(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）乃至（ｃ）のうちのいずれかである、植物由来の単離された熱抵抗性タンパク質：
（ａ）配列番号４のアミノ酸配列を有するタンパク質
（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列中の１〜２０の残基の置換、欠損または付加によって生じたものであり、かつ、配列番号４によって表されるアミノ酸配列と同一の機能を有する（ａ）のタンパク質由来のタンパク質
（ｃ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有し、かつ、配列番号４によって表されるアミノ酸配列と同一の機能を有する（ａ）のタンパク質由来のタンパク質。
【請求項２】
下記（Ａ）及び（Ｂ）からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する単離されたポリヌクレオチド。
（Ａ）配列番号２に記載されるヌクレオチド配列
（Ｂ）配列番号２に記載されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列
【請求項３】
（ｉ）および（ｉｉ）からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
（ｉ）請求項１に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｉｉ）（ｉ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項３に記載の発現ベクターを含むか、または、請求項２に記載のポリヌクレオチドを含む、遺伝的に操作された宿主細胞。
【請求項５】
請求項２に記載のポリヌクレオチド、または、請求項３に記載の発現ベクターが、そのゲノム中に組み込まれた遺伝的に操作された宿主細胞。
【請求項６】
（ａ）請求項４または５に記載の宿主細胞を培養する工程と、
（ｂ）請求項１に記載のタンパク質を発現させる工程と、
（ｂ）請求項１に記載のタンパク質を単離する工程と、
を含む請求項１に記載のタンパク質の製造方法。
【請求項７】
植物の熱抵抗性を改善するための、請求項１に記載のタンパク質または請求項１に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチドの使用。
【請求項８】
前記植物中の請求項１記載のタンパク質の発現または活性を与えるかまたは促進させる工程を含む改善された熱抵抗性を有する植物の製造方法。
【請求項９】
前記製造方法は、前記植物を、請求項１に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチドで形質転換させる工程を含む請求項８に記載の製造方法。
【請求項１０】
請求項１に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、前記植物のゲノムに形質転換される請求項９に記載の製造方法。
【請求項１１】
（１）請求項１に記載のタンパク質のコード配列を含む発現ベクターを含むアグロバクテリウム株を準備する工程と、
（２）植物細胞、器官または組織を準備する工程と、
（３）工程（２）の前記植物細胞、器官または組織と、工程（１）の前記アグロバクテリウム株とを接触させ、前記タンパク質のコード配列を前記植物細胞、器官または組織内に導入する工程と、
（４）任意に、植物細胞を選択する工程と、
（５）前記植物細胞、器官または組織を植物に生育させる工程と、を含む請求項９または１０に記載の製造方法。
【請求項１２】
前記コード配列が前記植物細胞、器官または組織内に導入された後に、前記コード配列が前記植物細胞、器官または組織のゲノムに組み込まれる請求項１１に記載の製造方法。
【請求項１３】
請求項２に記載のポリヌクレオチド、または請求項３に記載の発現ベクターを含む遺伝的に改変された植物。
【請求項１４】
前記植物は、アブラナ科、イネ科およびバラ科の植物からなる群から選択される請求項１３に記載の遺伝的に改変された植物。
【請求項１５】
請求項２に記載のポリヌクレオチド、または、請求項３に記載の発現ベクターを含む、遺伝的に改変された植物から得られた種子。
【請求項１６】
配列番号１または２の配列のうち少なくとも５０ヌクレオチドを含む、植物における熱抵抗性を特定するための分子マーカー。
【請求項１７】
前記分子マーカーは、植物細胞のＤＮＡの配列決定によって、植物中で特定される請求項１６に記載の分子マーカーを特定するための方法。
【請求項１８】
前記分子マーカーは、配列番号１または２のうち少なくとも５０ヌクレオチドを増幅し、かつ、増幅産物を検出することによって、植物中で特定される請求項１６に記載の分子マーカーを特定するための方法。
【請求項１９】
配列番号１または２のうち少なくとも５０ヌクレオチドは、ヌクレオチド配列番号５および６によって表されるプライマー対を使用することによって増幅される請求項１８に記載の分子マーカーを特定するための方法。
【請求項２０】
抽苔期における植物の熱抵抗性を改善するための請求項７、および１７乃至１９のいずれか１項に記載の使用または方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオテクノロジーおよび植物学の分野に属する。本発明は、植物の熱抵抗性を改善するための新規な方法に関する。本発明は、熱抵抗性を改善するための、上記植物中のタンパク質の使用に関する。本発明は、上記タンパク質の発現または活性の増強に関し、その増強の結果、上記タンパク質の発現を促進するように改変されていない植物と比較して、改善された熱抵抗性を植物に与える。
【背景技術】
【０００２】
キャベツ類（Ｃａｂｂａｇｅｓ）としては、主にハクサイ種（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ  Ｌ．  ｓｓｐ．  Ｐｅｋｉｎｅｎｓｉｓ）およびタイナ種（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ  Ｌ．  ｓｓｐ．  Ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）が挙げられる。タイナ種は、グリーンキャベツ（ｇｒｅｅｎ  ｃａｂｂａｇｅ）とも呼ばれ、これは中国北部の幼若のタイナ種である。
【０００３】
タイナ種は、高い適応性、成長性、生産性および栄養性を示す。タイナ種は、様々な野菜のうち最も消費される野菜であり、中国において、長江流域の地帯で広く生育されている。タイナ種には様々な種類および変種がある。キャベツ類は生育期間が短く、広範な適応性および高い生産性を有する。キャベツ類はまた、植え付けが容易であるため、持続的な通年の供給が可能である。タイナ種の産物は新鮮かつ痛みやすく、豊富な栄養を有し、消費者に好まれる。タイナ種は、１年の国内の総野菜生産量の約３０〜４０％を占め、また、農閑期における野菜の供給において顕著に寄与し、通年にわたって野菜の供給の平衡を保っている。
【０００４】
ハクサイ種およびタイナ種の両方は、涼しい気候を好み、通年植え付けができる。最も適した生育温度は１５〜２０℃である。近年、市場の要求に応えるため、キャベツ類は、主に集中的な培養技術によって植え付けがされる。四季間での均一な生産および供給を確実にするため、タイナ種は、一般的に、異なる季節においては異なる方法で植え付けがなされる必要がある。過去、タイナ種は、主に、春および冬に植え付けがされた。現在、タイナ種は、様々な栽培方法によって、暑い夏および秋に植え付けがされてきている。このことは、タイナ種を、その生育期間（特に晩春、夏および初秋）において、高温からのストレスに確実にさらす。高温期に栽培されたタイナ種は、２０日間の栽培後に大量に市場に流され得る。しかし、通常、高温は、伸張した節間、緩慢な生育、苦味および好ましくない繊維の増加等をもたらす。このことは、低い生産性および低い品質をもたらす。その結果、価格が上がり、供給が需要に追いつかなくなり、消費者の需要を満たすことができない。ハクサイ種は、高温への耐性が低い。ハクサイ種は、ロゼット期および結球期において、温度感受性が高い。平均温度が高過ぎる場合、心葉が堅固な鱗茎を構築する（ｂｕｉｌｔ  ａ  ｔｉｇｈｔ  ｂｕｌｂ）ように巻く（ａｍｐｌｅｘａｔｅ）ことができないか、または全く鱗茎ができない（ｎｏｔ  ｂｕｌｂ  ｕｐ）。不自然に鱗茎ができたとしても、穂が束ねられていない（ｌｏｏｓｅ）。夏における天然の田畑の条件では、生産性は、熱抵抗性植物の、通常の葉状の穂を形成できる力に依存する。そして、田畑における天然の高温下での結球形成能は、ハクサイ種の熱抵抗性の兆候となる。ハクサイ種およびタイナ種の両方はもともと中国において植えられた。
【０００５】
外国においては、キャベツ類の育種についてほとんど研究されていない。日本、韓国および台湾由来の変種は、熱抵抗性に乏しく、中国における栽植に不向きである。国内で優性なものは、主に、秋に植え付けられる疾病抵抗性変種である。キャベツ類の野菜は、熱抵抗性についての小さな遺伝子ライブラリーしかない。熱抵抗性キャベツ変種の育種は、キャベツ材料のスクリーニングに限られ、これにより、乏しい熱抵抗性および低いストレス抵抗性を有するいくつかの変種のみが得られた。
【０００６】
これらの問題を解決するため、国内の育種の専門家は、伝統的な育種方法を利用し、キャベツ類の野菜の熱抵抗性変種の広いスクリーニングおよび栽培を行い、熱抵抗性遺伝子を導入し、利用の供給源を広げた。この結果、ある程度までキャベツ類の野菜の熱抵抗性が改善され、実際の生産において効果を生んだ。
【０００７】
しかし、現在の方法は、局地気候および高温ストレス下での形態学的変化の下での熱抵抗性の評価に限定されている。これらの方法は、適した選択ストレスを有する田畑の条件を与えることができない温度の地域には適していない。単一の熱抵抗性植物を選択したとしても、次の春まで回収した種子中の熱抵抗性を維持するために、一連の複雑な方法および手段が要求されるだろう。
【０００８】
スクリーニングは長い期間を必要とし、地理的に制限されるため、普遍的に適応可能な熱抵抗性変種を提供できない。従って、熱抵抗性のキャベツ類の野菜の育種において、実生段階における熱障害の発生および発育についての集中的な研究、および実生段階における熱抵抗性のスクリーニングのための方法および技術の開発が急務である。これにより、改善された実現性、安定性、効率および適応性が与えられる。キャベツ類の熱抵抗性に非常に関連のある特性は、定量的性質のものであり、これは、遺伝子型の同定において非常な困難性をもたらす。特に、分子育種については、困難性には、補助的選択に有用なＤＮＡマーカーの数が限られていることだけではなく、量的形質遺伝子座（ＱＴＬ）の数および有意性が整合していないことも含まれる。従って、キャベツ類のゲノム配列決定がまだ終了しておらず、機能的ゲノム研究についての検討が注目されて来ているため、迅速で、高感受性かつ効率的な、植物およびＤＮＡプロファイルにおける様々な特性についての質的分析、植物の表現型ならびに遺伝子発現の変化についての定量分析に対するニーズがあり、これは熱抵抗性のキャベツ類の育種にとって有用である。
【０００９】
近年、分子生物学は迅速に発展してきた。特に、遺伝子チップは、作物の分子育種において広く使用されている。遺伝子チップ技術は、１９９０年代半ばから重大な影響を有する偉大な成果のうちの１つである。遺伝子チップは、マイクロエレクトロニクス、生物学、物理学、化学およびコンピューター科学を組み合わせた新規かつ高度な交雑技術である。遺伝子チップは、多くの特定のオリゴヌクレオチド断片または遺伝子断片がプローブとして配置され、かつ固定され、ＤＮＡマイクロアレイが形成された基板を有する。
【００１０】
