(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗線維化剤として用いられるＶＡＰ−１阻害剤であって、
前記ＶＡＰ−１阻害剤は、配列番号１から３からなる群から選択される１から３のＣＤＲコンセンサス配列を有する完全ヒト抗ＶＡＰ−１抗体であり、
前記抗体は、配列番号１９に示される重鎖可変領域及び配列番号４２に示される軽鎖可変領域を有するか、配列番号２０に示される重鎖可変領域及び配列番号４３に示される軽鎖可変領域を有するか、配列番号２１に示される重鎖可変領域及び配列番号４４に示される軽鎖可変領域を有するか、配列番号２２に示される重鎖可変領域及び配列番号４５に示される軽鎖可変領域を有するか、または配列番号２３に示される重鎖可変領域及び配列番号４６に示される軽鎖可変領域を有し、
前記ＶＡＰ−１阻害剤は、肺線維症、糖尿病性腎症に起因するものを含む腎線維症、およびＣＯＰＤから選択される線維性疾患の治療に用いるためのものであるＶＡＰ−１阻害剤。
【請求項２】
請求項１に記載のＶＡＰ−１阻害剤において、
前記抗体は、配列番号４７で示される重鎖ポリペプチドと配列ＩＤ番号４８で示される軽鎖ペプチドとを有する完全ヒト組み換え抗体である
ことを特徴とするＶＡＰ−１阻害剤。
【請求項３】
前記線維性疾患を治療する薬を製造するための請求項１または請求項２に記載のＶＡＰ−１阻害剤の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＶＡＰ−１阻害剤及び抗線維化剤としてのＶＡＰ−１阻害剤の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
線維性疾患は通常、外傷または慢性炎症後の創傷治癒過程での障害の結果起こる。線維性の病変は化学的及び生物的傷害に日常的に曝される臓器（例えば、肝臓、肺、皮膚、腎臓）に特に多い。急性的なものであるか慢性的なものであるかに係らず、疾患は異常な線維芽細胞の活性化及び細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の蓄積といった共通の特徴を共有し、正常な組織が傷ついた組織に取って代わられる場合、臓器機能の喪失につながる。病状は進行性、かつしばしば不可逆的であり、予後不良や低い生存率を伴う。
【０００３】
線維性瘢痕の組織は損傷の原因に係らずかなり類似する。線維症の深刻さの診断や検証は予後の見地から極めて重要である。治療の決定プロセスは、線維症の評価、その進行、及び合併症の発症に多くを依拠する。肝線維症において、経皮肝生検は肝疾患の評価やステージ分類の最も信頼のおける規準である。しかしながら、経皮肝生検は、回避不能なリスクや、多くの場合痛みや不快感を引き起こす合併症を伴う侵襲的手段である。この手段による合併症が原因の死亡率は１：１０００から１：１０，０００に及ぶ（Ｃｒｏｃｋｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６）。
【０００４】
血清モノアミンオキシダーゼ活性のレベルは、線維症に関係する肝硬変、慢性肝炎、肝臓がんの患者では上昇し、リウマチ性関節炎や全身性紅斑性狼瘡といった炎症性結合組織疾患の患者では正常であることが分かっている（ＭｃＥｗｅｎ  ａｎｄ  Ｃａｓｔｅｌｌ  １９６７，  Ｊ  Ｌａｂ  Ｃｌｉｎ  Ｍｅｄ．  ７０：３６−４７；  Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．  １９７１  Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ．  ４：４９−５８；  Ｍａ  Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９７６，  Ｐｒｏｃ  Ｓｏｃ  Ｅｘｐ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ．  １５１：４０−３）。しかしながら、血清モノアミンオキシダーゼ活性の上昇は単に組織損傷への反応またはマーカーとして考えられ、線維症発症に関与することは知られていなかった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従来の治療方法は主に線維症の炎症過程をターゲットとしており、コルチロイドや免疫抑制薬を用いる。しかしながら、残念なことに、このような薬品は臨床効果がほとんど、あるいは全くなく、線維性疾患を治療する新たな薬が明確に必要とされている。
【０００６】
本発明のいくつかの目標は、抗線維化剤としてのＶＡＰ−１阻害剤と、線維性疾患治療の薬を製造する際のＶＡＰ−１阻害剤の使用と、治療が必要なヒト対象にＶＡＰ−１阻害剤を有効量投与し、線維性疾患を予防、治療、緩和する方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的の実施形態において、ＶＡＰ−１阻害剤は、配列番号１から３からなる群から選択される１から３のＣＤＲコンセンサス配列を有する完全ヒト抗ＶＡＰ−１抗体からなり、前記抗体は、配列番号１９に示される重鎖可変領域及び配列番号４２に示される軽鎖可変領域を有するか、配列番号２０に示される重鎖可変領域及び配列番号４３に示される軽鎖可変領域を有するか、配列番号２１に示される重鎖可変領域及び配列番号４４に示される軽鎖可変領域を有するか、配列番号２２に示される重鎖可変領域及び配列番号４５に示される軽鎖可変領域を有するか、または配列番号２３に示される重鎖可変領域及び配列番号４６に示される軽鎖可変領域を有し、前記ＶＡＰ−１阻害剤は、肺線維症、糖尿病性腎症に起因するものを含む腎線維症、およびＣＯＰＤから選択される線維性疾患の治療に用いるためのものである。
