(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞の成長をサポートするための細胞成長基質を含む、細胞成長基質であって、
前記細胞成長基質は少なくとも１つの細長い筒状通路を含み、
前記細長い筒状通路は、前記細胞成長基質本体の表面にある第１の管腔開口から前記細胞成長基質の内部領域内に延びる管腔を定める通路壁を有し、
前記管腔は、細胞含有液体培地の流れを受けて細胞を前記細胞成長基質の内部領域内に分散させるように構成され、
前記細胞成長基質は、細胞成長をサポートするのに適した多孔性マトリクス材料からなる細胞成長基質体を含み、
前記細胞成長基質体は、組織ソースから分離されてシート構造を有する膜状組織である第１の脱細胞化された細胞外マトリックス組織シートと、組織ソースから分離されてシート構造を有する膜状組織である第２の脱細胞化された細胞外マトリックス組織シートとを含み、
前記第１の脱細胞化された細胞外マトリックス組織シートと前記第２の脱細胞化された細胞外マトリックス組織シートとの間に少なくとも１つの前記細長い筒状通路を定めるように、前記第２の脱細胞化された細胞外マトリックス組織シートに前記第１の脱細胞化された細胞外マトリックス組織シートは接続しており、
前記細長い筒状通路が有する前記通路壁は、（ｉ）前記第１の脱細胞化された細胞外マトリックス組織シートの面によって定められた第１の通路壁部分と、（ｉｉ）前記第２の脱細胞化された細胞外マトリックス組織シートの面によって定められた第２の通路壁部分と、（ｉｉｉ）前記第１の脱細胞化された細胞外マトリックス組織シートの面と前記第２の脱細胞化された細胞外マトリックス組織シートの面との間の第１の終端領域よって定められた第１の継ぎ目と、（ｉｖ）前記第１の脱細胞化された細胞外マトリックス組織シートの面と前記第２の脱細胞化された細胞外マトリックス組織シートの面との間の第２の終端領域よって定められた第２の継ぎ目とを有し、
前記第１の脱細胞化された細胞外マトリックス組織シートおよび前記第２の脱細胞化された細胞外マトリックス組織シートは、少なくとも１つの細長い筒状通路を囲む接続領域に沿って互いに接続される、細胞成長基質。
【請求項２】
前記基質は、コラーゲンを含み、前記基質の外側にあり前記管腔開口に流動結合された合成ポリマー筒状要素も含む、請求項１に記載の細胞成長基質。
【請求項３】
複数の前記筒状通路を含む、請求項１または２に記載の細胞成長基質。
【請求項４】
前記少なくとも１つの細長い筒状通路は、少なくとも１つの一次筒状通路と、前記一次筒状通路から分岐する少なくとも１つの二次筒状通路とを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞成長基質。
【請求項５】
前記筒状通路は、前記第１の管腔開口から、前記基質上で前記第１の管腔開口から間隔をあけて設けられる第２の管腔開口まで延びる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の細胞成長基質。
【請求項６】
前記筒状通路は前記基質の中で終端をなす、請求項１〜４のいずれか１項に記載の細胞成長基質。
【請求項７】
前記第１の脱細胞化された細胞外マトリックス組織シートおよび前記第２の脱細胞化された細胞外マトリックス組織シートはリモデリング可能なコラーゲン性細胞外マトリクスシート材料を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の細胞成長基質。
【請求項８】
前記リモデリング可能なコラーゲン性細胞外マトリクスシート材料が、前記シート材料のための動物ソース組織由来の成長因子、グリコサミノグリカン、およびプロテオグリカンを保持する、請求項７に記載の細胞成長基質。
【請求項９】
難分解性または生体吸収性ポリマーを含む筒状要素をも含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の細胞成長基質であって、
前記筒状要素は少なくとも１つの細長い筒状通路の間に収容される、細胞成長基質。
【請求項１０】
前記少なくとも１つの細長い筒状通路は、複数の通路に流動結合する、共通する供給通路を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の細胞成長基質。
【請求項１１】
前記第１の脱細胞化された細胞外マトリックス組織シートが前記第２の脱細胞化された細胞外マトリックス組織シートに接続領域で、接着、融着、糊付け、または架橋されている、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の細胞成長基質。
【請求項１２】
前記筒状要素は、多孔性の壁、または穴もしくは穿孔を有する壁を含む、請求項９に記載の細胞成長基質。
【請求項１３】
前記細長い筒状通路は、複数の屈曲部を有する曲がりくねった通路を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の細胞成長基質。
【請求項１４】
前記細長い筒状通路に結合され、かつ前記細長い筒状通路から出て延びている複数の二次通路をさらに含む、請求項１３に記載の細胞成長基質。
【請求項１５】
前記二次通路の各々の断面積が、前記細長い筒状通路の断面積よりも小さい、請求項１４に記載の細胞成長基質。
【請求項１６】
細胞と組み合わされた、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の細胞成長基質。
【請求項１７】
細胞が播種された材料を調製するための方法であって、
請求項１〜１５のいずれか１項に記載の細胞成長基質を細胞の液体懸濁液のソースに接続するステップであって、前記接続するステップは、前記細長い筒状通路を前記ソースの輸送管腔と流動連結することを含むステップと、
ある量の前記細胞の液体懸濁液を前記輸送管腔を通して前記細長い筒状通路の中に輸送することにより、細胞を前記基質の内部領域に送達するステップとを含む、方法。
【請求項１８】
前記接続するステップは、前記細胞の液体懸濁液のソースに流動接続された投入チューブを有する細胞播種チャンバに前記細胞成長基質を挿入し、前記投入チューブを前記基質の第１の管腔開口に流動結合するステップを含む、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、本明細書にその全体を引用により援用する２０１０年５月２５日に出願され「医療用移植片の細胞播種に有用な方法、基質、およびシステムと題する米国仮特許出願第６１／３４８，１３５号の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、概して、医療用材料および医療処置に関し、具体的な側面では、細胞を含む医療用移植片、ならびにこれらの調製に有用な方法、基質および装置に関する。
【背景技術】
【０００３】
再生医学の分野は、患者の広範囲にわたる多様な疾患または障害の治療を改善する大きな可能性を示してきた。１つの研究分野として、患者または他のソース由来の生細胞を含む移植可能な移植片材料を研究する分野がある。患者由来の細胞の採取および再導入に関し、いわゆる自家移植細胞治療、方法、およびシステムは、患者由来の組織サンプルを加工して患者に再導入できる細胞調製物にするものとして知られている。このような方法およびシステムは病院という環境における「臨床」で使用できるものであると提案されてきた。たとえば、病院における一回の処置または一回の通院で、生体組織サンプルを患者から採取、処理して細胞組成物にし、これを患者に再導入する。
【０００４】
ある使用形態では、患者にこれから導入する細胞を細胞成長基質と結合させることにより、移植可能な細胞含有移植片を形成できる。こういった使用形態は、細胞成長基質への適用後に細胞の数が増える培養期間を伴うことがある。これ以外の使用形態は、このような増殖を伴わず、細胞は、細胞成長基質に適用され、培養期間なしで移植される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
可能性は示されているものの、細胞含有移植片材料の臨床での実現は遅れている。細胞を細胞成長基質と結合させてこれらが患者の体内で生き残り多くの場合は増殖するようにするための、より簡便および／または有効な方法または材料が必要とされている。本発明は本発明のある局面においてこれら需要に応える。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、その実施の形態のいくつかにおいて、患者に投与するための細胞含有移植片材料の調製に有用な方法、細胞成長基質、および装置を提供する。本発明の細胞成長基質は、この基質と細胞懸濁液との結合を強化することができる特徴を含み得る。ある実施の形態において、このような特徴は、細胞成長基質内に定められ細胞懸濁液を基質に投与している間の細胞の分散を促進する、筒状通路を含む。本明細書に開示されるさらなる実施の形態は、細胞が播種された流動性マトリクス移植片組成物を調製するための方法および装置、細胞組成物を細胞成長基質に適用する前にこの基質をプレコンディショニングするための方法および装置、細胞組成物と、たとえば細胞を基質材料の体積全体に分散させるための特徴を含む基質材料とを結合させることにより、細胞が播種された移植可能な移植片を調製するための、自動化された方法および装置、ならびに、粒状形態の細胞成長基質およびこれを用いて流動性細胞移植材料を調製することに、関する。
【０００７】
ある特定の実施の形態において、細胞の成長をサポートするための細胞成長基質が提供される。この細胞成長基質は、少なくとも１つの細長い筒状通路を含み、この細長い筒状通路は管腔を定める通路壁を有し、この管腔は、細胞成長基質本体の表面にある第１の管腔開口から細胞成長基質の内部領域内に延びる。この管腔は、細胞含有液体培地の流れを受けて細胞を細胞成長基質の内部領域内に分散させるように構成してもよい。細胞成長基質は細胞成長マトリクスでもよい。この基質は、コラーゲンを含んでいてもよく、および／または基質の外側にあり管腔開口に流動結合された合成ポリマー筒状要素も含んでいてもよい。基質は複数の筒状通路を含んでいてもよい。上記少なくとも１つの筒状通路は、少なくとも１つの一次筒状通路と、一次筒状通路から分岐した少なくとも１つの二次筒状通路とを含んでいてもよい。基質は、リモデリング可能なコラーゲン性細胞外マトリクスシート材料を含んでいてもよく、シート材料は、このシート材料のための動物ソース組織由来の成長因子、グリコサミノグリカン、および／またはプロテオグリカンを保持していてもよい。
【０００８】
別の実施の形態において、上記段落に記載されたもののような細胞成長基質を細胞の液体懸濁液のソースに接続するステップであって、この接続するステップは、上記細長い通路を上記ソースの輸送管腔と流動連結することを含む、細胞が播種された材料を調製するための方法が提供される。この方法はまた、ある量の細胞の液体懸濁液を輸送管腔を通して細長い通路の中に輸送することにより、細胞を基質の内部領域に送達するステップを含む。この接続するステップは、細胞の液体懸濁液のソースに流動接続された投入チューブを有する細胞播種チャンバに基質を挿入し、投入チューブを基質の第１の管腔開口に流動結合するステップを含んでいてもよい。
【０００９】
さらなる実施の形態において、患者に送達するための細胞が播種された組成物を調製するための方法が提供される。この方法は、細胞外マトリクスの粒子と液体培地とを含む流体細胞外マトリクス粒状組成物を液体細胞懸濁液と結合させて細胞流体組成物を形成するステップとを含む。この方法はまた、細胞流体組成物を混合するステップおよび／または細胞流体組成物をゲル化するステップを含んでいてもよい。このゲル化するステップは、細胞流体組成物のｐＨを変えるステップおよび／または細胞流体組成物の温度を変えるステップを含んでいてもよい。
【００１０】
さらなる実施の形態は、細胞移植片を調製し投与するための方法を提供する。この方法は、血清タンパク質組成物を、患者に投与するのに適した生体適合性基質に適用することにより、血清タンパク質組成物と生体適合性基質とを含むプレコンディショニングされた基質を調製するステップを含む。プレコンディショニングされた基質に細胞を加えることによって細胞移植片を調製し、この細胞移植片を患者に投与する。血清タンパク質組成物を適用するステップは、この組成物を吹付けにより適用するステップを含んでいてもよい。細胞を加えるステップは、液体細胞懸濁液をプレコンディショニングされた基質に吹付けるステップおよび／または液体細胞懸濁液を基質の筒状通路の中に流すステップを含んでいてもよい。
【００１１】
別の実施の形態において、マトリクスに細胞を播種するための装置が提供される。この装置は、細胞の液体懸濁液を収容するための第１のチャンバと、細胞が播種される細胞成長マトリクス材料を収容するための第２のチャンバとを含む。この播種装置はさらに、ある量の細胞の液体懸濁液を第１のチャンバから第２のチャンバに移送するための通路と、細胞の液体懸濁液の少なくとも１つの状態を検出するための装置と、ある量の細胞の液体懸濁液を第２のチャンバに収容されているマトリクス材料に適用するための適用装置とをさらに含む。この適用装置は、少なくとも１つのスプレーノズル、または、管腔を有する少なくとも１つのカニューレを含んでいてもよい。播種装置はまた、スプレーノズルまたはカニューレを移動させるための機構を含んでいてもよい。適用装置がカニューレを含む場合、上記移動させるための機構は、液体細胞懸濁液を最遠位端開口といったカニューレの開口から分散させている間にカニューレを近位方向に後退させるように機能してもよい。播種装置はまた、マトリクス材料を、適用装置に対して予め定められた位置で保持するための位置合わせ構造も含んでいてもよい。播種装置はまた、第２のチャンバに付随し、かつ、適用装置によって細胞をマトリクス材料に適用した後マトリクス材料内での細胞の分散を容易にするように機能する、分散支援装置を含んでいてもよい。この分散支援装置は、マトリクス材料に磁界を発生させるように機能してもよく、第２のチャンバに収容された液体に流れを生じさせるように機能するミキサであってもよく、第２のチャンバ内で圧力傾斜を発生させるように機能してもよく、第２のチャンバに収容された細胞成長基質を動かすように機能してもよく、および／または第２のチャンバを回転させて細胞を少なくとも部分的に遠心力によって細胞成長マトリクス材料内で分散させるように機能してもよい。ミキサがある場合、流れを生じさせるように機能するミキサは、第２のチャンバに収容された液体の中でパルス状の双方向の流れを生じさせるように機能してもよい。
【００１２】
さらなる実施の形態は、流動性の、細胞が播種された移植片を調製するための装置を提供する。この装置は、細胞の液体懸濁液を含む第１のチャンバと、細胞の液体懸濁液が流動性細胞成長基質材料と結合することによって、流動性の、細胞が播種された移植片材料を形成できるように、第１のチャンバに流動接続され、細胞が播種される流動性細胞成長基質材料を含む第２のチャンバとを含む。この装置はまた、流動性の、細胞が播種された移植片材料を混合するように機能するミキサを含む。このミキサは、上記流動性の、細胞が播種された移植片材料の流路の中に配置された静止ミキサ、または回転ミキサを含んでいてもよい。第１および／または第２のチャンバは通路であってもよい。
【００１３】
別の実施の形態において、ヒトの患者を含む患者を治療するための細胞が播種された基質を調製するための方法、および場合によってはその患者を治療するための方法が提供される。この方法は、患者の組織サンプルを処理してその患者の細胞の懸濁液を得るステップと、細胞成長基質を細胞播種装置のインキュベーションチャンバ内に入れるステップとを含む。この方法はまた、細胞播種装置の動作を開始させるステップを含み、この動作により、細胞の懸濁液の少なくとも１つの状態を検出し、懸濁液の細胞を細胞成長基質と結合させることにより、細胞が播種された基質を形成する。患者を治療するための方法において、この方法は、細胞が播種された基質を患者に投与するステップも含む。
【００１４】
細胞を第１の粘度を有するゲル化可能な組成物と混合することによりゲル化可能な細胞混合物を形成するステップと、ゲル化可能な細胞混合物を細胞成長基質に適用するステップとを含む、細胞が播種されたマトリクスを調製するための方法も提供される。この方法はまた、ゲル化可能な細胞混合物をゲル化して上記細胞成長基質と接触する細胞ゲルを形成するステップを含む。このゲルは第１の粘度よりも大きい第２の粘度を有していてもよい。上記混合物のゲル化は、たとえば混合物のｐＨを変化させる（たとえば上げるまたは下げる）および／または混合物の温度を変化させる（たとえば上げるまたは下げる）ことを含む任意の適切な方策またはその組合せによって生じさせてもよい。この混合物を基質と接触させることにより、基質の外面上に層を与えることができ、および／またはこの混合物を基質全体（たとえば基質が多孔質の場合）または基質の少なくとも一部において実質的に均質的に分散させることができる。その後の混合物のゲル化によって、外部に細胞化されたゲル層が与えられる、および／または細胞化されたゲルが基質の全体または一部に実質的に均質的に分散する。
【００１５】
さらなる実施の形態において、細胞外マトリクス基質材料と、基質材料に適用されたコラーゲン性ゲルと、基質材料に、ゲルに、またはこれら双方に付着した細胞とを含む、細胞が播種された移植片が提供される。コラーゲン性ゲルは、天然コラーゲンと、細胞外マトリクス水解物のためのソース組織由来の少なくとも１つのさらなる天然生物活性物質とを含む、細胞外マトリクス水解物からなるものであってもよい。上記少なくとも１つのさらなる天然生物活性物質は、成長因子、グリコサミノグリカン、および／またはプロテオグリカンを含んでいてもよい。
【００１６】
さらなる実施の形態は、ヒトの患者を含む患者を治療するための細胞移植片を調製するための方法、および場合によってはその患者を治療するための方法を提供する。この方法は、患者から血清を採取するステップと、患者の組織サンプルを処理することにより患者の細胞群を得るステップとを含む。この方法はさらに、血清をマトリクス基質に適用することにより、血清がプレコンディショニングされたマトリクス基質を調製するステップと、細胞群をプレコンディショニングされたマトリクス基質に適用することにより、細胞移植片を形成するステップとを含む。患者を治療するための方法において、この方法は、細胞移植片を患者に投与するステップも含んでいてもよい。
【００１７】
