(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
β−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼポリペプチドであって、
ｉ）切断型ＣｇｔＢポリペプチドであって、２０個と３０個の間のアミノ酸がＣｇｔＢポリペプチドのＣ末端から取り去られており、前記ＣｇｔＢポリペプチドは、配列番号２、配列番号８、および配列番号１０からなる群より選択される、切断型ＣｇｔＢポリペプチドと、
ｉｉ）前記切断型ＣｇｔＢポリペプチドのＣ末端に融合されたマルトース結合タンパク質と、
を含み、
前記β−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼポリペプチドが、ガラクトース部分をドナー基質からアクセプター基質に転移し、前記β−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼポリペプチドは、増強されたガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有する、
β−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼポリペプチド。
【請求項２】
前記切断型ＣｇｔＢポリペプチドが、ＯＨ４３８４、ＮＣＴＣ１１１６８（１１１６８）、およびＨＳ：１０からなる群より選ばれるＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ株に由来するものである、請求項１に記載のβ−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼポリペプチド。
【請求項３】
前記アクセプター基質が、糖ペプチド、糖タンパク質、糖脂質、またはガングリオシドである、請求項１に記載のβ−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼポリペプチド。
【請求項４】
ガラクトシル化生成物糖類を産生する方法であって、
ａ）アクセプター基質を、ガラクトース部分を含むドナー基質および請求項１に記載のβ−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼポリペプチドと接触させるステップと、
ｂ）前記アクセプター基質への前記ガラクトース部分の転移を生じさせ、それによって、前記ガラクトシル化生成物糖類を産生するステップと、
を含む、
方法。
【請求項５】
ガラクトシル化タンパク質またはペプチドを産生する方法であって、
ａ）アクセプター基質を、ガラクトース部分を含むドナー基質および請求項１に記載のβ−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼポリペプチドと接触させるステップと、
ｂ）前記アクセプター基質への前記ガラクトース部分の転移を生じさせ、それによって、前記ガラクトシル化タンパク質またはペプチドを産生するステップと、
を含む、
方法。
【請求項６】
ガラクトシル化糖脂質またはガングリオシドを産生する方法であって、
ａ）アクセプター基質を、ガラクトース部分を含むドナー基質および請求項１に記載のβ−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼポリペプチドと接触させるステップと、
ｂ）前記アクセプター基質への前記ガラクトース部分の転移を生じさせ、それによって、前記ガラクトシル化糖脂質またはガングリオシドを産生するステップと、
を含む、
方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連する出願への相互参照
本願は、２００７年４月２０日に出願された米国仮特許出願第６０／９２５，４５１号の利益を主張する。米国仮特許出願第６０／９２５，４５１号は、全ての目的のために本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
本発明は、増強されたβ１，３−ガラクトサミニルトランスフェラーゼ活性を有するＣｇｔＢタンパク質、ＣｇｔＢタンパク質をコードする核酸、およびＣｇｔＢタンパク質を使用するための方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉの細胞表面糖脂質（リポオリゴ糖、ＬＯＳ）は、かなりの構造的多様性を示し、多くのガングリオシド模倣物が病原性株において見出されており、これは、遺伝子座の遺伝的多様性と互いに関連付けられてきた（非特許文献１）。多数のＣ．ｊｅｊｕｎｉ株のＬＯＳ生合成遺伝子クラスターが試験され、それらの遺伝子内容および遺伝子組織に基づいて８つのクラス（「Ａ」〜「Ｈ」）に分けられてきた（非特許文献２）。最初の３つのクラス（「Ａ」、「Ｂ」および「Ｃ」）は、シアル酸の生合成および成長しているＬＯＳへシアル酸を組み込んでガングリオシド模倣物を構成するために必要とされるｎｅｕＢＣＡおよびｃｓｔ−ＩＩ遺伝子を含む（非特許文献１；非特許文献２）。本発明者らは、シアリル化グリカンの合成に関心があるため、本発明者らは、クラス「Ａ」、「Ｂ」および「Ｃ」（非特許文献１に記載）に属するクラスターからの遺伝子によりコードされる酵素に本発明者らの研究努力の焦点を合わせた。
【０００４】
同じＬＯＳ生合成グリコシルトランスフェラーゼのためＣ．ｊｅｊｕｎｉ株間には、かなりのアミノ酸配列変化が存在する（非特許文献１）。８つの異なる血清型を発現する１１のＣ．ｊｅｊｕｎｉ株由来のＬＯＳ生合成遺伝子の調査は、この細菌がそのＬＯＳの構造を変えることができる５つの別個の機序の識別に至った（非特許文献１）。これらの機序の１つは、異なるアクセプター特異性を有する「対立遺伝子」グリコシルトランスフェラーゼをもたらす単一または複数の突然変異の発生にある（非特許文献１）。これは、ＣｇｔＡ（β１，４−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ）およびＣｓｔ−ＩＩ（α２，３−／２，８−シアリルトランスフェラーゼ）の変異体の調査によって明確に実証された。クラス「Ａ」、「Ｂ」および「Ｃ」からの６つのＣｇｔＡ変異体（全アミノ酸配列同一性の３４％を共有）は、非−シアリル化（ラクトース）、モノ（ＧＭ３１）−またはジシアリル化（ＧＤ３１）ＦＣＨＡＳＥ−標識アクセプターに対して異なる特異的活性を示した（非特許文献１）。同様に、クラス「Ａ」および「Ｂ」からのＣｓｔ−ＩＩの６つの変異体（全体アミノ酸配列同一性９２％を共有）は、非−シアリル化（ラクトース）またはシアリル化（ＧＭ３１）ＦＣＨＡＳＥ−標識アクセプターに対して異なる特異的活性を示した（非特許文献１）。クラス「Ｃ」に属するＣｓｔ−ＩＩ変異体がラクトース−ＦＣＨＡＳＥとは活性であり、ＧＭ３−ＦＣＨＡＳＥとは不活性であることがかねてより示されている（非特許文献３）。アクセプター選好性および特定の活性レベルにおけるこれらの違いは、酵素変異体間のアミノ酸配列ダイバージェンスの結果である。
【０００５】
ＣｇｔＡの場合と同様に、ＣｇｔＢ（β１，３−ガラクトサミニルトランスフェラーゼ）酵素は、配列ダイバージェンスを示す：クラス「Ａ」、「Ｂ」および「Ｃ」に属する１１の株由来の配列間でわずか４７％アミノ酸配列同一性が報告されている（非特許文献１）。しかしながら、クラス「Ａ」、「Ｂ」、および「Ｃ」からのＣｇｔＢ変異体の活性およびアクセプター選好性は、ＣｇｔＡおよびＣｓｔ−ＩＩについてなされた（非特許文献３；非特許文献１）ようには、決定されていない。
【０００６】
株ＡＴＣＣ ４３４３２由来のＣｇｔＢ配列（配列番号３および４）、株ＯＨ４３８４由来のＣｇｔＢ配列（配列番号１および２）および株ＡＴＣＣ４３４６０由来のＣｇｔＢ配列（ＳＥＱ ＩＤ：５および６）（それぞれ、血清型ＨＳ：４、ＨＳ：１９およびＨＳ：４１；すべてクラス「Ａ」のメンバー）は、９９％配列同一性を共有する（非特許文献１）。株ＯＨ４３８４由来のＣｇｔＢ（配列番号７および８）（ＣｇｔＢＯＨ４３８４、同じく血清型ＨＳ：１９；図１Ａ）が、さらなる特性決定のために選ばれた。なぜならば、それはすでに部分的に特性決定されているからである（非特許文献３）。クラス「Ｃ」グループのメンバーである株ＮＣＴＣ １１１６８からのＣｇｔＢ（配列番号７および８）（ＣｇｔＢ１１１６８；血清型ＨＳ：２；図１Ｂ）もまた選ばれた。なぜならば、ガングリオシドのグリコン部分ＧＭ１ａのｉｎｖｉｔｒｏ合成のため、およびガングリオシド模倣物の合成のために用いられてきたからである（非特許文献４；非特許文献５）。株ＡＴＣＣ４３４３８由来のものであるクラス「Ａ」の第２のメンバー（配列番号９および１０）（ＣｇｔＢＨＳ：１０；血清型ＨＳ：１０）が、比較のために含められた。なぜならば、その配列がクラス「Ａ」の他のメンバーの配列と異なるからである。そのクラスの他のメンバーと比較して、ＣｇｔＢＨＳ：１０のカルボキシ末端は、多数のアミノ酸置換基を含んでいる（非特許文献１）。これらの変化は、アクセプター選好性を反映することがある（図１Ｃ；非特許文献１）。クラス「Ｂ」からのＣｇｔＢ変異体は、まったく選ばれなかった。なぜならば、それらのアミノ酸配列は、クラス「Ａ」のアミノ酸配列と異ならないからである（非特許文献１）。
【０００７】
細菌グリコシルトランスフェラーゼは、様々な化学酵素スキームにおいてうまく組み入れられてきた。改善された酵素活性は、糖タンパク質、糖ペプチド、糖脂質、およびガングリオシドを含むオリゴ糖の産生における細菌グリコシルトランスフェラーゼの使用を増大させ得るかもしれない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｍ．ｅｔａｌ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７７：３２７−３３７（２００２）
【非特許文献２】Ｐａｒｋｅｒ，Ｃ．Ｔ．ｅｔａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４３：２７７１−２７８１（２００５）
【非特許文献３】ＧｉｌｂｅｒｔＭ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７５：３８９６−３９０６（２０００）
【非特許文献４】Ｌｉｎｔｏｎ，Ｄ．ｅｔａｌ．，Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３７：５０１−１４（２０００）
【非特許文献５】Ｂｌｉｘｔ，Ｏ．ｅｔａｌ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓ．３４０：１９６３−１９７２（２００５）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
１つの態様において、本発明は、１〜３５個のアミノ酸がＣｇｔＢポリペプチドのＣ−末端から取り去られ、マルトース結合タンパク質がＣｇｔＢポリペプチドのＣ−末端ドメインに融合された切断型ＣｇｔＢポリペプチドを含むβ−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼポリペプチドを提供する。本発明のβ−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼポリペプチドは、ガラクトース部分をドナー基質からアクセプター基質に転移する。
【００１０】
本発明のいくつかの実施形態において、β−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼポリペプチドは、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉ ＯＨ４３８４由来である。他の実施形態において、本発明のβ−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼポリペプチドは、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉＮＣＴＣ１１１６８由来である。いくつかの実施形態において、本発明のβ−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼポリペプチドは、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉＨＳ：１０由来である。
【００１１】
いくつかの態様において、本発明のＣｇｔＢポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、および配列番号１０からなる群より選ばれるアミノ酸配列と９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一性を共有する。
【００１２】
いくつかの実施形態において、β−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼのためのアクセプター基質は、糖類、オリゴ糖、糖ペプチド、糖タンパク質、糖脂質、ガングリオシド、またはガングリオシドヘッドグループである。
【００１３】
１つの態様において、本発明のβ−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼは、配列番号２のアミノ酸１〜２６６と９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一なアミノ酸配列を有する。別の態様において、本発明のβ−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼは、配列番号２のアミノ酸１〜２７１と９０％、９１％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を有する。配列番号２のアミノ酸１〜２６６との９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一性を有する切断型ＣｇｔＢポリペプチドは、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉ ＯＨ４３８３、またはＯＨ４３８２またはＯ：４、またはＯ：１９または０：３６、または０：４１またはＨＢ９３−１３から誘導され得る。
【００１４】
１つの実施形態において、本発明のＣｇｔＢ β−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸残基１〜２７１と少なくとも９１％同一性を共有する。別の実施形態において、ＣｇｔＢβ−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸残基１〜２７１を含む。さらなる実施形態において、ＣｇｔＢ β−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸残基１〜２７１およびタンパク質のＣ−末端に融合されたＭＢＰ領域を含む。
【００１５】
いくつかの実施形態において、本発明は、ガラクトシル化生成物糖類を産生する方法を提供し、この方法は、アクセプター基質をβ−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼポリペプチド（切断型ＣｇｔＢタンパク質）およびガラクトースを含むドナー基質と接触させるステップと、このようにして、ガラクトシル化生成物糖類という結果になるアクセプター糖類へのガラクトース部分の転移を生じさせるステップとを含む。
【００１６】
他の実施形態において、本発明は、ガラクトシル化生成物タンパク質またはペプチドを産生する方法を提供し、この方法は、アクセプター基質をβ−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼポリペプチド（切断型ＣｇｔＢタンパク質）およびガラクトースを含むドナー基質と接触させるステップと、このようにして、ガラクトシル化生成物タンパク質またはペプチドという結果になるアクセプター糖類へのガラクトース部分の転移を生じさせるステップとを含む。
【００１７】
いくつかの実施形態において、本発明は、ガラクトシル化生成物糖脂質またはガングリオシドを産生する方法を提供し、この方法は、アクセプター基質をβ−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼポリペプチド（切断型ＣｇｔＢタンパク質）およびガラクトースを含むドナー基質と接触させるステップと、このようにして、ガラクトシル化生成物糖脂質またはガングリオシドという結果になるアクセプター糖類へのガラクトース部分の転移を生じさせるステップとを含む。
【００１８】
１つの態様において、本発明は、ｇａｌａｃｏｓｅ部分をドナー基質からアクセプター基質へ転移する機能を有する約１〜約３５個のアミノ酸がＣ−末端から取り去られた切断型ＣｇｔＢポリペプチドを提供する。いくつかの態様において、本発明のＣｇｔＢポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、および配列番号１０からなる群より選ばれる。本発明は以下をも提供する。
（１）  β−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼポリペプチドであって、
ｉ）切断型ＣｇｔＢポリペプチドであって、１個と３５個の間のアミノ酸が前記ＣｇｔＢポリペプチドのＣ末端から取り去られている切断型ＣｇｔＢポリペプチドと、
ｉｉ）前記ＣｇｔＢポリペプチドの前記Ｃ−末端に融合されたマルトース結合タンパク質ドメインと、
を含み、
前記β−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼポリペプチドが、ガラクトース部分をドナー基質からアクセプター基質に転移する、
β−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼポリペプチド。
（２）  前記切断型ＣｇｔＢポリペプチドが、ＯＨ４３８４、ＮＣＴＣ１１１６８（１１１６８）、およびＨＳ：１０からなる群より選ばれるＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉ株由来である、項目１に記載のβ−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼポリペプチド。
（３）  前記切断型ＣｇｔＢポリペプチドが、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、および配列番号１０からなる群より選ばれるアミノ酸配列と９０％または９５％同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目１に記載のβ−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼポリペプチド。
（４）  前記アクセプター基質が、糖ペプチド、糖タンパク質、糖脂質、またはガングリオシドである、項目１に記載のβ−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼポリペプチド。
（５）  前記切断型ＣｇｔＢポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸１〜２６６と９０％または９５％同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目１に記載のβ−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼポリペプチド。
（６）  前記切断型ＣｇｔＢポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸１〜２７１と９０％または９５％同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目５に記載のβ−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼポリペプチド。
（７）  前記切断型ＣｇｔＢポリペプチドが、ＯＨ４３８４、ＯＨ４３８２、Ｏ：４、Ｏ：１９、Ｏ：３６、Ｏ：４１、またはＨＢ９３−１３からなる群より選ばれるＣ．ｊｅｊｕｎｉ株に由来する、項目５に記載のβ−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼポリペプチド。
（８）  前記切断型ＣｇｔＢポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸残基１〜２７１と少なくとも９１％同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目５に記載のβ−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼポリペプチド。
（９）  前記切断型ＣｇｔＢポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸残基１〜２７１の前記アミノ酸配列を含む、項目５に記載のβ−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼポリペプチド。
（１０）  ガラクトシル化生成物糖類を産生する方法であって、
ａ）アクセプター基質を、ガラクトース部分を含むドナー基質および項目１に記載のβ−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼポリペプチドと接触させるステップと、
ｂ）前記アクセプター糖類への前記ガラクトース部分の転移を生じさせ、それによって
、前記ガラクトシル化生成物糖類を産生するステップと、
を含む、
方法。
（１１）  ガラクトシル化タンパク質またはペプチドを産生する方法であって、
ａ）アクセプター基質を、ガラクトース部分を含むドナー基質および項目１に記載のβ−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼポリペプチドと接触させるステップと、
ｂ）前記アクセプター糖類への前記ガラクトース部分の転移を生じさせ、それによって、前記ガラクトシル化タンパク質またはペプチドを産生するステップと、
を含む、
方法。
（１２）  ガラクトシル化糖脂質またはガングリオシドを産生する方法であって、
ａ）アクセプター基質を、ガラクトース部分を含むドナー基質および項目１に記載のβ−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼポリペプチドと接触させるステップと、
ｂ）前記アクセプター糖類への前記ガラクトース部分の転移を生じさせ、それによって、前記ガラクトシル化糖脂質またはガングリオシドを産生するステップと、
を含む、
方法。
（１３）  切断型ＣｇｔＢポリペプチドであって、１個と３５個の間のアミノ酸が前記ＣｇｔＢポリペプチドのＣ末端から取り去られており、前記ＣｇｔＢポリペプチドが、ガラクトース部分をドナー基質からアクセプター基質に転移する、切断型ＣｇｔＢポリペプチド。
