(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物分解性ポリマーと、シクロデキストリンまたはその誘導体と、生物活性分子とを含んでなる、ナノ粒子であって、
前記生物分解性ポリマーが、メチルビニルエーテルおよび無水マレイン酸（ＰＶＭ／ＭＡ）のコポリマーであり、かつ前記生物活性分子が、Ｐ−糖タンパク質酵素の基質であり、該Ｐ−糖タンパク質酵素の基質がパクリタキセルであり、かつ生物活性分子と、シクロデキストリンまたはその誘導体との複合体が、ＰＶＭ／ＭＡのコポリマーのナノ粒子の内部に存在する、ナノ粒子。
【請求項２】
前記シクロデキストリンまたはその誘導体が、β−シクロデキストリン、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、６−モノデオキシ−６−モノアミノ−β−シクロデキストリン、およびそれらの混合物からなる群から選択されるものである、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項３】
請求項１または２に記載の生物分解性ポリマー、シクロデキストリンまたはその誘導体、および生物活性分子を含んでなる少なくとも一種のナノ粒子と、薬学上許容される賦形剤、担体、またはアジュバントとを含んでなり、ここで前記生物分解性ポリマーがメチルビニルエーテルおよび無水マレイン酸（ＰＶＭ／ＭＡ）のコポリマーであり、前記生物活性分子が、Ｐ−糖タンパク質酵素の基質であり、該Ｐ−糖タンパク質酵素の基質がパクリタキセルであり、かつ生物活性分子と、シクロデキストリンまたはその誘導体との複合体が、ＰＶＭ／ＭＡのコポリマーのナノ粒子の内部に存在する、医薬組成物。
【請求項４】
前記生物分解性ポリマー、およびシクロデキストリンまたはその誘導体と生物活性分子との複合体（［ＣＤ：ＢＡＭ］複合体）を有機溶媒中で同時にインキュベートした後、前記生物分解性ポリマーを水性アルコール溶液で脱溶媒和する工程、または前記生物分解性ポリマーのナノ粒子を、前記［ＣＤ：ＢＡＭ］複合体を含んでなる水溶液と共に、インキュベートする工程を含んでなり、ここで前記生物分解性ポリマーがメチルビニルエーテルおよび無水マレイン酸（ＰＶＭ／ＭＡ）のコポリマーであり、前記生物活性分子が、Ｐ−糖タンパク質酵素の基質であり、かつ該Ｐ−糖タンパク質酵素の基質がパクリタキセルである、請求項１または２に記載のナノ粒子の製造方法。
【請求項５】
前記シクロデキストリンが、β−シクロデキストリン、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、６−モノデオキシ−６−モノアミノ−β−シクロデキストリン、およびそれらの混合物から選択されるものである、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記ナノ粒子が、下記を含んでなる、請求項３に記載の医薬組成物：
成分 総量に対する重量％
メチルビニルエーテルおよび
無水マレイン酸(PVM/MA)のコポリマー                                75.00-95.00%
β−シクロデキストリン                                            10.00-24.99%
パクリタキセル                                                    0.01-15.00%
または、
成分 総量に対する重量％
メチルビニルエーテルおよび
無水マレイン酸(PVM/MA)のコポリマー                                70.00-95.00%
２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン                    5.00-24.99%
パクリタキセル                                                    0.01-20.00%
または、
成分 総量に対する重量％
メチルビニルエーテルおよび
無水マレイン酸(PVM/MA)のコポリマー                                75.00-95.00%
６−モノデオキシ−６−モノアミノ−β−シクロデキストリン          5.00-24.99%
パクリタキセル                                                    0.01-20.00%
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
発明の分野
本発明は、生物分解性ポリマーと、シクロデキストリンまたはその誘導体と、生物活性分子とを含んでなる生体接着特性を有するナノ粒子に関する。本発明はまた、それらの製造方法、前記ナノ粒子を含む組成物、およびそれらの応用にも関する。
【０００２】
発明の背景
ここ数年で、生物分解性のポリマー性ナノ粒子の、とりわけ経口経路による、薬物投与のための担体としての利用の開発がなされてきている。ナノ粒子は、一般に、天然または合成ポリマーで形成された、１μｍ未満の大きさの、固体粒子型のコロイド系として定義される。それらの調製方法によっては、二種類の構造（ナノスフェアまたはナノカプセル）が得られる。ナノスフェアは、ポリマーマトリックス型構造を有し、この内部に有効成分が分散されている。一方、ナノカプセルは、ポリマーシェルのようなシェルに取り囲まれた、有効成分を入れるコアを有する。これらの系は比表面積が大きいため、有効成分はナノ粒子系（the nanoparticular system）の表面にも吸着し得る。
【０００３】
経口経路は、最も一般に普及している魅力的な、医薬品の投与経路である。この経路の使用により、患者が薬物療法を承諾することが著しく増加し、それに伴い公衆衛生コストを低下させる。しかしながら、この経路により投与した場合に、効力が非常に低い薬物は、相当な数に上る。この現象は、薬物の経口バイオアベイラビリティを調節する次の要素のうちの一つまたはいくつかが原因があり得る：（ｉ）粘膜を通り抜けるための活性分子の透過性の低さ（一般に親水性薬物に関連）、（ii）消化管環境内での安定性の低さ（極端なｐＨ値であること、酵素など）、（iii）投与形からの薬物の不完全放出、（iv）消化管環境への有効成分の溶解度の低さ（疎水性薬物に関連）、および（ｖ）全身前代謝（presystemic metabolism）。
【０００４】
多くの場合において、ナノ粒子系は、生物活性分子のバイオアベイラビリティを著しく増加させ、そのため、新たな投与戦略を提供する。これらの担体の使用により得られるバイオアベイラビリティの向上は、消化管粘膜（the gastrointestinal mucosa tract）との生体接着相互作用を展開するポリマー性ナノ粒子の能力によって説明することができる。したがって、ナノ粒子の懸濁液を経口投与すると、これらの担体はいくつかの粘膜成分と相互作用し、接着相互作用を展開することができる。ある特定の物理化学的パラメーター（例えばポリマーの性質、大きさ、表面電荷または担体中にある特定のコーティングもしくはリガンドが存在すること）によって、ナノ粒子の生体接着特性は異なり、ある特定の場合では、この特性により、腸細胞表面に到達すること、あるいは消化管の極めて特異的な領域において生体接着相互作用を展開することが可能になる。これらの総ての現象により、（ｉ）粘膜の表面と密接に接触した投与形の滞留時間が増加し、または（ii）担体（薬物物質を含む）がある特定の領域に特異的に配置される。ナノ粒子が粘膜に付着すると、ナノ粒子はいくつかの機構により担持薬物の吸収やその薬物の体循環への接近を促進することができる。
【０００５】
封入またはナノ粒子への会合によって経口バイオアベイラビリティが高まる薬物の例示例としては、サケカルシトニン、フロセミド、アバロール、ジクマロール、ニフェジピン、フルオロピリミジン、プラスミドなどが挙げられる。
【０００６】
乳酸とグリコール酸とのホモ−およびコポリマー（ＰＬＧＡ）は、良好な組織適合性を有し、毒性がなく、再吸収可能な縫合材料として長年用いられていることから、微粒子系を製造するための生物分解性ポリマーとしてとりわけ重要である。これらの（コ）ポリマーは、クロロホルム、ジクロロメタン、アセトン、および酢酸エチルのような有機溶媒に可溶性であり、水性溶媒に不溶性である。しかしながら、これらの（コ）ポリマーは、分子量や組成に応じて、水を捕捉し、程度の差はあるが膨張することができる。これらのポリマーの欠点としては、ＰＬＧＡが、担持する抗原の多くと比べてかなり疎水性であり得ることを強調すべきである。さらに、侵食段階中の抗原の放出に必要な条件は、ＰＬＧＡの水和と分解の両方である。この侵食は、ポリマー分解産物である乳酸およびグリコール酸の蓄積によって、かなり酸性の微小環境をもたらし、そのｐＨはおよそ２−３まで低下し得る。放出されたタンパク質は、これらの条件により、酸性化した環境で加水分解および凝集を受け、多くの抗原は抗原能力を失う。
【０００７】
最後に、これらのポリマーはコストが高いことから使用が限定され、他のより安価な材料を捜し出すことが好ましいと思われた。
【０００８】
ポリエステルに代わるものとして、他のポリマーを用いて調製したナノ粒子が、薬物の経口投与に適していることが分かった。最もよく用いられているポリマーの一つがキトサンである。キトサンは、甲殻類の外骨格の主成分であるキチン質の脱アセチル化によって得られるセルロースと類似したポリマーである。キトサンは、キトサンが薬物を組み込んだ、様々な大きさのナノ粒子に処方することができる。キトサン粒子は、タイトジャンクションを一時的に開放し、粘膜表面でのタンパク質の吸収を増加させることができる。さらに、キトサンは、免疫調節効果を有し得、イン・ビトロでのサイトカイン産生を刺激し、抗原の非存在下で粘膜レベルにおける自然なＴｈ２／Ｔｈ３バランスを改善する。
【０００９】
最近、メチルビニルエーテルおよび無水マレイン酸のコポリマー（ＰＶＭ／ＭＡ）［Ｇａｎｔｒｅｚ］がナノ粒子製造のための生物分解性材料として提案された（Arbos et al., J. Control. Release, 83 (2002) 321-330）。これらのＰＶＭ／ＭＡコポリマーは、増粘剤、水溶液の安定剤、歯科用接着剤成分、経皮パッチとして、そして経口錠剤に広く用いられる。これらのポリ酸無水物の主な利点としては、低コスト、低経口毒性およびヒドロキシル基またはアミノ基を含む分子と反応しやすい官能基の有効性を強調するべきである（Arbos et al., J. Control. Release, 89 (2003) 19-30）。例えば、無水物基は、水性溶媒中で加水分解して二個のカルボキシル基を生じ、この反応によりリガンドとポリマー鎖または調製したナノ粒子の表面との結合が容易になる。
【００１０】
シクロデキストリン（ＣＤ）は、酵素によるデンプン分解によって得られる環状オリゴ糖の群である。シクロデキストリンは、互いに結合するα−１，４−グルコピラノース単位で形成されており、疎水性の内部空洞を有する円錐台型構造を形成している。ＣＤには、十五個より多いα−１，４−グルコピラノース単位を含むＣＤもあるが、最も多いのは六個（α−ＣＤ）、七個（β−ＣＤ）または八個（γ−ＣＤ）のα−１，４−グルコピラノース単位を含むものである。薬学的用途では、β−ＣＤおよびその誘導体が最もよく用いられ、特に２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（ＯＨ−β−ＣＤ）がよく用いられる。このＣＤは、原型化合物（β−ＣＤ）と比べて、水溶解度が高く、毒性がより低く、さらに、より疎水性が高い空洞を有する。シクロデキストリンを用いることによって形成した複合体は、ホスト分子を安定させ、ホスト分子の水溶解度を上昇させることができ、そしてそれはこの分子（例えば薬物）のバイオアベイラビリティの増加および／または副作用の低減につながる。さらに、リポソームおよび微粒子のローディング能力を高める能力は、文献に記載されている。また、ＣＤは、封入した薬物の放出プロファイルを変えることもできる。
【００１１】
多くの抗腫瘍薬が非経口投与されており、そしてそれによりいくつかの問題が生じている。抗腫瘍薬の経口投与に関する主な利点としては、患者の生活の質の向上や公衆衛生コストの削減が強調されるべきである。この投与経路は、適当かつ持続的な濃度レベルでの癌細胞の抗腫瘍薬への連続暴露を可能にし、そしてそのことにより治療係数を高め、副作用を低減することができる。しかしながら、抗腫瘍薬の大部分（例えばパクリタキセル）は、経口投与した場合にはバイオアベイラビリティが低い。
【００１２】
パクリタキセル（Taxol, Bristol Myers Squibb Company）は、タイヘイヨウイチイ（Taxus brevifolia）の樹木から抽出した生成物であり、１９７１年に初めて報告され、１９９３年以来、世界中で、癌に対して最もよく用いられる化学療法薬となっている。パクリタキセルは、細胞レベルで作用し、チュブリンの重合を促進する。そのため、パクリタキセルの存在下で形成された微小管は、異常な状態で安定し、機能しないため、微小管は動的かつ機能的に細胞分裂不能であることにより細胞死を引き起こす。ヨーロッパでは、この薬物は、進行性および転移性の、卵巣癌、乳癌、および非小細胞肺癌の治療のために個別薬剤としても、他の腫瘍学的治療と組み合わせても指示される。
【００１３】
この薬物の主な欠点は、水溶解度が低いこと、主に初回通過代謝効果が原因で経口バイオアベイラビリティが低いことにある。経口投与後、パクリタキセルは、Ｐ−糖タンパク質の基質だけでなく、ＢＣＲＰおよびＭＲＰ２のようなＡＢＣ（ＡＴＰ−結合カセット）スーパーファミリーの他のメンバーの基質にもなる。タンパク質輸送体であるＡＢＣスーパーファミリーは、毒性化合物や一部の抗癌薬に対する生物体の防御において中心的な役割を果たす。前記タンパク質（Ｐ−糖タンパク質、ＭＲＰ２、およびＢＣＲＰ）は、腸管膜、肝臓膜および腎臓膜の頂端部に存在し、生体異物および毒素の腸管腔、胆管腔および尿への送り出しを媒介する。さらに、Ｐ−糖タンパク質もＭＲＰ２もＣＹＰ３Ａ４、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼおよびＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼとともに共同で存在し、そしてそれは投与する薬物の経口バイオアベイラビリティの調節における相乗作用に関係している。
