(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内におけるヒトキネシンファミリーメンバー１１（Ｅｇ５／ＫＳＰ）遺伝子の発現を阻害する第１の二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）と、細胞内におけるヒトＶＥＧＦの発現を阻害する第２のｄｓＲＮＡとを含む核酸脂質粒子を含む組成物であって、
前記核酸脂質粒子が、４５〜６５モル％の陽イオン性脂質、５〜１５モル％の非陽イオン性脂質、２５〜４０モル％のステロール、および０．５〜５モル％のＰＥＧまたはＰＥＧ改変脂質を含む脂質製剤を含み、
前記第１のｄｓＲＮＡが、第１のセンス鎖と第１のアンチセンス鎖とからなり、前記第１のセンス鎖が、第１の配列を含み、前記第１のアンチセンス鎖が、
配列番号１３１１（５’−ＵＣＧＡＧＡＡＵＣＵＡＡＡＣＵＡＡＣＵ−３’）
のうちの少なくとも１５の連続ヌクレオチドと相補的な第２の配列を含み、
前記第１の配列が、前記第２の配列と相補的であり、前記第１のｄｓＲＮＡが、１５〜３０塩基対の長さであり；
前記第２のｄｓＲＮＡが、第２のセンス鎖と第２のアンチセンス鎖とからなり、前記第２のセンス鎖が、第３の配列を含み、前記第２のアンチセンス鎖が、
配列番号１５３８（５’−ＧＣＡＣＡＵＡＧＧＡＧＡＧＡＵＧＡＧＣＵＵ−３’）
のうちの少なくとも１５の連続ヌクレオチドと相補的な第４の配列を含み、
前記第３の配列が、前記第４の配列と相補的であり、前記第２のｄｓＲＮＡが、１５〜３０塩基対の長さであり、
前記陽イオン性脂質が、ＭＣ３（（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノエート）を含む、組成物。
【請求項２】
前記脂質製剤が、
【表４４】
0006032724.tif 000094
からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記第１のｄｓＲＮＡが、配列番号１５３４（５’−ＵＣＧＡＧＡＡＵＣＵＡＡＡＣＵＡＡＣＵＴＴ−３’）からなるセンス鎖と、配列番号１５３５（５’−ＡＧＵＵＡＧＵＵＵＡＧＡＵＵＣＣＵＧＡＴＴ−３’）からなるアンチセンス鎖とからなり、前記第２のｄｓＲＮＡが、配列番号１５３６（５’−ＧＣＡＣＡＵＡＧＧＡＧＡＧＡＵＧＡＧＣＵＵ−３’）からなるセンス鎖と、配列番号１５３７（５’−ＡＡＧＣＵＣＡＵＣＵＣＵＣＣＵＡＵＧＵＧＣＵＧ−３’）からなるアンチセンス鎖とからなる、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
小文字の「ｃ」または「ｕ」により示される２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドと、小文字の「ｓ」により示されるホスホロチオエートとを包含するように、各鎖が、以下：
前記第１のｄｓＲＮＡが、
配列番号１２４０（５’−ｕｃＧＡＧＡＡｕｃｕＡＡＡｃｕＡＡｃｕＴｓＴ−３’）
からなるセンス鎖と、
配列番号１２４１（５’−ＡＧＵｕＡＧＵＵｕＡＧＡＵＵＣＵＣＧＡＴｓＴ）
からなるアンチセンス鎖とからなり；
前記第２のｄｓＲＮＡが、
配列番号１２４２（５’−ＧｃＡｃＡｕＡＧＧＡＧＡＧＡｕＧＡＧＣＵｓＵ−３’）
からなるセンス鎖と、
配列番号１２４３（５’−ＡＡＧＣＵｃＡＵＣＵＣＵＣＣｕＡｕＧｕＧＣｕｓＧ−３’）からなるアンチセンス鎖とからなる、
ように改変される、
請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記第１および第２のｄｓＲＮＡが、少なくとも１つの改変ヌクレオチドを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記改変ヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチル改変ヌクレオチド、５’−ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、およびコレステリル誘導体またはドデカン酸ビスデシルアミド基に連結された末端ヌクレオチドからなる群から選択される、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記改変ヌクレオチドが、２’−デオキシ−２’−フルオロ改変ヌクレオチド、２’−デオキシ改変ヌクレオチド、ロックトヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’−アミノ改変ヌクレオチド、２’−アルキル改変ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホルアミデートを含むヌクレオチド、および非天然塩基を含むヌクレオチドからなる群から選択される、請求項５に記載の組成物。
【請求項８】
前記第１および第２のｄｓＲＮＡの各々が、少なくとも１つの２’−Ｏ−メチル改変リボヌクレオチドと、５’−ホスホロチオエート基を含む少なくとも１つのヌクレオチドとを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
各ｄｓＲＮＡの各鎖が、１９〜２３塩基の長さである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
各ｄｓＲＮＡの各鎖が、２１〜２３塩基の長さである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記第１のｄｓＲＮＡの各鎖が、２１塩基の長さであり、前記第２のｄｓＲＮＡの前記センス鎖が２１塩基の長さであり、前記第２のｄｓＲＮＡの前記アンチセンス鎖が２３塩基の長さである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記第１および第２のｄｓＲＮＡが、等モル比で存在する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
ソラフェニブをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
リポタンパク質をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１６】
Ｅｇ５を発現する細胞と接触させると、Ｅｇ５の発現を少なくとも４０％阻害する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１７】
ＶＥＧＦを発現する細胞と接触させると、ＶＥＧＦの発現を少なくとも４０％阻害する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１８】
前記組成物を細胞に投与すると、前記細胞におけるＥｇ５およびＶＥＧＦの発現が低下する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１９】
ｎＭ濃度で投与される、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記組成物を細胞に投与すると、前記細胞における単星の形成が増大する、請求項１に記載の組成物。
【請求項２１】
前記組成物を哺乳動物に投与すると、前記哺乳動物における腫瘍増殖の防止、腫瘍増殖の低減、または生存の延長からなる群から選択される少なくとも１つの効果がもたらされる、請求項１に記載の組成物。
【請求項２２】
前記効果が、体重の決定、器官重量の決定、視診、ｍＲＮＡ解析、血清ＡＦＰ解析、および生存のモニタリングからなる群から選択される少なくとも１つのアッセイを用いて測定される、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
細胞内におけるＥｇ５／ＫＳＰおよびＶＥＧＦの発現を阻害するための、請求項１に記載の組成物。
【請求項２４】
癌の治療を必要とする哺乳動物において、腫瘍の増殖を防止するか、腫瘍の増殖を低減するか、または生存を延長させるための、請求項１に記載の組成物。
【請求項２５】
前記哺乳動物が、肝臓癌を有する、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
前記哺乳動物が、肝臓癌を有するヒトである、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２７】
前記組成物が、０．２５ｍｇ／ｋｇ〜４ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡを含有する用量で前記哺乳動物に投与されることを特徴とする、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２８】
前記組成物が、０．０１、０．１、０．５、１．０、２．５、または５．０ｍｇ／ｋｇの前記ｄｓＲＮＡの用量でヒトに投与されることを特徴とする、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２９】
癌の治療を必要とする哺乳動物において腫瘍の増殖を低減するための、請求項１に記載の組成物であって、前記組成物の投与によって腫瘍の増殖が少なくとも２０％低減される、組成物。
【請求項３０】
前記組成物の投与によってＫＳＰの発現が少なくとも６０％低下される、請求項２９に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を含有する脂質製剤組成物と、ＲＮＡ干渉を媒介して、遺伝子の組合せ、例えば、Ｅｇ５遺伝子と、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）遺伝子との組合せの発現を阻害するためのそれらの使用に関する。ｄｓＲＮＡは、脂質製剤中に製剤化され、リポタンパク質、例えば、アポリポタンパク質Ｅを包含し得る。本発明にはまた、癌など、Ｅｇ５およびＶＥＧＦの発現によって媒介される病理学的過程を治療するための組成物の使用も包含される。
【０００２】
関連出願への相互参照
本出願は、それらのすべてが、参照により、それらの全体において、すべての目的で本明細書に組み込まれる、２００９年３月１２日に出願された、米国仮出願第６１／１５９，７８８号；２００９年８月５日に出願された、米国仮出願第６１／２３１，５７９号；ならびに２００９年１２月１１日に出願された、米国仮出願第６１／２８５，９４７号の利益を主張するものである。
【０００３】
配列表の参照
本出願は、２０１０年＿月ＸＸ日に、ＸＸＸ，ＸＸＸバイトのサイズで作成され、16564US_sequencelisting.txtと名付けられたテキストファイルとして電子データの形態で提出された配列表を包含する。該配列表は、参照により組み込まれる。
【背景技術】
【０００４】
生物内における細胞集団の維持は、細胞分裂およびプログラム細胞死という細胞過程により統御されている。正常細胞内では、各過程の開始および終了と関連する細胞イベントが、高度に制御されている。癌などの増殖性疾患では、これらの過程のうちの一方または両方が撹乱される場合がある。例えば、癌細胞は、おそらくは変異により、正の制御因子の過剰発現または負の制御因子の喪失を介して、細胞分裂周期の制御（監視点制御（ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  ｃｏｎｔｒｏｌ））を喪失している可能性がある。
【０００５】
代替的に、癌細胞は、負の制御因子の過剰発現を介して、プログラム細胞死を受ける能力を喪失している可能性もある。したがって、癌性細胞に、監視点制御およびプログラム細胞死の過程を回復させる、新規の化学療法薬を開発することが必要とされている。
【０００６】
ヒトの癌を治療するための１つの手法は、細胞周期の進行にとって不可欠なタンパク質を標的とすることである。細胞周期が、１つの段階から次の段階へと進むためには、特定の必須イベントが完了しなければならない。細胞周期内には、イベントおよび段階の適正な順序を強化する監視点が存在する。このような監視点の１つは、有糸分裂の中期段階において生じる、紡錘体による監視点である。有糸分裂において不可欠な機能を有するタンパク質を標的とする低分子は、紡錘体による監視点を開始させて、有糸分裂において細胞を停止させ得る。有糸分裂において細胞を停止させる低分子のうちで、臨床状況において抗腫瘍活性を示す低分子はまた、プログラム細胞死に関連する形態変化であるアポトーシスも誘導する。したがって、癌を治療するのに有効な化学療法剤は、監視点制御およびプログラム細胞死を誘導する化学療法剤であり得る。残念ながら、細胞内におけるこれらの過程を制御するのに利用可能な化合物は少ない。有糸分裂の停止およびアポトーシスを引き起こすことが公知である大半の化合物は、チューブリン結合剤として作用する。これらの化合物は、微小管の力学的不安定性を変化させ、有糸分裂紡錘体の機能／構造を間接的に変化させ、これにより、有糸分裂の停止を引き起こす。これらの化合物の大半は、すべての微小管の構成要素であるチューブリンタンパク質を特異的に標的とするため、微小管が役割を果たす多数の正常な細胞過程のうちの１つ以上にもまた影響を及ぼし得る。したがって、また、増殖する細胞と関連するタンパク質をより特異的に標的とする薬剤も必要とされている。
【０００７】
Ｅｇ５は、有糸分裂紡錘体に局在し、双極性有糸分裂紡錘体の形成および／または機能に必要とされることが公知である、複数のキネシン様モータータンパク質のうちの１つである。近年、有糸分裂紡錘体の双極性を妨害する低分子について報告がなされた（参照により本明細書に組み込まれるMayer, T. U.ら、１９９９年、Science、２８６巻（５４４１号）、９７１〜４頁）。より具体的に述べると、該低分子は、中心体の中心対から微小管の単星配列（ｍｏｎｏａｓｔｒａｌ  ａｒｒａｙ）を発生させ、該微小管の遠位端に染色体を結合させる、異常な有糸分裂紡錘体の形成を誘導した。該低分子は、単星配列にちなんで、「モナストロール」と名付けられた。この単星配列の表現型は、Ｅｇ５モータータンパク質を免疫枯渇させた有糸分裂細胞内において既に観察されていた。この特色ある単星配列の表現型により、モナストロールを、潜在的なＥｇ５阻害剤として同定することが容易となった。実際、モナストロールは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて、Ｅｇ５モーターに駆動される微小管の運動性を阻害することがさらに示された。Ｅｇ５阻害剤であるモナストロールは、類縁のキネシンモーターに対して、または細胞内におけるゴルジ体の運動の一因となるモーター（複数可）に対して明らかな影響を及ぼすことがなかった。Ｅｇ５の免疫枯渇またはモナストロールによるＥｇ５の阻害を介して単星配列の表現型を示す細胞は、細胞周期のＭ期において停止する。しかし、Ｅｇ５の免疫枯渇または阻害により誘導される有糸分裂の停止は、一過性である（Kapoor,T. M.、２０００年、J Cell Biol、１５０巻（５号）、９７５〜８０頁）。モナストロールにより誘導される、単星配列の表現型ならびに有糸分裂における細胞周期の停止は、いずれも可逆的である。細胞は回復して、正常な双極性有糸分裂紡錘体を形成し、有糸分裂を完了し、細胞周期および正常な細胞増殖を進める。これらのデータは、一過性の有糸分裂の停止を誘導したＥｇ５阻害剤が、癌細胞の増殖を治療するのに有効ではない場合があることを示唆する。にもかかわらず、モナストロールが有糸分裂の停止を引き起こすという発見は興味深く、したがって、ヒトの癌を治療するのに有効であるような形態でＥｇ５モータータンパク質を調節するのに用い得る化合物についてさらに研究し、これらを同定することが必要である。また、他の抗新生物剤と組み合わせたこれらの化合物の使用についても探索することが必要である。
【０００８】
ＶＥＧＦ（血管透過性因子；ＶＰＦとしても公知である、血管内皮増殖因子）とは、新脈管形成、内皮細胞の増殖、および内皮細胞の生存を刺激する、多機能性のサイトカインである。ＶＥＧＦは、多種多様な組織により生成され得、その過剰発現または異常な発現は、癌、ならびに加齢黄斑変性などの網膜障害、ならびに他の脈管形成障害を含めた各種の障害を結果としてもたらし得る。
【０００９】
近年、二本鎖ＲＮＡ分子（ｄｓＲＮＡ）が、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として公知の高度に保存的な制御機構において、遺伝子発現を遮断することが示されている。特許文献１（Fireら）は、少なくとも２５ヌクレオチドの長さのｄｓＲＮＡを用いて、C. elegansにおける遺伝子発現を阻害することについて開示している。ｄｓＲＮＡはまた、植物（例えば、特許文献２、Waterhouseら；ならびに特許文献３、Heifetzらを参照されたい）、Drosophila（例えば、Yang,D.ら、Curr. Biol.（２０００年）、１０巻：１１９１〜１２００頁を参照されたい）、および哺乳動物（特許文献４、Limmer；ならびにＤＥ１０１００５８６．５、Kreutzerらを参照されたい）を含めた他の生物においても、標的ＲＭＡを分解することが示されている。今や、この天然の機構は、遺伝子の制御が異常であるかまたは望ましくないことにより引き起こされる障害を治療する、新たなクラスの薬剤（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ａｇｅｎｔ）を開発するための焦点となっている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第９９／３２６１９号
【特許文献２】国際公開第９９／５３０５０号
【特許文献３】国際公開第９９／６１６３１号
【特許文献４】国際公開第００／４４８９５号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、ｄｓＲＮＡを含有する脂質製剤組成物を用いて、細胞におけるヒトＥｇ５／ＫＳＰ遺伝子およびＶＥＧＦ遺伝子の発現を阻害する組成物および方法を提供する。
【００１２】
本発明の組成物は、細胞におけるヒトキネシンファミリーメンバー１１（Ｅｇ５／ＫＳＰ）遺伝子の発現を阻害する第１の二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）と、細胞におけるヒトＶＥＧＦの発現を阻害する第２のｄｓＲＮＡとを有する核酸脂質粒子を包含する。該核酸脂質粒子は、４５〜６５モル％の陽イオン性脂質、５モル％〜約１０モル％の非陽イオン性脂質、２５〜４０モル％のステロール、および０．５〜５モル％のＰＥＧまたはＰＥＧ改変脂質を有する脂質製剤を有する。Ｅｇ５／ＫＳＰを標的とする該第１のｄｓＲＮＡは、第１のセンス鎖と第１のアンチセンス鎖とを包含し、該第１のセンス鎖が、第１の配列を有し、該第１のアンチセンス鎖が、配列番号１３１１（５’−ＵＣＧＡＧＡＡＵＣＵＡＡＡＣＵＡＡＣＵ−３’）のうちの少なくとも１５の連続ヌクレオチドと相補的な第２の配列を有し、該第１の配列が、該第２の配列と相補的であり、該第１のｄｓＲＮＡが、１５〜３０塩基対の長さである。該第２のｄｓＲＮＡは、第２のセンス鎖と第２のアンチセンス鎖とを包含し、該第２のセンス鎖が、第３の配列を有し、該第２のアンチセンス鎖が、配列番号１５３８（５’−ＧＣＡＣＡＵＡＧＧＡＧＡＧＡＵＧＡＧＣＵＵ−３’）のうちの少なくとも１５の連続ヌクレオチドと相補的な第４の配列を有し、該第３の配列が、該第４の配列と相補的であり、該第２のｄｓＲＮＡが、１５〜３０塩基対の長さである。
【００１３】
一実施形態では、該組成物の陽イオン性脂質が、
【００１４】
【化１】
0006032724.tif 000002
［式中、Ｒ１およびＲ２が、独立してアルキル、アルケニル、またはアルキニルであり、各々が、必要に応じて置換されていてもよく、Ｒ３およびＲ４が、独立して低級アルキルであるか、またはＲ３およびＲ４が一緒になって、必要に応じて置換されるヘテロ環式環を形成し得る］である式Ａを有する。
【００１５】
他の実施形態では、陽イオン性脂質が、ＸＴＣ（２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン）である。関連する実施形態では、陽イオン性脂質が、ＸＴＣであり、非陽イオン性脂質が、ＤＳＰＣであり、ステロールが、コレステロールであり、ＰＥＧ脂質が、ＰＥＧ−ＤＭＧを有する。さらに関連する実施形態では、陽イオン性脂質が、ＸＴＣであり、製剤が、
【００１６】
【表１】
0006032724.tif 000003
からなる群から選択される。
【００１７】
別の実施形態では、該組成物の陽イオン性脂質が、ＡＬＮＹ−１００（（３ａＲ，５ｓ，６ａＳ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，２−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエニル）テトラヒドロ−３ａＨ−シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−アミン））である。他の実施形態では、陽イオン性脂質が、ＡＬＮＹ−１００であり、製剤が、
【００１８】
【表２】
0006032724.tif 000004
を包含する。
【００１９】
他の実施形態では、陽イオン性脂質が、ＭＣ３（（（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノエート）である。関連する実施形態では、陽イオン性脂質が、ＭＣ３であり、脂質製剤が、
【００２０】
【表３】
0006032724.tif 000005
からなる群から選択される。
【００２１】
別の実施形態では、第１のｄｓＲＮＡが、配列番号１５３４（５’−ＵＣＧＡＧＡＡＵＣＵＡＡＡＣＵＡＡＣＵＴＴ−３’）からなるセンス鎖と、配列番号１５３５（５’−ＡＧＵＵＡＧＵＵＵＡＧＡＵＵＣＣＵＧＡＴＴ−３’）からなるアンチセンス鎖とを包含し、第２のｄｓＲＮＡが、配列番号１５３６（５’−ＧＣＡＣＡＵＡＧＧＡＧＡＧＡＵＧＡＧＣＵＵ−３’）からなるセンス鎖と、配列番号１５３７（５’−ＡＡＧＣＵＣＡＵＣＵＣＵＣＣＵＡＵＧＵＧＣＵＧ−３’）からなるアンチセンス鎖とを包含する。さらに別の実施形態では、小文字の「ｃ」または「ｕ」により示される２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドと、小文字の「ｓ」により示されるホスホロチオエートとを包含するように、各鎖が、以下の通りに改変されている：第１のｄｓＲＮＡが、配列番号１２４０（５’−ｕｃＧＡＧＡＡｕｃｕＡＡＡｃｕＡＡｃｕＴｓＴ−３’）からなるセンス鎖と、配列番号１２４１（５’−ＡＧＵｕＡＧＵＵｕＡＧＡＵＵＣＵＣＧＡＴｓＴ）からなるアンチセンス鎖とを包含し；第２のｄｓＲＮＡが、配列番号１２４２（５’−ＧｃＡｃＡｕＡＧＧＡＧＡＧＡｕＧＡＧＣＵｓＵ−３’）からなるセンス鎖と、配列番号１２４３（５’−ＡＡＧＣＵｃＡＵＣＵＣＵＣＣｕＡｕＧｕＧＣｕｓＧ−３’）からなるアンチセンス鎖とを包含する。
【００２２】
他の実施形態では、第１および第２のｄｓＲＮＡが、少なくとも１つの改変ヌクレオチドを包含する。一部の実施形態では、該改変ヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチル改変ヌクレオチド、５’−ホスホロチオエート基を有するヌクレオチド、およびコレステリル誘導体またはドデカン酸ビスデシルアミド基に連結された末端ヌクレオチドからなる群から選択される。別の実施形態では、改変ヌクレオチドが、２’−デオキシ−２’−フルオロ改変ヌクレオチド、２’−デオキシ改変ヌクレオチド、ロックトヌクレオチド（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）、脱塩基ヌクレオチド、２’−アミノ改変ヌクレオチド、２’−アルキル改変ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホルアミデートを含むヌクレオチド、および非天然塩基を有するヌクレオチドからなる群から選択される。さらに別の実施形態では、第１および第２のｄｓＲＮＡの各々が、少なくとも１つの２’−Ｏ−メチル改変リボヌクレオチドと、５’−ホスホロチオエート基を有する少なくとも１つのヌクレオチドとを含む。
【００２３】
一部の実施形態では、各ｄｓＲＮＡが、１９〜２３塩基の長さである。別の実施形態では、各ｄｓＲＮＡの各鎖が、２１〜２３塩基の長さである。さらに別の実施形態では、第１のｄｓＲＮＡの各鎖が、２１塩基の長さであり、該第２のｄｓＲＮＡのセンス鎖が２１塩基の長さであり、該第２のｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖が２３塩基の長さである。他の実施形態では、第１および第２のｄｓＲＮＡが、等モル比で存在する。一実施形態では、組成物が、ソラフェニブをさらに有する。別の実施形態では、組成物が、リポタンパク質をさらに有する。別の実施形態では、組成物が、アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）をさらに有する。
【００２４】
別の実施形態では、組成物が、Ｅｇ５を発現する細胞と接触すると、Ｅｇ５の発現を少なくとも４０％阻害する。さらに別の実施形態では、組成物が、ＶＥＧＦを発現する細胞と接触すると、ＶＥＧＦの発現を少なくとも４０％阻害する。他の実施形態では、組成物を細胞に投与すると、該細胞内におけるＥｇ５およびＶＥＧＦの発現が低下する。関連する実施形態では、組成物が、ｎＭ濃度で投与される。さらに関連する実施形態では、組成物を細胞に投与すると、該細胞内における単星の形成が増大する。
【００２５】
他の実施形態では、組成物を哺乳動物に投与する結果、該哺乳動物における腫瘍増殖の防止、腫瘍増殖の低減、または生存の延長からなる群から選択される少なくとも１つの効果がもたらされる。一部の実施形態では、効果が、体重の決定、器官重量の決定、視診、ｍＲＮＡ解析、血清ＡＦＰ解析、および生存のモニタリングからなる群から選択される少なくとも１つのアッセイを用いて測定される。
【００２６】
本発明はまた、細胞内におけるＥｇ５／ＫＳＰおよびＶＥＧＦの発現を阻害する方法も提供する。該方法は、本発明の組成物を細胞に投与する工程を包含する。本発明はまた、癌の治療を必要とする哺乳動物において、腫瘍の増殖を防止するか、腫瘍の増殖を低減するか、または生存を延長させる方法も提供する。該方法は、本発明の組成物を該哺乳動物に投与する工程を包含する。一実施形態では、哺乳動物が、肝臓癌を有する。別の実施形態では、哺乳動物が、肝臓癌を有するヒトである。いくつかの実施形態では、０．２５ｍｇ／ｋｇ〜４ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡを含有する用量が該哺乳動物に投与される。他の実施形態では、ｄｓＲＮＡが、約０．０１、０．１、０．５、１．０、２．５、または５．０ｍｇ／ｋｇでヒトに投与される。
【００２７】
さらに別の実施形態では、本発明が、癌の治療を必要とする哺乳動物において腫瘍の増殖を低減する方法を提供する。該方法は、本発明の組成物を該哺乳動物に投与する工程を包含し、腫瘍の増殖を少なくとも２０％低減する。別の実施形態では、該方法により、ＫＳＰの発現が少なくとも６０％低下する。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
細胞内におけるヒトキネシンファミリーメンバー１１（Ｅｇ５／ＫＳＰ）遺伝子の発現を阻害する第１の二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）と、細胞内におけるヒトＶＥＧＦの発現を阻害する第２のｄｓＲＮＡとを含む核酸脂質粒子を含む組成物であって、
前記核酸脂質粒子が、４５〜６５モル％の陽イオン性脂質、５モル％〜約１０モル％の非陽イオン性脂質、２５〜４０モル％のステロール、および０．５〜５モル％のＰＥＧまたはＰＥＧ改変脂質を含む脂質製剤を含み、
前記第１のｄｓＲＮＡが、第１のセンス鎖と第１のアンチセンス鎖とからなり、前記第１のセンス鎖が、第１の配列を含み、前記第１のアンチセンス鎖が、
配列番号１３１１（５’−ＵＣＧＡＧＡＡＵＣＵＡＡＡＣＵＡＡＣＵ−３’）
のうちの少なくとも１５の連続ヌクレオチドと相補的な第２の配列を含み、
前記第１の配列が、前記第２の配列と相補的であり、前記第１のｄｓＲＮＡが、１５〜３０塩基対の長さであり；
前記第２のｄｓＲＮＡが、第２のセンス鎖と第２のアンチセンス鎖とからなり、前記第２のセンス鎖が、第３の配列を含み、前記第２のアンチセンス鎖が、
配列番号１５３８（５’−ＧＣＡＣＡＵＡＧＧＡＧＡＧＡＵＧＡＧＣＵＵ−３’）
のうちの少なくとも１５の連続ヌクレオチドと相補的な第４の配列を含み、
前記第３の配列が、前記第４の配列と相補的であり、前記第２のｄｓＲＮＡが、１５〜３０塩基対の長さである組成物。
（項目２）
前記陽イオン性脂質が、式Ａを含み、
式Ａが、
【化８】
0006032724.tif 000006
、または
【化９】
0006032724.tif 000007
［式中、Ｒ１およびＲ２が、独立してアルキル、アルケニル、またはアルキニルであり、各々が、必要に応じて置換されていてもよく、Ｒ３およびＲ４が、独立して低級アルキルであるか、またはＲ３およびＲ４が一緒になって、必要に応じて置換されるヘテロ環式環を形成し得る］である、項目１に記載の組成物。
（項目３）
前記陽イオン性脂質が、ＸＴＣ（２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン）を含む、項目２に記載の組成物。
（項目４）
前記陽イオン性脂質が、ＸＴＣを含み、前記非陽イオン性脂質が、ＤＳＰＣを含み、前記ステロールが、コレステロールを含み、前記ＰＥＧ脂質が、ＰＥＧ−ＤＭＧを含む、項目２に記載の組成物。
（項目５）
前記陽イオン性脂質が、ＸＴＣを含み、前記製剤が、
【表４２】
0006032724.tif 000008
からなる群から選択される、項目２に記載の組成物。
（項目６）
前記陽イオン性脂質が、ＡＬＮＹ−１００（（３ａＲ，５ｓ，６ａＳ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，２−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエニル）テトラヒドロ−３ａＨ−シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−アミン））を含む、項目１に記載の組成物。
（項目７）
前記陽イオン性脂質が、ＡＬＮＹ−１００を含み、前記製剤が、
【表４３】
0006032724.tif 000009
からなる、項目６に記載の組成物。
（項目８）
前記陽イオン性脂質が、ＭＣ３（（（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノエート）を含む、項目１に記載の組成物。
（項目９）
前記陽イオン性脂質が、ＭＣ３を含み、前記脂質製剤が、
【表４４】
0006032724.tif 000010
からなる群から選択される、項目８に記載の組成物。
（項目１０）
前記第１のｄｓＲＮＡが、配列番号１５３４（５’−ＵＣＧＡＧＡＡＵＣＵＡＡＡＣＵＡＡＣＵＴＴ−３’）からなるセンス鎖と、配列番号１５３５（５’−ＡＧＵＵＡＧＵＵＵＡＧＡＵＵＣＣＵＧＡＴＴ−３’）からなるアンチセンス鎖とからなり、前記第２のｄｓＲＮＡが、配列番号１５３６（５’−ＧＣＡＣＡＵＡＧＧＡＧＡＧＡＵＧＡＧＣＵＵ−３’）からなるセンス鎖と、配列番号１５３７（５’−ＡＡＧＣＵＣＡＵＣＵＣＵＣＣＵＡＵＧＵＧＣＵＧ−３’）からなるアンチセンス鎖とからなる、項目１に記載の組成物。
（項目１１）
小文字の「ｃ」または「ｕ」により示される２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドと、小文字の「ｓ」により示されるホスホロチオエートとを包含するように、各鎖が、以下：
前記第１のｄｓＲＮＡが、
配列番号１２４０（５’−ｕｃＧＡＧＡＡｕｃｕＡＡＡｃｕＡＡｃｕＴｓＴ−３’）
からなるセンス鎖と、
配列番号１２４１（５’−ＡＧＵｕＡＧＵＵｕＡＧＡＵＵＣＵＣＧＡＴｓＴ）
からなるアンチセンス鎖とからなり；
前記第２のｄｓＲＮＡが、
配列番号１２４２（５’−ＧｃＡｃＡｕＡＧＧＡＧＡＧＡｕＧＡＧＣＵｓＵ−３’）
からなるセンス鎖と、
配列番号１２４３（５’−ＡＡＧＣＵｃＡＵＣＵＣＵＣＣｕＡｕＧｕＧＣｕｓＧ−３’）からなるアンチセンス鎖とからなる、
ように改変される、
項目１０に記載の組成物。
（項目１２）
前記第１および第２のｄｓＲＮＡが、少なくとも１つの改変ヌクレオチドを含む、請求
項１に記載の組成物。
（項目１３）
前記改変ヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチル改変ヌクレオチド、５’−ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、およびコレステリル誘導体またはドデカン酸ビスデシルアミド基に連結された末端ヌクレオチドからなる群から選択される、項目１２に記載の組成物。
（項目１４）
前記改変ヌクレオチドが、２’−デオキシ−２’−フルオロ改変ヌクレオチド、２’−デオキシ改変ヌクレオチド、ロックトヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’−アミノ改変ヌクレオチド、２’−アルキル改変ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホルアミデートを含むヌクレオチド、および非天然塩基を含むヌクレオチドからなる群から選択される、項目１２に記載の組成物。
（項目１５）
前記第１および第２のｄｓＲＮＡの各々が、少なくとも１つの２’−Ｏ−メチル改変リボヌクレオチドと、５’−ホスホロチオエート基を含む少なくとも１つのヌクレオチドとを含む、項目１に記載の組成物。
（項目１６）
各ｄｓＲＮＡの各鎖が、１９〜２３塩基の長さである、項目１に記載の組成物。
（項目１７）
各ｄｓＲＮＡの各鎖が、２１〜２３塩基の長さである、項目１に記載の組成物。
（項目１８）
前記第１のｄｓＲＮＡの各鎖が、２１塩基の長さであり、前記第２のｄｓＲＮＡの前記センス鎖が２１塩基の長さであり、前記第２のｄｓＲＮＡの前記アンチセンス鎖が２３塩基の長さである、項目１に記載の組成物。
（項目１９）
前記第１および第２のｄｓＲＮＡが、等モル比で存在する、項目１に記載の組成物。
（項目２０）
ソラフェニブをさらに含む、項目１に記載の組成物。
（項目２１）
リポタンパク質をさらに含む、項目１に記載の組成物。
（項目２２）
アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）をさらに含む、項目１に記載の組成物。
（項目２３）
Ｅｇ５を発現する細胞と接触させると、Ｅｇ５の発現を少なくとも４０％阻害する、項目１に記載の組成物。
（項目２４）
ＶＥＧＦを発現する細胞と接触させると、ＶＥＧＦの発現を少なくとも４０％阻害する、項目１に記載の組成物。
（項目２５）
前記組成物を細胞に投与すると、前記細胞におけるＥｇ５およびＶＥＧＦの発現が低下する、項目１に記載の組成物。
（項目２６）
ｎＭ濃度で投与される、項目２５に記載の組成物。
（項目２７）
前記組成物を細胞に投与すると、前記細胞における単星の形成が増大する、項目１に記載の組成物。
（項目２８）
前記組成物を哺乳動物に投与すると、前記哺乳動物における腫瘍増殖の防止、腫瘍増殖の低減、または生存の延長からなる群から選択される少なくとも１つの効果がもたらされる、項目１に記載の組成物。
（項目２９）
前記効果が、体重の決定、器官重量の決定、視診、ｍＲＮＡ解析、血清ＡＦＰ解析、および生存のモニタリングからなる群から選択される少なくとも１つのアッセイを用いて測定される、項目２８に記載の組成物。
（項目３０）
細胞内におけるＥｇ５／ＫＳＰおよびＶＥＧＦの発現を阻害する方法であって、項目１に記載の組成物を前記細胞に投与する工程を含む方法。
（項目３１）
癌の治療を必要とする哺乳動物において、腫瘍の増殖を防止するか、腫瘍の増殖を低減するか、または生存を延長させる方法であって、項目１に記載の組成物を前記哺乳動物に投与する工程を含む方法。
（項目３２）
前記哺乳動物が、肝臓癌を有する、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
前記哺乳動物が、肝臓癌を有するヒトである、項目３１に記載の方法。
（項目３４）
０．２５ｍｇ／ｋｇ〜４ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡを含有する用量が前記哺乳動物に投与される、項目３１に記載の方法。
（項目３５）
前記ｄｓＲＮＡが、約０．０１、０．１、０．５、１．０、２．５、または５．０ｍｇ／ｋｇでヒトに投与される、項目３１に記載の方法。
（項目３６）
癌の治療を必要とする哺乳動物において腫瘍の増殖を低減する方法であって、項目１に記載の組成物を前記哺乳動物に投与する工程を含み、腫瘍の増殖を少なくとも２０％低減する方法。
（項目３７）
ＫＳＰの発現を少なくとも６０％低下させる、項目３６に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１は、Ｈｅｐ３ＢマウスモデルにおけるＳＮＡＬＰ−ｓｉＲＮＡの投与後の、体重の百分率として肝臓重量を示すグラフである。
【図２Ａ】図２Ａは、Ｈｅｐ３Ｂマウスモデルにおける体重に対するＰＢＳの効果を示すグラフである。
【図２Ｂ】図２Ｂは、Ｈｅｐ３Ｂマウスモデルにおける体重に対するＳＮＡＬＰ−ｓｉＲＮＡ（ＶＥＧＦ／ＫＳＰ）の効果を示すグラフである。
【図２Ｃ】図２Ｃは、Ｈｅｐ３Ｂマウスモデルにおける体重に対するＳＮＡＬＰ−ｓｉＲＮＡ（ＫＳＰ／ルシフェラーゼ）の効果を示すグラフである。
【図２Ｄ】図２Ｄは、Ｈｅｐ３Ｂマウスモデルにおける体重に対するＳＮＡＬＰ−ｓｉＲＮＡ（ＶＥＧＦ／ルシフェラーゼ）の効果を示すグラフである。
【図３】図３は、Ｈｅｐ３Ｂマウスモデルにおける体重に対するＳＮＡＬＰ−ｓｉＲＮＡの効果を示すグラフである。
【図４】図４は、未治療対照動物における体重を示すグラフである。
【図５】図５は、Ｈｅｐ３Ｂマウスモデルにおける体重に対する対照ルシフェラーゼ−ＳＮＡＬＰ−ｓｉＲＮＡの効果を示すグラフである。
【図６】図６は、Ｈｅｐ３Ｂマウスモデルにおける体重に対するＶＳＰ−ＳＮＡＬＰ−ｓｉＲＮＡの効果を示すグラフである。
【図７Ａ】図７Ａは、Ｈｅｐ３Ｂマウスモデルにおける、マウスＧＡＰＤＨレベルに対して標準化したヒトＧＡＰＤＨレベルに対するＳＮＡＬＰ−ｓｉＲＮＡの効果を示すグラフである。
【図７Ｂ】図７Ｂは、Ｈｅｐ３Ｂマウスモデルにおける、血清ＥＬＩＳＡによって測定した、血清ＡＦＰレベルに対するＳＮＡＬＰ−ｓｉＲＮＡの効果を示すグラフである。
【図８】図８は、Ｈｅｐ３Ｂマウスモデルにおける、マウスＧＡＰＤＨレベルに対して標準化したヒトＧＡＰＤＨレベルに対するＳＮＡＬＰ−ｓｉＲＮＡの効果を示すグラフである。
【図９】図９は、Ｈｅｐ３Ｂマウスモデルにおける、ヒトＧＡＰＤＨレベルに対して標準化したヒトＫＳＰレベルに対するＳＮＡＬＰ−ｓｉＲＮＡの効果を示すグラフである。
【図１０】図１０は、Ｈｅｐ３Ｂマウスモデルにおける、ヒトＧＡＰＤＨレベルに対して標準化したヒトＶＥＧＦレベルに対するＳＮＡＬＰ−ｓｉＲＮＡの効果を示すグラフである。
【図１１Ａ】図１１Ａは、Ｈｅｐ３Ｂマウスモデルにおける、ヒトＧＡＰＤＨレベルに対して標準化したマウスＶＥＧＦレベルに対するＳＮＡＬＰ−ｓｉＲＮＡの効果を示すグラフである。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、Ｈｅｐ３Ｂマウスモデルにおける、ヒトＧＡＰＤＨレベルおよび血清ＡＦＰレベルに対する、ＳＮＡＬＰ−ｓｉＲＮＡの効果を示す一組のグラフである。
【図１２Ａ】図１２Ａは、Ｈｅｐ３Ｂマウスモデルにおける、相対的ｈＫＳＰｍＲＮＡの百分率によって測定した、腫瘍ＫＳＰに対するＰＢＳ、ルシフェラーゼ、およびＡＬＮ−ＶＳＰの効果を示すグラフである。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、Ｈｅｐ３Ｂマウスモデルにおける、相対的ｈＶＥＧＦｍＲＮＡの百分率によって測定した、腫瘍ＶＥＧＦに対するＰＢＳ、ルシフェラーゼ、およびＳＮＡＬＰ−ＶＳＰの効果を示すグラフである。
【図１２Ｃ】図１２Ｃは、Ｈｅｐ３Ｂマウスモデルにおける、相対的ｈＧＡＰＤＨｍＲＮＡの百分率によって測定した、ＧＡＰＤＨレベルに対するＰＢＳ、ルシフェラーゼ、およびＳＮＡＬＰ−ＶＳＰの効果を示すグラフである。
【図１３Ａ】図１３Ａは、肝臓腫瘍を有するマウスにおける、生存に対するＳＮＡＬＰ−ｓｉＲＮＡの効果を示すグラフである。治療は腫瘍細胞接種後１８日に開始した。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、肝臓腫瘍を有するマウスにおける、生存に対するＳＮＡＬＰ−ｓｉＲＮＡの効果を示すグラフである。治療は腫瘍細胞接種後２６日に開始した。
【図１４】図１４は、血清アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）レベルに対するＳＮＡＬＰ−ｓｉＲＮＡの効果を示すグラフである。
【図１５Ａ】図１５Ａは、２ｍｇ／ｋｇのＳＮＡＬＰ−ＶＳＰを投与した腫瘍担持動物（Ｈｅｐ３Ｂ細胞移植後３週間）におけるＨ＆Ｅ染色切片の画像である。２４時間後、腫瘍担持肝葉を組織学的分析用に処理した。矢印は単星を示す。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、２ｍｇ／ｋｇのＳＮＡＬＰ−Ｌｕｃを投与した腫瘍担持動物（Ｈｅｐ３Ｂ細胞移植後３週間）におけるＨ＆Ｅ染色切片の画像である。２４時間後、腫瘍担持肝葉を組織学的分析用に処理した。
【図１６】図１６は、ＳＮＡＬＰ製剤化ｓｉＲＮＡおよびソラフェニブ投与の生存に対する効果を示すグラフである。
【図１７】図１７は、インラインミキシング法のフローチャートである。
【図１８】図１８は、ＬＮＰ−０８製剤化ＶＳＰで治療した後のマウス中の肝内Ｈｅｐ３Ｂ腫瘍における、ＫＳＰおよびＶＥＧＦ発現に対する効果を示すグラフである。
【図１９】図１９は、ＰＥＧ−ＤＳＧおよびＰＥＧ−Ｃ−ＤＳＡの化学構造を示す図である。
【図２０】図２０は、カチオン性脂質ＡＬＮＹ−１００、ＭＣ３、およびＸＴＣの構造を示す図である。
【図２１】図２１は、ＳＮＡＬＰ−１９５５（Ｌｕｃ）、ＡＬＮ−ＶＳＰ０２、およびＳＮＡＬＰ−Ｔ−ＶＳＰＬＮＰ１１およびＬＮＰ−１２製剤化ＶＳＰで治療したマウス中の肝内Ｈｅｐ３Ｂ腫瘍における、ＫＳＰおよびＶＥＧＦ発現に対する効果を示すグラフである。
【図２２】図２２は、ＬＮＰ０８−Ｌｕｃ、ＡＬＮ−ＶＳＰ０２、ならびにＬＮＰ−０８およびＬＮＰ０８−Ｃ１８製剤化ＶＳＰで治療したマウス中の肝内Ｈｅｐ３Ｂ腫瘍における、ＫＳＰおよびＶＥＧＦ発現に対する効果を比較する一組のグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明は、ｄｓＲＮＡを用いて、細胞または哺乳動物におけるＥｇ５遺伝子およびＶＥＧＦ遺伝子の発現を阻害するための組成物および方法を提供する。ｄｓＲＮＡは、脂質核酸粒子内に封入される。本発明はまた、肝臓癌など、哺乳動物においてＥｇ５遺伝子およびＶＥＧＦ遺伝子が発現することにより引き起こされる病理学的状態および疾患を治療するための組成物および方法も提供する。ｄｓＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として公知の過程を介して、配列特異的にｍＲＮＡを分解することを指向する。
【００３０】
以下の詳細な記載は、Ｅｇ５遺伝子およびＶＥＧＦ遺伝子それぞれの発現を阻害するｄｓＲＮＡを含有する組成物の他、癌など、これらの遺伝子が発現することにより引き起こされる疾患および障害を治療するための組成物および方法をどのようにして作製および使用するかについて開示する。本発明で特色とされる薬学的組成物は、３０ヌクレオチド未満の長さ、一般には１９〜２４ヌクレオチドの長さであり、Ｅｇ５遺伝子のＲＮＡ転写物の少なくとも一部と実質的に相補的である相補性領域を含むアンチセンス鎖を有するｄｓＲＮＡを、薬学的に許容されるキャリアと併せて包含する。本発明で特色とされる組成物はまた、３０ヌクレオチド未満の長さ、一般には１９〜２４ヌクレオチドの長さであり、ＶＥＧＦ遺伝子のＲＮＡ転写物の少なくとも一部と実質的に相補的である相補性領域を有するアンチセンス鎖を有するｄｓＲＮＡも包含する。
【００３１】
したがって、本発明の特定の態様は、Ｅｇ５  ｄｓＲＮＡおよびＶＥＧＦ  ｄｓＲＮＡと、薬学的に許容されるキャリアとを含有する薬学的組成物、該組成物を用いて、Ｅｇ５遺伝子およびＶＥＧＦ遺伝子それぞれの発現を阻害する方法、ならびに該薬学的組成物を用いて、Ｅｇ５遺伝子およびＶＥＧＦ遺伝子の発現により引き起こされる疾患を治療する方法を提供する。
Ｉ．定義
便宜のため、本明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲で用いられる特定の用語および語句の意味を以下に示す。本明細書の他の部分における用語の用法と、本節において示されるその定義との間に見かけ上の齟齬が生じた場合は、本節における定義が優先されるものとする。
【００３２】
「Ｇ」、「Ｃ」、「Ａ」、および「Ｕ」は各々一般に、グアニン、シトシン、アデニン、およびウラシルを、それぞれ塩基として含有するヌクレオチドを表す。本明細書では、「Ｔ」と「ｄＴ」とが互換的に用いられ、核酸塩基がチミンであるデオキシリボヌクレオチド、例えば、デオキシリボチミンを指す。しかし、「リボヌクレオチド」または「ヌクレオチド」という用語はまた、以下でさらに詳述される改変ヌクレオチドを指す場合もあり、代用の置換部分を指す場合もあることが理解される。このような置換部分を保有するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの塩基対合特性を実質的に変化させることのない他の部分により、グアニン、シトシン、アデニン、およびウラシルを置換し得ることを、当業者は十分に承知している。例えば、限定なしに述べると、その塩基としてイノシンを含むヌクレオチドは、アデニン、シトシン、またはウラシルを含有するヌクレオチドと塩基対合し得る。したがって、ウラシル、グアニン、またはアデニンを含有するヌクレオチドは、本発明のヌクレオチド配列内において、例えば、イノシンを含有するヌクレオチドにより置換することができる。別の例では、該オリゴヌクレオチド内の任意の位置におけるアデニンおよびシトシンを、それぞれ、グアニンおよびウラシルにより置換して、標的のｍＲＮＡとＧ−Ｕ間のウォブル型塩基対合を形成させることができる。このような置換部分を含む配列は、本発明の実施形態である。
【００３３】
本明細書で用いられる「Ｅｇ５」とは、また、ＫＩＦ１１、Ｅｇ５、ＨＫＳＰ、ＫＳＰ、ＫＮＳＬ１、またはＴＲＩＰ５としても公知である、ヒトキネシンファミリーメンバー１１を指す。Ｅｇ５配列は、ＮＣＢＩ  ＧｅｎｅＩＤ：3832、ＨＧＮＣ  ＩＤ：HGNC:6388、およびＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ番号：NM_004523としても見出すことができる。「Ｅｇ５」および「ＫＳＰ」ならびに「Ｅｇ５／ＫＳＰ」という用語は、互換的に用いられる。
【００３４】
また、血管透過性因子としても公知である、本明細書で用いられる「ＶＥＧＦ」は、脈管形成の増殖因子である。ＶＥＧＦは、少なくとも３つの異なるアイソフォームで存在する、４５ｋＤａのホモ二量体の糖タンパク質である。ＶＥＧＦのアイソフォームは、内皮細胞で発現する。ＶＥＧＦ遺伝子は、１８９アミノ酸のタンパク質アイソフォームを発現する８つのエクソンを含有する。１６５アミノ酸のアイソフォームが、エクソン６によりコードされる残基を欠く一方、１２１アミノ酸のアイソフォームは、エクソン６および７によりコードされる残基を欠く。ＶＥＧＦ１４５は、１４５アミノ酸を含有し、エクソン７を欠くと予測される。ＶＥＧＦは、Ｆｌｔ−１（ＶＥＧＦＲ−１）またはＫＤＲ／ｆｌｋ−１（ＶＥＧＦＲ−２）など、内皮のチロシンキナーゼ受容体に結合することにより、内皮細胞に対して作用し得る。ＶＥＧＦＲ−２は、内皮細胞内で発現し、内皮細胞の分化および脈管形成に関与する。第３の受容体であるＶＥＧＦＲ−３は、リンパ球生成に関与している。
【００３５】
各種のアイソフォームは、生物学的活性および臨床的関与が異なる。例えば、ＶＥＧＦ１４５は、新脈管形成を誘導し、ＶＥＧＦ１８９と同様に（しかし、ＶＥＧＦ１６５とは異なり）、細胞外マトリックスと会合する硫酸ヘパリンには依存しない機構によって、細胞外マトリックスと効果的に結合する。ＶＥＧＦは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、内皮細胞のマイトジェンおよび化学遊走物質としての活性を示し、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、血管透過性および新脈管形成を誘導する。ＶＥＧＦは、多種多様な癌細胞型により分泌され、腫瘍に随伴する血管系の発生を誘導することにより、腫瘍の増殖を促進する。ＶＥＧＦ機能を阻害すると、実験による原発性腫瘍の増殖、ならびに免疫無防備状態のマウスにおける転移の発生がいずれも制限されることが示されている。ＶＥＧＦを指向する各種のｄｓＲＮＡが、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、同時係属中の米国特許出願第１１／０７８，０７３号および同第１１／３４０，０８０号において記載されている。
【００３６】
本明細書で用いられる「標的配列」とは、一次転写産物に対するＲＮＡプロセシング産物であるｍＲＮＡを含め、Ｅｇ５／ＫＳＰ遺伝子および／またはＶＥＧＦ遺伝子が転写されるときに形成されるｍＲＮＡ分子の連続するヌクレオチド配列部分を指す。
【００３７】
本明細書で用いられる「配列を含む鎖」という用語は、標準的なヌクレオチド命名法を用いて言及される配列により記載されるヌクレオチド鎖を含むオリゴヌクレオチドを指す。
【００３８】
別段に示されない限り、第２のヌクレオチド配列との関連で第１のヌクレオチド配列を説明するのに用いる場合に本明細書で用いられる「相補的」という用語は、当業者により理解される通り、該第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが、特定の条件下で、該第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとハイブリダイズして、二重鎖構造物を形成する能力を指す。このような条件は、ストリンジェントな条件でありえ、ストリンジェントな条件は、例えば、５０℃または７０℃で１２〜１６時間にわたる、４００ｍＭ  ＮａＣｌ、４０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ  ｐＨ６．４、１ｍＭ  ＥＤＴＡの後、洗浄することを包含し得る。生物の内部で遭遇し得る生理学的に重要な条件など、他の条件も適用され得る。当業者は、ハイブリダイズしたヌクレオチドを最終的に適用することにより、２つの配列の相補性を調べるのに最適の条件のセットを決定することができる。
【００３９】
「相補的」という用語は、第１および第２のヌクレオチド配列の全長にわたり、該第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが、該第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドと塩基対合することを包含する。本明細書では、このような配列を、互いに対して「完全に相補的」であると称する場合がある。しかし、本明細書において、第１の配列が、第２の配列に関して「実質的に相補的」であると称する場合、該２つの配列は、完全に相補的である場合もあり、ハイブリダイズするときに、それらの最終的な適用に最も関連した条件下でハイブリダイズする能力を保持しながらも、１つ以上であるが、一般に４、３、または２以下であるミスマッチ塩基対を形成する場合もある。しかし、２つのオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイズするときに、１つ以上の一本鎖突出を形成するようにデザインする場合、このような突出は、相補性の決定に関して、ミスマッチとは見なさないものとする。例えば、２１ヌクレオチドの長さの１つのオリゴヌクレオチドと、２３ヌクレオチドの長さの別のオリゴヌクレオチドとを含むｄｓＲＮＡであって、長いほうのオリゴヌクレオチドが、短いほうのオリゴヌクレオチドと完全に相補的な２１ヌクレオチドの配列を含むｄｓＲＮＡもやはり、本発明の目的では、「完全に相補的」と称する場合がある。
【００４０】
本明細書で用いられる「相補的」配列はまた、非ワトソン−クリック型塩基対、ならびに／またはそれらがハイブリダイズする能力に関する上記の要件が満たされる限りにおいて、非天然ヌクレオチドおよび改変ヌクレオチドから形成される塩基対を包含する場合もあり、これらから完全に形成される場合もある。このような非ワトソン−クリック型塩基対には、Ｇ：Ｕのウォブル型塩基対合またはフーグスティーン型塩基対合が含まれるがこれらに限定されない。
【００４１】
本明細書における「相補的」、「完全に相補的」、および「実質的に相補的」という用語は、それらが用いられる文脈から理解される通り、ｄｓＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖との塩基マッチングに関して用いることもでき、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖と標的配列との塩基マッチングに関して用いることもできる。
【００４２】
本明細書で用いられる、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）のうちの「少なくとも一部と実質的に相補的な」ポリヌクレオチドとは、５’側の非翻訳領域（ＵＴＲ）、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、または３’側ＵＴＲを含め、連続する対象の（例えば、Ｅｇ５／ＫＳＰおよび／またはＶＥＧＦをコードする）ｍＲＮＡ部分と実質的に相補的であるポリヌクレオチドを指す。例えば、その配列が、Ｅｇ５をコードするｍＲＮＡの中断されていない部分と実質的に相補的である場合、ポリヌクレオチドは、Ｅｇ５  ｍＲＮＡの少なくとも一部と相補的である。
【００４３】
本明細書で用いられる「二本鎖ＲＮＡ」または「ｄｓＲＮＡ」とは、２つのアンチパラレルな核酸鎖であり、かつ、上記で定義した通り、実質的に相補的な核酸鎖を含む二重鎖構造物を指す。一般に、各鎖のヌクレオチドの大半はリボヌクレオチドであるが、本明細書で詳細に記載される通り、各鎖または両方の鎖はまた、少なくとも１つの非リボヌクレオチド、例えば、デオキシリボヌクレオチドおよび／または改変ヌクレオチドも包含し得る。加えて、本明細書で用いられる「ｄｓＲＮＡ」は、複数のヌクレオチドにおける実質的な改変を含め、かつ、本明細書で開示されるかまたは当技術分野で公知であるすべての種類の改変を含め、リボヌクレオチドに対する化学修飾を包含し得る。本明細書および特許請求の範囲の目的では、「ｄｓＲＮＡ」が、ｓｉＲＮＡ型の分子において用いられる任意のこのような改変を包含する。
【００４４】
二重鎖構造物を形成する２つの鎖は、１つのより大型のＲＮＡ分子の異なる部分の場合もあり、個別のＲＮＡ分子の場合もある。２つの鎖が、１つのより大型の分子の一部であり、したがって、二重鎖構造物を形成する１つの鎖の３’端と、それぞれの他の鎖の５’端とが、途切れないヌクレオチド鎖により連結されている場合、この連結するＲＮＡ鎖を、「ヘアピンループ」と称する。二重鎖構造物を形成する１つの鎖の３’端と、それぞれの他の鎖の５’端とが、途切れないヌクレオチド鎖以外の手段により共有結合されている場合、この連結構造物を、「リンカー」と称する。ＲＮＡ鎖が有するヌクレオチドの数は、同じ場合もあり、異なる場合もある。塩基対の最大数は、ｄｓＲＮＡの短いほうの鎖におけるヌクレオチド数から、二重鎖内に存在するあらゆる突出を差し引いた数である。二重鎖構造物に加えて、ｄｓＲＮＡは、１つ以上のヌクレオチド突出を含み得る。一般に、各鎖のヌクレオチドの大半はリボヌクレオチドであるが、本明細書で詳細に記載される通り、各鎖または両方の鎖はまた、少なくとも１つの非リボヌクレオチド、例えば、デオキシリボヌクレオチドおよび／または改変ヌクレオチドも包含し得る。加えて、本明細書で用いられる「ｄｓＲＮＡ」は、複数のヌクレオチドにおける実質的な改変を含め、かつ、本明細書で開示されるかまたは当技術分野で公知であるすべての種類の改変を含め、リボヌクレオチドに対する化学修飾を包含し得る。本明細書および特許請求の範囲の目的では、「ｄｓＲＮＡ」が、ｓｉＲＮＡ型の分子において用いられる任意のこのような改変を包含する。
