(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸合成反応の反応性の向上方法であって、下記の式１で表される核酸合成反応の反応性を向上させることが可能である化合物であるω−アミノ酸を反応液に添加する工程を含む方法。
【化１】
0005849107.tif 000004
（式中ｎは、２以上の整数である。）
【請求項２】
式中ｎが２以上、７以下の整数である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
核酸合成反応がポリメラーゼ連鎖反応である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ω−アミノ酸、ＤＮＡポリメラーゼ、少なくとも１種のプライマー、及び少なくとも１種のデオキシリボヌクレオチド三リン酸を含有する反応液を調製する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
さらに、ベタインを反応液に添加する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
核酸合成反応用の組成物であって、
ＤＮＡポリメラーゼ、
反応緩衝剤、
少なくとも１種のプライマー、
少なくとも１種のデオキシリボヌクレオチド三リン酸、及び
下記の式１で表される核酸合成反応の反応性を向上させることが可能である化合物であるω−アミノ酸
を含有する組成物。
【化２】
0005849107.tif 000005
（式中ｎは、２以上の整数である。）
【請求項７】
さらに、ベタインを含有する、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
下記の式１で表される核酸合成反応の反応性を向上させることが可能である化合物であるω−アミノ酸を含有する核酸合成反応用の反応緩衝液。
【化３】
0005849107.tif 000006
（式中ｎは、２以上の整数である。）
【請求項９】
さらに、ベタインを含有する、請求項８に記載の反応緩衝液。
【請求項１０】
核酸合成反応のためのキットであって、以下の構成品を含むキット：
ＤＮＡポリメラーゼ、
反応緩衝剤、
少なくとも１種のデオキシリボヌクレオチド三リン酸、及び
下記の式１で表される核酸合成反応の反応性を向上させることが可能である化合物であるω−アミノ酸。
【化４】
0005849107.tif 000007
（式中ｎは、２以上の整数である。）
【請求項１１】
さらに、ベタインを含有する、請求項１０に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸合成反応の反応性の向上方法、核酸合成反応用の組成物、及び核酸合成反応用の反応緩衝液に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸合成方法、特にポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＰＣＲ）法は、試験管内において簡便に所望の核酸断片を増幅する技術であり、近年、遺伝子に関する研究のみならず、生物学、医学、農業等の幅広い分野において不可欠な実験手法となっている。【０００３】
ＰＣＲ等のＤＮＡポリメラーゼを用いる核酸合成反応では、その特異性等の反応性がしばしば問題となる。非特異的な核酸合成反応を回避するために、新たなＤＮＡポリメラーゼの開発、プライマーの設計方法の改善、反応液組成の至適化、化合物の添加等の試みがなされている。例えば、ＧＣリッチな鋳型の増幅に、ベタインの添加が効果的であることが見出されている（非特許文献１、２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】“Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ”、１９９４年９月１日、第５５巻、補遺第３号、第Ａ２３８頁
【非特許文献２】“Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ”、１９９７年１０月１日、第２５巻、第１９号、第３９５７頁〜第３９５８頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
核酸合成反応は、その反応性について改善の試みがなされてきたが、現在においても非特異的な反応が生じる場合や十分な量のＤＮＡを合成することができない場合がある。このため、核酸合成反応の反応性の更なる改善が望まれている。本発明の目的は、核酸合成反応の反応性の向上方法、核酸合成反応用の組成物、及び核酸合成反応用の反応緩衝液を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、核酸合成反応の反応液にω−アミノ酸を添加することにより、核酸合成反応の反応性を向上させることが可能であることを見出し、本発明を完成させるに至った。【０００７】
