(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
名称は組み替え大腸菌DALAであって、以下のような方法で製造されることを特徴とする組み替え大腸菌。
hemAMとhemL遺伝子を含む共発現ベクターp-hemAM-hemLを構築し、またrhtAを含む発現ベクターp-rhtAを構築する。そして、構築した組み替えプラスミド（plasmid）p-hemAM-hemLとp-rhtAを共に大腸菌の中に変換して、hemAM、hemLとrhtA遺伝子を同時過剰発現する組み換え大腸菌DALAを獲得する。
前記hemAMは、アリゾナサルモネラ菌からのhemA遺伝子の突然変異体であり、下記hemAM-FおよびhemAM-Rをプライマーとして用いたPCRによってクローンされたものである。
hemAM-F：5′-CCCGTCGACAAAGGAGGATATACATATGACCAAGAAGCTTTTAGCACTCGGTATCAAC -3′
hemAM-R：5′-AAATCTAGACTACTCCAGCCCGAGGCTGTCGCGCAGA-3′。
【請求項２】
前記hemAMは大腸菌或いはサルモネラ菌からのhemA遺伝子の突然変異体で、前記hemL遺
伝子は大腸菌或いはサルモネラ菌からで、前記rhtA遺伝子は大腸菌からであることを特徴
とする請求項１に記載の組み換え大腸菌。
【請求項３】
前記hemL遺伝子はサルモネラ菌からであることを特徴とする請求項２に記載の組み換え大腸菌。
【請求項４】
前記hemAM、hemL或いはrhtA遺伝子を発現するベクターはpBluescript SK-、pUC19、pUC18、pCL1920或いはpTrc99Aであることを特徴とする請求項１に記載の組み換え大腸菌。
【請求項５】
前記hemAMとhemL遺伝子を発現するベクターはpUC19を選び、前記rhtA遺伝子を発現するベクターはpCL1920を選ぶことを特徴とする請求項４に記載の組み換え大腸菌。
【請求項６】
前記大腸菌は大腸菌MG1655、大腸菌DH5α、大腸菌JM109、大腸菌W3110或いは大腸菌XL1-Blueを選ぶことを特徴とする請求項１に記載の組み換え大腸菌。
【請求項７】
前記大腸菌は大腸菌DH5αを選ぶことを特徴とする請求項６に記載の組み換え大腸菌。
【請求項８】
前記大腸菌DALAはDH5α/pUC-hemAM-hemL+ pCL1920-rhtAであることを特徴とする請求項１に記載の組み換え大腸菌。
【請求項９】
請求項１〜８の何れか１項に記載の組み換え大腸菌が改良の無機塩培養基の中で、ブドウ糖を発酵することによる5-アミノレブリン酸の生産における、前記組み換え大腸菌の使用。
前記改良の無機塩培養基は、ブドウ糖5-50 g/L、(NH4)2SO4 10-30 g/L、KH2PO4 1-8 g/L、Na2HPO4・12H2O 10-30 g/L、MgSO4・7H2O 0.1-1.5g/L、MnSO4・7H2O 0.001-0.1 g/L、酵母粉末 0.5-3 g/L、イソプロピル-β-D-チオガラクトシド（IPTG、isopropyl-β-D-thiogalactoside）0.05-1mM、アンピシリン（Ampicillin）30-50 μg/mL、スペクチノマイシン(spectinomycin)30-50 μg/mL。
【請求項１０】
請求項１〜８の何れか１項に記載の組み換え大腸菌が改良の無機塩培養基の中でブドウ糖を発酵する条件は次の通りであることを特徴とする5-アミノレブリン酸の生産における前記組み換え大腸菌の使用。
ブドウ糖を発酵する条件は、菌種の接種量が体積パーセント2%〜5%で、発酵温度が35℃-38℃で、pHが6.0-7.0で、溶存酸素を50%以上にコントロールし、発酵時間が36-60時間である。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［技術分野］
本発明は遺伝子工学と微生物発酵の分野、具体的には組み換え大腸菌及びその構築方法ならびに5-アミノレブリン酸(ALA)の生産における当該組み換え細菌株の応用に関する。
【０００２】
［背景技術］
