(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
自己免疫疾患又は神経変性疾患の予防又は処置のための、抗体集団を活性成分として含む薬剤であって、当該抗体集団は血漿免疫グロブリンＧ調製物からの濃縮により得られ得、ここで濃縮された抗体集団は、濃縮前の血漿免疫グロブリンＧ調製物と比較して、抗体のＦａｂ領域において増加した量のシアル酸付加を有し、そしてここでＦａｂ領域における増加したシアル酸付加に基づく濃縮の結果、濃縮前の血漿免疫グロブリンＧ調製物と比較した場合に、濃縮された集団の免疫調節特性が変更されている抗体の集団が生じ、ここでＦｃ部分におけるシアル酸付加の量が３０％未満だけ変更されている、上記薬剤。
【請求項２】
抗体集団が、血漿免疫グロブリンＧ調製物をセイヨウニワトコ凝集素カラム上のアフィニティークロマトグラフィーにかけること、並びに結合集団を酸性ラクトースを用いて溶離すること（＋ＳＡフラクション）により生産され、それにより、＋ＳＡフラクションがＦａｂ領域において増加した量のシアル酸付加を有し、そしてそれにより、Ｆａｂ領域において増加した量のシアル酸付加を有するフラクションが、変更された免疫調節特性を有する、請求項１に記載の薬剤。
【請求項３】
自己免疫疾患又は神経変性疾患が、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、抗リン脂質抗体症候群、免疫性血小板減少症（ＩＴＰ）、川崎病、ギラン・バレー症候群（ＧＢＳ）、多発性硬化症（ＭＳ）、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパシー（ＣＩＤＰ）、皮膚水疱疾患、皮膚筋炎、多発性筋炎、アルツハイマー病、パーキンソン病、ダウン症候群に関連するアルツハイマー病、脳アミロイド血管症、レビー小体型認知症、前頭側頭葉変性症及び血管性認知症から選択される、請求項１又は２に記載の薬剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｆａｂ領域において変更されたシアル酸付加を有する抗体集団、それらの製造方法、及びそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
免疫グロブリン（抗体としても知られる）は、免疫系の主要な分泌産物である。それらは典型的に基本的な構造単位から形成され−それぞれが２つの重鎖及び２つの軽鎖を含む−上記単位を１つ含むモノマー、２つの単位を含むダイマー、５つの単位を含むペンタマー、又は６つの単位を含むヘキサマーを形成する。抗体は先天免疫において重要な役割を果たす。病原体に対する天然の免疫応答において、病原体と抗体との間で複合体が形成される。これらの免疫複合体は、広範囲のエフェクター機能を活性化し、それ故病原体の殺傷、除去及び破壊をもたらす。抗体はまた身体自身の抗原とも反応し得、これにより自己免疫疾患をもたらし得、そして慢性炎症性症状に寄与し得る。抗体は、例えば炎症カスケードにおける種々のメディエーターを標的化及び中和することにより、抗炎症活性を有し得る。
【０００３】
免疫グロブリンの５つの主要なアイソタイプが存在し、これらは異なる役割を果たす。ＩｇＧは、進入する病原体に対して抗体ベースの免疫の大部分をもたらし、これは以下でより詳細に考察される。ＩｇＭは膜結合形態及び溶液で存在する。溶液において、これは典型的にはペンタマーを形成し、抗原への結合において高いアビディティを生じる。これはしばしば、十分な特異的ＩｇＧが産生される前に感染に対する最初の即時の防御である。ＩｇＡは通常ダイマーとして存在し、そして粘膜領域、例えば腸、肺及び尿生殖路において見出される。これはこれらの表面を病原体による集落形成に対して保護する。ＩｇＥは主にアレルギー反応に関与する。これはアレルゲンに結合してマスト細胞及び好塩基球からのヒスタミンの放出を開始させる。ＩｇＤは主に、抗原に対して暴露されていないＢリンパ球の表面上で見出される。
【０００４】
ヒトにおいてＩｇＧの４つのサブクラスが、正常血清中のそれらの相対的濃度にしたがって定義及び番号付けされる：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４、これらは血清ＩｇＧのそれぞれ約６０％、２５％、１０％及び５％を占め、それぞれのＩｇＧサブクラスは独特のエフェクター機能を有している。
【０００５】
一般に、それぞれ個々のモノマー免疫グロブリン単位、例えばＩｇＧ分子は、２つの同一の軽鎖及び２つの同一の重鎖からなり、これが今度は約１１０個のアミノ酸残基の反復構造モチーフを含む。軽鎖及び重鎖のドメインは、共有結合及び非共有結合で組になっており、それ故、可動性リンカー（いわゆるヒンジ領域）を介して接続された３つの独立したタンパク質部分を形成する。これらの部分のうち２つはＦａｂ（抗原結合フラグメント）領域と呼ばれ、同一の構造である。Ｆａｂ領域はそれぞれ同じ特異的抗原結合部位を形成する。第三の部分はＦｃ（結晶化可能フラグメント）領域であり、これはクリアランス及び輸送機構を活性化するリガンドに対する相互作用部位を形成する。
【０００６】
ＩｇＧは疾患において重要な役割を果たす。ＩｇＧ１型抗体は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）がしばしば重要と思われる場合にがんの免疫療法において最も一般的に使用される抗体である。さらに、ＩｇＧは、それらのＦｃフラグメントにより媒介される相互作用を通じて炎症促進性及び抗炎症性活性の両方を媒介することが知られている。一方では、Ｆｃとそのそれぞれの受容体との間の相互作用は免疫複合体及び細胞傷害性抗体の炎症促進特性の原因である。他方では、ガンマグロブリン静脈注射（ＩＶＩＧ）及びそのＦｃフラグメントは抗炎症性であり、そして炎症性疾患を抑制するために広く使用される。このような逆説的な特性の正確な機構は不明であるが、ＩｇＧのグリコシル化がＩｇＧの細胞傷害性及び炎症可能性の調節にとって非常に重要であるということが提案されてきた。
【０００７】
これまでに、ＩｇＧにより媒介される細胞傷害性及び炎症性作用の調節におけるグリコシル化の役割の研究は、主にＦｃ領域に焦点を合わせてきた。ＩｇＧのグリコシル化は、２つの重鎖の開構造を維持することによる全てのＦｃｙＲに対する結合に不可欠であった。ＦｃｙＲ結合に関するこのＩｇＧグリコシル化という要件は、脱グリコシル化したＩｇＧ抗体がインビボで誘発される炎症性応答、例えば抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、ファゴサイトーシス及び炎症メディエーターの放出を媒介することができないということを説明する。自己免疫状態とＩｇＧ抗体の特定のグリコシル化パターンとの間の関連性が、ＩｇＧ抗体の減少したガラクトシル化及びシアル酸付加が報告されている、関節リウマチ及びいくつかの自己免疫性血管炎（ｖａｓｃｕｌｉｔｉｅｓ）の患者において観察されている。（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３）。
【０００８】
特許文献１は、少なくとも１つのＩｇＧ  Ｆｃ領域を含有するポリペプチドを開示し、このポリペプチドは、未精製抗体と比較してより高い抗炎症活性及びより低い細胞傷害活性を有する。この出願において、Ｆｃフラグメント上のＮ連結グリコシル化部位の増加したシアル酸付加について濃縮されたＩｇＧ調製物がインビボで増強された抗炎症活性を示すことが見出された。対照的に、Ｆａｂフラグメントはこのインビボアッセイにおいて抗炎症活性を示さなかったと結論づけられた。
【０００９】
特許文献１と同じ発明者らによる特許文献２は、少なくとも１つのＩｇＧ  Ｆｃ領域を含有するポリペプチドを開示し、この少なくとも１つのＩｇＧ  Ｆｃ領域は、α−２，６連結によりそれぞれの末端シアル酸部分に接続された少なくとも１つのガラクトース部分でグリコシル化されている。特許文献２のポリペプチドは、未精製抗体と比較してより高い抗炎症活性を有する。またこの出願では、Ｆｃフラグメント上のＮ連結グリコシル化部位の増加したシアル酸付加について濃縮されたＩｇＧ調製物が、インビボで増強された抗炎症活性を示すことが見出された。対照的に、Ｆａｂフラグメントはこのインビボアッセイで抗炎症活性を示さなかったと結論づけられた。抗炎症活性が、ＦａｂフラグメントではなくＦｃフラグメント上の増加したシアル酸付加に起因するというさらなる証拠が、同じ発明者らによる特許文献３において提供されている。
【００１０】
Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎ及びＲａｖｅｔｃｈによる解説（非特許文献４）において、著者らはＦｃ領域におけるシアル酸付加がＩＶＩＧの抗炎症活性の鍵であると明確に教示する。さらに彼らは、ＩｇＧの抗炎症活性における抗原結合ドメイン（Ｆａｂ領域に位置する）に関する全般的な役割は彼らの方法ではなさそうであり、インタクトなＩＶＩＧ及びそのＦｃフラグメントは同等の抗炎症活性を有すると述べている。
【００１１】
特許文献４は、Ｆｃ含有分子の特性を制御するための方法に関し、この方法は、Ｆｃ領域におけるオリゴ糖のシアル酸付加を変更することを含む。この出願において、Ｆｃオリゴ糖のシアル酸付加のレベルがＦｃγ受容体の組換え産生された治療用抗体の親和性を変更し、これらの抗体の生物学的作用の種々の局面の調節をもたらすということが見出された。Ｆｃオリゴ糖からのシアル酸の除去が組換え産生された治療用抗体のそれらの標的分子に対するアビディティーを増強するということがさらに発見された。しかし、各Ｆａｂアームと標的との間の固有の親和性において差異が見られなかったのでこの効果はもっぱらＦｃに媒介されると考えられる。特許文献４の発明者らは、Ｆｃオリゴ糖から荷電した静止基（ｓｔａｔｉｃ  ｇｒｏｕｐ）を除去することにより抗体構造全体においてさらなる可動性が可能となり、それ故互いの関係において２つの結合ドメインについてより高い相互作用の可能性がもたらされると仮説を立てている。
【００１２】
Ｊｅｆｆｅｒｉｓによる最近の総説記事（非特許文献５）は、抗体ベースの治療を改善するためのストラテジーとしてグリコシル化について考察する。Ｊｅｆｆｅｒｉｓ  ２００９によれば、ポリクローナルヒトＩｇＧ分子の約３０％がＩｇＧ  Ｆａｂ領域においてＮ連結オリゴ糖を有しており、そしてＩｇＧ  ＦｃよりもＩｇＧ  Ｆａｂに対するより高いレベルのガラクトシル化及びシアル酸付加が観察される。存在する場合、グリコシル化は可変領域に付随し、そしてポリクローナルＩｇＧのＩｇＧ  Ｆａｂグリコシル化の機能的重要性は明らかではない。モノクローナル抗体での研究に基づいて、抗体のＦａｂ領域におけるグリコシル化が抗原結合に対して中立、ポジティブ又はネガティブな影響を有し得ると推測される。これをさらに研究することにも、Ｆａｂ領域においてグリコシル化された抗体集団を濃縮することにも動機付けは全くない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】国際特許出願ＷＯ  ２００７／１１７５０５
【特許文献２】国際出願ＷＯ  ２００８／０５７６３４
【特許文献３】国際出願ＷＯ  ２００９／０７９３８２
【特許文献４】国際出願ＷＯ  ２００７／００５７８６
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｐａｒｅｋｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１６，４５２  （１９８５）
【非特許文献２】Ｒａｄｅｍａｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１，６１２３  （１９９４）
【非特許文献３】Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１２８，６２１  （２０００）
【非特許文献４】Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎ  ＆  Ｒａｖｅｔｃｈ，ＪＥＭ  ２０４，１１−１５  （２００７）
【非特許文献５】Ｊｅｆｆｅｒｉｓ，Ｒ．；  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．２００９  Ｍａｒ；８（３）：２２６−３４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
従って、抗体のＦｃ領域において増加した量のシアル酸付加を有する抗体調製物は、種々の疾患の予防及び処置について熱心に研究されており、そしてまた抗体のＦａｂ領域のグリコシル化の可能性のある役割について考察されてきた。しかし、多数の抗体が現在使用されているが、代替物及び／又は臨床的応用においてより有益な有効性を有する改善された抗体調製物を提供する必要性が今もなお存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
