(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
コラーゲン、プロテオグリカン及びヒアルロン酸を含む気孔率が50〜99％の第一の複合材料層と、アパタイト／コラーゲン複合体を含む気孔率が70〜99％の第二の複合材料層とが、コラーゲン、プロテオグリカン、ヒアルロン酸及びアパタイト／コラーゲン複合体を含む接合層を介して接合してなる人工骨−軟骨複合体を製造する方法であって、(1) コラーゲン、プロテオグリカン及びヒアルロン酸を含む第一の複合材料を調製する工程、(2)アパタイト／コラーゲン複合体を含む第二の複合材料を調製する工程、(3) 前記第一の複合材料と前記第二の複合材料とを積層する工程、(4) 得られた積層物をゲル化し、前記第一の複合材料と前記第二の複合材料とが互いに拡散し連続的に組成が変化している前記接合層を形成する工程、及び(5) ゲル化させた積層物を凍結乾燥し、多孔質化させる工程を有することを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項1に記載の人工骨−軟骨複合体の製造方法において、前記第一の複合材料及び／又は前記第二の複合材料を積層工程の前又は後に遠心分離し、前記第一の複合材料及び／又は前記第二の複合材料の界面を平坦にする処理を有することを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項1及び2に記載の人工骨−軟骨複合体の製造方法において、前記第一の複合材料がゲル状であり、前記第二の複合材料がスラリー状又はゲル状であることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体軟骨の成分を原料とした弾力性に富んだ人工軟骨と人工骨とが強固に接合してなる人工骨−軟骨複合体、及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
変形性関節症、関節リウマチ等の骨関節疾患では経年的に組織が破壊され、関節軟骨組織は極めて修復能に乏しい。そのため、骨関節疾患の治療として薬物療法に加えて人工関節置換術が行われるようになってきた。骨欠損・破壊の治療用に開発されたハイドロキシアパタイトを主成分とする人工骨は、高い骨親和性と骨に類似した剛性を有し、骨折、骨腫瘍等の骨関連疾患における骨欠損部位に移植・充填することにより良好な治療成績を発揮している。
【０００３】
一方、関節摺動（可動）面での関節軟骨組織の高度変性・破壊に対しては金属による人工関節置換術が施行されているが、最近では構造及び機能ともに生体軟骨に近似した軟骨を再生する技術も開発された。高度の関節変性・破壊を伴う病変においては、軟骨組織ばかりでなく軟骨下骨層から関節近傍の骨組織に病変が及んでいる場合が多いため、軟骨だけでなくその下層の骨組織を含めて再生・再建する必要がある。
【０００４】
国際公開第2007/032404号（特許文献１）は、(a)グリコサミノグリカンとプロテオグリカンとを混合し、グリコサミノグリカン‐プロテオグリカン凝集体を調製する工程、及び(b)上記グリコサミノグリカン‐プロテオグリカン凝集体にコラーゲンを混合する工程を有する自己組織化グリコサミノグリカン/プロテオグリカン/コラーゲン複合体の製造方法を開示している。
【０００５】
国際公開第2004/041320号（特許文献２）は、アパタイト／コラーゲン複合体とコラーゲンとを含む分散物をゲル化し、凍結乾燥することにより多孔質体とした後で、多孔質体中のコラーゲンを架橋することにより、生体骨と同じ機構で体内に吸収されるとともに高い骨形成能を有し、人工骨等に使用できる多孔質アパタイト／コラーゲン架橋複合体を製造する方法を開示している。
【０００６】
特開2009-268494号（特許文献３）は、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン及びコラーゲンからなる軟骨様複合体を人工骨と接触させ、人工骨を基盤として軟骨様複合体を自己組織化させることにより、軟骨様複合体と人工骨とが融合した人工骨・軟骨一体型バイオマテリアルを製造する方法を開示しており、人工骨の上で軟骨構成成分を自己組織化させることで、コラーゲン線維が多孔性ハイドロキシアパタイト人工骨の表面ばかりではなく孔構造の内部にも結合すると記載している。しかしながら、特許文献３に記載の方法により作製したバイオマテリアルは、人工骨の気孔内部に軟骨様複合体が侵入し絡んでいるだけで人工骨から剥離する可能性がある。そのため、さらなる改良が望まれている。
【０００７】
特開2011-36320号（特許文献４）は、気孔率の低い多孔質ゼラチン層と、気孔率の高い多孔質ゼラチン層とが積層されてなる移植用多層軟骨ブロックであって、気孔率の低い多孔質ゼラチン層への血流の流入は制限されるが、気孔率の高い多孔質ゼラチン層には軟骨細胞が侵入し、もって軟骨細胞の成長を促進して軟骨の欠損部の早期修復を図ることができる移植用多層軟骨ブロックを開示している。しかし、特許文献４に記載の移植用多層軟骨ブロックは気孔率の異なる2種の多孔質ゼラチン層からなるものであり、人工軟骨と人工骨とが接合してなる複合材料としての機能は有していない。
【０００８】
