジリデン）−３−（２−トリフルオロメチル−ベンジル）−チアゾリジン−２−４−ジオン、（Ｚ）−３−シクロヘキシルメチル−５−（３，４−ジヒドロキシ−５−トリフルオロメチル−ベンジリデン）−チアゾリジン−２−４−ジオン、（Ｚ）−３−ベンジル−５−（３，４−ジヒドロキシ−５−トリフルオロメチル−ベンジリデン）−チアゾリジン−２−４−ジオン、（Ｚ）−３−シクロヘプチルメチル−５−（３，４−ジヒドロキシ−５−トリフルオロメチル−ベンジリデン）−チアゾリジン−２−４−ジオン、および（Ｚ）−５−（３，４−ジヒドロキシ−５−トリフルオロメチル−ベンジリデン）−３−イソブチル−チアゾリジン−２−４−ジオンからなる群より選択される、項目６に記載の方法。
（項目８）
Ｒ１は水素であり、Ｒ２およびＲ３はハロ部分である、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記化合物は、（Ｚ）−５−（３，５−ジブロモ−ベンジリデン）−３−（１−メチル−シクロヘキシルメチル）−チアゾリジン−２−４−ジオン、（Ｚ）−５−（３，５−ジブロモ−ベンジリデン）−３−（２−エチル−ブチル）−チアゾリジン−２−４−ジオン、（Ｚ）−５−（３，５−ジブロモ−ベンジリデン）−３−（２−エチル−ペンチル）−チアゾリジン−２−４−ジオン、（Ｚ）−５−（３，５−ジブロモ−ベンジリデン）−３−（４−イソプロピル−ベンジル）−チアゾリジン−２−４−ジオン、（Ｚ）−３−（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−５−（３，５−ジブロモ−ベンジリデン）−チアゾリジン−２−４−ジオン、（Ｚ）−５−（３，５−ジブロモ−ベンジリデン）−３−（２−トリフルオロメチル−ベンジル）−チアゾリジン−２−４−ジオン、（Ｚ）−３−シクロヘキシルメチル−５−（３，５−ジブロモ−ベンジリデン）−チアゾリジン−２−４−ジオン、（Ｚ）−３−ベンジル−５−（３，５−ジブロモ−ベンジリデン）−チアゾリジン−２−４−ジオン、（Ｚ）−３−シクロヘプチルメチル−５−（３，５−ジブロモ−ベンジリデン）−チアゾリジン−２−４−ジオン、および（Ｚ）−５−（３，５−ジブロモ−ベンジリデン）−３−イソブチル−チアゾリジン−２−４−ジオンからなる群より選択される、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記被験体は癌を有するリスクが高いかまたは癌を有すると診断された、項目１に記載の方法。
（項目１１）
被験体において解糖を阻害するための方法であって、該方法は、式ＩＩ：
【化５３】
0005847085.tif 000003
の化合物を含む医薬組成物を該被験体に投与することを包含し、式中、
Ｒ１は、アリール、アルキル、ヘテロアリール、シクロアルキル、およびヘテロシクロアルキル基から選択され、
Ｒ２は、水素、ハロ、およびニトロ部分、ならびにアルキル、アルコキシ、およびハロアルキル基から選択され、
Ｒ３は、水素およびハロ部分ならびにアルキル、アルコキシ、およびハロアルキル基から選択される、
方法。
（項目１２）
Ｒ１は
【化５４】
0005847085.tif 000004
から選択される、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
Ｒ２は、水素、ブロモ、クロロ、メチル、メトキシ、エトキシ、およびニトロから選択され、Ｒ３は、水素、メチル、メトキシ、およびブロモから選択される、項目１１に記載の方法。
（項目１４）
前記化合物は、構造：
【化５５】
0005847085.tif 000005
を有する、項目１１に記載の方法。
（項目１５）
前記被験体は癌を有するリスクが高いかまたは癌を有すると診断された、項目１１に記載の方法。
（項目１６）
被験体において解糖を阻害する方法であって、該方法は、式ＩＩＩ：
【化５６】
0005847085.tif 000006
の化合物を含む医薬組成物を該被験体に投与することを包含し、式中、
Ｒ１は低級アルキル基であり、Ｒ２はハロ、メチル、メトキシ、エチル部分から選択される、
方法。
（項目１７）
前記化合物は、５−［３−ブロモ−４−（６−エトキシ−２，５，７，８−テトラメチル−クロマン−２−イルメトキシ）−ベンジリデン］−チアゾリジン−２，４−ジオン、５−［４−（６−ブトキシ−２，５，７，８−テトラメチル−クロマン−２−イルメトキ
シ）−３−メトキシ−ベンジリデン］−チアゾリジン−２，４−ジオン、および４−｛２−［２−ブロモ−４−（２，４−ジオキソ−チアゾリジン−５−イリデンメチル）−フェノキシメチル］−２，５，７，８−テトラメチル−クロマン−６−イルオキシ｝−ブチロニトリルからなる群より選択される、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
被験体において解糖を阻害する方法であって、該方法は、式ＩＶ：
【化５７】
0005847085.tif 000007
の化合物を含む医薬組成物を該被験体に投与することを包含し、式中、
Ｒ１は水素、メチル、またはトリフルオロメチル部分であり、Ｒ２はメトキシまたはニトロ部分であり、そしてＲ３はアルキルまたはシクロアルキル基である、
方法。
（項目１９）
前記化合物は、４−メトキシ−Ｎ−｛４−［３−（１−メチル−シクロヘキシルメチル）−２，４−ジオキソ−チアゾリジン−５−イリデンメチル］−フェニル｝−ベンゼンスルホンアミド、Ｎ−｛４−［３−（１−メチル−シクロヘキシルメチル）−２，４−ジオキソ−チアゾリジン−５−イリデン−メチル］−フェニル｝−４−ニトロ−３−トリフルオロメチル−ベンゼンスルホンアミド、およびＮ−｛４−［３−（１−メチル−シクロヘキシルメチル）−２，４−ジオキソ−チアゾリジン−５−イリデンメチル］−フェニル｝−４−ニトロ−ベンゼンスルホンアミドからなる群より選択される、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
式ＩＩＩ：
【化５８】
0005847085.tif 000008
の化合物であって、式中、Ｒ１は低級アルキル基であり、Ｒ２はハロ、メチル、メトキシ、エチル部分から選択される、式ＩＩＩの化合物；
式Ｉ：
【化５９】
0005847085.tif 000009
の化合物であって、式中、Ｒ１はヒドロキシルであり、Ｒ２はトリフルオロメチルであり、Ｒ３は水素であり、そしてＲ４はアルキルまたはシクロアルキル基である、式Ｉの化合物；および
式ＩＶ：
【化６０】
0005847085.tif 000010
の化合物であって、式中、Ｒ１は水素、メチル、またはトリフルオロメチル部分であり、Ｒ２はメトキシまたはニトロ部分であり、そしてＲ３はアルキルまたはシクロアルキル基である、式ＩＶの化合物
からなる群より選択される有効量のチアゾリジンジオン誘導体を提供することによって、アデノシン一リン酸活性化プロテインキナーゼを活性化する方法。
（項目２１）
前記チアゾリジンジオン誘導体は、式ＩＩＩ：
【化６１】
0005847085.tif 000011
の化合物であり、式中、Ｒ１は低級アルキル基であり、Ｒ２はハロ、メチル、メトキシ、エチル部分から選択される、
項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記化合物は、５−［３−ブロモ−４−（６−エトキシ−２，５，７，８−テトラメチル−クロマン−２−イルメトキシ）−ベンジリデン］−チアゾリジン−２，４−ジオン、５−［４−（６−ブトキシ−２，５，７，８−テトラメチル−クロマン−２−イルメトキシ）−３−メトキシ−ベンジリデン］−チアゾリジン−２，４−ジオン、および４−｛２−［２−ブロモ−４−（２，４−ジオキソ−チアゾリジン−５−イリデンメチル）−フェノキシメチル］−２，５，７，８−テトラメチル−クロマン−６−イルオキシ｝−ブチロニトリルからなる群より選択される、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記チアゾリジンジオン誘導体は、式Ｉ：
【化６２】
0005847085.tif 000012
の化合物であり、式中、Ｒ１はヒドロキシルであり、Ｒ２はトリフルオロメチルであり、Ｒ３は水素であり、そしてＲ４はアルキルまたはシクロアルキル基である、
項目２０に記載の方法。
（項目２４）
前記化合物は、５−（４−ヒドロキシ−３−トリフルオロメチル−ベンジリデン）−３−（１−メチル−シクロヘキシルメチル）−チアゾリジン−２，４−ジオンおよび５−（４−ヒドロキシ−３−トリフルオロメチル−ベンジリデン）−３−プロピル−チアゾリジン−２，４−ジオンからなる群より選択される、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記チアゾリジンジオン誘導体は、式ＩＩＩ
【化６３】
0005847085.tif 000013
の化合物であり、式中、Ｒ１は低級アルキル基であり、Ｒ２はハロ、メチル、メトキシ、エチル部分から選択される、
項目２０に記載の方法。
（項目２６）
前記化合物は、４−メトキシ−Ｎ−｛４−［３−（１−メチル−シクロヘキシルメチル）−２，４−ジオキソ−チアゾリジン−５−イリデンメチル］−フェニル｝−ベンゼンスルホンアミド、Ｎ−｛４−［３−（１−メチル−シクロヘキシルメチル）−２，４−ジオキソ−チアゾリジン−５−イリデン−メチル］−フェニル｝−４−ニトロ−３−トリフルオロメチル−ベンゼンスルホンアミド、およびＮ−｛４−［３−（１−メチル−シクロヘキシルメチル）−２，４−ジオキソ−チアゾリジン−５−イリデンメチル］−フェニル｝−４−ニトロ−ベンゼンスルホンアミドからなる群より選択される、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
被験体においてＩＬ−６発現を阻害する方法であって、該方法は、
式ＩＩＩ：
【化６４】
0005847085.tif 000014
の化合物であって、式中、Ｒ１は低級アルキル基であり、Ｒ２はハロ、メチル、メトキシ、エチル部分から選択される、式ＩＩＩの化合物；
式Ｉ：
【化６５】
0005847085.tif 000015
の化合物であって、式中、Ｒ１はヒドロキシルであり、Ｒ２はトリフルオロメチルであり、Ｒ３は水素であり、およびＲ４はアルキルまたはシクロアルキル基である、式Ｉの化合物；および
式ＩＶ：
【化６６】
0005847085.tif 000016
の化合物であって、式中、Ｒ１は水素、メチル、またはトリフルオロメチル部分であり、Ｒ２はメトキシまたはニトロ部分であり、およびＲ３はアルキルまたはシクロアルキル基である、式ＩＶの化合物
からなる群より選択されるチアゾリジンジオン誘導体を含む医薬組成物を該被験体に投与することを包含する、方法。
（項目２８）
前記化合物は、５−［３−ブロモ−４−（６−エトキシ−２，５，７，８−テトラメチル−クロマン−２−イルメトキシ）−ベンジリデン］−チアゾリジン−２，４−ジオン、５−［４−（６−ブトキシ−２，５，７，８−テトラメチル−クロマン−２−イルメトキシ）−３−メトキシ−ベンジリデン］−チアゾリジン−２，４−ジオン、および４−｛２−［２−ブロモ−４−（２，４−ジオキソ−チアゾリジン−５−イリデンメチル）−フェノキシメチル］−２，５，７，８−テトラメチル−クロマン−６−イルオキシ｝−ブチロニトリルからなる群より選択される、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記化合物は、５−（４−ヒドロキシ−３−トリフルオロメチル−ベンジリデン）−３−（１−メチル−シクロヘキシルメチル）−チアゾリジン−２，４−ジオンおよび５−（４−ヒドロキシ−３−トリフルオロメチル−ベンジリデン）−３−プロピル−チアゾリジン−２，４−ジオンからなる群より選択される、項目２７に記載の方法。
（項目３０）
前記化合物は、４−メトキシ−Ｎ−｛４−［３−（１−メチル−シクロヘキシルメチル）−２，４−ジオキソ−チアゾリジン−５−イリデンメチル］−フェニル｝−ベンゼンスルホンアミド、Ｎ−｛４−［３−（１−メチル−シクロヘキシルメチル）−２，４−ジオキソ−チアゾリジン−５−イリデン−メチル］−フェニル｝−４−ニトロ−３−トリフルオロメチル−ベンゼンスルホンアミド、およびＮ−｛４−［３−（１−メチル−シクロヘキシルメチル）−２，４−ジオキソ−チアゾリジン−５−イリデンメチル］−フェニル｝−４−ニトロ−ベンゼンスルホンアミドからなる群より選択される、項目２７に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、エネルギー制限模倣剤として作用する能力を持つチアゾリジンジオン類（ＴＺＤ）に影響される様々な因子を示す概略図を提供する。
【図２】図２は、多数のチアゾリジンジオン化合物のライブラリを作成する固相法を示す概略図および表を提供する。図の上部分は推定合成スキームを示し、図の下部分はライブラリを構成する化合物に存在するＲ１およびＲ２の置換基を示す。
【図３】図３は、ＴＺＤのＰＰＡＲγ非依存抗増殖効果を示すグラフおよび免疫ブロットを提供する。セクションＡ）は、非悪性前立腺上皮細胞（ＰｒＥＣ）に対してのＬＮＣａＰ前立腺癌細胞およびＭＣＦ−７乳癌細胞を１０％ＦＢＳ補足培地に７２時間放置したときの生存度に与える、２つのエネルギー制限模倣剤、レスベラトロル（Ｒｅｓｖ）および２−デオキシグルコース（２−ＤＧ）に比べてのトログリタゾン（ＴＧ）、シグリタゾン（ＣＧ）、ＳＴＧ２８（ＳＴＧ）、およびＯＳＵ−ＣＧ１２（ＣＧ１２）の用量依存効果を示す。ＭＴＴデータは、平均値±９５％信頼区間（エラーバー）（ｎ＝６）として表されている。セクションＢ）は、ＰｒＥＣにおいてのβ−ＴｒＣＰ、Ｓｐ１、およびアンドロゲン受容体（ＡＲ）の発現量に与える、ＯＳＵ−ＣＧ１２の効果の欠如を示すもので、ＯＳＵ−ＣＧ１２の抗増殖活性に対する非悪性ＰｒＥＣの耐性を実証している。これらウェスタンブロットは３つの独立した実験を代表するものであり、すべてが類似の結果を示している。
【図４】図４は、ＴＺＤが自食を誘発するという証拠を提供する。左側パネルは、ＬＣ３−Ｉから、自食のマーカーであるＬＣ３−ＩＩへの変換に与える、５μＭのＯＳＵ−ＣＧ１２の時間依存効果を提供するが、このマーカーは自食阻害剤３−ＭＡ（１ｍＭ）によってブロックされ得る。ＬＮＣａＰ細胞を、ＧＦＰ−ＬＣ３プラスミドにより一時的にトランスフェクトし、続いて５μＭのＯＳＵ−ＣＧ１２に単独でまたは３−ＭＡの存在下で所定時間にわたって露出させた。ＧＦＰの免疫ブロットを行って、ＬＣ３−ＩＩの形成を検出した。右側パネルは、ＧＦＰ−ＬＣ３蛍光発光のパターンに与える、５μＭのＯＳＵ−ＣＧ１２単独のまたは１ｍＭの３−メチルアデニン（３−ＭＡ）の存在下での効果についての顕微分析からの画像を提供する。ＣＧ１２群で明らかな斑点パターンは、それが蓄積して自食胞となっていることを示している。６ウェルプレートで培養されたＧＦＰ−ＬＣ３発現ＬＮＣａＰ細胞に３６時間異なる薬物処理を施し、次に蛍光顕微鏡検査によって検査した。これら免疫ブロットおよび顕微鏡によるデータは３つの実験を代表するものであり、すべてが類似の結果を示している。
【図５】図５は、エネルギー制限およびＴＺＤがβ−ＴｒＣＰ介在タンパク質分解を助長する能力を共有していることを示す免疫ブロットを提供する。ＬＮＣａＰおよびＭＣＦ−７細胞を、図のように、トログリタゾン（ＴＧ）、ＳＴＧ２８、シグリタゾン（ＣＧ）、ＯＳＵ−ＣＧ１２（ＣＧ１２）、２つのエネルギー制限模倣剤である２−デオキシグルコース（２−ＤＧ）およびレスベラトロル、ならびに無グルコース培地（グルコース飢餓）に露出して、β−ＴｒＣＰ介在タンパク質分解の化合物における効果をウェスタンブロット法により評価した。これらの終点は、β−ＴｒＣＰ、β−ＴｒＣＰ基質、およびＳｐ１標的遺伝子産物の発現、ならびにβ−ＴｒＣＰ基質の認知の助長に関与するキナーゼのリン酸化の状態とした。免疫ブロットは３つの独立した実験を代表するものである。
【図６】図６は、ＴＺＤが、ＬＮＣａＰ細胞内のエネルギー制限に関連した細胞応答を引き出す２−デオキシグルコース（２−ＤＧ）およびグルコース飢餓の能力を共有していることを示す免疫ブロットを提供する。セクションＡ）は、エネルギー制限関連（Ｓｉｒｔ１発現、ｐ５３脱アセチル化、ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）リン酸化、および小胞体（ＥＲ）ストレス指標ＧＲＰ７８の発現）ならびにβ−ＴｒＣＰ依存タンパク質分解関連（β−ＴｒＣＰ、Ｓｐ１、およびサイクリンＤ１の発現量）の様々なマーカーに与える、１０ｍＭの２−ＤＧおよびグルコース飢餓に比べての１０μＭのＯＳＵ−ＣＧ１２（ＣＧ１２）の時間依存効果のウェスタンブロット分析を示す。セクションＢ）は、ＡにおけるようにＣＧ１２および２−ＤＧで処置されたＬＮＣａＰ細胞でのＲＴ−ＰＣＲによるＳｉｒｔ１、ＧＲＰ７８、β−ＴｒＣＰ、Ｓｐ１、およびサイクリンＤ１のｍＲＮＡ発現量の平行分析を示す。セクションＣ）は、ＬＮＣａＰ細胞でのＥＲストレスおよびＡＭＰＫ／ｍＴＯＲ／ｐ７０Ｓ６Ｋシグナル伝達に与える、２−ＤＧ、レスベラトロル、およびグルコース飢餓に対しての様々な用量でのＴＺＤの効果のウェスタンブロット分析を示す。ＥＲストレスの指標には、ＩＲＥ１α、ＥＲストレスセンサ、ＧＲＰ７８およびＧＡＤＤ１５３の発現量が含まれた。免疫ブロットおよびＰＣＲの結果は３つの独立した実験を代表するものである。
【図７】図７は、ＴＺＤが、グルコース摂取をブロックすることによってエネルギー代謝を標的にすることを示すグラフおよび免疫ブロットを提供する。セクションＡ）は、［３Ｈ］−２−デオキシグルコース（［３Ｈ］−２ＤＧ）摂取に与える、ＯＳＵ−ＣＧ１２（ＣＧ１２、左側パネル）およびレスベラトロル（中央パネル）の用量および時間依存効果を示す。データは、平均値±９５％信頼区間（エラーバー）（ｎ＝３）として表されている。右側パネルはＯＳＵ−ＣＧ１２およびレスベラトロルの球棒構造を示す。セクションＢ）は、ＬＮＣａＰ細胞での解糖速度（左側パネル）ならびにＮＡＤＨ（中央パネル）および乳酸塩（右側パネル）の細胞内濃度に与える、１０ｍＭの２−ＤＧに比べての１０μＭのＯＳＵ−ＣＧ１２の時間依存効果を示す。データは、平均値±９５％信頼区間（エラーバー）（ｎ＝３）として表されている。セクションＣ）は、補足グルコースが、ＬＮＣａＰ細胞でのＯＳＵ−ＣＧ１２の抗増殖活性に対する用量依存防御を提供することを実証している。表示した濃度のグルコースの存在下で培養した細胞の生存度を、７２時間の薬物処置の後ＭＴＴアッセイによって決定した。データは、平均値±９５％信頼区間（エラーバー）（ｎ＝６）として表されている。セクションＤ）では、左側パネルは、補足グルコース（２０ｍｇ／ｍｌ）が、２４時間にわたるＬＮＣａＰ細胞でのＯＳＵ−ＣＧ１２によるＳｉｒｔ１の一時的な誘発およびその結果としてのｐ５３の脱アセチル化を覆したことを実証している。Ｄ）の右側パネルは、補足グルコースが、ＰＡＲＰ開裂、ＡＭＰＫ活性化、および異なる用量のＯＳＵ−ＣＧ１２で処置されたＬＮＣａＰ細胞でのＧＲＰ７８、ＧＡＤＤ１５３、およびβ−ＴｒＣＰの発現の誘発を実証している。これら免疫ブロット結果は３つの独立した実験を代表するものである。
【図８】図８は、β−ＴｒＣＰ発現がエネルギー制限模倣剤の抗増殖効果にとって重要であり、またβ−ＴｒＣＰタンパク質のＳｉｒｔ１介在安定化によって上方調節されることを示すグラフおよび免疫ブロットを提供する。セクションＡ）は、ＯＳＵ−ＣＧ１２（ＣＧ１２、左側パネル）および２−デオキシグルコース（２−ＤＧ、左側パネル）によるＬＮＣａＰ細胞生存度の用量依存阻害に与える、β−ＴｒＣＰのワイルドタイプ（ＷＴ）または優性ネガティブ（ΔＦ）形態の異所性発現の効果を示す。細胞生存度は、ＭＴＴアッセイによって決定した。データは、平均値±９５％信頼区間（エラーバー）（ｎ＝６）として表されている。ｐＣＭＶは空ベクターによりトランスフェクトされた細胞である。セクションＢ）は、ＬＮＣａＰ細胞でのＰＡＲＰ開裂を助長するＯＳＵ−ＣＧ１２（５μＭ）および２−ＤＧ（５ｍＭ）の能力に与える、ＷＴ（ＷＴ−β−ＴｒＣＰ−Ｍｙｃ）および優性ネガティブ（ΔＦ−β−ＴｒＣＰ−Ｍｙｃ）β−ＴｒＣＰの異所性発現の効果を示す。セクションＣ）は、Ｓｉｒｔ１上方調節により、ＯＳＵ−ＣＧ１２処置されたＬＮＣａＰ細胞でのβ−ＴｒＣＰ発現量が高まることを示す。左側パネルでは、血球凝集素タグ化Ｓｉｒｔ１（ＨＡ−Ｓｉｒｔ１）の異所性発現により、β−ＴｒＣＰ発現が用量依存で上昇し、これに対応して標的タンパク質サイクリンＤ１およびＳｐ１の発現が減少した。右側パネルでは、Ｓｉｒｔ１の優性ネガティブ阻害により、ＯＳＵ−ＣＧ１２介在β−ＴｒＣＰ誘発およびＰＡＲＰ開裂がブロックされた。セクションＤ）は、Ｓｉｒｔ１によりタンパク質安定化を介してβ−ＴｒＣＰ発現が増加したという証拠を提供する。左側パネルでは、Ｓｉｒｔ１脱アセチル化活性が、ＯＳＵ−ＣＧ１２によるβ−ＴｒＣＰタンパク質の安定化にとって不可欠である。ニコチンアミドまたはスプリトマイシンによるＳｉｒｔ１脱アセチル化活性の薬理学的阻害により、β−ＴｒＣＰタンパク質安定性を向上させるＯＳＵ−ＣＧ１２の能力が覆された。ＬＮＣａＰ細胞を１２時間、５μＭのＯＳＵ−ＣＧ１２により、単独でまたは５０ｍＭのニコチンアミドもしくは２００μＭのスプリトマイシンの存在下で前処理し、続いて、さらに１２または２４時間、１００μｇ／ｍＬのシクロヘキシミドにより処置した。右側パネルでは、ＲＴ−ＰＣＲ分析により、上述のように処置されたＬＮＣａＰ細胞でのβ−ＴｒＣＰ  ｍＲＮＡレベルが変わらないままであることが分かった。すべての免疫ブロットおよびＰＣＲの結果は３つの独立した実験を代表するものである。
