(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
インフルエンザウイルスノイラミニダーゼを阻害するための組成物であって、治療上有効な量の、式（Ｉ）の化合物：
【化６６】
0005947289.tif 000072
（式中、Ａは、ＰＯ（ＯＲ）（ＯＲ５）であり、
ここでＲおよびＲ５は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アリール、アラルキルおよびＸから独立して選択され、ここでＸは、アンモニウム、メチルアンモニウム、ジメチルアンモニウム、トリメチルアンモニウム、テトラメチルアンモニウム、エタノール−アンモニウム、ジシクロヘキシルアンモニウム、グアニジニウム、エチレンジアンモニウムカチオン、リチウムカチオン、ナトリウムカチオン、カリウムカチオン、セシウムカチオン、ベリリウムカチオン、マグネシウムカチオン、カルシウムカチオン、および亜鉛カチオンからなる群より選択されるカチオン性対イオンであり、
式中、Ｂは、ＮＨＲ６、ＮＨ３＋Ｙ−、Ｒ６Ｎ（Ｃ＝ＮＨ）ＮＨ２もしくはＲ６Ｎ（Ｃ＝ＮＨ２＋）ＮＨ２Ｙ−であり、ここでＲ６は、水素、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アリール、もしくはアラルキルを表し、ここでＹ−は、クロリド、ブロミド、ヨージド、アセテート、トリフルオロアセテート、ホスフェート、ジホスフェート、ニトレート、スルフェート、ベンゼンスルホネート、ベンゾエート、サリチレート、ヒドロキシナフトエート、フマレート、マレエート、ラクテート、マレート、スクシネート、タートレート、シトレート、グルタメート、グルコネート、およびステアレートからなる群より選択されるアニオン性対イオンであり、
式中、Ｒ１は、ＣＨ３もしくはＣＦ３であり；
式中、Ｒ２は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１０アルキルもしくはＯ＝Ｃ−ＮＨＲ７であり、ここでＲ７は、ビオチン、蛍光団および抗炎症因子のような官能部分が付加されたリンカーを表し、そして
式中、Ｒ３およびＲ４は、独立して、水素、Ｃ１−Ｃ１０アルキルもしくはＯ＝Ｃ−Ｒ８であり、ここでＲ８は、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アリール、もしくはアラルキルを表す）
および薬学的に受容可能な賦形剤を含む、
組成物。
【請求項２】
前記化合物は、
【化６７】
0005947289.tif 000073
からなる群もしくは治療上有効なその塩より選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
以下の化合物：
【化６８】
0005947289.tif 000074
のうちの少なくとも１種を含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
以下の化合物：
【化６９】
0005947289.tif 000075
のうちの少なくとも１種を含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
以下の化合物：
【化７０】
0005947289.tif 000076
のうちの少なくとも１種を含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項６】
前記組成物は、インフルエンザウイルス株Ｈ１Ｎ１、Ｈ５Ｎ１、およびＨ３Ｎ２を結合する、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼは、野生型もしくはＨ２７４Ｙ変異型である、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
式（Ｉ）の化合物：
【化７１】
0005947289.tif 000077
（式中、Ａは、ＰＯ（ＯＲ）（ＯＲ５）であり、ここでＲおよびＲ５は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アリール、アラルキルおよびＸから独立して選択され、ここでＸは、アンモニウム、メチルアンモニウム、ジメチルアンモニウム、トリメチルアンモニウム、テトラメチルアンモニウム、エタノール−アンモニウム、ジシクロヘキシルアンモニウム、グアニジニウム、エチレンジアンモニウムカチオン、リチウムカチオン、ナトリウムカチオン、カリウムカチオン、セシウムカチオン、ベリリウムカチオン、マグネシウムカチオン、カルシウムカチオン、および亜鉛カチオンからなる群より選択されるカチオン性対イオンであり、式中、Ｂは、ＮＨＲ６、ＮＨ３＋Ｙ−、Ｒ６Ｎ（Ｃ＝ＮＨ）ＮＨ２もしくはＲ６Ｎ（Ｃ＝ＮＨ２＋）ＮＨ２Ｙ−であり、ここでＲ６は、水素、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アリール、もしくはアラルキルを表し、ここでＹ−は、クロリド、ブロミド、ヨージド、アセテート、トリフルオロアセテート、ホスフェート、ジホスフェート、ニトレート、スルフェート、ベンゼンスルホネート、ベンゾエート、サリチレート、ヒドロキシナフトエート、フマレート、マレエート、ラクテート、マレート、スクシネート、タートレート、シトレート、グルタメート、グルコネート、およびステアレートからなる群より選択されるアニオン性対イオンであり、式中、Ｒ１は、ＣＨ３もしくはＣＦ３であり；式中、Ｒ２は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１０アルキルもしくはＯ＝Ｃ−ＮＨＲ７であり、ここでＲ７は、ビオチン、蛍光団および抗炎症因子のような官能部分が付加されたリンカーを表し、そして式中、Ｒ３およびＲ４は、独立して、水素、Ｃ１−Ｃ１０アルキルもしくはＯ＝Ｃ−Ｒ８であり、ここでＲ８は、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アリール、もしくはアラルキルを表す）
を製造するためのプロセスであって、
該プロセスは、以下の工程：
（ａ）キラル前駆体シアル酸（２）をアセチル化して、中間体化合物（３）：
【化７２】
0005947289.tif 000078
を調製する工程；
（ｂ）中間体化合物（３）をジエチルトリメチルシリルホスファイトで処理して、中間体化合物（４）：
【化７３】
0005947289.tif 000079
を形成する工程；
（ｃ）中間体（４）をＮ−ブロモスクシンイミドで、光照射下で処理して、ブロモ置換化合物を生成し、該ブロモ置換化合物は、ピリジン中で中間体（５）：
【化７４】
0005947289.tif 000080
を形成する工程；
（ｄ）中間体化合物（５）をトリメチルシリルトリフルオロスルホネートで処理して、中間体化合物（６）：
【化７５】
0005947289.tif 000081
を形成する工程；ならびに
（ｅ）中間体化合物（６）をトリメチルシリルアジドで処理して、中間体化合物（７）：
【化７６】
0005947289.tif 000082
を形成する工程、
を包含する、プロセス。
【請求項９】
さらに以下の工程：
（ｆ）中間体化合物（７）を水素化し、次いで、１，３−ビス（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−２−メチルチオプソイドウレアおよびＥｔ３Ｎと反応させて、中間体化合物（８）：
【化７７】
0005947289.tif 000083
を形成する工程、
を包含する、請求項８に記載のプロセス。
【請求項１０】
さらに以下の工程：
（ｇ）中間体化合物（７）をブロモトリメチルシランで処理し、ナトリウムメトキシドで処理し、次いで、順次水素化して、化合物（１ａ）：
【化７８】
0005947289.tif 000084
を形成する工程、
を包含する、請求項８に記載のプロセス。
【請求項１１】
さらに以下の工程：
（ｉ）中間体化合物（７）をナトリウムエトキシドで処理し、次いで、水素化して、化合物（１ｃ）：
【化７９】
0005947289.tif 000085
を形成する工程、
を包含する、請求項８に記載のプロセス。
【請求項１２】
さらに以下の工程：
（ｈ）中間体化合物（８）をブロモトリメチルシランで処理し、次いで、ナトリウムメトキシドで処理して、化合物（１ｂ）：
【化８０】
0005947289.tif 000086
を形成する工程、
を包含する、請求項９に記載のプロセス。
【請求項１３】
さらに以下の工程：
（ｊ）中間体化合物（８）をナトリウムエトキシドで処理し、次いで、トリフルオロ酢酸で処理して、化合物（１ｄ）：
【化８１】
0005947289.tif 000087
を形成する工程、
を包含する、請求項９に記載のプロセス。
【請求項１４】
式（Ｉ）の化合物：
【化７１】
0005947289.tif 000088
（式中、Ａは、ＰＯ（ＯＲ）（ＯＲ５）であり、ここでＲおよびＲ５は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アリール、アラルキルおよびＸから独立して選択され、ここでＸは、アンモニウム、メチルアンモニウム、ジメチルアンモニウム、トリメチルアンモニウム、テトラメチルアンモニウム、エタノール−アンモニウム、ジシクロヘキシルアンモニウム、グアニジニウム、エチレンジアンモニウムカチオン、リチウムカチオン、ナトリウムカチオン、カリウムカチオン、セシウムカチオン、ベリリウムカチオン、マグネシウムカチオン、カルシウムカチオン、および亜鉛カチオンからなる群より選択されるカチオン性対イオンであり、式中、Ｂは、ＮＨＲ６、ＮＨ３＋Ｙ−、Ｒ６Ｎ（Ｃ＝ＮＨ）ＮＨ２もしくはＲ６Ｎ（Ｃ＝ＮＨ２＋）ＮＨ２Ｙ−であり、ここでＲ６は、水素、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アリール、もしくはアラルキルを表し、ここでＹ−は、クロリド、ブロミド、ヨージド、アセテート、トリフルオロアセテート、ホスフェート、ジホスフェート、ニトレート、スルフェート、ベンゼンスルホネート、ベンゾエート、サリチレート、ヒドロキシナフトエート、フマレート、マレエート、ラクテート、マレート、スクシネート、タートレート、シトレート、グルタメート、グルコネート、およびステアレートからなる群より選択されるアニオン性対イオンであり、式中、Ｒ１は、ＣＨ３もしくはＣＦ３であり；式中、Ｒ２は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１０アルキルもしくはＯ＝Ｃ−ＮＨＲ７であり、ここでＲ７は、ビオチン、蛍光団および抗炎症因子のような官能部分が付加されたリンカーを表し、そして式中、Ｒ３およびＲ４は、独立して、水素、Ｃ１−Ｃ１０アルキルもしくはＯ＝Ｃ−Ｒ８であり、ここでＲ８は、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アリール、もしくはアラルキルを表す）。
【請求項１５】
インフルエンザ感染を処置することが必要な被験体においてインフルエンザ感染を処置することに使用するための請求項１４に記載の化合物を含む組成物。
【請求項１６】
前記化合物は、以下：
【化８２】
0005947289.tif 000089
【化８３】
0005947289.tif 000090
からなる群もしくは治療上有効なその塩より選択される、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記被験体は、ヒトもしくは非ヒト哺乳動物である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１８】
前記被験体は、野生型ノイラミニダーゼもしくはＨ２７４Ｙノイラミニダーゼ変異型を含むインフルエンザウイルスに感染していると疑われている、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１９】
前記インフルエンザウイルス株は、Ｈ１Ｎ１、Ｈ５Ｎ１、およびＨ３Ｎ２から選択される、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
インフルエンザウイルスノイラミニダーゼを阻害するための組成物であって、該組成物が、
治療上有効な量の、以下の化合物：
【化９７】
0005947289.tif 000091
のうちの少なくとも１種または薬学的に有効なその塩；および
薬学的に受容可能な賦形剤を含む、
組成物。
【請求項２１】
インフルエンザウイルスノイラミニダーゼを阻害するための組成物であって、該組成物が、
治療上有効な量の、以下の化合物：
【化９８】
0005947289.tif 000092
のうちの少なくとも１種または薬学的に有効なその塩；および
薬学的に受容可能な賦形剤を含む、
組成物。
【請求項２２】
前記組成物は、インフルエンザウイルス株Ｈ１Ｎ１、Ｈ５Ｎ１、およびＨ３Ｎ２に結合する、請求項２０または２１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記組成物は、インフルエンザウイルスの野生型ノイラミニダーゼもしくはＨ２７４Ｙ変異型ノイラミニダーゼに結合する、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
式（１ｃ）、（１ｄ）、（１ｅ）、または（１ｆ）の化合物：
【化９９】
0005947289.tif 000093
または薬学的に有効なその塩。
【請求項２５】
インフルエンザ感染を処置することが必要な被験体においてインフルエンザ感染を処置することに使用するための請求項２３に記載の組成物。
【請求項２６】
前記化合物は、以下：
【化１００】
0005947289.tif 000094
からなる群もしくは治療上有効なその塩より選択される、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
前記被験体は、ヒトもしくは非ヒト哺乳動物である、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２８】
前記被験体は、野生型ノイラミニダーゼもしくはＨ２７４Ｙノイラミニダーゼ変異型を含むインフルエンザウイルスに感染していると疑われている、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２９】
前記インフルエンザウイルス株は、Ｈ１Ｎ１、Ｈ５Ｎ１、およびＨ３Ｎ２から選択される、請求項２８に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本願は、「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  Ｏｓｅｌｔａｍｉｖｉｒ  Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｖｉｒｕｓｅｓ」と題された、２０１０年５月１０日に出願された米国仮特許出願第６１／３３３，１３７号の利益を主張し、この米国仮特許出願の全体の内容は、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（発明の技術分野）
本発明は、インフルエンザウイルスに対して有効である新規な化合物に関する。本発明は、野生型、ならびにＨ１Ｎ１、Ｈ５Ｎ１およびＨ３Ｎ２インフルエンザウイルスのオセルタミビル耐性株に由来するインフルエンザウイルスノイラミニダーゼを阻害する新規なホスホネート化合物に関する。本発明は、薬物耐性病原体の検出に関する。特に、本発明は、オセルタミビル耐性インフルエンザウイルスの検出に関する。より具体的には、本発明は、本発明において開示される新規な化合物を使用する、オセルタミビル耐性インフルエンザウイルスの検出に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
インフルエンザＡウイルスの大流行により、全世界で罹患率および死亡率の広がりが続いている。米国単独において、人口のうちの推定５〜２０％が、毎年インフルエンザＡウイルスに感染し、約２００，０００人が入院し、３６，０００人の死亡を引き起こしている。包括的ワクチン接種方針の確立は、インフルエンザ罹患率を制限するのに有効な手段であった。しかし、上記ウイルスの頻繁な遺伝的浮動から、毎年上記ワクチンの再処方が必要となり、潜在的には、上記ワクチンに存在するウイルス株と、蔓延しているウイルス株との間でのミスマッチがおこっている。
【０００４】
インフルエンザＡウイルスは、９個の構造タンパク質からなり、さらに２個の、調節機能を有する非構造ＮＳ  １タンパク質をコードする。上記ウイルスゲノムの分節に分かれた性質は、異なるウイルス株が細胞に混合感染する間に、遺伝的リアソートメント（ゲノム分節の交換）の機構が起こることを可能にする。上記インフルエンザＡウイルスは、それらの表面に提示される異なるヘマグルチニン（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）のウイルスタンパク質に依存して、種々のサブタイプに分類される。インフルエンザＡウイルスサブタイプは、２種のウイルス表面糖タンパク質である、ヘマグルチニン（ＨＡもしくはＨ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡもしくはＮ）によって同定される。各インフルエンザウイルスサブタイプは、Ｈタンパク質およびＮタンパク質のその組み合わせによって同定される。１６種の公知のＨＡサブタイプおよび９種の公知のＮＡサブタイプが存在する。
【０００５】
インフルエンザウイルスは、ヒトを含む多くの動物種に感染し得るマイナスセンス分節に分かれたＲＮＡウイルスである。上記ウイルスがコードしたＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによるインフルエンザゲノムの複製は、間違いが起こりやすいプロセスであり、このことから、常に変化した遺伝子配列を有する子孫が生成される。遺伝子変化を有する生きたウイルスは、「抗原連続変異」変異体といわれる。上記ウイルスゲノムの分節に分かれた性質、および異なる動物種に感染する可能性から、「抗原不連続変異」変異体が生成され得る（Ｐ．  Ｋ．  Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ，  Ｅｍｅｒｇ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．  １５，  ９６６  （２００９））。望ましい条件下では、ドミナントバリアントがヒトもしくは動物にとって突出した病原体になり得る。変異体進化をもたらす多ステップの選択プロセスは、完全には理解されていない（Ｌ．  Ｃｏｈｅｎ−Ｄａｎｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｖｉｒｏｌ．  ４４，  １３８  （２００９）；  Ｒ．  Ｗａｇｎｅｒ，  Ｍ．  Ｍａｔｒｏｓｏｖｉｃｈ，  Ｈ．  Ｄ．  Ｋｌｅｎｋ，  Ｒｅｖ．  Ｍｅｄ．  Ｖｉｒｏｌ．  １２，  １５９  （２００２））。ワクチンはしばしば、インフルエンザウイルス感染症を予防するために使用されるのに対して、インフルエンザ感染症の処置に関する最も有用な治療は、タミフル（登録商標）（オセルタミビルエチルエステルのリン酸塩，Ｒｏｃｈｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．）およびリレンザ（登録商標）（ザナミビル，Ｇｌａｘｏ  Ｗｅｌｌｃｏｍｅ，  Ｉｎｃ．）の投与を含む（Ｎ．  Ｊ．  Ｃｏｘ，  Ｊ．  Ｍ．  Ｈｕｇｈｅｓ，  Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３４１，  １３８７  （１９９９））。オセルタミビルおよびザナミビルは、ウイルスシアリダーゼ（ノイラミニダーゼ）インヒビターであり、粘膜分泌物内での子孫ビリオンの放出および分散を妨げ、それによって、ウイルス感染性を低下させる。ノイラミニダーゼ（ＮＡ）（上記インフルエンザウイルス表面に発現される糖タンパク質）は、宿主細胞の表面シアロレセプターと該子孫ウイルスとの間の結合を壊すことによって、ウイルス複製および感染性に必須である。従って、構造ベースのストラテジーによるＮＡの阻害は、抗インフルエンザ薬の発見に適用されてきた。
【０００６】
ザナミビル（リレンザＴＭ）（ｖｏｎ  Ｉｔｚｓｔｅｉｎ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  １９９３，  ３６３，  ４１８．  Ｄｕｎｎ，  Ｃ．Ｊ．；  Ｇｏａ，  Ｋ．Ｌ．  Ｄｒｕｇｓ  １９９９，  ５８，  ７６１．）は、インフルエンザの処置に関して普及した薬物である。タミフルは、肝臓エステラーゼによって容易に加水分解されて、その対応するオセルタミビルカルボン酸を、ウイルスノイラミニダーゼ（ＮＡ）の活性部位における３個のアルギニン残基（Ａｒｇ１１８、Ａｒｇ２９２およびＡｒｇ３７１）と相互作用する活性インヒビターとして与える、プロドラッグである（ｖｏｎ  Ｉｔｚｓｔｅｉｎ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  １９９３，  ３６３，  ４１８．  Ｌｅｗ，  Ｗ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｕｒｒ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ２０００，  ７，  ６６３．  Ｒｕｓｓｅｌｌ，  Ｒ．  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  ２００６，  ４４３，  ４５．）。オセルタミビルおよびザナミビルはともに、宿主細胞の表面シアロレセプターと該子孫ウイルスとの間の結合を切断することによって、ウイルス増殖に必須であるインフルエンザウイルスＮＡを阻害する。上記ＮＡインヒビターは、シアル酸（Ｎ−アセチルノイラミン酸）（これは、ウイルスＮＡの活性部位との結合のための、細胞表面糖タンパク質上の最も外側にあるサッカリドである）の酵素切断部位において（オキサ）シクロヘキセン足場を有してオキソニウム遷移状態を摸倣するように設計される。オセルタミビルカルボン酸との結合に適合させるために、大きな疎水性ポケットを作り出すための上記ＮＡの誘導適合は、３−ペンチル側鎖のために必要とされる（Ｃｏｌｌｉｎｓ，  Ｐ．  Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  ２００８，  ４５３，  １２５８．）。比較すると、ザナミビルは、オセルタミビルホスフェートより新たに進化した耐性ウイルスに影響されにくい。上記疎水性結合ポケットを生成する必要がない場合、上記ＮＡ変異型（例えば、臨床的に関連するＨ２７４Ｙ変異型）へのザナミビルの阻害効力は、変化を受けない。
