(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸の発酵生産方法であって、以下の工程：
−メチオニンを生産するように改変された組換え微生物を、炭素源、硫黄源、および窒素源を含んでなる適当な培養培地において培養する工程、
−該培養培地から２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸を回収する工程
を含んでなり、
該組換え微生物が、窒素制限条件下で培養される、方法。
【請求項２】
培養培地のＣ／Ｎモル比が、５より大きい、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
培養培地のＣ／Ｎモル比が、１０より大きい、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
培養培地のＣ／Ｎモル比が、２０より大きい、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
Ｃ／Ｎモル比が、２０〜２５の間である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
以下の連続的工程：
−炭素源、硫黄源、および窒素源を含んでなる適当な培養培地において組換え微生物を増殖させる工程、
−前記適当な培養培地において、窒素制限条件下で該組換え微生物を培養する工程、
−該培養培地から２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸を回収する工程
を含んでなる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
微生物が、バイオリアクター系において、以下の２つの連続的工程：
−炭素源、硫黄源、および窒素源を含んでなる適当な培養培地において、１０時間〜２０時間の該微生物の増殖工程、
−適当な培養培地において、窒素制限条件における、１０時間〜２０時間の該微生物の培養工程
により培養される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
微生物が、バイオリアクター系において、以下の２つの連続的工程：
−炭素源、硫黄源、および窒素源を含んでなる適当な培養培地において、１５時間〜２０時間の該微生物の増殖工程、
−適当な培養培地において、窒素制限条件における、１０時間〜１５時間の該微生物の培養工程
により培養される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
組換え微生物が、以下の遺伝子改変：
−以下の遺伝子：ｍｅｔＡ＊、ｍｅｔＨ、ｃｙｓＰＵＷＡＭ、ｃｙｓＪＩＨ、ｇｃｖＴＨＰ、ｍｅｔＦ、ｓｅｒＢ、ｔｈｒＡ＊、ｃｙｓＥ、ｓｅｒＡ、ｓｅｒＣの発現の増加、
−以下の遺伝子：ｍｅｔＪ、ｐｙｋＦ、ｐｙｋＡ、ｐｕｒＵ、ｙｎｃＡ、ｙｂｄＬの発現の減弱
の少なくとも１つを含んでなる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
組換え微生物が、以下の改変：
−遺伝子ｐｎｔＡＢおよび／またはｐｙｃの発現の増加、
−遺伝子ｕｄｈＡの発現の減弱
の少なくとも１つをさらに含んでなる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
発酵性炭素源が、グルコースまたはスクロースである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
培養培地における硫黄源が、硫酸塩、チオ硫酸塩、硫化水素、ジチオン酸塩、亜ジチオン酸塩、亜硫酸塩、または種々の供給源の組合せである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸が、培養培地から抽出により回収される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、必須アミノ酸メチオニンの類似体である２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸（ＨＭＢＡ）を発酵により生産するための方法に関する。発酵は、微生物が、培養培地により提供される炭素、硫黄および窒素を用いて、通常化学合成される目的産物を生合成する生物学的プロセスである。
【背景技術】
【０００２】
「ヒドロキシメチオニン」と一般的に呼ばれている２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸（ＨＭＢＡ）は、必須アミノ酸メチオニンの類似体であり、重要な飼料添加物である。市販のトウモロコシ・大豆ベースの飼料中のメチオニンが第１の制限アミノ酸であると考えられることから、家禽飼料においてＨＭＢＡが一般的に用いられている。
【０００３】
メチオニンヒドロキシ類似体は、メチオニン分子のα−炭素上にアミノ基ではなくヒドロキシル基を有する。ＨＭＢＡは下式：
【化１】
0005847840.tif 000002
を有する。
【０００４】
アミノ酸と比べて、ＨＭＢＡは生物によりタンパク質合成に直接使用されないが、それはＨＭＢＡが同化作用によってタンパク質合成に使用されるアミノ酸へと変換される必要があるためである。ＨＭＢＡは純粋な形態では使用されず、様々な形態、すなわち、
・ＨＭＢＡのカルシウム塩およびアンモニウム塩の混合物（米国特許第２，７４５，７４５号および同２，９３８，０５３第）、
・酸性水溶液（米国特許第４，３５３，９２４号）、
・米国特許第３，１７５，０００号に記載されているプロセスによって得られる、ＨＭＢＡのカルシウム塩
で使用される。
【０００５】
化学的経路によるＨＭＢＡの調製は長い間知られている。NOVUS International（ＰＣＴ／ＵＳ９８／０１５９５）、MONSANTO Company（ＥＰ０１４２４８８）、BRITISH Telecomm（ＥＰ０１４３０００）またはRhone Poulenc Animal Nutrition S.A.（米国特許第６，１８０，３５９号）が所有するいくつかの特許には、２段階プロセスによる２−ヒドロキシ−４−メチルチオ−ヒドロキシブチロニトリル（ＨＭＢＮ）のＨＢＭＡへの加水分解が記載されている。これら総ての技術は、だいたい、同じ原料と重要な中間体とに依存している。
【０００６】
第１段階は、２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチロニトリル（ＨＭＢＮ）を塩酸または硫酸などの強無機酸と接触させることにある。次の段階で、水での希釈後に、より高い温度で加水分解が完了する。次に、水との混和性があまりない、ケトンなどの有機溶媒でＨＭＢＡが抽出され、その後、エレクトロポレーションにより溶媒は除去される。
【０００７】
２−ヒドロキシ−４−メチルチオ−ブチロニトリル（ＨＭＢＮ）というアミドは、メチル−メルカプト−プロピオンアルデヒド（ＭＭＰ）とヒドロシアン酸（ＨＣＮ）またはシアン化ナトリウム（ＮａＣＮ）との反応によって合成される。
【０００８】
この数年の間に、酵素または生物学的材料に関連して、新たな方法が分かってきた。例えば、Aventis Animal Nutrition S. A.は、２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチロニトリル中間体の酵素加水分解によるＨＭＢＡ製造方法を記載し、特許を取得した。その発明は、ニトリラーゼ活性を有する固定生物学的材料とＨＭＢＮ分子を接触させた後のその生物変換に基づいている（米国特許第６，１８０，３５９号）。Novus社によって、２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）−ブタンニトリルからの２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）−ブタンアミドまたは２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）−ブタン酸または塩への酵素変換を用いて同様の方法が記載された（ＷＯ１９９８０３２８７２）。