【００１４】
上記のことから、パクリタキセルは、臨床診療でＣｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ：エタノール（１：１）で作製した担体において静脈内経路により用いるために現在処方されている。最近、静脈内経路によるＣｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬの毒性効果を防ぎ、最小限に抑え、薬物の治療係数を高める目的で、薬物をＡｂｒａｘａｎｅと呼ばれるアルブミンナノ粒子中に封入することに基づいた新規の処方物（Green et al. Annals of Oncology 17:1263-1268, 2006）が市販されている。
【００１５】
したがって、経口投与した場合に、多くの有効成分、とりわけ親油性を有する薬物のバイオアベイラビリティを増加することができ、および／またはＰ−糖タンパク質の基質（例えばパクリタキセル）である薬物投与系を開発する必要がある。有利には、前記投与系は、生体接着特性を有するべきであり、可変量の親油性薬物を組み込む能力を有するべきであり、そして、理想的には、輸送する薬物に対するＰ−糖タンパク質の効果を防ぐことができるべきである。これらの目的は、本発明により提供されるナノ粒子によって達成することができる。
【発明の概要】
【００１６】
発明の概要
メチルビニルエーテルおよび無水マレイン酸（ＰＶＭ／ＭＡ）のコポリマーなどの生物分解性ポリマーのナノ粒子の、生物活性分子と結合したシクロデキストリンとの会合によって、物理化学的特性および消化管粘膜への生体接着特性を有するナノ粒子を得て、あらゆる種類の生物活性分子、とりわけ疎水性（親油性）の生物活性分子例えばパクリタキセルの輸送体として極めて興味深い系にそれらを転換することができることが意外にも見出された。前記ナノ粒子は、それらを経口投与した後の粘膜での滞留時間を伸ばすことができる。さらに、前記ナノ粒子は、Ｐ−糖タンパク質の基質であり得る生物活性分子のバイオアベイラビリティを向上させることができる。同様に、前記ナノ粒子は、生物活性分子の持続的かつ一定な血漿レベルを最大２４時間提供し、そしてそのことから病院での潅流の考えられる代替治療が可能になる。そして、これらの種類の薬物を用いた治療の公衆衛生コストの削減が可能になる。従って、毒性の高い薬物（例えば細胞増殖抑制薬）の投与のための系としても用いることができる。
【００１７】
よって、ナノ粒子がナノ粒子（生物活性分子を含む）と粘膜表面との相互作用に有利に働く適当な生体接着特性を有するという事実に基づいて、本発明は、粘膜を通じての、とりわけ経口経路による効果的な投与のための、大量の生物活性分子、とりわけ疎水性の生物活性分子と会合する能力を有するナノ粒子を提供する。これらのナノ粒子は、経口的にまたは生物体の他の粘膜を通じて投与された場合に、広範囲の生物活性分子、とりわけ親油性の生物活性分子を輸送することができ、何よりも、生物活性分子を放出することができ、生物活性分子の持続的かつ一定な血漿レベルを提供する。輸送する生物活性分子がＰ−糖タンパク質の基質である場合には、本発明のナノ粒子は、このタンパク質の問題の生物活性分子に対する作用も防ぐことができる。
【００１８】
本発明によって提供されるナノ粒子は、生物分解性ポリマーと、シクロデキストリンまたはその誘導体と、生物活性分子とを含んでなる。特に、ポリビニルメチルエーテルおよび無水マレイン酸のコポリマーと、β−シクロデキストリン（β−ＣＤ）、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（ＯＨ−β−ＣＤ）、または６−モノデオキシ−６−モノアミノ−β−シクロデキストリン（ＮＨ−β−ＣＤ）とによって形成されるナノ粒子は、生成が容易であり、それらを疎水性生物活性分子（例えばパクリタキセル）の投与に適するようにする優れた生体接着、大きさおよびζ電位特性を提供することが見出された。さらに、それらを生成するのに用いられるシクロデキストリンの種類を選択することによって、これらのナノ粒子の特性を適切に変えることが可能であり、それは輸送する生物活性分子の種類および／または医薬処方物の投与方法に従って有利に用いることができることも見出された。最後に、これらのナノ粒子にパクリタキセルを組み込むことにより、その経口バイオアベイラビリティを、極めて重要なことに、増加させることができ、消化管粘膜レベルでのＰ−糖タンパク質の効果を最小限に抑えることも見出された。
【００１９】
したがって、第一の態様においては、本発明は、生物分解性ポリマーと、シクロデキストリンまたはその誘導体と、生物活性分子とを含んでなる生物活性分子の輸送に有用なナノ粒子に関する。特定の実施形態およびは、前記生物分解性ポリマーはメチルビニルエーテルおよび無水マレイン酸（ＰＶＭ／ＭＡ）のコポリマーである。もう一つの特定の実施形態においては、前記シクロデキストリンは、β−ＣＤ、ＯＨ−β−ＣＤ、またはＮＨ−β−ＣＤである。
【００２０】
特定の実施形態においては、本発明のナノ粒子中に存在する生物活性分子はパクリタキセルである。この際、前記ナノ粒子はパクリタキセルの経口バイオアベイラビリティを顕著に増加させるが、パクリタキセルの経口吸収は、その物理化学的特性（高親油性）やパクリタキセルが消化管に存在するＰ−糖タンパク質の基質であるという事実から実質的にゼロである。
【００２１】
もう一つの態様においては、本発明は、前記ナノ粒子を含んでなる医薬組成物に関する。
【００２２】
もう一つの態様においては、本発明は、前記ナノ粒子の製造方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】は、用いたシクロデキストリン（ＣＤ）の種類［β−ＣＤ：β−シクロデキストリン、ＯＨ−β−ＣＤ：２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、ＮＨ−β−ＣＤ：６−モノデオキシ−６−モノアミノ−β−シクロデキストリン］およびナノ粒子調製前のＣＤとメチルビニルエーテルおよび無水マレイン酸（ＰＶＭ／ＭＡ）のコポリマー（１００ｍｇ）とのインキュベーション時間による、ＰＭＶ／ＭＡナノ粒子と会合したＣＤの量の変化を示すグラフである。これらの結果は平均±標準偏差（ｎ＝８）を示す。
【図２】は、β−シクロデキストリンを含むＰＶＭ／ＭＡに基づくナノ粒子（β−ＣＤ−ＮＰ）の凍結乾燥試料の走査型電子顕微鏡写真である。
【図３】は、模擬胃環境中（最初の一時間：０−１時間）および模擬腸環境（１時間−２４時間）中、３７＋１℃でのインキュベーション後のシクロデキストリンを含むナノ粒子（β−ＣＤ−ＮＰ：β−ＣＤを含むＰＶＭ／ＭＡに基づくナノ粒子、ＯＨ−β−ＣＤ−ＮＰ：ＯＨ−β−ＣＤを含むＰＶＭ／ＭＡに基づくナノ粒子、ＮＨ−β−ＣＤ−ＮＰ：ＮＨ−β−ＣＤを含むＰＶＭ／ＭＡに基づくナノ粒子）と対照ナノ粒子（ＮＰ）からのＲＢＩＴＣの放出を示すグラフである。このデータは平均±標準偏差（ｎ＝３）を示す。
【図４】は、１０ｍｇのＲＢＩＴＣ蛍光標識ナノ粒子の経口投与後の消化管粘膜における（Ａ）ヒドロキシプロピル−β−ＣＤを含むＰＶＭ／ＭＡに基づくナノ粒子（ＯＨ−β−ＣＤ−ＮＰ）、（Ｂ）β−ＣＤを含むＰＶＭ／ＭＡに基づくナノ粒子、および（Ｃ）対照ナノ粒子（ＮＰ）の分布を表す棒グラフを示す。ｘ軸は異なる粘膜セグメントを表し、ｙ軸は粘膜に接着したナノ粒子画分を表し、そしてｚ軸は投与後の経過時間を表す。
【図５】は、時間に対し消化管全体に接着したナノ粒子画分を表して得た生体接着曲線を示すグラフである。表した処方物は、（●）ＯＨ−β−ＣＤ−ＮＰ、（▲）β−ＣＤ−ＮＰ、および（黒四角）対照ＮＰである。これらの値は平均±標準偏差（ｎ＝３）を示す。
【図６】は、単回用量１０ｍｇの経口投与の２時間後のラット回腸に付着した対照ナノ粒子（Ａ）および０Ｈ−β−ＣＤ−ＮＰ（Ｂ，  Ｃ）の蛍光顕微鏡検査法による観察を示す一連の写真である。
【図７】は、用いたシクロデキストリンの種類および最初に加えた薬物の量による、異なる処方物中に封入されたパクリタキセル（ＰＴＸ）量の展開を示すグラフである。これらの結果は平均±標準偏差（ｎ＝６）を示す。ＰＴＸ−ＮＰ：パクリタキセルを含む通常のＰＶＭ／ＭＡナノ粒子、ＰＴＸ−β−ＣＤ−ＮＰ：パクリタキセルを含むＰＶＭ／ＭＡ・β−ＣＤナノ粒子、ＰＴＸ−ＯＨ−β−ＣＤ−ＮＰ：パクリタキセルを含むＰＶＭ／ＭＡ・ＯＨ−β−ＣＤナノ粒子、およびＰＴＸ−ＮＨ−β−ＣＤ−ＮＰ：パクリタキセルを含むＰＶＭ／ＭＡ・ＮＨ−β−ＣＤナノ粒子。
【図８】は、異なるＰＴＸ処方物についての、実験動物における投与後の経過時間による、パクリタキセル（ＰＴＸ）の血漿中濃度を表す一連のグラフである。これらの結果は平均±標準偏差を示す。（Ａ）静脈内経路、用量：１０ｍｇ／ｋｇ。Ｔａｘｏｌ：市販のパクリタキセル処方物。（Ｂ）経口経路、用量：１０ｍｇ／ｋｇ。Ｔａｘｏｌ：市販のパクリタキセル処方物、ＰＴＸ−β−ＣＤ：パクリタキセルを含むβ−ＣＤ複合体、ＰＴＸ−ＯＨ−β−ＣＤ：パクリタキセルを含むＯＨ−β−ＣＤ複合体、ＰＴＸ−ＮＨ−β−ＣＤ：パクリタキセルを含むＮＨ−β−ＣＤ複合体。（Ｃ）経口経路、用量：１０ｍｇ／ｋｇ。ＰＴＸ−ＮＰ：パクリタキセルを含む通常のＰＶＭ／ＭＡナノ粒子、ＰＴＸ−β−ＣＤ−ＮＰ：パクリタキセルを含むＰＶＭ／ＭＡ・β−ＣＤナノ粒子、ＰＴＸ−ＯＨ−β−ＣＤ−ＮＰ：パクリタキセルを含むＰＶＭ／ＭＡ・ＯＨ−β−ＣＤナノ粒子、およびＰＴＸ−ＮＨ−β−ＣＤ−ＮＰ：パクリタキセルを含むＰＶＭ／ＭＡ・ＮＨ−β−ＣＤナノ粒子、Ｔａｘｏｌ：パクリタキセルを含む市販の処方物。市販のＴａｘｏｌ処方物およびＰＴＸ−ＮＰで得た値は、Ｘ軸上で重なり現われる（表９）。
【発明の具体的説明】
【００２４】
ナノ粒子
一つの態様においては、本発明は、生物分解性ポリマーと、シクロデキストリンまたはその誘導体と、生物活性分子とを含んでなるナノ粒子（以下、本発明のナノ粒子）に関する。
【００２５】
本発明のナノ粒子は、適した物理化学的特性、特異性特性、および消化管粘膜への生体接着特性を有する。そして、そのことから本発明のナノ粒子は、生物活性分子、特に親油性生物活性分子（例えばパクリタキセルなど）および／またはＰ−糖タンパク質の基質である生物活性分子の輸送に潜在的に有用な系となる。本発明のナノ粒子は、生物活性分子、一般にかつ特に、親油性生物活性分子および／またはＰ−糖タンパク質の基質であり得る生物活性分子のバイオアベイラビリティを向上させることができる。実際に、本発明のナノ粒子は、それらを経口投与した後の粘膜での滞留時間を伸ばすことができる。同様に、本発明のナノ粒子は、かかる薬物の持続的かつ一定な血漿レベルを最大２４時間提供し、そしてそのことから病院での潅流の代替治療の設計が可能になり、これらの種類の薬物を用いた治療の公衆衛生コストの削減をもたらすという事実によって、毒性の高い生物活性分子（例えば、細胞増殖抑制薬）の輸送のための系としても用いることができる。
【００２６】
本明細書において、「ナノ粒子」という用語は、平均の大きさが１．０マイクロメートル（μｍ）未満の球または同様な形態を表す。本発明のナノ粒子は、一般に、１−９９９ナノメートル（ｎｍ）、好ましくは１０−９００ｎｍの平均粒径を有する。特定の実施形態においては、本発明のナノ粒子は、１００−４００ｎｍの平均粒径を有する。
【００２７】
「平均の大きさ」とは、水性溶媒中で協力するナノ粒子集団の平均直径と理解される。これらの系の平均の大きさは、当業者に公知の、例として、以下に記載する実施例に付随する実施部分に記載されている標準的な手順によって測定することができる。平均粒径は、主として生物分解性ポリマーの量および分子量により影響を受けるが、本発明のナノ粒子中に存在する、シクロデキストリン、またはその誘導体の性質および量や生物活性分子の性質および量（一般に、該成分の量または分子量が大きいほど、該ナノ粒子の平均の大きさは大きくなる）、そして該ナノ粒子の製造方法の一部のパラメーター、例えば攪拌速度などの影響も受け得る。
【００２８】
生物分解性ポリマー
本発明のナノ粒子は、生物分解性ポリマーを含んでなる。本明細書において、「生物分解性」という用語は、ポリマーがｐＨ１−９、典型的にはｐＨ４−９、２５℃−４０℃の温度の生理学的溶液に暴露されると、所望な応用（この場合は、イン・ビボ療法）に許容可能な時間で溶解または分解するポリマーを表す。
【００２９】
本発明を実践するために、ナノ粒子を形成する当該技術分野で知られている実質的にいかなる生物分解性ポリマーをも用いることができる。前記生物分解性ポリマーの限定されない例示例としては、ポリ乳酸、ポリグリコール酸などのポリヒドロキシ酸、およびそれらのコポリマー、例えばポリ（乳酸−グリコール酸コポリマー）［ＰＬＧＡ］など、ポリ酸無水物、ポリエステル、多糖類、例えばキトサンなどが挙げられる。前記生物分解性ポリマーの分子量は、そのポリマーがナノ粒子を形成し、そして生物分解性であるという既定の条件を満たす条件で、広い範囲内で変えることができる。
【００３０】
特定の実施形態においては、用いる生物分解性ポリマーは、無水物形態でのメチルビニルエーテルおよび無水マレイン酸のコポリマー（ＰＶＭ／ＭＡ）である。具体的な実施形態においては、例えば、Ｇａｎｔｒｅｚ  ＡＮという商品名で市販されているＰＶＭ／ＭＡコポリマーを用いることができる。特定の実施形態においては、前記ＰＶＭ／ＭＡコポリマーは、１００−２，４００ＫＤａ、好ましくは２００−２，０００ＫＤａ、より好ましくは１８０−２５０ＫＤａの分子量を有する。この生物分解性ポリマー（ＰＶＭ／ＭＡ）は、その毒性が低く（ＬＤ５０＝経口経路によれば８−９ｇ／ｋｇ）かつ生体適合性に優れていることにより医薬技術に広く用いられるため特に好都合である。さらに、量およびその価格に関しても入手が容易である。この生物分解性ポリマー（ＰＶＭ／ＭＡ）は、毒性がかなり高い通常の有機試薬（グルタルアルデヒド、カルボジイミド誘導体など）に頼ることなしに、その無水物基により様々な親水性物質と反応することができる。ＰＶＭ／ＭＡコポリマーは、水性溶媒には不溶性であるが、その無水物基が加水分解してカルボキシル基を生じる。解離は遅く、解離が起こる条件に依存する。ＰＶＭ／ＭＡ中の官能基の有効性により、水酸化物またはアミノのような求核基を有する分子の共有結合が水性溶媒中でインキュベートするだけで起こる。
【００３１】
ＰＶＭ／ＭＡコポリマーナノ粒子は、国際特許出願ＷＯ  ０２／０６９９３８号に記載されており、この出願の内容は引用することにより本明細書の開示の一部とされる。例として、前記ＰＶＭ／ＭＡコポリマーナノ粒子は、その有機溶液に（コポリマーの溶液と相溶性の）第一の極性溶媒を加え、続いて、第二の非溶媒液体、例えば水性アルコール溶液、を加えることによりコポリマーを脱溶媒和することによって容易に得られる。場合によって架橋剤を加えることができる。