【００４５】
本明細書で用いられる「ヌクレオチド突出」とは、ｄｓＲＮＡの一方の鎖の３’端が、他方の鎖の５’端を超えて伸長するか、またはこの逆の場合に、ｄｓＲＮＡの二重鎖構造物から突出する、対合しない１つ以上のヌクレオチドを指す。「平滑」または「平滑末端」とは、ｄｓＲＮＡのその末端では、対合しないヌクレオチドが存在しないこと、すなわち、ヌクレオチド突出が存在しないことを意味する。「平滑末端」のｄｓＲＮＡとは、その全長にわたり二本鎖であるｄｓＲＮＡ、すなわち、その分子のいずれの末端にもヌクレオチド突出が見られないｄｓＲＮＡである。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡが、二重鎖の一方の末端においてヌクレオチド突出を有し、他方の末端において平滑末端を有し得る。
【００４６】
「アンチセンス鎖」という用語は、標的配列と実質的に相補的な領域を包含するｄｓＲＮＡ鎖を指す。本明細書で用いられる「相補性領域」という用語は、配列、例えば、本明細書で定義される標的配列と実質的に相補的なアンチセンス鎖上の領域を指す。相補性領域が、標的配列と完全には相補的ではない場合、その分子の内部領域または末端領域には、ミスマッチが存在し得る。一般に、許容度が最も高いミスマッチは、末端領域、例えば、５’末端および／または３’末端から６、５、４、３、または２ヌクレオチド以内の領域に存在する。
【００４７】
本明細書で用いられる「センス鎖」という用語は、アンチセンス鎖領域と実質的に相補的な領域を包含するｄｓＲＮＡの鎖を指す。
【００４８】
ｄｓＲＮＡに言及する場合の「細胞内への導入」とは、当業者により理解される通り、細胞内への取込みまたは吸収を促進することを意味する。ｄｓＲＮＡの吸収または取込みは、補助を伴わない細胞による拡散過程または能動過程を介して生じる場合もあり、補助剤または補助デバイスにより生じる場合もある。この用語の意味は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける細胞に限定されない。ｄｓＲＮＡはまた、細胞が生きている生物の一部である「細胞内への導入」でもあり得る。このような場合、その細胞内への導入は、その生物への送達を包含する。例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける送達の場合、ｄｓＲＮＡは、組織部位内に注射することもでき、全身投与することもできる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける細胞内への導入は、電気穿孔およびリポフェクションなど、当技術分野で公知の方法を包含する。
【００４９】
それらが、Ｅｇ５遺伝子および／またはＶＥＧＦ遺伝子に言及する限りにおいて、本明細書における「〜をサイレンシングする」、ならびに「〜の発現を阻害する」、「〜の発現を下方制御する」、「〜の発現を抑制する」などの用語は、Ｅｇ５遺伝子の発現に対する少なくとも部分的な抑制であって、それは、Ｅｇ５遺伝子および／またはＶＥＧＦ遺伝子が転写されかつＥｇ５遺伝子および／またはＶＥＧＦ遺伝子の発現が阻害されるように処理されている、第１の細胞または細胞群から単離し得るＥｇ５  ｍＲＮＡおよび／またはＶＥＧＦ  ｍＲＮＡの量が、第１の細胞または細胞群と実質的に同一であるがそのように処理されてはいない第２の細胞または細胞群（対照細胞）と比較して、減少することにより明らかとなる抑制を指す。阻害度は通常、
【００５０】
【化１−１】
0006032724.tif 000011
との関係で表される。
【００５１】
代替的に、阻害度は、Ｅｇ５遺伝子および／またはＶＥＧＦ遺伝子の発現と機能的に関連するパラメーターの減少、例えば、細胞により生成されるＥｇ５遺伝子および／またはＶＥＧＦ遺伝子によりコードされるタンパク質の量の減少、または特定の表現型、例えば、アポトーシスを示す細胞の数との関係でも与えることができる。原則として、標的遺伝子のサイレンシングは、該標的を構成的に、または遺伝子操作により発現する任意の細胞内で決定することもできるが、任意の適切なアッセイにより決定することもできる。しかし、所与のｄｓＲＮＡが、Ｅｇ５遺伝子の発現を特定の程度阻害するかどうか、したがって、本発明に包含されるかどうかを決定するための基準が必要な場合は、以下の実施例で示されるアッセイが、このような基準として用いられるものとする。
【００５２】
例えば、場合によっては、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドを投与することにより、Ｅｇ５遺伝子（またはＶＥＧＦ遺伝子）の発現が、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％抑制される。一部の実施形態では、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドを投与することにより、Ｅｇ５遺伝子および／またはＶＥＧＦ遺伝子が、少なくとも約６０％、７０％、または８０％抑制される。他の実施形態では、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドを投与することにより、Ｅｇ５遺伝子および／またはＶＥＧＦ遺伝子が、少なくとも約８５％、９０％、または９５％抑制される。以下の表および実施例は、各種のＥｇ５  ｄｓＲＮＡ分子および／またはＶＥＧＦ  ｄｓＲＮＡ分子を様々な濃度で用いて発現を阻害した場合の値を示す。
【００５３】
本明細書のＥｇ５発現（またはＶＥＧＦ発現）の文脈で用いられる「治療する」、「治療」などの用語は、Ｅｇ５の発現および／またはＶＥＧＦの発現を介する病理学的過程の軽減または緩和を指す。本発明の文脈で、それが、本明細書の以下で列挙される他の状態（Ｅｇ５の発現および／またはＶＥＧＦの発現を介する病理学的過程以外の状態）のうちのいずれかに関する限りにおいて、「治療する」、「治療」などの用語は、このような状態と関連する少なくとも１つの症状を軽減もしくは緩和するか、または肝臓癌の進行を遅らせるなど、このような状態の進行を遅らせるかもしくは逆転させることを意味する。
【００５４】
本明細書で用いられる「治療有効量」および「予防有効量」という語句は、Ｅｇ５の発現および／もしくはＶＥＧＦの発現を介する病理学的過程、またはＥｇ５の発現および／もしくはＶＥＧＦの発現を介する病理学的過程の顕在的な症状を治療、予防、または管理するのに治療的利益をもたらす量を指す。具体的な治療有効量は、通常の医療従事者により容易に決定することが可能であり、例えば、Ｅｇ５の発現および／またはＶＥＧＦの発現を介する病理学的過程の種類、患者の病歴および年齢、Ｅｇ５の発現および／またはＶＥＧＦの発現を介する病理学的過程の病期、ならびにＥｇ５の発現および／またはＶＥＧＦの発現を介する病理学的過程に対する他の抗作用物質の投与など、当技術分野で公知の因子に依存して変化し得る。
【００５５】
本明細書で用いられる「薬学的組成物」は、薬理学的有効量のｄｓＲＮＡと、薬学的に許容されるキャリアとを含む。本明細書で用いられる「薬理学的有効量」、「治療有効量」、または単に「有効量」とは、意図される薬理学的結果、治療的結果、または予防的結果をもたらすのに有効なＲＮＡの量を指す。例えば、疾患または障害と関連する測定可能なパラメーターが少なくとも２５％低下すれば所与の臨床的治療が有効であると考えられる場合、その疾患または障害を治療するのに治療的に有効な薬物の量とは、そのパラメーターを少なくとも２５％低下させるのに必要な量である。
【００５６】
「薬学的に許容されるキャリア」という用語は、治療剤を投与するためのキャリアを指す。以下でより詳細に記載する通り、このようなキャリアには、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびこれら組合せが含まれるがこれらに限定されない。この用語は、細胞培地を特に除外する。経口投与薬の場合、薬学的に許容されるキャリアには、不活性の希釈剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、甘味剤、芳香剤、着色剤、および防腐剤などの薬学的に許容される賦形剤が含まれるがこれらに限定されない。適切な不活性の希釈剤には、炭酸ナトリウムおよび炭酸カルシウム、リン酸ナトリウムおよびリン酸カルシウム、ならびにラクトースが包含されるのに対し、コーンスターチおよびアルギニン酸が適切な崩壊剤である。結合剤には、デンプンおよびゼラチンが含まれ得るのに対し、存在する場合、滑沢剤は一般に、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、または滑石である。所望の場合は、錠剤を、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルなどの材料によりコーティングして、消化管内における吸収を遅らせることができる。
【００５７】
本明細書で用いられる「形質転換細胞」とは、そこからｄｓＲＮＡ分子が発現し得るベクターが導入された細胞である。
ＩＩ．二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）
本明細書でより詳細に記載される通り、本発明は、細胞または哺乳動物におけるＥｇ５遺伝子および／またはＶＥＧＦ遺伝子の発現を阻害する二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）分子であって、Ｅｇ５遺伝子および／またはＶＥＧＦ遺伝子が発現するときに形成されるｍＲＮＡの少なくとも一部と相補的な相補性領域を含むアンチセンス鎖を含み、該相補性領域が、３０ヌクレオチド未満の長さ、一般には１９〜２４ヌクレオチドの長さであり、前記Ｅｇ５遺伝子および／またはＶＥＧＦ遺伝子を発現する細胞と接触すると、前記Ｅｇ５遺伝子および／またはＶＥＧＦ遺伝子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子を提供する。本発明のｄｓＲＮＡは、１つ以上の一本鎖ヌクレオチド突出をさらに包含し得る。
【００５８】
ｄｓＲＮＡは、例えば、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ社、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社から市販されるなど、例えば、自動式のＤＮＡ合成器を用いることにより、以下でさらに論じられる通り、当技術分野で公知の標準的な方法により合成することができる。ｄｓＲＮＡは、ハイブリダイズして二重鎖構造物を形成するのに十分な程度に相補的な２つの鎖を含む。ｄｓＲＮＡの一方の鎖（アンチセンス鎖）は、Ｅｇ５遺伝子および／またはＶＥＧＦ遺伝子が発現するときに形成されるｍＲＮＡ配列に由来する標的配列と実質的に相補的であり、一般には完全に相補的な相補性領域を含み、他方の鎖（センス鎖）は、適切な条件下で混合すると、２つの鎖がハイブリダイズして二重鎖構造物を形成するように、アンチセンス鎖と相補的な領域を含む。一般に、二重鎖構造物は、１５〜３０、２５〜３０、または１８〜２５、または１９〜２４、または１９〜２１、または１９、２０、もしくは２１塩基対の長さである。一実施形態では、二重鎖が、１９塩基対の長さである。別の実施形態では、二重鎖が、２１塩基対の長さである。２つの異なるｓｉＲＮＡを組み合わせて用いる場合、二重鎖の長さは、同一の場合もあり、異なる場合もある。
【００５９】
本発明のｄｓＲＮＡの各鎖は一般に、１５〜３０、または１８〜２５、または１８、１９、２０、２１、２２、２３、もしくは２４ヌクレオチドの長さである。他の実施形態では、各鎖が、２５〜３０塩基対の長さである。二重鎖の各鎖は、同じ長さの場合もあり、異なる長さの場合もある。２つの異なるｓｉＲＮＡを組み合わせて用いる場合、各ｓｉＲＮＡの各鎖の長さは、同一の場合もあり、異なる場合もある。例えば、組成物は、２１ヌクレオチドのセンス鎖と、２１ヌクレオチドのアンチセンス鎖とを有する、Ｅｇ５を標的とするｄｓＲＮＡ、ならびに２１ヌクレオチドのセンス鎖と、２３ヌクレオチドのアンチセンス鎖とを有する、ＶＥＧＦを標的とする第２のｄｓＲＮＡを包含し得る。
【００６０】
本発明のｄｓＲＮＡは、１つ以上のヌクレオチドによる、１つ以上の一本鎖突出（複数可）を包含し得る。一実施形態では、ｄｓＲＮＡの少なくとも一方の末端が、１〜４、一般には１または２ヌクレオチドの一本鎖ヌクレオチド突出を有する。別の実施形態では、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖が、３’端および５’端の各々においてセンス鎖を超える１〜１０ヌクレオチドの突出を有する。さらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡのセンス鎖が、３’端および５’端の各々においてアンチセンス鎖を超える１〜１０ヌクレオチドの突出を有する。
【００６１】
少なくとも１ヌクレオチドの突出を有するｄｓＲＮＡは、平滑末端の対応物より予測外に優れた阻害特性を有し得る。一部の実施形態では、１ヌクレオチドの突出が存在するだけで、その全体的安定性を損なうことなく、ｄｓＲＮＡの干渉活性が強化される。１つの突出を有するだけで、ｄｓＲＮＡは、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ならびに各種の細胞、細胞培地、血液、および血清中において特に安定的かつ有効であることが分かっている。一般に、一本鎖突出は、アンチセンス鎖の３’末端、または代替的に、センス鎖の３’末端に位置する。ｄｓＲＮＡはまた、一般にアンチセンス鎖の５’端に位置する平滑末端も有し得る。このようなｄｓＲＮＡは、安定性および阻害活性が改善され、したがって、低用量、すなわち、１日当たり５ｍｇ／ｋｇ受容者体重未満での投与を可能とする。一般に、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、３’端においてヌクレオチド突出を有し、５’端が平滑末端である。別の実施形態では、突出内における１つ以上のヌクレオチドが、チオリン酸ヌクレオシドにより置換されている。
【００６２】
本明細書でより詳細に記載する通り、本発明の組成物は、Ｅｇ５を標的とする第１のｄｓＲＮＡと、ＶＥＧＦを標的とする第２のｄｓＲＮＡとを包含する。第１および第２のｄｓＲＮＡが、同じ突出構成、例えば、各鎖上において同じ数のヌクレオチド突出を有する場合もあり、各ｄｓＲＮＡが異なる構成（ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ）を有する場合もある。一実施形態では、Ｅｇ５を標的とする第１のｄｓＲＮＡが、各鎖の３’端において２ヌクレオチドの突出を包含し、ＶＥＧＦを標的とする第２のｄｓＲＮＡが、アンチセンス鎖の３’端における２ヌクレオチドの突出と、アンチセンス鎖の５’端（例えば、センス鎖の３’末端）における平滑末端とを包含する。
【００６３】
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡにより標的とされるＥｇ５遺伝子が、ヒトＥｇ５遺伝子である。一実施形態では、Ｅｇ５を標的とするｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖が、表１〜３のアンチセンス配列のうちの１つによる少なくとも１５の連続ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡの第１の配列が、表１〜３のセンス鎖のうちの１つから選択され、第２の配列が、表１〜３のアンチセンス配列からなる群から選択される。表１〜３に示される標的配列中のいずれかの位置を標的とする代替的なアンチセンス剤は、標的配列と、これを挟むＥｇ５配列とを用いて容易に決定することができる。一部の実施形態では、Ｅｇ５を標的とするｄｓＲＮＡは、表１〜３に示される配列群から選択される少なくとも２ヌクレオチドの配列を含む。２つの配列のうちの一方は、２つの配列のうちの他方と相補的であり、該配列の一方は、Ｅｇ５遺伝子が発現するときに生成されるｍＲＮＡ配列と実質的に相補的である。それ自体、ｄｓＲＮＡは、２つのオリゴヌクレオチドを含み、１つのオリゴヌクレオチドが、表１〜３のセンス鎖として説明され、第２のオリゴヌクレオチドが、表１〜３のアンチセンス鎖として説明される。
【００６４】
ＶＥＧＦを標的とする第２のｄｓＲＮＡを用いる実施形態では、このような薬剤が、実施例、表４ａおよび４ｂ、ならびに参照により本明細書に組み込まれる同時係属中の米国特許出願第１１／０７８，０７３号および同第１１／３４０，０８０号において例示されている。一実施形態では、ＶＥＧＦを標的とするｄｓＲＮＡが、表４ａにおいて説明されるＶＥＧＦ標的配列のうちの少なくとも１５の連続ヌクレオチドと相補的なアンチセンス鎖を有する。他の実施形態では、ＶＥＧＦを標的とするｄｓＲＮＡが、表４ｂのアンチセンス配列のうちの１つ、もしくは表４ｂのセンス配列のうちの１つを含むか、または表４ｂの二重鎖（センス鎖およびアンチセンス鎖）のうちの１つを含む。
【００６５】
２０〜２３塩基対の二重鎖構造物であるが、とりわけ２１塩基対の二重鎖構造物を含むｄｓＲＮＡが、ＲＮＡ干渉を誘導するのに特に有効であると認められていることを、当業者は十分に承知している（Elbashirら、EMBO、２００１、２０巻：６８７７〜６８８８頁）。しかし、より短いｄｓＲＮＡまたはより長いｄｓＲＮＡもまた有効であり得ることを、他の当業者が見出している。上記で説明される実施形態では、表１〜３に示されるオリゴヌクレオチド配列の性質により、本発明のｄｓＲＮＡが、最小で２１ヌクレオチドの長さの少なくとも１つの鎖を含み得る。表１〜３の配列のうちの１つから、一方または両方の末端において数ヌクレオチドだけを差し引いた配列を含む、より短いｄｓＲＮＡも、上記で説明したｄｓＲＮＡと比較して同様に有効であり得ることを予測することは理に適い得る。したがって、本発明では、表１〜３の配列のうちの１つに由来する少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０以上の連続ヌクレオチドによる部分的な配列を含み、かつ、本明細書の下記で説明するＦＡＣＳアッセイにおいてＥｇ５遺伝子の発現を阻害する能力が、完全な配列を含むｄｓＲＮＡによる阻害と５、１０、１５、２０、２５または３０％を超えては異ならないｄｓＲＮＡが意図される。表１〜３に示される標的配列内で切断するさらなるｄｓＲＮＡも、示されるＥｇ５配列および標的配列を用いて容易に作製することができる。ＶＥＧＦを標的とするさらなるｄｓＲＮＡも、表４ａおよび４ｂ、実施例、ならびに参照により本明細書に組み込まれる同時係属中の米国特許出願第１１／０７８，０７３号および同第１１／３４０，０８０号において開示される配列を用いる類似の材料（ｍａｔｔｅｒ）によりデザインすることができる。
【００６６】
加えて、表１〜３に示されるＲＮＡｉ剤は、Ｅｇ５  ｍＲＮＡ内における、ＲＮＡｉベースの切断を受けやすい部位も同定する。本発明はそれ自体、本発明の薬剤のうちの１つにより標的とされる配列内を標的とするＲＮＡｉ剤、例えば、ｄｓＲＮＡもさらに包含する。本明細書で用いられる第２のＲＮＡｉ剤は、それが、第１のＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖と相補的なｍＲＮＡ内のいずれかの位置においてメッセージを切断する場合、該第１のＲＮＡｉ剤の配列内を標的とするという。このような第２の薬剤は一般に、Ｅｇ５遺伝子において選択された配列と隣接する領域から選ばれたさらなるヌクレオチド配列に連結された、表１〜３に示される配列のうちの１つに由来する少なくとも１５の連続ヌクレオチドからなる。例えば、配列番号１の最後の１５ヌクレオチドを、標的であるＥｇ５遺伝子に由来する次の６ヌクレオチドと組み合わせることにより、表１〜３に示される配列のうちの１つに基づく２１ヌクレオチドの一本鎖剤がもたらされる。ＶＥＧＦを標的とするさらなるＲＮＡｉ剤、例えば、ｄｓＲＮＡも、表４ａおよび４ｂ、実施例、ならびに参照により本明細書に組み込まれる同時係属中の米国特許出願第１１／０７８，０７３号および同第１１／３４０，０８０号において開示される配列を用いる類似の材料によりデザインすることができる。
【００６７】
本発明のｄｓＲＮＡは、標的配列との１つ以上のミスマッチを含有し得る。好ましい実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡが、３を超えないミスマッチを含有する。ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖が、標的配列とのミスマッチを含有する場合、ミスマッチの領域は、相補性領域の中央に位置しないことが好ましい。ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖が、標的配列とのミスマッチを含有する場合、該ミスマッチは、いずれかの末端からの５ヌクレオチド、例えば、相補性領域の５’端または３’端からの５、４、３、２、または１ヌクレオチドに限定されることが好ましい。例えば、Ｅｇ５遺伝子の領域と相補的な２３ヌクレオチドのｄｓＲＮＡ鎖の場合、該ｄｓＲＮＡは一般に、中央の１３ヌクレオチドの範囲内ではミスマッチを含有しない。本発明で記載される方法を用いて、標的配列とのミスマッチを含有するｄｓＲＮＡが、Ｅｇ５遺伝子の発現を阻害するのに有効であるかどうかを判定することができる。とりわけ、Ｅｇ５遺伝子における特定の相補性領域が、集団内において、多形の配列変異を有することが公知である場合は、ミスマッチを有するｄｓＲＮＡが、Ｅｇ５遺伝子の発現を阻害するのに有効であるかどうかを考慮することが重要である。
改変
さらに別の実施形態では、ｄｓＲＮＡを化学修飾して安定性を増強する。本発明の核酸は、参照により本明細書に組み込まれる、「Current protocols in nucleic acid chemistry」、Beaucage, S.L.ら（編）、JohnWiley & Sons, Inc.、New York、NY、USAにおいて記載される方法など、当技術分野において十分に確立した方法により合成および／または改変することができる。本発明において有用な、好ましいｄｓＲＮＡ化合物の具体例には、改変骨格または非天然のヌクレオシド間結合を含有するｄｓＲＮＡが含まれる。本明細書で定義される通り、改変骨格を有するｄｓＲＮＡは、該骨格内にリン原子を保持するｄｓＲＮＡと、該骨格内にリン原子を有さないｄｓＲＮＡとを包含する。本明細書の目的において、また、当技術分野で場合によって言及される通り、それらのヌクレオシド間骨格においてリン原子を有さない改変ｄｓＲＮＡもまた、オリゴヌクレオシドと考えることができる。
【００６８】
好ましい改変ｄｓＲＮＡ骨格には、例えば、ホスホロチオエート；キラルホスホロチオエート；ホスホロジチオエート；ホスホトリエステル；アミノアルキルホスホトリエステル；３’−アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含めた、メチルホスホネートならびに他のアルキルホスホネート；ホスフィネート；３’−アミノホスホルアミデートおよびアミノアルキルホスホルアミデートを含めたホスホルアミデート；チオノホスホルアミデート；チオノアルキルホスホネート；チオノアルキルホスホトリエステル；ならびに通常の３’−５’結合を有するボラノホスホネート；これらの２’−５’結合類似体；ならびに隣接するヌクレオシド単位の対が、３’−５’が５’−３’に連結されるか、または２’−５’が５’−２’に連結される、逆極性のボラノホスホネートが含まれる。各種の塩、混合塩、および遊離酸形態もまた含まれる。
【００６９】
上記のリン含有結合物の調製について教示する代表的な米国特許には、それらの各々が、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第３，６８７，８０８号；同第４，４６９，８６３号；同第４，４７６，３０１号；同第５，０２３，２４３号；同第５，１７７，１９５号；同第５，１８８，８９７号；同第５，２６４，４２３号；同第５，２７６，０１９号；同第５，２７８，３０２号；同第５，２８６，７１７号；同第５，３２１，１３１号；同第５，３９９，６７６号；同第５，４０５，９３９号；同第５，４５３，４９６号；同第５，４５５，２３３号；同第５，４６６，６７７号；同第５，４７６，９２５号；同第５，５１９，１２６号；同第５，５３６，８２１号；同第５，５４１，３１６号；同第５，５５０，１１１号；同第５，５６３，２５３号；同第５，５７１，７９９号；同第５，５８７，３６１号；および同第５，６２５，０５０号が含まれるがこれらに限定されない。
【００７０】
その中にリン原子を包含しない、好ましい改変ｄｓＲＮＡ骨格は、短鎖のアルキルもしくはシクロアルキルによるヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキルによるヌクレオシド間結合、または１以上の短鎖のヘテロ原子もしくはヘテロ環によるヌクレオシド間結合により形成される骨格を有する。これらには、モルホリノ結合（部分的には、ヌクレオシドの糖部分から形成される）を有する骨格；シロキサン骨格；スルフィド骨格、スルホキシド骨格、およびスルホン骨格；ホルムアセチル骨格およびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチル骨格およびチオホルムアセチル骨格；アルケンを含有する骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノ骨格およびメチレンヒドラジノ骨格；スルホネート骨格およびスルホンアミド骨格；アミド骨格；ならびにＮ、Ｏ、Ｓ、およびＣＨ２の構成要素部分を混合した他の骨格が含まれる。
【００７１】
上記のオリゴヌクレオシドの調製について教示する代表的な米国特許には、それらの各々が、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，０３４，５０６号；同第５，１６６，３１５号；同第５，１８５，４４４号；同第５，２１４，１３４号；同第５，２１６，１４１号；同第５，２３５，０３３号；同第５，６４，５６２号；同第５，２６４，５６４号；同第５，４０５，９３８号；同第５，４３４，２５７号；同第５，４６６，６７７号；同第５，４７０，９６７号；同第５，４８９，６７７号；同第５，５４１，３０７号；同第５，５６１，２２５号；同第５，５９６，０８６号；同第５，６０２，２４０号；同第５，６０８，０４６号；同第５，６１０，２８９号；同第５，６１８，７０４号；同第５，６２３，０７０号；同第５，６６３，３１２号；同第５，６３３，３６０号；同第５，６７７，４３７号；および同第５，６７７，４３９号が含まれるがこれらに限定されない。
【００７２】
他の好ましいｄｓＲＮＡ模倣体では、ヌクレオチド単位の糖およびヌクレオシド間結合の両方、すなわち骨格が、新規の基により置換される。塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションが維持される。このようなオリゴマー化合物の１つであり、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているｄｓＲＮＡ模倣体を、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と称する。ＰＮＡ化合物ではｄｓＲＮＡの糖骨格が、アミドを含有する骨格、特に、アミノエチルグリシン骨格により置換される。これらの核酸塩基は保持され、該骨格のアミド部分のアザ窒素原子へと直接的または間接的に結合される。ＰＮＡ化合物の調製について教示する代表的な米国特許には、それらの各々が、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，５３９，０８２号；同第５，７１４，３３１号；および同第５，７１９，２６２号が含まれるがこれらに限定されない。ＰＮＡ化合物についてのさらなる教示は、Nielsenら、Science、１９９１年、２５４巻、１４９７〜１５００頁において見出すことができる。
【００７３】
本発明の最も好ましい実施形態は、ホスホロチオエート骨格を有するｄｓＲＮＡ、ならびにヘテロ原子骨格を有するオリゴヌクレオシドであり、特に、上記で言及した米国特許第５，４８９，６７７号の−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−［メチレン（メチルイミノ）骨格またはＭＭＩ骨格として公知である］、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、および−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−［ここで、天然のホスホジエステル骨格を、−Ｏ−Ｐ−Ｏ−ＣＨ２−として表す］；ならびに上記で言及した米国特許第５，６０２，２４０号のアミド骨格を有するものである。また、上記で参照した米国特許第５，０３４，５０６号によるモルホリノ骨格構造物を有するｄｓＲＮＡも好ましい。
【００７４】
改変ｄｓＲＮＡはまた、１つ以上の置換糖部分も含有し得る。好ましいｄｓＲＮＡは、２’位において、以下：ＯＨ；Ｆ；Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、もしくはＮ−アルキル；Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、もしくはＮ−アルケニル；Ｏ−アルキニル、Ｓ−アルキニル、もしくはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキルのうちの１つを含む［式中、アルキル、アルケニル、およびアルキニルは、置換または非置換のＣ１〜Ｃ１０アルキルまたはＣ２〜Ｃ１０アルケニルおよびＣ２〜Ｃ１０アルキニルであり得る］。特に、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２［式中、ｎおよびｍは、１〜約１０である］が好ましい。他の好ましいｄｓＲＮＡは、２’位において、以下：Ｃ１〜Ｃ１０の低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリール、アラルキル、Ｏ−アルカリールまたはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、挿入剤、ｄｓＲＮＡの薬物動態特性を改善する基、またはｄｓＲＮＡの薬力学特性を改善する基、ならびに同様の特性を有する他の置換基のうちの１つを含む。好ましい改変には、２’−メトキシエトキシ（また、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）または２’−ＭＯＥとしても公知の２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３）（Martinら、Helv. Chim. Acta、１９９５年、７８巻、４８６〜５０４頁）、すなわち、アルコキシ−アルコキシ基が含まれる。さらに好ましい改変には、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、本明細書下記の実施例で説明される、また、２’−ＤＭＡＯＥとしても公知のＯ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基、ならびに２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（当技術分野ではまた、２’−Ｏ−ジメチルアミノエトキシエチルまたは２’−ＤＭＡＥＯＥとしても公知である）、すなわち、また、本明細書下記の実施例でも説明される２’−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ２）２も含まれる。
【００７５】
他の好ましい改変には、２’−メトキシ（２’−ＯＣＨ３）、２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、および２’−フルオロ（２’−Ｆ）が含まれる。類似の改変はまた、ｄｓＲＮＡ上の他の位置、特に、３’末端ヌクレオチド上における糖の３’位、または２’−５’連結されたｄｓＲＮＡ内、および５’末端ヌクレオチドの５’位においても作製することができる。ｄｓＲＮＡはまた、ペントフラノシル糖に代わるシクロブチル部分などの糖模倣体も有し得る。このような改変糖構造物の調製について教示する代表的な米国特許には、それらの一部が本出願により共同所有され、かつ、それらの各々が参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第４，９８１，９５７号；同第５，１１８，８００号；同第５，３１９，０８０号；同第５，３５９，０４４号；同第５，３９３，８７８号；同第５，４４６，１３７号；同第５，４６６，７８６号；同第５，５１４，７８５号；同第５，５１９，１３４号；同第５，５６７，８１１号；同第５，５７６，４２７号；同第５，５９１，７２２号；同第５，５９７，９０９号；同第５，６１０，３００号；同第５，６２７，０５３号；同第５，６３９，８７３号；同第５，６４６，２６５号；同第５，６５８，８７３号；同第５，６７０，６３３号；および同第５，７００，９２０号が含まれるがこれらに限定されない。
【００７６】
ｄｓＲＮＡはまた、核酸塩基（当技術分野では、単に、「塩基」として言及されることが多い）の改変または置換も包含し得る。本明細書で用いられる「非改変」核酸塩基または「天然」核酸塩基には、プリン塩基であるアデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基であるチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ）が含まれる。改変核酸塩基には、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）；５−ヒドロキシメチルシトシン；キサンチン；ヒポキサンチン；２−アミノアデニン；アデニンおよびグアニンの６−メチル誘導体ならびに他のアルキル誘導体；アデニンおよびグアニンの２−プロピルならびに他のアルキル誘導体；２−チオウラシル；２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよび５−ハロシトシン；５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシン；６−アゾウラシル、６−アゾシトシン、および６−アゾチミン；５−ウラシル（シュードウラシル）；４−チオウラシル；８−ハロアデニンおよび８−ハログアニン、８−アミノアデニンおよび８−アミノグアニン、８−チオールアデニンおよび８−チオールグアニン、８−チオアルキルアデニンおよび８−チオアルキルグアニン、８−ヒドロキシルアデニンおよび８−ヒドロキシルグアニン、ならびに他の８−置換アデニンおよび８−置換グアニン；５−ハロウラシルおよび５−ハロシトシン、特に、５−ブロモウラシルおよび５−ブロモシトシン、５−トリフルオロメチルウラシルおよび５−トリフルオロメチルシトシン、ならびに他の５−置換ウラシルおよび５−置換シトシン；７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニン、ならびに３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンなど、他の合成核酸塩基および天然核酸塩基も含まれる。さらなる核酸塩基には、米国特許第３，６８７，８０８号において開示される核酸塩基、「The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering」、８５８〜８５９頁、Kroschwitz,J. L編、John Wiley & Sons、１９９０年において開示される核酸塩基、Englischら、「Angewandte Chemie」、InternationalEdition、１９９１年、３０巻、６１３頁により開示される核酸塩基、ならびにSanghvi, Y S.、１５章、「DsRNA Research andApplications」、２８９〜３０２頁、Crooke, S. T.およびLebleu, B.編、CRC Press、１９９３年により開示される核酸塩基も含まれる。これらの核酸塩基のうちの一部は、本発明のオリゴマー化合物の結合アフィニティーを増大させるのに特に有用である。これらには、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、ならびに２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル、および５−プロピニルシトシンを含めた、Ｎ−２置換プリン、Ｎ−６置換プリン、およびＯ−６置換プリンが含まれる。５−メチルシトシン置換は、核酸二重鎖の安定性を０．６〜１．２℃増大させることが示されており（Sanghvi,Y. S.、Crooke, S. T.、およびLebleu, B.編、「DsRNA Research and Applications」、CRC Press、BocaRaton、１９９３年、２７６〜２７８頁）、現在のところ好ましい塩基置換であり、特に、２’−Ｏ−メトキシエチル糖改変と組み合わせた場合、なおより好ましい。
【００７７】
上記で言及した改変核酸塩基、ならびに他の改変核酸塩基のうちの一部の調製について教示する代表的な米国特許には、上記で言及した米国特許第３，６８７，８０８号ならびに、それらの各々が、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第４，８４５，２０５号；同第５，１３０，３０号；同第５，１３４，０６６号；同第５，１７５，２７３号；同第５，３６７，０６６号；同第５，４３２，２７２号；同第５，４５７，１８７号；同第５，４５９，２５５号；同第５，４８４，９０８号；同第５，５０２，１７７号；同第５，５２５，７１１号；同第５，５５２，５４０号；同第５，５８７，４６９号；同第５，５９４，１２１号；同第５，５９６，０９１号；同第５，６１４，６１７号；および同第５，６８１，９４１号、ならびにまた、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，７５０，６９２号も含まれるがこれらに限定されない。
コンジュゲート
本発明のｄｓＲＮＡに対する別の改変は、ｄｓＲＮＡの活性、細胞における分布、または細胞への取込みを増強する１つ以上の部分またはコンジュゲートを、該ｄｓＲＮＡに化学結合させることを伴う。このような部分には、コレステロール部分（Letsingerら、Proc. Natl. Acid. Sci. USA、１９９巻、８６号、６５５３〜６５５６頁）、コール酸（Manoharanら、Biorg.Med. Chem. Let.、１９９４年、４巻、１０５３〜１０６０頁）、チオエーテル、例えば、ベリル−Ｓ−トリチルチオール（Manoharanら、Ann.N.Y. Acad. Sci.、１９９２年、６６０巻、３０６〜３０９頁; Manoharanら、Biorg. Med. Chem. Let.、１９９３年、３巻、２７６５〜２７７０頁）、チオコレステロール（Oberhauserら、Nucl.Acids Res.、１９９２年、２０巻、５３３〜５３８頁）、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオール残基もしくはウンデシル残基（Saison-Behmoarasら、EMBOJ、１９９１年、１０巻、１１１１〜１１１８頁; Kabanovら、FEBS Lett.、１９９０年、２５９巻、３２７〜３３０頁; Svinarchukら、Biochimie、１９９３年、７５巻、４９〜５４頁）、リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールもしくはトリエチル−アンモニウム−１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート（Manoharanら、TetrahedronLett.、１９９５年、３６巻、３６５１〜３６５４頁; Sheaら、Nucl. Acids Res.、１９９０年、１８巻、３７７７〜３７８３頁）、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖（Manoharanら、Nucleosides& Nucleotides、１９９５年、１４巻、９６９〜９７３頁）、またはアダマンタン酢酸（Manoharanら、Tetrahedron Lett.、１９９５年、３６巻、３６５１〜３６５４頁）、パルミチル部分（Mishraら、Biochim.Biophys. Acta、１９９５年、１２６４巻、２２９〜２３７頁）、またはオクタデシルアミン部分もしくはヘキシルアミノ−カルボニルオキシコレステロール部分（Crookeら、J.Pharmacol. Exp. Ther.、１９９６年、２７７巻、９２３〜９３７頁）などの脂質部分が含まれるがこれらに限定されない。
【００７８】
このようなｄｓＲＮＡコンジュゲートの調製について教示する代表的な米国特許には、それらの各々が、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第４，８２８，９７９号；同第４，９４８，８８２号；同第５，２１８，１０５号；同第５，５２５，４６５号；同第５，５４１，３１３号；同第５，５４５，７３０号；同第５，５５２，５３８号；同第５，５７８，７１７号；同第５，５８０，７３１号；同第５，５９１，５８４号；同第５，１０９，１２４号；同第５，１１８，８０２号；同第５，１３８，０４５号；同第５，４１４，０７７号；同第５，４８６，６０３号；同第５，５１２，４３９号；同第５，５７８，７１８号；同第５，６０８，０４６号；同第４，５８７，０４４号；同第４，６０５，７３５号；同第４，６６７，０２５号；同第４，７６２，７７９号；同第４，７８９，７３７号；同第４，８２４，９４１号；同第４，８３５，２６３号；同第４，８７６，３３５号；同第４，９０４，５８２号；同第４，９５８，０１３号；同第５，０８２，８３０号；同第５，１１２，９６３号；同第５，２１４，１３６号；同第５，０８２，８３０号；同第５，１１２，９６３号；同第５，２１４，１３６号；同第５，２４５，０２２号；同第５，２５４，４６９号；同第５，２５８，５０６号；同第５，２６２，５３６号；同第５，２７２，２５０号；同第５，２９２，８７３号；同第５，３１７，０９８号；同第５，３７１，２４１号；同第５，３９１，７２３号；同第５，４１６，２０３号；同第５，４５１，４６３号；同第５，５１０，４７５号；同第５，５１２，６６７号；同第５，５１４，７８５号；同第５，５６５，５５２号；同第５，５６７，８１０号；同第５，５７４，１４２号；同第５，５８５，４８１号；同第５，５８７，３７１号；同第５，５９５，７２６号；同第５，５９７，６９６号；同第５，５９９，９２３号；同第５，５９９，９２８号；および同第５，６８８，９４１号が含まれるがこれらに限定されない。
【００７９】
所与の化合物におけるすべての位置が一様に改変されることは必要でなく、実際、上述の改変のうちの複数を、単一の化合物に組み込むこともでき、さらに、ｄｓＲＮＡ内の単一のヌクレオシドに組み込むこともできる。本発明はまた、キメラ化合物であるｄｓＲＮＡ化合物も包含する。本発明の文脈における「キメラ」ｄｓＲＮＡ化合物または「キメラ体」は、ｄｓＲＮＡ化合物、特に、各々が、少なくとも１つの単量体単位、すなわち、ｄｓＲＮＡ化合物の場合にはヌクレオチドからなる、２つ以上の化学的に異なる領域を含有するｄｓＲＮＡである。これらのｄｓＲＮＡは、ヌクレアーゼによる分解に対する耐性の増大、細胞への取込みの増大、および／または標的核酸に対する結合アフィニティーの増大を付与するように改変される少なくとも１つの領域を含有することが典型的である。ｄｓＲＮＡのさらなる領域は、ＲＮＡ:ＤＮＡハイブリッド体またはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッド体を切断することが可能な酵素に対する基質として用いることができる。例として述べると、ＲＮアーゼＨは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖のうちのＲＮＡ鎖を切断する細胞エンドヌクレアーゼである。したがって、ＲＮアーゼＨを活性化すると、結果としてＲＮＡ標的が切断され、これにより、ｄｓＲＮＡが遺伝子発現を阻害する有効性が大幅に増強される。その結果、キメラｄｓＲＮＡを用いる場合、同じ標的領域にハイブリダイズするホスホロチオエートデオキシｄｓＲＮＡと比較して、しばしば、より短いｄｓＲＮＡにより同等の結果を得ることができる。ＲＮＡ標的の切断は、ゲル電気泳動、ならびに、必要な場合は、当技術分野で公知の関連する核酸ハイブリダイゼーション法により日常的に検出することができる。
【００８０】
特定の場合には、ｄｓＲＮＡを、非リガンド基により改変することができる。ｄｓＲＮＡの活性、細胞における分布、または細胞への取込みを増強する目的で、多数の非リガンド分子がｄｓＲＮＡにコンジュゲートされており、このようなコンジュゲート形成を実施する手順は、科学文献において利用可能である。このような非リガンド部分には、コレステロール部分（Letsingerら、Proc. Natl. Acid. Sci. USA、１９８９年、８６号、６５５３頁）、コール酸（Manoharanら、Bioorg.Med. Chem. Lett.、１９９４年、４巻、１０５３頁）、チオエーテル、例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール（Manoharanら、Ann.N.Y. Acad. Sci.、１９９２年、６６０巻、３０６頁; Manoharanら、Bioorg. Med. Chem. Let.、１９９３年、３巻、２７６５頁）、チオコレステロール（Oberhauserら、Nucl.Acids Res.、１９９２年、２０巻、５３３頁）、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオール残基もしくはウンデシル残基（Saison-Behmoarasら、EMBOJ、１９９１年、１０巻、１１１頁; Kabanovら、FEBS Lett.、１９９０年、２５９巻、３２７頁; Svinarchukら、Biochimie、１９９３年、７５巻、４９頁）、リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールもしくはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート（Manoharanら、TetrahedronLett.、１９９５年、３６巻、３６５１頁; Sheaら、Nucl. Acids Res.、１９９０年、１８巻、３７７７頁）、ポリアミン鎖もしくはポリエチレングリコール鎖（Manoharanら、Nucleosides& Nucleotides、１９９５年、１４巻、９６９頁）、またはアダマンタン酢酸（Manoharanら、Tetrahedron Lett.、１９９５年、３６巻、３６５１頁）、パルミチル部分（Mishraら、Biochim.Biophys. Acta、１９９５年、１２６４巻、２２９頁）、またはオクタデシルアミン部分もしくはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分（Crookeら、J.Pharmacol. Exp. Ther.、１９９６年、２７７巻、９２３頁）などの脂質部分が含まれている。このようなｄｓＲＮＡコンジュゲートの調製について教示する代表的な米国特許は、上記に列挙されている。典型的なコンジュゲート形成プロトコールは、配列の１つ以上の位置においてアミノリンカーを保有するｄｓＲＮＡの合成を伴う。次いで、適切な連結試薬または活性化試薬を用いて、アミノ基を、コンジュゲートされる分子と反応させる。コンジュゲート形成反応は、なおも固体の支持体に結合するｄｓＲＮＡにより、または溶液相中においてｄｓＲＮＡを切断させた後で実施することができる。ＨＰＬＣによるｄｓＲＮＡコンジュゲートの精製は、純粋なコンジュゲートをもたらすことが典型的である。
【００８１】
場合によって、リガンドが多官能性のこともあり、かつ／またはｄｓＲＮＡが複数のリガンドにコンジュゲートされることもある。例えば、ｄｓＲＮＡを、１つのリガンドにコンジュゲートして取込みを改善し、第２のリガンドにコンジュゲートして放出を改善することができる。
ベクターによりコードされるｓｉＲＮＡ剤
本発明の別の態様では、転写単位から発現するＥｇ５特異的ｄｓＲＮＡ分子およびＶＥＧＦ特異的ｄｓＲＮＡ分子を、ＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクター内へと挿入することができる（例えば、Couture, Aら、TIG.（１９９６年）、１２巻：５〜１０頁; Skillern, A.ら、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ００／２２１１３号;Conrad、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ００／２２１１４号；およびConrad、米国特許第６，０５４，２９９号を参照されたい）。これらのトランス遺伝子を、宿主ゲノム内へと統合されるトランス遺伝子として組み込まれ、かつ、遺伝することが可能な、直鎖状構築物、環状プラスミド、またはウイルスベクターとして導入することができる。トランス遺伝子はまた、それが、染色体外プラスミドとして遺伝することを可能とするように構築することもできる（Gassmannら、Proc.Natl. Acad. Sci. USA（１９９５年）、９２巻：１２９２頁）。
【００８２】
ｄｓＲＮＡの個々の鎖は、２つの個別の発現ベクターにおけるプロモーターにより転写され、標的細胞内へと共トランスフェクトされ得る。代替的に、ｄｓＲＮＡの各個別の鎖は、それらのいずれもが同じ発現プラスミド上に位置するプロモーターによって転写される場合もある。好ましい実施形態では、それがステムおよびループ構造を有するように、リンカーポリヌクレオチド配列によって連結した反転反復配列としてｄｓＲＮＡが発現される。
【００８３】
組換えｄｓＲＮＡ発現ベクターは一般に、ＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターである。ｄｓＲＮＡを発現するウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（総説については、Muzyczkaら、Curr. Topics Micro. Immunol.（１９９２年）、１５８巻：９７〜１２９頁を参照されたい）；アデノウイルス（例えば、Berknerら、BioTechniques（１９９８年）、６巻：６１６頁）；Rosenfeldら（１９９１年、Science、２５２巻：４３１〜４３４頁）；およびRosenfeldら（１９９２年）、Cell、６８巻：１４３〜１５５頁を参照されたい；またはアルファウイルスの他、当技術分野で公知の他のウイルスに基づいて構築し得るがこれらに限定されない。ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、上皮細胞を含め、多くの異なる細胞型内へと各種の遺伝子を導入するには、レトロウイルスが用いられている（例えば、Eglitisら、Science（１９８５年）、２３０巻：１３９５〜１３９８頁;DanosおよびMulligan、Proc. NatI. Acad. Sci. USA（１９９８年）、８５巻：６４６０〜６４６４頁; Wilsonら、１９８８年、Proc.Natl. Acad. Sci. USA、８５巻：３０１４〜３０１８頁; Armentanoら、１９９０年、Proc. Natl. Acad. Sci.USA、８７巻：６１４１〜６１４５頁; Huberら、１９９１年、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、８８巻：８０３９〜８０４３頁;Ferryら、１９９１年、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、８８巻：８３７７〜８３８１頁; Chowdhuryら、１９９１、Science、２５４巻：１８０２〜１８０５頁;van Beusechemら、１９９２年、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、８９巻：７６４０〜１９頁; Kayら、１９９２年、HumanGene Therapy、３巻：６４１〜６４７頁; Daiら、１９９２年、Proc. Natl.Acad. Sci. USA、８９巻：１０８９２〜１０８９５頁;Hwuら、１９９３年、J. Immunol.、１５０巻：４１０４〜４１１５頁；米国特許第４，８６８，１１６号；米国特許第４，９８０，２８６号；ＰＣＴ出願第ＷＯ８９／０７１３６号；ＰＣＴ出願第ＷＯ８９／０２４６８号；ＰＣＴ出願第ＷＯ８９／０５３４５号；およびＰＣＴ出願第ＷＯ９２／０７５７３号を参照されたい）。細胞のゲノム内へと挿入される遺伝子を形質導入および発現させることが可能な組換えレトロウイルスベクターは、組換えレトロウイルスゲノムを、ＰＡ３１７およびＰｓｉ−ＣＲＩＰなどの適切な封入細胞系内へとトランスフェクトすることにより作製することができる（Cometteら、１９９１年、HumanGene Therapy、２巻：５〜１０頁; Coneら、１９８４年、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、８１巻：６３４９頁）。感受性の宿主（例えば、ラット、ハムスター、イヌ、およびチンパンジー）における多種多様な細胞および組織に感染させるには、組換えアデノウイルスベクターを用いることができ（Hsuら、１９９２年、J.Infectious Disease、１６６巻：７６９頁）、これらはまた、感染させるのに、有糸分裂が活性である細胞を必要としない利点も有する。
【００８４】
例えば、アデノウイルス（ＡＶ）；アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）；レトロウイルス（例えば、レンチウイルス（ＬＶ）、ラブドウイルス、マウス白血病ウイルス）；ヘルペスウイルスなどに由来するベクターなど、発現させるｄｓＲＮＡ分子（複数可）をコードする配列を受容することが可能な任意のウイルスベクターを用いることができる。ウイルスベクターの指向性は、適宜、他のウイルスに由来するエンベロープタンパク質または他の表面抗原によりベクターを偽型化する（ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｉｎｇ）ことにより改変することもでき、異なるウイルスカプシドタンパク質に置換することにより改変することもできる。
【００８５】
例えば、本発明のレンチウイルスベクターは、水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、狂犬病ウイルス、エボラウイルス、モコラウイルスなどに由来する表面タンパク質により偽型化することができる。本発明のＡＡＶベクターは、それを異なるカプシドタンパク質の血清型を発現するように操作することにより、異なる細胞を標的とするように作製することができる。例えば、血清型２ゲノムにおいて血清型２カプシドを発現するＡＡＶベクターを、ＡＡＶ  ２／２と称する。ＡＡＶ  ２／２ベクターにおけるこの血清型２カプシド遺伝子を、血清型５カプシド遺伝子で置換することにより、ＡＡＶ  ２／５ベクターを作製することができる。異なる血清型のカプシドタンパク質を発現するＡＡＶベクターを構築する技法は、当技術分野の範囲内にある：例えば、その全体的な開示が、参照により本明細書に組み込まれる、Rabinowitz J Eら（２００２年）、J Virol ７６巻：７９１〜８０１頁を参照されたい。
【００８６】
本発明において用いるのに適する組換えウイルスベクター、ｄｓＲＮＡを発現する核酸配列を該ベクター内へと挿入する方法、ならびに該ウイルスベクターを対象の細胞へと送達する方法の選択は、当技術分野の範囲内にある。例えば、それらの全体的な開示が、参照により本明細書に組み込まれる、Dornburg R（１９９５年）、Gene Therap.、２巻：３０１〜３１０頁; Eglitis M A（１９８８年）、Biotechniques、６巻：６０８〜６１４頁;Miller A D（１９９０年）、Hum Gene Therap.、１巻：５〜１４頁; Anderson W F（１９９８年）、Nature、３９２巻：２５〜３０頁；およびRubinsonD Aら、Nat. Genet.、３３巻：４０１〜４０６頁を参照されたい。