【０００９】
微生物によるメチオニンの生産を向上するための取り組みにおいて、本発明者らは驚くべきことに、ヒドロキシメチオニンも、微生物において発酵プロセスにより単純炭素源から生産され得ることを見出した。これは、メチオニンヒドロキシ類似体の完全に生物学的な生産の初めての報告である。
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、ヒドロキシメチオニンの発酵生産方法であって、
−メチオニンを生産するように改変された組換え微生物を、炭素源、硫黄源、および窒素源を含んでなる適当な培養培地において培養する工程、
−該培養培地からヒドロキシメチオニンを回収する工程
を含んでなる方法に関する。
【００１１】
発酵生産は微生物の増殖に基づいており、その場合、微生物によって、増殖および目的化合物の生合成の両方に単純炭素源、通常、糖が使用される。
【発明の具体的説明】
【００１２】
本発明は、ヒドロキシメチオニンの生産方法であって、メチオニン生産用に最適化された組換え微生物が、炭素源、硫黄源、および窒素源からヒドロキシメチオニンを生産する方法に関する。
【００１３】
・産物
「ヒドロキシメチオニン」または「メチオニンヒドロキシ類似体」または「ＭＨＡ」または「２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）酪酸」または「２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）ブタン酸」または「ＨＭＴＢＡ」または「ＨＭＢＡ」または「ＤＬ−２−ヒドロキシ−４−（メチルメルカプト）ブタン酸」という用語は、発酵産物を表して互換的に用いられる。
【００１４】
・微生物
本発明は、ヒドロキシメチオニンを生産するための、メチオニン生産用に最適化された微生物の使用に関する。
【００１５】
「メチオニン生産用の微生物」または「メチオニン生産微生物」または「メチオニンを生産するように改変された微生物」または「メチオニン生産用に最適化された微生物」という用語は、内因的に必要なメチオニンしか生産しない非生産微生物よりも高レベルのメチオニンを生産する微生物を表し、その際、改変微生物は微生物代謝に必要な量より多くのメチオニンを生産する。メチオニン生産用に最適化された微生物は当技術分野で周知であり、特に、特許出願ＷＯ２００５／１１１２０２、ＷＯ２００７／０７７０４１およびＷＯ２００９／０４３８０３において開示されている。
【００１６】
「組換え微生物」または「改変微生物」という用語は、遺伝子の付加または抑制、あるいは一部の遺伝子の発現調節の改変によって、遺伝的に改変された微生物を表す。
【００１７】
本発明によれば、組換え微生物により生産されるメチオニンの量、特に、メチオニン収率（炭素源ｇ／ｍｏｌ当たりに生産されるメチオニンｇ／ｍｏｌの割合）は、対応する未改変微生物と比べて改変微生物で高い。通常の改変としては、形質転換および組換えによる遺伝子の欠失、遺伝子置換、ならびに遺伝子の過剰発現、または異種遺伝子の発現のためのベクターの導入が含まれる。
【００１８】
メチオニン生産用に最適化されたこれらの微生物は、同時に、ヒドロキシメチオニンを生産することが可能である。本発明者らは、それらの微生物によってメチオニンがより多く生産されるならば、ヒドロキシメチオニンもより多く生産されることを見出した。
【００１９】
本発明で用いられる微生物は、細菌、酵母または真菌である。好適には、微生物は、腸内細菌科(Enterobacteriaceae)、バチルス科(Bacillaceae)、ストレプトミセス科(Streptomycetaceae)およびコリネバクテリウム科(Corynebacteriaceae)の中から選択される。より好適には、微生物は、エシェリキア属(Escherichia)、クレブシェラ属(Klebsiella)、パンテア属(Pantoea)、サルモネラ菌属(Salmonella)、またはコリネバクテリウム属(Corynebacterium)のものである。いっそうより好適には、微生物は、大腸菌（Escherichia coli）またはコリネバクテリウム・グルタミクム(Corynebacterium glutamicum)種のいずれかである。
【００２０】
・発酵
「発酵プロセス」、「培養」または「発酵」という用語は、単純炭素源、硫黄源および窒素源を含有する適当な増殖培地における細菌の増殖を表して互換的に用いられる。
【００２１】
本発明の発酵プロセスでは、炭素源は、
・バイオマス生産：とりわけ、培地の炭素源を変換することによる微生物の増殖、および
・ヒドロキシメチオニンおよび／またはメチオニン生産：バイオマスによる同じ炭素源からヒドロキシメチオニンおよび／またはメチオニンへの変換
に同時に用いられる。
【００２２】
２つの工程は同時に起こり、増殖する微生物による炭素源の変換により培地においてヒドロキシメチオニンおよび／またはメチオニンの生産が行われる。これは、微生物がそのような変換を可能にする代謝経路を有するためである。
【００２３】
発酵は、好気性、微好気性または嫌気性条件下で行うことができる古典的プロセスである。
【００２４】
発酵は一般に、少なくとも１つの単純炭素源を、必要であれば代謝産物の生産のための補助基質とともに含有する、使用する微生物に適合された適当な培養培地の入った発酵槽で行われる。
【００２５】
本発明において、発酵はフェドバッチ式で行われる。これは、発酵中に追加の増殖培地が加えられるがバッチ終了まで培養物が取り出されない（サンプリングおよびＨＰＬＣ／ＧＣＭＳ分析に用いる少量は除く）発酵形式を意味する。このプロセスは２つの主要な工程を含み、第１の工程は適当なバッチ無機培地およびフェドバッチ無機培地中での一連の前培養である。続いて、適当な最少バッチ培地を充填した発酵槽を使用し、所望の生産に応じた異なるフェドバッチ培地を用いて培養を進める。
【００２６】
当業者ならば、本発明による微生物に対する培養条件および培養培地組成を定義することができる。特に、細菌は、２０℃〜５５℃の間、好適には、２５℃〜４０℃の間、より具体的には、Ｃ．グルタミクムでは約３０℃の温度で、大腸菌では約３７℃の温度で発酵される。
【００２７】
大腸菌に対する既知の培養培地の例として、その培養培地は、Ｍ９培地(Anderson, 1946, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 32:120-128)、Ｍ６３培地(Miller, 1992; A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)またはSchaefer et al. (1999, Anal. Biochem. 270: 88-96)により定義されているものなどの培地と同一または類似の組成のものであり得る。
【００２８】
Ｃ．グルタミクムに対する既知の培養培地の例として、その培養培地は、ＢＭＣＧ培地(Liebl et al., 1989, Appl. Microbiol. Biotechnol. 32: 205-210)またはRiedel et al. (2001, J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 3: 573-583)により記載されているものなどの培地と同一または類似の組成のものであり得る。