（１４）  前記ＣｇｔＢポリペプチドが、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８および配列番号１０からなる群より選ばれる、項目１３に記載の切断型ＣｇｔＢポリペプチド。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、３つのＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ株由来のコアオリゴ糖を表す。（Ａ）株ＯＨ４３８４（Ａｓｐｉｎａｌｌ，Ｇ．Ｏ．ｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．３３：２４１−２４９ （１９９４））。（Ｂ）イタリック体で表示される相可変末端Ｇａｌ残基（Ｓｔ−Ｍｉｃｈａｅｌ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．，ＥｕｒＪ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６９：５１１９−５１３６（２００２））を伴う株ＮＣＴＣ １１１６８（Ｓｚｙｍａｎｓｋｉ，Ｃ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７８：２４５０９−２４５２０（２００３））。（Ｃ）株ＡＴＣＣ４３４３８（Ｎａｍ，Ｓｈｉｎ Ｊ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓ．３０５：２２３−２３２（１９９７））。すべての場合において、ＣｇｔＢにより付加されたガラクトシル残基は太字であり、アクセプター選好性にとり重要な分岐シアル酸残基はボックスに入れてある。
【図２】図２Ａは、代表的なＣｇｔＢ酵素変異体の多重配列整列を例示する。ＯＨ４３８４はＣｇｔＢＯＨ４３８４であり、１１１６８はＣｇｔＢ１１１６８であり、ＨＳ：１０はＣｇｔＢＨ：１０である。３つの配列すべてにおける同一のアミノ酸残基は、黒い背景中で白く表示され、いずれか２つの配列間で同一のアミノ酸残基は、灰色の背景中で白く表示される。この整列は、ＣｌｕｓｔａｌＸ（Ｎｉｃｈｏｌａｓ，Ｋ．Ｂ．ｅｔａｌ．，ＧｅｎｅＤｏｃ：Ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃ ｖａｒｉａｔｉｏｎ．ＥＭＢＮＥＷ．ＮＥＷＳ．４：１４（ｗｗｗ．ｐｓｃ．ｅｄｕ／ｂｉｏｍｅｄ／ｇｅｎｅｄｏｃ）（１９９７））を用いておこなわれ、ＧｅｎｅＤｏｃ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ｅｔａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：４８７６−４８８２（１９９７））において再フォーマットされた。図２Ｂは、Ｇｅｎｅｄｏｃにおいて割り当てられるいずれか２つのＣｇｔＢ変異体間の同一性および類似性のパーセンテージを示す。
【図３】図３Ａは、ＩＦＮα２ｂ［Ｔｎ］−ＦＣＨＡＳＥのＣＥ−ＭＳ分析の結果を示し、図３Ｂは、ＩＦＮα２ｂ［Ｔ−Ａｇ］−ＦＣＨＡＳＥのＣＥ−ＭＳ分析の結果を示す。関連する種は、質量分析器で同定され、詳細については本文を参照されたい。
【図４】図４Ａは、ＩＦＮα２ｂのＭＡＬＤＩ分析を例示し、図４Ｂは、ＩＦＮα２ｂ［Ｔｎ］のＭＡＬＤＩ分析を例示し、図４Ｃは、ＩＦＮα２ｂ［Ｔ−Ａｇ］のＭＡＬＤＩ分析を例示する。
【図５−１】図５は、本研究のために用いられたオリゴヌクレオチドプライマーを示す。
【図５−２】図５は、本研究のために用いられたオリゴヌクレオチドプライマーを示す。
【図５−３】図５は、本研究のために用いられたオリゴヌクレオチドプライマーを示す。
【図６】図６は、ＣｇｔＢ１１１６８（Δ３０、Ｃ−末端ＭａｌＥ）タンパク質によるヒト成長ホルモン（ＭａｌＥ−ｈＧＨ）タンパク質のガラクトシル化を示す。試料は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離、続いてｃｏｍａｓｓｉｅ染色（左側）およびピーナッツ凝集素によるウェスタンブロット法（右側）を用いて分析された。レーンＡは、４℃で４ヶ月間に保持されたＭａｌＥ−ｈＧＨの標本１μｇである。レーンＢは、グリコシル化されていないＭａｌＥ−ｈＧＨである。レーンＣは、［Ｔｎ］−ＭａｌＥ−ｈＧＨである。レーンＤは、ＣｇｔＢ１１１６８（Δ３０、Ｃ−末端ＭａｌＥ）反応のガラクトシル化ＭａｌＥ−ｈＧＨ生成物である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
Ｉ．  序
本発明は、増強された酵素活性を有する初めてＣ−末端切断型ＣｇｔＢタンパク質を提供する。本発明は、特定のＣｇｔＢタンパク質のための好ましいアクセプターの開示およびＣｇｔＢタンパク質を用いる方法も提供する。
【００２１】
代表的なＣ−末端切断型ＣｇｔＢタンパク質としては、例えば、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ＯＨ４３８３由来のＣｇｔＢ（ＣｇｔＢＯＨ４３８４）、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉＮＣＴＣ１１１６８由来のＣｇｔＢ（ＣｇｔＢ１１１６８）、およびＣ．ｊｅｊｕｎｉ ＨＳ：１０由来のＣｇｔＢ（ＣｇｔＢＨＳ１０）が含まれる。マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）ドメインが、Ｃ−末端切断型ＣｇｔＢＯＨ４３８４、ＣｇｔＢ１１１６８、またはＣｇｔＢＨＳ１０タンパク質のＣ−末端に融合された場合に、酵素活性のさらなる増強が観察された。
【００２２】
ＩＩ．定義
以下の略語が本明細書中において用いられる：
Ａｒａ＝アラビノシル；
Ｆｒｕ＝フルクトシル；
Ｆｕｃ＝フコシル；
Ｇａｌ＝ガラクトシル；
ＧａｌＮＡｃ＝Ｎ−アセチルガラクトサミニル；
Ｇｌｃ＝グルコシル；
ＧｌｃＮＡｃ＝Ｎ−アセチルグルコサミニル；
Ｍａｎ＝マンノシル；および
ＮｅｕＡｃ＝ シアリル（Ｎ−アセチルノイラミニル）。
【００２３】
グリコシルトランスフェラーゼ、例えば、ＣｇｔＢポリペプチドのための「アクセプター基質」または「アクセプター糖類」は、特定のグリコシルトランスフェラーゼのためのアクセプターとして働き得るオリゴ糖部分である。アクセプター基質が、対応するグリコシルトランスフェラーゼおよび糖ドナー基質、ならびに他の必要な反応混合物成分と接触させられ、反応混合物が十分な時間インキュベートされる場合、グリコシルトランスフェラーゼは、糖残基を糖ドナー基質からアクセプター基質へ転移させる。アクセプター基質は特定のグリコシルトランスフェラーゼの種々のタイプについて変わり得る。従って、用語「アクセプター基質」は、特定の用途のための関心対象の特定のグリコシルトランスフェラーゼと共に文脈の中で理解される。β−１，３−グリコシルトランスフェラーゼ、例えば、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ株ＯＨ４３８３、ＮＣＴＣ１１１６８、およびＨＳ：１０由来のＣｇｔＢ、ならびに付加的なグリコシルトランスフェラーゼのためのアクセプター基質が本明細書中において記載される。いくつかの実施形態において、ＣｇｔＢアクセプター基質は、末端ガラクトース残基を有する。いくつかの実施形態において、ＣｇｔＢアクセプター基質は、Ｎ−アセチルガラクトサミニル残基を有する。標識されたＣｇｔＢアクセプター基質としては、例えば、ＧａｌＮＡｃβ−１、４−Ｇａｌβ−１、４−Ｇｌｃ−ＦＣＨＡＳＥ、ＧａｌＮＡｃβ−１、４−［ＮｅｕＡｃα−２，３］−Ｇａｌβ−１、４−ＧＬｃ−ＦＣＨＡＳＥ、ＧａｌＮＡｃβ−１、４−［ＮｅｕＡｃ−α−２，３］−Ｇａｌβ−１、４−Ｇｌｃ−スフィンゴシン−ＦＣＨＡＳＥ、ＧａｌＮＡｃβ−１，４−［ＮｅｕＡｃα−２，８−ＮｅｕＡｃα−２，３］−Ｇａｌβ−１、４−Ｇｌｃ−ＦＣＨＡＳＥ、ＧａｌＮＡｃβ−ＦＣＨＡＳＥ、ＧａｌＮＡｃ−α−ＦＣＨＡＳＥ、ＧａｌＮＡｃ−β−ｐ−ニトロフェニル、ＧａｌＮＡｃ−α−ｐ−ニトロフェニル、．ＦＣＨＡＳＥ−ＮＨ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ［ＧａｌＮＡｃ−α−］Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−ＣＯＯＨ、ＩＦＮα２ｂ［Ｔｈｒ−１３４−ＧａｌＮＡｃ］が含まれる。切断型ＣｇｔＢタンパク質はまた、ガラクトース残基を、例えば、上記で列挙された構造を有する標識されていないアクセプター基質に付加するために用いられ得る。標識されていないアクセプター基質は、例えば、ガラクトシル化生成物を商業的規模で作るために用いられる。
【００２４】
グリコシルトランスフェラーゼのための「ドナー基質」は、活性化ヌクレオチド糖である。そのような活性化糖は一般に、糖のウリジン、グアノシン、およびシチジン一リン酸誘導体（それぞれ、ＵＭＰ、ＧＭＰおよびＣＭＰ）または二リン酸誘導体（それぞれ、ＵＤＰ、ＧＤＰ、およびＣＤＰ）からなり、その中でヌクレオシド一リン酸または二リン酸は、脱離基として働く。例えば、フコシルトランスフェラーゼのためのドナー基質は、ＧＤＰ−フコースである。ＣｇｔＥタンパク質のためのドナー基質としては、例えば、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃまたはＵＤＰ−Ｇａｌが含まれる。シアリルトランスフェラーゼのためのドナー基質は、例えば、所望のシアル酸を含む活性化糖ヌクレオチドである。ＣｇｔＢのためのドナー基質は、ＵＤＰ−Ｇａｌである。例えば、ＮｅｕＡｃの場合、活性化糖は、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃである。細菌、植物、および真菌系は、他の活性化ヌクレオチドを使うことができることがある。ＣｇｔＢタンパク質のためのドナー基質としては、例えば、ＵＤＰ−Ｇａｌが含まれる。
【００２５】
還元末の糖類が実際に還元糖であるか否かにかかわらず、オリゴ糖は、還元末端および非還元末端を有すると考えられる。公認の命名法に従い、オリゴ糖は本明細書中において、非還元末端を左に、還元末端を右に描かれる。本明細書中において記載されるすべてのオリゴ糖は、非還元糖類についての名称また略号（例えば、Ｇａｌ）、続いてグリコシド結合の立体配置（αまたはβ）、環結合、結合に関与した還元糖類の環位置、および次に還元糖類についての名称また略号の名称または略号（例えば、ＧＬｃＮＡｃ）と共に記載される。２つの糖間の連鎖は、例えば、２，３、２→３、または（２，３）として発現され得る。各糖類は、ピラノースまたはフラノースである。
【００２６】
本明細書中において用いられるように、「ガラクトース部分」は、ガラクトースを含むまたはガラクトースから誘導され得る分子を指す。ガラクトース部分は通常、単糖類、例えば、ガラクトースである。
【００２７】
本明細書中において用いられるように、「ガラクトシル化生成物糖類」は、ガラクトース部分を含む、糖脂質または糖タンパク質、例えば、生体分子にコンジュゲートされていないか、またはコンジュゲートされたオリゴ糖、多糖、もしくは炭水化物部分を指す。上記のガラクトース部分のいずれも用いることができ、例えば、ガラクトースである。好ましい実施形態において、ＣｇｔＢにより転移されたガラクトース部分は、ＵＤＰ−Ｇａｌである。
【００２８】
「ポリ−ガラクトシル化生成物糖類」は、ガラクトース残基のポリマー、例えば、２つ以上のガラクトース残基のポリマーを含む、糖脂質または糖タンパク質、例えば、生体分子にコンジュゲートされていないか、またはコンジュゲートされたオリゴ糖、多糖、もしくは炭水化物部分を指す。いくつかの実施形態において、Ｃ−末端切断型ＣｇｔＢタンパク質（Ｃ−末端ＭＢＰドメインを有するまたは有さない）により形成される生成物は、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％未満のポリ−ガラクトシル化生成物糖類を有する。
【００２９】
いくつかの実施形態において、他の糖部分、例えば、フコース、シアル酸、グルコース、ＧａｌＮＡｃまたはＧｌｃＮＡｃも、付加的なグリコシルトランスフェラーゼの作用を介してアクセプター基質に付加されて、ガラクトシル化生成物糖類を産生する。いくつかの実施形態において、アクセプター基質は、ガラクトース部分を含み、ＣｇｔＢタンパク質は、分子上の異なる部位に付加的なガラクトース部分を付加するために用いられて、ガラクトシル化生成物糖類を作る。
【００３０】
用語「シアル酸」または「シアル酸部分」は、９−炭素カルボキシル化糖のファミリーの任意のメンバーを指す。シアル酸ファミリーの最も一般的なメンバーは、Ｎ−アセチル−ノイラミン酸（２−ケト−５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクトノヌロピラノス−１−オン酸（しばしば、Ｎｅｕ５Ａｃ、ＮｅｕＡｃ、またはＮＡＮＡとして略記される）。ファミリーの第２のメンバーは、Ｎ−グリコイル−ノイラミン酸（Ｎｅｕ５ＧｃまたはＮｅｕＧｃ）であり、その中で、ＮｅｕＡｃのＮ−アセチル基は、ヒドロキシル化されている。第３のシアル酸ファミリーメンバーは、２−ケト−３−デオキシ−ノヌロソン酸（ＫＤＮ）（Ｎａｄａｎｏｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１： １１５５０−１１５５７；Ｋａｎａｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：２１８１１−２１８１９（１９９０））。９−Ｏ−ラクチル−Ｎｅｕ５Ａｃまたは９−Ｏ−アセチル−Ｎｅｕ５Ａｃのような９−Ｏ−Ｃ１−Ｃ６アシル−Ｎｅｕ５Ａｃ、９−デオキシ−９−フルオロ−Ｎｅｕ５Ａｃおよび９−アジド−９−デオキシ−Ｎｅｕ５Ａｃのような９−置換シアル酸も含まれる。シアル酸ファミリーの総説については、例えば、Ｖａｒｋｉ，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ２： ２５−４０（１９９２）；Ｓｉａｌｉｃ Ａｃｉｄｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，Ｒ．Ｓｃｈａｕｅｒ，Ｅｄ．（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９２））を参照されたい。シアリル化手順におけるシアル酸化合物の合成および使用は、１９９２年１０月１日公開の国際公開第９２／１６６４０号に開示されている。
【００３１】
本出願において必要とされる命名法および一般的な実験手順の多くは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ Ｅｄ．），Ｖｏｌ．１−３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９８９に見出すことができる。このマニュアルは、以下で「Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ」として参照される。
【００３２】
用語「Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ由来のＣｇｔＢ」、「ＣｇｔＢ」、あるいは「Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ由来のＣｇｔＢ」または「ＣｇｔＢ」をコードする核酸は、（１）例えば、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ株ＯＨ４３８４  ＮＣＴＣ１１１６８、およびＨＳ：１０由来のＣｇｔＢ核酸（代表的なＣｇｔＢ核酸については、例えば、配列番号１、３、５、７、または９参照）によりコードされたアミノ酸配列または、例えば、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ株ＯＨ４３８４  ＮＣＴＣ１１１６８、およびＨＳ：１０由来のＣｇｔＢのアミノ酸配列（代表的なＣｇｔＢタンパク質配列については、例えば、配列番号２、４、６、８、または１０参照）に対して、好ましくは２５、５０、１００、２００、５００、１０００、またはそれ以上のアミノ酸の領域にわたって、少なくとも６０％アミノ酸配列同一性、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、好ましくは９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％あるいはそれ以上のアミノ酸配列同一性を有し；（２）抗体、例えば、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ由来のＣｇｔＢのアミノ酸配列（上記の例）を含む免疫原に対して生じさせられたポリクロナール抗体、および保存的に修飾されたそれらの変異体に結合し；（３）Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ由来のＣｇｔＢ、および保存的に修飾されたその変異体をコードする核酸配列に対応するアンチセンスストランドにストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし、（４）Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ由来のＣｇｔＢ核酸、例えば、配列番号１、３、５、７、または９、あるいは触媒ドメインをコードする核酸に対して、好ましくは少なくとも約２５、５０、１００、２００、５００、１０００、またはそれ以上のヌクレオチドの領域にわたって、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上のヌクレオチド配列同一性を有する、本明細書中において記載される核酸およびポリペプチド多形変異体、対立遺伝子、突然変異体、種間相同体、および活性な切断型タンパク質を指す。好ましくは、触媒ドメインは、配列番号２、４、６、８、または１０のＣｇｔＢ触媒ドメインに対し、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％アミノ酸同一性を有する。ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列は典型的に、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、およびＰａｓｔｅｕｒｅｌｌａを含むがそれらに限定されない細菌に由来する。本発明の核酸およびタンパク質は両方とも、天然または組換え分子を含む。Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ由来のＣｇｔＢタンパク質は典型的に、本明細書中において記載されるように、適切なドナー基質およびアクセプター基質を用いて、当業者に既知の方法に従ってアッセイされ得るβ−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有する。いくつかの実施形態は、例えば、ＣｇｔＢ１１１６８（Δ３０）、ＣｇｔＢＨＳ：１０（Δ２０）およびＣｇｔＢＯＨ４３８４（Δ３０）のＣｇｔＢタンパク質の切断型形状を含む。付加的な実施形態は、タンパク質、例えば、ＣｇｔＢ１１１６８（Δ３０、Ｃ−末端ＭａｌＥ）、ＣｇｔＢ���Ｓ：１０（Δ２０、Ｃ−末端ＭａｌＥ）およびＣｇｔＢＯＨ４３８４（Δ３０、Ｃ−末端ＭａｌＥ）のＣ−末端におけるＭＢＰドメインに融合されたＣ−末端切断型ＣｇｔＢタンパク質を含む。
【００３３】
「商業的規模」は、単一反応におけるガラクトシル化生成物のグラムスケール産生を指す。好ましい実施形態において、商業的規模は、約５０、７５、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、または２００グラム以上のガラクトシル化生成物の産生を指す。
【００３４】
本明細書中において用いられるように、「切断型ＣｇｔＢポリペプチド」または文法的異形は、切断型ＣｇｔＢポリペプチドが酵素活性を保持する限り、天然の野生型ＣｇｔＢポリペプチドに比して、少なくとも１つのアミノ酸残基を取り去るように操作されたＣｇｔＢポリペプチドを指す。野生型または天然のＣｇｔＢタンパク質の例としては、例えば、配列番号２、４、６、８、または１０が含まれる。
【００３５】
本明細書中において用いられるように、「マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）ドメイン」または文法的異形は、Ｅ．ｃｏｌｉマルトース結合ドメインタンパク質を指す。ＭＢＰドメインは典型的に、細胞とのタンパク質の可溶性を増強するためにタンパク質に融合される。例えば、ＫａｐｕｓｔおよびＷａｕｇｈＰｒｏ．Ｓｃｉ．８：１６６８−１６７４（１９９９）を参照されたい。他のマルトース結合ドメインが知られており、本明細書中において記載されるように、ＣｇｔＢタンパク質に融合されることができ、例えば、ＹｅｒｓｉｎｉａＥ．ｃｏｌｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍａｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍｅ、およびＶｉｂｒｉｏｃｈｏｌｅｒａｅ由来のＭＢＰドメインである。アミノ酸リンカーは、ＭＢＰドメインとＣｇｔＢタンパク質との間に置かれ得る。
【００３６】
「保存的に修飾された変異体」は、アミノ酸および核酸配列の双方にあてはまる。特定の核酸配列に関して、保存的に修飾された変異体は、同一または本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸、または核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に同一の配列を指す。遺伝コードの縮重のため、多数の機能的に同一の核酸は、任意のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵはすべて、アミノ酸アラニンをコードする。従ってコドンによりアラニンが指定されるあらゆる位置に置いて、コドンは、コードされたポリペプチドを変更することなく記載された対応するコドンのうちのいずれにでも変更され得る。そのような核酸変動は、「サイレント変動」であり、これは、保存的に修飾された変動の１種である。ポリペプチドをコードする本明細書中におけるすべての核酸はまた、核酸のあらゆる考え得るサイレント変動を記述する。当業者は、核酸中の各コドン（通常、メチオニンのための唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常、トリプトファンのための唯一のコドンであるＴＧＧを除く）が、機能的に同一の分子を産生するように修飾され得ることを理解するであろう。従って、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変動は、発現生成物に関しては、各記述された配列において暗黙的であるが、実際のプローブ配列に関してはそうではない。
【００３７】
