(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アスペルギルス(Aspergillus)属に属する微生物、並びにモナスカス・ピロサス（Monascus pilosus）、モナスカス・プルプレアス（Monasucus purpureus）、モナスカス・ラバー（Monasucus rubber）、リゾプス・アジゴスポラス（Rhizopus azygosporus）、リゾプス・ミクロポラス（Rhizopus microporus）、リゾプス・オリゼ（Rhizopus oryzae）、ペニシリウム・ロケフォルチ（Penicillium roqueforti）、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、及びサッカロマイセス・パストリアヌス（Saccharomyces pastorianus）からなる群から選択される微生物を、麦芽エキス、酵母エキス、大豆カゼイン又はそれの混合物を含有する培地にて液体培養し、産生された14−デヒドロエルゴステロールを回収することを含むことを特徴とする、14−デヒドロエルゴステロールの製造方法。
【請求項２】
前記液体培養において、前記微生物の菌体が、前記培地に、初発の胞子数として104個/ml〜106個/mlで添加されることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
初発の胞子数が105個/ml〜106個/mlである、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
前記回収が、前記微生物の培養菌体から抽出によって行われ、前記抽出の前又は抽出と同時に、菌体破壊を行うことを特徴とする、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５】
アスペルギルス(Aspergillus)属に属する微生物が、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）、アスペルギルス・ソーヤ（Aspergillus sojae）、アスペルギルス・タマリ（Aspergillus tamari）、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギルス・フェチダス（Aspergillus foetidus）、アスペルギルス・カワチ（Aspergillus kawachii）、アスペルギルス・フェニシス（Aspergillus phoenicis）、及びアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）からなる群から選択される、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６】
前記微生物が、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）, アスペルギルス・フェチダス（Aspergillus foetidus）, アスペルギルス・カワチ（Aspergillus kawachii）, 及びアスペルギルス・フェニシス（Aspergillus phoenicis）からなる群から選択されることを特徴とする、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７】
前記抽出が、アルカリ抽出又はアルコール抽出によって行われることを特徴とする、請求項4〜6のいずれか1項に記載の方法。
【請求項８】
前記抽出の前に、アルコールに培養菌体を浸漬し、その後に菌体破壊を行うことを特徴とする、請求項4〜7のいずれか1項に記載の方法。
【請求項９】
前記アルコールがイソプロパノールであることを特徴とする、請求項7又は8に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物醗酵により14−デヒドロエルゴステロール（以下「14-DHE」とも称する）を高生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
14-DHEは、1951年にアスペルギルス・ニガーにおいて見出され（非特許文献1）、2009年にキウイフルーツ果皮の一成分として再発見されたが（非特許文献2）、その生理的活性については知られていなかった。近年、本発明者らは、14−DHEが、樹状細胞(DC)を修飾することによって制御性T細胞（Treg）を誘導する作用、ナイーブT細胞に直接的に働きかけて制御性Ｔ細胞を誘導する作用、並びに、抗原刺激による炎症性T細胞の増殖を抑制する作用を有することを見出した（特許文献1）。これにより、14-DHEは、免疫疾患（アレルギー、自己免疫疾患、腸炎など）における免疫系の過剰な活性化に関連する症状を予防又は治療したり、或いは、組織や臓器の移植の際の拒絶反応を抑制したり、或いは、炎症性T細胞の増殖を抑制するために、有用であろうと考えられ、注目されている。
【０００３】
