(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質発現用の改変宿主細胞であって、
（ａ）下記式の通り定義される稼働率Ａの偏差値が７０以上である少なくとも１種のｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、および／または
（ｂ）下記式の通り定義される稼働率Ｂの偏差値が７０以上である少なくとも１種のｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチド
が導入された改変宿主細胞（但し、稼働率Ａまたは稼働率Ｂの偏差値が７０以上であるｔＲＮＡのうち１種のみをコードするポリヌクレオチドが導入された大腸菌を除く）。
【数１】
0005947470.tif 000035
【数２】
0005947470.tif 000036
【請求項２】
宿主細胞が属する生物種と同属の生物種に由来するタンパク質の発現に用いるものである、請求項１に記載の改変宿主細胞。
【請求項３】
ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチドであって、未改変の宿主細胞のゲノム中には存在しないポリヌクレオチドがさらに導入された、請求項１または２に記載の改変宿主細胞。
【請求項４】
以下の工程を含む、タンパク質発現用改変宿主細胞の製造方法：
（ｉ）宿主細胞を提供する工程；
（ｉｉ）請求項１において定義される稼働率Ａおよび／または請求項１において定義される稼働率Ｂに基づいて、該稼働率Ａおよび／または稼働率Ｂの偏差値が７０以上である少なくとも１種のｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを選択する工程；および
（ｉｉｉ）該ポリヌクレオチドを含む核酸分子またはベクターを用いて該宿主細胞を形質転換する工程。
【請求項５】
宿主細胞を改変するために用いる、以下を含む核酸分子またはベクター：
（Ａ）請求項１において定義される稼働率Ａの偏差値が７０以上である少なくとも１種のｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、および／または
（Ｂ）請求項１において定義される稼働率Ｂの偏差値が７０以上である少なくとも１種のｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチド
（但し、該宿主細胞が大腸菌であり、該核酸分子またはベクターが、稼働率Ａまたは稼働率Ｂの偏差値が７０以上であるｔＲＮＡのうち１種のみをコードするポリヌクレオチドを含む場合を除く）。
【請求項６】
宿主細胞を改変するために用いる、以下を含むキット：
（Ａ）請求項１において定義される稼働率Ａの偏差値が７０以上である少なくとも１種のｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、および／または請求項１において定義される稼働率Ｂの偏差値が７０以上である少なくとも１種のｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチド； および
（Ｂ）該ポリヌクレオチドを組み込むことができるベクターであって、宿主細胞を形質転換するために用いるベクター
（但し、該宿主細胞が大腸菌であり、該ポリヌクレオチドが稼働率Ａまたは稼働率Ｂの偏差値が７０以上であるｔＲＮＡのうち１種のみをコードするポリヌクレオチドである場合を除く）。
【請求項７】
タンパク質発現用の改変宿主細胞を製造するための、以下を含むキット：
（Ａ）宿主細胞； および
（Ｂ）請求項１において定義される稼働率Ａの偏差値が７０以上である少なくとも１種のｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチドおよび／または請求項１において定義される稼働率Ｂの偏差値が７０以上である少なくとも１種のｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子またはベクター
（但し、該宿主細胞が大腸菌であり、該核酸分子またはベクターが、稼働率Ａまたは稼働率Ｂの偏差値が７０以上であるｔＲＮＡのうち１種のみをコードするポリヌクレオチドを含む場合を除く）。
【請求項８】
タンパク質発現用の改変宿主細胞を製造するための、以下を含むキット：
（Ａ）宿主細胞；
（Ｂ）請求項１において定義される稼働率Ａの偏差値が７０以上である少なくとも１種のｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチドおよび／または請求項１において定義される稼働率Ｂの偏差値が７０以上である少なくとも１種のｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチド； および
（Ｃ）該ポリヌクレオチドを組み込むことができるベクターであって、宿主細胞を形質転換するために用いるベクター
（但し、該宿主細胞が大腸菌であり、該ポリヌクレオチドが稼働率Ａまたは稼働率Ｂの偏差値が７０以上であるｔＲＮＡのうち１種のみをコードするポリヌクレオチドである場合を除く）。
【請求項９】
以下の工程を含む、改変微生物の製造方法であって、該改変微生物が未改変の同一種の微生物と比較して増大した化合物生産性を有する、方法：
（ｉ）請求項１において定義される稼働率Ａおよび／または請求項１において定義される稼働率Ｂに基づいて、該稼働率Ａおよび／または稼働率Ｂの偏差値が７０以上である少なくとも１種のｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを選択する工程；
（ｉｉ）該ポリヌクレオチドを含む核酸分子またはベクターを提供する工程；および
（ｉｉｉ）該核酸分子またはベクターを用いて微生物を形質転換する工程。
【請求項１０】
以下の工程を含む、化合物の生産方法：
（ｉ）（ａ）該化合物の合成反応を触媒する酵素をコードするポリヌクレオチドならびに（ｂ）請求項１において定義される稼働率Ａの偏差値が７０以上である少なくとも１種のｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチドおよび／または（ｃ）請求項１において定義される稼働率Ｂの偏差値が７０以上である少なくとも１種のｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチドが導入された宿主細胞を提供する工程； および
（ｉｉ）該宿主細胞を培養する工程。
【請求項１１】
以下の工程を含む、化合物の生産方法：
（ｉ）該化合物の合成反応を触媒する酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子またはベクターを提供する工程；
（ｉｉ）請求項１において定義される稼働率Ａの偏差値が７０以上である少なくとも１種のｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチドおよび／または請求項１において定義される稼働率Ｂの偏差値が７０以上である少なくとも１種のｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子またはベクターを提供する工程；
（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の核酸分子またはベクターを用いて宿主細胞を形質転換する工程； および
（ｉｖ）該形質転換された宿主細胞を培養する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物による物質生産性を向上させる方法、ならびに該方法に用いる改変宿主細胞およびキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物を利用したタンパク質組換え発現等の物質生産技術は、種々の有用物質の生産に用いられている。微生物を用いて目的物質を工業的に大量生産するためには、目的タンパク質自体、あるいは目的化合物の生合成に関与する酵素タンパク質等の発現効率を高めることが求められる。【０００３】
微生物を宿主細胞として用いるタンパク質の組換え発現においては、該タンパク質をコードする遺伝子が該宿主細胞において使用頻度の低い所謂レアコドンを含むことによる発現効率の低下が問題となり得る。かかる問題を解決する手段としては、（１）タンパク質をコードする遺伝子のヌクレオチド配列中に存在するレアコドンを、宿主細胞における使用頻度の高い同義コドンに置換した改変遺伝子をタンパク質発現に用いる方法（いわゆるコドン最適化）（特許文献２）、（２）レアコドンに対応するｔＲＮＡをコードする遺伝子を宿主細胞に導入し、該ｔＲＮＡの供給量を増大させる方法等が知られている（特許文献１、特許文献３、非特許文献１〜３）。【０００４】
しかし、上記のコドン最適化は、目的タンパク質が多種類に及ぶ場合、各々のタンパク質についてコード遺伝子を改変する手間が大きい。また、異なる宿主細胞を用いる場合には再度のコドン最適化が必要になる。さらに、目的タンパク質が同種タンパク質（宿主細胞として用いる微生物と同じ生物種に由来するタンパク質）である場合、該タンパク質をコードするヌクレオチド配列は通常、該微生物のコドン使用頻度に適合しており、レアコドンを含まない場合が多いため、上記の方法ではタンパク質発現量を増大させることができないケースが多い。【０００５】
そこで、微生物において種々のタンパク質の生産効率を向上させることができる新たなタンパク質発現改良技術の開発が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第００／４４９２６号
【特許文献２】国際公開第２００４／０２４９１５号
【特許文献３】欧州特許第２０２７２６８号明細書
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Rosenberg, A.H. et al.,（1993）J. Bacteriol. 175, 716-722
【非特許文献２】Brinkmann, U. et al.,（1989）Gene 85, 109-114
【非特許文献３】Seidel, H.M. et al.,（1992）Biochemistry 31, 2598-2608
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、タンパク質の種類や由来生物種を問わず、微生物におけるタンパク質の発現量を増大させ得る方法を提供することを目的とする。また、本発明は、微生物における化合物の生産性を向上させる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、微生物を宿主細胞として用いるタンパク質の生産に関し、宿主細胞が有するｔＲＮＡの中に、該宿主細胞における供給量に対して宿主細胞内の全タンパク質コード配列の翻訳における使用頻度が高いｔＲＮＡが存在すること、および、かかる使用頻度の高いｔＲＮＡをコードする遺伝子を該宿主細胞に導入して発現させることにより、該宿主細胞におけるタンパク質の発現量を増大させ得ることを見出した。【００１０】
