(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
二本鎖核酸の切断方法であって、下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）からなる群より選択された少なくとも一種のポリペプチドをミスマッチ塩基対を有する二本鎖核酸に作用させ、当該二本鎖核酸の両鎖をミスマッチ塩基対部位で切断することを特徴とする、方法：
（ｉ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（ｉｉ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されてなるアミノ酸配列を有し、かつミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド；及び
（ｉｉｉ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド。
【請求項２】
ミスマッチ塩基対が、二本鎖核酸上、通常の塩基対合を行う２個の塩基対の間に存在する、連続して１以上８以下のミスマッチ塩基対である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
下記（ａ）〜（ｃ）を含む組成物：
（ａ）ＤＮＡポリメラーゼ；
（ｂ）少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー；及び
（ｃ）下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）からなる群より選択された少なくとも一種のポリペプチド：
（ｉ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（ｉｉ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されてなるアミノ酸配列を有し、かつミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド；及び
（ｉｉｉ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド。
【請求項４】
エラー率の低減した核酸増幅方法であって、下記（ａ）〜（ｂ）の工程を含む方法：
（ａ）請求項３に記載の組成物と鋳型になる核酸分子を含む組成物を調製する工程；及び
（ｂ）工程（ａ）により得られた組成物を適切な条件下で反応させ、核酸増幅を行う工程。
【請求項５】
核酸増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法、等温核酸増幅法、又はＭＤＡ（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法で実施される請求項４に記載の方法。
【請求項６】
下記（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選択されるポリペプチド：
（Ａ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において、７７番目のトリプトファンが他のアミノ酸残基に置換されてなるアミノ酸配列を有し、かつミスマッチエンドヌクレアーゼ活性するポリペプチド；
（Ｂ）前記（Ａ）のポリペプチドのアミノ酸配列において、７７番目のアミノ酸残基を除く１〜１０個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されてなるアミノ酸配列を有し、かつミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド；及び
（Ｃ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列において、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列における７７番目のトリプトファンに対応するアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されてなるアミノ酸配列を有し、かつミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド。
【請求項７】
下記（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選択される、請求項６記載のポリペプチド：
（Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド； 
（Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において、７７番目のフェニルアラニンを除く１〜１０個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されてなるアミノ酸配列を有し、かつミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド；及び
（Ｃ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列において、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列における７７番目のトリプトファンに対応するアミノ酸残基がフェニルアラニンに置換されてなるアミノ酸配列を有し、かつミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド。
【請求項８】
核酸増幅反応において特定の塩基配列を有する核酸の増幅を抑制する方法であって、下記の（ａ）〜（ｄ）の存在下で核酸増幅反応を行う工程を含む方法：
（ａ）前記特定の塩基配列を有する核酸またはその相補鎖とハイブリダイズさせた際に１個もしくは数個のミスマッチを生じるように設計されたオリゴデオキシヌクレオチド；
（ｂ）ＤＮＡポリメラーゼ；
（ｃ）少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー；及び
（ｄ）ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド、ここで、該ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドは、下記（ｉ）〜（ｖｉ）からなる群より選択された少なくとも一種のポリペプチドである：
（ｉ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（ｉｉ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されてなるアミノ酸配列を有し、かつミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド； 
（ｉｉｉ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド；
（ｉｖ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド； 
（ｖ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において、７７番目のフェニルアラニンを除く１〜１０個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されてなるアミノ酸配列を有し、かつミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド；及び
（ｖｉ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列において、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列における７７番目のトリプトファンに対応するアミノ酸残基がフェニルアラニンに置換されてなるアミノ酸配列を有し、かつミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド、
ここで、当該工程は、前記ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドが、前記オリゴデオキシヌクレオチドとのハイブリダイズにより生じるミスマッチ塩基対を有する二本鎖核酸に作用して、当該二本鎖核酸の両鎖をミスマッチ塩基対部位で切断する反応を含む。
【請求項９】
核酸増幅反応がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法、又は等温核酸増幅法である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
標的ＤＮＡを優先的に増幅する方法であって、当該標的ＤＮＡと１個もしくは数個の塩基が異なる塩基配列のＤＮＡの増幅を請求項８記載の方法で抑制することを特徴とする方法。
【請求項１１】
野生型塩基配列のＤＮＡと、当該ＤＮＡに一塩基多型変異が生じたＤＮＡとを区別して増幅する目的に使用される請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
一塩基多型変異が、癌化、又は癌治療用薬剤による治療効果と相関する一塩基多型変異である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＤＮＡ増幅反応がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、又は等温核酸増幅法で実施される請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、二本鎖核酸中のミスマッチ塩基対を認識して切断する耐熱性のミスマッチエンドヌクレアーゼ、当該ミスマッチエンドヌクレアーゼを含む組成物、及びミスマッチエンドヌクレアーゼを用いた方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の生物工学技術の発展は著しく、特にゲノム解析法の進歩に伴った大規模ゲノム解析の結果、膨大なゲノム配列情報が蓄積されてきている。さらに前記情報と各種の生理機能解析と合わせることで、機能的な遺伝子変異が数多く見出されてきた。これらの変異解析は、農作物の改良や有用微生物の分離、作製ばかりではなく、人の遺伝子診断などにも利用されるようになってきており、一般生活上にも大きな恩恵を与えている。【０００３】
これらの変異の解析法としては、ゲノム配列を直接解析する他に、ミスマッチ塩基対を認識する酵素群を利用する方法が行われてきた。変異型と野生型のＤＮＡを対合させて形成されたミスマッチ塩基対に対して、特異的結合能力のある因子を結合させて検出する解析方法がその一つであり、代表的な例としては大腸菌のＭｕｔＳ、ＭｕｔＴ、ＭｕｔＬ複合体を利用した変異部位の検索が挙げられる（特許文献１）。【０００４】
また、ミスマッチ部位を特異的に切断するミスマッチエンドヌクレアーゼを利用する方法も行われている。この場合は、ミスマッチエンドヌクレアーゼを利用し、ミスマッチ塩基対付近で切断されたＤＮＡ断片を解析することで、変異の有無やその位置を検出する。代表的な例としては、セロリ由来のＣｅｌＩ遺伝子産物を利用する方法が知られており（特許文献２）、実際に変異塩基の解析に利用されている。しかし、この酵素は耐熱性を持たず、ＰＣＲ法など高温の反応過程を含む手法には直接使用できない。このため、変異塩基の検出を行う際にも、増幅、ミスマッチ形成、ミスマッチ切断、検出の４ステップが必要となる。【０００５】
また、変異解析の他にも大きな影響を与えている生物工学的技術としては、核酸増幅技術が挙げられる。
この核酸増幅技術の中で代表的な技術であるポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＰＣＲ）法は、試験管内において簡便に所望の核酸断片を増幅する技術であり、遺伝子に関する研究のみならず、生物学、医学、農業等の幅広い分野において不可欠の実験手法となっている。ＰＣＲ法は、変異型遺伝子の検出や、ＤＮＡのメチル化の解析にも応用されている。
また、ＬＡＭＰ法やＩＣＡＮ法などの等温核酸増幅法は特別な機器を必要としないことから、より安価な核酸検出法として使用されている。
さらに近年になり行われるようになったゲノム全体の構造解析においては、特に希少な試料からの解析を行う上で、全ゲノム増幅法は重要な技術である。【０００６】
これらの核酸増幅法の問題点として、一定確率で間違った塩基の取り込みを起こすことがあげられる。ポリメラーゼの改良などを通して、この確率は低減されてきたものの、依然精密な解析の際には障害となっている。【０００７】
また、核酸増幅技術はある特定の塩基配列を有するＤＮＡの増幅のみならず、共通の塩基配列領域を両端に保持するＤＮＡの混合物を増幅する際にも用いられる。具体的な例としては、ゲノムライブラリーやｃＤＮＡライブラリーの構築などが挙げられるが、その際に含有率の高いＤＮＡ分子が優先的に増幅され、多様な種類のＤＮＡの解析やスクリーニングの障害となることがある。【０００８】
その問題を解決するため、自己ハイブリダイゼーションを利用した正規化（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）により含有率の高いＤＮＡの比率の低減が行われている（非特許文献１）。またＰＣＲ法と自己ハイブリダイザーションを組み合わせたＳＳＨ−ＰＣＲ法も使用されている（非特許文献２）が、含有率の高いＤＮＡと相同性を持つＤＮＡも取り除かれる危険性も存在している。【０００９】
