(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類細胞の心臓発生能を決定する方法であって、
ａ）前記細胞における、遺伝子の定量された発現量を収集する、ここで前記遺伝子は、Nkx2.5、Tbx5、MEF2C、GATA4、GATA6、Mesp1、及びFOG1（各遺伝子はその相同体であってもよい）である、工程と、
ｂ）心臓発生能指数（ＣＡＲＰＩ）を決定する、ここで、心臓発生能指数（ＣＡＲＰＩ）は、前記細胞の前記遺伝子の定量された発現量の平均として計算される、工程と、
を含み、
前記遺伝子の発現量が、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡｓ）、機能性ＲＮＡ、又はこれらの組み合わせのＲＮＡ発現量で定量される
、方法。
【請求項２】
前記機能性ＲＮＡが、マイクロＲＮＡｓである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞は、体細胞、生殖細胞、臍帯血細胞、心臓前駆細胞、胚性細胞、及びこれらのあらゆる組み合わせからなる群から選択される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞は、遺伝子組み換えされている、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞は、検出可能なサルコメアタンパク質を有しない、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ＣＡＲＰＩは、心臓発生性処置の前後の前記細胞について評価される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記心臓発生性処置は、前記細胞を、細胞の心臓発生能を向上させることができる少なくとも２つの心臓発生性物質を含む組成物に接触させる工程を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞は、一種類の哺乳類に由来する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞は、哺乳類又は哺乳類群に由来し、該ＣＡＲＰＩは、定量され、別の哺乳類又は哺乳類群由来の細胞のＣＡＲＰＩと比較される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＣＡＲＰＩは、下記式：
【数１】
0005921430.tif 000004
（式中、ｉは選択した遺伝子を表し、ｎは選択した遺伝子の全ての番号を表す）
を用いて、前記２つ以上の遺伝子の発現量の線形平均として計算される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＣＡＲＰＩは、処置の心臓発生能を定量的に評価するために測定される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＣＡＲＰＩは、心機能のパラメータと相関を有し、前記心機能のパラメータが心臓の駆出率である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
処理装置と、該処理装置と組み合されて１つ又は複数の非神経性のネットワークプログラムをコード化するメモリーとを備えるコンピュータ装置であって、
該プログラムは、
ａ）哺乳類細胞における、遺伝子の定量された発現量を収集する、ここで前記遺伝子は、Nkx2.5、Tbx5、MEF2C、GATA4、GATA6、Mesp1、及びFOG1（各遺伝子はその相同体であってもよい）である、工程と、
ｂ）心臓発生能指数（ＣＡＲＰＩ）を決定する、ここで、心臓発生能指数（ＣＡＲＰＩ）は、前記細胞の前記遺伝子の定量された発現量の平均として計算される、工程と、
ｃ）前記ＣＡＲＰＩを表示する工程と、
を含み、
前記遺伝子の発現量が、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡｓ）、機能性ＲＮＡ、又はこれらの組み合わせのＲＮＡ発現量で定量される、
方法を前記処理装置に実行させる、コンピュータ装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２００９年５月２０日出願の国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０４４７５１について優先権の利益を主張する。先の出願の開示は、本出願の開示の一部とみなされる（また、本出願の開示に参考として援用される）。
