(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるＷＮＴタンパク質の活性を示すペプチドを有効成分として含む皮膚状態（ｓｋｉｎ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）改善用の組成物であって、
前記皮膚状態の改善は、しわの改善、皮膚弾力の改善、皮膚老化の防止、皮膚保湿の改善、傷跡の除去又は皮膚の再生である皮膚状態改善用の組成物。
【請求項２】
前記ペプチドのＮ末端は、アセチル基、フルオレニルメトキシカルボニル基、ホルミル基、パルミトイル基、ミリスチル基、ステアリル基及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）から構成された群より選択される保護基が結合されていることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ペプチドは、ヒトＷＮＴタンパク質から由来することを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記ペプチドは、繊維芽細胞又は角質細胞の成長促進能を有することを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＷＮＴ系列由来の新規なペプチド及びこれの用途に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
毛包は哺乳動物の皮膚の独特の器官であって、始原表皮の下部が成長してより深い皮膚層に伸びた器官である。毛包の基部には毛乳頭又は毛乳頭細胞として知られている細胞のプラグが存在し（非特許文献１）、乳頭は毛包の正常な循環（非特許文献２）及び毛幹の成長に必須である。毛幹は、ケラチンフィラメントとフィラメント凝集タンパク質で充填された固く密着した上皮細胞で製造されたスレッド形状の構造である。
【０００３】
ヒトの毛は周期的に成長期、退行期、休止期を繰り返して、毛が抜けて再度生成される過程を経る。毛週期の調節はホルモンの調節や多くの成長因子などの調節を通じてなされる。一方、酷いストレスや栄養欠乏などによっても早期退行期を経た休止期導入による酷い脱毛症が誘発されることもある（非特許文献３）。男性型ハゲにおいて、頭皮の前面及び上部の毛包はアンドロゲンに対して感受性である。したがって、男性型ハゲの場合、毛包の破壊よりは毛包の小型化に該当するが、その原因としては、男性ホルモンであるアンドロゲンの過度な分泌によって５α還元酵素が活性化されてテストステロン（ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ）がジヒドロテストステロン（ｄｉｈｙｄｒｏｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ，  ＤＨＴ）に変形され、このように生成されたジヒドロテストステロンは毛髪が伸びる期間を短縮させ、毛包を小型化させて、太くて強い成毛の数を減少させることで脱毛を誘発する。また、脱毛女性の２０％は、たびたび頭皮上部の髪が細くなることを特徴とする、彼女らの一生でいくつかの種類の脱毛を経験するものと推定される。年をとるにつれて脱毛が拡散する。例えば、瘢痕性脱毛症、やけど又は圧迫傷害に係る傷跡形成が顕著な脱毛を起こすことがある。原因に関わらず、脱毛は、現代社会の女性進出が多くなり、男性も外見に気を使うようになることで、最終的に自尊心と自負心の喪失と共に、顕著な精神的、社会的及び性的影響力を行使する結果をもたらし得る。このような脱毛現象を治療するために、今までは医薬品として様々な物質などが使用されて来ているが、あまりにも高価であり、様々な副作用が誘発されている。また、このような医薬品は持続的な使用を必要とし、使用を中断したときには再度脱毛が誘発される短所がある。また、効能に対する個人の差が大きく、副作用も個人別に差があるという短所がある。
【０００４】
その他化粧品として用いられている原料は、安価であるという長所があるが、植物抽出物由来の成分から構成されているため、実際にその効能は大きくないという短所がある。
【０００５】
したがって、より効果的で且つコスト面でより経済的な新しい有効成分への要求が、当業界に浮かび上がっている。
【０００６】
今まで知られている２つの利用可能な薬物（ミノキシジル及びフィナステリド）は追加の脱毛を遅延させることはできるが、実際に新しい毛包の再生を誘導する効果はなかった。また、多くの頭髪化粧品のうち植物抽出物などを用いた脱毛防止製品がたくさん発売されているが、特に、クララ、唐辛子、当薬、桑白皮、桑の葉、人参、カンゾウ、シャクヤク、地黄、ウイキョウ、サンシュユ、ニンニクなどの抽出物を含有する製品、キサンチン及び成長ホルモンを含有する組成物を添加してジヒドロテストステロンの過剰による細胞代謝の抑制を改善すると共に、成長ホルモンの成長促進の効果を用いることで、脱毛防止及び毛髪再生を通じた毛髪成長促進の効果を示す製品、ミネラル及びビタミン類、緑茶、ローズマリー、ヨモギ、カンゾウ抽出液を含有して頭皮と毛髪に対する栄養供給を通じて脱毛予防及び毛髪成長促進の効果を示す製品、そしてビタミンＢ、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ニコチン酸、パントテン酸、ビオチン及び葉酸などの物質と植物抽出物を混合して体内の５α還元酵素を抑制し、男性ホルモンの代謝過程でジヒドロテストステロンが形成されないようにし、毛髪の新陳代謝作用を助けて男性型脱毛の改善を助ける製品が開発されたが、新生毛の生成まで影響を及ぼす製品はなかった。一方、日本の東京慈恵会医科大学健康医学センターの研究グループ臨床チームによって糖尿などに効能を示すことが明らかになったコロソリン酸（ｃｏｒｏｓｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）を用いた製品が開発され、体内の５α還元酵素を抑制して毛髪成長に優れた効能を示す製品が開発された。