本発明は、宿主細胞内の供給量に対して使用頻度の高いｔＲＮＡ（後述の「高稼働ｔＲＮＡ」）を補充することに基づく、タンパク質発現用の改変宿主細胞、該改変宿主細胞の製造方法、宿主細胞を改変するための核酸分子、ベクターおよびキット、ならびに微生物による化合物の生産性を向上させる方法等を提供する。【００１１】
より具体的には、本発明は、以下に記載する態様を提供する：
（１）タンパク質発現用の改変宿主細胞であって、
（ａ）下記式の通り定義される稼働率Ａの偏差値が７０以上である少なくとも１個のｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、および／または
（ｂ）下記式の通り定義される稼働率Ｂの偏差値が７０以上である少なくとも１個のｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチド
が導入された改変宿主細胞（第一の態様）；
【数１】
0005947470.tif 000002
【数２】
0005947470.tif 000003
（２）宿主細胞が属する生物種と同属の生物種に由来するタンパク質の発現に用いるものである、（１）に記載の改変宿主細胞；
（３）ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチドであって、未改変の宿主細胞のゲノム中には存在しないポリヌクレオチドがさらに導入された、（１）または（２）に記載の改変宿主細胞；
（４）以下の工程を含む、タンパク質発現用改変宿主細胞の製造方法（第二の態様）：
（ｉ）宿主細胞を提供する工程； および
（ｉｉ）（１）において定義される稼働率Ａの偏差値が７０以上である少なくとも１個のｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチドおよび／または（１）において定義される稼働率Ｂの偏差値が７０以上である少なくとも１個のｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子またはベクターを用いて該宿主細胞を形質転換する工程；
（５）宿主細胞を改変するために用いる、以下を含む核酸分子またはベクター（第三の態様）：
（Ａ）（１）において定義される稼働率Ａの偏差値が７０以上である少なくとも１個のｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、および／または
（Ｂ）（１）において定義される稼働率Ｂの偏差値が７０以上である少なくとも１個のｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチド；
（６）宿主細胞を改変するために用いる、以下を含むキット（第四の態様）：
（Ａ）（１）において定義される稼働率Ａの偏差値が７０以上である少なくとも１個のｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、および／または（１）において定義される稼働率Ｂの偏差値が７０以上である少なくとも１個のｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチド； および
（Ｂ）該ポリヌクレオチドを組み込むことができるベクターであって、宿主細胞を形質転換するために用いるベクター；
（７）タンパク質発現用の改変宿主細胞を製造するための、以下を含むキット（第五の態様）：
（Ａ）宿主細胞； および
（Ｂ）（１）において定義される稼働率Ａの偏差値が７０以上である少なくとも１個のｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチドおよび／または（１）において定義される稼働率Ｂの偏差値が７０以上である少なくとも１個のｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子またはベクター；
（８）タンパク質発現用の改変宿主細胞を製造するための、以下を含むキット（第六の態様）：
（Ａ）宿主細胞；
（Ｂ）（１）において定義される稼働率Ａの偏差値が７０以上である少なくとも１個のｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチドおよび／または（１）において定義される稼働率Ｂの偏差値が７０以上である少なくとも１個のｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチド； および
（Ｃ）該ポリヌクレオチドを組み込むことができるベクターであって、宿主細胞を形質転換するために用いるベクター；
（９）以下の工程を含む、微生物による化合物の生産性を向上させる方法（第七の態様）：
（ｉ）（１）において定義される稼働率Ａの偏差値が７０以上である少なくとも１個のｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチドおよび／または（１）において定義される稼働率Ｂの偏差値が７０以上である少なくとも１個のｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子またはベクターを提供する工程； および
（ｉｉ）該核酸分子またはベクターを用いて微生物を形質転換する工程；
（１０）（９）の方法によって得られる改変微生物であって、未改変の同一種の微生物と比較して増大した化合物生産性を有する微生物（第八の態様）；
（１１）以下の工程を含む、化合物の生産方法（第九の態様）：
（ｉ）（ａ）該化合物の合成反応を触媒する酵素をコードするポリヌクレオチドならびに（ｂ）（１）において定義される稼働率Ａの偏差値が７０以上である少なくとも１個のｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチドおよび／または（ｃ）（１）において定義される稼働率Ｂの偏差値が７０以上である少なくとも１個のｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチドが導入された宿主細胞を提供する工程； および
（ｉｉ）該宿主細胞を培養する工程；  ならびに
（１２）以下の工程を含む、化合物の生産方法（第十の態様）：
（ｉ）該化合物の合成反応を触媒する酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子またはベクターを提供する工程；
（ｉｉ）（１）において定義される稼働率Ａの偏差値が７０以上である少なくとも１個のｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチドおよび／または（１）において定義される稼働率Ｂの偏差値が７０以上である少なくとも１個のｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子またはベクターを提供する工程；
（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の核酸分子またはベクターを用いて宿主細胞を形質転換する工程； および
（ｉｖ）該形質転換された宿主細胞を培養する工程。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の改変宿主細胞は、高稼働ｔＲＮＡをコードする遺伝子の導入により、該ｔＲＮＡの供給量が増大している。その結果、本発明の改変宿主細胞は、種々のタンパク質について、非改変宿主細胞と比較して増大したタンパク質発現量を達成することができる。また、本発明に係る高稼働ｔＲＮＡをコードする遺伝子の導入は、微生物が有する化合物の生合成酵素等を含むあらゆるタンパク質の発現を増大させ得るため、微生物による二次代謝産物等の有用物質の生産性を向上させることもできる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ストレプトマイセス・コエリカラー（Streptomyces coelicolor A3(2)）の全タンパク質コード配列に基づくｔＲＮＡの稼働率（稼働率Ａ）の偏差値の算出結果を示すグラフである。横軸ラベルは、ｔＲＮＡの種類をアンチコドンの配列（３’から５’方向）で表したものである。
【図２】ストレプトマイセス・コエリカラー（Streptomyces coelicolor A3(2)）における高発現タンパク質のコード配列に基づくｔＲＮＡの稼働率（稼働率Ｂ）の偏差値の算出結果を示すグラフである。横軸ラベルは、ｔＲＮＡの種類をアンチコドンの配列（３’から５’方向）で表したものである。
【図３】ストレプトマイセス・コエリカラー（Streptomyces coelicolor A3(2)）のｔＲＮＡ発現ベクターの構造を示す図である。
【図４】ｔＲＮＡ発現ベクターで形質転換されたストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）1326株における、コドンＧＣＣ（Ａｌａ）に対応するｔＲＮＡ発現量の定量結果を示す図である。左が未改変株、右がコドンＧＣＣ（Ａｌａ）に対応するｔＲＮＡ遺伝子を導入した株である。
【図５】タンパク質発現ベクターの構造を示す図である。"promoter"の位置に各種プロモーター、"target protein"の位置にタンパク質発現実験に用いたタンパク質コード遺伝子がそれぞれ対応する。
【図６】ｔＲＮＡ発現ベクターｐＢｕＴ０４、ｐＢｕＴ０２、ｐＲａＴ０２およびｐＳＨ０４のいずれかを導入して得たｔＲＮＡ高発現株における各種タンパク質の発現量を示すグラフである。「元株」とは、ｔＲＮＡ発現ベクターが導入されていないタンパク質発現株である。横軸ラベルには、発現させたタンパク質の種類および用いたプロモーターを示した。
【図７】コドンＧＣＣ（Ａｌａ）に対応するｔＲＮＡ遺伝子を組み込んだ発現ベクターの構造を示す図である。
【図８】ｍｅｌＣオペロン領域を組み込んだベクターの構造を示す図である。
【図９】エシェリシア・コリ  Ｋ１２（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ１２）のｔＲＮＡの稼働率（稼働率Ａ）の偏差値の算出結果を示す図である。
【図１０】ｔＲＮＡ発現ベクターｐＢｕＴ０４Ｅ、ｐＲａＴ０２ＥおよびｐＳＨ０４Ｅの構造を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本明細書において、「宿主細胞」とは、例えばタンパク質の組換え発現や遺伝子クローニング等に用いる目的で、外部から遺伝因子（典型的には組換え核酸）が導入される細胞をいう。用い得る宿主細胞の種類としては、微生物細胞、動物細胞（例えば哺乳動物細胞や昆虫細胞）、植物細胞等が挙げられる。本発明の好ましい態様においては、宿主細胞として微生物細胞を用いる。
【００１５】