【００８７】
好ましいウイルスベクターは、ＡＶおよびＡＡＶに由来するベクターである。特に好ましい実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡを、例えば、Ｕ６  ＲＮＡプロモーターもしくはＨ１  ＲＮＡプロモーター、またはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを有する組換えＡＡＶベクターに由来する、２つの個別の相補的な一本鎖ＲＮＡ分子として発現させる。
【００８８】
本発明のｄｓＲＮＡを発現させるのに適するＡＶベクター、該組換えＡＶベクターを構築する方法、ならびに該ベクターを標的細胞内へと送達する方法は、Xia Hら（２００２年）、Nat. Biotech.、２０巻：１００６〜１０１０頁において記載されている。
【００８９】
本発明のｄｓＲＮＡを発現させるのに適するＡＡＶベクター、該組換えＡＶベクターを構築する方法、ならびに該ベクターを標的細胞内へと送達する方法は、それらの全体的な開示が参照により本明細書に組み込まれる、Samulski Rら（１９８７年）、J. Virol.、６１巻：３０９６〜３１０１頁; Fisher K Jら（１９９６年）、J.Virol、７０巻：５２０〜５３２頁; Samulski Rら（１９８９年）、J. Virol.、６３巻：３８２２〜３８２６頁；米国特許第５，２５２，４７９号；米国特許第５，１３９，９４１号；国際特許出願第ＷＯ９４／１３７８８号；および国際特許出願第ＷＯ９３／２４６４１号において記載されている。
【００９０】
本発明のＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターにおいてｄｓＲＮＡの発現を駆動するプロモーターは、真核生物のＲＮＡポリメラーゼＩ（例えば、リボソームＲＮＡプロモーター）、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（例えば、ＣＭＶ初期プロモーター、またはアクチンプロモーター、またはＵ１  ｓｎＲＮＡプロモーター）、または一般的に、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター（例えば、Ｕ６  ｓｎＲＮＡプロモーター、または７ＳＫ  ＲＮＡプロモーター）でもありえ、原核生物プロモーター、例えば、発現プラスミドがまた、Ｔ７プロモーターからの転写に必要とされるＴ７  ＲＮＡポリメラーゼもコードすると仮定した場合におけるＴ７プロモーターでもありえる。プロモーターはまた、トランス遺伝子の発現を、膵臓へと方向づけることも可能である（例えば、膵臓のインスリン制御配列（Bucchiniら、１９８６年、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、８３巻：２５１１〜２５１５頁）を参照されたい）。
【００９１】
加えて、トランス遺伝子の発現は、例えば、特定の生理学的制御因子、例えば、循環グルコースレベル、またはホルモンに対して感受性である制御配列など、誘導性の制御配列および発現系を用いることにより、正確に制御することもできる（Dochertyら、１９９４年、FASEB J.、８巻：２０〜２４頁）。細胞または哺乳動物におけるトランス遺伝子の発現を制御するのに適するこのような誘導性発現系には、エクジソンによる制御、エストロゲン、プロゲステロン、テトラサイクリン、二量体化の化学的誘導剤、ならびにイソプロピル−ベータ−Ｄ１−チオガラクトピラノシド（ＥＰＴＧ）による制御が含まれる。当業者であれば、ｄｓＲＮＡトランス遺伝子について意図される使用に基づいて、適切な制御／プロモーター配列を選択することができる。
【００９２】
一般に、ｄｓＲＮＡ分子を発現させることが可能な組換えベクターは、以下に記載する通りに送達され、標的細胞内にとどまる。代替的に、ｄｓＲＮＡ分子の一過性発現をもたらすウイルスベクターも用いることができる。このようなベクターは、必要に応じて繰り返し投与することができる。発現すると、ｄｓＲＮＡは、標的ＲＮＡに結合し、その機能または発現を調節する。ｄｓＲＮＡを発現するベクターの送達は、静脈内投与または筋肉内投与による場合もあり、患者から外植された標的細胞に投与した後で患者へと再導入することによる場合もあり、所望の標的細胞内への導入を可能とする他の任意の手段による場合もあるなど、全身性であり得る。
【００９３】
ｄｓＲＮＡを発現するＤＮＡプラスミドは、陽イオン性脂質キャリア（例えば、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）または非陽イオン性脂質ベースのキャリア（例えば、Ｔｒａｎｓｉｔ−ＴＫＯ（商標））との複合体として、標的細胞内へとトランスフェクトすることが典型的である。１週間以上にわたり、単一のＥＧ５遺伝子（またはＶＥＧＦ遺伝子）または複数のＥｇ５遺伝子（またはＶＥＧＦ遺伝子）の異なる領域を標的とする、ｄｓＲＮＡを介するノックダウンための複数回にわたる脂質トランスフェクションもまた、本発明により意図される。本発明のベクターを宿主細胞内へと導入することが成功したかどうかは、公知の各種の方法を用いてモニタリングすることができる。例えば、一過性のトランスフェクションは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの蛍光マーカーなど、レポーターによりシグナル化することができる。ｅｘ  ｖｉｖｏにおける細胞の安定的なトランスフェクションは、トランスフェクトした細胞に、ハイグロマイシンＢ耐性など、特定の環境因子（例えば、抗生剤および薬物）に対する耐性を付与するマーカーを用いて確認することができる。
【００９４】
Ｅｇ５特異的ｄｓＲＮＡ分子およびＶＥＧＦ特異的ｄｓＲＮＡ分子はまた、ベクター内に挿入して、ヒト患者のための遺伝子治療ベクターとして用いることもできる。遺伝子治療ベクターは、例えば、静脈内注射、局所投与（米国特許第５，３２８，４７０号を参照されたい）により被験体に送達することもでき、定位注射（例えば、Chenら（１９９４）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、９１巻：３０５４〜３０５７頁を参照されたい）により被験体に送達することもできる。遺伝子治療ベクターによる薬学的調製物は、許容可能な希釈剤中に遺伝子治療ベクターを包含する場合もあり、遺伝子送達媒体が埋め込まれる徐放マトリックスを包含する場合もある。代替的に、組換え細胞から無傷で、完全な遺伝子送達ベクター、例えば、レトロウイルスベクターを作製し得る場合、該薬学的調製物は、遺伝子送達系をもたらす１つ以上の細胞も包含し得る。
ｄｓＲＮＡを含有する薬学的組成物
一実施形態では、本明細書で記載されるｄｓＲＮＡと、薬学的に許容されるキャリアとを含有する薬学的組成物、ならびにこれを投与する方法とを本発明が提供する。ｄｓＲＮＡを含有する薬学的組成物は、Ｅｇ５／ＫＳＰおよび／またはＶＥＧＦの発現を介する病理学的過程、例えば、肝臓癌など、Ｅｇ５／ＫＳＰ遺伝子および／またはＶＥＧＦ遺伝子の発現または活性化と関連する疾患または障害を治療するのに有用である。このような薬学的組成物は、送達方式に基づき製剤化される。
投与量
本明細書で特色とされる薬学的組成物は、ＥＧ５／ＫＳＰ遺伝子および／またはＶＥＧＦ遺伝子の発現を阻害するのに十分な投与量で投与される。一般に、ｄｓＲＮＡの適切な用量は、１日当たり受容者体重１キログラム（ｋｇ）当たり０．０１〜２００．０ミリグラム（ｍｇ）の範囲内、一般に、１日当たり体重１キログラム当たり１〜５０ｍｇの範囲内にある。例えば、ｄｓＲＮＡは、１回の投与当たり０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、または５０ｍｇ／ｋｇで投与することができる。
【００９５】
薬学的組成物を毎日１回投与することもでき、ｄｓＲＮＡを１日全体にわたる適切な間隔で、２、３回以上の分割投与として投与することもできる。１回の投与がＥＧ５／ＫＳＰレベルおよび／またはＶＥＧＦレベルに対して及ぼす効果は、その後の投与間隔が、７日間を超えないか、または１、２、３、もしくは４週間を超えないように、長期持続性である。
【００９６】
一部の実施形態では、放出制御製剤による持続的な注入または送達を用いて、ｄｓＲＮＡを投与する。その場合、毎日の全投与量を達成するためには、各分割用量中に含有されるｄｓＲＮＡが、これに対応してより少量でなくてはならない。投与量単位はまた、例えば、数日間にわたりｄｓＲＮＡの持続放出をもたらす、従来の持続放出製剤を用いて、数日間にわたる送達用に調合することもできる。持続放出製剤は、当技術分野において周知であり、本発明の薬剤と共に用い得るなど、特定の部位における薬剤の送達に特に有用である。この実施形態では、投与量単位が、毎日の用量の対応する倍量を含有する。
【００９７】
疾患または障害の重症度、既往の治療、被験体の全般的健康および／または年齢、ならびに存在する他の疾患が含まれるがこれらに限定されない特定の因子が、該被験体を有効に治療するのに必要とされる投与量およびタイミングに影響を及ぼし得ることを、当業者は理解する。さらに、治療有効量の組成物による被験体の治療は、単回の治療または一連の治療を包含し得る。本発明により包含される、個々のｄｓＲＮＡの有効投与量およびｉｎ  ｖｉｖｏにおける半減期は、従来の方法を用いて、または本明細書の別の箇所に記載される適切な動物モデルを用いるｉｎ  ｖｉｖｏにおける試験に基づき推定することができる。
【００９８】
マウス遺伝学の伸展により、ＥＧ５／ＫＳＰの発現および／またはＶＥＧＦの発現を介する病理学的過程など、各種のヒト疾患を研究するためのいくつかのマウスモデルが作製されている。このようなモデルは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてｄｓＲＮＡを調べる他、治療有効用量を決定するのにも用いられる。適切なマウスモデルは、例えば、ヒトＥＧ５／ＫＳＰおよび／またはＶＥＧＦを発現するプラスミドを含有するマウスである。別の適切なマウスモデルは、ヒトＥＧ５／ＫＳＰおよび／またはＶＥＧＦを発現するトランス遺伝子を保有するトランスジェニックマウスである。
【００９９】
このような化合物の毒性および治療有効性は、細胞培養物または実験動物において、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対する致死用量）およびＥＤ５０（集団の５０％における治療有効用量）を決定する、標準的な薬学的手順により決定することができる。毒性作用用量と治療効果用量との比が治療指数であり、これを比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる。治療指数が高い化合物が好ましい。
【０１００】
細胞培養物アッセイおよび動物試験から得られるデータは、ヒトにおいて用いられる投与量範囲を処方するのに用いることができる。本発明で特色とされる組成物の投与量は一般に、毒性がほとんどまたは全くないＥＤ５０を包含する循環濃度の範囲内にある。用量は、用いられる剤形、ならびに用いられる投与経路に応じて、この範囲内で変化し得る。本発明で特色とされる方法において用いられる任意の化合物については、まず細胞培養物アッセイから治療有効用量を推定することができる。動物モデルでは、細胞培養物において決定されるＩＣ５０（すなわち、症状の最大半量の阻害を達成する被験化合物濃度）を含め、化合物の循環血漿濃度範囲、または適宜、標的配列のポリペプチド産物（例えば、ポリペプチド濃度の低下を達成する）の循環血漿濃度範囲を達成する用量を処方することができる。このような情報を用いて、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定することができる。血漿中レベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーにより測定することができる。
【０１０１】
上記で論じたそれらの投与に加え、本発明で特色とされるｄｓＲＮＡは、標的の遺伝子発現を介する病理学的過程を治療するのに有効な、他の公知の薬剤と組み合わせて投与することもできる。いずれにせよ、投与する医師は、当技術分野で公知であるか、または本明細書に記載される、有効性についての標準的な尺度を用いて観察される結果に基づき、ｄｓＲＮＡの投与量および投与タイミングを調整することができる。
投与
本発明の薬学的組成物は、局所治療または全身治療のいずれが望ましいかに応じ、かつ、治療される領域に応じるいくつかの方法により投与することができる。投与は、局所投与、肺投与、例えば、噴霧器による投与を含め、粉末またはエアゾールを吸入または吹送することによる投与、気管内投与、鼻腔内投与、表皮投与および経皮投与、ならびに皮下（subdermal）投与、経口投与、または非経口投与、例えば、皮下（subcutaneous）投与であり得る。
【０１０２】
高脂血症を有する哺乳動物を治療する場合は、非経口的手段を介して、ｄｓＲＮＡ分子を全身投与することが典型的である。非経口投与には、静脈内注射もしくは静脈内注入、動脈内注射もしくは動脈内注入、皮下注射もしくは皮下注入、腹腔内注射もしくは腹腔内注入、または筋肉内注射もしくは筋肉内注入；あるいは頭蓋内投与、例えば、実質内投与、髄腔内（ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ）投与、または脳室内投与が含まれる。例えば、コンジュゲートｄｓＲＮＡまたは非コンジュゲートｄｓＲＮＡを患者に静脈内投与することもでき、リポソームを伴い調合されたｄｓＲＮＡまたはこれを伴わずに調合されたｄｓＲＮＡを患者に静脈内投与することもできる。このような場合、ｄｓＲＮＡ分子は、滅菌および非滅菌の水溶液、アルコールなど一般的な溶媒中における非水溶液、または液体もしくは固体の油ベース中における溶液などの組成物へと製剤化することができる。このような溶液はまた、緩衝剤、希釈剤、ならびに他の適切な添加剤も含有し得る。非経口投与、髄腔内投与、または脳室内投与の場合、ｄｓＲＮＡ分子は、緩衝剤、希釈剤、ならびに他の適切な添加剤（例えば、浸透増強剤、キャリア化合物、ならびに他の薬学的に許容されるキャリア）もまた含有し得る滅菌水溶液などの組成物中へと製剤化することができる。製剤については、本明細書により詳細に記載する。
【０１０３】
ｄｓＲＮＡは、肝臓など特定の組織（例えば、肝臓の肝細胞）を標的とする様式で送達することができる。
製剤
単位剤形で存在すると好都合であり得る本発明の医薬製剤は、製薬業界において周知である従来の技法により調製することができる。このような技法は、有効成分を、薬学的なキャリア（複数可）または賦形剤（複数可）と会合させる工程を包含する。一般に、製剤は、有効成分を、液体のキャリアもしくは微細化した固体のキャリアまたはそれらの両方と、一様かつ十分に会合させ、次いで、必要な場合は、生成物を成形することにより調製する。
【０１０４】
本発明の組成物は、錠剤、カプセル、ゲルカプセル、液体シロップ、軟性ゲル、坐剤、および浣腸剤などであるがこれらに限定されない多くの可能な剤形のうちのいずれかへと製剤化することができる。本発明の組成物はまた、水性媒体、非水性媒体、または混合媒体中における懸濁液としても製剤化することができる。水性懸濁液は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、および／またはデキストランを含め、懸濁液の粘稠性を増大させる物質をさらに含有し得る。懸濁液はまた、安定化剤も含有し得る。
【０１０５】
本発明の薬学的組成物には、溶液、エマルジョン、およびリポソーム含有製剤が含まれるがこれらに限定されない。これらの組成物は、予備成形液体、自己乳化固体、および自己乳化半固体が含まれるがこれらに限定されない各種の構成要素から作製することができる。一態様では、高脂血症などの肝障害を治療する場合、製剤は、肝臓を標的とする。
【０１０６】
加えて、ＥＧ５／ＫＳＰ遺伝子および／またはＶＥＧＦ遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡは、他の分子、分子構造物、または核酸混合物と混合するか、これらにより封入するか、これらとコンジュゲートするか、または他の形態でこれらと会合させたｄｓＲＮＡを含有する組成物へと製剤化することができる。例えば、Ｅｇ５／ＫＳＰ遺伝子および／またはＶＥＧＦ遺伝子を標的とする１つ以上のｄｓＲＮＡ剤を含有する組成物は、他の癌治療剤、またはＥＧ５／ＫＳＰおよび／もしくはＶＥＧＦ以外の遺伝子を標的とする１以上のｄｓＲＮＡ化合物など、他の治療剤を含有し得る。
経口製剤、非経口製剤、局所製剤、および生物学的製剤
経口投与のための組成物および製剤には、粉末または顆粒、マイクロ粒子、ナノ粒子、水または非水性媒体中における懸濁液または溶液、カプセル、ゲルカプセル、トローチ、錠剤またはミニ錠剤が含まれる。増粘剤、芳香剤、希釈剤、乳化剤、分散補助剤、または結合剤が所望される場合がある。一部の実施形態では、経口製剤が、それにより本発明で特色とされるｄｓＲＮＡが１つ以上の浸透増強剤、界面活性剤、およびキレート化剤と共に投与される製剤である。適切な界面活性剤には、脂肪酸および／またはそれらのエステルもしくは塩、胆汁酸および／またはそれらの塩が含まれる。適切な胆汁酸／塩には、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）およびウルソデオキシコール酸（ursodeoxychenodeoxycholic acid）（ＵＤＣＡ）、コール酸、デヒドロコール酸、デオキシコール酸、グルコール酸（glucholicacid）、グリコール酸（glycholic acid）、グリコデオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、タウロ−２４，２５−ジヒドロフシジン酸ナトリウムおよびグリコジヒドロフシジン酸ナトリウムが含まれる。適切な脂肪酸には、アラキドン酸、ウンデカン酸、オレイン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプリレート、トリカプリレート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、またはモノグリセリド、ジグリセリド、もしくは薬学的に許容されるその塩（例えば、ナトリウム塩）が含まれる。一部の実施形態では、浸透増強剤の組合せ、例えば、胆汁酸／塩と組み合わせた脂肪酸／塩が用いられる。１つの例示的な組合せは、ラウリン酸、カプリン酸、およびＵＤＣＡのナトリウム塩である。さらなる浸透増強剤には、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−２０−セチルエーテルが含まれる。本発明で特色とされるｄｓＲＮＡは、噴霧用乾燥粒子、またはマイクロ粒子もしくはナノ粒子を形成するように複合体化された粒子を含め、顆粒形態で経口送達することができる。ｄｓＲＮＡ複合体化剤には、ポリアミノ酸；ポリイミン；ポリアクリレート；ポリ（アクリル酸アルキル）、ポリオキシエタン、ポリ（シアノアクリル酸アルキル）；陽イオン化ゼラチン、アルブミン、デンプン、アクリレート、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびデンプン；ポリ（シアノアクリル酸アルキル）；ＤＥＡＥ誘導体化ポリイミン、ポルラン、セルロース、およびデンプンが含まれる。適切な複合体化剤には、キトサン、Ｎ−トリメチルキトサン、ポリ−Ｌ−リシン、ポリヒスチジン、ポリオルニチン、ポリスペルミン、プロタミン、ポリビニルピリジン、ポリチオジエチルアミノメチルエチレン  Ｐ（ＴＤＡＥ）、ポリアミノスチレン（例えば、ｐ−アミノスチレン）、ポリ（シアノアクリル酸メチル）、ポリ（シアノアクリル酸エチル）、ポリ（シアノアクリル酸ブチル）、ポリ（シアノアクリル酸イソブチル）、ポリ（シアノアクリル酸イソヘキシル）、ＤＥＡＥ−メタクリレート、ＤＥＡＥ−アクリル酸ヘキシル、ＤＥＡＥ−アクリルアミド、ＤＥＡＥ−アルブミンおよびＤＥＡＥ−デキストラン���ポリ（アクリル酸メチル）、ポリ（アクリル酸ヘキシル）、ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸）、ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、アルギネート、ならびにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が含まれる。ｄｓＲＮＡの経口製剤およびそれらの調製については、それらの各々が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，８８７，９０６号；米国特許公開第２００３００２７７８０号；および米国特許第６，７４７，０１４号において記載されている。
【０１０７】
非経口投与、脳実質内（脳内）投与、髄腔内投与、脳室内投与、または肝臓内投与のための組成物および製剤には、また、緩衝剤、希釈剤、ならびに、浸透増強剤、キャリア化合物、ならびに他の薬学的に許容されるキャリアまたは賦形剤などであるがこれらに限定されない他の適切な添加剤も含有し得る滅菌水溶液が含まれ得る。
【０１０８】
局所投与のための薬学的組成物および製剤には、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、坐剤、スプレー、液体、および粉末が含まれ得る。従来の薬学的キャリア、水性基剤、粉末基剤、または油性基剤、増粘剤などは、必要または所望される場合がある。適切な局所製剤には、その中において本発明で特色とされるｄｓＲＮＡが脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート化剤、および界面活性剤などの局所送達剤と混合される製剤が含まれる。適切な脂質およびリポソームには、中性の脂質およびリポソーム（例えば、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン）、陰性の脂質およびリポソーム（例えば、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ））、ならびに陽イオン性の脂質およびリポソーム（例えば、ジオレオイルテトラメチルアミノプロピルＤＯＴＡＰ）およびジオレオイルホスファチジルエタノールアミン ＤＯＴＭＡ）が含まれる。本発明で特色とされるｄｓＲＮＡは、リポソーム内に封入することもでき、それらとの複合体、特に、陽イオン性リポソームとの複合体を形成することもできる。代替的に、ｄｓＲＮＡは、脂質、特に、陽イオン性脂質と複合体化させることができる。適切な脂肪酸およびエステルには、アラキドン酸、オレイン酸、エイコサン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプリレート、トリカプリレート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル−１−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、またはＣ１〜１０のアルキルエステル（例えば、ミリスチン酸イソプロピル；ＩＰＭ）、モノグリセリド、ジグリセリド、もしくは薬学的に許容されるその塩が含まれるがこれらに限定されない。局所製剤は、それが参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，７４７，０１４号において詳細に記載されている。加えて、ｄｓＲＮＡ分子は、例えば、米国特許第６，２７１，３５９号において記載される通り、生物学的手段として哺乳動物に投与される場合もあり、非生物学的手段として哺乳動物に投与される場合もある。非生物学的送達は、（１）本明細書に記載のｄｓＲＮＡ分子によりリポソームを充填すること、ならびに（２）ｄｓＲＮＡ分子を、脂質またはリポソームと複合体化させて、核酸−脂質複合体または核酸−リポソーム複合体を形成することが含まれるがこれらに限定されない各種の方法により達成することができる。リポソームは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて細胞にトランスフェクトするのに一般に用いられる陽イオン性脂質および中性脂質からなる場合がある。陽イオン性脂質は、負に帯電した核酸と複合して（例えば、電荷により会合して）リポソームを形成し得る。陽イオン性リポソームの例には、リポフェクチン、リポフェクタミン、リポフェクタス、およびＤＯＴＡＰが含まれるがこれらに限定されない。リポソームを形成する手順は、当技術分野において周知である。リポソーム組成物は、例えば、ホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、またはジオレオイルホスファチジルエタノールアミンから形成することができる。Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）（カリフォルニア州、カールスバード、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）およびＥｆｆｅｃｔｅｎｅ（商標）（カリフォルニア州、バレンシア、Ｑｉａｇｅｎ社製）を含め、多数の親油性剤が市販されている。加えて、その各々をＤＯＰＥまたはコレステロールなどの中性脂質と混合し得る、ＤＤＡＢまたはＤＯＴＡＰなど、市販の陽イオン脂質を用いて、全身送達法を最適化することができる。場合によっては、Templetonら（Nature Biotechnology、１５巻：６４７〜６５２頁（１９９７年））によって記載されているリポソームなどのリポソームを用いることができる。他の実施形態では、ポリエチレンイミンなどのポリ陽イオンを用いて、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｅｘ  ｖｉｖｏにおける送達を達成することができる（Bolettaら、J.Am Soc. Nephrol.、７巻：１７２８頁（１９９６年））。核酸を送達するためのリポソームの使用に関するさらなる情報は、米国特許第６，２７１，３５９号；ＰＣＴ公開第ＷＯ９６／４０９６４号；およびMorrissey,D.ら、２００５年、Nat Biotechnol.、２３巻（８号）：１００２〜７頁において見出すことができる。
【０１０９】
生物学的送達は、ウイルスベクターの使用が含まれるがこれらに限定されない各種の方法により達成することができる。例えば、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルスベクターおよびヘルペスウイルスベクター）を用いて、ｄｓＲＮＡ分子を肝細胞へと送達することができる。標準的な分子生物学の技法を用いて、本明細書に記載のｄｓＲＮＡのうちの１つ以上を、既に開発されている多くの異なるウイルスベクターのうちの１つへと導入し、核酸を細胞へと送達することができる。結果として得られるこれらのウイルスベクターを用いて、例えば、感染により、１つ以上のｄｓＲＮＡを細胞へと送達することができる。
リポソーム製剤
マイクロエマルジョン以外に、多くの界面活性剤構造物の構成が研究され、薬物の製剤化に用いられている。これらには、単一層、ミセル、二重層、および小胞が含まれる。リポソームなどの小胞は、それらがもたらす特異性および作用時間のために、薬物送達の視点から多大の関心を惹起してきた。本発明で用いられる「リポソーム」という用語は、１つまたは複数の球形二重層内に配置された両親媒性脂質からなる小胞を意味する。
【０１１０】
リポソームは、親油性物質および水性の内部から形成される膜を有する、単一ラメラ小胞または複数ラメラ小胞である。水性部分は、送達される組成物を含有する。陽イオン性リポソームは、細胞壁に融合することが可能な利点を有する。非陽イオン性リポソームは、細胞壁とはそれほど効率的に融合しえないが、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、マクロファージにより取り込まれる。
【０１１１】
完全な哺乳動物の皮膚を透過する（ｃｒｏｓｓ）ために、脂質小胞は、各々の直径が５０ｎｍ未満であり、適切な経皮勾配の影響下にある一連の微小孔を通過しなければならない。したがって、高度に変形可能であり、このような微小孔を通過することが可能なリポソームを用いることが望ましい。
【０１１２】
リポソームのさらなる利点には、天然のリン脂質から得られるリポソームは、生体適合性および生体分解性であること；リポソームは、広範な水溶性薬物および脂溶性薬物を組み込み得ること；ならびにリポソームは、それらの内部コンパートメント内に封入された薬物を、代謝および分解から保護し得ること（Rosoff、「Pharmaceutical Dosage Forms」、Lieberman、Rieger、およびBanker（編）、１９８８年、MarcelDekker, Inc.、New York, N.Y.、第１巻、２４５頁）が含まれる。リポソーム製剤を調製する際に重要な考慮点は、リポソームの脂質表面の電荷、小胞のサイズ、ならびに水性容量である。
【０１１３】
リポソームは、有効成分を作用部位に移動させ、かつ送達するのに有用である。リポソームの膜は、生体膜と構造的に類似しているので、組織に適用されると、リポソームは、細胞膜と合体を開始し、リポソームと細胞との合体（ｍｅｒｇｉｎｇ）が進むにつれて、リポソームの内容物は、有効成分が作用し得る細胞内へと移入する。
【０１１４】
リポソーム製剤は、多くの薬物の送達方式として、広範な探索の焦点となっている。局所投与については、リポソームが、他の製剤を上回る複数の利点を示す証拠が増加しつつある。このような利点には、投与された薬物の全身吸収が高度であることと関連して副作用が軽度であること、所望の標的に投与される薬物の蓄積量が高量であること、ならびに親水性および疎水性両方の多種多様な薬物を皮膚へと投与し得ることが含まれる。
【０１１５】
複数の報告が、高分子量のＤＮＡを含めた薬剤を皮膚へと送達するリポソームの能力について詳述している。鎮痛剤、抗生剤、ホルモン、および高分子量のＤＮＡを含めた化合物が、皮膚へと投与されている。大半の適用では、結果として、表皮上部が標的化されている。
【０１１６】
リポソームは、大まかに２つのクラスに分かれる。陽イオン性リポソームとは、負に帯電したＤＮＡ分子と相互作用して安定的な複合体を形成する、正に帯電したリポソームである。正に帯電したＤＮＡ／リポソーム複合体は、負に帯電した細胞表面に結合し、エンドソーム内へと内部移行される。エンドソーム内ではｐＨが酸性であるため、リポソームは破裂し、それらの内容物を細胞質内へと放出する（Wangら、Biochem. Biophys. Res. Commun.、１９８７年、１４７巻、９８０〜９８５頁）。
【０１１７】
ｐＨ感受性であるか、または負に帯電したリポソームは、ＤＮＡと複合体化するのではなく、ＤＮＡを封入する。ＤＮＡおよび脂質が共に同符号で帯電しているので、複合体形成ではなくて反発が生じる。にもかかわらず、一部のＤＮＡは、これらのリポソームの水性の内部へと捕捉される。チミジンキナーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを、培養物中における細胞の単一層へと送達するのに、ｐＨ感受性リポソームが用いられてきた。標的細胞内では、外因性遺伝子の発現が検出された（Zhouら、Journal of Controlled Release、１９９２年、１９巻、２６９〜２７４頁）。
【０１１８】
リポソーム組成物の１つの主要な種類には、天然由来のホスファチジルコリン以外のリン脂質が含まれる。中性のリポソーム組成物は、例えば、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）またはジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）から形成することができる。陰イオン性リポソーム組成物が一般に、ジミリストイルホスファチジルグリセロールから形成されるのに対し、陰イオン性の融合性リポソームは、主に、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）から形成される。別の種類のリポソーム組成物は、例えば、ダイズホスファチジルコリン（ＰＣ）および鶏卵ＰＣなどのＰＣから形成される。別の種類は、リン脂質および／またはホスファチジルコリンおよび／またはコレステロールの混合物から形成される。
【０１１９】
皮膚へのリポソーム薬物製剤の局所送達については、複数の研究が評価している。インターフェロンを含有するリポソームをモルモットの皮膚へと適用した結果、皮膚のヘルペス痛が軽減されたのに対し、他の手段（例えば、溶液として、またはエマルジョンとして）を介するインターフェロンの送達は有効でなかった（Weinerら、Journal of Drug Targeting、１９９２年、２巻、４０５〜４１０頁）。さらに、水性系を用いるインターフェロンの投与に加えて、リポソーム製剤の一部として投与されたインターフェロンの有効性について調べたところ、リポソーム製剤は、水性投与より優れていることが結論付けられた（duPlessisら、Antiviral Research、１９９２年、１８巻、２５９〜２６５頁）。
【０１２０】
非イオン性リポソーム系、特に、非イオン性界面活性剤およびコレステロールを含む系もまた検討され、薬物を皮膚へと送達するときのそれらの有用性が判定されている。Ｎｏｖａｓｏｍｅ（商標）Ｉ（ジラウリル酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）およびＮｏｖａｓｏｍｅ（商標）ＩＩ（ジステアリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）を含む非イオン性リポソーム製剤を用いて、シクロスポリンＡをマウス皮膚の真皮内へと送達した。その結果、シクロスポリンＡが皮膚の異なる層内に沈着することを促進するのに、このような非イオン性リポソーム系が有効であることが示された（Huら、S.T.P. Pharma. Sci.、１９９４年、４巻、６号、４６６頁）。
【０１２１】
リポソームはまた、「立体的に安定」なリポソームも包含するが、本明細書で用いられるこの用語は、リポソーム内に組み込まれると、それらを欠くリポソームと比べ、循環における寿命が結果として延長される、１つ以上の特殊な脂質を含むリポソームを指す。立体的に安定なリポソームの例は、その小胞を形成するリポソームの脂質部分の一部が、（Ａ）モノシアロガングリオシドＧＭ１など、１つ以上の糖脂質を含むか、または（Ｂ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分など、１つ以上の親水性ポリマーにより誘導体化されているリポソームである。特定の理論に拘束されることを望まないが、当技術分野では、少なくとも、ガングリオシド、スフィンゴミエリン、またはＰＥＧにより誘導体化された脂質を含有する、立体的に安定なリポソームについては、網内系（ＲＥＳ）細胞内への取込みが低下することに由来して、これらの立体的に安定なリポソームの循環における半減期が延長されると考えられている（Allenら、FEBS Letters、１９８７年、２２３巻、４２頁; Wuら、Cancer Research、１９９３年、５３巻、３７６５頁）。
【０１２２】
当技術分野では、１つ以上の糖脂質を含む各種のリポソームが公知である。Papahadjopoulosら（Ann.N.Y. Acad. Sci.、１９８７年、５０７巻、６４頁）は、モノシアロガングリオシドＧＭ１、硫酸ガラクトセレブロシド、およびホスファチジルイノシトールが、リポソームの血中半減期を延長させ得ることについて報告した。これらの知見は、Gabizonら（Proc.Natl. Acad. Sci. U.S.A.、１９８８年、８５巻、６９４９頁）により詳しく記載された。いずれもAllenらに対する米国特許第４，８３７，０２８号；およびＷＯ８８／０４９２４号は、（１）スフィンゴミエリンを含むリポソーム、ならびに（２）ガングリオシドＧＭ１または硫酸ガラクトセレブロシドエステルを含むリポソームについて開示している。米国特許第５，５４３，１５２号（Webbら）は、スフィンゴミエリンを含むリポソームについて開示している。１，２−ｓｎ−ジミリストイルホスファチジルコリン（dimyristoylphosphat-idylcholine）を含むリポソームは、ＷＯ９７／１３４９９（Limら）において開示されている。
【０１２３】
当技術分野では、１つ以上の親水性ポリマーにより誘導体化された脂質を含む多くのリポソーム、ならびにそれらを調製する方法が公知である。Sunamotoら（Bull. Chem. Soc. Jpn.、１９８０年、５３巻、２７７８頁）は、ＰＥＧ部分を含有する非イオン性洗浄剤である２Ｃ１２１５Ｇを含むリポソームについて記載した。Illumら（FEBSLett.、１９８４年、１６７巻、７９頁）は、ポリスチレン粒子を、グリコールポリマーにより親水性コーティングすると、結果として血中半減期が著明に延長されることについて言及した。Sears（米国特許第４，４２６，３３０号；および同第４，５３４，８９９号）は、ポリアルキレングリコール（例えば、ＰＥＧ）のカルボキシル基を結合させることにより改変した合成リン脂質について記載した。Klibanovら（FEBSLett.、１９９０年、２６８巻、２３５頁）は、ＰＥＧまたはステアリン酸ＰＥＧにより誘導体化されたホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）を含むリポソームが、血液循環中における半減期を著明に延長させることを証明する実験について記載した。Blumeら（Biochimicaet Biophysica Acta、１９９０年、１０２９巻、９１頁）は、このような観察を、ＰＥＧにより誘導体化された他のリン脂質、例えば、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）とＰＥＧとを組み合わせることにより形成されたＤＳＰＥ−ＰＥＧへと拡張した。それらの外部表面上においてＰＥＧ部分を共有結合させているリポソームは、Fisherに対する欧州特許第ＥＰ０４４５１３１Ｂ１号；およびＷＯ９０／０４３８４号において記載されている。ＰＥＧにより誘導体化された、１〜２０モルパーセントのＰＥを含有するリポソーム組成物、ならびにそれらを用いる方法は、Woodleら（米国特許第５，０１３，５５６号；および同第５，３５６，６３３号）およびMartinら（米国特許第５，２１３，８０４号；欧州特許第ＥＰ０４９６８１３Ｂ１号）により記載されている。他の多数の脂質−ポリマーコンジュゲートを含むリポソームは、ＷＯ９１／０５５４５；および米国特許第５，２２５，２１２号（いずれも、Martinらに対する）；ならびにＷＯ９４／２００７３（Zalipskyら）において開示されている。ＰＥＧ改変されたセラミド脂質を含むリポソームは、ＷＯ９６／１０３９１（Choiら）において記載されている。米国特許第５，５４０，９３５号（Miyazakiら）；および米国特許第５，５５６，９４８号（Tagawaら）は、それらの表面上において官能性部分によりさらに誘導体化され得る、ＰＥＧを含有するリポソームについて記載している。
【０１２４】
当技術分野では、核酸を含む多数のリポソームが公知である。Thierryらに対するＷＯ９６／４００６２は、高分子量の核酸をリポソーム内に封入する方法について開示している。Tagawaらに対する米国特許第５，２６４，２２１号は、タンパク質を結合させたリポソームについて開示し、このようなリポソームの内容物は、ｄｓＲＮＡを包含し得ると主張している。Rahmanらに対する米国特許第５，６６５，７１０号は、オリゴデオキシヌクレオチドをリポソーム内に封入する特定の方法について記載している。Loveらに対するＷＯ９７／０４７８７は、ｒａｆ遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡを含むリポソームについて開示している。
【０１２５】
トランスファーソームは、さらに別の種類のリポソームであり、薬物送達媒体に魅力的な候補物質となる、高度に変形可能な脂質凝集物である。トランスファーソームは、高度に変形可能であるため、それより小さい小孔を容易に透過し得る脂質液滴として説明することができる。トランスファーソームは、それらが用いられる環境に適合性である、例えば、トランスファーソームは、自己最適化性であり（皮膚内の小孔の形状に対して適合性であり）、自己修復性であり、断片化することなしにそれらの標的に到達することが多く、自己充填性であることが多い。トランスファーソームを作製するには、標準的なリポソーム組成物に表面縁辺活性化剤、通常は界面活性剤を添加することが可能である。トランスファーソームは、血清アルブミンを皮膚へと送達するのに用いられている。トランスファーソームを介する血清アルブミンの送達は、血清アルブミンを含有する溶液の皮下注射と同様に有効であることが示されている。
【０１２６】
界面活性剤は、エマルジョン（マイクロエマルジョンを含めた）およびリポソームなどの製剤において広く適用されている。天然および合成両方の多くの異なる種類の界面活性剤の特性を分類およびランク付けする最も一般的な方法は、親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）の使用による。親水性基（また、「ヘッド」としても公知である）の性質は、製剤中において用いられる異なる界面活性剤を分類するのに最も有用な手段をもたらす（Rieger、「Pharmaceutical Dosage Forms」、Marcel Dekker, Inc.、New York、N.Y.、１９８８年、２８５頁）。
【０１２７】
界面活性剤分子がイオン化されていない場合、それは、非イオン性界面活性剤として分類される。非イオン性界面活性剤は、医薬品および化粧品において広く適用されており、広範囲のｐＨ値にわたり使用可能である。一般に、それらのＨＬＢ値は、それらの構造物に応じて、２〜約１８の範囲にある。非イオン性界面活性剤には、エチレングリコールエステル、プロピレングリコールエステル、グリセリルエステル、ポリグリセリルエステル、ソルビタンエステル、スクロースエステル、およびエトキシル化エステルなど、非イオン性エステルが含まれる。エトキシル酸脂肪アルコール（ｆａｔｔｙ  ａｌｃｏｈｏｌ  ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅ）、プロポキシル化アルコール、およびエトキシル化／プロポキシル化ブロックポリマーなど、非イオン性アルカノールアミドおよびエーテルもまた、このクラスに包含される。ポリオキシエチレン界面活性剤は、非イオン性界面活性剤のクラスで最も一般的なメンバーである。
【０１２８】
界面活性剤分子を水中に溶解または分散させたときにこれが負の電荷を帯びる場合、その界面活性剤は、陰イオン性として分類される。陰イオン性界面活性剤には、石鹸などのカルボキシレート、アシルラクチレート、アミノ酸のアシルアミド、硫酸アルキルおよびエトキシル化硫酸アルキルなどの硫酸エステル、アルキルベンゼンスルホネートなどのスルホネート、アシルイセチオネート、アシルタウレート、およびスルホスクシネート、ならびにホスフェートが含まれる。陰イオン性界面活性剤クラスで最も重要なメンバーは、硫酸アルキルおよび石鹸である。
【０１２９】
界面活性剤分子を水中に溶解または分散させたときにこれが正の電荷を帯びる場合、その界面活性剤は、陽イオン性として分類される。陽イオン性界面活性剤には、四級アンモニウム塩およびエトキシル化アミンが含まれる。四級アンモニウム塩が、このクラスで最もよく用いられるメンバーである。
【０１３０】
界面活性剤分子が正または負の電荷を帯びる能力を有する場合、その界面活性剤は、両性として分類される。両性界面活性剤には、アクリル酸誘導体、置換アルキルアミド、Ｎ−アルキルベタイン、およびホスファチドが含まれる。
【０１３１】
医薬品、製剤、およびエマルジョンにおける界面活性剤の使用については総説されている（Rieger、「PharmaceuticalDosage Forms」、Marcel Dekker, Inc.、New York、N.Y.、１９８８年、２８５頁）。
核酸脂質粒子
一実施形態では、本発明で特色とされるｄｓＲＮＡが、脂質製剤中に完全に封入されて、例えば、核酸−脂質粒子を形成する。核酸−脂質粒子は、陽イオン性脂質、非陽イオン性脂質、ステロール、ならびに粒子の凝集を防止する脂質（例えば、ＰＥＧ−脂質コンジュゲート）を含有することが典型的である。核酸−脂質粒子は、静脈内（ｉ．ｖ．）注射後の循環中における寿命が延長され、遠位部位（例えば、投与部位から物理的に遠隔の部位）に蓄積されるので、全身適用に極めて有用である。加えて、核酸は、本発明の核酸−脂質粒子内に存在すると、水溶液中において、ヌクレアーゼによる分解に対して抵抗性となる。核酸−脂質粒子、ならびにそれらを調製する方法は、例えば、米国特許第５，９７６，５６７号；同第５，９８１，５０１号；同第６，５３４，４８４号；同第６，５８６，４１０号；同第６，８１５，４３２号；ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ９６／４０９６４号において開示されている。
【０１３２】
核酸−脂質粒子は、１つ以上のさらなる脂質および／またはコレステロールなどの他の成分もさらに包含し得る。脂質の酸化を防止する目的、またはリガンドをリポソーム表面へと結合させる目的など各種の目的で、他の脂質を、リポソーム組成物中に包含させることができる。両親媒性脂質、中性脂質、陽イオン性脂質、および陰イオン性脂質を含め、多数の脂質のうちのいずれかを存在させることができる。このような脂質は、単独または組合せで用いることができる。本明細書では、存在させ得るさらなる脂質成分の具体例について記載する。
【０１３３】
核酸−脂質粒子内に存在させ得るさらなる成分には、ポリアミドオリゴマー（例えば、米国特許第６，３２０，０１７号を参照されたい）などの二重層安定化成分、ペプチド、タンパク質、洗浄剤、ホスファチジルエタノールアミンに連結したＰＥＧ、ならびにセラミドにコンジュゲートしたＰＥＧ（米国特許第５，８８５，６１３号を参照されたい）などの脂質誘導体などが含まれる。
【０１３４】
核酸−脂質粒子は、第２のアミノ脂質または陽イオン性脂質、中性脂質、ステロール、ならびに形成の間に脂質粒子の凝集を低下させる（これは、形成の間に電荷に誘導される凝集を防止する、粒子の立体的安定化から生じ得る）ように選択される脂質のうちの１つ以上を包含し得る。
【０１３５】
核酸−脂質粒子には、例えば、ＳＰＬＰ、ｐＳＰＬＰ、およびＳＮＡＬＰが含まれる。「ＳＮＡＬＰ」という用語は、ＳＰＬＰを含めた、安定的な核酸−脂質粒子を指す。「ＳＰＬＰ」という用語は、脂質小胞内に封入されたプラスミドＤＮＡを含む核酸−脂質粒子を指す。ＳＰＬＰは、「ｐＳＰＬＰ」を包含し、これは、ＰＣＴ公開第ＷＯ００／０３６８３号において示される封入型縮合剤−核酸複合体を包含する。
【０１３６】
本発明の粒子は、平均直径が典型的には約５０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、より典型的には約６０ｎｍ〜約１３０ｎｍ、より典型的には約７０ｎｍ〜約１１０ｎｍ、最も典型的には約７０ｎｍ〜約９０ｎｍであり、実質的に非毒性である。
【０１３７】
一実施形態では、脂質対薬物比（質量／質量比）（例えば、脂質対ｄｓＲＮＡ比）が、約１：１〜約５０：１、約１：１〜約２５：１、約３：１〜約１５：１、約４：１〜約１０：１、約５：１〜約９：１、もしくは約６：１〜約９：１、または約６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、もしくは３３：１の範囲内にある。
陽イオン性脂質
本発明の核酸−脂質粒子は、陽イオン性脂質を包含することが典型的である。陽イオン性脂質は、例えば、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ−（Ｉ−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ−（Ｉ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ジオレイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルカルバモイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−Ｃ−ＤＡＰ）、１，２−ジリノレイオキシ−３−（ジメチルアミノ）アセトキシプロパン（ＤＬｉｎ−ＤＡＣ）、１，２−ジリノレイオキシ−３−モルホリノプロパン（ＤＬｉｎ−ＭＡ）、１，２−ジリノレオイル−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２−ジリノレイルチオ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−Ｓ−ＤＭＡ）、１−リノレオイル−２−リノレイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−２−ＤＭＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ−ＴＭＡ．Ｃｌ）、１，２−ジリノレオイル−３−トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ−ＴＡＰ．Ｃｌ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−（Ｎ−メチルピペラジノ）プロパン（ＤＬｉｎ−ＭＰＺ）、または３−（Ｎ，Ｎ−ジリノレイルアミノ）−１，２−プロパンジオール（ＤＬｉｎＡＰ）、３−（Ｎ，Ｎ−ジオレイルアミノ）−１，２−プロパンジオ（ＤＯＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキソ−３−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エトキシプロパン（ＤＬｉｎ−ＥＧ−ＤＭＡ）、１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ）またはそれらの類似体、（３ａＲ，５ｓ，６ａＳ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，２−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエニル）テトラヒドロ−３ａＨ−シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−アミン（ＡＬＮＹ−１００）、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＭＣ３）、またはこれらの混合物であり得る。
【０１３８】
上記で具体的に説明した陽イオン性脂質に加えて、おおよそ生理学的なｐＨにおいて正味の正電荷を帯びる他の陽イオン性脂質もまた、本発明の脂質粒子内に包含させることができる。このような陽イオン性脂質には、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（“ＤＯＤＡＣ”）；Ｎ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル−Ｎ，Ｎ−Ｎ−トリエチルアンモニウムクロリド（“ＤＯＴＭＡ”）；Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（“ＤＤＡＢ”）；Ｎ−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（“ＤＯＴＡＰ”）；１，２−ジオレイルオキシ−３−トリメチルアミノプロパンクロリド塩（“ＤＯＴＡＰ．Ｃｌ”）；３β−（Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル）コレステロール（“ＤＣ−Ｃｈｏｌ”）、Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ−２−（スペルミンカルボキサミド）エチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムトリフルオルアセテート（“ＤＯＳＰＡ”）、ジオクタデシルアミドグリシルカルボキシスペルミン（“ＤＯＧＳ”）、１，２−ジレオイル−ｓｎ−３−ホスホエタノールアミン（“ＤＯＰＥ”）、１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（“ＤＯＤＡＰ”）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ジオレイルオキシ）プロピルアミン（“ＤＯＤＭＡ”）、およびＮ−（１，２−ジミリスチルオキシプロプ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（“ＤＭＲＩＥ”）が含まれるがこれらに限定されない。加えて、例えば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ社から市販されている、ＤＯＴＭＡおよびＤＯＰＥを包含する）、およびＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ社から市販されている、ＤＯＳＰＡおよびＤＯＰＥを含む）など、多数の市販の陽イオン性脂質調製物を用いることができる。具体的な実施形態では、陽イオン性脂質が、アミノ脂質である。
【０１３９】
本明細書で用いられる「アミノ脂質」という用語は、生理学的ｐＨにおいてプロトン化して陽イオン性脂質を形成し得る、１または２の脂肪酸鎖または脂肪アルキル鎖と、アミノヘッド基（アルキルアミノ基またはジアルキルアミノ基を含めた）とを有する脂質を包含することを意図する。
【０１４０】
他のアミノ脂質には、代替的な脂肪酸基、ならびにアルキル置換基が異なるジアルキルアミノ基（例えば、Ｎ−エチル−Ｎ−メチルアミノ−、Ｎ−プロピル−Ｎ−エチルアミノ−など）を含めた、他のジアルキルアミノ基を有するアミノ脂質が含まれる。Ｒ１１およびＲ１２の両方が長鎖アルキル基または長鎖アシル基である実施形態の場合、アミノ脂質は、同じ場合もあり、異なる場合もある。一般に、飽和度の少ないアシル鎖を有するアミノ脂質は、特に、濾過滅菌の目的で、該複合体が、約０．３ミクロン未満のサイズでなければならない場合、決めたサイズの作製がより容易となる。炭素鎖の長さがＣ１４〜Ｃ２２の範囲内にある不飽和脂肪酸を含有するアミノ脂質が好ましい。アミノ脂質のアミノ基と、脂肪酸部分または脂肪アルキル部分とを分離するにはまた、他の骨格も用いることができる。当業者には、適切な骨格が公知である。
【０１４１】
特定の実施形態では、生理学的ｐＨ（例えば、ｐＨ７．４）以下のｐＨで正に帯電し、好ましくは生理学的ｐＨ以上である第２のｐＨで中性であるように、本発明のアミノ脂質または陽イオン性脂質が、少なくとも１つのプロトン化可能基または脱プロトン化可能基を有する。当然ながら、ｐＨの関数としてのプロトンの付加または除去は平衡過程であり、帯電脂質または中性脂質への言及は主要な種の性質を指すものであり、すべての脂質が帯電形態または中性形態で存在することを必要とするものではないことが理解される。１つを超えるプロトン化可能基もしくは脱プロトン化可能基を有するか、または双性イオン性である脂質も、本発明における使用からは除外されない。
【０１４２】
特定の実施形態では、本発明によるプロトン化可能な脂質は、プロトン化可能基のｐＫａが、約４〜約１１の範囲内にある。より低ｐＨの製剤化段階では、これらの脂質が陽イオン性であるのに対し、ｐＨ７．４周辺の生理学的ｐＨでは、粒子の表面が大部分（完全にではないが）中性化されるため、約４〜約７のｐＫａが最も好ましい。ｐＫａがこの範囲であることの利益の１つは、粒子の外側表面と会合する少なくとも一部の核酸が、生理学的ｐＨではその静電相互作用を喪失し、単純な透析により除去され、したがって、粒子の易クリアランス性が大幅に低減されることである。
【０１４３】