5-アミノレブリン酸（ALA）は、分子式がC5O3NH9で、分子量が131.13で、融解点が118 ℃であり、農業において重要な役割を果たしている。研究が表明しているように、ALAは生物分解性を持つ無公害の天然物質である。5-アミノレブリン酸は新規農薬であって、環境の中で分解されやすくて、無残留で、哺乳動物に対して毒性を示さないので、無公害のエコ農薬として注目されている。ALAは農業分野においても広く使われている。主にエコ除草剤、植物成長調整剤、殺虫剤などに応用されている。農業のほかに、医学の分野において、ALAは安全性・選択性・浸透性に優れた光力学薬物として人気がある。ALAはすでに皮膚癌、膀胱癌、消化管癌、肺癌などの診断と光力学治療（PDT）に応用されている。
【０００３】
現在では、ALAの生産方法は主に化学合成である。前世紀の50年代に、δ-ALAの化学合成の方法に関する報道はすでに出現し、20世紀90年代に入って、化学合成に関する研究は最も活躍し、主に馬尿酸（ベンゾイルグリシン）と琥珀酸を原料とする合成工程の研究、フルフラールなどの複素環式化合物を原料とする合成工程の研究、及びレブリン酸（levulinic acid, acetylpropionic acid）或いはその誘導体を原料とする合成工程の研究などに集中している。化学合成は、反応のプロセスが複雑で、副生成物が多く、分離純化が難しく、ALAのイールドレイトが低いから、生産コストが高い。そのほか、化学合成では有毒試薬が使用されるから環境に悪い。そのため、社会と科学技術の発展にしたがって、安値で再生可能な資源を基質に、微生物の発酵を利用してALAを生産することがこれからの傾向であると思われる。現在では、ブドウ糖の市場価格が4500元/トンで、ALAの価格が80000000元/トンである。ALA-HClでも、その価格が極めて高くて4，000，0000元/トンに達する。そのため、ブドウ糖のような安価の基質を原料に、発酵の方法でALAを生産するのは、コストの面では優位を占めている。
【０００４】
海外の研究者は、突然変異誘発育種の方法で、光合成細菌ロドバクター・スフェロイデス(Rhodobacter sphaeroides)の変異を誘発して、高生産のALA菌株を選別する。発酵の工程を通して、ALAの産生量が7.2 g/Lに達した。しかし、光合成細菌を発酵する際に光線の照射を採用するので、コストが増え、大規模の工業発酵生産として不適当である。大腸菌(E. coli)は生産工業産物の宿主として、遺伝背景がはっきりし、操作しやすくて、生長が早くて、培養が簡単である上、無機塩培養基に培養可能で、多種の炭素源を利用することもできるため、ますます重視されている。遺伝子工事技術の成熟に従って、人々は、遺伝子組み換え技術を採用して、R. sphaeroidesの中のALAの合成酵素遺伝子（hemA）を野生型の大腸菌に発現させた。MarietとZeikus は大腸菌(Escherichia coli)の組み替え菌株を得、ALAの発酵産生量は3.79 g/Lに達した。L. Xie et al. らはR. sphaeroidesのALA合成酵素遺伝子を含む組み換え大腸菌を発酵・最適化させ、ALAの産生量を5.2 g/Lに達させた。上述したALAの生産方法はC4-ルートを利用することであり、即ちALA合成酵素を発現することによって琥珀酸とグリココル(glycocoll)を生物変換させ、ALAを生産することである。
【０００５】
今のところ、琥珀酸は主に化学合成法で調製されるため、琥珀酸とグリココルを基質に生物変換の方法でALAを生産するコストが高い。そして、高濃度のグリココル（＞1.7g/L）は菌体の成長を抑制するため、生物変換のプロセスは比較的複雑である。同時に、生物変換における培養基が高価なLB培養基であることも、ALA工業化のボトルネックとなる。発酵コストの低減及び発酵工程の簡略化は、ALAの大規模的な工業化のキーポイントとなる。生物法によるALAの生産コストを低減するとともに、発酵工程を簡略化してはじめて、微生物を利用するALAの工業化生産で現在の化学合成の方法を代えることができる。
【０００６】
［発明の内容］
現在のALA生産における欠陥に対して、本発明が解決しようとする問題は、組み換え大腸菌及びその構築方法ならびに5-アミノレブリン酸(ALA)の生産における当該組み換え菌株の応用である。
【０００７】
本発明の技術方案はALAのC5ルートに基づき、大腸菌において、大腸菌或いはサルモネラ菌からのhemAの遺伝子突然変異体及び大腸菌での大腸菌、アリゾナ（Arizona）サルモネラ菌或いはチフス菌からのhemL遺伝子を過剰発現し、ブドウ糖を唯一の炭素源として改良の無機塩培養基で5-アミノレブリン酸(ALA)を発酵生産する。