アミノ酸配列に関して、当業者は、コードされた配列において単一のアミノ酸または小さいパーセンテージのアミノ酸を変更、付加または欠失する、核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列に対する個々の置換、欠失または付加が、化学的に同様なアミノ酸によるアミノ酸の置換という結果になる「保存的に修飾された変異体」であることを理解するであろう。機能的に同様なアミノ酸を提供する保存的置換表は、当該技術分野においてよく知られている。そのような保存的に修飾された変異体は、本発明の多形変異体、種間相同体、および対立遺伝子に加えられるものであり、これらを除外しない。
【００３８】
当業者は、タンパク質の機能に影響を及ぼすことなく多くのアミノ酸がタンパク質中で互いに置換され得ること、すなわち、保存的な置換が、開示されるＣｇｔＢタンパク質のようなタンパク質の保存的に修飾された変異体の基礎であり得ることを理解する。保存的なアミノ酸置換の不完全なリストは、以下の通りである。以下の８つの群は各々、互いに保存的置換であるアミノ酸を含む：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）、アラニン（Ａ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、システイン（Ｃ）；および８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９８４）参照）。
【００３９】
本発明の細胞および方法は、一般にガラクトース部分をドナー基質からアクセプター分子に転移させることによりガラクトシル化生成物を産生するために有用である。本発明の細胞および方法はまた、一般に付加的な単糖類またはサルフェート基をドナー基質からアクセプター分子に転移させることにより、付加的な糖残基を含むガラクトシル化生成物糖を産生するために有用である。付加は一般に、オリゴ糖、多糖（例えば、ヘパリン、ｃａｒｒａｇｅｎｉｎなど）または、糖脂質もしくは糖タンパク質、例えば、生体分子上の炭水化物部分の非還元末端において起こる。ここで定義されるような生体分子としては、炭水化物、オリゴ糖、ペプチド（例えば、糖ペプチド）、タンパク質（例えば、糖タンパク質）、および脂質（例えば、糖脂質、リン脂質、スフィンゴ脂質およびガングリオシド）のような生物学的に重要な分子が含まれるが、それらに限定されない。
【００４０】
本発明の組換えタンパク質は、タンパク質の精製または同定を容易にする分子「精製タグ」を一端に有する融合タンパク質として構築および発現され得る。そのようなタグはまた、グリコシル化反応の間に関心対象のタンパク質の固定のために使われ得る。適切なタグとしては、「エピトープタグ」が含まれ、これは、抗体により特異的に認識されるタンパク質配列である。エピトープタグは一般に、融合タンパク質を明瞭に検出または単離するための容易に利用可能な抗体の使用を可能にするために、融合タンパク質に組み込まれる。「ＦＬＡＧタグ」は、モノクロナール抗−ＦＬＡＧ抗体により特異的に認識される一般的に用いられるエピトープタグであり、配列ＡｓｐＴｙｒＬｙｓＡｓｐＡｓｐＡｓｐＡｓｐＬｙｓまたはその実質的に同一の変異体からなる。他の適切なタグが当業者に知られており、例えば、ニッケルもしくはコバルトイオンのような金属イオンまたはｍｙｃタグに結合するヘキサシスチジンペプチドのようなアフィニティタグが含まれる。精製タグを含むタンパク質は、精製タグに結合する結合パートナー、例えば、精製タグ、ニッケルもしくはコバルトイオンまたは樹脂、およびアミロース、マルトース、またはシクロデキストリンに対する抗体を用いて精製され得る。精製タグはまた、マルトース結合ドメインおよびデンプン結合ドメインを含む。マルトース結合ドメインタンパク質の精製は、当業者に知られている。デンプン結合ドメインは、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第９９／１５６３６号に記載されている。ベータシクロデキストリン（ＢＣＤ）誘導樹脂を用いたデンプン結合ドメインを含む融合タンパク質のアフィニティ精製は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２００５年２月１７日公開の国際公開第２００５／０１４７７９号に記載されている。
【００４１】
用語「核酸」は、単鎖か二重鎖形のデオシキリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを意味し、別に限定されない限り、天然のヌクレオチドと同様な様式で核酸にハイブリダイズする天然ヌクレオチドの既知の類似体を包含する。別に示されない限り、特定の核酸配列は、その相補的配列を含む。用語「核酸」、「核酸配列」、および「ポリヌクレオチド」は、本明細書中において区別なく用いられる。
【００４２】
用語「作動可能に連結された」は、核酸発現制御配列（プロモーター、シグナル配列、または転写因子結合部位のアレイのような）と第２の核酸配列との間の機能的連結を意味し、発現制御配列は、第２の配列に対応する核酸の転写および／または翻訳に影響を及ぼす。
【００４３】
用語「組換え」は、細胞に関連して用いられる場合、細胞が異種核酸を複製、または異種核酸によってコードされたペプチドもしくはタンパク質を発現することを示す。組換え細胞は、細胞の未変性（非組換え）形態内には見出されない遺伝子を含み得る。組換え細胞はまた、細胞の未変性形態中に見出される遺伝子も含むことがあり、その場合、遺伝子は修飾され、人工的手段により細胞内に再導入される。この用語は、核酸を細胞から取り除くことなく修飾された細胞に対し内因性の核酸を含む細胞も包含し、そのような修飾としては、遺伝子置換、部位特異的突然変異、および関連した技術により得られる修飾が含まれる。
【００４４】
「組換え核酸」は、人工的に構築された（例えば、２つの天然のまたは合成の核酸断片を連結することによって形成される）核酸を指す。この用語は、人工的に構築された核酸の複製または転写により産生される核酸にもあてはまる。「組換えポリペプチド」は、組換え核酸（すなわち、細胞に対し未変性ではない、またはその天然の形態から修飾されている核酸）の転写、その後の結果として生じる翻訳により発現される。
【００４５】
本明細書中において用いられるような「異種ポリヌクレオチド」または「異種核酸」は、特定の宿主細胞に対し外来の供給源に起因する、または、もし同じ供給源からであれば、その元の形態から修飾されているものである。従って、原核生物宿主細胞における異種グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子は、特定の宿主細胞に対し内因的であるが、修飾されているグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子を含む。異種配列の修飾は、例えば、プロモーターと動作可能に連結され得るＤＮＡ断片を生成するためにＤＮＡを制限酵素を用いて処理することにより生じることがある。部位特的突然変異のような技術も、異種配列を修飾するために有用である。
【００４６】
「部分配列」は、核酸またはアミノ酸のより長い配列（例えば、ポリペプチド）の一部をそれぞれ含む核酸またはアミノ酸の配列を指す。
【００４７】
「組換え発現カセット」または単に「発現カセット」は、そのような配列と共存できる宿主における構造遺伝子の発現に影響を及ぼすことができる核酸要素を用いて組換え的、または合成的に生成される核酸構築物である。発現カセットは、少なくともプロモーターを、そして任意に転写終結シグナルを含む。典型的には、組換え発現カセットは、転写される核酸（例えば、所望のポリペプチドをコードする核酸）、およびプロモーターを含む。発現を生じさせる際に必要または役立つ付加的な因子も、本明細書中において記載されるように使用され得る。例えば、発現カセットは、宿主細胞からの発現されたタンパク質の分泌物を指示するシグナル配列をコードするヌクレオチド配列も含み得る。転写終結シグナル、エンハンサー、および遺伝子発現に影響する他の核酸配列も、発現カセットに含まれ得る。
【００４８】
本発明の「融合ＣｇｔＢポリペプチド」または「融合ガラクトシルトランスフェラーゼポリペプチド」は、ＣｇｔＢまたはβ−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ触媒ドメインを含むポリペプチドである。融合ポリペプチドは、糖ヌクレオチド（例えば、ＵＤＰ−ガラクトース）の合成ならびに糖ヌクレオチドからアクセプター分子への糖残基の転移を触媒することができる。典型的には、融合ポリペプチドの触媒ドメインは、触媒ドメインが誘導されるグリコシルトランスフェラーゼおよび融合タンパク質の触媒ドメインと少なくとも実質的に同一である。いくつかの実施形態において、ＣｇｔＢポリペプチドおよびエピメラーゼ、例えば、ＵＤＰ−グルコース４’エピメラーゼ、ポリペプチドが融合されて単一のポリペプチドを形成する。ガラクトシルトランスフェラーゼ／ＵＤＰ−グルコース４’エピメラーゼの例については、例えば、すべての目的のために参照により本明細書に組み込まれる国際公開第ｌ９９９／０３１２２４号を参照されたい。
【００４９】
本明細書において言及されるような「補助酵素」は、例えば、グリコシルトランスフェラーゼ反応のための基質または他の反応物を形成する反応を触媒する際に関与させられる酵素である。補助酵素は、例えば、グリコシルトランスフェラーゼにより糖ドナー部分として使われるヌクレオチド糖の形成を触媒することができる。補助酵素は、ヌクレオチド糖の形成のために必要なヌクレオチド三リン酸の生成において、またはヌクレオチド糖に組み込まれる糖の生成において使われる酵素でもあり得る。補助酵素の１つの例が、ＵＤＰ−グルコース４’エピメラーゼ、例えば、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（受入ｕｍｂｅｒＭ３０１７５）由来のＧａｌＥである。
【００５０】
「触媒ドメイン」は、通常酵素によって実行される酵素反応を触媒するのに十分な酵素の部分を指す。例えば、ＣｇｔＢポリペプチドの触媒ドメインは、ガラクトース部分を糖ドナーからアクセプター糖類へ転移するのに十分なＣｇｔＢの部分を含む。触媒ドメインは、酵素全体、その部分配列を含むことができ、または自然界で見出されるような酵素または部分配列には付属しない付加的なアミノ酸配列を含むことができる。
【００５１】
用語「単離された」は、酵素の活性を阻害する成分を実質的にまたは本質的に含まない物質を指す。本発明の細胞、糖類、核酸、およびポリペプチドの場合、用語「単離された」は、ある物質の未変性状態において見出されるような、その材料に通常付随する成分を実質的にまたは本質的に含まない物質を指す。典型的には、本発明の糖類、タンパク質または核酸は、少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％または８５％純粋であり、銀染色ゲル上のバンド強度または純度を決定するための他の方法で測定した場合に、通常少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％純粋である。純度または等質性は、タンパク質または核酸試料のポリアクリルアミドゲル電気泳動、続いての染色時視覚化のような当該技術分野においてよく知られた複数の手段で示すことができる。ある特定の目的のために、高解像度が必要とされ、精製のためのＨＰＬＣまたは同様な手段が利用される。オリゴヌクレオチドまたは他のガラクトシル化生成物については、純度は、例えば、薄層クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、または質量分析を用いて決定され得る。
【００５２】
２つ以上の核酸またはポリヌクレオチド配列の文脈における用語「同一の」またはパーセント「同一性」は、２つ以上の配列または部分配列を意味し、これらは、同じであるか、あるいは以下の配列比較アルゴリズムの１つを用いてまたは目視検査により測定される最大一致について比較および整列された場合に、同じである指定されたパーセンテージのアミノ酸残基またはヌクレオチドを有する。
【００５３】
２つの核酸またはポリヌクレオチドの文脈における文言「実質的に同一」は、以下の配列比較アルゴリズムの１つを用いてまたは目視検査により測定される最大一致について比較および整列された場合に、少なくとも６０％、好ましくは８０％または８５％、最も好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％ヌクレオチドまたはアミノ酸残基同一性を有する２つ以上の配列または部分配列を指す。好ましくは、実質的な同一性は、長さが少なくとも約５０残基である配列の領域上にわたり、より好ましくは、少なくとも約１００残基の領域上にわたり、そして最も好ましくは、少なくとも約１５０残基の領域にわたり存在する。最も好ましい実施形態において、配列は、コード化領域の全長にわたり実質的に同一である。
【００５４】
配列比較のため、典型的には、１つの配列が基準配列の役割を果たし、これと試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムが用いられる場合、試験および基準配列がコンピュータに入力され、もし必要であれば、部分配列座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメータは指定される。配列比較アルゴリズムは次に、指定されたプログラムパラメータに基づいて、基準配列を基準として、試験配列（単数または複数）についてパーセント配列同一性を計算する。
【００５５】
比較のための配列の最適な整列は、例えば、Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ． Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所的相同性アルゴリムにより、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性整列アルゴリズムにより、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２４４４（１９８８）の類似性探求方法により、これらのアルゴリズムのコンピュータ化実施により（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，ＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩにおけるＧＡＰ，ＢＥＳＴＦＩＴ，ＦＡＳＴＡ，およびＴＦＡＳＴＡ）、または目視検査（全般的には、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ ｊｏｉｎｔｖｅｎｔｕｒｅ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，（１９９５Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）（Ａｕｓｕｂｅｌ）を参照）により実施され得る。
【００５６】
パーセント配列同一性および配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムの例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズムであり、これらは、Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０およびＡｌｔｓｃｈｕｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９７７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２においてそれぞれ記載される。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を介して公的に利用可能である。このアルゴリズムは、データベース配列中の同じ長さのワードと整列された場合に、ある正値のしきい値スコアＴと一致するか満足する、問い合わせ配列中の長さＷの短いワードを識別することにより高スコアリング配列ペア（ＨＳＰ）を最初に識別するステップを伴う。Ｔは、近隣ワードスコアしきい値と呼ばれる（上記のＡｌｔｓｃｈｕｌｅｔ ａｌ）。これらの初期の近隣ワードヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを見出す探索を開始するためのシードの役割を果たす。ワードヒットは次に、累積整列スコアが増大できる限り各配列に沿って両方向に拡張される。累積スコアは、ヌクレオチド配列については、パラメータＭ（１対の一致する残基についての報酬スコア；常に＞０）およびＮ（不一致残基についてのペナルティスコア；常に＜０）を用いて計算される。アミノ酸配列については、スコアリングマトリックスが、累積スコアを計算するために使用される。各方向におけるワードヒットの拡張は、以下の場合に停止される：累積整列スコアが、その最大達成値から量Ｘだけ低下する場合；１つ以上の負スコアリング残基整列の累積のために累積スコアがゼロまたはそれ以下になる場合；またはいずれかの配列の末端に達した場合。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ、およびＸは、整列の感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列のための）は、初期値として、１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両方のストランドの比較を用いる。アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、初期値として、３のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ＆ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５（１９８９）参照）を用いる。
【００５７】
パーセント配列同一性の計算に加え、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性の統計分析も実行する（例えば、Ｋａｒｌｉｎ＆ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５７８７（１９９３）参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの測度は、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の一致が偶然に生じる確率の示度を提供する。例えば、もし基準核酸と試験核酸との比較における最小合計確率が約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満であれば、核酸は基準配列とほぼ同等であると考えられる。
【００５８】
２つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一であるというさらなる示度は、以下に記載されるように、第１の核酸によってコードされたポリペプチドが、第２の核酸によってコードされたポリペプチドと、免疫学的に交叉反応性であるということである。従って、ポリペプチドは典型的に、例えば、２つのペプチドが保存的置換によってのみ異なる場合、第２のポリペプチドと実質的に同一である。２つの核酸配列が実質的に同一であるという別の示度は、以下で記載されるように、２つの分子がストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。
【００５９】
文言「〜に特異的にハイブリダイズする」は、複合混合物（例えば、全細胞）ＤＮＡまたはＲＮＡ中に特定のヌクレオチド配列が存在する場合、ストリンジェントな条件下における、その配列のみへの分子の結合、二重化、またはハイブリダイズを指す。
【００６０】
用語「ストリンジェントな条件」は、プローブがその標的部分配列にハイブリダイズするが、他の配列にはハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は、配列依存的であり、異なる環境において異なる。より長い配列は、より高い温度において特異的にハイブリダイズする。一般に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびｐＨにおいて特定の配列についての熱的融点（Ｔｍ）より約５℃低い温度として選択される。このＴｍは、標的配列に対し相補的なプローブの５０％が、標的配列に対し平衡状態においてハイブリダイズする温度（規定されたイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度の下）である。（標的配列が、一般に、Ｔｍにおいて過剰に存在する場合、プローブの５０％は、平衡状態で占められる）。典型的には、ストリンジェントな条件は、塩濃度が約１．０ＭＮａ＋イオン未満であり、典型的には、ｐＨ７．０〜８．３において約０．０１〜１．０Ｍ Ｎａ＋イオン濃度（または他の塩）であり、温度は、短いプローブ（約１０〜５０ヌクレオチド）について少なくとも約３０℃であり、長いプローブ（例えば、５０ヌクレオチドより長い）について少なくとも約６０℃の条件である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドのような不安定化剤の添加によって達成され得る。高ストリンジェンシーＰＣＲ増幅については、高ストリンジェンシーアニーリング温度は、プライマー長さおよび特異性に応じて約５０℃〜約６５℃の範囲にわたり得るが、約６２℃の温度が典型的である。高および低ストリンジェンシー増幅のための典型的なサイクル条件は、９０〜９５℃、３０〜１２０秒間の変性段階３０〜１２０秒間続くアニーリング段階、および約７２℃、１〜２分間の伸長段階を含む。低および高ストリンジェンシー増幅反応のためのプロトコルおよびガイドラインは、例えば、Ｉｎｎｉｓ，ｅｔａｌ．（１９９０）ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ． Ｙ．において利用可能である。
【００６１】
抗体に言及する場合、文言「〜に特異的に結合する」または「〜と特異的に免疫反応性である」は、タンパク質、糖類、および他の生物製剤の異種集団の存在下において、タンパク質または他の抗原の存在を決定する結合反応を指す。従って、指定された免疫学的アッセイ条件下では、規定された抗体は、特定のタンパク質に優先的に結合し、そして試料中に存在する他のタンパク質に、有意な量では結合しない。そのような条件下でのタンパク質への特異的結合は、抗体を必要とし、この抗体は、特定の抗原に対するその特異性について選択される。種々のイムノアッセイ形式が、特定の抗原と特異的に免疫反応性である抗体を選択するために使用される。例えば、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイは、抗原と特異的に免疫反応性であるモノクロナール抗体を選択するために日常的に使用される。特異的な免疫反応性を決定するために使用され得るイムノアッセイ形式および条件の記載については、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい。
