(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
置換９Ｒ、１５Ｔ、６８Ａ、２１８Ｄ及び２４５Ｒを含む、親サブチリシンの変異体であって、
変異体が更に、修飾６１｛Ｄ，Ｅ｝、６２｛Ｄ，Ｅ｝、７６｛Ｄ，Ｅ｝、＊９７ａＧ、９８｛Ｇ，Ｓ｝、９９Ｇ、１０１Ｇ、１２０｛Ｖ，Ｑ，Ｄ｝、１３１｛Ｔ，Ｓ｝、１３７Ｈ、１９４Ｐ、２２８Ｖ、２３０Ｖ及び２６１Ｄのうち少なくとも１つを含み、前記位置は配列番号２の成熟ポリペプチド［ＢＰＮ’］の位置に相当すると共に、
改善された卵汚れ除去能を有する、変異体。
【請求項２】
変異体が置換Ｇ６１Ｅを含む、請求項１に記載の変異体。
【請求項３】
変異体が置換Ａ９８Ｓを含む、請求項１又は２に記載の変異体。
【請求項４】
変異体が置換Ｓ９９Ｇを含む、請求項１〜３の何れか一項に記載の変異体。
【請求項５】
変異体が置換Ｓ９Ｒ、Ａ１５Ｔ、Ｇ６１Ｅ、Ｖ６８Ａ、Ａ９８Ｓ、Ｓ９９Ｇ、Ｎ２１８Ｄ及びＱ２４５Ｒを含む、請求項１〜４の何れか一項に記載の変異体。
【請求項６】
親サブチリシンが、配列番号１に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドである、請求項１〜５の何れか一項に記載の変異体。
【請求項７】
親サブチリシンがサブグループＩ−Ｓ２に属する、請求項１〜６の何れか一項に記載の変異体。
【請求項８】
変異体が、親サブチリシンと比較して改善された１又は２以上の特性を有し、
改善された特性が、洗浄性能、安定性、触媒活性及び食器洗い性能を含む、請求項１〜７の何れか一項に記載の変異体。
【請求項９】
請求項１〜８の何れか一項に記載の変異体をコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項９に記載のポリヌクレオチドを含む核酸コンストラクト。
【請求項１１】
請求項１０に記載の核酸コンストラクトを含む発現ベクター。
【請求項１２】
請求項１０に記載の核酸コンストラクトを含む宿主細胞。
【請求項１３】
請求項１〜８の何れか一項に記載の変異体を含む清浄又は洗剤組成物。
【請求項１４】
請求項１に記載の変異体を作製する方法であって、
親サブチリシンに対して、以下の置換：
ｉ）位置９のＳのＲによる置換、
ii）位置１５のＡのＴによる置換、
iii）位置６８のＶのＡによる置換、
iv）位置２４５のＱのＲによる置換、及び
ｖ）位置２１８のＮのＤによる置換、
並びに、以下の修飾のうち１又は２以上：
位置６１のＧのＥによる置換、
位置６２のＮのＤによる置換、
位置７６のＮのＤによる置換、
位置９７へのＧの挿入、
位置９８のＡのＳによる置換、
位置９９のＳのＧによる置換、
位置１０１のＳのＧによる置換、
位置１２０のＨのＤによる置換、
位置１３１のＰのＴによる置換、
位置１３７のＱのＨによる置換、
位置１９４のＡのＰによる置換、
位置２２８のＡのＶによる置換、
位置２３０のＡのＶによる置換、及び、
位置２６１のＮのＤによる置換、
を導入することを含み、
前記位置は配列番号２の成熟ポリペプチド［ＢＰＮ’］の位置に相当する方法。
【請求項１５】
親サブチリシンが、配列番号１に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、親サブチラーゼに比して、洗浄性能、熱安定性、保存安定性又は触媒活性を含む１又は２以上の特性において改変を示す、新規なサブチラーゼ（subtilase）変異体に関する。本発明の変異体は、例えば清浄又は洗剤組成物、例えば洗濯洗剤組成物及び食器洗い用組成物、例えば自動食器洗浄機用組成物における使用に適する。また、本発明は、前記変異体をコードする単離ＤＮＡ配列、発現ベクター、宿主細胞、及び本発明の変異体を生成及び使用する方法にも関する。さらに、本発明は、本発明の変異体を含む清浄及び洗剤組成物にも関する。
【背景技術】
【０００２】
洗剤業界において、酵素は３０年以上も洗剤処方に利用されてきた。斯かる処方に使用される酵素としては、プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、マンノシダーゼ、並びにその他の酵素、又はそれらの混合物が挙げられる。商業上最も重要な酵素はプロテアーゼである。
【０００３】
商業上使用されているプロテアーゼの中でも増加しているのは、タンパク質工学により合成された天然野生型プロテアーゼの変異体である。例としては、DURAZYM(R)、RELASE（登録商標）、ALCALASE（登録商標）、サビナーゼ（登録商標）、PRIMASE（登録商標）、DURALASE（登録商標）、ESPERASE（登録商標）、OVOZYME（登録商標）、RELASE(R)及びKANNASE（登録商標）（Novozymes A/S）、AXAPEM(R)（Gist-Brocades N.V.）、PURAFECT(R)（Genencor International, Inc.）、MAXATASETM、MAXACALTM、MAXAPEMTM、PROPERASETM、PURAFECTTM、PURAFECT OxPTM、FN２TM、FN３TM及びFN４TM（Genencor International, Inc.）等が挙げられる。
【０００４】
他にも当業界では数々の変異体が報告されている。例えば国際公開第０４／０４１９７９号（NOVOZYMES A/S）は、親サブチラーゼと比べて、例えば洗浄性能、熱安定性、保存安定性又は触媒活性等において改変を示すサブチラーゼ変異体を記載する。これらの変異体は、例えば清浄又は洗剤組成物に適している。
【０００５】
これまで有用なプロテアーゼ変異体が数々報告されており、その多くが種々の洗剤において改善された活性、安定性、溶解性を示す。しかし、様々な要因ゆえに、プロテアーゼの更なる改善が望ましい。温度やｐＨ等について言えば、洗浄条件は変化し続けており、多くの菌株は依然として、従来の洗浄条件下における完全な除去は困難である。よって、プロテアーゼ開発における徹底的な研究にもかかわらず、新規の改良されたプロテアーゼが依然として必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、本発明の目的は、親酵素と比較して改善された性能を有するサブチリシンの変異体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、親サブチリシンの変異体に関する。親サブチリシンは、例えば配列番号１に示すサブチリシンである。
【０００８】
一観点によれば、本発明の変異体は、親サブチリシン、例えば配列番号１に示すサブチリシンと比較して少なくとも１つの改善された特性を有する。前記改善された特性は、例えば、改善された洗浄性能、例えば改善されたしみ除去能力、硬質表面洗浄における改善された洗浄性能、例えば改善された食器洗い性能、改善された安定性、例えば貯蔵又は熱安定性又は改善された触媒活性である。本発明の一観点によれば、変異体は、改善された卵除去能力、例えば硬質表面からゆで卵卵黄の改善された除去能力を有する。
【０００９】
すなわち、本発明の一観点によれば、置換９｛Ｒ，Ｋ，Ｈ｝、１５｛Ｇ，Ａ，Ｓ，Ｔ，Ｍ｝、６８｛Ｇ，Ａ，Ｓ，Ｔ，Ｍ｝、２１８｛Ｄ，Ｓ，Ｇ，Ｖ｝及び２４５｛Ｒ，Ｋ，Ｈ｝を含む、親サブチリシンの変異体に関し、前記変異体はさらに、修飾６１｛Ｄ，Ｅ｝、６２｛Ｄ，Ｅ｝、７６｛Ｄ，Ｅ｝、＊９７ａＧ、９８｛Ｇ，Ｓ｝、９９Ｇ、１０１Ｇ、１２０｛Ｖ，Ｑ，Ｄ｝、１３１｛Ｔ，Ｓ｝、１３７Ｈ、１９４Ｐ、２２８Ｖ、２３０Ｖ、２６１Ｄのうち少なくとも１つを含み、ここで前記位置は配列番号２の成熟ポリペプチド［ＢＰＮ’］の位置に相当する。
【００１０】
一観点によれば、本発明の変異体はさらに、置換Ｇ６１Ｅを含む。
【００１１】
一観点によれば、本発明の変異体はさらに、置換Ａ９８Ｓを含む。
【００１２】
一観点によれば、本発明の変異体はさらに、置換Ｓ９９Ｇを含む。
【００１３】
一観点によれば、本発明の変異体はさらに、次の置換Ｓ９Ｒ、Ａ１５Ｔ、Ｇ６１Ｅ、Ｖ６８Ａ、Ａ９８Ｓ、Ｓ９９Ｇ、Ｎ２１８Ｄ及びＱ２４５Ｒを含む。
【００１４】
一観点によれば、親サブチリシンは、配列番号１に対して少なくとも５０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
【００１５】
別の観点によれば、変異体は、親サブチリシンと比較して改善された１又は２以上の特性を有し、改善された特性は、洗浄性能、安定性、触媒活性及び食器洗い性能を含む。
【００１６】
更なる観点によれば、改善された特性は、改善された洗浄性能、例えば改善されたしみ除去能力、硬質表面洗浄、例えば食器洗浄における改善された洗浄性能、改善された安定性、例えば貯蔵又は熱安定性、又は改善された触媒活性を含む。本発明の一観点によれば、前記変異体は、改善された卵除去能力、例えば硬質表面からゆで卵卵黄の改善された除去能力を有する。
【００１７】
別の観点は、変異体を生成する方法であって、親サブチリシンに対して、以下の置換：
ｉ）位置９の｛Ｒ，Ｋ，Ｈ｝による置換；
ii）位置１５の｛Ｇ，Ａ，Ｓ，Ｔ，Ｍ｝による置換、
iii）位置６８の｛Ｇ，Ａ，Ｓ，Ｔ，Ｍ｝による置換、
iv）位置２４５の｛Ｒ，Ｋ，Ｈ｝による置換、及び
ｖ）位置２１８の｛Ｄ，Ｓ，Ｇ又はＶ｝による置換、
並びに、以下の修飾のうち１又は２以上：
位置６１の｛Ｄ，Ｅ｝による置換、
位置６２の｛Ｄ，Ｅ｝による置換、
位置７６の｛Ｄ，Ｅ｝による置換、
位置９７へのＧの挿入、
位置９８の｛Ｇ，Ｓ｝による置換、
位置９９のＧによる置換、
位置１０１のＧによる置換、
位置１２０の｛Ｖ，Ｑ，Ｄ｝による置換、
位置１３１の｛Ｔ，Ｓ｝による置換、
位置１３７のＨによる置換、
位置１９４のＰによる置換、
位置２２８のＶによる置換、
位置２３０のＶによる置換、及び
位置２６１のＤによる置換（前記位置は配列番号２の成熟ポリペプチド
［ＢＰＮ’］の位置に相当する）、
を導入することによる方法に関する。
【００１８】
本発明の別の観点は、変異体サブチリシンをコードする単離されたポリヌクレオチド、及び前記ポリヌクレオチドを含む核酸コントラクト、ベクター及び宿主細胞に関する。
【００１９】
本発明の一観点は、清浄又は洗剤組成物、好ましくは本発明の変異体を含む洗濯又は食器洗い用組成物に関する。本発明の一観点は、洗剤、例えば洗濯又は食器洗いへの変異体の使用に関する。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
定義
・タンパク分解活性（proteolytic activity）：この用語は、本明細書において、タンパク分解によりタンパク質を分解する（break down）能力をいう。ここでタンパク分解（proteolysis）とは、タンパク質を形成するポリペプチド鎖内のアミノ酸を連結するペプチド結合を加水分解することにより、タンパク質を代謝することをいう。すなわち、タンパク分解活性を有するプロテアーゼによって、タンパク質はアミノ酸に分解される。用語「プロテアーゼ活性」（protease activity）及び「タンパク分解活性」は相互交換可能に用いられる。以下の「プロテアーゼ」の定義も参照。
【００２１】
・変異体：本明細書において「変異体」（variant）とは、１又は２以上（数個）の特定の位置における１又は２以上（数個）のアミノ酸残基の（１又は２以上の）改変又は修飾（例えば置換、挿入及び／又は欠失）を含むポリペプチドとして定義される。改変ポリヌクレオチドは、人間の介入によりポリヌクレオチド配列を修飾して得られる。斯かる変異体としてはサブチリシン変異体、即ち、サブチリシン（subtilisin）（例えば配列番号１に開示されるポリヌクレオチド配列又はその相同配列）の変異体が挙げられる。用語「プロテアーゼ変異体」及び「サブチリシン変異体」は相互交換可能に用いられる。本発明の変異体はプロテアーゼ活性又はタンパク分解活性を有することが好ましい。用語「１又は２以上（one or more）」、「１又は数個（one or several）」、及び、少なくとも１つ（at least one）、は相互交換可能に用いられる。
【００２２】
・修飾：本明細書において「修飾」（modification(s)）とは、サブチラーゼの化学修飾と、親プロテアーゼをコードするＤＮＡの遺伝子操作とを包含するものとして定義される。斯かる修飾としては、（１又は２以上の）アミノ酸側鎖の（１又は２以上の）置換、所望の（１又は２以上の）アミノ酸の（１又は２以上の）置換、欠失及び／又は挿入が挙げられる。
【００２３】
・野生型酵素：「野生型」（wild-type）プロテアーゼ変異体とは、天然微生物（例えば自然界に見られる細菌、酵母又は糸状菌等）により発現されるプロテアーゼ変異体を指す。即ち、斯かるプロテアーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドは、人間の介入によりポリヌクレオチド配列を修飾して得られるものではない。
【００２４】
・親酵素：本明細書において「親」（parent）プロテアーゼ変異体、例えば「親」サブチリシン変異体とは、本発明の酵素変異体を作製するべく修飾（例えば（１又は２以上の）置換、挿入、欠失及び／又は切断）を加える対象となるプロテアーゼ（例えばサブチリシン）を意味する。また、この用語は、変異体の比較・アラインメントの対象となるポリペプチドも意味する。斯かる親としては、天然（野生型）ポリペプチド又は変異体が挙げられる。例えば、斯かる親ポリペプチドとしては、天然ポリペプチドのアミノ酸配列を修飾又は改変した変異体が挙げられる。親は対立遺伝子多型であってもよい。対立遺伝子多型（allelic variant）とは、同一の染色体座を択一的に占める一遺伝子の複数形態の何れかによってコードされるポリペプチドである。
【００２５】
単離変異体又はポリペプチド：本明細書において「単離変異体」（isolated variant）又は「単離ポリペプチド」（isolated polypeptide）とは、出所源から単離された変異体又はポリペプチドを指す。一側面によれば、斯かる変異体又はポリペプチドは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定される純度において、少なくとも１％の純度、好ましくは少なくとも５％の純度、より好ましくは少なくとも１０％の純度、より好ましくは少なくとも２０％の純度、より好ましくは少なくとも４０％の純度、より好ましくは少なくとも６０％の純度、より一層好ましくは少なくとも８０％の純度、最も好ましくは少なくとも９０％の純度を有する。
【００２６】
実質的に純粋な変異体又はポリペプチド：本明細書において「実質的に純粋な変異体」（substantially pure variant）又は「実質的に純粋なポリペプチド」（substantially pure polypeptide）とは、天然又は組換により混在する他のポリペプチド材料の含有率が、重量基準で最大１０％、好ましくは最大８％、より好ましくは最大６％、より好ましくは最大５％、より好ましくは最大４％、より好ましくは最大３％、より一層好ましくは最大２％、最も好ましくは最大１％、とりわけ好ましくは最大０.５％であるポリペプチド調製物を指す。従って、実質的に純粋な変異体又はポリペプチドは、調製物中の総ポリペプチド材料に対して、重量基準で少なくとも９２％の純度、好ましくは少なくとも９４％の純度、より好ましくは少なくとも９５％の純度、より好ましくは少なくとも９６％の純度、より好ましくは少なくとも９６％の純度、より好ましくは少なくとも９７％の純度、より好ましくは少なくとも９８％の純度、より一層好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは少なくとも９９.５％の純度、とりわけ好ましくは１００％の純度を有することが好ましい。本発明の変異体及びポリペプチドは、実質的に純粋な形態であることが好ましい。これは例えば、周知の組換え法や従来の精製法を用いて変異体又はポリペプチドを調製することにより達成される。
【００２７】
・成熟ポリペプチド：本明細書において「成熟ポリペプチド」（mature polypeptide）とは、翻訳及び任意の翻訳後修飾（例えばＮ末端プロセシング、Ｃ末端切断、グリコシル化、リン酸化等）を経た最終形態にある、プロテアーゼ変異体活性を有するポリペプチドとして定義される。一側面によれば、成熟ポリペプチドは、配列番号３又は配列番号４のポリペプチドである。シグナルプログラムSignalIP3.0を用いて成熟ポリペプチドを予測してもよい。
【００２８】
・成熟ポリペプチドコーディング配列：本明細書において「成熟ポリペプチドコーディング配列」（mature polypeptide coding sequence）とは、プロテアーゼ変異体活性を有する成熟ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列として定義される。一側面によれば、成熟ポリペプチドコーディング配列は、配列番号３又は配列番号４をコードするヌクレオチドである。
【００２９】
・同一性：２つのアミノ酸配列間又は２つのヌクレオチド配列間の関連性を、「同一性」（identity）というパラメーターで表す。
【００３０】
本発明の目的においては、２つのアミノ酸配列間の同一性の度合いは、Needleman-Wunsch アルゴリズム（Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443-453）を、EMBOSSパッケージ（EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends in Genetics 16:276-277；http://emboss.org）のNeedleプログラム（好ましくはバージョン３.０.０以降）で実行することにより決定される。任意パラメーターは、ギャップ・オープン・ペナルティー（gap open penalty）が１０、ギャップ・エクステンション・ペナルティー（gap extension penalty）が０.５であり、また、EBLOSUM62（BLOSUM62のEMBOSSバージョン）置換マトリックスを使用する。「最長同一性」（longest identity）と表示されたNeedleの出力値（-nobriefオプションを用いて得られるもの）を％同一性として使用する。これは以下の式に従い算出される。
（同一残基数 × １００）／（アラインメント長 − アラインメント中のギャップ総数）
【００３１】
本発明の目的においては、２つのデオキシリボヌクレオチド配列間の同一性の度合いは、Needleman-Wunsch アルゴリズム（Needleman and Wunsch, 1970、同上）を、EMBOSSパッケージ（EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000、同上；http://emboss.org）のNeedleプログラム（好ましくはバージョン３.０.０以降）で実行することにより決定される。任意パラメーターは、ギャップ・オープン・ペナルティー（gap open penalty）が１０、ギャップ・エクステンション・ペナルティー（gap extension penalty）が０.５であり、また、EDNAFULL（NCBI NUC4.4のEMBOSSバージョン）置換マトリックスを使用する。「最長同一性」（longest identity）と表示されたNeedleの出力値（-nobriefオプションを用いて得られるもの）を％同一性として使用する。これは以下の式に従い算出される。
（同一デオキシリボヌクレオチド数 × １００）／（アラインメント長 − アラインメント中のギャップ総数）
【００３２】
・相同配列：本明細書において「相同配列」（homologous sequence）とは、tfastyサーチ（Pearson, W.R., 1999, in Bioinformatics Methods and Protocols, S. Misener and S. A. Krawetz, ed., pp.185-219）において、ミクロドキウム・ニバレ（Micrododhium nivale）プロテアーゼ変異体CBS 100236とのＥ値（又は予測値：expectancy score）が０.００１未満と予測されるポリペプチドとして定義される。
【００３３】
・ポリペプチド断片：本明細書において「ポリペプチド断片」（polypeptide fragment）とは、成熟ポリペプチドのアミノ及び／又はカルボキシル末端から１又は２以上（数個）のアミノ酸が欠失してなるポリペプチド、又はその相同配列をいう。斯かる断片はプロテアーゼ変異体活性を有する。
【００３４】
・下位配列：本明細書において「下位配列」（subsequence）とは、成熟ポリペプチドコーディング配列の５'及び／又は３'末端から１又は２以上（数個）のヌクレオチドが欠失してなるポリヌクレオチド配列、又はその相同配列をいう。斯かる下位配列はプロテアーゼ変異体活性を有するポリペプチド断片である。
【００３５】
・対立遺伝子多型（対立遺伝子変異体）：本明細書において「対立遺伝子多型（対立遺伝子変異体）」（allelic variant）とは、同一の染色体座を択一的に占める一遺伝子の複数形態の夫々を指す。対立遺伝子変異（allelic variation）は自然界において突然変異により生じる。これにより個体集団内に多型が生じる場合もある。遺伝子の突然変異はサイレントである（コードされるポリペプチドは変化しない）場合もあるが、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列に変化が生じる場合もある。ポリペプチドの対立遺伝子多型とは、遺伝子の対立遺伝子多型によりコードされるポリペプチドである。
【００３６】
・単離ポリヌクレオチド：本明細書において「単離ポリヌクレオチド」（isolated polynucleotide）とは、出所源から単離されたポリヌクレオチドを指す。一側面によれば、斯かる単離ポリヌクレオチドは、アガロース電気泳動により決定される純度において、少なくとも１％の純度、好ましくは少なくとも５％の純度、より好ましくは少なくとも１０％の純度、より好ましくは少なくとも２０％の純度、より好ましくは少なくとも４０％の純度、より好ましくは少なくとも６０％の純度、より一層好ましくは少なくとも８０％の純度、最も好ましくは少なくとも９０％の純度、とりわけ好ましくは少なくとも９５％の純度を有する。
【００３７】
・実質的に純粋なポリヌクレオチド：本明細書において「実質的に純粋なポリヌクレオチド」（substantially pure polynucleotide）とは、他の外因性又は不所望のヌクレオチドを含まず、遺伝子組換えポリペプチド生産系における使用に適した形態にあるポリヌクレオチド調製物を指す。すなわち、実質的に純粋なポリヌクレオチドは、天然又は組換により混在する他のポリペプチド材料の含量が、重量基準で最大１０％、好ましくは最大８％、より好ましくは最大６％、より好ましくは最大５％、より好ましくは最大４％、より好ましくは最大３％、より一層好ましくは最大２％、最も好ましくは最大１％、とりわけ好ましくは最大０.５％である。しかし、実質的に純粋なポリヌクレオチドは、天然の５’及び３’非翻訳領域、例えばプロモーター及びターミネーターを含んでいてもよい。実質的に純粋なポリヌクレオチドは、重量基準で少なくとも９０％の純度、好ましくは少なくとも９２％の純度、より好ましくは少なくとも９４％の純度、より好ましくは少なくとも９５％の純度、より好ましくは少なくとも９６％の純度、より好ましくは少なくとも９７％の純度、より一層好ましくは少なくとも９８％の純度、最も好ましくは少なくとも９９％、とりわけ好ましくは少なくとも９９.５％の純度を有することが好ましい。本発明のポリヌクレオチドは、実質的に純粋な形態であることが好ましい。即ち、天然又は組換により混在する他のポリペプチド材料を本質的に含まないポリヌクレオチド調製物であることが好ましい。斯かるポリヌクレオチドは、ゲノム、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、半合成、合成の何れに由来するものでもよく、これらの任意の組み合わせでもよい。
【００３８】
・コーディング配列：本明細書において使用される場合、「コーディング配列」（coding sequence）とは、そのポリペプチド産物のアミノ酸配列を直接規定するポリヌクレオチドを意味する。コーディング配列の境界は通常、オープン・リーディング・フレーム（open reading frame）により画定される。オープン・リーディング・フレームは通常、ＡＴＧ開始コドン、又はＧＴＧやＴＴＧ等の代替開始コドンから開始し、ＴＡＡ、ＴＡＧ、ＴＧＡ等の停止コドンで停止する。コーディング配列は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成、組換えポリヌクレオチドの何れでもよい。
【００３９】
・ｃＤＮＡ：本明細書において「ｃＤＮＡ」とは、真核細胞から得られるスプライス後の成熟ｍＲＮＡ分子から逆転写により調製されるＤＮＡ分子として定義される。ｃＤＮＡは、対応するゲノムＤＮＡ中に通常存在するイントロン配列を有さない。初期一次ＲＮＡ転写産物がｍＲＮＡの前駆体となり、これが一連の処理工程を経て、最終的にスプライス後の成熟ｍＲＮＡを生じる。これらの工程には、スプライシングと呼ばれるプロセスによるイントロン配列の除去が含まれる。よって、ｍＲＮＡから得られるｃＤＮＡは、イントロン配列を有さない。
【００４０】
・核酸コンストラクト：本明細書において「核酸コンストラクト」（nucleic acid construct）とは、天然遺伝子から単離され、或いは天然では存在しない核酸のセグメントを含むように修飾され、或いは合成された、一本鎖又は二本鎖の核酸分子を指す。核酸コンストラクトが本発明のコーディング配列の発現に必要な調節配列を含む場合、核酸コンストラクトは「発現カセット」（expression cassette）と同義となる。
【００４１】
・調節配列：本明細書において「調節配列」（control sequence）とは、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現に必要な全ての構成要素を含むものとして定義される。各調節配列は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して同種でも外来でもよく、互いに同種でも外来でもよい。斯かる調節配列としては、これらに限定されるものではないが、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、シグナルペプチド配列、及び転写ターミネーターが挙げられる。少なくとも、調節配列はプロモーターと、転写及び翻訳停止シグナルとを含む。特定の制限部位を導入する目的で、調節配列にリンカーを付加してもよい。これにより斯かる調節配列と、ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドのコーディング領域との連結が容易になる。
【００４２】
・作動式に連結され：本明細書において「作動式に連結され」（operably linked）との記載は、ポリペプチドのコーディング配列が調節配列により発現されるように、ポリヌクレオチド配列の調節配列がコーディング配列に対して適切な位置に配置された構成を意味する。
【００４３】
・発現：「発現」（expression）との語は、ポリペプチドの産生に関与する任意のステップを意味する。斯かるステップとしては、これらに制限されるものではないが、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾、及び分泌が挙げられる。
【００４４】