試料中のＤＮＡまたはＲＮＡは、様々な技術（ＰＣＲ増幅およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写等）によって蛍光で標識される。プローブが試料中の標識された分子とハイブリダイズされた後に、チップは蛍光検出システムによってスキャンされ、コンピューターシステムを使用することによって全てのプローブの蛍光シグナルが比較および測定される。各プローブ分子の検出されたハイブリダイゼーションシグナルの強度を得ることによって、試料分子の量および配列に関する情報を迅速に得ることができる。現在、遺伝子チップ技術は、様々な分野（例えば、薬物のスクリーニング、農業、疾病の診断および治療、伝統的な漢方薬の種の同定、司法鑑定、食品および衛生設備への監督、環境検出、国家の防衛等）において広く使用されている。植物における遺伝子チップの使用についての報告は多くない。報告は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、イチゴおよびアサガオ等に主に焦点を当てている。遺伝子チップの用途については、遺伝子発現レベルの分析および検出が最も一般的であり、かつ、確立されている可能性がある。
【００１１】
遺伝子チップでは、何千ものプローブをチップ上に固定できるため、同時に多くの遺伝子を検出できる。これにより、１つのゲノムにおいて、多くの遺伝子について異なる条件下での異なる転写レベルを比較できるだけではなく、異なるゲノム中の対応する遺伝子の異なる転写レベルも比較できる。従って、遺伝子チップは、１または２の遺伝子しか一度に研究できなかった以前の研究におけるボトルネックを克服する。従って、いくつかの有用な熱抵抗性植物遺伝子を得るための、チップ技術の利用による熱抵抗性植物遺伝子の開発方法に対するニーズがある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、植物に熱抵抗性を与えることである。熱抵抗性を与えられた植物によれば、例えば、植物が熱い期間にさらされている間、熱抵抗性を与えられていない植物と比較して、作物および／または植物生産物の収率を高めることができる。上記植物中のＪＡＺ５ａ遺伝子の発現を促進すると、植物に熱抵抗性を与えることができることが見出された。従って、本発明は、単離された熱抵抗性植物タンパク質ならびにその方法および使用を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
１つの実施態様では、下記のいずれかの単離された熱抵抗性植物タンパク質が提供される：
（ａ）配列番号４のアミノ酸配列を有するタンパク質
（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列中の１以上の残基の置換、欠損または付加によって生じたものであり、かつ、配列番号４によって表されるアミノ酸配列と同一の機能を有する（ａ）のタンパク質由来のタンパク質
（ｃ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性を有し、かつ、配列番号４によって表されるアミノ酸配列と同一の機能を有する（ａ）のタンパク質由来のタンパク質。
【００１４】
１つの実施態様では、単離された熱抵抗性植物タンパク質は、配列番号４で表されるアミノ酸配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。１つの実施態様では、配列番号４のアミノ酸配列中において１〜２０、好ましくは１〜１０、より好ましくは１〜５、最も好ましくは１〜３の残基が置換され、欠損され、または付加される。
【００１５】
１つの実施態様では、上記植物はアブラナ科（Ｃｒｕｃｉｆｅｒａｅ）の植物である。１つの実施態様では、上記アブラナ科植物は、ナノハナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｓｐｐ．）植物およびシロイヌナズナ（Ａｂｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｓｐｐ．）植物からなる群から選択される。
【００１６】
１つの実施態様では、上記ナノハナ植物はハクサイである。
【００１７】
１つの実施態様では、上記シロイヌナズナ植物はシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  （Ｌ．）  Ｈｅｙｎｈ）である。
【００１８】
１つの実施態様では、上記熱抵抗性植物タンパク質は、ナノハナ植物由来であり、好ましくは、タイナ種由来である。
【００１９】
本発明の１つの実施態様では、単離されたポリヌクレオチドは、下記からなる群から選択される：
（ｉ）上記タンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｉｉ）（ｉ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド。
【００２０】
１つの実施態様では、上記ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号１または２である。
【００２１】
１つの実施態様では、上記ポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。
【００２２】
１つの実施態様では、上記ベクターまたは上記ポリヌクレオチドを含み、上記宿主細胞のゲノム中に組み込まれ得る遺伝的に操作された宿主細胞が提供される。
【００２３】
１つの実施態様では、上述のポリヌクレオチドのうちのいずれかを含む植物が提供される。
【００２４】
１つの実施態様では、
（ａ）発現に適した条件下で上記宿主細胞を培養する工程と、
（ｂ）培養物から上記タンパク質を単離する工程と、
を含む上述のタンパク質の製造方法が提供される。
【００２５】
１つの実施態様では、植物の熱抵抗性を改善するため、または、熱抵抗性植物を提供するために、上述のタンパク質またはそのコード遺伝子の使用が提供される。
【００２６】
１つの実施態様では、上述のタンパク質またはそのコード遺伝子は、抽苔期における植物の熱抵抗性を改善するために使用される。
【００２７】
１つの実施態様では、上記植物中の上述のタンパク質の発現または活性を促進する工程を含む、植物の熱抵抗性を改善するための方法が提供される。
【００２８】
１つの実施態様では、上記方法は、上述のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを上記植物のゲノムに形質転換する工程を含む。
【００２９】
別の好ましい実施形態では、上記方法は、
（１）上述のタンパク質のコード配列を含む発現ベクターを有するアグロバクテリウムを準備する工程と、
（２）植物細胞、器官または組織を準備する工程と、
（３）上記植物細胞、器官または組織と、工程（１）の上記アグロバクテリウムとを接触させ、上記タンパク質のコード配列を上記植物細胞内に導入する工程と、
（４）任意に、上記タンパク質の導入されたコード配列を含む植物細胞、器官または組織を選択する工程と、
（５）工程（３）の植物細胞、器官または組織を植物に再生させる工程と、
を含む。
【００３０】
１つの実施態様では、上記導入されたコード配列は、上記植物細胞のゲノム中に組み込まれる。
【００３１】
本発明の別の態様では、上述の方法によって得られる遺伝子導入植物、または得ることができる遺伝子導入植物が提供される。
【００３２】
本発明の１つの実施態様では、植物における熱抵抗性または改善された熱抵抗性を特定するための分子マーカーが提供され、上記分子マーカーは、配列番号１または２の配列の少なくとも５０ヌクレオチドを含む。１つの実施形態では、上記分子マーカーは、植物中において、植物細胞のＤＮＡの配列決定によって特定される方法が提供される。１つの実施態様では、上記分子マーカーは、配列番号１または２の配列を増幅し、かつ、増幅産物を検出することによって特定される方法が提供される。１つの実施態様では、配列番号１または２の配列を増幅できるプライマー対が提供される。１つの実施態様では、ヌクレオチド配列番号５および６によって表されるプライマー対が提供される。
【００３３】
本発明の他の態様は、本願明細書の内容に基づき、当業者に明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】図１は、ハクサイ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）の熱抵抗性および熱感受性の変種におけるＢｃｃＬＯＸ３およびＢｃｃＪＡＺ５のｃＤＮＡ−ＡＦＬＰの結果を示す。ＨＳ０、ＨＳ１、・・・、およびＨＳ５中の番号０、１、・・・、および５は、それぞれ処理番号を指し、この番号は、その上に示されたサンプリング時間に相当する。「ｍ」は分を意味し、「ｈ」は時間を意味する。
【図２】図２は、ＲＴ−ＰＣＲによって検出された、ハクサイの熱抵抗性および熱感受性変種におけるＢｃｃＪＡＺ５ａおよびＢｃｃＪＡＺ５ｂの転写レベルを示す。４６℃、１時間での熱処理後、全ＲＮＡを抽出した。ＵＢＱ５は、対照である。ＣＫは、熱処理にさらされていない対照を指す。つまり、この対照は、通常の生育温度にさらされた。０−１および１−２は、対照について２回繰り返された実験を示し、１−１および１−２は、熱処理について２回繰り返された実験を示す。
【図３】図３は、遺伝子導入植物３５Ｓ：：ＢｃｃＪＡＺ５ａのＴ２世代の熱抵抗性の表現型を示す。パネルＡは、ＲＴ−ＰＣＴによる、遺伝子導入植物（ｇＢｃｃＪＡＺ５ａ）および野生型植物（Ｃｏｌ）における、ＢｃｃＪＡＺ５ａおよび内在性のＡｔＪＡＺ５の発現レベルを示す。ｇＢｃｃＪＡＺ５Ａ  ＨＲ／ＣｏｌＴ２は、ＢｃｃＪＡＺ５ＡゲノムＤＮＡで形質転換された遺伝子導入シロイヌナズナ植物から繁殖した第２世代のヘテロ接合性植物を指す（「ｇ」はゲノムＤＮＡを示す）。記号１−１、１−２、２−１、２−２、３−１、３−２において、「−」の前の番号は、それぞれ遺伝子導入植物１、２および３を指し、「−」の後の番号は、それぞれ遺伝子導入植物について２回繰り返された実験を指す。Ｃｏｌ−１およびＣｏｌ−２は、野生型シロイヌナズナについての２回の実験を指す。パネルＢは、熱処理にさらされた遺伝子導入植物および野生型植物を示す。７日齢の実生を２２℃で栽培し、次いで、４４〜４６℃で１時間熱処理にさらした。次いで、さらに７日間、２２℃にもどした後に写真を撮影した。パネルＣは、実生段階における３つの遺伝子導入植物の生育状態を示す。通常の生育条件下で、２番（＃２）の遺伝子導入系統の植物は、他の２つの遺伝子導入系統の植物よりも小さかった。
【図４】図４は、３５Ｓ：ＢｃｃＪＡＺ５ａ遺伝子導入系統が、抽苔期における改善された熱抵抗性を有することを示す。当該植物は、２２℃で、抽苔まで栽培した。次いで、４５℃で３時間または４６℃で、２．５時間熱処理にさらし、４４℃、６０分間に変え、次いでさらに５日間２２℃に切り替えた後に写真を撮影した。各系統について、２回の実験を繰り返して行った。図中、記号１−１−１および１−１−２は、それぞれ遺伝子導入系統１の２つのＴ２世代植物を指し、記号２−１−８は、遺伝子導入系統２の１つのＴ２世代植物を指し、２−１−７は、遺伝子導入系統２の別のＴ２世代植物を指す。同様に、３−１−１および３−１−３は、遺伝子導入系統３の２つのＴ２世代植物を指す。
【図５】図５は、ＢｃｃＪＡＺ５ａタンパク質（配列番号４）中のドメインの分析を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
（定義）
下記の記載および実施例では、いくつかの用語が使用される。明細書および請求項（このような用語に与えられる範囲を含む）の明確かつ一貫した理解を与えるために、下記の定義が提供される。本願明細書において特に定義されていない限り、使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって通常理解されるものと同一の意味を有する。全ての文献、特許出願、特許および他の参考文献の開示は、参照によってその全体を本願明細書に援用する。