【００６２】
「抗体」は、抗原と特異的に結合および認識する免疫グロブリン遺伝子またはその断片からのフレームワーク領域を含むポリペプチドを指す。認識される免疫グロブリン遺伝子としては、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、エプシロン、およびミュー定常域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。好ましい実施形態において、ＣｇｔＢタンパク質に特異的に結合する抗体が産生される。軽鎖は、カッパか、ラムダとして分類される。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはエプシロンとして分類され、これらが今度は免疫グロブリンクラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥをそれぞれ定義する。典型的には、抗体の抗原結合領域は、結合の特異性および親和性において最も決定的である。
【００６３】
代表的な免疫グロブリン（抗体）構造単位は、四量体を含む。各四量体は、ポリペプチド鎖の２つの同一の対により構成されており、各対は、１つの「軽」（約２５ｋＤ）および１つの「重」（約５０〜７０ｋＤ）鎖を有する。各鎖のＮ−末端は、主に抗原認識をつかさどる約１００〜１１０のアミノ酸の可変領域を定義する。可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）という用語は、これらの軽および重鎖をそれぞれ指す。
【００６４】
抗体は、例えば、無傷の免疫グロブリンとして、または様々なペプチダーゼによる消化によって産生された、いくつかの十分に特徴付けられた断片として存在する。従って、例えば、ペプシンは、抗体をヒンジ領域中のジスルフィド結合下方で消化して、Ｆａｂの二量体であるＦ（ａｂ）’２を産生し、これは、それ自身がジスルフィド結合によってＶＨ−ＣＨ１に結合された軽鎖である。Ｆ（ａｂ）’２は、穏やかな条件のもとで還元されてヒンジ領域中のジスルフィド連鎖を壊し、それによって、Ｆ（ａｂ）’２二量体をＦａｂ’単量体に転換することができる。Ｆａｂ’単量体は本質的に、ヒンジ領域の一部を持つＦａｂである（ＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｐａｕｌ ｅｄ．，３ｄ ｅｄ．１９９３参照）。様々な抗体断片が、無傷の抗体の消化の観点から定義される一方で、当業者は、そのような断片が、化学的にか、または組換えＤＮＡ方法論を用いて新たに合成され得ることを理解するであろう。従って、抗体という用語は、本明細書中において用いられるように、抗体全体の修飾によって産生された抗体断片か、あるいは組換えＤＮＡ方法論を用いて新たに合成された抗体断片か（例えば、単鎖Ｆｖ）、またはファージディスプレイライブラリーを用いて同定された抗体断片（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２−５５４（１９９０）参照）も含む。
【００６５】
抗体、例えば、組換え抗体、モノクロナール抗体、またはポリクロナール抗体の調整については、当該技術分野において知られている多くの手法を用いることができる（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７（１９７５）；Ｋｏｚｂｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４：７２（１９８３）；Ｃｏｌｅｅｔ ａｌ．，ｐｐ．７７−９６ ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８５）；Ｃｏｌｉｇａｎ，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９１）；Ｈａｒｌｏｗ ＆ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８８）；およびＧｏｄｉｎｇ，ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（２ｄ ｅｄ． １９８６）参照）。関心対象の抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子は、細胞からクローニングすることができ、例えば、モノクロナール抗体をコードする遺伝子は、ハイブリドーマからクローニングして、組換えモノクロナール抗体を産生するために使用され得る。モノクロナール抗体の重および軽鎖をコードする遺伝子ライブラリーはまた、ハイブリドーマまたはプラズマ細胞から作られ得る。重および軽鎖遺伝子生成物のランダムな組み合わせは、異なる抗原特異性を有する抗体の大きなプールを生成する（例えば、Ｋｕｂｙ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（３ｒｄｅｄ．１９９７）参照）。単鎖抗体または組換え抗体の産生のための手法（米国特許第４，９４６，７７８号、米国特許第４，８１６，５６７号）は、本発明のポリペプチドに対する抗体を産生するために適合させ得る。また、トランスジェニックマウス、または他の哺乳動物のような他の生物体は、ヒト化抗体またはヒト抗体を発現させるために用いられ得る（例えば、米国特許第５，５４５，８０７号；同第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，６６１，０１６号；Ｍａｒｋｓｅｔ ａｌ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：７７９−７８３（１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６−８５９（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ３６８：８１２−１３（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：８４５−５１（１９９６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：８２６（１９９６）；およびＬｏｎｂｅｒｇ ＆ Ｈｕｓｚａｒ，Ｉｎｔｅｒｎ． Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３（１９９５）参照）。あるいは、ファージディスプレイ技術は、選択された抗原に特異的に結合する抗体およびヘテロメリックＦａｂ断片を同定するために用いられ得る（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２−５５４（１９９０）；Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：７７９−７８３（１９９２）参照）。抗体はまた、二重特異性、すなわち、２つの異なる抗原を認識できるようにすることができる（例えば、国際公開第９３���０８８２９号，Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１０：３６５５−３６５９（１９９１）；およびＳｕｒｅｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １２１：２１０（１９８６）参照）の方法。抗体はまた、ヘテロ接合体、すなわち、２つの共有結合的に接合された抗体、または免疫毒素であり得る（例えば、米国特許第４，６７６，９８０号，国際公開第９１／００３６０号；国際公開第９２／２００３７３号；および欧州特許第０３０８９号参照）。
【００６６】
１つの実施形態において、抗体は「エフェクター」部分に接合される。エフェクター部分は、診断アッセイにおいて使用するための放射性標識または蛍光標識のような標識部分を含む、任意の数の分子であり得る。
【００６７】
抗体に「特異的に（または選択的に）結合する」あるいは「〜に対して特異的（または選択的）免疫反応性を有する」という文言は、タンパク質またはペプチドに言及する場合、多くの場合タンパク質および他の生体物質の不均一集団における、該タンパク質の存在を決定する結合反応を指す。従って、指定されたイムノアッセイ条件下において、特定の抗体は、バックグラウンドの少なくとも２倍、より典型的にはバックグラウンドの１０倍〜１００倍を上回って、特定のタンパク質に結合する。そのような条件下における抗体への特異的結合には、特定のタンパク質に対するその特異性について選択された抗体が必要である。例えば、ＣｇｔＢタンパク質、その多型変異体、対立遺伝子、オルソログ、および、保存的修飾変異体、またはスプライス変異体、あるいはその一部に対して生じさせられたポリクロナール抗体は、ＣｇｔＢタンパク質に対して特異的免疫反応性を有するが他のタンパク質に対しては有さないポリクロナール抗体のみを得るために選択される。この選択は、他の分子と交叉反応する抗体を除くことによって達成され得る。特定のタンパク質に対して特異的免疫反応性を有する抗体を選択するために、様々なイムノアッセイ形式を用いることができる。例えば、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイは、タンパク質に対して特異的免疫反応性を有する抗体を選択するために慣用的に使用される（特異的免疫反応性を決定するために使用できるイムノアッセイ形式および条件の説明については、例えば、Ｈａｒｌｏｗ＆ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８８）を参照されたい）。
【００６８】
「抗原」は、抗体により認識および結合される分子、例えば、ペプチド、炭水化物、有機分子、または、糖脂質および糖タンパク質のようなより複雑な分子である。抗体結合の標的である抗原の部分が抗原決定基であり、単一の抗原決定基に対応する小さな官能基はハプテンと呼ばれる。
【００６９】
「標識」とは、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、または化学的手段により検出可能な組成物である。例えば、有用な標識としては、３２Ｐ、１２５Ｉ、蛍光色素、高電子密度試薬、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡにおいて一般に使用される酵素）、ビオチン、ジゴキシゲニン、または、その抗血清もしくはモノクロナール抗体が入手可能なハプテンおよびタンパク質（例えば、放射標識をペプチドに組み込むことによって、例えば、配列番号２のポリペプチドを検出可能にすることができ、これを用いて該ペプチドに対して特異的反応性を有する抗体を検出することができる）が含まれる。
【００７０】
用語「イムノアッセイ」は、抗原に特異的に結合する抗体を使用するアッセイである。イムノアッセイは、抗原を単離、標的化、および／または定量するために特定の抗体の特異的結合特性を使用することを特徴とする。
【００７１】
用語「担体分子」は、Ｔ細胞によって認識される抗原決定基を含む免疫原性分子を意味する。担体分子は、タンパク質であってもよく、または脂質であってもよい。ポリペプチドを免疫原性にするために、担体タンパク質がポリペプチドに接合される。担体タンパク質としては、キーホールリンペットヘモシアニン、カブトガニヘモシアニン、およびウシ血清アルブミンが含まれる。
【００７２】
用語「アジュバント」は、抗原に対する免疫応答を非特異的に増強する物質を意味する。アジュバントとしては、完全か、または不完全なフロイントアジュバント；ＴｉｔｅｒｍａｘＧｏｌｄアジュバント；ミョウバン；および細菌ＬＰＳが含まれる。
【００７３】
用語「接触させる」は、本明細書において以下と互換的に使用される：組み合わせる、添加する、混合する、通す、インキュベーションする、流す等。
【００７４】
ＩＩＩ．ＣｇｔＢポリペプチド
ＣｇｔＢポリペプチドは、β−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ酵素であり、ガラクトースをＵＤＰ−ガラクトースから、オリゴ糖上の末端ＧａｌＮＡｃ残基を有するオリゴ糖、二糖類、またはＧａｌＮＡｃ単糖類へ転移する機能的活性を有する。全長、野生型、または天然のＣｇｔＢタンパク質の例は、例えば、配列番号２または配列番号４または配列番号６または配列番号８または配列番号１０である。
【００７５】
本発明の切断型ＣｇｔＢポリペプチドは、配列番号２または配列番号４または配列番号６または配列番号８または配列番号１０の一部分、すなわち、タンパク質のＣ−末端から１〜３０個の間のアミノ酸残基を欠く配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０と同一、または特定のパーセント同一性を共有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、切断型ＣｇｔＢタンパク質は、タンパク質のＣ−末端に融合されたＭＢＰドメインも含む。ＣｇｔＢポリペプチドは、β−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ酵素であり、ガラクトースをＵＤＰ−ガラクトースから、末端Ｎ−アセチル−ガラクトサミンを含むオリゴ糖へ転移する機能的活性を有する。
【００７６】
Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ＯＨ４３８４由来のＣｇｔＢタンパク質に関連するタンパク質をコードする核酸も、他のＣ．ｊｅｊｕｎｉ株、例えば、ＡＴＣＣ４３４３２、ＡＴＣＣ ４３４６０  ＮＣＴＣ １１１６８およびＡＴＣ ４３４３８において同定された。これらのタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号４、配列番号６、配列番号８および配列番号１０にそれぞれ見出される。
【００７７】
ＣｇｔＢアミノ酸配列は、保存されたアミノ酸残基を同定するために分析され得る。例えば、ＣｌｕｓｔａｌＸプログラムが、ＣｇｔＢＯＨ４３８４、ＣｇｔＢ１１１６８およびＣｇｔＢＨＳ１０タンパク質を配列比較するために用いられた。結果が図２に示してある。３つの配列すべてにおける同一のアミノ酸残基は、黒い背景中で白く表示され；いずれか２つの配列間で同一のアミノ酸残基は、灰色の背景中で白く表示される（図２Ａ参照）。図２Ｂは、Ｇｅｎｅｄｏｃにおいて割り当てられるいずれか２つのＣｇｔＢタンパク質間の同一性および類似性のパーセンテージを示す。
【００７８】
ＣｌｕｓｔａｌＸまたは当業者に公知の類似プログラムにより生成された配列比較を用いて、同一の、保存的な、または半保存的な残基を同定することができ、ＣｇｔＢ活性に対して有害であろうアミノ酸残基における変更を予想および回避するためにこれらを使用することができる。そのような配列比較は、タンパク質活性に影響を及ぼすことなく変更され得る可能性が最も高いアミノ酸残基を同定するために用いることもできる。本明細書においてまたはＣｌｕｓｔａｌＸウェブサイトで同定された保存的残基を選択することにより、あるいは、図２などの図面における対応するアミノ酸の１つに対する修飾を選択することにより、必要に応じて、アミノ酸の変更を行うことができる。
【００７９】
ＩＶ．ＣｇｔＢポリペプチドをコードする核酸の単離
ＣｇｔＢポリペプチドをコードする核酸としては、上述の全長、天然のＣｇｔＢポリペプチド、例えば、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８および配列番号１０ならびにそれらの配列の酵素的に活性な切断をコードする核酸が含まれる。本発明のＣｇｔＢポリペプチドは、ドナー基質からアクセプター基質へのガラクトース部分の転移を触媒し、その活性を測定するためのアッセイは、本明細書中において開示される。
【００８０】
本明細書に開示された情報に基づくさらなるＣｇｔＢポリペプチドをコードする核酸、およびそのような核酸を入手する方法は、当業者に公知である。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写増幅システム（ＴＡＳ）、または自立配列複製システム（ＳＳＲ）のようなｉｎｖｉｔｒｏ法によって、適切な核酸（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノム、または部分配列（プローブ））をクローニング、または増幅することができる。多種多様なクローニングおよびｉｎｖｉｔｒｏ増幅の方法論が、当業者に周知である。これらの手法および、多くのクローニング演習によって当業者を導くのに十分な教示の例は、Ｂｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｋｉｍｍｅｌ，Ｇｕｉｄｅｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １５２ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ（Ｂｅｒｇｅｒ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄｅｄ．）Ｖｏｌ．１−３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，（Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔ ａｌ．）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａｊｏｉｎｔ ｖｅｎｔｕｒｅ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，（１９９４Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）（Ａｕｓｕｂｅｌ）；Ｃａｓｈｉｏｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，０１７，４７８号；およびＣａｒｒ，欧州特許第０，２４６，８６４号に見出される。
【００８１】
標準分子生物学方法、例えば、ＰＣＲは、任意の既知のＣｇｔＢ配列の切断を生成するために使用され得る。
【００８２】
ＣｇｔＢポリペプチドをコードするＤＮＡ、またはその部分配列は、例えば、クローニングおよび制限酵素による適切な配列の制限消化を含む上述の適切な方法のいずれかによって調製することができる。１つの好ましい実施形態において、ＣｇｔＢポリペプチドをコードする核酸は、慣用のクローニング法によって単離される。例えば、配列番号１において提供されるＣｇｔＢポリペプチドのヌクレオチド配列を用いて、ゲノムＤＮＡ試料中のＣｇｔＢポリペプチドをコードする遺伝子に、あるいは全ＲＮＡ試料中のＣｇｔＢポリペプチドをコードするｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプローブを提供することができる（例えばサザンブロットまたはノーザンブロットにおいて）。ひとたびＣｇｔＢポリペプチドをコードする標的核酸が同定されたら、当業者に公知の標準的方法に従ってこれを単離することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｖｏｌｓ．１−３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ；Ｂｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｋｉｍｍｅｌ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５２：Ｇｕｉｄｅ ｔｏ ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．；またはＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９８７）ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい）。さらに、単離された核酸を制限酵素で切断して、全長ＣｇｔＢポリペプチドをコードする核酸、または、例えば、ＣｇｔＢポリペプチドの触媒ドメインの少なくとも部分配列をコードする部分配列を含む、その部分配列を作製することができる。次に、ＣｇｔＢポリペプチドまたはその部分配列をコードするこれらの制限酵素断片を、例えばＣｇｔＢタンパク質をコードする核酸を産生するために、ライゲーションすることができる。
【００８３】
ＣｇｔＢポリペプチドをコードする核酸、またはその部分配列は、発現産物についてアッセイすることによって特性決定することができる。発現タンパク質の物理的、化学的、または免疫学的特性の検出に基づくアッセイを用いることができる。例えば、クローニングされたＣｇｔＢ核酸にコードされるタンパク質がドナー基質からアクセプター基質へのガラクトース部分の移動を触媒することができる能力によって、該核酸を同定することができる。１つの方法において、反応産物を検出するためにキャピラリー電気泳動が用いられる。この高感度アッセイは、Ｗａｋａｒｃｈｕｋｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（４５）：２８２７１−２７６に記載されるようにフルオレセインで標識される糖類または二糖類のアミノフェニル誘導体のいずれかの使用を伴う。ＣｇｔＢ活性をアッセイするために、ＧａｌＮａｃ−β−ＦＣＨＡＳＥを基質として用いることができる。他のグリコシルトランスフェラーゼの反応産物は、キャピラリー電気泳動を用いて検出することができ、例えば、ナイセリアｌｇｔＣ酵素をアッセイするためには、ＦＣＨＡＳＥ−ＡＰ−ＬａｃまたはＦＣＨＡＳＥ−ＡＰ−Ｇａｌのいずれかを用いることができるが、一方ナイセリアｌｇｔＢ酵素に関しては、適切な試薬はＦＣＨＡＳＥ−ＡＰ−ＧｌｃＮＡｃ（Ｗａｋａｒｃｈｕｋ、上記）である。α２，８−シアリルトランスフェラーゼをアッセイするために、ＧＭ３−ＦＣＨＡＳＥが基質として用いられる。例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，５０３，７４４号を参照されたい。オリゴ糖反応生成物を検出するためのその他の方法としては、薄層クロマトグラフィーおよびＧＣ／ＭＳが含まれ、これらは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，５０３，７４４号に開示されている。
【００８４】
