(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
齧歯動物の生殖系列ゲノム中に、内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子座において、内在性重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結された、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む齧歯動物であって、前記再構成された重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ＶＨ３−２３／Ｘ１Ｘ２／ＪＨの配列をコードし、Ｘ１は任意のアミノ酸であり、Ｘ２は任意のアミノ酸であり、前記齧歯動物は、ラットまたはマウスである、齧歯動物。
【請求項２】
Ｘ１がＧｌｙであり、Ｘ２がＴｙｒである、請求項1に記載の齧歯動物。
【請求項３】
前記ヒトＪＨ遺伝子セグメントが、ＪＨ１、ＪＨ２、ＪＨ３、ＪＨ４、ＪＨ５、ＪＨ６、およびそれらの多形変異体からなる群より選択される、請求項１に記載の齧歯動物。
【請求項４】
前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列が、ヒトＶＨ３−２３／ＧＹ／ＪＨ４−４の配列（配列番号１３７）をコードする、請求項１に記載の齧歯動物。
【請求項５】
前記齧歯動物がマウスである、請求項４に記載の齧歯動物。
【請求項６】
前記重鎖定常領域遺伝子配列が、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、およびそれらの組み合わせから選択される、請求項１に記載の齧歯動物。
【請求項７】
実質的に全ての内在性機能性ＶＨ、Ｄ、及びＪＨ遺伝子セグメントが、前記齧歯動物の前記免疫グロブリン重鎖遺伝子座から欠失させられるか、または非機能性にされる、請求項１に記載の齧歯動物。
【請求項８】
前記齧歯動物が、内在性機能性ＶＨ、Ｄ、及びＪＨ遺伝子セグメントを欠失させるか、または非機能性にする修飾を含む、請求項１に記載の齧歯動物。
【請求項９】
前記再構成された重鎖可変領域ヌクレオチド配列によってコードされる免疫グロブリン重鎖可変ドメインは、前記非齧歯動物に対して免疫原性ではない、請求項１に記載の齧歯動物。
【請求項１０】
前記齧歯動物が、Ａｄａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはその両方を含む、請求項１に記載の齧歯動物。
【請求項１１】
前記齧歯動物が、再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖Ｖ遺伝子セグメント（ＶＬ）および再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖Ｊ遺伝子セグメント（ＪＬ）をコードするヌクレオチド配列をさらに含み、前記ヌクレオチド配列は、免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結されている、請求項１に記載の齧歯動物。
【請求項１２】
前記軽鎖定常領域遺伝子配列が、齧歯動物およびヒト定常領域遺伝子配列から選択される、請求項１１に記載の齧歯動物。
【請求項１３】
前記軽鎖定常領域遺伝子配列が、マウス軽鎖定常領域遺伝子配列またはラット軽鎖定常領域遺伝子配列から選択される齧歯動物軽鎖定常領域遺伝子配列である、請求項１２に記載の齧歯動物。
【請求項１４】
前記再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖（ＶＬ）遺伝子セグメントおよび前記再構成されていないヒト免疫グロブリン（ＪＬ）遺伝子セグメントが、内在性齧歯動物遺伝子座において、齧歯動物免疫グロブリン定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、請求項１1に記載の齧歯動物。
【請求項１５】
齧歯動物を作製する方法であって、
（ａ）齧歯動物のゲノムを、内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子座の実質的に全ての内在性機能性免疫グロブリン重鎖ＶＨ、ＤおよびＪＨ遺伝子セグメントを、欠失させるか、または非機能性にするように修飾することであって、前記齧歯動物がラット又はマウスである、ことと、
（ｂ）前記ゲノム中に、前記内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子座において、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を定置することであって、前記再構成された重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、内在性重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結されたＶＨ３−２３／Ｘ１Ｘ２／ＪＨの配列をコードし、Ｘ１は任意のアミノ酸であり、Ｘ２は任意のアミノ酸である、ことと
を含む、方法。
【請求項１６】
修飾された齧歯動物であって、そのゲノム中に
（ｉ）内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子座において、内在性重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結された、再構成されたヒト重鎖可変領域核酸配列であって、前記再構成された重鎖可変領域核酸配列は、ＶＨ３−２３／Ｘ１Ｘ２／ＪＨの配列をコードし、Ｘ１は任意のアミノ酸であり、Ｘ２は任意のアミノ酸であり、前記齧歯動物はラットまたはマウスである、再構成されたヒト重鎖可変領域核酸配列と、
（ｉｉ）軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結された、1つ以上であるが野生型より少
ない数のヒト免疫グロブリン軽鎖ＶＬおよびＪＬ遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン軽鎖遺伝子座と
を含む、修飾された齧歯動物。
【請求項１７】
Ｘ１がＧｌｙであり、Ｘ２がＴｙｒである、請求項１６に記載の修飾された齧歯動物。
【請求項１８】
前記ヒトＪＨ遺伝子セグメントが、ＪＨ１、ＪＨ２、ＪＨ３、ＪＨ４、ＪＨ５、ＪＨ６およびその多形変異体からなる群より選択される、請求項１６に記載の修飾された齧歯動物。
【請求項１９】
前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列が、ヒトＶＨ３−２３／ＧＹ／ＪＨ４−４の配列（配列番号１３７）をコードする、請求項１６に記載の修飾された齧歯動物。
【請求項２０】
前記１つ以上であるが野生型より少ない数のヒト免疫グロブリン軽鎖ＶＬおよびＪＬ遺伝子セグメントが、内在性遺伝子座において前記軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される、請求項１６に記載の修飾された齧歯動物。
【請求項２１】
前記免疫グロブリン軽鎖遺伝子座が、２つのヒトＶＬ遺伝子セグメント、Ｖκ１−３９およびＶκ３−２０を含む、請求項１６に記載の修飾された齧歯動物。
【請求項２２】
前記ヒト軽鎖ＶＬまたはＪＬ遺伝子セグメントのうちの少なくとも１つは、対応するヒト生殖系列軽鎖可変遺伝子セグメントによってはコードされない１つ以上のヒスチジンコドンをコードする、請求項１６に記載の修飾された齧歯動物。
【請求項２３】
前記ＶＬ遺伝子セグメントのうちの少なくとも１つは、ヒスチジンコドンの付加、または前記対応するヒト生殖系列ＶＬセグメント配列によってコードされる少なくとも１つの非ヒスチジンコドンの、ヒスチジンコドンでの置換を含む、請求項１６に記載の修飾された齧歯動物。
【請求項２４】
前記付加または置換されるヒスチジンコドンは、ＣＤＲ３中に存在する、請求項２３に記載の修飾された齧歯動物。
【請求項２５】
前記齧歯動物が、Ａｄａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはそれらの両方を含む、請求項５に記載のマウス。
【請求項２６】
前記非齧歯動物が、再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖Ｖ遺伝子セグメント（ＶＬ）および再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖Ｊ遺伝子セグメント（ＪＬ）をコードするヌクレオチド配列をさらに含み、前記ヌクレオチド配列は、免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、請求項５に記載のマウス。
【請求項２７】
前記齧歯動物がマウスである、請求項１６に記載の齧歯動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、参照によりその全体が本明細書に援用される、２０１３年２月２０日に出願された米国仮特許出願第６１／７６６，７６５号、及び２０１３年９月１８日に出願された米国仮特許出願第６１／８７９，３３８号に対する優先権の利益を主張する。
【０００２】
配列リスト
テキストファイル形式の配列リスト（「１２７０ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔ」と題され、２０１４年２月２０日に作成され、８７，０００バイトのサイズである）が、参照によりその全体が本明細書に援用される。
【０００３】
発明の分野
定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されたヒト重鎖可変領域核酸配列（即ち、再構成された重鎖ＶＤＪ配列）を含む、遺伝子的に修飾された非ヒト動物、例えば、マウス及びラットなどの齧歯動物。幾つかの実施形態では、動物は、免疫グロブリン定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される再構成された重鎖可変領域（ＶＤＪ配列）核酸配列を含む免疫グロブリン遺伝子座を有するように、遺伝子的に改変され、ＶＤＪ配列は、ヒトＶＤＪ配列であり、定常領域遺伝子配列は、ヒトまたは非ヒトである。幾つかの実施形態では、遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座を含有する非ヒト動物は、（１）再構成された重鎖可変ドメインをコードする第１のヌクレオチド配列（即ち、第１のヌクレオチド配列は、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列である）であって、第１のヌクレオチド配列は、軽鎖（例えば、κまたはλ軽鎖）定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、第１のヌクレオチド配列と、（２）ヒトまたは非ヒト軽鎖（例えば、κまたはλ軽鎖）可変ドメインをコードする第２のヌクレオチド配列（即ち、第２のヌクレオチド配列は、再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変ヌクレオチド配列である）であって、第２のヌクレオチド配列は、重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、第２のヌクレオチド配列と、を含む。幾つかの実施形態では、非ヒト動物は、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む遺伝子的に修飾された免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含み、再構成された重鎖可変ドメインは、スペーサーを介して重鎖Ｊ遺伝子セグメント（ＪＨ）配列に作動可能に連結される重鎖Ｖ遺伝子セグメント（ＶＨ）配列を含み、スペーサーは、少なくとも１つのアミノ酸残基を含む。そのゲノム中に（ｉ）定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されたヒト重鎖可変領域核酸配列と、（ｉｉ）１つ以上であるが野生型より少ない数のヒト軽鎖可変領域遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン軽鎖遺伝子座と、を含む、遺伝子的に修飾された非ヒト動物、例えば、マウス及びラットなどの齧歯動物が提供される。そのゲノム中に（ｉ）定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されたヒト重鎖可変領域核酸配列と、（ｉｉ）１つ以上であるが野生型より少ない数のヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン軽鎖遺伝子座と、を含む、遺伝子的に修飾された非ヒト動物が提供される。幾つかの実施形態では、可変領域遺伝子セグメントのうちの少なくとも１つは、対応するヒト生殖系列軽鎖可変領域遺伝子セグメントによってはコードされない１つ以上のヒスチジン残基をコードする。本明細書に記載される遺伝子的に修飾された非ヒト動物を作製する方法が、提供される。重鎖の不在下で抗原に結合することができ、ならびに／または再構成された重鎖可変ドメインに関連付けられ、及び／もしくはｐＨ依存性抗原結合特徴を示すことができる、免疫グロブリン軽鎖（例えば、κまたはλ軽鎖）可変領域配列を産生するための方法が提供され、これは、二重特異性抗体を産生するために有用である。
【背景技術】
【０００４】
二重特異性抗体は、２つの別個の抗原決定基に結合することができる抗原結合部位を含む多機能性抗体であり、癌を含む多くの疾患を治療するための主要な治療用生物製剤のうちの１つとして現れた。近年、二重の抗原結合特性を有する多様な二重特異性抗体が開発されてきたが、従来の二重特異性抗体では、重鎖かまたは軽鎖かのいずれかの可変ドメインのみが各抗原決定基への結合に寄与しているのに対し、標準的な抗体では、軽鎖と重鎖との両方の可変領域が同一の抗原決定基への結合に寄与することができるため、従来の二重特異性抗体における免疫グロブリン軽鎖または重鎖可変ドメインの特異性及び親和性は、ある程度犠牲にされなければならなかった。それに加えて、所望のレベルの有効性の達成において、治療用抗体、例えば、二重特異性治療用抗体は、インビボでのそれらの限定されたリサイクリング可能性のため、高用量または複数回用量の抗体を必要とすることが多い。
【０００５】
現在開発されている２つの抗原またはエピトープを標的化する大部分の抗原結合タンパク質は、２つの抗原結合アーム、（ｉ）第１の抗原またはエピトープへの結合に寄与する免疫グロブリン重−軽鎖可変ドメイン対を含む第１の抗原結合アームと、（ｉｉ）第２の抗原またはエピトープへの結合に寄与する第２の重−軽鎖可変ドメイン対を含む第２の抗原結合アームと、を含む。これらの抗原結合タンパク質は、抗原結合タンパク質全体という文脈においては二重特異性であるが、各抗原結合アームの内部では必ずしも二重特異性ではなく、例えば、三重特異性抗原結合タンパク質などの多重特異性フォーマットにおける抗原結合タンパク質の使用を限定する。本明細書に開示されるように、ユニバーサルな重鎖可変ドメインを発現する非ヒト動物は、抗原結合タンパク質の多くの異なるフォーマットにおける使用のための抗原結合タンパク質を作製するための一般的なツールとして採用することができる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
抗原特異性及び親和性が、専らもしくは主に免疫グロブリン軽鎖可変ドメインの多様性からもたらされ、及び／または、専らもしくは主に免疫グロブリン軽鎖可変ドメインの多様性に属する、免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン配列を生成する必要が当該技術分野に存在する。かかる配列は、各可変ドメインが、別個の抗原特異的結合に別々に貢献する抗原結合タンパク質、例えば、二重特異性抗体の設計において極めて有用であろう。本明細書に記載される種々の態様及び実施形態は、再構成された重鎖可変遺伝子配列（例えば、再構成された重鎖ＶＤＪ配列）によってコードされる免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含む遺伝子的に修飾された非ヒト動物は、この必要を満たすことができるという驚くべき発見に部分的に基づく。再構成された免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（即ち、ユニバーサル重鎖可変ドメイン）をコードする非ヒト動物は、抗体の多様化のメカニズムを再構成されていない（即ち、多様化可能な）抗体軽鎖可変ドメイン（単数または複数）に集中させる。非ヒト動物としては、例えば、哺乳動物、また特定の実施形態では、齧歯動物（例えば、マウス、ラット、またはハムスター）が含まれる。
【０００７】
関心の抗原による刺激に際して、専らまたは主に抗体軽鎖可変ドメイン内に存在する抗原結合特異性を有する抗体を産生する、遺伝子的に修飾された非ヒト動物が提供される。軽鎖抗体可変ドメインアミノ酸及び対応する核酸配列は、かかる遺伝子的に修飾された動物によって産生される抗体から特定することができ、また配列は、重鎖可変ドメインから独立して（また、十分な特異性及び親和性を伴って）抗原決定基に結合する軽鎖可変ドメインを発生させるような組み換え抗体または他の抗原結合タンパク質において利用することができる。さらに、再構成された重鎖可変ドメインを含む（即ち、予め構成された重鎖可変ドメイン遺伝子配列を含む）遺伝子的に修飾された動物の実用性は、再構成された重鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を、多様なゲノムコンテクスト、例えば、異なる免疫グロブリン遺伝子座中に定置することによって適用することができる。再構成された重鎖可変ドメイン遺伝子配列は、再構成された重鎖可変ドメイン配列が、ヒトかまたは非ヒトかのいずれかの重鎖または軽鎖定常配列に作動可能に連結されることができるように、重鎖遺伝子座または軽鎖遺伝子座に標的化されることができる。再構成された重鎖可変ドメイン遺伝子配列は、ヒト、非ヒト、または混合ヒト／非ヒト免疫グロブリン定常領域配列との作動可能な連結において、ゲノム中のどこにでも定置することができる。さらに、再構成された重鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む非ヒト動物は、免疫グロブリン遺伝子座の追加の遺伝子修飾と組み合わせる（例えば、免疫グロブリン遺伝子座の追加の遺伝子修飾を含む動物と異種交配する）ことができる。例えば、軽鎖遺伝子座に標的化される再構成された重鎖可変ドメイン遺伝子配列によって付与される集中された多様化は、重鎖遺伝子座内に挿入される軽鎖可変ドメイン遺伝子配列と対にされることができ、それによって、選択されるゲノムコンテクストのタイミング及び多様化（例えば、重鎖遺伝子座の多様化メカニズム）を完全に利用する動物を生成して、選択される抗体可変遺伝子配列（例えば、抗体軽鎖可変遺伝子配列）の多様性を増加させることができる。それに加えて、制限された（限定された）軽鎖可変領域遺伝子セグメントレパートリー（例えば、１つ以上であるが野生型より少ない数のヒトＶＬ遺伝子セグメントを上述の単一の再構成された重鎖配列と組み合わせて含む、制限された数の軽鎖可変遺伝子配列）を有するマウスを利用することによって、免疫グロブリン重鎖可変ドメインとより効率的に対を成すことができる免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを産生することができる。
【０００８】
したがって、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域（即ち、再構成された重鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列、即ち、再構成された重鎖ＶＤＪ配列）を含む免疫グロブリン遺伝子座を含む遺伝子的に修飾された非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、またはハムスターなどの齧歯動物）が、提供される。
【０００９】
種々の態様では、遺伝子的に修飾された非ヒト動物によって発現されるゲノム重鎖可変ドメインコード核酸配列のみが、再構成された重鎖可変ドメインである。したがって、遺伝子的に修飾された非ヒト動物によって産生される抗体重鎖可変ドメインの多様性は、極めて制限される。
【００１０】
幾つかの実施形態では、そのゲノム中に、その可変領域配列が単一の再構成されたヒト重鎖可変領域から本質的に成るように遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座を有する、遺伝子的に修飾された非ヒト動物が、提供される。かかる遺伝子的に修飾された非ヒト動物内の異なる細胞は、（例えば、複製エラー、体細胞超変異、または他のメカニズムのため）単一の再構成されたヒト重鎖可変領域内に完全に同一の配列を必ずしも有していない場合があるが、それにも関わらず、かかる遺伝子的に修飾された非ヒト動物は、再構成されていない重鎖可変配列を有する動物、及び／またはそのゲノムが複数の重鎖可変領域遺伝子セグメント（例えば、特に再構成されていない場合、複数のＶ、Ｄ、及び／またはＪセグメント）を含む動物と比較して、劇的に制限された抗体重鎖可変ドメインの多様性を示すことが理解される。
【００１１】
種々の態様では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む（即ち、再構成された重鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む）遺伝子的に修飾された免疫グロブリン重鎖遺伝子座が提供される。種々の態様では、それがコードする再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列及び再構成された重鎖可変ドメインは、ヒトＶ、Ｄ、及びＪ遺伝子セグメントに由来する。種々の態様では、それがコードする再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列及び再構成された重鎖可変ドメインは、ヒトＶＨ遺伝子及びヒトＪＨセグメントに由来する。種々の態様では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される。種々の態様では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、軽鎖定常領域領域遺伝子配列に作動可能に連結される。種々の態様では、遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座は、非ヒト動物の生殖系列中に存在する。種々の態様では、遺伝子的に修飾された非ヒト動物は、軽鎖定常領域遺伝子配列との作動可能な連結において軽鎖遺伝子を形成するように再構成することが可能な再構成されていない軽鎖可変遺伝子セグメントの完全な補体を含む。他の態様では、遺伝子的に修飾された非ヒト動物は、複数であるが完全な補体より少ない（即ち、野生型より少ない数）の再構成されていない軽鎖可変遺伝子セグメントを含む。種々の態様では、再構成されていない軽鎖可変遺伝子セグメントは、重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される。特定の態様では、非ヒト動物は、齧歯動物、例えば、マウス、ラット、またはハムスターである。別の態様では、本明細書に記載されるように、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域を含む（即ち、再構成された重鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列、即ち、予め再構成された重鎖ＶＤＪ配列を含む）核酸構築物が提供される。
【００１２】
再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む免疫グロブリン遺伝子座を有する（即ち、再構成された重鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む免疫グロブリン遺伝子座を有する）、遺伝子的に修飾された非ヒト動物の多数の変形が、本明細書に開示される。各変形は、抗体の多様化のメカニズムを免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列に集中させる能力を有する。
【００１３】
種々の態様では、再構成された重鎖可変ドメイン（即ち、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変ドメイン）をコードするヌクレオチド配列は、ヒトまたは非ヒト重鎖定常領域遺伝子配列（例えば、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びそれらの組み合わせから選択される免疫グロブリンアイソタイプをコードする重鎖定常領域遺伝子配列）に作動可能に連結される。例えば、（ａ）第１のヌクレオチド配列が、再構成された重鎖可変ドメインをコードし（即ち、第１のヌクレオチド配列は、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列である）、第１のヌクレオチド配列は、ヒトまたは非ヒト（または混合ヒト／非ヒト）重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結され、（ｂ）第２のヌクレオチド配列が、軽鎖可変ドメインをコードし（即ち、第２のヌクレオチド配列は、再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変ヌクレオチド配列である）、第２のヌクレオチド配列は、ヒトまたは非ヒト軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、免疫グロブリン遺伝子座を含む、遺伝子的に修飾された非ヒト動物が提供される。
【００１４】
別の態様では、修飾された非ヒト動物であって、該動物は、重鎖可変ドメインをコードする再構成されたヌクレオチド配列を含み、重鎖可変ドメインは、スペーサーを介して重鎖Ｊセグメント（ＪＨ）配列に作動可能に連結される重鎖可変（ＶＨ）配列を含み、スペーサーは、少なくとも１つのアミノ酸残基をコードする、修飾された非ヒト動物が提供される。
【００１５】
別の態様では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む（即ち、再構成された重鎖可変ドメインをコードする核酸配列、即ち、再構成された重鎖ＶＤＪ配列を含む）遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座を含む、非ヒト動物であって、遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座が、非ヒト動物の生殖系列中に存在する、非ヒト動物が提供される。幾つかの実施形態では、遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座は、重鎖遺伝子座である。幾つかの実施形態では、遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座は、軽鎖遺伝子座である。
【００１６】
別の態様では、遺伝子的に修飾された免疫グロブリンゲノム遺伝子座、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を有する、遺伝子的に修飾された非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、またはハムスターなどの齧歯動物）であって、ヌクレオチド配列は、ヒトまたは非ヒト軽鎖（例えば、κまたはλ軽鎖）定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、遺伝子的に修飾された非ヒト動物が提供される。
【００１７】
別の態様では、（ａ）軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列と、（ｂ）ヒトまたは非ヒト重鎖定常領域遺伝子配列（例えば、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びそれらの組み合わせから選択される免疫グロブリンアイソタイプをコードする重鎖定常領域遺伝子配列）に作動可能に連結される再構成されていないヒトまたは非ヒト軽鎖（例えば、κまたはλ軽鎖）可変領域ヌクレオチド配列と、を含む、遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座を含む非ヒト動物が提供される。
【００１８】
別の態様では、
（ａ）第１の対立遺伝子であって、
（ｉ）重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、再構成された重鎖可変ドメインをコードする第１のヌクレオチド配列（即ち、第１のヌクレオチド配列は、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列である）、及び
（ｉｉ）軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、軽鎖可変ドメインをコードする第２のヌクレオチド配列（即ち、第２のヌクレオチド配列は、再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変ヌクレオチド配列である）、を含む、第１の対立遺伝子と、
（ｂ）第２の対立遺伝子であって、
（ｉ）重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、軽鎖可変ドメインをコードする第３のヌクレオチド配列（即ち、第３のヌクレオチド配列は、再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変ヌクレオチド配列である）、及び
（ｉｉ）軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、再構成された重鎖可変ドメインをコードする第４のヌクレオチド配列（即ち、第４のヌクレオチド配列は、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列である）、を含む、第２の対立遺伝子と、を含む免疫グロブリン遺伝子座を有する、遺伝子的に修飾された非ヒト動物が提供される。
【００１９】
種々の態様では、再構成されていない軽鎖可変領域遺伝子配列または遺伝子座を有する遺伝子的に修飾された非ヒト動物が、提供される。幾つかの実施形態では、遺伝子的に修飾された非ヒト動物は、野生型の数（即ち、全てまたは実質的に全て）のヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント（即ち、配列）を含む。他の態様では、本明細書に記載される非ヒト動物は、軽鎖可変遺伝子セグメントの限定されたレパートリー、例えば、非ヒト軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される、（ｉ）１つ、２つ、またはそれ以上であるが野生型より少ない数のヒトＶＬ遺伝子セグメント、及び（ｉｉ）１つ以上のヒトＪＬ遺伝子セグメントを含む。重鎖核酸配列及び／または軽鎖セグメントは、例えば、導入遺伝子中に、または内在性免疫グロブリン遺伝子座に存在してもよい。
【００２０】
種々の態様では、遺伝子的に修飾された非ヒト動物であって、該動物の全ての免疫グロブリン重鎖可変ドメインは、同一の再構成された可変重鎖遺伝子配列に由来し、該可変ドメインは、少なくとも１つ、２つ、または３つ以上のＶＬ遺伝子セグメント及び少なくとも１つ、２つ、または３つ以上のＪＬ遺伝子セグメントのうちの１つに由来する軽鎖可変ドメインと同起源で発現される、遺伝子的に修飾された非ヒト動物が提供される。それに加えて、そのゲノム中に、（ｉ）ヒトまたは非ヒト重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されたヒト重鎖可変領域核酸配列を含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座と、（ｉｉ）ヒトまたは非ヒト軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される１つ以上であるが野生型より少ない数のヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント（例えば、２つのヒトＶκ遺伝子セグメント及び１つ以上のヒトＪκ遺伝子セグメント）を含む免疫グロブリン軽鎖遺伝子座と、を含む、遺伝子的に修飾された非ヒト動物（例えば、マウス及びラットなどの齧歯動物）が、提供される。幾つかの実施形態では、軽鎖定常領域は、ラットまたはマウス定常領域、例えば、ラットまたはマウスＣκ定常領域である。
【００２１】
別の態様では、本明細書に記載される遺伝子的に修飾された非ヒト動物は、関心の抗原による刺激に際して、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖アミノ酸配列を含む抗原結合タンパク質を発現し、重鎖アミノ酸配列は、重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されたヒト重鎖可変領域核酸配列を含む遺伝子的に修飾された重鎖遺伝子座に由来する。特定の態様では、軽鎖アミノ酸配列は、非ヒト軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される、１つ以上であるが野生型より少ない数のヒトＶＬ遺伝子セグメント及び（ｉｉ）２つ以上のヒトＪＬ遺伝子セグメントを含む、遺伝子的に修飾された免疫グロブリン軽鎖遺伝子座に由来する。
【００２２】
スペーサーを介して重鎖Ｊ遺伝子セグメント（ＪＨ）配列に作動可能に連結される重鎖Ｖ遺伝子セグメント（ＶＨ）を含む再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域核酸配列をそのゲノム中に含む、遺伝子的に修飾された非ヒト動物であって、スペーサーは、少なくとも１つのアミノ酸（例えば、２つのアミノ酸、３つのアミノ酸、または４つのアミノ酸）及び／または修飾されたＤ遺伝子セグメントをコードする、遺伝子的に修飾された非ヒト動物が提供される。種々の実施形態では、再構成された重鎖可変領域核酸配列は、ヒトまたは非ヒト重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される。種々の実施形態では、非ヒト動物は、そのゲノム中に、ヒトまたは非ヒト軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される、１つ以上であるが野生型より少ない数のヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント、例えば、２つのヒトＶκ遺伝子セグメント及び１つ以上のヒトＪκ遺伝子セグメントを含む遺伝子的に修飾された免疫グロブリン軽鎖遺伝子座をさらに含む。
【００２３】
本明細書に記載される遺伝子的に修飾された非ヒト動物を作製及び使用する方法も、提供される。再構成されたヒト重鎖可変領域核酸配列を、免疫グロブリン重鎖または軽鎖定常領域核酸配列との作動可能な連結において、非ヒト動物のゲノム中に定置するための方法が提供される。
【００２４】
別の態様では、重鎖可変領域アミノ酸配列から独立して抗原に結合することが可能な免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列を獲得するための方法が、提供される。
【００２５】
別の態様では、本明細書に記載される方法のいずれかによって獲得可能な遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座が提供される。
【００２６】
種々の態様では、本明細書に記載される遺伝子的に修飾された非ヒト動物によって産生されるか、またはそれに由来する、抗原結合タンパク質（例えば、抗体）が提供される。多重特異性（例えば、二重特異性または三重特異性）抗原結合タンパク質を含む、抗原結合タンパク質を作製するための方法も提供される。エフェクター軽鎖免疫グロブリン可変ドメインを作製するための方法も提供される。
【００２７】
別の態様では、本明細書に記載される種々のゲノム修飾を含む非ヒト動物に由来する、多能性細胞、誘導多能性、または全能性幹細胞が提供される。例えば、前核注入によって細胞内に導入される修飾など、本明細書に記載される遺伝子修飾を含有する核を含む細胞も提供される。
【００２８】
種々の態様では、そのゲノムが、定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されたヒト重鎖可変領域核酸配列を含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む細胞を含む、非ヒト動物胚が提供される。特定の態様では、非ヒト動物胚は、軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される、２つ以上であるが野生型より少ない数のヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン軽鎖遺伝子座をさらに含む。
【００２９】
重鎖可変ドメインから独立して抗原またはそのエピトープに結合することが可能な免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列をコードする核酸配列を作製するための方法であって、（ａ）非ヒト動物を、関心の抗原またはその免疫原で免疫付与することであって、非ヒト動物は、そのゲノム中に（ｉ）重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域核酸配列、及び（ｉｉ）軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域核酸配列、を含む、免疫付与することと、（ｂ）非ヒト動物に免疫応答を開始させることと、（ｃ）免疫付与された非ヒト動物から、抗原に結合することができる軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を含む細胞を単離することと、（ｄ）細胞から、抗原に結合することができる軽鎖可変ドメイン（ＶＬドメイン）をコードする核酸配列を獲得することと、を含む、方法も提供される。種々の実施形態では、細胞は、ナチュラルキラー細胞、Ｔ細胞、及びＢ細胞を含むがそれらに限定されない、リンパ球である。種々の実施形態では、方法は、（ｃ）’リンパ球を癌細胞、例えば、骨髄腫細胞と融合させることをさらに含む。
【００３０】
重鎖可変ドメインから独立して抗原またはそのエピトープに結合することが可能な免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列をコードする核酸配列を作製するための方法であって、（ａ）非ヒト動物を、関心の抗原またはその免疫原で免疫付与することであって、非ヒト動物は、そのゲノム中に（ｉ）重鎖定常領域核酸配列作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域核酸配列、及び（ｉｉ）軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される、２つ以上であるが野生型より少ない数のヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント（ＶＬ及びＪＬ）を含む、免疫付与することと、（ｃ）免疫付与された非ヒト動物から、抗原に結合することができる軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を含む細胞を単離することと、（ｄ）細胞から、抗原に結合することができる軽鎖可変ドメイン（ＶＬドメイン）をコードする核酸配列を獲得することと、を含む、方法も提供される。種々の実施形態では、細胞は、ナチュラルキラー細胞、Ｔ細胞、及びＢ細胞を含むがそれらに限定されない、リンパ球である。種々の実施形態では、方法は、（ｃ）’リンパ球を癌細胞、例えば、骨髄腫細胞と融合させることをさらに含む。
【００３１】
重鎖可変ドメインから独立して抗原またはそのエピトープに結合することが可能な免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列をコードする核酸配列を作製するための方法であって、（ａ）非ヒト動物を、関心の抗原またはその免疫原で免疫付与することであって、非ヒト動物は、そのゲノム中に（ｉ）軽鎖定常領域核酸配列作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域核酸配列、及び（ｉｉ）重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結されるヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント（ＶＬ及びＪＬ）、を含む、免疫付与することと、（ｃ）免疫付与された非ヒト動物から、抗原に結合することができる軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を含む細胞を単離することと、（ｄ）細胞から、抗原に結合することができる軽鎖可変ドメイン（ＶＬドメイン）をコードする核酸配列を獲得することと、を含む、方法も提供される。種々の実施形態では、細胞は、ナチュラルキラー細胞、Ｔ細胞、及びＢ細胞を含むがそれらに限定されない、リンパ球である。種々の実施形態では、方法は、（ｃ）’リンパ球を癌細胞、例えば、骨髄腫細胞と融合させることをさらに含む。
【００３２】
抗原結合タンパク質を作製するための方法であって、
（ａ）非ヒト動物を、第１のエピトープまたはその免疫原性部分を含む第１の抗原で免疫付与することであって、非ヒト動物は、そのゲノム中に（ｉ）重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域核酸配列、及び（ｉｉ）軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域核酸配列を含む、免疫付与することと、
（ｂ）非ヒト動物に、第１のエピトープまたはその免疫原性部分に対する免疫応答を開始させることと、
（ｃ）非ヒト動物から、第１のエピトープまたはその免疫原性部分に特異的に結合する軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を含む細胞を単離することと、
（ｄ）（ｃ）の細胞から、第１のエピトープまたはその免疫原性部分に特異的に結合する軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を獲得することと、
（ｅ）（ｃ）の核酸配列を、ヒト免疫グロブリン定常領域核酸配列に融合される、発現構築物において採用することと、
（ｆ）（ｃ）の核酸配列を、第２の抗原またはそのエピトープに特異的に結合するヒト免疫グロブリン重鎖を発現する産生細胞株の中に発現させて、その軽鎖が（ｃ）の核酸によってコードされ、重鎖から独立して第１のエピトープまたはその免疫原性部分に結合し、またその重鎖が第２の抗原またはエピトープに特異的に結合する、抗原結合タンパク質を形成することと、を含む、方法も提供される。
【００３３】
抗原結合タンパク質を作製するための方法であって、
（ａ）非ヒト動物を、第１のエピトープまたはその免疫原性部分を含む第１の抗原で免疫付与することであって、非ヒト動物は、そのゲノム中に（ｉ）重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域核酸配列、及び（ｉｉ）軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される、２つ以上であるが野生型より少ない数のヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント（ＶＬ及びＪＬ）を含む、免疫付与することと、
（ｂ）非ヒト動物に、第１のエピトープまたはその免疫原性部分に対する免疫応答を開始させることと、
（ｃ）非ヒト動物から、第１のエピトープまたはその免疫原性部分に特異的に結合する軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を含む細胞を単離することと、
（ｄ）（ｃ）の細胞から、第１のエピトープまたはその免疫原性部分に特異的に結合する軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を獲得することと、
（ｅ）（ｃ）の核酸配列を、ヒト免疫グロブリン定常領域核酸配列に融合される、発現構築物において採用することと、
（ｆ）（ｃ）の核酸配列を、第２の抗原またはそのエピトープに特異的に結合するヒト免疫グロブリン重鎖を発現する産生細胞株の中に発現させて、その軽鎖が（ｃ）の核酸によってコードされ、重鎖から独立して第１のエピトープまたはその免疫原性部分に結合し、またその重鎖が第２の抗原またはエピトープに特異的に結合する、抗原結合タンパク質を形成することと、を含む、方法も提供される。
【００３４】
抗原結合タンパク質を作製するための方法であって、
（ａ）非ヒト動物を、第１のエピトープまたはその免疫原性部分を含む第１の抗原で免疫付与することであって、非ヒト動物は、そのゲノム中に（ｉ）軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域核酸配列、及び（ｉｉ）重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結されるヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント（ＶＬ及びＪＬ）、を含む、免疫付与することと、
（ｂ）非ヒト動物に、第１のエピトープまたはその免疫原性部分に対する免疫応答を開始させることと、
（ｃ）非ヒト動物から、第１のエピトープまたはその免疫原性部分に特異的に結合する軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を含む細胞を単離することと、
（ｄ）（ｃ）の細胞から、第１のエピトープまたはその免疫原性部分に特異的に結合する軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を獲得することと、
（ｅ）（ｃ）の核酸配列を、ヒト免疫グロブリン定常領域核酸配列に融合される、発現構築物において採用することと、
（ｆ）（ｃ）の核酸配列を、第２の抗原またはそのエピトープに特異的に結合するヒト免疫グロブリン重鎖を発現する産生細胞株の中に発現させて、その軽鎖が（ｃ）の核酸によってコードされ、重鎖から独立して第１のエピトープまたはその免疫原性部分に結合し、またその重鎖が第２の抗原またはエピトープに特異的に結合する、抗原結合タンパク質を形成することと、を含む、方法も提供される。
【００３５】
種々の態様では、その生殖系列ゲノム中に、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む、非ヒト動物が提供される。幾つかの実施形態では、非ヒト動物は、哺乳動物である。幾つかの実施形態では、哺乳動物は、齧歯動物である。幾つかの実施形態では、マウス、ラット、及びハムスターから成る群から選択される齧歯動物。幾つかの実施形態では、非ヒト動物は、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列に関してホモ接合性である。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、非ヒト重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される。特定の実施形態では、非ヒト重鎖定常領域遺伝子配列は、Ｆｃをコードする。特定の実施形態では、非ヒト重鎖定常領域遺伝子配列は、マウスまたはラット重鎖定常領域遺伝子配列である。幾つかの実施形態では、非ヒト動物は、齧歯動物であり、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒト重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される。特定の実施形態では、重鎖定常領域遺伝子配列は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、及びそれらの組み合わせから選択される。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒト重鎖ＶＨ遺伝子セグメント、ヒト重鎖Ｄ遺伝子セグメント、及びヒト重鎖ＪＨ遺伝子セグメントに由来する。特定の実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒト生殖系列重鎖ＶＨセグメント、ヒト生殖系列重鎖Ｄセグメント、及びヒト生殖系列重鎖ＪＨセグメントに由来する。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒトＶＨ３−２３／ＧＹ／ＪＨ４−４の配列をコードする。幾つかの実施形態では、実質的に全ての内在性機能性ＶＨ、Ｄ、及びＪＨ遺伝子セグメントは、非ヒト動物の免疫グロブリン重鎖遺伝子座から欠失させられるか、または非機能性にされる。幾つかの実施形態では、非ヒト動物は、内在性機能性ＶＨ、Ｄ、及びＪＨ遺伝子セグメントを欠失させるか、または非機能性にする修飾を含み、非ヒト動物は、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を含み、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、異所的に存在する。幾つかの実施形態では、再構成された重鎖可変領域ヌクレオチド配列によってコードされる免疫グロブリン重鎖可変ドメインは、非ヒト動物に対して免疫原性ではない。幾つかの実施形態では、非ヒト動物は、Ａｄａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはその両方を含む。幾つかの実施形態では、非ヒト動物は、再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖（ＶＬ）遺伝子セグメント及び再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖Ｊ遺伝子セグメントをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。特定の実施形態では、再構成されていない軽鎖Ｖ遺伝子セグメント（ＶＬ）及び再構成されていない軽鎖（ＪＬ）遺伝子セグメントをコードするヌクレオチド配列は、免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される。特定の実施形態では、軽鎖定常領域遺伝子配列は、齧歯動物及びヒト定常領域遺伝子配列から選択される。またより特定の実施形態では、齧歯動物は、マウス、ラット、及びハムスターから選択される。特定の実施形態では、再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖（ＶＬ）遺伝子セグメント及び再構成されていないヒト免疫グロブリン（ＪＬ）遺伝子セグメントは、内在性齧歯動物遺伝子座において、齧歯動物免疫グロブリン定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される。幾つかの実施形態では、免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列の複数のコピーを含む。
【００３６】
追加の態様では、重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む、非ヒト生殖細胞中の非ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座であって、定常領域遺伝子配列は、非ヒト配列、ヒト配列、またはそれらの組み合わせを含む、非ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座が提供される。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、内在性非ヒト免疫グロブリン定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される。特定の実施形態では、内在性非ヒト免疫グロブリン定常領域遺伝子配列は、マウスまたはラット重鎖定常領域遺伝子配列である。
【００３７】
追加の態様では、非ヒト動物を作製するための方法であって、
（ａ）内在性機能性免疫グロブリン重鎖ＶＨ、Ｄ、及び及びＪＨ遺伝子セグメントを欠失させるか、または非機能性にするように、非ヒト動物のゲノムを修飾することと、
（ｂ）ゲノム中に、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を定置することと、を含む、方法が提供される。
幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される。特定の実施形態では、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列は、マウスまたはラット免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列である。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ゲノム中の内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子座に定置される。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、非ヒト動物の生殖系列ゲノム中に存在する。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ゲノム中の異所性遺伝子座に存在する。幾つかの実施形態では、非ヒト動物は、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列の複数のコピーを含む。幾つかの実施形態では、非ヒト動物は、Ａｄａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはその両方を含む。幾つかの実施形態では、非ヒト動物は、マウス、ラット、またはハムスターから成る群から選択される齧歯動物である。幾つかの実施形態では、本明細書に記載される免疫グロブリン重鎖遺伝子座に関してヘテロ接合性である非ヒト動物であって、非ヒト動物は、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を優勢的に免疫グロブリン重鎖遺伝子座から発現する、非ヒト動物が提供される。
【００３８】
追加の態様では、
（ａ）軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列と、
（ｂ）重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列と、を含む、遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座を含む非ヒト動物が提供される。
幾つかの実施形態では、非ヒト動物は、哺乳動物である。特定の実施形態では、哺乳動物は、マウス、ラット、及びハムスターから成る群から選択される。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、κ軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、λ軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される。幾つかの実施形態では、軽鎖定常領域遺伝子配列は、マウスまたはラット軽鎖定常領域遺伝子配列である。幾つかの実施形態では、軽鎖定常領域遺伝子配列は、ヒト軽鎖定常領域遺伝子配列である。幾つかの実施形態では、重鎖定常領域遺伝子配列は、マウスまたはラット重鎖定常領域遺伝子配列である。幾つかの実施形態では、重鎖定常領域遺伝子配列は、ヒト重鎖定常領域遺伝子配列である。幾つかの実施形態では、重鎖定常領域遺伝子配列は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、及びそれらの組み合わせから選択される配列をコードする。幾つかの実施形態では、再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒトκ軽鎖可変ドメイン遺伝子配列を含む。幾つかの実施形態では、再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒトλ軽鎖可変ドメイン遺伝子配列を含む。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒト重鎖ＶＨ遺伝子セグメント、ヒト重鎖Ｄ遺伝子セグメント、及びヒト重鎖ＪＨ遺伝子セグメントに由来する。特定の実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒト生殖系列重鎖ＶＨセグメント、ヒト生殖系列重鎖Ｄセグメント、及びヒト生殖系列重鎖ＪＨセグメントに由来する。特定の実施形態では、ヒトＶＨ遺伝子セグメントは、ＶＨ１−２、ＶＨ１−３、ＶＨ１−８、ＶＨ１−１８、ＶＨ１−２４、ＶＨ１−４５、ＶＨ１−４６、ＶＨ１−５８、ＶＨ１−６９、ＶＨ２−５、ＶＨ２−２６、ＶＨ２−７０、ＶＨ３−７、ＶＨ３−９、ＶＨ３−１１、ＶＨ３−１３、ＶＨ３−１５、ＶＨ３−１６、ＶＨ３−２０、ＶＨ３−２１、ＶＨ３−２３、ＶＨ３−３０、ＶＨ３−３０−３、ＶＨ３−３０−５、ＶＨ３−３３、ＶＨ３−３５、ＶＨ３−３８、ＶＨ３−４３、ＶＨ３−４８、ＶＨ３−４９、ＶＨ３−５３、ＶＨ３−６４、ＶＨ３−６６、ＶＨ３−７２、ＶＨ３−７３、ＶＨ３−７４、ＶＨ４−４、ＶＨ４−２８、ＶＨ４−３０−１、ＶＨ４−３０−２、ＶＨ４−３０−４、ＶＨ４−３１、ＶＨ４−３４、ＶＨ４−３９、ＶＨ４−５９、ＶＨ４−６１、ＶＨ５−５１、ＶＨ６−１、ＶＨ７−４−１、ＶＨ７−８１、及びそれらの多型変異体から成る群から選択される。特定の実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントは、Ｄ１−１、Ｄ１−７、Ｄ１−１４、Ｄ１−２０、Ｄ１−２６、Ｄ２−２、Ｄ２−８、Ｄ２−１５、Ｄ２−２１、Ｄ３−３、Ｄ３−９、Ｄ３−１０、Ｄ３−１６、Ｄ３−２２、Ｄ４−４、Ｄ４−１１、Ｄ４−１７、Ｄ４−２３、Ｄ５−１２、Ｄ５−５、Ｄ５−１８、Ｄ５−２４、Ｄ６−６、Ｄ６−１３、Ｄ６−１９、Ｄ６−２５、Ｄ７−２７、及びそれらの多型変異体から成る群から選択される。���定の実施形態では、ヒトＪＨ遺伝子セグメントは、ＪＨ１、ＪＨ２、ＪＨ３、ＪＨ４、ＪＨ５、ＪＨ６、及びそれらの多型変異体から成る群から選択される。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒトＶＨ３−２３／ＧＹ／ＪＨ４−４の配列（配列番号１３７）をコードする。幾つかの実施形態では、遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座は、非ヒト動物の生殖系列中に存在する。幾つかの実施形態では、実質的に全ての内在性機能性ＶＨ、Ｄ、及びＪＨ遺伝子セグメントは、非ヒト動物の免疫グロブリン重鎖遺伝子座から欠失させられるか、または非機能性にされる。幾つかの実施形態では、非ヒト動物は、内在性機能性ＶＨ、Ｄ、及びＪＨ遺伝子セグメントを欠失させるか、または非機能性にする修飾を含み、非ヒト動物は、軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を含み、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ゲノム中の異所性遺伝子座に存在する。幾つかの実施形態では、非ヒト動物は、Ａｄａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはその両方を含む。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変ドメインは、非ヒト動物に対して免疫原性ではない。幾つかの実施形態では、遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座は、軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列の複数のコピーを含む。
【００３９】
追加の態様は、
（１）軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列と、
（２）重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列と、を含む、非ヒト動物の生殖系列ゲノム中の免疫グロブリン遺伝子座を提供する。
幾つかの実施形態では、軽鎖定常領域遺伝子配列は、κ軽鎖定常領域遺伝子配列である。幾つかの実施形態では、軽鎖定常領域遺伝子配列は、λ軽鎖定常領域遺伝子配列である。幾つかの実施形態では、軽鎖定常領域遺伝子配列は、マウスまたはラット軽鎖定常領域遺伝子配列である。
【００４０】
追加の態様は、修飾された免疫グロブリン遺伝子座を含む非ヒト動物を作製する方法であって、
（ａ）非ヒト動物のゲノムを、
（ｉ）内在性機能性免疫グロブリン重鎖Ｖ、Ｄ、及びＪ遺伝子セグメント、ならびに
（ｉｉ）内在性機能性免疫グロブリン軽鎖Ｖ及びＪ遺伝子セグメント、を欠失させるか、または非機能性にするように修飾することと、
（ｂ）ゲノム中に、
（ｉ）軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列、及び
（ｉｉ）重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列、を定置することと、を含む、方法を提供する。
幾つかの実施形態では、再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、κ軽鎖可変ドメインをコードする。幾つかの実施形態では、再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、λ軽鎖可変ドメインをコードする。幾つかの実施形態では、重鎖定常領域遺伝子配列は、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列である。特定の実施形態では、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列は、マウスまたはラット重鎖定常領域遺伝子配列である。特定の実施形態では、重鎖定常領域遺伝子配列は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、及びそれらの組み合わせから選択される配列をコードする。幾つかの実施形態では、非ヒト動物は、マウス、ラット、またはハムスターから成る群から選択される齧歯動物である。幾つかの実施形態では、修飾された免疫グロブリン遺伝子座は、非ヒト動物の生殖系列ゲノム中に存在する。幾つかの実施形態では、非ヒト動物は、Ａｄａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはその両方を含む。
【００４１】
スペーサーを介して重鎖Ｊセグメント（ＪＨ）配列に作動可能に連結される重鎖Ｖセグメント（ＶＨ）配列を含む再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む、修飾された免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む非ヒト動物であって、スペーサーは、少なくとも１つのアミノ酸残基を含む、非ヒト動物も提供される。幾つかの実施形態では、非ヒト動物は、齧歯動物である。幾つかの実施形態では、齧歯動物は、マウス、ラット、及びハムスターから成る群から選択される。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、非ヒト重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される。幾つかの実施形態では、非ヒト重鎖定常領域遺伝子配列は、マウスまたはラット定常領域遺伝子配列である。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒト重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される。特定の実施形態では、重鎖定常領域遺伝子配列は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、及びそれらの組み合わせから選択される配列をコードする。幾つかの実施形態では、ＶＨ配列及びＪＨ配列は、ヒトＶＨ遺伝子セグメント及びヒトＪＨ遺伝子セグメントに由来する。特定の実施形態では、ヒトＶＨ遺伝子セグメントは、ＶＨ１−２、ＶＨ１−３、ＶＨ１−８、ＶＨ１−１８、ＶＨ１−２４、ＶＨ１−４５、ＶＨ１−４６、ＶＨ１−５８、ＶＨ１−６９、ＶＨ２−５、ＶＨ２−２６、ＶＨ２−７０、ＶＨ３−７、ＶＨ３−９、ＶＨ３−１１、ＶＨ３−１３、ＶＨ３−１５、ＶＨ３−１６、ＶＨ３−２０、ＶＨ３−２１、ＶＨ３−２３、ＶＨ３−３０、ＶＨ３−３０−３、ＶＨ３−３０−５、ＶＨ３−３３、ＶＨ３−３５、ＶＨ３−３８、ＶＨ３−４３、ＶＨ３−４８、ＶＨ３−４９、ＶＨ３−５３、ＶＨ３−６４、ＶＨ３−６６、ＶＨ３−７２、ＶＨ３−７３、ＶＨ３−７４、ＶＨ４−４、ＶＨ４−２８、ＶＨ４−３０−１、ＶＨ４−３０−２、ＶＨ４−３０−４、ＶＨ４−３１、ＶＨ４−３４、ＶＨ４−３９、ＶＨ４−５９、ＶＨ４−６１、ＶＨ５−５１、ＶＨ６−１、ＶＨ７−４−１、ＶＨ７−８１、及びそれらの多型変異体から成る群から選択される。特定の実施形態では、ヒトＶＨ遺伝子セグメントは、ＶＨ３−２３またはその多型変異体である。幾つかの実施形態では、スペーサーは、ヒトＤ遺伝子セグメントに由来する配列をコードする。特定の実施形態では、ヒトＤ遺伝子セグメントは、Ｄ１−１、Ｄ１−７、Ｄ１−１４、Ｄ１−２０、Ｄ１−２６、Ｄ２−２、Ｄ２−８、Ｄ２−１５、Ｄ２−２１、Ｄ３−３、Ｄ３−９、Ｄ３−１０、Ｄ３−１６、Ｄ３−２２、Ｄ４−４、Ｄ４−１１、Ｄ４−１７、Ｄ４−２３、Ｄ５−１２、Ｄ５−５、Ｄ５−１８、Ｄ５−２４、Ｄ６−６、Ｄ６−１３、Ｄ６−１９、Ｄ６−２５、Ｄ７−２７、及びそれらの多型変異体から成る群から選択される。特定の実施形態では、スペーサーは、Ｄ４−４またはその多型変異体の配列をコードする。特定の実施形態では、ヒトＪＨ遺伝子セグメントは、ＪＨ１、ＪＨ２、ＪＨ３、ＪＨ４、ＪＨ５、ＪＨ６、及びそれらの多型変異体から成る群から選択される。特定の実施形態では、ヒトＪＨセグメントは、ＪＨ４−４またはその多型変異体である。幾つかの実施形態では、再構成された免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒトＶＨ３−２３／ＧＹ／ＪＨ４−４の配列（配列番号１３７）をコードする。幾つかの実施形態では、実質的に全ての内在性機能性ＶＨ、Ｄ、及びＪＨ遺伝子セグメントは、非ヒト動物の免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座から欠失させられるか、または非機能性にされる。幾つかの実施形態では、非ヒト動物は、内在性機能性ＶＨ、Ｄ、及びＪＨ遺伝子セグメントを欠失させるか、または非機能性にする修飾を含み、非ヒト動物は、そのゲノムの異所性遺伝子座に、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変ドメインは、非ヒト動物に対して免疫原性ではない。幾つかの実施形態では、非ヒト動物は、Ａｄａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはその両方を含む。
