(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
冷凍ストレス耐性が増強されたパン酵母の作製方法であって、下記工程：
（ｉ）ＰＯＧ１遺伝子を不活性化する工程、および
（ｉｉ）ＰＯＧ１遺伝子を不活性化した酵母とＰＯＧ１遺伝子を不活性化していない酵母とを冷凍ストレス耐性について比較する工程、
を包含する方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、さらに、
冷凍ストレス耐性の向上した酵母を選択する工程、
を包含する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵母育種の分野に関する。さらに、本発明は、冷凍ストレスに対する耐性の高いパン酵母、該酵母の製造方法、該酵母を用いるパン生地、パン等の製造方法、ならびに、これら製造方法によって生産された製品に関する。
【背景技術】
【０００２】
パンは、その製品の製造過程でパン酵母の発酵による生地膨張を行う必要があるが、一定した品質のパンを提供するためには、パン酵母、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)の発酵の綿密な制御が必要となる。パン酵母細胞は、製パン過程において、凍結、乾燥、高温、および高浸透圧などの多くの環境ストレスに曝されており、(非特許文献１)、これらの環境ストレスは、酵母の発酵力の低下をもたらす。このため、環境ストレスに対する高度な耐性を有する酵母株の作出技術の確立が望まれており、近年、冷凍生地製パン法が急速に普及したことから、該方法で付加される冷凍ストレスに対する耐性を有する酵母株の作出が、特に望まれている。【０００３】
製パン業界及びイースト製造業界では、製パン時にパン酵母に負荷され発酵を制限する環境ストレスに対する取り組みを行っており、その多くは、これら環境ストレスに対する耐性を有するパン酵母の作出によって問題解決を試みている。【０００４】
一方、ストレス耐性機構に対する知見の蓄積に伴い、耐性関連遺伝子を改変することにより耐性を増強する試みもなされている。
例えば、アミノ酸の１つであるプロリンは、冷凍や乾燥・酸化等のストレスから酵母を防御する性質を有し（特許文献１）、変異型のγ-グルタミルキナーゼをコードするＰＲＯ１遺伝子を発現し、プロリンオキシダーゼをコードするＰＵＴ１遺伝子の破壊株が細胞にプロリンを蓄積することでエタノール耐性となることが知られている（特許文献２）。
また、Ｎ-アセチルトランスフェラーゼＭｐｒ１は、酵母を、熱ショック、過酸化水素処理、エタノール、および低温などの酸化ストレスから防御し（非特許文献２から４）、変異型Ｍｐｒ１を効率よく発現した酵母が乾燥、高温に対する耐性を有することが知られている（特許文献３）。
その他にも、ＣＢＳ２遺伝子の欠損により、乾燥ストレス感受性になること（非特許文献５）、ＤＢＦ２遺伝子の破壊により、ソルビトールストレス高感受性になること（非特許文献６）、芳香族アミノ酸合成関連の遺伝子（ＡＲＯ１など）の破壊株で高ショ糖ストレス耐性が著しく損なわれ、ＢＵＤ２３、ＧＯＮ７、ＳＰＴ２０の遺伝子破壊株が高ショ糖ストレスに高い感受性を示すこと（非特許文献７）、リン酸タンパク質の脱リン酸化を基質とするホスファターゼをコードするＯＣＡ１遺伝子またはＯＣＡ２遺伝子、あるいはＡＬＤ２遺伝子の破壊株では高ショ糖ストレス耐性が高まること（特許文献４）等が知られている。
冷凍ストレス耐性に関しては、酸性トレハラーゼをコードするＡＴＨ１遺伝子の破壊株で冷凍生地ストレス耐性及び高ショ糖ストレス耐性が高まること（特許文献５）、アルギナーゼをコードするＣＡＲ1遺伝子の破壊株で、細胞内に極性の高いアミノ酸が著量蓄積され、冷凍ストレス耐性が高まること（特許文献６）、ＰＭＲ１遺伝子またはＳＮＦ５遺伝子の破壊株で冷凍ストレス耐性が損なわれること（非特許文献８）等が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平９−２３４０５８号公報
【特許文献２】特開２００６−６７８０６号公報
【特許文献３】特開２０１０−１８３８８７号公報
【特許文献４】特開２００８−１４８６８８号公報
【特許文献５】特開平１１−１６９１８０号公報
【特許文献６】特開２００１−２３８６６５号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Attfield, Nat. Biotechnol. 15:1351-1357 (1997)
【非特許文献２】Du and Takagi, Appl. Microbiol. Biotechnol. 75:1343-1351 (2007)
【非特許文献３】Du and Takagi, J. Biochem. 138:391-397 (2005)
【非特許文献４】Nomura and Takagi, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101:12616-12621 (2004)
【非特許文献５】Shima et al., Yeast(2008)25:179-190）
【非特許文献６】Makrantoni et al., Microbilogy 153:4016-4026 (2007)