【０００２】
本発明は、哺乳類細胞の注射による心疾患の治療に関する。特に、哺乳類細胞の心臓発生能を定量的に評価する方法に関し、これにより、修復を必要とする心臓の修復の成功についての予測可能性を良好にする。また、この心臓発生能の組み換え、及び細胞分化を目的とする処置の心臓発生能を定量的に評価する方法、並びに、処理装置、及び処理装置と結合した１つ又は複数の非神経系プログラムをコード化するメモリーを含むコンピュータ装置に関し、ここで、該プログラムは、処理装置に方法を使用させ、該方法は、ＣＡＲＰＩを計算する工程を含む。
【背景技術】
【０００３】
患者管理の進歩にも拘らず、心疾患は、世界中で死亡及び罹患の主要原因となっている。高い修復能を有する組織とは対照的に、心臓組織は、非修復性の損傷に対して脆弱である。心疾患に対処するため、細胞ベースの心血管再生医学が今日、臨床現場において求められている。
【０００４】
近年の幹細胞生物学の発展により、現在の実施形式の範囲が、従来の寛解から治療的な修復にまで広がっている。一般的に、臨床上は、幹細胞を不変状態で送達することを基礎としてきた。第一世代の生物製剤は、未処理のヒト幹細胞であり、容易に用いることができる細胞型とされた。数名の個体について、未処理のヒト幹細胞の送達時に、改善を生ずることが示されてきた。ヒトの心臓への未処理細胞の移植の分野における最新技術は、とりわけ、Abdel-Latif A. et al.による概説'Adult bone marrow-derived cells for cardiac repair: a systematic review and meta-analysis.' Arch Intern Med. (2007) 167:989-997.、及びその引用文献中に示された。
【０００５】
臨床的成果を高めるため、患者に注射する前に未処理のヒト幹細胞を心筋系列に誘導する、第二世代の幹細胞治療が開発された。Behfar et al.による総説'Guided stem cell cardiopoietic: Discovery and translation' J. Mol. and Cell. Cardiology (2008) 45: 523-529.において、心臓形成細胞などの心臓前駆細胞を、心臓再生に用いる考えが議論された。
【０００６】
心臓形成細胞は、特有の表現型を有し、Nkx2.5及びMEF2Cポリペプチドが核移行すること、及び検出可能なサルコメアタンパク質が存在しないことを特徴とする。この心臓形成の状態は、中間の細胞表現型、すなわち、心筋系列になりかけているが、まだ完全には分化していない表現型に相当する。サルコメアタンパク質が検出できないレベルであることが、心臓形成細胞の特有の特徴であり、該特徴により、この細胞と、幹細胞に由来し、且つ、Chunhui Xu（米国特許出願公開第２００５／０１６４３８２号明細書及びLough et al (米国特許出願公開第２００２／００６１８３７号明細書)などの他の出願に記載された、収縮性でありサルコメア含有である心筋様細胞とが区別される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００５／０１６４３８２号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００２／００６１８３７号明細書
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】'Adult bone marrow-derived cells for cardiac repair: a systematic review and meta-analysis.' Arch Intern Med. (2007) 167:989-997.
【非特許文献２】'Guided stem cell cardiopoietic: Discovery and translation' J. Mol. and Cell. Cardiology (2008) 45: 523-529.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