この技術的課題に対する解決は、特許請求の範囲において特徴づけられる実施態様を提供することにより達成される。本発明者らは、驚くべきことに、Ｆａｂ領域において変更されたシアル酸付加を示す抗体の濃縮（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）が免疫調節特性を変更するということを示した。
【００１７】
発明の要旨
従って本発明の一実施態様は、抗体調製物からの濃縮により得られる抗体集団であり、ここで濃縮された抗体集団は、濃縮前の抗体調製物と比較して抗体のＦａｂ領域において変更された量のシアル酸付加を有し、そしてＦａｂ領域における変更されたシアル酸付加に基づく濃縮により、濃縮前の抗体調製物と比較した場合に濃縮された集団の免疫調節特性が変更されている抗体の集団が生じたものである。
【００１８】
好ましくは、本抗体集団は、抗体調製物をセイヨウニワトコ（Ｓａｍｂｕｃｕｓ  ｎｉｇｒａ）凝集素カラム又はその等価物でアフィニティークロマトグラフィーにかけること、並びに（ａ）非結合フラクション（−ＳＡフラクション）を集めること、及び／又は  （ｂ）結合フラクションを酸性ラクトースを用いて溶離すること（＋ＳＡフラクション）により生成され、それにより、−ＳＡフラクションがＦａｂ領域において減少した量のシアル酸付加を有し、かつ＋ＳＡフラクションがＦａｂ領域において増加した量のシアル酸付加を有し、そしてそれにより、Ｆａｂ領域において変更された量のシアル酸付加を有するフラクションが、変更された免疫調節特性を有する。
【００１９】
さらに好ましい実施態様は、上記の抗体集団であって、濃縮された抗体集団が、濃縮前の抗体調製物と比較して抗体のＦａｂ領域において変更された量のシアル酸付加を有し、ここでＦｃ部分におけるシアル酸付加の量は、検出された糖ペプチドの総量のうちシアル酸付加された糖ペプチドの％を測定した場合に、１００％（すなわち２倍）未満、好ましくは５０％（１．５倍）未満、より好ましくは３０％未満、さらにより好ましくは２０％未満だけ濃縮されているものである。
【００２０】
さらに好ましい実施態様は、上記の抗体集団であって、濃縮された抗体集団が、濃縮前の抗体調製物と比較して抗体のＦａｂ領域において変更された量のシアル酸付加を有し、Ｆａｂ部分におけるシアル酸付加の量は、濃縮前の抗体調製物中のＦａｂ領域におけるシアル酸付加の量と比較して、少なくとも１．２５倍、より好ましくは少なくとも１．５倍、より好ましくは少なくとも２倍、なおより好ましくは少なくとも３倍、最も好ましくは少なくとも４倍だけ変更されているものである。
【００２１】
本発明の別の実施態様は、抗体調製物から抗体集団を濃縮する方法であって、濃縮された抗体集団は濃縮前の抗体調製物と比較して抗体のＦａｂ領域において変更された量のシアル酸付加を有し、該方法は：
（ａ）  抗体調製物を、抗体のシアル酸付加されたＦａｂ領域に対する親和性を用いるアフィニティークロマトグラフィーにかける工程；
（ｂ−ｉ）  工程（ａ）において結合していない抗体集団を収集する工程；［ここで該抗体集団は、濃縮前の抗体調製物と比較して抗体のＦａｂ領域においてより少ない量のシアリル酸を有する（−ＳＡフラクション）］；及び／又は
（ｂ−ｉｉ）  工程（ａ）において結合している抗体集団を溶離して収集する工程、［ここで該抗体集団（＋ＳＡフラクション）は、濃縮前の抗体調製物と比較して抗体のＦａｂ領域においてより多い量のシアリル酸を有する］、
を含み、
ここでＦａｂ領域におけるシアル酸付加の変更された量に基づく濃縮により、濃縮前の抗体調製物と比較した場合に、変更された免疫調節特性を有する抗体の集団が生じたものである、方法である。
【００２２】
好ましくは、工程（ａ）におけるアフィニティークロマトグラフィーは、セイヨウニワトコ凝集素を用いる。好ましくは、得られた−ＳＡフラクション又は得られた＋ＳＡフラクションのＦｃ部分におけるシアル酸付加は、糖ペプチドの総量のうちシアル酸付加された糖ペプチドの％を測定した場合に、アフィニティークロマトグラフィー前の抗体調製物におけるＦｃシアル酸付加と１００％（２倍）未満、好ましくは５０％未満、より好ましくは３０％未満、最も好ましくは２０％未満だけ異なる。
【００２３】
好ましくは、抗体調製物は血漿免疫グロブリン調製物、より好ましくは血漿免疫グロブリンＧ調製物、なおより好ましくはヒト血漿免疫グロブリンＧ調製物、最も好ましくは静注用免疫グロブリンＧ（ＩＶＩＧ）又は皮下注用免疫グロブリンＧ（ＳＣＩＧ）である。
【００２４】
好ましい実施態様において、抗体のＦａｂ領域のシアル酸付加の量は、好ましくは酵素的に、さらに変更される。好ましくは、−ＳＡフラクションにおけるシアル酸付加の量は、シアル酸残基を除去する酵素によりさらに低減され、一方で＋ＳＡフラクションにおけるシアル酸付加の量は、シアル酸残基を付加する酵素によりさらに増加される。
【００２５】
１つの好ましい実施態様は、変更された量のシアル酸付加がＦａｂ領域におけるシアル酸付加の量の減少である、抗体集団又は抗体集団を生じる方法である。
【００２６】
本発明の第二の代替の好ましい実施態様は、シアル酸付加の変更された量が、Ｆａｂ領域におけるシアル酸付加の量の増加である、抗体集団又は方法である。
【００２７】
本発明のさらなる実施態様は、本発明の抗体集団を含む医薬組成物である。場合により、本医薬組成物は薬学的に許容しうる担体、添加剤及び／又は希釈剤を含み得る。
【００２８】
本発明のさらなる実施態様は、薬剤における使用のための、上記のようなＦａｂ領域におけるシアル酸付加が変更されている抗体集団である。
【００２９】
好ましい実施態様において、本発明の抗体集団は、アテローム性動脈硬化症、がん及び細菌感染症、ウイルス感染症又は真菌感染症のような感染症の予防及び／又は処置における使用のためのものである。
【００３０】
別の好ましい実施態様において、本発明の抗体集団は、炎症状態の予防又は処置における使用のためのものである。好ましくは、炎症状態は自己免疫疾患又は神経変性疾患であり、例えば自己免疫疾患又は神経変性疾患は、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、抗リン脂質抗体症候群、免疫性血小板減少症（ＩＴＰ）、川崎病、ギラン・バレー症候群（ＧＢＳ）、多発性硬化症（ＭＳ）、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパシー（ＣＩＤＰ）、皮膚水疱（ｓｋｉｎ  ｂｌｉｓｔｅｒｉｎｇ）疾患、皮膚筋炎、多発性筋炎、アルツハイマー病、パーキンソン病、ダウン症候群に関連するアルツハイマー病、脳アミロイド血管症、レビー小体型認知症、前頭側頭葉変性症及び血管性認知症である。好ましくは、炎症状態の処置において使用される抗体集団は、Ｆａｂ領域において増加したシアル酸含有量を有する。
【００３１】
発明の詳細な説明
本発明は、抗体調製物から濃縮された抗体集団に関し、ここで濃縮された抗体集団は、濃縮前の抗体調製物と比較して抗体のＦａｂ領域において変更された量のシアル酸付加を有する。好ましくは、抗体集団は、抗体調製物からの濃縮により得ることができ、ここで濃縮された抗体集団は、濃縮前の抗体調製物と比較して抗体のＦａｂ領域において変更された量のシアル酸付加を有し、そしてＦａｂ領域における変更されたシアル酸付加に基づく濃縮により、濃縮前の抗体調製物と比較した場合に、濃縮された集団の免疫調節特性が変更されている抗体の集団が生じたものである。
【００３２】
本実施態様に従う抗体集団は、明細書全体を通して「本発明の濃縮された抗体集団」とも呼ばれる。
【００３３】
本発明の全ての実施態様に従う用語「抗体集団」は、均質である（すなわち、１つの特定の抗体のみのいくつかの分子を含む）か、又は不均質（複数の異なる抗体を含む）のいずれかである抗体の群を指す。いずれの場合も、抗体集団はＩｇＧクラスの抗体から優先的になるかＩｇＧクラスの抗体を含む（以下も参照のこと）。しかし、これはＩｇＭ若しくはＩｇＡクラスの抗体、又はＩｇＧ、ＩｇＭ及び／若しくはＩｇＡクラスの免疫グロブリンの混合物も含むかこれらからなり得る。
【００３４】
本発明によれば、用語「濃縮された抗体集団」は、濃縮前の抗体調製物と比較して、それが目的の特定の特徴を有する、すなわち抗体のＦａｂ領域において変更された量のシアル酸付加を有する抗体をより多く含むという意味でより濃縮されている（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ）抗体集団を指す。用語「シアル酸付加の量」及び「シアル酸の量」は本明細書において交換可能に使用される。以下で定義されるように、シアル酸付加の変更された量は、抗体のＦａｂ領域におけるシアル酸付加の量の増加でも減少でもよい。従って、濃縮された抗体集団は、例えばそれらのＦａｂ領域においてシアル酸付加を有する抗体について濃縮され、従って濃縮前の抗体集団と比較して増加した量のシアル酸付加を有する集団を生じていてもよい。別の例として、濃縮された抗体集団は、それらのＦａｂ領域においてシアル酸付加を有していない抗体について濃縮され、従って、濃縮前の抗体集団と比較して減少した量のシアル酸付加を有する集団を生じていてもよい。好ましくは、濃縮された抗体集団は、濃縮前の抗体調製物中のＦａｂ領域におけるシアル酸付加の量と比較して少なくとも１．２５倍多いか若しくは少ない、より好ましくは少なくとも１．５倍多いか若しくは少ない、より好ましくは少なくとも２倍多いか若しくは少ない、例えば少なくとも３倍又は少なくとも４倍多いか若しくは少ない量のシアル酸付加を有することにより濃縮前の抗体調製物と異なる。より好ましくは、シアル酸付加の量は、濃縮前の抗体調製物中のＦａｂ領域におけるシアル酸付加の量と比較して少なくとも５倍多いか又は少ない。用語「倍多いか又は少ない」は、全グリカンのうちシアル酸付加されたグリカンの％を測定した場合に出発物質と比較した相対的な増加又は減少を指す。例えば、濃縮前の抗体集団がグリカンの１５％のシアル酸の量を有する場合、３倍多いか又は少ない量のシアル酸を有する濃縮された抗体集団は、それぞれ４５％又は５％のシアリル酸を有するグリカンの量を有する。ＩｇＧの場合、Ｆｃフラグメントのシアル酸付加は、トリプシンのようなプロテアーゼを用いた消化、続いて得られたＦｃ特異的糖ペプチドの分析（例えば実施例２，方法（ａ）に記載されるように）により決定され、そして本明細書で引用される濃縮についての数量は、全Ｆｃ特異的糖ペプチドのうち、１つ又はそれ以上のシアル酸残基を有するＦｃ特異的糖ペプチドの濃縮倍数又はパーセントを指す。ＩｇＧ分子のシアル酸付加の総量（Ｆａｂシアル酸付加及びＦｃシアル酸付加を含む）は、トリプシンペプチドをＮ−グリコシダーゼＦを用いて消化し、続いて放出されたグリカンを（例えば実施例２、方法（ｂ）において記載されるように）分析することにより決定され得る。この場合、数量は、全グリカンのうち１つ又はそれ以上のシアル酸残基を有するグリカンの数量又はパーセントを指す。
【００３５】
濃縮された抗体集団は、濃縮に使用される出発物質としての抗体調製物の選択に依存して、そして選択された濃縮方法に依存して、単離及び／又は精製された抗体集団であってもよい。本明細書において使用される「精製された抗体集団」は、１つのクラスの抗体（例えばＩｇＧ）のみを含む抗体集団を指す。抗体集団はまた、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３若しくはＩｇＧ４のような特定のサブクラスの抗体のみを含むか若しくは本質的にそれのみ（すなわち９０％より多く）を含むか、又はある抗原に対して確定された特異性の抗体のみを含むか若しくは本質的にそれのみを含むという趣旨で、精製され得る。用語「単離された抗体集団」は、抗体以外の分子を含まない抗体集団を指す。
【００３６】
本発明全体を通して使用される用語「抗体」は、例えばポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を包含する。用語「抗体」はまた、抗原結合特異性をまだ保持しているその誘導体又はフラグメントも含む。従って、キメラ（ヒト定常ドメイン、非ヒト可変ドメイン）、単鎖及びヒト化（非ヒトＣＤＲ以外はヒト抗体）抗体、さらにはとりわけＦａｂ又はＦａｂ'フラグメントのような抗体フラグメントのような実施態様も含まれる。抗体フラグメント又は誘導体は、Ｆｄ、Ｆ（ａｂ'）2、Ｆｖ又はｓｃＦｖフラグメントをさらに含む；例えばＨａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ  「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８８及びＨａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ  「Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９９を参照のこと。
【００３７】