【００２９】
本発明による「炭素源」という用語は、微生物の正常な増殖を支援するために当業者が使用可能な任意の炭素源を表し、六炭糖（グルコース、ガラクトースまたはラクトースなど）；五炭糖；単糖類；二糖類（スクロース（糖蜜）、セロビオースまたはマルトースなど）；オリゴ糖（デンプンまたはその誘導体など）；ヘミセルロース；グリセロールおよびそれらの組合せであり得る。特に好ましい炭素源はグルコースである。別の好ましい炭素源はスクロースである。
【００３０】
本発明の特定の態様では、炭素源は再生可能な供給原料に由来する。再生可能な供給原料は、短時間で、その目的生成物への変換を可能とするのに十分な量で再生され得る、特定の工業プロセスに必要とされる原料と定義される。処理を受けるまたは受けない植物バイオマスは興味深い再生可能な炭素源である。
【００３１】
炭素源は発酵性である、つまり、炭素源は微生物による増殖に使用され得る。
【００３２】
本発明による「硫黄源」という用語は、硫酸塩、チオ硫酸塩、硫化水素、ジチオン酸塩、亜ジチオン酸塩、亜硫酸塩、メチルメルカプタン、硫化ジメチルおよび他のメチルキャップを有する硫化物または種々の供給源の組合せを意味する。より好適には、培養培地中の硫黄源は硫酸塩またはチオ硫酸塩またはそれらの混合物である。
【００３３】
培養は、微生物が無機基質、特に、リン酸塩および／またはカリウムについて制限されるかまたは飢餓状態にされるような条件で行われ得る。生物が無機基質の制限を受けるとは、微生物の増殖が供給された無機化学物質の量に支配され、それでもなお弱い増殖が認められる条件を定義する。微生物が無機基質について飢餓状態にされるとは、無機基質が存在しないために微生物の増殖が完全に停止する条件を定義する。
【００３４】
「窒素源」という用語は、アンモニウム塩またはアンモニアガスのいずれかに相当する。窒素は無機源（例えば、（ＮＨ４）２ＳＯ４）または有機源（例えば、尿素またはグルタミン酸塩）から得られる。本発明において、培養における窒素源は（ＮＨ４）２ＨＰＯ４、（ＮＨ４）２Ｓ２Ｏ３およびＮＨ４ＯＨである。
【００３５】
本発明の特定の側面では、組換え微生物は窒素制限条件下で培養される（cultivated）。実際に、本発明者らは、窒素制限条件によってヒドロキシメチオニン生産が高まることを見出した。
【００３６】
「窒素制限条件」という用語は、無機源（例えば、（ＮＨ４）２ＳＯ４）または有機源（例えば、尿素またはグルタミン酸塩）から供給され得る窒素を制限された濃度で含む培養培地を意味する。「窒素飢餓条件」という用語は、窒素源を全く含まない培地を意味する。
【００３７】
「窒素制限」とは、利用可能な窒素源が、細菌の増殖速度および／またはバイオマス収量が制限されるような量で存在する、つまり、窒素源が、最大増殖速度および／またはバイオマス収量を支援するのに必要な量に満たない量で存在することを意味する。当業者ならば、ヒドロキシメチオニンの生産を誘導するのに適した、適当な窒素制限濃度を決定することができる。実際の「窒素制限量」は、特定の培地や、使用する微生物株によって変動し得る。例えば、微生物は、窒素要求が高い、メチオニンおよびヒドロキシメチオニンを生産する組換え細菌である。培地に適用される窒素の量は、これらの特徴によって異なる。その量は、種々の濃度の窒素源を受けた培地中で細菌を用いる日常的な実験によって決定し得る。さらに、当業者ならば、制限条件を決定するために、発酵中に培地中の利用可能な窒素の濃度を測定し、そのようにして、残留窒素濃度を測定するための、イオンクロマトグラフィーなどの方法を知っている。
【００３８】
通常条件での非改変大腸菌株の増殖ではＣ／Ｎ比（モル／モル）約４．２が必要であることは知られている(Energetics and kinetics in biotechnology. J.A. Roels. Elsevier Science & Technology (May 1983))。
【００３９】
本発明の特定の態様では、発酵は一般的な条件で行われ、その条件では、培養に使用される種々の培地によって、Ｃ／Ｎモル比は約５より大きくなり、好ましくは、約１０より大きくなり、より好ましくは、約２０より大きくなり、最も好ましくは、約２０〜約２５の間となる（この場合、Ｃ／Ｎ比は炭水化物および窒素源それぞれの炭素元素の窒素元素に対するモル比として測定される）。
【００４０】
本発明の好ましい態様では、生産プロセスは、同じ培養用バッチ培地における同じ微生物を用いる３つの連続的工程：
・発酵性炭素源、硫黄源および窒素源を含んでなる適当な培養培地において組換え微生物を増殖させる工程、
・前記適当な培養培地において、窒素制限条件下で該組換え微生物を培養する工程、
・該培養培地からヒドロキシメチオニンを回収する工程
を含む。
【００４１】
発酵は、微生物性能および培養中に至るフェドバッチ培地の組成に応じて培養状態が発展する総てのプロセス中、同じ初期バッチ培地において行われる。
【００４２】
「増殖」工程は、メチオニンの生産が開始する、制限のない最少培地条件において行われる。ヒドロキシメチオニンの生産が高められる「培養」工程は、窒素制限条件下で行われる。
【００４３】
窒素制限は、微生物がその分裂および生産のために培養培地中に存在するほぼ総ての窒素を消費したときに起こる。微生物が増殖し、メチオニンを生産するほど、その微生物による窒素の使用は多くなる。このため、窒素制限条件は、微生物の特徴、より正確に言えば、その増殖および生産速度に依存する。当業者ならば、組換え微生物の特定の要求を計算し、予測することができる。
【００４４】
本発明の特定の態様では、組換え微生物は、バイオリアクター系において以下の２つの連続的工程：
ａ．発酵性炭素源、硫黄源および窒素を含んでなる適当な培養培地において、約１０時間〜２０時間の、好ましくは、約１５時間〜２０時間の該微生物の増殖工程、
ｂ．前記適当な培養培地において窒素制限条件における、約１０時間〜２０時間の、好ましくは、約１０時間〜１５時間の該微生物の培養工程
により培養される。
【００４５】
これまでに記載した通り、本発明によるプロセスに使用される組換え微生物は、炭素源をメチオニンおよびヒドロキシメチオニンへと変換するために遺伝的に改変されている。
【００４６】
・遺伝子改変
本発明の記載において、遺伝子およびタンパク質は大腸菌における対応する遺伝子の名称を用いて識別される。しかしながら、特に断りのない限り、これらの名称の使用は本発明に従うより一般的な意味を有し、他の生物、より詳しくは微生物における対応する遺伝子およびタンパク質の総てを包含する。
【００４７】
ＰＦＡＭ(アラインメントのタンパク質ファミリーデータベースおよび隠れマルコフモデル(protein families database of alignments and hidden Markov models); http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/)は、タンパク質配列アラインメントを多数集めたものである。各ＰＦＡＭにより、多重アラインメントを視覚化し、タンパク質ドメインを調べ、生物間の分布を評価し、他のデータベースへのアクセスを確保し、既知のタンパク質構造を視覚化することができる。
【００４８】
３８の系統発生系を示す、６６の配列決定されたゲノムからのタンパク質配列を比較することにより、ＣＯＧ（タンパク質のオーソロガス群のクラスター(clusters of orthologous groups of proteins)；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/）が得られる。各ＣＯＧは、少なくとも３つの系から定義されるので、前に保存されたドメインを同定することができる。