【００１２】
さらに別の実施形態では、前記抗体は、配列番号４７で示される重鎖ポリペプチドと配列番号４８で示される軽鎖ペプチドとを有する組み換え完全ヒト組換抗体からなる。
【００１５】
本発明の他の具体的な実施例は従属クレームで示される。
本発明の他の目的、詳細及び効果は以下の図面、詳細な説明及び実施例から明らかになるものと思われる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
以下では、本発明は添付の図面を参照して好ましい実施形態によってさらに詳細に記載される。
【図１】ＶＡＰ−１抗体ＢＴＴ−１０２９の投与によりＣＣ１４により誘発された肝線維症がほぼ完全に予防されることを示す図である。鉱油（ＭＯ、対照群）、ＣＣｌ４またはＶＡＰ−１抗体と並行してＣＣｌ４を注入されたＷＴ及びＶＡＰ−１ノックアウトマウスから得た肝臓のシリウスレッド染色。Ｉｍａｇｅ  Ｊによる限界値分析を用いて線維性瘢痕の定量測定が行われた。３つのセットから得られた平均±ＳＥＭが示される。倍率ｘ１０
【図２】ＣＣｌ４線維症誘発にも係らず、ＶＡＰ−１抗体投与肝臓及びＶＡＰ−１ノックアウト肝臓で肝炎及び壊死部分が顕著に欠如することを示す。壊死肝細胞（矢じり部分）及び進行中の肝炎（矢印）を強調するｘ２０倍率のヘマトキシリン・エオシン染色が示される。
【図３】ＶＡＰ−１抗体が線維性組織におけるエラスチン発現及びコラーゲンＩＶの増加を防ぐことを示す。コラーゲンＩＶ、エラスチン及びラミニン染色の定量測定はＩｍａｇｅ  Ｊによる限界値分析を用いて行われた。３つのセットから得られた平均±ＳＥＭが示される。
【図４】ｍＲＮＡレベルが肝星細胞及び線維芽細胞に対するＶＡＰ−１の規制効果を示すことを明らかにする。エラスチン、ａＳＭＡ、ＶＡＰ−１及びＴＩＭＰ１の量的ＲＴ−ＰＣＲ分析が示される。データは３回測定された３匹のマウスから得た平均の±ＳＥＭとして示される。＊ｐ＜０．０５，  ＊＊＜０．０１，  ＊＊＊＜０．００１  （ＡＮＯＶＡ）
【図５】ＣＣ１４により誘発された肝線維症に反応して、血清での可溶性ＶＡＰ−１及びＳＳＡＯ活性が増加することを示す。図５Ａは、時間分解蛍光ＤＥＬＦＩＡアッセイで分析された、血清の可溶性ＶＡＰ−１レベルに対するＣＣ１４により誘発された肝線維症の影響を示す。図５Ｂは、放射化学的アッセイにより、ＣＣ１４により誘発されたＷＴ肝臓の血清でＳＳＡＯ活性レベルの上昇が見つかったことを示す。
【図６】ＣＣ１４によって誘発された糸球体病変がＶＩＰ−１ノックアウトマウス及びＶＩＰ−１抗体投与Ｃ５７ＢＬ／６マウスで救済されることを示す。糸球体を強調するｘ４０倍率のヘマトキシリン・エオシン染色が示される。
【図７】ＣＣ１４により誘発された糸球体線維症の結果としてのコラーゲンの蓄積が、ＶＡＰ−１ノックアウトマウス及びＶＡＰ−１抗体投与マウスで大幅に減少することを示す。鉱油（ＭＯ、対照群）、ＣＣｌ４またはＶＡＰ−１抗体と並行してＣＣｌ４を注入されたＷＴ及びＶＡＰ−１ノックアウトマウスから得た腎臓のシリウスレッド染色が示される。Ｉｍａｇｅ  Ｊによる限界値分析を用いて線維性瘢痕の定量測定が行われた。３つのセットから得られた平均±ＳＥＭが示される。倍率ｘ４０
【図８】ビヒクル投与マウスと比べ、タバコ煙に曝されたＶＡＰ−１抗体（ＢＴＴ−１０２９）投与マウスから得た気管支肺胞洗浄液で細胞総数が減少することを示す。
【図９】ビヒクル投与マウスと比べ、タバコ煙に曝された対照ロフルミラスト投与マウスから得た気管支肺胞洗浄液で細胞総数が減少することを示す。
【図１０】ＮａＣｌ０．９％投与対照群と比べ、デキサメタゾン投与群及びＳＳＡＯ阻害剤（ＢＴＴ−２０８９）投与群の双方で中膜新生が大幅に減少することを示す。
【図１１】ＮａＣｌ０．９％投与対照群と比べ、デキサメタゾン投与群及び双方のＳＳＡＯ阻害剤（ＢＴＴ−２０８９）投与群で内膜新生が大幅に減少することを示す。
【図１２】ヘマトキシリン・フロキシン・サフラン（ＨＰＳ）染色された血管セグメントの例を示す。対照群Ａと比べ、ＳＳＡＯ阻害剤投与群Ｃ及びＤでルーメンの大きさが増加する。Ａ−ＮａＣｌ０．９％群；Ｂ−デキサメタゾン；Ｃ−ＢＴＴ２０８９  １０ｍｇ／ｋｇ；Ｄ−ＢＴＴ−２０８９  ３０ｍｇ／ｋｇ
【図１３】抗ＶＡＰ−１抗体またはイソタイプ適合対照抗体で染色された、正常な肝臓、ＮＡＳＨ硬変肝臓及びＡＬＤ硬変肝臓の組織を示す。ＶＡＰ−１染色は正常またはイソタイプ対照に比べてＮＡＳＨ硬変肝臓及びＡＬＤ硬変肝臓で暗く示され、線維症部分におけるＶＡＰ−１の発現の増加を反映する。
【図１４】抗ＶＡＰ−１、抗ＣＤ３１及び抗コラーゲンＩＶ抗体で染色された正常な肝臓及びＮＡＳＨ硬変肝臓の組織を示す。ＶＡＰ−１染色は矢印で示され、主にＮＡＳＨ硬変肝臓に現れて線維症部分におけるＶＡＰ−１の発現の増加を反映する。
【図１５】抗ＶＡＰ−１、抗ＣＤ９０及び抗ＣＤ３抗体で染色されたＮＡＳＨ硬変肝臓の組織を示す。ＶＡＰ−１染色は矢印で示され、ＮＡＳＨ硬変肝臓に現れて線維症部分におけるＶＡＰ−１の発現の増加を反映する。
【図１６】抗ＶＡＰ−１及び抗平滑筋アクチン抗体で染色された肝星細胞及び抗ＶＡＰ−１、抗ＣＤ−９０及び抗コラーゲンＩＶ抗体で染色された肝筋線維芽細胞を示す。ＶＡＰ−１染色は矢印で示され、肝星細胞及び肝筋線維芽細胞に現れる。
【図１７】ｓＶＡＰ−１レベル及びそれに対応する組織学的な線維症ステージの散布図である。直線は中央値を示す。
【図１８】重篤な肝線維症（Ｆ２−４）（図１８Ａ）、進行性の肝線維症（Ｆ３−４）（図１８Ｂ）及び硬変（Ｆ４）（図１８Ｃ）を予測する単独のバイオマーカーとして用いられるＶＡＰ−１の受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を示す。