特表2008-531230号（特許文献５）は、無機材料及び有機材料を含有するコンポジット生体材料の調製方法であって、(1) 液体担体、無機材料及び有機材料を含有する第一スラリー組成物を調製する工程と、(2) 液体担体、有機材料及び任意に無機材料を含んでなる第二スラリー組成物を調製する工程と、(3) 第一スラリー組成物を注入する前又は後に第二スラリー組成物を型に注入する工程と、(4) 液体担体が複数の固体結晶又は粒子に変化する温度で、型に注入されたスラリーを冷却する工程と、(5) 少なくとも固体結晶又は粒子の一部を好ましくは昇華及び／又は蒸発によって除去し、無機材料及び有機材料を含んでなる多孔質コンポジット材料とする工程と、(6) 型から多孔質コンポジット材料を取り出す工程とを有する方法を開示している。特許文献５は、第一スラリー組成物がコラーゲン、リン酸カルシウム及びグリコサミノグリカンの三成分共沈殿物を含有し、第二スラリー組成物が、コラーゲン及びグリコサミノグリカンの二成分共沈殿物、コラーゲン及びリン酸カルシウムの二成分共沈殿物、又はコラーゲン、グリコサミノグリカン及びリン酸カルシウムの三成分共沈殿物を含有すると記載している。しかしながら、特許文献５に記載の方法は、スラリーの状態で2種の異なる組成の材料を積層しているので、得られるコンポジット材料は2種のスラリーはほぼ均一に混じり合った混合物になり、人工軟骨と人工骨とが接合した構造とならない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第2007/032404号パンフレット
【特許文献２】国際公開第2004/041320号パンフレット
【特許文献３】特開2009-268494号公報
【特許文献４】特開2011-36320号公報
【特許文献５】特表2008-531230号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従って、本発明の目的は、人工軟骨が人工骨に強固に接合してなる人工骨−軟骨複合体、及びその製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記目的に鑑み鋭意研究の結果、本発明者らは、コラーゲン、プロテオグリカン及びヒアルロン酸を含む第一の複合材料層層と、コラーゲン及びリン酸カルシウムを含む第二の複合材料層層とを、境界部に第一の複合材料層及び第二の複合材料層が互いに混合してなる接合層が形成されるように接合することにより、第一の複合材料層層と第二の複合材料層層とが強固に接合し、人工骨−軟骨複合体として好適な材料が得られることを見出し、本発明に想到した。
【００１２】
すなわち、本発明の人工骨−軟骨複合体は、コラーゲン、プロテオグリカン及びヒアルロン酸を含む第一の複合材料層層と、コラーゲン及びリン酸カルシウムを含む第二の複合材料層層とが、コラーゲン、プロテオグリカン、ヒアルロン酸及びリン酸カルシウムを含む接合層を介して接合してなることを特徴とする。
【００１３】
第一の複合材料層層は15〜95質量％のコラーゲン、4.9〜70質量％のプロテオグリカン及び0.1〜20質量％のヒアルロン酸を含むのが好ましい。
【００１４】
第二の複合材料層層は多孔質アパタイト／コラーゲン複合体であるのが好ましい。
【００１５】
第二の複合材料層層におけるアパタイト／コラーゲンの比率は8/2〜2/8（質量比）であるのが好ましい。
【００１６】
本発明の人工骨−軟骨複合体は架橋処理されているのが好ましい。
【００１７】
コラーゲン、プロテオグリカン及びヒアルロン酸を含む第一の複合材料層層と、コラーゲン及びリン酸カルシウムを含む第二の複合材料層層とが、コラーゲン、プロテオグリカン、ヒアルロン酸及びリン酸カルシウムを含む接合層を介して接合してなる人工骨−軟骨複合体を製造する本発明の方法は、(1) コラーゲン、プロテオグリカン及びヒアルロン酸を含む第一の複合材料を調製する工程、(2) コラーゲン及びリン酸カルシウムを含む第二の複合材料を調製する工程、(3) 第一の複合材料と第二の複合材料とを積層する工程、及び(4) 得られた積層物を凍結乾燥する工程を有することを特徴とする。
【００１８】
第一の複合材料及び／又は第二の複合材料を積層工程の前又は後に遠心分離処理するのが好ましい。
【００１９】
積層物を凍結乾燥工程前にゲル化させるのが好ましい。
【００２０】
第一の複合材料はゲル状であり、第二の複合材料はスラリー状又はゲル状であるのが好ましい。
【発明の効果】
【００２１】
本発明の人工骨−軟骨複合体は、コラーゲン、プロテオグリカン及びヒアルロン酸を含む第一の複合材料層（人工軟骨）層と、コラーゲン及びリン酸カルシウムを含む第二の複合材料層（人工骨）層とが著しく強固に接合しているので、人工骨−軟骨複合体として特に高い圧力のかかる欠損部分の補填に好適である。本発明の方法により、高い強度で接合された人工軟骨と人工骨とからなる人工骨−軟骨複合体を、簡便に再現性良く製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本発明の人工骨−軟骨複合体における人工軟骨と人工骨との境界部を示す電子顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
[1] 人工骨−軟骨複合体
(A) 全体構成