【０００７】
毛髪の成長及び退化の過程には非常に多くの要因が互いに関連しているが、本研究者らは毛根の生成において最も重要な毛髪の角質細胞の増殖を促進し、毛髪への分化を誘導するための研究、及び毛髪周囲に栄養分を供給し、血管内皮増殖因子の活性を促進させる一連の成長因子を活用した研究を行った。
【０００８】
特に、毛周期をコントロールする様々な成長因子のうちヒト由来ＷＮＴは、細胞からシグナルを伝達して毛髪に影響を与えるが、このようなＷＮＴのシグナル伝達経路は、分泌したＷＮＴとこれらの受容体であるフリズルド（ｆｒｉｚｚｌｅｄ）タンパク質間の相互作用によって活性化され、このとき、ＬＤＬ受容体関連タンパク質であるＬＲＰ５及びＬＲＰ６が補助受容体として作用する。ＷＮＴのシグナル伝達の下流影響はディシブルド（ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ）タンパク質の活性化を含んで、Ａｋｔを活性化させた後、Ａｘｉｎ−β−カテニン−ＧＳＫ３β−複合体として動員させる（非特許文献４）。その後、ＧＳＫ３βがリン酸化及び不活性化されて、β−カテニンのリン酸化及び分解が抑制される。蓄積されたβ−カテニンは核に転移して、リンパ系エンハンサー因子−Ｔ細胞因子（ＬＥＦ−ＴＣＦ）族の転写因子と相互作用して標的遺伝子の転写を誘導する。このように発現されたタンパク質は毛髪の成長と分化に重要に作用し、母細胞が新しく生成できるようにする。また、男性ホルモンによるジヒドロテストステロンの機能を低下させることで、脱毛を防止する機能を有している。
【０００９】
本明細書の全体にかけて多数の論文及び特許文献が参照されてその引用が表示されている。引用された論文及び特許文献の開示内容はその全体が本明細書に参照により組み込まれ、本発明の属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｓｔｅｎｎ  ａｎｄ  Ｐａｕｓ，  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｒｅｖ．，  ８１：４４９（２００２）
【非特許文献２】Ｏｌｉｖｅｒ，  Ｅｍｂｒｙｏｌ．  Ｅｘｐ．  Ｍｏｒｐｈ．  １５：３３１（１９６６）
【非特許文献３】Ａｒｃｋ，  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，  １６２（３）：  ８０３（２００３）
【非特許文献４】Ｆｕｋｕｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７６：１７４７９−１７４８３（２００１）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明者らは、成長因子のうちＷＮＴと同一の機能又は類似する機能を維持しながらも、天然のＷＮＴタンパク質より活性、皮膚透過度及び安定性に優れた物質を開発すべく努力した結果、天然のＷＮＴタンパク質のアミノ酸配列に基づいて上述した特性を示す多数のＷＮＴ系列ペプチドを合成し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
したがって、本発明の目的は、配列表の配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４に記載のアミノ酸配列から構成された群より選択される１種のアミノ酸配列からなるＷＮＴタンパク質の活性を示すペプチドを提供することにある。
【００１３】
本発明の別の目的は、上記ペプチドを有効成分として含む発毛促進及び毛髪生成改善用の組成物を提供することにある。
【００１４】
本発明のまた別の目的は、上記ペプチドを有効成分として含む脱毛防止改善用の組成物を提供することにある。
【００１５】
本発明の別の目的は、上記ペプチドを有効成分として含む皮膚状態（ｓｋｉｎ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）改善用の組成物を提供することにある。
【００１６】
本発明の別の目的は、上記ペプチドを有効成分として含むＷＮＴ関連シグナル伝達不全に関連する疾患の改善又は治療用の組成物を提供することにある。
【００１７】
本発明のまた別の目的は、上記ペプチドを有効成分として含むＷＮＴの拮抗剤であるＤＫＫ−１タンパク質に関連する疾患の治療用の組成物を提供することにある。
【００１８】
本発明の別の目的及び利点は、下記の発明の詳細な説明、請求の範囲及び図面によってより明確になる。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明の一様態によれば、配列表の配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４に記載のアミノ酸配列から構成された群より選択される１種のアミノ酸配列からなるＷＮＴタンパク質の活性を示すペプチドを提供する。
【００２０】
本発明者らは成長因子のうちＷＮＴタンパク質と同一の機能あるいは類似する機能を維持しながらも、天然のＷＮＴタンパク質より活性、皮膚透過度及び安定性に優れた物質を開発すべく努力した結果、天然のＷＮＴタンパク質のアミノ酸配列に基づいて上述した特性を示す多数の成長因子関連ペプチドを合成した。
【発明の効果】
【００２１】
本発明の特徴及び利点を要約すれば、次のとおりである：
（ｉ）本発明のＷＮＴ系列ペプチドは、天然のＷＮＴタンパク質と同一か類似する機能を果たすことができる。
（ｉｉ）本発明のペプチドは、天然のＷＮＴタンパク質に比べて非常に安定性に優れており、皮膚透過度に非常に優れている。
（ｉｉｉ）したがって、本発明のペプチドを含む組成物は、毛髪の成長及び生成に活性を有し、成長因子の活性が要求される疾患又は状態を治療、予防又は改善するのに非常に優れた効能を発揮する。