陽イオン性脂質の一例は、１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）である。ＤｌｉｎＤＭＡを含めた核酸−脂質粒子の合成および調製については、２００９年４月１５日に出願された、国際出願第ＰＣＴ／ＣＡ２００９／００４９６号において記載されている。
【０１４４】
一実施形態では、核酸−脂質粒子を調製するのに、陽イオン性脂質であるＸＴＣ（２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン）が用いられる。ＸＴＣの合成については、参照により本明細書に組み込まれる、２００８年１０月２３日に出願された、米国仮特許出願第６１／１０７，９９８号において記載されている。
【０１４５】
別の実施形態では、核酸−脂質粒子を調製するのに、陽イオン性脂質であるＭＣ３（（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノエート）（例えば、ＤＬｉｎ−Ｍ−Ｃ３−ＤＭＡ）が用いられる。ＭＣ３ならびにＭＣ３を含む製剤の合成については、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、２００９年９月２２日に出願された米国仮出願第６１／２４４，８３４号、ならびに２００９年６月１０日に出願された米国仮出願第６１／１８５，８００号において記載されている。
【０１４６】
別の実施形態では、核酸−脂質粒子を調製するのに、陽イオン性脂質であるＡＬＮＹ−１００（（３ａＲ，５ｓ，６ａＳ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，２−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエニル）テトラヒドロ−３ａＨ−シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−アミン）が用いられる。ＡＬＮＹ−１００の合成については、参照により本明細書に組み込まれる、２００９年１１月１０日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０９／６３９３３号において記載されている。
【０１４７】
図２０は、ＡＬＮＹ−１００、ＭＣ３、およびＸＴＣの構造を示す。
【０１４８】
陽イオン性脂質は、粒子内に存在する全脂質の約２０モル％〜約７０モル％、または約４５〜６５モル％、または約４０モル％を含み得る。
非陽イオン性脂質
本発明の核酸−脂質粒子は、非陽イオン性脂質を包含し得る。非陽イオン性脂質は、陰イオン性脂質の場合もあり、中性脂質の場合もある。例には、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＤＯＰＥ−ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１６−Ｏ−モノメチルＰＥ、１６−Ｏ−ジメチルＰＥ、１８−１−ｔｒａｎｓ  ＰＥ、１−ステアロイル−２−オレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）（ＳＯＰＥ）、コレステロール、またはこれらの混合物が含まれるがこれらに限定されない。
【０１４９】
本発明の脂質粒子で用いるのに適する陰イオン性脂質には、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジン酸、Ｎ−ドデカノイルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ−スクシニルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ−グルタリールホスファチジルエタノールアミン、リシルホスファチジルグリセロール、ならびに中性脂質に連結された他の陰イオン性改変基が含まれるがこれらに限定されない。
【０１５０】
中性脂質は、脂質粒子内に存在すると、生理学的ｐＨで非荷電または中性の双性イオン性形態で存在する、多くの脂質種のうちのいずれかであり得る。このような脂質には、例えば、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、セファリン、およびセレブロシドが含まれる。本明細書で記載される粒子内において用いられる中性脂質の選択は一般に、例えば、リポソームのサイズ、ならびに血流中におけるリポソームの安定性を考慮することにより導かれる。中性脂質成分は、２つのアシル基を有する脂質（すなわち、ジアシルホスファチジルコリンおよびジアシルホスファチジルエタノールアミン）であることが好ましい。鎖長および飽和度が異なる各種のアシル鎖基を有する脂質が利用可能であるか、またはこれらを周知の技法により単離もしくは合成することができる。一実施形態群では、炭素鎖の長さがＣ１４〜Ｃ２２の範囲内にある飽和脂肪酸を含有する脂質が好ましい。別の実施形態群では、炭素鎖の長さがＣ１４〜Ｃ２２の範囲内にあるモノ不飽和脂肪酸またはジ不飽和脂肪酸を伴う脂質が用いられる。加えて、飽和脂肪酸鎖と不飽和脂肪族鎖との混合物を有する脂質も用いることができる。本発明で用いられる中性脂質は、ＤＯＰＥ、ＤＳＰＣ、ＰＯＰＣ、または任意の類縁のホスファチジルコリンであることが好ましい。本発明で有用な中性脂質はまた、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、またはセリンおよびイノシトールなど他のヘッド基を伴うリン脂質から構成されるものでもあり得る。
【０１５１】
一実施形態では、非陽イオン性脂質が、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）である。別の実施形態では、非陽イオン性脂質が、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）である。
【０１５２】
非陽イオン性脂質は、粒子内に存在する全脂質の約５モル％〜約９０モル％、または約５モル％〜約１０モル％、約１０モル％、またはコレステロールが包含される場合は約５８モル％であり得る。
コンジュゲート脂質
核酸−脂質粒子において、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）改変脂質、モノシアロガングリオシドＧｍ１、ならびに米国特許第６，３２０，０１７号において記載されるものなどのポリアミドオリゴマー（「ＰＡＯ」）を含めたコンジュゲート脂質を用いて、凝集を防止することができる。ＰＥＧ、Ｇｍ１、またはＡＴＴＡなど、製剤化の間に凝集を防止する、非荷電、親水性の立体障害部分を有する他の化合物もまた、脂質に連結して、本発明の方法および組成物において用いることができる。ＡＴＴＡ−脂質は、例えば、米国特許第６，３２０，０１７号において記載されており、ＰＥＧ−脂質コンジュゲートは、例えば、米国特許第５，８２０，８７３号；同第５，５３４，４９９号；および同第５，８８５，６１３号において記載されている。凝集を低減するのに選択される脂質成分の濃度は、約１〜１５％（脂質のモル百分率による）であることが典型的である。
【０１５３】
本発明で有用なＰＥＧ改変脂質（または脂質−ポリオキシエチレンコンジュゲート）の具体例は、ＰＥＧ部分を脂質小胞の表面へと固定するように「アンカリング」する各種の脂質部分を有し得る。適切なＰＥＧ改変脂質の例には、ＰＥＧ改変ホスファチジルエタノールアミンおよびＰＥＧ改変ホスファチジン酸、参照により本明細書に組み込まれる、同時係属中のＵＳＳＮ０８／４８６，２１４において記載されるＰＥＧ−セラミドコンジュゲート（例えば、ＰＥＧ−ＣｅｒＣ１４またはＰＥＧ−ＣｅｒＣ２０）、ＰＥＧ改変ジアルキルアミン、ならびにＰＥＧ改変１，２−ジアシルオキシプロパン−３−アミンが含まれる。ＰＥＧ改変ジアシルグリセロールおよびＰＥＧ改変ジアルキルグリセロールが特に好ましい。
【０１５４】
ＰＥＧまたはＡＴＴＡなどの立体的に大型の部分が脂質アンカーにコンジュゲートされる実施形態では、コンジュゲートがどのような形態で脂質粒子と会合するかに、脂質アンカーの選択が依存する。粒子が循環からクリアランスされるまで、おそらくは、およそ数日間にわたり、ｍｅＰＥＧ（分子量２０００）−ジアステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）がリポソームとの会合を維持することは周知である。ＰＥＧ−ＣｅｒＣ２０など、他のコンジュゲートも、同様の滞留能を有する。しかし、一部のアッセイにおいて、ＰＥＧ−ＣｅｒＣ１４は、血清へと曝露されると速やかに製剤から置換され、Ｔ１／２は６０分間未満である。米国特許出願第０８／４８６，２１４号において示される通り、少なくとも３つの特性：アシル鎖の長さ、アシル鎖の飽和度、および立体障害ヘッド基のサイズが、置換速度に影響する。本発明には、これらの特色が適切な形態で変化する化合物が有用であり得る。一部の治療的適用では、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、ＰＥＧ改変脂質が、核酸−脂質粒子から速やかに失われることが好ましい場合があり、この場合、ＰＥＧ改変脂質は、脂質アンカーが比較的短い。他の治療的適用では、核酸−脂質粒子の血漿循環における寿命が長いことが好ましい場合があり、この場合、ＰＥＧ改変脂質は、脂質アンカーが比較的長い。例示的な脂質アンカーには、長さが約Ｃ１４〜約Ｃ２２、好ましくは約Ｃ１４〜約Ｃ１６である脂質アンカーが含まれる。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分、例えば、ｍＰＥＧ−ＮＨ２が、約１０００、２０００、５０００、１０，０００、１５，０００、または２０，０００ドルトンのサイズである。
【０１５５】
凝集を防止する化合物であるからといって、脂質コンジュゲート形成が適正に機能することを必ずしも必要とするわけではないことに注意すべきである。溶解した遊離ＰＥＧまたは遊離ＡＴＴＡが存在すれば、凝集を防止するのに十分であり得る。製剤化後に粒子が安定である場合は、被験体に投与する前に、ＰＥＧまたはＡＴＴＡを透析により除去することができる。
【０１５６】
粒子の凝集を阻害するコンジュゲート脂質は、例えば、ＰＥＧ−ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、ＰＥＧ−ジアルキルオキシプロピル（ＤＡＡ）、ＰＥＧ−リン脂質、ＰＥＧ−セラミド（Ｃｅｒ）、またはこれらの混合物が含まれるがこれらに限定されない、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−脂質であり得る。ＰＥＧ−ＤＡＡコンジュゲートは、例えば、ＰＥＧ−ジラウリルオキシプロピル（Ｃｉ２）、ＰＥＧ−ジミリスチルオキシプロピル（Ｃｉ４）、ＰＥＧ−ジパルミチルオキシプロピル（Ｃｉ６）、またはＰＥＧ−ジステアリルオキシプロピル（Ｃ］８）であり得る。さらなるコンジュゲート脂質には、ポリエチレングリコール−ジジミリストイルグリセロール（ＰＥＧの平均分子量が２０００Ｄａである、Ｃ１４−ＰＥＧまたはＰＥＧ−Ｃ１４）（ＰＥＧ−ＤＭＧ）；（Ｒ）−２，３−ビス（オクタデシルオキシ）プロピル１−（メトキシポリ（エチレングリコール）２０００）プロピルカルバメート（ＰＥＧ−ＤＳＧ）；ＰＥＧの平均分子量が２０００Ｄａである、ＰＥＧ−カルバモイル−１，２−ジミリスチルオキシプロピルアミン（ＰＥＧ−ｃＤＭＡ）；Ｎ−アセチルガラクトサミン−（（Ｒ）−２，３−ビス（オクタデシルオキシ）プロピル１−（メトキシポリ（エチレングリコール）２０００）プロピルカルバメート））（ＧａｌＮＡｃ−ＰＥＧ−ＤＳＧ）；およびポリエチレングリコール−ジパルミトイルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＰＧ）が含まれる。
【０１５７】
一実施形態では、コンジュゲート脂質が、ＰＥＧ−ＤＭＧである。別の実施形態では、コンジュゲート脂質が、ＰＥＧ−ｃＤＭＡである。さらに別の実施形態では、コンジュゲート脂質が、ＰＥＧ−ＤＰＧである。代替的には、コンジュゲート脂質が、ＧａｌＮＡｃ−ＰＥＧ−ＤＳＧである。
【０１５８】
粒子の凝集を防止するコンジュゲート脂質は、粒子内に存在する全脂質の０モル％〜約２０モル％、または約０．５〜約５．０モル％、または約２モル％であり得る。
【０１５９】
存在する場合の脂質混合物のステロール成分は、リポソーム調製、脂質小胞調製、または脂質粒子調製の分野で従来用いられるステロールのうちのいずれかであり得る。好ましいステロールは、コレステロールである。
【０１６０】
一部の実施形態では、核酸−脂質粒子が、粒子内に存在する全脂質の、例えば、約１０モル％〜約６０モル％、または約２５〜約４０モル％、または約４８モル％のステロール、例えば、コレステロールをさらに包含する。
リポタンパク質
一実施形態では、本発明の製剤が、アポリポタンパク質をさらに含む。本明細書で用いられる「アポリポタンパク質」または「リポタンパク質」という用語は、当業者に公知のアポリポタンパク質、ならびにこれらの変異体および断片と、アポリポタンパク質のアゴニスト、類似体、または以下で記載されるこれらの断片とを指す。
【０１６１】
適切なアポリポタンパク質には、ＡｐｏＡ−Ｉ、ＡｐｏＡ−ＩＩ、ＡｐｏＡ−ＩＶ、ＡｐｏＡ−Ｖ、およびＡｐｏＥ、ならびにこれらの活性多形形態、アイソフォーム、変異体、およびミュータントの他、断片または切断形態が含まれるがこれらに限定されない。特定の実施形態では、アポリポタンパク質が、チオールを含有するアポリポタンパク質である。「チオールを含有するアポリポタンパク質」とは、少なくとも１つのシステイン残基を含有する、アポリポタンパク質、変異体、断片、またはアイソフォームを指す。最も一般的な、チオールを含有するアポリポタンパク質は、１つのシステイン残基を含有する、ＡｐｏＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ（ＡｐｏＡ−ＩＭ）およびＡｐｏＡ−Ｉ  Ｐａｒｉｓ（ＡｐｏＡ−ＩＰ）である（Jiaら、２００２年、Biochem. Biophys. Res. Comm.、２９７巻：２０６〜１３頁; BielickiおよびOda、２００２年、Biochemistry、４１巻：２０８９〜９６頁）。ＡｐｏＡ−ＩＩ、ＡｐｏＥ２、およびＡｐｏＥ３もまた、チオールを含有するアポリポタンパク質である。それを組み換えることにより作製された形態を含め、単離ＡｐｏＥならびに／またはその活性断片およびポリペプチド類似体は、それらの開示が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，６７２，６８５号；同第５，５２５，４７２号；同第５，４７３，０３９号；同第５，１８２，３６４号；同第５，１７７，１８９号；同第５，１６８，０４５号；同第５，１１６，７３９号において記載されている。ＡｐｏＥ３は、Weisgraberら、「HumanE apoprotein heterogeneity: cysteine-arginine interchanges in the amino acidsequence of the apo-E isoforms」、J. Biol. Chem.（１９８１年）、２５６巻：９０７７〜９０８３頁；およびRallら、「Structuralbasis for receptor binding heterogeneity of apolipoprotein E from type IIIhyperlipoproteinemic subjects」、Proc. Nat. Acad. Sci.（１９８２年）、７９巻：４６９６〜４７００頁において開示されている（また、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号第K00396号も参照されたい）。
【０１６２】
特定の実施形態では、アポリポタンパク質が、その成熟形態にある場合もあり、そのプレプロアポリポタンパク質の形態にある場合もあり、そのプロアポリポタンパク質の形態にある場合もある。プロＡｐｏＡ−Ｉおよび成熟ＡｐｏＡ−Ｉ（Duvergerら、１９９６年、Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol.、１６巻（１２号）：１４２４〜２９頁）、プロＡｐｏＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏおよび成熟ＡｐｏＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ（Klonら、２０００年、Biophys.J.、７９巻：（３号）、１６７９〜８７頁; Franceschiniら、１９８５年、J. Biol. Chem.、２６０巻：１６３２〜３５頁）、プロＡｐｏＡ−Ｉ  Ｐａｒｉｓおよび成熟ＡｐｏＡ−Ｉ  Ｐａｒｉｓ（Daumら、１９９９年、J.Mol. Med.、７７巻：６１４〜２２頁）、プロＡｐｏＡ−ＩＩおよび成熟ＡｐｏＡ−ＩＩ（Shelnessら、１９８５年、J. Biol. Chem.、２６０巻（１４号）：８６３７〜４６頁;Shelnessら、１９８４年、J. Biol. Chem.、２５９巻（１５号）：９９２９〜３５頁）、プロＡｐｏＡ−ＩＶおよび成熟ＡｐｏＡ−ＩＶ（Duvergerら、１９９１年、Euro.J. Biochem.、２０１巻（２号）：３７３〜８３頁）、ならびにプロＡｐｏＥおよび成熟ＡｐｏＥ（McLeanら、１９８３年、J. Biol. Chem.、２５８巻（１４号）：８９９３〜９０００頁）のホモ二量体およびヘテロ二量体（存在可能な場合）もまた、本発明の範囲内で用いることができる。
【０１６３】
特定の実施形態では、アポリポタンパク質が、その断片、変異体、またはアイソフォームであり得る。「断片」という用語は、アミノ酸配列が、天然のアポリポタンパク質のアミノ酸配列より短く、その断片が、脂質結合特性を含め、天然のアポリポタンパク質の活性を保持する、任意のアポリポタンパク質を指す。「変異体」とは、アポリポタンパク質のアミノ酸配列内における置換または変化を意味し、これらの置換または変化、例えば、アミノ酸残基の付加および欠失は、脂質結合特性を含め、天然のアポリポタンパク質の活性を消失させない。したがって、変異体は、本明細書に記載の天然アポリポタンパク質と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、１つ以上のアミノ酸残基が、化学的に類似のアミノ酸により保存的に置換されているタンパク質またはペプチドを含み得る。保存的置換の例には、イソロイシン、バリン、ロイシン、またはメチオニンなど、少なくとも１つの疎水性残基を別の疎水性残基に代えて置換することが含まれる。同様に、本発明は、例えば、アルギニンとリシンとの間、グルタミンとアスパラギンとの間、ならびにグリシンとセリンとの間など、少なくとも１つの親水性残基の置換も意図する（米国特許第６，００４，９２５号；同第６，０３７，３２３号；および同第６，０４６，１６６号を参照されたい）。「アイソフォーム」という用語は、機能が同じであるか、より高度であるか、または部分的であり、かつ、配列が類似であるか、同一であるか、または部分的であるタンパク質を指し、同じ遺伝子の産物の場合もあり、そうでない場合もあり、通常、組織特異的である（Weisgraber、１９９０年、J. Lipid Res.、３１巻（８号）：１５０３〜１１頁; HixsonおよびPowers、１９９１年、J.Lipid Res.、３２巻（９号）：１５２９〜３５頁; Lacknerら、１９８５年、J. Biol. Chem.、２６０巻（２号）：７０３〜６頁;Hoegら、１９８６年、J. Biol. Chem.、２６１巻（９号）：３９１１〜４頁; Gordonら、１９８４年、J. Biol. Chem.、２５９巻（１号）：４６８〜７４頁;Powellら、１９８７年、Cell、５０巻（６号）：８３１〜４０頁; Aviramら、１９９８年、Arterioscler. Thromb. Vase.Biol.、１８巻（１０号）：１６１７〜２４頁; Aviramら、１９９８年、J. Clin. Invest.、１０１巻（８号）：１５８１〜９０頁;Billeckeら、２０００年、Drug Metab. Dispos.、２８巻（１１号）：１３３５〜４２頁; Draganovら、２０００年、J. Biol.Chem.、２７５巻（４３号）：３３４３５〜４２頁; SteinmetzおよびUtermann、１９８５年、J. Biol. Chem.、２６０巻（４号）：２２５８〜６４頁;Widlerら、１９８０年、J. Biol. Chem.、２５５巻（２１号）：１０４６４〜７１頁; Dyerら、１９９５年、J. Lipid Res.、３６巻（１号）：８０〜８頁;Sacreら、２００３年、FEBS Lett.、５４０巻（１〜３号）：１８１〜７頁; Weersら、２００３年、Biophys. Chem.、１００巻（１〜３号）：４８１〜９２頁;Gongら、２００２年、J. Biol. Chem.、２７７巻（３３号）：２９９１９〜２６頁; Ohtaら、１９８４年、J. Biol. Chem.、２５９巻（２３号）：１４８８８〜９３頁；ならびに米国特許第６，３７２，８８６号を参照されたい）。
【０１６４】
特定の実施形態では、本発明の方法および組成物が、アポリポタンパク質のキメラ構築物の使用を包含する。例えば、アポリポタンパク質のキメラ構築物は、虚血再灌流に対する防御特性を含有するアポリポタンパク質ドメインと関連する、高度の脂質結合能を有するアポリポタンパク質ドメインを含み得る。アポリポタンパク質のキメラ構築物は、アポリポタンパク質内の個別領域を包含する構築物（すなわち、同種構築物）の場合もあり、異なるアポリポタンパク質間の個別領域を包含する構築物（すなわち、異種構築物）の場合もある。キメラ構築物を含む組成物はまた、アポリポタンパク質の変異体であるセグメントを包含する場合もあり、特定の特徴（例えば、脂質結合特性、受容体結合特性、酵素的特性、酵素活性化特性、抗酸化特性、または還元酸化特性）を有するようにデザインされたセグメントを包含する場合もある（Weisgraber、１９９０年、J. Lipid Res.、３１巻（８号）：１５０３〜１１頁; HixsonおよびPowers、１９９１年、J.Lipid Res.、３２巻（９号）：１５２９〜３５頁; Lacknerら、１９８５年、J. Biol. Chem.、２６０巻（２号）：７０３〜６頁;Hoegら、１９８６年、J. Biol. Chem.、２６１巻（９号）：３９１１〜４頁; Gordonら、１９８４年、J. Biol. Chem.、２５９巻（１号）：４６８〜７４頁;Powellら、１９８７年、Cell、５０巻（６号）：８３１〜４０頁; Aviramら、１９９８年、Arterioscler. Thromb. Vase.Biol.、１８巻（１０号）：１６１７〜２４頁; Aviramら、１９９８年、J. Clin. Invest.、１０１巻（８号）：１５８１〜９０頁;Billeckeら、２０００年、Drug Metab. Dispos.、２８巻（１１号）：１３３５〜４２頁; Draganovら、２０００年、J. Biol.Chem.、２７５巻（４３号）：３３４３５〜４２頁; SteinmetzおよびUtermann、１９８５年、J. Biol. Chem.、２６０巻（４号）：２２５８〜６４頁;Widlerら、１９８０年、J. Biol. Chem.、２５５巻（２１号）：１０４６４〜７１頁; Dyerら、１９９５年、J. Lipid Res.、３６巻（１号）：８０〜８頁;Sorensonら、１９９９年、Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol.、１９巻（９号）：２２１４〜２５頁;Palgunachari、１９９６年、Arterioscler. Throb. Vasc. Biol.、１６巻（２号）：３２８〜３８頁; Thurbergら、J.Biol. Chem.、２７１巻（１１号）：６０６２〜７０頁; Dyer、１９９１年、J. Biol. Chem.、２６６巻（２３号）：１５０００９〜１５頁;Hill、１９９８年、J. Biol. Chem.、２７３巻（４７号）：３０９７９〜８４頁を参照されたい）。
【０１６５】
本発明で用いられるアポリポタンパク質はまた、組換えアポリポタンパク質、合成アポリポタンパク質、半合成アポリポタンパク質、または精製アポリポタンパク質も包含する。本発明により用いられるアポリポタンパク質またはこれらの同等物を得る方法は、当技術分野において周知である。アポリポタンパク質は、例えば、密度勾配遠心分離または免疫アフィニティークロマトグラフィーにより、例えば、血漿または天然生成物から分離することもでき、合成により、半合成により、または当業者に公知の組換えＤＮＡ法を用いて作製することもできる（例えば、Mulugetaら、１９９８年、J. Chromatogr.、７９８巻（１〜２号）：８３〜９０頁; Chungら、１９８０年、J.Lipid Res.、２１巻（３号）：２８４〜９１頁; Cheungら、１９８７年、J. Lipid Res.、２８巻（８号）：９１３〜２９頁;Perssonら、１９９８年、J. Chromatogr.、７１１巻：９７〜１０９頁；米国特許第５，０５９，５２８号；同第５，８３４，５９６号；同第５，８７６，９６８号；および同第５，７２１，１１４；ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ８６／０４９２０号；および同第ＷＯ８７／０２０６２号を参照されたい）。
【０１６６】
本発明で用いられるアポリポタンパク質は、ＡｐｏＡ−Ｉ、ＡｐｏＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ（ＡｐｏＡ−ＩＭ）、ＡｐｏＡ−Ｉ  Ｐａｒｉｓ（ＡｐｏＡ−ＩＰ）、ＡｐｏＡ−ＩＩ、ＡｐｏＡ−ＩＶ、およびＡｐｏＥの活性を模倣するペプチドおよびペプチド類似体など、アポリポタンパク質のアゴニストをさらに包含する。例えば、アポリポタンパク質は、それらの内容が参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第６，００４，９２５号；同第６，０３７，３２３号；同第６，０４６，１６６号；および同第５，８４０，６８８号において記載されるアポリポタンパク質のうちのいずれかであり得る。
【０１６７】
アポリポタンパク質のアゴニストであるペプチドまたはペプチド類似体は、例えば、米国特許第６，００４，９２５号；同第６，０３７，３２３号；および同第６，０４６，１６６号において記載される技法を含め、当技術分野で公知のペプチドを合成するための任意の技法を用いて合成または製造することができる。例えば、ペプチドは、Merrifield（１９６３年、J. Am. Chem. Soc.、８５巻：２１４９〜２１５４頁）により最初に記載された固相合成法を用いて調製することができる。他のペプチド合成法は、Bodanszkyら、PeptideSynthesis、John Wiley & Sons、第２版（１９７６年）、ならびに当業者には容易に入手可能な他の参考文献において見出すことができる。ポリペプチド合成法の概要は、StuartおよびYoung、「SolidPhase Peptide. Synthesis」、Pierce Chemical Company、Rockford、Ill.（１９８４年）において見出すことができる。ペプチドはまた、「TheProteins」、第ＩＩ巻、第３版、Neurathら編、１０５〜２３７頁、Academic Press、New York、N.Y.（１９７６年）において記載される溶液法によって合成することもできる。異なるペプチド合成において用いるのに適切な保護基は、上述の教科書の他、McOmie、「ProtectiveGroups in Organic Chemistry」、Plenum Press、New York、N.Y.（１９７３年）において記載されている。本発明のペプチドはまた、例えば、アポリポタンパク質Ａ−Ｉの大半の部分から、化学的または酵素的に切断することによっても調製することができる。
【０１６８】
特定の実施形態では、アポリポタンパク質が、複数のアポリポタンパク質の混合物であり得る。一実施形態では、アポリポタンパク質が、同種混合物、すなわち、単一種類のアポリポタンパク質であり得る。別の実施形態では、アポリポタンパク質が、異種混合物、すなわち、２つ以上の異なるアポリポタンパク質の混合物であり得る。アポリポタンパク質の異種混合物の実施形態は、例えば、動物供給源に由来するアポリポタンパク質と、半合成供給源に由来するアポリポタンパク質との混合物を含み得る。特定の実施形態では、異種混合物が、例えば、ＡｐｏＡ−Ｉと、ＡｐｏＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏとの混合物を含み得る。特定の実施形態では、異種混合物が、例えば、ＡｐｏＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏと、ＡｐｏＡ−Ｉ  Ｐａｒｉｓとの混合物を含み得る。本発明の方法および組成物で用いるのに適する混合物は、当業者に明らかである。
【０１６９】
アポリポタンパク質が、天然の供給源から得られる場合、それは、植物供給源または動物供給源から得ることができる。アポリポタンパク質が、動物供給源から得られる場合、それは、任意の種に由来し得る。特定の実施形態では、アポリポタンパク質を、動物供給源から得ることができる。特定の実施形態では、アポリポタンパク質を、ヒト供給源から得ることができる。本発明の好ましい実施形態では、アポリポタンパク質が、それが投与される個体と同じ種に由来する。
他の成分
多くの実施形態では、本発明の脂質粒子に両親媒性脂質が包含される。「両親媒性脂質」とは、脂質材料の疎水性部分が疎水性相にむけて配向するのに対し、親水性部分は水性相にむけて配向する、任意の適切な材料を指す。このような化合物には、リン脂質、アミノ脂質、およびスフィンゴ脂質が含まれるがこれらに限定されない。代表的なリン脂質には、スフィンゴミエリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン、リソホスファチジルコリン、リソホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、またはジリノレイルホスファチジルコリンが含まれる。スフィンゴ脂質、グリコスフィンゴ脂質ファミリー、ジアシルグリセロール、およびβ−アシルオキシ酸など、他のリンを欠く化合物もまた用いることができる。加えて、このような両親媒性脂質は、トリグリセリドおよびステロールなど、他の脂質とも容易に混合することができる。
【０１７０】
プログラム可能な融合脂質もまた、本発明の脂質粒子内に組み込むのに適している。このような脂質粒子は、所与のシグナルイベントが生じるまでは、細胞膜と融合し、それらのペイロードを送達する傾向に乏しい。これは、生物または疾患部位への注射後、細胞との融合を開始する前に、脂質粒子が、より均一に分布することを可能とする。シグナルイベントは、例えば、ｐＨ、温度、イオン環境、または時間の変化であり得る。時間変化の場合、ＡＴＴＡ−脂質コンジュゲートまたはＰＥＧ−脂質コンジュゲートなど、融合遅延成分または融合「遮蔽」成分は、時間が経過すると、脂質粒子膜から単純に置換され得る。例示的な脂質アンカーには、長さが約Ｃ１４〜約Ｃ２２、好ましくは約Ｃ１４〜約Ｃ１６である脂質アンカーが含まれる。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分、例えば、ｍＰＥＧ−ＮＨ２が、約１０００、２０００、５０００、１０，０００、１５，０００、または２０，０００ドルトンのサイズである。
【０１７１】
核酸剤にコンジュゲートした脂質粒子はまた、標的化部分、例えば、細胞型または組織に特異的な標的化部分も包含し得る。リガンド、細胞表面受容体、糖タンパク質、ビタミン（例えば、リボフラビン）、およびモノクローナル抗体など、各種の標的化部分を用いる脂質粒子の標的化については、既に記載されている（例えば、米国特許第４，９５７，７７３号；および同第４，６０３，０４４号を参照されたい）。標的化部分は、全タンパク質を包含する場合もあり、その断片を包含する場合もある。標的化機構は一般に、標的化部分が、標的、例えば、細胞表面受容体との相互作用に利用可能であるような様式で、標的化剤（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）が脂質粒子の表面上に位置することを必要とする。例えば、Sapra, P.およびAllen, TM, Prog. Lipid Res.、４２巻（５号）：４３９〜６２頁（２００３年）;ならびにAbra,RMら、J. Liposome Res.、１２巻：１〜３頁（２００２年）において記載される標的化剤および標的化法を含め、当技術分野では、各種の異なる標的化剤および標的化法が公知であり、利用可能である。
【０１７２】
標的化のために、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖などの親水性ポリマー鎖による表面コーティングを伴う脂質粒子、すなわち、リポソームの使用が提起されている（Allenら、Biochimica et Biophysica Acta、１２３７巻：９９〜１０８頁（１９９５年）; DeFreesら、Journalof the American Chemistry Society、１１８巻：６１０１〜６１０４頁（１９９６年）; Blumeら、Biochimica etBiophysica Acta、１１４９巻：１８０〜１８４頁（１９９３年）; Klibanovら、Journal of Liposome Research、２巻：３２１〜３３４頁（１９９２年）；米国特許第５，０１３５５６号;Zalipsky、Bioconjugate Chemistry、４巻：２９６〜２９９頁（１９９３年）; Zalipsky、FEBS Letters、３５３巻：７１〜７４頁（１９９４年）;Zalipsky、「Stealth Liposomes」、第９章（LasicおよびMartin編）、CRC Press、Boca Raton、Fl（１９９５年））。一手法では、脂質粒子を標的とする、抗体などのリガンドを、脂質粒子を形成する脂質の極性ヘッド基に連結する。別の手法では、標的化リガンドを、親水性のポリマーコーティングを形成するＰＥＧ鎖の遠位端に結合させる（Klibanovら、Journalof Liposome Research、２巻：３２１〜３３４頁（１９９２年）; Kirpotinら、FEBS Letters、３８８巻：１１５〜１１８頁（１９９６年））。
【０１７３】
標的剤（ｔａｒｇｅｔ  ａｇｅｎｔ）に連結するには、標準的な方法を用いることができる。例えば、活性化させて標的剤を結合させ得るホスファチジルエタノールアミン、または脂質により誘導体化させたブレオマイシンなど、誘導体化した親油性化合物を用いることができる。抗体が標的とするリポソームは、例えば、プロテインＡを組み込むリポソームを用いて構築することができる（Renneisenら、J. Bio. Chem.、２６５巻：１６３３７〜１６３４２頁（１９９０年）；およびLeonettiら、Proc.Natl. Acad. Sci.（USA）、８７巻：２４４８〜２４５１頁（１９９０年）を参照されたい）。抗体コンジュゲート形成の他の例は、その教示が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，０２７，７２６号において開示されている。標的化部分の例にはまた、新生物または腫瘍と関連する抗原を含め、細胞の構成要素に特異的な他のタンパク質も含まれ得る。標的化部分として用いられるタンパク質は、共有結合を介してリポソームに結合させることができる（Heath、「CovalentAttachment of Proteins to Liposomes」、１４９巻、Methods in Enzymology、１１１〜１１９頁（AcademicPress, Inc.、１９８７年）を参照されたい）。他の標的化法には、ビオチン−アビジン系が含まれる。
核酸−脂質粒子の作製
一実施形態では、本発明の核酸−脂質粒子製剤は、押出し法またはインライン混合法により作製される。
【０１７４】
押出し法（また、予備成形法またはバッチ工程とも称する）は、まず、空のリポソーム（すなわち、核酸を伴わない）を調製した後に、該空のリポソームに核酸を添加することによる方法である。小孔を伴うポリカーボネート膜または非対称セラミック膜を介してリポソーム組成物を押し出すことにより、比較的明確なサイズ分布が結果として得られる。所望のリポソーム複合体のサイズ分布が達成されるまで、１または複数回にわたり膜を介して懸濁液を循環させることが典型的である。リポソームを逐次的により小さな小孔を伴う膜を介して押し出すことにより、リポソームのサイズを段階的に減少させることができる。場合によっては、形成される脂質−核酸組成物を、サイズを定めずに用いることもできる。これらの方法は、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、ＵＳ５，００８，０５０；ＵＳ４，９２７，６３７；ＵＳ４，７３７，３２３; Biochim Biophys Acta.、１９７９年１０月１９日、５５７巻（１号）：９〜２３頁; Biochim BiophysActa.、１９８０年１０月２日、６０１巻（３号）：５５９〜７頁; Biochim Biophys Acta.、１９８６年６月１３日、８５８巻（１号）：１６１〜８頁；およびBiochim.Biophys. Acta、１９８５年、８１２巻、５５〜６５頁において開示されている。
【０１７５】
インライン混合法とは、脂質および核酸の両方が、並行して混合チャンバー内へと添加される方法である。混合チャンバーは、単純なＴ型コネクターの場合も、当業者に公知の他の任意の混合チャンバーの場合もある得る。これらの方法は、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第６，５３４，０１８号；およびＵＳ６，８５５，２７７；米国特許公開第２００７／００４２０３１号；ならびにPharmaceuticals Research、２２巻、３号、２００５年３月、３６２〜３７２頁において開示されている。
【０１７６】
本発明の製剤は、当業者に公知の任意の方法により調製し得ることがさらに理解される。
核酸−脂質粒子の特徴付け
標準的な方法または押出しを伴わない方法により調製される製剤も、同様の方法で特徴付けることができる。例えば、目視検査により製剤を特徴付けることが典型的である。製剤は、凝集または沈殿を伴わない、白色がかった半透明の溶液であるものとする。脂質ナノ粒子の粒径および粒径分布は、例えば、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（米国、Ｍａｌｖｅｒｎ社製）を用いる光散乱法により測定することができる。粒子は、４０〜１００ｎｍなど、約２０〜３００ｎｍのサイズであるものとする。粒径分布は、単峰性であるものとする。製剤中の他、封入画分中における全ｓｉＲＮＡ濃度も、色素排除アッセイを用いて推定する。製剤化されたｓｉＲＮＡ試料は、製剤を崩壊させる界面活性剤、例えば、０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００の存在または不在下において、Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製）などのＲＮＡ結合色素と共にインキュベートすることができる。製剤中における全ｓｉＲＮＡは、界面活性剤を含有する試料からのシグナルを、標準曲線と比べることにより決定することができる。封入画分は、「遊離」ｓｉＲＮＡ含量（界面活性剤の不在下におけるシグナルにより測定される）を、全ｓｉＲＮＡ含量から減じることにより決定される。封入ｓｉＲＮＡの百分率は、＞８５％であることが典型的である。一実施形態では、本発明の製剤が、少なくとも７５％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％封入される。
【０１７７】
核酸−脂質粒子製剤の場合、粒子サイズは、少なくとも３０ｎｍ、少なくとも４０ｎｍ、少なくとも５０ｎｍ、少なくとも６０ｎｍ、少なくとも７０ｎｍ、少なくとも８０ｎｍ、少なくとも９０ｎｍ、少なくとも１００ｎｍ、少なくとも１１０ｎｍ、ならびに少なくとも１２０ｎｍである。適切な範囲は、少なくとも約５０ｎｍ〜少なくとも約１１０ｎｍ、少なくとも約６０ｎｍ〜少なくとも約１００ｎｍ、または少なくとも約８０ｎｍ〜少なくとも約９０ｎｍであることが典型的である。
核酸−脂質粒子の製剤化
ＬＮＰ０１
核酸−脂質粒子合成の一例は、以下の通りである。リピドイドであるＮＤ９８・４ＨＣｌ（分子量１４８７）（式１）、コレステロール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）、およびＰＥＧ−セラミドＣ１６（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ社製）を用いて核酸−脂質粒子を合成する。この核酸−脂質粒子は、場合によって、ＬＮＰ０１粒子とも称する。エタノール中における各々の原液は、以下：ＮＤ９８、１３３ｍｇ／ｍｌ；コレステロール、２５ｍｇ／ｍｌ；ＰＥＧ−セラミドＣ１６、１００ｍｇ／ｍｌの通りに調製することができる。次いで、ＮＤ９８、コレステロール、およびＰＥＧ−セラミドＣ１６の原液を、例えば、４２：４８：１０のモル比で混合することができる。最終エタノール濃度を約３５〜４５％とし、最終酢酸ナトリウム濃度を約１００〜３００ｍＭとするように、混合脂質溶液を、ｓｉＲＮＡ水溶液（例えば、ｐＨ５の酢酸ナトリウム中）と混合することができる。混合すると、脂質−ｓｉＲＮＡナノ粒子が自発的に形成されることが典型的である。所望の粒径分布に応じて、例えば、Ｌｉｐｅｘ  Ｅｘｔｒｕｄｅｒ（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｌｉｐｉｄｓ社製）などのサーモバレル型押出し器を用いて、結果として得られるナノ粒子混合物を、ポリカーボネート膜（例えば、１００ｎｍのカットオフ）を介して押し出すことができる。場合によっては、押出し工程を省くこともできる。エタノールの除去、ならびにこれと同時に行われる緩衝剤の置換は、例えば、透析またはタンジェンシャルフロー濾過により達成することができる。緩衝剤は、約ｐＨ７、例えば、約ｐＨ６．９、約ｐＨ７．０、約ｐＨ７．１、約ｐＨ７．２、約ｐＨ７．３、または約ｐＨ７．４の、例えば、リン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）により置換することができる。
【０１７８】
【化２】
0006032724.tif 000012
ＬＮＰ０１製剤は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、国際出願公開第ＷＯ２００８／０４２９７３号において記載されている。
【０１７９】
さらなる例示的な核酸−脂質粒子製剤を、以下の表に記載する。表における核酸−脂質粒子の名称は、限定的であることを意図するものではないことを理解されたい。例えば、本明細書で用いられるＳＮＡＬＰという用語は、陽イオン性脂質ＤＬｉｎＤＭＡを包含する製剤を指す。
【０１８０】
【表４−１】
0006032724.tif 000013
【０１８１】
【表４−２】
0006032724.tif 000014
ＸＴＣを含む製剤は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、２００９年９月３日に出願された、米国仮出願第６１／２３９，６８６号において記載されている。
【０１８２】
ＭＣ３を含む製剤は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、２００９年９月２２日に出願された、米国仮出願第６１／２４４，８３４号；ならびに、２００９年６月１０日に出願された米国仮出願第６１／１８５，８００号において記載されている。
【０１８３】
ＡＬＮＹ−１００を含む製剤は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、２００９年１１月１０日に出願された、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０９／６３９３３号において記載されている。
【０１８４】
さらなる代表的な製剤を、表２５および２６に示す。「脂質」とは、陽イオン性脂質を指す。
【０１８５】
【表５−１】
0006032724.tif 000015
【０１８６】
【表５−２】
0006032724.tif 000016
【０１８７】
【表５−３】
0006032724.tif 000017
【０１８８】
【表５−４】
0006032724.tif 000018
【０１８９】
【表６−１】
0006032724.tif 000019
【０１９０】
【表６−２】
0006032724.tif 000020
陽イオン性脂質の合成
本発明の核酸−脂質粒子で用いられる任意の化合物、例えば、陽イオン性脂質などは、実施例においてより詳細に記載される方法を含めた、公知の有機合成法により調製することができる。別段に示さない限り、すべて置換基は、以下で定義される通りである。
【０１９１】
「アルキル」とは、１〜２４の炭素原子を含有する、直鎖状または分枝状、非環状または環状の飽和脂肪族炭化水素を意味する。代表的な直鎖状飽和アルキルには、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシルなどが含まれるのに対し；代表的な分枝状飽和アルキルには、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソペンチルなどが含まれる。代表的な環状飽和アルキルには、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルなどが含まれるのに対し；代表的な環状不飽和アルキルには、シクロペンテニルおよびシクロヘキセニルなどが含まれる。
【０１９２】
「アルケニル」とは、上記で定義したアルキルであって、隣接する炭素原子間において少なくとも１つの二重結合を含有するアルキルを意味する。アルケニルは、ｃｉｓ異性体およびｔｒａｎｓ異性体の両方を包含する。代表的な直鎖状アルケニルおよび分枝状アルケニルには、エチレニル、プロピレニル、１−ブテニル、２−ブテニル、イソブチレニル、１−ペンテニル、２−ペンテニル、３−メチル−１−ブテニル、２−メチル−２−ブテニル、２，３−ジメチル−２−ブテニルなどが含まれる。
【０１９３】
「アルキニル」とは、上記で定義した任意のアルキルまたはアルケニルであって、隣接する炭素間において少なくとも１つの三重結合をさらに含有するアルキルまたはアルケニルを意味する。代表的な直鎖状アルキニルおよび分枝状アルキニルには、アセチレニル、プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、１−ペンチニル、２−ペンチニル、３−メチル−１−ブチニルなどが含まれる。
【０１９４】
「アシル」とは、結合点における炭素が、以下で定義されるオキソ基により置換されている、任意のアルキル、アルケニル、またはアルキニルを意味する。例えば、−Ｃ（＝Ｏ）アルキル、−Ｃ（＝Ｏ）アルケニル、および−Ｃ（＝Ｏ）アルキニルは、アシル基である。
【０１９５】
「ヘテロ環」とは、５〜７員の単環式飽和ヘテロ環式環、５〜７員の単環式不飽和ヘテロ環式環、もしくは５〜７員の単環式芳香族ヘテロ環式環、または７〜１０員の二環式飽和ヘテロ環式環、７〜１０員の二環式不飽和ヘテロ環式環、もしくは７〜１０員の二環式芳香族ヘテロ環式環を意味し、窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される１つまたは２つのヘテロ原子を含有し、該窒素および硫黄のヘテロ原子が、必要に応じて酸化され得、該窒素のヘテロ原子が、必要に応じて、上記ヘテロ環のうちのいずれかがベンゼン環へと縮合される二環式環を含め、四級化され得る。ヘテロ環は、任意のヘテロ原子または炭素原子を介して結合し得る。ヘテロ環には、以下で定義されるヘテロアリールが含まれる。ヘテロ環には、モルホリニル、ピロリジノニル、ピロリジニル、ピペリジニル（piperidinyl）、ピペリジニル（piperizynyl）、ヒダントイニル、バレロラクタミル、オキシラニル、オキセタニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロピリジニル、テトラヒドロピリミジニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオピラニル、テトラヒドロピリミジニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオピラニルなどが含まれる。
【０１９６】
「必要に応じて置換されるアルキル」、「必要に応じて置換されるアルケニル」、「必要に応じて置換されるアルキニル」、「必要に応じて置換されるアシル」、ならびに「必要に応じて置換されるヘテロ環」という用語は、置換されるとき、少なくとも１つの水素原子が置換基により置換されることを意味する。オキソ置換基（＝Ｏ）の場合は、２つの水素原子が置換される。この点で、置換基には、オキソ、ハロゲン、ヘテロ環、−ＣＮ、−ＯＲｘ、−ＮＲｘＲｙ、−ＮＲｘＣ（＝Ｏ）Ｒｙ、−ＮＲｘＳＯ２Ｒｙ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｘ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｘ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｘＲｙ、−ＳＯｎＲｘ、および−ＳＯｎＮＲｘＲｙ［式中、ｎは０、１、または２であり、ＲｘおよびＲｙは、同じであるかまたは異なり、独立して水素、アルキル、またはヘテロ環であり、前記アルキル置換基およびヘテロ環置換基の各々は、オキソ、ハロゲン、−ＯＨ、−ＣＮ、アルキル、−ＯＲｘ、ヘテロ環、−ＮＲｘＲｙ、−ＮＲｘＣ（＝Ｏ）Ｒｙ、−ＮＲｘＳＯ２Ｒｙ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｘ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｘ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｘＲｙ、−ＳＯｎＲｘ、および−ＳＯｎＮＲｘＲｙのうちの１つ以上によりさらに置換され得る］が含まれる。
【０１９７】
「ハロゲン」とは、フルオロ、クロロ、ブロモ、およびヨードを意味する。
【０１９８】
一部の実施形態では、本発明の方法が、保護基の使用を必要とし得る。保護基法は、当業者に周知である（例えば、「Protective Groups in Organic Synthesis」、Green, T.W.ら、Wiley-Interscience、NewYork City、１９９９年を参照されたい）。略述すると、本発明の文脈における保護基とは、官能基の望ましくない反応性を低減するかまたは消失させる任意の基である。官能基に保護基を付加して、特定の反応中におけるその反応性を遮蔽し、次いで、これを除去して、元の官能基を露出させる。一部の実施形態では、「アルコール保護基」を用いる。「アルコール保護基」とは、アルコール官能基の望ましくない反応性を低減するかまたは消失させる任意の基である。保護基は、当技術分野において周知の技法を用いて付加および除去することができる。
式Ａの合成
一実施形態では、本発明の核酸−脂質粒子が、式Ａの陽イオン性脂質：
【０１９９】
【化３】
0006032724.tif 000021
［式中、Ｒ１およびＲ２は、独立して、アルキル、アルケニル、またはアルキニルであり、各々は、必要に応じて、置換することが可能であり、Ｒ３およびＲ４は、独立して、低級アルキルであるか、またはＲ３およびＲ４が一緒になって、必要に応じて置換されるヘテロ環を形成することができる］を用いて製剤化される。一部の実施形態では、陽イオン脂質が、ＸＴＣ（２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン）である。一般に、上記の式Ａの脂質は、以下の反応スキーム１または２（別段に示さない限り、すべての置換基は、上記で定義した通りである）により作製することができる。
【０２００】
スキーム１
【０２０１】
【化４】
0006032724.tif 000022
Ｒ１およびＲ２が、独立してアルキル、アルケニル、またはアルキニルであり、各々が、必要に応じて置換されていてもよく、Ｒ３およびＲ４が、独立して低級アルキルであるか、またはＲ３およびＲ４が一緒になって、必要に応じて置換されるヘテロ環式環を形成し得る脂質Ａは、スキーム１により調製することができる。ケトン１および臭化物２は、購入することもでき、当業者に公知の方法により調製することもできる。１と２とを反応させることにより、ケタール３が得られる。ケタール３をアミン４で処理することにより、式Ａの脂質が得られる。式Ａの脂質は、式５の有機塩［式中、Ｘは、ハロゲン、水酸化物イオン、ホスフェート、サルフェートなどから選択される対陰イオン（ａｎｉｏｎ  ｃｏｕｎｔｅｒ  ｉｏｎ）である］により、対応するアンモニウム塩へと転換させることができる。
【０２０２】
スキーム２
【０２０３】
【化５】
0006032724.tif 000023
代替的に、出発材料であるケトン１は、スキーム２により調製することができる。グリニャール試薬６およびシアン化物７は、購入することもでき、当業者に公知の方法により調製することもできる。６と７とを反応させることにより、ケトン１が得られる。ケトン１を、対応する式Ａの脂質へと転換させる反応は、スキーム１で記載した通りである。
ＭＣ３の合成
ＤＬｉｎ−Ｍ−Ｃ３−ＤＭＡ（すなわち、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノエート）の調製は、以下の通りであった。ジクロロメタン（５ｍＬ）中における（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−オール（０．５３ｇ）、４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ酪酸ヒドロクロリド（０．５１ｇ）、４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（０．６１ｇ）、および１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロリド（０．５３ｇ）の溶液を、室温で一晩にわたり撹拌した。該溶液を希塩酸で洗浄の後、重炭酸ナトリウム希釈水溶液により洗浄した。有機画分を、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、回転式蒸発器（ｒｏｔｏｖａｐ）で溶媒を除去した。残留物を、１〜５％のメタノール／ジクロロメタン溶出勾配を用いたシリカゲルカラム（２０ｇ）にかけて流過させた。精製された生成物を含有する画分を混合し、溶媒を除去することにより、無色の油（０．５４ｇ）が得られた。
ＡＬＮＹ−１００の合成
ケタール５１９［ＡＬＮＹ−１００］の合成は、以下のスキーム３：
スキーム３
【０２０４】
【化６】
0006032724.tif 000024
を用いて実施した。
５１５の合成：
２つ口丸底フラスコ（ＲＢＦ）（１Ｌ）内の２００ｍｌ  無水ＴＨＦ中におけるＬｉＡｌＨ４（３．７４ｇ、０．０９８５２モル）の撹拌懸濁液に、７０ｍＬのＴＨＦ中における５１４（１０ｇ、０．０４９２６モル）の溶液を、０℃の窒素雰囲気下でゆっくりと添加した。添加が完了した後に、反応混合物を室温まで温め、次いで、４時間にわたり加熱して還流させた。反応の進行は、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によりモニタリングした。反応が完了した後に（ＴＬＣによる）、混合物を０℃まで冷却し、飽和Ｎａ２ＳＯ４溶液を注意深く添加することによりクエンチした。反応混合物を室温で４時間にわたり撹拌し、濾過した。残留物を、ＴＨＦにより十分に洗浄した。濾過物および洗浄物を混合し、４００ｍＬのジオキサンおよび２６ｍＬの濃ＨＣｌにより希釈し、室温で２０分間にわたり撹拌した。真空下で揮発物を除去して、白色固体としての５１５の塩酸塩を得た。収量：７．１２ｇ。1H-NMR (DMSO, 400MHz): δ= 9.34 (広幅, 2H), 5.68 (s, 2H), 3.74 (m, 1H),2.66-2.60 (m, 2H), 2.50-2.45 (m, 5H).