本発明の人工骨−軟骨複合体は、コラーゲン、プロテオグリカン及びヒアルロン酸を含む第一の複合材料層と、コラーゲン及びリン酸カルシウムを含む第二の複合材料層とが接合してなり、第一の複合材料層及び第二の複合材料層の境界部にコラーゲン、プロテオグリカン、ヒアルロン酸及びリン酸カルシウムを含む接合層を有する。第一の複合材料層はいわゆる人工軟骨として機能し、第二の複合材料層はいわゆる人工骨として機能する。接合層は、第一の複合材料と第二の複合材料とが互いに拡散し、連続的に組成が変化しているため、明確な境界を有さない。本明細書では、第一の材料と第二の材料とが拡散により混合した部分を接合層と呼ぶ。
【００２４】
従って、接合層は、第一の複合材料及び第二の複合材料が混合された組成、すなわちコラーゲン、プロテオグリカン、ヒアルロン酸及びリン酸カルシウムからなる組成を有しており、第一の複合材料層に近づくにつれて、コラーゲン、プロテオグリカン及びヒアルロン酸からなる第一の複合材料の組成に近づき、第二の複合材料層に近づくにつれて、コラーゲン及びリン酸カルシウムからなる第二の複合材料の組成に近づく。
【００２５】
このような第一の複合材料層及び第二の複合材料層が混合した接合層を有することにより、第一の複合材料層及び第二の複合材料層は強固に接合されており、患部に移植した場合も簡単に剥離することはない。
【００２６】
人工骨−軟骨複合体のサイズ及び形状、並びに第一の複合材料層と第二の複合材料層とのサイズ比は、人工骨−軟骨複合体を使用する部位に応じて適宜決めることができる。一般には、第一の複合材料層は1 mm〜2 cm程度の厚さを有するのが好ましく、第二の複合材料層は5 mm〜10 cm程度の厚さを有するのが好ましい。それぞれ形状は、円柱状、直方体などであってよく、特に制限はない。また第一の複合材料層と第二の複合材料層は、同一形状であっても、異なる形状であってもよい。
【００２７】
(B) 第一の複合材料層
第一の複合材料層は、コラーゲン、プロテオグリカン及びヒアルロン酸を含み、いわゆる人工軟骨として機能するものである。第一の複合材料層は、15〜95質量％のコラーゲン、4.9〜70質量％のプロテオグリカン及び0.1〜20質量％のヒアルロン酸を含むのが好ましい。コラーゲンにより軟骨組織の骨格となる網目構造が形成され、さらにヒアルロン酸及びプロテオグリカンとの架橋が物理的及び／又は化学的に形成され、十分な水分を保持することができ、軟骨特有の弾力性を有する人工軟骨（第一の複合材料層）が得られる。第一の複合材料層中のコラーゲン、プロテオグリカン及びヒアルロン酸の量はそれぞれ45〜65質量％、20〜40質量％及び1.5〜5質量％であるのがより好ましい。この範囲である場合、人工軟骨は特に関節軟骨として好適である。
【００２８】
コラーゲン含有量が15質量％未満の場合、生体中に挿入したときの膨張率が大きいため人工軟骨を軟骨欠損部へ適合させるのが難しくなり、また膨張により気孔率が低下してしまう。コラーゲン含有量が95質量％超の場合、人工軟骨の着色が大きくなる。プロテオグリカン含有量が4.9質量％未満の場合、人工軟骨の弾性率が低下して軟骨としての性能が低下する。プロテオグリカン含有量が70質量％超の場合、膨張による大きさの変化が大きく、人工軟骨の気孔率が低下してしまう。ヒアルロン酸含有量が0.1質量％未満の場合、人工軟骨の弾性率が低下して軟骨としての性能が低下するとともに、人工軟骨表面の潤滑性（低摩擦性）が低下する。ヒアルロン酸含有量が20質量％超の場合、生体軟骨に含まれている割合を大きく超え、人工軟骨は生体軟骨とは異なる成分の材料になってしまうため、適用部位によっては、コラーゲンとプロテオグリカンの所望の含有割合を確保することが難しくなる。
【００２９】
コラーゲンとしては特に限定されず、動物等から抽出したものを使用できる。また由来する動物の種、組織部位、年齢等も特に限定されない。一般的には哺乳動物（例えばウシ、ブタ、ウマ、ウサギ、ネズミ等）や鳥類（例えばニワトリ等）の皮膚、骨、軟骨、腱、臓器等から得られるコラーゲンが使用できる。また魚類（例えばタラ、ヒラメ、カレイ、サケ、マス、マグロ、サバ、タイ、イワシ、サメ等）の皮、骨、軟骨、ひれ、うろこ、臓器等から得られるコラーゲン様蛋白を使用してもよい。なおコラーゲンの抽出方法は特に限定されず、一般的な抽出方法を使用することができる。動物組織から抽出したコラーゲンの代わりに、合成コラーゲンや遺伝子組み替え技術によって得られたコラーゲンを使用してもよい。
【００３０】
グリコサミノグリカンは、アミノ糖とウロン酸又はガラクトースが結合した2糖の繰り返し構造からなる酸性多糖類の一種である。本発明において用いられるヒアルロン酸はグリコサミノグリカンの一種であり、ヒアルロン酸以外のグリコサミノグリカン、例えばコンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン等も使用できるが、ヒアルロン酸を用いるのが好ましい。
【００３１】
プロテオグリカンとは、一つの核となるタンパク質に、一本又は多数のグリコサミノグリカン鎖が結合したものである。プロテオグリカンとしては特に制限はなく、アグリカン、バーシカン、ニューロカン、ブレビカン、デコリン、ビグリカン、セルグリシン、パールカン、シンデカン、グリピカン、ルミカン、ケラトカン等が挙げられるが、アグリカンを用いるのが好ましい。
【００３２】
プロテオグリカンの由来に特に制限はなく、複合体の使用目的に応じて、ほ乳類(ヒト、ウシ、ブタ等)、鳥類(ニワトリ等)、魚類(サメ、鮭等)、甲殻類(カニ、エビ等)等の各種動物由来の中から適宜選択することができる。特に本発明の人工骨−軟骨複合体をヒトの軟骨欠損又は変性の治療用として用いるのであれば、ヒトにおける免疫原性の低い由来の中から選択するのが望ましい。