本明細書全体を通して使用される用語「Ｆａｂ領域」は、抗体の各重鎖及び軽鎖からの１つの定常ドメイン及び１つの可変ドメインで構成される抗体の領域を指し、そしてこれは抗原結合に関与する部位を含む。それぞれのインタクトな天然ＩｇＧ抗体は２つのＦａｂ領域を含む。本発明によれば、用語「Ｆａｂフラグメント」は、抗体がパパインで消化される場合に一般的に得られる抗体のフラグメントに対して使用される。パパイン消化により、２つの重鎖を連結しているジスルフィド架橋の上側の抗体の切断が生じ、従って、２つの個々のＦａｂフラグメントが放出される。他方では、ペプシンを用いた消化により、抗体のヒンジ領域により一緒に連結される２つのＦａｂフラグメント（いわゆる「Ｆ（ａｂ'）2フラグメント」）が放出される。これらの酵素消化により消化されない抗体に関して、用語「Ｆａｂ領域」は、パパイン又はペプシンでの消化が行われた場合にＦａｂ及び／又はＦ（ａｂ'）2フラグメントを形成するであろう抗体の部分を指す。パパイン又はペプシン消化により得られる抗体フラグメントに関して、Ｆａｂ領域はＦａｂフラグメントに相当する。Ｆａｂフラグメントの場合、対応する分子はＦａｂ領域と同一である。
【００３８】
しかし、Ｆａｂ領域におけるグリコシル化は抗体の可変領域に位置するので、本発明の文脈において、Ｆｖ領域、単鎖Ｆｖフラグメント又は抗体の可変領域を含む他のフラグメントは等価と見なされる。
【００３９】
本発明の全ての実施態様によれば、抗体は血漿から抽出することができるか、又は例えばＨａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ（１９８８）及び（１９９９）（前出）に記載されるような、当該分野で公知の種々の手順のいずれか１つにより製造することができる。従って、抗体は、例えば合成により製造され得、そしてペプチド模倣剤も含み得る。さらに、単鎖抗体の製造に関して記載される技術（とりわけ米国特許第４，９４６，７７８号を参照のこと）が適用され得る。また、トランスジェニック動物又は植物（例えば米国特許第６，０８０，５６０号を参照のこと）が、（ヒト化）抗体を発現するために使用され得る。モノクローナル抗体の製造には、連続的な細胞株培養により産生される抗体を提供するいずれかの技術を使用することができる。例えばＨａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ（１９８８）及び（１９９９）（前出）に記載されるような、当該分野で公知のこのような技術の例としては、ハイブリドーマ技術（Ｋｏｅｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  Ｎａｔｕｒｅ  ２５６  （１９７５），４９５−４９７）、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ４  （１９８３），７２）及びヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８５），７７−９６）が挙げられる。用語「抗体」が、細胞において発現され得る抗体構築物、例えばとりわけウイルス又はプラスミドベクターを介してトランスフェクト及び／又は形質導入され得る抗体構築物を含むことも、本発明の文脈において考慮される。
【００４０】
本発明にしたがって使用される用語「変更された量のシアル酸付加」は、抗体集団におけるシアル酸の量の変化を指し、ここでシアル酸は上記集団の抗体のＦａｂ領域に位置している。従って、濃縮された抗体集団の抗体のＦａｂ領域におけるシアル酸の全体の量が、濃縮前の抗体調製物の抗体のＦａｂ領域におけるシアル酸の全体の量と異なる場合、濃縮された抗体集団のシアル酸付加の量は変更されている。シアル酸の量の変化は、増加した量のシアル酸であっても減少した量のシアル酸であってもよい。濃縮前の抗体調製物と比較して抗体集団が抗体のＦａｂ領域において変更された量のシアル酸付加を有するか否かの決定は、当該分野で公知の種々の方法のいずれかを使用して行うことができる。例えば、シアル酸付加の量は、濃縮前の抗体調製物及び目的の抗体集団の両方に対して決定することができ、そしてそのようにして得られた結果を直接比較することができる。シアル酸付加の量を決定する方法は当該分野で周知である。非限定的な例としては、実施例の項に詳述される方法、又は例えばＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ：Ｕｎｉｔ  １２．４  （Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ），１２．６（Ｒｏｙｌｅ  ｅｔ  ａｌ）及び１２．７（Ｈａｒｖｅｙ  ｅｔ  ａｌ），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（２００６）に記載されるような、目的の抗体のペプシン消化と、それに続くＦｃフラグメントからの得られたＦ（ａｂ’）2及びペプシンフラグメントの分離（例えばｃｅｎｔｒｉｃｏｎを使用する）、そしてこれらのフラクションにおけるシアル酸の定量（例えばＨＰＬＣ若しくはＭＳを用いるか又は酵素ベースの測光アッセイ、ＱＡ−ｂｉｏ  ＬＬＣ，Ｐａｌｍ  Ｄｅｓｅｒｔ，Ｃａ：ｑａ−ｂｉｏ．ｃｏｍで利用可能）が挙げられる。これらの方法は、本明細書に記載される全ての実施態様のシアル酸付加の変更された量の決定のために使用することができる。シアル酸付加の増加量又は減少量は、一般的に全グリカンのうちシアル酸付加されたグリカンの％として表されるか、又はＦｃシアル酸付加については糖ペプチドの総量のうちシアル酸付加された糖ペプチドの％として表される。
【００４１】
本発明によれば、用語「シアル酸」は、ノイラミン酸（９つの炭素の骨格を有する単糖）のＮ−置換又はＯ−置換誘導体を指す。このノイラミン酸誘導体のファミリーの最もよく知られたメンバーは、Ｎ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ又はＮＡＮＡ）である。このファミリーのさらなるメンバーはＮ−グリコリルノイラミン酸（ＮＧＮＡ又はＮｅｕ５Ｇｃ）であり、ここでＮｅｕ５ＡｃのＮ−アセチル基はヒドロキシル化されている。用語シアル酸には、２−ケト−３−デオキシノヌロソン酸（ＫＤＮ）（Ｎａｄａｎｏ  ｅｔ  ａＩ．（１９８６）  Ｊ．ＢｉｏＩ．Ｃｈｅｍ．２６１：１１５５０−１１５５７；Ｋａｎａｍｏｒｉ  ｅｔ  ａＩ．，Ｊ．ＢｉｏＩ．Ｃｈｅｍ．２６５：２１８１１−２１８１９  （１９９０））、さらには９−置換シアル酸、例えば９−Ｏ−ラクチル−Ｎｅｕ５Ａｃ又は９−Ｏ−アセチル−Ｎｅｕ５Ａｃのような９−Ｏ−Ｃ−Ｃ６アシルＮｅｕ５Ａｃ、９−デオキシ−９−フルオロ−Ｎｅｕ５Ａｃ及び９アジド−９−デオキシ−Ｎｅｕ５Ａｃ（Ｖａｒｋｉ，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２：２５−４０（１９９２）；Ｓｉａｌｉｃ  Ａｃｉｄｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，Ｒ．Ｓｃｈａｕｅｒ，Ｅｄ．（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２））も包含される。
【００４２】
本発明によれば、用語「免疫調節特性」は、抗体集団が免疫系に及ぼす作用を指す。免疫調節作用は免疫抑制でも免疫賦活でもよい。種々のインビトロ又はインビボでの方法が、抗体集団のような物質の免疫調節特性を測定するために当業者に利用可能である。例えば、単球由来細胞株、例えばＵ９３７細胞は、レチノイン酸又はビタミンＤを用いて増殖及び分化され得る。次いでこれらを試験物質の存在下及び不在下で、例えばインターフェロン−γ又は植物性血球凝集素を用いて刺激し得る。適切なインキュベーションの後、ＩＬ−８のような炎症マーカーの量を細胞の上清において測定することができ、そしてＵ９３７細胞上の細胞表面マーカー、例えばＣＤ５４、ＣＤ１４又はＣＤ４５を、例えば蛍光活性化細胞分析（ＦＡＣＳ分析）により決定することができる。免疫抑制、例えば抗炎症特性を有する物質は、コントロールサンプルと比較してより少ない量の炎症マーカーを生じるだろう。物質はこのようなアッセイを用いて抗炎症作用についてランク付けされ得る；生じた炎症マーカーが少ない量であるほど、抗炎症作用が高い。別の例は、ヒト血液から単離され、ロキソリビン又はＣｐＧのような特定の物質で刺激された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を試験物質の不在下又は存在下にて使用する方法である。試験物質によるインターフェロン−α産生の阻害は、免疫抑制、例えば抗炎症作用の指標になるだろう。免疫賦活を測定する同様のアッセイもまた利用可能である。例えば、例えばインターフェロン又は植物性血球凝集素又は類似の賦活薬による刺激を使用しないこと以外は上記と同じ方法を使用することができる。
【００４３】
本発明によれば、驚くべきことに、中性又は塩基性のｐＨでレクチンアフィニティークロマトグラフィーを使用して抗体調製物を分離することにより、抗体のＦｃ領域におけるシアル酸付加の量では小さい差異しか示さなかったが抗体のＦａｂ領域におけるシアル酸付加の量では大きな差異を示す抗体集団が得られるということを見出した。実施例４に示されるように、これらの集団は異なる抗原認識パターンを有し、これによりこれらのフラクションを例えばアテローム性動脈硬化症のような臨床適用において使用して有益な効果がもたらされ、この場合、特に抗体のＦａｂ領域において減少した量のシアル酸を有する集団について保護作用が示された。
【００４４】
本発明はまた、抗体調製物から抗体集団を濃縮する方法に関し、ここで濃縮された抗体集団は濃縮前の抗体調製物と比較して抗体のＦａｂ領域において変更された量のシアル酸付加を有し、該方法は：（ａ）  抗体調製物を、抗体のシアル酸付加されたＦａｂ領域に対する親和性を用いるアフィニティークロマトグラフィーにかける工程；（ｂ−ｉ）  工程（ａ）において結合していない抗体集団を収集する工程；［ここで該抗体集団は、濃縮前の抗体調製物と比較して抗体のＦａｂ領域においてより少ない量のシアル酸を有する（−ＳＡフラクション）］；及び／又は（ｂ−ｉｉ）  工程（ａ）において結合している抗体集団を溶離して収集する工程、［ここで該抗体集団は、濃縮前の抗体調製物と比較して抗体のＦａｂ領域においてより多い量のシアリル酸を有する（＋ＳＡフラクション）］を含み、
ここでＦａｂ領域におけるシアル酸付加の変更された量に基づく濃縮により、濃縮前の抗体調製物と比較した場合に、変更された免疫調節特性を有する抗体の集団が生じたものである。好ましくは、工程（ａ）におけるアフィニティークロマトグラフィーは、セイヨウニワトコ凝集素を用いる。好ましい実施態様において、−ＳＡフラクション又は＋ＳＡフラクションのＦｃ部分におけるシアル酸付加は、糖ペプチドの総量のうちシアル酸付加された糖ペプチドの％を測定した場合に、抗体調製物におけるＦｃシアル酸付加と、１００％（２倍）未満、好ましくは５０％未満、より好ましくは３０％未満、最も好ましくは２０％未満だけ異なる。
【００４５】
本発明に従う用語「抗体のシアル酸付加されたＦａｂ領域に対する親和性を用いるアフィニティークロマトグラフィー」は、アフィニティーマトリックスと抗体のＦａｂ領域に存在するシアル酸との間の特異的相互作用に基づいて、抗体の混合物を分離するクロマトグラフィー法に関する。それらのシアル酸に基づいて抗体を分離するいくつかの方法が当業者に公知であり、例えばレクチンクロマトグラフィー、シアル酸特異的化学リガンド、イオン交換クロマトグラフィー（例えばＡＩＥＸ）、疎水性若しくは親水性相互作用クロマトグラフィー又は混合モードの液体クロマトグラフィー（例えばアニオン−カチオン交換／疎水性相互作用クロマトグラフィー）（Ｍａｎｔ  ＣＴ，Ｊ  Ｓｅｐ  Ｓｃｉ．３１，２７５４，２００８）である。これらの方法は、例えば以下に詳述されるように、そして本発明の実施例において示されるように、Ｆａｂ領域に存在するそれらのシアル酸に基づいて抗体を分離することが可能となるように適合され得る。
【００４６】
Ｆａｂ領域において低レベルのシアル酸付加を有するかシアル酸付加を有していない抗体は本発明に従うアフィニティークロマトグラフィーにより結合されないので、工程（ａ）において結合しておらず工程（ｂ−ｉ）において収集される抗体集団は、濃縮前の調製物と比較して抗体のＦａｂ領域において減少した量のシアル酸付加を有する濃縮された集団である。換言すると、この抗体集団は、シアル酸が減少した集団である。工程（ａ）で結合し、工程（ｂ−ｉｉ）で収集される抗体集団は、Ｆａｂ領域において高レベルのシアル酸付加を有する抗体のアフィニティークロマトグラフィーに対する結合に起因して、濃縮前の調製物と比較して抗体のＦａｂ領域において増加した量のシアル酸付加を有する濃縮された集団である。従って、出発抗体集団の抗体は、抗体のＦａｂ領域において増加した量又は減少した量のいずれかのシアル酸付加を有する濃縮された集団に分離される。
【００４７】