５１６の合成：
２５０ｍＬの２つ口ＲＢＦ内の１００ｍＬ乾燥ＤＣＭ中における化合物５１５の撹拌溶液に、ＮＥｔ３（３７．２ｍＬ、０．２６６９モル）を添加し、窒素雰囲気下で０℃まで冷却した。５０ｍｌの乾燥ＤＣＭ中にＮ−（ベンジルオキシ−カルボニルオキシ）−スクシンイミド（２０ｇ、０．０８００７モル）をゆっくりと添加した後に、反応混合物を室温まで温めた。反応が完了した後に（ＴＬＣにより２〜３時間）、混合物を１Ｎ  ＨＣｌ溶液（１００ｍＬで１回）および飽和ＮａＨＣＯ３溶液（５０ｍＬで１回）により逐次洗浄した。次いで、有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、溶媒を蒸発させて粗物質を得、これを、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、粘着性の塊としての５１６を得た。収量：１１ｇ（８９％）。1H-NMR (CDCl3, 400MHz): δ = 7.36-7.27(m, 5H), 5.69 (s, 2H), 5.12 (s,2H), 4.96 (br., 1H) 2.74 (s, 3H), 2.60(m, 2H), 2.30-2.25(m, 2H).ＬＣ−ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］：２３２．３（９６．９４％）。
５１７Ａおよび５１７Ｂの合成：
５００ｍＬの１つ口ＲＢＦ内の２２０ｍＬアセトンおよび水（１０：１）の溶液中にシクロペンテンである５１６（５ｇ、０．０２１６４モル）を溶解させ、これに、室温で、Ｎ−メチルモルホリン−Ｎ−オキシド（N-methyl morpholine-N-oxide）（７．６ｇ、０．０６４９２モル）を添加した後、ｔｅｒｔ−ブタノール中のＯｓＯ４の７．６％溶液（０．２７５ｇ、０．００１０８モル）４．２ｍＬを添加した。反応（約３時間）が完了した後、固体のＮａ２ＳＯ３を添加することにより混合物をクエンチし、結果として得られる混合物を、室温で１．５時間にわたり撹拌した。反応混合物を、ＤＣＭ（３００ｍＬ）で希釈し、水（１００ｍＬで２回）で洗浄した後、飽和ＮａＨＣＯ３溶液（５０ｍＬで１回）、水（３０ｍＬで１回）、ならびに最後にブライン（５０ｍＬで１回）で洗浄した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、真空中で溶媒を除去した。この粗物質を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、ジアステレオマーの混合物を得、これを、調製用ＨＰＬＣにより分離した。収量：６ｇの粗５１７Ａ：ピーク１（白色の固体）、５．１３ｇ（９６％）。1H-NMR(DMSO, 400MHz): δ= 7.39-7.31(m, 5H), 5.04(s, 2H), 4.78-4.73 (m, 1H),4.48-4.47(d, 2H), 3.94-3.93(m, 2H), 2.71(s, 3H), 1.72- 1.67(m, 4H).ＬＣ−ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］：２６６．３、［Ｍ＋ＮＨ４＋］：２８３．５が存在、ＨＰＬＣ：９７．８６％。Ｘ線により立体化学を確認した。
５１８の合成：
化合物５０５の合成について記載した手順と同様の手順を用いて、化合物５１８（１．２ｇ、４１％）を、無色の油として得た。1H-NMR (CDCl3, 400MHz): δ= 7.35-7.33(m, 4H), 7.30-7.27(m, 1H),5.37-5.27(m, 8H), 5.12(s, 2H), 4.75(m,1H), 4.58-4.57(m,2H), 2.78-2.74(m,7H),2.06-2.00(m,8H), 1.96-1.91(m, 2H), 1.62(m, 4H), 1.48(m, 2H), 1.37-1.25(br m,36H), 0.87(m, 6H).ＨＰＬＣ：９８．６５％。
化合物５１９を合成するための一般的な手順：
ヘキサン（１５ｍＬ）中の化合物５１８溶液（１等量）を、ＴＨＦ中の氷冷ＬＡＨ溶液（１Ｍ、２等量）へと滴下する形で添加した。添加が完了した後に、混合物を、４０℃で０．５時間にわたり加熱し、次いで、氷浴上において再度冷却した。飽和Ｎａ２ＳＯ４水溶液により混合物を注意深く加水分解し、次いで、セライトを介して濾過し、油へと還元した。カラムクロマトグラフィーにより、無色の油として得られる純粋な５１９（１．３ｇ、６８％）がもたらされた。13C NMR δ = 130.2, 130.1 (x2), 127.9 (x3), 112.3, 79.3, 64.4, 44.7,38.3, 35.4, 31.5, 29.9 (x2), 29.7, 29.6 (x2), 29.5 (x3), 29.3 (x2), 27.2 (x3),25.6, 24.5, 23.3, 226, 14.1;エレクトロスプレーＭＳ（＋ｖｅ）：Ｃ４４Ｈ８０ＮＯ２（Ｍ＋Ｈ）＋の分子量：計算値６５４．６、測定値６５４．６。
治療剤−脂質粒子組成物および製剤
本発明の脂質粒子と、該脂質粒子と会合させた活性作用物質とを含む組成物を、本発明は包含する。具体的な実施形態では、活性作用物質が、治療剤である。具体的な実施形態では、活性作用物質を、脂質粒子の水性の内部に封入する。他の実施形態では、活性作用物質を、脂質粒子の１つ以上の脂質層内に存在させる。他の実施形態では、活性作用物質を、脂質粒子の外部または内部の脂質表面に結合させる。
【０２０５】
本明細書で用いられる「完全封入」とは、粒子内の核酸が、遊離ＤＮＡを大幅に分解する血清またはヌクレアーゼアッセイへの曝露後においてもそれほど分解されないことを示す。完全封入系では、通常は遊離核酸の１００％を分解する処理において、粒子内核酸（ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）のうちで分解されるのが好ましくは２５％未満であり、粒子内核酸のうちで分解されるのがより好ましくは１０％未満であり、最も好ましくは５％未満である。代替的に、完全封入は、Ｏｌｉｇｒｅｅｎ（登録商標）アッセイにより決定することができる。Ｏｌｉｇｒｅｅｎ（登録商標）とは、溶液中におけるオリゴヌクレオチドおよび一本鎖ＤＮＡを定量化するための、核酸用超高感度蛍光染料である（カリフォルニア州、カールスバード、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から入手可能である）。完全封入はまた、粒子が血清中において安定であること、すなわち、ｉｎ  ｖｉｖｏで投与しても、粒子が、それらの構成要素部分へと即座には分解されないことも示唆する。
【０２０６】
本明細書で用いられる活性作用物質は、細胞、組織、器官、または被験体に対して所望の効果を及ぼすことが可能な任意の分子または化合物を包含する。このような効果は、例えば、生物学的な場合もあり、生理学的な場合もあり、美容的な場合もある。活性作用物質は、例えば、核酸、ペプチド、ならびに、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、抗体断片；ヒト化抗体、組換え抗体、組換えヒト抗体、およびＰｒｉｍａｔｉｚｅｄ（商標）抗体などの抗体；サイトカイン、増殖因子、アポトーシス因子、分化誘導因子、細胞表面受容体およびそれらのリガンド；ホルモン；ならびに有機低分子または有機低分子化合物を含めた低分子などを含めたポリペプチドを含めた、任意の種類の分子または化合物であり得る。
【０２０７】
一実施形態では、活性作用物質が、治療剤、またはその塩もしくは誘導体である。治療剤の誘導体は、それ自体が治療的に有効な場合もあり、さらなる改変を受けると活性となるプロドラッグの場合もある。したがって、一実施形態では、治療剤の誘導体が、非改変薬剤と比較して治療活性の一部または全部を保持するのに対し、別の実施形態では、治療剤の誘導体が、治療活性を欠く。
【０２０８】
各種の実施形態では、抗炎症性化合物、抗うつ剤、刺激剤、鎮痛剤、抗生剤、出産制御薬、解熱剤、血管拡張剤、抗脈管形成剤、細胞血管剤、シグナル伝達阻害剤、心血管薬、例えば、抗不整脈剤、血管収縮剤、ホルモン、およびステロイドなど、治療的に有効な任意の薬剤または薬物が治療剤に含まれる。
【０２０９】
特定の実施形態では、治療剤が、抗腫瘍薬、抗癌薬、腫瘍薬、抗新生物剤などとも称し得る癌治療薬（ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ｄｒｕｇ）である。本発明により用い得る癌治療薬の例には、アドリアマイシン、アルケラン、アロプリノール、アルトレタミン、アミフォスチン、アナストロゾール、ａｒａＣ、三酸化ヒ素、アザチオプリン、ベキサロテン、ｂｉＣＮＵ、ブレオマイシン、静脈内ブスルファン、経口ブスルファン、カペシタビン（Ｘｅｌｏｄａ）、カルボプラチン、カルムスチン、ＣＣＮＵ、セレコキシブ、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、シクロスポリンＡ、シタラビン、シトシンアラビノシド、ダウノルビシン、シトキサン、ダウノルビシン、デキサメタゾン、デクスラゾキサン、ドセタキセル（dodetaxel）、ドキソルビシン、ドキソルビシン、ＤＴＩＣ、エピルビシン、エストラムスチン、リン酸エトポシド、エトポシドおよびＶＰ−１６、エキセメスタン、ＦＫ５０６、フルダラビン、フルオロウラシル、５−ＦＵ、ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ）、ゲムツズマブ−オゾガマイシン、酢酸ゴセレリン、ハイドレア、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イホスファミド、メシル酸イマチニブ、インターフェロン、イリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓｔａｒ、ＣＰＴ−１１１）、レトロゾール、ロイコボリン、ロイスタチン、ロイプロリド、レバミゾール、アリトレチノイン（litretinoin）、メガストロール、メルファラン、Ｌ−ＰＡＭ、メスナ、メトトレキサート、メトキサレン、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトザントロン、窒素マスタード、パクリタキセル、パミドロネート、Ｐｅｇａｄｅｍａｓｅ、ペントスタチン、ポルフィマーナトリウム、プレドニゾン、リツキサン、ストレプトゾシン、ＳＴＩ−５７１、タモキシフェン、タキソテーレ、テモゾロミド（temozolamide）、テニポシド、ＶＭ−２６、トポテカン（Ｈｙｃａｍｔｉｎ）、トレミフェン、トレチノイン、ＡＴＲＡ、バルルビシン、ベルバン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ＶＰ１６、およびビノレルビンが含まれるがこれらに限定されない。本発明により用い得る他の癌治療薬の例は、エリプチシンおよびエリプチシン類似体またはエリプチシン誘導体、エポチロン、細胞内キナーゼ阻害剤およびカンプトテシンである。
【０２１０】
他の製剤
エマルジョン
本発明の組成物は、エマルジョンとして調製および製剤化することができる。典型的にはエマルジョンは、通常直径０．１μｍを超える液滴の形態で別の液体中に分散した一液体の不均質系である（Idson、in Pharmaceutical Dosage Forms、Lieberman、Rieger andBanker(eds.)、１９８８年、Marcel Dekker、Inc., New York、N.Y.１巻、１９９頁、Rosoff、inPharmaceutical Dosage Forms、Lieberman、Rieger and Banker(eds.)、１９８８年、MarcelDekker、Inc., New York、N.Y.１巻、２４５頁、Block、in Pharmaceutical Dosage Forms、Lieberman、Riegerand Banker(eds.)、１９８８年、Marcel Dekker、Inc., New York、N.Y.２巻、３３５頁、Higuchiら、inRemington's Pharmaceutical Sciences、Mack Publishing Co.、Easton、Pa.、１９８５年、３０１頁）。エマルジョンは、完全に混合し互いに分散した２つの不溶性液相を含む二相系であることが多い。一般にエマルジョンは、油中水型（ｗ／ｏ）または水中油型（ｏ／ｗ）のいずれかであってよい。水相が細かく分かれ、バルク油相に微細液滴として分散するとき、生成する組成物は油中水型（ｗ／ｏ）エマルジョンと呼ばれる。あるいは、油相が細かく分かれ、バルク水相に微細液滴として分散するとき、生成する組成物は水中油型（ｏ／ｗ）エマルジョンと呼ばれる。エマルジョンは、分散相、および水相、油相のいずれか中に溶液として、またはそれ自体が分離相として存在し得る活性薬剤以外に、他の構成要素を含有することができる。乳化剤、安定剤、色素、および抗酸化剤などの薬学的賦形剤も、必要に応じてエマルジョン中に存在してよい。薬学的エマルジョンは、例えば油中水中油型（ｏ／ｗ／ｏ）エマルジョンおよび水中油中水型（ｗ／ｏ／ｗ）エマルジョンの場合など、２相より多くから構成される多層エマルジョンであってもよい。このような複合体製剤は、単純２層エマルジョンが与えない特定の利点を与えることが多い。ｏ／ｗエマルジョンの個々の油滴が小さな水滴を封入する多層エマルジョンはｗ／ｏ／ｗエマルジョンを構成する。同様に、油連続相中で安定化した水の小滴中に封入された油滴の系はｏ／ｗ／ｏエマルジョンをもたらす。
【０２１１】
エマルジョンが、熱力学的安定性によって特徴付けられることは、ほとんどまたは全くない。しばしば、エマルジョンの分散相または不連続相は外部相または連続相に十分分散し、乳化剤または製剤の粘性によってこの形態で維持される。エマルジョン系軟膏基剤およびクリームの場合と同様に、エマルジョン相のいずれかは半固体または固体であってよい。エマルジョンを安定化する他の手段は、エマルジョンのいずれかの相に取り込むことができる乳化剤の使用を伴う。乳化剤は４つのカテゴリー、合成界面活性剤、天然乳化剤、吸収基剤、および微細分散固体に広く分類することができる（Idson、in Pharmaceutical Dosage Forms、Lieberman、Rieger andBanker(Eds.)、１９８８年、Marcel Dekker、Inc., New York、N.Y.１巻、１９９頁）。
【０２１２】
表面活性剤としても公知である合成界面活性剤は、エマルジョンの製剤化において広い適用性が見出されており、文献中に総説されている（Rieger、in Pharmaceutical Dosage Forms、Lieberman、Rieger andBanker(Eds.)、１９８８年、Marcel Dekker、Inc., New York、N.Y.１巻、２８５頁、Idson、inPharmaceutical Dosage Forms、Lieberman、Rieger and Banker(Eds.)、１９８８年、MarcelDekker、Inc., New York、N.Y.１巻、１９９頁）。界面活性剤は典型的には両親媒性であり、親水性および疎水性部分を含む。界面活性剤の親水性と疎水性の割合は親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）と呼ばれており、製剤の調製において界面活性剤を分類および選択する際の貴重なツールである。界面活性剤は、親水性基：非イオン性、アニオン性、カチオン性および両性の性質に基づいて異なるクラスに分類することができる（Rieger、inPharmaceutical Dosage Forms、Lieberman、Rieger and Banker(Eds.)、１９８８年、MarcelDekker、Inc., New York、N.Y.１巻、２８５頁）。
【０２１３】
エマルジョン製剤において使用する天然乳化剤には、ラノリン、ビーズワックス、ホスファチド、レシチンおよびアカシアがある。無水ラノリンおよび親水ワセリンなどの吸収基剤は親水性を有し、したがって、その半固体の粘稠度を保持しながら、それらを水に浸漬してｗ／ｏエマルジョンを形成することができる。微細分散固体も、特に界面活性剤と組み合わせて、および粘性調製物において優れた乳化剤として使用されている。これらは、重金属水酸化物などの極性無機固体、ベントナイト、アタパルジャイト、ヘクトライト、カオリン、モンモリロナイト、コロイド状ケイ酸アルミニウムおよびコロイド状ケイ酸マグネシウムアルミニウムなどの非膨潤性粘土、色素および炭素またはグリセリルトリステアレートなどの無極性固体を含む。
【０２１４】
広く様々な非乳化剤物質もエマルジョン製剤中に含まれ、エマルジョンの性質に貢献する。これらは、脂肪、油、ワックス、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪エステル、保水剤、親水性コロイド、防腐剤および抗酸化剤を含む（Block、in Pharmaceutical Dosage Forms、Lieberman、Rieger and Banker(Eds.)、１９８８年、MarcelDekker、Inc., New York、N.Y.１巻、３３５頁、Idson、in Pharmaceutical Dosage Forms、Lieberman、Riegerand Banker(Eds.)、１９８８年、Marcel Dekker、Inc., New York、N.Y.１巻、１９９頁）。
【０２１５】
親水性コロイドまたはハイドロコロイドには、多糖（例えば、アカシア、寒天、アルギン酸、カラギーナン、ガーゴム、カラヤゴム、およびトラガカント）、セルロース誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロースおよびカルボキシプロピルセルロース）、および合成ポリマー（例えば、カルボマー、セルロースエーテル、およびカルボキシビニルポリマー）などの、天然ゴムおよび合成ポリマーが挙げられる。これらは水中で分散または膨潤して、分散相液滴周辺に強力な界面薄膜を形成し、外部相の粘性を増大することによってエマルジョンを安定状態にするコロイド溶液を形成する。
【０２１６】
エマルジョンは、微生物の増殖を容易にサポートすることができる、炭水化物、タンパク質、ステロールおよびホスファチドなどのいくつかの成分を含有することが多いので、これらの製剤は防腐剤を取り込むことが多い。エマルジョン製剤中に含まれ一般に使用される防腐剤には、メチルパラベン、プロピルパラベン、第四級アンモニウム塩、塩化ベンザルコニウム、ｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステル、およびホウ酸が挙げられる。製剤の劣化を予防するために、抗酸化剤も一般にエマルジョン製剤に加える。使用する抗酸化剤は、トコフェロール、没食子酸アルキル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエンなどのフリーラジカルスカベンジャー、またはアスコルビン酸およびメタ重亜硫酸ナトリウムなどの還元剤、およびクエン酸、酒石酸、およびレシチンなどの抗酸化相乗剤であってよい。
【０２１７】
皮膚、経口および非経口経路によるエマルジョン製剤の適用例、およびそれらを製造するための方法は、文献中に総説されている（Idson、in Pharmaceutical Dosage Forms、Lieberman、Rieger andBanker(Eds.)、１９８８年、Marcel Dekker、Inc., New York、N.Y.１巻、１９９頁）。経口送達用のエマルジョン製剤は、製剤化の容易さ、ならびに吸収および生物学的利用能の観点からの有効性のため、非常に広く使用されている（Rosoff、inPharmaceutical Dosage Forms、Lieberman、Rieger and Banker(Eds.)、１９８８年、MarcelDekker、Inc., New York、N.Y.１巻、２４５頁、Idson、in Pharmaceutical Dosage Forms、Lieberman、Riegerand Banker(Eds.)、１９８８年、Marcel Dekker、Inc., New York、N.Y.１巻、１９９頁）。特に鉱油系下剤、油溶性ビタミンおよび高脂肪栄養調製物は、ｏ／ｗエマルジョンとして一般に経口投与されている物質である。
【０２１８】
本発明の一実施形態では、ｄｓＲＮＡと核酸の組成物をマイクロエマルジョンとして製剤化する。マイクロエマルジョンは、単一の光学的に等方であり熱力学的に安定した液体溶液である、水、油および両親媒性物質の系として定義することができる（Rosoff、in Pharmaceutical Dosage Forms、Lieberman、Rieger and Banker(Eds.)、１９８８年、MarcelDekker、Inc., New York、N.Y.１巻、２４５頁）。典型的にはマイクロエマルジョンは、水性界面活性剤溶液中に油を最初に分散させ、次いで十分な量の第四の構成要素、一般に中間鎖長アルコールを加えて透明系を形成することによって調製される系である。したがってマイクロエマルジョンは、表面活性分子の界面薄膜によって安定化する２つの非混和性液体の熱力学的に安定した、等方で透明な分散液としても記載されている（Leungand Shah、in: Controlled Release of Drugs: Polymers and Aggregate Systems、Rosoff、M.,Ed.、１９８９年、VCH Publishers、New York、１８５〜２１５頁）。一般にマイクロエマルジョンは、油、水、界面活性剤、補助界面活性剤（ｃｏｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）および電解質を含む３〜５個の構成要素の組合せによって調製される。マイクロエマルジョンが油中水型（ｗ／ｏ）または水中油型（ｏ／ｗ）であるかどうかは、使用する油およびの性質、ならびに界面活性剤分子の極性頭部および炭化水素尾部の構造的および幾何的充填に依存する（Schott、inRemington's Pharmaceutical Sciences、Mack Publishing Co., Easton、Pa、１９８５年、２７１頁）。
【０２１９】
相図を利用する現象学的手法は広く研究されており、マイクロエマルジョンの製剤化方法の、広範囲の知識を当業者に与えている（Rosoff、in Pharmaceutical Dosage Forms、Lieberman、Rieger andBanker(Eds.)、１９８８年、Marcel Dekker、Inc., New York、N.Y.１巻、２４５頁、Block、inPharmaceutical Dosage Forms、Lieberman、Rieger and Banker(Eds.)、１９８８年、MarcelDekker、Inc., New York、N.Y.１巻、３３５頁）。従来のエマルジョンと比較して、マイクロエマルジョンは、自然に形成される熱力学的に安定した液滴の製剤中に水に不溶性の薬剤を溶かす利点をもたらす。
【０２２０】
マイクロエマルジョンの調製に使用する界面活性剤には、単独または補助界面活性剤と組み合わせた、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、Ｂｒｉｊ９６、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリグリセロール脂肪酸エステル、テトラグリセロールモノラウレート（ＭＬ３１０）、テトラグリセロールモノオレエート（ＭＯ３１０）、ヘキサグリセロールモノオレエート（ＰＯ３１０）、ヘキサグリセロールペンタオレエート（ＰＯ５００）、デカグリセロールモノカプレート（ＭＣＡ７５０）、デカグリセロールモノオレエート（ＭＯ７５０）、デカグリセロールセクイオレエート（ＳＯ７５０）、デカグリセロールデカオレエート（ＤＡＯ７５０）が挙げられるが、これらだけには限らない。補助界面活性剤、通常エタノール、１−プロパノール、および１−ブタノールなどの単鎖アルコールは、界面活性剤薄膜に浸透し、後に界面活性剤分子間に生じる空所のため乱れた薄膜を生じることによって界面流動性を増大するように働く。しかしながら、マイクロエマルジョンは補助界面活性剤を使用せずに調製することができ、アルコールを含まない自己乳化型マイクロエマルジョン系は当技術分野で公知である。水相は、典型的には、水、薬剤の水溶液、グリセロール、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ポリグリセロール、プロピレングリコール、およびエチレングリコール誘導体だけには限らないが、これらであってよい。油相は、Ｃａｐｔｅｘ３００、Ｃａｐｔｅｘ３５５、ＣａｐｍｕｌＭＣＭ、脂肪酸エステル、中鎖（Ｃ８〜Ｃ１２）モノ、ジ、およびトリグリセリド、ポリオキシエチル化グリセリル脂肪酸エステル、脂肪アルコール、ポリグリコライズドグリセリド（ｐｏｌｙｇｌｙｃｏｌｉｚｅｄ  ｇｌｙｃｅｒｉｄｅ）、飽和ポリグリコライズドＣ８〜Ｃ１０グリセリド、植物油およびシリコーン油などの物質だけには限らないが、これらを含むことができる。
【０２２１】
マイクロエマルジョンは、薬剤の可溶化および薬剤の高い吸収性の観点から特に重要である。脂質系マイクロエマルジョン（ｏ／ｗとｗ／ｏの両方）は、ペプチドを含めた薬剤の経口生物学的利用能を高めると言われている（Constantinidesら、Pharmaceutical Research、１９９４年、１１巻、１３８５〜１３９０頁、Ritschel、Meth.Find. Exp. Clin. Pharmacol.、１９９３年、１３巻、２０５頁）。マイクロエマルジョンは、改善された薬剤の可溶化、酵素加水分解からの薬剤の保護、界面活性剤誘導型の膜流動性および浸透性の変化が原因の考えられる薬剤吸収の増大、調製のし易さ、固体剤形に優る経口投与のし易さ、改善された臨床有効性、および毒性の低下の利点をもたらす（Constantinidesら、PharmaceuticalResearch、１９９４年、１１巻、１３８５頁、Hoら、J. Pharm. Sci.、１９９６年、８５巻、１３８〜１４３頁）。しばしばマイクロエマルジョンは、それらの構成要素が周囲温度で一緒になるとき自然に形成され得る。熱不安的な薬剤、ペプチドまたはｄｓＲＮＡを製剤化するとき、これは特に有利な場合がある。マイクロエマルジョンは、美容用途と薬学的用途の両方における活性成分の経皮送達においても有効となっている。本発明のマイクロエマルジョン組成物および製剤は、胃腸管からのｄｓＲＮＡおよび核酸の高い全身吸収を容易にし、かつｄｓＲＮＡおよび核酸の局所における細胞取込みを改善すると予想される。
【０２２２】
本発明のマイクロエマルジョンは、製剤の性質を改善し本発明のｄｓＲＮＡおよび核酸の吸収を高めるために、ソルビタンモノステアレート（Ｇｒｉｌｌ３）、ラブラゾール、および浸透増強剤などの、他の構成要素および添加剤をさらに含有することもできる。本発明のマイクロエマルジョンにおいて使用する浸透増強剤は、５つの広いカテゴリー、界面活性剤、脂肪酸、胆汁塩、キレート剤、および非キレート非界面活性剤の１つに属するとして分類することができる（Leeら、Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems、１９９１年、９２頁）。これらのクラスの各々は上記で論じている。
【０２２３】
浸透増強剤
一実施形態において本発明は、様々な浸透増強剤を利用して、動物の皮膚への、核酸、特にｄｓＲＮＡの有効な送達を達成する。大部分の薬剤は、イオン形態と非イオン形態の両方で溶解して存在する。しかしながら通常、脂溶性または親油性薬剤のみが細胞膜を容易に横断する。横断すべき膜を浸透増強剤で処理する場合、非親油性薬剤でさえ細胞膜を横断することができることが発見されている。細胞膜を越える非親油性薬剤の拡散を助長する以外に、浸透増強剤は親油性薬剤の浸透性（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ）も高める。
【０２２４】
浸透増強剤は、５つの広いカテゴリー、すなわち界面活性剤、脂肪酸、胆汁塩、キレート剤、および非キレート非界面活性剤の１つに属するとして分類することができる（Leeら、Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems、１９９１年、９２頁）。上記のクラスの浸透増強剤の各々は、以下でさらに詳細に記載する。
【０２２５】
界面活性剤：本発明に関して、界面活性剤（または「表面活性剤」）は、水溶液中に溶けると、溶液の表面張力または水溶液と別の液体の間の界面張力を低減させ、結果として粘膜を介したｄｓＲＮＡの吸収を高める化学的実体である。胆汁塩と脂肪酸以外に、これらの浸透増強剤には、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテルおよびポリオキシエチレン−２０−セチルエーテル）（Leeら、Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems、１９９１年、９２頁）、およびＦＣ−４３などのペルフルオロケミカルエマルジョン（Takahashiら、J.Pharm. Pharmacol.、１９８８年、４０巻、２５２頁）が挙げられる。
【０２２６】
脂肪酸：浸透増強剤として作用する様々な脂肪酸およびそれらの誘導体には、例えば、オレイン酸、ラウリン酸、カプリン酸（ｎ−デカン酸）、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン（１−モノオレオイル−ｒａｃ−グリセロール）、ジラウリン、カプリル酸、アラキドン酸、グリセロール１−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、それらのＣ１〜１０アルキルエステル（例えば、メチル、イソプロピルおよびｔ−ブチル）、ならびにそのモノ−およびジ−グリセリド（すなわち、オレエート、ラウレート、カプレート、ミリステート、パルミテート、ステアレート、リノレートなど）が挙げられる（Leeら、Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems、１９９１年、９２頁、Muranishi、CriticalReviews in Therapeutic Drug Carrier Systems、１９９０年、７巻、１〜３３頁、El Haririら、J. Pharm.Pharmacol.、１９９２年、４４巻、６５１〜６５４頁）。
【０２２７】
胆汁塩：胆汁の生理的役割には、脂質および脂溶性ビタミンの分散および吸収の促進が挙げられる（Brunton、Chapter ３８ in Goodman and Gilman's The Pharmacological Basisof Therapeutics、９th Ed、Hardmanら、Eds、McGraw-Hill、New York、１９９６年、９３４〜９３５頁）。様々な天然胆汁塩、およびそれらの合成誘導体が浸透増強剤として作用する。したがって用語「胆汁塩」は、胆汁の任意の天然構成要素、および任意のそれらの合成誘導体を含む。適切な胆汁塩には、例えば、コール酸（またはその薬学的に許容されるナトリウム塩、コール酸ナトリウム）、デヒドロコール酸（デヒドロコール酸ナトリウム）、デオキシコール酸（デオキシコール酸ナトリウム）、グルコール酸（ｇｌｕｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）（グルコール酸ナトリウム）、グリコール酸（グリコール酸ナトリウム）、グリコデオキシコール酸（グリコデオキシコール酸ナトリウム）、タウロコール酸（タウロコール酸ナトリウム）、タウロデオキシコール酸（タウロデオキシコール酸ナトリウム）、ケノデオキシコール酸（ケノデオキシコール酸ナトリウム）、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、タウロ−２４，２５−ジヒドロフシジン酸ナトリウム（ＳＴＤＨＦ）、グリコジヒドロフシジン酸ナトリウムおよびポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ＰＯＥ）が挙げられる（Leeら、CriticalReviews in Therapeutic Drug Carrier Systems、１９９１年、９２頁、Swinyard、Chapter ３９ In:Remington's Pharmaceutical Sciences、１８th Ed、Gennaro ed.、Mack Publishing Co、Easton、Pa、１９９０年、７８２〜７８３頁、Muranishi、CriticalReviews in Therapeutic Drug Carrier Systems、１９９０年、７巻、１〜３３頁、Yamamotoら、J. Pharm.Exp. Ther.、１９９２年、２６３巻、２５頁、Yamashitaら、J. Pharm. Sci.、１９９０年、７９巻、５７９〜５８３頁）。
【０２２８】
キレート剤：本発明に関して使用するキレート剤は、金属イオンと錯体を形成することによって溶液から金属イオンを除去し、結果として粘膜を介したｄｓＲＮＡの吸収を高める化合物として定義することができる。本発明における浸透増強剤としてのそれらの使用に関して、キレート剤はＤＮａｓｅ阻害剤としてさらに働く追加利点を有する。大部分の特徴付けられたＤＮＡヌクレアーゼは触媒に二価金属イオンを必要とし、したがってキレート剤によって阻害されるからである（Jarrett、J. Chromatogr.、１９９３年、６１８巻、３１５〜３３９頁）。適切なキレート剤には、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）、クエン酸、サリチレート（例えば、サリチル酸ナトリウム、５−メトキシサリチレートおよびホモバニレート）、コラーゲンのＮ−アシル誘導体、β−ジケトンのラウレス−９およびＮ−アミノアシル誘導体（エナミン）が挙げられるが、これらだけには限らない（Leeら、CriticalReviews in Therapeutic Drug Carrier Systems、１９９１年、９２頁、Muranishi、CriticalReviews in Therapeutic Drug Carrier Systems、１９９０年、７巻、１〜３３頁、Buurら、J. ControlRel.、１９９０年、１４巻、４３〜５１頁）。
【０２２９】
非キレート非界面活性剤：本明細書で使用するように、非キレート非界面活性剤浸透増強化合物は、キレート剤または界面活性剤ほど顕著な活性は示さないが、それにもかかわらず消化管粘膜を介したｄｓＲＮＡの吸収を高める化合物として定義することができる（Muranishi、Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems、１９９０年、７巻、１〜３３頁）。このクラスの浸透増強剤には、例えば、不飽和環状尿素、１−アルキル−および１−アルケニルアザシクロ−アルカノン誘導体（Leeら、CriticalReviews in Therapeutic Drug Carrier Systems、１９９１年、９２頁）、およびジクロフェナクナトリウム、インドメタシンおよびフェニルブタゾンなどの非ステロイド性抗炎症薬が挙げられる（Yamashitaら、J.Pharm. Pharmacol.、１９８７年、３９巻、６２１〜６２６頁）。
【０２３０】
細胞レベルでｄｓＲＮＡの取込みを高める作用物質を、本発明の薬学的組成物および他の組成物に加えることもできる。例えば、リポフェクチンなどのカチオン性脂質（Junichiら、米国特許第５，７０５，１８８号）、カチオン性グリセロール誘導体、およびポリリシンなどのポリカチオン性分子（Lolloら、ＰＣＴ出願ＷＯ９７／３０７３１）は、ｄｓＲＮＡの細胞取込みを高めることも公知である。
【０２３１】
他の作用物質を使用して、エチレングリコールおよびプロピレングリコールなどのグリコール、２−ピロールなどのピロール、アゾン、ならびにリモネンおよびメントンなどのテルペンを含めて、投与する核酸の浸透を高めることができる。
【０２３２】
キャリア
本発明のｄｓＲＮＡは、薬学的に許容されるキャリアまたは希釈剤で製剤化することができる。（本明細書では「賦形剤」とも呼ぶ）「薬学的に許容されるキャリア」は、薬学的に許容される溶媒、懸濁剤、または任意の他の薬理学的に不活性な媒体（ｖｅｈｉｃｌｅ）である。薬学的に許容されるキャリアは液体または固体であってよく、望ましいバルク、コンシステンシー、および他の適切な輸送および化学的性質を与えるように、計画した投与形式を念頭に置いて選択することができる。典型的な薬学的に許容されるキャリアには、例えば、水、食塩水溶液、結合剤（例えば、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）、増量剤（例えば、ラクトースおよび他の糖、ゼラチン、または硫酸カルシウム）、滑沢剤（例えば、デンプン、ポリエチレングリコール、または酢酸ナトリウム）、崩壊剤（例えば、デンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム）、および湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）が挙げられるが、これらだけには限らない。
【０２３３】
本発明の特定の組成物は製剤中にキャリア化合物も取り込む。本明細書で使用する「キャリア化合物」または「キャリア」は、不活性である（すなわち、それ自体は生物活性を有していない）が、例えば生物学的に活性な核酸の分解または循環からのその除去の促進により、生物活性を有する核酸の生物学的利用能を低減するｉｎ  ｖｉｖｏプロセスによって核酸として認識される、核酸、またはそのアナログを指すことができる。核酸とキャリア化合物の同時投与、典型的には後者の物質が過剰である同時投与は、おそらく共通受容体に対するキャリア化合物と核酸の間の競合のため、肝臓、腎臓または他の外部循環リザーバにおいて回収される核酸の量の実質的な低減をもたらし得る。例えば、それをポリイノシン酸、硫酸デキストラン、ポリシチジン酸または４−アセトアミド−４’イソチオシアノ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸と同時投与するとき、肝臓組織中の部分的ホスホロチオエートｄｓＲＮＡの回収が低減し得る（Miyaoら、DsRNA Res. Dev.、１９９５年、５巻、１１５〜１２１頁、Takakuraら、DsRNA & Nucl.Acid Drug Dev.、１９９６年、６巻、１７７〜１８３頁）。
【０２３４】
賦形剤
キャリア化合物と対照的に、「薬学的キャリア」または「賦形剤」は、１つ以上の核酸を動物に送達するための、薬学的に許容される溶媒、懸濁剤、または任意の他の薬理学的に不活性な媒体である。賦形剤は、液体または固体であってよく、核酸および所与の薬学的組成物の他の構成要素と組み合わせると、望ましいバルク、コンシステンシーなどを与えるように、計画した投与形式を念頭に置いて選択することができる。典型的な薬学的キャリアには、結合剤（例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）、増量剤（例えば、ラクトースおよび他の糖、微結晶セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレートまたはリン酸水素カルシウムなど）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸、ステアリン酸金属、硬化植物油、トウモロコシデンプン、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなど）、崩壊剤（例えば、デンプン、デンプングリコール酸ナトリウムなど）、および湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウムなど）が挙げられるが、これらだけには限らない。
【０２３５】
核酸と有害に反応しない非経口でない投与に適した薬学的に許容される有機または無機賦形剤を使用して、本発明の組成物を製剤化することもできる。適切な薬学的に許容されるキャリアには、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられるが、これらだけには限らない。
【０２３６】
核酸の局所投与用の製剤は、滅菌および非滅菌水溶液、アルコールなどの一般的な溶媒中の非水溶液、または液体もしくは固体油ベース中の核酸溶液を含むことができる。溶液はバッファー、希釈剤および他の適切な添加剤を含有することもできる。核酸と有害に反応しない非経口でない投与に適した薬学的に許容される有機または無機賦形剤を使用することができる。
【０２３７】
適切な薬学的に許容される賦形剤には、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられるが、これらだけには限らない。
【０２３８】
他の構成要素
本発明の組成物は、その当技術分野で確立した使用レベルで、薬学的組成物において従来見られる他の補助構成要素をさらに含有することができる。したがって、例えば、組成物は追加的な、適合性のある、薬学的に活性がある物質、例えばかゆみ止め薬、収斂薬、局所麻酔薬または抗炎症薬などを含有することができ、または色素、香味剤、防腐剤、抗酸化剤、乳白剤、増粘剤および安定剤などの、様々な剤形の本発明の組成物を物理的に製剤化する際に有用である追加的な物質を含有することができる。しかしながら、このような物質は添加のときに、本発明の組成物の構成要素の生物活性に過度に干渉してはならない。製剤は滅菌することができ、および望む場合、製剤の核酸（複数可）と有害に相互作用しない、補助剤、例えば滑沢剤、防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与える塩、バッファー、着色物質、香味物質および／または芳香物質などと混合することができる。
【０２３９】
水性懸濁液は、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよび／またはデキストランを含めた、懸濁液の粘性を増大する物質を含有することができる。懸濁液は安定剤を含有することもできる。
【０２４０】
併用療法
一態様では、本発明の組成物を併用療法において使用することができる。用語「併用療法」は、他の生物活性成分（第二の異なる抗新生物剤などが挙げられるが、これに限らない）、および非薬剤療法（外科手術または放射線治療などが挙げられるが、これに限らない）とのさらなる併用で対象化合物の投与を含む。例えば、本発明の化合物は、他の薬学的に活性な化合物、好ましくは本発明の化合物の作用を高めることができる化合物と併用して使用することができる。本発明の化合物は、（単一の調製物または別の調製物として）同時に、または他の薬剤療法と連続して投与することができる。一般に、併用療法は、療法の単一サイクルまたは単一コース中の２個以上の薬剤投与を想定する。
【０２４１】