【図１９】重篤な線維症（Ｆ２−４）（図１９Ａ）、進行性の線維症（Ｆ３−４）（図１９Ｂ）及び硬変（Ｆ４）（図１９Ｃ）を予測する線維化スコアの受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を示す。線維化スコアはｓＶＡＰ−１レベル、糖尿病の状態及びＡＳＴ／ＡＬＴ比率から求められる（０．８３７＋ｓＶＡＰ−１（ｎｇ／ｍｌ）ｘ０．００１＋Ｄｉａｂｅｔｅｓ（ｙｅｓ＝１  ｎｏ＝０）ｘ０．５９１＋ｌｏｇＡＳＴ／ＡＬＴｘ０．８）。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、セミカルバジド感受性アミンオキシダーゼ（ＳＳＡＯ）としても知られ、かつヒト遺伝子ＡＯＣ３によって定義される血管接着タンパク質−１（ＶＡＰ−１）が、線維性組織の形成において直接的な役割を果たすという驚くべき発見に基づく。これまで、ＶＡＰ−１が、組織への白血球の移動を媒介することによって多くの炎症性疾患に関与することは示されてきたが、線維症の発症自体に直接的に関与することは示されていなかった。
【００１８】
「線維症」という用語は臓器または組織における過度に連結した組織の形成または存在を意味する。線維症は組織の損傷ないし炎症といった刺激に対する修復または補充反応として生じることもある。
【００１９】
本発明の基礎となる目的の一つは、線維性損傷に対し臓器を保護する際のＶＡＰ−１阻害剤の役割を検証することであった。例えば、マウスにおいて四塩化炭素により引き起こされた慢性線維性肝損傷、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）のタバコ煙により誘発されたマウスモデル、及び、血管リモデリングや血管狭窄症や新生内膜肥厚（線維症）のマウスモデルにおいて、素晴らしい結果が得られている。従って、ＶＡＰ−１阻害剤は実際に抗線維化剤として見なされうる。
【００２０】
ある様態では、したがって、本発明の実施形態は、ＶＡＰ−１阻害剤の有効量を治療が必要なヒト患者に投与することによって体内（人体内）の線維症を減少あるいは治療する方法を提供する。「治療」または「治療する」という用語は、例えば、肝線維症等の線維症やその素因をつくる炎症性疾患といった病気の予防、改善、防止または治癒のために対象に対してＶＡＰ−１阻害剤を投与することを意図し、このような病気としては、急性または慢性肝炎、胆道疾患及び中毒性肝障害、肺線維症、腎線維症（糖尿病性腎症によるものも含む）、骨髄線維症、膵臓線維症、強皮症、結合組織病、瘢痕、皮膚線維症、心臓線維症、臓器移植、血管狭窄症、再狭窄、動脈線維症、関節線維症、乳腺線維症、筋肉線維症、後腹膜線維症、甲状腺線維症、リンパ節線維症、膀胱線維症、胸膜線維症及びＣＯＰＤ、気管壁が筋線維芽細胞やコラーゲンの蓄積により線維化し、同様の全ての線維性組織が罹患する病気が挙げられる。
【００２１】
ＶＡＰ−１阻害剤の「有効量」とは、線維症の悪影響が少なくとも改善される量を意味する。ＶＡＰ−１阻害剤の投与量と投与レジュメは、線維性疾患治療に関する臨床分野の当業者によって容易に決定されうる。好ましくは、モノクローナル抗ＶＡＰ−１抗体であるＶＡＰ−１阻害剤は、０．０１ｍｇ／ｋｇから２０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇから１５ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは１．０ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇの量で、１週間に１回から３ヶ月に１回の間の間隔で経脈管内に投与される。あるいは、ＶＡＰ−１阻害剤は、０．１ｍｇ／ｋｇから２０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．２ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは０．５ｍｇ／ｋｇから５ｍｇ／ｋｇの量で、１週間に１回から３ヶ月に１回の間の間隔で皮下に投与される。
【００２２】
ＳＳＡＯの阻害剤を構成する本願の化合物は、約０．１μｇ／ｋｇから約３００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１．０μｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇの用量域内の有効量で投与されても良い。
【００２３】
本願の化合物は１日１回またはｋｇ体重あたりで投与されてもよく、また、１日当たりの総投薬量は１日２、３または４回に分けて投与されてもよい。
【００２４】
前記様態は別の方法で示されてもよい。すなわち、本発明の実施形態は、肝線維症やその素因をつくる炎症性疾患といった線維症を予防、治療及び／または緩和する抗線維化剤としてのＶＡＰ−１阻害剤を提供し、このような病気としては、急性または慢性肝炎、胆道疾患及び中毒性肝障害、肺線維症、腎線維症（糖尿病性腎症によるものも含む）、骨髄線維症、膵臓線維症、強皮症、結合組織病、瘢痕、皮膚線維症、心臓線維症、臓器移植、血管狭窄症、再狭窄、動脈線維症、関節線維症、乳腺線維症、筋肉線維症、後腹膜線維症、甲状腺線維症、リンパ節線維症、膀胱線維症、胸膜線維症及びＣＯＰＤ、気管壁が筋線維芽細胞やコラーゲンの蓄積により線維化し、同様の全ての線維性組織が罹患する病気が挙げられる。したがって、ＶＡＰ−１阻害剤は前記線維性疾患の薬の製造に用いられてもよい。
【００２５】
「ＶＡＰ−１阻害剤」という用語は、ＶＡＰ−１の機能またはそのＳＳＡＯ活性をブロックする能力を有する化合物を意味する。ＶＡＰ−１阻害剤は、遮断抗体及びＳＳＡＯ阻害剤といった２つの主なカテゴリーに分けられてもよい。
【００２６】