本発明の方法の好ましい実施態様において、少なくとも１つの洗浄工程が、工程（ｂ−ｉ）と（ｂ−ｉｉ）との間で行われる。適切な洗浄液は当業者に周知であり、例えばｔｒｉｓ緩衝化生理食塩水（ＴＢＳ）又はリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）から選択される。
【００４８】
本発明の濃縮された抗体集団又は本発明の方法の好ましい実施態様において、抗体調製物は血漿免疫グロブリンＧ調製物である。
【００４９】
本発明に従う用語「血漿免疫グロブリンＧ調製物」は、血漿から単離された免疫グロブリンＧ調製物を指す。血漿から単離される免疫グロブリンＧは、循環Ｂ細胞（抗体を分泌する形質細胞）により分泌されたものであってよい。血漿免疫グロブリンＧ調製物は、例えばヒトのような哺乳動物から得ることができるが、  非限定的な例として、ヒト免疫グロブリンＧ調製物レパートリーを発現するトランスジェニック動物、例えばブタ、ヤギ、ヒツジまたはウシからも得ることができる（Ｅｃｈｅｌａｒｄ  Ｙ  ａｎｄ  Ｍｅａｄｅ  Ｈ．，「Ｔｏｗａｒｄ  ａ  ｎｅｗ  ｃａｓｈ  ｃｏｗ．」  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００２  Ｓｅｐ；２０（９）：８８１−２で概説される）。
【００５０】
より好ましい実施態様において、血漿免疫グロブリンＧ調製物は、静注用免疫グロブリンＧ（ＩＶＩＧ）である。
【００５１】
本発明に従う「静注用免疫グロブリンＧ（ＩＶＩＧ）」は当業者に周知であり、１千を超える血液ドナーの血漿から抽出されたプールＩｇＧ免疫グロブリンを含有する血漿調製物を指す。ＩＶＩＧは、免疫不全、炎症性疾患及び自己免疫疾患、さらには急性感染症のような疾患の処置のために静脈投与される製品としての薬剤において使用される。ＩＶＩＧの好ましい例はＰｒｉｖｉｇｅｎTMである。
【００５２】
別のより好ましい実施態様において、血漿免疫グロブリンＧ調製物は皮下注用免疫グロブリンＧ（ＳＣＩＧ）である。
【００５３】
本発明に従う「皮下注用免疫グロブリンＧ（ＳＣＩＧ）」は当業者に周知であり、ＩＶＩＧに類似であるが皮下投与される製品としての薬剤においてのみ使用される血漿調製物を指す。ＳＣＩＧの好ましい例はＨｉｚｅｎｔｒａTMである。
【００５４】
別のより好ましい実施態様において、血漿免疫グロブリンＧ調製物はヒト血漿免疫グロブリンＧ調製物である。
【００５５】
本発明の方法の別の好ましい実施態様において、抗体のシアル酸付加されたＦａｂ領域に対する親和性を用いるアフィニティークロマトグラフィーは、ｐＨ８〜１１でのレクチンアフィニティークロマトグラフィーである。
【００５６】
本発明に従う用語「レクチンアフィニティークロマトグラフィー」は、アフィニティーマトリックスがレクチンであるクロマトグラフィーに関する。凝集素のようなレクチンは、特定の炭水化物分子に結合することができるタンパク質であり、従ってそれらのグリカン基に基づいてタンパク質を分離することができる。本発明のレクチンアフィニティークロマトグラフィーにおける使用に適したレクチンの非限定的な例は、セイヨウニワトコ凝集素（ＳＮＡ、Ｓａｍｂｕｃｕｓ  ｎｉｇｒａ）、コムギ胚芽凝集素（ＷＧＡ、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）並びにイヌエンジュレクチン（ＭＡＬ、Ｍａａｃｋｉａ  ａｍｕｒｅｎｓｉｓ）アイソフォームＩ及びＩＩ（Ｍａｌ  Ｉ及び（ｕｎｄ）Ｍａｌ  ＩＩ）である。
【００５７】
本発明によれば、驚くべきことに、レクチンアフィニティークロマトグラフィーにおいて使用されるｐＨを適応させることがシアル酸に対するレクチンの結合能に影響を及ぼすということが見出された。レクチンは中性ｐＨでＦｃフラグメントにおけるシアル酸に結合するが、レクチンに対するＦｃフラグメントの結合は、塩基性ｐＨにおいてほとんど観察されなかった（実施例３において示されるとおり）。従って、実施例において示されるように、塩基性ｐＨを使用する場合、抗体のＦａｂ領域におけるシアル酸に基づく分離が可能となる。
【００５８】
より好ましい実施態様において、このｐＨ値は９〜１０の間であり、より好ましくはｐＨは９．５である。
【００５９】
好ましい実施態様において、レクチンはセイヨウニワトコ凝集素である。このレクチンでのアフィニティークロマトグラフィーは、塩基性でも中性でも、又はわずかに酸性のｐＨでも行われ得る。
【００６０】
本発明の方法の別の好ましい実施態様において、抗体のシアル酸付加されたＦａｂ領域に対する親和性を用いるアフィニティークロマトグラフィーは、抗体のＦａｂ領域のシアル酸付加に特異的なリガンドを使用して行われる。
【００６１】
本発明に従う「抗体のＦａｂ領域のシアル酸付加に特異的なリガンド」は、第一にシアル酸に特異的に結合し、第二に、Ｆａｂ領域におけるシアル酸に特異的に結合するが抗体の他の領域に含まれるシアル酸には結合しないリガンドである。このような特異的リガンドは、例えば分子認識の原理にしたがって合成的に生成される受容体分子を使用するような、当業者に周知の方法により得ることができる。受容体分子は、物質混合物中で目的とするグリコシル化パターン（例えばシアル酸付加）を有するタンパク質を認識することにより標的タンパク質を見分けて、種々の結合部位で同時にそれに結合し、そしてそれを物理的に三次構造に封入する。その後、標的タンパク質は溶離緩衝液のｐＨ値又は塩濃度を変化させることにより再び放出される。
【００６２】
より好ましい実施態様において、抗体のＦａｂ領域のシアル酸付加に特異的なリガンドは、例えばコンビナトリアルケミストリー及びリガンドスクリーニングにより得られた合成的に生成されたリガンドから選択される（Ｓｔｉｌｌ  ＷＣ，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２９，１５５，１９９６．Ｂｒａｄｙ  Ｐ，Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．２６，３２７，１９９７．Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ  Ｓ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３９，３１１１，１９９８）。
【００６３】
本発明の方法のより好ましい実施態様において、アフィニティークロマトグラフィーは、抗体のシアル酸付加されたＦａｂ領域に対するよりも、抗体のシアル酸付加されたＦｃ領域に対して低い親和性を有し、すなわち、親和性はＦｃシアル酸付加よりもＦａｂシアル酸付加に対して選択的である。従って、本発明の方法において使用されるアフィニティーマトリックスは、抗体のＦａｂ領域に含まれるシアル酸に優先的に結合するが、抗体のＦｃ領域に含まれるシアル酸には結合しないか又は小さい程度で結合するのみだろう。結果として、分離はＦａｂシアル酸付加に基づくので、工程（ｂ−ｉｉ）で得られる抗体集団は、Ｆｃシアル酸付加を有する抗体よりも、Ｆａｂシアル酸付加を有する抗体についてより多く濃縮されており、そして同様に、工程（ｂ−ｉ）において得られる抗体集団は、それらのＦｃシアル酸付加に関係なく、Ｆａｂシアル酸付加を有していないか又はほとんど有していない抗体についてより多く濃縮されている。好ましくは、Ｆｃシアル酸付加は、糖ペプチドの総量のうちシアル酸付加された糖ペプチドの％として測定した場合に、１００％未満、より好ましくは５０％未満、なおより好ましくは３０％未満、最も好ましくは２０％未満だけ異なるだろう。
【００６４】
本発明はさらに、濃縮前の抗体調製物と比較して、抗体のＦａｂ領域において変更された量のシアル酸付加を有する抗体集団に関する。
【００６５】
抗体集団が濃縮前の抗体調製物と比較して抗体のＦａｂ領域において変更された量のシアル酸付加を有するか否かの決定は、上記のように行うことができる。変更された量のシアル酸付加は、現在利用可能な多数の方法の検出限界内でのＩＶＩＧのシアル酸付加の量と同じでないシアル酸付加の量と見なされる。好ましくは、抗体集団のシアル酸付加の量は、濃縮前の抗体調製物中の抗体のＦａｂ領域におけるシアル酸付加の量と比較して、少なくとも１．２５倍多いか又は少なく、より好ましくは少なくとも１．５倍多いか又は少なく、より好ましくは少なくとも２倍多いか又は少なく、例えば少なくとも３倍又は少なくとも４倍多いか又は少ない。より好ましくは、シアル酸付加の量は、濃縮前の抗体調製物中の抗体のＦａｂ領域におけるシアル酸付加の量と比較して、少なくとも５倍多いか又は少ない。上記のような、用語「倍多いか又は少ない」は、濃縮前の抗体調製物中のシアル酸の量と比較した相対的な増加又は減少を指す。
【００６６】
濃縮前の抗体調製物と比較して抗体のＦａｂ領域において変更された量のシアル酸付加を有する本発明の抗体集団の好ましい実施態様において、抗体集団は血漿免疫グロブリンＧ調製物である。
【００６７】
より好ましい実施態様において、血漿免疫グロブリンＧ調製物はヒト血漿免疫グロブリンＧ調製物である。
【００６８】
本発明の抗体集団又は本発明の方法の好ましい実施態様において、抗体のＦａｂ領域のシアル酸付加の量はさらに変更される。
【００６９】
この実施態様において、シアル酸付加の量は、抗体のＦａｂ領域におけるシアル酸付加のさらなる増加又は減少が得られ、そしてそれぞれの抗体集団の全体的なシアル酸付加の量のさらなる変更がもたらされるように変更される。抗体のＦａｂ領域におけるシアル酸の量の増加と減少の両方が考慮される。本発明の抗体集団が抗体のＦａｂ領域において増加した量のシアル酸を有する場合、さらなる変更は抗体のＦａｂ領域におけるシアル酸の量のさらなる増加であることが好ましい。本発明の抗体集団が抗体のＦａｂ領域において減少した量のシアル酸を有する場合、さらなる変更は抗体のＦａｂ領域におけるシアル酸の量のさらなる減少であることも好ましい。
【００７０】
この実施態様において、シアル酸付加のパターン、すなわちシアル酸の型及び／又は抗体のＦａｂ領域におけるそれらの位置がさらに変更されることも考慮される。
【００７１】
より好ましい実施態様において、シアル酸付加パターンの変更は酵素的に達成される。
【００７２】
酵素による変更は、例えば、抗体のＦａｂ領域におけるシアル酸の量を増加させるためにシアリルトランスフェラーゼ及びシアル酸ドナーを使用することにより行われ得る。あるいは、抗体のＦａｂ領域におけるシアル酸の量の減少は、例えばシアリダーゼ酵素を使用して、それによりシアル酸を除去することにより達成され得る。
【００７３】
シアリルトランスフェラーゼの非限定的な例は、ＳＴ３Ｇａｌ  ＩＩＩ（α−（２，３）シアリルトランスフェラーゼとも呼ばれる（ＥＣ２．４．９９．６））、及びα−（２，６）シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．９９．１）である。α−（２，３）シアリルトランスフェラーゼは、Ｇａｌ−β−１，３ＧｌｃＮＡｃ又はＧａｌ−β−１，４  ＧｌｃＮＡｃグリコシドのＧａｌへのシアル酸の転移を触媒し（Ｗｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２１０１１（１９９２）；Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｅｉｊｎｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ＢｉｏＩ．Ｃｈｅｍ．２５６：３１５９（１９９１））、そして糖ペプチドにおけるアスパラギン連結オリゴ糖のシアル酸付加に関与する。α−（２，６）シアリルトランスフェラーゼの活性は、６−シアル酸付加オリゴ糖（６−シアル酸付加ガラクトースを含む）を生じる。α−（２，６）シアリルトランスフェラーゼの異なる形態が存在し、これは異なる組織から単離され得るか、又は組み換え技術を使用して産生され得る。
【００７４】
シアリダーゼ（ノイラミニダーゼ、Ｎ−アセチルノイラミネートグリコヒドロラーゼとも呼ばれる）の非限定的な例は、シアリダーゼＡｕ、アルファ−（２−３，６，８，９）（ＥＣ３．２．１．１８）；シアリダーゼＣｐ、アルファ−（２−３，６）（ＥＣ３．５．１．１８）及びシアリダーゼＳｐアルファ−（２−３）（ＥＣ３．５．１．１８）である。
【００７５】
抗体のＦａｂ領域におけるシアル酸付加の量の選択的変更を達成するために、抗体のＦｃ領域を当該分野で公知の種々の方法のいずれかにより酵素活性から保護してもよい。例えば、特異的Ｆｃ結合リガンドは、Ｆｃ領域をマスクするために使用され得る。このようなＦｃ特異的リガンドの非限定的な例としては、上記に記載されるような化学的に合成されたリガンド、又は可溶性Ｆｃ受容体、Ｆｃ特異的抗体若しくはプロテインＡ／Ｇのような生物学的リガンドが挙げられる。
【００７６】