【非特許文献７】Ando et al.，FEMS Yeast Res 6:249-267 (2006)
【非特許文献８】Ando et al., FEMS Yeast Res 7:244-253 (2007)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、ストレス耐性を有するパン酵母の探索はいまだ十分とはいえない。このためにストレス耐性に関与する遺伝子を見出し、より高いストレス耐性を有する酵母または、そのような酵母の育種法の開発が強く求められている。【０００８】
本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、冷凍生地製パン法などにおける酵母発酵の環境ストレスである冷凍環境においても十分に発酵力を維持できる酵母、すなわち、十分に高い冷凍ストレス耐性を有する酵母を提供すること、および、そのような酵母の育種法を提供すること、さらに、そのような酵母を用いるパン生地、パンの製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、ＰＯＧ１遺伝子に着目した。ＰＯＧ１遺伝子の過剰発現株は塩化リチウム耐性の表現型を示すことが実験室酵母株で知られている (Demae et al., FEMS Microbiol. Lett., 277, 70-78 (2007))。本発明者らは、酵母においてＰＯＧ１遺伝子を不活性化することによって酵母の冷凍ストレス耐性能を増強できることを見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち本発明は以下の構成からなるものである。【００１０】
（１）ＰＯＧ１遺伝子が不活性化されていることを特徴とする、冷凍ストレス耐性が増強された酵母。
（２）ＰＯＧ１遺伝子が以下のいずれかのポリヌクレオチドからなる、上記（１）に記載の酵母：
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１又は数個以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入及び／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｅ）上記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
（３）前記酵母はパン酵母である、上記（１）〜（２）のいずれかに記載の酵母。
（４）上記（１）〜（３）のいずれかに記載の酵母を用いる、パン生地の製造方法。
（５）上記（１）〜（３）のいずれかに記載の酵母を用いる、パンの製造方法。
（６）ＰＯＧ１遺伝子を不活性化する工程を含む冷凍ストレス耐性が増強された酵母の作製方法。
（７）ＰＯＧ１遺伝子が以下のいずれかのポリヌクレオチドからなる、上記（６）に記載の方法：
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１又は数個以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入及び／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｅ）上記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
（８）上記（６）または（７）に記載の方法であって、さらに、
ＰＯＧ１遺伝子を不活性化した酵母とＰＯＧ１遺伝子を不活性化していない酵母とを冷凍ストレス耐性について比較する工程、
を包含する方法。
（９）上記（８）に記載の方法であって、さらに、
冷凍ストレス耐性の向上した酵母を選択する工程、
を包含する方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、冷凍ストレスに対しより耐性を有する酵母株を容易に得ることできる。さらに、本発明によって、所定の酵母株を簡便に冷凍ストレス耐性株とすることも可能である。このため本発明の酵母は、冷凍パン生地などの製造に好適である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、ＰＯＧ１遺伝子破壊株の作製法を示す図である。
【図２】図２は、ＰＯＧ１遺伝子破壊株作製を確認する実験結果を示す図である。
【図３】図３は、非ストレス条件およびストレス条件における発酵力を比較した結果を示す図である。a)は非ストレス、b)は冷凍ストレス後１週間後に解凍、c)は冷凍ストレス後３週間後に解凍の条件での発酵時間当たりの炭酸ガス発生量(mL)を示す。Ｗｉｌｄは野生株、ＰＯＧ１はＰＯＧ１遺伝子高発現株、Δｐｏｇ１はＰＯＧ１遺伝子破壊株を示す。
