(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）投与量５−４５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙのＮ−アセチル−Ｌ−システイン、
（ｉｉ）投与量０．４−１．２μｇ／ｋｇ／ｄａｙのセレノメチオニンの形のセレン、および
（ｉｉｉ）投与量０．０２−０．０８ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙのメラトニン、および／または
生理学的に許容されるそれらの塩を、別々にまたは一緒に含み、
皮膚病の治療用であり、前記皮膚病は、白斑、乾癬または脱毛症である、医薬品。
【請求項２】
哺乳類に対して、同時に、逐次的に、または別個に組み合わせて投与される請求項１に記載の医薬品。
【請求項３】
成分（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）が経口投与用である請求項２に記載の医薬品。
【請求項４】
前記医薬品は、成分（ｉ）Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、（ｉｉ）セレノメチオニン、および（ｉｉｉ）メラトニンを含有する医薬組成物である請求項１から３の何れか１項に記載の医薬品。
【請求項５】
（ｉ）Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、（ｉｉ）セレノメチオニンの形のセレン、および（ｉｉｉ）メラトニンを別々にまたは一緒に含み、経皮投与の濃度が、それぞれ３−１０重量％、０．３−１重量％、および０．０１−０．２重量％であり、
皮膚病の治療用であり、前記皮膚病は、白斑、乾癬または脱毛症である、医薬品。
【請求項６】
体液と接触する用途に適合された医療機器に抗菌剤として使用される請求項１に記載の医薬品。
【請求項７】
成分（ｉ）Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、（ｉｉ）セレノメチオニン、および（ｉｉｉ）メラトニンが、医療機器用のヒドロゲルコーティングに含まれる請求項６に記載の医薬品。
【請求項８】
殺菌剤、貴金属溶液、および／またはデキサメタゾンを含む付加的活性化合物をさらに含む請求項６または７に記載の医薬品。
【請求項９】
請求項１に記載の医薬品を含有する抗菌剤。
【請求項１０】
医療機器用のヒドロゲルコーティングに使用される請求項９に記載の抗菌剤。
【請求項１１】
医療機器のプラスチックに融合される請求項９に記載の抗菌剤。
【請求項１２】
請求項１に記載の医薬品を含有し、殺菌剤、貴金属溶液、および／またはデキサメタゾンを含む付加的活性化合物を任意に含有する医療機器。
【請求項１３】
体液と接触する用途に適合された医療機器に対する抗菌剤としての請求項１に記載の医薬品の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、好ましくはセレノメチオニンとしてのセレン、およびメラトニンの組み合わせに関し、また、そのような組み合わせを含み、様々な病気や疾患の治療に有用な医薬組成物に関する。病気や疾患としては、例えば、様々なタイプの癌を含む良性および悪性の新生組織形成、自己免疫疾患、神経変性疾患、内分泌疾患、２型糖尿病、全てのタイプの繊維症、アミロイド症、子宮内膜症、多嚢胞性卵巣症候群、月経困難症、白斑や脱毛症、乾癬を含む皮膚病等が挙げられる。またこの組み合わせは、抗菌剤としても、美容目的でも有用である。
【背景技術】
【０００２】
細胞内の酸化還元（redox：レドックス）環境の制御および調節は、細胞過程と重要な関連がある。例えば、細胞周期の酸化還元の制御を失うと、酸化剤がより多い環境につながって、Ｇ１期からＳ期への進行を促すので、新生組織形成の特徴である異常増殖につながる。また、大抵の慢性炎症性疾患は、酸化還元の制御を失うことに付随して起きる。従って、より酸化された細胞内環境に向かう異常調節は、異常増殖および炎症と関連があり、究極的には、これらに限られたものではないが、癌、神経変性疾患、糖尿病、異常な創傷治癒、線維症などの病気に関連している。さらに、酸化性の環境においては、たんぱく質が酸化的に修飾され得るが、このプロセスはアミロイドの形で凝集体の形成を伴うことが多い。
【０００３】
細胞の機能状態は外的刺激の制御下にあり、重要なたんぱく質の機能および遺伝子発現に影響を及ぼす。信号検知およびメッセンジャーによる特異的エフェクターへの変換は、たんぱく質の翻訳後修飾によって動作する。中でも、チオール（−ＳＨ）還元／酸化（レドックス）スイッチが基本的な役割を果たす。たんぱく質中の感受性システイン残基が上述の酸化還元スイッチを構成する。ここで、「感受性」とは、特異的なたんぱく質構造の結果生じるシステイン／シスチン酸化還元対（ＳＨ／Ｓ−Ｓ）の電気化学ポテンシャルが低いことを示す。例えば酵素、受容体、輸送体、転写因子、構造要素、たんぱく質輸送合成および分解の調節因子、並びに、細胞骨格構造におけるチオール酸化還元スイッチが、細胞恒常性全体に極めて深い影響を及ぼす。
【０００４】
哺乳類細胞中の酸化剤の生成は、解糖およびミトコンドリア呼吸鎖等の基礎的なプロセスに由来するものであり、結果的に活性酸素種（中でも最も安定なものは過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）で代表される）が生成される。生成された酸化剤は厳重な制御下に置かれなければならず、酸化経路の逆転が必要である。酸化還元制御は、いくつかの低分子量物質と酵素（中でも、グルタチオンレダクターゼ（ＧＲ）およびセレン依存性グルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰｘ）族を含む）の複雑なネットワークによって影響される。還元型グルタチオン（ＧＳＨ）は、大抵の有機体における支配的な低分子量チオール種であり、その酸化還元ポテンシャルは、ＧＲおよびＧＰｘを含め、細胞中の酸化還元制御を担う多くの酵素によって、自身の酸化還元状態を再循環させるために使用される。
【０００５】
還元型グルタチオン（ＧＳＨ）は、すべてのヒト組織中に比較的高い濃度で存在するトリペプチドであって、１０ｍＭを越えることさえあり、体内において重要な機能を担っている。上述のように、還元型グルタチオンは、主要な内因性抗酸化剤と見なされており、１）細胞の酸化還元状態の制御、および２）外的刺激の受容体（例えばホルモン受容体）を含め、信号伝達に関連するたんぱく質の酸化状態の制御に関与している。還元型グルタチオンは、ＤＮＡ合成と修復、たんぱく質合成、プロスタグランジン合成、アミノ酸輸送、および酵素活性化といった多くの代謝反応や生化学反応において基本的な役割を担っている。また、一酸化窒素サイクルの調節に関与し、多くの発癌性物質およびその他の生体異物を中和し、免疫システムの多くの部分における最適な応答に対して重要な役割を果たす。従って、体内の大部分のシステムは、グルタチオン系の状態による影響を受ける。例えば、グルタチオン欠乏状態としては、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、化学的な伝染性肝炎、前立腺癌およびその他の癌、白内障、アルツハイマー病、パーキンソン病、慢性閉塞性肺疾患、ぜんそく、放射能中毒、栄養失調状態、つらい肉体的ストレスと身体の老化等が含まれ、不十分な免疫反応と関係がある。また低グルタチオンは、消耗性で負の窒素バランスにも強く関与しており、癌、ＡＩＤＳ、敗血症、心的外傷、日焼け、および運動上のオーバートレーニングにさえも見られ、双極性障害、主要な抑うつ障害、および統合失調症にも関与している。
【０００６】
グルタチオンは、アミノ酸Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン酸、およびグリシンから合成される。システインのスルフヒドリル（チオール）基（ＳＨ）がプロトンドナーとして作用し、グルタチオンの生物学的な活性に貢献している。システインは比較的まれな栄養素であるので、システインの供給が、細胞によるグルタチオン合成における律速因子である。従って、様々な病気や症状に対してグルタチオンを補給することが提唱されている。
【０００７】
しかしながら、グルタチオンを経口摂取しても胃の中で既に分解されてしまうので、消化管では十分に吸収されない。従って、グルタチオンを直接補給することによってグルタチオンレベルを上昇させることは困難である。その代わりに、グルタチオン前駆体として作用する物質を補給することが、グルタチオンの血漿濃度を増加させるために用いられる。Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（以降、「ＮＡＣ」と記す）はグルタチオンよりも単純な分子であって、ほとんどすべての組織や細胞中に自由に拡散し、生物学的に最も利用可能なグルタチオンの前駆体である。細胞の酸化還元状態の調節における有効性を試験したいくつかのチオール物質のうち、ヒトへの使用については、ＮＡＣが最も有望である。ＮＡＣの臨床使用に関連する利点として、実質的に副作用が無いことが挙げられる。この化合物は、病院にとって、粘液溶解薬およびパラセタモール中毒の解毒剤として、長い間利用されてきている。
【０００８】
近年、ＮＡＣは他の有益な特徴を持つことも認識されてきている。例えば、ＮＡＣは抗炎症作用を持つことが報告され、非ステロイド系の抗炎症剤（ＮＳＡＩＤｓ）群に加えられている。本願開示の発明者達は、in vitro条件下、哺乳類細胞において、ＮＡＣが増殖を抑制するとともに休止を促進し、さらに末端分化に進化することを以前に示している（WO 02/051405 A1, T. Parasassi, et. al. (Cell Death and Differentiation (2005), Vol. 12, No. 10, 1285-1296ページ); E. K. Krasnowska et. al. (Free Radicals Biology and Medicine 2008, 45(11):1566-72) and A. C. Gustafsson et. al. (BMC Cancer (2005), 5:75)。その中で、ＮＡＣが癌細胞に対して著しい抗増殖効果を有することを見出し、また、子宮内膜症の治療に効果的であることも見出した。さらに、ＮＡＣは、多嚢胞性卵巣症候群（ＰＣＯＳ）の治療、並びに、例えば、腎臓保護剤、間質性肺疾患、統合失調症、双極性障害、および抑うつ症等の様々なその他の病気や疾患の治療に使用され、また、その他の様々な用途が提唱されてきた。
【０００９】
すなわち、ＮＡＣは多くの用途に対して有効である。にもかかわらず、長期間のＮＡＣによる治療は、ＮＡＣの血漿中濃度の低下を招くので、その有効濃度を増加させねばならず、その結果、望ましくない副作用のリスクが増大する（L Pendyala and P J Creaven, Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 1995; 4:245-251）。ＮＡＣの効果の低下に対抗するために、ウォッシュアウト期間を考慮したパルス状の治療が提案された。考えられる別の解決法は、ＮＡＣが有効性を示す濃度を下げることであって、これはまた短期的な治療にも有利である。