【００３３】
人工軟骨中のコラーゲンの定量法は、UV吸収の測定による方法、HPLCによる方法等が挙げられる。ヒアルロン酸の定量法は、カルバゾール硫酸法、ヒアルロン酸結合性タンパク質を利用した阻害法、HPLCによる方法等が挙げられる。プロテオグリカンの定量法として、比色定量法（色素DMMBを用いる）、HPLCによる方法等が挙げられる。
【００３４】
人工軟骨に架橋処理を施すのが好ましい。架橋処理は、物理的又は化学的方法により行うことができる。また人工軟骨はガンマ線処理等の方法により滅菌処理するのが好ましい。
【００３５】
人工軟骨の気孔率は、50〜99％であるのが好ましく、60〜99％であるのがより好ましい。人工軟骨の平均気孔径は、1〜1000μmであるのが好ましく、50〜800μmであるのがより好ましい。
【００３６】
(C) 第二の複合材料層
第二の複合材料層はコラーゲン及びリン酸カルシウムを含み、いわゆる人工骨として機能する。第二の複合材料層は多孔質アパタイト／コラーゲン複合体であるのが好ましい。多孔質アパタイト／コラーゲン複合体は、湿潤させることで変形可能なスポンジ状体となり、複雑な形状の患部であっても容易に適用できる。また第二の複合材料層は経時的に自家骨と置き換わる。
【００３７】
多孔質アパタイト／コラーゲン複合体は、アパタイト／コラーゲン複合体繊維の複数の層からなる。繊維層は10〜500μm程度の厚さを有する板状であり、ランダムな向き及びランダムな層数で重なっている。繊維層の間には、アパタイト／コラーゲン複合体繊維が集合してなる柱が散在する。微視的に見ると、繊維層の重なり方向は散在する柱によって支持されているだけであるので、この方向にはアパタイト／コラーゲン多孔体は比較的脆いと考えられる一方、層方向には強度を有すると考えられる。しかし、上述のように、繊維層の重なりはランダムであるので、巨視的に見ると、繊維層の重なり方向は平均化されており、強度の異方性はさほど大きくない。
【００３８】
繊維層の間に柱が散在することによって気孔はほぼ板状に形成される。ほぼ板状の気孔の厚さは、繊維層の0.5〜10倍程度である。この多孔質アパタイト／コラーゲン複合体を生体内に埋入したときに、ほぼ板状の気孔に血管や比較的大きなタンパク質等が入り込みやすいので、骨形成が促進されると考えられる。
【００３９】
多孔質アパタイト／コラーゲン複合体中のアパタイト／コラーゲンの比率は8/2〜2/8（質量比）であるのが好ましく、約8/2（質量比）であるのが特に好ましい。多孔質アパタイト／コラーゲン複合体の気孔率は70〜99％であるのが好ましく、80〜97％であるのがより好ましい。多孔質アパタイト／コラーゲン複合体の平均気孔径は1〜1000μmであるのが好ましく、100〜700μmであるのがより好ましい。
【００４０】
(D) 接合層
第一の複合材料層及び第二の複合材料層の境界部は、コラーゲン、プロテオグリカン、ヒアルロン酸及びリン酸カルシウムを含む接合層を有する。図1に示すように、接合層は第一の複合材料層及び第二の複合材料層が混じり合った組成を有し、両複合材料層を強固に接合する。接合層は、第一の複合材料層及び第二の複合材料層が剥離しない程度の実用的な強度を有するような厚さであるのが好ましい。具体的には、接合層の厚さは1〜3000μmであるのが好ましく、1〜2000μmであるのがより好ましく、1〜1000μmであるのが最も好ましい。
【００４１】
[2] 製造方法
人工骨−軟骨複合体を製造する本発明の方法は、(1) コラーゲン、プロテオグリカン及びヒアルロン酸を含む第一の複合材料を調製する工程、(2) コラーゲン及びリン酸カルシウムを含む第二の複合材料を調製する工程、(3) 第一の複合材料と第二の複合材料とを積層する工程、及び(4) 得られた積層物を凍結乾燥する工程を有する。
【００４２】
第一の複合材料及び／又は第二の複合材料は、積層工程の前又は後に遠心分離処理するのが好ましい。積層物を凍結乾燥する前にゲル化を行うのが好ましい。第一の複合材料はゲル状であるのが好ましく、第二の複合材料はスラリー状又はゲル状であるのが好ましい。
【００４３】
(A) 第一の複合材料の調製
第一の複合材料は、人工軟骨の原料となるコラーゲン、プロテオグリカン及びヒアルロン酸を、混合後に15〜95質量％のコラーゲン、4.9〜70質量％のプロテオグリカン及び0.1〜20質量％のヒアルロン酸を含む組成となるように混合することによって得られる。コラーゲンはあらかじめ水又は希塩酸（5〜50 mM程度の濃度）に0.1〜20質量％の濃度で溶解したものを用いるのが好ましい。プロテオグリカンは、あらかじめ無菌水（注射用水等）に0.1〜20質量％の濃度で溶解したものを用いるのが好ましい。ヒアルロン酸は、あらかじめ無菌水（注射用水等）に0.1〜20質量％の濃度で溶解したものを用いるのが好ましい。
【００４４】
第一の複合材料は、(a-1) ヒアルロン酸及びコラーゲンの混合物とプロテオグリカン及びコラーゲンの混合物とを別々に調製した後混合する第一の混合方法、又は(a-2) コラーゲン、プロテオグリカン及びヒアルロン酸を同時に混合する第二の混合方法を行った後、(b) 得られた混合物を凍結乾燥し（第一の凍結乾燥）することにより調製することができる。第一の凍結乾燥工程の後、得られた凍結乾燥物を粉砕する工程と、粉砕した凍結乾燥物を水に分散させる工程と、得られた分散物を再度凍結乾燥する工程（第二の凍結乾燥工程）とを行っても良い。