【図４】図４は、ストレス条件における発酵力を比較した結果を示す図である。野生株（Ｗｉｌｄ）の非ストレス条件下での炭酸ガス発生量に対する冷凍ストレス条件下の炭酸ガス発生量の割合を１００とし、ＰＯＧ１遺伝子高発現株（ＰＯＧ１）およびＰＯＧ１遺伝子破壊株（Δｐｏｇ１）の冷凍ストレス前後での炭酸ガス発生量の変化の割合との相対比較を示す。a)は冷凍ストレス後１週間後に解凍、b)は冷凍ストレス後３週間後に解凍の条件での結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の実施形態について、以下に詳細に説明する。なお、本明細書中に記載された学術文献及び特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。本明細書において特記しない限り、数値範囲を示す「Ａ〜Ｂ」は、「Ａ以上Ｂ以下」を意味する。
【００１４】
また、本明細書中で使用される場合、塩基およびアミノ酸の表記は、適宜ＩＵＰＡＣおよびＩＵＢの定める１文字表記または３文字表記を使用する。本明細書において使用される場合、用語「タンパク質」は、「ペプチド」または「ポリペプチド」と交換可能に使用される。また、用語「ポリヌクレオチド」は、「遺伝子」、「核酸」又は「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。ここで、遺伝子は、ＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ）、又はＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態で存在し得る。ＤＮＡ又はＲＮＡは、二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡは、コード鎖（センス鎖）であっても、非コード鎖（アンチセンス鎖）であってもよい。また、遺伝子は化学的に合成してもよく、コードするタンパク質の発現が向上するように、コドンユーセージ（Codon usage）を変更してもよい。勿論、同じアミノ酸をコードするコドン同士であれば置換することも可能である。また、遺伝子は、タンパク質をコードするものであれば、遺伝暗号の縮重に基づく任意の塩基配列を有するＤＮＡが含まれる。
【００１５】
＜１．用語の定義＞
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
本明細書において「酵母」とは、大部分の生活環を単細胞で経過する菌類をいう。代表的な酵母としては、Saccharomyces属、Schizosaccharomyces属に属する酵母、特にSaccharomyces cerevisiae、Saccharomyces ludwigii、およびSchizosaccharomyces pombeが挙げられる。
【００１６】
本明細書において「パン酵母」とは、パンの製造に使用される、Saccharomyces cerevisiaeに属し、パンの製造に使用される酵母をいう。
【００１７】
本明細書において使用する場合、用語「ショ糖濃度（％）」とは、特に単位を記載しない限り、発酵する材料中の小麦粉に対するショ糖の相対濃度をいい、より具体的には、小麦粉１００ｇに対して添加されるショ糖のグラム数をいう。
【００１８】
本明細書において「冷凍ストレス」とは、０℃以下にて酵母を冷凍することをいう。酵母が冷凍される限り、０℃以下の任意の温度が使用されうる。また、「冷凍ストレス耐性」とは、冷凍ストレス条件下で、野生型酵母と比較してより高い発酵力を示す酵母の特性をいう。代表的には、変異型酵母が「冷凍ストレス耐性」を有するか否かについては、冷凍ストレス下における発酵力を酵母が発生する炭酸ガスの発生量を指標として決定する。
【００１９】
本明細書において「発酵力」とは、酵母を培養した場合に、糖質を無酸素的に分解した代謝産物を生じる能力をいう。酵母の発酵には、代表的には、アルコール発酵、グリセロール発酵などが挙げられるが、これらに限定されない。発酵力を示す指標としては、例えば、パン生地中の酵母から生じる炭酸ガス量を測定するファーモグラフという機械を使用することで、パン生地の発酵力を測定する方法が使用可能である。その単位としては、例えば、ＯＤ６００が１００である酵母が発生する炭酸ガス量をｍｌ／１００ＯＤ６００として用いることができるが、これに限定されない。上記以外の指標としては、例えば、低糖条件における発酵力（Ｆ１０）、高糖状態における発酵力（Ｆ４０）、およびマルトース発酵力（Ｆｍ）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２０】
本明細書において「生地」とは、パン類の発酵に供される材料のみならず、パン類の生地に添加される「種生地」をも含む。本明細書において使用する場合、用語「種生地」とは、パン生地の発酵を行うために添加される種（スタータ）であって、発酵に必要な菌および配合原材料の少なくとも一部を含む生地をいう。
【００２１】
本明細書において「発酵」とは、配合原材料中の物質の少なくとも一部が、菌によって分解される現象をいう。
【００２２】
本明細書において遺伝子の「不活性化」とは、遺伝子の破壊（例えば、Methods in enzymology, 194, 281-301 (1991))、遺伝子への転移因子の導入（例えば、Methods in enzymology, 194, 342-361 (1991))、遺伝子のアンチセンス遺伝子の導入・発現（例えば、特公平7-40943、23rd European Brewery Conv. Proc., 297-304 (1991)）、遺伝子の近傍へのサイレンシングに関与するＤＮＡの導入（例えば、Cell, 75, 531-541 (1993)）、遺伝子のコードするポリペプチドに対する抗体の処理（例えば、European J. Biochem., 231, 329-336 (1995)）等、遺伝子工学的手法または生物工学的手法を用いて、遺伝子または該遺伝子のコードするポリペプチドが本来有する機能を低下または失活させることを意味する。