すなわち本発明は、
［１］核酸合成反応の反応性の向上方法であって、ω−アミノ酸を反応液に添加する工程を含む方法、
［２］ω−アミノ酸が、下記の式１で表される化合物である、［１］に記載の方法、
【化１】
0005849107.tif 000002
（式中ｎは、２以上の整数である）、
［３］式中ｎが２以上、７以下の整数である、［２］に記載の方法。
［４］核酸合成反応がポリメラーゼ連鎖反応である、［１］に記載の方法、
［５］ω−アミノ酸、ＤＮＡポリメラーゼ、少なくとも１種のプライマー、及び少なくとも１種のデオキシリボヌクレオチド三リン酸を含有する反応液を調製する工程を含む、［１］に記載の方法、
［６］さらに、ベタインを反応液に添加する工程を含む、［１］に記載の方法、
［７］核酸合成反応用の組成物であって、ＤＮＡポリメラーゼ、反応緩衝剤、少なくとも１種のプライマー、少なくとも１種のデオキシリボヌクレオチド三リン酸、及びω−アミノ酸を含有する組成物、
［８］ω−アミノ酸が、［２］に示される式１で表される化合物である、［７］に記載の組成物、
［９］さらに、ベタインを含有する、［７］に記載の組成物、
［１０］ω−アミノ酸を含有する核酸合成反応用の反応緩衝液、
［１１］ω−アミノ酸が、［２］に示される式１で表される化合物である、［１０］に記載の反応緩衝液、
［１２］さらに、ベタインを含有する、［１０］に記載の反応緩衝液、
［１３］核酸合成反応のためのキットであって、以下の構成品を含むキット：ＤＮＡポリメラーゼ、反応緩衝剤、少なくとも１種のデオキシリボヌクレオチド三リン酸、及びω−アミノ酸、
［１４］ω−アミノ酸が、［２］に示される式１で表される化合物である、［１３］に記載のキット、
［１５］さらに、ベタインを含有する、［１３］に記載のキット
に関する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、核酸合成反応の反応性の向上方法、反応性に優れた核酸合成反応用の組成物、及び核酸合成反応用の反応緩衝液が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】実施例１におけるアガロースゲル電気泳動の結果を示す図である。
【図２】実施例２におけるアガロースゲル電気泳動の結果を示す図である。
【図３】実施例３におけるアガロースゲル電気泳動の結果を示す図である。
【図４】実施例４におけるアガロースゲル電気泳動の結果を示す図である。
【図５】実施例５におけるアガロースゲル電気泳動の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の核酸合成反応の反応性の向上方法は、ω−アミノ酸を反応液に添加する工程を含む。ω−アミノ酸を含有する反応液でＤＮＡポリメラーゼによる核酸合成反応を行うことにより、核酸合成反応の反応性を向上させることができる。また、本発明は反応性に優れた核酸の合成方法を提供する。
【００１１】
本発明の方法における核酸合成反応としては、ＤＮＡ又はＲＮＡを鋳型としてこれに相補的なＤＮＡを合成する反応であれば特に限定はないが、プライマー伸長反応、逆転写反応、ＰＣＲ、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ＩＣＡＮ法、ＬＡＭＰ法、ＳＤＡ法等の当分野で周知の核酸合成反応が例示される。
【００１２】
本発明をＰＣＲの反応性の向上に利用する場合、ＰＣＲの温度サイクル条件としては一般的な条件が適用できる。例えば、二本鎖鋳型ＤＮＡの一本鎖への解離（変性）、一本鎖鋳型ＤＮＡへのプライマーのアニーリング、プライマーからの相補鎖合成（伸長）の３つのステップからなる反応により、又は「シャトルＰＣＲ」［『ＰＣＲ法最前線』、「蛋白質核酸  酵素」別冊、第４１巻、第５号、４２５頁〜４２８頁（１９９６）］と呼ばれる、前述の３ステップ反応のうちプライマーのアニーリング及び伸長のステップを同一温度で行なう２ステップ反応によりＰＣＲが実施される。
【００１３】