【００４５】
(1-1) 第一の混合方法
第一の混合方法は、(a) ヒアルロン酸及びコラーゲンからなる第一の組成物を調製する工程と、(b) プロテオグリカン及びコラーゲンからなる第二の組成物を調製する工程と、(c) 第一の組成物と第二の組成物とを混合する工程とを有する。
【００４６】
(a) 第一及び第二の組成物の調製
第一の組成物を調製する工程において、ヒアルロン酸水溶液とコラーゲン水溶液とを、ヒアルロン酸／コラーゲンの質量比が好ましくは10000：1〜1：10000、より好ましくは5000：1〜1：5000、最も好ましくは15：1〜1：15となるように混合する。ヒアルロン酸水溶液とコラーゲン水溶液との混合は3〜25℃で行うのが好ましい。
【００４７】
第二の組成物を調製する工程において、プロテオグリカン水溶液とコラーゲン水溶液とを、プロテオグリカン／コラーゲンの質量比が好ましくは10000：1〜1：10000、より好ましくは5000：1〜1：5000、最も好ましくは10：1〜1：10となるように混合する。プロテオグリカン水溶液とコラーゲン水溶液との混合は3〜25℃で行うのが好ましい。
【００４８】
ヒアルロン酸水溶液とコラーゲン水溶液との混合（第一の組成物の調製）及びプロテオグリカン水溶液とコラーゲン水溶液との混合（第二の組成物の調製）は特に高いせん断を必要しないので、通常用いられているスターラー、ミキサー等の器具を用いて行うことができる。混合は、それぞれヒアルロン酸及びコラーゲンの均一混合物、及びプロテオグリカン及びコラーゲンの均一混合物が得られるように、3〜25℃で1秒〜3分程度行うのが好ましい。
【００４９】
(b) 第一及び第二の組成物の混合
第一の組成物と第二の組成物との混合比は、混合後に15〜95質量％のコラーゲン、4.9〜70質量％のプロテオグリカン及び0.1〜20質量％のヒアルロン酸を含む組成となるように決める。第一及び第二の組成物の混合は、ホモジナイザー、ディゾルバー等の器具を用いて、せん断力を有する方法により行うのが好ましい。例えば、ホモジナイザーを使用する場合、1,000〜12,000 rpmの回転数で、30秒〜3分の攪拌を2〜5回繰り返して行うのが好ましい。混合時の試料は3〜25℃程度に保つのが好ましい。別々に調製した第一及び第二の組成物を混合することにより、軟骨の合成の進行を促すことができる。
【００５０】
(1-2) 第二の混合方法
第二の混合方法では、15〜95質量％のコラーゲン、4.9〜70質量％のプロテオグリカン及び0.1〜20質量％のヒアルロン酸を含む組成となるように、コラーゲン水溶液、プロテオグリカン水溶液及びヒアルロン酸水溶液を同時に混合する。
【００５１】
コラーゲン水溶液、プロテオグリカン水溶液及びヒアルロン酸水溶液は、ホモジナイザー、ディゾルバー等の器具を用いて、せん断力をかけて混合するのが好ましい。例えば、ホモジナイザーを使用する場合、1,000〜12,000 rpmの回転数で、30秒〜3分の攪拌を2〜5回繰り返して行うのが好ましい。コラーゲン水溶液、プロテオグリカン水溶液及びヒアルロン酸水溶液の混合は3〜25℃で行うのが好ましい。
【００５２】
(2) 第一の凍結乾燥
第一の混合方法又は第２の混合方法により得られた混合物を、熱伝導性のよい容器（金属のバット等）に入れ、−80℃〜−60℃で一晩凍結する。凍結した混合物に対して、棚温度−50℃〜−5℃程度（好ましくは−40℃〜−5℃）で混合物の水分（氷）がほぼなくなるまで10時間〜10日間程度真空引きする第一の乾燥工程を行い、棚温度を20〜40℃程度（好ましくは25〜40℃）に上げてさらに3〜24時間真空引きする第二の乾燥工程を行う。このように、二段階に温度を変化させて凍結乾燥することにより、結合水までもが除去され、より乾燥して優れた保存性を有する凍結乾燥物が得られる。
【００５３】
(3) 粉砕
得られた凍結乾燥物はミル等の固体粉砕器で粉砕する。粉砕の方法は特に限定されるものではないが、凍結乾燥物があまり高い温度にならないように行うのが好ましい。
【００５４】
(4) 分散
粉砕した凍結乾燥物を3〜20質量％の濃度となるように水又は生理食塩水と混合し、ホモジナイザー等の器具を用いて、3〜25℃及び1,000〜15,000 rpmの条件で、30秒〜3分間×1〜5回分散処理を行い、第一の複合材料を得る。
【００５５】
(5) ゲル化
分散物（第一の複合材料）は必要に応じてゲル化させても良い。ゲル化は、第一の複合材料をシャーレ等の容器に入れてフタをし、30〜40℃で1〜5時間静置することにより行うのが好ましい。
【００５６】
(B) 第二の複合材料の調製
(1) 組成
第二の複合材料は、アパタイト／コラーゲン複合体からなる繊維を含むスラリーであり、コラーゲン、リン酸又はその塩、及びカルシウム塩を原料として得られる。コラーゲンとしては特に限定されず、動物等から抽出したものを使用できる。なお由来する動物の種、組織部位、年齢等は特に限定されない。一般的には哺乳動物（例えばウシ、ブタ、ウマ、ウサギ及びネズミ）や鳥類（例えばニワトリ）の皮膚、骨、軟骨、腱、臓器等から得られるコラーゲンが使用できる。また魚類（例えばタラ、ヒラメ、カレイ、サケ、マス、マグロ、サバ、タイ、イワシ及びサメ）の皮、骨、軟骨、ひれ、うろこ、臓器等から得られるコラーゲン様蛋白を使用してもよい。なおコラーゲンの抽出方法も特に限定されず、一般的な抽出方法によることができる。動物組織から抽出したコラーゲンの代わりに、合成コラーゲンや遺伝子組み替え技術によって得られたコラーゲンを使用してもよい。