また、ＣｇｔＢポリペプチドをコードする核酸、またはその部分配列を化学的に合成することもできる。適切な方法としては、Ｎａｒａｎｇｅｔ ａｌ．（１９７９）Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０−９９のホスホトリエステル法；Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：１０９−１５１のホスホジエステル法；Ｂｅａｕｃａｇｅｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔ．，２２：１８５９−１８６２のジエチルホスホラミダイト法；および米国特許第４，４５８，０６６号の固体支持体法が含まれる。化学合成によって、一本鎖オリゴヌクレオチドが産生される。これを、相補配列とのハイブリダイゼーションによって、または、鋳型として上記一本鎖を用いたＤＮＡポリメラーゼによる重合によって、二本鎖ＤＮＡへ変換することができる。ＤＮＡの化学合成は約１００塩基の配列に制限されることが多いが、より短い配列をライゲーションすることによってより長い配列が得られることを当業者は認識している。
【００８５】
ＣｇｔＢポリペプチドをコードする核酸、またはその部分配列を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のようなＤＮＡ増幅法を用いてクローニングすることができる。従って、例えば、１つの制限酵素部位（例えば、ＮｄｅＩ）を含むセンスプライマーおよび別の制限酵素部位（例えば、ＨｉｎｄＩＩＩ）を含むアンチセンスプライマーを用いて、核酸配列または部分配列がＰＣＲ増幅される。これによって、所望のＣｇｔＢポリペプチドまたは部分配列をコードしかつ末端制限酵素部位を有する核酸が産生される。次にこの核酸を、第２の分子をコードする核酸を含有しかつ対応する適切な制限酵素部位を有するベクター内に、容易にライゲーションすることができる。当業者は、ＧｅｎＢａｎｋまたはその他の情報源より提供される配列情報を用いて、適切なＰＣＲプライマーを決定することができる。適切な制限酵素部位を、ＣｇｔＢタンパク質またはそのタンパク質部分配列をコードする核酸に、部位特異的突然変異誘発によって付加することもできる。ＣｇｔＢタンパク質をコードするヌクレオチド配列または部分配列を含むプラスミドは、適切な制限エンドヌクレアーゼで切断され、次に、標準的方法によって増幅および／または発現のための適切なベクターへライゲーションされる。ｉｎｖｉｔｒｏ増幅法を通じて当業者を導くのに十分な技術の例は、Ｂｅｒｇｅｒ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、およびＡｕｓｕｂｅｌ、ならびにＭｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）米国特許第４，６８３，２０２号；ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）（Ｉｎｎｉｓ）；Ａｒｎｈｅｉｍ ＆ Ｌｅｖｉｎｓｏｎ（Ｏｃｔｏｂｅｒ １，１９９０）Ｃ＆ＥＮ ３６−４７；Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ＯｆＮＩＨ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９１）３：８１−９４；（Ｋｗｏｈ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１１７３；Ｇｕａｔｅｌｌｉｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７，１８７４；Ｌｏｍｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，３５：１８２６；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：１０７７−１０８０；Ｖａｎ Ｂｒｕｎｔ（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：２９１−２９４；Ｗｕ ａｎｄＷａｌｌａｃｅ（１９８９）Ｇｅｎｅ ４：５６０；およびＢａｒｒｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｇｅｎｅ ８９：１１７に見出される。
【００８６】
細菌ＣｇｔＢタンパク質をコードするいくつかの核酸を、本明細書に開示されるＣｇｔＢ核酸の配列に基づくＰＣＲプライマーを用いて増幅することができる。ＣｇｔＢタンパク質をコードする核酸を増幅するために使用できるＰＣＲプライマーの例としては、以下のプライマー対が含まれる：
Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ＯＨ４３８４および関連する株由来のｃｇｔＢは、以下のものを用いて増幅できる：
【００８７】
【化１−１】
0005921065.tif 000002
Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ＮＣＴＣ １１１６８および関連する株由来のｃｇｔＢは、以下のものを用いて増幅できる：
【００８８】
【化１−２】
0005921065.tif 000003
Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ Ｏ：１０および関連する株由来のｃｇｔＢは、以下のものを用いて増幅できる：
【００８９】
【化２】
0005921065.tif 000004
細菌によっては、特定の染色体遺伝子座、例えばＣ．ｊｅｊｕｎｉのＬＯＳ遺伝子座を増幅し、次に、該遺伝子座において典型的に見出されるＣｇｔＢ核酸を同定することによって、ＣｇｔＢタンパク質をコードする核酸を単離することができる（例えば、米国特許第６，５０３，７４４号を参照されたい）。ＣｇｔＢタンパク質をコードする核酸を含むＬＯＳ遺伝子座を増幅するために使用できるＰＣＲプライマーの例としては、以下のプライマー対が含まれる：
【００９０】
【化３】
0005921065.tif 000005
特定の核酸から発現された組換えＣｇｔＢポリペプチドのその他の物理特性を公知のＣｇｔＢポリペプチドの特性と比較して、アクセプター基質特異性および／または触媒活性の決定因子であるＣｇｔＢポリペプチドの適切な配列またはドメインを同定する別の方法を提供することができる。あるいは、推定ＣｇｔＢポリペプチドまたは組換えＣｇｔＢポリペプチドを変異させることができ、かつ、グリコシルトランスフェラーゼとしてのその役割、または特定の配列もしくはドメインの役割を、変異していない、天然の、または対照のＣｇｔＢポリペプチドにより通常産生される糖質の構造における変動を検出することにより確立できる。ＣｇｔＢポリペプチドをコードする核酸を操作するための分子生物学的技術、例えば、ＰＣＲによって、本発明のＣｇｔＢポリペプチドの変異または修飾が促進され得ることを当業者は認識するであろう。
【００９１】
本明細書に記載のように、ポリペプチドを変異させるか修飾するための標準的方法を用いることによって、ならびに、アクセプター基質活性および／または触媒活性のような活性についてこれらを試験することによって、新たに同定されたＣｇｔＢポリペプチドの機能的ドメインを同定することができる。様々なＣｇｔＢポリペプチドの機能的ドメインを用いて、ＣｇｔＢポリペプチドおよび１つ以上のＣｇｔＢポリペプチドの機能的ドメインをコードする核酸を構築することができる。次に、望ましいアクセプター基質または触媒活性について、これらの多−ＣｇｔＢ融合タンパク質を試験することができる。
【００９２】
ＣｇｔＢタンパク質をコードする核酸をクローニングするための代表的なアプローチにおいて、クローニングされたＣｇｔＢポリペプチドの既知の核酸またはアミノ酸配列を整列化および比較し、様々なＣｇｔＢポリペプチド間の配列同一性の量を決定する。この情報を用いて、関心対象のＣｇｔＢタンパク質の間の配列同一性の量に基づき、ＣｇｔＢ活性、例えば、アクセプター基質活性および／または触媒活性を付与または調節するタンパク質ドメインを同定および選択することができる。例えば、関心対象のＣｇｔＢタンパク質間の配列同一性を有するドメイン、および、既知の活性と関連するドメインを用いて、該ドメインを含有しかつ該ドメインに関連する活性（例えば、アクセプター基質特異性および／または触媒活性）を有するＣｇｔＢタンパク質を構築することができる。
【００９３】
Ｖ．宿主細胞におけるＣｇｔＢポリペプチドの発現
Ｅ．ｃｏｌｉ、その他の細菌宿主、および酵母を含む様々な宿主細胞中で、本発明のＣｇｔＢタンパク質を発現させることができる。宿主細胞は好ましくは、例えば、酵母細胞、細菌細胞、または糸状菌細胞のような微生物細胞である。適切な宿主細胞の例としては、中でも、例えば、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒｓｐ．（例えば、Ａ．ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．Ｅｒｗｉｎｉａ ｓｐ．、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｓｐ．（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｒｈｉｚｏｂｉａ、Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａ、ＰａｒａｃｏｃｃｕｓおよびＫｌｅｂｓｉｅｌｌａｓｐ．が含まれる。細胞は、以下を含む複数の属のいずれかであり得る：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、Ｃａｎｄｉｄａ（例えば、Ｃ．ｕｔｉｌｉｓ、Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、Ｃ．ｋｒｕｓｅｉ、Ｃ．ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ、Ｃ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｃ．ｚｅｙｌａｎｏｉｄｅｓ、Ｃ．ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、およびＣ．ｈｕｍｉｃｏｌａ）、Ｐｉｃｈｉａ（例えば、Ｐ．ｆａｒｉｎｏｓａおよびＰ．ｏｈｍｅｒｉ）、Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ（例えば、Ｔ．ｃａｎｄｉｄａ、Ｔ．ｓｐｈａｅｒｉｃａ、Ｔ．ｘｙｌｉｎｕｓ、Ｔ．ｆａｍａｔａ、およびＴ．ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ）、Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ（例えば、Ｄ．ｓｕｂｇｌｏｂｏｓｕｓ、Ｄ．ｃａｎｔａｒｅｌｌｉｉ、Ｄ．ｇｌｏｂｏｓｕｓ、Ｄ．ｈａｎｓｅｎｉｉ、およびＤ．ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ（例えば、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉおよびＺ．ｂａｉｌｉｉ）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ（例えば、Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ（例えば、Ｈ．ａｎｏｍａｌａおよびＨ．ｊａｄｉｎｉｉ）、ならびにＢｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ（例えば、Ｂ．ランビカスおよびＢ．ａｎｏｍａｌｕｓ）。有用な細菌の例としては、これらに限定されるわけではないが、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａが含まれる。
【００９４】
ひとたび宿主細胞中で発現されると、ＣｇｔＢポリペプチドは、ガラクトシル化生成物を産生するために用いることができる。例えば、標準的なタンパク質精製手法を用いてＣｇｔＢポリペプチドを単離することができ、かつこれを、ガラクトシル化生成物を作製するための本明細書に記載のｉｎｖｉｔｒｏ反応において使用することができる。透過処理済み宿主細胞と同じく、部分的に精製されたＣｇｔＢポリペプチドも、ガラクトシル化生成物を作製するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ反応において用いることができる。ガラクトシル化生成物を産生するためのｉｎｖｉｖｏ系（例えば、発酵産生）において、宿主細胞を使用することもできる。
【００９５】
典型的には、ＣｇｔＢポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、所望の宿主細胞中で機能するプロモーターの制御下に置く。特定の用途に応じて、極めて多種多様なプロモーターが周知であり、本発明の発現ベクター中で使用可能である。通常、プロモーターが活性となるべき細胞によって、プロモーターが選択される。リボソーム結合部位、転写終結部位などのその他の発現制御配列も、任意で含まれる。１つ以上のこれらの制御配列を含む構築物は、「発現カセット」と呼ばれる。従って、本発明は、所望の宿主細胞における高レベル発現のための融合タンパク質をコードする核酸が組み込まれる発現カセットを提供する。
【００９６】
特定の宿主細胞における使用に適した発現制御配列は、該細胞中で発現する遺伝子のクローニングによって得られることが多い。通常使用される原核制御配列は、本明細書においてリボソーム結合部位配列と共に任意でオペレーターを伴う転写開始用プロモーターを含むと定義されており、ベータ−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトース（ｌａｃ）プロモーター系（Ｃｈａｎｇｅｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７７）１９８：１０５６）、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇｏｅｄｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９８０）８：４０５７）、ｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒ，ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８３）８０：２１−２５）、ならびに、ラムダ−由来ＰＬプロモーターおよびＮ−遺伝子リボソーム結合部位（Ｓｈｉｍａｔａｋｅｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）２９２：１２８）のような、通常使用されるプロモーターを含む。特定のプロモーター系は、本発明にとり重要ではなく、原核生物中で機能する任意の利用可能なプロモーターを用いることができる。
【００９７】
Ｅ．ｃｏｌｉ以外の原核細胞におけるＣｇｔＢタンパク質の発現のためには、特定の原核生物種において機能するプロモーターが必要である。そのようなプロモーターは、該種からクローニングされた遺伝子より入手可能であり、あるいは、異種プロモーターが使用可能である。例えば、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃプロモーターは、Ｅ．ｃｏｌｉに加えてＢａｃｉｌｌｕｓ中でも機能する。
【００９８】
リボソーム結合部位（ＲＢＳ）は、本発明の発現カセット中に都合よく含まれる。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ中のＲＢＳは、開始コドンから３〜１１ヌクレオチド上流に位置する３〜９ヌクレオチド長のヌクレオチド配列からなる（Ｓｈｉｎｅａｎｄ Ｄａｌｇａｒｎｏ， Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５４：３４；Ｓｔｅｉｔｚ，Ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：Ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（ｅｄ．Ｒ．Ｆ．Ｇｏｌｄｂｅｒｇｅｒ），ｖｏｌ．１，ｐ．３４９，１９７９，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，ＮＹ）。
【００９９】
酵母におけるＣｇｔＢタンパク質の発現については、都合のよいプロモーターとしては、ＧＡＬ１−１０（Ｊｏｈｎｓｏｎ ａｎｄＤａｖｉｅｓ（１９８４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：１４４０−１４４８）、ＡＤＨ２（Ｒｕｓｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ（１９８３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：２６７４−２６８２）、ＰＨＯ５（ＥＭＢＯＪ．（１９８２）６：６７５−６８０）、およびＭＦα（Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ ａｎｄ Ｏｓｈｉｍａ（１９８２）ｉｎ Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆｔｈｅ Ｙｅａｓｔ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ（ｅｄｓ．Ｓｔｒａｔｈｅｒｎ，Ｊｏｎｅｓ，ａｎｄ Ｂｒｏａｃｈ）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，ｐｐ．１８１−２０９）が含まれる。酵母における使用に適した別のプロモーターは、Ｃｏｕｓｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ６１：２６５−２７５（１９８７）に記載のＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨハイブリッドプロモーターである。例えば、真菌Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓの株（ＭｃＫｎｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．、米国特許第４，９３５，３４９号）のような糸状菌に関して、有用なプロモーターの例としては、ＡＤＨ３プロモーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．４：２０９３ ２０９９（１９８５））およびｔｐｉＡプロモーターのようなＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ糖分解遺伝子由来のプロモーターが含まれる。適切なターミネーターの例は、ＡＤＨ３ターミネーターである（ＭｃＫｎｉｇｈｔｅｔ ａｌ．）。
【０１００】
本発明において、構成的なプロモーターまたは調節されたプロモーターのいずれかを用いることができる。融合タンパク質の発現が誘導される前に宿主細胞が高密度に増殖できるので、調節されたプロモーターが有利であり得る。異種タンパク質の高レベル発現は、状況によっては細胞増殖を遅延させる。誘導性プロモーターとは、例えば、温度、ｐＨ、無気条件または有気条件、光、転写因子および化学物質のような環境因子または発達因子によってその発現レベルが修飾可能である遺伝子の発現を導くプロモーターである。そのようなプロモーターは、本明細書において「誘導性」プロモーターと呼ばれ、これによって、グリコシルトランスフェラーゼまたはヌクレオチド糖合成に関与する酵素の発現のタイミングを制御することが可能になる。Ｅ．ｃｏｌｉおよびその他の細菌宿主細胞に関して、誘導性プロモーターは当業者に公知である。これらには、例えば、ｌａｃプロモーター、バクテリオファージラムダＰＬプロモーター、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃプロモーター（Ａｍａｎｎｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｇｅｎｅ ２５：１６７；ｄｅ Ｂｏｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：２１）、およびバクテリオファージＴ７プロモーター（Ｓｔｕｄｉｅｒｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｊ． Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．；Ｔａｂｏｒ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：１０７４−８）が含まれる。これらのプロモーターおよびその使用は、上記のＳａｍｂｒｏｏｋｅｔ ａｌ．で論じられている。原核生物における発現のために好ましい特定の誘導性プロモーターは、ガラクトース代謝に関与する酵素をコードする単数または複数の遺伝子から得られたプロモーター成分（例えば、ＵＤＰガラクトース４−エピメラーゼ遺伝子（ｇａｌＥ）由来のプロモーター）に連結されたｔａｃプロモーター成分を含む、二重プロモーターである。二重ｔａｃ−ｇａｌプロモーターは、国際公開第９８／２０１１１号に記載されている。
【０１０１】
遺伝子発現制御シグナルに機能的に連結された関心対象のポリヌクレオチドを含む構築物であって、該シグナルが適切な宿主細胞中に配置された場合に該ポリヌクレオチドの発現を駆動する構築物は、「発現カセット」と呼ばれる。本発明の融合タンパク質をコードする発現カセットは、宿主細胞への導入用の発現ベクター内に配置されることが多い。ベクターは典型的には、発現カセットに加えて、１つ以上の選択された宿主細胞中でベクターが独立して複製を行うことを可能にする核酸配列を含む。一般に、この配列は、宿主染色体ＤＮＡとは独立してベクターが複製を行うことを可能にする配列であり、複製起点または自立複製配列を含む。そのような配列は、様々な細菌について知られている。例えば、プラスミドｐＢＲ３２２由来の複製起点は、大部分のグラム陰性細菌に適している。あるいは、ベクターは、宿主細胞ゲノム補体に一体化され、細胞がＤＮＡ複製を受ける際に複製されることにより、複製することができる。細菌細胞における酵素の発現のために好ましい発現ベクターはｐＴＧＫであり、これは、二重ｔａｃ−ｇａｌプロモーターを含み、国際公開第９８／２０１１１号に記載されている。
【０１０２】
ポリヌクレオチド構築物の構築には一般に、細菌中で複製可能なベクターの使用が必要である。細菌からのプラスミドの精製に関しては、極めて多くのキットが市販されている（例えば、ＥａｓｙＰｒｅｐＪ、ＦｌｅｘｉＰｒｅｐＪ、どちらもＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ製；ＳｔｒａｔａＣｌｅａｎＪ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製；およびＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｑｉａｇｅｎを参照されたい）。次に、単離および精製されたプラスミドを、その他のプラスミドを産生するようにさらに操作することができ、かつ細胞のトランスフェクションのために使用することができる。ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓまたはＢａｃｉｌｌｕｓにおけるクローニングも可能である。