【００４９】
相同配列およびそれらの相同性％を同定する手段は当業者によく知られており、特にＢＬＡＳＴプログラムが挙げられ、このプログラムは、ウェブサイトhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/から、このウェブサイトに示されているデフォルトパラメーターとともに利用することができる。次に、得られた配列を、例えばプログラムＣＬＵＳＴＡＬＷ(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/)またはＭＵＬＴＡＬＩＮ(http://multalin.toulouse.intra.fr/multalin/)を、これらのウェブサイトに示されているデフォルトパラメーターとともに用いて活用する（例えば、アラインする）ことができる。
【００５０】
当業者ならば、ＧｅｎＢａｎｋに示されている既知の遺伝子に関する参照番号を用いて他の生物、細菌株、酵母、真菌、哺乳類、植物などにおける等価な遺伝子を決定することができる。この常法は、有利には、他の微生物由来の遺伝子との配列アラインメントを行い、縮重プローブを設計して、他の生物における対応する遺伝子をクローニングすることにより決定することができるコンセンサス配列を使用して行われる。これらの分子生物学の常法は当業者によく知られており、例えば、Sambrook et al. (1989 Molecular Cloning: a Laboratory Manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York.)に記載されている。
【００５１】
本発明による「活性の減弱」という用語は、酵素または遺伝子に対して使用することができ、いずれの場合においても、対応する遺伝子の発現の部分的または完全な抑制を表し、その場合、該遺伝子は「減弱された」といわれる。この発現抑制は、該遺伝子の発現の阻害、該遺伝子発現に必要なプロモーター領域の総てまたは一部の欠失、該遺伝子のコード領域の欠失、あるいはより弱い天然または合成プロモーターによるその野生型プロモーターの置換のいずれであってもよい。好適には、遺伝子の減弱は本質的に該遺伝子の完全欠失であり、該遺伝子は本発明による株の同定、単離および精製を容易にする選択マーカー遺伝子で置き換えることができる。遺伝子は、好適には、相同組換え技術により不活性化される(Datsenko, K.A. & Wanner, B.L. (2000) “One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products”. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 6640-6645)。
【００５２】
「増強された活性」という用語は、非改変微生物の酵素活性よりも優れている酵素活性を表す。当業者ならば、該酵素の酵素活性を測定する方法を知っている。
【００５３】
酵素活性を増強するために、当業者ならば、種々の手段を知っている：該タンパク質の触媒部位の改変、該タンパク質の安定性の増加、そのメッセンジャーＲＮＡの安定性の増加、該タンパク質をコードする遺伝子の発現の増加。
【００５４】
タンパク質を安定させる要素は当技術分野で公知であり（例えば、ＧＳＴタグ、Amersham Biosciences）、メッセンジャーＲＮＡを安定させる要素(Carrier and Keasling (1998) Biotechnol. Prog. 15, 58-64)も同様である。
【００５５】
「遺伝子の増加された発現」、「遺伝子の増強された発現」または「遺伝子の過剰発現」という用語は、本明細書において互換的に用いられ、同様の意味を有する。
【００５６】
遺伝子の発現を増加させるために、当業者ならば、種々の技術を知っている：微生物における該遺伝子のコピー数の増加、該遺伝子の高レベル発現を誘導するプロモーターの使用、該遺伝子の直接的または間接的転写レプレッサーの活性および／または発現の減弱。
【００５７】
該遺伝子は染色体上または染色体外にコードされる。該遺伝子が染色体上に位置する場合、当技術分野の専門家には公知の組換え法（遺伝子置換を含む）によって該遺伝子の数コピーを染色体上に導入することができる。該遺伝子が染色体外に位置する場合、該遺伝子は、それらの複製起点と、それによる細胞内でのそれらのコピー数が異なる種々のタイプのプラスミドによって担持される。これらのプラスミドは微生物中に１〜５コピー、または約２０コピー、または最大５００コピーで存在し、プラスミドの性質によって異なる：厳格な複製を行う低コピー数プラスミド（ｐＳＣ１０１、ＲＫ２）、低コピー数プラスミド（ｐＡＣＹＣ、ｐＲＳＦ１０１０）または高コピー数プラスミド（ｐＳＫ  ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ）。
【００５８】
本発明の特定の態様では、遺伝子は異なる強度のプロモーターを用いて発現させる。本発明の一態様では、プロモーターは誘導性である。これらのプロモーターは同種または異種である。当業者ならば、どのプロモーターが最も便宜なプロモーターであるかを知っており、例えば、プロモーターＰｔｒｃ、Ｐｔａｃ、ＰｌａｃまたはλプロモーターｃＩが広く用いられている。
【００５９】
・メチオニン生合成経路の最適化：
微生物においてメチオニン生産に関与する遺伝子は当技術分野で周知であり、メチオニン特異的生合成経路に関与する遺伝子、ならびに前駆体供給経路に関与する遺伝子およびメチオニン消費経路に関与する遺伝子を含んでなる。
【００６０】
メチオニンの効率的生産には、メチオニン特異的経路およびいくつかの前駆体供給経路の最適化が求められる。メチオニン生産株は特許出願ＷＯ２００５／１１１２０２、ＷＯ２００７／０７７０４１およびＷＯ２００９／０４３８０３に記載されている。これらの出願は引用することにより本願の一部とされる。
【００６１】
特許出願ＷＯ２００５／１１１２０２には、その阻害剤ＳＡＭおよびメチオニンに対するフィードバック感受性が低減されたホモセリンスクシニルトランスフェラーゼ対立遺伝子（ｍｅｔＡ＊と呼称する）を過剰発現するメチオニン生産株が記載されている。この出願には、これらの対立遺伝子と、メチオニンレギュロンのダウンレギュレーションに関与するメチオニンレプレッサーＭｅｔＪの欠失との組合せも記載されている。加えて、その出願には、アスパルトキナーゼ／ホモセリンデヒドロゲナーゼ（ｔｈｒＡ遺伝子によりコードされる）の過剰発現を伴う２つの改変の組合せも記載されている。
【００６２】
メチオニンの生産を向上させるために、微生物は以下を示す場合がある：
−以下からなる群の中から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現の増加：
・ＷＯ２００７／０７７０４１およびＷＯ２００９／０４３８０３に記載されている、原形質周辺の硫酸結合タンパク質をコードするｃｙｓＰ、
・ＷＯ２００７／０７７０４１およびＷＯ２００９／０４３８０３に記載されている、硫酸ＡＢＣ輸送体の構成要素をコードするｃｙｓＵ、
・ＷＯ２００７／０７７０４１およびＷＯ２００９／０４３８０３に記載されている、膜結合型硫酸輸送タンパク質をコードするｃｙｓＷ、
・ＷＯ２００７／０７７０４１およびＷＯ２００９／０４３８０３に記載されている、硫酸透過酵素をコードするｃｙｓＡ、