さらに、核酸増幅法によるＤＮＡの検出においては、検出対象のＤＮＡの増幅と、検出対象でないＤＮＡの増幅とが競合し得る場合がある。すなわち、検出対象以外のＤＮＡも同時に増幅され、対象のＤＮＡの検出が困難な場合である。サイクリングプローブやＴａｑＭａｎプローブ等のプローブを用いたリアルタイムＰＣＲによって検出対象のＤＮＡの増幅のみを検出して上記の問題を解消できることもあるが、検出対象でないＤＮＡが検出対象のＤＮＡに対して大過剰に存在する場合には、大多数の類似ＤＮＡの存在による偽陽性反応のため、検出対象のＤＮＡの検出は困難となる。【００１０】
このような問題は、例えば正常対立遺伝子の存在下における少数の変異対立遺伝子の検出（血中循環腫瘍ＤＮＡの検出等）、エピジェネティックアッセイでの少数のメチル化あるいは非メチル化対立遺伝子の検出、母親の血液中に循環する少量の胎児ＤＮＡ配列の検出等の実施において起こり得る。【００１１】
上記の問題を解決するために、Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＲＥＭＳ  ＰＣＲ）と呼ばれる方法が開発された（非特許文献３）。この方法は、耐熱性の制限酵素を利用し、例えば鋳型が正常型の塩基配列を持つ場合のみにこの制限酵素による切断が起こるように設計したプライマーを用いて、変異型の塩基配列を持つＤＮＡのみを選択的に検出する方法である。しかしながら、検出しようとするＤＮＡによっては、ＲＥＭＳ  ＰＣＲによる選択的検出に適した認識配列を持つ耐熱性の制限酵素が存在しない場合もある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】米国特許第５９２２５３９号明細書
【特許文献２】国際公開第０１／０６２９７４号パンフレット
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】“Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ”、２００４年２月、第３２巻、３号、ｅ３７
【非特許文献２】“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”、２００９年、第４９６巻、２号、ｐ．２２３−２４３
【非特許文献３】“Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ”、１９９８年８月、第１５３巻、２号、ｐ．３７３−３７９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の目的は、耐熱性ミスマッチエンドヌクレアーゼ、当該ミスマッチエンドヌクレアーゼを含む組成物、及びミスマッチエンドヌクレアーゼを用いた方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、上記の事情を鑑みて鋭意努力した結果、複製機構の１因子と考えられていた古細菌由来のタンパク質が耐熱性のミスマッチエンドヌクレアーゼの酵素活性を持つことを見出した。【００１６】
また、特定の塩基配列を有する核酸とハイブリダイズさせた際に１以上のミスマッチを生じるように設計されたオリゴデオキシヌクレオチドとこのミスマッチエンドヌクレアーゼの存在下で核酸増幅反応を行うことで、特定の塩基配列を有するＤＮＡの増幅を抑制することが可能となった。【００１７】
さらには、この耐熱性のミスマッチエンドヌクレアーゼを基にして、塩基特異性を向上させた変異型ミスマッチエンドヌクレアーゼの創製に成功した。そして、ミスマッチエンドヌクレアーゼを使用することで、特定のミスマッチ塩基対以外の切断が抑えられ、より特異的な増幅抑制が可能であることを見出し、本発明を完成させた。【００１８】
すなわち、本発明の第１の発明は、
［１］二本鎖核酸の切断方法であって、下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）からなる群より選択された少なくとも一種のポリペプチドをミスマッチ塩基対を有する二本鎖核酸に作用させ、当該二本鎖核酸の両鎖をミスマッチ塩基対部位で切断することを特徴とする、方法：
（ｉ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（ｉｉ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されてなるアミノ酸配列を有し、かつミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド；及び
（ｉｉｉ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して５０％以上のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド、
［２］ミスマッチ塩基対が、二本鎖核酸上、通常の塩基対合を行う２個の塩基対の間に存在する、連続して１以上８以下のミスマッチ塩基対である、［１］に記載の方法、
［３］下記（ａ）〜（ｃ）を含む組成物：
（ａ）ＤＮＡポリメラーゼ；
（ｂ）少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー；及び
（ｃ）下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）からなる群より選択された少なくとも一種のポリペプチド：
（ｉ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（ｉｉ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されてなるアミノ酸配列を有し、かつミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド；及び
（ｉｉｉ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して５０％以上のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド、
［４］核酸の増幅方法であって、下記（ａ）〜（ｂ）の工程を含む方法：
（ａ）［３］に記載の組成物と鋳型になる核酸分子を含む組成物を調製する工程；及び
（ｂ）工程（ａ）により得られた組成物を適切な条件下で反応させ、核酸増幅を行う工程、
［５］核酸増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法、等温核酸増幅法、又はＭＤＡ（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法で実施される［４］に記載の方法、
［６］下記（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選択されるポリペプチド：
（Ａ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において、７７番目のトリプトファンが他のアミノ酸残基に置換されてなるアミノ酸配列を有し、かつミスマッチエンドヌクレアーゼ活性するポリペプチド；
（Ｂ）前記（Ａ）のポリペプチドのアミノ酸配列において、７７番目のアミノ酸残基を除く１〜１０個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されてなるアミノ酸配列を有し、かつミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド；及び
（Ｃ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して５０％以上のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列において、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列における７７番目のトリプトファンに対応するアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されてなるアミノ酸配列を有し、かつミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド、
［７］下記（Ａ）〜（C）からなる群より選択される、［６］記載のポリペプチド：
（Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド； 
（Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において、７７番目のフェニルアラニンを除く１〜１０個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されてなるアミノ酸配列を有し、かつミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド；及び
（Ｃ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して５０％以上のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列において、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列における７７番目のトリプトファンに対応するアミノ酸残基がフェニルアラニンに置換されてなるアミノ酸配列を有し、かつミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド、
［８］核酸増幅反応において特定の塩基配列を有する核酸の増幅を抑制する方法であって、下記の（ａ）〜（ｄ）の存在下で核酸増幅反応を行う工程を含む方法：
（ａ）前記特定の塩基配列を有する核酸またはその相補鎖とハイブリダイズさせた際に１個もしくは数個のミスマッチを生じるように設計されたオリゴデオキシヌクレオチド；
（ｂ）ＤＮＡポリメラーゼ；
（ｃ）少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー；及び
（ｄ）ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド、
［９］核酸増幅反応がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法、又は等温核酸増幅法である、［８］に記載の方法、
［１０］ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドが、下記（ｉ）〜（ｖｉ）からなる群より選択された少なくとも一種のポリペプチドである、［８］に記載の方法；
（ｉ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（ｉｉ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されてなるアミノ酸配列を有し、かつミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド；
（ｉｉｉ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して５０％以上のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド；
（ｉｖ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド； 
（ｖ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において、７７番目のフェニルアラニンを除く１〜１０個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されてなるアミノ酸配列を有し、かつミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド；及び
（ｖｉ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して５０％以上のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列において、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列における７７番目のトリプトファンに対応するアミノ酸残基がフェニルアラニンに置換されてなるアミノ酸配列を有し、かつミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド、
［１１］標的ＤＮＡを優先的に増幅する方法であって、当該標的ＤＮＡと１個もしくは数個の塩基が異なる塩基配列のＤＮＡの増幅を［８］記載の方法で抑制することを特徴とする方法、
［１２］野生型塩基配列のＤＮＡと、当該ＤＮＡに一塩基多型変異が生じたＤＮＡとを区別して増幅する目的に使用される［１１］に記載の方法、
［１３］一塩基多型変異が、癌化、又は癌治療用薬剤による治療効果と相関する一塩基多型変異である、［１２］に記載の方法、および
［１４］ＤＮＡ増幅反応がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、又は等温核酸増幅法で実施される［１１］に記載の方法
に関する。
【発明の効果】
【００１９】