・発現ベクター：本明細書において「発現ベクター」（expression vector）とは、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むとともに、その発現を可能とする更なるヌクレオチドと作動式に連結された、線状又は環状ＤＮＡ分子として定義される。
【００４５】
・宿主細胞：本明細書において「宿主細胞」（host cell）とは、本発明のポリヌクレオチドを含む核酸コンストラクト又は発現ベクターにより形質転換（transformation）、トランスフェクション（transfection）、形質導入（transduction）等が可能な任意の細胞型を含む。「宿主細胞」という語には、親細胞の任意の子孫であって、複製時に生じた突然変異により親細胞とは同一ではなくなったものも含まれる。
【００４６】
・改善された特性：本明細書において「改善された特性」（improved property）とは、変異体に伴う特性であって、親プロテアーゼ変異体と比較して改善されたものをいう。斯かる改善された特性としては、これらに限定されるものではないが、よごれ等の洗浄性能、例えばタンパク質含有よごれに対する性能、よごれ除去、例えば卵汚れの除去、安定性、例えば熱安定性、酸化安定性、化学安定性、ｐＨ安定性、或いは粉末、液体又はゲル上の洗剤処方又は食器洗い組成物中での安定性等が挙げられる。本発明の変異体は、改変された温度依存活性プロファイル、ｐＨ活性、基質特異性、生成物特異性等を有していてもよい。一実施形態によれば、改善された特性としては、改善された食器洗い性能及び改善された安定性、並びに改善された食器洗い性能と改善された安定性との組み合わせ等が挙げられる。一実施形態によれば、改善された特性としては、改善された洗浄又は食器洗い性能、例えばタンパク質性よごれ等の除去、例えば卵汚れ等の除去等が挙げられる。
【００４７】
・洗浄性能：本記載中「洗浄性能」（wash performance）とは、例えば洗浄又は硬表面清浄時に洗浄対象物に存在するタンパク質又は有機物によるよごれを除去する酵素の能力を指すものとして用いられる。洗浄性能の改善は、例えば本明細書実施例３において定義されるいわゆる強度値（intensity value：Int）を算出することにより定量化することができる。本明細書実施例３の洗浄性能試験も参照のこと。洗浄性能と食器洗い性能とは相互交換可能に用いられる。
【００４８】
・改善された洗浄性能：本明細書において「改善された洗浄性能」（improved wash performance）とは、親プロテアーゼ変異体の洗浄性能と比較して、例えばよごれ除去の向上等によるプロテアーゼ変異体の洗浄性能の改変を示す酵素変異体として定義される。「洗浄性能」には洗濯物の洗浄性能の他、例えば食器洗いにおける洗浄性能も含まれる。
【００４９】
・硬表面清浄（hard surface cleaning）：本用語は「食器洗い」（dish wash）を含み、硬物体の清浄、例えば典型的な食器洗いの対象の清浄を指す。斯かる食器洗いの対象としては、これらに制限されるものではないが、皿類、カップ類、グラス類、ボウル類、並びに食事用器具類、例えばスプーン類、ナイフ類、フォーク類、給仕用具類、セラミック類、プラスチック類、金属類、陶器類、ガラス類、及びアクリル類等が挙げられる。
【００５０】
・食器洗い用組成物：「食器洗い用組成物」（dish wash composition）とは、硬表面を清浄するためのあらゆる形態の組成物を指す。本発明は、如何なる種類の食器洗い用組成物にも、又は如何なる特定の洗剤にも限定されない。
【００５１】
・プロテアーゼ（proteases）
タンパク質基質中のアミド結合を開裂する酵素は、プロテアーゼに、或いは（ほぼ同義である）ペプチターゼ（peptitases）に分類される（Walsh, 1979, Enzymatic Reaction Mechanisms. W. H. Freeman and Company, San Francisco, Chapter 3参照）。
【００５２】
アミノ酸の位置／残基の番号付け
別途記載がない限り、本明細書で使用するアミノ酸の番号付けは、サブチラーゼＢＰＮ’（BASBPN）配列の番号に従う。ＢＰＮ’配列の更なる説明は、配列番号２又は Siezen et al., Protein Engng. 4 (1991) 719-737 を参照のこと。
【００５３】
セリンプロテアーゼ
セリンプロテアーゼはペプチド結合の加水分解を触媒する酵素であり、その活性部位には重要なセリン残基が存在する（White, Handler and Smith, 1973 "Principles of Biochemistry," Fifth Edition, McGraw-Hill Book Company, NY, pp.271-272）。
【００５４】
細菌セリンプロテアーゼは、２０，０００から４５，０００ダルトンの範囲の分子質量を有し、ジイソプロピルフルオロリン酸類により阻害される。単純に末端エステルを加水分解し、真核細胞のキモトリプシン、更にはセリンプロテアーゼと同様の活性を有する。サブグループを意味するより狭義の語であるアルカリプロテアーゼは、ｐＨ９．０〜１１．０という高い最適ｐＨを有する一部のセリンプロテアーゼを表す（概説につき、Priest (1977) Bacteriological Rev. 41 711-753 を参照のこと）。
【００５５】
サブチラーゼ
セリンプロテアーゼのサブグループである仮称サブチラーゼは、Siezen et al., Protein Engng. 4 (1991) 719-737 及び Siezen et al., Protein Science 6 (1997) 501-523 により提案された。サブチラーゼは、従前はサブチリシン様プロテアーゼと呼ばれていたセリンプロテアーゼの１７０超のアミノ酸配列のホモロジー分析により定義された。サブチリシンは従前、グラム陽性細菌又は真菌により産生されるセリンプロテアーゼとして定義される場合が多かったが、Siezen et al. によれば、現在はサブチラーゼのサブグループとされている。様々なサブチラーゼが同定され、また、数々のサブチラーゼのアミノ酸配列が決定されてきた。サブチラーゼ及びそのアミノ酸配列のより詳しい解説については、Siezen et al. (1997) を参照のこと。
【００５６】
サブチラーゼのサブグループの一つであるI-S1、別称「真」（true）サブチリシンには、「旧知の」（classical）サブチリシン類、例えばサブチリシン１６８（BSS168）、サブチリシンＢＰＮ’、サブチリシンCarlsberg（ALCALASE（登録商標）、NOVOZYMES A/S）、及びサブチリシンＤＹ（BSSDY）が含まれる。
【００５７】
サブチラーゼの別のサブグループであるI-S2、別称、高アルカリサブチリシンは、Siezen et al. により認められた（同上）。サブグループI-S2 プロテアーゼは、高アルカリ性のサブチリシンとして規定され、例としてはサブチリシンＰＢ９２（BAALKP）（MAXACAL（登録商標）、Genencor International Inc.)、サブチリシン３０９（サビナーゼ（登録商標）、NOVOZYMES A/S）、サブチリシン１４７（BLS147）（ESPERASE（登録商標）、NOVOZYMES A/S)、及びアルカリ性エラスターゼＹａＢ（BSEYAB）等の酵素が挙げられる。
【００５８】
「サビナーゼ（登録商標）」
サビナーゼ（登録商標）は、NOVOZYMES A/Sが販売するＢ．レンタス（B. Lentus）由来のサブチリシン３０９であり、ＢＡＡＬＫＰとの差異は一箇所のみ（Ｎ８７Ｓ）である。サビナーゼ（登録商標）のアミノ酸配列を配列番号１に示す。
【００５９】
親サブチラーゼ
「親サブチラーゼ」（parent subtilaze）という語は、Siezen et al. により定義されるサブチラーゼをいう（１９９１及び１９９７）。更なる詳細については、上記「サブチラーゼ」の欄を参照のこと。親サブチラーゼは、天然物から単離されたサブチラーゼに対して、サブチラーゼの特性を保持しつつ修飾を加えたものであってもよい。更には、例えばJ.E. Ness et al., Nature Biotechnology, 17, 893-896 (1999) 等に記載のＤＮＡシャフリング（DNA shuffling）法により調製されたサブチラーゼであってもよい。
【００６０】
或いは、「親サブチラーゼ」を「野生型サブチラーゼ」（wild type subtilaze）と称する場合もある。
【００６１】
参考のために、本明細書記載の種々のサブチラーゼの同義語を以下の表に示す。更なる同義語については、Siezen et al., Protein Engng. 4 (1991) 719-737 及び Siezen et al, Protein Science 6 (1997) 501-523 を参照のこと。
【００６２】
【表１】
0005947213.tif 000002
【００６３】
サブチラーゼの修飾
本明細書において「修飾」（modification(s)）とは、サブチラーゼの化学修飾に加えて、サブチラーゼをコードするＤＮＡの遺伝子操作をも含むものとして定義される。１又は２以上の修飾としては、１又は２以上のアミノ酸側鎖の１又は２以上の置換、１又は２以上の所望のアミノ酸における１又は２以上の置換、欠失及び／又は挿入が挙げられる。
【００６４】
サブチラーゼ変異体
「変異体」という語及び「サブチラーゼ変異体」という語は上述の通りである。
【００６５】
相同サブチラーゼ配列
本明細書において、２つのアミノ酸配列間のホモロジーは、「同一性」というパラメーターにより記載される。本発明の目的においては、２つのアミノ酸配列間の同一性の程度は、上述の Needleman-Wunsch アルゴリズムを用いて決定される。上記ルーチンにより、アミノ酸アラインメントに加えて、２つの配列間の「％同一性」が出力される。
【００６６】
本明細書に基づき、当業者であれば定型の操作により、本発明に従い修飾し得る適切な相同サブチラーゼを特定することが可能である。
【００６７】
一側面によれば、親プロテアーゼは、配列番号１に対し、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８１％、より好ましくは少なくとも８２％、より好ましくは少なくとも８３％、より好ましくは少なくとも８４％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８６％、より好ましくは少なくとも８７％、より好ましくは少なくとも８８％、より好ましくは少なくとも８９％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、とりわけ好ましくは少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、更には１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００６８】
実質的に相同な親プロテアーゼ変異体は、１又は２以上（数個）のアミノ酸の置換、欠失及び／又は挿入を有していてもよい。本明細書において「１又は２以上」（one or more）と「数個」（several）は相互交換可能に用いられる。これらの変更は軽微なものであることが好ましい。即ち、上述の保存アミノ酸の置換や、タンパク質又はポリペプチドの三次元フォールディング又は活性に実質的な影響を与えないその他の置換；微小な欠失、通常は１から約３０のアミノ酸の欠失；並びに、アミノ末端又はカルボキシル末端の微小な伸長、例えばアミノ末端のメチオニン残基や、最大２０〜２５残基程度の微小なリンカーペプチド、或いは精製を容易にする微小な伸長（アフィニティータグ）、例えばポリヒスチジントラクトやタンパク質Ａ等である（Nilsson et al., 1985, EMBO J. 4:1075；及びNilsson et al., 1991, Methods Enzymol. 198:3。また、概要について、Ford et al., 1991, Protein Expression and Purification 2:95-107 も参照のこと）。
【００６９】
上述の変更は軽微なものであることが好ましいが、斯かる変更は本質的なものであってもよい。例えば、アミノ酸数が最大３００又はそれ以上のより大きなポリペプチドを、アミノ又はカルボキシル末端の双方に連結、伸長してもよい。
【００７０】
親プロテアーゼは、例えば、配列番号１のアミノ酸配列、又はその対立遺伝子多型、又はプロテアーゼ活性を有するその断片を含み、又はこれらの何れかから構成される。一側面によれば、親プロテアーゼは、配列番号１のアミノ酸配列を含み、又は配列番号１のアミノ酸配列から構成される。
【００７１】
サブチラーゼ変異体
本発明は、親サブチラーゼに対し、以下の１又は２以上の特性が改変された新規サブチラーゼ変異体に関する。洗浄性能、例えば改善されたしみの除去能力、硬質表面洗浄、例えば食器洗いにおける洗浄性能、安定性、例えば貯蔵又は熱安定性及び触媒活性。本発明の一観点によれば、前記変異体は、改善された卵除去能力、例えば硬質表面からのゆで卵卵黄の改善された除去能力を有する。
【００７２】
本発明のサブチラーゼ変異体の洗剤組成物における洗浄性能は、洗浄実験により決定することができる。酵素変異体は、実施例３に詳細に説明するように、自動機械負荷分析（Automated Mechanical Stress Assay：ＡＭＳＡ）を用いて試験することができる。
【００７３】
本発明の変異体の触媒活性は、実施例に詳細に説明するように、“Kinetic Suc AAPF-pNA”アッセイを用いて決定することができる。
【００７４】
一態様によれば、本発明の一部として想定される変異体は、親サブチラーゼと比較して１又は２以上のアミノ酸残基が置換、欠失又は挿入されている変異体であって、置換９｛Ｒ，Ｋ，Ｈ｝、１５｛Ｇ，Ａ，Ｓ，Ｔ，Ｍ｝、６８｛Ｇ，Ａ，Ｓ，Ｔ，Ｍ｝、２１８｛Ｄ，Ｓ，Ｇ，Ｖ｝及び２４５｛Ｒ，Ｋ，Ｈ｝を含み、更に修飾６１｛Ｄ，Ｅ｝、６２｛Ｄ，Ｅ｝、７６｛Ｄ，Ｅ｝、＊９７ａＧ、９８｛Ｇ，Ｓ｝、９９Ｇ、１０１Ｇ、１２０｛Ｖ，Ｑ，Ｄ｝、１３１｛Ｔ，Ｓ｝、１３７Ｈ、１９４Ｐ、２２８Ｖ、２３０Ｖ、２６１Ｄのうち少なくとも１つを含む（前記位置は配列番号２の成熟ポリペプチド［ＢＰＮ’］の位置に相当する）。
【００７５】
本発明の一態様によれば、変異体は更に、改変Ｇ６１Ｅ、Ａ９８Ｓ又はＳ９９Ｇのうち少なくとも１つを含む。
【００７６】
本発明の特定の態様によれば、変異体は、置換Ｓ９Ｒ、Ａ１５Ｔ、Ｇ６１Ｅ、Ｖ６８Ａ、Ａ９８Ｓ、Ｓ９９Ｇ、Ｎ２１８Ｄ及びＱ２４５Ｒを含む。
【００７７】
天然由来又は人工多様化合成により得られた酵素の場合も、或いは親サブチラーゼから変異体を設計して産生する場合も、親サブチラーゼはサブグループＩ−Ｓ１又はＩ−Ｓ２、特にサブグループＩ−Ｓ２に属することが好ましい。
【００７８】
サブグループＩ−Ｓ１由来の変異体に関しては、ＢＳＳ１６８（ＢＳＳＡＳ、ＢＳＡＰＲＪ、ＢＳＡＰＲＮ、ＢＭＳＡＭＰ）、ＢＡＳＢＰＮ、ＢＳＳＤＹ、ＢＬＳＣＡＲ（ＢＬＫＥＲＡ、ＢＬＳＣＡ１、ＢＬＳＣＡ２、ＢＬＳＣＡ３）、ＢＳＳＰＲＣ（セリンプロテアーゼＣ）、及びＢＳＳＰＲＤ（セリンプロテアーゼＤ）、或いはサブグループＩ−Ｓ１の特性を保持するその機能的変異体からなる群より選択される親サブチラーゼを選択するのが好ましい。
【００７９】
サブグループＩ−Ｓ由来の変異体に関しては、ＢＳＡＰＲＱ、ＢＬＳ１４７（ＢＳＡＰＲＭ、ＢＡＨ１０１）、ＢＬＳＡＶＩ（ＢＳＫＳＭＫ、ＢＡＡＬＫＰ、ＢＬＳＵＢＬ）、ＢＹＳＹＡＢ、ＢＡＰＢ９２、ＴＶＴＨＥＲ、及びＢＳＡＰＲＳ、或いはサブグループＩ−Ｓ２の特性を保持するその機能的変異体からなる群より選択される親サブチラーゼを選択するのが好ましい。
【００８０】
例えば、親サブチラーゼはＢＬＳＡＶＩ（サビナーゼ（登録商標）、NOVOZYMES A/S）であり、従って本発明の好ましいサブチラーゼ変異体は、サビナーゼ（登録商標）（配列番号１）の変異体である。
【００８１】
変異体の設計上の規約
本発明の目的においては、配列番号２に記載のＢＰＮ’のアミノ酸配列を用いて、別のプロテアーゼ又はプロテアーゼ変異体の対応するアミノ酸残基を決定する。別のプロテアーゼ又はプロテアーゼ変異体のアミノ酸配列を、配列番号２に開示のプロテアーゼのアミノ酸配列とアラインし、このアラインメントに基づいて、配列番号２に開示のプロテアーゼ変異体のアミノ酸配列における任意のアミノ酸残基に対応するアミノ酸位置の番号を決定することができる。
【００８２】
ポリペプチド配列のアラインメントは、例えば「ClustalW」を用いて実施することができる（Thompson, J.D., Higgins, D.G. and Gibson, T.J., 1994, CLUSTAL W:Improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, sites-specific gap penalties and weight matrix choice, Nucleic Acids Research 22:4673-4680）。ＤＮＡ配列のアラインメントは、例えば、ポリペプチドアラインメントをテンプレートとして用い、アミノ酸をＤＮＡ配列の対応するコドンに置き換えることにより実施される。
【００８３】
配列同一性がおよそ２０〜３０％を超えない程度のポリペプチド配列間の類似性を検出するには、常用の配列対比較アルゴリズムで十分である（Doolittle, 1992, Protein Sci. 1:191-200; Brenner et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 6073-6078）。しかし、同程度且つ同様の生物学的機能を有する真に相同なポリペプチドであっても、従来の配列に基づく比較ではその関連性を検出できない程度にまで分化したものも多々存在する（Lindahl and Elofsson, 2000, J. Mol. Biol. 295:613-615）。ポリペプチドファミリー（プロファイル）の確率的表現を用いてデータベースを検索する検索プログラムを用いることにより、より高い感度で配列に基づく検索を行うことができる。例えば、PSI-BLAST プログラムは、反復データベース検索プロセスを通じてプロファイルを生成するもので、遠縁のホモログを検出することが可能である（Atschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402）。着目するポリペプチドのファミリー又はスーパーファミリーが１又は２以上（数個）の表現がタンパク質構造データベースに存在する場合には、更に高い感度が達成可能である。例えばGenTHREADER（Jones 1999, J. Mol. Biol. 287:797-815; McGuffin and Jones, 2003, Bioinformatics 19:874-881）等のプログラムは、種々のソース由来の情報（PSI-BLAST、二次構造予測（secondary structure prediction）、構造アラインメントプロファイル（structural alignment profiles）、及び溶媒和ポテンシャル（solvation potentials））をニューラルネットワークに入力し、クエリー配列の折り畳み構造を予測する。同様に、Gough et al., 2000, J. Mol. Biol. 313:903-919 の方法を用いれば、未知の構造の配列を SCOP データベースに存在するスーパーファミリーモデルとアラインすることができる。これらのアラインメントを用いれば、更に着目するポリペプチドのホモロジーを生成することができる。斯かるモデルの精度を検証するには、その目的で開発された種々のツールを用いればよい。
【００８４】
構造既知のタンパク質の場合、構造的アラインメントの検索及び生成に、幾つかのツールやリソースが利用できる。例えばタンパク質の SCOP スーパーファミリーは構造的にアラインメントがなされており、斯かるアラインメントはアクセス及びダウンロード可能である。２以上のタンパク質構造のアラインメントには、種々のアルゴリズム、例えばディスタンス・アラインメント・マトリックス（distance alignment matrix）（Holm and Sander, 1998, Proteins 33:88-96）又はコンビナトリアル・エクステンション（combinatorial extension）（Shindyalov and Bourne, 1998, Protein Eng. 11:739-747）が使用できる。更には、これらのアルゴリズムを実行し、着目する構造について構造データベースにクエリーすれば、可能性のある構造的ホモログを発見することも可能である（例えば Holm and Park, 2000, Bioinformatics 16:566-567）。これらの構造的アラインメントを用いて、同一の構造的スーパーファミリーに属するタンパク質中の、構造的及び機能的に対応するアミノ酸残基を予測することもできる。斯かる情報を、ホモロジーモデリング及びプロファイル検索から得られた情報と組み合わせれば、所望の突然変異によりあるタンパク質を近縁又は遠縁のホモログに移行させるためには、どの残基を変異させればよいかを予測することが可能となる。
【００８５】
本発明の種々のプロテアーゼ変異体を記述するにあたり、参照の便宜のため、以下に記載の命名法を採用する。いずれの場合も、アミノ酸の略称としては、周知のＩＵＰＡＣによる１文字又は３文字の略称を用いる。
【００８６】
本発明に従って製造又は設計される種々のサブチラーゼ酵素変異体を記述するに当たり、参照の便宜のため、以下の命名法及び規約を採用する。
【００８７】
基準系は、単離酵素又は親酵素を最初に上述のサブチリシンＢＰＮ’（BASBPN）配列番号２とアラインすることにより定義する。
【００８８】
親プロテアーゼ変異体
置換  アミノ酸置換については、以下の命名法を使用する：原アミノ酸、位置、置換アミノ酸。従って、位置２２６におけるスレオニンのアラニンによる置換は、「Ｔｈｒ２２６Ａｌａ」又は「Ｔ２２６Ａ」と表す。多重突然変異については、例えば加算記号（「＋」）により区切って表記する。例えば「Ｇｌｙ２０５Ａｒｇ＋Ｓｅｒ４１１Ｐｈｅ」又は「Ｇ２０５Ｒ＋Ｓ４１１Ｆ」は、位置２０５のグリシン（Ｇ）をアルギニン（Ｒ）に置換し、位置４１１のセリン（Ｓ）のフェニルアラニン（Ｆ）に置換する突然変異を表す。或いは、多重突然変異をスペースで区切り、例えばＧ２０５Ｒ  Ｓ４１１Ｆのように表記し、又はカンマ（，）で区切り、例えばＧ２０５Ｒ，Ｓ４１１Ｆのように表記してもよい。
【００８９】
欠失  アミノ酸欠失については、以下の命名法を使用する：原アミノ酸、位置＊。従って、位置１９５におけるグリシンの欠失は、「Ｇｌｙ１９５＊」又は「Ｇ１９５＊」と表す。多重欠失については、置換の場合と同様に、例えばカンマ（，）で区切り、「Ｇｌｙ１９５＊、Ｓｅｒ４１１＊」又は「Ｇ１９５＊、Ｓ４１１＊」のように表記すればよい。
【００９０】
挿入  アミノ酸挿入については、以下の命名法を使用する：原アミノ酸、位置、原アミノ酸、新たに挿入されるアミノ酸。従って、位置１９５のグリシンの後へのリシンの挿入は、「Ｇｌｙ１９５ＧｌｙＬｙｓ」又は「Ｇ１９５ＧＫ」又は「＊１９５ａＫ」と表す。アミノ酸の多重挿入は、［原アミノ酸、位置、原アミノ酸、新たに挿入されるアミノ酸＃１、新たに挿入されるアミノ酸＃２；等］と表す。例えば、位置１９５のグリシンの後にリシン及びアラニンを挿入する場合、「Ｇｌｙ１９５ＧｌｙＬｙｓＡｌａ」又は「Ｇ１９５ＧＫＡ」と表す。
【００９１】
斯かる場合において、挿入される（１又は２以上の）アミノ酸残基の番号付けは、挿入される（１又は２以上の）アミノ酸残基に先立つアミノ酸残基の位置番号に対し、小文字を付加することにより行う。すなわち、上記例の場合、配列は以下のようになる。
【表２】
0005947213.tif 000003
【００９２】
親プロテアーゼ変異体は、任意の材料から取得できる。例としては微生物材料、例えば真菌、例えば糸状菌又は酵母が挙げられる。或いは、既知の核酸又はアミノ酸配列情報から調製した人工配列でもよい。
【００９３】
斯かる菌株は、American Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zelikulturen GmbH（ＤＳＭ）及びCentraalbureau Voor Schimmelcultures（ＣＢＳ）等の菌株保存機関から、一般に容易に入手可能である。
【００９４】
本発明の一側面によれば、親サブチリシンは、配列番号１に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
【００９５】
本発明の一側面によれば、親プロテアーゼは、配列番号１に対するアミノ酸配列同一性が、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８１％、より好ましくは少なくとも８２％、より好ましくは少なくとも８３％、より好ましくは少なくとも８４％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８６％、より好ましくは少なくとも８７％、より好ましくは少なくとも８８％、より好ましくは少なくとも８９％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、最も好ましくは少なくとも９５％、とりわけ好ましくは少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、更には１００％であるアミノ酸配列を含む。
【００９６】
別の側面によれば、親プロテアーゼは、配列番号１に対するアミノ酸配列同一性が好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８１％、より好ましくは少なくとも８２％、より好ましくは少なくとも８３％、より好ましくは少なくとも８４％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８６％、より好ましくは少なくとも８７％、より好ましくは少なくとも８８％、より好ましくは少なくとも８９％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、最も好ましくは少なくとも９５％、とりわけ好ましくは少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、更には１００％であり、プロテアーゼ活性を有するアミノ酸配列を含む。
【００９７】
本発明の一側面によれば、変異体は、配列番号１との差異が３０アミノ酸、２９アミノ酸、２８アミノ酸、２７アミノ酸、２６アミノ酸、２５アミノ酸、２４アミノ酸、２３アミノ酸、２２アミノ酸、２１アミノ酸、２０アミノ酸、１９アミノ酸、１８アミノ酸、１７アミノ酸、１６アミノ酸、１５アミノ酸、１４アミノ酸、１３アミノ酸、１２アミノ酸、１１アミノ酸、１０アミノ酸、９アミノ酸、８アミノ酸、７アミノ酸、６アミノ酸、５アミノ酸、４アミノ酸、３アミノ酸、２アミノ酸、又は１アミノ酸であるアミノ酸配列を有する。
【００９８】
本発明の特定の側面によれば、本発明の変異体は、配列番号１との差異が１２アミノ酸、より好ましくは１１アミノ酸、より好ましくは１０アミノ酸、より一層好ましくは９アミノ酸、最も好ましくは８アミノ酸であるアミノ酸配列を有する。
【００９９】