（ｉｖ）上述した本発明のペプチドの優れた活性及び安定性は、医薬、医薬部外品及び化粧品に非常に有利に適用されることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本発明の合成例によって製造された配列表の配列番号１（ペプチド−１）ないし配列番号４（ペプチド−４）のペプチドの高性能液体クロマトグラフィーの分析結果を示すグラフである。
【図２ａ】本発明の合成例によって製造されたペプチド（配列番号１；ペプチド−１、配列番号２；ペプチド−２、配列番号３；ペプチド−３、配列番号４；ペプチド−４）を処理した角質細胞の細胞成長促進の効果を示すグラフである。
【図２ｂ】本発明の合成例によって製造されたペプチド（配列番号１；ペプチド−１、配列番号２；ペプチド−２、配列番号３；ペプチド−３、配列番号４；ペプチド−４）を処理した繊維芽細胞の細胞成長促進の効果を示すグラフである。
【図２ｃ】本発明の合成例によって製造されたペプチド（配列番号１；ペプチド−１、配列番号２；ペプチド−２、配列番号３；ペプチド−３、配列番号４；ペプチド−４）を処理した毛包細胞の細胞成長促進の効果を示すグラフである。
【図３ａ】本発明のペプチド（配列番号１；ペプチド−１、配列番号２；ペプチド−２、配列番号３；ペプチド−３、配列番号４；ペプチド−４）を処理した角質細胞の細胞成長促進の効果を顕微鏡で確認した写真である。
【図３ｂ】本発明のペプチド（配列番号１；ペプチド−１、配列番号２；ペプチド−２、配列番号３；ペプチド−３、配列番号４；ペプチド−４）を処理した繊維芽細胞の細胞成長促進の効果を顕微鏡で確認した写真である。
【図３ｃ】本発明のペプチド（配列番号１；ペプチド−１、配列番号２；ペプチド−２、配列番号３；ペプチド−３、配列番号４；ペプチド−４）を処理した毛包細胞の細胞成長促進の効果を顕微鏡で確認した写真である。
【図４】本発明のペプチド（配列番号１；ペプチド−１、配列番号２；ペプチド−２、配列番号３；ペプチド−３、配列番号４；ペプチド−４）による受容体であるＬＲＰ５のリン酸化が増加することを確認したデータである。
【図５ａ】本発明のペプチド（配列番号１；ペプチド−１、配列番号２；ペプチド−２、配列番号３；ペプチド−３、配列番号４；ペプチド−４）によってβ−カテニンの活性が増加することを確認したデータである。
【図５ｂ】本発明のペプチド（配列番号１；ペプチド−１、配列番号２；ペプチド−２、配列番号３；ペプチド−３、配列番号４；ペプチド−４）及びＷＮＴ抑制剤であるＤＫＫ−１を処理した後、β−カテニンの活性が増加することを確認したデータである。
【図６】本発明のペプチド（配列番号１；ペプチド−１、配列番号２；ペプチド−２、配列番号３；ペプチド−３、配列番号４；ペプチド−４）による転写因子であるＬＥＦ−１の活性を示すデータである。
【図７ａ】本発明のペプチド（配列番号１；ペプチド−１、配列番号２；ペプチド−２、配列番号３；ペプチド−３、配列番号４；ペプチド−４）の処理時間によるフィブロネクチンの発現が増加することを示すグラフである。
【図７ｂ】本発明のペプチド（配列番号１；ペプチド−１、配列番号２；ペプチド−２、配列番号３；ペプチド−３、配列番号４；ペプチド−４）によってＤＫＫ−１であるＷＮＴ抑制剤及び脱毛遺伝子が存在したときにもフィブロネクチンの発現が増加することを示すグラフである。
【図７ｃ】本発明のペプチド（配列番号１；ペプチド−１、配列番号２；ペプチド−２、配列番号３；ペプチド−３、配列番号４；ペプチド−４）を細胞に処理したとき、免疫染色化学法を通じてペプチドが細胞に存在することを示す写真である。
【図８】本発明のペプチド（配列番号１；ペプチド−１、配列番号２；ペプチド−２、配列番号３；ペプチド−３、配列番号４；ペプチド−４）を処理したマウスの背中皮膚の毛髪成長の効果を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明のペプチドは、ヒトＷＮＴタンパク質から由来するものであって、ＷＮＴ系列由来の配列表の配列番号１（ペプチド−１）ないし配列番号４（ペプチド−４）のアミノ酸配列から構成された群より選択されるアミノ酸配列を含む。好ましくは、本発明のペプチドは、配列表の配列番号１ないし配列表の配列番号４のアミノ酸配列から構成された群より選択されるアミノ酸配列から必須に構成されている。本明細書において用語「ペプチド」とは、ペプチド結合によってアミノ酸残基が互いに結合されて形成された線状の分子を意味する。
【００２４】
本発明のペプチドは、当業界に公知された化学的合成法、特に固相合成技術（ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）によって製造されることができる（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，  Ｊ．  Ａｍｅｒ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  ８５：２１４９−５４（１９６３）；  Ｓｔｅｗａｒｔ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  ２ｎｄ．  ｅｄ．，  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍ．  Ｃｏ．：  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，  １１１（１９８４））。
【００２５】
本発明のペプチドは、ＷＮＴタンパク質の複数部位を無作為に部分合成して受容体タンパク質に対する結合可能部位を１次探索した後、この予測された部位のアミノ酸配列を最適化して本発明のペプチドとして選定製造し、これら候補ペプチドのうち最も活性に優れたペプチドをスクリーニングすることで、本発明のペプチドが提供される。
【００２６】
配列表の配列番号１のペプチド（ペプチド−１）、配列番号２のペプチド（ペプチド−２）、配列番号３のペプチド（ペプチド−３）及び配列番号４のペプチド（ペプチド−４）は、天然のＷＮＴタンパク質と類似する作用を果たす。これは受容器と結合して成長因子のような機能を果たすペプチドである。