【０００７】
インフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）ウイルスは、上記ノイラミニダーゼ（ＮＡ）タンパク質の２７４位においてヒスチジンからチロシンへのオセルタミビル耐性付与アミノ酸変化（Ｈ２７４Ｙ）を有する。季節性Ｈ１Ｎ１における上記オセルタミビル耐性Ｈ２７４Ｙ変異体の２００８年の急増（Ａ．  Ｍｏｓｃｏｎａ，  Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３６０，  ９５３  （２００９））は、混乱を生じた。なぜなら、これら変異の増大は、上記Ｈ２７４Ｙ流行地域のうちの多くでのオセルタミビルの使用に相関しないからである（Ｊ．  Ｍｏｓｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  ，  Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ．  ８４，  ９１  （２００９）；  Ｍ．  Ｊｏｎｇｅｓ  ｅｔ  ａｌ，  Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ．  ８３，  ２９０  （２００９））。さらに、上記Ｈ２７４Ｙオセルタミビル耐性汎流行性Ｈ１Ｎ１（Ａ．  Ｇｕｌｌａｎｄ，  Ｂｒ．  Ｍｅｄ．  Ｊ．  ３３９，  ｂ４９７５  （２００９））およびＨ５Ｎ１変異体（Ｑ．  Ｍ．  Ｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ４３７，  １１０８  （２００５））は、患者において報告されている。このことは、これらの変異体が、インフルエンザ治療の選択に影響を及ぼし得たことを示唆する（Ｉ．  Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．  ４８，  ３８９  （２００９））。
【０００８】
ザナミビルの多くの誘導体は、シアル酸の酵素切断においてオキソニウム遷移状態を摸倣するように、グリセリル部分の足場における改変によって調製されてきた。ホスホネート基は、一般に、薬物設計においてカルボキシレートのバイオ同配体（ｂｉｏｉｓｏｓｔｅｒｅ）として使用される（Ｗｈｉｔｅ，  Ｃ．  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １９９５，  ２４５，  ６２３．  Ｓｃｈｕｇ，  Ｋ．  Ａ．；  Ｌｉｎｄｎｅｒ，  Ｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｖ．  ２００５，  １０５，  ６７．Ｓｔｒｅｉｃｈｅｒ，  Ｈ．；  Ｂｕｓｓｅｂ，  Ｈ．  Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ２００６，  １４，  １０４７．）。カルボキシレート−グアニジニウムイオン対と比較すると、ホスホネートイオンは、上記グアニジニウムイオンとのより強力な静電相互作用を示す。従って、上記ザナミビルホスホネート同族体（ｃｏｎｇｅｎｅｒ）は、Ｈ１Ｎ１およびＨ５Ｎ１ウイルス、さらには上記Ｈ２７４Ｙ変異型のノイラミニダーゼに対して、より強力であると予測される。その増強された親和性は、生理学的条件において、上記ホスホネート基と、３個のアルギニン残基（Ａｒｇ１１８、Ａｒｇ２９２およびＡｒｇ３７１）との強力な静電相互作用の原因であり得る。
【０００９】
溶液相ノイラミニダーゼ阻害アッセイは、通常、蛍光原基質２’−（４−メチルウンベリフェリル）−α−Ｄ−アセチル−ノイラミン酸を使用し、上記基質は、ノイラミニダーゼによって切断されて、蛍光計を使用して定量化され得る蛍光生成物を生じる（Ｐｏｔｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ，  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ９４：２８７−２９６  （１９７９））。しかし、このアッセイ法は、ハイスループット形式には対応しない。さらに、耐性ウイルス株の素早い出現に起因して（ＭｃＫｉｍｍ−Ｂｒｅｓｃｈｋｉｎ，  Ｊ．  Ｌ．  Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ．  ２０００，  ４７，  １−１７を参照のこと）、未だ、新たなインフルエンザノイラミニダーゼインヒビターを見いだす必要がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の要旨）
２００８年におけるオセルタミビル耐性Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルスの全世界的な急増から、耐性変異体に対する調査ならびにオセルタミビル感受性についての迅速試験開発の必要性が促がされた。潜在的に蔓延しているオセルタミビル耐性Ｈ１Ｎ１ウイルスのただ中において、医師の診療室における患者の標本のオセルタミビル感受性を迅速評価するための「ポイントオブケア」検査が必要であり、それは、処置選択肢に関する決定に利益をもたらす。
【００１１】
新規なホスホネート化合物が記載される。上記化合物は、Ｈ１Ｎ１、Ｈ５Ｎ１およびＨ３Ｎ２インフルエンザウイルスの野生型およびオセルタミビル耐性株に対してノイラミニダーゼインヒビターとして活性を有する。いくつかの実施形態において、上記オセルタミビル耐性インフルエンザ株は、ノイラミニダーゼにおいてＨ２７４Ｙ変異を含む。本開示はまた、シアル酸を介した新規なホスホネート化合物へのエナンチオ選択的合成経路を提供する。
【００１２】
本開示の特徴によれば、式（Ｉ）に従う化合物が開示され、
【００１３】
【化１】
0005947289.tif 000002
【００１４】
式中、Ａは、ＰＯ（ＯＲ）（ＯＲ５）であり、ここでＲおよびＲ５は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アリール、アラルキルおよびＸから独立して選択され、ここでＸは、アンモニウム、メチルアンモニウム、ジメチルアンモニウム、トリメチルアンモニウム、テトラメチルアンモニウム、エタノール−アンモニウム、ジシクロヘキシルアンモニウム、グアニジニウム、エチレンジアンモニウムカチオン、リチウムカチオン、ナトリウムカチオン、カリウムカチオン、セシウムカチオン、ベリリウムカチオン、マグネシウムカチオン、カルシウムカチオン、および亜鉛カチオンからなる群より選択されるカチオン性対イオンであり、式中、Ｂは、ＮＨＲ６、ＮＨ３＋Ｙ−、Ｒ６Ｎ（Ｃ＝ＮＨ）ＮＨ２もしくはＲ６Ｎ（Ｃ＝ＮＨ２＋）ＮＨ２Ｙ−であり、ここでＲ６は、水素、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アリール、もしくはアラルキルを表し、ここでＹ−は、クロリド、ブロミド、ヨージド（ｉｏｄｉｄｅ）、アセテート、トリフルオロアセテート、ホスフェート、ジホスフェート、ニトレート、スルフェート、ベンゼンスルホネート、ベンゾエート、サリチレート、ヒドロキシナフトエート、フマレート、マレエート、ラクテート、マレート、スクシネート、タートレート、シトレート、グルタメート、グルコネート、およびステアレートからなる群より選択されるアニオン性対イオンであり、式中、Ｒ１は、ＣＨ３もしくはＣＦ３であり；式中、Ｒ２は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１０アルキルもしくはＯ＝Ｃ−ＮＨＲ７であり、ここでＲ７は、ビオチン、蛍光団および抗炎症因子のような官能部分が付加されたリンカーを表し、そして式中、Ｒ３およびＲ４は、独立して、水素、Ｃ１−Ｃ１０アルキルもしくはＯ＝Ｃ−Ｒ８であり、ここでＲ８は、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アリール、もしくはアラルキルである。
【００１５】
治療上有効な量の式（Ｉ）および薬学的に受容可能な賦形剤を含む組成物が開示され、ここで上記組成物は、インフルエンザウイルスノイラミニダーゼの活性を阻害するために生物に投与されるように設計される。
【００１６】
本発明の特徴によれば、治療上有効な量の、以下のうちの少なくとも１種：
【００１７】
【化２】
0005947289.tif 000003
【００１８】
もしくは以下のうちの少なくとも１種：
【００１９】
【化３】
0005947289.tif 000004
【００２０】
もしくは以下のうちの少なくとも１種：
【００２１】
【化４】
0005947289.tif 000005
【００２２】
を含む組成物が開示される。
【００２３】
本開示の特徴によれば、式Ｉの組成物を作製するためのプロセスが開示され、上記プロセスは、以下の工程を包含する：
（ａ）キラル前駆体シアル酸（２）をアセチル化して、中間体化合物（３）：
【００２４】
【化５】
0005947289.tif 000006
【００２５】
を調製する工程；
（ｂ）中間体化合物（３）をジエチルトリメチルシリルホスファイトで処理して、中間体化合物（４）：
【００２６】
【化６】
0005947289.tif 000007
【００２７】
を形成する工程；
（ｃ）中間体（４）をＮ−ブロモスクシンイミドで、光照射下で処理して、ブロモ置換化合物を生成し、上記ブロモ置換化合物は、ピリジン中で中間体（５）：
【００２８】
【化７】
0005947289.tif 000008
【００２９】
を形成する工程；
（ｄ）中間体化合物（５）をトリメチルシリルトリフルオロスルホネートで処理して、中間体化合物（６）：
【００３０】
【化８】
0005947289.tif 000009
【００３１】
を形成する工程；ならびに
（ｅ）中間体化合物（６）をトリメチルシリルアジドで処理して、中間体化合物（７）：
【００３２】
【化９】
0005947289.tif 000010
【００３３】
を形成する工程。
【００３４】
いくつかの実施形態において、上記プロセスは、中間体化合物（７）をブロモトリメチルシランで処理し、ナトリウムメトキシドで処理し、次いで、順次水素化して、化合物（１ａ）：
【００３５】
【化１０】
0005947289.tif 000011
【００３６】
を形成する工程をさらに包含する。
【００３７】
いくつかの実施形態において、上記プロセスは、中間体化合物（７）をナトリウムエトキシドで処理し、次いで、水素化して、化合物（１ｃ）：
【００３８】
【化１１】
0005947289.tif 000012
【００３９】
を形成する工程をさらに包含する。
【００４０】
いくつかの実施形態において、上記プロセスは、中間体化合物（７）を水素化し、次いで、１，３−ビス（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−２−メチルチオプソイドウレアおよびＥｔ３Ｎと反応させて、中間体化合物（８）：
【００４１】
【化１２】
0005947289.tif 000013
【００４２】
を形成する工程をさらに包含する。
【００４３】
いくつかの実施形態において、上記プロセスは、中間体化合物（８）をブロモトリメチルシランで処理し、次いで、ナトリウムメトキシドで処理して、化合物（１ｂ）：
【００４４】
【化１３】
0005947289.tif 000014
【００４５】
を形成する工程をさらに包含する。
【００４６】
いくつかの実施形態において、上記プロセスは、中間体化合物（８）をナトリウムエトキシドで処理し、次いで、トリフルオロ酢酸で処理して、化合物（１ｄ）：
【００４７】
【化１４】
0005947289.tif 000015
【００４８】
を形成する工程をさらに包含する。
【００４９】
一局面において、本発明は、本明細書で開示されるプロセスによって生成される式（Ｉ）に従う任意の生成物に関する。
【００５０】
本開示の特徴によれば、インフルエンザ感染を処置するための方法が開示され、上記方法は、治療上有効な量の、式（Ｉ）に従う組成物を、それを必要とする被験体に提供する工程を包含する。
【００５１】
本発明の特定の局面によれば、式（Ｉ）に従う化合物は、以下のうちの少なくとも１種：
【００５２】
【化１５】
0005947289.tif 000016
【００５３】
である。
【００５４】
本発明の別の実施は、ノイラミニダーゼの活性を阻害する方法を提供し、上記方法は、上記ノイラミニダーゼと、化合物（Ｉ）のうちのいずれか１種とを接触させる工程を包含する。一局面において、上記ノイラミニダーゼは、インフルエンザノイラミニダーゼであり、その活性は、インビボで阻害される。別の局面において、上記活性は、インビトロで阻害される。
【００５５】
本発明は、上記薬物およびその競合的インヒビターの結合を測定することによって、病原体の薬物感受性を決定することに関する。
【００５６】
本発明は、オセルタミビル耐性インフルエンザウイルスの存在を決定するための方法に関し、上記方法は、（ａ）オセルタミビル耐性インフルエンザウイルスもしくはウイルス粒子を含むことが疑われるサンプルを提供する工程；（ｂ）上記サンプルと、インフルエンザノイラミニダーゼ認識ユニット（Ｒ）を含む結合分子とを、オセルタミビル（ｏｓｔｅｌａｍｉｖｉｒ）カルボキシレート（ＯＣ）の存在下および非存在下で接触させる工程；ならびに（ｃ）オセルタミビルの存在下および非存在下での上記インフルエンザウイルスもしくはウイルス粒子への結合分子の結合における差異を決定する工程を包含し、ここでオセルタミビル感受性インフルエンザウイルスコントロールと接触させたときの結合レベルにおける低下と比較して、オセルタミビルの存在下での上記認識ユニット（Ｒ）による結合レベルにおける低下の欠如は、上記サンプル中のオセルタミビル耐性インフルエンザウイルスの存在を示す。上記インフルエンザウイルスへの上記認識ユニット（Ｒ）の結合は、オセルタミビルカルボキシレートによる同時結合（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔ  ｂｉｎｄｉｎｇ）によって競合的に阻害される。
【００５７】
いくつかの実施形態において、上記オセルタミビル耐性インフルエンザは、インフルエンザのノイラミニダーゼ（ＮＡ）タンパク質のアミノ酸２７４位において変異を含む。いくつかの実施形態において、上記変異は、Ｈ２７４Ｙである。
【００５８】
いくつかの局面において、上記インフルエンザウイルス含有サンプルは、粘液、唾液、呼吸器分泌物、のど洗浄液、鼻洗浄液、脊髄液、痰、尿、精液、汗、糞便、血漿、血液、気管支肺胞洗浄液、膣液、涙液および組織生検からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、上記インフルエンザウイルスは、細胞培養物から得られる。いくつかの実施形態において、上記細胞培養物は、Ｖｅｒｏ細胞培養物である。いくつかの実施形態において、上記インフルエンザウイルス含有サンプルは、インフルエンザウイルスに感染した細胞である。
【００５９】
いくつかの局面において、上記インフルエンザウイルス含有サンプルは、固体基材に固定される。上記固体基材は、マイクロウェル、マイクロタイタープレート、シリコンチップ、ガラススライド、ビーズ、微粒子、フィルム、クロマトグラフィー用紙、膜、ボトル、ディッシュ、スライド、ブロッティング材料、フィルタ、ファイバー、織布繊維、成形ポリマー、粒子、ディップスティック、試験管、チップ、マイクロチップ、Ｌａｎｇｍｕｉｒ  Ｂｌｏｄｇｅｔｔ膜、ガラス、ゲルマニウム、ケイ素、（ポリ）テトラフルオロエチレン、ポリスチレン、ヒ化ガリウム、リン化ガリウム、酸化ケイ素、窒化ケイ素、およびこれらの組み合わせからなる群より選択され得る。いくつかの実施形態において、上記インフルエンザウイルスもしくはウイルス粒子は、インフルエンザウイルスのヘマグルチニン成分への炭水化物レセプターの結合を介して、上記固体基材に固定される。
【００６０】
いくつかの局面において、上記固体基材への上記インフルエンザウイルスもしくはウイルス粒子の固定は、上記インフルエンザウイルスもしくはその粒子のノイラミニダーゼ成分への、上記結合分子もしくはオセルタミビルカルボキシレートの結合を変化させない。
【００６１】
いくつかの実施形態において、上記認識ユニット（Ｒ）は、ザナミビル、またはタミホスホルグアニジンモノエステル、またはホスファザナミビルもしくはそのモノエステル、ならびにこれらの塩、エステルおよび誘導体から選択される。いくつかの実施形態において、上記認識ユニット（Ｒ）は、検出可能である感知ユニット（Ｓ）に繋がれる。いくつかの実施形態において、上記認識ユニット（Ｒ）は、リンカー（Ｌ）を介して上記感知ユニットに繋げられ、その結果、上記結合分子は、構造Ｒ−Ｌ−Ｓを有する。いくつかの実施形態において、上記リンカー（Ｌ）は、上記認識ユニットの上記インフルエンザウイルスへの結合による上記感知ユニット（Ｓ）の検出への効果を低下させる。
【００６２】
上記リンカー（Ｌ）は、脂肪族鎖、トリアゾール、水溶性リンカー、およびエチレングリコールリンカーから選択され得る。
【００６３】
いくつかの局面において、上記感知ユニットは、直接的にもしくは間接的に検出可能である。いくつかの実施形態において、上記感知ユニットは、ストレプトアビジン−ビオチン相互作用によって検出可能な部分に繋げられる。
【００６４】
いくつかの局面において、上記感知ユニットは、蛍光標識、金標識、酵素標識、放射活性標識、量子ドット標識、およびタンパク質標識から選択される検出可能な部分である。いくつかの実施形態において、上記検出可能な部分は、発光シグナル、比色シグナル、蛍光シグナル、もしくは放射活性シグナルから選択されるシグナルによって検出される。
【００６５】
いくつかの実施形態において、上記蛍光標識は、フルオレセイン、ＢＯＤＩＰＹ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、オレゴングリーン、テトラメチルローダミン、ローダミンレッド、テキサスレッド、ピリジルオキサゾール、ベンゾオキサジアゾール誘導体、ＮＢＤハライド、ヨードアセトアミド、ＳＢＤ；ルシファーイエロー、ヨードアセトアミド；スチルベン、クマリン、ナフタレン、アジリジン、ダポキシル、ピレン、ビマン、キサンテン、シアニン、ピレン、フタロシアニン、フィコビリタンパク質、スクアライン（ｓｑｕａｒｅｎｅ）色素、エネルギー移動色素の組み合わせ、およびこれらの誘導体からなる群より選択される。
【００６６】
いくつかの実施形態において、ビオチン感知ユニットは、蛍光標識されたストレプトアビジンによって検出可能である。いくつかの実施形態において、蛍光感知ユニットは、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、Ａｌｅｘａ色素および量子ドットから選択される。いくつかの実施形態において、上記ビオチン感知ユニットは、ストレプトアビジン結合体化酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、もしくは西洋ワサビペルオキシダーゼ）によって検出可能である。いくつかの実施形態において、タミホスホルグアニジンモノエステルは、そのアンモニウム塩である。いくつかの実施形態において、ホスファザナミビルは、そのアンモニウム塩である。
【００６７】
本開示は、インフルエンザウイルスもしくはその粒子のノイラミニダーゼに結合する化合物に関し、ここで上記結合は、オセルタミビルカルボキシレート（ＯＣ）によって競合的に阻害され、上記化合物は、式Ｒ−Ｌ−Ｓを含み、ここで：Ｒは、ザナミビル、またはタミホスホルグアニジンモノエステル、またはホスファザナミビルもしくはそのものエステル、およびこれらの塩、エステルおよび誘導体から選択され；Ｌは、任意選択であり、トリアゾールリンカー、脂肪族リンカー、もしくはエチレングリコールリンカーから選択され；そしてＳは、（ａ）蛍光検出、比色検出、発光検出および放射活性検出から選択される方法によって直接検出可能な部分、または（ｂ）ビオチンおよびストレプトアビジン結合体化レポートシステムから選択される間接的に検出可能な部分、から選択される。
【００６８】
本開示は、診断キットに関し、上記診断キットは、包装材料およびサンプル中のオセルタミビル耐性インフルエンザウイルスの存在を検出するための組成物を含み、ここで上記組成物は、本開示に従う化合物を含む。いくつかの実施形態において、上記キットは、サンプル中のオセルタミビル耐性インフルエンザウイルスの検出のためのキットを使用するための適応または指示を含むラベルもしくはパッケージ挿入物をさらに含む。
【００６９】
これらおよび他の局面は、以下の図面に関連して考慮される好ましい実施形態の以下の記載から明らかになるが、そこでのバリエーションおよび改変は、本開示の新規な概念の趣旨および範囲から逸脱することなく用い得る。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本開示の特定の局面をさらに実証するために含まれ、本発明は、本明細書で提示される具体的実施形態の詳細な記載と合わせて、これら図面のうちの１つ以上を参照することによってよりよく理解され得る。特許もしくは出願ファイルは、カラーで制作された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面（複数可）付きのこの特許もしくは特許出願の公報のコピーは、請求および必要な料金の支払いの際に当該官庁によって提供される。
【図１】図１は、ザナミビルホスホネート同族体および誘導体の合成のためのスキームを示す。
【図２】図２Ａ〜２Ｄは、化合物１ａ（２Ａ）、１ｂ（２Ｂ）、ザナミビル（２Ｃ）およびオセルタミビル酸（２Ｄ）の分子モデルを示す。
【図３】図３は、ザナミビル−ビオチン結合体（ＺＢ，９）の合成のためのスキームを示す。
【図４】図４は、ザナミビル−フルオレセイン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｅ）結合体１５および１７の合成のためのスキームを示す。
【図５】図５は、タミホスホルビオチン結合体２４の合成のためのスキームを示す。
【図６】図６は、ジザナミビル−ビオチン結合体２６の合成のためのスキームを示す。