【図９】図９は、ＡＭＰＫの優性ネガティブまたは薬理学的阻害はＯＳＵ−ＣＧ１２介在自食をブロックしたが、アポトーシスまたはＥＲストレスには効果がなかったことを示す免疫ブロットを提供する。左側パネルでは、ｐ−ｍＴＯＲ、ｐ−ｐ７０Ｓ６Ｋ、β−ＴｒＣＰ、およびＧＡＤＤ１５３の発現量、ＧＦＰ−ＬＣ３の変換、ならびにＧＦＰ−ＬＣ３発現ＬＮＣａＰ細胞でのＰＡＲＰ開裂を調整するＯＳＵ−ＣＧ１２（５μＭ）の能力に与える、ＡＭＰＫのＫ４５Ｒキナーゼデッド型優性ネガティブ（ＤＮ）形態に対してのワイルドタイプ（ＷＴ）形態の異所性発現の効果を示す。右側パネルでは、ＡＭＰＫの薬理学的阻害剤である化合物Ｃの効果の平行分析である。
【図１０】図１０は、ＴＳＣ２のｓｈＲＮＡ介在ノックダウンにより細胞がＯＳＵ−ＣＧ１２誘発自食から防御されたことを示す免疫ブロットおよび顕微鏡画像を提供する。左側パネルでは、ＯＳＵ−ＣＧ１２処置細胞でのＴＳＣ２およびｐ−ＡＭＰＫ発現のウェスタンブロット分析により、ＴＳＣ２のｓｈＲＮＡ介在ノックダウンの有効性の確認を示す。右側パネルでは、スクランブル化またはＴＳＣ２  ｓｈＲＮＡによりトランスフェクトされたＧＦＰ−ＬＣ３発現ＬＮＣａＰ細胞をＤＭＳＯまたは５μＭのＯＳＵ−ＣＧ１２に３６時間露出させ、次に蛍光顕微鏡検査によって検査してＧＦＰ−ＬＣ３蛍光発光のパターンを評価した。
【図１１】図１１は、ＯＳＵ−ＣＧ１２が、ＡＭＰＫ／ＴＳＣ２／ｍＴＯＲ／ｐ７０Ｓ６Ｋシグナル経路を標的にすることによって自食を誘発することを示すグラフおよび免疫ブロットを提供する。セクションＡ）は、ＡＭＰＫの優性ネガティブ阻害によりＬＮＣａＰ細胞がＯＳＵ−ＣＧ１２介在抗増殖効果から部分的に防御されたことを示す。データは、平均値±９５％信頼区間（エラーバー）（ｎ＝６）として表されている。セクションＢ）は、ＧＡＤＤ１５３（ＤＤＩＴ３）のｓｉＲＮＡ介在ノックダウンが、ＰＡＲＰ開裂、β−ＴｒＣＰ誘発、ＡＭＰＫ活性化のいずれにも影響を与えなかったことを示す。すべての免疫ブロットおよび蛍光顕微鏡検査のデータは３つの独立した実験を代表するものである。
【図１２】図１２において、セクション（Ａ）は、先導ＡＭＰＫ活性剤を同定するための、ベンジリデン−チアゾリジンジオン系の集中化合物ライブラリの２段スクリーニングの概略表示を提供する。セクション（Ｂ）は、シリーズＡ−Ｃ化合物の一般的な合成手順を提供する。反応条件：シリーズＡ：ａ、Ｋ２ＣＯ３／Ｒ１−Ｂｒ；ｂ、ＬＡＨ、ＴＨＦ；ｃ、（ＣＦ３ＳＯ２）２Ｏ、ピリジン、ＣＨ２Ｃｌ２；ｄ、Ｋ２ＣＯ３、ＤＭＦ；ｅ、ＡｃＯＨ、ピペリジン、エタノール／還流。シリーズＢ：ａ、ＡｃＯＨ、ピペリジン、エタノール／還流；ｂ、Ｋ２ＣＯ３、ＤＭＦ。シリーズＣ：ａ、Ｋ２ＣＯ３、ＤＭＦ；ｂ、ピペリジン、ＣＨ２Ｃｌ２；ｃ、ＬＡＨ、ドライＴＨＦ、０℃；ｄ、ＭｎＯ２、ＣＨ２Ｃｌ２、還流；ｄ、ピペリジン、ＥｔＯＨ、還流；ｅ、ＡｃＯＨ、ピペリジン、エタノール／還流。
【図１３】図１３は、チアゾリジンジオン系の集中化合物ライブラリにおける化合物１〜６０の化学構造を提供する。
【図１４】図１４において、セクション（Ａ）は、ｍＴＯＲおよびＩＬ−６／ＩＬ−６受容体介在のシグナル経路の負の調節剤としてのＡＭＰＫの役割の概略表示を提供する。セクション（Ｂ）は、６時間の処置後、１０％のＦＢＳ含有培地において、ＬＰＳ処理されたおよび非処置（対照）のＴＨＰ−１マクロファージにおける場合に対しての、ＬＰＳ処理されたＴＨＰ−１細胞でのＡＭＰＫ、ｐ７０Ｓ６Ｋ、およびＳｔａｔ３のリン酸化に与える、各１０μＭでのシグリタゾンおよび６２の効果のウェスタンブロット分析を提供する。（Ｃ）左側パネルは、６時間の処置後、１０％のＦＢＳ含有培地において、ＴＨＰ−１マクロファージでのＬＰＳ刺激ＩＬ−６の産生に与える、表示した濃度のシグリタゾン（ＣＧ）および６２の阻害効果のＥＬＩＳＡ分析である。カラムは平均；バーはＳＤ（Ｎ＝３）。右側パネルは、ＭＴＴアッセイ（Ｎ＝６）によるＴＨＰ−１細胞の生存度に与える対応する効果である。
【図１５】図１５において、セクション（Ａ）は、６時間の処置後、１０％のＦＢＳ含有培地における、ＬＰＳ処理のみ（Ｌ）および非処置（対照）のＴＨＰ−１マクロファージにおける場合に対しての、ＬＰＳ処理されたＴＨＰ−１細胞でのＡＭＰＫ、ｐ７０Ｓ６Ｋ、およびＳｔａｔ３のリン酸化に与える、各１０μＭでのシグリタゾン（ＣＧ）に比べての化合物１〜６０の効果のウェスタンブロット分析を提供する。セクション（Ｂ）の上側パネルは、６時間の処置後、１０％のＦＢＳ含有培地における、ＴＨＰ−１マクロファージでのＬＰＳ刺激ＩＬ−６の産生に与える、各１０μＭでのシグリタゾン（ＣＧ）に比べての化合物１〜６０の阻害効果のＥＬＩＳＡ分析を提供する。カラムは平均；バーはＳＤ（Ｎ＝３）。下側パネルは、ＭＴＴアッセイ（Ｎ＝６）によるＴＨＰ−１細胞の生存度に与える対応する効果を示す。
【図１６】図１６において、セクション（Ａ）は、分化されたＴＨＰ−１細胞でのＰＰＡＲγ活性化に与える、各１０μＭでのシグリタゾン（ＣＧ）に比べての化合物８、１２、３１、４４、４９、５３および５４の効果を示す。ＴＨＰ−１細胞を、ＰＰＲＥ−ｘ３−ＴＫ−Ｌｕｃレポーターベクターにより一時的にトランスフェクトし、次に１０％ＦＢＳ補足ＲＰＭＩ１６４０培地で４８時間、個々の薬剤またはＤＭＳＯビヒクルに露出させた。カラムは平均；バーはＳＤ（Ｎ＝６）。セクション（Ｂ）の上側パネルは、６時間の処置後、１０％のＦＢＳ含有培地における、ＴＨＰ−１マクロファージでのＬＰＳ刺激ＩＬ−６の産生に与える、各１μＭでのシグリタゾン（ＣＧ）に比べての化合物８、１２、２１、３１、４４、４９、５３および５４の阻害効果のＥＬＩＳＡ分析を提供する。カラムは平均；バーはＳＤ（Ｎ＝３）。下側パネルは、ＭＴＴアッセイ（Ｎ＝６）によるＴＨＰ−１細胞の生存度に与える対応する効果を示す。
【図１７】図１７において、セクション（Ａ）は、６時間の処置後、１０％のＦＢＳ含有培地における、ＴＨＰ−１マクロファージでのＬＰＳ刺激ＩＬ−６の産生に与える、化合物５３の用量依存効果のＥＬＩＳＡ分析を提供する。カラムは平均；バーはＳＤ（Ｎ＝３）。セクション（Ｂ）は、６時間の処置後、１０％のＦＢＳ含有培地における、ＬＰＳ処理されたＴＨＰ−１マクロファージでのｍＲＮＡレベルのＩＬ−６に与える、化合物５３の用量依存抑制効果のＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を示す。カラムは平均；バーはＳＤ（Ｎ＝３）。セクション（Ｃ）は、６時間の処置後、１０％のＦＢＳ含有培地における、ＬＰＳ処理されたＴＨＰ−１マクロファージでのＡＭＰＫおよびｐ７０Ｓ６Ｋのリン酸化レベルに与える、０．５ｍＭのＡＩＣＡＲに対しての化合物５３の用量依存効果のウェスタンブロット分析を示す。
【図１８】図１８において、セクション（Ａ）は、優性ネガティブ（ＤＮ）ＡＭＰＫプラスミドまたはｐＣＭＶ空ベクターにより一時的にトランスフェクトされたＴＨＰ−１マクロファージでのＡＭＰＫの発現量のウェスタンブロット分析を提供する。セクション（Ｂ）は、１０μＭの化合物５３と共同処置されたまたはされていないＴＨＰ−１マクロファージでのＬＰＳ刺激ＩＬ−６産生に与える、ＤＮ−ＡＭＰＫの異所性発現の防御効果を示す。カラムは平均；バーはＳＤ（Ｎ＝３）。セクション（Ｃ）は、１０％のＦＢＳ含有培地における、Ｃ−２６腺癌細胞でのＡＭＰＫおよびｐ７０Ｓ６Ｋのリン酸化レベルに与える、化合物５３の用量依存および時間依存効果のウェスタンブロット分析を示す。セクション（Ｄ）は、ＰＴ１およびＡ−７６９６６２に対しての化合物５３の表面静電位および構造を示す。
【図１９】図１９は、様々な癌細胞株における化合物５３および５４の細胞生存度を示すグラフを提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、チアゾリジンジオン誘導体を含む医薬組成物を被験体に投与することを包含する、被験体でのエネルギー代謝を制限する方法を提供する。特に、本発明は、式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、または式ＩＶによるチアゾリジンジオン誘導体を含む医薬組成物を被験体に投与することを包含する、被験体において解糖を阻害する方法を提供する。本発明は、エネルギー代謝を制限するためにこれまで使用されていない多数のチアゾリジンジオン誘導体であって、これらの多くは従来のエネルギー制限模倣剤より高い効能を示す誘導体を提供する。
【００１７】
別の局面では、本発明は、有効量のチアゾリジンジオン誘導体を送達することによって、アデノシン一リン酸活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）を活性化させる方法を提供する。特に、本発明は、式Ｉ、式ＩＩＩ、または式ＩＶによる有効量のチアゾリジンジオン誘導体を提供することによって、ＡＭＰＫを活性化させる方法を提供する。ＡＭＰＫの活性化によりＩＬ−６が阻害されるため、これらチアゾリジンジオン誘導体はまた、式Ｉ、ＩＩＩ、またはＩＶによるチアゾリジンジオン誘導体を含む医薬組成物を被験体に投与することにより、被験体においてＩＬ−６発現を阻害する方法においても使用され得る。
【００１８】
定義
本明細書にて示される用語は、実施形態の説明のためのみのものであって、本発明を全体として限定するものとして解釈されるべきではない。本発明の説明および添付の請求の範囲において使用されるものとして、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、これらの前後の文脈によって禁忌とされない限り、それらの複数形を含む。
【００１９】
本明細書で用いられる用語「有機基」は、脂肪族基、環状基、または脂肪族基と環状基との組み合わせ（例えば、アルカリルおよびアラルキル基）として分類される炭化水素基を意味するために用いられる。本発明の文脈では、本発明のチアゾリジンジオン類のための適切な有機基は、チアゾリジンジオン類のエネルギー制限活性を妨害しないものである。本発明の文脈では、用語「脂肪族基」は、飽和または不飽和で線状または分枝状の炭化水素基を意味する。この用語は、例えばアルキル、アルケニル、およびアルキニル基を包含するために用いられる。
【００２０】
本明細書で用いられる用語「アルキル」、「アルケニル」、および接頭語「ａｌｋ」は、直鎖基および側鎖基を含む。特に指定しない限り、これらの基は１〜２０個の炭素原子を含有し、アルケニル基は２〜２０個の炭素原子を含有する。いくつかの実施形態では、これらの基は、合計多くて１０個の炭素原子、多くて８個の炭素原子、多くて６個の炭素原子、または多くて４個の炭素原子を有する。４個以下の炭素原子を含むアルキル基はまた低級アルキル基とも称され得る。アルキル基はまた、これらが含む炭素原子の数によって参照され得る（すなわち、Ｃ１〜Ｃ４アルキル基は、１〜４個の炭素原子を含むアルキル基である）。
【００２１】
本明細書で用いられるシクロアルキルは、環構造を形成するアルキル基（すなわち、アルキル、アルケニル、またはアルキニル基）を指す。環状基は、単環式または多環式であり得、好ましくは３〜１０個の環状炭素原子を有し得る。シクロアルキル基は、４個以下の炭素原子を含むアルキル基を介して主構造に結合することができる。環状基の例としては、シクロプロピル、シクロプロピルメチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、アダマンチル、ならびに置換および非置換のボルニル、ノルボルニル、およびノルボルネニルが挙げられる。
【００２２】
特に指定しない限り、「アルキレン」および「アルケニレン」は、上記に定義した「アルキル」および「アルケニル」基の二価の形態である。用語「アルキレニル」および「アルケニレニル」は、それぞれ「アルキレン」および「アルケニレン」が置換されるときに用いられる。例えば、アリールアルキレニル基は、アリール基が結合するアルキレン部分を備えている。
【００２３】
用語「ハロアルキル」は、ペルフルオロ化基を含む、１個以上のハロゲン原子によって置換される基を含む。これはまた、接頭語「ハロ」を含む他の基にも当てはまる。適切なハロアルキルの例としては、クロロメチル、トリフルオロメチルなどがある。ハロ部分としては、塩素、臭素、フッ素、およびヨウ素を含む。
【００２４】
本明細書で用いられる用語「アリール」は、カルボシクリック芳香族環または環系を含む。アリール基の例としては、フェニル、ナフチル、ビフェニル、フルオレニルおよびインデニルが挙げられる。アリール基は置換されても非置換でもよい。
【００２５】
特に指定しない限り、用語「ヘテロ原子」とは原子Ｏ、Ｓ、またはＮのことである。用語「ヘテロアリール」は、少なくとも１つの環ヘテロ原子（例えば、Ｏ、Ｓ、Ｎ）を含有する芳香族環または環系を含む。いくつかの実施形態では、用語「ヘテロアリール」は、２〜１２個の炭素原子を含有する環または環系、１〜３個の環、１〜４個のヘテロ原子、およびヘテロ原子としてＯ、Ｓ、および／またはＮを含む。適切なヘテロアリール基としては、フリル、チエニル、ピリジル、キノリニル、イソキノリニル、インドリル、イソインドリル、トリアゾリル、ピロリル、テトラゾリル、イミダゾリル、ピラゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、ベンゾフラニル、ベンゾチオフェニル、カルバゾリル、ベンゾキサゾリル、ピリミジニル、ベンズイミダゾリル、キノキサリニル、ベンゾチアゾリル、ナフチリジニル、イソキサゾリル、イソチアゾリル、プリニル、キナゾリニル、ピラジニル、１−オキシドピリジル、ピリダジニル、トリアジニル、テトラジニル、オキサジアゾリル、チアジアゾリルなどが含まれる。
【００２６】
用語「アリーレン」および「ヘテロアリーレン」は、上記に定義された「アリール」および「ヘテロアリール」基の二価の形態である。用語「アリーレニル」および「ヘテロアリーレニル」は、それぞれ「アリーレン」および「ヘテロアリーレン」が置換されるときに用いられる。例えば、アルキルアリーレニル基は、アルキル基が結合するアリーレン部分を備えている。
【００２７】
本明細書で説明するいかなる式またはスキームにおいても、ある基が一度より多く現れる場合、各基（または置換基）は、明示されているかどうかにかかわらず、独立して選択される。例えば、式−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ２において各Ｒ基は独立して選択される。
【００２８】
本出願全体を通して用いられるある特定の用語の検討および再引用を簡単にする手段として、用語「基」および「部分」は、置換を考慮にいれているかまたは置換される可能性のある化学的な種と、そのように置換を考慮にいれていないかまたは置換される可能性のない化学的な種との間を区別するために使用される。従って、用語「基」がある化学的な置換基について説明するために用いられるときは、その説明された化学物質は、非置換基、およびカルボニル基または他の従来の置換基と同様に、鎖に、例えば、非過酸化Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｓｉ、またはＦ原子を有する基を含む。用語「部分」がある化学的な化合物または置換基を説明するために用いられるときは、非置換の化学物質のみが含まれるものとされる。例えば、「アルキル基」という語句は、メチル、エチル、プロピル、ｔｅｒｔ−ブチルなどの純粋な開鎖飽和炭化水素アルキル置換基だけでなく、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキルスルホニル、ハロゲン原子、シアノ、ニトロ、アミノ、カルボキシルなどの当該分野では公知のさらなる置換基を有するアルキル置換基をも含むものとされる。従って、「アルキル基」は、エーテル基、ハロアルキル類、ニトロアルキル類、カルボキシアルキル類、シアノアルキル類などを含む。一方、「アルキル部分」という語句は、メチル、エチル、プロピル、ｔｅｒｔ−ブチルなどの純粋な開鎖飽和炭化水素アルキル置換基の包含に限定される。
【００２９】
本発明は、本明細書で述べる化合物を、異性体（例えば、ジアステレオマーおよびエナンチオマー）、互変体類、塩類、溶媒和物、多形体、プロドラッグ類などを含む薬学的に許容可能ないかなる形態においても含む。特に、化合物が光学活性である場合、本発明は特に、その化合物のエナンチオマーのそれぞれをエナンチオマーのラセミ混合物と共に含む。用語「化合物」は、明示されているかどうかにかかわらず（「塩」が明示されている場合もあるが）、このような形態のいずれかまたはすべてを含むことは理解されたい。
【００３０】
本明細書で用いられる用語チアゾリジンジオン誘導体は、本明細書において提供される式によって記載されるように、本発明のチアゾリジンジオン化合物の簡略形であり、当業者によりチアゾリジンジオンとして特徴付けられ得るすべての可能な化合物を包含するようには意図されない。
【００３１】
本明細書で用いられる「処置する」、「処置すること」、および「処置」などは、少なくとも１つの症状の緩和または抑制、疾患の進行の遅延、疾患の発症の防止または遅延などを通しての状態の改善を含む、癌などの状態または疾患に罹るリスクがあるかまたは罹っている被験体に恩恵をもたらすあらゆる作用のことをいう。被験体は、発癌物質への露出により危険に晒されるとか、解糖を含む障害などに遺伝子的に罹りやすいなどの場合がある。
【００３２】
本明細書で用いられる「薬学的に許容可能な」とは、化合物または組成物が、疾患の重症度および処置の必要性に照らして過度に有害な副作用はなく、本明細書にて述べる方法にとって、被験体への投与に適切であることを意味する。
【００３３】
用語「治療上有効な」および「薬理学的に有効な」とは、他の治療に典型的に関連する有害な副作用などの副作用を避ける一方で疾患の重症度を下げるという目標を実現する各薬剤の量を限定するよう意図される。治療上有効な量は、１以上の用量で投与され得る。一方で、有効量とは、検出可能な量のＡＭＰＫの活性化など、有意の化学効果を提供するのに十分な量である。
【００３４】
チアゾリジンジオン誘導体を用いたエネルギー代謝の制限
本発明は、本発明の１つ以上のチアゾリジンジオン誘導体を被験体に投与することによって被験体でのエネルギー代謝を制限する方法を提供する。特に、本発明は、１つ以上のチアゾリジンジオン誘導体を含む医薬組成物を被験体に投与することによって被験体において解糖を阻害する方法を提供する。
【００３５】
本明細書にて定義する被験体とは、動物、好ましくは家畜（例えば、雌牛、馬、豚）または愛玩動物（例えば、犬、猫）などの哺乳類である。より好ましくは、被験体は人間である。被験体はまた、エネルギー制限を必要とする被験体であり得る。エネルギー制限を必要とする被験体とは、エネルギー制限によって生じる様々な生化学的な効果によりエネルギー制限から利益を得る被験体である。例えば、代謝ストレスを減らす必要がある被験体は、エネルギー制限を必要とする被験体であり得る。エネルギー制限によって生じる他の効果については本明細書に述べる。エネルギー制限を必要とする被験体はまた、癌になるリスクが高いかまたは罹っていると診断された被験体、癌を有すると診断されていない被験体、糖尿病の被験体、代謝障害の被験体、または長寿および／または代謝レベルの低下を望む被験体であり得る。
【００３６】
エネルギー代謝の制限とは、例えば、制約カロリー摂取（すなわち、カロリー制限）などの食事エネルギー制限によってもたらすことができる効果をいう。食事エネルギー制限の結果、グルコース利用可能性が減り、結果としてグルコース代謝および解糖が減少する。解糖とは、１分子のグルコースが２分子のピルビン酸塩に分解され２個のＡＴＰ分子という純益を与える一連の代謝プロセスである。正常の細胞では、解糖は細胞エネルギー産生という最初の工程を提供し、ミトコンドリア中で実行されグルコース分子毎に実質的により多くの量のＡＴＰを生成するトリカルボン酸サイクルへの前駆体である。
【００３７】
エネルギー代謝の制限はまた、エネルギー制限模倣剤と呼ばれる適切な化合物を投与することによって模倣することができる。例えば、２−デオキシグルコースは、ヘキソキナーゼによってリン酸化され、これが次に、累積してさらなるグルコース代謝を妨げるリン酸化状態に閉じ込められる結果として、エネルギー代謝を制限することができる。本発明者によって実行され本明細書に述べる実験により、本発明のチアゾリジンジオン誘導体は、サイレントインフォメーションレギュレータ１（Ｓｉｒｔ１）遺伝子誘発、ＡＭＰＫ活性化、および小胞体ストレスなどの飢餓関連の細胞応答を引き出すことができることが実証される。チアゾリジンジオン誘導体は飢餓関連の細胞応答を引き出すことができるため、また本明細書にて述べる他の理由により、チアゾリジンジオン誘導体は有効なエネルギー制限模倣剤（ＥＲＭ）である。