【００２３】
本明細書において「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる塩基配列に特異的な２本鎖のポリヌクレオチドが形成され、非特異的な２本鎖のポリヌクレオチドが形成されない条件をいう。換言すれば、相同性が高い核酸同士、例えば完全にマッチしたハイブリッドの融解温度（Ｔｍ値）から１５℃、好ましくは１０℃、更に好ましくは５℃低い温度までの範囲の温度でハイブリダイズする条件ともいえる。例えば、一般的なハイブリダイゼーション用緩衝液中で、６８℃、２０時間の条件でハイブリダイズする条件を挙げることができる。一例を示すと、０．２５ＭＮａ２ＨＰＯ４，ｐＨ７．２，７%ＳＤＳ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，１×デンハルト溶液からなる緩衝液中で温度が６０〜６８℃、好ましくは６５℃、さらに好ましくは６８℃の条件下で１６〜２４時間ハイブリダイズさせ、さらに２０ｍＭＮａ２ＨＰＯ４，ｐＨ７．２，１%ＳＤＳ，１ｍＭ ＥＤＴＡからなる緩衝液中で温度が６０〜６８℃、好ましくは６５℃、さらに好ましくは６８℃の条件下で１５分間の洗浄を２回行う条件を挙げることができる。他の例としては、２５％ホルムアミド、より厳しい条件では５０％ホルムアミド、４×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）、５０ｍＭＨＥＰＥＳ ｐＨ７．０、１０×デンハルト溶液、２０μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含むハイブリダイゼーション溶液中、４２℃で一晩プレハイブリダイゼーションを行った後、標識したプローブを添加し、４２℃で一晩保温することによりハイブリダイゼーションを行う。その後の洗浄における洗浄液および温度条件は、「１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃」程度で、より厳しい条件としては「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」程度で、さらに厳しい条件としては「０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」程度で実施することができる。このようにハイブリダイゼーションの洗浄の条件が厳しくなるほどプローブ配列と高い相同性を有するＤＮＡの単離を期待し得る。ただし、上記ＳＳＣ、ＳＤＳおよび温度の条件の組み合わせは例示であり、当業者であれば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上記若しくは他の要素（例えば、プローブ濃度、プローブの長さ、ハイブリダイゼーション反応時間など）を適宜組み合わせることにより、上記と同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。例えば、当業者であれば、Molecular Cloning（Sambrook and Russell, Molecular Cloning :A Laboratory Manual 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Woodbury, NY (2001)）等を参照することにより、こうした遺伝子を容易に取得することができる。
【００２４】
本明細書において配列（核酸配列、アミノ酸配列など）の「相同性」とは、２以上の配列の、互いに対する同一性の程度をいう。また、本明細書において配列（核酸配列、アミノ酸配列など）の「同一性」とは、２以上の対比可能な配列の、互いに対する同一の配列（個々の核酸、アミノ酸など）の程度をいう。従って、ある２つの遺伝子の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。配列（例えば、核酸配列、アミノ酸配列など）の「類似性」とは、上記相同性において、保存的置換を同一とみなした場合の、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。２種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、または核酸の場合ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べ得る。アミノ酸配列および塩基配列の同一性および相同性の比較は、配列分析用ツールである、ＦＡＳＴＡ検索やＢＬＡＳＴ検索により決定することができる。
【００２５】
＜２．冷凍ストレス耐性が増強された酵母＞