【００３６】
本発明の方法において使用される従来の技術を実行する方法は、当業者に明らかであろう。分子生物学、生化学、計算化学、細胞培養、組換えＤＮＡ、生物情報学、ゲノム科学、配列決定および関連分野における従来の技術の実行は、当業者に周知であり、例えば、下記の文献において議論されている：Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．  ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．  Ｙ．，  １９８９；  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ．  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８７  ａｎｄ  ｐｅｒｉｏｄｉｃ  ｕｐｄａｔｅｓ；  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｅｒｉｅｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ。
【００３７】
本願明細書および請求項中において、動詞「含む」およびその活用は、その非限定的な意味で使用され、当該用語の後に続く事項が含まれることを意味するが、特に言及されていない事項は除外されない。
【００３８】
本願明細書で使用される単数形は、特段の明示がない限り複数形の対象を含む。例えば、上記で使用された、（単数の）ＤＮＡ分子を単離する方法は、複数の分子（例えば、数十、数百、数千、数万、数十万、数百万またはそれ以上の分子）を単離することを含む。
【００３９】
本願明細書で使用される用語「熱ストレス」または「熱」は、温度に関連する最適以下の環境条件を指す。本願明細書で使用される用語「熱」は、大気および／または土壌の温度が生育および／または発育に最適な温度よりも高い環境条件を指す。例えば、キャベツ類の生育に最適な大気の温度は、１５〜２０℃の範囲である。温度がこの範囲よりも高いと、キャベツ類は、「熱ストレス」にさらされる。植物を「熱ストレス」にさらす影響は、その植物が最適に生育および／または発育しないことである。例えば、タイナ種を熱ストレスにさらすと、節間の伸張、生育の緩慢化、苦味の発生、繊維量の増加等の影響が生じ得る。ロゼット期および結球期の間にハクサイを熱ストレスにさらすと、心葉が堅固な鱗茎を構築するように巻くことができないか、または全く鱗茎ができないという効果を生じ得る。不自然に鱗茎ができたとしても、穂が束ねられていない。
【００４０】
用語「熱抵抗性」とは、植物が熱抵抗性を与えられた場合（または熱抵抗性である場合）に、熱ストレスにさらされた際に、影響を示さないか、または、熱抵抗性を与えられていない植物と比較して軽減された影響を示すことを指す。植物が「熱抵抗性」である場合、さもなければ通常の植物に低減された生育および／または発育をもたらす高温にさらされても、通常の生育および／または通常の発育を維持できる。従って、熱抵抗性は、植物を別の植物と比較することによって特定される相対的な用語である。そのため、（通常の）生育を最も維持できる植物は「熱抵抗性」植物である可能性があり、一方、維持できない植物は、「熱感受性」植物と呼ばれ得る。従って、熱抵抗性を与えることは、熱抵抗性を与えられていない植物と比較して、植物の熱抵抗性を改善することを含むことが理解されるだろう。
【００４１】
アライニングおよびアラインメント：用語「アライニング」および「アラインメント」とは、同一のまたは類似するヌクレオチドの短いまたは長い配列の存在に基づく、２以上のヌクレオチド配列の比較を意味する。ヌクレオチド配列のアラインメントのためのいくつかの方法は、当該技術分野で公知であり、下記でさらに説明する。
【００４２】
「遺伝子の発現」とは、適切な調節領域（特にプロモーター）に作動可能に連結されたＤＮＡ領域が、生物学的に活性な（例えば、生物学的に活性なタンパク質もしくはペプチドまたは活性なペプチド断片に翻訳され得る）ＲＮＡに転写される工程を指す。ある実施態様では、活性なタンパク質とは、構成的に活性なタンパク質を指す。コード配列は、好ましくは、センス方向であり、所望の、生物学的に活性なタンパク質もしくはペプチド、または活性なペプチド断片をコードする。
【００４３】
「機能的な」とは、タンパク質（または変異体（オルソログまたは変異体等）および断片）と関連して、植物の定量的および／または質的な特徴に対して効果を与えることができる、遺伝子および／またはコードされたタンパク質の能力を指す。上記遺伝子の発現レベルを（例えば、発現を促進させること、または発現を低下させることによって）改変することによって、植物の定量的および／または質的な特徴が影響される。例えば、タンパク質が熱抵抗性の機能を有する場合、遺伝子発現を促進すると、熱抵抗性がもたらされ得る。当業者ならば、非生物的ストレス（熱等）についての機能性を検討することに困難性はないであろう。
【００４４】
用語「遺伝子」は、適した調節領域（例えばプロモーター）に作動可能に連結される領域（転写された領域）を含むＤＮＡ配列を意味し、これは細胞中でＲＮＡ分子（例えばｍＲＮＡ）に転写される。従って、遺伝子は、いくつかの作動可能に連結された配列（プロモーター、５’リーダー配列（例えば翻訳開始に関与する配列を含むもの）、（タンパク質）コード領域（ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）および３’非翻訳配列（例えば転写終結配列部位を含むもの）等）を含む可能性がある。
【００４５】
「同一性」は、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の同一性の基準である。一般的に、配列は順序の一致が最も高くなるようにアラインメントされる。「同一性」自体は、当該技術分野で承認された意味を有し、公知の技術を使用して算出できる。例えば、下記を参照：（ＣＯＭＰＵＴＡＴＩＯＮＡＬ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，  Ｌｅｓｋ，  Ａ．  Ｍ．，  ｅｄ．，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８８；  ＢＩＯＣＯＭＰＵＴＩＮＧ：  ＩＮＦＯＲＭＡＴＩＣＳ  ＡＮＤ  ＧＥＮＯＭＥ  ＰＲＯＪＥＣＴＳ，  Ｓｍｉｔｈ，  Ｄ．  Ｗ．，  ｅｄ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９３；  ＣＯＭＰＵＴＥＲ  ＡＮＡＬＹＳＩＳ  ＯＦ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＤＡＴＡ，  ＰＡＲＴ  Ｉ，  Ｇｒｉｆｆｉｎ，  Ａ．  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，  Ｈ．  Ｇ．，  ｅｄｓ．，  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，  １９９４；  ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＡＮＡＬＹＳＩＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，  ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，  Ｇ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８７；および  ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＡＮＡＬＹＳＩＳ  ＰＲＩＭＥＲ；  Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，  Ｍ．  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，  Ｊ．，  ｅｄｓ．，  Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９１）。
【００４６】
２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列の間の同一性を測定するための方法としては、いくつかの方法が存在するが、用語「同一性」は、当業者に周知である（Ｃａｒｉｌｌｏ，  Ｈ．，  ａｎｄ  Ｌｉｐｔｏｎ，  Ｄ．，  ＳＩＡＭ  Ｊ．  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ  （１９８８）  ４８：１０７３）。２つの配列の間の同一性または類似性を特定するために一般的に使用される方法としては、下記に開示されたものが挙げられるが、これに限定されない：ＧＵＩＤＥ  ＴＯ  ＨＵＧＥ  ＣＯＭＰＵＴＥＲＳ，  Ｍａｒｔｉｎ  Ｊ．  Ｂｉｓｈｏｐ，  ｅｄ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  １９９４，および  Ｃａｒｉｌｌｏ，  Ｈ．，  ａｎｄ  Ｌｉｐｔｏｎ，  Ｄ．，  ＳＩＡＭ  Ｊ．  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ  （１９８８）  ４８：１０７３。同一性および類似性を特定するための方法は、コンピュータープログラムで分類することである。２つの配列の間の同一性および類似性を特定するための好ましいコンピュータープログラム方法としては、下記に開示されたものが挙げられるが、これらに限定されない：ＧＣＳ  ｐｒｏｇｒａｍ  ｐａｃｋａｇｅ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，  Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  （１９８４）  １２（１）：３８７），  ＢＬＡＳＴＰ，  ＢＬＡＳＴＮ，  ＦＡＳＴＡ  （Ａｔｓｃｈｕｌ，  Ｓ．  Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌｅｃ．  Ｂｉｏｌ．  （１９９０）  ２１５：４０３）。
【００４７】
例として、特定の配列のポリペプチドをコードする参照ヌクレオチド配列と少なくとも、例えば、９５％の「同一性」を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとは、当該ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、ポリヌクレオチド配列が参照ポリペプチド配列の各１００ヌクレオチドあたり最大５の点変異を含み得る場合を除いて、参照配列と同一であることを意図する。換言すると、参照ヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るためには、参照配列中の最大５％のヌクレオチドを欠損させるか、かつ／または別のヌクレオチドによって置換してもよく、かつ／または、参照配列中の全ヌクレオチドの最大５％のいくつかのヌクレオチドを参照配列中に挿入してもよい。参照配列のこれらの変異は、参照ヌクレオチド配列の５’もしくは３’末端の位置、または、参照配列におけるヌクレオチドの間に個々に分散しているか、もしくは参照配列内の１以上の近接する群中に分散している、これらの末端位置の間のどこかに生じていてもよい。
【００４８】