【０００８】
本発明の組み替え大腸菌は、名称が組み替え大腸菌DALAであって、以下のような方法で製造されることを特徴とする。hemAMとhemL遺伝子を含む共発現ベクターp-hemAM-hemLを構築し、またrhtAを含む発現ベクターp-rhtAを構築する。そして、構築した組み替えプラスミド（plasmid）p-hemAM-hemLとp-rhtAを共に大腸菌の中に変換して、hemAM、hemLとrhtA遺伝子を同時過剰発現する組み換え大腸菌DALAを獲得する。
【０００９】
そのなか、前記hemAMは大腸菌或いはサルモネラ菌からのhemA遺伝子の突然変異体で、前記hemL遺伝子は大腸菌或いはサルモネラ菌からで、前記rhtA遺伝子は大腸菌からである。
【００１０】
前記hemAMはアリゾナサルモネラ菌からのhemA遺伝子の突然変異体で、前記hemL遺伝子はサルモネラ菌からであることがさらに望ましい。
【００１１】
上述したhemAM、hemL或いはrhtA遺伝子を発現するベクターはpBluescript SK-、pUC19、pUC18、pCL1920或いはpTrc99Aである。その中のプラスミドのpBluescript SK-とpCL1920はDSMZ(ドイツ微生物保存センター、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen)からで、プラスミドのpUC19、pUC18及びpTrc99Aはfamentas 会社からである。
【００１２】
その中、前記hemAMとhemL遺伝子を発現するベクターはpUC19を選ぶのが望ましくて、前記rhtA遺伝子を発現するベクターはpCL1920を選ぶのが望ましい。上述した原株の大腸菌として、大腸菌MG1655、大腸菌DH5α、大腸菌JM109大腸菌W3110或いは大腸菌XL1-Blueを選ぶ。その中のMG1655、JM109とW3110はATCC(アメリカ典型菌種保存センター)からで、大腸菌DH5αと大腸菌Xl1-blueはDSMZ(ドイツ微生物保存センター)からである。そのうち、前記大腸菌は大腸菌DH5αを選ぶのが望ましい。
【００１３】
上述した組み替え大腸菌DALAは、DH5α/pUC-hemAM-hemL+ pCL1920-rhtAを選ぶのが望ましい。
【００１４】
本発明に説明する組み換え大腸菌の構築プロセス：
1．hemAMとhemL遺伝子の共発現ベクターの構築：
基本の方法としては、大腸菌或いはサルモネラ菌からのhemA遺伝子の突然変異体hemAMを、大腸菌からのhemL遺伝子を含むプラスミドベクターpBluescript SK-、pUC19、pUC18、pCL1920或いはpTrc99Aに挿入し、または、大腸菌からのhemL遺伝子を大腸菌或いはサルモネラ菌からのhemA遺伝子突然変異体を含むhemAMのプラスミドベクターpBluescript SK-、pUC19、pUC18、pCL1920又はpTrc99Aに挿入することによって、hemAMとhemL遺伝子の共発現ベクターp-hemAM-hemLを獲得する。
【００１５】
2．rhtA 遺伝子発現ベクターの構築
基本の方法としては、大腸菌遺伝子グループをフォームに、rhtA遺伝子のクローンをする。クローンして得られたrhtAをプラスミドのpBluescript SK-、pUC19、pUC18、pCL1920或いはpTrc99Aに挿入して、rhtAの発現ベクターp-rhtAを獲得する。
【００１６】
3．ALA発酵組み替え菌株の構築
基本の方法としては、構築した組み替えプラスミドのp-hemAM-hemLとp-rhtAを共にMG1655、JM109、DH5α、W3110、BL21或いはXL1-blueの中に変換して、hemAM、hemLとrhtAが過剰発現する組み替え大腸菌DALAを獲得する。
【００１７】
上述したhemAM、hemLとrhtAが過剰発現する組み替え大腸菌DALAは組み替え大腸菌DALA DH5α/pUC-hemAM-hemL+ pCL1920-rhtAを構築するのが望ましい。
【００１８】