本明細書において用いられる「抗ＶＡＰ−１抗体（Ａｂ）」または「モノクローナル抗ＶＡＰ−１抗体（ＭＡｂ）」といった用語は、特にＶＡＰ−１プロテインに結合可能な無傷抗体及びＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２フラグメントといった抗体フラグメントを含む。
【００２７】
本発明の様態に用いられる適当な抗ＶＡＰ−１抗体は先行技術において利用可能であり、さらに、抗体は当業者に公知の方法で製造されてもよい。例えば、米国特許第５，５８０，７８０号に記載のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）１Ｂ２は、ヒトＶＡＰ−１を認識し、凍結切片アッセイにおいて扁桃ＨＥＶに対するリンパ球結合を阻害することができる。ＭＡｂ  １Ｂ２はマウスＩｇＭ抗体であり、ヒトＶＡＰ−１に対して特異的である。国際公開第０３／０９３３１９号に記載のキメラ抗ＶＡＰ−１モノクローナル抗体ＢＴＴ−１００２は、対応のマウス抗体と比べ免疫原性を低下させている。しかしながら、キメラ抗体であることから、ヒト治療への適用性は、その免疫原性及びそれに起因する抗体の生成のため低下する。
【００２８】
本明細書に援用される国際公開第２００８／１２９１２４号は、免疫原性及びサイトカイン放出が減少した完全ヒト抗ＶＡＰ−１抗体を開示する。好ましい完全ヒトモノクローナル抗ＶＡＰ−１抗体としては、配列番号１から３からなる群から選択される１から３つのＣＤＲコンセンサス配列を有する重鎖ポリペチド、及び／または、配列番号２４から２６からなる群から選択される１から３つのＣＤＲコンセンサス配列を有する軽鎖ポリペプチドを備えるものが挙げられる。
【００２９】
他の好ましい抗ＶＡＰ−１抗体としては、配列番号４から８の中から選択される第１のＣＤＲ配列と、配列番号９から１３の中から選択される第２のＣＤＲ配列と、配列番号１４から１８の中から選択される第３のＣＤＲ配列とを備える重鎖ポリペプチド、及び／または、配列番号２７から３１の中から選択される第１のＣＤＲ配列と、配列番号３２から３６の中から選択される第２のＣＤＲ配列と、配列番号３７から４１の中から選択される第３のＣＤＲ配列とを備える軽鎖ポリペプチドを有するものが挙げられる。
【００３０】
本発明の別の実施形態では、完全ヒト抗ＶＡＰ−１抗体は８Ｃ１０として示され、配列番号１９に示される重鎖可変領域及び配列番号４２に示される軽鎖可変領域を有する。本発明のさらに別の実施形態では、抗ＶＡＰ−１抗体は８Ａ４として示され、配列番号２０に示される重鎖可変領域及び配列番号４３に示される軽鎖可変領域を有する。本発明のさらに別の実施形態では、抗ＶＡＰ−１抗体は３Ｆ１０として示され、配列番号２１に示される重鎖可変領域及び配列番号４４に示される軽鎖可変領域を有する。本発明のさらに別の実施形態では、抗ＶＡＰ−１抗体は５Ｆ１２として示され、配列番号２２に示される重鎖可変領域及び配列番号４５に示される軽鎖可変領域を有する。本発明のさらに別の実施形態では、抗ＶＡＰ−１抗体は４Ｂ３として示され、配列番号２３に示される重鎖可変領域及び配列番号４６に示される軽鎖可変領域を有する。これらの抗体はまた、配列番号４７に示される重鎖ポリペプチド及び配列番号４８に示される軽鎖ポリペプチドを有する組換体ｒ８Ｃ１０（ＢＴＴ−１０２３）といった組換体抗体として構成されてもよい。
【００３１】
本実施形態で用いられる適当なＳＳＡＯ阻害剤としては、これらに限られないが、アリルヒドラジンといったヒドラジン誘導体が挙げられ、特に、フェニルアリルヒドラジン及びヒドロキシルアミン（すなわちアミノキシ）誘導体が挙げられる。フェニルアリルヒドラジンのより具体的な例としては、これらに限られないが、２−（フェニル−アリル）−ヒドラジン、Ｎ−［２−（４’−フルオロフェニル）−アリル］−ヒドラジン及び（Ｅ）−１−フルオロ−２−フェニル−３−ヒドラジンプロペンが挙げられ、一方、ヒドロキシルアミン誘導体のより具体的な例としては、これらに限られないが、２−アミノオキシル−１−フェニル−エタノール及び２−アミノオキシル−１−（３’，４’−ジメトキシ−フェニル）−エタノールが挙げられる。このようなＳＳＡＯ阻害剤は国際公開第２００６／０９４２０１号及び国際公開第２００５／０１４５３０号に記載され、本明細書に援用される。他の適当なヒドラジン誘導体としては、これらに限られないが国際公開第２００９／１４５３６０号（本明細書に援用）に記載の２−（４−｛２−［５−（４−アセチルピペラジン−１−イル）ピリジン−２−イル］エチル｝フェニル）アセトヒドラジドといったアセトヒドラジドや、これらに限られないが国際公開第０２／０２０９０号（本明細書に援用）に記載の（１Ｒ，２Ｓ）−２−（１−メチルヒドラジノ）−１−フェニル−１−プロパノール、（１Ｒ，２Ｓ）−２−（１−メチルヒドラジノ）−１，２−ジフェニルエタノール、１−（１’−メチルヒドラジノ）−３−（ｍ−メトキシフェノキシ）−２−プロパノール及び（１Ｓ，２Ｒ）−２−（１−メチルヒドラジノ）−１，２−ジフェニルエタノール（ＢＴＴ−２０７９）といったヒドラジンアルコールや、これらに限られないが国際公開第０３／００６００３号や国際公開第２００５／０８０３１９号（本明細書に援用）に記載の（１Ｓ，２Ｓ）−２−（１−メチルヒドラジノ）−１−インダノールといったヒドラジンインダンが挙げられる。
【００３２】