同様に、少なくとも、例えば、配列番号１の参照アミノ酸配列と９５％の「同一性」を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドとは、ポリペプチド配列が配列番号１の参照アミノ酸の各１００アミノ酸あたり最大５のアミノ酸変化を含み得る場合を除いて、当該ポリペプチドのアミノ酸配列は、参照配列と同一であることを意図する。換言すると、参照アミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るためには、参照配列中の最大５％のアミノ酸残基が欠損させるか、または別のアミノ酸によって置換してもよく、または、参照配列中の全アミノ酸残基の最大５％のいくつかのアミノ酸を参照配列中に挿入してもよい。参照配列のこれらの変化は、参照アミノ酸配列のアミノもしくはカルボキシ末端の位置または、参照配列における残基の間に個々に分散しているか、もしくは参照配列内の１以上の近接する群中に個々に分散している、これらの末端位置の間のどこかに生じていてもよい。
【００４９】
本発明の核酸は、ピリミジンおよびプリン塩基（それぞれ、好ましくはシトシン、チミン、およびウラシルならびにアデニンおよびグアニン）のポリマーまたはオリゴマーのうちのいずれかを含んでいてもよい（Ａｌｂｅｒｔ  Ｌ．  Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ７９３−８００（Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂ．  １９８２）を参照、これはその全体を参照によって本願明細書に組み込まれる）。
【００５０】
本発明は、全てのデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドまたはペプチド核酸成分および全てのその化学的な変異体（例えば、これらの塩基のメチル化された形態、ヒドロキシメチル化された形態またはグリコシル化された形態等）を意図する。ポリマーまたはオリゴマーは、組成において、異種または同種であってもよく、天然に存在する供給源から単離されたものであってもよく、または、人工的にもしくは合成的に産生されたものであってもよい。さらに、核酸はＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはその混合物であってもよく、一本鎖のまたは二本鎖の形態（ホモ二本鎖、ヘテロ二本鎖およびハイブリッドの状態等）で持続的にまたは暫定的に存在していてもよい。
【００５１】
本願明細書で使用される用語「作動可能に連結された」とは、機能的な関連性におけるポリヌクレオチド因子の連鎖を指す。核酸は、別の核酸配列との機能的な関連性において配置されると「作動可能に連結される」。例えば、プロモーター、または特に転写制御配列は、コード配列の転写に影響すると、コード配列と作動可能に連結される。作動可能に連結されたとは、連結されたＤＮＡ配列が、典型的には近接しており、２つのタンパク質コード領域を結合させる必要がある場合には、近接しており、かつ読み枠中にあり、「キメラタンパク質」を産生することを意味する。「キメラタンパク質」または「ハイブリッドタンパク質」は、それ自体は天然に見出されないが、結合して機能的なタンパク質を形成する様々なタンパク質「ドメイン」（またはモチーフ）から構成される。「キメラタンパク質」または「ハイブリッドタンパク質」は、結合されたドメインの機能性を示す。キメラタンパク質はまた、天然に存在する２以上のタンパク質の融合タンパク質であってもよい。本願明細書で使用される用語「ドメイン」とは、別のタンパク質に導入されて、少なくともドメインの機能的な特徴を有する新規なハイブリッドタンパク質を与えることができる、特定の構造または機能を有するタンパク質のいずれかの部分またはドメインを意味する。
【００５２】
「植物」とは、植物全体または植物の部分（植物から得ることができる細胞、組織または器官（例えば、花粉、種子、生殖体、根、葉、花、花芽、葯、果実等）等）、およびこれらのいずれかの誘導体、ならびに自家受粉または交雑によるこのような植物由来の子孫のいずれかを指す。「植物細胞」としては、単離物中または組織、器官または生物内のプロトプラスト、生殖体、懸濁培養物、小胞子、花粉粒子等が挙げられる。
【００５３】
本願明細書で使用される用語「プロモーター」とは、１以上の遺伝子の転写を制御する機能を有し、遺伝子の転写開始部位の転写方向に対して上流に位置する核酸断片を指し、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、転写開始部位および任意の他のＤＮＡ配列（転写因子結合部位、抑制タンパク質結合部位および活性化タンパク質結合部位および、プロモーターからの転写量を直接的または間接的に制御するように作用する当業者に公知のヌクレオチドの任意の他の配列が挙げられるが、これらに限定されない）についての結合部位の存在によって構造的に特定される。任意に、本願明細書における用語「プロモーター」には、５’ＵＴＲ領域（５’非翻訳領域）も含まれる。例えば、本願明細書におけるプロモーターは、遺伝子の翻訳開始コドンの上流（５’）の１以上の部分を含み得る。なぜならば、この領域は、転写および／または翻訳を制御する役割を有する可能性があるからである。「構成的」プロモーターは、多くの生理的条件および発育条件下で、多くの組織において活性なプロモーターである。「誘導性」プロモーターは、生理学的に（例えば、特定の化合物の外的処理によって）または発生的に制御されるプロモーターである。「組織特異的な」プロモーターは、特定の種類の組織または細胞においてのみ活性である。「植物または植物細胞において活性なプロモーター」とは、植物または植物細胞内で転写させるプロモーターの一般的な能力を指す。これは、プロモーターの時空間的な活性を意味するものでは全くない。
【００５４】
用語「タンパク質」または「ポリペプチド」は互換的に使用され、特定の作用形態、大きさ、三次構造または由来を参照することなく、アミノ酸鎖からなる分子を指す。従って、タンパク質の「断片」または「部分」も、依然として「タンパク質」と呼ばれ得る。「単離されたタンパク質」は、その天然の環境にもはや存在せず、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏまたは組換え細菌の宿主細胞もしくは植物の宿主細胞中にあるタンパク質を指すために使用される。
【００５５】
本願明細書において「遺伝的に改変された植物」とは、例えば、発現が促進するような内在性の遺伝子もしくはその部分における変異の導入によって、または、外因性遺伝子もしくは付加的な複製物もしくは内在性の遺伝子の複製物の導入によって形質転換された、植物または植物細胞を指す。上記外因性遺伝子または付加的な内在性の遺伝子は、ゲノム内に組み込まれていてもよい。（単離された）ポリヌクレオチド配列で形質転換された遺伝子導入植物細胞、ならびに当該細胞から再生された植物細胞および植物は全て、上記（単離された）ポリヌクレオチド配列を含むことが理解されるであろう。遺伝子導入植物細胞とは、単離物もしくは組織培養中における植物細胞、または、植物もしくは分化した器官または組織中に含まれる植物細胞をも指していてよく、両方の可能性が特に本願明細書に含まれる。
【００５６】
従って、本願明細書または請求項中の植物細胞への参照は、培養物中の単離された細胞またはプロトプラストを指すだけではなく、どこに位置するかに関わらず、または、それが存在し得る植物組織もしくは器官の種類に関わらず、全ての植物細胞を指すことを意味する。遺伝子導入植物細胞および植物を得るための方法は当該技術分野で周知であり、下記が挙げられるがこれらに限定されない：植物の外植片のアグロバクテリウム媒介性形質転換、植物の外植片の粒子照射、ウィスカーの技術を使用した植物の外植片の形質転換、ウイルスベクターを使用した形質転換、植物プロトプラストの電気穿孔、ポリエチレングリコールを使用したプロトプラストによるＤＮＡの直接取り込み、植物の外植片および／またはプロトプラストの微量注入。アグロバクテリウム媒介性形質転換は、本発明の核酸分子を植物の外植片中に導入するための好ましい方法である。アグロバクテリウム腫大物は、植物ゲノムへの外在性の核酸分子の導入に適するように操作された、Ｔｉプラスミドと呼ばれる天然のベクターを有する。遺伝子形質転換については、植物由来の外植片は、アグロバクテリウム細胞の懸濁液でインキュベーションした後に、形質転換された細胞のみの生育および再生を促進する選択剤を含む培地で外植片を培養する。
【００５７】
（本発明の詳細な説明）
根気強い研究の後に、本発明者は、熱抵抗性植物遺伝子の開発におけるチップ技術の使用によって、初めて、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｓｐｐ．）から新規な熱抵抗性植物遺伝子を単離した。この遺伝子は、植物における熱抵抗性を改善するために使用できる。この単離された遺伝子は、「ＢｃｃＪＡＺ５ａ」と名付けられ、これにより、改善された熱抵抗性を有する遺伝子導入植物を産生できる。
【００５８】
本発明において使用できる植物としては、遺伝子によって形質転換するのに適した植物である限り、特に限定されない。上記植物としては、様々な作物、花植物または森林植物等が挙げられる。特に、上記植物としては、双子葉類、単子葉植物または裸子植物が挙げられるが、これらに限定されない。より具体的には、上記植物としては、コムギ、オオムギ、ライムギ、イネ、トウモロコシ、ソルガム、テンサイ、リンゴ、セイヨウナシ、セイヨウスモモ、モモ、アンズ、サクランボ、イチゴ、タイワンウラジロイチゴ（Ｒｕｂｕｓ  ｓｗｉｎｈｏｅｉ  Ｈａｎｃｅ）、ブラックベリー、マメ、レンズマメ、エンドウマメ、ダイズ、ナタネ、カラシナ、ケシ、オリーブ、ヒマワリ、ココナツ、ヒマシ油を産生する植物、カカオ、ピーナッツ、ヒョウタン、キュウリ、スイカ、ワタ、アマ、アサ、ジュート、柑橘類（ｃｉｔｒｕｓ）、レモン、グレープフルーツ、ホウレンソウ、レタス、アスパラガス、キャベツ（ｃａｂｂａｇｅ）、ハクサイ種、タイナ種、ニンジン、タマネギ、マーフィー、トマト、ピーマン、アボカド、カッシア、カンファー、タバコ、ナッツ、コーヒー、ナス、サトウキビ、茶、コショウ、ブドウ、イラクサ、バナナ、天然ゴムノキおよび観賞植物等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５９】
用語「植物」としては、アブラナ科（Ｃｒｕｃｉｆｅｒａｅ）、イネ科（Ｇｒａｍｉｎｅａｅ）およびバラ科（Ｒｏｓａｃｅａｅ）の植物が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、「植物」としては下記のものが挙げられるがこれらに限定されない：アブラナ科のアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｓｐｐ．）のハクサイ種およびタイナ種；アブラナ科のシロイヌナズナ（Ａｂｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｓｐｐ．）植物；イネ科のイネ；ならびにタバコ、メロンおよび果実、野菜、ナタネ等。より好ましくは、「植物」は、アブラナ科のアブラナ属またはシロイヌナズナの植物である。
【００６０】
本願明細書で使用される用語「単離された」とは、物質が、それが最初に見出された本来の環境または自然環境から分離されたことを意味する。例えば、生細胞中の、天然の状態でのポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、単離または精製されていない。しかし、そのポリヌクレオチドまたはポリペプチドが上記天然の状態において共存する他の物質から分離された場合、それは、「単離された」および／または「精製された」と呼ばれる。