さらに他の実施の形態において、患者を治療するための材料を調製する方法、および場合によってはその患者を治療する方法も提供される。この方法は、細胞の懸濁液を粒状細胞成長基質と結合させるステップと、細胞の数が大幅に増えない程度の期間および条件で、粒状細胞成長基質と接触させて細胞の懸濁液をインキュベートすることにより、粒状細胞成長基質の粒子に付着した細胞を有する、細胞化された粒状体を形成するステップとを含む。患者を治療するための方法において、この方法は、細胞化された粒状体を患者に投与するステップも含んでいてもよい。いくつかの形態において、この方法のインキュベートするステップは、懸濁液内の細胞の少なくとも２０％は粒子に付着するが細胞の数は増えない程度の期間および条件で行なわれてもよい。
【００１８】
別の実施の形態は、患者を治療するための細胞移植片を提供し、場合によっては、患者をこの細胞移植片で治療するための方法におけるおよび／または患者の治療のための材料を製造するための方法におけるこの細胞移植片の使用も提供する。この細胞移植片は、細胞外マトリクス粒子に付着した細胞からなる、細胞化された粒状体を含む。治療に使用する場合、細胞移植片を患者の体内に導入してもよい。
【００１９】
別の実施の形態は、粒状細胞成長基質材料と、細胞成長基質材料の粒子に付着した細胞とを含む細胞移植片材料を提供する。細胞は、血管内皮前駆細胞、筋肉由来細胞、またはその組合せを含む。粒子は、動物ソースから分離させられ任意で処理されることにより内因性成長因子、グリコサミノグリカンおよび／またはプロテオグリカンを保持する、天然由来細胞外マトリクスシート材料の粒子であってもよい。このような天然由来細胞外マトリクスシート材料の粒子は、シート材料を粉砕することによりランダムに発生した粒子を形成することによって、および／またはシート材料を切断して規則的な形状（たとえば円形、卵型および／または多角形）の粒子を形成することによって、調製してもよい。
【００２０】
さらなる実施の形態は、細胞外マトリクス材料からなるフィラメントと、フィラメントに付着した細胞群とを含む細胞移植片を提供する。フィラメントは、動物ソースから分離させられ処理されることにより内因性成長因子、グリコサミノグリカン、および／またはプロテオグリカンを保持する、天然由来細胞外マトリクスシート材料のセグメントであってもよい。
【００２１】
別の実施の形態は、フィラメントの形態の細胞成長基質と、フィラメントに付着した細胞群とを含む細胞移植片を提供する。細胞は血管内皮前駆細胞を含む。この細胞移植片は、細胞の組織の血管新生のための方法を提供する本発明のさらなる実施の形態において患者の組織内に導入してもよい。
【００２２】
別の実施の形態は、細胞移植片を調製するための方法を提供する。この方法は、第１の細胞成長基質シートを調製するステップと、最初に、細胞組成物を第１の細胞成長基質シートの表面に適用することにより、第１の細胞播種面を形成するステップとを含む。上記最初の適用の後、この方法は、第２の細胞成長基質シートを前記第１の細胞播種面の上に積層するステップを含む。この方法は、次に、細胞組成物を第２の細胞成長基質シートの表面に適用するステップも含んでいてもよい。
【００２３】
別の実施の形態は、第１の細胞成長基質シートと、第１のシートの上に積層させた第２の細胞成長基質シートとを含む細胞移植片を提供する。この移植片はまた、第１のシートと第２のシートとの間にある、細胞が播種された層を含む。
【００２４】
別の実施の形態は、細胞が播種された移植片を調製するための装置を提供する。この装置は、細胞成長基質を収容するためのインキュベーションチャンバと、ある量の懸濁液を供給するための複数のカニューレを含む、液体細胞懸濁液を細胞成長基質に適用するための適用装置とを含む。この装置は、上記ある量の懸濁液を複数のカニューレから供給している間にこれらカニューレを後退させるように構成してもよい。
【００２５】
さらに別の実施の形態において、小型形状を有するシート形態細胞成長基質粒子を有する粒状材料を含む細胞成長基質組成物が提供される。いくつかの形態において、シート形態基質粒子の少なくとも２５％は、シートの面で考えたとき、第１の最大断面寸法軸を有し、この最大断面寸法軸は、この軸に対して垂直でありかつこの軸を中心とする線上の第２の断面軸の長さの約２倍以下である。基質粒子の最大断面寸法は、約２０ミクロン〜約２０００ミクロンの範囲であってもよい。基質粒子は、動物ソースから分離させられ任意で処理されることにより内因性成長因子、グリコサミノグリカンおよび／またはプロテオグリカンを保持する、天然由来細胞外マトリクスシート材料の粒子であってもよい。このような天然由来細胞外マトリクスシート材料の粒子は、たとえばシート材料を切断して小型形状（たとえば円形、卵型および／または多角形）の粒子を形成することによって調製してもよい。
【００２６】
別の実施の形態は、小型形状を有するシート形態細胞外マトリクス粒子を有する粒状細胞外マトリクス材料を含む細胞外マトリクス組成物を提供する。シート形態細胞外マトリクス粒子の少なくとも２５％は、シートの面で考えたとき、第１の最大断面寸法軸を有していてもよく、この最大断面寸法軸は、この軸に対して垂直でありかつこの軸を中心とする線上の第２の断面軸の長さの約２倍以下であってもよい。細胞外マトリクス粒子の最大断面寸法は、約２０ミクロン〜約２０００ミクロンの範囲であってもよい。細胞外マトリクス粒子は、動物ソースから分離させられ任意で処理されることにより内因性成長因子、グリコサミノグリカンおよび／またはプロテオグリカンを保持する、天然由来細胞外マトリクスシート材料の粒子であってもよい。このような天然由来細胞外マトリクスシート材料の粒子は、たとえば、シート材料を切断することにより小型形状（たとえば円形、卵型および／または多角形）の粒子を形成することによって調製してもよい。細胞外マトリクス組成物はまた、粒子に付着した細胞を含んでいてもよく、この細胞は、いくつかの実施の形態では、粒子の外面の実質的に全体を覆いおよび／または粒子の表面上に実質的にコンフルエントな単一層を形成する。この細胞は、内皮細胞、血管内皮前駆細胞、またはその混合物を含んでいてもよく、および／またはクローンであってもよい。いくつかの形態では、細胞は、内皮細胞、血管内皮前駆細胞、またはその混合物からなるものであってもよい。
【００２７】
別の実施の形態において、細胞成長基質材料と、細胞成長基質材料を封入し、基質材料を通して流体培地の流れを導くように構成された、封入材料とを含む、細胞成長基質物が提供される。この封入材料は、少なくとも第１の開口と、第１の開口から間隔をあけて設けられた少なくとも第２の開口とを定めるものであってもよい。
【００２８】
別の実施の形態は、脂肪組織由来の混合された細胞群を含み、幹細胞、血管内皮前駆細胞、白血球、内皮細胞、および血管平滑筋細胞を含む、細胞移植片を提供する。この細胞移植片はまた、細胞外マトリクス材料からなる、および／または粒子の形態の、細胞成長基質を含む。細胞外マトリクス材料は、細胞外マトリクス材料のためのソース組織由来の、保持された生物活性成分を含んでもよい。この保持された生物活性成分は、成長因子、グリコサミノグリカンおよび／またはプロテオグリカンであってもよい。使用されるとき、粒状細胞成長基質はシート形態粒子を含んでいてもよい。これらの目的のために、天然由来細胞外マトリクスシート材料からなるシート形態粒子は、たとえば、シート材料を切断することによりたとえば小型形状（たとえば円形、卵型および／または多角形）の粒子を形成することによって調製してもよい。
【００２９】
さらなる実施の形態において、血管内皮前駆細胞群と粒状細胞成長基質とを含む細胞移植片が提供される。粒状細胞成長基質は、シート形態粒子を含んでいてもよく、および／または細胞外マトリクス材料を含んでいてもよい。細胞外マトリクス粒子は、これらの目的のために、動物ソースから分離させられ任意で処理されることにより内因性成長因子、グリコサミノグリカンおよび／またはプロテオグリカンを保持する、天然由来細胞外マトリクスシート材料の粒子であってもよい。このような天然由来細胞外マトリクスシート材料の粒子は、たとえば、シート材料を切断することにより小型形状（たとえば円形、卵型および／または多角形）の粒子を形成することによって調製してもよく、または、たとえばシート材料をランダムに粉砕することによって生成されたシート材料の破片であってもよい。
【００３０】
別の実施の形態は、マトリクスに細胞を播種するためのシステムを提供する。このシステムは、これから細胞で播種される細胞成長基質と細胞を結合させるためのチャンバを含む。このシステムはまた、細胞の基質への付着を評価するための機構を含む。この評価するための機構は、細胞カウンタを含んでいてもよい。関連するマトリクス播種方法は、これから細胞で播種される細胞成長基質と細胞を結合させるステップと、細胞の基質への付着を評価するステップとを含む。治療方法において、上記方法はまた、付着した細胞が播種された基質を、ヒトの患者を含む患者に投与するステップを含んでいてもよい。
【００３１】
本発明のさらなる実施の形態ならびにその特徴および利点は、本明細書におけるさらなる説明から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】本発明の細胞成長基質のある実施の形態の側面図を示す。
【図２】本発明の細胞成長基質の別の実施の形態の側面図を示す。
【図３】図１の基質の上面図を示す。
【図４】本発明の代替の細胞成長基質の上面図を示す。
【図５】細胞成長基質のさらなる実施の形態の上面図を示す。
【図６】マニホールド供給部を有する細胞成長基質の別の実施の形態の上面図である。
【図７】細胞成長基質の別の実施の形態の上面図を示す。
【図８】基質内において大きな一次チャネルと小さな二次チャネルとを有する細胞成長基質の別の実施の形態の上面図を示す。
【図９】細胞組成物を細胞成長基質に適用するためのシステムのある実施の形態の概略図を示す。
【図９Ａ】図９のシステムのいくつかの二次構成要素のある実施の形態を示す。
【図９Ｂ】図９のシステムのいくつかの二次構成要素の別の実施の形態を示す。
【図１０】細胞組成物を細胞成長基質と結合させるための装置の別の実施の形態の概略図を示す。
【図１１】その組成物が細胞成長基質として有用である、脱細胞化されたＥＣＭシートの小型シート粒子のデジタル画像を示す。
【図１１Ａ】送達装置と結合する、本発明の流動性細胞移植片材料を示す。
【図１２】本発明の細胞化されたフィラメント移植片を示す。
【図１２Ａ】遠位保持針を有する、本発明の細胞化されたフィラメント移植片を示す。
【図１２Ｂ】移植片の移植に使用されているときの送達針カニューレに収容された図１２Ａのグラフトを示す。
【図１３】複数の、積層された細胞成長基質シートを有する、本発明の細胞移植片を示す。
【図１４】本発明の製品である細胞成長基質物を示す。
【図１５】本発明の製品である細胞成長基質物を示す。
【図１６】本発明の製品である細胞成長基質物を示す。
【図１７】本発明のさらなる細胞移植片構造体を示す。
【図１８】本発明のさらなる細胞移植片構造体を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
次に、本発明の原理の理解を促すために、そのいくつかは図面に示されている実施の形態を参照する。これら実施の形態については特定の表現を用いて説明する。しかしながら、これは本発明の範囲を限定することを意図しているのではないことが理解されるであろう。記載された実施の形態における任意の変更およびさらなる変形、ならびに本明細書に記載の発明の原理のさらなる任意の応用は、本発明に関連する技術の当業者が通常想到するものであると、考えられる。
【００３４】
ここまでの開示されてきたように、本発明の局面は、細胞を基質材料と結合させることにより、患者に対する医療用移植組織としていくつかの実施の形態で使用可能な組成物を調製するための方法、材料およびシステムに関する。
【００３５】
定められた内部通路を有する細胞成長基質
次に図１〜図８を参照して、細胞組成物と結合させて細胞含有移植片材料を形成するのに特に有用な細胞成長基質構造体のさまざまな実施の形態を示す。
【００３６】
具体的に、図１は、マトリクス基質２０の側面図を示す。基質２０は、好ましくは細胞成長をサポートするのに適した多孔性マトリクス材料からなる基質体２１を含む。基質体２１は内部に定められた通路２２を含み、この通路は基質体２１の内部領域に延在する。ここで示されている実施の形態２０において、基質体２１は第１のシート２３および第２のシート２４を含み、シート２３は、シート２３とシート２４との間において通路２２を定めるようにシート２４に接続される。シート２３およびシート２４は、通路２２を囲む領域において接続領域２５に沿って互いに接続される。接続領域２５は、たとえば、接着、融着、糊付け、架橋、縫合、または他の方法によって、シート２３およびシート２４の対向する面同士を密に接続したものであってもよい。したがって、筒状通路２２は、シート２３の面によって定められた部分２６と対向するシート２４の面によって定められた部分２７とを有する通路壁を含む。ここで示されている実施の形態では、領域２６および２７は、おおむね丸くされ、実質的に円形または卵型の断面を通路２２に与えている。多角形のまたは不規則な断面形状を有する通路を含めて他の構成も適切であることが理解されるであろう。接続領域２５は、通路２２の管腔において終端領域２８および２９を有する。終端領域２８および２９はしたがって、通路２２の壁に沿う継ぎ目として生じ得る。
【００３７】
基質２０を調製するためには、１つまたは複数の通路形成要素を、シート２３とシート２４との間に配置し、次に、これらのシートを接続領域２５において互いに接続することにより、これらシートの間に上記１つまたは複数の通路形成要素を挟めばよい。上記のように、この接続は、接着、融着、糊付けまたはその他の方法によるものでよい。通路２２が基質２０の最外端で開口していることが望ましい場合、１つまたは複数の通路形成要素は、シート２３および２４を重ねたときにこれらのシートの最外端までまたはこの最外端を越えて延びることにより最終製品において上記開口を提供するものであってもよい。このような調製の方法において、１つまたは複数の通路形成要素は、シート２３とシート２４との間において空間を維持することにより通路を完成品に与えるのに適した、ロッド、棒、櫛型構造、ワイヤ、筒、またはその他任意の要素であってもよい。１つまたは複数の通路形成要素が接続領域２５の形成後に除去される実施の形態においては、通路形成要素の外面が、シート２３および２４の対向する面同士が互いに張付かないようにまたは結合しないようにするのに足りるものであることによって、接続領域２５の形成後通路２２を傷つけずに通路形成要素を除去できることが、望ましい。
【００３８】
いくつかの実施の形態において、通路形成要素またはその少なくとも一部は、最終製品の中に残されたままである。次に図２を参照して、１つのこのような実施の形態が示されている。基質３０は、マトリクス２０と同じ特徴を含み、通常は同じやり方で構成できる。したがって、基質３０は、本体３１と、本体３１の内部領域への通路３２と、互いに接続されたシート３３および３４とを含む。加えて、基質３０の中には、シート３３と３４との間に収容された筒状要素３５が残されている。筒状要素３５は、生体適合性ポリマーまたは他の適切な材料で作られていてもよく、基質３０内に残されたままで患者に移植されてもよい。筒状要素３５は、難分解性ポリマー（非生体吸収性）または生体吸収性ポリマーを含むものであってもよい。いくつかの実施の形態において、筒状要素３５は、生体吸収性ポリマーを含み患者への移植後に完全に吸収されるものであってもよい。基質３０の製造においては、筒状要素３５をシート３３と３４との間に置き、次に、これらシートを基質２０（図１）について述べたように接続すればよい。これに代えて、基質２０のような要素をまず調製し、その後、筒状要素を通路２２に挿入してもよい。筒状要素３５は、多孔性の壁、またはその壁における穴もしくは穿孔を含むことにより、流動性細胞懸濁液が筒状要素３５の壁を通過し周囲にある、移植片本体３１の領域に入ることができるようにするものであってもよい。いくつかの形態において、筒状要素３５は、水性細胞懸濁液に対する吸収性が本体３１の材料よりも低いことによっておよび／または濡れたときに本体３１の材料よりも堅い状態を保つことによって開放された通路を維持する材料で構成され、したがって、水性細胞懸濁液の流れを通路３２に沿って一層良好に送ることによりこの液が基質３１の内側領域に到達するようにできる。筒状要素３５の多孔性または穿孔を制御することによって、水性細胞懸濁液の流れを通路３２の中に投入したときの濡れ性および基質３１の細胞播種を最適にできる。
【００３９】
次に図３を参照して、図１の基質要素２０の上面図が示されている。通路２２は架空の線（点線）で示されている。示されている基質２０は、おおむね平行な側面４０および４１からなる第１の対とこれらに対して垂直であるおおむね平行な側面４２および４３からなる第２の対とを含む、おおむね矩形の構造である。通路２２は、基質２０の側面４０において露出した開口を有する。示されている実施の形態の通路２２は、めくら穴であり、本体２１の内部において、本体２１の側面４１から距離「ｄ」だけ離れた位置にある終端４４を有する。このようにして、水性細胞懸濁液のような流体組成物を、側面４０から通路２２の中に通すことができ、この流体組成物は、通路２２によって反対側４１まで運ばれることはない。これにより、流体圧力を通路２２の中で生み出すことにより、より速やかに基質プレコンディショニング培地のような細胞懸濁液および／または別の流体を、本体２１の隣接領域の中に分散させることができる。いくつかの使用モードでは、めくら穴通路２２に対し、側面４０にある通路２２の開口を通して導入された流体から圧力が加わることにより、この流体および溶解または懸濁した（たとえば細胞）材料を、本体２１の体積の中におよびこれを通して流すことができる。
【００４０】
図４〜図８を参照して、内部通路を定める基質要素の代替の実施の形態が示されている。具体的には図４を参照して、通路が基質の第１の縁から第２の縁まで全体的に延びていることを除いて図１および図３の基質２０と同様の特徴を有する細胞成長基質５０が示されている。具体的に、基質５０は、第１の側面５２と、側面５２に対しておおむね平行である第２の側面５３と、第３の側面５４と、側面５４に対しておおむね平行である第４の側面５５とを有するおおむね矩形の本体５１を含む。基質５０は、本体５１の材料を通して延びる複数の通路２２を含む。通路２２は、基質５０の側面５２における第１の開口５６群と、側面５２の反対側の基質５０の側面５３における第２の開口５７群とを有する。このようにして、通路２２は、基質本体５１において間隔があいた場所であって示されている実施の形態では対向する側面５２および５３にある、開口５６および５７を示す。細胞を含む流動性組成物を開口５６から開口５７まで通路２２を通して流すことにより、細胞が本体５１の材料を通りこれに接触し付着するようにして、基質５０に細胞を植付けることができる。