一側面によれば、親（例えば配列番号１に示すアミノ酸配列を有する親プロテアーゼ変異体）との比較における、本発明の変異体中のアミノ酸改変の数は、２０改変、１９改変、１８改変、１７改変、１６改変、１５改変、１４改変、１３改変、１２改変、１１改変、１０改変、９改変、８改変、７改変、６改変、５改変、４改変、より好ましくは３改変、より一層好ましくは２改変、最も好ましくは１改変からなり、或いはこれらを含む。別の側面によれば、本発明の変異体中のアミノ酸改変の数は、好ましくは２０改変、１９改変、１８改変、１７改変、１６改変、１５改変、１４改変、１３改変、１２改変、１１改変、１０改変、９改変、８改変、７改変、６改変、５改変、４改変、３改変、２改変、又は１改変からなる。
【０１００】
一側面によれば、親（例えば配列番号１に示すアミノ酸配列を有する親プロテアーゼ変異体）との比較における、本発明の変異体中のアミノ酸改変の数は、２０置換、１９置換、１８置換、１７置換、１６置換、１５置換、１４置換、１３置換、１２置換、１１置換、１０置換、９置換、８置換、７置換、６置換、５置換、４置換、より好ましくは３置換、より一層好ましくは２置換、最も好ましくは１置換からなり、或いはこれらを含む。別の側面によれば、本発明の変異体中のアミノ酸改変の数は、２０置換、１９置換、１８置換、１７置換、１６置換、１５置換、１４置換、１３置換、１２置換、１１置換、１０置換、９置換、８置換、７置換、６置換、５置換、４置換、３置換、２置換、又は１置換からなる。
【０１０１】
一側面によれば、変異体は、配列番号１に対するアミノ酸配列同一性が好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８１％、より好ましくは少なくとも８２％、より好ましくは少なくとも８３％、より好ましくは少なくとも８４％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８６％、より好ましくは少なくとも８７％、より好ましくは少なくとも８８％、より好ましくは少なくとも８９％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、最も好ましくは少なくとも９５％、とりわけ好ましくは少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、更には１００％であるアミノ酸配列を含む。
【０１０２】
一側面によれば、変異体は、配列番号１に対するアミノ酸配列同一性が好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８１％、より好ましくは少なくとも８２％、より好ましくは少なくとも８３％、より好ましくは少なくとも８４％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８６％、より好ましくは少なくとも８７％、より好ましくは少なくとも８８％、より好ましくは少なくとも８９％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、最も好ましくは少なくとも９５％、とりわけ好ましくは少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、更には１００％であり、プロテアーゼ活性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１０３】
一側面によれば、本発明は、配列番号３のアミノ酸配列又はその対立遺伝子多型、又はプロテアーゼ変異体活性を有するその断片等からなり、或いはこれを含む変異体の使用に関する。一側面によれば、斯かる変異体は、配列番号３のアミノ酸配列からなり、或いはこれを含む。別の側面によれば、本発明は、配列番号３のアミノ酸配列、又は対立遺伝子多型からなり、或いはこれを含む変異体の硬表面清浄における使用に関する。更に、本発明は、タンパク質性の汚れ、特にゆで卵による汚れを、硬表面又は洗濯物布地から除去する方法であって、卵よごれを含む硬表面又は卵よごれを含む洗濯物布地を、配列番号３のアミノ酸配列又はその対立遺伝子多型からなり、或いはこれを含むサブチリシン変異体を含む清浄又は洗剤組成物、好ましくは洗濯又は食器洗い用組成物に接触させることを含む方法にも関する。
【０１０４】
一側面によれば、変異体は、配列番号３に対するアミノ酸配列同一性が好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８１％、より好ましくは少なくとも８２％、より好ましくは少なくとも８３％、より好ましくは少なくとも８４％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８６％、より好ましくは少なくとも８７％、より好ましくは少なくとも８８％、より好ましくは少なくとも８９％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、最も好ましくは少なくとも９５％、とりわけ好ましくは少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、更には１００％であるアミノ酸配列を含む。
【０１０５】
一側面によれば、変異体は、配列番号３に対するアミノ酸配列同一性が好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８１％、より好ましくは少なくとも８２％、より好ましくは少なくとも８３％、より好ましくは少なくとも８４％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８６％、より好ましくは少なくとも８７％、より好ましくは少なくとも８８％、より好ましくは少なくとも８９％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、最も好ましくは少なくとも９５％、とりわけ好ましくは少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、更には１００％であり、プロテアーゼ活性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１０６】
一側面によれば、変異体は、配列番号３との差異が３０アミノ酸、２９アミノ酸、２８アミノ酸、２７アミノ酸、２６アミノ酸、２５アミノ酸、２４アミノ酸、２３アミノ酸、２２アミノ酸、２１アミノ酸、２０アミノ酸、１９アミノ酸、１８アミノ酸、１７アミノ酸、１６アミノ酸、１５アミノ酸、１４アミノ酸、１３アミノ酸、１２アミノ酸、１１アミノ酸、１０アミノ酸、９アミノ酸、８アミノ酸、７アミノ酸、６アミノ酸、５アミノ酸、４アミノ酸、３アミノ酸、２アミノ酸、又は１アミノ酸であるアミノ酸配列を有する。
【０１０７】
一側面によれば、本発明は、配列番号４のアミノ酸配列又はその対立遺伝子多型、又はプロテアーゼ変異体活性を有するその断片等からなり、或いはこれを含む変異体の使用に関する。一側面によれば、斯かる変異体は、配列番号４のアミノ酸配列からなり、或いはこれを含む。別の側面によれば、本発明は、配列番号４のアミノ酸配列、又は対立遺伝子多型からなり、或いはこれを含む変異体の硬表面清浄における使用に関する。更に、本発明は、タンパク質性の汚れ、特にゆで卵による汚れを、硬表面又は洗濯物布地から除去する方法であって、卵よごれを含む硬表面又は卵よごれを含む洗濯物布地を、配列番号４のアミノ酸配列又はその対立遺伝子多型からなり、或いはこれを含むサブチリシン変異体を含む清浄又は洗剤組成物、好ましくは洗濯又は食器洗い用組成物に接触させることを含む方法にも関する。
【０１０８】
一側面によれば、変異体は、配列番号４に対するアミノ酸配列同一性が好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８１％、より好ましくは少なくとも８２％、より好ましくは少なくとも８３％、より好ましくは少なくとも８４％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８６％、より好ましくは少なくとも８７％、より好ましくは少なくとも８８％、より好ましくは少なくとも８９％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、最も好ましくは少なくとも９５％、とりわけ好ましくは少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、更には１００％であるアミノ酸配列を含む。
【０１０９】
一側面によれば、変異体は、配列番号４に対するアミノ酸配列同一性が好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８１％、より好ましくは少なくとも８２％、より好ましくは少なくとも８３％、より好ましくは少なくとも８４％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８６％、より好ましくは少なくとも８７％、より好ましくは少なくとも８８％、より好ましくは少なくとも８９％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、最も好ましくは少なくとも９５％、とりわけ好ましくは少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、更には１００％であり、プロテアーゼ活性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１１０】
一側面によれば、変異体は、配列番号４との差異が３０アミノ酸、２９アミノ酸、２８アミノ酸、２７アミノ酸、２６アミノ酸、２５アミノ酸、２４アミノ酸、２３アミノ酸、２２アミノ酸、２１アミノ酸、２０アミノ酸、１９アミノ酸、１８アミノ酸、１７アミノ酸、１６アミノ酸、１５アミノ酸、１４アミノ酸、１３アミノ酸、１２アミノ酸、１１アミノ酸、１０アミノ酸、９アミノ酸、８アミノ酸、７アミノ酸、６アミノ酸、５アミノ酸、４アミノ酸、３アミノ酸、２アミノ酸、又は１アミノ酸であるアミノ酸配列を有する。
【０１１１】
実質的に相同な変異体は、１又は２以上のアミノ酸置換、欠失及び／又は挿入を有していてもよい。これらの変更は軽微なものであることが好ましい。即ち、上述の保存アミノ酸の置換や、タンパク質又はポリペプチドの三次元フォールディング又は活性に実質的な影響を与えないその他の置換；微小な欠失、通常は１から約３０のアミノ酸の欠失；並びに、アミノ末端又はカルボキシル末端の微小な伸長、例えばアミノ末端のメチオニン残基や、最大２０〜２５残基程度の微小なリンカーペプチド、或いは精製を容易にする微小な伸長（アフィニティータグ）、例えばポリヒスチジントラクトやタンパク質Ａ等である（Nilsson et al., 1985, EMBO J. 4:1075；及びNilsson et al., 1991, Methods Enzymol. 198:3。また、概要について、Ford et al., 1991, Protein Expression and Purification 2:95-107 も参照のこと）。
【０１１２】
上述の変更は軽微なものであることが好ましいが、斯かる変更は本質的なものであってもよい。例えば、アミノ酸数が最大３００又はそれ以上のより大きなポリペプチドを、アミノ又はカルボキシル末端の双方に連結、伸長してもよい。
【０１１３】
変異体の調製
親プロテアーゼの変異体は、当業界で周知の任意の突然変異誘発法、例えば部位特異的突然変異誘発法、合成遺伝子構築法、半合成遺伝子構築法、ランダム突然変異誘発法、シャッフリング等を用いて調製可能である。
【０１１４】
部位特異的突然変異誘発法（site-directed mutanogenesis）は、親プロテアーゼ変異体をコードするポリヌクレオチド分子内の所定の部位に１又は数個の突然変異を形成する手法である。インビトロ（in vitro）でもインビボ（in vivo）でも実施可能である。
【０１１５】
合成遺伝子構築法（synthetic gene construction）は、所望のポリペプチド分子をコードするポリヌクレオチド分子を設計し、これをインビトロで合成するものである。遺伝子合成は数々の手法を用いて実施可能である。例としては、Tian, et. al.が報告する多重マイクロチップ法（multiplex microchip-based technology）（Tian, et. al., Nature 432:1050-1054）や、類似の手法が挙げられる。これらの手法は、光プログラム可能なマイクロ流体チップ上で、オリゴヌクレオチドを合成、構築するものである。
【０１１６】
部位特異的突然変異誘発法は、所望の突然変異を含むオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲにより、インビトロで実施可能である。また、親プロテアーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミド内の部位を制限酵素で切断し、次いで当該ポリヌクレオチド中に所望の突然変異を含むオリゴヌクレオチドを連結する工程を含むカセット突然変異誘発法によっても、部位特異的突然変異誘発法をインビトロで実施することができる。通常、プラスミド及びオリゴヌクレオチドを同一の制限酵素で消化することにより、プラスミド及び挿入物の付着末端を互いに連結することが可能となる。例えばScherer and Davis, 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:4949-4955；及び Barton et al., 1990, Nucleic Acids Research 18:7349-4966 等を参照のこと。
【０１１７】
部位特異的突然変異誘発法は、当業界で周知の任意の手法により、インビボでも実施可能である。例えば、米国特許出願第２００４/０１７１１５４号；Storici et al., 2001, Nature Biotechnology 19:773-776； Kren et al., 1998, Nat. Med. 4: 285-290；及び Calissano and Macino, 1996, Fungal Genet. Newslett. 43:15-16 等を参照のこと。
【０１１８】
本発明では任意の部位特異的突然変異誘発法を使用できる。親プロテアーゼ変異体の変異体の調製に使用し得るキットは多々市販されている。
【０１１９】
単一又は多重のアミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入を形成・検証するには、公知の突然変異誘発法、組換え、及び／又はシャッフリングを用いた後、適切なスクリーニング法、例えば Reidhaar-Olson and Sauer, 1988, Science 241:53-57；Bowie and Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2152-2156；国際公開第９５／１７４１３号；又は国際公開第９５／２２６２５号等に開示の手法を用いればよい。他の使用可能な方法としては、error-pr1 ＰＣＲ、ファージ・ディスプレイ（phage display）（例えば Lowman et al., 1991, Biochem. 30:10832-10837；米国特許第５，２２３，４０９号；国際公開第９２／０６２０４号等）及び領域特異的突然変異誘発法（Derbyshire et al., 1986, Gene 46:145；Ner et al., 1988, DNA 7:127）等が挙げられる。
【０１２０】
突然変異誘発法／シャッフリング法をハイスループット自動スクリーニング法と組み合わせることにより、宿主細胞により発現されるクローン化突然変異ポリペプチドの活性を検出することが可能となる。当業界の標準法により、活性ポリペプチドをコードする突然変異ＤＮＡ分子を宿主細胞から回収し、即時に配列決定することができる。これらの手法により、着目するポリペプチドにおける個々のアミノ酸残基の重要性を、迅速に決定することが可能となる。
【０１２１】
半合成遺伝子構築法（semi-synthetic gene construction）は、合成遺伝子構築法、及び／又は部位特異的突然変異誘発法、及び／又はランダム突然変異誘発法、及び／又はシャッフリングの態様を組み合わせることにより実施される。半合成構築法の代表的なプロセスは、合成ポリヌクレオチド断片をＰＣＲ法と組み合わせたものである。すなわち、例えば遺伝子の所定の領域を新規合成し、他の領域は部位特異的突然変異プライマー等を用いて増幅し、更に別の領域についてはerror-pr1 ＰＣＲ や non-error-pr1 ＰＣＲ増幅等を用いることができる。その後、ポリヌクレオチド断片をシャッフルしてもよい。
【０１２２】
本発明の別の側面は、変異体を生成する方法であって、親サブチリシン中に、以下の置換：
ｉ）位置９の｛Ｒ，Ｋ，Ｈ｝による置換；
ii）位置１５の｛Ｇ，Ａ，Ｓ，Ｔ，Ｍ｝による置換、
iii）位置６８の｛Ｇ，Ａ，Ｓ，Ｔ，Ｍ｝による置換、
iv）位置２４５の｛Ｒ，Ｋ，Ｈ｝による置換、及び
ｖ）位置２１８の｛Ｄ，Ｓ，Ｇ又はＶ｝による置換、
並びに、以下の修飾のうち１又は２以上：位置６１の｛Ｄ，Ｅ｝による置換、位置６２の｛Ｄ，Ｅ｝による置換、位置７６の｛Ｄ，Ｅ｝による置換、位置９７へのＧの挿入、位置９８の｛Ｇ，Ｓ｝による置換、位置９９のＧによる置換、位置１０１のＧによる置換、位置１２０の｛Ｖ，Ｑ，Ｄ｝による置換、位置１３１の｛Ｔ，Ｓ｝による置換、位置１３７のＨによる置換、位置１９４のＰによる置換、位置２２８のＶによる置換、位置２３０のＶによる置換、及び位置２６１のＤによる置換（前記位置は配列番号２の成熟ポリペプチド［ＢＰＮ’］の位置に相当する）、を導入することによる方法に関する。
【０１２３】
一側面によれば、前記方法は、位置９、１５、６８、２１８及び２４５に相当する位置での置換を含む。別の側面によれば、前記方法は、９、１５、６８、２１８及び２４５に相当する位置でのＲ、Ｋ、Ｈ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｅ又はＤによる置換を含む。別の側面によれば、前記方法は、それぞれ、位置９、１５、６８、２１８及び２４５に相当する位置でのＲ、Ｔ、Ａ、Ｄ及びＲの置換を含む。別の側面によれば、前記方法は、配列番号１の成熟ポリペプチド中へのＳ９Ｒ、Ａ１５Ｔ、Ｖ６８Ａ、Ｎ２１８Ｄ及びＱ２４５Ｒの置換を含む。
【０１２４】
一側面によれば、前記方法は、位置９、１５、６８、１２０、２１８及び２４５に相当する位置での置換を含む。別の側面によれば、前記方法は、９、１５、６８、１２０、２１８及び２４５に相当する位置でのＲ、Ｋ、Ｈ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｅ又はＤによる置換を含む。別の側面によれば、前記方法は、それぞれ、位置９、１５、６８、１２０、２１８及び２４５に相当する位置でのＲ、Ｔ、Ａ、Ｖ、Ｄ及びＲの置換を含む。別の側面によれば、前記方法は、配列番号１の成熟ポリペプチド中へのＳ９Ｒ、Ａ１５Ｔ、Ｖ６８Ａ、Ｈ１２０Ｖ、Ｎ２１８Ｄ及びＱ２４５Ｒの置換を含む。
【０１２５】
一側面によれば、前記方法は、位置９、１５、６８、１２０、２１８及び２４５に相当する位置での置換を含む。別の側面によれば、前記方法は、９、１５、６８、１２０、２１８及び２４５に相当する位置でのＱ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｅ又はＤによる置換を含む。別の側面によれば、前記方法は、それぞれ、位置９、１５、６８、１２０、２１８及び２４５に相当する位置でのＲ、Ｔ、Ａ、Ｑ、Ｄ及びＲの置換を含む。別の側面によれば、前記方法は、配列番号１の成熟ポリペプチド中へのＳ９Ｒ、Ａ１５Ｔ、Ｖ６８Ａ、Ｈ１２０Ｑ、Ｎ２１８Ｄ及びＱ２４５Ｒの置換を含む。
【０１２６】
一側面によれば、前記方法は、位置９、１５、６８、７６、２１８及び２４５に相当する位置での置換を含む。別の側面によれば、前記方法は、９、１５、６８、２１８及び２４５に相当する位置でのＲ、Ｋ、Ｈ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｅ又はＤによる置換を含む。別の側面によれば、前記方法は、それぞれ、位置９、１５、６８、７６、２１８及び２４５に相当する位置でのＲ、Ｔ、Ａ、Ｄ、Ｄ及びＲの置換を含む。別の側面によれば、前記方法は、配列番号１の成熟ポリペプチド中へのＳ９Ｒ、Ａ１５Ｔ、Ｖ６８Ａ、Ｎ７６Ｄ、Ｎ２１８Ｄ及びＱ２４５Ｒの置換を含む。
【０１２７】
一側面によれば、前記方法は、位置９、１５、６１、６８、２１８及び２４５に相当する位置での置換を含む。別の側面によれば、前記方法は、９、１５、６１６８、２１８及び２４５に相当する位置でのＲ、Ｋ、Ｈ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｅ又はＤによる置換を含む。別の側面によれば、前記方法は、それぞれ、位置９、１５、６１、６８、２１８及び２４５に相当する位置でのＲ、Ｔ、Ｅ、Ａ、Ｄ及びＲの置換を含む。別の側面によれば、前記方法は、配列番号１の成熟ポリペプチド中へのＳ９Ｒ、Ａ１５Ｔ、Ｇ６１Ｅ、Ｖ６８Ａ、Ｎ２１８Ｄ及びＱ２４５Ｒの置換を含む。
【０１２８】
一側面によれば、前記方法は、位置９、１５、６１、６８、９８、２１８及び２４５に相当する位置での置換を含む。別の側面によれば、前記方法は、９、１５、６１、６８、９８、２１８及び２４５に相当する位置でのＲ、Ｋ、Ｈ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｅ又はＤによる置換を含む。別の側面によれば、前記方法は、それぞれ、位置９、１５、６１、６８、９８、２１８及び２４５に相当する位置でのＲ、Ｔ、Ｅ、Ａ、Ｓ、Ｄ及びＲの置換を含む。別の側面によれば、前記方法は、配列番号１の成熟ポリペプチド中へのＳ９Ｒ、Ａ１５Ｔ、Ｇ６１Ｅ、Ｖ６８Ａ、Ａ９８Ｓ、Ｎ２１８Ｄ及びＱ２４５Ｒの置換を含む。
【０１２９】
一側面によれば、前記方法は、位置９、１５、６１、６８、９８、９９、２１８及び２４５に相当する位置での置換を含む。別の側面によれば、前記方法は９、１５、６１、６８、９８、９９、２１８及び２４５に相当する位置でのＲ、Ｋ、Ｈ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｅ又はＤによる置換を含む。別の側面によれば、前記方法は、それぞれ、位置９、１５、６１、６８、９８、９９、２１８及び２４５に相当する位置でのＲ、Ｔ、Ｅ、Ａ、Ｓ、Ｇ、Ｄ及びＲの置換を含む。別の側面によれば、前記方法は、配列番号１の成熟ポリペプチド中へのＳ９Ｒ、Ａ１５Ｔ、Ｇ６１Ｅ、Ｖ６８Ａ、Ａ９８Ｓ、Ｓ９９Ｇ、Ｎ２１８Ｄ及びＱ２４５Ｒの置換を含む。
【０１３０】
ある特定の側面は、親サブチリシンに対して、下記の置換：
ｉ）位置９のＳのＲによる置換、
ii）位置１５のＡのＴによる置換、
iii）位置６８のＶのＡによる置換、
iv）位置２４５のＱのＲによる置換、及び
ｖ）位置２１８のＮのＤ、Ｓ、Ｇ又はＶによる置換、
並びに、以下の修飾のうち１又は２以上：
位置６１のＧのＥによる置換、位置６２のＮのＤによる置換、位置７６のＮのＤによる置換、位置９７へのＧの挿入、位置９８のＡのＳによる置換、位置９９のＳのＧによる置換、位置１０１のＳのＧによる置換、位置１２０のＨのＤ、Ｖ又はＱによる置換、位置１３１のＰのＴによる置換、位置１３９のＱのＨによる置換、位置１９４のＡのＰによる置換、位置２２８のＡのＶによる置換、位置２３０のＡのＶによる置換、及び位置２６１のＮのＤによる置換、を導入する方法に関する。
【０１３１】
変異体：
一側面によれば、本発明は、置換９｛Ｒ，Ｋ，Ｈ｝、１５｛Ｇ，Ａ，Ｓ，Ｔ，Ｍ｝、６８｛Ｇ，Ａ，Ｓ，Ｔ，Ｍ｝、２１８｛Ｄ，Ｓ，Ｇ，Ｖ｝及び２４５｛Ｒ，Ｋ，Ｈ｝、並びに次の修飾：６１｛Ｄ，Ｅ｝、６２｛Ｄ，Ｅ｝、７６｛Ｄ，Ｅ｝、＊９７ａＧ、９８｛Ｇ，Ｓ｝、９９Ｇ、１０１Ｇ、１２０｛Ｖ，Ｑ，Ｄ｝、１３１｛Ｔ，Ｓ｝、１３７Ｈ、１９４Ｐ、２２８Ｖ、２３０Ｖ、２６１Ｄのうち少なくとも１つを含む、親サブチラーゼの変異体に関する（前記位置は配列番号２の成熟ポリペプチド［ＢＰＮ’］の位置に相当する）。
【０１３２】
一側面によれば、変異体は、位置９に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置９に対応する位置に、Ｒ、Ｋ又はＨによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置９に対応する位置に、Ｒによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対し、置換Ｓ９Ｒを含む。
【０１３３】
一側面によれば、変異体は、位置１５に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置１５に対応する位置に、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ又はＭによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置１５に対応する位置に、Ｔによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対し、置換Ａ１５Ｔを含む。
【０１３４】
一側面によれば、変異体は、位置６１に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、６１に対応する位置に、Ｅ又はＤによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置６１に対応する位置に、Ｅによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ｇ６１Ｅを含む。
【０１３５】
一側面によれば、変異体は、位置６２に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、６２に対応する位置に、Ｅ又はＤによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置６２に対応する位置に、Ｄによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ｎ６２Ｄを含む。
【０１３６】
一側面によれば、変異体は、位置６８に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、６８に対応する位置に、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ又はＭによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置６８に対応する位置に、Ａによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ｖ６８Ａを含む。
【０１３７】
一側面によれば、変異体は、位置７６に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、７６に対応する位置に、Ｅ又はＤによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置７６に対応する位置に、Ｄによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ｎ７６Ｄを含む。
【０１３８】
一側面によれば、変異体は、位置９７に対応する位置に挿入を含む。別の側面によれば、変異体は、９７に対応する位置に、Ｇの挿入を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、＊９７ａＧの挿入を含む。