【００６１】
本願明細書で使用される用語「単離された熱抵抗性植物タンパク質（ポリペプチド）」、「植物の熱抵抗性を改善する単離されたポリペプチド」、「単離されたＢｃｃＪＡＺ５ａタンパク質」または「単離されたＢｃｃＪＡＺ５ａポリペプチド」とは、上記タンパク質と天然に関連する他のタンパク質、脂質、糖類および他の物質を実質的に含まないＢｃｃＪＡＺ５ａタンパク質を指す。当業者は、ＢｃｃＪＡＺ５ａタンパク質を精製するために標準的なタンパク質精製技術を利用できる。実質的に純粋なポリペプチドは、非還元性ポリアクリルアミドゲル上に単一の主要なバンドを形成し得る。
【００６２】
本願明細書で使用される用語「含む」、「有する」には、「含んでいる」、「実質的に・・・からなる」、「基本的に・・・からなる」および「からなる」が含まれる。「実質的に・・・からなる」、「基本的に・・・からなる」、および「からなる」は、一般的な用語「含む」、「有する」の特定の概念である。
【００６３】
本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然のポリペプチドまたは合成ポリペプチドであってもよい。好ましくは、本発明のポリペプチドは組換えポリペプチドである。本発明のポリペプチドは、天然の供給源から精製された生成物、化学的に合成された生成物、または原核生物の宿主もしくは真核生物の宿主（細菌、酵母、高等植物、昆虫および哺乳類細胞等）によって組換え的に産生された生成物であってもよい。組換え産生において使用された宿主に応じて、本発明のポリペプチドは、グリコシル化されていてもよく、または、グリコシル化されていなくともよい。本発明のポリペプチドは、さらに、第１の天然のメチオニン残基を含んでいてもよく、または含んでいなくともよい。
【００６４】
本発明は、ＢｃｃＪＡＺ５ａタンパク質の断片、誘導体および類似体をさらに含む。本願明細書で使用される用語「断片」、「誘導体」および「類似体」は、本発明のＢｃｃＪＡＺ５ａタンパク質と実質的に同一の生物学的機能および／または活性を有するポリペプチドを指す。本発明のポリペプチド断片、誘導体または類似体は下記のものであってもよい：（ｉ）１もしくはいくつかの（好ましくは）保存的な、または非保存的なアミノ酸残基が、遺伝的にコードされた（またはコードされていない）１以上のアミノ酸残基によって置換されたポリペプチド、または（ｉｉ）置換基を有する１以上のアミノ酸残基を有するポリペプチド、または（ｉｉｉ）成熟ポリペプチドおよび別の化合物（ポリペプチドの半減期を延長するための化合物（ポリエチレングリコール等）等）の融合ポリペプチド、または（ｉｖ）ポリペプチド配列に融合する付加的なアミノ酸配列（リーダー配列または分泌配列、または精製を促進する配列、またはタンパク新生配列、または融合タンパク質等）によって形成されたポリペプチド。
【００６５】
本願明細書に記載された定義により、これらの断片、誘導体および類似体は当業者に理解されるだろう。
【００６６】
本願明細書で使用される用語「ＢｃｃＪＡＺ５ａタンパク質」とは、配列番号４の配列に基づく、改善された熱抵抗性を与えるポリペプチドを指す。これはまた、改善された植物の熱抵抗性を示す配列番号４の変異体を含む。変異としては下記が挙げられるが、これらに限定されない：１以上の（一般的に１〜５０、好ましくは１〜３０、より好ましくは１〜２０、最も好ましくは１〜１０、さらにより好ましくは１〜８または１〜５の）アミノ酸欠損、挿入および／または置換、ならびに、Ｃ末端および／またはＮ末端での１以上の（一般的に２０以下、好ましくは１０以下、より好ましくは５以下の）アミノ酸の付加または欠損。例えば、近いまたは類似する特性を有するアミノ酸残基による置換は、一般的に、タンパク質の機能に影響しないことが理解されるだろう。さらに、例えば、Ｃ末端および／またはＮ末端での１以上のアミノ酸の付加または欠損は、一般的に、タンパク質の機能に影響しない。当該用語には、ＢｃｃＪＡＺ５ａタンパク質の活性断片および活性誘導体も含まれる。
【００６７】
ポリペプチドの変異体としては、その相同配列、保存的な変異体、対立遺伝子の変異体、天然の変異体、誘導された変異体、高ストリンジェントな条件または低ストリンジェントな条件下でＢｃｃＪＡＺ５ａタンパク質のＤＮＡとハイブリダイズできるＤＮＡによってコードされたタンパク質、および、ＢｃｃＪＡＺ５ａタンパク質に対する抗血清を利用することによって得られたポリペプチドまたはタンパク質が挙げられる。本発明はまた、より関連するポリペプチド（ＢｃｃＪＡＺ５ａタンパク質またはその断片を含む融合タンパク質等）を提供する。全長ポリペプチドまたはほぼ全長のポリペプチドに加えて、本発明はまた、ＢｃｃＪＡＺ５ａタンパク質の可溶性断片を含む。一般的に、上記断片は、ＢｃｃＪＡＺ５ａタンパク質の少なくとも約２０の、一般的に少なくとも約３０の、好ましくは少なくとも約５０の、より好ましくは少なくとも約８０の、最も好ましくは少なくとも約１００の連続的なアミノ酸を含む。
【００６８】
本発明はまた、ＢｃｃＪＡＺ５ａタンパク質またはポリペプチドの類似体を提供する。これらの類似体は、天然のＢｃｃＪＡＺ５ａタンパク質と、一次配列において、もしくはその一次配列についての修飾パターンにおいて、またはこれらの両方において異なっていてもよい。これらのポリペプチドとしては、天然の遺伝子変異体または誘導された遺伝子変異体が挙げられる。誘導された変異体は、様々な技術によって（例えば、放射線によって、または、変異原にさらしてランダム変異原性を産生することによって）得てもよい。これらは、部位特異的な変異原性またはいくつかの他の公知の生物学的技術によっても得ることができる。類似体としては、天然のＬ−アミノ酸と異なる残基を有するもの（Ｄ−アミノ酸等）、および非天然のまたは合成のアミノ酸（β−アミノ酸およびγ−アミノ酸等）を有するものも挙げられる。本発明のポリペプチドが上記の代表的な例に限定されないことは理解されるであろう。
【００６９】
一次構造を変化させない修飾パターンとしては、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏの化学的誘導（アセチル化またはカルボキシル化等）が挙げられる。修飾は、グリコシル化であってもよい。修飾は、配列中のアミノ酸残基のリン酸化（リン酸化チロシン、リン酸化セリンおよびリン酸化スレオニン等）であってもよい。改善された抗タンパク質分解特性を有するか、または溶解特性を最適化するように改変されたポリペプチドも含まれる。
【００７０】
本発明において、「ＢｃｃＪＡＺ５ａタンパク質の保存的な変異体」とは、類似する特性を有するアミノ酸によって置換された配列番号４のアミノ酸配列中の最大２０、好ましくは最大１０、より好ましくは最大５、最も好ましくは最大３のアミノ酸を有するポリペプチドを指す。これらの変異ポリペプチドは、表１に示されたアミノ酸置換に従って産生されてもよい。
【００７１】
【表１】
0005924782.tif 000002
【００７２】
本発明は、本発明のＢｃｃＪＡＺ５ａタンパク質またはその保存的な変異ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列をさらに提供する。
【００７３】
本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子であってもよい。ＤＮＡ分子としては、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよび合成ＤＮＡが挙げられる。ＤＮＡ分子は、一本鎖または二本鎖の形態であってもよい。ＤＮＡ分子は、コード鎖または非コード鎖であってよい。成熟ポリペプチドをコードするコード配列は、配列番号１または２のコード配列と同一であってもよく、または、それらの変性変異体であってもよい。本願明細書で使用される「変性変異体」とは、配列番号１または２に記載されるコード配列と異なるヌクレオチド配列を含む配列番号４の配列を有するタンパク質をコードする核酸分子を指す。
【００７４】
配列番号４のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、下記を含んでいてもよい：ポリペプチドのみをコードするコード配列；ポリペプチドのコード配列および付加的なコード配列；ポリペプチドのコード配列および非コード配列、ならびに、任意に付加的なコード配列。
【００７５】
用語「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」には、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに加えて、任意に、付加的なコードポリヌクレオチドおよび／または非コードポリヌクレオチドが含まれていてもよい。
【００７６】
本発明はさらに上記のポリヌクレオチドの変異体に関し、これは本発明のポリペプチドならびにその断片、類似体および誘導体と同一のアミノ酸配列をコードする。ポリヌクレオチドの変異体は、天然に存在する対立遺伝子の変異体または天然に存在しない変異体であってもよい。ヌクレオチド変異体としては、置換変異体、欠損変異体および挿入変異体が挙げられる。先行技術において知られるように、対立遺伝子の変異体は、ポリヌクレオチドの別の形態であり、その変異は１以上のヌクレオチドの置換、欠損または挿入であってもよいが、対立遺伝子の変異体によってコードされたポリペプチドの機能は実質的に変化しない。
【００７７】
本発明はまた、上記の配列のいずれかとハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％の２つの配列間の配列同一性を有するポリヌクレオチドに関する。本発明は、特に、ストリンジェントな条件下で本発明のポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。
【００７８】
本発明において、「ストリンジェントな条件」とは、以下のいずれかを指す：（１）相対的に低いイオン強度および相対的に高い温度（０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０℃等）でハイブリダイゼーションおよび溶出すること；または（２）ハイブリダイゼーションの間に変性剤が存在すること（例えば、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、０．１％子ウシ血清／０．１  ％Ｆｉｃｏｌｌ、４２℃等）；または（３）少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％同一性を有する２つの配列間でのみハイブリダイゼーションできる条件。さらに、ハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドは、配列番号４に示された成熟ポリペプチドと同一の生物学的機能および活性を示す。
【００７９】
本発明は、上記の配列のいずれにもハイブリダイズできる核酸断片にも関する。本願明細書で使用される「核酸断片」は、少なくとも１５ヌクレオチド、好ましくは少なくとも３０ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも５０ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも１００ヌクレオチドを含む。核酸の断片は、ＢｃｃＪＡＺ５ａタンパク質をコードするポリヌクレオチドを特定および／または単離するために、核酸の増幅技術（ＰＣＲ等）において使用してもよい。
【００８０】