【００３８】
解糖の阻害の結果、エネルギー代謝が制限される。解糖はグルコースをピルビン酸塩に変換する代謝経路であり、この結果、高エネルギー化合物、ＡＴＰおよびＮＡＤＨが放出される。正常レベルの解糖のいかなる量の減少も、本明細書にて述べる本発明に関してはエネルギー代謝の制限を表す。しかし、本発明の異なる実施形態によって阻害レベルは変動し得る。例えば、チアゾリジンジオン誘導体を投与することにより、解糖は１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくは完全な阻害、またはこの数値範囲内の他のいかなる有意の阻害レベルとなり得る。実現される阻害レベルは、用いられるチアゾリジンジオン誘導体の用量により変動し得、よって用量依存的である。高レベルの解糖阻害を実現可能な一方で、もっと穏当なレベル、すなわち５０％以下の阻害が、高レベルの解糖阻害の潜在的な毒性を避けるため、一般的により臨床上で有用であることは留意されたい。
【００３９】
解糖の阻害は、当業者には公知の様々な異なる化合物および効果を用いて測定することができる一方で、解糖の減少を測定するのに通例用いられるマーカーの例としては、細胞によるグルコース摂取速度の減少、ＮＡＤＨおよび乳酸塩の形成の減少、および自食の増加があり、この自食の増加は、自食胞の形成の対応する増加によって同定することができる。本発明のチアゾリジンジオン誘導体のこれらのおよび他の効果を図１に概略的に示す。
【００４０】
本発明のチアゾリジンジオン誘導体は、グルコースホメオスタシスを破壊し、この結果、一時的なＳｉｒｔ１誘発、ＡＭＰＫ活性化、およびＥＲストレスを含む特徴的な細胞応答が生じる。これら応答のそれぞれが、ＴＺＤの抗腫瘍効果の媒介となる役目を果たす。本発明者のデータにより、Ｓｉｒｔ１誘発とβ−ＴｒＣＰタンパク質蓄積との間の機構的な関連が示され、これが一連のアポトーシス調節タンパク質のプロテアソーム分解および転写抑制を通してアポトーシスに達する。ＡＭＰＫ活性化は、ＡＭＰＫ−ＴＳＣ２−ｍＴＯＲ−ｐ７０Ｓ６Ｋ経路を介して自食という結果となる。ＥＲストレス信号は、ＧＲＰ７８、ＧＡＤＤ１５３およびＩＲＥ１αなどのセンサタンパク質の上方調節を引き起こし、これもまたアポトーシス誘発で役割を果たす。
【００４１】
被験体での解糖の阻害により、１つ以上の有益な効果を得ることができる。例えば、被験体での解糖の阻害により癌を処置する方法を提供することができる。解糖の阻害はまた、癌を有すると診断されていない被験体を含む、被験体において寿命を延ばす（すなわち、寿命延長効果を提供する）ために使用することができる。解糖の阻害はまた、インスリンレベルの低下、代謝障害の処置、または自食の刺激など当業者には公知のいかなる他の効果を提供するためにも実行することができる。
【００４２】
様々なチアゾリジンジオン誘導体の癌成長を阻害する能力を下の表Ｉに示す。化合物に対して、３−（４，５−ジメチルチアゾル−２−イル）−２，５−臭化ジフェニルテトラゾリウム（ＭＴＴ）アッセイによる測定で、ＬＮＣａＰ前立腺癌細胞の生存度を下げるこれらの能力を試験した。試験した化合物は、２−ＤＧまたはレスベラトロルなどの公知のエネルギー制約模倣剤より著しく高い活性（すなわち、より低いＩＣ５０）を示した。癌細胞増殖阻害のための多くのチアゾリジンジオン誘導体のＩＣ５０値は低μＭ範囲内であり、これらはそれぞれレスベラトロルおよび２−デオキシグルコースより少なくとも１〜３桁は高い効き目であった。
【００４３】
【表１】
0005847085.tif 000017
本明細書に示すように、悪性細胞は、正常な細胞に対して著しく高い解糖活性、つまりワールブルグ効果と呼ばれる効果を示す。この効果をもたらすとして、ミトコンドリア欠損、癌組織内の低酸素環境への順応、発癌シグナル、およびいくつかの代謝酵素の異常発現を含む幾つかのメカニズムが示唆されている。ミトコンドリアの呼吸機構を用いてＡＴＰを生成する癌細胞の能力が低下するため、癌細胞は、成長を続けるための十分なＡＴＰ生成を維持するため自らの解糖活性を増大させるよう強いられる。この代謝順応により、癌細胞は解糖経路に依存することになり、その阻害による被害を受けやすくなる。さらに、この代謝交替は癌細胞ではほとんど偏在しているため、解糖経路を標的にすることは、広範囲の異なるタイプの癌を処置する有用な方法を表す。抗癌処置のための解糖阻害の使用についてのさらなる検討については、Ｐｅｌｉｃａｎｏら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、２５、ｐ．４６３３−４６４６（２００６）を参照されたい。
【００４４】
解糖が阻害されると、正常細胞内の無傷のミトコンドリアにより、これら細胞が脂肪酸およびアミノ酸などの代替のエネルギー源を使用して、呼吸を通じてのＡＴＰ産生のためのトリカルボン酸サイクルへと通じる代謝中間体を産生することが可能になる。この結果、正常なミトコンドリアを持つ細胞は、癌細胞に対して、解糖を阻害する薬剤に対して感度が低く、治療選択性をもたらす。よって、本発明は、癌細胞内での解糖を選択的に阻害するチアゾリジンジオン誘導体の能力の結果としてチアゾリジンジオン誘導体を用いた癌を処置する方法を提供する。
【００４５】
癌の処置の有効性は、チアゾリジンジオン誘導体の投与に応答した被験体での腫瘍負荷の低下または腫瘍成長の減少を評価することによって測定され得る。腫瘍負荷の低下は、質量の直接の減少によって表されてもよく、または腫瘍成長の遅延によって測定されてもよく、これは、対照腫瘍がある特定の体積まで成長する平均時間を、処置された腫瘍が同じ体積まで成長するのに要する時間から引くことによって計算される。
【００４６】
チアゾリジンジオン誘導体は、癌の処置および防止の両方を行うために用いることができる。本明細書において、用語「防止」は、臨床的に明らかな望ましくない細胞増殖の開始を完全に防ぐこと、またはリスクを持つ個体での望ましくない急速な細胞増殖の臨床前に明らかな段階の開始を防ぐことのいずれかを含む。この定義はまた、悪性細胞の転移の防止または悪性細胞の進行の阻止もしくは反転も包含するものと意図される。これは、前癌状態および癌を発症させるリスクが高い個体の予防処置を含む。高いリスクとは、被験体が癌を発症する平均より上のリスクを表し、これは、例えば、家系または癌を発症する素因を引き起こす遺伝子の検出を通して決定することができる。
【００４７】
癌細胞は、細胞の相対的に無制限の成長を結果としてもたらす遺伝子の損傷を含む。癌細胞に存在する遺伝子の損傷は、癌細胞株のその後の世代において遺伝形質として維持される。本発明の方法によって処置される癌は、当業者には公知のまたは本明細書で述べる癌の形態のいずれであってもよい。固形腫瘍として現れる癌、およびそうではなく白血病で典型的にみられるように非固形腫瘍を形成する癌の両方が処置され得る。すべてのタイプの癌において好気性解糖の増加が優勢であることに基づいて、本発明は、上皮性悪性腫瘍、非上皮性悪性腫瘍、およびリンパ腫を含む様々な異なるタイプの癌に罹る被験体を処置する方法を提供する。
【００４８】
本発明者は、チアゾリジンジオン誘導体を、様々な異なるタイプの癌細胞の成長を阻害するために使用し得ることを実証している。例えば、前立腺癌、乳癌、白血病、非小細胞肺癌、結腸癌、ＣＮＳ癌、黒色腫、卵巣癌、および腎臓癌細胞の成長の阻害に対するチアゾリジンジオン誘導体の有効性を実証する実験を実行した。これらの実験は本明細書にて後述の実施例２で述べる。
【００４９】
チアゾリジンジオン誘導体による解糖の阻害はまた、２型糖尿病または代謝症候群の処置に使用することができる。本明細書にて定義する代謝症候群は、心臓病または糖尿病を発症するリスクの増大を招き得る障害の組み合わせであり、２型糖尿病または空腹時血糖障害でみられるような空腹時高血糖、耐糖能障害、またはインスリン耐性；高血圧；主に胴回りの脂肪沈着を伴う中心性肥満；ＨＤＬコレステロールの低下；およびトリグリセリドの上昇から選択される複数の症状を特徴とする。チアゾリジンジオン誘導体は、医薬組成物における治療上有効な量のチアゾリジンジオン誘導体を、これを必要とする被験体に送達することによって、２型糖尿病または代謝症候群を処置または防止するために使用することができる。チアゾリジンジオン誘導体は、本明細書に述べるように、解糖に及ぼすこれらの影響の結果として、およびＡＭＰＫに与える影響の結果として有効である。ＡＭＰＫ系は、真核細胞における細胞エネルギー状態のセンサとして作用することが知られており、代謝制御およびインスリンシグナル伝達に重要な影響を及ぼす。Ｔｏｗｌｅｒら、Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ、１００、３２８−３４１（２００７）。
【００５０】
チアゾリジンジオン誘導体を投与することによって被験体にエネルギー代謝制限を提供する別の潜在的な利点としては、処置される被験体の寿命を延ばし、これにより寿命延長効果を提供することができることである。実験用ラットおよびマウスでの再現可能な寿命延長の研究により、エネルギー制限が寿命を有意に増加させ、また加齢に関連した疾患の発病を遅らせ得ることが実証された。類似の効果は様々な無脊椎種で見られ、また霊長類についての最近の研究は、エネルギー制限により齧歯類で観察されたものに匹敵する生理学的な効果が生じることを示している。エネルギー制約模倣剤の寿命に与える効果を評価するために研究もまた実行されている。Ｉｎｇｒａｍら、Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．１０１９、ｐ．４１２−２３（２００４）参照。
【００５１】
酸化的ストレスの減少、炎症の制御、および高分子の糖化に対する防御を含むエネルギー制約模倣剤の寿命延長効果に対して幾つかのメカニズムが提案されている。特に、解糖の阻害により自食が刺激され、この結果、有意量の反応性酸素種を放出する細胞小器官を取り除くことができることが分かった。さらに、エネルギー制約の寿命延長効果は、エネルギー利用率が低い期間、有機体のエネルギーを再生ではなく生き残りの方に向け直す進化的に保存されたストレス応答であり得ると仮定されている。
【００５２】
寿命延長効果とは、非処置の被験体に比べて、治療上有効な用量のエネルギー制約模倣剤で処置された被験体の平均寿命を増大させる効果である。寿命延長効果もまた癌などの疾患を診断された被験体において実現することができる一方で、寿命延長効果は、疾患の除去に依存しないため、健康な被験体で得ることができる。寿命延長効果は、酸化的ストレスまたは炎症などの慢性的な問題を防ぐ結果として見られるため、被験体は、有意な寿命延長効果を得るためには長期間にわたって処置を行わなければならない。マウスにみられる結果に基づけば、寿命延長効果は寿命の１０％、２０％、３０％、または４０％の増大を提供し得る。Ｍａｔｔｓｏｎ、Ｍ．Ｐ．、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｕｔｒ．２５：ｐ．２３７−６０（２００５）。
【００５３】
寿命延長効果は、健康であると診断された被験体または疾患もしくは障害を有すると診断されていない被験体において提供することができる。例えば、寿命延長効果は、癌ではないと診断された被験体または癌であると診断されていない被験体において提供することができる。癌であると診断する方法は当業者には周知である。
【００５４】
数多くのチアゾリジンジオン誘導体の活性を調査する努力の一部として、本発明者は、インハウスのチアゾリジンジオン系の集中化合物ライブラリのスクリーニングを行って、アデノシン一リン酸活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）のペルオキシソーム増殖剤活性化受容体（ＰＰＡＲ）γ非依存の活性化およびインターロイキン（ＩＬ）−６産生の抑制の媒介となる能力を有する化合物を同定した。ラパマイシンの標的のＡＭＰＫおよび哺乳類の相同物の活性化状態（すなわち、それぞれＡＭＰＫおよびｐ７０リボソームタンパク質Ｓ６キナーゼのリン酸化）、およびリポ多糖体（ＬＰＳ）刺激ＴＨＰ−１ヒトマクロファージでのＩＬ−６／ＩＬ−６受容体シグナル伝達（すなわち、それぞれＩＬ−６産生ならびに転写３リン酸化のシグナルトランスデューサおよび活性剤）に関係する細胞系のアッセイを用いて、この化合物ライブラリをスクリーニングし、様々な活性チアゾリジンジオン誘導体の同定に至った。ここで、化合物５３（Ｎ−｛４−［３−（１−メチル−シクロヘキシルメチル）−２，４−ジオキソ−チアゾリジン−５−イリデン−メチル］−フェニル｝−４−ニトロ−３−トリフルオロ−メチル−ベンゼンスルホンアミド）が先導薬剤であると同定された。本明細書の実施例に記載の証拠により、ＩＬ−６産生の抑制はＡＭＰＫ活性化に起因したものであることが分かる。チアゾリジンジオン誘導体介在のＡＭＰＫ活性化はまた、Ｃ−２６結腸腺癌細胞でも実証されたため、この効果が細胞株特異的ではないことを示す。ＡＭＰＫは、２型糖尿病、メタリックシンドローム、および癌の処置のための治療上関連する標的を表し、チアゾリジンジオン誘導体のエネルギー制約模倣剤としての使用がさらに支持される。
【００５５】
従って、本発明のさらなる局面は、有効量のチアゾリジンジオン誘導体を提供することによってアデノシン一リン酸活性化プロテインキナーゼを活性化する方法を提供する。加えて、本発明の別の局面は、ＡＭＰＫ活性剤として有効であると本明細書で述べるチアゾリジンジオン誘導体の１つを含む医薬組成物を被験体に投与することによって、被験体においてＩＬ−６発現を阻害する方法を提供する。
【００５６】
チアゾリジンジオン誘導体
本発明のチアゾリジンジオン誘導体は、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶの化合物を含む。例えば、チアゾリジンジオン誘導体は式Ｉ
【００５７】
【化１】
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式中、Ｒ１は水素またはヒドロキシル；Ｒ２およびＲ３は、水素、ヒドロキシル、ハロ、アミノ、メチル、メトキシ、エチル、エトキシ、ニトロ、アミノスルホニル、トリフルオロメチルスルホニル（ｔｒｉｆｌｕｒｏｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ）、およびハロアルキル部分から選択され；Ｒ４は、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、およびアリール基から選択される。本発明の特定の実施形態では、Ｒ１はヒドロキシルである。さらなる実施形態ではＲ２はトリフルオロメチルであり、一方なおさらなる実施形態ではＲ３は水素である、
を有する化合物であり得る。
【００５８】
さらなる実施形態では、式Ｉのチアゾリジンジオン誘導体は以下に示す化合物のいずれでもあり得る。例えば、チアゾリジンジオン誘導体は以下の化合物のいずれであってもよい。
【００５９】
（Ｚ）−５−（４−ヒドロキシ−３−トリフルオロメチル−ベンジリデン）−３−（１−メチル−シクロヘキシルメチル）−チアゾリジン−２−４−ジオン（ＯＳＵ−ＣＧ１２）
【００６０】
【化２】
0005847085.tif 000019
（Ｚ）−３−（２−エチル−ブチル）−５−（４−ヒドロキシ−３−トリフルオロメチル−ベンジリデン）−チアゾリジン−２−４−ジオン（ＯＳＵ−ＣＧ５）
【００６１】
【化３】
0005847085.tif 000020
（Ｚ）−３−（２−エチル−ペンチル）−５−（４−ヒドロキシ−３−トリフルオロメチル−ベンジリデン）−チアゾリジン−２−４−ジオン
【００６２】
【化４】
0005847085.tif 000021
（Ｚ）−５−（４−ヒドロキシ−３−トリフルオロメチル−ベンジリデン）−３−（４−イソプロピル−ベンジル）−チアゾリジン−２−４−ジオン
【００６３】
【化５】
0005847085.tif 000022
（Ｚ）−３−（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−５−（４−ヒドロキシ−３−トリフルオロメチル−ベンジリデン）−トリアゾリジン−２−４−ジオン
【００６４】
【化６】
0005847085.tif 000023
（Ｚ）−５−（４−ヒドロキシ−３−トリフルオロメチル−ベンジリデン）−３−（２−トリフルオロメチル−ベンジル）−チアゾリジン−２−４−ジオン
【００６５】
【化７】
0005847085.tif 000024
（Ｚ）−３−シクロヘキシルメチル−５−（４−ヒドロキシ−３−トリフルオロメチル−ベンジリデン）−チアゾリジン−２−４−ジオン
【００６６】
【化８】
0005847085.tif 000025
（Ｚ）−３−ベンジル−５−（４−ヒドロキシ−３−トリフルオロメチル−ベンジリデン）−チアゾリジン−２−４−ジオン
【００６７】
【化９】
0005847085.tif 000026
（Ｚ）−３−シクロヘプチルメチル−５−（４−ヒドロキシ−３−トリフルオロメチル−ベンジリデン）−チアゾリジン−２−４−ジオン
【００６８】
【化１０】
0005847085.tif 000027
（Ｚ）−５−（４−ヒドロキシ−３−トリフルオロメチル−ベンジリデン）−３−イソブチル−チアゾリジン−２−４−ジオン
【００６９】
【化１１】
0005847085.tif 000028
本発明の他の実施形態では、式Ｉのチアゾリジンジオン誘導体は、Ｒ１がヒドロキシル、Ｒ２がトリフルオロメチル、およびＲ３がヒドロキシルであるように定義される。式ＩのＲ４を変えることにより、以下に示すチアゾリジンジオン誘導体が提供される。
【００７０】
（Ｚ）−５−（３，４−ジヒドロキシ−５−トリフルオロメチル−ベンジリデン）−３−（１−メチル−シクロヘキシルメチル）−チアゾリジン−２−４−ジオン
【００７１】
【化１２】
0005847085.tif 000029
（Ｚ）−５−（３，４−ジヒドロキシ−５−トリフルオロメチル−ベンジリデン）−３−（２−エチル−ブチル）−チアゾリジン−２−４−ジオン
【００７２】
【化１３】
0005847085.tif 000030
（Ｚ）−５−（３，４−ジヒドロキシ−５−トリフルオロメチル−ベンジリデン）−３−（２−エチル−ペンチル）−チアゾリジン−２−４−ジオン
【００７３】
【化１４】
0005847085.tif 000031
（Ｚ）−５−（３，４−ジヒドロキシ−５−トリフルオロメチル−ベンジリデン）−３−（４−イソプロピル−ベンジル）−チアゾリジン−２−４−ジオン
【００７４】
【化１５】
0005847085.tif 000032
（Ｚ）−３−（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−５−（３，４−ジヒドロキシ−５−トリフルオロメチル−ベンジリデン）−トリアゾリジン−２−４−ジオン
【００７５】
【化１６】
0005847085.tif 000033
（Ｚ）−５−（３，４−ジヒドロキシ−５−トリフルオロメチル−ベンジリデン）−３−（２−トリフルオロメチル−ベンジル）−チアゾリジン−２−４−ジオン
【００７６】
【化１７】
0005847085.tif 000034
（Ｚ）−３−シクロヘキシルメチル−５−（３，４−ジヒドロキシ−５−トリフルオロメチル−ベンジリデン）−チアゾリジン−２−４−ジオン
【００７７】
【化１８】
0005847085.tif 000035
（Ｚ）−３−ベンジル−５−（３，４−ジヒドロキシ−５−トリフルオロメチル−ベンジリデン）−チアゾリジン−２−４−ジオン
【００７８】
【化１９】
0005847085.tif 000036
（Ｚ）−３−シクロヘプチルメチル−５−（３，４−ジヒドロキシ−５−トリフルオロメチル−ベンジリデン）−チアゾリジン−２−４−ジオン
【００７９】
【化２０】
0005847085.tif 000037
（Ｚ）−５−（３，４−ジヒドロキシ−５−トリフルオロメチル−ベンジリデン）−３−イソブチル−チアゾリジン−２−４−ジオン
【００８０】
【化２１】
0005847085.tif 000038
本発明の他の実施形態では、式Ｉのチアゾリジンジオン誘導体は、Ｒ１が水素ならびにＲ２およびＲ３がハロ部分であるように定義される。さらなる実施形態では、Ｒ２およびＲ３は共にブロモ部分である。この実施形態に対して、式ＩのＲ４を変えることにより、以下に示すチアゾリジンジオン誘導体が提供される。
【００８１】
（Ｚ）−５−（３，５−ジブロモ−ベンジリデン）−３−（１−メチル−シクロヘキシルメチル）−チアゾリジン−２−４−ジオン
【００８２】
【化２２】
0005847085.tif 000039
（Ｚ）−５−（３，５−ジブロモ−ベンジリデン）−３−（２−エチル−ブチル）−チアゾリジン−２−４−ジオン