【０１３９】
一側面によれば、変異体は、位置９８に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、９８に対応する位置に、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ又はＭによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置９８に対応する位置に、Ｓによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ａ９８Ｓを含む。
【０１４０】
一側面によれば、変異体は、位置９９に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、９９に対応する位置に、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ又はＭによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、９９に対応する位置に、Ｇによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ｓ９９Ｇを含む。
【０１４１】
一側面によれば、変異体は、位置１０１に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、１０１に対応する位置に、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ又はＭによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、１０１に対応する位置に、Ｇによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ｓ１０１Ｇを含む。
【０１４２】
一側面によれば、変異体は、位置１２０に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、１２０に対応する位置に、Ｑ、Ｖ、Ｎ、Ｅ又はＤによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置１２０に対応する位置に、Ｄによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ｈ１２０Ｄを含む。
【０１４３】
一側面によれば、変異体は、位置１２０に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、１２０に対応する位置に、Ｑ、Ｎ、Ｅ又はＤによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置１２０Ｎに対応する位置に、による置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ｈ１２０Ｎを含む。
【０１４４】
一側面によれば、変異体は、位置１２０に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、１２０に対応する位置に、Ｑ、Ｖ、Ｎ、Ｅ又はＤによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置１２０に対応する位置に、Ｖによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ｈ１２０Ｖを含む。
【０１４５】
一側面によれば、変異体は、位置１２０に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、１２０に対応する位置に、Ｑ、Ｎ、Ｅ又はＤによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置１２０に対応する位置に、Ｑによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ｈ１２０Ｑを含む。
【０１４６】
一側面によれば、変異体は、位置１３１に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、１３１に対応する位置に、Ｔ又はＳによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置１３１に対応する位置に、Ｓによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ｐ１３１Ｓを含む。
【０１４７】
一側面によれば、変異体は、位置１３７に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、１３７に対応する位置に、Ｒ、Ｋ又はＨによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置１３７に対応する位置に、Ｈによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ｑ１３７Ｈを含む。
【０１４８】
一側面によれば、変異体は、位置１９４に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、１９４に対応する位置に、Ｐによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ａ１９４Ｐを含む。
【０１４９】
一側面によれば、変異体は、位置２１８に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、２１８に対応する位置に、Ｅ、Ｄ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ又はＭによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置２１８に対応する位置に、Ｖによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ｎ２１８Ｄを含む。
【０１５０】
一側面によれば、変異体は、位置２２８に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、２２８に対応する位置に、Ｌ、Ｉ又はＶによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置２２８に対応する位置に、Ｖによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ａ２２８Ｖを含む。
【０１５１】
一側面によれば、変異体は、位置２３０に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、２３０に対応する位置に、Ｌ、Ｉ又はＶによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置２３０に対応する位置に、Ｖによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ａ２３０Ｖを含む。
【０１５２】
一側面によれば、変異体は、位置２４５に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、２４５に対応する位置に、Ｒ、Ｋ又はＨによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置２４５Ｒに対応する位置に、による置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ｑ２４５Ｒを含む。
【０１５３】
一側面によれば、変異体は、位置２６１に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、２６１に対応する位置に、Ｅ又はＤによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置２６１に対応する位置に、Ｄによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ｎ２６１Ｄを含む。
【０１５４】
一側面によれば、変異体は、位置９及び１５に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、９及び１５に対応する位置に、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ又はＭによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置９及び１５に対応する位置に、夫々Ｒ及びＴによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ｓ９Ｒ及びＡ１５Ｔを含む。
【０１５５】
一側面によれば、変異体は、位置９及び６８に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、９及び６８に対応する位置に、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ又はＭによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置９及び６８に対応する位置に、夫々Ｒ及びＡによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ｓ９Ｒ及びＶ６８Ａを含む。
【０１５６】
一側面によれば、変異体は、位置９及び２１８に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、９及び２１８に対応する位置に、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｅ、Ｄ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ又はＭによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置９及び２１８に対応する位置に、夫々Ｒ及びＤによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ｓ９Ｒ及びＮ２１８Ｄを含む。
【０１５７】
一側面によれば、変異体は、位置９及び２４５に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、９及び２４５に対応する位置に、Ｒ、Ｋ又はＨによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置９及び２４５に対応する位置に、夫々Ｒによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ｓ９Ｒ及びＱ２４５Ｒを含む。
【０１５８】
一側面によれば、変異体は、位置１５及び６８に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、１５及び６８に対応する位置に、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ又はＭによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置１５及び６８に対応する位置に、夫々Ｔ及びＡによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ａ１５Ｔ及びＶ６８Ａを含む。
【０１５９】
一側面によれば、変異体は、位置１５及び２１８に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、１５及び２１８に対応する位置に、Ｅ、Ｄ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ又はＭによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置１５及び２１８に対応する位置に、夫々Ｔ及びＤによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ａ１５Ｔ及びＮ２１８Ｄを含む。
【０１６０】
一側面によれば、変異体は、位置１５及び２４５に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、１５及び２４５に対応する位置に、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｒ、Ｋ又はＨによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置１５及び２４５に対応する位置に、夫々Ｔ及びＲによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ａ１５Ｔ及びＱ２４５Ｒを含む。
【０１６１】
一側面によれば、変異体は、位置６８及び２１８に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、６８及び２１８に対応する位置に、Ｅ、Ｄ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ又はＭによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置６８及び２１８に対応する位置に、夫々Ａ及びＤによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ｖ６８Ａ及びＮ２１８Ｄを含む。
【０１６２】
一側面によれば、変異体は、位置６８及び２４５に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、６８及び２４５に対応する位置に、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｒ、Ｋ又はＨによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置６８及び２４５に対応する位置に、夫々Ａ及びＲによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ｖ６８Ａ及びＱ２４５Ｒを含む。
【０１６３】
一側面によれば、変異体は、位置２１８及び２４５に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、２１８及び２４５に対応する位置に、Ｅ、Ｄ、Ｒ、Ｋ、Ｈによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置２１８及び２４５に対応する位置に、夫々Ｄ及びＲによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ｎ２１８Ｄ及びＱ２４５Ｒを含む。
【０１６４】
一側面によれば、変異体は、位置９、１５及び６１に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、９、１５及び６１に対応する位置に、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｄ又はＥによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置９、１５及び６１に対応する位置に、夫々Ｒ、Ｔ及びＥによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して置換Ｓ９Ｒ、Ａ１５Ｔ及びＧ６１Ｅを含む。
【０１６５】
一側面によれば、変異体は、位置９、１５及び６２に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、９、１５及び６２に対応する位置に、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｄ又はＥによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置９、１５及び６２に対応する位置に、夫々Ｒ、Ｔ及びＤによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して置換Ｓ９Ｒ、Ａ１５Ｔ及びＮ６２Ｄを含む。
【０１６６】
一側面によれば、変異体は、位置９、１５及び６８に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、９、１５及び６８に対応する位置に、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ又はＭによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置９、１５及び６８に対応する位置に、夫々Ｒ、Ｔ及びＡによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ｓ９Ｒ、Ａ１５Ｔ、Ｖ６８Ａを含む。
【０１６７】
一側面によれば、変異体は、位置９、１５及び７６に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、９、１５及び７６に対応する位置に、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｄ又はＥによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置９、１５及び７６に対応する位置に、夫々Ｒ、Ｔ及びＤによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して置換Ｓ９Ｒ、Ａ１５Ｔ及びＮ７６Ｄを含む。
【０１６８】
一側面によれば、変異体は、位置９、１５及び９７に対応する位置に修飾を含む。別の側面によれば、変異体は、９及び１５に対応する位置に、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ又はＭによる置換を含み、９７に対応する位置に挿入を含む。別の側面によれば、変異体は、位置９及び１５に対応する位置に、夫々Ｒ及びＴによる置換を含み、位置９７に対応する位置に、Ｇの挿入を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、修飾Ｓ９Ｒ、Ａ１５Ｔ及び＊９７ａＧを含む。
【０１６９】
一側面によれば、変異体は、位置９、１５及び９８に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、９、１５及び９８に対応する位置に、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ又はＭによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置９、１５及び９８に対応する位置に、夫々Ｒ、Ｔ及びＳによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ｓ９Ｒ、Ａ１５Ｔ及びＡ９８Ｓを含む。
【０１７０】
一側面によれば、変異体は、位置９、１５及び９９に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、９、１５及び９９に対応する位置に、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ又はＭによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置９、１５及び９９に対応する位置に、夫々Ｒ、Ｔ及びＧによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ｓ９Ｒ、Ａ１５Ｔ及びＳ９９Ｇを含む。
【０１７１】
一側面によれば、変異体は、位置９、１５及び１２０に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、９、１５及び１２０に対応する位置に、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｖ、Ｄ、Ｅ又はＭによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置９、１５及び１２０に対応する位置に、夫々Ｒ、Ｔ及びＤによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ｓ９Ｒ、Ａ１５Ｔ及びＨ１２０Ｄを含む。
【０１７２】
一側面によれば、変異体は、位置９、１５及び１２０に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、９、１５及び１２０に対応する位置に、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｖ、Ｄ、Ｅ又はＭによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置９、１５及び１２０に対応する位置に、夫々Ｒ、Ｔ及びＮによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ｓ９Ｒ、Ａ１５Ｔ及びＨ１２０Ｎを含む。
【０１７３】
一側面によれば、変異体は、位置９、１５及び１２０に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、９、１５及び１２０に対応する位置に、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｖ、Ｄ、Ｅ又はＭによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置９、１５及び１２０に対応する位置に、夫々Ｒ、Ｔ及びＶによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ｓ９Ｒ、Ａ１５Ｔ及びＨ１２０Ｖを含む。
【０１７４】
一側面によれば、変異体は、位置９、１５及び１２０に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、９、１５及び１２０に対応する位置に、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｖ、Ｄ、Ｅ又はＭによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置９、１５及び１２０に対応する位置に、夫々Ｒ、Ｔ及びＱによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ｓ９Ｒ、Ａ１５Ｔ及びＨ１２０Ｑを含む。
【０１７５】
一側面によれば、変異体は、位置９、１５及び１３１に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、９、１５及び１３１に対応する位置に、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ又はＭによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置９、１５及び１３１に対応する位置に、夫々Ｒ、Ｔ及び｛Ｓ、Ｔ｝による置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ｓ９Ｒ、Ａ１５Ｔ及びＰ１３１｛Ｓ、Ｔ｝を含む。
【０１７６】
一側面によれば、変異体は、位置９、１５及び１３７に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、９、１５及び１３７に対応する位置に、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ又はＭによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置９、１５及び１３７に対応する位置に、夫々Ｒ、Ｔ及びＨによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して置換Ｓ９Ｒ、Ａ１５Ｔ及びＱ１３７Ｈを含む。
【０１７７】
一側面によれば、変異体は、位置９、１５及び１９４に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、９、１５及び１９４に対応する位置に、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ又はＭによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置９、１５及び１９４に対応する位置に、夫々Ｒ、Ｔ及びＰによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して置換Ｓ９Ｒ、Ａ１５Ｔ及びＡ１９４Ｐを含む。
【０１７８】
一側面によれば、変異体は、位置９、１５及び２１８に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、９、１５及び２１８に対応する位置に、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｅ又はＤによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置９、１５及び２１８に対応する位置に、夫々Ｒ、Ｔ及びＤによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ｓ９Ｒ、Ａ１５Ｔ、Ｎ２１８Ｄを含む。
【０１７９】
一側面によれば、変異体は、位置９、１５及び２２８に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、９、１５及び２２８に対応する位置に、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｌ、Ｉ、Ｖ又はＭによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置９、１５及び２２８に対応する位置に、夫々Ｒ、Ｔ及びＶによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ｓ９Ｒ、Ａ１５Ｔ及びＡ２２８Ｖを含む。
【０１８０】
一側面によれば、変異体は、位置９、１５及び２３０に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、９、１５及び２３０に対応する位置に、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｌ、Ｉ、Ｖ又はＭによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置９、１５及び２３０に対応する位置に、夫々Ｒ、Ｔ及びＶによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ｓ９Ｒ、Ａ１５Ｔ及びＡ２３０Ｖを含む。
【０１８１】
一側面によれば、変異体は、位置９、１５及び２４５に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、９、１５及び２４５に対応する位置に、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ又はＭによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置９、１５及び２４５に対応する位置に、夫々Ｒ、Ｔ及びＲによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ｓ９Ｒ、Ａ１５Ｔ、Ｑ２４５Ｒを含む。