【００４２】
追加の態様は、スペーサーを介して重鎖Ｊ遺伝子セグメント（ＪＨ）に作動可能に連結される重鎖可変遺伝子セグメント（ＶＨ）を含む再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を含み、スペーサーは、少なくとも１つのアミノ酸残基をコードする、非ヒト動物の生殖系列中の免疫グロブリン重鎖遺伝子座を提供する。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、非ヒト重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される。特定の実施形態では、非ヒト重鎖定常領域遺伝子配列は、マウスまたはラット重鎖定常領域遺伝子配列である。幾つかの実施形態では、免疫グロブリン遺伝子座は、再構成された重鎖可変領域ヌクレオチド配列の複数のコピーを含む。
【００４３】
追加の態様では、修飾された免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む非ヒト動物を作製する方法であって、
（ａ）内在性機能性免疫グロブリン重鎖ＶＨ、Ｄ、及びＪＨ遺伝子セグメントを欠失させるか、または非機能性にするように、非ヒト動物のゲノムを修飾することと、
（ｂ）ゲノム中に、スペーサーを介して重鎖Ｊ遺伝子セグメント（ＪＨ）に作動可能に連結される重鎖可変遺伝子セグメント（ＶＨ）を含む再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を定置することと、を含み、スペーサーは、少なくとも１つのアミノ酸残基を含む、方法が提供される。
幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖ヌクレオチド配列は、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される。特定の実施形態では、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列は、マウスまたはラット重鎖定常領域遺伝子配列である。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ゲノム中の内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子座に定置される。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ゲノム中の異所性遺伝子座に存在する。幾つかの実施形態では、修飾された重鎖遺伝子座は、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列の複数のコピーを含む。幾つかの実施形態では、非ヒト動物は、マウス、ラット、またはハムスターから成る群から選択される齧歯動物である。幾つかの実施形態では、非ヒト動物は、Ａｄａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはその両方を含む。幾つかの実施形態では、修飾された免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、非ヒト動物の生殖系列ゲノム中に存在する。
【００４４】
追加の態様は、そのゲノム中に、
（ａ）重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されたヒト重鎖可変領域核酸配列を含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座と、
（ｂ）軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される１つ以上であるが野生型より少ない数のヒト免疫グロブリン軽鎖ＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン軽鎖遺伝子座と、を含む、修飾された非ヒト動物を提供する。
幾つかの実施形態では、非ヒト動物は、哺乳動物である。特定の実施形態では、哺乳動物は、齧歯動物である。特定の実施形態では、齧歯動物は、マウス、ラット、及びハムスターから成る群から選択される。幾つかの実施形態では、重鎖定常領域核酸配列は、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、及びそれらの組み合わせから選択される免疫グロブリンアイソタイプをコードする齧歯動物定常領域配列である。幾つかの実施形態では、軽鎖定常領域核酸配列は、齧歯動物κまたはλ定常領域核酸配列である。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト重鎖可変領域核酸配列は、ヒト生殖系列ＶＨセグメント、ヒト生殖系列Ｄセグメント、及びヒト生殖系列ＪＨセグメントから選択される。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト重鎖可変領域核酸配列は、内在性遺伝子座において定常領域核酸配列に作動可能に連結される。幾つかの実施形態では、１つ以上であるが野生型より少ない数のヒト免疫グロブリン軽鎖ＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメントは、内在性遺伝子座において軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される。幾つかの実施形態では、非ヒト動物は、２つ以下のヒト免疫グロブリン非再構成ＶＬ遺伝子セグメントと、１つ、２つ、または３つ以上のヒト非再構成ＪＬ遺伝子セグメントとを含む。幾つかの実施形態では、再構成された重鎖可変領域核酸配列は、ＶＨ１−２、ＶＨ１−３、ＶＨ１−８、ＶＨ１−１８、ＶＨ１−２４、ＶＨ１−４５、ＶＨ１−４６、ＶＨ１−５８、ＶＨ１−６９、ＶＨ２−５、ＶＨ２−２６、ＶＨ２−７０、ＶＨ３−７、ＶＨ３−９、ＶＨ３−１１、ＶＨ３−１３、ＶＨ３−１５、ＶＨ３−１６、ＶＨ３−２０、ＶＨ３−２１、ＶＨ３−２３、ＶＨ３−３０、ＶＨ３−３０−３、ＶＨ３−３０−５、ＶＨ３−３３、ＶＨ３−３５、ＶＨ３−３８、ＶＨ３−４３、ＶＨ３−４８、ＶＨ３−４９、ＶＨ３−５３、ＶＨ３−６４、ＶＨ３−６６、ＶＨ３−７２、ＶＨ３−７３、ＶＨ３−７４、ＶＨ４−４、ＶＨ４−２８、ＶＨ４−３０−１、ＶＨ４−３０−２、ＶＨ４−３０−４、ＶＨ４−３１、ＶＨ４−３４、ＶＨ４−３９、ＶＨ４−５９、ＶＨ４−６１、ＶＨ５−５１、ＶＨ６−１、ＶＨ７−４−１、ＶＨ７−８１、及びそれらの多型変異体から成る群から選択されるヒト生殖系列ＶＨ遺伝子セグメントに由来する。特定のでは、再構成された重鎖可変領域核酸配列は、ヒト生殖系列ＶＨ３−２３遺伝子セグメントに由来する。幾つかの実施形態では、再構成された重鎖可変領域核酸配列は、ヒトＶＨ３−２３／ＧＹ／ＪＨ４−４の配列（配列番号１３７）をコードする。幾つかの実施形態では、再構成された重鎖可変領域核酸配列は、ＶＨ３−２３／Ｘ１Ｘ２／Ｊの配列をコードし、Ｘ１は、任意のアミノ酸であり、Ｘ２は、任意のアミノ酸である。特定の実施形態では、Ｘ１は、Ｇｌｙであり、Ｘ２は、Ｔｙｒである。幾つかの実施形態では、免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、機能性Ａｄａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはその両方を含む。特定の実施形態では、Ａｄａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはその両方は、内在性Ａｄａｍ６遺伝子である。幾つかの実施形態では、遺伝子的に修飾された非ヒト動物は、Ａｄａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、ま��はその両方をゲノムの異所性遺伝子座に含む。幾つかの実施形態では、ヒト可変領域ＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメントは、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを再構成及びコードすることが可能である。幾つかの実施形態では、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、２つのヒトＶＬ遺伝子セグメント、Ｖκ１−３９及びＶκ３−２０を含む。特定の実施形態では、遺伝子セグメントは、生殖系列遺伝子セグメントである。特定の実施形態では、非ヒト動物は、Ｊκ１、Ｊκ２、Ｊκ３、Ｊκ４、及びＪκ５遺伝子セグメントを含む。幾つかの実施形態では、２つ以上、３つ以上、４つ以上、または５つ以上のヒトＶＬ遺伝子セグメント、及び２つ以上のヒトＪＬ遺伝子セグメントが、内在性軽鎖遺伝子座に存在する。幾つかの実施形態では、ヒト軽鎖ＶＬまたはＪＬ遺伝子セグメントのうちの少なくとも１つは、対応するヒト生殖系列軽鎖可変遺伝子セグメントによってはコードされない１つ以上のヒスチジンコドンをコードする。幾つかの実施形態では、ＶＬ遺伝子セグメントのうちの少なくとも１つは、ヒスチジンコドンの付加、または対応するヒト生殖系列ＶＬセグメント配列によってコードされる少なくとも１つの非ヒスチジンコドンの、ヒスチジンコドンでの置換を含む。特定の実施形態では、付加または置換されるヒスチジンコドンは、ＣＤＲ３中に存在する。幾つかの実施形態では、ヒトＶＬ遺伝子セグメントは、ヒトＶκ１−３９及びＶκ３−２０遺伝子セグメントであり、ヒトＶκ１−３９及びＶκ３−２０遺伝子セグメントの各々は、対応するヒト生殖系列ＶＬ遺伝子セグメントによってコードされる少なくとも１つの非ヒスチジンコドンの、ヒスチジンコドンでの置換を含む。特定の実施形態では、置換は、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントの３つの非ヒスチジンコドンのものであり、置換は、１０６位、１０８位、及び１１１位にてヒスチジンを発現するように設計される。特定の実施形態では、置換は、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントの４つの非ヒスチジンコドンのものであり、置換は、１０５位、１０６位、１０８位、及び１１１位にてヒスチジンを発現するように設計される。特定の実施形態では、置換は、ヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントの３つの非ヒスチジンコドンのものであり、置換は、１０５位、１０６位、及び１０９位にてヒスチジンを発現するように設計される。特定の実施形態では、置換は、ヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントの４つの非ヒスチジンコドンのものであり、置換は、１０５位、１０６位、１０７位、及び１０９位にてヒスチジンを発現するように設計される。幾つかの実施形態では、非ヒト動物は、関心の抗原による刺激に際して、抗原に特異的に結合する抗原結合タンパク質を発現し、抗原結合タンパク質は、ヒトＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメントに由来するアミノ酸配列を含み、抗原結合タンパク質は、ヒトＶＬ遺伝子セグメントによってコードされるアミノ酸位置に、少なくとも１つのヒスチジン残基を含む、請求項１０７に記載の非ヒト動物。幾つかの実施形態では、非ヒト動物は、抗原に応答して抗原結合タンパク質の集団を発現し、集団内の全ての抗原結合タンパク質は、（ａ）再構成されたヒト可変領域核酸配列に由来するヒト重鎖可変ドメインを含む免疫グロ��リン重鎖と、（ｂ）非ヒト動物のゲノム中のヒトＶＬ遺伝子セグメント及びＪＬ遺伝子セグメントの再構成に由来する免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む免疫グロブリン軽鎖と、を含み、ヒトＶＬ遺伝子セグメントのうちの少なくとも１つは、対応するヒト生殖系列ＶＬ遺伝子セグメントによってはコードされない１つ以上のヒスチジンコドンをコードする。
【００４５】
追加の態様は、修飾された免疫グロブリン遺伝子座を含む非ヒト動物を作製するための方法であって、
（ａ）非ヒト動物のゲノムを、
（ｉ）内在性機能性免疫グロブリン重鎖ＶＨ、Ｄ、及び／またはＪＨ遺伝子セグメント、ならびに
（ｉｉ）内在性機能性免疫グロブリン軽鎖ＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメント、を欠失させるか、または非機能性にするように修飾することと、
（ｂ）非ヒト動物の修飾されたゲノム中に、
（ｉ）免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結されている再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域核酸配列、ならびに
（ｉｉ）免疫グロブリン軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結されている１つ以上であるが野生型より少ない数のヒト免疫グロブリン軽鎖ＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメント、を定置することと、を含む、方法を提供する。
幾つかの実施形態では、非ヒト動物は、齧歯動物である。特定の実施形態では、齧歯動物は、マウス、ラット、またはハムスターである。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域核酸配列は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、及びそれらの組み合わせから選択されるマウスまたはラット重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域核酸配列ならびにヒト免疫グロブリン軽鎖ＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメントは、野生型非ヒト動物の対応するヌクレオチド配列またはその付近に定置される。幾つかの実施形態では、再構成された免疫グロブリンヒト重鎖可変領域核酸配列ならびにヒト免疫グロブリン軽鎖ＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメントは、ゲノム中の異所性遺伝子座に定置される。幾つかの実施形態では、非ヒト動物は、内在性Ａｄａｍ６ａ遺伝子，Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはその両方を含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む。幾つかの実施形態では、非ヒト動物は、Ａｄａｍ６ａ遺伝子，Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはその両方をゲノムの異所性遺伝子座に含む。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域核酸配列は、ヒトＶＨ３−２３／ＧＹ／ＪＨ４−４の配列（配列番号１３７）をコードする。幾つかの実施形態では、免疫グロブリン軽鎖定常領域核酸配列は、ラットまたはマウスＣκ定常領域核酸配列である。幾つかの実施形態では、ヒト免疫グロブリン軽鎖ＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメントは、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメインをコードすることが可能である。幾つかの実施形態では、非ヒト動物は、２つのヒトＶＬ遺伝子セグメント、Ｖκ１−３９及びＶκ３−２０を含む免疫グロブリン軽鎖遺伝子座を含む。特定の実施形態では、非ヒト動物は、Ｊκ１、Ｊκ２、Ｊκ３、Ｊκ４、及びＪκ５遺伝子セグメントを含む。幾つかの実施形態では、２つ以上、３つ以上、４つ以上、または５つ以上のヒトＶＬ遺伝子セグメント、及び２つ以上のヒトＪＬ遺伝子セグメントは、内在性軽鎖遺伝子座に存在する。幾つかの実施形態では、ヒト免疫グロブリン軽鎖ＶＬまたはＪＬ遺伝子セグメントのうちの少なくとも１つは、対応するヒト生殖系列軽鎖可変遺伝子セグメントによってはコードされない１つ以上のヒスチジンコドンをコードする。幾つかの実施形態では、ＶＬ遺伝子セグメントのうちのすくなくとも１つは、ヒスチジンコドンの付加、または対応するヒト生殖系列ＶＬセグメント配列によってコードされる少なくとも１つの非ヒスチジンコドンの、ヒスチジンコドンでの置換を含む。特定の実施形態では、付加または置換されるヒスチジンコドンは、ＣＤＲ３中に存在する。特定の実施形態では、ヒトＶＬ遺伝子セグメントは、ヒトＶκ１−３９及びＶκ３−２０遺伝子セグメントであり、ヒトＶκ１−３９及びＶκ３−２０遺伝子セグメントの各々は、対応するヒト生殖系列ＶＬ遺伝子セグメントによってコードされる少なくとも１つの非ヒスチジンコドンの、ヒスチジンコドンでの置換を含む。特定の実施形態では、置換は、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントの３つの非ヒスチジンコドンのものであり、置換は、１０６位、１０８位、及び１１１位にてヒスチジンを発現するよ���に設計される。特定の実施形態では、置換は、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントの４つの非ヒスチジンコドンのものであり、置換は、１０５位、１０６位、１０８位、及び１１１位にてヒスチジンを発現するように設計される。特定の実施形態では、置換は、ヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントのものであり、３つの非ヒスチジンコドン置換は、１０５位、１０６位、及び１０９位にてヒスチジンを発現するように設計される。特定の実施形態では、置換は、ヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントの４つの非ヒスチジンコドンのものであり、置換は、１０５位、１０６位、１０７位、及び１０９位にてヒスチジンを発現するように設計される。
【００４６】
追加の態様は、重鎖可変ドメインから独立して抗原に結合することが可能な免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）をコードする核酸配列を獲得するための方法であって、
（ａ）非ヒト動物を、関心の抗原またはその免疫原で免疫付与することであって、非ヒト動物は、そのゲノム中に（ｉ）重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域核酸配列、及び（ｉｉ）軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される２つ以上であるが野生型より少ない数のヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント（ＶＬ及びＪＬ）、を含む、免疫付与することと、
（ｂ）非ヒト動物に、免疫応答を開始させることと、
（ｃ）免疫付与された非ヒト動物から、抗原に結合することができる軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を含む細胞を単離することと、
（ｄ）細胞から、抗原に結合することができる軽鎖可変ドメイン（ＶＬドメイン）をコードする核酸配列を獲得することと、を含む、方法を提供する。
幾つかの実施形態では、単離するステップ（ｃ）は、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）またはフローサイトメトリーを介して実行される。幾つかの実施形態では、抗原に結合する軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を含む細胞は、リンパ球である。特定の実施形態では、リンパ球は、ナチュラルキラー細胞、Ｔ細胞、またはＢ細胞を含む。幾つかの実施形態では、方法は、（ｃ）’リンパ球を癌細胞と融合させるステップをさらに含む。特定の実施形態では、癌細胞は、骨髄腫細胞である。幾つかの実施形態では、（ｄ）の核酸配列は、免疫グロブリン定常領域核酸配列をコードする核酸配列と融合される。幾つかの実施形態では、軽鎖定常領域核酸配列は、ヒトカッパ配列またはヒトラムダ配列である。幾つかの実施形態では、重鎖定常領域核酸配列は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、及びそれらの組み合わせから選択されるヒト配列である。幾つかの実施形態では、（ｄ）の核酸配列は、動物のゲノム中の再構成されていないＶＬ遺伝子セグメントに由来する、１つ以上のヒスチジンコドン置換または挿入を含む。
【００４７】
追加の態様は、重鎖可変ドメインから独立して抗原に結合することができる免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質を作製するための方法であって、
（ａ）遺伝子的に修飾された非ヒト動物を、第１のエピトープまたはその免疫原性部分を含む第１の抗原で免疫付与することであって、非ヒト動物は、そのゲノム中に、
（ｉ）重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されたヒト重鎖可変領域核酸配列、及び
（ｉｉ）免疫グロブリン軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される２つ以上であるが野生型より少ない数のヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント（ＶＬ及びＪＬ）、を含む、免疫付与することと、
（ｂ）非ヒト動物に、第１のエピトープまたはその免疫原性部分に対する免疫応答を開始させることと、
（ｃ）非ヒト動物から、第１のエピトープまたはその免疫原性部分に特異的に結合する軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を含む細胞を単離することと、
（ｄ）（ｃ）の細胞から、第１のエピトープまたはその免疫原性部分に特異的に結合する軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を獲得することと、
（ｅ）（ｄ）の核酸配列を、ヒト免疫グロブリン定常領域核酸配列に融合される、発現構築物において採用することと、
（ｆ）（ｄ）の核酸配列を、第２の抗原またはエピトープに特異的に結合するヒト免疫グロブリン重鎖を発現する産生細胞株の中に発現させて、その軽鎖が（ｄ）の核酸によってコードされ、重鎖から独立して第１のエピトープまたはその免疫原性部分に結合し、またその重鎖が第２の抗原またはエピトープに特異的に結合する、抗原結合タンパク質を形成することと、を含む、方法を提供する。
ヒト軽鎖ＶＬまたはＪＬ遺伝子セグメントのうちの少なくとも１つは、対応するヒト生殖系列軽鎖可変遺伝子セグメントによってはコードされない１つ以上のヒスチジンコドンをコードする。幾つかの実施形態では、第１のエピトープは、細胞表面受容体に由来する。特定の実施形態では、細胞表面受容体は、Ｆｃ受容体である。またより特定の実施形態では、Ｆｃ受容体は、ＦｃＲｎである。幾つかの実施形態では、第２の抗原またはエピトープは、可溶性抗原に由来する。幾つかの実施形態では、第２の抗原またはエピトープは、細胞表面受容体に由来する。幾つかの実施形態では、第１の抗原は、Ｆｃ受容体であり、第２の抗原は、可溶性タンパク質であり、抗原結合タンパク質は、非ヒト動物のゲノム中のＶＬ遺伝子セグメントに由来する、１つ以上のヒスチジン置換及び挿入を含む。
【００４８】
追加の態様は、重鎖可変ドメインから独立して抗原に結合することが可能な免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）をコードする核酸配列を獲得するための方法であって、
（ａ）非ヒト動物を、第１のエピトープまたはその免疫原性部分を含む第１の抗原で免疫付与することであって、非ヒト動物は、そのゲノム中に、
（ｉ）重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域核酸配列、及び
（ｉｉ）軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域核酸配列、を含む、免疫付与することと、
（ｂ）非ヒト動物に、免疫応答を開始させることと、
（ｃ）免疫付与された非ヒト動物から、抗原に結合することができる軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を含む細胞を単離することと、
（ｄ）細胞から、抗原に結合することができる軽鎖可変ドメイン（ＶＬドメイン）をコードする核酸配列を獲得することと、を含む、方法を提供する。
幾つかの実施形態では、単離するステップ（ｃ）は、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）またはフローサイトメトリーを介して実行される。幾つかの実施形態では、抗原に結合する軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を含む細胞は、リンパ球である。特定の実施形態では、リンパ球は、ナチュラルキラー細胞、Ｔ細胞、またはＢ細胞を含む。幾つかの実施形態では、方法は、（ｃ）’リンパ球を癌細胞と融合させることをさらに含む。特定の実施形態では、癌細胞は、骨髄腫細胞である。幾つかの実施形態では、（ｄ）の核酸配列は、免疫グロブリン定常領域核酸配列をコードする核酸配列と融合される。幾つかの実施形態では、軽鎖定常領域核酸配列は、ヒトカッパ配列またはヒトラムダ配列である。幾つかの実施形態では、重鎖定常領域核酸配列は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、及びそれらの組み合わせから選択されるヒト配列である。幾つかの実施形態では、（ｄ）の核酸配列は、動物のゲノム中の再構成されていないＶＬ遺伝子セグメントに由来する、１つ以上のヒスチジンコドン置換または挿入を含む。
【００４９】
追加の態様は、重鎖可変ドメインから独立して抗原に結合することが可能な免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）をコードする核酸配列を獲得するための方法であって、
（ａ）非ヒト動物を、第１のエピトープまたはその免疫原性部分を含む第１の抗原で免疫付与することであって、非ヒト動物は、そのゲノム中に（ｉ）軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域核酸配列、及び（ｉｉ）重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結されるヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント（ＶＬ及びＪＬ）、を含む、免疫付与することと、
（ｂ）非ヒト動物に、免疫応答を開始させることと、
（ｃ）免疫付与された非ヒト動物から、抗原に結合することができる軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を含む細胞を単離することと、
（ｄ）細胞から、抗原に結合することができる軽鎖可変ドメイン（ＶＬドメイン）をコードする核酸配列を獲得することと、を含む、方法を提供する。
幾つかの実施形態では、単離するステップ（ｃ）は、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）またはフローサイトメトリーを介して実行される。幾つかの実施形態では、抗原に結合する軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を含む細胞は、リンパ球である。特定の実施形態では、リンパ球は、ナチュラルキラー細胞、Ｔ細胞、またはＢ細胞を含む。幾つかの実施形態では、方法は、（ｃ）’リンパ球を癌細胞と融合させることをさらに含む。特定の実施形態では、癌細胞は、骨髄腫細胞である。幾つかの実施形態では、（ｄ）の核酸配列は、免疫グロブリン定常領域核酸配列をコードする核酸配列と融合される。幾つかの実施形態では、軽鎖定常領域核酸配列は、ヒトカッパ配列またはヒトラムダ配列である。幾つかの実施形態では、重鎖定常領域核酸配列は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、及びそれらの組み合わせから選択されるヒト配列である。幾つかの実施形態では、（ｄ）の核酸配列は、動物のゲノム中の再構成されていないＶＬ遺伝子セグメントに由来する、１つ以上のヒスチジンコドン置換または挿入を含む。
【００５０】
追加の態様は、重鎖可変ドメインから独立して抗原に結合することができる免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質を作製するための方法であって、
（ａ）遺伝子的に修飾された非ヒト動物を、第１のエピトープまたはその免疫原性部分を含む第１の抗原で免疫付与することであって、非ヒト動物は、そのゲノム中に、
（ｉ）重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されたヒト重鎖可変領域核酸配列、及び
（ｉｉ）軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント（ＶＬ及びＪＬ）、を含む、免疫付与することと、
（ｂ）非ヒト動物に、第１のエピトープまたはその免疫原性部分に対する免疫応答を開始させることと、
（ｃ）非ヒト動物から、第１のエピトープまたはその免疫原性部分に特異的に結合する軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を含む細胞を単離することと、
（ｄ）（ｃ）の細胞から、第１のエピトープまたはその免疫原性部分に特異的に結合する軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を獲得することと、
（ｅ）（ｄ）の核酸配列を、ヒト免疫グロブリン定常領域核酸配列に融合される、発現構築物において採用することと、
（ｆ）（ｄ）の核酸配列を、第２の抗原またはエピトープに特異的に結合するヒト免疫グロブリン重鎖を発現する産生細胞株の中に発現させて、その軽鎖が（ｄ）の核酸によってコードされ、重鎖から独立して第１のエピトープまたはその免疫原性部分に結合し、またその重鎖が第２の抗原またはエピトープに特異的に結合する、抗原結合タンパク質を形成することと、を含む、方法を提供した。
ヒト軽鎖ＶＬまたはＪＬ遺伝子セグメントのうちの少なくとも１つは、対応するヒト生殖系列軽鎖可変遺伝子セグメントによってはコードされない１つ以上のヒスチジンコドンをコードする。幾つかの実施形態では、第１のエピトープは、細胞表面受容体に由来する。特定の実施形態では、細胞表面受容体は、Ｆｃ受容体である。特定の実施形態では、Ｆｃ受容体は、ＦｃＲｎである。幾つかの実施形態では、第２の抗原またはエピトープは、可溶性抗原に由来する。幾つかの実施形態では、第２の抗原またはエピトープは、細胞表面受容体に由来する。幾つかの実施形態では、第１の抗原は、Ｆｃ受容体であり、第２の抗原は、可溶性タンパク質であり、抗原結合タンパク質は、非ヒト動物のゲノム中のＶＬ遺伝子セグメントに由来する、１つ以上のヒスチジン置換及び挿入を含む。
【００５１】
追加の態様は、重鎖可変ドメインから独立して抗原に結合することができる免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質を作製するための方法であって、
（ａ）遺伝子的に修飾された非ヒト動物を、第１のエピトープまたはその免疫原性部分を含む第１の抗原で免疫付与することであって、非ヒト動物は、そのゲノム中に、
（ｉ）軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されたヒト重鎖可変領域核酸配列、及び
（ｉｉ）重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント（ＶＬ及びＪＬ）、を含む、免疫付与することと、
（ｂ）非ヒト動物に、第１のエピトープまたはその免疫原性部分に対する免疫応答を開始させることと、
（ｃ）非ヒト動物から、第１のエピトープまたはその免疫原性部分に特異的に結合する軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を含む細胞を単離することと、
（ｄ）（ｃ）の細胞から、第１のエピトープまたはその免疫原性部分に特異的に結合する軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を獲得することと、
（ｅ）（ｄ）の核酸配列を、ヒト免疫グロブリン定常領域核酸配列に融合される、発現構築物において採用することと、
（ｆ）（ｄ）の核酸配列を、第２の抗原またはエピトープに特異的に結合するヒト免疫グロブリン重鎖を発現する産生細胞株の中に発現させて、その軽鎖が（ｄ）の核酸によってコードされ、重鎖から独立して第１のエピトープまたはその免疫原性部分に結合し、またその重鎖が第２の抗原またはエピトープに特異的に結合する、抗原結合タンパク質を形成することと、を含む、方法を提供した。
ヒト軽鎖ＶＬまたはＪＬ遺伝子セグメントのうちの少なくとも１つは、対応するヒト生殖系列軽鎖可変遺伝子セグメントによってはコードされない１つ以上のヒスチジンコドンをコードする。幾つかの実施形態では、第１のエピトープは、細胞表面受容体に由来する。特定の実施形態では、細胞表面受容体は、Ｆｃ受容体である。特定の実施形態では、Ｆｃ受容体は、ＦｃＲｎである。幾つかの実施形態では、第２の抗原またはエピトープは、可溶性抗原に由来する。幾つかの実施形態では、第２の抗原またはエピトープは、細胞表面受容体に由来する。幾つかの実施形態では、第１の抗原は、Ｆｃ受容体であり、第２の抗原は、可溶性タンパク質であり、抗原結合タンパク質は、非ヒト動物のゲノム中のＶＬ遺伝子セグメントに由来する、１つ以上のヒスチジン置換及び挿入を含む。
本発明の好ましい実施形態では、例えば、以下が提供される。
（項目１）
その生殖系列ゲノム中に、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む、非ヒト動物。
（項目２）
前記非ヒト動物は、哺乳動物である、項目１に記載の非ヒト動物。
（項目３）
前記哺乳動物は、齧歯動物である、項目２に記載の非ヒト動物。
（項目４）
前記齧歯動物は、マウス、ラット、及びハムスターから成る群から選択される、項目３に記載の非ヒト動物。
（項目５）
前記非ヒト動物は、前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列に関してホモ接合性である、項目１に記載の非ヒト動物。
（項目６）
前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、非ヒト重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、項目１に記載の非ヒト動物。
（項目７）
前記非ヒト重鎖定常領域遺伝子配列は、Ｆｃをコードする、項目６に記載の非ヒト動物。
（項目８）
前記非ヒト重鎖定常領域遺伝子配列は、マウスまたはラット重鎖定常領域遺伝子配列である、項目７に記載の非ヒト動物。
（項目９）
前記非ヒト動物は、齧歯動物であり、前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒト重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、項目１に記載の非ヒト動物。
（項目１０）
前記重鎖定常領域遺伝子配列は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、及びそれらの組み合わせから選択される、項目６〜９のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
（項目１１）
前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒト重鎖ＶＨ遺伝子セグメント、ヒト重鎖Ｄ遺伝子セグメント、及びヒト重鎖ＪＨ遺伝子セグメントに由来する、項目１に記載の非ヒト動物。
（項目１２）
前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒト生殖系列重鎖ＶＨセグメント、ヒト生殖系列重鎖Ｄセグメント、及びヒト生殖系列重鎖ＪＨセグメントに由来する、項目１１に記載の非ヒト動物。
（項目１３）
前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒトＶＨ３−２３／ＧＹ／ＪＨ４−４の配列をコードする、項目１に記載の非ヒト動物。
（項目１４）
実質的に全ての内在性機能性ＶＨ、Ｄ、及びＪＨ遺伝子セグメントが、前記非ヒト動物の前記免疫グロブリン重鎖遺伝子座から欠失させられるか、または非機能性にされる、項目１に記載の非ヒト動物。
（項目１５）
前記非ヒト動物は、内在性機能性ＶＨ、Ｄ、及びＪＨ遺伝子セグメントを欠失させるか、または非機能性にする修飾を含み、前記非ヒト動物は、前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を含み、前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、異所的に存在する、項目１に記載の非ヒト動物。
（項目１６）
前記再構成された重鎖可変領域ヌクレオチド配列によってコードされる免疫グロブリン重鎖可変ドメインは、前記非ヒト動物に対して免疫原性ではない、項目１に記載の非ヒト動物。
（項目１７）
前記非ヒト動物は、Ａｄａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはその両方を含む、項目１に記載の非ヒト動物。
（項目１８）
前記非ヒト動物は、再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖Ｖ遺伝子セグメント（ＶＬ）及び再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖Ｊ遺伝子セグメント（ＪＬ）をコードするヌクレオチド配列をさらに含む、項目１に記載の非ヒト動物。
（項目１９）
前記再構成されていない軽鎖Ｖ遺伝子セグメント（ＶＬ）及び前記再構成されていない軽鎖（ＪＬ）遺伝子セグメントをコードする前記ヌクレオチド配列は、免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、項目１８に記載の非ヒト動物。
（項目２０）
前記軽鎖定常領域遺伝子配列は、齧歯動物及びヒト定常領域遺伝子配列から選択される、項目１９に記載の非ヒト動物。
（項目２１）
前記齧歯動物は、マウス、ラット、及びハムスターから選択される、項目２０に記載の非ヒト動物。
（項目２２）
前記再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖（ＶＬ）遺伝子セグメント及び前記再構成されていないヒト免疫グロブリン（ＪＬ）遺伝子セグメントは、内在性齧歯動物遺伝子座において、齧歯動物免疫グロブリン定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、項目１８に記載の非ヒト動物。
（項目２３）
前記免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列の複数のコピーを含む、項目１に記載の非ヒト動物。
（項目２４）
重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む、非ヒト生殖細胞のゲノム中の非ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座であって、前記定常領域遺伝子配列は、非ヒト配列、ヒト配列、またはそれらの組み合わせを含む、非ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座。
（項目２５）
前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、内在性非ヒト免疫グロブリン定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、項目２４に記載の免疫グロブリン重鎖遺伝子座。
（項目２６）
前記内在性非ヒト免疫グロブリン定常領域遺伝子配列は、マウスまたはラット重鎖定常領域遺伝子配列である、項目２５に記載の免疫グロブリン重鎖遺伝子座。
（項目２７）
非ヒト動物を作製する方法であって、
（ａ）内在性機能性免疫グロブリン重鎖ＶＨ、Ｄ、及びＪＨ遺伝子セグメントを欠失させるか、または非機能性にするように、非ヒト動物のゲノムを修飾することと、
（ｂ）前記ゲノム中に、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を定置することと、を含む、方法。
（項目２８）
前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列は、マウスまたはラット免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列である、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、前記ゲノム中の内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子座に定置される、項目２７に記載の方法。
（項目３１）
前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、前記非ヒト動物の生殖系列ゲノム中に存在する、項目２７に記載の方法。
（項目３２）
前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、前記ゲノム中の異所性遺伝子座に存在する、項目２７に記載の方法。
（項目３３）
前記非ヒト動物は、前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列の複数のコピーを含む、項目２７に記載の方法。
（項目３４）
前記非ヒト動物は、Ａｄａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはその両方を含む、項目２７に記載の方法。
（項目３５）
前記非ヒト動物は、マウス、ラット、またはハムスターから成る群から選択される齧歯動物である、項目２７に記載の方法。
（項目３６）
項目２４に記載の免疫グロブリン重鎖遺伝子座に関してヘテロ接合性である非ヒト動物であって、前記非ヒト動物は、前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を優勢的に前記免疫グロブリン重鎖遺伝子座から発現する、非ヒト動物。
（項目３７）
（ａ）軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列と、
（ｂ）重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列と、を含む遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座を含む、非ヒト動物。
（項目３８）
前記非ヒト動物は、哺乳動物である、項目３７に記載の非ヒト動物。
（項目３９）
前記哺乳動物は、マウス、ラット、及びハムスターから成る群から選択される、項目３８に記載の非ヒト動物。
（項目４０）
前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、κ軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、項目３７に記載の非ヒト動物。
（項目４１）
前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、λ軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、項目３７に記載の非ヒト動物。
（項目４２）
前記軽鎖定常領域遺伝子配列は、マウスまたはラット軽鎖定常領域遺伝子配列である、項目３７に記載の非ヒト動物。
（項目４３）
前記軽鎖定常領域遺伝子配列は、ヒト軽鎖定常領域遺伝子配列である、項目３７に記載の非ヒト動物。
（項目４４）
前記重鎖定常領域遺伝子配列は、マウスまたはラット重鎖定常領域遺伝子配列である、項目３７に記載の非ヒト動物。
（項目４５）
前記重鎖定常領域遺伝子配列は、ヒト重鎖定常領域遺伝子配列である、項目３７に記載の非ヒト動物。
（項目４６）
前記重鎖定常領域遺伝子配列は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、及びそれらの組み合わせから選択される配列をコードする、項目４４または４５のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
（項目４７）
前記再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒトκ軽鎖可変ドメイン遺伝子配列を含む、項目３７に記載の非ヒト動物。
（項目４８）
前記再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒトλ軽鎖可変ドメイン遺伝子配列を含む、項目３７に記載の非ヒト動物。
（項目４９）
前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒト重鎖ＶＨ遺伝子セグメント、ヒト重鎖Ｄ遺伝子セグメント、及びヒト重鎖ＪＨ遺伝子セグメントに由来する、項目３７に記載の非ヒト動物。
（項目５０）
前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒト生殖系列重鎖ＶＨセグメント、ヒト生殖系列重鎖Ｄセグメント、ヒト生殖系列重鎖ＪＨセグメントに由来する、項目４９に記載の非ヒト動物。
（項目５１）
前記ヒトＶＨ遺伝子セグメントは、ＶＨ１−２、ＶＨ１−３、ＶＨ１−８、ＶＨ１−１８、ＶＨ１−２４、ＶＨ１−４５、ＶＨ１−４６、ＶＨ１−５８、ＶＨ１−６９、ＶＨ２−５、ＶＨ２−２６、ＶＨ２−７０、ＶＨ３−７、ＶＨ３−９、ＶＨ３−１１、ＶＨ３−１３、ＶＨ３−１５、ＶＨ３−１６、ＶＨ３−２０、ＶＨ３−２１、ＶＨ３−２３、ＶＨ３−３０、ＶＨ３−３０−３、ＶＨ３−３０−５、ＶＨ３−３３、ＶＨ３−３５、ＶＨ３−３８、ＶＨ３−４３、ＶＨ３−４８、ＶＨ３−４９、ＶＨ３−５３、ＶＨ３−６４、ＶＨ３−６６、ＶＨ３−７２、ＶＨ３−７３、ＶＨ３−７４、ＶＨ４−４、ＶＨ４−２８、ＶＨ４−３０−１、ＶＨ４−３０−２、ＶＨ４−３０−４、ＶＨ４−３１、ＶＨ４−３４、ＶＨ４−３９、ＶＨ４−５９、ＶＨ４−６１、ＶＨ５−５１、ＶＨ６−１、ＶＨ７−４−１、ＶＨ７−８１、及びそれらの多型変異体から成る群から選択される、項目４９に記載の非ヒト動物。
（項目５２）
前記ヒトＤ遺伝子セグメントは、Ｄ１−１、Ｄ１−７、Ｄ１−１４、Ｄ１−２０、Ｄ１−２６、Ｄ２−２、Ｄ２−８、Ｄ２−１５、Ｄ２−２１、Ｄ３−３、Ｄ３−９、Ｄ３−１０、Ｄ３−１６、Ｄ３−２２、Ｄ４−４、Ｄ４−１１、Ｄ４−１７、Ｄ４−２３、Ｄ５−１２、Ｄ５−５、Ｄ５−１８、Ｄ５−２４、Ｄ６−６、Ｄ６−１３、Ｄ６−１９、Ｄ６−２５、Ｄ７−２７、及びそれらの多型変異体から成る群から選択される、項目４９に記載の非ヒト動物。
（項目５３）
前記ヒトＪＨ遺伝子セグメントは、ＪＨ１、ＪＨ２、ＪＨ３、ＪＨ４、ＪＨ５、ＪＨ６、及びそれらの多型変異体から成る群から選択される、項目４９に記載の非ヒト動物。
（項目５４）
前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒトＶＨ３−２３／ＧＹ／ＪＨ４−４の配列（配列番号１３７）をコードする、項目３７に記載の非ヒト動物。
（項目５５）
前記遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座は、前記非ヒト動物の前記生殖系列中に存在する、項目３７に記載の非ヒト動物。
（項目５６）
実質的に全ての内在性機能性ＶＨ、Ｄ、及びＪＨ遺伝子セグメントが、前記非ヒト動物の前記免疫グロブリン重鎖遺伝子座から欠失させられるか、または非機能性にされる、項目３７に記載の非ヒト動物。
（項目５７）
前記非ヒト動物は、内在性機能性ＶＨ、Ｄ、及びＪＨ遺伝子セグメントを欠失させるか、または非機能性にする修飾を含み、前記非ヒト動物は、前記軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を含み、前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、前記ゲノム中の異所性遺伝子座に存在する、項目３７に記載の非ヒト動物。
（項目５８）
前記非ヒト動物は、Ａｄａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはその両方を含む、項目３７に記載の非ヒト動物。
（項目５９）
前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変ドメインは、前記非ヒト動物に対して免疫原性ではない、項目３７に記載の非ヒト動物。
（項目６０）
前記遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座は、前記軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列の複数のコピーを含む、項目３７に記載の非ヒト動物。
（項目６１）
（１）軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列と、
（２）重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列と、を含む、非ヒト動物の生殖系列ゲノム中の免疫グロブリン遺伝子座。
（項目６２）
前記軽鎖定常領域遺伝子配列は、κ軽鎖定常領域遺伝子配列である、項目６１に記載の遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座。
（項目６３）
前記軽鎖定常領域遺伝子配列は、λ軽鎖定常領域遺伝子配列である、項目６１に記載の遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座。
（項目６４）
前記軽鎖定常領域遺伝子配列は、マウスまたはラット軽鎖定常領域遺伝子配列である、項目６１に記載の遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座。
（項目６５）
修飾された免疫グロブリン遺伝子座を含む非ヒト動物を作製する方法であって、
（ａ）非ヒト動物のゲノムを、
（ｉ）内在性機能性免疫グロブリン重鎖Ｖ、Ｄ、及びＪ遺伝子セグメント、ならびに
（ｉｉ）内在性機能性免疫グロブリン軽鎖Ｖ及びＪ遺伝子セグメント、を欠失させるか、または非機能性にするように修飾することと、
（ｂ）前記ゲノム中に、
（ｉ）軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列、及び
（ｉｉ）重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列、を定置することと、含む、方法。
（項目６６）
前記再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、κ軽鎖可変ドメインをコードする、項目６５に記載の方法。
（項目６７）
前記再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、λ軽鎖可変ドメインをコードする、項目６５に記載の方法。
（項目６８）
前記重鎖定常領域遺伝子配列は、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列である、項目６５に記載の方法。
（項目６９）
前記非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列は、マウスまたはラット重鎖定常領域遺伝子配列である、項目６８に記載の方法。
（項目７０）
前記重鎖定常領域遺伝子配列は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、及びそれらの組み合わせから選択される配列をコードする、項目６８または６９に記載の方法。
（項目７１）
前記非ヒト動物は、マウス、ラット、またはハムスターから成る群から選択される齧歯動物である、項目６５に記載の方法。
（項目７２）
前記修飾された免疫グロブリン遺伝子座は、前記非ヒト動物の生殖系列ゲノム中に存在する、項目６５に記載の方法。
（項目７３）
前記非ヒト動物は、Ａｄａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはその両方を含む、項目６５に記載の方法。
（項目７４）
スペーサーを介して重鎖Ｊセグメント（ＪＨ）配列に作動可能に連結される重鎖Ｖセグメント（ＶＨ）配列を含む再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む、修飾された免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む、非ヒト動物であって、前記スペーサーは、少なくとも１つのアミノ酸残基を含む、非ヒト動物。
（項目７５）
前記非ヒト動物は、齧歯動物である、項目７４に記載の非ヒト動物。
（項目７６）
前記齧歯動物は、マウス、ラット、及びハムスターから成る群から選択される、項目７５に記載の非ヒト動物。
（項目７７）
前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、非ヒト重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、項目７４に記載の非ヒト動物。
（項目７８）
前記非ヒト重鎖定常領域遺伝子配列は、マウスまたはラット定常領域遺伝子配列である、項目７７に記載の非ヒト動物。
（項目７９）
前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒト重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、項目７４に記載の非ヒト動物。
（項目８０）
前記重鎖定常領域遺伝子配列は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、及びそれらの組み合わせから選択される配列をコードする、項目７７〜７９のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
（項目８１）
前記ＶＨ配列及び前記ＪＨ配列は、ヒトＶＨ遺伝子セグメント及びヒトＪＨ遺伝子セグメントに由来する、項目７４に記載の非ヒト動物。
（項目８２）
前記ヒトＶＨ遺伝子セグメントは、ＶＨ１−２、ＶＨ１−３、ＶＨ１−８、ＶＨ１−１８、ＶＨ１−２４、ＶＨ１−４５、ＶＨ１−４６、ＶＨ１−５８、ＶＨ１−６９、ＶＨ２−５、ＶＨ２−２６、ＶＨ２−７０、ＶＨ３−７、ＶＨ３−９、ＶＨ３−１１、ＶＨ３−１３、ＶＨ３−１５、ＶＨ３−１６、ＶＨ３−２０、ＶＨ３−２１、ＶＨ３−２３、ＶＨ３−３０、ＶＨ３−３０−３、ＶＨ３−３０−５、ＶＨ３−３３、ＶＨ３−３５、ＶＨ３−３８、ＶＨ３−４３、ＶＨ３−４８、ＶＨ３−４９、ＶＨ３−５３、ＶＨ３−６４、ＶＨ３−６６、ＶＨ３−７２、ＶＨ３−７３、ＶＨ３−７４、ＶＨ４−４、ＶＨ４−２８、ＶＨ４−３０−１、ＶＨ４−３０−２、ＶＨ４−３０−４、ＶＨ４−３１、ＶＨ４−３４、ＶＨ４−３９、ＶＨ４−５９、ＶＨ４−６１、ＶＨ５−５１、ＶＨ６−１、ＶＨ７−４−１、ＶＨ７−８１、及びそれらの多型変異体から成る群から選択される、項目８１に記載の非ヒト動物。
（項目８３）
前記ヒトＶＨ遺伝子セグメントは、ＶＨ３−２３またはその多型変異体である、項目８１に記載の非ヒト動物。
（項目８４）
前記スペーサーは、ヒトＤ遺伝子セグメントに由来する配列をコードする、項目７４に記載の非ヒト動物。
（項目８５）
前記ヒトＤ遺伝子セグメントは、Ｄ１−１、Ｄ１−７、Ｄ１−１４、Ｄ１−２０、Ｄ１−２６、Ｄ２−２、Ｄ２−８、Ｄ２−１５、Ｄ２−２１、Ｄ３−３、Ｄ３−９、Ｄ３−１０、Ｄ３−１６、Ｄ３−２２、Ｄ４−４、Ｄ４−１１、Ｄ４−１７、Ｄ４−２３、Ｄ５−１２、Ｄ５−５、Ｄ５−１８、Ｄ５−２４、Ｄ６−６、Ｄ６−１３、Ｄ６−１９、Ｄ６−２５、Ｄ７−２７、及びそれらの多型変異体から成る群から選択される、項目８４に記載の非ヒト動物。
（項目８６）
前記スペーサーは、Ｄ４−４またはその多型変異体の配列をコードする、項目８４に記載の非ヒト動物。
（項目８７）
前記ヒトＪＨ遺伝子セグメントは、ＪＨ１、ＪＨ２、ＪＨ３、ＪＨ４、ＪＨ５、ＪＨ６、及びそれらの多型変異体から成る群から選択される、項目８１に記載の非ヒト動物。
（項目８８）
前記ヒトＪＨセグメントは、ＪＨ４−４またはその多型変異体である、項目８１に記載の非ヒト動物。
（項目８９）
前記再構成された免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒトＶＨ３−２３／ＧＹ／ＪＨ４−４の配列（配列番号１３７）をコードする、項目７４に記載の非ヒト動物。
（項目９０）
実質的に全ての内在性機能性ＶＨ、Ｄ、及びＪＨ遺伝子セグメントが、前記非ヒト動物の前記免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座から欠失させられるか、または非機能性にされる、項目７４に記載の非ヒト動物。
（項目９１）
前記非ヒト動物は、内在性機能性ＶＨ、Ｄ、及びＪＨ遺伝子セグメントを欠失させるか、または非機能性にする修飾を含み、前記非ヒト動物は、そのゲノムの異所性遺伝子座に、前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む、項目７４に記載の非ヒト動物。
（項目９２）
前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変ドメインは、前記非ヒト動物に対して免疫原性ではない、項目７４に記載の非ヒト動物。
（項目９３）
前記非ヒト動物は、Ａｄａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはその両方を含む、項目７４に記載の非ヒト動物。
（項目９４）
スペーサーを介して重鎖Ｊ遺伝子セグメント（ＪＨ）に作動可能に連結される重鎖可変遺伝子セグメント（ＶＨ）を含む再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を含み、前記スペーサーは、少なくとも１つのアミノ酸残基をコードする、非ヒト動物の生殖系列ゲノム中の免疫グロブリン重鎖遺伝子座。
（項目９５）
前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、非ヒト重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、項目９４に記載の免疫グロブリン重鎖遺伝子座。
（項目９６）
前記非ヒト重鎖定常領域遺伝子配列は、マウスまたはラット重鎖定常領域遺伝子配列である、項目９５に記載の免疫グロブリン重鎖遺伝子座。
（項目９７）
前記免疫グロブリン遺伝子座は、前記再構成された重鎖可変領域ヌクレオチド配列の複数のコピーを含む、項目９４に記載の免疫グロブリン重鎖遺伝子座。
（項目９８）
修飾された免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む非ヒト動物を作製する方法であって、
（ａ）内在性機能性免疫グロブリン重鎖ＶＨ、Ｄ、及びＪＨ遺伝子セグメントを欠失させるか、または非機能性にするように、非ヒト動物のゲノムを修飾することと、
（ｂ）前記ゲノム中に、スペーサーを介して重鎖Ｊ遺伝子セグメント（ＪＨ）に作動可能に連結される重鎖可変遺伝子セグメント（ＶＨ）を含む再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を定置することと、を含み、前記スペーサーは、少なくとも１つのアミノ酸残基を含む、方法。
（項目９９）
前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖ヌクレオチド配列は、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、項目９８に記載の方法。
（項目１００）
前記非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列は、マウスまたはラット重鎖定常領域遺伝子配列である、項目９９に記載の方法。
（項目１０１）
前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、前記ゲノム中の内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子座に定置される、項目９８に記載の方法。
（項目１０２）
前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、前記ゲノム中の異所性遺伝子座に存在する、項目９８に記載の方法。
（項目１０３）
前記修飾された重鎖遺伝子座は、前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列の複数のコピーを含む、項目９８に記載の方法。
（項目１０４）
前記非ヒト動物は、マウス、ラット、またはハムスターから成る群から選択される齧歯動物である、項目９８に記載の方法。
（項目１０５）
前記非ヒト動物は、Ａｄａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはその両方を含む、項目９８に記載の方法。
（項目１０６）
前記修飾された免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、前記非ヒト動物の生殖系列ゲノム中に存在する、項目９８に記載の方法。
（項目１０７）
そのゲノム中に、
（ｉ）重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されたヒト重鎖可変領域核酸配列を含む、免疫グロブリン重鎖遺伝子座と、
（ｉｉ）軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される１つ以上であるが野生型より少ない数のヒト免疫グロブリン軽鎖ＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメントを含む、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座と、を含む、修飾された非ヒト動物。
（項目１０８）
前記非ヒト動物は、哺乳動物である、項目１０７に記載の修飾された非ヒト動物。
（項目１０９）
前記哺乳動物は、齧歯動物である、項目１０８に記載の修飾された非ヒト動物。
（項目１１０）
前記齧歯動物は、マウス、ラット、及びハムスターから成る群から選択される、項目１０９に記載の修飾された非ヒト動物。
（項目１１１）
前記重鎖定常領域核酸配列は、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、及びそれらの組み合わせから選択される免疫グロブリンアイソタイプをコードする齧歯動物定常領域配列である、項目１０７に記載の修飾された非ヒト動物。
（項目１１２）
前記軽鎖定常領域核酸配列は、齧歯動物κまたはλ定常領域核酸配列である、項目１０７に記載の修飾された非ヒト動物。
（項目１１３）
前記再構成されたヒト重鎖可変領域核酸配列は、ヒト生殖系列ＶＨセグメント、ヒト生殖系列Ｄセグメント、及びヒト生殖系列ＪＨセグメントから選択される、項目１０７に記載の修飾された非ヒト動物。
（項目１１４）
前記再構成されたヒト重鎖可変領域核酸配列は、内在性遺伝子座において前記定常領域核酸配列に作動可能に連結される、項目１０７に記載の修飾された非ヒト動物。
（項目１１５）
前記１つ以上であるが前記野生型より少ない数のヒト免疫グロブリン軽鎖ＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメントは、内在性遺伝子座において前記軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される、項目１０７に記載の修飾された非ヒト動物。
（項目１１６）
前記非ヒト動物は、２つ以下のヒト免疫グロブリン非再構成ＶＬ遺伝子セグメントと、１つ、２つ、または３つ、または３つ以上のヒト非再構成ＪＬ遺伝子セグメントとを含む、項目１０７に記載の修飾された非ヒト動物。
（項目１１７）
前記ヒト生殖系列ＶＨ遺伝子セグメントは、ＶＨ１−２、ＶＨ１−３、ＶＨ１−８、ＶＨ１−１８、ＶＨ１−２４、ＶＨ１−４５、ＶＨ１−４６、ＶＨ１−５８、ＶＨ１−６９、ＶＨ２−５、ＶＨ２−２６、ＶＨ２−７０、ＶＨ３−７、ＶＨ３−９、ＶＨ３−１１、ＶＨ３−１３、ＶＨ３−１５、ＶＨ３−１６、ＶＨ３−２０、ＶＨ３−２１、ＶＨ３−２３、ＶＨ３−３０、ＶＨ３−３０−３、ＶＨ３−３０−５、ＶＨ３−３３、ＶＨ３−３５、ＶＨ３−３８、ＶＨ３−４３、ＶＨ３−４８、ＶＨ３−４９、ＶＨ３−５３、ＶＨ３−６４、ＶＨ３−６６、ＶＨ３−７２、ＶＨ３−７３、ＶＨ３−７４、ＶＨ４−４、ＶＨ４−２８、ＶＨ４−３０−１、ＶＨ４−３０−２、ＶＨ４−３０−４、ＶＨ４−３１、ＶＨ４−３４、ＶＨ４−３９、ＶＨ４−５９、ＶＨ４−６１、ＶＨ５−５１、ＶＨ６−１、ＶＨ７−４−１、ＶＨ７−８１、及びそれらの多型変異体から成る群から選択される、項目１１３に記載の修飾された非ヒト動物。
（項目１１８）
前記ヒト生殖系列ＶＨ遺伝子セグメントは、ＶＨ３−２３遺伝子セグメントである、項目１１３に記載の修飾された非ヒト動物。
（項目１１９）
前記再構成された重鎖可変領域核酸配列は、ヒトＶＨ３−２３／ＧＹ／ＪＨ４−４の配列（配列番号１３７）をコードする、項目１０７に記載の修飾された非ヒト動物。
（項目１２０）
前記再構成された重鎖可変領域核酸配列は、ＶＨ３−２３／Ｘ１Ｘ２／Ｊの配列をコードし、Ｘ１は、任意のアミノ酸であり、Ｘ２は、任意のアミノ酸である、項目１０７に記載の修飾された非ヒト動物。
（項目１２１）
Ｘ１は、Ｇｌｙであり、Ｘ２は、Ｔｙｒである、項目１２０に記載の修飾された非ヒト動物。
（項目１２２）
前記免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、機能性Ａｄａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはその両方を含む、項目１０７に記載の修飾された非ヒト動物。
（項目１２３）
前記Ａｄａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはその両方は、内在性Ａｄａｍ６遺伝子である、項目１２２に記載の修飾された非ヒト動物。
（項目１２４）
前記修飾された非ヒト動物は、前記ゲノムの異所性遺伝子座にＡｄａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはその両方を含む、項目１０７に記載の修飾された非ヒト動物。
（項目１２５）