本明細書において核酸合成反応の反応性の向上とは、本発明を特に限定するものではないが、例えば反応特異性の向上、及び標的とする核酸配列を有するＤＮＡの合成量の増大からなる群より選択される効果のことをいう。本発明によれば、ω−アミノ酸を反応液に添加することによって、核酸合成反応の反応性を向上させることができる。本発明を特に限定するものではないが、本発明により明らかになったω−アミノ酸が奏する核酸合成反応の反応性の向上効果から推測すると、ω−アミノ酸が核酸合成反応におけるプライマーのプライミングの特異性を向上させる性質を有している可能性がある。ω−アミノ酸による核酸合成反応の反応性の向上は、例えばω−アミノ酸を含む反応液と、ω−アミノ酸を含まない反応液とを用いてそれぞれ核酸合成反応を行った後、反応後の反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、核酸合成反応の反応特異性や標的とする核酸配列を有するＤＮＡの合成量を比較することにより確認することができる。また、インターカレーティング色素やＦＲＥＴ（Fluorescence Resonance Energy Transfer）標識プローブ等を用いて核酸の増幅をモニターし、核酸合成反応の反応特異性や標的とする核酸配列を有するＤＮＡ合成量を、反応液にω−アミノ酸を含む場合と含まない場合とで比較することによっても確認できる。前記の反応特異性の向上は、例えば非特異的な核酸の増幅が起こる頻度の減少や当該核酸の合成量の減少から評価される。
【００１４】
本明細書においてアミノ酸とは、広義のアミノ酸を意味し、カルボキシル基の代わりにスルホン酸基を含むものも含まれる。本明細書においてω−アミノ酸とは、カルボキシル基又はスルホン酸基の結合した炭素と反対側の炭素鎖末端に第一級アミノ基が結合したアミノ酸であって、α−アミノ酸に分類されるアミノ酸を除くアミノ酸のことをいう。本明細書におけるω−アミノ酸には、β−アミノ酸、γ−アミノ酸、δ−アミノ酸、及びε−アミノ酸も含まれる。本発明を特に限定するものではないが、本発明に使用されるω−アミノ酸としては、炭素数が３個以上のω−アミノ酸が例示され、炭素数が３〜８個のω−アミノ酸が好適に例示される。このようなω−アミノ酸としては、例えば下記の
【化２】
0005849107.tif 000003
（式中ｎは、２以上の整数である。）
で表わされる化合物が例示され、なかでも前記の式１で表わされる化合物においてｎが２以上、７以下の整数である化合物がより好適に例示される。
【００１５】
前記の式１で表わされるω−アミノ酸としては、例えば、β−アラニン、γ−アミノ−ｎ−酪酸（ＧＡＢＡ）、δ−アミノペンタン酸（５−アミノペンタン酸）、ε−アミノヘキサン酸（６−アミノヘキサン酸）、ω−アミノヘプタン酸（７−アミノエナント酸）、及び８−アミノオクタン酸、９−アミノノナン酸、及び１０−アミノデカン酸が挙げられる。
【００１６】
本発明の方法においてω−アミノ酸は、ＤＮＡポリメラーゼによる核酸合成反応の反応性の向上に効果のある量で反応液に添加される。核酸合成反応の反応性の向上が期待できる反応液中のω−アミノ酸の濃度は、例えば前記の核酸合成反応の反応性の向上の確認方法により容易に決定できる。本発明を特に限定するものではないが、例えば本発明の方法におけるω−アミノ酸として６−アミノヘキサン酸を利用する場合は、反応液中の６−アミノヘキサン酸の濃度は３００ｍＭ未満が好ましく、１０〜２００ｍＭがより好ましく、２０〜２００ｍＭ、例えば１００ｍＭが更により好ましい。また、本発明の方法におけるω−アミノ酸としてβ−アラニンを用いる場合は、反応液中のβ−アラニンの濃度は１Ｍ以下が好ましく、１００ｍＭ〜５００ｍＭがより好ましく、２５０〜５００ｍＭ、例えば５００ｍＭがさらに好ましい。反応液中のω−アミノ酸の至適な濃度範囲は、例えば後述の実施例４や実施例５と同様の方法により、使用するＤＮＡポリメラーゼの種類や標的配列等に応じて容易に確認することができる。
【００１７】
本発明の方法における核酸合成反応のための反応液は、ω−アミノ酸、ＤＮＡポリメラーゼ、反応緩衝剤、少なくとも１種のプライマー、少なくとも１種のデオキシリボヌクレオチド、及び鋳型となる核酸を含む組成物等を組み合わせて調製することができる。ＤＮＡポリメラーゼ、反応緩衝剤、少なくとも１種のプライマー、少なくとも１種のデオキシリボヌクレオチド、及びω−アミノ酸を含有する組成物は、本発明の一態様である。また、ＤＮＡポリメラーゼ、反応緩衝剤、少なくとも１種のデオキシリボヌクレオチド三リン酸、及びω−アミノ酸を含有するキットも本発明の一態様である。このキットは、１種以上のプライマーを含んでいてもよい。
【００１８】
ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ又はＲＮＡを鋳型としてこれに相補的なＤＮＡを合成する活性を有するものであれば、いずれのＤＮＡポリメラーゼであっても本発明に使用できる。本発明に使用されるＤＮＡポリメラーゼとしては、特に耐熱性のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが好ましい。このようなＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｔｈｅｒｍｕｓ属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来ＤＮＡポリメラーゼ等）や好熱性Ｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ由来ＤＮＡポリメラーゼ等）等の真正細菌由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、及びＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ属古細菌由来ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．由来ＤＮＡポリメラーゼ等）やＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属古細菌由来ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  Ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ由来ＤＮＡポリメラーゼ等）の古細菌由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが例示される。
【００１９】
ＤＮＡポリメラーゼとして２種以上のＤＮＡポリメラーゼを組み合わせて使用してもよい。２種類以上のＤＮＡポリメラーゼとしては、３´→５´エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼと３´→５´エキソヌクレアーゼ活性を実質的に有さないＤＮＡポリメラーゼとの組み合わせが例示される。なお、このような２種類のＤＮＡポリメラーゼを含む反応液でＰＣＲを行う技術は、ＬＡ−ＰＣＲ（Ｌｏｎｇ  ａｎｄ  Ａｃｃｕｒａｔｅ  ＰＣＲ）として知られている。
【００２０】
本発明の方法におけるＤＮＡポリメラーゼの使用量は、特に限定はないが、例えば従来の核酸合成反応において使用されている量を使用すればよい。ＰＣＲ法の場合、好適なＤＮＡポリメラーゼの使用量は当業者に周知である。例えばＴｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来ＤＮＡポリメラーゼを用いて反応液量２５μＬでＤＮＡ合成反応を行う場合、反応液中の該酵素量は０．１２５Ｕ〜５Ｕである。
【００２１】
本明細書において反応緩衝剤とは、反応液の水素イオン濃度（ｐＨ）の変動を和らげる作用を持つ化合物又は混合物のことをいう。一般に弱酸とその塩、あるいは弱塩基とその塩の混合溶液は、強い緩衝作用を持つため反応緩衝剤としてｐＨコントロールの目的で広く用いられている。本発明には生化学分野で公知の、各種の反応緩衝剤を使用することができる。例えば、Ｔｒｉｓ塩酸、Ｔｒｉｓ酢酸、ＨＥＰＥＳ水酸化カリウム、ＨＥＰＥＳ水酸化ナトリウムなどのグッドバッファーやリン酸バッファー等の反応緩衝剤が挙げられる。本発明の方法における反応液のｐＨは、遺伝子増幅反応が実施される通常の範囲、例えば２５℃におけるｐＨが８．０〜９．５の範囲に設定されるのが適当である。
【００２２】
プライマーは、鋳型となる核酸に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであり、使用される反応条件において鋳型となる核酸に対してアニールするものであれば特に限定されるものではない。本発明をＰＣＲに利用する場合には、標的配列を増幅可能な互いに対向する２種又はそれ以上のプライマーを設計して用いればよい。プライマーの鎖長は、特異的なアニーリングを行う観点から、好ましくは６ヌクレオチド以上であり、更に好ましくは１０ヌクレオチド以上であり、オリゴヌクレオチドの合成の観点から、好ましくは１００ヌクレオチド以下であり、更に好ましくは３０ヌクレオチド以下である。前記オリゴヌクレオチドは、例えば公知の方法で化学的に合成されたものであっても良い。また、生物試料由来のオリゴヌクレオチドであっても良く、例えば天然の試料より調製したＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ消化物から単離して作製しても良い。
【００２３】
デオキシリボヌクレオチドは、有機塩基に結合したデオキシリボースにホスホエステル結合を介してリン酸基が結合した化合物である。それぞれアデニン、グアニン、シトシン及びチミン塩基を有する４種のデオキシリボヌクレオチドが天然型ＤＮＡに見られる。塩基のアデニン、グアニン、シトシン、及びチミンはそれぞれ、Ａ、Ｇ、Ｃ、及びＴと略されることが多い。デオキシリボヌクレオチドは、遊離の一リン酸型、二リン酸型及び三リン酸型（すなわち、リン酸基が、それぞれ、１つ、２つ又は３つのリン酸部分を有する）を含む。また、塩基部分にヒポキサンチンやウラシルを有するデオキシリボヌクレオチド三リン酸も核酸合成反応に使用できることが知られている。本発明には、デオキシリボヌクレオチド三リン酸（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＩＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ）及びそれらの誘導体の少なくとも１種が使用される。本発明の組成物に含まれるデオキシリボヌクレオチド三リン酸としては、好適にはｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰの４種類の混合物が例示される。