【００４１】
図５を参照して、第１の組の通路と第２の組の通路が交差していることを除いて図４の基質５０と同様の細胞成長基質６０が示されている。したがって、基質６０は、第１の側面６２、第２の側面６３、第３の側面６４、および第４の側面６５を有する基質本体６１を含む。基質６０は第１の複数の通路２２を含み、これら通路は、本体６１の側面６２における開口６６と本体６１の側面６３における反対側の開口６７とを有する。基質６０は第２の複数の通路６８を含み、これら通路は、本体６１を通して、通路２２の方向を横断する方向に、示されている実施の形態では通路２２の方向に対して実質的に垂直に延びている。通路６８は、側面６４にある開口６９と、側面６５にある対向する開口７０とを含む。いくつかの実施の形態では、通路６８は、通路２２に流動結合され、本体６１全体に分散している通路交点７１で通路２２と交差する。使用時には、細胞組成物を通路２２および通路６８を通して流すことによって、基質６０に細胞を植付けることができる。この点に関し、流体細胞組成物は、通路２２および６８に、同時に流しても時間をずらして流してもよく、または、細胞植付け作業中においてこれらを組合せて流してもよい。通路２２および６８が互いに交差ししたがって流動結合される実施の形態では、細胞組成物またはその他の流体を通路２２および６８に同時に流すことにより、交点７１において、乱流、渦、または通路２２にも６８にも一致しないベクトルに沿う実際の流れの部分的な方向変化といった、流体の流れの状態を生じさせることができる。これにより、容易に流体を通路から外に出して基質本体６１を構成する周囲の材料の体積の中に流すことができる。これにより、細胞またはその他の物質を、基質本体６１の体積を通して、より速やかにまたは効率的に分散させることができる。
【００４２】
図６を参照して、一般的なマニホールド構造によって与えられる複数の通路２２を有する細胞成長基質８０が示されている。具体的には、基質８０は本体８１を含み、本体８１には、この本体を通して延びる複数の通路２２がある。共通する供給通路８２は複数の通路２２に流動結合する。共通する供給通路８２は、本体８１の外部に対する開口８４を有する投入通路８３に流動結合される。通路２２は各々、本体８１の外部に対する開口８５を有する。使用時には、細胞組成物といった流体を、開口８４を通して投入経路８３の中に流すことができ、そうすると、流体組成物は共通する通路８２の中に流れ、これが、流体組成物を通路２２の中に流しこれを通して分散させ、流体組成物は開口８５を介して外に出る。このようにして、流体細胞組成物またはその他の組成物を基質８０を通して循環させ場合によっては再循環させることにより、基質に細胞を植付けることができる。本明細書に記載の他の実施の形態と同様、このためには、通路２２および場合によっては通路８２および８３もこの組成物に対する透過性を有することによって、この組成物が隣接する本体８１の体積の中に流れ出すようにすればよい。
【００４３】
次に図７を参照して、別の細胞成長基質９０が示されている。基質９０は、本体９１と、第１、第２、第３および第４の側面９２、９３、９４、９５とを含む。本体９１は、本体９１の材料を通して延び、第１の外部開口９７とこれに対して間隔があいた位置にある第２の外部開口９８とを有する曲がりくねった通路９６を含む。示されている実施の形態において、曲がりくねった内部通路９６は、第１の屈曲部９９とその反対側にある第２の屈曲部１００とを含み、屈曲部９９および１００は反対方向に位置する。おおむね直線状の通路部分１０１は、屈曲部９９と１００とを互いに接続する。このように、曲がりくねった通路９６は、開口９７から開口９８にかけて、概ね繰返される正弦波の形状を有する。細胞を含有する流体を開口９７から曲がりくねった通路９６を通して開口９８へと循環させ、その間に、細胞および流体が通路９６から出るようにすることによって、基質９１の体積に細胞を播種することができる。
【００４４】
次に図８を参照して、上記基質９０と共通する多くの特徴を有する細胞成長基質１１０が示されており、これら特徴には対応する番号が付されている。しかしながら、基質１１０は、一次通路１１６に流動結合されかつ一次通路１１６から出て延びている複数の二次通路１２２も含んでいる。二次通路の直径または断面積は、曲がりくねった通路１１６よりも小さい。したがって、二次通路１２２は、一次通路１１６を通る細胞流体の流れを受けて、この流体およびこの流体に伴う細胞の基質本体１１１における分散を助けることができる。
【００４５】
図１および図３〜図８に示される細胞成長基質のさらなる実施の形態では、図２に関して先に述べたように、別個の筒状要素が、定められた内部通路の一部またはすべてに収容されるようにしてもよい。加えて、好ましい実施の形態において、示された基質を調製するために使用されるシート（たとえば２３および２４）は、以下で説明するように、脱細胞化されたＥＣＭ組織のシート、望ましくは天然（内因性）生物活性成分を保持するもので構成されていてもよい。また、図１〜図８に示される基質の本体は、多孔性スポンジまたは発泡体マトリクスからなるまたはこれで構成されるものであってもよい。この多孔性スポンジまたは発泡体マトリクスは、例として、たとえば本明細書に記載のもののうちいずれかのマトリクス形成材料を通路の周りにおいて鋳造することによって形成することができ、上記のようにこれをその後取出すかまたは最終製品の中に残すことによって通路を与えることができる。
【００４６】
細胞／基質処理システムおよび方法
本発明のさらなる局面において、細胞を基質に自動的に播種するための装置が提供される。図９は、自動化された細胞播種システム２００のある実施の形態の概略図を示す。システム２００は、任意で、未処理のまたは初期段階の組織サンプルを処理してこの組織サンプルから得られた単細胞懸濁液を与える未処理組織処理モジュール２０１を含んでいてもよい。処理モジュール２０１はしたがって、この目的に共通する１つ以上の機能として、たとえば、組織の物理的な破壊（たとえば液浸軟化）、組織の酵素（たとえばコラゲナーゼ、トリプシン）によりまたはその他の化学的切断、および／または組織もしくは細胞成分を食塩水もしくはその他適切な洗浄媒体で洗浄することを含む機能を果たすように動作してもよい。組織処理モジュール２０１はまた、たとえば、特定の細胞種または群の免疫化学的選択、分別、ろ過、沈降またはその他同様の作業を含む、細胞分離または濃度を高める工程を行なってもよい。モジュール２０１はまた、たとえば、成長基質または成長培地および細胞数を増すのに適切なインキュベート条件を提供する、細胞数増大のための特徴を含んでいてもよい。細胞懸濁液を提供する組織処理のためのシステムの例は、２００５年２月３日に公開された米国特許出願公開ＵＳ２００５／００２５７５５、２００７年１月１８日に公開された国際公報ＷＯ２００７／００９０３６、２００８年１月１７日に公開された米国特許出願公開ＵＳ２００８／００１４１８１、および２００６年７月２９日に公開された米国特許出願公開ＵＳ２００６／０１４１６２３に開示されている。これら公報は各々、システム２００のモジュール２０１で使用するのに適した単細胞懸濁液を得るための組織処理方法および機器を教示しているものとして、その全体が本明細書に引用により援用される。
【００４７】
モジュール２０１から提供された細胞懸濁液は、導管２０２を介して細胞懸濁液チャンバ２０３に移される。細胞懸濁液の少なくとも１つの状態を検出するための装置２０４が、場合によっては細胞懸濁液を基質に与える前に調節するため、および／または細胞懸濁液を基質に与えるためのパラメータを最適化するための入力を与えるために、設けられる。たとえば、装置２０４は、チャンバ２０３内の細胞懸濁液における細胞の濃度を求めるように機能できるものであってもよく、かつチャンバ２０３に機能的に付随する。非制限的な例として、装置２０４は、細胞が液体で満たされたチャネルを通過している間のこのチャネルの電気抵抗の変化に基づいて細胞カウント値を得るコールターカウンタのような細胞カウント装置であってもよい。この抵抗の変化は電流または電圧パルスとして検知することができ、これを細胞懸濁液内の細胞の濃度と関連付けることできる。装置２０４はまた、レーザを用いて前方への光の分散といった光の分散を利用して細胞の濃度の値を算出する装置であってもよい。また、装置２０４は、流動細胞分析法（flow cytometry）用いて細胞懸濁液内の細胞の濃度を求める装置であってもよい。細胞濃度を測定するための他の手段は当業者にとって明らかであろう。また、細胞濃度を測定するための特定の手段は本明細書に開示されているシステムおよび方法にとって極めて重要なものではないことが理解されるであろう。
【００４８】
細胞濃度の解析を容易にするために、装置２０４は、解析のために導管２０５を介して細胞懸濁液のサンプルを抜取ることができる。任意で、装置２０４は、チャンバ２０３内の細胞懸濁液に望ましくない汚染が生じないのであれば、この細胞サンプルを解析後に導管２０６を介してチャンバ２０３に戻してもよい。汚染が生じるのであれば抜取ったサンプルは廃棄ライン（図示せず）を介して破棄すればよい。装置２０４および／またはチャンバ２０３は、導管２０５、２０６を通して細胞サンプルを移動させるのに適したバルブおよび任意のポンプ（図示せず）を含んでいてもよく、これは当業者には明らかであろう。このようなバルブおよび／またはポンプは、以下でより詳細に述べるように、プロセスコントローラ２２９によって制御されてもよい。
【００４９】
システム２００はまた、導管２０８を介してチャンバ２０３に流動結合された処理培地ユニット２５０を含んでいてもよい。システム２００内において流体培地を移送するための他のすべての導管と同様、導管２０８を、任意のバルブ（図示せず）と、流体を培地ユニット２５０からチャンバ２０３に移送するための動力を与えるように機能するポンプ２０９とに、付随させてもよい。ポンプ２０９は、システム２００のさまざまなチャンバまたは他の構成要素のうちいくつかまたはすべての間において流体を移送するための動力を１つのポンプが与える、共有ポンプ機能によって提供されてもよいことが、理解されるであろう。したがって、システム２００に関しては別個のいくつかのポンプについて述べているが、これらポンプ機能はシステム２００の機能の中で共有されるものであっても別々のものであってもこれらを組合せたものであってもよいことが理解されるであろう。このようなバルブおよび／またはポンプは、以下でより詳細に説明するプロセスコントローラ２２９によって制御されてもよい。処理培地ユニット２５０は、モジュール２０１から与えられた細胞懸濁液組成物を加工または処理するためのさまざまな培地のうちいずれかを含むまたはいずれかで満たされた１つ以上のチャンバを含んでいてもよい。これら培地は、例として、たとえば細胞増殖相の異なる段階に対する異なる培地を含め、細胞成長基質に適用するための準備を細胞に対して行なうための、洗浄媒体、細胞培養培地、またはその他の材料を含み得る。
【００５０】
システム２００はまた、導管２１１を介して第１の細胞懸濁液チャンバ２０３と流動連通する最適化細胞調合チャンバ２１０と、任意のバルブ（図示せず）と、付随するポンプ２１２とを含む。このようなバルブおよび／またはポンプ２１２は、以下でより詳細に述べるようにプロセスコントローラ２２９によって制御されてもよい。このように、チャンバ２０３において何らかの初期処理を行なった後、細胞懸濁液組成物を、ポンプ２１２の動作によって導管２１１を通して移送することによって、さらなる処理のためにチャンバ２１０に移送してもよい。チャンバ２１０内の最適化された細胞調合物内の細胞の濃度を求めるための装置２１３が設けられる。装置２１３の設計は上記装置２０４と同様であってもよい。導管２１４は、細胞懸濁液組成物のサンプルをチャンバ２１０から解析のために装置２１３に移送するのに役立つものであってもよい。導管２１５は、任意で、適切であればサンプルをチャンバ２１０に戻すために設けてもよい。上記のようにその代わりにサンプルを解析後に廃棄ラインを介して廃棄してもよい。
【００５１】
調合培地ユニット２１６は、導管２１７を介してチャンバ２１０に流動結合される。ユニット２１６の１つ以上のチャンバからチャンバ２１０への材料の移送は、任意のバルブ（図示せず）およびポンプ２１８によって容易になるようにしてもよい。このようなバルブおよび／またはポンプ２１８は、以下でより詳細に述べるようにプロセスコントローラ２２９によって制御されてもよい。調合培地ユニット２１６は、細胞懸濁液と組合される、生理学的に患者に投与可能な材料を含んでいてもよい。調合培地は、たとえば、食塩水、細胞培養培地、抗生物質といった薬物、分化または休止といった特定の細胞反応を禁止するように設計された物質、または他の材料を含み得る。ある用途では、装置２１３を、チャンバ２１０内の細胞懸濁液の細胞濃度を求めるために使用する。細胞の濃度が細胞成長基質に与えるのに望ましい濃度よりも高い場合、調合培地をチャンバ２１６から追加して細胞懸濁液を希釈することにより、所望の細胞濃度を得てもよい。追加する調合培地の体積は、チャンバ２１０内の組成物の全体積および装置２１３によって求められた細胞濃度に基づいて算出してもよい。細胞成長基質に与える、最適化された細胞調合物にとって有益な細胞濃度値は、約１０５〜約１０８細胞／ｍｌの範囲でもよいが、他の濃度を使用してもよい。これとは異なり細胞濃度が所望の濃度よりも低い場合、たとえばある量の培地を取除くことによって細胞濃度を高めるための手段と、チャンバ２１０とを、機能的に関連付けてもよい。ある実施の形態では、チャンバ２１０からの出口２３８にフィルタ２３９を設けてもよく、このフィルタの穴の大きさとして、細胞は通さないが細胞懸濁流体培地は通す大きさが選択される。任意のバルブ（図示せず）およびポンプ２４０を設けて、ある量の細胞懸濁液をこのフィルタに抵抗して押すまたは引くことにより、ある量の流体培地を選択的にチャンバ２１０から除去して、チャンバ２１０内の細胞懸濁液を濃縮してもよい。必要であれば振動装置２４１を与えることによって振動をフィルタに与え作業中フィルタが細胞で詰らないようにしてもよい。これに加えてまたはその代わりに、このシステムを適切なポンプおよび／またはバルブで構成することにより、上記フィルタを通して液体を逆流させることにより、フィルタを逆流モードで洗浄してもよい。このような機能およびそれに伴う値、ポンプ２４０および／または振動装置２４１は、以下でより詳細に述べるようにプロセスコントローラ２２９によって制御されてもよい。出口２３８を介してチャンバ２１０から除去された材料は、たとえば廃棄ユニット（「Ｗ」）に送られてもよい。必要に応じ、廃棄ユニットＷは、チャンバ２０３にまたはシステム２００内の他の流体ソースにも流動結合されて、このチャンバまたは流体ソースから１つの廃棄チャンバまたは別々の廃棄チャンバへの廃棄物を受けてもよい。先に開始された濃度測定の結果、またはそうでなければチャンバ２１０に培地を導入したもしくはチャンバ２１０から培地を除去した結果として、チャンバ２１０内の細胞濃度を高めるまたは下げる調節を行なった後、さらなるサンプルを抜取って装置２１３に入れて評価することにより、細胞懸濁液が所望の濃度範囲にあることを確認してもよい。必要に応じてさらに調節を行なうことにより、所望の細胞濃度を得てもよい。細胞懸濁液が所望の細胞濃度を有することが確認された後、細胞懸濁液を、チャンバ２１０から適用装置２２１に、任意のバルブ（図示せず）を用いポンプ２２０による動力の供給を受けて移送することができる。このようなバルブおよび／またはポンプ２２０は、以下でより詳細に述べるようにプロセスコントローラ２２９によって制御されてもよい。
【００５２】
適用装置２２１は、細胞懸濁液組成物を播種チャンバ２２２内に収容されている細胞成長基質２２３に与えるためのさまざまな装置のうちいずれかでよい。適用装置２２１は、動作中静止していてもよく、または、動作中、静止していれば実現可能なより広い面積または体積に材料を与えるように移動できるものであってもよい。適用装置２２１は、以下でより詳細に述べるようにプロセスコントローラ２２９によって制御されてもよい。ある実施の形態において、適用装置２２１は、スプレー装置、たとえばインクジェットプリンタにおいて見られるのと同様のスプレーノズルまたはジェットスプレー装置であってもよい。このようなスプレー装置は、静止位置から、または１、２、もしくは３次元で移動することにより、細胞懸濁液組成物を基質に対して噴射することによって、この組成物を基質に与えるように配置すればよい。別の実施の形態では、適用装置２２１は、静止位置から、または１、２、もしくは３次元で移動している間に細胞組成物を細胞成長基質２２３の表面におよび／またはその中に与える、少なくとも１つのカニューレおよび好ましくは複数のカニューレを有するカニューレ状装置であってもよい。いくつかの実施の形態は、細胞組成物を与えている間基質２２３に挿入される１つのカニューレまたは複数のカニューレを有するカニューレ状の適用装置２２３を取入れ、細胞組成物は、たとえばカニューレが基質２２３の体積内の遠位位置で挿入されてから抜取られている間にカニューレから押出される。特定の実施の形態において、このような適用装置は、細胞組成物を基質２２３に与えるための線形のまたは他のアレイの針を含む。さらに他の適用モードは当業者には明らかであろう。
【００５３】
適用装置２２１は、望ましくは細胞組成物を実質的に均一に基質の表面にまたは基質の体積を通して与える。しかしながら、他の実施の形態では、適用装置２２１は基質のある部分に選択的に播種してもよく、したがって、適用装置２２１は、細胞組成物を基質２２３の特定領域に与えながら基質の他の領域には細胞組成物がない状態にしておくように構成してもよい。異なる種類の適用装置２２１を組合せてシステム２００に組込んでもよく、この場合、たとえば、システムはスプレー適用装置およびカニューレ状適用装置双方を含む。
【００５４】