14-DHEの生産に関して、特許文献1には、麹菌による小麦フスマ醗酵物からエタノール抽出及びヘキサン抽出によって得たことが記載されている。
【０００４】
特許文献2には、麹菌を、該麹菌の難分解性糖質を含有する液体培地を用いて培養する方法が記載されている。このなかにはさらに麹菌の液体培養によりグルコアミラーゼを製造する方法や酒類等の食品を製造する方法も記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第WO 2010/150867号
【特許文献２】特開2003-265165号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Barton, DHR.and Bruun, T., J. Chem. Soc., 2728-2733 (1951)
【非特許文献２】Fiorentino, A. et al., J. Agric. Food Chem., 57:4148-4155 (2009)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
14-DHEの医薬上の有用性については最近解明されたばかりであり、これまで14-DHEにはほとんど注目されてこなかった。そのため、14-DHEの製造法についてもほとんど知られていなかった。
【０００８】
したがって、本発明は、微生物醗酵により14-DHEを高生産する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、以下の特徴を包含する。
(1) アスペルギルス(Aspergillus)属、モナスカス(Monascus)属、リゾプス(Rhizopus)属、ペニシリウム(Penicillium)属及びサッカロマイセス(Saccharomyces)属に属する微生物を培地にて培養し、産生された14−デヒドロエルゴステロールを回収することを含むことを特徴とする、14−デヒドロエルゴステロール（14-DHE）の製造方法。
(2) 前記培養が液体培養であることを特徴とする、上記(1)に記載の方法。
(3) 前記微生物が、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）, アスペルギルス・ソーヤ（Aspergillus sojae）, アスペルギルス・タマリ（Aspergillus tamari）, アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）, アスペルギルス・フェチダス（Aspergillus foetidus）, アスペルギルス・カワチ（Aspergillus kawachii）, アスペルギルス・フェニシス（Aspergillus phoenicis）, アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）, モナスカス・ピロサス（Monascus pilosus）, モナスカス・プルプレアス（Monasucus purpureus）, モナスカス・ラバー（Monasucus rubber）, リゾプス・アジゴスポラス（Rhizopus azygosporus）, リゾプス・ミクロポラス（Rhizopus microporus）, リゾプス・オリゼ（Rhizopus oryzae）,ペニシリウム・ロケフォルチ（Penicillium roqueforti）, サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）, 及びサッカロマイセス・パストリアヌス（Saccharomyces pastorianus）からなる群から選択されることを特徴とする、上記(1)又は(2)に記載の方法。
(4) 前記微生物が、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）, アスペルギルス・フェチダス（Aspergillus foetidus）, アスペルギルス・カワチ（Aspergillus kawachii）, 及びアスペルギルス・フェニシス（Aspergillus phoenicis）からなる群から選択されることを特徴とする、上記(3)に記載の方法。
(5) 前記微生物の菌体が、前記培地に、初発の胞子数として104個/ml〜106個/mlで添加されることを特徴とする、上記(1)〜(4)のいずれかに記載の方法。
(6) 前記培地が、麦芽エキス、酵母エキス、大豆カゼイン又はそれの混合物を含有することを特徴とする、上記(1)〜(5)のいずれかに記載の方法。
(7) 前記回収が、前記微生物の培養菌体から抽出によって行われることを特徴とする、上記(1)〜(6)のいずれかに記載の方法。
(8) 前記抽出が、アルカリ抽出又はアルコール抽出によって行われることを特徴とする、上記(7)に記載の方法。
(9) 前記抽出の前又は抽出と同時に、菌体破壊を行うことを特徴とする(8)に記載の方法。
(10) 前記抽出の前に、アルコールに培養菌体を浸漬し、その後に菌体破壊を行うことを特徴とする、上記(7)に記載の方法。