【００２７】
本発明のペプチドは、それ自体で天然のＷＮＴタンパク質より非常に安定性に優れている。
【００２８】
本発明の好ましい実現例によれば、上記ペプチドのＮ末端は、アセチル基、フルオレニルメトキシカルボニル基、ホルミル基、パルミトイル基、ミリスチル基、ステアリル基及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）から構成された群より選択される保護基が結合されている。
【００２９】
上述したアミノ酸の変形は、本発明のペプチドの安定性を大きく改善する作用をする。本明細書において用語「安定性」とは、「インビボ」安定性だけでなく、保存安定性（例えば、常温保存安定性）も意味する。上述した保護基は、生体内のタンパク質切断酵素の攻撃から本発明のペプチドを保護する作用をする。
【００３０】
本発明の別の様態によれば、本発明のペプチドを有効成分として含む発毛促進及び毛髪生成改善用の組成物を提供する。
【００３１】
本発明の別の様態によれば、本発明のペプチドを対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）に処理するステップを含む発毛促進及び毛髪生成改善方法を提供する。
【００３２】
本発明のまた別の様態によれば、本発明は、発毛促進及び毛髪生成改善用の医薬品（ｍｅｄｉｃａｍｅｎｔｓ）を製造するための本発明のペプチドの用途を提供する。
【００３３】
本発明の組成物は、上述した本発明の成長因子関連ペプチドを有効成分として含むので、これら間で共通する内容は、本明細書の過度な複雑性を避けるために、その記載を省略する。
【００３４】
下記の実施例で立証されたように、本発明の成長因子関連ペプチド配列は、繊維芽細胞、角質細胞又は毛包細胞の成長促進能力を持ち、またＷＮＴタンパク質の代表的なシグナルであるβ−カテニンシグナルにより統制されることが見られる。また、ＤＫＫ−１というＷＮＴの抑制剤が存在しても、ＷＮＴのシグナルがそのまま伝達されることが見られる。ＷＮＴのターゲット遺伝子であるフィブロネクチンの発現もペプチドによって増加することが見られ、ＤＫＫ−１が存在したときにもフィブロネクチンの発現量が増加することが見られる。これは動物実験を通じて毛髪の成長を非常に高く促進する機能を果たす。
【００３５】
本発明の別の様態によれば、本発明のペプチドを有効成分として含む脱毛防止改善用の組成物を提供する。
【００３６】
本発明のまた別の様態によれば、本発明のペプチドを対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）に処理するステップを含む脱毛防止改善方法を提供する。
【００３７】
本発明のまた別の様態によれば、本発明は、脱毛防止改善用の医薬品を製造するための本発明のペプチドの用途を提供する。
【００３８】
本発明のペプチドは、毛根を生成できるようにする皮膚組織の毛包（ｈａｉｒ  ｆｏｌｌｉｃｌｅ）にある幹細胞の増殖を誘導し、毛根に行けるように分化を誘導して新しい毛包が生成できるようにする。さらに、ジヒドロテストステロンから誘導されたＤＫＫ−１（Ｄｉｃｋｋｏｐｆ−１）脱毛遺伝子が存在してＷＮＴの機能を抑制する状況でも、ペプチドはＷＮＴ−β−カテニン（ｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ）のシグナルを活性化させて発毛促進遺伝子を発現させる。また、ペプチドは、毛髪が生成されて成長される時期である成長期を促進させる役割をし、種々の環境的な要因によって退行期に行く毛周期を成長期に維持することで、脱毛抑制の効果を奏し、正常毛髪では毛髪成長と毛髪に栄養分を供給して、健康な髪に大きく影響する。よって、本発明の組成物は、毛髪の成長及び皮膚状態の改善に非常に効果的である。
【００３９】
本発明の別の様態によれば、本発明のペプチドを有効成分として含む皮膚状態（ｓｋｉｎ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）改善用の組成物を提供する。
【００４０】
本発明のまた別の様態によれば、本発明のペプチドを対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）に処理するステップを含む皮膚状態（ｓｋｉｎ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）改善方法を提供する。
【００４１】
本発明のまた別の様態によれば、本発明は、皮膚状態（ｓｋｉｎ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）改善用の医薬品（ｍｅｄｉｃａｍｅｎｔ）を製造するための本発明のペプチドの用途を提供する。
【００４２】
本発明の好ましい実現例によれば、本発明の組成物は、しわの改善、皮膚弾力の改善、皮膚老化の防止、皮膚保湿の改善、傷跡の除去又は皮膚の再生を含む皮膚状態の改善に用いられることが好ましい。
【００４３】
本発明の別の様態によれば、本発明のペプチドを有効成分として含むＷＮＴ関連シグナル伝達不全による種々の疾患の予防又は治療用の組成物を提供する。
【００４４】
本発明のまた別の様態によれば、本発明のペプチドを対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）に処理するステップを含むＷＮＴ関連シグナル伝達不全に関連する疾患の予防又は治療方法を提供する。
【００４５】
本発明のまた別の様態によれば、本発明は、ＷＮＴ関連シグナル伝達不全に関連する疾患の予防又は治療用の医薬品（ｍｅｄｉｃａｍｅｎｔ）を製造するための本発明のペプチドの用途を提供する。
【００４６】
本発明の好ましい実現例によれば、本発明の組成物は、骨疾患、骨発生疾患、骨折、骨の老人性損失、軟骨異栄養症、高カルシウム血症、過骨症、骨形成不全症、骨軟化症、骨髄炎、骨粗鬆症、パジェット病、骨関節炎、くる病又は肥満を含むＷＮＴ関連シグナル伝達不全に関連する疾患の予防又は治療に用いられることが好ましく、より好ましくは、骨粗鬆症、骨疾患又は肥満に用いられる。