【図７】図７Ａ〜７Ｂは、固定したインフルエンザサンプルを使用する、オセルタミビルカルボキシレート（ＯＣ）感受性の決定を示す。（７Ａ）本研究において使用される化合物の構造。（７Ｂ）ＯＣ感受性（Ｓ）もしくはＯＣ耐性（Ｒ）のＷＳＮウイルスサンプルを、１０５、１０４、もしくは１０３  ＰＦＵ／ウェルで、抗ＨＡ被覆マイクロプレートウェルに固定した。三連のウェルにおいて上記固定したウイルスサンプルを、完全な結合のために３０ｎＭ  ＺＢとともに、もしくは３０ｎＭ  ＺＢ＋１５０ｎＭの競合ＯＣとともにインキュベートして、ＯＣ耐性ＺＢ結合（ＯＣ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ＺＢ  ｂｉｎｄｉｎｇ）を測定した。結合したウイルスを、ストレプトアビジン結合体化アルカリホスファターゼとともに、続いて、化学発光基質とともにさらにインキュベートして、結合したアルカリホスファターゼによる触媒作用に起因する相対発光単位（ＲＬＵ）増大を測定した。ＯＣ耐性ＺＢ結合の値を、ＯＣ競合の存在下で測定されたＲＬＵと、ＯＣの非存在下で測定されたＲＬＵとの比として計算した。競合するＯＣによる有意な結合低下を生じる条件は、ｐ＜０．００１について「＊＊」で表示される。破線は、高力価（１０５  ＰＦＵ／ウェル）  ２７４Ｈウイルスサンプルを使用した場合に、ＯＣで完全に阻害できない、３％の残留ＺＢ結合を記した。
【図８】図８Ａ〜８Ｄは、２００５〜２００９年において台湾で集められた臨床インフルエンザ分離株のＯＣ感受性の決定を示す。２００５〜２００７年（８Ａ）、２００８年（８Ｂ）、および２００９年（８Ｃ）に台湾で集めた季節性のＨ１Ｎ１を、ＯＣ感受性研究に使用した。ＯＣ耐性ＺＢ結合を測定し、図１Ｂに記載されるように計算した。１％未満の結合値を、１％として示した。５％の結合値を記した破線は、試験ウイルスの感受性状態を評するために使用した。（８Ｄ）  ７つの２００９年の汎流行性Ｈ１Ｎ１分離株のＯＣ感受性を、完全なおよびＯＣ耐性の結合に対して三連の測定を行ったことを除いて同一の様式で測定した。さらに、完全なおよびＯＣ耐性結合をともに示す。
【図９】図９Ａ〜９Ｄは、インフルエンザウイルスサンプルのＯＣ感受性決定のためのプロトタイプの「ポイントオブケア」アッセイを示す。（９Ａ）  固定した抗ＨＡ抗体スロットを有するＰＶＤＦ膜を使用して、３０ｎＭ  ＺＢ、もしくは３０ｎＭ  ＺＢ＋１５０ｎＭ  ＯＣのいずれかとともにプレインキュベートしたインフルエンザサンプルを吸収した。この研究において、１０４、１０５、１０６  ＰＦＵ／スロットでの野生型ＷＳＮ（２７４Ｈ）もしくは上記ＯＣ耐性ＷＳＮ（２７４Ｙ）変異ウイルスを使用した。ブロッティングおよび洗浄の後、上記膜を、ストレプトアビジン結合体化アルカリホスファターゼで処理し、ＢＣＩＰ／ＮＢＴで染色して、上記ウイルスサンプルのＯＣ感受性を視覚的に決定した。（９Ｂ）  １０個の２００８年の台湾季節性Ｈ１Ｎ１分離株（図８Ｂに記載した）を、上記膜アッセイを使用して確認した。（９Ｃ）  同様に、図８Ｄにおいて試験した４つの汎流行性Ｈ１Ｎ１ウイルス株を、上記プロトタイプアッセイを使用して評価した。（９Ｄ）  ＺＢ結合のＯＣ競合を、抗体なしのＰＶＤＦ膜への上記ウイルスサンプルの直接固定を含む改変法を使用して、いくつかの他のＡ型もしくはＢ型のインフルエンザウイルスで決定し、次いで、同じ様式で処理した。
【図１０】図１０は、Ａ／Ｈａｎｏｉ／３０４０８／２００５  Ｈ５Ｎ１のノイラミニダーゼ  ｃＤＮＡを発現する２９３Ｔ細胞の表面におけるＺＢ（ザナミビル  ビオチン）結合を示す。上記２９３Ｔ細胞を、リポフェクタミンＴＭ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＵＳＡ）によって、ＮＡ発現ベクターｐＣＤＮＡ３．１−ＮＡでトランスフェクトした。４８時間後、トランスフェクトした細胞を、１００ｎＭ  ザナミビル−ビオチン（ＺＢ）で染色し、ＤｙＬｉｇｈｔ  ４８８結合体化ストレプトアビジンとともにさらにインキュベートした。免疫蛍光画像を、Ｌｅｉｃａ  ＴＣＳ−ＳＰ５レーザー走査型共焦点顕微鏡を使用して獲得した。
【図１１】図１１Ａ〜１１Ｆは、ＯＣ耐性ノイラミニダーゼを発現する細胞を種々の含量混合した２９３細胞のＺＢ結合を示す。ＯＣ感受性細胞（２７４Ｈ）およびＯＣ耐性細胞（２７４Ｙ）を発現する組換え２９３Ｔ細胞を、以下に示されるように異なる比へと混合した：（１１Ａ）  ２７４Ｈ：２７４Ｙ＝１００：０、（１１Ｂ）  ２７４Ｈ：２７４Ｙ＝９９９：１、（１１Ｃ）  ２７４Ｈ：２７４Ｙ＝９９：１、（１１Ｄ）  ２７４Ｈ：２７４Ｙ＝９５：５、（１１Ｅ）  ２７４Ｈ：２７４Ｙ＝９０：１０、（１１Ｆ）  ２７４Ｈ：２７４Ｙ＝０：１００。混合した細胞を、１０ｎＭ  ＺＢで、室温において１時間にわたって処理し、続いて、さらにＡＰＣ結合体化ストレプトアビジンを付加し、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）およびＦＣＳ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ３．０ソフトウェアによって分析した。ＺＢ標識細胞のパーセンテージは、１１Ａ，８３．９５％；  １１Ｂ，８４．４％；  １１Ｃ，８４．６２％；  １１Ｄ，８６．０７％；  １１Ｅ，８３．５８％；  および１１Ｆ，７５．１％であった。
【図１２】図１２Ａ〜１２Ｆは、ＯＣ耐性ノイラミニダーゼを発現する細胞を種々の含量混合した２９３Ｔ細胞におけるオセルタミビルカルボキシレート耐性ＺＢ結合を示す。細胞を、図１１のように、１０ｎＭ  ＺＢおよび３００ｎＭの過剰のＯＣで処理し、同様に処理した。ＺＢ標識細胞のパーセンテージは、１２Ａ，１．００％；  １２Ｂ，２．６４％；  １２Ｃ，２．７８％；  １２Ｄ，７．１０％；  １２Ｅ，１２．４１％；  および１２Ｆ，６８．２９％であった。
【図１３】図１３Ａ〜１３Ｂは、インフルエンザウイルス感染ＭＤＣＫ細胞へのＺＢ結合のＯＣ競合を示す。（１３Ａ）  ＭＤＣＫ細胞を、ＯＣ感受性２７４ＨウイルスもしくはＯＣ耐性２７４Ｙウイルスに感染させた。感染後２０時間で、上記２７４Ｈウイルス感染した細胞を、１０ｎＭ（白三角）もしくは５０ｎＭ（白丸）のＺＢとともに、種々の濃度の競合するＯＣの存在下でインキュベートした。同様に、上記２７４Ｙ感染細胞をまた、種々のＯＣ含量を含んで、１０ｎＭ  ＺＢ（黒三角）もしくは５０ｎＭ  ＺＢ（黒丸）とともにインキュベートした。ＺＢが結合した細胞を、さらに、ストレプトアビジン結合体化アルカリホスファターゼとともにインキュベートして、競合ＯＣの種々の濃度における相対的ＺＢ結合を決定した。（１３Ｂ）  ＯＣ感受性（２７４Ｈ）ＷＳＮウイルスもしくはＯＣ耐性（２７４Ｙ）ＷＳＮウイルスに感染させ、３０ｎＭ  ＺＢもしくは３０ｎＭ  ＺＢ＋１５０ｎＭ  ＯＣのいずれかとインキュベートし、続いて、ストレプトアビジン結合体化ＰＥとインキュベートしたＭＤＣＫ細胞の画像。蛍光画像を、４８８ｎｍおよび５７５ｎｍにおいてそれぞれ励起および発光させレーザー駆動プレートリーダーを使用して獲得した。
【図１４】図１４は、ＯＣを競合させてのＺＢ結合によって、ＯＣ耐性ウイルス含量を推定するための、固定ＷＳＮウイルスのＲＡＢＣアッセイを示す。種々の含量の２７４Ｈウイルスおよび２７４Ｙウイルスと混合したＷＳＮウイルスサンプルを、１ウェルあたり１０５  ＰＦＵ（三角）、１０４  ＰＦＵ（四角）、および１０３  ＰＦＵ（丸）、抗ＨＡ被覆マイクロウェルに各々３連で固定した。それらに、１時間にわたって３０ｎＭ  ＺＢおよび１５０ｎＭ  ＯＣを添加し、続いて、ストレプトアビジン結合体化アルカリホスファターゼと結合させて、上記実験に使用した２７４Ｙの含量に対してプロットされるＯＣ耐性の推定％値を決定した。
【図１５】図１５〜６３は、本開示の化合物のＮＭＲスペクトルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００７１】
（発明の詳細な説明）
本明細書で使用される用語は、一般に、当該分野で、本発明の状況内において、および各用語が使用される具体的な状況においてそれらの通常の意味を有する。本発明を記載するために使用される特定の用語は、本発明の記載に関して実施者にさらなるガイダンスを提供するために、以下で、もしくは本明細書中の他の箇所で述べられる。便宜上、例えば、斜体および／もしくは引用符を使用して、特定の用語が強調され得る。強調の使用は、用語の範囲および意味に何ら影響を及ぼさない；用語の範囲および意味は、同じ状況においては、強調されようがされまいが、同じである。同じことが、１つより多くの方法で言われ得ることが、認識される。その結果として、代替の言葉および類義語が、本明細書で述べられる用語のうちのいずれか１つ以上に使用され得るが、用語が本明細書で練られもしくは述べられていても、そうでなくても、何ら特別に重きは置かれない。特定の用語に関する類義語が、提供される。１種以上の類義語の詳述は、他の類義語の使用を排除しない。本明細書で述べられる任意の用語の例を含む、本明細書でいずれかの箇所での例示の使用は、例示に過ぎず、本発明の範囲および意味も、いかなる例示される用語の範囲および意味も、決して限定しない。同様に、本発明は、本明細書で与えられる種々の実施形態にも限定されない。
【００７２】
別段定義されなければ、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合には、定義も含めて本文書が優先する。
【００７３】
オセルタミビルは、内因性エステラーゼによって、オセルタミビルカルボキシレート（ＯＣ）へと変換される経口プロドラッグである。ザナミビルは、上記ノイラミニダーゼタンパク質の活性部位へ結合することによって作用し、インフルエンザウイルスを、その宿主細胞から脱出できなくして、他の細胞へ感染できなくする（Ｃｙｒａｎｏｓｋｉ  Ｄ（２００５年９月）  Ｎａｔ．  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １１  （９）：  ９０９）。それはまた、インビトロおよびインビボでのインフルエンザウイルス複製のインヒビターである。ザナミビルのバイオアベイラビリティーは２％であり、これは通常、吸入によって投与される。
【００７４】
薬物耐性トリインフルエンザ感染およびタミフル（登録商標）処置を受けた小児における副作用に関する近年の報告から、ノイラミニダーゼインヒビター（ＮＡＩ）の新たな化学的な本質（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）が、汎流行性インフルエンザの脅威に対する戦いに必要とされることが示唆される。上記ＮＡインヒビターは、シアル酸の酵素切断におけるオキソニウム遷移状態を摸倣するために、（オキサ）シクロヘキセン足場を有するように設計される（Ｒｕｓｓｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ，  Ｎａｔｕｒｅ  ２００６，４４３  ：４５）。肝臓エステラーゼによる加水分解に対して、活性なカルボキシレートであるオセルタミビルは、ＮＡの活性部位における３個のアルギニン残基（Ａｒｇ１１８、Ａｒｇ２９２およびＡｒｇ３７１）と相互作用するように曝される（同上文献）。
【００７５】
（抗インフルエンザ活性を有するザナミビルホスホネート同族体の合成）
本開示は、ザナミビルの新規なホスホネート同族体（ｃｏｎｇｅｒ）への新規な合成経路を提供する。Ｄ−シアル酸を、新規な活性ノイラミニダーゼインヒビターの合成のためのキラル前駆体として利用した。新規なホスホネート同族体は、Ｈ１Ｎ１ウイルスおよびＨ５Ｎ１ウイルスの野生型およびＨ２７４Ｙ変異型のノイラミニダーゼを阻害することによって、ザナミビルおよびオセルタミビルより良好な抗インフルエンザ活性を示す。
【００７６】
一実施において、本発明は、合理的に高収量を有する種々のザナミビルホスホネート同族体およびその誘導体のエナンチオ選択的合成のための新規な合成法を提供する。上記合成経路は、図１に示される。図１に記載される試薬および工程は、以下のとおりである：
工程１．  シアル酸（２）を、ピリジン中の無水酢酸で処理して、過アセチル化中間体を得、これを、１００℃において加熱して、脱カルボキシル化を誘導し、化合物３を得た（Ｈｏｒｎ，  Ｅ．  Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．  Ｒｅｓ．  ２００８，  ３４３，  ９３６）。
【００７７】
工程２．  化合物３を、適切な求核剤としてトリメチルシリルジエチルホスフェートで処理して、ホスホネート化合物４を、αアノマーおよびβアノマーの混合物（２：３）として得、これを、クロマトグラフィーによって分離し、ＮＭＲスペクトル分析によって特徴付けることができた。
【００７８】
工程３．  ホスホネート４（アノマー混合物として）を、ＣＨ２Ｃｌ２溶液中のＮ−ブロモスクシンイミド（ＮＢＳ）に曝して、ラジカルタイプ臭素化を受けさせ、これを、ピリジンでインサイチュ処理して、β脱離生成物５（Ｎｅｕ５Ａｃ２ｅｎのホスホネート誘導体（ＤＡＮＡ））を得た。５についてのこの合成法は、ジメチルホスホネートのそのアナログに関して以前に報告されていた冗長な手順より遙かに効率的であった（Ｖａｓｅｌｌａ，  Ａ．；  Ｗｙｌｅｒ，  Ｒ．  Ｈｅｌｖ．  Ｃｈｉｍ．  Ａｃｔａ  １９９１，  ７４，  ４５１）。
【００７９】
工程４．  無水酢酸、酢酸および濃Ｈ２ＳＯ４の媒体中で、化合物５を、オキサゾリン６に変換した。
【００８０】
工程５．  アジドトリメチルシランでのオキサゾリン６のレジオ選択的および立体選択的な開環反応を行って、アジド化合物７を重要な中間体として得た。これは、化合物１ａ、１ｂ、１ｃおよび１ｄをもたらした。
【００８１】
工程６．  化合物７を、一連の３つの反応によってホスホン酸１ａに変換した：ブロモトリメチルシランでホスホネート７からの両方のエチル基の除去、メタノール中のナトリウムメトキシドを使用しての、脱アセチル化、およびＬｉｎｄｌａｒ触媒の存在下での水素化による、アジド基の、アミンへの選択的還元。
【００８２】
あるいは、１個のみのエチル基を、エタノール中のナトリウムエトキシドでの処理においてホスホネートジエステル７から除去し、アジド基のその後の還元後に、ホスホネートジエステル１ｃを得た。
【００８３】
工程７．  グアニジノ置換基を導入するために、化合物７におけるアジド基を、最初に還元して、アミンを得、これを、１，３−ビス（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−２−メチルチオプソイドウレアと、塩化水銀およびトリエチルアミンの存在下で反応させて、グアニジン化合物８を得た。
【００８４】
工程８．  ホスホネート８における両方のエチル基を、ブロモトリメチルシランによって除去し、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）基の同時の除去を、インサイチュで生じたＨＢｒに起因して、メタノールでのワークアップによって実現した。上記ザナミビルホスホネート（１ｂ）を、脱アセチル化によって得た。
【００８５】
あるいは、ホスホネートジエステル７を、ナトリウムエトキシドでモノエステルに変換し、続いて、トリフルオロ酢酸でＢｏｃ基を除去して、化合物１ｄを得た。
【００８６】
本発明の組成物は、必要に応じて、本明細書における化合物の塩（特に、薬学的に受容可能な非毒性塩（例えば、Ｎａ＋、Ｌｉ＋、Ｋ＋、Ｃａ＋＋、およびＭｇ＋＋を含む））を含む。このような塩としては、適切なカチオン（例えば、アルカリ金属イオンおよびアルカリ土類金属イオンもしくはアンモニウムイオンおよび四級アミンイオン）と酸アニオン部分との組み合わせによって得られるものが挙げられ得る。
【００８７】
金属塩は、金属水酸化物と本発明の化合物とを反応させることによって調製される。このようにして調製される金属塩の例は、Ｎａ＋、Ｌｉ＋、Ｋ＋を含む塩である。
【００８８】
さらに、塩は、塩基性中心（代表的には、アミン）への特定の有機酸および無機酸（例えば、ＨＣｌ、ＨＢｒ、Ｈ２ＳＯ４、もしくは有機スルホン酸）の酸付加から形成され得る。最後に、本明細書中の組成物は、本発明の化合物をそれらの非イオン化形態および両性イオン形態、ならびに水和物でのように化学量論的な量の水と結合（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）して含むことが理解されるべきである。本発明の別の局面は、ノイラミニダーゼの活性を阻害する方法に関し、上記方法は、ノイラミニダーゼを含むと疑われるサンプルを本発明の化合物で処置する工程を包含する。
【００８９】
本発明の化合物は、従来のキャリアおよび賦形剤とともに処方され、上記キャリアおよび賦形剤は、通常の実施に従って選択される。錠剤は、賦形剤、滑沢剤、充填剤、および結合剤などを含む。水性処方物は、滅菌形態で調製され、経口投与以外による送達が意図される場合、一般に、等張性である。すべての処方物は、必要に応じて、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ」（１９８６）（これは、その全体において参考として明示的に援用される）に示されるもののような賦形剤を含む。賦形剤としては、アスコルビン酸および他の抗酸化剤、キレート化剤（例えば、ＥＤＴＡ）、炭水化物（例えば、デキストリン）、ヒドロキシアルキルセルロース、ヒドロキシアルキルメチルセルロース、およびステアリン酸などが挙げられる。上記処方物のｐＨは、約ｐＨ３〜約ｐＨ１１の範囲に及ぶが、通常は、約ｐＨ７〜ｐＨ１０である。
【００９０】
本発明の１種以上の化合物（本明細書で活性成分といわれる）は、処置されるべき状態に適した任意の経路によって投与される。適切な経路としては、経口、直腸、鼻、局所（口腔および舌下を含む）、膣および非経口（皮下、筋肉内、静脈内、皮内、髄腔内および硬膜外を含む）などが挙げられる。好ましい経路が、例えば、レシピエントの状態で変動し得ることは、認識される。
【００９１】
上記活性成分が単独で投与されることは可能性がある一方で、それらを薬学的処方物として提示することは、好ましいことであり得る。本発明の処方物（獣医学的使用およびヒト使用の両方）は、少なくとも１種の活性成分（上記で定義されるとおり）と一緒に、そのための１種以上の受容可能なキャリア、および必要に応じて、他の治療成分を含む。上記キャリア（複数可）は、上記処方物の他の成分と適合性であり、そのレシピエントにとって生理学的に無害であるという意味において「受容可能」でなければならない。
【００９２】
上記処方物は、上記の投与経路に適切なものを含む。上記処方物は、便利なことには、単位剤形において提示され得、薬学分野で周知の方法のうちのいずれかによって調製され得る。技術および処方は、一般には、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  （Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｅａｓｔｏｎ，  Ｐａ．）において見いだされる。このような方法は、上記活性成分と１種以上の補助成分を構成するキャリアとを会合した状態にする工程を包含する。一般に、上記処方物は、均一にかつ密接に、上記活性成分と、液体キャリアもしくは微細に分割した固体キャリア、またはその両方を会合した状態にし、次いで、必要であれば、上記生成物を成形することによって、調製される。
【００９３】
経口投与に適した本発明の処方物は、別個の単位（例えば、カプセル剤、カシェ剤もしくは錠剤（各々は、所定の量の活性成分を含む））として；散剤もしくは顆粒剤として；液剤または水性の液体もしくは非水性の液体中の懸濁物として；または水中油型液体エマルジョンもしくは油中水型液体エマルジョンとして、調製される。上記活性成分はまた、ボーラス、舐剤もしくはパスタ剤として提示され得る。
【００９４】
錠剤は、必要に応じて、１種以上の補助成分とともに圧縮もしくは成形することによって作製される。圧縮錠剤は、適切な機械において、自由に流動する形態の活性成分を（例えば、粉末もしくは顆粒）を、必要に応じて、結合剤、滑沢剤、不活性希釈剤、保存剤、界面活性剤または分散剤と混合して圧縮することによって、調製され得る。成形された錠剤は、不活性液体希釈剤でしめらせた粉末化した活性成分の混合物を適切な機械で成形することによって作製され得る。上記錠剤は、必要に応じて、被覆され得るかまたは刻み目が付けられ、必要に応じて、上記活性成分のゆっくりとしたもしくは制御された放出を提供するために処方される。
【００９５】
眼もしくは他の外部組織（例えば、口および皮膚）の感染に関して、上記処方物は、好ましくは、例えば、０．０７５〜２０％  ｗ／ｗ（０．１％  ｗ／ｗずつ増えて、０．１％〜２０％の間の範囲の活性成分（複数可）を含む（例えば、０．６％  ｗ／ｗ、０．７％  ｗ／ｗなど））、好ましくは、０．２〜１５％  ｗ／ｗおよび最も好ましくは、０．５〜１０％  ｗ／ｗの量において、上記活性成分（複数可）を含む局所軟膏剤もしくはクリーム剤として適用される。軟膏剤に処方される場合、上記活性成分は、パラフィン基剤もしくは水混和性軟膏基剤のいずれかとともに使用され得る。
【００９６】
あるいは、上記活性成分は、クリーム剤において、水中油型クリーム基剤とともに処方され得る。
【００９７】
所望であれば、クリーム基剤の水相は、例えば、少なくとも３０％  ｗ／ｗの多価アルコール（すなわち、２個以上のヒドロキシル基を有するアルコール（例えば、プロピレングリコール、ブタン１，３−ジオール、マンニトール、ソルビトール、グリセロールおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ  ４００を含む）ならびにこれらの混合物））を含み得る。局所処方物は、望ましくは、皮膚もしくは他の罹患領域を通って上記活性成分の吸収もしくは浸透を増強する化合物を含み得る。このような皮膚浸透増強剤の例としては、ジメチルスルホキシド（ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｐｈｏｘｉｄｅ）および関連アナログが挙げられる。
【００９８】
本発明のエマルジョンの油相は、公知の様式において公知の成分から構成され得る。上記相は、単に乳化剤（別途、乳化剤（ｅｍｕｌｇｅｎｔ）として公知）を含み得る一方で、望ましくは、少なくとも１種の乳化剤と、脂肪もしくは油との、または脂肪および油の両方との混合物を含む。好ましくは、親水性乳化剤が、安定化剤として作用する親油性乳化剤と一緒に含まれる。油および脂肪の両方を含むこともまた、好ましい。一緒に、安定化剤（複数可）が存在もしくは存在しない乳化剤（複数可）は、いわゆる乳化ワックスを構成し、上記ワックスは、上記油および脂肪と一緒に、いわゆる乳化軟膏基剤（これは、クリーム処方物の油性分散相を形成する）を構成する。