本発明のＢｃｃＪＡＺ５ａタンパク質またはその断片の全長ヌクレオチド配列は、典型的には、ＰＣＲ増幅法、組換え方法または人工合成によって調製できる。ＰＣＲ増幅に関しては、対象の配列は、本発明において開示された関連ヌクレオチド配列（例えば、読み取り枠）に従ってプライマーを設計すること、および当該技術分野で公知の従来の方法のいずれかに従って調製された市販のｃＤＮＡライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーを鋳型として使用することによって増幅できる。長い配列については、典型的に、２回以上のＰＣＲ増幅が必要となる可能性があり、各増幅によって得られた断片は、正しい方向で、例えばライゲーションすることによって、一緒に融合してもよい。
【００８１】
いったん関連配列が得られると、組換え技術を使用して大量に産生できる。当該配列は、ベクター内にクローニングされてもよい。当該ベクターは、細胞内に形質転換されてもよく、次いで、配列を、従来の方法を使用して増殖された宿主細胞から単離できる。
【００８２】
さらに、関連配列は、例えば、断片が相対的に短い場合は、人工合成によって合成できる。いくつかの小断片をまず合成し、次いで、例えば、融合ＰＣＲまたはライゲーションによって、長い断片内に融合してもよい。
【００８３】
本発明のタンパク質（またはその断片または誘導体）をコードするＤＮＡ配列は、化学合成によって完全に調製できる。得られたＤＮＡ配列は、様々な公知のＤＮＡ分子（ベクター等）内に、次いで、細胞内に組み入れることができる。さらに、変異は、化学合成によって本発明のタンパク質配列内に導入されてもよい。
【００８４】
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターに関し、本発明のＢｃｃＪＡＺ５ａタンパク質のベクターまたはコード配列を含むように遺伝的に操作された宿主細胞、および本発明のポリペプチドを組換え的に製造するための方法に関する。
【００８５】
本発明のポリヌクレオチドは、従来の組換えＤＮＡ技術を使用して、組換えＢｃｃＪＡＺ５ａタンパク質を発現または産生するために使用できる。このような用途において、下記の工程が含まれていてもよい：
（１）宿主細胞を、本発明のＢｃｃＪＡＺ５ａタンパク質をコードするポリヌクレオチド（またはその変異体）、または上記ポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターで形質転換または形質移入する工程、
（２）培地中で宿主細胞を培養する工程、
（３）培地または培養細胞からタンパク質を単離および精製する工程。
【００８６】
本発明において、ＢｃｃＪＡＺ５ａタンパク質のポリヌクレオチド配列は、組換え発現ベクター中に挿入できる。用語「組換え発現ベクター」とは、細菌性プラスミド、ファージ、酵母プラスミド、植物細胞ウイルス、哺乳類細胞ウイルスおよび、当該技術分野で公知の任意の他のベクターを指す。宿主中で安定的に複製および保持できる限り、全てのプラスミドおよびベクターを使用できる。発現ベクターは、複製起点、プロモーター、マーカーおよび／または翻訳調節領域を含んでいてもよい。
【００８７】
当該技術分野で公知の様々な方法が、ＢｃｃＪＡＺ５ａタンパク質および適した転写／翻訳制御シグナルをコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターを構築するために使用できる。これらの方法としては、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ組換え技術、ＤＮＡ合成、ｉｎ  ｖｉｖｏ組換え技術等が挙げられる。ＤＮＡ配列は、適したプロモーター下で、発現ベクター中でｍＲＮＡ合成を行うように、作動可能に連結され得る。発現ベクターは、さらに、翻訳開始および転写終結のためにリボソーム結合部位を含んでいてもよい。
【００８８】
さらに、発現ベクターは、１以上の選択的に標識された遺伝子を含み、形質転換された宿主細胞を選択するための表現型特性を与えてもよい。標識された遺伝子は、例えば、真核細胞の培養のためにジヒドロ葉酸還元酵素、ネオマイシン抵抗性および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードしてもよく、大腸菌の培養のためにカナマイシンまたはアンピシリン抵抗性をコードしてもよい。
【００８９】
上記の適したＤＮＡ配列および適したプロモーターまたは制御配列を含むベクターは、タンパク質の発現のために適した宿主細胞を形質転換するために使用できる。
【００９０】
宿主細胞は、原核細胞（細菌細胞等）または下等真核細胞（酵母細胞等）または高等真核細胞（植物細胞等）でもよい。例としては、大腸菌、ストレプトマイセス、アグロバクテリウム、真菌細胞（酵母等）および植物細胞等が挙げられる。
【００９１】
高等真核細胞において本発明のポリヌクレオチドを発現させる場合、エンハンサー配列がベクター内に挿入された際に、転写を促進させてもよい。エンハンサーはＤＮＡのシス作用性因子でもよく、これは約１０〜３００ｂｐを含む可能性があり、プロモーターに作用して遺伝子の転写を促進できる。
【００９２】
当業者ならば、ベクター、プロモーター、エンハンサーおよび宿主細胞の選択方法を理解するはずである。組換えＤＮＡによる宿主細胞の形質転換は、当業者に周知の従来の技術を使用して行うことができる。宿主細胞が原核細胞（大腸菌等）である場合、ＤＮＡを取り込むことができるコンピテントな細胞は、指数関数的な生育期後に回収することができ、次いで、当該技術分野において十分に記述されたＣａＣｌ２法によって処理される。別の方法は、ＭｇＣｌ２を使用することである。所望であれば、形質転換は電気穿孔を使用して行うことができる。宿主細胞が真核生物由来である場合、下記のＤＮＡトランスフェクト方法のうちの１以上を使用してもよい：リン酸カルシウム沈殿、従来の機械的方法（マイクロインジェクション等）、電気穿孔、リポソームパッキング等。植物の形質転換はまた、アグロバクテリウムまたは遺伝子銃形質転換等（リーフディスク形質転換、イネ未熟胚形質転換等）を使用して実現してもよい。形質転換された植物細胞、組織または器官は、従来の方法によって植物に再生でき、変化した特性を有する植物を得ることができる。
【００９３】
形質転換体は従来の方法で培養して、本発明の遺伝子によってコードされるポリペプチドを発現させることができる。使用される宿主細胞に応じて、培養のために使用される培地は、様々な従来の培地から選択してもよい。培養は、宿主細胞の生育に適した条件下で行われる。宿主細胞が適した密度に生育したら、選択されたプロモーターを適した方法（温度変化または化学誘導等）によって導入でき、その後に細胞をさらに一定期間さらに培養してもよい。
【００９４】
上記の方法において、組換えポリペプチドは、細胞中もしくは細胞膜上に発現させるかまたは、細胞外に分泌させることができる。所望であれば、組換えタンパク質は、様々な単離方法により、タンパク質の物理的特性、化学的特性または他の特性を利用することによって、単離および精製され得る。これらの方法は当該技術分野で周知である。例としては、従来の再現処理、タンパク質沈殿剤による処理（塩析等）、遠心分離、（細菌の破壊ための）浸透、超処理、超遠心、分子ふるいクロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー（高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等）等、およびその組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９５】
組換えＢｃｃＪＡＺ５ａは多くの用途において使用できる。例えば、抗体、ポリペプチドまたは、ＢｃｃＪＡＺ５ａタンパク質の機能に作動的または拮抗的な他のリガンドのスクリーニングに使用できる。発現された組換えＢｃｃＪＡＺ５ａタンパク質によるポリペプチドライブラリーのスクリーニングは、ＢｃｃＪＡＺ５ａタンパク質の機能を阻害または促進できる有用なポリペプチド分子の探索に役立つ。
【００９６】
本発明の全ポリヌクレオチドまたはその部分はプローブとして使用でき、これは遺伝子発現差異解析を行うために、マイクロアレイまたはＤＮＡチップ（「遺伝子チップ」とも呼ばれる）上に固定され得る。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの増幅のためのＲＮＡ逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を行うための、ＢｃｃＪＡＺ５ａタンパク質に特異的なプライマーもＢｃｃＪＡＺ５ａタンパク質の転写産物を検出するために使用できる。
【００９７】
本発明はまた、（植物の熱抵抗性を改善するために）植物を改変するための方法に関し、植物におけるＢｃｃＪＡＺ５ａ遺伝子の発現および／またはコードされたタンパク質の活性を促進する工程を含む。
【００９８】
ＢｃｃＪＡＺ５ａ遺伝子の発現を促進させるための方法は、当該技術分野で周知である。例えば、植物は、ＢｃｃＪＡＺ５ａコード遺伝子を有する発現構築物で形質転換し、ＢｃｃＪＡＺ５ａ遺伝子を過剰発現させることができる。プロモーターをＢｃｃＪＡＺ５ａ遺伝子の発現を促進させるために使用できる。エンハンサー（イネ  ｗａｘｙ遺伝子の第１のイントロンまたはアクチン遺伝子の第１のイントロン等）を、ＢｃｃＪＡＺ５ａ遺伝子の発現を促進させるために使用できる。プロモーターとしては、３５Ｓプロモーター、およびイネおよびトウモロコシにおけるＵｂｉプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９９】
本発明の１つの実施態様では、ＢｃｃＪＡＺ５ａタンパク質の発現が促進された植物を得るための方法は下記の工程を含む：
（１）発現ベクターを含むアグロバクテリウム株を準備する工程であって、当該発現ベクターはＢｃｃＪＡＺ５ａタンパク質のＤＮＡコード配列を含む工程、
（２）植物細胞、組織または器官と、工程（１）のアグロバクテリウムとを接触させ、ＢｃｃＪＡＺ５ａタンパク質のＤＮＡコード配列を植物細胞に形質転換し、染色体に組み込む工程、
（３）ＢｃｃＪＡＺ５ａタンパク質のＤＮＡコード配列で形質転換された植物細胞または組織を選択する工程、
（４）工程（３）の植物細胞または組織を植物に再生する工程。
【０１００】
全ての適した従来の方法（試薬、温度および圧力の制御等）を、この工程において使用できる。
【０１０１】
本発明には、ＢｃｃＪＡＺ５ａタンパク質またはそのコード遺伝子への作動薬もまた含まれる。ＢｃｃＪＡＺ５ａタンパク質の作動薬は、ＢｃｃＪＡＺ５ａタンパク質の活性または発現を制御できるため、上記作動薬は、ＢｃｃＪＡＺ５ａタンパク質に影響し、その特性を改善することで、植物の熱抵抗性を促進することもできる。
【０１０２】
ＢｃｃＪＡＺ５ａタンパク質の作動薬とは、ＢｃｃＪＡＺ５ａの活性を促進でき、ＢｃｃＪＡＺ５ａの安定性を維持でき、ＢｃｃＪＡＺ５ａの発現を促進でき、ＢｃｃＪＡＺ５ａの効果持続期間を延長でき、または、ＢｃｃＪＡＺ５ａの転写および翻訳を促進できる全ての物質を指す。これらの物質は、本発明において、植物の熱抵抗性を促進させるための薬剤として使用できる。
【０１０３】
本発明の実施形態では、ＢｃｃＪＡＺ５ａ遺伝子が提供され、そのゲノム配列は配列番号１に記載され、そのＣＤＳ配列は配列番号２に示される。上記遺伝子は、２７０のアミノ酸を含むタンパク質をコードする（配列番号４）。上記ＢｃｃＪＡＺ５ａ遺伝子は、植物の耐性の修飾ための新規な経路を提供する。
【０１０４】