【００２４】
本発明の方法におけるω−アミノ酸を反応液に添加する工程は、反応液の調製のいずれの段階において実施されてもよく、好ましくは反応液を核酸合成反応に適した温度でのインキュベートに供する前に実施される。例えば、反応緩衝剤を含む溶液（反応緩衝液）にω−アミノ酸を予め添加し、この反応緩衝液と、ＤＮＡポリメラーゼ、少なくとも１種のプライマー、少なくとも１種のデオキシリボヌクレオチド三リン酸、及び鋳型となる核酸とを組み合わせて反応液を調製した後に、核酸合成反応を実施してもよい。
【００２５】
従って、ω−アミノ酸を含有する核酸合成用の反応緩衝液は、本発明の好適な一態様である。反応緩衝液には、ω−アミノ酸や反応緩衝剤の他に、２価陽イオン及び／又は１価陽イオンやそれらの塩、核酸合成反応に有用なその他の成分をさらに含んでいてもよい。２価の陽イオンとしては、マグネシウムイオンやマンガンイオン等の２価の金属イオンが好適に例示される。１価の陽イオンとしては、ナトリウムイオン、カリウムイオン、アンモニウムイオン等が好適に例示される。核酸合成反応に有用なその他の成分としては、陰イオン性の界面活性剤、非イオン性の界面活性剤、テトラメチルアンモニウム塩等が好適に例示される。
【００２６】
本発明の方法は、さらにベタインを反応液に添加する工程を含んでいてもよい。本発明の方法におけるベタインを反応液に添加する工程は、反応液の調製のいずれの段階において実施されてもよく、好ましくは反応液を核酸合成反応に適した温度でのインキュベーションに供する前に実施される。また、本発明の組成物や本発明の反応緩衝液は、ベタインを含んでいてもよい。本発明においてベタインとは、正電荷と負電荷を同一分子内の隣り合わない位置に持ち、正電荷をもつ原子には解離しうる水素原子が結合しておらず、分子全体としては電荷を持たない化合物の総称のことを指す。代表的なベタインの例としては、トリメチルグリシンやその誘導体が挙げられる。
【００２７】
ベタインは、核酸合成反応の反応性を向上させる添加物として公知である。本願発明者らは、ω−アミノ酸とベタインとは、核酸合成反応の反応性の向上に関して相乗効果を奏することを見出した。また、高濃度のω−アミノ酸の添加により核酸増幅反応が抑制されることがあるが、この抑制がベタインの添加により解消されることも観察している。本発明の方法におけるベタインの添加量は、ベタインによる核酸合成反応の反応性の向上が認められる範囲であれば特に限定はないが、好ましくは０．１Ｍ以上３Ｍ以下、さらに好ましくは０．３Ｍ以上２．５Ｍ以下である。
【００２８】
本発明は、インターカレーティング色素やＦＲＥＴ標識プローブ等を用いる核酸の増幅をモニタリング可能なリアルタイムＰＣＲにも利用できる。この場合、本発明の方法における反応液、本発明の組成物、及び本発明の反応緩衝液は、インターカレーティング色素やＦＲＥＴ標識プローブを含みうる。
【実施例】
【００２９】
以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明は以下の実施例のみに限定されるものではない。なお、以下の実施例におけるＰＣＲの反応装置としては、ＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｄｉｃｅ（登録商標）  Ｇｒａｄｉｅｎｔ（タカラバイオ社）を使用した。【００３０】
実施例１
β―アラニン（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社）を超純水（ミリＱ水）に溶解した後、トリス酢酸緩衝液（ｐＨ８．９）を滴下することでｐＨを８．５に調整した５Ｍのβ−アラニン溶液を調製した。同様にして、６−アミノヘキサン酸（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社）をミリＱ水に溶解した後にｐＨを８．５に調整した２Ｍの６−アミノヘキサン酸溶液、及び８−アミノオクタン酸（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社）をミリＱ水に溶解した後にｐＨを８．５に調整した１Ｍの８−アミノオクタン酸溶液を調製した。また、ベタイン（トリメチルグリシン；ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社、Ｂ２６２９）をミリＱ水に溶解し、５Ｍのベタイン溶液を調製した。これらを下記の反応液の調製に用いた。【００３１】
Ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ（クロンテック社）  １００ｎｇを鋳型とし、プライマー対として配列番号１の塩基配列からなるプライマー及び配列番号２の塩基配列からなるプライマーを用い、ＴＧＦβ１遺伝子領域の９８７ｂｐ（ＧＣ比率７２．３％）を増幅するためのＰＣＲ反応液を、ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（登録商標）  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｖｅｒｓｉｏｎ（タカラバイオ社）を用いて氷上調製した。ＰＣＲ反応液は、製品に添付の説明書に記載の反応液の組成に加えて、ω−アミノ酸として終濃度５００ｍＭのβ−アラニン、終濃度１００ｍＭの６−アミノヘキサン酸、又は終濃度５０ｍＭの８−アミノオクタン酸を含む２０μＬの反応液、及びω−アミノ酸を含まない対照としての２０μＬの反応液、の合わせて４種類の反応液を調製した。また、これらの反応液の組成に加えてさらに終濃度３００ｍＭのベタイン（トリメチルグリシン）を含む反応液を４種類調製した。次に、氷上調製したこれらのＰＣＲ反応液について、９４℃、１分の活性化反応後、９８℃、１０秒〜５５℃、３０秒〜７２℃、１分を１サイクルとする３５サイクルのＰＣＲを実施した。ＰＣＲ終了後、各反応液のうち４μＬをアガロースゲル電気泳動に供して増幅産物の鎖長と増幅量を確認した。アガロースゲル電気泳動の結果を図１に示す。図中Ｍは、１ｋｂ  ＤＮＡ  Ｌａｄｄｅｒ（タカラバイオ社）マーカー２００ｎｇの電気泳動を行ったレーンであることを示す。【００３２】
その結果、ＰＣＲ反応液中にω−アミノ酸を含まない場合は、９８７ｂｐの目的増幅産物に相当するバンドがほとんど認められなかった。これに対し、各種ω−アミノ酸を含むＰＣＲ反応液では、９８７ｂｐの目的増幅産物に相当するバンドが認められた。また、ω−アミノ酸に加えてベタインを含むＰＣＲ反応液では、９８７ｂｐの目的増幅産物の増幅量が増加した。さらに、β―アラニンを含むＰＣＲ反応液や６−アミノヘキサン酸とベタインとを含むＰＣＲ反応液では、９８７ｂｐの目的増幅産物の特異的な増幅が認められた。【００３３】
実施例２
ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（登録商標）（タカラバイオ社）に代えてＰｙｒｏｂｅｓｔ（登録商標）  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社）を用いる点、及びベタインを含む反応液についてベタインの終濃度が１ＭとなるようにＰＣＲ反応液を調製する点以外は実施例１と同様の方法で、ω−アミノ酸の効果を検討した。なお、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ（登録商標）  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅは、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．由来ＤＮＡポリメラーゼを含む製品である。【００３４】
ＰＣＲ後の反応液のうち４μＬをアガロースゲル電気泳動に供した結果を図２に示す。図中Ｍは、１ｋｂ  ＤＮＡ  Ｌａｄｄｅｒ（タカラバイオ社）マーカー２００ｎｇの電気泳動を行ったレーンであることを示す。その結果、ＰＣＲ反応液中にω−アミノ酸やベタインを含まない場合、非特異的増幅産物のみが認められた。これに対し、ＰＣＲ反応液中にω−アミノ酸が含まれる場合には、主要な増幅産物として９８７ｂｐの目的産物が認められ、さらには増幅産物量の増大も認められた。また、ＰＣＲ反応液中にω−アミノ酸に加えてベタインを含む場合には、非特異的増幅はほとんど観察されず、９８７ｂｐの目的産物が特異的に増幅していた。また、β―アラニンを含む反応液や６−アミノヘキサン酸とベタインとを含むＰＣＲ反応液では、ベタインのみを含むＰＣＲ反応液による反応に比べて、９８７ｂｐの目的産物の増幅量が増加していた。【００３５】
実施例３