【００８３】
【化２３】
0005847085.tif 000040
（Ｚ）−５−（３，５−ジブロモ−ベンジリデン）−３−（２−エチル−ペンチル）−チアゾリジン−２−４−ジオン
【００８４】
【化２４】
0005847085.tif 000041
（Ｚ）−５−（３，５−ジブロモ−ベンジリデン）−３−（４−イソプロピル−ベンジル）−チアゾリジン−２−４−ジオン
【００８５】
【化２５】
0005847085.tif 000042
（Ｚ）−３−（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−５−（３，５−ジブロモ−ベンジリデン）−チアゾリジン−２−４−ジオン
【００８６】
【化２６】
0005847085.tif 000043
（Ｚ）−５−（３，５−ジブロモ−ベンジリデン）−３−（２−トリフルオロメチル−ベンジル）−チアゾリジン−２−４−ジオン
【００８７】
【化２７】
0005847085.tif 000044
（Ｚ）−３−シクロヘキシルメチル−５−（３，５−ジブロモ−ベンジリデン）−チアゾリジン−２−４−ジオン
【００８８】
【化２８】
0005847085.tif 000045
（Ｚ）−３−ベンジル−５−（３，５−ジブロモ−ベンジリデン）−チアゾリジン−２−４−ジオン
【００８９】
【化２９】
0005847085.tif 000046
（Ｚ）−３−シクロヘプチルメチル−５−（３，５−ジブロモ−ベンジリデン）−チアゾリジン−２−４−ジオン
【００９０】
【化３０】
0005847085.tif 000047
（Ｚ）−５−（３，５−ジブロモ−ベンジリデン）−３−イソブチル−チアゾリジン−２−４−ジオン
【００９１】
【化３１】
0005847085.tif 000048
本発明の別の局面では、チアゾリジンジオン誘導体は、式ＩＩ
【００９２】
【化３２】
0005847085.tif 000049
式中、Ｒ１は、アリール、アルキル、ヘテロアリール、シクロアルキル、およびヘテロシクロアルキル基から選択され；Ｒ２は、水素、ハロ、およびニトロ部分、ならびにアルキル、アルコキシ、およびハロアルキル基から選択され；Ｒ３は、水素およびハロ部分ならびにアルキル、アルコキシ、およびハロアルキル基から選択される、
を有する化合物であり得る。
【００９３】
式ＩＩのチアゾリジンジオン誘導体はまた、いくつかの実施形態では、以下から選択されるＲ１を有し得る。
【００９４】
【化３３】
0005847085.tif 000050
追加の実施形態では、式ＩＩのチアゾリジンジオン誘導体は、Ｒ２が水素、ブロモ、クロロ、メチル、メトキシ、エトキシ、およびニトロから選択され；Ｒ３が水素、メチル、メトキシ、およびブロモから選択されるように定義される。
【００９５】
チアゾリジンジオン誘導体はまた、以下の構造を有する化合物ＳＴＧ２８であり得る。
【００９６】
【化３４】
0005847085.tif 000051
本発明のさらなる実施形態では、チアゾリジンジオン誘導体は式ＩＩＩ
【００９７】
【化３５】
0005847085.tif 000052
式中、Ｒ１は低級アルキル基であり、Ｒ２はハロ、メチル、メトキシ、エチル部分から選択される、
を有する化合物であり得る。
【００９８】
式ＩＩＩによる化合物の例としては、５−［３−ブロモ−４−（６−エトキシ−２，５，７，８−テトラメチル−クロマン−２−イルメトキシ）−ベンジリデン］−チアゾリジン−２−４−ジオン、５−［４−（６−ブトキシ−２，５，７，８−テトラメチル−クロマン−２−イルメトキシ）−３−メトキシ−ベンジリデン］−チアゾリジン−２−４−ジオン、および４−｛２−［２−ブロモ−４−（２，４−ジオキソ−チアゾリジン−５−イリデンメチル）−フェノキシメチル］−２，５，７，８−テトラメチル−クロマン−６−イルオキシ｝−ブチロニトリルからなる群より選択され得る。
【００９９】
本発明のさらなる実施形態では、チアゾリジンジオン誘導体は式ＩＶ
【０１００】
【化３６】
0005847085.tif 000053
式中、Ｒ１は、水素、メチル、またはトリフルオロメチル部分であり、Ｒ２は、メトキシまたはニトロ部分であり、Ｒ３は、アルキルまたはシクロアルキル基である、
を有する化合物であり得る。
【０１０１】
式ＩＶによる化合物の例としては、４−メトキシ−Ｎ−｛４−［３−（１−メチル−シクロヘキシルメチル）−２，４−ジオキソ−チアゾリジン−５−イリデンメチル］−フェニル｝−ベンゼンスルホンアミド、Ｎ−｛４−［３−（１−メチル−シクロヘキシルメチル）−２，４−ジオキソ−チアゾリジン−５−イリデン−メチル］−フェニル｝−４−ニトロ−３−トリフルオロメチル−ベンゼンスルホンアミド、およびＮ−｛４−［３−（１−メチル−シクロヘキシルメチル）−２，４−ジオキソ−チアゾリジン−５−イリデンメチル］−フェニル｝−４−ニトロ−ベンゼンスルホンアミドからなる群より選択され得る。
【０１０２】
本発明の多数のチアゾリジンジオン誘導体は、ＡＭＰＫを活性化する能力を示す。特に、式Ｉ、ＩＩＩ、およびＩＶの化合物は、ＡＭＰＫを活性化可能であることが示されている。これら化合物は、エネルギー制限模倣剤として有用な化合物を説明するのに用いられたのと同じ全体式の多くを有する一方で、これらの式の化合物に対する置換基は異なってもよい。従って、チアゾリジンジオン誘導体は、式ＩＩＩ
【０１０３】
【化３７】
0005847085.tif 000054
式中、Ｒ１は低級アルキル基であり、Ｒ２はハロ、メチル、メトキシ、エチル部分から選択される、
による化合物；式Ｉ
【０１０４】
【化３８】
0005847085.tif 000055
式中、Ｒ１はヒドロキシル；Ｒ２はトリフルオロメチル；Ｒ３は水素；Ｒ４はアルキルまたはシクロアルキル基である、
の化合物；および式ＩＶ
【０１０５】
【化３９】
0005847085.tif 000056
式中、Ｒ１は水素、メチル、またはトリフルオロメチル部分；Ｒ２はメトキシまたはニトロ部分、Ｒ３はアルキルまたはシクロアルキル基である、
の化合物であり得る。
【０１０６】
ＡＭＰＫを活性化するための特に好適な化合物は、化合物５３であり、これは以下の構造を有する。
【０１０７】
【化４０】
0005847085.tif 000057
チアゾリジンジオン誘導体の同定
本発明のさらなる局面は、被験体でのエネルギー代謝を制限するために使用され得るチアゾリジンジオン誘導体を同定する方法を含む。試験に適している潜在的な薬剤を本明細書では「候補薬剤」と呼ぶ。様々な異なるアッセイを用いてエネルギー代謝を制限する薬剤の能力を同定することができる。例えば、グルコース摂取、解糖速度、またはＮＡＤＨおよび乳酸塩の産生を減らす化合物の能力を測定することができる。あるいは、またはこれに加えて、Ｓｉｒｔ１誘発、ＡＭＰＫ活性化、ＥＲストレス、またはβ−ＴｒＣＰ介在タンパク質分解などのグルコース飢餓様の応答を引き出す化合物の能力を測定することができる。これらの分析を実行する手順は当業者には公知であり、多くが本明細書に示す実施例１に記載されている。候補薬剤の供給源としては、例えば、図２に示すような化合物ライブラリまたは天然源が挙げられる。
【０１０８】
候補薬剤はまた動物モデルにおいて試験され得る。例えば、エネルギー制限の結果として癌を阻害するチアゾリジンジオン誘導体の能力は、Ｃ４−２異種移植片腫瘍モデルにおいて評価することができる。動物モデル（例えば、マウス）での様々な癌の研究は、ヒト癌の研究のための一般に是認された慣行である。しかし、候補薬剤はまた、寿命延長効果のために動物モデルにて評価することもできる。例えば、体温および血漿インスリンレベルは共にエネルギー制限効果の指標であり、言うまでもなく動物モデルの寿命を測定することができる。典型的には、候補薬剤で処置された対照動物と処置を受けていない対照の同腹子との間で結果を比較する。
【０１０９】
例えば、Ｃ４−２前立腺癌異種移植片腫瘍を、等量の無血清培地およびマトリゲル（２×１０６細胞数／０．１ｍｌ／マウス）中に懸濁させたＣ４−２細胞の皮下注射によって、去勢雄ＮＣｒ無胸腺ヌードマウス（生後５〜７週間）に定着させることができる。腫瘍の体積が約１００ｍｍ３に達すると、マウスをランダムに実験群（１０匹／群）に割り当てる。経口投与用にチアゾリジンジオン誘導体を調製し、研究期間中一日一回、それぞれの最大耐量の１００％、５０％、２５％、および１０％を強制投与する。対照として、レスベラトロルを一日一回１００ｍｇ／ｋｇ投与することができる。重量および腫瘍サイズを毎週測定する。対照腫瘍が１０００ｍｍ３に達すると、マウスを犠牲にして、組織をバイオマーカー評価のために採取する。グルコース摂取をブロックするチアゾリジンジオン誘導体の能力はまた、ポジトロン断層法により、［１８Ｆ］−フルオロデオキシグルコース摂取を用いて試験マウスおいて評価することができる。
【０１１０】
免疫組織化学およびウェスタンブロット法を用いて、表ＩＩに示すような試験動物でのチアゾリジンジオン活性のインビボにおける腫瘍内バイオマーカーを特徴付けることができる。これらバイオマーカーは３つのカテゴリー、すなわちβ−ＴｒＣＰシグナル伝達（一時的なＳｉｒｔ１誘発のための代理マーカーとして）、ＡＭＰＫ活性化、およびＥＲストレス応答に分類することができる。腫瘍血管形成のマーカーもまた、エネルギー制限により調整され得るため、検査することができる。
【０１１１】
【表２】
0005847085.tif 000058
チアゾリジンジオン誘導体の調剤および投与
本発明は、医薬組成物中の１つ以上のチアゾリジンジオン誘導体を投与する方法を提供する。医薬組成物の例としては、経口、静脈内、筋肉内、皮下、もしくは腹腔内投与、または当業者には公知の任意の他経路のための医薬組成物が挙げられ、一般に薬学的に許容可能なキャリアと共に調剤されるチアゾリジンジオン誘導体を提供することを含む。
【０１１２】
本明細書で述べる化合物を経口投与のために調製する場合、医薬組成物は、例えば、錠剤、カプセル、懸濁液、または液体の形態であり得る。医薬組成物は好ましくは、特定量の活性成分を含有する投薬量単位の形態で作製される。このような投薬量単位の例としては、ラクトース、マンニトール、トウモロコシ澱粉またはジャガイモ澱粉などの従来の添加物；結晶セルロース、セルロース誘導体、アカシア、トウモロコシ澱粉、またはゼラチンなどの結合剤；トウモロコシ澱粉、ジャガイモ澱粉、またはカルボキシルメチルセルロースナトリウムなどの分解剤；およびタルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの滑剤を含む、カプセル、錠剤、粉末、顆粒、または懸濁液がある。活性成分はまた、例えば、生理食塩水、ブドウ糖、または水が適切なキャリアとして使用され得る組成物として注射により投与され得る。
【０１１３】
静脈内、筋肉内、皮下、または腹腔内投与のためには、化合物は、好ましくは受容体の血液と等張である滅菌水溶液と組み合わされ得る。このような調剤物は、固形活性成分を、塩化ナトリウム、グリシンなどの生理学的に相溶性の物質を含有し、かつ生理学的条件と適合する緩衝ｐＨを有する水に溶解させて水溶液を生成し、この溶液を滅菌することによって調製され得る。調剤物は、封印アンプルまたはバイアルなどの単一用量または多用量容器内に存在してもよい。
【０１１４】
非経口投与にとって適切な調剤物は、好ましくは等張にされる活性化合物の滅菌水溶液調製物を含むのが都合がよい。注射用の調製物はまた、化合物を、植物油、合成脂肪酸グリセリド、高級脂肪酸のエステル、またはプロピレングリコールなどの非水性溶媒中で化合物を懸濁または乳化することによって調剤され得る。
【０１１５】
投薬の形態および量は、公知の処置または予防レジメン（ｒｅｇｉｍｅｎｔｓ）を参照することによって容易に確立することができる。投与される治療的に活性の化合物の量、および疾患状態を本発明の化合物および／または組成物により処置するための投薬レジメンは、被験体の年齢、体重、性別、および病状、疾患の重症度、投与の経路および頻度、ならびに用いる特定の化合物、望ましくない増殖細胞の位置、また処置される個体の薬物動態特性を含む様々な要因に依存するので、広く変動し得る。化合物が全身的にではなく局所的に、また処置のためではなく予防のために投与される場合、投薬量は一般に低くなり得る。このような処置は、必要なだけの頻度で、また処置を行う医師が必要と判断した期間、投与され得る。当業者であれば、投薬レジメンまたは投与されるべき阻害剤の治療上有効な量は個体毎に最適化する必要があることは理解されよう。医薬組成物は活性成分を約０．１〜２０００ｍｇの範囲で、好ましくは約０．５〜５００ｍｇの範囲で、最も好ましくは約１〜２００ｍｇの範囲で含有し得る。日用量約０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは約０．１〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重が適切であり得る。日用量は１日１〜４回で投与することができる。
【０１１６】
例えば、チアゾリジンジオン誘導体に対する最大耐量（ＭＴＤ）は、腫瘍のない無胸腺ヌードマウスにおいて決定することができる。薬剤を、０．５％のメチルセルロース（ｗ／ｖ）および０．１％のＴｗｅｅｎ８０（ｖ／ｖ）を含有する滅菌水での懸濁液として調製し、マウス（７匹／群）に、一日一回、０、２５、５０、１００および２００ｍｇ／ｋｇの用量で１４日間、強制経口投与する。１週間に２度測定する体重、および一般的な健康および挙動の毎日の直接の観察が、薬物耐性の第１の指標となる。ＭＴＤは、１４日の処置期間にわたって１０％以下の体重減少をもたらす最大用量と定義される。
【０１１７】
チアゾリジンジオン誘導体はまた薬学的に許容可能な塩として提供され得る。用語「薬学的に許容可能な」とは、アルカリ金属塩を形成するためにおよび遊離酸または遊離塩基の付加塩を形成するために一般に用いられる塩を意味する。この塩の性質は、これが薬学的に許容可能であれば重要ではない。式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶの化合物の適切な薬学的に許容可能な酸付加塩は、無機酸からまたは有機酸から調製され得る。このような無機酸の例としては、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、炭酸、硫酸、およびリン酸がある。適切な有機酸は、脂肪族、脂環式、芳香族、芳香脂肪族、複素環式、カルボキシル基、およびスルホン基クラスの有機酸から選択され得、これらの例としては、蟻酸、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、グルコン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、グルクロン（ｇｌｕｃｏｒｏｎｉｃ）酸、マレイン酸、フマル酸、ピルビン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、安息香酸、アントラニル酸、メシル酸、サリチル酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、フェニル酢酸、マンデル酸、アンボン酸、パモン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、パントテン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、トルエンスルホン酸、スルファニル酸、シクロヘキシルアミノスルホン酸、ステアリン酸、アルゲン酸、γ−ヒドロキシ酪酸、ガラクタル酸、およびガラクツロン酸が挙げられる。本明細書で述べる化合物の適切な薬学的に許容可能な塩基付加塩としては、アルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、および亜鉛からなる金属塩が挙げられる。あるいは、Ｎ，Ｎ’−ベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、メグルミン（Ｎ−メチルグルカミン）およびプロカインからなる有機塩を用いて、本明細書で述べる化合物の塩基付加塩を形成してもよい。これらの塩のすべてが、本明細書で述べる対応する化合物から、例えば適切な酸または塩基を該化合物と反応させることによって、従来の手段により調製され得る。
【０１１８】
チアゾリジンジオン誘導体の調製
本発明の化合物は、化学的技術において、特に本明細書に含まれる記述に照らして周知のプロセスに類似のプロセスを含む合成経路によって合成され得る。出発材料は一般にＡｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、米国）などの市販源から入手可能であり、または当業者には周知の方法を用いて容易に調製される（例えば、Ｌｏｕｉｓ  Ｆ．ＦｉｅｓｅｒおよびＭａｒｙ  Ｆｉｅｓｅｒ、Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、ｖ．１−１９、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９６７−１９９９版）および当業者には公知の類似のテキストに一般的に記載された方法によって調製される）。様々なチアゾリジンジオン誘導体の調製は、本発明者によって先に出願された特許出願に記載されている。共にＣｈｅｎらによる米国特許第７，５６６，７８７号および米国特許出願第１２／３８９，７５９号を参照されたい。これらの開示は全体が本明細書において参考により援用されている。多数の具体的なチアゾリジンジオン誘導体の調製を本明細書の実施例において説明する。
【０１１９】
多数のチアゾリジンジオン誘導体はまた、図２に示すように、固相コンビナトリアル化学を用いて調製することができる。図２に示すように、フェノール環（Ｒ１）および末端疎水性部分（Ｒ２）の置換基を変えることによって、集中化合物ライブラリを作成することができる。
【０１２０】
図２の合成スキームで示すように、置換ベンズアルデヒド（ｉ）の−ＯＨ官能基により、ファーマコフォアが求核置換反応を介してメリフィールド樹脂に繋がって共役（ｉｉ）を形成し、続いてチアゾリジンジオン環を添加して共役（ｉｉｉ）を生じさせることができる。異なる疎水性付属物（Ｒ２ＯＨ）を、ミツノブ反応（ｉｖ）を介してチアゾリジンジオン環に導入することができ、これにより樹脂からの脱カップリングで高収率および高純度の最終生成物（ｖ）が提供される。このコンビナトリアル合成は２４ウェルのフォーマットにて行われるため、各サイクルは約１０日で多ｍｇ量の２４の誘導体を生成する。同図に示す誘導体に基づいて、全２７２の誘導体（８Ｒ１×３４Ｒ２）を合成することができる。追加のチアゾリジンジオン誘導体の調製は図１２および図１３に示す。
【０１２１】
本発明を以下の実施例によって示す。特定の実施例、材料、量、および手順は、本明細書に示す本発明の範囲および精神に従って広範囲に解釈されることは理解されよう。
【実施例】
【０１２２】
実施例１：癌細胞におけるエネルギー制限に与えるチアゾリジンジオン化合物の効果
本実施例では、本発明者は、トログリタゾン、シグリタゾン、ＳＴＧ２８、およびＯＳＵ−ＣＧ１２が、ＬＮＣａＰ前立腺癌およびＭＣＦ−７乳癌細胞におけるエネルギー制限に特有の特徴的な細胞応答を引き出すことができたことを示す。これらのエネルギー制限関連の変化としては、解糖速度ならびにＮＡＤＨおよび乳酸塩の産生の減少、サイレントインフォメーションレギュレータ１（Ｓｉｒｔ１）遺伝子発現の一時的な誘発、および細胞内細胞燃料センサＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）の活性化および小胞体（ＥＲ）ストレスを含み、これらの間の相互作用の結果、自食およびアポトーシスとなる。この知見の意味することは多岐にわたる。第１に、これにより、強力なエネルギー制限模倣剤としてのＯＳＵ−ＣＧ１２の同定によって実証されるように、強力なエネルギー制限模倣剤を開発する足場としてＴＺＤを使用する分子基礎が提供される。ＯＳＵ−ＣＧ１２は、飢餓関連の細胞応答の媒介となり、またレスベラトロルより１桁高い（ＩＣ５０、５μＭ対６０〜１１０μＭ）癌細胞の成長を抑制するのに効力を示す。第２に、機構的な見地からは、本研究は、細胞サイクルおよびアポトーシス調節タンパク質のβトランスデューシン繰り返し体含有タンパク質（β−ＴｒＣＰ）依存プロテアソーム分解が、一時的なＳｉｒｔ１転写活性化という下流細胞事象を表しているという第１の証拠を提供する。β−ＴｒＣＰシグナル伝達の活性化は、アポトーシス誘発に与える、グルコース飢餓およびエネルギー制限模倣剤の効果の根底にある。
【０１２３】
方法
細胞培養および試薬