本発明により、生物工学上利用価値の高い耐熱性ミスマッチエンドヌクレアーゼ、当該ミスマッチエンドヌクレアーゼを含む組成物、及びミスマッチエンドヌクレアーゼを用いた方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】実施例２におけるポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す図である。
【図２】実施例２におけるＰＦ００１２タンパク質のミスマッチ切断活性を蛍光強度の上昇を指標に示した図である。
【図３】実施例３におけるＰＦ００１２相同タンパク質のミスマッチ切断活性を蛍光強度の上昇を指標に示した図である。
【図４】実施例５における変異型ＰＦ００１２相同タンパク質のミスマッチ切断活性を蛍光強度の上昇を指標に示した図である。
【図５】実施例６における特異的配列を持つＤＮＡの増幅抑制をリアルタイムＰＣＲの技術を用いて示した図である。
【図６】実施例６におけるＨＲＭ解析法を用いた１塩基変異遺伝子の検出を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明においてミスマッチとは、二本鎖核酸中に存在するワトソン−クリック塩基対とは異なる塩基の対合、すなわちＧ（グアニン塩基）−Ｃ（シトシン塩基）、Ａ（アデニン塩基）−Ｔ（チミン塩基）またはＵ（ウラシル塩基）の塩基対結合以外の組み合わせの塩基結合を示す。
【００２２】
本明細書において、ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド(ミスマッチエンドヌクレアーゼと記載することがある)とは、二本鎖核酸中のミスマッチ部位を切断する活性を有するヌクレアーゼのことをいう。前記のミスマッチエンドヌクレアーゼ活性は、ミスマッチ塩基対を形成するヌクレオチドに隣接するリン酸ジエステル結合を切断する活性の他、ミスマッチ塩基対から１〜５塩基対、好ましくは１〜３塩基対離れたヌクレオチドに隣接するリン酸ジエステル結合を切断する活性を包含する。本発明においてミスマッチエンドヌクレアーゼは、特定のミスマッチ塩基対を特異的に認識して二本鎖核酸を切断する活性を有するもの（例えばＧＴミスマッチを特異的に認識するものや、ＧＴミスマッチ及びＧＧミスマッチを特異的に認識するもの等）であってもよい。また、本発明において耐熱性のミスマッチエンドヌクレアーゼは、二本鎖核酸中のミスマッチ部位を切断する活性の他に、一本鎖ＤＮＡ、一本鎖核酸と二本鎖核酸のジャンクション部分、ダブルフラップ構造、レプリケーションフォーク構造、Ｄ−ループ構造、及び／又はニックが入ったホリデイジャンクション構造を認識して核酸を切断する活性を有していても良い。また、本明細書において耐熱性のミスマッチエンドヌクレアーゼとは、５０℃以上の温度において二本鎖核酸中のミスマッチ部位を切断する活性を示すヌクレアーゼのことをいい、本発明においては耐熱性のミスマッチエンドヌクレアーゼの使用が好ましい。
【００２３】
本発明を特に限定するものではないが、本発明に使用される耐熱性のミスマッチエンドヌクレアーゼとしては、古細菌由来の耐熱性のミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドが例示される。本発明者らは、これまで複製系の１因子と考えられていたＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ由来のポリペプチドＰＦ００１２（ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＰ＿５７７７４１、配列表の配列番号１）が耐熱性のミスマッチエンドヌクレアーゼであることを見出した。さらには、ＰＦ００１２のホモログであるＭｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ由来のポリペプチドＭＪ＿０２２５（ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＰ＿２４７１９４、配列表の配列番号８）、及びＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｂａｒｏｐｈｉｌｕｓ由来のポリペプチドＴＥＲＭＰ＿０１８７７（ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＹＰ＿００４０７２０７５、配列表の配列番号７）も同様に耐熱性のミスマッチエンドヌクレアーゼであることを見出した。なお、ＭＪ＿０２２５、ＴＥＲＭＰ＿０１８７７は、それぞれＰＦ００１２のアミノ酸配列に対して５７％、７３％の配列同一性を有する。従って、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、当該ポリペプチドのアミノ酸配列において１〜１０個、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されてなるアミノ酸配列を有するポリペプチド、及び配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、または７５％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、またさらに好ましくは９５％以上のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドは、本発明における耐熱性のミスマッチエンドヌクレアーゼとして好適である。さらには、配列表の配列番号７に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、当該ポリペプチドのアミノ酸配列において１〜１０個、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されてなるアミノ酸配列を有するポリペプチド、及び配列表の配列番号７に記載のアミノ酸配列に対して５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、または７５％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、またさらに好ましくは９５％以上のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドも、本発明における耐熱性のミスマッチエンドヌクレアーゼとして好適である。またさらに、配列表の配列番号８に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、当該ポリペプチドのアミノ酸配列において１〜１０個、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されてなるアミノ酸配列を有するポリペプチド、及び配列表の配列番号８に記載のアミノ酸配列に対して５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、または７５％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、またさらに好ましくは９５％以上のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドも、本発明における耐熱性のミスマッチエンドヌクレアーゼとして好適である。
【００２４】
さらに本発明者らは、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、７７番目のトリプトファン残基が他のアミノ酸残基、好ましくはフェニルアラニンに置換されてなるアミノ酸配列を有するポリペプチドが、Ｇ（グアニン塩基）−Ｇ（グアニン塩基）ミスマッチを特異的に認識する耐熱性のミスマッチエンドヌクレアーゼであることを見出した。当該ミスマッチエンドヌクレアーゼのグアニン塩基同士で形成されたミスマッチ塩基対に対する切断活性を測定したところ、他のミスマッチ塩基対に対する切断活性の１０倍以上であった。従って、こうして作成された配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、ならびにそのホモログは、本発明の一態様である。配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド及びそのホモログとしては、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列における７７番目のトリプトファン残基が他のアミノ酸残基に置換されてなるポリペプチド、当該ポリペプチドのアミノ酸配列において、７７番目のアミノ酸残基を除く１〜１０個、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されてなるアミノ酸配列を有するポリペプチド、及び配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、または７５％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、またさらに好ましくは９５％以上のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、かつ配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列における７７番目のトリプトファン残基に対応するアミノ酸残基がトリプトファン以外のアミノ酸残基であり、それぞれがミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドが例示される。このようなミスマッチエンドヌクレアーゼは、後述する種々の用途、例えば特異的ＤＮＡ配列を含有するＤＮＡを排除しその他のＤＮＡを増幅、検出する方法に好適である。
ここで、ミスマッチエンドヌクレアーゼの活性は、ミスマッチ塩基対を含有する二本鎖核酸を基質として測定することができる。具体的には、ミスマッチ塩基対を含有する二本鎖核酸を調製した後、ミスマッチエンドヌクレアーゼに対して過剰量の当該二本鎖核酸をミスマッチエンドヌクレアーゼと反応させ、単位時間当たりの切断核酸量を測定することで活性測定が実施される。切断された二本鎖核酸は、電気泳動などにより切断を受けなかった核酸と分離して定量することが可能である。切断を受けた場合にのみ蛍光強度の増加が検出できるように蛍光物質と消光物質とで二重に標識した二本鎖核酸を使用すれば、反応溶液中の蛍光強度を適当な時間ごとに測定することにより活性を簡便に測定することができる。また、基質となる二本鎖核酸の中のミスマッチ塩基対の塩基を変えることで、特定のミスマッチ塩基対に対する切断活性を調べることも可能である。
【００２５】
本発明の二本鎖核酸の切断方法は、ミスマッチ塩基対を有する二本鎖核酸に配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、又はそのホモログを作用させることで行われる。配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドのホモログとしては、本発明を特に限定するものではないが、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において１〜１０個、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されてなるアミノ酸配列を有し、かつミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド、及び配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、または７５％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、またさらに好ましくは９５％以上のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド、ならびに上記した配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド及びそのホモログが例示される。また、本発明の二本鎖核酸の切断方法におけるポリペプチドの由来生物としては、古細菌が例示され、好適には耐熱性の古細菌が、より好適にはＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｂａｒｏｐｈｉｌｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ等の耐熱性の古細菌が例示される。本発明の二本鎖核酸の切断方法においては、ＰＦ００１２のホモログであるＭｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ由来のポリペプチドＭＪ＿０２２５（ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＰ＿２４７１９４、配列表の配列番号８）又はそのホモログ、あるいはＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｂａｒｏｐｈｉｌｕｓ由来のポリペプチドＴＥＲＭＰ＿０１８７７（ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＹＰ＿００４０７２０７５、配列表の配列番号７）又はそのホモログも使用できる。配列表の配列番号７に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドのホモログとしては、本発明を特に限定するものではないが、配列表の配列番号７に記載のアミノ酸配列において１〜１０個、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されてなるアミノ酸配列を有し、かつミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド、及び配列表の配列番号７に記載のアミノ酸配列に対して５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、または７５％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、またさらに好ましくは９５％以上のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドが例示される。配列表の配列番号８に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドのホモログとしては、本発明を特に限定するものではないが、配列表の配列番号８に記載のアミノ酸配列において１〜１０個、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されてなるアミノ酸配列を有し、かつミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド、及び配列表の配列番号８に記載のアミノ酸配列に対して５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、または７５％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、またさらに好ましくは９５％以上のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドが例示される。