【００１０】
近年、セレン（以降、「Ｓｅ」と記す）およびメラトニン（以降、「Ｍｅｌ」と記す）両者の保護的および／または治療的役割に、広く関心が持たれている。Ｓｅ補給は、抗酸化剤または免疫のエンハンサーとして、例えば癌の予防に提唱されている。同様に、メラトニンも、癌、免疫疾患、および、その他の様々な疾患の治療に対して研究されてきている。こうした事情にもかかわらず、これら２つの物質の効果に関して意見の分かれる報告も成されている。例えば、Ｍｅｌはその抗酸化作用が認識されているが、時として酸化促進剤として作用することも報告されている（Cemeli E, Baumgartner A, Anderson D. Mutat Res. 2009; 681:51-67; Wolfler A, Caluba HC, Abuja PM et al. FEBS Lett. 2001; 502(3):127-31; Radogna F et al. Toxicology and Applied Pharmacology 2009; 239:37-45）。
【００１１】
Ｓｅについて言うと、期待される前立腺癌またはその他の癌の予防が実現されなかったことが大規模試験によって示された（Lippman SM et al., Journal of American Medical Association. 2009; 301(1):39-51）。EA Klein（J Natl Cancer Inst. 2009; 101: 283-285）は、戒めの教訓を持って次のように結論付けた。「上手く実行された大規模な対照臨床試験が、生物学が示すものと我々が信じることを必ずしも立証するものではなく、また、我々のモデル系は、現実世界における臨床結果の不完全な評価にすぎない。」また、糖尿病のリスクに及ぼすＳｅの予防的役割が報告され、その「インスリン様」活性およびセレン酵素の抗酸化特性によるものであるとされたが、プロスペクティブ研究は、セレンと糖尿病のリスクとの間に何の重要な関係も見出さなかった（Akbaraly TN et al., Nutr Metab (Lond). 2010; 7:21）。
【００１２】
先行文献
Balanskyらは、"Interactions between N-acetylcysteine and sodium selenite in modulating the clastogenicity of urethane and 2-acetylaminofluorene in mice", Int. J. Cancer, Vol. 108, 2004, pp. 158-161において、癌治療における細胞毒性薬および化学抗癌剤の副作用を緩和するために、ＮＡＣとＳｅとを組み合わせて使用することを開示している。
【００１３】
Safarinejadらは、"Efficacy of selenium and/or N-acetyl-cysteine for improving semen parameters in infertile men: a double-blind, placebo controlled, randomized study", J. Urol., Vol. 181, No. 1, 2009, pp. 741-751, Epub December 2008において、不妊症男性の精液品質を改善するために、ＮＡＣとＳｅとを組み合わせて、あるいは単独で使用することを開示している。ＮＡＣとＳｅとを組み合わせて投与することにより、付加的で有用な効果がもたらされた。
【００１４】
Yalcinらは、"Synergistic action of sodium selenite and N-acetylcysteine in acetaminophen-induced liver damage", Hum. Exp. Toxicol., Vol. 27, No. 5, 2008, pp. 425-429において、アセトアミノフェン過剰摂取の治療に対し、ＮＡＣとＳｅとを組み合わせて、あるいは単独で使用することを開示している。ＮＡＣとＳｅとを組み合わせることにより、どちらか一方の薬剤を単独で使用する場合に比べて、肝臓毒性に対するより良い保護を提供できることが見出された。
【００１５】
Emonetらは、"Thiols and selenium: protective effect on human skin fibroblasts exposed to UVA radiation", J. Photochem. Photobiol.,Vol. 40, No.1, 1997, pp. 84-90において、ＵＶＡによるダメージから細胞を保護するために、ＮＡＣとＳｅとを組み合わせて使用することを開示している。
【００１６】
Lookらは、"Sodium selenite and N-acetylcysteine in antiretroviral-naive HIV-1-infected patients: a randomized, controlled pilot study", J. Clin. Invest., Vol. 28, No. 5, 1998, pp. 389-397において、ＨＩＶ感染患者の血球数を改善しウイルス量を減少させることを目的として、ＮＡＣとＳｅとを組み合わせて経口投与することを開示している。
【００１７】
Senerらは、"Melatonin and N-acetylcysteine have beneficial effects during hepatic ischemia and reperfusion", Life Sciences, Vol. 72, 2003, pp. 2707-2718において、肝虚血を治療するためにＮＡＣとＭｅｌとを単独で、または組み合わせて使用することを開示している。ＭｅｌはＮＡＣよりも有効であり、両者を組み合わせることは、一方を単独で使用する場合よりも一層効果的であることが見出された。
【００１８】
国際公開第０３／０７７９００号および米国特許出願公開第２００５／０１６４９１１号明細書は、ＮＡＣ、メラトニン、またはその組み合わせと、ＮＡＣおよびＭｅｌを含む薬剤を投与することによって、癌または神経変性疾患の進行を防ぐ方法を開示している。
【００１９】
国際公開第００／５３１３７６号は、システイン、セレン、およびメラトニンを他の多くの成分と一緒に含んだ組成物を記載している。米国特許出願公開第２００７／０２３１３１２号明細書、米国特許出願公開第２０１１／０２７７７１号明細書、国際公開第９８／３３４９４号、および米国特許第６２０７１９０号明細書は、いずれも、特にＮＡＣ、Ｓｅ、およびＭｅｌを含有する異なる薬剤を記載している。さらに米国特許出願公開第２００４／０４５５６６号明細書は、タバコの煙から有害成分を吸収するために、グルタチオン、セレン、およびメラトニンを含有する組成物を記載している。上記の文献のいずれにも、セレノメチオニンの使用は開示されていない。
【００２０】
上記先行技術文献にて参照した全ての文献において、セレンはそのままの状態で使用されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
本発明の全般的な目的は、ＮＡＣの有効性を増大させるという課題に対する解決法を提供することである。目的の１つの側面は、有効性の増大したＮ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）を提供する医薬品または薬学的組み合わせを提供することである。目的の１つの側面は、ヒトのような哺乳類の病気の治療に使用する上で、有効性の増大したＮＡＣを提供する医薬品または薬学的組み合わせを提供することである。病気としては、例えば、様々なタイプの癌を含む良性および悪性の過剰増殖、自己免疫疾患、神経変性疾患、内分泌疾患、２型糖尿病、全てのタイプの繊維症、アミロイド症、子宮内膜症、多嚢胞性卵巣症候群、月経困難症、白斑や脱毛症、乾癬を含む皮膚病、および細菌感染症等が挙げられる。目的の他の側面は、抗菌剤としての使用や、美容目的での使用に対して、有効性の増大したＮＡＣを与える医薬品を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明の発明者達は、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）が、セレノメチオニンの形でのセレン（Ｓｅ）およびメラトニン（Ｍｅｌ）と一緒に投与される場合に、ＮＡＣの効果が増大されることを示す。セレノメチオニンおよびＭｅｌを組み合わせることにより、ＮＡＣの有効性が非常に大きく増大し、またＮＡＣ濃度を低減できるので、短期間および長期間の治療の両面において、その有効性が改善される。ＮＡＣ、Ｓｅ（例えばセレノメチオニン（以降、「ＳｅＭｅｔ」と記す）の形で）、およびＭｅｌを組み合わせたこの治療の有効性のin vitroおよびin vivo条件下における試験の後に、発明者達はまた、ＳｅおよびＭｅｌの望ましくない効果が回避されることを示す。
【００２３】
従って、本発明は、例えば、様々なタイプの癌を含む良性および悪性の過剰増殖、自己免疫疾患、神経変性疾患、内分泌疾患、糖尿病、全てのタイプの繊維症、アミロイド症、子宮内膜症、多嚢胞性卵巣症候群、月経困難症、皮膚病、および細菌感染症等の様々な病気や疾患の治療に有用な、ＮＡＣ、ＳｅＭｅｔおよびＭｅｌの組み合わせを提供する。また、この組み合わせは、抗菌剤として、および美容目的でも有用である。それに加えて本発明は、上記の組み合わせを含んだ医薬品および医薬組成物、並びにＮＡＣ、ＳｅＭｅｔおよびＭｅｌを患者に同時に投与する治療法を提供する。
【００２４】
１つの側面において、本発明は、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、セレノメチオニン、およびメラトニン、および／または生理学的に許容されるそれらの塩を別々にまはた一緒に含有する医薬品を提供する。「別々に」とは、３つの物質が医薬品の一部であるが、別々のユニットとして、医薬品の別々の区画内に提供されることを意味してよい。「一緒に」とは、３つの物質が、例えば混合物として、医療機器の同一の部分中に提供されることを意味してよい。本発明の１つの側面における医薬品は、哺乳類に対して同時に、逐次的に、または別個に組み合わせて投与するために使用される。
【００２５】
１つの実施形態において、経口投与用の医薬品の成分は、例えば、投与量５−４５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙのＮ−アセチル−Ｌ−システイン、投与量０．４−１．２μｇ／ｋｇ／ｄａｙのセレノメチオニンの形でのセレン、および、投与量０．０２−０．０８ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙのメラトニンである。１つの実施形態において、医薬品は、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、セレノメチオニンの形でのセレン、およびメラトニンを含む医薬組成物である。
【００２６】