【００９９】
本発明の処方物における使用に適した乳化剤およびエマルジョン安定化剤としては、ＴｗｅｅｎＴＭ  ６０、ＳｐａｎＴＭ  ８０、セトステアリルアルコール、ベンジルアルコール、ミリスチルアルコール、グリセリルモノステアレートおよびラウリル硫酸ナトリウムが挙げられる。
【０１００】
上記処方物に適切な油もしくは脂肪の選択は、所望の審美的特性を達成することに基づく。上記クリーム剤は、好ましくは、ベタベタせず、色移りせず、チューブもしくは他の容器から漏れるのを回避するために適切な粘稠度を有する洗浄可能な生成物であるべきである。直鎖もしくは分枝鎖の、一塩基性アルキルエステルもしくは二塩基性アルキルエステル（例えば、ジイソアジペート、イソセチルステアレート、ココナツ脂肪酸のプロピレングリコールジエステル、イソプロピルミルステート、デシルオレエート、イソプロピルパルミテート、ブチルステアレート、２−エチルヘキシルパルミテートまたは分枝鎖エステル（Ｃｒｏｄａｍｏｌ  ＣＡＰとして公知）のブレンド）が使用され得、最後の３つは、好ましいエステルである。これらは、必要とされる特性に依存して、単独で、もしくは組み合わせにおいて使用され得る。あるいは、高融点脂質（例えば、白色ワセリンおよび／もしくは流動パラフィンまたは他のミネラルオイル）が使用される。
【０１０１】
眼への局所投与に適した処方物としてはまた、上記活性成分が適切なキャリア（特に、上記活性成分のための水性溶媒）に溶解もしくは懸濁される点眼剤が挙げられる。上記活性成分は、好ましくは、０．５〜２０％、有利なことには、０．５〜１０％、特に、約１．５％  ｗ／ｗの濃度で、このような処方物に存在する。
【０１０２】
口内での局所投与に適した処方物としては、上記活性成分を、風味を添えた基剤（通常は、スクロースおよびアカシアもしくはトラガカント）に含むロゼンジ；上記活性成分を不活性基剤（例えば、ゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアカシア）に含む香錠；および上記活性成分を適切な液体キャリアに含むマウスウォッシュが挙げられる。
【０１０３】
直腸投与のための処方物は、適切な基剤（例えば、カカオ脂もしくはサリチレートを含む）による坐剤として提示され得る。
【０１０４】
肺内投与もしくは鼻投与に適した処方物は、例えば、０．１〜５００ミクロンの範囲の粒径（ミクロンずつ増えて、０．１〜５００ミクロンの間の範囲の粒径（例えば、０．５ミクロン、１ミクロン、３０ミクロン、３５ミクロンなど）を含む）を有し、これは、肺胞嚢に達するように、鼻経路からの迅速な吸入によって、もしくは口からの吸入によって、投与される。適切な処方物は、上記活性成分の水性溶液もしくは油性溶液を含む。エアロゾルもしくは乾燥粉末の投与に適した処方物は、従来の方法に従って調製され得、他の治療剤（例えば、インフルエンザＡもしくはインフルエンザＢ感染症の処置もしくは予防において本明細書以前で使用された化合物）とともに送達され得る。
【０１０５】
膣投与に適した処方物は、上記活性成分に加えて、適切であることが当該分野で公知であるような、このようなキャリアを含む、ペッサリー、タンポン、クリーム剤、ゲル剤、パスタ剤、発泡物（ｆｏａｍ）もしくはスプレー処方物として提示され得る。
【０１０６】
非経口投与に適した処方物としては、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および上記処方物を意図されるレシピエントの血液と等張性にする溶質を含み得る、水性および非水性の滅菌注射液剤；ならびに懸濁化剤および増粘剤を含み得る、水性および非水性の滅菌懸濁剤が挙げられる。
【０１０７】
上記処方物は、単位用量もしくは複数用量の容器（例えば、シールされたアンプルおよびバイアル）において提示され、使用直前に滅菌液体キャリア（例えば、注射用水）の添加のみを必要とするフリーズドライした（凍結乾燥した）状態で貯蔵され得る。即席の注射溶液および懸濁物は、以前に記載された種類のうちの滅菌散剤、顆粒剤および錠剤から調製される。好ましい単位投与量の処方物は、本明細書で上記に記載されるように、上記活性成分の日用量もしくは単位１日分割用量（ｕｎｉｔ  ｄａｉｌｙ  ｓｕｂ−ｄｏｓｅ）、またはその適切な小部分（ｆｒａｃｔｉｏｎ）を含むものである。
【０１０８】
上記で特に言及される成分に加えて、本発明の処方物は、問題の処方物のタイプを考慮して、当該分野で従来の他の剤を含み得ることは、理解されるべきである（例えば、経口投与に適したものとしては、香味剤が挙げられ得る）。
【０１０９】
本発明は、獣医学的組成物のための獣医学的キャリアと一緒に、上記で定義されるとおりの少なくとも１種の活性成分を含む獣医学的組成物をさらに提供する。獣医学的キャリアは、上記組成物を投与する目的で有用な材料であり、そしてそれは、固体、液体もしくは気体の材料であり得、これらは、別の方法で、不活性であるかもしくは獣医学分野において受容可能であり、上記活性成分と適合性である。これら獣医学的組成物は、経口的に、非経口的に、もしくは任意の他の所望の経路によって、投与され得る。本発明の化合物は、活性成分として１種以上の本発明の化合物を含む、制御された放出の薬学的処方物（「制御放出処方物」）を提供するために使用される。ここで上記活性成分の放出は制御および調節されて、より少ない頻度の投薬を可能にするか、所定の活性成分の薬物動態プロフィールもしくは毒性プロフィールを改善する。活性成分の有効用量は、少なくとも、処置される状態の性質、毒性、上記化合物が、予防的に使用される（低用量）のか、または活発なインフルエンザ感染に対して使用されるのか、送達法、および薬学的処方に依存し、従来の用量漸増試験を使用して、臨床医によって決定される。それは、約０．０００１〜約１００ｍｇ／ｋｇ  体重／日、代表的には、約０．０１〜約１０ｍｇ／ｋｇ  体重／日、より代表的には、約０．０１〜約５ｍｇ／ｋｇ  体重／日、より代表的には、約０．０５〜約０．５ｍｇ／ｋｇ  体重／日であると予測され得る。例えば、吸入に関しては、約７０ｋｇ体重の成人の１日の候補用量は、１ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは、５ｍｇ〜５００ｍｇの間の範囲であり、そして単一用量もしくは複数用量の形態をとり得る。
【０１１０】
一実施において、本発明の活性成分はまた、他の活性成分と組み合わせて使用される。このような組み合わせは、処置されるべき状態、成分の交差反応性および上記組み合わせの薬物特性に基づいて選択される。例えば、呼吸器系のウイルス感染症（特に、インフルエンザ感染）を処置する場合に、本発明の組成物は、抗ウイルス剤（例えば、アマンタジン（ａｍａｎｔｉｄｉｎｅ）、リマンタジンおよびリバビリン）、粘膜溶解薬、去痰薬、気管支拡張薬（ｂｒｏｎｃｈｉａｌｄｉｌａｔｏｒ）、抗生物質、解熱剤、もしくは鎮痛剤と組み合わせられる。通常は、抗生物質、解熱剤、および鎮痛剤が、本発明の化合物と一緒に投与される。
【０１１１】
本発明の別の実施は、本明細書に記載される化合物のインビボ代謝生成物が先行技術を通して新規かつ非自明である程度まで、そのような生成物を含む。このような生成物は、例えば、主に酵素的プロセスに起因して、投与される上記化合物の酸化、還元、加水分解、アミド化、およびエステル化などから生じ得る。よって、本発明は、本発明の化合物と哺乳動物とを、その代謝産物を生じるに十分な期間にわたって接触させる工程を包含するプロセスによって生成される、新規かつ非自明の化合物を包含する。このような生成物は、代表的には、本発明の放射標識された（例えば、１４Ｃもしくは３Ｈ）化合物を調製し、これを、検出可能な用量（例えば、約０．５ｍｇ／ｋｇより多い）において動物（ラット、マウス、モルモット、サルなど）、もしくはヒトに非経口投与し、十分な時間を与えて代謝が起こるようにし（代表的には、約３０秒間〜３０時間）、そしてその変換生成物を、尿、血液もしくは他の生物学的サンプルから単離することによって、同定される。これら生成物は、容易に単離される。なぜなら、それらは、標識されているからである（他のものは、代謝産物に残っているエピトープを結合し得る抗体の使用によって単離される）。代謝産物の構造は、従来の様式で（例えば、ＭＳもしくはＮＭＲ分析によって）決定される。一般に、代謝産物の分析は、当業者に周知の従来からの薬物代謝研究と同じ方法で行われる。上記変換生成物は、それらが別の方法でインビボで見いだされない限り、たとえ、それら自体がノイラミニダーゼ阻害活性を有さないとしても、本発明の化合物の治療的投薬のための診断アッセイにおいて有用である。
【０１１２】
新規なホスホネート同族体のプロドラッグが、企図される。極性のホスホネート基およびグアニジニウム基はともに、必要に応じて、薬物動態および／もしくは薬力学的特性を増強するために、当該分野で公知の技術によってさらに官能化され得る。例えば、プロドラッグ（例えば、アシルオキシメチルホスホネートエステルおよびアリールホスホネートエステル）の処方および使用は、経口的なバイオアベイラビリティーを増強するために利用され得る（Ｋｒｉｓｅ  ａｎｄ  Ｓｔｅｌｌａ，  Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．  Ｒｅｖ．  １９９６，  １９，  ２８７）。
【０１１３】
本発明の一局面において、ノイラミニダーゼを含むと疑われるサンプルは、天然の材料もしくは人の手で作られた材料（例えば、生きている生物；組織もしくは細胞培養物；生物学的サンプル（例えば、生物学的材料のサンプル（血液、血清、尿、脳脊髄液、涙液、痰、唾液、および組織サンプルなど））；実験室サンプル；食品、水、もしくは空気のサンプル；生体生成物サンプル（例えば、細胞抽出物、特に、所望の糖タンパク質を合成する組換え細胞など））を含む。代表的には、上記サンプルは、ノイラミニダーゼを生成する生物（頻繁には、ウイルスのような病原性生物）を含むと疑われる。サンプルは、水および有機溶媒／水混合物を含む任意の媒体に含まれ得る。サンプルは、生きている生物（例えば、ヒト）、および人の手で作られた材料（例えば、細胞培養物）を含む。
【０１１４】
本発明の処理工程は、本発明の組成物を上記サンプルに添加する工程を包含するか、または上記組成物の前駆物質を上記サンプルに添加する工程を包含する。上記添加工程は、上記のような、任意の投与法を含む。所望であれば、上記組成物の適用後のノイラミニダーゼの活性を、任意の方法（ノイラミニダーゼ活性を検出する直接的および間接的な方法が挙げられる）によって観察し得る。ノイラミニダーゼ活性を決定する定量的、定性的、および半定量的な方法が、すべて企図される。代表的には、上記のスクリーニング法のうちの１つが適用されるが、任意の他の方法（例えば、生きている生物の生理学的特性の観察）もまた、適用可能である。
【０１１５】
ノイラミニダーゼを含む生物としては、細菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、およびＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｉａｌｏｐｈｉｌｕｓ）およびウイルス（特に、オルソミクソウイルスもしくはパラミクソウイルス（例えば、インフルエンザウイルスＡ（例えば、Ｈ１Ｎ１、Ｈ５Ｎ１）およびインフルエンザウイルスＢ）、パラインフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、ニューキャッスル病ウイルス、家禽ペストウイルス、およびセンダイウイルス）が挙げられる。これら生物のうちのいずれかから得られるもしくはいずれかに見出されるノイラミニダーゼ活性の阻害は、本発明の目的の範囲内である。インフルエンザウイルスのウイルス学は、「Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ」（Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８６），第２４章に記載される。本発明の化合物は、インフルエンザ感染症の予防、または動物（例えば、アヒルおよび他のトリ、齧歯類、ブタ）、もしくはヒトにおける既存のインフルエンザ感染症の処置において有用である。
【０１１６】
本発明の組成物は、酵素活性を評価するための従来技術のうちのいずれかによって、ノイラミニダーゼに対する阻害活性についてスクリーニングされる。本発明の状況内で、代表的には、組成物は、最初に、ノイラミニダーゼの阻害についてインビトロでスクリーニングされ、阻害活性を示す組成物は、次いで、活性についてインビボでスクリーニングされる。
【０１１７】
約５×１０−６Ｍ未満、代表的には、約１×１０−７Ｍ未満、および好ましくは、約５×１０−８Ｍ未満のインビトロＫｉ（阻害定数）を有する組成物は、インビボでの使用に好ましい。
【０１１８】
有用なインビトロスクリーニングは、詳細に記載されており、ここでは詳述されない（Ｉｔｚｓｔｅｉｎ，  Ｍ．  ｖｏｎ  ｅｔ  ａｌ．；  「Ｎａｔｕｒｅ」，  ３６３（６４２８）：４１８−４２３  （１９９３）；  Ｐｏｔｉｅｒ，  Ｍ．；  ｅｔ  ａｌ；  「Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．」，  ９４：２８７−２９６  （１９７９）；  Ｃｈｏｎｇ，  Ａ．  Ｋ．  Ｊ．；  ｅｔ  ａｌ；  「Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ」，  １０７７：６５−７１  （１９９１）；およびＣｏｌｍａｎ，  Ｐ．  Ｍ．；  ｅｔ  ａｌ；国際公開番号ＷＯ  ９２／０６６９１  （国際出願番号ＰＣＴ／ＡＵ９０／００５０１（公開日１９９２年４月３０日）））。インビボスクリーニングもまた、詳細に記載されている（Ｉｔｚｓｔｅｉｎ，  ｅｔ  ａｌ，  １９９３  特に、４２１頁第２欄第１段落の全て〜第４２３頁第２欄１段落の一部、およびＣｏｌｍａｎ，ｐ．３６）。
【０１１９】
表１は、ザナミビルおよびオセルタミビル酸との比較において、ザナミビルホスホネート誘導体１ａおよび１ｂのノイラミニダーゼ阻害、抗インフルエンザ活性、および細胞傷害活性を示す。上記ホスホネート誘導体１ａおよび１ｂは、種々の野生型インフルエンザウイルスおよび変異型インフルエンザウイルスに対してザナミビルより有効性を示した。
【０１２０】
【表１】
0005947289.tif 000017
【０１２１】
ａインフルエンザウイルス  Ａ／ＷＳＮ／１９３３（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ＷＳＮ／１９３３（Ｈ１Ｎ１）に由来するＨ２７４Ｙノイラミニダーゼ変異型、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９（汎流行性Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４  ＲＧ１４（Ｈ５Ｎ１）、およびＡ／Ｕｄｏｒｎ／３０７／１９７２（Ｈ３Ｎ２）を、ノイラミニダーゼ阻害および抗インフルエンザアッセイのためのバイオアッセイ材料として使用した。ヒト２９３Ｔ細胞を、化合物についての細胞傷害性測定のために使用した。
ｂ蛍光基質である２’−（４−メチルウンベリフェリル）−α−Ｄ−Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＭＵＮＡＮＡ）を、異なるインフルエンザノイラミニダーゼ酵素の５０％阻害を引き起こす化合物濃度であるＩＣ５０値を決定するために使用した。
ｃ阻害定数を、基質としてＭＵＮＡＮＡを使用する動態研究によって決定した。
ｄ異なるインフルエンザ株に対する上記抗インフルエンザ活性を、異なるインフルエンザ株による感染に起因して、細胞変性効果の５０％防御についての化合物濃度であるＥＣ５０値として測定した。
ｅ最高濃度を、２９３Ｔ細胞に対する細胞傷害性のアッセイにおいて顕著な毒性効果なく使用した。
【０１２２】
上記ノイラミニダーゼ阻害アッセイを、酵素源としてインフルエンザ関連ノイラミニダーゼを使用して、いくつかのインフルエンザ株のノイラミニダーゼに対して測定した。蛍光基質であるＭＵＮＡＮＡ（２’−（４−メチルウンベリフェリル）−α−Ｄ−Ｎ−アセチルノイラミン酸）を使用して、すべてのウイルス酵素についてのノイラミニダーゼ活性を測定した。表１は、ノイラミニダーゼ活性の５０％阻害のための化合物濃度を測定し、これら化合物の相対的ノイラミニダーゼ阻害効力を評価するＩＣ５０値を示す。
【０１２３】
すべての５種のノイラミニダーゼに対する１ａおよび１ｂの両方についてのＩＣ５０値は、すべて、ザナミビルより顕著に強力であり、オセルタミビル酸のものについては同様である。これら２種のホスホネート化合物は、チロシン残基が上記ノイラミニダーゼの２７４位において親ヒスチジンを置き換えるＷＳＮ  ２７４Ｙのオセルタミビル耐性ノイラミニダーゼ変異型を阻害することにおいて顕著により活性である。
【０１２４】
これら化合物の抗インフルエンザ活性を、インフルエンザ感染媒介性細胞変性効果を防御する能力について、５つのインフルエンザ株に対して測定した。上記抗インフルエンザ活性を、上記感染媒介性細胞変性効果の５０％防御のための濃度であるＥＣ５０値として決定した。表１は、１ａおよび１ｂが、Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルス（例えば、ＷＳＮ株および２００９年の汎流行性Ｈ１Ｎ１株）に対してより大きな抗インフルエンザ活性を有することを示す。
【０１２５】
１ａおよび１ｂの抗インフルエンザ活性は、上記オセルタミビル耐性ＷＳＮ（Ｈ１Ｎ１）ウイルスに対して特に顕著である。２７４位において上記オセルタミビル耐性ノイラミニダーゼ変異を有するＨ１Ｎ１インフルエンザウイルスは、クリニックにおいて優勢なＨ１Ｎ１分離株であった（Ｍｏｓｃｏｎａ，  Ａ．  Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ２００５，  ３５３，  ２６３３）。この変異ノイラミニダーゼについて１ａおよび１ｂの優れた抗インフルエンザ活性は、この優勢なインフルエンザ株を処置するための選択に影響を及ぼし得る。上記Ｈ１Ｎ１インフルエンザ株に対する強力な抗インフルエンザインヒビターであることに加えて、１ａおよび１ｂはまた、ＲＧ１４（Η５Ν１）およびＵｄｏｒｎ（Η３Ν２）インフルエンザ株に対する抗インフルエンザ薬剤として、ザナミビルに匹敵する。
【０１２６】
バイオアッセイ測定値は、１ａおよび１ｂの両方が、強力な抗ノイラミニダーゼ化合物および抗インフルエンザ化合物であることを示した。それらは、一般に、ザナミビルより強力であり、上記オセルタミビル耐性Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルスに対して非常に活性である。強力な抗インフルエンザ薬剤であることに加えて、それらは、最高の試験濃度においてヒト２９３Ｔ細胞に対して非毒性である（表１）。
【０１２７】
本開示の一実施において、ホスホネート１ａは、強力なＮＡインヒビターであり、それぞれ、０．６５ｎＭおよび１．３ｎＭのＩＣ５０およびＥＣ５０値を有するＡ／ＷＳＮ／１９３３（Ｈ１Ｎ１）ウイルスに対する抗インフルエンザ薬剤である。
【０１２８】
本開示の一実施において、ホスホネート１ａは、強力なＮＡインヒビターであり、それぞれ、０．５ｎＭおよび２７ｎＭのＩＣ５０値およびＥＣ５０値を有するＡ／ＷＳＮ／１９３３  （Ｈ１Ｎ１）ウイルスのＨ２７４Ｙ変異体に対する抗インフルエンザ薬剤である。上記ザナミビルホスホネートのこれらＩＣ５０値およびＥＣ５０値は、タミフル耐性Ｈ１Ｎ１ウイルスについて特に印象的である。
【０１２９】
本開示の一実施において、ホスホネート１ａはまた、強力なＮＡインヒビターであり、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９（汎流行性Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４  ＲＧ１４（Ｈ５Ｎ１）、およびＡ／Ｕｄｏｒｎ／３０７／１９７２（Ｈ３Ｎ２）ウイルスに対する抗インフルエンザ薬剤である。
【０１３０】
本開示の一実施において、ホスホネート１ｂは、強力なＮＡインヒビターであり、それぞれ、１．２ｎＭおよび２．４ｎＭのＩＣ５０値およびＥＣ５０値を有するＡ／ＷＳＮ／１９３３（Ｈ１Ｎ１）ウイルスに対する抗インフルエンザ薬剤である。
【０１３１】
本開示の一実施において、ホスホネート１ｂは、強力なＮＡインヒビターであり、それぞれ、０．２５ｎＭおよび２６ｎＭのＩＣ５０値およびＥＣ５０値を有するＡ／ＷＳＮ／１９３３（Ｈ１Ｎ１）ウイルスのＨ２７４Ｙ変異体に対する抗インフルエンザ薬剤である。タミフル耐性Ｈ１Ｎ１ウイルスに対する１ｂの高い効力は、非常に顕著である。
【０１３２】
本開示の一実施において、ホスホネート１ｂはまた、強力なＮＡインヒビターであり、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９（汎流行性Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４  ＲＧ１４（Ｈ５Ｎ１）、およびＡ／Ｕｄｏｒｎ／３０７／１９７２（Ｈ３Ｎ２）ウイルスに対する抗インフルエンザ薬剤である。
【０１３３】
本発明の一局面において、ノイラミニダーゼ−ホスホネート複合体の分子モデリングは、上記ホスホネートと活性部位における３個のアルギニン残基との直接関係のある結合様式を示す。既知のＮｌ結晶構造（ＰＤＢコード：  ２ＨＵ４）を使用する分子ドッキング実験（図２）は、上記ホスホネートインヒビター１ｂが、ＮＡの３個のアルギニン残基と強力に結合すること、加えて、ノイラミニダーゼ−ザナミビル複合体と同様に結合ポケットにおいて、Ｃ７−Ｃ９グリセリル基、Ｃ４−アセトアミド基およびＣ５−グアニジノ基によって発揮される他の相互作用を明らかにしている。
【０１３４】
本発明の一局面において、ホスホネートインヒビター１ａの分子モデリングは、ノイラミニダーゼの３個のアルギニン残基との強い相互作用、加えて、結合ポケットにおけるＣ７−Ｃ９グリセリル基、Ｃ４−アセトアミド基およびＣ５−アミノ基によって発揮される他の相互作用を示した（図２）。
【０１３５】
（タミフル耐性ウイルス分離株の同定）