本発明における酵母では、ＰＯＧ１遺伝子が不活性化されている。ＰＯＧ１遺伝子は、ＤＮＡ配列から推定すると、分子量約３９ｋＤａのタンパク質Ｐｏｇ１をコードしている。これまで転写因子として酵母の細胞周期制御に関わるという報告があるが（Maria, A. et al., Genetics, 151;531-543 (1999)）、アミノ酸配列上に転写因子の特徴であるＤＮＡ結合モチーフは見出されず、実際に遺伝子の転写を制御しているという報告もないため、その機能は未だに不明のままである。またこれまでに、推定アミノ酸配列レベルで相同性のある遺伝子は、酵母のみならず、すべての生物種で見つかっていない。ＰＯＧ１遺伝子は酵母ユビキチンリガーゼＲｓｐ５変異株のストレス感受性を相補するマルチコピーサプレッサーとして取得され、同遺伝子の過剰発現株が塩化リチウム耐性の表現型を示すことが実験室酵母株で知られているが (Demae et al., FEMS Microbiol. Lett., 277, 70-78 (2007)) 、ＰＯＧ１遺伝子の不活性化によって冷凍ストレス耐性の向上が得られたことは全く予想外であった。
【００２６】
ＰＯＧ１遺伝子は、上記のように定義づけされるものであれば、特に限定しないが、好ましくは以下のいずれかのポリヌクレオチドからなる：
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１又は数個以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入及び／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（ｄ）配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｅ）上記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
【００２７】
上記（ｂ）のポリヌクレオチドは、配列番号１で表されるアミノ酸配列と一定以上の相同性を有しているものである。一定以上の相同性とは、配列番号１で表されるアミノ酸配列と少なくとも８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％以上の配列の同一性をいう。
【００２８】
上記（ｃ）のポリヌクレオチドにおいて、欠失、置換、若しくは付加されてもよいアミノ酸の数としては、その機能を失わせない限り、その個数は制限されないが、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異導入法により欠失、置換、若しくは付加できる程度の数をいう。通常は、３０アミノ酸以内であり、好ましくは２０アミノ酸以内であり、さらに好ましくは１０アミノ酸以内であり、最も好ましくは５アミノ酸以内（例えば、５，４，３，２，１アミノ酸）である。変異を導入したタンパク質が酵母に所望の形質を付与するかどうかは、そのタンパク質をコードする遺伝子を不活性化し、その酵母の冷凍ストレス耐性が増強されているかどうか調べることにより判断できる。また、ここでいう「変異」は、主には部位特異的突然変異誘発法等により人為的に導入された変異を意味するが、天然に存在する同様の変異であってもよい。
【００２９】
変異するアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが好ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ，Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ，Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ，Ｉ、Ｐ）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｓ、Ｔ、Ｙ）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃ、Ｍ）、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）、塩基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｒ、Ｋ、Ｈ）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）を挙げることができる。さらに、例えば、変異マトリクス（mutational matrix）によってアミノ酸を分類することも周知である（Taylor 1986, J, Theor. Biol. 119, 205-218; Sambrook and Russell, Molecular Cloning 3rd ed. A7.6-A7.9, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001）。この分類を以下に要約すると、脂肪族アミノ酸（Ｌ、Ｉ、Ｖ）、芳香族アミノ酸（Ｈ、Ｗ、Ｙ、Ｆ）、荷電アミノ酸（Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ）、正荷電アミノ酸（Ｒ、Ｋ、Ｈ）、負荷電アミノ酸（Ｄ、Ｅ）、疎水性アミノ酸（Ｈ、Ｗ、Ｙ、Ｆ、Ｍ、Ｌ，Ｉ、Ｖ、Ｃ、Ａ，Ｇ、Ｔ、Ｋ）、極性アミノ酸（Ｔ、Ｓ、Ｎ、Ｄ、Ｅ、Ｑ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｗ、Ｙ）、小型アミノ酸（Ｐ、Ｖ、Ｃ、Ａ、Ｇ、Ｔ、Ｓ、Ｎ、Ｄ）、微小アミノ酸（Ａ、Ｇ、Ｓ）及び大型（非小型）アミノ酸（Ｑ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｗ、Ｙ、Ｆ、Ｍ、Ｌ、Ｉ）が挙げられる。なお、上記括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す。