【００２６】
本発明の二本鎖核酸の切断方法におけるミスマッチ塩基対は、二本鎖核酸の内部（通常の塩基対合を行う２個の塩基対の間）に存在するものであれば二本鎖核酸中に１つのミスマッチ塩基対が存在するものに限定されることはなく、ミスマッチ塩基対が間隔をおいて複数個存在するものであってもよいし、２以上の連続するミスマッチ塩基対が存在していてもよい。本発明の二本鎖核酸の切断方法におけるミスマッチ塩基対としては、好ましくは二本鎖核酸の内部に存在する１又は８以下の連続するミスマッチ塩基対、より好ましくは１又は４以下の連続するミスマッチ塩基対、さらにより好ましくは２つの連続するミスマッチ塩基対又は１つのミスマッチ塩基対が例示される。本発明の二本鎖核酸の切断方法において、二本鎖核酸中に複数のミスマッチ塩基対が存在する場合は、該複数のミスマッチ塩基対は、同種のミスマッチ塩基対であってもよいし、または異なる種類のミスマッチ塩基対であってもよい。
【００２７】
ミスマッチ塩基対を有する二本鎖核酸としては、ＰＣＲ産物、ゲノムＤＮＡやその断片などの生物試料由来の核酸、及び合成核酸等が例示される。また、ミスマッチ塩基対を有する二本鎖核酸は、複数の生物試料由来の混合物又は生物試料由来の核酸と合成核酸との混合物を融解、再アニーリングさせて生成された核酸混合物であってもよい。例えば、変異を有する核酸と野生型の核酸を混合し、融解、再アニーリングした場合、ミスマッチ塩基対が形成され、この部位でミスマッチエンドヌクレアーゼの切断を受ける。こうして生じたミスマッチエンドヌクレアーゼによる切断後の核酸断片の大きさを観察することで、変異の有無、位置を検証できる。本発明のミスマッチエンドヌクレアーゼを利用することにより、ＰＣＲ法などの核酸増幅法の反応液にこのミスマッチエンドヌクレアーゼを添加するだけの一段階の反応で変異解析を行うことが可能である。ＰＣＲ法においては、そのサイクル数を一定数以上増加させても、増幅効果が得られなくなることが知られている。添加されている核酸の枯渇や、プライマーと反応産物のアニーリングの競合がその主な原因であるが、この時には反応産物同士のアニーリングが起こっており、変異を有する鋳型と野生型の鋳型が混在していれば、これらから増幅した反応産物同士のアニーリングにより変異部位にミスマッチ塩基対が生じることになる。したがって、本発明のミスマッチエンドヌクレアーゼの共存下でのＰＣＲを通常よりも増加させたサイクル数で実施することだけで、変異解析が可能になる。すなわち、本発明は、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド又はそのホモログを二本鎖核酸に作用させることを含む、変異解析方法を提供する。さらに、本発明は、配列表の配列番号７に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド又はそのホモログを二本鎖核酸に作用させることを含む、変異解析方法を提供する。またさらに、本発明は、配列表の配列番号８に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド又はそのホモログを二本鎖核酸に作用させることを含む、変異解析方法を提供する。
【００２８】
また、核酸増幅反応の過程でも本発明の二本鎖核酸の切断方法を実施することができる。核酸増幅の反応液にミスマッチエンドヌクレアーゼを添加することで、増幅過程の誤ったヌクレオチドの取り込みで生じたミスマッチ塩基対を有する二本鎖核酸が切断される。この結果、反応開始前の鋳型核酸とは異なる配列の核酸の増幅が抑制される。こうして、エラー率の低減した核酸増幅が可能になる。すなわち、本発明は、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド又はそのホモログを用いてミスマッチ塩基対を有する二本鎖核酸を切断する工程を含む、核酸増幅方法を提供する。さらに、本発明は、配列表の配列番号７に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド又はそのホモログを用いてミスマッチ塩基対を有する二本鎖核酸を切断する工程を含む、核酸増幅方法を提供する。またさらに、本発明は、配列表の配列番号８に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド又はそのホモログを用いてミスマッチ塩基対を有する二本鎖核酸を切断する工程を含む、核酸増幅方法を提供する。該ミスマッチ塩基対を有する二本鎖核酸を切断する工程は、核酸増幅工程と同時に行われてもよい。さらに、（ａ）ＤＮＡポリメラーゼ、（ｂ）少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー、並びに（ｃ）（ｉ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（ｉｉ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において１〜１０個、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されてなるアミノ酸配列を有し、かつミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド、及び（ｉｉｉ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、または７５％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、またさらに好ましくは９５％以上のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドからなる群より選択された少なくとも１種のポリペプチドを含む組成物も、本発明の一態様である。また、本発明の別の態様として、（ａ）ＤＮＡポリメラーゼ、（ｂ）少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー、並びに（ｃ）（ｉ）配列表の配列番号７に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（ｉｉ）配列表の配列番号７に記載のアミノ酸配列において１〜１０個、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されてなるアミノ酸配列を有し、かつミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド、及び（ｉｉｉ）配列表の配列番号７に記載のアミノ酸配列に対して５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、または７５％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、またさらに好ましくは９５％以上のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドからなる群より選択された少なくとも１種のポリペプチドを含む組成物が提供される。また、本発明のさらに別の態様として、（ａ）ＤＮＡポリメラーゼ、（ｂ）少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー、並びに（ｃ）（ｉ）配列表の配列番号８に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（ｉｉ）配列表の配列番号８に記載のアミノ酸配列において１〜１０個、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されてなるアミノ酸配列を有し、かつミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド、及び（ｉｉｉ）配列表の配列番号８に記載のアミノ酸配列に対して５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、または７５％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、またさらに好ましくは９５％以上のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドからなる群より選択された少なくとも１種のポリペプチドを含む組成物が提供される。同様に、さらに上記の核酸増幅反応用の組成物と鋳型となる核酸分子を含む組成物を調製する工程、及び得られたこの組成物を適切な条件下で反応させ、核酸増幅を行う工程を含む核酸の増幅方法も、本発明の一態様である。
【００２９】
上記の組成物は、さらに反応緩衝剤、２価の金属イオン、デオキシリボヌクレオチド、オリゴヌクレオチドプローブ、及びインターカレーティング色素から選択される少なくとも１種を含んでもよい。また、上記の組成物を核酸増幅反応に使用する場合、上記の組成物は、さらに核酸増幅反応の鋳型となる核酸を含んでいても良い。上記の反応緩衝剤とは、反応溶液の水素イオン濃度（ｐＨ）の変動を和らげる作用を持つ化合物又は混合物のことをいう。一般に弱酸とその塩、あるいは弱塩基とその塩の混合溶液は強い緩衝作用を持つので、反応緩衝剤としてｐＨコントロールの目的で広く用いられている。本発明に使用される反応緩衝剤としては、例えばＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ等のグッドバッファーやリン酸ナトリウムバッファー等のリン酸バッファーが挙げられる。上記の２価の金属イオンとしては、例えばマグネシウムイオン、マンガンイオン、亜鉛イオン、及びコバルトイオンが挙げられる。２価の金属イオンは、塩化物、硫酸塩、又は酢酸塩等の塩の形態で供給され得る。
【００３０】
上記の核酸の増幅法としては、本発明を特に限定するものではないが、ＤＮＡを増幅する方法が例示される。ＤＮＡを増幅する方法としては、たとえばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法、ＭＤＡ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、及びＩＣＡＮ法やＬＡＭＰ法等の等温核酸増幅法が挙げられる。
【００３１】
上記の核酸増幅反応用の組成物中のミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドの濃度は、適宜各々の反応系でＤＮＡの増幅反応を阻害しない濃度やミスマッチ塩基対の切断に有効な濃度を検定して決定すればよい。
【００３２】
上記の核酸増幅反応用の組成物に使用される少なくとも１対のプライマーとしては、各種の核酸増幅法に適した２個以上のプライマーが選択される。これらは、所望の増幅が生じるものであればＤＮＡ、ＲＮＡのほか、ＤＮＡの一部がＲＮＡに置換されている所謂キメラプライマーであっても良い。また、公知の核酸アナログを含むプライマーや検出などを目的とした蛍光色素などにより標識されたプライマーであってもよい。
【００３３】
さらに、本発明者らは、ミスマッチエンドヌクレアーゼと適切に設計されたオリゴデオキシヌクレオチドとを利用して、核酸増幅反応において特定の塩基配列を有する核酸の増幅を抑制可能であることを見出した。従って、（ａ）前記特定の塩基配列を有する核酸とハイブリダイズさせた際に１個もしくは数個のミスマッチを生じるように設計されたオリゴデオキシヌクレオチド、（ｂ）ＤＮＡポリメラーゼ、（ｃ）少なくとも一対のプライマー、及び（ｄ）ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドの存在下で核酸増幅反応を行う工程を含む、核酸増幅反応において特定の塩基配列を有する核酸の増幅を抑制する方法も、本発明の一態様である。また、この方法を使用して標的核酸の塩基配列と１個もしくは数個の塩基が異なる特定の塩基配列を有する核酸の増幅を抑制することによって、標的核酸を優先的に増幅する方法も、本発明の一態様である。