本発明の第一から第六ならびに第九および第十の態様において、宿主細胞は、好ましくは、Escherichia属、Corynebacterium属、Brevibacterium属、Bacillus属、Brevibacillus属、Microbacterium属、Pseudomonas属、Aspergillus属、Arthrobacter属、Rhodobacter属、Rhodococcus属、Streptomyces属、Zymomonas属, Novosphigobium属、Saccharomyces属、Schizosaccharomyces属、Zymobacter属等に属する微生物等を挙げることができる。該微生物の具体例としては、例えば、Aspergillus niger、Aspergillus oryzae、Aspergillus phoenicis、Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus licheniformis、Bacillus subtilis、Brevibacillus choshinensis、Corynebacterium ammoniagenes、Corynebacterium glutamicum、Escherichia coli、Psudomonas putida、Rhodococcus rhodochrous、Saccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomyces pombe、Streptomyces avermitilis、Streptomyces coelicolor、Streptomyces lividans、Streptomyces griseus、Streptomyces venezuelae、Zymobacter palmaem、Zymomonas mobilis等が挙げられる。一つの態様において、宿主細胞はStreptomyces属またはEscherichia属の微生物である。Streptomyces属の微生物としては、例えばStreptomyces lividans（例えば Sterptomyces lividans 1326株）を用いることができる。また、Streptomyces lividansに限らず、Streptomyces属のうち性状が詳しく解析されている種もしくは株を用いることができる。Escherichia属の微生物としては、例えばEscherichia coli（例えば Escherichia coli K12株）を用いることができる。また、Escherichia coliに限らず、Escherichia属のうち性状が詳しく解析されている種もしくは株を用いることができる。一つの態様において、宿主細胞はStreptomyces lividansまたはEscherichia coliである。
【００１６】
本明細書において、「コドン使用頻度」とは、宿主細胞のゲノムに存在するタンパク質コード配列中における各コドンの出現頻度を意味する。本明細書においては、一定個数のコドンあたりの出現回数（例えばＸＸ回／１，０００コドン等）により表す。本明細書において用いる「ゲノム」の用語には、染色体だけでなくプラスミド等の染色体外遺伝因子も含まれるものとする。したがって、「ゲノムにコードされている全てのタンパク質のコード配列」には、染色体に存在するタンパク質コード配列に加えて、プラスミド等の染色体外遺伝因子に存在するタンパク質コード配列が含まれる。
【００１７】
本明細書において、「ｔＲＮＡの使用頻度」とは、特定のコドンに対応するｔＲＮＡをコードするｔＲＮＡ遺伝子の使用頻度であり、コドン使用頻度と同様に、対応する各コドンの出現頻度として表す（例えばＸＸ回／１，０００コドン等）。
【００１８】
本明細書において、「タンパク質（の）コード配列」とは、タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列をいい、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）やコーディング配列（ＣＤＳ）に相当するものである。かかる核酸配列は、通常はＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列である。
【００１９】
本発明において、宿主細胞あるいは微生物に導入されるポリヌクレオチド（ｔＲＮＡ遺伝子、タンパク質コード遺伝子）は、転写あるいは翻訳の調節に関与する各種調節配列（例えばプロモーター、エンハンサー、５’非翻訳領域、３’非翻訳領域等）を伴うものであってもよい。これら調節配列は、例えば発現させるタンパク質等に応じて適当なものを選択できるが、特定の配列に限定されるものではない。例えば、所望のプロモーター配列の下流に所望のタンパク質コード配列を連結したポリヌクレオチドを、宿主細胞に導入することができる。
【００２０】
本発明の第一の態様は、宿主細胞内における使用頻度の高いｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチドが導入された改変宿主細胞である。
本発明は、宿主細胞内においてタンパク質コード配列の翻訳における使用頻度が非常に高く、需要に対して供給が不足しているｔＲＮＡの存在を見出したことに基づく。本発明は、かかるｔＲＮＡを宿主細胞内で過剰発現させることにより、タンパク質翻訳効率を改善し、宿主細胞内におけるタンパク質の発現量を増大させることを特徴とする。
【００２１】
本明細書において、ｔＲＮＡの供給量に対する、タンパク質コード配列の翻訳における該ｔＲＮＡの使用頻度の比率を「稼働率」と称する。また、かかる稼働率の高いｔＲＮＡを「高稼働ｔＲＮＡ」と称する。
【００２２】
特定のｔＲＮＡの供給量は、通常、ゲノム中における該特定のｔＲＮＡをコードする遺伝子の数を反映するものと考えられる。また、ある生物種において高発現しているタンパク質のコード配列中における各コドンの使用頻度の分布は、該生物種における各コドンに対応するｔＲＮＡの使用頻度の分布に合致しているものと考えられる。したがって、本明細書においては、宿主細胞における特定のｔＲＮＡについての「稼働率」およびその偏差値（Ｔスコア）を以下の式によって算出し、高稼働ｔＲＮＡの指標として用いる。
【数３】
0005947470.tif 000004
または
【数４】
0005947470.tif 000005
【００２３】
本発明の第一の態様において、宿主細胞に導入されるポリヌクレオチドは、（ａ）上記式の通り定義される稼働率Ａの偏差値が７０以上であるｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、および／または（ｂ）上記式の通り定義される稼働率Ｂの偏差値が７０以上であるｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチドである。稼働率Ａの偏差値は、好ましくは７２．５以上、より好ましくは７５以上である。稼働率Ｂの偏差値は、好ましくは７１以上、より好ましくは７２以上である。一つの態様において、稼働率Ｂの偏差値は７８以上であり得る。
【００２４】
本発明の第一の態様に係る宿主細胞には、稼働率Ａの偏差値が７０以上または稼働率Ｂの偏差値が７０以上のいずれかの基準を満たす少なくとも１個のｔＲＮＡ（該ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチド）が導入されれば足りる。所望により、かかる基準を満たす２個以上のｔＲＮＡ、例えば２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個以上のｔＲＮＡを宿主細胞に導入してもよい。
【００２５】
宿主細胞に導入されたｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは、プラスミド等の染色体外遺伝因子として保持されてもよく、非相同組換えまたは相同組換え等によってゲノム中に組み込まれてもよい。
【００２６】
上記稼働率Ａおよび稼働率Ｂの式における「宿主細胞が属する生物種と同属の１種または複数種の生物種」は、好ましくは宿主細胞が属する生物種と同属の１種の生物種であり、より好ましくは宿主細胞が属する生物種と同種の生物種である。
【００２７】
ある生物種の「ゲノムにコードされている全てのタンパク質のコード配列」とは、該生物種のゲノム中に存在する全てのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を意味する。しかし、生物種によって、得られているゲノム情報の量や精度は異なる。したがって、通常、本発明において高稼働ｔＲＮＡの特定に用いる生物種の「全ての」タンパク質コード配列は、各種ゲノムデータベース等から情報を入手できる限度における全てのオープンリーディングフレームである。
【００２８】
種々の生物種における各種コドンの使用頻度は、かずさＤＮＡ研究所の Codon Usage Database（http://www.kazusa.or.jp/codon/）から入手することができる。あるいは、所望の生物種のゲノム（好ましくは全ゲノム）の塩基配列を各種ゲノムデータベース等から取得し、Glimmer3（http://ccb.jhu.edu/software/glimmer/index.shtml）、GeneMark（http://opal.biology.gatech.edu/）、PRODIGAL（http://prodigal.ornl.gov/）等の解析ソフトを用いて該塩基配列からＯＲＦを抽出し、各コドンの出現回数をカウントする等の方法によってコドンの使用頻度を特定することもできる。所望の塩基配列におけるコドン使用頻度の算出は、例えば、かずさＤＮＡ研究所が提供する Countcodon program（http://www.kazusa.or.jp/codon/countcodon.html）を用いて容易に行うことができる。あるいは、Perl等のプログラミング言語を用いて解析プログラムを作成し、該プログラムを用いてコドン使用頻度を算出することもできる。
【００２９】
所望の生物種のゲノム中における特定のｔＲＮＡをコードする遺伝子の数は、tRNAdb データベース（http://trna.bioinf.uni-leipzig.de/DataOutput/）、Genomic tRNA Database（http://lowelab.ucsc.edu/GtRNAdb/）等において確認することができる。あるいは、所望の生物種のゲノム（好ましくは全ゲノム）の塩基配列を各種ゲノムデータベース等から取得し、tRNAscan-SE（http://lowelab.ucsc.edu/tRNAscan-SE/）等の解析ソフトを用いて塩基配列からｔＲＮＡをコードする遺伝子を抽出する方法によって、ｔＲＮＡをコードする遺伝子の数を特定することもできる。
【００３０】