本発明の特定の実施の形態において、システム２００は、たとえば図１〜図８に示されるような基質である、細胞組成物の流れを受けるための内部通路を定める細胞成長基質の上および／または中に細胞を播種するように構成された適用装置２２１を有する。このような実施の形態の適用装置２２１は、望ましくは、少なくとも１つのカニューレ、好ましくは複数のカニューレを含む。ある実施の形態において、カニューレは、基質内に定められた通路（たとえば図１〜図８の通路２２、６８、８３、８４、９６、および／または１１６）に流動結合され、ある量の細胞組成物をこの通路の中に送るように機能する。さらなる実施の形態では、カニューレは、適用装置２２１において、細胞成長基質の外側への通路の各開口に設けられ、この場合のカニューレは、このような開口に対応し、かつ位置合わせされる。細胞組成物を与えている間静止している適用装置２２１において、カニューレは、細胞組成物を圧力をかけて通路の中に導いてもよく、これにより、細胞組成物は、通路を通って流れ、通路の側壁から外に出て、周囲にある基質の材料の体積の中に入る。たとえば、図４の間隔をあけて配置された開口５６および５７を有する基質の通路２２、図５の間隔をあけて配置された開口対６６、６７および６９、７０をそれぞれ有する基質の通路２２および６８、図６の間隔をあけて配置された開口８４および８５を有する基質の通路８３、８４および２２、ならびに、図７および図８の間隔をあけて配置された開口対９７、９８および１１７、１１８をそれぞれ有する基質の通路９６および１１６といった、間隔をあけて基質に配置された開口を有する個々の通路を含む細胞成長基質の場合、適用装置２２１のカニューレは、各開口に流動接続されていてもよい。このような適用装置２２１は、たとえば、貫流モード、対向流モード、またはその組合せで機能してもよい。貫流モードでは、投入カニューレが、細胞組成物を通路への第１の開口の中に押出し、排出カニューレが、通路を通過し、投入された組成物の細胞の少なくとも一部を細胞成長基質の中に置いた後の流体を受ける。対向流モードでは、投入カニューレが、細胞組成物を通路への第１の開口および第２の開口双方の中に押出し、投入された流れはそれぞれ通路において逆方向に流れる。このようにして通路の中で圧力を生じさせることにより、細胞流体を通路から押出して周囲にある基質材料の体積の中に入れることによって、簡単により均一な播種動作を行なうことができる。
【００５５】
上記貫流モードでは、基質を通る細胞組成物の通路は１つだけであってもよいが、好都合な実施の形態は、排出カニューレが受けた材料を少なくとも１度基質通路に戻してさらに細胞を播種するように、実施されるであろう。これは、たとえば、排出された流体を集めて通路における流れを逆にすることによって、および／または排出された流体を再び同じ投入カニューレに導き基質の通路を通して排出カニューレに戻す再循環ループを設けることによって、実現してもよい。多くの実施の形態において、播種されていない細胞を含む元の排出流体を、複数回基質通路に戻して、細胞組成物の、より高い割合の元の細胞を、基質に播種することができる。
【００５６】
この点に関しては、図９とともに図９Ａを参照すると、この図は、図４に示されるような内部に管がある細胞成長基質５０に対する播種に有用な循環ループ適用装置２２１の１つの実施の形態を示している。適用装置２２１は、複数の投入カニューレ２２１ａと複数の排出カニューレ２２１ｂとを有し、投入カニューレ２２１ａは基質５０の開口５６に流動結合され、排出カニューレ２２１ｂは基質５０の開口５７に流動結合されている。投入カニューレ２２１ａは投入マニホールド２２１ｃに設けられ、これは開口２２１ｅを有する内部投入マニホールド通路２２１ｄを定め、マニホールド通路２２１ｄはカニューレ２２１ａ各々に流動結合されこれに対する供給を行なう。開口２２１ｅは、チャンバ２１０から細胞組成物を供給する導管２１９（図９）に流動接続されている。排出カニューレ２２１ｂは排出開口２２１ｈを有する内部排出マニホールド通路２２１ｇを定める排出マニホールド２２１ｆに設けられ、排出カニューレ２２１ｂは、排出マニホールド通路２２１ｇに流動結合されこれに対する供給を行なう。循環ループ２２１ｉは、投入マニホールド２２１ｃの投入開口２２１ｅと排出マニホールド２２１ｆの排出開口２２１ｈとを流動接続するように設けられる。コールター原理、光散乱、または流動細胞分析法を利用するカウンタのような細胞カウンタ２２１ｊを循環ループ２２１ｉに流動結合してもよい。細胞カウンタ２２１ｊは、上記のように、インラインでまたはサンプルを抜出して評価することによってループ２２１内で循環する流体における細胞濃度を求めることができる。任意のバルブ（図示せず）およびポンプ２２１ｋを設けて適用装置２２１における循環を促して基質５０に播種する。このような細胞カウンタ２２１ｊ、バルブ、および／またはポンプ２２１ｋは、以下でより詳細に述べるようにプロセスコントローラ２２９によって制御されてもよい。
【００５７】
使用時、バッチ操作で、連続的に、または間欠的に導管２１９から適用装置２２１の循環ループに供給された細胞組成物は、投入マニホールド２２１ｃ、投入カニューレ２２１ａ、基質５０、排出カニューレ２２１ｂ、排出マニホールド２２１ｆ、および循環ループ２２１ｉを通って繰返し循環する。この動作中に、細胞は基質５０に播種されいくつかの細胞は循環する流体の中に残るであろう。細胞カウンタ２２１ｊを用いて、循環ループ２２１ｉ内で循環している流体の細胞濃度を連続的にまたは周期的に求めることができる。最初に与えられた細胞のうち許容できる割合の細胞が基質５０に播種されたことは、細胞カウンタ２２１ｊが検出する細胞濃度が所望のまたは予め定められた低い値に達したときに、システム２００によって判断され、および／またはたとえば以下でより詳細に説明するプロセスコントローラ２２９を用いることによってユーザに伝えられる。その後、適用装置２２１内の循環を終了させてもよく、基質５０を、直ちにまたはさらなるインキュベーションもしくは培養期間後に患者に投与するように調製してもよい。
【００５８】
先に開示したように、他の実施の形態において、適用装置２２１は、細胞組成物を基質に適用している間動くように構成される。図９と合わせて図９Ｂを参照すると、（図９Ｂの点線で示される）図３の基質２０または図４の基質５０のような管が予め設けられた細胞成長基質に細胞組成物を与えるのに有用な、このような１つの適用装置２２１が示されている。図９Ｂの適用装置２２１は、投入マニホールド台２２１ｌに装着された複数のカニューレ２２１ｋを含む。投入マニホールド台２２１ｌは、投入開口２２１ｎを有する内部マニホールド通路２２１ｍを定め、マニホールド通路２２１ｍは、カニューレ２２１ｋに流動結合されこれに対する供給を行なう。投入開口２２１ｎは、システム２００の導管２１９に流動接続され、これはチャンバ２１０からの細胞組成物を供給する。投入マニホールド台２２１ｌは、台の柱２２１ｏに装着され、この柱は、柱供給台２２１ｐの開口において、移動可能な状態で収容される。電気モータ、ソレノイド、またはその他の動力機構（図示せず）が、柱２２１ｏに機械的に結合され、好ましくは一定の速度でまたは別の予め定められたやり方で、柱２２１ｏを台２２１ｐを通して後退させることにより、マニホールド台２２１ｌおよびこれに関連付けられたカニューレ２２１ｋを引戻す動作を生じさせる。基質２０、５０は、この引戻す動作の間、基質２０、５０の周囲の少なくとも一部と係合するクランプ部材２２４ａによって、または、適用装置２２１に対して位置合わせされた基質の位置を保つための他の適切な機構によって、最初の位置で安定して保持される（位置合わせ装置２２４に関する以下のさらなる説明参照）。カニューレ２２１ｋは、最初は基質２０または５０の通路２２の中に収容されており、その遠位端はこの通路内における遠位位置にあり、自動化された引戻し動作が開始されると、その間に細胞組成物は予め定められた速度でポンピングされカニューレ２２１ｋの先端から押出される。このようにして、引戻す速度およびカニューレ２２１ｋからの流量を制御することにより、システム２００は、細胞成長基質に所与の流動性細胞組成物を非常に効果的に播種できる。
【００５９】
引続き図９を参照して、上記のように、システム２００は、細胞成長基質２２３を、適用装置２２１のまたはチャンバ２２２内の最初のまたは処理中の位置に対する予め定められた位置で保持するための、位置合わせ装置２２４を含んでいてもよい。このようにして、所望のやり方で細胞組成物を基質２２３に植付けるように装置２２１を確実に機能させてもよい。位置合わせ装置２２４は、たとえば、基質２２３の材料または形状と連携して基質２２３をチャンバ２２２内の適所で保持する、直立する壁、クランプ、ピン、またはその他の特徴を含み得る。さらに、基質２２３は、チャンバ２２２内に供給されている間位置合わせ装置２２４と協働する機械要素を備えていてもよい。たとえば、基質２２３は、一時的に装着される（移植不能な）または永久的に装着される（移植可能な）比較的堅いプラスチックのストリップまたはバーを有することにより、位置合わせ装置２２４の堅い構造体と確実に協働して、チャンバ２２２内で安定して配置されるようにしてもよい。播種後、移植の前に、このような機械要素は、移植することが意図されていなければまたは移植に適さなければ、基質２２３から外してもよい。
【００６０】
システム２００はまた、細胞を基質２２３全体にまたは基質２２３を通して分散させることを容易にするための分散支援装置２２５を有していてもよい。したがって、分散支援装置２２５は、チャンバ２２２内のおよび／または基質２２３上にある細胞組成物に力を加えるように機能するものであってもよい。分散支援装置２２５は、たとえば真空を生成して細胞組成物をしたがって細胞を基質２２３の厚みを通して引張ることによって細胞を基質２２３の中で一層均一に分散させるように機能してもよい。これに代えて、分散支援装置２２５は、永久磁石または電磁石といった磁石でもよく、基質２２３を囲む磁界を与えてもよい。これは、細胞に付随する磁性材料とともに、たとえば、細胞が付着するリポゾームを磁化するものであって、細胞を基質２２３を通しておよび／または基質２２３に沿って動かして分散させるために使用してもよい。これに代えて、分散支援装置２２５は、振動または回転といった動きを基質２２３に与えて、細胞組成物の基質２２３における分散を支援するように機能してもよい。ある実施の形態において、分散支援装置２２５は高速回転を与えることによって求心力で細胞組成物を動かしてもよく、基質２２３は動かされる細胞組成物の経路に（たとえば水平面における回転の場合は実質的に鉛直方向のまたは直立する壁に沿って）配置すればよい。この仕組みを用いて細胞組成物を基質２２３に対して動かして基質２２３の中に入れることができる。たとえばパルス状および／または双方向性の流れをチャンバ２２２の中の液体に与えることができる装置２２５を含め、力を細胞組成物および／または基質２２３に加えることによりこれら２つの連結を強化するさらに他の装置２２５を用いてもよい。ある実施の形態において、シート状の基質２２３をチャンバ２２２内に置いてチャンバ２２２を第１および第２の体積に分割してもよく、第１および第２の体積は基板の部分を除いて互いに流体封止される。次に、分散装置２２５の助けを借りて圧力差を生じさせることにより指向性の流れをチャンバ２２２内に作ることによって、基質２２３に細胞懸濁液の貫壁性の流れを作り、細胞を基質２２３の上に、場合によっては基質２２３の中に分散させる。チャンバ２２２の機能はすべて、以下でより詳細に述べるプロセスコントローラ２２９によって制御されてもよい。
【００６１】
他の実施の形態において、たとえば本明細書に記載のものを含む細胞外マトリクス水解物またはゲル材料を、細胞とともにチャンバ２２２に入れ、固体の立体的に安定した細胞成長基質を、この水解物／ゲルおよび細胞の混合物の中で、これを含みながらもその中に完全に浸漬された状態で、インキュベートしてもよい。結合した材料は、本明細書に記載のように撹拌してもよい。上記固体の立体的に安定した基質は、好ましくは本明細書に記載の少なくとも１つの天然（内因性）生物活性成分またはその組合せを保持する、本明細書に記載のＥＣＭ材料であってもよく、および／またはシート状、フィラメント状、糸状、または粒状であってもよい。本明細書に記載のように結合した材料をインキュベートした後で患者に投与してもよい。
【００６２】
さらに他の実施の形態において、適用装置２２１は、本明細書に記載の１つ以上のカニューレを有していてもよく、このカニューレの排出開口は、スポンジ、発泡体またはその他同様の繊維状基質等の固体細胞成長基質２２３の体積の中に配置してもよい。次に、細胞流体を基質材料２２３の内部体積に注入してもよく、そうすると、この細胞流体は圧力を受けて基質２２３の外面に向かって（場合によっては基質の外面の外に）移動し、その途中で細胞を基質の中に植付ける。ある実施の形態において、カニューレおよびその／それらの開口ならびに基質２２３を、流体材料が基質２２３全体において基質内のほぼ中央の位置から全方向に向かって実質的に均一に流れるように構成することにより、容易に細胞を基質２２３内で均一的に分散させてもよい。
【００６３】
本明細書に記載の基質２２３に対する播種および一定時間のインキュベートの間におよび／またはその後、システム２００は、播種が行なわれた基質２２３を評価することにより、相当数の付着していない細胞が基質２２３の上またはその中に残っているか否か判断してもよい。これは、たとえば、基質２２３のすべてまたは一部に液体の検査パルスを流すことによって、付着していないまたは付着状態が悪い細胞を強制的に移動させた後、この液体パルスを収集して細胞の有無を評価することによって行なってもよい。この評価は、いくつかの実施の形態では定量的評価を含む。検査パルスは、たとえば、（以下でさらに説明する）培地ユニット２２６内のチャンバからライン２２７を介してチャンバ２２２に送ってもよく、または、別の独立したソースおよび供給ラインを設けてもよい。上記試験パルス液は、たとえば、生理食塩水、プレコンディショニング培地、細胞培養培地、または、基質２２３上の付着していないまたは付着状態が悪い細胞を移動させてから検出できるようにする他の液体であってもよい。ある実施の形態において、本明細書に記載のように、移動させた細胞を伴う収集されたパルス体積を、除去された細胞を検出器２１３に送ってもよく、この検出器はたとえばコールター原理を利用する細胞カウント装置または細胞をカウントする別の手段であってもよい。検査パルスによって過度に多い数の細胞が移動させられた場合、基質２２３および細胞をさらなる期間インキュベートすることにより、細胞が付着するようにしてもよい。テストパルスにおいて収集された細胞がない場合または収集された細胞の数が十分に少ない場合、播種が行なわれた基質２２３をチャンバ２２２から取出して患者に投与してもよい。システム２００は、任意で視覚信号および／または可聴信号といった信号を生成することにより、チャンバ２２２内の播種が行なわれた基質２２３は患者に投与できる状態であることを示してもよい。これら機能はすべて、以下でさらに説明するプロセスコントローラ２２９の指示に従うものであってもよい。
【００６４】
システム２００はまた、適用装置２２１に導管２２７を介して流動結合されポンプ２２８から動力を与えられる１つまたは複数のチャンバを有するプレコンディショニング培地ユニット２２６を含んでいてもよい。適用装置２２１は、細胞組成物およびプレコンディショニング培地を基質２２３に与えるという役目を共有してもよく、または、別の適用装置が組込まれていてもよい。プレコンディショニングユニット２２６は、基質２２３を前処理して細胞組成物を受けるためにコンディショニングするための培地を含み供給してもよい。チャンバ２２６内のプレコンディショニング培地は、たとえば細胞培養培地でもよく、または、細胞にとって有益なもしくは基質２２３を細胞の生存により適したものにするタンパク質もしくはその他の物質を含有していてもよい。ある実施の形態において、ユニット２２６内のプレコンディショニング培地は、システム２００を用いて生成された細胞移植片を受ける血清、好ましくは患者由来の自家血清を含む。プレコンディショニング培地は適用装置２２１を用いて基質２２３に与えてもよい。任意で、プレコンディショニングユニット２２６またはシステム２００のその他の構成要素が、基質の検査またはその他の作業のために他のプレコンディショニング培地による処理が行なわれた後で基質２２３をすすぐための材料を取入れてもよい。これら目的のために、ある実施の形態ではチャンバ２２２が廃棄ラインに接続されたドレーンを含んでいてもよい。
【００６５】
システム２００は、好ましくは自動化され、したがってプロセスコントローラ２２９を含み、このコントローラは、ポンプ、バルブ、温度制御ユニット、装置２０４および２１３といった検出器、適用装置２２１、分散支援装置２２５、およびシステム２００のその他の構成要素といったシステム２００内のさまざまな機構を制御することによって本明細書に記載の機能を実現するように動作することができる。プロセスコントローラ２２９は、システム２００のさまざまな機構をすべて、完全に自動的にまたはユーザ制御を支援することにより制御するための、プロセッサに基づくシステムであってもよい。図９には明確にするために示されていないが、プロセスコントローラ２２９は、コントローラ２２９が制御するまたは適切な入力および／または出力通信経路によって検知データをコントローラ２２９に与えるシステム２００のさまざまな機構に結合される。これは当業者には明らかであろう。
【００６６】
プロセスコントローラ２２９は、接続２３１を介して接続されたキーボードおよび／またはマウスといった電子ユーザ入力装置２３０を含んでいてもよい。接続２３３を介して接続されたディスプレイ２３２を設けて、状態エントリ、解析結果、ユーザに対する注意、および要望に応じた他の情報を、表示してもよい。接続２４３を介して接続されたプリンタ装置２４２を設けて、解析結果の印刷記録、細胞播種作業の現在の状況、および／または細胞播種作業中にシステム２００が完了した作業の記録、および要望に応じた他の情報を、生成してもよい。これら装置は、ユーザ制御指示がプロセスコントローラ２２９に与えられてシステム２００が必要に応じて現在の細胞播種作業のために動作するように、かつ、さまざまな形態の情報が表示、印刷され、またはユーザによって操作されるように、結合される。
【００６７】
プロセスコントローラ２２９は、パーソナルコンピュータ、ワークステーションコンピュータ、ラップトップコンピュータ、パームトップコンピュータ、タブレットコンピュータ、計算機能を有する無線端末（たとえばウインドウズ（登録商標）ＣＥ、パームオペレーティングシステム等を備えた携帯電話または携帯情報端末（ＰＤＡ））上で実現されてもよく、または、システム２００に組込まれたマイクロコントローラで実現されてもよい。これら以外のコンピュータシステムアーキテクチャも採用できること、および、選択された特定のアーキテクチャは本明細書に開示されているシステムおよび方法にとって極めて重要なものではないことは、当業者にとって明らかであろう。