【０１８２】
一側面によれば、変異体は、位置９、１５及び２６１に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、９、１５及び２６１に対応する位置に、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｄ、Ｅ又はＭによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置９、１５及び２６１に対応する位置に、夫々Ｒ、Ｔ及びＤによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ｓ９Ｒ、Ａ１５Ｔ及びＮ２６１Ｄを含む。
【０１８３】
一側面によれば、変異体は、位置１５、６８及び２１８に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、１５、６８及び２１８に対応する位置に、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｅ又はＤによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置１５、６８及び２１８に対応する位置に、夫々Ｔ、Ａ及びＤによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ａ１５Ｔ、Ｖ６８Ａ及びＮ２１８Ｄを含む。
【０１８４】
一側面によれば、変異体は、位置１５、６８及び２４５に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、１５、６８及び２４５に対応する位置に、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ又はＭによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置１５、６８及び２４５に対応する位置に、夫々Ｔ、Ａ及びＲによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ａ１５Ｔ、Ｖ６８Ａ及びＱ２４５Ｒを含む。
【０１８５】
一側面によれば、変異体は、位置６８、２１８及び２４５に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、６８、２１８及び２４５に対応する位置に、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｅ又はＤによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置６８、２１８及び２４５に対応する位置に、夫々Ａ、Ｄ及びＲによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ｖ６８Ａ、Ｎ２１８Ｄ及びＱ２４５Ｒを含む。
【０１８６】
一側面によれば、変異体は、位置９、１５、６８及び２１８に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、９、１５、６８及び２１８に対応する位置に、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｅ又はＤによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置９、１５、６８及び２１８に対応する位置に、夫々Ｒ、Ｔ、Ａ及びＤによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ｓ９Ｒ、Ａ１５Ｔ、Ｖ６８Ａ及びＮ２１８Ｄを含む。
【０１８７】
一側面によれば、変異体は、位置９、１５、６８及び２４５に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、９、１５、６８及び２４５に対応する位置に、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ又はＭによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置９、１５、６８及び２４５に対応する位置に、夫々Ｒ、Ｔ、Ａ及びＲによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ｓ９Ｒ、Ａ１５Ｔ、Ｖ６８Ａ及びＱ２４５Ｒを含む。
【０１８８】
一側面によれば、変異体は、位置１５、６８、２１８及び２４５に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、１５、６８、２１８及び２４５に対応する位置に、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｅ又はＤによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置１５、６８、２１８及び２４５に対応する位置に、夫々Ｔ、Ａ、Ｄ及びＲによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ａ１５Ｔ、Ｖ６８Ａ、Ｎ２１８Ｄ及びＱ２４５Ｒを含む。
【０１８９】
一側面によれば、変異体は、位置９、１５、６８、２１８及び２４５に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、９、１５、６８、２１８及び２４５に対応する位置に、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｅ又はＤによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置９、１５、６８、２１８及び２４５に対応する位置に、夫々Ｒ、Ｔ、Ａ、Ｄ及びＲによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ｓ９Ｒ、Ａ１５Ｔ、Ｖ６８Ａ、Ｎ２１８Ｄ及びＱ２４５Ｒを含む。
【０１９０】
一側面によれば、変異体は、位置９、１５、６８、１２０、２１８及び２４５に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、９、１５、６８、１２０、２１８及び２４５に対応する位置に、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｎ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｑ、Ｅ又はＤによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置９、１５、６８、２１８及び２４５に対応する位置に、夫々Ｒ、Ｔ、Ａ、Ｑ、Ｄ及びＲによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ｓ９Ｒ、Ａ１５Ｔ、Ｖ６８Ａ、Ｈ１２０Ｑ、Ｎ２１８Ｄ及びＱ２４５Ｒを含む。
【０１９１】
一側面によれば、変異体は、位置９、１５、６８、１２０、２１８及び２４５に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、９、１５、６８、１２０、２１８及び２４５に対応する位置に、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｎ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｑ、Ｅ又はＤによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置９、１５、６８、２１８及び２４５に対応する位置に、夫々Ｒ、Ｔ、Ａ、Ｖ、Ｄ及びＲによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ｓ９Ｒ、Ａ１５Ｔ、Ｖ６８Ａ、Ｈ１２０Ｖ、Ｎ２１８Ｄ及びＱ２４５Ｒを含む。
【０１９２】
一側面によれば、変異体は、位置９、１５、６８、７６、２１８及び２４５に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、９、１５、６８、７６、２１８及び２４５に対応する位置に、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｅ又はＤによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置９、１５、６８、７６、２１８及び２４５に対応する位置に、夫々Ｒ、Ｔ、Ａ、Ｄ、Ｄ及びＲによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ｓ９Ｒ、Ａ１５Ｔ、Ｖ６８Ａ、Ｈ７６Ｄ、Ｎ２１８Ｄ及びＱ２４５Ｒを含む。
【０１９３】
一側面によれば、変異体は、位置９、１５、６１、６８、２１８及び２４５に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、９、１５、６１  ６８、２１８及び２４５に対応する位置に、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｅ又はＤによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置９、１５、６１、６８、２１８及び２４５に対応する位置に、夫々Ｒ、Ｔ、Ｅ、Ａ、Ｄ及びＲによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、置換Ｓ９Ｒ、Ａ１５Ｔ、Ｇ６１Ｅ、Ｖ６８Ａ、Ｎ２１８Ｄ及びＱ２４５Ｒを含む。
【０１９４】
一側面によれば、変異体は、位置９、１５、６１、６８、９８、２１８及び２４５に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置９、１５、６１、６８、９８、２１８及び２４５に対応する位置に、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｅ又はＤによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置９、１５、６１、６８、９８、２１８及び２４５に対応する位置に、夫々Ｒ、Ｔ、Ｅ、Ａ、Ｓ、Ｄ及びＲによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して置換Ｓ９Ｒ、Ａ１５Ｔ、Ｇ６１Ｅ、Ｖ６８Ａ、Ａ９８Ｓ、Ｎ２１８Ｄ及びＱ２４５Ｒを含む。
【０１９５】
一側面によれば、変異体は、位置９、１５、６１、６８、９８、９９、２１８及び２４５に対応する位置に置換を含む。別の側面によれば、変異体は、９、１５、６１、６８、９８、９９、２１８及び２４５に対応する位置に、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｅ又はＤによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、位置９、１５、６１、６８、９８、９９、２１８及び２４５に対応する位置に、夫々Ｒ、Ｔ、Ｅ、Ａ、Ｓ、Ｇ、Ｄ及びＲによる置換を含む。別の側面によれば、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して置換Ｓ９Ｒ、Ａ１５Ｔ、Ｇ６１Ｅ、Ｖ６８Ａ、Ａ９８Ｓ、Ｓ９９Ｇ、Ｎ２１８Ｄ及びＱ２４５Ｒを含む。
【０１９６】
更なる実施形態によれば、本明細書に記載のサブチラーゼ変異体は、以下の何れかの位置に、１又は２以上の修飾を有するのが有利である。
２７、３６、５６、８７、９５、９６、１００、１０２、１０３、１０４、１２３、１５９、１６７、１７０、２０６、２２２、２２４、２３２、２３５、２３６、２４５、２４８、２５２及び２７４。
【０１９７】
具体的には、以下のＢＬＳＡＶＩ、ＢＬＳＵＢＬ、ＢＳＫＳＭＫ及びＢＡＡＬＫＰ修飾が、組み合わせに適している。
Ｋ２７Ｒ、＊３６Ｄ、Ｓ５６Ｐ、Ｓ８７Ｎ、Ｓ１０３Ａ、Ｖ１０４Ａ、Ｖ１０４Ｉ、Ｖ１０４Ｎ、Ｖ１０４Ｙ、Ｓ１０６Ａ、Ｎ１２３Ｓ、Ｇ１５９Ｄ、Ｙ１６７Ａ、Ｒ１７０Ｓ、Ｒ１７０Ｌ、Ｎ２０４Ｄ、Ｖ２０５Ｉ、Ｑ２０６Ｅ、Ｌ２１７Ｄ、Ｍ２２２Ｓ、Ｍ２２２Ａ、Ｔ２２４Ｓ、Ａ２３２Ｖ、Ｋ２３５Ｌ、Ｑ２３６Ｈ、Ｎ２４８Ｄ、Ｎ２５２Ｋ及びＴ２７４Ａ。
【０１９８】
更に有用な変異体として、Ｓ１０１Ｇ＋Ｖ１０４Ｎ、Ｓ８７Ｎ＋Ｓ１０１Ｇ＋Ｖ１０４Ｎ、Ｋ２７Ｒ＋Ｖ１０４Ｙ＋Ｎ１２３Ｓ＋Ｔ２７４Ａ、Ｎ７６Ｄ＋Ｓ１０３Ａ＋Ｖ１０４Ｉ、Ｓ９９Ｄ＋Ｓ１０１Ｒ＋Ｓ１０３Ａ＋Ｖ１０４Ｉ＋Ｇ１６０Ｓ、Ｓ３Ｔ＋Ｖ４Ｉ＋Ｓ９９Ｄ＋Ｓ１０１Ｒ＋Ｓ１０３Ａ＋Ｖ１０４Ｉ＋Ｇ１６０Ｓ＋Ｖ１９９Ｍ＋Ｖ２０５Ｉ＋Ｌ２１７Ｄ、Ｓ３Ｔ＋Ｖ４Ｉ＋Ｓ９９Ｄ＋Ｓ１０１Ｒ＋Ｓ１０３Ａ＋Ｖ１０４Ｉ＋Ｇ１６０Ｓ＋Ａ１９４Ｐ＋Ｖ１９９Ｍ＋Ｖ２０５Ｉ＋Ｌ２１７Ｄ、Ｓ３Ｔ＋Ｖ４Ｉ＋Ｓ９９Ｄ＋Ｓ１０１Ｒ＋Ｓ１０３Ａ＋Ｖ１０４Ｉ＋Ｇ１６０Ｓ＋Ｖ２０５Ｉ又はＮ７６Ｄ＋Ｖ１０４Ａのうち何れかの修飾を、或いは他の修飾の組み合わせとして、Ｋ２７Ｒ、＊３６Ｄ、Ｓ５６Ｐ、Ｓ８７Ｎ、Ｇ９７Ｎ、Ｓ９９ＳＥ、Ｓ１０１Ｇ、Ｓ１０３Ａ、Ｖ１０４Ａ、Ｖ１０４Ｉ、Ｖ１０４Ｎ、Ｖ１０４Ｙ、Ｓ１０６Ａ、Ｎ１２３Ｓ、Ｇ１５９Ｄ、Ｙ１６７Ａ、Ｒ１７０Ｓ、Ｒ１７０Ｌ、Ｎ２０４Ｄ、Ｖ２０５Ｉ、Ｑ２０６Ｅ、Ｌ２１７Ｄ、Ｍ２２２Ｓ、Ｍ２２２Ａ、Ｔ２２４Ｓ、Ａ２３２Ｖ、Ｋ２３５Ｌ、Ｑ２３６Ｈ、Ｎ２４８Ｄ、Ｎ２５２Ｋ又はＴ２７４Ａを、上述の１又は２以上の修飾との組み合わせで有するものが、改善された特性を発揮する。
【０１９９】
ある側面によれば、変異体は、配列番号３の成熟ポリペプチドの位置６１｛Ｄ，Ｅ｝、６２｛Ｄ，Ｅ｝、７６｛Ｄ，Ｅ｝、＊９７ａＧ、９８｛Ｇ，Ｓ｝、９９Ｇ、１０１Ｇ、１２０｛Ｎ，Ｄ｝、１３１｛Ｔ，Ｓ｝、１３７Ｈ、１９４Ｐ、２２８Ｖ、２３０Ｖ、２６１Ｄの１又は２以上に対応する位置に修飾を含む。
【０２００】
ある側面によれば、変異体は、配列番号４の成熟ポリペプチドの位置６１｛Ｄ，Ｅ｝、６２｛Ｄ，Ｅ｝、７６｛Ｄ，Ｅ｝、＊９７ａＧ、９８｛Ｇ，Ｓ｝、９９Ｇ、１０１Ｇ、１２０｛Ｎ，Ｄ｝、１３１｛Ｔ，Ｓ｝、１３７Ｈ、１９４Ｐ、２２８Ｖ、２３０Ｖ、２６１Ｄ１又は２以上に対応する位置に修飾を含む。
【０２０１】
更に、本発明の主側面に係るサブチラーゼ変異体を、位置６１、６２、７６、９７、９８、９９、１０１、１２０、１３１、１３７、１９４、２２８、２３０及び２６１の何れかの位置における１又は２以上の修飾、好ましくは６１｛Ｄ，Ｅ｝、６２｛Ｄ，Ｅ｝、７６｛Ｄ，Ｅ｝、＊９７ａＧ、９８｛Ｇ，Ｓ｝、９９Ｇ、１０１Ｇ、１２０｛Ｄ，Ｎ，Ｖ，Ｑ｝、１３１｛Ｔ，Ｓ｝、１３７Ｈ、１９４Ｐ、２２８Ｖ、２３０Ｖ、２６１Ｄ、より一層好ましくは６１Ｅ、６２Ｄ、７６Ｄ、＊９７ａＧ、９８Ｓ、９９Ｇ、１０１Ｇ、１２０Ｄ、１３１Ｔ、１３７Ｈ、１９４Ｐ、２２８Ｖ、２３０Ｖ、２６１Ｄと組み合わせることが好ましい。これらの修飾は何れも、サブチラーゼ変異体の生産において、その発現レベルを増大させることが期待される。
【０２０２】
特に興味ある変異体は、本発明の修飾の他に、次の置換を含む変異体である。
Ｓ９Ｒ、Ａ１５Ｔ、Ｇ６１Ｅ、Ｖ６８Ａ、Ａ９８Ｓ、Ｓ９９Ｇ、Ｎ２１８Ｄ及びＱ２４５Ｒ。
【０２０３】
更に興味深い変異体の例を以下に挙げる。
【表３】
0005947213.tif 000004
【０２０４】
本発明の選択された変異体の洗浄性能は、例えば本明細書の実施例３に示す洗浄性能試験により検証することができる。斯かる洗浄性能試験により、例えば変異体を標準的な洗剤組成物又は市販の洗剤組成物に組み込んだ上で、硬表面からタンパク質性の汚れを除去する能力を、基準となる系との対比で、即ち親サブチラーゼ又は（同一の洗剤系に組み込んで同一条件下で試験した場合に）より優れた洗浄性能を示す同様のサブチラーゼとの比較において検証することができる。本発明の酵素変異体は、自動機械負荷分析（Automated Mechanical Stress Assay：ＡＭＳＡ）を用いて試験された。ＡＭＳＡ試験を用いれば、少量の酵素洗剤溶液が多数存在する場合でも、その洗浄性能を迅速に検証することができる。この試験を用いて選択された変異体の洗浄性能をまず検査し、選択された変異体が親サブチラーゼと比べて顕著な改善を示さない場合には、通常それ以上の実験を実施する必要はない。
【０２０５】
従って、本明細書に記載の目的において特に興味深い変異体は、市販の洗剤組成物 例えば欧州系の食器洗い用洗剤、米国系の食器洗い用洗剤、アジア系の洗濯用洗剤、欧州系の洗濯用洗剤、又はラテンアメリカ系の洗濯用洗剤（一部の例を洗浄性能試験（実施例３）に示す）において試験した場合に、同一条件下で試験された親サブチラーゼと比べて改善された洗浄性能を示すような変異体である。
【０２０６】
もちろん、本発明の変異体は、上記基準を少なくとも上記記載の最低レベルで充足すればよいが、最高レベルで充足することがより好ましい。
【０２０７】
核酸コンストラクト
本発明は、本発明のプロテアーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドと、これと作動式に連結された１又は２以上の調節配列とを含む核酸コンストラクトであって、適切な宿主細胞中において、調節配列に適合する条件下、前記調節配列により前記コーディング配列が発現されるような核酸コンストラクトにも関する。
【０２０８】
本発明のプロテアーゼ変異体の発現を可能とするべく、当該変異体をコードする単離ポリヌクレオチドを、種々の手法により操作してもよい。発現ベクターの種類によっては、ベクターへの挿入前にポリヌクレオチドを操作することが好適又は必要な場合がある。組換えＤＮＡ法を用いてポリヌクレオチドを修飾する手法は、当業者には周知である。
【０２０９】
調節配列としては、ポリヌクレオチドの発現のために宿主細胞に認識される、適切なプロモーター配列が挙げられる。プロモーター配列は、変異プロテアーゼ変異体の発現を媒介する転写調節配列を含む。プロモーターは、選択された宿主細胞内で転写活性を示すものであれば、如何なる核酸配列であってもよく、突然変異型、切断型、ハイブリッド型等のプロモーターであってもよい。また、宿主細胞に対して同種又は異種の細胞外又は細胞内ポリペプチドをコードする何れの遺伝子から取得されたものでもよい。
【０２１０】
細菌宿主細胞において本発明の核酸コンストラクトの転写を引き起こすのに適したプロモーターの例としては、大腸菌（E. coli）乳糖オペロン（lac operon）、ストレプトミセス・セリカラー（Streptomyces coelicolor）アガラーゼ遺伝子（dagA）、バシラス・サチリス（Bacillus subtilis）レバンスクラーゼ遺伝子（sacB）、バシラス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）α−アミラーゼ遺伝子（amyL）、バチルス・ステアロテルモフィルス（Bacillus stearothermophilus）マルトース生成アミラーゼ遺伝子（amyM）、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）α−アミラーゼ遺伝子（amyQ）、バシラス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）ペニシリナーゼ遺伝子（penP）、バシラス・サチリス（Bacillus subtilis）xylA 及び xylB 遺伝子、及び原核β−ラクタマーゼ遺伝子（Villa-Kamaroff et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75:3727-3731）由来のプロモーター、並びに tac プロモーター（DeBoer et al., 1983, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80:21-25）が挙げられる。更なるプロモーターは"Useful proteins from recombinant bacteria", Scientific American, 1980, 242:74-94；及び Sambrook et al., 1989（同上）に記載されている。
【０２１１】
糸状菌宿主細胞において本発明の核酸コンストラクトの転写を引き起こすのに適したプロモーターの例としては、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）TAKA アミラーゼ、リゾムコル・ミエヘイ（Rhizomucor miehei）アスパラギン酸プロテイナーゼ、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）中性α−アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）酸安定α−アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）又はアスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）グルコアミラーゼ（glaA）、リゾムコル・ミエヘイ（Rhizomucor miehei）リパーゼ、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）アルカリ性プロテアーゼ、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）トリオースリン酸イソメラーゼ、アスペルギルス・ニズランス（Aspergillus nidulans）アセトアミダーゼ、フザリウム・ベネナツム（Fusarium venenatum）アミログルコシダーゼ （国際公開第００/５６９００号）、フザリウム・ベネナツム（Fusarium venenatum）Daria（国際公開第００／５６９００号）、フザリウム・ベネナツム（Fusarium venenatum）Quinn（国際公開第００／５６９００号）、フザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）トリプシン様プロテアーゼ（国際公開第９６／００７８７号）、トリコデルマ・レセイ（Trichoderma reesei）β−グルコシダーゼ、トリコデルマ・レセイ（Trichoderma reesei）セロビオヒドロラーゼＩ、トリコデルマ・レセイ（Trichoderma reesei）セロビオヒドロラーゼ II、トリコデルマ・レセイ（Trichoderma reesei）エンドグルカナーゼＩ、トリコデルマ・レセイ（Trichoderma reesei）エンドグルカナーゼII、トリコデルマ・レセイ（Trichoderma reesei）エンドグルカナーゼIII、トリコデルマ・レセイ（Trichoderma reesei）エンドグルカナーゼIV、トリコデルマ・レセイ（Trichoderma reesei）エンドグルカナーゼＶ、トリコデルマ・レセイ（Trichoderma reesei）キシラナーゼＩ、トリコデルマ・レセイ（Trichoderma reesei）キシラナーゼII、トリコデルマ・レセイ（Trichoderma reesei）β−キシロシダーゼ由来のプロモーター、並びに NA2-tpiプロモーター（アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）中性α−アミラーゼ及びアスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）トリオースリン酸イソメラーゼ由来のプロモーターのハイブリッド）；並びにこれらの突然変異型、切断型、ハイブリッド型プロモーターが挙げられる。
【０２１２】
酵母宿主の場合、有用なプロモーターとしては、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）エノラーゼ（ENO-１）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ガラクトキナーゼ（GAL１）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）アルコール デヒドロゲナーゼ／グリセロアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ADH１、ADH２/GAP）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）トリオースリン酸イソメラーゼ（TPI）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）メタロチオネイン（CUP１）、及びサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）３−ホスホグリセリン酸キナーゼ由来のプロモーターが挙げられる。酵母宿主細胞に有用な他のプロモーターは、Romanos et al., 1992, Yeast 8:423-488 に記載されている。
【０２１３】
調節配列としては、転写を停止するために宿主細胞に認識される、適切な転写ターミネーター配列も挙げられる。ターミネーター配列は、変異プロテアーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドの３’末端に作動式に連結される。本発明では、選択された宿主細胞において機能し得る任意のターミネーターを使用することができる。
【０２１４】
糸状菌宿主細胞の場合、ターミネーターとしては、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）TAKA アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）グルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニズランス（Aspergillus nidulans）アントラニル酸シンターゼ、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）α−グルコシダーゼ、及びフザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）トリプシン様プロテアーゼ由来のターミネーターが好ましい。
【０２１５】
酵母宿主細胞の場合、ターミネーターとしては、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）エノラーゼ、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）シトクロームＣ（CYC1）、及びサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）グリセロアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ由来のターミネーターが好ましい。酵母宿主細胞に有用な他のターミネーターは、Romanos et al., 1992（同上）に記載されている。
【０２１６】
調節配列としては、適切なリーダー配列も挙げられる。リーダー配列は、宿主細胞による翻訳に重要な役割を果たすｍＲＮＡの非翻訳領域である。リーダー配列は、変異プロテアーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドの５’末端に作動式に連結される。リーダー配列本発明では、選択された宿主細胞において機能し得る任意のリーダー配列本を使用することができる。
【０２１７】