本発明の一態様では、対象化合物は、様々な疾患状態に関与するプロテインキナーゼを調節する１つ以上の別の作用物質と併用して投与することができる。このようなキナーゼの例は、セリン／スレオニン特異的キナーゼ、受容体チロシン特異的キナーゼおよび非受容体チロシン特異的キナーゼに限らないが、これらを含むことができる。セリン／スレオニンキナーゼには、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）、減数分裂特異的キナーゼ（ＭＥＫ）、ＲＡＦおよびオーロラキナーゼが挙げられる。受容体キナーゼファミリーの例には、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）（例えば、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＥｒｂＢ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、Ｘｍｒｋ、ＤＥＲ、Ｌｅｔ２３）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）受容体（例えば、ＦＧＦ−Ｒ１、ＧＦＦ−Ｒ２／ＢＥＫ／ＣＥＫ３、ＦＧＦ−Ｒ３／ＣＥＫ２、ＦＧＦ−Ｒ４／ＴＫＦ、ＫＧＦ−Ｒ）、肝細胞増殖／分散因子受容体（ＨＧＦＲ）（例えば、ＭＥＴ、ＲＯＮ、ＳＥＡ、ＳＥＸ）、インスリン受容体（例えば、ＩＧＦＩ−Ｒ）、Ｅｐｈ（例えば、ＣＥＫ５、ＣＥＫ８、ＥＢＫ、ＥＣＫ、ＥＥＫ、ＥＨＫ−Ｉ、ＥＨＫ−２、ＥＬＫ、ＥＰＨ、ＥＲＫ、ＨＥＫ、ＭＤＫ２、ＭＤＫ５、ＳＥＫ）、ＡｘＩ（例えば、Ｍｅｒ／Ｎｙｋ、Ｒｓｅ）、ＲＥＴ、および血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）（例えば、ＰＤＧＦα−Ｒ、ＰＤＧβ−Ｒ、ＣＳＦ１−Ｒ／ＦＭＳ、ＳＣＦ−Ｒ／Ｃ−ＫＩＴ、ＶＥＧＦ−Ｒ／ＦＬＴ、ＮＥＫ／ＦＬＫ１、ＦＬＴ３／ＦＬＫ２／ＳＴＫ−１）が挙げられる。非受容体チロシンキナーゼファミリーには、ＢＣＲ−ＡＢＬ（例えば、ｐ４３ａｂｌ、ＡＲＧ）、ＢＴＫ（例えば、ＩＴＫ／ＥＭＴ、ＴＥＣ）、ＣＳＫ、ＦＡＫ、ＦＰＳ、ＪＡＫ、ＳＲＣ、ＢＭＸ、ＦＥＲ、ＣＤＫおよびＳＹＫが挙げられるが、これらだけには限らない。
【０２４２】
本発明の別の態様では、対象化合物は、非キナーゼ生物標的またはプロセスを調節する１つ以上の作用物質と併用して投与することができる。このような標的には、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）、熱ショックタンパク質（例えば、ＨＳＰ９０）、およびプロテオソームが挙げられる。
【０２４３】
一実施形態では、対象化合物は、ゾリンザ、タルセバ、イレッサ、タイケルブ、グリベック、スーテント、スプリセル、ネクサバール、ソラフェニブ、ＣＮＦ２０２４、ＲＧ１０８、ＢＭＳ３８７０３２、Ａｆｆｍｉｔａｋ、アバスチン、ハーセプチン、エルビタックス、ＡＧ２４３２２、ＰＤ３２５９０１、ＺＤ６４７４、ＰＤ１８４３２２、オバトダックス（Ｏｂａｔｏｄａｘ）、ＡＢＴ７３７およびＡＥＥ７８８などの、１つ以上の生物標的を阻害する抗新生物剤（例えば、低分子、モノクローナル抗体、アンチセンスＲＮＡ、および融合タンパク質）と併用することができる。このような併用は、任意の作用物質単独によって得られる有効性を超えて治療有効性を高めることができ、耐性の変異性変異体（ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｖａｒｉａｎｔ）の出現を予防または遅延させることができる。
【０２４４】
特定の好ましい実施形態では、本発明の化合物を化学療法剤と併用して投与する。化学療法剤は腫瘍学の分野における広範囲の療法治療剤を包含する。これらの作用物質は、腫瘍の縮小、外科手術後に残存したままの癌細胞の破壊、寛解の誘導、寛解の維持および／または癌またはその治療と関係がある症状の緩和の目的で、疾患の様々な段階で投与する。このような作用物質の例には、マスタードガス誘導体（メクロレタミン、シクロホスファミド、クロラムブシル、メルファラン、イフォスファミド）、エチレンイミン（チオテパ、ヘキサメチルメラニン）、アルキルスルホネート（ブスルファン）、ヒドラジンおよびトリアジン（アルトレタミン、プロカルバジン、ダカルバジンおよびテモゾロミド）、ニトロソウレア（カルムスチン、ロムスチンおよびストレプトゾシン）、イフォスファミドおよび金属塩（カルボプラチン、シスプラチン、およびオキサリプラチン）などのアルキル化剤、ポドフィロトキシン（エトポシドおよびテニソピド（Ｔｅｎｉｓｏｐｉｄｅ））、タキサン（パクリタキセルおよびドセタキセル）、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシンおよびビノレルビン）、およびカンプトテカンアナログ（イリノテカンおよびトポテカン）などの植物性アルカロイド、クロモマイシン（ダクチノマイシンおよびプリカマイシン）、アントラサイクリン（ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、ミトザントロン、バルルビシンおよびイダルビシン）、およびマイトマイシン、アクチノマイシンおよびブレオマイシンなどの種種雑多な抗生物質などの抗腫瘍性抗生物質、葉酸アンタゴニスト（メトトレキサート、ペメトレキセド、ラルチトレキセド、アミノプテリン）、ピリミジンアンタゴニスト（５−フルオロウラシル、フロクスウリジン、シタラビン、カペシタビン、およびゲムシタビン）、プリンアンタゴニスト（６−メルカプトプリンおよび６−チオグアニン）およびアデノシンデアミナーゼ阻害剤（クラドリビン、フルダラビン、メルカプトプリン、クロファラビン、チオグアニン、ネララビンおよびペントスタチン）などの代謝拮抗薬、トポイソメラーゼＩ阻害剤（イロノテカン、トポテカン）およびトポイソメラーゼＩＩ阻害剤（アムサクリン、エトポシド、リン酸エトポシド、テニポシド）などのトポイソメラーゼ阻害剤、モノクローナル抗体（アレムツズマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、リツキシマブ、トラツズマブ、イブリツモマブチウキセタン（Ｔｉｏｘｅｔａｎ）、セツキシマブ、パニツムマブ、トシツモマブ、ベバシズマブ）、およびリボヌクレオチドリダクターゼ阻害剤（ヒドロキシウレア）などの種種雑多な抗新生物剤、副腎皮質ステロイド阻害剤（ミトーテン）、酵素（アスパラギナーゼおよびペガスパルガーゼ）、微小管阻害薬（エストラムスチン）、およびレチノイド（ベキサロテン、イソトレチノイン、トレチノイン（ＡＴＲＡ）が挙げられるが、これらだけには限らない。特定の好ましい実施形態では、本発明の化合物を化学保護剤と併用して投与する。化学保護剤は、身体を保護するように、または化学療法の副作用を最小にするように働く。このような作用物質の例にはアムホスチン、メスナ、およびデキスラゾキサンが挙げられるが、これらだけには限らない。
【０２４５】
本発明の一態様では、対象化合物を放射線療法と併用して投与する。放射線は一般に、内部（癌部位付近の放射性物質の移植）または光子（ｘ線もしくはγ線）または粒子放射線を利用して機器から外部に送達される。併用療法が放射線治療をさらに含む場合、治療剤と放射線治療の併用の同時作用から有益な効果が得られる限り、放射線治療は任意の適切な時間に実施することができる。例えば、適切な例では、放射線治療が治療剤の投与から一時的に除かれるとき、数日間またはさらに数週間、有益な効果が依然として得られる。
【０２４６】
本発明の化合物を、免疫療法剤と併用して使用することができることは理解される。免疫療法の１つの形態は、腫瘍から遠く離れた部位にワクチン組成物を投与することによる、宿主起源の活性な全身腫瘍特異的免疫応答の生成である。単離腫瘍抗原ワクチンおよび抗イディオタイプワクチンを含めた、様々な型のワクチンが提案されている。別の手法は、治療する被験体由来の腫瘍細胞、またはこのような細胞の誘導体を使用することである（Schirrmacherら、（１９９５年）J. Cancer Res. Clin. Oncol. １２１巻、４８７頁によって総説された）。米国特許第５，４８４，５９６号において、HannaJr.らは、切除可能な腫瘍を治療して再発または転移を予防するための方法であって、腫瘍を外科手術によって除去すること、コラゲナーゼで細胞を分散させること、細胞を照射すること、および約１０７個の細胞の少なくとも３回連続の投与で患者をワクチン接種することを含む方法を特許請求している。
【０２４７】
本発明の化合物を、１つ以上の補助療法剤と併用して有利に使用することができることは理解される。補助療法に適した作用物質の例には、コルチコステロイド（アムシノニド、ベタメタゾン、ジプロピオン酸ベタメタゾン、吉草酸ベタメタゾン、ブデソニド、クロベタゾール、クロベタゾールアセテート、クロベタゾールブチレート、クロベタゾール１７−プロピオネート、コルチゾン、デフラザコート、デスオキシメタゾン、吉草酸ジフルコルトロン、デキサメタゾン、リン酸デキサメタゾンナトリウム、デソニド、フロエート、フルオシノニド、フルオシノロンアセトニド、ハルシノニド、ヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾンブチレート、コハク酸ヒドロコルチゾンナトリウム、吉草酸ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、モノメタゾン、プレドニカルベート、プレドニゾロン、トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニド、およびハロベタゾールプロピオネート）などのステロイド、トリプタン（例えば、スマトリプタンまたはナラトリプタン）などの５ＨＴｉアゴニスト、アデノシンＡ１アゴニスト、ＥＰリガンド、グリシンアンタゴニストなどのＮＭＤＡモジュレーター、ナトリウムチャネルブロッカー（例えば、ラモトリジン）、サブスタンスPアンタゴニスト（例えば、ＮＫｉアンタゴニスト）、カンナビノイド、アセトアミノフェンまたはフェナセチン、５−リポキシゲナーゼ阻害剤、ロイコトリエン受容体アンタゴニスト、ＤＭＡＲＤ（例えば、メトトレキセート）、ガバペンチンおよび関連化合物、三環系抗うつ薬（例えば、アミトリプチリン）、ニューロン（ｎｅｕｒｏｎｅ）安定化抗てんかん薬、モノアミン作動性取込み阻害薬（例えば、ベンラファキシン）、マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤、ｉＮＯＳまたはｎＮＯＳ阻害剤などの一酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）阻害剤、腫瘍壊死因子αの放出、または作用の阻害剤、モノクローナル抗体療法などの抗体療法、ヌクレオシド阻害剤（例えば、ラミブジン）または免疫系モジュレーター（例えば、インターフェロン）などの抗ウイルス薬、オピオイド鎮痛薬、局所麻酔薬、カフェインを含めた刺激剤、Ｈ２アンタゴニスト（例えば、ラニチジン）、プロトンポンプ阻害薬（例えば、オメプラゾール）、制酸剤（例えば、水酸化アルミニウムまたは水酸化マグネシウム）、ガス抜き薬（例えば、シメチコン）、充血緩和剤（例えば、フェニレフリン、フェニルプロパノールアミン、シュードエフェドリン、オキシメタゾリン、エピネフリン、ナファゾリン、キシロメタゾリン、プロピルヘキセドリン、またはレボ−デスオキシエフェドリン）、鎮咳薬（例えば、コデイン、ヒドロコドン、カルミフェン、カルベタペンタン、またはデキストラメトルファン）、利尿剤、または鎮静性もしくは非鎮静性抗ヒスタミンが挙げられる。
【０２４８】
本発明の化合物を、他の遺伝子を標的化するｓｉＲＮＡと同時投与することができる。例えば本発明の化合物は、ｃ−Ｍｙｃ遺伝子を標的化するｓｉＲＮＡと同時投与することができる。一例ではＡＤ−１２１１５は、ｃ−ＭｙｃｓｉＲＮＡと同時投与することができる。ｃ−Ｍｙｃ標的化ｓｉＲＮＡの例は、参照によって本明細書に組み込む米国特許出願第１２／３７３，０３９号中に開示される。
【０２４９】
Ｅｇ５遺伝子およびＶＥＧＦ遺伝子の発現によって引き起こされる疾患を治療するための方法
本発明は特に、肝臓癌などの癌を治療するため、例えば腫瘍増殖および腫瘍転移を阻害するための、少なくとも２つのｄｓＲＮＡ、Ｅｇ５遺伝子を標的化するｄｓＲＮＡ、およびＶＥＧＦ遺伝子を標的化するｄｓＲＮＡを含有する組成物の使用に関する。例えば、薬学的組成物などの組成物を、例えば肝臓の癌において生じる可能性がある肝臓内腫瘍などの、固形腫瘍の治療に使用することができる。Ｅｇ５を標的化するｄｓＲＮＡおよびＶＥＧＦを標的化するｄｓＲＮＡを含有する組成物を使用して、他の腫瘍および癌、例えば乳癌、肺癌、頭頸部癌、脳癌、腹部癌、結腸癌、結腸直腸癌、食道癌、胃腸癌、グリオーマ、舌癌、神経芽腫、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、網膜芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、多発性骨髄腫などを治療すること、メラノーマのような皮膚癌を治療すること、リンパ腫および血液癌を治療することも可能である。本発明はさらに、異なる型の癌、例えば肝臓癌、乳癌、肺癌、頭部癌、頸部癌、脳癌、腹部癌、結腸癌、結腸直腸癌、食道癌、胃腸癌、グリオーマ、舌癌、神経芽腫、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、網膜芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、多発性骨髄腫、皮膚癌、メラノーマ、リンパ腫および血液癌において、腹水および胸水の蓄積を阻害するための、Ｅｇ５ｄｓＲＮＡおよびＶＥＧＦｄｓＲＮＡを含有する組成物の使用に関する。Ｅｇ５およびＶＥＧＦ発現に対する阻害効果のため、本発明による組成物またはそこから調製する薬学的組成物は生活の質を高めることができる。
【０２５０】
一実施形態では、ＡＦＰ発現と関係がある腫瘍、またはＡＦＰを分泌する腫瘍、例えば肝細胞癌または奇形腫を有する患者を治療する。特定の実施形態では、患者は悪性奇形腫、内胚葉洞腫瘍（卵黄嚢癌）、神経芽腫、肝芽腫、肝細胞癌、精巣癌または卵巣癌を有する。
【０２５１】
本発明はさらに、例えば、他の医薬および／または他の治療法、例えば公知の医薬および／または公知の治療法、例えば癌を治療するためおよび／または腫瘍転移を予防するために現在利用されている方法などと併用した、癌を治療するためまたは腫瘍転移を予防するための、ｄｓＲＮＡまたはその薬学的組成物の使用に関する。放射線療法およびシスプラチン、シクロホスファミド、５−フルオロウラシル、アドリアマイシン、ダウノルビシンまたはタモキシフェンなどの化学療法剤との併用が好ましい。
【０２５２】
任意の従来の化学療法剤などの別の抗癌化学療法剤と併用して、特異的ＲＮＡｉ作用物質を含めることによって、本発明を実施することもできる。特異的結合剤とこのような他の作用物質の併用によって、化学療法プロトコールの効力が増す。多数の化学療法プロトコールが、本発明の方法に組み込むことができるとして当業者に理解される。アルキル化剤、代謝拮抗薬、ホルモンおよびアンタゴニスト、放射性同位体、および天然産物を含めた、任意の化学療法剤を使用することができる。例えば、本発明の化合物は、ドキソルビシンおよび他のアントラサイクリンアナログなどの抗生物質、シクロホスファミドなどのナイトロジェンマスタード、５−フルオロウラシルなどのピリミジンアナログ、シスプラチン、ヒドロキシウレア、タキソールおよびその天然および合成誘導体などと投与することができる。別の例として、腫瘍がゴナドトロピン依存性およびゴナドトロピン非依存性細胞を含む乳腺癌などの混合腫瘍の場合、ロイプロリドまたはゴセレリン（ＬＨ−ＲＨの合成ペプチドアナログ）と併用して化合物を投与することができる。他の抗腫瘍プロトコールは、テトラサイクリン化合物、および本明細書で「補助抗腫瘍モダリティ」とも呼ぶ別の治療モダリティ、例えば外科手術、照射などの使用を含む。したがって、本発明の方法はこのような従来のレジメンと利用することができ、副作用を低減し有効性を高める利点を有する。
【０２５３】
Ｅｇ５遺伝子およびＶＥＧＦ遺伝子の発現を阻害するための方法
さらに別の態様では、本発明は、哺乳動物中のＥｇ５遺伝子およびＶＥＧＦ遺伝子の発現を阻害するための方法を提供する。この方法は、標的Ｅｇ５遺伝子および標的ＶＥＧＦ遺伝子の発現が抑制されるように、本発明の特徴を有する組成物を哺乳動物に投与することを含む。
【０２５４】
一実施形態では、Ｅｇ５遺伝子発現およびＶＥＧＦ遺伝子発現を阻害するための方法は、２つの異なるｄｓＲＮＡ分子、治療する哺乳動物のＥｇ５遺伝子のＲＮＡ転写産物の少なくとも一部分と相補的なヌクレオチド配列を有するｄｓＲＮＡ分子、治療する哺乳動物のＶＥＧＦ遺伝子のＲＮＡ転写産物の少なくとも一部分と相補的なヌクレオチド配列を有する他のｄｓＲＮＡ分子を含有する組成物を投与することを含む。治療する生物がヒトなどの哺乳動物であるとき、静脈内、筋肉内、皮下、経皮、気道（エアロゾル）、鼻腔、直腸、および局所（頬および舌下を含む）投与を含めた経口または非経口経路だけには限らないが、これらを含めた、当技術分野で公知である任意の手段によって、組成物を投与することができる。好ましい実施形態では、組成物は静脈内注入または注射によって投与する。
【０２５５】
脂質粒子を調製する方法
本発明の方法および組成物は特定のカチオン性脂質を利用し、その合成、調製および特徴付けは以下および添付の実施例中に記載する。さらに本発明は、治療剤、例えば核酸と結合する粒子を含めた、脂質粒子を調製する方法を提供する。本明細書に記載する方法において、脂質の混合物は核酸の緩衝水溶液と組み合わせて、脂質粒子中に封入された核酸を含有する中間体混合物を生成し、この場合封入核酸は約３重量％〜約２５重量％、好ましくは５重量％〜１５重量％の核酸／脂質比で存在する。中間体混合物は必要に応じてサイズ分けして、脂質部分が単層小胞であり、好ましくは３０〜１５０ｎｍ、より好ましくは約４０〜９０ｎｍの直径を有する脂質封入核酸粒子を得ることができる。次いでｐＨを上昇させ、脂質−核酸粒子の表面電荷の少なくとも一部分を中和し、したがって少なくとも部分的に表面が中和した脂質封入核酸組成物を与える。
【０２５６】
上に記載したように、いくつかのこれらのカチオン性脂質は、アミノ基のｐＫａ未満のｐＨでは帯電し、そのｐＫａを超えるｐＨでは実質的に中性であるアミノ脂質である。これらのカチオン性脂質は滴定可能なカチオン性脂質と呼ばれ、２工程プロセスを使用して本発明の製剤において使用することができる。最初に、核酸存在下において滴定可能なカチオン性脂質と他の小胞構成要素を用いて、低ｐＨにおいて脂質小胞が形成され得る。このようにして、小胞は核酸を封入し捕捉する。第二に、新たに形成される小胞の表面電荷は、存在する滴定可能なカチオン性脂質のｐＫａを超えるレベルまで、すなわち生理的ｐＨ以上まで培地のｐＨを増大することによって中和することができる。このプロセスの特に有利な態様は、任意の表面吸着核酸と中性表面を有する生成核酸送達媒体の両方の容易な除去を含む。中性表面を有するリポソームまたは脂質粒子は、循環からの迅速な除去を回避し、かつカチオン性リポソーム調製物と関係がある特定の毒性を回避されると予想される。核酸−脂質粒子の製剤におけるこのような滴定可能なカチオン性脂質のこれらの使用に関する他の詳細は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，２８７，５９１号および米国特許第６，８５８，２２５号中に与えられる。
【０２５７】
このようにして形成される小胞は、核酸の含有量が高い均一な小胞サイズの製剤をもたらすことに、さらに留意されたい。さらに、小胞は約３０〜約１５０ｎｍ、より好ましくは約３０〜約９０ｎｍの大きさ範囲を有する。
【０２５８】
いかなる特定の理論によっても縛られることを意図しないで、核酸封入の非常に高い有効性は低ｐＨでの静電相互作用の結果であると考えられる。酸性ｐＨ（例えば、ｐＨ４．０）では、小胞表面は帯電し静電相互作用によって核酸の一部分と結合する。外部酸性バッファーをより中性のバッファー（例えば、ｐＨ７．５）と交換すると、脂質粒子またはリポソームの表面は中和され、任意の外部核酸を除去することができる。製剤化プロセスに関するより詳細な情報は様々な刊行物（例えば、米国特許第６，２８７，５９１号および米国特許第６，８５８，２２５号）に与えられる。
【０２５９】
上記の事項を鑑みて、本発明は、脂質／核酸製剤を調製する方法を提供する。本明細書に記載する方法において、脂質の混合物は核酸の緩衝水溶液と組み合わせて、脂質粒子中に封入された核酸を含有する中間体混合物を生成し、例えばこの場合封入核酸は約１０重量％〜約２０重量％の核酸／脂質比で存在する。中間体混合物は必要に応じてサイズ分けして、脂質部分が単層小胞であり、好ましくは３０〜１５０ｎｍ、より好ましくは約４０〜９０ｎｍの直径を有する脂質封入核酸粒子を得ることができる。次いでｐＨを上昇させ、脂質−核酸粒子の表面電荷の少なくとも一部分を中和し、したがって少なくとも部分的に表面が中和した脂質封入核酸組成物を与える。
【０２６０】
特定の実施形態では、脂質の混合物は、少なくとも２つの脂質構成要素、脂質がｐＫａ未満のｐＨではカチオン性であり、そのｐＫａを超えるｐＨでは中性であるようなｐＫａを有する脂質の中から選択される本発明の第一のアミノ脂質構成要素、および脂質−核酸粒子の形成の間に粒子の凝集を妨げる脂質の中から選択される第二の脂質構成要素を含む。特定の実施形態では、アミノ脂質は本発明の新規なカチオン性脂質である。
【０２６１】
本発明の核酸−脂質粒子を調製する際に、脂質の混合物は典型的には有機溶媒中の脂質の溶液である。次いで、この脂質の混合物を乾燥して薄膜を形成するかまたは、水性バッファーで水和する前に凍結乾燥して粉末を形成し、リポソームを形成することができる。あるいは、好ましい方法では、脂質混合物はエタノールなどの水混和性アルコールに溶かすことができ、このエタノール溶液を水性バッファーに加え、自然なリポソーム形成をもたらすことができる。大部分の実施形態では、市販されている形態でアルコールを使用する。例えば、エタノールは無水エタノール（１００％）として、または９５％エタノール、残りは水として使用することができる。この方法は米国特許第５，９７６，５６７号中により詳細に記載される）。
【０２６２】
本発明によれば、脂質混合物は、核酸を含有し得る緩衝水溶液と組み合わせる。緩衝水溶液は、典型的にはバッファーが脂質混合物中のプロトン化可能脂質のｐＫａ未満のｐＨを有する溶液である。適切なバッファーの例には、クエン酸塩、リン酸塩、酢酸塩、およびＭＥＳバッファーが挙げられる。特に好ましいバッファーはクエン酸バッファーである。好ましいバッファーは封入する核酸の化学的性質に応じて１〜１０００ｍＭアニオンの範囲であり、バッファー濃度の最適化は高い充填レベルを得るのに重要である場合がある（例えば、米国特許第６，２８７，５９１号および米国特許第６，８５８，２２５号を参照）。あるいは、クロライド、サルフェートなどでｐＨ５〜６に酸性化した純水が有用である場合がある。この場合、粒子を透析してエタノールを除去する、ｐＨを増加させる、またはノーマルセーラインなどの薬学的に許容されるキャリアと混合するとき、粒子膜の浸透ポテンシャルのバランスを保つ、５％グルコース、または別の非イオン性溶質を加えることは適切であり得る。バッファー中の核酸の量は変わり得るが、典型的には約０．０１ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬである。
【０２６３】
脂質と治療用核酸の緩衝水溶液の混合物を組み合わせて中間体混合物を与える。中間体混合物は、典型的には封入核酸を有する脂質粒子の混合物である。さらに中間体混合物は、脂質粒子表面の負に帯電した核酸と正に帯電した脂質のイオン間引力のため、脂質粒子（リポソームまたは脂質小胞）の表面と結合した一定部分の核酸を含有する場合もある（プロトン化可能第一脂質構成要素を構成するアミノ脂質または他の脂質は、脂質上のプロトン化可能基のｐＫａ未満のｐＨを有するバッファー中で正に帯電している）。好ましい実施形態の一群では、脂質の混合物は脂質のアルコール溶液であり、各溶液の体積は、組合せの際に、生成するアルコール含有量が約２０体積％〜約４５体積％であるように調節する。混合物を組み合わせる方法は任意の様々なプロセスを含むことができ、生成する製剤の規模に依存することが多い。例えば、全体積が約１０〜２０ｍＬ以下であるとき、溶液は試験管中で組み合わせ、ボルテックスミキサーを使用して一緒に撹拌することができる。大規模なプロセスは適切な生産規模のガラス製品で実施することができる。
【０２６４】
必要に応じて、脂質混合物と治療剤（核酸）の緩衝水溶液を組み合わせることによって生じる脂質封入治療剤（例えば核酸）複合体をサイズ分けして、望ましいサイズ範囲および比較的狭い分布の脂質粒子サイズを得ることができる。好ましくは、本明細書で提供する組成物は約７０〜約２００ｎｍ、より好ましくは約９０〜約１３０ｎｍの平均径にサイズ分けする。いくつかの技法は、リポソームを望ましいサイズにサイズ分けするのに利用される。１つのサイズ分け法は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，７３７，３２３号中に記載される。バス音波処理（ｂａｔｈ  ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）またはプローブ音波処理のいずれかによりリポソーム懸濁液を音波処理することによって、約０．０５ミクロンサイズ未満の小単層小胞（ＳＵＶ）までの累進的なサイズの低下をもたらす。均質化は、大リポソームを小リポソームに断片化するせん断エネルギーを利用する別の方法である。典型的な均質化手順では、典型的には約０．１ミクロンと０．５ミクロンの間の選択したリポソームサイズを観察するまで、多ラメラ小胞を標準的なエマルジョンホモジナイザーによって再循環させる。両方の方法において、従来のレーザービームによる粒径測定によって、粒径分布をモニタリングすることができる。本明細書の特定の方法に関して、押出しを使用して均一な小胞サイズを得る。
【０２６５】
細孔ポリカーボネート膜または非対称セラミック膜を介したリポソーム組成物の押出しは、比較的明確なサイズ分布をもたらす。典型的には、望ましいリポソーム複合体のサイズ分布を得るまで、懸濁液を一回または複数回膜を介して循環させる。リポソームは連続的に孔が小さくなった膜を介して押し出して、リポソームサイズの段階的低減を得ることができる。いくつかの場合、形成される脂質−核酸組成物を、いかなるサイズ分けもせずに使用することができる。
【０２６６】
特定の実施形態では、本発明の方法は、脂質−核酸組成物の脂質部分の少なくとも一部の表面電荷を中和する工程をさらに含む。表面電荷を少なくとも部分的に中和することによって、非封入核酸は脂質粒子表面から遊離し、従来の技法を使用して組成物から除去することができる。非封入核酸および表面吸着核酸は、バッファー溶液の交換によって生成組成物から除去することが好ましい。例えば、クエン酸バッファー（ｐＨ約４．０、組成物を形成するのに使用）の、ＨＥＰＥＳ緩衝食塩水（ＨＢＳｐＨ約７．５）溶液による交換は、リポソーム表面の中和および表面からの核酸遊離をもたらす。遊離した核酸は次いで標準法を使用したクロマトグラフィーによって除去し、次いで使用する脂質のｐＫａを超えるｐＨを有するバッファーに移すことができる。
【０２６７】
必要に応じては、脂質小胞（すなわち脂質粒子）を水性バッファー中での水和によって形成し、核酸を加える前に上に記載した方法のいずれかを使用してサイズ分けすることができる。上に記載したように、水性バッファーはアミノ脂質のｐＫａ未満のｐＨでなければならない。次いで核酸の溶液を、これらのサイズ分けした、予め形成された小胞に加えることができる。このような「予め形成された」小胞への核酸の封入を可能にするために、混合物はエタノールなどのアルコールを含有しなければならない。エタノールの場合、それは約２０％（ｗ／ｗ）〜約４５％（ｗ／ｗ）の濃度で存在しなければならない。さらに、脂質小胞の組成および核酸の性質に応じて、約２５℃〜約５０℃の温度まで、水性バッファーエタノール混合物中で予め形成された小胞と核酸の混合物を温めることが必要である場合がある。脂質小胞中に望ましいレベルの核酸を得るための封入プロセスの最適化が、エタノール濃度および温度などの変数の操作を必要とすることは、当業者には明らかである。核酸封入に適した条件の例は実施例中に与える。核酸を予め形成された小胞内に封入した後、外部ｐＨは少なくとも部分的に表面電荷を中和するまで増加させることができる。次いで非封入核酸および表面吸着核酸を、上に記載したように除去することができる。
【０２６８】
使用法
本発明の脂質粒子を使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで細胞に治療剤を送達することができる。特定の実施形態では、治療剤は核酸であり、本発明の核酸−脂質粒子を使用してそれを細胞に送達する。本発明の脂質粒子および関連の薬学的組成物を使用する様々な方法の以下の記載は、核酸−脂質粒子に関する記載によって例示されるが、これらの方法および組成物を、このような治療から恩恵を受ける任意の疾患または障害を治療するための任意の治療剤の送達に、容易に適合することができることは理解される。
【０２６９】
特定の実施形態では、本発明は、細胞に核酸を導入するための方法を提供する。細胞に導入するのに好ましい核酸は、ｓｉＲＮＡ、免疫刺激オリゴヌクレオチド、プラスミド、アンチセンスおよびリボザイムである。細胞内送達が起こるのに十分な時間の間、本発明の粒子または組成物と細胞を接触させることによって、これらの方法を実施することができる。
【０２７０】
本発明の組成物は、殆ど任意の細胞型に吸着させることが可能である。吸着後、核酸−脂質粒子を細胞の一部分によって取り込ませる（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｅｄ）、脂質と細胞膜を交換する、または細胞と融合することのいずれかが可能である。複合体の核酸部分の移動または取込みは、これらの経路のいずれか１つによって実施することができる。本発明の範囲に関して制限することは意図せずに、エンドサイトーシスによって細胞に取り込まれる粒子の場合、次に粒子はエンドソーム膜と相互作用し、おそらく非二層相の形成によってエンドソーム膜の不安定化をもたらし、細胞の細胞質への封入核酸の導入をもたらすと考えられる。同様に、粒子と細胞原形質膜の直接融合の場合、融合が起こると、リポソーム膜は細胞膜に組み込まれ、リポソームの含有物は細胞内液と組み合わさる。細胞と脂質−核酸組成物の間の接触は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施するとき、生物学的適合性がある培地で行う。組成物の濃度は個々の用途に応じて広く変わり得るが、一般には約１μｍｏｌと約１０ｍｍｏｌの間である。特定の実施形態では、脂質−核酸組成物を用いた細胞の治療は、約１〜２４時間、好ましくは約２〜８時間の期間、一般に生理的温度（約３７℃）で実施する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ用途に関して、核酸の送達は、植物または動物起源、脊椎動物または無脊椎動物、および任意の組織または型であれ、培養中に増殖する任意の細胞への送達であってよい。好ましい実施形態では、細胞は動物細胞、より好ましくは哺乳動物細胞、および最も好ましくはヒト細胞である。
【０２７１】
一群の実施形態では、脂質−核酸粒子懸濁液を、約１０３〜約１０５個細胞／ｍＬ、より好ましくは約２×１０４個細胞／ｍＬの細胞密度を有する６０〜８０％集密度のプレート培養された細胞に加える。細胞に加える懸濁液の濃度は好ましくは約０．０１〜２０μｇ／ｍＬ、より好ましくは約１μｇ／ｍＬである。
【０２７２】
典型的な用途は、特定細胞標的をノックダウンまたは抑制するためのｓｉＲＮＡの細胞内送達をもたらすための周知の手順の使用を含む。あるいは用途は、治療上有用なポリペプチドをコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡ配列の送達を含む。このようにして、欠損遺伝子産物または存在しない遺伝子産物を供給することによって遺伝疾患用の療法を与える（すなわち、Ｄｕｃｈｅｎｎｅ型筋ジストロフィー症に関しては、Kunkelら、Brit. Med. Bull. ４５巻（３号）：６３０〜６４３頁（１９８９年）を参照、および嚢胞性線維症に関しては、Goodfellow、Nature３４１巻：１０２〜１０３頁（１９８９年）を参照）。本発明の組成物に関する他の使用は、細胞におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドの導入を含む（Bennettら、Mol.Pharm. ４１巻：１０２３〜１０３３頁（１９９２年）を参照）。
【０２７３】
あるいは、本発明の組成物は、当業者に公知である方法を使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞への核酸の送達にも使用することができる。ＤＮＡまたはｍＲＮＡ配列の送達に関する本発明の適用例に関して、参照により本明細書に組み込まれるZhuら、Science２６１巻：２０９〜２１１頁（１９９３年）は、ＤＯＴＭＡ−ＤＯＰＥ複合体を使用した、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）−クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）発現プラスミドの静脈内送達を記載する。参照により本明細書に組み込まれるHydeら、Nature３６２巻：２５０〜２５６頁（１９９３年）は、リポソームを使用した、マウスの気道上皮および肺中の肺胞への嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）遺伝子の送達を記載する。参照により本明細書に組み込まれるBrighamら、Am.J. Med. Sci. ２９８巻：２７８〜２８１頁（１９８９年）は、細胞内酵素、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）をコードする機能的原核生物遺伝子を用いたマウス肺のｉｎ  ｖｉｖｏトランスフェクションを記載する。したがって、本発明の組成物は感染疾患の治療に使用することができる。
【０２７４】
ｉｎ  ｖｉｖｏ投与に関して、薬学的組成物は非経口、すなわち関節内、静脈内、腹腔内、皮下、または筋肉内投与することが好ましい。特定の実施形態では、ボーラス注射によって薬学的組成物を静脈内または腹腔内投与する。一例に関しては、参照により本明細書に組み込まれるStadlerら、米国特許第５，２８６，６３４号を参照。細胞内核酸送達も、Straubringerら、METHODS INENZYMOLOGY、Academic Press、New York．１０１巻：５１２〜５２７頁（１９８３年）、Manninoら、Biotechniques６巻：６８２〜６９０頁（１９８８年）、Nicolauら、Crit.Rev. Ther. Drug Carrier Syst.６巻：２３９〜２７１頁（１９８９年）、およびBehr、Acc. Chem. Res.２６巻：２７４〜２７８頁（１９９３年）で論じられている。脂質系療法剤を投与するさらに他の方法は、例えばRahmanら、米国特許第３，９９３，７５４号、Sears、米国特許第４，１４５，４１０号、Papahadjopoulosら、米国特許第４，２３５，８７１号、Schneider、米国特許第４，２２４，１７９号、Lenkら、米国特許第４，５２２，８０３号およびFountainら、米国特許第４，５８８，５７８号中に記載される。
【０２７５】
他の方法では、組織への調製物の直接施用によって、標的組織と薬学的組成物を接触させることが可能である。施用は局所、「開放」または「閉鎖」手順によって実施することができる。「局所」によって、例えば皮膚、口腔咽頭部、外耳道などの、環境に曝された組織への薬学的調製物の直接施用を意味する。「開放」手順は、患者の皮膚を切開し、薬学的調製物を施用する下層にある組織を直接目に見える状態にすることを含む手順である。これは一般に、肺にアクセスするための開胸手術、腹部臓器にアクセスするための腹式開腹、または標的組織に対する他の直接的外科手術手法などの、外科手術手順によって実施される。「閉鎖」手順は、内部標的組織を直接目に見える状態にしないが、皮膚の小さな創傷を介して挿入器具によってアクセスする侵襲的手順である。例えば、ニードル洗浄により腹膜に調製物を投与することができる。同様に、薬学的調製物は、腰椎穿刺中の注入、次に脊椎麻酔または脊髄メトリザミド（ｍｅｔｒａｚａｍｉｄｅ）イメージングに関して一般に実施される患者の適切な配置によって、髄膜または脊髄に投与することができる。あるいは薬学的調製物は、内視鏡デバイスによって投与することができる。
【０２７６】
脂質−核酸組成物を、肺に吸引されるエアロゾルで（Brighamら Am. J.Sci. ２９８巻（４号）：２７８〜２８１頁（１９８９年）参照）または疾患部位への直接注射によって投与することもできる（Culver、Human GeneTherapy、Mary Ann Liebert、Inc.、Publishers、New York.７０〜７１頁（１９９４年））。
【０２７７】
本発明の方法は、様々な宿主において実施することができる。好ましい宿主には、例えばヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジなどの哺乳動物種が挙げられる。
【０２７８】
本発明の脂質−治療剤粒子に関する投与量は、治療剤と脂質の比、ならびに患者の年齢、体重、および状態に基づく投与する医師の意見に依存する。
【０２７９】
一実施形態では、本発明は、標的ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現を調節する方法を提供する。これらの方法は、標的ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現を調節することができる核酸と結合する本発明の脂質粒子と、細胞を接触させることを一般に含む。本明細書で使用する用語「調節する」は、標的ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現を変えることを指す。異なる実施形態では、調節は増大もしくは増強を意味することができ、またはそれは減少または低減を意味することができる。標的ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現のレベルを測定する方法は当技術分野で公知および利用可能であり、例えば、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）および免疫組織化学的技法を利用する方法を含む。特定の実施形態では、標的ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現のレベルは、適切な対照値と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、または５０％を超えて増大または低減する。例えば、所望のポリペプチドの発現が増大する場合、核酸は所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターであり得る。他方で、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの低減した発現が望まれる場合、そのときは核酸は、例えば、標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を含み、それによって標的ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現を妨害する、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、またはマイクロＲＮＡであり得る。あるいは核酸は、このようなアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、またはマイクロＲＮＡを発現するプラスミドであってよい。
【０２８０】
特定の一実施形態では、本発明は、細胞によるポリペプチドの発現を調節する方法であって、例えば、約３５〜６５％の式Ａのカチオン性脂質、３〜１２％の中性脂質、１５〜４５％のステロール、および０．５〜１０％のＰＥＧまたはＰＥＧ改変脂質のモル比で、式Ａのカチオン性脂質、中性脂質、ステロール、ＰＥＧ改変脂質のＰＥＧからなる、または本質的にこれらからなる脂質粒子を細胞に与えることを含み、脂質粒子がポリペプチドの発現を調節することができる核酸と結合する方法を提供する。特定の実施形態では、モル脂質比は約６０／７．５／３１／１．５または５７．５／７．５／３１．５／３．５（ｍｏｌ％、脂質Ａ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−ＤＭＧ）である。別群の実施形態では、これらの組成物中の中性脂質をＤＰＰＣ（ジパルミトイルホスファチジルコリン）、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥまたはＳＭと交換する。
【０２８１】
特定の実施形態では、治療剤はｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドを発現することができるプラスミドから選択され、この場合ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、またはアンチセンスＲＮＡは、ポリペプチドの発現が低減するように、ポリペプチド、またはその相補体をコードするポリヌクレオチドと特異的に結合するポリヌクレオチドを含む。
【０２８２】
他の実施形態では、核酸は、ポリペプチドまたはその機能的変異体もしくは断片の発現が増大するような、ポリペプチドまたはその機能的変異体もしくは断片をコードするプラスミドである。
【０２８３】
関連実施形態では、本発明は、被験体におけるポリペプチドの過剰発現によって特徴付けられる疾患または障害を治療する方法であって、本発明の薬学的組成物を被験体に与えることを含み、治療剤がｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドを発現することができるプラスミドから選択され、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、またはアンチセンスＲＮＡが、ポリペプチド、またはその相補体をコードするポリヌクレオチドと特異的に結合するポリヌクレオチドを含む方法を提供する。
【０２８４】
一実施形態では、薬学的組成物は、例えば、約３５〜６５％の式Ａのカチオン性脂質、３〜１２％の中性脂質、１５〜４５％のステロール、および０．５〜１０％のＰＥＧまたはＰＥＧ改変脂質ＰＥＧ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧまたはＰＥＧ−ＤＭＡのモル比で、脂質Ａ、ＤＳＰＣ、ＣｈｏｌおよびＰＥＧ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧまたはＰＥＧ−ＤＭＡからなる、または本質的にこれらからなる脂質粒子を含み、この脂質粒子は治療核酸と結合する。特定の実施形態では、モル脂質比は約６０／７．５／３１／１．５または５７．５／７．５／３１．５／３．５（ｍｏｌ％、脂質Ａ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−ＤＭＧ）である。別群の実施形態では、これらの組成物中の中性脂質をＤＰＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥまたはＳＭと交換する。
【０２８５】
別の関連実施形態では、本発明は、被験体におけるポリペプチドの過小発現によって特徴付けられる疾患または障害を治療する方法であって、本発明の薬学的組成物を被験体に与えることを含み、治療剤がポリペプチドまたはその機能的変異体もしくは断片をコードするプラスミドである方法を含む。
【０２８６】
他に定義しない限り、本明細書で使用するすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載する方法および材料と同等または均等な方法および材料を、本発明の実施または試験において使用することができるが、適切な方法および材料を以下に記載する。本明細書で言及するすべての刊行物、特許出願、特許、および他の参照文献は、それらの全容を参照により本明細書に組み込む。係争の場合、本明細書が定義を含めて管理する。さらに、材料、方法、および実施例は単なる例示的なものであり、制限することを意図するものではない。
【実施例】
【０２８７】
（実施例１）
ｄｓＲＮＡ合成
試薬の供給元
試薬の供給元を本明細書で具体的に与えない場合、分子生物学における適用例の品質／純度標準で、分子生物学の任意の試薬供給業者から、このような試薬を入手することができる。
【０２８８】
ｓｉＲＮＡ合成