本実施形態で用いられる適当なＳＳＡＯ阻害剤のさらなる例としては、これらに限られないが、プロペニル−及びプロパギルアミン、４−置換−２−ブチニルアミン、ハロアリルアミン（特に２−及び３−ハロアリルアミン）、ピロリン誘導体、プロパギルジアミン、アリルアミン及びジアミンが挙げられる。前述のＳＳＡＯ阻害剤のより具体的な例としては、これらに限られないが、５−フェノキシペンタ−２，３−ジエニルアミン、４−（４−メトキシフェニル）ブト−３−イニルアミン、４−フェニルブト−３−イニルアミン、２−フェニル−３−フルオロアリルアミン、Ｓ−（Ｅ）−４−（４−アミノ−２−フルオロブト−２−エニルオキシ）−Ｎ−（１−フェニルエチル）ベンズアミド、（Ｅ）−３−フルオロ−４−（４−（メチルスルホニル）フェノキシ）ブト−２−エン−１−アミン、（Ｅ）−３−フルオロ−４−（２−メチルベンゾ［ｄ］チアゾール−５−イルオキシ）ブト−２−エン−１−アミン、（Ｅ）−４−（４−アミノ−２−フルオロブト−２−エニルオキシ）−Ｎ−（１−フェニルエチル）ベンゼンスルホンアミド及び（Ｅ）−２−（４−フルオロフェネチル）−３−フルオロアリルアミン（ＢＴＴ−２０８９、モフェギリン）が挙げられる。このような化合物は、国際公開第２００７／００５７３７号、国際公開第２００５／０８２３４３号、国際公開第２００９／０６６１５２号、国際公開第２００９／０５５００２号及びＰａｌｆｒｅｙｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｕｒａｌ  Ｔｒａｎｓｍ．  （１９９４），  ４１，  ４０７−４１４）（全て本明細書に援用）に記載される。
【００３３】
本実施形態で用いられる適当なＳＳＡＯ阻害剤のさらに別の例としては、これらに限られないが、４，５，６，７−テトラヒドロイミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン誘導体（本明細書に援用される国際公開第０２／３８１５３号に記載）や、国際公開第２００６／０１３２０９号及び米国特許出願公開第２００７／０６６６４６号（本明細書に援用）に記載されるＮ−ヒドロキシ−２−（２−（２−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）アセトアミド）アセトアミド及び５−アミノ−２−ヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシベンジル）ベンズアミドといったカルボキサミド及びＮ２−｛［４−（１，１−ジメチルプロピル）フェニル］スルホニル｝−Ｎ１−ヒドロキシセリンアミドといったスルホンアミドが挙げられる。
【００３４】
さらに、チアゾール及び／またはグアニジン誘導体、特に２アシルアミノトリアゾール誘導体、が本発明の各実施形態での使用に適している。このようなＳＳＡＯ阻害剤のより具体的な例としては、これらに限られないが、Ｎ−｛４−［２−（４−｛［アミノ（イミノ）メチル］アミノ｝フェニル）エチル］−１，３−チアゾール−２−イル｝アセトアミド、Ｎ−｛４−［２−（４−｛［アミノ（イミノ）メチル］アミノ｝フェニル）エチル］−５−［４−（メチルスルホニル）ベンジル］−１，３−チアゾール−２−イル｝アセトアミド、Ｎ−｛４−［２−（４−｛［２−アミノ−１Ｈ−イミダゾール−４−イル）メチル］フェニル｝エチル）チアゾール−２−イル］−アセトアミド、２−（４−｛２−［２−（アセチルアミノ）−１，３−チアゾール−４−イル］エチル｝フェニル）−Ｎ−［アミノ（イミノ）メチル］アセトアミドが挙げられる。このような化合物は、国際公開第２００４／０８７１３８号、国際公開第２００４／０６７５２１号、国際公開第２００６／０２８２６９号、国際公開第２００６／０１１６３１号及び国際公開第２００５／０８９７５５号（全て本明細書に援用）に記載される。
【００３５】
また、各種オキシム誘導体もＳＳＡＯ阻害剤を構成することから、本発明の各種実施形態に用いられてもよい。このようなオキシム誘導体としては、これらに限られないが、本明細書に援用される国際公開第２０１０／０２９３７９号に記載の５−ブロモ−１，３−ベンゾジオキソール−４−カルバルデヒドオキシム、６−エトキシ−１，３−ジメチル−２，４−ジオキソ−１，２，３，４−テトラヒドロピリミジン−５−カルバルデヒドオキシム、１，３−ジメチル−６−（メチルチオ）−２，４−ジオキソ−１，２，３，４−テトラ−ヒドロピリミジン−５−カルバルデヒドオキシムが挙げられる。
【００３６】
また、国際公開第２０１０／０１５８７０号、国際公開第２００５／０７２７３８号、Ｌｙｌｅｓ  Ｇ．  Ａ．，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  Ｖｏｌ．  ２８  ｐｐ２５９−２７６  （１９９６）及びＭｃＤｏｎａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎｕａｌ  ｒｅｐｏｒｔｓ  ｉｎ  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  Ｖｏｌ．  ４２  ｐｐ．  ２２９−２４３  （２００７）（全て本明細書に援用）に記載のジヒドラジン、アリールアルキルアミン、オキサゾリジノン、ハロアルキルアミン及びベンホチアミン（ビタミンＢ１）も本発明の各実施形態においてＳＳＡＯ阻害剤として用いられてもよい。
【００３７】
さらに本発明の様態及び実施形態での使用に適当なＳＳＡＯ阻害剤としては、本明細書に援用される国際公開第２０１０／０６４０２０号に記載のイミダゾピリジン誘導体が挙げられる。
【００３８】
さらに、本発明の実施形態で用いられる適当なＳＳＡＯ阻害剤としては、ＶＡＰ−１のＳＳＡＯ活性を抑制またはブロックする能力を有する、立体異性体、立体異性体の混合物、ＥまたはＺ構造、Ｅ及びＺ構造の混合物、プロドラッグ、代謝産物、結晶性形状、非結晶性形状、水和物、溶媒和物またはその塩が挙げられる。
【００３９】