【００３０】
あるアミノ酸配列に対する１又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチドがその生物学的活性を維持することはすでに知られている。さらに、標的アミノ酸残基は、共通した性質をできるだけ多く有するアミノ酸残基に変異させることがより好ましい。
【００３１】
また、上記（ｅ）のポリヌクレオチドは、上記（ｄ）のポリヌクレオチド（配列番号２に記載の塩基配列）と相同性において少なくとも８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列の同一性を有することが好ましい。
【００３２】
酵母は、特に限定されないが、好ましくはSaccharomyces cerevisiaeに属する酵母であり、より好ましくは、パン酵母であり、さらに好ましくは二倍体パン酵母である。
【００３３】
このような酵母は、実施例において示すように、冷凍ストレスに対して耐性能を有し、冷凍ストレスの存在下において、ＰＯＧ１遺伝子を不活性化しない野生株と比較して、発酵力が増強している。
【００３４】
また、本発明の冷凍ストレス耐性が増強された酵母は、自然変異によりＰＯＧ１遺伝子が不活性化されているものであってもよい。
【００３５】
＜３．冷凍ストレス耐性が増強された酵母の作製方法＞
本発明の冷凍ストレス耐性が増強された酵母の作製方法は遺伝子組換え技術を用いて、ＰＯＧ１遺伝子を不活性化させる工程を含む。
【００３６】
ＰＯＧ１遺伝子の不活性化に用いる、遺伝子工学または生物工学に関する基本的操作については、市販の実験書、例えば、Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory (1982)、Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Woodbury, NY (2001) 、Methods in Enzymology, 194 (1991) 、実験医学別冊・酵母による遺伝子実験法羊土社(1994)等に記載された方法に従って行うことができる。
【００３７】
ＰＯＧ１遺伝子を酵母内で不活性化させる方法は、ＰＯＧ１遺伝子またはＰＯＧ１遺伝子がコードするタンパク質Ｐｏｇ１の機能を低下、失活させる方法であれば、遺伝子の破壊（例えば、Methods in enzymology, 194, 281-301 (1991))、遺伝子への転移因子の導入（例えば、Methods in enzymology, 194, 342-361 (1991))、遺伝子のアンチセンス遺伝子の導入・発現（例えば、特公平7-40943、23rd European Brewery Conv. Proc., 297-304 (1991)）、遺伝子の近傍へのサイレンシングに関与するＤＮＡの導入（例えば、Cell, 75, 531-541 (1993)）、遺伝子のコードするポリペプチドに対する抗体の処理（例えば、European J. Biochem., 231, 329-336 (1995)）等、いずれの手法を用いてもよい。
【００３８】
ＰＯＧ１遺伝子の不活性化に用いられる酵母としては、特に限定されないが、好ましくはSaccharomyces cerevisiaeに属する酵母であり、より好ましくは、パン酵母である。
【００３９】
ＰＯＧ１遺伝子の破壊とは、ＰＯＧ１遺伝子と相同的な塩基配列を有するが付加、欠失、置換などの変異を起こしてＰＯＧ１遺伝子として働き得ないＤＮＡを、酵母の細胞中へ導入して相同的組換えを起こさせ、この変異をゲノム上の遺伝子に取込ませることをいう。
【００４０】
遺伝子の破壊に用いるＤＮＡの作製方法としては、例えば制限酵素等により低温感受性を相補する遺伝子を切断して、ＤＮＡを付加、欠失、置換等を行う方法または低温感受性を相補する遺伝子を細胞外で変異（インビトロ・ミュータジェネシス）させる方法などが用いられる。ＤＮＡを付加、置換する方法としては、マーカー遺伝子を挿入する方法などを用いてもよい。
【００４１】
ＰＯＧ１遺伝子を破壊するには、ＰＯＧ１遺伝子のプロモーター部分、オープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）部分、ターミネーター部分等いずれの部位を破壊してもよく、各部位を組み合わせて破壊してもよい。また、ＰＯＧ１遺伝子全体を欠失させることによっても遺伝子を破壊することができる。