さらに、細胞培養条件は、細胞培養において産生される抗体のシアル酸付加の量を変化させるために変更され得る。例えば、増加した量のシアル酸は、産生速度が減少して浸透圧が一般的に約２５０ｍＯｓｍ〜約４５０ｍＯｓｍの範囲に維持される場合に得られる。この及び他の適切な細胞培養条件は、例えば米国特許第６，６５６，４６６号に記載される。さらに、Ｐａｔｅｌら（Ｐａｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ，２８５，８３９−８４５（１９９２））により、抗体連結糖側鎖中のシアル酸の含有量は、抗体が腹水として又は無血清若しくは血清含有培地中で産生された場合に有意に異なるということを報告した。さらに、細胞培養に異なるバイオリアクターを使用すること、及び培地中の溶解酸素の量が抗体連結糖部分におけるガラクトース及びシアル酸の量に影響を与えることも示されている（Ｋｕｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．，１．６，４６２−４７０（２０００））。
【００７７】
本発明の抗体集団又は本発明の方法の別の好ましい実施態様において、変更された量のシアル酸付加は、上記のように、Ｆａｂ領域におけるシアル酸付加の量の減少である。
【００７８】
本発明の抗体集団又は本発明の方法の別の好ましい実施態様において、変更された量のシアル酸付加は、上記のように、Ｆａｂ領域におけるシアル酸付加の量の増加である。
【００７９】
本発明はさらに、薬剤における使用のための、本発明の抗体集団に関する。
【００８０】
本発明はさらに、炎症状態、例えば自己免疫疾患及び／又は神経変性疾患、例えば関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、抗リン脂質抗体症候群、免疫性血小板減少症（ＩＴＰ）、川崎病、ギラン・バレー症候群（ＧＢＳ）、多発性硬化症（ＭＳ）、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパシー（ＣＩＤＰ）、皮膚水疱（ｓｋｉｎ  ｂｌｉｓｔｅｒｉｎｇ）疾患、皮膚筋炎、多発性筋炎、アルツハイマー病、パーキンソン病、ダウン症候群に関連するアルツハイマー病、脳アミロイド血管症、レビー小体型認知症、前頭側頭葉変性症又は血管性認知症の処置における使用のための、本発明の抗体集団に関する。好ましくは、これらの状態における使用のための抗体集団は、Ｆａｂ領域において増加したシアル酸含有量を有する。
【００８１】
実施例６に示されるように、抗体のＦａｂ領域において変更された量のシアル酸付加を有する抗体集団は、例えばアテローム性動脈硬化症のような疾患の処置において使用され得る。
【００８２】
本発明はまた、本発明の抗体集団を含む組成物に関する。
【００８３】
本発明に従う用語「組成物」は、濃縮された抗体集団が濃縮前の抗体調製物と比較して抗体のＦａｂ領域において変更されたシアル酸付加パターンを有する、抗体調製物から濃縮された抗体集団を少なくとも含むか、又は濃縮前の抗体調製物と比較して抗体のＦａｂ領域において変更されたシアル酸付加パターンを有する抗体集団を少なくとも含む、組成物に関する。本組成物は、本発明の抗体集団の特徴を変更することができ、それにより例えば抗体の機能を低減、安定化、遅延、調節及び／又は活性化するさらなる分子を場合により含んでいてもよい。本組成物は、固形でも液状形態でもよく、そしてとりわけ、散剤（単数又は複数）、錠剤（単数又は複数）、液剤（単数又は複数）又はエアロゾル（単数又は複数）の形態であってよい。
【００８４】
好ましい実施態様において、本発明の組成物は、薬学的に許容しうる担体、添加剤及び／又は希釈剤を場合によりさらに含む医薬組成物である。
【００８５】
本発明によれば、用語「医薬組成物」は、患者、好ましくはヒト患者に投与するための組成物に関する。本発明の医薬組成物は、上記の抗体集団を含む。本発明の医薬組成物は、場合により、そしてさらに、薬学的に許容しうる担体を含み得る。「薬学的に許容しうる担体」により、任意の型の非毒性の固形、半固形、又は液体のフィラー、希釈剤、封入材料又は製剤化補助剤を意味する。適切な製薬用担体の例は当該分野で周知であり、これには塩化ナトリウム溶液、リン酸緩衝化塩化ナトリウム溶液、水、油／水エマルションのようなエマルション、種々の型の湿潤剤、滅菌溶液、有機溶媒などが含まれる。好ましくは、担体は非経口担体であり、より好ましくはレシピエントの血液と等張性の溶液である。担体は、等張性及び化学的安定性を増強する物質のような少量の添加剤を適切に含む。このような物質は使用される投薬量及び濃度でレシピエントに対して非毒性であり、そしてこれらとしては、リン酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、酢酸及び他の有機酸若しくはそれらの塩のような緩衝剤；アスコルビン酸のような抗酸化剤；低分子量（約１０未満の残基）の（ポリ）ペプチド、例えばポリアルギニン若しくはトリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、若しくはさらなる免疫グロブリンのようなタンパク質；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸若しくはアルギニン；単糖類、二糖類及びセルロース若しくはその誘導体を含む他の炭水化物、グルコース、マンノース、若しくはデキストリン；ＥＤＴＡのようなキレート剤；マンニトール若しくはソルビトールのような糖アルコール；ナトリウムのような対イオン；並びに／又はポリソルベート、ポロキサマー、若しくはＰＥＧのような非イオン性界面活性剤が挙げられる。
【００８６】
このような担体を含む組成物は、周知の従来の方法により製剤化され得る。一般に、製剤は医薬組成物の成分を均一かつ徹底的に液体担体又は微粉化された固形担体又はその両方と接触させることにより製造される。次いで、必要な場合、生成物を所望の製剤へと成形する。
【００８７】
これらの医薬組成物は適切な用量で被験体に投与され得る。投与計画は主治医及び臨床因子により決定されるだろう。医学技術分野において周知であるように、いずれか１患者についての投薬量が多くの因子に依存し、これには患者の大きさ、体表面面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、時間及び投与経路、全体的な健康、並びに同時に投与される他の薬物が含まれる。所定の状況についての治療有効量は、慣用の実験により容易に決定され、通常の臨床医又は医師の技術及び判断の範囲内である。医薬組成物は、１回の投与用でも、長期間にわたる規則的な投与用でもよい。一般に、医薬組成物の投与は、単回投与について例えば１０μｇ／体重ｋｇから２ｇ／体重ｋｇの範囲であるべきである。しかし、より好ましい投薬量は、単回投与について１００μｇ／体重ｋｇ〜１．５ｇ／体重ｋｇ、なおより好ましくは１ｍｇ／体重ｋｇ〜１ｇ／体重ｋｇ、そしてなおより好ましくは１０ｍｇ／体重ｋｇ〜５００ｍｇ／体重ｋｇの範囲であり得る。本発明の医薬組成物の投与は、様々な方法で、例えば静脈内、腹腔内、皮下、筋内、皮内、経口、鼻腔内又は気管支内投与により達成され得る。
【００８８】
治療投与に使用しようとする医薬組成物の成分は無菌でなくてはならない。無菌性は、滅菌ろ過膜（例えば０．２ミクロンの膜）を通してろ過することにより容易に達成される。
【００８９】
医薬組成物の成分は、通常、単回又は複数回用量の容器、例えば密封されたアンプル又はバイアルで、水溶液として、又は再構成用の凍結乾燥された製剤として保存される。凍結乾燥された製剤の例として、１０−ｍｌバイアルを滅菌ろ過された１％（ｗ／ｖ）水溶液５ｍｌで満たし、そして得られた混合物を凍結乾燥する。注入液剤は、凍結乾燥された化合物を静菌性の注射用蒸留水を使用して再構成することにより製造される。保存料及び他の添加剤、例えば抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、及び不活性ガスなどが存在していてもよい。医薬組成物は、その医薬組成物の意図される用途に依存してさらなる薬剤を含んでいてもよい。
【００９０】
本医薬組成物は、疾患、好ましくは以下に開示されるような疾患の処置に特に有用であり得る。
【００９１】
本発明はまた、アテローム性動脈硬化症、がん及び細菌感染症、ウイルス感染症又は真菌感染症のような感染症の予防及び／又は処置における使用のための本発明の抗体集団に関する。
【００９２】
本発明によれば、「アテローム性動脈硬化症」は、動脈血管に影響を及ぼす慢性疾患を指す。これは主にマクロファージ白血球の蓄積に起因する動脈壁における慢性炎症性応答であり機能的高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）によりマクロファージから脂肪及びコレステロールが適切に除去されることなく低密度リポタンパク質により促進される。これは動脈内で多発性プラークが形成されることにより引き起こされる。炎症はアテローム性動脈硬化症の全ての段階において中心的であり、先天性及び適応性の両方の免疫−炎症機構が関与する。疾患の進行は酸化されたリポタンパク質に対する自己抗体の形成、並びに循環するサイトカイン及び炎症マーカーの増加を伴う。
【００９３】
本発明によれば、「がん」は、制御されない細胞分裂、及び浸潤により隣接する組織中に直接増殖するか、又は転移により離れた部位への移入（この場合、がん細胞は血流又はリンパ系を通って輸送される）のいずれかにより広がるこれらの能力を特徴とする疾患又は障害のクラスを指す。
【００９４】
本発明によれば、「感染」は、外来種による宿主生物の有害な集落形成である。感染において、感染した生物は、（通常宿主を犠牲にして）増殖するために宿主の資源を利用しようとする。感染に対する宿主の応答は炎症である。
【００９５】
本発明によれば、細菌感染症としては、細菌性髄膜炎、コレラ、ジフテリア、リステリア症、百日咳（Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）（百日咳（Ｗｈｏｏｐｉｎｇ  Ｃｏｕｇｈ））、肺炎球菌性肺炎、サルモネラ症、破傷風、チフス、結核、黄色ブドウ球菌又は尿路感染症が挙げられるがこれらに限定されない。
【００９６】
本発明によれば、ウイルス感染症としては、単核球症、ＡＩＤＳ、水痘、感冒、サイトメガロウイルス感染症、デング熱、エボラ出血熱、手足口病、肝炎、インフルエンザ、耳下腺炎、灰白髄炎、狂犬病、痘瘡、ウイルス性脳炎、ウイルス性胃腸炎、ウイルス性脳炎、ウイルス性髄膜炎、ウイルス性肺炎又は黄熱が挙げられるがこれらに限定されない。
【００９７】
本発明に従う真菌感染としては、アスペルギルス症、ブラストミセス症、カンジダ症、コクイシジオイデス真菌症、クリプトコックス症、ヒストプラスマ症、又は足部白癬症が挙げられるがこれらに限定されない。
【００９８】
本発明の抗体集団が、例えば例えば抗生物質（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃａ）耐性の発生に起因して（ｄｕｅ）、従来の処置計画に影響を受けない感染症の予防及び／又は処置において使用され得ることは特に好ましい。
【００９９】
本発明はさらに、炎症性状態、例えば自己免疫疾患及び／又は神経変性疾患、例えば関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、抗リン脂質抗体症候群、免疫性血小板減少症（ＩＴＰ）、川崎病、ギラン・バレー症候群（ＧＢＳ）、多発性硬化症（ＭＳ）、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパシー（ＣＩＤＰ）、皮膚水疱（ｓｋｉｎ  ｂｌｉｓｔｅｒｉｎｇ）疾患、皮膚筋炎、多発性筋炎、アルツハイマー病、パーキンソン病、ダウン症候群に関連するアルツハイマー病、脳アミロイド血管症、レビー小体型認知症、前頭側頭葉変性症又は血管性認知症の処置における使用のための、本発明の抗体集団に関する。好ましくは、これらの状態における使用のための抗体集団は、Ｆａｂ領域において増加したシアル酸含有量を有する。
【０１００】
用語「炎症性状態」は、炎症に関連する異常を指し、これは多数のヒトの疾患の根底にある。炎症は有害な刺激に対する複雑な生物学的応答であり、有害な刺激を除去して治癒を開始しようとする身体の試みである。しかし、異常が生じて慢性炎症又は自己免疫疾患のような炎症性状態をもたらし得る。
【０１０１】
用語「自己免疫疾患」は、免疫系が自己抗原を攻撃する状態を指す。例としては、関節リウマチ、多発性硬化症、狼瘡、重症筋無力症、乾癬が挙げられる。
【０１０２】
用語「神経変性疾患」は、ニューロンの死を含むニューロンの構造又は機能の進行性の喪失が見られる状態を指す。神経変性疾患の例としては、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、ハンティングトン病が挙げられる。
【０１０３】
本明細書中に記載される疾患は全て当業者に周知であり、従来技術及びに当業者の一般的な知識に従って定義されている。
【０１０４】
アテローム性動脈硬化症の予防及び／又は処置における使用には、抗体のＦａｂ領域において減少した量のシアル酸を有する抗体集団を使用することが特に好ましい。