他の実施形態においては、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、セレノメチオニンの形でのセレン、およびメラトニンを別々にまたは一緒に含む医薬品は、経皮投与用である。１つの実施形態のそのような医薬品においては、Ｎ−アセチル−Ｌ−システインの投与濃度は３−１０重量％、セレノメチオニンの形でのセレンの投与濃度は０．３−１重量％、メラトニンの投与濃度は０．０１−０．２重量％である。１つの実施形態において、医薬品は、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、セレノメチオニンの形でのセレン、およびメラトニンを含有する医薬組成物である。
【００２７】
１つの実施形態において、医薬品は、様々なタイプの癌を含む良性および悪性の新生組織形成の治療用である。他の実施形態においては、肌の美容処置用および皮膚病の治療用である。また医薬品は、自己免疫疾患、神経変性疾患、内分泌疾患、２型糖尿病、全てのタイプの繊維症、アミロイド症、子宮内膜症、多嚢胞性卵巣症候群、月経困難症、およびその他の病気の治療に使用することができる。１つの実施形態においては、医薬品は抗菌剤として使用される。
【００２８】
本発明の他の側面において、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、セレノメチオニンの形でのセレン、およびメラトニンを含有する医薬品は、抗菌剤として使用され、体液と接触するような用途に適合された医療機器の表面中、表面と一緒に、あるいは表面上において使用される。医薬品は、例えば、そうした医療機器用のコーティングに使用されてもよく、あるいは、そうした医療機器の例えばプラスチック等の材料に組み込まれてもよい。本発明の１つの実施形態においては、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、セレノメチオニンの形でのセレン、およびメラトニンが、医療機器用のヒドロゲルコーティングに含有される。抗菌剤として使用される医薬品は、殺菌剤、貴金属溶液、および／またはデキサメタゾン等の付加的な活性化合物をさらに含んでもよい。
【００２９】
１つの側面において、本発明は、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、セレノメチオニンの形でのセレン、およびメラトニン、および／または生理学的に許容されるそれらの塩を別々にまたは一緒に含有する抗菌剤を提供する。１つの実施形態において、抗菌剤は、医療機器用のヒドロゲルコーティングに使用される。他の実施形態においては、医療機器のプラスチックに融合される。
【００３０】
他の側面において、本発明は、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、セレノメチオニンの形でのセレン、およびメラトニン、および／または生理学的に許容されるそれらの塩、さらに殺菌剤、貴金属溶液、および／またはデキサメタゾン等の付加的な活性化合物を任意に含有する医薬品を含んだ医療機器を提供する。
【００３１】
１つの側面において、本発明は、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、セレノメチオニンの形でのセレン、およびメラトニン、および／または生理学的に許容されるそれらの塩を別々にまたは一緒に含有する医薬品を、様々なタイプの癌を含む良性および悪性の新生組織形成、自己免疫疾患、神経変性疾患、内分泌疾患、２型糖尿病、全てのタイプの繊維症、アミロイド症、子宮内膜症、多嚢胞性卵巣症候群、月経困難症、白斑や脱毛症、または乾癬を含む皮膚病、あるいは細菌感染症の治療に使用することを提供する。また本発明は、医薬品を、肌の美容処置や、体液と接触するような用途に適合された医療機器の抗菌剤として使用することも提供する。
【００３２】
１つの側面において本発明は、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、セレノメチオニンの形でのセレン、およびメラトニン、および／または生理学的に許容されるそれらの塩を、ヒトまたは哺乳類の患者に対し、同時に、逐次的に、あるいは別個に組み合わせて投与することを含む、病気の治療法あるいは美容目的の処置法を提供する。病気または美容目的としては、様々なタイプの癌を含む良性および悪性の新生組織形成、自己免疫疾患、神経変性疾患、内分泌疾患、２型糖尿病、全てのタイプの繊維症、アミロイド症、子宮内膜症、多嚢胞性卵巣症候群、月経困難症、白斑や脱毛症、乾癬を含む皮膚病、または細菌感染症、あるいは肌の美容処置から選択される。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
添付の図面を参照しながら、以下の記載において、本発明をより詳細に説明する。
【００３４】
【図１】セレン依存性グルタチオンペルオキシダーゼ（ｃＧＰｘ（Ｓｅ））およびグルタチオンレダクターゼ（ＧＲ）によるグルタチオン（ＧＳＨ）の代謝再循環過程を示す。ＧＲの活性には、酵素グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）の活性によって供給されるＮＡＤＰＨが必要である。ここで、Ｇ６Ｐはグルコース−６−リン酸、６ＰＧは６−ホスホグルコン酸、ＲＯ・はアルコキシルラジカル、・ＯＨはヒドロキシルラジカル、ＲＯＯＨはヒドロペルオキシドを表す。
【００３５】
【図２】実施例１に記載されるように、白斑を持つ患者に対し、ＮＡＣ＋ＳｅＭｅｔ＋Ｍｅｌを用いて３ヶ月治療した効果を示す。
【００３６】
【図３Ａ】実施例２に記載されるように、ＮＡＣ＋ＳｅＭｅｔ＋Ｍｅｌを用いて１ヶ月処置した場合の、肌のきめに対する効果を示す。肌表面のマイクロレリーフを特徴付ける細い線のネットワークを示した、シリコンラバー肌レプリカの顕微鏡画像である。処置後には、ネットワークがより規則的であることに注目されたい。パネル中に示されるように、倍率は５倍または１０倍である。
【００３７】
【図３Ｂ】図３Ａに示す画像のうちのいくつかの高速フーリエ変換（ＦＦＴ）を示す。処置前のサンプル（ＡおよびＢ）が単一の方向に広がった不規則なパターンを示す一方、処置後（ＣおよびＤ）においては規則的な円形のパターンが観測される。
【００３８】
【図４】実施例３に記載される実験の結果を示す。図に示すように、０．２ｍＭのメナジオンおよび／または０．４ｍＭのＮＡＣ、および／または０．２ｍＭのＳｅＭｅｔ、および／または２ｍＭのＭｅｌを用いてＫ５６２細胞を処置した。ヒストグラム中におけるＳｅという表示は、常にＳｅＭｅｔを意味する。
【００３９】
【図５】実施例３に記載される実験の結果を示す。図に示すように、０．１３３ｍＭのメナジオン、および／または０．４ｍＭのＮＡＣ、および／または０．２ｍＭのＳｅＭｅｔ、および／または２ｍＭのＭｅｌを用いてＨＬ６０細胞を処置した。ヒストグラム中におけるＳｅという表示は、常にＳｅＭｅｔを意味する。
【００４０】
【図６】実施例３に記載される実験の結果を示す。図に示すように、０．５ｍＭのメナジオン、および／または１ｍＭのＮＡＣ、および／または０．２ｍＭのＳｅＭｅｔ、および／または１ｍＭのＭｅｌを用いてＨＬ６０細胞を処置した。ヒストグラム中におけるＳｅという表示は、常にＳｅＭｅｔを意味する。
【００４１】
【図７】実施例３に記載される実験結果を示す。図に示すように、０．１３３ｍＭのメナジオン、０．２ｍＭのＳｅＭｅｔ、２ｍＭのＭｅｌ、および異なる濃度のＮＡＣを用いてＨＬ６０細胞を処置した。
【００４２】
【図８】実施例４に記載される実験の結果を示すものであり、ＳｅＭｅｔおよびＭｅｌと組み合わせたＮＡＣの抗増殖作用および分化作用を示している。増殖遺伝子Ｐ２１阻害剤の倍率変化（fold change）の平均（５回の実験の平均）、および、分化マーカーＳＩ（５回の実験）、ＡＬＰＩ（４回の実験）、ＣＬＤＮ１（６回の実験）、およびＰＣＤＨ１（５回の実験）の倍率変化の平均を示す。ＮＡＣ＋ＳｅＭｅｔ＋Ｍｅｌの組み合わせに比べて有意差の見られなかった＊印を付した２つのサンプル（ＮＡＣ＋ＳｅおよびＮＡＣ＋Ｍｅｌの組み合わせ）を除いた有意性はｐ＜０．０５である。ヒストグラム中におけるＳｅという表示は、常にＳｅＭｅｔを意味する。
【００４３】
【図９】ＮＡＣ単独の場合の効果と、３つの物質を組み合わせた場合の効果との比較を示す。ヒストグラム中におけるＳｅという表示は、常にＳｅＭｅｔを意味する。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
ＮＡＣ
Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）は、良く知られた低分子量の薬剤であり、化学式は次の通りである。
【化１】
0005895303.tif 000002
【００４５】
本発明の目的のためには、ＮＡＣは、その二量体形（ｄｉ−ＮＡＣ）として投与されてもよい。
【００４６】
ＮＡＣは、様々なメカニズムによって分子としての効果および生理学的な効果を発揮することが見出されてきている。ＮＡＣの特性は主としてそのチオール基に関連している。チオール基は、グルタチオン（ＧＳＨ）が作用する大抵の生化学的経路においてＮＡＣの効果を発現させる。ＮＡＣは細胞によって処理されてＬ−システインとなり、ＧＳＨのデノボ合成に用いられるので、ＧＳＨの前駆体と考えられている。
【００４７】
ＮＡＣが作用するメカニズムの詳細は完全には解明されていないが、そのチオール基によるべきものであることは間違いない。従って、細胞中でのチオール基の複雑な酸化還元サイクルに関与しており、これによって細胞の酸化還元状態の調節、並びに、細胞内および細胞間の信号伝達に影響を及ぼす。この酸化還元サイクルにおいていくつかの酵素が作用するが、その酸化還元遷移は、グルタチオン（ＧＳＨ）の酸化／還元によって生じる。図１にまとめるように、ＮＡＣがこの点に関与していることは以前から証明されており、ＮＡＣはＧＳＨと比較して同等か、あるいはそれ以上の有効性を持っている。この点においてＮＡＣは強力な抗酸化剤であると考えられている。
【００４８】
生理学的に極めて重要な点は、ジスルフィドの形成と開裂の循環である。この共通のメカニズムによって、たんぱく質活性および細胞信号伝達が調節される。例えばたんぱく質チロシンホスファターゼおよびたんぱく質チロシンキナーゼ等の酵素が、細胞周期の制御、細胞の増殖および分化に極めて重要な役割を果たす。それらの多くは、システインの酸化還元状態によって調節される。
【００４９】
ＮＡＣは依然として粘液溶解薬として広く使用されており、その作用機構は、粘液たんぱく質中の不安定なシステインジスルフィド架橋の酸化還元開裂によるものと一般的に考えられている。さらにＮＡＣは、パラセタモール中毒の第１の処置である。
【００５０】
近年、ＮＡＣがその他の有益な特徴を持つことも認識されてきている。例えば、ＮＡＣは抗炎症作用を持つことが報告されており、これが、非ステロイド系の抗炎症剤（ＮＳＡＩＤｓ）群に加えられている理由である。さらにＮＡＣは細胞増殖を抑制し、細胞休止を促進し、また、末端分化に進化することが見出されてきた。その中では、ＮＡＣが癌細胞に対して著しい抗増殖効果を有することが見出され、また、子宮内膜症の治療に効果的であることも見出された。例えば、発明者達は比較的最近になって、上皮性起源の癌細胞に対して著しい抗増殖効果をＮＡＣが有することを見出した（Cell Death and Differentiation 2005, 12(10): 1285-1296; BMC Cancer 2005, 5: 75）。