他の適当なＳＳＡＯ阻害剤は、先行技術において公知のＳＳＡＯアッセイによってスクリーニングや認識されてもよい。このようなアッセイは、モノアミンオキシダーゼ及びその関連酵素に関して記載されるように（Ｈｏｌｔ，  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２４４：３８４−３９２  （１９９７））、結合比色法（ｃｏｕｐｌｅｄ  ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ｍｅｔｈｏｄ）の利用が不可欠なＶＡＰ−１  ＳＳＡＯ活性アッセイを含んでもよい。内皮細胞のＳＳＡＯ活性もまた、アンプレックスレッド試薬（１０−アセチル−３，７−ジヒドロキシフェノキサジン）及びＨ２Ｏ２用の高感度で安定したプローブ（Ｚｈｏｕ  Ｍ，  Ｐａｎｃｈｕｋ−Ｖｏｌｏｓｈｉｎａ  Ｎ．  Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２５３（２）：１６９−７４  （１９９７））を用いて個別に測定可能である。さらに、アミンオキシダーゼ活性は、［７−１４Ｃ］−ベンジルアミン塩酸塩を基質として用いて放射化学的に測定可能である（Ｊａａｋｋｏｌａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ：１５５（６）：１９５３−６５  （１９９９））。ＶＡＰ−１  ＳＳＡＯ酵素源としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞のような細胞株に発現する組換ヒトＶＡＰ−１  ＳＳＡＯが利用可能である（Ｓｍｉｔｈ，  Ｄ．Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １８８：１７−２７  （１９９８））。他の適当なＳＳＡＯ  ＶＡＰ−１酵素源としては、霊長類やげっ歯類といった異なる種の血清や組織試料が挙げられる。
【００４０】
本発明に基づいて使用される場合、ＶＡＰ−１阻害剤は薬学的に利用可能なキャリアまたは希釈剤を含む薬学的組成物や活性成分（ＶＡＰ−１阻害剤）として提供されてもよい。この組成物は、患者のＳＳＡＯ活性を中和（完全ないし部分的に）するのに十分な量のＶＡＰ−１阻害剤、または、このような中和が必要な患者が有する、ＶＡＰ−１の生物学的配位子に結合可能な生得のＶＡＰ−１を含む。
【００４１】
ＶＡＰ−１阻害剤の投与量と投与レジュメは、線維性疾患治療の臨床分野の当業者によって容易に決定されうる。一般的には、ＶＡＰ−１阻害剤による治療の投与量は条件次第で変わるものと思われる。条件としては、処置される患者の年齢、性別及び全体的な健康状態、現行の処置の種類（もしあれば）、処置の頻度と所望の効果の性質、組織損傷の程度、症状の持続期間、及び各医師によって調整されうる他の変数等が挙げられる。所望の投与量は、所望の結果を得るために１回以上の適用で投与可能である。本実施形態の薬学的組成物は単位投薬形態で提供されてもよい。
【００４２】
この薬学的組成物は、投薬の際任意の適当な薬理学的キャリアで投与されてもよい。組成物は、ヒトまたは動物患者の線維性疾患に対し予防的、緩和的、阻止的、または治癒的効果がある任意の形態で投与することができる。
【００４３】
非経口及び局所的投与のための薬学的組成物は、滅菌水溶液または非水性溶媒、懸濁液及び乳剤を含む。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、魚油、及び注射可能な有機エステルである。水性担体としては、水、水−アルコール溶液（生理食塩水を含む）、ならびに緩衝化された医療用非経口ビヒクル（塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース溶液、デキストロースと塩化ナトリウムの溶液、ラクトース含有リンガー溶液を含む）、または固定油が挙げられる。静脈内投与用のビヒクルとしては、流体、栄養補液、リンガーデキストロース等をベースとするもののような電解質補液などが挙げられる。本実施形態の水性組成物には、ナトリウム及びカリウムのリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、炭酸塩のような適当な緩衝化剤、または標的化されるｐＨ範囲に応じたグリシン緩衝液が含まれてもよい。塩化ナトリウムの張性調整剤としての使用もまた有用である。組成物には、安定化剤または保存剤のような他の賦形剤が含まれ得る。有用な安定化賦形剤としては、界面活性剤（ポリソルベート２０及びポリソルベート８０、ポロキサマー４０７）、ポリマー（ポリエチレングリコール、ポビドン）、炭水化物（スクロース、マンニトール、グルコース、ラクトース）、アルコール（ソルビトール、グリセロール、プロピレングリコール、エチレングリコール）、適当なタンパク質（アルブミン）、適当なアミノ酸（グリシン、グルタミン酸）、脂肪酸（エタノールアミン）、抗酸化物質（アスコルビン酸、システインなど）、キレート剤（ＥＤＴＡ塩、ヒスチジン、アスパラギン酸）、または金属イオン（Ｃａ、Ｎｉ、Ｍｇ、Ｍｎ）が挙げられる。中でも有用な保存剤は、ベンジルアルコール、クロロブタノール、塩化ベンズアルコニウム、及び場合によってはパラベンである。
【００４４】
薬学的組成物は、濃縮状または粉末状で提供され、必要に応じて水で戻してもよい。そのような場合には、上記注射／注入用賦形剤用の溶液のための粉末の処方物が使用され得る。凍結乾燥の場合には、ポリマー（ポビドン、ポリエチレングリコール、デキストラン）、糖（スクロース、グルコース、ラクトース）、アミノ酸（グリシン、アルギニン、グルタミン酸）、及びアルブミンを含む特定の抗凍結剤が好ましい。再構成用の溶液がパッケージングに加えられる場合には、これは、例えば、注射用の純水、または塩化ナトリウム溶液、またはデキストロースもしくはグルコース溶液から構成され得る。
【００４５】