【００６８】
一般的に、このようなプロセスコントローラ２２９は、コンピュータを用いて実現される場合、情報を伝達するためのバス、このバスに結合され情報を処理するためのプロセッサ、このバスに結合され情報およびプロセッサに対する命令を格納するためのメインメモリ、ならびに、このバスに結合され静的情報およびプロセッサに対する命令を格納するための読出専用メモリを含む。表示装置２３２はこのバスに結合されシステム２００のユーザに対して情報を表示し、入力装置２３０はバスに結合され情報およびユーザの命令選択をプロセッサに伝える。デジタル情報を含むデータ記憶装置と通信するための大容量記憶装置インターフェイスも、ネットワークと通信するためのネットワークインターフェイスとともに、プロセスコントローラ２２９に含まれていてもよい。
【００６９】
プロセッサは、インテル社（Intel Corporation）が製造するＰＥＮＴＩＵＭ（登録商標）、ＣＯＲＥ（登録商標）およびＸＥＯＮ（登録商標）マイクロプロセッサ、ＩＢＭ社（IBM Corporation）が製造するＰＯＷＥＲ  ＰＣまたはＰＯＷＥＲ  ＩＳＡ、サン社（Sun Corporation）が製造するＳＰＡＲＣプロセッサ等の、広範囲にわたる汎用プロセッサまたはマイクロプロセッサのうちいずれであってもよい。しかしながら、その他のさまざまなプロセッサも任意の特定のコンピュータシステムで使用できることは、当業者には明らかであろう。表示装置２３２は、液晶装置（ＬＣＤ）、陰極線管（ＣＲＴ）、プラズマモニタ、発光ダイオード（ＬＥＣ）装置、またはその他適切な表示装置であってもよい。大容量記憶装置インターフェイスは、プロセッサがバスを介してデータ記憶装置のデジタル情報にアクセスできるようにする。大容量記憶装置インターフェイスは、バスに結合され情報および命令を送信するための、ユニバーサルシリアルバス（ＵＳＢ）インターフェイス、集積ドライブエレクトロニクス（ＩＤＥ）インターフェイス、シリアルアドバンストテクノロジーアタッチメント（ＳＡＴＡ）インターフェイス等であってもよい。データ記憶装置は、従来のハードディスクドライブ、フロッピー（登録商標）ディスクドライブ、フラッシュ装置（ジャンプドライブまたはＳＤカード等）、コンパクトディスク（ＣＤ）ドライブ、デジタル多目的ディスク（ＤＶＤ）ドライブ、ＨＤ  ＤＶＤドライブ、ブルーレイ（登録商標）ＤＶＤドライブ等の光学ドライブ、または別の磁気、ソリッドステート、または光データ記憶装置に、関連する媒体（フロッピーディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤなど）を伴うものであってもよい。
【００７０】
一般的に、プロセッサは、大容量記憶装置インターフェイスを用いてデータ記憶装置から処理命令およびデータを取出し、この情報を実行のためにランダムアクセスメモリにダウンロードする。次に、プロセッサはランダムアクセスメモリまたは読出専用メモリからの命令ストリームを実行する。入力装置２３０で入力された命令選択および情報を用いて、プロセッサが実行する命令の流れを導く。次に、この処理実行結果を用いてシステム２００内のさまざまな機構を制御してもよい。
【００７１】
プロセスコントローラ２２９は、表示装置２３２上で表示するためおよび／またはプリンタ２４２を駆動してハードコピーを印刷するための出力を生成するように構成される。好ましくは、表示装置２３２は、ユーザが表示された情報と対話できるようにするためのグラフィカルユーザインターフェイスでもある。
【００７２】
プロセスコントローラ２２９はまた、ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）、ワイドエリアネットワーク（ＷＡＮ）またはインターネットといったネットワークを介して１つ以上の外部システム（図示せず）と通信できるように構成されてもよい。プロセスコントローラ２２９および外部システムはともに、ウェブサーバとして、クライアントとして、またはウェブサーバおよびクライアントとして機能するように構成されてもよく、かつ、ブラウザによって使用可能にされてもよい。このように、システム２００は、遠隔から情報アクセスおよび／または情報格納を行なってもよく、遠隔から制御および／またはモニタされてもよく、プロセスコントローラ２２９と他のシステムとの間でデータの交換が行なわれてもよい。
【００７３】
細胞の移送作業中の損失を最小にするために、細胞懸濁液の処理において使用するチャンバの数はできる限り少ない方が望ましいであろう。このため、ある実施の形態では、システム２００に最適化細胞調合チャンバ２１０およびこれに関連する検出器２１３を設けず、その代わりに、第１のチャンバ２０３内で細胞懸濁液を基質に与えるのに望ましい状態になるように処理してもよい。したがって、この代替の実施の形態において、点線で示されている導管２３４が、チャンバ２０３を適用装置２２１に流動接続する。導管２３４は、ポンプ２３５から動力を受けて、最適化された細胞懸濁液を装置２２１に移送してもよい。このより簡略化されたタイプのシステム２００はまた、調合培地チャンバ２１６から細胞懸濁液チャンバ２０３への供給を行ないポンプ２１８によって動力が与えられる導管２３６を含んでいてもよい。したがって、細胞懸濁液組成物は、チャンバ２５０からの処理培地、およびチャンバ２１６からの調合培地を用いて、すべて１つのチャンバ２０３の中で処理してもよい。さまざまな培地を用いる後続の処理ステップのために、チャンバ２０３は、上記フィルタのような与えられた培地を除去するための手段、または、加工培地をチャンバ２５０および／または２１６から与えた後で液体を除去できるまたは細胞の濃度を高めることができる他の装置を備えていてもよい。チャンバ２０３内で細胞懸濁液組成物を処理および調節した後、装置２０４を用いて、この細胞懸濁液組成物の細胞濃度が所望の範囲内であることを確認してもよく、その後、この組成物を基質２２３に与えるために適用装置２２１に送ってもよい。取扱いおよび作業の便宜上、システム２００は、本明細書に記載の構成要素のうちいくつかまたはすべてを収容するハウジング２３７を含んでいてもよい。
【００７４】
図１０を参照して、もう１つの自動化された細胞播種システム２５０の概略図が示されている。システム２５０を用いて流動性細胞移植片を調製してもよく、この流動性細胞移植片は、ある実施の形態では、貫通針、カテーテル、またはその他の経皮的導入送達装置といった低侵襲技術によって送達してもよい。システム２５０は、上記システム２００（図９）と共通する多くの構成要素を含み、これらは図１０において同じ番号が付されその説明を繰返す必要はない。他の構成要素に関しては、システム２５０は、粒状形態の基質、ゲル形態の基質もしくはその前駆物質材料、またはこれらの組合せを、場合によっては移植片のためのその他の材料とともに収容するための、細胞成長基質投入チャンバ２５１を含む。処理された細胞懸濁液組成物は、任意のバルブ（図示せず）を用いポンプ２２０から動力を受けて導管２１９を介してチャンバ２５１内の細胞成長基質と結合する。細胞および基質材料を含む、調製された組成物は、チャンバ２５１から、任意のバルブ（図示せず）を用いポンプ２５３から動力を受けて導管２５２を介した流れによって容器２５４に移送される。このようなバルブおよび／またはポンプ２２０および２５３は、プロセスコントローラ２２９によって制御されてもよい。容器２５４は、導管２５２に一時的に装着され流動接続されたチャンバ装置であってもよく、これを取外して細胞移植片材料をシステム２５０から搬送してもよい。容器２５４はしたがって、導管２５２に流動接続されたバイアル、袋、またはその他の容器でもよい。ある実施の形態において、容器２５４は、細胞移植片組成物またはその構成要素を患者に送るための送達装置を含んでいてもよい。１つの実施の形態において、容器２５４は、チャンバ、例としてシリンジバレルを含み、ここから、細胞移植片組成物は、流動結合された針、カテーテルまたはその他低侵襲装置によって強制的に排出されて患者の組織に送られる。システム２５０は、このような容器２５４が導管２５２に流動結合して調整された流動性細胞移植片材料を受けることができるように容器２５４を挿入および係合させるための構造的係合機能を含んでいてもよい。
【００７５】
チャンバ２５１は、チャンバ２５１内で材料を混合する装置２５５を備えていてもよい。装置２５５は、完全にチャンバ２５１の外に位置するがチャンバ２５１またはその部品に対して動きを与えてその中にある成分を混合する機構で構成されていてもよい。たとえば、このような装置は、振動器、攪拌器、渦発生器といった回転要素、または混合する成分のための流路に位置する静止混合器を含んでいてもよい。装置２５５はまた、パドル、撹拌棒またはインペラーといったチャンバ２５１内に位置する機構で構成されていてもよい。このような機構はモータまたはその他の手段によって駆動されてチャンバ２５１内に収容された流動性組成物をかき混ぜる。装置２５５はまた、磁気結合されたパドルを駆動する外部移動（たとえば回転）磁石、チャンバ２５１内の攪拌棒またはその他の要素のように、チャンバ２５１の内部の要素およびその外部の要素双方で構成されていてもよい。装置２５５はプロセスコントローラ２２９によって制御されてもよい。
【００７６】
チャンバ２５１内に混合機能を与えることに加えて、システム２５０は、チャンバ２５１と関連付けられた熱制御装置２５６および／または容器２５４と関連付けられた熱制御装置２５７を含んでいてもよく、これら装置は上記チャンバおよび容器内のそれぞれの材料の温度を制御するように機能する。熱制御装置２５６、２５７はプロセスコントローラ２２９によって制御されてもよく、温度フィードバック測定値を与えて温度の管理を容易にする適切な温度検知要素を含んでいてもよい。熱制御装置２５６は、加熱要素および／または冷却要素であってもよい。あるモードでは、熱制御装置２５６を、チャンバ２５１内の材料の温度を制御することによりその粘度を管理するように機能させてもよい。一例として、チャンバ２５１内に収容される細胞成長基質組成物は、ゲル化可能な材料を含んでいてもよく、熱制御装置２５６は、ゲル化可能な材料が導管２１９から供給された細胞懸濁液と結合する前および結合している間はこの材料をゲル化していない状態で保つように、機能させてもよい。このようにして、基質材料の粘度がより低粘度の状態であることにより、細胞懸濁液材料との混合がさらに容易になるであろう。この用途において、温度の低下に伴って粘度が増大するゲル化可能な材料に対し、熱制御装置２５６は、チャンバ２５１内の材料を加熱するように機能する。この点に関し、加熱は、たとえば細胞が存在するときには約４２℃未満の温度に加熱するといったように、細胞が熱によって大きな損傷を受けないように行なうことが望ましい。ある実施の形態では、基質組成物内のゲル化可能な材料として、３７℃またはそれよりもわずかに高い温度でゲル化するものを選択する。細胞懸濁液と混合して実質的に均質的な組成物を得るために、ゲル化可能な材料を、そのゲル化点を上回る温度であるが細胞に大きな損傷を与える温度よりも低い温度（たとえば約４２℃未満）で加熱してもよい。混合後、細胞／基質組成物を、患者に投与する前および患者に投与している間は、たとえば熱制御装置２５７を用いて、基質材料のゲル温度を上回る温度に保ってもよい。このようにして、この材料は、たとえば針またはその他のカニューレを用いて送達されている間は粘度がより低い（かつより流動性が高い）送達状態にされるが、患者（たとえば平熱が約３７℃であるヒトの患者）に送達された後はゲル化しそれに伴って粘度が増す。こうすれば、送達された移植片材料を投与部位で維持し易くなる。これに代えて、混合されて実質的に均質的な状態にされた後で、細胞／基質材料が、患者の外で（たとえば装置２５６および／または２５７を用いた冷却によって）ゲル化するまたはゲル化させられることにより、粘度がより高い移植片として送達されてもよい。
【００７７】
温度の上昇に伴ってゲル化するかそうでなければ粘度が増すゲル化可能な基質材料に対しては、熱制御装置２５６を、チャンバ２５１内の材料を冷却するように機能させてもよい。この点に関し、冷却は、たとえば約０℃よりも高い温度まで冷却するといったように、凍結による大きな損傷が細胞に生じないように行なうことが望ましい。ある実施の形態では、基質組成物内のゲル化可能な材料として、たとえばおおむね室温（約２５℃）以下の温度といった、より低い温度に対し、約３７℃という温度でゲル化するかそうでなければ粘度が増す材料を選択する。細胞懸濁液との混合により実質的に均質的な組成物を得るために、この材料を装置２５６を用いて冷却して粘度が低い状態を保ってもよい。混合後、細胞／基質組成物を、送達前および送達中は、熱制御装置２５６および／または２５７を用いて冷却状態に保ってもよい。このようにして、この材料は、たとえば針またはその他のカニューレを通して送達されている間はより流動性が高い状態にされるが、患者（たとえば平熱が約３７℃のヒトの患者）に送達された後はその粘度が増すことで、送達された移植片材料を投与部位で維持し易くなる。これに代えて、混合して実質的に均質的な状態にした後で、細胞／基質材料を、たとえば装置２５６および／または２５７を用いて温めて、または周囲の設定において温まるようにして、粘度がより高い移植片として送達してもよい。
【００７８】
温度以外の条件を用いて、細胞成長基質材料を、望ましいとき（たとえば細胞との混合後）に、ゲル化してもよい。たとえば、ｐＨの上昇によってゲル化するコラーゲン性材料を選択してもよい。チャンバ２５１内での混合作業中、基質／細胞組成物のｐＨは、少なくとも混合期間中は、組成物の流動性はより高いままであるが細胞が生存できる比較的低いレベルで保ってもよい。一例として、このようなｐＨは約４〜約６．５の範囲にあってもよい。混合後、組成物のｐＨを高めることにより、コラーゲン性材料がゲル化し移植片材料の粘度が増すようにしてもよい。このようなｐＨの調節は、生体適合性塩基または緩衝剤または双方を追加することによって行なってもよい。これら添加剤は、ユニット２２６内のチャンバから与えられてもよく、または、システム２５０内に設けられたもう１つの試薬チャンバから与えられてもよい。混合後の組成物のｐＨは、たとえば約６．５〜約８の範囲にあってもよい。混合後のｐＨは、患者に対する投与に適したものでかつ特定の実施の形態では約７〜約７．５であることが望ましい。
【００７９】
上記のようにシステム２００または２５０内で細胞成長基質材料を細胞組成物と結合させた後、直ちに播種された移植片材料を患者に投与してもよい。他の実施の形態では、細胞が播種された移植片材料を、体外で、細胞の少なくとも一部を細胞成長基質に付着させるのに少なくとも十分な期間、インキュベートしてもよい。細胞成長基質に付着させる細胞は、望ましくは相当な割合の細胞であり、たとえば最初に与えられた細胞の約２０％を上回る割合の細胞である。このような細胞を付着させるインキュベート相が継続される時間は、１分〜約５時間であり、特定の実施の形態では約５分〜約３時間までである。この期間中、組成物は、この組成物内の細胞の少なくとも一部がその天然の性質によって表面に付着し、組合された組成物内の、細胞成長基質シート、粒子またはその他の材料に付着する状態に、保たれる。細胞付着相またはサイクルが行なわれている間は、最初に与えられた細胞の数が大幅に増えないようにしてもよく、たとえば、この組成物の生存可能な細胞の割合は、最初に細胞成長基質と結合された細胞の１０％以下であり、ある実施の形態では、組成物の細胞の数は、細胞成長基質と最初に結合された細胞の数と実質的に同一であるかそれよりも少ない。
【００８０】
自動化されたシステム２５０において流動性移植片材料を調製するに当たり、組成物は、任意で、上記細胞付着相の間、たとえばミキサ装置２５５を用いて、連続的にまたは周期的に攪拌してもよい。特定の実施の形態において、細胞付着サイクル中、ミキサ装置２５５を用いて周期的に静かに組成物を攪拌する。比較的静かな細胞付着相は、攪拌相と攪拌相との間において生じる。たとえば、複数の非撹拌相の期間各々を約３分〜約２０分にし、その間にたとえば約１０秒〜５分のより短い攪拌相を挟んでもよい。この攪拌は、静かに行なうことにより、懸濁している自由細胞をさらに細胞成長基質粒子または材料と接触させるがすでに基質材料に付着している細胞の顕著な移動が発生しないようにする。
【００８１】
本明細書に記載のチャンバ２５１内での基質に対する播種および一定期間のインキュベートの間および／またはその後、システム２５０は、流動性基質細胞／基質混合物を評価することにより、基質に付着していない相当数の細胞が混合物の懸濁培地内に残っているか否か判断してもよい。これは、たとえば、サンプルを収集してろ過することにより細胞が付着した基質材料を除去し懸濁培地内で自由に懸濁している細胞のみを残すことによって行なってもよい。次に、この懸濁している自由細胞を検出器２１３または別の独立した検出器に送り、細胞を本明細書に記載の細胞をカウントするためのコールター原理、光散乱または別の手段を利用してカウントする。別のモードでは、（たとえば粒状基質、懸濁培地および細胞を含む）チャンバ２５１からの培地全体をサンプリングし、コールター原理、光散乱または別の手段を利用して検査してもよい。培地に対する評価値（たとえば散乱または電気抵抗）は、自由に懸濁している細胞に対する（たとえば基質粒子に）付着した細胞の割合に応じて変化するため、評価値を、基質に対する細胞付着の許容できるレベルと関連付けてもよい。懸濁培地に自由状態で残っている細胞の数が過度に多ければ、基質および細胞をさらなる期間インキュベートすることによって細胞が付着するようにしてもよい。懸濁培地の中で自由状態で残っている細胞がなければまたはそのような細胞の数が非常に少なければ、播種された基質材料をチャンバ２５１から取出して患者に投与してもよい。システム２００と同様、システム２５０は、任意で（たとえばディスプレイ２３２上の）視覚信号および／または可聴信号といった信号を生成することにより、チャンバ２５１内の播種が行なわれた基質材料は患者に投与できる状態であることを示してもよい。これら機能はすべて、プロセスコントローラ２２９の指示に従うものであってもよい。
【００８２】