【００５１】
癌の研究におけるＮＡＣの抗増殖効果は、細胞死または毒性に関連するものではなく、その代わりに、生理学的な分化経路の活性化によるものである。これは、原発組織に向かった細胞機能の正常化と見なすことができる。
【００５２】
ＮＡＣの使用に関連する利点は、実質的に副作用が生じないことである。不利な点は、長期間治療した場合の有効性の低下であり、血漿中濃度の減少が報告されている。そのため、必要な投与量が増加するので、何らかの望ましくない効果のリスクが増大する。
【００５３】
ＳｅおよびＭｅｌと組み合わせたＮＡＣ
これに基づき、本発明者達は、ＮＡＣとの間で相乗効果を発揮することのできる他の薬剤を同時に使用することによって、有効ＮＡＣ投与量を低減することを目的とした。有効ＮＡＣ投与量の低減は、長期間および短期間の治療の両方にとって有用である。この目的のために、チオール酸化還元サイクルを支配する酵素ネットワーク、特に、グルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰｘ）およびグルタチオンレダクターゼ（ＧＲ）等の酵素によるグルタチオン再循環に関与する反応に注意を集中させた。こうした酸化還元反応の流れに注目することは、これらが生物学における酸化還元反応の９９．９％近くを占めており（DP Jones. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 2008; 295:C849-C868）、ＮＡＣ作用は、ほとんどが、これら複数の酵素の活性を調節することに関連している（Parasassi T, Brunelli R, Costa G, et al. TheScientificWorldJOURNAL 2010; 10:1192-1202）という観察結果によって、正当であることが証明される。
【００５４】
ＮＡＣによる長期間の治療の後に、ＧＲの発現が減少することが報告された（L Pendyala and P J Creaven, Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 1995; 4:245-251）。Ｍｅｌの補給が、ＧＲおよびチオール酸化還元反応に関連する他の酵素グルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰｘ）の発現および／または活性の増大を生み出すことを示す報告も存在する（Hardeland R, Cardinali DP, Srinivasan V, et al. Prog Neurobiol. 2011; 93(3):350-84, Epub Dec 28 2010; Garcia T, Esparza JL, Giralt M, et al., Biol Trace Elem Res. 2010;135:220-32）。
【００５５】
この状況においてＳｅは、いくつかのグルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰｘ）の補助因子を務める。ＳｅはＧＰｘ活性に必要であり（例えば Bulato et al. Free Radic Biol Med. 2007; 42:118-23を参照のこと）、ＧＰｘ酵素が存在しない場合には、何ら特定の抗酸化作用を発現しない。
【００５６】
従って発明者達は、望ましくない効果が無く、バランスの取れた作用を確実にするためには、ＳｅはＳｅＭｅｔの形でＭｅｌと一緒に投与されねばならない、つまり、ＧＲとＧＰｘとが活性化され、ＧＰｘがその活性を十分に発揮できるような条件でなければならないと結論付けた。この状況において、ＮＡＣは、全体の動力学が進行するような還元ポテンシャルを保証できるので、結局のところ、グルタチオン（ＧＳＨ）よりも効果的である。
【００５７】
チオール酸化還元系の生物化学に基づいて、発明者達は、ＮＡＣの効果の増大、ＮＡＣの治療濃度の低減、および長期間の治療におけるＮＡＣの有効性の保証を目的とした。この目的は、チオール酸化還元系に存在する要素の活性化によって実現された。
【００５８】
１）チオール信号伝達酸化還元制御を司る酵素の発現／活性を復元／増大すること、２）長期間の治療においてさえも適切なＮＡＣ作用を再確立すること、および３）有効ＮＡＣ濃度を低減すること、を目的として、ＮＡＣ治療を、セレノメチオニンの形でのセレンおよびメラトニンを補給することと組み合わせた。この組み合わせは、ＧＰｘの活性にセレンが必要なこと、および、ＧＲや恐らくＧＰｘの発現／活性の増加に関して報告されているメラトニンの効果によって喚起された。
【００５９】
従って、本発明は、以下によるチオール酸化還元系の増進を利用して、ＮＡＣ作用を増大するという目的に基づいている。
１）Ｓｅの生物学的に利用可能な形であるセレノメチオニン（ＳｅＭｅｔ）の形でＳｅを補給することにより、グルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰｘ）の活性を刺激すること。
２）セレンの代わりにセレノメチオニンを使用することがその効果にとって非常に重要である。Ｍｅｌによってグルタチオンレダクターゼ（ＧＲ）およびグルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰｘ）の発現および／または活性が増大すること。
【００６０】
これら２つの付加的な物質と組み合わせたＮＡＣの作用は、ＮＡＣの抗酸化効果、抗増殖効果、および分化効果を試験することによって立証された。ＮＡＣ、Ｍｅｌ、ＳｅＭｅｔの形でのＳｅ間の組み合わせの効果および予想される相乗効果を、酸化性の刺激剤による挑戦を受けた２つの細胞株を使用したin vitro条件下（実施例３および４）、並びに、白斑を持つ患者での皮膚病学的なin vivo条件下（実施例１および２）で試験した。
【００６１】
過酸化水素の刺激産生の減少として測定される、チオール酸化還元系におけるＮＡＣの抗酸化効果に関し、以下の知見を得た。
１）この関連によってＮＡＣ作用は確実に増大される。いくつかの場合においてＮＡＣは、単独の場合に比べて、ＳｅＭｅｔおよびＭｅｌと組み合わせることにより、ほぼ３倍も効果的であった。
２）ＮＡＣ濃度が低減され、半分よりも小さな濃度で使用しても同様な効果に達した。
３）驚くべきことに、いくつかの細胞系においては、これらの物質のうちの２つのみを組み合わせた場合（つまり、ＮＡＣ＋ＳｅＭｅｔまたはＮＡＣ＋Ｍｅｌ）に、好ましくない酸化効果が観測された。このような組み合わせは有益であることが科学論文において報告されているので（Safarinejad MR. J Urol. 2009; 181:741-51. Yalcin S et al. Hum Exp Toxicol. 2008; 27:425-9）、これは予想外のことである。対照的に、３つの物質を組み合わせた場合には細胞の保護を回復し、酸化効果がほぼ完全に存在しない最終的な効果が観測された。
【００６２】
細胞増殖の低減および分化過程の誘発に関連するＮＡＣの効果について、以下の知見を得た。
１）ＮＡＣを単独で使用する場合に比べて、ＳｅＭｅｔおよびＭｅｌと組み合わせることにより、ＮＡＣの抗増殖作用が２倍になる。
２）ＮＡＣの分化作用は、上記の組み合わせによって確実に増大し、特異的マーカーにもよるが、ＮＡＣを単独で使用する場合に比べて３０−５０％高かった。
３）いくつかの特異的分化マーカーを解析したところ、ＮＡＣ＋ＳｅＭｅｔまたはＮＡＣ＋Ｍｅｌの組み合わせは、３つの物質の組み合わせに匹敵する効果を有することが観測された。にもかかわらず、３つの物質を組み合わせた場合には、ＮＡＣの作用は明らかに全体的な増加傾向にある。
【００６３】
投与
ここに記載するＮＡＣ、ＳｅＭｅｔの形でのＳｅ、およびＭｅｌの新規な組み合わせは、ヒト等の哺乳類に対して、同時に、逐次的に、または別個に組み合わせて投与されてよい。同時に組み合わせて投与するとは、哺乳類に対して、３つの物質を全て一緒にして、同一の位置に一度に投与することを意味する。逐次的に組み合わせて投与するとは、３つの物質全てが哺乳類の体内において組み合わせて存在することができるように、哺乳類に対して、３つの物質を同一の治療期間、例えば、同一の治療日、同一の治療週間（複数週間でもよい）、同一の治療月間（複数月間でもよい）の間に投与することを意味する。３つの物質は、哺乳類に対して、それぞれ異なるタイミングにて、定められた順番で投与される。別個に組み合わせて投与するとは、同様に、３つの物質全てが哺乳類の体内において組み合わせて存在することができるように、哺乳類に対して、同一の治療期間の間に３つの物質を投与することを意味するが、３つの物質は、それぞれ異なるタイミングにて、不規則な順番で投与される。投与は、局所的または全身的（腸溶性または非経口）であってよい。典型的な投与法としては、経口投与および経皮投与が挙げられる。その他の考えられる投与法としては、静脈内投与、皮内投与、皮下投与、筋内投与、膣内投与、子宮内投与、腹腔内投与、直腸投与、経鼻投与、くも膜下腔投与、吸入投与、および膀胱内投与が挙げられる。
【００６４】
製剤
本発明によるＮＡＣ、ＳｅＭｅｔおよびＭｅｌの組み合わせは、それぞれが３つの有効成分のうちの１つだけを含有する個別の薬剤／医薬組成物として投与されてよい（つまり、それぞれがＮＡＣ、または、ＳｅＭｅｔ、またはＭｅｌを含有する）。あるいは、３つの有効成分のうち、２つを含有する医薬組成物または３つ全てを含有する医薬組成物として投与されてもよい。どちらの場合であっても、単一成分を含有する医薬組成物、あるいは、ＮＡＣおよび／またはＳｅＭｅｔおよび／またはＭｅｌを組み合わせて含有する医薬組成物は、薬学分野の当業者によく知られた方法で調合されてよい。
【００６５】
医薬組成物は、例えば経口投与用に適応させてよい。そのような組成物は様々な形式で投与されてよく、現時点で好ましくは錠剤である。カプセル、座薬、液体、懸濁液、シロップ等、その他の形式も考えられる。経口投与用の投薬単位の形としての薬剤において、活性な成分は、固体、粉末状の担体、または賦形剤と混合されてよい。固体、粉末状の担体、または賦形剤としては、活性な成分に対する賦形剤や媒体として働くラクトース、サッカロース、ソルビトール、マンニトール、でんぷん、アミロペクチン、セルロース誘導体、ゼラチン、クエン酸、クエン酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、またはその他の適切な担体等、例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム等の炭酸塩、水酸化物、および酸化物等のアルカリ化合物のような安定化剤、並びに、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、フマル酸ステアリルナトリウム、ポリエチレングリコールワックス等の潤滑剤が挙げられる。次いで混合物を処理して顆粒状にするか、圧縮して錠剤にする。投薬形態が胃の中に留まっている間に活性な化合物が酸触媒によって分解されることを防ぐために、顆粒や錠剤は、腸溶コーティングによって被覆されてもよい。腸溶コーティングは、薬学的に許容される腸溶コーティング材料、例えば、蜜ろう、セラックニス、またはアニオン性の塗膜形成ポリマ等から選択され、好ましければ適当な可塑剤と組み合わせてよい。タブレットや顆粒が含有する活性化合物の量を識別するために、様々な染料をコーティングに添加してよい。