【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１】レクチンアフィニティークロマトグラフィー（ＳＮＡ）を使用したＩＶＩＧの分画。典型的なクロマトグラムを示す（Ａ）。ＩｇＧ中の総シアル酸含有量を非還元条件（Ｂ及びＣ）又は還元条件（Ｄ）を使用してＳＤＳ−ＰＡＧＥでの分離の間にレクチンブロットを用いてモニタリングした。クーマシー染色ゲル（Ｂ）及びＳＮＡ−ビオチンプローブ（ｐｒｏｂｅｄ）ブロット（Ｃ及びＤ）を示す。重鎖及び軽鎖のシアル酸付加を検出することができた（Ｄ）。
【図２】ＩＶＩＧ中のシアル酸付加Ｎ−グリカンを（実施例２及び４に記載されるように）ＬＣ−ＭＳ分析により測定した。総Ｎ−グリカン、Ｆｃ−特異的糖ペプチド及びＦ（ａｂ’）2−グリカンの相対的な量を異なるＩＶＩＧフラクションについて計算した。Ｆ（ａｂ’）2−グリカンをＩＶＩＧ、−ＳＡ  ＩＶＩＧ及び＋ＳＡ  ＩＶＩＧからペプシン消化により製造した。
【図３】異なるレクチンアフィニティークロマトグラフィー条件の比較。ｐＨ７．５（Ａ）又はｐＨ９．５（Ｂ）でのレクチンアフィニティークロマトグラフィーを使用して分離されたＩＶＩＧからのＦｃフラグメントのレクチンブロット分析。Ｆｃ  ＦＴ：ロードされたＦｃのフロースルー（シアル酸減少フラクション；−ＳＡ  Ｆｃ）；ＦｃＥ：溶離液（シアル酸濃縮フラクション；＋ＳＡ  Ｆｃ）。
【図４】元のＦ（ａｂ'）2フラグメント及び分画されたＦ（ａｂ'）2フラグメントのグリカンプロフィール。ＩＶＩＧからのＦ（ａｂ'）2フラグメントをレクチンアフィニティークロマトグラフィーを使用して分離した。グリカンをＰＮＧａｓｅＦ消化によりＦ（ａｂ'）2から放出させて、Ｃ１８クロマトグラフィーにより精製し、そしてアルジトールに変換し、そしてＬＣ−ＭＳでネガティブモードにてＡｇｉｌｅｎｔ  Ｑ−ＴＯＦで黒鉛化カーボンブラックＨＰＬＣカラムを使用してグリカン分離について分析した。
【図５】特異的抗体及びＦ（ａｂ'）2中のシアル酸の分布。ＩＶＩＧからのＦ（ａｂ'）2フラグメントから生成された＋／−ＳＡフラクションを特徴付けすることにより、レクチンベースの分離におけるＦａｂシアル酸付加の寄与に取り組んだ。Ｆ（ａｂ’）2  １ｇあたりの相対的抗Ｂ１９ウイルス力価を市販のＥＬＩＳＡキットを使用して測定し、そしてＩＶＩＧ由来のＦ（ａｂ’）2に対して正規化した（Ａ）。シアル酸付加Ｎ−グリカンの相対的な量をＦ（ａｂ'）2フラクションのＬＣ−ＭＳ分析（Ｂ）、及びＨＰＬＣを用いたＩｇＧあたりの酸放出シアル酸の定量（Ｍｏｌ／Ｍｏｌ）（Ｃ）から計算した。
【図６】ＩＶＩＧのシアル酸濃縮フラクション対減少フラクションへの特異的抗体の分布。サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、破傷風毒素（ＴｅｔＴｏｘ）、Ｂ１９ウイルス（Ｂ１９Ｖ）、風疹及び麻疹（Ｍｅａｓｅｌｓ）に対する特異的抗体の分布を、市販のＥＬＩＳＡキットを使用して測定した（パネルＡ）。ウサギ、ヒツジ及びヒトの赤血球に対する結合を、蛍光標識抗ヒトＩｇＧ二次抗体を使用するＦＡＣＳ分析により測定した。
【図７】全ＩＶＩＧ、「ＩＶＩＧ＋ＳＡ」又は「ＩＶＩＧ−ＳＡ」で処置されたマウス及びコントロールマウス（「ＰＢＳ」）における大動脈尖（ａｏｒｔｉｃ  ｃｕｓｐｓ）の外観から２００、４００、６００及び８００μｍで測定された病変密度。病変密度は、病変により占められる大動脈横断面のパーセントを表す。左上及び右上のパネルは同等のものであるが、右のパネルでは分析された４つのレベルの値を平均している。下の表は：Ｆｉｓｃｈｅｒの事後検定（ｐｏｓｔｈｏｃ  ｔｅｓｔ）を示す。Ｓ：統計学的に有意。
【図８】（ａ）  ＴＬＲ７アゴニストロキソリビン（２００μＭ）で刺激された、末梢血単核細胞によるインターフェロン−アルファ（ＩＦＮ−α）産生の、ＩＶＩＧ又は対応するＦ（ａｂ’）２フラグメントフラクション（セイヨウニワトコ凝集素でのアフィニティークロマトグラフィーによりＦａｂ領域において増加された（＋ＳＡ）又は減少した（−ＳＡ）シアル酸付加）による阻害
【実施例】
【０１０６】
以下の実施例は、本発明を説明することを意図されるが限定することを意図されない。
【０１０７】
実施例１：２，６シアル酸特異的セイヨウニワトコ凝集素（ＳＮＡ）を使用したＩＶＩＧの分画
１００ｍｌ  ｔｒｉｓ緩衝化食塩水（ＴＢＳ）（０．１ｍＭ  ＣａＣｌ2、ｐＨ  ９−１０）中の１ｇ  ＩＶＩＧを１００ｍｌ  セイヨウニワトコ凝集素（ＳＮＡ）カラムで１時間再循環させた。１００ｍｌ  ＴＢＳ／ＣａＣｌ2洗浄液と一緒にフロースルーを集めた。ＴＢＳ  ２Ｘ  ２００ｍｌで洗浄した後、ＳＮＡカラムに結合したフラクション（＋ＳＡ  ＩＶＩＧ）を０．２Ｍ酢酸中０．５Ｍラクトース２００ｍｌで溶離した。二度目のフロースルーフラクションをカラムに流して−ＳＡ  ＩＶＩＧを得た（図１）。
【０１０８】
ＩｇＧ中の総シアル酸含有量を、ＳＤＳ  ＰＡＧＥ（非還元条件）及びレクチンブロットでモニタリングした（図１）。得られたＩＶＩＧフラクションを、Ｎｕｐａｇｅ  １０％  ＢｉｓＴｒｉｓゲルを使用するＳＤＳ  ＰＡＧＥで分離した。ゲルをクーマシーで染色してニトロセルロースにブロットした。ブロットをビオチン−ＳＮＡ及びＡＰ−ストレプトアビジンを用いてプローブし（ｐｒｏｂｅｄ）、そして発色基質で可視化した。図１Ｄにおいて、重鎖及び軽鎖を還元条件下でのＳＤＳ  ＰＡＧＥで分離した。ＳＮＡ−ビオチンでプローブしたレクチンブロットにおいて、両方の鎖は明確に現れ、軽鎖シアル酸付加を示していた。それ故、有意なＦａｂシアル酸付加は＋ＳＡ  ＩＶＩＧで検出することができた。
【０１０９】
シアル酸の定量
シアル酸を酸性加水分解により放出させて、１，２−ジアミノ−４，５−メチレンジオキシベンゼン二塩酸塩（ＤＭＢ）を用いて誘導体化を行った。定量はＮ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）を標準として使用する逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）で行い、そしてＩｇＧあたりのシアル酸（質量／質量又はＭｏｌ／Ｍｏｌ）で表した。
【０１１０】
この方法を用いて、分離前のＩＶＩＧと比較して、ＩｇＧあたり（Ｍｏｌ／Ｍｏｌ）、＋ＳＡ  ＩＶＩＧにおける総シアル酸の５倍の増加、及び−ＳＡ  ＩＶＩＧにおける総シアル酸の２倍の減少が見られた（データは示していない）。
【０１１１】
実施例２：グリカン分析
分離前後のＩＶＩＧのグリコシル化プロフィールを調べるために、典型的なＩＶＩＧ調製物のＦｃ領域由来のトリプシン糖ペプチドを同定してプロファイリングし、そしてＩＶＩＧの総Ｎ−グリカン集団をグリカン放出及び分析によりプロファイリングした。
【０１１２】
方法
（ａ）  ペプチドマッピングによるＩｇＧ１及びＩｇＧ２／３  Ｆｃグリカンプロフィールの決定
ＩＶＩＧサンプルを、トリプシン消化後に液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）により分析して、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２／３  Ｆｃ領域に特異的なグリカンプロフィールを決定した。ＩｇＧ２  Ｆｃ領域についてモニタリングした糖ペプチドはＩｇＧ３  Ｆｃ領域にも見出され得、そのためこれらをＩｇＧ２／３と呼ぶ。血清中のＩｇＧサブクラスの既知の相対的存在量に基づいて、ＩｇＧ２／３ペプチドについて見られるシグナルの大部分はＩｇＧ２分子起源であると予想される。変性、還元（グアニジン−ＨＣｌ及びＤＴＴと共に加熱）及びアルキル化（ヨードアセトアミドを用いる）の後に、１：５０の酵素対基質比を使用してトリプシン消化した。トリプシンペプチドを単離し、そしてＣ１８固相抽出（ＳＰＥ）スピンカラムで精製し、そして真空下でチューブ中にて乾燥した。ＬＣ−ＭＳ分析を、ペプチド分離にＡｇｉｌｅｎｔ  Ｐｒｏｓｈｅｌｌ  ３００ＳＢ−Ｃ１８カラムを使用するＡｇｉｌｅｎｔ  Ｑ−ＴＯＦシステムで行った。クロマトグラムを抽出し、そして［Ｍ＋２Ｈ］２＋及び［Ｍ＋３Ｈ］３＋シグナルを合計し、そして推定構造の計算されたモノアイソトピック質量を使用して各ＩｇＧ１及びＩｇＧ２／３糖ペプチドについて統合した。データを分析し、そしてＡｇｉｌｅｎｔ  ＭａｓｓＨｕｎｔｅｒソフトウェア、バージョンＢ．０２．００（Ｈｕｄｄｌｅｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  ６５，８７７，１９９３）を使用して処理した。
【０１１３】
ＩｇＧ糖ペプチドの同定
トリプシン消化物のＬＣ−ＭＳ分析は複雑なクロマトグラムを生じた。有効な糖ペプチドを同定するために、ＩｇＧサブクラス１〜４について重鎖定常領域の配列をＥｎｔｒｅｚタンパク質データベースから得た（それぞれ受入番号１２０５４０７２、１２０５４０７４、１２０５４０７６及び１２０５４０７８）。配列をインシリコで消化した。表１に列挙されるペプチドを、Ｎ−連結グリコシル化コンセンサス配列の存在により有効な糖ペプチドと同定した。これらのペプチドの理論的質量を共通のＩｇＧグリカンＧ０Ｆと結びつけて、予測［Ｍ＋３Ｈ］３＋イオンも計算した。
【０１１４】
表１．４つのＩｇＧサブクラスからの予測糖ペプチドのリスト。Ｎ−連結グリコシル化コンセンサス配列を太字で強調している。裸の（ｂａｒｅ）ペプチド、Ｇ０Ｆグリカンに接続されたペプチド、及び［Ｍ＋３Ｈ］３＋イオンの計算されたモノアイソトピック質量を示す。
【表１】
0006008740.tif 000002
【０１１５】
（ｂ）  全体的なグリカンプロフィールの決定
サンプルを以下のように分析して全体的なグリカンプロフィールを決定した。各サンプル２５０μｇから誘導された乾燥トリプシンペプチドを５０μＬ  １００ｍＭ  ＮＨ4ＨＣＯ3で再構成し、そして２５０Ｕ  Ｎ−グリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅ  Ｆ）と共に３７℃で終夜インキュベートした。二回目のＣ１８  ＳＰＥ精製を行い、脱グリコシルしたトリプシンペプチドを放出されたグリカンから分離した。放出されたグリカンを、塩基性水素化ホウ素ナトリウム溶液を使用して、終夜４５℃でインキュベートしてアルジトールに変換した。残りのボロハイドライドの分解後、グリカンアルジトールをＤｏｗｅｘ  ５０  ＷＸ４−４００イオン交換樹脂スピンカラムで脱塩して乾燥した。残りのホウ酸を除去するためにメタノール中１％酢酸の添加及びエバポレーションを繰り返した。グリカンアルジトールを出発移動相（１０ｍＭ  ＮＨ4ＨＣＯ3）で再構成し、そしてネガティブモードでＬＣ−ＭＳで繰り返して分析した。１０ｍＭ  ＮＨ4ＨＣＯ3／アセトニトリル移動相系を使用する黒鉛化カーボン高速（ｈｉｇｈ）ＨＰＬＣカラムでグリカン分離を行った。クロマトグラムを抽出して、各グリカンについて統合した。グリカンアルジトールの［Ｍ−１Ｈ］１−、［Ｍ−２Ｈ］２−、及び［Ｍ−３Ｈ］３−シグナルからのシグナルを合計した。グリカンアルジトールの製造及び分析は、以前に報告された研究と同様である（Ｋａｒｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ  １８，２２８２，２００４）。
【０１１６】
結果
Ｆｃにおけるシアル酸付加のレベルは、ＩＶＩＧ及び−ＳＡ  ＩＶＩＧに比べて＋ＳＡ
ＩＶＩＧではあまり高くなかった。図２に示されるように、Ｆｃ領域における全ての糖ペプチドのうちシアル酸付加された糖ペプチドの％は２０％未満（すなわち、全てのペプチドの１０．３％〜１２．１％）しか変わらなかった。他方で、全てのＮ−グリカンのシアル酸付加レベル（Ｆａｂ領域及びＦｃ領域におけるシアル酸付加を含む）は、＋ＳＡ  ＩＶＩＧフラクションにおいて有意に高く（図２）：ほとんど７０％（すなわち、全てのグリカンの５０．０％から８４．５％）増加している。これらの結果に基づいて、それぞれより高い、より低いシアル酸付加レベルは、ＩＶＩＧのＦａｂ領域における異なるシアル酸付加に主に起因すると結論づけることができる。
【０１１７】
要約すれば、実施例１に記載される分画方法により、元のＩｇＧ調製物（ＩＶＩＧ）と比較してより高いシアル酸付加（＋ＳＡ  ＩＶＩＧ）又はより低いシアル酸付加（−ＳＡ  ＩＶＩＧ）のＩｇＧ調製物が生じる。観察されたより高いシアル酸付加レベルは、ＩｇＧのＦａｂ領域におけるより高いシアル酸含有量に主に起因する。
【０１１８】
実施例３：ｐＨ７．５又は９．５でのレクチンアフィニティークロマトグラフィーの比較