治療に用いられる抗ＶＡＰ−１抗体は、化学的にあるいは遺伝子操作によって所望の作用部位に抗体の標準を合わせることが可能な他の薬剤と結合してもよい。あるいは、他の化合物が化学的にあるいは遺伝子操作によって抗体と結合し、抗体に対してさらなる特性、特にＶＡＰ−１結合によって媒介される有害な作用の緩和を促進する抗体の能力を高める特性を付与してもよい。
【００４６】
抗ＶＡＰ−１抗体は化学的にあるいは遺伝子操作によって標識化され、検出可能な抗体を提供してもよい。このような標識化された抗体は、ヒトの線維症部位の画像化、特に線維症部位の体内免疫シンチグラフィーイメージングに有用なツールとなろう。画像化のためには、抗体断片を使用するのが抗線維症治療に対する完全な抗体を用いるアプローチよりも好ましく、完全ヒト抗体に由来する断片は、それらのキメラまたはマウス等価物よりもさらに安全と思われる。
【００４７】
本発明の様態のいくつかは線維性疾患の診断に関する。本発明に関連して、体液（血清や血漿等）中の可溶性ＶＡＰ−１（ｓＶＡＰ−１）の上昇したレベルとその結果上昇したＳＳＡＯ活性が、線維症の度合いと相関関係を持つことが分かった。したがって、本発明の実施形態は、肝線維症やその素因をつくる炎症性疾患といった線維性疾患を診断する方法及び手段を提供する。このような疾患としては、急性または慢性肝炎、胆道疾患及び中毒性肝障害、肺線維症、腎線維症（糖尿病性腎症によるものも含む）、骨髄線維症、膵臓線維症、強皮症、結合組織病、瘢痕、皮膚線維症、心臓線維症、臓器移植、血管狭窄症、再狭窄、動脈線維症、関節線維症、乳腺線維症、筋肉線維症、後腹膜線維症、甲状腺線維症、リンパ節線維症、膀胱線維症、胸膜線維症及びＣＯＰＤ、気管壁が筋線維芽細胞やコラーゲンの蓄積により線維化し、同様の全ての線維性組織が罹患する病気が挙げられる。
【００４８】
実施形態において、体液中の上昇したｓＶＡＰ−１レベル及び／またはＳＳＡＯ活性に基づく線維性疾患の診断は、線維症疾患用の予測バイオマーカーの既存パネル（ｅｘｉｓｔｉｎｇ  ｐａｎｅｌｓ）の分析と組み合わされてもよい。これにより、既存のバイオマーカーの診断能力が改善される。言い換えれば、ｓＶＡＰ−１レベル／ＳＳＡＯ活性は単独で用いられてもよく、あるいは、線維症の存在を予測する新しい非侵襲的な試験として他の臨床的、生化学的マーカーと組み合わされて用いられてもよい。
【００４９】
血清等の体液試料中のｓＶＡＰ−１のレベルは以下の方法で決定されてもよい。可溶性ＶＡＰ−１の定量化が可能な時間解析免疫蛍光アッセイ（ＴＲ−ＩＦＭＡ）（ＤＥＬＦＩＡ）は、ビオチン結合マウス抗ヒトＶＡＰ−１抗体ＴＫ８−１４（Ｂｉｏｔｉｅ  Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ社）をストレプトアビジンが塗布されたマイクロタイタープレート上の捕捉物質として利用する。結合した可溶性ＶＡＰ−１の検出は、ユーロピウム結合マウス抗ヒト抗体ＴＫ８−１８（Ｂｉｏｔｉｅ  Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ社）をトレーサとして用いて行われる。標識は時間分解蛍光を６１５ｎｍで測定し（Ｖｉｃｔｏｒ３マルチラベルカウンター）検出する。蛍光カウント数は試料中に存在する可溶性ＶＡＰ−１の量と直接的に相関する。その後、試料のデータを対照の標準曲線と比較して分析する。
【００５０】
本発明の実施形態では、線維症は、こういった診断が必要である、及び／または、線維症を患っている疑いがある対象から得た体液中のＳＳＡＯ活性に基づき診断される。このような目的に適当な方法がＬｉ  ｅｔ  ａｌ．  ｉｎ  Ｊ．  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．  Ｂ，  ８１０  （２００４）  ２７７−２８２に開示されている。ＳＳＡＯ活性を測定する他の手段及び方法は当該分野において公知である。
【００５１】
なお、本発明の様態はさらに線維症診断に用いられるキットを提供する。実施形態において、当該キットは、ある特定の抗ＶＡＰ−１抗体（例えば、前述の抗ＶＡＰ−１抗体のうちの一つ）といった、ｓＶＡＰ−１量を評価するための一つ以上の試薬を備える。他の実施形態では、当該キットは血清または血漿といった体液中のＳＳＡＯ活性を評価するための一つ以上の試薬を備える。例えば、当該キットは、適当なＳＳＡＯ酵素活性アッセイバッファーと共にＶＡＰ−１  ＳＳＡＯに適当な基質（ベンジルアミン、メチルアミン、アミノケトン、他の脂肪族または芳香族モノアミン等）を備え、かつ、ＳＳＡＯ活性を検出する試薬一式及び方法を備えてもよい。ＳＳＡＯ活性は、モノアミン基質上のＳＳＡＯ活性の活動による過酸化水素の発生を測定する結合アッセイを用いて検出されてもよく、あるいは、ベンジルアミンなどの１４Ｃ標識アミン基質を用いて水溶性アミンの有機溶剤可溶性アルデヒドへの転化をモニタリングすることにより直接測定されてもよい。
【００５２】
技術進歩に伴い本発明の概念を様々な方法で実行できることは当業者に明らかであろう。本発明とその実施形態は下記の実施例には限定されず、特許請求の範囲内で変更可能である。
【実施例】
【００５３】
［実施例１］
〔肝線維症のマウスモデルにおけるＶＡＰ−１阻害剤の効果〕
この検証の目的は、ＶＡＰ−１阻害剤のマウスの線維性肝損傷に対する効果を評価することだった。
【００５４】
ホームオフィス規則（Ｈｏｍｅ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ）に従い、マウスは全てバーミンガム大学のバイオメディカルサービス部（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ｓｅｒｖｉｃｅｓ  ｕｎｉｔ）において従来の条件下で維持・収容された。４匹のマウスがケージ毎に収容され、実験前の一週間その収容状態に順化した。８から１０週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６及びＶＡＰ−１−／−マウス（ＶＡＰ−１欠損のＡＯＣ３遺伝子ノックアウトマウス）が検証に利用された。Ｃ５７ＢＬ／６マウスはバーミンガム大学バイオメディカルサービス部のストック群（ｓｔｏｃｋ  ｃｏｌｏｎｙ）から入手し、一方、ＶＡＰ−１−／−（ＡＯＣ３遺伝子ノックアウト）マウスは契約ブリーダーであるデンマークのタコニック社から入手した。