宿主細胞として用いる生物種が上記データベースに登録されていない場合、該生物種と近縁な他の種、例えば該生物種と同じ属の別の生物種のデータを利用して稼働率Ａおよび／または稼働率Ｂを算出することが可能である。宿主細胞が属する生物種と同属の１種の生物種のデータを用いてもよく、同属の複数種の生物種のデータをプールして用いてもよい。宿主細胞が属する生物種と近縁な種のデータも利用できない場合には、公知の手法により宿主細胞が属する生物種と同属の１種または複数種の生物種のゲノム解析を行って、同定されたＯＲＦ中のコドンの使用頻度およびｔＲＮＡ遺伝子の情報を得ることができる。
【００３１】
本明細書において、特に上記稼働率Ｂの式に関し、ある生物種において「高発現しているタンパク質」とは、（ａ）該生物種における全タンパク質の二次元電気泳動において信頼性のあるスポットとして検出されるタンパク質、または（ｂ）該生物種において、表１に記載のタンパク質およびそれらのホモログからなる群より選択される１種以上のタンパク質と同等以上の発現量を有するタンパク質をいうものとする。
上記（ａ）のタンパク質に関しては、例えば、SWICZ（http://proteom.biomed.cas.cz/）、SWISS-2DPAGE（http://world-2dpage.expasy.org/swiss-2dpage/）、Proteome 2D-PAGE Database（http://web.mpiib-berlin.mpg.de/cgi-bin/pdbs/2d-page/extern/index.cgi）、DOGAN（http://www.bio.nite.go.jp/dogan/top）等のプロテオームデータベースにおいて、Streptomyces coelicolor、Streptomyces granaticolor（以上SWICZ）、Escherichia coli、Saccharomyces cerevisiae（以上SWISS-2DPAGE）、Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus anthracis（以上Proteome 2D-PAGE Database）、Aspergillus oryzae および Rhodococcus opacus（以上DOGAN）を含む様々な生物種のプロテオーム解析（二次元電気泳動）の結果に基づいて同定されたタンパク質のリストを入手することができ、これらのタンパク質を本発明における高発現タンパク質として上記「稼働率Ｂ」の算出に用いることができる。
また、プロテオーム解析のデータベースが利用できない生物種の場合には、公知の方法によって該生物種の全タンパク質の二次元電気泳動を行い、信頼性のあるスポットとして検出されるタンパク質を同定することが可能である。この場合、信頼性のあるスポットの選定は、例えば Garrels et. al, J. Biol. Chem., 1989, vol. 264, No. 9, pp. 5269-5282 において定義される「スポットクオリティ」の値が５０以上であるスポットを選択すること等により行い得る。
【００３２】
本発明の改変宿主細胞は、例えば、稼働率Ａの偏差値が７０以上である少なくとも１個のｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチドおよび／または稼働率Ｂの偏差値が７０以上である少なくとも１個のｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子またはベクターを用いて該宿主細胞を形質転換することによって得ることができる。また、本発明の改変宿主細胞は、上記稼働率の偏差値の基準を満たすｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを導入することができる限り、他の改変方法、例えば細胞融合等によって得たものであってもよい。
【００３３】
本発明の改変宿主細胞は、タンパク質の発現に好適に用い得る。本発明の改変宿主細胞に所望のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを導入し、該宿主細胞を培養することにより、該タンパク質を高い効率で生産することができる。発現させるタンパク質は、該宿主細胞が属する生物種と同属の生物種に由来するものであってもよく、該宿主細胞が属する生物種とは異なる属の生物種に由来するものであってもよい。また、発現させるタンパク質をコードする遺伝子は、宿主細胞におけるコドン使用頻度に合わせてコドン最適化等を行った改変遺伝子や人工遺伝子であってもよい。例えば、宿主細胞が属する生物種とは異なる種または異なる属の生物種に由来するタンパク質を発現させる場合、かかる改変遺伝子や人工遺伝子を用いることが効率的な発現のために有効な手段となり得る。コドン最適化等の遺伝子改変や、所望の（例えばコドン最適化された）配列を有する人工遺伝子の合成等は、当該技術分野において公知の方法を用いて行い得る。一つの態様において、本発明の改変宿主細胞は、該宿主細胞が属する生物種と同属の生物種、好ましくは同種の生物種に由来するタンパク質の発現に用いるものである。別の態様において、本発明の改変宿主細胞は、該宿主細胞が属する生物種とは異なる種または異なる属の生物種に由来するタンパク質の発現に用いるものである。
【００３４】
一つの態様において、本発明の改変宿主細胞には、ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチドであって、未改変の宿主細胞のゲノム中には存在しないポリヌクレオチド（本明細書において「非存在ｔＲＮＡ遺伝子」とも称する）をさらに導入し得る。これにより、未改変の宿主細胞のゲノムにコードされておらず、該宿主細胞中に全く存在していなかったｔＲＮＡを新たに供給し、該ｔＲＮＡに対応するコドンをコード配列中に含むタンパク質の発現効率を向上させることができる。所望の宿主細胞における非存在ｔＲＮＡ遺伝子は、上記 tRNAdb データベースにおいて、終止コドンを除く全種類のコドンに対応するアンチコドンを有するｔＲＮＡ遺伝子のうち、該宿主細胞が属する生物種が有していないｔＲＮＡ遺伝子として特定することができる。
【００３５】
例えば、ストレプトマイセス・コエリカラー（Streptomyces coelicolor A3(2)）では、全てのＯＲＦにおけるコドンＧＣＣ（Ａｌａ）の使用頻度は７８．４回／１０００コドンであり（かずさＤＮＡ研究所 Codon Usage Databaseより）、コドンＧＣＣ（Ａｌａ）に対応するｔＲＮＡ（アンチコドンはＣＧＧ（３’から５’方向））をコードする遺伝子はストレプトマイセス・コエリカラーのゲノム中に２個存在する（tRNAdbより）。したがって、コドンＧＣＣ（Ａｌａ）に対応するｔＲＮＡの「稼働率Ａ」は７８．４÷２＝３９．２である。さらに、ストレプトマイセス・コエリカラーのゲノムにコードされている全てのｔＲＮＡについて同様に稼働率Ａを求めると、稼働率Ａの平均値は１０．０、標準偏差は１０．５となる。こうして得られた平均値および標準偏差を用いて、上記の式によりコドンＧＣＣ（Ａｌａ）に対応するｔＲＮＡの稼働率Ａの偏差値を求めると、該偏差値は７７．８となる。したがって、宿主細胞として Streptomyces属の種、例えばストレプトマイセス・コエリカラー、ストレプトマイセス・エバメチルス、ストレプトマイセス・グリセウス、ストレプトマイセス・リビダンス等を用いる場合、コドンＧＣＣ（Ａｌａ）に対応するｔＲＮＡは、本発明における高稼働ｔＲＮＡの基準を満たす。
【００３６】
本発明の第二の態様は、高稼働ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子またはベクターを用いて宿主細胞を形質転換することにより、タンパク質発現効率の向上した改変宿主細胞を製造する方法である。
【００３７】
第二の態様において用いる高稼働ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは、上記の通り定義される稼働率Ａの偏差値が７０以上である少なくとも１個のｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、および／または上記の通り定義される稼働率Ｂの偏差値が７０以上である少なくとも１個のｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチドである。好ましい稼働率Ａの偏差値および稼働率Ｂの偏差値については、上記第一の態様において記載したものと同様である。
【００３８】
２つ以上の高稼働ｔＲＮＡを宿主細胞に導入する場合、該ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは、単一の核酸分子またはベクターに含まれていてもよく、複数の核酸分子またはベクター内に別々に含まれていてもよい。
【００３９】
本明細書において、宿主細胞の形質転換に用い得る「ポリヌクレオチドを含む核酸分子」には、該ポリヌクレオチドとアダプター等の他のヌクレオチド配列とを含む核酸分子のほか、該ポリヌクレオチドのみからなる核酸分子も含まれるものとする。かかる核酸分子は、例えば、直鎖ＤＮＡの形態であり得る。
【００４０】
宿主細胞の形質転換に用い得るベクターとしては、プラスミドベクターやウイルスベクターのほか、トランスポゾンや挿入配列（ＩＳ）等の転移因子を利用したベクター等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００４１】
宿主細胞の形質転換方法としては、エレクトロポレーション、ヒートショック法、酢酸リチウム法、アグロバクテリウム法、プロトプラスト−ＰＥＧ法等、当該技術分野において公知の方法を用い得る。
【００４２】
本発明の第三の態様は、宿主細胞を改変するために用いる、高稼働ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子またはベクターである。
高稼働ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、ならびに該ポリヌクレオチドを含む核酸分子およびベクターについては、上記第二の態様と同様である。高稼働ｔＲＮＡの指標である稼働率Ａの偏差値および稼働率Ｂの偏差値の好ましい範囲は、上記第一の態様において記載したものと同様である。
【００４３】
本発明の第四の態様は、宿主細胞を改変するために用いる、高稼働ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチドおよび該ポリヌクレオチドを組み込むことができる形質転換用ベクターを含むキットである。
高稼働ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、および宿主細胞の形質転換に用い得るベクターについては、上記第二の態様と同様である。高稼働ｔＲＮＡの指標である稼働率Ａの偏差値および稼働率Ｂの偏差値の好ましい範囲は、上記第一の態様において記載したものと同様である。
【００４４】
本発明の第五の態様は、タンパク質発現用の改変宿主細胞を製造するための、宿主細胞および高稼働ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子またはベクターを含むキットである。