本明細書は、ここで、タミフル耐性ウイルス分離株の有効な診断法を開発するための結合競合による耐性評価（Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｂｙ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｎ）（ＲＡＢＣ）の方法の設計および実施を開示する。
【０１３６】
ザナミビルおよびＯＣは、インフルエンザノイラミニダーゼ（ＮＡ）の同じ活性部位に結合する。しかし、オセルタミビル耐性Ｈ５Ｎ１ウイルスノイラミニダーゼは、ザナミビルになお感受性を保持し得る（Ｃｏｌｌｉｎｓ  ＰＪ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）．  Ｎａｔｕｒｅ  ４５３  （７１９９）：  １２５８−  １２６１）。Ｇｌｕ２７６残基の、Ａｒｇ２２４への再配向（より大きな疎水性ポケットを作り出す）を包含するノイラミニダーゼの誘導適合は、ＯＣの側鎖を収容する（ａｃｃｏｍｍｏｄａｔｅ）ために必要とされる（Ｍ．  Ｚ．  Ｗａｎｇ，  Ｃ．  Ｙ．  Ｔａｉ，  Ｄ．  Ｂ．  Ｍｅｎｄｅｌ，  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４６，  ３８０９  （２００２）；  Ｐ．  Ｊ．  Ｃｏｌｌｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ  ，  Ｎａｔｕｒｅ  ４５３，  １２５８  （２００８））。Ｎ１群のノイラミニダーゼは、変異を有する耐性形態（例えば、上記疎水性ポケットの形成を妨げ、オセルタミビルのＫｉ値において数百倍の増大を生じるＨ２７４Ｙ）へと進化し得る。疎水性ポケットの必要性がない場合、Ｈ２７４Ｙノイラミニダーゼに対するザナミビルのＫｉは、変化しない（Ｐ．  Ｊ．  Ｃｏｌｌｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ  ，  Ｎａｔｕｒｅ  ４５３，  １２５８  （２００８））。本発明の特徴において、結合の差異を調査して、ウイルス分離株のＯＣ感受性についての新規な診断法を開発した。
【０１３７】
インフルエンザウイルスノイラミニダーゼのオセルタミビル結合領域に結合する認識ユニット（Ｒ）の選択、およびインフルエンザウイルスのオセルタミビル感受性バージョンと、オセルタミビル耐性バージョンとの間の差次的結合を使用することは、驚くべきことに、インフルエンザウイルスのタミフル耐性株を検出するための基本であることがわかった。
【０１３８】
本発明の特定の局面において、上記認識ユニット（Ｒ）は、感知ユニット（Ｓ）に繋がれる。いくつかの実施形態において、上記認識ユニット（Ｒ）は、リンカー（Ｌ）に繋がれ、続いて、リンカー（Ｌ）が感知ユニット（Ｓ）に繋がれる。そのＲ−Ｌ−Ｓ分子は、タミフル耐性インフルエンザウイルスを、タミフル感受性インフルエンザウイルスから区別するために使用される。
【０１３９】
強力なノイラミニダーゼインヒビターであることから、オセルタミビルカルボキシレート（ＯＣ；タミフル（登録商標））は、インフルエンザウイルスにおけるＮＡ分子に結合する非ＯＣ分子（Ｒ）の有効な競合因子である。しかし、ＯＣは、非ＯＣ認識ユニット（Ｒ）をなお結合し、等しく野生型ＮＡも結合するＯＣ耐性変異型（例えば、Ｈ２７４Ｙ）に対する結合の不十分な競合因子である。
【０１４０】
上記認識ユニット（Ｒ）は、代表的には、ザナミビルのような既知のＮＡ結合部分、タミホスホルグアニジンモノエステル、またはザナミビルホスホネート１ａもしくはその誘導体１ｂ、１ｃおよび１ｄから選択される。いくつかの実施形態において、Ｒは、米国特許第７，８８８，３３７Ｂ２号に開示されるように、Ｈ１Ｎ１ウイルスおよびＨ５Ｎ１ウイルスの野生型およびＨ２７４Ｙ変異型に対するノイラミニダーゼインヒビターとしての活性を有するオセルタミビル含有ホスホネート化合物から選択される。
【０１４１】
ＮＡへの結合は、上記感知部分（すなわち、検出可能な部分）からのシグナルが観察され得ることによって検出される。このような同種の（ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ）蛍光感知部分および熱量感知部分は、当業者に公知である。例えば、Ｗａｎｇ  Ｑ．  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ，「Ａ  ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ−１４  ３Ｃ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｕｓｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｐ−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅｓ  ａｓ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ」  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｖｏｌ．  ２５２，  ｐｐ．  ２３８−４５  （１９９７）、およびＢａｓａｋ  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  「Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｅｌｕｃｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｂｉｏａｓｓａｙ  ｏｆ  ｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ  ４  ｕｓｉｎｇ  ｉｎｔｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒｌｙ  ｑｕｅｎｃｈｅｄ  ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ」  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  Ｖｏｌ．  ３８０，  ｐｐ．  ５０５−１４  （２００４）を参照のこと。
【０１４２】
上記感知ユニットは、直接的にもしくは間接的に（アビジン／ストレプトアビジン−ビオチン、抗体−抗原、もしくは当該分野で公知の他の方法を介して）、蛍光標識、金標識および酵素標識からなる群より選択される検出可能な部分に連結される。種々の種類のセンサーは、特に限定されず、上記目的に従って適切に選択され得る。その例としては、放射活性標識、量子ドット標識、およびタンパク質標識などが挙げられる。
【０１４３】
いくつかの局面において、上記感知ユニットは、結合体化した結合パートナーと検出可能な結合複合体を形成し（結合対を形成する）、ここで上記結合パートナーは、試薬に結合体化されている。上記結合対は、以下のうちのいずれかに基づき得る：上記結合対は、ストレプトアビジン：ビオチン；  アビジン：ビオチン；  葉酸：フォレート（ｆｏｌａｔｅ）結合タンパク質；  シアル酸、炭水化物、もしくは糖タンパク質：レクチン；  オリゴ−ｄＡもしくはポリ−ｄＡ：オリゴ−ｄＴもしくはポリ−ｄＴ；  オリゴ−ｄＣもしくはポリ−ｄＣ：オリゴ−ｄＧもしくはポリ−ｄＧ；  フェニルボロン酸：サリチルヒドロキサム酸；  アルデヒドおよびケトン部分：ヒドラジド；  スルフヒドリル部分：マレイミド；  アミノ部分：Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル；  ならびに重金属：チオール；  ＩｇＧのＦｃ部分：プロテインＡ／プロテインＧ／プロテインＡ／Ｇ；  ジゴキシゲニン：抗ジゴキシゲニン；  ５−ブロモデオキシウリジン：抗ブロモデオキシウリジン；  ジニトロフェニル：抗ジニトロフェニル；  フルオレセインイソチオシアネート：抗フルオレセインイソチオシアネート；  Ｎ−２−アセチルアミノフルオレン：抗Ｎ−２−アセチルアミノフルオレン；  ならびにＮ−２−アセチルアミノ−７−ヨードフルオレン：抗Ｎ−２−アセチルアミノ−７−ヨードフルオレンからなる群より選択されるいずれか１つである。
【０１４４】
特定の局面において、上記標識は、蛍光団を含む。いくつかの局面において、上記蛍光団は、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、レゾルフィン、キサンテン、シアニン、ピレン、フタロシアニン、フィコビリタンパク質、Ａｌｅｘａ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、スクアライン色素、エネルギー移動色素を生じる組み合わせ、ならびにこれらの誘導体からなる群より選択される。上記Ａｌｅｘａ蛍光色素は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２からなる群より選択され得る。いくつかの実施形態において、上記蛍光団は、ＢＯＤＩＰＹマレイミド、ヨードアセトアミドおよびメチルブロミド；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒマレイミド；フルオレセイン５−およびフルオレセイン６−アイソマーマレイミドならびにメチルブロミド；オレゴングリーンイソチオシアネートおよびマレイミド；テトラメチルローダミン５−アイソマー  ヨードアセトアミドおよびマレイミドならびにテトラメチルローダミン６−アイソマー  ヨードアセトアミドおよびマレイミド；ローダミンレッドマレイミド；テキサスレッドブロモアセトアミドおよびマレイミド；ピリジルオキサゾールマレイミド；ベンゾオキサジアゾール誘導体（ＮＢＤハライドおよびヨードアセトアミドを含む）、ＳＢＤ；ルシファーイエローヨードアセトアミド；スチルベンヨードアセトアミドおよびマレイミド；クマリンマレイミドおよびヨードアセトアミド、すなわち、ＭＤＣＣ、ＩＤＣＣなど；ナフタレン誘導体（すなわち、アクリロダン、バダン、ＩＡＡＮＳ、ＭＩＡＮＳ、ＩＡＥＤＡＮＳ、およびダンシル；アジリジン；ダポキシル誘導体（すなわち、ダポキシル（２−ブロモアセトアミジル）スルホンアミド；ピレンマレイミドおよびヨードアセチル誘導体；ならびにモノブロモ−およびモノクロロビマンからなる群より選択される。
【０１４５】
上記感知ユニット（Ｓ）からのシグナルを検出するための方法もしくは手段は、特に限定されず、上記目的に従って適切に選択され得る。例えば、上記シグナルが発光、消光などである場合、それは、光検出器、カメラなどによって検出される。
【０１４６】
上記発光部分と消光部分との組み合わせは、特に制限されず、上記目的に従って適切に選択され得る。例えば、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）などの技術として公知のものは、適切に採用され得る。
【０１４７】
上記発光部分は、これが発光し得る限りにおいて特に限定されず、上記目的に従って適切に選択され得る。その例としては、蛍光物質、化学発光物質、電気化学発光物質などを含むもの、またはこれら物質から形成されるものが挙げられる。これらは、単独で使用されてもよいし、２種以上が組み合わされて使用されてもよい。これらの中で、上記消光部分が上記発光部分に隣接して存在する場合、上記消光部分の作用によって発光が消光されるものが好ましく、蛍光物質が、その視認性が優れておりかつ検出が容易であるという点で、より好ましい。上記蛍光物質は、特に限定されず、上記目的に従って適切に選択され得る。その例としては、アントラセン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン（例えば、テトラメチルローダミン、およびスルホローダミン）、ダンシルクロリド、テキサスレッド、ＡＬ  ３５０、およびインドカルボシアニン（ＣＹ）などが挙げられる。
【０１４８】
上記消光部分は、これが、上記発光部分に隣接して位置する場合に上記発光部分の発光を消光し得るようであれば、特に限定されず、上記消光部分は、上記発光部分のタイプなどに従って適切に選択され得る。その例としては、消光物質を含むもの、または上記消光物質から形成されるものが挙げられる。上記消光物質は、特に限定されず、上記目的に従って適切に選択され得る。上記発光部分が、上記蛍光物質から形成される場合、上記消光物質の例としては、上記蛍光物質が発光する場合に放出されるエネルギーを吸収し得る物質などが挙げられる。適切な例としては、上記発光物質の間の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を可能にする物質を含む。具体例としては、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、ジメチルアミノベンゼンスルホニル（ＤＡＢＳＹＬ）、金ナノ粒子、およびブラックホールクエンチャーなどが挙げられる。
【０１４９】
上記認識ユニットは、センサーに結合体化され、上記センサーは、続いて、発光部分および消光部分に結合される。上記消光部分は、上記認識ユニットがその標的ＮＡに結合する前に（すなわち、上記消光部分が、上記発光部分に隣接して存在する場合に）、上記発光部分の発光を消光し得る。上記認識ユニットがその標的ＮＡに結合した後、上記消光部分は、上記標的核酸から解離する。結果として、上記消光部分は、上記発光部分から離れ存在し、上記消光部分の作用の喪失を生じ、上記発光部分が発光を生じることを可能にする。
【０１５０】
上記リンカーユニット（Ｌ）は、特に限定されず、本発明の効果を損なわない限り、適切に選択され得る。例えば、水溶性リンカー（例えば、エチレングリコールリンカー）が、使用され得る。上記水溶性リンカーの長さは、適切な長さへと決定され得る。
【０１５１】
一局面において、試験されるべきインフルエンザウイルスサンプルもしくはＲ−Ｌ−Ｓ複合体のいずれかが、アレイのような固体表面に固定される。上記固体表面は、Ｌａｎｇｍｕｉｒ  Ｂｌｏｄｇｅｔｔフィルム、ガラス、ゲルマニウム、ケイ素、（ポリ）テトラフルオロエチレン、ポリスチレン、ヒ化ガリウム、リン化ガリウム、酸化ケイ素、窒化ケイ素、およびこれらの組み合わせからなる群より選択され得る。上記固体表面は、マイクロウェルもしくはマイクロタイタープレートもしくはディッシュ、シリコンチップ、ガラススライド、ビーズ、微粒子、フィルムもしくは膜、ボトル、ディッシュ、スライド、ブロッティング材料、フィルタ、ファイバー、織布繊維、成形ポリマー、粒子、ディップスティック、試験管、チップ、およびマイクロチップからなる群より選択される任意のものであり得る。
【０１５２】
一実施形態において、上記インフルエンザウイルスおよび／もしくはウイルス粒子は、天然もしくは合成のオリゴサッカリド（これは、グリコホリン、α１−酸糖タンパク質、α２−マクログロブリン、オボムコイド、およびこれらの組み合わせのような糖タンパク質に結合体化されるか、またはこれらとの組成物中に置かれる（ｓｉｔｕａｔｅｄ））からなる群より選択される炭水化物レセプター（該炭水化物レセプターは、上記ウイルスおよび／もしくはウイルス粒子のヘマグルチニン成分に結合する）のうちの少なくとも１つのタイプを含む支持体に結合される。特に、タミフル（登録商標）に通常感受性であるすべての公知のトリインフルエンザ（ＡＩ）サブタイプを含むインフルエンザウイルスおよび／もしくはウイルス粒子は、検出され得る。上記方法は、タミフル（登録商標）に耐性である非常に病原性のバリアントを含むインフルエンザウイルスおよび／もしくはウイルス粒子を検出するために適している。本発明は、特に、クロマトグラフィー用紙もしくは膜である支持体を用いて行われ得る。このような材料は、当業者に周知である。本発明によれば、上記炭水化物レセプターを上記支持体に共有結合的に結合させるか、または物理的に吸着させることは可能である（米国特許出願公開第２０１００００９３３９号）。
【０１５３】
本発明の方法は、粘液、唾液、呼吸器分泌物、のど洗浄液、鼻洗浄液、脊髄液、痰、尿、精液、汗、糞便、血漿、血液、気管支肺胞洗浄液、膣液、涙液および組織生検からなる群より選択される、インフルエンザウイルス含有が疑われているサンプルで使用され得る。類似の技術もまた、細胞培養物からのウイルスサンプル（例えば、細胞（例えば、Ｖｅｒｏ細胞など）において増殖したインフルエンザサンプル）での使用に適用可能である。本発明の方法は、インタクトなインフルエンザウイルス感染細胞もしくはインフルエンザウイルスの無細胞サンプルで実施するのに適している。上記インフルエンザウイルスは、哺乳動物（ヒト、ウマ、ブタなど）もしくはトリが起源のものであり得る。
【０１５４】
（キット）
本発明のノイラミニダーゼ結合分子を含むキットはまた、想定される。種々のキット成分が、別個の容器に包装され得、使用直前に混合され得る。上記成分をこのように別個に包装することは、上記活性成分の機能を失うことなく、長期の貯蔵を可能にし得る。成分のうちの２種以上が同じ容器中に見いだされる実施形態はまた、企図される。例示的なキットは、以下の試薬のうちの１種以上を含み得る：ヘテロジニアスアッセイを使用して使用するための洗浄バッファ試薬；ノイラミニダーゼ結合能がない陰性コントロール試薬；シグナル生成部分から検出可能なシグナルを発生させるためのシグナル生成試薬；およびサンプル採取手段（例えば、シリンジ、咽頭スワブ、もしくは他のサンプル採取デバイス）。本発明のキットは、所望であれば、本発明のキットの１つ以上のユニットを含み得るパックにおいて提示され得る。上記パックは、上記キットを使用するための指示が添えられ得る。上記パックはまた、実験用補助物質（ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ）の製造、使用もしくは販売を規制する政府当局によって指示された（ｐｒｅｓｃｒｉｂｅｄ）形態において、上記容器と関連する通知によって適合させられ得、この通知は、上記組成物の形態の、機関による承認を示す。
【０１５５】
（結合分子の例示的実施形態）
本発明は、認識ユニット（Ｒ）-任意選択のリンカー（Ｌ）-感知ユニット（Ｓ）という構造を有する特定の結合分子の結合能を決定することによる、タミフル耐性インフルエンザウイルス株の検出に関する。
【０１５６】
本発明に従う結合分子（ＢＭ）のいくつかの実施形態の例は、以下である：
ＢＭ  １：  ザナミビル−トリアゾールリンカー−ビオチン
【０１５７】
【化１６】
0005947289.tif 000018
【０１５８】
トリアゾール基含有リンカーは、クリックケミストリー（アルキンおよびアジドの１，３−双極環付加）によって形成される。蛍光標識したストレプトアビジンは、ビオチンユニットを検出するために使用される。
【０１５９】
ＢＭ  ２：  ザナミビル−トリアゾールリンカー−フルオレセイン
【０１６０】
【化１７】
0005947289.tif 000019
【０１６１】
フルオレセインは、（水中で）４９４ｎｍにおいて最大吸収を有し、５２１ｎｍで最大発光を有する。フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）は、上記リンカーに接続するために使用される。あるいは、他の蛍光実体（例えば、Ａｌｅｘａ色素および量子ドット）が、使用され得る。
ＢＭ  ３：ザナミビル−エチレングリコールリンカー−ビオチン
【０１６２】
【化１８】
0005947289.tif 000020
【０１６３】
エチレングリコールリンカーの長さは、ｘ＝１からｘ＝４まで調節され得る。
ＢＭ  ４：  ザナミビル−エチレングリコールリンカー−フルオレセイン
【０１６４】
【化１９】
0005947289.tif 000021
【０１６５】
ＢＭ  ５：  タミホスホルグアニジン−リンカー−ビオチン
【０１６６】
【化２０】
0005947289.tif 000022
【０１６７】
タミホスホルグアニジンは、インフルエンザウイルスのタミフル感受性およびタミフル耐性（Ｈ２７４Ｙ）の両方の株に結合する。上記タミホスホルグアニジンモノエステルは、塩形態（例えば、アンモニウム塩）で存在し得る。上記肪族鎖は、上記リンカーに１〜６個の炭素（ｘ＝１〜４）を有し得る。あるいは、上記脂肪族鎖は、実施例３に示されるように、エチレングリコール鎖によって置き換えられ得る。
ＢＭ  ６：タミホスホルグアニジン−エチレングリコールリンカー−フルオレセイン
【０１６８】
【化２１】
0005947289.tif 000023
【０１６９】
ＢＭ  ７：ホスファザナミビル−トリアゾールリンカー−ビオチン
【０１７０】
【化２２】
0005947289.tif 000024
【０１７１】
ホスファザナミビルは、塩形態（例えば、アンモニウム塩）で存在し得る。
ＢＭ  ８：ホスファザナミビル−エチレングリコールリンカー−フルオレセイン
【０１７２】
【化２３】
0005947289.tif 000025
【０１７３】
ホスファザナミビルは、塩形態（例えば、アンモニウム塩）で存在し得る。
ＢＭ  ９：ホスファザナミビルモノエステル−エチレングリコールリンカー−ビオチン
【０１７４】
【化２４】
0005947289.tif 000026
【０１７５】
エチレングリコールリンカーの長さは、ｘ＝１からｘ＝４まで調節され得る。
ＢＭ  １０：ホスファザナミビルモノエステル−エチレングリコールリンカー−フルオレセイン
【０１７６】
【化２５】
0005947289.tif 000027
【０１７７】
エチレングリコールリンカーの長さは、ｘ＝１からｘ＝４までであり得る。
【０１７８】
一般構造Ｒ−Ｌ−ＳのインフルエンザＮＡ結合分子の他の例は、Ｋａｌｅ，  Ｒ．  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ，  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  ２００８，  １３０，  ８１６９−８１７１  ；Ｍｃｋｉｍｍ−Ｂｒｅｓｃｈｋｉｎ，  Ｊ．  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｇｅｗ，  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  ２００３，  ４２，  ３１１８−３１２１；  Ｌｕ，  Ｃ．−Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  ２００５，  ４４，  ６８８８−６８９２；  Ｋｉｍｕｒａ，  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．  ２００９，  ５０，  ３２０５−３２０８に開示されている。