本発明の組み換え大腸菌が5-アミノレブリン酸の生産における応用は、前記組み替え大腸菌が改良の無機塩培養基でブドウ糖を発酵することによって5-アミノレブリン酸を生産し、前記改良の無機塩培養基の調剤は次の通りであることを特徴とする。ブドウ糖5-50 g/L、(NH4)2SO4 10-30  g/L、KH2PO4 1-8 g/L、Na2HPO4・12H2O 10-30 g/L、MgSO4・7H2O 0.1-1.5g/L、MnSO4・7H2O 0.001-0.1  g/L、酵母粉末 0.5-3  g/L、イソプロピル-β-D-チオガラクトシド（IPTG、isopropyl-β-D-thiogalactoside）0.05-1mM；前記発酵培養基に50-100 μg/mL濃度のアンピシリン（Ampicillin）と30-50 μg/mL濃度のスペクチノマイシン(spectinomycin)を添加する。
【００１９】
上述した改良の無機塩培養基の調剤は次の通りであることがさらに望ましい。(NH4)2SO4 16 g/L、KH2PO43 g/L、Na2HPO4・12H2O 16 g/L、 MgSO4・7H2O 1 g/L、 MnSO4・7H2O 0.01 g/L、酵母粉末 2 g/L、イソプロピル-β-D-チオガラクトシド（IPTG）0.1mM、ブドウ糖35 g/L。
【００２０】
5-アミノレブリン酸の生産における本発明の組み換え大腸菌の応用について、具体的な方法は次の通りである：
1．振盪培養及びALA測定
振盪培養：構築した組み換え菌株の単集落を選んで、3-5mLの発酵培養基を入れていた25mLの三角瓶に入れる。アンピシリンの終末濃度を100μg/mLに、スペクチノマイシンの終末濃度を50μg/mLにする。温度を37℃に、速度を225転/分にして，12時間培養する。
【００２１】
宵越しに培養した菌液を0.5-3%（v/v）の接種量で50mLの発酵培養基を入れていた300mLの三角瓶に入れる。アンピシリンの濃度を100μg/mLに、スペクチノマイシンの濃度を50μg/mLにする。温度を37℃に、速度を200-280転/分に設定して、8-56時間発酵する。発酵する間に2-6hごとにサンプリングし、色度分析によってALAの濃度を測定する。
【００２２】
ALAの測定方法：サンプルを2mLまで希釈して、1mLのアセテート(acetate)と0.5mLのアセチルアセトン(acetylacetone)を入れる。それから、15分間に煮る。そして、室温まで冷却させる。2mLの反応液を新しい管に入れて、2mLの改良のEhrlich’s試薬を加入する。20分間の反応の後、分光の光度計554nmで測定する。
【００２３】
2．発酵缶培養とALA測定
種液の調製：構築した組み換え菌株の単集落を選んで、3-5mLの発酵培養基が入れている25mLの三角瓶に入れる。アンピシリンの濃度は100μg/mLにし、スペクチノマイシンの濃度は50μg/mLにする。温度を37-39℃に、速度を200-250転/分に設定し、8−16時間培養する。
【００２４】
宵越しに培養した菌液を0.5-3%（v/v）の接種量で50mLの発酵培養基を入れている300mLの三角瓶に入れる。アンピシリンの濃度を100μg/mLに、スペクチノマイシンの濃度を50μg/mLにする。温度を37℃に、速度を200-250転/分に設定し、6-10時間に発酵し、種液を獲得する。
【００２５】
発酵缶での培養：調製した種液を2%の接種量で3Lの発酵培養基を入れていた5Lの発酵缶に入れて培養する。発酵温度は35℃-38℃、pHは6.0-7.0、溶存酸素を50%以上にコントロールする。発酵時間は36-60時間である。2-6時間ごとにサンプリングし、色度分析によってALAの濃度を測定する。
【００２６】
ALAの測定方法は同上。
【００２７】
5-アミノレブリン酸の生産における上述した組み替え大腸菌の応用では、発酵温度は37℃、pHは6.2を選ぶのが望ましい。溶存酸素を50%以上にコントロールする。発酵時間は60時間である。
【００２８】
本発明が提供した組み換え大腸菌及び5-アミノレブリン酸 (ALA)の生産方法は、非常に重要な工業の応用価値を持っている。
【００２９】
実験の比較を通じて本発明の組み替え菌株DALAのALAの産生量が一番高いことが発見された。
【００３０】