【００３２】
シクロデキストリンおよびその誘導体
本発明のナノ粒子は、生物分解性ポリマーに加えて、シクロデキストリンまたはその誘導体を含んでなる。
【００３３】
本明細書に用いる、「シクロデキストリン」という用語は、α−１，４（α−１，４−グルコピラノース）グリコシド結合により結合したグルコース単位で形成されるいかなる環状オリゴ糖をも包含する。これらの単位は、シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ（ＣＧＴａｓｅ）酵素によるデンプン分解の分子内トランスグリコシル化反応の結果として生じる。
【００３４】
「シクロデキストリン」には、十五個より多いα−１，４グルコピラノース単位を含むシクロデキストリンもあるが、最も豊富なのは、六個、七個または八個のα−１，４−グルコピラノース単位を含むものであり、それぞれ、いわゆるα−シクロデキストリン（α−ＣＤ）、β−シクロデキストリン（β−ＣＤ）、またはγ−シクロデキストリン（γ−ＣＤ）になる。それらは総て、円錐台型構造を有し、疎水性の内部空洞と、親水性の外面とを有する。これは、ヒドロキシル基がシクロデキストリンの外側に向かっており、一方、シクロデキストリンの疎水性内部空洞内では、ヒドロキシル基がメチレン基の水素やエーテル型酸素で覆われているという事実のためである。よって、シクロデキストリンは、ゲスト分子を完全にまたは部分的に捕捉することによりホストとして作用することができる。特定の実施形態においては、前記シクロデキストリンはα−シクロデキストリン、β−シクロデキストリンまたはγ−シクロデキストリンである。
【００３５】
本明細書に用いる、「シクロデキストリン誘導体」という用語は、少なくとも一個の修飾末端ヒドロキシル基を有するいかなるシクロデキストリンをも包含する。シクロデキストリンの化学修飾は、それらの物理化学的特性を変えることができ、溶解度、安定性を向上させ、それらが結合する分子（ゲスト分子）の化学活性を制御する。シクロデキストリンのＯＨ基の反応を利用したアルキル基、アリール基、カルボキシアルキル基、シアノアルキル基、ヒドロキシアルキル基、スルホアルキル基、アミノ基、アジド基、複素環式基、アセチル基、ベンゾイル基、スクシニル基、およびリン、硫黄などを含むその他の基の組込みは記載されている（Robyt (1998) "Essentials of carbohydrate chemistry", Ed. Charles R. Canto, Springer Advanced Text in Chemistry）。特定の実施形態においては、前記末端ヒドロキシル基の少なくとも一個は、その水素が、直鎖もしくは分枝Ｃ１−Ｃ８アルキル基、例えばメチル、エチル、プロピルなど、トリ（Ｃ１−Ｃ８）アルキルシリル、例えばｔ−ブチルジメチルシリルなど、Ｃ１−Ｃ８ヒドロキシアルキル、例えば２−ヒドロキシエチル、２−ヒドロキシプロピルなど、場合によってカルボキシル基で置換されていてよい、（Ｃ１−Ｃ８）アルキルカルボニル、例えばアセチル、スクシニルなど、アリールカルボニル、例えばベンゾイルなど、（Ｃ１−Ｃ２）シアノアルキル、例えばシアノメチル、シアノエチル、場合によって置換されていてよいアミノ、アジド、スルホ、（Ｃ１−Ｃ４）スルホアルキル、または糖類基、例えばグルコシル、マンノシルなどで置換されて、修飾されている。もう一つの特定の実施形態においては、ＣＤの二個以上の末端ヒドロキシル基、例えば、β−ＣＤ中に存在する二個、三個、四個、五個、六個、または七個の末端ヒドロキシル基は、前記基のいずれかにより修飾されている。
【００３６】
親シクロデキストリン（すなわち誘導体化していない）、特にβ−ＣＤは、結晶状態ではシクロデキストリン分子間の結合が強いこともあって、非環状糖と比べて水溶解度が低い。さらに、β−ＣＤは、第二ヒドロキシル基間の分子内水素結合を形成し得、それによって不利な溶解エンタルピーを示し、そのため、水溶解度が低くなる。水溶解度は、水素結合のいずれかをメトキシ基またはエトキシ基のような疎水基と置換することによって高まる。例えば、β−ＣＤの水溶解度は、室温で１．８５％（ｗ／ｖ）であるが、メチル化の程度を高めることにより最大１５０倍高めることができた（メチル−β−ＣＤ）。もう一つの特に重要なシクロデキストリン誘導体は、β−ＣＤをプロピレンオキシドで処理した後に得られる２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（ＯＨ−β−ＣＤ）であり、そしてそれは水溶解度が６０％（ｗ／ｖ）である。また、これらの誘導体は、毒性プロファイル、生物活性分子を封入し、それらの放出プロファイルを調整する能力を向上させることもできる。親シクロデキストリンの主な問題は、主にβ−ＣＤの場合には、その水溶解度が低いため、非経口投与後の腎毒性である。ゆえに、０Ｈ−β−ＣＤのような最も親水性の高い誘導体は、より容易に排出することができるため、これらの腎毒性問題は軽減される。メチル化β−ＣＤ誘導体の場合には、同じことは起こらず、β−ＣＤより可溶性が高いにもかかわらず、内因性脂質と相互作用する能力が強いために全身毒性の発生は免れられず、そしてそのことにより非経口使用が制限される。一方、経口投与後に行った毒性研究において、この経路によればシクロデキストリンだけでなくそれらの誘導体も毒性がないことが示されている。
【００３７】
シクロデキストリンは、薬物の経口投与、非経口投与、および局所投与が認可されている水溶性高分子である。薬物の経口投与においてシクロデキストリンを適用するのは、主にその薬物の経口バイオアベイラビリティを向上させるためであり、その溶解度を上昇させ、消化管内および／または処方物中におけるその薬物の安定性を高めるためである。さらに、ある特定の薬物では、とりわけ、薬物自体が引き起こす局所刺激作用の軽減、消化管中での薬物放出制御または望ましくない感覚刺激特性のマスキングにおけるシクロデキストリンの可能性も興味深い。イトラコナゾールの場合がそうであり、イトラコナゾールは米国やヨーロッパで市販されており、経口投与のために０Ｈ−β−ＣＤと会合されており、別々に投与した場合には消化管内で起こる刺激作用を著しく軽減する。
【００３８】
加えて、シクロデキストリンは、薬物の皮膚および粘膜透過性を高める能力を有することから用いられ、そしてそれにより薬物のより良好かつより均一な吸収がもたらされる。これは、投与後の薬物の活性増加につながり（例えば、フルタミドとＯＨ−β−ＣＤとで形成される複合体など）、経口投与後の薬物の吸収を実質的に改善する。
【００３９】
特定の実施形態においては、前記シクロデキストリン誘導体は、α−シクロデキストリン誘導体、β−シクロデキストリン誘導体、またはγ−シクロデキストリン誘導体である。本発明を実践するために用いることができるシクロデキストリン誘導体の限定されない例示例としては、エチル−β−ＣＤ、ヘプタキス（２，３，６−トリ−Ｏ−エチル）−β−ＣＤ、２−ヒドロキシプロピル−β−ＣＤ、２−Ｏ−２−ヒドロキシプロピル−β−ＣＤ、２−ヒドロキシエチル−β−ＣＤ、スクシニル化β−ＣＤ誘導体、スクシニル化２−ヒドロキシプロピル−β−ＣＤ誘導体、ブチル−β−ＣＤ、ヘプタキス（２，６−ジ−Ｏ−ｎ−ブチル）−β−ＣＤ、ヘプタキス（２，６−ジ−Ｏ−ｎ−ペンチル）−β−ＣＤ、メチル−β−ＣＤ、メチル−β−ＣＤ、カルボキシメチル−β−ＣＤ、カルボキシエチル−β−ＣＤ、ヘプタキス（２，６−ジ−Ｏ−メチル）−β−ＣＤ、ヘプタキス（２，３，６−トリ−Ｏ−メチル）−β−ＣＤ、アセチル−β−ＣＤ、ヘプタキス（３−Ｏ−アセチル−２，６−ジ−Ｏ−ｎ−ペンチル）−β−ＣＤ、ヘプタキス（３−Ｏ−アセチル−２，６−ジ−Ｏ−メチル）−β−ＣＤ、スルホ−β−ＣＤ、スルファプロピル−β−ＣＤ（ｓｕｌｆａｐｒｏｐｙｌ−β−ＣＤ）、ｎ−ブチル−β−ＣＤ、ヘプタキス（３−Ｏ−ｎ−ブチリル−２，６−ジ−Ｏ−ペンチル）−β−ＣＤ、２−シアノエチル−β−ＣＤ、６−モノデオキシ−６−モノアジド−β−ＣＤ、ヘプタキス（２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル）−β−ＣＤ、ヘプタキス（２，３，６−トリ−Ｏ−ベンゾイル）−β−ＣＤ、６−モノデオキシ−６−モノアミノ−β−ＣＤ、ヘプタキス（２，６−ジ−Ｏ−ｎ−ペンチル−３−Ｏ−トリフルオロアセチル）−β−ＣＤ、ヘプタキス（２，３，６−トリ−Ｏ−ｎ−オクチル）−β−ＣＤ、ヘプタキス（２，３−ジ−Ｏ−アセチル−６−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−β−ＣＤ、ヘプタキス（６−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−β−ＣＤ、ヘプタキス（６−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−２，３−ジ−Ｏ−メチル）−β−ＣＤ、ヘプタキス（２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−β−ＣＤ、ヘプタキス（２，３，６−トリ−Ｏ−トリフルオロアセチル）−β−ＣＤ、ヘプタキス（２，６−ジ−Ｏ−メチル−３−Ｏ−ｎ−ペンチル）−β−ＣＤが挙げられる。
【００４０】
シクロデキストリン、またはその誘導体と、生物分解性ポリマーとの重量比は、広い範囲内で変えることができ、特定の実施形態においては、前記シクロデキストリン（またはその誘導体）：生物分解性ポリマー重量比は、１：１〜１０、好ましくは１：１〜５、より好ましくは約１：４である。特定の実施形態においては、前記生物分解性ポリマーはＰＶＭ／ＭＡである。
【００４１】
既に述べたとおり、薬学的用途においては、β−ＣＤおよびその誘導体が最もよく用いられ、特に、水溶解度が高く、毒性が低く、β−ＣＤより疎水性が高い空洞を有することから、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（ＯＨ−β−ＣＤ）である。
【００４２】
特定の実施形態においては、本発明のナノ粒子中に存在するシクロデキストリンには置換ヒドロキシル基は存在しない。具体的な実施形態においては、前記シクロデキストリンは、七個のα−１，４−グルコピラノース単位を含むβ−シクロデキストリン（β−ＣＤ）である。β−ＣＤ：生物分解性ポリマー重量比は、１：１〜１０、好ましくは１：１〜５であるが、１：４の比が良好な結果を与える。例として、生物分解性ポリマー１ｍｇ当たりおよそ０．２５ｍｇのβ−ＣＤで有効会合が得られる。この場合にはナノ粒子と会合したβ−ＣＤの量は、ナノ粒子１ｍｇ当たりおよそ９０μｇである。これらのナノ粒子は、一般に球形およびほぼ１５０ｎｍの大きさを有することを特徴とする。
【００４３】
もう一つの特定の実施形態においては、本発明のナノ粒子中に存在するシクロデキストリンは、より親水性が高いβ−ＣＤ誘導体、例えば一個以上のヒドロキシアルキル基（例えばヒドロキシプロピル）を含んでなるヒドロキシル化β−ＣＤ誘導体である。好ましい特定の実施形態においては、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（ＯＨ−β−ＣＤ）を用いる。ＯＨ−β−ＣＤ：生物分解性ポリマー重量比は、１：１−１０、好ましくは１：１−５であるが、１、４の重量比が良好な結果を与える。例として、生物分解性ポリマー１ｍｇ当たりおよそ０．２５ｍのＯＨ−β−ＣＤで有効会合が得られる。この場合にはナノ粒子と会合したβ−ＣＤの量は、ナノ粒子１ｍｇ当たりおよそ６５μｇである。これらのナノ粒子は、一般に球形およびほぼ１５０ｎｍの大きさを有することを特徴とする。
【００４４】
もう一つの特定の実施形態においては、本発明のナノ粒子中に存在するシクロデキストリンは、ヒドロキシルとは異なる一個以上の末端官能基、例えば一個以上の、場合によって置換されていてよい、アミノ基を有するＣＤ誘導体である。これらのアミノ基も置換されており、他の官能基、例えばＣ１−Ｃ４アルキルを有する場合がある、前記置換アミノ基の例示例としては、メチルアミン、エチルアミン、ジエチルアミンなどが挙げられる。好ましい特定の実施形態においては、前記アミノ基は、置換されていない遊離アミノ基（−ＮＨ２）である。実施した幾つかのアッセイにおいては、前記基を有する場合には、経口投与した本発明のナノ粒子はある特定の腸管セグメントに蓄積し、これにより特異的投与が可能となることが観察された。具体的な実施形態においては、本発明のナノ粒子中に存在するシクロデキストリン誘導体は、６−モノデオキシ−６−モノアミノ−β−シクロデキストリン（ＮＨ−β−ＣＤ）である。ＮＨ−β−ＣＤ：生物分解性ポリマー重量比は、１：１〜１０、好ましくは１：１〜５であるが、１：４の比が良好な結果を与える。これらのナノ粒子は、一般に球形およびほぼ１５０ｎｍの大きさを有することを特徴とする。
【００４５】
特定の実施形態においては、本発明のナノ粒子中に存在するシクロデキストリン、またはその誘導体は、β−シクロデキストリン（β−ＣＤ）、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（ＯＨ−β−ＣＤ）、６−モノデオキシ−６−モノアミノ−β−シクロデキストリン（ＮＨ−β−ＣＤ）、およびそれらの混合物からなる群から選択される。
【００４６】
本発明者らが実施したいくつかのアッセイによって、シクロデキストリンを含む生物分解性ポリマーに基づくナノ粒子は、これらの担体（ナノ粒子）と消化管の表面の成分との直接生体接着相互作用の形成を可能にすることが示されている。この密接な接触は、生物活性分子を粘膜に接近する任意の経路（例えば経口経路、直腸経路、経膣経路、経眼経路、または経鼻経路）によって投与する場合には、生物活性分子のバイオアベイラビリティの増加において興味深い。
【００４７】
シクロデキストリンを含む生物分解性ポリマー（例えばＰＶＭ／ＭＡ）に基づくナノ粒子（空のナノ粒子、すなわち生物活性分子を含まない）は、例えば、国際特許出願ＷＯ  ０２／０６９９３８号に記載されている溶媒置換法に基づく方法によって得ることができる。例として、生物分解性ポリマー（例えばＰＶＭ／ＭＡ）およびシクロデキストリン、またはその誘導体を含んでなる前記空のナノ粒子は、二つの別法によって、具体的には、二成分、生物分解性ポリマー（例えばＰＶＭ／ＭＡ）と、シクロデキストリンまたはその誘導体（例えばβ−ＣＤ、ＯＨ−β−ＣＤまたはＮＨ−β−ＣＤ）とを有機相中で同時にインキュベートすること［別法１］によって、あるいは生物分解性ポリマー（例えばＰＶＭ／ＭＡ）ナノ粒子を、シクロデキストリン、またはその誘導体（例えばβ−ＣＤ、ＯＨ−β−ＣＤ、またはＮＨ−β−ＣＤ）の水溶液と共にインキュベートすること［別法２］によって、得ることができる。