【００５７】
リン酸又はその塩（以下単に「リン酸（塩）」という）としてはリン酸、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二カリウム及びリン酸二水素カリウムが挙げられる。またカルシウム塩としては炭酸カルシウム、酢酸カルシウム及び水酸化カルシウムが挙げられる。リン酸塩及びカルシウム塩はそれぞれ均一な水溶液又は水性懸濁液の状態で添加するのが好ましい。
【００５８】
使用するアパタイト原料［リン酸（塩）及びカルシウム塩］とコラーゲンとの質量比により、第二の複合材料中のアパタイト／コラーゲンの質量比を制御できる。このため使用するアパタイト原料とコラーゲンとの質量比は、目的とするアパタイト／コラーゲン複合体繊維の含有割合により適宜決定する。アパタイト原料／コラーゲンの質量比は9/1〜6/4が好ましく、約8/2が特に好ましい。
【００５９】
(2) 調製
コラーゲン及びリン酸（塩）の水溶液（単に「コラーゲン／リン酸（塩）水溶液」という。）、及びカルシウム塩の水溶液又は水性懸濁液を調製する。コラーゲン／リン酸（塩）水溶液において、コラーゲンの濃度は0.1〜1.2質量％が好ましく、約0.85質量％が特に好ましく、リン酸（塩）の濃度は50〜250 mM程度が好ましい。カルシウム塩水溶液（又は水性懸濁液）の濃度は200〜600 mM程度が好ましい。コラーゲンは低濃度のリン酸水溶液の状態でリン酸（塩）水溶液に加え、コラーゲン／リン酸（塩）水溶液を調製するのが好ましい。コラーゲンのリン酸水溶液では、コラーゲンの濃度が0.5〜1.5質量％で、リン酸の濃度が10〜30 mMであるのが好ましい。
【００６０】
(3) 合成
カルシウム塩水溶液（又は水性懸濁液）の好ましくは0.5〜2倍、より好ましくは0.8〜1.2倍、特にカルシウム塩水溶液（又は水性懸濁液）とほぼ同量の水（約40℃）に、コラーゲン／リン酸（塩）水溶液及びカルシウム塩水溶液（又は水性懸濁液）を同時に滴下することにより、アパタイト／コラーゲン複合体繊維を合成する。滴下条件（温度、滴下速度、撹拌速度等）によってアパタイト／コラーゲン複合体繊維の長さを制御できる。滴下速度は10〜50 ml/min程度であるのが好ましく、撹拌は50〜300 rpm程度であるのが好ましい。
【００６１】
滴下中、カルシウムイオン濃度を3.75 mM以下、かつリン酸イオン濃度を2.25 mM以下に維持するため、反応溶液のpHを8.9〜9.1に保つのが好ましい。カルシウムイオン及び／又はリン酸イオンの濃度が上記範囲を超えると、アパタイト／コラーゲン複合体の自己組織化が妨げられる。本明細書中「自己組織化」とは、コラーゲン繊維に沿って、ハイドロキシアパタイト（アパタイト構造を有するリン酸カルシウム）が生体骨特有の配向をしていること、すなわちハイドロキシアパタイトのC軸がコラーゲン繊維に沿うように配向していることを意味する。以上の滴下条件により、アパタイト／コラーゲン複合体繊維は、多孔体の原料として好適な1 mm以下の長さで、自己組織化したものとなる。
【００６２】
滴下終了後、スラリー状になったアパタイト／コラーゲン複合体繊維の分散物を凍結乾燥する。凍結乾燥は、−10℃以下に凍結した状態で真空引きし、急速に乾燥させることにより行う。
【００６３】
(4) 分散物の調製
アパタイト／コラーゲン複合体繊維に水、リン酸水溶液等を加えて撹拌し、ペースト状の分散物を調製する。この分散物が含有する液体の含有量は、80〜99体積％であるのが好ましく、90〜97体積％であるのがより好ましい。つまり、複合体繊維の含有量は、1〜20体積％であるのが好ましく、3〜10体積％であるのがより好ましい。アパタイト／コラーゲン複合体繊維にはあらかじめ水蒸気を付着させておくのが好ましい。この場合は、アパタイト／コラーゲン複合体繊維に付着させた水蒸気の量を差し引いて、加える水の量を決める必要がある。
【００６４】
製造する多孔体の気孔率P（％）は分散物中のアパタイト／コラーゲン複合体繊維と液体との体積比に依存し、下記式(1)：
P = Y／(X＋Y)×100    ・・・  (1)
［ただし、Xは分散物中のアパタイト／コラーゲン複合体繊維の体積、Yは分散物中の液体の体積を示す。］により表される。このため加える液体の量によって、多孔体の気孔率Pを制御することができる。液体を加えた後で分散物を撹拌することにより、アパタイト／コラーゲン複合体繊維が切断され繊維長の分布幅が大きくなるため、製造する多孔体の強度が向上する。
【００６５】
アパタイト／コラーゲン複合体繊維の分散物にバインダーとなるコラーゲンを加え、さらに撹拌する。コラーゲンの添加量は、アパタイト／コラーゲン複合体繊維100質量％に対して、1〜10質量％であるのが好ましく、3〜6質量％であるのがより好ましい。アパタイト／コラーゲン複合体繊維の場合と同様に、コラーゲンはリン酸水溶液に溶解した状態で加えるのが好ましい。コラーゲン／リン酸（塩）水溶液におけるコラーゲン及びリン酸（塩）の濃度は特に限定されないが、実用的にはコラーゲンの濃度は0.8〜0.9質量％（例えば0.85質量％）であるのが好ましく、リン酸（塩）の濃度は15〜25 mM（例えば20 mM）であるのが好ましい。
【００６６】