【００４７】
本発明の別の様態によれば、本発明のペプチドを有効成分として含むＷＮＴの拮抗剤であるＤＫＫ−１タンパク質に関連する疾患の予防又は治療用の組成物を提供する。
【００４８】
本発明の別の様態によれば、本発明のペプチドを対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）に処理するステップを含むＷＮＴの拮抗剤であるＤＫＫ−１タンパク質に関連する疾患の予防又は治療方法を提供する。
【００４９】
本発明の別の様態によれば、本発明は、ＷＮＴの拮抗剤であるＤＫＫ−１タンパク質に関連する疾患の予防又は治療用の医薬品（ｍｅｄｉｃａｍｅｎｔ）を製造するための本発明のペプチドの用途を提供する。
【００５０】
本発明の好ましい実現例によれば、本発明の組成物は、インスリン抵抗性、低インスリン血症、高インスリン血症、糖尿病又は肥満を含むＤＫＫ−１タンパク質に関連する疾患の予防又は治療に用いられることが好ましい。
【００５１】
本発明の組成物は、（ａ）上述した本発明の成長因子関連ペプチドの薬剤学的有効量；及び（ｂ）薬剤学的に許容される担体を含む薬剤学的組成物として用いることができる。
【００５２】
本明細書において用語「薬剤学的有効量」とは、上述した成長因子関連ペプチドの効能又は活性を達成するのに十分な量を意味する。
【００５３】
本発明の薬剤学的組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通常用いられるものであって、ラクトース、デキトロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、滑石、ステアリン酸マグネシウム及び鉱油などを含むが、これに限定されるものではない。本発明の薬剤学的組成物は、上記成分以外に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含むことができる。
【００５４】
本発明の薬剤学的組成物は、非経口で投与することが好ましく、例えば、皮膚局所投与によって投与することができる。
【００５５】
本発明の薬剤学的組成物の好適な投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、病的状態、食べ物、投与時間、投与経路、排泄速度及び反応感応性といった要因によって多様であり、普通に熟練した医者は所望の治療又は予防に効果的な投与量を容易に決定及び処方することができる。本発明の好ましい実現例によれば、本発明の薬剤学的組成物の１日投与量は、０．００１〜１０００ｍｇ／ｋｇである。
【００５６】
本発明の薬剤学的組成物は、当該発明の属する技術分野における通常の知識を有する者が容易に実施できる方法によって、薬剤学的に許容される担体及び／又は賦形剤を用いて製剤化することで単位用量形態に製造されるか、又は多用量容器内に内入させて製造されることができる。このとき、剤形は、オイル又は水性媒質中の溶液、懸濁液又は乳化液の形態であるか、エキス剤、粉剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤又はゲル（例えば、ハイドロゲル）の形態であってもよく、分散剤又は安定化剤をさらに含んでもよい。
【００５７】
また、本発明の組成物は、（ａ）上述した本発明の成長因子関連ペプチドの化粧品学的有効量（ｃｏｓｍｅｔｉｃａｌｌｙ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｍｏｕｎｔ）；及び（ｂ）化粧品学的に許容される担体を含む化粧品組成物として用いることができる。
【００５８】
本明細書において用語「化粧品学的有効量」とは、上述した本発明の組成物の皮膚改善の効能を達成するのに十分な量を意味する。
【００５９】
本発明の化粧品組成物は、当業界で通常製造されるいずれの剤形にも製造されることができ、例えば、溶液、懸濁液、乳濁液、ペースト、ゲル、クリーム、ローション、パウダー、石鹸、界面活性剤含有クレンジング、オイル、粉状ファンデーション、乳濁液ファンデーション、ワックスファンデーション及びスプレーなどに剤形化することができるが、これに限定されるものではない。より詳細には、柔軟化粧水、栄養化粧水、栄養クリーム、マッサージクリーム、エッセンス、アイクリーム、クレンジングクリーム、クレンジングフォーム、クレンジングウォーター、パック、スプレー又はパウダーの剤形に製造することができる。
【００６０】
本発明の剤形がペースト、クリーム又はゲルの場合には、担体成分として、動物油、植物油、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、シリカ、滑石又は酸化亜鉛などを用いることができる。
【００６１】
本発明の剤形がパウダー又はスプレーの場合には、担体成分として、ラクトース、滑石、シリカ、アルミニウムヒドロキシド、カルシウムシリケート又はポリアミドパウダーが用いられることができ、特にスプレーの場合には、さらにクロロフルオロハイドロカーボン、プロパン／ブタン又はジメチルエーテルのような推進剤を含むことができる。
【００６２】
本発明の剤形が溶液又は乳濁液の場合には、担体成分として、溶媒、溶解化剤又は乳濁化剤が用いられ、例えば、水、エタノール、イソプロパノール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチルグリコールオイル、グリセリン脂肪族エステル、ポリエチレングリコール又はソルビタン脂肪酸エステルがある。
【００６３】
本発明の剤形が懸濁液の場合には、担体成分として、水、エタノール又はプロピレングリコールのような液状の希釈剤、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールエステル及びポリオキシエチレンソルビタンエステルのような懸濁剤、微結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天又はトラガントなどを用いることができる。