糸状菌宿主細胞の場合、リーダー配列としては、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）TAKA アミラーゼ、及びアスペルギルス・ニズランス（Aspergillus nidulans）トリオースリン酸イソメラーゼ由来のリーダー配列が好ましい。
【０２１８】
酵母宿主細胞に適したリーダー配列としては、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）エノラーゼ（ENO-1）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）３-ホスホグリセリン酸キナーゼ、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）α−因子、及びサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）アルコールデヒドロゲナーゼ／グリセロアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ADH2/GAP）由来のリーダー配列が挙げられる。
【０２１９】
調節配列としては、ポリアデニル化配列も挙げられる。ポリアデニル化配列は、ポリペプチドをコードする配列の３’末端に作動式に連結され、転写時に宿主細胞によって、転写されたｍＲＮＡにポリアデノシン残基を付加するシグナルとして認識される。本発明では、選択された宿主細胞において機能し得る任意のポリアデニル化配列を使用することができる。
【０２２０】
糸状菌宿主細胞の場合、ポリアデニル化配列としては、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）TAKA アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）グルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニズランス（Aspergillus nidulans）アントラニル酸シンターゼ、フザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）トリプシン様プロテアーゼ、及びアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）α−グルコシダーゼ由来のポリアデニル化配列が好ましい。
【０２２１】
酵母宿主細胞において有用なポリアデニル化配列は、Guo and Sherman, 1995, Molecular Cellular Biology 15:5983-5990 に記載されている。
【０２２２】
調節配列としては、シグナルペプチドコーディング領域も挙げられる。これは、変異プロテアーゼ変異体のアミノ末端に連結され、コードされたポリペプチドを細胞の分泌経路に誘導するためのアミノ酸配列をコードする配列である。ポリヌクレオチドのコーディング配列の５’末端が、翻訳リーディングフレーム内において、分泌される変異プロテアーゼ変異体をコードするコーディング領域のセグメントと当初から連結された、固有のシグナルペプチドコーディング領域を有していてもよい。或いは、コーディング配列の５’末端が、コーディング配列に対して外来のシグナルペプチドコーディング領域を有していてもよい。外来のシグナルペプチドコーディング領域が必要となるのは、例えば、コーディング配列が生来のシグナルペプチドコーディング領域を有さない場合である。或いは、変異プロテアーゼ変異体の分泌を促進するために、外来のシグナルペプチドコーディング領域により、生来のシグナルペプチドコーディング領域をそのまま置換してもよい。しかしながら、本発明では、発現されたポリペプチドを選択された宿主細胞の分泌経路に誘導し得るものであれば、任意のシグナルペプチドコーディング領域を使用できる。
【０２２３】
糸状菌宿主細胞において有効なシグナルペプチドコーディング配列としては、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）TAKA アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）中性アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）グルコアミラーゼ、リゾムコル・ミエヘイ（Rhizomucor miehei）アスパラギン酸プロテイナーゼ、フミコラ・インソレンス（Humicola insolens）セルラーゼ、フミコラ・インソレンス（Humicola insolens）エンドグルカナーゼＶ及びフミコラ・ランギノサ（Humicola lanuginosa）リパーゼ由来の配列が挙げられる。
【０２２４】
酵母宿主細胞において有用なシグナルペプチドとしては、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）α−因子及びサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）インベルターゼが挙げられる。他の有用なシグナルペプチドコーディング配列は、Romanos et al., 1992（同上）に記載されている。
【０２２５】
調節配列としては、プロペプチドコーディング領域も挙げられる。これは、変異プロテアーゼ変異体のアミノ末端に配置されるアミノ酸配列をコードする配列である。得られるポリペプチドは酵素前駆体（proenzyme）又はプロポリペプチド（propolypeptide）（或いは場合によりチモーゲン（zymogen））と呼ばれる。プロポリペプチドは通常不活性であるが、触媒又は自己触媒によりプロペプチドがプロポリペプチドから切断されると、成熟活性ポリペプチドに変換される。プロペプチドコーディング領域としては、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）α−因子、リゾムコル・ミエヘイ（Rhizomucor miehei）アスパラギン酸プロテイナーゼ、及びミセリオフィソラ・テルモフィラ（Myceliophthora thermophila）ラッカーゼ（国際公開第９５／３３８３６号）由来の配列が挙げられる。
【０２２６】
ポリペプチドのアミノ末端にシグナルペプチド及びプロペプチド領域の双方が存在する場合には、ポリペプチドのアミノ末端の隣にプロペプチド領域が配置され、プロペプチド領域のアミノ末端の隣にシグナルペプチド領域が配置される。
【０２２７】
また、宿主細胞の生育との関連において、変異プロテアーゼ変異体の発現調節を可能にする調節配列を付与することも望ましい。調節系の例としては、調節化合物の存在等の化学又は物理刺激に応答して遺伝子の発現を開始又は停止させる系が挙げられる。原核細胞系における調節系としては、lac、tac、及びtrp オペレータ系が挙げられる。酵母においては、例えば ADH2 系又はGAL1 系が使用できる。糸状菌においては、例えば TAKA α−アミラーゼプロモーター、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）グルコアミラーゼプロモーター、及びアスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）グルコアミラーゼプロモーターを調節配列として使用できる。他の調節配列の例としては、遺伝子の増幅を可能にする系が挙げられる。真核細胞系における斯かる調節配列としては、メトトレキサートの存在下で増幅されるジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子や、重金属により増幅されるメタロチオネイン遺伝子が挙げられる。これらの場合、変異プロテアーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドは、斯かる調節配列に作動式に連結される。
【０２２８】
発現ベクター
本発明は、本発明の変異プロテアーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドと、プロモーターと、転写及び翻訳停止シグナルとを含む組換え発現ベクターにも関する。上述の種々のヌクレオチド及び調節配列を組み合わせ、１又は２以上（数個）の制限部位を含む組換え発現ベクターを構築すれば、前記変異体をコードするポリヌクレオチドを斯かる部位に挿入又は置換することができ、好適である。或いは、前記ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含む核酸コンストラクトを、発現に適したベクターに挿入することにより、ポリヌクレオチドを発現させてもよい。発現ベクターを作製する際には、発現に適した調節配列とコーディング配列とが作動式に連結されるように、コーディング配列をベクター内に配置する。
【０２２９】
組換え発現ベクターは、組換えＤＮＡ法に好適に利用でき、且つポリヌクレオチドの発現を生じ得るものであれば、任意のベクター（例えばプラスミド又はウイルス）が使用できる。ベクターの選択は、通常はベクターを導入する宿主細胞と、ベクターとの適合性に依存する。ベクターは線状でも閉環状プラスミドでもよい。
【０２３０】
ベクターは自己複製ベクター、即ち、染色体外成分として存在し、染色体複製とは独立に複製するベクターであってもよい。例としては、プラスミド、染色体染色体要素、ミニ染色体、又は人工染色体等が挙げられる。斯かるベクターは、自己複製を促進する任意の手段を含んでいてもよい。或いは、ベクターは、宿主細胞内に導入されるとゲノム内に組み込まれ、統合された染色体と一緒に複製されるものであってもよい。なお、宿主細胞のゲノムに導入されるＤＮＡ群は、単一のベクター又はプラスミドが含んでいてもよく、或いは２以上のベクター又はプラスミドが共同で含んでいてもよい。
【０２３１】
本発明のベクターは、形質転換、トランスフェクション、形質導入等を生じた細胞の選択を容易にする、１又は２以上（数個）の選択マーカーを含むことが好ましい。選択マーカーは、殺生物剤、ウイルス耐性、重金属耐性、原栄養又は栄養要求性等を付与する物質を産生する遺伝子である。
【０２３２】
酵母宿主細胞に適したマーカーとしては、ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、及びURA3 が挙げられる。糸状菌宿主細胞に使用される選択マーカーとしては、これらに限定されるものではないが、amdS（アセトアミダーゼ）、argB（オルニチン カルバモイルトランスフェラーゼ）、bar（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）、hph（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、niaD（硝酸レダクターゼ）、pyrG（オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ）、sC（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）、及びtrpC（アントラニル酸シンターゼ）、並びにこれらの同等物が挙げられる。アスペルギルス（Aspergillus）細胞での使用には、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）又はアスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）の amdS 及び pyrG 遺伝子、並びにストレプトミセス・ハイグロスコピカス（Streptomyces hygroscopicus）の bar 遺伝子が好適である。
【０２３３】
本発明のベクターは、ベクターの宿主細胞ゲノムへの組み込み、又は、細胞内におけるゲノムとは独立したベクターの自律的な複製を可能にする（１又は２以上の）要素を含むことが好ましい。
【０２３４】
宿主細胞ゲノムへの組み込みの場合、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、或いはベクターのその他の要素に基づく相同又は非相同組換えにより、ゲノムへの組み込みを生じさせてもよい。或いは、宿主細胞ゲノムの（１又は２以上の）染色体内の（１又は２以上の）正確な位置に対して、相同組換えによるベクターの組み込みを生じさせるような更なるヌクレオチド配列を、ベクターが含んでいてもよい。正確な位置に組み込まれる確率を高めるべく、組み込み要素は、相同組換えの可能性を高めるよう、対応する標的配列と高い同一性を有する十分な数の核酸（例えば１００〜１０，０００塩基対、好ましくは４００〜１０，０００塩基対、最も好ましくは８００〜１０，０００塩基対）を有することが好ましい。斯かる組み込み要素は、宿主細胞のゲノムの標的配列に相同な配列であれば、任意の配列でよい。更に、斯かる組み込み要素は、非コーディング配列でもコーディング配列ヌクレオチド配列でもよい。一方、ベクターは非相同組換えにより宿主細胞ゲノムに組み込まれてもよい。
【０２３５】
自律的な複製の場合、ベクターは更に、所期の宿主細胞内でのベクターの自律的な複製を可能にする複製起点を含んでいてもよい。複製起点としては、自律的複製を生じさせるプラスミド複製子であって、細胞内で機能し得る任意の配列が挙げられる。本明細書において「複製起点」（origin of replication）又は「プラスミド複製子」（plasmid replicator）とは、プラスミド又はベクターのインビボでの複製を可能にするヌクレオチド配列として定義される。
【０２３６】
酵母宿主細胞に使用される複製起点の例としては、２ミクロン複製起点、ARS1、ARS4、ARS1とCEN3との組み合わせ、及び、ARS4とCEN6との組み合わせが挙げられる。
【０２３７】
糸状菌細胞において有用な複製起点の例としては、AMA1 及び ANS1 が挙げられる（Gems et al., 1991, Gene 98:61-67；Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Research 15:9163-9175；国際公開第００／２４８８３号）。AMA1 遺伝子の単離、及び、当該遺伝子を含むプラスミド又はベクターの構築は、国際公開第００／２４８８３号に開示の手法により達成することができる。
【０２３８】
本発明のポリヌクレオチドを２コピー以上、宿主細胞に挿入することにより、プロテアーゼ変異体の産生を増進してもよい。ポリヌクレオチドのコピー数の増大は、前記配列の少なくとも１つの更なるコピーを宿主細胞ゲノム内に組み込むことにより、或いは、増幅可能な選択マーカー遺伝子をポリヌクレオチド内に含め、適切な選択物質の存在下で細胞を培養した場合に、選択マーカー遺伝子の増幅されたコピー、更には前記ポリヌクレオチドの更なるコピーを含む細胞が選択できるようにすることにより達成される。
【０２３９】
実質的に純粋なプロテアーゼ変異体を得るべく、上述の要素を連結して本発明の組換え発現ベクターを構築する手法は、当業者には周知である（例えば Sambrook et al., 1989（同上）参照）。
【０２４０】
宿主細胞
本発明は、変異プロテアーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドを含み、当該変異体の組換え産生に有利に使用される組換え宿主細胞にも関する。本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞に導入し、ベクターが上述の染色体組み込み体として、或いは自己複製染色体外ベクターとして維持されるようにする。宿主細胞の選択は、ポリペプチドをコードする遺伝子及びその起源に大きく依存する。
【０２４１】
宿主細胞としては、変異プロテアーゼ変異体の組換え産生に有用な任意の細胞が挙げられる。宿主細胞は真核細胞、例えば哺乳類、虫、植物、又は真菌の細胞であってもよい。
【０２４２】
一側面によれば、宿主細胞は真菌細胞である。本明細書において「真菌」（fungi）とは、子嚢菌（Ascomycota）門、担子菌（Basidiomycota）門、ツボカビ（Chytridiomycota）門、及び接合菌（Zygomycota）門を含む（Hawksworth et al., In, Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8th edition, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK の定義による）とともに、卵菌類（Oomycota）（Hawksworth et al., 1995（同上）１７１頁に言及あり）及び全ての分生子形成菌（Hawksworth et al., 1995（同上））をも含む。
【０２４３】
別の側面によれば、真菌宿主細胞は酵母細胞である。本明細書において「酵母」（yeast）とは、有子嚢胞子酵母（Endomycetales）、担子胞子形成酵母、及び不完全菌に属する酵母（Blastomycetes）を含む。酵母の分類は今後変更される可能性があるが、本発明の目的においては、酵母はBiology and Activities of Yeast（Skinner, F.A., Passmore, S.M., and Davenport, R.R., eds, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9, 1980）に記載の定義に従うものとする。
【０２４４】
別の側面によれば、酵母宿主細胞は、カンジダ（Candida）、ハンゼヌラ（Hansenula）、クルイベロミセス（Kluyveromyces）、ピチア（Pichia）、サッカロミセス（Saccharomyces）、シゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）、又はヤロウイア（Yarrowia）細胞である。
【０２４５】
別の側面によれば、酵母宿主細胞は、サッカロミセス・カールスベルゲンシス（Saccharomyces carlsbergensis）、サッカロミセス・セルビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、サッカロミセス・ジアスタチカス（Saccharomyces diastaticus）、サッカロミセス・ドウグラシ（Saccharomyces douglasii）、サッカロミセス・クルイベリ（Saccharomyces kluyveri）、サッカロミセス・ノルベンシス（Saccharomyces norbensis）、又はサッカロミセス・オビフォルミス（Saccharomyces oviformis）細胞である。別の側面によれば、酵母宿主細胞は、クルイベロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）細胞である。別の側面によれば、酵母宿主細胞は、ヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）細胞である。
【０２４６】
別の側面によれば、真菌宿主細胞は、糸状菌細胞である。「糸状菌」は（Hawksworth et al., 1995（同上）に定義のとおり）全ての真菌亜門（Eumycota）及び卵菌亜門（Oomycota）の線状体を含む。糸状菌は通常、キチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナン、及び他の複合多糖類からなる菌糸壁を特徴とする。栄養増殖は菌糸伸長により、炭素代謝は偏性好気性である。対して酵母、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）による栄養増殖は、単細胞性葉状体の出芽により、炭素代謝は醗酵でも可能である。
【０２４７】
別の側面によれば、糸状菌宿主細胞は、アクレモニウム（Acremonium）、アスペルギルス（Aspergillus）、アウレオバシジウム（Aureobasidium）、ブイェルカンデラ（Bjerkandera）、セリポリオプシス（Ceriporiopsis）、クリソスポリウム（Chrysosporium）、コプリナス（Coprinus）、コリオラス（Coriolus）、クリプトコッカス（Cryptococcus）、フィリバシジウム（Filibasidium）、フサリウム（Fusarium）、フミコラ（Humicola）、マナポルテ（Magnaporthe）、ムコール（Mucor）、ミセリオフトラ（Myceliophthora）、ネオカリマスティクス（Neocallimastix）、ニューロスポラ（Neurospora）、パエシロミセス（Paecilomyces）、ペニシリウム（Penicillium）、ファネロカエテ（Phanerochaete）、フレビア（Phlebia）、ピロミセス（Piromyces）、プレウロタス（Pleurotus）、スキゾフィラム（Schizophyllum）、タラロミセス（Talaromyces）、テルモアスカス（Thermoascus）、ティエラビア（Thielavia）、トリポクラジウム（Tolypocladium）、トラメテス（Trametes）、又はトリコデルマ（Trichoderma）細胞である。
【０２４８】
別の側面によれば、糸状菌宿主細胞は、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギルス・フミガタス（Aspergillus fumigatus）、アスペルギルス・（Aspergillus foetidus）、アスペルギルス・フォエティダス（Aspergillus japonicus）、アスペルギルス・ニドゥランス（Aspergillus nidulans）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）又はアスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）細胞である。別の側面によれば、糸状菌宿主細胞は、フザリウム・バクトリディオイデス（Fusarium bactridioides）、フザリウム・セレアリス（Fusarium cerealis）、フザリウム・クロークウェレンス（Fusarium crookwellense）、フザリウム・カルモラム（Fusarium culmorum）、フザリウム・グラミネアラム（Fusarium グラムinearum）、フザリウム・グラミナム（Fusarium グラムinum）、フザリウム・ヘテロスポラム（Fusarium heterosporum）、フザリウム・ネガンジ（Fusarium negundi）、フザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）、フザリウム・レチクララム（Fusarium reticulatum）、フザリウム・ロゼウム（Fusarium roseum）、フザリウム・サンブキナム（Fusarium sambucinum）、フザリウム・サルコキロウム（Fusarium sarcochroum）、フザリウム・スポロトリキオイデス（Fusarium sporotrichioides）、フザリウム・スルフレウム（Fusarium sulphureum）、フザリウム・トルロサム（Fusarium torulosum）、フザリウム・トリコテシオイデス（Fusarium trichothecioides）、又はフザリウム・ベネナツム（Fusarium venenatum）細胞である。別の側面によれば、糸状菌宿主細胞は、ブイェルカンデラ・アジュスタ（Bjerkandera adusta）、セリポリオプシス・アネイリナ（Ceriporiopsis aneirina）、セリポリオプシス・アネイリナ（Ceriporiopsis aneirina）、セリポリオプシス・カレジエナ（Ceriporiopsis caregiea）、セリポリオプシス・ジルベセンス（Ceriporiopsis gilvescens）、セリポリオプシス・パンノシンタ（Ceriporiopsis pannocinta）、セリポリオプシス・リブロザ（Ceriporiopsis rivulosa）、セリポリオプシス・スブルファ（Ceriporiopsis subrufa）、セリポリオプシス・スブベルミスポラ（Ceriporiopsis subvermispora）、クリソスポリウム・ケラチノフィラム（Chrysosporium keratinophilum）、クリソスポリウム・ルクノウェンス（Chrysosporium lucknowense）、クリソスポリウム・トロピカム（Chrysosporium tropicum）、クリソスポリウム・メルダリウム（Chrysosporium merdarium）、クリソスポリウム・イノプス（Chrysosporium inops）、クリソスポリウム・パニコラ（Chrysosporium pannicola）、クリソスポリウム・クィーンズランディカム（Chrysosporium queenslandicum）、クリソスポリウム・ゾナタム（Chrysosporium zonatum）、コプリナス・シネレウス（Coprinus cinereus）、コリオラス・ヒルスタス（Coriolus hirsutus）、フミコラ・インソレンス（Humicola insolens）、フミコラ・ラヌジノサ（Humicola lanuginosa）、ムコール・ミエヘイ（Mucor miehei）、ミセリオフトラ・テルモフィラ（Myceliophthora thermophila）、ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）、ペニシリウム・プルプロゲナム（Penicillium purpurogenum）、ファネロカエテ・クリソスポリウム（Phanerochaete chrysosporium）、フレビア・ラジアタ（Phlebia radiata）、プレウロタス・エリンギ（Pleurotus eryngii）、チエラビア・テレストリス（Thielavia terrestris）、トラメテス・ビロサ（Trametes villosa）、トラメテス・ベルシコロール（Trametes versicolor）、トリコデルマ・ハルジアナム（Trichoderma harzianum）、トリコデルマ・コニンギイ（Trichoderma koningii）、トリコデルマ・ロンギブラキアタム（Trichoderma longibrachiatum）、トリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）又はトリコデルマ・ビリデ（Trichoderma viride）細胞である。
【０２４９】
真菌細胞は、公知の手法により、プロトプラスト形成、プロトプラストの形質転換、及び細胞壁の再生を含むプロセスにより形質転換してもよい。アスペルギウス（Aspergillus）及びトリコデルマ（Trichoderma）宿主細胞の形質転換に適した手法は、欧州特許第２３８０２３号及び Yelton et al., 1984, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81:1470-1474 に記載されている。フサリウム（Fusarium）属の形質転換に適した手法は、Malardier et al., 1989, Gene 78:147-156、及び国際公開第９６／００７８７号に記載されている。酵母は、例えばBecker and Guarente, In Abelson, J.N. and Simon, M.I., editors, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp 182-187, Academic Press, Inc., New York；Ito et al., 1983, Journal of Bacteriology 153:163；及び Hinnen et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75:1920 に記載の手法により形質転換される。