前記ヒト可変領域ＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメントは、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを再構成及びコードすることが可能である、項目１０７に記載の修飾された非ヒト動物。
（項目１２６）
前記免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、２つのヒトＶＬ遺伝子セグメント、Ｖκ１−３９及びＶκ３−２０を含む、項目１０７に記載の修飾された非ヒト動物。
（項目１２７）
前記遺伝子セグメントは、生殖系列遺伝子セグメントである、項目１２６に記載の修飾された非ヒト動物。
（項目１２８）
前記非ヒト動物は、Ｊκ１、Ｊκ２、Ｊκ３、Ｊκ４、及びＪκ５遺伝子セグメントを含む、項目１２６に記載の修飾された非ヒト動物。
（項目１２９）
２つ以上、３つ以上、４つ以上、または５つ以上のヒトＶＬ遺伝子セグメント、及び２つ以上のヒトＪＬ遺伝子セグメントが、内在性軽鎖遺伝子座に存在する、項目１０７に記載の修飾された非ヒト動物。
（項目１３０）
前記ヒト軽鎖ＶＬまたはＪＬ遺伝子セグメントのうちの少なくとも１つは、対応するヒト生殖系列軽鎖可変遺伝子セグメントによってはコードされない１つ以上のヒスチジンコドンをコードする、項目１０７に記載の修飾された非ヒト動物。
（項目１３１）
前記ＶＬ遺伝子セグメントのうちの少なくとも１つは、ヒスチジンコドンの付加、または前記対応するヒト生殖系列ＶＬセグメント配列によってコードされる少なくとも１つの非ヒスチジンコドンの、ヒスチジンコドンでの置換を含む、項目１０７に記載の修飾された非ヒト動物。
（項目１３２）
前記付加または置換されるヒスチジンコドンは、ＣＤＲ３中に存在する、項目１３１に記載の修飾された非ヒト動物。
（項目１３３）
前記ヒトＶＬ遺伝子セグメントは、ヒトＶκ１−３９及びＶκ３−２０遺伝子セグメントであり、前記ヒトＶκ１−３９及びＶκ３−２０遺伝子セグメントの各々は、対応するヒト生殖系列ＶＬ遺伝子セグメントによってコードされる少なくとも１つの非ヒスチジンコドンの、前記ヒスチジンコドンでの置換を含む、項目１０７に記載の修飾された非ヒト動物。
（項目１３４）
前記置換は、前記ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントの３つの非ヒスチジンコドンのものであり、前記置換は、１０６位、１０８位、及び１１１位にてヒスチジンを発現するように設計される、項目１３３に記載の修飾された非ヒト動物。
（項目１３５）
前記置換は、前記ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントの４つの非ヒスチジンコドンのものであり、前記置換は、１０５位、１０６位、１０８位、及び１１１位にてヒスチジンを発現するように設計される、項目１３３に記載の修飾された非ヒト動物。
（項目１３６）
前記置換は、前記ヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントの３つの非ヒスチジンコドンのものであり、前記置換は、１０５位、１０６位、及び１０９位にてヒスチジンを発現するように設計される、項目１３３に記載の修飾された非ヒト動物。
（項目１３７）
前記置換は、前記ヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントの４つの非ヒスチジンコドンのものであり、前記置換は、１０５位、１０６位、１０７位、及び１０９位にてヒスチジンを発現するように設計される、項目１３３に記載の修飾された非ヒト動物。
（項目１３８）
前記非ヒト動物は、関心の抗原による刺激に際して、前記抗原に特異的に結合する抗原結合タンパク質を発現し、前記抗原結合タンパク質は、前記ヒトＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメントに由来するアミノ酸配列を含み、前記抗原結合タンパク質は、前記ヒトＶＬ遺伝子セグメントによってコードされるアミノ酸位置に、少なくとも１つのヒスチジン残基を含む、項目１０７に記載の修飾された非ヒト動物。
（項目１３９）
前記非ヒト動物は、抗原に応答して抗原結合タンパク質の集団を発現し、前記集団内の全ての抗原結合タンパク質は、（ａ）前記再構成されたヒト可変領域核酸配列に由来するヒト重鎖可変ドメインを含む免疫グロブリン重鎖と、（ｂ）前記非ヒト動物の前記ゲノム中の前記ヒトＶＬ遺伝子セグメント及び前記ＪＬ遺伝子セグメントの再構成に由来する免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む免疫グロブリン軽鎖と、を含み、前記ヒトＶＬ遺伝子セグメントのうちの少なくとも１つは、前記対応するヒト生殖系列ＶＬ遺伝子セグメントによってはコードされない１つ以上のヒスチジンコドンをコードする、項目１０７に記載の修飾された非ヒト動物。
（項目１４０）
修飾された免疫グロブリン遺伝子座を含む非ヒト動物を作製するための方法であって、
（ａ）非ヒト動物のゲノムを、
（ｉ）内在性機能性免疫グロブリン重鎖ＶＨ、Ｄ、及び／またはＪＨ遺伝子セグメント、ならびに
（ｉｉ）内在性機能性免疫グロブリン軽鎖ＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメント、を欠失させるか、または非機能性にするように修飾することと、
（ｂ）前記非ヒト動物の前記修飾されたゲノム中に、
（ｉ）免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結されている再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域核酸配列、ならびに
（ｉｉ）免疫グロブリン軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結されている１つ以上であるが野生型より少ない数のヒト免疫グロブリン軽鎖ＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメント、を定置することと、を含む、方法。
（項目１４１）
前記非ヒト動物は、齧歯動物である、項目１４０に記載の方法。
（項目１４２）
前記齧歯動物は、マウス、ラット、またはハムスターである、項目１４１に記載の方法。
（項目１４３）
前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域核酸配列は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、及びそれらの組み合わせから選択されるマウスまたはラット重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、項目１４０に記載の方法。
（項目１４４）
前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域核酸配列ならびに前記ヒト免疫グロブリン軽鎖ＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメントは、前記野生型非ヒト動物の対応するヌクレオチド配列またはその付近に定置される、項目１４０に記載の方法。
（項目１４５）
前記再構成された免疫グロブリンヒト重鎖可変領域核酸配列ならびに前記ヒト免疫グロブリン軽鎖ＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメントは、前記ゲノム中の異所性遺伝子座に定置される、項目１４０に記載の方法。
（項目１４６）
前記非ヒト動物は、内在性Ａｄａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはその両方を含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む、項目１４０に記載の方法。
（項目１４７）
前記非ヒト動物は、Ａｄａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはその両方を前記ゲノムの異所性遺伝子座に含む、項目１４０に記載の方法。
（項目１４８）
前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域核酸配列は、ヒトＶＨ３−２３／ＧＹ／ＪＨ４−４の配列（配列番号１３７）をコードする、項目１４０に記載の方法。
（項目１４９）
前記免疫グロブリン軽鎖定常領域核酸配列は、ラットまたはマウスＣκ定常領域核酸配列である、項目１４０に記載の方法。
（項目１５０）
前記ヒト免疫グロブリン軽鎖ＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメントは、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを再構成及びコードすることが可能である、項目１４０に記載の方法。
（項目１５１）
前記非ヒト動物は、２つのヒトＶＬ遺伝子セグメント、Ｖκ１−３９及びＶκ３−２０を含む免疫グロブリン軽鎖遺伝子座を含む、項目１４０に記載の方法。
（項目１５２）
前記非ヒト動物は、Ｊκ１、Ｊκ２、Ｊκ３、Ｊκ４、及びＪκ５遺伝子セグメントを含む、項目１５１に記載の方法。
（項目１５３）
２つ以上、３つ以上、４つ以上、または５つ以上のヒトＶＬ遺伝子セグメント、及び２つ以上のヒトＪＬ遺伝子セグメントが、内在性軽鎖遺伝子座に存在する、項目１４０に記載の方法。
（項目１５４）
前記ヒト免疫グロブリン軽鎖ＶＬまたはＪＬ遺伝子セグメントのうちの少なくとも１つは、対応するヒト生殖系列軽鎖可変遺伝子セグメントによってはコードされない１つ以上のヒスチジンコドンをコードする、項目１４０に記載の方法。
（項目１５５）
前記ＶＬ遺伝子セグメントのうちの少なくとも１つは、ヒスチジンコドンの付加、または前記対応するヒト生殖系列ＶＬセグメント配列によってコードされる少なくとも１つの非ヒスチジンコドンの、ヒスチジンコドンでの置換を含む、項目１４０に記載の方法。
（項目１５６）
前記付加または置換されるヒスチジンコドンは、ＣＤＲ３中に存在する、項目１５５に記載の方法。
（項目１５７）
前記ヒトＶＬ遺伝子セグメントは、ヒトＶκ１−３９及びＶκ３−２０遺伝子セグメントであり、前記ヒトＶκ１−３９及びＶκ３−２０遺伝子セグメントの各々は、対応するヒト生殖系列ＶＬ遺伝子セグメントによってコードされる少なくとも１つの非ヒスチジンコドンの、前記ヒスチジンコドンでの前記置換を含む、項目１５５に記載の方法。
（項目１５８）
前記置換は、前記ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントの３つの非ヒスチジンコドンのものであり、前記置換は、１０６位、１０８位、及び１１１位にてヒスチジンを発現するように設計される、項目１５７に記載の方法。
（項目１５９）
前記置換は、前記ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントの４つの非ヒスチジンコドンのものであり、前記置換は、１０５位、１０６位、１０８位、及び１１１位にてヒスチジンを発現するように設計される、項目１５７に記載の方法。
（項目１６０）
前記置換は、前記ヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントの３つの非ヒスチジンコドンのものであり、前記置換は、１０５位、１０６位、及び１０９位にてヒスチジンを発現するように設計される、項目１５７に記載の方法。
（項目１６１）
前記置換は、前記ヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントの４つの非ヒスチジンコドンのものであり、前記置換は、１０５位、１０６位、１０７位、及び１０９位にてヒスチジンを発現するように設計される、項目１５７に記載の方法。
（項目１６２）
重鎖可変ドメインから独立して抗原に結合することが可能な免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）をコードする核酸配列を獲得するための方法であって、
（ａ）非ヒト動物を、関心の抗原またはその免疫原で免疫付与することであって、前記非ヒト動物は、そのゲノム中に（ｉ）重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域核酸配列、及び（ｉｉ）軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される２つ以上であるが野生型より少ない数のヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント（ＶＬ及びＪＬ）、を含む、免疫付与することと、
（ｂ）前記非ヒト動物に、免疫応答を開始させることと、
（ｃ）前記免疫付与された非ヒト動物から、前記抗原に結合することができる軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を含む細胞を単離することと、
（ｄ）前記細胞から、前記抗原に結合することができる前記軽鎖可変ドメイン（ＶＬドメイン）をコードする核酸配列を獲得することと、を含む、方法。
（項目１６３）
単離するステップ（ｃ）は、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）またはフローサイトメトリーを介して実行される、項目１６２に記載の方法。
（項目１６４）
前記抗原に結合する前記軽鎖可変ドメインをコードする前記核酸配列を含む前記細胞は、リンパ球である、項目１６２に記載の方法。
（項目１６５）
前記リンパ球は、ナチュラルキラー細胞、Ｔ細胞、またはＢ細胞を含む、項目１６４に記載の方法。
（項目１６６）
前記方法は、（ｃ）’前記リンパ球を癌細胞と融合させることをさらに含む、項目１６２に記載の方法。
（項目１６７）
前記癌細胞は、骨髄腫細胞である、項目１６６に記載の方法。
（項目１６８）
前記（ｄ）の核酸配列は、免疫グロブリン定常領域核酸配列をコードする核酸配列と融合される、項目１６２に記載の方法。
（項目１６９）
前記軽鎖定常領域核酸配列は、ヒトカッパ配列またはヒトラムダ配列である、項目１６２に記載の方法。
（項目１７０）
前記重鎖定常領域核酸配列は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、及びそれらの組み合わせから選択されるヒト配列である、項目１６２に記載の方法。
（項目１７１）
前記（ｄ）の核酸配列は、前記動物の前記ゲノム中の前記再構成されていないＶＬ遺伝子セグメントに由来する、１つ以上のヒスチジンコドン置換または挿入を含む、項目１６２に記載の方法。
（項目１７２）
重鎖可変ドメインから独立して抗原に結合することができる免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質を作製するための方法であって、
（ａ）遺伝子的に修飾された非ヒト動物を、第１のエピトープまたはその免疫原性部分を含む第１の抗原で免疫付与することであって、前記非ヒト動物は、そのゲノム中に、
（ｉ）重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されたヒト重鎖可変領域核酸配列、及び、
（ｉｉ）免疫グロブリン軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される２つ以上であるが野生型より少ない数のヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント（ＶＬ及びＪＬ）、を含む、免疫付与することと、
（ｂ）前記非ヒト動物に、前記第１のエピトープまたはその免疫原性部分に対する免疫応答を開始させることと、
（ｃ）前記非ヒト動物から、前記第１のエピトープまたはその免疫原性部分に特異的に結合する軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を含む細胞を単離することと、
（ｄ）前記（ｃ）の細胞から、前記第１のエピトープまたはその免疫原性部分に特異的に結合する前記軽鎖可変ドメインをコードする前記核酸配列を獲得することと、
（ｅ）前記（ｄ）の核酸配列を、ヒト免疫グロブリン定常領域核酸配列に融合される、発現構築物において採用することと、
（ｆ）前記（ｄ）の核酸配列を、第２の抗原またはエピトープに特異的に結合するヒト免疫グロブリン重鎖を発現する産生細胞株の中に発現させて、その軽鎖が前記（ｄ）の核酸によってコードされ、前記重鎖から独立して前記第１のエピトープまたはその免疫原性部分に結合し、またその重鎖が前記第２の抗原またはエピトープに特異的に結合する、抗原結合タンパク質を形成することと、を含む、方法。
（項目１７３）
前記ヒト軽鎖ＶＬまたはＪＬ遺伝子セグメントのうちの少なくとも１つは、対応するヒト生殖系列軽鎖可変遺伝子セグメントによってはコードされない１つ以上のヒスチジンコドンをコードする、項目１７２に記載の方法。
（項目１７４）
前記第１のエピトープは、細胞表面受容体に由来する、項目１７２に記載の方法。
（項目１７５）
前記細胞表面受容体は、Ｆｃ受容体である、項目１７４に記載の方法。
（項目１７６）
前記Ｆｃ受容体は、ＦｃＲｎである、項目１７５に記載の方法。
（項目１７７）
前記第２の抗原またはエピトープは、可溶性抗原に由来する、項目１７２に記載の方法。
（項目１７８）
前記第２の抗原またはエピトープは、細胞表面受容体に由来する、項目１７２に記載の方法。
（項目１７９）
前記第１の抗原は、Ｆｃ受容体であり、前記第２の抗原は、可溶性タンパク質であり、前記抗原結合タンパク質は、前記非ヒト動物の前記ゲノム中の前記ＶＬ遺伝子セグメントに由来する１つ以上のヒスチジン置換及び挿入を含む、項目１７２に記載の方法。
（項目１８０）
重鎖可変ドメインから独立して抗原に結合することが可能な免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）をコードする核酸配列を獲得するための方法であって、
（ａ）非ヒト動物を、第１のエピトープまたはその免疫原性部分を含む第１の抗原で免疫付与することであって、前記非ヒト動物は、そのゲノム中に（ｉ）重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域核酸配列、及び（ｉｉ）軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域核酸配列を含む、免疫付与することと、
（ｂ）前記非ヒト動物に、免疫応答を開始させることと、
（ｃ）前記免疫付与された非ヒト動物から、前記抗原に結合することができる軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を含む細胞を単離することと、
（ｄ）前記細胞から、前記抗原に結合することができる前記軽鎖可変ドメイン（ＶＬドメイン）をコードする核酸配列を獲得することと、を含む、方法。
（項目１８１）
単離するステップ（ｃ）は、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）またはフローサイトメトリーを介して実行される、項目１８０に記載の方法。
（項目１８２）
前記抗原に結合する前記軽鎖可変ドメインをコードする前記核酸配列を含む前記細胞は、リンパ球である、項目１８０に記載の方法。
（項目１８３）
前記リンパ球は、ナチュラルキラー細胞、Ｔ細胞、またはＢ細胞を含む、項目１８２に記載の方法。
（項目１８４）
前記方法は、（ｃ）’前記リンパ球を癌細胞と融合させることをさらに含む、項目１８０に記載の方法。
（項目１８５）
前記癌細胞は、骨髄腫細胞である、項目１８４に記載の方法。
（項目１８６）
前記（ｄ）の核酸配列は、免疫グロブリン定常領域核酸配列をコードする核酸配列と融合される、項目１８０に記載の方法。
（項目１８７）
前記軽鎖定常領域核酸配列は、ヒトカッパ配列またはヒトラムダ配列である、項目１８０に記載の方法。
（項目１８８）
前記重鎖定常領域核酸配列は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、及びそれらの組み合わせから選択されるヒト配列である、項目１８０に記載の方法。
（項目１８９）
前記（ｄ）の核酸配列は、前記動物の前記ゲノム中の前記再構成されていないＶＬ遺伝子セグメントに由来する、１つ以上のヒスチジンコドン置換または挿入を含む、項目１８０に記載の方法。
（項目１９０）
重鎖可変ドメインから独立して抗原に結合することが可能な免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）をコードする核酸配列を獲得するための方法であって、
（ａ）非ヒト動物を、第１のエピトープまたはその免疫原性部分を含む第１の抗原で免疫付与することであって、前記非ヒト動物は、そのゲノム中に（ｉ）軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域核酸配列、及び（ｉｉ）重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結されるヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント（ＶＬ及びＪＬ）、を含む、免疫付与することと、
（ｂ）前記非ヒト動物に、免疫応答を開始させることと、
（ｃ）前記免疫付与された非ヒト動物から、前記抗原に結合することができる軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を含む細胞を単離することと、
（ｄ）前記細胞から、前記抗原に結合することができる前記軽鎖可変ドメイン（ＶＬドメイン）をコードする核酸配列を獲得することと、を含む、方法。
（項目１９１）
単離するステップ（ｃ）は、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）またはフローサイトメトリーを介して実行される、項目１９０に記載の方法。
（項目１９２）
前記抗原に結合する前記軽鎖可変ドメインをコードする前記核酸配列を含む前記細胞は、リンパ球である、項目１９０に記載の方法。
（項目１９３）
前記リンパ球は、ナチュラルキラー細胞、Ｔ細胞、またはＢ細胞を含む、項目１９２に記載の方法。
（項目１９４）
前記方法は、（ｃ）’前記リンパ球を癌細胞と融合させることをさらに含む、項目１９０に記載の方法。
（項目１９５）
前記癌細胞は、骨髄腫細胞である、項目１９４に記載の方法。
（項目１９６）
前記（ｄ）の核酸配列は、免疫グロブリン定常領域核酸配列をコードする核酸配列と融合される、項目１９０に記載の方法。
（項目１９７）
前記軽鎖定常領域核酸配列は、ヒトカッパ配列またはヒトラムダ配列である、項目１９０に記載の方法。
（項目１９８）
前記重鎖定常領域核酸配列は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、及びそれらの組み合わせから選択されるヒト配列である、項目１９０に記載の方法。
（項目１９９）
前記（ｄ）の核酸配列は、前記動物の前記ゲノム中の前記再構成されていないＶＬ遺伝子セグメントに由来する、１つ以上のヒスチジンコドン置換または挿入を含む、項目１９０に記載の方法。
（項目２００）
重鎖可変ドメインから独立して抗原に結合することができる免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質を作製するための方法であって、
（ａ）遺伝子的に修飾された非ヒト動物を、第１のエピトープまたはその免疫原性部分を含む第１の抗原で免疫付与することであって、前記非ヒト動物は、そのゲノム中に、
（ｉ）重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されたヒト重鎖可変領域核酸配列、及び
（ｉｉ）軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント（ＶＬ及びＪＬ）、を含む、免疫付与することと、
（ｂ）前記非ヒト動物に、前記第１のエピトープまたはその免疫原性部分に対する免疫応答を開始させることと、
（ｃ）前記非ヒト動物から、前記第１のエピトープまたはその免疫原性部分に特異的に結合する軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を含む細胞を単離することと、
（ｄ）前記（ｃ）の細胞から、前記第１のエピトープまたはその免疫原性部分に特異的に結合する前記軽鎖可変ドメインをコードする前記核酸配列を獲得することと、
（ｅ）前記（ｄ）の核酸配列を、ヒト免疫グロブリン定常領域核酸配列に融合される、発現構築物において採用することと、
（ｆ）前記（ｄ）の核酸配列を、第２の抗原またはエピトープに特異的に結合するヒト免疫グロブリン重鎖を発現する産生細胞株の中に発現させて、その軽鎖が前記（ｄ）の核酸によってコードされ、前記重鎖から独立して前記第１のエピトープまたはその免疫原性部分に結合し、またその重鎖が前記第２の抗原またはエピトープに特異的に結合する、抗原結合タンパク質を形成することと、を含む、方法。
（項目２０１）
前記ヒト軽鎖ＶＬまたはＪＬ遺伝子セグメントのうちの少なくとも１つは、対応するヒト生殖系列軽鎖可変遺伝子セグメントによってはコードされない１つ以上のヒスチジンコドンをコードする、項目２００に記載の方法。
（項目２０２）
前記第１のエピトープは、細胞表面受容体に由来する、項目２００に記載の方法。
（項目２０３）
前記細胞表面受容体は、Ｆｃ受容体である、項目２０２に記載の方法。
（項目２０４）
前記Ｆｃ受容体は、ＦｃＲｎである、項目２０３に記載の方法。
（項目２０５）
前記第２の抗原またはエピトープは、可溶性抗原に由来する、項目２００に記載の方法。
（項目２０６）
前記第２の抗原またはエピトープは、細胞表面受容体に由来する、項目２００に記載の方法。
（項目２０７）
前記第１の抗原は、Ｆｃ受容体であり、前記第２の抗原は、可溶性タンパク質であり、前記抗原結合タンパク質は、前記非ヒト動物の前記ゲノム中の前記ＶＬ遺伝子セグメントに由来する、１つ以上のヒスチジン置換及び挿入を含む、項目２００に記載の方法。
（項目２０８）
重鎖可変ドメインから独立して抗原に結合することができる免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質を作製するための方法であって、
（ａ）遺伝子的に修飾された非ヒト動物を、第１のエピトープまたはその免疫原性部分を含む第１の抗原で免疫付与することであって、前記非ヒト動物は、そのゲノム中に、
（ｉ）軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されたヒト重鎖可変領域核酸配列、及び
（ｉｉ）重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント（ＶＬ及びＪＬ）、を含む、免疫付与することと、
（ｂ）前記非ヒト動物に、前記第１のエピトープまたはその免疫原性部分に対する免疫応答を開始させることと、
（ｃ）前記非ヒト動物から、前記第１のエピトープまたはその免疫原性部分に特異的に結合する軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を含む細胞を単離することと、
（ｄ）前記（ｃ）の細胞から、前記第１のエピトープまたはその免疫原性部分に特異的に結合する前記軽鎖可変ドメインをコードする前記核酸配列を獲得することと、
（ｅ）前記（ｄ）の核酸配列を、ヒト免疫グロブリン定常領域核酸配列に融合される、発現構築物において採用することと、
（ｆ）前記（ｄ）の核酸配列を、第２の抗原またはエピトープに特異的に結合するヒト免疫グロブリン重鎖を発現する産生細胞株の中に発現させて、その軽鎖が前記（ｄ）の核酸によってコードされ、前記重鎖から独立して前記第１のエピトープまたはその免疫原性部分に結合し、またその重鎖が前記第２の抗原またはエピトープに特異的に結合する、抗原結合タンパク質を形成することと、を含む、方法。
（項目２０９）
前記ヒト軽鎖ＶＬまたはＪＬ遺伝子セグメントのうちの少なくとも１つは、対応するヒト生殖系列軽鎖可変遺伝子セグメントによってはコードされない１つ以上のヒスチジンコドンをコードする、項目２０８に記載の方法。
（項目２１０）
前記第１のエピトープは、細胞表面受容体に由来する、項目２０８に記載の方法。
（項目２１１）
前記細胞表面受容体は、Ｆｃ受容体である、項目２１０に記載の方法。
（項目２１２）
前記Ｆｃ受容体は、ＦｃＲｎである、項目２１１に記載の方法。
（項目２１３）
前記第２の抗原またはエピトープは、可溶性抗原に由来する、項目２０８に記載の方法。
（項目２１４）
前記第２の抗原またはエピトープは、細胞表面受容体に由来する、項目２０８に記載の方法。
（項目２１５）
前記第１の抗原は、Ｆｃ受容体であり、前記第２の抗原は、可溶性タンパク質であり、前記抗原結合タンパク質は、前記非ヒト動物の前記ゲノム中の前記ＶＬ遺伝子セグメントに由来する、１つ以上のヒスチジン置換及び挿入を含む、項目２０８に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】ヒトＶＨ３−２３プロモータ（配列番号１３９）に作動可能に連結される、再構成されたヒト免疫グロブリン可変領域ヌクレオチド配列（ＶＨ３−２３／Ｄ／ＪＨ４、配列番号１３６）及びＪＨ４のイントロン（配列番号１４０）を含む、再構成された重鎖可変ドメインミニ遺伝子座（ｍｉｎｉ−ｌｏｃｕｓ）（「ＵＨＣミニ遺伝子座」）を構築するためのスキームを例証する。ＵＨＣミニ遺伝子座は、５’及び３’においてマウス相同アームに隣接する。ステップ１（Ｉ−ＣｅｕＩ／ＳｐｅＩライゲーション（Ａｍｐ＋Ｓｐｅｃ））では、ｐＪＳｈ００３８（ＵＨＣミニ遺伝子座；）を生成するために、スペクチノマイシン選択カセットが、Ｉ−ＣｅｕＩ及びＳｐｅＩ部位の間でプロモータの上流に導入された。
【図２】（Ａ）ＭＡＩＤ１１１５ＢＡＣクローンの５’末端（２．ＢＨＲ（Ｈｙｇ＋Ｋａｎ））中へのハイグロマイシン選択カセット（ＥＭ７−ＨＹＧ）の標的化、及び（Ｂ）ＶＩ４３２ＢＡＣクローン（３．ＢＨＲ（Ｓｐｅｃ＋Ｈｙｇ））中のＩｇＭ遺伝子座の上流へのＵＨＣミニ遺伝子座（ｐＪＳｈ００３８）の標的化のためのスキームを例証する。
【図３】（Ａ）５’〜３’に、Ａｄａｍ６ａ遺伝子（３’〜５’方向に存在する）、ＦＲＴ部位に隣接するネオマイシンカセット（３’〜５’方向に存在する）、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子（３’〜５’方向に存在する）、遺伝子間制御領域１（ＩＧＣＲ１、ｋｅｙＶ（Ｄ）Ｊ組み換え調節領域）、及びスペクチノマイシンカセット（５’〜３’方向に存在する）を含む、ＶＩ４２１クローンの３’末端中へのクロラムフェニコールカセットを含むｐＤＢａ００４９構築物の標的化（４．ＢＨＲ（Ｃｍ＋Ｋａｎ））、ならびに（Ｂ）Ｉ−ＣｅｕＩ及びＡｓｃＩ部位の間の制限消化及びライゲーション（５．Ｉ−ＣｅｕＩ／ＡｓｃＩライゲーション（Ｈｙｇ＋Ｋａｎ））を介した、Ａｄａｍ６ａ及び６ｂ遺伝子を含有するＶＩ４４４ＢＡＣクローンのゲノム遺伝子座の、ＶＩ４４３ＢＡＣクローンのユニバーサル重鎖（ＵＨＣ）ゲノム遺伝子座の上流への標的化と、のためのスキームを例証する。
【図４】（Ａ）１６６１ヘテロ接合性のマウスから単離されたＥＳ細胞中への最終構築物（ＭＡＩＤ６０３１ＢＡＣ  ＤＮＡ）の標的化のためのスキームを例証し、（Ｂ）スクリーニングアッセイにおいて使用されるプローブ及びプライマーのゲノムの場所を示す。
【図５】ＵＨＣ  ＣＤＲ３配列（ＡＫＤＹＳＮＹＹＦＤＹ、配列番号１４３）に類似のＣＤＲ３配列を含有する、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ  ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓのＡＳＡＰデータベース内の抗体のリストを示す。
【図６】６０３１細菌人工染色体（ＢＡＣ）ＤＮＡ及び６０３１ヘテロ接合性ＥＳ細胞のゲノム構成、ならびにスクリーニングアッセイにおいて使用されるプライマー及びプローブのゲノムの場所を例証する。
【図７】スクリーニングアッセイにおいて対立遺伝子の減少（ＬＯＡ）、対立遺伝子の増加（ＧＯＡ）、または親対立遺伝子（ｐａｒｅｎｔａｌ）を確認するために使用される、プライマー及びプローブのリストを示す。
【図８】スクリーニングアッセイにおいて使用されるプライマー及びプローブの配列を示す。
【図９】標的化される対立遺伝子の１つのコピーを含有する、遺伝子的に修飾されたＦ０マウスの免疫グロブリン重鎖遺伝子座のゲノム構造を例証する（Ａｄａｍ６ａ／６ｂ遺伝子及び再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列（ｈＶＨ３−２３（Ｄ）ＪＨ４、を含む）。（Ａ）ＭＡＩＤ６０３１ｈｅｔ：選択カセットを伴う遺伝子的に修飾された免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含むヘテロ接合性のＦ０マウス、及び（Ｂ）ＭＡＩＤ６０３２ｈｅｔ：選択カセットを伴わない遺伝子的に修飾された免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含むヘテロ接合性のＦ０マウス。
【図１０】野生型または６０３２ヘテロ接合性マウスから単離された骨髄細胞の蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）分析の結果を示す。上パネル：野生型またはＦ０  ６０３２ヘテロ接合性のマウスから単離された骨髄細胞を、シングレットにゲートし、ＣＤ１９発現（Ｂ細胞マーカー）及びＣＤ３発現（Ｔ細胞マーカー）に基づいて分類した。下パネル：ＣＤ１９＋ゲートＢ細胞を、ＩｇＭｂ抗体（野生型対立遺伝子から産生される抗体、Ｂ６対立遺伝子）またはＩｇＭａ抗体（再構成された重鎖可変ドメイン（ｈＶＨ３−２３（Ｄ）ＪＨ４）をコードする遺伝子的に修飾された対立遺伝子（１２９対立遺伝子）から産生される抗体）の存在に基づいて分類した。
【図１１】野生型または６０３２ヘテロ接合性マウスから単離された脾臓細胞のＦＡＣＳ分析の結果を示す。上パネル：野生型またはＦ０  ６０３２ヘテロ接合性のマウスから単離された脾臓細胞を、シングレットにゲートし、ＣＤ１９発現（Ｂ細胞マーカー）及びＣＤ３発現（Ｔ細胞マーカー）に基づいて分類した。下パネル：ＣＤ１９＋ゲートＢ細胞を、ＩｇＭｂ抗体（野生型対立遺伝子から産生される抗体、Ｂ６対立遺伝子）またはＩｇＭａ抗体（再構成された重鎖可変ドメイン（ｈＶＨ３−２３（Ｄ）ＪＨ４）をコードする遺伝子的に修飾された対立遺伝子（１２９対立遺伝子）から産生される抗体）の存在に基づいて分類した。
【図１２】野生型または６０３２ヘテロ接合性のマウスから単離された血液細胞のＦＡＣＳ分析の結果を示す。上パネル：野生型またはＦ０  ６０３２ヘテロ接合性のマウスから単離された血液細胞を、シングレットにゲートし、ＣＤ１９発現（Ｂ細胞マーカー）及びＣＤ３発現（Ｔ細胞マーカー）に基づいて分類した。下パネル：ＣＤ１９＋ゲートＢ細胞を、ＩｇＭｂ抗体（野生型対立遺伝子から産生される抗体、Ｂ６対立遺伝子）またはＩｇＭａ抗体（再構成された重鎖可変ドメイン（ｈＶＨ３−２３（Ｄ）ＪＨ４）をコードする遺伝子的に修飾された対立遺伝子（１２９対立遺伝子）から産生される抗体）の存在に基づいて分類した。
【図１３Ａ】野生型マウス（ＷＴ）及び再構成されたヒト免疫グロブリン可変領域ヌクレオチド配列（ＶＨ３−２３／Ｄ／ＪＨ４）に関してホモ接合性のマウス（６０３２ＨＯ）からの、採取された脾臓からのＣＤ１９＋Ｂ細胞未熟Ｂ細胞（ＣＤ１９＋ＩｇＤｉｎｔＩｇＭｈｉ）及び成熟Ｂ細胞（ＣＤ１９＋ＩｇＭｌｏＩｇＤｈｉ）の総数のＦＡＣＳ分析の結果を示す。上パネル：野生型またはＦ２  ６０３２ホモ接合性のマウスから単離された脾臓細胞を、シングレットにゲートし、ＣＤ１９発現（Ｂ細胞マーカー）及びＣＤ３発現（Ｔ細胞マーカー）に基づいて分類した。下パネルは、ＣＤ１９＋にゲートされ、免疫グロブリンＤ（ＩｇＤ）及び免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）に関して染色された、野生型マウス（ＷＴ）及び再構成された重鎖ヒト免疫グロブリン可変領域ヌクレオチド配列（ＶＨ３−２３／Ｄ／ＪＨ４）に関してホモ接合性のマウスからの脾細胞の代表的な等高線図を示す。各ゲート領域内の細胞の割合が示される。
【図１３Ｂ】野生型（ＷＴ）及び再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列（ＶＨ３−２３／Ｄ／ＪＨ４）に関してホモ接合性のマウスから採取された脾臓中の、Ｂ細胞（ＣＤ１９＋）、成熟Ｂ細胞（ＣＤ１９＋ＩｇＤｈｉＩｇＭｌｏ）、及び未熟Ｂ細胞（ＣＤ１９＋ＩｇＤｉｎｔＩｇＭｈｉ）の総数を示す。
【図１３Ｃ】野生型マウス（ＷＴ）及び再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列（ＶＨ３−２３／Ｄ／ＪＨ４）に関してホモ接合性のマウス（６０３２ＨＯ）からの、ＣＤ１９＋にゲートされたＩｇλ＋及びＩｇκ＋脾細胞の代表的な等高線図を示す。
【図１３Ｄ】野生型（ＷＴ）及び再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列（ＶＨ３−２３／Ｄ／ＪＨ４）に関してホモ接合性のマウスから採取された脾臓中のＢ細胞（ＣＤ１９＋）、Ｉｇκ＋Ｂ細胞（ＣＤ１９＋Ｉｇκａｐｐａ＋）、及びＩｇλ＋Ｂ細胞（ＣＤ１９＋Ｉｇラムダ＋）の総数を示す。
【図１３Ｅ】野生型マウス及び再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列（ＶＨ３−２３／Ｄ／ＪＨ４）に関してホモ接合性のマウスにおける末梢Ｂ細胞発生を示す。等高線図の１列目（左）は、未熟及び成熟Ｂ細胞を示すＣＤ１９＋にゲートされたＣＤ９３＋及びＢ２２０＋脾細胞を示す。等高線図の２列目（中央）は、Ｔ１（ＩｇＤ−ＩｇＭ＋ＣＤ２１ｌｏＣＤ２３−）、Ｔ２（ＩｇＤｈｉＩｇＭｈｉＣＤ２１ｍｉｄＣＤ２３＋）、及びＴ３Ｂ細胞集団を示す未熟Ｂ細胞内のＩｇＭ＋及びＣＤ２３＋発現を示す。等高線図の３列目（右）は、辺縁帯Ｂ細胞を生じさせるより小さい第１の集団と濾胞性（ＦＯ）Ｂ細胞を生じさせる第２の集団とを示す、成熟Ｂ細胞のＣＤ２１＋（ＣＤ３５＋）及びＩｇＭ＋発現を示す。各ゲート領域内の細胞の割合が示される。
【図１４Ａ】野生型マウス（ＷＴ）及び再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列（ＶＨ３−２３／Ｄ／ＪＨ４）に関してホモ接合性のマウスからの、Ｂ及びＴ細胞（それぞれ、ＣＤ１９＋及びＣＤ３＋）に関して染色された骨髄の代表的な等高線図を示す。
【図１４Ｂ】野生型マウス（ＷＴ）及び再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列（ＶＨ３−２３／Ｄ／ＪＨ４）に関してホモ接合性のマウスの大腿骨から単離された骨髄内の細胞の絶対数（左）、細胞の総数（中央）、及びＢ（ＣＤ１９＋）細胞の総数（右）を示す。
【図１４Ｃ】野生型マウス（ＷＴ）及び再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列（ＶＨ３−２３／Ｄ／ＪＨ４）に関してホモ接合性のマウスからの、免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）及びＢ２２に関して染色されたシングレットにゲートされた、骨髄の代表的な等高線図を示す。未熟、成熟、及びプロ／プレＢ細胞が、等高線図の各々に記される。
【図１４Ｄ】野生型マウス（ＷＴ）及び再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列（ＶＨ３−２３／Ｄ／ＪＨ４）に関してホモ接合性のマウスの大腿骨から単離された骨髄内の細胞の総数及び成熟Ｂ（Ｂ２２０ｈｉＩｇＭ＋）及び未熟Ｂ（Ｂ２２０ｉｎｔＩｇＭ＋）を示す。
【図１４Ｅ】野生型マウス（ＷＴ）及び再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列（ＶＨ３−２３／Ｄ／ＪＨ４）に関してホモ接合性のマウスからの、免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）及びＢ２２０に関して染色されたシングレットにゲートされた骨髄の代表的な等高線図を示す。未熟、成熟、及びプロ／プレＢ細胞が、等高線図の各々に記される。
【図１４Ｆ】野生型マウス（ＷＴ）及び再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列（ＶＨ３−２３／Ｄ／ＪＨ４）に関してホモ接合性のマウスの大腿骨から単離された、Ｉｇκ及びＩｇλ発現に関して染色された未熟（Ｂ２２０ｉｎｔＩｇＭ＋）及び成熟（Ｂ２２０ｈｉＩｇＭ＋）Ｂ細胞にゲートされた、骨髄の代表的な等高線図を示す。
【図１５】足蹠免疫付与後、第１５日及び第２４日のマウス血清（野生型または６０３１ＨＥＴ  Ｆ０及びＦ１）中の抗原特異的ｍＩｇＧのレベルを示す。
【図１６】ｈＶＨ３−２３（Ｄ４−４＿リーディングフレーム３）ＪＨ６（配列番号１４５）のコドン最適化ヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列を示す。
【図１７】ｈＶＨ３−２３（Ｄ４−４＿リーディングフレーム２）ＪＨ６（配列番号１４６）のコドン最適化ヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列を示す。
【図１８】ｈＶＨ３−２３（Ｄ４−４＿リーディングフレーム３）ＪＨ４（配列番号１４７）のコドン最適化ヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列を示す。
【図１９】ｈＶＨ３−２３（Ｄ４−４＿リーディングフレーム２）ＪＨ４（配列番号１４８）のコドン最適化ヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列を示す。
【図２０】２つの遺伝子的に修飾された二重軽鎖（ｄｕａｌ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ）（ＤＬＣ）遺伝子座の例を示す。上の遺伝子座（ＤＬＣ−５Ｊ）は、２つのヒトＶκ遺伝子セグメント及び５つのヒトＪκ遺伝子セグメントを含有する改変されたヒトＤＮＡ断片を含有する。下の遺伝子座（ＤＬＣ−１Ｊ）は、２つのヒトＶκ遺伝子セグメント及び１つのヒトＪκ遺伝子セグメントを含有する改変されたヒトＤＮＡ断片を含有する。各遺伝子座は、内在性軽鎖定常領域（例えば、Ｃκ）に作動可能に連結されるヒトＶκ領域を形成するように再構成することが可能である。全て、Ｆｒｔ組み換え部位を含有するネオマイシンカセットに（５’）上流に隣接する、免疫グロブリンプロモータ（Ｐ、遺伝子座の上の白矢印）、リーダーエクソン（Ｌ、短い白矢印）、及び２つのヒトＶκ遺伝子セグメント（長い白矢印）が示される。ヒト遺伝子セグメント（Ｖκ及びＪκ）の各々を用いて改変された組み換えシグナル配列は、各遺伝子セグメントと並ぶ白楕円によって示される。ほとんどの実施形態では、別段に指示されない限り、黒塗りの形状及び実線は、マウス配列を表し、白い形状及び二重線は、ヒト配列を表す。図は、縮尺通りに提示されてはいない。
【図２１Ａ】２つのヒトＶκセグメント（ｈＶκ１−３９及びｈＶκ３−２０）及び１つのヒトＪκセグメント（Ｊκ５）、ならびにマウスエンハンサー及びＩｇκＣアームを含む、免疫グロブリンカッパ遺伝子座の改変のための標的化ベクターの構築のための一般的な戦略を示す。図２１Ｄは、この標的化ベクターのＥＳ細胞内への導入及びそれを有するヘテロ接合性マウスの生成を示し、図２１Ｅは、ＦＬＰ酵素を使用したＥＳ細胞内の選択カセットの欠失を示す。ほとんどの実施形態では、別段に指示されない限り、黒塗りの形状及び実線は、マウス配列を表し、白い形状及び二重線は、ヒト配列を表す。図は、縮尺通りに提示されてはいない。
【図２１Ｂ】２つのヒトＶκセグメント（ｈＶκ１−３９及びｈＶκ３−２０）及び１つのヒトＪκセグメント（Ｊκ５）、ならびにマウスエンハンサー及びＩｇκＣアームを含む、免疫グロブリンカッパ遺伝子座の改変のための標的化ベクターの構築のための一般的な戦略を示す。図２１Ｄは、この標的化ベクターのＥＳ細胞内への導入及びそれを有するヘテロ接合性マウスの生成を示し、図２１Ｅは、ＦＬＰ酵素を使用したＥＳ細胞内の選択カセットの欠失を示す。ほとんどの実施形態では、別段に指示されない限り、黒塗りの形状及び実線は、マウス配列を表し、白い形状及び二重線は、ヒト配列を表す。図は、縮尺通りに提示されてはいない。
【図２１Ｃ】２つのヒトＶκセグメント（ｈＶκ１−３９及びｈＶκ３−２０）及び１つのヒトＪκセグメント（Ｊκ５）、ならびにマウスエンハンサー及びＩｇκＣアームを含む、免疫グロブリンカッパ遺伝子座の改変のための標的化ベクターの構築のための一般的な戦略を示す。図２１Ｄは、この標的化ベクターのＥＳ細胞内への導入及びそれを有するヘテロ接合性マウスの生成を示し、図２１Ｅは、ＦＬＰ酵素を使用したＥＳ細胞内の選択カセットの欠失を示す。ほとんどの実施形態では、別段に指示されない限り、黒塗りの形状及び実線は、マウス配列を表し、白い形状及び二重線は、ヒト配列を表す。図は、縮尺通りに提示されてはいない。
【図２１Ｄ】２つのヒトＶκセグメント（ｈＶκ１−３９及びｈＶκ３−２０）及び１つのヒトＪκセグメント（Ｊκ５）、ならびにマウスエンハンサー及びＩｇκＣアームを含む、免疫グロブリンカッパ遺伝子座の改変のための標的化ベクターの構築のための一般的な戦略を示す。図２１Ｄは、この標的化ベクターのＥＳ細胞内への導入及びそれを有するヘテロ接合性マウスの生成を示し、図２１Ｅは、ＦＬＰ酵素を使用したＥＳ細胞内の選択カセットの欠失を示す。ほとんどの実施形態では、別段に指示されない限り、黒塗りの形状及び実線は、マウス配列を表し、白い形状及び二重線は、ヒト配列を表す。図は、縮尺通りに提示されてはいない。
【図２１Ｅ】２つのヒトＶκセグメント（ｈＶκ１−３９及びｈＶκ３−２０）及び１つのヒトＪκセグメント（Ｊκ５）、ならびにマウスエンハンサー及びＩｇκＣアームを含む、免疫グロブリンカッパ遺伝子座の改変のための標的化ベクターの構築のための一般的な戦略を示す。図２１Ｄは、この標的化ベクターのＥＳ細胞内への導入及びそれを有するヘテロ接合性マウスの生成を示し、図２１Ｅは、ＦＬＰ酵素を使用したＥＳ細胞内の選択カセットの欠失を示す。ほとんどの実施形態では、別段に指示されない限り、黒塗りの形状及び実線は、マウス配列を表し、白い形状及び二重線は、ヒト配列を表す。図は、縮尺通りに提示されてはいない。
【図２２Ａ】２つのヒトＶκセグメント（ｈＶκ１−３９及びｈＶκ３−２０）及び１つのヒトＪκセグメントを含む免疫グロブリンκ遺伝子座の改変された部分のヌクレオチド配列（配列番号８２）を示し、ヌクレオチド配列は、改変されたヒト配列にわたり、５’及び３’末端の両方にて１００塩基対の内在性マウス配列を含む。図２２Ｄの下側は、種々の配列を描写するために使用される異なるフォントを説明する。
【図２２Ｂ】２つのヒトＶκセグメント（ｈＶκ１−３９及びｈＶκ３−２０）及び１つのヒトＪκセグメントを含む免疫グロブリンκ遺伝子座の改変された部分のヌクレオチド配列（配列番号８２）を示し、ヌクレオチド配列は、改変されたヒト配列にわたり、５’及び３’末端の両方にて１００塩基対の内在性マウス配列を含む。図２２Ｄの下側は、種々の配列を描写するために使用される異なるフォントを説明する。
【図２２Ｃ】２つのヒトＶκセグメント（ｈＶκ１−３９及びｈＶκ３−２０）及び１つのヒトＪκセグメントを含む免疫グロブリンκ遺伝子座の改変された部分のヌクレオチド配列（配列番号８２）を示し、ヌクレオチド配列は、改変されたヒト配列にわたり、５’及び３’末端の両方にて１００塩基対の内在性マウス配列を含む。図２２Ｄの下側は、種々の配列を描写するために使用される異なるフォントを説明する。
【図２２Ｄ】２つのヒトＶκセグメント（ｈＶκ１−３９及びｈＶκ３−２０）及び１つのヒトＪκセグメントを含む免疫グロブリンκ遺伝子座の改変された部分のヌクレオチド配列（配列番号８２）を示し、ヌクレオチド配列は、改変されたヒト配列にわたり、５’及び３’末端の両方にて１００塩基対の内在性マウス配列を含む。図２２Ｄの下側は、種々の配列を描写するために使用される異なるフォントを説明する。
【図２３Ａ】２つのヒトＶκセグメント（ｈＶκ１−３９及びｈＶκ３−２０）及び５つのヒトＪκセグメント、ならびにマウスエンハンサー及びＩｇκＣアームを含む、免疫グロブリンカッパ遺伝子座の改変のための標的化ベクターの構築のための一般的な戦略を示す。図２３Ｃは、この標的化ベクターのＥＳ細胞内への導入及びそれを有するヘテロ接合性マウスの生成を示し、図２３Ｄは、ＦＬＰ酵素を使用したＥＳ細胞内の選択カセットの欠失を示す。ほとんどの実施形態では、別段に指示されない限り、黒塗りの形状及び実線は、マウス配列を表し、白い形状及び二重線は、ヒト配列を表す。図は、縮尺通りに提示されてはいない。
【図２３Ｂ】２つのヒトＶκセグメント（ｈＶκ１−３９及びｈＶκ３−２０）及び５つのヒトＪκセグメント、ならびにマウスエンハンサー及びＩｇκＣアームを含む、免疫グロブリンカッパ遺伝子座の改変のための標的化ベクターの構築のための一般的な戦略を示す。図２３Ｃは、この標的化ベクターのＥＳ細胞内への導入及びそれを有するヘテロ接合性マウスの生成を示し、図２３Ｄは、ＦＬＰ酵素を使用したＥＳ細胞内の選択カセットの欠失を示す。ほとんどの実施形態では、別段に指示されない限り、黒塗りの形状及び実線は、マウス配列を表し、白い形状及び二重線は、ヒト配列を表す。図は、縮尺通りに提示されてはいない。
【図２３Ｃ】２つのヒトＶκセグメント（ｈＶκ１−３９及びｈＶκ３−２０）及び５つのヒトＪκセグメント、ならびにマウスエンハンサー及びＩｇκＣアームを含む、免疫グロブリンカッパ遺伝子座の改変のための標的化ベクターの構築のための一般的な戦略を示す。図２３Ｃは、この標的化ベクターのＥＳ細胞内への導入及びそれを有するヘテロ接合性マウスの生成を示し、図２３Ｄは、ＦＬＰ酵素を使用したＥＳ細胞内の選択カセットの欠失を示す。ほとんどの実施形態では、別段に指示されない限り、黒塗りの形状及び実線は、マウス配列を表し、白い形状及び二重線は、ヒト配列を表す。図は、縮尺通りに提示されてはいない。
【図２３Ｄ】２つのヒトＶκセグメント（ｈＶκ１−３９及びｈＶκ３−２０）及び５つのヒトＪκセグメント、ならびにマウスエンハンサー及びＩｇκＣアームを含む、免疫グロブリンカッパ遺伝子座の改変のための標的化ベクターの構築のための一般的な戦略を示す。図２３Ｃは、この標的化ベクターのＥＳ細胞内への導入及びそれを有するヘテロ接合性マウスの生成を示し、図２３Ｄは、ＦＬＰ酵素を使用したＥＳ細胞内の選択カセットの欠失を示す。ほとんどの実施形態では、別段に指示されない限り、黒塗りの形状及び実線は、マウス配列を表し、白い形状及び二重線は、ヒト配列を表す。図は、縮尺通りに提示されてはいない。
【図２４Ａ】２つのヒトＶκセグメント（ｈＶκ１−３９及びｈＶκ３−２０）及び５つのヒトＪκセグメントを含む改変された免疫グロブリンκ遺伝子ヌクレオチド配列（配列番号８３）を示し、ヌクレオチド配列は、改変されたヒト配列にわたり、５’及び３’末端の両方にて１００塩基対の内在性マウス配列を含む。図２４Ｄの下側は、種々の配列を描写するために使用される異なるフォントを説明する。
【図２４Ｂ】２つのヒトＶκセグメント（ｈＶκ１−３９及びｈＶκ３−２０）及び５つのヒトＪκセグメントを含む改変された免疫グロブリンκ遺伝子ヌクレオチド配列（配列番号８３）を示し、ヌクレオチド配列は、改変されたヒト配列にわたり、５’及び３’末端の両方にて１００塩基対の内在性マウス配列を含む。図２４Ｄの下側は、種々の配列を描写するために使用される異なるフォントを説明する。
【図２４Ｃ】２つのヒトＶκセグメント（ｈＶκ１−３９及びｈＶκ３−２０）及び５つのヒトＪκセグメントを含む改変された免疫グロブリンκ遺伝子ヌクレオチド配列（配列番号８３）を示し、ヌクレオチド配列は、改変されたヒト配列にわたり、５’及び３’末端の両方にて１００塩基対の内在性マウス配列を含む。図２４Ｄの下側は、種々の配列を描写するために使用される異なるフォントを説明する。
【図２４Ｄ】２つのヒトＶκセグメント（ｈＶκ１−３９及びｈＶκ３−２０）及び５つのヒトＪκセグメントを含む改変された免疫グロブリンκ遺伝子ヌクレオチド配列（配列番号８３）を示し、ヌクレオチド配列は、改変されたヒト配列にわたり、５’及び３’末端の両方にて１００塩基対の内在性マウス配列を含む。図２４Ｄの下側は、種々の配列を描写するために使用される異なるフォントを説明する。
【図２５Ａ】上パネルでは、野生型マウス（ＷＴ）ならびに２つのヒトＶκ及び５つのヒトＪκ遺伝子セグメントに関してホモ接合性のマウス（ＤＬＣ−５Ｊ）からの、Ｂ及びＴ細胞（それぞれ、ＣＤ１９＋及びＣＤ３＋）に関して染色された骨髄の代表的な等高線図を示す。下パネルは、野生型マウス（ＷＴ）ならびに２つのヒトＶκ及び５つのヒトＪκ遺伝子セグメントに関してホモ接合性のマウス（ＤＬＣ−５Ｊ）からの、ＣＤ１９＋にゲートされ、ｃｋｉｔ＋及びＣＤ４３＋に関して染色された骨髄の代表的な等高線図を示す。プロ及びプレＢ細胞が、下パネルの等高線図上に記される。
【図２５Ｂ】野生型マウス（ＷＴ）ならびに２つのヒトＶκ及び５つのヒトＪκ遺伝子セグメントに関してホモ接合性のマウス（ＤＬＣ−５Ｊ）の大腿骨から採取された骨髄中のプロ（ＣＤ１９＋ＣＤ４３＋ｃｋｉｔ＋）及びプレ（ＣＤ１９＋ＣＤ４３−ｃｋｉｔ−）Ｂ細胞の数を示す。
【図２６Ａ】野生型マウス（ＷＴ）ならびに２つのヒトＶκ及び５つのヒトＪκ遺伝子セグメントに関してホモ接合性のマウス（ＤＬＣ−５Ｊ）からの、免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）及びＢ２２０に関して染色されたシングレットにゲートされた骨髄の代表的な等高線図を示す。未熟、成熟、及びプロ／プレＢ細胞が、等高線図の各々に記される。
【図２６Ｂ】野生型マウス（ＷＴ）ならびに２つのヒトＶκ及び５つのヒトＪκ遺伝子セグメントに関してホモ接合性のマウス（ＤＬＣ−５Ｊ）の大腿骨から単離された骨髄中のＢ（ＣＤ１９＋）、未熟Ｂ（Ｂ２２０ｉｎｔＩｇＭ＋）、及び成熟Ｂ（Ｂ２２０ｈｉＩｇＭ＋）細胞の総数を示す。
【図２７Ａ】野生型マウス（ＷＴ）ならびに２つのヒトＶκ及び５つのヒトＪκ遺伝子セグメントに関してホモ接合性のマウス（ＤＬＣ−５Ｊ）からの、免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）及びＢ２２０に関して染色されたシングレットにゲートされた骨髄の代表的な等高線図を示す。未熟、成熟、及びプロ／プレＢ細胞が、等高線図の各々に記される。
【図２７Ｂ】野生型マウス（ＷＴ）ならびに２つのヒトＶκ及び５つのヒトＪκ遺伝子セグメントに関してホモ接合性のマウス（ＤＬＣ−５Ｊ）の大腿骨から単離された、Ｉｇκ及びＩｇλ発現に関して染色された未熟（Ｂ２２０ｉｎｔＩｇＭ＋）及び成熟（Ｂ２２０ｈｉＩｇＭ＋）Ｂ細胞にゲートされた骨髄の代表的な等高線図を示す。
【図２８Ａ】上パネルでは、野生型マウス（ＷＴ）ならびに２つのヒトＶκ及び５つのヒトＪκ遺伝子セグメントに関してホモ接合性のマウス（ＤＬＣ−５Ｊ）からの、シングレットにゲートされ、Ｂ及びＴ細胞（それぞれ、ＣＤ１９＋及びＣＤ３＋）に関して染色された脾細胞の代表的な等高線図を示す。下パネルは、野生型マウス（ＷＴ）ならびに２つのヒトＶκ及び５つのヒトＪκ遺伝子セグメントに関してホモ接合性のマウス（ＤＬＣ−５Ｊ）からの、ＣＤ１９＋にゲートされ、免疫グロブリンＤ（ＩｇＤ）及び免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）に関して染色された脾細胞の代表的な等高線図を示す。成熟（ＷＴに関して５４、ＤＬＣ−５Ｊに関して５６．９）及び移行（ＷＴに関して２３．６、ＤＬＣ−５Ｊに関して２５．６）Ｂ細胞が、等高線図の各々に記される。
【図２８Ｂ】野生型マウス（ＷＴ）ならびに２つのヒトＶκ及び５つのヒトＪκ遺伝子セグメントに関してホモ接合性のマウス（ＤＬＣ−５Ｊ）から採取された脾臓中のＣＤ１９＋Ｂ細胞、移行Ｂ細胞（ＣＤ１９＋ＩｇＭｈｉＩｇＤｌｏ）、及び成熟Ｂ細胞（ＣＤ１９＋ＩｇＭｌｏＩｇＤｈｉ）の総数を示す。
【図２９Ａ】野生型マウス（ＷＴ）ならびに２つのヒトＶκ及び５つのヒトＪκ遺伝子セグメントに関してホモ接合性のマウス（ＤＬＣ−５Ｊ）からの、ＣＤ１９＋にゲートされたＩｇλ＋及びＩｇκ＋脾細胞の代表的な等高線図を示す。
【図２９Ｂ】野生型（ＷＴ）ならびに２つのヒトＶκ及び５つのヒトＪκ遺伝子セグメントに関してホモ接合性のマウス（ＤＬＣ−５Ｊ）から採取された脾臓中のＢ細胞（ＣＤ１９＋）、Ｉｇκ＋Ｂ細胞（ＣＤ１９＋Ｉｇκ＋）、及びＩｇλ＋Ｂ細胞（ＣＤ１９＋Ｉｇλ＋）の総数を示す。
【図３０Ａ】２つのヒトＶκ及び５つのヒトＪκ遺伝子セグメントに関してホモ接合性のマウスにおける末梢Ｂ細胞発生を示す。第１の（左端）等高線図は、未熟（３９．６）及び成熟（５７．８）Ｂ細胞を示すＣＤ１９＋にゲートされたＣＤ９３＋及びＢ２２０＋脾細胞を示す。第２の（上中央）等高線図は、Ｔ１（３３．７、ＩｇＤ−ＩｇＭ＋ＣＤ２１ｌｏＣＤ２３−）、Ｔ２（２１．２、ＩｇＤｈｉＩｇＭｈｉＣＤ２１ｍｉｄＣＤ２３＋）、及びＴ３（２９．１）Ｂ細胞集団を示す未熟Ｂ細胞中のＩｇＭ＋及びＣＤ２３＋発現を示す。第３の（下中央）等高線図は、辺縁帯Ｂ細胞を生じさせる小集団（１４．８）と、濾胞性（ＦＯ）Ｂ細胞を生じさせる第２の集団（７０．５）とを示す、成熟Ｂ細胞のＣＤ２１＋（ＣＤ３５＋）及びＩｇＭ＋発現を示す。第４の（上右）等高線図は、辺縁帯（９０．５、ＭＺ）及び辺縁帯前駆体（７．３、ＩｇＭｈｉＩｇＤｈｉＣＤ２１ｈｉＣＤ２３＋）Ｂ細胞集団を示す、成熟Ｂ細胞中のＢ２２０＋及びＣＤ２３＋発現を示す。第５の（下右）等高線図は、ＦＯ−Ｉ（７９．０、ＩｇＤｈｉＩｇＭｌｏＣＤ２１ｍｉｄＣＤ２３＋）及びＦＯ−ＩＩ（１５．１、ＩｇＤｈｉＩｇＭｈｉＣＤ２１ｍｉｄＣＤ２３＋）Ｂ細胞集団を示す、成熟Ｂ細胞中のＩｇＤ＋及びＩｇＭ＋発現を示す。各ゲート領域内の細胞の割合が示される。
【図３０Ｂ】野生型マウスにおける末梢Ｂ細胞発生を示す。第１の（左端）等高線図は、未熟（３１．１）及び成熟（６４．４）Ｂ細胞を示すＣＤ１９＋にゲートされたＣＤ９３＋及びＢ２２０＋脾細胞を示す。第２の（上中央）等高線図は、Ｔ１（２８．５、ＩｇＤ−ＩｇＭ＋ＣＤ２１ｌｏＣＤ２３−）、Ｔ２（２８．７、ＩｇＤｈｉＩｇＭｈｉＣＤ２１ｍｉｄＣＤ２３＋）、及びＴ３（３０．７）Ｂ細胞集団を示す未熟Ｂ細胞中のＩｇＭ＋及びＣＤ２３＋発現を示す。第３の（下中央）等高線図は、辺縁帯Ｂ細胞を生じさせる小集団（７．６９）と、濾胞性（ＦＯ）Ｂ細胞を生じさせる第２の集団（７８．５）とを示す、成熟Ｂ細胞のＣＤ２１＋（ＣＤ３５＋）及びＩｇＭ＋発現を示す。第４の（上右）等高線図は、辺縁帯（７９．９、ＭＺ）及び辺縁帯前駆体（１９．４、ＩｇＭｈｉＩｇＤｈｉＣＤ２１ｈｉＣＤ２３＋）Ｂ細胞集団を示す成熟Ｂ細胞中のＢ２２０＋及びＣＤ２３＋発現を示す。第５の（下右）等高線図は、ＦＯ−Ｉ（８３．６、ＩｇＤｈｉＩｇＭｌｏＣＤ２１ｍｉｄＣＤ２３＋）及びＦＯ−ＩＩ（１３．１、ＩｇＤｈｉＩｇＭｈｉＣＤ２１ｍｉｄＣＤ２３＋）Ｂ細胞集団を示す成熟Ｂ細胞中のＩｇＤ＋及びＩｇＭ＋発現を示す。各ゲート領域内の細胞の割合が示される。
【図３１】野生型（ＷＴ）ならびに２つのヒトＶκ及び５つのヒトＪκ遺伝子セグメントに関してホモ接合性のマウス（ＤＬＣ−５Ｊ）の採取された脾臓中の、移行、辺縁帯、及び濾胞性Ｂ細胞集団の総数を示す。
【図３２】ヒトＶκ及びＪκ遺伝子セグメント（Ｈκ）（ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスのヒト軽鎖）での内在性Ｖκ及びＪκ遺伝子セグメントの置き換えに関してホモ接合性のマウス、野生型マウス（ＷＴ）、２つのヒトＶκ遺伝子セグメント及び５つのヒトＪκ遺伝子セグメントに関してホモ接合性のマウス（ＤＬＣ−５Ｊ）、ならびに２つのヒトＶκ遺伝子セグメント及び１つのヒトＪκ遺伝子セグメントに関してホモ接合性のマウス（ＤＬＣ−１Ｊ）における、Ｖκ３−２０またはＶκ１−３９遺伝子セグメントに特異的なプローブを使用した定量的ＰＣＲアッセイにおける、Ｖκ３−２０由来及びＶκ１−３９由来軽鎖の骨髄（ｙ軸）中の相対ｍＲＮＡ発現を示す。シグナルは、マウスＣκの発現に正規化される。ＮＤ：検出無し。
【図３３】ヒトＶκ及びＪκ遺伝子セグメント（Ｈκ）（ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスのヒト軽鎖）での内在性Ｖκ及びＪκ遺伝子セグメントの置き換えに関してホモ接合性のマウス、野生型マウス（ＷＴ）、２つのヒトＶκ遺伝子セグメント及び５つのヒトＪκ遺伝子セグメントに関してホモ接合性のマウス（ＤＬＣ−５Ｊ）、ならびに２つのヒトＶκ遺伝子セグメント及び１つのヒトＪκ遺伝子セグメントに関してホモ接合性のマウス（ＤＬＣ−１Ｊ）における、Ｖκ３−２０またはＶκ１−３９遺伝子セグメントに特異的なプローブを使用した定量的ＰＣＲアッセイにおける、Ｖκ３−２０由来及びＶκ１−３９由来軽鎖の全脾臓（ｙ軸）中の相対ｍＲＮＡ発現を示す。シグナルは、マウスＣκの発現に正規化される。ＮＤ：検出無し。
【図３４】図３４は、４つのヒスチジン残基をヒトＶκ１−３９及びＶκ３−２０軽鎖配列のＣＤＲ３へと改変するために使用される、選択される突然変異生成プライマーの配列及び特性（％ＧＣ含有量、Ｎ、％不整合、Ｔｍ）を示す。配列リスト内で使用されるこれらのプライマーに対する配列番号は、下の表に含まれる。Ｆ＝順プライマー、Ｒ＝逆プライマー。
【図３５Ａ】４つのヒスチジン残基及び５つのヒトＪκで各々置換された２つのヒトＶκ軽鎖セグメントを含む標的化ベクターのＥＳ細胞への導入、ならびにそれを有するヘテロ接合性マウスの生成を示し、図３５Ｂは、ＦＬＰｏ酵素を使用したＥＳ細胞中の選択カセットの欠失を示す。ほとんどの実施形態では、別段に指示されない限り、黒塗りの形状及び実線は、マウス配列を表し、白い形状及び二重線は、ヒト配列を表す。図は、縮尺通りに提示されてはいない。
【図３５Ｂ】４つのヒスチジン残基及び５つのヒトＪκで各々置換された２つのヒトＶκ軽鎖セグメントを含む標的化ベクターのＥＳ細胞への導入、ならびにそれを有するヘテロ接合性マウスの生成を示し、図３５Ｂは、ＦＬＰｏ酵素を使用したＥＳ細胞中の選択カセットの欠失を示す。ほとんどの実施形態では、別段に指示されない限り、黒塗りの形状及び実線は、マウス配列を表し、白い形状及び二重線は、ヒト配列を表す。図は、縮尺通りに提示されてはいない。
【図３６】３つのヒスチジン残基をヒトＶκ１−３９及びＶκ３−２０軽鎖配列のＣＤＲ３へと改変するために使用される、選択される突然変異生成プライマーの配列及び特性（％ＧＣ含有量、Ｎ、％不整合、Ｔｍ）を示す。配列リスト内で使用されるこれらのプライマーに対する配列番号は、下の表に含まれる。Ｆ＝順プライマー、Ｒ＝逆プライマー。
【図３７Ａ】３つのヒスチジン残基及び５つのヒトＪκで各々置換された２つのヒトＶκ軽鎖セグメントを含む標的化ベクターのＥＳ細胞への導入、ならびにそれを有するヘテロ接合性マウスの生成を示し、図３７Ｂは、ＦＬＰｏ酵素を使用したＥＳ細胞中の選択カセットの欠失を示す。ほとんどの実施形態では、別段に指示されない限り、黒塗りの形状及び実線は、マウス配列を表し、白い形状及び二重線は、ヒト配列を表す。図は、縮尺通りに提示されてはいない。
【図３７Ｂ】３つのヒスチジン残基及び５つのヒトＪκで各々置換された２つのヒトＶκ軽鎖セグメントを含む標的化ベクターのＥＳ細胞への導入、ならびにそれを有するヘテロ接合性マウスの生成を示し、図３７Ｂは、ＦＬＰｏ酵素を使用したＥＳ細胞中の選択カセットの欠失を示す。ほとんどの実施形態では、別段に指示されない限り、黒塗りの形状及び実線は、マウス配列を表し、白い形状及び二重線は、ヒト配列を表す。図は、縮尺通りに提示されてはいない。
【図３８Ａ】ＣＤＲ３配列（上配列）中で３つのヒスチジン残基で各々置換された、２つのＶカッパセグメント（Ｖκ３−２０及びＶκ１−３９）を含むマウスにおいて発現されるＩｇＭ軽カッパ鎖可変配列の例示的なアミノ酸翻訳を有するヒト生殖系列Ｖκ３−２０配列（下配列）によってコードされるアミノ酸配列の整列を示し、整列は、生殖系列配列内に導入された３つ全てのヒスチジン置換を保持したマウスにおいて発現されるＩｇＭカッパ鎖可変配列を示す。図３８Ｂは、ＣＤＲ３配列（各整列内の上配列）中で３つのヒスチジン残基で各々置換された、２つのＶカッパセグメント（Ｖκ３−２０及びＶκ１−３９）を含むマウスにおいて発現されるＩｇＭ軽カッパ鎖可変配列の例示的なアミノ酸翻訳を有するヒト生殖系列Ｖκ１−３９配列（各整列内の下配列）によってコードされるアミノ酸配列の整列を示し、上の整列は、生殖系列配列内に導入された３つ全てのヒスチジン修飾を保持したマウスにおいて発現されるＩｇＭカッパ鎖可変配列を示し、下の整列は、生殖系列配列内に導入された３つのヒスチジン修飾のうちの２つを保持したマウスにおいて発現されるＩｇＭカッパ鎖可変配列を示す。幾つかの実施形態では、Ｖκの最後の位置に導入されるヒスチジンは、Ｖ−Ｊ再構成中に失われる場合がある。
【図３８Ｂ】ＣＤＲ３配列（上配列）中で３つのヒスチジン残基で各々置換された、２つのＶカッパセグメント（Ｖκ３−２０及びＶκ１−３９）を含むマウスにおいて発現されるＩｇＭ軽カッパ鎖可変配列の例示的なアミノ酸翻訳を有するヒト生殖系列Ｖκ３−２０配列（下配列）によってコードされるアミノ酸配列の整列を示し、整列は、生殖系列配列内に導入された３つ全てのヒスチジン置換を保持したマウスにおいて発現されるＩｇＭカッパ鎖可変配列を示す。図３８Ｂは、ＣＤＲ３配列（各整列内の上配列）中で３つのヒスチジン残基で各々置換された、２つのＶカッパセグメント（Ｖκ３−２０及びＶκ１−３９）を含むマウスにおいて発現されるＩｇＭ軽カッパ鎖可変配列の例示的なアミノ酸翻訳を有するヒト生殖系列Ｖκ１−３９配列（各整列内の下配列）によってコードされるアミノ酸配列の整列を示し、上の整列は、生殖系列配列内に導入された３つ全てのヒスチジン修飾を保持したマウスにおいて発現されるＩｇＭカッパ鎖可変配列を示し、下の整列は、生殖系列配列内に導入された３つのヒスチジン修飾のうちの２つを保持したマウスにおいて発現されるＩｇＭカッパ鎖可変配列を示す。幾つかの実施形態では、Ｖκの最後の位置に導入されるヒスチジンは、Ｖ−Ｊ再構成中に失われる場合がある。
【図３９】重鎖遺伝子座中に再構成された重鎖可変領域核酸配列を含み（ＭＡＩＤ６０３２、「ＵＨＣマウス」）、２つのヒトＶκ遺伝子セグメント（例えば、ヒトＶκ１−３９及びヒトＶκ３−２０遺伝子セグメント）及び５つのヒトＪκ遺伝子セグメント（ｈＪκ１−５、ＤＬＣ−５Ｊ）を含有する遺伝子的に改変された軽鎖遺伝子座をさらに含む（ＭＡＩＤ１９１２ＨＯ）、遺伝子的に修飾されたＦ２マウスのゲノム構造を例証する。
【図４０Ａ】上パネルでは、遺伝子的に修飾された対照マウス（ＶＩ３、１２９３ＨＯ１４６０ＨＯ）と、重鎖遺伝子座中の再構成された重鎖可変領域核酸配列ならびに軽鎖遺伝子座中の２つのヒトＶκ及び５つのヒトＪκ遺伝子セグメント（ＭＡＩＤ１９１２ＨＯ６０３２ＨＯ、ＤＬＣ×ＵＨＣ）に関してホモ接合性のマウスとからの、シングレットにゲートされ、Ｂ及びＴ細胞（それぞれ、ＣＤ１９＋及びＣＤ３＋）に関して染色された脾細胞の代表的な等高線図を示す。下パネルは、遺伝子的に修飾された対照マウス（ＶＩ３、１２９３ＨＯ１４６０ＨＯ）と、重鎖遺伝子座中の再構成された重鎖可変領域核酸配列ならびに軽鎖遺伝子座中の２つのヒトＶκ及び５つのヒトＪκ遺伝子セグメント（ＭＡＩＤ１９１２ＨＯ６０３２ＨＯ、ＤＬＣ×ＵＨＣ）に関してホモ接合性のマウスからの、ＣＤ１９＋にゲートされ、免疫グロブリンＤ（ＩｇＤ）及び免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）に関して染色された脾細胞の代表的な等高線図を示す。成熟及び未熟Ｂ細胞が、等高線図の各々に記される。
【図４０Ｂ】遺伝子的に修飾された対照マウス（ＶＩ３、１２９３ＨＯ１４６０ＨＯ）と、重鎖遺伝子座中の再構成された重鎖可変領域核酸配列ならびに軽鎖遺伝子座中の２つのヒトＶκ及び５つのヒトＪκ遺伝子セグメントに関してホモ接合性のマウス（ＭＡＩＤ１９１２ＨＯ６０３２ＨＯ、ＤＬＣ×ＵＨＣ）とから採取された脾臓中の、ＣＤ１９＋Ｂ細胞、成熟Ｂ細胞（ＣＤ１９＋ＩｇＭｌｏＩｇＤｈｉ）、及び未熟Ｂ細胞（ＣＤ１９＋ＩｇＭｈｉＩｇＤｉｎｔ）の総数を示す。