本発明について、下記の実施例と組み合わせてさらに説明する。これらの実施例は、本発明を説明するためのものであるが、本発明の範囲を多少なりとも制限するものとは理解されないことが理解されるはずである。実験方法については、下記の実施例に特定の条件が記載されていない場合、従来の条件（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ：  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ２００２）に記載された条件）または製造者によって推奨される条件に従って行った。特に示さない限り、割合および部は、質量に基づいて算出した。特に示さない限り、本願明細書で使用される全ての科学用語は、当業者に知られたものと同一の意味を有する。さらに、開示された内容と等価な全ての方法および材料を本発明において使用できる。本願明細書に開示された好ましい実施方法および材料は、説明目的のためだけのものである。
【実施例】
【０１０５】
Ｉ．材料および方法
（材料）
熱抵抗性タイナ種（Ｂｃｃ）のＨＲ種子、温度感受性のタイナ種（Ｂｃｃ）のＨＳ種子、ハクサイ種（Ｂｃｐ）９９Ｂｒｅの種子およびハクサイ種のＣＨＩＦＵ変種の種子を、Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｓｅｅｄ，ＬＬＣ．から入手した。Ｃｏｌは、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓから入手したシロイヌナズナの野生型である。
【０１０６】
（植物組織からの全ＲＮＡ抽出）
試薬：ＴａＫａＲａ  ＲＮＡｉｓｏ  Ｒｅａｇｅｎｔの抽出キット。
工程：
ａ）液体窒素中で材料をよく粉砕し、抽出バッファー１ｍｌあたり１００ｍｇの材料となるように試料中に抽出バッファーを加え、均一に撹拌し、次いで室温で１０分間静置した。
ｂ）１３０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を新しい遠心管に移し、２００μｌのクロロホルムを加え、均一に撹拌し、次いで室温で１０分間静置し、相分離させた。
ｃ）１３０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を新しい遠心管に注意深くピペットで移した。
ｄ）等量のイソプロパノールを加え、よく混合した後に室温で１０分間静置した。
ｅ）１３０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を捨て、１ｍｌの７５％（ｖ／ｖ）エタノールで１度洗浄した。
ｆ）７８００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を捨て、および低速度で再度遠心した。残りの液をチップで移した。室温で風乾した。ＲＮＡが乾き始めたら適量のＲＮａｓｅフリーの水を加えた。６５℃で１０分間、完全に溶解させた。次いで、−７０℃で保存した。
【０１０７】
（半定量的ＲＴ−ＰＣＲ）
ＲＴ−ＰＣＴにおいて使用したプライマーは下記の通りである。
【０１０８】
【表２】
0005924782.tif 000003
【０１０９】
試薬：
ＡＭＶ逆転写酵素（ＴＡＫＡＲＡ）
ＲＮａｓｅ阻害剤（ＴＡＫＡＲＡ）
ＤＮａｓｅ  Ｉ（ＲＮａｓｅフリー）（ＴＡＫＡＲＡ）
【０１１０】
工程：
ａ）異なる熱処理の後に、タイナ種の葉から全ＲＮＡをそれぞれ抽出した。ＤＮＡｓｅ  Ｉ（ＲＮａｓｅフリー）で３０分間処理し、次いで、フェノール−クロロホルムによって抽出した。沈殿させ、風乾し、ＲＮａｓｅフリーの水中に溶解させた。
ｂ）ＯＤ２６０値を測定し、電気泳動によって定量し、１μｇの全ＲＮＡを採取し、標準的な方法に従って４２℃で１時間および９４℃で５分間反応させ、逆転写酵素を不活性化させた。
ｃ）逆転写物を２倍量に溶出させ、それぞれ１μｌを採取し、ＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応条件は下記の通りである：９４℃、３秒間；９４℃、３０秒間、５５℃、３０秒間、７２℃、３０秒間、２５〜２８サイクル；７２℃、５分間。ＲＴ−ＰＣＲにおける鋳型量のキャリブレーションのために、平行して行ったＰＣＲ反応における内部標準として、ユビキチンのプライマー（ＢｃｃＵＢＱ５）およびアクチンを使用した。
【０１１１】
（ＣＴＡＢ法による全植物ＤＮＡの抽出）
試薬：
２×ＣＴＡＢ  バッファー（１００ｍｌ）：１０ｍｌ  １Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０；４ｍｌ  ０．５Ｍ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０；８．１９ｇ  ＮａＣｌ；２ｇ  ＣＴＡＢ；１ｇ  ＰＶＰ  Ｋ３０；１００ｍｌにメスアップした。
１×ＣＴＡＢ  バッファー（１００ｍｌ）：５ｍｌ  １Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０；２ｍｌ  ０．５Ｍ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０；１ｇ  ＣＴＡＢ；１００ｍｌにメスアップした。
高塩濃度のＴＥ（１００ｍｌ）：１ｍｌ  １Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０；２００μｌ  ０．５Ｍ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０；５．８４４ｇ  ＮａＣｌ；１００ｍｌにメスアップした。
１０％（ｗ／ｖ）ＣＴＡＢ（５０ｍｌ）：５ｇ  ＣＴＡＢ；２．０４５ｇ  ＮａＣｌ；１００ｍｌにメスアップした。
【０１１２】
工程：
ａ）液体窒素中で５ｇの植物材料を粉砕し、粉末にした。次いで、４０ｍｌの遠心管に移した。
ｂ）当該遠心管に、６５℃で予め加熱された１５ｍｌ  ２×ＣＴＡＢバッファー（１：１）を加え、よく混合した後に、６５℃で１０分間インキュベーションした。インキュベーションの間、数回転倒混合した。
ｃ）１倍量のクロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）を加え、均一に混合した後に、１１０００ｒｐｍで５分間遠心した。
ｄ）上清を新しい遠心管へピペットで移し、１／１０量の１０％ＣＴＡＢを加え、次いで１倍量のクロロホルム：イソアミルアルコールを加え、均一に混合した後に５分間遠心した。
ｅ）上清を移し、工程ｄ）を２〜３回繰り返し、次いで、上清を新しい遠心管に移し、２倍量超の沈殿バッファー（１×ＣＴＡＢ）を加え、穏やかに撹拌し、均一な溶液を生成し、室温で３０分間静置した。
ｆ）遠心し、沈殿物を回収し、５ｍｌの高塩濃度のＴＥ（少量のＲＮａｓｅが任意に添加されていてもよい）中に６５℃で沈殿物を再懸濁し、３７℃で、３０分間インキュベーションした。
ｇ）１１０００ｒｐｍで１０分間遠心し、次いで、上清を新しい１．５ｍｌ遠心管に移した。
ｈ）当該遠心管に２倍量の無水エタノールを加え、均一に撹拌した後に、−２０℃で３０分間静置した。遠心し、上清を捨て、７０％エタノールで洗浄し、次いで風乾し、１００μｌ  ＴＥ中に溶解させた。
【０１１３】
（ベクター（３５Ｓ：：ＢｃｃＪＡＺ５ａゲノムＤＮＡ）の構築）
ゲノムＤＮＡからＢｃｃＪＡＺ５ａＤＮＡを増幅するために使用したプライマーは下記の通りである。
【０１１４】
【表３】
0005924782.tif 000004
【０１１５】
工程：
ａ）タイナ種の全ゲノムＤＮＡから、ＰＣＲによってＢｃｃＪＡＺ５ａのゲノム断片を単離した。
ｂ）当該断片をＫｐｎ  Ｉで切断し、その断片を、ｐＣＡＭＢＩＡ１３００  ベクター（ｐＣＡＭＢＩＡ１３００開始ベクターはＣＡＭＢＩＡ社から得た）にクローニングした（そのＰＣＲ産物は３５ＳとＮｏｓとの間につなげた）。この断片は１つの酵素によって切断されたため、２方向（フォワードおよびリバース）へのライゲーションがあり得る。従って、検証のために配列決定を行った。
ｃ）フォワード方向の遺伝子を含むｐＣＡＭＢＩＡ１３００−ＤＲＥ８２Ａのベクターを、アグロバクテリウム  ＧＶ３１０１株（インビトロジェン）に、凍結融解による形質転換によって形質転換し、ＰＣＲによって確認した。
【０１１６】
（コンピテントなアグロバクテリウム細胞の調製および凍結融解法による形質転換）
ａ）単一のＧＶ３１０１クローンを未使用のプレートから採取し、２８℃で、４８時間培養し、２０ｍｌ  ＬＢ液体培地（ｒｉｆ  ５０ｍｇ／ｌ、ＧＭ  ５０  ５０ｍｇ／ｌ）に移し、次いで、２５０ｒｐｍで振とうしながら一晩２８℃で培養した（濃度が高くなり過ぎないようにした）。（下記の全ての操作は無菌条件で行った）。
ｂ）工程ａ）の菌株溶液を氷浴に２０分間置いた。次いで、遠心管中へ一定分量に分注した（遠心管あたり４ｍｌ）。遠心管を氷浴に１０分間置いた。
ｃ）遠心管を４０００ｒｐｍ（５〜１０℃）で１０分間遠心し、上清を捨てた。
ｄ）２０ｍＭの予め冷やしたＣａＣｌ２を各遠心管に入れ、菌株ペレットを再懸濁した。遠心管を氷浴に１０分間置いた。
ｅ）遠心管を４０００ｒｐｍ（５〜１０℃）で１０分間遠心し、上清を捨てた。
ｆ）３００μｌの２０ｍＭ  ＣａＣｌ２（株の濃度に依存する）を各遠心管に入れた。遠心管中の溶液を１．５ｍｌの遠心管に注いだ。
ｇ）１μｌのプラスミドまたは全ての連結された産物を遠心管に加え、遠心管を氷浴に５分間置いた。その後、遠心管を液体窒素中に４〜５分間置いた。
ｈ）遠心管を３７℃で５分間静置した。次いで、４００μｌのＬＢ培地を各遠心管に入れた。遠心管を２８℃で、２時間インキュベーションしてバクテリアを回復させ、適切な抗生物質耐性遺伝子を発現させた。
ｉ）２００μｌの溶液を各遠心管から採取し、播種し、プレートを室温で順化のために維持した。次いで２８℃で培養した。
【０１１７】
（ｆｌｏｒａｌ−ｄｉｐ法およびスクリーニングによるシロイヌナズナの形質転換）
試薬：
形質転換バッファー（１Ｌ）：主要成分（５０×）：１０ｍｌ；微量成分（１０００×）：０．５ｍｌ；ＣａＣｌ２（１００×）：５ｍｌ；鉄塩（２００×）：２．５ｍｌ；有機物（１００×）：１０ｍｌ；ショ糖：５０ｇ；６−ＢＡ（１ｍｇ／ｍｌ）：１０μｌ；Ｓｉｌｗｅｔ  Ｌ−７７：４００μｌ（真空濾過において使用した場合は２００μｌ）；ＫＯＨを使用してｐＨ５．８に調整した。１Ｌにメスアップした。
【０１１８】
スクリーニングのための培養プレート：３％（ｗ／ｖ）ショ糖ＭＳ０固形培地（ｐＨ５．８）、カナマイシン（Ｋａｎ）を加え、濃度を５０ｍｇ／ｌにした（シロイヌナズナにおけるＮｏｓｓｅｎ  バックグラウンドスクリーニングのため）。
【０１１９】
工程：
ａ）シロイヌナズナの茎が、抽苔後、高さ５ｃｍに達した際に、形質転換を行った。結実率が低い植物については、形質転換を摘花４日間後に行った。
ｂ）形質転換の前に、受粉された花および短角果を除去し、土壌一晩吸水させた。
ｃ）一晩培養されたアグロバクテリウムを、培地中に１：１００の割合で大きなフラスコ中で希釈した。２８℃で、２４時間培養した後、培地を５０００ｒｐｍ、４℃で遠心した。上清を捨てた。アグロバクテリウムのペレットを、菌株ストック溶液の２倍量の形質転換バッファー中で再懸濁し、約０．８のＯＤ６００を与えた。
ｄ）シロイヌナズナの地上部を菌株溶液中に３０秒間完全に浸漬させ、次いで取り出し、保存フィルムおよび新聞紙で包み、一晩暗所に静置した。翌日、植物部分を通常の継代培養のために人工気象室に移した。種子を回収し２週間乾燥させた。
ｅ）滅菌後、種子を５０ｍｇ／ｌ  Ｋａｎを含むＭＳ０固形プレートに広げた。４℃で２日間の春化後、プレートを組織培養庫内に移した。Ｋａｎ抵抗性を有する実生を選択し、土壌中に移して生育させた。
ｆ）ゲノムＤＮＡを葉から抽出した。ＰＣＲ同定後、陽性の実生を得た。純粋な遺伝子導入系統を、さらなる２回の継代によって得て、これをさらなる分析に使用した。
【０１２０】
（真空濾過によるキャベツ類の形質転換およびスクリーニング）
（１）ハクサイの形質転換
ａ）ハクサイの種子を水で湿らせた濾紙の上に置き、４℃で、２ヶ月間春化させた（ハクサイ種植物は、春化にさらされると、若い実生期の間に抽苔し、開花する。これにより、形質転換を促進できる）。次いで、胚軸が伸張したハクサイの実生を土壌に移した。抽苔および第１の開花の時点で、形質転換を行うことができた。形質転換の前に、土壌を一晩灌注した。