・ＷＯ２００７／０７７０４１およびＷＯ２００９／０４３８０３に記載されている、Ｏ−アセチルセリンスルフヒドララーゼ(an O-acetyl serine sulfhydralase)をコードするｃｙｓＭ、
・ＷＯ２００７／０７７０４１およびＷＯ２００９／０４３８０３に記載されている、亜硫酸レダクターゼのαサブユニットおよびβサブユニットそれぞれをコードするｃｙｓＩおよびｃｙｓＪ。ｃｙｓＩおよびｃｙｓＪは一緒に過剰発現されることが好ましい、
・ＷＯ２００７／０７７０４１およびＷＯ２００９／０４３８０３に記載されている、アデニリル硫酸レダクターゼをコードするｃｙｓＨ、
・ＷＯ２００７／０７７０４１に記載されている、セリンアシルトランスフェラーゼをコードするｃｙｓＥ、
・ＷＯ２００７／０７７０４１およびＷＯ２００９／０４３８０３に記載されている、ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼをコードするｓｅｒＡ、
・ＷＯ２００７／０７７０４１およびＷＯ２００９／０４３８０３に記載されている、ホスホセリンホスファターゼをコードするｓｅｒＢ、
・ＷＯ２００７／０７７０４１およびＷＯ２００９／０４３８０３に記載されている、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼをコードするｓｅｒＣ、
・ＷＯ２００５／１１１２０２に記載されている、Ｓ−アデノシルメチオニンおよび／またはメチオニンに対するフィードバック感受性が低減されたホモセリンスクシニルトランスフェラーゼをコードするｍｅｔＡ対立遺伝子（ｍｅｔＡ＊）、
・ＷＯ２００９／０４３８０３およびＷＯ２００５／１１１２０２に記載されている、トレオニンに対するフィードバック阻害が低減されたアスパルトキナーゼ／ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードするｔｈｒＡまたはｔｈｒＡ対立遺伝子（ｔｈｒＡ＊）、
−あるいは以下の遺伝子の少なくとも１つの発現の阻害：
・ＷＯ２００７／０７７０４１およびＷＯ２００９／０４３８０３に記載されている、ピルビン酸キナーゼをコードするｐｙｋＡ、
・ＷＯ２００７／０７７０４１およびＷＯ２００９／０４３８０３に記載されている、ピルビン酸キナーゼをコードするｐｙｋＦ、
・ＷＯ２００７／０７７０４１およびＷＯ２００９／０４３８０３に記載されている、ホルミルテトラヒドロ葉酸デホルミラーゼをコードするｐｕｒＵ、
・ＷＯ２０１０／０２０６８１に記載されている、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼをコードするｙｎｃＡ、
・ＷＯ２００５／１１１２０２に記載されている、メチオニン生合成経路のレプレッサーをコードするｍｅｔＪ、
・アミノトランスフェラーゼをコードするｙｂｄＬ
−あるいはメチオニン生産の向上をもたらすＣ１代謝の増加。
【００６３】
本発明によれば、「Ｃ１代謝の増加」は、ＭｅｔＦ、ＧｃｖＴＨＰ、Ｌｐｄ、ＧｌｙＡ、ＭｅｔＥまたはＭｅｔＨの中から選択される、Ｃ１代謝に関与する少なくとも１つの酵素の活性の増加に関するものである。酵素活性を増加させるためには、これらの異なる酵素の対応する遺伝子を過剰発現させてもよいし、または活性が向上した酵素を発現するようにそれらの核酸配列を改変してもよいし、あるいは、フィードバック調節に対するそれらの感受性を低減してもよい。
【００６４】
本発明の好ましい態様では、一炭素代謝は、メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼＭｅｔＦの活性および／またはグリシン開裂複合体ＧｃｖＴＨＰの活性および／またはセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼＧｌｙＡの活性を増強することによって増加される。
【００６５】
本発明の特定の態様では、ＭｅｔＦの活性は、遺伝子ｍｅｔＦを過剰発現させることによって、かつ／またはその翻訳を最適化することによって増強される。
【００６６】
本発明の特定の態様では、ｍｅｔＦ遺伝子の過剰発現は、Ｐｔｒｃファミリープロモーターに属する強いプロモーターの制御下で、または出願ＰＣＴ／ＦＲ２００９／０５２５２０に記載されている温度誘導プロモーターＰＲのような、誘導プロモーターの制御下でその遺伝子を発現させることによって達成される。
【００６７】
本発明の別の態様によれば、タンパク質ＭｅｔＦの翻訳の最適化は、ＲＮＡ安定剤を使用することによって達成される。遺伝子の過剰発現のための他の手段は、当技術分野の専門家には公知であり、ｍｅｔＦ遺伝子の過剰発現のために使用することができる。
【００６８】
本発明の特定の態様では、遺伝子は誘導プロモーターの制御下にあってよい。特許出願ＰＣＴ／ＦＲ２００９／０５２５２０には、トレオニンに対するフィードバック阻害が低減されたｔｈｒＡ対立遺伝子と、ｃｙｓＥを誘導プロモーターの制御下で発現するメチオニン生産株が記載されている。この出願は引用することにより本願の一部とされる。
【００６９】
本発明の好ましい態様では、ｔｈｒＡ遺伝子または対立遺伝子は温度誘導プロモーターの制御下にある。最も好ましい態様では、使用される温度誘導プロモーターはＰＲプロモーターファミリーに属する。
【００７０】
本発明の別の側面では、ピルビン酸カルボキシラーゼの活性は増強される。ピルビン酸カルボキシラーゼの活性の増加は、対応する遺伝子を過剰発現させるか、または活性が向上した酵素を発現するようにこの遺伝子の核酸配列を改変することによって得られる。本発明の別の態様では、ｐｙｃ遺伝子は、組換えにより一コピーまたは数コピーで染色体上に導入されるか、あるいは改変微生物中に少なくとも一コピーで存在するプラスミドによって担持される。ｐｙｃ遺伝子は、インゲン根粒菌(Rhizobium etli)、枯草菌(Bacillus subtilis)、蛍光菌(Pseudomonas fluorescens)、乳酸連鎖球菌(Lactococcus lactis)またはコリネバクテリウム属の種に由来する。
【００７１】
メチオニン生産の向上をもたらす他の遺伝子改変は、特許出願ＥＰ１０３０６１６４．４およびＵＳ６１／４０６２４９に記載されている、ｐｎｔＡＢの発現の増加および／またはｕｄｈＡの減弱である。
【００７２】
本発明の特定の態様では、過剰発現される遺伝子は、染色体上のその天然の位置にあるか、または天然でない位置に組み込まれる。最適なメチオニン生産を得るには、数コピーの遺伝子が必要となる場合があり、これらの複数のコピーは特定の遺伝子座に組み込まれ、その改変はメチオニン生産に悪影響を及ぼさない。
【００７３】
細胞の代謝を妨害せずに、遺伝子を組み込み得る遺伝子座の例は下記の通りである。
【００７４】
【表１】
0005847840.tif 000003
0005847840.tif 000004
0005847840.tif 000005
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【００７５】
本発明はまた、上記方法によって得られるような、生物学的に生産されたヒドロキシメチオニンにも関する。
【００７６】
本発明はまた、生物学的に生産されたヒドロキシメチオニンを含んでなる動物栄養用組成物、および生物学的に生産されたヒドロキシメチオニンを含んでなる化粧用組成物にも関する。
【００７７】
・ヒドロキシメチオニンの回収
「培養培地からヒドロキシメチオニンを回収すること」という操作は、ヒドロキシメチオニンを回収し精製するという操作を表す。
【００７８】
本発明の特定の態様では、ヒドロキシメチオニンは抽出により発酵培養液（培養培地）から回収される。
【００７９】