転写因子に占めるタンパク質量の増加は、細胞質又は核のいずれかにおけるその細胞内局在を示すものではないといえる。Nkx2.5及びMEF2Cポリペプチドの核移行は、心筋系列への関係づけの決定に必要である。このことは、Behfar A. et alらにより説明されている(Derivation of a cardiopoietic population from human mesenchymal stem cells yields cardiac progeny, Nature Clinical Practice, 2006, 3: S78-S82)。核移行は、免疫細胞化学又は免疫組織化学により定量的に観察することができるものの、総タンパク質量を観察するウェスタンブロッティング又は蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）などの技術は、ポリぺプチドの細胞内分布を定量的に評価するのに適していない。ポリペプチドの細胞内分布の観察は、米国特許出願公開第２００８／００１９９４４号明細書に記載されるように、定性的であるだけでなく、産業上の視点から時間がかかり、実施者の技術に依存する。従って、臨床成績、すなわち、これら「第一世代」の未処理の幹細胞及び「第二世代」の誘導された幹細胞の心臓発生能は、注射前に予測することは容易ではなかった。
【００１０】
哺乳類細胞の心臓発生能を定量的に評価する方法は、提案段階に留まっていた。
【００１１】
本発明は、哺乳類細胞の心臓発生能を決定する、かかる予測方法をここに提供し、該方法は、その細胞の遺伝子の発現量を定量する関数としての心臓発生能指数（ＣＡＲＰＩ）を定量的に評価する工程を含む。本発明は、哺乳類細胞の心臓発生能の組み換え、及び細胞分化を目的とする処置の心臓発生能の定量的評価も行う。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本願明細書中では、特に断らない限り、以下の括弧で示される用語は、下記のように定義する。
【００１３】
細胞の「心臓発生能」とは、その細胞が、心臓細胞、例えば心筋細胞の発生を達成する能力をいう。
【００１４】
「心臓形成細胞」とは、中間の細胞表現型、すなわち、心筋系列になりかけているが、まだ完全には分化していない表現型に相当する。心臓形成細胞は、Nkx2.5及びMEF2Cの核移行と、サルコメアタンパク質が検出できないレベルであることと、を特徴とする（Behfar et al. 'Derivation of a cardiopoietic population from human mesenchymal stem yields progeny', Nature Clin. Pract., Cardiovasc. Med. (2006) 3: S78-S82）。心臓形成細胞は、増殖能を保持する。心臓形成細胞は、例えば、ヒト間葉系幹細胞(Terzic et al. 米国特許出願公開第２００８／００１９９４４号明細書)、マウス胚性幹細胞(Behfar et al, 'Cardiopoietic programming of embryonic stem cells for tumour-free heart repair' J Exp Med 2007 204: 405-420)、胚様幹細胞、人工多能性幹細胞、臍帯血細胞、心臓幹細胞等を含む幹細胞、又は（それらの生産がヒト胚の破壊とならない限り）あらゆる他の適した細胞源由来のものを使用できる。
【００１５】
「カクテル」又は「心臓発生性カクテル」とは、少なくとも２つの心臓発生性物質を含有する組成物をいう。
【００１６】
「心臓発生性処置」とは、細胞の心臓発生能を向上させる処置をいう。かかる処置の例としては、上記細胞をカクテルに接触させるが挙げられる。かかるカクテルの例としては、成長因子、サイトカイン、ホルモン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも２つの物質が挙げられる。上記少なくとも２つの物質は、BMP-1、BMP-2、BMP-5、BMP-6等の骨形成タンパク質(BMP)；上皮増殖因子(EGF)；エリスロポエチン(EPO)；FGF-1、FGF-4、FGF-5、FGF-12、FGF-13、FGF-15、FGF-20等の線維芽細胞増殖因子(FGF)；顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)；顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)；増殖分化因子9(GDF-9)；肝細胞増殖因子(HGF)；IGF-2等のインスリン様成長因子(IGF)；ミオスタチン(GDF-8)；NT-3, NT-4, NT-1及び神経成長因子(NGF)等のニューロトロフィン；PDGF-β、PDGF-AA、PDGF-BB等の血小板由来増殖因子(PDGF)；トロンボポエチン(TPO)；トランスフォーミング増殖因子α(TGF-α）；TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3等のトランスフォーミング増殖因子β(TGF-β）；VEGF-A、VEGF-C等の血管内皮増殖因子(VEGF)；TNF