シアル酸付加されたＦｃの結合親和性に対する、レクチンアフィニティークロマトグラフィーにおいて適用される異なるｐＨ条件の効果を比較するために、ＩＶＩＧをパパインで消化した（パパイヤ（ｐａｐａｙ）ラテックス、０．７Ｕ／ｍｇ  ＩｇＧ  ２時間３７℃）。Ｆｃフラグメントを、プロテインＡ、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）及びタンパク質Ｌを使用して（例えばＣｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ：Ｕｎｉｔ  ２．７及び２．８（Ａｎｄｒｅｗ  ｅｔ  ａｌ）  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ  （１９９７）に記載されるように）精製した。ＩＶＩＧから生じたＦｃフラグメントをＳＮＡカラムにロードして、ｐＨ７．５又はｐＨ９．５のいずれかのＴＢＳを使用したことを除いて上記のような方法を使用して分離した。得られたフラクションの等しいアリコートをＳＤＳ  ｐａｇｅ（Ｎｕｐａｇｅ  １０％  ＢｉｓＴｒｉｓ  Ｇｅｌｓ）を用いて分離し、そしてニトロセルロースにブロットし、これらのブロットをビオチン−ＳＮＡ及びＡＰ−ストレプトアビジンでプローブし、そして発色基質で可視化した（図３）。
【０１１９】
中性ｐＨ（ｐＨ７．５）で行ったレクチンクロマトグラフィーはシアル酸付加Ｆｃフラグメントの有意な濃縮をもたらした（図３Ａ、溶離液Ｅ）。他方で、アルカリ条件（ｐＨ９．５）を使用すると、図３Ｂ（溶離液Ｅ）に示されるように、検出可能な量のより高いシアル酸付加Ｆｃはほとんどなかった。これらの知見は実施例２の結果と一致しており、この場合、＋ＳＡフラクションと−ＳＡフラクションとの間でＦｃシアル酸付加における有意な差は検出できなかった。アルカリｐＨ条件の使用は、Ｎ−グリカン全体の増加したシアル酸付加レベルにもかかわらずシアル酸付加Ｆｃに対してレクチンクロマトグラフィーにおいて非常に低い結合親和性をもたらすので、このことは、このシアル酸付加がＦａｂ領域であることを示す。
【０１２０】
さらに、この実験は、単離されたＦｃフラグメントがレクチンアフィニティークロマトグラフィーを使用して分離される場合、これにより、インタクトなＩｇＧ分子の分離と比較して異なるＦｃシアル酸付加レベルを有するフラクションが生じるということを示す。このことは、レクチン結合Ｆａｂ領域が存在しないことで説明できる。
【０１２１】
実施例４：Ｆ（ａｂ’）2及び＋／−ＳＡ  Ｆ（ａｂ'）2のグリカン分析
Ｆ（ａｂ'）2はＩＶＩＧのペプシン消化により製造した。酢酸緩衝液中ｐＨ４．０で２時間３７℃にてペプシン（０．５ｍｇ／ｇ  ＩＶＩＧ）を用いてＩＶＩＧを消化した。ｐＨ８に達するまで２Ｍ  Ｔｒｉｓ塩基を加えることにより反応を停止させた。濃縮及び低分子消化生成物からの精製、そしてＰＢＳへの緩衝液交換をＣｅｎｔｒｉｃｏｎ（３０’０００  Ｍｗカットオフ）を使用して（例えばＣｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ：Ｕｎｉｔ  ２．７及び２．８（Ａｎｄｒｅｗ  ｅｔ  ａｌ）  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ  （１９９７）に記載されるように）行った。シアル酸が濃縮及び減少されたＦ（ａｂ'）2をレクチンアフィニティークロマトグラフィーによりＳＮＡ−アガロースを使用して製造した。Ｆ（ａｂ’）2（１２ｍｌ  ＴＢＳ（０．１ｍＭ  ＣａＣｌ2、ｐＨ  ９．５）中８０ｍｇ）を１時間ＳＮＡ−アガロース１２ｍｌにロードした。フロースルーフラクションを集めて−ＳＡ  Ｆ（ａｂ'）2と名付けた。ＴＢＳ  ２４ｍｌで２回洗浄した後、＋ＳＡ  Ｆ（ａｂ'）2フラクションを０．２Ｍ酢酸中０．５Ｍラクトース２４ｍｌで溶離した。
【０１２２】
トリプシン消化の後、サンプルをＬＣ−ＭＳにより分析した。材料の変性、還元、そしてアルキル化の後、上記のようにトリプシン消化を行った。サンプルを上記のように（実施例２）分析して全体的なグリカンプロフィールを決定した。
【０１２３】
全ＩＶＩＧグリカン及びＦ（ａｂ'）２グリカンのプロファイリング
１６の異なるグリカン種の相対的な定量を、グリカン放出及びアルジトールへの変換後のサンプルについて行った。一般に、レクチンに結合したフラクションは、分画していないサンプルと比較して、非シアル酸付加グリカンの減少及びシアル酸付加グリカンの増加を示す。逆に、非結合フラクションは分画していないサンプルよりも、シアル酸付加グリカンが低く非シアル酸付加グリカンが高かった。レクチンに結合したＦ（ａｂ'）2は非シアル酸付加グリカンをほとんど含まない（図４、図５Ｂ及びＣ）。
【０１２４】
Ｆ（ａｂ'）2における特異的抗体及びシアル酸の分布
ＩＶＩＧ由来のＦ（ａｂ'）2フラグメントから製造された＋／−ＳＡフラクションの特徴付けにより、レクチンベースの分離におけるＦａｂシアル酸付加の寄与に取り組んだ。＋ＳＡ  Ｆ（ａｂ'）2において、より多い相対量のシアル酸付加Ｎ−グリカンがＬＣ−ＭＳ分析で観察され、そしてより高い量の総シアル酸が、ＨＰＬＣで酸放出シアル酸を定量した場合に検出された（図５Ｂ及びＣ）。抗Ｂ１９ウイルス力価の差は、＋ＳＡ  対  −ＳＡ  Ｆ（ａｂ'）2フラクションが異なる抗原認識パターンを有するということを示す（図５Ａ）。
【０１２５】
実施例５：ＩＶＩＧのシアル酸濃縮フラクション対シアル酸減少フラクションへの特異的抗体の分布
サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、破傷風毒素（ＴｅｔＴｏｘ）、Ｂ１９ウイルス（Ｂ１９Ｖ）、風疹及び麻疹に対する特異的抗体の分布を市販のＥＬＩＳＡキットを使用して測定した（図６Ａ）。ウサギ、ヒツジ及びヒトの赤血球に対する結合を、蛍光標識及び抗ヒトＩｇＧ二次抗体を使用してＦＡＣＳ分析により測定した。
【０１２６】
結果は、ＩｇＧ  １ｇあたり測定された抗原について異なる相対的抗体力価が３つのＩＶＩＧフラクションにおいて見られるということを示す（図６）。ＩＶＩＧフラクションの抗原認識パターンにおけるこの差は、様々な臨床適用において＋ＳＡ  ＩＶＩＧ又は−ＳＡ  ＩＶＩＧフラクションのいずれかを使用して増強された効果をもたらし得る。
【０１２７】
実施例６：Ｆａｂのシアル酸付加について濃縮されたＩＶＩＧのフラクションとＦａｂのシアル酸付加が減少されたＩＶＩＧのフラクションとのアテローム調節（ａｔｈｅｒｏｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ）活性のインビボでの比較
アテローム性動脈硬化症は、先天性及び適応性の両方の免疫炎症（ｉｍｍｕｎｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）機序が関与する動脈壁の慢性疾患である。炎症はアテローム性動脈硬化症の全ての段階において中心的である。これは初期の脂肪線条の形成に関与し、このときに内皮が活性化され、そしてケモカイン及び接着分子を発現させ、単球／リンパ球の動員、そして内皮下層への浸潤をもたらす。これは有害な臨床的血管事象の発生時も作用し、このときプラーク内の活性化された細胞はマトリックスプロアーゼを分泌し、これが細胞外マトリックスタンパク質を分解し、線維性被膜を弱らせ、そして破断及び血栓形成をもたらす。疾患の進行は、酸化されたリポタンパク質に対する自己抗体の形成並びに循環するサイトカイン及び炎症マーカーの増加に関連する。
【０１２８】
アテローム性動脈硬化症及びＩＶＩＧ
ポリクローナル免疫グロブリン調製物（ＩＶＩＧ）はアテローム性動脈硬化を抑制する（Ｎｉｃｏｌｅｔｔｉ，Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０２：９１０−９１８，１９９８）。コレステロール誘導アテローム性動脈硬化症の遺伝モデルであるアポリポタンパク質Ｅノックアウト（ＡｐｏＥ  ＫＯ）マウスで実証が行われており、ここでは先天性及び適応性の両方の免疫が中心的な役割を果たす。７週齢雄性ａｐｏ  ＥノックアウトマウスにＩＶＩＧを５日間の間注射すると、２ヶ月間のコレステロール食の間に脂肪線条形成を３５％減少させることが示された。４ヶ月間の食事処理により誘導された繊維脂肪性病変は、その食事の２ヶ月後にＩＶＩＧを与えることにより５０％減少した。これらの結果はいくつかのグループによって確認及び再検討されたが、ＩＶＩＧがアテローム保護（ａｔｈｅｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）をもたらす正確な機序は大部分理解されないままである。
【０１２９】
材料及び方法
実施例１において上で記載されたように得られたＩＶＩＧの３つの調製物を使用した：全ＩＶＩＧ（ｔｏｔａｌ  ＩＶＩＧ）（「全ＩＶＩＧ（ＩＶＩＧ  ｔｏｔａｌ）」）、シアル酸濃縮ＩＶＩＧフラクション（「ＩＶＩＧ＋ＳＡ」）及びシアル酸減少ＩＶＩＧフラクション（「ＩＶＩＧ−ＳＡ」）。これらの調製物を１０ｍｇ／マウス／注射の用量で腹腔内注射した。マウス（６−７週齢）に連続して５日間注射を行った。コントロールマウスには食塩水を注射した（「ＰＢＳ」）。合計で、ＡｐｏＥ  ＫＯマウス１グループあたり１０匹のマウスが含まれる（ｎ＝１０／グループ）。マウスを最初の注射の２ヶ月後に屠殺した。注射された製品のいずれかに応じたマウスの異常の反応は見られなかった。
【０１３０】
結果
アテローム性動脈硬化の発達を大動脈根でのレベルで評価した。大動脈の総表面積には統計学的な差は無く、ＩＶＩＧ注射は主要な血管リモデリングを誘導しなかったということを示した。しかし、ＩＶＩＧ調製物で処置されたマウスにおいて病変サイズは有意に減少した。全ＩＶＩＧ及びＩＶＩＧ＋ＳＡは、これらのマウスグループにおいて病変密度の平均２５％の減少を伴う同様の保護をもたらした。より少ないシアル酸付加のＩＶＩＧ（ＩＶＩＧ−ＳＡ）調製物を与えられたマウスは、最も保護され、コントロールのサイズの半分の病変であった（図７）。
【０１３１】
実施例７：インビトロ細胞刺激アッセイにおいて試験された抗炎症活性に対するＦａｂシアル酸付加の効果
種々の自己免疫疾患及び神経変性疾患において、炎症状態はこれらの疾患と関連がある。インビトロ細胞培養アッセイにおいて、インビボで観察される炎症状態は、様々なシアル酸が濃縮されたＩＶＩＧ及び減少したＩＶＩＧ及びＦａｂフラクションの抗炎症活性について試験するために作られたものである。
【０１３２】
多くの全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）患者は、疾患の活性及び重症度に関連するＩ型「ＩＦＮサイン」を有する（Ｂｅｎｇｔｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，（２０００）  Ｌｕｐｕｓ  ９（９）６６４−６７１）。ＲＮＡ又はＤＮＡ核タンパク質を含有する免疫複合体（ＩＣ）は、取り込まれてＴｏｌｌ様受容体を（ＴＬＲ  ７，９）を刺激し得、ＩＦＮ−α産生をもたらす（Ｖｏｌｌｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ（２００５）  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２００２（１１），１５７５−１５８５）。この実験において、目的は、シアル酸付加（ＳＡ＋）ＩｇＧがＩＦＮ−α産生をヒト細胞のＴＬＲ７／ＴＬＲ９刺激後に調節するか否か、及びどのように調節するかを決定することである。
【０１３３】
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、健常ボランティアのヘパリン化静脈血からＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）での密度勾配遠心分離により単離した。ＰＢＭＣ培養物（９６ウェル丸底組織培養プレートにおいて５ｘ１０5／ウェル、Ｎｕｎｃ、総体積１５０μＬ）をロキソリビン（２００μＭ、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）又はＣｐＧ  ２２１６（２００ｎＭ、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）で刺激し、そしてＩＶＩＧ（実施例１に記載されるようなシアル酸付加フラクションが濃縮されるか又は減少したもの）又は対応するＦ（ａｂ’）２部分で５００μｇ／ｍｌのＩｇＧ又は等モル量Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（３３３μｇ／ｍｌ  Ｆ（ａｂ’）２）の濃度で処理した。２０±２時間後に上清を集めてＩＦＮ−αを社内のＥＬＩＳＡで市販の抗体を記載されるように使用して定量した（Ｓａｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２００９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８２，１１９２−１２０１）。結果をＩＶＩＧ処理を受けなかった細胞と比較したＩＦＮ−αの阻害パーセントとして表す。
【０１３４】
等モル濃度でＦ（ａｂ’）２調製物はそれらの全ＩｇＧ対応物と同じレベルの阻害（又はおそらく少し高い阻害も）を生じるということが見られ、これはより高いＩＦＮ−α阻害の原因であるのは増加したシアル酸付加を有するＦａｂ部分であるということを示している。
【０１３５】
実施例８：ヒト単球細胞株Ｕ９３７を使用する、インビトロ抗炎症活性に対するＦａｂシアル酸付加の効果