ＴＧＦβ１遺伝子領域を増幅するプライマー対に代えてＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ＤＮＡ，  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ｂｒｅａｋｐｏｉｎｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｎ  ２２ｑ１１：  Ｔｙｐｅ  Ｃ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢ２６１９９９．１）領域の９６５ｂｐ（ＧＣ比率３５．４％）を増幅するプライマー対（配列番号３の塩基配列からなるプライマー、及び配列番号４の塩基配列からなるプライマー）を使用する以外は、実施例１と同様の方法で、ω−アミノ酸の効果を確認した。【００３６】
ＰＣＲ後の反応液のうち４μＬをアガロースゲル電気泳動に供した結果を図３に示す。図中Ｍは、１ｋｂ  ＤＮＡ  Ｌａｄｄｅｒ（タカラバイオ社）マーカー２００ｎｇの電気泳動を行ったレーンであることを示す。その結果、ＰＣＲ反応液中にω−アミノ酸を含まない場合は、目的産物以外に非特異的な増幅が観察されたが、各種ω−アミノ酸を含むＰＣＲ反応液では、これらの非特異的な増幅は抑制されていた。【００３７】
以上のことより、ＧＣ比率の高い鋳型ばかりではなく、ＧＣ比率の低い（ＡＴ比率の高い）増幅困難な鋳型ＤＮＡに対してもＰＣＲ反応液へのω−アミノ酸の添加は有効であることが示された。【００３８】
実施例４
核酸合成反応の反応性の向上に有効な６−アミノヘキサン酸の濃度を検証した。各種のω−アミノ酸の代わりに終濃度２ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭ、２００ｍＭ、又は３００ｍＭの６−アミノヘキサン酸を含む以外は実施例１と同様の反応液、及びω−アミノ酸を含まない対照としての２０μＬの反応液、の合わせて９種類の反応液を調製した。次に、実施例１と同様の方法でＰＣＲを行った後、各反応液のうち４μＬをアガロースゲル電気泳動に供して増幅産物の鎖長と増幅量を確認した。アガロースゲル電気泳動の結果を図４に示す。図中Ｍは、１ｋｂ  ＤＮＡ  Ｌａｄｄｅｒ（タカラバイオ社）マーカー２００ｎｇの電気泳動を行ったレーンであることを示す。【００３９】
その結果、２０ｍＭ以上の６−アミノヘキサン酸の添加で目的の増幅ＤＮＡに由来すると思われるバンドが観察されるようになり、２００ｍＭの６−アミノヘキサン酸の添加で目的のＤＮＡのみの増幅が可能になった。【００４０】
実施例５
ＴＧＦβ１遺伝子領域を増幅するプライマー対に代えてＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ＤＮＡ，  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ｂｒｅａｋｐｏｉｎｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｎ  ２２ｑ１１：  Ｔｙｐｅ  Ｃ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢ２６１９９９．１）領域のプライマー対（配列番号３の塩基配列からなるプライマー、及び配列番号４の塩基配列からなるプライマー）を使用する以外は実施例４と同様の方法で、核酸合成反応の反応性の向上に有効な６−アミノヘキサン酸の有効濃度を検討した。【００４１】
ＰＣＲ後の反応液のうち４μＬをアガロースゲル電気泳動に供した結果を図５に示す。図中Ｍは、１ｋｂ  ＤＮＡ  Ｌａｄｄｅｒ（タカラバイオ社）マーカー２００ｎｇの電気泳動を行ったレーンであることを示す。その結果、１０ｍＭ以上の６−アミノヘキサン酸の添加で目的の増幅ＤＮＡに由来すると思われるバンドが観察されるようになり、５０ｍＭ、１００ｍＭ、２００ｍＭの６−アミノヘキサン酸の添加で目的のＤＮＡのみの増幅が可能になった。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
本発明は、遺伝子工学、生物学、医学、農業等の幅広い分野において有用である。
【配列表フリーテキスト】
【００４３】
SEQ ID NO:1 ; Synthetic primer for PCR to amplify of TGF-beta 1 gene.
SEQ ID NO:2 ; Synthetic primer for PCR to amplify of TGF-beta 1 gene.
SEQ ID NO:3 ; Synthetic primer for PCR to amplify of translocation breakpoint sequence region.
SEQ ID NO:4 ; Synthetic primer for PCR to amplify of translocation breakpoint sequence region.
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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