【図４１Ａ】遺伝子的に修飾された対照マウス（ＶＩ３、１２９３ＨＯ１４６０ＨＯ）と、重鎖遺伝子座中の再構成された重鎖可変領域核酸配列ならびに軽鎖遺伝子座中の２つのヒトＶκ及び５つのヒトＪκ遺伝子セグメントに関してホモ接合性のマウス（ＭＡＩＤ１９１２ＨＯ６０３２ＨＯ、ＤＬＣ×ＵＨＣ）とからの、ＣＤ１９＋にゲートされたＩｇλ＋及びＩｇκ＋脾細胞の代表的な等高線図を示す。
【図４１Ｂ】遺伝子的に修飾された対照マウス（ＶＩ３、１２９３ＨＯ１４６０ＨＯ）と、重鎖遺伝子座中の再構成された重鎖可変領域核酸配列ならびに軽鎖遺伝子座中の２つのヒトＶκ及び５つのヒトＪκ遺伝子セグメントに関してホモ接合性のマウス（ＭＡＩＤ１９１２ＨＯ６０３２ＨＯ、ＤＬＣ×ＵＨＣ）とから採取された脾臓中の、Ｂ細胞（ＣＤ１９＋）、Ｉｇκ＋Ｂ細胞（ＣＤ１９＋Ｉｇκ＋）、及びＩｇλ＋Ｂ細胞（ＣＤ１９＋Ｉｇλ＋）の総数を示す。
【図４２】遺伝子的に修飾された対照マウス（ＶＩ３、１２９３ＨＯ１４６０ＨＯ）と、重鎖遺伝子座中の再構成された重鎖可変領域核酸配列ならびに軽鎖遺伝子座中の２つのヒトＶκ及び５つのヒトＪκ遺伝子セグメントに関してホモ接合性のマウス（ＭＡＩＤ１９１２ＨＯ６０３２ＨＯ、ＤＬＣ×ＵＨＣ）とから採取された脾臓中のＢ細胞上のＩｇＭ表面発現のフローサイトメトリー分析を示す。細胞は、ＩｇＭに対する蛍光（ＰＥ−Ｃｙ７共役型）抗体を用いて染色された。
【図４３Ａ】遺伝子的に修飾された対照マウス（ＶＩ３、１２９３ＨＯ１４６０ＨＯ）と、重鎖遺伝子座中の再構成された重鎖可変領域核酸配列ならびに軽鎖遺伝子座中の２つのヒトＶκ及び５つのヒトＪκ遺伝子セグメントに関してホモ接合性のマウス（ＭＡＩＤ１９１２ＨＯ６０３２ＨＯ、ＤＬＣ×ＵＨＣ）とにおける、末梢Ｂ細胞発生を示す。第１の（左端）等高線図は、未熟及び成熟Ｂ細胞を示すＣＤ１９＋にゲートされたＣＤ９３＋及びＢ２２０＋脾細胞を示す。第２の（中）等高線図は、Ｔ１（ＩｇＤ−ＩｇＭ＋ＣＤ２１ｌｏＣＤ２３−）、Ｔ２（ＩｇＤｈｉＩｇＭｈｉＣＤ２１ｍｉｄＣＤ２３＋）、及びＴ３Ｂ細胞集団を示す未熟Ｂ細胞中のＩｇＭ＋及びＣＤ２３＋発現を示す。第３の（右）等高線図は、辺縁帯Ｂ細胞を生じさせる第１のより小さい集団と、濾胞性（ＦＯ）Ｂ細胞を生じさせる第２のより大きい集団とを示す、成熟Ｂ細胞のＣＤ２１＋（ＣＤ３５＋）及びＩｇＭ＋発現を示す。各ゲート領域内の細胞の割合が示される。
【図４３Ｂ】遺伝子的に修飾された対照マウス（ＶＩ３、１２９３ＨＯ１４６０ＨＯ）と、重鎖遺伝子座中の再構成された重鎖可変領域核酸配列ならびに軽鎖遺伝子座中の２つのヒトＶκ及び５つのヒトＪκ遺伝子セグメントに関してホモ接合性のマウス（ＭＡＩＤ１９１２ＨＯ６０３２ＨＯ、ＤＬＣ×ＵＨＣ）とにおける末梢Ｂ細胞発生を示す。第１の（左）等高線図は、辺縁帯Ｂ細胞を生じさせる小集団と濾胞性（ＦＯ）Ｂ細胞を生じさせる第２の集団とを示す、成熟Ｂ細胞のＣＤ２１＋（ＣＤ３５＋）及びＩｇＭ＋発現を示す。第２の（中央）等高線図は、辺縁帯（ＭＺ）及び辺縁帯前駆体（ＩｇＭｈｉＩｇＤｈｉＣＤ２１ｈｉＣＤ２３＋）Ｂ細胞集団を示す、成熟Ｂ細胞中のＢ２２０＋及びＣＤ２３＋発現を示す。第３の（右）等高線図は、ＦＯ−Ｉ（ＩｇＤｈｉＩｇＭｉｎｔＣＤ２１ｉｎｔＣＤ２３＋）及びＦＯ−ＩＩ（ＩｇＤｈｉＩｇＭｉｎｔＣＤ２１ｉｎｔＣＤ２３＋）Ｂ細胞集団を示す、成熟Ｂ細胞中のＩｇＤ＋及びＩｇＭ＋発現を示す。各ゲート領域内の細胞の割合が示される。
【図４４Ａ】遺伝子的に修飾された対照マウス（ＶＩ３、１２９３ＨＯ１４６０ＨＯ）と、重鎖遺伝子座中の再構成された重鎖可変領域核酸配列ならびに軽鎖遺伝子座中の２つのヒトＶκ及び５つのヒトＪκ遺伝子セグメントに関してホモ接合性のマウス（ＭＡＩＤ１９１２ＨＯ６０３２ＨＯ、ＤＬＣ×ＵＨＣ）とからの、Ｂ及びＴ細胞（それぞれ、ＣＤ１９＋及びＣＤ３＋）に関して染色された骨髄の代表的な等高線図を示す。
【図４４Ｂ】遺伝子的に修飾された対照マウス（ＶＩ３、１２９３ＨＯ１４６０ＨＯ）と、重鎖遺伝子座中の再構成された重鎖可変領域核酸配列ならびに軽鎖遺伝子座中の２つのヒトＶκ及び５つのヒトＪκ遺伝子セグメントに関してホモ接合性のマウス（ＭＡＩＤ１９１２ＨＯ６０３２ＨＯ、ＤＬＣ×ＵＨＣ）との大腿骨から採取された骨髄中のリンパ球の割合、細胞／大腿骨の総数、及びＣＤ１９＋Ｂ細胞の数を示す。
【図４５Ａ】遺伝子的に修飾された対照マウス（ＶＩ３、１２９３ＨＯ１４６０ＨＯ）と、重鎖遺伝子座中の再構成された重鎖可変領域核酸配列ならびに軽鎖遺伝子座中の２つのヒトＶκ及び５つのヒトＪκ遺伝子セグメントに関してホモ接合性のマウス（ＭＡＩＤ１９１２ＨＯ６０３２ＨＯ、ＤＬＣ×ＵＨＣ）とからの、ＣＤ１９＋にゲートされ、ｃｋｉｔ＋及びＣＤ４３＋に関して染色された骨髄の代表的な等高線図を示す。プロ及びプレＢ細胞が、等高線図上に示される。
【図４５Ｂ】遺伝子的に修飾された対照マウス（ＶＩ３、１２９３ＨＯ１４６０ＨＯ）と、重鎖遺伝子座中の再構成された重鎖可変領域核酸配列ならびに軽鎖遺伝子座中の２つのヒトＶκ及び５つのヒトＪκ遺伝子セグメントに関してホモ接合性のマウス（ＭＡＩＤ１９１２ＨＯ６０３２ＨＯ、ＤＬＣ×ＵＨＣ）との大腿骨から採取された骨髄中の、プレ（ＣＤ１９＋ＣＤ４３−ｃｋｉｔ−）及びプロ（ＣＤ１９＋ＣＤ４３＋ｃｋｉｔ＋）Ｂ細胞の数を示す。
【図４６Ａ】遺伝子的に修飾された対照マウス（ＶＩ３、１２９３ＨＯ１４６０ＨＯ）と、重鎖遺伝子座中の再構成された重鎖可変領域核酸配列ならびに軽鎖遺伝子座中の２つのヒトＶκ及び５つのヒトＪκ遺伝子セグメントに関してホモ接合性のマウス（ＭＡＩＤ１９１２ＨＯ６０３２ＨＯ、ＤＬＣ×ＵＨＣ）とからの、免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）及びＢ２２０に関して染色されたシングレットにゲートされた骨髄の代表的な等高線図を示す。未熟、成熟、及びプロ／プレＢ細胞が、等高線図の各々に記される。
【図４６Ｂ】遺伝子的に修飾された対照マウス（ＶＩ３、１２９３ＨＯ１４６０ＨＯ）と、重鎖遺伝子座中の再構成された重鎖可変領域核酸配列ならびに軽鎖遺伝子座中の２つのヒトＶκ及び５つのヒトＪκ遺伝子セグメントに関してホモ接合性のマウス（ＭＡＩＤ１９１２ＨＯ６０３２ＨＯ、ＤＬＣ×ＵＨＣ）との大腿骨から単離された骨髄中の、細胞／大腿骨の総数、未熟Ｂ（Ｂ２２０ｉｎｔＩｇＭ＋）、及び成熟Ｂ（Ｂ２２０ｈｉＩｇＭ＋）細胞の数を示す。
【図４７】遺伝子的に修飾された対照マウス（ＶＩ３、１２９３ＨＯ１４６０ＨＯ）と、重鎖遺伝子座中の再構成された重鎖可変領域核酸配列ならびに軽鎖遺伝子座中の２つのヒトＶκ及び５つのヒトＪκ遺伝子セグメントに関してホモ接合性のマウス（ＭＡＩＤ１９１２ＨＯ６０３２ＨＯ、ＤＬＣ×ＵＨＣ）との大腿骨から単離された、Ｉｇλ及びＩｇκ発現に関して染色された未熟（Ｂ２２０ｉｎｔＩｇＭ＋）及び成熟（Ｂ２２０ｈｉＩｇＭ＋）Ｂ細胞にゲートされた骨髄の代表的な等高線図を示す。
【図４８】足蹠免疫付与前、足蹠免疫付与の第１のラウンドの２３日後、足蹠免疫付与の第１のラウンドの５週後、及び足蹠免疫付与の第２のラウンド後の、マウス血清（野生型または１９１２ＨＯ６０３１ＨＥＴ（ホモ接合性ＤＬＣ×ヘテロ接合性ＵＨＣ））中の抗原特異的ｍＩｇＧのレベルを示す。
【図４９】図４９は、カッパ軽鎖遺伝子座中に再構成された重鎖可変領域核酸配列（即ち、カッパ軽鎖定常核酸配列に作動可能に連結される再構成された重鎖ＶＤＪ配列）を含有する遺伝子的に修飾されたＦ１マウスのゲノム構造を例証する。
【図５０Ａ】上パネルでは、野生型マウス（ＷＴ）及びカッパ軽鎖遺伝子座中の再構成された重鎖可変領域核酸配列（ｈＶＨ３−２３／Ｄ／ＪＨ４）に関してホモ接合性のマウスからの、Ｂ及びＴ細胞（それぞれ、ＣＤ１９＋及びＣＤ３＋）に関して染色された骨髄の代表的な等高線図を示す。下パネルは、野生型マウス（ＷＴ）及びカッパ軽鎖遺伝子座中の再構成された重鎖可変領域核酸配列（ｈＶＨ３−２３／Ｄ／ＪＨ４）に関してホモ接合性のマウスからの、ＣＤ１９＋にゲートされ、ｃｋｉｔ＋及びＣＤ４３＋に関して染色された骨髄の代表的な等高線図を示す。プロ及びプレＢ細胞が、下パネルの等高線図上に記される。
【図５０Ｂ】野生型マウス（ＷＴ）及びカッパ軽鎖遺伝子座再構成された重鎖可変領域核酸配列（ｈＶＨ３−２３／Ｄ／ＪＨ４）に関してホモ接合性のマウスの大腿骨から採取された骨髄中の、プロ（ＣＤ１９＋ＣＤ４３＋ｃｋｉｔ＋）及びプレ（ＣＤ１９＋ＣＤ４３−ｃｋｉｔ−）Ｂ細胞の数を示す。
【図５１Ａ】野生型マウス（ＷＴ）及びカッパ軽鎖遺伝子座中の再構成された重鎖可変領域核酸配列（ｈＶＨ３−２３／Ｄ／ＪＨ４）に関してホモ接合性のマウスからの、免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）及びＢ２２０に関して染色されたシングレットにゲートされた骨髄の代表的な等高線図を示す。未熟、成熟、及びプロ／プレＢ細胞が、等高線図の各々に記される。
【図５１Ｂ】野生型マウス（ＷＴ）及びカッパ軽鎖遺伝子座中の再構成された重鎖可変領域核酸配列（ｈＶＨ３−２３／Ｄ／ＪＨ４）に関してホモ接合性のマウスの大腿骨から単離された骨髄中の、Ｂ（ＣＤ１９＋）及びプロ／プレＢ（ＩｇＭ−Ｂ２２０＋）細胞の総数を示す。
【図５１Ｃ】野生型マウス（ＷＴ）及びカッパ軽鎖遺伝子座中の再構成された重鎖可変領域核酸配列（ｈＶＨ３−２３／Ｄ／ＪＨ４）に関してホモ接合性のマウスの大腿骨から単離された骨髄中の、未熟Ｂ（Ｂ２２０ｉｎｔＩｇＭ＋）及び成熟Ｂ（Ｂ２２０ｈｉＩｇＭ＋）細胞の数を示す。
【図５２】野生型マウス（ＷＴ）及びカッパ軽鎖遺伝子座中の再構成された重鎖可変領域核酸配列（ｈＶＨ３−２３／Ｄ／ＪＨ４）に関してホモ接合性のマウスの大腿骨から単離された、Ｉｇλ及びＩｇκ発現に関して染色された未熟（Ｂ２２０ｉｎｔＩｇＭ＋）及び成熟（Ｂ２２０ｈｉＩｇＭ＋）Ｂ細胞にゲートされた骨髄の代表的な等高線図を示す。
【図５３Ａ】上パネルでは、野生型マウス（ＷＴ）及びカッパ軽鎖遺伝子座中の再構成された重鎖可変領域核酸配列（ｈＶＨ３−２３／Ｄ／ＪＨ４）に関してホモ接合性のマウスからの、シングレットにゲートされ、Ｂ及びＴ細胞（それぞれ、ＣＤ１９＋及びＣＤ３＋）に関して染色された脾細胞の代表的な等高線図を示す。下パネルは、野生型マウス（ＷＴ）及びカッパ軽鎖遺伝子座中の再構成された重鎖可変領域核酸配列（ｈＶＨ３−２３／Ｄ／ＪＨ４）に関してホモ接合性のマウスからの、ＣＤ１９＋にゲートされ、免疫グロブリンＤ（ＩｇＤ）及び免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）に関して染色された脾細胞の代表的な等高線図を示す。成熟（ＷＴに関して５６．９、カッパ上のｈＶＨ３−２３／Ｄ／ＪＨ４に関して４３）及び移行（ＷＴに関して２６．８、カッパ上のｈＶＨ３−２３／Ｄ／ＪＨ４に関して３４）Ｂ細胞が、等高線図の各々に記される。
【図５３Ｂ】野生型マウス（ＷＴ）及びカッパ軽鎖遺伝子座中の再構成された重鎖可変領域核酸配列（ｈＶＨ３−２３／Ｄ／ＪＨ４）に関してホモ接合性のマウスから採取された脾臓中のＣＤ１９＋Ｂ細胞、成熟Ｂ細胞（ＣＤ１９＋ＩｇＭｌｏＩｇＤｈｉ）、及び移行Ｂ細胞（ＣＤ１９＋ＩｇＭｈｉＩｇＤｉｎｔ）の総数を示す。
【図５４Ａ】野生型マウス（ＷＴ）及びカッパ軽鎖遺伝子座中の再構成された重鎖可変領域核酸配列（ｈＶＨ３−２３／Ｄ／ＪＨ４）からの、ＣＤ１９＋にゲートされたＩｇλ＋及びＩｇκ＋脾細胞の代表的な等高線図を示す。
【図５４Ｂ】野生型（ＷＴ）及びカッパ軽鎖遺伝子座中の再構成された重鎖可変領域核酸配列（ｈＶＨ３−２３／Ｄ／ＪＨ４）に関してホモ接合性のマウスから採取された脾臓中のＢ細胞（ＣＤ１９＋）、Ｉｇκ＋Ｂ細胞（ＣＤ１９＋Ｉｇκ＋）、及びＩｇλ＋Ｂ細胞（ＣＤ１９＋Ｉｇλ＋）の総数を示す。
【図５５】野生型マウスと比較した、カッパ軽鎖遺伝子座中の再構成された重鎖可変領域核酸配列（ｈＶＨ３−２３／Ｄ／ＪＨ４）に関してホモ接合性のマウスの脾臓区画内の末梢Ｂ細胞発生を示す。第１の（左）等高線図は、未熟及び成熟Ｂ細胞を示す、ＣＤ１９＋にゲートされたＣＤ９３＋及びＢ２２０＋脾細胞を示す。第２の（中央）等高線図は、Ｔ１、Ｔ２、及びＴ３Ｂ細胞集団を示す、未熟Ｂ細胞中のＩｇＭ＋及びＣＤ２３＋発現を示す。第３の（右）等高線図は、辺縁帯Ｂ細胞を生じさせる第１のより小さい小集団と濾胞性（ＦＯ）Ｂ細胞を生じさせる第２のより大きい集団とを示す、成熟Ｂ細胞のＣＤ２１＋（ＣＤ３５＋）及びＩｇＭ＋発現を示す。各ゲート領域内の細胞の割合が示される。
【図５６】カッパ軽鎖遺伝子座中の再構成された重鎖可変領域核酸配列に関してホモ接合性（ＭＡＩＤ６０７９ＨＯ、ホモ接合性「カッパ上ＵＨＣマウス（ＵＨＣ  ｏｎ  ｋａｐｐａ  ｍｏｕｓｅ）」）、及び重鎖遺伝子座中のカッパ軽鎖可変領域核酸配列に関してホモ接合性（ＭＡＩＤ１９９４ＨＯ、重鎖上カッパ（ｋａｐｐａ  ｏｎ  ｈｅａｖｙ）（「ＫｏＨ」）マウス）の遺伝子的に修飾されたＦ２マウスのゲノム構造を例証する。
【図５７Ａ】上パネルでは、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）（ＶＩ３）、ならびにカッパ軽鎖遺伝子座中の再構成された重鎖可変領域核酸配列に関してホモ接合性、及び重鎖遺伝子座中のカッパ軽鎖可変領域核酸配列に関してホモ接合性のマウスからの、Ｂ及びＴ細胞（それぞれ、ＣＤ１９＋及びＣＤ３＋）に関して染色された骨髄の代表的な等高線図を示す。下パネルは、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）（ＶＩ３）、ならびにカッパ軽鎖遺伝子座中の再構成された重鎖可変領域核酸配列に関してホモ接合性、及び重鎖遺伝子座中のカッパ軽鎖可変領域核酸配列に関してホモ接合性のマウスからの、ＣＤ１９＋にゲートされ、ｃｋｉｔ＋及びＣＤ４３＋に関して染色された骨髄の代表的な等高線図を示す。プロ及びプレＢ細胞が、下パネルの等高線図上に記される。
【図５７Ｂ】ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウス（１２４２ＨＯ１６４０ＨＯ）、ならびにカッパ軽鎖遺伝子座中の再構成された重鎖可変領域核酸配列に関してホモ接合性、及び重鎖遺伝子座中のカッパ軽鎖可変領域核酸配列に関してホモ接合性のマウス（１９９４ＨＯ６０７９ＨＯ）の大腿骨から採取された骨髄中の、Ｂ細胞（ＣＤ１９＋）の総数ならびにプロ（ＣＤ１９＋ＣＤ４３＋ｃｋｉｔ＋）及びプレ（ＣＤ１９＋ＣＤ４３−ｃｋｉｔ−）Ｂ細胞の数を示す。数は、１大腿骨当たりの細胞の絶対数と細胞の割合との両方として提示される。
【図５８Ａ】ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウス（１２４２ＨＯ１６４０ＨＯ）、ならびにカッパ軽鎖遺伝子座中の再構成された重鎖可変領域核酸配列に関してホモ接合性、及び重鎖遺伝子座中のカッパ軽鎖可変領域核酸配列に関してホモ接合性のマウス（１９９４ＨＯ６０７９ＨＯ）からの、免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）及びＢ２２０に関して染色されたシングレットにゲートされた骨髄の代表的な等高線図を示す。未熟、成熟、及びプロ／プレＢ細胞が、等高線図の各々に記される。
【図５８Ｂ】ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウス（１２４２ＨＯ１６４０ＨＯ）、ならびにカッパ軽鎖遺伝子座中の再構成された重鎖可変領域核酸配列に関してホモ接合性、及び重鎖遺伝子座中のカッパ軽鎖可変領域核酸配列に関してホモ接合性のマウス（１９９４ＨＯ６０７９ＨＯ）の大腿骨から単離された骨髄中の、未熟Ｂ（Ｂ２２０ｉｎｔＩｇＭ＋）及び成熟Ｂ（Ｂ２２０ｈｉＩｇＭ＋）細胞の数を示す。数は、１大腿骨当たりの細胞の絶対数と細胞の割合との両方として提示される。
【図５９】ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウス（１２４２ＨＯ１６４０ＨＯ）、ならびにカッパ軽鎖遺伝子座中の再構成された重鎖可変領域核酸配列に関してホモ接合性、及び重鎖遺伝子座中のカッパ軽鎖可変領域核酸配列に関してホモ接合性のマウス（１９９４ＨＯ６０７９ＨＯ）の大腿骨から単離された、Ｉｇλ及びＩｇκ発現に関して染色された未熟（Ｂ２２０ｉｎｔＩｇＭ＋）及び成熟（Ｂ２２０ｈｉＩｇＭ＋）Ｂ細胞にゲートされた骨髄の代表的な等高線図を示す。
【図６０Ａ】ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウス（ＶＩ３、１２４２ＨＯ１６４０ＨＯ）、ならびにカッパ軽鎖遺伝子座中の再構成された重鎖可変領域核酸配列に関してホモ接合性、及び重鎖遺伝子座中のカッパ軽鎖可変領域核酸配列に関してホモ接合性のマウス（１９９４ＨＯ６０７９ＨＯ）からの、ＣＤ１９＋にゲートされ、免疫グロブリンＤ（ＩｇＤ）及び免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）に関して染色された脾細胞の代表的な等高線図を示す。成熟及び移行／未熟Ｂ細胞が、等高線図の各々に記される。
【図６０Ｂ】ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウス（１２４２ＨＯ１６４０ＨＯ）、ならびにカッパ軽鎖遺伝子座中の再構成された重鎖可変領域核酸配列に関してホモ接合性、及び重鎖遺伝子座中のカッパ軽鎖可変領域核酸配列に関してホモ接合性のマウス（１９９４ＨＯ６０７９ＨＯ）から採取された脾臓中の、ＣＤ１９＋Ｂ細胞、成熟Ｂ細胞（ＣＤ１９＋ＩｇＭｌｏＩｇＤｈｉ）、及び移行Ｂ細胞（ＣＤ１９＋ＩｇＭｈｉＩｇＤｌｏ）の総数を示す。
【図６１】ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウス（１２４２ＨＯ１６４０ＨＯ）ならびにカッパ軽鎖遺伝子座中の再構成された重鎖可変領域核酸配列に関してホモ接合性、及び重鎖遺伝子座中のカッパ軽鎖可変領域核酸配列に関してホモ接合性のマウス（１９９４ＨＯ６０７９ＨＯ）から採取された脾臓中の、Ｂ細胞（ＣＤ１９＋）、Ｉｇκ＋Ｂ細胞（ＣＤ１９＋Ｉｇκ＋）、及びＩｇλ＋Ｂ細胞（ＣＤ１９＋Ｉｇλ＋）の総数を示す。数は、絶対細胞数とリンパ球の細胞割合との両方として提示される。
【図６２】ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウス（１２４２ＨＯ１６４０ＨＯ）、ならびにカッパ軽鎖遺伝子座中の再構成された重鎖可変領域核酸配列に関してホモ接合性、及びまた重鎖遺伝子座中のカッパ軽鎖可変領域核酸配列に関してホモ接合性のマウス（１９９４ＨＯ６０７９ＨＯ）の脾臓区画内の末梢Ｂ細胞発生を示す。上の等高線図は、未熟及び成熟Ｂ細胞を示すＣＤ１９＋にゲートされた、ＣＤ９３＋及びＢ２２０＋脾細胞を示す。下の等高線図は、Ｔ１、Ｔ２、及びＴ３Ｂ細胞集団を示す未熟Ｂ細胞中のＩｇＭ＋及びＣＤ２３＋発現を示す。各ゲート領域内の細胞の割合が示される。
【発明を実施するための形態】
【００５３】
本発明は、記載される特定の方法及び実験条件に限定されず、したがって方法及び条件は変動する場合がある。本明細書に使用される専門用語は、単に特定の実施形態を説明する目的のためのみのものであり、本発明の範囲は特許請求の範囲によって定義されるため、限定的であることを意図されないことも理解されるべきである。
【００５４】
別段に定義されない限り、本明細書に使用される全ての用語及び語句は、別段に明確に指示されるか、または用語または語句が使用される文脈から明らかでない限り、その用語及び語句が当該技術分野において獲得している意味を含む。本明細書に記載されるものと類似または等価の任意の方法及び材料を本発明の実践及び試験において使用することができるが、特定の方法及び材料をここに説明する。言及される全ての出版物は、参照により本明細書に援用される。
【００５５】
用語「抗体」は、本明細書で使用されるとき、ジスルフィド結合によって相互に接続される４つのポリペプチド鎖、２つの重（Ｈ）鎖、及び２つの軽（Ｌ）鎖を含む、免疫グロブリン分子を含む。各重鎖は、重鎖可変ドメイン及び重鎖定常領域（ＣＨ）を含む。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む。重鎖及び軽鎖可変ドメインは、フレームワーク領域（ＦＲ）と称されるより保存された領域が組み入れられた、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域にさらに細分することができる。各重鎖及び軽鎖可変ドメインは、以下の順序でアミノ末端からカルボキシ末端に構成される３つのＣＤＲ及び４つのＦＲを含む：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４（重鎖ＣＤＲは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３と略される場合があり、軽鎖ＣＤＲは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３と略される場合がある）。用語「高親和性」抗体とは、その標的エピトープに対して、約１０−９Ｍ以下（例えば、約１×１０−９Ｍ、１×１０−１０Ｍ、１×１０−１１Ｍ、または約１×１０−１２Ｍ）のＫＤを有する抗体を指す。１つの実施形態では、ＫＤは、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）などの表面プラズモン共鳴によって測定され、別の実施形態では、ＫＤは、ＥＬＩＳＡによって測定される。
【００５６】
語句「二重特異性抗体」は、２つ以上のエピトープを選択的に結合することが可能な抗体を含む。二重特異性抗体は概して、２つの非同一の重鎖を含み、各重鎖は、異なる分子（例えば、２つの異なる免疫原上の異なるエピトープ）上か、または同一の分子（例えば、同一の免疫原上の異なるエピトープ）上かのいずれかで、異なるエピトープに特異的に結合する。二重特異性抗体が、２つの異なるエピトープ（第１のエピトープ及び第２のエピトープ）を選択的に結合することが可能な場合、第１のエピトープに対する第１の重鎖の親和性は、概して、第２のエピトープに対する第１の重鎖の親和性よりも少なくとも１〜２、または３、または４桁以上小さく、逆もまた同様となる。二重特異性抗体によって特異的に結合されるエピトープは、同一または異なる標的上（例えば、同一または異なるタンパク質上）であることができる。例示的な二重特異性抗体としては、腫瘍抗原に特異的な第１の重鎖と、細胞毒性マーカー、例えば、Ｆｃ受容体（例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩなど）、またはＴ細胞マーカー（例えば、ＣＤ３、ＣＤ２８など）に特異的な第２の重鎖とを有するものが挙げられる。さらに、第２の重鎖可変ドメインは、異なる所望の特異性を有する重鎖可変ドメインで置換されることができる。例えば、腫瘍抗原に特異的な第１の重鎖と毒素に特異的な第２の重鎖とを有する二重特異性抗体は、毒素（例えば、サポリン、ビンカアルカロイドなど）を腫瘍細胞へ送達するように対にされることができる。他の例示的な二重特異性抗体としては、活性化受容体（例えば、Ｂ細胞受容体、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃαＲＩ、Ｔ細胞受容体など）に特異的な第１の重鎖と、抑制性受容体（例えば、ＦｃγＲＩＩＢ、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７２、ＣＤ３００ａなど）に特異的な第２の重鎖とを有するものが挙げられる。かかる二重特異性抗体は、細胞活性化（例えば、アレルギー及び喘息）に関連付けられる治療条件のために構築することができる。二重特異性抗体は、例えば、同一の免疫原の異なるエピトープを認識する重鎖を組み合わせることによって作製することができる。例えば、同一の免疫原の異なるエピトープを認識する重鎖可変配列をコードする核酸配列は、同一または異なる重鎖定常領域をコードする核酸配列と融合させることができ、かかる配列は、免疫グロブリン軽鎖を発現する細胞中に発現させることができる。典型的な二重特異性抗体は、３つの重鎖ＣＤＲ、及びそれに続く（Ｎ末端からＣ末端へ）ＣＨ１ドメイン、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを各々有する２つの重鎖と、エピトープ結合特異性を付与しないが、各重鎖に関連することができるか、または各重鎖に関連することができ、重鎖エピトープ結合領域によって結合されるエピトープのうちの１つ以上に結合することができるか、または各重鎖に関連することができ、重鎖のうちの一方または両方の一方または両方のエピトープへの結合を可能にする免疫グロブリン軽鎖とを有する。同様に、用語「三重特異性抗体」は、３つ以上のエピトープを選択的に結合することが可能な抗体を含む。
【００５７】
用語「細胞」は、組み換え核酸配列を発現するために好適な任意の細胞を含む。細胞としては、原核生物及び真核生物（単細胞または多細胞）の細胞、細菌細胞（例えば、大腸菌、バチルス属種、ストレプトマイセス属種の株など）、マイコバクテリウム細胞、真菌細胞、酵母細胞（例えば、出芽酵母、分裂酵母、Ｐ．パストリス、Ｐ．メタノリカなど）、植物細胞、昆虫細胞（例えば、ＳＦ−９、ＳＦ−２１、バキュロウイルス感染昆虫細胞、キンウワバなど）、非ヒト動物細胞、ヒト細胞、または、例えば、ハイブリドーマもしくはクアドローマなどの細胞融合が挙げられる。幾つかの実施形態では、細胞は、ヒト、サル、類人猿、ハムスター、ラット、またはマウス細胞である。幾つかの実施形態では、細胞は、真核性であり、以下の細胞から選択される：ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ  Ｋ１、ＤＸＢ−１１  ＣＨＯ、Ｖｅｇｇｉｅ−ＣＨＯ）、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ−７）、網膜細胞、Ｖｅｒｏ、ＣＶ１、腎臓（例えば、ＨＥＫ２９３、２９３ＥＢＮＡ、ＭＳＲ２９３、ＭＤＣＫ、ＨａＫ、ＢＨＫ）、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、ＷＩ３８、ＭＲＣ５、Ｃｏｌｏ２０５、ＨＢ８０６５、ＨＬ−６０、（例えば、ＢＨＫ２１）、Ｊｕｒｋａｔ、Ｄａｕｄｉ、Ａ４３１（表皮性）、ＣＶ−１、Ｕ９３７、３Ｔ３、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、ＳＰ２／０、ＮＳ−０、ＭＭＴ０６０５６２、Ｓｅｒｔｏｌｉ細胞、ＢＲＬ３Ａ細胞、ＨＴ１０８０細胞、骨髄腫細胞、腫瘍細胞、及び前述の細胞に由来する細胞株。幾つかの実施形態では、細胞は、例えば、ウイルス遺伝子を発現する網膜細胞（例えば、ＰＥＲ．Ｃ６（商標）細胞）など、１つ以上のウイルス遺伝子を含む。
【００５８】
語句「相補性決定領域」、または用語「ＣＤＲ」は、通常（即ち、野生型動物において）免疫グロブリン分子（例えば、抗体またはＴ細胞受容体）の軽鎖または重鎖の可変領域内の２つのフレームワーク領域間に出現する有機体の免疫グロブリン遺伝子の核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含む。ＣＤＲは、例えば、生殖系列配列、または再構成されたもしくは再構成されていない配列によって、また例えば、未感作もしくは成熟したＢ細胞もしくはＴ細胞によって、コードされることができる。ＣＤＲは、体細胞変異される（例えば、動物の生殖系列でコードされる配列と異なる）、ヒト化される、及び／またはアミノ酸置換、付加、もしくは欠失で修飾されることができる。ある環境では（例えば、ＣＤＲ３に関して）、ＣＤＲは、例えば、配列のスプライシングまたは接続（例えば、重鎖ＣＤＲ３を形成するようなＶ−Ｄ−Ｊ組み換え）の結果、連続していない（例えば、再構成されていない核酸配列内で）が、Ｂ細胞核酸配列内で連続している２つ以上の配列（例えば、生殖系列配列）によって、コードされることができる。
【００５９】
用語「保存」は、保存アミノ酸置換を説明するために使用されるとき、類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する側鎖Ｒ基を有する別のアミノ酸残基による、アミノ酸残基の置換を含む。概して、保存アミノ酸置換は、例えば、所望の親和性で標的エピトープに特異的に結合する可変領域の能力など、タンパク質の関心の機能性特性を実質的に変化させないであろう。類似の化学的特性を有する側鎖を有するアミノ酸の群の例としては、脂肪族側鎖、例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンなど、脂肪族ヒドロキシル側鎖、例えば、セリン及びトレオニンなど、アミド含有側鎖、例えば、アスパラギン及びグルタミンなど、芳香族側鎖、例えば、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンなど、塩基性側鎖、例えば、リジン、アルギニン、及びヒスチジンなど、酸性側鎖、例えば、アスパラギン酸及びグルタミン酸など、ならびに硫黄含有側鎖、例えば、システイン及びメチオニンなどが挙げられる。保存アミノ酸置換基としては、例えば、バリン／ロイシン／イソロイシン、フェニルアラニン／チロシン、リジン／アルギニン、アラニン／バリン、グルタメート／アスパルテート、及びアスパラギン／グルタミンが挙げられる。幾つかの実施形態では、保存アミノ酸置換は、例えば、アラニンスキャニング突然変異生成において使用される、タンパク質内の任意の天然の残基のアラニンでの置換であることができる。幾つかの実施形態では、参照により本明細書に援用されるＧｏｎｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｅｘｈａｕｓｔｉｖｅ  Ｍａｔｃｈｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｎｔｉｒｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１４４３−４５に開示される、ＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスにおいて正の値を有する保存置換が作製される。幾つかの実施形態では、置換は、置換が、ＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスにおいて非負の値を有する中程度の保存置換である。
【００６０】
幾つかの実施形態では、免疫グロブリン軽鎖または重鎖中の残基位置は、１つ以上の保存アミノ酸置換だけ異なる。幾つかの実施形態では、免疫グロブリン軽鎖またはその機能性断片（例えば、例えば、Ｂ細胞からの、発現及び分泌を可能にする断片）中の残基位置は、そのアミノ酸配列が本明細書に記載されているが１つ以上の保存アミノ酸置換だけ異なる軽鎖と、同一ではない。
【００６１】
語句「エピトープ結合タンパク質」は、少なくとも１つのＣＤＲを有し、エピトープを選択的に認識することが可能な、例えば、約１マイクロモル以下（例えば、約１×１０−６Ｍ、１×１０−７Ｍ、１×１０−９Ｍ、１×１０−９Ｍ、１×１０−１０Ｍ、１×１０−１１Ｍ、または約１×１０−１２ＭのＫＤ）のＫＤでエピトープに結合することが可能なタンパク質を含む。治療用エピトープ結合タンパク質（例えば、治療用抗体）は、ナノモルまたはピコモル範囲内のＫＤを要することが多い。
【００６２】
語句「機能性断片」は、発現され、分泌され、マイクロモル、ナノモル、またはピコモル範囲内のＫＤでエピトープに特異的に結合することができる、エピトープ結合タンパク質の断片を含む。特定の認識としては、少なくともマイクロモル範囲、ナノモル範囲、またはピコモル範囲内のＫＤを有することが挙げられる。
【００６３】
語句「重鎖」、または「免疫グロブリン重鎖」は、任意の有機体からの、免疫グロブリン重鎖定常領域配列を含む免疫グロブリン重鎖配列を含む。
【００６４】
語句「重鎖」、または「免疫グロブリン重鎖」は、任意の有機体からの、免疫グロブリン重鎖定常領域配列を含む、免疫グロブリン重鎖配列を含む。重鎖可変ドメインは、別段に特定されない限り、３つの重鎖ＣＤＲ及び４つのＦＲ領域を含む。重鎖の断片としては、ＣＤＲ、ＣＤＲ及びＦＲ、ならびにそれらの組み合わせが挙げられる。典型的な重鎖は、可変ドメイン（Ｎ末端からＣ末端へ）の次に、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを有する。重鎖の機能性断片は、エピトープを特異的に認識する（例えば、マイクロモル、ナノモル、またはピコモル範囲内のＫＤでエピトープを認識する）ことが可能であり、細胞から発現及び分泌することが可能であり、少なくとも１つのＣＤＲを含む、断片を含む。重鎖可変ドメインは、概して、生殖系列中に存在するＶＨ、ＤＨ、及びＪＨセグメントのレパートリーに由来するＶＨ、ＤＨ、及びＪＨセグメントを含む、可変領域遺伝子配列によってコードされる。種々の有機体に関するＶ、Ｄ、及びＪ重鎖セグメントに関する配列、場所、及び述語体系は、ＩＭＧＴデータベース、ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇに見出すことができる。
【００６５】
用語「同一性」は、配列と併せて使用されるとき、当該技術分野において既知である、ヌクレオチド及び／またはアミノ酸配列同一性を測定するために使用することができる異なるアルゴリズムの数によって決定される同一性を含む。本明細書に記載される幾つかの実施形態では、同一性は、１０．０の開放ギャップペナルティ（ｏｐｅｎ  ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ）、０．１の延長ギャップペナルティ（ｅｘｔｅｎｄ  ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ）を採用するＣｌｕｓｔａｌＷ  ｖ．１．８３（ｓｌｏｗ）整列を使用して、及びＧｏｎｎｅｔ類似度マトリックス（ＭＡＣベクター（商標）１０．０．２、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ  Ｉｎｃ．、２００８）を使用して決定される。配列の同一性に関して比較される配列の長さは、具体的な配列に依存することになるが、軽鎖定常ドメインの場合、長さは、標準的な軽鎖定常ドメインを形成するような自己会合が可能な、例えば、例えば、ベータストランドを含む２つのベータシートを形成することが可能であり、また少なくとも１つのヒトまたはマウスのＣＨ１ドメインと相互作用することが可能である、軽鎖定常ドメインへ折り畳むのに十分な長さの配列を含有するべきである。ＣＨ１ドメインの場合、配列の長さは、ベータストランドを含む２つのベータシートを形成することが可能であり、少なくとも１つのマウスまたはヒトの軽鎖定常ドメインと相互作用することが可能なＣＨ１ドメインへと折り畳むのに十分な長さの配列を含有するべきである。
【００６６】
語句「免疫グロブリン分子」は、２つの免疫グロブリン重鎖及び２つの免疫グロブリン軽鎖を含む。重鎖は、同一であっても異なっていてもよく、また軽鎖は、同一であっても異なっていてもよい。
【００６７】
語句「軽鎖」は、任意の有機体からの免疫グロブリン軽鎖配列を含み、また別段に特定されない限り、ヒトカッパ及びラムダ軽鎖ならびにＶｐｒｅＢ、ならびに代替軽鎖を含む。軽鎖可変ドメインは、別段に特定されない限り、典型的には３つの軽鎖ＣＤＲ及び４つのフレームワーク（ＦＲ）領域を含む。概して、全長軽鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へ、ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４を含む可変ドメイン、及び軽鎖定常領域を含む。軽鎖可変ドメインは、概して、生殖系列中に存在するＶ及びＪセグメントのレパートリーに由来するＶＬ及びＪＬセグメントを含む、軽鎖可変領域遺伝子配列によってコードされる。種々の有機体に関するＶ及びＪ軽鎖セグメントに関する配列、場所、及び述語体系は、ＩＭＧＴデータベース、ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇに見出すことができる。軽鎖としては、例えば、その中にそれらが出現するエピトープ結合タンパク質によって選択的に結合される第１かまたは第２かのいずれかのエピトープを、選択的に結合しないものが挙げられる。軽鎖としてはまた、その中にそれらが出現するエピトープ結合タンパク質によって選択的に結合される１つ以上のエピトープに結合及び認識するか、または重鎖がそれらに結合及び認識するのを助けるものが挙げられる。共通のまたはユニバーサルな軽鎖としては、ヒトＶκ１−３９Ｊκ５遺伝子またはヒトＶκ３−２０Ｊκ１遺伝子に由来するものが挙げられ、またそれらの体細胞変異された（例えば、親和性成熟された）バージョンが挙げられる。二重軽鎖（ＤＬＣ）としては、２つ以下のヒトＶκセグメント、例えば、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメント及びヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントを含む軽鎖遺伝子座に由来するものが挙げられ、またそれらの体細胞変異された（例えば、親和性成熟された）バージョンが挙げられる。
【００６８】
語句「体細胞超変異された」は、クラススイッチされたＢ細胞中の免疫グロブリン可変領域の核酸配列（例えば、重鎖可変ドメインをコードするか、または重鎖ＣＤＲまたはＦＲ配列を含むヌクレオチド配列）が、例えば、クラススイッチを受けたＢ細胞とクラススイッチを受けていないＢ細胞との間でのＣＤＲまたはフレームワーク核酸配列の差異など、クラススイッチ以前のＢ細胞中の核酸配列と同一ではない、クラススイッチを受けたＢ細胞からの核酸配列への言及を含む。「体細胞変異された」は、親和性成熟されていないＢ細胞中の対応する免疫グロブリン可変領域配列（即ち、生殖系列細胞のゲノム中の配列）と同一ではない親和性成熟されたＢ細胞からの核酸配列への言及を含む。語句「体細胞変異された」はまた、核酸配列が、関心のエピトープへのＢ細胞の曝露以前の対応する核酸配列と異なる、関心のエピトープへのＢ細胞の曝露後のＢ細胞からの免疫グロブリン可変領域核酸配列への言及も含む。語句「体細胞変異された」は、免疫原攻撃に応答して、例えば、ヒト免疫グロブリン可変領域核酸配列を有するマウスなどの動物において生成され、またかかる動物において本来作動する選択プロセスから得られる抗体からの配列を指す。
【００６９】
用語、核酸配列に関して「再構成されていない」は、動物細胞の生殖系列中に存在する核酸配列を含む。
【００７０】
語句「可変ドメイン」は、配列内に（別段に指示のない限り）Ｎ末端からＣ末端へ以下のアミノ酸領域を含む、（所望により修飾された）免疫グロブリン軽鎖または重鎖のアミノ酸配列を含む：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。
【００７１】
用語「作動可能に連結される」は、作動可能に連結される成分がその意図される様式で機能する関係性を指す。一例では、タンパク質をコードする核酸配列は、適切な転写調節を保持するように、調節配列（例えば、プロモータ、エンハンサー、サイレンサー配列など）に作動可能に連結されてもよい。一例では、免疫グロブリン可変領域（またはＶ（Ｄ）Ｊセグメント）の核酸配列は、免疫グロブリン重鎖または軽鎖配列への配列間の適切な組み換えを可能にするように、免疫グロブリン定常領域の核酸配列に作動可能に連結されてもよい。
【００７２】
「機能性」は、例えば、機能性ポリペプチドに関して、本明細書で使用されるとき、通常は天然タンパク質に関連付けられる少なくとも１つの生物学的活性を保持するポリペプチドを含む。別の例では、機能性免疫グロブリン遺伝子セグメントは、再構成された免疫グロブリン遺伝子配列を生成するような生産的な再構成が可能な可変遺伝子セグメントを含んでもよい。
【００７３】
「中性ｐＨ」は、約７．０〜約８．０の間のｐＨ、例えば、約７．０〜約７．４の間のｐＨ、例えば、約７．２〜約７．４の間、例えば、生理的ｐＨを含む。「酸性ｐＨ」は、６．０以下のｐＨ、例えば、約５．０〜約６．０の間のｐＨ、約５．７５〜約６．０の間のｐＨ、例えば、エンドソームまたはリソソーム区画のｐＨを含む。
【００７４】
用語「多型変異体」は、本明細書で使用されるとき、１つ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸が、与えられた配列と比較して異なるヌクレオチドまたはアミノ酸によって置換されている配列を含む。ヒト免疫グロブリン重鎖可変遺伝子セグメント（ＶＨ遺伝子）の多型対立遺伝子は、主に遺伝子セグメントの挿入／欠失、及びコード領域内での単一のヌクレオチドの差異の結果であり、そのどちらも、免疫グロブリン分子における機能的な帰結を有する可能性を有する。一般的なヒト免疫グロブリンＶＨ遺伝子の多型対立遺伝子の例は、当該技術分野において周知である（例えば、参照によりその全体が本明細書に援用される、ＵＳ第１３／６５３，４５６号を参照）。
【００７５】
用語「実質的」または「実質的に全て」は、遺伝子セグメントの量に関して使用されるとき（例えば、「実質的に全て」のＶ、Ｄ、またはＪ遺伝子セグメント）は、機能性及び非機能性遺伝子セグメントの両方を含み、また種々の実施形態では、例えば、全てのＶ、Ｄ、またはＪ遺伝子セグメントの８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上を含む。種々の実施形態では、「実質的に全ての」遺伝子セグメントは、機能性（即ち、非偽遺伝子）遺伝子セグメントの、例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含む。
【００７６】
再構成された重鎖可変領域遺伝子配列、及び任意追加的に、再構成されていない軽鎖可変遺伝子セグメントの限定されたレパートリーを含む非ヒト動物
二重の抗原結合特性を有する多様な二重特異性抗体が開発されてきたが、従来の二重特異性抗体では、重鎖かまたは軽鎖かのいずれかの可変領域のみが各別々の抗原決定基の結合に寄与しているのに対し、標準的な抗体では、軽鎖と重鎖との両方の可変領域が同一の抗原決定基の結合に寄与することができるため、従来の二重特異性抗体における軽鎖または重鎖可変領域の特異性及び親和性は、ある程度犠牲にされなければならなかった。
【００７７】
したがって、重鎖可変領域から独立して抗原に結合する能力を有する軽鎖可変領域の生成は、抗原結合分子（例えば、ＶＬと融合される（例えば、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、及びそれらの組み合わせから選択される）重鎖定常領域を含む二重特異性結合分子）、特に、同一または類似の重鎖定常領域を有するが、異なる特異性及び／または親和性を伴うＶＬを有するヘテロ二量体を含む、重鎖可変ドメインを含まないものにおける使用のための軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を作製するのに有用であることができる。
【００７８】
重鎖可変領域から独立して抗原に結合することができるかかる軽鎖可変ドメインを産生するための１つのアプローチは、軽鎖（ＶＬ）の可変領域またはドメインをコードするヌクレオチド配列に選択的圧力を印加して、より多様な抗原結合レパートリーを有する軽鎖ＣＤＲ３を生成することである。本明細書に開示されるように、これは、そのゲノム中に再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を含有する遺伝子的に修飾された非ヒト動物を生成することによって達成することができる。重鎖配列は、これらの動物において共通のまたはユニバーサルな（即ち、同一または極めて類似の）配列に制限されるため、軽鎖可変領域ヌクレオチド配列（即ち、遺伝子）は、重鎖可変領域から独立して抗原決定基に結合することができる、より多様で効率的な抗原結合特性を有する軽鎖ＣＤＲ３を作製せざるを得ないであろう。さらに、本明細書に開示されるように、生殖系列可変領域遺伝子セグメントの正確な置き換えは、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を部分的に有する動物（例えば、マウス）を（例えば、相同的組み換え媒介遺伝子の標的化によって）作製することを可能にする。何故なら、部分的なヒト免疫グロブリン遺伝子座は、正常に再構成、超変異、及び体細胞変異（例えば、クラススイッチ）するため、部分的なヒト免疫グロブリン遺伝子座は、ヒト可変領域を含む動物において抗体を生成する。これらの動物は、野生型動物に実質的に類似の体液性免疫系を示し、−動物が、ヒト可変領域遺伝子セグメントの完全なレパートリーを欠損している場合であっても−正常な細胞集団及び正常なリンパ器官構造を見せる。これらの動物（例えば、マウス）を免疫付与することは、可変遺伝子セグメント利用の幅広い多様性を見せる強固な体液性応答をもたらす。可変領域をコードするヌクレオチド配列は、特定及びクローン化され、次に、例えば、特定の使用に好適な任意の免疫グロブリンアイソタイプなどの任意の選択された配列と（例えば、インビトロシステムにおいて）融合されることができ、ヒト配列に完全に由来する抗体または抗原結合タンパク質をもたらすことができる。
【００７９】
それに加えて、制限された（限定された）軽鎖可変領域遺伝子セグメントレパートリー、例えば、１つ以上であるが野生型より少ない数のヒトＶＬ遺伝子セグメントを含む制限された軽鎖可変セグメントレパートリー（例えば、二重軽鎖または「ＤＬＣ」、米国特許出願公開第２０１３／０１９８８８０号、その全体は本明細書に援用される）を有する動物（例えば、マウスまたはラット）を、上述の再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列と組み合わせて利用することによって、免疫グロブリン重鎖可変ドメインとより効率的に対を成すことができる免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを産生することができる。さらに、ヒスチジンコドンを、例えば、１つ以上のヒスチジンコドンの付加またはヒスチジンコドンでの１つ以上の非ヒスチジンコドの置換を介して、上述の非ヒト動物のゲノム中の限定された軽鎖可変遺伝子セグメントへ導入することによって、改善されたｐＨ依存性リサイクル可能性を抗原結合タンパク質（例えば、二重特異性または三重特異性抗体）に付与することができる軽鎖可変領域アミノ酸配列を生成することができる。
【００８０】
幾つかの実施形態では、本明細書に記載される遺伝子的に修飾された非ヒト動物は、同時に多様性を限定しながら抗体のより大きい収率を提供し、それによって、単一の再構成された軽鎖可変領域を含む非ヒト動物（例えば、ユニバーサル軽鎖（「ＵＬＣ」）マウス、例えば、参照により本明細書に援用される米国付与前公開（Ｕ．Ｓ．ｐｒｅ−ｇｒａｎｔ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ）第２０１３／０１８５８２１号を参照）において生成された重鎖との、軽鎖の成功した対形成の可能性を増加させる。幾つかの実施形態では、軽鎖は、それ自体で抗原結合特性を示すことができる。幾つかの実施形態では、非ヒト動物は、その軽鎖内に存在する抗原特異性を示す抗原結合タンパク質を産生するように誘発されることができる（例えば、マウスまたはラットの重鎖遺伝子座を、単一の再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む遺伝子座で置き換えることによってなど、例えば、マウスまたはラットの免疫グロブリン重鎖レパートリーを限定することによって）。幾つかの実施形態では、かかる動物において産生される抗原結合タンパク質（例えば、抗体）は、その軽鎖結合を通して、特定の第１のエピトープ（例えば、エフェクター抗原、細胞毒性分子、Ｆｃ受容体、毒素、活性化または抑制性受容体、Ｔ細胞マーカー、免疫グロブリン輸送体など）に特異的であろう。これらの非ヒト動物に由来するかかるエピトープ特異的ヒト軽鎖は、例えば、ＵＬＣマウスまたはラットなどの限定された軽鎖レパートリーを有するマウスに由来するヒト重鎖と共発現されてもよく、重鎖は、第２のエピトープ（例えば、異なる抗原上の第２のエピトープ）に結合するその能力に基づいて選択される。
【００８１】
種々の態様では、その生殖系列ゲノム中に、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列（即ち、再構成された重鎖ＶＤＪ配列）を含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む、非ヒト動物が、提供される。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒトまたは非ヒト重鎖定常領域配列に作動可能に連結される。幾つかの実施形態では、再構成された重鎖可変領域ヌクレオチド配列によってコードされる免疫グロブリン重鎖可変ドメインは、非ヒト動物に対して免疫原性ではない。幾つかの実施形態では、非ヒト動物は、重鎖定常ドメインに作動可能に連結される再構成された重鎖可変ドメインの２つのコピー、３つのコピー、４つのコピー、またはそれ以上をコードするヌクレオチド配列を含むように、修飾される。幾つかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列の複数のコピーをコードする。例えば、ヌクレオチド配列は、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つのコピーをコードすることができる。幾つかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列の１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のコピーをコードする。幾つかの実施形態では、遺伝子座は、重鎖定常ドメイン遺伝子配列に作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列の複数のコピーを含む。
【００８２】
他の態様では、ヒトまたは非ヒト軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される再構成された重鎖可変ドメインをコードする免疫グロブリン軽鎖遺伝子座（即ち、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む軽鎖遺伝子座）を含有するように遺伝子的に改変された、非ヒト動物が提供される。例えば、幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列（即ち、予め設計されたＶＤＪ領域、即ち、共通またはユニバーサルな重鎖配列）は、再構成された重鎖配列を、カッパかまたはラムダかのいずれかの、マウスまたはラット軽鎖遺伝子座中へ標的化することによって、軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結されることができる。したがって、幾つかの実施形態では、再構成された重鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列は、非ヒト動物の生殖系列ゲノム中に存在する。幾つかの実施形態では、遺伝子的に修飾された非ヒト動物によって発現される再構成された重鎖可変ドメインは、非ヒト動物に対して免疫原性ではない。幾つかの実施形態では、非ヒト動物は、軽鎖定常ドメインに作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列の２つのコピー、３つのコピー、４つのコピー、またはそれ以上をコードするヌクレオチド配列を含むように、修飾される。幾つかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列の複数のコピーをコードすることができる。例えば、ヌクレオチド配列は、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のコピーをコードする。幾つかの実施形態では、遺伝子座は、軽鎖定常ドメイン遺伝子配列に作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列の複数のコピーを含む。
【００８３】
種々の態様では、本明細書に記載される非ヒト動物の免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、非ヒト軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される、軽鎖可変遺伝子セグメントの限定されたレパートリー、例えば、１つ以上であるが野生型より少ない数のヒトＶＬ遺伝子セグメントと、１つ以上のヒトＪＬ遺伝子セグメントとを含む。したがって、そのゲノム中に、（ｉ）ヒトまたは非ヒト重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されたヒト重鎖可変領域核酸配列を含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座と、（ｉｉ）軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される２つ以上であるが野生型より少ない数のヒト免疫グロブリン軽鎖可変ＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン軽鎖遺伝子座と、を含む、遺伝子的に修飾された非ヒト動物が提供される。幾つかの実施形態では、軽鎖定常領域は、ラットまたはマウス定常領域、例えば、ラットまたはマウスＣκ定常領域である。幾つかの実施形態では、ヒト可変領域遺伝子セグメントは、抗体のヒト可変ドメインを再構成及びコードすることが可能であり、非ヒト動物は、内在性ＶＬ遺伝子セグメントを含まない。幾つかの実施形態では、非ヒト動物は、５つのヒトＪκ遺伝子セグメント、例えば、Ｊκ１、Ｊκ２、Ｊκ３、Ｊκ４、及びＪκ５遺伝子セグメントを含む。幾つかの実施形態では、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、２つのヒトＶＬ遺伝子セグメント、Ｖκ１−３９及びＶκ３−２０を含む。幾つかの実施形態では、１つ以上（例えば、２、３、４、または５つ）のヒトＶＬ遺伝子セグメント及び２つ以上のヒトＪＬ遺伝子セグメントは、内在性軽鎖遺伝子座に、例えば、内在性カッパ軽鎖遺伝子座に存在する。幾つかの実施形態では、マウスは、機能性λ軽鎖遺伝子座を含む。幾つかの実施形態では、マウスは、非機能性λ軽鎖遺伝子座を含む。幾つかの実施形態では、１つ以上のヒトＶＨ、１つ以上のヒトＤＨ、及び１つ以上のヒトＪＨ遺伝子セグメントは、マウスまたはラット重鎖定常領域配列に作動可能に連結される。
【００８４】
幾つかの実施形態では、そのゲノム中に（ｉ）ヒトまたは非ヒト重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されたヒト重鎖可変領域核酸配列を含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座と、（ｉｉ）軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される２つ以上であるが野生型より少ない数のヒト免疫グロブリン軽鎖可変ＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン軽鎖遺伝子座と、を含む遺伝子的に修飾されたマウスは、野生型マウス、またはその免疫グロブリン遺伝子座の他の修飾を含有するマウス（即ち、遺伝子的に修飾された対照マウス、例えば、マウスの体液性免疫系が野生型マウスのものと同様に機能する、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウス）において観察される数と、実質的に同一のＣＤ１９＋Ｂ細胞数及び成熟Ｂ細胞数を示す。幾つかの実施形態では、かかるマウスは、遺伝子的に修飾された対照マウスと比較して、脾臓中の未熟Ｂ細胞数の増加を示す。特定の実施形態では、かかるマウスは、遺伝子的に修飾された対照マウスと比較して、脾臓中の未熟Ｂ細胞数の約２倍、約３倍、約４倍、または約５倍以上の増加を示す。幾つかの実施形態では、かかるマウスはまた、脾臓Ｂ細胞中でのカッパ及びガンマ軽鎖利用に関して、野生型マウスまたは遺伝子的に修飾された対照マウスに実質的に類似する。幾つかの実施形態では、かかるマウスは、遺伝子的に修飾された対照マウスと比較して、脾臓Ｂ細胞における増加された表面ＩｇＭ（即ち、１細胞当たりのより多いＩｇＭ表面発現）を示す。幾つかの実施形態では、かかるマウスは、遺伝子的に修飾された対照マウスと比較して、脾臓区画内のＢ細胞発生の種々の段階を通して、例えば、未熟、Ｔ１、及び／または辺縁帯Ｂ細胞の増加などの、変更された末梢Ｂ細胞発生を示す。幾つかの実施形態では、かかるマウスは、遺伝子的に修飾された対照マウスにおいて示される数に実質的に類似の骨髄区画内のＣＤ１９＋Ｂ細胞の数を示す。幾つかの実施形態では、かかるマウスは、遺伝子的に修飾された対照マウスと比較して、より少ない骨髄中のプロＢ細胞を示す。特定の実施形態では、骨髄区画内のプロＢ細胞の数は、遺伝子的に修飾された対照マウスと比較して、約２倍、約５倍、約１０倍、約１５倍、約２０倍、約２５倍、またはそれ以上低減される。幾つかの実施形態では、かかるマウスは、遺伝子的に修飾された対照マウスと比較して、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍などのより少ない骨髄中の未熟及び／または成熟Ｂ細胞を示す。幾つかの実施形態では、かかるマウスは、遺伝子的に修飾された対照マウスと比較して、ラムダ軽鎖遺伝子の利用に関して、骨髄区画内の僅かな偏向（例えば、２倍の増加）を示す。
【００８５】
別の態様では、（ａ）再構成された重鎖可変ドメインをコードする第１のヌクレオチド配列（即ち、第１のヌクレオチド配列は、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列である）であって、第１のヌクレオチド配列は、軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、第１のヌクレオチド配列と、（ｂ）ヒト軽鎖可変ドメインをコードする第２のヌクレオチド配列（即ち、第２のヌクレオチド配列は、再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列である）であって、第２のヌクレオチド配列は、重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、第２のヌクレオチド配列と、を含む、遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座を含む、非ヒト動物が提供される。例えば、幾つかの実施形態では、予め設計されたＶＤＪ領域からの再構成された重鎖（即ち、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列、即ち、共通またはユニバーサルな重鎖配列）は、再構成された重鎖配列を、カッパかまたはラムダかのいずれかの、マウス軽鎖遺伝子座中へ標的化することによって、軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結されることができる。したがって、他の実施形態でのように、この遺伝子的に改変された免疫グロブリン遺伝子座は、非ヒト動物の生殖系列ゲノム中に存在する。重鎖定常領域遺伝子配列との作動可能な連結においてヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む遺伝子的に修飾された非ヒト動物は、参照により本明細書に援用される米国付与前公開第２０１２／００９６５７２号に記載される。幾つかの実施形態では、再構成された重鎖可変ドメインをコードする第１のヌクレオチド配列は、κ軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される。幾つかの実施形態では、再構成された重鎖可変ドメインをコードする第１のヌクレオチド配列は、マウスまたはラットκ軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される。幾つかの実施形態では、再構成された重鎖可変ドメインをコードする第１のヌクレオチド配列は、ヒトκ軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される。幾つかの実施形態では、再構成された重鎖可変ドメインをコードする第１のヌクレオチド配列は、λ軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される。幾つかの実施形態では、再構成された重鎖可変ドメインをコードする第１のヌクレオチド配列は、マウスまたはラットλ軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される。幾つかの実施形態では、再構成された重鎖可変ドメインをコードする第１のヌクレオチド配列は、ヒトλ軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される。
【００８６】
幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を含有する免疫グロブリン軽鎖遺伝子座と、再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン配列（例えば、カッパ軽鎖遺伝子）を含有する免疫グロブリン重鎖遺伝子座とを含む遺伝子的に修飾されたマウスは、野生型マウス、または免疫グロブリン遺伝子座に他の修飾を有する遺伝子的に修飾されたマウス（即ち、遺伝子的に修飾された対照マウス、例えば、マウスの体液性免疫系が野生型マウスのものと同様に機能する、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウス）と比較して、変更された骨髄中のＣＤ１９＋及びプレＢ細胞頻度を提示する。特定の実施形態では、骨髄中のＣＤ１９＋Ｂ細胞及びプレＢ細胞数は、野生型マウスまたは遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座対照マウスと比較して、２倍低い、３倍低い、４倍低い、または５倍低い。特定の実施形態では、骨髄中の未熟Ｂ細胞の数は、野生型マウスまたは遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座対照マウスと比較して、２倍少ない、３倍少ない、４倍少ない、または５倍少ない。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を含有する免疫グロブリン軽鎖遺伝子座と、再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン配列（例えば、カッパ軽鎖遺伝子）を含有する免疫グロブリン重鎖遺伝子座とを含む遺伝子的に修飾されたマウスは、骨髄細胞中にラムダ軽鎖遺伝子を発現しないか、または本質的に発現しない。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を含有する免疫グロブリン軽鎖遺伝子座と、再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン配列（例えば、カッパ軽鎖遺伝子）を含有する免疫グロブリン重鎖遺伝子座とを含む遺伝子的に修飾されたマウスは、野生型マウスまたは遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座対照マウスと比較して、低減されたレベルの脾臓Ｂ細胞を有する。特定の実施形態では、脾臓Ｂ細胞及び成熟Ｂ細胞のレベルは、野生型マウスまたは遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座対照マウスと比較して、２倍少ない、３倍少ない、４倍少ない、または５倍少ない。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を含有する免疫グロブリン軽鎖遺伝子座と、再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン配列（例えば、カッパ軽鎖遺伝子）を含有する免疫グロブリン重鎖遺伝子座とを含む遺伝子的に修飾されたマウスは、脾臓Ｂ細胞中にラムダ軽鎖遺伝子を発現しないか、または本質的に発現しない。特定の実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を含有する免疫グロブリン軽鎖遺伝子座と、再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン配列（例えば、カッパ軽鎖遺伝子）を含有する免疫グロブリン重鎖遺伝子座とを含む遺伝子的に修飾されたマウスは、野生型マウスまたは遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座対照マウスと比較して、脾臓中のＴ１相における増加された細胞の頻度を有する。
【００８７】
幾つかの実施形態では、非ヒト動物は、哺乳動物である。本明細書では、マウスにおける再構成されたヒト重鎖可変ドメイン（即ち、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む免疫グロブリン遺伝子座を有するマウス）を採用する実施形態が、広範囲に述べられているが、再構成されたヒト重鎖可変ドメインをコードする遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座を含む他の非ヒト動物も、提供される。かかる非ヒト動物としては、本明細書に開示される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を発現するように遺伝子的に修飾されることができるもののいずれかが挙げられ、例えば、哺乳動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ウシ属（例えば、雌牛、雄牛、水牛）、シカ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ネコ、イヌ、フェレット、霊長類（例えば、マーモセット、アカゲザル）などが挙げられる。例えば、好適な遺伝子的に修飾可能なＥＳ細胞が容易に利用可能ではないこれらの非ヒト動物に関しては、遺伝子修飾を含む非ヒト動物を作製するために、他の方法が採用される。かかる方法としては、例えば、非ＥＳ細胞ゲノム（例えば、線維芽細胞または誘導多能性細胞）を修飾すること、及び体細胞核移植（ＳＣＮＴ）を採用して、遺伝子的に修飾されたゲノムを好適な細胞、例えば、除核卵母細胞へ移植し、胚を形成するのに好適な条件下で、修飾された細胞（例えば、修飾された卵母細胞）を非ヒト動物内で温めることが挙げられる。非ヒト動物ゲノム（例えば、ブタ、雌牛、齧歯動物、ニワトリなどのゲノム）を修飾するための方法としては、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）または転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を採用して、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を含むようにゲノムを修飾することが挙げられる。
【００８８】