【００３４】
上記の（ａ）のオリゴデオキシヌクレオチドは、特定の塩基配列を有する核酸とハイブリダイズさせた際に１個もしくは数個のミスマッチを生じるように設計されたオリゴデオキシヌクレオチドであれば特に限定はなく、ＤＮＡの一部がＲＮＡに置換されている所謂キメラオリゴデオキシヌクレオチドであっても良い。また、本発明を特に限定するものではないが、このオリゴデオキシヌクレオチドの３’端は、このオリゴデオキシヌクレオチドからのＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応を抑制するための修飾を施されていてもよい。たとえば、アミノ化などの修飾が例示される。また、オリゴデオキシヌクレオチドは、このオリゴデオキシヌクレオチドが結合する核酸がミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドの切断を受ける限りにおいて、ホスホロチオエート化やその他の修飾によりデオキシリボヌクレアーゼからの切断から保護されていてもよい。さらに、検出などを目的とした蛍光色素や消光物質などにより標識されていてもよい。
【００３５】
上記オリゴデオキシヌクレオチドの鎖長は、実施される反応の条件の下で前記特定の塩基配列を有する核酸とこのオリゴデオキシヌクレオチドとがハイブリダイズできるように、適宜決定できる。また、特定の塩基配列を有する核酸とハイブリダイズさせた際にミスマッチを生じる位置は、このオリゴデオキシヌクレオチドの５’末端、３’末端の両方から少なくとも３ヌクレオチド以上離れていることが望ましい。
【００３６】
本発明の、核酸増幅反応において特定の塩基配列を有する核酸の増幅を抑制する方法には、ミスマッチ部位を特異的に切断する活性を有する任意のミスマッチエンドヌクレアーゼを使用することができる。例えば、核酸増幅法として高温での反応を包含するＰＣＲ法のような方法で、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを使用する場合には、ミスマッチエンドヌクレアーゼも耐熱性を有するものを使用することが好ましい。本発明を特に限定するものではないが、このような場合には、前記の耐熱性のミスマッチエンドヌクレアーゼ、すなわち、（ｉ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（ｉｉ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において１〜１０個、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されてなるアミノ酸配列を有し、かつミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド、（ｉｉｉ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、または７５％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、またさらに好ましくは９５％以上のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド、（ｉｖ）配列表の配列番号７に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（ｖ）配列表の配列番号７に記載のアミノ酸配列において１〜１０個、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されてなるアミノ酸配列を有し、かつミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド、（ｖｉ）配列表の配列番号７に記載のアミノ酸配列に対して５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、または７５％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、またさらに好ましくは９５％以上のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド、（ｖｉｉ）配列表の配列番号８に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（ｖｉｉｉ）配列表の配列番号８に記載のアミノ酸配列において１〜１０個、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されてなるアミノ酸配列を有し、かつミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド、及び（ｉｘ）配列表の配列番号８に記載のアミノ酸配列に対して５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、または７５％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、またさらに好ましくは９５％以上のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドからなる群から選択される少なくとも１種のポリペプチドを使用することが好適である。
【００３７】
本発明の、核酸増幅反応において特定の塩基配列を有する核酸の増幅を抑制する方法には、特定のミスマッチ塩基対を含む二本鎖核酸のみを特異的に切断する活性を有するミスマッチエンヌクレアーゼを使用することがさらに好ましい。この場合、増幅抑制する塩基配列を１種類に限定することが可能である。例えば、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列における７７番目のトリプトファン残基が他のアミノ酸残基に置換されている配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、Ｇ（グアニン塩基）−Ｇ（グアニン塩基）ミスマッチを含む二本鎖核酸を特異的に切断するため、Ｇ（グアニン塩基）以外の塩基がミスマッチを生じる位置に存在する二本鎖核酸は切断されず、増幅抑制を受けることがない。すなわち、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列における７７番目のトリプトファン残基が他のアミノ酸残基に置換されてなるポリペプチド、ならびにそのホモログは特定の塩基配列を有する核酸の増幅を抑制する方法に好適である。
したがって、本発明はさらに、下記（ａ）〜（ｄ）を含む核酸増幅反応用組成物を提供する：
（ａ）特定の塩基配列を有する核酸またはその相補鎖とハイブリダイズさせた際に１個もしくは数個のミスマッチを生じるように設計されたオリゴデオキシヌクレオチド；
（ｂ）ＤＮＡポリメラーゼ；
（ｃ）少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー；及び
（ｄ）下記（ｉ）〜（ｘｉｉ）からなる群より選択された少なくとも一種のポリペプチド：
（ｉ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（ｉｉ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において１〜１０個、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されてなるアミノ酸配列を有し、かつミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド；
（ｉｉｉ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、または７５％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、またさらに好ましくは９５％以上のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド；
（ｉｖ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド； 
（ｖ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において、７７番目のフェニルアラニンを除く１〜１０個、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されてなるアミノ酸配列を有し、かつミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド；
（ｖｉ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、または７５％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、またさらに好ましくは９５％以上のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列において、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列における７７番目のトリプトファンに対応するアミノ酸残基がフェニルアラニンに置換されてなるアミノ酸配列を有し、かつミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド；
（ｖｉｉ）配列表の配列番号７に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（ｖｉｉｉ）配列表の配列番号７に記載のアミノ酸配列において１〜１０個、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されてなるアミノ酸配列を有し、かつミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド；
（ｉｘ）配列表の配列番号７に記載のアミノ酸配列に対して５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、または７５％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、またさらに好ましくは９５％以上のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド；
（ｘ）配列表の配列番号８に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（ｘｉ）配列表の配列番号８に記載のアミノ酸配列において１〜１０個、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されてなるアミノ酸配列を有し、かつミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド；及び
（ｘｉｉ）配列表の配列番号８に記載のアミノ酸配列に対して５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、または７５％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、またさらに好ましくは９５％以上のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド。上記の組成物は、さらに反応緩衝剤、２価の金属イオン、デオキシリボヌクレオチド、オリゴヌクレオチドプローブ、及びインターカレーティング色素から選択される少なくとも１種を含んでもよい。また、上記の組成物は、さらに核酸増幅反応の鋳型となる核酸を含んでいてもよい。
【００３８】
本発明の核酸増幅反応において特定の塩基配列を有する核酸の増幅を抑制する方法は、任意の核酸増幅法において実施することができる。本発明を特に限定するものではないが、ＤＮＡを増幅する方法に特に好適である。たとえばＰＣＲ法、ＭＤＡ法、及びＩＣＡＮ法やＬＡＭＰ法等の等温核酸増幅法等で本発明を実施することができる。
【００３９】
本発明の、核酸増幅反応において特定の塩基配列を有する核酸の増幅を抑制する方法は、任意の核酸を対象として実施することができる。ＤＮＡを増幅対象とする場合には、人工的に作製されたＤＮＡ混合物、環境由来試料や生物由来の試料、又はその試料より調製されたＤＮＡ混合物中に存在するＤＮＡが例示される。本発明を特に限定するものではないが、生物由来の試料としては、ヒト等の哺乳類由来の試料が例示される。また、本発明を特に限定するものではないが、ＤＮＡ混合物としては、断片化されたゲノムＤＮＡ混合物、ｍＲＮＡより逆転写反応により生じたｃＤＮＡ混合物、複数のＰＣＲ産物の混合物などが例示される。増幅が抑制される特定の塩基配列を有するＤＮＡとしては、分離されずにのこるｒＲＮＡ由来の逆転写産物や、プライマー同士の対合により生じる低分子ＤＮＡなどが例示される。後に機能的スクリーニングを行う遺伝子ライブラリーを増幅する場合には、陽性を示す既知の遺伝子の配列を持つＤＮＡの増幅を抑制することで、より効率的に未知遺伝子を探索できるライブラリーの作製も可能になる。
【００４０】