そのなか、振盪培養において、実験に使われた組み換え菌株であるDEX、DEL、DA、DALと DXALのALA産生量はそれぞれ0.016 g/L、0.024 g/L、0.176 g/L、2.05 g/L 及び1.32 g/Lである。それに対して、本発明の組み換え菌株DALA のALAの産生量は2.86 g/Lであり、すべての実験菌において最高で、菌株DEXのALAの産生量の179倍である。発酵缶培養において、実験の組み換え大腸菌DALA のALAの産生量は4.13g/Lに達し、ブドウ糖の変換率は0.168g ALA/gブドウ糖である。非常に良い工業開発と応用の将来性があることを示した。
【００３１】
［図面の簡単な説明］
図1.組み換え大腸菌によってブドウ糖を発酵してALAを生産するルート。
【００３２】
図2.プラスミド発現ベクター図録の構築。
【００３３】
図3.各組み換え菌株ALAの産生量の比較。
【００３４】
図4.発酵缶培養の組み換え菌株でALAを生産する。
【００３５】
［発明を実施するための形態］
一般的な説明：実施例に関係する酵素はすべてTaKaRa会社から購入する。プラスミドを抽出する試薬箱は天根会社から購入する。アガロース・ゲル（agarose gel）回収DNAフラグメントの試薬箱は申能博彩会社から購入する。操作は完全に相応の説明書に従う。プラスミドの構築における遺伝子の配列の測定は華大遺伝子会社によって完成する。ALAの標準サンプル及びその他の試薬はすべてSigma会社から購入する。DH5αコンピテント細胞は全式金生物技術有限会社から購入する。
【００３６】
LB液体培養基（1L）： 酵母粉末 5，ペプトン（peptone） 10，NaCl 10， pH 7.0。
【００３７】
LB-アンピシリン耐性固定培養基（1L）：酵母粉末 5，ペプトン 10，NaCl 10，アンピシリン 100μg/mL。
【００３８】
ALA の測定方法：サンプルを2mLまでに希釈して、1mLのアセテート緩衝液と0.5mLのアセチルアセトンを入れて、15分間煮る。室温まで冷却させてから、2mLの反応液を新しい管に入れて、2mLの改良のEhrlich’s試薬を加入する。20分間反応して、分光の光度計554nmで測定する。
【００３９】
前記アセテート緩衝液の配分（1L）：57mL氷酢酸、82g無水酢酸ナトリウム。
【００４０】
前記改良のEhrlich’s試薬：50mLのメスシリンダーに30mLの氷酢酸、1gのp‐ジメチルアミノベンズアルデヒド及び8mLの 70%過塩素酸を入れてから、50mLに定容する。
【００４１】
実施例1、gltX遺伝子発現ベクターの構築
NCBIが発表した大腸菌遺伝子の配列に基づいて、プライマーのgltX-F：5′-TCCCTGCAGAAAGGAGGATATACATATGAAAATCAAAACTCGCTTCGCGC-3′ と gltX-R：5′-GGCGTCGACTTACTGCTGATTTTCGCGTTCAGCAATAAAATCC-3′を利用して、大腸菌遺伝子グループ又は直接的に菌落PCRを採用して、gltXの遺伝子をクローンする。エンドヌクレアーゼのPstIとSalIをそれぞれ利用して、クローンしたgltXフラグメントを消化処理する。同時に、エンドヌクレアーゼのPstIとSalIをそれぞれ利用して、プラスミドベクターpUC19をも消化処理する。アガロース・ゲル試薬箱を利用して消化処理したgltXフラグメントとpUC19プラスミドベクターを回収し、T4リガーゼで結合させる。結合体系は10μLである：
gltX フラグメント：6μL
pUC19ベクター：2μL
10×Buffer：1μL
T4リガーゼ：1μL
16℃の温度で12時間結合してから、10μLの結合液を大腸菌DH5αコンピテント細胞に変換する。変換過程：10μLの結合液を100μLのDH5αコンピテント細胞に加入して、均一にかき混ぜる。30分間に氷浴し、42℃の温度で90秒間に熱衝撃してから、２分間に氷浴し、900μLのLB培養基を加入する。温度を37℃に、速度を100転/分にして、1時間孵化する。アンピシリン耐性プレートを塗装し、16時間培養し、変換子を選別し、プラスミドを抽出して検証する。それから、配列の測定でgltX遺伝子の正確さをさらに検証して、組み換えプラスミドpUC-gltXを獲得する。
【００４２】
実施例2、hemL 遺伝子発現ベクターの構築