(11) 前記アルコールがイソプロパノールであることを特徴とする、上記(10)に記載の方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、14-DHEを高生産可能にする微生物醗酵法が提供される。特に液体培養法を使用するときには、固体培養法と比べて、副産物の生成が最小限に抑えられるため、効率的な精製が可能になるという利点がある。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】アスペルギルス(Aspergillusu)属の菌類のなかで14-DHE高生産種及び高生産株の探索を行った結果を示す。
【図２】14-DHEの抽出方法の検討結果を示す。
【図３】胞子添加数と14-DHEの産生量との関係を示す。
【図４】培地組成の違いによる14-DHEの産生量を検討した結果を示す。
【図５】液体培養(A)と固体培養(B)とにおける、14-DHE含有抽出物中の副産物のレベルの違いを示すHPLCクロマトグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明をさらに詳細に説明する。
上述のように、本発明は、微生物醗酵による14-DHEの製造方法を提供する。
【００１３】
14-DHEは、従来、アスペルギルス・ニガー及びキウイフルーツ果皮の他に、穀類の麹菌醗酵物（WO 2010/150867）中に見出されてきた。本発明者らは今回、麹菌を含む微生物から14-DHEを高生産する菌種又は菌株を見出し、その培養法についても検討し、従来の固体培養に比べて、14-DHEの精製が容易である液体培養法を開発した。
【００１４】
１．  14-DHE
14-DHEは、慣用名14-デヒドロエルゴステロールであり、以下の構造式及び物理化学的特性を有する。
【００１５】
【化１】
0005921883.tif 000002
【００１６】
(1) 分子量：394.32275
(2) 分子式：C28H42O
(3) 溶剤に対する溶解性：水に不溶、クロロホルムに易溶
(4) 紫外部吸収スペクトル(MeCN):391nm
(5) 1H-NMR(CD3OD)ppm： 6.15 (1H, m), 5.75 (1H, m), 5.65 (1H, dd, J = 2.2, 5.9 Hz), 5.27 (1H, dd, J = 7.0, 15.1 Hz), 5.21 (1H, dd, J = 7.9, 15.1 Hz), 3.64 (1H, m), 2.51 (1H, ddd, J = 2.2, 5.1, 10.6 Hz), 2.30 (1H, m), 2.20 (1H, m), 2.20 (1H, dd, J = 3.2, 7.8 Hz), 2.06 (1H, m), 2.05 (1H, m), 1.94 (1H, m), 1.90 (1H, m), 1.87 (2H, m), 1.87 (1H, ddd, J = 3.2, 7.0, 7.3 Hz), 1.71 (1H, m), 1.59 (1H, m), 1.57 (1H, m), 1.45 (1H, m), 1.45 (1H, ddd, J = 3.2, 6.3, 6.5 Hz), 1.30 (1H, m), 1.05 (3H, d, J = 6.8 Hz ), 0.93 (3H, d, J = 7.3 Hz), 0.92 (3H, s,), 0.89 (3H, s), 0.85 (3H, d, J = 6.5 Hz), 0.83 (3H, d, J = 6.3 Hz) 
(6) 13C-NMR(CD3OD)ppm： 149.2 (s), 143.0 (s), 135.4 (s), 132.2 (s), 132.0 (s), 120.5 (s), 120.4 (s), 117.4 (s), 70.4 (s), 58.1 (s), 46.3 (s), 45.4 (s), 42.8 (s), 41.0 (s), 39.0 (s), 38.9 (s), 37.8 (s), 37.0 (s), 36.0 (s), 33.1 (s), 32.0 (s), 21.1 (s), 19.9 (s), 19.7 (s), 19.6 (s), 17.6 (s), 16.8 (s), 14.5 (s) 
(7) 例えばDevelosil C30-UG-5(10×250mm)（野村化学社製）を用いた高速液体クロマトグラフィー（アセトニトリル／イソプロパノール＝99/1）にかけた場合、保持時間約32.5〜33.5分に溶出する。
【００１７】
14−DHEは、本発明者らによって、樹状細胞(DC)を修飾することによって制御性T細胞（Treg）を誘導する作用、ナイーブT細胞に直接的に働きかけて制御性Ｔ細胞を誘導する作用、並びに、抗原刺激による炎症性T細胞の増殖を抑制する作用を有することが見出されている（WO 2010/150867）。
【００１８】
２．  微生物醗酵生産
２．１  菌類
本発明者らは、後述の表1に示される微生物のなかで14-DHE高生産種及び高生産株の探索を行った結果、以下の微生物、すなわち、アスペルギルス(Aspergillus)属、モナスカス(Monascus)属、リゾプス(Rhizopus)属、ペニシリウム(Penicillium)属及びサッカロマイセス(Saccharomyces)属に属する微生物が14-DHEを生産することを見出した。