本発明[８]の、核酸増幅反応において特定の塩基配列を有する核酸の増幅を抑制する方法における（ｄ）のミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドの濃度は、適宜各々の反応系でＤＮＡの増幅反応を阻害しない濃度やミスマッチ塩基対の切断に有効な濃度を検定して決定すればよい。（ａ）のオリゴデオキシヌクレオチドの濃度は、鋳型量や目的ＤＮＡの増幅効率を勘案して、使用濃度を最適化し、決定すればよい。例えば増幅反応に使用されるプライマーの濃度の０．１倍〜１０倍の濃度で実施可能である。
【００４１】
本発明[１１]の、標的ＤＮＡを優先的に増幅する方法は、更に増幅された標的ＤＮＡを検出する工程を含んでいても良い。本明細書においては、本発明のこの態様のことを「本発明の検出方法」と記載することがある。例えば、ＤＮＡを検出対象とする本発明の検出方法によれば、検出対象でないＤＮＡ（特定の塩基配列を有するＤＮＡ）が検出対象のＤＮＡ（標的ＤＮＡ）に対して大過剰に存在する場合においても、本発明[８]の核酸増幅反応において特定の塩基配列を有する核酸の増幅を抑制する方法における（ａ）のオリゴデオキシヌクレオチドと（ｄ）のミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドとにより検出対象でないＤＮＡを鋳型としたＤＮＡの増幅が抑制されるため、検出対象のＤＮＡの検出を行うことが可能となる。
【００４２】
本発明の検出方法は、例えば変異の存在が知られている遺伝子に対応する核酸について、野生型と変異型とを区別して検出することを可能にする。特定の塩基配列を有する核酸として、野生型の塩基配列を含有するＤＮＡを設定して本発明の検出方法を実施することにより、大過剰の正常対立遺伝子（すなわち野生型の塩基配列を有するＤＮＡ）の存在下における少数の変異対立遺伝子の検出が可能となる。例えば血中循環腫瘍ＤＮＡの検出や母親の血液中に含有されている少量の胎児ＤＮＡ配列の検出に本発明の方法は有用である。当該変異としては、微小欠失及び点突然変異が例示される。なお、点突然変異によって生じた多型は一塩基多型（ＳＮＰｓ）と呼ばれる。本明細書においては、ＳＮＰｓのうち変異型の塩基配列を有するＤＮＡのことを、一塩基多型変異を有するＤＮＡと記載することがある。
【００４３】
本発明を特に限定するものではないが、前記の特定の塩基配列を有する核酸としては、腫瘍マーカーとして利用される一塩基多型変異、癌治療用薬剤による治療効果と相関する一塩基多型変異、及び細胞の癌化との相関が知られている一塩基多型変異からなる群より選択された少なくとも１つの一塩基多型変異を含む核酸が好ましい。ＳＮＰｓには、腫瘍細胞に高頻度で認められるものや、癌治療用薬剤による治療効果や発癌との相関が知られているものがある。このようなＳＮＰｓとしては、Ｋ−ｒａｓ遺伝子、Ｂ−ｒａｆ遺伝子、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）遺伝子のＳＮＰｓが例示される。Ｋ−ｒａｓ遺伝子の体細胞変異は、結腸直腸癌、肺腺癌、甲状腺癌等において高頻度で認められる。Ｂ−ｒａｆ遺伝子の体細胞変異は、結腸直腸癌、悪性黒色腫、甲状腺乳頭癌、非小細胞肺癌、肺腺癌等において高頻度で認められる。また、ＥＧＦＲ遺伝子の体細胞変異は、様々な固形腫瘍において高頻度で認められる。ゲフィチニブやエルロチニブ等のＥＧＦＲ阻害剤による癌の治療は、癌組織のＥＧＦＲ遺伝子が特定の一塩基多型変異を有する場合に有効である可能性が高いことが知られている。一方、癌組織のＫ−ｒａｓ遺伝子が一塩基多型変異を有する場合には、ＥＧＦＲ阻害剤への抵抗性を示す可能性が高いことが知られている。
【００４４】
本発明の検出方法は、生物由来試料から抽出したメチル化ＤＮＡを含む組成物を亜硫酸水素塩処理した後に得られたＤＮＡを材料として実施してもよい。本発明の検出方法によれば、大過剰の非メチル化対立遺伝子の存在下における少数のメチル化対立遺伝子の検出、あるいは大過剰のメチル化対立遺伝子の存在下における少数の非メチル化対立遺伝子の検出を行うことができる。
【００４５】
前記の亜硫酸水素塩による処理として、メチル化ＤＮＡの検出に用いられる公知の亜硫酸水素塩法（バイサルファイト法）が利用できる。当該処理により非メチル化シトシンはウラシルに変換されるが、メチル化シトシンは変化しない。さらに、このバイサルファイト処理済みの反応液をＰＣＲ法で増幅すると、ウラシルはチミンに変換され、メチル化シトシンはシトシンとなる。つまり特定の部位での大過剰の非メチル化対立遺伝子の存在下における少数のメチル化対立遺伝子の検出、あるいは大過剰のメチル化対立遺伝子の存在下における少数の非メチル化対立遺伝子の検出は、それぞれ大過剰のチミンの中のシトシンの存在、または大過剰のシトシンの中のチミンの存在を検証することに他ならない。ここで大過剰に存在するチミンあるいはシトシンを含有するＤＮＡからの増幅を抑制できれば、少数のメチル化対立遺伝子あるいは非メチル化対立遺伝子の存在はたやすく検証することができる。
【００４６】
本発明の検出方法における標的核酸を検出する工程には、電気泳動、塩基配列解析、サイクリングプローブやＴａｑＭａｎプローブ等のプローブを用いたリアルタイムＰＣＲを利用することができる。これらの検定方法は一般的な手法をそのまま用いることが可能である。特にＨＲＭ（Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｍｅｌｔｉｎｇ）解析法を用いた場合、目的ＤＮＡの増幅と検出を１段階で行うことができ、迅速かつ簡便な目的ＤＮＡの検証が可能になる。
【実施例】
【００４７】
以下に本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれら実施例に限定されるものではない。【００４８】
調製例１  ゲノムＤＮＡの調製
Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓのゲノムＤＮＡの調製は、日本特許第３７４２６５９号公報の実施例１に記載の方法に従い行った。Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｂａｒｏｐｈｉｌｕｓ、およびＭｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉのゲノムＤＮＡの調製は、菌株としてＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓの代わりにＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｂａｒｏｐｈｉｌｕｓ、又はＭｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉを使用する以外は国際公開第０２／２２８３１号パンフレットの実施例８に記載の方法に従って行った。なお、これらの菌株は、ドイッチェ・ザムルンク・フォン・ミクロオルガニスメン・ウント・ツェルクルツレンＧｍｂＨ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ）より購入可能である。【００４９】
調製例２  ＰＦ００１２タンパク質の調製
（１）ＰＦ００１２の発現用プラスミド  ｐＥＴ−ＰＦ１２の作製
ＰＦ００１２タンパク質の機能解析を行うため、大腸菌での強制発現系を構築した。Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃ．ＮＣ＿００３４１３で公開されているＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ  ＰＦ００１２遺伝子のタンパク質翻訳領域（塩基番号１１８１０−１２６１０）をＩｎ―Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標） ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ社）を用いてクローニングするため、２種のプライマー、ＰＦ１２ＦとＰＦ１２Ｒを設計した。ＰＦ００１２のアミノ酸配列を配列番号１に、プライマーＰＦ１２ＦとＰＦ１２Ｒの塩基配列をそれぞれ配列番号３、４に示す。Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓのゲノムＤＮＡを鋳型として、これらのプライマーを用いてＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標） ＨＳ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社）を使用して当該領域を増幅した。この増幅領域の塩基配列を配列番号５に示す。この増幅断片をＩｎ―Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標） ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いてプラスミドｐＥＴ１５ｂ（メルクミリポア社）のＮｄｅＩ、ＢａｍＨＩ切断サイト間に挿入した。このＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、アンピシリン耐性となったクローンから、ＰＦ００１２発現プラスミド  ｐＥＴ−ＰＦ１２を分離した。このプラスミドを保持する大腸菌の粗抽出液から、後述の実施例２記載の方法によりミスマッチエンドヌクレアーゼ活性が検出できた。しかしこのプラスミドは非常に安定性が悪く、内部欠失を高頻度で起こすため、タンパク質生産には不適だった。【００５０】
（２）最適化ＰＦ００１２発現用プラスミド  ｐＥＴ−ｏｐｔＰＦ１２の作製
ｐＥＴ−ＰＦ１２を用いたＰＦ００１２タンパク質の発現が安定しなかったため、ＰＦ００１２のアミノ酸配列を大腸菌型のコドンでコードする塩基配列を設計し、この配列を含むＤＮＡを人工合成した。このＤＮＡの塩基配列を配列番号６に示す。このＤＮＡを制限酵素ＮｄｅＩ、ＢａｍＨＩで切断した後、精製を行い、得られたＤＮＡ断片をプラスミドｐＥＴ１５ｂの同制限酵素部位間にＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ＜Ｍｉｇｈｔｙ  Ｍｉｘ＞（タカラバイオ社）を用いて挿入した。このＬｉｇａｔｉｏｎ反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、アンピシリン耐性となったクローンを選択した。このクローンから最適化ＰＦ００１２発現プラスミドｐＥＴ−ｏｐｔＰＦ１２を得た。【００５１】
（３）ＰＦ００１２タンパク質の発現
プラスミドｐＥＴ−ｏｐｔＰＦ１２で大腸菌ＢＬ２１  ＤＥ３株を形質転換しアンピシリン耐性となったクローンを分離した。得られた新鮮な単一コロニーをアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地（以下ＬＢ−ＡＰ培地と称する）２ｍｌに接種し３７℃で終夜培養を行った。終夜培養液５００μｌを５０ｍｌのＬＢ−ＡＰ培地に加えて３７℃で３時間培養した後、培養液に終濃度１ｍＭのＩＰＴＧを加えてさらに３７℃で３時間培養した。培養終了後、６０００×ｇ  １０分の遠心分離を行って培養液より菌体を採取した。【００５２】
（４）ＰＦ００１２タンパク質の精製
上記で得られた菌体を３ｍｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１００ｍＭ  ＮａＣｌ溶液（以下Ｂｕｆｆｅｒ  Ａと称する）に懸濁し、ＶＰ―５Ｓ Ｕｌｔｒａｓ． Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ（ＴＡＩＴＥＣ社）を用いて超音波破砕を行った。３０秒間の超音波処理を３回繰り返す操作を行い、懸濁液が透明になることを確認した。
超音波破砕後の懸濁液を９５℃  １０分加温し易熱性タンパク質を変性させ、１７０００×ｇ  １０分遠心し上清を回収した。こうして得た粗抽出液に対して５００μｌのＮｉ−ＮＴＡ  Ａｇａｒｏｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ社）を添加して４℃で２時間緩やかに撹拌した。この樹脂をエコノパック（登録商標）カラム（Ｂｉｏ−ｒａｄ社）に充てんし、５ｍＭイミダゾールを含むＢｕｆｆｅｒ  Ａ  ２０ｍｌで洗浄した。洗浄後１ｍｌの３００ｍＭイミダゾールを含むＢｕｆｆｅｒ  ＡでＰＦ００１２タンパク質を溶出した。溶出液を４℃、Ｂｕｆｆｅｒ  Ａで２回透析し、さらに５０％Ｇｌｙｃｅｒｏｌを含むＢｕｆｆｅｒ  Ａで４℃終夜透析し、ＰＦ００１２タンパク質溶液を得た。【００５３】
調製例３  ＰＦ００１２相同タンパク質の調製
（１）ＰＦ００１２相同タンパク質の発現用プラスミドｐＥＴ−ＴＢＡ、ｐＥＴ−ＭＪＡの作製
古細菌に属するＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｂａｒｏｐｈｉｌｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉの２つの菌株からＰＦ００１２相同タンパク質の分離を目指して、これらをコードする領域のクローニングを行った。この２つの株由来のＰＦ００１２相同タンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号７、８に示す。
それぞれ、Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃ．ＣＰ００２３７２．１、Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃ．ＮＣ＿０００９０９．１にて公開されている塩基配列情報より、各々のＰＦ００１２相同タンパク質の翻訳領域に相当する配列情報（ＴＥＲＭＰ＿０１８７７：塩基番号１６７４８３６−１６７５５９１、ＭＪ＿０２２５：塩基番号２１５４４９−２１６２４０）を取得し、対応遺伝子をクローニングするためのプライマーの設計及び作製を行った。ＴＥＲＭＰ＿０１８７７遺伝子のクローニングにはＴＢＡ１８７７Ｆ、ＴＢＡ１８７７Ｒのプライマー対、ＭＪ＿０２２５遺伝子のクローニングにはＭＪ２５５Ｆ、ＭＪ２５５Ｒのプライマー対を使用した。それぞれのプライマーの塩基配列をそれぞれ配列番号９、１０、１１、１２に示す。
Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｂａｒｏｐｈｉｌｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉのゲノムＤＮＡを鋳型として、前記のプライマー対とＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＨＳ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社）を使用して当該領域を増幅した。増幅されたＤＮＡの配列を塩基配列１３、１４に示す。上述のｐＥＴ−ＰＦ１２の作製と同様に、この増幅ＤＮＡをそれぞれプラスミドｐＥＴ１５ｂへ挿入し、プラスミドｐＥＴ−ＴＢＡ、プラスミドｐＥＴ−ＭＪＡを作製した。【００５４】
（２）ＰＦ００１２相同タンパク質の発現
ＰＦ００１２相同タンパク質の発現、精製は、使用するプラスミドをｐＥＴ−ＴＢＡ、ｐＥＴ−ＭＪＡに変更し、菌体破砕後の易熱性タンパク質を沈殿させるための高温処理を７５℃  １０分に変更する以外は、上述のＰＦ００１２タンパク質の発現の場合と同様に行い、ＰＦ００１２相同タンパク質であるＴＥＲＭＰ＿０１８７７タンパク質、ＭＪ＿０２２５タンパク質を得た。【００５５】
実施例１  変異型ＰＦ００１２タンパク質の調製
（１）変異型ＰＦ００１２の発現用プラスミド  ｐＥＴ−ｏｐｔＰＦ１２−Ｗ７７Ｆの作製
ＰＦ００１２タンパク質の相同タンパク質ＮｕｃＳの解析（Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ、２００９年、第２８巻、ｐ.２４７９−２４８９）より、ｓｓＤＮＡ結合領域と考えられたＰＦ００１２タンパク質(配列番号１)の７７番目のアミノ酸トリプトファン（コドンＴＧＧ）をフェニルアラニン（コドンＴＴＴ）に変換した変異型ＰＦ００１２をコードする遺伝子を作製した。この変異型ＰＦ００１２タンパク質（以下、Ｗ７７Ｆ変異体と記載する）のアミノ酸配列を配列番号２に示す。
変異導入用のプライマーとして配列番号１５、１６に示されるｍｕｔＦ１、ｍｕｔＲ１を作製した。ｐＥＴ−ｏｐｔＰＦ１２を鋳型として、前記のプライマーとＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標） Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｂａｓａｌ Ｋｉｔ（タカラバイオ社）を用いてＰＣＲを行った。この増幅反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性となったクローンから、Ｗ７７Ｆ変異体発現プラスミドｐＥＴ−ｏｐｔＰＦ１２−Ｗ７７Ｆを得た。【００５６】
（２）Ｗ７７Ｆ変異体の発現、精製
Ｗ７７Ｆ変異体の発現、精製は、使用するプラスミドをｐＥＴ−ｏｐｔＰＦ１２−Ｗ７７Ｆに変更した以外は、上述の野生型ＰＦ００１２タンパク質の場合と同様に行った。【００５７】
実施例２  ＰＦ００１２タンパク質のミスマッチ切断活性
（１）切断活性測定用基質の作製１
ＰＦ００１２タンパク質のミスマッチ切断活性を確認するため、活性検出用の基質を作製した。
ＦＡＭおよびＲＯＸでそれぞれ５’末端を標識した２本の合成ＤＮＡを混合、アニールしたものを基質として使用した。ＲＯＸ標識ＤＮＡはＲＯＸ−ｐｒｏｂｅ−Ｇ、ＲＯＸ−ｐｒｏｂｅ−Ａ、ＲＯＸ−ｐｒｏｂｅ−Ｔ、ＲＯＸ−ｐｒｏｂｅ−Ｃの４種を合成した。これら４種それぞれの塩基配列を配列番号１７、１８、１９、２０に示す。ＲＯＸ−ｐｒｏｂｅ−Ｇ、ＲＯＸ−ｐｒｏｂｅ−Ａ、ＲＯＸ−ｐｒｏｂｅ−Ｔ、ＲＯＸ−ｐｒｏｂｅ−Ｃは５’末端から１１番目の塩基以外は同じ塩基配列をしており、１１番目にはそれぞれＧ、Ａ、Ｔ、Ｃの塩基が挿入されている。ＦＡＭ標識ＤＮＡはＦＡＭ−ｐｒｏｂｅ−Ｇ、ＦＡＭ−ｐｒｏｂｅ−Ａ、ＦＡＭ−ｐｒｏｂｅ−Ｔ、ＦＡＭ−ｐｒｏｂｅ−Ｃの４種を合成した。それぞれの塩基配列を配列番号２１、２２、２３、２４に示す。ＦＡＭ−ｐｒｏｂｅ−Ｇ、ＦＡＭ−ｐｒｏｂｅ−Ａ、ＦＡＭ−ｐｒｏｂｅ−Ｔ、ＦＡＭ−ｐｒｏｂｅ−Ｃも、同じく５’末端から１５番目の塩基（それぞれＧ、Ａ、Ｔ、Ｃ）以外は同じ配列である。これらのうちＲＯＸ標識ＤＮＡとＦＡＭ標識ＤＮＡをそれぞれ１種選んで混合してハイブリダイズさせ、ミスマッチ切断活性を検出するための基質とした。これらの基質はＲＯＸで標識された塩基から数えて１１番目の塩基以外で塩基対を形成し、１１番目の塩基に１か所のミスマッチ塩基対を保有する二本鎖ＤＮＡである。【００５８】
（２）ＰＦ００１２タンパク質によるミスマッチ切断反応（ＰＡＧＥによる検出）
５μＭ  ＲＯＸ標識ＤＮＡ１種  １μｌ、５μＭ  ＦＡＭ標識ＤＮＡ１種  １μｌ、１０×Ｅｘ  ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ社  ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（登録商標）に付属）１μｌ、ＰＦ００１２タンパク質とＨ２Ｏを加えることで最終反応液量１０μｌとした。この反応液を６０℃で１時間保温した後、反応を停止させて、１０％ポリアクリルアミド変性ゲルで電気泳動を行った。泳動後、ゲル中の蛍光シグナルをＦＭＢＩＯ（登録商標）（日立ソリューションズ社）で検出した。【００５９】
図１ａ）はＲＯＸのシグナルを検出した図であり、図１ｂ）は同じ泳動ゲルからＦＡＭのシグナルで検出したものである。図の上部のＲＯＸの左に示されたアルファベットは使用したＲＯＸ標識ＤＮＡの種類を示している。すなわちＧ、Ａ、Ｔ、ＣはそれぞれＲＯＸ−ｐｒｏｂｅ−Ｇ、ＲＯＸ−ｐｒｏｂｅ−Ａ、ＲＯＸ−ｐｒｏｂｅ−Ｔ、ＲＯＸ−ｐｒｏｂｅ−Ｃが使用されたことを示している。同様にＦＡＭの左のアルファベットはＦＡＭ標識ＤＮＡの種類を示し、Ｇ、Ａ、Ｔ、ＣはそれぞれＦＡＭ−ｐｒｏｂｅ−Ｇ、ＦＡＭ−ｐｒｏｂｅ−Ａ、ＦＡＭ−ｐｒｏｂｅ−Ｔ、ＦＡＭ−ｐｒｏｂｅ−Ｃが使用されたことを示している。空欄になっている場合にはＦＡＭ標識ＤＮＡは使用されず、ＲＯＸ標識ＤＮＡのみで反応されたことを示す。
両方の検出系において、Ｇ−Ｇ、Ｇ−Ｔ、Ｔ−Ｇ、Ｔ−Ｔのミスマッチの存在する基質を使用した場合のみ、低分子領域に切断断片と思われるＤＮＡ由来の蛍光シグナルが観察された。このことはＰＦ００１２タンパク質がＧ−Ｇ、Ｇ−Ｔ、Ｔ−Ｇ、Ｔ−Ｔのミスマッチ部位を認識し、その付近でＤＮＡの両鎖を切断する活性を持つことを示している。
また、切断断片によるシグナルがスメアパターンを示さないことから、ＰＦ００１２タンパク質はエキソヌクレアーゼ活性を有しないと考えられた。さらに、単一の蛍光標識ＤＮＡのみを使用した場合にも低分子領域に蛍光シグナルは観察されないことから、ＰＦ００１２タンパク質は一本鎖のＤＮＡに対する切断活性もほぼ有しないことが明らかになった。
ＰＦ００１２タンパク質は切断できるミスマッチの塩基に選択性を持つものの、ミスマッチに対する特異性が高く、通常の塩基対を形成する二本鎖ＤＮＡ、および一本鎖のＤＮＡに対しては反応性が低いことが明らかとなった。本タンパク質の高いミスマッチへの特異性は核酸増幅反応への添加という点で、反応阻害を起こしにくく有利である。【００６０】
（３）切断活性測定用基質の作製２
ＰＦ００１２によるミスマッチ切断活性を継時的に観察するため、切断により蛍光シグナルを発する基質を作製した。
５’末端に消光物質であるｅｃｌｉｐｓｅ、３’末端にＦＡＭを結合させた配列番号２５、２６、２７、２８で示される塩基配列のＤＮＡ、ＤＤ−ｐｒｏｂｅ−Ｇ、ＤＤ−ｐｒｏｂｅ−Ａ、ＤＤ−ｐｒｏｂｅ−Ｔ、ＤＤ−ｐｒｏｂｅ−Ｃを合成した。さらに相補鎖側のｔｅｍｐｌａｔｅ  ＤＮＡとして配列番号２９、３０で示されるｔｅｍｐｌａｔｅ−Ｇ、ｔｅｍｐｌａｔｅ−Ｔを作製した。蛍光標識されたＤＮＡとｔｅｍｐｌａｔｅ  ＤＮＡを混合することで、５’末端の塩基から５番目にミスマッチ塩基対を保有する二本鎖ＤＮＡ基質を作製した。【００６１】
（４）ＰＦ００１２タンパク質によるミスマッチ切断反応の継時的観察
５μＭの蛍光標識されたＤＮＡ（ＤＤ−ｐｒｏｂｅ−Ｇ、ＤＤ−ｐｒｏｂｅ−Ａ、ＤＤ−ｐｒｏｂｅ−Ｔ、ＤＤ−ｐｒｏｂｅ−Ｃのいずれか１つ）１．５μｌ、２５μＭ  ｔｅｍｐｌａｔｅ−Ｇ  １μｌ、１０×Ｅｘ  ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ  ２．５μｌ、ＰＦ００１２タンパク質とＨ２Ｏを加えることで２５μｌとした。この反応液を５５℃で１時間反応させ、１分ごとに蛍光強度の変化を観察した。反応および蛍光シグナルの測定にはＴｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｄｉｃｅ（登録商標）Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（タカラバイオ社）を使用した。【００６２】
図２は１分ごとの蛍光強度を測定したものである。未切断の基質ではＦＡＭ由来の蛍光はｅｃｌｉｐｓｅにより消光されている。しかし、ＰＦ００１２タンパク質により基質が切断されると、ＦＡＭとｅｃｌｉｐｓｅとの間の距離が増大するためＦＡＭの蛍光が観察できるようになる。
実際にＧ−Ｇ、Ｇ−Ｔミスマッチの存在する基質を使用した場合のみ蛍光強度の上昇が観察でき、Ｇ−ＡミスマッチやＧ−Ｃ塩基結合を保持する基質では蛍光強度の上昇は観察できなかった。この実験においてもＰＦ００１２タンパク質はＧ、Ｔの介在するミスマッチを切断する活性を持つことが示された。また、個々のミスマッチ塩基対に対する切断活性は、反応開始時点の初速度、つまり、直線性を保持している区間の傾きにそれぞれの基質の蛍光強度の補正を加えた値で表される。図２の曲線から算出される反応の初速度の比較からは、ＰＦ００１２タンパク質のＧ−Ｇミスマッチに対する切断活性は、Ｇ−Ｔミスマッチに対するより２倍程度高いことが分かった。【００６３】
実施例３  ＰＦ００１２相同タンパク質のミスマッチ切断活性
（１）ＰＦ００１２相同タンパク質によるミスマッチ切断反応
Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｂａｒｏｐｈｉｌｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ由来のＰＦ００１２相同タンパク質についても、ミスマッチ切断活性およびその塩基特異性について検証した。
酵素タンパク質をＰＦ００１２相同タンパク質（ＴＥＲＭＰ＿０１８７７タンパク質、ＭＪ＿０２２５タンパク質）に変更した以外は、ＰＦ００１２タンパク質によるミスマッチ切断反応の継時的観察と同様に行い、ミスマッチ切断活性を蛍光強度の増加を指標に観察した。
その結果、図３に示す通り、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｂａｒｏｐｈｉｌｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ由来のタンパク質についても、ＰＦ００１２タンパク質と同様にＧ、Ｔの介在するミスマッチ部位を切断する活性を持つことが示された。【００６４】
実施例４  ＰＦ００１２タンパク質添加によるＰＣＲ法を用いた遺伝子増幅のエラー率の減少
ＰＦ００１２タンパク質は、二本鎖核酸中のミスマッチ塩基対を認識してその両鎖を切断することができる。またこのタンパク質は耐熱性であるため、ＰＣＲのような高温の反応系に直接添加することが可能である。ＰＣＲ中に生じたミスマッチ塩基対を含む二本鎖核酸を特異的に切断することで、増幅反応で生じるエラーを抑制することが期待できる。【００６５】
（１）ＰＦ００１２タンパク質を添加したＰＣＲ
ＰＣＲの反応液にＰＦ００１２タンパク質を添加し、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８のゲノムＤＮＡを鋳型に４個のプライマー対を用いてＰＣＲを行った。使用したプライマー対はＴｔｈ１Ｆ（配列番号３１）とＴｔｈ１Ｒ（配列番号３２）、Ｔｔｈ２Ｆ（配列番号３３）とＴｔｈ２Ｒ（配列番号３４）、Ｔｔｈ３Ｆ（配列番号３５）とＴｔｈ３Ｒ（配列番号３６）、Ｔｔｈ４Ｆ（配列番号３７）とＴｔｈ４Ｒ（配列番号３８）である。Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（タカラバイオ社）を鋳型として、上記プライマー対とＰＦ００１２タンパク質を添加し、ＴａＫａＲａ  Ｔａｑ（登録商標）  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｖｅｒｓｉｏｎ（タカラバイオ社）を用いて、９８℃１０秒、５５℃３０秒、７２℃１分の条件で３０サイクル行うＰＣＲを行った。【００６６】
（２）ＰＣＲによるエラー率の算出
上記で増幅したＤＮＡ断片をＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ―ｕｐ（タカラバイオ社）を用いて精製し、そのＤＮＡ断片をｐＭＤ１９（ｓｉｍｐｌｅ）プラスミド（タカラバイオ社）にＴＡクローニングを行った。各増幅ＤＮＡ断片につき９６個、合わせて３８４個のクローンのプラスミドについて増幅領域の塩基配列決定を行った。