NCBIが発表した大腸菌遺伝子の配列に基づいて、プライマーのhemL-F：5′-ACAGGATCCAAAGGAGGATATACATATGAGTAAGTCTGAAAATCTTTACAGCG-3′ とhemL-R：5′-AATGAGCTCTCACAACTTCGCAAACACCCGACGTGCAGCA-3′を利用して、大腸菌遺伝子グループ又は直接的に菌落PCRを採用して、hemL遺伝子をクローンする。エンドヌクレアーゼのBamIとSacIをそれぞれ利用して、クローンしたhemLフラグメントを消化処理する。同時に、エンドヌクレアーゼのPstIとSalIをそれぞれ利用して、プラスミドベクターpUC19をも消化処理する。アガロース・ゲル試薬箱を利用して消化処理したhemLフラグメントとpUC19プラスミドベクターを回収してから、T4リガーゼで結合させる。結合体系は10μLである：
hemL フラグメント：6μL
pUC19ベクター：2μL
10×Buffer：1μL
T4リガーゼ：1μL
16℃の温度で12時間結合してから、10μLの結合液を大腸菌DH5αコンピテント細胞に変換する。変換過程：10μLの結合液を100μLのDH5αコンピテント細胞に加入して、均一にかき混ぜる。30分間氷浴し、42℃の温度で90秒間熱衝撃してから、2分間に氷浴して、900μLのLB培養基を加入する。温度を37℃に、速度を100転/分にして、1時間孵化する。アンピシリン耐性プレートを塗装し、16時間培養し、変換子を選別し、プラスミドを抽出して検証する。それから、配列の測定でhemL遺伝子の正確さをさらに検証して、組み換えプラスミドpUC-hemLを獲得する。
【００４３】
実施例3、hemA遺伝子の突然変異及び発現ベクターの構築
NCBIが発表したサルモネラ菌の配列に基づいて、プライマーのhemAM-F：5′-CCCGTCGACAAAGGAGGATATACATATGACCAAGAAGCTTTTAGCACTCGGTATCAAC -3′ と hemAM-R：5′-AAATCTAGACTACTCCAGCCCGAGGCTGTCGCGCAGA-3′を利用して、大腸菌遺伝子グループ又は直接的に菌落PCRを採用して、hemAMをクローンする。エンドヌクレアーゼのSalIとXbaIをそれぞれ利用して、クローンしたhemLフラグメントを消化処理する。同時に、エンドヌクレアーゼのPstIとSalIをそれぞれ利用して、プラスミドベクターpUC19をも消化処理する。アガロース・ゲル試薬箱を利用して消化処理したhemAMフラグメントとpUC19プラスミドベクターを回収してから、T4リガーゼで結合させる。結合体系は10μLである：
hemAM フラグメント：6μL
pUC19ベクター：2μL
10×Buffer：1μL
T4リガーゼ：1μL
16℃の温度で12時間結合してから、10μLの結合液を大腸菌DH5αコンピテント細胞に変換する。変換過程：10μLの結合液を100μLのDH5αコンピテント細胞に加入して、均一にかき混ぜる。30分間氷浴し、42℃の温度で90秒間熱衝撃し、2分間氷浴して、900μLのLB培養基を加入する。温度を37℃に、速度を100転/分にして、1時間孵化する。アンピシリン耐性プレートを塗装し、16時間培養し、変換子を選別し、プラスミドを抽出して検証する。それから、配列の測定でhemAM遺伝子の正確さをさらに検証して、組み換えプラスミドpUC-hemAMを獲得する。
【００４４】
実施例4、hemAMとhemL遺伝子共発現ベクターの構築
エンドヌクレアーゼのBamIとSacIによって、プラスミドのpUC-hemLを消化処理して、フラグメントのBamI-hemL-SacIを獲得する。それから、エンドヌクレアーゼのBamIとSacIによって、プラスミドのpUC-hemAMを消化処理する。T4リガーゼでフラグメントのBamI-hemL-SacIをpUC-hemAMに結合させる。結合体系は10μLである：
hemAM フラグメント：6μL
pUC-hemAMベクター：2μL
10×Buffer：1μL
T4リガーゼ：1μL
16℃の温度で12h結合してから、10μLの結合液を大腸菌DH5αコンピテント細胞に変換する。変換過程：10μLの結合液を100μLのDH5αコンピテント細胞に加入して、均一にかき混ぜる。30分間氷浴し、42℃の温度で90秒間熱衝撃し、2分間氷浴して、900μLのLB培養基を加入する。温度を37℃に、速度を100転/分にして、1時間孵化する。アンピシリン耐性プレートを塗装し、16時間培養して、変換子を選別し、プラスミドを抽出して検証する。それから、配列の測定でhemAMとhemL遺伝子の正確さをさらに検証して、組み換えプラスミドpUC-hemAM-hemLを獲得する。