ｄｓＲＮＡのスクリーニング用に、Ｅｘｐｅｄｉｔｅ８９０９合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ａｐｐｌｅｒａ  Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ  ＧｍｂＨ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）および固体支持体として制御細孔ガラス（ＣＰＧ、５００Å、Ｐｒｏｌｉｇｏ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ、Ｈａｍｂｕｒｇ、ドイツ）を使用して、１μｍｏｌｅのスケールで固相合成によって一本鎖ＲＮＡを生成した。ＲＮＡおよび２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを含有するＲＮＡを、それぞれ対応するホスホラミダイトおよび２’−Ｏ−メチルホスホラミダイト（Ｐｒｏｌｉｇｏ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ、Ｈａｍｂｕｒｇ、ドイツ）を利用して固相合成によって作製した。これらの構成単位（ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ｂｌｏｃｋ）を、Current protocols in nucleic acid chemistry、Beaucage、S.Lら、(Edrs.)、JohnWiley and Sons、Inc.、New York、NY、USAに記載された方法などの、標準的なヌクレオシドホスホラミダイト化学合成法を使用して、オリゴリボヌクレオチド鎖の配列内の選択部位に組み込んだ。ホスホロチオエート結合を、アセトニトリル中のＢｅａｕｃａｇｅ試薬の溶液（１％）（Ｃｈｒｕａｃｈｅｍ  Ｌｔｄ、Ｇｌａｓｇｏｗ、ＵＫ）でヨウ素酸化剤溶液を置換することによって導入した。さらなる補助試薬はＭａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ  Ｂａｋｅｒ（Ｇｒｉｅｓｈｅｉｍ、ドイツ）から入手した。
【０２８９】
アニオン交換ＨＰＬＣによる粗製オリゴヌクレオチドの脱保護および精製は、確立した手順に従い実施した。分光光度計（ＤＵ６４０Ｂ、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＧｍｂＨ、Ｕｎｔｅｒｓｃｈｌｅｉｓｓｈｅｉｍ、ドイツ）を使用して、２６０ｎｍの波長での各ＲＮＡ溶液のＵＶ吸収により収量および濃度を決定した。二本鎖ＲＮＡは相補鎖の等モル溶液をアニーリングバッファー（２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８、１００ｍＭ塩化ナトリウム）中に混合することによって作製し、３分間８５〜９０℃において水浴中で加熱し、３〜４時間にわたって室温に冷却した。アニーリングＲＮＡ溶液は、使用するまで−２０℃で保存した。
【０２９０】
Ｅｇ５遺伝子を標的化するｄｓＲＮＡ
初期スクリーニング設定
ｓｉＲＮＡ設計を実施して、（ＫＩＦ１１、ＨＳＫＰ、ＫＮＳＬ１およびＴＲＩＰ５としても公知である）Ｅｇ５を標的化するｓｉＲＮＡを同定した。Ｅｇ５に対するヒトｍＲＮＡ配列、参照配列ＩＤ番号：ＮＭ＿００４５２３を使用した。
【０２９１】
ヒトおよびマウスＥｇ５と交差反応するｓｉＲＮＡデュプレックスを設計した。２４のデュプレックスをスクリーニング用に合成した（表１ａ）。二次のスクリーニング設定は、ヒトＥｇ５を標的化する２６６ｓｉＲＮＡ、およびそのアカゲザルオルソログを用いて定義した（表２ａ）。他種の任意のＥｇ５ｍＲＮＡとの適合を必要とせずに、拡大スクリーニング設定はヒトＥｇ５を標的化する３２８ｓｉＲＮＡで選択した（表３ａ）。
【０２９２】
ヒトＥｇ５ｍＲＮＡおよび部分的アカゲザルＥｇ５ｍＲＮＡに関する配列はＮＣＢＩヌクレオチドデータベースからダウンロードし、ヒト配列は参照配列としてさらに使用した（ヒトＥＧ５：ＮＭ＿００４５２３．２，４９０８ｂｐ、およびアカゲザルＥＧ５：ＸＭ＿００１０８７６４４．１，８７８ｂｐ（ヒトＥＧ５の５’部分のみ））。
【０２９３】
表に関して：キー：Ａ，Ｇ，Ｃ，Ｕ−リボヌクレオチド：Ｔ−デオキシチミジン：ｕ，ｃ−２’−Ｏ−メチルヌクレオチド：ｓ−ホスホロチオエート結合。
【０２９４】
【表７】
0006032724.tif 000025
【０２９５】
【表７−１】
0006032724.tif 000026
【０２９６】
【表８】
0006032724.tif 000027
【０２９７】
【表９−１】
0006032724.tif 000028
【０２９８】
【表９−２】
0006032724.tif 000029
【０２９９】
【表９−３】
0006032724.tif 000030
【０３００】
【表９−４】
0006032724.tif 000031
【０３０１】
【表９−５】
0006032724.tif 000032
【０３０２】
【表９−６】
0006032724.tif 000033
【０３０３】
【表１０−１】
0006032724.tif 000034
【０３０４】
【表１０−２】
0006032724.tif 000035
【０３０５】
【表１０−３】
0006032724.tif 000036
【０３０６】
【表１０−４】
0006032724.tif 000037
【０３０７】
【表１０−５】
0006032724.tif 000038
【０３０８】
【表１０−６】
0006032724.tif 000039
【０３０９】
【表１０−７】
0006032724.tif 000040
【０３１０】
【表１１−１】
0006032724.tif 000041
【０３１１】
【表１１−２】
0006032724.tif 000042
【０３１２】
【表１１−３】
0006032724.tif 000043
【０３１３】
【表１１−４】
0006032724.tif 000044
【０３１４】
【表１１−５】
0006032724.tif 000045
【０３１５】
【表１１−６】
0006032724.tif 000046
【０３１６】
【表１１−７】
0006032724.tif 000047
ＶＥＧＦ遺伝子を標的化するｄｓＲＮＡ
ＶＥＧＦ−Ａ１２１ｍＲＮＡ配列のエクソン１〜５内で４００の標的配列を同定した。参照転写産物はＮＭ＿００３３７６である。
【０３１７】
【表１２】
0006032724.tif 000048
表４ａは同定した標的配列を含む。これらの配列を標的化する対応するｓｉＲＮＡをバイオインフォマティクススクリーニングに施した。
【０３１８】
これらの配列がＶＥＧＦ配列に特異的であり、任意の他の遺伝子由来の配列には特異的でなかったことを確実にするために、ＮＣＢＩによって提供されるＢＬＡＳＴ検索エンジンを使用して、Ｇｅｎｂａｎｋ中の配列に対して標的配列を調べた。ＢＬＡＳＴアルゴリズムの使用は、Altschulら、J. Mol. Biol. ２１５：４０３巻、１９９０年、およびAltschul and Gish、Meth.Enzymol.２６６：４６０巻、１９９６年中に記載されている。
【０３１９】
ｓｉＲＮＡは、サル、ラットおよびヒトＶＥＧＦ配列と交差反応するそれらの能力に関しても優先した。
【０３２０】
これら４００の考えられる標的配列の中で、少数の主要候補を同定するための実験スクリーニングによる分析用に８０を選択した。合計１１４のｓｉＲＮＡ分子をこれら８０の標的配列１１４用に設計した（表４ｂ）。
【０３２１】
【表１３−１】
0006032724.tif 000049
【０３２２】
【表１３−２】
0006032724.tif 000050
【０３２３】
【表１３−３】
0006032724.tif 000051
【０３２４】
【表１３−４】
0006032724.tif 000052
【０３２５】
【表１３−５】
0006032724.tif 000053
【０３２６】
【表１３−６】
0006032724.tif 000054
【０３２７】
【表１４−１】
0006032724.tif 000055
【０３２８】
【表１４−２】
0006032724.tif 000056
【０３２９】
【表１４−３】
0006032724.tif 000057
【０３３０】
【表１４−４】
0006032724.tif 000058
【０３３１】
【表１４−５】
0006032724.tif 000059
【０３３２】
【表１４−６】
0006032724.tif 000060
【０３３３】
【表１４−７】
0006032724.tif 000061
【０３３４】
【表１４−８】
0006032724.tif 000062
【０３３５】
【表１４−９】
0006032724.tif 000063
（実施例２）
細胞増殖を介したＥｇ５ｓｉＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニング
Ｅｇ５のサイレンシングは有糸分裂停止を引き起こすことが示されているので（Weil, Dら、［２００２年］Biotechniques３３巻：１２４４〜８頁）、細胞生存率アッセイをｓｉＲＮＡの活性スクリーニングに使用した。ＨｅＬａ細胞（ウエル当たり１４０００［スクリーニング１および３］またはウエル当たり１００００［スクリーニング２］）を９６ウエルプレートに接種し、３０ｎＭのウエル中最終ｓｉＲＮＡ濃度、ならびに５０ｎＭ（一次スクリーニング）および２５ｎＭ（二次スクリーニング）の最終濃度で、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて同時にトランスフェクトした。デュプレックスのサブセットは三次スクリーニングにおいて２５ｎＭで試験した（表５）。
【０３３６】
トランスフェクション後７２時間で、培養培地にＷＳＴ−１試薬（Ｒｏｃｈｅ）を加えることにより細胞増殖をアッセイし、４５０ｎｍでその後吸光度を測定した。対照（非トランスフェクト）細胞の吸光度値を１００パーセントとみなし、ｓｉＲＮＡトランスフェクトウエルの吸光度は対照値と比較した。アッセイは３スクリーニングのそれぞれに関して６連（ｓｅｘｔｕｐｌｉｃａｔｅ）で実施した。ｓｉＲＮＡのサブセットは一定範囲のｓｉＲＮＡ濃度でさらに試験した。アッセイはＨｅＬａ細胞において実施した（ウエル当たり１４０００、上と同じ方法、表５）。
【０３３７】
【表１５】
0006032724.tif 000064
表５中で最大増殖阻害を示した９個のｓｉＲＮＡデュプレックスを、ＨｅＬａ細胞において一定範囲のｓｉＲＮＡ濃度で再試験した。試験したｓｉＲＮＡ濃度は、１００ｎＭ、３３．３ｎＭ、１１．１ｎＭ、３．７０ｎＭ、１．２３ｎＭ、０．４１ｎＭ、０．１４ｎＭおよび０．０４６ｎＭであった。アッセイは６連で実施し、細胞増殖の５０パーセント阻害をもたらしたそれぞれのｓｉＲＮＡ濃度（ＩＣ５０）を計算した。この用量応答分析はそれぞれのデュプレックスに関して２回〜４回実施した。平均ＩＣ５０値（ｎＭ）は表６中に与える。
【０３３８】
【表１６】
0006032724.tif 000065
（実施例３）
ｍＲＮＡ阻害を介したＥｇ５ｓｉＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニング
トランスフェクション直前に、ＨｅＬａＳ３（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−２．２、ＬＣＧ  Ｐｒｏｍｏｃｈｅｍ  ＧｍｂＨ、Ｗｅｓｅｌ、ドイツ）細胞を、７５μｌの増殖培地（ハムのＦ１２、１０％ウシ胎仔血清、１００ｕペニシリン／１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、いずれもＢｏｏｋｒｏｏｍ  ＡＧ、ベルリン、ドイツ）が入った９６ウエルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ  ＧｍｂＨ、Ｆｒｉｃｋｅｎｈａｕｓｅｎ、ドイツ）に１．５×１０４個の細胞／ウエルで接種した。トランスフェクションは４連で実施した。それぞれのウエルに関して、０．５μｌのリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＧｍｂＨ、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、ドイツ）を１２μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合し、室温で１５分間インキュベートした。１００μｌのトランスフェクション体積中に５０ｎＭであるｓｉＲＮＡ濃度に関して、１μｌの５μＭｓｉＲＮＡをウエル当たり１１．５μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭと混合し、リポフェクタミン２０００−Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ混合物と組み合わせ、室温で１５分間再度インキュベートした。ｓｉＲＮＡ−リポフェクタミン２０００−複合体を（ウエル当たりそれぞれ２５μｌで）細胞に完全に施し、細胞は加湿インキュベーター（Ｈｅｒｏｅｓ  ＧｍｂＨ、Ｈａｎａｕ）において３７℃および５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。単回用量スクリーニングは、それぞれ５０ｎＭおよび２５ｎＭで一回行った。
【０３３９】
５０μｌの溶解混合物（Ｇｅｎｏｓｐｅｃｔｒａ、Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＵＳＡからのＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ  ｂＤＮＡキットの含有物）を、１００μｌの増殖培地を含有するそれぞれのウエルに加えることによって細胞を採取し、３０分間５３℃で溶かした。その後、５０μｌの一覧（ｌｉｓｔ）をヒトＥｇ５およびヒトＧＡＰＤＨに特異的なプローブセットとインキュベートし、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅに関する製造者のプロトコールに従い進めた。最後に、ＲＬＵ（相対光単位）としてＶｉｃｔｏｒ２−Ｌｉｇｈｔ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ、ドイツ）中で化学発光を測定し、ｈＥｇ５プローブセットを用いて得た値は各ウエルのそれぞれのＧＡＰＤＨ値に対して標準化した。Ｅｇ５を対象とするｓｉＲＮＡを用いて得た値は（ＨＣＶを対象とする）非特異的ｓｉＲＮＡを用いて得た値（これを１００％に設定した）と比較した（表１ｂ、２ｂおよび３ｂ）。
【０３４０】
スクリーニングからの有効なｓｉＲＮＡは用量応答曲線によってさらに特徴付けた。用量応答曲線のトランスフェクションは、以下の濃度：１００ｎＭ、１６．７ｎＭ、２．８ｎＭ、０．４６ｎＭ、７７ピコＭ、１２．８ピコＭ、２．１ピコＭ、０．３５ピコＭ、５９．５ｆＭ、９．９ｆＭおよび擬似（ｓｉＲＮＡなし）で実施し、上記のプロトコールに従い１２．５μｌの最終濃度にＯｐｔｉ−ＭＥＭを用いて希釈した。マイクロソフトエクセルアドインソフトウェアＸＬ−ｆｉｔ４．２（ＩＤＢＳ、Ｇｕｉｌｄｆｏｒｄ、Ｓｕｒｒｅｙ、ＵＫ）を使用すること、および用量応答モデル番号２０５を適用することによって、データ分析を実施した（表１ｂ、２ｂおよび３ｂ）。
【０３４１】
主要ｓｉＲＮＡ  ＡＤ１２１１５を、（先に記載したように）ＲｏｃｈｅからのＷＳＴ増殖アッセイを適用することによってさらに分析した。
【０３４２】
最大活性を示した表２からの３４デュプレックスのサブセットを、１００ｎＭから１０ｆＭの範囲の最終濃度でＨｅＬａ細胞においてトランスフェクションによってアッセイした。トランスフェクションは４連で実施した。２回の用量応答アッセイをそれぞれのデュプレックスに関して実施した。ＫＳＰ  ｍＲＮＡの２０％（ＩＣ２０）、５０％（ＩＣ５０）および８０％（ＩＣ８０）の低減を与える濃度を、それぞれのデュプレックスに関して計算した（表７）。
【０３４３】
【表１７】
0006032724.tif 000066
（実施例４）
ＬＮＰ０１製剤化ｓｉＲＮＡの単回ボーラス投与後の幼若ラットにおける肝臓Ｅｇ５／ＫＳＰのサイレンシング
生まれてから約２３日齢まで、成長中のラット肝臓においてＥｇ５／ＫＳＰ発現を検出することができる。製剤化Ｅｇ５／ＫＳＰ  ｓｉＲＮＡを用いた標的のサイレンシングを、デュプレックスＡＤ−６２４８を使用して幼若ラットにおいて評価した。
【０３４４】
【表１８】
0006032724.tif 000067
方法
動物の投薬。オスの、幼若Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（１９日齢）に、尾静脈注射によって単回用量のリピドイド（「ＬＮＰ０１」）製剤化ｓｉＲＮＡを投与した。１０匹の動物群に、体重１キログラム当たり１０ミリグラム（ｍｇ／ｋｇ）の用量のＡＤ６２４８または非特異的ｓｉＲＮＡのいずれかを与えた。用量レベルは、製剤で投与するｓｉＲＮＡデュプレックスの量を指す。第三群にはリン酸緩衝食塩水を与えた。動物はｓｉＲＮＡ投与後２日で屠殺した。肝臓を切開し、液体窒素中に急速凍結し、粉末状に粉砕した。
【０３４５】
ｍＲＮＡの測定。Ｅｇ５／ＫＳＰ  ｍＲＮＡのレベルを全治療群からの肝臓において測定した。それぞれの肝臓粉末のサンプル（約１０ミリグラム）は、プロテイナーゼＫを含有する組織溶解バッファーにおいて均質状にした。Ｅｇ５／ＫＳＰおよびＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡのレベルを、Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ  ｂｒａｎｃｈｅｄ  ＤＮＡアッセイ（ＧｅｎｏＳｐｅｃｔｒａ）を使用してそれぞれのサンプルに関して３連で測定した。Ｅｇ５／ＫＳＰの平均値はそれぞれのサンプルの平均ＧＡＰＤＨ値に対して標準化した。それぞれの実験に関して、群の平均値を決定しＰＢＳ群に対して標準化した。
【０３４６】
統計分析。有意性はＡＮＯＶＡ次にターキーのポストホックテストによって決定した。
【０３４７】
結果
データの要約
Ｅｇ５／ＫＳＰ  ｍＲＮＡに関する平均値（±標準偏差）を与える。ＰＢＳ群に対する統計的有意性（ｐ値）を示す（ｎｓ、有意性なし［ｐ＞０．０５］）。
【０３４８】
【表１９】
0006032724.tif 000068
肝臓Ｅｇ５／ＫＳＰ  ｍＲＮＡの統計上有意な低減を、１０ｍｇ／ｋｇの用量で製剤化ＡＤ６２４８を用いた治療後に得た。
【０３４９】
（実施例５）
ＬＮＰ０１製剤化ＶＳＰの静脈内注入後のラット肝臓ＶＥＧＦのサイレンシング
２つのｓｉＲＮＡの等モル混合物を含む「リピドイド」製剤をラットに投与した。本明細書で使用するＶＳＰは、２つのｓｉＲＮＡ、Ｅｇ５／ＫＳＰを対象とするｓｉＲＮＡおよびＶＥＧＦを対象とするｓｉＲＮＡを有する組成物を指す。この実験用に、ＶＥＧＦを対象とするデュプレックスＡＤ３１３３およびＥｇ５／ＫＳＰを対象とするＡＤ１２１１５を使用した。Ｅｇ５／ＫＳＰの発現は成体ラット肝臓においてほぼ検出不能なので、ｓｉＲＮＡ治療後にＶＥＧＦレベルのみを測定した。
【０３５０】
【表２０】
0006032724.tif 000069
方法
動物の投薬。成体、メスのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに、大腿静脈への２時間の注入によってリピドイド（「ＬＮＰ０１」）製剤化ｓｉＲＮＡを投与した。４匹の動物群に、体重１キログラム当たり５、１０および１５ミリグラム（ｍｇ／ｋｇ）の用量の製剤化ｓｉＲＮＡを与えた。用量レベルは、製剤において投与するｓｉＲＮＡデュプレックスの合計量を指す。第四群にはリン酸緩衝食塩水を与えた。動物はｓｉＲＮＡ注入終了後７２時間で屠殺した。肝臓を切開し、液体窒素中に急速凍結し、粉末状に粉砕した。
【０３５１】
製剤化手順
リピドイドＮＤ９８・４ＨＣｌ（ＭＷ１４８７）（製剤１、上記）、コレステロール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、およびＰＥＧ−セラミドＣ１６（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ）を使用して脂質−ｓｉＲＮＡナノ粒子を調製した。
【０３５２】
エタノール中のそれぞれのストック溶液を調製した：ＮＤ９８、１３３ｍｇ／ｍＬ、コレステロール、２５ｍｇ／ｍＬ、ＰＥＧ−セラミドＣ１６、１００ｍｇ／ｍＬ。ＮＤ９８、コレステロール、およびＰＥＧ−セラミドＣ１６のストック溶液を４２：４８：１０のモル比で次いで組み合わせた。組み合わせた脂質溶液は、最終エタノール濃度が３５〜４５％であり最終酢酸ナトリウム濃度が１００〜３００ｍＭであるように、水性ｓｉＲＮＡ（酢酸ナトリウムｐＨ５中）とすぐに混合した。脂質−ｓｉＲＮＡナノ粒子は混合の際に自然に形成された。望ましい粒径分布に応じて、いくつかの場合、生成したナノ粒子混合物を、サーモバレル押出機（Ｌｉｐｅｘ  Ｅｘｔｒｕｄｅｒ、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｌｉｐｉｄｓ、Ｉｎｃ）を使用して、ポリカーボネート膜（１００ｎｍカットオフ）を介して押し出した。他の場合、押出し工程を省略した。エタノール除去および同時のバッファー交換は透析またはタンジェンシャルフロー濾過のいずれかによって実施した。バッファーはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．２に交換した。
【０３５３】
製剤の特徴付け
標準法または押出し遊離法のいずれかによって調製した製剤を同様の様式で特徴付けする。製剤は外観検査によって最初に特徴付けする。それらは凝集体または沈殿物を含まない白色半透明溶液であるべきである。脂質−ナノ粒子の粒径および粒径分布は、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ、ＵＳＡ）を使用して動的光散乱によって測定する。粒子は２０〜３００ｎｍ、および理想的には４０〜１００ｎｍの大きさでなければならない。粒径分布は単峰でなければならない。製剤、ならびに捕捉画分中の全体のｓｉＲＮＡ濃度は、色素排除アッセイを使用して評価する。製剤化ｓｉＲＮＡのサンプルは、製剤化を妨害する界面活性剤、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００の有無の下でＲＮＡ結合色素Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）とインキュベートする。製剤中の全体のｓｉＲＮＡは、標準曲線と比較して、界面活性剤を含有するサンプルからのシグナルによって決定する。捕捉画分は、全体のｓｉＲＮＡ含有量から（界面活性剤の不在下でのシグナルによって測定した）「遊離」ｓｉＲＮＡ含有量を差し引くことによって決定する。捕捉ｓｉＲＮＡの割合は典型的には＞８５％である。ＳＮＡＬＰ製剤に関して、粒径は少なくとも３０ｎｍ、少なくとも４０ｎｍ、少なくとも５０ｎｍ、少なくとも６０ｎｍ、少なくとも７０ｎｍ、少なくとも８０ｎｍ、少なくとも９０ｎｍ、少なくとも１００ｎｍ、少なくとも１１０ｎｍ、および少なくとも１２０ｎｍである。好ましい範囲は少なくとも約５０ｎｍ〜少なくとも約１１０ｎｍ、好ましくは少なくとも約６０ｎｍ〜少なくとも約１００ｎｍ、最も好ましくは少なくとも約８０ｎｍ〜少なくとも約９０ｎｍである。一例では、それぞれの粒径は少なくとも約１：１の比のＥｇ５  ｄｓＲＮＡとＶＥＧＦ  ｄｓＲＮＡを含む。
【０３５４】
ｍＲＮＡの測定。それぞれの肝臓粉末のサンプル（約１０ミリグラム）を、プロテイナーゼＫを含有する組織溶解バッファー中で均質状にした。ＶＥＧＦおよびＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡのレベルを、Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ  ｂｒａｎｃｈｅｄ  ＤＮＡアッセイ（ＧｅｎｏＳｐｅｃｔｒａ）を使用してそれぞれのサンプルに関して３連で測定した。ＶＥＧＦの平均値はそれぞれのサンプルの平均ＧＡＰＤＨ値に対して標準化した。それぞれの実験に関して、群の平均値を決定しＰＢＳ群に対して標準化した。
【０３５５】
タンパク質の測定。それぞれの肝臓粉末のサンプル（約６０ミリグラム）を、１ｍｌのＲＩＰＡバッファー中に均質状にした。全体のタンパク質濃度はＭｉｃｒｏ  ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して決定した。それぞれの動物からの全タンパク質のサンプルを使用して、ＶＥＧＦ  ＥＬＩＳＡアッセイ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してＶＥＧＦタンパク質レベルを決定した。それぞれの実験に関して、群の平均値を決定しＰＢＳ群に対して標準化した。
【０３５６】
統計分析。有意性はＡＮＯＶＡ次にターキーのポストホックテストによって決定した。
【０３５７】
結果
データの要約
ｍＲＮＡ（ＶＥＧＦ／ＧＡＰＤＨ）およびタンパク質（相対ＶＥＧＦ）に関する平均値（±標準偏差）をそれぞれの治療群に関して示す。それぞれの実験に関してＰＢＳ群に対する統計的有意性（ｐ値）を示す。
【０３５８】
【表２１】
0006032724.tif 000070
肝臓ＶＥＧＦ  ｍＲＮＡおよびタンパク質の統計上有意な低減を、全３個のｓｉＲＮＡ用量レベルで測定した。
【０３５９】
（実施例６）
ヒト肝臓腫瘍のマウスモデルにおけるＶＳＰ  ＳＮＡＬＰの評価
これらの試験は、ＫＳＰ／Ｅｇ５を標的化するｄｓＲＮＡおよびＶＥＧＦを標的化するｄｓＲＮＡを含有するＶＳＰ  ｓｉＲＮＡカクテルを利用した。本明細書で使用するＶＳＰは、２つのｓｉＲＮＡ、Ｅｇ５／ＫＳＰを対象とするｓｉＲＮＡおよびＶＥＧＦを対象とするｓｉＲＮＡを有する組成物を指す。この実験用に、（ＶＥＧＦを対象とする）デュプレックスＡＤ３１３３および（Ｅｇ５／ＫＳＰを対象とする）ＡＤ１２１１５を使用した。ｓｉＲＮＡカクテルは以下に記載するようにＳＮＡＬＰに製剤化した。
【０３６０】
最大試験サイズは２０〜２５匹のマウスを利用した。肝臓癌を治療するためのｓｉＲＮＡ  ＳＮＡＬＰカクテルの有効性を試験するために、１×１０６個の腫瘍細胞を試験マウスの左側葉に直接注射した。切り口は縫合によって閉じ、マウスは２〜５時間で回復させた。マウスは４８〜７２時間以内に完全に回復した。ＳＮＡＬＰ  ｓｉＲＮＡ治療は腫瘍接種後８〜１１日に開始した。
【０３６１】
利用したＳＮＡＬＰ製剤は、（ｉ）ＶＳＰ（ＫＳＰ＋ＶＥＧＦ  ｓｉＲＮＡカクテル（１：１のモル比））、（ｉｉ）ＫＳＰ（ＫＳＰ＋Ｌｕｃ  ｓｉＲＮＡカクテル）、および（ｉｉｉ）ＶＥＧＦ（ＶＥＧＦ＋Ｌｕｃ  ｓｉＲＮＡカクテル）であった。すべての製剤は等量（ｍｇ）の各活性ｓｉＲＮＡを含有していた。すべてのマウスに全ｓｉＲＮＡ／脂質用量を与え、それぞれのカクテルは、元のクエン酸バッファーの条件を使用して、１：５７  ｃＤＭＡ  ＳＮＡＬＰ（１．４％ＰＥＧ−ｃＤＭＡ、５７．１％ＤＬｉｎＤＭＡ、７．１％ＤＰＰＣ、および３４．３％コレステロール）、６：１  脂質：薬剤に製剤化した。
【０３６２】
ヒトＨｅｐ３Ｂ試験Ａ：ＶＳＰ−ＳＮＡＬＰの抗腫瘍活性
ヒトヘパトーマＨｅｐ３Ｂ腫瘍を、肝臓内接種によってｓｃｉｄ／ｂｅｉｇｅマウスにおいて樹立した。群Ａ（ｎ＝６）の動物にはＰＢＳを投与し、群Ｂ（ｎ＝６）の動物にはＶＳＰ  ＳＮＡＬＰを投与し、群Ｃ（ｎ＝５）の動物にはＫＳＰ／ＬｕｃＳＮＡＬＰを投与し、群Ｄ（ｎ＝５）の動物にはＶＥＧＦ／Ｌｕｃ  ＳＮＡＬＰを投与した。
【０３６３】
ＳＮＡＬＰ治療は腫瘍接種後８日に開始した。ＳＮＡＬＰは３ｍｇ／ｋｇの全ｓｉＲＮＡを週に二回（月曜日と木曜日）、合計６用量（累計１８ｍｇ／ｋｇ  ｓｉＲＮＡ）投薬した。最終用量は第２５日に投与し、終点エンドポイントは第２７日であった。
【０３６４】
腫瘍量は、（ａ）体重、（ｂ）肝臓重量、（ｃ）第２７日における外観検査＋写真、（ｄ）ヒト特異的ｍＲＮＡ分析、および（ｅ）第２７日に測定した血中アルファフェトプロテインレベルによってアッセイした。
【０３６５】
以下の表１０は、接種（左側方）肝葉において測定した腫瘍量の外観スコアの結果を示す。スコア：「−」＝肉眼で見える腫瘍なし、「＋」＝注射部位における腫瘍組織の証拠、「＋＋」＝肝葉から突出した不連続な腫瘍小結節、「＋＋＋」＝肝葉の両側で突出した大きな腫瘍、「＋＋＋＋」＝大きな腫瘍、肝葉全体中の複数の小結節。
【０３６６】
【表２２】
0006032724.tif 000071
図１、図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｃおよび図２Ｄ中に示す体重の百分率として肝臓重量は、マウス体重、マウスにおけるヒトヘパトーマＨｅｐ３Ｂ腫瘍に対するＰＢＳ、ＶＳＰ、ＫＳＰおよびＶＥＧＦの効果を示す。
【０３６７】
この試験から、以下の結論を得た。（１）ＶＳＰ  ＳＮＡＬＰはＨｅｐ３Ｂ１Ｈモデルにおいて強力な抗腫瘍効果を実証した、（２）ＶＳＰカクテルの抗腫瘍活性はＫＳＰの構成要素と大きく関係があるようであった、（３）抗ＫＳＰ活性は単回用量の組織学的分析によって確認した、および（４）ＶＥＧＦ  ｓｉＲＮＡはこのモデルにおける腫瘍増殖の阻害に対して測定可能な効果は示さなかった。
【０３６８】
ヒトＨｅｐ３Ｂ試験Ｂ：ＶＳＰ治療による生存の延長
第二のＨｅｐ３Ｂ試験では、ヒトヘパトーマＨｅｐ３Ｂ腫瘍を、肝臓内接種によってｓｃｉｄ／ｂｅｉｇｅマウスにおいて樹立した。これらのマウスはリンパ球およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞に欠陥があったが、それは免疫媒介抗腫瘍効果について最小の余地がある。群Ａ（ｎ＝６）のマウスは未治療であり、群Ｂ（ｎ＝６）のマウスにはルシフェラーゼ（ｌｕｃ）１９５５  ＳＮＡＬＰ（ロット番号ＡＰ１０−０２）を投与し、群Ｃ（ｎ＝７）のマウスにはＶＳＰ  ＳＮＡＬＰ（ロット番号ＡＰ１０−０１）を投与した。ＳＮＡＬＰは１：５７  ｃＤＭＡ  ＳＮＡＬＰ、および６：１  脂質：薬剤であった。
【０３６９】
ＳＮＡＬＰ治療は腫瘍接種後８日に開始した。ＳＮＡＬＰは３ｍｇ／ｋｇ  全ｓｉＲＮＡで、週に二回（月曜日と木曜日）、合計６用量（累計１８ｍｇ／ｋｇ  ｓｉＲＮＡ）投薬した。最終用量は第２５日に送達し、本試験の終点エンドポイントは第２７日であった。
【０３７０】
腫瘍量は、（１）体重、（２）第２７日における外観検査＋写真、（３）ヒト特異的ｍＲＮＡ分析、および（４）第２７日に測定した血中アルファフェトプロテインによってアッセイした。
【０３７１】
図３は、体重を投薬のそれぞれの日（第８、１１、１４、１８、２１および２５日）および屠殺の日に測定したことを示す。
【０３７２】
【表２３】
0006032724.tif 000072
スコア：「−」＝肉眼で見える腫瘍なし、「＋」＝注射部位における腫瘍組織の証拠、
「＋＋」＝肝葉から突出した不連続な腫瘍小結節、「＋＋＋」＝肝葉の両側で突出した
大きな腫瘍、「＋＋＋＋」＝大きな腫瘍、肝葉全体の複数の小結節。
【０３７３】
体重と腫瘍量（ｔｕｍｏｒ  ｂｕｒｄｅｎ）の間の相関を図４、５および６に示す。図４は、未治療マウスにおける２７日間にわたる体重の百分率を示す。図５は、１９５５  Ｌｕｃ  ＳＮＡＬＰ治療マウスにおける２７日間にわたる体重の百分率を示す。図６は、ＶＳＰ  ＳＮＡＬＰ治療マウスにおける２７日間にわたる体重の百分率を示す。
【０３７４】
Ｈｅｐ３ＢマウスへのＶＳＰ  ＳＮＡＬＰの単回用量（２ｍｇ／ｋｇ）は、組織学的染色によって調べた肝臓組織サンプルにおいて紡錘体の形成をもたらした。
【０３７５】
腫瘍量は定量ＲＴ−ＰＣＲ（ｐＲＴ−ＰＣＲ）（Ｔａｑｍａｎ）によって定量化した。ヒトＧＡＰＤＨは種特異的ＴａｑｍａｎアッセイによってマウスＧＡＰＤＨに対して標準化した。図７Ａは、ＧＡＰＤＨレベルに相関した上の表において肉眼観察によって示した腫瘍スコアを示す。
【０３７６】
血清ＥＬＩＳＡを実施して腫瘍によって分泌されたアルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）を測定した。以下に記載するように、ＡＦＰのレベルが治療後に低下する場合、腫瘍は増殖していない。図７Ｂは、ＶＳＰを用いた治療は、対照を用いた治療と比較してＡＦＰレベルを低下させたことを示す。
【０３７７】
ヒトＨｅｐＢ３試験Ｃ：
三次の試験では、ヒトＨＣＣ細胞（ＨｅｐＢ３）をＳＣＩＤ／ｂｅｉｇｅマウスの肝臓に直接注射し、治療は２０日後に開始した。群Ａの動物にはＰＢＳを投与し、群Ｂの動物には４ｍｇ／ｋｇのＬｕｃ−１９５５  ＳＮＡＬＰを投与し、群Ｃの動物には４ｍｇ／ｋｇのＳＮＡＬＰ−ＶＳＰを投与し、群Ｄの動物には２ｍｇ／ｋｇのＳＮＡＬＰ−ＶＳＰを投与し、群Ｅの動物には１ｍｇ／ｋｇのＳＮＡＬＰ−ＶＳＰを投与した。治療は単回静脈内（ｉｖ）投薬で行い、マウスは２４時間後に屠殺した。
【０３７８】
腫瘍量および標的サイレンシングはｑＲＴ−ＰＣＲ（Ｔａｑｍａｎ）によってアッセイした。腫瘍スコアも上に記載したように目視で測定し、その結果は以下の表に示す。図８に示すように、ｈＧＡＰＤＨレベルは以下の表に示す肉眼で見える腫瘍スコアと相関がある。
【０３７９】
【表２４】
0006032724.tif 000073
スコア:「+」=様々な腫瘍生着/いくつかの小さな腫瘍、「++」=肝葉から突出した
不連続な腫瘍小結節、「+++」=肝葉の両側で突出した大きな腫瘍
ヒト（腫瘍由来）ＫＳＰサイレンシングはＴａｑｍａｎ分析によってアッセイし、その結果は図９に示す。ｈＫＳＰ発現はｈＧＡＰＤＨに対して標準化した。約８０％の腫瘍ＫＳＰサイレンシングを４ｍｇ／ｋｇのＳＮＡＬＰ−ＶＳＰで観察し、有効性は１ｍｇ／ｋｇで明らかであった。図９の白線は小（低ＧＡＰＤＨ）腫瘍からの結果を表す。
【０３８０】
ヒト（腫瘍由来）ＶＥＧＦサイレンシングはＴａｑｍａｎ分析によってアッセイし、その結果は図１０中に示す。ｈＶＥＧＦ発現はｈＧＡＰＤＨに対して標準化した。約６０％の腫瘍ＶＥＧＦサイレンシングを４ｍｇ／ｋｇのＳＮＡＬＰ−ＶＳＰで観察し、有効性は１ｍｇ／ｋｇで明らかであった。図１０の白線は小（低ＧＡＰＤＨ）腫瘍からの結果を表す。
【０３８１】
マウス（肝臓由来）ＶＥＧＦサイレンシングはＴａｑｍａｎ分析によってアッセイし、その結果は図１１Ａに示す。ｍＶＥＧＦ発現はｈＧＡＰＤＨに対して標準化した。約５０％の肝臓ＶＥＧＦサイレンシングを４ｍｇ／ｋｇのＳＮＡＬＰ−ＶＳＰで観察し、有効性は１ｍｇ／ｋｇで明らかであった。
【０３８２】
ヒトＨｅｐＢ３試験Ｄ：腫瘍増殖に対するそれぞれのｄｓＲＮＡの寄与
第四の試験では、ヒトＨＣＣ細胞（ＨｅｐＢ３）をＳＣＩＤ／ｂｅｉｇｅマウスの肝臓に直接注射し、治療は８日後に開始した。治療は静脈内（ｉｖ）ボーラス注射で、週に二回、合計６用量で行った。最終用量は第２５日に投与し、終点エンドポイントは第２７日であった。
【０３８３】
腫瘍量は肉眼的組織学法、ヒト特異的ｍＲＮＡ分析（ｈＧＡＰＤＨ  ｑＰＣＲ）、および血中アルファフェトプロテインレベルによってアッセイした（ＥＬＩＳＡによる血清ＡＦＰ）。
【０３８４】
試験１では、群ＡはＰＢＳで治療し、群ＢはＳＮＡＬＰ−ＫＳＰ＋Ｌｕｃ（３ｍｇ／ｋｇ）で治療し、群ＣはＳＮＡＬＰ−ＶＥＧＦ＋Ｌｕｃ（３ｍｇ／ｋｇ）で治療し、および群ＤはＳＮＡＬＰ−ＶＳＰ（３ｍｇ／ｋｇ）で治療した。
【０３８５】
試験２では、群ＡはＰＢＳで治療し、群ＢはＳＮＡＬＰ−ＫＳＰ＋Ｌｕｃ（１ｍｇ／ｋｇ）で治療し、群ＣはＡＬＮ−ＶＳＰ０２（１ｍｇ／ｋｇ）で治療した。
【０３８６】
（図１１Ｂに示すように）ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡレベルと血清ＡＦＰレベルの両方が、ＳＮＡＬＰ−ＶＳＰを用いた治療後に低下したことが示された。
【０３８７】
組織学的試験：
ヒトヘパトーマＨｅｐ３Ｂ腫瘍を、マウスにおける肝臓内接種によって樹立した。ＳＮＡＬＰ治療は腫瘍接種後２０日に開始した。腫瘍担持マウス（群当たり３匹）を、２ｍｇ／ｋｇの全ｓｉＲＮＡで（ｉ）ＶＳＰ  ＳＮＡＬＰまたは（ｉｉ）対照（Ｌｕｃ）ＳＮＡＬＰの単回静脈内（ＩＶ）用量によって治療した。
【０３８８】
肝臓／腫瘍サンプルを、単回ＳＮＡＬＰ投与後２４時間の従来のＨ＆Ｅ組織学的方法のために回収した。
【０３８９】
大きな肉眼で見える腫瘍小結節（５〜１０ｍｍ）が剖検で明らかであった。
【０３９０】
Ｈｅｐ３ＢマウスにおけるＳＮＡＬＰ−ＶＳＰの効果：
ＳＮＡＬＰ−ＶＳＰ（ＫＳＰ  ｄｓＲＮＡとＶＥＧＦ  ｄｓＲＮＡのカクテル）治療によって、腫瘍量および腫瘍由来ＫＳＰおよびＶＥＧＦの発現が低減した。腫瘍量の指標であるＧＡＰＤＨのｍＲＮＡレベルも、ＳＮＡＬＰ−ＶＳＰ  ｄｓＲＮＡの投与後に低下することを観察した（図１２Ａ、図１２Ｂおよび図１２Ｃ中に示す）。肉眼観察による腫瘍量の低下もＳＮＡＬＰ−ＶＳＰの投与後に明らかであった。
【０３９１】
ＳＮＡＬＰ−ＶＳＰの単回ＩＶボーラス注射は紡錘体形成をさらにもたらし、これはＨｅｐ３Ｂマウス由来の肝臓組織サンプルにおいて明らかに検出した。この観察結果は細胞周期の休止を示した。
【０３９２】
（実施例７）
ＳＮＡＬＰ−ＶＳＰ動物対ＳＮＡＬＰ−Ｌｕｃ治療動物の生存
癌被験体の生存率に対するｓｉＲＮＡ  ＳＮＡＬＰの効果を試験するために、腫瘍をマウスにおける肝臓内接種によって樹立し、マウスはＳＮＡＬＰ−ｓｉＲＮＡで治療した。これらの試験は、ＫＳＰ／Ｅｇ５およびＶＥＧＦを標的化するｄｓＲＮＡを含有するＶＳＰ  ｓｉＲＮＡカクテルを利用した。対照はＬｕｃを標的化するｄｓＲＮＡであった。ｓｉＲＮＡカクテルはＳＮＡＬＰに製剤化した。
【０３９３】
腫瘍細胞（ヒトヘパトーマＨｅｐ３Ｂ、１×１０６個）をｓｃｉｄ／ｂｅｉｇｅマウスの左側葉に直接注射した。これらのマウスは、リンパ球およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞に欠陥があったが、免疫媒介抗腫瘍効果に関して最小限の余地を有する。切り口は縫合によって閉じ、マウスは２〜５時間で回復させた。マウスは４８〜７２時間以内に完全に回復した。
【０３９４】
すべてのマウスに全ｓｉＲＮＡ／脂質を静脈内（ｉｖ）投与し、それぞれのカクテルは、元のクエン酸バッファーの条件を使用して、１：５７  ｃＤＭＡ  ＳＮＡＬＰ（１．４％ＰＥＧ−ｃＤＭＡ、５７．１％ＤＬｉｎＤＭＡ、７．１％ＤＰＰＣ、および３４．３％コレステロール）、６：１脂質：薬剤に製剤化した。
【０３９５】
ｓｉＲＮＡ−ＳＮＡＬＰ治療は腫瘍接種後に以下で示す日（第１８日または２６日）に開始した。ｓｉＲＮＡ−ＳＮＡＬＰは、４ｍｇ／ｋｇの用量で第１８日または２６日後に３週間、週に二回投与した。生存をモニタリングし、動物はヒト代替エンドポイント（例えば、動物の体重、腹部膨満／変色、および全体的な健康状態）に基づいて安楽死させた。
【０３９６】
腫瘍接種後第１８日に開始した治療に関する生存データは、表１３、表１４、および図１３Ａに要約する。
【０３９７】
【表２５】
0006032724.tif 000074
【０３９８】
【表２６】
0006032724.tif 000075
図１３Ａは、腫瘍接種後の日数に対するＳＮＡＬＰ−ＶＳＰ動物およびＳＮＡＬＰ−Ｌｕｃ治療動物の平均生存率を示す。ＳＮＡＬＰ−ＶＳＰ動物の平均生存はＳＮＡＬＰ−Ｌｕｃ治療動物に対して約１５日延びた。
表15. 治療前および治療末期の時間における、それぞれの動物に関する血清アルファフェトプロテイン(AFP)濃度(濃度、μg/mlで)
【０３９９】
【表２７】
0006032724.tif 000076
腫瘍量を、実験の行程中の血清ＡＦＰレベルを使用してモニタリングした。アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）は、胎児期中に卵黄嚢および肝臓によって産生される主な血漿タンパク質である。このタンパク質は、血清アルブミンの胎児の対応物であると考えられ、ヒトＡＦＰとアルブミン遺伝子は第４染色体上で同じ転写方向にタンデムで存在する。ＡＦＰはモノマーの形態、ならびにダイマーの形態およびトリマーの形態で見られ、銅、ニッケル、脂肪酸およびビリルビンと結合する。ＡＦＰレベルは生後徐々に低下し、８〜１２カ月後に成体レベルに達する。正常な成体ＡＦＰレベルは低いが、検出可能である。ＡＦＰは正常な成体では公知の機能はなく、成体でのＡＦＰの発現はヘパトーマおよび奇形腫などの腫瘍の一部と関係があることが多い。ＡＦＰは、精巣癌、卵巣癌、および悪性奇形腫をモニタリングするために使用される腫瘍マーカーである。ＡＦＰを分泌する主な腫瘍には、内胚葉洞腫瘍（卵黄嚢癌）、神経芽腫、肝芽腫、および肝細胞癌が挙げられる。ＡＦＰ分泌腫瘍を有する患者では、ＡＦＰの血清レベルは腫瘍サイズと相関することが多い。血清レベルは、治療に対する応答を評価する際に有用である。典型的には、ＡＦＰのレベルが治療後に低下する場合、腫瘍は増殖していない。化学療法直後のＡＦＰの一時的増大は、腫瘍が増殖していることではなく、それが萎縮していること（および腫瘍細胞が死ぬとＡＦＰが放出されること）を示し得る。切除は血清レベルの低下と通常関係がある。図１４に示すように、ＳＮＡＬＰ−ＶＳＰ治療動物における腫瘍量は有意に低減した。
【０４００】
移植後２６、２９、３２、３５、３９、および４２日にＳＮＡＬＰ−ｓｉＲＮＡ治療で実験を反復した。データは図１３Ｂ中に示す。ＳＮＡＬＰ−ＶＳＰ動物の平均生存は、ＳＮＡＬＰ−Ｌｕｃ治療動物（約１９日、または３８％）に対して約１５日延びた。
【０４０１】
（実施例８）
樹立腫瘍中の単星の誘導
分裂細胞中のＫＳＰの阻害は、組織切片において容易に観察可能である単星の形成をもたらす。単星の形成がＳＮＡＬＰ−ＶＳＰ治療腫瘍中で起こったかどうか決定するために、（Ｈｅｐ３Ｂ細胞移植後３週間の）腫瘍担持動物に、尾静脈注射によって２ｍｇ／ｋｇのＳＮＡＬＰ−ＶＳＰを投与した。対照動物には２ｍｇ／ｋｇのＳＮＡＬＰ−Ｌｕｃを与えた。それぞれのカクテルは、元のクエン酸バッファーの条件を使用して、１：５７ｃＤＭＡ  ＳＮＡＬＰ（１．４％ＰＥＧ−ｃＤＭＡ、５７．１％ＤＬｉｎＤＭＡ、７．１％ＤＰＰＣ、および３４．３％コレステロール）、６：１  脂質：薬剤に製剤化した。
【０４０２】
２４時間後、動物を屠殺し、腫瘍担持肝葉を組織学的分析用に処理した。Ｈ＆Ｅ染色組織切片の代表的な画像は図１５に示す。広範囲の単星の形成は、ＳＮＡＬＰ−ＶＳＰ治療腫瘍（Ａ）において明らかであったが、ＳＮＡＬＰ−Ｌｕｃ治療腫瘍（Ｂ）では明らかでなかった。後者では、正常な有糸分裂像は明らかであった。単星の生成はＫＳＰ阻害の特徴的な性質であり、ＳＮＡＬＰ−ＶＳＰが樹立した肝臓腫瘍中で顕著な活性を有する、さらなる証拠を与える。
【０４０３】
（実施例９）
ＡＬＮ−ＶＳＰ０２（ＳＮＡＬＰ−ＶＳＰ）の製造プロセスおよび製品仕様
ＡＬＮ−ＶＳＰ０２製品は、注入を介したＩＶ投与用に（ＳＮＡＬＰと呼ばれる）滅菌脂質粒子製剤に製剤化された２ｍｇ／ｍＬの薬剤物質ＡＬＮ−ＶＳＰＤＳ０１を含有する。薬剤物質ＡＬＮ−ＶＳＰＤＳ０１は、等モル比の２つのｓｉＲＮＡ（ＫＳＰを標的化するＡＬＮ−１２１１５およびＶＥＧＦを標的化するＡＬＮ−３１３３）からなる。この薬剤製品は５ｍＬの充填体積で１０ｍＬガラスバイアル中にパッケージされる。
【０４０４】
薬剤物質は、例えばカチオン性脂質ＸＴＣ、ＡＬＮＹ−１００、およびＭＣ３と、本明細書に記載するように、他の核酸−脂質粒子製剤に製剤化することができる。
【０４０５】
以下の用語を本明細書で使用する：
【０４０６】
【表２８】
0006032724.tif 000077
９．１  薬剤物質ＡＬＮ−ＶＳＰＤＳ０１の調製