【０１０３】
選択可能マーカーは、本発明のポリヌクレオチドを発現させるために用いられる発現ベクター中に組み込まれることが多い。これらの遺伝子は、選択的培養培地中で増殖する形質転換宿主細胞の生存または増殖に必要な、タンパク質のような遺伝子産物をコードすることができる。選択遺伝子を含むベクターで形質転換されていない宿主細胞は、上記培養培地中で生存しないと考えられる。典型的な選択遺伝子は、アンピシリン、ネオマイシン、カナマイシン、クロラムフェニコール、もしくはテトラサイクリンなどの抗生物質またはその他の毒素に対する耐性を付与するタンパク質をコードする。あるいは選択可能マーカーは、栄養要求性の欠乏を補完するか複合培地からは入手できない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードしてもよく、例えば、ＢａｃｉｌｌｕｓについてはＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子である。ベクターは、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、または宿主細胞に導入される前にベクターが複製されるその他の細胞において機能的である選択可能マーカーを１つ有することが多い。いくつかの選択可能マーカーは、当業者に公知であり、例えば、上記のＳａｍｂｒｏｏｋｅｔ ａｌ．に記載されている。
【０１０４】
上記で列挙した成分の１つ以上を含む適切なベクターの構築には、上記で引用した参考文献に記載の標準的なライゲーション技術が用いられる。単離されたプラスミドまたはＤＮＡ断片は、切断され、調整され、かつ、必要なプラスミドを作製するために望ましい形態で再ライゲーションされる。構築されたプラスミド中の正しい配列を確認するために、制限エンドヌクレアーゼ消化のような標準的手法によって、および／または公知の方法による配列決定によって、プラスミドを解析することができる。これらの目的を達成するための分子クローニング技術は、当技術分野で公知である。組換え核酸の構築に適した多種多様なクローニングおよびｉｎｖｉｔｒｏ増幅法は、当業者に周知である。これらの手法および多くのクローニング実習によって当業者を導くのに十分な教示の例は、Ｂｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｋｉｍｍｅｌ，Ｇｕｉｄｅｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ １５２，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ（Ｂｅｒｇｅｒ）；およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ ｊｏｉｎｔ ｖｅｎｔｕｒｅ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，（１９９８ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）（Ａｕｓｕｂｅｌ）に見出される。
【０１０５】
本発明の発現ベクター構築のための出発材料としての使用に適した様々な一般的ベクターが、当技術分野で周知である。細菌におけるクローニングに関して、一般的なベクターとしては、ｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（商標）のようなｐＢＲ３２２由来ベクター、およびλ−ファージ由来ベクターが含まれる。酵母においては、ベクターは、酵母組込みプラスミド（例えば、ＹＩｐ５）および酵母複製プラスミド（ＹＲｐシリーズのプラスミド）およびｐＧＰＤ−２を含む。哺乳動物細胞における発現は、ｐＳＶ２、ｐＢＣ１２ＢＩ、およびｐ９１０２３を含む一般に入手可能な様々なプラスミド、ならびに、溶解ウイルスベクター（例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、およびバキュロウイルス）、エピソームウイルスベクター（例えば、ウシパピローマウイルス）、およびレトロウイルスベクター（例えば、マウスレトロウイルス）を用いて達成できる。
【０１０６】
選ばれた宿主細胞中に発現ベクターを導入するための方法は特に重要ではなく、そのような方法は当業者に公知である。例えば、塩化カルシウム形質転換によって、Ｅ．ｃｏｌｉを含む原核細胞中に、および、リン酸カルシウム処置またはエレクトロポレーションによって真核細胞中に、発現ベクターを導入することができる。その他の形質転換法もまた適している。
【０１０７】
翻訳カップリングを用いて、発現を増強してもよい。この戦略では、プロモーターの下流に配置された、翻訳系固有の高発現遺伝子に由来する上流の短いオープンリーディングフレーム、および、終結コドンによる数アミノ酸コドンの後に続くリボソーム結合部位が用いられる。終結コドンの直前には第２のリボソーム結合部位があり、終結コドンの後ろは翻訳開始のための開始コドンである。この系によってＲＮＡ中の二次構造が解消され、効率的な翻訳開始が可能になる。Ｓｑｕｉｒｅｓ，ｅｔ．ａｌ．（１９８８），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１６２９７−１６３０２を参照されたい。
【０１０８】
ＣｇｔＢポリペプチドは、細胞内で発現させることができ、または、細胞から分泌させることができる。細胞内発現は高収量につながることが多い。必要ならば、再折りたたみ工程の実施により、可溶性で活性な融合タンパク質の量を増大させることもできる（例えば、上記のＳａｍｂｒｏｏｋｅｔ ａｌ．；Ｍａｒｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８４）２：８００；Ｓｃｈｏｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８５）３：１５１を参照されたい）。ＣｇｔＢポリペプチドが細胞から、周辺質または細胞外培地のいずれかへ分泌される実施形態においては、ＤＮＡ配列は、切断可能なシグナルペプチド配列と連結される。シグナル配列は、細胞膜を介した融合タンパク質の移行を導く。Ｅ．ｃｏｌｉ中での使用に適したプロモーター−シグナル配列単位を含むベクターの例は、ｐＴＡ１５２９であり、これは、Ｅ．ｃｏｌｉｐｈｏＡプロモーターおよびシグナル配列を有する（例えば、上記のＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．；Ｏｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８５）８２：７２１２；Ｔａｌｍａｄｇｅｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ（１９８０）７７：３９８８；Ｔａｋａｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８５）２６０：２６７０を参照されたい）。別の実施形態においては、例えば、精製、分泌、または安定性を促進するために、ＣｇｔＢタンパク質は、プロテインＡまたはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の部分配列と融合される。
【０１０９】
また、本発明のＣｇｔＢポリペプチドを、その他の細菌タンパク質にさらに連結することもできる。正常な原核制御配列は転写および翻訳を指示するので、このアプローチにより高収量が得られることが多い。Ｅ．ｃｏｌｉにおいては、異種タンパク質を発現させるためにｌａｃＺ融合物を用いることが多い。ｐＵＲ、ｐＥＸ、およびｐＭＲ１００シリーズのような適切なベクターは容易に入手可能である（例えば、上記のＳａｍｂｒｏｏｋｅｔ ａｌ．を参照されたい）。特定の用途に関しては、精製後に非グリコシルトランスフェラーゼおよび／またはアクセサリー酵素アミノ酸を融合タンパク質から切断することが望ましい。臭化シアン、プロテアーゼ、または第Ｘａ因子による切断を含む当該技術分野で公知のいくつかの方法のいずれかによって、これを達成することができる（例えば、上記のＳａｍｂｒｏｏｋｅｔ ａｌ．；Ｉｔａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９７７）１９８：１０５６；Ｇｏｅｄｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７９）７６：１０６；Ｎａｇａｉｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８４）３０９：８１０；Ｓｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８６）８３：５６１を参照されたい）。所望の切断箇所で融合タンパク質のための遺伝子内に切断部位を設けることができる。
【０１１０】
複数の転写カセットを単一の発現ベクター内に配置することによって、または、クローニング戦略において使用される各発現ベクターについて異なる選択可能マーカーを利用することによって、２つ以上の組換えタンパク質を単一の宿主細胞中で発現させてもよい。
【０１１１】
そのＮ−末端の完全性を維持しているＥ．ｃｏｌｉ由来の組換えタンパク質を得るための適切な系は、Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ７：６９８−７０４ （１９８９）に記載されている。この系において、関心対象の遺伝子は、ペプチダーゼ切断部位を含む酵母ユビキチン遺伝子の最初の７６残基へのＣ−末端融合物として産生される。２つの部分の接合部における切断は、無傷の真性Ｎ−末端残基を有するタンパク質の産生という結果になる。
【０１１２】
ＶＩ．ＣｇｔＢポリペプチドの精製
本発明のＣｇｔＢタンパク質を、例えば、細胞内タンパク質として、または細胞から分泌されるタンパク質として発現させることができ、そして本発明の方法においてこの形態で使用可能である。例えば、発現された細胞内ＣｇｔＢポリペプチドまたは分泌ＣｇｔＢポリペプチドを含む粗製細胞抽出物を、本発明の方法において使用することができる。
【０１１３】
あるいは、硫安塩析、アフィニティカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動等を含む当該技術分野の標準的手順により、ＣｇｔＢポリペプチドを精製することができる（一般的に、Ｒ．Ｓｃｏｐｅｓ，ＰｒｏｔｅｉｎＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．（１９８２），Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１８２：Ｇｕｉｄｅｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．（１９９０）を参照されたい）。少なくとも約７０、７５、８０、８５、９０％の均一性の実質的に純粋な組成物が好ましく、９２、９５、９８〜９９％またはそれ以上の均一性が最も好ましい。例えば、抗体産生のための免疫原として、精製タンパク質を使用してもよい。
【０１１４】
本発明のＣｇｔＢポリペプチドの精製を容易にするために、タンパク質をコードする核酸は、アフィニティ結合試薬を利用することのできるエピトープまたは「タグ」、すなわち精製タグ用のコード配列を含むこともできる。適切なエピトープの例としては、ｍｙｃおよびＶ−５レポーター遺伝子が含まれ；これらのエピトープを有する融合タンパク質の組換え体産生に有用な発現ベクターが市販されている（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（ＣａｒｌｓｂａｄＣＡ）ベクターであるｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−ＨｉｓおよびｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓが哺乳動物細胞中での発現に適している）。本発明のＣｇｔＢポリペプチドにタグを付着させるために適したさらなる発現ベクター、および対応する検出系は当業者に公知であり、いくつかが市販されている（例えば、ＦＬＡＧ”（Ｋｏｄａｋ，ＲｏｃｈｅｓｔｅｒＮＹ））。適切なタグの別の例はポリヒスチジン配列であり、これは金属キレートアフィニティリガンドに結合することができる。典型的には、隣接する６個のヒスチジンが使用されるが、７個以上または５個以下も利用可能である。ポリヒスチジンタグに対する結合部分として働くことができる適切な金属キレートアフィニティリガンドとしては、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）が含まれる（Ｈｏｃｈｕｌｉ，Ｅ．（１９９０）“Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ ｍｅｔａｌ ｃｈｅｌａｔｉｎｇ ａｄｓｏｒｂｅｎｔｓ”Ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｊ．Ｋ．Ｓｅｔｌｏｗ，Ｅｄ．，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ；Ｑｉａｇｅｎ（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒｉｔａ，ＣＡ）より市販）。その他の精製タグまたはエピトープタグとしては、例えば、ＡＵ１、ＡＵ５、ＤＤＤＤＫ（ＥＣ５）、Ｅタグ、Ｅ２タグ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、６残基ペプチド、ポリオーマ中間Ｔタンパク質に由来するＥＹＭＰＭＥ、ＨＡ、ＨＳＶ、ＩＲＳ、ＫＴ３、Ｓタグ、Ｓ１タグ、Ｔ７タグ、Ｖ５タグ、ＶＳＶ−Ｇ、β−ガラクトシダーゼ、Ｇａｌ４、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ルシフェラーゼ、プロテインＣ、プロテインＡ、セルロース結合タンパク質、ＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）、ｓｔｅｐ−タグ、Ｎｕｓ−Ｓ、ＰＰＩ−ａｓｅ、Ｐｆｇ２７、カルモジュリン結合タンパク質、ｄｓｂＡおよびその断片、ならびにグランザイムＢが含まれる。エピトープ配列に特異的に結合するエピトープペプチドおよび抗体は、例えば、Ｃｏｖａｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．；ＢｅｔｈｙｌＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．； Ａｂｃａｍ Ｌｔｄ．；およびＮｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｉｎｃより市販されている。
【０１１５】
精製タグとしては、マルトース結合ドメインおよびデンプン結合ドメインも含まれる。精製タグを含むタンパク質は、該精製タグと結合する結合パートナー、例えば、該精製タグに対する抗体、ニッケルイオンもしくはコバルトイオンまたは樹脂、および、アミロース、マルトース、またはシクロデキストリンを用いて精製することができる。精製タグとしては、デンプン結合ドメイン、Ｅ．ｃｏｌｉチオレドキシンドメイン（ベクターおよび抗体は、例えば、ＳａｎｔａＣｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．およびＡｌｐｈａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．より市販されている）、およびＳＵＭＯタンパク質（ベクターおよび抗体は、例えば、ＬｉｆｅＳｅｎｓｏｒｓ Ｉｎｃ．より市販されている）のカルボキシ末端側の半分も含まれる。Ｅ．ｃｏｌｉ由来のマルトース結合ドメインおよびＡ．ｎｉｇｅｒのアミラーゼ由来のＳＢＤ（デンプン結合ドメイン）のようなデンプン結合ドメインは、国際公開第９９／１５６３６号に記載され、これは参照により本明細書に組み込まれる。ベータシクロデキストリン（ＢＣＤ）誘導体化樹脂を用いた、デンプン結合ドメインを含む融合タンパク質のアフィニティ精製は、２００５年２月１７日公開の国際公開第２００５／０１４７７９号に記載されており、その全文が参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態において、ＣｇｔＢポリペプチドは、２つ以上の精製タグまたはエピトープタグを含む。
【０１１６】
タグとしての使用に適したその他のハプテンは当業者に公知であり、例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（６ｔｈ Ｅｄ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ ＯＲ）に記載されている。例えば、ジニトロフェノール（ＤＮＰ）、ジゴキシゲニン、バルビツレート（例えば、米国特許第５，４１４，０８５号を参照されたい）、およびいくつかの種類のフルオロフォアは、これらの化合物の誘導体であるので、ハプテンとして有用である。ハプテンおよびその他の部分をタンパク質およびその他の分子に連結するためのキットが市販されている。例えば、ハプテンがチオールを含む場合、ＳＭＣＣのようなヘテロ二官能性リンカーを用いて、捕捉試薬上に存在するリシン残基にタグを付着させることができる。
【０１１７】
その生物活性を減少させることなくＣｇｔＢポリペプチドの触媒ドメインまたは機能ドメインを修飾できることを、当業者は認識するであろう。融合タンパク質への触媒ドメインのクローニング、発現、または組み込みを促進するために、いくつかの修飾をおこなってもよい。そのような修飾は当業者には周知であり、例えば、そのような修飾としては、例えば、開始部位を提供するためにアミノ末端に付加されたメチオニンを提供するための触媒ドメインをコードするポリヌクレオチドのいずれかの末端へのコドンの付加、あるいは、好都合に配置された制限酵素部位または終結コドンもしくは精製配列を作製するためにいずれかの末端に配置されたさらなるアミノ酸（例えばポリＨｉｓ）が含まれる。
【０１１８】
ＶＩＩ.ドナー基質及びアクセプター基質
ＣｇｔＢポリペプチドによって使用される適切なドナー基質としては、例えば、ＵＤＰ−Ｇａｌが含まれる。Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．，ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｃｈｅｍ． ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ．６８：１−２０（１９９７）。
【０１１９】
典型的には、アクセプター基質は、β−１，３結合によるガラクトース残基の付加のための末端ＧａｌＮＡｃまたは誘導体を含む。適切なアクセプターの例としては、β１，４結合によってＧａｌに連結される末端ＧｌｃＮＡｃ、および還元末端においてアグリコン基に連結される末端ＧａｌＮＡｃが含まれる。適切な標識アクセプターとしては、例えば、ＧａｌＮＡｃβ−１，４−Ｇａｌβ−１，４−Ｇｌｃ−ＦＣＨＡＳＥ、ＧａｌＮＡｃβ−１，４−［ＮｅｕＡｃα−２，３］−Ｇａｌβ−１，４−Ｇｌｃ−ＦＣＨＡＳＥ、ＧａｌＮＡｃβ−１，４−［ＮｅｕＡｃ−α−２，３］−Ｇａｌβ−１，４−Ｇｌｃ−スフィンゴシン−ＦＣＨＡＳＥ、ＧａｌＮＡｃβ−１，４−［ＮｅｕＡｃα−２，８−ＮｅｕＡｃα−２，３］−Ｇａｌβ−１，４−Ｇｌｃ−ＦＣＨＡＳＥ、ＧａｌＮＡｃβ−ＦＣＨＡＳＥ、ＧａｌＮＡｃ−α−ＦＣＨＡＳＥ、ＧａｌＮＡｃ−β−ｐ−ニトロフェニル、ＧａｌＮＡｃ−α−ｐ−ニトロフェニルが含まれる。いくつかの実施形態において、アクセプター残基は、例えば、ペプチド、タンパク質、脂質、またはプロテオグリカンに付着さたオリゴ糖の一部である。ＦＣＨＡＳＥ−ＮＨ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ［ＧａｌＮＡｃ−α−］Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−ＣＯＯＨ、ＩＦＮα２ｂ［Ｔｈｒ−１３４−ＧａｌＮＡｃ。切断型ＣｇｔＢタンパク質はまた、ガラクトース残基を、例えば、上記で列挙された構造を有する標識されていないアクセプター基質に付加するために使用できる。標識されていないアクセプター基質は、例えば、ガラクトシル化製品を商業的規模で作製するために用いられる。
【０１２０】
本発明のＣｇｔＢポリペプチドおよび方法によって使用される適切なアクセプター基質としては、多糖およびオリゴ糖が含まれるが、これらに限定されない。本明細書に記載のＣｇｔＢポリペプチドは、好都合な出発材料から所望の生成物を産生するための多酵素系においても使用することができる。
【０１２１】
本発明のＣｇｔＢポリペプチドおよび方法によって使用される適切なアクセプター基質としては、本発明の方法によって修飾可能なタンパク質、脂質、ペプチド、糖タンパク質、糖脂質、糖ペプチド、ガングリオシド、およびその他の生物学的構造体（例えば、細胞全体）が含まれるが、これらに限定されない。これらのアクセプター基質は典型的には、上述の多糖またはオリゴ糖分子を含む。本発明の方法により修飾することができる代表的な構造としては、当業者に公知の細胞上の糖脂質、糖タンパク質および炭水化物構造体のいくつかが含まれる。
【０１２２】
本発明は、所望のオリゴ糖部分を有するオリゴ糖、糖タンパク質および糖脂質を産生する能力に関して選択されるＣｇｔＢポリペプチドを提供する。同様に、もし存在すれば、所望の活性化糖基質に基づいて、または生成物であるオリゴ糖において見出される糖に基づいて、アクセサリー酵素が選択される。
【０１２３】
糖タンパク質の合成については、様々な量の関心対象のＣｇｔＢポリペプチド（例えば、０．０１〜１００ ｍＵ／ｍｇタンパク質）を、該関心対象のＣｇｔＢタンパク質によるグリコシル化のための潜在的アクセプター部位を有するオリゴ糖に連結された糖タンパク質（例えば１〜１０ｍｇ／ｍｌ）と反応させることにより、適切なＣｇｔＢポリペプチドを容易に同定することができる。本発明の組換えＣｇｔＢタンパク質が所望のアクセプター部位において糖残基を付加できる能力を比較し、所望の特性（例えば、アクセプター基質選択性または触媒活性）を有するＣｇｔＢポリペプチドを選択する。
【０１２４】
一般に、所望のガラクトシル化オリゴ糖部分を有するオリゴ糖、糖タンパク質、および糖脂質の酵素的合成の有効性を、組換え的に産生された本発明のＣｇｔＢポリペプチドの使用によって増強させることができる。組換え技術は、オリゴ糖、糖タンパク質および糖脂質の大規模なｉｎｖｉｔｒｏ修飾に必要な組換えＣｇｔＢポリペプチドの大量産生を可能にする。
【０１２５】