【０２５０】
サブチラーゼ変異体を製造する方法
本発明は、本発明に係る単離酵素を製造する方法を提供する。この手法によれば、酵素をコードするＤＮＡ配列で形質転換された適切な宿主細胞を、酵素の産生を可能とする条件下で培養し、得られた酵素を培養物から回収する。
【０２５１】
酵素をコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターを異種宿主細胞に形質転換すれば、本発明の酵素の異種組換え産生が可能となる。これにより、同種の不純物を含まない、高度に精製されたサブチラーゼ組成物を産生することが可能となる。
【０２５２】
形質転換宿主細胞を培養するのに使用される培地としては、対象となる宿主細胞の成育に適した培地であれば、従来の任意の培地を使用できる。発現されたサブチラーゼは培地に分泌されるのが好適であり、周知の手法、例えば遠心分離又は濾過による培地からの細胞の分離や、硫酸アンモニウム等の塩を用いた培地中のタンパク質成分の沈殿等を用いて培地から回収した後、イオン交換クロマトグラフィーやアフィニティークロマトグラフィー等のクロマトグラフィー法に供してもよい。
【０２５３】
清浄及び洗剤組成物
本発明の酵素を洗剤組成物に添加してもよい。すなわち、本発明の酵素を洗剤組成物の構成要素としてもよい。清浄及び洗剤組成物については当業界では概して詳しく報告されているとおりであるが、適切な清浄及び洗剤組成物の更なる説明については、国際公開第９６／３４９４６号；国際公開第９７／０７２０２号；国際公開第９５／３００１１号を参照のこと。
【０２５４】
本発明の洗剤組成物は、例えば手洗い用又は洗濯機用洗剤組成物として、例えば汚れた布地の前処理に適した洗濯用添加剤組成物や、リンスを添加した柔軟剤組成物として調製することができる。また、家事全般における硬表面清浄作業用の洗剤組成物として、又は手洗い又は食器洗い機用に調製することができる。
【０２５５】
特定の形態によれば、本発明は、本発明の酵素を含む洗剤添加剤を提供する。洗剤添加剤及び洗剤組成物は、１又は２以上の他の酵素、例えばプロテアーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、アラビナーゼ、ガラクタナーゼ、キシラナーゼ、オキシダーゼ、例えばラッカーゼ、及び／又はペルオキシダーゼ等を含んでいてもよい。
【０２５６】
一般に、選択される酵素の特性は、選択される洗剤と適合性を有すべきであり（即ち最適ｐＨ、他の酵素系及び非酵素系成分との適合性等）、また、酵素は有効量で存在すべきである。
【０２５７】
プロテアーゼ：適切なプロテアーゼとしては、動物由来、植物由来又は微生物由来のものが挙げられる。微生物由来のものが好ましい。化学修飾された変異体や、タンパク質工学により操作された変異体も含まれる。プロテアーゼとしては、セリンプロテアーゼ又は金属プロテアーゼが挙げられるが、アルカリ性微生物プロテアーゼ又はトリプシン様プロテアーゼが好ましい。アルカリ性プロテアーゼの例としては、サブチリシン、特にバシラス（Bacillus）由来のもの、例えば、サブチリシンNovo、サブチリシンCarlsberg、サブチリシン３０９、サブチリシン１４７及びサブチリシン１６８（国際公開第８９/０６２７９号に記載）が挙げられる。トリプシン様プロテアーゼの例としては、トリプシン（例えば豚又は牛由来のもの）、及び、国際公開第８９／０６２７０号及び国際公開第９４／２５５８３号に記載のフサリウム（Fusarium）プロテアーゼが挙げられる。
【０２５８】
有用なプロテアーゼの例としては、国際公開第９２／１９７２９号、国際公開第９８／２０１１５号、国際公開第９８／２０１１６号、及び国際公開第９８／３４９４６号に記載の変異体、特に位置２７、３６、５７、７６、８７、９７、１０１、１０４、１２０、１２３、１６７、１７０、１９４、２０６、２１８、２２２、２２４、２３５及び２７４のうち１又は２以上の位置に置換を有する変異体が挙げられる。
【０２５９】
好ましい市販のプロテアーゼ酵素としては、ドゥラジム（Durazym）（登録商標）、リラーゼ（Relase）（登録商標）、アルカラーゼ（Alcalase）（登録商標）、サビナーゼ（登録商標）、プリマーゼ（Primase）（登録商標）、ドゥララーゼ（Duralase）（登録商標）、エスペラーゼ（Esperase）（登録商標）、オボザイム（Ovozyme）（登録商標）及びカンナーゼ（Kannase）（登録商標）（Novozymes A/S）、マキサターゼ（Maxatase）（登録商標）、マキサセル（Maxacal）（登録商標）、マキサペム（Maxapem）（登録商標）、プロペラーゼ（Properase）（登録商標）、プラフェクト（Purafect）（登録商標）、プラフェクトOxP（Purafect OxP）（登録商標）、FN2（登録商標）、FN3（登録商標）及び FN4（登録商標）（Genencor International、Inc.）が挙げられる。
【０２６０】
リパーゼ：適切なリパーゼとしては、細菌又は真菌由来のものが挙げられる。化学修飾された変異体や、タンパク質工学により操作された変異体も含まれる。有用なリパーゼの例としては、フミコラ（Humicola）（別名テルモミセス（Thermomyces））由来のリパーゼ、例えばＨ．ラヌギノザ（H. lanuginosa）（Ｔ．ラヌギノザ（T. lanuginosus））由来のもの（欧州特許出願第２５８ ０６８号及び欧州特許出願第３０５ ２１６号に記載）、又はＨ．イソレンス（H. insolens）由来のもの（国際公開第９６／１３５８０号に記載）、フュードモナス（Pseudomonas）リパーゼ、例えばＰ．アルカリ（P. alcali）遺伝子又はＰ．フュードアルカリ（P. pseudoalcali）遺伝子（欧州特許出願第２１８ ２７２号）、Ｐ．セパシア（P. cepacia）（欧州特許出願第３３１ ３７６号）、Ｐ．スツツゼリ（P. stutzeri）（英国特許出願第１，３７２，０３４号）、Ｐ．フルオレセンス（P. fluorescens）、フュードモナス株（Pseudomonas sp. strain）SD705（国際公開第９５／０６７２０号及び国際公開第９６／２７００２号）、Ｐ．ウィスコンシネンシス（P. wisconsinensis）（国際公開第 号 ９６/１２０１２）、バチラス（Bacillus）リパーゼ、例えばＢ．サブチリス（B. subtilis）由来のもの（Dartois et al. (1993), (Biochemica et Biophysica Acta, 1131, 253-360）、Ｂ．ステアロテルモフィラス（B. stearothermophilus）（特開昭６４−７４４９９２）又はＢ．プミラス（B. pumilus）由来のもの（国際公開第９１／１６４２２号）が挙げられる。
【０２６１】
他の例としては、例えば国際公開第９２／０５２４９号、国際公開第９４／０１５４１号、欧州特許出願第４０７ ２２５号、欧州特許出願第２６０ １０５号、国際公開第９５／３５３８１号、国際公開第９６／００２９２号、国際公開第９５／３０７４４号、国際公開第９４／２５５７８号、国際公開第９５／１４７８３号、国際公開第９５／２２６１５号、国際公開第９７／０４０７９号及び国際公開第９７／０７２０２号に記載のリパーゼ変異体が挙げられる。
【０２６２】
好ましい市販のリパーゼ酵素としては、リペックス（Lipex）（登録商標）、リポラーゼ（Lipolase）（登録商標）及びリポラーゼウルトラ（Lipolase Ultra）（登録商標）（Novozymes A/S）が挙げられる。
【０２６３】
アミラーゼ：適切なアミラーゼ（α及び／又はβ）としては、細菌又は真菌由来のものが挙げられる。化学修飾された変異体や、タンパク質工学により操作された変異体も含まれる。アミラーゼとしては、例えば、バチラス（Bacillus）から得られるα−アミラーゼ、例えばＢ．リケニフォルミス（B. licheniformis）の特別株由来のものが挙げられる。詳細は英国特許出願第１,２９６,８３９号に記載されている。
【０２６４】
有用なアミラーゼの例としては、国際公開第９４／０２５９７号、国際公開第９４／１８３１４号、国際公開第９６／２３８７３号、及び国際公開第９７／４３４２４号に記載の変異体、特に位置１５、２３、１０５、１０６、１２４、１２８、１３３、１５４、１５６、１８１、１８８、１９０、１９７、２０２、２０８、２０９、２４３、２６４、３０４、３０５、３９１、４０８、及び４４４のうち１又は２以上の位置に置換を有する変異体が挙げられる。
【０２６５】
市販のアミラーゼとしては、ドゥラミル（Duramyl）（登録商標）、テルマミル（Termamyl）（登録商標）、フンガミル（Fungamyl）（登録商標）及びBAN（登録商標）（Novozymes A/S）、ラピダーゼ（Rapidase）（登録商標）及びピュラスター（Purastar）（登録商標）（Genencor International Inc.）が挙げられる。
【０２６６】
セルラーゼ：適切なセルラーゼとしては、細菌又は真菌由来のものが挙げられる。化学修飾された変異体や、タンパク質工学により操作された変異体も含まれる。適切なセルラーゼとしては、バシラス（Bacillus）属、フュードモナス（Pseudomonas）属、フミコラ（Humicola）属、フサリウム（Fusarium）属、チエラビア（Thielavia）属、アクレモニウム（Acremonium）属由来のセルラーゼ、例えばフミコラ・インソレンス（Humicola insolens）、ミセリオフィソラ・テルモフィラ（Myceliophthora thermophila）及びフザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）由来の真菌セルラーゼ（米国特許第４，４３５，３０７号、米国特許第５，６４８，２６３号、米国特許第５，６９１，１７８号、米国特許第５，７７６，７５７号及び国際公開第８９／０９２５９号に開示）が挙げられる。
【０２６７】
特に適切なセルラーゼは、色彩上の利点を有するアルカリ性又は中性のセルラーゼである。斯かるセルラーゼの例としては、欧州特許出願第０ ４９５ ２５７号、欧州特許出願第０ ５３１ ３７２号、国際公開第９６／１１２６２号、国際公開第９６／２９３９７号、国際公開第９８／０８９４０号に記載のセルラーゼが挙げられる。他のセルラーゼ変異体の例としては、例えば国際公開第９４／０７９９８号、欧州特許出願第０ ５３１ ３１５号、米国特許第５，４５７，０４６号、米国特許第５，６８６，５９３号、米国特許第５，７６３，２５４号、国際公開第９５／２４４７１号、国際公開第９８／１２３０７号及び国際出願ＰＣＴ／ＤＫ９８／００２９９号に記載のものが挙げられる。
【０２６８】
市販のセルラーゼとしては、セルザイム（Celluzyme）（登録商標）及びケアザイム（Carezyme）（登録商標）（Novozymes A/S）、クラジナーゼ（Clazinase）（登録商標）及びピュラダックスHA（Puradax HA）（登録商標）（Genencor International Inc.）、並びにKAC-500(B)（登録商標）（Kao Corporation）が挙げられる。
【０２６９】
ペルオキシダーゼ／オキシダーゼ：適切なペルオキシダーゼ／オキシダーゼとしては、植物、細菌又は真菌由来のものが挙げられる。化学修飾された変異体や、タンパク質工学により操作された変異体も含まれる。有用なペルオキシダーゼの例としては、コプリナス（Coprinus）由来、例えばＣ．シネレウス（C. cinereus）由来のペルオキシダーゼ、及びその変異体（国際公開第９３／２４６１８号、国際公開第９５／１０６０２号、及び国際公開第９８／１５２５７号に記載）が挙げられる。市販の ペルオキシダーゼとしては、ガードザイム（Guardzyme）（登録商標）（Novozymes A/S）が挙げられる。
【０２７０】
洗剤酵素を洗剤組成物に含めるには、１又は２以上の酵素を含む個別の添加剤を加えてもよく、これら全ての酵素を含む組み合わせ添加剤を加えてもよい。本発明の洗剤添加剤、即ち個別の添加剤又は組み合わせ添加剤は、例えば粉末、液体、スラリー等として調製することができる。好ましい洗剤添加剤処方は、顆粒、特に非粉化顆粒、液体、特に安定化した液体、又はスラリーである。
【０２７１】
非粉化顆粒は、例えば米国特許第４，１０６，９９１号及び同第４，６６１，４５２号に開示の方法によって調製することができる。周知の方法により被覆してもよい。ワックス被覆材料の例としては、平均モル重量１０００〜２００００のポリ（エチレンオキシド）製品（ポリエチレングリコール、ＰＥＧ）；１６〜５０のエチレンオキシド単位を有するエトキシ化ノニルフェノール；アルコール部分が１２〜２０の炭素原子を含み、１５〜８０のエチレンオキシド単位を有するエトキシ化脂肪アルコール；脂肪アルコール；脂肪酸；並びに脂肪酸のモノ−、ジ−及びトリグリセリドが挙げられる。流動床法による適用に適した膜形成被覆材料の例は、英国特許出願第１４８３５９１号に記載のとおりである。液体酵素調製物を、確立された方法に従い、例えばポリオール、例えばプロピレングリコール、糖又は糖アルコール、乳酸又はホウ酸等を添加することにより安定化してもよい。保護された酵素は、例えば欧州特許出願第２３８，２１６号に開示の方法に従い調製することができる。
【０２７２】
本発明の洗剤組成物は、任意の便宜な形態とすることができる。例としては、棒状、錠剤状、粉末状、顆粒状、ペースト状、液状、粒状又は細粒状の、汎用又は「強力」（heavy-duty）洗浄剤、特に洗濯用洗剤；液状、ゲル状又はペースト状の汎用洗浄剤、特に所謂「強力」（heavy-duty）液剤；液状高級布地用洗剤；手洗い用食器洗い洗剤又は簡易（light duty）食器洗い洗剤、特に泡立ち型のもの；家庭用及び業務用の食器洗浄機用洗浄剤、例えば種々の錠剤状、粒状、液状及び濯ぎ補助型のものが挙げられる。組成物は単位毎の個別包装としてもよい。例としては、当業界に周知のものや、水溶性及び／又は透水性のものが挙げられる。液体洗剤としては、水性のもの、典型的には最大７０％の水と０〜３０％の有機溶媒を含むものでもよく、非水性のものでもよい。
【０２７３】
本発明の洗剤組成物は更に、界面活性剤、洗浄助剤（builders）、漂白剤、漂白活性化剤、漂白触媒、着色剤、漂白増強剤、キレート剤、染料移動剤、付着助剤（deposition aids）、分散剤、更なる酵素、及び酵素安定化剤、触媒材料、漂白活性化剤、過酸化水素、過酸化水素源、光学的光沢剤、光活性化剤、蛍光剤、柔軟材、予調製過酸、ポリマー状分散剤、土壌粘土除去／再付着防止剤（anti-redeposition agents）、充填剤塩、ヒドロトロープ（hydrotropes）、漂白剤、消泡剤、可塑剤、柔軟剤、加水分解性界面活性剤、保存料、抗酸化剤、縮み防止剤、殺菌剤、殺真菌剤、変色防止剤、防腐剤、アルカリ源、溶解剤、担体、処理助剤、顔料、染料、香料、及びｐＨ調整剤、他の酵素、酵素安定化系を含んでいてもよい。
【０２７４】
すなわち、洗剤組成物は、１又は２以上の界面活性剤を含む。界面活性剤は、非イオン性（半極性含む）、及び／又は、アニオン性、及び／又は、カチオン性、及び／又は、双イオン性、及び／又は、両イオン性、及び／又は、半極性非イオン性、及び／又は、これらの混合の何れでもよい。界面活性剤は通常、洗剤組成物に対して０．１〜６０重量％の範囲の量で存在するが、別の実施形態では、約１％〜約５０％の量であり、更に別の実施形態では、約５％〜約４０％の量である。
【０２７５】
場合により、洗剤は通常、約１％〜約４０％のアニオン性界面活性剤、例えば直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩、α−オレフィンスルホン酸塩、アルキル硫酸塩（脂肪アルコール硫酸塩）、アルコールエトキシ硫酸塩、２級アルカンスルホン酸塩、α−スルホ脂肪酸メチルエステル、アルキル−又はアルケニルコハク酸、又は石鹸を含む。
【０２７６】
更なる適切なアニオン性界面活性剤としては、石鹸、及び、スルフェート又はスルホン酸基を含むものが挙げられる。スルホン酸型の界面活性剤の中で考慮されるものとしては、（Ｃ９−Ｃ１３−アルキル）ベンゼンスルホン酸塩及びオレフィンスルホン酸塩が挙げられる。後者は、アルケンスルホン酸塩及びヒドロキシアルカンスルホン酸塩、並びに同ジスルホン酸塩の混合物であると理解される。これは例えば、末端又は内部に二重結合を有するＣ１２−Ｃ１８モノオレフィンのスルホン酸化により得られる。他に適切なものとしては、（Ｃ１２−Ｃ１８）アルカンスルホン酸塩、及び、α−スルホ脂肪酸（エステルスルホン酸塩）のエステル、例えばココナッツ、パーム核又は獣脂の脂肪酸の水素添加物のα−スルホン酸化メチルエステルが挙げられる。ＭＥＳの鹸化により得られるα−スルホカルボン酸も使用できる。
【０２７７】
更に適切なアニオン性界面活性剤としては、モノ−、ジ−及びトリ−エステル並びにそれらの混合物を含む、スルホン酸化脂肪酸グリセロールエステルが挙げられる。
【０２７８】
好適なアルキル（アルケニル）硫酸塩は、例えばココナッツ脂肪アルコール、獣脂脂肪アルコール、ラウリル、ミリスチル、セチル若しくはステアリルアルコール等のＣ１２−Ｃ１８脂肪アルコール又はＣ１０−Ｃ２０オキソアルコールの硫酸モノエステルのアルカリ金属塩及びナトリウム塩、又は同鎖長の２級アルコールの硫酸モノエステルのアルカリ金属塩及びナトリウム塩が挙げられる。洗浄技術の観点からは、とりわけ好適なのはＣ１２−Ｃ１６アルキルスルホン酸塩、Ｃ１２−Ｃ１５アルキルスルホン酸塩、特にＣ１４−Ｃ１５アルキルスルホン酸塩である。適切なアニオン性界面活性剤としては、例えば米国特許第３，２３４，２５８号又は米国特許第５，０７５，０４１号に従って調製されるアルカン−２，３−ジイルビス（硫酸塩）も挙げられる。
【０２７９】
他に適切なのは、１〜６モルのエチレンオキシドでエトキシ化された直鎖又は分岐のＣ７−Ｃ２１アルコール硫酸モノエステル、例えば平均３．５モルのエチレンオキシド（ＥＯ）による２−メチル−分岐Ｃ９−Ｃ１１アルコール、又は、１〜４ＥＯによるＣ１２−Ｃ１８脂肪アルコールが挙げられる。これらは高発泡特性を有するため、通常は洗浄及び清浄組成物に少量、例えば１〜５重量％加えられる。
【０２８０】
アニオン性界面活性剤は更に、スルホコハク酸とＣ８−Ｃ１８脂肪アルコール残基とのジエステル、及び／又は、そのモノエステルの塩、或いはそれらの混合物を含んでいてもよい。とりわけ好ましいのは、脂肪アルコール残基の鎖長分布が小さいスルホコハク酸塩である。また、好ましくはアルキル（アルケニル）鎖内に８〜１８Ｃ原子を有するアルキル（アルケニル） スルホコハク酸又はその塩を使用することも可能である。
【０２８１】
考慮に値する他のアニオン性界面活性剤としては、アミノ酸の脂肪酸誘導体、例えばメチルタウリン（タウリド（taurides））及び／又はメチルグリシン（サルコシド（sarcosides））の誘導体である。考慮すべき他のアニオン性界面活性剤は石鹸である。飽和脂肪酸石鹸、例えばラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、水素化エルカ酸及びベヘン酸の塩、並びに、天然脂肪酸由来の石鹸混合物、例えばココナッツ、パーム核又は獣脂脂肪酸由来のもの。アニオン性界面活性剤（石鹸を含む）は、そのナトリウム、カリウム又はアンモニウム塩の形態で存在していてもよく、有機塩基（例えばモノ−、ジ−又はトリエタノールアミン）との可溶塩の形態で存在してもよい。アニオン性界面活性剤はそのナトリウム又はカリウム塩の形態で存在してもよい。
【０２８２】
非イオン性界面活性剤としては、アルコキシル化された（好適にはエトキシ化及び／又はプロポキシ化された）１級アルコールであって、８〜１８Ｃ原子を有し、アルコール１モルに対して平均１〜１２モルのエチレンオキシド（ＥＯ）及び／又は１〜１０モルのプロピレンオキシド（ＰＯ）を有するものを用いることが好ましい。とりわけ好ましいのは、Ｃ８−Ｃ１６アルコールアルコキシレート、好適にはエトキシ化及び／又はプロポキシ化されたＣ１０−Ｃ１５アルコールアルコキシレート、特にＣ１２−Ｃ１４アルコールアルコキシレートであって、エトキシ化度が２〜１０、又は３〜８、及び／又は、プロポキシ化度が１〜６、又は１．５〜５のものである。アルコール残基は、直鎖であるか、特に２位にメチル分岐鎖を有することが好ましいが、通常のオキソアルコールのように、直鎖とメチル分岐鎖との混合物であってもよい。しかしながら、とりわけ好ましいのは、１２〜１８のＣ原子を有する天然由来の直鎖アルコール（例えばココナッツ、パーム及び獣脂脂肪アルコール又はオレイルアルコール等）と、アルコール１モルあり平均２〜８のＥＯとからなるアルコールエトキシレートである。エトキシ化アルコールとしては、例えば、３ＥＯ又は４ＥＯを有するＣ１２−Ｃ１４アルコール、７ＥＯを有するＣ９−Ｃ１１アルコール、３ＥＯ、５ＥＯ、７ＥＯ又は８ＥＯを有するＣ１３−Ｃ１５アルコール、３ＥＯ、５ＥＯ又は７ＥＯを有するＣ１２−１８アルコール、これらの混合物、例えば３ＥＯを有するＣ１２−Ｃ１４アルコールと５ＥＯを有するＣ１２−Ｃ１８アルコールとの混合物が挙げられる。上述のエトキシ化及びプロポキシ化度は統計平均値であって、製品によって整数の場合も小数の場合もある。アルコールエトキシレート及びプロポキシレートは、同族体分布が制限されていることが好ましい（狭い範囲のエトキシレート／プロポキシレート、ＮＲＥ／ＮＲＰ）。これらの非イオン性界面活性剤に加えて、１２超のＥＯを有する脂肪アルコールエトキシレートを使用してもよい。例としては、１４ＥＯ、２５ＥＯ、３０ＥＯ又は４０ＥＯを有する獣脂脂肪アルコールエトキシレートが挙げられる。
【０２８３】
他に適切なものとしては、アルコキシル化（エトキシ化及び／又はプロポキシ化）されたアミンであって、１アルキル鎖当たり１〜１８のＣ原子を有し、アミン１モル当たり平均で１〜１２モルのエチレンオキシド（ＥＯ）及び／又は１〜１０モルのプロピレンオキシド（ＰＯ）を有する１級及び２級アミンが挙げられる。
【０２８４】
加えて、更なる非イオン性界面活性剤として、一般式Ｒ１Ｏ（Ｇ）ｘのアルキルポリグリコシドも使用できる。式中、Ｒ１は、Ｃ原子数８〜２２、好ましくは１２〜１８の１級直鎖又はメチル分岐（特に２位メチル分岐鎖）アルキル基であり、記号「Ｇ」は、Ｃ原子数５又は６のグリコース（単糖）単位である。Ｇとしてはグルコースが好ましい。重合度ｘは、グリコース単位の平均数を表し、通常は１〜１０の範囲であるが、１．２〜１．４が好ましい。
【０２８５】
単独の非イオン性界面活性剤として、又は他の非イオン性界面活性剤との組み合わせとして使用可能な、更なる非イオン性界面活性剤の種類としては、アルコキシル化（好ましくはエトキシ化、又は、エトキシ化及びプロポキシ化）脂肪酸アルキルエステル、であって、アルキル鎖が１〜４のＣ原子を有するもの、特に脂肪酸メチルエステル（例えば特開昭５８−２１７５９８に記載のもの）が挙げられる。
【０２８６】
アミンオキシド型の非イオン性界面活性剤、例えばＮ−（ココアルキル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミンオキシド及びＮ−（獣脂−アルキル）−Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミンオキシド、並びに脂肪酸アルカノールアミド又はエトキシ化脂肪酸アルカノールアミド型の非イオン性界面活性剤も適切である。
【０２８７】
より好適な実施形態によれば、界面活性剤は、ドデシル硫酸ナトリウム、４級アンモニウム化合物、ヨウ化アルキルピリジニウム、Tween 80、Tween 85、Triton X-100、Brij 56、生物学的界面活性剤、ラムノリピド（rhamnolipid）、サーファクチン（surfactin）、ビスコンシン（visconsin）、又はスルホン酸である。
【０２８８】
場合により、洗剤は通常、約０．２％〜約４０％の非イオン性界面活性剤、例えばアルコールエトキシレート、ノニル-フェノールエトキシレート、アルキルポリグリコシド、アルキルジメチルアミンオキシド、エトキシ化脂肪酸モノエタノールアミド、脂肪酸モノエタノールアミド、ポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミド、又はグルコサミンのＮ−アシルＮ−アルキル誘導体（「グルコサミド」）を有していてもよい。
【０２８９】
ある実施形態によれば、本発明は、布地１グラム当たり、少なくとも１つの界面活性剤の濃度が、０〜５００、０．００００１〜１００、０．０００１〜５０、０．０００１〜４０、０．００１〜３０、０．０１〜２０、０．１〜１５、１〜１０ミリグラムである方法に関する。
【０２９０】
ある実施形態によれば、本発明は、溶液１Ｌ当たり、少なくとも１つの界面活性剤の濃度が、０〜５０、０．０００１〜４０、０．００１〜３０、０．０１〜２０、０．１〜１０、又は１〜５ｇである方法に関する。
【０２９１】
洗剤は、０〜６５％の洗浄助剤（detergent builder）又は錯化剤（complexing agent）、例えばゼオライト、二リン酸塩、三リン酸塩、ホスホン酸塩、カルボン酸塩、クエン酸塩、ニトリロ三酢酸、エチレンジアミン四酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸、アルキル又はアルケニルコハク酸、可溶性ケイ酸塩又は層状ケイ酸塩、例えばＭＧＤＡ（メチルグリシン二酢酸）、又は代わりにＧＬＤＡ（Ｌ−グルタミン酸、Ｎ，Ｎ−二酢酸、四ナトリウム塩）を含んでいてもよい。洗剤組成物は、洗浄助剤による補助を受けない（unbuilt）、即ち本質的に洗浄助剤を含まないものであってもよい。
【０２９２】
洗浄助剤の量は、例えば５％超、１０％超、２０％超、３０％超、４０％超又は５０％超であり、また、８０％未満、６５％未満である。食器洗い用洗剤の場合、洗浄助剤の量は通常４０〜６５％、特に５０〜６５％である。
【０２９３】
洗浄助剤としては特に、Ｃａ及びＭｇと水溶性錯体を形成するキレート剤であってもよい。洗浄助剤とＣａ＋＋及び／又はＭｇ＋＋とにより形成される錯体の強度は、ｌｏｇＫ値により（平衡又は安定度定数として、又は所与のｐＨでの条件安定度定数として）表され、３〜８の範囲、特に５〜８の範囲である。安定度定数は、例えば２５℃で、イオン強度０．１Ｍで測定され、条件安定度定数は、例えば同じ条件で、ｐＨ８．５又は９で測定される。
【０２９４】
洗浄助剤はアミノ基を有していてもよく、例えばアミノカルボキシレート、アミノポリカルボキシレート又はホスフェートであってもよい。１、２又は３つのアミノ基（通常は２級又は３級アミノ基）を含むモノマー分子であってもよく、２、３、４又は５つのカルボキシル基を有していてもよい。適切な洗浄助剤の例としては、メチルグリシン二酢酸（ＭＧＤＡ）、グルタミン酸Ｎ，Ｎ−二酢酸（Ｎ，Ｎ−ジカルボキシメチルグルタミン酸四ナトリウム塩、ＧＬＤＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、ジエチレントリアミンン五酢酸（ＤＴＰＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸（ＥＤＤＳ）、Ｎ−（１，２−ジカルボキシエチル）−Ｄ，Ｌ−アスパラギン酸（ＩＤＳ）及びＮ−（２−ヒドロキシエチル）イミノ二酢酸（ＥＤＧ）、及びそれらの塩が挙げられる。