ＬＮＣａＰホルモン応答前立腺癌細胞およびＭＣＦ−７ＥＲα陽性乳癌細胞を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から得て、それぞれ１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）補足ＲＰＭＩ１６４０培地およびＦ１２／ＤＭＥＭ培地により維持した。非悪性前立腺上皮細胞（ＰｒＥＣ）を前立腺上皮成長培地（ＰｒＥＧＭ）（Ｌｏｎｚａ  Ｉｎｃ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）にて維持した。すべての細胞を、５％のＣＯ２を含む加湿インキュベータで３７℃で培養した。トログリタゾンおよびシグリタゾンならびにそれらのＰＰＡＲγ不活性誘導体ＳＴＧ２８およびＯＳＵ−ＣＧ１２を公表された手順に従って合成した。Ｙａｎｇら、Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．５１、ｐ．２１００−２１０７（２００８）およびＺｈｕら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６５、ｐ．７０２３−７０３０（２００５）。無グルコースのＲＰＭＩ１６４０培地をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）から購入した。２−ＤＧ、レスベラトロル、３−メチルアデニン（３−ＭＡ）、ニコチンアミドおよびスプリトマイシンをＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。ＡＭＰＫ阻害剤化合物ＣおよびシクロヘキシミドをＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から得た。これらの薬剤を、最終ＤＭＳＯ濃度０．１％の培地に添加した。様々なタンパク質に対する抗体を以下の供給源から得た。マウスモノクローナル抗体：βカテニン、サイクリンＤ１、Ｗｅｅｌ、ｐ５３およびＧＦＰ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）；β−ＴｒＣＰ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；βアクチン、ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ（Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）。ラビット抗体：Ｍｙｃ、ＰＡＲＰ、ＮＦκＢ／ｐ１０５、ＡＲ、ＥＲα、ｐ−Ｓｅｒ９−ＧＳＫ３β、ＧＳＫ３β、ｐ−Ｓｅｒ４７３−Ａｋｔ、Ａｋｔ、ｐ−Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４−ＥＲＫ、ＥＲＫ、ｐ−Ｔｈｒ１８０／Ｔｙｒ１８２−ｐ３８、ｐ３８、ｐ−Ｓｅｒ１７６／１８０−ＩκＢキナーゼα（ＩＫＫα）、ＩＫＫα、ｐ−Ｔｈｒ１７２−ＡＭＰＫ、ＡＭＰＫ、ＧＲＰ７８、Ｓｉｒｔ１、ＡｃＫ３８２−ｐ５３、ＩＲＥ１α、ｐＳｅｒ２４４８−ｍＴＯＲ、ｍＴＯＲ、ｐ−Ｔｈｒ３８９−ｐ７０Ｓ６Ｋ、ｐ７０Ｓ６ＫおよびＴＳＣ２、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）；ＥＧＦＲ、Ｓｐ１およびＧＡＤＤ１５３、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ。ヒトＤＤＩＴ３  ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ  ｓｉＲＮＡはＤｈａｒｍａｃｏｎ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、Ｃｏ）から得た。フラグタグ化Ｓｉｒｔ１（ワイルドタイプ［ＷＴ］およびＨ３６３Ｙ優性ネガティブ）、ＨＡタグ化Ｓｉｒｔ１、Ｍｙｃタグ化ＡＭＰＫ（ＷＴおよびＫ４５Ｒキナーゼデッド）およびＴＳＣ２  ｓｈＲＮＡ血漿をＡｄｄｇｅｎｅ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）から購入した。ＷＴおよびΔＦ−β−ＴｒＣＰ−Ｍｙｃ血漿を記述のように調製した（Ｗｅｉら、Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．７６、ｐ．４７−５７（２００９））。ＧＦＰ−ＬＣ３血漿は親切にも同僚から提供された（Ｋａｂｅｙａら、ＬＣ３、ＥＭＢＯ  Ｊ．１９、ｐ．５７２０−５７２８（２０００））。
【０１２４】
ＲＮＡ単離および半定量ＰＣＲ分析
全ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いて、薬物処置したＬＮＣａＰ細胞から単離し、次にＯｍｎｉｓｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて製造業者の指示書に従ってｃＤＮＡに逆転写した。ＰＣＲ生成物を、１％のアガロースゲルにて電気泳動で分離して、臭化エチジウム染色によって視覚化した。
【０１２５】
一時的トランスフェクション、免疫ブロットおよび蛍光顕微鏡分析
Ａｍａｘａ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒシステム（Ａｍａｘａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃｏｌｏｇｎｅ、ドイツ）のＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキットＲを用いて電気泳動によってトランスフェクションを行った。ＬＮＣａＰ細胞を以下の血漿またはｓｉＲＮＡ、すなわち、ＷＴ−およびＨ３６３Ｙ−フラグ−Ｓｉｒｔ１（ＤＮ−Ｓｉｒｔ１）、ＷＴ−およびＫ４５Ｒ−Ｍｙｃ−ＡＭＰＫ（ＤＮ−ＡＭＰＫ）、ＧＦＰ−ＬＣ３、ＴＳＣ２  ｓｈＲＮＡ、ならびにＤＤＩＴ３  ｓｉＲＮＡ（ＧＡＤＤ１５３）によりトランスフェクトした。様々な標的タンパク質に対する免疫ブロットを、既述のように、Ｍ−ＰＥＲ溶解緩衝剤（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｌｄ、ＩＬ）により採取した細胞溶解物において行った（Ｗｅｉら、Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．７６、ｐ．４７−５７（２００９））。蛍光顕微鏡分析に対しては、ＧＦＰ−ＬＣ３発現血漿により、またはスクランブル化もしくはＴＳＣ２  ｓｈＲＮＡによりトランスフェクトされたＬＮＣａＰ細胞を３６時間、指示されたように処置した。細胞を室温で２０分間、３．７％のホルムアルデヒドにより固定した後、検査前に４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）含有固定培地（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）を用いて核対比染色を行った。ニコン顕微鏡（Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＴＥ３００）を用いて画像を観察した。
【０１２６】
解糖速度の決定
［５−３Ｈ］グルコース（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）の３Ｈ２Ｏへの変換を公表手順（Ａｓｈｃｒｏｆｔら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．１２６、ｐ．５２５−５３２（１９７２））に従って測定することによって、解糖速度を決定した。簡単に述べると、ＬＮＣａＰ細胞を６ウェルプレート（４×１０５細胞数／ウェル）で播種して、次いで２４時間後に様々な間隔で１０ｍＭの２−ＤＧまたは１０μＭのＯＳＵ−ＣＧ１２により処置した。ＰＢＳで洗浄後、細胞をトリプシン処理し、１ｍＭの非放射性グルコースおよび５μＣｉ／ｍＬの［５−３Ｈ］グルコースを含有する５００μＬのＫｒｅｂｓ緩衝液［２５ｍＭのＮａＨＣＯ３、１１５ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＭｇＣｌ２および０．２５％のＢＳＡ（ｐＨ７．４）］において３７℃で１時間、再懸濁させた。各処置群からのアリコートを、１ｍＬのＨ２Ｏを含有するシンチレーションバイアルに直立に配置された開管内で０．２ＮのＨＣｌに添加した。バイアルを密封して、グルコース消費によって生成されたＨ２Ｏを室温で最小限２４時間、管外のＨ２Ｏで均衡化させた。管内に保持された３Ｈの量、ならびに蒸発および凝縮によって周りのＨ２Ｏへと拡散した量を、シンチレーションカウンタＬＳ６５００（Ｂｅｃｋｍａｎ）を用いて個別に決定した。以下の等式：利用したグルコース（ｐｍｏｌ）＝形成された［３Ｈ］水（ｄ．ｐ．ｍ）／［５−３Ｈ］グルコース（ｄ．ｐ．ｍ／ｐｍｏｌ）］を用いた［５−３Ｈ］グルコースからＨ２Ｏへの変換速度の計算のために、［５−３Ｈ］グルコースのみおよび３Ｈ２Ｏのみの標準を各実験に含めた。
【０１２７】
グルコース摂取アッセイ
６ウェルプレート（４×１０５細胞数／ウェル）でのＬＮＣａＰ細胞を、異なる濃度のレスベラトロルまたはＯＳＵ−ＯＧ１２に露出し、次にＫｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒリン酸塩緩衝液（１２８ｍＭのＮａＣｌ、４．７ｍＭのＫＣｌ、２．５ｍＭのＭｇＳＯ４、５ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４および１％のＢＳＡ）により３７℃で３０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄した後、１μＣｉ／ｍＬの［３Ｈ］−２−ＤＧ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）および１００ｍＭの非放射性２−ＤＧを含有する１ｍＬのＰＢＳの添加によってグルコース摂取を開始した。５分後、ＰＢＳによる広範囲な洗浄によってグルコース摂取を終了させ、細胞を０．１％のＳＤＳ緩衝液にて可溶化した。シンチレーションカウンタＬＳ６５００（Ｂｅｃｋｍａｎ）を用いて放射能を測定するためにアリコートを取り出した。
【０１２８】
ＮＡＤＨアッセイおよび乳酸塩アッセイ
ＮＡＤＨおよび乳酸塩の細胞内レベルの決定を、それぞれＥｎｚｙＣｈｒｏｍ  ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨアッセイキットおよびＥｎｚｙＣｈｒｏｍ  Ｌ−Ｌａｃｔａｔｅアッセイキットを用いて行った（ＢｉｏＡｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｈａｙｗａｒｄ、ＣＡ）。簡単に述べると、ＬＮＣａＰ細胞を、２４ウェルプレートにて２×１０５細胞数／ウェルの密度で２４時間培養し、次いで１０ｍＭの２−ＤＧまたは１０μＭのＯＳＵ−ＣＧ１２を様々な時間間隔で処置した。細胞をトリプシン処理して収集した後、ＮＡＤＨおよび乳酸塩の細胞内レベルを製造業者の指示書に従って決定した。
【０１２９】
細胞生存度アッセイ
細胞生存度を、３−（４，５−ジメチルチアゾル−２−イル）−２，５−臭化ジフェニルテトラゾリウム（ＭＴＴ）アッセイを用いて決定した。ＬＮＣａＰおよびＭＣＦ−７細胞を９６ウェルプレート（５０００細胞数／ウェル）にて播種し、１０％のＦＢＳで補足されたそれぞれの培地で２４時間インキュベートした。次に細胞を様々な濃度のＯＳＵ−ＣＧ１２、ＳＴＧ２８、ＣＧ、ＴＧ、レスベラトロル、および２−ＤＧにより７２時間処置した。次に薬物含有培地を１ｘＭＴＴ（ＲＰＭＩ１６４０で０．５ｍｇ／ｍＬ）に置き換え、次いで３７℃で２時間インキュベーションした。培地を取り除いた後、減少したＭＴＴ染料を２００μＬ／ウェルのＤＭＳＯにて可溶化し、吸収度を５７０ｍｍで測定した。補足グルコースの効果の評価のため、細胞をＯＳＵ−ＣＧ１２により、０．５、２、１０、または２０ｍｇ／ｍＬのグルコースの存在下で７２時間処置し、その後ＭＴＴを添加した。β−ＴｒＣＰ過剰発現実験では、ＷＴ−またはΔＦ−β−ＴｒＣＰ−Ｍｙｃ血漿によりトランスフェクトされた細胞を様々な濃度のＯＳＵ−ＣＧ１２に７２時間露出させ、その後ＭＴＴを添加した。
【０１３０】
流量サイトメトリ解析
ＷＴ−またはΔＦ−β−ＴｒＣＰによりトランスフェクトされたＬＮＣａＰ細胞を６ウェルプレート（４×１０５細胞数／ウェル）にて播種し、２４時間培養し、次にＤＭＳＯ、５ｍＭの２−ＤＧまたは５μＭのＯＳＵ−ＣＧ１２により４８時間処置した。ＰＢＳによる広範囲な洗浄後、細胞を冷寒８０％エタノール中に４℃で一晩固定し、次にヨウ化プロピジウム（１００ユニット／ｍＬのＲＮＡａｓｅＡを含有するＰＢＳ中に５０μｇ／ｍＬ）により染色した。細胞サイクル相分布を、ＦａＣＳｃｏｒｔ流量サイトメータを用いて決定して、ＭｏｄＦｉｔＬＴ  Ｖ３．０プログラムによって分析した。
【０１３１】
統計分析
各実験を３部で行った。すべての実験を少なくとも２回異なる場合に行った。必要な場合は、データは平均値±９５％信頼区間として提示される。
【０１３２】
結果
ＴＺＤは癌細胞での自食を誘発する能力を示す。本発明者は、ＴＺＤおよびグルコース除去が、β−ＴｒＣＰ介在プロテアソーム分解を誘発する能力を共有し、これによりＴＺＤをエネルギー制限模倣剤として用いることができることを実証した。文献では、腫瘍エネルギー代謝を選択的に標的とすることにより、多くの低分子薬剤が癌細胞増殖を抑制すると報告されており、これらの薬剤の中でも、２−ＤＧおよびレスベラトロルが特に注目に値する。しかし、これらの薬剤は一般に抗増殖効能が低く、これが治療への適応を制限する要因となる。例えば、ＬＮＣａＰ前立腺癌およびＭＣＦ−７乳癌細胞の生存度を阻害する場合の２−ＤＧに対するＩＣ５０値は、それぞれ５．５ｍＭおよび４．２ｍＭであり、レスベラトロルの場合はそれぞれ１１０μＭおよび６０μＭであった（図３Ａ）。これに対して、トログリタゾン（７０μＭおよび７０μＭ）ならびにシグリタゾン（７０μＭおよび４２μＭ）の抗増殖効能はレスベラトロルのそれに匹敵する一方で、それらのＰＰＡＲγ不活性の最適な誘導体、ＳＴＧ２８（１２μＭおよび１１μＭ）ならびにＯＳＵ−ＣＧ１２（５．７μＭおよび５．０μＭ）はそれぞれレスベラトロルおよび２−ＤＧより１〜３桁高い効能を示した。等しく重要なことに、２−ＤＧおよびレスベラトロルと同様に、これらＴＺＤは、正常な前立腺上皮細胞（ＰｒＥＣ）に対して低い細胞毒性を示した。この悪性細胞と非悪性細胞との間の異なる抗増殖効果は、高い濃度のＯＳＵ−ＣＧ１２を４８時間処置した後、β−ＴｒＣＰ、Ｓｐ１、およびＡＲの発現レベルが変化しなかったことによって証明されるように、ＴＺＤにはＰｒＥＣでのβ−ＴｒＣＰ介在プロテアソーム分解を誘発する能力が無いことに起因するかもしれない（図３Ｂ）。
【０１３３】
自食とは、健康な細胞と同様に癌細胞でのエネルギー制限への特徴的な細胞応答を表す（Ｓｉｎｇｌｅｔａｒｙら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ  ＢｉｏｍａｒｋｅｒｓＰｒｅｖ．１７、ｐ．１５９６−１６１０（２００８））。２−ＤＧ（ＤｉＰａｏｌａら、Ｐｒｏｓｔａｔｅ．６８  ｐ．１７４３−１７５２（２００８））およびレスベラトロル（Ｋｕｅｃｋら、Ｇｙｎｅｃｏｌ  Ｏｎｃｏｌ．１０７  ｐ．４５０−４５７（２００７））は、抗増殖効果を引き起こすのに必要とされる各濃度に合わせてそれぞれ５〜２５ｍＭおよび５０〜１００μＭの用量範囲で癌細胞に自食を誘発すると報告されている。従って、本発明者は、オートファーゴソーム形成のための不可欠の工程である、微小管関連のタンパク質１軽鎖３（ＬＣ３）−ＩＩのＬＣ３−Ｉからの変換の媒介となるＴＺＤの能力を調べた。ＬＮＣａＰ細胞をＧＦＰ−ＬＣ３発現ベクターにより一時的にトランスフェクトして、公知の自食阻害剤である１ｍＭの３−メチルアデニン（３−ＭＡ）と共にまたはこれを使用せず、５μＭのＯＳＵ−ＣＧ１２による処置を行った。抗ＧＦＰ抗体によるウェスタンブロットにより、薬物処理した細胞ではＬＣ３−ＩＩの時間依存蓄積が判明するが、これは３−ＭＡによってブロックされ得る（図４、左側パネル）。さらに、蛍光顕微鏡検査により、ＯＳＵ−ＣＧ１２が蛍光の断続蛍光パターンを誘発し、これはＧＦＰ−ＬＣ３が蓄積して自食胞となっていることを示す（右側パネル）。この場合も、このＧＦＰ−ＬＣ３蛍光の断続パターンは３−ＭＡ共同処置によって防止された。類似の結果はまた、ＭＣＦ−７細胞の場合（データ図示せず）と同様に他のＴＺＤでも得られた。これらのデータは、ＴＺＤがエネルギー制限によって誘発されるものに匹敵する癌細胞における応答を引き出すという主張に対するさらなる支持を提供する。
【０１３４】
β−ＴｒＣＰ介在プロテアソーム分解は、エネルギー制限が引き出したシグナル伝達事象を表す。サイクリンＤ１およびＳｐ１のβ−ＴｒＣＰ依存タンパク質分解は、ＴＺＤによる処置の後だけではなく、グルコース除去に応答して起こるという本発明者の先の知見に基づき、このβ−ＴｒＣＰ介在プロテアソーム分解はエネルギー代謝を乱すＴＺＤの能力の結果であると仮説を立てた。この仮説に取り組むために、本発明者は、β−ＴｒＣＰ介在タンパク質分解をエネルギー制限が引き出したシグナル伝達事象として確立しようと努めた。このため、グルコース飢餓の効果を、ＬＮＣａＰおよびＭＣＦ−７細胞でのβ−ＴｒＣＰ依存タンパク質分解に関係する一連のシグナル伝達タンパク質の発現レベルにおいて、２つの公知のエネルギー制限模倣剤、２−ＤＧおよびレスベラトロル、ならびに４つの異なるＴＺＤ（トログリタゾン、シグリタゾン、およびそれらのＰＰＡＲγ不活性類似物、ＳＴＧ２８およびＯＳＵ−ＣＧ１２）を用いて評価した。これらのタンパク質としては、β−ＴｒＣＰ、β−ＴｒＣＰ基質Ｓｐ１、β−カテニン、サイクリンＤ１、Ｗｅｅｌ、ＮＦ−κＢ／ｐ１０５、ならびにＳｐ１標的遺伝子産物ＡＲ、ＥＲα、およびＥＧＦＲを含めた。図５に示すように、β−ＴｒＣＰ発現を上方調節し、β−ＴｒＣＰ基質およびＳｐ１標的タンパク質の発現を抑制するＴＺＤの能力は、グルコース飢餓および２つのエネルギー制限模倣剤によって共有された。これらの効果を誘発した相対的な効能が、これら薬剤による成長阻害に対して観察されたものに匹敵するものであったのは注目に値する。
【０１３５】
さらに、標的タンパク質のＤＳＧモチーフ内のセリン残基のリン酸化が、β−ＴｒＣＰによる認知にとっての前提条件であるため、ＧＳＫ３β（β−カテニンおよびＳｐ１）、ＥＲＫ（Ｓｐ１）、ＩＫＫα（サイクリンＤ１）、Ａｋｔ、およびｐ３８を含むβ−ＴｒＣＰ基質のリン酸化に潜在的に関与する一連のキナーゼの活性化状態に与える、グルコース飢餓、２−ＤＧ、およびレスベラトロルに比べてのＴＺＤの効果を比較した。β−ＴｒＣＰ助長タンパク質分解を促進するＴＺＤおよびエネルギー制限の共有能力と一致して、ＬＮＣａＰ細胞のこれら薬剤のいずれかまたは無グルコース培地への露出により、これらキナーゼのリン酸化レベルが同様に変化した（図５）。具体的には、Ａｋｔのリン酸化の低下は、ＧＳＫ３β、ＥＲＫ、ｐ３８、およびＩＫＫαのリン酸化の低下を伴った。これらシグナル伝達バイオマーカーの発現／リン酸化に与える類似の効果はまた、５μＭのＯＳＵ−ＣＧ１２、５ｍＭの２−ＤＧまたはグルコース飢餓により処置されたＭＣＦ−７細胞においても示された。合わせて、これら相関データは、β−ＴｒＣＰ介在タンパク質分解はエネルギー制限の下流シグナル伝達事象を表すことを示唆する。
【０１３６】
ＴＺＤは、Ｓｉｒｔ１発現の誘発、ＡＭＰＫ活性化、およびＥＲストレス応答によるエネルギー制限を模倣する。ＴＺＤが、エネルギー代謝を乱すことによって癌細胞内にβ−ＴｒＣＰ介在プロテアソーム分解を誘発するという仮説をさらに評価するために、エネルギー制限に対する３つの十分に立証された特徴的な細胞応答、Ｓｉｒｔ１遺伝子発現（Ｃｏｈｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０５、ｐ．３９０−３９２（２００４））、ＡＭＰＫ活性化（Ｊｉａｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６８、ｐ．５４９２−５４９９（２００８））、およびＥＲストレス（Ｌｉｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．８１、ｐ．９８８−９９２（１９８４））を引き出すＴＺＤの能力を調べた。これらのエネルギー制限応答、すなわち、Ｓｉｒｔ１発現の誘発およびその結果生じるｐ５３の脱アセチル化、ＡＭＰＫのリン酸化、およびグルコース調節タンパク質（ＧＲＰ）７８の発現、ならびにＥＲストレス応答タンパク質のそれぞれの代表であるバイオマーカーの時間経過による変化を、ウェスタンブロットおよび／またはＲＴ−ＰＣＲにより、１０μＭのＯＳＵ−ＣＧ１２により処置したＬＮＣａＰ細胞において、１０ｍＭの２−ＤＧおよびグルコース飢餓と比較して、評価した。
【０１３７】