いくつかの実施形態において、本発明のＣｇｔＢポリペプチドおよび方法による使用に適したオリゴ糖、糖タンパク質、および糖脂質は、グリコシル化反応の際に固体支持体上に固定化された糖タンパク質および糖脂質であり得る。用語「固体支持体」は、半固体支持体も包含する。好ましくは、グリコシル化反応が完了した後にそれぞれの糖タンパク質または糖脂質を放出できるように、標的糖タンパク質または糖脂質は可逆的に固定化される。多くの適切なマトリクスが、当業者には公知である。例えば、イオン交換を用いて、グリコシル化反応が進行する間、糖タンパク質または糖脂質を適切な樹脂上に一時的に固定化することができる。関心対象の糖タンパク質または糖脂質に特異的に結合するリガンドを、親和性に基づく固定化に用いることもできる。例えば、糖タンパク質に特異的に結合する抗体が適している。また、関心対象の糖タンパク質自体が抗体であるかその断片を含む場合、アフィニティ樹脂としてプロテインＡまたはＧを使用することができる。関心対象の糖タンパク質または糖脂質に特異的に結合する色素およびその他の分子も、適している。
【０１２６】
好ましくは、アクセプター糖類が全長糖タンパク質の切断型である場合、これは、好ましくは、全長糖タンパク質の生物学的に活性な部分配列を含む。代表的な生物学的に活性な部分配列としては、酵素活性部位、レセプター結合部位、リガンド結合部位、抗体の相補性決定領域、および抗原の抗原性領域が含まれるが、これらに限定されない。
【０１２７】
ＶＩＩＩ．ガラクトシル化生成物の産生
ｉｎ ｖｉｔｒｏ反応混合物中でまたはｉｎ ｖｉｖｏ反応によって、例えば、ＣｇｔＢポリペプチドをコードするヌクレオチドを含む組換え微生物の発酵性増殖によってガラクトシル化生成物を作製するために、ＣｇｔＢポリペプチドを用いることができる。
【０１２８】
Ａ．ｉｎ ｖｉｔｒｏ反応
ｉｎ ｖｉｔｒｏ反応混合物中でガラクトシル化生成物を作製するために、ＣｇｔＢポリペプチドを用いることができる。ｉｎ ｖｉｔｒｏ反応混合物は、ＣｇｔＢポリペプチド、部分精製ＣｇｔＢポリペプチド、または精製ＣｇｔＢポリペプチド、ならびに、ドナー基質  アクセプター基質、および適切な反応緩衝液を含む、透過処理済み微生物を含み得る。ｉｎｖｉｔｒｏ反応に関しては、ＣｇｔＢポリペプチドなどの組換えグリコシルトランスフェラーゼタンパク質、アクセプター基質、ドナー基質、およびその他の反応混合物成分を、水性反応培地中での混合によって組み合わせる。所望のガラクトシル化生成物に応じて、付加的なグリコシルトランスフェラーゼをＣｇｔＢポリペプチドと組み合わせて用いることができる。培地は一般に、約５〜約８．５のｐＨ値を有する。培地の選択は、培地がｐＨ値を所望のレベルで維持できる能力に基づく。したがって、いくつかの実施形態において、培地は約７．５のｐＨ値に緩衝されている。緩衝液が使用されない場合、使用される特定のガラクトシルトランスフェラーゼに応じて、培地のｐＨは、約５〜８．５に維持されるべきである。ＣｇｔＢポリペプチドについては、ｐＨ範囲を約７．０〜８．０に維持することが好ましい。シアリルトランスフェラーゼについては、範囲は、好ましくは約５．５〜約８．０である。
【０１２９】
酵素量または濃度は活性単位で表されるが、これは触媒作用の初速度の尺度である。１活性単位は、所与の温度（典型的には３７℃）およびｐＨ値（典型的には７．５）において、１分間あたり生成物１μｍｏｌの形成を触媒する。従って、１０単位の酵素は、温度３７℃およびｐＨ値７．５において１分間で基質１０μｍｏｌが生成物１０μｍｏｌに変換される触媒量の酵素である。
【０１３０】
反応混合物は、二価の金属カチオン（Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋）を含み得る。反応培地はまた、もし必要であれば、可溶化界面活性剤（例えば、ＴｒｉｔｏｎまたはＳＤＳ）およびメタノールまたはエタノールのような有機溶媒を含んでもよい。酵素は、溶液中で遊離させて利用することができ、または、ポリマーのような支持体に結合させることができる。従って、反応混合物は、当初は実質的に均一であるが、いくらかの沈殿物が反応の間に形成され得る。
【０１３１】
上記プロセスが実行される温度は、凍結温度のすぐ上から感受性の高い酵素の大部分が変性する温度までの範囲をとり得る。この温度範囲は、好ましくは約０℃〜約４５℃であり、より好ましくは約２０℃〜約３７℃である。
【０１３２】
このように形成された反応混合物は、グリコシル化されるべき生体分子に付着したオリゴ糖基上に存在する所望のオリゴ糖決定基を所望の高収率で得るのに十分な期間、維持される。大規模調製については、約０．５〜２４０時間、より典型的には約１〜３６時間、反応を進行させることが多い。
【０１３３】
グリコシルトランスフェラーゼサイクルの一部として、１回以上のグリコシルトランスフェラーゼ反応を実行できる。グリコシルトランスフェラーゼサイクルの好ましい条件および説明が記載されている。いくつかのグリコシルトランスフェラーゼサイクル（例えば、シアリルトランスフェラーゼサイクル、ガラクトシルトランスフェラーゼサイクル、およびフコシルトランスフェラーゼサイクル）が、米国特許第５，３７４，５４１号および国際公開第９４２５６１５Ａ号に記載されている。その他のグリコシルトランスフェラーゼサイクルは、以下に記載されている：Ｉｃｈｉｋａｗａｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：９２８３（１９９２）、Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５７：４３４３（１９９２）、ＤｅＬｕｃａ，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７：５８６９−５８７０（１９９５）、およびＩｃｈｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．Ｉｎ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ ａｎｄ ＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅＰｏｌｙｍｅｒｓ．Ｙａｌｔａｍｉ，ｅｄ．（ＡＴＬ Ｐｒｅｓｓ，１９９３）。
【０１３４】
上記のグリコシルトランスフェラーゼサイクルについて、プロセス中で使用される様々な反応物の濃度または量は、温度およびｐＨ値などの反応条件を含む数多くの要因、ならびにグリコシル化されるべきアクセプター糖類の選択および量に依存する。グリコシル化プロセスによって触媒量の酵素の存在下での活性化ヌクレオチドの再生、活性化されたドナー糖および産生されたＰＰｉの捕捉が可能になるので、このプロセスは、上述の化学量論的基質の濃度または量によって制限される。本発明の方法に従って使用できる反応物の濃度の上限は、そのような反応物の溶解度によって決定される。
【０１３５】
好ましくは、アクセプターが消費されるまでグリコシル化が進行するように、活性化ヌクレオチド、リン酸ドナー、ドナー糖および酵素の濃度が選択される。以下で論じられる考察は、シアリルトランスフェラーゼの文脈ではあるものの、その他のグリコシルトランスフェラーゼサイクルにも一般に適応可能である。
【０１３６】
それぞれの酵素は、触媒量で存在する。特定の酵素の触媒量は、該酵素の基質の濃度によって、ならびに、温度、時間およびｐＨ値のような反応条件によって変動する。予め選択した基質濃度および反応条件下での所与の酵素についての触媒量を決定するための手段は、当業者に知られている。
【０１３７】
Ｂ．ｉｎ ｖｉｖｏ反応
ｉｎ ｖｉｖｏ反応、例えば、ＣｇｔＢポリペプチドを含む組換え微生物の発酵性増殖によってガラクトシル化生成物を作製するために、ＣｇｔＢポリペプチドを用いることができる。組換え微生物の発酵性増殖は、アクセプター基質、例えばＧａｌＮＡｃ、およびドナー基質またはドナー基質の前駆体、例えばガラクトースを含む培地の存在下で生じ得る。例えば、Ｐｒｉｅｍｅｔ ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １２：２３５−２４０（２００２）を参照されたい。微生物がアクセプター基質およびドナー基質またはドナー基質の前駆体を吸収し、生細胞中で、アクセプター基質へのドナー基質の付加が起こる。例えば、糖輸送タンパク質を発現させることによって、アクセプター基質の摂取を促進するように微生物を改変することができる。例えば、ラクトースがアクセプター糖類である場合、ＬａｃＹパーミアーゼを発現するＥ．ｃｏｌｉ細胞を使用することができる。アクセプター糖類の分解を低減するため、または、ドナー糖類もしくはドナー糖類の前駆体の産生を増大するために、その他の方法を用いることができる。いくつかの実施形態において、宿主微生物の操作によってガラクトシル化生成物の産生が増強される。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、例えばＣＭＰ−シアレート合成酵素を欠いた宿主株（ＮａｎＡ−）を用いることによって、シアル酸の分解を最小限にすることができる。（いくつかのＥ．ｃｏｌｉ株において、ＣＭＰ−シアレート合成酵素が分解酵素であることが分かっている。）また、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、ラクトースが例えばアクセプター糖類であるかまたはガラクトシル化生成物合成における中間体である場合、ＬａｃＺ−である宿主細胞を用いることによってラクトース分解を最小限にすることができる。
【０１３８】
Ｃ．ガラクトシル化生成物の特性決定および単離
例えば、所望の生成物の産生が生じたことを判定することにより、または、アクセプター基質のような基質が消尽されたことを判定することにより、ガラクトシル化生成物の産生をモニターすることができる。例えば、ペーパーもしくはＴＬＣプレートを用いるクロマトグラフィーなどの技術を用いて、または質量分析法、例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法により、あるいはＮＭＲ分光法により、オリゴ糖のようなガラクトシル化生成物を同定できることを当業者は認識するであろう。ガラクトシル化生成物の同定法は当業者に公知であり、例えば、すべての目的について参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，６９９，７０５号において、およびＶａｒｋｉｅｔ ａｌ．，Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ，ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ １７（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ，１９９３）において見出される。
【０１３９】
ＣｇｔＢポリペプチドを用いて産生される生成物は、精製せずに使用することができる。しかしながら、標準的な周知の手法、例えば、薄層もしくは厚層クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、または膜濾過を、ガラクトシル化糖類の回収のために用いることができる。また、例えば、本発明の譲受人に譲受された豪州特許第７３５６９５号に記載のナノ濾過膜または逆浸透膜を利用した膜濾過を用いることができる。さらなる例として、タンパク質を除去するために、約１０００〜約１０，０００ダルトンの分子量カットオフを膜が有する膜濾過を用いることができる。別の例として、塩を除去するために、次にナノ濾過または逆浸透を用いることができる。ナノフィルター膜は逆浸透膜の一種であり、これは、一価の塩は通過させるが、使用する膜に応じて約２００〜約１０００ダルトンを上回る多価塩および非荷電溶質は保持する。従って、例えば、本発明の組成物および方法によって産生されるオリゴ糖は膜内部で保持されることができ、混入塩は通過することになる。糖タンパク質ガラクトシル化生成物は、本明細書に記載のものを含む標準的なタンパク質精製手法を用いて単離または精製することができる。
【実施例】
【０１４０】
Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ株において見出されるリポオリゴ糖（ＬＯＳ）構造は、構造的に多様であり、その多様性は、ＬＯＳ遺伝子座から発現されたグリコシルトランスフェラーゼと相関している。例えば、ガラクトースは、ＣｇｔＢタンパク質によってβ−１，３立体配置に付加される。ガラクトシル化オリゴ糖生成物の構造は、ＣｇｔＢタンパク質の配列と同様に、種々のＣ．ｊｅｊｕｎｉ株において変わる。例えば、図１および２を参照されたい。しかしながら、様々な天然のＣｇｔＢタンパク質はすべて、β−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有する。本研究により、β−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ活性のために必要とされるコアＣｇｔＢ構造、および修飾されたＣｇｔＢタンパク質と関連する驚くほど改善された酵素活性が同定される。
【０１４１】
以下の例において用いられる略号は次の通りである：ＣＥ、キャピラリー電気泳動；ＦＣＨＡＳＥ、６−（フルオレセイン−５−カルボキサミド）ヘキサン酸、スクシンイミジルエステル；ＨＥＰＥＳ、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸；ＩＰＴＧ、イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、ＬＯＳ、リポオリゴ糖；ＬＰＳ、リポ多糖；ＭＥＳ、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸；ＰＣＲ、ポリメラーゼ連鎖反応。
【０１４２】
彼の報告全体を通してＣｇｔＢ酵素アッセイにおいて用いられるアクセプター糖は、それらの対応するガングリオシドヘッドグループの後に命名した（ｌｙｓｏ−ＧＭ２のケースを除き、たとえそれらがそれらのグリコン部分に存在するのみであったとしても）。従って、ＧＡ２はＧａｌＮＡｃβ−１，４−Ｇａｌβ−１，４−Ｇｌｃ−ＦＣＨＡＳＥであり、ＧＭ２−ＦＣＨＡＳＥはＧａｌＮＡｃβ−１，４−［ＮｅｕＡｃα−２，３］−Ｇａｌβ−１，４−Ｇｌｃ−ＦＣＨＡＳＥであり、ｌｙｓｏ−ＧＭ２はＧａｌＮＡｃβ−１，４−［ＮｅｕＡｃ−α−２，３］−Ｇａｌβ−１，４−Ｇｌｃ−スフィンゴシン−ＦＣＨＡＳＥである。ＧＤ３−ＦＣＨＡＳＥはＮｅｕＡｃα−２，８−ＮｅｕＡｃα−２，３−Ｇａｌβ−１，４−Ｇｌｃ−ＦＣＨＡＳＥであり、ＧＭ３−ＦＣＨＡＳＥはＮｅｕＡｃα−２，３−Ｇａｌβ−１，４−Ｇｌｃ−ＦＣＨＡＳＥである。ＣｇｔＢ反応の生成物であるＧＭｌａ−ＦＣＨＡＳＥは、Ｇａｌβ−１，３−ＧａｌＮＡｃβ−１，４−［ＮｅｕＡｃα−２，３］−Ｇａｌβ−１，４−Ｇｌｃ−ＦＣＨＡＳＥである。ＩＦＮα２ｂ［Ｔｎ］−ＦＣＨＡＳＥはＩＦＮα２ｂ［ＧａｌＮＡｃα］−ＦＣＨＡＳＥであり、ＩＦＮα２ｂ［Ｔ−Ａｇ］−ＦＣＨＡＳＥはＩＦＮα２ｂ［Ｇａｌβ１，３−ＧａｌＮＡｃα］−ＦＣＨＡＳＥであり（両方の例における標識ペプチドアクセプター）；ＩＦＮα２ｂ［Ｔｎ］はＩＦＮα２ｂ［ＧａｌＮＡｃα］であり、ＩＦＮα２ｂ［Ｔ−Ａｇ］はＩＦＮα２ｂ［Ｇａｌβ１，３−ＧａｌＮＡｃα］である（両方の例におけるタンパク質アクセプター）。
【０１４３】
（実施例１）
ＣｇｔＢ変異体配列比較および解析
３種類の天然ＣｇｔＢタンパク質が同定されており、３つのＣ．ｊｅｊｕｎｉ株由来のＣｇｔＢタンパク質：ＣｇｔＢＯＨ４３８４、ＣｇｔＢ１１１６８、およびＣｇｔＢＯＨ：１０により表される。天然ＣｇｔＢタンパク質の多重配列比較が図２Ａに示してある。３つのＣｇｔＢタンパク質のいずれか２つを用いたペア比較は、それらが、全長配列にわたって５４〜５９％配列同一性および６７〜７５％配列類似性を共有することを示している（図２Ｂ）。ＣｇｔＢの高度に保存されたアミノ末端ドメインは、ドナー結合ドメインであると考えられる。ＣｇｔＢにおいて、このドメインは、３つの配列間の配列同一性に基づいて最初の１０８の位置として描かれている。いずれか２つのＣｇｔＢタンパク質間のＮ−末端ドメインのペア比較は、Ｎ−末端ドメインが高度に保存されており、いずれか２つのＣｇｔＢタンパク質が少なくと８７％の配列同一性および少なくとも９２％の配列類似性を共有していることを示す（図２Ｂ）。
【０１４４】
ＣｇｔＢタンパク質のカルボキシ−末端ドメインは、アクセプター結合ドメインであり、ＣｇｔＢの位置１０９から末端までを含む。Ｃ−末端ドメインを用いたペア比較は、より多くの配列ダイバージェンスを明らかにしており、いずれか２つのＣｇｔＢタンパク質は、少なくとも３７％の配列同一性および少なくとも５４％の配列類似を共有している（図２Ｂ）。アクセプター結合ドメインにおいて観察される配列ダイバージェンスは、アクセプターＬＯＳ分子において観察される相違、例えば、それらの外部コアにおける分岐シアル酸残基の有無、と相関している。
【０１４５】
ＣｇｔＢＯＨ４３８４、ＣｇｔＢ１１１６８、およびＣｇｔＢＯＨ：１０の活性のために必要とされる最小のアミノ酸構造を決定するために、切断型ＣｇｔＢタンパク質を発現させる核酸を構築した。
【０１４６】
（実施例２）
構築物およびタンパク質精製
本研究において使用した細菌株およびプラスミドが表Ｉに列挙してある。
【０１４７】
【表１】
0005921065.tif 000006
本研究のために使用したすべてのオリゴヌクレオチドプライマーが図５に列挙してある。増幅反応は、以前記載されたように、生成Ｃ．ｊｅｊｕｎｉＤＮＡを用いて行った（Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７７：３２７−３３７（２００２））。アンプリコンを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮＩｎｃ．，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，Ｏｎｔａｒｉｏ）を用いて精製し、ＮｄｅＩおよびＳａｌＩ末端（ｐＣＷｏｒｉ＋またはｐＣＷｍａｌＥ−Ｎ中）か、ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩ末端（ｐＣＷｍａｌＥ−Ｃ中）を用いてクローニングした。ｐＣＷｍａｌＥ−ＣおよびｐＣＷｍａｌＥ−Ｎを用いて、Ｃ−末端およびＮ−末端ＭａｌＥ融合タンパク質を作製した（ｍａｌＥはマルトース結合タンパク質についてコードする）。以前記載されたようにＤＮＡシークエンス反応を実行した（ＧｉｌｂｅｒｔＭ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７７：３２７−３３７（２００２））。Ｃ．ｊｅｊｕｎｉの様々な血清型由来のｃｇｔＢのヌクレオチド配列は、Ｇｅｎｂａｎｋにおいて入手可能である（ｃｇｔＢＯＨ４３８４、ｃｇｔＢＨＳ：１０、およびｃｇｔＢ１１１６８についてのエントリはそれぞれ、ＡＦ１３０９８４、ＡＦ４０００４８、およびＡＬ１３９０７７）。ＣｇｔＢ配列間の類似性および同一性百分率を、ＰａｉｒｗｉｓｅＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｎｃｅｓ；ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｂｌ２ｓｅｑ／ｂｌ２．ｈｔｍｌにてオンライン）を使用して決定した。
【０１４８】
上記のように液体培地中で増殖させた細胞を、ＮａＨＥＰＥＳ ２０ｍＭ ｐＨ７．０、２００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ β−メルカプトエタノール、１ｍＭＥＤＴＡ、１０％グリセロール（緩衝液Ａ）中に１０％（ｗ／ｖ）で再懸濁させ、Ｅｍｕｌｓｉｆｌｅｘ（Ａｖｅｓｔｉｎ，Ｏｔｔａｗａ，Ｏｎｔａｒｉｏ）を２回通して溶解した。細胞可溶化物を、４℃で３０分間、２００００×ｇで遠心分離した（ＳＳ−３４ローター）。必要に応じ、上清を緩衝液Ａ中に希釈し、アミロース樹脂の２０ｍＬカラム（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｌｔｄ．，Ｐｉｃｋｅｒｉｎｇ，Ｏｎｔａｒｉｏ）に適用した。試料適用後、カラムを２カラム容量で洗い、非結合タンパク質を溶出した。結合タンパク質を、緩衝液Ｂ（緩衝液Ａに２０ｍＭマルトースを添加したもの）でカラムを洗うことにより溶出し、溶出物を２ｍＬフラクションに収集した。溶出されたタンパク質を含有するフラクションをプールし、１００容量の酢酸ナトリウム５０ｍＭｐＨ６．０、グリセロール２０％に対して４℃で一晩透析した。タンパク質定量を、ＢＣＡ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて行った。
【０１４９】
（実施例３）
酵素アッセイ
オリゴ糖アクセプターおよびインターフェロンアルファ２ｂ（ＩＦＮα２ｂ）ペプチド（ＶＧＶＴＥＴＰ，成熟ＩＦＮα２ｂタンパク質の位置１０３〜１０９に対応）を、以前に記載されたように、ＦＣＨＡＳＥで標識した（Ｗａｋａｒｃｈｕｋ，Ｗ．ｅｔａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７１：１９１６６−１９１７３（１９９６））。ＩＦＮα２ｂ−ＦＣＨＡＳＥは、アセトニトリルの勾配（４カラム容量にわたり０〜１００％）を有する１０ｍＭ酢酸アンモニウムｐＨ５．５中でのＰＲＰ−１カラム（１０ｘ２５０ｍｍ，ＨａｍｍｉｌｔｏｎＣｏｍｐａｎｙ，Ｒｅｎｏ，ＮＶ）を用いた逆相クロマトグラフィーにより精製した。ＣｇｔＢ活性アッセイを、細胞溶解物中で、または精製酵素を使用して、５０ｍＭ ＭＥＳｐＨ６．０、０．５ｍＭのＦＣＨＡＳＥ−アクセプター（特に指定のない限り）、１０ｍＭ ＭｎＣｌ２、１０ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＵＤＰ−Ｇａ中で、３７℃で５〜３０分間行った。すべての反応を、１０μＬの５０％アセトニトリル、１０ｍＭＥＤＴＡおよび１％ＳＤＳの添加により停止し、Ｈ２Ｏで希釈し、１０〜１５μＭの最終濃度のＦＣＨＡＳＥ−標識化合物を得に。レーザーモジュール４８８（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ，ＣＡ）を備えたＰ／ＡＣＥ ＭＤＱキャピラ電気泳動システムを使用したこと以外は、以前に記載されたように（Ｗａｋａｒｃｈｕｋ，Ｗ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．，ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌ Ｂｉｏｌ．２１３：２６３−２７４（２００３））、試料をキャピラリー電気泳動によって分析した。反応の定量化を、ＭＤＱ３２Ｋａｒａｔソフトウェアを用いたトレースピークの積分により実行した。
【０１５０】
（実施例４）
ＩＦＮα２ｂ−ＦＣＨＡＳＥおよびＩＦＮα２ｂのグリコシル化