コラーゲン／リン酸（塩）水溶液の添加により分散物は酸性となっているので、水酸化ナトリウム水溶液を加えてpHを6.8〜7.6にするのが好ましく、7.0〜7.4にするのがより好ましく、約7にするのが特に好ましい。分散物のpHを6.8〜7.6とすることにより、バインダーとして加えたコラーゲンの繊維化を促進することができる。
【００６７】
分散物にリン酸緩衝溶液（PBS）の2.5〜10倍程度の濃縮液を加えて撹拌し、イオン強度をPBSと同程度（0.2〜0.8程度）とするのが好ましい。分散物のイオン強度を大きくすることにより、バインダーとして加えたコラーゲンの繊維化を促進することができる。
【００６８】
このようにして、スラリー状のアパタイト／コラーゲン複合材料（第二の複合材料）を得ることができる。なお、バインダー添加、pH調整、及びイオン強度調整のいずれかあるいは全てを省略しても良い。スラリー状のアパタイト／コラーゲン複合体は、35〜43℃で0.5〜3.5時間保持することによってゲル化させても良い。
【００６９】
(C) 第一の複合材料と第二の複合材料との積層
得られたゲル状の第一の複合材料、及びスラリー状又はゲル状の第二の複合材料は、容器中で両者の界面が乱れないように積層する。第一及び第二の複合材料の積層順は特に限定されないが、あらかじめ容器に第二の複合材料を入れ、その上に第一の複合材料を界面が乱れないように入れて積層するのが好ましい。
【００７０】
両複合材料を順に容器に入れるときに、界面を平坦にするために遠心分離処理を行うのが好ましい。例えば、容器に下層を構成する一方の複合材料を入れた状態で1回目の遠心分離処理を行い、一方の複合材料の表面を平坦にする。次に、上層を構成する他方の複合材料を容器に入れて両層を積層し、その状態で2回目の遠心分離処理を行う。これにより、両複合材料層の界面が平坦な積層物が得られる。1回目の遠心分離処理及び2回目の遠心分離処理の一方を省略しても良い。
【００７１】
(D) ゲル化
得られた積層物を所定の温度に保持することにより、積層物はゲル化するとともに、第一の複合材料及び第二の複合材料を構成する成分（コラーゲン、プロテオグリカン、ヒアルロン酸及びリン酸カルシウム）は相互に拡散する。その結果、コラーゲン、プロテオグリカン、ヒアルロン酸及びリン酸カルシウムからなる組成を有し、かつその組成が、第一の複合材料層に近づくにつれてプロテオグリカン及びヒアルロン酸が多くなり（第一の複合材料層の組成に近づき）、第二の複合材料層に近づくにつれてリン酸カルシウムが多くなる（第二の複合材料層の組成に近づく）ように連続的に変化する接合層が形成される。ゲル化及び接合層の形成のために保持する温度は35〜43℃であるのが好ましく、35〜40℃であるのがより好ましい。分散物を十分にゲル化させて接合層を形成するため、保持時間は0.5〜3.5時間であるのが好ましく、1〜3時間であるのがより好ましい。
【００７２】
(E) 第二の凍結乾燥
ゲル化させた積層物を凍結させ乾燥させると、人工骨−軟骨複合体が得られる。凍結する際には、ステンレスバット内に置いた網皿の上に積層物を入れた容器を載せるのが好ましい。凍結は、あらかじめゲル化させた積層物を2〜10℃で1〜24時間冷蔵した後に行うのが好ましい。凍結温度は−100〜0℃であるのが好ましく、−90〜−10℃であるのがより好ましく、−80〜−20℃であるのが最も好ましい。凍結温度が−100℃未満では、凍結乾燥後の多孔質アパタイト／コラーゲン複合体層（第二の複合材料層）の気孔径が小さくなり過ぎる。凍結温度が0℃超では凍結しない。凍結時間は12〜48時間が好ましい。
【００７３】
凍結させた積層物に対して、棚温度−50℃〜−5℃程度（好ましくは−40℃〜−5℃）で積層物の水分（氷）がほぼなくなるまで3日〜1週間程度真空引きする第一の乾燥工程を行い、真空引きしたまま棚温度を20〜40℃程度（好ましくは25〜40℃）に上げてさらに3〜24時間第二の乾燥工程を行う。このように、二段階に温度を変化させて凍結乾燥することにより、結合水までもが除去され、より乾燥して優れた保存性を有する凍結乾燥物が得られる。
【００７４】
(F) 架橋及び滅菌処理
人工骨−軟骨複合体の機械的強度を高めるとともに、体内に挿入されたときに長期間に渡って保持し得るようにするため、凍結乾燥後の多孔質積層物を架橋処理するのが好ましい。架橋処理としては、γ線、紫外線、電子線、熱脱水等を用いた物理的架橋法、又は架橋剤や縮合剤を用いた化学的架橋法を用いて行うことができる。化学的架橋法としては、例えば凍結乾燥後の多孔質積層物を架橋剤の溶液に浸漬する方法、凍結乾燥後の多孔質積層物に架橋剤を含有する蒸気を作用させる方法、及び第一の複合材料及び第二の複合材料の水溶液又は分散物に架橋剤を添加する方法が挙げられる。
【００７５】
これらの方法のうち、本発明においては熱脱水架橋法が好ましい。熱脱水架橋は、凍結乾燥後の多孔質積層物を100〜160℃及び0〜100 hPaの真空オーブン中に10〜30時間保持することにより行うことができる。
【００７６】
このようにして得られた人工骨−軟骨複合体は紫外線、γ線、電子線、乾燥加熱等により滅菌処理するのが好ましい。特に、25 kGy以下のガンマ線を照射することにより滅菌するのが好ましい。
【実施例】
【００７７】
本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はそれらに限定されるものではない。
【００７８】
実施例1
(1) 第一の複合材料の調製