【００６６】
活性化合物、植物油、脂肪、または軟ゼラチンカプセル用の他の適切な賦形剤の混合物を含有するカプセルによって、軟ゼラチンカプセルを調合してもよい。軟ゼラチンカプセルは、上述の手法により腸溶コーティングされてもよい。
【００６７】
硬ゼラチンカプセルは、活性化合物の顆粒または腸溶コーティングされた顆粒を含有してよい。硬ゼラチンカプセルは、ラクトース、サッカロース、ソルビトール、マンニトール、じゃがいもでんぷん、アミロペクチン、セルロース誘導体、またはゼラチン等の、固体粉末状の担体と組み合わせて活性化合物を含有することもできる。上述の手法によってカプセルに腸溶コーティングを施してもよい。
【００６８】
１つのオプションは、ＮＡＣおよび／またはＳｅＭｅｔおよび／またはＭｅｌを徐放性（持続放出性、あるいは放出制御性とも呼ばれる）剤として提供することである。血流への活性物質の拡散および取り込みの速度を低減できるので、そのような薬剤によって、より長い間隔を置いた多量の投与が可能になる。続いて、投与された薬剤は、例えば１日２回の投与計画の場合には、１２＋１２時間に及ぶ長い時間をかけて少量ずつ血中に分配される。徐放性に関する多くの様々な技術や薬剤がこの分野で長い間知られており、本発明にも適用することができる。そのような技術においては、例えば、投与された場所では体液中で不溶性または難溶性のコーティングあるいは基質中に活性物質は封入されている。徐放性と胃を保護する効果を組み合わせた製剤も可能であり、本発明において使用してもよい。
【００６９】
経口投与用の液体製剤は、シロップや懸濁液の形で調製されてよく、例えば、０．２から２０重量％の活性成分と、糖または糖アルコール、およびエタノール、水、グリセロール、プロピレングリコール、および／またはポリエチレングリコールの混合物から成るその他の成分を含有する溶液または懸濁液である。必要に応じて、着色剤、香味剤、サッカリン、およびカルボキシメチルセルロース、またはその他の増粘剤を、そのような液体製剤に含有させてもよい。経口投与用の液体製剤は、使用に先立って適切な溶媒によって液状に戻される乾燥粉末として調製されてもよい。
【００７０】
局所投与向けに、ＮＡＣおよび／またはＳｅＭｅｔおよび／またはＭｅｌを、純粋な形態、つまり液体として適用してもよい。より好ましくは、乳化されたクリーム、軟膏、ローション、塗布薬、粉末等の固体または液体であり、皮膚科学的に許容される担体を含有する組成物／薬剤として投与される。液体担体の例としては、水、アルコール、またはグリコール、あるいは水−アルコール／グリコールの混合物が挙げられる。本発明の化合物は、その中で効果的に溶解または分散することができ、補助として毒性の無い界面活性剤を任意で加えてよい。軟膏、ローション、ペースト、ジェル等を形成するために、合成ポリマ、脂肪酸、脂肪酸の塩およびエステル、脂肪アルコール、変性セルロース、または変性無機物質等の増粘剤を加えてもよい。固体担体の例としては、タルク、粘土、微結晶性セルロース、シリカ、アルミナ等の微粉化した固体が挙げられる。香料および付加的な抗菌薬のような補助薬を添加してもよい。好ましい実施形態においては、局所投与向けのガレヌス製剤は、アクア、セテアレス２５、ステアリン酸グリセリル、ステアリン酸ＴＥＡ、セテアリルアルコール、カプリル酸／カプリン酸トリグリセリル、ジメチコーン、グリセリン水添ポリイソブテン、ポリソルベート６０、ペンチレングリコール、および任意にバニラ等を含む。
【００７１】
活性化合物の静脈内投与用または腹腔内投与用溶液は、毒性の無い界面活性剤を任意に混ぜた水中で調製することができる。分散は、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、トリアセチン、およびそれらの混合物中、並びにオイル中で調製することができ、任意でリポソーム中に封入することもできる。最終的な投与形態は、無菌状態であり、流動性を有し、製造条件下および貯蔵条件下で安定でなければならない。液体担体または賦形剤は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール等）、植物油、非毒性のグリセリルエステル、およびそれらの適切な混合物を含んだ溶媒または液状分散媒体であってよい。例えば、リポソームの形成、分散の場合に要求される粒子サイズの維持、あるいは界面活性剤の使用によって、適切な流動性を保つことができる。例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等の様々な抗菌剤および抗真菌薬を導入することにより、微生物の作用を防ぐことができる。多くの場合、例えば糖、緩衝剤、あるいは塩化ナトリウム等の等張剤を含有することが好ましい。注射可能な組成物の吸収を長引かせることは、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンのように、吸収を遅らせる物質を組成物中に使用することによって実現される。殺菌された注射可能な溶液は、上記の通り列挙したその他の様々な成分と一緒に、適切な溶媒中に必要量の活性化合物を包含することによって調製され、続いて、必要に応じて濾過滅菌される。殺菌された注射可能な溶液を調製するための無菌粉末の場合は、真空乾燥技術および凍結乾燥技術が好ましい調製法である。これによって、活性成分に加えて、事前に濾過滅菌された溶液中に存在する所望の成分が添加された粉末が生産される。
【００７２】
直腸投与用の投与単位は、中性脂肪基材と混合された活性物質を含有する座薬の形で調製されてもよい。あるいはゼラチン直腸カプセルの形で調製されてもよく、これは、植物油、パラフィン油、またはゼラチン直腸カプセル用の適当なその他の賦形剤との混合物中に活性物質を含む。あるいはまた、出来合いのミクロ浣腸剤の形で調製されてもよく、あるいは、投与の直前に適当な溶媒中で戻される乾燥ミクロ浣腸剤の形で調製されてもよい。
【００７３】
非経口投与用の溶液は、薬学的に許容される溶媒中に、好ましくは０．１から１０重量％の濃度で本発明の活性成分が含まれる溶液として調製されてよい。これらの溶液はまた、安定化剤および／または緩衝剤を含んでもよく、異なる単位投与量のアンプルまたは小瓶中に製造されてもよい。非経口投与用の溶液は、使用に先立って、適切な溶媒によって即座に戻される乾燥製剤として調製されてもよい。
【００７４】
ＮＡＣに関して本発明は、有効投与量を得るために、ＮＡＣ薬剤の薬学的品質を厳重に評価する必要がある。ＮＡＣは安定な分子ではなく、活性度の高いチオール残基が、酸素や光、その他の放射線によって容易に酸化されるので、有効投与量に到達しなくなってしまう。従って、好ましくは、調製は光から保護される。経口投与用の場合、溶解中に水から酸素を部分的に除去することを補助する炭酸水素ナトリウムと一緒に溶解性錠剤としてＮＡＣを調製することが好ましい。
【００７５】
ＮＡＣの投与量が大きいと腹痛を引き起こすことが知られている。これを克服するための１つのオプションは、胃の中でのＮＡＣの放出／溶解性を妨げるのに適した胃の保護剤と一緒に調製されたＮＡＣを提供することである。そのような製剤はこの分野では広く知られており、本発明にも適用できる。例えば、胃液に対して抵抗力があり、胃を通過した後、腸の中でのみ薬剤を放出することのできる錠剤コーティングを使用することができる。通常用いられている製剤としては、セルロース誘導体、メタクリル酸アミノエステル共重合体が挙げられる。このコーティングは、胃を通り過ぎた後でｐＨが増加することに呼応して膨潤または溶解化し薬剤を放出するｐＨ感受性ポリマを使用することによって、胃の酸性環境下で錠剤の中心部が分解されることを防ぐことができる。
【００７６】
投与量
ヒトおよびその他の哺乳類への経口投与用に適当な１日のＮＡＣの投与量は、約５−４５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ、好ましくは２０−３０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙである。ＳｅＭｅｔの適当な１日の投与量は、約０．０００４−０．００１２ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ、好ましくは約０．０００８ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙである。Ｍｅｌの適当な１日の投与量は、約０．０２−０．０８ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ、好ましくは約０．０４ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙである。投与は、１日１回でもよい。あるいは、２回、または好ましくは３回または４回であるそれ以上の回数に１または２投与分（例えば錠剤）を分けて、１日分の投与を行ってもよい。各投与は、例えば０．１５−３．０ｇ、好ましくは０．３−０．６ｇで、好ましくは１日当たり３回のＮＡＣ、０．０２８−０．１１０ｍｇ、好ましくは約０．０５５ｍｇのＳｅＭｅｔ、および、１−６ｍｇ、好ましくは約３ｍｇのＭｅｌを含む。
【００７７】
経口投与の場合、ＳｅＭｅｔに対するＮＡＣの１日当たりの投与量重量比は４０００：１から６００００：１の範囲内であり、好ましくは５０００：１から４００００：１または２５０００：１から３７０００：１であり、最も好ましくは３２５００：１である。Ｍｅｌに対するＮＡＣの１日当たりの投与量重量比は、６０：１から２０００：１の範囲内であり、好ましくは１５０：１から１０００：１または５００：１から７５０：１であり、最も好ましくは６００：１である。３つの物質は、典型的には、ＮＡＣ対ＳｅＭｅｔ対Ｍｅｌの１日当たりの投与量重量比が約３２５００：１：５４で投与される。これらの物質は、同時に、別個に、または、３つの物質を全て含有する組成物として、上述の比率で投与されてよい。
【００７８】
経皮投与（例えば乳液クリーム、軟膏、ローション、塗布薬、およびその類似物）の場合、ＮＡＣの適切な濃度は約３−１０重量％、好ましくは５重量％である。ＳｅＭｅｔの適切な濃度は約０．３−１重量％、好ましくは０．５重量％であり、Ｍｅｌの適切な１日の投与量は約０．０１−０．２重量％、好ましくは０．１重量％である。クリーム、ローション、またはその類似物は、１日１回の適用でもよく、あるいは２回でも、もしくは好ましくは３回または４回であるそれ以上の回数でもよい。
【００７９】
経皮投与の場合、ＳｅＭｅｔに対するＮＡＣの重量％比は、３：１から３３：１の範囲内であり、好ましくは約１０：１である。Ｍｅｌに対するＮＡＣの重量％比は、１５：１から１０００：１の範囲内であり、好ましくは約５０：１である。３つの物質は、典型的にはＮＡＣ対ＳｅＭｅｔ対Ｍｅｌの重量％比が約５０：１：５で経皮投与される。これらの物質は、同時に、別個に、または３つの物質を全て含有する組成物として、上述の比率で投与されてよい。