図６Ａに示すように、ＯＳＵ−ＣＧ１２は、これら細胞応答の媒介となる点で２−ＤＧおよびグルコース飢餓に対して高い類似性を示した。例えば、ＯＳＵ−ＣＧ１２、２−ＤＧ、またはグルコース飢餓にＬＮＣａＰ細胞を１０分間露出させることで、Ｓｉｒｔ１発現およびＡＭＰＫリン酸化が即座に着実に増加し、続いて約１時間の後処置でＧＲＰ７８の発現レベルが上昇した。これに対して、β−ＴｒＣＰの発現レベルの増大およびその結果のＳｐ１およびサイクリンＤ１の分解は、これらシグネチャー細胞応答より１０時間より長く遅れ、β−ＴｒＣＰ上方調節がこれらエネルギー制限誘発経路の少なくとも１つの下流事象を表すことが示唆される。これら知見に関して２つの重要な特徴が注目に値する。第１に、Ｓｉｒｔ１遺伝子発現の転写活性は、ＯＳＵ−ＣＧ１２に対する１時間から２−ＤＧおよびグルコース除去に対する４時間までの範囲の短期間の一時的なものであり、これはＳｉｒｔ１デアセチラーゼ基質であるｐ５３のアセチル化レベルの変化に匹敵した。第２に、ＲＴ−ＰＣＲ分析により、ＴＺＤ処置および２−ＤＧ処置細胞の両方のＳｉｒｔ１およびＧＲＰ７８の発現レベルの増加はｍＲＮＡレベルの変化を通して媒介され、一方薬物処置はβ−ＴｒＣＰのｍＲＮＡの存在度には効果を与えなかったため、β−ＴｒＣＰの場合はタンパク質レベルでの調節に起因した（図６Ｂ）。
【０１３８】
ＴＺＤによるエネルギー制限の標的化に対する追加の証拠として、ＥＲストレスおよびＡＭＰＫシグナル伝達に与えるＴＺＤおよびエネルギー制限の平行効果において明らかである。トログリタゾン、ＳＴＧ２８、シグリタゾン、およびＯＳＵ−ＣＧ１２によるＬＮＣａＰ細胞の処置により、ＥＲストレスが誘発され、これは、２つのＥＲストレス応答タンパク質、ＧＲＰ７８、成長停止および損傷誘発遺伝子（ＧＡＤＤ）１５３、ならびにＧＲＰ７８およびＧＡＤＤ１５３発現を上方調節することが示されている、１αを必要とするＥＲ関連トランスデューサイノシトール（ＩＲＥ１α）の発現レベルの用量依存上方調節によって明らかであった（図６Ｃ）。さらに、ＡＭＰＫシグナル伝達を活性化するＴＺＤの能力は、共にタンパク質合成の調節を介して細胞成長および増殖の主要なエフェクターである、ラパマイシン（ｍＴＯＲ）およびｐ７０Ｓ６Ｋの哺乳類標的の同時脱リン酸化によって立証された（Ｈａｙら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１８、ｐ．１９２６−１９４５（２００４）およびＭａｒｔｉｎら、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１７、ｐ．１５８−１６６（２００５））。このＥＲストレスおよびＡＭＰＫシグナル伝達活性化のマーカーの調整は、２−ＤＧ、レスベラトロルおよびグルコース飢餓により処置された細胞で観察されるものに匹敵した。
【０１３９】
ＯＳＵ−ＣＧ１２は、グルコース摂取をブロックすることによってエネルギー代謝を標的にする。上述の知見により、ＴＺＤは、エネルギー制限への細胞応答に特有の細胞シグナル経路を誘発することが示される。これらの知見に従って、ＴＺＤがグルコースの細胞摂取をブロックすることによってエネルギー制限を模倣することを示す、いくつかの証拠が得られた。第１に、［３Ｈ］−２−ＤＧのＬＮＣａＰ細胞への輸送に与える、公知のグルコース摂取阻害剤（Ｋｕｅｃｋら、Ｇｙｎｅｃｏｌ  Ｏｎｃｏｌ．１０７、ｐ．４５０−４５７（２００７））であるレスベラトロルに対してのＯＳＵ−ＣＧ１２の効果を評価した。図示するように、５および１０μＭでのＯＳＵ−ＣＧ１２ならびに５０および１００μＭでのレスベラトロルは、用量依存で（すべての時点でＰ＜０．０５）グルコース摂取を著しく阻害することができた（図７Ａ）。構造的な見地からは、ＯＳＵ−ＣＧ１２およびレスベラトロルは、特に親水性官能基の空間配置に対して、ある程度の類似性を示し、これがグルコース摂取を阻害する場合の共通の作用モードの基底をなすと思われる。第２に、ＯＳＵ−ＣＧ１２（１０μＭ）は、２−ＤＧ（１０ｍＭ）の場合と類似した様式で解糖速度の時間依存抑制、ＮＡＤＨ産生、およびＬＮＣａＰ細胞での乳酸塩形成の媒介となった（図７Ｂ）。いずれかの薬剤で２４時間処置すると、グルコース消費および細胞内ＮＡＤＨおよび乳酸塩レベルが５０％〜７０％減少した。第３に、高レベルの補足グルコースにより、細胞をＯＳＵ−ＣＧ１２の抗増殖効果から防御することができた。ＬＮＣａＰ細胞のＯＳＵ−ＣＧ１２に対する感受性に与えるグルコースの効果を調べるために、異なる量のグルコースをグルコース欠乏培地に加えて、最終濃度を０．５ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌの範囲とした。２ｍｇ／ｍｌに対して、未修飾の１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地でのグルコース含有量、１０および２０ｍｇ／ｍｌグルコースは、ＯＳＵ−ＣＧ１２誘発細胞死に対して著しい防御を示し（すべての時点でＰ＜０．０５）、一方０．５ｍｇ／ｍｌの場合は、ＬＮＣａＰ細胞は薬物効果に対する感受性がより大きくなった（図７Ｃ）。この防御効果はさらに、ＯＳＵ−ＣＧ１２誘発ＰＡＲＰ開裂、およびＳｉｒｔ１、β−ＴｒＣＰ、ＧＲＰ７８、およびＧＡＤＤ１５３の発現レベルの増加ならびにＡＭＰＫの活性化を含むエネルギー制限関連細胞応答を抑制する、１０および／または２０ｍｇ／ｍｌでの補足グルコースの能力によって確認された（図７Ｄ）。
【０１４０】
β−ＴｒＣＰの優性ネガティブ阻害は、ＯＳＵ−ＣＧ１２および２−ＤＧ誘発アポトーシスから細胞を防御した。上述の知見により、β−ＴｒＣＰ発現およびその結果生じる基質のタンパク質分解の上方調節は、エネルギー制限への主要な細胞応答を表すことが示唆される。β−ＴｒＣＰは一連の細胞サイクルおよびアポトーシス調節タンパク質の分解を助長するため、本発明者は、β−ＴｒＣＰはエネルギー制限模倣剤の抗増殖効果の媒介となるのに重要な役目を果たし得ると仮説を立てた。この仮定を立証するために、ＯＳＵ−ＣＧ１２および２−ＤＧ誘発成長阻害に与える、Ｆボックスモチーフの欠如により優性ネガティブ突然変異体として作用する、Ｆボックス削除β−ＴｒＣＰ（ΔＦ−β−ＴｒＣＰ）に対してのワイルドタイプ（ＷＴ）β−ＴｒＣＰの異質発現の効果を調べた。ｐＣＭＶ対照に対して、β−ＴｒＣＰ強制発現により、ＬＮＣａＰ細胞生存度に対するＯＳＵ−ＣＧ１２および２−ＤＧの抑制活性が向上し、一方ΔＦ−β−ＴｒＣＰによるβ−ＴｒＣＰ機能の優性ネガティブ阻害により、両薬剤の成長阻害効果に対して細胞が防御された（図８Ａ）。ウェスタンブロット分析により、これらの効果が、ＰＡＲＰ開裂およびサブＧ１個体数の増加ならびにサイクリンＤ１およびＳｐ１を含むβ−ＴｒＣＰ基質のプロテアソーム分解によって実証されるように、異質ＷＴβ−ＴｒＣＰおよびΔＦ−β−ＴｒＣＰがＯＳＵ−ＣＧ１２および２−ＤＧ誘発アポトーシスをそれぞれ促進および抑制する能力に関連したことが示される（図８Ｂ）。
【０１４１】
β−ＴｒＣＰタンパク質発現の増加はＳｉｒｔ１上方調節の結果である。β−ＴｒＣＰタンパク質発現の上方調節とエネルギー制限関連の細胞応答、すなわちＳｉｒｔ１上方調節、ＡＭＰＫ活性化、およびＥＲストレスの誘発との間の一時的な関係に照らして（図６）、本発明者は、β−ＴｒＣＰ発現の増加はこれら特徴的な応答の１つの結果であり得るという仮説を立てた。この仮説を試験するために、発明者は、β−ＴｒＣＰ発現を上方調節するＯＳＵ−ＣＧ１２の能力に与える、Ｓｉｒｔ１、ＡＭＰＫ、およびＧＡＤＤ１５３の機能および／または発現を阻害する効果を調べた。
【０１４２】
得られたデータは、Ｓｉｒｔ１の優性ネガティブ形態（Ｈ３６３ＹＳｉｒｔ１）の強制発現が、β−ＴｒＣＰ発現、およびアポトーシスのためのバイオマーカーであるＰＡＲＰ開裂の誘発に与えるＯＳＵ−ＣＧ１２の効果を覆したことを示している（図８Ｃ、右側パネル）。この機構的な関連はさらに、ＷＴ  Ｓｉｒｔ１の異質発現により、β−ＴｒＣＰレベルの上昇が、その標的タンパク質サイクリンＤ１およびＳｐ１の発現の減少と共に、用量依存の様式でもたらされたという知見によって立証された（図８Ｃ、左側パネル）。さらに、共にＳｉｒｔ１デアセチラーゼ活性の薬理学的阻害剤であるニコチンアミドおよびスプリトマイシンを用いて、ＯＳＵ−ＣＧ１２処置ＬＮＣａＰ細胞でのβ−ＴｒＣＰ発現のＳｉｒｔ１誘発上方調節が、デアセチラーゼ依存メカニズムを介してβ−ＴｒＣＰタンパク質の安定性を向上させるその能力に起因するという証拠が得られた。第１に、タンパク質の安定性を評価するためにシクロヘキシミドを用いて、ビヒクル前処理された細胞において、β−ＴｒＣＰは１２時間より少ない半減期を示した（図８Ｄ、左側パネル）。これに対して、５μＭでのＯＳＵ−ＣＧ１２は、β−ＴｒＣＰタンパク質のレベルがシクロヘキシミドの存在下でも２４時間まで変化しなかったため、β−ＴｒＣＰの安定性を増大させた。しかし、β−ＴｒＣＰに与えるＯＳＵ−ＣＧ１２のこの安定化効果は、細胞をニコチンアミドまたはスプリトマイシンにより共同処置すると覆された。第２に、ＲＴ−ＰＣＲ分析により、β−ＴｒＣＰのｍＲＮＡレベルは、ＯＳＵ−ＣＧ１２単独でのまたはいずれかのＳｉｒｔ１阻害剤の存在下での処置後、変化しないことが確認された（図８Ｄ、右側パネル）。加えて、Ｓｉｒｔ１活性の薬理学的阻害により、ＬＮＣａＰ細胞を、ΔＦ−β−ＴｒＣＰ（データ示さず）による優性ネガティブ阻害の場合に類似する様式で、ＯＳＵ−ＣＧ１２誘発細胞死から防御することができた。合わせて、これらの知見により、Ｓｉｒｔ１発現での一時的なＴＺＤまたはエネルギー制限誘発の上方調節と、その結果得られる、向上したタンパク質安定化を通してのβ−ＴｒＣＰ発現の上昇との間の偶然の関係が示唆される。
【０１４３】
これに対して、ＯＳＵ−ＣＧ１２誘発ＡＭＰＫ活性化の優性ネガティブおよび薬理学的阻害は、β−ＴｒＣＰタンパク質発現の上方調節に影響を与えなかった（図９）。同様に、ＧＡＤＤ１６３発現のｓｉＲＮＡ介在サイレンシングは、ＯＳＵ−ＣＧ１２誘発β−ＴｒＣＰタンパク質発現に影響を与えなかった（図１１Ｂ）。これらのデータにより、ＡＭＰＫおよびＥＲストレスの活性化は、β−ＴｒＣＰ発現のＴＺＤまたはエネルギー制限誘発の上方調節の媒介とならないことが示される。
【０１４４】
自食細胞死は、エネルギー制限模倣剤の抗増殖効果において役割を果たす。
【０１４５】
上述の知見は、２−ＤＧおよびＯＳＵ−ＣＧ１２誘発アポトーシスにおけるＳｉｒｔ１−β−ＴｒＣＰ経路の重要な役割を示している。引き続き本発明者は、エネルギー制限模倣剤の抗腫瘍効果におけるＡＭＰＫおよびＥＲストレスシグナル伝達の潜在的な役割を評価した。エネルギー制限は、ラパマイシン（ｍＴＯＲ）経路のＡＭＰＫ結節硬化錯体（ＴＳＣ）１／２哺乳類標的を介する自食を誘発することが報告されている（Ｓｉｎｇｌｅｔａｒｙら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  Ｐｒｅｖ．１７、ｐ．１５９６−１６１０（２００８））。従って、ＡＭＰＫ機能をブロックすることで、ＬＮＣａＰ細胞が、エネルギー制限模倣剤に応答して自食を経験するのを防ぐはずである。図９に示すように、下流標的ｍＴＯＲおよびｐ７０Ｓ６Ｋのリン酸化レベルが変わらないことによって証明される、ＯＳＵ−ＣＧ１２誘発ＡＭＰＫ活性化の優性ネガティブ（左側パネル）または薬理学的阻害は、ＧＦＰタグ化ＬＣ３−Ｉの、オートファーゴソーム形成の指標であるＬＣ３−ＩＩへの変換を防止した。さらに、ＯＳＵ−ＣＧ１２処置ＬＮＣａＰ細胞ではβ−ＴｒＣＰまたはＧＡＤＤ１５３の発現レベルへの効果は観測されなかったため、この自食の阻害は、β−ＴｒＣＰおよびＥＲストレスへの薬物誘発変化とは無関係であった。
【０１４６】
この知見に従って、ＯＳＵ−ＯＧ１２介在自食に与えるＴＳＣ２ノックダウンの効果を蛍光顕微鏡検査により評価した。ＴＳＣ２  ｓｈＲＮＡによるＬＮＣａＰ細胞の安定したトランスフェクションにより、ＡＭＰＫを活性化するＯＳＵ−ＣＧ１２の能力に影響を及ぼすことなく、ＴＳＣ２発現の完全な抑制がもたらされた（図１０、左側パネル）。ＡＭＰＫ活性化の阻害に類似して、ＴＳＣ２発現のサイレンシングにより、ＯＳＵ−ＣＧ１２によるＧＦＰ−ＬＣ３ポジティブ斑点の形成が防止され（図１０、右側パネル）、ＯＳＵ−ＣＧ１２誘発自食におけるＡＭＰＫ／ＴＳＣ１／２経路の中心的な役割が確認された。自食は、治療に応えて癌細胞ホメオスタシスを管理することにおいてはアポトーシスに匹敵することが認められるが、それを促進または阻害することにより薬物誘発細胞死を調整する場合のその機能は、細胞状態によって変動する（Ｔｓｕｃｈｉｈａｒａら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ、２７８、ｐ．１３０−１３８（２００９））。
【０１４７】
エネルギー制限誘発細胞死における自食の役割を評価するために、ＯＳＵ−ＣＧ１２介在アポトーシスおよび細胞生存度の抑制に与える、優性ネガティブＡＭＰＫの異質発現により自食を阻害する効果を調べた。ＰＡＲＰ開裂によって示されるように、ＡＭＰＫ自食経路の阻害によっては細胞をＯＳＵ−ＣＧ１２誘発アポトーシスから防御することはできなかった（図９）が、ＭＴＴデータは、自食をブロックすることによって、ｐＣＭＶ対照に対してＯＳＵ−ＣＧ１２誘発細胞死が実質的に減った（すべてのデータポイントにおいてｐ＜０．０１）ことを示し（図１１Ａ）、これはまた２−ＤＧおよびレスベラトロル処置細胞（データ示さず）においても確認された。これに対して、ＧＡＤＤ１５３のｓｉＲＮＡ介在サイレンシングによるＥＲストレスシグナル伝達の阻害は、ＯＳＵ−ＣＧ１２処置ＬＮＣａＰ細胞におけるＰＡＲＰ開裂に影響を与えず（図１１Ｂ）、またＬＮＣａＰ細胞のＯＳＵ−ＣＧ１２の抗増殖活性に対する感受性にも影響を与えなかった（データ示さず）。合わせて、これら知見により、Ｓｉｒｔ１−β−ＴｒＣＰ経路に加えて、ＡＭＰＫ活性化誘発自食が、癌細胞におけるエネルギー制限模倣剤の抗増殖効果の媒介に重要な役割を果たすことが明らかである。
【０１４８】
考察
癌細胞は、細胞エネルギー代謝を好気性解糖に移行させることにより腫瘍微環境において成長上の利点を得る、いわゆるワールブルク効果が長い間認められてきた。Ｇａｔｅｎｂｙら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ、４、ｐ．８９１−８９９（２００４）；Ｋｉｍら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６６、ｐ．８９２７−８９３０（２００６）；およびＳａｍｕｄｉｏら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６９、ｐ．２１６３−２１６６（２００９）。この悪性関連の解糖移行が、ポシトロン断層法で［１８Ｆ］−フルオロデオキシグルコース摂取をトレースすることによって癌の分子画像化の基礎を構成する。より最近では、様々な自然のまたは化学誘発の腫瘍動物モデルでの発癌を抑制する場合の、食物カロリー制限（Ｈｕｒｓｔｉｎｇら、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｍｅｄ．５４、ｐ．１３１−１５２（２００３））、レスベラトロル（Ｃｕｃｃｉｏｌｌａら、Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ．６、ｐ．２４９５−２５１０（２００７））、および２−ＤＧ（Ｚｈｕら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６５、ｐ．７０２３−７０３０（２００５））のインビボでの有効性によって示されるように、解糖阻害への悪性細胞対正常細胞の感受性の違いを利用することによって、癌治療のために好気性解糖を標的にする（Ｃｈｅｎら、Ｊ  Ｂｉｏｅｎｅｒｇ  Ｂｉｏｍｅｍｂｒ．３９、ｐ２６７−２７４（２００７））ことに関心が高まっている。慢性エネルギー制限は、一般的な個体数による化学的予防方策として実現するのは難しいので、２−ＤＧおよびレスベラトロルが、それぞれグルコース代謝および摂取を阻害することによりエネルギー制限の有益な効果を模倣するこれらの能力のために、幅広い注目を集めている。しかし、レスベラトロルおよび２−ＤＧは、グルコース代謝をブロックする場合のインビトロにおける効能が比較的弱く、ＩＣ５０値はそれぞれ少なくとも５０μＭおよび４ｍＭであり、このためこれらの治療への適用は限られている。
【０１４９】
実験により、ＴＺＤは、レスベラトロルおよび２−ＤＧの場合に類似する様式でエネルギー制限に特有の特徴的な細胞応答を引き出すこれらの能力を考慮すれば、新規のクラスのエネルギー制限模倣剤を表すことが実証されている。これらエネルギー制限関連応答としては、最後には自食およびアポトーシスとなる、Ｓｉｒｔ１遺伝子発現の一時的な誘発および細胞内燃料センサＡＭＰＫおよびＥＲストレスの活性化を含んだ（図１１Ｂ）。しかし、これらの応答は、培養培地に補足グルコースが存在することによって覆され得る。さらに、ＴＺＤ、２−ＤＧ、レスベラトロル、およびグルコース除去すべてが、Ａｋｔ、ＧＳＫ３β、ＭＡＰキナーゼ、およびＩＫＫαを含む、検査したシグナル伝達キナーゼのリン酸化状態を調整する能力を共有した。これはさらにエネルギー制限模倣剤としてのＴＺＤの提案した活性をさらに支持する
レスベラトロルと同様、ＯＳＵ−ＣＧ１２は、解糖速度の低下ならびにＮＡＤＨおよび乳酸塩の産生の減少によって明らかにされるように、グルコース摂取をブロックすることによりエネルギー制限の効果を模倣した。この薬物誘発代謝障害が、癌細胞において一時的なＳｉｒｔ１遺伝子発現、ＡＭＰＫ活性化、およびＥＲストレスを含む上述の飢餓関連細胞応答の誘発のシグナルとなった。機構的な見地からは、これら細胞応答のそれぞれが、個別の下流シグナル経路の媒介となり、これらの間の相互作用の結果、ＯＳＵ−ＣＧ１２の抗増殖効果となる。例えば、データにより、ＯＳＵ−ＣＧ１２誘発ＡＭＰＫ活性化は、ＴＳＣ１／２−ｍＴＯＲ−ｐ７０Ｓ６Ｋ経路を介して自食へと至る一方、ＥＲストレスの場合は、哺乳類細胞でのＥＲストレス応答の重要なメディエータであるＩＲＥ１αの上方調節を介してＥＲシャペロンＧＲＰ７８およびＧＡＤＤ１５３の転写活性化をシグナル伝達した。
【０１５０】
以前の研究は、ＡＭＰＫ活性化およびＥＲストレスをカロリー制限中の選択的癌細胞殺滅のための標的として意味付けている（Ｓａｉｔｏら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６９、ｐ．４２２５−４２３４（２００９））。しかし、細胞死応答を調節する場合のＮＡＤ＋依存ヒストンデアセチラーゼであるＳｉｒｔ１の役割は、腫瘍促進剤または腫瘍抑制剤としての従来の役割に照らして十分には定義されていない（Ｄｅｎｇら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｓｃｉ，５、ｐ．１４７−１５２（２００９））。Ｓｉｒｔ１は、ｐ５３、網膜芽細胞腫タンパク質、ＮＦ−κＢ、いくつかのフォークヘッドファミリー転写因子（ＦＯＸＯ）、ＭｙｏＤ、ＤＮＡ修復タンパク質Ｋｕ７０、転写コアクチベータＰＣＧ−１αおよびｐ３００を含む、脱アセチル化を介する幅広い範囲の非ヒストンシグナル伝達タンパク質の機能と共に、後成変化を調節する能力を示す。Ｓｉｒｔ１は、ＮＦ−κＢ／Ｒｅ１Ａの脱アセチル活性化を通して細胞死または細胞サイクル阻止を向上させると示されている（Ｙｅｕｎｇら、ＥＭＢＯ  Ｊ．２３、ｐ．２３６９−２３８０（２００４））一方で、これはまたｐ５３、ＦＯＸＯおよびＫｕ７０などの腫瘍抑制およびＤＮＡ損傷修復に関与するいくつかの標的タンパク質を不活性化する。
【０１５１】
本発明者の研究により、Ｓｉｒｔ１の発現が、たとえ非常に短い期間であっても、β−ＴｒＣＰ助長プロテアソーム分解の活性化を通して癌細胞でのエネルギー制限模倣剤によるアポトーシスの誘発の効果の媒介に重要な役割を果たすという第１の証拠が提供される。この機構的な関連は、ＯＳＵ−ＣＧ１２または２−ＤＧ誘発アポトーシス死をブロックするβ−ＴｒＣＰまたはＳｉｒｔ１の優性ネガティブおよび／または薬理学的阻害の能力によって実証された。β−ＴｒＣＰ発現のＳｉｒｔ１介在上方調節は、タンパク質安定化を通して実現され、タンパク質安定化のためには、Ｓｉｒｔ１のデアセチラーゼ活性が重要であったことは注目に値する。β−ＴｒＣＰタンパク質のこの安定化は、プロテアソーム介在タンパク質分解のためにβ−ＴｒＣＰを標的にする特定のＥ３リガーゼの発現／活性を抑制するＳｉｒｔ１の能力に起因すると考えられる。この潜在的なメカニズムは現在調査中である。加えて、ＡＭＰＫは、細胞内ＮＡＤ＋レベルを上げることによってＳｉｒｔ１活性を向上させると報告されているが、本データは、ＡＭＰＫの遺伝的阻害および薬理学的阻害のいずれも、ＴＺＤ処置癌細胞でのβ−ＴｒＣＰ発現に効果を与えなかったことを示し、ＡＭＰＫ活性化はβ−ＴｒＣＰタンパク質安定性を上方調節するのに主要な役割を果たさなかったことを示唆した。
【０１５２】