α；白血病抑制因子(LIF)；インターロイキン６(IL-6)；レチノイン酸；ストロマ細胞由来因子1(CSDF-1)；脳由来神経栄養因子(BDNF)；ペリオスチン；アンジオテンシンII；Flt3リガンド；グリア細胞由来神経栄養因子；ヘパリン；インスリン様増殖因子結合タンパク質３；インスリン様増殖因子結合タンパク質５；インターロイキン３；インターロイキン８；ミッドカイン；プロゲステロン；プトレシン；幹細胞因子；Wnt1；Wnt3a；Wnt5a；カスパーゼ4；ケモカインリガンド１；ケモカインリガンド２；ケモカインリガンド５；ケモカインリガンド７；ケモカインリガンド１１；ケモカインリガンド２０；ハプトグロビン；レクチン；コレステロール−２５−ヒドロキシラーゼ；シンタキシン−８；シンタキシン−１１；セルロプラスミン；補体第一成分；補体第三成分；インテグリンα６；リゾリーマル酸リパーゼ１；β−２ミクログロブリン；ユビキチン；マクロファージ遊走阻止因子；コフィリン；シクロフィリンA；FKBP12；NDPK；プロフィリン１；シスタチンC；カルサイクリン；スタニオカルシン-1；PGE-2；mpCCL2；IDO；iNOS；HLA-G5；M-CSF；アンジオポエチン；PIGF；MCP-1；細胞外マトリックス分子；CCL2 (MCP-1)；CCL3 (MIP-1α ); CCL4 (MIP-1 β); CCL5（ランテス）；CCL7 (MCP-3); CCL20 (MIP-3α ); CCL26（エオタキシン-3）；CX3CL1（フラクタルカイン）；CXCL5 (ENA-78); CXCL11 (i-TAC); CXCL1 (GROα); CXCL2 (GROβ); CXCL8 (IL-8); CCL10 (IP-10);及びそれらの組み合わせからなる群から選択することができる。
【００１７】
「カクテル誘導細胞」又は「心臓分化に誘導された細胞」とは、カクテルに接触させた細胞をいう。
【００１８】
「分化」とは、特殊化していない細胞がより特殊化した細胞になる工程をいう。
【００１９】
「駆出率」とは、心拍の間に排出される血液の画分を意味する。特に限定がない場合、駆出率という用語は、特に左心室のそれ（左心室駆出率又はＬＶＥＦ）をいうものとする。
【００２０】
本願明細書に用いられる、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、特に断りのない限り、複数の態様も含む。従って、例えば、「ａ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ」という場合、１つの細胞も、２つ以上の細胞も含み；「ａｎ  ａｇｅｎｔ」又は「ａ  ｒｅａｇｅｎｔ」という場合、１つの成分又は薬剤も、２つ以上の成分又は薬剤も含み；「ｔｈｅ  ｉｎｖｅｎｔｉｏｎ」又は「ａｎ  ｉｎｖｅｎｔｉｏｎ」という場合、１つ又は複数の本発明の態様を含む。
【００２１】
断りのない限り、本願明細書で用いられるあらゆる技術的及び科学的用語は、本発明の属する分野における当業者に共通して理解されるものと同じ意味を有するものとする。本願明細書に記載される方法及び材料に類似するもの又は相当するものは、本発明を実施するために使用可能であるが、適切な方法及び材料については以下に記載する通りである。本願明細書で言及されるあらゆる文献、特許出願、特許、及び他の文献は、参照して取り込まれる。本願明細書の記載は、定義を含めて、矛盾が生じないように調整し得る。加えて、材料、方法、及び実施例は、例示に過ぎず、限定することを目的としない。
【００２２】
本発明は、哺乳類細胞の心臓発生能、又は処置の心臓発生能を決定する方法を提供し、該方法は、その細胞の遺伝子の発現量を定量する関数としての心臓発生能指数（ＣＡＲＰＩ）を定量的に評価する工程を含む。
【００２３】
好適には、ＣＡＲＰＩは、上記細胞の特定の遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）レベルを定量する関数である。
【００２４】
好適には、少なくとも一つの遺伝子は、Nkx2.5、Tbx5、MEF2C、GATA4、GATA6、Mesp1、FOG1、FOG2、Flk1、これらの哺乳類における相同体、及びこれらの遺伝子の組み合わせからなる群から選択される。細胞は、心臓前駆細胞であってもよい。それらは、体細胞、生殖、臍帯血、心臓前駆、胚、及び／又は遺伝子組み換えされた細胞とすることもできる。