この回収は発酵培養液の液液抽出によって得られるであろう。好ましくは、この抽出に用いられる溶媒は実質的に水不混和性である。好適な溶媒は、アセトン、メチルエチルケトン、メチルアミルケトン、メチルイソアミルケトン、メチルイソプロピルケトン、メチルイソブチルケトン、エチルブチルケトン、ジイソブチルケトンなどのケトン；イソプロピルエーテル、テトラヒドロフランおよびジメトキシエタンなどのエーテル、２−プロパノールなどの第二級アルコール、ｎ−ブチルアルデヒドなどのアルデヒド、ならびに酢酸エチル、酢酸ｎ−ブチル、酢酸ｎ−プロピル(n-proyl acetate)および酢酸イソプロピルなどのエステルの中から選択される。好ましい溶媒は、ケトン、エーテルおよび第二級アルコールの中から選択される。
【００８０】
本発明の別の態様では、抽出は液液抽出と固固抽出の組合せであってよい。
【００８１】
抽出から回収されたヒドロキシメチオニンは、その後、蒸留、好ましくは、蒸気蒸留により、または蒸発により精製される。
【００８２】
発酵産物の精製中、所望により、０〜１００％、好適には、少なくとも９０％、より好適には、９５％、いっそうより好適には、少なくとも９９％のバイオマスは維持され得る。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】発酵に用いられる３つのフェドバッチ溶液を用いた株１の培養物のアンモニウム残留濃度。
【実施例】
【００８４】
実施例Ｉ：実施例ＩＩで試験するメチオニンおよびヒドロキシメチオニンの生産株の構築
１．プロトコール
いくつかのプロトコールを用いてメチオニンおよびヒドロキシメチオニンの生産株を構築したが、これらを下記の実施例に記載する。
【００８５】
プロトコール１：相同組換えによる染色体改変および組換え体の選択(Datsenko, K.A. & Wanner, B.L. (2000)
特定の染色体遺伝子座における対立遺伝子置換または遺伝子破壊は、Datsenko. & Wanner (2000)により記載されているように相同組換えによって行った。Ｆｌｐ認識部位が隣接した、クロラムフェニコール（Ｃｍ）耐性ｃａｔ遺伝子、カナマイシン（Ｋｍ）耐性ｋａｎ遺伝子またはゲンタマイシン（Ｇｔ）耐性ｇｍ遺伝子を、ＰＣＲにより、鋳型としてそれぞれｐＫＤ３またはｐＫＤ４またはｐ３４Ｓ−Ｇｍ(Dennis et Zyltra, AEM july 1998, p 2710-2715)プラスミドを用いることで増幅した。得られたＰＣＲ産物を用いて、λＲｅｄ（γ、β、ｅｘｏ）リコンビナーゼを発現するプラスミドｐＫＤ４６を担持するレシピエント大腸菌株を形質転換した。次に、抗生物質耐性形質転換体を選択し、突然変異遺伝子座の染色体構造を、適当なプライマーを用いたＰＣＲ解析により確認した。
【００８６】
プロトコール２：ファージＰ１の形質導入
染色体改変をＰ１形質導入により、所与の大腸菌レシピエント株に移入した。このプロトコールは、（ｉ）耐性関連の染色体改変を含むドナー株のファージ溶解液の調製と、（ｉｉ）このファージ溶解液によるレシピエント株の感染の２工程から構成される。
【００８７】
ファージ溶解液の調製
・１０ｍｌのＬＢ＋Ｋｍ  ５０μｇ／ｍｌ＋グルコース０．２％＋ＣａＣｌ２  ５ｍＭ（構築物の耐性カセットに対応する抗生物質を含有する）中に、目的の染色体改変を有するＭＧ１６５５株の一晩培養物１００μｌを植菌する。
・振盪しながら３７℃で３０分間インキュベートする。
・ドナーＭＧ１６５５株で調製したＰ１ファージ溶解液１００μｌ（約１×１０９ファージ／ｍｌ）を添加する。
・細胞が完全に溶解するまで３７℃で３時間振盪する。
・２００μｌのクロロホルムを加え、ボルテックスにかける。
・４５００ｇで１０分間遠心分離して細胞残屑を除去する。
・上清を滅菌試験管に移す。
・溶解液を４℃で保存する。
【００８８】
形質導入
・ＬＢ培地中で培養した大腸菌レシピエント株の一晩培養物５ｍｌを１５００ｇで１０分間遠心分離する。
・２．５ｍｌのＭｇＳＯ４  １０ｍＭ、ＣａＣｌ２  ５ｍＭに細胞ペレットを懸濁させる。
・１００μｌの細胞に、染色体に改変を有するＭＧ１６５５株のＰ１ファージ溶解液１００μｌ（供試試験管）を感染させ、対照試験管として、Ｐ１ファージ溶解液を含まない細胞１００μｌと、細胞を含まないＰ１ファージ溶解液１００μｌとを感染させる。
・振盪せずに３０℃で３０分間インキュベートする。
・各試験管に１００μｌの１Ｍクエン酸ナトリウムを加え、ボルテックスにかける。
・１ｍＬのＬＢを加える。
・振盪しながら３７℃で１時間インキュベートする。
・７０００ｒｐｍで３分間遠心分離する。
・ＬＢ＋Ｋｍ  ５０μｇ／ｍｌ（または耐性カセットに対応する抗生物質）に播種する。
・３７℃で一晩インキュベートする。
【００８９】
【表２】
0005847840.tif 000015
【００９０】
２．株１の構築
インゲン根粒菌のピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子を過剰発現させるために、ｐＪＢ１３７−ＰｇａｐＡ−ｐｙｃＲｅプラスミドを構築した。このプラスミドは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＳＫ(Alting-Mees et al, Nucleic Acids Res. 17 (22), 9494 (1989)およびｐＪＢ１３７プラスミド(Blatny et al., Appl. Environ. Microbiol. 63: 370-379, 1997)から誘導される。
【００９１】
ＰｇａｐＡ−ｐｙｃＲｅインサートを構築するために、２つのプラスミドを構築した；ｐＳＫ−ＰｇａｐＡおよびｐＳＫ−ＰｇａｐＡ−ｐｙｃＲｅ。
【００９２】
まず、ｇａｐＡプロモーターおよびそのＲＢＳ配列を、プライマーＯｍｅ  ００５３−ｇａｐＡ  Ｆ（配列番号１）およびＯｍｅ  ００５４−ｇａｐＡ  Ｒ（配列番号２）を用い、ＰＣＲにより、大腸菌ＭＧ１６５５ゲノムＤＮＡから増幅した。得られたＰＣＲ産物をＨｉｎｄＩＩＩにより消化し、プラスミドｐＳＫのＨｉｎｄＩＩＩ部位間にクローニングした。得られたプラスミドを、ＤＮＡ配列決定法により確認し、ｐＳＫ−ＰｇａｐＡと呼称した。
【００９３】
次に、ｐｙｃＲｅ遺伝子を、プライマーＯｍｅ  ００５７−ＰｙｃＲ（配列番号３）およびＯｍｅ０５８−ＰｙｃＦ（配列番号４）を用い、インゲン根粒菌ＣＦＮ  ４２ゲノムＤＮＡから増幅した。得られたＰＣＲ産物を、ＳｍａＩおよびＮｄｅＩ制限酵素により消化し、ｐＳＫ−ＰｇａｐＡプラスミドのＳｍａＩ部位とＮｄｅＩ部位の間にクローニングした。得られたプラスミドを、ＤＮＡ配列決定法により確認し、ｐＳＫ−ＰｇａｐＡ−ｐｙｃＲｅと呼称した。
【００９４】
最後に、ｐＳＫ−ＰｇａｐＡ−ｐｙｃＲｅを、ＳｍａＩおよびＰｓｉＩ制限酵素により消化し、得られたＰｇａｐＡ−ｐｙｃＲｅ消化断片を、ｐＪＢ１３７プラスミドのＳｍａＩ部位間にクローニングした。得られたプラスミドを、ＤＮＡ配列決定法により確認し、ｐＪＢ１３７−ＰｇａｐＡ−ｐｙｃＲｅと呼称した。
【００９５】
Ｏｍｅ  ００５３−ｇａｐＡ  Ｆ（配列番号１）
【化２】
0005847840.tif 000016
この配列において
・下線を施した大文字の配列は、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＰｍｅＩ制限部位および余分な塩基である。
・大文字の配列は、ｇａｐＡプロモーター配列（１８６０６４０〜１８６０６６１、ウェブサイトhttp://ecogene.org/上に参照配列）と相同である。
【００９６】
Ｏｍｅ  ００５４−ｇａｐＡ  Ｒ  （配列番号２）
【化３】