ＩＦＮα２ｂタンパク質をＣｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｃａｎｔｏｎ，ＭＡ）から購した。ＩＦＮα２ｂ−ＦＣＨＡＳＥおよびＩＦＮα２ｂを、ＧＡＬＮＴ２−ＭＢＰ（ＮＥＯＳＥＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからの寄贈）を用いてＩＦＮα２ｂ［Ｔｎ］−ＦＣＨＡＳＥおよびＩＦＮα２ｂ［Ｔｎ］に変換した（ＤｅＦｒｅｅｓ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ．１６：８３３−８４３（２００６））。ＩＦＮα２ｂ［Ｔｎ］−ＦＣＨＡＳＥを、上記のように逆相クロマトグラフィーによって精製した。ＩＦＮα２ｂ［Ｔｎ］を、ＮＨ４ＯＡｃｐＨ４．５の０．０１〜１Ｍ勾配を用いたＭｉｎｉ Ｓ４．６／５．０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂａｉｅ ｄ’Ｕｒｆｅ，Ｑｕｅｂｅｃ）を使用して陽イオン交換クロマトグラフィーによって精製した。
【０１５１】
精製ＩＦＮα２ｂ［Ｔｎ］−ＦＣＨＡＳＥ ５００μｇ（３６０ナノモル）を、１５ｍＵの精製ＣＪＬ−１３６、５０ｍＭ ＭＥＳｐＨ６．０、１０ｍＭ ＭｎＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴおよび２ｍＭ ＵＤＰ−Ｇａｌを含有する反応中でＩＦＮα２ｂ［Ｔ−Ａｇ］−ＦＣＨＡＳＥに変換した。反応を３０分後に停止し、ＳｅｐＰａｋ Ｃｌ８カラム（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）上で浄化し、ＩＦＮα２ｂ［Ｔ−Ａｇ］−ＦＣＨＡＳＥを、上記のように逆相クロマトグラフィーにより精製した。
【０１５２】
ＩＦＮα２ｂ［Ｔｎ］を、５０ｍＭ ＮａＯＡｃ ｐＨ６．０中の２．５ｍｇのＩＦＮα２ｂ［Ｔｎ］、１０ｍＭ ＭｎＣｌ２、１ｍＭＤＴＴ、２ｍＭ ＵＤＰ−Ｇａｌ、５０ｍＭ ＮａＣｌおよび５ｍＵの精製ＣＪＬ−１３６を含有する１ｍＬ反応中でＩＦＮα２ｂ［Ｔ−Ａｇ］に変換した。
【０１５３】
反応を、室温で一晩放置した。翌日、反応に、１ｍＭ ＵＤＰ−Ｇａｌおよび２．５ｍＵの精製ＣＪＬ−１３６を補った。新たに合成されたＩＦＮα２ｂ［Ｔ−Ａｇ］を、上記のように陽イオン交換クロマトグラフィーによって精製した。
【０１５４】
（実施例５）
質量分析
Ｐｒｉｎｃｅ ＣＥシステム（Ｐｒｉｎｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｅｍｍｅｎ， Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を、４０００ＱＴＲＡＰ質量分析器（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＭＤＳ Ｓｃｉｅｘ，Ｓｔｒｅｅｔｓｖｉｌｌｅ，Ｃａｎａｄａ）に連結した。シース液（イソプロパノール−メタノール、２：１）を１．０μＬ／分の流量で送出した。分離は、脱イオン水中の酢酸アンモニウム１５ｍＭ、ｐＨ９．０を用いて、長さ約９０ｃｍの露出型石英ガラスキャピラリー上で得た。５ｋＶのエレクトロスプレーイオン化電圧を、陽イオンモードに使用した。パルス窒素レーザー（３３７ｎｍ）を備えたＶｏｙａｇｅｒ−ＤＥＳＴＲ質量分析器（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）上で、ポジティブモードで加速電圧として２０ｋＶの電圧を用いてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを取得した。
【０１５５】
（実施例６）
ＣｇｔＢ変異体のアクセプター選好性
各全長ＣｇｔＢタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＭａｌＥタンパク質とのＮ−末端融合物として発現させ（表Ｉ）、精製した。次に、３つの精製酵素を、それらのアクセプター選好性を調べるために、合成アクセプターＧａｌＮＡｃα−、ＧａｌＮＡｃβ−、ＧＭ２１−、ｌｙｓｏ−ＧＭ２１−、およびＧＡ２１−ＦＣＨＡＳＥでアッセイした（表ＩＩ）。このデータは、様々なアクセプターに関する各ＣｇｔＢ変異体の活性のスクリーニングを表す。表ＩＩのデータは、相対活性で呈示されており、ＧＭ２−ＦＣＨＡＳＥに関して測定した活性が、ＣＪＬ−１０（ＣｇｔＢＯＨ４３８４（ＦＬ、Ｎ−末端ＭａｌＥ））およびＣＪＬ−２０（ＣｇｔＢ１１１６８（ＦＬ、Ｎ−末端ＭａｌＥ））についての基準として用いられたのに対し、ＧＡ２−ＦＣＨＡＳＥに関する活性は、ＣＪＬ−２９（ＣｇｔＢＯＨ：１０（ＦＬ、Ｎ−末端ＭａｌＥ））についての基準であった。各ＣｇｔＢタンパク質についての基準アクセプターは、対応する株のＬＯＳの構造との構造的類似性に基づいて選ばれた（図１）。
【０１５６】
活性傾向は、ＣｇｔＢＯＨ４３８４（ＦＬ、Ｎ−末端ＭａｌＥ）およびＣｇｔＢ１１１６８（ＦＬ、Ｎ−末端ＭａｌＥ）が、非脂質含有アクセプターＧＭ２−ＦＣＨＡＳＥと比較して、ｌｙｓｏ−ＧＭ２−ＦＣＨＡＳＥアクセプターと最も活性的であることを示した。どちらの単糖アクセプターとの活性も、四糖アクセプターＧＭ２−ＦＣＨＡＳＥとの活性よりも低かった（表ＩＩ）。ＣｇｔＢＯＨ：１０（ＦＬ、Ｎ−末端ＭａｌＥ）の場合、非シアリル化アクセプターＧＡ２−ＦＣＨＡＳＥとのその活性は、どのシアリル化アクセプターまたは単糖アクセプターとの活性よりも有意に高かった（表ＩＩ）。
【０１５７】
【表２】
0005921065.tif 000007
合わせて考えると、これらのデータは、３つのＣｇｔＢタンパク質が異なるアクセプター選好性を有することを示す。特に、違いは、シアリル化および非シアリル化アクセプター間（ＧＭ２−、ｌｙｓｏ−ＧＭ２−対 ＧＭＡ２−ＦＣＨＡＳＥ）で観察された差は、アクセプターのシアリル化が、アクセプター選好性における重要な決定因子であることを示している。これは、ｉｎ ｖｉｖｏの各株の内部コアＬＯＳのシアリル化状態と完全に相関する。ｌｙｓｏ−ＧＭ２−ＦＣＨＡＳＥとのＣｇｔＢＯＨ４３８４（ＦＬ、Ｎ−末端ＭａｌＥ）およびＣｇｔＢ１１１６８（ＦＬ、Ｎ−末端ＭａｌＥ）のより高い活性は、天然ＬＯＳアクセプターの脂質Ａ部分を模倣するアクセプターのスフィンゴシン脂質アグリコンに帰せられる。
【０１５８】
（実施例７）
ＣｇｔＢ酵素改良：カルボキシ末端欠失の構築
Ｅ．ｃｏｌｉにおける未修飾ｃｇｔＢの発現は、ＣｇｔＢタンパク質の目に見える過剰産生をもたらさなかった。タンパク質は、膜と完全に会合していた（ＧｉｌｂｅｒｔＭ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７５：３８９６−３９０６（２０００）；Ｌｉｎｔｏｎ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３７：５０１−１４（２０００））。他の細菌グリコシルトランスフェラーゼにより、Ｃ−末端残基のショートストレッチの除去が、Ｅ．ｃｏｌｉにおける組換え酵素の可溶性の増加をもたらし得ることが示されている（Ｗａｋａｒｃｈｕｋ，Ｗ．Ｗ．ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１１：２９５−３０２（１９９８）；Ｃｈｉｕ，Ｃ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１１：１６３−１７０（２００４））。１０、２０、および３０個のアミノ酸がＣｇｔＢＯＨ４３８４およびＣｇｔＢ１１１６８タンパク質のＣ末端から切断されたが、これらの修飾タンパク質は、親構築物よりも少しも可溶性ではなく、ずっと高いレベルで発現もされなかった（データは示してない）。これらの融合タンパク質がそもそも多少可溶性であったので、切断体は次に、Ｎ−末端ＭａｌＥ−ＣｇｔＢ融合タンパク質に組み込まれた。切断体は、これらの融合タンパク質の可溶性をあまり改善せず、実際、より長い欠失は、活性にとり有害であった（表ＩＩＩ）。
【０１５９】
【表３】
0005921065.tif 000008
ＣｇｔＢＯＨ４３８４およびＣｇｔＢ１１１６８タンパク質双方からの１０および２０個のアミノ酸残基のＣ−末端切断は、予備的精製において十分に精製せず、それ以上追求されなかった。３０個のアミノ酸残基欠失は、ＣｇｔＢＯＨ４３８４およびＣｇｔＢ１１１６８タンパク質双方の活性にとって有害であったが、これらのタンパク質は若干より可溶性なので、精製および特性決定できるかもしれない。Ｎ−末端においてＭａｌＥに融合された全長ＣｇｔＢタンパク質は、Ｎ−末端においてＭａｌＥに融合された対応する切断型ＣｇｔＢタンパク質と比較して、試験されたすべてのアクセプターとより良好な活性を示し、これは、活性において約２倍から約１５倍までの範囲であった（表ＩＩＩ）
ＣｇｔＢＯＨ：１０によって、他の２つの切断があまり活性的ではなかったので、２０個のアミノ酸切断のみが調べられた。この場合、切断後の活性減少は、ＧａｌＮＡｃのα−アノマーに関してのみ見られるが、ベータ−アノマーに関する活性は、実際には若干増大する。「最良の」アクセプターＧＡ２−ＦＣＨＡＳＥに関する活性も、他の酵素／アクセプターの組み合わせについて観察されたように、タンパク質の切断後に減少した。
【０１６０】
（実施例８）
融合順序の反転およびＣｇｔＢ特異的活性に対する影響
以前の例からのデータは、ＣｇｔＢのカルボキシ末端が、アクセプター相互作用にとって重要であり、切断に対して敏感であることを示した。融合の反転を、ＭａｌＥを切断型ＣｇｔＢタンパク質のＣ−末端に融合させることにより評価した。これらの融合物を、以前に記載されたように構築し、精製し、アッセイした。ひとたびこれらの切断型ＣｇｔＢ−ＭａｌＥＣ−末端融合物が生成されると、それらを、他のＣｇｔＢ構築物との並列比較において使用し、どのタンパク質が最も活性的であり、どのアクセプターに対して活性があるかを評価した（表ＩＩＩ）。意外にも、反転された遺伝子順序、すなわち、Ｎ−末端ＭａｌＥ融合物ではなくＣ−末端ＭａｌＥ融合物は、以前に構築されたＣｇｔＢ融合物および切断体よりもずっと活性があるＣｇｔＢタンパク質を産生した。例として、アクセプターとして四糖ＧＭ２−ＦＣＨＡＳＥを用いると、ＣｇｔＢＯＨ４３８４（Δ３０、Ｃ−末端ＭａｌＥ）タンパク質は、ＣｇｔＢＯＨ４３８４（ＦＬ、Ｎ−末端ＭａｌＥ）タンパク質より１１倍もの増大を示す。この改善は、ヒトタンパク質（以下を参照されたい）におけるコア１Ｏ−グリコシル化を産生するためのモデル系である核糖ペプチドアクセプターが、今や効果的に修飾できるかもしれないという点でも重要であった。
【０１６１】
それほど顕著ではないが、ＣｇｔＢ−Ｃ−末端−ＭａｌＥ融合物からの改善された活性の驚くべき傾向は、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ株ＮＣＴＣ１１１６８およびＯＨ：１０についても見られた（表ＩＩＩ）。いくつかの違いが見られ；１つの著しい例外は、ＧａｌＮＡｃのα−アノマーに対するＣｇｔＢ１１１６８（Δ３０、Ｃ−末端ＭａｌＥ）の活性が不変であることである。
【０１６２】
ＣｇｔＢＯＨ４３８４（Δ３０、Ｃ−末端ＭａｌＥ）は、試験したすべてのＣｇｔＢタンパク質の中で最高の特異的活性を有していた（表ＩＩＩ）。従って、その動力学的パラメータを、単糖アクセプターＧａｌＮＡｃα−ＦＣＨＡＳＥおよびＧａｌＮＡｃβ−ＦＣＨＡＳＥを用い、そのドナー糖ＵＤＰ−Ｇａｌについて調べた（表ＩＶ）。
【０１６３】
【表４】
0005921065.tif 000009
Ｎ−末端ＭａｌＥ−ＣｇｔＢを用いて動力学的パラメータを得ようとする試みは、単糖アクセプターの低い溶解度によって妨げられてきており、アクセプター飽和の条件に近づくことは決してできないことを意味する（データは示されない）。２つ単糖アクセプターの溶解度制限のため、アッセイは飽和条件下で実行されず、従って、表ＩＶに報告される値は、実際の動力学的パラメータの推定値である。ＧａｌＮａｃα−ＦＣＨＡＳＥについてＫｍ（ａｐｐ）値は１．６８ｍＭであり、ＧａｌＮＡｃβ−ＦＣＨＡＳＥについての値は３．１８ｍＭである。ＧａｌＮＡｃβ−ＦＣＨＡＳＥについてのＫｍ（ａｐｐ）、Ｖｍａｘ、およびｋｃａｔ値は、ＧａｌＮＡｃα−ＦＣＨＡＳＥについての値より２．１倍高い。しかしながら、特異性定数、ｋｃａｔ／Ｋｍは、これら２つのアクセプターについて非常に類似しており、これは、ＣｇｔＢＯＨ４３８４（Δ３０、Ｃ−末端ＭａｌＥ）が、これら２つのアノマーを強く区別しないことを示し、これにより、このｅｎｙｚｍｅは、コア１型二糖を産生するための非常によい触媒になる。
【０１６４】
（実施例９）
ＩＦＮα２ｂ［Ｔｎ］−ＦＣＨＡＳＥペプチドに関する活性
ＧａｌＮＡｃα−ＦＣＨＡＳＥについて測定された最も高い活性は、ＣｇｔＢＯＨ４３８４（Δ３０、Ｃ−末端ＭａｌＥ）の活性であった（５３１．５ｍＵ／ｍｇ、表ＩＩＩ）。従って、ＣｇｔＢＯＨ４３８４（Δ３０、Ｃ−末端ＭａｌＥ）は、ペプチドおよびタンパク質上でＯ−結合グリカンを作製するツールとして評価された。Ｎ−末端ＭａｌＥＣｇｔＢＯＨ４３８４構成物（全長およびΔ３０）も、比較のため試験した。キャピラリー電気泳動の３０分後のＩＦＮα２ｂ［Ｔｎ］−ＦＣＨＡＳＥのガラクトシル化の分析により、９１．９％の材料がＩＦＮα２ｂ［Ｔ−Ａｇ］−ＦＣＨＡＳＥに変換されており、４．４％の望ましくない副生成物（それぞれ、４．３％および０．１％のＩＦＮα２ｂ［Ｇａｌ−Ｔ−Ａｇ］−ＦＣＨＡＳＥおよびＩＦＮα２ｂ［Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｔ−Ａｇ］−ＦＣＨＡＳＥ）もあったことが明らかになった。これらの望ましくないポリ−ガラクトシル化生成物は、より単純な単糖アクセプターに関してはずと大きい割合で見られ、ＧＭ２−ＦＣＨＡＳＥアクセプターではより小さい割合で見られた。反応条件は、反応液中のドナーの濃度を２ｍＭより低く保持することによってペプチドアクセプターのポリ−ガラクトシル化を最小限にするように最適化した。ポリガラクトシル化のレベルは可変であった：ペプチドアクセプターに関して１０％を超える副生成物が観察されることは決してなかったのに対して、単糖アクセプターでは、３０％を超えるポリガラクトシル化生成物が容易に得られた。
【０１６５】
反応生成物を、キャピラリー電気泳動質量分析法（ＣＥ−ＭＳ；図３Ａ〜Ｂ）により分析した。ＩＦＮα２ｂ［Ｔｎ］−ＦＣＨＡＳＥのＣＥ−ＭＳスペクトル（図３Ａ）は、ｍ／ｚ１３７７．２に１価プロトン化分子イオンを、およびｍ／ｚ ６８９．４に２化プロトン化イオンを含んでいる。ナトリウムおよびカリウム付加物を伴う２価プロトン化イオンが、ｍ／ｚ７００．３および７０８．３においてそれぞれ検出された。加えて、そのカルボキシ−末端プロリル残基を失っている全長ＩＦＮα２ｂ−ＦＣＨＡＳＥおよびＩＦＮα２ｂ−ＦＣＨＡＳＥに対応するイオンも、ｍ／ｚ１１７４．１および１０５９．０においてそれぞれ観察された。ＩＦＮα２ｂ［Ｔ−Ａｇ］−ＦＣＨＡＳＥのＣＥ−ＭＳスペクトルにおける優勢な化学種は、ｍ／ｚ １５３８．９における１価帯電イオン、ｍ／ｚ７７８．７に対応するアンモニウム付加物を伴うｍ／ｚ ７７０．０における２価プロトン化イオンであった（図３Ｂ）。予想されるように、ＩＦＮα２ｂ［Ｔ−Ａｇ］−ＦＣＨＡＳＥの分子量は、ＩＦＮα２ｂ［Ｔｎ］−ＦＣＨＡＳＥの分子量よりも１６２ダルトン高く、従って、ＣｇｔＢＯＨ４３８４（Δ３０、Ｃ−末端ＭａｌＥ）によるペプチドのガラクトシル化が確認される。
【０１６６】
（実施例１０）
タンパク質ＩＦＮα２ｂ［Ｔｎ］に対する活性
ＩＦＮα２ｂタンパク質をｉｎ ｖｉｔｒｏでグリコシル化することが可能である（ＤｅＦｒｅｅｓ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ．１６：８３３−８４３（２００６））。従って、改善されたＣｇｔＢ（ＣＪＬ−１３６）を、このタンパク質上にコア１二糖を作製することについて評価した。ＩＦＮα２ｂのＭＡＬＤＩスペクトル（図４Ａ）およびＩＦＮα２ｂ［Ｔｎ］のＭＡＬＤＩスペクトル（図４Ｂ）は、ｍ／ｚ１９２９３および１９５１２にピークを示しており、これらのピークは、ＩＦＮα２ｂおよび対応するグリコシル化生成物の予想分子量と合致する。ＣｇｔＢＯＨ４３８４（Δ３０、Ｃ−末端ＭａｌＥ）によるＩＦＮα２ｂ［Ｔｎ］のガラクトシル化から生成されたＩＦＮα２ｂ［Ｔ−Ａｇ］のＭＡＬＤＩスペクトル（図４Ｃ）は、１９６６５のｍ／ｚを有する主要な化学種を示しており、これは、図４Ｂにおける主ピーク比較した場合、付加的なヘキソシル残基の存在と合致する。ｍ／ｚ１９６６５における化学種の存在は、ＩＦＮα２ｂ［Ｔｎ］タンパク質がＣＪＬ−１３６によってガラクトシル化され得るという証拠である。非標識基質を使用した場合、検出限界内で、ポリ−ガラクトシル化生成物は産生されなかった。
【０１６７】
（実施例１１）
ＣｇｔＢβ−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ生成物のポリ−ガラクトシル化
いくつかの反応条件の下で、ＣｇｔＢＯＨ４３８４は、第２のＧａｌ残基を、オリゴ糖基質に、例えば、ＧＭ２−誘導体から合成されたＧＭ１ａ−誘導体に付加する。第２のＧａｌの付加の程度は制御が困難であるが、長いインキュベーション時間および大過剰のドナーの存在においてより高くなる傾向がある。ＣｇｔＢＯＨ４３８４は、ＣｇｔＢ１１１６８およびＣｇｔＢＨＳ：１０よりずっと活性なので、第２のＧａｌの付加が、ＣｇｔＢＯＨ４３８４についてより明白であったか、またはＣｇＴＢ１１１６８およびＣｇｔＢＨＳ：１０の場合に本当に存在していなかったかは不明確であった。Ｃ−末端にＭａｌＥを有する切断型ＣｇｔＢ構築物を用いて、６０分間のインキュベーション後に約９０％のＧＭ１ａ（ＣｇｔＢＨＳ：１０のためのＧＡ２）を得るように反応を設定した（表５参照）。反応混合物は、アクセプター（１ｍＭ）の３倍過剰のドナー（３ｍＭ）を含有していた。ＣｇｔＢ１１１６８（Δ３０、Ｃ−末端ＭａｌＥ）およびＣｇｔＢＨＳ：１０（Δ２０、Ｃ−末端ＭａｌＥ）の場合、６０分間のインキュベーション後および一晩のインキュベーション後、ジ−Ｇａｌ生成物の痕跡しかなかった。ＧＭ２およびＧＭ１ａ変換収率が８０％以上になるとすぐに、ジ−Ｇａｌ生成物は、ＣｇｔＢＯＨ４３８４（Δ３０、Ｃ−末端ＭａｌＥ）について明白である。ジ−Ｇａｌ生成物は、長時間にわたるインキュベーションにおいて、約２５％の平坦域に達した。
【０１６８】
【表５】
0005921065.tif 000010
（実施例１２）
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるヒト成長ホルモンのガラクトシル化
ＭａｌＥ−ヒト成長ホルモン（ＭａｌＥ−ｈＧＨ）タンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現させた。ヒトＧａｌＮＡｃＴ２も、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現させ、ｉｎｖｉｔｒｏでＭａｌＥ−ｈＧＨタンパク質をグリコシル化するために用いた。グルコシル化ＭａｌＥ−ｈＧＨタンパク質を濃縮し、５０ｍＭ ＮａＯＡｃ（ｐＨ６．０）＋５０ｍＭＮａＣｌを含有する反応混合物に添加し、１０ｍＭ ＭｎＣｌ２（新たに作製したストックから）、１ｍＭ ＤＴＴ、２．０ｍＭ ＵＤＰ−Ｇａｌおよび６ミリ−単位のＣｇｔＢ１１１６８（Δ３０、Ｃ−末端ＭａｌＥ）を添加し、この反応を室温（２１℃）で２３時間インキュベートした。Ａ２８０データから、存在する融合タンパク質の量は２６ｎｍｏｌｅであると推定された。試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離を用い、続いてｃｏｍａｓｓｉｅ染色およびＴ−Ａｇを認識するピーナッツ凝集素によるウェスタンブロットにより分析した。約１．０μｇの各調製物を、クーマシー染色用ゲル上にロードし、約０．５μｇをＰＮＡ−ブロット用に使用した。４℃で４ヶ月間保持したＭａｌＥ−ｈＧＨの調製物１μｇ（Ａ）も、それらの保存条件下での融合タンパク質の安定性を決定するために、ゲル上にロードした。結果は、図６、レーンＡ〜Ｄに示してある。レーンＢおよびＣは、それぞれ非グリコシル化ＭａｌＥ−ｈＧＨおよび［Ｔｎ］−ＭａｌＥ−ｈＧＨである。（［Ｔｎ］−ＭａｌＥ−ｈＧＨは、ヒトＧａｌＮＡｃＴ２の作用により形成される。）レーンＤは、ＣｇｔＢ１１１６８（Δ３０、Ｃ−末端ＭａｌＥ）反応の生成物である。ＰＮＡブロット後のレーンＤにおける増大した染色は、ＣｇｔＢ１１１６８（Δ３０、Ｃ−末端ＭａｌＥ）タンパク質が、ｉｎｖｉｔｒｏでＭａｌＥ−ｈＧＨタンパク質をガラクトシル化したことを示す。
【０１６９】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎｄ」、および「ｔｈｅ」は、特に文脈により明確に指示されない限り、複数の指示対象を含むことが留意されなければならない。従って、例えば、「１つの核酸」への言及は、複数のそのような核酸を含み、「そのポリペプチド」への言及は、１つまたは複数のポリペプチドおよび当業者に公知のその同等物への言及が含まれ、その他も同様である。
【０１７０】
上記の発明は、理解を明確にするために説明および例を用いてある程度詳細に記載されてきたが、本発明の教示に照らして、添付の特許請求の範囲の趣旨や範囲から逸脱することなく特定の変更および修飾を加えることが可能であることは、当業者であれば容易に理解できよう。
【０１７１】
本明細書において論じられた刊行物は、本出願の出願日以前のそれらの開示についてのみ提供されるものである。本明細書におけるいかなる記載も、先行発明により本発明がそのような刊行物に先行する権利を有さないことの承認として解釈されるべきでない。さらに、提供された公開日は実際の公開の日付と異なることがあり、これは個別に確認する必要があり得る。全ての引用は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１７２】
【化４】
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【０１７３】
【化５】
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【０１７４】
【化６】
0005921065.tif 000013
【０１７５】
【化７】
0005921065.tif 000014
【図１Ａ】
0005921065.tif 000015
【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図２】
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【図５−１】
0005921065.tif 000021
【図５−２】
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【図５−３】
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【図６】
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【配列表】
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