幾つかの実施形態では、非ヒト動物は、小型の哺乳動物、例えば、トビネズミまたはネズミ上科のものである。幾つかの実施形態では、遺伝子的に修飾された動物は、齧歯動物である。幾つかの実施形態では、齧歯動物は、マウス、ラット、及びハムスターから選択される。幾つかの実施形態では、齧歯動物は、ネズミ上科から選択される。幾つかの実施形態では、遺伝子的に修飾された動物は、カンガルーハムスター科（例えば、マウス様ハムスター）、キヌゲネズミ科（例えば、ハムスター、新世界ラット及びマウス、ハタネズミ）、ネズミ科（トゥルーマウス及びラット（ｔｒｕｅ  ｍｉｃｅ  ａｎｄ  ｒａｔ）、アレチネズミ、トゲネズミ、タテガミネズミ（ｃｒｅｓｔｅｄ  ｒａｔ））、アシナガマウス科（キノボリマウス（ｃｌｉｍｂｉｎｇ  ｍｉｃｅ）、イワマウス（ｒｏｃｋ  ｍｉｃｅ）、ウィズテールドラット（ｗｉｔｈ−ｔａｉｌｅｄ  ｒａｔ）、マダガスカルラット及びマウス）、トゲヤマネ科（例えば、トゲヤマネ）、及びメクラネズミ科（例えば、モールレート、タケネズミ、及びモグラネズミ）から選択される科に由来する。特定の実施形態では、遺伝子的に修飾された齧歯動物は、トゥルーマウスまたはラット（ネズミ科）、アレチネズミ、トゲネズミ、及びタテガミネズミから選択される。幾つかの実施形態では、遺伝子的に修飾されたマウスは、ネズミ科のメンバーに由来する。幾つかの実施形態では、動物は、齧歯動物である。特定の実施形態では、齧歯動物は、マウス及びラットから選択される。幾つかの実施形態では、非ヒト動物は、マウスである。
【００８９】
幾つかの実施形態では、非ヒト動物は、Ｃ５７ＢＬ／Ａ、Ｃ５７ＢＬ／Ａｎ、Ｃ５７ＢＬ／ＧｒＦａ、Ｃ５７ＢＬ／ＫａＬｗＮ、Ｃ５７ＢＬ／６、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／６ＢｙＪ、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ、Ｃ５７ＢＬ／１０、Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ、Ｃ５７ＢＬ／１０Ｃｒ、及びＣ５７ＢＬ／Ｏｌａから選択されるＣ５７ＢＬ系のマウスである齧歯動物である。別の実施形態では、マウスは、１２９系である。幾つかの実施形態では、１２９系は、１２９Ｐ１、１２９Ｐ２、１２９Ｐ３、１２９Ｘ１、１２９Ｓ１（例えば、１２９Ｓ１／ＳＶ、１２９Ｓ１／ＳｖＩｍ）、１２９Ｓ２、１２９Ｓ４、１２９Ｓ５、１２９Ｓ９／ＳｖＥｖＨ、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）、１２９Ｓ７、１２９Ｓ８、１２９Ｔ１、１２９Ｔ２（例えば、Ｆｅｓｔｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｒｅｖｉｓｅｄ  ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ｆｏｒ  ｓｔｒａｉｎ  １２９  ｍｉｃｅ，Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  １０：８３６を参照、同様にＡｕｅｒｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｃｈｉｍｅｒａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  １２９／ＳｖＥｖ−  ａｎｄ  Ｃ５７ＢＬ／６−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓも参照）から成る群から選択される。幾つかの実施形態では、遺伝子的に修飾されたマウスは、前述の１２９系と前述のＣ５７ＢＬ系（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６系）との混合である。別の実施形態では、マウスは、前述の１２９系の混合、または前述のＣ５７ＢＬ／６系の混合である。幾つかの実施形態では、混合の１２９系は、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）系である。別の実施形態では、マウスは、１２９／ＳｖＥｖ由来系とＣ５７ＢＬ／６由来系との混合である。特定の実施形態では、マウスは、Ａｕｅｒｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．２０００  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２９：１０２４−１０３２に記載されるように、１２９／ＳｖＥｖ由来系とＣ５７ＢＬ／６由来系との混合である。別の実施形態では、マウスは、ＢＡＬＢ系、例えば、ＢＡＬＢ／ｃ系である。別の実施形態では、マウスは、ＢＡＬＢ系（例えば、ＢＡＬＢ／ｃ系）と前述の別の系との混合である。
【００９０】
幾つかの実施形態では、非ヒト動物は、ラットである。幾つかの実施形態では、ラットは、Ｗｉｓｔａｒラット、ＬＥＡ系、Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ系、Ｆｉｓｃｈｅｒ系、Ｆ３４４、Ｆ６、ＡＣＩ、及びＤａｒｋ  Ａｇｏｕｔｉ（ＤＡ）から選択される。幾つかの実施形態では、ラット系は、Ｗｉｓｔａｒ、ＬＥＡ、Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ、Ｆｉｓｃｈｅｒ、Ｆ３４４、Ｆ６、ＡＣＩ、及びＤａｒｋ  Ａｇｏｕｔｉ（ＤＡ）から成る群から選択される系のうちの２つ以上の混合である。
【００９１】
幾つかの実施形態では、その生殖系列ゲノム中に再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む、遺伝子的に修飾されたマウスは、野生型マウスと比較して本質的に正常な脾臓成熟及び未熟Ｂ細胞集団を生成する。幾つかの実施形態では、かかる遺伝子的に修飾されたマウスは、脾臓Ｂ細胞中で、野生型と比較して僅かな軽鎖ラムダ遺伝子配列の利用の減少を有する。特定の実施形態では、かかる遺伝子的に修飾されたマウスは、脾臓Ｂ細胞中で、野生型より２倍、３倍、４倍、または５倍低い頻度で軽鎖ラムダ遺伝子配列を使用する。幾つかの実施形態では、かかる遺伝子的に修飾されたマウスは、野生型と比較して、Ｔ１集団脾臓Ｂ細胞の僅かな減少及び辺縁帯脾臓Ｂ細胞の増加を有する。幾つかの実施形態では、かかる遺伝子的に修飾されたマウスは、骨髄中に正常に近いＢ細胞集団を有する。幾つかの実施形態では、かかる遺伝子的に修飾されたマウスは、野生型においてラムダ遺伝子配列が使用される頻度の半分または半分未満の頻度でラムダ遺伝子配列を使用する。
【００９２】
種々の実施形態では、本明細書に記載されるように、再構成された重鎖可変ドメイン（例えば、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列）は、ヒトＶ、Ｄ、及びＪ遺伝子配列またはセグメントに由来する。幾つかの実施形態では、再構成された重鎖可変ドメインは、ヒト生殖系列Ｖセグメント、ヒト生殖系列Ｄセグメント、及びヒト生殖系列Ｊセグメントに由来する。幾つかの実施形態では、ヒトＶＨセグメントは、ヒト集団において観察される変異体に対応する。
【００９３】
種々の実施形態では、本明細書に記載されるように、ヒトＶ遺伝子セグメントは、ＶＨ１−２、ＶＨ１−３、ＶＨ１−８、ＶＨ１−１８、ＶＨ１−２４、ＶＨ１−４５、ＶＨ１−４６、ＶＨ１−５８、ＶＨ１−６９、ＶＨ２−５、ＶＨ２−２６、ＶＨ２−７０、ＶＨ３−７、ＶＨ３−９、ＶＨ３−１１、ＶＨ３−１３、ＶＨ３−１５、ＶＨ３−１６、ＶＨ３−２０、ＶＨ３−２１、ＶＨ３−２３、ＶＨ３−３０、ＶＨ３−３０−３、ＶＨ３−３０−５、ＶＨ３−３３、ＶＨ３−３５、ＶＨ３−３８、ＶＨ３−４３、ＶＨ３−４８、ＶＨ３−４９、ＶＨ３−５３、ＶＨ３−６４、ＶＨ３−６６、ＶＨ３−７２、ＶＨ３−７３、ＶＨ３−７４、ＶＨ４−４、ＶＨ４−２８、ＶＨ４−３０−１、ＶＨ４−３０−２、ＶＨ４−３０−４、ＶＨ４−３１、ＶＨ４−３４、ＶＨ４−３９、ＶＨ４−５９、ＶＨ４−６１、ＶＨ５−５１、ＶＨ６−１、ＶＨ７−４−１、ＶＨ７−８１、及びそれらの多型変異体から成る群から選択される。幾つかの実施形態では、ヒトＶセグメントは、ＶＨ３−２３またはその多型変異体である。種々の実施形態では、本明細書に記載されるように、ヒトＤ遺伝子セグメントは、Ｄ１−１、Ｄ１−７、Ｄ１−１４、Ｄ１−２０、Ｄ１−２６、Ｄ２−２、Ｄ２−８、Ｄ２−１５、Ｄ２−２１、Ｄ３−３、Ｄ３−９、Ｄ３−１０、Ｄ３−１６、Ｄ３−２２、Ｄ４−４、Ｄ４−１１、Ｄ４−１７、Ｄ４−２３、Ｄ５−１２、Ｄ５−５、Ｄ５−１８、Ｄ５−２４、Ｄ６−６、Ｄ６−１３、Ｄ６−１９、Ｄ６−２５、Ｄ７−２７、及びそれらの多型変異体から成る群から選択される。幾つかの実施形態では、ヒトまたは非ヒト動物重鎖定常領域配列は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、及びそれらの組み合わせから選択される配列を含む。特定の実施形態では、定常領域配列は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３を含む。種々の実施形態では、本明細書に記載されるように、ヒトＪ遺伝子セグメントは、ＪＨ１、ＪＨ２、ＪＨ３、ＪＨ４、ＪＨ５、ＪＨ６、及びそれらの多型変異体から成る群から選択される。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒトＶＨ３−２３／ＧＹ／ＪＨ４−４の配列をコードする（配列番号１３７）。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列によってコードされ、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列から発現される再構成された重鎖可変ドメインは、ヒトＶＨ３−２３／Ｘ１Ｘ２／Ｊの配列を含む（Ｘ１は、任意のアミノ酸であり、Ｘ２は、任意のアミノ酸である）。幾つかの実施形態では、Ｘ１は、Ｇｌｙであり、Ｘ２は、Ｔｙｒである。幾つかの実施形態では、再構成された重鎖可変ドメインは、ヒトＶＨ３−２３／Ｘ１Ｘ２／ＪＨ４−４の配列を含む（Ｘ１は、任意のアミノ酸であり、Ｘ２は、任意のアミノ酸である）。幾つかの実施形態では、Ｘ２は、フェニル基を含むアミノ酸である。特定の実施形態では、Ｘ２は、Ｔｙｒ及びＰｈｅから選択される。
【００９４】
幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、動物において自己反応性でない（非免疫原性）ヒトＤセグメントを含む。幾つかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、マウスの成熟Ｂ細胞の重鎖可変配列中に発現されることが可能なヒトＤセグメントを含む。幾つかの実施形態では、Ｄセグメントは、ヒトＶＨ、ヒトＤ、及びヒトＪＨセグメントを含むヒト化された免疫グロブリン遺伝子座を含むマウスにおいて発現されたセグメントである。
【００９５】
種々の実施形態は、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウスに由来する特徴または配列情報を利用または包括する。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウスは、内在性遺伝子座における、マウス免疫グロブリン重鎖（ＩｇＨ）及び免疫グロブリン軽鎖（例えば、κ軽鎖、Ｉｇκ）の生殖系列可変領域の、対応するヒト免疫グロブリン可変領域での正確で大規模な置き換えを含有する（例えば、その全内容が参照により本明細書に援用される米国６，５９６，５４１号及び米国８，５０２，０１８号を参照）。総じて、約６のマウス遺伝子座のメガ塩基対が、約１．５のヒトゲノム配列のメガ塩基対で置き換えられる。この正確な置き換えは、ヒト可変領域及びマウス定常領域を有する重鎖及び軽鎖を作製するハイブリッド免疫グロブリン遺伝子座を有するマウスをもたらす。マウスＶＨ−Ｄ−ＪＨ及びＶκ−Ｊκセグメントの正確な置き換えは、ハイブリッド免疫グロブリン遺伝子座において隣接するマウス配列を無傷で機能性のまま残す。マウスの体液性免疫系は、野生型マウスのものと同様に機能する。Ｂ細胞発生は、いかなる顕著な点に関しても妨げられず、ヒト可変領域の豊富な多様性が、抗原攻撃に際してマウスにおいて生成される。さらに、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウスは、免疫付与に対して、本質的に正常な野生型応答を見せ、それは、ただ１つの顕著な点においてのみ野生型と異なる−免疫付与に応答して生成される可変領域は、完全にヒトである。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウスは、重鎖及びκ軽鎖に関する免疫グロブリン遺伝子セグメントが、ヒト及びマウスにおいて類似して再構成するため、可能である。遺伝子座は、同一ではないが十分に類似しており、その結果、重鎖可変遺伝子遺伝子座のヒト化は、全てのＶＨ、Ｄ、及びＪＨ遺伝子セグメントを含有する約３百万の塩基対の連続したマウス配列を、ヒト免疫グロブリン遺伝子座からの基本的に等価の配列をカバーする約百万の塩基の連続したヒトゲノム配列で置き換えることによって達成することができる。例えば、幾つかの実施形態では、Ｄセグメントは、抗原で免疫付与されたＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウスの成熟Ｂ細胞中に発現される重鎖に由来し、Ｄセグメントは、２つ以下のアミノ酸を重鎖ＣＤＲ３配列に送る。
【００９６】
特定の実施形態では、再構成された重鎖可変ドメインをコードする免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む（即ち、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む）、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスが提供される。このように修飾されたＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスは、マウス免疫グロブリン重鎖可変遺伝子セグメントの、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列（即ち、内在性重鎖遺伝子座におけるユニバーサル重鎖配列）での置き換え、及びマウス免疫グロブリンκ軽鎖可変遺伝子セグメントの、少なくとも４０個のヒトＶκ遺伝子セグメント及び５つのヒトＪκ遺伝子セグメントでの置き換えを含む。幾つかの実施形態では、ヒトＶκ遺伝子セグメントは、Ｖκ１−５、Ｖκ１−６、Ｖκ１−８、Ｖκ１−９、Ｖκ１−１２、Ｖκ１−１３、Ｖκ１−１６、Ｖκ−１７、Ｖκ１−２２、Ｖκ１−２７、Ｖκ１−３２、Ｖκ１−３３、Ｖκ１−３５、Ｖκ１−３７、Ｖκ１−３９、Ｖκ１Ｄ−８、Ｖκ１Ｄ−１２、Ｖκ１Ｄ−１３、Ｖκ１Ｄ−１６、Ｖκ１Ｄ−１７、Ｖκ１Ｄ−２２、Ｖκ１Ｄ−２７、Ｖκ１Ｄ−３２、Ｖκ１Ｄ−３３、Ｖκ１Ｄ−３５、Ｖκ１Ｄ−３７、Ｖκ１Ｄ−３９、Ｖκ１Ｄ−４２、Ｖκ１Ｄ−４３、Ｖκ１−ＮＬ１、Ｖκ２−４、Ｖκ２−１０、Ｖκ２−１４、Ｖκ２−１８、Ｖκ２−１９、Ｖκ２−２３、Ｖκ２−２４、Ｖκ２−２６、Ｖκ２−２８、Ｖκ２−２９、Ｖκ２−３０、Ｖκ２−３６、Ｖκ２−３８、Ｖκ２−４０、Ｖκ２Ｄ−１０、Ｖκ２Ｄ−１４、Ｖκ２Ｄ−１８、Ｖκ２Ｄ−１９、Ｖκ２Ｄ−２３、Ｖκ２Ｄ−２４、Ｖκ２Ｄ−２６、Ｖκ２Ｄ−２８、Ｖκ２Ｄ−２９、Ｖκ２Ｄ−３０、Ｖκ２Ｄ−３６、Ｖκ２Ｄ−３８、Ｖκ２Ｄ−４０、Ｖκ３−７、Ｖκ３−１１、Ｖκ３−１５、Ｖκ３−２０、Ｖκ３−２５、Ｖκ３−３１、Ｖκ３−３４、Ｖκ３Ｄ−７、Ｖκ３Ｄ−７、Ｖκ３Ｄ−１１、Ｖκ３Ｄ−１５、Ｖκ３Ｄ−１５、Ｖκ３Ｄ−２０、Ｖκ３Ｄ−２５、Ｖκ３Ｄ−３１、Ｖκ３Ｄ−３４、Ｖκ３−ＮＬ１、Ｖκ３−ＮＬ２、Ｖκ３−ＮＬ３、Ｖκ３−ＮＬ４、Ｖκ３−ＮＬ５、Ｖκ４−１、Ｖκ５−２、Ｖκ６−２１、Ｖκ６Ｄ−２１、Ｖκ６Ｄ−４１、及びＶκ７−３から成る群から選択される。幾つかの実施形態では、ヒトＶκ  遺伝子セグメントは、Ｖκ４−１、Ｖκ５−２、Ｖκ７−３、Ｖκ２−４、Ｖκ１−５、及びＶκ１−６を含む。１つの実施形態では、Ｖκ遺伝子セグメントは、Ｖκ３−７、Ｖκ１−８、Ｖκ１−９、Ｖκ２−１０、Ｖκ３−１１、Ｖκ１−１２、Ｖκ１−１３、Ｖκ２−１４、Ｖκ３−１５、及びＶκ１−１６を含む。幾つかの実施形態では、ヒトＶκ遺伝子セグメントは、Ｖκ１−１７、Ｖκ２−１８、Ｖκ２−１９、Ｖκ３−２０、Ｖκ６−２１、Ｖκ１−２２、Ｖκ１−２３、Ｖκ２−２４、Ｖκ３−２５、Ｖκ２−２６、Ｖκ１−２７、Ｖκ２−２８、Ｖκ２−２９、及びＶκ２−３０を含む。幾つかの実施形態では、ヒトＶκ遺伝子セグメントは、Ｖκ３−３１、Ｖκ１−３２、Ｖκ１−３３、Ｖκ３−３４、Ｖκ１−３５、Ｖκ２−３６、Ｖκ１−３７、Ｖκ２−３８、Ｖκ１−３９、及びＶκ２−４０を含む。特定の実施形態では、Ｖκ遺伝子セグメントは、Ｖκ４−１からＶκ２−４０までのヒト免���グロブリンκ軽鎖遺伝子座にわたる連続したヒト免疫グロブリンκ遺伝子セグメントを含み、Ｊκ遺伝子セグメントは、Ｊκ１からＪκ５までのヒト免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座にわたる連続した遺伝子セグメントを含む。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト重鎖可変ドメインヌクレオチド配列は、マウス重鎖定常領域配列に作動可能に連結される。再構成された重鎖可変ドメインをコードする免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む（即ち、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む）ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスは、本明細書に記載される態様、実施形態、方法などのいずれにおいても使用することができる。
【００９７】
種々の実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒトまたはマウス重鎖定常領域遺伝子配列（例えば、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びそれらの組み合わせから選択される免疫グロブリンアイソタイプをコードする重鎖定常領域遺伝子配列）に作動可能に連結される。例えば、（ａ）第１のヌクレオチド配列が、再構成された重鎖可変ドメインをコードし（即ち、第１のヌクレオチド配列は、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列である）、第１のヌクレオチド配列は、ヒトまたは非ヒト重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結され、（ｂ）第２のヌクレオチド配列が、軽鎖可変ドメインをコードし（即ち、第２のヌクレオチド配列は、再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変ヌクレオチド配列である）、第２のヌクレオチド配列は、ヒトまたは非ヒト軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、免疫グロブリン遺伝子座を含む、遺伝子的に修飾された非ヒト動物が提供される。幾つかの実施形態では、ヒト重鎖定常領域遺伝子配列は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、及びそれらの組み合わせから選択される。幾つかの実施形態では、マウス重鎖定常領域遺伝子配列は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、及びそれらの組み合わせから選択される。幾つかの実施形態では、特定の非ヒト動物定常領域遺伝子配列の、ヒト遺伝子配列でのさらなる置き換え（例えば、マウスＣＨ１配列のヒトＣＨ１配列での置き換え、及びマウスＣＬ配列のヒトＣＬ配列での置き換え）は、例えば、完全なヒト抗体断片、例えば、完全なヒトＦａｂを作製するのに好適な、ヒト可変領域及び部分的なヒト定常領域を有する抗体を作製するハイブリッド免疫グロブリン遺伝子座を有する、遺伝子的に修飾された非ヒト動物をもたらす。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ラット重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される。幾つかの実施形態では、ラット重鎖定常領域遺伝子配列は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、及びそれらの組み合わせから選択される。種々の実施形態では、非ヒト動物の遺伝子的に修飾された免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、重鎖定常ドメイン遺伝子配列に作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列の２つのコピー、３つのコピー、４つのコピー、またはそれ以上を含む。特定の実施形態では、遺伝子座は、重鎖定常ドメイン遺伝子配列に作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列の複数のコピーを含む。
【００９８】
種々の実施形態では、重鎖定常領域ヌクレオチド配列は、ＣＨ２またはＣＨ３内に修飾を含み、修飾は、酸性環境（例えば、ｐＨが約５．５〜約６．０にわたるエンドソーム内）でのＦｃＲｎに対する重鎖定常領域アミノ酸配列の親和性を増加させる。幾つかの実施形態では、重鎖定常領域ヌクレオチド配列は、ＥＵ付番方式による２５０位（Ｋａｂａｔ付番方式による２６３位）（例えば、ＥもしくはＱ）；ＥＵ付番方式による２５０位（Ｋａｂａｔ付番方式による２６３位）及びＥＵ付番方式による４２８位（Ｋａｂａｔ付番方式による４５９位）（例えば、ＬもしくはＦ）；ＥＵ付番方式による２５２位（Ｋａｂａｔ付番方式による２６５位）（例えば、Ｌ／Ｙ／Ｆ／ＷもしくはＴ）、ＥＵ付番方式による２５４位（Ｋａｂａｔ付番方式による２６７位）（例えば、ＳもしくはＴ）、及びＥＵ付番方式による２５６位（Ｋａｂａｔ付番方式による２６９位）（例えば、Ｓ／Ｒ／Ｑ／Ｅ／ＤもしくはＴ）における修飾、またはＥＵ付番方式による４２８位（Ｋａｂａｔ付番方式による４５９位）及び／もしくはＥＵ付番方式による４３３位（Ｋａｂａｔ付番方式による４６４位）（例えば、Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｐ／ＱもしくはＫ）及び／もしくはＥＵ付番方式による４３４位（Ｋａｂａｔ付番方式による４６５位）（例えば、Ｈ／ＦまたはＹ）における修飾、またはＥＵ付番方式による２５０位（Ｋａｂａｔ付番方式による２６３位）及び／もしくはＥＵ付番方式による４２８位（Ｋａｂａｔ付番方式による４５９位）における修飾、またはＥＵ付番方式による３０７位（Ｋａｂａｔ付番方式による３２６位）もしくはＥＵ付番方式による３０８位（Ｋａｂａｔ付番方式による３２７位）（例えば、３０８Ｆ、Ｖ３０８Ｆ）、及びＥＵ付番方式による４３４位（Ｋａｂａｔ付番方式による４６５位）における修飾を含む、ヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。１つの実施形態では、修飾は、ＥＵ付番方式による４２８Ｌ（例えば、Ｍ４２８Ｌ）及び４３４Ｓ（例えば、Ｎ４３４Ｓ）修飾（Ｋａｂａｔ付番方式による４５９、例えば、Ｍ４５９Ｌ、及び４６５Ｓ（例えば、Ｎ４６５Ｓ）修飾）、ＥＵ付番方式による４２８Ｌ、２５９Ｉ（例えば、Ｖ２５９Ｉ）、及び３０８Ｆ（例えば、Ｖ３０８Ｆ）修飾（Ｋａｂａｔ付番方式による４５９Ｌ、２７２Ｉ（例えば、Ｖ２７２Ｉ）、及び３２７Ｆ（例えば、Ｖ３２７Ｆ）修飾）、ＥＵ付番方式による４３３Ｋ（例えば、Ｈ４３３Ｋ）及び４３４（例えば、４３４Ｙ）修飾（Ｋａｂａｔ付番方式による４６４Ｋ（例えば、Ｈ４６４Ｋ）及び４６５（例えば、４６５Ｙ）修飾）、ＥＵ付番方式による２５２、２５４、及び２５６（例えば、２５２Ｙ、２５４Ｔ、及び２５６Ｅ）修飾（Ｋａｂａｔ付番方式による２６５、２６７、２６９（例えば、２６５Ｙ、２６７Ｔ、及び２６９Ｅ）修飾）、ＥＵ付番方式による２５０Ｑ及び４２８Ｌ修飾（例えば、Ｔ２５０Ｑ及びＭ４２８Ｌ）（Ｋａｂａｔ付番方式による２６３Ｑ及び４５９Ｌ修飾、例えば、Ｔ２６３Ｑ及びＭ４５９Ｌ）、ならびにＥＵ付番方式による３０７及び／または３０８修飾（例えば、３０７Ｆまたは３０８Ｐ）（Ｋａｂａｔ付番方式による３２６及び／または３２７修飾、例えば、３２６Ｆまたは３０８Ｐ）を含み、修飾は、酸性環境（例えば、ｐＨが約５．５〜約６．０にわたるエンドソーム内）でのＦｃＲｎに対する重鎖定常領域アミノ酸配列の親和性を増加させる。幾つかの実施形態では、重鎖定常領域ヌクレオチド配列は、ＥＵ付番方式による２５２位〜２５７位のアミノ酸残基の間の少なくとも１つの修飾（即ち、Ｋａｂａｔ付番方式によるアミノ酸２６５位〜２７０位の間の少なくとも１つの修飾）を含むヒトＣＨ２アミノ酸配列をコードし、修飾は、酸性環境（例えば、ｐＨが約５．５〜約６．０にわたるエンドソーム内）でのＦｃＲｎに対するヒトＣＨ２アミノ酸配列の親和性を増加させる。幾つかの実施形態では、重鎖定常領域ヌクレオチド配列は、３０７位〜３１１位のアミノ酸残基の間の少なくとも１つの修飾（即ち、Ｋａｂａｔ付番方式によるアミノ酸３２６位〜３３０位の間の少なくとも１つの修飾）を含むヒトＣＨ２アミノ酸配列をコードし、修飾は、酸性環境（例えば、ｐＨが約５．５〜約６．０にわたるエンドソーム内）でのＦｃＲｎに対するＣＨ２アミノ酸配列の親和性を増加させる。幾つかの実施形態では、重鎖定常領域ヌクレオチド配列は、ヒトＣＨ３アミノ酸配列をコードし、ＣＨ３アミノ酸配列は、ＥＵ付番方式による４３３位〜４３６位のアミノ酸残基の間の少なくとも１つの修飾（即ち、Ｋａｂａｔ付番方式による４６４位〜４６７位のアミノ酸残基の間の少なくとも１つの修飾）を含み、修飾は、酸性環境（例えば、ｐＨが約５．５〜約６．０にわたるエンドソーム内）でのＦｃＲｎに対するＣＨ３アミノ酸配列の親和性を増加させる。幾つかの実施形態では、重鎖定常領域ヌクレオチド配列は、ＥＵ付番方式によるＭ４２８Ｌ（Ｋａｂａｔ付番方式４５９）、ＥＵ付番方式によるＮ４３４Ｓ（Ｋａｂａｔ付番方式による４６５）、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。幾つかの実施形態では、重鎖定常領域ヌクレオチド配列は、ＥＵ付番方式によるＭ４２８Ｌ（Ｋａｂａｔ付番方式によるＭ４５９Ｌ）、ＥＵ付番方式によるＶ２５９Ｉ（Ｋａｂａｔ付番方式によるＶ２７２Ｉ）、ＥＵ付番方式によるＶ３０８Ｆ（Ｋａｂａｔ付番方式によるＶ３２７）、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。幾つかの実施形態では、重鎖定常領域ヌクレオチド配列は、ＥＵ付番方式によるＮ４３４Ａ変異（Ｋａｂａｔ付番方式によるＮ４６５Ａ変異）を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。幾つかの実施形態では、重鎖定常領域ヌクレオチド配列は、ＥＵ付番方式によるＭ２５２Ｙ（Ｋａｂａｔ付番方式によるＭ２６５Ｙ）、ＥＵ付番方式によるＳ２５４Ｔ（Ｋａｂａｔ付番方式によるＳ２６７Ｔ）、ＥＵ付番方式によるＴ２５６Ｅ（Ｋａｂａｔ付番方式によるＴ２６９Ｅ）、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。幾つかの実施形態では、重鎖定常領域ヌクレオチド配列は、ＥＵ付番方式によるＴ２５０Ｑ（Ｋａｂａｔ付番方式によるＴ２６３Ｑ）、ＥＵ付番方式によるＭ４２８Ｌ（Ｋａｂａｔ付番方式によるＭ４５９Ｌ）、またはその両方から成る群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。幾つかの実施形態では、重鎖定常領域ヌクレオチド配列は、ＥＵ付番方式によるＨ４３３Ｋ（Ｋａｂａｔ付番方式によるＨ４６４Ｋ）、ＥＵ付番方式によるＮ４３４Ｙ（Ｋａｂａｔ付番方式によるＮ４６５Ｙ）、またはその両方から成る群から選択される変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。
【００９９】
幾つかの実施形態では、遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座は、（１）本明細書に記載される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、及びそれらの組み合わせから選択されるヒトＩｇＧの第１のＣＨ３アミノ酸配列をコードする第１の重鎖定常領域ヌクレオチド配列に作動可能に連結される、第１の対立遺伝子と、（２）本明細書に記載される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、及びそれらの組み合わせから選択されるヒトＩｇＧの第２のＣＨ３アミノ酸配列をコードする第２の重鎖定常領域ヌクレオチド配列に作動可能に連結される、第２の対立遺伝子と、を含み、第２のＣＨ３アミノ酸配列は、第２のＣＨ３アミノ酸配列に関するタンパク質Ａへの結合を低減または排除する修飾を含む（例えば、参照によりその全体が本明細書に援用される米国特許第８，５８６，７１３号を参照）。幾つかの実施形態では、第２のＣＨ３アミノ酸配列は、Ｈ９５Ｒ修飾（ＩＭＧＴエクソン付番方式による、ＥＵ付番方式によるＨ４３５Ｒ）を含む。一実施形態では、第２のＣＨ３アミノ酸配列は、Ｙ９６Ｆ修飾（ＩＭＧＴエクソン付番方式による、ＥＵによるＨ４３６Ｆ）をさらに含む。別の実施形態では、第２のＣＨ３アミノ酸配列は、Ｈ９５Ｒ修飾（ＩＭＧＴエクソン付番方式による、ＥＵ付番方式によるＨ４３５Ｒ）とＹ９６Ｆ修飾（ＩＭＧＴエクソン付番方式による、ＥＵによるＨ４３６Ｆ）との両方を含む。幾つかの実施形態では、第２のＣＨ３アミノ酸配列は、修飾されたヒトＩｇＧ１からのものであり、Ｄ１６Ｅ、Ｌ１８Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、及びＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ、ＥＵによるＤ３５６Ｅ、Ｌ３８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、及びＶ４２２Ｉ）から成る群から選択される変異をさらに含む。幾つかの実施形態では、第２のＣＨ３アミノ酸配列は、修飾されたヒトＩｇＧ２からのものであり、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、及びＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ：ＥＵによるＮ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、及びＶ４２２Ｉ）から成る群から選択される変異をさらに含む。幾つかの実施形態では、第２のＣＨ３アミノ酸配列は、修飾されたヒトＩｇＧ４からのものであり、Ｑ１５Ｒ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、Ｒ６９Ｋ、Ｅ７９Ｑ、及びＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ：ＥＵによるＱ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０９Ｋ、Ｅ４１９Ｑ、及びＶ４２２Ｉ）から成る群から選択される変異をさらに含む。幾つかの実施形態では、重鎖定常領域アミノ酸配列は、非ヒト定常領域アミノ酸配列であり、重鎖定常領域アミノ酸配列は、上述の修飾の種類のいずれかのうちの１つ以上を含む。
【０１００】
種々の実施形態では、Ｆｃドメインは、変更されたＦｃ受容体結合を有するように修飾され、それは次に、エフェクター機能に影響を及ぼす。幾つかの実施形態では、Ｆｃドメインを含む改変された重鎖定常領域（ＣＨ）は、キメラである。したがって、キメラＣＨ領域は、複数の免疫グロブリンアイソタイプに由来するＣＨドメインを組み合わせる。例えば、キメラＣＨ領域は、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、またはヒトＩｇＧ４分子に由来するＣＨ２ドメインのうちの一部または全部を、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、またはヒトＩｇＧ４分子に由来するＣＨ３ドメインのうちの一部または全部と組み合わせて含む。幾つかの実施形態では、キメラＣＨ領域は、キメラヒンジ領域を含有する。例えば、キメラヒンジは、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、またはヒトＩｇＧ４ヒンジ領域に由来する「上部ヒンジ」アミノ酸配列（ＥＵ付番方式に従う２１６〜２２７位のアミノ酸残基、Ｋａｂａｔ付番方式に従う２２６〜２４０位のアミノ酸残基）を、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、またはヒトＩｇＧ４ヒンジ領域に由来する「下部ヒンジ」配列（ＥＵ付番方式に従う２２８〜２３６位のアミノ酸残基、Ｋａｂａｔ付番方式に従う２４１〜２４９位のアミノ酸位置）と組み合わせて含むことができる。幾つかの実施形態では、キメラヒンジ領域は、ヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ４上部ヒンジに由来するアミノ酸残基、及びヒトＩｇＧ２下部ヒンジに由来するアミノ酸残基を含む。
【０１０１】
幾つかの実施形態では、Ｆｃドメインは、Ｆｃ含有タンパク質の（例えば、抗体の）所望の薬物動態特性に影響を及ぼすことなく、正常なＦｃエフェクター機能のうちの全て、一部を活性化するか、またはいずれも活性化しないように、改変されてもよい。キメラＣＨ領域を含み、変更されたエフェクター機能を有するタンパク質の例に関しては、その全体が本明細書に援用される、２０１３年２月１日に出願された米国仮特許出願第６１／７５９，５７８号を参照されたい。
【０１０２】
種々の態様では、非ヒト動物のゲノムは、（ｉ）免疫グロブリン遺伝子座中で、全てもしくは実質的に全ての内在性機能性免疫グロブリンＶＨ、Ｄ、ＪＨセグメントを欠失させるか、あるいは非機能性にする（例えば、ヌクレオチド配列（例えば、外在性ヌクレオチド配列）の挿入を介して）、または非機能性再構成もしくは逆位を介して非機能性にするように、及び（ｉｉ）再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を含むように、修飾され、ヌクレオチド配列は、内在性遺伝子座（即ち、野生型非ヒト動物においてヌクレオチド配列が配置される所）に存在する。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ゲノム中の異所性遺伝子座に（例えば、そのゲノム中の内在性免疫グロブリン鎖遺伝子座とは異なる遺伝子座に、またはその内在性遺伝子座中、例えば、内在性遺伝子座がゲノム中の異なる場所に定置もしくは移動される免疫グロブリン可変遺伝子座中に）ある。幾つかの実施形態では、例えば、全ての内在性機能性重鎖Ｖ、Ｄ、またはＪ遺伝子セグメントの約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上、または約９９％以上が、欠失させられるか、または非機能性にされる。幾つかの実施形態では、例えば、内在性機能性重鎖Ｖ、Ｄ、またはＪ遺伝子セグメントの少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％が、欠失させられるか、または非機能性にされる。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒトまたは非ヒト重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、カッパかまたはラムダかのいずれかの、ヒトまたは非ヒト軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される。
【０１０３】
幾つかの実施形態では、遺伝子的に修飾された非ヒト動物は、内在性機能性ＶＨ、Ｄ、及びＪＨ重鎖可変遺伝子セグメントならびに内在性機能性軽鎖可変ＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメントを、欠失させるか、または非機能性にする修飾を含み、（ｉ）再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列と、（ｉｉ）再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖Ｖ遺伝子セグメント（ＶＬ）及び再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖Ｊ遺伝子セグメント（ＪＬ）（即ち、ヌクレオチド配列が、野生型非ヒト度動物において配置される所）をコードするヌクレオチド配列とを、または異所性の場所に（例えば、そのゲノム中の内在性免疫グロブリン鎖遺伝子座とは異なる遺伝子座に、例えば、内在性遺伝子座がゲノム中の異なる場所に定置もしくは移動される内在性遺伝子座中に）含む。幾つかの実施形態では、遺伝子的に修飾された非ヒト動物は、内在性機能性ＶＨ、Ｄ、及びＪＨ重鎖可変遺伝子セグメントならびに内在性機能性軽鎖可変ＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメントを欠失させるか、または非機能性にする修飾を含み、（ｉ）再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列と、（ｉｉ）１つ以上であるが野生型より少ない数のヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント（ＶＬ及びＪＬ）とを、内在性場所に（即ち、ヌクレオチド配列が野生型非ヒト動物において配置される所）、または異所性の場所に（例えば、そのゲノム中の内在性免疫グロブリン鎖遺伝子座とは異なる遺伝子座に、またはその内在性遺伝子座中、例えば、内在性遺伝子座がゲノム中の異なる場所に定置もしくは移動される免疫グロブリン可変領域遺伝子座中に）含む。幾つかの実施形態では、例えば、全ての内在性機能性重鎖Ｖ、Ｄ、またはＪ遺伝子セグメントの約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上、または約９９％以上が、欠失させられるか、または非機能性にされる。幾つかの実施形態では、例えば、内在性機能性重鎖Ｖ、Ｄ、またはＪ遺伝子セグメントの少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％が、欠失させられるか、または非機能性にされる。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒトまたは非ヒト重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、カッパかまたはラムダかのいずれかの、ヒトまたは非ヒト軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される。
【０１０４】
種々の実施形態は、軽鎖可変ドメインを包括する。軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列は、本明細書に記載される遺伝子的に修飾された非ヒトの作製に使用されることができ、かかる動物によって発現されることができ、及び／またはかかる動物によって産生される（またはかかる動物によって多様化された配列に由来する）抗体ボディード中に存在するアミノ酸をコードすることができる。幾つかの実施形態では、軽鎖可変ドメインは、ヒトκ軽鎖可変ドメインである。幾つかの実施形態では、軽鎖可変ドメインは、マウスκ軽鎖可変ドメインである。幾つかの実施形態では、軽鎖可変ドメインは、ラットκ軽鎖可変ドメインである。幾つかの実施形態では、軽鎖可変ドメインは、ヒトλ軽鎖可変ドメインである。幾つかの実施形態では、軽鎖可変ドメインは、マウスλ軽鎖可変ドメインである。幾つかの実施形態では、軽鎖可変ドメインは、ラットλ軽鎖可変ドメインである。
【０１０５】
種々の実施形態では、本明細書に記載される遺伝子的に修飾された非ヒト動物によって産生される軽鎖可変ドメインは、１つ以上のマウスまたはヒト免疫グロブリンκ軽鎖可変遺伝子セグメントによってコードされる。幾つかの実施形態では、１つ以上のマウス免疫グロブリンκ軽鎖可変遺伝子セグメントは、約３メガ塩基対のマウス免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座を含む。幾つかの実施形態では、１つ以上のマウス免疫グロブリンκ軽鎖可変遺伝子セグメントは、マウス免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座の、少なくとも１３７個のＶκ遺伝子セグメント、少なくとも５つのＪκ遺伝子セグメント、またはそれらの組み合わせを含む。幾つかの実施形態では、１つ以上のヒト免疫グロブリンκ軽鎖可変遺伝子セグメントは、約半分のメガ塩基対のヒト免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座を含む。特定の実施形態では、１つ以上のヒト免疫グロブリンκ軽鎖可変遺伝子セグメントは、ヒト免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座の（免疫グロブリンκ定常領域に関して）近位反復（ｐｒｏｘｉｍａｌ  ｒｅｐｅａｔ）を含む。幾つかの実施形態では、１つ以上のヒト免疫グロブリンκ軽鎖可変遺伝子セグメントは、ヒト免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座の、少なくとも４０個のＶκ遺伝子セグメント、少なくとも５つのＪκ遺伝子セグメント、またはそれらの組み合わせを含む。
【０１０６】
特定の実施形態では、遺伝子的に修飾された非ヒト動物は、再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖（ＶＬ）遺伝子セグメント及び再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖（ＪＬ）遺伝子セグメントをコードするヌクレオチド配列を更に含む。幾つかの実施形態では、再構成されていない軽鎖Ｖ遺伝子セグメント及び再構成されていない軽鎖Ｊ遺伝子セグメントをコードするヌクレオチド配列は、免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される。他の実施形態では、再構成されていない軽鎖Ｖ遺伝子セグメント及び再構成されていない軽鎖Ｊ遺伝子セグメントをコードするヌクレオチド配列は、免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される。幾つかの実施形態では、再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖Ｖ（ＶＬ）遺伝子セグメント及び再構成されていないヒト免疫グロブリンＪ（ＪＬ）遺伝子セグメントは、齧歯動物免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子、例えば、κまたはλ軽鎖定常領域遺伝子に、内在性齧歯動物遺伝子座にて作動可能に連結される
【０１０７】
種々の実施形態では、再構成されていないヒト可変領域遺伝子セグメント（例えば、ヒトＶκ遺伝子セグメント）は、抗体のヒト可変ドメインを再構成及びコードすることが可能である。幾つかの実施形態では、非ヒト動物は、内在性ＶＬ遺伝子セグメントを含まない。幾つかの実施形態では、非ヒト動物によって発現されるヒトＶκ遺伝子セグメントは、Ｖκ１−５、Ｖκ１−６、Ｖκ１−８、Ｖκ１−９、Ｖκ１−１２、Ｖκ１−１３、Ｖκ１−１６、Ｖκ１−１７、Ｖκ１−２２、Ｖκ１−２７、Ｖκ１−３２、Ｖκ１−３３、Ｖκ１−３５、Ｖκ１−３７、Ｖκ１−３９、Ｖκ１Ｄ−８、Ｖκ１Ｄ−１２、Ｖκ１Ｄ−１３、Ｖκ１Ｄ−１６、Ｖκ１Ｄ−１７、Ｖκ１Ｄ−２２、Ｖκ１Ｄ−２７、Ｖκ１Ｄ−３２、Ｖκ１Ｄ−３３、Ｖκ１Ｄ−３５、Ｖκ１Ｄ−３７、Ｖκ１Ｄ−３９、Ｖκ１Ｄ−４２、Ｖκ１Ｄ−４３、Ｖκ１−ＮＬ１、Ｖκ２−４、Ｖκ２−１０、Ｖκ２−１４、Ｖκ２−１８、Ｖκ２−１９、Ｖκ２−２３、Ｖκ２−２４、Ｖκ２−２６、Ｖκ２−２８、Ｖκ２−２９、Ｖκ２−３０、Ｖκ２−３６、Ｖκ２−３８、Ｖκ２−４０、Ｖκ２Ｄ−１０、Ｖκ２Ｄ−１４、Ｖκ２Ｄ−１８、Ｖκ２Ｄ−１９、Ｖκ２Ｄ−２３、Ｖκ２Ｄ−２４、Ｖκ２Ｄ−２６、Ｖκ２Ｄ−２８、Ｖκ２Ｄ−２９、Ｖκ２Ｄ−３０、Ｖκ２Ｄ−３６、Ｖκ２Ｄ−３８、Ｖκ２Ｄ−４０、Ｖκ３−７、Ｖκ３−１１、Ｖκ３−１５、Ｖκ３−２０、Ｖκ３−２５、Ｖκ３−３１、Ｖκ３−３４、Ｖκ３Ｄ−７、Ｖκ３Ｄ−７、Ｖκ３Ｄ−１１、Ｖκ３Ｄ−１５、Ｖκ３Ｄ−１５、Ｖκ３Ｄ−２０、Ｖκ３Ｄ−２５、Ｖκ３Ｄ−３１、Ｖκ３Ｄ−３４、Ｖκ３−ＮＬ１、Ｖκ３−ＮＬ２、Ｖκ３−ＮＬ３、Ｖκ３−ＮＬ４、Ｖκ３−ＮＬ５、Ｖκ４−１、Ｖκ５−２、Ｖκ６−２１、Ｖκ６Ｄ−２１、Ｖκ６Ｄ−４１、及びＶκ７−３から成る群から選択される。幾つかの実施形態では、本明細書に記載される遺伝子的に修飾された非ヒト動物は、全ての機能性ヒトＶκ遺伝子を発現する。幾つかの実施形態では、ヒトＶκ遺伝子セグメントは、Ｖκ４−１、Ｖκ５−２、Ｖκ７−３、Ｖκ２−４、Ｖκ１−５、及びＶκ１−６を含む。幾つかの実施形態では、Ｖκ遺伝子セグメントは、Ｖκ３−７、Ｖκ１−８、Ｖκ１−９、Ｖκ２−１０、Ｖκ３−１１、Ｖκ１−１２、Ｖκ１−１３、Ｖκ２−１４、Ｖκ３−１５、及びＶκ１−１６を含む。幾つかの実施形態では、ヒトＶκ遺伝子セグメントは、Ｖκ１−１７、Ｖκ２−１８、Ｖκ２−１９、Ｖκ３−２０、Ｖκ６−２１、Ｖκ１−２２、Ｖκ１−２３、Ｖκ２−２４、Ｖκ３−２５、Ｖκ２−２６、Ｖκ１−２７、Ｖκ２−２８、Ｖκ２−２９、及びＶκ２−３０を含む。幾つかの実施形態では、ヒトＶκ遺伝子セグメントは、Ｖκ３−３１、Ｖκ１−３２、Ｖκ１−３３、Ｖκ３−３４、Ｖκ１−３５、Ｖκ２−３６、Ｖκ１−３７、Ｖκ２−３８、Ｖκ１−３９、及びＶκ２−４０を含む。種々の実施形態では、非ヒト動物は、５つのヒトＪκ遺伝子セグメント、例えば、Ｊκ１、Ｊκ２、Ｊκ３、Ｊκ４、及びＪκ５遺伝子セグメントを含む。特定の実施形態では、Ｖκ遺伝子セグメントは、Ｖκ４−１からＶκ２−４０までのヒト免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座にわたる連続したヒト免疫グロブリンκ遺伝子セグメントを含み、Ｊκ遺伝子セグメントは、Ｊκ１からＪκ���までのヒト免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座にわたる連続した遺伝子セグメントを含む。幾つかの実施形態では、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、２つのヒトＶＬ遺伝子セグメント、Ｖκ１−３９及びＶκ３−２０を含む。幾つかの実施形態では、１つ以上（例えば、２、３、４、または５つ）のヒトＶＬ遺伝子セグメント及び２つ以上のヒトＪＬ遺伝子セグメントは、内在性軽鎖遺伝子座に、例えば、内在性カッパ軽鎖遺伝子座に存在する。幾つかの実施形態では、遺伝子的に修飾された非ヒト動物は、機能性λ軽鎖遺伝子座を含むマウスである。他の実施形態では、マウスは、非機能性λ軽鎖遺伝子座を含む。幾つかの実施形態では、１つ以上のヒトＶＨ、１つ以上のヒトＤＨ、及び１つ以上のヒトＪＨ遺伝子セグメントは、マウスまたはラット重鎖定常領域配列に作動可能に連結される（即ち、１つ以上のヒトＶＬ遺伝子セグメント及び２つ以上のヒトＪＬ遺伝子セグメントは、内在性重鎖遺伝子座に存在する）。
【０１０８】
幾つかの実施形態では、本明細書に記載される遺伝子的に修飾された非ヒト動物（例えば、マウスまたはラット）は、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を発現し（即ち、再構成された重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質を産生し）、またＶκ１−５、Ｖκ１−６、Ｖκ１−８、Ｖκ１−９、Ｖκ１−１２、Ｖκ１−１３、Ｖκ１−１６、Ｖκ１−１７、Ｖκ１−２２、Ｖκ１−２７、Ｖκ１−３２、Ｖκ１−３３、Ｖκ１−３５、Ｖκ１−３７、Ｖκ１−３９、Ｖκ１Ｄ−８、Ｖκ１Ｄ−１２、Ｖκ１Ｄ−１３、Ｖκ１Ｄ−１６、Ｖκ１Ｄ−１７、Ｖκ１Ｄ−２２、Ｖκ１Ｄ−２７、Ｖκ１Ｄ−３２、Ｖκ１Ｄ−３３、Ｖκ１Ｄ−３５、Ｖκ１Ｄ−３７、Ｖκ１Ｄ−３９、Ｖκ１Ｄ−４２、Ｖκ１Ｄ−４３、Ｖκ１−ＮＬ１、Ｖκ２−４、Ｖκ２−１０、Ｖκ２−１４、Ｖκ２−１８、Ｖκ２−１９、Ｖκ２−２３、Ｖκ２−２４、Ｖκ２−２６、Ｖκ２−２８、Ｖκ２−２９、Ｖκ２−３０、Ｖκ２−３６、Ｖκ２−３８、Ｖκ２−４０、Ｖκ２Ｄ−１０、Ｖκ２Ｄ−１４、Ｖκ２Ｄ−１８、Ｖκ２Ｄ−１９、Ｖκ２Ｄ−２３、Ｖκ２Ｄ−２４、Ｖκ２Ｄ−２６、Ｖκ２Ｄ−２８、Ｖκ２Ｄ−２９、Ｖκ２Ｄ−３０、Ｖκ２Ｄ−３６、Ｖκ２Ｄ−３８、Ｖκ２Ｄ−４０、Ｖκ３−７、Ｖκ３−１１、Ｖκ３−１５、Ｖκ３−２０、Ｖκ３−２５、Ｖκ３−３１、Ｖκ３−３４、Ｖκ３Ｄ−７、Ｖκ３Ｄ−７、Ｖκ３Ｄ−１１、Ｖκ３Ｄ−１５、Ｖκ３Ｄ−１５、Ｖκ３Ｄ−２０、Ｖκ３Ｄ−２５、Ｖκ３Ｄ−３１、Ｖκ３Ｄ−３４、Ｖκ３−ＮＬ１、Ｖκ３−ＮＬ２、Ｖκ３−ＮＬ３、Ｖκ３−ＮＬ４、Ｖκ３−ＮＬ５、Ｖκ４−１、Ｖκ５−２、Ｖκ６−２１、Ｖκ６Ｄ−２１、Ｖκ６Ｄ−４１、及びＶκ７−３から成る群から選択されるＶκ遺伝子によってコードされる１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上などの軽鎖可変ドメインを発現する。
【０１０９】
種々の実施形態では、軽鎖可変領域遺伝子セグメント（例えば、ヒト軽鎖可変領域遺伝子セグメント）のうちの少なくとも１つは、対応するヒト生殖系列軽鎖可変遺伝子セグメントによってはコードされない１つ以上のヒスチジンコドンをコードする。幾つかの実施形態では、本明細書に記載される軽鎖可変ドメインは、酸性ｐＨにおいて、中性ｐＨと比較して、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、または少なくとも約３０倍の解離半減期（ｔ１／２）の減少を示す。幾つかの実施形態では、中性ｐＨと比較して酸性ｐＨでのｔ１／２の減少は、約３０倍以上である。幾つかの実施形態では、ＶＬ遺伝子セグメントのうちの少なくとも１つは、対応するヒト生殖系列ＶＬセグメント配列によってコードされる少なくとも１つの非ヒスチジンコドンの、ヒスチジンコドンでの置換を含む。幾つかの実施形態では、置換は、１、２、３、または４つのコドン（例えば、３または４つのコドン）のものである。幾つかの実施形態では、置換は、ＣＤＲ３コドン（単数または複数）中である。幾つかの実施形態では、ヒトＶＬ遺伝子セグメントは、ヒトＶκ１−３９及びＶκ３−２０遺伝子セグメントであり、ヒトＶκ１−３９及びＶκ３−２０遺伝子セグメントの各々は、対応するヒト生殖系列ＶＬ遺伝子セグメントによってコードされる少なくとも１つの非ヒスチジンコドンの、ヒスチジンコドンでの置換を含む。幾つかの実施形態では、ヒトＶκ１−３９及びＶκ３−２０遺伝子セグメントの各々は、３または４つのヒスチジンコドンの置換を含む。幾つかの実施形態では、３または４つの置換は、ＣＤＲ３領域中である。幾つかの実施形態では、置換は、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントの３つの非ヒスチジンコドンのものであり、置換は、１０６位、１０８位、及び１１１位にてヒスチジンを発現するように設計される。幾つかの実施形態では、置換は、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントの４つの非ヒスチジンコドンのものであり、置換は、１０５位、１０６位、１０８位、及び１１１位にてヒスチジンを発現するように設計される（例えば、参照により本明細書に援用される、ＵＳ第２０１３／０２４７２３４Ａ１号及びＷＯ第２０１３／１３８６８０号を参照）。幾つかの実施形態では、置換は、ヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントの３つの非ヒスチジンコドンのものであり、置換は、１０５位、１０６位、及び１０９位にてヒスチジンを発現するように設計される。またさらなる実施形態では、置換は、ヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントの４つの非ヒスチジンコドンのものであり、置換は、１０５位、１０６位、１０７位、及び１０９位にてヒスチジンを発現するように設計される。幾つかの実施形態では、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、１つ以上であるが野生型より少ない数のヒトＶＬ遺伝子セグメント、及び１つ以上、例えば、２つ以上のヒトＪＬ遺伝子セグメントを含み、ヒトＶＬ遺伝子セグメントの各々は、対応するヒト生殖系列ＶＬ遺伝子セグメントによってはコードされない少なくとも１つのヒスチジンコドンを含む。種々の実施形態では、本明細書に記載される遺伝子的に修���された免疫グロブリン遺伝子座を含む非ヒト動物は、関心の抗原による刺激に際して、ヒトＶＬ遺伝子セグメントに由来するアミノ酸配列を含む抗原結合タンパク質を発現し、抗原結合タンパク質は、ヒトＶＬ遺伝子セグメント内に導入される少なくとも１つのヒスチジンコドンによってコードされるアミノ酸位置に、少なくとも１つのヒスチジン残基を保持する。幾つかの実施形態では、動物は、抗原に応答して、抗原結合タンパク質の集団を発現し、集団内の全ての抗原結合タンパク質は、（ａ）ヒトＶＬ遺伝子セグメント及びＪＬ遺伝子セグメントの再構成に由来する免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであって、ヒトＶＬ遺伝子セグメントのうちの少なくとも１つが、対応するヒト生殖系列ＶＬ遺伝子セグメントによってはコードされない１つ以上のヒスチジンコドンをコードする、免疫グロブリン軽鎖可変ドメインと、（ｂ）再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列によってコードされるヒト重鎖可変ドメインを含む免疫グロブリン重鎖と、を含む。
【０１１０】
種々の実施形態は、軽鎖定常領域配列を包括する。幾つかの実施形態では、例えば、再構成された重鎖可変ドメインをコードする第１のヌクレオチド配列（即ち、第１のヌクレオチド配列は、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列である）は、重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結され、ヒト軽鎖可変ドメインをコードする第２のヌクレオチド配列（即ち、第２のヌクレオチド配列は、再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変ヌクレオチド配列である）は、軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される。幾つかの実施形態では、再構成された重鎖可変ドメインをコードする第１のヌクレオチド配列（即ち、第１のヌクレオチド配列は、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列である）は、軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結され、ヒト軽鎖可変ドメインをコードする第２のヌクレオチド配列（即ち、第２のヌクレオチド配列は、再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変ヌクレオチド配列である）は、重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される。種々の実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列に作動可能に連結される軽鎖定常領域配列は、ヒトκ軽鎖定常領域配列である。幾つかの実施形態では、再構成された重鎖可変ドメインに作動可能に連結される軽鎖定常領域配列は、マウスκ軽鎖定常領域配列である。幾つかの実施形態では、再構成された重鎖可変ドメインに作動可能に連結される軽鎖定常領域配列は、ラットκ軽鎖定常領域配列である。幾つかの実施形態では、再構成された重鎖可変ドメインに作動可能に連結される軽鎖定常領域配列は、ヒトλ軽鎖定常領域配列である。幾つかの実施形態では、再構成された重鎖可変ドメインに作動可能に連結される軽鎖定常領域配列は、マウスλ軽鎖定常領域配列である。幾つかの実施形態では、再構成された重鎖可変ドメインに作動可能に連結される軽鎖定常領域配列は、ラットλ軽鎖定常領域配列である。
【０１１１】
種々の態様では、再構成された重鎖可変ドメインをコードする遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座（即ち、免疫グロブリン遺伝子座は、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む）を含む非ヒト動物であって、再構成された重鎖可変ドメインは、スペーサーを介して重鎖Ｊセグメント（ＪＨ）配列に作動可能に連結される重鎖可変（ＶＨ）配列を含み、スペーサーは、少なくとも１つのアミノ酸残基を含む、非ヒト動物が提供される。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、非ヒト重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される。幾つかの実施形態では、非ヒト重鎖定常領域遺伝子配列は、マウスまたはラット定常領域遺伝子配列である。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒト重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される。幾つかの実施形態では、重鎖定常領域は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、及びそれらの組み合わせから選択される配列を含む。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、非ヒト軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される。幾つかの実施形態では、非ヒト軽鎖定常領域遺伝子配列は、マウスまたはラット定常領域遺伝子配列である。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒト軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される。幾つかの実施形態では、スペーサーは、単一のアミノ酸残基である。幾つかの実施形態では、スペーサーは、２つのアミノ酸残基である。幾つかの実施形態では、スペーサーは、３つのアミノ酸残基である。幾つかの実施形態では、スペーサーは、４つのアミノ酸残基である。幾つかの実施形態では、スペーサーは、５つのアミノ酸残基である。幾つかの実施形態では、スペーサーは、６つのアミノ酸残基である。
【０１１２】
別の態様では、遺伝子的に修飾された非ヒト動物であって、該動物は、機能性ユニバーサル軽鎖（「ＵＬＣ」）免疫グロブリン遺伝子座を含む、非ヒト動物と、該動物を作製するための方法が提供される。幾つかの実施形態では、かかる動物は、再構成された重鎖可変ドメイン遺伝子座（即ち、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む重鎖可変ドメイン免疫グロブリン遺伝子座）をさらに含む。ＵＬＣは、例えば、ＦｃＲｎ結合に影響を及ぼして半減期を改善させるような修飾、例えば、抗原に結合する重鎖とＦｃＲｎに結合する軽鎖とを含む二重特異性などの機能を含有する二重特異性フォーマットにおいて使用することができる、一般的な軽鎖である。例えば、本明細書に記載される遺伝子的に修飾されたマウスは、ＦｃＲＮで免疫付与されて、専ら軽鎖を通じてＦｃＲＮに結合する抗体を獲得する。遺伝子的に修飾された非ヒト動物によって産生されるこれらの軽鎖は、二重特異性抗体がＦｃＲｎに関連するのに役立つＵＬＣとして使用され、それによって半減期を増加させるのを助ける。抗体の残り（例えば、第２の異なる軽鎖か、またはＦｃＲｎとは異なる抗原に結合する重鎖かのいずれか）は、第２の機能を実施するように選択される。本明細書に記載される実施形態において使用されるＵＬＣはまた、その多様性が主に体細胞変異（例えば、超変異）のプロセスからもたらされる抗体可変鎖配列を生成し、それによって、その抗原結合能力がポストゲノム事象から利益を得る抗体可変鎖配列を解明するために使用することもできる。
【０１１３】
種々の態様は、そのゲノム中に再構成されたヒト重鎖可変領域核酸配列を含み、またそのゲノム中に、カッパ定常領域、ラムダ定常領域、重鎖定常領域（例えば、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される）から選択される定常領域核酸配列上へクローン化された本明細書に記載される軽鎖可変ドメインをコードする核酸をさらに含む、遺伝子的に修飾された非ヒト動物を含む。幾つかの実施形態では、軽鎖可変領域核酸配列は、第１のヒト重鎖定常領域核酸配列上へクローン化され、第２の軽鎖可変ドメインは、第２のヒト重鎖定常領域核酸配列上へクローン化され、第１及び第２のヒト重鎖定常領域核酸配列は、同一であり、第１の軽鎖可変ドメインは、第１の抗原に特異的に結合し、第２の軽鎖可変ドメインは、第２の抗原に特異的に結合する。これらの実施形態では、重鎖定常領と融合された軽鎖可変ドメインの各々が別個の抗原結合特異性を示す、２つのポリペプチドの二量体が形成される。
【０１１４】
別の態様では、血液脳関門を横断する受容体または他の部分、例えば、トランスフェリン受容体に結合する軽鎖を産生することが可能な、遺伝子的に修飾された非ヒト動物（例えば、マウス）が提供される。先行研究は、トランスフェリン受容体に対する低親和性抗体は、低親和性のため、血液脳関門を横断して放出されるであろうことを示している。したがって、幾つかの実施形態では、本明細書に記載される遺伝子的に修飾された動物（例えば、マウス）は、血液脳関門を横断することが可能な部分（例えば、トランスフェリン受容体）に対する低親和性抗体を作製するために使用され、低親和性抗体は、二重特異性であり、所望の標的に対する第２の結合特異性を含む（即ち、抗体は、横断部分に結合し、また横断部分とは異なる標的も結合する）。
【０１１５】
本明細書に記載される遺伝子的に修飾された非ヒト動物を作製及び使用する方法が、提供される。再構成されたヒト重鎖可変領域核酸配列を、免疫グロブリン重鎖または軽鎖定常領域核酸配列との作動可能な連結において、非ヒト動物のゲノム中に定置するための方法が提供される。種々の実施形態では、定常領域核酸配列は、ヒトまたは非ヒトであり、非ヒト動物は、齧歯動物である。種々の実施形態では、方法は、ヒトまたは非ヒト軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される、１つ以上であるが野生型より少ない数のヒト軽鎖可変領域遺伝子セグメント、例えば、２つのヒトＶκ遺伝子セグメントと、１つ以上のヒトＪκ遺伝子セグメントとを含む免疫グロブリン軽鎖遺伝子座をさらに含む、非ヒト動物を作製することを含む。種々の態様では、方法は、例えば、例えば、宿主胚、生殖細胞（例えば、卵母細胞）などを有する修飾された多能性または全能性ドナー細胞（例えば、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞）を採用することを含む遺伝子導入技術を採用して、前述の配列を、非ヒト動物、例えば、齧歯動物の生殖系列中に定置することを含む。したがって、実施形態は、重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む非ヒト生殖細胞のゲノム中の非ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含み、定常領域遺伝子配列は、非ヒト配列、ヒト配列、またはそれらの組み合わせを含む。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、内在性非ヒト免疫グロブリン定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される。幾つかの実施形態では、内在性非ヒト免疫グロブリン定常領域遺伝子配列は、マウスまたはラット重鎖定常領域遺伝子配列である。
【０１１６】
種々の態様では、遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座を含む非ヒト動物を作製する方法であって、（ａ）内在性機能性免疫グロブリン重鎖Ｖ、Ｄ、及びＪ遺伝子セグメントを欠失させるか、または非機能性にするように、非ヒト動物のゲノムを修飾することと、（ｂ）ゲノム中に、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を定置することと、を含む、方法が提供される。１つのかかる態様では、非ヒト動物の生殖系列中の再構成された重鎖遺伝子配列から単一の免疫グロブリン重鎖を発現する非ヒト動物を作製するための方法であって、非ヒト動物を、その抗体発現成熟Ｂ細胞集団全体が（ｉ）単一のＶＨ遺伝子セグメント、（ｉｉ）１、２、３、４、５、または６個のアミノ酸のアミノ酸スペーサー、及び（ｉｉｉ）単一のＪＨ遺伝子セグメントに由来する重鎖を発現するように、遺伝子的に修飾するステップを含む、方法が提供される。幾つかの態様では、方法は、内在性重鎖免疫グロブリン可変遺伝子座を、不活性化するか、または本明細書に記載される単一の再構成された重鎖遺伝子で置き換えることを含む。
【０１１７】
別の態様では、遺伝子的に修飾された免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む非ヒト動物を作製する方法が提供され、かかる方法は、（ａ）内在性機能性免疫グロブリン重鎖Ｖ、Ｄ、及びＪ遺伝子セグメントを欠失させるか、または非機能性にするように、非ヒト動物のゲノムを修飾することと、（ｂ）ゲノム中に、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を定置することと、を含む。幾つかの実施形態では、実質的に全ての内在性機能性ＶＨ、Ｄ、及びＪＨ遺伝子セグメントは、（例えば、ヌクレオチド配列（例えば、免疫グロブリン遺伝子座中の外在性ヌクレオチド配列）の挿入を介して、または内在性ＶＨ、Ｄ、ＪＨセグメントの非機能性再構成もしくは逆位を介して）非ヒト動物の免疫グロブリン重鎖遺伝子座から欠失させられるか、または非機能性にされる。幾つかの実施形態では、方法は、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列（即ち、再構成された重鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列）を、内在性の（即ち、ヌクレオチド配列が非ヒト動物において配置される所に標的化される）場所へ挿入することを含む。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、異所的に（例えば、そのゲノム中の内在性免疫グロブリン鎖遺伝子座とは異なる遺伝子座に、またはその内在性遺伝子座中、例えば、内在性遺伝子座がゲノム中の異なる場所に定置もしくは移動される免疫グロブリン可変遺伝子座中に）存在する。幾つかの実施形態では、例えば、全ての内在性機能性Ｖ、Ｄ、またはＪ遺伝子セグメントの約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上、または約９９％以上が、欠失させられるか、または非機能性にされる。幾つかの実施形態では、例えば、内在性機能性重鎖Ｖ、Ｄ、またはＪ遺伝子セグメントの少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％が、欠失させられるか、または非機能性にされる。