5m M塩酸にコラーゲンを溶解し、1質量％の濃度のコラーゲン水溶液を作製した。また注射用水にプロテオグリカンを溶解し、1質量％の濃度のプロテオグリカン水溶液を作製し、さらに、注射用水にヒアルロン酸を溶解し、0.1質量％の濃度のヒアルロン酸水溶液を作製した。なおこれらの調製は全て4℃で行った。
【００７９】
コラーゲン水溶液及びプロテオグリカン水溶液を、1：1（質量比）で混合し、ミキサーで攪拌し混合液Aを得た。同様に、コラーゲン水溶液及びヒアルロン酸水溶液を、1：1（質量比）で混合し、ミキサーで攪拌し混合液Bを得た。混合液A及びBを2：1（質量比）で混合し、ホモジナイザーで10,000 rpmの回転数で1分間の攪拌を30秒のインターバルをおいて3回行った。なお攪拌は試料の温度を5℃に保温して行った。
【００８０】
得られた混合物に対して下記の手順で第一の凍結乾燥を行った。すなわち、混合物をバットに流し込み−80℃で19時間凍結した後、棚温度−5℃で10日間真空引きして第一の乾燥を行った。この第一の乾燥で、混合物の水分（氷）はほぼなくなった。引き続き真空引きしたまま棚温度を25℃に上げてさらに3時間第二の乾燥を行い、凍結乾燥物を得た。
【００８１】
得られた凍結乾燥物をミルで粉砕した後、粉砕した凍結乾燥物を10.7質量％の濃度となるように生理食塩水を混合し、ホモジナイザーで10,000 rpmの条件で、1分間の分散を3回（インターバル：1分）行った。なお、ホモジナイザーによる分散は5℃に保温して行った。
【００８２】
得られた分散物を、自転・公転ミキサー（シンキー社製、あわとり練太郎ARE-250）で1分間攪拌し、分散物中に含まれる気泡を取り除き、ゲル状のコラーゲン／プロテオグリカン／ヒアルロン酸複合材料（第一の複合材料）を得た。
【００８３】
(2) 第二の複合材料の調製
120 mMのリン酸水溶液42 mlに、コラーゲン／リン酸水溶液（コラーゲン濃度：0.57質量％、リン酸濃度：20 mM）を350 g加えて撹拌し、「液I」と呼ぶコラーゲン／リン酸水溶液を調製した。他方、400 mMの水酸化カルシウム水性懸濁液（液II）を200 ml調製した。反応容器に200 mlの純水を入れ、38℃に加熱した。この反応容器中の純水にコラーゲン／リン酸水溶液（液I）と水酸化カルシウム水性懸濁液（液II）とをそれぞれ約30 ml/分の速度で同時に滴下しながら、反応溶液を200 rpmで撹拌して、アパタイト／コラーゲン複合体繊維を含むスラリーを作製した。滴下速度は、反応溶液のpHが8.9〜9.1に保持されるよう調節した。生成したアパタイト／コラーゲン複合体繊維のスラリーを−30℃で凍結乾燥した。アパタイト／コラーゲン複合体繊維の長さは概ね1 mm以下であり、アパタイト／コラーゲン質量比は8/2であった。
【００８４】
凍結乾燥したアパタイト／コラーゲン複合体繊維2重量部に、13重量部の生理食塩水を加えて撹拌し、ペースト状の分散物とした。分散物を37.5℃で2時間静置した後、さらに5℃で静置してゲル化させ、ゲル状のアパタイト／コラーゲン複合材料（第二の複合材料）を得た。
【００８５】
(3) 積層物の作製
細胞培養用マルチプレート（容量3.4 mL）に、ゲル状のアパタイト／コラーゲン複合材料（第二の複合材料）を3g入れ、3,000 rpmの回転数（約1200 G）で、4℃で5分間の遠心分離処理を行った。遠心分離後の第二の複合材料の上に、ゲル状のコラーゲン／プロテオグリカン／ヒアルロン酸複合材料（第一の複合材料）をゆっくりと載せ、3,000 rpmの回転数（約1200 G）で、4℃で1分間の遠心分離処理を行った。
【００８６】
(4)ゲル化及び冷蔵
得られた積層物を37.5℃で1時間静置することによりゲル化させた後、5℃で2時間冷蔵した。
【００８７】
(5) 第二の凍結乾燥
ステンレスバット内に置いた網皿の上に冷蔵した積層物を容器ごと置き、−60℃で17時間凍結した後、棚温度−5℃で6日間真空引きする第一の乾燥を行った。この第一の乾燥で、積層物の水分（氷）はほぼなくなった。引き続き真空引きしたまま棚温度を25℃に上げてさらに4時間第二の乾燥を行い、凍結乾燥物を得た。
【００８８】
(6) 架橋及び滅菌
真空オーブンで110℃の条件で20時間凍結乾燥物を熱脱水架橋した後、25 kGyの線量のガンマ線を照射して滅菌処理し、コラーゲン及びリン酸カルシウムを含む第二の複合材料層の上に、コラーゲン、プロテオグリカン及びヒアルロン酸を含む第一の複合材料層を積層してなる人工骨−軟骨複合体を得た。
【００８９】
図1は、得られた人工骨−軟骨複合体の第一複合材料層と第二の複合材料層との境界部（接合層）を示す電子顕微鏡写真である。図1の上側が第一の複合材料層であって人工軟骨として機能し、下側が第二の複合材料層であって人工骨として機能する。この境界部には明確な界面が観察されないので、第一及び第二の複合材料が相互に拡散し、コラーゲン、プロテオグリカン、ヒアルロン酸及びリン酸カルシウムを含む接合層が形成されているものと考えられる。さらに、境界部以外は、第一の複合材料あるいは第二の複合材料が単独で存在していることが確認できる。
【００９０】
人工骨−軟骨複合体を水中に浸漬し真空脱気を行ったところ、第一の複合材料層及び第二の複合材料層は境界部で剥がれず、第一及び第二の複合材料層が強固に接合していることがわかった。
【図１】
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