【００２５】
細胞は、一人の個体から採取してもよく、その細胞を心臓発生性処置に供する前後の細胞について、ＣＡＰＲＩを評価してもよい。
【００２６】
別の実施形態では、個体又は個体群の細胞を、別の個体又は個体群と比較して、そのＣＡＰＲＩを評価する。
【００２７】
特に好適な方法では、ＣＡＲＰＩは、ｍＲＮＡレベルでの遺伝子の発現量を変数として定量する、多変数数式の値である。
【００２８】
前記値、好適には、多項式関数、超越関数、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００２９】
本発明が提供する方法の特定の実施形態では、処置の心臓発生能を定量的に評価するために、ＣＡＲＰＩを測定する。
【００３０】
本発明が提供する方法の一つの実施形態によれば、ＣＡＲＰＩを心機能のパラメータと関係づけることができる。
【００３１】
本発明は、処理装置、及び処理装置と結合した１つ又は複数のプログラムをコード化するメモリーを含むコンピュータ装置にも関するものであり、ここで、該１つ又は複数のプログラムは、処理装置に方法を実行させ、該方法は、ＣＡＲＰＩの計算を包含する。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】未処理のヒトＭＳＣ（ｈＭＳＣ）及びカクテルで誘導したｈＭＳＣ（ＣＰ−ｈＭＳＣ）の両方について、遺伝子の発現量のｍＲＮＡレベルでの定量に基づいて計算したＣＡＲＰＩを、任意単位（ＡＵ）でＹ軸に示し、マウスの梗塞心臓における注射前後のＬＶＥＦの変化（ΔＥＦ）を、パーセントでＸ軸に示した図である。黒色記号は、個々のデータを表し：中抜きの記号は平均のデータ（Ａｖｇ）を表す。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００３３】
（実施例１）
骨髄の試料を、虚血性心疾患のために冠動脈バイパス術を受けている患者から収集した。管轄の倫理審査委員会により承認された方法により、患者からインフォームドコンセントを得た。
【００３４】
生の骨髄をプラスチック皿に播種し、１２時間後に１回洗浄し、ＣＤ３４−／ＣＤ４５−／ＣＤ１３３＋マーカーパネルを用いた蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）での分析により確認しながら接着細胞を選択することによって、間葉系幹細胞を得た。細胞を、５％ヒト血小板溶解液添加ＤＭＥＭ(メイヨークリニック血液バンク、ミネソタ州ロチェスター)中、３７℃で、更に培養し、増殖させた。
【００３５】
心臓形成細胞群へと誘導するために、未処理のヒト骨髄由来の骨髄細胞を、TGFβ-1 (2.5 ng/ml)、BMP4 (5 ng/ml)、FGF2 (5 ng/ml)、IGF-1 (50 ng/ml)、アクチビン−Ａ(10 ng/ml)、カルジオトロフィン（1 ng/ml）、α−トロンビン(1 U/ml)、及びカルジオゲノールC (100 nM)からなる心臓発生性カクテルを添加した、血小板溶解液又は血清のいずれかの中で培養した。
【００３６】
本発明は、２以上の遺伝子の発現量をＲＮＡレベルで定量することによって、上記心臓形成細胞群の心臓発生能の定量的評価を可能にする。本発明は、定量的観察の問題、すなわち、転写因子ポリペプチドの細胞内局在の観察に特有の、時間及び実施者の技術への依存の問題を解決する。方法の選択肢の一つとしては、リアルタイム定量逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）である。この方法は、オペレーター非依存的であり、参照標準と比較して定量化した結果を、迅速に（１日以内に）提供する。加えて、免疫染色した試料は、一回ごとの蛍光顕微鏡検査による評価を必要とするところ、９６穴プレートを用いたｑＰＣＲにより、最大４８の異なった試料（又は条件）について二重試験を行うことができる。
【００３７】
ｑＰＣＲ用の適切なマーカーを決めるために、心臓形成細胞からｍＲＮＡを抽出し、免疫蛍光染色により評価した。
【００３８】
参照標準は、心臓発生性カクテル非存在下で培養した同じバッチに由来する細胞とした。
【００３９】
心臓の転写活性において代表的な、表１に挙げる遺伝子について評価した。
【００４０】
アプライトバイオシステムズ７，９００ＨＴ配列検出システム（アプライトバイオシステムズ、フォスターシティ、カリフォルニア）と用いて、ＴａｑＭａｎＰＣＲキットでｑＰＣＲを行った。ＴａｑＭａｎ遺伝子発現反応物を、９６穴プレートでインキュベートし、三重試験を行った。閾値のサイクル（ＣＴ）を、蛍光が一定の閾値を越えたときのサイクル数として定義した。ＴａｑＭａｎのＣＴ値は、２−ΔΔＣＴ法を用いて決定した相対変化倍数に変換し、ハウスキーピング遺伝子の発現、すなわちＧＡＰＤＨ（Ｐ／Ｎ  ４３５，２６６２−０５０６００３）に対して標準化した。