【０１１８】
別の態様では、遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座を含む非ヒト動物を作製するための方法であって、（ａ）内在性機能性免疫グロブリン軽鎖Ｖ及びＪ遺伝子セグメントを欠失させるか、または非機能性にするように、非ヒト動物のゲノムを修飾することと、（ｂ）内在性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座中に、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列（即ち、再構成された重鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列）を定置することと、を含み、ヌクレオチド配列は、軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、方法が提供される。幾つかの実施形態では、遺伝子的に改変された免疫グロブリン遺伝子座は、非ヒト動物の生殖系列ゲノム中に存在する。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、κ軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、マウスまたはラットκ軽鎖定常領域遺伝子配に作動可能に連結される。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒトκ軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、λ軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、マウスまたはラットλ軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒトλ軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される。
【０１１９】
別の態様では、遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座を含む非ヒト動物を作製するための方法であって、（ａ）非ヒト動物のゲノムを、（ｉ）内在性機能性免疫グロブリン重鎖Ｖ、Ｄ、及びＪ遺伝子セグメント、ならびに（ｉｉ）内在性機能性免疫グロブリン軽鎖Ｖ及びＪ遺伝子セグメント、を欠失させるか、または非機能性にするように修飾することと、（ｂ）ゲノム中に、（ｉ）再構成された重鎖可変ドメインをコードする第１のヌクレオチド配列（即ち、第１のヌクレオチド配列は、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列である）であって、第１のヌクレオチド配列は、軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、第１のヌクレオチド配列、及び（ｉｉ）ヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメインをコードする第２のヌクレオチド配列（即ち、第２のヌクレオチド配列は、再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列である）であって、第２のヌクレオチド配列は、重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、第２のヌクレオチド配列、を定置することと、を含む、方法が提供される。幾つかの実施形態では、遺伝子的に改変された免疫グロブリン遺伝子座は、非ヒト動物の生殖系列ゲノム中に存在する。幾つかの実施形態では、再構成された重鎖可変ドメインをコードする第１のヌクレオチド配列は、κ軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される。幾つかの実施形態では、再構成された重鎖可変ドメインをコードする第１のヌクレオチド配列は、マウスまたはラットκ軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される。幾つかの実施形態では、再構成された重鎖可変ドメインをコードする第１のヌクレオチド配列は、ヒトκ軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される。幾つかの実施形態では、再構成された重鎖可変ドメインをコードする第１のヌクレオチド配列は、λ軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される。幾つかの実施形態では、再構成された重鎖可変ドメインをコードする第１のヌクレオチド配列は、マウスまたはラットλ軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される。幾つかの実施形態では、再構成された重鎖可変ドメインをコードする第１のヌクレオチド配列は、ヒトλ軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される。幾つかの実施形態では、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメインは、κ軽鎖可変ドメインである。したがって、幾つかの実施形態では、第２のヌクレオチド配列は、ヒトカッパ軽鎖可変領域ヌクレオチド配列である。幾つかの実施形態では、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメインは、λ軽鎖可変ドメインである。したがって、幾つかの実施形態では、第２のヌクレオチド配列は、ヒトラムダ軽鎖可変領域ヌクレオチド配列である。幾つかの実施形態では、重鎖定常領域遺伝子配列は、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列である。幾つかの実施形態では、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列は、マウスまたはラット重鎖定常領域遺伝子配列である。
【０１２０】
別の態様では、遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座を含む非ヒト動物を作製するための方法であって、（ａ）非ヒト動物のゲノムを、（ｉ）内在性機能性免疫グロブリン重鎖Ｖ、Ｄ、及びＪ遺伝子セグメント、ならびに（ｉｉ）内在性機能性免疫グロブリン軽鎖Ｖ及びＪ遺伝子セグメント、を欠失させるか、または非機能性にするように修飾することと、（ｂ）ゲノム中に、（ｉ）再構成された重鎖可変ドメインをコードする第１のヌクレオチド配列（即ち、第１のヌクレオチド配列は、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列である）であって、第１のヌクレオチド配列は、重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、第１のヌクレオチド配列、及び（ｉｉ）ヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメインをコードする第２のヌクレオチド配列（即ち、第２のヌクレオチド配列は、再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列である）であって、第２のヌクレオチド配列は、軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、第２のヌクレオチド配列、を定置することと、を含む、方法が提供される。幾つかの実施形態では、軽鎖定常領域遺伝子配列は、κ軽鎖定常領域遺伝子配列である。幾つかの実施形態では、軽鎖定常領域遺伝子配列は、マウスまたはラットκ軽鎖定常領域遺伝子配列である。幾つかの実施形態では、軽鎖定常領域遺伝子配列は、ヒトκ軽鎖定常領域遺伝子配列である。幾つかの実施形態では、軽鎖定常領域遺伝子配列は、λ軽鎖定常領域遺伝子配列である。幾つかの実施形態では、軽鎖定常領域遺伝子配列は、マウスまたはラットλ軽鎖定常領域遺伝子配列である。幾つかの実施形態では、軽鎖定常領域遺伝子配列は、ヒトλ軽鎖定常領域遺伝子配列である。幾つかの実施形態では、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメインは、κ軽鎖可変ドメインである。幾つかの実施形態では、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメインは、λ軽鎖可変ドメインである。幾つかの実施形態では、重鎖定常領域遺伝子配列は、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列である。幾つかの実施形態では、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列は、マウスまたはラット重鎖定常領域遺伝子配列である。
【０１２１】
別の態様では、遺伝子的に修飾された免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む非ヒト動物を作製する方法であって、（ａ）内在性機能性免疫グロブリン重鎖Ｖ、Ｄ、及びＪ遺伝子セグメントを欠失させるか、非機能性にするように、非ヒト動物のゲノムを修飾することと、（ｂ）ゲノム中に、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を定置することと、を含み、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、スペーサーを介して重鎖Ｊ遺伝子セグメント（ＪＨ）配列に作動可能に連結される重鎖Ｖ遺伝子セグメント（ＶＨ）配列を含み、スペーサーは、少なくとも１つのアミノ酸残基を含む、方法が提供される。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される。幾つかの実施形態では、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列は、マウスまたはラット免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列である。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、非ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される。幾つかの実施形態では、非ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列は、マウスまたはラット免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列である。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、内在性の場所（即ち、ヌクレオチド配列は、野生型非ヒト動物において配置される所）に存在する。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、異所的に（例えば、そのゲノム中の内在性免疫グロブリン鎖遺伝子座とは異なる遺伝子座に、またはその内在性遺伝子座中、例えば、内在性遺伝子座がゲノム中の異なる場所に定置もしくは移動される免疫グロブリン可変遺伝子座中に）存在する。幾つかの実施形態では、スペーサーは、単一のアミノ酸残基である。幾つかの実施形態では、スペーサーは、２つのアミノ酸残基である。幾つかの実施形態では、スペーサーは、３つのアミノ酸残基である。幾つかの実施形態では、スペーサーは、４つのアミノ酸残基である。幾つかの実施形態では、スペーサーは、５つのアミノ酸残基である。幾つかの実施形態では、スペーサーは、６つのアミノ酸残基である。幾つかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、重鎖定常ドメイン遺伝子配列に作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列の２つのコピー、３つのコピー、４つのコピー、またはそれ以上をコードする。幾つかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、重鎖定常ドメイン遺伝子配列に作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列の複数のコピーをコードする。
【０１２２】
非ヒト動物を作製するための方法であって、（ａ）非ヒト動物のゲノムを、（ｉ）内在性機能性免疫グロブリン重鎖ＶＨ、Ｄ、及び／またはＪＨ遺伝子セグメント、ならびに（ｉｉ）内在性機能性免疫グロブリン軽鎖Ｖ及びＪ遺伝子セグメント、を欠失させるか、または非機能性にするように修飾することと、（ｂ）（ｉ）再構成された重鎖可変領域核酸配列であって、再構成された重鎖可変領域核酸配列は、スペーサーを介して重鎖Ｊ遺伝子セグメント（ＪＨ）配列に作動可能に連結される重鎖Ｖ遺伝子セグメント（ＶＨ）配列を含み、スペーサーは、少なくとも１つのアミノ酸残基を含む、再構成された重鎖可変領域核酸配列、及び（ｉｉ）ヒトまたは非ヒト軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される、１つ以上であるが野生型より少ない数のヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント（例えば、２つのヒトＶκ遺伝子セグメント及び少なくとも１つのヒトＪκ遺伝子セグメント）、を定置することと、を含む、方法が提供される。幾つかの実施形態では、軽鎖可変領域遺伝子セグメントのうちの少なくとも１つは、対応するヒト生殖系列軽鎖可変遺伝子セグメントによってはコードされない１つ以上のヒスチジンコドンをコードする。
【０１２３】
幾つかの態様では、遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座を含む非ヒト動物を作製するための方法であって、
（ａ）内在性機能性免疫グロブリン軽鎖Ｖ及びＪ遺伝子セグメントを欠失させるか、または非機能性にするように、非ヒト動物のゲノムを修飾することと、
（ｂ）非ヒト動物のゲノム中に、軽鎖定常領域ヌクレオチド配列への作動可能な連結において再構成されたヒト重鎖可変領域ヌクレオチド配列を定置することと、を含む、方法が提供される。
種々の実施形態では、非ヒト動物は、齧歯動物、例えば、マウス、ラット、またはハムスターである。幾つかの実施形態では、齧歯動物は、マウスである。幾つかの実施形態では、軽鎖定常領域は、ラットまたはマウス定常領域、例えば、ラットまたはマウスＣκ定常領域である。
【０１２４】
別の態様では、遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座を含む非ヒト動物を作製するための方法であって、
（ａ）非ヒト動物のゲノムを、
（ｉ）内在性機能性免疫グロブリン重鎖Ｖ、Ｄ、及び／またはＪ遺伝子セグメント、ならびに
（ｉｉ）内在性機能性免疫グロブリン軽鎖Ｖ及びＪ遺伝子セグメント、を欠失させるか、または非機能性にするように修飾することと、
（ｂ）非ヒト動物のゲノム中に、
（ｉ）再構成された重鎖可変ドメインをコードする第１のヌクレオチド配列（即ち、第１のヌクレオチド配列は、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列である）であって、第１のヌクレオチド配列は、軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、第１のヌクレオチド配列、及び
（ｉｉ）ヒトまたは非ヒト軽鎖可変ドメインをコードする第２のヌクレオチド配列（即ち、第２のヌクレオチド配列は、再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列である）であって、第２のヌクレオチド配列は、重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、第２のヌクレオチド配列、を定置することと、を含む、方法が提供される。
種々の実施形態では、非ヒト動物は、齧歯動物、例えば、マウス、ラット、またはハムスターである。幾つかの実施形態では、齧歯動物は、マウスである。幾つかの実施形態では、軽鎖定常領域は、ラットまたはマウス定常領域、例えば、ラットまたはマウスＣκ定常領域である。幾つかの実施形態では、第２のヌクレオチド配列は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、及びそれらの組み合わせから選択されマウスまたはラット重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される。幾つかの実施形態では、第２のヌクレオチド配列は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、及びそれらの組み合わせから選択されるヒト重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される。
【０１２５】
別の態様では、遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座を含む非ヒト動物を作製するための方法であって、
（ａ）非ヒト動物のゲノムを、
（ｉ）内在性機能性免疫グロブリン重鎖Ｖ、Ｄ、及び／またはＪ遺伝子セグメント、ならびに
（ｉｉ）内在性機能性免疫グロブリン軽鎖Ｖ及びＪ遺伝子セグメント、を欠失させるか、または非機能性にするように修飾することと、
（ｂ）非ヒト動物のゲノム中に、
（ｉ）再構成された重鎖可変ドメインをコードする第１のヌクレオチド配列（即ち、第１のヌクレオチド配列は、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列である）であって、第１のヌクレオチド配列は、重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、第１のヌクレオチド配列、及び
（ｉｉ）軽鎖可変ドメインをコードする第２のヌクレオチド配列（即ち、第２のヌクレオチド配列は、再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列である）であって、第２のヌクレオチド配列は、軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、第２のヌクレオチド配列、を定置することと、を含む、方法が提供される。
【０１２６】
別の態様では、遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座を含む非ヒト動物を作製するための方法であって、
（ａ）非ヒト動物のゲノムを、
（ｉ）内在性機能性免疫グロブリン重鎖Ｖ、Ｄ、及び／またはＪ遺伝子セグメント、ならびに
（ｉｉ）内在性機能性免疫グロブリン軽鎖Ｖ及びＪ遺伝子セグメント、を欠失させるか、または非機能性にするように修飾することと、
（ｂ）非ヒト動物のゲノム中に、
（ｉ）第１の対立遺伝子であって、
（１）重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、再構成された重鎖可変ドメインをコードする第１のヌクレオチド配列（即ち、第１のヌクレオチド配列は、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列である）、及び
（２）軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、軽鎖可変ドメインをコードする第２のヌクレオチド配列（即ち、第２のヌクレオチド配列は、再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列である）、を含む、第１の対立遺伝子と、
（ｉｉ）第２の対立遺伝子であって、
（１）重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、軽鎖可変ドメインをコードする第３のヌクレオチド配列（即ち、第３のヌクレオチド配列は、再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列である）、及び
（２）軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、再構成された重鎖可変ドメインをコードする第４のヌクレオチド配列（即ち、第４のヌクレオチド配列は、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列である）、を含む、第２の対立遺伝子と、を定置することと、を含む、方法が提供される。
【０１２７】
別の態様では、遺伝子的に修飾された免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む非ヒト動物を作製する方法であって、（ａ）内在性機能性免疫グロブリン重鎖Ｖ、Ｄ、及び／またはＪ遺伝子セグメントを欠失させるか、または非機能性にするように、非ヒト動物のゲノムを修飾することと、（ｂ）ゲノム中に、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を定置することと、を含み、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、スペーサーを介して重鎖Ｊ遺伝子セグメント（ＪＨ）配列に作動可能に連結される重鎖Ｖ遺伝子セグメント（ＶＨ）配列を含み、スペーサーは、少なくとも１つのアミノ酸残基を含む、方法が提供される。
【０１２８】
別の態様では、遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座を含む非ヒト動物を作製するための方法であって、
（ａ）非ヒト動物のゲノムを、
（ｉ）内在性機能性免疫グロブリン重鎖Ｖ、Ｄ、及び／またはＪ遺伝子セグメント、ならびに
（ｉｉ）内在性機能性免疫グロブリン軽鎖Ｖ及びＪ遺伝子セグメント、を欠失させるか、または非機能性にするように修飾することと、
（ｂ）非ヒト動物のゲノム中に、
（ｉ）重鎖定常領域ヌクレオチド配列に作動可能に連結されている再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列、及び
（ｉｉ）軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結されている１つ以上であるが野生型より少ない数のヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント、を定置することと、を含む、方法が提供される。
種々の実施形態では、非ヒト動物は、齧歯動物、例えば、マウス、ラット、またはハムスターである。幾つかの実施形態では、齧歯動物は、マウスである。幾つかの実施形態では、軽鎖定常領域は、ラットまたはマウス定常領域、例えば、ラットまたはマウスＣκ定常領域である。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト重鎖可変領域核酸配列は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、及びそれらの組み合わせから選択されるマウスまたはラット重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される。幾つかの実施形態では、再構成された重鎖可変領域核酸配列は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、及びそれらの組み合わせから選択されるヒト重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される。
【０１２９】
別の態様では、遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座を含む非ヒト動物を作製するための方法であって、
（ａ）非ヒト動物のゲノムを、
（ｉ）内在性機能性免疫グロブリン重鎖Ｖ、Ｄ、及び／またはＪ遺伝子セグメント、ならびに
（ｉｉ）内在性機能性免疫グロブリン軽鎖Ｖ及びＪ遺伝子セグメント、を欠失させるか、または非機能性にするように修飾することと、
（ｂ）非ヒト動物のゲノム中に、
（ｉ）軽鎖定常領域ヌクレオチド配列に作動可能に連結されている再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列、ならびに
（ｉｉ）重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結されている１つ以上であるが野生型より少ない数のヒト免疫グロブリン軽鎖可変ＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメント、を定置することと、を含む、方法が提供される。
種々の実施形態では、非ヒト動物は、齧歯動物、例えば、マウス、ラット、またはハムスターである。幾つかの実施形態では、齧歯動物は、マウスである。幾つかの実施形態では、軽鎖定常領域は、ラットまたはマウス定常領域、例えば、ラットまたはマウスＣκ定常領域である。
【０１３０】
別の態様では、再構成された重鎖可変ドメインをコードする核酸配列（即ち、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列であるヌクレオチド配列、即ち、予め再構成された可変重鎖ＶＤＪヌクレオチド配列）が、提供される。び幾つかの実施形態では、核酸配列は、ヒトＶ、Ｄ、及びＪ遺伝子配列またはセグメントに由来する。幾つかの実施形態では、核酸配列は、ヒト生殖系列Ｖセグメント、ヒト生殖系列Ｄセグメント、及びヒト生殖系列Ｊセグメントに由来する。幾つかの実施形態では、ヒトＶＨセグメントは、ヒト集団において観察される変異体に対応する。種々の実施形態では、核酸配列は、ＶＨ１−２、ＶＨ１−３、ＶＨ１−８、ＶＨ１−１８、ＶＨ１−２４、ＶＨ１−４５、ＶＨ１−４６、ＶＨ１−５８、ＶＨ１−６９、ＶＨ２−５、ＶＨ２−２６、ＶＨ２−７０、ＶＨ３−７、ＶＨ３−９、ＶＨ３−１１、ＶＨ３−１３、ＶＨ３−１５、ＶＨ３−１６、ＶＨ３−２０、ＶＨ３−２１、ＶＨ３−２３、ＶＨ３−３０、ＶＨ３−３０−３、ＶＨ３−３０−５、ＶＨ３−３３、ＶＨ３−３５、ＶＨ３−３８、ＶＨ３−４３、ＶＨ３−４８、ＶＨ３−４９、ＶＨ３−５３、ＶＨ３−６４、ＶＨ３−６６、ＶＨ３−７２、ＶＨ３−７３、ＶＨ３−７４、ＶＨ４−４、ＶＨ４−２８、ＶＨ４−３０−１、ＶＨ４−３０−２、ＶＨ４−３０−４、ＶＨ４−３１、ＶＨ４−３４、ＶＨ４−３９、ＶＨ４−５９、ＶＨ４−６１、ＶＨ５−５１、ＶＨ６−１、ＶＨ７−４−１、ＶＨ７−８１、及びそれらの多型変異体から成る群から選択されるヒトＶ遺伝子を含む。幾つかの実施形態では、ヒトＶセグメントは、ＶＨ３−２３またはその多型変異体である。種々の実施形態では、核酸配列は、Ｄ１−１、Ｄ１−７、Ｄ１−１４、Ｄ１−２０、Ｄ１−２６、Ｄ２−２、Ｄ２−８、Ｄ２−１５、Ｄ２−２１、Ｄ３−３、Ｄ３−９、Ｄ３−１０、Ｄ３−１６、Ｄ３−２２、Ｄ４−４、Ｄ４−１１、Ｄ４−１７、Ｄ４−２３、Ｄ５−１２、Ｄ５−５、Ｄ５−１８、Ｄ５−２４、Ｄ６−６、Ｄ６−１３、Ｄ６−１９、Ｄ６−２５、Ｄ７−２７、及びそれらの多型変異体から成る群から選択されるヒトＤ遺伝子セグメントを含む。幾つかの実施形態では、核酸配列は、動物において自己反応性でない（非免疫原性の）ヒトＤセグメントを含む。幾つかの実施形態では、核酸配列は、マウスの成熟Ｂ細胞の重鎖可変配列中に発現されることが可能なヒトＤセグメントを含む。幾つかの実施形態では、核酸配列は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、及びそれらの組み合わせから選択されるヒトまたは非ヒト動物重鎖定常領域遺伝子配列をさらに含む。特定の実施形態では、核酸は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３を含む定常領域遺伝子配列を含む。種々の実施形態では、核酸配列は、ＪＨ１、ＪＨ２、ＪＨ３、ＪＨ４、ＪＨ５、ＪＨ６、及びそれらの多型変異体から成る群から選択されるヒトＪ遺伝子セグメントを含む。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒトＶＨ３−２３／ＧＹ／ＪＨ４−４の配列（配列番号１３７）をコードする。幾つかの実施形態では、核酸配列は、ヒトＶＨ３−２３／Ｘ１Ｘ２／Ｊの配列（Ｘ１は、任意のアミノ酸であり、Ｘ２は、任意のアミノ酸である）を含む再構成された重鎖可変ドメインをコードする。幾つかの実施形態では、Ｘ１は、Ｇｌｙであり、Ｘ２は、Ｔｙｒである。幾つかの実施形態では、核酸配列は、ヒトＶＨ３−２３／Ｘ１Ｘ２／ＪＨ４−４の配列（Ｘ１は、任意のアミノ酸であり、Ｘ２は、任意のアミノ酸である）を含む再構成された重鎖可変ドメインをコードする。幾つかの実施形態では、Ｘ２は、フェニル基を含むアミノ酸である。特定の実施形態では、Ｘ２は、Ｔｙｒ及びＰｈｅから選択される。幾つかの実施形態では、核酸配列は、ヒトまたは非ヒト動物軽鎖定常領域遺伝子配列をさらに含む。
【０１３１】
別の態様では、本明細書に記載される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列（即ち、予め再構成された重鎖ＶＤＪ配列）を含む核酸構築物が、提供される。幾つかの実施形態では、核酸構築物は、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列が、ヒトまたは非ヒト動物重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結されるような方法で設計される。幾つかの実施形態では、核酸構築物は、重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列の２つのコピー、３つのコピー、４つのコピー、またはそれ以上を含有する。幾つかの実施形態では、核酸構築物は、標的化ベクターである。幾つかの実施形態では、標的化ベクターは、Ａｄａｍ６ａ／６ｂ遺伝子の欠失に関連付けられる生殖能力問題を防止するために、Ａｄａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはその両方を含む（例えば、参照によりその全体が本明細書に援用される、ＵＳ第２０１２−０３２２１０８Ａ１号を参照）。幾つかの実施形態では、Ａｄａｍ６ａ及びＡｄａｍ６ｂ遺伝子は、ユニバーサル重鎖配列の転写単位の５’上流に定置される。幾つかの実施形態では、標的化ベクターは、組み換え部位に隣接する選択カセットを含む。幾つかの実施形態では、標的化ベクターは、１つ以上の部位特異的組み換え部位（例えば、ｌｏｘＰまたはＦＲＴ部位）を含む。
【０１３２】
別の態様では、重鎖可変領域アミノ酸配列から独立して抗原に結合することが可能な軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列を獲得するための方法であって、（ａ）本明細書に記載される遺伝子的に修飾された非ヒト動物（例えば、重鎖または軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結されている再構成されたヒト重鎖可変領域核酸配列を含む遺伝子的に修飾された動物）を、関心の抗原で免疫付与することであって、非ヒト動物は、抗原に対する免疫応答を開始する、免疫付与することと、（ｂ）遺伝子的に修飾された非ヒト動物の細胞（例えば、成熟Ｂ細胞）から、抗原に特異的に結合する軽鎖可変ドメインの再構成された軽鎖（ＶＪ）核酸配列を獲得することと、を含む、方法が提供される。種々の実施形態では、かかる方法によって産生される軽鎖可変領域が提供される。
【０１３３】
幾つかの態様では、重鎖可変領域から独立して抗原に結合することが可能な免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）ドメインをコードする核酸配列を獲得するための方法であって、（ａ）非ヒト動物を、関心の抗原またはその免疫原で免疫付与することであって、非ヒト動物は、そのゲノム中に（ｉ）重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域核酸配列を含む、免疫付与することと、（ｂ）非ヒト動物に免疫応答を開始させることと、（ｃ）免疫付与された非ヒト動物から、抗原に結合することができる軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を含む細胞を単離することと、（ｄ）細胞から、抗原に結合することができる軽鎖可変ドメイン（ＶＬドメイン）をコードする核酸配列を獲得することと、を含む、方法が提供される。幾つかの実施形態では、重鎖定常領域遺伝子配列は、マウスまたはラット重鎖定常領域遺伝子配列である。幾つかの実施形態では、重鎖定常領域遺伝子配列は、ヒト重鎖定常領域遺伝子配列である。幾つかの実施形態では、遺伝子的に修飾された遺伝子座によって発現される再構成された重鎖可変ドメインは、非ヒト動物に対して自己反応性ではない、即ち、非免疫原性である。幾つかの実施形態では、非ヒト動物は、そのゲノム中に、２つ以上であるが野生型より少ない数のヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント（ＶＬ及びＪＬ）をさらに含む。幾つかの実施形態では、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント（ＶＬ及びＪＬ）は、軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される。幾つかの実施形態では、単離するステップ（ｃ）は、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）またはフローサイトメトリーを介して実行される。幾つかの実施形態では、抗原に結合する軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を含む細胞は、リンパ球である。幾つかの実施形態では、リンパ球は、ナチュラルキラー細胞、Ｔ細胞、またはＢ細胞を含む。幾つかの実施形態では、方法は、（ｃ）’リンパ球を癌細胞と融合させるステップをさらに含む。特定の実施形態では、癌細胞は、骨髄腫細胞である。
【０１３４】
したがって、種々の態様では、重鎖可変ドメインから独立して抗原に結合することが可能な免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）をコードする核酸配列を獲得するための方法であって、
（ａ）非ヒト動物を、関心の抗原またはその免疫原で免疫付与することであって、非ヒト動物は、そのゲノム中に（ｉ）重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域核酸配列、及び（ｉｉ）軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント（ＶＬ及びＪＬ）を含む、免疫付与することと、
（ｂ）非ヒト動物に、免疫応答を開始させることと、
（ｃ）免疫付与された非ヒト動物から、抗原に結合することができる軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を含む細胞を単離することと、
（ｄ）細胞から、抗原に結合することができる軽鎖可変ドメイン（ＶＬドメイン）をコードする核酸配列を獲得することと、を含む、方法が提供される。
幾つかの実施形態では、単離するステップ（ｃ）は、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）またはフローサイトメトリーを介して実行される。幾つかの実施形態では、抗原に結合する軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を含む細胞は、リンパ球である。特定の実施形態では、リンパ球は、ナチュラルキラー細胞、Ｔ細胞、またはＢ細胞を含む。幾つかの実施形態では、方法は、（ｃ）’リンパ球を癌細胞と融合させるステップをさらに含む。特定の実施形態では、癌細胞は、骨髄腫細胞である。幾つかの実施形態では、（ｄ）の核酸配列は、免疫グロブリン定常領域核酸配列をコードする核酸配列と融合される。幾つかの実施形態では、軽鎖定常領域核酸配列は、ヒトカッパ配列またはヒトラムダ配列である。幾つかの実施形態では、軽鎖定常領域核酸配列は、マウスカッパ配列またはマウスラムダ配列である。幾つかの実施形態では、軽鎖定常領域核酸配列は、ラットカッパ配列またはラットラムダ配列である。幾つかの実施形態では、重鎖定常領域核酸配列は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、及びそれらの組み合わせから選択されるヒト配列である。幾つかの実施形態では、重鎖定常領域核酸配列は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、及びそれらの組み合わせから選択されるマウスまたはラットである。幾つかの実施形態では、（ｄ）の核酸配列は、動物のゲノム中の再構成されていないＶＬ遺伝子セグメントに由来する、１つ以上のヒスチジンコドン置換または挿入を含む。
【０１３５】
種々の態様では、重鎖可変ドメインから独立して抗原に結合することが可能な免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）をコードする核酸配列を獲得するための方法であって、
（ａ）非ヒト動物を、関心の抗原またはその免疫原で免疫付与することであって、非ヒト動物は、そのゲノム中に（ｉ）軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域核酸配列、及び（ｉｉ）重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント（ＶＬ及びＪＬ）、を含む、免疫付与することと、
（ｂ）非ヒト動物に、免疫応答を開始させることと、
（ｃ）免疫付与された非ヒト動物から、抗原に結合することができる軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を含む細胞を単離することと、
（ｄ）細胞から、抗原に結合することができる軽鎖可変ドメイン（ＶＬドメイン）をコードする核酸配列を獲得することと、を含む、方法が提供される。
幾つかの実施形態では、単離するステップ（ｃ）は、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）またはフローサイトメトリーを介して実行される。幾つかの実施形態では、抗原に結合する軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を含む細胞は、リンパ球である。特定の実施形態では、リンパ球は、ナチュラルキラー細胞、Ｔ細胞、またはＢ細胞を含む。幾つかの実施形態では、方法は、（ｃ）’リンパ球を癌細胞と融合させるステップをさらに含む。特定の実施形態では、癌細胞は、骨髄腫細胞である。幾つかの実施形態では、（ｄ）の核酸配列は、免疫グロブリン定常領域核酸配列をコードする核酸配列と融合される。幾つかの実施形態では、軽鎖定常領域核酸配列は、ヒトカッパ配列またはヒトラムダ配列である。幾つかの実施形態では、軽鎖定常領域核酸配列は、マウスカッパ配列またはマウスラムダ配列である。幾つかの実施形態では、軽鎖定常領域核酸配列は、ラットカッパ配列またはラットラムダ配列である。幾つかの実施形態では、重鎖定常領域核酸配列は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、及びそれらの組み合わせから選択されるヒト配列である。幾つかの実施形態では、重鎖定常領域核酸配列は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、及びそれらの組み合わせから選択されるマウスまたはラットである。幾つかの実施形態では、（ｄ）の核酸配列は、動物のゲノム中の再構成されていないＶＬ遺伝子セグメントに由来する、１つ以上のヒスチジンコドン置換または挿入を含む。
【０１３６】
幾つかの態様では、重鎖可変ドメインから独立して抗原に結合することが可能な免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）をコードする核酸配列を獲得するための方法であって、
（ａ）非ヒト動物を、関心の抗原またはその免疫原で免疫付与することであって、非ヒト動物は、そのゲノム中に（ｉ）重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域核酸配列、及び（ｉｉ）軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される２つ以上であるが野生型より少ない数のヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント（ＶＬ及びＪＬ）、を含む、免疫付与することと、
（ｂ）非ヒト動物に、免疫応答を開始させることと、
（ｃ）免疫付与された非ヒト動物から、抗原に結合することができる軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を含む細胞を単離することと、
（ｄ）細胞から、抗原に結合することができる軽鎖可変ドメイン（ＶＬドメイン）をコードする核酸配列を獲得することと、を含む、方法が提供される。
幾つかの実施形態では、単離するステップ（ｃ）は、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）またはフローサイトメトリーを介して実行される。幾つかの実施形態では、抗原に結合する軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を含む細胞は、リンパ球である。特定の実施形態では、リンパ球は、ナチュラルキラー細胞、Ｔ細胞、またはＢ細胞を含む。幾つかの実施形態では、方法は、（ｃ）’リンパ球を癌細胞と融合させるステップをさらに含む。特定の実施形態では、癌細胞は、骨髄腫細胞である。幾つかの実施形態では、（ｄ）の核酸配列は、免疫グロブリン定常領域核酸配列をコードする核酸配列と融合される。幾つかの実施形態では、軽鎖定常領域核酸配列は、ヒトカッパ配列またはヒトラムダ配列である。幾つかの実施形態では、軽鎖定常領域核酸配列は、マウスカッパ配列またはマウスラムダ配列である。幾つかの実施形態では、軽鎖定常領域核酸配列は、ラットカッパ配列またはラットラムダ配列である。幾つかの実施形態では、重鎖定常領域核酸配列は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、及びそれらの組み合わせから選択されるヒト配列である。幾つかの実施形態では、重鎖定常領域核酸配列は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、及びそれらの組み合わせから選択されるマウスまたはラットである。幾つかの実施形態では、（ｄ）の核酸配列は、動物のゲノム中の再構成されていないＶＬ遺伝子セグメントに由来する、１つ以上のヒスチジンコドン置換または挿入を含む。
【０１３７】
幾つかの態様では、重鎖可変ドメインから独立して抗原に結合することが可能な免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）をコードする核酸配列を獲得するための方法であって、
（ａ）本明細書に記載される遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座を含有する非ヒト動物を、関心の抗原で免疫付与することであって、非ヒト動物は、そのゲノム中に、重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域核酸配列を含む、免疫付与することと、
（ｂ）非ヒト動物に、免疫応答を開始させることと、
（ｃ）免疫付与された非ヒト動物から、リンパ球（例えば、Ｂ細胞）を採取することと、
（ｄ）リンパ球を骨髄腫細胞と融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成することと、
（ｅ）ハイブリドーマ細胞から、抗原に結合することができる軽鎖可変ドメイン（ＶＬドメイン）をコードする核酸配列を獲得することと、を含む、方法が提供される。
【０１３８】
別の態様では、重鎖可変領域から独立して抗原に結合することが可能な免疫グロブリン軽鎖の免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）核酸配列をコードする核酸配列を獲得するための方法であって、
（ａ）本明細書に記載される遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座を含有する非ヒト動物を、関心の抗原で免疫付与することであって、非ヒト動物は、そのゲノム中に、重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域核酸配列を含む、免疫付与することと、
（ｂ）非ヒト動物に、免疫応答を開始させることと、
（ｃ）重鎖可変領域から独立して抗原に結合するＶＬアミノ酸配列を発現する免疫付与された非ヒト動物から、リンパ球（例えば、Ｂ細胞）を特定することと、
（ｃ）のリンパ球から、（ｃ）のＶＬアミノ酸配列をコードする核酸配列をクローン化することと、を含む、方法が提供される。
【０１３９】
別の態様では、重鎖可変領域から独立して抗原に結合することが可能な免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列を獲得するための方法であって、
（ａ）本明細書に記載される遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座を含有する非ヒト動物を、関心の抗原で免疫付与することであって、非ヒト動物は、そのゲノム中に（ｉ）再構成された重鎖可変ドメインをコードする第１のヌクレオチド配列（即ち、第１のヌクレオチド配列は、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列である）であって、第１のヌクレオチド配列は、軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、第１のヌクレオチド配列と、（ｉｉ）ヒトまたは非ヒト軽鎖可変ドメインをコードする第２のヌクレオチド配列（即ち、第２のヌクレオチド配列は、再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変ヌクレオチド配列である）であって、第２のヌクレオチド配列は、重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、第２のヌクレオチド配列、を含む、免疫付与することと、
（ｂ）非ヒト動物に、免疫応答を開始させることと、
（ｃ）免疫付与された非ヒト動物から、リンパ球（例えば、Ｂ細胞）を採取することと、
（ｄ）リンパ球を骨髄腫細胞と融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成することと、
（ｅ）ハイブリドーマ細胞から、抗原に結合することができる軽鎖可変ドメイン（ＶＬドメイン）をコードする核酸配列を獲得することと、を含む、方法が提供される。
【０１４０】
別の態様では、重鎖可変ドメインから独立して抗原に結合することが可能な免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）をコードする核酸配列を獲得するための方法であって、
（ａ）本明細書に記載される遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座を含有する非ヒト動物を、関心の抗原で免疫付与することであって、非ヒト動物は、そのゲノム中に（ｉ）再構成された重鎖可変ドメインをコードする第１のヌクレオチド配列（即ち、第１のヌクレオチド配列は、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列である）であって、第１のヌクレオチド配列は、軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、第１のヌクレオチド配列と、（ｉｉ）ヒトまたは非ヒト軽鎖可変ドメインをコードする第２のヌクレオチド配列（即ち、第２のヌクレオチド配列は、再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変ヌクレオチド配列である）であって、第２のヌクレオチド配列は、重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、第２のヌクレオチド配列、を含む、免疫付与することと、
（ｂ）非ヒト動物に、免疫応答を開始させることと、
（ｃ）重鎖可変領域から独立して抗原に結合するＶＬアミノ酸配列を発現する免疫付与された非ヒト動物から、リンパ球（例えば、Ｂ細胞）を特定することと、
（ｃ）のリンパ球から、（ｃ）のＶＬアミノ酸配列をコードする核酸配列をクローン化することと、を含む、方法が提供される。
【０１４１】
別の態様では、重鎖可変領域から独立して抗原に結合することが可能な免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列を獲得するための方法であって、
（ａ）本明細書に記載される遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座を含有する非ヒト動物を、関心の抗原で免疫付与することであって、非ヒト動物は、そのゲノム中に（ｉ）重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域核酸配列、及び（ｉｉ）２つ以上であるが野生型より少ない数のヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント（ＶＬ及びＪＬ）、を含む、免疫付与することと、
（ｂ）非ヒト動物に、免疫応答を開始させることと、
（ｃ）免疫付与された非ヒト動物から、リンパ球（例えば、Ｂ細胞）を採取することと、
（ｄ）リンパ球を骨髄腫細胞と融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成することと、
（ｅ）ハイブリドーマ細胞から、抗原に結合することができる軽鎖可変ドメイン（ＶＬドメイン）をコードする核酸配列を獲得することと、を含む、方法が提供される。
【０１４２】
別の態様では、重鎖可変領域から独立して抗原に結合することが可能な免疫グロブリン軽鎖の免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）核酸配列を獲得するための方法であって、
（ａ）本明細書に記載される遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座を含有する非ヒト動物を、関心の抗原で免疫付与することであって、非ヒト動物は、そのゲノム中に（ｉ）重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域核酸配列、及び（ｉｉ）２つ以上であるが野生型より少ない数のヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント（ＶＬ及びＪＬ）、を含む、免疫付与することと、
（ｂ）非ヒト動物に、免疫応答を開始させることと、
（ｃ）重鎖可変領域から独立して抗原に結合するＶＬアミノ酸配列を発現する免疫付与された非ヒト動物から、リンパ球（例えば、Ｂ細胞）を特定することと、
（ｃ）のリンパ球から、（ｃ）のＶＬアミノ酸配列をコードする核酸配列をクローン化することと、を含む、方法が提供される。
【０１４３】
種々の実施形態では、本明細書に記載される軽鎖可変ドメインは、エフェクター軽鎖可変ドメインである。幾つかの実施形態では、エフェクター軽鎖可変ドメインは、ＦｃＲｎに特異的に結合して、多重特異性抗体の半減期を改善する。例えば、二重特異性抗体は、抗原に結合する重鎖可変ドメインと、ＦｃＲｎに結合する軽鎖可変ドメインとを含む。幾つかの実施形態では、本明細書に記載される遺伝子的に修飾されたマウスは、ＦｃＲＮで免疫付与されて、専ら軽鎖を通じてＦｃＲＮに結合する抗体を獲得する。遺伝子的に修飾された非ヒト動物によって産生されるこれらの軽鎖は、二重特異性抗体がＦｃＲｎに関連するのに役立つ、ユニバーサルなまたは共通の軽鎖として使用され、それによって半減期を増加させるのを助ける。抗体の残り（例えば、第２の異なる軽鎖か、またはＦｃＲｎとは異なる抗原に結合する重鎖かのいずれか）は、第２の機能を実施するように選択される。
【０１４４】
追加の態様では、本明細書に記載される方法のいずれかによって獲得可能な遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座が、提供される。種々の実施形態では、本明細書に記載される方法によって産生される軽鎖可変領域、及びかかる軽鎖可変領域をコードする核酸配列も提供される。
【０１４５】
幾つかの態様では、（１）重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列と、（２）軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列と、を含む、非ヒト動物の生殖系列ゲノム中の免疫グロブリン遺伝子座が提供される。幾つかの態様では、（１）軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列と、（２）重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列と、を含む、非ヒト動物の生殖系列ゲノム中の免疫グロブリン遺伝子座が提供される。幾つかの態様では、（１）重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列と、（２）２つ以上であるが野生型より少ない数のヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント（ＶＬ及びＪＬ）をコードするヌクレオチド配列と、を含む、非ヒト動物の生殖系列ゲノム中の免疫グロブリン遺伝子座が提供される。幾つかの実施形態では、軽鎖定常領域遺伝子配列は、κ軽鎖定常領域遺伝子配列である。幾つかの実施形態では、軽鎖定常領域遺伝子配列は、λ軽鎖定常領域遺伝子配列である。幾つかの実施形態では、軽鎖定常領域遺伝子配列は、マウスまたはラット軽鎖定常領域遺伝子配列である。幾つかの実施形態では、軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、κ軽鎖可変領域遺伝子配列である。幾つかの実施形態では、軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、λ軽鎖可変領域遺伝子配列である。幾つかの実施形態では、軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、マウスまたはラット軽鎖可変領域遺伝子配列である。
【０１４６】
追加の態様は、本明細書に記載される遺伝子的に修飾された非ヒト動物によって作製される抗原結合タンパク質（例えば、抗体）を含む。同様に、本明細書に記載される遺伝子的に修飾された非ヒト動物に由来するか、またはそれによって産生される（即ち、再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントから発現される）軽鎖可変領域（ＶＬ）配列を有する、抗原結合タンパク質（例えば、組み換え抗体）も提供される。幾つかの実施形態では、本明細書に記載される方法によって産生される抗原結合タンパク質は、重鎖及び軽鎖を含み、重鎖は、抗原への軽鎖の結合に干渉せず、及び／または重鎖は、軽鎖の不の不在下で抗原に結合しない。幾つかの実施形態では、軽鎖可変ドメインは、重鎖の不の不在下ででは、重鎖の存在下よりも１桁しか大きくないＫＤで関心の抗原に結合する（例えば、重鎖の存在下ではＫＤは約１０−１０、または重鎖の不の不在下でではＫＤは約１０−９である）。幾つかの実施形態では、本明細書に記載される抗原結合タンパク質は、１０−６、１０−７、１０−８、１０−９、または１０−１０未満の親和性（ＫＤ）で関心の抗原に特異的に結合することができる免疫グロブリン軽鎖を含む。幾つかの実施形態では、該方法によって産生される免疫グロブリン軽鎖は、重鎖可変領域の不の不在下でで、１０−６、１０−７、１０−８、１０−９、または１０−１０未満の親和性（ＫＤ）で関心の抗原に特異的に結合することが可能である。
【０１４７】
種々の実施形態では、本明細書に記載されるように生成される軽鎖可変ドメインは、標的分子（「Ｔ」）に特異的に結合する。標的分子は、任意のタンパク質、ポリペプチド、またはその活性もしくは細胞外濃度が減衰、低減、または排除されことが望ましい他の巨体分子である。多くの場合、軽鎖可変領域が結合する標的分子は、タンパク質またはポリペプチド（即ち、「標的タンパク質」）であるが、標的分子（「Ｔ」）が、炭水化物、糖タンパク質、脂質、リポタンパク質、リポ多糖類、または軽鎖可変領域が結合する他の非タンパク質ポリマーもしくは分子である実施形態も、提供される。種々の実施形態では、Ｔは、細胞表面に発現される標的タンパク質または可溶性標的タンパク質であることができる。抗原結合分子による標的結合は、細胞外または細胞表面文脈で発生することができる。しかしながら、特定の実施形態では、抗原結合分子は、標的分子を、細胞内で、例えば、小胞体、ゴルジ、エンドソーム、リソソームなどの細胞内成分の内部で結合する。細胞表面に発現される標的分子の例としては、細胞表面に発現される受容体、膜結合リガンド、イオンチャネル、及び細胞膜に付着するか、または細胞膜に関連付けられる細胞外部分を有する任意の他の単量体または多量体ポリペプチド成分が挙げられる。本明細書に提供される多重特異性抗原結合分子によって標的化されることができる非限定的で例示的な細胞表面に発現される標的分子としては、例えば、サイトカイン受容体（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１３、ＩＬ−２２、ＩＬ−２５、ＩＬ−３３などに対する受容体）、及びＰＲＬＲなどの他のタイプ１膜貫通受容体、ＧＣＧＲなどのＧ−タンパク質共役型受容体、Ｎａｖ１．７、ＡＳＩＣ１、またはＡＳＩＣ２などのイオンチャネル、ＭＨＣ−Ｉなどの非受容体表面タンパク質（例えば、ＨＬＡ−Ｂ＊２７）を含む細胞表面標的などが挙げられる。Ｔが細胞表面に発現される標的タンパク質である実施形態では、多重特異性抗原結合分子のＤ１成分は、例えば、細胞表面に発現される標的タンパク質と特異的に相互作用するＴ、またはリガンドもしくはリガンドの一部分に特異的に結合する、抗体または抗体の抗原結合断片であることができる。例えば、ＴがＩＬ−４Ｒである場合、Ｄ１成分は、ＩＬ−４またはその受容体結合部分を含むか、またはＩＬ−４またはその受容体結合部分から成ることができる。可溶性標的分子の例としては、サイトカイン、成長因子、ならびに他のリガンド及びシグナルタンパク質が挙げられる。本明細書に提供される多重特異性  抗原結合  分子によって標的化されることができる非限定的で例示的な可溶性標的タンパク質としては、例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１３、ＩＬ−２２、ＩＬ−２５、ＩＬ−３３、ＳＯＳＴ、ＤＫＫ１などが挙げられる。可溶性標的分子としてはまた、例えば、アレルゲン（例えば、Ｆｅｌ  Ｄ１、Ｂｅｔｖ１、ＣｒｙＪ１）、病原体（例えば、カンジダアルビカンス、黄色ブドウ球菌など）などの非ヒト標的分子、及び病原性分子（例えば、リポ多糖類（ＬＰＳ）、リポテコイック酸（ＬＴＡ）、タンパク質Ａ、毒素など）が挙げられる。Ｔが可溶性標的分子である実施形態では、多重特異性抗原結合分子のＤ１成分は、例えば、可溶性標的分子と特異的に相互作用するＴ、または受容体もしくは受容体の一部分に特異的に結合する、抗体または抗体の抗原結合断片であることができる。例えば、ＴがＩＬ−４である場合、Ｄ１成分は、ＩＬ−４Ｒまたはそのリガンド結合部分を含むか、またはＩＬ−４Ｒまたはそのリガンド結合部分から成ることができる。標的分子としてはまた、腫瘍関連抗原も挙げられる。
【０１４８】
別の態様では、抗原結合タンパク質（例えば、二重特異性または三重特異性抗体）は、再構成されたヒト重鎖可変領域核酸配列を有する免疫グロブリン遺伝子座を含む非ヒト動物（即ち、予め設計された、再構成された重鎖ＶＤＪ配列を含む動物）に由来する（即ち、それによって生成されるヒト軽鎖可変領域（ＶＬ）配列を有する）抗原特異的軽鎖可変ドメインを利用して、調製することができる。かかる抗原特異的な逆キメラ（例えば、ヒト可変／マウス定常）軽鎖は、好適なヒト軽鎖定常領域配列を有する発現ベクターにフレーム内でクローン化されることができる抗原特異的軽鎖可変領域配列を駆動するために使用することができる。再構成されたヒト重鎖可変領域核酸配列を有する免疫グロブリン遺伝子座を含む動物（即ち、予め設計された再構成された重鎖ＶＤＪ配列を含むマウス）からの、（抗原特異的軽鎖と同一のまたは異なる抗原上の異なるエピトープに特異的な）抗原特異的ヒト重鎖可変領域（単数または複数）は、ヒト重鎖定常領域配列を含む発現ベクターへフレーム内でクローン化されることができ、抗原特異的ヒト軽鎖及び重鎖は、抗原結合タンパク質（例えば、二重特異性または三重特異性ヒト抗体）を獲得するのに好適な細胞内で共発現されることができる。別法として、事前に選択された抗原特異的重鎖、例えば、再構成されたヒト重鎖可変領域核酸配列において使用されるものと同一の可変領域遺伝子セグメントに由来する軽鎖を含む抗体からの重鎖は、ヒト重鎖定常領域配列を含む発現ベクターへフレーム内でクローン化されてもよく、抗原特異的ヒト軽鎖及び重鎖は、抗原結合タンパク質（例えば、二重特異性または三重特異性ヒト抗体）を獲得するのに好適な細胞内で共発現されることができる。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、非ヒト重鎖定常領域遺伝子配列（例えば、マウスまたはラット、カッパまたはラムダ）に作動可能に連結される。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、非ヒト軽鎖定常領域遺伝子配列（例えば、マウスまたはラット、カッパまたはラムダ）に作動可能に連結される。幾つかの実施形態では、ヒト軽鎖可変領域（ＶＬ）配列は、カッパ遺伝子配列である。
【０１４９】
別の態様では、多重特異性抗原結合タンパク質を作製するための方法であって、
（ａ）本明細書に記載される第１の遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座を含有する第１の非ヒト動物を、関心の抗原で免疫付与することであって、第１の非ヒト動物は、そのゲノム中に（ｉ）重鎖定常領域核酸配列作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む、免疫付与することと、
（ｂ）第１の非ヒト動物に、免疫応答を開始させることと、
（ｃ）免疫付与された第１の非ヒト動物から、第１のリンパ球（例えば、Ｂ細胞）を採取することであって、第１のリンパ球は、親和性成熟された抗体を発現し、親和性成熟された抗体は、非ヒト定常ドメインと融合されるヒト可変ドメインを含む、採取することと、
（ｄ）親和性成熟された抗体のヒト軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を特定することと、
（ｅ）（ｄ）の核酸配列を、好適なヒト定常領域核酸配列（例えば、ヒトラムダまたはカッパ配列）と共に第１の発現構築物にフレーム内でクローン化して、第１のポリペプチド遺伝子を形成することと、
（ｆ）本明細書に記載される遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座を含有する第２の非ヒト動物を、第２の関心の抗原で免疫付与することであって、第２の非ヒト動物は、そのゲノム中に（ｉ）非ヒト重鎖定常領域核酸配列に連結される再構成されていないヒトＶ、Ｄ、及びＪ遺伝子セグメント、及び（ｉｉ）単一の再構成されたヒト軽鎖可変領域配列、を含む、免疫付与することと、
（ｇ）第２の非ヒト動物に、免疫応答を開始させることと、
（ｈ）免疫付与された第２の非ヒト動物から、第２のリンパ球を採取することであって、第２のリンパ球は、親和性成熟された抗体を発現し、親和性成熟された抗体は、非ヒト定常ドメインと融合されるヒト重鎖可変ドメインを含む、採取することと、
（ｉ）第２の抗原に特異的に結合する親和性成熟された抗体のヒト重鎖可変ドメインをコードする核酸配列を特定することと、
（ｊ）（ｉ）の核酸配列を、好適なヒト定常領域核酸配列（例えば、ヒトＩｇＧ１定常配列）と共に第２の発現構築物にフレーム内でクローン化して、第２のポリペプチド遺伝子を形成することと、
（ｋ）第１の発現構築物及び第２の発現構築物を、第１のポリペプチド遺伝子及び第２のポリペプチド遺伝子を発現するのに好適な細胞内へ導入して、第２のポリペプチドの二量体を含む抗原結合タンパク質を形成することであって、第２のポリペプチドの各単量体は、第１のポリペプチドの単量体に関連付けられる、形成することと、を含む、方法が提供される。
種々の実施形態では、第１の発現構築物及び第２の発現構築物は、別々のベクター上にある。種々の実施形態では、第１の発現構築物及び第２の発現構築物は、同一のベクター上にある。種々の実施形態では、第１の抗原及び第２の抗原は、異なる。１つの実施形態では、第１の抗原及び第２の抗原は、同一である。種々の実施形態では、第１の抗原は、細胞表面受容体であり、第２の抗原は、細胞表面に結合された可溶性抗原及び抗原から選択される。特定の実施形態では、第１の抗原は、Ｆｃ受容体（例えば、ＦｃＲＮ）であり、第２の抗原は、可溶性タンパク質であり、抗原結合タンパク質は、非ヒト動物のゲノム中のＶＬ遺伝子セグメントに由来する１つ以上のヒスチジン置換及び挿入を含む。
【０１５０】
別の態様では、多重特異性抗原結合タンパク質を作製するための方法であって、
（ａ）本明細書に記載される第１の遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座を含有する第１の非ヒト動物を、関心の抗原で免疫付与することであって、第１の非ヒト動物は、そのゲノム中に（ｉ）再構成された重鎖可変ドメインをコードする第１のヌクレオチド配列（即ち、第１のヌクレオチド配列は、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列である）であって、第１のヌクレオチド配列は、軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、第１のヌクレオチド配列、及び（ｉｉ）ヒトまたは非ヒト軽鎖可変ドメインをコードする第２のヌクレオチド配列（即ち、第２のヌクレオチド配列は、再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変ヌクレオチド配列である）であって、第２のヌクレオチド配列は、重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、第２のヌクレオチド配列、を含む、免疫付与することと、
（ｂ）第１の非ヒト動物に、免疫応答を開始させることと、
（ｃ）免疫付与された第１の非ヒト動物から、第１のリンパ球（例えば、Ｂ細胞）を採取することであって、第１のリンパ球は、親和性成熟された抗体を発現し、親和性成熟された抗体は、非ヒト定常ドメインと融合されるヒト可変ドメインを含む、採取することと、
（ｄ）親和性成熟された抗体のヒト軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を特定することと、