【００６４】
本発明の剤形が界面活性剤含有クレンジングの場合には、担体成分として、脂肪族アルコールサルフェート、脂肪族アルコールエーテルサルフェート、スルホコハク酸モノエステル、イセチオン酸、イミダゾリニウム誘導体、メチルタウレート、サルコシネート、脂肪酸アミドエーテルサルフェート、アルキルアミドベタイン、脂肪族アルコール、脂肪酸グリセリド、脂肪酸ジエタノールアミド、植物油、ラノリン誘導体又はエトキシル化グリセリン脂肪酸エステルなどを用いることができる。
【００６５】
本発明の化粧品組成物に含まれる成分は、有効成分としてのペプチド類と担体成分以外に、化粧品組成物に通常用いられる成分を含み、例えば、抗酸化剤、安定化剤、溶解化剤、ビタミン、顔料及び香料のような通常の補助剤を含むことができる。
【実施例】
【００６６】
以下、実施例を通じて、本発明をより詳しく説明する。これら実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨によって本発明の範囲がこれら実施例によって制限されないということは、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者にとって自明であろう。
【００６７】
実施例
合成例１：Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ（配列表）の合成
クロロトリチルクロリド樹脂（Ｃｈｌｏｒｏ  ｔｒｉｔｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ｒｅｓｉｎ；ＣＴＬ  ｒｅｓｉｎ，  Ｎｏｖａ  ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃａｔ  Ｎｏ．  ０１−６４−００２１）７００ｍｇを反応容器に入れて、メチレンクロライド（ＭＣ）１０ｍｌを加えて３分間攪拌した。溶液を除去し、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１０ｍｌを入れて３分間攪拌した後、さらに溶媒を除去した。反応器に１０ｍｌのジクロロメタン溶液を入れて、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（ｐｂｆ）−ＯＨ（Ｂａｃｈｅｍ，  Ｓｗｉｓｓ）２００ｍｍｏｌｅ及びジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）４００ｍｍｏｌｅを入れた後、攪拌してよく溶かし、１時間攪拌しながら反応させた。反応後、洗浄してメタノールとＤＩＥＡ（２：１）をＤＣＭ（ｄｅｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ）に溶かして１０分間反応させ、過量のＤＣＭ／ＤＭＦ（１：１）で洗浄した。溶液を除去してジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を１０ｍｌ入れて３分間攪拌した後、さらに溶媒を除去した。脱保護溶液（２０％のピペリジン（Ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ）／ＤＭＦ）１０ｍｌを反応容器に入れて、１０分間常温で攪拌した後、溶液を除去した。同量の脱保護溶液を入れて、さらに１０分間反応を維持した後、溶液を除去してそれぞれ３分ずつＤＭＦで２回、ＭＣで１回、ＤＭＦで１回洗浄して、Ａｒｇ（ｐｂｆ）−ＣＴＬ  Ｒｅｓｉｎを製造した。新たな反応器に１０ｍｌのＤＭＦ溶液を入れて、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（ｔｒｔ）−ＯＨ（Ｂａｃｈｅｍ，  Ｓｗｉｓｓ）２００ｍｍｏｌｅ、ＨｏＢｔ  ２００ｍｍｏｌｅ及びＢｏｐ  ２００ｍｍｏｌｅを入れた後、攪拌してよく溶かした。反応器に４００ｍｍｏｌｅ  ＤＩＥＡを分画で２回にかけて入れた後、全ての固体が溶けるまで最小限５分間攪拌した。溶かしたアミノ酸混合溶液を脱保護された樹脂がある反応容器に入れて、１時間常温で攪拌しながら反応させた。反応液を除去してＤＭＦ溶液で３回５分ずつ攪拌した後、除去した。反応樹脂を少量取ってカイザー試験（Ｋａｉｓｅｒ  Ｔｅｓｔ）を用いて反応程度を点検した。脱保護溶液で上記と同様に２回脱保護反応させてＧｌｎ（ｔｒｔ）−Ａｒｇ（ｐｂｆ）−ＣＴＬ  Ｒｅｓｉｎを製造した。ＤＭＦとＭＣで十分洗浄し、再度カイザー試験を行った後、上記と同様に下記のアミノ酸付着実験を行った。選定されたアミノ酸配列に基づいて、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（ｐｂｆ）、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（ｐｂｆ）、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（ｔｒｔ）及びＦｍｏｃ−Ｇｌｙ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（ｐｂｆ）、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ及びＦｍｏｃ−Ｌｅｕの順に連鎖反応させた。Ｆｍｏｃ−保護基を脱保護溶液で１０分ずつ２回反応させた後、よく洗浄して除去した。無水酢酸とＤＩＥＡ、ＨｏＢｔを入れて１時間アセチル化を行った後、製造されたペプチジル樹脂をＤＭＦ、ＭＣ及びメタノールでそれぞれ３回洗浄し、窒素空気をゆっくり流して乾燥した後、Ｐ２Ｏ５下で真空に減圧して完全に乾燥した後、脱漏溶液［トリフルオロ酢酸（Ｔｒｉｆｌｕｒｏａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）９５％、蒸留水２．５％、チオアニソール（Ｔｈｉｏａｎｉｓｏｌｅ）２．５％］３０ｍｌを入れた後、常温でたまに振りながら２時間反応を維持した。フィルタリングして樹脂をろ過し、樹脂を少量のＴＦＡ溶液で洗浄した後、母液と合わせた。減圧を用いて全体ボリュームが半分程度残るように蒸留し、５０ｍｌの冷たいエーテルを加えて沈殿を誘導した後、遠心分離して沈殿を集めて、さらに２回冷たいエーテルで洗浄した。母液を除去し、窒素下で十分乾燥して、精製前Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ａｒｇペプチド−１を０．６５ｇ合成した（収率：９２．６％）。分子量測定器を用いて測定したとき、分子量１５４３．８（理論値：１５４３．８１）を得ることができた。他の配列番号２、配列番号３及び配列番号４のペプチドも上記のような方法で合成を進行した（図１）。