【００１９】
上記の微生物の菌種は、以下のものに限定されないが、例えばアスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）, アスペルギルス・ソーヤ（Aspergillus sojae）, アスペルギルス・タマリ（Aspergillus tamari）, アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）, アスペルギルス・フェチダス（Aspergillus foetidus）, アスペルギルス・カワチ（Aspergillus kawachii）, アスペルギルス・フェニシス（Aspergillus phoenicis）, アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）, モナスカス・ピロサス（Monascus pilosus）, モナスカス・プルプレアス（Monasucus purpureus）, モナスカス・ラバー（Monasucus rubber）, リゾプス・アジゴスポラス（Rhizopus azygosporus）, リゾプス・ミクロポラス（Rhizopus microporus）, リゾプス・オリゼ（Rhizopus oryzae）,ペニシリウム・ロケフォルチ（Penicillium roqueforti）, サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）, 及びサッカロマイセス・パストリアヌス（Saccharomyces pastorianus）を挙げることができる。
【００２０】
これらの菌種のなかで、アスペルギルス属に属する菌種の多くが14-DHE高産生種であり、そのより好適な菌種は、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）又は黒麹菌、アスペルギルス・フェチダス（Aspergillus foetidus）、アスペルギルス・カワチ（Aspergillus kawachii）又は白麹菌、及びアスペルギルス・フェニシス（Aspergillus phoenicis）である。
【００２１】
WO 2010/150867で14-DHEが見出されたAOK1597株（黒麹菌（秋田今野商店：黒麹マイルド（アスペルギルス・アワモリ））と対比して、それと同等か又はそれ以上の14-DHEを生産するスペルギルス属に属する菌株は、例えば、アスペルギルス・アワモリの菌株であるAOK1598, NBRC4033, NBRC4115, NBRC4119, NBRC4120, NBRC4125, NBRC4314, NBRC4388及びNBRC4397； アスペルギルス・フェチダスの菌株であるNBRC4031, NBRC4312, NBRC4338及びNBRC5708； アスペルギルス・カワチの菌株であるNBRC4308； アスペルギルス・フェニシスの菌株であるNBRC6648, NBRC6649, NBRC6650, NBRC7523, NBRC8872, NBRC8873及びNBRC8874である。特にAOK1597株と比べて14-DHE高生産の菌株は、AOK1598, NBRC4033, NBRC4115, NBRC4120, NBRC4125, NBRC4314, NBRC4388, NBRC5708, NBRC4308, NBRC7523, NBRC8872, NBRC8873, NBRC8874である。ここで、NBRCを付した菌株は、NITE Biological Resource Center（〒292-0818  千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8)に寄託されており分譲可能な菌株である。また、AOK株は、秋田今野商店から購入可能な菌株である。
【００２２】
２．２  培養条件
上記微生物の菌種又はその胞子を栄養培地中で液体培養又は固体培養し、菌体内に14-DHEを産生させる。以下では、そのような培養条件について説明する。
【００２３】
14-DHEを醗酵生産するための培養は、アスペルギルス(Aspergillus)属、モナスカス(Monascus)属、リゾプス(Rhizopus)属、ペニシリウム(Penicillium)属及びサッカロマイセス(Saccharomyces)属に属する微生物の菌種又は菌株の培養で通常使用される、窒素源、炭素源、無機塩類を含有する培地、それらの菌種又は菌株で通常使用される培養温度、等の培養条件を用いて行うことができる。
【００２４】
培地は、天然培地又は合成培地のいずれを使用してもよい。固体培地としては、以下のものに限定されないが、例えば、蒸煮穀類（例えば、米、小麦、大麦、ライ麦、トウモロコシ、アワ、ヒエなどの種子、糠又はふすま）などの天然培地や、寒天培地などの合成培地が挙げられる。上記のような天然培地の場合には、培地中の水分含量を約50〜60％に維持することが望ましい。
【００２５】