高稼働ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、ならびに該ポリヌクレオチドを含む核酸分子およびベクターについては、上記第二の態様と同様である。高稼働ｔＲＮＡの指標である稼働率Ａの偏差値および稼働率Ｂの偏差値の好ましい範囲は、上記第一の態様において記載したものと同様である。
【００４５】
本発明の第六の態様は、タンパク質発現用の改変宿主細胞を製造するための、宿主細胞、高稼働ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、および該ポリヌクレオチドを組み込むことができる形質転換用ベクターを含むキットである。
高稼働ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、および宿主細胞の形質転換に用い得るベクターについては、上記第二の態様と同様である。高稼働ｔＲＮＡの指標である稼働率Ａの偏差値および稼働率Ｂの偏差値の好ましい範囲は、上記第一の態様において記載したものと同様である。
【００４６】
本発明の第七の態様は、高稼働ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子またはベクターを用いて微生物を形質転換する工程を含む、微生物による化合物の生産性を向上させる方法である。
高稼働ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含む核酸分子およびベクター、ならびに形質転換方法については、上記第二の態様と同様である。高稼働ｔＲＮＡの指標である稼働率Ａの偏差値および稼働率Ｂの偏差値の好ましい範囲は、上記第一の態様において記載したものと同様である。
【００４７】
本発明の第八の態様は、本発明の第七の態様として記載した方法によって得られる改変微生物であって、未改変の同一種の微生物と比較して増大した化合物生産性を有する微生物である。
【００４８】
本発明の第七および第八の態様において用い得る微生物の種類は、特に限定されない。一つの態様において、該微生物は、好ましくは、Escherichia属、Corynebacterium属、Brevibacterium属、Bacillus属、Brevibacillus属、Microbacterium属、Pseudomonas属、Aspergillus属、Arthrobacter属、Rhodobacter属、Rhodococcus属、Streptomyces属、Zymomonas属、Novosphigobium属、Saccharomyces属、Schizosaccharomyces属、Zymobacter属等に属する微生物等を挙げることができる。
本発明の第七および第八の態様において、該微生物の具体例としては、例えば、Aspergillus niger、Aspergillus oryzae、Aspergillus phoenicis、Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus licheniformis、Bacillus subtilis、Brevibacillus choshinensis、Corynebacterium ammoniagenes、Corynebacterium glutamicum、Escherichia coli、Psudomonas putida、Rhodococcus rhodochrous、Saccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomyces pombe、Streptomyces avermitilis、Streptomyces coelicolor、Streptomyces lividans、Streptomyces griseus、Streptomyces venezuelae、Zymobacter palmaem、Zymomonas mobilis等が挙げられる。一つの態様において、宿主細胞はStreptomyces属またはEscherichia属の微生物である。Streptomyces属の微生物としては、例えばStreptomyces lividans（例えば Sterptomyces lividans 1326株）を用いることができる。また、Streptomyces lividansに限らず、Streptomyces属のうち性状が詳しく解析されている種もしくは株を用いることができる。Escherichia属の微生物としては、例えばEscherichia coli（例えば Escherichia coli K12株）を用いることができる。また、Escherichia coliに限らず、Escherichia属のうち性状が詳しく解析されている種もしくは株を用いることができる。一つの態様において、宿主細胞はStreptomyces lividansまたはEscherichia coliである。
【００４９】
微生物への高稼働ｔＲＮＡの導入は、該微生物が発現するあらゆるタンパク質の生産効率を向上させ得る。したがって、本発明の第七および第八の態様によって生産性を向上させ得る化合物は、微生物内で生合成されるものであるか、または微生物内で生産される酵素が触媒する反応によって生成されるものである限り、特に限定されない。例えば、化合物の合成反応を触媒する酵素は、微生物によって生産された後、菌体外へ分泌され、菌体外で反応を触媒するものであってもよい。
【００５０】
一つの態様において、本発明の方法によって微生物における生産性が向上する化合物は、該微生物の二次代謝産物、例えばアミノ酸誘導体、イソプレノイド、抗生物質、色素、ポリケチド等であり得る。例えば、本発明の方法によって改変される微生物が放線菌（例えばストレプトマイセス・リビダンス）である場合、ジオスミン、アクチノロージン等の生産性を向上させることができる。
【００５１】
本発明の第九の態様は、化合物の合成反応を触媒する酵素をコードするポリヌクレオチドならびに高稼働ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチドが導入された宿主細胞を培養することにより、化合物を生産する方法である。
高稼働ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチドについては、上記第二の態様と同様である。高稼働ｔＲＮＡの指標である稼働率Ａの偏差値および稼働率Ｂの偏差値の好ましい範囲は、上記第一の態様において記載したものと同様である。
【００５２】
本発明の第十の態様は、化合物の合成反応を触媒する酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子またはベクターならびに高稼働ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子またはベクターを用いて形質転換された宿主細胞を培養することにより、化合物を生産する方法である。
高稼働ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含む核酸分子およびベクター、ならびに形質転換方法については、上記第二の態様と同様である。高稼働ｔＲＮＡの指標である稼働率Ａの偏差値および稼働率Ｂの偏差値の好ましい範囲は、上記第一の態様において記載したものと同様である。
【００５３】
本発明の第九および第十の態様において、高稼働ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチドが導入された宿主細胞によって生産される化合物は、特に限定されない。目的化合物の合成反応を触媒する酵素の選択が適切であり、該酵素の基質となる化合物が提供される限り、所望するあらゆる化合物を生産することができる。一つの態様において、該宿主細胞により生産される化合物は、アミノ酸誘導体、例えばメラニン、ポルフィラ-３３４等であり得る。別の態様において、該宿主細胞により生産される化合物は、イソプレノイド、例えばα‐セリネン、β‐カロテン等であり得る。例えば、高稼働ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチドおよびα‐ピネン合成酵素をコードするポリヌクレオチドが導入された宿主細胞を培養することにより、α‐ピネンを得ることができる。
【００５４】
目的化合物の合成反応を触媒する酵素（以下、単に「合成酵素」とも称する）の基質となる化合物は、宿主細胞によって生産されるものであり得る。この場合、該合成酵素をコードするポリヌクレオチドが導入された宿主細胞を、当該技術分野において用いられる任意の培地において培養することにより、目的化合物を得ることができる。
【００５５】
別の態様において、目的化合物の生産は、合成酵素をコードするポリヌクレオチドが導入された宿主細胞を、該合成酵素の基質となる化合物の存在下で培養することにより達成し得る。この場合、合成酵素の基質となる化合物は、宿主細胞を培養する培地中に存在させればよい。
【００５６】
本発明の第九および第十の態様において、宿主細胞を培養する条件は、宿主細胞に導入されたポリヌクレオチドから合成酵素および高稼働ｔＲＮＡが産生される限り、特に限定されない。培養条件は、用いる宿主細胞、合成酵素、該合成酵素の基質等に応じて適宜決定し得る。
【００５７】
以下、実施例によって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００５８】
１．放線菌における高稼働ｔＲＮＡの同定
（１）全タンパク質コード配列に基づく稼働率の算出および高稼働ｔＲＮＡの同定
ストレプトマイセス・コエリカラー（Streptomyces coelicolor A3(2)）のゲノム（GenBank No. NC_003888）およびプラスミド（GenBank No. NC_003903, NC_003904）に含まれる全ＯＲＦ中におけるコドン使用頻度の情報を、かずさＤＮＡ研究所の Codon Usage Database から取得した。ストレプトマイセス・コエリカラーのゲノム中におけるｔＲＮＡ遺伝子の数は、ｔＲＮＡデータベースである tRNAdb（http://trna.bioinf.uni-leipzig.de/DataOutput/）においてストレプトマイセス・コエリカラーが有するものとして登録されているｔＲＮＡ遺伝子の数を、ｗｏｂｂｌｅ則による複数コドンの認識を考慮して補正した値（[特定のコドンに対応するアンチコドンを有するｔＲＮＡをコードする遺伝子の個数]＋[ｗｏｂｂｌｅ則により該特定のコドンを認識する他のｔＲＮＡをコードする遺伝子の個数×０．６]）とした。
コドン使用頻度およびｔＲＮＡ遺伝子数に基づき、以下の式を用いてｔＲＮＡの稼働率Ａを算出した。各ｔＲＮＡについての稼働率Ａの算出結果を図１に示す。
【数５】
0005947470.tif 000006
【００５９】
次に、全てのｔＲＮＡについて求めた稼働率Ａの平均値および標準偏差に基づき、以下の式を用いて算出した稼働率Ａの偏差値が７０以上であるｔＲＮＡを高稼働ｔＲＮＡと判定した。
【数６】