上記開示されたシステム２００および２５０において、記載されているチャンバは、たとえば、袋、バイアル、通路、プラスチック容器などを含む任意の適切な構成によって与えてもよい。記載されている導管は、管材料、このシステムのより大きなプラスチック構造体を通る管腔、または任意のその他適切な構成によって与えてもよい。また、バルブをチャンバおよび／または導管内に設けることによってポンプまたはその他の材料移送手段との連携により状況に応じて選択的に流れを通したり止めたりできることが、理解されるであろう。当業者は、本明細書の開示を与えられると、上記およびその他の物理的なシステムの特徴に容易に想到するであろう。
【００８３】
システム２００および２５０は、患者への移植前の細胞移植片材料の滞留時間が、たとえば最長約３時間といったように比較的短くなるように構成してもよい。このような構成は、典型的には、細胞の数を大幅に増やすことなく（たとえば細胞数は増加しないかまたはその増加が１０％未満）細胞を基質に付着させるように設計されるであろう。しかしながら、ある実施の形態では、システム２００および２５０を、細胞移植片材料のインキュベートおよび培養期間がより長くなるように構成して、細胞の数が、最初に基質上に播種された細胞の数と比較してたとえば２０％を上回る増加を示しいくつかの実施の形態では１００％を上回る増加を示すようにしてもよい。これら目的のために、システム２００および２５０は、力、たとえば剪断力、歪、または張力を、培養期間中に基質に与えるための機構も含んでいてもよい。これらの力は、インキュベート／培養期間中、播種された細胞の成長および分別に影響を与えることができ、結果として、力を加えずにインキュベート／培養した場合の同じ細胞とは異なるタンパク質発現パターンが示される。このようにして、細胞移植片を患者の体内における所与の最終用途に合わせて改善することができる。
【００８４】
また、ある実施の形態において、システム２００または２５０は、チャンバ２２２から独立した二次細胞インキュベーションチャンバを含んでいてもよい。チャンバ２２２内でインキュベートされた細胞とは異なる細胞を、二次チャンバ内で培養することにより、チャンバ２２２に移送される、ホルモン、サイトカイン、成長因子等のシグナル分子が分泌されるようにしてもよい。このシグナル分子は、チャンバ２２２内での培養時の細胞と接触することにより、たとえばその細胞の成長または分化を調整することができる。二次インキュベーションチャンバからチャンバ２２２へのシグナル分子の移送は、たとえば、導管を通してこれら分子をポンピングすることにより、膜を通る流れにより、またはその他の手段により、行なってもよい。いくつかの形態では、シグナル分子は、チャンバ２２２において培養された、より高い割合の幹細胞または前駆細胞を、所与の分化通路に送るのに有効であろう。二次細胞インキュベーションチャンバの制御は、プロセスコントローラ２２９によって、または任意で上記プロセスコントローラ２２９と通信する別のプロセスコントローラによって行なってもよい。
【００８５】
粒状多細胞／基質移植片材料
本発明のある実施の形態において、提供される流動性細胞移植片材料は、液体培地の中で懸濁している多細胞体を含み、多細胞体は各々、細胞が付着した細胞成長基質粒子からなる。基質粒子の最大断面寸法は約２０ミクロン〜約２０００ミクロンであってもよく、ある実施の形態では約１００ミクロン〜約１０００ミクロンであってもよい。基質粒子は、その大きさが互いに実質的に均一であってもよく、たとえば最大断面寸法が互いの約２０％または１０％以内であってもよく、または大きさが互いに異なっていてもよい（たとえば相対的に小さな粒子と大きな粒子があり、場合によっては、大きさが互いに異なる粒子群の中で実質的に均一な粒子群を２つ以上混合することにより、制御された１つの全体的な粒子群を形成する）。好都合な変形では、基質粒子はシート状であり、このシートの厚みは約２０〜約２０００ミクロン、より好ましくは約２０〜約５００ミクロンであってもよく、および／またはこのシートの面（たとえば高さまたは幅）で考えたときの最大断面軸長さは、シートの厚みよりも大きく約２５〜約２５００ミクロンの範囲、より好ましくは約１００〜約１０００ミクロンの範囲である。このシートの厚みは、ある実施の形態において、約２０〜約１０００ミクロンであってもよく、および／またはこのシートの面で考えたときの最大断面軸長さは約１００〜約１５００ミクロンの範囲であってもよい。これに加えてまたはその代わりに、基質粒子は、シートの面で考えたときに、長く繊維状であるのではなく比較的丸く小さくてもよい。基質粒子の形状は互いに規則的であってもよくまたは互いに不規則であってもよい。ある実施の形態において、粒子はおおむね円形、卵型および／または多角形（たとえば辺の数が３〜１０、たとえば三角形、正方形もしくは矩形、五角形、六角形など）のシート状粒子であってもよい。たとえば、基質粒子、またはシートの面で考えたときの組成物における相当な割合（たとえば約２５％を上回る割合）の基質粒子の、最大断面寸法軸は、最大断面寸法軸に対して垂直でありこの最大断面寸法軸を中心とするライン上の断面寸法軸の長さの約２倍以下であり、好ましくは、少なくとも約５０％の基質粒子がこの特徴を有し、より好ましくは少なくとも約７０％の基質粒子がこの特徴を有する。このような粒状細胞成長基質材料も、単独で（たとえば細胞のない組織移植片材料として）または本明細書に記載の細胞組成物と組合されて使用される本発明の実施の形態を構成する。
【００８６】
上記小さくシート状の基質粒子は、より大きな基質材料シートから切出してもよい。ある実施の形態において、このより大きな基質材料シートは、本明細書に記載の、組織ソースから採取され脱細胞化された細胞外マトリクスシートである。上記特徴を有するシート状粒子は、パンチまたはダイといった機械工具を用いて、またはレーザを用いた切断によって、または他の適切な手段を用いて、より大きなＥＣＭシートから切出してもよい。所望の実施の形態において、使用される切断方法は、本明細書でより詳細に説明するように、天然生物活性ＥＣＭ特徴または天然生物活性ＥＣＭ分子が、処理されるより大きな出発ＥＣＭシート材料にある場合、この特徴または分子を排除しない。加えて、処理されているＥＣＭシート、および結果として得られるＥＣＭシート粒子は、シート材料の片側または両側において保持された天然上皮基底膜を有していてもよく、および／またはこのシートの片側または両側において生合成により堆積させた基底膜成分を有していてもよい。シートの両側に天然上皮基底膜を与えるためには、各々が１つの基底膜側とその反対側を有する分離された脱細胞化ＥＣＭ層を２層、積重ね、基底膜側が外側を向くようにして互いに融着または接着すればよい。次に、結果として得られる２層からなるシートを処理して上記シート状粒子を形成すればよい。天然でない基底膜成分が堆積した粒子を調製するためには、脱細胞化されたＥＣＭシートを、外皮、内皮、またはその他の細胞を両側において成長させることによって処理して、基底膜成分を堆積させてもよい。次に、細胞を、基底膜成分を残しながら除去してもよく、その後シートを処理することにより上記シート状粒子を調製することができる。
【００８７】
図１１は、より大きなＥＣＭシートからレーザで切出した非常に小さい例示としてのＥＣＭ「ドット」のデジタル画像を示す。この特定の例において利用されたＥＣＭシートは、米国インディアナ州ウエストラファイアエットのクックバイオテック社（Cook Biotech Incorporated）から入手可能な、単層のブタ小腸粘膜下組織であった。このシートの面における最大断面軸の長さは約５０５ミクロンであり、この最大断面軸に対して垂直でありこの軸を中心とする断面軸の長さは約４１３ミクロンであることがわかる。したがって、これら２つの長さ寸法は互いの約２５％内であり、小さなシート粒子構造をもたらす。ＥＣＭ粒子組成物の約５０％を超える粒子の長さ寸法にこの程度の相関関係があることは、使用時において特に有益であり、とりわけ、約５０％を上回る粒子の、シートの面における最大断面軸の範囲が、約１００〜約１０００ミクロンであるときに、有益である。
【００８８】
細胞が播種された移植片組成物を調製するためには、上記粒状成長基質を、たとえば上記システム２５０を用いて細胞調製物と結合させればよい。流動性移植片については、粒状成長基質を、水溶性培地といった液体培地の中で懸濁させればよい。投与前に、移植片組成物を、上記のもののうちいずれかのような細胞付着サイクルの間、インキュベートしてもよい。粒状細胞成長基質の大きさおよびその形状が比較的平坦で小さいことにより、好都合な懸濁および細胞付着特性が得られ、これは、細胞外マトリクスシート材料といった可撓性基質材料を用いてより向上させることもできる。患者に投与するために、流動性の細胞が播種された移植片をシリンジまたはその他の送達装置に入れ、移植片を移植の対象組織に送達してもよい。一例として、図１１を参照して、シリンジ３０２内に入れられた流動性細胞移植片組成物３０１を含む医療装置３００が示されている。細胞移植片組成物３０１は、ここでのおよび先の説明にあるように、マトリクス粒子３０４を含む複数の細胞化体３０３を含み、細胞３０５の群が各マトリクス粒子３０４に付着している。ある実施の形態において、細胞３０５は、マトリクス粒子３０４を覆うおおむねコンフルエントな層を形成する。細胞化体３０３は、任意で細胞のための養分を含有しヒトまたはその他の患者に対して生理的に適合する水溶性培地といった液体培地３０６において懸濁している。細胞移植片組成物３０１は、流動性であり、シリンジ３０２のバレル３０７内に収容される。プランジャ３０８は、バレル３０７に収容され、直線状に操作されることによって組成物３０１を、流動結合された針３０９を通して押出してその開口３１０の外に出す。このように、医療装置３００を用いて組成物３０１を患者の組織の中に投与できる。ある好ましい実施の形態において、ターゲット組織は血管再生が必要であり、細胞移植片体３０３は、たとえばある実施の形態では本明細書に記載の内皮コロニー形成細胞を含む内皮細胞または血管内皮前駆細胞である、血管を形成可能な細胞３０５を含む。マトリクス粒子３０４は、ターゲット組織に注入されると、ターゲット領域における細胞３０５の保持を支援する。特に好ましい実施の形態において、粒子３０４は本明細書に記載の細胞外マトリクス粒子である。
【００８９】
ゲルでコーティングされたマトリクス基質を有する細胞移植片
本発明の細胞移植片は、細胞外マトリクスゲルといったゲルで少なくとも一部がコーティングされた多孔性マトリクス細胞成長基質を有していてもよい。この場合の細胞は、ゲルの中、ゲルの表面上、または双方にある。このゲルを、細胞と混合する前、細胞と混合した後、細胞との混合中、またはこれらのうちいくつかを組合せたタイミングで、多孔性マトリクス基質に与えてもよい。このゲルは、フィブロネクチン、ラミニン、コラーゲンＩ、またはその他の材料といった、細胞が基質に付着する性質を強化する物質を含んでいてもよい。ゲルまたはゲルの前駆材料は、細胞と混合されて与えられる場合、その粘度が低い（たとえばゲル化していない）状態で与えることによって、基質に与え易くしてもよく、所望されるのであれば細胞とともに基質の多孔性ネットワークの中に浸透してもよい。次に、ゲルまたはゲル化可能な前駆物質がゲル化するようにするまたはこれをゲル化させるまたはその粘度を高めることによって、ゲルおよびその中にある細胞が直ちに多孔性マトリクス基質に付着するよう促してもよい。ある実施の形態では、ゲルは、たとえばその全体を本明細書に引用により援用する、２００７年４月１２日に公開された米国特許出願公開ＵＳ２００７００８２０６０、２００４年８月２５日に出願された米国特許出願第１０／５６９，２１８号に記載の細胞外マトリクスゲルからなる。したがって、ゲルは、本明細書に記載のようなＥＣＭ組織を酸および／または酵素で分解させることによって調製したＥＣＭ水解組成物を含み得る。この組成物は、ｐＨを約６．８〜約８まで高めると、および／または材料の温度を約３７℃まで高めるとゲル化することができる。このような組成物は、成長因子、グルコサミノグリカン、プロテオグリカン、および／または以下でＥＣＭ材料に関して述べる他の材料といった、出発ＥＣＭ材料の天然コラーゲンおよび天然（内因性）生物活性非コラーゲン成分を含み得る。
【００９０】
上記システム２００を用いて、ゲルでコーティングされたマトリクス基質を有するこれら細胞移植片を調製してもよい。たとえば、ゲルまたはゲル前駆物質を、適用装置２２１を用いて基質２２３に適用してもよい。細胞の前にゲル材料を適用するために、ゲルまたはゲル前駆物質を、プレコンディショニング培地ユニット２２６から供給し基質２２３に適用してもよい。基質に適用する前に細胞をゲルまたはゲル前駆物質と結合させるために、細胞およびゲル材料を、インラインで、適用装置２２１から放出する前に導管２１９および２２７から与えられたものを結合させることによって、混合すればよい。または、細胞材料を、適用装置２２１に与える前に、プレコンディショニング培地ユニット２２６のチャンバまたは別のチャンバ内で、ゲルまたはゲル前駆物質と結合させてもよい。必要に応じて、温度および／またはｐＨ制御をシステム２２０によって行なうことにより、適用された材料の、基質２２３と接触した後の粘度を、容易に高めることができる。一例として、ｐＨの調節のために、ＮａＯＨといった塩基性物質を一定量、基質２２３に適用する直前に、細胞／ゲル前駆物質組成物と結合させることにより、材料の完全なゲル化を十分に遅延させて基質２２３に適用しその後安定させてもよい。これに代えて、基質２２３を、塩基性または緩衝物質でプレコンディショニングすることにより、より酸性度の高い細胞／ゲル前駆物質材料の、基質２２３と接触したときのｐＨを、中和するかまたは高めてもよい。さらに、細胞／ゲル前駆物質材料の温度を、基質２２３に適用する前および／または適用した後に加熱要素によって上昇させてもよい。ゲルを形成するための上記およびその他の調節を、システム２００によって自動化してもよい。
【００９１】
細胞移植片フィラメント
さらなる実施の形態において、本発明は、細長いフィラメントの形態の細胞成長基質を含み細胞群がこのフィラメントに沿って付着した、細胞移植片を提供する。これら実施の形態において、フィラメントの長さは、少なくとも約１ｍｍでもよく、たとえばある実施の形態では約１ｍｍ〜約３０ｍｍまたは約５ｍｍ〜約３０ｍｍの範囲であってもよい。また、このフィラメントの最大断面寸法は、約２０ミクロン〜約２ｍｍ、または約１００ミクロン〜約１ｍｍであってもよい。これら目的のためには本明細書に記載の細胞外マトリクス基質が好ましい。こういった細胞移植片を調製するためには、細長い基質を、所望の細胞を含有する細胞懸濁液の存在下で、少なくとも細胞が基質に付着するのに十分な期間、たとえば本明細書に記載のシステム２００またはシステム２５０等の自動化されたシステムの中で、インキュベートしてもよい。図１２を参照して、細胞化されたフィラメント移植片が数個概略的に示されている。細胞化されたフィラメント移植片２３０は各々、細長い細胞成長基質３２１と、基質３２１に付着した細胞３２２群とを含む。細胞３２２は、ある実施の形態において、細胞成長基質３２１を覆うおおむねコンフルエントな層を形成してもよい。これを得るために、最初に与えられた十分な細胞を基質３２１に付着させて層を形成してもよく、または、基質フィラメント３２０に播種した後これをおおむねコンフルエントな層を形成するのに十分なだけ培養してもよい。使用時、細胞化されたフィラメント移植片３２０を個々に、たとえば、各細胞化フィラメント移植片３２０を長手方向に針の管腔の中に配置し、針を所望のターゲット組織に挿入し、移植片３２０を流体圧力を用いて針から押出すことによって、治療部位に導入してもよい。これにより、移植片３２０はターゲット組織の細長い領域を通して細胞３２２を分散させる。これはたとえばその領域の１つまたは複数の血管の発達が望ましい場合には有用であろう。これら目的のためには、上記ＥＣＦＣ細胞を含む、内皮細胞または血管内皮前駆細胞といった血管形成細胞を使用してもよい。代替の実施の形態において、複数の細長いフィラメント移植片３２０を含む流動性細胞移植片懸濁液を、シリンジの中に入れてターゲット組織に注入してもよい。このような懸濁液およびその送達のための医療製品は、相対的により小さく粒状の細胞移植片体３０３の代わりにまたはこれに加えて細長い移植片３２０を用いることを除いて、図１１に示される製品３００と同様である。
【００９２】
次に図１２Ａを参照して、本発明のもう１つの細胞化フィラメント移植片３２０Ａが示されている。移植片３２０Ａは、細長いフィラメント基質３２１Ａおよびこの基質に付着した細胞３２２Ａ群を含めて上記移植片３２０と同じ特徴を有し得る。移植片３２０Ａはさらに、患者の組織と係合する固定要素を含み、この固定要素は、例示の実施の形態では、軸部分３２４Ａと、組織と係合する棘端部３２５Ａとを有する、棘またはフック３２３Ａとして示されている。この棘３２３Ａまたはその他の固定要素は、この例示の実施の形態において、フィラメント基質３２１Ａの端部にまたはその近くに装着される。この装着は、結び付けることによって、溶着によって、接着によって、一体的な形成によって、またはその他適切な手段によって行なってもよい。ある実施の形態におけるこの棘３２３Ａといった固定要素は、組織におけるある方向の通過に対し、その反対方向の通過よりも強く抵抗する。これはたとえば方向性のある棘３２５Ａによって実現してもよい。棘３２３Ａまたはその他の固定要素は、永続性材料で、または生体吸収性材料で作ってもよい。一例として、持続性または生体吸収性材料は、金属またはポリマー材料で形成できる。適切な生体吸収性ポリマーは、グリコール酸のポリマー、乳酸のポリマー、またはグリコール酸と乳酸のコポリマーと、ポリカプロラクトン、およびその他公知の材料を含む。使用時に、棘３２３Ａまたはその他の固定要素は、患者の筋肉またはその他の組織といった組織に移植片３２０Ａが一旦移植されると、移植片３２０Ａの移動に抵抗する。
【００９３】