【０１７９】
本開示は、初めて、上記構造Ｒ−Ｌ−Ｓの分子のＮＡ結合能が、インフルエンザウイルスのタミフル耐性バージョンを検出するために使用され得ることを明らかにする。
【０１８０】
（ＮＡと、オセルタミビルカルボキシレート（ＯＣ）およびＲ−Ｌ−Ｓタイプ結合分子との競合的結合）
インフルエンザノイラミニダーゼを効率的に結合するビオチン結合体化ザナミビル（ＺＢ）を調製した。ザナミビル結合の競合因子としてのオセルタミビルカルボキシレート（ＯＣ）の存在下で、ＯＣ感受性が決定され得る。そのＯＣ結合競合アッセイから、２００８年のＯＣ耐性Ｈ１Ｎ１分離株の劇的な増加および台湾におけるＯＣ耐性汎流行性２００９  Ｈ１Ｎ１の出現が確認された。結合競合による耐性評価（ＲＡＢＣ）アッセイを使用して、ＯＣ感受性評価のためのプロトタイプ「ポイントオブケア」試験を開発した。上記ＲＡＢＣアッセイ原理は、一般に、ハイスループット調査および病原体の薬物感受性の迅速診断に利用可能であり得る。
【０１８１】
ビオチン結合体化ザナミビル（ＺＢ）を、この研究のために調製した（図１Ａ，実施例）。ザナミビルへの、その７−ＯＨ位置でのリンカーを介するビオチンの結合体化によって、ＺＢを作製し、それにより、ノイラミニダーゼ阻害の大きな低下なくして誘導体化できた（Ｄ．  Ｍ．  Ａｎｄｒｅｗｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ３４，  ５６３  （１９９９）；  Ｔ．  Ｈｏｎｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔｔ．  １２，  １９２５  （２００２）；  Ｗ．  Ｈ．  Ｗｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ５２，  ４９０３  （２００９））。ノイラミニダーゼに対するＺＢのＩＣ５０値は、７．７ｎＭであり、ザナミビル（２．１ｎＭ）のＩＣ５０値より高いことがわかった。インフルエンザノイラミニダーゼへのＺＢの結合を、ノイラミニダーゼをトランスフェクトした細胞（図４）、インフルエンザ感染細胞（実施例を参照のこと）、および固定インフルエンザウイルス（図１Ｂ）を使用して実証した。強力なノイラミニダーゼインヒビターであるので、オセルタミビルカルボキシレート（ＯＣ）は、インフルエンザウイルスへのＺＢ結合についての有効な競合因子であり得る。
【０１８２】
にも拘わらず、ＯＣはまた、ＺＢが等しく良好に結合するＯＣ耐性Ｈ２７４Ｙ変異体の結合についての不十分な競合因子であると予測された。図１Ｂは、ＺＢ結合に対する有意なＯＣ阻害（ｐ＜０．００１）は、１０３〜１０５  ＰＦＵの範囲の力価で、２７４Ｈインフルエンザウイルスの測定において示されたことを示す。残留するＺＢ結合約３％は、より高い力価の２７４ＨウイルスサンプルのＯＣ競合において認められた。対照的に、競合するＯＣによるＺＢ結合の有意な阻害は、同じ力価のＯＣ耐性２７４Ｙ  ＷＳＮウイルスにおいて認められなかった。
【０１８３】
形質転換された細胞およびインフルエンザ感染細胞を使用して同じ観察が実証された（図１１〜１４）。本発明者らは、このアッセイを、結合競合による耐性評価、すなわち、ＲＡＢＣ（略称）と称した。本発明者らはまた、上記ＲＡＢＣアッセイが、１０％を超える耐性内容物を含む混合集団中のＯＣ耐性２７４Ｙ変異体の検出を可能にすることを示した（図１４）。
【０１８４】
２００５〜２００９年に集めた合計１３７株の台湾の季節性Ｈ１Ｎ１臨床分離株を、ＯＣ感受性についてＲＡＢＣアッセイによって調べた。上記ウイルスサンプルを、抗Ｈ１Ｎ１被覆マイクロプレートウェルに固定し、二連のアッセイにおいて、３０ｎＭ  ＺＢもしくは３０ｎＭ  ＺＢ＋１５０ｎＭ  ＯＣのいずれかを使用して結合について試験した。５％残留するＺＢ結合を、ＯＣ感受性決定のためのカットオフとして使用した。上記ＲＡＢＣアッセイ結果は、すべての試験した、２００８年より前に集めた季節性Ｈ１Ｎ１分離株（図８Ａ）もしくは２００８年の早期に集めた季節性Ｈ１Ｎ１分離株（図８Ｂ）が、ＯＣ感受性であることを示唆した。２００８年半ばになって初めて、ＯＣ耐性Ｈ１Ｎ１が、台湾で単離された（図８Ｂ）。同様に、２００９年に集めた５０株の季節性Ｈ１Ｎ１のうちの４８株を、ＯＣ耐性として評価した（図８Ｃ）。本発明者らはまた、台湾で集めた汎流行性２００９  Ｈ１Ｎ１分離株のＯＣ感受性を試験した。図８Ｄは、分離株＃＃１〜４および分離株＃＃５〜７が、それぞれ、ＯＣ感受性ウイルスおよびＯＣ耐性ウイルスであることを示す。上記７株のＲＡＢＣアッセイを、ブラインドで行い、結果は、後に、それらのＯＣ感受性および配列結果と一致していることが示された。ＲＡＢＣアッセイを使用する感受性予測を評価するために、図８Ａ〜Ｃに記載される上記季節性Ｈ１Ｎ１サンプルの６０の分離株を、無作為に取りあげ、それらのノイラミニダーゼ配列を分析した。上記ＲＡＢＣアッセイによってＯＣ感受性と予測されるすべてのサンプルは、ヒスチジンを有する一方で、ＯＣ耐性であると予測されるサンプルは、上記ノイラミニダーゼの対応する残基２７４においてチロシンを有する（表２）。進化している耐性集団が存在する可能性を調べるために、本発明者らは、３〜５％残留するＺＢ結合値を有するそれらサンプルをより詳細に調べた。これらサンプルからのいくつかの単離ウイルスプラークの分析から、結合分析もしくは配列分析によってＯＣ耐性ウイルスを同定できなかった。
【０１８５】
表２は、上記ＲＡＢＣアッセイによるそれらのＯＣ感受性状態の決定について、この研究において使用したすべての台湾の臨床Ｈ１Ｎ１分離株を列挙する。６０株のウイルス分離株を、ウイルスノイラミニダーゼのアミノ酸２７４（ＡＡ２７４；Ｎ２命名法）においてそれらの配列を決定するために無作為に選択した。さらに、数個のサンプルを、ＯＣ感受性決定のため、膜での迅速アッセイを使用して試験した。すべてのアッセイ結果において矛盾は全く見いだされなかった。このことから、上記ＲＡＢＣが、ＯＣ感受性決定に対して信頼性があることが示された。
表２．  台湾の季節性Ｈ１Ｎ１分離株のＯＣ感受性決定
上記ＲＡＢＣアッセイによって決定した各インフルエンザ分離株のＯＣ感受性を、図８の結果に従ってＲ（耐性）もしくはＳ（感受性）として示す。いくつかの分離株を、ＡＡ２７４の分析および（もしくは）膜での迅速試験（括弧中の数字は、図８Ｂにおいて使用されるサンプル番号に対応する）によって確認のために無作為に選択した。
【０１８６】
【表２−１】
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【０１８７】
【表２−２】
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【０１８８】
（ポイントオブケアアッセイ）
本明細書で開示されるのは、上記インフルエンザウイルスのＯＣ感受性状態の視覚的評価のための膜でのプロトタイプアッセイである。図９Ａは、ＺＢによるＯＣ感受性Ｈ１Ｎ１（ＷＳＮ）の染色が、ＯＣ競合によってブロックされた一方で、ＯＣ耐性２７４Ｙ  ＷＳＮの染色が、同じ競合に対して耐性であったことを示す。本発明者らは、膜での染色を使用して、いくつかの季節性および汎流行性Ｈ１Ｎ１分離株のＯＣ感受性の状態を確認した（図９Ｂおよび図９Ｃ）。感受性株のＺＢ結合はまた、膜に直接固定したＨ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、およびＢ型インフルエンザウイルスに対して実証された（図９Ｄ）。上記プロトタイプＲＡＢＣベースの染色アッセイは、迅速であり、検出のために機器を何ら必要としない。これは、上記季節性Ｈ１Ｎ１もしくは汎流行性Ｈ１Ｎ１感染症の処置の選択を、時宜を得て決定するために、医師の診療室において「ポイントオブケア」アッセイっとして使用され得る。さらに、上記試験は、他の呼吸器感染症に対してインフルエンザウイルスを区別するために使用され得る。なぜなら、大部分の他の呼吸器感染病原体は、ノイラミニダーゼを有しないからである。
【０１８９】
上記ＲＡＢＣアッセイは、単純でかつ強力な方法であり、それは、種々のアッセイプラットフォームを使用して、異なるインフルエンザウイルスおよび感染細胞で実証されてきた。上記アッセイの原理は、薬物感受性評価について、他の病原体標的に適用可能であり得る。
【実施例】
【０１９０】
本発明の範囲を限定することを意図せず、本発明の実施形態に従う例示的機器、装置、方法およびそれらの関連する結果が、以下に提供される。標題もしくは副題は、読み手の便宜のために実施例において使用され得るが、本発明の範囲を決して限定すべきではないことに注意。さらに、特定の理論が、本明細書において提唱され、開示される；しかし、これらが正しかろうと誤っていようと、それらは、本発明が任意の特定の理論もしくは作用機序に拘わらず、本発明に従って実施される限りにおいて、本発明の範囲を決して限定するべきではない。
【０１９１】
すべての試薬は市販されており、別段示されなければ、さらに精製せずに使用した。すべての溶媒は、別段示されなければ無水グレードであった。すべての非水性の反応は、オーブン乾燥したガラス製品において、別段注記されなければ、僅かに陽圧のアルゴン下で行った。反応を、磁気を用いて撹拌し、シリカゲルの薄層クロマトグラフィーによってモニターした。フラッシュクロマトグラフィーを、６０〜２００μｍ粒径のシリカゲルで行った。収量は、分光光度的に純粋な化合物に対して報告する。融点は、Ｅｌｅｃｔｒｏｔｈｅｒｍａｌ  ＭＥＬ−ＴＥＭＰ（登録商標）  １１０１Ｄ融点装置で記録した。そして上記融点は、補正していない。１Ｈおよび１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルを、Ｂｒｕｋｅｒ  ＡＶＡＮＣＥ  ６００分光計で記録した。３１Ｐ  ＮＭＲスペクトルを、Ｂｒｕｋｅｒ  ＡＶＡＮＣＥ  ５００分光計で記録した。化学シフトを、テトラメチルシラン（ＴＭＳ）に対するδ値で与える；カップリング定数Ｊは、Ｈｚで与えられる。内部標準は、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルについてはＣＤＣｌ３（δＨ＝７．２４）、ＭｅＯＨ−ｄ４（δＨ＝３．３１）もしくはＤ２Ｏ（δＨ＝４．７９）、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルについてはＣＤＣｌ３（δＣ＝７７．０）もしくはＭｅＯＨ−ｄ４（δＣ＝４９．１５）、および３１Ｐ−ＮＭＲスペクトルについてはＤ２Ｏ中のＨ３ＰＯ４（δＰ＝０．００）であった。分裂パターンを、ｓ（一重線）、ｄ（二重線）、ｔ（三重線）、ｑ（四重線）、ｍ（多重線）、ｂｒ（ブロード）およびｄｄ（二重線の二重線（ｄｏｕｂｌｅ  ｏｆ  ｄｏｕｂｌｅｔｓ））として報告する。ＩＲスペクトルを、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｎｉｃｏｌｅｔ  ３８０  ＦＴ−ＩＲ分光計で記録した。旋光を、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｍｏｄｅｌ  ３４１偏光計で記録した。高分離能ＥＳＩ質量スペクトルを、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ分光計で記録した。
【０１９２】
実施例１：  ３−アセトアミド−４，６−ジアセトキシ−２−（１，２，３−トリアセトキシ）プロピル−３，４，５，６−テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン（３）
【０１９３】
【化２６】
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【０１９４】
窒素雰囲気下で、ピリジン（７５ｍＬ）および無水酢酸（７５ｍＬ）中のＮ−アセチルノイラミン酸（５ｇ，１６．２ｍｍｏｌ）の懸濁物を、室温において１２時間にわたって撹拌し、次いで、１００℃において５時間にわたって加熱した。その反応混合物を室温へと冷却し、減圧下で濃縮した。その残留物の褐色のガラス状オイルを、ＣＨ２Ｃｌ２（１５０ｍＬ）に溶解し、飽和水性ＮａＨＣＯ３（１００ｍＬ）、水性１Ｍ  ＨＣｌ（１００ｍＬ）およびブライン（１００ｍＬ）で順次洗浄した。その有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮した。その褐色の残留物を、シリカゲルでのカラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン，６７：３３〜１００：０）によって精製して、３を淡黄色発泡物として得た（３．８ｇ，５０％）。これは、分離できないアノマー混合物を含んでいた（α／β＝１：５）。３のアノマー混合物を、さらに分離せずに次の工程において使用した。
【０１９５】
【化２７】
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【０１９６】
実施例２：ジエチル（５−アセトアミド−４−アセトキシ−６−（１，２，３−トリアセトキシ）プロピル−３，４，５，６−テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）ホスホネート（４）
無水ＣＨ２Ｃｌ２（３０ｍＬ）中の３のアノマー混合物（２．１５ｇ，４．５２ｍｍｏｌ）およびジエチルトリメチルシリルホスファイト（３．１１ｍＬ，１３．６５ｍｍｏｌ）を、０℃においてトリメチルシリルトリフルオロメチルスルホネート（ＴＭＳＯＴｆ，１．２３ｍＬ，６．７８ｍｍｏｌ）で処理した。３０分後、上記混合物を、室温へと加温し、２４時間にわたって撹拌した。上記混合物を氷水（２０ｍＬ）に注ぎ、その水層を、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出した（２０ｍＬ，２×）。その合わせた抽出物を、飽和水性ＮａＨＣＯ３（５０ｍＬ）およびブライン（５０ｍＬ）で順次洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮した。その残留物を、シリカゲルでのカラムクロマトグラフィー（アセトン／ＥｔＯＡｃ，１：９）によって精製して、４を無色シロップ状物として得た（１．５５ｇ，６２％）。これは、α−アノマーおよびβ−アノマー（２：３）の混合物を含んでいた。ホスホネート４のアノマー混合物を、さらに分離せずに次の工程において使用した。純粋なα−アノマーおよびβ−アノマー（４αおよび４β）の分析サンプルを、シリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／アセトン，１００：０〜９０：１０）によって得た。
【０１９７】
【化２８】
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【０１９８】
実施例３：ジエチル（５−アセトアミド−４−アセトキシ−６−（１，２，３−トリアセトキシ）プロピル−４，５，６−トリヒドロピラン−２−イル）ホスホネート（５）
無水ＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）中のホスホネート４のアノマー混合物（１．１ｇ，２ｍｍｏｌ）およびＮ−ブロモスクシンイミド（８８５ｍｇ，５ｍｍｏｌ）を、１００Ｗタングステンランプの照射下で加熱還流した。反応の進行を、ＴＬＣによってモニターした。完了したら（約６時間）、その混合物を室温へと冷却し、その沈殿物であるスクシンイミドを、濾別した。その濾液を減圧下でエバポレートして、粗製の２−ブロモ誘導体を黄色のシロップ状物として得た。これを、さらに精製せずに次の工程において使用した。
【０１９９】
無水ピリジン（１０ｍＬ）中の上記で調製したブロモ化合物の溶液を、５０℃において２時間にわたって撹拌した。その溶液を減圧下で濃縮し、その褐色の残留物を、シリカゲルでのカラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／アセトン，１００：０〜９０：１０）によって精製して、結合体化したホスホネート５を無色発泡物として得た（８２７ｍｇ，２工程について７５％）。
【０２００】
【化２９】
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【０２０１】
実施例４：ジエチル（４−（１，２，３−トリアセトキシ）プロピル−２−メチル−３ａ，７ａ−ジヒドロ−４Ｈ−ピラノ（３，４−ｄ）オキサゾール−６−イル）ホスホネート（６）
【０２０２】
【化３０】
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【０２０３】
酢酸（２ｍＬ）と無水酢酸（２ｍＬ）の混合物中のホスホネート５（５５０ｍｇ，１ｍｍｏｌ）の溶液に対し、濃Ｈ２ＳＯ４（０．２ｍＬ）で処理した。その混合物を、４８時間にわたって室温において撹拌し、冷たい（０℃）飽和水性ＮａＨＣＯ３（ｐＨ９）中に注ぎ、３０分間にわたって撹拌し、その後、ＥｔＯＡｃで抽出した（３０ｍＬ，５×）。その合わせた抽出物を、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。その残留物の油状物を、シリカゲルでのカラムクロマトグラフィー（アセトン／ＥｔＯＡｃ，１：９）によって精製して、６を淡黄色シロップ状物として得た（３９４ｍｇ，２工程について８０％）。
【０２０４】
【化３１】
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【０２０５】
実施例５：ジエチル（５−アセトアミド−４−アジド−６−（１，２，３−トリアセトキシ）プロピル−４，５，６−トリヒドロピラン−２−イル）ホスホネート（７）
ｔ−ＢｕＯＨ（１０ｍＬ）中のオキサゾリン６（３９３ｍｇ，０．８ｍｍｏｌ）の溶液に対し、アジドトリメチルシラン（０．５３ｍＬ，４ｍｍｏｌ）で、８０℃において２４時間にわたって処理した。その溶液を、飽和水性ＮａＨＣＯ３中に注ぎ、ＥｔＯＡｃで抽出した（３０ｍＬ，３×）。その合わせた抽出物を、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮して、アジド化合物７を無色のシロップ状物として得た（３７１ｍｇ，８７％）。これは、実際には純粋であったので、次の工程において使用した。分析サンプルを、シリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ中の１０％  アセトン）によって得た。
【０２０６】
【化３２】
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【０２０７】
実施例６：ジエチル｛５−アセトアミド−４−（Ｎ２，Ｎ３−ビス（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル））グアニジノ−６−（１，２，３−トリアセトキシ）プロピル−４，５，６−トリヒドロピラン−２−イル｝ホスホネート（８）
【０２０８】
【化３３】
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【０２０９】
エタノール（２５ｍＬ）中のアジド７（３５０ｍｇ，０．７１ｍｍｏｌ）の溶液を、水素雰囲気下で、Ｌｉｎｄｌａｒ触媒（３０ｍｇ）により水素化した。その混合物を５時間撹拌し、セライトのパッドを通して濾過し、エタノールで洗浄した。その濾液を減圧下で濃縮して、無色の発泡物を得た（２７８ｍｇ）。その粗製のアミン生成物を、無水ＣＨ２Ｃｌ２（３０ｍＬ）に溶解し、１，３−ビス（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−２−メチルチオプソイドウレア（２４７ｍｇ，０．８５ｍｍｏｌ）およびＥｔ３Ｎ（２３０μｌ，１．７ｍｍｏｌ）で処理した。その混合物を０℃へと冷却し、ＨｇＣｌ２（２３１ｍｇ，０．８５ｍｍｏｌ）をゆっくりと添加した。その懸濁物を室温へと加温し、１２時間にわたって撹拌した。その後、その混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、セライトのパッドを通して濾過した。その濾液を濃縮し、フラッシュカラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ）によって精製して、グアニジン８（４４２ｍｇ，８３％収率）を無色発泡物として得た。
【０２１０】
【化３４】
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【０２１１】
実施例７：（５−アセトアミド−４−アミノ−６−（１，２，３−ヒドロキシ）プロピル−４，５，６−トリヒドロピラン−２−イル）ホスホン酸（１ａ）
【０２１２】
【化３５】
0005947289.tif 000039
【０２１３】
０℃において無水ＣＨ２Ｃｌ２（４ｍＬ）中のジエチルホスホネート７（８０ｍｇ，０．１５ｍｍｏｌ）の溶液を、ブロモトリメチルシラン（０．１２ｍＬ，０．８７ｍｍｏｌ）で処理した。２４時間にわたって０℃において撹拌した後、ＭｅＯＨ（２ｍＬ）を添加し、その混合物を減圧下で濃縮した。その残留物を、無水ＭｅＯＨ（５ｍＬ）に溶解し、ナトリウムメトキシド（ＭｅＯＨ中５．４Ｍ溶液，０．９ｍＬ，４．８６ｍｍｏｌ）で処理した。１時間にわたって室温において撹拌した後、その混合物を、Ｄｏｗｅｘ  ５０ＷＸ８（Ｈ＋形態）を通して濾過し、次いで、減圧下で濃縮した。その残留物を、ＭｅＯＨ（５ｍＬ）に溶解し、Ｌｉｎｄｌａｒの触媒（２０ｍｇ）の存在下で室温において水素化（１気圧）に供した。３時間後、その混合物を、セライトのパッドを通して濾過し、ＭｅＯＨですすいだ。その濾液を濃縮し、残留するその固体を、Ｅｔ２Ｏで洗浄して（３×１０ｍＬ）、ホスホネート１ａを得た。
【０２１４】
実施例８：（５−アセトアミド−４−グアニジノ−６−（１，２，３−ヒドロキシ）プロピル−４，５，６−トリヒドロピラン−２−イル）ホスホン酸（１ｂ）
【０２１５】
【化３６】
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【０２１６】