【００４５】
実施例6、gltX、hemAMとhemL遺伝子共発現ベクターの構築
エンドヌクレアーゼのPstIとSalIによって、プラスミドのpUC-gltXを消化処理して、フラグメントのPstI-gltX-SalIを獲得する。それから、エンドヌクレアーゼのPstIとSalIによって、プラスミドのpUC-hemAM-hemLを消化処理する。T4リガーゼでフラグメントのPstI-gltX-SalIをpUC-hemAM-hemLに結合させる。結合体系は10μLである：
gltX フラグメント：6μL
pUC-hemAM-hemLベクター：2μL
10×Buffer：1μL
T4リガーゼ：1μL
16℃の温度で12時間結合してから、10μLの結合液を大腸菌DH5αコンピテント細胞に変換する。変換過程：10μLの結合液を100μLのDH5αコンピテント細胞に加入して、均一にかき混ぜる。30分間氷浴し、42℃の温度で90秒間熱衝撃し、2分間氷浴し、900μLのLB培養基を加入する。温度を37℃に、速度を100転/分にして、1時間孵化する。アンピシリン耐性プレートを塗装し、16時間培養し、変換子を選別し、プラスミドを抽出して検証する。このようにして、組み換えプラスミドpUC-gltX-hemAM-hemLを獲得する。
【００４６】
実施例7、rhtA発現ベクターの構築
NCBIが発表した大腸菌の配列に基づいて、プライマーのrhtA-F：5′-CCGAAGCTTTTAATAAGGAGGATATACATATGCCTGGTTCATTACGTAAAATGCCGG-3′ と rhtA-R：5′- GCCCTGCAGTTAATTAATGTCTAATTCTTTTATTTTGCTCTC-3′を利用して、大腸菌遺伝子グループ又は直接的に菌落PCRを採用して、rhtAをクローンする。エンドヌクレアーゼのHindIIIとPstIをそれぞれ利用して、クローンしたrhtAフラグメントを消化処理する。同時に、エンドヌクレアーゼのHindIIIとPstIをそれぞれ利用して、プラスミドベクターのpCL1920をも消化処理する。アガロース・ゲル試薬箱を利用して消化処理したrhtAフラグメントとpCL1920プラスミドベクターを回収してから、T4リガーゼで結合させる。結合体系は10μLである：
rhtA フラグメント：6μL
pCL1920ベクター：2μL
10×Buffer：1μL
T4リガーゼ：1μL
16℃の温度で12時間結合してから、10μLの結合液を大腸菌DH5αコンピテント細胞に変換する。変換過程：10μLの結合液を100μLのDH5αコンピテント細胞に加入して、均一にかき混ぜる。30分間氷浴し、42℃の温度で90秒間熱衝撃し、2分間氷浴し、900μLのLB培養基を加入する。温度を37℃に、速度を100転/分にして、1時間孵化する。アンピシリン耐性プレート(30 μg/mL)を塗装し、16時間培養し、変換子を選別し、プラスミドを抽出して検証する。それから、配列の測定でrhta遺伝子の正確さをさらに検証して、過剰発現するrhtAの組み換えプラスミドpCL1920-rhtAを獲得する。
【００４７】
実施例8、組み換え菌株の構築及びALA産生量の比較
組み替え菌株の構築：上で構築したプラスミドpUC-gltX、pUC-hemL、pUC-hemAM、pUC-hemAM-hemL及びpUC-gltX-hemAM-hemLをそれぞれ大腸菌DH5αコンピテント細胞に変換して、組み替え菌株のDH5α/pUC-gltX (DEXと命名)、DH5α/pUC-hemL (DELと命名)、DH5α/pUC-hemAM (DAと命名)、DH5α/pUC-hemAM-hemL (DALと命名)及びDH5α/pUC-gltX-hemAM-hemL (DXALと命名)を獲得する。組み替えプラスミドpUC-hemAM-hemLと組み替えプラスミドpCL1920-rhtAを共に大腸菌DH5αコンピテント細胞に変換して、組み替え菌株DH5α/pUC-hemAM-hemL+pCL1920-rhtA (DALAと命名)を獲得する。
【００４８】