【００８０】
治療期間は、治療すべき病気または疾患に応じて、１日あるいは数日から、数か月にまで渡って続けられてよい。
【００８１】
例えば１−２ヶ月、あるいはそれ以上におよぶＮＡＣ、ＳｅＭｅｔ、およびＭｅｌによる長期間の治療の場合、治療を間欠的に行ってもよい。間欠的な投与または治療とは、治療を複数の期間に分断することを意味する。つまり、医薬組成物をある期間（例えば数日間）投与し、続いて、医薬組成物をある期間（例えば数日間）全く投与しない中断期間を設け、さらに、その後再度投与することを意味する。間欠的な投与は規則的であってよい。例えば、固定の日数もしくは週数の間治療を行い、続けて、固定の日数もしくは週数の間中断する。例としては、各週において４日間治療を行い、続いて３日間中断する繰り返し計画や、あるいは、２週間治療してその後１週間中断する繰り返し計画が挙げられる。規則的な間欠的治療の特別な場合が、パルス状の治療である。これはつまり、規則正しい治療と中断の期間を設けることである。例えば、１日おきの投与、または、２日間投与して次の２日間は中断する、等である。例えば治療に対する応答に応じて、規則的でない繰り返しや、もっと複雑な繰り返し計画を有する不規則な間欠的治療計画も考えられる。本発明の様々な実施例においては、ＮＡＣ、ＳｅＭｅｔ、およびＭｅｌの所定の投与は、３−５日間連続して投与された後２−４日間中断されるか、あるいは、１−３日間連続して投与された後１−２日間中断される。
【００８２】
ＮＡＣ、ＳｅＭｅｔ、およびＭｅｌの好ましい投与量は、選択される特定の調剤法、投与経路、治療すべき病気や疾患の性質、並びに、患者の体重、年齢、健康状態、および種（ヒトか動物か）に依存する。
【００８３】
最適量のＳｅＭｅｔおよびＭｅｌと一緒にＮＡＣを投与する場合、特定の病気や疾患を治療するための既知の好ましいＮＡＣ投与量は、典型的には約半分になり得る。例えば、子宮内膜症の治療に対するＮＡＣの好ましい投与量は、単独使用の場合には、２ヶ月以上に渡る経口投与において、２０−９０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ、好ましくは３０−６０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙである。ＳｅＭｅｔおよびＭｅｌと組み合わせてＮＡＣを投与する場合、ＮＡＣ投与量を、２ヶ月以上に渡って１５−３０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙまで低減することができる。
【００８４】
本発明の使用／医学的示唆
ＮＡＣ、セレノメチオニンとしてのＳｅ、およびＭｅｌの組み合わせを含有する本発明は、ＮＡＣが使用される、あるいはＮＡＣが効果を有することが知られているいかなる目的に対しても使用することができる。例えば、グルタチオンが関与する病気、および／または、信号伝達の場合のようにチオール（−ＳＨ）還元／酸化（レドックス）スイッチが重要な役割を果たす病気、ホルモンによってもたらされる病気において、または、ＮＡＣの抗増殖効果および分化促進効果、抗酸化効果または抗炎症効果が利用される場合等において使用することができる。例えば、様々なタイプの癌を含む良性および悪性の新生組織形成、２型糖尿病、様々なタイプの繊維症、子宮内膜症、多嚢胞性卵巣症候群、月経困難症、および白斑や乾癬を含む皮膚病の治療に使用されてよい。アミロイドを形成するたんぱく質凝集における酸化現象との関連性により、本発明は、アルツハイマー病等の様々なタイプのアミロイド症の予防や治療に使用することもできる。さらに、抗菌剤として、および美容目的にも使用することができる。その他の用途としては、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、化学的な伝染性肝炎、白内障、パーキンソン病、慢性閉塞性肺疾患、ぜんそく、放射能中毒、栄養失調状態、つらい肉体的ストレス、老化、敗血症、心的外傷、日焼け、双極性障害、主要な抑うつ障害、および統合失調症等の治療、および、免疫反応が不十分な患者の治療が挙げられる。
【００８５】
皮膚病治療の例として、白斑を持つ一人の患者を、３つの物質の組み合わせを用いて治療した。３ヶ月の治療後、脱色素の極度の低減が観測された（実施例１、図２）。
【００８６】
美容処置の例として、３つの化合物を含有するガレヌス製剤によって顔の肌を１ヶ月間処置した被験者における肌のきめをモニターした。ＮＡＣ、ＳｅＭｅｔ、およびＭｅｌを含有するクリーム製剤を組み合わせた処置を１ヶ月間行ったところ、顔表面の線がより規則的に見え、肌のきめはより細かく且つより滑らかな肌に見え、肌の不規則性や吹き出物が減少した。
【００８７】
ＮＡＣ、ＳｅＭｅｔ、およびＭｅｌの組み合わせの抗菌剤としての使用
本発明はまた、ＮＡＣ、ＳｅＭｅｔ、およびＭｅｌの組み合わせが、例えば、ラテックスやポリ塩化ビニル製カテーテル等の医療器具および医療機器のコーティングに含有された場合の、抗菌剤としての有効性も示す（実施例５）。あるいは、ＮＡＣ、ＳｅＭｅｔ、およびＭｅｌの組み合わせを、医療機器に使用されるプラスチック材料に組み込むこともできる。
【００８８】
例えば、ヒドロゲルコーティングは固体物質の表面修飾法に使用することができる。ヒドロゲルコーティングの例としては、ポリウレタン（ＰＵＲ）またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）に基づいた水溶性ヒドロゲルが挙げられる。物質の生体適合性、親水性、および潤滑性を改善するような利点の他に、ヒドロゲルコーティングは、例えばＮＡＣ、ＳｅＭｅｔ、およびＭｅｌである活性剤を表面に組み込むという付加的な可能性をもたらす。親水性の基質と、ＮＡＣ、ＳｅＭｅｔ、およびＭｅｌの疎水性薬剤組成物とを組み合わせることは、特に有望であると考えられる。
【００８９】
ヒドロゲル修飾された表面は、非修飾表面に比べて、局所的薬物送達のための薬剤容器として機能できるという、付加的な利点を有する。例えば、特定の環境下における薬剤投与時間は、３日よりも長くはないが、少なくとも数時間持続すべきである。これは、例えば気管切開チューブのような機器の移植の場合に望ましい。この場合、気管狭窄症のような後の副作用を防ぐために、まず最初に抗炎症活性物質が放出されるべき一方で、その後は、後続の治癒過程および上皮形成における正常な細胞分裂を妨げるべきでないことが求められる。親水性ヒドロゲル基質と疎水性ＮＡＣ、ＳｅＭｅｔ、およびＭｅｌとを使用すると、膨潤する間に制御薬剤放出系として働く親水性基質の特質により、このような放出プロファイルを容易に得ることができる。
【００９０】
医療器具および医療機器に使用されるコーティングまたはプラスチックに対して、ＮＡＣ、ＳｅＭｅｔ、およびＭｅｌに加えて、例えば殺菌剤、貴金属溶液、および／またはデキサメタゾン等の活性物質をさらに加えてもよい。
【００９１】
活性剤、つまりＮＡＣ、ＳｅＭｅｔ、およびＭｅｌ、並びに、場合によっては１つ以上の付加的な活性物質を、次の２つの異なるモードでコーティングに組み込むことができる。すなわち、Ｉ．例えばヒドロゲルコーティングのポリマ化の間のように、コーティング形成の任意のステップにおいて溶液の成分として組み込むか、ＩＩ．含侵槽を通して組み込む。後者のモードＩＩは、ヒドロゲルコーティングの形成後に付加的なステップとして行うことが好ましいが、そのようなコーティングを行わずに、医療機器に直接行ってもよい。モードＩＩによって、ポリマコーティングステップを行わなくても、あるいは、ポリマコーティングステップに続いて活性物質を添加することによっても、シリコンカテーテルまたはポリグリコール酸再吸収可能な縫合糸といった機器の改良が可能である。
【００９２】
２０％のメタノールまたはエタノールを有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に対する薬剤溶解試験、抽出を通して、また殺菌剤の場合には発育阻止帯法（inhibited growth zones method）によって、活性物質を組み込むことの効果が発明者達によって実証された（データは示していない）。薬剤の溶解速度、最大投入量、およびコーティング安定性のプロセスパラメータに対する依存性を調査した。物質（ＮＡＣ、ＳｅＭｅｔ、Ｍｅｌ）の固体微粒子がコーティング層から周囲の溶液に沈殿したので、発明者達は、ヒドロゲル膨潤の間のＮＡＣ、ＳｅＭｅｔ、およびＭｅｌの拡散効果を観測した。
【００９３】
本発明者達は、ＮＡＣ、ＳｅＭｅｔ、およびＭｅｌを含有するヒドロゲルコーティングをカテーテル材料（ポリ塩化ビニル、ラテックス）に使用することにより、コーティングしていない骨格物質の場合、並びにＮＡＣ、ＳｅＭｅｔおよびＭｅｌを含有しないヒドロゲルコーティング物質の場合に比べて、こうした材料上における細菌の成長および細菌性バイオフィルムの形成が、著しく減少されることを示す（実施例５）。
【００９４】
実施例
実施例１：白斑の治療
白斑は、皮膚のメラニン細胞が失われる、後天性色素異常症である。その結果、人体の様々な部位の皮膚に白色の斑点が現れる。白斑の有病率は、世界的に見て０．１−２％の範囲である。白斑は、病気に冒された患者に対して心理的に大きなダメージを与えるものであり、生活の質、自尊心、結婚、および雇用に影響を及ぼし得る（Halder RM, Chappell JL. Semin Cutan Med Surg. 2009; 28(2):86-92）。病因を正確に捉えることが依然として難しい。提唱されているメカニズムは、自己免疫性、生化学的、酸化剤−抗酸化剤、神経系、およびウィルス性といった範疇に分類される。メラニン細胞に対して有害なフリーラジカルの蓄積が、その破壊へとつながることを、いくつかの研究が示唆している。実際のところ、対照群患者に比べると、白斑患者の赤色細胞は、グルタチオンレベルが低い。
【００９５】
本実施例においては、首回りおよび脇の下に広範性白斑を持つ４５歳の女性の場合について報告する。彼女は、市販される次の薬を用いて、錠剤の形で経口摂取することにより、３ヶ月間治療を受けた。手順としては、０．６ｇのＮＡＣを１日３回、５５マイクログラムのＳｅＭｅｔを１日１回、３ｍｇのＭｅｌを１日１回、３つの薬全てを１週間のうち同一の３日間摂取し、続く４日間は摂取を中断した（無投与）。
【００９６】
彼女の首および両脇の下の写真を、３ヶ月の治療の開始時および終了時に撮影した。
【００９７】
有害な副作用は報告されなかった。
【００９８】
図２に示す写真から、脱色素の低減は歴然としており、両脇の下においてはほとんど完全に再色素沈着している。
【００９９】
実施例２：肌の美容処置
成人に徐々に発生するしわ、弾力性の喪失、たるみ、および、菲薄化のため、肌の老化は肉眼で認識できる。従って、肌表面のきめを決定することは、そのような測定が肌診断法および治療処置または美容処置の評価に使用できるので、皮膚科学分野において特に重要である。
【０１００】