ＰＯＧ１遺伝子を破壊するには、例えば、ＰＯＧ１遺伝子を破壊するためのプラスミドあるいはプラスミドの断片を酵母に形質転換し、形質転換されたプラスミドあるいはプラスミドの断片に含まれるＤＮＡ断片が酵母のゲノム上の遺伝子と相同組換えを起こすことによって行うことができる。相同組換えを起こすＤＮＡ断片としては、ＰＯＧ１遺伝子の破壊用プラスミドまたはその断片と酵母のゲノム上のＰＯＧ１遺伝子とが、相同組換えを起こせる程度に相同性を持っていればよい。相同組換えを起こすＤＮＡ断片であるかどうかは、該ＤＮＡ断片を酵母に導入し、相同組換えを起こした株が分離できるかどうか、すなわち発酵力が冷凍ストレス耐性を示す株が分離できるかどうかで確認することができる。
【００４２】
ＰＯＧ１遺伝子の破壊用プラスミドを作製するために用いるベクターとしては、酵母中で保持することが可能なベクター、例えば、ＹＥｐ、ＹＣｐ、ＹＩｐなどの他、大腸菌中で保持することが可能なベクター、例えばｐＧＥＭ−Ｔ、ｐＵＣ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔなど、いずれを用いてもよい。
マーカー遺伝子としては、酵母において用いることのできるマーカー遺伝子であれば、例えばURA3、TRP1、LEU2、HIS3等の栄養要求性変異を相補する遺伝子、G418、ヒグロマイシンＢ、セルレニン、パラフルオロフェニルアラニン等の化学物質に対する耐性遺伝子(例えば、J. Ferment. Bioeng., 76, 60-63 (1993)、Enzyme and Microb. Technol., 15, 874-876 (1993))等など、いずれを用いてもよい。
【００４３】
酵母のゲノム上のＰＯＧ１遺伝子の破壊は、ＰＯＧ１遺伝子の破壊用プラスミドで酵母を形質転換することによって行うことができる。酵母の形質転換は、遺伝子工学ないし生物工学の分野で慣用されている方法、例えばスフェロプラスト法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84,1929(1978))、酢酸リチウム法(J.Bacteriol.,153,163(1983), Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75,1929(1978))、エレクトロポーレーション法(Methods.Enzymol.,194,182(1990))等によって行うことができる。
【００４４】
ＰＯＧ１遺伝子の破壊用プラスミドにマーカー遺伝子を導入することにより、そのマーカーを指標にして、容易に形質転換体を分離することができる。また、酵母のゲノム上のＰＯＧ１遺伝子が破壊されると冷凍ストレス下で発酵力が増強することを指標にして、形質転換体を分離することもできる。ＰＯＧ１遺伝子が破壊された株の冷凍ストレス耐性の確認は、当該酵母の冷凍ストレス下での発酵力を調べることによって行うことができる。
【００４５】
上記ＰＯＧ１遺伝子破壊株の作製は、すべて酵母の遺伝子からなり、外来遺伝子を一切含まないセルフクローニング技術で作製されることが好ましい。セルフクローニング技術で作製された酵母は、通常の食品微生物と同様に扱うことが出来るためである。このとき、導入するＵＲＡ３等のマーカー遺伝子は、セルフクローニングを達成するためにサッカロミセス・セレビシエ、特にパン酵母のものが好ましい。
【００４６】
また、ＰＯＧ１遺伝子破壊株は、変異処理を行なった酵母の中から選択して得ることもできる。すなわち、本発明の方法においては、変異処理によりＰＯＧ１遺伝子を破壊してもよい。変異処理の方法は特に限定されず、紫外線照射、放射線照射等の物理的変異処理、及びエチルメタンスルフォン酸等の変異剤で処理する化学的変異処理のいずれであってもよい。変異処理により得られた変異株の中から、冷凍ストレス下で発酵力が増強することを指標として、ＰＯＧ１遺伝子破壊株を選択することができる。
【００４７】
本発明に係る酵母は好ましくは二倍体である。ＰＯＧ１遺伝子の二倍体ホモ接合型変異株は、周知の常法により得ることができる。例えば、（１）ＰＯＧ１遺伝子の一倍体変異株を異なる接合型の一倍体（a型及びα型）より作製し、それらの一倍体変異株を交雑して二倍体変異株を作製する方法、および、（２）異なる２つの選択マーカーを用い、第一の選択マーカーを用いて第一の対立遺伝子に変異を導入し、その後、その変異株を用いて、第二の選択マーカーを用いて第二の対立遺伝子に変異を導入する方法、が挙げられるがこれらに限定されない。
【００４８】
以上の操作によって、冷凍ストレス耐性が増強された酵母を作製することができる。
【００４９】
＜４．パン生地の製造方法、パンの製造方法＞
本発明の酵母は、ＰＯＧ１遺伝子が不活性化されており、冷凍ストレス耐性、特に冷凍パン生地における冷凍ストレス耐性にきわめてすぐれている。したがって、本発明に係るパン酵母は、冷凍パン生地において、冷凍ストレスによく耐え、発酵させたときに、良くその能力を発揮し、これを焼き上げたときに、美味な各種パンを得ることができる。本発明に係る冷凍生地は、ＰＯＧ１遺伝子が不活性化された冷凍ストレス耐性パン酵母を使用するほかは、定法にしたがって製造すればよく、パンの製造もＰＯＧ１遺伝子が不活性化された冷凍ストレス耐性パン酵母を使用するほかは、定法にしたがっておこなえばよい。
【００５０】