0005947470.tif 000007
【００６０】
計算の結果、ストレプトマイセス・コエリカラー（Streptomyces coelicolor A3(2)）では、稼働率Ａの平均値は１０．０、標準偏差は１０．５であった。コドンＧＣＣ（Ａｌａ）に対応するｔＲＮＡ（稼働率Ａが３９．２、偏差値は７７．８であった）、およびコドンＣＴＧ（Ｌｅｕ）に対応するｔＲＮＡ（稼働率Ａが３８．１、偏差値は７６．７であった）を高稼働ｔＲＮＡとして同定し、以後の実験に使用した。また、コドンＣＧＧは、偏差値７０以上の条件を満たしている（稼働率Ａが３１．９、偏差値は７０．９）が、稼働率Ｂの偏差値（偏差値７２．２）のほうが高かったため、以後の実験においては稼働率Ｂの高いｔＲＮＡとして取り扱った。【００６１】
（２）高発現タンパク質コード配列に基づく稼働率の算出および高稼働ｔＲＮＡの同定
プロテオームデータベースである SWICZ: Swiss-Czech Proteomics server（http://proteom.biomed.cas.cz/）を利用し、放線菌の菌体内で高発現しているタンパク質を選定した。SWICZ に登録されているストレプトマイセス・コエリカラー（Streptomyces coelicolor）の二次元電気泳動像（Master Gel）においてスポットとして同定されているタンパク質を、本発明における「高発現タンパク質」として稼働率の算出に用いた。かかる高発現タンパク質のリストを表１に示す。（これらタンパク質はいずれも、Garrels et. al, J. Biol. Chem., 1989, vol. 264, No. 9, pp. 5269-5282 において定義される“スポットクオリティ”の値が５０以上のスポットに対応するものである。）【００６２】
【表１−１】
0005947470.tif 000008
【表１−２】
0005947470.tif 000009
【表１−３】
0005947470.tif 000010
【表１−４】
0005947470.tif 000011
【００６３】
表１に示すタンパク質のコード配列におけるコドン使用頻度と、上記稼働率Ａの算出にも用いたストレプトマイセス・コエリカラー（Streptomyces coelicolor）の全ＯＲＦ中におけるコドン使用頻度に基づき、以下の式を用いてｔＲＮＡの稼働率Ｂを算出した。各ｔＲＮＡについての稼働率Ｂの算出結果を図２に示す。
【数７】
0005947470.tif 000012
【００６４】
次いで、表１に示すタンパク質のコード配列中における使用頻度が１０回／コドン１０００個以上であるコドンに対応するｔＲＮＡについて求めた稼働率Ｂの平均値および標準偏差に基づき、以下の式を用いて算出した稼働率Ｂの偏差値が７０以上であるｔＲＮＡを高稼働ｔＲＮＡと判定した。
【数８】
0005947470.tif 000013
【００６５】
計算の結果、ストレプトマイセス・コエリカラー（Streptomyces coelicolor A3(2)）では、稼働率Ｂの平均値が１．０２、標準偏差が０．２９であった。コドンＣＧＧ（Ａｒｇ）に対応するｔＲＮＡ（稼働率Ｂが１．６６、偏差値は７２．２であった）、およびコドンＧＧＧ（Ｇｌｙ）に対応するｔＲＮＡ（稼働率Ｂが１．９１、偏差値は８０．７であった）を高稼働ｔＲＮＡとして同定し、以後の実験に使用した。【００６６】
（３）非存在ｔＲＮＡ遺伝子の同定
上述の tRNAdb に登録されているｔＲＮＡ遺伝子の情報から、ストレプトマイセス・コエリカラー（Streptomyces coelicolor A3(2)）のゲノム中には、コドンＣＧＣ（Ａｒｇ）、ＣＧＡ（Ａｒｇ）およびＡＴＡ（Ｉｌｅ）に対応するｔＲＮＡをコードする遺伝子が存在しないことが判明した。これらのｔＲＮＡも、以後の実験（宿主細胞の改変）に使用した。【００６７】
２．高稼働ｔＲＮＡ発現株（改変宿主細胞）の作成
（１−１）ｔＲＮＡ遺伝子のクローニング１
ストレプトマイセス・コエリカラー（Streptomyces coelicolor A(3)2）のゲノム情報（GenBank no. NC_003888）を基に、ｔＲＮＡ遺伝子を増幅するためのプライマーを設計した（表２）。ストレプトマイセス・リビダンス TK64（Streptomyces lividans TK64） のゲノムＤＮＡをテンプレート、設計したプライマーをフォワードプライマーとリバースプライマーとし、タカラバイオ社の PrimeSTAR(登録商標) GXL DNA Polymeraseキットを用いてＰＣＲ反応を行い、目的のｔＲＮＡ遺伝子を増幅した。例えば、GCC断片取得のためのPCR反応は、（９８℃にて２分）を１サイクル後、（９８℃にて３０秒，５５℃にて３０秒，６８℃にて３０秒）を３０サイクルの条件で行った。かかる増幅により得た、ＧＣＣ（Ａｌａ）、ＣＴＧ（Ｌｅｕ）、ＣＧＧ（Ａｒｇ）、ＧＧＧ（Ｇｌｙ）およびＡＴＣ（Ｉｌｅ）に対応するｔＲＮＡ遺伝子（上流および下流領域を含む）の配列は、それぞれ配列番号１７、１８、１９、２０および２１に対応する。その後、各遺伝子を、ｐＳＧ５の複製起点を有するプラスミドに導入した。【００６８】
【表２】
0005947470.tif 000014
【００６９】
（１−２）ｔＲＮＡ遺伝子のクローニング２
ストレプトマイセス・コエリカラーのゲノムに存在しないｔＲＮＡ遺伝子は、点変異導入法により作成した。変異導入のために、表３に示したプライマーを設計した。点変異導入前のｔＲＮＡ遺伝子が組込まれたプラスミドをテンプレートとし、設計したプライマーとタカラバイオ社のPrimeSTAR(登録商標)  GXL DNA Polymeraseキットを用いてＰＣＲ反応を行った。例えば、PCR反応は、（９８℃にて２分）を１サイクル後、（９８℃にて３０秒、５５℃にて３０秒、６８℃にて４２０秒）を２０サイクルの条件で行った。その後、増幅産物をＤｐｎＩで処理することにより、それぞれコドンＣＧＣ（Ａｒｇ）、ＣＧＡ（Ａｒｇ）およびＡＴＡ（Ｉｌｅ）に対応するｔＲＮＡ遺伝子（上流および下流領域を含み、それぞれ配列番号２２、２３および２４に対応する）を得た。【００７０】
【表３】
0005947470.tif 000015
【００７１】
（２）ｔＲＮＡ発現ベクターの作成
ｐＳＧ５の複製起点を有するベクターに、上記の通り取得したｔＲＮＡ遺伝子を連結し、ｔＲＮＡ発現ベクターを作成した。作成したｔＲＮＡ発現ベクターの名称および組み込んだｔＲＮＡ遺伝子を表４に示し、該ｔＲＮＡ発現ベクターの構造を図３に示す。【００７２】
【表４】
0005947470.tif 000016
【００７３】
（３）放線菌の形質転換  
ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）1326株（独立行政法人 製品評価技術基盤機構 バイオテクノロジー本部 生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ）：ＮＢＲＣ番号１５６７５）を各ｔＲＮＡ発現ベクターで形質転換した。放線菌の形質転換は、放線菌に関する遺伝子操作技術についての「Genetic Manipulation of Streptomyces」（Hopwood,D.A.ら、1985年、Genetic Manipulation of Streptomyces: a Laboratory Manual，the John Innes Foundation，Norwich）に記載の方法に従って行った。【００７４】
（４）ｔＲＮＡ遺伝子の発現確認
宿主細胞内でｔＲＮＡ遺伝子が過剰発現しているかどうかは、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）法によって確認した。ｔＲＮＡ発現ベクターで形質転換された放線菌（Streptomyces lividans）をカナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含有するＳＳＭＰ培地５ｍＬにて、試験管培養（２８℃で４８時間）した。１ｍＬの培養液を分取し、遠心分離（１４，０００ｒｐｍ、２０分）により、該培養液から菌体を回収した。Invitrogen社のPureLink(商標) miRNA Isokation Kit を用いて低分子ＲＮＡを精製した後、TOYOBO社のReverTraAce(登録商標) qPCR RT Kit を用いてｃＤＮＡを作製した。次に、TOYOBO社のTHUNDERBIRD(登録商標) SYBR(登録商標) qPCR Mix kitを用いて、目的ｔＲＮＡの発現量を定量した。ｔＲＮＡの検出には、表５に示すプライマーを設計し、これをプライマー対として、検出に用いた。定量ＰＣＲ反応には、コルベットリサーチ社のRotergene 3000を用いた。PCR反応は、（９５℃にて６０秒）を１サイクル後、（９５℃にて１５秒，５５℃にて１０秒，７２℃にて３０秒）を４０サイクルの条件で行った。【００７５】
【表５】
0005947470.tif 000017
【００７６】
未改変のストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）1326株、およびコドンＧＣＣ（Ａｌａ）に対応するｔＲＮＡ遺伝子を組み込んだ発現ベクターを用いてプロトプラスト−ＰＥＧ法により形質転換されたストレプトマイセス・リビダンス1326株において、コドンＧＣＣ（Ａｌａ）に対応するｔＲＮＡの発現量を定量した。コントロール実験として、コドンＧＡＣ（Ａｓｐ）に対応するｔＲＮＡの発現量を定量した。【００７７】
ｔＲＮＡの定量結果を図４に示す。株間の差を排除するために、コドンＧＣＣに対応するｔＲＮＡの発現量をコドンＧＡＣに対応するｔＲＮＡの発現量で補正し、相対発現量を算出した。ｔＲＮＡ発現ベクターの導入により、コドンＧＣＣに対応するｔＲＮＡの発現量は２．８倍に増加した。かかる結果より、ｔＲＮＡ発現ベクターからｔＲＮＡが発現していることが確認できた。【００７８】
３．改変宿主細胞を用いたタンパク質発現
（１）タンパク質発現ベクターの構築および改変宿主細胞の作成
タンパク質を高発現させるために、４種類のプロモーター（ストレプトマイセス・スンナモネウス由来ホスソリパーゼD遺伝子（ＰＬＤ）プロモーター（配列番号３９）（特開２００２−５１７８０に開示）、ストレプトマイセス・セプタタス由来メタロエンドプロテアーゼ（ＳＳＭＰ）プロモーター（配列番号３８）（特開２００９−６５８３７に開示）、ストレプトマイセス・エバメチルス由来キシロースイソメラーゼ（ｘｙｌＡ）プロモーター（配列番号４０）（J. Microbiol. Biotechnol. 2008 May;18(5):837-44に開示））およびストレプトマイセス・エバメチルス由来メタロプロテアーゼ遺伝子プロモーター（ＳＡＶプロモーター）（配列番号８０）を利用した。これらプロモーターと共に、表６に記載したタンパク質をｐＩＪ１０１の複製起点を有するベクターに連結し、タンパク質発現ベクターとした。該タンパク質発現ベクターの構造を図５に示す。また、該発現ベクターに導入したタンパク質コード遺伝子とプロモーターの組合せを表７に示す。