関連性を増しているものに、肌に対する環境汚染の影響があり、老化および機能障害に関連する汚染物質によって、多くの場合肌が劣化される。肌は、汚染に対して直接露出されており、個体の表面は約２平方メートルと評価され、ヒトのその他の組織のどこよりも大きい。汚染によるダメージのメカニズムは、主に、酸化的ストレスと炎症反応の誘発によるものである。これらのメカニズムを考慮して、我々は、やや老化した吹き出物のある油性肌の場合に、ＮＡＣをＳｅＭｅｔおよびＭｅｌと組み合わせて使用することに思い至った。
【０１０１】
４３歳の女性が、油性肌、赤み、および吹き出物のために皮膚科を訪れた。彼女は、アクア、セテアレス２５、ステアリン酸グリセリル、ステアリン酸ＴＥＡ、セテアリルアルコール、５％のＮＡＣ、０．５％のＳｅＭｅｔ、０．１％のＭｅｌ、カプリル酸／カプリン酸トリグリセリル、ジメチコーン、グリセリン水添ポリイソブテン、ポリソルベート６０、ペンチレングリコール、バニラを含有するガレヌス製剤によって、１か月間治療を受けた。
【０１０２】
報告されている手順（Setaro M, Sparavigna A. Irregularity skin index (ISI): a tool to evaluate skin surface texture. Skin Res Technol. 2001;7(3):159-63）に従って、皮膚科医によって作製され、顕微鏡によって観察されたシリコンラバー肌レプリカ上で、肌のきめを評価した（図３Ａ）。これらの著者によって示されるように、肌レプリカの顕微鏡写真は、表面の線を解析することによって肌表面のきめの一様性の変化を示す。ＮＡＣ、ＳｅＭｅｔ、およびＭｅｌを含有するクリーム製剤を組み合わせて１ヶ月間治療した後では、特に、治療前に見られたランダムならせん状の外観と比べると、顔表面の線がより一様に現れ、ネットワークの程度が印象的なほどに増大している。SetaroおよびSparavignaの方法に従って行われた、画像の高速フーリエ変換（ＦＦＴ）解析によって、優先方向を有するパターンが治療前には実際に示された（図３Ｂ）。これは、左側のパネルＡおよびＢ中に矢印で示されており、不均一なきめを示すものである。一方、治療後のＦＦＴ解析は、一様な肌のきめを示す、ほぼ完全に一様な円形のパターンを示した。
【０１０３】
１か月間の治療の後、皮膚科医および患者の両者が、肌の不均一性の視覚的な低減とともに、よりきめが細かく滑らかな外観、皮脂腺分泌の正常化、および赤みと吹き出物の消失を報告した。
【０１０４】
実施例３：in vitro培養された芽球様細胞株に対する抗酸化効果
方法
ヒトリンパ芽球様細胞株ＨＬ６０および前赤芽球様細胞株Ｋ５６２を用いた。ＲＰＭＩ１６４０培地（Invitrogen, Gibco, Milano, Italy）中、３７℃の条件下、１０％のウシ胎仔血清、５μｇ／ｍｌのペニシリン、５μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、２ｍＭのグルタミンを補給して培養し、一週間に３回定期的に二次培養した。細胞は、メナジオン単独（対照群）、ＮＡＣのみ、ＮＡＣ＋Ｓｅ−メチオニン（ＳｅＭｅｔ）、ＮＡＣ＋Ｍｅｌ、またはＮＡＣ＋ＳｅＭｅｔ＋Ｍｅｌによって処置された。ＳｅＭｅｔを補給する場合には、緩衝剤中のＳｅＭｅｔ溶液（濃度は図４−７に記載の通り）を用いて、実験の２日前に補給を実行した。Ｍｅｌを補給する場合には、エタノール中の溶液（濃度は図４−７に記載の通り）を用いて、実験の２０時間前に補給を実行した。成長培地中のエタノール濃度は１．３％以下であり、この溶媒のみを用いた対照群も並行して成長させた。
【０１０５】
ＮＡＣ、Ｍｅｌ、ＳｅＭｅｔ、およびこれらの物質の組み合わせが酸化性の刺激から細胞を保護する効果を、蛍光プローブ５−（および６−）クロロメチル−２'，７'−ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート、アセチルエステル（ＣＭ−Ｈ２ＤＣＦＤＡ）（Invitrogen, Molecular Probes）を使用して検出した。ＣＭ−Ｈ２ＤＣＦＤＡは、反応性酸素種に対する細胞浸透性の指示薬であり、細胞内のエステラーゼによってそのアセテート基が除去され、且つ、細胞内で酸化されるまで蛍光性を示さない。従って、蛍光の増加により、ヒドロペルオキシド（主にＨ２Ｏ２）の細胞内での増加をモニターすることができる。Ｈ２Ｏ２を増加させる酸化性の刺激は、メナジオンを用いて行った。
【０１０６】
細胞と蛍光プローブ定数との間の比率を保つように注意しつつ、細胞を数えた。洗浄した細胞を２ｍｌのＨＢＳＳ中において１０６／ｍｌの濃度で再懸濁させ、次いでキュベットに移し、フルオリメータのセルホルダー中にて、３７±０．１℃で１５分間、軽く撹拌しながら平衡化させた。続いて、ＤＭＳＯ中のＣＭ−Ｈ２ＤＣＦＤＡ溶液２μｌを加え、時間に対する蛍光強度を読み取った。最初の２００秒間蛍光強度を読み取った後、適当な分量のＮＡＣ溶液（リン酸緩衝液中、濃度は図４−７に記載の通り）、１０μｌの０．１Ｍメナジオン溶液（エタノール中）を加え、蛍光強度の読み取りを続行した。強度読み取りの間、サンプルを軽く撹拌し続けた。
【０１０７】
キセノンアークランプを備えたＫ２フルオリメータ（ISS Inc. Champaign, IL）中で、４９５ｎｍの励起光、５３０ｎｍの発光、８ｎｍのバンド幅を用いて、２０分間、蛍光強度を連続的にモニターした。
【０１０８】
結果
それぞれの処置を行った後の細胞中の酸化応答について、代表的な結果を図４、図５、および図６に示す。異なる濃度のメナジオン、ＮＡＣ、ＳｅＭｅｔ、およびＭｅｌを試験したところ、細胞株にも依存して、異なる応答が見られた。それにもかかわらず、３つの物質の組み合わせは、酸化がもたらす蛍光の増加を防ぐことにおいて、常に最も有効な結果を示した。メナジオンによる酸化へ向けた挑戦を受けた後では、ＤＣＦＤＡ蛍光強度が増加した。ＮＡＣの添加は、この強度増加の反応速度に関連した低減をもたらす。これは、その傾きによって評価される。ＮＡＣと共にＳｅＭｅｔまたはＭｅｌのどちらかが存在すると、細胞タイプや濃度に依存して、効果の違いが見られた。
【０１０９】
特に、いくつかの場合において、ＮＡＣ＋ＳｅＭｅｔまたはＮＡＣ＋Ｍｅｌという２者間の組は、応答を低減する代わりに、蛍光強度を促進することが観測された。つまり、酸化促進効果が示唆される。その代表的な例は図６に示される。しかし、たとえこのような場合があっても、３つの成分の組み合わせＮＡＣ＋ＳｅＭｅｔ＋Ｍｅｌによって、対照群と比較した場合の傾きの減少は最大となった。つまり、酸化応答の低減が最大であった。
【０１１０】
ＮＡＣ＋ＳｅＭｅｔ＋Ｍｅｌの組み合わせがもたらす強力な抗酸化防御により、ＮＡＣ濃度を６０％低減することができた。この点は図７に示されており、１ｍＭのＮＡＣが発揮する保護効果と、ＳｅＭｅｔおよびＭｅｌとの組み合わによる、わずか０．４ｍＭのＮＡＣを用いた場合の保護効果とが同等レベルである。
【０１１１】
結論
ＮＡＣをＳｅＭｅｔおよびＭｅｌと組み合わせることによって、明らかに、ＮＡＣの抗酸化防御が増大する。ＮＡＣの作用のみならず、３つの成分それぞれ単独の作用についても、組合わせによって相乗効果が発揮される。ＮＡＣをＳｅＭｅｔおよびＭｅｌと組み合わせて使用したもののいくつかの場合、ＮＡＣ単独の場合に比べて、抗酸化効果は３倍も有効であった。
【０１１２】
ＮＡＣ濃度を低減することが可能となり、半分よりも小さな濃度で、同様な効果に達した。
【０１１３】
驚くべきことに、いくつかの場合においては、ＮＡＣと組み合せた場合であっても、ＳｅＭｅｔまたはＭｅｌについて望ましくない酸化促進効果が観測された。そのメカニズムは依然として議論の最中にあるが、文献においてはＳｅおよびＭｅｌの両者に関して、不利益な酸化促進効果が報告されている。それにもかかわらず、ＳｅＭｅｔの形でＳｅを提供する我々の実験において、３つの物質の組み合わせは、抗酸化細胞保護を復元し、酸化剤による挑戦を受けた後でさえも、最終的な酸化効果は無視できるほどであった。
【０１１４】
実施例４：結腸癌細胞中の分化効果
ＮＡＣは、細胞増殖および分化を調節すること、特に、正常な分化経路に向けて細胞を転換することにより増殖を低減することが以前に報告されている。報告によると、この作用は、正常細胞と同様に癌細胞でも生じる。
【０１１５】
ＳｅＭｅｔまたはＭｅｌまたは両者と組み合わせたＮＡＣによって処置された結腸癌細胞株（Ｃａｃｏ−２）における増殖および分化に関連した遺伝子発現を以下の通りに解析した。結果を図８および図９に示す。
【０１１６】
方法
結腸癌細胞Ｃａｃｏ−２（サブクローンＴＣ７、Chantret et al., J. Cell Sci. 107:213-225; 1994）を、１０％の加熱不活性化したウシ胎仔血清ＦＢＳ（Gibco, Invitrogen）を含有する高グルコースＤＭＥＭ（Gibco, Invitrogen, Milan, Italy）中において、定期的に維持した。細胞を、密度３×１０３／ｃｍ２で６ウェルプレート上に播種した。播種の２４時間後に、ＮＡＣ（２ｍＭ）および／またはＳｅＭｅｔ（２５ｎＭ）および／またはＭｅｌ（２５μＭ）によって細胞を処置した。７２時間処置した後、細胞の遺伝子発現を解析した。
【０１１７】
腸細胞分化に特徴的な遺伝子の発現を評価した。刷子縁ヒドロラーゼに対する２つの遺伝子符号化、腸のアルカリホスファターゼ（ＡＬＰＩ）およびスクラーゼ−イソマルターゼ  アルファグルコシダーゼ（ＳＩ）、並びに、細胞間接着複合体のたんぱく質に対する２つの遺伝子符号化、タイトジャンクションクローディン１（ＣＬＤＮ１）および接着結合プロトカドヘリン１（ＰＣＤＨ１）である。細胞周期の重要な抑制因子、サイクリン依存キナーゼ抑制因子１Ａ（ＣＤＫＮ１Ａ／Ｐ２１ｗａｆ１／ｃｉｐ１）も、Ｃａｃｏ−２細胞分化を通常伴う細胞周期停止のマーカとして、その発現を解析した。グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）をハウスキーピング遺伝子として使用した。
【０１１８】
http://www.ncbi.nlm.nih.govにて入手可能なソフトウェアPrimer-BLASTを用いて特定のプライマー配列を設計した。表１に示す。
【０１１９】
トータルＲＮＡをTRIzol試薬（Invitrogen）中で抽出した。各サンプルからのトータルＲＮＡ１マイクログラムを１ＵのDNAse I（Invitrogen）によって処理し、２０μｌ（最終体積）中２５０ｎｇのランダムプライマーを用いて、２００ＵのSuperScript III Reverse Transcriptase（Invitrogen）によって逆転写した。１０ｎｇのｃＤＮＡおよび０．６μｌの各プライマー（１０μＭ）を含有する２５μｌの反応体積中で5 Prime RealMasterMix SYBR ROX 2.5X（Eppendorf, Milan, Italy）を使用し、ABI Prism 7000（Applied Biosystems, Monza, Italy）上でリアルタイムの定量的ＰＴ−ＰＣＲを実行した。手順は次の通りである。９５℃で１０分間を１周期、９５℃で２０秒間、６０℃で４０秒間、および６８℃で４５秒間を含む３段階を４０周期。全ての実験は、３またはそれ以上の別個の試料にて繰り返して行われた。汚染が無いことを検証するために、各反応について陰性対象（テンプレート無し）を実行した。また、増幅の特異性を融解曲線分析によって確認した。全てのデータを標準誤差を有する平均として解析した。ＡＮＯＶＡを使用し、ｐパラメータによって有意性を評価した。相対転写産物量の決定には、２−ΔΔＣＴ法を使用した（Livak KJ, Schmittgen TD. Methods 2001; 25: 402-408）。