実質的な証拠は癌における自食の重要性を示しているが、細胞の薬物誘発細胞死を高めるかまたはこれを防御することによりその治療上の応答を調整する役割は不明瞭のままである。その機能は、異なる死シグナル経路に応答して、および／または異なる腫瘍形成段階で変動すると考えられる。エネルギー制限模倣剤の場合には、提供されたデータは、自食とアポトーシスとの間の相互作用はこれらの抗増殖活動の媒介となるのに重要な役割を果たすと示唆している。
【０１５３】
終わりに、本明細書に提供された知見は３つの点で注目に値する。第１に、エネルギー制限を標的にする場合のトログリタゾンおよびシグリタゾンの新規の機能により、幅広い範囲のシグナル伝達標的に与えるこれらのＰＰＡＲγ非依存効果を説明する機構的な基礎が提供される。第２に、本発明者は、β−ＴｒＣＰ助長プロテアソーム分解のＳｉｒｔ１介在上方調節は、エネルギー制限が引き出したシグナル伝達事象であり、エネルギー制限模倣剤の抗腫瘍効果にとって重要であることを初めて示した。第３に、証拠により、ＴＺＤは、グルコース飢餓関連細胞応答を引き出すことによって、抗腫瘍効果の媒介となることが示されている。この知見により、これらＴＺＤを潜在的なエネルギー制限模倣剤を開発するための足場として用いる分子基礎が提供される。ＯＳＵ−ＣＧ１２は、レスベラトロルおよび２−ＤＧに対して飢餓状細胞応答を引き出すのにそれぞれ１桁および３桁高い効能を示す。化学療法薬剤としてのＯＳＵ−ＣＧ１２の翻訳値はその経口生体利用効率、および急性毒性を招くことなく腫瘍異種移植成長を抑制する場合の有効性によって強調される。
【０１５４】
実施例２：ＮＣＩ６０細胞株スクリーニング分析による癌細胞成長を抑制するチアゾリジンジオン誘導体ＯＳＵ−ＣＧ５およびＯＳＵ−ＣＧ１２の能力
米国国立癌研究所は、様々な異なる癌に対するＯＳＵ−ＣＧ５およびＯＳＵ−ＣＧ１２の抗癌活性を、様々な異なる細胞株を用いて評価するため実験を行った。ＮＣＩ６０スクリーニング方法の検討に関しては、Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ，Ｒ．Ｈ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、６：ｐ．８１３−８２３（２００６）を参照。より詳しくは、ＯＳＵ−ＣＧ５およびＯＳＵ−ＣＧ１２を試験して、これらの前立腺癌、乳癌、白血病、非小細胞肺癌、結腸癌、ＣＮＳ癌、黒色腫、卵巣癌、および腎臓癌細胞株の成長を阻害する能力を調べた。様々な異なる細胞株を使用して、各タイプの癌の阻害を評価した。例えば、ＣＣＦＲ−ＣＥＭ、ＨＬ−６０、Ｋ−５６２、ＭＯＬＴ−４、ＲＰＭＩ−８２２６、およびＳＲ細胞株を用いて、白血病に与えるＯＳＵ−Ａ９Ｍの効果を評価した。これらの実験からのデータにより、ＯＳＵ−ＣＧ５およびＯＳＵ−ＣＧ１２は共に、様々な異なるタイプの癌細胞において著しい抗腫瘍効能を示したことが実証された。
【０１５５】
ＮＣＩ６０スクリーニング方法は以下の技法を用いて実行された。癌スクリーニングパネルのヒト腫瘍細胞株を、５％のウシ胎仔血清および２ｍＭのＬ−グルタミンを含有するＲＰＭＩ１６４０培地にて成長させた。次に細胞を、個別の細胞株の倍加時間に依存して、５，０００〜４０，０００細胞数／ウェルの範囲のプレート密度で１００μＬ中に９６ウェルマイクロタイタープレートへと播種した。細胞播種後、マイクロタイタープレートを３７℃、５％のＣＯ２、９５％の空気および１００％の相対湿度で２４時間インキュベートし、その後チアゾリジンジオン誘導体を添加する。
【０１５６】
２４時間後、各細胞株の２つのプレートをＴＣＡによりインサイチュで固定して、薬物添加（Ｔｚ）時での各細胞株に対する細胞個体数の測定を表すこととした。次にチアゾリジンジオン誘導体を、所望最終最大試験濃度の４００倍の濃度でジメチルスルホキシド中で可溶化させ、使用に先立ち冷凍保存した。薬物添加時には、冷凍濃縮物のアリコートを解凍して、５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを含有する完全培地により所望最終最大試験濃度の２倍に希釈した。さらに４個の１０倍または１／２ｌｏｇの連続希釈液を作製し、合計５種の薬物濃度プラス対照を提供した。これら異なる薬物希釈液の１００μｌのアリコートを、１００μｌの培地を既に含有する適切なマイクロタイターウェルに添加し、必要な最終薬物濃度とする。
【０１５７】
薬物添加に続いて、プレートを３７℃、５％のＣＯ２、９５％の空気および１００％の相対湿度でさらに４８時間インキュベートした。接着細胞に対しては、冷ＴＣＡを添加することによってアッセイを終了させた。細胞を、５０μｌの冷５０％（ｗ／ｖ）ＴＣＡ（最終濃度１０％ＴＣＡ）を静かに添加することによってインサイチュで固定して、４℃で６０分間インキュベートした。上清を除去し、プレートを水道水で５回洗浄し、空気乾燥させた。１％の酢酸中に０．４％（ｗ／ｖ）のスルホローダミンＢ（ＳＲＢ）溶液（１００μｌ）を各ウェルに添加して、プレートを室温で１０分間インキュベートする。染色後、１％の酢酸で５回洗浄することによって非結合の染料を取り除き、プレートを空気乾燥させる。続いて結合した染料を１０ｍＭのトリズマ塩基で可溶化し、自動プレート読取り装置上で波長５１５ｎｍで吸光度を読み取った。懸濁細胞に対しては、５０μｌの８０％ＴＣＡ（最終濃度１６％ＴＣＡ）を静かに添加することによってウェルの底の沈殿した細胞を固定することでアッセイを終える以外は技法は同じである。７つの吸光度測定［時間ゼロ（Ｔｚ）、対照成長（Ｃ）および５つの濃度レベル（Ｔｉ）での薬物の存在下における試験成長］を用いて、成長百分率を各薬物濃度レベルで計算する。成長阻害百分率は次のように計算される。
【０１５８】
濃度Ｔｉ≧Ｔｚの場合［（Ｔｉ−Ｔｚ）／（Ｃ−Ｔｚ）］×１００
濃度Ｔｉ＜Ｔｚの場合［（Ｔｉ−Ｔｚ）／Ｔｚ］×１００  。
【０１５９】
各実験薬剤に対して３つの用量応答パラメータを計算した。［（Ｔｉ−Ｔｚ）／（Ｃ−Ｔｚ）］×１００＝５０から、５０％の成長阻害（ＧＩ５０）が計算され、これは、薬物インキュベーション期間での対照細胞における純タンパク質増加（ＳＲＢ染色で測定）において５０％の減少をもたらす薬物濃度である。全成長阻害（ＴＧＩ）をもたらす薬物濃度は、Ｔｉ＝Ｔｚから計算した。処置後の細胞の純損失を示すＬＣ５０（薬物処置の終了時の測定タンパク質が開始時のそれに比べて５０％の減少をもたらす薬物濃度）は、［（Ｔｉ−Ｔｚ）／Ｔｚ］×１００＝−５０から計算される。活性のレベルに達した場合はこれら３つのパラメータのそれぞれに対して値を計算した。しかし、効果が達していない場合または超えている場合は、そのパラメータに対する値は、試験された最大または最小濃度より大きいまたは小さいとして表される。
【０１６０】
実施例３：新規のアデノシン一リン酸活性化プロテインキナーゼ活性剤の開発
ＡＭＰＫのＰＰＡＲγ非依存活性化の媒介となるチアゾリジンジオンファミリーのＰＰＡＲγアゴニストに固有の能力に照らして、本発明者は、これらの薬剤は、これら２つの薬理学的活性を切り離すことによって強力なＡＭＰＫ活性剤を開発するために薬理学的に利用され得ると仮説を立てた。インハウスのチアゾリジンジオン系の集中化合物ライブラリの２段スクリーニングを行って、低μＭ濃度で、ＡＭＰＫを活性化しまたヒトＴＨＰ−１マクロファージ中のＰＰＡＲγとは独立してＩＬ−６産生を阻害する能力を示す新規の薬剤を同定した。
【０１６１】
チアゾリジンジオン類のＰＰＡＲγ活性をなくすために、本発明者は、トログリタゾンならびにシグリタゾン６１（Δ２ＴＧ）および６２（Δ２ＣＧ）の不飽和誘導体を、６０個の化合物（１〜６０；図１３）よりなる集中化合物ライブラリを開発するための足場として用いた。ＡＭＰＫおよびｍＴＯＲの活性状態［すなわち、ＡＭＰＫおよびｐ７０リボソームタンパク質Ｓ６キナーゼ（ｐ７０Ｓ６Ｋ）それぞれのリン酸化レベル］、ならびにリボ多糖（ＬＰＳ）刺激ＴＨＰ−１マクロファージでのＩＬ−６／ＩＬ−６受容体シグナル伝達［すなわち、それぞれＩＬ−６産生ならびに転写３（Ｓｔａｔ３）リン酸化のシグナルトランスデューサおよび活性剤］に関係する細胞系のアッセイを用いて、ウェスタンブロットおよび酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を介してこの化合物ライブラリをスクリーニングした（図１４Ａ）。１０μＭでの個々の化合物の第１段のスクリーニングは８つの活性薬剤（８、１２、２１、３１、４２、４９、５３、および５４）をカバーし、これらは３つの構造シリーズに類別された（図１２Ａ）。ＩＬ−６のＬＰＳ刺激産生をブロックする１μＭでのこれら薬剤の能力をさらに調べることで、化合物５３を最適薬剤と同定した。シリーズＡ〜Ｃ化合物の合成のための一般的な手順を図１２Ｂに示す。
【０１６２】
方法
細胞および細胞培養。ＴＨＰ−１単核細胞をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から購入し、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、０．２５％のグルコース、０．０１％のピルビン酸ナトリウム、５０μＭの２−メルカプトエタノール、および０．１ｍｌ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン／Ｌ−グルタミンで補足されたＬ−グルタミン含有ＲＰＭＩ１６４０により維持した。ＴＨＰ−１単核細胞のマクロファージへの分化を、上述のＲＰＭＩ１６４０培地で２４時間ＰＭＡ（５０ｎＭ）に露出させることによって実行した。結腸２６（Ｃ−２６）腺癌細胞をＯｈｉｏ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの研究者から提供を受けた。Ｃ−２６細胞を、５％のＦＢＳおよび１％のペニシリン／ストレプトマイシンで補足されたＲＰＭＩ１６４０培地で維持した。すべての細胞タイプを５％のＣＯ２を含む加湿インキュベータで３７℃で培養した。
【０１６３】
ＥＬＩＳＡ。１０ｎｇ／ｍｌのＬＰＳに応答した分化ＴＨＰ−１マクロファージによるＩＬ−６の放出を、ＩＬ−６ＥＬＩＳＡキット（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．；Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）を用いて、製造業者の指示書に従って３部で分析した。ＬＰＳ刺激ＩＬ−６放出に与える各テスト化合物の効果を阻害百分率で表し、以下の式を用いて計算した。阻害百分率＝１００％×｛１−［（サンプルのＯ．Ｄ．−対照のＯ．Ｄ．）／（ＬＰＳのＯ．Ｄ．−対照のＯ．Ｄ．）］｝  。
【０１６４】
ウェスタンブロット。ＴＨＰ−１細胞を、冷ＰＢＳ緩衝液で洗浄後ＳＤＳサンプル緩衝液に溶解させ、次に９５℃で２０分間加熱した。新たに添加した１％のホスファターゼおよびプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を含有するＭ−ＰＥＲ哺乳類タンパク質抽出試薬（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を用いてタンパク質抽出物を調製した。溶解物を１３０００ｇで１０分間遠心分離した後、上清を収集し、各サンプルのタンパク質濃度をタンパク質アッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）によって決定した。次にタンパク質抽出物を２ｘＳＤＳサンプル緩衝液に懸濁させ、１０％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動により分離し、半乾燥転移細胞を用いてニトロセルロース膜に転移させた。トランスブロットされた膜を、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０（ＴＢＳＴ）を含有するトリス緩衝化生理食塩水で２度洗浄した。５％の脱脂牛乳を含有するＴＢＳＴで１時間ブロックした後、膜を一次抗体：ｐ１７２Ｔｈｒ−ＡＭＰＫ、ＡＭＰＫ、ｐ７０５Ｔｙｒ−ＳＴＡＴ３およびＳＴＡＴ３（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）；ｐ３８９Ｔｈｒ−ｐ７０Ｓ６Ｋおよびｐ７０Ｓ６Ｋ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）により、それぞれ１：１，０００の希釈で１％のＴＢＳＴ−脱脂牛乳にて４℃で一晩中インキュベートした。一次抗体によるインキュベーション後、膜をＴＢＳＴにより３回、合計３０分間洗浄し、次にセイヨウワサビペルオキシダーゼ共役ヤギ抗マウスＩｇＧ（希釈１：２５００）により室温で１時間インキュベーションした。ＴＢＳＴによる合計３０分間の３回の十分な洗浄後、免疫ブロットを強化化学発光により可視化した。
【０１６５】
一時的トランスフェクション。Ｋ４５Ｒキナーゼデッド型優性ネガティブＡＭＰＫプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）または空ベクターによるＴＨＰ−１細胞のトランスフェクションを、Ａｍａｘａ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍａｘａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ、Ｃｏｌｏｇｎｅ、ドイツ）のＨｕｍａｎ  Ｍｏｎｏｃｙｔｅ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  Ｋｉｄを用いて電気穿孔により、Ｓｃｈｎｏｏｒら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、３４４、１０９−１１５（２００９）に従って行った。
【０１６６】
ＰＰＡＲγ活性化の分析。チミジンキナーゼ促進剤−ルシフェラーゼ構造物に先行するＰＰＡＲ応答要素の３つの複製を含むＰＰＲＥ−ｘ３−ＴＫ−Ｌｕｃレポーターベクターを用いてＰＰＡＲγ活性化の検出を行った。分化ＴＨＰ−１マクロファージを、２４ウェルプレートに１×１０５細胞数／ウェルの密度で配置し、次にＰＰＲＥ−ｘ３−ＴＫ−Ｌｕｃレポータープラスミドによるヌクレオフェクションにより一時的にトランスフェクトし、次にＬＰＳの存在下で４８時間、１０μＭのシグリタゾンまたはこの誘導体に３部で露出させた。細胞をパッシブ溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）により溶解させ、溶解物のアリコート（５０μＬ）を、９６ウェルプレートに移し、１００μＬのルシフェラーゼ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ）と混合した。ルシフェラーゼ活性を、ＷｉｎＧｌｏｗソフトウェアパッケージと共に、ＭｉｃｒｏＬｕｍａｔＰｌｕｓ  ＬＢ９６Ｖ照度計（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｏａｋ  Ｒｉｄｇｅ、ＴＮ）を用いて決定した。
【０１６７】
全ＲＮＡ単離およびＩＬ−６発現のＲＴ−ＰＣＲ分析。全ＲＮＡを薬物またはビヒクル処置ＴＨＰ−１マクロファージからＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）により抽出し、次にＯｍｎｉｓｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いてｃＤＮＡへ逆転写した。適切なＩＬ−６：正方向および逆方向；ならびにβアクチン：正方向および逆方向プライマ−を用いた。ＰＣＲ生成物を１％のアガロースゲル上で電気泳動により分離し、臭化エチジウム染色により可視化した。
【０１６８】
分子モデル実験。化合物５３、Ａ−７６９６６２、およびＰＴＩの分子構造に、先ずＳｐａｒｔａｎ’０８（Ｗａｖｅｆｕｃｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）で入手可能なＭｅｒｃｋ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｆｏｒｃｅ  Ｆｉｅｌｄプログラムを用いて１０００ステップのＭｏｎｔｅ  Ｃａｒｌｏシミュレーションを行った。次にシミュレーションによって達した最小コンフォメーションを、Ｇａｕｓｓｉａｎ０３（Ｇａｕｓｓｉａｎ，Ｉｎｃ、Ｗａｌｌｉｎｇｆｏｒｄ、ＣＴ）によりＢ３ＬＹＰ／６−３１Ｇ＊の密度関数理論レベルで十分に最適化した。十分に最適化した構造のすべてを通常のモード分析により確認した。負の周波数は見つからなかった。Ｇａｕｓｓｉａｎ０３を用いることによるＨａｒｔｒｅｅ−Ｆｏｃｋ／６−３１Ｇ＊機能理論の下での電位ポピュレーション分析によって各最適構造に対して静電位および密度の計算を行った。各化合物に対する静電位マップを、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｏｐｅｒａｔｉｏｎ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ２００８（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ、Ｍｏｎｔｒｅａｌ、カナダ）によって作成し、静電位を電子密度上にマッピングして示す。
【０１６９】
結果
チアゾリジンジオン類が潜在的なＡＭＰＫ活性剤を開発するように構造的に最適化され得るという概念の実証。
【０１７０】
本発明者は、初代マクロファージの多くの固有の特徴を模倣する細胞株モデルであるホルボール１２−ミリスチン酸１２−アセテート（ＰＭＡ）分化ＴＨＰ−１細胞を用いて、ＡＭＰＫ活性化およびＬＰＳ誘発ｍＴＯＲ活性化に与えるチアゾリジンジオン誘導体の効果、および培地へのＩＬ−６分泌を調べた。加えて、ｐ７０Ｓ６ＫおよびＳｔａｔ３のリン酸化を、薬物処置細胞においてそれぞれｍＴＯＲおよびＩＬ−６受容体シグナル経路の活性化状態に対するマーカーとしてモニタリングした（図１４Ａ）。ＡＭＰＫを活性化するには高用量のシグリタゾン（≧１００μＭ）が必要であったという最近の報告（Ｗａｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６８、４６４０−４６４８（２００８））と一致して、データは、１０μＭでのシグリタゾンは、６時間の処置後のＬＰＳ処理対照に比べてｐ−ＡＭＰＫまたはｐ−ｐ７０Ｓ６Ｋのレベルに明らかな効果を与えなかったことを示している（図１４Ｂ）。これに対して、同じ濃度のそのＰＰＡＲγ不活性の相当物６２は、ｐ−ＡＭＰＫのレベルの上昇、これに伴うｐ７０Ｓ６Ｋリン酸化の平行する減少に効果的であった。それにもかかわらず、シグリタゾンは、ＬＰＳ刺激ＩＬ−６産生の阻害で６２より数倍高い効能を示し（図１４Ｃ）、シグリタゾンの抗ＩＬ−６活性が主にＰＰＡＲγ依存メカニズムに起因することが示唆される。このＩＬ−６産生の減少は、いずれの薬剤も調べた用量範囲内でＴＨＰ−１細胞の生存度を阻害しなかったため、薬物誘発細胞死によるものではなかった。さらに、ＬＰＳ活性ＩＬ−６受容体シグナル伝達を抑制する１０μＭでのシグリタゾンおよび６２の能力は、対照に対してＳｔａｔ３リン酸化が減少したことにより明らかであった（図１３Ｂ）。
【０１７１】
ＩＬ−６産生の抑制に高い効能を持つ有効なＡＭＰＫ活性剤を同定するための、インハウスのベンジリデン−チアゾリジンジオン系の集中化合物ライブラリのスクリーニング。
【０１７２】
上記の知見に基づいて、６１および６２を、多様な構造を有する６０個の誘導体よりなる集中化合物ライブラリを生成するための足場として用いた。ここで６２はスクリーニングプロセスの間、対照（化合物３３）として隠れて埋め込まれた（図１３）。これらの化合物およびシグリタゾン、それぞれ１０μＭを、ＡＭＰＫを活性化する能力およびＬＰＳ刺激ＴＨＰ−１細胞でのＩＬ−６産生を阻害する能力に対して評価した（図１５）。先に述べた知見と一致して、１０μＭの６２は、ｐ７０Ｓ６ＫおよびＳｔａｔ３のリン酸化の阻害に関連して、ＡＭＰＫ活性化においておよびＩＬ−６分泌に対して控えめな活性を示し、一方シグリタゾンは、ＡＭＰＫリン酸化状態に影響を及ぼすことなくＩＬ−６産生の阻害に有効であった。調べた他の化合物のうちで、８個の誘導体（８、１２、２１、３１、４４、４９、５３、５４）は、これらのマーカーすべての全体的な評価において６２に対して実質的に高い効能を示した（図１５；ＩＬ−６産生の阻害が８０％より高いもののみを選択した）。この場合も、これら薬剤のいずれもＴＨＰ−１細胞の生存度の顕著な抑制を引き出さず（図１５Ｂ、下側パネル）、ＩＬ−６産生の阻害は細胞死によるものではなかったことを示す。ライブラリの中の薬剤のいくつかはＡＭＰＫ活性化に活性を示したが、ＩＬ−６産生の抑制（例えば、化合物４および５）に与える効果はなく、またはその逆（例えば、化合物９、１９、５１、５２、５５および５９）も同じであり、それらの作用モードには別のメカニズムが関与していることが示唆される。
【０１７３】