無水ＣＨ２Ｃｌ２（４ｍＬ）中のジエチルホスホネート８（１３０ｍｇ，０．１７ｍｍｏｌ）の溶液を、ブロモトリメチルシラン（０．１３ｍＬ，０．９４ｍｍｏｌ）で、０℃において処理し、その反応混合物を、２４時間にわたって０℃において撹拌した。ＭｅＯＨ（２ｍＬ）を、激しく撹拌しながら添加した。３０分後、その溶液を減圧下でエバポレートし、無水ＭｅＯＨ（５ｍＬ）の溶液としてのその残留物を、メタノール（１ｍＬ，５．４ｍｍｏｌ）中のナトリウムメトキシドの５．４Ｍ溶液で処理した。１時間にわたって室温において撹拌した後、その溶液を、Ｄｏｗｅｘ  ５０ＷＸ８（Ｈ＋形態）を通して濾過し、凍結乾燥に供した。その残留物の淡黄色固体を、Ｅｔ２Ｏで洗浄して（３×２０ｍＬ）、ホスホネート１ｂを白色固体として得た。
【０２１７】
実施例９：（５−アセトアミド−４−アミノ−６−（１，２，３−ヒドロキシ）プロピル−４，５，６−トリヒドロピラン−２−イル）ホスホン酸モノエチルエステル（１ｃ）
【０２１８】
【化３７】
0005947289.tif 000041
【０２１９】
アルゴン雰囲気下で、ＰＭｅ３（１．４ｍＬ，ＴＨＦ中１．４Ｍ）の溶液を、０℃において無水ＴＨＦ（５ｍＬ）中のアジド７（１４８ｍｇ，０．２８ｍｍｏｌ）の溶液に滴下して加えた。その混合物を、室温において１９時間にわたって撹拌した。Ｅｔ３Ｎ（０．５ｍＬ）およびＨ２Ｏ（０．５ｍＬ）を添加し、その混合物をさらに３０分間にわたって撹拌した。その混合物を減圧下で濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２，６：９４〜１０：９０）によって精製して、アミン生成物を得た（１１２ｍｇ，７９％収率）。
【０２２０】
上記アミン生成物（１１０ｍｇ，０．２２ｍｍｏｌ）を、ＥｔＯＨ（２ｍＬ）に溶解し、ＮａＯＥｔ（４９０μｌ，ＥｔＯＨ中２．６８Ｍ）の溶液を滴下して加えた。その混合物を、２日間にわたって撹拌し、ＴＬＣによってモニターした。Ｄｏｗｅｘ  ５０Ｗ樹脂によって中和した後、その濾液を減圧下で濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ＰｒＯＨ／Ｈ２Ｏ，７：３）に供した。適切な画分を集め、減圧下で濃縮した。その残留物を、１Ｍ  ＨＣｌ（２ｍＬ）で処理し、次いで、真空中で濃縮して、ホスホネートモノエステル１ｃを得た（５０ｍｇ，６０％収率）。
【０２２１】
【化３８】
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【０２２２】
実施例１０：（５−アセトアミド−４−グアニジノ−６−（１，２，３−ヒドロキシ）プロピル−４，５，６−トリヒドロピラン−２−イル）ホスホン酸モノエチルエステル（１ｄ）
【０２２３】
【化３９】
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【０２２４】
化合物８（５２ｍｇ，０．０７ｍｍｏｌ）を、ＥｔＯＨ（１ｍＬ）に溶解し、ＮａＯＥｔの溶液（２０９μｌ，ＥｔＯＨ中２．６８Ｍ）を滴下して加えた。その混合物を、４日間にわたって撹拌し、ＴＬＣによってモニターした。Ｄｏｗｅｘ  ５０Ｗ樹脂によって中和した後、その濾液を減圧下で濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ＰｒＯＨ／Ｈ２Ｏ，８：２）に供した。適切な画分を集め、減圧下で濃縮した。その残留物を、１Ｍ  ＨＣｌ（２ｍＬ）で処理し、次いで、真空中で濃縮して、ホスホネートモノエステル１ｄを得た（９ｍｇ，３０％収率）。Ｃ１３Ｈ２５Ｎ４Ｏ８Ｐ；
【０２２５】
【化４０】
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【０２２６】
実施例１１：ザナミビル  ビオチン結合体の合成
図３は、ザナミビル−ビオチン結合体９の合成を示す。アジドが付加されたビオチン誘導体１１を、トリエチルアミンおよびベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）の存在下で、ビオチン（１０）と５−アジド−１−ペンチルアミンとの縮合によって調製した（Ｊ．  Ｗ．  Ｌｅｅ，  Ｓ．  Ｉ．  Ｊｕｎ，  Ｋ．  Ｋｉｍ，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．４２，  ２７０９  （２００１））。他方で、ザナミビルｐ−ニトロフェニルカーボネート１２（公知の手順に従ってシアル酸から調製した（Ｍ．  Ｃｈａｎｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｈ，  Ｊ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ，  Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．  １：  １１７３  （１９９５）；  Ｌ．  Ｙｉｎｇ，  Ｊ．  Ｇｅｒｖａｙ  −Ｈａｇｕｅ，  ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ  ６，  １８５７  （２００５））を、プロパルギルアミノとカップリングして、アルキニルヒンジが付いたザナミビル誘導体１３を得た（Ｗ．−Ｈ．  Ｗｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ５２，  ４９０３  （２００９））。その後の、アジドが付加されたビオチン誘導体１１と、アルキニルザナミビル誘導体１３との間の１，３−双極付加（クリック反応；Ｖ．  Ｖ．  Ｒｏｓｔｏｖｔｓｅｖ  ｅｔ  ａｌ，  Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．，  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  ４１，  ２５９６  （２００２）；  Ｂ．−Ｙ．  Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．  ４７，  ５１０５  （２００６））を、ＣＨ２Ｃｌ２／Ｈ２Ｏ（１：１）の混合溶媒中で行って、所望のザナミビル−ビオチン結合体９を、保護基を除去した後に、８８％の全体収率で得た。
【０２２７】
実施例１２：ビオチン誘導体１１
【０２２８】
【化４１】
0005947289.tif 000045
【０２２９】
ＰＰｈ３（５．０ｇ，１９．１ｍｍｏｌ）および、１，５−ジブロモペンタンとＮａＮ３との置換反応から調製した１，５−ジアジドペンタン（３．３６ｇ，２１．８ｍｍｏｌ）の溶液を、ＥｔＯＡｃ／Ｅｔ２Ｏ（ｖ／ｖ＝１：１，３５ｍＬ）中の５％水性ＨＣｌ（２２ｍＬ）とともに、室温において２４時間にわたって激しく撹拌して、５−アジド−１−ペンチルアミン１（ｐｅｎｔｙｌａｍｉｎｅｓ１）（１．６０ｇ，５９％）を得た（Ｊ．  Ｗ．  Ｌｅｅ，  Ｓ．  Ｉ．  Ｊｕｎ，  Ｋ．  Ｋｉｍ，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．  ４２，  ２７０９  （２００１）．）。
【０２３０】
ビオチン（１０，  １３６ｍｇ，０．５６ｍｍｏｌ）のサンプルを、ＤＭＦ溶液（５ｍＬ）中の５−アジド−１−ペンチルアミン（１１，  ８６ｍｇ，０．６９ｍｍｏｌ）、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ，３６０ｍｇ，０．６９ｍｍｏｌ）およびＥｔ３Ｎ（０．１１６ｍＬ，０．８４ｍｏｌ）とともに室温において３時間にわたって撹拌した。その混合物を減圧下で濃縮し、Ｈ２Ｏで洗浄した。その残留物を、シリカゲルクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ＝１５：１）によって精製して、アジドが付加されたビオチン誘導体１１を得た（１８０ｍｇ，９２％）。
【０２３１】
【化４２】
0005947289.tif 000046
【０２３２】
実施例１３：ザナミビル−ビオチン結合体９
【０２３３】
【化４３】
0005947289.tif 000047
【０２３４】
アジドが付加されたビオチン誘導体１１（１００ｍｇ，０．２８ｍｏｌ）の溶液、およびアルキニルヒンジが付いたザナミビル誘導体１３（１８８ｍｇ，０．２８ｍｍｏｌ）を、ＣＨ２Ｃｌ２／Ｈ２Ｏ（６ｍＬ，ｖ／ｖ＝１：１）中のＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ（１０ｍｇ，０．０４ｍｍｏｌ）およびアスコルビン酸ナトリウム（２５ｍｇ，０．１３ｍｍｏｌ）とともに、室温において８時間にわたって撹拌した。その水層をＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。その有機層を合わせ、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、回転蒸発によって減圧下で濃縮した。その残留物を、カラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ＝２０：１〜１０：１）によって精製して、保護基を含むザナミビル−ビオチン結合体を得た（２７０ｍｇ，９５％）。
【０２３５】
【化４４】
0005947289.tif 000048
【０２３６】
上記保護されたザナミビル−ビオチン結合体（３４ｍｇ，０．０３３ｍｍｏｌ）のサンプルを、ＭｅＯＨ（１ｍＬ）中の水性ＮａＯＨ（１Ｍ，１ｍＬ）で、室温において１５分間にわたって処理した。その混合物を、Ｄｏｗｅｘ  ５０Ｗｘ８（Ｈ＋）で中和し、濾過し、減圧下で濃縮した。次いで、その残留物を、ＣＨ２Ｃｌ２（１ｍＬ）中のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ，１ｍＬ）とともに、室温において１．５時間にわたって撹拌した。その混合物を減圧下でエバポレートし、Ｈ２Ｏ（１ｍＬ）を室温において添加した。１０分間にわたって撹拌した後、その混合物を減圧下で濃縮し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−１０カラムでのクロマトグラフィー（溶離液：  Ｈ２Ｏ中の０．１％  ＴＦＡ）によって精製して、所望のザナミビル−ビオチン誘導体９（２４ｍｇ，９３％）を得た。
【０２３７】
【化４５】
0005947289.tif 000049
【０２３８】
実施例１４：化合物１４
【０２３９】
【化４６】
0005947289.tif 000050
【０２４０】
ピリジン（２ｍＬ）中のカーボネート１２（０．２５ｇ，０．３３ｍｍｏｌ）、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ，６０ｍｇ，０．５０ｍｍｏｌ）の溶液に、アミンＨ２Ｎ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）３ＣＨ２ＣＨ２Ｎ３（０．１４ｇ，０．６６ｍｍｏｌ）を添加した。その混合物を、４０時間にわたって室温において、Ｎ２雰囲気下で撹拌し、次いで、ＨＣｌ（１０ｍＬの１Ｍ水溶液）およびＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）で抽出した。その有機層を、ブライン（３０ｍＬ）および飽和ＮａＨＣＯ３（水溶液）（３０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、減圧下で濃縮した。その残留物を、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル，ＥｔＯＡｃ／ヘキサン＝１：１）によって精製して、カルバメート１４（０．２ｇ，７４％）を得た。
【０２４１】
【化４７】
0005947289.tif 000051
【０２４２】
実施例１５：ザナミビル−ＦＩＴＣ結合体１５
【０２４３】
【化４８】
0005947289.tif 000052
【０２４４】
ＥｔＯＨ（１ｍＬ）中のアジド１４（８０ｍｇ，０．０９６ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｐｄ（ＯＨ）２（９ｍｇ，０．０５８ｍｍｏｌ）を添加した。その混合物を、１．５時間にわたって室温において、Ｈ２雰囲気下で撹拌し、次いで、ＭｅＯＨでの溶出によってセライトのパッドを通して濾過した。その混合物を減圧下で濃縮して、アミン生成物（６６ｍｇ）を得た。
【０２４５】
【化４９】
0005947289.tif 000053
【０２４６】
Ｎ２雰囲気下で、フルオレセインイソチオシアネート（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｅ  ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）（ＦＩＴＣ，３７ｍｇ，０．０９５ｍｍｏｌ）を、無水ＴＨＦ（１ｍＬ）中の上記で調製したアミン化合物の溶液に添加した。その混合物を、４時間にわたって室温において撹拌し、減圧下で濃縮し、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル，ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ＝９２：８）によって精製して、コンジュゲート形成生成物を得た（５０ｍｇ，５２％）。
【０２４７】
【化５０】
0005947289.tif 000054
【０２４８】
ＭｅＯＨ（１．５ｍＬ）中の上記で調製したＦＩＴＣ結合体（４７ｍｇ，０．０３９ｍｍｏｌ）の溶液を、ＮａＯＨ（１ｍＬの１Ｍ水溶液）で処理した。その混合物を、１時間にわたって室温において撹拌し、Ｄｏｗｅｘ  ５０ｗｘ８（Ｈ＋）で中和し、濾過した。その濾液を濃縮し、その残留物を、ＣＨ２Ｃｌ２（１ｍＬ）中のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ，１ｍＬ）で処理した。その混合物を１時間にわたって撹拌し、減圧下で濃縮し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−１０カラム（溶離液：  Ｈ２Ｏ中の０．１％  ＴＦＡ）でのクロマトグラフィーによって精製して、所望のザナミビル−ＦＩＴＣ結合体１５を得た（１０ｍｇ，５６％）。
【０２４９】
【化５１】
0005947289.tif 000055
【０２５０】
実施例１６：ザナミビル−ＦＩＴＣ結合体１７
【０２５１】
【化５２】
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【０２５２】
ｔ−ＢｕＯＨ（１ｍＬ）およびＨ２Ｏ（１ｍＬ）中のアルキン１３（８７ｍｇ，０．１３ｍｍｏｌ）および１０−アジドデカンアミン（３０ｍｇ，０．１６ｍｍｏｌ）の溶液に、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ（４ｍｇ，０．０１６ｍｍｏｌ）、アスコルビン酸ナトリウム（１８ｍｇ，０．０９１ｍｍｏｌ）およびトリス［（１−ベンジル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル］アミン（ＴＢＴＡ，８ｍｇ，０．０４ｍｍｏｌ）を添加した。その混合物を、１２時間にわたって室温において撹拌し、次いで、ＣＨ２Ｃｌ２（３０ｍＬ）およびＨ２Ｏ（３０ｍＬ）で抽出した。その有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、減圧下で濃縮し、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル，ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ＝９：１）によって精製して、化合物１６を得た（５３ｍｇ，５０％）。
【０２５３】
【化５３】
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【０２５４】
ＴＨＦ（１ｍＬ）およびＭｅＯＨ（２ｍＬ）中の上記で調製したアミン（０．１ｇ，０．１１５ｍｍｏｌ）の溶液に、ＦＩＴＣ（４５ｍｇ，０．１１５ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（０．０３８ｍＬ）を添加した。その混合物を、室温において２０時間にわたって撹拌し、次いで、減圧下で濃縮して、コンジュゲート形成生成物を赤色固体として得た。ＭｅＯＨ（１ｍＬ）中の上記で調製したコンジュゲート形成化合物の溶液を、ＮａＯＨ（１ｍＬの１Ｍ水溶液）とともに、１時間にわたって室温において撹拌し、Ｄｏｗｅｘ  ５０ｗｘ８（Ｈ＋）によって中和し、濾過した。濃縮後、その残留物を、ＣＨ２Ｃｌ２（１ｍＬ）およびＴＦＡ（１ｍＬ）に溶解した。その混合物を、３０分間にわたって室温において撹拌し、減圧下で濃縮し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−１０カラム（溶離液：Ｈ２Ｏ中０．１％  ＴＦＡ）でのクロマトグラフィーによって精製して、所望のザナミビル−ＦＩＴＣ結合体１７を得た（５０ｍｇ，４３％）。
【０２５５】
【化５４】
0005947289.tif 000058
【０２５６】
実施例１７：タミホスホルビオチン結合体の合成
図４は、タミホスホルビオチン結合体２４の合成を示す。ヨウ化化合物１８を、以前に報告された手順に従って調製した。［Ｓｈｉｅ，  Ｊ．−Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  ２００８，  ４７，  ５７８８．］。ジ［４−（トリメチルシリル）ブタ−３−イン−１−イル］ジアルキルホスファイト１７を、ＰＣｌ３の、２当量の４−（トリメチルシリル）ブタ−３−イン−１−オールによる置換反応によって調製した。１８の、ホスファイト１９でのホスホニル化（ｐｈｏｓｐｈｏｎｙｌａｔｉｏｎ）を、Ｐｄ（ＰＰｈ３）４の触媒によって達成して、ホスホネート２０を６４％の収率で得た。Ｂｏｃ基を除去した後に、アミン中間体を、Ｎ，Ｎ’−ジ−Ｂｏｃ−Ｎ”−トリフルオロメタンスルホニル−グアニジンで処理し、続いて、トリメチルシリル基をＫＦで除去して、化合物２１を得た。２１と５−アジドペンタンアミンとのクリック反応、続いて、ＫＯＨでの処理から、ホスホネートモノエステル２２を得た。２０と、ビオチン−ＯＳｕ（２３）とのカップリング反応から、保護Ｂｏｃ基の除去の後に、ついに所望のタミホスホルビオチン結合体２４になった。
【０２５７】
実施例１８：化合物２０
【０２５８】
【化５５】
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【０２５９】
無水トルエン（２．１ｍＬ）中のヨウ素１８（１００ｍｇ，０．２１ｍｍｏｌ）、ホスファイト１９（８５ｍｇ，０．２６ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（１００ｍｇ，０．６４ｍｍｏｌ）の混合物を、窒素を１０分間にわたって通気することによって脱酸素し、次いで、窒素雰囲気下で丸底フラスコに入れたテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（１０ｍｇ，８．６μｍｏｌ）に添加した。得られた溶液を、９０℃へと徐々に加熱し、この温度において１２時間にわたって維持した。その反応混合物を、セライトのパッドを通して濾過し、その濾液を減圧下でエバポレートして、黄色発泡物を得た（１１０ｍｇ）。これを、シリカゲルカラムでのフラッシュクロマトグラフィー［ＥｔＯＡｃ／ヘキサン＝１：１〜ＥｔＯＡｃ］によって精製して、ホスホネート２０を得た（９２ｍｇ，６４％）。
Ｃ３２Ｈ５７Ｎ４Ｏ９Ｐ；黄色油状物；  ＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン，１：１）  Ｒｆ＝０．２９；
【０２６０】
【化５６】
0005947289.tif 000060
【０２６１】
実施例１９：化合物２１
【０２６２】
【化５７】
0005947289.tif 000061
【０２６３】
無水ＣＨ２Ｃｌ２（１．０ｍＬ）中のホスホネート２０（９２ｍｇ，０．１４ｍｍｏｌ）の溶液を、アイスバス中で０℃へと冷却し、トリフルオロ酢酸（０．１６ｍＬ，２．１ｍｍｏｌ）を添加した。その混合物を、１時間にわたって室温において撹拌し、減圧下で濃縮し、次いで、無水ＣＨ２Ｃｌ２（１．０ｍＬ）に溶解した。Ｎ−Ｎ’−ジ−Ｂｏｃ−Ｎ”−トリフルオロメタンスルホニルグアニジン（６７ｍｇ，０．２１ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（０．０６ｍＬ，０．４１ｍｍｏｌ）を添加した。その混合物を、室温において３時間にわたって撹拌し、１Ｍ  ＨＣｌ（５ｍＬ）およびＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ×３）で抽出した。その有機層を、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮し、シリカゲルカラムでのフラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン＝１：１）によって精製して、グアニジン誘導体を得た。
【０２６４】
ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ（１．２ｍＬ／１．２ｍＬ，ｖ／ｖ）中のそのグアニジン化合物の溶液に、ＫＦ（７１ｍｇ，１．２ｍｍｏｌ）を添加した。その混合物を、室温において２４時間にわたって撹拌し、次いで。減圧下で濃縮した。その混合物を、ＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ×３）およびＨ２Ｏ（５ｍＬ）で抽出した。その有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮し、シリカゲルカラムでのフラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン＝１：１）によって精製して、化合物２１を得た（６３ｍｇ，６９％）。Ｃ３２Ｈ５１Ｎ４Ｏ９Ｐ；無色の油状物；ＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン，１：１）  Ｒｆ＝０．２４；
【０２６５】
【化５８】
0005947289.tif 000062
【０２６６】
実施例２０：タミホスホルビオチン結合体２４
【０２６７】
【化５９】
0005947289.tif 000063
【０２６８】
ｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ（０．６ｍＬ，ｖ／ｖ＝１：１）中の５−アジド−１−ペンタンアミンアジド（４６ｍｇ，０．３６ｍｍｏｌ）および化合物１９（１２０ｍｇ，０．１８ｍｍｏｌ）の溶液に、テトラキス（アセトニトリル）銅（Ｉ）リンヘキサフルオリドを添加した。その混合物を、室温において１２時間にわたって撹拌し、減圧によって濃縮し、ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ（１：９〜９：１）の溶出を用いたＲＰ−１８逆相カラムによって精製した。トリアゾール化合物の粗製生成物を、１，４−ジオキサン（１．０ｍＬ）に溶解し、１Ｍ  ＫＯＨ（水溶液）（１．０ｍＬ）を添加した。その溶液を、２５℃において１２０時間にわたって撹拌し（１Ｈ  ＮＭＲによってモニター）、Ｄｏｗｅｘ  ５０Ｗｘ８を添加して、上記溶液を中和した。その混合物を濾過し、減圧下で濃縮した。その粗製生成物（１０ｍｇ，０．０１３ｍｍｏｌ）を、無水ＤＭＦ（０．１ｍＬ）に溶解し、ビオチン−ＯＳｕ（４．５ｍｇ，０．０１３ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（４．２ｍｇ，０．０２６ｍｍｏｌ）を添加した。その混合物を、室温において３時間にわたって撹拌し、減圧下で濃縮した。その残留物を、ＭｅＯＨ（０．５ｍＬ）に溶解し、アイスバス中で０℃へと冷却し、トリフルオロ酢酸（０．１６ｍＬ，２．１ｍｍｏｌ）を添加した。その混合物を、１時間にわたって室温において撹拌し、減圧下で濃縮し、ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ（１：９〜９：１）の溶出を用いたＲＰ−１８逆相カラムで精製して、標題化合物を得た（４０ｍｇ，３０％  全体収率）。Ｃ３３Ｈ５７Ｎ１０Ｏ７ＰＳ；黄色固体；
【０２６９】
【化６０】
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【０２７０】
実施例２１：化合物２５
【０２７１】
【化６１】
0005947289.tif 000065
【０２７２】
無水ＤＭＦ（５ｍＬ）中のジ（５−アジドペンチル）アミン（０．１２ｇ，０．４９ｍｍｏｌ）の溶液に、ビオチン（０．１２ｇ，０．４１ｍｍｏｌ）、ＰｙＢＯＰ（０．２５ｇ，０．４９ｍｍｏｌ）およびＥｔ３Ｎ（０．２３ｍＬ，１．６４ｍｍｏｌ）を添加した。その混合物を、２２時間にわたって室温において、アルゴン下で撹拌し、次いで、減圧下で濃縮した。その残留物を、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル，ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ＝１３：１）によって精製して、ビオチン−ジアジド化合物２５を得た（０．１５ｇ，７９％）。Ｃ２０Ｈ３５Ｎ９Ｏ２Ｓ；淡黄色油状物；
【０２７３】
【化６２】
0005947289.tif 000066
【０２７４】
実施例２２：ジザナミビル−ビオチン結合体２６
【０２７５】
【化６３】
0005947289.tif 000067
【０２７６】
ｔ−ＢｕＯＨ（１ｍＬ）およびＨ２Ｏ（１ｍＬ）中のビオチン−ジアジド２５（３６ｍｇ，０．０７５ｍｍｏｌ）の溶液に、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ（４ｍｇ，０．０１５ｍｍｏｌ）、アスコルビン酸ナトリウム（１０ｍｇ，０．０４５ｍｍｏｌ）、およびＴＢＴＡ（８ｍｇ，０．０１５ｍｍｏｌ）を添加した。その混合物を、５分間にわたって撹拌し、上記アルキニルヒンジが付いたザナミビル誘導体１３（０．１ｇ，０．１５ｍｍｏｌ）を添加した。その混合物を、１２時間にわたって室温において撹拌し、ＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）およびＨ２Ｏ（２０ｍＬ）で抽出し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、減圧下で濃縮した。その残留物を、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル，ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ＝９．５：１）によって試製して、カップリング生成物を得た（６４ｍｇ，４７％）。
【０２７７】
【化６４】
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【０２７８】
ＭｅＯＨ（１ｍＬ）中の上記で調製したカップリング生成物（６０ｍｇ，０．０３３ｍｍｏｌ）を、ＮａＯＨ（１ｍＬの１Ｍ水溶液）とともに、１時間にわたって室温において撹拌し、Ｄｏｗｅｘ  ５０Ｗｘ８（Ｈ＋）で中和し、濾過した。濃縮後、その残留物を、ＣＨ２Ｃｌ２（１ｍＬ）およびＴＦＡ（１ｍＬ）に溶解した。その混合物を、１時間にわたって室温において撹拌し、減圧下で濃縮し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−１０カラム（溶離液：Ｈ２Ｏ中の０．１％  ＴＦＡ）でのクロマトグラフィーによって精製して、ジザナミビル−ビオチン結合体２６を得た（５０ｍｇ，４３％）。
【０２７９】
【化６５】
0005947289.tif 000069
【０２８０】
実施例２３：細胞、ウイルス、および生物学的試薬
ＭＤＣＫ細胞および２９３Ｔ細胞の両方、ならびに２種のインフルエンザウイルス：Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／６８（Ｈ３Ｎ２）およびＢ／Ｌｅｅ／４０を、それぞれ、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，  ＶＡ，  ＵＳＡ）から得た。インフルエンザウイルスＡ／ＷＳＮ／１９３３（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｕｄｏｒｎ／３０７／１９７２（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／ＰＲ／８／１９３４（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｔａｉｗａｎ／３４４６／２００２（Ｈ３Ｎ２）、インフルエンザＢ／Ｔａｉｗａｎ／７０６４／２００４分離株を、Ｓｈｉｎ−Ｒｕ  Ｓｈｉｈ博士の研究室（Ｃｈａｎｇ  Ｇｕｎｇ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，  Ｔａｉｗａｎ）からのものであり、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４  ＲＧ１４（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７（Ｈ１Ｎ１）およびＡ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７（Ｈ３Ｎ２）を、Ｊｉａ−Ｔｓｒｏｎｇ  Ｊａｎ博士の研究室（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ，  Ａｃａｄｅｍｉａ  Ｓｉｎｉｃａ，  Ｔａｉｗａｎ）から得たものであった。上記オセルタミビル耐性ＷＳＮ変異体を、ＯＣ（オセルタミビルカルボキシレート）の濃度を徐々に上げて、ＭＤＣＫ細胞で６継代することによって選択した。この変異インフルエンザは、１μΜ  ＯＣの存在下で十分に増殖し、そのＮＡ遺伝子において単一のＨ２７４Ｙ変異（配列分析によって確認される）を有する。台湾の他の臨床Ｈ１Ｎ１分離株を、疾病管理センター（Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ）（Ｔａｉｐｅｉ，  Ｔａｉｗａｎ）のインフルエンザ収集センターから得た。これらは、表１に記載される。７種のＳ−ＯＩＶ分離株をまた、疾病管理センター（Ｔａｉｐｅｉ，  Ｔａｉｗａｎ）から得、＃１（Ａ／Ｔａｉｗａｎ／Ｔ１９４１／２００９）、＃２（Ａ／Ｔａｉｗａｎ／Ｔ１３３８／２００９）、＃３（Ａ／Ｔａｉｗａｎ／Ｔ１３３９／２００９）、＃４（Ａ／Ｔａｉｗａｎ／６６６２／２００９）、＃５（Ａ／Ｔａｉｗａｎ／６６６３／２００９）、＃６（Ａ／Ｔａｉｗａｎ／７７１７／２００９）、および＃７（Ａ／Ｔａｉｗａｎ／７８５５／２００９）として符号化した。インフルエンザＮＰに対する抗体およびフルオレセイン標識２次抗体を、それぞれ、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｃ．（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，  ＭＡ，  ＵＳＡ）およびＳｉｇｍａ  （Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ，  ＵＳＡ）から購入した。抗ＷＳＮウサギ抗体を、不活性化ＷＳＮインフルエンザを抗原として使用して、本研究室において調製した。抗ＨＡ抗体（Ａｂｃａｍ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  ＭＡ，  ＵＳＡ）を、Ｉｎｔｅｒｌａｂ  Ｌｔｄ．（Ｔａｉｐｅｉ，  Ｔａｉｗａｎ）から購入した。
【０２８１】
実施例２４：ノイラミニダーゼ発現細胞を使用するＯＣ感受性アッセイの開発
ザナミビルおよびＺＢのノイラミニダーゼ阻害活性を比較したところ、ＺＢが、ＩＣ５０  ７ｎＭを有して、ノイラミニダーゼに関してなお非常に強力なインヒビターであるが、ＩＣ５０  ２ｎＭを有するザナミビルより僅かに活性が低いことがわかった。細胞表面で発現する機能的ノイラミニダーゼは、ＯＣ感受性評価のためのＺＢ結合およびＯＣ競合のためのモデルシステムとして有用であり得た。Ａ／Ｈａｎｏｉ／３０４０８／２００５（Ｈ５Ｎ１）のノイラミニダーゼについてのｃＤＮＡを、発現プラスミドにクローニングし、これを使用して、野生型（２７４Ｈ）ノイラミニダーゼの発現のために２９３Ｔ細胞をトランスフェクトした。発現したノイラミニダーゼは、主に細胞表面に位置することが見出され、ＺＢを使用する結合および標識が可能であった（図１０）。上記ノイラミニダーゼ  ｃＤＮＡを、ＯＣ耐性２７４Ｙ変異酵素の発現のために変異誘発した。野生型および変異誘発したｃＤＮＡの両方を使用して、それぞれ、２７４Ｈノイラミニダーゼおよび２７４Ｙノイラミニダーゼの発現についての安定な２９３Ｔ細胞系を生成した。異なる比でのこれら２つの細胞の混合物を、ＺＢもしくはＺＢ＋過剰なＯＣとともにインキュベートし、次いで、ＡＰＣ結合体化ストレプトアビジンで修飾して、フローサイトメトリー分析によって、ＺＢを結合する細胞の集団を決定した。図１１は、ＺＢが２７４Ｈ発現細胞および２７４Ｙ発現細胞を同様の程度に結合したことを示す。過剰のＯＣの存在下では、ＺＢ結合は、２７４Ｈノイラミニダーゼを発現する細胞において完全にブロックされたのに対して、２７４Ｙ発現細胞へのＺＢ結合は、実質的に変化しなかった（図１２）。これら結果から、ＺＢ結合は、ＯＣ競合によってＯＣ感受性ノイラミニダーゼおよびＯＣ耐性ノイラミニダーゼを区別するために使用され得るという原理が立証される。
【０２８２】
実施例２５：インフルエンザウイルス感染細胞を使用したＯＣ感受性の決定
ＮＡ発現細胞を使用する、ＺＢ結合に対する競合的ＯＣ阻害の結果から、本発明者らは、インフルエンザウイルスのＯＣ感受性を評価するためにＺＢおよびＯＣの濃度を定義することをすすめた。ＯＣ感受性もしくはＯＣ耐性のＷＳＮウイルスのいずれかに感染させたＭＤＣＫ細胞を使用して、種々のＺＢおよびＯＣ濃度を使用して、上記ＯＣ感受性評価の実行可能性を試験した。図１３Ａは、インフルエンザウイルス感染ＭＤＣＫ細胞へのＺＢ結合のＯＣ競合を示す。インフルエンザ感染細胞を、１０ｎＭもしくは５０ｎＭのＺＢのいずれかで標識することによって、感染しているウイルスのＯＣ感受性を、上記標識ＺＢの０．５〜１０倍濃度における、ＯＣとの競合結合から推定できた。例えば、ＯＣ感受性およびＯＣ耐性のＷＳＮバリアントの明らかな区別は、３０ｎＭにおける標識ＺＢおよび１５０ｎＭにおける競合ＯＣを使用して感染細胞を処理することによって観察した（図１３Ｂ）。
【０２８３】
ＭＤＣＫ細胞を、野生型（２７４Ｈ）ＷＳＮウイルスもしくはＯＣ耐性（２７４Ｙ）ＷＳＮウイルスのいずれかに感染させた。感染後１６〜２０時間において、上記感染細胞を、３０ｎＭ  ＺＢもしくは３０ｎＭ  ＺＢ＋１５０ｎＭ  ＯＣのいずれかで処理した。得られた細胞を、ストレプトアビジン−ＦＩＴＣで修飾し、洗浄し、蛍光顕微鏡を使用して観察した。フローサイトメトリー研究のために、上記ＺＢ標識した細胞を、抗ＮＰ抗体を使用してさらに標識し、トリプシン処理し、次に、ＰＥ結合体化ストレプトアビジン＋ＤｙＬｉｇｈｔ−６４９標識抗ウサギ２次抗体（両方を、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，  ＰＡ，  ＵＳＡ）から購入した）で処理した。さらなる洗浄後、上記細胞を、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）のＦＡＣＳＣａｎｔｏによって分析した。より多くのサンプルの分析については、感染細胞を培養するために、黒色９６ウェル透明底マイクロプレートを使用するハイスループット法を開発した。感染後１６〜２０時間において、細胞を、３０ｎＭ  ＺＢもしくは３０ｎＭ  ＺＢ＋１５０ｎＭ  ＯＣで標識し、洗浄し、ＰＥ−ストレプトアビジンで処理した。次いで、上記プレートを、４８８ｎｍにおいてＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）のＩｓｏｃｙｔｅＴＭ  レーザー走査型プラットフォームでスキャンした。
【０２８４】
実施例２６：固定インフルエンザサンプルを使用するＯＣ耐性内容物の推定
図７Ｂを参照して記載されるように、上記ＲＡＢＣアッセイは、マイクロウェルにおいて固定されたウイルスを使用して、ＯＣ感受性決定のために適用可能である。固定されたウイルスを使用する上記ＲＡＢＣアッセイは、ＯＣ感受性ウイルスおよびＯＣ耐性ウイルスの両方からなる混合集団において、ＯＣ耐性変異体の含量を推定するためにも使用できた。総ウイルス含量が１０３、１０４、および１０５  ＰＦＵ／ウェルであって、２７４Ｈ  ＷＳＮウイルスおよび２７４Ｙ  ＷＳＮウイルスが種々の比にあるウイルスサンプルを固定して、ＯＣ耐性含量の推定として、ＯＣ耐性ＺＢ結合を測定した。図１４は、上記推定ＯＣ耐性含量が、１０％より大きい実験２７４Ｙウイルス含量と良好に一致したことを示す。１０％未満の耐性ウイルスを含む混合集団に関しては、上記耐性含量の過大評価が認められた。このことは、おそらく、高力価ウイルスサンプルを使用するアッセイにおいてより高い、バックグラウンド結合に起因する。
【０２８５】
高結合９６ウェルマイクロプレート６５５０６１（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ（Ｆｒｉｃｋｅｎｈａｕｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）製）を、１５０ｎｇ／ウェルにおいて抗ＨＡ抗体（Ａｂｃａｍ）で一晩コーティングし、次いで、３％  ＢＳＡを含むＰＢＳでブロッティングした。インフルエンザサンプルを、３０ｎＭ  ＺＢもしくは３０ｎＭ  ＺＢ＋１５０ｎＭ  ＯＣで、３０分間にわたって処理し、抗体被覆ウェルに添加した。３０分間のインキュベーション後、上記マイクロウェルを、ＰＢＳ中の３％  ＢＳＡで洗浄し、アルカリホスファターゼ結合体化ストレプトアビジンを３０分間にわたって添加し、再びＰＢＳ中のＢＳＡで洗浄し、次いで、製造業者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）の指示に従って、発光基質Ｅｍｅｒａｌｄ−ＩＩＴＭを添加した。上記ＲＬＵ（相対発光単位）を、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ（Ｗａｌｔｈａｍ，  ＭＡ，  ＵＳＡ）のＥｎｖｉｓｉｏｎを使用して読み取った。パーセント相対耐性を、ＯＣ競合の非存在下で測定されたＺＢ結合についての総ＲＬＵで除算された、ＯＣの存在下で測定されたＺＢ結合についての決定されたＲＬＵの％として計算した。
【０２８６】
実施例２７：インフルエンザノイラミニダーゼ配列の決定
総ＲＮＡを、Ｔａｉｐｅｉ  Ｐｈａｒｍａ（Ｔａｉｐｅｉ，  Ｔａｉｗａｎ）において購入したＲｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ製のＨｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  Ｖｉｒａｌ  ＲＮＡキットを使用して、インフルエンザウイルスから抽出した。上記ＲＮＡサンプルを、ランダムヘキサマーおよび２００ｎＭにおいて２種のプライマー：５’−
【０２８７】
【数１】
0005947289.tif 000070
【０２８８】
を使用して、ＰＣＲによって増幅されるｃＤＮＡ合成のために、Ｔｏｙｏｂｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ（Ｔｏｋｙｏ，  Ｊａｐａｎ）のＭＭＬＶ  ＲＴａｓｅを使用して逆転写した。そのＤＮＡ生成物を精製し、そのＮＡ配列を決定するために使用した。
【０２８９】
実施例２８：膜上でのインフルエンザウイルスのＯＣ感受性の迅速検出
Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｉｎｃ．（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）のＢｉｏ−Ｄｏｔ  ＳＦ上に載せたＰＶＤＦ膜を、メタノールで濡らし、吸引によって１スロットあたり１μｇの抗ＨＡ抗体（Ａｂｃａｍ）を添加した。３０ｎＭ  ＺＢもしくは３０ｎＭ  ＺＢ＋１５０ｎＭ  ＯＣのいずれかで１時間にわたって予め処理したインフルエンザウイルスサンプルを、吸引によって隣接するスロットに導入した。上記膜を、３％  ＢＳＡを含むＰＢＳを使用してブロッティングし、次いで、製造業者の指示に従って、ＫＰＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，  ＭＤ，  ＵＳＡ）製のアルカリホスファターゼ結合体化ストレプトアビジンとともにインキュベートした。３％  ＢＳＡを含むＰＢＳを使用してさらに洗浄した後、アルカリホスファターゼ基質である、Ａｍｒｅｓｃｏ  Ｉｎｃ．（Ｓｏｌｏｎ，  ＯＨ，  ＵＳＡ）のＡｍｒｅｓｃｏ  Ｅ１１６溶液を、発色させるために添加した。目に見える色は、通常は、２分間で発色し、写真法で記録した。
【０２９０】
実施例２９：組換え野生型（２７４Ｈ）およびＯＣ耐性（２７４Ｙ）ノイラミニダーゼを安定に発現する２９３Ｔ細胞の調製
インフルエンザＡ／Ｈａｎｏｉ／３０４０８／２００５（Ｈ５Ｎ１）（ＧｅｎｅＢａｎｋ：  ＡＢ２３９１２６．１）から推定した上記ノイラミニダーゼ遺伝子のｃＤＮＡ配列を使用して、Ｇｅｎｅａｒｔ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）によるこの遺伝子の合成バージョンを調製し、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）のｐＣＤＮＡ３．１のＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ制限酵素認識部位に、ｐＣＤＮＡ３．１−ＮＡとしてクローニングした。上記ＮＡ遺伝子を、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）製のＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）  ＸＬ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔを使用して改変して、１対のプライマー：
【０２９１】
【数２】
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【０２９２】
を使用して、Ｈ２７４ＹのＯＣ耐性ＮＡ変異型を生成した。野生型（２７４Ｈ）ＮＡ遺伝子およびＯＣ耐性変異（２７４Ｙ）ＮＡ遺伝子をともに、配列分析によって確認した。これらのＮＡ遺伝子を、野生型ノイラミニダーゼおよびＯＣ耐性ノイラミニダーゼについて一過性のＮＡ発現のために使用した。それらをまた、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）のｐＲｅｔｒｏ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクターに、それぞれｐＲｅｔｒｏ−ＮＡ（２７４Ｈ）−ＩＲＥＳ−ＧＦＰおよびｐＲｅｔｒｏ−ＮＡ（２７４Ｙ）−ＩＲＥＳ−ＧＦＰとしてクローニングした。これら２つのプラスミドおよびｐＧａｇＰｏｌを使用して作製した組換えレトロウイルスと、ｐＶＳＶＧとを使用して、２９３Ｔ細胞を形質導入した。安定な細胞系を、９５％を超えるＧＦＰを発現する集団について蛍光活性化セルソーターによって選択し、ＯＣ感受性ノイラミニダーゼまたはＯＣ耐性ノイラミニダーゼの合成について確認した。
【０２９３】
本明細書において引用されるすべての刊行物および特許出願は、各個々の刊行物もしくは特許出願が、参考として援用されるのが具体的にかつ個々に示されるかのように、本明細書に参考として援用される。
【０２９４】
上記の発明は、理解を明瞭にする目的で、図示および例示によって幾分詳細に記載されてきたが、特定の変更および改変が、添付の特許請求の範囲の趣旨もしくは範囲から逸脱することなく、本発明に対してなされ得ることは、本発明の教示に鑑みれば、当業者には容易に明らかである。
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図８】
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【図１４】
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【図２】
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【図５】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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