【０２９５】
洗浄助剤の緩衝能（別名余アルカリ度（reserve alkalinity））は４超であることが好ましい（緩衝定数における酸及び塩の総量を一定とした場合に、１リットルの緩衝溶液のｐＨを１単位変更するのに必要な強酸の当量数）。
【０２９６】
洗浄助剤は、例えば国際公開第０９／１０２８５４号に記載される、環境配慮型の抑制剤（sequesterant）であってもよい。適切な環境配慮型の抑制剤としては、１又は２以上のアミノ酸系抑制剤、コハク酸系抑制剤、クエン酸及びそれらの塩が挙げられる。
【０２９７】
適切なアミノ酸系化合物の例としては、ＭＧＤＡ（メチルグリシン二酢酸）並びにその塩及び誘導体、ＧＬＤＡ（グルタミン−Ｎ，Ｎ−二酢酸）並びにその塩及び誘導体が挙げられる。他の適切な洗浄助剤は、米国特許第６４２６２２９号に記載されている。特定の適切な洗浄助剤としては、例えば、アスパラギン酸−Ｎ−モノ酢酸（ＡＳＭＡ）、アスパラギン酸−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＡＳＤＡ）、アスパラギン酸−Ｎ−モノプロピオン酸（ＡＳＭＰ）、イミノジコハク酸（ＩＤＡ）、Ｎ−（２−スルホメチル）アスパラギン酸（ＳＭＡＳ）、Ｎ−（２−スルホエチル）アスパラギン酸（ＳＥＡＳ）、Ｎ−（２−スルホメチル）グルタミン酸（ＳＭＧＬ）、Ｎ−（２−スルホエチル）グルタミン酸（ＳＥＧＬ）、Ｎ−メチルイミノ二酢酸（ＭＩＤＡ）、α−アラニン−Ｎ，Ｎ−二酢酸（α−ＡＬＤＡ）、セリン−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＳＥＤＡ）、イソセリン−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＩＳＤＡ）、フェニルアラニン−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＰＨＤＡ）、アントラニル酸−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＡＮＤＡ）、スルファニル酸−Ｎ、Ｎ−二酢酸（ＳＬＤＡ）、タウリン−Ｎ、Ｎ−二酢酸（ＴＵＤＡ）及びスルホメチル−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＳＭＤＡ）、並びにこれらのアルカリ金属塩又はアンモニウム塩が挙げられる。一側面によれば、ＧＬＤＡ塩及びその誘導体も使用できる。一側面によれば、ＧＬＤＡの四ナトリウム塩が使用できる。
【０２９８】
適切な洗浄助剤の更なる例としては、Ｎ−（ヒドロキシエチル）−エチリデンジアミントリアセテート（ＨＥＤＴＡ）、ジエタノールグリシン（ＤＥＧ）、１−ヒドロキシエチリデン−１，１−ジホスホン酸（ＨＥＤＰ）、ジエチレントリアミンン五（メチレンホスホン酸）（ＤＴＰＭＰ）、エチレンジアミン四（メチレンホスホン酸）（ＥＤＴＭＰＡ）及びアミノトリス（メチレンホスホン酸）（ＡＴＭＰ）が挙げられる。
【０２９９】
適切なコハク酸化合物の例は、米国特許第５９７７０５３号に記載されている。一側面によれば、適切なコハク酸化合物としてイミノコハク酸四ナトリウムが挙げられる。
【０３００】
洗浄助剤の分類は、M.K.Nagarajan et al., JAOCS, Vol. 61, no. 9 (September 1984), pp. 1475-1478 に記載の方法により行うことができる。この方法は、濃度０．２００％の仮想的な洗剤溶液において、ｐＨ１０．５における水硬度を２００ｐｐｍ（ＣａＣＯ３換算）から１０ｐｐｍまで下げるのに必要な洗浄助剤の最低濃度を決定し、仮想的な洗剤中における重量％で表す。或いは、現代の一般的な洗濯用洗剤がより低いｐＨを有することを反映して、ｐＨ８．５で実施してもよい。この方法を何れかのｐＨで実施した場合に求められるレベルは０〜２５％（強）、２５〜３５％（中）又は＞３５％（弱）である。より好ましいのは、強及び中の洗浄助剤を含む組成物であり、最も好ましいのは、強程度の洗浄助剤を含む組成物である。
【０３０１】
洗浄助剤は、強洗浄助剤、例えばメチルグリシン二酢酸（「ＭＧＤＡ」）又はＮ，Ｎ−ジカルボキシメチルグルタミン酸四ナトリウム塩（ＧＬＤＡ）等であってもよく、中洗浄助剤、例えばナトリウムトリ−ポリリン酸（ＳＴＰＰ）等であってもよく、弱洗浄助剤、例えばナトリウムクエン酸塩等であってもよい。より好ましいのは、強及び中の洗浄助剤を含む組成物であり、最も好ましいのは、強程度の洗浄助剤を含む組成物である。他の洗浄助剤の例としては、ゼオライト、二リン酸塩、三リン酸塩、ホスホン酸塩、カルボン酸塩、ニトリロ三酢酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミンン五酢酸、アルキル又はアルケニルコハク酸、可溶性ケイ酸塩及び層状ケイ酸塩（例えば Hoechst 製 SKS-6）等が挙げられる。
【０３０２】
洗剤は１又は２以上のポリマーを含んでいてもよい。例としては、カルボキシメチルセルロース、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニル−ピリジン−Ｎ−オキシド）、ポリ（ビニルイミダゾール）、ポリカルボキシレート、例えばポリアクリレート、マレイン酸／アクリル酸コポリマー、及びラウリルメタクリレート／アクリル酸コポリマー等が挙げられる。
【０３０３】
洗剤は、漂白系、又は、１又は２以上の漂白剤を含んでいてもよい。これらはＨ２Ｏ２源、例えば過ホウ酸塩又は過カルボン酸塩等を含んでいてもよく、更にはこれらとの組み合わせで、過酸形成漂白活性化剤、例えば四アセチルエチレンジアミン又はノナノイルオキシベンゼンスルホン酸等を含んでいてもよい。或いは、漂白系は、例えばアミド、イミド、又はスルホン形のペルオキシ酸を含んでいてもよい。更に適切な漂白剤としては、その他の光漂白剤、予調製過酸、過酸化水素源、漂白活性化剤、過酸化水素、漂白触媒、及びこれらの混合物が挙げられる。一般に、漂白剤を使用する場合、本発明の組成物は、清浄組成物に対する重量比で、例えば約０．１％〜約５０％、更には約０．１％〜約２５％の漂白剤を含有する。
【０３０４】
洗剤は、他の従来の洗剤成分を含んでいてもよい。例えば、粘土を含む柔軟材、発泡増強剤、消泡剤、防腐剤、汚れ成分懸濁剤、汚れ成分再付着防止剤（anti-soil redeposition agents）、染料、抗細菌剤、光学的光沢剤、ヒドロトロープ（hydrotropes）、変色防止剤、又は香料等が挙げられる。
【０３０５】
地方や地域によって、例えば水硬度や洗浄温度等の条件にばらつきがあるため、地域用の洗剤組成物も求められる。洗剤例１及び２は夫々、一般的な欧州の自動食器洗浄機（ＡＤＷ）用洗剤及び一般的な欧州の粉末洗剤の組成範囲である。
【０３０６】
洗剤例１：一般的な欧州のＡＤＷ洗剤組成物
【表４】
0005947213.tif 000005
【０３０７】
洗剤例２：一般的な欧州の粉末洗剤組成物
【表５】
0005947213.tif 000006
【０３０８】
本発明の洗剤組成物の酵素は、従来の安定化剤及びプロテアーゼ阻害剤により安定化されていてもよい。例としては、ポリオール、例えばプロピレングリコール又はグリセロール、糖又は糖アルコール、異なる塩、例えばＮａＣｌ；ＫＣｌ；乳酸、ギ酸、ホウ酸、又はホウ酸誘導体、例えば芳香族ホウ酸エステル等、又はフェニルホウ酸誘導体、例えば４−ホルミルフェニルホウ酸、又はペプチドアルデヒド、例えばジ−、トリ−又はテトラペプチドアルデヒド又はアルデヒド類似物（式Ｂ１−Ｂ０−Ｒで表されるもの（式中、ＲはＨ、ＣＨ３、ＣＸ３、ＣＨＸ２、又はＣＨ２Ｘ（Ｘ＝ハロゲン）であり、Ｂ０は単一のアミノ酸残基（好ましくは、置換されていてもよい脂肪族又は芳香族側鎖を有するもの）であり；Ｂ１は１又は２以上（好ましくは１、２又は３つ）のアミノ酸残基からなり、Ｎ末端保護基を有していてもよい）、又は、国際公開第０９１１８３７５号及び国際公開第９８／１３４５９号に記載のもの）、又はタンパク質型のプロテアーゼ阻害剤、例えばRASI、BASI、WASI（米、大麦及び小麦由来の二官能型α−アミラーゼ／サブチリシン阻害剤）又は CI2 又は SSI が挙げられる。組成物は、例えば国際公開第９２／１９７０９号、国際公開第９２／１９７０８号及び米国特許６，４７２，３６４号の記載に従って調製される。ある実施形態によれば、本明細書で使用される酵素は、最終的に調製された組成物中において、水溶性の亜鉛（II）、カルシウム（II）及び／又はマグネシウム（II）イオン源の存在により安定化される。これにより、前述のイオンや、その他の他の金属イオン（例えばバリウム（II）、スカンジウム（II）、鉄（II）、マンガン（II）、アルミニウム（III）、錫（II）、コバルト（II）、銅（II）、ニッケル（II）、及びオキソバナジウム（IV）等）が酵素に提供される。
【０３０９】
現時点では、洗剤組成物に対し、任意の単一の酵素、特に本発明の酵素を、例えば洗浄液１リットル当たり酵素タンパク質０．０１〜２００ｍｇ、好ましくは洗浄液１リットル当たり酵素タンパク質０．０５〜５０ｍｇ、特に洗浄液１リットル当たり酵素タンパク質０．１〜１０ｍｇ加えることが考えられる。
【０３１０】
通常、本発明の洗剤組成物は、本発明により提供される少なくとも１つの酵素を、例えば、少なくとも０．０００１重量％、約０．０００１〜約１０、約０．００１〜約１、又は約０．０１〜約０．１、又は約０．０５〜約１５％、又は約０．０５〜約２０％、又は約１〜約２０％、又は約１〜約１５％の濃度で含んでいればよい。好ましい実施形態によれば、本明細書において提供される洗剤組成物は通常、水を用いた清浄操作において、洗浄水のｐＨが約５．０〜約１１．５となるように調製され、別の実施形態によれば、約６．０〜約１０．５となるように調製される。好ましい実施形態によれば、粒状又は液状洗濯製品は、ｐＨが約６〜約８となるように調製される。所望の使用レベルとなるようにｐＨを調整する手法としては、緩衝剤、アルカリ、酸等の使用が挙げられ、当業者には周知である。
【０３１１】
更に、本発明の酵素を、国際公開第９７／０７２０２号に開示の洗剤処方に配合してもよい。本公報は引用により本明細書に組み込まれる。
【０３１２】
材料及び方法
プロテアーゼ変異体活性の決定方法
【０３１３】
布地：
標準布片はEMPA St. Gallen, Lerchfeldstrasse 5, CH-9014 St.Gallen, Switzerlandから入手される。特にタイプEMPA117（血液、ミルク及びインク汚れ付着ポリエステル／綿布地）。標準布片はCenter For Testmaterials BV, P.O. Box 120, 3133 KT Vlaardingen, the Netherlandsから入手される。特にタイプC-10（オイル／ミルク／色素汚れ付着綿）及びPC-03（チョコレートミルク／すす汚れ付着ポリエステル／綿布地）。
【０３１４】
メラミンタイル：
標準的なメラミンタイルはCenter For Testmaterials BV, P.O. Box 120, 3133 KT Vlaardingen（オランダ）から入手される。特にタイプDM-21（卵黄）。
【０３１５】
菌種及びプラスミド：
バシラス・レンタス（Bacillus lentus）株３０９はＮＣＩＢに寄託され、受託番号ＮＣＩＢ１０３０９を受けているもので、米国特許第３，７２３，２５０号に記載されている。本公報は引用により本明細書に組み込まれる。親サブチラーゼ３０９又はサビナーゼ（登録商標）は、株３０９から取得される。発現宿主生物はバシラス・サブチリス（Bacillus subtilis）である。
【０３１６】
プラスミドｐＳＸ２２２を、大腸菌（E. coli）−バシラス・サブチリス（Bacillus subtilis）シャトルベクター及びバシラス・サブチリス（Bacillus subtilis）発現ベクターとして使用する（国際公開第９６/３４９４６号に記載のとおり）。
【０３１７】
一般的な分子生物学的手法：
別途記載しない限り、ＤＮＡ操作及び形質転換は、分子生物学の標準的な手法を用いて行う（Sambrook et al. (1989) Molecular cloning：A laboratory manual, Cold Spring Harbor lab., Cold Spring Harbor, NY；Ausubel, F. M. et al. (eds.) "Current protocols in Molecular Biology". John Wiley and Sons, 1995； Harwood, C. R., and Cutting, S. M. (eds.) "Molecular Biological Methods for Bacillus". John Wiley and Sons, 1990）。
【０３１８】
ＤＮＡ操作のための酵素：
別途記載しない限り、ＤＮＡ操作のための酵素（例えば制限エンドヌクレアーゼ、リガーゼ等）は全て、New England Biolabs, Inc. から入手する。ＤＮＡ操作用の酵素は、サプライヤーの説明書に従って使用する。
【０３１９】
醗酵：
サブチラーゼ酵素の産生のための醗酵は、５０ｍｌ試験管内に１５ｍｌの二重ＴＹ培地（double TY media）を入れて、ｐＨ７．３、３７℃で、回転振盪台を用いて２２５ｒｐｍで２〜３日かけて行う。
【０３２０】
ＴＹ培地の説明については、"Current protocols in Molecular Biology". John Wiley and Sons, 1995; Harwood, C. R., and Cutting, S. M. (eds.) の１．１．３「Media Preparation and Bacteriological Tools」の欄を参照のこと。
【０３２１】
精製：
宿主細胞から分泌されるサブチラーゼ変異体は、周知の手法により培地から好適に回収できる。例としては、遠心分離又は濾過により細胞を培地から分離し、又は、例えば硫酸アンモニウム等の塩を用いて培地中のタンパク質成分を沈殿させた後、イオン交換クロマトグラフィーやアフィニティークロマトグラフィー等のクロマトグラフィー法にかける手法が挙げられる。
【０３２２】
触媒活性
本発明の変異体の触媒活性は、例えば以下の「Kinetic Suc AAPF-pNA」アッセイを用いて決定することができる。
ｐＮＡ基質：Suc-AAPF-pNA（Bachem L-1400）。
温度：室温。
アッセイ緩衝剤：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、ｐＨ９．０。
【０３２３】
２０ｍｌプロテアーゼ（０.０１％ Triton X-100で希釈）を１００ｍｌのアッセイ緩衝剤と混合する。１００ｍｌのｐＮＡ基質（５０ｍｇを１．０ｍｌのＤＭＳＯに溶解させ、更に０.０１％の Triton X-100 で４５倍に希釈する）を加えてアッセイを開始する。ＯＤ４０５の増加をモニターし、プロテアーゼ活性の指標とする。
【０３２４】
洗浄性能試験：
選択されたサブチラーゼ変異体の洗剤組成物中における洗浄性能を調べるには、洗浄実験を実施する。本発明の酵素変異体は自動機械負荷アッセイ（Automated Machine Stress Assay：ＡＭＳＡ）で試験する。ＡＭＳＡ試験により、少量の酵素洗剤溶液の洗浄性能を、多数調べることが可能になる。詳細は実施例３を参照のこと。
【０３２５】
洗剤：
本発明のサブチラーゼ酵素の洗浄性能試験のための洗剤は、完成品である市販の洗剤を市場で購入し、熱処理（水溶液中８５℃で５分間）によって酵素成分を不活性化することにより、得ることができる。また、酵素を含まない市販の洗剤基材を製造者から直接購入することも可能である。更には、本明細書の記載に従い、適切なモデル洗剤を調製し、洗浄性能試験に使用してもよい。
【実施例】
【０３２６】
実施例１
酵素変異体の構築及び発現：
本発明の変異体は、当業者に周知の手法で構築し、発現させることが可能である。下記は本発明に係る変異体の作製法の例である。
【０３２７】
部位特異的突然変異誘発法：
特定の挿入／欠失／置換を含む本発明のサブチリシン３０９（サビナーゼ（登録商標））の位置特異的変異体は、所望の突然変異を含むオリゴを用いたＰＣＲで作製したＤＮＡ断片を従来法でクローニングすることにより作製される（Sambrook et al., Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor, 1989）。
【０３２８】
テンプレートプラスミドＤＮＡとしてはｐＳＸ２２２、又はサブチリシン３０９変異体を含有するその類似体が使用し得る。オリゴを用いた突然変異誘発法によって、変異体のコンストラクトに突然変異を導入する。
【０３２９】
サブチリシン３０９変異体を大腸菌（E. coli）に形質転換する。斯かる形質転換体の一晩培養物から精製されたＤＮＡを、制限エンドヌクレアーゼ消化、ＤＮＡ断片の精製、連結、Ｂ．サブチリス（B. subtilis）の形質転換という手順により、Ｂ．サブチリス（B. subtilis）に形質転換する。Ｂ．サブチリス（B. subtilis）の形質転換は、Dubnau et al., 1971, J. Mol. Biol. 56, pp. 209-221 に記載の手法で実施する。
【０３３０】
特定の領域に突然変異を導入するための部位特異的突然変異誘発法：
変異原性プライマー（オリゴヌクレオチド）は、突然変異部位の側位に存在し、挿入／欠失／置換を定義するＤＮＡ塩基対により分離されるＤＮＡ配列に対応するように合成する。
【０３３１】
続いて、得られた変異原性プライマーを用いて、修飾されたプラスミドｐＳＸ２２２のＰＣＲ反応を実施する。得られたＰＣＲ断片を精製し、第２のＰＣＲ反応により伸長し、得られたＰＣＲ産物を精製し、第３のＰＣＲ反応により伸長した後、エンドヌクレアーゼで消化し、大腸菌（E. coli）−Ｂ．サブチリス（B. subtilis）シャトルベクターｐＳＸ２２２にクローン化する。ＰＣＲ反応は通常の条件下で実施する。プラスミドＤＮＡは常法により大腸菌（E. coli）に形質転換し、大腸菌（E. coli）コロニーの一つの配列を決定して計画通りの突然変異が生じていることを確認する。
【０３３２】
本発明のサブチラーゼ変異体を精製するために、本発明の変異体を含むｐＳＸ２２２発現プラスミドをコンピテントなＢ．サブチリス（B. subtilis）株に形質転換し、上述の手法で醗酵した。
【０３３３】
実施例２
酵素の精製及び濃度測定：
醗酵後、サブチリシン変異体の精製は、疎水性電荷誘導クロマトグラフィー（Hydrophobic Charge Induction Chromatography：ＨＣＩＣ）及びそれに続く真空濾過により行う。
【０３３４】
酵素を捕捉するために、ＨＣＩＣには、４−メルカプト−エチル−ピリジン（４−ＭＥＰ）を結合したセルロースマトリックスを使用する。
【０３３５】
８０〜１００μｍサイズのセルロースマトリックスのビーズを、酵母エキス及びサブチリシン変異体分泌能を有する形質転換Ｂ．サブチリス（B. subtilis）を含む培地と混合し、Unifilter（登録商標）マイクロプレート中、ｐＨ９.５でインキュベートする。
【０３３６】
４−ＭＥＰはｐＨ＞７で疎水性であり、サブチリシン変異体はｐＨ９．５で疎水性であるので、分泌された酵素とビーズ上の４−ＭＥＰとの間に疎水性会合が形成される。インキュベーション後、培地及び細胞残屑を真空濾過で除去し、ビーズ及び酵素をフィルター上に回収する。
【０３３７】
酵素をビーズから溶出させるために、フィルターを溶出緩衝液（ｐＨ５）で洗浄してｐＨを低下させる。こうしてビーズから離れた酵素を、緩衝液から回収することができる。
【０３３８】
精製されたサブチリシン酵素変異体の濃度を、活性部位滴定（active site titration：ＡＳＴ）により決定する。
【０３３９】
精製された酵素を、様々な量の活性部位を阻害する異なる濃度の高親和性阻害剤ＣＩ−２Ａとともにインキュベートする。プロテアーゼと阻害剤とは１：１の比率で互いに結合するので、酵素濃度は全プロテアーゼを不活性化する阻害剤濃度と直接関係することになる。残存プロテアーゼ活性の測定は、阻害剤とのインキュベーション後に基質（Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液中０．６ｍＭ Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐＮＡ）を加え、続く４分間の間に生じる分解産物ｐＮＡ（パラニトロフェノール）を、Elisa Readerを用いて４０５nmで周期的に測定することにより行う。
【０３４０】
実施例３
本発明の変異体の硬表面に対する洗浄性能をＡＭＳＡで評価した。方法及び結果を以下に示す。
【０３４１】
硬表面に対するサブチリシン変異体の洗浄性能：
ＡＭＳＡ試験法の説明：
食器洗い用洗剤組成物、即ちＭＧＤＡ添加ＡＤＷモデル洗剤及びＳＴＰＰ添加ＡＤＷモデル洗剤中における、選択されたプロテアーゼ変異体の洗浄性能を評価するために洗浄実験を実施する。自動機械負荷分析（Automated Mechanical Stress Assay：ＡＭＳＡ）を用いて本発明のプロテアーゼを試験する。ＡＭＳＡによれば、少量ずつ多数の酵素洗剤溶液の洗浄性能を調べることができる。ＡＭＳＡプレートは、試験溶液用の多数のスロットと、食器洗いサンプル、即ち洗浄対象のメラミンタイルを、スロットの全開口部に対して硬く締め付けるリッドとを有する。洗浄期間の間、プレート、試験溶液、メラミンタイル及びリッドを烈しく振盪し、試験溶液を汚れたメラミンタイルに接触させると共に、定期的且つ周期的な振動による機械的応力を印加する。更なる説明については、国際公開第０２／４２７４０号、特に２３〜２４頁の「Special Method Examples」のパラグラフを参照のこと。
【０３４２】
実験は以下に示す実験条件下で行った。
【表６】
0005947213.tif 000007
【０３４３】
【表７】
0005947213.tif 000008
【０３４４】
異なる変異体についてのＡＤＷ試験の結果を以下に示す。結果中、インデックスは１である。サビナーゼの性能試験を１の値とし、変異体の結果をこの値と比較する。
【０３４５】
【表８】
0005947213.tif 000009
【０３４６】
【表９】
0005947213.tif 000010
【０３４７】
これらの結果は、本発明の変異体が、タンパク質性よごれ、例えばゆで卵による汚れに対して、有効に作用することを示している。
【０３４８】
更なるサブチリシン変異体の硬表面に対する洗浄性能
本発明の更なる変異体についても、硬表面に対する洗浄性能を、ＡＭＳＡにより、上述と同様の条件下で評価した。
【０３４９】
【表１０】
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【０３５０】
【表１１】
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【０３５１】
これらの結果は、本発明の変異体が、タンパク質性よごれ、例えばゆで卵による汚れに対して、有効に作用することを示している。
【０３５２】
布地に対するサブチリシン変異体の洗浄性能：
市販の洗剤基材組成物中における選択されたサブチラーゼ変異体の洗浄性能を評価するべく、洗浄実験を実施した。本発明の酵素変異体を、自動機械負荷分析（ＡＭＳＡ）を用いて試験した。ＡＭＳＡによれば、少量ずつ多数の酵素洗剤溶液の洗浄性能を調べることができる。ＡＭＳＡプレートは、試験溶液用の多数のスロットと、食器洗いサンプル、即ち洗浄対象のメラミンタイルを、スロットの全開口部に対して硬く締め付けるリッドとを有する。洗浄期間の間、プレート、試験溶液、メラミンタイル及びリッドを烈しく振盪し、試験溶液を前記布地に接触させ、機械的応力を印加する。
【０３５３】
ＡＭＳＡ試験法の説明：
食器洗い用洗剤組成物、即ちＭＧＤＡ添加ＡＤＷモデル洗剤及びＳＴＰＰ添加ＡＤＷモデル洗剤中における、選択されたプロテアーゼ変異体の洗浄性能を評価するために洗浄実験を実施する。自動機械負荷分析（Automated Mechanical Stress Assay：ＡＭＳＡ）を用いて本発明のプロテアーゼを試験する。ＡＭＳＡによれば、少量ずつ多数の酵素洗剤溶液の洗浄性能を調べることができる。ＡＭＳＡプレートは、試験溶液用の多数のスロットと、食器洗いサンプル、即ち洗浄対象のメラミンタイルを、スロットの全開口部に対して硬く締め付けるリッドとを有する。洗浄期間の間、プレート、試験溶液、メラミンタイル及びリッドを烈しく振盪し、試験溶液を前記布地に接触させると共に、定期的且つ周期的な振動による機械的応力を印加する。更なる説明については、国際公開第０２／４２７４０号、特に２３〜２４頁の「Special Method Examples」のパラグラフを参照のこと。
【０３５４】
実験は以下に詳述する実験条件下で行った。
【表１２】
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【０３５５】
試験系にＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２及びＮａＨＣＯ３（Ｃａ２＋：Ｍｇ２＋＝４：１：７．５）を加えて、水硬度を１５°ｄＨに調節した。洗浄後、布地を水道水で漱ぎ、乾燥した。
【０３５６】
酵素変異体の性能は、個々のプロテアーゼにより洗浄された布地の色の明度として測定する。明度は、白色光照射時の光の反射強度として表すこともできる。汚れた試料からの反射光強度は、きれいな試料からの反射光強度よりも低い。よって、反射光強度を用いて、プロテアーゼの洗浄性能を測定することができる。
【０３５７】
測色は、専用フラットベッドスキャナー（Kodak iQsmart、Kodak、Midtager 29、DK-2605 Brandby、Denmark）を用い、洗浄された布地を撮像して行う。
【０３５８】
スキャン撮像からの光強度値の抽出は、例えば、特別設計のソフトウェアアプリケーション（Novozymes Color Vector Analyzer）を使用し、画像からの２４ビットピクセル値を、赤、緑及び青（ＲＧＢ）値に転換して行う。強度値（Ｉｎｔ）の算出は、ＲＧＢ値をベクトルとして加算し、得られたベクトルの長さを求めることにより行う。
【数１】
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【０３５９】
布地：
C-10及びPC-03は、Center For Testmaterials BV, P.O. Box 120, 3133 KT Vlaardingen, Netherlandsから入手し、EMPA117は、EMPA Testmaterials AG Movenstrasse 12, CH-9015 St. Gallen, Switzerlandから入手する。
【０３６０】
種々の変異体のＡＭＳＡ洗濯試験の結果を以下に示す。サビナーゼの性能結果を１の値とし、変異体の結果をこの値と比較する。
【表１３】
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【０３６１】
種々の変異体のＡＭＳＡ洗濯試験の更なる結果を以下に示す。親（即ち置換Ｎ２１８Ｄ不含有）の性能結果を１の値とし、変異体の結果をこの値と比較する。
【表１４】
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【０３６２】
結果は、本発明の変異体が、親と比較して、洗濯布地における高められた洗浄性能を有することを明白に示す。
【配列表】
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