次に図１２Ｂを参照して、ある使用モードでは、移植片３２０Ａを針カニューレといった送達カニューレ３２６Ａと組合せてもよい。ある形態では、移植片３２０Ａのフィラメント基質３２１Ａのすべてまたは一部がカニューレ３２６Ａの管腔３２８Ａに収容されていてもよい。同様に、棘要素３２３Ａは、一部または全体がカニューレ３２６Ａに収容されてもよく、または、棘３２３Ａはたとえばその遠位に設けられてカニューレ３２６Ａの完全に外にあってもよい。例示されている実施の形態では、軸３２４Ａまたはその少なくとも一部がカニューレ３２６Ａの遠位領域の管腔に収容され、棘端部３２５Ａはカニューレ３２６Ａの組織に通された遠位端３２７Ａ（たとえば針の先端）を超えた場所に位置する。この状態で組合された装置を用いて、カニューレ３２６Ａおよび棘３２５Ａを、移植片３２０Ａを受ける患者の組織に、患者の皮膚「Ｓ」に刺し下にある組織の所望の深さまで押出すことによって、挿入してもよい。その後、カニューレ３２６Ａを後退させる力を加え、棘の先端３２５Ａが患者の組織と係合しこの後退に抵抗している間に、カニューレ３２６Ａを後退させることによって、移植片３２０Ａをカニューレ３２６Ａを後退させている間に管腔３２８Ａから送達する。移植片３２０Ａはその後そのまま患者に移植され、細胞群３２２Ａはある実施の形態では患者の治療において増殖してもよい。この発明のある変形では、細胞群３２２Ａは、たとえば本明細書に記載の細胞を形成する内皮コロニーを含む内皮細胞および／または血管内皮前駆細胞を含む。治療の対象であり移植片３２０Ａが移植される組織は、たとえば心筋層の虚血組織または重大な肢虚血を原因とする虚血組織である、血管発生を必要とする組織であってもよい。このような用途では、細胞群３２２Ａを基質３２１Ａに沿う細長い領域に移植すると、細長い移植領域に沿って１つまたは複数の血管を生成できる。しかしながら、他の種類の細胞群３２２Ａおよびその他の疾患、欠陥、または病気をフィラメント移植片３２０Ａを用いて治療できる。
【００９４】
積層された基質層を有する細胞移植片
本発明の細胞移植片は、積層構成の複数の細胞成長基質シートを含むものであってもよく、細胞群はこれら積層されたシートとシートの間にあり、場合によってはこの構造体の最外層も形成する。このような移植片を調製するためには、たとえば細胞懸濁液を含む液体膜をシートの少なくとも片側に与えることによって、第１の細胞成長基質層に細胞を播種すればよい。次に、第２の基質層を、第１の基質層の上記液体膜が設けられた側の上に積重ね、続いて別の細胞液体膜を第２の基質層の露出している側に与えればよい。要求があればこのプロセスを繰返すことによって積層された基質からなる構造体を形成してもよく、細胞はこの構造体の厚み全体を通して均等にまたは局所的に分散している。図１３は、このような積層移植片構造体３３０の概略図を示す。構造体３３０は、望ましくは本明細書に記載の、採取され、純化された細胞外マトリクス組織シートである、積重ねられた複数の細胞成長基質層３３１を含む。これら積重ねられた層３３１は部分的にまたは完全に重なり合っていてもよい。各々が１群の細胞３３３からなる細胞層３３２は、シート３３１の間に設けられ、任意で、構造体３３０の最外面にも設けられる。移植前に、構造体３３０を、細胞がシート３３１に付着するのに少なくとも十分な時間インキュベートしてもよく、これは、一体化された移植片ユニットとしての構造体の安定性に寄与し得る。これに代わる例では、構造体３３０を、培養期間の間インキュベートすることにより、最初に播種された細胞群を増殖させる。また、構造体３３０の作成中に細胞３３３をシート３３１に与える前に、シート３３１を、血清または血清タンパク質といった血液成分および／または他の培養培地成分、たとえば養分、塩等で、プレコンディショニングしてもよい。
【００９５】
構造体３３０のような積層細胞移植片構造体は、図９のシステム２００のような自動化されたシステムの中で調製してもよい。そのためには、第１の基質シート３３１をチャンバ２２２の中に置き、適用装置２２１を用いて、処理された細胞懸濁液をシート３３１の上面に与えればよい。次に、第２の基質シート３３１を第１のシートの上に載せ、適用装置２２１を用いて、さらなる量の細胞懸濁液を第２のシート３３１に与えればよい。このプロセスは複数回、たとえば２回、３回、４回、または５回繰返してもよい。加えて、プレコンディショニング培地を、培地ユニット２２６から供給し、細胞懸濁液を与える前にそれぞれのシート３３１に与えてもよい。第１、第２、およびそれ以降のシートを、ユーザによる手作業でまたはシステム２００が提供する自動供給機構を利用して、チャンバ２２２内で順次配置してもよい。
【００９６】
図１７は、積層された成長基質シートを有する本発明の細胞移植片の別の実施の形態を示す。細胞移植片３８０は、望ましくは本明細書で同定された細胞外マトリクス層のうちいずれかである、第１の細胞成長基質シート３８１と、シート３８１の表面上に積層された細胞材料３８２とを含む。細胞材料３８２は、本明細書で同定された細胞のいずれかを、流動性細胞成長材料もしくは基質、たとえば本明細書に記載の粒状細胞成長基質、および／または本明細書に記載のゲル細胞成長基質材料とともに、含み得る。材料３８２をシート３８１の表面上に堆積させた後、第２の細胞成長基質シート３８３を材料３８２の上に積層することにより、積層されたまたは挟まれた細胞移植片を作る。
【００９７】
図１８は、本発明の細胞移植片のさらに別の実施の形態を示す。移植片３９０は第１の細胞成長基質シート３９１を含み、このシートは、その内部に定められシート３９１の厚みの一部のみにおいて延びている複数のウェル３９２を有する。細胞材料３９３をウェル３９２の中に堆積させている。細胞材料３９３は、たとえば、単に細胞群であってもよく、または、以下でさらに説明するように、細胞に、粒状基質もしくはゲルが形成された基質もしくはその組合せ等の流動性細胞成長材料を、組合せたものであってもよい。第２の細胞成長基質シート３９４が、第１のシート３９１の上に積層されて、充填されたウェル３９２を覆い、任意で細胞材料３９１を少なくとも一時的にウェル３９２内に閉込める。細胞成長基質シート３９１および／または３９４ならびにいくつかの実施の形態は、本明細書に記載のＥＣＭ層のいずれかである。
【００９８】
流れを導く層を有する細胞成長基質製品
本発明はまた、細胞成長基質材料が第２の材料で覆われまたは包まれている製品を提供する。第２の材料は、細胞成長基質材料よりも、水性細胞組成物といった流体に対する透過性が低い。この覆っているまたは包んでいる材料は、細胞成長基質材料の長さまたは厚みを通して細胞流体の流れを導き易くすることにより、この材料における細胞の分散を促進することができる。図１４を参照して、本明細書に記載のいずれかの材料のような細胞成長基質材料３４１と、細胞基質材料３４１を囲む透過性または半透過性の封入材料３４２とを含む細胞成長基質製品３４０が示されている。この封入材料３４２は、第１の開口３４３と、第１の開口３４３から間隔をあけて設けられた第２の開口３４４とを定めてもよい。ある実施の形態において、開口３４３および３４４はそれぞれ、細胞成長基質材料３４１の互いに対向する側にある。さらに、代替の実施の形態では複数の開口３４３および／または３４４を設けてもよい。使用時には、製品３４０を液体細胞懸濁液のソースに接続し、圧力で懸濁液を開口３４３の中に送ることにより、細胞懸濁液材料を細胞成長基質３４１を通して流して、細胞を基質３４１に付着させるかまたは細胞が基質３４１の中に埋込まれるようにしてもよい。細胞懸濁液の流体は、最初にあった細胞のうち少なくともいくつかが失われた状態で、開口３４４を介して外に出てもよい。任意で、開口３４４から出た流体を、開口３４３を通して再循環させて、残っている少なくともいくつかの細胞を基質３４１に播種してもよい。細胞成長基質材料３４１は、本明細書に記載の、モノリシック、粒状、またはその他の細胞成長基質材料であってもよい。封入材料３４２は、患者に移植可能なものであってもよく、または、移植を意図しない材料であって細胞播種後の細胞成長基質３４１の移植前に除去してもよい。封入材料３４２は、たとえば、永続性または移植時に生体吸収性である天然または合成ポリマー材料であってもよい。本明細書のいずれかに開示されているもののような生体吸収性合成ポリマーを用いて材料３４２を封入すればよい。
【００９９】
図１５を参照して、本発明の別の細胞成長基質製品が示されている。この製品３５０は、本明細書に開示されている基質のいずれかのような細胞成長基質３５１と、材料３５１を収容する第１の封入材料３５２とを含む。細胞が懸濁しているまたは細胞がこれから懸濁する液体、たとえば水または別の水溶性培地に対する、封入材料３５２の透過性は、基質材料３５１よりも低く、たとえば水またはその他水溶性培地の中で懸濁されるまたはこれから懸濁される。封入材料３５２は、材料３５１が収容される、たとえばプラスチックまたはその他のポリマーのトレイであってもよい。このトレイまたはその他の封入材料３５２は、第１の開口３５３と、第１の開口３５３から間隔をあけて設けられた第２の開口３５４とを定めてもよい。第２の封入材料３５５が、トレイまたはその他の材料３５２によって定められた開口を覆い封止する。封入材料３５５は、たとえば、トレイまたはその他の封入材料３５２から引きはがすことができるポリマーフィルムであってもよい。これらの目的のために、フィルムまたはその他の材料３５５は、望ましくはその周辺部に、露出し把持可能な部分３５６を含んでいてもよく、この部分を掴んで材料３５５をトレイまたはその他の材料３５２から引き剥がすのに用いることにより、トレイまたはその他の材料３５２によって定められる開口を開き、細胞成長基質３５１を取出すために露出させてもよい。このように、図１４との関連で先に述べたような細胞播種作業中、材料３５５は、材料３５２に対する封止を保ちしたがって細胞成長基質３５１を閉込めることにより、流体が開口３５３から開口３５４に案内され細胞が材料３５１の体積を通して播種されることを支援する。この播種プロセスの後、封入材料３５５を材料３５２から剥がし、播種された基質３５１を取出して患者に移植すればよい。
【０１００】
次に図１６を参照して、細胞成長基質製品３６０の別の実施の形態が示されている。製品３６０は多くの点について上記製品３５０と似ているため、「３６０」から始まる番号を付したこと以外は同様に番号が付された特徴を有する。製品３６０はさらに、少なくとも流体入口開口３６３に、好ましくはこの開口と流体出口開口３６４双方とに関連する、流体分散機能を含む。望ましくは、これらの機能が、製品３６０を通る流体の実質的に栓流を容易にする。この「栓」の断面寸法は実質的に基質３６１の断面形状である。これは、基質３６１を通した細胞の均一的な分散を助けるであろう。これらの目的のために、トレイまたはその他の封入材料３６２は、開口３６３から細胞成長基質３６１の周囲に向かいながら分岐している分岐壁３６７および３６８を定める。望ましくは、分岐壁３６７および３６８の内面の終端は、細胞成長基質３６１の実質的に外周にある２つのポイントにある。このように、開口３６３から入った流体が基質３６１の近位側に定められた空隙３６９を満たした後、開口３６３から入った流体の圧力は均一に分布し、基質３６１の断面寸法を通して実質的な栓流が生じる。次に、基質３６１を通って流れる流体は、出口開口３６４の方向に収束する壁３７１および３７２によって定められた空隙３７３に集められる。本発明では、製品３６０内の基質３６１を通した実質的な栓流を容易にするための上記およびその他の特徴が意図されている。
【０１０１】
本発明の実施の形態で使用される細胞成長基質材料
上記のように、本発明で使用される細胞成長基質は、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）組織を含んでいてもよい。このＥＣＭ組織は、ヒツジ、ウシ、またはブタといった温血脊椎動物から得てもよい。たとえば、適切なＥＣＭ組織は、粘膜下組織、腎被膜、真皮コラーゲン、硬脳膜、心膜、太腿筋膜、漿膜、腹膜、または肝臓基底膜を含む基底膜層を含む。上記目的にとって適切な粘膜下組織材料は、たとえば、小腸粘膜下組織を含む腸粘膜下組織、胃粘膜下組織、膀胱粘膜下組織、および子宮粘膜下組織を含む。本発明に有用な粘膜下組織を（場合によってはその他関連する組織とともに）含むＥＣＭ組織は、このような組織ソースを採取し、粘膜下組織を含むマトリクスを、平滑筋層、粘膜層、および／またはこの組織ソースの中にある他の層から、層状剥離させることによって、得てもよい。ブタ組織ソースは、粘膜下組織を含むＥＣＭ組織を含むＥＣＭ組織を採取するための好ましいソースである。
【０１０２】
ＥＣＭ組織は、本発明で使用される場合、好ましくは、たとえばその全体を本明細書に引用により援用する、クック（Cook）他の米国特許第６，２０６，９３１号または２００８年１１月２０日付米国特許出願公開第ＵＳ２００８／２８６２６８号、２００８年７月２３日出願の米国特許出願第１２／１７８，３２１号に記載されているように、脱細胞化され高度に純化される。好ましいＥＣＭ組織材料は、エンドトキシンレベルが約１２エンドトキシン単位（ＥＵ）／ｇ、より好ましくは約５ＥＵ／ｇ、最も好ましくは約１ＥＵ／ｇ未満である。さらに好ましくは、粘膜下組織またはその他のＥＣＭ材料のバイオベーデンは、約１コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｇ未満、より好ましくは約０．５ＣＦＵ／ｇ未満であってもよい。真菌レベルは、望ましくは同様に低く、たとえば約１ＣＦＵ／ｇ未満、より好ましくは約０．５ＣＦＵ／ｇ未満である。核酸レベルは、好ましくは約５μｇ／ｍｇ未満、より好ましくは約２μｇ／ｍｇ未満であり、ウイルスレベルは、好ましくは約５０プラーク形成単位（ＰＦＵ）／ｇ未満、より好ましくは約５ＰＦＵ／ｇ未満である。上記およびさらなる粘膜下組織またはその他ＥＣＭ組織の特性は米国特許第６，２０６，９３１号または米国特許出願公開第ＵＳ２００８２８６２６８号において教示されており、これらは本発明で使用されるＥＣＭ組織の特徴であってもよい。
【０１０３】
ある実施の形態において、細胞成長基質としてまたは細胞成長基質の中で使用されるＥＣＭ組織材料は、組織ソースから分離されてシート構造を有する膜状組織であろう。ＥＣＭ組織の、分離されたときの層の厚みの範囲は、完全に水和した状態で約５０〜約２５０ミクロン、より典型的には完全に水和した状態で約５０〜約２００ミクロンであってもよいが、分離された、他の厚みを有する層も、得られ使用されるであろう。これら層の厚みは、組織ソースとして使用される動物の種類および年齢によって異なり得る。同じく、これら層の厚みは、動物ソースから得る組織のソースによっても異なり得る。
【０１０４】
利用されるＥＣＭ組織材料は、非ランダム配向のコラーゲンおよび／またはエラスチンといった構造繊維タンパク質を含むソース組織由来の構造マイクロアーキテクチャを保っていることが望ましい。このような非ランダムコラーゲンおよび／またはその他の構造タンパク質繊維は、ある実施の形態において、引張り強度に関して異方性であるＥＣＭ組織を提供することができ、したがって、ある方向における引張り強度は他の少なくとも１つの方向における引張り強度と異なる。
【０１０５】
ＥＣＭ組織材料は、ＥＣＭ組織材料のソースに由来しかつ処理を通してＥＣＭ組織材料の中で保持される１つ以上の生物活性剤を含み得る。たとえば、粘膜下組織またはリモデリング可能なＥＣＭ組織材料は、１つ以上の天然成長因子を含み得る。天然成長因子の例としては、塩基性フィブロブラスト成長因子（ＦＧＦ−２）、トランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦ−β）、表皮成長因子（ＥＧＦ）、軟骨由来成長因子（ＣＤＧＦ）、および／または血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）が挙げられるがこれらに限定されるわけではない。同様に、粘膜下組織またはその他ＥＣＭ材料は、本発明で使用される場合、その他の天然生物活性剤を含み得る。この生物活性材の例としては、タンパク質、糖タンパク質、プロテオグリカン、およびグリコサミノグリカンが挙げられるがこれらに限定されるわけではない。たとえば、ＥＣＭ材料は、ヘパリン、硫酸ヘパリン、ヒアルロン酸、フィブロネクチン、サイトカインなどを含み得る。このように、一般的に言えば、粘膜下組織またはその他ＥＣＭ材料は、ソース組織由来の、細胞の形態、増殖、成長、タンパク質または遺伝子発現の変化といった細胞性応答を直接的または間接的に誘発する、１つ以上の生物活性成分を保持し得る。
【０１０６】
本発明で使用される粘膜下組織を含むまたはその他のＥＣＭ材料は、任意の適切な臓器またはその他の組織ソース、通常は結合組織を含むソースから得ることができる。本発明で使用するために処理されるＥＣＭ材料は、典型的には大量のコラーゲンを含み、最も一般的には乾燥重量で少なくとも約８０重量％のコラーゲンで構成されるであろう。このような天然由来のＥＣＭ材料は、大抵の場合、非ランダム配向、たとえば全体的に単軸または多軸であるが規則的に配向するファイバとして発生する、コラーゲンファイバを含む。ＥＣＭ材料は、処理されて天然生物活性因子を保持する場合、固体としてコラーゲン繊維の上および／または中に散在するこれら因子を含むことができる。特に望ましい天然由来のＥＣＭ材料であって本発明で使用されるものは、適切に染色して光学顕微鏡検査で容易に識別できるこのような散在した非コラーゲン性の固体を大量含むであろう。このような非コラーゲン性固体は、本発明のある実施の形態では、ＥＣＭ材料の乾燥重量の相当な割合を構成することができ、たとえば本発明のさまざまな実施の形態では、少なくとも約１重量％、少なくとも約３重量％、および少なくとも約５重量％である。
【０１０７】
本発明で使用される粘膜下組織を含有するまたはその他のＥＣＭ材料は、血管新生特性を示すこともあり、したがって、この材料で、移植された受容者に血管新生を誘発するのに有効である。この点に関し、血管新生とは、身体が新たな血管を作り、より多くの血液の組織への供給を行なうプロセスである。よって、血管新生材料は、受容者の組織と接触すると、新たな血管の形成を促進または高める。生体材料の移植による血管新生のin vivo測定方法が最近開発された。たとえば、このような方法の１つは、皮下移植モデルを使用して材料の血管新生特性を求める。Ｃ．ヒーシェン（C. Heeschen）他、Nature Medicine 7 (2001), No. 7, 833-839参照。このモデルは、蛍光ミクロ血管造影技術と組合されて、生体材料への血管新生の定量的尺度および定性的尺度双方を提供することができる。Ｃ．ジョンソン（C. Johnson）他、Circulation Research 94 (2004), No. 2, 262-268。
【０１０８】