【００４８】
生物活性分子
本発明のナノ粒子は、生物分解性ポリマーおよびシクロデキストリンまたはその誘導体に加え、生物活性分子を含んでなる。
【００４９】
本明細書において、「生物活性分子」という用語は、予防または治療目的で被験体、好ましくはヒトに投与されるあらゆる物質、すなわち疾患の治療、治癒、予防、または診断においてあるいはヒトおよび動物の肉体および精神の健康の向上のために用いることができるあらゆる物質を表す。前記「生物活性分子」という用語は、一般に薬物と抗原およびアレルゲンのいずれも包含する。
【００５０】
本発明のナノ粒子は、それらの溶解度特性と関係なく一種以上の生物活性分子を組み込むことができ、該ナノ粒子は疎水性生物活性分子の投与に特に有用な系であると証明されている。
【００５１】
本発明のナノ粒子は、生物体の任意の粘膜に接近する任意の経路（例えば、経口経路、直腸経路、経鼻経路、経膣経路、経眼経路など）によって投与する場合には、それらが含む生物活性分子の分布の分布変更を可能にする。
【００５２】
生物活性分子の化学的性質は、小分子から高分子化合物（ペプチド、ポリヌクレオチドなど）まで広い範囲内で変えることができる。
【００５３】
特定の実施形態においては、前記生物活性分子は、ペプチドまたはタンパク質である。本明細書において、「ペプチド」という用語は、ペプチド結合によって結合したアミノ酸により形成される化合物を表し、オリゴペプチド（十個以下のアミノ酸により形成される）およびポリペプチド（十個より多いアミノ酸により形成される）を包含する。同様に、本明細書において、「タンパク質」という用語は、ペプチド結合によって結合したアミノ酸の線状鎖により形成される高分子量の高分子を表し、タンパク質は、一本または数本のペプチド鎖により形成され得る。
【００５４】
もう一つの特定の実施形態においては、前記生物活性分子は、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、または核酸である。本明細書において、「オリゴヌクレオチド」は、５’−３’ホスホジエステル結合によって結合した、５０ヌクレオチド長以下のヌクレオチドポリマーであり、一方、「ポリヌクレオチド」は、５’−３’ホスホジエステル結合によって結合した、５０単位より長い長さのヌクレオチドポリマーである。同様に、「核酸」という用語も５’−３’ホスホジエステル結合によって結合したヌクレオチドポリマーを表し、それらのヌクレオチドがリボヌクレオチドであるかデオキシリボヌクレオチドであるか否かによって該核酸はそれぞれＲＮＡまたはＤＮＡとなる。これらの核酸は生存する生物の細胞において異なる働き（遺伝情報の保存および次世代へのその伝達（ＤＮＡ）またはタンパク質合成中のこの情報の発現（ｍＲＮＡおよびｔＲＮＡ）など）をし、それらは細胞オルガネラの構造成分（リボソーム（ｒＲＮＡ）など）であり、それらはある特定の化学反応（リボザイム）を触媒し、（ＲＮＡ干渉によりｍＲＮＡの相補的ＲＮＡすなわちｄｓＲＮＡによって）遺伝子発現調節機構に関与する。
【００５５】
もう一つの特定の実施形態においては、前記生物活性分子は、小（有機または無機）分子であり、一般に、これらの分子は化学合成法または半合成法により得られ、またはそれらの起源から単離される。具体的な実施形態においては、前記小（有機または無機）分子は、比較的低い分子量、一般には５，０００以下、典型的には２，５００以下、有利には１，５００以下を有する。多くの治療有効成分はこれらの特徴を含むため、本発明を実践するために用いることができる。
【００５６】
本発明のナノ粒子中に存在する生物活性分子は、親水性物質および疎水性物質のいずれもあり得るが、特定の実施形態においては、本発明のナノ粒子は、疎水性生物活性分子の投与に有用である。そのため、特定の実施形態においては、本発明のナノ粒子中に存在する生物活性分子は、疎水性物質である。本明細書において、「疎水性物質」は、その特性または組成から水性溶媒に溶けにくく、典型的には、２０℃、ＰＨ１−７．５および大気圧で溶解度１％未満（水性溶媒１００ｍｌ当たり有効成分１ｇ）の物質である。
【００５７】
本発明を実践するために、実質的にいかなる疎水性生物活性分子をも用いることができる。本発明のナノ粒子中に存在し得る疎水性生物活性分子の限定されない例示例としては、抗寄生虫薬（例えばアルベンダゾール、メベンダゾール、プラジカンテルなど）、抗真菌薬（例えばクロトリマゾール、イトラコナゾールなど）、抗生物質（例えばスルファメチゾール、ゲンタマイシン、グリセオフルビンなど）、強心薬（例えばジゴキシンなど）、抗腫瘍薬（例えばカンプトセシン、メトトレキサート、ドセタキセル、フルオロウラシル、パクリタキセルなど）、免疫抑制薬（例えばタクロリムス、シクロスポリン）、（グルコ）コルチコイド（例えばコルチゾン、デキサメタゾン、プレドニゾロン、プレドニゾン、トリアムシノロンなど）などが挙げられる。
【００５８】
もう一つの特定の実施形態においては、本発明のナノ粒子中に存在する生物活性分子は、Ｐ−糖タンパク質の基質である物質である。実際、本発明のナノ粒子の重要な応用性は、ある特定の薬物の粘膜を通じての吸収に対するＰ−糖タンパク質の悪影響を最小限に抑えるそれらの能力にある。
【００５９】
公知のように、Ｐ−糖タンパク質（ＰＧＹ１、  酵素  ＥＣ  ３．６．３．４４）は、ヒトにおいて、ＭＤＲ１（多剤耐性１）遺伝子とも呼ばれるＡＢＣＢ１遺伝子によりコードされるタンパク質である。Ｐ−糖タンパク質は、その基質（一般に薬物および他の生体異物）をその細胞内ドメインからその細胞外ドメインへと移動させる膜貫通輸送体またはポンプとして作用する。Ｐ−糖タンパク質は、その解剖学的位置によって、主に三通りの役割を果たす：（１）Ｐ−糖タンパク質は、経口投与後に腸細胞管腔膜中でのその発現の結果として生物体内への薬物物質の侵入を制限し、（２）その薬物が血液循環に達したとき、Ｐ−糖タンパク質は、肝細胞小管膜中および近位尿細管細胞管腔膜中でのその発現の結果として胆汁中および尿中からのその排出を促進し、そして（３）一端、全身血液循環へ入った後、Ｐ−糖タンパク質は、感受性組織への薬物の浸透を制限する。
【００６０】
よって、Ｐ−糖タンパク質の基質物質とは、次の反応：
ＡＴＰ＋Ｈ２Ｏ＋生体異物（内側）＝ＡＤＰ＋リン酸＋生体異物（外側）
に従って、ＡＴＰを消費することによって、Ｐ−糖タンパク質を細胞の外側へと輸送することができるように、Ｐ−糖タンパク質の細胞内ドメインと結合する親和性を有する物質、例えば生体異物を表す。
【００６１】
本発明のナノ粒子中に生物活性分子として存在し得るＰ−糖タンパク質の既知基質の限定されない例示例としては、とりわけ（Ｆｒｏｍｍ  ＭＦ、  Ｔｒｅｎｄｓ  ２００４、  ２５：  ４２３−４２９）、抗腫瘍薬（例えば、ドセタキセル、エトポシド、イマチニブ、パクリタキセル、テニポシド、ビンブラスチン、ビンクリスチン、アントラサイクリン（例えば、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシンなど）など）、β−アドレナリン受容体拮抗薬（例えばブニトロロール、カルベジロール、セリプロロール、タリノロールなど）、Ｃａ２＋チャネル遮断薬（例えばジルチアゼム、ミベフラジル、ベラパミルなど）、強心薬（例えばジギトキシン、ジゴキシン、キニジンなど）、抗ウイルス薬（例えば、アンプレナビル、インジナビル、ネルフィナビル、サキナビル、リトナビルなど）、ステロイド（例えば、デキサメタゾン、メチルプレドニゾロンなど）、免疫抑制薬（例えば、シクロスポリンＡ、シロリムス、タクロリムスなど）、制吐薬（ドンペリドン、オンダンセトロンなど）、抗生物質（例えば、エリスロマイシン、レボフロキサシンなど）、抗高脂血薬（例えば、アトルバスタチン、ロバスタチンなど）、ヒスタミンＨ１受容体拮抗薬（例えば、フェキソフェナジン、テルフェナジンなど）、および他の治療物質群の薬物（例えば、アミトリプチリン、コルヒチン、デブリソキン、イトラコナゾール、ロサルタン、モルヒネ、フェニトイン、リファンピン、アクチノマイシンＤ、トポテカン、エストラジオール、ラパマイシン、ＦＫ５０６など）が挙げられる。
【００６２】
特定の実施形態においては、前記生物活性分子は、アクチノマイシンＤ、アルベンダゾール、アミトリプチリン、アンプレナビル、アトルバスタチン、ブニトロロール、カンプトセシン、カルベジロール、セリプロロール、シクロスポリン、クロトリマゾール、コルヒチン、コルチゾン、ダウノルビシン、デブリソキン、デキサメタゾン、ジギトキシン、ジゴキシン、ジルチアゼム、ドセタキセル、ドンペリドン、ドキソルビシン、エピルビシン、エリスロマイシン、エストラジオール、エトポシド、フェニトイン、フェキソフェナジン、ＦＫ５０６、フルオロウラシル、ゲンタマイシン、グリセオフルビン、イマチニブ、インジナビル、イトラコナゾール、レボフロキサシン、ロサルタン、ロバスタチン、メベンダゾール、メチルプレドニゾロン、メトトレキサート、ミベフラジル、モルヒネ、ネルフィナビル、オンダンセトロン、パクリタキセル、プラジカンテル、プレドニゾロン、プレドニゾン、キニジン、ラパマイシン、リファンピシン、サキナビル、シロリムス、スルファメチゾール、リトナビル、タクロリムス、タリノロール、テニポシド、テルフェナジン、トポテカン、トリアムシノロン、ベラパミル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、およびそれらの混合物からなる群から選択される疎水性物質またはＰ−糖タンパク質酵素の基質物質である。
【００６３】
好ましい実施形態においては、本発明のナノ粒子中に存在する生物活性分子はパクリタキセルである。
【００６４】
特定の実施形態においては、本発明の医薬組成物は、一種以上の異なる薬物を含む本発明のナノ粒子を含んでなる。前記薬物の限定されない例としては、異なる治療物質群に属する薬物、例えば、抗腫瘍薬、β−アドレナリン受容体拮抗薬、鎮痛薬、Ｃａ２＋チャネル遮断薬、強心薬、抗ウイルス薬、ステロイド、免疫抑制薬、制吐薬、抗生物質（例えば抗菌薬、抗真菌薬、抗ウイルス薬、抗寄生虫薬など）  抗高脂血薬、ヒスタミンＨ１受容体拮抗薬、抗炎症薬、神経保護物質、抗アレルギー薬、抗喘息薬、抗生物質、肺表面活性物質などが挙げられる。
【００６５】
気づくように、Ｐ−糖タンパク質の基質である生物活性分子のいくつかは、疎水性を有する。同様に、本発明によって提供される生物活性分子の投与系は、多くの治療物質群の薬物を投与する可能性を意図する。
【００６６】
もう一つの特定の実施形態においては、本発明の医薬組成物は、生物活性分子としてワクチン用の一種以上の異なる抗原、または免疫療法用の一種以上の異なるアレルゲンを含む本発明のナノ粒子を含んでなる。
【００６７】
本明細書に用いる、「抗原」という用語は、被験体に導入した場合に被験体の免疫系が認識することができかつ／または被験体において体液性免疫応答もしくは細胞性免疫反応を誘発することができ、Ｂ細胞および／またはＴ細胞の活性化をもたらすあらゆる物質を表す。その例として、前記用語は、高等生物からまたは微生物、例えば細菌、ウイルス、寄生虫、原生動物、真菌などから得られる、一個以上の抗原決定基、例えば、該生物の構造成分を含むあらゆる自然または組換え免疫原性産物、毒素、例えば、外毒素などを包含する。抗原をローディングした本発明のナノ粒子の調製には、実質的にいかなる抗原をも用いることができる。
【００６８】
限定されない例として、「抗原」という用語は、以下を包含する：
−「微生物」抗原、すなわち、限定されるものではないが、感染性ウイルス、細菌、真菌、および寄生虫を含む、微生物の抗原、前記抗原としては、天然または人工起源の、完全微生物ならびにそれらの部分、断片、および誘導体、ならびに微生物の天然抗原と同一であるかまたは類似しており、この微生物に特異的な免疫応答を誘発する合成または組換え産物が挙げられる、この意味において、ある化合物が、この微生物の天然抗原のような（体液性および／または細胞性）免疫応答を誘発するならば、それは微生物の天然抗原と類似している、前記抗原は当業者により日常的に用いられる。そして
−「腫瘍」抗原、すなわち、特にＭＨＣ分子で提示されたときに免疫応答を引き起こし得る、腫瘍または癌と会合する物質、例えば、ペプチド（「腫瘍マーカー」）、例えばＨｅｒ２（乳癌）、ＧＤ２（神経芽腫）、ＥＧＦ−Ｒ（悪性膠芽腫）、ＣＥＡ（甲状腺髄様癌）、ＣＤ５２（白血病）、ヒト黒色腫ｇｐ１００タンパク質、ヒト黒色腫ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１タンパク質、チロシナーゼ、ＮＡ１７−Ａ  ｎｔタンパク質、ＭＡＧＥ−３タンパク質、ｐ５３タンパク質、ＨＰＶ１６Ｅ７タンパク質、前記抗原の抗原性断片など。
【００６９】
本明細書に用いる、「アレルゲン」という用語は、被験体が感受性を有する、免疫反応を引き起こす物質、例えば、花粉アレルゲン抽出物、昆虫アレルゲン抽出物、食物または食品アレルゲン抽出物、被験体において過敏症反応を誘発する昆虫の唾液、はさみまたは刺傷中に存在する成分、被験体において過敏症反応を誘発する植物中に存在する成分など、例えば、花粉タンパク質抽出物（例えばイネ科（graminaceous）の花粉、アレルゲン性ホソムギ（Lolium perenne）抽出物、アレルゲン性オリーブ属（オリーブ）抽出物など）、昆虫タンパク質抽出物（例えばチリダニ由来など）、アレルゲン性食物成分抽出物などを表す。
【００７０】
本発明の組成物のアレルゲンをローディングしたナノ粒子の調製には、実質的にいかなるアレルゲンを用いることができる。それにもかかわらず、特定の実施形態においては、前記アレルゲンは、実験アレルゲンモデルとして広く用いられているタンパク質であるオボアルブミン（ＯＶＡ）である。
【００７１】
本発明のナノ粒子を含み得る前記生物活性分子の限定されない例示例としては、細菌抗原：細胞質抗原、原形質周辺抗原、細胞エンベロープ抗原（例えば、内膜タンパク質、外膜タンパク質、リポ多糖および混合複合体、細胞壁と会合したタンパク質など）など、表面構造（例えば線毛、グリコカリックス（glycocalix）、鞭毛など）の抗原（例えば、ブルセラ菌属種（Brucella sp.）、サルモネラ菌属種（Salmonella sp.）のような細胞内病原体のものを含む）など、真核微生物の可溶性抗原および表面抗原の両方、ウイルス抗原、例えば、マトリックス抗原、キャプシド抗原、エンベロープ抗原、内部抗原（酵素抗原を含む）、動物種（ダニなど）のアレルゲン、植物（イネ科（gramineae）など）のアレルゲンなどが挙げられる。