Ｕ９３７細胞（ＡＴＣＣ）をＡＴＣＣにより提供される指示にしたがって培養で増殖させた。細胞をレチノイン酸（０．５μＭ）及び／又はビタミンＤを用いて実験の１日前に分化させた。
【０１３６】
分化させたＵ９３７細胞を４００ｘｇでの遠心分離により採取し、そして１％ヒトアルブミンを含有するＰＢＳを用いて再懸濁させた。次いで細胞をインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮγ）５０〜５００単位又は植物性血球凝集素（ＰＨＡ）０．１〜２マイクログラムを用いて刺激した。シアル酸が増強されるか及び減少したＩＶＩＧ及びそのフラグメントを刺激の間又は刺激薬剤の添加前に細胞に加えた。
【０１３７】
３７℃での２０＋／−２時間のインキュベーションの後、上清中の炎症マーカーを市販のＥＬＩＳＡキット又はＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  （ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）からのヒト炎症サイトカイン用ビーズアレイにより測定することにより刺激をモニタリングした。ＩＬ−８及びネオプテリンをＥＬＩＳＡキット（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ／Ｄｅｍｅｄｉｔｅｃ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用して測定した。
【０１３８】
表面マーカー（ＣＤ５４、ＣＤ１４、ＣＤ４５）をＦＡＣＳ分析により蛍光標識抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を使用してＢＤ  ＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で定量した。
【０１３９】
ＩＶＩＧの＋ＳＡフラクションによる、及び＋ＳＡフラクションから製造された等モル量のＦ（ａｂ’）２フラグメントによる炎症マーカーの減少が、分画していないＩＶＩＧ及び対応するＦ（ａｂ’）２フラグメントと比較して観察され、これは免疫グロブリンの抗炎症特性がＦａｂ領域における増加したシアル酸付加のために濃縮されたことを示す。
【０１４０】
実施例９：単球誘導樹状細胞（ｍｏＤＣ）刺激アッセイ
ヒト単球の単離及び未熟単球誘導樹状細胞（ｉＭｏＤＣ）の分化
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を１ドナーの提供全血の細胞部分を含有するバフィーコート（Ｂｌｕｔｓｐｅｎｄｅｄｉｅｎｓｔ  ＳＲＫ，Ｂｅｒｎ，ＣＨ）から密度遠心分離により単離した。バフィーコートをＰＢＳで１／１希釈した。希釈したバフィーコート２５ｍｌをＦｉｃｏｌｌ  Ｐｌａｑｕｅ  （ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ，Ｏｔｅｌｆｉｎｇｅｎ，ＣＨ）１５ｍｌにロードし、そして３５分間遠心分離した（室温、４００ｇ、停止用ブレーキなし）。ＰＢＭＣを含有する細胞層を集めてプールした。洗浄（５０ｍｌ  ＰＢＳで２回）した後、単球をＣＤ１４−ＭＡＣＳビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＧｍｂＨ，Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ，ＧＥＲ）を使用して磁気細胞分離（ＭＡＣＳ）により単離した。ＰＢＭＣの正確な数（１０ｘ必要な単球の数）をＭＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ）中に取り、そして抗ＣＤ１４  ｍＡｂ被覆ＭＡＣＳビーズ（８０μｌ／１０7  ＰＢＭＣｓ；
Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＧｍｂＨ）と共に２０分間氷上で（暗所）インキュベートした。ＭＡＣＳ緩衝液で洗浄（２００ｇで１０分間遠心分離）した後、ビーズで標識した細胞を予備洗浄した（３ｍｌ  ＭＡＣＳ緩衝液）ＬＳ  ＭＡＣＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＧｍｂＨ）にロードし、洗浄し（３ｍｌ  ＭＡＣＳ緩衝液を用いて３回）、そしてカラムを磁場から外した後５ｍｌ  ＭＡＣＳ緩衝液で洗い流した。ＰＢＳで洗浄した後、新しく単離した単球を、１０％ｉＦＣＳ（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  ＡＧ、Ｂｅｒｌｉｎ、ＤＥ）、１００００Ｕ／ｍｌペニシリン及びストレプトマイシン（Ａｍｉｍｅｄ、ＢｉｏＣｏｎｃｅｐｔ、Ａｌｌｓｃｈｗｉｌ、ＣＨ）及び１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含有するＲＰＭＩ−１６４０に入れて２４ウェル（０．５ｘ１０6単球／ウェル（ｍｌ））又は４８ウェルプレート（０．２５ｘ１０６単球／ウェル（０．５ｍｌ））（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に０．５ｘ１０6単球／ｍｌの濃度で分配した。単離された単球の純度をＣ１４染色によりＦＡＣＳ分析で評価した。ＦＡＣＳ分析の詳細を以下に記載する。
【０１４１】
その後６日間の間、単球を５０ｎｇ／ｍｌ  ＧＭ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｅｕｒｏｐｅ  Ｌｔｄ．，Ａｂｉｎｇｄｏｎ，ＵＫ）及び２０ｎｇ／ｍｌ組み換えヒトＩＬ−４（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ  ＥＣ  Ｌｔｄ．，Ｌｏｎｄｏｎ  ＵＫ）の存在下で未成熟単球誘導樹状細胞（ｉＭｏＤＣ）へと分化させた。分化の間、１日おきに培地の半分を除去して十分に補充された（上記を参照のこと）新鮮な培地と置き換えた。６日後、細胞をＤＣ−表現型について光学顕微鏡法及びＦＡＣＳ分析により分析した。ＣＤ１４、ＤＣ−ＳＩＧＮ  （ＣＤ２０９）、ＣＤ１１ｃ及びＣＤ１ａ（全てＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓからのモノクローナル抗体）の細胞表面発現を評価した。ＦＡＣＳ分析の詳細を以下に記載する。
【０１４２】
新しく単離された単球、分化したｉＭｏＤＣ及び成熟ＭｏＤＣのＦＡＣＳ分析
ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、２％ｉＦＣＳ）５０μｌ中の約６０，０００〜１００，０００個の細胞を、すぐに使える（ｒｅａｄｙ−ｔｏ−ｕｓｅ）ｍＡｂ（抗−ＣＤ１４、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１ａ、ＤＣ−ＳＩＧＮ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ８３、ＣＤ６４、ＣＤ３２及びＣＤ１６；全ての抗体はＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓの直接標識されたモノクローナル抗体である）１〜２μｌを用いて染色し、そして３０分間４℃（暗所）でインキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄し、そしてＰＢＳ  ５０μｌに入れて３５０μｌ  １ｘＢＤ  ＣｅｌｌＦｉｘ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で固定し、そして暗所にて４℃で採取するまで貯蔵した。サンプルあたり１０，０００個の細胞をＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒを用いて取得し、そしてＢＤ  ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（両方ともＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により分析した。
【０１４３】
免疫複合体によるｉＭｏＤＣの刺激
未成熟（ｉ）ＭｏＤＣを、示されるような様々な量のＩＶＩＧフラクションＦ（ａｂ’）2フラグメントと共に３時間プレインキュベートした。ｉＭｏＤＣを、示されるように０．１〜１００μｇ／ｍｌ  ＬＰＳを用いて刺激した。十分に補充されたＲＰＭＩ（５０ｎｇ／ｍｌ  ＧＭ−ＣＳＦ及び２０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−４を含む）中で２４ウェルにおいて分化させた０．５ｘ１０6  ｉＭｏＤＣを、ＬＰＳと共に２４時間の間３７℃、５％ＣＯ2でインキュベートした。ＩＣ−媒介刺激（成熟化）の分析のために、ＦＡＣＳ分析及びサイトカイン測定を行った。それらの細胞をウェルの底からピペット操作により洗い出すことにより採取した。細胞懸濁液を集めて直ぐに氷上で保存した。遠心分離（３００ｇ、１０分、４℃）後に、上清を集めて後のサイトカイン測定のために−２０℃で保存した。細胞をＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、２％ｉＦＣＳ）５０μｌ中に入れてＦＡＣＳ分析を上記のように行った。２つの共起刺激分子ＣＤ８０（Ｂ７−１）及びＣＤ８６（Ｂ７−２）の細胞表面発現を測定し、ＤＣ特異的成熟マーカーＣＤ８３（全て直接標識されたｍＡｂ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）も同様に測定した。
【０１４４】
細胞培養上清におけるサイトカイン測定
ｉＭｏＤＣ刺激実験の細胞培養上清を集めてサイトカイン測定まで−２０℃で保存した。ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−１０、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１βを製造者の指示書にしたがってＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）からのヒト炎症性サイトカイン用の細胞数測定ビーズアレイ（Ｃｙｔｏｍｅｔｉｒｃ  Ｂｅａｄ  Ａｒｒａｙ）（ＣＢＡ）により測定した。
【０１４５】
炎症マーカーの、ＩＶＩＧの＋ＳＡフラクションによる減少及び＋ＳＡフラクションから製造された等モル量のＦ（ａｂ’）２フラグメントによる減少が、分画されていないＩＶＩＧ及び対応するＦ（ａｂ’）２フラグメントと比較して観察され、これはＦａｂ領域における増加したシアル酸付加について濃縮された免疫グロブリンの抗炎症特性を示している。
【０１４６】
実施例１０：ＥＡＥマウスモデルにおける従来のＩＶＩｇと比較した、シアル酸付加されたＩＶＩｇの有利な効果の評価
ＩＶＩＧ＋ＳＡの抗炎症効果の評価は、自己免疫モデルで観察することができ、そして原因となる機序を調べることができる。このモデルにおいて、ＩＶＩＧが調節性Ｔ細胞の増殖によりその抗炎症効果を及ぼすということが示された。ＥＡＥを使用して、Ｓｉａｌ  Ｆｃ、シアル酸付加Ｆ（ａｂ’）2、シアル酸付加されたインタクトなＩＶＩｇ及びＩＶＩｇの間での比較を行った。様々な用量のこれらの調製物を０日目から疾患のピークまで、又は５日目まで投与した。臨床スコア及び生存を測定した。
【０１４７】
ＥＡＥの誘導：マウスのＣ５７ＢＬ／６Ｊ系統を使用してＥＡＥを誘導した。実験動物に関する倫理的規則にしたがって実験を行った。１０〜１２週齢の雌性マウスを、無成育性の乾燥結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）Ｈ３７ＲＡ  ８００μｇを含有するＣＦＡ（１ｖ／１ｖ）中に乳化させたＭＯＧ35-55ペプチド（純度＞９５％）２００μｇで免疫した。最終体積２００μｌを側腹部上の４箇所に皮下（ｓ．ｃ．）注射した。さらに、百日咳毒素３００ｎｇを同じ日及び２日後に静脈内投与した。ＥＡＥの臨床徴候を毎日以下のスコア付けシステムを用いて評価した：０−無徴候；１−尾部麻痺；２−後肢脱力及び尾部麻痺；３−後肢及び尾部の麻痺；４−後肢及び尾部の麻痺並びに前肢脱力；５−病的状態（ｍｏｒｂｉｄｕｍ）；６−死亡。ＥＡＥの症状は１０日目以後から観察されて免疫２１〜２５日後あたりでピークとなり、平均臨床スコアは
３であった。
【０１４８】
臨床症状の、ＩＶＩＧの＋ＳＡフラクションによる減少、及び＋ＳＡフラクションから製造された等モル量のＦ（ａｂ’）２フラグメントによる減少が、未分画ＩＶＩＧ及び対応するＦ（ａｂ’）２フラグメントと比較して観察され、これはＦａｂ領域における増加したシアル酸付加について濃縮された免疫グロブリンの抗炎症特性を示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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