ＩＬ−６産生の薬物誘発阻害がＰＰＡＲγと無関係であることを実証するために、ＰＰＡＲγを転写活性化する、シグリタゾンに対してのこれら８つの薬剤の能力を、ＰＰＡＲ応答要素（ＰＰＲＥ）ルシフェラーゼレポーターアッセイを用いることによって調べた。レポーター構造体（ＰＰＲＥ−ｘ３−ＴＫ−Ｌｕｃ）により一時的にトランスフェクトされたＴＨＰ−１細胞では、シグリタゾンは１０μＭで、ルシフェラーゼ活性を著しく増大させた（Ｐ＜０．００１）（図１６Ａ）。これに対して、調べた８つの薬剤のいずれもＰＰＡＲγ活性化において明らかな活性を示さなかった。
【０１７４】
化合物５３は、ＡＭＰＫ活性化およびＩＬ−６抑制において先導薬剤を表す。
【０１７５】
ＩＬ−６放出をブロックする場合の、シグリタゾンに比べてのこれら候補薬剤活性をさらに１μＭで評価した。図示するように、化合物５３は、シグリタゾンの場合を超えて、最も高い効能を示し、これに５４および４９が続いた（図１６Ｂ、上側パネル）。これら３つはすべて、置換基の違いはあるが多くは共通の構造上のモチーフを有する。この場合も、これら薬剤のいずれもＴＨＰ−１細胞生存度に顕著な効果を与えていないため、ＩＬ−６産生のこの阻害は細胞死によるものではなかった（下側パネル）。
【０１７６】
化合物５３は、約１μＭのＩＣ５０で、用量依存の様式でＬＰＳ刺激ＩＬ−６産生を阻害し（図１７Ａ）、細胞内ＩＬ−６ｍＲＮＡ発現（図１７Ｂ）ならびにＡＭＰＫおよびｐ７０Ｓ６Ｋのリン酸化レベルに与えるその効果に匹敵する（図１７Ｃ）。さらに、ＡＭＰＫを活性化する場合の化合物５３の効能は、ＡＩＣＡＲの場合より約２桁高い（図１７Ｃ）。
【０１７７】
ＡＭＰＫ活性化と抗ＩＬ−６活性との間の機構的な関連を確立するために、Ｋ４５Ｒキナーゼデッド突然変異体（図１８Ａ）の異質発現を介するＡＭＰＫの優性ネガティブ（ＤＮ）阻害の効果を調べた。ｐＣＭＶ対照に対して、ＤＮ−ＡＭＰＫ突然変異体による分化ＴＨＰ−１細胞の一時的なトランスフェクションにより、ＬＰＳ誘発ＩＬ−６産生を著しく向上させ、化合物５３（１０μＭ）の阻害効果を覆した（図１８Ｂ）。この知見は、ＡＭＰＫ活性化は、ＬＰＳ刺激ＩＬ−６産生を抑制する化合物５３の能力にとって不可欠であることを示唆する。
【０１７８】
ＡＭＰＫおよびｐ７０Ｓ６Ｋのリン酸化に与える化合物５３の効果を、癌カヘキシー研究に一般に使用される細胞モデルであるＣ−２６結腸腺癌細胞においてさらに評価した。ＴＨＰ−１細胞で観察されたものと同様、化合物５３は、用量および時間依存の様式で、ｐ−ＡＭＰＫレベルの確固とした上昇、およびこれに平行するｐ−ｐ７０Ｓ６Ｋの減少の媒介となった（図１８Ｃ）。このＡＭＰＫ活性化が薬物処置のほとんど直後に生じたのは注目に値する。合わせてこれらの知見により、この薬物効果が細胞株特異的な事象ではないことが確認された。
【０１７９】
化合物５３および５４ではまた、様々な異なる癌細胞株の成長を阻害するそれらの能力について試験をおこなった。用いられた癌細胞株はＰＣ−３、ＬＮＣａＰ、ＭＣＦ−７、およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１であった。２４時間、４８時間、および７２時間での阻害の量を図１９に示す。
【０１８０】
考察
最近の証拠により、ＡＭＰＫは、成長因子シグナル伝達を、ｍＴＯＲの負の調節を通して細胞代謝と統合させることによって、代謝チェックポイントとして働くことが示唆される。Ｃａｒｌｉｎｇ，Ｄ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ、２９、１８−２４（２００４）。この機能的な役割により、癌に対するインスリン抵抗からエネルギー代謝の調節にいたる異なる疾患でのＡＭＰＫ活性化を標的とする治療値が強調される。例えば、最近の研究では、ＡＩＣＡＲが、コレステロールおよび脂肪酸生合成を阻害することによって、ＥＧＦＲ活性神経膠芽腫細胞の成長を抑制するのに効果的であったことが示されている。Ｇｕｏら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１０６、１２９３２−１２９３７（２００９）。
【０１８１】
従って、本実施例は、新規のＡＭＰＫ活性剤を開発するためにチアゾリジンジオン類の薬理学的活用を目的とした。ＡＭＰＫは細胞エネルギー状態の高度に保護されたセンサであるが、その機能的な役割は細胞状況および細胞タイプ特異的な様式で変動する。ここでは、分化ＴＨＰ−１マクロファージを細胞プラットホームとして用いて、ＩＬ−６などの炎症性サイトカンの産生を抑制することによってマクロファージの抗炎症表現型を促進する場合の、ｍＴＯＲの負の調節剤としてのＡＭＰＫの中心的な役割に照らして、薬物スクリーニングを行った。インハウスのチアゾリジンジオン系の集中化合物ライブラリをスクリーニングすることによって、この細胞系アッセイにより、化合物５３は、ＡＭＰＫを活性化しＴＨＰ−１細胞でのＬＰＳ誘発ＩＬ−６分泌を阻害する場合に低μＭ効能を持つ先導薬剤として同定された。さらに、このＬＰＳ刺激ＩＬ−６産生の薬物誘発抑制がＡＭＰＫ活性化に起因することが示されたが、これはシグリタゾンのＰＰＡＲγ依存機構とは対照をなす。それにもかかわらず、調べた多数の薬剤は、ＡＭＰＫ活性化では不活性であったが、ＩＬ−６産生に著しい効果を示した（化合物９、１９、５１、５２、５５および５９）。機構的な見地からは、これら２つの薬理学的活性の分離は、これら薬理学的薬剤の間での作用モードの多様性を示唆する。この仮定は、明白なメカニズムを通してＩＬ−６産生を調整する多数の小分子薬剤の能力によって明らかにされる。例えば、フラボノイドの１つであるルテオリンは、Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）活性剤タンパク質（ＡＰ）−１経路を阻害することによって、ＬＰＳ誘発ＩＬ−６産生を減少させ（Ｊａｎｇら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１０５、７５３４−７５３９（２００８））、一方ＩＬ−６発現のクロロキン介在の阻害は、ｍＲＮＡ安定性およびｍＲＮＡレベルの低下に関連した。Ｊａｎｇら、Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ（Ｏｘｆｏｒｄ）、４５、７０３−７１０（２００６）。加えて、ビスフォスフォネートゾレドロン酸もまた、基礎となる機構は不明であるが、前立腺癌細胞でのＩＬ−６遺伝子発現を下方調節すると報告された。Ａｓｂａｇｈら、Ｉｎｔ  Ｂｒａｚ  Ｊ  Ｕｒｏｌ、３４、３５５−３６３（２００８）。これに対して、ＪＮＫおよびＴｏｌｌ様受容体４シグナル経路の活性化を通してのパクリタキセルおよびまだ確認されていない機構を通しての多キナーゼ阻害剤スニチニブを含む、多くの治療薬剤がＩＬ−６発現の上方調節と関連している。このため、このＡＭＰＫ非依存誘発の機構を理解することが、ＩＬ−６産生の調節に光明を投ずることになろう。
【０１８２】
最近、ＡＭＰＫの２つの直接の小分子活性剤、Ａ−７６９６６２およびＰＴ１、が発見され、それぞれが独自の活性化モードを示す。Ｃｏｏｌら、Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂ、３、４０３−４１６（２００６）。証拠により、Ａ−７６９６６２のＡＭＰＫγサブユニットへのアロステリック結合が、Ｔｈｒ−１７２での脱リン酸化を阻害するＡＭＰＫのコンフォメーションを安定させ、一方ＰＴ１は、自己阻害ドメインの近くのαサブユニットに結合することによりＡＭＰＫ自己阻害を無効にすることが示唆される。Ｐａｎｇら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２８３、１６０５１−１６０６０（２００８）。タンパク質−リガンド認知のモードは不明のままであるが、ＰＴ１のＡＭＰＫα１の分子ドッキングにより、結合は主に静電相互作用に起因することが示唆される。化合物５３は、Ａ−７６９６６２およびＰＴ１と同様、多くの電子が豊富な部分を含むので、これらの化合物の静電位を比較するため分子モデリング分析を実行した（図１８Ｄ）。図示するように、化合物５３の静電位マップは、ＰＴ１のそれにある程度類似し、Ａ−７６９６６２にはもっと低い程度で類似した。この知見により、化合物５３は、ＰＴ１またはＡ−７６９６６２の場合に類似したアロステリックな結合メカニズムを通してＡＭＰＫ活性化の媒介となるであろうことが示唆され、これが本調査の現在の焦点を構成する。
【０１８３】
ＡＭＰＫは代謝症候群および癌の処置のための治療上の関連標的を表すため（Ｌｕｏら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｓｃｉ、２６、６９−７６（２００５）；Ｚｈａｎｇら、Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂ、９、４０７−４１６（２００９））、この燃料感知酵素に対する新規の薬理学的活性剤の開発への興味が増大している。しかし、特に肝臓および骨格筋における、ＡＭＰＫの持続性薬理学的活性化の潜在的な副作用に関して問題が残っている。この課題にもかかわらず、アイソザイム特異的な活性剤および／または組織選択的送達を設計することへの準備として、異なる組織でのＡＭＰＫアイソザイムの機能的役割を理解することは、緊急の課題である。
【０１８４】
結論
ＡＭＰＫ活性化およびＩＬ−６産生の阻害における化合物５３の高い効能に照らして、化合物５３は、細胞および動物モデルでの異なる疾患の治療的介入におけるこれら２つのシグナル伝達エフェクターを調整する効果を調査するための有用な薬剤として働く。加えて、ＡＭＰＫ活性化でのその機構の特徴付けにより、ＡＭＰＫの機能調節に光明が投じられ、これはさらなるＡＭＰＫ活性剤の同定に至る可能性がある。
【０１８５】
実施例４：アデノシン一リン酸活性化タンパク質活性剤の調製
化学試薬および有機溶剤は特に言及のない限りＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。核磁気共鳴スペクトル（１Ｈ  ＮＭＲ）をＢｒｕｋｅｒ  ＤＰＸ３００モデル分光計で測定した。化学シフト（δ）は、ＴＭＳピークに対して百万分の一（ｐｐｍ）の単位で報告した。電気スプレーイオン化質量分析を、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  Ｑ−Ｔｏｆ  ＩＩ高解像度電気スプレー質量分析計で行った。試験するすべての化合物の純度は化学分析により９５％より高く、これはＡｔｌａｎｔｉｃ  Ｍｉｃｒｏｌａｂ、Ｉｎｃ．（Ｎｏｒｃｒｏｓｓ、ＧＡ）により行われ、計算値の０．４％以内であると報告された。フラッシュカラムクロマトグラフィーをシリカゲル（２３０〜４００メッシュ）を用いて行った。８つの先導候補の構造は３つのシリーズ、すなわち、Ａ（８、１２、および２１）、Ｂ（３１および４４）、ならびにＣ（４９、５３、および５４）に分類することができた（図１２Ａ）。シリーズＡ〜Ｃ化合物の合成のための一般的な手順を図１２Ｂに示す。シリーズＡおよびＢの化合物は、既に報告した手順を少し修正したものに従って合成した。Ｈｕａｎｇら、Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ、４９、４６８４−４６８９（２００６）；Ｙａｎｇら、Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ、５１、２１００−２１０７（２００８）。シリーズＣ活性化合物（４９、５３、および５４）の合成は、例として化合物５３の合成によって示す。
【０１８６】
５−［３−ブロモ−４−（６−エトキシ−２，５，７，８−テトラメチル−クロマン−２−イルメトキシ）−ベンジリデン］−チアゾリジン−２，４−ジオン（８）
【０１８７】
【化４１】
0005847085.tif 000059
Ｃ２６Ｈ２８ＢｒＮＯ５Ｓ（Ｍ＋Ｎａ）＋のＨＲＭＳ正確な質量、５６８．０７６９ａｍｕ；（Ｍ＋Ｎａ）＋の観察質量、５６８．０７８６ａｍｕ。分析、計算値Ｃ５７．１４、Ｈ５．１６、Ｏ１４．６４；実測値Ｃ５７．２３、Ｈ５．２６、Ｏ１４．６６。
【０１８８】
５−［４−（６−ブトキシ−２，５，７，８−テトラメチル−クロマン−２−イルメトキシ）−３−メトキシ−ベンジリデン］−チアゾリジン−２，４−ジオン（１２）
【０１８９】
【化４２】
0005847085.tif 000060
Ｃ２９Ｈ３５ＮＯ６Ｓ（Ｍ＋Ｎａ）＋のＨＲＭＳ正確な質量、５４８．２０８３ａｍｕ；（Ｍ＋Ｎａ）＋の観察質量、５４８．２０９５ａｍｕ。分析、計算値Ｃ６６．２６、Ｈ６．７１、Ｏ１８．２６；実測値Ｃ６６．３２、Ｈ６．８０、Ｏ１８．２９。
【０１９０】
４−｛２−［２−ブロモ−４−（２，４−ジオキソ−チアゾリジン−５−イリデンメチル）−フェノキシメチル］−２，５，７，８−テトラメチル−クロマン−６−イルオキシ｝−ブチロニトリル（２１）
【０１９１】
【化４３】
0005847085.tif 000061
Ｃ２８Ｈ２９ＢｒＮ２Ｏ５Ｓ（Ｍ＋Ｎａ）＋のＨＲＭＳ正確な質量、６０７．０８７８ａｍｕ；（Ｍ＋Ｎａ）＋の観察質量、６０７．０８８２ａｍｕ。分析、計算値Ｃ５７．４４、Ｈ４．９９、Ｏ１３．６６；実測値Ｃ５７．５４、Ｈ５．０４、Ｏ１３．７２。
【０１９２】
５−（４−ヒドロキシ−３−トリフルオロメチル−ベンジリデン）−３−（１−メチル−シクロヘキシルメチル）−チアゾリジン−２，４−ジオン（３１）
【０１９３】
【化４４】
0005847085.tif 000062
Ｃ１９Ｈ２０Ｆ３ＮＯ３Ｓ（Ｍ＋Ｎａ）＋のＨＲＭＳ正確な質量、４２２．１０１４ａｍｕ；実測値：４２２．１０１２ａｍｕ。分析、計算値Ｃ５７．１３、Ｈ５．０５、Ｏ１２．０２；実測値Ｃ５７．３８、Ｈ５．０４、Ｏ１２．１６。
【０１９４】
５−（４−ヒドロキシ−３−トリフルオロメチル−ベンジリデン）−３−プロピル−チアゾリジン−２，４−ジオン（４４）
【０１９５】
【化４５】
0005847085.tif 000063
Ｃ１４Ｈ１２Ｆ３ＮＯ３Ｓ（Ｍ＋Ｎａ）＋のＨＲＭＳ正確な質量、３３１．３１１２ａｍｕ；実測値：３３１．３１２４ａｍｕ。分析、計算値Ｃ５０．７５、Ｈ３．６５、Ｏ１４．４９；実測値Ｃ５０．８４、Ｈ３．６８、Ｏ１４．５４。
【０１９６】
Ｎ−｛４−［３−（１−メチル−シクロヘキシルメチル）−２，４−ジオキソ−チアゾリジン−５−イリデン−メチル］−フェニル｝−４−ニトロ−３−トリフルオロメチル−ベンゼンスルホンアミド（５３）
ステップａ．トリフルオロメタンスルホン酸１−メチル−シクロヘキシルメチルエステル（ｉ）を上述のように１−メチルシクロヘキサンカルボン酸から調製した。Ｙａｎｇら、Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ、５１、２１００−２１０７（２００８）。ｉ（０．５ｍｍｏｌ）、２，４−チアゾリジンジオン（０．６ｍｍｏｌ）およびＫ２ＣＯ３（０．７ｍｍｏｌ）の混合物をＤＭＦ（３ｍＬ）に溶解し、４時間攪拌しつつ８０℃まで加熱し、水に注ぎ、エチルアセテート（１０ｍＬ）で３回抽出し、濃縮した。残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製して、３−（１−メチル−シクロヘキシルメチル）−チアゾリジン−２，４−ジオン（ｉｉ）を５０％の収率で得た。
【０１９７】
ステップｂ．乾燥塩化メチレン（１００ｍＬ）中のメチル４−アミノベンゾエート（１．５１ｇ、１０ｍｍｏｌ）およびピリジン（０．９７ｍＬ）の混合物に、乾燥塩化メチレン（２０ｍＬ）中の４−ニトロ−３−塩化トリフルオロメチルベンゼンスルホニル（２．８９ｇ、１０ｍｍｏｌ）をゆっくりと添加し、１ＮのＨＣｌ、水、１０％のＮａ２ＣＯ３水溶液、および塩水によりタンデムに洗浄した。有機層を乾燥させ、濾過し、濃縮した。残留物をクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ−ヘキサン、１：５）により精製して、４−（４−ニトロ−３−トリフルオロメチル−フェニル−スルファモイル）−安息香酸メチルエステル（ｉｉｉ）を無色結晶として８６％の収率で得た。
【０１９８】
【化４６】
0005847085.tif 000064
ステップｃ．化合物（ｉｉｉ）（３．２６ｇ、８．０６ｍｍｏｌ）の乾燥ＴＨＦ溶液（５０ｍＬ）に、ＬＡＨパレット（０．４６ｇ、１２．１０ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。得られる反応混合物を４時間攪拌し、水（５ｍＬ）の添加で急冷し、濃縮し、酢酸エチル（５０ｍＬ）で希釈し、１ＮのＨＣｌ、水、１０％のＮａ２ＣＯ３水溶液、および塩水によりタンデムに洗浄した。有機層を乾燥させ、濾過し、濃縮した。残留物をシリカゲルクロマトグラフィー（酢酸エチル−ヘキサン、３：７）により精製して、４−ヒドロキシメチル−Ｎ−（４−ニトロ−３−トリフルオロメチル−フェニル）−ベンゼンスルホンアミド（ｉｖ）を淡黄色固体として７１％の収率で得た。
【０１９９】
【化４７】
0005847085.tif 000065
ステップｄ．クロロホルム（１００ｍＬ）中の化合物ｉｖ（２．００ｇ、５．３１ｍｍｏｌ）およびＭｎＯ２（２．３４ｇ、２６．５７ｍｍｏｌ）の反応混合物を一晩還流させ、濃縮し、酢酸エチルで希釈し、濾過し、濃縮した。残留物をシリカゲルクロマトグラフィー（酢酸エチル−ヘキサン、１：７）により精製して、Ｎ−（４−ホルミル−フェニル）−４−ニトロ−３−トリフルオロメチル−ベンゼンスルホンアミド（ｖ）を淡黄色固体として８８％の収率で得た。
【０２００】
【化４８】
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ステップｅ．エチルアルコール（５０ｍＬ）中の化合物ｉｉ（０．７３ｇ、３．２１ｍｍｏｌ）、化合物ｖｉ（１．２５ｇ、３．２１ｍｍｏｌ）、および触媒量のピペリジンの反応混合物を一晩還流させ、濃縮し、酢酸エチル（５０ｍＬ）で希釈し、酢酸で中和し、水および塩水で洗浄し、乾燥させ、濃縮した。残留物をシリカゲルクロマトグラフィー（酢酸エチル−ヘキサン、１：７）により精製して、化合物５３を黄色固体として７２％の収率で得た。
【０２０１】
【化４９】
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Ｃ２５Ｈ２４Ｆ３Ｎ３Ｏ６Ｓ２（Ｍ＋Ｎａ）＋のＨＲＭＳ正確な質量、６０６．０９５６ａｍｕ；実測値：６０６．０９７４ａｍｕ。分析、計算値Ｃ５１．４５、Ｈ４．１５、Ｏ１６．４５；実測値Ｃ５１．７２、Ｈ４．２０、Ｏ１６．５４。
【０２０２】
４−メトキシ−Ｎ−｛４−［３−（１−メチル−シクロヘキシルメチル）−２，４−ジオキソ−チアゾリジン−５−イリデンメチル］−フェニル｝−ベンゼンスルホンアミド（４９）
【０２０３】
【化５０】
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Ｃ２６Ｈ２８Ｎ２Ｏ５Ｓ２（Ｍ＋Ｎａ）＋のＨＲＭＳ正確な質量、５３５．１３３７ａｍｕ；実測値：５３５．１３５２ａｍｕ。分析、計算値Ｃ６０．９２、Ｈ５．５１、Ｏ１５．６０；実測値Ｃ６０．７２、Ｈ５．６０、Ｏ１５．５４。
【０２０４】
Ｎ−｛４−［３−（１−メチル−シクロヘキシルメチル）−２，４−ジオキソ−チアゾリジン−５−イリデンメチル］−フェニル｝−４−ニトロ−ベンゼンスルホンアミド（５４）
【０２０５】
【化５１】
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Ｃ２４Ｈ２５Ｎ３Ｏ６Ｓ２（Ｍ＋Ｎａ）＋のＨＲＭＳ正確な質量、５３８．１０８３ａｍｕ；実測値：５３８．１０９２ａｍｕ。分析、計算値Ｃ５５．９１、Ｈ４．８９、Ｏ１８．６２；実測値Ｃ５５．９８、Ｈ４．９８、Ｏ１８．７６。
【０２０６】
本明細書で引用したすべての特許、特許出願、および刊行物の完全な開示、ならびに電子的に利用可能な資料は、参考により援用されている。上述の詳細な説明および実施例は理解を明瞭にするためにのみ提示されている。このことから不必要な制約はないことは理解されよう。特に、様々な理論を提供して、チアゾリジンジオン誘導体が有効となる可能なメカニズムについて述べているが、チアゾリジンジオン誘導体は用いられる特定のメカニズムには関係なく有効であり、従って本発明者は本明細書で述べた理論に拘束されない。当業者にとって自明の変形例も請求の範囲によって規定される本発明の範囲に含まれ得るため、本発明は、図示および記述した通りの細部に制約されない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１６】
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【図１９】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１７】
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【図１８】
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