ｂ）シロイヌナズナを形質転換するための方法に従って、アグロバクテリウムを含む形質転換溶液を調製した。
ｃ）ハクサイ種の地上部分を菌株溶液に完全に浸漬させ、ひっくり返した。次いで、上記部分を真空ポンプを有する乾燥機内に静置した。乾燥機を５分間、２回（２分間の間隔を空けた）、葉が透明になるまで減圧した。乾燥機を通気させ、植物を取り出し、水平に静置し、保存フィルムおよび新聞紙で覆い、一晩暗所に静置した。翌日、植物を移し、大きなツボに植え、従来の方法で栽培した。開花期の間、受粉を芽に対して手作業で行い、次いで、各芽を袋に入れた。種子を回収後、２週間乾燥させた。
ｄ）滅菌された種子を無菌濾紙の上で乾燥させた。次いで、当該種子をＫａｎ  ５０ｍｇ／ｌを含む培地を含む三角フラスコに移した。春化を４℃で、２〜３日間行った。次いで、フラスコをインキュベーションのために恒温室に移した。
ｅ）ハクサイ種の形質転換体を本葉（ｅｕｐｈｙｌｌａ）が発育した後に特定した。当該形質転換体は緑色の本葉および正常に発育した根を有する。一方、非形質転換体は白い本葉を有し、根を有さない。本葉の３〜４葉が形質転換体から発育した後、当該形質転換体を、３日間の順化後に土壌中に移した。
【０１２１】
（２）タイナ種の形質転換
同様に、タイナ種を真空濾過によって形質転換した。形質転換の方法および条件は、ハクサイ種において使用したものと同一である。
【０１２２】
ＩＩ．実施例
（実施例１：目的遺伝子の取得）
植物中の遺伝子発現、特に機能的な遺伝子の発現は、時間的にかつ／または空間的に特異である。本発明者は、異なる熱処理にさらされた試料から抽出したｍＲＮＡを、タイナ種における機能的な遺伝子の全てを表すチップとハイブリダイズすることによって、異なる熱処理条件下でのタイナ種の試料中の機能的な遺伝子の発現を検出した。遺伝子発現を検出するための従来の方法は、大規模な配列決定を要求し、これは、１回で少数の遺伝子発現を低い検出感度でしか検出できなかった。遺伝子チップ技術を使用することにより、定量的にかつ定性的に、遺伝子発現レベルを高感度で特定できるだけではなく、１試料中の数千の遺伝子の発現を同時に検討することもできる。遺伝子チップ技術によれば、スクリーニング時間を短縮できるだけではなく、より安定かつ、より特定された結果を得ることもできる。遺伝子チップ技術は、その高い適応性および有用な価値によって推奨される。
【０１２３】
さらに、ＡＦＬＰ（増幅断片長多型）は、制限断片を選択的に増幅するために近年開発された分子マーカーである。この方法は、様々な分野（野菜の遺伝子マッピング、遺伝的多様性および関連性についての分析、重要な遺伝子の位置、遺伝子発現の調節についての研究、野菜における遺伝子指紋法および系統の純度の同定、ならびに分子マーカー支援選択等）で広く使用されている。
【０１２４】
タイナ種を夏および秋に植えることへのニーズを満たすために、本発明者は、遺伝子チップ技術とｃＤＮＡ−ＡＦＬＰ技術とを組み合わせて使用し、キャベツ類における熱抵抗性遺伝子についてスクリーニングを行い、キャベツ類における熱抵抗性遺伝子を得た。本発明者は、上記遺伝子を発現する遺伝子導入株も開発した。
【０１２５】
本発明において得られる遺伝子「ＢｃｃＪＡＺ５」は、２つの複製物を有し、その複製物はそれぞれＢｃｃＪＡＺ５ａ（複製物ａ）およびＢｃｃＪＡＺ５ｂ（複製物ｂ）である。ＢｃｃＪＡＺ５ａのゲノム配列は配列番号１に示され、そのＣＤＳ配列は配列番号２に示される。これは、２７０ａａ（配列番号４）を有するタンパク質「ＢｃｃＪＡＺ５ａ」をコードする。ＢｃｃＪＡＺ５ｂのゲノム配列は配列番号３に示される。
【０１２６】
（実施例２：熱処理後のＲＴ−ＰＣＲによる候補熱抵抗性遺伝子の発現の検出）
ｃＤＮＡ−ＡＦＬＰデータにおいて、ジャスモン酸シグナル経路は熱処理後に変化した。本発明者は、この経路における２つの遺伝子について検討した。ＢｃｃＬＯＸ３はジャスモン酸生合成酵素であり、ＢｃｃＪＡＺ５は、ユビキチン修飾によって制御される負の相関を有するシグナルタンパク質である。熱感受性変種において、これらの２つの遺伝子は、熱処理によって誘導されると強く発現した。図１を参照。
【０１２７】
本発明のｃＤＮＡ−ＡＦＬＰは、複製物ｂの発現が有意に変化したことを示す。ハクサイ種のＣＨＩＦＵ変種の複製物ａと複製物ｂとの間のＤＮＡ配列の相同性は、７５．８％である。しかし、熱抵抗性および熱感受性の変種における対応する複製物の相同性は、９８％超だった。配列アラインメントの結果を表２および３に示す。
【０１２８】
【表４】
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【０１２９】
【表５】
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【０１３０】
本発明者は、熱処理条件下で、ＢｃｃＪＡＺ５ｂおよびＢＣＣＬＯＸ３の両方の発現が上方制御され、かつ、この上方制御が熱感受性変種においてより顕著であることを、ＲＴ−ＰＣＲによってさらに示した。図２を参照。
【０１３１】
（実施例３：熱抵抗性遺伝子を有する遺伝子導入植物の表現型）
熱抵抗性遺伝子の機能を特定するため、本発明者は、３５Ｓプロモーターを含む植物発現ベクター３５Ｓ：：ＢｃｃＪＡＺ５ａを構築した。このベクターを、シロイヌナズナを形質転換するために使用した。シロイヌナズナのＴ２世代植物の遺伝子発現および熱抵抗性を検出した。
【０１３２】
本発明者は、外在性のＢｃｃＪＡＺ５ａおよび内在性のＡｔＪＡＺ５ａを、ＲＴ−ＰＣＲによって検出した。図３中の３つの遺伝子導入系統３５Ｓ：：ＢｃｃＪＡＺ５ａを参照。全ての遺伝子導入植物におけるＢｃｃＪＡＺ５ａの発現は上方制御された。しかし、これらは、野生型植物と比較して、より強い熱抵抗性を示さなかった。一方、２番（２＃）の遺伝子導入系統は、最も悪い生存率を示した。本発明者は、２番目の遺伝子導入系統におけるＡｔＪＡＺ５ａの発現が阻害されていることを見出した。このことは、熱への低い耐性をもたらし得る。次いで、２＃は、明白な生育不良を示した。本発明者は、抽苔期における遺伝子導入植物３５Ｓ：：ＢｃｃＪＡＺ５ａのＴ４世代の表現型をさらに検討した。全ての３つの遺伝子導入系統は、野生型植物と比較して、改善された熱抵抗性を示した。この結果は、実生段階における植物で得られたものと逆だった。従って、ＢｃｃＪＡＺ５ａは、抽苔期における熱抵抗性機能を奏し得る。これは、例えば、実生段階および抽苔期における熱ストレスへの反応機構が異なるからである。図４を参照。
【０１３３】
（実施例４：熱処理後の遺伝子導入ハクサイ種およびタイナ種の植物の表現型）
本発明者は、熱処理後の遺伝子導入ハクサイ種およびタイナ種の植物の表現型を検証するために熱処理系を使用した。当該遺伝子導入植物の種子について、出芽を促進し、低温下で春化にさらし、次いでプラスチック製培養器に植えた。実生を２５℃で培養した。抽苔が開始したら、着実な生育状態を有する実生を選択し、昇温での熱処理のために培養箱に静置した。温度は３２℃に維持し、この処理を１０日間続けた。次いで、温度を２日間、２５℃に切り替えた。熱障害の指標を算出し、かつ分析した。熱障害の代表的な症候（葉のしわおよびゆがみ、葉の白化、生育遅延、植物のしおれおよび枯れ等）を特定し、かつスコア化した。
葉のしわおよびゆがみ：軽度、Ａ；中程度、Ａ＋；重度、Ａ＋＋
葉の白化：軽度、Ｂ；中程度、Ｂ＋；重度、Ｂ＋＋
生育遅延：軽度、Ｃ；中程度、Ｃ＋；重度、Ｃ＋＋
しおれおよび枯れ：軽度、Ｄ；中程度、Ｄ＋；重度、Ｄ＋＋
【０１３４】
実験結果は、ハクサイ種植物の遺伝子導入植物における熱障害の症候は、全て軽度であるとスコアされたことを示す（ＡＢＣＤとして表される）。対照植物（野生型ハクサイ種、Ｂ−ｈｏｔ  キャベツ）における熱障害の症候は、全て重度としてスコアされた（Ａ＋＋Ｂ＋＋Ｃ＋＋Ｄ＋＋として表される）。
【０１３５】
実験結果は、タイナ種植物の遺伝子導入植物における熱障害の症候は、全て軽度であるとスコアされたことを示す（ＡＢＣＤとして表される）。対照植物（野生型タイナ種、熱感受性タイナ種  ＨＳ）における熱障害の症候は、全て重度としてスコアされた（Ａ＋＋Ｂ＋＋Ｃ＋＋Ｄ＋＋として表される）。
【０１３６】
ハクサイ種およびタイナ種の遺伝子導入植物は、抽苔期において、野生型植物と比較して、熱ストレスに対する耐性がよりずっと高いことが理解できる。
【０１３７】
（実施例５：ＪＡＺ５ａタンパク質中のドメイン、その変異体および機能についての検討）
本発明者は、ＢｃｃＪＡＺ５ａタンパク質（配列番号４）中のドメインを、図５に示す通り特定した。当該結果は、位置１０１−１３０がｔｉｆｙドメインを構成し、かつ、１８４−２０９の分節がＣＣＴ＿２モチーフであることを示した。これらのドメインは、タンパク質の熱抵抗性機能にとって重要な活性部位である。
【０１３８】
上記の分析に基づき、本発明者は、ＢｃｃＪＡＺ５ａタンパク質のいくつかの変異体を下記の通り構築した。
ＢｃｃＪＡＺ５ａタンパク質（配列番号４）の配列において、アミノ酸９をＡからＶに改変し、ＢｃｃＪＡＺ５ａ−１変異体を得た。
ＢｃｃＪＡＺ５ａタンパク質（配列番号４）の配列において、アミノ酸２５３をＬからＩに改変し、ＢｃｃＪＡＺ５ａ−Ｍ２変異体を得た。
ＢｃｃＪＡＺ５ａタンパク質（配列番号４）の配列において、アミノ酸１４７をＶからＡに改変し、ＢｃｃＪＡＺ５ａ−Ｍ３変異体を得て、アミノ酸２３０をＬからＩに改変した。
ＢｃｃＪＡＺ５ａタンパク質（配列番号４）の配列において、アミノ酸２６６−２７０を欠損させ、ＢｃｃＪＡＺ５ａ−Ｍ４変異体を得た。
ＢｃｃＪＡＺ５ａタンパク質（配列番号４）の配列において、アミノ酸１５９−１６１を欠損させ、ＢｃｃＪＡＺ５ａ−Ｍ５変異体を得た。
ＢｃｃＪＡＺ５ａタンパク質（配列番号４）の配列において、４つのアミノ酸（ＡＴＡＡ）をＣ末端に付加し、ＢｃｃＪＡＺ５ａ−Ｍ６変異体を得た。
【０１３９】
配列番号２に示されるＢｃｃＪＡＺ５ａ遺伝子のＣＤＳ配列を、まずｐＣＡＢＩＡ１３００ベクター中に、Ｋｐｎ  Ｉ部位でクローン化し、上記ＣＤＳを含む組換えベクターを得た。次いで、部位特異的な変異誘発を行い、対応する置換、欠損および付加を導入し、それぞれ上記変異体を含む組換えベクターを得た。
【０１４０】
上記のように構築された組換えベクターでアグロバクテリウム株を形質転換した。次いで、当該アグロバクテリウム株を、シロイヌナズナを形質転換させるために使用し、下記の遺伝子導入シロイヌナズナ植物を得た：Ｍ１−Ｌｉｎｅ１、Ｍ１−Ｌｉｎｅ２；Ｍ２−Ｌｉｎｅ１、Ｍ２−Ｌｉｎｅ２；Ｍ３−Ｌｉｎｅｌ、Ｍ３−Ｌｉｎｅ２；Ｍ４−Ｌｉｎｅ１、Ｍ４−Ｌｉｎｅ２；Ｍ５−Ｌｉｎｅ１、Ｍ５−Ｌｉｎｅ２；Ｍ６−Ｌｉｎｅ１、Ｍ６−Ｌｉｎｅ２。
【０１４１】
熱処理系をこれらの遺伝子導入シロイヌナズナ植物の表現型を検証するために使用した。当該植物を２２℃で、抽苔まで生育させた。次いで、当該植物を、４５℃で、３時間熱処理にさらし、次いで、２２℃に５日間切り替えた後に、写真を撮影した。各系統について、２回の実験を繰り返して行った。遺伝子導入植物は、野生型植物と比較して、熱ストレスに耐性があった。
【０１４２】
要約すると、キャベツ類およびその変異体のＢｃｃＪＡＺ５ａは、抽苔期における植物の熱抵抗性を改善するために使用できる有効な熱抵抗性遺伝子である。
【０１４３】
本発明に引用された全ての参考文献は、それらのうちそれぞれ１つが各々引用される際に、参照によって本願明細書に援用される。さらに、様々な改変および／または変更は、本発明の教示を考慮し、明細書および請求項によって定義される範囲内であることが当業者に明らかであることが理解される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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