【００６８】
【表１】
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【００６９】
試験例１：合成ペプチドを活用した細胞成長効果の確認
合成例で合成された配列ペプチドに対する成長因子の類似効能及び抑制効能を分析するために、リジノなどの方法（Ｒｉｚｚｉｎｏ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ４８：４２６６（１９８８））を参照して、ＨａＣａＴ角質細胞株とＮＩＨ３Ｔ３繊維芽細胞、そしてＨＨＦＤＰＣ毛包細胞を用いたＳＲＢ（Ｓｕｌｆｏｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｂ）比色法を用いて測定した。
【００７０】
ＨａＣａＴ角質細胞株（韓国細胞株銀行）及びＮＩＨ３Ｔ３繊維芽細胞（韓国細胞株銀行）、ＨＨＦＤＰＣ毛包細胞（ｃｅｌｌ  ｓｃｉｅｎｃｅ）を、それぞれ２５０ｍｌ用量の組織培養用フラスコを用いて１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；  ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ，  Ｓｉｇｍａ）を含むＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ  ，  Ｇｉｂｃｏ，  Ｕ．Ｓ．Ａ．）で培養した。培養された細胞株を１％トリプシン溶液で培養容器の底から剥がした後、遠心分離して細胞沈殿物のみを集めた。これをＦＢＳが含有されていないＤＭＥＭ培養液にさらに懸濁した後、組織培養用の９６ウェルプレートに各ウェル当たり３×１０３細胞になるように入れて、２４時間３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。２４時間後、血清を完全に除外した同一の培養液に培地を交換した後、標準を設定するための空試料と合成ペプチドを１０％ＤＭＳＯに滅菌状態で溶かした後、１ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ及び１０μｇ／ｍｌの濃度で７２時間上記と同一条件で培養した。培養が完了した後、培養上層液を除去し、エタノールを用いて細胞を固定化して、細胞固定が終わった後、ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ  ｓａｌｉｎｅ）で３回洗浄した。洗浄溶液を除去してから、比色ＳＲＢ溶液で処理して１％酢酸（ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）で十分洗浄した後、顕微鏡で細胞を観察して生存細胞の状態を観察し、紫外線５９０ｎｍで吸光度を測定して細胞の生存状態を測定した。
【００７１】
図２は、ペプチド処理後の角質細胞（図２ａ）及び繊維芽細胞（図２ｂ）、毛包細胞（図２ｃ）の成長に対する結果が示されており、図３には、細胞にペプチド処理から７２間後、細胞の形態変化を顕微鏡で観察して角質細胞及び繊維芽細胞、毛包細胞の成長を確認した。
【００７２】
図２は、本発明のペプチドが角質細胞と繊維芽細胞、毛包細胞の成長を大きく増進させることを示し、図３は、本発明のペプチドが角質細胞及び繊維芽細胞、毛包細胞の成長及び形態学的な模様を変化させることを示す。
【００７３】
試験例２：合成ペプチドの受容体及びシグナル遺伝子の発現量増加の効果分析
４８時間を培養したＨａＣａＴ細胞に合成例１で合成したペプチドを処理して５時間経過後、ＷＮＴタンパク質の受容体であるＬＲＰ５のリン酸化増加と、シグナルであるβ−カテニンの発現量を測定した。発現量は、Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＬＲＰ５の抗体（ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）とβ−カテニンの抗体（サンタクルーズ、米国）を用いてウェスタンブロッティングを通じて観察し、β−カテニンによって増加する転写因子であるＬＥＦ−１の発現も共に観察した。本発明のペプチドを処理した場合、Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＬＲＰ５の発現が増加することを確認し（図４）、次のシグナルであるβ−カテニンの発現も増加することを確認した（図５ａ）。ＤＫＫ−１のＷＮＴ抑制剤及びβ−カテニンシグナル抑制剤が存在しても、ペプチドを処理したときにβ−カテニンの活性を示すことを確認した（図５ｂ）。また、転写因子（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）であるＬＥＦ−１の発現も、ペプチドを処理したときに増加することが確認された（図６）。
【００７４】
試験例１及び２の実験結果を総合すれば、本発明のペプチドは非常に優れた発毛促進及び脱毛抑制の機能を発揮し、抗老化にも機能を発揮することが分かる。
【００７５】
試験例３：合成ペプチドによってフィブロネクチン発現量の増加