これらのタンパク質発現ベクターを用いて ストレプトマイセス・リビダンス1326株を形質転換し、タンパク質発現株を得た。さらに、これらの株を上記の表４に示すｔＲＮＡ発現ベクターを用いて形質転換し、ｔＲＮＡ高発現株とした。形質転換はいずれもプロトプラスト−ＰＥＧ法により行った。【００７９】
【表６】
0005947470.tif 000018
【００８０】
【表７】
0005947470.tif 000019
【００８１】
（２）培養方法
上記の通り作成したｔＲＮＡ高発現株を、まず種菌培養として、チオストレプトン（５０μｇ／ｍＬ）及びカナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含有するＴＳＢ培地（ベクトン・ディッキンソン製 Bacto(商標) Tryptic Soy Broth (Soybean-Casein Digest Medium、品番：211825）５ｍｌにて、試験管培養（２８℃で７２時間）した。その後、ＳＳＭＰ培地５ｍｌに、種菌培養溶液を３％（１５０μＬ）植菌し、試験管培養（２８℃で９６時間）した（ただし、ＳＡＶ＿６３７２発現株のみ４８時間培養した）。ｘｙｌＡプロモーターを利用した場合は、培養開始４８時間後に１０％キシロース溶液を５００μＬ添加した。用いたＳＳＭＰ培地の組成を表８に示す。【００８２】
【表８】
0005947470.tif 000020
【００８３】
（３）発現量評価
培養終了後、菌体外タンパク質（ＳＡＶ＿６２０８、ＳＧＲ＿５５０６、ＳＡＶ＿９６７、ＳＣＯ７５７６、ＡＡＳ６８２２２、ＳＣＯ３２２２、ＳＡＶ＿５２６８、ＳＡＶ＿６１３９、ＳＣＯ５９１２）は、菌体培養液１ｍｌを分取後、遠心（１４，０００ｒｐｍ、２０分）により分離し、上清を回収した。菌体内タンパク質（ＳＣＯ１３５２、ＳＡＶ＿６３７２、ＳＣＯ２４３１）は、菌体培養液１ｍｌを分取後、超音波破砕を行った。次に、得られたサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥデータから、BioRad社のGel DocTM EZ Systemと付属解析ソフト（Image Lab(商標)）を用いて、目的タンパク質のバンドを数値化して発現レベルを定量し、タンパク質発現レベルを比較した。【００８４】
（４）タンパク質発現レベルの比較
タンパク質発現レベルは、ｔＲＮＡ発現ベクター導入前の株におけるタンパク質発現量に対する、ｔＲＮＡ高発現株におけるタンパク質発現量の比率として評価した。結果を図６ならびに表９および１０に示した。作成したいずれのｔＲＮＡ高発現株においても、ｔＲＮＡ発現ベクター導入前の株と比較してタンパク質の発現量が有意に増加した。これらの結果より、本発明において同定した高稼働ｔＲＮＡをコードする遺伝子の導入は、プロモーターに依存せず、宿主細胞におけるタンパク質の発現量を増加させる効果があることが示された。【００８５】
【表９】
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【００８６】
【表１０】
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【００８７】
４．ｔＲＮＡ稼働率とタンパク質発現量増大効果
本明細書で定義した稼働率Ａの偏差値が７０未満であるｔＲＮＡと、該偏差値が７０以上であるｔＲＮＡの効果を比較した。具体的には、ストレプトマイセス・コエリカラー（Streptomyces coelicolor A3(2)）において、コドンＡＴＣ（Ｉｌｅ）に対応するｔＲＮＡ（稼働率Ａ＝２７．５、偏差値＝６６．７）と、コドンＧＣＣ（Ａｌａ）に対応するｔＲＮＡ（稼働率Ａ＝３９．２、偏差値＝７７．８）のそれぞれをコードするｔＲＮＡ遺伝子を、ｐＳＧ５の複製起点を有するベクターに導入し、ｔＲＮＡ発現ベクターとした。コドンＧＣＣ（Ａｌａ）に対応するｔＲＮＡ遺伝子を導入した発現ベクターの構造を図７に示す。
該ｔＲＮＡ発現ベクターを用いて、上記「３．改変宿主細胞を用いたタンパク質発現」と同様の方法に従ってタンパク質発現株の構築、該発現株の培養、およびタンパク質発現量の評価を行った。宿主細胞はストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）1326株、発現させたタンパク質はトランスグルタミナーゼ、用いたプロモーターはＳＳＭＰプロモーターである。【００８８】
タンパク質発現量の評価結果を表１１に示す。コドンＡＴＣに対応するｔＲＮＡ遺伝子を導入した株ではタンパク質発現量の増加がみられない一方で、コドンＧＣＣに対応するｔＲＮＡ遺伝子を導入した株ではタンパク質発現量の増加が確認された。かかる結果から、稼働率の高いｔＲＮＡ、例えば稼働率Ａの偏差値が７０以上であるｔＲＮＡを少なくとも１個、宿主細胞に導入することによって、タンパク質発現量の増大効果が得られることが確認できた。即ち、本明細書で定義した稼働率の偏差値は、宿主細胞への導入によってタンパク質発現量の増大をもたらす高稼働ｔＲＮＡを同定するための指標として有効に機能するものである。【００８９】
【表１１】
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【００９０】
５．改変宿主細胞を用いた化合物生産
（１）アミノ酸誘導体の生産
ｉ）メラニン生産株の構築
プラスミドｐＩＪ７０２に存在する Streptomyces antibioticus のｍｅｌＣオペロン領域（配列番号４３）を、表１２に示すプライマーを用いてクローニングし、ｐＫ１８ｍｏｂクローニングベクターに組み込んだ。得られたベクターの構造を図８に示す。このベクターを用いた形質転換により Streptomyces lividans の染色体上にｍｅｌＣオペロンを導入した。さらに、この株を上記「２．高稼働ｔＲＮＡ発現株（改変宿主細胞）の作成」において作成した４種類のｔＲＮＡ発現ベクター（ｐＢｕＴ０４、ｐＢｕＴ０２、ｐＲａＴ０２およびｐＳＨ０４）を用いて形質転換し、ｔＲＮＡ高発現株とした。形質転換はいずれもプロトプラスト−ＰＥＧ法により行った。【００９１】
【表１２】
0005947470.tif 000024
【００９２】
ｉｉ）培養方法
得られたｔＲＮＡ高発現株を、種菌培養として、チオストレプトン（５０μｇ／ｍＬ）及びカナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含有するＴＳＢ培地５ｍｌにて、試験管培養（２８℃で７２時間）した。その後、ＴＳＢ培地５ｍｌに、種菌培養溶液を３％（１５０μＬ）植菌し、２８℃で９６時間振とう培養した。【００９３】
ｉｉｉ）メラニンの定量
培養終了後、菌体培養液を１ｍｌ回収し、遠心（１４，０００ｒｐｍ、２０分）により分離した。上清を回収し、４０５ｎｍの吸光度を測定した。具体的には、ｔＲＮＡ遺伝子導入前の株の４０５ｎｍにおける吸光度に対する、ｔＲＮＡ高発現株の４０５ｎｍにおける吸光度の比率を算出することにより、ｔＲＮＡ遺伝子導入によるメラニン生産量の変化を評価した。結果を表１３に示す。該表に示される結果から、高稼働ｔＲＮＡをコードする遺伝子の宿主細胞への導入が、メラニン等のアミノ酸誘導体の生産量の増加に寄与することが示された。【００９４】
【表１３】
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【００９５】
（２）イソプレノイド（テルペン）の生産
ｉ）α‐セリネン生産株の構築
Herpetosiphon aurantiacus DSM 785 由来のα‐セリネン合成遺伝子（GenBank Gene ID: 5734860）の情報を基に、人工遺伝子合成技術を用いて放線菌に最適化されたコドン使用頻度をもつ人工遺伝子（配列番号４４）を作成した。また、Streptomyces avermitilis MA-4680 のゲノムＤＮＡをテンプレートとし、表１４に示すプライマーを用いて、Streptomyces avermitilis MA-4680 由来のｐｔｌＢ遺伝子（GenBank Gene ID: 1210633、配列番号４７）をクローニングした。この２つの遺伝子を、プラスミドｐＩＪ１０１の複製起点を有するベクターに導入し、α‐セリネン発現ベクターとした。このベクターは、図５に対応させると、"promoter"の位置にストレプトマイセス・エバメチルス由来メタロプロテアーゼ遺伝子プロモーター（ＳＡＶプロモーター）（配列番号８０）、"target protein"の位置にα‐セリネン合成遺伝子およびｐｔｌＢ遺伝子が組み込まれた構造を有するものである。
このα‐セリネン発現ベクターを用いて Streptomyces lividans を形質転換し、これをα‐セリネン発現株とした。さらに、この株を上記「２．高稼働ｔＲＮＡ発現株（改変宿主細胞）の作成」において作成した３種類のｔＲＮＡ発現ベクター（ｐＢｕＴ０４、ｐＢｕＴ０２およびｐＲａＴ０２）を用いて形質転換し、ｔＲＮＡ高発現株とした。形質転換はいずれもプロトプラスト−ＰＥＧ法により行った。【００９６】
【表１４】
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【００９７】
ｉｉ）培養方法
得られたｔＲＮＡ高発現株を、種菌培養として、チオストレプトン（５０μｇ／ｍＬ）及びカナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含有するＴＳＢ培地５ｍｌにて、２８℃で７２時間振とう培養した。その後、ＡＶＭ半合成培地５ｍｌに、種菌培養溶液を１％（５０μＬ）植菌し、２８℃で１２０時間振とう培養した。用いたＡＶＭ半合成培地の組成を表１５に示す。【００９８】
【表１５】
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【００９９】
ｉｉｉ）α‐セリネンの定量
培養終了後、菌体培養液を２ｍｌ回収後、遠心（１４，０００ｒｐｍ、２０分）により分離し、菌体を回収した。回収した菌体を１．５ｍｌのメタノールで分散し、５分間振蕩してα‐セリネンを抽出した。次いで、遠心（１４，０００ｒｐｍ、２０分）により上清のメタノール１ｍｌを回収し、０．２５ｍｌ蒸留水及び０．５ｍｌヘキサンを加えて振蕩で混合した。さらに遠心分離後、上層のヘキサン層１５０μｌをサンプルとし、このヘキサン溶液中のα‐セリネンの量を、GL Sciences社のInertCap 5カラムを用いた島津製作所のガスクロマトグラフィーで、レート２０℃／分の５０℃（２分保持）〜２８０℃（６．５分保持）の温度グラジェントで溶出し定量した。なお、この条件では、α‐セリネンは１０．１分付近に溶出される。また、α‐セリネンの量は、上記クロマトグラムにおけるβ‐カリオフィレン標準品の検量線により算出される。
結果を表１６に示す。ｐＲａＴ０２による生産量増加が最も大きかったが、高稼働ｔＲＮＡセット（ｐＢｕＴ０４、ｐＢｕＴ０２）を導入した場合にもα‐セリネン生産量の増加が確認された。【０１００】
【表１６】
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【０１０１】