さらに、このような天然生物活性成分の包含に加えてまたはこれに代えて、組換技術またはその他の方法で合成によって製造されたもの等の非天然生物活性成分（たとえばＤＮＡ等の遺伝物質）を、本発明で使用されるＥＣＭ材料に組込んでもよい。こういった非天然生物活性成分は、ＥＣＭ組織内で自然に発生するがおそらく異なる種のものに相当する、天然由来のまたは組換技術で製造されるタンパク質であってもよい。この非天然生物活性成分は、薬物であってもよい。材料に追加できる薬物の例には、たとえば、ヘパリン等の抗凝固剤、抗生物質、抗炎症剤、血栓促進物質としてたとえばトロンビン、フィブリノゲン等の血液凝固因子、および抗増殖剤としてパクリタキセル等のタキソール誘導体が、含まれる。このような非天然生物活性成分は、たとえば、２、３の例を挙げると表面処理（例として吹付け）および／または含浸（例として浸漬）といった、任意の適切な方法で、ＥＣＭ材料の中におよび／または上に組込むことができる。また、これら物質は、ＥＣＭ材料に、製造前段階として、処置の直前に（たとえばこの材料をセファゾリン等の適切な抗生物質を含む溶液の中に浸漬させることによって）、または、材料が患者の中に生着している間またはその後に、適用してもよい。
【０１０９】
本明細書における本発明の移植片組成物は、異種移植片ＥＣＭ材料（すなわち、ヒトでないドナーからヒトであるレシピエントに提供される組織材料といった異種間材料）、同種移植片ＥＣＭ材料（すなわち、レシピエントと同種のドナーから提供される組織材料である種間材料）、および／または自家移植ＥＣＭ材料（すなわち、ドナーとレシピエントが同じ個人）を組込んでもよい。さらに、ＥＣＭ材料に組込まれる外因性生物活性物質は、ＥＣＭ材料を採取した動物と同じ種から提供されるもの（たとえばＥＣＭ材料に対して自家または同種）であってもよく、またはＥＣＭ材料ソースと異なる種から提供されるもの（ＥＣＭ材料に対して異種間）であってもよい。ある実施の形態では、ＥＣＭ組織材料は、移植片を受ける患者にとって異種であり、追加される細胞またはその他外因性材料は、移植片を受ける患者と同種から提供されるもの（たとえば自家または同種）である。一例として、ヒトである患者を、本明細書に記載の、外因性ヒト細胞および／または血清タンパク質および／または他の材料で修正された異種間ＥＣＭ材料（たとえばブタ、ウシ、またはヒツジ由来）で治療してもよい。これら外因性材料は天然由来および／または組換で製造されたものである。
【０１１０】
ＥＣＭ材料は、本発明で使用されるとき、さらなる非天然架橋はなくてもまたは実質的になくてもよく、またはさらなる架橋を含んでいてもよい。このようなさらなる架橋は、光架橋技術によって、または、化学的架橋剤によって、または、脱水もしくはそれ以外の手段によって生じるタンパク質の架橋によって、得てもよい。しかしながら、ある架橋技術、ある架橋剤、および／またはある架橋の程度により、リモデリング可能な材料のリモデリング特性が損なわれることがあり、リモデリング特性を保つことが望まれる場合は、リモデリング可能なＥＣＭ材料の何らかの架橋を、材料がそのリモデリング可能な特性の少なくとも一部を保持する程度にまたはそのようにするやり方で、行なってもよい。使用できる化学的架橋剤は、たとえば、グルタルアルデヒド等のアルデヒド類、カルボジイミド、たとえば１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩等のジイミド類、リボースまたはそれ以外の糖、アシルアジ化物、スルホ−Ｎ−ヒドロキシコハク酸アミド、またはポリエポキシド化合物を含み、これは、たとえばナガセケムテックス株式会社（日本、大阪）のデナコール（DENACOL）ＥＸ８１０の商標名で入手可能なエチレングリコールジグリシジルエーテル等のポリグリシジルエーテル類、およびこれもナガセケムテックス株式会社から入手可能なデナコールＥＸ３１３の商標名で入手可能なグリセロールポリグリセロールエーテルを含む。典型的には、ポリグリセロールエーテル類またはその他のポリエポキシド化合物は、使用される場合、１分子当たり２〜約１０のエポキシド基を有するであろう。
【０１１１】
さらに他の実施の形態では、ＥＣＭのまたはその他のコラーゲン性材料に対しこの材料を拡張させる処理を施したものから、本発明の基質を作ってもよい。いくつかの形態では、このように拡張させた材料は、ＥＣＭ材料を、この材料が拡張するまで１つまたはそれ以上のアルカリ性物質等の変性剤と接触させることによって形成できる。例として、この接触は、ＥＣＭ材料を、当初の体積の少なくとも１２０％（すなわち１．２倍）に、または、形態によっては当初の体積の少なくとも約２倍に拡張させるのに十分でありうる。その後、拡張させた材料を、任意で、たとえば中和および／または濯ぎ落しによってアルカリ性媒体から分離することができる。この収集された拡張させた材料は、任意の適切なやり方で基質の調製に使用することができる。例として、拡張させた材料に対し、所望の形状または構成の基質の形成において、生物活性成分の富化、乾燥、および／または成形などを行なうことができる。いくつかの実施の形態では、拡張させたＥＣＭ材料を用いて形成された乾燥基質は、高い圧縮性および／または拡張性を有することができる。
【０１１２】
ＥＣＭ材料をアルカリ性材料等の変性剤で処理することにより、この材料の物理的構造の変化を生じさせ、その結果、これを拡張させてもよい。このような変化は、この材料内のコラーゲンの変性を含み得る。ある実施の形態では、この材料を、最初の体積の少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、または少なくとも約６倍以上に拡張することが好ましい。拡張の程度が、たとえば、特に、アルカリ性培地の濃度またはｐＨ、アルカリ性培地の材料に対する露出時間、および拡張させる材料の処理温度が含まれる、いくつかの要因に関連することは、当業者には明らかであろう。本明細書の開示に基づき、これら要因を通常の実験を通して変化させることにより、所望の拡張レベルを有する材料を得ることができる。
【０１１３】
コラーゲン原繊維は、トロポコラーゲンが４分の１ずつジグザグに配置されたアレイからなる。トロポコラーゲン分子自体は、共有結合分子内結合および水素結合によって結合されて三重螺旋を形成する３つのポリペプチド鎖から形成される。加えて、共有結合分子内結合は、コラーゲン原繊維内の異なるトロポコラーゲン分子間に形成される。しばしば、複数のコラーゲン原繊維が互いに組合さってコラーゲン繊維を形成することがある。この材料にアルカリ性物質を本明細書に記載のように追加することにより、分子内および分子間結合が大きく破壊されないようにし、それでもなお材料を、この材料の処理後の厚みが増すように、たとえば自然発生する厚みの少なくとも２倍となるように変性させることもできると考えられている。基質として使用するために処理されて拡張した材料を作るＥＣＭ材料は、本明細書に開示されたもののうちいずれかまたは他の適切なＥＣＭ材料を含み得る。典型的なこのようなＥＣＭ材料は、自然発生した分子間架橋および自然発生した分子内架橋を有するコラーゲン原繊維のネットワークを含むであろう。本明細書に記載のように拡張する処理を行なうと、自然発生した分子内架橋および自然発生した分子間架橋を、処理されたコラーゲン性マトリクス材料の中で十分に保持することにより、コラーゲン性マトリクス材料を、そのままのコラーゲン性シート材料として維持することができる。しかしながら、コラーゲン性シート材料内のコラーゲン原繊維は変性する可能性があり、コラーゲン性シート材料のアルカリ処理された厚みは、出発材料の厚みよりも大きく、たとえば当初の厚みの少なくとも１２０％、または当初の厚みの少なくとも２倍になり得る。次に、拡張させたＥＣＭ材料を処理して、たとえば細かく砕くこと、鋳造、および処理された材料の乾燥により、発泡体またはスポンジ基質を提供してもよい。拡張させたＥＣＭ材料およびその調製に関するさらなる情報は、本明細書にその全体を引用により援用する、２００９年１２月３１日公開の米国特許出願公開第ＵＳ２００９０３２６５７７号、２００９年６月２２日出願の米国特許出願第１２／４８９，１９９号に記載されている。
【０１１４】
ＥＣＭ材料に加えてまたはその代わりとして、本発明で使用される細胞成長基質は、他の適切な材料からなるものであってもよい。例示としての材料は、たとえば合成によって製造された、天然または合成ポリマーからなる基質を含む。例示としての合成ポリマーは、酢酸セルロース、硝酸セルロース、シリコーン、ポリエチレンテレフタラート、ポリウレタン、ポリアミド、ポリエステル、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリエーテルスルホン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、高分子量ポリエチレン、ポリテトラフルオロエチレン、またはその混合物もしくは共重合体等の非吸収性合成生体適合性ポリマー、または、ポリ乳酸、ポリグリコール酸もしくはその共重合体、ポリ無水物、ポリカプロラクトン、ポリヒドロキシブチレートバレレート、ポリヒドロキシアルカノエート等の吸収性合成ポリマー材料、または、別の成分解析ポリマーまたはその混合物を含み得る。上記またはその他の材料からなる好ましい細胞成長基質は、細胞の侵入およびマトリクスへの内殖を可能にするように構成された多孔性マトリクス材料であろう。
【０１１５】
本発明の実施の形態で使用される細胞
広範囲にわたる細胞の種類のうちいずれか１つまたはいずれかの組合せを、本発明の細胞移植片に関する組成物および方法で使用してもよい。たとえば、細胞は、皮膚細胞、骨格筋細胞、心筋細胞、肺細胞、腸間膜細胞、または脂肪細胞であってもよい。脂肪細胞は、大網脂肪、腹膜前脂肪、腎周囲脂肪、心筋脂肪、皮下脂肪、胸部脂肪、または精巣上体脂肪に由来するものであってもよい。ある実施の形態において、細胞は、間質細胞、幹細胞、またはその組合せを含む。本明細書で使用される「幹細胞」という用語は、広い意味で使用され、従来の幹細胞、脂肪由来幹細胞、前駆細胞、前前駆細胞（preprogenitor cell）、貯蔵細胞等を含む。代表的な幹細胞は、胚性幹細胞、成体幹細胞、多能性幹細胞、神経幹細胞、肝臓幹細胞、筋肉幹細胞、筋肉前駆体幹細胞、血管内皮前駆細胞、骨髄幹細胞、軟骨形成幹細胞、リンパ球系幹細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、中央神経系幹細胞、末梢神経系幹細胞等を含む。使用できるさらなる細胞の例には肝細胞、上皮細胞、クッパー細胞、繊維芽細胞、ニューロン、心筋細胞、筋細胞、軟骨細胞、膵腺房細胞、ランゲルハンス島、骨細胞、筋芽細胞、随伴細胞、内皮細胞、脂肪細胞、前脂肪細胞、胆管上皮細胞、およびこれらの細胞種のいずれかの前駆細胞が、含まれる。
【０１１６】
いくつかの実施の形態において、細胞移植片に組込まれる細胞は、血管内皮前駆細胞（ＥＰＣ）であるまたはこれを含む。本発明で使用するのに好ましいＥＰＣは、内皮コロニー形成細胞（ＥＣＦＣ）、特に増殖ポテンシャルが高いＥＣＦＣである。こういった細胞として好ましいものは、たとえばその全体を本明細書に引用により援用する、２００５年１２月１日公開の米国特許出願公開第２００５０２６６５５６号、２００５年２月９日出願の米国特許出願第１１／０５５，１８２号、および２００８年１月１日公開の米国特許出願公開第２００８００２５９５６号、２００７年８月１３日出願の米国特許出願第１１／８３７，９９９号に記載されている。このようなＥＣＦＣ細胞は、クローン群であってもよく、および／またはヒトもしくはその他の動物の臍帯血液から得たものであってもよい。それに加えてまたはその代わりに、内皮コロニー形成細胞には以下の特徴がある。（ａ）細胞表面抗原ＣＤ３１、ＣＤ１０５、ＣＤ１４６、およびＣＤ１４４を発現し、および／または（ｂ）ＣＤ４５およびＣＤ１４を発言せず、および／または（ｃ）摂取アセチル化ＬＤＬ、および／または（ｄ）単細胞から培養されたとき少なくとも２０００の細胞の少なくとも二次コロニーに置き換わる、および／または（ｅ）高レベルのテロメラーゼを発現、その少なくとも３４％はＨｅＬａ細胞によって発現される、および／または核の細胞質に対する比率が０．８よりも高い、および／または（ｇ）細胞の直径が約２２ミクロン未満である。これらの特徴（ａ）〜（ｇ）のうちいくつかの任意の組合せ、またはすべては、本発明で使用されるＥＣＦＣを特徴付けるであろう。
【０１１７】
他の実施の形態において、細胞移植片に組込まれる細胞は、筋肉由来の筋芽細胞および／または筋肉由来の幹細胞を含む筋肉由来細胞である、またはこれを含む。適切なこのような幹細胞およびこれらを得るための方法は、たとえば各々の全体を本明細書に引用により援用する米国特許第６，８６６，８４２号および米国特許第７，１５５，４１７号に記載されている。筋肉由来細胞は、Ｍ−カドヘリン、ＭｙｏＤ、ミオゲニン、ＣＤ３４、および／またはＢｃｌ−２を発現することができ、ＣＤ４５またはｃ−Ｋｉｔ細胞マーカーの発現はないことがある。
【０１１８】
さらに他の実施形態において、細胞移植片に組込まれる細胞は、脂肪組織由来の幹細胞である、またはこれを含む。適切なこのような細胞およびこれらを得るための方法は、たとえば各々の全体を本明細書に引用により援用する、米国特許第６，７７７，２３１号および米国特許第７，５９５，０４３号に記載されている。細胞群は、脂肪由来の幹および再生細胞を含んでいてもよく、これらの細胞は、間質血管細胞群と呼ばれることもあり、成体由来の細胞であってもよい、幹細胞、血管内皮前駆細胞、白血球、内皮細胞、および血管平滑筋細胞を含む混合群であってもよい。ある形態において、本発明の細胞移植片は、骨細胞、軟骨細胞、神経細胞、または筋肉細胞のうち２つ以上に分化し得る脂肪由来細胞で調製されてもよくこれらを含んでいてもよい。
【０１１９】
細胞移植片を用いた医療
本発明の、本発明に従い調製された細胞移植片は、損傷を受けた、疾患のある、または不十分な組織を治療するために、広範囲にわたる臨床応用で使用でき、かつ、ヒトまたは非ヒト動物に対して使用できる。治療するこのような組織は、たとえば、筋肉組織、神経組織、脳組織、血液、心筋組織、軟骨組織、肺、肝臓または腎臓組織といった臓器組織、骨組織、動脈または静脈血管組織、皮膚組織などであってもよい。
【０１２０】
ある実施の形態では、細胞移植片を用いて、患者の血管形成を強化することにより、たとえば組織内の局所貧血を緩和することができる。たとえば内皮コロニー形成細胞またはその他の血管内皮前駆細胞を含む移植片である、血管形成細胞移植片を、局所貧血部位に直接投与することにより、疾患のある領域における新たな血管の形成を促し、血流またはその他の結果を改善することができる。治療する局所貧血組織は、たとえば梗塞後の局所貧血心筋組織、または、深刻な四肢の局所貧血で生じるもののような脚部またはその他の四肢の局所貧血組織かもしれない。局所貧血組織に投与される細胞移植片は、流動性移植片材料であってもよく、特に本明細書に記載の注入可能な移植片材料であってもよい。
【０１２１】
細胞移植片は、皮膚潰瘍、例として糖尿病性潰瘍および火傷等の、皮膚の厚みの一部または全体にわたる傷の治療にも使用できる。一例として、内皮コロニー形成細胞またはその他の血管内皮前駆細胞を含む移植片をこのような傷に投与することにより、傷の治療を改善することができる。
【０１２２】
他の応用例では、細胞移植片を用いて、たとえば骨格筋組織、平滑筋組織、心筋組織または他の組織の治療においてターゲット部位に筋肉組織を生成するのに使用できる。一例として、筋肉由来の筋芽細胞を含む本発明の細胞移植片を、たとえば注射によって、膀胱括約筋といった括約筋の筋肉組織に送達することにより失禁の治療を行なうことができる。
【０１２３】
本明細書に記載の細胞含有移植片材料の実施の形態、および本明細書に記載の方法の実施の形態はすべて、本明細書に記載の細胞播種装置およびシステムを用いて調製し行なうことができることが理解されるであろう。たとえば、この装置およびシステムは概して、基質材料を細胞播種装置に投入するステップと、細胞組成物を細胞播種装置に投入するステップと、基質材料と細胞とを少なくとも部分的に場合によっては完全に細胞播種装置の動作によって組合せるステップとを含む。プレコンディショニング培地、ゲルまたはゲル化可能な材料等、本明細書に記載の他の組成物を使用する場合は、これらを、一般的に説明されているように、細胞播種装置の機能によって、他の材料との作用および組合せのために、細胞播種装置の適切なチャンバまたは通路に投入すればよい。本明細書に記載の特徴および実施の形態の上記組合せが本発明のさらなる局面を構成することを、当業者は容易に理解するであろう。よって、細胞が播種された移植材料を、細胞播種装置から得て、たとえば本明細書に示した医療適用のために、任意でヒトの患者を含む患者に投与することができる。
【０１２４】
本発明の記載の文脈において（特に以下の請求項の文脈において）使用される「１つの（“a”と“an”)」および「この（“the”）」ならびに類似する指示語は、本明細書で特に明記しない限りまたは明らかに文脈と矛盾しない限り、単一のものおよび複数のもの双方を含むと解釈されねばならない。本明細書における値の範囲の記載は、本明細書で特に明記しない限り、その範囲に含まれる個々の値を個別に示すための簡略方法を意図しているに過ぎず、個々の値は、本明細書において個別に記載された場合と同じように明細書に含まれる。本明細書に記載のすべての方法は、本明細書で特に明記しない限りまたは明らかに文脈と矛盾しない限り、任意の適切な順序で実行できる。本明細書で使用されるすべての例または例示を示す表現（たとえば「等（“such as”)」）は、本発明をより明らかにすることを意図しているに過ぎず、特に請求項に記載しない限り本発明の範囲を限定しない。本明細書の表現は請求項に記載されていない要素が本発明の実施に不可欠であることを示すものではないと理解されねばならない。
【０１２５】
本発明について図面および上述の記載において詳細に示し説明してきたが、これは例示であって制限的な性質のものではないとみなされるべきものであり、好ましい実施の形態のみが示され説明されていることおよび本発明の精神に含まれるすべての変更および変形の保護が望まれていることが理解される。加えて、本明細書で挙げられたすべての引用は、当業者のレベルを示すものであって、その全体が本明細書に引用により援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図１１】
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【図１１Ａ】
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【図１２】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図９】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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