（ｅ）（ｄ）の核酸配列を、好適なヒト定常領域核酸配列（例えば、ヒトラムダまたはカッパ配列）と共に第１の発現構築物にフレーム内でクローン化して、第１のポリペプチド遺伝子を形成することと、
（ｆ）本明細書に記載される遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座を含有する第２の非ヒト動物を、第２の関心の抗原で免疫付与することであって、第２の非ヒト動物は、そのゲノム中に（ｉ）非ヒト重鎖定常領域核酸配列に連結される再構成されていないヒトＶ、Ｄ、及びＪ遺伝子セグメント、及び（ｉｉ）単一の再構成されたヒト軽鎖可変領域配列、を含む、免疫付与することと、
（ｇ）第２の非ヒト動物に、免疫応答を開始させることと、
（ｈ）免疫付与された第２の非ヒト動物から、第２のリンパ球を採取することであって、第２のリンパ球は、親和性成熟された抗体を発現し、親和性成熟された抗体は、非ヒト定常ドメインと融合されるヒト重鎖可変ドメインを含む、採取することと、
（ｉ）第２の抗原に特異的に結合する親和性成熟された抗体のヒト重鎖可変ドメインをコードする核酸配列を特定することと、
（ｊ）（ｉ）の核酸配列を、好適なヒト定常領域核酸配列（例えば、ヒトＩｇＧ１定常配列）と共に第２の発現構築物にフレーム内でクローン化して、第２のポリペプチド遺伝子を形成することと、
（ｋ）第１の発現構築物及び第２の発現構築物を、第１のポリペプチド遺伝子及び第２のポリペプチド遺伝子を発現するのに好適な細胞内へ導入して、第２のポリペプチドの二量体を含む抗原結合タンパク質を形成することであって、第２のポリペプチドの各単量体は、第１のポリペプチドの単量体に関連付けられる、形成することと、を含む、方法が提供される。
種々の実施形態では、第１の発現構築物及び第２の発現構築物は、別々のベクター上にある。種々の実施形態では、第１の発現構築物及び第２の発現構築物は、同一のベクター上にある。幾つかの実施形態では、第１の抗原及び第２の抗原は、異なる。幾つかの実施形態では、第１の抗原及び第２の抗原は、同一である。種々の実施形態では、第１の抗原は、細胞表面受容体であり、第２の抗原は、細胞表面に結合された可溶性抗原及び抗原から選択される。特定の実施形態では、第１の抗原は、Ｆｃ受容体（例えば、ＦｃＲＮ）であり、第２の抗原は、可溶性タンパク質であり、抗原結合タンパク質は、非ヒト動物のゲノム中のＶＬ遺伝子セグメントに由来する１つ以上のヒスチジン置換及び挿入を含む。
【０１５１】
別の態様では、多重特異性抗原結合タンパク質を作製するための方法であって、
（ａ）本明細書に記載される第１の遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座を含有する第１の非ヒト動物を、関心の抗原で免疫付与することであって、第１の非ヒト動物は、そのゲノム中に（ｉ）重鎖定常領域核酸配列作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列、及び（ｉｉ）２つ以上であるが野生型より少ない数のヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント（ＶＬ及びＪＬ）、を含む、免疫付与することと、
（ｂ）第１の非ヒト動物に、免疫応答を開始させることと、
（ｃ）免疫付与された第１の非ヒト動物から、第１のリンパ球（例えば、Ｂ細胞）を採取することであって、第１のリンパ球は、親和性成熟された抗体を発現し、親和性成熟された抗体は、非ヒト定常ドメインと融合されるヒト可変ドメインを含む、採取することと、
（ｄ）親和性成熟された抗体のヒト軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を特定することと、
（ｅ）（ｄ）の核酸配列を、好適なヒト定常領域核酸配列（例えば、ヒトラムダまたはカッパ配列）と共に第１の発現構築物にフレーム内でクローン化して、第１のポリペプチド遺伝子を形成することと、
（ｆ）本明細書に記載される遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座を含有する第２の非ヒト動物を、第２の関心の抗原で免疫付与することであって、第２の非ヒト動物は、そのゲノム中に（ｉ）非ヒト重鎖定常領域核酸配列に連結される再構成されていないヒトＶ、Ｄ、及びＪ遺伝子セグメント、ならびに（ｉｉ）単一の再構成されたヒト軽鎖可変領域配列、を含み、単一の再構成されたヒト軽鎖可変領域配列は、ステップ（ｃ）の軽鎖可変ドメインをコードするＶＬ遺伝子セグメントと同一のＶＬ遺伝子セグメントに由来する、免疫付与することと、
（ｇ）第２の非ヒト動物に、免疫応答を開始させることと、
（ｈ）免疫付与された第２の非ヒト動物から、第２のリンパ球を採取することであって、第２のリンパ球は、親和性成熟された抗体を発現し、親和性成熟された抗体は、非ヒト定常ドメインと融合されるヒト重鎖可変ドメインを含む、採取することと、
（ｉ）第２の抗原に特異的に結合する親和性成熟された抗体のヒト重鎖可変ドメインをコードする核酸配列を特定することと、
（ｊ）（ｉ）の核酸配列を、好適なヒト定常領域核酸配列（例えば、ヒトＩｇＧ１定常配列）と共に第２の発現構築物にフレーム内でクローン化して、第２のポリペプチド遺伝子を形成することと、
（ｋ）第１の発現構築物及び第２の発現構築物を、第１のポリペプチド遺伝子及び第２のポリペプチド遺伝子を発現するのに好適な細胞内へ導入して、第２のポリペプチドの二量体を含む抗原結合タンパク質を形成することであって、第２のポリペプチドの各単量体は、第１のポリペプチドの単量体に関連付けられる、形成することと、を含む、方法が提供される。
種々の実施形態では、第１の発現構築物及び第２の発現構築物は、別々のベクター上にある。種々の実施形態では、第１の発現構築物及び第２の発現構築物は、同一のベクター上にある。種々の実施形態では、第１の抗原及び第２の抗原は、異なる。種々の実施形態では、第１の抗原及び第２の抗原は、同一である。種々の実施形態では、第１の抗原は、細胞表面受容体であり、第２の抗原は、細胞表面に結合された可溶性抗原及び抗原から選択される。種々の実施形態では、第１の抗原は、Ｆｃ受容体（例えば、ＦｃＲＮ）であり、第２の抗原は、可溶性タンパク質であり、抗原結合タンパク質は、非ヒト動物のゲノム中のＶＬ遺伝子セグメントに由来する１つ以上のヒスチジン置換及び挿入を含む。
【０１５２】
別の態様では、多重特異性抗原結合タンパク質を作製するための方法であって、
（ａ）本明細書に記載される遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座を含有する非ヒト動物を、第１の抗原で免疫付与することであって、非ヒト動物は、そのゲノム中に（ｉ）重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列、ならびに（ｉｉ）１つ以上のヒト免疫グロブリンＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメント、を含む、免疫付与することと、
（ｂ）非ヒト動物に、免疫応答を開始させることと、
（ｃ）免疫付与された非ヒト動物から、リンパ球（例えば、Ｂ細胞）を採取することであって、リンパ球は、マウス免疫グロブリン定常ドメインに融合されるヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む親和性成熟された抗体を発現する、採取することと、
（ｄ）親和性成熟された抗体のヒト軽鎖可変ドメインをコードする第１の核酸配列を特定することと、
（ｅ）（ｄ）の第１の核酸配列を、ヒト軽鎖定常領域核酸配列と共に第１の発現ベクターにフレーム内でクローン化することと、
（ｆ）宿主細胞内へ、（ｉ）第１の核酸配列をヒト軽鎖定常領域核酸配列と共にフレーム内に含む、第１の発現ベクター、及び（ｉｉ）ヒト重鎖定常領域に融合される第１の抗原特異的重鎖可変ドメインをコードする第２の核酸配列を含む、第２の発現ベクター、を導入することと、
（ｇ）宿主細胞を培養して、多重特異性抗体の発現を可能にすることと、
（ｈ）多重特異性抗体を単離することであって、多重特異性抗体は、第１の抗原特異的重鎖及び軽鎖可変ドメインを含み、多重特異性抗体の重鎖可変ドメインは、軽鎖可変ドメインとは別個の抗原結合特異性を示す、単離することと、を含む、方法が提供される。
種々の実施形態では、多重特異性抗体は、二重特異性抗体である。幾つかの実施形態では、多重特異性抗体は、三重特異性抗体であり、ステップ（ｆ）は、ヒト重鎖定常領域配列と融合される第２の抗原特異的重鎖可変ドメインをコードする第３の核酸配列を含む第３の発現ベクターを導入することをさらに含む。
【０１５３】
別の態様では、多重特異性抗原結合タンパク質を作製するための方法であって、
（ａ）本明細書に記載される遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座を含有する非ヒト動物を、第１の抗原で免疫付与することであって、非ヒト動物は、そのゲノム中に（ｉ）重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成された重鎖可変ドメイン、ならびに（ｉｉ）１つ以上であるが野生型より少ない数のヒト免疫グロブリンＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメント、を含む、免疫付与することと、
（ｂ）非ヒト動物に、免疫応答を開始させることと、
（ｃ）免疫付与された非ヒト動物から、リンパ球（例えば、Ｂ細胞）を採取することであって、リンパ球は、マウス免疫グロブリン定常ドメインに融合されるヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む親和性成熟された抗体を発現する、採取することと、
（ｄ）親和性成熟された抗体のヒト軽鎖可変ドメインをコードする第１の核酸配列を特定することと、
（ｅ）（ｄ）の第１の核酸配列を、ヒト軽鎖定常領域核酸配列と共に第１の発現ベクターにフレーム内でクローン化することと、
（ｆ）宿主細胞内へ、（ｉ）第１の核酸配列をヒト軽鎖定常領域核酸配列と共にフレーム内に含む、第１の発現ベクター、及び（ｉｉ）ヒト重鎖定常領域に融合される第１の抗原特異的重鎖可変ドメインをコードする第２の核酸配列を含む、第２の発現ベクター、を導入することと、
（ｇ）宿主細胞を培養して、多重特異性抗体の発現を可能にすることと、
（ｈ）多重特異性抗体を単離することであって、多重特異性抗体は、第１の抗原特異的重鎖及び軽鎖可変ドメインを含み、多重特異性抗体の重鎖可変ドメインは、軽鎖可変ドメインとは別個の抗原結合特異性を示す、単離することと、を含む、方法が提供される。
種々の実施形態では、多重特異性抗体は、二重特異性抗体である。幾つかの実施形態では、多重特異性抗体は、三重特異性抗体であり、ステップ（ｆ）は、ヒト重鎖定常領域配列と融合される第２の抗原特異的重鎖可変ドメインをコードする第３の核酸配列を含む第３の発現ベクターを導入することをさらに含む。
【０１５４】
別の態様では、重鎖可変ドメインから独立して抗原に結合することができる免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質を作製するための方法が提供される。かかる方法は、
（ａ）遺伝子的に修飾された非ヒト動物を、第１のエピトープまたはその免疫原性部分を含む第１の抗原で免疫付与することであって、非ヒト動物は、そのゲノム中に、
（ｉ）重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されたヒト重鎖可変領域核酸配列、及び
（ｉｉ）免疫グロブリン軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント（ＶＬ及びＪＬ）、を含む、免疫付与することと、
（ｂ）非ヒト動物に、第１のエピトープまたはその免疫原性部分に対する免疫応答を開始させることと、
（ｃ）非ヒト動物から、第１のエピトープまたはその免疫原性部分に特異的に結合する軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を含む細胞を単離することと、
（ｄ）（ｃ）の細胞から、第１のエピトープまたはその免疫原性部分に特異的に結合する軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を獲得することと、
（ｅ）（ｄ）の核酸配列を、ヒト免疫グロブリン定常領域核酸配列に融合される、発現構築物において採用することと、
（ｆ）（ｄ）の核酸配列を、第２の抗原またはエピトープに特異的に結合するヒト免疫グロブリン重鎖を発現する産生細胞株の中に発現させて、その軽鎖が（ｄ）の核酸によってコードされ、重鎖から独立して第１のエピトープまたはその免疫原性部分に結合し、またその重鎖が第２の抗原またはエピトープに特異的に結合する、抗原結合タンパク質を形成することと、を含む。
幾つかの実施形態では、再構成されていないヒト軽鎖ＶＬまたはＪＬ遺伝子セグメントのうちの少なくとも１つは、対応するヒト生殖系列軽鎖可変遺伝子セグメントによってはコードされない１つ以上のヒスチジンコドンをコードする。幾つかの実施形態では、第１のエピトープは、細胞表面受容体に由来する。特定の実施形態では、Ｆｃ受容体は、ＦｃＲｎである。特定の実施形態では、Ｆｃ受容体は、ＦｃＲｎである。幾つかの実施形態では、第２の抗原またはエピトープは、可溶性抗原に由来する。幾つかの実施形態では、第２の抗原またはエピトープは、細胞表面受容体に由来する。幾つかの実施形態では、第１の抗原は、Ｆｃ受容体であり、第２の抗原は、可溶性タンパク質であり、抗原結合タンパク質は、非ヒト動物のゲノム中のＶＬ遺伝子セグメントに由来する、１つ以上のヒスチジン置換及び挿入を含む。
【０１５５】
別の態様では、重鎖可変ドメインから独立して抗原に結合することができる免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質を作製するための方法が提供される。かかる方法は、
（ａ）遺伝子的に修飾された非ヒト動物を、第１のエピトープまたはその免疫原性部分を含む第１の抗原で免疫付与することであって、非ヒト動物は、そのゲノム中に、
（ｉ）軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されたヒト重鎖可変領域核酸配列、及び
（ｉｉ）免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント（ＶＬ及びＪＬ）を含む、免疫付与することと、
（ｂ）非ヒト動物に、第１のエピトープまたはその免疫原性部分に対する免疫応答を開始させることと、
（ｃ）非ヒト動物から、第１のエピトープまたはその免疫原性部分に特異的に結合する軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を含む細胞を単離することと、
（ｄ）（ｃ）の細胞から、第１のエピトープまたはその免疫原性部分に特異的に結合する軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を獲得することと、
（ｅ）（ｄ）の核酸配列を、ヒト免疫グロブリン定常領域核酸配列に融合される、発現構築物において採用することと、
（ｆ）（ｄ）の核酸配列を、第２の抗原またはエピトープに特異的に結合するヒト免疫グロブリン重鎖を発現する産生細胞株の中に発現させて、その軽鎖が（ｄ）の核酸によってコードされ、重鎖から独立して第１のエピトープまたはその免疫原性部分に結合し、またその重鎖が第２の抗原またはエピトープに特異的に結合する、抗原結合タンパク質を形成することと、を含む。
幾つかの実施形態では、再構成されていないヒト軽鎖ＶＬまたはＪＬ遺伝子セグメントのうちの少なくとも１つは、対応するヒト生殖系列軽鎖可変遺伝子セグメントによってはコードされない１つ以上のヒスチジンコドンをコードする。幾つかの実施形態では、第１のエピトープは、細胞表面受容体に由来する。特定の実施形態では、Ｆｃ受容体は、ＦｃＲｎである。特定の実施形態では、Ｆｃ受容体は、ＦｃＲｎである。幾つかの実施形態では、第２の抗原またはエピトープは、可溶性抗原に由来する。幾つかの実施形態では、第２の抗原またはエピトープは、細胞表面受容体に由来する。幾つかの実施形態では、第１の抗原は、Ｆｃ受容体であり、第２の抗原は、可溶性タンパク質であり、抗原結合タンパク質は、非ヒト動物のゲノム中のＶＬ遺伝子セグメントに由来する、１つ以上のヒスチジン置換及び挿入を含む。
【０１５６】
別の態様では、重鎖可変ドメインから独立して抗原に結合することができる免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質を作製するための方法が提供される。かかる方法は、
（ａ）遺伝子的に修飾された非ヒト動物を、第１のエピトープまたはその免疫原性部分を含む第１の抗原で免疫付与することであって、非ヒト動物は、そのゲノム中に、
（ｉ）重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されたヒト重鎖可変領域核酸配列、及び
（ｉｉ）免疫グロブリン軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される２つ以上であるが野生型より少ない数のヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント（ＶＬ及びＪＬ）、を含む、免疫付与することと、
（ｂ）非ヒト動物に、第１のエピトープまたはその免疫原性部分に対する免疫応答を開始させることと、
（ｃ）非ヒト動物から、第１のエピトープまたはその免疫原性部分に特異的に結合する軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を含む細胞を単離することと、
（ｄ）前記（ｃ）の細胞から、前記第１のエピトープまたはその免疫原性部分に特異的に結合する前記軽鎖可変ドメインをコードする前記核酸配列を獲得することと、
（ｅ）（ｄ）の核酸配列を、ヒト免疫グロブリン定常領域核酸配列に融合される、発現構築物において採用することと、
（ｆ）（ｄ）の核酸配列を、第２の抗原またはエピトープに特異的に結合するヒト免疫グロブリン重鎖を発現する産生細胞株の中に発現させて、その軽鎖が（ｄ）の核酸によってコードされ、重鎖から独立して第１のエピトープまたはその免疫原性部分に結合し、またその重鎖が第２の抗原またはエピトープに特異的に結合する、抗原結合タンパク質を形成することと、を含む。
幾つかの実施形態では、ヒト軽鎖ＶＬまたはＪＬ遺伝子セグメントのうちの少なくとも１つは、対応するヒト生殖系列軽鎖可変遺伝子セグメントによってはコードされない１つ以上のヒスチジンコドンをコードする。幾つかの実施形態では、第１のエピトープは、細胞表面受容体に由来する。特定の実施形態では、Ｆｃ受容体は、ＦｃＲｎである。特定の実施形態では、Ｆｃ受容体は、ＦｃＲｎである。幾つかの実施形態では、第２の抗原またはエピトープは、可溶性抗原に由来する。幾つかの実施形態では、第２の抗原またはエピトープは、細胞表面受容体に由来する。幾つかの実施形態では、第１の抗原は、Ｆｃ受容体であり、第２の抗原は、可溶性タンパク質であり、抗原結合タンパク質は、非ヒト動物のゲノム中のＶＬ遺伝子セグメントに由来する、１つ以上のヒスチジン置換及び挿入を含む。
【０１５７】
別の態様では、本明細書に記載される抗原結合タンパク質の容易な分離を可能にするために、重鎖のうちの１つは、タンパク質Ａ結合決定基を除くように修飾され、ヘテロ二量体結合タンパク質から異なったホモ二量体結合タンパク質のタンパク質Ａ結合親和性をもたらす。この問題に対処する組成物及び方法は、参照により本明細書に援用される、２０１３年１１月１９日に付与された「Ｒｅａｄｉｌｙ  Ｉｓｏｌａｔｅｄ  Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｎａｔｉｖｅ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｆｏｒｍａｔ」と題された米国特許第８，５８６，７１３号に記載される。同一の軽鎖を伴うヘテロ二量体重鎖を含む種が選択されると、この二重特異性抗原結合タンパク質は、そのｐＨ依存性抗原結合特性の保持を確認するためにスクリーニングされることができる。
【０１５８】
種々の態様では、本明細書内の種々のゲノム修飾を含む非ヒト動物に由来する多能性細胞、誘導多能性、または全能性幹細胞が、提供される。幾つかの実施形態では、多能性または全能性細胞は、非ヒト動物に由来する。幾つかの実施形態では、非ヒト動物は、齧歯動物、例えば、マウス、ラット、またはハムスターである。幾つかの実施形態では、齧歯動物は、マウスである。特定の実施形態では、多能性細胞は、胚性幹（ＥＳ）細胞である。幾つかの実施形態では、多能性細胞は、そのゲノム中に（ｉ）重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されたヒト重鎖可変領域核酸配列を含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座、ならびに（ｉｉ）軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される、１つ以上であるが野生型より少ない数のヒト免疫グロブリン軽鎖可変ＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン軽鎖遺伝子座を含む。特定の実施形態では、多能性、誘導多能性、または全能性幹細胞は、マウスまたはラット胚性幹（ＥＳ）細胞である。幾つかの実施形態では、多能性、誘導多能性、または全能性幹細胞は、ＸＸ核型またはＸＹ核型を有する。
【０１５９】
例えば、前核注入によって細胞内に導入される修飾など、本明細書に記載される遺伝子修飾を含有する核を含む細胞も提供される。別の態様では、本明細書に記載される非ヒト動物の細胞に由来するハイブリドーマまたはクアドローマが提供される。幾つかの実施形態では、非ヒト動物は、齧歯動物、例えば、マウス、ラット、またはハムスターである。
【０１６０】
別の態様では、本明細書に記載される遺伝子的に修飾された非ヒト動物から単離されたリンパ球が提供される。幾つかの実施形態では、リンパ球は、Ｂ細胞であり、Ｂ細胞は、ヒトまたは非ヒト動物（例えば、マウスまたはラット）重鎖または軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む免疫グロブリンゲノム遺伝子座を含む。幾つかの実施形態では、Ｂ細胞は、本明細書に記載される再構成された重鎖可変ドメインが重鎖または軽鎖定常ドメインに作動可能に連結される抗体を産生することが可能である。
【０１６１】
別の態様では、そのゲノムが（ｉ）定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されたヒト重鎖可変領域核酸配列を含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座、及び（ｉｉ）軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される、２つ以上であるが野生型より少ない数のヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン軽鎖遺伝子座、を含む細胞を含む、非ヒト動物胚。
【０１６２】
種々の実施形態では、遺伝子的に修飾された非ヒト動物は、再構成された重鎖可変ドメイン、及び複数の軽鎖Ｖセグメント（及び複数の軽鎖Ｊセグメント）をコードするヌクレオチド配列に由来する、抗体レパートリー（例えば、ＩｇＧレパートリー）を発現する。幾つかの実施形態では、遺伝子的に修飾された遺伝子座は、１０−６、１０−７、１０−８、１０−９、または１０−１０未満の親和性（ＫＤ）で関心の抗原に特異的に結合することが可能な免疫グロブリン軽鎖を含む、抗体集団を産生する。幾つかの実施形態では、遺伝子的に修飾された遺伝子座によって発現される免疫グロブリン軽鎖は、１０−６、１０−７、１０−８、１０−９、または１０−１０以下の親和性（ＫＤ）で、重鎖可変領域の不在下で関心の抗原に特異的に結合することが可能である。
【０１６３】
種々の実施形態では、本明細書に記載される遺伝子修飾は、非ヒト動物の生殖能力に影響を及ぼさない（例えば、その全体が参照により援用される、ＵＳ第２０１２−０３２２１０８Ａ１号を参照）。幾つかの実施形態では、重鎖遺伝子座は、内在性Ａｄａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはその両方を含み、内在性Ａｄａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはその両方の発現及び／または機能に影響を及ぼさない。幾つかの実施形態では、遺伝子的に修飾された非ヒト動物のゲノムは、異所的に配置されたＡｄａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはその両方を含む。幾つかの実施形態では、Ａｄａｍ６ａ及び／またはＡｄａｍ６ｂ遺伝子は、再構成された重鎖可変領域核酸配列の写単位の５’上流に定置される。幾つかの実施形態では、Ａｄａｍ６ａ及び／またはＡｄａｍ６ｂ遺伝子は、再構成された重鎖可変領域核酸配列の転写単位の３’下流に定置される。
【０１６４】
幾つかの実施形態では、遺伝子的に修飾された重鎖遺伝子座は、遺伝子間制御領域１（ＩＧＣＲ１）核酸配列を含まない。幾つかの実施形態では、遺伝子的に修飾された重鎖遺伝子座は、再構成された重鎖可変領域核酸配列の下流にＩＧＣＲ１配列を含む。幾つかの実施形態では、ＩＧＣＲ１核酸配列は、再構成された重鎖可変領域核酸配列と最もＶに近位のＤＨ遺伝子セグメントとの間に存在する。
【０１６５】
幾つかの態様では、先に述べたように、本明細書に記載される非ヒト動物の免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、軽鎖可変遺伝子セグメントの限定されたレパートリー、例えば、（ｉ）１つ、２つ、またはそれ以上であるが野生型より少ない数のヒトＶＬ遺伝子セグメントを含む。幾つかの実施形態では、非ヒト動物は、マウスであり、免疫グロブリン軽鎖可変ドメインは、２つのヒトＶκ遺伝子セグメントのうちの１つ及び１、２、３、４、または５つのヒトＪκ遺伝子セグメントのうちの１つ再構成から生成される。幾つかの実施形態では、マウスは、約１〜約１５の、（ａ）Λ軽鎖を有する免疫グロブリンを発現する骨髄中のＢ細胞の（ｂ）Κ軽鎖を有する免疫グロブリンを発現する骨髄中のＢ細胞に対する比を示す。幾つかの実施形態では、再構成は、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントを含む。幾つかの実施形態では、再構成は、ヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントを含む。幾つかの実施形態では、２つのヒトＶκ遺伝子セグメントは、内在性免疫グロブリンＶκ遺伝子座にあり、また幾つかの実施形態では、２つのヒトＶκ遺伝子セグメントは、全てまたは実質的に全てのマウス免疫グロブリンＶκ遺伝子セグメントを置き換える。幾つかの実施形態では、２つのヒトＶκ遺伝子セグメントは、内在性免疫グロブリンＶκ遺伝子座にあり、また幾つかの実施形態では、２つのヒトＶκ遺伝子セグメントは、全てまたは実質的に全てのマウス免疫グロブリンＶκ及びＪκ遺伝子セグメントを置き換える。幾つかの実施形態では、２つのヒトＶκ遺伝子セグメントは、２つ以上（例えば、２、３、４、５つ）のヒトＪκ遺伝子セグメントに作動可能に連結される。幾つかの他の実施形態では、マウスの軽鎖可変ドメインは、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントまたはヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントと２つ以上の（例えば、２、３、４、または５つ）ヒトＪκ遺伝子セグメントのうちの１つの再構成を通して生成される。幾つかのかかる実施形態では、Λ軽鎖を有する免疫グロブリンを発現する骨髄中の未熟Ｂ細胞のκ軽鎖を有する免疫グロブリンを発現する未熟Ｂ細胞に対する比は、約１〜約１３である。幾つかの他の実施形態では、マウスの軽鎖可変ドメインは、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントまたはヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントと２つ以上（例えば、２、３、４、または５つ）のヒトＪκ遺伝子セグメントのうちの１つとの再構成を通して生成され、λ軽鎖を有する免疫グロブリンを発現する骨髄中の成熟Ｂ細胞のκ軽鎖を有する免疫グロブリンを発現する未熟Ｂ細胞に対する比は、約１〜約７である。
【０１６６】
特定の実施形態では、本明細書に記載される遺伝子的に修飾されたマウスの軽鎖可変ドメインは、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントまたはヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントと２つ以上（例えば、２、３、４、または５つ）のヒトＪκ遺伝子セグメントのうちの１つとの再構成を通して生成され、例えば、約２．５×１０４、３．０×１０４、３．５×１０４、４．０×１０４、４．５×１０４、５．０×１０４、５．５×１０４、６．０×１０４、６．５×１０４、７．０×１０４、７．５×１０４、８．０×１０４、８．５×１０４、９．０×１０４、９．５×１０４、１．０×１０５、または１．５×１０５個の細胞を含む、約２．５×１０４〜約１．５×１０５個の範囲内の細胞の骨髄中プロＢ細胞集団を有し、幾つかの実施形態では、本明細書に記載される修飾された齧歯動物（例えば、マウス）は、約２．８８×１０４個の細胞の骨髄中プロＢ細胞集団を含み、幾つかの実施形態では、本明細書に記載される修飾された齧歯動物（例えば、マウス）は、約６．４２×１０４個の細胞の骨髄中プロＢ細胞集団を含み、幾つかの実施形態では、本明細書に記載される修飾された齧歯動物（例えば、マウス）は、約９．１６×１０４個の細胞の骨髄中プロＢ細胞集団を含み、幾つかの実施形態では、本明細書に記載される修飾された齧歯動物（例えば、マウス）は、約１．１９×１０５個の細胞の骨髄中プロＢ細胞集団を含む。本明細書に記載される遺伝子的に修飾された齧歯動物（例えば、マウス）の例示的な骨髄中プロＢ細胞は、ＣＤ１９、ＣＤ４３、ｃ−ｋｉｔ、及び／またはそれらの組み合わせ（例えば、ＣＤ１９＋、ＣＤ４３＋、ｃ−ｋｉｔ＋）の発現によって特徴付けられる。幾つかの実施形態では、本明細書に記載される齧歯動物（例えば、マウス）は、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントまたはヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントと２つ以上（例えば、２、３、４、または５つ）ヒトＪκ遺伝子セグメントのうちの１つとの再構成を通して生成される軽鎖を発現し、例えば、約１．０×１０６、１．１×１０６、１．２×１０６、１．３×１０６、１．４×１０６、１．５×１０６、１．６×１０６、１．７×１０６、１．８×１０６、１．９×１０６、または２．０×１０６個の細胞を含む、約１×１０６〜約２×１０６個の範囲内の細胞の骨髄中プレＢ細胞集団を有し、幾つかの実施形態では、本明細書に記載される修飾された齧歯動物（例えば、マウス）は、約１．２５×１０６個の細胞の骨髄中プレＢ細胞集団を含み、幾つかの実施形態では、本明細書に記載される修飾された齧歯動物（例えば、マウス）は、約１．４６×１０６個の細胞の骨髄中プレＢ細胞集団を含み、幾つかの実施形態では、本明細書に記載される修飾された齧歯動物（例えば、マウス）は、約１．６４×１０６個の細胞の骨髄中プレＢ細胞集団を含み、幾つかの実施形態では、本明細書に記載される修飾された齧歯動物（例えば、マウス）は、約２．０３×１０６個の細胞の骨髄中プレＢ細胞集団を含む。本明細書に記載される遺伝子的に修飾された齧歯動物（例えば、マウス）の例示的な骨髄中プレＢ細胞は、ＣＤ１９、ＣＤ４３、ｃ−ｋｉｔ、及び／またはそれらの組み合わせ（例えば、ＣＤ１９＋、ＣＤ４３−、ｃ−ｋｉｔ−）の発現によって特徴付け���れる。
【０１６７】
種々の実施形態では、本明細書に記載される遺伝子的に修飾されたマウスは、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントまたはヒトＶκ−２０遺伝子セグメントと２つ以上（例えば、２、３、４、または５つ）ヒトＪκ遺伝子セグメントのうちの１つとの再構成を通して生成される軽鎖を発現し、例えば、約５．０×１０５、５．１×１０５、５．２×１０５、５．３×１０５、５．４×１０５、５．５×１０５、５．６×１０５、５．７×１０５、５．８×１０５、５．９×１０５、６．０×１０５、６．１×１０５、６．２×１０５、６．３×１０５、６．４×１０５、６．５×１０５、６．６×１０５、６．７×１０５、６．８×１０５、６．９×１０５、または７．０×１０５個の細胞を含む、約５×１０５〜約７×１０５個の範囲内の細胞の骨髄中未熟Ｂ細胞集団を有し、幾つかの実施形態では、本明細書に記載される修飾された齧歯動物（例えば、マウス）は、約５．３３×１０５個の細胞の骨髄中未熟Ｂ細胞集団を含み、幾つかの実施形態では、本明細書に記載される修飾された齧歯動物（例えば、マウス）は、約５．８０×１０５個の細胞の骨髄中未熟Ｂ細胞集団を含み、幾つかの実施形態では、本明細書に記載される修飾された齧歯動物（例えば、マウス）は、約５．９２×１０５個の細胞の骨髄中未熟Ｂ細胞集団を含み、幾つかの実施形態では、齧歯動物（例えば、マウス）は、約６．６７×１０５個の細胞の骨髄中未熟Ｂ細胞集団を含む。本明細書に記載される遺伝子的に修飾された齧歯動物（例えば、マウス）の例示的な骨髄中未熟Ｂ細胞は、ＩｇＭ、Ｂ２２０、及び／またはそれらの組み合わせ（例えば、ＩｇＭ＋、Ｂ２２０ｉｎｔ）の発現によって特徴付けられる。
【０１６８】
種々の実施形態では、本明細書に記載される遺伝子的に修飾されたマウスは、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントまたはヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントと２つ以上（例えば、２、３、４、または５つ）ヒトＪκ遺伝子セグメントのうちの１つとの再構成を通して生成される軽鎖を含み、例えば、約３．０×１０４、３．５×１０４、４．０×１０４、４．５×１０４、５．０×１０４、５．５×１０４、６．０×１０４、６．５×１０４、７．０×１０４、７．５×１０４、８．０×１０４、８．５×１０４、９．０×１０４、９．５×１０４、１．０×１０５、または１．５×１０５個の細胞を含む、約３×１０４〜約１．５×１０５個の範囲内の細胞の骨髄中成熟Ｂ細胞集団を有し、幾つかの実施形態では、本明細書に記載される修飾された齧歯動物（例えば、マウス）は、約３．１１×１０４個の細胞の骨髄中成熟Ｂ細胞集団を含み、幾つかの実施形態では、本明細書に記載される修飾された齧歯動物（例えば、マウス）は、約１．０９×１０５個の細胞の骨髄中成熟Ｂ細胞集団を含み、幾つかの実施形態では、本明細書に記載される修飾された齧歯動物（例えば、マウス）は、約１．１６×１０５個の細胞の骨髄中成熟Ｂ細胞集団を含み、幾つかの実施形態では、本明細書に記載される修飾された齧歯動物（例えば、マウス）は、約１．４４×１０５個の細胞の骨髄中成熟Ｂ細胞集団を含む。本明細書に記載される遺伝子的に修飾された齧歯動物（例えば、マウス）の例示的な骨髄中成熟Ｂ細胞は、ＩｇＭ、Ｂ２２０、及び／またはそれらの組み合わせ（例えば、ＩｇＭ＋、Ｂ２２０ｈｉ）の発現によって特徴付けられる。
【０１６９】
種々の実施形態では、本明細書に記載される遺伝子的に修飾された齧歯動物（例えば、マウス）は、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントまたはヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントと２つ以上（例えば、２、３、４、または５つ）のヒトＪκ遺伝子セグメントのうちの１つとの再構成を通して生成される軽鎖を発現し、例えば、約１．０×１０６、１．１×１０６、１．２×１０６、１．３×１０６、１．４×１０６、１．５×１０６、１．６×１０６、１．７×１０６、１．８×１０６、１．９×１０６、２．０×１０６、２．１×１０６、２．２×１０６、２．３×１０６、２．４×１０６、２．５×１０６、２．６×１０６、２．７×１０６、２．８×１０６、２．９×１０６、または２．０×１０６個の細胞を含む、約１×１０６〜約３×１０６個の範囲内の細胞の骨髄中総Ｂ細胞集団を有し、幾つかの実施形態では、本明細書に記載される修飾された齧歯動物（例えば、マウス）は、約１．５９×１０６個の細胞の骨髄中総Ｂ細胞集団を含み、幾つかの実施形態では、本明細書に記載される修飾された齧歯動物（例えば、マウス）は、約１．７５×１０６個の細胞の骨髄中総Ｂ細胞集団を含み、幾つかの実施形態では、本明細書に記載される修飾された齧歯動物（例えば、マウス）は、約２．１３×１０６個の細胞の骨髄中総Ｂ細胞集団を含み、幾つかの実施形態では、本明細書に記載される修飾された齧歯動物（例えば、マウス）は、約２．５５×１０６個の細胞の骨髄中総Ｂ細胞集団を含む。本明細書に記載される遺伝子的に修飾された齧歯動物（例えば、マウス）の例示的な骨髄中総Ｂ細胞は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、及び／またはそれらの組み合わせ（例えば、ＣＤ１９＋）の発現によって特徴付けられる。
【０１７０】
種々の実施形態では、本明細書に記載される遺伝子的に修飾された齧歯動物（例えば、マウス）は、２つの再構成されていないヒト免疫グロブリンＶκ遺伝子セグメントと２つ以上（例えば、２、３、４、または５つ）の再構成されていないヒトＪκ遺伝子セグメントとを含む免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座を含み、齧歯動物（例えば、マウス）は、免疫グロブリンκ軽鎖ＶとＪ遺伝子セグメントとの野生型補体を含む齧歯動物（例えば、マウス）と概ね同一の移行（例えば、Ｔ１、Ｔ２、及びＴ３）Ｂ細胞集団を含む、末梢脾臓Ｂ細胞集団を含む。本明細書に記載される遺伝子的に修飾された齧歯動物（例えば、マウス）の例示的な脾臓中移行Ｂ細胞集団（例えば、Ｔ１、Ｔ２、及びＴ３）は、ＩｇＭ、ＣＤ２３、ＣＤ９３、Ｂ２２０、及び／またはそれらの組み合わせの発現によって特徴付けられる。
【０１７１】
種々の実施形態では、本明細書に記載される遺伝子的に修飾された齧歯動物（例えば、マウス）は、例えば、約２．０×１０６、２．５×１０６、３．０×１０６、３．５×１０６、４．０×１０６、４．５×１０６、５．０×１０６、５．５×１０６、６．０×１０６、６．５×１０６、または７．０×１０６個の細胞を含む、約２×１０６〜約７×１０６個の範囲内の細胞の脾臓中Ｔ１  Ｂ細胞集団（例えば、ＣＤ９３＋、Ｂ２２０＋、ＩｇＭｈｉ、ＣＤ２３−）を含み、幾つかの実施形態では、本明細書に記載される修飾された齧歯動物（例えば、マウス）は、約２．１６×１０６個の細胞の脾臓中Ｔ１  Ｂ細胞集団を含み、幾つかの実施形態では、本明細書に記載される齧歯動物（例えば、マウス）は、約３．６３×１０６個の細胞の脾臓中Ｔ１  Ｂ細胞集団を含み、幾つかの実施形態では、本明細書に記載される修飾された齧歯動物（例えば、マウス）は、約３．９１×１０６個の細胞の脾臓中Ｔ１  Ｂ細胞集団を含み、幾つかの実施形態では、本明細書に記載される修飾された齧歯動物（例えば、マウス）は、約６．８３×１０６個の細胞の脾臓中Ｔ１  Ｂ細胞集団を含む。
【０１７２】
種々の実施形態では、本明細書に記載される遺伝子的に修飾された齧歯動物（例えば、マウス）は、例えば、約１．０×１０６、１．５×１０６、２．０×１０６、２．５×１０６、３．０×１０６、３．５×１０６、４．０×１０６、４．５×１０６、５．０×１０６、５．５×１０６、６．０×１０６、６．５×１０６、または７．０×１０６個の細胞を含む、約１×１０６〜約７×１０６個の範囲内の細胞の脾臓中Ｔ２  Ｂ細胞集団（例えば、ＣＤ９３＋、Ｂ２２０＋、ＩｇＭｈｉ、ＣＤ２３＋）を含み、幾つかの実施形態では、本明細書に記載される修飾された齧歯動物（例えば、マウス）は、約１．３０×１０６個の細胞の脾臓中Ｔ２  Ｂ細胞集団を含み、幾つかの実施形態では、本明細書に記載される修飾された齧歯動物（例えば、マウス）は、約２．４６×１０６個の細胞の脾臓中Ｔ２  Ｂ細胞集団を含み、幾つかの実施形態では、本明細書に記載される修飾された齧歯動物（例えば、マウス）は、約３．２４×１０６個の脾臓中Ｔ２  Ｂ細胞集団を含み、幾つかの実施形態では、本明細書に記載される修飾された齧歯動物（例えば、マウス）は、約６．５２×１０６個の細胞の脾臓中Ｔ２  Ｂ細胞集団を含む。
【０１７３】
種々の実施形態では、本明細書に記載される遺伝子的に修飾された齧歯動物（例えば、マウス）、例えば、約１．０×１０６、１．５×１０６、２．０×１０６、２．５×１０６、３．０×１０６、３．５×１０６、または４．０×１０６個の細胞を含む、約１×１０６〜約４×１０６個の範囲内の細胞の脾臓中Ｔ３  Ｂ細胞集団（例えば、ＣＤ９３＋、Ｂ２２０＋、ＩｇＭｌｏ、ＣＤ２３＋）、幾つかの実施形態では、本明細書に記載される修飾された齧歯動物（例えば、マウス）は、約１．０８×１０６個の細胞の脾臓中Ｔ３  Ｂ細胞集団を含み、幾つかの実施形態では、本明細書に記載される修飾された齧歯動物（例えば、マウス）は、約１．３５×１０６個の細胞の脾臓中Ｔ３  Ｂ細胞集団を含み、幾つかの実施形態では、本明細書に記載される修飾された齧歯動物（例えば、マウス）は、約３．３７×１０６個の細胞の脾臓中Ｔ３  Ｂ細胞集団を含み、幾つかの実施形態では、本明細書に記載される修飾された齧歯動物（例えば、マウス）は、約３．６３×１０６個の細胞の脾臓中Ｔ３  Ｂ細胞集団を含む。
【０１７４】
辺縁帯Ｂ細胞は、脾臓の辺縁帯（ＭＺ）内に解剖学的に分離する、非循環成熟Ｂ細胞である。齧歯動物においては、ＭＺ  Ｂ細胞は、付着性であり、辺縁洞と赤脾髄との間の脾臓の外側白脾髄内に存在するこの領域は、大食細胞、樹枝状細胞、及びＭＺ  Ｂ細胞の複数のサブタイプを含有し、齧歯動物では出生後２〜３週間、またヒトでは１〜２年まで完全には形成されない。この領域内のＭＺ  Ｂ細胞は、典型的には、高レベルのｓＩｇＭ、ＣＤ２１、ＣＤ１、ＣＤ９を、低〜極僅かなレベルのｓＩｇＤ、ＣＤ２３、ＣＤ５、及びＣＤ１１ｂと共に発現し、それは、濾胞性（ＦＯ）Ｂ細胞及びＢ１  Ｂ細胞からそれらを表現型的に区別するのに役立つ。Ｂ１  Ｂ細胞と同様に、ＭＺ  Ｂ細胞は、独立した方法でＴ細胞内において初期適応的免疫応答へ迅速に入ることができる。ＭＺ  Ｂ細胞は、循環に入り脾臓内で捕捉される全身性の血液感染性抗原に対する防御の第一線として、良好に定置される。それらは、細菌細胞壁成分に対して特に反応し、脂質特異性抗体の重要な源であると考えられる。ＭＺ  Ｂ細胞はまた、加速された一次抗体応答にさらに寄与する形質細胞の分化に関する増大された傾向を有するそれらのＦＯ  Ｂ細胞対応物より、低い活性化閾値を見せる。
【０１７５】
種々の実施形態では、本明細書に記載される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列（例えば、ＶＨ３−２３／Ｄ／ＪＨ４）を含む遺伝子的に修飾された齧歯動物（例えば、マウス）は、野生型齧歯動物（例えば、野生型マウス）と比較して、増加されたレベルの辺縁帯Ｂ細胞を有する。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む遺伝子的に修飾された齧歯動物（例えば、マウス）における辺縁帯Ｂ細胞は、野生型齧歯動物（例えば、野生型マウス）と比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％以上増加される。
【０１７６】
種々の実施形態では、本明細書に記載される遺伝子的に修飾された齧歯動物（例えば、マウス）は、２つの再構成されていないヒト免疫グロブリンＶκ遺伝子セグメントと１、２、３、４、または５つの再構成されていないヒト免疫グロブリンＪκ遺伝子セグメントとを含む免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座を含み、齧歯動物（例えば、マウス）は、疫グロブリンＶκ及びＪκ遺伝子セグメントの野生型補体を含む齧歯動物（例えば、マウス）と概ね同一の辺縁帯及び辺縁帯前駆体Ｂ細胞集団を含む、末梢脾臓Ｂ細胞集団を含む。本明細書に記載される遺伝子的に修飾された齧歯動物（例えば、マウス）の例示的な脾臓中辺縁帯Ｂ細胞集団は、ＩｇＭ、ＣＤ２１／３５、ＣＤ２３、ＣＤ９３、Ｂ２２０、及び／またはそれらの組み合わせの発現によって特徴付けられる。
【０１７７】
種々の実施形態では、本明細書に記載される遺伝子的に修飾された齧歯動物（例えば、マウス）は、例えば、約１．０×１０６、１．５×１０６、２．０×１０６、２．５×１０６、または３．０×１０６個の細胞を含む、約１×１０６〜約３×１０６個の範囲内の細胞の脾臓中辺縁帯Ｂ細胞集団（例えば、ＣＤ９３−、Ｂ２２０＋、ＩｇＭｈｉ、ＣＤ２１／３５ｈｉ、ＣＤ２３−）を含み、幾つかの実施形態では、本明細書に記載される修飾された齧歯動物（例えば、マウス）は、約１．４７×１０６個の細胞の脾臓中辺縁帯Ｂ細胞集団を含み、幾つかの実施形態では、本明細書に記載される修飾された齧歯動物（例えば、マウス）は、約１．４９×１０６個の細胞の脾臓中辺縁帯Ｂ細胞集団を含み、幾つかの実施形態では、本明細書に記載される修飾された齧歯動物（例えば、マウス）は、約２．２６×１０６個の細胞の脾臓中辺縁帯Ｂ細胞集団を含み、幾つかの実施形態では、本明細書に記載される修飾された齧歯動物（例えば、マウス）は、約２．３３×１０６個の細胞の脾臓中辺縁帯Ｂ細胞集団を含む。
【０１７８】
種々の実施形態では、遺伝子的に修飾された齧歯動物（例えば、マウス）が提供され、齧歯動物（例えば、マウス）は、２つの再構成されていないヒト免疫グロブリンＶκ遺伝子セグメントと１、２、３、４、または５つの再構成されていないヒト免疫グロブリンＪκ遺伝子セグメントとを含む免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座を含み、齧歯動物（例えば、マウス）は、免疫グロブリンＶκ及びＪκ遺伝子セグメントの野生型補体を含む齧歯動物（例えば、マウス）と概ね同一の濾胞性（例えば、ＦＯ−Ｉ及びＦＯ−ＩＩ）Ｂ細胞集団（単数または複数）を含む、末梢脾臓Ｂ細胞集団を含む。本明細書に記載される遺伝子的に修飾された齧歯動物（例えば、マウス）の例示的な脾臓中濾胞性Ｂ細胞集団（例えば、ＦＯ−Ｉ及びＦＯ−ＩＩ）は、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＣＤ２１／３５、ＣＤ９３、Ｂ２２０、及び／またはそれらの組み合わせの発現によって特徴付けられる。
【０１７９】
種々の実施形態では、本明細書に記載される遺伝子的に修飾された齧歯動物（例えば、マウス）は、例えば、約３．０×１０６、３．５×１０６、４．０×１０６、４．５×１０６、５．０×１０６、５．５×１０６、６．０×１０６、６．５×１０６、７．０×１０６、７．５×１０６、８．０×１０６、８．５×１０６、９．０×１０６、９．５×１０６、１．０×１０７、または１．５×１０７個の細胞を含む、約３×１０６〜約１．５×１０７個の範囲内の細胞の脾臓濾胞性タイプ１Ｂ細胞集団（例えば、ＣＤ９３−、Ｂ２２０＋、ＣＤ２１／３５ｉｎｔ、ＩｇＭｌｏ、ＩｇＤｈｉ）を含み、幾つかの実施形態では、本明細書に記載される修飾された齧歯動物（例えば、マウス）は、約３．５７×１０６個の細胞の脾臓中濾胞性タイプ１Ｂ細胞集団を含み、幾つかの実施形態では、本明細書に記載される修飾された齧歯動物（例えば、マウス）は、６．３１×１０６個の細胞の脾臓中濾胞性タイプ１Ｂ細胞集団を含み、幾つかの実施形態では、本明細書に記載される修飾された齧歯動物（例えば、マウス）は、約９．４２×１０６個の細胞の脾臓中濾胞性タイプ１Ｂ細胞集団を含み、幾つかの実施形態では、本明細書に記載される修飾された齧歯動物（例えば、マウス）は、約１．１４×１０７個の細胞の脾臓中濾胞性タイプ１Ｂ細胞集団を含む。
【０１８０】
種々の実施形態では、本明細書に記載される遺伝子的に修飾された齧歯動物（例えば、マウス）は、例えば、１．０×１０６、１．２５×１０６、１．５×１０６、１．７５×１０６、または２．０×１０６個の細胞を含む、約１×１０６〜約２×１０６個の範囲内の細胞の脾臓中濾胞性タイプ２Ｂ細胞集団（例えば、ＣＤ９３−、Ｂ２２０＋、ＣＤ２１／３５ｉｎｔ、ＩｇＭｉｎｔ、ＩｇＤｈｉ）を含み、幾つかの実施形態では、本明細書に記載される修飾された齧歯動物（例えば、マウス）は、約１．１４×１０６個の細胞の脾臓中濾胞性タイプ２Ｂ細胞集団を含み、幾つかの実施形態では、本明細書に記載される修飾された齧歯動物（例えば、マウス）は、約１．４５×１０６個の細胞の脾臓中濾胞性タイプ２Ｂ細胞集団を含み、幾つかの実施形態では、本明細書に記載される修飾された齧歯動物（例えば、マウス）は、約１．８０×１０６個の脾臓中濾胞性タイプ２Ｂ細胞集団を含み、幾つかの実施形態では、本明細書に記載される修飾された齧歯動物（例えば、マウス）は、約２．０６×１０６個の細胞の脾臓中濾胞性タイプ２Ｂ細胞集団を含む。
【０１８１】
本明細書に記載される遺伝子的に修飾された非ヒト動物の、軽鎖可変領域またはドメイン（例えば、軽鎖ＣＤＲ３）をコードする遺伝子またはポリヌクレオチドに選択的圧力を印加する能力は、多様な可変軽鎖遺伝子配列に適用することができる。換言すれば、本明細書に開示される再構成された重鎖可変ドメイン遺伝子配列は、軽鎖遺伝子座の１つ以上の遺伝子修飾及び／または軽鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列の重鎖遺伝子座への挿入と対にすることができる。これは、例えば、本明細書に記載される非ヒト動物（共通またはユニバーサル重鎖可変ドメインに制限される）を、１つ以上の軽鎖コード遺伝子座内に遺伝子修飾を含む非ヒト動物と交尾させること（即ち、単一の修飾を有する動物の異種交配または異系交配）によって達成することができる。再構成された重鎖可変ドメインと１つ以上の軽鎖修飾との両方を有する免疫グロブリン遺伝子座を含む遺伝子的に修飾された非ヒト動物はまた、同時に、または連続的に（例えば、胚性幹細胞内での連続的な組み換えによって）かのいずれかでの複数の遺伝子座の標的化された遺伝子置き換えによって生成することもできる。軽鎖遺伝子座における修飾の種類も方法も、特に明記されない限り、本明細書に記載される実施形態を限定しない。むしろ、本明細書に記載される実施形態によって促進される選択的圧力は、発現されて、軽鎖抗原結合配列として機能することが可能な任意のポリヌクレオチド配列に事実上印加されることができ、それによってフィッター抗体可変領域（ｆｉｔｔｅｒ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ）の発生を駆動する。
【０１８２】
例えば、本明細書に記載されるように、再構成された重鎖可変ドメイン遺伝子配列を有する免疫グロブリン遺伝子座を含む遺伝子的に修飾された非ヒト動物は、ＷＯ第２０１１／０７２２０４号、ＷＯ第２０１１／１６３３１１号、ＷＯ第２０１１／１６３３１４号、ＷＯ第２０１２／０１８７６４号、ＷＯ第２０１２／１４１７９８号、Ｕ．Ｓ．第２０１３／０１８５８２１号、ＷＯ第２０１３／０２２７８２号、ＷＯ第２０１３／０９６１４２号、ＷＯ第２０１３／１１６６０９号に記載される１つ以上の修飾を、（例えば、異種交配または複数の遺伝子標的化戦略を介して）さらに含んでもよく、これらの出版物は、参照によりその全体が本明細書に援用される。特定の実施形態では、軽鎖遺伝子座中に再構成された重鎖可変領域核酸配列（即ち、ヒトまたは非ヒトκ軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される再構成された重鎖可変ドメイン遺伝子配列）を含む遺伝子的に修飾されたマウスは、ヒト軽鎖可変領域遺伝子セグメント（例えば、マウス重鎖遺伝子座中に挿入された４０ヒトＶκ遺伝子及び全てのヒトＪκ遺伝子、例えば、参照により本明細書に援用される、米国付与前公開第２０１２／００９６５７２号を参照）を含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む遺伝子的に修飾されたマウスと交配される。特定の実施形態では、軽鎖遺伝子座中に再構成された重鎖可変領域核酸配列（即ち、ヒトまたは非ヒトκ軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される再構成された重鎖可変ドメイン遺伝子配列）を含む遺伝子的に修飾されたマウスは、１つ以上（例えば、２つ）であるが野生型より少ない数のヒト軽鎖可変領域遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む遺伝子的に修飾されたマウスと交配される。結果として得られるマウスは、ゲノム軽鎖可変配列に由来する可変重鎖を有するカッパ＋Ｂ細胞を産生することが可能であり、したがって、特定の標的に結合し、その後、軽鎖へと再フォーマットされ、多様な重鎖と対形成されて、二重または三重特異性抗体を産生することができる、カッパＶＪ配列の特定を促進する。
実施例
【０１８３】
以下の実施例は、本明細書に記載される非ヒト動物をいかに作製及び使用するかに関する完全な開示及び説明を当業者に提供するために提示され、発明者らが自身の発明として考える範囲を限定することを意図するものではなく、また下記の実験は、実施される全てまたは唯一のものを表すことも意図されない。使用される数（例えば、量、温度など）に関しては正確性を確実するために努力が成されているが、実験的な誤差及び偏差は考慮されるべきである。別段に指示されない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏であり、圧力は大気圧またはその付近である。
【０１８４】
実施例１．候補ユニバーサル重鎖配列のクローン化及び発現分析
先行研究は、ｈＶＨ３−２３は熱安定性のヒト可変重鎖遺伝子セグメントであり、またヒトレパートリーにおいて最も一般的に使用される可変セグメントのうちの１つであることを示している。したがって、再構成された重鎖可変配列（以下、「ユニバーサル重鎖」または「ＵＨＣ」）を設計するために、コドン最適化ヒトＶＨ３−２３、Ｄ４−４（リーディングフレーム２または３）、及びＪＨ４（またはＪＨ６）遺伝子セグメントが選択された。
【０１８５】
手短に述べると、以下の４つの再構成されたＶＤＪ配列の候補を、新たに合成し（ＩＤＴによる）、ＣＭＶ発現ベクター（例えば、ｐＲＧ１３０１またはｐＲＧ１３６８）：（１）ｈＶＨ３−２３（Ｄ４−４＿ＲＦ２）ＪＨ４（配列番号１４８）、（２）ｈＶＨ３−２３（Ｄ４−４＿ＲＦ２）ＪＨ６（配列番号１４６）、（３）ｈＶＨ３−２３（Ｄ４−４＿ＲＦ３）ＪＨ４（配列番号１４７）、（４）ｈＶＨ３−２３（Ｄ４−４＿ＲＦ３）ＪＨ６（配列番号１４５）へクローン化した。これら構築物の全ては、合成されたＵＨＣ遺伝子が、Ｘｈｏ  Ｉ／Ｓａｐ  Ｉによる消化後にｐＲＧ１３０１（ｈＩｇＧ１）またはｐＲＧ１３６８（ｍＩｇＧ１）ベクターにライゲートされることができるような方法で設計した。発現分析のために、ｐＩＤＴＳＭＡＲＴ内の４つのＵＨＣ遺伝子（１−４）を、ｐＲＧ１３０１（ｈＩｇＧ１）またはｐＲＧ１３６８（ｍＩｇＧ１）のＸｈｏ  Ｉ／Ｓａｐ  Ｉ部位へサブクローン化し、各発現構築物を、ＣＨＯ細胞内へ別々に導入した。導入後、４つの候補ＶＤＪ配列の全ては、十分なレベルで発現し、発現したペプチドは、異なるκ及びλ軽鎖と対を成すことが可能であった。
【０１８６】
遺伝子的に修飾されたマウスにおけるＢ細胞枯渇につながる可能性のある潜在的な自己反応性抗体を回避するために、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウスによって産生された抗体から生成されたＲｅｇｅｎｅｒｏｎ  ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓのＡＳＡＰ抗体データベースを、ｈＶＨ３−２３（Ｄ４−４）ＪＨ４に類似のアミノ酸配列を含有する抗体に関して検索した（図５）。より具体的には、非自己反応性抗体を特定するために使用された基準は、ＤＹＳＮＹ（配列番号１４４）のアミノ酸配列またはＤＹＳＮＹ（配列番号１４４）に類似の配列を含んだ。しかしながら、ＣＨＯ細胞における発現研究から、ＤＹＳＮＹ（配列番号１４４）を含有するＵＨＣ配列は、哺乳類細胞において良好に発現されないことが分かった。したがって、Ｄを欠損するが配列ＹＳＮＹ（即ち、抗体Ｈ１Ｈ２００２Ｂ、ＡＫＧＹＹＦＤＹ（配列番号１４３）、式中、ＡＫは、３−２３からのものであり、ＧＹは、ＤもしくはＮ付加またはＮ及びＰ付加からのものであり、ＹＦＤＹは、ＪＨ４である）を有する別の配列を代わりに選択し、ＣＨＯ細胞内でのその発現に関して試験した。修飾されたＵＨＣ配列は、ＣＨＯ細胞内で十分なレベルで発現した。これらの結果は、幾つかのアミノ酸残基（即ち、スペーサー）が、哺乳類細胞内での再構成されたＶＤＪ配列の適切な発現のために重鎖Ｖ遺伝子セグメントによってコードされる配列と重鎖Ｊ遺伝子セグメントによってコードされる配列との間で必要であることを示唆している。
【０１８７】
それに加えて、再構成されたＶＤＪ配列（ＶＨ３−２３／ＧＹ／ＪＨ４、ＨＩＨ２００２Ｂ）に由来するペプチドＡＫＧＹＹＦＤＹのＣＨＯ細胞内での発現レベルを、５つのヒトκ鎖、３つのヒトλ鎖、及び他の再構成されたＶＤＪ配列（即ち、ＶＨ３−２０及びＶＨ１−３９）の発現に関して、ＶＨ３−２３／Ｄ４−４（リーディングフレーム２）／ＪＨ４（配列番号１４８）に由来するペプチドと比較した。選択された再構成されたＶＤＪ配列（ＶＨ３−２３／ＧＹ／ＪＨ４）は、対照のものと同等の発現レベルを示した。
【０１８８】
これらのデータに基づき、ＶＨ３−２３／ＧＹ／ＪＨ４（配列番号１３７、ＨＩＨ２００２Ｂ）を、遺伝子的に修飾されたマウスを作成するための再構成された重鎖可変ドメイン配列として選択した。再構成された重鎖可変ドメインをコードする遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座を含有するマウス（即ち、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域を含有する免疫グロブリン遺伝子座を含むマウス）を生成するための詳細な標的化戦略は、図１〜９に例証され、また下記に記載される通りである。
【０１８９】
実施例２．再構成されたＶＤＪ配列を含有する免疫グロブリン重鎖遺伝子座の構築
再構成されたヒトＶＤＪ配列を含有する免疫グロブリン重鎖遺伝子座の構築を、細菌人工染色体（ＢＡＣ）ＤＮＡを使用して、細菌細胞（ＢＨＲ）内で一連の相同的組み換え反応によって実行した。再構成された重鎖可変ドメインを発現する遺伝子的に改変されたマウスの作成のための幾つかの標的化構築物を、ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）遺伝子改変技術を使用して生成した（例えば、参照によりその全体が本明細書に援用される、米国特許第６，５８６，２５１号及びＶａｌｅｎｚｕｅｌａ，Ｄ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．  （２００３），Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２１（６）：６５２−６５９を参照）。
【０１９０】
手短に述べると、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列（即ち、ｈＶＨ３−２３（Ｄ）ＪＨ４、配列番号１３６）を全てまたは実質的に全ての内在性機能性免疫グロブリン重鎖Ｖ、Ｄ、Ｊ遺伝子セグメントが欠失された遺伝子的に修飾されたマウスに導入するように、標的化ベクターを設計した。それに加えて、標的化ベクターは、マウスにおけるＡｄａｍ６ａ／６ｂ遺伝子を含むゲノム領域の欠失に関連付けられる生殖能力問題を防ぐために、Ａｄａｍ６ａ及びＡｄａｍ６ｂ遺伝子を含むゲノム領域を含んだ（例えば、その全体が参照により本明細書に援用される、ＵＳ第２０１２−０３２２１０８Ａ１号を参照）。
【０１９１】
まず、２２３９−ｂｐＶＨ３−２３プロモータ（配列番号１３９）に作動可能に連結される、リーダー配列（これは、小胞体を通して重鎖を導く）、再構成された重鎖可変領域ヌクレオチド配列（ＶＨ３−２３（Ｄ）ＪＨ４、配列番号１３６）、及びｈＪＨ４のイントロン（配列番号１４０）を含むマウスＢＡＣクローンを修飾するためのＢＨＲドナーを、構築した。それに加えて、ゲノム遺伝子座は、ＭＡＩＤ１１１５ＢＡＣクローンでの相同的組み換えのためのマウスＩｇＨ相同ボックスに５’及び３’隣接した（図１）。
【０１９２】
それに加えて、以下の５つの修飾を実行して、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を含有する標的化構築物を作成した。
【０１９３】
第一に、スペクチノマイシン選択カセットを、ＶＨ３−２３プロモータの上流（Ｉ−ＣｅｕＩ及びＳｐｅＩ部位の間）へ導入して、ｐＪＳｈ００３８（ＵＨＣミニ遺伝子座、配列番号１４２）を生成した（図１の１．Ｉ−ＣｅｕＩ／ＳｐｅＩライゲーション（Ａｍｐ＋Ｓｐｅｃ））。ＵＨＣミニ遺伝子座は、（１）ライゲーションのためのＩ−ＣｅｕＩ／ＡｓｃＩ部位を有するスペクチノマイシン（Ｓｐｅｃ）カセット、（２）２２３９−ｂｐ  ｈＶＨ３−２３プロモータ（配列番号１３９）、（３）再構成されたｈＶＨ３−２３（Ｄ）ＪＨ４ヌクレオチド配列（配列番号１３６）、（４）ｈＪＨ４イントロン（配列番号１４０）、及び（５）ＢＨＲ（ＭＡＩＤ１１１５）のためのマウス相同ボックスを含有した。
【０１９４】
第二に、ハイグロマイシン選択カセット（ＥＭ７−ＨＹＧ）を、ＩｇＭゲノム領域の上流にｌｏｘＰ隣接ネオマイシンカセット（Ｐｇｋ−Ｎｅｏ）を含有する、ＭＡＩＤ１１１５ＢＡＣクローンのゲノム領域の５’末端内へ標的化した。ハイグロマイシンカセットの挿入は、ＭＡＩＤ１１１５クローンの５’末端に配置されたｌｏｘＰ部位を欠失させた。遺伝子的に修飾されたＢＡＣクローン（ＶＩ４３２）を含有する細菌細胞を、ハイグロマイシン／カナマイシン選択を介して選択した（図２の２．ＢＨＲ（Ｈｙｇ＋Ｋａｎ））。
【０１９５】
第三に、ステップ１で構築したＵＨＣミニ遺伝子座を、ＶＩ４３２ＢＡＣクローンのＩｇＭ遺伝子座の上流へ標的化した。ＵＨＣミニ遺伝子座の導入は、フロックスネオマイシン選択カセットを新規のスペクチノマイシンカセット（ＶＩ４４３）で置き換えた。遺伝子的に修飾されたＢＡＣクローン（ＶＩ４４３）を含有する細菌細胞を、スペクチノマイシン及びハイグロマイシン選択を介して選択した（図２の３．ＢＨＲ（Ｓｐｅｃ＋Ｈｙｇ））。
【０１９６】
第四に、５’〜３’に、（１）Ａｄａｍ６ａ遺伝子（３’〜５’方向に存在する）、（２）ＦＲＴ部位に隣接するネオマイシンカセット（３’〜５’方向に存在する）、（３）Ａｄａｍ６ｂ遺伝子（３’〜５’方向に存在する）、（４）遺伝子間制御領域１（ＩＧＣＲ１、即ち、ｋｅｙＶ（Ｄ）Ｊ組み換え調節領域）、及び（５）スペクチノマイシンカセット（５’〜３’方向に存在する）を含むＶＩ４２１ＢＡＣクローンを、クロラムフェニコール（Ｃｍ）カセット、クロラムフェニコール遺伝子の上流のＡｓｃＩ制限部位、ならびに５’及び３’相同アームを含有するｐＤＢａ００４９構築物で標的化した。ｐＤＢａ００４９構築物の標的化は、ＶＩ４２１クローンからＩＧＣＲ１及びスペクチノマイシンカセットを除去し、新規のＡｓｃＩ制限部位及びクロラムフェニコールカセットを、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子の下流へ導入した。成功的に標的化されたクローン（ＶＩ４４４）を含有する細菌細胞を、クロラムフェニコール及びカナマイシン選択を介して選択した（図３の４．ＢＨＲ（Ｃｍ＋Ｋａｎ））。
【０１９７】
第五に、Ａｄａｍ６ａ及び／または６ｂ遺伝子を含有するＶＩ４４４ＢＡＣクローンのゲノム領域を、Ｉ−ＣｅｕＩ及びＡｓｃＩ部位の間で、ＶＩ４４３ＢＡＣクローン内のユニバーサル重鎖ゲノム遺伝子座の上流へ制限消化及びライゲーションを介して導入した（図３）。この修飾は、Ａｄａｍ６ａ及び／または６ｂ遺伝子をクローン内へ導入し、スペクチノマイシンカセットをネオマイシンカセットで置き換え、最終標的化構築物（ＭＡＩＤ６０３１、ＶＩ４４５）を生み出す。最終標的化構築物（ＭＡＩＤ６０３１、ＶＩ４４５）を含有する細菌細胞（ＢＨＲ）を、ハイグロマイシン及びカナマイシン選択に基づいて選択した（図３の５．Ｉ−ＣｅｕＩ／ＡｓｃＩライゲーション（Ｈｙｇ＋Ｋａｎ））。
【０１９８】
再構成されたヒト重鎖可変ドメイン配列を含有するゲノム遺伝子座の作成のための最終標的化構築物（ＭＡＩＤ６０３１）は、５’〜３’へ、（１）約２００００ｂｐのマウスゲノム配列を内在性Ｉｇ重鎖遺伝子座の上流に含有する５’相同アーム、（２）Ａｄａｍ６ａ遺伝子、（３）５’ＦＲＴ部位、（４）ネオマイシンカセット、（５）３’ＦＲＴ部位、（６）Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、（７）２２３９ｂｐのｈＶＨ３−２３プロモータ（配列番号１３９）、（８）再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖ヌクレオチド配列（ｈＶＨ３−２３（Ｄ）ＪＨ４、配列番号１３６）、（９）ｈＪＨ４イントロン（配列番号１４０）、及び（１０）約７４００ｂｐのマウスゲノム配列をマウスＪＨ遺伝子セグメントの下流に含有する３’相同アームを含有する。
【０１９９】
最終標的化構築物、ＭＡＩＤ６０３１ＢＡＣ  ＤＮＡを、線形化し、野生型Ｉｇ重鎖ＶＤＪゲノム遺伝子座と全てのＶＨ、Ｄ、ＪＨ遺伝子が欠失された変異したＶＤＪゲノム遺伝子座とを含有する１６６１ヘテロ接合性のマウス（図４）から単離したＥＳ細胞内へ電気穿孔した。成功的に標的化されたマウスＥＳ細胞を、図６〜８に記載されるプライマー及びプローブを使用してスクリーニングした。成功的に標的化されたマウスＥＳ細胞を、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を使用して宿主マウス胚内に導入して、遺伝子的に修飾されたヘテロ接合性Ｆ０マウスを産生した。選択カセット（即ち、ＦＲＴ−Ｕｂ−Ｎｅｏ−ＦＲＴ）を有さないマウス（ＭＡＩＤ６０３２ｈｅｔ）を生成するために、成功的に標的化されたＥＳ細胞を、宿主胚内へ導入する前に、Ｆｌｐリコンビナーゼを発現するプラスミドを用いて電気穿孔した。別法として、選択カセットを有するＭＡＩＤ６０３１ヘテロ接合性雄マウスを、Ｆｌｐリコンビナーゼを発現する雌マウスと繁殖させて、カセットを除去した。修飾を担持するヘテロ接合性マウスを、互いに繁殖させて、遺伝子的に修飾された遺伝子座のみからの免疫グロブリン重鎖を作製することが可能なホモ接合体（ＭＡＩＤ６０３２ＨＯ）を生成した。
【０２００】
実施例３．再構成された重鎖可変ドメインを発現する遺伝子的に修飾されたマウスの特徴付け
全てのマウスは、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓにて特定の病原体を含まない条件で飼育及び繁殖された。３匹の野生型（ＷＴ）同腹仔対照マウス（１６週齢、雄、ｎ＝２、バックグラウンド：７５％Ｃ５７／ＢＬ６及び２５％１２９）、及び２〜４匹のＭＡＩＤ６０３２ＨＥＴ  Ｆ０マウス（図９、９週齢、雄、ｎ＝２、バックグラウンド：５０％Ｃ５７／ＢＬ６及び５０％１２９）を屠殺し、血液、脾臓、及び骨髄を動物から採取した。それに加えて、４匹の野生型（ＷＴ）同腹仔対照マウス（１０週齢、雄２匹及び雌２匹）、及び４匹のＭＡＩＤ６０３２ホモ接合性（「ＨＯ」）Ｆ２マウス（１０週齢、雄３匹、雌１匹）を屠殺し、血液、脾臓、及び骨髄を動物から採取した。血液は、ＥＤＴＡ（Ｃａｔ＃３６５９７３）を用いてＢＤマイクロティナ（ｍｉｃｒｏｔａｉｎｅｒ）管内へ収集した。骨髄は、完全ＲＰＭＩ媒質（ウシ胎仔血清、ピルビン酸ナトリウム、Ｈｅｐｅ、２−メルカプトエタノール、非必須アミノ酸、及びゲンタマイシンを補充したＲＰＭＩ媒質）で洗い流すことによって、大腿骨から収集した。末梢血液、脾臓及び骨髄調製物からの赤血球を、ＡＣＫ溶解緩衝液で溶解し、完全ＲＰＭＩ媒質で洗浄した。