６．放線菌改変宿主細胞を用いた異種タンパク質発現
特開２００７−１２４９２２の実施例に基づき、ロドトルラ・ルブラ（Rhodotolura rubra）JCM3782株由来の３−キヌクリジノン不斉還元酵素（以下、単に「キヌクリジノン」とも称する）のｃＤＮＡ（配列番号５０）をクローニングした。この遺伝子をｐＩＪ１０１の複製起点を有するベクターに導入し、キヌクリジノン発現ベクターとした。このベクターは、図５に対応させると、"promoter"の位置にストレプトマイセス・エバメチルス由来メタロプロテアーゼ遺伝子プロモーター（ＳＡＶプロモーター）（配列番号８０）、"target protein"の位置にキヌクリジノン遺伝子が組み込まれた構造を有するものである。【０１０２】
このキヌクリジノン発現ベクターを用いて Streptomyces lividans を形質転換し、これをキヌクリジノン発現株とした。さらに、この株を「２．高稼働ｔＲＮＡ発現株（改変宿主細胞）の作成」において作成した４種類のｔＲＮＡ発現ベクター（ｐＢｕＴ０４、ｐＢｕＴ０２、ｐＲａＴ０２およびｐＳＨ０４）を用いて形質転換し、ｔＲＮＡ高発現株とした。形質転換はいずれもプロトプラスト−ＰＥＧ法により行った。【０１０３】
培養方法は、上記「３．改変宿主細胞を用いたタンパク質発現の（２）培養方法」と同様の手法で実施した。また、発現量は、上記「３．改変宿主細胞を用いたタンパク質発現の（３）発現量評価」における菌体内タンパク質と同様の手法で評価した。発現レベルの比較は、「３．改変宿主細胞を用いたタンパク質発現の（４）タンパク質発現レベルの比較」と同様の手法で行った。結果を表１７に示した。使用頻度が高いｔＲＮＡ高発現株では、ｔＲＮＡ発現ベクター導入前の株と比較してタンパク質の発現量が有意に増加した。この結果より、高稼働ｔＲＮＡの高発現は、宿主細胞由来の遺伝子のみならず、異種由来の遺伝子の発現においてもタンパク質の発現量を増加させる効果があることが示された。【０１０４】
【表１７】
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【０１０５】
７．大腸菌における高稼働ｔＲＮＡの同定
（１）全タンパク質コード配列に基づく稼働率Ａの算出および高稼働ｔＲＮＡ遺伝子の同定
エシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）  Ｋ１２のゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＣ＿０００９１３）に対して、ｔＲＮＡ稼働率Ａを上記「１．放線菌における高稼働ｔＲＮＡの同定の（１）全タンパク質コード配列に基づく稼働率の算出および高稼働ｔＲＮＡの同定」と同様の方法に従って算出した。計算の結果（図９）、エシェリシア・コリ  Ｋ１２では、稼働率Ａの平均値は９．２８、標準偏差は５．２９であった。コドンＣＡＴ（Ｈｉｓ）に対応するｔＲＮＡ（稼働率が２６．３、偏差値が８２．２）、コドンＧＣＧ（Ａｌａ）に対応するｔＲＮＡ（稼働率Ａが２１．４、偏差値は７２．９）、およびコドンＧＡＴ（Ａｓｐ）に対応するｔＲＮＡ（稼働率Ａが２１．１、偏差値は７２．３）を高稼働率ｔＲＮＡと同定した。しかし、これらのコドンに対応するｔＲＮＡ遺伝子は、大腸菌ゲノム上に見出すことができなかった。そこで、ｗｏｂｂｌｅ則に従い、これらのコドンを認識するｔＲＮＡ、すなわちコドンＣＡＣ（Ｈｉｓ）、コドンＧＣＡ（Ａｌａ）およびコドンＧＡＣ（Ａｓｐ）に対応するｔＲＮＡを高稼働率ｔＲＮＡとして以後の実験に使用した。【０１０６】
（２）非存在ｔＲＮＡ遺伝子の同定
ｔＲＮＡｄｂに登録されているｔＲＮＡ遺伝子の情報から、エシェリシア・コリ  Ｋ１２（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）のゲノム中には、コドンＣＧＣ（Ａｒｇ）、ＣＧＡ（Ａｒｇ）およびＡＴＡ（Ｉｌｅ）に対応するｔＲＮＡをコードする遺伝子が存在しなかった。これらのｔＲＮＡも、以後の実験に使用した。【０１０７】
８．高稼働ｔＲＮＡ発現株（大腸菌）の作成
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ１２のゲノム情報を基に、ｔＲＮＡ遺伝子を増幅するためのプライマーを設計した（表１８）。上記「２．高稼働ｔＲＮＡ発現株（改変宿主細胞）の作成の（１−１）ｔＲＮＡ遺伝子のクローニング１」と同様に、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ１２のゲノムＤＮＡをテンプレートとし、設計したプライマーとタカラバイオ社の PrimeSTAR(登録商標) GXL DNA Polymeraseキットを用いてＰＣＲ反応を行い、目的のｔＲＮＡ遺伝子を増幅した。ＰＣＲ反応条件も上記「２．高稼働ｔＲＮＡ発現株（改変宿主細胞）の作成の（１−１）ｔＲＮＡ遺伝子のクローニング１」と同様である。かかる増幅により得た、ＧＡＣ（Ａｓｐ）、ＧＣＡ（Ａｌａ）、ＣＡＣ（Ｈｉｓ）、ＡＧＧ（Ａｒｇ）およびＡＴＣ（Ｉｌｅ）に対応するｔＲＮＡ遺伝子（上流および下流領域を含む）の配列は、それぞれ配列番号６７、６８、６９、７０および７１に対応する。その後、各遺伝子を、ｐＭＢ１を複製起点として有するプラスミドに導入した。【０１０８】
【表１８】
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【０１０９】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ１２のゲノムに存在しないｔＲＮＡは、点変異導入法により作成した。表１９に示したプライマーを設計した。上記「２．高稼働ｔＲＮＡ発現株（改変宿主細胞）の作成の（１−２）ｔＲＮＡ遺伝子のクローニング２」と同様に、点変異導入前のｔＲＮＡ遺伝子が組込まれたプラスミドをテンプレートとした。テンプレートとなるＡＧＧ（Ａｒｇ）およびＡＴＣ（Ｉｌｅ）は、上記項目に述べた手法でｔＲＮＡ遺伝子をクローニングした。テンプレートと設計したプライマーとタカラバイオ社のPrimeSTAR(登録商標) GXL DNA Polymeraseキットを用いてＰＣＲ反応を行った後、ＤｐｎＩ処理により、それぞれコドンＣＧＣ（Ａｒｇ）、ＣＧＡ（Ａｒｇ）およびＡＴＡ（Ｉｌｅ）に対応する遺伝子（上流および下流領域を含み、それぞれ配列番号７２、７３および７４に対応する）を得た。ＰＣＲ反応条件も上記「２．高稼働ｔＲＮＡ発現株（改変宿主細胞）の作成の（１−２）ｔＲＮＡ遺伝子のクローニング２」と同じである。【０１１０】
【表１９】
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【０１１１】
ｐＡＣＹＣの複製起点を有するベクターに、上記の通り取得したｔＲＮＡ遺伝子を連結し、ｔＲＮＡ発現ベクターを作成した。作成したｔＲＮＡ発現ベクターの名称および組み込んだｔＲＮＡ遺伝子を表２０に示し、該ｔＲＮＡ発現ベクターの構造を図１０に示す。【０１１２】
【表２０】
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【０１１３】
９．大腸菌改変宿主細胞を用いたタンパク質発現
（１）タンパク質発現ベクターの構築および改変宿主細胞の作成
３種類のタンパク質を高発現させるために、ｐＫＫ２３３−３ベクター（ファルマシア・バイオテックス社製）を利用した。リパーゼはＡｃｔｉｎｏｂａｃｔｏｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ  ｓｕｂｓｐ．  ａｎｔｉｒａｔｕｓのゲノムＤＮＡをテンプレートとし、表２１に示すプライマーを用いて、該生物由来リパーゼ遺伝子（配列番号７７）をクローニングした。Ｅｑｕｕｓ  ｃａｂａｌｌｕｓ由来フェリチンＬサブユニット遺伝子（配列番号７８、GenBak Gene ID: 167621434）およびＬｉｓｔｅｒｉａ  ｉｎｎｏｃｕａ由来ＤＰＳ遺伝子（配列番号７９、GenBak Gene ID: 26185792）は、人工遺伝子合成技術を用いて全合成した。プロモーターと共にこれらの遺伝子をｐＢＲ３２２の複製起点を有するベクターに連結し、タンパク質発現ベクターとした。
これらのタンパク質発現ベクター、および表２０に示すｔＲＮＡ発現ベクターの２種類を用いて、大腸菌Ｗ３１１０株を形質転換し、ｔＲＮＡ高発現株とした。形質転換はヒートショック法により行った。【０１１４】
【表２１】
0005947470.tif 000033
【０１１５】
（２）培養方法
上記の通り作成したｔＲＮＡ高発現株を、まず種菌培養として、アンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）及びクロラムフェニコール（１５μｇ／ｍＬ）を含有するＬＢ培地（ナカライテスク製  ＬＢ培地、Ｍｉｌｌｅｒ、品番：２００６８−７５）３ｍＬにて、試験管培養（３７℃で２４時間）した。その後、２ｘＹＴ培地（ナカライテスク製、ＬＢ培地、Ｌｅｎｎｏｘ、品番：２００６６−９５を２倍濃度で使用）に終濃度１％になるようにラクトース溶液を加えた培養液３ｍＬに、種菌培養溶液を０．１％（３μＬ）植菌し、試験管培養（３７℃で７２時間）した。【０１１６】
（３）発現量評価
培養終了後、菌体培養液１０μＬを回収し、等量のＳＤＳバッファーを加え、ボルテックスした。９９℃で５分間熱処理後、得られたサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥデータから、BioRad社のGel DocTM EZ Systemと付属解析ソフト（Image Lab(商標)）を用いて、目的タンパク質のバンドを数値化して発現レベルを定量し、タンパク質発現レベルを比較した。
タンパク質発現レベルは、上記「３．改変宿主細胞を用いたタンパク質発現の（４）タンパク質発現レベルの比較」と同様の手法で評価した。結果を表２２に示す。作成したいずれのｔＲＮＡ高発現株においても、ｔＲＮＡ発現ベクター導入前の株と比較してタンパク質の発現量が有意に増加した。これらの結果より、高稼働ｔＲＮＡの高発現は、宿主細胞を大腸菌とした場合でもタンパク質の発現量を増加させる効果があること、また宿主細胞に依存せず、ｔＲＮＡ発現ベクターの導入によりタンパク質の発現量を増加させる効果があることが示された。【０１１７】
【表２２】
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【産業上の利用可能性】
【０１１８】
本発明は、タンパク質発現用の改変宿主細胞であって、該宿主細胞において稼働率の高いｔＲＮＡをコードする遺伝子が導入された改変宿主細胞を提供する。該改変宿主細胞は、該ｔＲＮＡコード遺伝子が導入されていない宿主細胞と比較して高い効率でタンパク質を発現するものであり、タンパク質の組換え発現や有用化合物の生産において好適に用いることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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