各組み換え菌株の発酵の比較：構築した組み換え菌株のDEX、DEL、DA、DAL、DXAL及び DALAの単集落を選んで、20mLの発酵培養基を入れている250mLの三角瓶に入れる。温度を37℃に、速度を225転/分にして、12時間培養する。培養液を体積比1%の接種量で50mLの発酵培養基を入れている300mLの三角瓶に入れる。温度を37℃に、速度を225転/分にして、4時間サンプリングする。発酵の時間は36時間である。そのうち、DEX、DEL、DA、DAL、DXALの発酵培養基グループの配分：(NH4)2SO4 16 g/L、KH2PO43 g/L、Na2HPO4・12H2O 16 g/L、MgSO4・7H2O 1 g/L、MnSO4・7H2O 0.01 g/L、酵母粉末 2 g/L，100μg/mLアンピシリン、IPTG 0.1mM、ブドウ糖35 g/L。その中で、アンピシリンの添加はプラスミドの安定を保つためである。それに対して、組み換え菌株DALAの発酵培養基グループの配分： (NH4)2SO416 g/L、KH2PO4 3  g/L、Na2HPO4・12H2O 16 g/L、MgSO4・7H2O 1 g/L、MnSO4・7H2O 0.01 g/L、酵母粉末 2 g/L、100μg/mLアンピシリン、50μg/mLスペクチノマイシン、IPTG 0.1mM、ブドウ糖35 g/L。その中、アンピシリンとスペクチノマイシンの添加はプラスミドの安定を保つためである。
【００４９】
ALAを測定する具体的な方法：サンプルを2mLまで希釈して、1mLのアセテート(acetate)と0.5mLのアセチルアセトン(acetylacetone)を入れる。それから、15分間煮る。室温まで冷却してから、2mLの反応液を新しい管に入れて、2mLの改良のEhrlich’s試薬を加入する。20分間反応して、分光の光度計554nmで測定する。
【００５０】
各組み換え菌株ALAの産生量の統計は図3の通りである。そのうち、組み換え菌株DEX、DEL、DA、DALと DXALのALA産生量はそれぞれ0.016 g/L、0.024 g/L、0.176 g/L、2.05 g/L と1.32 g/Lである。それに対して、組み替え菌株 DALA のALAの産生量は2.86 g/Lに達し、最高であり、菌株DEXのALAの産生量の179倍である。
【００５１】
実施例9、組み替え菌株E. coli DALAによる組別のALAの発酵生産
種液の調製：構築した組み換え大腸菌の単集落を選んで、4mLの発酵培養基を入れている25mLの三角瓶に入れる。温度を37℃に、速度を225転/分にして、12時間培養する。培養の菌液を1%（v/v）の接種量で50mLの発酵培養基を入れている300mLの三角瓶に入れる。温度を37℃に、速度を225転/分にして、8時間培養する。それで、種液が出来上がる。
【００５２】
発酵缶培養：調製した種液を2%（v/v）の接種量で3Lの発酵培養基をいれている5Lの発酵缶に入れて培養する。発酵の温度は37℃で、pHは6.2で、溶存酸素は50%以上にコントロールする。発酵の時間は56hである。4hごとにサンプリングする。それから、色度分析によってALAの濃度を測定する。
【００５３】
ALAの測定方法は色度分析である。詳しいことについては、実施例の一般的な説明を参照する。
【００５４】
上述した組み換え菌株DALAの発酵培養基グループの配分： (NH4)2SO4 16 g/L、KH2PO43 g/L、Na2HPO4・12H2O 16 g/L、MgSO4・7H2O 1 g/L、MnSO4・7H2O 0.01 g/L、酵母粉末 2 g/L、100μg/mLアンピシリン、50μg/mLスペクチノマイシン、IPTG 0.1mM、ブドウ糖35 g/L。
【００５５】
発酵の結果は図4に示した通りである。組み換え大腸菌DALAのALAの産生量は4.13 g/Lに達し、ブドウ糖の変換率は0.168g ALA/g ブドウ糖に達する。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】組み換え大腸菌によってブドウ糖を発酵してALAを生産するルートを示す図である。
【図２】プラスミド発現ベクター図録の構造を示す図である。
【図３】各組み換え菌株ALAの産生量を比較した結果を示す図である。
【図４】発酵缶培養の組み換え菌株でALAを生産することを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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