培地に含まれる窒素源としては、以下のものに限定されないが、例えば麦芽エキス、酵母エキス、肉エキス、大豆カゼイン又は大豆蛋白、蛋白加水分解物、ペプトン、コーンスティープリカー、無機窒素類、例えばアンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウムなど、が挙げられる。とりわけ、麦芽エキス、酵母エキス、大豆カゼイン蛋などの窒素源を含む培地が14-DHEの高生産に適している（図4参照）。
【００２６】
培地に含まれる炭素源としては、以下のものに限定されないが、例えばグルコース、マルトース、ショ糖、乳糖、デンプンなどの糖類が挙げられる。
【００２７】
無機塩としては、以下のものに限定されないが、例えばリン酸塩、マグネシウム塩、鉄塩、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、亜鉛塩、銅塩、マンガン塩、コバルト塩などが挙げられる。
【００２８】
培養については、固体培養であれば、静置培養であるか、或いは、ふすまなどの蒸煮穀類を培地とする場合には、通気のために定期的に培地をかき混ぜて培養を行うことができる。液体培養の場合には、条件制御可能な醗酵槽を用いて、例えば攪拌培養、通気培養、振とう培養などを挙げることができる。培養は、好気的条件で行われる。攪拌速度や通気量は、微生物菌体の種類や培養条件に応じて適宜選択される。
【００２９】
微生物菌体又は胞子の初期接種量は、以下のものに限定されないが、例えば103個/ml〜1010個/ml、104個/ml〜108個/ml、好ましくは104個/ml〜107個/ml、より好ましくは104個/ml〜106個/mlである（図3参照）。
【００３０】
培養温度は、微生物菌種に適した温度を選択する。温度は、通常15〜45℃、好ましくは20〜40℃、より好ましくは20〜35℃である。固体培養の場合には、醗酵熱が発生するため、必要に応じて、適当な手段で冷却し、適温に保持することが必要である。
【００３１】
培養時間は、通常、1日〜15日であり、これより長い時間であってもよいが、菌の生育が定常状態に達した段階で培養を終了してよい。
【００３２】
２．３  14-DHEの回収
14-DHEは、上記の培養により微生物菌体内に産生される。菌体内から14-DHEを回収する手法の例は、以下のとおりである。
【００３３】
固体培養、液体培養のいずれの場合であっても、菌体を回収した後、菌体を、約10〜20％(重量/体積)水酸化カリウム、水酸化ナトリウムなどのアルカリ水で煮沸処理するか、或いは、メタノール、エタノール、イソプロパノールなどのアルコール中で超音波発生装置、ダイノミル、フレンチプレス等の菌体破壊装置で菌体を破壊処理するか、或いは、イソプロパノールに一晩以上浸漬した後に超音波発生装置、ダイノミル、フレンチプレス等の菌体破壊装置で菌体を破壊処理する、などの手段によって抽出液を回収し、その後、ヘキサン、ヘプタン、オクタン等のn-アルカン溶媒との分配を行ってn-アルカン溶媒画分を回収する。いずれの方法であっても、14-DHEを回収可能であるが、イソプロパノールに約10〜24時間浸漬した後、超音波発生装置、ダイノミル、フレンチプレス等の菌体破壊装置で菌体を破壊処理することを含む手段が好ましい（図2参照）。
【００３４】
上記の画分はさらに、必要に応じて濃縮した後に、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーにかけて精製するか、或いは、結晶化などの公知の手法によって精製することができる。
【００３５】
14-DHEを製造するための固体培養法では、14-DHEと物性的に類似する副産物（(3β,5α,22E)-Ergosta-7,22,24(28)-trien-3β-ol）が液体培養法と比べて比較的多く産生するため、培養後の処理が増えることとなり、コストパフォーマンスが劣る。
【００３６】
一方、液体培養の場合には、培養の制御が固体培養に比べて容易であるし、また、上記の副産物の産生が固体培養の場合より非常に少ないため、その後の精製が容易になるという利点がある。
【００３７】
本発明によって、14-DHEを、固体培養及び液体培養のいずれによっても生産可能であるが、液体培養によってより高生産することが可能である。そのための製造時の条件として、
(a) 初発の胞子数を104個/ml〜106個/mlで培地に添加すること、
(b) 麦芽エキス、酵母エキス、大豆カゼインなどに代表される富栄養窒素源を含有する培地を使用すること、
(c) 抽出時にはイソプロパノール中に一定時間浸漬した後に菌体破壊を行うこと、
などによって、14-DHEの高生産をもたらすことができる。
【００３８】
さらに、本発明による液体培養により、精製時の問題となる副産物の生成が最小限に抑えられるため、14-DHEの効率的な精製が可能となる。
【００３９】
（実施例）
以下の実施例を参照しながら本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の技術的範囲は、それらの実施例によって制限されないものとする。
【００４０】
（実施例１）
[14-DHE高産生株のスクリーニング]