合成例１で合成したペプチドのＷＮＴのターゲットタンパク質であるフィブロネクチンの発現量が増加するかに関する結果を観察するために、繊維芽細胞を組織培養用の６ウェルプレートに各ウェル当たり４×１０３細胞になるように入れて、２４時間３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。２４時間後、血清を完全に除外した同一の培養液に培地を交換した後、標準を設定するための空試料と合成ペプチドを１０％ＤＭＳＯに滅菌状態で溶かした後、１μｇ／ｍｌのペプチドを処理した後、３時間、１０時間、２４時間、４８時間、上記と同一条件で培養した。７２時間培養後、培養溶液を回収してフィブロネクチンＥＬＩＳＡ  ＫＩＴ（ＲｎＤ  ｓｙｓｔｅｍｓ，  米国）を用いて培養液中のフィブロネクチンの発現量を測定した。図７ａから確認できるように、ペプチドの処理によってフィブロネクチンの発現量が増加することが確認された。また、図７ｂから見られるように、ＤＫＫ−１タンパクを処理して上記と同一の培養条件で培養した後、フィブロネクチンの発現量を観察したとき、ＤＫＫ−１によって抑制されたフィブロネクチンの発現が、ペプチドとＤＫＫ−１を同時に処理したとき、フィブロネクチンの発現量が再度増加することが見られた。図７ｃは、繊維芽細胞に処理した本発明のペプチドを免疫染色化学法を通じて観察したものであって、細胞で染色されることから、細胞に存在するのかが分かる。
【００７６】
このような結果は、ＤＫＫ−１というＷＮＴ抑制剤及び脱毛遺伝子が存在しても、ペプチドによってＷＮＴ−β−カテニンシグナルが伝達されて、発毛促進及び脱毛抑制、そして抗老化に効能を示すことを意味する。
【００７７】
試験例４：製造されたペプチドを処理したマウスの毛髪成長の効果
合成例を通じて製造されたペプチドをナノソーム化して背中の皮膚に除毛をしたＣ５７ＢＬ／６マウスに一日に二回ずつ、１５日間塗布した。対照群としては、リン酸緩衝液を一日に二回ずつ塗布した。塗布してから１０日目になる日、マウスの背中の皮膚が黒味を帯びることが確認され、塗布してから１５日目には対照群に比べて多い量の毛が伸びることを確認することができた（図８）。
【００７８】
実施例１：  ナノ化ペプチドの製造
上記合成例にて得たペプチド２種を、５０ｍｇをそれぞれ正確に秤量した後、蒸留水５００ｍｌで十分に攪拌して溶解した。配合体溶液をレシチン５ｇ、オレイン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｏｌｅａｔｅ）０．３ｍｌ、エタノール５０ｍｌを混合した後、総量が１Ｌになるように蒸留水で定容し、マイクロフルイダイザで高圧を用いて乳化させて、サイズ１００ｎｍ程度のナノソームを製造した。製造されたナノソームは、最終濃度が約５０ｐｐｍで単独あるいは複合的に化粧品製造用に使用された。
【００７９】
剤形例１：柔軟化粧水
上記実施例で製造されたペプチドナノソームを含み、下記組成からなる柔軟化粧水を、通常の化粧水の製造方法によって製造した。
【表２】
0005993454.tif 000003
【００８０】
剤形例２：栄養クリーム
上記実施例で製造されたペプチドナノソームを含み、下記組成からなる栄養クリームを、通常の栄養クリームの製造方法によって製造した。
【表３】
0005993454.tif 000004
【００８１】
剤形例３：栄養化粧水
上記実施例で製造されたペプチドナノソームを含み、下記組成からなる栄養化粧水を、通常の化粧水の製造方法によって製造した。
【表４】
0005993454.tif 000005
【００８２】
剤形例４：エッセンス
上記実施例で製造されたペプチドナノソームを含み、下記組成からなるエッセンスを、通常のエッセンスの製造方法によって製造した。
【表５】
0005993454.tif 000006
【００８３】
剤形例５：ヘアセラム
上記実施例で製造されたペプチドナノソームを含み、下記組成からなるヘアセラムを、通常のヘアセラムの製造方法によって製造した。
【表６】
0005993454.tif 000007
【００８４】
剤形例６：ヘア化粧水
上記実施例で製造されたペプチドナノソームを含み、下記組成からなるヘア化粧水を、通常のヘア化粧水の製造方法によって製造した。
【表７】
0005993454.tif 000008
【００８５】
以上、本発明の特定の部分を詳細に記述したが、当業界の通常の知識を有する者にとってこのような具体的な記述は単に好ましい実現例に過ぎず、これに本発明の範囲が制限されないことは明らかである。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とそれの等価物によって定義されると言える。
【図１】
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【図２ａ】
0005993454.tif 000010
【図２ｂ】
0005993454.tif 000011
【図２ｃ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図４】
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【図５ａ】
0005993454.tif 000017
【図５ｂ】
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【図６】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
0005993454.tif 000021
【図７ｃ】
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【図８】
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【配列表】
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