0005847840.tif 000017
この配列において
・下線を施した大文字の配列は、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＡｇｅＩ、ＡｆｌＩＩＩおよびＮｄｅＩ制限部位および余分な塩基である。
・大文字の配列は、ｇａｐＡプロモーター配列（１８６０７７２〜１８６０７９１、ウェブサイトhttp://ecogene.org/上に参照配列）と相同である。
【００９７】
Ｏｍｅ  ００５７−ＰｙｃＲ  （配列番号３）
【化４】
0005847840.tif 000018
この配列において
・下線を施した大文字の配列は、ＳｍａＩ制限部位および余分な塩基である。
【００９８】
・大文字の配列は、インゲン根粒菌ピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｙｃＲｅ）遺伝子（４２４０３６８〜４２４０３８８、ウェブサイトhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/上に参照配列）と相同である。
【００９９】
Ｏｍｅ  ００５８−ＰｙｃＦ（配列番号４）
【化５】
0005847840.tif 000019
この配列において
・下線を施した大文字の配列は、ＳｎａＢＩ、ＮｄｅＩ制限部位および余分な塩基である。
・大文字の配列は、ｐｙｃＲｅ遺伝子のＧＴＧ開始コドンがＡＴＧで置き換えられていることを除いて、インゲン根粒菌ピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｙｃＲｅ）遺伝子（４２３６８８９〜４２３６９０８、ウェブサイトhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/上に参照配列）と相同である。
【０１００】
ｐＪＢ１３７−ＰｇａｐＡ−ｐｙｃＲｅをエレクトロポレーションによって、ＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  Ｐｔｒｃ０７−ｓｅｒＢ ΔｍｅｔＪ ΔｐｙｋＦ ΔｐｙｋＡ ΔｐｕｒＵ ΔｙｎｃＡ ΔｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔｕｘａＣＡ ：：ＴＴ０７−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔｗｃａＭ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔｔｒｅＢＣ：：ＴＴ０２−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣ株に導入した。この株は特許出願ＥＰ１０３０６１６４．４およびＵＳ６１／４０６２４９に記載されている。ｐＪＢ１３７−ＰｇａｐＡ−ｐｙｃＲｅの存在を確認し、選択したＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  Ｐｔｒｃ０７−ｓｅｒＢ ΔｍｅｔＪ ΔｐｙｋＦ ΔｐｙｋＡ ΔｐｕｒＵ ΔｙｎｃＡ ΔｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔｕｘａＣＡ ：：ＴＴ０７−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔｗｃａＭ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ＤｔｒｅＢＣ：：ＴＴ０２−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣ  ｐＪＢ１３７−ＰｇａｐＡ−ｐｙｃＲｅ株を株１と呼称した（表１）。
【０１０１】
３．株２の構築
メチオニンおよびヒドロキシメチオニンの生産株２（表１）は特許出願ＥＰ１０３０６１６４．４およびＵＳ６１／４０６２４９に記載されており、これは引用することにより本願の一部とされる。
【０１０２】
４．株３の構築
４．１．ＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  ｐＫＤ４６  ΔｙｂｄＬ：：Ｋｍの構築
ＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  ｐＫＤ４６株のｙｂｄＬ遺伝子を欠失させるために、プロトコール１を用いたが、プラスミドｐＫＤ４由来のカナマイシン耐性カセットの増幅には、プライマーＯｍｅ  ０５８９−ＤｙｂｄＬＦ（配列番号５）およびＯｍｅ  ０５９０−ＤｙｂｄＬＲ（配列番号６）を用いた。
【０１０３】
Ｏｍｅ  ０５８９−ＤｙｂｄＬＦ（配列番号５）
【化６】
0005847840.tif 000020
この配列において
・大文字の配列は、ｙｂｄＬ遺伝子の下流配列（６３３７９１〜６３３８７０、ウェブサイトhttp://ecogene.org/上に参照配列）と相同である。
・下線を施した大文字の配列は、ｐＫＤ４プラスミドのプライマー部位１（Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645）に相当する。
【０１０４】
Ｏｍｅ  ０５９０−ＤｙｂｄＬＲ（配列番号６）
【化７】
0005847840.tif 000021
この配列において
・大文字の配列は、ｙｂｄＬ遺伝子の上流配列（６３２７９７〜６３２８７４、ウェブサイトhttp://ecogene.org/上に参照配列）と相同である。
・下線を施した大文字の配列は、プラスミドｐＫＤ４のプライマー部位２(Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645)に相当する
【０１０５】
カナマイシン耐性組換え体を選択した。耐性カセットの挿入を、プライマーＯｍｅ  ０５９１−ｙｂｄＬＲ（配列番号７）およびＯｍｅ  ０５９２−ｙｂｄＬＦ（配列番号８）を用いたＰＣＲと、ＤＮＡ配列決定法により確認した。確認済みの選択株をＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１ ΔｙｂｄＬ：：Ｋｍ  ｐＫＤ４６と呼称した。
【０１０６】
Ｏｍｅ  ０５９１−ｙｂｄＬＲ（配列番号７）
ｙｂｄＭ遺伝子の上流配列（６３４０５４〜６３４０３５、ウェブサイトhttp://ecogene.org/上に参照配列）と相同な
【化８】
0005847840.tif 000022
Ｏｍｅ  ０５９２−ｙｂｄＬＦ（配列番号８）
ｙｂｄＨ遺伝子の下流配列（６３２６６３〜６３２６８３、ウェブサイトhttp://ecogene.org/上に参照配列）と相同な
【化９】
0005847840.tif 000023
【０１０７】
４．２．ｙｂｄＬの形質導入
次に、ΔｙｂｄＬ：：Ｋｍ欠失を、上に第４．１．章で記載したＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  ｐＫＤ４６  ΔｙｂｄＬ：：Ｋｍ株のＰ１ファージ溶解液（プロトコール２）を用いることによって、特許出願ＥＰ１０３０６１６４．４およびＵＳ６１／４０６２４９に記載されているＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  Ｐｔｒｃ０７−ｓｅｒＢ ΔｍｅｔＪ ΔｐｙｋＦ ΔｐｙｋＡ ΔｐｕｒＵ ΔｙｎｃＡ ΔｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔｕｘａＣＡ：：ＴＴ０７−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔｗｃａＭ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔｔｒｅＢＣ：：ＴＴ０２−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣに形質導入した。