【００７２】
本発明のナノ粒子は、例えば、国際特許出願ＷＯ  ０２／０６９９３８号に記載されている溶媒置換法に基づく方法によって得ることができる。この方法は、（ｉ）（シクロデキストリンまたはその誘導体）−（生物活性分子）複合体（以下、［ＣＤ：ＢＡＭ］複合体）を形成すること、および（ii）ナノ粒子の形成前に該［ＣＤ：ＢＡＭ］複合体を有機溶媒中の生物分解性ポリマーの溶液に組み込むことを含む。
【００７３】
要するに、前記［ＣＤ：ＢＡＭ］複合体の形成は、アルコール、エタノールのような有機溶媒中の生物活性分子（ＢＡＭ）の溶液を、例えば、シクロデキストリンまたはその誘導体（ＣＤ）の水溶液に加えることを含む。この混合物は平衡に達するまで攪拌に供する。その後、水と有機溶媒（例えば、エタノール）を任意の適当な通常の方法によって、例えば、弱い蒸発下または溶媒を除去するための任意の他のシステムの下で除去する。
【００７４】
前記［ＣＤ：ＢＡＭ］複合体中に存在するＣＤ：ＢＡＭのモル比は、いくつかある因子の中でも特に、シクロデキストリンまたはその誘導体（ＣＤ）によって、さらに前記複合体中に存在する生物活性分子（ＢＡＭ）によって広い範囲内で変えることができる。それにもかかわらず、特定の実施形態においては、前記［ＣＤ：ＢＡＭ］複合体中に存在するＣＤ：ＢＡＭのモル比は１：１〜４、典型的には１：１〜２である。具体的な実施形態においては、前記生物活性分子がパクリタキセルである場合、前記［ＣＤ：ＢＡＭ］複合体中のＣＤ：ＢＡＭのモル比は１：１である。
【００７５】
ナノ粒子形成前の前記［ＣＤ：ＢＡＭ］複合体の有機溶媒中生物分解性ポリマー溶液への組込みは、前記複合体を生物分解性ポリマー溶液に加え、続いて両成分、生物分解性ポリマー（例えばＰＶＭ／ＭＡ）と［ＣＤ：ＢＡＭ］複合体とを、生物分解性ポリマー（例えばＰＶＭ／ＭＡ）含んでなる有機相（例えばアセトン）中で、およそ２０℃〜３０℃の温度で適当な時間、典型的には１０〜６０分間、攪拌下で、例えば、超音波、磁気、または機械攪拌装置を用いることによって）同時にインキュベートすること（特定の実施形態においては、前記生物活性分子がパクリタキセルである場合、インキュベーションは室温（２５℃）で３０分間行うことができる）によって行うことができ、このように操作することにより、［ＣＤ：ＢＡＭ］複合体と生物分解性ポリマーとの高度の会合が一般に得られる。要するに、この工程は、前記生物分解性ポリマーと前記［ＣＤ：ＢＡＭ］複合体とを有機溶媒（例えばアセトン）中に同時に溶解および／または分散することを含む。この混合物を室温で一定期間攪拌下でインキュベートする。前記生物分解性ポリマーの濃度は、好ましくは０．００１％−１０％ｗ／ｖであり、前記［ＣＤ：ＢＡＭ］複合体の濃度は０．００１％−５％ｗ／ｖである。場合によって、必要に応じて、ポリマーの溶液と相溶性の極性溶媒（例えばエタノール）のある特定量を、前記溶液に加える。さらに、ＷＯ  ０２／０６９９３８号に記載のとおり、場合によって、必要に応じて、前記ナノ粒子の安定性を向上させるために架橋剤を用いることもできる。用いることができる架橋剤の例示例としては、ジアミノ化分子（例えば１，３−ジアミノプロパンなど）、多糖類または単糖類、タンパク質、および一般には前記生物分解性ポリマー中に存在する基と、例えば、ＰＶＭ／ＭＡ中に存在する無水物基と反応することができる官能基を有する任意の分子が挙げられる。しかし、シクロデキストリンまたはその誘導体が存在するためにこれは同時に起こるので一般に架橋は必要でない。架橋が所望な場合には、指示された生成物のいずれかを少量加えなければならない。
【００７６】
さらに、本発明のナノ粒子を形成するために、前の混合物に同様の容量の第二の非溶媒液体、好ましくは水性アルコール溶液を加える。特定の実施形態においては、医薬級水（精製水または注射用水（ｗｆｉ）、本願に従う）を用いる。有機相：水性アルコール溶液の容量比は、好ましくはｌ：１〜１：１０の範囲である。ナノ粒子は即座に媒質中に形成され、乳白懸濁液の外観を有する。有機溶媒は減圧下での蒸発のような任意の適当な方法によって除去することができ、ナノ粒子は安定な水性懸濁液に残る。あるいは、必要に応じて、ナノ粒子は、遠心分離、超遠心分離、接線濾過、または蒸発であって、真空の使用を含むような通常の手段によって精製することもできる。最後に、必要に応じて、ナノ粒子を長期間の保管や保存のために凍結乾燥することができる。スクロース、ラクトースまたはマンニトールのような通常の凍結防止剤を、好ましくは０．１重量％−１０重量％の濃度で用いて凍結乾燥を促進させることができる。
【００７７】
もう一つの方法として、生物分解性ポリマーに基づく本発明のナノ粒子は、生物分解性ポリマー（例えばＰＶＭ／ＭＡ）ナノ粒子を、［ＣＤ：ＢＡＭ］複合体を含んでなる水溶液と共にインキュベートすることを含む方法によって得ることができる。要するに、この別法は、前記生物分解性ポリマーをアセトンのような有機溶媒中に溶解することを含む。続いて、この溶液にエタノールのような水性アルコール溶液のある特定量を加え、最後に同様の容量の水を加える。ナノ粒子は即座に媒質中に形成され、乳白懸濁液の外観を有する。有機溶媒は前の方法で記載した方法と同様の方法により、例えば減圧下での蒸発により除去し、ナノ粒子は安定な水性懸濁液に残る。その後、生物分解性ポリマーのナノ粒子を、事前に得た［ＣＤ：ＢＡＭ］複合体を含んでなる水溶液中でインキュベートする。生物分解性ポリマーのナノ粒子と［ＣＤ：ＢＡＭ］複合体とのインキュベーションは、前の方法に関して記載した条件と同様の条件で適当な温度で一定期間（例えば２０℃−３０℃の温度で一般には１０−６０分間）、攪拌下で（例えば超音波、磁気または機械攪拌装置を用いることによって）行うことができる。続いて、ナノ粒子を通常の方法、例えば、遠心分離により精製し、最後に、必要に応じて、ナノ粒子を上記の同じ方法に従って凍結乾燥する。
【００７８】
本発明のナノ粒子中に存在するＢＡＭ：生物分解性ポリマーの重量比は、いくつかある因子の中でも特に、生物分解性ポリマー（例えばＰＶＭ／ＭＡ）によって、さらに前記ナノ粒子中に存在する生物活性分子（ＢＡＭ）によって広い範囲内で変えることができるが、それにもかかわらず、特定の実施形態においては、本発明のナノ粒子中に存在するＢＡＭ：生物分解性ポリマーの重量比は、１：４〜２０、好ましくは１：１０である。
【００７９】
本発明のナノ粒子中に存在する［ＣＤ−ＢＡＭ］複合体：生物分解性ポリマーの比は、いくつかある因子の中でも特に、生物分解性ポリマー（例えばＰＶＭ／ＭＡ）によって、シクロデキストリンまたはその誘導体によって、さらに前記ナノ粒子中に存在する生物活性分子（ＢＡＭ）によって広い範囲内で変えることができる。それにもかかわらず、特定の実施形態においては、本発明のナノ粒子中に存在する［ＣＤ−ＢＡＭ］複合体：生物分解性ポリマーの重量比は、１：１〜２０、有利には１：２〜２０、好ましくは３：１０（約１：３．３）である。
【００８０】
特定の実施形態において、前記生物分解性ポリマーはＰＶＭ／ＭＡである。
【００８１】
もう一つの特定の実施形態においては、前記生物活性分子はパクリタキセルである。
【００８２】
もう一つの特定の実施形態においては、前記シクロデキストリン誘導体は、β−シクロデキストリン（β−ＣＤ）、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（ＯＨ−β−ＣＤ）、または６−モノデオキシ−６−モノアミノ−β−シクロデキストリン（ＮＨ−β−ＣＤ）である。
【００８３】
もう一つの特定の実施形態においては、前記生物活性分子はパクリタキセルであり、前記（シクロデキストリンまたはその誘導体）：パクリタキセルモル比は１：１である。
【００８４】
具体的な実施形態においては、前記［ＣＤ：ＢＡＭ］複合体は、１：１モル比のβ−ＣＤ：パクリタキセル複合体であり、前記パクリタキセル：生物分解性ポリマー（例えばＰＶＭ／ＭＡ）重量比は１：４〜２０であるが、１：１０に近い比が良好な結果を与える。例として、ポリマー１ｍｇ当たり、１：１モル比のβ−ＣＤ：パクリタキセル複合体中のおよそ０．２５ｍｇのパクリタキセルで有効会合が得られる。この場合にはナノ粒子と会合した薬物の量は、ナノ粒子１ｍｇ当たりおよそ４０μｇのパクリタキセルである。これらのナノ粒子は、球形およびほぼ３００ｎｍの大きさを有することを特徴とする。
【００８５】
もう一つの具体的な実施形態においては、前記［ＣＤ：ＢＡＭ］複合体は、１：１モル比のＯＨ−β−ＣＤ複合体であり、前記パクリタキセル：生物分解性ポリマー（例えばＰＶＭ／ＭＡ）重量比は１：４〜２０であるが、１：１０に近い比が良好な結果を与える。例として、ポリマー１ｍｇ当たり、１：１モル比のＯＨ−β−ＣＤ：パクリタキセル複合体中のおよそ０．２５ｍｇのパクリタキセルで有効な会合が得られる。この場合にはナノ粒子と会合した薬物の量は、ナノ粒子１ｍｇ当たりおよそ１７０μｇのパクリタキセルである。これらのナノ粒子は、球形およびほぼ３００ｎｍの大きさを有することを特徴とする。
【００８６】
もう一つの具体的な実施形態においては、前記［ＣＤ：ＢＡＭ］複合体は、１：１モル比のＮＨ−β−ＣＤ複合体であり、前記パクリタキセル：生物分解性ポリマー（例えばＰＶＭ／ＭＡ）重量比は１：４〜２０であるが、１：１０に近い比が良好な結果を与える。例として、ポリマー１ｍｇ当たり、１：１モル比のＯＨ−β−ＣＤ：パクリタキセル複合体中のおよそ０．２５ｍｇのパクリタキセルで有効会合が得られる。この場合にはナノ粒子と会合した薬物の量は、ナノ粒子１ｍｇ当たりおよそ１００μｇのパクリタキセルである。これらのナノ粒子は、球形およびほぼ３００ｎｍの大きさを有することを特徴とする。
【００８７】
特定の実施形態においては、β−ＣＤを用いて本発明のナノ粒子に処方した用量１０ｍｇ／ｋｇのパクリタキセルを経口投与した場合には、およそ５時間で最高血漿濃度（Ｃｍａｘ）に到達した後、一定かつ持続的な血漿レベルが少なくとも２４時間得られる。この最高血漿濃度（Ｃｍａｘ）は、市販の処方物の静脈内投与後に得られる最高血漿濃度と同様である。この処方物で得られるパクリタキセルの血漿曲線下面積（ＡＵＣ）は、同じ用量で投与する市販の医薬品の静脈内投与により得られる面積よりもおよそ５倍大きい。この処方物は、市販の処方物の静脈内投与後に得られる生物体内での前記薬物の平均滞留時間［ＭＲＴ］よりもおよそ４倍長い平均滞留時間を提供することを特徴とする。
【００８８】
もう一つの特定の実施形態においては、ＯＨ−β−ＣＤを用いて本発明のナノ粒子に処方した用量１０ｍｇ／ｋｇのパクリタキセルを経口投与した場合には、およそ６時間で最高血漿濃度（Ｃｍａｘ）に到達した後、一定かつ持続的な血漿レベルが少なくとも２４時間得られる。この最高血漿濃度は、市販の処方物の静脈内投与後に得られる最高血漿濃度よりも２倍高い。この処方物で得られるパクリタキセルの血漿曲線下面積（ＡＵＣ）は、同じ用量で投与する市販の製剤の静脈内投与により得られる面積よりもおよそ５倍大きい。この処方物は、市販の処方物の静脈内投与後に得られる生物体内での前記薬物の平均滞留時間［ＭＲＴ］よりもおよそ３．５倍長い平均滞留時間を提供することを特徴とする。
【００８９】
もう一つの特定の実施形態においては、ＮＨ−β−ＣＤを用いて本発明のナノ粒子に処方した用量１０ｍｇ／ｋｇのパクリタキセルを経口投与した場合には、およそ４．７時間で最高血漿濃度（Ｃｍａｘ）に到達した後、一定かつ持続的な血漿レベルが少なくとも２４時間得られる。この最高血漿濃度は、市販の処方物の静脈内投与後に得られる最高血漿濃度のおよそ半分である。この処方物で得られるパクリタキセルの血漿曲線下面積（ＡＵＣ）は、同じ用量で投与する市販の医薬品の静脈内投与により得られる面積とほぼ同じである。この処方物は、市販の処方物の静脈内投与後に得られる生物体内での前記薬物の平均滞留時間［ＭＲＴ］よりもおよそ３倍長い平均滞留時間を提供することを特徴とする。
【００９０】
医薬組成物
もう一つの態様では、本発明は、少なくとも一種の本発明のナノ粒子と、薬学上許容される賦形剤、担体、またはアジュバントとを含んでなる医薬組成物に関する。
【００９１】
前記生物活性分子は、一般に、シクロデキストリンまたはその誘導体と複合体を形成し、該複合体は、主として、本発明のナノ粒子の内部に存在するものである。それにもかかわらず、相対的割合の、生物活性分子を含む前記複合体はそのナノ粒子の表面にも結合するということが起こり得たが、その大部分は（例えば封入した）本発明のナノ粒子の内部に存在する。
【００９２】
本発明のナノ粒子を生物体の任意の粘膜に接近する経路（経口経路、直腸経路、経鼻経路、経膣経路、または経眼経路など）によって投与する場合には、それらは会合した生物活性分子の分布を変更するのに用いることができる。加えて、それを非経口投与することもできる。
【００９３】
医薬組成物の例としては、経口投与、口内投与、舌下投与、局所投与、経眼投与、経鼻投与、経膣投与、または非経口投与用の任意の液体組成物（前記ナノ粒子の懸濁液または分散液）、その局所投与、経眼投与、経鼻投与、または経膣投与用の任意のゲル、軟膏、クリーム、またはバーム形態の組成物、あるいはその経口投与用の任意の固体組成物（錠剤、カプセル）が挙げられる。特定の実施形態においては、前記医薬組成物は経口投与される。もう一つの特定の実施形態においては、前記医薬組成物は非経口投与される。
【００９４】
記載した医薬組成物は、それぞれの処方物について適当な賦形剤を含んでなる。例えば、錠剤またはカプセル形態の経口処方物の場合には、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、充填剤、腸溶性コーティングなどが必要に応じて包含される。経口固体処方物は、本発明のナノ粒子の混合、湿式造粒または乾式造粒および組込みによって通常に調製される。これらの医薬組成物は、適当な投与形での、例えば、滅菌溶液、懸濁液または凍結乾燥物の形態での非経口投与に適合させることもできる、この場合、該医薬組成物は、緩衝液、界面活性剤などのような適当な賦形剤を包含する。いずれにせよ、前記賦形剤は、選択した医薬投与形に従って選択される。薬物の種々の医薬投与形について、そしてそれらの調製についての総説は書籍において見つけることができる”Tratado de Farmacia Galenica”, by C. Fauli i Trillo, 10th Edition, 1993, Luzan 5, S.A. de Ediciones.