【０１２０】
【表１】
0005895303.tif 000003
【０１２１】
結果
結果を図８および図９に示す。それぞれの処置を細胞に施した場合の、５つの遺伝子の遺伝子発現における増加（倍率変化）を示している。リアルタイムの定量的ＲＴ−ＰＣＲデータは、疑う余地無く下記の点を示している。
１）ＮＡＣの抗増殖作用（Ｐ２１遺伝子の発現増加によって示される）が、ＮＡＣ単独の場合と比較して、ＳｅＭｅｔおよびＭｅｌと組み合わせた場合に２倍になっている。
２）ＮＡＣの分化作用（マーカー遺伝子ＳＩ、ＡＬＰＩ、ＣＬＤＮ１、ＰＣＤＨ１の発現増加によって示される）が、上記の組み合わせによって明らかに増進しており、ＮＡＣ単独の場合と比較して、マーカー遺伝子発現が４０−８０％高い。
３）例えばＡＬＰＩ、ＣＬＤＮ１およびＰＣＤＨ１といったいくつかの特定の分化マーカーを解析したところ、ＮＡＣ＋ＳｅＭｅｔまたはＮＡＣ＋Ｍｅｌという２者間の組み合わせが、３つの物質の組み合わせに匹敵する効果を有する場合が観測された。しかしながら、３つの物質を組み合わせて使用した場合に、分化誘発の全体的な増加傾向が明らかに見られる。
【０１２２】
実施例５：医療機器のヒドロゲルコーティングにおけるＮＡＣ、ＳｅＭｅｔ、およびＭｅｌの抗菌効果
方法
ヒドロゲルコーティング
ポリウレタン（ＰＵＲ）およびポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）に基づき、ポリマ製の医療機器用に設計された、水に不溶なヒドロゲルのポリマコーティング技術おける既知の方法を使用して、尿道用ポリ塩化ビニルカテーテル並びにラテックスカテーテルにコーティングを施した。フーリエ変換赤外全反射（ＦＴＩＲ−ＡＴＲ）分光法、豚の組織面に対する静止摩擦係数および運動摩擦係数のコーティングされていない骨格物質面に対する相対値、水のぬれ角、および顕微鏡観察によって、このヒドロゲル層は事前に特徴が解析されている。発明者達が行った試験（データは示していない）によって、摩擦係数の減少を含め、水和状態における表面組成、超親水性、および潤滑性の変化が確かめられた。内面にヒドロゲルコーティングを施した尿道用ポリ塩化ビニルカテーテルの場合、毛細管現象が観測された。これは、コーティングと水分子との間の高い親和性を証明するものである。
【０１２３】
細菌の成長とバイオフィルム形成
接着性、固着性細菌の形成に対する効果を測定するため、Nickelらによって記載された技術（Antimicrob Agents Chemother. 1985; 27(4):619-24）に従って、人工カテーテルを構成した。使用したカテーテルの材質は、ラテックス、ヒドロゲルを含有する貴金属でコーティングしたラテックス、ＮＡＣ、ＳｅＭｅｔおよびＭｅｌ（ＮＡＣ＋ＳｅＭｅｔ＋Ｍｅｌ）でコーティングしたラテックス、並びに、貴金属と（ＮＡＣ＋ＳｅＭｅｔ＋Ｍｅｌ）の両者でコーティングしたラテックスであった。３７℃のウォーターバス中に保持された、in vitro条件下における膀胱として機能する２リットルの容器に人工カテーテル装置を接続した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を含有する媒質が、送出力５０ｍｌ／ｈに設定したポンプによって、人工カテーテルを通して容器からポンプ注入された。大腸菌に曝す前後で、１０ｃｍ２のカテーテル中央部を試験した。これらの実験で使用した大腸菌株は、カテーテル関連尿路感染症にかかった患者から単離されたものである。使用した媒質は、０．４％のニュートリエント培地を補給された人工尿である。細菌は、試験管中の傾斜寒天（スラント）において−７０℃で貯蔵され、１０時間の間隔をおいて連続的に培養された。分光光度計によって６００ｎｍで得た標準化された濁度を成長パラメータとして使用することによって、in vitro膀胱内での細菌の成長をモニターした。
【０１２４】
大腸菌を含有する人工尿を、１０時間にわたって人工カテーテルを通過させ、カテーテル物質の表面をサンプリングして、細菌バイオフィルムの発達をモニターした。固着性の細菌を有するサンプルディスクを、無菌状態で走査電子顕微鏡用に除去した。また、無菌のリン酸緩衝生理食塩水溶液中において、カテーテルディスクの表面剥離物を低出力超音波処理することによって、生存している接着性細菌の定量数を取得した。１０−４までの希釈系列を作製し、定量的なプレートカウントを取得したニュートリエント寒天上に広げた。ＳＥＭ用に指定されたカテーテル試料を人工カテーテルから除去し、カコジル酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．２）中５％のグルタルアルデヒドから成る固定液中に２２℃において１時間セットした。続いて、一連の水性エタノール溶液（２０−１００％）およびフレオン１１３−エタノール溶液（３０−１００％）によって脱水し、次いで乾燥した。サンプルをスパッター中で金コーティングし、走査電子顕微鏡によって検査した。
【０１２５】
結果
カテーテルディスクの表面剥離物のニュートリエント寒天上における成長により、ヒドロゲルコーティングされた物質の場合、コーティングされていない骨格物質の場合と比較して、生存可能な大腸菌の数が著しく減少したことが明らかになった。ＮＡＣ、ＳｅＭｅｔ、およびＭｅｌをヒドロゲルに添加した場合、接着性細菌のコロニーの数が、さらに劇的に減少したことが注目される。
骨格物質上のコロニーの数：１００
ヒドロゲルコーティングされた物質上のコロニーの数：７３
ＮＡＣ、ＳｅＭｅｔ、およびＭｅｌを添加したヒドロゲルコーティングされた物質上のコロニーの数：５８
【０１２６】
ラテックス、貴金属コーティングされたラテックス、（ＮＡＣ＋ＳｅＭｅｔ＋Ｍｅｌ）コーティングされたラテックス、および、貴金属＋（ＮＡＣ＋ＳｅＭｅｔ＋Ｍｅｌ）コーティングされたラテックスのカテーテルディスクは、大腸菌に曝される前であれば、エタノール殺菌された細菌細胞を有意数持たないことがＳＥＭ検査によって示された。人口尿中の大腸菌細胞に曝してから１０分後に、ラテックスディスクにおいて有意な数の接着性細菌細胞が見られた。これに対して、貴金属コーティングされたラテックスまたは（ＮＡＣ＋ＳｅＭｅｔ＋Ｍｅｌ）コーティングされたディスクにおいては最小限のコロニー形成が見られ、貴金属＋（ＮＡＣ＋ＳｅＭｅｔ＋Ｍｅｌ）コーティングされたディスクにおいてはコロニー形成は見られなかった。コロニー形成から１０時間後には、コーティングされていないラテックスに特徴的なプレート様の表面は、数多くの接着性細菌によって完全に塞がれた。接着性細菌は、大量な自分自身のアモルファス状エキソ多糖類に埋め込まれて、厚い付着性のバイオフィルムを形成した。貴金属コーティングされたカテーテルディスクおよび（ＮＡＣ＋ＳｅＭｅｔ＋Ｍｅｌ）コーティングされたカテーテルディスクにおいては、バイオフィルム形成の兆候がまばらに見られた。一方、貴金属と（ＮＡＣ＋ＳｅＭｅｔ＋Ｍｅｌ）の組み合わせによってコーティングされたディスクにはバイオフィルムが見られなかった。
（項目１）
（ｉ）Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、
（ｉｉ）セレノメチオニンの形のセレン、および
（ｉｉｉ）メラトニン、および／または
生理学的に許容されるそれらの塩を、別々にまたは一緒に含む医薬品。
（項目２）
哺乳類に対して、同時に、逐次的に、または別個に組み合わせて投与される項目１に記載の医薬品。
（項目３）
成分（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）が経口投与用である項目２に記載の医薬品。
（項目４）
成分（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）の投与量が、それぞれ５−４５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ、０．４−１．２μｇ／ｋｇ／ｄａｙ、および０．０２−０．０８ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙである項目３に記載の医薬品。
（項目５）
上記医薬品は、成分（ｉ）Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、（ｉｉ）セレノメチオニン、および（ｉｉｉ）メラトニンを含有する医薬組成物である項目１から４の何れか１項に記載の医薬品。
（項目６）
成分（ｉ）Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、（ｉｉ）セレノメチオニン、および（ｉｉｉ）メラトニンが経皮投与用である項目１または２に記載の医薬品。
（項目７）
成分（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）の投与濃度が、それぞれ３−１０重量％、０．３−１重量％、および０．０１−０．２重量％である項目６に記載の医薬品。
（項目８）
良性または悪性の新生組織形成の治療用である項目１から７の何れか１項に記載の医薬品。
（項目９）
皮膚病の治療用である項目１から７の何れか１項に記載の医薬品。
（項目１０）
肌の美容処置用である項目１から７の何れか１項に記載の医薬品。
（項目１１）
体液と接触する用途に適合された医療機器に抗菌剤として使用される項目１に記載の医薬品。
（項目１２）
成分（ｉ）Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、（ｉｉ）セレノメチオニン、および（ｉｉｉ）メラトニンが、医療機器用のヒドロゲルコーティングに含まれる項目１１に記載の医薬品。
（項目１３）
殺菌剤、貴金属溶液、および／またはデキサメタゾン等の付加的活性化合物をさらに含む項目１１または１２に記載の医薬品。
（項目１４）
項目１に記載の医薬品を含有する抗菌剤。
（項目１５）
医療機器用のヒドロゲルコーティングに使用される項目１４に記載の抗菌剤。
（項目１６）
医療機器のプラスチックに融合される項目１４に記載の抗菌剤。
（項目１７）
項目１に記載の医薬品を含有し、殺菌剤、貴金属溶液、および／またはデキサメタゾン等の付加的活性化合物を任意に含有する医療機器。
（項目１８）
様々なタイプの癌を含む良性および悪性の新生組織形成、自己免疫疾患、神経変性疾患、内分泌疾患、２型糖尿病、全てのタイプの繊維症、アミロイド症、子宮内膜症、多嚢胞性卵巣症候群、月経困難症、白斑、脱毛症、または乾癬を含む皮膚病、あるいは細菌感染症の治療に対する項目１から７の何れか１項に記載の医薬品の使用。
（項目１９）
肌の美容処置に対する項目１から７の何れか１項に記載の医薬品の使用。
（項目２０）
体液と接触する用途に適合された医療機器に対する抗菌剤としての項目１に記載の医薬品の使用。
【図１】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【配列表】
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