薬剤物質ＡＬＮ−ＶＳＰＤＳ０１、ＡＬＮ−１２１１５およびＡＬＮ−３１３３の２つのｓｉＲＮＡ構成要素を、市販の合成装置および素材を使用して化学的に合成する。製造プロセスは、ホスホラミダイト化学合成法、ならびに５’Ｏジメトキシトリフェニルメチル（ＤＭＴ）保護基、およびｔｅｒｔブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）で保護した２’ヒドロキシル、または２’メトキシ基（２’ＯＭｅ）で置換した２’ヒドロキシルを使用した従来の固相オリゴヌクレオチド合成によって、それぞれのデュプレックスの２つの一本鎖オリゴヌクレオチド（ＡＬＮ−１２１１５のＡ１９５６２センスとＡ１９５６３アンチセンスおよびＡＬＮ−３１３３のＡ３９８１センスおよびＡ３９８２アンチセンス）の合成からなる。制御細孔ガラスまたはポリスチレンなどの固相支持体上でのホスホラミダイト法によるオリゴヌクレオチド鎖の構築。サイクルは５’脱保護、カップリング、酸化、およびキャッピングからなる。それぞれのカップリング反応は、５（エチルチオ）１Ｈテトラゾール試薬、次に支持体固定保護ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドの遊離５’ヒドロキシル基のカップリングを使用して、適切に保護されたリボ、２’ＯＭｅ、またはデオキシリボヌクレオシドアミダイトの活性化によって実施する。適切なサイクル数の後、最終５’保護基を酸処理によって除去する。粗製オリゴヌクレオチドは、水性メチルアミン処理、ならびにシアノエチル保護基と核酸塩基保護基の同時除去によって固相支持体から切断される。２’ＯＴＢＤＭＳ基はフッ化水素含有試薬を使用して次いで切断し、粗製オリゴヌクレオチドを得て、これは強アニオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、次に限外濾過を使用した脱塩を使用して精製する。デュプレックスへのアニーリング前に、精製した一本鎖を分析して、正確な分子量、分子配列、不純物プロファイルおよびオリゴヌクレオチド含有量を確認する。アニーリングしたデュプレックス中間体ＡＬＮ１２１１５およびＡＬＮ３１３３は凍結乾燥および２０℃で保存し、または１：１のモル比で混合し、溶液を凍結乾燥して薬剤物質ＡＬＮ  ＶＳＰＤＳ０１を得る。デュプレックス中間体を乾燥粉末として保存する場合、それらは混合前に水中に再度溶かす。ＨＰＬＣ法により混合プロセスをモニタリングすることによって等モル比を得る。
【０４０７】
例示的な仕様を表１６ａに示す。
【０４０８】
【表２９】
0006032724.tif 000078
ＡＬＮ−ＶＳＰＤＳ０１薬剤物質に関する１２カ月までの安定性試験の結果を表１６ｂに示す。これらのアッセイ法を選択して、物理的性質（外観、ｐＨ、含水率）、純度（ＳＥＣおよび変性アニオン交換クロマトグラフィーによる）および効能（変性アニオン交換クロマトグラフィー［ＡＸ−ＨＰＬＣ］による）を評価した。
【０４０９】
【表３０】
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９．２  薬剤製品ＡＬＮ−ＶＳＰ０２の調製
ＡＬＮ  ＶＳＰ０２は、等張バッファー中の２つのｓｉＲＮＡ（１：１のモル比）と脂質賦形剤との滅菌製剤である。脂質賦形剤は２つのｓｉＲＮＡと結合し、循環系中の分解からそれらを保護し、標的組織へのそれらの送達を促進する。（表１７に示す）それぞれの具体的な脂質賦形剤および定量比は、多数の異なる製剤の物理化学的性質、安定性、薬力学、薬物動態、毒性および製品製造性を比較した一連の反復実験によって選択した。賦形剤ＤＬｉｎＤＭＡは、哺乳動物細胞のエンドソームで見られるように低ｐＨで正に帯電しているが、全血のより中性なｐＨでは比較的無電荷である滴定可能なアミノ脂質である。この特徴は、使用前に製剤バッファーをより中性な保存バッファーで置換することによって、低ｐＨで負に帯電したｓｉＲＮＡの効率よい封入を容易にし、空粒子の形成を妨げ、さらに粒子電荷の調節（低減）を可能にする。コレステロールおよび中性脂質ＤＰＰＣを取り込ませて、粒子に物理化学的安定性を与える。ポリエチレングリコール脂質コンジュゲートＰＥＧ２０００Ｃ  ＤＭＡは薬剤製品の安定性を助け、目的とする用途に最適な循環時間を与える。ＡＬＮ  ＶＳＰ０２脂質粒子は、低多分散値で約８０〜９０ｎｍの平均径を有する。中性ｐＨでは、粒子は本質的に無電荷であり、６ｍＶ未満のゼータ電位値を有する。製造プロセスに基づく空（非充填）粒子の証拠はない。
【０４１０】
【表３１】
0006032724.tif 000080
脂質の溶液（エタノール中）とＡＬＮ  ＶＳＰＤＳ０１薬剤物質（水性バッファー中）を混合し、希釈して約８０〜９０ｎｍの平均粒径を有するｓｉＲＮＡ脂質粒子のコロイド分散液を形成する。次いでこの分散液を０．４５／０．２μｍフィルターを介して濾過し、濃縮し、タンジェンシャルフロー濾過によって透析濾過する。インプロセス試験および２．０ｍｇ／ｍＬへの濃度調節後、製品は滅菌濾過し、無菌状態でガラスバイアルに充填し、ストッパーをつけ、キャップをし、そして５±３℃に置く。エタノールおよびすべての水性バッファーの構成要素はＵＳＰグレードであり、使用したすべての水はＵＳＰ注射用滅菌水グレードである。ＡＬＮ−ＶＳＰ０２。
【０４１１】
同様の方法を使用して、他の脂質製剤、例えばカチオン性脂質ＸＴＣ、ＡＬＮＹ−１００、およびＭＣ３を含む製剤にＡＬＮ−ＶＳＰＤＳ０１を製剤化する。
【０４１２】
（実施例１０）
ヒト癌細胞系におけるＡＬＮ−ＶＳＰ０２のｉｎ  ｖｉｔｒｏ有効性
ヒト癌細胞系におけるＡＬＮ−ＶＳＰ０２治療の有効性を、治療後のＫＳＰｍＲＮＡ、ＶＥＧＦｍＲＮＡ、および細胞生存率の測定によって決定した。ＩＣ５０（ｎＭ）値はそれぞれの細胞系においてＫＳＰおよびＶＥＧＦに関して決定した。
【０４１３】
【表３２】
0006032724.tif 000081
細胞は第１日に完全培地が入った９６ウエルプレートでプレート培養し、第２日に７０％の密度を得た。第２日に、培地をＯｐｔｉ−ＭＥＭ低血清培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１１０５８−０２１）と交換し、１．８μＭで始めて１０ｐＭまで下げた濃度範囲で、細胞をＡＬＮ−ＶＳＰ０２または対照ＳＮＡＬＰ−Ｌｕｃのいずれかでトランスフェクトした。６時間後、培地を完全培地と交換した。それぞれの実験のそれぞれの細胞系に関して３連のプレートを実施した。
【０４１４】
ＡＬＮ−ＶＳＰ０２は表１７に記載したように製剤化した。
【０４１５】
細胞はトランスフェクション後２４時間で採取した。ＫＳＰレベルはｂＤＮＡを使用して測定し、ＶＥＧＦ  ｍＲＮＡレベルはヒトＴａｑＭａｎアッセイを使用して測定した。
【０４１６】
生存率は、製造者の奨励に従い４８および／または７２時間でＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｂｌｕｅ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号：Ｇ８０８０）を使用して測定した。
【０４１７】
表２０に示すように、複数のヒト細胞系において、ＶＳＰ０２のｎＭ濃度はＫＳＰとＶＥＧＦ両方の発現を低減することにおいて有効である。処理した細胞の生存率はしなかった。
【０４１８】
【表３３】
0006032724.tif 000082
（実施例１１）
樹立Ｈｅｐ３Ｂ肝臓内腫瘍におけるソラフェニブに対するＶＳＰ  ＳＮＡＬＰの抗腫瘍有効性
樹立Ｈｅｐ３Ｂ肝臓内腫瘍を有するｓｃｉｄ／ｂｅｉｇｅマウスにおけるソラフェニブに対する複数投薬ＶＳＰ  ＳＮＡＬＰの抗腫瘍効果を試験した。ソラフェニブは、肝細胞癌（ＨＣＣ）の治療用に承認されたプロテインキナーゼの低分子阻害剤である。
【０４１９】
腫瘍は本明細書に記載するように、ｓｃｉｄ／ｂｅｉｇｅマウスにおける肝臓内接種によって樹立した。治療は接種後１１日に開始した。マウスはソラフェニブおよび対照ｓｉＲＮＡ−ＳＮＡＬＰ、ソラフェニブおよびＶＳＰ  ｓｉＲＮＡ−ＳＮＡＬＰ、またはＶＳＰ  ｓｉＲＮＡ−ＳＮＡＬＰのみで治療した。対照マウスはバッファー（ソラフェニブに関してＤＭＳＯおよびｓｉＲＮＡ−ＳＮＡＬＰに関してＰＢＳ）のみで治療した。ソラフェニブは、全１５回の注射に関して体重に従い１５ｍｇ／ｋｇで３週間にわたり月曜から金曜まで非経口（ｉｎｔｒａｐａｒｅｎｔｅｒａｌｌｙ）投与した。ソラフェニブはＳＮＡＬＰ注射後少なくとも１時間投与した。ｓｉＲＮＡ−ＳＮＡＬＰは、３週間にわたり（合計６用量）第１、４、７、１０、１４、および１７日に、最も最近記録した体重（１０ｍｌ／ｋｇ）に基づき３ｍｇ／ｋｇに従い側面尾静脈を介して静脈内投与をした。
【０４２０】
それぞれのｓｉＲＮＡ−ＳＮＡＬＰは、元のクエン酸バッファーの条件を使用して、１：５７ｃＤＭＡ  ＳＮＡＬＰ（１．４％ＰＥＧ−ｃＤＭＡ、５７．１％ＤＬｉｎＤＭＡ、７．１％ＤＰＰＣ、および３４．３％コレステロール）、６：１  脂質：薬剤に製剤化した。
【０４２１】
マウスは、進行性の体重減少を含めた腫瘍量の評価、および健康状態、腹部膨満／変色および運動性を含めた臨床兆候に基づいて安楽死させた。
【０４２２】
生存率データは図１６に示す。ＶＳＰ  ｓｉＲＮＡ−ＳＮＡＬＰとソラフェニブの同時投与によって、ソラフェニブまたはＶＳＰ  ｓｉＲＮＡ−ＳＮＡＬＰのみの投与と比較して生存率が増大した。ＶＳＰｓｉＲＮＡ−ＳＮＡＬＰはソラフェニブと比較して生存率を増大した。
【０４２３】
（実施例１２）
ＡＤ−１２１１５およびＡＤ−３１３３の変異体を使用したＶＳＰのｉｎ  ｖｉｔｒｏ有効性
Ｅｇ５／ＫＳＰおよびＶＥＧＦを標的化する２組のデュプレックスを設計し合成した。それぞれの組は、ＡＤ−１２１１５およびＡＤ−３１３３の一方に対する標的部位の各方向に１０ヌクレオチドをタイリングする（ｔｉｌｉｎｇ）デュプレックスを含んでいた。
【０４２４】
それぞれのデュプレックスに関する標的、センス鎖、およびアンチセンス鎖の配列は以下の表に示す。
【０４２５】
それぞれのデュプレックスは、本明細書に記載するアッセイを使用して発現の阻害に関してアッセイする。デュプレックスは、単独および／または組合せ、例えばＥｇ５／ＫＳＰ  ｄｓＲＮＡとＶＥＧＦ  ｄｓＲＮＡの組合せで投与する。いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡは本明細書に記載する核酸脂質粒子（例えばＳＮＡＬＰ）製剤で投与する。
【０４２６】
【表３４−１】
0006032724.tif 000083
【０４２７】
【表３４−２】
0006032724.tif 000084
【０４２８】
【表３４−３】
0006032724.tif 000085
（実施例１３）
単一平滑末端を有するＶＥＧＦを標的化するｄｓＲＮＡ
ＶＥＧＦを標的化する一組のｄｓＲＮＡデュプレックスを設計し合成した。この組は、ＡＤ−３１３３に対する標的部位の各方向に１０ヌクレオチドをタイリングするデュプレックスを含んでいた。それぞれのデュプレックスは、アンチセンス鎖の３’末端に相当する末端に２塩基の突出部分を含み、アンチセンス鎖の５’末端に相当する末端、例えば平滑末端には突出部分を含まない。
【０４２９】
これらのデュプレックスのそれぞれの鎖の配列は以下の表に示す。
【０４３０】
それぞれのデュプレックスは、本明細書に記載するアッセイを使用して発現の阻害に関してアッセイする。ＶＥＧＦデュプレックスは単独および／または、Ｅｇ５／ＫＳＰ  ｄｓＲＮＡ（例えばＡＤ−１２１１５）との組合せで投与する。いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡは本明細書に記載する核酸脂質粒子（例えばＳＮＡＬＰ）製剤で投与する。
【０４３１】
【表３５】
0006032724.tif 000086
【０４３２】
【表３６】
0006032724.tif 000087
（実施例１４）
ｄｓＲＮＡオリゴヌクレオチド合成
合成
すべてのオリゴヌクレオチドはＡＫＴＡｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ合成装置で合成する。市販の制御細孔ガラス固体支持体（ｄＴ−ＣＰＧ、５００Å、Ｐｒｉｍｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）およびＲＮＡホスホラミダイトおよび標準的保護基、５’−Ｏ−ジメトキシトリチルＮ６−ベンゾイル−２’−ｔ−ブチルジメチルシリル−アデノシン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホラミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ４−アセチル−２’−ｔ−ブチルジメチルシリル−シチジン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホラミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ２−−イソブチリル−２’−ｔ−ブチルジメチルシリル−グアノシン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホラミダイト、および５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−ｔ−ブチルジメチルシリル−ウリジン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホラミダイト（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をオリゴヌクレオチド合成に使用した。２’−Ｆホスホラミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ４−アセチル−２’−フルオロ（ｆｌｕｒｏ）−シチジン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチル−ホスホラミダイトおよび５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−フルオロ−ウリジン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチル−ホスホラミダイトは（Ｐｒｏｍｅｇａ）から購入する。１０％ＴＨＦ／ＡＮＣ（ｖ／ｖ）中の０．２Ｍの濃度で使用するグアノシン以外、すべてのホスホラミダイトはアセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）中の０．２Ｍの濃度で使用する。１６分のカップリング／リサイクル時間を使用する。アクチベーターは５−エチルチオテトラゾール（０．７５Ｍ、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）であり、ＰＯ酸化用にヨウ素／水／ピリジンを使用し、ＰＳ酸化用には２，６−ルチジン／ＡＣＮ（１：１ｖ／ｖ）中のＰＡＤＳ（２％）を使用する。
【０４３３】
３’リガンド結合鎖を、対応するリガンドを含有する固体支持体を使用して合成する。例えば、配列中のコレステロール単位の導入はヒドロキシプロリノール−コレステロールホスホラミダイトから実施する。コレステロールは６−アミノヘキサノエート結合を介してトランス−４−ヒドロキシプロリノールと結合させて、ヒドロキシプロリノール−コレステロール部分を得る。５’末端Ｃｙ−３およびＣｙ−５．５（フルオロフォア）標識ｓｉＲＮＡは、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した対応するＱｕａｓａｒ−５７０（Ｃｙ−３）ホスホラミダイトから合成する。５’末端およびまたは内部位置とリガンドの結合は、適切に保護されたリガンド−ホスホラミダイト構成単位を使用することによって実施する。５−（エチルチオ）−１Ｈ−テトラゾールアクチベーターの存在下での、固体支持体結合オリゴヌクレオチドと無水ＣＨ３ＣＮ中ホスホラミダイトの０．１Ｍ溶液のさらに１５分のカップリング。ヌクレオチド間のホスフェートへのホスファイトの酸化は、報告された標準的なヨウ素−水の使用（１）、またはｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド／アセトニトリル／水（１０：８７：３）および１０分の酸化待機時間結合オリゴヌクレオチドを用いた処理によって実施する。（ＡＭ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから購入した）ＤＤＴＴなどの硫黄転移反応試薬、ＰＡＤＳおよびまたはＢｅａｕｃａｇｅ試薬を使用することによるホスホロチオエートへのホスファイトの酸化によって、ホスホロチオエートを導入する。コレステロールホスホラミダイトは室内で合成し、ジクロロメタン中に０．１Ｍの濃度で使用する。コレステロールホスホラミダイトに関するカップリング時間は１６分である。
【０４３４】
脱保護Ｉ（核酸塩基脱保護）
合成終了後、支持体を１００ｍＬガラス容器（ＶＷＲ）に移す。オリゴヌクレオチドは、５５℃で６．５時間のエタノールアンモニアの８０ｍＬ混合物［アンモニア：エタノール（３：１）］を用いた塩基とホスフェート基の同時脱保護によって支持体から切断する。容器は氷上で軽く冷却し、次いでエタノールアンモニア混合物を新たな２５０ｍＬ容器に濾過する。ＣＰＧは２×４０ｍＬ量のエタノール／水（１：１ｖ／ｖ）で洗浄する。次いでロータリーエバポレーター（ｒｏｔｏ−ｖａｐ）によって混合物の体積を約３０ｍＬに減らす。次いで混合物はドライアイス上で凍結させ、ｓｐｅｅｄ  ｖａｃで真空下において乾燥させる。
【０４３５】
脱保護ＩＩ（２’−ＴＢＤＭＳ基の除去）
乾燥残渣を２６ｍＬのトリエチルアミン、トリエチルアミントリヒドロフルオリド（ＴＥＡ・３ＨＦ）またはピリジン−ＨＦおよびＤＭＳＯ（３：４：６）中に再縣濁し、６０℃で９０分間加熱して、２’位置のｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）基を除去する。次いで反応を５０ｍＬの２０ｍＭ酢酸ナトリウムを用いて停止させ、ｐＨは６．５に調整する。オリゴヌクレオチドは精製までフリーザー中に保存する。
【０４３６】
分析
オリゴヌクレオチドは精製前に高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって分析し、バッファーおよびカラムの選択は配列およびまたは結合リガンドの性質に依存する。
【０４３７】
ＨＰＬＣ精製
リガンド結合オリゴヌクレオチドは逆相調製ＨＰＬＣによって精製する。非結合オリゴヌクレオチドは、室内でパッケージしたＴＳＫゲルカラム上でアニオン交換ＨＰＬＣによって精製する。バッファーは、１０％ＣＨ３ＣＮ中２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８．５）（バッファーＡ）、および１０％ＣＨ３ＣＮ、１ＭＮａＢｒ中２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８．５）（バッファーＢ）である。完全長オリゴヌクレオチドを含有する画分をプールし、脱塩し、凍結乾燥する。約０．１５ＯＤの脱塩オリゴヌクレオチドを１５０μＬまで水に希釈し、次いでＣＧＥおよびＬＣ／ＭＳ分析用に特殊バイアルに移す。次いで化合物はＬＣ−ＥＳＭＳおよびＣＧＥによって分析する。
【０４３８】
ｓｉＲＮＡ調製
ｓｉＲＮＡの調製用に、等モル量のセンス鎖とアンチセンス鎖を９５℃において５分間１×ＰＢＳ中で加熱して、室温までゆっくりと冷却する。デュプレックスの完全性はＨＰＬＣ分析によって確認する。本明細書に記載するＡＤ−３１３３およびＡＤ−ＡＤ−１２１１５を合成する。
【０４３９】
（実施例１５）
結合脂質の合成
ｍＰＥＧ２０００−１，２−ジ−Ｏ−アルキル−ｓｎ３−カルバモイルグリセリド（ｃａｒｂｏｍｏｙｌｇｌｙｃｅｒｉｄｅ）（ＰＥＧ−ＤＭＧ）などのＰＥＧ−脂質を以下の手順を使用して合成した：
【０４４０】
【化７】
0006032724.tif 000088
ｍＰＥＧ２０００−１，２−ジ−Ｏ−アルキル−ｓｎ３−カルバモイルグリセリド
化合物４ａの調製：１，２−ジ−Ｏ−テトラデシル−ｓｎ−グリセリド１ａ（３０ｇ、６１．８０ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ’−スクシンイミジルカルボネート（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｃａｒｂｏａｎｔｅ）（ＤＳＣ、２３．７６ｇ、１．５当量）をジクロロメタン（ＤＣＭ、５００ｍＬ）中におき、氷水混合物上で撹拌した。トリエチルアミン（２５．３０ｍＬ、３当量）を撹拌溶液に加え、その後反応混合物は周囲温度で一晩撹拌した。反応の進行はＴＬＣによってモニタリングした。反応混合物はＤＣＭ（４００ｍＬ）で希釈し、有機層は水（２×５００ｍＬ）、ＮａＨＣＯ３水溶液（５００ｍＬ）で洗浄し、次に標準的な後処理をした。得られた残渣は、一晩高真空下において周囲温度で乾燥させた。乾燥後、このようにして得た粗製カルボネート２ａはジクロロメタン（５００ｍＬ）中に溶かし、氷浴上で撹拌した。この撹拌溶液に、ｍＰＥＧ２０００−ＮＨ２（３、１０３．００ｇ、４７．２０ｍｍｏｌ、ＮＯＦ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、日本から購入）および無水ピリジン（８０ｍＬ、過剰）をアルゴン下で加えた。いくつかの実施形態では、メトキシ−（ＰＥＧ）ｘ−アミンは４５〜４９、好ましくは４７〜４９、およびより好ましくは４９のｘを有する。次いで反応混合物を、一晩周囲温度で撹拌した。溶媒および揮発性物質は真空下で除去し、残渣はＤＣＭ（２００ｍＬ）中に溶かし、酢酸エチル中にパッケージしたシリカゲルのカラムにチャージした。カラムは最初に酢酸エチルで、次にジクロロメタン中５〜１０％メタノールの勾配で溶出して、白い固体として所望のＰＥＧ−脂質４ａを得た（１０５．３０ｇ、８３％）。1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ=5.20-5.12(m, 1H), 4.18-4.01(m, 2H), 3.80-3.70(m, 2H), 3.70-3.20(m, -O-CH2-CH2-O-,PEG-CH2), 2.10-2.01(m, 2H), 1.70-1.60 (m, 2H), 1.56-1.45(m, 4H),1.31-1.15(m, 48H), 0.84(t, J= 6.5Hz, 6H)。実測したＭＳ範囲：２６６０〜２８３６。
【０４４１】
４ｂの調製：１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｓｎ−グリセリド１ｂ（１．００ｇ、１．８４８ｍｍｏｌ）とＤＳＣ（０．７１０ｇ、１．５当量）をジクロロメタン（２０ｍＬ）中で一緒にして、氷水混合物中で０℃まで冷却した。トリエチルアミン（１．００ｍＬ、３当量）をそれに加え、一晩撹拌した。反応物はＴＬＣによって追跡し、ＤＣＭで希釈し、水（２回）、ＮａＨＣＯ３溶液で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒は減圧下で除去し、残渣２ｂは高真空下に一晩置いた。この化合物は、さらに精製せずに次の反応で直接使用した。ＭＰＥＧ２０００−ＮＨ２３（１．５０ｇ、０．６７８ｍｍｏｌ、ＮＯＦ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、日本から購入）および上の工程２ｂからの化合物（０．７０２ｇ、１．５当量）をジクロロメタン（２０ｍＬ）中にアルゴン下で溶かした。反応物は０℃に冷却した。ピリジン（１ｍＬ、過剰）をそれに加え、一晩撹拌した。反応物はＴＬＣによってモニタリングした。溶媒および揮発性物質は真空下で除去し、残渣はクロマトグラフィー（最初に酢酸エチル、次いで勾配溶出液として５〜１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）により精製して、白い固体として、必要な化合物４ｂを得た（１．４６ｇ、７６％）。1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ=5.17(t, J= 5.5Hz, 1H), 4.13(dd, J= 4.00Hz, 11.00 Hz,  1H), 4.05(dd, J=5.00Hz, 11.00 Hz,  1H),  3.82-3.75(m, 2H), 3.70-3.20(m, -O-CH2-CH2-O-,PEG-CH2), 2.05-1.90(m, 2H), 1.80-1.70 (m, 2H), 1.61-1.45(m, 6H),1.35-1.17(m, 56H), 0.85(t, J= 6.5Hz, 6H)。実測したＭＳ範囲：２７１６〜２８９２。
【０４４２】
４ｃの調製：１，２−ジ−Ｏ−オクタデシル−ｓｎ−グリセリド１ｃ（４．００ｇ、６．７０ｍｍｏｌ）とＤＳＣ（２．５８ｇ、１．５当量）をジクロロメタン（６０ｍＬ）中に一緒にして、氷水混合物中で０℃まで冷却した。トリエチルアミン（２．７５ｍＬ、３当量）をそれに加え、一晩撹拌した。反応物はＴＬＣによって追跡し、ＤＣＭで希釈し、水（２回）、ＮａＨＣＯ３溶液で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒は減圧下で除去し、残渣は高真空下に一晩置いた。この化合物は、さらに精製して次の反応で直接使用した。ＭＰＥＧ２０００−ＮＨ２３（１．５０ｇ、０．６８７ｍｍｏｌ、ＮＯＦ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、日本から購入）および上の工程２ｃからの化合物（０．７６０ｇ、１．５当量）をジクロロメタン（２０ｍＬ）中にアルゴン下で溶かした。反応物は０℃に冷却した。ピリジン（１ｍＬ、過剰）をそれに加え、一晩撹拌した。反応物はＴＬＣによってモニタリングした。溶媒および揮発性物質は真空下で除去し、残渣はクロマトグラフィー（最初に酢酸エチル、次いで勾配溶出液として５〜１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）により精製して、白い固体として、必要な化合物４ｃを得た（０．９２ｇ、４８％）。1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ=5.22-5.15(m, 1H), 4.16(dd, J= 4.00Hz, 11.00 Hz,  1H), 4.06 (dd, J= 5.00Hz,11.00 Hz,  1H), 3.81-3.75(m, 2H), 3.70-3.20(m, -O-CH2-CH2-O-,PEG-CH2), 1.80-1.70 (m, 2H), 1.60-1.48(m, 4H), 1.31-1.15(m, 64H),0.85(t, J= 6.5Hz, 6H)。実測したＭＳ範囲：２７７４〜２９４８。
【０４４３】
（実施例１６）
押出し法に関する一般的なプロトコール
脂質（例えば、脂質Ａ、ＤＳＰＣ、コレステロール、ＤＭＧ−ＰＥＧ）を溶かし、所望のモル比に従いエタノール中に混合する。エタノール注入法によってリポソームを形成し、この場合混合した脂質はｐＨ５．２で酢酸ナトリウムバッファーに加える。これは３５％エタノール中でリポソームの自発的形成をもたらす。リポソームは０．０８μｍのポリカーボネート膜を介して少なくとも２回押し出す。ストックｓｉＲＮＡ溶液を酢酸ナトリウムおよび３５％エタノール中で調製し、リポソームに加えて充填する。ｓｉＲＮＡ−リポソーム溶液は３０分間３７℃でインキュベートし、およびその後希釈する。エタノールを除去し、透析またはタンジェンシャルフロー濾過によってＰＢＳバッファーに交換する。
【０４４４】
（実施例１７）
インラインミキシング法に関する一般的なプロトコール
個々および別々のストック溶液、脂質を含有する溶液、およびｓｉＲＮＡを含有する他の溶液を調製する。例えば、脂質Ａ、ＤＳＰＣ、コレステロールおよびＰＥＧ脂質を含有する脂質ストックは９０％エタノール中に溶かすことによって調製する。残りの１０％は低ｐＨクエン酸バッファーである。脂質ストックの濃度は４ｍｇ／ｍＬである。このクエン酸バッファーのｐＨは、利用される融合性脂質のタイプに応じて、ｐＨ３〜５の範囲であり得る。ｓｉＲＮＡも４ｍｇ／ｍＬの濃度でクエン酸バッファーに可溶化される。小規模用に、５ｍＬの各ストック溶液を調製する。
【０４４５】
ストック溶液は完全に透明であり、ｓｉＲＮＡと組み合わせる前に脂質は完全に溶かさなければならない。したがって、ストック溶液を加熱して脂質を完全に溶かすことができる。このプロセス中で使用するｓｉＲＮＡは非改変オリゴヌクレオチドまたは改変オリゴヌクレオチドであって、コレステロールなどの親油性部分と結合することができる。
【０４４６】
個々のストックは、Ｔ字形接合部（Ｔ−ｊｕｎｃｔｉｏｎ）にそれぞれの溶液をポンプで送ることによって組み合わせる。デュアルヘッドのワトソンマーローポンプを使用して２つの流れの開始と停止を同時に制御する。１．６ｍｍのポリプロピレンチューブを０．８ｍｍのチューブにさらに縮小して線流速を増加させる。ポリプロピレンライン（ＩＤ＝０．８ｍｍ）をＴ字形接合部の片側に連結させる。ポリプロピレンＴは、４．１ｍｍ３の生成体積に関して１．６ｍｍの線状端を有する。ポリプロピレンラインの太い端（ｌａｒｇｅ  ｅｎｄ）（１．６ｍｍ）のそれぞれを、可溶化脂質ストックまたは可溶化ｓｉＲＮＡのいずれかを含有する試験管中に置く。Ｔ字形接合部の後に１本のチューブを置き、そこで組み合わさった流れが発する。次いでチューブを２×体積のＰＢＳを有する容器の中まで伸ばす。ＰＢＳは迅速に撹拌する。ポンプの流速は３００ｒｐｍまたは１１０ｍＬ／分の設定である。エタノールを除去し、透析によってＰＢＳに交換する。次いで脂質製剤を、遠心分離またはダイアフィルトレーションを使用して適切な作業濃度まで濃縮する。
【０４４７】
図１７は、インラインミキシング法の概略を示す図である。
【０４４８】
（実施例１８）
マウスの肝臓内Ｈｅｐ３Ｂ腫瘍におけるＬＮＰ−０８製剤化ＶＳＰによるｓｉＲＮＡサイレンシング
ＶＳＰのサイレンシング（ＶＥＧＦおよびＫＳＰ）を、核酸−脂質粒子を含有するＸＴＣで製剤化したｓｉＲＮＡ、例えばＬＮＰ−０８の静脈内投与後、同所性（肝臓内）Ｈｅｐ３Ｂ腫瘍において実施した。
【０４４９】
８週齢のメスＦｏｘ  ｓｃｉｄ／ｂｅｉｇｅマウスの右側腹部への、１×１０６個のＨｅｐ３Ｂ細胞の移植によって腫瘍を樹立した。細胞を操作してホタルルシフェラーゼを安定的に発現させた。腫瘍量は、ＩＶＩＳシステム（Ｃａｌｉｐｅｒ，Ｉｎｃ．）を使用してｉｎ  ｖｉｖｏバイオフォトニックイメージング（ｂｉｏｐｈｏｔｏｎｉｃ  ｉｍａｇｉｎｇ）によって、週一回モニタリングした。腫瘍移植後約４週間で、腫瘍担持動物のコホートに以下の試験品の静脈内（尾静脈）注射をした：
【０４５０】
【表３７】
0006032724.tif 000089
ＬＮＰ０８−１９５５は、約３．０のＮ：Ｐ比でＸＴＣ（６０ｍｏｌ％）、ＤＳＰＣ（７．５ｍｏｌ％）、コレステロール（３１ｍｏｌ％）およびＰＥＧ−ｃＤＭＧ（１．５ｍｏｌ％）を含む脂質ナノ粒子で製剤化した（ホタルルシフェラーゼを標的化する）ｓｉＲＮＡ  ＡＤ−１９５５である。
【０４５１】
ＬＮＰ０８−ＶＳＰは、約３．０のＮ：Ｐ比でＸＴＣ（６０ｍｏｌ％）、ＤＳＰＣ（７．５ｍｏｌ％）、コレステロール（３１ｍｏｌ％）およびＰＥＧ−ｃＤＭＧ（１．５ｍｏｌ％）を含む脂質ナノ粒子で製剤化した、１：１のモル比の（ＫＳＰを標的化する）ｓｉＲＮＡ  ＡＤ−１２１１５および（ＶＥＧＦを標的化する）ＡＤ−３１３３である。
【０４５２】
治療後１日で、動物を屠殺し、腫瘍担持肝葉を分析用に回収した。全ＲＮＡを抽出し、次にランダムプライミングによってｃＤＮＡを合成した。ヒトＧＡＰＤＨに対して標準化したヒトＫＳＰおよびヒトＶＥＧＦのレベルを、ヒト特異的カスタムＴａｑｍａｎ（登録商標）アッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）を使用して測定した。群の平均を計算して、ＬＮＰ０８−１９５５治療群に対して標準化した。
【０４５３】
図１８に示すように、ＬＮＰ０８−ＶＳＰを用いた治療（群２）は、ＬＮＰ０８−１９５５治療（群１）と比較して、腫瘍ＫＳＰ  ｍＲＮＡの６０％を超える、例えば６８％の低減（ｐ＜０．００１）、およびＶＥＧＦ  ｍＲＮＡの少なくとも４０％の低減（ｐ＜０．０５）をもたらした。
【０４５４】
（実施例１９）
マウスＨｅｐ３ｂ腫瘍モデルにおけるＬＮＰ−０１１およびＬＮＰ−０１２脂質製剤の評価
マウスの肝臓内Ｈｅｐ３Ｂ腫瘍におけるＫＳＰおよびＶＥＧＦの発現に対する様々なＶＳＰ製剤の効果を比較した。３５匹のメスＦｏｘ  Ｓｃｉｄ  ｂｅｉｇｅマウスに、直接的肝臓内手術によって、０．０２５ｃｃのＰＢＳに縣濁した１×１０６個のＨｅｐ３Ｂ−Ｌｕｃ細胞を注射した。ＸｅｎｏｇｅｎによるＬｕｃ読み取り値によって腫瘍増殖をモニタリングした。
【０４５５】
マウスには、単回ボーラス用量（４ｍｇ／ｋｇ）の以下の：ＳＮＡＬＰ−１９５５（ルシフェラーゼ対照）、ＡＬＮ−ＶＳＰ０２、ＳＮＡＬＰ−Ｔ−ＶＳＰ（Ｃ−１８  ＰＥＧを有する）−ＶＳＰ、ＬＮＰ−１１−ＶＳＰ、およびＬＮＰ−１２  ＶＳＰの１つを与えた。動物は投薬後２４時間で安楽死させ、腫瘍特異的ＫＳＰおよびＶＥＧＦノックダウンの検出用にＴａｑｍａｎプロトコールを使用した。
【０４５６】
結果は図２１に示す。ＳＮＡＰＬ−Ｔ−ＶＳＰ；ＬＮＰ−１１−ＶＳＰ、およびＬＮＰ−１２  ＶＳＰは、ＡＬＮ−ＶＳＰ０２と比較してＫＳＰ発現の増大したノックダウンを実証した。
【０４５７】
（実施例２０）
マウスＨｅｐ３ｂ腫瘍モデルにおけるＬＮＰ−０８＋／−Ｃ１８脂質製剤の評価
以下のＶＳＰ製剤の効果をＨＥＰ３Ｂ腫瘍モデルにおいて試験した。腫瘍担持（肝臓内）マウスに、上に記載したプロトコールに従い、単回ボーラスＩＶ用量として調製および投与した以下の製剤の１つを注射した：
【０４５８】
【表３８】
0006032724.tif 000090
ＡＬＮ−ＶＳＰ０２の製剤化は実施例９に記載したとおりであった。
【０４５９】
ＬＮＰ０８−Ｌｕｃは、約３．０のＮ：Ｐ比でＸＴＣ（６０ｍｏｌ％）、ＤＳＰＣ（７．５ｍｏｌ％）、コレステロール（３１ｍｏｌ％）およびＰＥＧ−ｃＤＭＧ（１．５ｍｏｌ％）を含む脂質ナノ粒子で製剤化した（ホタルルシフェラーゼを標的化する）ｓｉＲＮＡ  ＡＤ−１９５５である。
【０４６０】
ＬＮＰ０８−ＶＳＰは、約３．０のＮ：Ｐ比でＸＴＣ（６０ｍｏｌ％）、ＤＳＰＣ（７．５ｍｏｌ％）、コレステロール（３１ｍｏｌ％）およびＰＥＧ−ｃＤＭＧ（１．５ｍｏｌ％）を含む脂質ナノ粒子で製剤化した、１：１モル比の（ＫＳＰを標的化する）ｓｉＲＮＡ  ＡＤ−１２１１５および（ＶＥＧＦを標的化する）ＡＤ−３１３３である。
【０４６１】
ＬＮＰ０８−Ｃ１８−ＶＳＰは、約３．０のＮ：Ｐ比でＸＴＣ（６０ｍｏｌ％）、ＤＳＰＣ（７．５ｍｏｌ％）、コレステロール（３１ｍｏｌ％）およびＰＥＧ−ｃＤＳＧ（１．５ｍｏｌ％）を含む脂質ナノ粒子で製剤化した、１：１モル比の（ＫＳＰを標的化する）ｓｉＲＮＡ  ＡＤ−１２１１５および（ＶＥＧＦを標的化する）ＡＤ−３１３３である。
【０４６２】
図１９は、ＰＥＧ−ＤＳＧおよびＰＥＧ−Ｃ−ＤＳＡの化学構造を示す。ＰＥＧ−ＤＳＧは、その中でＰＥＧがＣ１８−ＰＥＧまたはＰＥＧ−Ｃ１８のいずれかであり、かつＰＥＧが２０００Ｄａの平均分子量を有する、ポリエチレングリコールジスチリルグリセロールである。
【０４６３】
治療後２４時間で、動物を屠殺し、腫瘍を分析用に回収した。全ＲＮＡを腫瘍から抽出し、次にランダムプライミングによってｃＤＮＡを合成した。ヒトＧＡＰＤＨに対して標準化したヒトＫＳＰおよびヒトＶＥＧＦのレベルを、ヒト特異的カスタムＴａｑｍａｎ（登録商標）アッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）を使用して測定した。
【０４６４】
結果は図２２のグラフに示し、ＡＬＮ−ＶＳＰ０２によるサイレンシングに匹敵するＫＳＰサイレンシングおよびＶＥＧＦサイレンシングを示す。
【０４６５】
（実施例２１）
ＨｅＬａ細胞におけるリポソームの細胞取込みにおけるＡｐｏＥの役割
ＬＮＰ製剤化ｄｓＲＮＡを、組換えヒトＡｐｏＥを加えることによって調製する。生成したＬＮＰ−ＡｐｏＥ製剤化ｄｓＲＮＡを、細胞によるｄｓＲＮＡの取込みに対する効果に関してＨｅＬａ細胞において試験する。イオン化脂質と共にＡｐｏＥを利用する組成物および方法は、その全容を参照により本明細書に組み込む国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１０／２２６１４号に記載される。
【０４６６】
実験プロトコール：
一晩、１ウエル当たり６０００個のＨｅＬａ細胞を９６ウエルプレート（Ｇｒｅｎｉｅｒ）に接種する。Ａｌｅｘａ−ｆｌｕｏｒ６４７標識ＧＦＰ  ｓｉＲＮＡの３つの異なるリポソーム製剤、１）ＬＮＰ０１、２）ＳＮＡＬＰ、３）ＬＮＰ０５を、５０ｎＭの最終濃度まで３つの培地条件の１つに希釈する。調べた培地条件は、ＯｐｔｉＭｅｍ、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ、または１０％ＦＢＳおよび１０ｕｇ／ｍＬのヒト組換えＡｐｏＥ（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）を含むＤＭＥＭである。培地中または１０分間ＡｐｏＥと予め複合体形成した培地中の、示されたリポソームを、４、６、または２４時間のいずれかの間、細胞に加える。それぞれの実験条件に関して３回の反復を実施した。示した時間地点の間に、プレート中のＨｅＬａ細胞に添加した後、細胞を１５分間４％パラホルムアルデヒトで固定し、次いで核と細胞質をＤＡＰＩおよびＳｙｔｏ色素で染色した。Ｐｅｒｋｉｎ  ＥｌｍｅｒからのＯｐｅｒａ回転盤自動共焦点システムを使用して画像を得る。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７  ｓｉＲＮＡの取込みの定量化はＡｃａｐｅｌｌａソフトウェアを使用して実施する。４つの異なるパラメーター、１）細胞数、２）視野当たりのｓｉＲＮＡ陽性スポットの数、３）細胞当たりのｓｉＲＮＡ陽性スポットの数、および４）統合したスポットシグナル、または細胞当たりのｓｉＲＮＡスポットの平均数×平均スポット強度を定量化する。したがって平均スポットシグナルは、細胞当たりの全ｓｉＲＮＡ含量のおよその推定値である。
【０４６７】
さらに、４つの異なるＬＮＰ−ＡｐｏＥ製剤化ｄｓＲＮＡ（ＳＮＡＬＰ（ＤＬｉｎＤＭａ）、ＸＴＣ、ＭＣ３、ＡＬＮＹ−１００）を以下の細胞系において試験し、細胞によるｄｓＲＮＡの取込みに対する効果を決定する：
Ａ３７５（メラノーマ）、Ｂ１６Ｆ１０（メラノーマ）、ＢＴ−４７４（乳房）、ＧＴＬ−１６（胃癌）、Ｈｃｔ１１６（結腸）、Ｈｅｐ３ｂ（肝性）、ＨｅｐＧ２（肝臓）、ＨｅＬａ（子宮頸部）、ＨＵＨ７（肝臓）、ＭＣＦ７（乳房）、Ｍｅｌ−２８５（ぶどう膜メラノーマ）、ＮＣＩ−Ｈ１９７５（肺）、ＯＭＭ−１．３（ぶどう膜メラノーマ）、ＰＣ３（前立腺）、ＳＫＯＶ−３（卵巣）、Ｕ８７（膠芽腫）。
【０４６８】
（実施例２２）
ＡｐｏＥの存在下でのＫＳＰ  ｓｉＲＮＡのＫｄ
ＫＳＰを標的化するＬＮＰ−０８製剤化ｓｉＲＮＡのＫｄ（親和性）に対するＡｐｏＥの効果を複数の細胞系において評価した。ＬＮＰ０８とＣ１８ＰＥＧ製剤化ｓｉＲＮＡを含むＬＮＰ０８の両方を使用した。ＫＳＰを標的化するｓｉＲＮＡデュプレックスはＡＬ−ＤＰ−６２４８であった。
【０４６９】
【表３９】
0006032724.tif 000091
以下の細胞系を使用した。
【０４７０】
【表４０】
0006032724.tif 000092
第１日に、１ウエル当たり２０，０００個の細胞を、９６ウエルプレートでプレート培養した。第２日に、製剤化ｓｉＲＮＡを血清含有培地＋／−ＡｐｏＥと１５〜３０分間３７℃でインキュベートした。培地は細胞から除去し、予め温めた複合体は２０ｎＭのｓｉＲＮＡ濃度で１００ｕＬ／ウエルで細胞上に層状にした。ＡｐｏＥ濃度は１．０、３．０、９．０、および２０．０μｇ／ｍｌで滴定した。細胞は製剤化デュプレックスと２４時間インキュベートした。第３日に、細胞を溶かし、ｂＤＮＡ分析およびｋＤ計算用に調製した。
【０４７１】
ＡｐｏＥの存在によって、ＨＣＴ−１１６、ＨｅＬａ、Ａ３７５、およびＢ１６Ｆ１０を含めたいくつかの細胞系でｋＤが改善された（データ示さず）。
【０４７２】
（実施例２３）
ＡｐｏＥの存在下でのＫＳＰｓｉＲＮＡのＩＣ５０
ＫＳＰを標的化するＬＮＰ−０８製剤化ｓｉＲＮＡのＩＣ５０（有効性）に対するＡｐｏＥの効果を多数の細胞系において評価した。ＬＮＰ０８とＣ１８ＰＥＧ製剤化ｓｉＲＮＡを含むＬＮＰ０８の両方を使用した。ＫＳＰ標的化ｓｉＲＮＡデュプレックスはＡＬ−ＤＰ−６２４８であった。
【０４７３】
第０日に、１ウエル当たり１５，０００〜２０，０００個の細胞を９６ウエルプレートでプレート培養した。第１日に、血清含有培地、製剤化デュプレックス、および＋／−３ｕｇ／ｍｌのＡｐｏＥを１５〜３０分間３７℃でインキュベートした。ｓｉＲＮＡの連続希釈物は０．０１ｎＭ〜１．０μＭの範囲で使用した。培地は細胞から除去し、予め温めた複合体を１００ｕＬ／ウエルで細胞上に層状にした。細胞はｓｉＲＮＡと２４時間インキュベートした。第２日に、細胞を溶かし、本明細書に記載するｂＤＮＡ分析用に調製した。ＫＳＰ  ｍＲＮＡのレベルはＱｕａｎｔｉｇｅｎｅ１．０を使用して決定して、ＧＡＰＤＨと比較したＫＳＰのレベルを決定した。陰性対照はルシフェラーゼを標的化したｓｉＲＮＡ、ＡＤ−１９５５であった。
【０４７４】
結果は以下の表に示す。ＬＮＰ−０８製剤化ｓｉＲＮＡはすべての細胞系において活性があった。いくつかの細胞系では、ＡｐｏＥの添加は、より低いＩＣ５０によって実証されたようにｓｉＲＮＡ治療の有効性を改善した。
【０４７５】
【表４１】
0006032724.tif 000093
（実施例２４）
ヒトにおけるＥｇ５／ＫＳＰおよびＶＥＧＦ発現の阻害
ヒト被験体を、薬学的組成物、例えばＥｇ５／ＫＳＰ遺伝子を標的化するｄｓＲＮＡとＶＥＧＦ遺伝子を標的化するｄｓＲＮＡの両方を有する核酸−脂質粒子で治療して、核酸−脂質粒子においてＥｇ５／ＫＳＰおよびＶＥＧＦ遺伝子の発現を阻害する。核酸−脂質粒子は、例えばＸＴＣ、ＭＣ３、またはＡＬＮＹ−１００を含む。
【０４７６】
治療を必要とする被験体を選択または同定する。被験体は癌、例えば肝臓癌の治療を必要とする被験体であってよい。
【０４７７】
時間ゼロで、適切な第一用量の組成物を被験体に皮下投与する。組成物は本明細書に記載するように製剤化する。一定期間後、例えば腫瘍増殖の測定、血清ＡＦＰレベルの測定などによって、被験体の状態を評価する。この測定は、前記被験体におけるＥｇ５／ＫＳＰおよび／またはＶＥＧＦ発現、および／またはＥｇ５／ＫＳＰおよび／またはＶＥＧＦ  ｍＲＮＡを標的化する首尾よいｓｉＲＮＡの産物の測定を伴ってよい。他の関連基準を測定することもできる。投薬の数および強度は被験体の必要性に応じて調節する。
【０４７８】
治療後、被験体の状態を、治療前に存在した状態、または同様に罹患しているが未治療の被験体の状態に対して比較する。
【０４７９】
当業者は、本明細書の後に添付の特許請求の範囲の全範囲で本発明を実施するのを可能にする本開示中に、具体的に述べる方法および組成物以外の方法および組成物に精通している。
【図１】
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【図２Ａ】
0006032724.tif 000096
【図２Ｂ】
0006032724.tif 000097
【図２Ｃ】
0006032724.tif 000098
【図２Ｄ】
0006032724.tif 000099
【図３】
0006032724.tif 000100
【図４】
0006032724.tif 000101
【図５】
0006032724.tif 000102
【図６】
0006032724.tif 000103
【図７Ａ】
0006032724.tif 000104
【図７Ｂ】
0006032724.tif 000105
【図８】
0006032724.tif 000106
【図９】
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【図１０】
0006032724.tif 000108
【図１１Ａ】
0006032724.tif 000109
【図１１Ｂ】
0006032724.tif 000110
【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
0006032724.tif 000112
【図１２Ｃ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
0006032724.tif 000119
【図１７】
0006032724.tif 000120
【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
0006032724.tif 000123
【図２１】
0006032724.tif 000124
【図２２】
0006032724.tif 000125
【配列表】
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