本出願人の出願（WO2010/150867）において14-DHEが極めて効果の高い免疫調節・免疫抑制物質として発見された。一方で、14-DHEの生合成経路については未知であり、化学合成法も確立されていないことから醗酵生産を考えるにあたっては、高生産種あるいは高生産株の同定が非常に有用である。そのため下記に示すような方法により、14-DHE高生産種及び高生産株の探索を行った。
【００４１】
＜実験方法＞
(1) 固体培養、抽出、分析
下記の表1に示すAspergillus oryzae, Aspergillus sojae, Aspergillus tamari, Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus phoenicis, Aspergillus niger, Monascus pilosus, Monasucus purpureus, Monasucus rubber, Rhizopus azygosporus, Rhizopus microporus, Rhizopus oryzae, Penicillium candidum, Penicillium roquefortiについてポテトデキストロース寒天培地 (Difco, BD)に植菌し、25℃で7日間静置培養、Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces pastorianusについてはYPD寒天培地(2% glucose(wako), 1% yeast extract(Difco), 2% bacto peptone(Difco), 1.5% bacto peptone(Difco))に植菌し、25℃で静置培養した。なお、表中の菌株はIFO=財団法人醗酵研究所から、JCM=Japan Collection of Microorganisms(独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター）から、ATCC=American Type Culture Collectionから、IAM=東京大学分子細胞生物学研究所からそれぞれ分譲されたものである。培養した菌体を回収し、イソプロパノールにて超音波抽出を行った。抽出液とヘキサンを液々分配し、ヘキサン画分を回収した。抽出物について、HPLCにて溶媒をヘキサン/イソプロパノール(=99/1)、カラムを、流速を1ml/分の条件で14-DHEの含有量を測定した。
【００４２】
【表１−１】
0005921883.tif 000003
【表１−２】
0005921883.tif 000004
【００４３】
＜結果＞
39株について14-DHEの産生について解析した結果、Penicillium candidumを除くほぼ全ての菌種において産生が確認された（図1）。その結果、14-DHEは幅広い一般的な糸状菌からで産生されるものと言える。特にAspergillus awamori, Aspergillus foeditus, Aspergillus phoenicis, Aspergillus kawachiiといった酒類製造種麹に多い傾向が確認された。その産生量は、WO2010/150867において14-DHEの発見に至ったAOK1597（図1の棒グラフ黒）と比しても同等以上の株が多く、これらのAspergillus種は14-DHE高産生種として結論するに至った。Barton，DHR.とBruun，T.（J.Chem.Soc.,2728-2733（1951））においてAspergillus nigerが14-DHEを産生することが知られているが、対照として試験したAspergillus niger NBRC4066株がAOK1597株の半分に満たない産生量であることからも、上記のAspergillus種の高産生能は明らかである。中でも、Aspergillus awamori(NBRC4033及び4125), Aspergillus foetidus NBRC4312, Aspergillus kawachii (NBRC4308), Aspergillus phoenicis (NBRC7523)株に至ってはAOK1597株と比して5倍以上の極めて高い産生が得られたため、これらの株は14-DHE高生産種の中でも特に実生産に適した高生産株であると言える。
【００４４】
（実施例２）
[14-DHE液体培養からの生産法]
14-DHEは、WO2010/150867において小麦フスマにAspergillusカビを生やした固体培養にて生産を行ってきた。一方で固体培養法はハンドリングの点で難があり、スケールアップに適さず、抽出・精製にかかるコストも非常に大きい。そのため、極力余分な成分を含まずに抽出・精製を行う目的で液体培養法の開発を行い、下記のような生産法を確立するに至った。
【００４５】
＜実験方法＞
14-DHE高生産株であるAspergillus kawachii (NBRC4308株)について高効率な抽出方法の検討を行った。ポテトデキストロース培地(Difco)で7日間120rpm、25度で振盪培養を行った。培養菌体を回収後、20%(w/v)水酸化カリウムで煮沸処理、エタノール、イソプロパノール、ジクロロメタン、ジクロロメタン/メタノール(=80/20)で超音波処理、イソプロパノールにて一晩浸漬後、超音波処理を行い、抽出液とする。抽出液についてヘキサンと分配を行い、ヘキサン画分に含まれる14-DHEの含有量を測定した。