本発明は、以上説示した各構成に限定されるものではなく、明細書に記載した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された文献の全てが参考として援用される。以下、実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はかかる実施例のみに限定されるものではない。
【実施例】
【００５１】
以下に実施例を示して本発明をさらに詳しく説明するが、この発明は以下の例に限定されるものではない。【００５２】
（１）実用酵母を用いるＰＯＧ１遺伝子破壊二倍体酵母の作製： 
ＰＯＧ１遺伝子破壊株の作製法を図１に示す。ＵＲＡ３遺伝子領域を増幅するために、正方向プライマーとして核酸配列（CTAGGGAAGACAAGCAACGAAACG:配列番号３）を有するURA3up-Fwプライマー、および、逆方向プライマーとして核酸配列（GGGCGGGTTATCAGATATTATCAGG:配列番号４）を有するURA3down-Rvプライマーを用いた。S.cerevisiaeのパン酵母株の染色体ＤＮＡを鋳型としてこれらプライマー対を用いて、ＵＲＡ３遺伝子領域を増幅した。増幅断片を鋳型として、５‘末端にＰＯＧ１遺伝子の一部を付加した正方向プライマーとして核酸配列（CCTGCGCTTAACTCATACAAAAAGGCGCAAAACATTTCAAGAGTCCCACGATTAATTGCAGAAATTGAAAgattcggtaatctccgag:配列番号５）を有するPOG1+URA3-Fｗプライマー、および、同じく５‘末端にＰＯＧ１遺伝子の一部を付加した逆方向プライマーとして核酸配列（TGAACTGAAGTAAGGTGGACGGATGCATCGAATGAAGGTTAGGAAGGGATATAGTTTTAGAAATTAGGTGgtaataactgatataattaaattg:配列番号６）を有するPOG1+URA3-Rvプライマーを用いて、ＰＯＧ１遺伝子破壊用断片を増幅した。増幅断片をパン酵母一倍体ウラシル要求性株（３３４６ Ｕｒａ３−、３３４７Ｕｒａ３−）に形質転換し、ＰＯＧ１遺伝子破壊株を、ウラシル非要求性を指標に単離した。ＰＯＧ１遺伝子破壊株が作製されたことを、POG1upstream-Fwプライマー（TTAAAGGCTACGCAGAAGAGG：配列番号７）およびURA3ORF-Rvプライマー（GGCCTCTAGGTTCCTTTGTTACTTC：配列番号８）を用いるＰＣＲによって確認した。ａ型とα型それぞれの一倍体において作製したＰＯＧ１遺伝子破壊株同士を接合させることにより二倍体株を作製した。二倍体株が作製出来たことは、胞子形成培地上（０．０５％グルコース、０．１％Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ、１％酢酸カリウム、２％寒天）での胞子形成により確認した。【００５３】
（２）ＰＯＧ１遺伝子破壊二倍体酵母の冷凍ストレス耐性：
実施例１において作製した変異株の冷凍ストレス耐性の評価を行った。
野生株、ＰＯＧ１遺伝子破壊株、およびＰＯＧ１遺伝子高発現株を、廃糖蜜培地（５．８８％廃糖蜜、０．２１４％尿素、０．０５１％リン酸二水素カリウム）で定常期まで培養した後培養した細胞を、磁器乾燥版（ニッカトー株式会社）を使用して、含水量が６６％になるまで脱水した。この酵母をパン生地用小麦粉１００ｇに対して５ｇのショ糖、２ｇの塩化ナトリウム、水６８ｍＬを含む高糖パン生地に４ｇ加えた。これら混合物をスワンソンタイプミキサー（National Mfg. Co., Ltd.）を用いて１００ｒｐｍで３分間攪拌した後、４０ｇずつに小分けし、スクリューキャップボトルに封をして入れ、３０℃、１２０分間の前発酵を行い、その後パン生地ごと―２０℃で冷凍した。冷凍後１及び３週間後、３０℃で３０分間解凍した後、炭酸ガス発生量をファーモグラフII（アトー株式会社）にて測定した。結果をそれぞれ図３ｂ）、ｃ）および図４ａ）、ｂ）に示す。また、冷凍を行わずに前発酵後すぐに炭酸ガス発生量を測定した結果は図３ａ)に示す。【００５４】
表１  本発明のＰＯＧ１遺伝子破壊株の野生株に対する発酵力の比
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【００５５】
その結果、ＰＯＧ１遺伝子を破壊した実用パン酵母二倍体株は、冷凍後のパン生地中での発酵力が野生株と比較して１週間後では約５６％、３週間後では約７２％有意に高かった。このことから、ＰＯＧ１遺伝子破壊は冷凍生地耐性実用パン酵母の作製に適する方法であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明の酵母を用いることによって、冷凍ストレス条件下であっても高い発酵力を発揮する酵母を単離することが可能となる。そのような酵母を用いることによって、従来、十分な発酵を行うことが困難であった冷凍生地製パン法などの冷凍環境での発酵の効率を高めることが可能となる。
【配列表フリーテキスト】
【００５７】
配列番号３〜８:プライマー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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