【０２０１】
フローサイトメトリー
本明細書に記載される遺伝子的に修飾されたヘテロ接合性のＦ０マウス（ＭＡＩＤ６０３２ＨＥＴ）の、遺伝子的に修飾された対立遺伝子に（即ち、再構成されたＶＨ３−２３／Ｄ／ＪＨ４の単一のコピーを含有する対立遺伝子に）由来する抗体を産生する能力を調べるために、野生型または６０３２ヘテロ接合性マウスから単離した血液、脾臓、骨髄細胞を使用して蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）分析を実施した。
【０２０２】
手短に述べると、１×１０６個の細胞を、マウス抗ＣＤ１６／ＣＤ３２抗体（２．４Ｇ２、ＢＤ）と共に氷上で１０分間定温放置した後、以下の抗体カクテルを用いて氷上で３０分間標識した：抗マウスＦＩＴＣ−ＩｇＭａ（ＤＳ−１、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｐａｃｉｆｉｃ  ｂｌｕｅ−ＣＤ３（１７Ａ２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＡＰＣ−Ｈ７−ＣＤ１９（１Ｄ３、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、及びＰＥ−ＩｇＭｂ（ＡＦ６−７８、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）。染色した細胞を、洗浄し、２％ホルムアルデヒド内で固定した。データ収集は、ＢＤ  ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメータ上で実施し、ＦｌｏｗＪｏで分析した。野生型またはＦ０  ６０３２ヘテロ接合性マウスから単離した骨髄細胞、脾臓細胞、及び血液細胞を、シングレットにゲートし、ＣＤ１９発現（Ｂ細胞マーカー）またはＣＤ３発現（Ｔ細胞マーカー）に基づいて分類した。それに加えて、ＣＤ１９＋−ゲートしたＢ細胞を、ＩｇＭｂ抗体（野生型対立遺伝子（Ｂ６対立遺伝子）から産生されるＩｇＭ抗体）、または再構成された重鎖可変領域ヌクレオチド配列（ｈＶＨ３−２３（Ｄ）ＪＨ４、）を含むＩｇＭａ抗体（遺伝子的に修飾された対立遺伝子（１２９）対立遺伝子から産生される抗体）の存在に基づいて分類した。ＦＡＣＳ分析（図１１〜１２）は、標的化された対立遺伝子に関してヘテロ接合性のマウス（即ち、再構成された重鎖可変配列の１つのコピーを含有する、ＭＡＩＤ６０３２ｈｅｔ）は、遺伝子的に修飾された１２９（ＩｇＭａ）対立遺伝子に主に由来するＩｇＭ抗体を産生することが可能であることを示唆した。
【０２０３】
本明細書に記載される遺伝子的に修飾されたホモ接合性Ｆ２マウス（ＭＡＩＤ６０３２  ＨＯ）の、遺伝子的に修飾された対立遺伝子に（即ち、再構成されたＶＨ３−２３／Ｄ／ＪＨ４の単一のコピーを含有する対立遺伝子に）由来する抗体を産生する能力を調べるために、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）分析を、野生型または６０３２ホモ接合性マウスから単離した脾臓及び骨髄細胞を使用して上述の通りに実施した。
【０２０４】
成熟Ｂリンパ球のみが、脾臓及びリンパ節のリンパ濾胞に入り、したがって免疫応答に効率的に関与することができる。成熟した長命のＢリンパ球は、骨髄中の短命の前駆体から駆動する。成熟プール内への選択は、活動的プロセスであり、脾臓内で起こる。脾臓Ｂ細胞の２つの集団を、成熟Ｂ細胞のための前駆体として特定した。タイプ１（Ｔ１）の移行Ｂ細胞は、骨髄から新しく移動してきたものである。これらは、タイプ２（Ｔ２）の移行Ｂ細胞へと成長し、それは循環しており、脾臓の一次濾胞内でのみ見出される。成熟Ｂ細胞は、Ｔ１またはＴ２  Ｂ細胞から生成されることができる。Ｌｏｄｅｒ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９０（１）：７５−８９，１９９９。
【０２０５】
ＦＡＣＳ分析（図１３Ａ及び１３Ｂ）は、標的化された対立遺伝子に関してホモ接合性のマウス（即ち、再構成された重鎖可変配列の２つのコピーを含む：ＭＡＩＤ６０３２ＨＯ）は、野生型（図１３Ｃ及び１３Ｄ）と比較してラムダ配列の僅かな減少を伴うが、正常な脾臓成熟及び未熟Ｂ細胞集団を産生することができることを示唆した。また、脾臓内で、ＭＡＩＤ６０３２ＨＯマウスは、Ｔ１集団Ｂ細胞の僅かな減少及び辺縁帯Ｂ細胞の増加を示した（図１３Ｅ）。
【０２０６】
骨髄内では、ＭＡＩＤ６０３２ＨＯマウスは、野生型（図１４Ｆ）の半分であるラムダ配列の利用を伴う正常に近いＢ細胞集団（図１４Ａ−１４Ｅ）を産生した。
【０２０７】
免疫付与研究
５匹のＷＴ（７５％Ｃ５７ＢＬ６／２５％１２９バックグラウンド）及び３〜４匹のＭＡＩＤ６０３２ＨＥＴマウスを、２．３５μｇの抗原Ｘ、１０μｇのＣｐＧオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ１８２６、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、ｃａｔ＃ｔｌｒｌ−１８２６）、及び２５μｇのリン酸アルミニウムゲルアジュバント（Ｂｒｅｎｎｔａｇ、ｃａｔ＃７７８４−３０−７）を含有する０．０２５ｍｌの混合物で、足蹠に免疫付与した。マウスを、同一の用量で６回ブーストした。最初の免疫付与後１５日目及び２４日目に、麻酔をしたマウスから、眼窩後方血液を使用してＢＤ血清分離器管（ＢＤ、ｃａｔ＃３６５９５６）内に血液を収集し、製造者の指示に従って血清を収集した。
【０２０８】
抗原特異的ＩｇＧ抗体のレベルを測定し、ｍｏｍ（ｍｙｃ−ｍｙｃ−ｈｉｓ）タグをカウンタースクリーニングするために、ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ）に、４℃で一晩定温放置した１μｇ／ｍｌの抗原Ｘでコーティングした。余剰抗原を、室温で１時間ＰＢＳ＋１％ＢＳＡで遮断する前に洗い落とした。血清の連続希釈を適用し、プレートを、洗浄前に室温で１時間定温放置した。プレートを、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）共役型抗ＩｇＧ（ｃａｔ＃１０３０−０５、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）抗体と共に室温で１時間定温放置した。洗浄後、プレートを、ＴＭＢ基質（ｃａｔ＃５５５２１４、ＢＤ）と共に進行させた。１Ｎの硫酸で反応を停止させ、Ｖｉｃｔｏｒ  Ｘ５  Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｒｅａｄｅｒを使用して、Ｏ．Ｄ．を４５０ｎｍで読み取った。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを用いてデータを分析し、バックグラウンドより２倍上である血清の希釈を算出した。全ての動物実験は、ＩＡＣＵＣ及びＲｅｇｅｎｅｒｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓによって認可された。
【０２０９】
図１５に示される通り、標的化された対立遺伝子に関してヘテロ接合性である（即ち、再構成されたＶＨ３−２３／Ｄ／ＪＨ４ヌクレオチド配列の１つのコピーを含有する）遺伝子的に修飾されたＦ０及びＦ１マウス（ＭＡＩＤ６０３２ｈｅｔ）は、最初の免疫付与後１５日目及び２４日目の両方において、野生型マウスによって産生されるものに匹敵するレベルで抗原特異的ＩｇＧ抗体を産生することが可能であった。
【０２１０】
実施例３．２つのヒト軽鎖Ｖセグメントを含むマウスの生成及び分析
実施例３．１：２つのヒト軽鎖Ｖセグメントを含むマウスの生成のためお標的化ベクターの構築
２つのヒトＶκ遺伝子セグメント（例えば、ヒトＶκ１−３９及びヒトＶκ３−２０遺伝子セグメント、即ち、二重軽鎖（「ＤＬＣ」））を含有する２つの改変された軽鎖遺伝子座を構築した（図２０）。１つの改変された軽鎖遺伝子座は、２つのヒトＶκ遺伝子セグメント及び５つのヒトＪκ遺伝子セグメントを再構成されていない構成で含有した（ＤＬＣ−５Ｊ）。第２の改変された軽鎖遺伝子座は、２つのヒトＶκ遺伝子セグメント及び１つのヒトＪκ遺伝子セグメントを再構成されていない構成で含有した（ＤＬＣ−１Ｊ）。２つの追加の改変された軽鎖遺伝子座の各々に関して、ヒト遺伝子セグメントは、Ｂ細胞中のヒト遺伝子セグメントのインビボ再構成を可能にするように、組み換えシグナル配列と３’隣接した。
【０２１１】
ＤＬＣ−１Ｊマウスの改変及び生成乃至はＤＬＣ−１Ｊと称される、２つのヒトＶκ遺伝子セグメント（Ｖκ１−３９及びＶκ３−２０）及び１つのヒトＪκ遺伝子セグメント（Ｊκ５）を含む軽鎖遺伝子座の生成をもたらす改変ステップが、図２１に描写される。具体的には、ヒトＶκ１−３９及びＶκ３−２０配列を、ＢＡＣテンプレート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのＰＣＲによって増幅させ、組み換えシグナル配列（ｒｓｓ）及びヒトＪκ５セグメントを含有する増幅された配列と共に、４方向ライゲーションを介してＵＢ−ハイグロマイシン選択カセットを含有するプラスミドへクローン化した（図２１Ａ）。５’及び３’アームは、図２１Ｂ及び２１Ｃに描写される通りに付着された。
【０２１２】
得られた標的化構築物は、白楕円の組み換えシグナル配列（ＲＳＳ）と共に図２１Ｃ（下図、ＤＬＣ−１Ｊ）に描写される。マウス配列（即ち、内在性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座の上流及び下流配列）に作動可能に連結される改変されたＤＬＣ−１Ｊ軽鎖遺伝子座の修飾されたＢＡＣ  ＤＮＡクローンを、２つのヒトＶκ遺伝子セグメントを含有する改変された軽鎖遺伝子座内の配列に配置されたプライマーを使用して、ＰＣＲによって確認し、その後、マウスＩｇκ可変遺伝子座（κ可変及びジョイニング遺伝子セグメントを含む）の欠失を含むＥＳ細胞内へ電気穿孔して（図２１Ｄ）、２つのヒトＶκ遺伝子セグメントのうちのいずれかを発現するマウスを作成した。改変されたＤＬＣ−１Ｊ軽鎖遺伝子座を含有する陽性ＥＳ細胞クローンを、改変されたＤＬＣ−１Ｊ軽鎖遺伝子座に特異的なプローブを使用して、Ｔａｑｍａｎ（商標）スクリーニング及び核型分析によって確認した。ＤＬＣ−１Ｊ  ＥＳ細胞のＥＳ細胞スクリーニングに使用したプライマー及びプローブの配列は、下の表８に描写され、また配列リストに含まれる。
【０２１３】
【表１−１】
0005993102.tif 000002
【表１−２】
0005993102.tif 000003
【０２１４】
次に、確認されたＥＳ細胞クローンを使用して、ＤＬＣ−１Ｊ軽鎖遺伝子座を含み、マウスＣκドメインと融合されたヒト軽鎖可変ドメインを発現する同腹仔を生み出すように、雌マウスに移植した。仔マウスの遺伝子型分析に使用したプライマー及びプローブの配列は、上の表８に記載される。１００ヌクレオチドのマウス配列を挿入された改変された配列の上流及び下流に含む、改変されたＤＬＣ−１Ｊ遺伝子座内の配列は、図２２Ａ〜２２Ｄに提示され、また配列番号８２に記載される。
【０２１５】
改変された軽鎖遺伝子座を担持するＥＳ細胞は、標的化構築物によって導入されたＦＲＴｅｄネオマイシンカセットを除去するために、ＦＬＰを発現する構築物を導入することができる（図２１Ｅ参照）。任意追加的に、ネオマイシンカセットは、ＦＬＰリコンビナーゼを発現するマウスを繁殖させることによって除去される（例えば、ＵＳ第６，７７４，２７９号）。任意追加的に、ネオマイシンカセットは、マウス内に保持される。
【０２１６】
ＤＬＣ−５Ｊマウスの改変及び生成乃至はＤＬＣ−５Ｊと称される、２つのヒトＶκ遺伝子セグメント（Ｖκ１−３９及びＶκ３−２０）及び５つのヒトＪκ遺伝子セグメント（Ｊκ１、Ｊκ２、Ｊκ３、Ｊκ４、及びＪκ５）を含む軽鎖遺伝子座を生成するために、５つのヒトＪκの全てを含む２０００塩基対の増幅された配列を、図２１Ｂ（中）に描写される２つのヒトＶκ遺伝子セグメント及び１つのヒトＪκを含むベクターにライゲートした（図２３Ａを参照）。その後の改変ステップは、図２３Ｂに描写される３’及び５’アームの付着を含んだ。
【０２１７】
得られた標的化構築物は、白楕円の組み換えシグナル配列（ＲＳＳ）と共に図２３Ｂ（下図、ＤＬＣ−５Ｊ）に描写される。マウス配列（即ち、内在性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座の上流及び下流配列）に作動可能に連結される改変されたＤＬＣ−５Ｊ軽鎖遺伝子座の修飾されたＢＡＣ  ＤＮＡクローンを、２つのヒトＶκ遺伝子セグメントを含有する改変された軽鎖遺伝子座内の配列に配置されたプライマーを使用して、ＰＣＲによって確認し、その後、マウスＩｇκ可変遺伝子座（κ可変及びジョイニング遺伝子セグメントを含む）の欠失を含むＥＳ細胞内へ電気穿孔して（図２３Ｃ）、２つのヒトＶκ遺伝子セグメントのうちのいずれかを発現するマウスを作成した。改変されたＤＬＣ−５Ｊ軽鎖遺伝子座を含有する陽性ＥＳ細胞クローンを、改変されたＤＬＣ−５Ｊ軽鎖遺伝子座に特異的なプローブを使用して、Ｔａｑｍａｎ（商標）スクリーニング及び核型分析によって確認した。ＤＬＣ−５Ｊ  ＥＳ細胞のＥＳ細胞スクリーニングに使用したプライマー及びプローブの配列は、下の表９に描写され、また配列リストに含まれる。
【表２−１】
0005993102.tif 000004
【表２−２】
0005993102.tif 000005
【０２１８】
次に、確認されたＥＳ細胞クローンを使用して、ＤＬＣ−５Ｊ軽鎖遺伝子座を含み、マウスＣκドメインと融合されたヒト軽鎖可変ドメインを発現する同腹仔を生み出すように、雌マウスに移植した。仔マウスの遺伝子型分析に使用したプライマー及びプローブの配列は、上の表９に記載される。１００ヌクレオチドのマウス配列を挿入された改変された配列の上流及び下流に含む、改変されたＤＬＣ−５Ｊ遺伝子座内の配列は、図２４Ａ〜２４Ｄに提示され、また配列番号８３に記載される。
【０２１９】
改変された軽鎖遺伝子座を担持するＥＳ細胞は、標的化構築物によって導入されたＦＲＴｅｄネオマイシンカセットを除去するために、ＦＬＰを発現する構築物を導入することができる（図２３Ｄ参照）。任意追加的に、ネオマイシンカセットは、ＦＬＰリコンビナーゼを発現するマウスを繁殖させることによって除去される（例えば、ＵＳ第６，７７４，２７９号）。任意追加的に、ネオマイシンカセットは、マウス内に保持される。
【０２２０】
実施例３．２：２つのヒトＶセグメントを含むマウスの特徴付け
フローサイトメトリー．ＤＬＣマウスにおけるＢ細胞集団及びＢ細胞発生を、脾細胞及び骨髄調製物のフローサイトメトリー分析によって検証した。２つのヒトＶκ遺伝子セグメント及び５つのヒトＪκ遺伝子セグメントに関してホモ接合性のマウス（ｎ＝４）、２つのヒトＶκ遺伝子セグメント及び１つのヒトＪκ遺伝子セグメントに関してホモ接合性のマウス（ｎ＝４）、ならびに野生型マウス（ｎ＝４）からの細胞懸濁液を、標準的な方法を使用して作製し、蛍光標識された抗体で染色した。
【０２２１】
手短に述べると、１ｘ１０６個の細胞を、抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２（クローン２．４Ｇ２、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ）と共に氷上で１０分間定温放置した後、以下の抗体カクテルを用いて氷上で３０分間標識した：ＡＰＣ−Ｈ７共役型抗マウスＣＤ１９（クローン１Ｄ３、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ）、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ共役型抗マウスＣＤ３（クローン１７Ａ２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＦＩＴＣ共役型抗マウスＩｇκ（クローン１８７．１、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ）または抗マウスＣＤ４３（クローン１Ｂ１１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＰＥ共役型抗マウスＩｇλ（クローンＲＭＬ−４２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）または抗マウスｃ−ｋｉｔ（クローン２Ｂ８、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５共役型抗マウスＩｇＤ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＰＥ−Ｃｙ７共役型抗マウスＩｇＭ（クローンＩＩ／４１、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＡＰＣ共役型抗マウスＢ２２０（クローンＲＡ３−６Ｂ２、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）。染色後、細胞を洗浄し、２％ホルムアルデヒド内で固定した。データ収集は、ＬＳＲＩＩフローサイトメータ上で実施し、ＦｌｏｗＪｏ（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ，Ｉｎｃ．）で分析した。ゲート：総Ｂ細胞（ＣＤ１９＋ＣＤ３−）、Ｉｇκ＋Ｂ細胞（Ｉｇκ＋Ｉｇλ−ＣＤ１９＋ＣＤ３−）、Ｉｇλ＋Ｂ細胞（Ｉｇκ−Ｉｇλ＋ＣＤ１９＋ＣＤ３−）。骨髄区画に関する結果は、図２５Ａ〜２７Ｂに示される。脾臓区画に関する結果は、図２８Ａ〜図３１に示される。
【０２２２】
本実施例に示されるように、ＤＬＣ−５Ｊマウスは、脾臓及び骨髄区画内に正常なＢ細胞集団を示す（図２５Ａ〜３１）。ＤＬＣ−５Ｊマウスは、骨髄区画内に、野生型同腹仔において観察されるものと実質的に同一の未熟、成熟、及びプレ／プロＢ細胞集団を示した。実際、ＤＬＣ−５Ｊ遺伝子座は、野生型マウスにおいて観察されるものと実質的に同一のカッパ：ラムダ比を得るために、内在性ラムダ軽鎖遺伝子座に匹敵することが可能であった（図２７Ｂ）。また、ＤＬＣ−５Ｊマウスは、野生型マウスにおいて観察されるものと実質的に同一の様式で発生する、脾臓区画における種々の段階（例えば、未熟、成熟、Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３、辺縁帯前駆体、辺縁帯、濾胞性−Ｉ、濾胞性−ＩＩなど）を通したＢ細胞の進行として、正常な末梢Ｂ細胞発生を示す（図３０Ａ〜３１）。対照的に、ＤＬＣ−１Ｊマウスは、改変されたカッパ軽鎖と比較して、より低いＢ細胞総数及び増加されたラムダ軽鎖利用を示した（データ図示無し）。
【０２２３】
二重軽鎖発現両ヒトＶκ遺伝子セグメントの発現を、ホモ接合性マウスにおいて定量的ＰＣＲアッセイを使用して分析した。手短に述べると、ＣＤ１９＋Ｂ細胞を、野生型マウス、マウス重鎖及びκ軽鎖可変遺伝子座の、対応するヒト重鎖及びκ軽鎖可変領域遺伝子座（Ｈκ）での置き換えに関してホモ接合性のマウス、ならびに２つのヒトＶκ遺伝子セグメントと、５つのヒトＪκ遺伝子セグメント（ＤＬＣ−５Ｊ）または１つのヒトＪκ遺伝子セグメント（ＤＬＣ−１Ｊ）のうちのいずれかとを含有する改変されたκ軽鎖遺伝子座に関してホモ接合性のマウスの骨髄及び全脾臓から精製した。相対的発現を、マウスＣκ領域の発現に正規化した（１群当たりｎ＝３〜５匹のマウス）。結果は、図３２及び図３３に示される。
【０２２４】
再構成されたヒトＶκ３−２０またはヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントを含有する軽鎖の発現を、ＤＬＣ−５Ｊ及びＤＬＣ−１Ｊマウスの骨髄中及び脾臓中の両方で検出した（図３２及び図３３）。骨髄区画内では、ＤＬＣマウスの両系における両ヒトＶκ３−２０由来及びヒトＶκ１−３９由来軽鎖の発現は、マウスＶκ及びＪκ遺伝子セグメントの、対応するヒトＶκ及びＪκ遺伝子セグメントでの置き換えを含むマウス（Ｈκ、図３２）と比較して、著しく高かった。ヒトＶκ３−２０由来軽鎖発現は、Ｈκマウスにおけるものよりも約６倍（ＤＬＣ−５Ｊ）〜１５倍（ＤＬＣ−１Ｊ）高く観察された。ＤＬＣ−１Ｊマウスは、骨髄区画内で、ＤＬＣ−５Ｊマウスよりも約２倍高いヒトＶκ３−２０由来軽鎖の発現を示した。ヒトＶκ１−３９由来軽鎖発現は、Ｈマウスにおけるものよりも約６倍（ＤＬＣ−５Ｊ）〜１３倍（ＤＬＣ−１Ｊ）高く観察された。ＤＬＣ−１Ｊマウスは、骨髄区画内で、ＤＬＣ−５Ｊマウスよりも約２倍高いヒトＶκ１−３９由来軽鎖の発現を示した。
【０２２５】
脾臓区画内では、ＤＬＣマウスの両系における両ヒトＶκ３−２０由来及びヒトＶκ１−３９由来軽鎖の発現は、Ｈκマウスと比較して著しく高かった（図３３）。ヒトＶκ３−２０由来軽鎖発現は、Ｈκマウスにおけるものよりも約４倍（ＤＬＣ−５Ｊ）〜８倍（ＤＬＣ−１Ｊ）高く観察された。ＤＬＣ−１Ｊマウスは、脾臓区画内で、ＤＬＣ−５Ｊマウスよりも約２倍高いヒトＶκ３−２０由来軽鎖の発現を示した。ヒトＶκ１−３９由来軽鎖発現は、Ｈκマウスにおけるものよりも約４倍（ＤＬＣ−５Ｊ）〜５倍（ＤＬＣ−１Ｊ）高く観察された。ＤＬＣ−１Ｊマウスは、脾臓区画内で、ＤＬＣ−５Ｊマウスと比較して同様のヒトＶκ１−３９由来軽鎖の発現を示した。
【０２２６】
ＤＬＣ−５ＪマウスにおけるヒトＶκ／Ｊκ利用２つの再構成されていないヒトＶκ遺伝子セグメント及び５つの再構成されていないヒトＪκ遺伝子セグメントに関してホモ接合性のマウス（ＤＬＣ−５Ｊ）を、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって、脾臓Ｂ細胞中のヒトＶκ／Ｊκ遺伝子セグメント利用に関して分析した。
【０２２７】
手短に述べると、ホモ接合性ＤＬＣ−５Ｊ（ｎ＝３）及び野生型（ｎ＝２）マウスからの脾臓を採取し、１０％の熱不活性化ウシ胎仔血清を含有する１０ｍＬのＲＰＭＩ１６４０（Ｓｉｇｍａ）中ですり板ガラススライドを使用してメッシュし、単一の細胞懸濁液を作成した。脾細胞を、遠心分離（１２００ｒｐｍで５分間）を用いてペレット化し、赤血球を、５ｍＬのＡＣＫ溶解緩衝液（ＧＩＢＣＯ）中で３分間溶解させた。脾細胞を、ＰＢＳ（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で希釈し、０．７μｍの細胞濾過器で濾過し、再び遠心分離して細胞をペレット化し、それを次に１ｍＬのＰＢＳ中で再懸濁した。
【０２２８】
ＲＮＡを、ＡｌｌＰｒｅｐ  ＤＮＡ／ＲＮＡ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、製造者の仕様書に従ってペレット化した脾細胞から単離した。ＲＴ−ＰＣＲを、５’ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の迅速増幅）Ｓｙｓｔｅｍを使用して、製造者の仕様書（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従ってマウスＣκ遺伝子に特異的なプライマーを用いて脾細胞上で実施した。マウスＣκ遺伝子に特異的なプライマーは、３’ｍＩｇκＣ  ＲＡＣＥ１（ＡＡＧＡＡＧＣＡＣＡ  ＣＧＡＣＴＧＡＧＧＣ  ＡＣ、配列番号９０）及びｍＩｇκＣ３’−１（ＣＴＣＡＣＴＧＧＡＴ  ＧＧＴＧＧＧＡＡＧＡ  ＴＧＧＡ、配列番号９１）であった。ＰＣＲ産生物を、ゲル精製し、ｐＣＲ（登録商標）２．１−ＴＯＰＯ（登録商標）ベクター（ＴＯＰＯ（登録商標）ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）Ｋｉｔ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へクローン化し、クローン化部位に隣接する場所でベクター内に配置されたＭ１３順（ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣ  ＧＧＣＣＡＧ、配列番号９２）及びＭ１３逆（ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧ  ＣＴＡＴＧＡＣ、配列番号９３）プライマーを用いて配列決定した。各脾臓標本からの１０個のクローンを、配列決定した。配列を、ＩＭＧＴ／Ｖ−ＱＵＥＳＴ参照ディレクトリセットからのマウス及びヒト免疫グロブリンセットと比較して、Ｖκ／Ｊκ利用を決定した。表１０は、各脾細胞標本からのＲＴ−ＰＣＲクローンにて観察された選択されたクローンに関するＶκ／Ｊκ組み合わせを記載する。表１１は、ＤＬＣ−５Ｊホモ接合性マウスからの選択されたＲＴ−ＰＣＲクローンのヒトＶκ／ヒトＪκ及びヒトＪκ／マウスＣκ分岐のアミノ酸配列を記載する。小文字は、可変領域のアミノ酸配列における変異、または組み換え中のＮ及び／もしくはＰ付加の結果として生じる非テンプレート付加を示す。
【０２２９】
本実施例に示される通り、マウスＣκ遺伝子に作動可能に連結される、２つの再構成されていないヒトＶκ遺伝子セグメント及び５つの再構成されていないヒトＪκ遺伝子セグメントに関してホモ接合性のマウス（ＤＬＣ−５Ｊ）は、両ヒトＶκ遺伝子セグメントを複数のヒトＪκ遺伝子セグメントに生産的に組み換えて、限定された免疫グロブリン軽鎖レパートリーを産生することが可能である。表１０に示されるＤＬＣ−５Ｊホモ接合性マウスにおける再構成の中で、固有のヒトＶκ／Ｊκ再構成がＶκ１−３９／Ｊκ２（１）、Ｖκ１−３９／Ｊκ３（１）、Ｖκ３−２０／Ｊκ１（７）、Ｖκ３−２０／Ｊκ２（４）、及びＶκ３−２０／Ｊκ３（１）に関して観察された。さらに、かかる固有の再構成は、発生中のヒトＶκ及びＪκ遺伝子セグメントの変異及び／または組み換えから得られる軽鎖のＣＤＲ３領域内の固有のアミノ酸（表１１）の存在を通して、分岐多様性を示す。全ての再構成は、マウスＣκを通して機能的な読み取りを示した（表１１）。
【０２３０】
総じて、これらのデータは、そのどちらも免疫グロブリン軽鎖のヒトＶＬドメインを再構成し（例えば、１つ以上の、また幾つかの実施形態では、最大５つのヒトＪκ遺伝子セグメントを伴って）、コードすることが可能な２つ以下のヒトＶκ遺伝子セグメントの選択を提示するように改変されたマウスは、全ての態様において野生型に近いＢ細胞数及び発生を有することを示している。かかるマウスは、その群内に存在する２つの可能なヒトＶＬ遺伝子セグメントのうちの１つを有する免疫グロブリン軽鎖を有する、抗体群を産生する。マウスは、抗原攻撃に応答してこの抗体群を産生し、抗体群は、逆キメラ（ヒト可変／マウス定常）重鎖の多様性に関連付けられる。
【表３−１】
0005993102.tif 000006
【表３−２】
0005993102.tif 000007
【表４】
0005993102.tif 000008
【０２３１】
実施例４：２つのヒスチジン置換ヒト軽鎖を含むマウスの生成及び特徴付け
実施例４．１：各々４つのヒスチジン置換を含有する２つのＶカッパセグメントを含むマウスの改変及び生成
ヒスチジン置換を、Ｖκ１−３９及びＶκ３−２０ＵＬＣマウスに関して上述される通り、二重軽鎖遺伝子座内へ導入した。手短に述べると、図２３Ａ（下）に描写されるＤＬＣ配列を、図３４に描写されるプライマーを使用して部位特異的突然変異生成に供し、初めにＶκ１−３９配列を修飾し、その後Ｖκ３−２０配列を修飾した。得られた二重軽鎖配列は、１０５位、１０６位、１０８位、及び１１１位にて生殖系列配列内に導入されたヒスチジンを有するＶκ１−３９セグメント、１０５位、１０６位、１０７位、及び１０９位にて生殖系列配列内に導入されたヒスチジンを有するＶκ３−２０セグメント、ならびに全ての５つのＪκセグメント（Ｊκ１、Ｊκ２、Ｊκ３、Ｊκ４、及びＪκ５）を含有した。その後の改変ステップは、ＦＲＴ−ＵＢ−ＮＥＯ−ＦＲＴカセットを有する５’アーム、ならびにマウスＩｇκエンハンサー及び定常領域を有する３’アームの付着を含んだ。この標的化ベクターを、図３５Ａに描写される通り、マウスＩｇκ可変遺伝子座（κ可変及びジョイニング遺伝子セグメントを含む）の欠失を含むＥＳ細胞内へ電気穿孔した（組み換えシグナル配列、ＲＳＳは、この図では省略される）。標的化されたＥＳ細胞を、表１、５、８、及び９内の上述の領域（特に、１６３３ｈ２、１６３５ｈ２、ｎｅｏ、Ｊｘｎ  １−３９／３−２０、ｍＩｇＫｄ２、及びｍＩｇＫｐ１５）を検出するプライマー及びプローブ、ならびに下記の表１２に記載されるプライマー及びプローブの２つの追加のセットを使用して、上述の対立遺伝子アッセイの修飾によってスクリーニングした。これらのプライマー及びプローブの２つの追加のセットの配列は、配列リストに含まれる。
【表５】
0005993102.tif 000009
【０２３２】
次に、確認されたＥＳ細胞クローンを使用して、２つの現存するＶＬセグメント配列の各々に４つのヒスチジン修飾を有するＤＬＣ−５Ｊ軽鎖遺伝子座を含み、マウスＣκドメインと融合されたヒト軽鎖可変ドメインを発現する同腹仔を生み出すように、雌マウスに移植した。ＥＳ細胞スクリーニングに使用したものと同一の配列の幾つかを、仔マウスの遺伝子型分析にも使用する。
【０２３３】
改変された軽鎖遺伝子座を担持するＥＳ細胞は、標的化構築物によって導入されたＦＲＴｅｄネオマイシンカセットを除去するために、ＦＬＰ（例えば、ＦＬＰｏ）を発現する構築物を導入することができる（図３５Ｂを参照、ＲＳＳはこの図では省略される）。任意追加的に、ネオマイシンカセットは、ＦＬＰリコンビナーゼを発現するマウスを繁殖させることによって除去される（例えば、ＵＳ第６，７７４，２７９号）。任意追加的に、ネオマイシンカセットは、マウス内に保持される。
【０２３４】
実施例４．２：各々３つのヒスチジン置換を含有する２つのＶカッパセグメントを含むマウスの改変及び生成
３つのヒスチジン置換を、二重軽鎖マウスの各Ｖκ１−３９及びＶκ３−２０内へ導入した。手短に述べると、図２３Ａ（下）に描写されるＤＬＣ配列を、図３６描写されるプライマーを使用して部位特異的突然変異生成に供し、初めにＶκ１−３９配列を修飾し、その後Ｖκ３−２０配列を修飾した。得られた二重軽鎖配列は、１０６位、１０８位、及び１１１位にて生殖系列配列内に導入されたヒスチジンを有するＶκ１−３９セグメント、１０５位、１０６位、及び１０９位生殖系列配列内に導入されたヒスチジンを有するＶκ３−２０セグメント、ならびに全ての５つのＪκセグメント（Ｊκ１、Ｊκ２、Ｊκ３、Ｊκ４、及びＪκ５）を含有した。その後の改変ステップは、ＦＲＴ−ＵＢ−ＮＥＯ−ＦＲＴカセットを有する５’アーム、ならびにマウスＩｇκエンハンサー及び定常領域を有する３’アームの付着を含んだ。この標的化ベクターを、図３７Ａに描写される通り、マウスＩｇκ可変遺伝子座（κ可変及びジョイニング遺伝子セグメントを含む）の欠失を含むＥＳ細胞内へ電気穿孔した（ＲＳＳは、この図では省略される）。標的化されたＥＳ細胞を、表１、５、８、及び９内の上述の領域（特に、１６３３ｈ２、１６３５ｈ２、ｎｅｏ、Ｊｘｎ１−３９／３−２０、ｍＩｇＫｄ２、及びｍＩｇＫｐ１５）を検出するプライマー及びプローブ、ならびに下記の表１３に記載されるプライマー及びプローブの２つの追加のセットを使用して、上述の対立遺伝子アッセイの修飾によってスクリーニングした。これらのプライマー及びプローブの２つの追加のセットの配列は、配列リストに含まれる。
【表６】
0005993102.tif 000010
【０２３５】
次に、確認されたＥＳ細胞クローンを使用して、２つの現存するＶＬセグメント配列の各々に４つのヒスチジン修飾を有するＤＬＣ−５Ｊ軽鎖遺伝子座を含み、マウスＣκドメインと融合されたヒト軽鎖可変ドメインを発現する同腹仔を生み出すように、雌マウスに移植した。ＥＳ細胞スクリーニングに使用したものと同一の配列の幾つかを、仔マウスの遺伝子型分析にも使用する。
【０２３６】
改変された軽鎖遺伝子座を担持するＥＳ細胞は、標的化構築物によって導入されたＦＲＴｅｄネオマイシンカセットを除去するために、ＦＬＰ（例えば、ＦＬＰｏ）を発現する構築物を導入することができる（図３７Ｂを参照、ＲＳＳはこの図では省略される）。任意追加的に、ネオマイシンカセットは、ＦＬＰリコンビナーゼを発現するマウスを繁殖させることによって除去される（例えば、ＵＳ第６，７７４，２７９号）。任意追加的に、ネオマイシンカセットは、マウス内に保持される。
【０２３７】
実施例４．３：ヒトヒスチジン置換二重軽鎖を含むマウスの繁殖
改変されたヒトヒスチジン置換二重軽鎖遺伝子座を担持するマウスを、内在性λ軽鎖遺伝子座の欠失を含有するマウスと繁殖させて、二重軽鎖遺伝子座に由来する改変されたヒスチジン置換軽鎖をその唯一の軽鎖として発現する子孫を生成する。
【０２３８】
改変されたヒトヒスチジン置換二重軽鎖遺伝子座を担持するマウスを、内在性マウス重鎖可変遺伝子座のヒト重鎖可変遺伝子座での置き換えを含有するマウスと繁殖させる（ＵＳ第６，５９６，５４１号及びＵＳ第８，５０２，０１８号を参照、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウス、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）。
【０２３９】
実施例４．４：各々３つのヒスチジン置換を含有する２つのＶカッパセグメントを含むマウスから獲得される免疫グロブリン軽鎖内のヒスチジン修飾の検出
脾臓Ｂ細胞ｍＲＮＡからのＶカッパ単位複製配列を、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）及びハイスループットスクリーニングを使用して調製した。
【０２４０】
手短に述べると、各々３つのヒスチジン置換を含有する２つのＶカッパセグメント（Ｖκ１−３９及びＶκ３−２０）を含む５匹のヘテロ接合性のマウス（そのカッパ遺伝子座が図３５に描写されるマウス）からの脾臓及び内在性マウス重鎖を、採取し、ガラススライドを使用して１×ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）中で均質化した。細胞を、遠心分離（５００×ｇで５分間）にてペレット化し、赤血球を、ＡＣＫ溶解緩衝液（Ｇｉｂｃｏ）中で３分間溶解させた。細胞を１×ＰＢＳで洗浄し、０．７μｍの細胞濾過器を使用して濾過した。Ｂ細胞を、ＣＤ１９に関するＭＡＣＳ磁気陽性選択（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して脾臓細胞から単離した。全ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してペレット化されたＢ細胞から単離した。ポリＡ＋ｍＲＮＡを、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ  Ｄｉｒｅｃｔ  ｍＲＮＡ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して全ＲＮＡから単離した。
【０２４１】
２本鎖ｃＤＮＡを、ＳＭＡＲＴｅｒ  Ｐｉｃｏ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して５’ＲＡＣＥによって脾臓Ｂ細胞ｍＲＮＡから調製した。Ｃｌｏｎｔｅｃｈ逆転写酵素及びｄＮＴＰを、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ及びｄＮＴＰで置換した。免疫グロブリン軽鎖レパートリーを、ＩｇＫ定常領域に特異的なプライマー及びＳＭＡＲＴｅｒ５’ＲＡＣＥプライマー（表１４）を使用して、ｃＤＮＡから増幅させた。ＰＣＲ産生物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して除去した。ＰＣＲの第２のラウンドを、同一の５’ＲＡＣＥプライマー及びＩｇＫ定常領域に特異的なネスト化３’プライマー（表１５）を使用して行った。第２のラウンドのＰＣＲ産生物を、ＳｉｚｅＳｅｌｅｃｔ  Ｅ−ｇｅｌ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して精製した。第３のＰＣＲを、４５４のアダプター及びバーコードを付加するプライマーを用いて実施した。第３のラウンドのＰＣＲ産生物を、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ  Ｂｅａｄｓを使用して精製した。精製されたＰＣＲ産生物を、ＫＡＰＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＫＡＰＡ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してＳＹＢＲ−ｑＰＣＲによって定量化した。プールしたライブラリを、製造者のプロトコルに従って、４５４ＧＳ  Ｊｕｎｉｏｒ  Ｔｉｔａｎｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  Ｌｉｂ−Ａ  ｅｍＰＣＲ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用したエマルジョンＰＣＲ（ｅｍＰＣＲ）及びＲｏｃｈｅ４５４ＧＳ  Ｊｕｎｉｏｒ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔを使用した二方向性配列決定に供した。
【表７】
0005993102.tif 000011
【０２４２】
生物情報学分析のために、４５４の配列読み取りを、標本バーコード完全整合に基づいて分類し、品質を調整した。配列には、ｉｇｂｌａｓｔの局所導入（ＮＣＢＩ、ｖ２．２．２５＋）を使用して、再構成されたＩｇ配列のヒト生殖系列Ｖ及びＪセグメントデータベースに対する整列に基づいて注記を付けた。同一のスコアを有する複数の最良ヒットが検出された場合、配列は、不明瞭として印を付け、分析から除去した。１セットのパールスクリプトを開発して、結果を分析し、データをｍｙｓｑｌデータベースに保存した。カッパ軽鎖のＣＤＲ３領域は、保存されたＣコドンとＦＧＸＧモチーフとの間で定義した。
【０２４３】
図３８は、ヒスチジン修飾ＤＬＣ−５Ｊを含むマウス（上述の通り、各々３つのヒスチジン修飾を有するＶκ１−３９及びＶκ３−２０遺伝子セグメントを含む軽鎖可変遺伝子座を含む）において生成される生産的に再構成された抗体から獲得された例示的なＶκ配列のアミノ酸翻訳を有するヒト生殖系列ＩｇＫＶ３−２０（図３８Ａ）またはＩｇＫＶ１−３９（図３８Ｂ）配列によってコードされるアミノ酸配列の整列を表す。配列読み取りは、生産的に再構成された軽鎖の大多数は、その生殖系列ＣＤＲ３内に導入された少なくとも１つのヒスチジンを保持することを示した。幾つかの例では、少なくとも１つのヒスチジン残基を保持するＶκ３−２０配列を含む全ての生産的に再構成されたヒト軽鎖の大多数において、その生殖系列ＣＤＲ３内に導入された３つのヒスチジン修飾の全てが保持される（図３８Ａを参照）。幾つかの例では、少なくとも１つのヒスチジン残基を保持するＶκ１−３９配列を含む生産的に再構成されたヒト軽鎖において、軽鎖の約５０％は、その生殖系列ＣＤＲ３内に導入された３つのヒスチジンの全てを保持し（図３８Ｂの上の整列を参照）、一方、軽鎖の約５０％は、その生殖系列ＣＤＲ３内に導入された３つのヒスチジンのうちの２つを保持する（図３８Ｂの下の整列を参照）。幾つかの例では、Ｖセグメント配列の最終位置のヒスチジンは、Ｖ−Ｊ再構成のため失われる場合がある。
【０２４４】
実施例５．単一の再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖ヌクレオチド配列及び２つのＶカッパ遺伝子セグメントを含むマウスの生成及び分析
重鎖遺伝子座中に再構成された重鎖可変領域核酸配列を含むマウス（ＭＡＩＤ６０３１、「ＵＨＣマウス」）を、上述の通り生成した。手短に述べると、ＵＨＣマウスにおいて、全ての内在性機能性重鎖可変遺伝子セグメントを欠失させ、内在性重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結されるｈＶＨ３−２３／Ｄ／ＪＨ４をコードする単一の再構成された重鎖可変領域核酸配列で置き換えた。
【０２４５】
２つのヒトＶκ遺伝子セグメント（例えば、ヒトＶκ１−３９及びヒトＶκ３−２０遺伝子セグメント）と、１つのヒトＪκセグメント（Ｊκ５、ＤＬＣ−１Ｊ）かまたは５つのヒトＪκ遺伝子セグメント（ｈＪκ１−５、ＤＬＣ−５Ｊ）かのいずれかとを含有する、遺伝子的に改変された軽鎖遺伝子座を含むマウスを、上述の通り生成した。手短に述べると、１つの改変された軽鎖遺伝子座は、２つのヒトＶκ遺伝子セグメント及び５つのヒトＪκ遺伝子セグメント（Ｊκ１−５）を再構成されていない構成で含有し、内在性マウスκ定常領域配列（ＭＡＩＤ１９１１（ＤＬＣ−５Ｊ）、図１９Ｅ）に作動可能に連結される。他の改変された軽鎖遺伝子座は、２つのヒトＶκ遺伝子セグメント及び１つのヒトＪκ（Ｊκ１）遺伝子セグメントを再構成されていない構成で含有し、内在性マウスκ定常領域配列に作動可能に連結される（ＭＡＩＤ１９１３（ＤＬＣ−１Ｊ）、図２１Ｄ）。２つの追加の改変された軽鎖遺伝子座の各々に関して、ヒト遺伝子セグメントは、Ｂ細胞中のヒト遺伝子セグメントのインビボ再構成を可能にするように、組み換えシグナル配列と３’隣接した。
【０２４６】
上述のホモ接合性ＵＨＣマウス（ＭＡＩＤ６０３１）を、ホモ接合性ＤＬＣ−５Ｊ（ＭＡＩＤ１９１１）マウスと繁殖させて、ＵＨＣ対立遺伝子及びＤＬＣ−５Ｊ対立遺伝子に関してヘテロ接合性のマウスを生み出した。同様に、ホモ接合性ＵＨＣマウス（ＭＡＩＤ６０３１）を、ホモ接合性ＤＬＣ−１Ｊ（ＭＡＩＤ１９１３）マウスと繁殖させて、ＵＨＣ対立遺伝子及びＤＬＣ−１Ｊ対立遺伝子に関してヘテロ接合性のマウスを生成した。これらの交配から生成されたＦ１ヘテロ接合性マウスを、互いに繁殖させて、各対立遺伝子に関してホモ接合性のマウスを得た。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖遺伝子座中の遺伝子的に修飾された対立遺伝子の存在を、上述の特異的プローブ及びプライマーを使用してＴＡＱＭＡＮ（商標）スクリーニング及び核型分析によって確認した。
【０２４７】
ＵＨＣ対立遺伝子に関してヘテロ接合性のマウス及びＤＬＣ−５Ｊを、互いに繁殖させて、主に遺伝子的に修飾された遺伝子座から免疫グロブリン「軽」鎖を発現するホモ接合体（ＭＡＩＤ１９１２ＨＯ６０３２ＨＯ、「ＤＬＣ×ＵＨＣ」）を生成した。ＭＡＩＤ１９１２ＨＯ６０３２ＨＯ（ホモ接合性ＤＬＣ×ＵＨＣ）マウスは、本明細書に記載されるユニバーサル重鎖（例えば、ｈＶＨ３−２３／ｈＤ／ｈＪＨ４）の、全ての内在性可変重鎖ＶＤＪ遺伝子が欠失されたマウス重鎖遺伝子座、及び全てのマウスＶκ及びＪκ遺伝子が欠失されたＤＬＣ−５Ｊ（ｈＶκ１−３９  ｈＶκ３−２０  ｈＪκ１−５）マウスカッパ（κ）軽鎖遺伝子座内への挿入を含む。
【０２４８】
全てのマウスは、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓにて特定の病原体を含まない条件で飼育及び繁殖された。３匹のＦ５  ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）（ＭＡＩＤ１２９３Ｏ  １６４０ＨＯ（「ＶＩ３」）、参照により本明細書に援用される米国特許第８，５０２，０１８号を参照）マウス（１４週齢、雄、バックグラウンド：２６．５％Ｃ５７／ＢＬ６、２２．７５％１２９、及び５０．７５％Ｂａｌｂ／ｃ）及び３匹のＭＡＩＤ１９１２ＨＯ６０３２ＨＯ  Ｆ２マウス（図３９、７〜８週齢、雌、バックグラウンド：１８．７５Ｃ５７／ＢＬ６、１８．７５％１２９、及び６２．５％Ｂａｌｂ／ｃ）を屠殺し、脾臓及び骨髄を動物から採取した。骨髄は、完全ＲＰＭＩ媒質（ウシ胎仔血清、ピルビン酸ナトリウム、Ｈｅｐｅ、２−メルカプトエタノール、非必須アミノ酸、及びゲンタマイシンを補充したＲＰＭＩ媒質）で洗い流すことによって、大腿骨から収集した。脾臓及び骨髄調製物からの赤血球を、ＡＣＫ溶解緩衝液で溶解し、完全ＲＰＭＩ媒質で洗浄した。
【０２４９】
フローサイトメトリー
本明細書に記載される遺伝子的に修飾されたホモ接合性「ＤＬＣ×ＵＨＣ」（ＭＡＩＤ１９１２ＨＯ６０３２ＨＯ）マウスの、遺伝子的に修飾された対立遺伝子（例えば、重鎖遺伝子座中に再構成されたＶＨ３−２３／Ｄ／ＪＨ４の単一のコピーを含有する対立遺伝子、及び軽鎖遺伝子座中に２つのヒトＶκ、５つのヒトＪκ遺伝子を含有する対立遺伝子）に由来する抗体を産生する能力を調べるために、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）分析を実施例３にあるように実施した。
【０２５０】
脾臓区画内では、ＭＡＩＤ１９１２ＨＯ６０３２ＨＯマウスは、その免疫グロブリン遺伝子座中に他の遺伝子修飾を有するマウスに対してＭＡＩＤ１９１２ＨＯ６０３２ＨＯマウスにおいて観察される特定の効果に関する対照の役割を果たす、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）（ＶＩ３）マウス（図４０Ａ〜４０Ｂ）において観察される数と実質的に同一のＣＤ１９＋Ｂ細胞数及び成熟Ｂ細胞数を示し、またＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスの体液性免疫系は、体液性免疫系のものと同様に機能する（上記）。ＭＡＩＤ１９１２ＨＯ６０３２ＨＯマウスは、ＶＩ３マウスと比較して、脾臓中の未熟Ｂ細胞数の２倍の増加を示した（図４０Ａ〜４０Ｂ）。ＭＡＩＤ１９１２ＨＯ６０３２ＨＯマウスはまた、カッパ及びガンマ軽鎖利用に関してＶＩ３マウスに実質的に類似した（図４１Ａ〜４１Ｂ）。ＭＡＩＤ１９１２ＨＯ６０３２ＨＯ（ＤＬＣ×ＵＨＣ）マウスはまた、ＶＩ３マウスと比較して、脾臓Ｂ細胞における増加された表面ＩｇＭ（即ち、１細胞当たりのより多いＩｇＭ表面発現）を示した（図４２）。
【０２５１】
また、ＭＡＩＤ１９１２ＨＯ６０３２ＨＯ（ＤＬＣ×ＵＨＣ）マウスは、ＶＩ３マウスにおいて観察されるものと異なる様式で発生する、脾臓区画における種々の段階（例えば、未熟、成熟、Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３、辺縁帯前駆体、辺縁帯、濾胞性−Ｉ、濾胞性−ＩＩなど）を通したＢ細胞の進行として、変更された末梢Ｂ細胞発生を示した（図４３Ａ）。具体的には、ＭＡＩＤ１９１２ＨＯ６０３２ＨＯ（ＤＬＣ×ＵＨＣ）マウスは、ＶＩ３マウスと比較して、脾臓区画内により多くの未熟、Ｔ１、及び辺縁帯（ＭＺ）Ｂ細胞を示した。ＭＡＩＤ１９１２ＨＯ６０３２ＨＯ（ＤＬＣ×ＵＨＣ）マウスにおける濾胞性−Ｉ及び濾胞性−ＩＩ細胞の数は、ＶＩ３マウスにおいて観察されるものと実質的に同一であった（図４３Ｂ）。
【０２５２】
骨髄区画においては、ＭＡＩＤ１９１２ＨＯ６０３２ＨＯ（ＤＬＣ×ＵＨＣ）マウスは、ＶＩ３マウス対照と比較して、類似のＣＤ１９＋Ｂ細胞数を示した（図４４Ａ〜４４Ｂ）。しかしながら、ＭＡＩＤ１９１２ＨＯ６０３２ＨＯ（ＤＬＣ×ＵＨＣ）マウスは、ＶＩ３マウスと比較して、骨髄中に約２５倍少ないプロＢ細胞を示した（図４５Ａ〜４５Ｂ）。ＭＡＩＤ１９１２ＨＯ６０３２ＨＯ（ＤＬＣ×ＵＨＣ）マウスはまた、ＶＩ３マウスと比較して、骨髄中に約２倍少ない未熟Ｂ細胞及び２倍少ない成熟Ｂ細胞を示した（図４６Ａ〜４６Ｂ）。また、ＭＡＩＤ１９１２ＨＯ６０３２ＨＯ（ＤＬＣ×ＵＨＣ）マウスは、ＶＩ３マウスと比較してラムダ発現への偏向（２倍増加）を示した（図４７）。
【０２５３】
免疫付与研究
５匹のＷＴ（７５％Ｃ５７ＢＬ６／２５％１２９バックグラウンド）及び７匹のＦ２  ＭＡＩＤ１９１２ＨＯ６０３１ＨＥＴ（ホモ接合性ＤＬＣ×ヘテロ接合性ＵＨＣ）マウスを、２．３５μｇの抗原Ｘ、１０μｇのＣｐＧオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ１８２６、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、ｃａｔ＃ｔｌｒｌ−１８２６）、及び２５μｇのリン酸アルミニウムゲルアジュバント（Ｂｒｅｎｎｔａｇ、ｃａｔ＃７７８４−３０−７）を含有する０．０２５ｍｌの混合物で、足蹠に免疫付与した。マウスを、同一の用量で６回ブーストした。最初の免疫付与後０日目、１５日目、及び２３日目に、麻酔をしたマウスから、眼窩後方血液を使用してＢＤ血清分離器管（ＢＤ、ｃａｔ＃３６５９５６）内に血液を収集し、製造者の指示に従って血清を収集した。免疫付与の第２のラウンドを、免疫付与の第１のラウンドの５週間後に上述の通りに実施した。
【０２５４】
抗原特異的ＩｇＧ抗体のレベルを測定するために、実施例３にあるようにＥＬＩＳＡを実施した。図４８に示される通り、再構成されたＶＨ３−２３／Ｄ／ＪＨ４ヌクレオチド配列を含有する標的化された対立遺伝子に関してヘテロ接合性であり、ＤＬＣ−５Ｊを含有する標的化された対立遺伝子に関してホモ接合性である、遺伝子的に修飾されたマウスは、最初の免疫付与後２３日目と５週目の両方において、野生型マウスによって産生されるものに匹敵するレベルで抗原特異的ＩｇＧ抗体を産生することが可能であった。ＭＡＩＤ１９１２ＨＯ６０３１ＨＥＴ（ホモ接合性ＤＬＣ×ヘテロ接合性ＵＨＣ）マウスは、免疫付与の第２のラウンド後、野生型マウスによって産生されるものに匹敵するレベルで抗原特異的ＩｇＧ抗体を産生することが可能であった。
したがって、これらのマウスは、２つのヒトＶＬ遺伝子セグメント（Ｖκ１−３９またはＶκ３−２０遺伝子セグメント）のうちの１つ及びヒトＪκセグメントの再構成に由来する逆キメラ軽鎖（ヒト軽鎖可変ドメイン及びマウスＣκ）と、単一の再構成されたヒト重鎖可変遺伝子セグメンに由来する逆キメラ重鎖（ヒト重鎖可変ドメイン及びマウスＣＨ）とを含む抗体を産生する。逆キメラ抗体（即ち、これらの逆キメラ鎖から成る抗体）は、関心の抗原による免疫付与後に獲得される。
【０２５５】
実施例６．単一の再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖ヌクレオチド配列と３つのヒスチジン置換を含有する２つのＶカッパ遺伝子セグメントとを含むマウスの生成及び分析
同様に、ヒスチジン修飾された二重軽鎖を含む改変されたヒト軽鎖遺伝子座を担持するマウス（例えば、本明細書に上述されるヒスチジン修飾を有する２つのヒトＶＬ遺伝子セグメントを含むマウス）を、内在性マウス重鎖可変遺伝子座のユニバーサルヒト重鎖遺伝子座（本明細書に上述される単一の再構成されたヒト重鎖可変ドメインを含む遺伝子座）での置き換えを含有するマウスと繁殖させる。したがって、これらのマウスは、２つのヒスチジン修飾されたヒトＶＬ遺伝子セグメント（Ｖκ１−３９またはＶκ３−２０遺伝子セグメント）のうちの１つ及びヒトＪκセグメントの再構成に由来する逆キメラ軽鎖（ヒト軽鎖可変ドメイン及びマウスＣκ）と、単一の再構成されたヒト重鎖可変ドメインに由来する逆キメラ重鎖（ヒト重鎖可変ドメイン及びマウスＣＨ）とを含む抗体を産生する。逆キメラ抗体は、関心の抗原による免疫付与後に獲得される。かかるマウスにおいて生成されるｐＨ依存性ヒト抗体を、当該技術分野において既知であるか、または上述の抗体単離及びスクリーニング方法を使用して特定する。
【０２５６】
抗体を発現するＢ細胞の可変軽鎖及び重鎖領域ヌクレオチド配列を特定し、完全なヒト軽鎖及び重鎖を、それぞれ、ヒトＣＬ及びＣＨヌクレオチド配列への可変軽鎖及び重鎖領域ヌクレオチド配列の融合によって作製する。関心の軽鎖、例えば、関心の抗原に結合する軽鎖（例えば、当該技術分野において既知である多様なアッセイ、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）アッセイを使用してｐＨ依存性抗原も示す抗体からの軽鎖）を、他の抗体に由来する重鎖、例えば、関心の軽鎖（例えば、Ｖκ１−３９またはＶκ３−２０）にあるものと同一のＶＬ遺伝子セグメントに由来する軽鎖を含む抗体に由来する重鎖と共に、好適な発現システムにて共発現させ、再構築された抗体を、抗原結合及びｐＨ依存性抗原結合特性を保持するその能力に関して試験する。
【０２５７】
実施例７．再構成された重鎖ＶＤＪ配列を含有する免疫グロブリン軽鎖遺伝子座を含むマウスの構築
カッパ軽鎖遺伝子座中に再構成された重鎖可変領域核酸配列を含むマウス（ＭＡＩＤ６０７９、「カッパ上ＵＨＣマウス」）を、重鎖遺伝子座を標的化するために上述のものに類似した方法によって生成した。手短に述べると、カッパ上ＵＨＣマウスにおいて、全ての内在性機能性軽鎖カッパ可変Ｖκ及びＪκ遺伝子セグメントを欠失させ、内在性軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結されるｈＶＨ３−２３／Ｄ／ＪＨ４をコードする単一の再構成された重鎖可変領域核酸配列で置き換えた。再構成されたヒト重鎖可変ドメイン配列を含有するゲノム遺伝子座の作成のための最終標的化構築物は、５’〜３’へ、（１）約２２５００ｂｐのマウスゲノム配列を内在性Ｉｇ軽鎖遺伝子座の上流に含有する５’相同アーム、（２）５’ＦＲＴ部位、（３）ネオマイシンカセット、（４）３’ＦＲＴ部位、（５）２２３９ｂｐのｈＶＨ３−２３プロモータ（配列番号１３９）、（６）再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖ヌクレオチド配列（ｈＶＨ３−２３／Ｄ／ＪＨ４、配列番号１３６）、（７）ＪｈＨ４イントロン（配列番号１４０）、及び（８）約７５０００ｂｐのマウスゲノム配列をマウスＪＬ遺伝子セグメントの下流に含有する３’相同アームを含有する。修飾を担持するヘテロ接合性マウスを、互いに繁殖させて、遺伝子的に修飾された遺伝子座のみからの免疫グロブリン「軽」鎖を作製することが可能なホモ接合体（ＭＡＩＤ６０７９ＨＯ）を生成した。ＭＡＩＤ６０７９ＨＯ（ホモ接合性カッパ上ＵＨＣ）マウスは、本明細書に記載されるユニバーサル重鎖（例えば、ｈＶＨ３−２３／ｈＤ／ｈＪＨ４）の、全てのマウスＶκ及びＪκ遺伝子が欠失されたマウスカッパ（κ）軽鎖遺伝子座内への挿入を含む。
【０２５８】
全てのマウスは、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓにて特定の病原体を含まない条件で飼育及び繁殖された。４匹のＭＡＩＤ６０７９ＨＯ  Ｆ１マウス（図４９、７〜１２．５週齢、雄及び雌）及び４匹のＭＡＩＤ６０７９  Ｆ１野生型同腹仔対照マウス（７〜１２．５週齢、雄及び雌）を屠殺し、脾臓及び骨髄を動物から採取した。骨髄は、完全ＲＰＭＩ媒質（ウシ胎仔血清、ピルビン酸ナトリウム、Ｈｅｐｅ、２−メルカプトエタノール、非必須アミノ酸、及びゲンタマイシンを補充したＲＰＭＩ媒質）で洗い流すことによって、大腿骨から収集した。脾臓及び骨髄調製物からの赤血球を、ＡＣＫ溶解緩衝液で溶解し、完全ＲＰＭＩ媒質で洗浄した。
【０２５９】
フローサイトメトリー
本明細書に記載される遺伝子的に修飾されたホモ接合性「カッパ上ＵＨＣマウス」（ＭＡＩＤ６０７９ＨＯ）マウスの、遺伝子的に修飾された対立遺伝子（例えば、カッパ軽鎖遺伝子座中に再構成されたＶＨ３−２３／Ｄ／ＪＨ４の単一のコピーを含有する対立遺伝子）に由来する抗体を産生する能力を調べるために、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）分析を実施例３にあるように実施した。
【０２６０】
ＭＡＩＤ６０７９ＨＯマウスは、骨髄区画内に、野生型同腹仔において観察されるものと実質的に同一のプロ及びプレＢ細胞の数を示した（図５０Ａ〜５０Ｂ）。対照的に、それらは、野生型同腹仔と比較して骨髄区画内により低い数の未熟及び成熟Ｂ細胞を示した（図５１Ａ〜５１Ｃ）。実際、マウスは、２倍少ない未熟Ｂ細胞及びほぼ４倍少ない成熟Ｂ細胞を有した。ＭＡＩＤ６０７９ＨＯマウスは、骨髄内において未熟及び成熟Ｂ細胞中でほぼラムダ軽鎖配列のみを使用した（図５２）。
【０２６１】
脾臓区画においては、ＭＡＩＤ６０７９ＨＯマウスは、野生型同腹仔と比較してより少ない成熟Ｂ細胞を示した（図５３Ａ〜５３Ｂ）。骨髄内で観察されたものと同様に、ＭＡＩＤ６０７９ＨＯマウスは、脾臓区画内においてほぼラムダ軽鎖配列のみを使用した（図５４Ａ〜５４Ｂ）。それらはまた、野生型同腹仔と比較してより少ない未熟細胞、辺縁帯Ｂ細胞の増加、及び濾胞性Ｂ細胞の減少を示した（図５５）。
【０２６２】
実施例８．再構成された重鎖ＶＤＪ配列を含有する免疫グロブリン軽鎖遺伝子座及びヒト軽鎖可変ドメイン配列を含有する免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含むマウスの生成及び分析
軽鎖遺伝子座中の再構成された重鎖可変領域核酸配列に関してホモ接合性のマウス（ＭＡＩＤ６０７９ＨＯ、ホモ接合性「カッパ上ＵＨＣマウス」）を、上述の通り生成した。これらのマウスを、重鎖遺伝子座中のカッパ軽鎖可変領域核酸配列に関してホモ接合性（ＭＡＩＤ１９９４ＨＯ）のマウス（重鎖上カッパ（「ＫｏＨ」）マウス）と交配した。ＭＡＩＤ１９９４ホモ接合性ＫｏＨマウスは、マウスＩｇ重鎖定常鎖遺伝子座（即ち、欠失されたマウスＩｇ重鎖遺伝子座））内に挿入された、長ＩＧＣＲ及びマウスＡＤＡＭ６と共に、４０個のヒトＶκ遺伝子及び全てのヒトＪκ遺伝子を含む。ＫｏＨは、これまでに説明されており、例えば、参照により本明細書に援用される米国付与前公開第２０１２／００９６５７２号を参照されたい。
【０２６３】
全てのマウスは、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓにて特定の病原体を含まない条件で飼育及び繁殖された。２匹のＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）（ＭＡＩＤ１２４２ＨＯ１６４０ＨＯ（「ＶＩ３」）、参照により本明細書に援用される米得特許第８，５０２，０１８号を参照）マウス（１５週齢、雌、ｎ＝２、バックグラウンド：２８％Ｃ５７／ＢＬ６、１３％１２９、及び５９％Ｂａｌｂ／ｃ）、４匹のＭＡＩＤ１９９４ＨＯ６０７９ＨＯ  Ｆ２マウス（図５６、１３〜１４週齢、雄、ｎ＝２、バックグラウンド：２５％Ｃ５７／ＢＬ６、２５％１２９、及び５０％Ｂａｌｂ／ｃ）、及びＭＡＩＤ６０７９野生型同腹仔対照マウスを屠殺し、脾臓及び骨髄を動物から採取した。骨髄は、完全ＲＰＭＩ媒質（ウシ胎仔血清、ピルビン酸ナトリウム、Ｈｅｐｅ、２−メルカプトエタノール、非必須アミノ酸、及びゲンタマイシンを補充したＲＰＭＩ媒質）で洗い流すことによって、大腿骨から収集した。脾臓及び骨髄調製物からの赤血球を、ＡＣＫ溶解緩衝液で溶解し、完全ＲＰＭＩ媒質で洗浄した。
【０２６４】
フローサイトメトリー
本明細書に記載される遺伝子的に修飾されたホモ接合性「ＫｏＨ×カッパ上ＵＨＣ」（ＭＡＩＤ１９９４ＨＯ６０７９ＨＯ）マウスの、遺伝子的に修飾された対立遺伝子（例えば、再構成されたＶＨ３−２３／Ｄ／ＪＨ４の単一のコピーを含有する対立遺伝子、及び重鎖遺伝子座中にカッパ軽鎖可変領域核酸配列を含有する対立遺伝子）に由来する抗体を産生する能力を調べるために、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）分析を実施例３にあるように実施した。
【０２６５】
ＭＡＩＤ１９９４ＨＯ６０７９ＨＯマウスは、ＶＩ３マウスと比較して骨髄区画内により少ないＣＤ１９＋及びプレＢ細胞頻度を示した（図５７Ａ）。具体的には、ＭＡＩＤ１９９４０  ６０７９ＨＯマウスは、ＶＩ３マウスと比較して骨髄内に約２倍少ないＣＤ１９＋及びプレＢ細胞数を示した（図５７Ｂ）。それに加えて、ＭＡＩＤ１９９４ＨＯ６０７９ＨＯマウスは、ＶＩ３マウスと比較して、骨髄区画内に約３倍少ない未熟Ｂ細胞を示した（図５８Ａ及び５８Ｂ）。ＭＡＩＤ１９９４ＨＯ６０７９ＨＯマウスからのＢ細胞は、骨髄内でラムダ軽鎖の発現を本質的に欠損することも見出された（図５９）。
【０２６６】
ＭＡＩＤ１９９４ＨＯ６０７９ＨＯマウスは、脾臓区画内でより少ないＢ細胞の頻度を示した。具体的には、ＭＡＩＤ１９９４ＨＯ６０７９ＨＯマウスは、ＶＩ３マウスと比較してより少ない脾臓Ｂ細胞（約２倍少ない）及び成熟Ｂ細胞（約３倍少ない）数を有した（図６０Ａ−６０Ｂ）。ここでも、それらはＶＩ３マウスと比較してラムダ軽鎖の発現の欠損を示した（図６１）。
【０２６７】
脾臓内の末梢Ｂ細胞発生を考慮すると、ＦＡＣＳ分析は、ＭＡＩＤ１９９４ＨＯ６０７９ＨＯマウスは、脾臓内のＴ１相においてＶＩ３マウスよりも増加された細胞頻度を有するということを示した（図６２）。
【０２６８】
当業者は、単に日常的な実験を使用して、本明細書に記載される発明の特定の実施形態の多くの等価物を認識するか、または確認することが可能であろう。かかる等価物は、以下の特許請求の範囲によって包括される。
【０２６９】
本出願を通して引用される全ての非特許資料、特許出願、及び特許の全内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される。
【０２７０】
記載される発明は、その特定の態様及び実施形態への参照と共に説明されているが、当業者は、本発明の真の趣旨及び範囲から逸脱することなく、種々の変更が成され得、また等価物が置き換えられ得ることを理解する。それに加えて、多くの修正が、特定の状況、材料、組成物、プロセス、プロセスステップ、またはステップを記載される発明の目的の趣旨及び範囲に適合するために成され得る。全てのかかる修正は、ここに添付の特許請求の範囲内である。
＊  ＊  ＊
【図９】
0005993102.tif 000012
【図２８Ａ】
0005993102.tif 000013
【図２９Ａ】
0005993102.tif 000014
【図４９】
0005993102.tif 000015
【図５６】
0005993102.tif 000016
【図１】
0005993102.tif 000017
【図２】
0005993102.tif 000018
【図３】
0005993102.tif 000019
【図４】
0005993102.tif 000020
【図５】
0005993102.tif 000021
【図６】
0005993102.tif 000022
【図７】
0005993102.tif 000023
【図８】
0005993102.tif 000024
【図１０】
0005993102.tif 000025
【図１１】
0005993102.tif 000026
【図１２】
0005993102.tif 000027
【図１３Ａ】
0005993102.tif 000028
【図１３Ｂ】
0005993102.tif 000029
【図１３Ｃ】
0005993102.tif 000030
【図１３Ｄ】
0005993102.tif 000031
【図１３Ｅ】
0005993102.tif 000032
【図１４Ａ】
0005993102.tif 000033
【図１４Ｂ】
0005993102.tif 000034
【図１４Ｃ】
0005993102.tif 000035
【図１４Ｄ】
0005993102.tif 000036
【図１４Ｅ】
0005993102.tif 000037
【図１４Ｆ】
0005993102.tif 000038
【図１５】
0005993102.tif 000039
【図１６】
0005993102.tif 000040
【図１７】
0005993102.tif 000041
【図１８】
0005993102.tif 000042
【図１９】
0005993102.tif 000043
【図２０】
0005993102.tif 000044
【図２１Ａ】
0005993102.tif 000045
【図２１Ｂ】
0005993102.tif 000046
【図２１Ｃ】
0005993102.tif 000047
【図２１Ｄ】
0005993102.tif 000048
【図２１Ｅ】
0005993102.tif 000049
【図２２Ａ】
0005993102.tif 000050
【図２２Ｂ】
0005993102.tif 000051
【図２２Ｃ】
0005993102.tif 000052
【図２２Ｄ】
0005993102.tif 000053
【図２３Ａ】
0005993102.tif 000054
【図２３Ｂ】
0005993102.tif 000055
【図２３Ｃ】
0005993102.tif 000056
【図２３Ｄ】
0005993102.tif 000057
【図２４Ａ】
0005993102.tif 000058
【図２４Ｂ】
0005993102.tif 000059
【図２４Ｃ】
0005993102.tif 000060
【図２４Ｄ】
0005993102.tif 000061
【図２５Ａ】
0005993102.tif 000062
【図２５Ｂ】
0005993102.tif 000063
【図２６Ａ】
0005993102.tif 000064
【図２６Ｂ】
0005993102.tif 000065
【図２７Ａ】
0005993102.tif 000066
【図２７Ｂ】
0005993102.tif 000067
【図２８Ｂ】
0005993102.tif 000068
【図２９Ｂ】
0005993102.tif 000069
【図３０Ａ】
0005993102.tif 000070
【図３０Ｂ】
0005993102.tif 000071
【図３１】
0005993102.tif 000072
【図３２】
0005993102.tif 000073
【図３３】
0005993102.tif 000074
【図３４】
0005993102.tif 000075
【図３５Ａ】
0005993102.tif 000076
【図３５Ｂ】
0005993102.tif 000077
【図３６】
0005993102.tif 000078
【図３７Ａ】
0005993102.tif 000079
【図３７Ｂ】
0005993102.tif 000080
【図３８Ａ】
0005993102.tif 000081
【図３８Ｂ】
0005993102.tif 000082
【図３９】
0005993102.tif 000083
【図４０Ａ】
0005993102.tif 000084
【図４０Ｂ】
0005993102.tif 000085
【図４１Ａ】
0005993102.tif 000086
【図４１Ｂ】
0005993102.tif 000087
【図４２】
0005993102.tif 000088
【図４３Ａ】
0005993102.tif 000089
【図４３Ｂ】
0005993102.tif 000090
【図４４Ａ】
0005993102.tif 000091
【図４４Ｂ】
0005993102.tif 000092
【図４５Ａ】
0005993102.tif 000093
【図４５Ｂ】
0005993102.tif 000094
【図４６Ａ】
0005993102.tif 000095
【図４６Ｂ】
0005993102.tif 000096
【図４７】
0005993102.tif 000097
【図４８】
0005993102.tif 000098
【図５０Ａ】
0005993102.tif 000099
【図５０Ｂ】
0005993102.tif 000100
【図５１Ａ】
0005993102.tif 000101
【図５１Ｂ】
0005993102.tif 000102
【図５１Ｃ】
0005993102.tif 000103
【図５２】
0005993102.tif 000104
【図５３Ａ】
0005993102.tif 000105
【図５３Ｂ】
0005993102.tif 000106
【図５４Ａ】
0005993102.tif 000107
【図５４Ｂ】
0005993102.tif 000108
【図５５】
0005993102.tif 000109
【図５７Ａ】
0005993102.tif 000110
【図５７Ｂ】
0005993102.tif 000111
【図５８Ａ】
0005993102.tif 000112
【図５８Ｂ】
0005993102.tif 000113
【図５９】
0005993102.tif 000114
【図６０Ａ】
0005993102.tif 000115
【図６０Ｂ】
0005993102.tif 000116
【図６１】
0005993102.tif 000117
【図６２】
0005993102.tif 000118
【配列表】
0005993102000001.app