【００９５】
本発明のナノ粒子に組み込む生物活性分子の割合は、広い範囲内で変えることができ、例えば、その割合は、本発明のナノ粒子の総重量に対して最大２５重量％であり得る。それにもかかわらず、その適当な割合はいずれの場合も組み込む生物活性分子によって決まる。
【００９６】
本発明のナノ粒子の投与用量は、広い範囲内で変えることができ、例えば体重１ｋｇにつき約０．０１ｍｇ〜約１０ｍｇ、好ましくは体重１ｋｇにつき０．１〜２ｍｇである。
【００９７】
以下においていくつかの実施例を用いて本発明を記載するが、それらの実施例は本発明を限定するものではなく例示するものである。
【実施例】
【００９８】
次の実施例では、シクロデキストリンを組み込んだ生物分解性ポリマー（ＰＶＭ／ＭＡ）に基づくナノ粒子（実施例１−５）と、シクロデキストリンおよび生物活性分子を組み込んだ生物分解性ポリマー（ＰＶＭ／ＭＡ）に基づくナノ粒子（この生物活性分子はシクロデキストリンとおよび／または生物分解性ポリマー（ＰＶＭ／ＭＡ）と会合し、該ナノ粒子のマトリックスを形成する）（実施例６および７）の製造および特性評価について記載する。前記実施例では、前記ナノ粒子の、粘膜との生体接着相互作用を展開する能力およびパクリタキセルのような生物活性分子の経口吸収を促進する能力を示す。前記実施例において分かるように、パクリタキセルを生物活性分子として用いる場合には、シクロデキストリン、特に２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンを組み込んだＰＶＭ／ＭＡに基づく前記ナノ粒子にそれを組み込むことで、前記薬物物質の一定かつ持続的な血漿レベルを少なくとも２４時間得ることが可能になる。
【００９９】
前記ナノ粒子の製造および特性評価に用いる一般的方法を以下に記載する。
【０１００】
Ａ．  シクロデキストリンと、場合によって生物活性分子を含むナノ粒子の製造
シクロデキストリンと、場合によって生物活性分子を組み込んだ生物分解性ポリマー（ＰＶＭ／ＭＡ）に基づくナノ粒子の製造方法は、該ポリマーの制御脱溶媒和に基づく前述の一般的方法の改良法である［Arbos et al., J. Control. Release, 83 (2002) 321-330］。その目的に向けて、メチルビニルエーテルおよび無水マレイン酸（ＰＶＭ／ＭＡ）のコポリマーとある特定量のシクロデキストリン、あるいはシクロデキストリン：生物活性分子複合体、通常の方法（例えば、Hamada et al., J Biosci Bioeng 102(4):369-71, 2006）によりアセトン中、磁気攪拌下で得る。インキュベーション後、この相に磁気攪拌下で相溶性有機溶媒（エタノール）と同様の容量の脱イオン水を加え、ナノ粒子の形成が起こり、乳白懸濁液の外観を有する。その後、有機溶媒（エタノールおよびアセトン）を減圧下での蒸発によって除去し、ナノ粒子は安定な水性懸濁液に残る。形成したナノ粒子は、場合によって水溶性生物活性分子でまたは結果として得られるナノ粒子に特異的ターゲッティング特性を付与することができるリガンドでコーティングすることができる。ナノ粒子懸濁液を均質化した後、例えばＢｕｃｈｉ  Ｒ−１４４  ロータリーエバポレーター（スイス）のようなロータリーエバポレーターを用いることによって、両方の有機溶媒が除去されるまで、減圧下で蒸発させる。続いて、この懸濁液を超遠心分離（Sigma 3k30, ローター No.-12150, ドイツ）によるかまたは接線濾過による精製に供し、あるいは、ナノ粒子をそれらのその後の凍結乾燥や長期間の保存のために−８０℃で凍結させることもできる（Ｖｉｒｔｉｓ  Ｇｅｎｅｓｉｓ，  ニューヨーク、米国）。
【０１０１】
Ｂ．  ナノ粒子の物理化学的特性評価
ナノ粒子の特性評価には、以下に記載するいくつかの研究が必要であった。物理化学的研究のうち、ナノ粒子の粒径および表面電荷を決定し、表面電荷はζ電位の測定により決定した。どちらのパラメーターも光子相関分光法により、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  ｎａｎｏ  Ｚ−Ｓ（Malvern Instruments/Optilas, スペイン）を用いて得た。
【０１０２】
この方法の収率を二つの方法により計算した。第一の方法では、収率を重量測定法で、式１：
収率＝（凍結乾燥物の重量／初期重量）ｘ１００［式１］
（式中、
初期重量は、処方物に加えた生物分解性ポリマー（例えばＰＶＭ／ＭＡ）およびシクロデキストリンに重量であり、および
凍結乾燥物の重量は、凍結乾燥工程後の処方物の重量である）
に従って、凍結防止剤を含まない凍結乾燥試料の重量を用いて計算した。
【０１０３】
第二の方法は、以下に記載する方法によるＥＬＳＤ（蒸発光散乱検出）型検出器を用いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による定量に基づいたものであり（Agueros et al., J. Pharm. and Biomed. Anal., 39 (2005) 495-502）、この方法ではシクロデキストリンおよびＰＶＭ／ＭＡコポリマーの定量が可能である。この場合には、収率を下記式２：
収率＝（Ｑinitial−ＱＰＶＭ／ＭＡ）ｘ１００    ［式２］
（式中、
Ｑinitialは、加えたＰＶＭ／ＭＡの初期量であり、および
ＱＰＶＭ／ＭＡは、上清で確認されたＰＶＭ／ＭＡの量である）
に従って計算した。
【０１０４】
ナノ粒子の形態を走査型電子顕微鏡（Zeiss, DSM 940A ドイツ）によって観察した。その目的に向けて、凍結乾燥したナノ粒子を約９ｎｍの金分子層でコーティングし（Emitech K550 Equipment, Sputter-Coater, 英国）、Ｚｅｉｓｓ  ＤＭＳ  Ａ顕微鏡（米国）を用いて写真を作成した。
【０１０５】
ナノ粒子と会合したシクロデキストリンの存在を確認するために（以下に記載する定量法）、異なるナノ粒子処方物の元素分析をＬＥＣＯ  ＣＨＮ−９００型元素分析計（LECO Corporation, 米国）を用いて行った。
【０１０６】
ナノ粒子と会合したシクロデキストリンの量の定量
ナノ粒子と会合した非アミノ化シクロデキストリン［例えばシクロデキストリン（β−ＣＤ）および２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（ＯＨ−β−ＣＤ）］の量を決定するために、ＥＬＳＤ型検出器を用いたＨＰＬＣ法を用いた。分析を１１００シリーズＬＣ型クロマトグラフ（Agilent, Waldbornn, ドイツ）により行い、データをＨｅwlett-Packard社製コンピューターでChem-Station G2171プログラムにより解析した（Agueros et al., J. Pharm. and Biomed. Anal., 39 (2005) 495-502）。
【０１０７】
試料の分析では、ナノ粒子の精製工程後に得た上清を精製水で１０ｍｌまで希釈した。内部標準（ＰＥＧ  ６０００）を加えた後、試料として上清の１ｍｌアリコートを採取した。これらの試料を、Ｚｏｒｂａｘ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＸＤＢ−フェニルカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ  １５０ｍｍｘ２．１ｍｍ）および移動相として流量０．２５ｍｌ／分で水／アセトニトリル勾配混合物（表１参照）を用いて分析した。
【０１０８】
【表１】
0005847397.tif 000002
【０１０９】
検出器（ＥＬＳＤ）の条件を、移動相に用いる勾配により最大感度になるまで最適化した（ネブライザー温度：１１５℃、窒素流量：３．２ｍｌ／分）。異なるシクロデキストリン、ＰＶＭ／ＭＡおよび内部標準（ＰＥＧ  ６０００）のクロマトグラフ分離を１５分未満で行った。保持時間は：
ＰＶＭ／ＭＡでは１．０８±０．０５分、
β−ＣＤでは４．５８±０．０７分、
ＯＨ−β−ＣＤでは１０．２７±０．０６、および
内部標準では１３．６０±０．０４分
であった。
【０１１０】
定量限界は、シクロデキストリンでは０．２ｍｇ／ｍｌ、ポリマー（ＰＶＭ／ＭＡ）では０．０５ｍｇ／ｍｌであった。精度は７％の限界以下であった。
【０１１１】
ナノ粒子と会合したアミノ化シクロデキストリン［例えば６−モノデオキシ−６−モノアミノ−β−シクロデキストリン（ＮＨ−β−ＣＤ）］の定量の場合には、シクロデキストリンとポリマーのピークが重複しないように、上記方法の変形を用いた。そのため、試料を、４０℃に加熱したＮＨ２−Ｚｏｒｂａｘカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ  ４．６ｘ１５０ｍｍ，  ５μｍ）および移動相として流量１ｍｌ／分でメタノール／水（８０／２０  ｖ／ｖ）混合物を用いて分析した。検出器（ＥＬＳＤ）の条件は以下であった：ネブライザー温度：７１℃および窒素流量：１．９ｍｌ／分。６−モノデオキシ−６−モノアミノ−β−シクロデキストリンのクロマトグラフ分離を７分未満で行った。保持時間は３．８±０．０７分であった。
【０１１２】
最後に、ナノ粒子と会合したシクロデキストリン（ＣＤ）の量を、最初に加えたＣＤの量と、上清で定量したＣＤの量との差として計算した。
【０１１３】
ＲＢＩＴＣの定量
ナノ粒子中に組み込まれたローダミンＢイソチオシアネート（ＲＢＩＴＣ）の量を比色定量により波長５４０ｎｍで決定した（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ  ｉＥＭＳ  Ｒｅａｄｅｒ  ＭＦ，  フィンランド）。この定量では、０．１Ｎ  ＮａＯＨ中のＲＢＩＴＣの５−５０μｇ／ｍｌの範囲の較正曲線、ｒ＝０．９９９、を用いた。
【０１１４】
ＲＢＩＴＣの量は、加えた初期量と、０．１Ｎ  ＮａＯＨ中でのある特定量のナノ粒子の完全加水分解（２４時間，  ３７℃）後に見られる量との差として推定した。
【０１１５】
ＲＢＩＴＣの放出
ナノ粒子からのＲＢＩＴＣの放出の動力学をＶivａｓｐｉｎ  １００，０００  ＭＷＣＯ透析チューブ（ＶＩＶＡＳＰＩＮ，  Ｈａｎｎｏｖｅｒ，  ドイツ）において実行した。その目的に向けて、１０ｍｇのナノ粒子を１ｍｌの模擬胃環境（０−１時間）中または模擬腸環境（１−２４時間）（ＵＳＰ  ＸＸＩＩＩ）中に３７＋１℃で分散させた。ある特定の時期において、ナノ粒子懸濁液を遠心分離し（５，０００ｘｇ，  １５分）、濾液中のＲＢＩＴＣの量を比色定量（λ＝５４０ｎｍ）により定量した。
【０１１６】
パクリタキセルの定量
ナノ粒子中に封入されているパクリタキセルの量をＨＰＬＣにより決定した。分析は、ダイオード−アレイＵＶ検出システムと連結した１１００シリーズＬＣ型クロマトグラフ（Ａｇｉｌｅｎｔ，  Ｗａｌｄｂｏｒｎｎ，  ドイツ）により行った。データはＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ社製コンピューターでＣｈｅｍ−Ｓｔａｔｉｏｎ  Ｇ２１７１プログラムにより解析した。パクリタキセルの分離には、３０℃に加熱したＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｇｅｍｉｎｉ  Ｃ１８逆相カラム（１５０ｍｍｘ３ｍｍ、５μｍ）を用いた。移動相は、リン酸塩調節溶液（ｐＨ＝２、０．０１Ｍ）と、アセトニトリルの（５０／５０容量比の）混合物とし、流量０．５ｍｌ／分で注入した。検出は２２８ｎｍで行った。
【０１１７】
新たな試料分析では、１００μｌの水性ナノ粒子懸濁液を採取し、１００μｌのアセトニトリルで破壊した。溶媒を蒸発させ（遠心エバポレーター）、用いる移動相で試料を再構成した。それらの分析のために１００μｌアリコートをＨＰＬＣカラムに注入した。
【０１１８】
Ｃ．  生体接着研究
生体接着研究は、前述のプロトコール［Ａｒｂｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．，  ２４２  （２００２）  １２９−１３６］を用いて、ナバラ大学の倫理委員会の規則に従い実験動物に関する欧州法（８６／６０９／ＥＵ）に従って行った。
【０１１９】
その目的に向けて、平均重量２２５ｇの雄Ｗｉｓｔａｒラット（ｍａｌｅ  Ｗｉｓｔａｒ  ｍａｌｅ  ｒａｔｓ）  （Ｈａｒｌａｎ，  スペイン）を食物および水のない通常の条件下で飼育した。ＲＢＩＴＣで標識したナノ粒子１０ｍｇを含む水性懸濁液１ｍｌを動物に経口投与した。これらの動物を様々な時期（０．５時間、１時間、３時間および８時間）に頸部脱臼によって犠牲にした。腹腔を開き、消化管を摘出し、六つの解剖学的部分：胃（Ｓｔｏ）、小腸（Ｉ１、Ｉ２、Ｉ３、およびＩ４）および盲腸（Ｃｅ）に分割した。それぞれの粘膜セグメントを縦に開き、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗い流した。さらに、これらの部分それぞれを五つの同様な部分に切断し、この組織を１ｍｌの３Ｍ  ＮａＯＨで２４時間消化した。ローダミンの抽出に２ｍｌのメタノールを用い、それをボルテックスにより１分間攪拌した後、２，０００ｘｇで１０分間遠心分離した（５８０４Ｒ遠心機，ローター  Ａ−４−４４，  ドイツ）。得た上清の１ｍｌアリコートを水（３ｍｌ）で希釈し、それらを蛍光分光分析によりλｅｘ＝５４０ｎｍおよびλｅｍ＝５８０ｎｍにおいて分析して（ＧＥＮｉｏｓ，  オーストリア）、粘膜に接着したナノ粒子画分を推定した。較正線は、３Ｍ  ＮａＯＨ中のＲＢＩＴＣの溶液（０．５−１０μｇ／ｍｌ）を対照組織セグメント（同じ抽出工程に供する）に加えることによって作成した（ｒ＞０．９９６）。
【０１２０】
異なる処方物を比較するために、生体接着動力学および曲線を研究した。その目的に向けて、接着したナノ粒子画分を経時的に表すことによって生体接着曲線を得た。生体接着曲線に基づき、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ  １．５コンピューターアプリケーション（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  米国）を用いて、次の動力学的生体接着パラメーターを決定した：Ｑｍａｘ、ＡＵＣａｄｈ、Ｔｍａｘ、ＭＲＴａｄｈおよびＫａｄｈ（Ａｒｂｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｏｎｔｒｏｌ．  Ｒｅｌｅａｓｅ，  ８９  （２００３）  １９−３０）。Ｑｍａｘ（ｍｇ）は、消化管粘膜に付着したナノ粒子の初期最大能力であり、生体接着相互作用を展開するそれらの能力に関係している。ＡＵＣａｄｈ（ｍｇ．ｈ）は、接着したナノ粒子画分についての曲線下面積であり、生体接着強度を表す。ＭＲＴａｄｈ（ｈ）は、処方物が粘膜と接着した状態にある推定平均時間である。Ｋａｄｈは、粘膜と接着した画分の消失速度と定義される。これらのパラメーターは総て、０−８時間の間に評価した。計算は、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ  １．５プログラム（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  ＵＳＡ）を用いて行った。