【００４１】
処置した細胞についての結果を、対応する参照標準について得られた結果に対して標準化した。
【００４２】
ＣＡＲＰＩ、すなわち上記細胞の２以上の遺伝子の発現量を定量する関数を、スプレッドシート計算（マイクロソフトＥｘｃｅｌ  ２００７（登録商標）、マイクロソフト社）を用いて、Nkx2.5、Tbx-5、MEF2C、GATA-4、GATA-6、MESP-1及びFOG-1のＲＮＡレベルにおける発現量の線形平均として計算した。下記式を用いた：
【数１】
0005921430.tif 000002
ここで、「ｉ」は選択した遺伝子を表し、「ｎ」は選択した遺伝子の全ての番号を、最小値を２として表す。特に本実施例では、ｎ＝７である。
【００４３】
ｈＭＳＣ由来の心臓形成細胞の心臓発生能を、免疫不全性のヌードマウス（ハーラン、インディアナ州インディアナポリス）で評価した。プロトコルは、管轄の動物実験委員会から承認を得たものである。
【００４４】
心筋梗塞を生じさせた。盲検法に沿って、心筋梗塞の１月後、１２．５μｌの血小板溶解液無添加の生育培地に懸濁させた、全部で６００，０００個の生存する未処理のｈＭＳＣ、又は全部で６００，０００個の生存するｈＭＳＣ由来の心臓形成細胞を、顕微鏡で観察しながら、左心室前壁上の心外膜の５箇所の部位に注射した（注射部位当たり２．５μｌ）。
【００４５】
左心室の機能及び構造を、経胸壁心エコー(Ｓｅｑｕｏｉａ  ５１２；シーメンス、マルバーン、ピーエー  アンド  ヴィジュアルソニック  インク、トロント、カナダ）により連続的に観察した。左心室駆出率（ＬＶＥＦ、％）を、[(ＬＶＶｄ−ＬＶＶｓ)／ＬＶＶｄ]×１００として計算した。ここで、ＬＶＶｄは、左心室拡張末期容量（μｌ）であり、ＬＶＶｓは、左心室収縮末期容量（μｌ）である。
【００４６】
ＬＶＥＦの変化（ΔＥＦ）を、細胞注射の１月後に測定したＬＶＥＦと、細胞注射前に測定したＬＶＥＦとの差として計算した。
【００４７】
図１は、各細胞培養物についてのＣＡＲＰＩを、その各細胞培養物を注射したマウスについての対応するΔＥＦに対して、プロットしたグラフである。未処理のｈＭＳＣ（小さな黒色のダイアモンドで示す）は、細胞注射の１月後に心筋の機能が実質的に向上せず（負のΔＥＦ）、概して低いＣＡＲＰＩを示した。生来の再生能を有し、生来の高いＣＡＲＰＩ値を有する未処理のｈＭＳＣｓのバッチがほとんどないことは、注意に値する。未処理のｈＭＳＣｓの全てのバッチについての平均を、大きな白色の三角で示す。ｈＭＳＣ由来の心臓形成細胞（小さな黒色の四角）は、心筋の機能が堅調に増大し（正のΔＥＦ）、概して高いＣＡＲＰＩを示した。ｈＭＳＣ由来の心臓形成細胞の全てのバッチの平均を、大きな白色の四角で示す。平均は、対応する９５％信頼区間と共に表示する。
【００４８】
このように、発明者らは、梗塞心臓において、注射される細胞のＣＡＲＰＩの高さと、注射後の駆出率変化との間に、正の相関関係があることを示した。このように、ＣＡＲＰＩは、心臓発生能の予測指数である。
【００４９】
【表１】
0005921430.tif 000003
【００５０】
（実施例２）
組換え型のTGFβ-1(2.5 ng/ml)、BMP-4 (5 ng/ml)、アクチビン−Ａ(5 ng/ml)、FGF-2 (10 ng/ml)、α-トロンビン(1 U/ml)、IGF-1 (50 ng/ml)、カルジオトロフィン(1 ng/ml)、及びカルジオゲノールC(100 nM)を組み合わせて用い、これらを含有するカクテルで処理することによって、同様の結果が得られた。
【００５１】
（実施例３）
組換え型のTGFβ-1(2.5 ng/ml)、BMP-4 (5 ng/ml)、アクチビン−Ａ(5 ng/ml)、FGF-2 (10 ng/ml)、α-トロンビン (1 U/ml)、IGF-1 (50 ng/ml)、インターロイキン−６（１００ｎｇ／ｍｌ）及びレチノイン酸（1μM）を組み合わせて用い、これらを含有するカクテルで処理することによって、同様の結果が得られた。
【００５２】
（他の実施形態）
本発明は、その詳細な説明について記載されるが、上記説明は例示を目的としたものであり、添付の請求項の範囲により定められる本発明の範囲を限定するものではない。他の態様、効果、及び変更も、下記の請求項の範囲に含まれる。
【図１】
0005921430.tif 000005