【０１０８】
カナマイシン耐性形質導入体を選択し、ΔｙｂｄＬ：：Ｋｍ染色体改変の存在を、Ｏｍｅ  ０５９１−ｙｂｄＬＲ（配列番号７）およびＯｍｅ  ０５９２−ｙｂｄＬＦ（配列番号８）を用いたＰＣＲにより確認した。得られた株は以下の遺伝子型ＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  Ｐｔｒｃ０７−ｓｅｒＢ ΔｍｅｔＪ ΔｐｙｋＦ ΔｐｙｋＡ ΔｐｕｒＵ ΔｙｎｃＡ ΔｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｕｘａＣＡ：：ＴＴ０７−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔｗｃａＭ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ＤｔｒｅＢＣ：：ＴＴ０２−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣ ＤｙｂｄＬ：：Ｋｍを有する。
【０１０９】
特許出願ＥＰ１０３０６１６４．４およびＵＳ６１／４０６２４９に記載されているｐＣＬ１９２０−ＰｇａｐＡ−ｐｙｃＲｅ−ＴＴ０７をエレクトロポレーションによって前記株に導入した。ｐＣＬ１９２０−ＰｇａｐＡ−ｐｙｃＲｅ−ＴＴ０７の存在を確認し、得られたＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  Ｐｔｒｃ０７−ｓｅｒＢ ΔｍｅｔＪ ΔｐｙｋＦ ΔｐｙｋＡ ΔｐｕｒＵ ΔｙｎｃＡ ΔｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔｕｘａＣＡ：：ＴＴ０７−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ΔｗｃａＭ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１ ＤｔｒｅＢＣ：：ＴＴ０２−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣ  ＤｙｂｄＬ：：Ｋｍ  ｐＣＬ１９２０−ＰｇａｐＡ−ｐｙｃＲｅ−ＴＴ０７株を株３と呼称した（表１）。
【０１１０】
実施例ＩＩ：窒素制限下でのフェドバッチ法を用いた発酵によるヒドロキシメチオニンの生産
続いて、フラスコ内で十分な量の目的代謝産物を生産した株を、フェドバッチ法を用い、２．５Ｌ発酵槽(Pierre Guerin)において生産条件下で試験した。使用した異なる培地の組成を表０２〜０５に示す。
【０１１１】
簡潔には、２．５ｇ．Ｌ−１グルコースを添加したＬＢ培地１０ｍＬで増殖させた２４時間培養物を用いて、最少培地（Ｂ１ａ）に２４時間前培養物を植菌した。これらのインキュベーションは、５０ｍＬの最少培地（Ｂ１ａ）の入った５００ｍＬバッフル付フラスコで、回転式振盪培養機（２００ＲＰＭ）に入れて行った。１回目の前培養は３０℃の温度で行い、２回目の前培養は３４℃の温度で行った。
【０１１２】
３回目の前培養工程はバイオリアクター(Sixfors)で行い、バイオリアクターには２００ｍＬの最少培地（Ｂ１ｂ）を充填し、３ｍＬ濃縮前培養物をバイオマス濃度１．２ｇ．Ｌ−１に植菌した。前培養温度は３４℃で一定に保ち、ｐＨは１０％ＮＨ４ＯＨ溶液を用いて６．８の値に自動調整した。溶存酸素濃度は、空気供給および／または撹拌により大気分圧飽和の３０％の値に連続的に調整した。バッチ培地のグルコース枯渇後、フェドバッチを初期流速０．７ｍＬ．ｈ−１で開始し、増殖速度０．１３ｈ−１で２４時間、指数関数的に増加させ、最終細胞濃度約１８ｇ．Ｌ−１を得た。
【０１１３】
【表３】
0005847840.tif 000024
【０１１４】
【表４】
0005847840.tif 000025
【０１１５】
【表５】
0005847840.tif 000026
0005847840.tif 000027
【０１１６】
【表６】
0005847840.tif 000028
【０１１７】
必要な場合には、異なる培地中に、スペクチノマイシンおよびカナマイシンを終濃度５０ｍｇ．Ｌ−１で加え、クロラムフェニコールを３０ｍｇ．Ｌ−１で、カルベニシリンを１００ｍｇ．Ｌ−１で、ゲンタマイシンを１０ｍｇ．Ｌ−１で加えた。
【０１１８】
続いて、２．５Ｌ発酵槽(Pierre Guerin)に６００ｍＬの最少培地（Ｂ２）を充填し、５５〜７０ｍＬの間の範囲の前培養物量をバイオマス濃度２．１ｇ．Ｌ−１に植菌した。
【０１１９】
培養温度は３７℃で一定に保ち、ｐＨはＮＨ４ＯＨ溶液の自動添加（ＮＨ４ＯＨ  １０％を９時間、その後、培養終了まで２８％）により作業値（６．８）に維持した。バッチ段階中、初期撹拌速度は２００ＲＰＭに設定し、フェドバッチ段階中は１０００ＲＰＭまで速めた。バッチ段階中、初期気流速度は４０ＮＬ．ｈ−１に設定し、フェドバッチ段階開始時に１００ＮＬ．ｈ−１まで速めた。溶存酸素濃度は撹拌回数を増やすことにより２０〜４０％の間の値、好適には、３０％飽和に維持した。
【０１２０】
細胞塊が５ｇ．Ｌ−１に近い濃度に達したら、フェドバッチを初期流速５ｍＬ．ｈ−１で開始した。供給溶液（実験に応じてＦ２、Ｆ３またはＦ４）は、流速が上昇し２６時間後には２４ｍＬ．ｈ−１に達するＳ字状プロフィールで注入した。正確な供給条件は下式：
【数１】
0005847840.tif 000029
（式中、Ｑ（ｔ）は供給流速（ｍＬ．ｈ−１）であり、バッチ容量６００ｍＬの場合、ｐ１＝１．８０、ｐ２＝２２．４０、ｐ３＝０．２７０、ｐ４＝６．５である）
により算出した。
【０１２１】
２６時間のフェドバッチ後、供給溶液ポンプを止め、グルコース枯渇後に培養を停止した。
【０１２２】
細胞外アミノ酸を、ＯＰＡ／Ｆｍｏｃ誘導体化後にＨＰＬＣにより定量し、他の関連代謝産物を、屈折率検出によるＨＰＬＣ（有機酸およびグルコース）およびシリル化後のＧＣ−ＭＳを用いて分析した。
【０１２３】
ヒドロキシメチオニン生産を高めるために、本発明者らは窒素制限下でフェドバッチ発酵を行った。培養は、上昇するアンモニウム濃度を有する、Ｆ２、Ｆ３およびＦ４と呼称した異なるフェドバッチ培地（表５の組成を参照のこと）を用い、上記のように行った。
【０１２４】
Ｆ２培地の場合、窒素制限は培養時間１５時間前後で起こるが、一方、Ｆ３培地の場合、制限は培養時間１９時間前後で起こる。Ｆ４フェドバッチ溶液の場合、細胞は窒素制限状態にはならなかった。
【０１２５】
Ｆ２培地およびＦ３培地の場合、下の図１に示すイオンクロマトグラフィー測定により確認された通り、最終残留アンモニウム濃度は０に近かった。
【０１２６】
表６に示す結果は、メチオニンおよびヒドロキシメチオニンを生産するように遺伝的に改変された３つの組換え株により生産されたヒドロキシメチオニンのレベルを示している（表１の遺伝子型を参照のこと）。
【０１２７】
【表７】
0005847840.tif 000030
【０１２８】
分かるように、培養中、窒素制限が早期に起こるほど、ヒドロキシメチオニン生産がより多く増加する。フェドバッチ培地Ｆ２で培養される株１および株３によって生産されるヒドロキシメチオニンは１０ｍＭより多いが、Ｆ４では１ｍＭに過ぎない。
【０１２９】
参照文献
0005847840.tif 000031
【図１】
0005847840.tif 000032
【配列表】
0005847840000001.app