目的ＤＮＡを含まないものや塩基配列解析操作時に生じた誤りと考えられる配列情報を取り除いたのち、増幅領域の塩基配列を元のゲノムＤＮＡ配列と比較し、異なった塩基数を解析された総塩基数で割ってエラー率とした。
ＰＦ００１２タンパク質を含まないＰＣＲから増幅されたＤＮＡ中には、１２８８２６ｂｐ中７１ｂｐの間違いが見いだされエラー率は０．０５５％であった。ＰＦ００１２タンパク質を添加したＰＣＲでは９７１１２ｂｐ中２８ｂｐの間違いが見いだされ、エラー率は０．０２９％であった。
このように、ＰＣＲの反応液にＰＦ００１２タンパク質を添加するだけで、核酸増幅によって生じるエラーを減らすことが可能であった。【００６７】
実施例５  Ｗ７７Ｆ変異体のミスマッチ切断活性
ＰＦ００１２タンパク質はもともとＧ、Ｔを含むミスマッチ塩基対に対して選択性を持っている。このタンパク質に変異を導入することで、認識するミスマッチ塩基対をさらに限定させた酵素タンパク質を作製することを試みた。【００６８】
（１）Ｗ７７Ｆ変異体によるミスマッチ切断反応の継時的観察
実施例１で作製されたＷ７７Ｆ変異体のミスマッチ切断活性、およびその塩基特異性を前述の蛍光ＤＮＡ基質を用いて観察した。ＰＦ００１２タンパク質に変えて、Ｗ７７Ｆ変異体を使用し、ＤＤ−ｐｒｏｂｅ−Ｇ、ＤＤ−ｐｒｏｂｅ−Ｔとｔｅｍｐｌａｔｅ−Ｇ、ｔｅｍｐｌａｔｅ−Ｔを組み合わせて実験を行った。そのほかの反応条件は実施例２（４）の継時的ミスマッチ切断活性の測定と同様に行った。【００６９】
図４にあるように、Ｗ７７Ｆ変異体はＧ−Ｇのミスマッチはよく切断できるが、Ｇ−Ｔのミスマッチに対する切断活性はその１／２０以下であり、Ｔ−Ｔのミスマッチについては切断できなかった。野生型ＰＦ００１２タンパク質のＧ−Ｔのミスマッチに対する活性は図２にあるようにＧ−Ｇのミスマッチに対する活性と比較すると１／２程度であるので、Ｗ７７Ｆ変異体は、Ｇ−Ｇのミスマッチに対してより特異的な切断活性を持っていることが分かった。【００７０】
実施例６  Ｗ７７Ｆ変異体添加による希少混入変異型遺伝子の特異的増幅
（１）鋳型プラスミドの調製
変異遺伝子増幅試験のため、鋳型となるプラスミドを調製した。
Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃ．ＮＧ＿０１７０１３で公開されているｈｕｍａｎ  ＴＰ５３遺伝子領域の配列情報から配列番号３９、４０でそれぞれ示される２種のプライマー、ＴＰ５３ＣｌｏｎｅＦとＴＰ５３ＣｌｏｎｅＲを設計、合成した。これらのプライマーを用いてｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を鋳型として、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標） ＨＳ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを使用して当該領域を増幅した。増幅した領域の塩基配列情報は配列番号４１に示す。この増幅したＤＮＡ断片をプラスミドｐＭＤ１９（ｓｉｍｐｌｅ）（タカラバイオ社）にＴＡクローニングを行った。得られたプラスミドをｐＴＰ５３（Ｇ）とした。このｐＴＰ５３（Ｇ）を鋳型にＴＰ５３遺伝子の増幅領域の９９番目の塩基ＧをＡに変換するため、変異導入用プライマーとして配列番号４２、４３に示されるＴＰ５３ＡＦ、ＴＰ５３ＡＲを設計、作製した。プラスミドｐＴＰ５３（Ｇ）を鋳型にこの変異導入用プライマー対とＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標） Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｂａｓａｌ Ｋｉｔを用いて目的部位のＧをＡに変換した変異体プラスミドｐＴＰ５３（Ａ）を作製した。【００７１】
（２）特異的変異型遺伝子切断用プローブの設計、調製
特異的変異型遺伝子切断用オリゴヌクレオチドとして、ｐＴＰ５３（Ｇ）上の変異を導入した部位の５´側に８塩基、３´側に７塩基伸ばした領域の相補鎖の配列を持ち、変異部位に対応するＣをＧに変換したオリゴヌクレオチドを設計した。本オリゴヌクレオチドはｐＴＰ５３（Ｇ）にハイブリダイズするとＧ−Ｇのミスマッチを生じる。また、このオリゴヌクレオチドからの伸長反応が起こらないように、オリゴヌクレオチドの３’末端のヒドロキシ基はアミノ基に置換されている。このオリゴヌクレオチドを特異的ＳＮＰ切断用オリゴヌクレオチド、ＴＰ５３ｄｅｇと命名した。ＴＰ５３ｄｅｇの塩基配列を配列番号４４に示す。【００７２】
（３）特異的変異型遺伝子増幅抑制ＰＣＲ
プラスミドｐＴＰ５３（Ｇ）単独、プラスミドｐＴＰ５３（Ａ）単独、ならびに両プラスミドを混合したもののそれぞれを鋳型として、Ｗ７７Ｆ変異体とＴＰ５３ｄｅｇを添加しＰＣＲを行った。プラスミドの混合比はｐＴＰ５３（Ｇ）  １００ｎｇに対し、ｐＴＰ５３（Ａ）  １００ｎｇ（１／１）、１０ｎｇ（１／１０）、１ｎｇ（１／１００）、１００ｐｇ（１／１０００）、１０ｐｇ（１／１００００）を混合したものをそれぞれ準備した。反応液はＲｏｃｈｅ社のＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標） ４８０ Ｈｉｇｈ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｍｅｌｔｉｎｇ Ｍａｓｔｅｒに従って調製した。増幅用プライマーとして配列番号４５、４６でそれぞれ示されるプライマー  ＴＰ５３ＡｍｐＦ、ＴＰ５３ＡｍｐＲを終濃度３μＭ、特異的変異型遺伝子切断用オリゴヌクレオチドとしてＴＰ５３ｄｅｇを終濃度で３μＭ添加し、Ｗ７７Ｆ変異体を加えて最終容量を２０μｌとした。ＰＣＲおよび蛍光検出はＲｏｓｃｈ社のＬＣ４８０で行った。ＰＣＲの反応条件は、９５℃  ５分の予温の後、９５℃  １０秒、９５℃  ２０秒、７２℃  ２０秒の３ｓｔｅｐ反応を４０ｃｙｃｌｅ行い、最後に解離反応として９５℃  １分、４０℃  １分の後、５０℃から９５℃まで継時的に温度を上昇させ、各温度の蛍光強度を観察した。また、Ｗ７７Ｆ変異体を添加しない反応液で同様の測定を行った。【００７３】
（４）希少変異型遺伝子の検出
このＰＣＲの増幅曲線を示したのが図５となる。また、この測定結果から計算されるＣｔ値を表１に示す。反応液にＷ７７Ｆ変異体を含まない場合には、鋳型の混合比によるＣｔ値の変化はほとんど観察されなかった。一方、Ｗ７７Ｆ変異体を添加してＰＣＲを実施した場合は、プラスミドｐＴＰ５３（Ｇ）を単独で鋳型に用いる反応は抑制を受けて、Ｃｔ値で１０以上の遅れとなった。このことはこのプラスミドからのＤＮＡの増幅がＷ７７Ｆ変異体によって１０００倍以上抑制されていることを示している。一方、プラスミドｐＴＰ５３（Ａ）を単独で鋳型に用いる増幅についてはＷ７７Ｆ変異体を加えた場合でも、Ｃｔ値はほぼ変化せず、ほとんど抑制を受けなかった。また、プラスミド混合物を鋳型とした場合には、ｐＴＰ５３（Ａ）の量に応じた増幅が観察できた。このことは、Ｗ７７Ｆ変異体はＰＣＲの反応液中にｐＴＰ５３（Ｇ）とＴＰ５３ｄｅｇが形成するＧ−Ｇのミスマッチ塩基対を含む二本鎖核酸は切断するにもかかわらず、ｐＴＰ５３（Ａ）とＴＰ５３ｄｅｇが形成するＧ−Ａのミスマッチ塩基対に対してはほとんど切断活性を示さないことを示している。また、ミスマッチを持たない核酸に対しては、Ｗ７７Ｆ変異体は増幅阻害効果を示さないことが分かった。さらに、ｐＴＰ５３（Ｇ）に対して１／１００００のコピー数のｐＴＰ５３（Ａ）が含まれている場合にもＣｔ値はｐＴＰ５３（Ｇ）プラスミド単独の場合より小さく、Ｗ７７Ｆ変異体によって１/１００００の混入比率の鋳型からも変異型（Ａ）の遺伝子領域が特異的に増幅されていることを示唆している。
【００７４】
【表１】
0006009649.tif 000002
【００７５】
各増幅産物を５０℃から９５℃まで温度上昇させながら蛍光強度を測定し、融解曲線解析（Ｍｅｌｔｉｎｇ  ｃｕｒｖｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）を行った。各温度に対する蛍光強度の一次微分のグラフを示したものが図６である。図６ａ）にあるようにＷ７７Ｆ変異体を添加せずＰＣＲを行った場合には、ｐＴＰ５３（Ｇ）を単独で鋳型に用いた増幅産物の解離曲線解析で９０．２℃にｐｅａｋが現れた。ｐＴＰ５３（Ａ）を単独で鋳型に用いた場合には、８９．６℃のｐｅａｋとなり、さらに両プラスミドが１対1で存在するヘテロ２重鎖の場合には、単独の際に現れるｐｅａｋに加えて８８．５℃付近の幅の広いｐｅａｋを示した。このように解離曲線の一次微分のｐｅａｋの違いを利用して、野生型（Ｇ）と変異型（Ａ）を有する鋳型を判別することが可能である。
Ｗ７７Ｆ変異体を添加しＰＣＲを行った場合は、図６ｂ）にあるようにプラスミドｐＴＰ５３（Ａ）の混合比率が１／１００以上の場合にはｐＴＰ５３（Ａ）を単独で鋳型に用いた場合の波形とほぼ同じとなり、ｐＴＰ５３（Ａ）のみを鋳型とした増幅のみが起こっていることが示された。１／１０００、１／１００００の混合比率の場合にもｐＴＰ５３（Ａ）に由来すると思われる８９．６℃のピークが観察でき、同時にヘテロ２重鎖に由来すると思われる８８．５℃付近の幅の広いピークもみられた。このことは、これらの混入率の場合にもｐＴＰ５３（Ａ）由来の断片が優先的に増幅されていることを示している。【００７６】
本実施例において、反応液中にＰＦ００１２タンパク質の変異体と目的遺伝子領域の塩基配列との間にミスマッチを生じるオリゴデオキシヌクレオチドを添加することにより、前記塩基配列を持つ遺伝子の増幅を抑制し、希少なＳＮＰを有する遺伝子を特異的に増幅することが可能になることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００７７】
本発明は、遺伝子工学、生物学、医学、農業等幅広い分野において有用である。
【配列表フリーテキスト】
【００７８】
SEQ ID NO:1 ; The amino acid sequence of PF0012 from Pyrococcus furiosus
SEQ ID NO:2 ; The amino acid sequence of PF0012 Y77F mutant
SEQ ID NO:3-4 ; A designed oligonucleotide primer for PCR
SEQ ID NO:5 ; The nucleic acid sequence of inserted DNA in the circular double stranded DNA for cloning PF0012 gene.
SEQ ID NO:6 ; The nucleic acid sequence of inserted DNA in the circular double stranded DNA for cloning a designed sequence deduced from PF0012 amino acid sequence.
SEQ ID NO:7 ; The amino acid sequence of TERMP_01877 from Thermococcus barophilus
SEQ ID NO:8 ; The amino acid sequence of MJ_0225 from Methanocaldococcus jannaschii
SEQ ID NO:9-12 ; A designed oligonucleotide primer for PCR
SEQ ID NO:13 ; The nucleic acid sequence of inserted DNA in the circular double stranded DNA for cloning TERMP_01877 gene.
SEQ ID NO:14 ; The nucleic acid sequence of inserted DNA in the circular double stranded DNA for cloning MJ_0225 gene.
SEQ ID NO:15-16 ; A designed oligonucleotide primer for PCR
SEQ ID NO:17-30 ; A designed oligonucleotide DNA for assay of a mismatch nuclease activity.
SEQ ID NO:31-40 ; A designed oligonucleotide primer for PCR
SEQ ID NO:41 ; The nucleic acid sequence of inserted DNA in the circular double stranded DNA for cloning partial TP53 gene.
SEQ ID NO:42-43 ; A designed oligonucleotide primer for PCR
SEQ ID NO:44 ; A designed oligonucleotide DNA for suppression of amplification of specific TP53 fragment
SEQ ID NO:45-46 ; A designed oligonucleotide primer for PCR
【図１】
0006009649.tif 000003
【図２】
0006009649.tif 000004
【図３】
0006009649.tif 000005
【図４】
0006009649.tif 000006
【図５】
0006009649.tif 000007
【図６】
0006009649.tif 000008
【配列表】
0006009649000001.app