【０１２１】
Ｄ．粘膜に付着したナノ粒子の観察
消化管粘膜における、シクロデキストリンと、場合によって生物活性分子を含むナノ粒子を蛍光顕微鏡検査法により観察した。その目的に向けて、ＲＢＩＴＣを含む処方物を用いた。前記処方物（１０ｍｇのナノ粒子）を実験動物（雄Ｗｉｓｔａｒラット）に経口投与し、これらの動物を２時間後に犠牲にした。犠牲にした後、生体接着研究に関して前述したように、消化管を摘出し、小腸の様々な部分を集め、それらをリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ＝７．４、０．１５Ｍ）で洗浄した。様々な腸切片をＯ．Ｃ．Ｔ．（Ｓａｋｕｒａ、オランダ）で処理し、液体窒素中で凍結させた。続いて、組織試料をクライオスタット（２８００  Ｆｒｉｇｏｃｕｔ  Ｅ，  Ｒｅｉｃｈｅｒｔ−Ｊｕｎｇ，  ドイツ）で５μｍ厚の切片に切断し、蛍光顕微鏡検査法によりそれらを観察するために支持体に固定した。
【０１２２】
Ｅ．  薬物動態研究
薬物動態研究は、ナバラ大学の倫理委員会の規則に従い実験動物に関する欧州法（８６／６０９／ＥＵ）に従って行った。その目的に向けて、平均重量２２５ｇの雄Ｗｉｓｔａｒラット（Ｈａｒｌａｎ、スペイン）を、処方物の投与の１２時間前に代謝ケージに隔離し、食物は与えなかったが、飲料水は自由に与えた。
【０１２３】
動物を８処置群（１群当たり６動物）に分け、次の処方物：
（ｉ）Ｔａｘｏｌ（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ，  マドリード，  スペイン）のｉ．ｖ．溶液、
（ii）Ｔａｘｏｌの経口溶液、
（iii）パクリタキセル（ＰＴＸ）−２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（ＯＨ−β−ＣＤ）［ＰＴＸ−ＯＨ−β−ＣＤ］複合体、
（iv）パクリタキセル（ＰＴＸ）−β−シクロデキストリン（β−ＣＤ）［ＰＴＸ−β−ＣＤ］複合体、
（ｖ）パクリタキセル（ＰＴＸ）−６−モノデオキシ−６−モノアミノ−β−シクロデキストリン（ＮＨ−β−ＣＤ）［ＰＴＸ−ＮＨ−β−ＣＤ］複合体、
（ｖｉ）パクリタキセル（ＰＴＸ）−２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（０Ｈ−β−ＣＤ）−ＰＶＭ／ＭＡに基づくナノ粒子（ＮＰ）［ＰＴＸ−ＯＨ−β−ＣＤ−ＮＰ］複合体、
（ｖii）パクリタキセル（ＰＴＸ）−β−シクロデキストリン（β−ＣＤ）−ＰＶＭ／ＭＡに基づくナノ粒子（ＮＰ）［ＰＴＸ−β−ＣＤ−ＮＰ］複合体、および
（ｖiii）パクリタキセル（ＰＴＸ）−６−モノデオキシ−６−モノアミノ−β−シクロデキストリン−ＰＶＭ／ＭＡに基づくナノ粒子（ＮＰ）［ＰＴＸ−ＮＨ−β−ＣＤ−ＮＰ］複合体
のいずれかに組み込んだ単回用量１０ｍｇ／ｋｇ（２．２５ｍｇ）のパクリタキセルで処置した。
【０１２４】
ｉ．ｖ．溶液（市販の処方物）の場合（尾静脈に投与した（０．３ｍｌ））を除き、水に溶解または分散した１ｍｌの異なる処方物を動物に投与した。
【０１２５】
投与後、およそ３００μｌの血液量を様々な時期に抽出し、抗凝固薬としてエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）を用い、同量の生理食塩水を用いて腹膜内（ｉ．ｐ．）経路により動物（ラット）の血液量を回復させた。血液を５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清（血漿）を−８０℃の温度で凍結させた。この研究は、動物実験に関する国際的指針（WHO Chronicle, 39 (2): 51-56, 1985; A CIOMS Ethical Code for Animal Experimentation）の本質に従い、ナバラ大学動物実験倫理委員会によって承認されたプロトコールを用いて行った
【０１２６】
試料の前処理
血漿からのパクリタキセルの抽出を、液−液抽出法により、抽出溶媒としてブチルメチルエーテルを用いて行った。その目的に向けて、血漿アリコート（０．１ｍｌ）を採取し、水で容量１ｍｌに調製し、それらに内部標準として０．２μｇのドセタキセルを加えた。次いで、４ｍｌのｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルを加え、それらを１分間攪拌した。その後、試料を１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清（有機相）を集め、遠心エバポレーター（Ｓａｖａｎｔ，  バルセロナ，  スペイン）で蒸発させた。このようにして得た抽出物を、アセトニトリルとリン酸塩調節溶液（ｐＨ＝２、０．０１  Ｍ）の混合物（５０／５０  ｖ／ｖ）２００μLで、ボルテックスしながら１分間攪拌することにより再構成した。得た溶液を注射用バイアルに移した。
【０１２７】
分析法：ＨＰＬＣ
パクリタキセルの定量を、紫外可視検出を用いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により行い、ドセタキセルを内部標準として用いた。分析は、１１００シリーズＬＣ型クロマトグラフ（Ａｇｉｌｅｎｔ，  Ｗａｌｄｂｏｒｎｎ、ドイツ）により行った。データはＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ社製コンピューターでＣｈｅｍ−Ｓｔａｔｉｏｎ  Ｇ２１７１プログラムにより解析した。パクリタキセルの分離には、３０℃に加熱したＧｅｍｉｎｉ  Ｃ１８逆相カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）  １５０ｍｍｘ３ｍｍ、５μｍを用いた。移動相はリン酸塩調節溶液（ｐＨ＝２、０．０１Ｍ）とアセトニトリルの（５０／５０容量比の）混合物とし、流量０．５ｍｌ／分でカラムに通した。検出は２２８ｎｍで行った。
【０１２８】
検出器の応答と、４０〜３，２００ｎｇ／ｍｌの濃度範囲でのパクリタキセルの血漿濃度との直線関係は実証されており、用いた分析法は有効であった。
【０１２９】
薬物動態解析
パクリタキセルの投与後に得た経時的血漿中濃度データの薬物動態解析を、ＷｉＮＮｏｎｌｉｎ  １．５薬物動態調整プログラム（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  マウンテンヴュー，  米国）の非コンパートメント調整工程を用いて行った。
【０１３０】
次の薬物動態パラメーターを計算した：最高濃度（Ｃｍａｘ）、Ｃｍａｘに到達する時間（ｔｍａｘ）、血漿レベル曲線下面積（ＡＵＣ０−ｉｎｆ）、平均滞留時間（ＭＲＴ）、および最終排出相における生物学的半減期（ｔ１／２ｚ）、クリアランス（Ｃｌ）ならびに定常状態分布量。
【０１３１】
平均滞留時間（ＭＲＴ）は、ＡＵＭＣの値（血漿中濃度の最初の時点での曲線下面積）とＡＵＣの値との比率によって計算した。クリアランス（Ｃｌ）は、用量ｘバイオアベイラビリティ／ＡＵＣとして計算し、定常状態分布量（Ｖｓｓ）は、クリアランスと、１／ＭＲＴとして計算される最終排出定数（ｋ）との比率として計算した。
【０１３２】
Ｆ．  統計分析
生体接着および薬物動態研究では、処方物をノンパラメトリックの「マンホイットニー」検定を用いて解析した。Ｐ＜０．０５の値を有意と見なした。総ての計算を、ＳＰＳＳ統計ソフトウェアプログラム（ＳＰＳＳ  １０，  Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ，  米国）を用いて行った。
【０１３３】
実施例１
ナノ粒子を得るための生物分解性ポリマー（ＰＶＭ／ＭＡ）と、シクロデキストリンとの会合方法の最適化
ナノ粒子を、前述の方法の改良後の制御脱溶媒和により調製した  ［Ａｒｂｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｏｎｔｒｏｌ．  Ｒｅｌｅａｓｅ，  ８３  （２００２）  ３２１−３３０］。その目的に向けて、メチルビニルエーテルおよび無水マレイン酸（ＰＶＭ／ＭＡ）のコポリマーと、ある特定量のβ−シクロデキストリン（β−ＣＤ）、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（ＯＨ−β−ＣＤ）、または６−モノデオキシ−６−モノアミノ−β−シクロデキストリン（ＮＨ−β−ＣＤ）をアセトン中、磁気攪拌下でインキュベートした。インキュベーション後、この相に磁気攪拌下で相溶性有機溶媒（エタノール）と同様の容量の脱イオン水を加え、ナノ粒子の形成が生じ、乳白懸濁液の外観を有した。ナノ粒子懸濁液を均質化した後、両方の有機溶媒が除去されるまで、減圧下で蒸発させた（Ｂｕｃｈｉ  Ｒ−１４４  ロータリーエバポレーター、スイス）。続いて、この懸濁液を超遠心分離（Ｓｉｇｍａ  ３ｋ３０、ローター  Ｎｏ．−１２１５０、ドイツ）により精製した。得たナノ粒子の一部をそれらのその後の凍結乾燥や長期間の保存のために−８０℃で凍結させた（Ｖｉｒｔｉｓ  Ｇｅｎｅｓｉｓ、ニューヨーク、米国）。
【０１３４】
図１は、ナノ粒子を調製しながらの生物分解性ポリマー（ＰＶＭ／ＭＡ）とのインキュベーション時間による、ナノ粒子と会合したシクロデキストリンの量を示す。総ての場合において、ＣＤとポリマーとの最適なインキュベーション時間が観察された。このインキュベーション時間は３０分であった。最後に、β−ＣＤは、そのヒドロキシル化（ＯＨ−β−ＣＤ）またはアミノ化（ＮＨ−β−ＣＤ）誘導体よりもＰＶＭ／ＭＡナノ粒子とより効率的に会合することを強調しなければならない。
【０１３５】
得られた結果に従い、その後の研究について次の実験条件を選択した：
−シクロデキストリン：ＰＶＭ／ＭＡコポリマー（１：４）比、および
−３０分のインキュベーション時間。
【０１３６】
実施例２
シクロデキストリンを含むナノ粒子の製造
２．１  シクロデキストリンを含むナノ粒子の製造
ナノ粒子を、前述の方法の改良後の制御脱溶媒和により調製した［Arbos et al., J. Control. Release, 83 (2002) 321-330］。その目的に向けて、２５ｍｇのβ−ＣＤ、ＯＨ−β−ＣＤまたはＮＨ−β−ＣＤを、超音波を用いて（Ｍｉｃｒｏｓｏｎすなわち超音波浴中冷却下で１分間）２ｍｌのアセトンに分散した。この懸濁液をアセトン３ｍｌ中のメチルビニルエーテルおよび無水マレイン酸（ＰＶＭ／ＭＡ）のコポリマー［Ｇａｎｔｒｅｚ  ＡＮ  １１９］１００ｍｇの溶液に加え、この混合物を３０分間インキュベートした。続いて、この相に磁気攪拌下で１０ｍｌのエタノールと１０ｍｌの脱イオン水を加えた。結果として得られた混合物を５分間均質化した。その後、両方の有機溶媒が除去されるまで、ナノ粒子懸濁液を減圧下で蒸発させ（Ｂｕｃｈｉ  Ｒ−１４４、スイス）、最終容量を水で１０ｍｌに調製した。続いて、懸濁液を超遠心分離（２７，０００ｘｇで２０分）（Ｓｉｇｍａ  ３ｋ３０、ローター  Ｎｏ．−１２１５０、ドイツ）による精製に供した。上清を除去し、残渣を水にまたは５％スクロース水溶液に再懸濁した。あるいは、得られたナノ粒子に一部をそれらのその後の凍結乾燥や長期間の保存のために−８０℃で凍結させた（Ｖｉｒｔｉｓ  Ｇｅｎｅｓｉｓ、ニューヨーク、米国）。
【０１３７】
２．２  シクロデキストリンを含むＰＶＭ／ＭＡに基づく、異なる獲得ナノ粒子の物理化学的特性評価
物理化学的特性を決定することにより、ナノ粒子が、用いたＣＤとは関係なく、同様の大きさおよび表面電荷を有する次第を確かめることが可能になる。さらに、この表面電荷は、処理していないナノ粒子の表面電荷と同様であり、そのため、ＣＤの大部分はナノ粒子内部に存在し、ナノ粒子の表面には吸着されないと考えることができる。表２に解析したナノ粒子の主要な物理化学的特性を要約する。
【０１３８】
【表２】
0005847397.tif 000003
【０１３９】
表２に示されるように、ナノ粒子は、用いたシクロデキストリンとは関係なく、同様の大きさおよび表面電荷を有する。さらに、この表面電荷は、処理していないナノ粒子の表面電荷と同様であり、そのため、シクロデキストリンの大部分はナノ粒子内部に存在し、ナノ粒子の表面には吸着されないと考えることができる。シクロデキストリンとＰＶＭ／ＭＡに基づくナノ粒子とを会合させることにより、大きさが通常のナノ粒子（ＮＰ）より小さいナノ粒子を得ることが可能になる。表２に示されるように、シクロデキストリンを含むＰＶＭ／ＭＡに基づくナノ粒子はほぼ１５０ｎｍの大きさを示す。このサイズ減少はナノ粒子製造方法の高収率に関係する可能性がある。これらの収率は、この工程の終了時およびナノ粒子の凍結乾燥後にそれらの重量を測定することにより得た。製造収率は、ＰＶＭ／ＭＡコポリマーおよびシクロデキストリンの初期質量に関して計算した百分率で表される。
【０１４０】
ナノ粒子と会合したシクロデキストリンの量は、用いたオリゴ糖の種類によって異なり、β−ＣＤでは約９０μｇ／ｍｇ、ＯＨ−β−ＣＤおよびＮＨ−β−ＣＤでは７０μｇ／ｍｇである。異なる処方物の元素分析後にＰＶＭ／ＭＡに基づくナノ粒子と会合したＣＤの存在の確認を行った。得た結果（表３）より、対照ナノ粒子（ＮＰ）との比較による、会合したＣＤを有する処方物中の酸素の比率の重要な増加、ならびに炭素の割合の減少からＣＤの存在を確認した。
【０１４１】
【表３】
0005847397.tif 000004
【０１４２】
ナノ粒子の形態を走査型電子顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ，  ドイツ）によって観察し、そして、均質で８０−２００ｎｍの大きさの典型的な球形のナノ粒子を確認した。図２は、β−ＣＤを含むＰＶＭ／ＭＡに基づくナノ粒子（β−ＣＤ−ＮＰ）の凍結乾燥試料を走査型電子顕微鏡に供した結果を示す。
【０１４３】
実施例３
シクロデキストリンおよびＲＢＩＴＣを含むナノ粒子の製造
ナノ粒子を、前述の方法の改良後の制御脱溶媒和により調製した［Arbos et al., J. Control. Release, 83 (2002) 321-330］。その目的に向けて、２５ｍｇのβ−ＣＤ、ＯＨ−β−ＣＤ、またはＮＨ−β−ＣＤを、超音波を用いて（Ｍｉｃｒｏｓｏｎすなわち超音波浴中冷却下で１分間）２ｍｌのアセトンに分散した。この懸濁液をアセトン３ｍｌ中のメチルビニルエーテルおよび無水マレイン酸（ＰＶＭ／ＭＡ）のコポリマー［Gantrez AN 119］１００ｍｇの溶液に加え、この混合物を３０分間インキュベートした。続いて、この相に磁気攪拌下で１０ｍｌのエタノールと１０ｍｌの脱イオン水を加えた。結果として得た混合物を５分間均質化した。その後、両方の有機溶媒が除去されるまで、ナノ粒子懸濁液を減圧下で蒸発させ（Ｂｕｃｈｉ  Ｒ−１４４、スイス）、最終容量を水で１０ｍｌに調製した。さらに、ナノ粒子にローダミンＢイソチオシアネート（ＲＢＩＴＣ）水溶液を加え、それを室温で５分間磁気攪拌しながらインキュベートした。続いて、懸濁液を超遠心分離（２７，０００ｘｇで２０分）（Ｓｉｇｍａ  ３ｋ３０、ローター  Ｎｏ．−１２１５０、ドイツ）による精製に供した。上清を除去し、残渣を水にまたは５％スクロース水溶液に再懸濁した。あるいは、得たナノ粒子の一部をそれらのその後の凍結乾燥や長期間の保存のために−８０℃で凍結させた（Ｖｉｒｔｉｓ  Ｇｅｎｅｓｉｓ、ニューヨーク、米国）。