【００４６】
培養開始時の添加胞子数の検討を行った。培養開始時に1.0x103〜1.0x106胞子/mlとなるように胞子を添加し、(1)と同様の方法で培養し、イソプロパノールに一晩浸漬し、14-DHEの抽出を行い、含有量を測定した。
【００４７】
高生産な培地組成の検討を行った。ポテトデキストロース、モルトエクストラクト(Difco)、ソイビーンカゼイン(ニッスイ)、YPD培地(2% glucose(wako), 1% yeast extract(Difco), 2% bacto peptone(Difco))に1.0x105胞子/mlでAspergillus kawachii (NBRC4308)を添加し、7日間120rpm、25度で振盪培養を行った。培養菌体を回収し(2)と同様の方法で抽出し、含有量を測定した。
【００４８】
高生産になる培養時間の検討を行った。モルトエクストラクト培地に1.0x105胞子/mlでAspergillus kawachii (NBRC4308)を添加し、3、5、7、10日間120rpm、25度で振盪培養を行った。培養菌体を回収し(2)と同様の方法で抽出し、含有量を測定した。
【００４９】
液体培養時と固体培養時の抽出物HPLC分析を行った。(1)に記載のイソプロパノールにて一晩浸漬後、超音波処理を行い、抽出液とする方法で抽出後、ヘキサンと液液分配を行い、ヘキサンか区分をドライアップし、ヘキサン：エタノール＝8：2の溶媒に溶解した。これをDevelosil C30-UG-5(10×250mm）（野村化学社製）を用いた高速液体クロマトグラフィー（アセトニトリル/イソプロパノール＝99/1）にかけ分析した。
【００５０】
＜結果＞
(1) 14-DHEの抽出方法の検討を行った結果、イソプロパノールに浸漬後、超音波抽出する方法が最も効率よく抽出できた(図2)。
(2) 胞子添加数を103〜106個/mlの間で濃度を振って14-DHEの産生量を確認した結果、104個/mlで生産量が103個/ml時と比して3倍となり、105個/mlで7.5倍と極大量となり、106個/mlにおいても5.5倍の生産量を維持していた(図3)。
(3) 培地組成の違いによる14-DHEの産生量を検討した結果、モルトエクストラクト、イーストエクストラクト、ソイビーンカゼイン培地において、ポテトデキストロース培地を遥かに凌駕する産生量が確認され、14-DHEの産生においてはこれらの富栄養培地で液体培養を行うことにより、非常に効率よく生産が可能であることが証明された(図4)。
(4) 培養時間ごとの14-DHEの産生量を検討した結果、168時間までは非常に産生量が増加する事が判明した。168〜240時間の間も産生量が増大したが、比較的増大速度は緩やかになった。72時間時と比して、168時間以上では10倍以上の生産量であったことから、十分な生産には7日以上の培養が適していることが証明された。
(5) 小麦フスマAspergillus awamori AOK1597株醗酵物からイソプロパノール抽出し、ヘキサンと液液分配を行ったヘキサン画分を高速液体クロマトグラフィーにかけたものが図5中、固体培養（図5B)と示したものである。C30-UG-5(10x250mm)(野村化学社製)を用いた高速液体クロマトグラフィー(アセトニトリル/イソプロパノール=99/1)に分析した。この方法では14-DHEの溶出ピークの直前に副産物の大きなピークが存在しており（NMR解析により、副産物は(3β,5α,22E)-Ergosta-7,22,24(28)-trien-3β-olであると判明した。）、精製の際の大きな障害となっていた。一方、液体培養（図5A）ではこの混入ピークの生成が最小限に抑えられており、効率的な生産ができることが明らかとなった。
【００５１】
これらの結果から、14-DHEの液体培養による高生産が可能であることが証明され、好ましくは、(a)初発の胞子数を104個/ml〜106個/mlで添加すること、(b)麦芽エキス(malt)、酵母エキス(yeast)、大豆カゼイン(soy)に代表される富栄養培地を使用すること、(c)抽出時にはイソプロパノールにて一定時間の浸漬後菌体破壊を行うこと、がさらなる高生産能をもたらすことが分かった。さらに、本発明による液体培養により、精製時の問題となる副産物の生成が最小限に抑えられることにより、効率的な精製が可能となった。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
本発明により、医薬上有用性の高い14−デヒドロエルゴステロールを、微生物醗酵による高生産法によって製造することができるから、産業上有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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