【０１４４】
ＲＢＩＴＣの量は、加えた初期量と、０．１Ｎ  ＮａＯＨ中でのある特定量のナノ粒子の完全加水分解（２４時間，  ３７℃）後に見られる量との差として推定した。表４にアッセイした異なる処方物についてのＲＢＩＴＣ値（ナノ粒子１ｍｇ当たりのＲＢＩＴＣのμｇ数）を示す。
【０１４５】
【表４】
0005847397.tif 000005
【０１４６】
図３は、模擬胃環境（０−１時間）中および模擬腸環境（１−２４時間）中での３７＋１℃におけるナノ粒子からのＲＢＩＴＣの放出の動力学を示している。総ての場合において、インキュベーションの２４時間後に放出されたＲＢＩＴＣの割合は、常に、ナノ粒子と会合した量の１０％未満であることが確かめられた。そのため、その後の生体接着研究や蛍光顕微鏡検査法により得る結果、すなわち、蛍光強度はナノ粒子と会合したＲＢＩＴＣに対応すると考えることができる。
【０１４７】
実施例４
ラットの消化管におけるシクロデキストリンを含むナノ粒子の生体接着特性の評価
図４は、前述の方法による、経口投与の３０分後、１時間後、３時間後、および８時間後の異なる消化管セグメント（胃、小腸：Ｉ１−Ｉ４、盲腸）における接着したナノ粒子画分を表す、アッセイした処方物の生体接着プロファイルを示す。図４より分かるように、シクロデキストリンと会合したナノ粒子は、対照ナノ粒子とは異なる生体接着プロファイルを示した。最近の研究において、ＰＶＭ／ＭＡコポリマーの生体接着能力は、それを単純な水溶液として投与した場合よりもナノ粒子に組み込んだ場合にずっと高いことが証明された（Ａｒｂｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｏｎｔｒｏｌ．  Ｒｅｌｅａｓｅ，  ８９  （２００３）  １９−３０）。この事実は、ナノ粒子の形状が粘膜の成分との初期接触および接着相互作用の両方を容易にすることを示唆した先行研究と一致する。
【０１４８】
投与の三十分後に、アッセイした総ての処方物は、胃中および空腸（図４の部分１２）中で最大の生体接着を示した。いずれにせよ、ＯＨ−β−ＣＤと会合したナノ粒子とより大きな相互作用が観察されるように思われる。そのため、投与の３０分後に処方物の投与用量の約１２−２０％が胃に付着し、およそ１４−２２％が小腸に付着すると述べることができる。前記値は、ＣＤを含まない（ＰＶＭ／ＭＡに基づく）通常のナノ粒子の場合（この場合には胃および小腸それぞれに、投与用量の１０％未満および１２％以下が付着する）に見られる値とは有意に異なる。
【０１４９】
投与の一時間後に、消化管粘膜に付着したシクロデキストリン含有ナノ粒子画分がどのように減少し、消化管の遠位部に移動するかを観察することができる。いずれにせよ、前記分布は均一であり、消化管の任意の領域に特異性を示す処方物はないことが分かる。
【０１５０】
異なる処方物の接着能力を比較するために、生体接着動力学および曲線を研究した。その目的に向けて、接着したナノ粒子画分を経時的に表すことによって生体接着曲線を得た。これらの曲線を図５に示す。生体接着曲線に基づき、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ  １．５コンピューターアプリケーション（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  米国）を用いて、次の動力学的生体接着パラメーターを決定した：Ｑｍａｘ、ＡＵＣａｄｈ、Ｔｍａｘ、ＭＲＴａｄｈ、およびＫａｄｈ（Ａｒｂｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｏｎｔｒｏｌ．  Ｒｅｌｅａｓｅ，  ８９  （２００３）  １９−３０）。表５にこれらのパラメーターを示す。
【０１５１】
【表５】
0005847397.tif 000006
【０１５２】
分かるように、ＯＨ−β−ＣＤと会合したナノ粒子は、対照ナノ粒子（ＮＰ）で見られるＡＵＣａｄｈ（生体接着相互作用の強さを測定するパラメーター）よりも１．５倍大きいＡＵＣａｄｈを特徴とする。同様に、シクロデキストリンと会合した処方物の接着画分は、対照ＮＰの消失速度（Ｋａｄｈ）よりも有意に低いＫａｄｈ（ｐ＜０．０１）および約３．５時間の平均滞留時間（ＭＲＴａｄｈ）を示した。これらの結果から、シクロデキストリン（とりわけＯＨ−ＣＤ）の存在によって消化管粘膜との相互作用を促進し、粘膜の成分との接着相互作用をＮＰよりも強く展開することができると仮定することができる。
【０１５３】
実施例５
消化管粘膜におけるシクロデキストリンを含むナノ粒子の観察
消化管粘膜における、シクロデキストリンと会合したナノ粒子の分布を蛍光顕微鏡検査法により観察した。その目的に向けて、ＲＢＩＴＣで標識した異なる処方物を実験動物に投与した。それらの投与の二時間後に動物を犠牲にし、小腸の様々な部分を調べた。図６は、回腸試料におけるナノ粒子の分布を観察することができる数枚の写真を示す。
【０１５４】
イン・ビボ生体接着研究によれば、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンと会合したナノ粒子は、粘膜との生体接着相互作用を確立する能力が対照ナノ粒子よりも高い。通常のナノ粒子は、粘膜の内側を覆う粘液層に浸透することができるにもかかわらず、腸細胞に到達することはできなった。一方、シクロデキストリンと会合したナノ粒子は、腸の腸細胞に著しく付着した。
【０１５５】
実施例６
パクリタキセルを含んでなるシクロデキストリン含有ナノ粒子
パクリタキセルを含むシクロデキストリン含有ナノ粒子の製造方法は、二つの異なる工程：
１）形成と形成された複合体の精製の両方を含む、パクリタキセル−シクロデキストリン複合体の製造、および
２）パクリタキセル−シクロデキストリン複合体を含むナノ粒子の製造
からなる。
【０１５６】
パクリタキセル−シクロデキストリン複合体の製造
このために、シクロデキストリン（β−ＣＤ、ＯＨ−β−ＣＤ、またはＮＨ−β−ＣＤ）の水溶液を調製し、これをパクリタキセル（ＰＴＸ）薬物のエタノール溶液に８０：２０（ｖ：ｖ）比で加え、薬物：シクロデキストリン（１：１）モル比であった。この混合物を、平衡に達するまで、暗所、室温で磁気攪拌下で（３００ｒｐｍ）維持した（少なくとも７２時間）。その後、減圧蒸発下でエタノールを除去し、懸濁液を濾過して（０．４５μｍ）溶けていない薬剤結晶を除去した。最後に、最終的な水溶液から減圧下での蒸発により水分を完全に除去し、パクリタキセル−シクロデキストリン複合体が残り、白色粉末の外観を有していた。
【０１５７】
パクリタキセル−シクロデキストリン複合体を含んでなるナノ粒子の製造
ナノ粒子を、前述の方法の改良後の制御脱溶媒和により得た（Ａｒｂｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２、前記）。その目的に向けて、パクリタキセルとシクロデキストリン（β−ＣＤ、ＯＨ−β−ＣＤ、またはＮＨ−β−ＣＤ）とで事前に作製したある特定量の複合体を２ｍｌのアセトンに分散した。この懸濁液をアセトン３ｍｌ中のメチルビニルエーテルおよび無水マレイン酸（ＰＶＭ／ＭＡ）のコポリマー［Ｇａｎｔｒｅｚ  ＡＮ  １１９］１００ｍｇの溶液に加え、この混合物を３０分間インキュベートした。続いて、この相に磁気攪拌下で１０ｍｌのエタノールと、１０ｍｌの脱イオン水とを加えた。結果として得た混合物を５分間均質化した。その後、両方の有機溶媒が除去されるまで、ナノ粒子懸濁液を減圧下で蒸発させ（Ｂｕｃｈｉ  Ｒ−１４４，  スイス）、最終容量を水で１０ｍｌに調製した。続いて、懸濁液を超遠心分離（２７，０００ｘｇで２０分）（Ｓｉｇｍａ  ３ｋ３０、ローター  Ｎｏ．−１２１５０、ドイツ）による精製に供した。上清を除去し、残渣を水にまたは５％スクロース水溶液に再懸濁した。得たナノ粒子の一部をそれらのその後の凍結乾燥や長期間の保存のために−８０℃で凍結させた（Ｖｉｒｔｉｓ  Ｇｅｎｅｓｉｓ、ニューヨーク、米国）。
【０１５８】
ナノ粒子中へのパクリタキセル−シクロデキストリン複合体の封入方法の最適化
図７は、用いたシクロデキストリンの量および種類による、シクロデキストリンおよびＰＴＸを含むナノ粒子中のＰＴＸ含量の展開を示す。最初に、ＰＴＸ単独（すなわちＣＤと複合体を形成していないＰＴＸ）では、ナノ粒子に含まれる可能性がなく、濾過によるナノ粒子の精製工程で除去されることを強調すべきである。ゆえに、パクリタキセル−シクロデキストリン（ＰＴＸ−ＣＤ）複合体を形成する必要がある。異なる使用シクロデキストリンに関しては、ＰＴＸがＯＨ−β−ＣＤ、続いてＮＨ−β−ＣＤ、そして非置換のβ−ＣＤと複合体を形成した場合にどのように最良の封入効率が得られるかを観察した。
【０１５９】
同様に、異なる量のＰＴＸ（５ｍｇ、７．５ｍｇ、１０ｍｇ、および２５ｍｇ）もアッセイし、対応するシクロデキストリンに関しては常に１：１モル比を維持した。ＰＴＸ［ＰＴＸ：ＰＶＭ／ＭＡ  （１：１０）］の量を１０ｍｇより多くしても、封入薬物の量は多くならず、その結果として、ＮＰ中へのＰＴＸ−ＣＤ複合体の封入効率の低下が認められた。これらのアッセイ後、アッセイ条件において、異なる処方物に含めるＰＴＸの最適な量は１０ｍｇであり、このようにして最良の収率が得られることが分かった。表７に、複合体の形成に用いた異なるシクロデキストリンによる、１０ｍｇを最初に加えたときに封入されたＰＴＸ量を示す。
【０１６０】
【表６】
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【０１６１】
実施例７
異なるパクリタキセル処方物の経口投与後の薬物動態研究
パクリタキセルは、用量依存的な薬物動態プロファイルを有することを特徴とする薬物である。そのため、市販のパクリタキセル処方物を、ナノ粒子中のその処方物の選択用量（１０ｍｇ／ｋｇ）で経口または静脈内投与した後の薬物動態プロファイルを事前に決定することが必要であった。
【０１６２】
薬物動態研究は、ナバラ大学の倫理委員会の規則に従い実験動物に関する欧州法（８６／６０９／ＥＵ）に従って行った。その目的に向けて、平均重量２２５ｇの雄Ｗｉｓｔａｒラット（Ｈａｒｌａｎ，  スペイン）を、処方物の投与の１２時間前に代謝ケージに隔離し、食物は与えなかったが、飲料水は自由に与えた。
【０１６３】
【表７】
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【０１６４】
表８に、薬物動態研究においてアッセイしたナノ粒子の主要な物理化学的特性を要約する。対照ナノ粒子（ＰＴＸ−ＮＰ）は約２００ｎｍの大きさを示し、負表面電荷は−３８ｍＶである。加えて、封入ＰＴＸ−ＣＤ複合体を含むナノ粒子は、総ての場合において、著しく大きくなる（約３００ｎｍ）が同様のζ電位を示す。最後に、ＰＴＸ−ＣＤ複合体の存在はナノ粒子の製造収率に影響を及ぼさず、その製造収率は５０−６０％の間で異なることを強調すべきである。
【０１６５】
薬物動態研究は三つの段階で構成した。第一の研究においては、１０ｍｇ／ｋｇの市販のパクリタキセル処方物（Ｔａｘｏｌ）を二群の雄Ｗｉｓｔａｒラット（ｎ＝６）に静脈内（ｉ．ｖ．）および経口投与した。第二の研究は、（ｉ）β−ＣＤ、（ii）ＯＨ−β−ＣＤ、または（iii）ＮＨ−β−ＣＤを含むパクリタキセル（１０ｍｇ／ｋｇ）溶液の、６動物で形成したラット群への経口投与で構成した。最後に、異なる処方物の薬物動態研究では、異なるナノ粒子処方物（ｉ）ＰＴＸ−ＯＨ−β−ＣＤ−ＮＰ、（ii）ＰＴＸ−β−ＣＤ−ＮＰ、（iii）ＰＴＸ−ＮＨ−β−ＣＤ−ＮＰ、または（iv）ＰＴＸ−ＮＰを異なる動物群に経口投与した。パクリタキセルの選択用量は１０ｍｇ／ｋｇであった。
【０１６６】
投与後、およそ３００μｌの血液量を様々な時期（０分、１０分、３０分、９０分、１８０分、３６０分、４８０分、２４時間、および３０時間）に抽出し、抗凝固薬としてＥＤＴＡを用い、同量の生理食塩水を用いて腹膜内（ｉ．ｐ．）経路により動物（ラット）の血液量を回復させた。パクリタキセルの投与後に得た結果の薬物動態解析を、ＷｉＮＮｏｎｌｉｎ  １．５薬物動態調整プログラム（Pharsight Corporation, マウンテンヴュー，  米国）の非コンパートメント調整工程を用いて行った。
【０１６７】
得られた結果を図８に示す。分かるように、通常の処方物（市販のＴａｘｏｌ）のｉ．ｖ．投与では、採取した第一の試料においてパクリタキセルの血漿中濃度ピークを示し、その後、経時的に二段階の低下が起こる。前記プロファイルは他の著者らによって記載されたプロファイルと同様である（Yeh et al., Pharm Res 22(6): 867-74, 2005）。前記市販の処方物を経口投与した場合（図８Ｂ）には、パクリタキセルの血漿レベルはゼロであった。ＰＴＸ：ＣＤ複合体の投与でも同様の結果を得、それらの中で経時的にパクリタキセルの有意なレベルを検出または定量することができたものはなかった。一方、シクロデキストリンおよびパクリタキセルを含むパクリタキセルナノ粒子処方物を経口投与した場合には、これらの処方物は、少なくとも２４時間経時的に持続的な血漿レベルに代わることを証明することができた。前記ナノ粒子の投与後４時間〜最大２４時間の時期に、三つの処方物で、ゼロ次速度過程で薬物を放出する処方物に典型的な血漿中濃度プラトーを観察することができた。いずれにせよ、ＰＴＸ−β−ＣＤ−ＮＰ処方物およびＰＴＸ−ＯＨ−β−ＣＤ−ＮＰ処方物では、ＰＴＸ−ＮＨ−β−ＣＤ−ＮＰ処方物で得られる血漿レベルよりもかなり高い（３−４倍）血漿レベルを得ることが可能である。また、通常のナノ粒子でのパクリタキセルの投与では薬物が吸収されないということを強調するのも興味深い。
【０１６８】
表９に、異なるパクリタキセルナノ粒子処方物の投与後に得た実験データの非コンパートメント解析の実施により得た薬物動態パラメーターの値を示す。表９より分かるように、ＡＵＣおよびＭＲＴの値は、処方物に用いたシクロデキストリンの種類によって大きく変化する。経口ＰＴＸ−ＯＨ−β−ＣＤ−ＮＰ処方物および経口ＰＴＸ−β−ＣＤ−ＮＰ処方物の場合には、同様のＡＵＣ値を得た。どちらの経口処方物（ＰＴＸ−ＯＨ−β−ＣＤ−ＮＰおよびＰＴＸ−β−ＣＤ−ＮＰ）においても、達した最高濃度は、それぞれ、６時間および５時間の時期に残りの処方物において達した濃度よりも著しく高い。生物体内での薬物の平均滞留時間（ＭＲＴ）は、シクロデキストリンを含む三つの処方物では同様であった。これらの値は、市販の処方物（Ｔａｘｏｌ）の経口投与後に達する値よりも３−５倍高かった。
【０１６９】
同様に、最終相における薬物の消失半減期（Ｔ１／２ｚ）もシクロデキストリンおよびパクリタキセルを含むナノ粒子処方物では同様である。いずれにせよ、市販の処方物（Ｔａｘｏｌ）の静脈内投与で得られるＴ１／２ｚよりも短かった。
【０１７０】
【表８】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図４】
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【図６】
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