【００５５】
四塩化炭素（ＣＣｌ４；アルデリッチケミカル（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ））を鉱油に溶かして１ｍｌ／ｋｇの投与量で８週間隔週毎に腹膣内投与して慢性的な肝線維症のマウスモデルを確立した一方、対照群は鉱油のみを与えられた。マウス抗マウスＶＡＰ−１抗体ＢＴＴ−１０２９を投与されたマウスは、ＣＣｌ４投与前及び投与中の２週間、週に一回点滴注射を受けた。動物らはＣＣｌ４の最終的な投与の９６時間後に処分された。イソフルラン麻酔中に心穿刺によって血液試料が引き出され、その後マウスは頸椎脱臼によって処分された。肝臓は解剖され、異なる処置用に４つに切り分けられた。
【００５６】
統計ＡＮＯＶＡがＳＰＳＳ  ｆｏｒ  Ｗｉｎｄｏｗｓバージョン１１．０を用いて行われた。フィッシャーの最小有意差ポストホックテストがその後に続く一元位置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）を用いて２つ以上の可変群に基づき試料の有意性を分析した。
【００５７】
肝臓標本は４％のパラホルムアルデヒド中に固定されて、パラフィンに埋め込まれ、４μｍ切片に切り分けられた。組織病理学的分析用の切片は、標準的な手順に従ってシリウスレッドまたはＨ＆Ｅ染色された。免疫蛍光染色の際、固定されたマウス肝臓は３０％のスクロースによって凍結防止され、急速に凍結され、低温保持装置内で７μｍに切断された。切片は０．１％のトリトンＸ−１００を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳＴ）で軽く１０分間洗浄され、０．１％のＰＢＳＴ中で１０％のヤギ血清により室温で１時間培養された。
【００５８】
エラスチン、コラーゲンＩＶ及び血清−ＰＢＳＴで希釈されたラミニン（アブカム社）を一次抗体により培養した後、スライドがＰＢＳＴ中で３回洗浄され、室温で１時間二次抗体によって培養された。
【００５９】
予想通り、ＣＣｌ４はＣ５７ＢＬ／６マウスで深刻な線維性損傷を引き起こした。８週までに、野生型マウスでは肝細胞の壊死及び進行中の肝炎があるシリウスレッド線維の肝臓含有量が８倍増加した。興味深いことに、ＶＡＰ−１欠損マウス及びＢＴＴ−１０２９が投与された野生型マウスの両方で線維症損傷が大幅に減少した。これらのマウスはほんの少量のシリウスレッド線維を示し、肝組織像は、壊死部分が完全になく深刻ではない肝炎があるに過ぎず、ほぼ正常に見えた（図１及び２）。さらに、成熟マクロファージの数は大幅に少なくなっており、このことは野生型に比べ深刻な損傷がかなり少なくなったことを再度示した（データ示されず）。
【００６０】
肝臓における肝星細胞活性化に関する遺伝子のｍＲＮＡレベルはｑＲＴ−ＰＣＲによって評価された。この目的を達成するために、キアゲンＲＮＡイージーミニキット（＃７４１０４）を用いて全ＲＮＡがマウスの肝臓から抽出された。ＲＮＡは、ランダムプライマー（プロメガ社）及びインビトロジェン社のスパースクリプトＩＩＩを用いてｃＤＮＡテンプレートに逆転写された。ｑＲＴ−ＰＣＲのパラメータは以下の通りだった。変性  ９５°Ｃ  １０分間、増幅  ９５°Ｃ  １０秒間、５５°Ｃ  ３０秒間、７２°Ｃ  １秒間、５５サイクル定量的リアルタイムＰＣＲは参照遺伝子ＧＡＰＤＨ及びロシュ社のプローブを用いてロシュ社ライトサイクラー４８０システムで測定された。発現レベルは「Ｅ方法」（ロシュ社）を用いて定量化された。
【００６１】
データは肝星細胞（ＨＳＣ）の制御による肝線維症の進行におけるＶＡＰ−１の役割を示す。活性化ＨＳＣは線維症の肝臓でＥＣＭ成分（エラスチンを含む）を合成する主要源とされている。ＣＣｌ４が投与された野生型の肝臓は、ＨＳＣｓを発現するαＳＭＡの蓄積及びエラスチンの堆積を意味する、αＳＭＡ及びｍＲＮＡレベルの甚大な増加を示した（図４）。ＢＴＴ−１０２９が投与された野生型のＶＡＰ−１−／−肝臓では野生型肝臓に比べαＳＭＡ及びエラスチン双方のｍＲＮＡレベルが大幅に低かった。エラスチン及びコラーゲンＩＶの違いも共焦点顕微鏡法によって確認されたが、ラミニンレベルは変化しないままだった（図３）。
【００６２】
結論として、ＢＴＴ−１０２９による治療は、肝星細胞の活性化を低下させることにより生成（ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ）した肝線維症のほぼ完全な保護を可能にし、線維性病変における線維芽細胞の発達を制限する。同様の効果がＶＡＰ−１−／−マウスでも実証され、ＣＣｌ４によって引き起こされる損傷に対し完全に近い保護を示した。これらの結果は、ＶＡＰ−１が肝星細胞に対する制御効果を通じて肝線維症の進行における主要な役割を果たすものであることを示す。ＶＡＰ−１  ＳＳＡＯは銅アミンオキシダーゼであり、エラスチンやコラーゲンといったＥＣＭプロテインの架橋に関与する別の銅アミンオキシダーゼであるリシルオキシダーゼと類似している。ＶＡＰ−１のＳＳＡＯ活性もＥＣＭプロテインの架橋形成に直接的に影響する可能性がある。
【００６３】
さらに、血清や肝組織試料のＳＳＡＯ活性は、［７−１４Ｃ］−ベンジルアミン塩酸塩（ｓｐｅｃ．  ａｃｔ．  ５７ｍＣｉ／ｍｍｏｌ）を基質として用い放射科学的に分析された（図５）。血清（４０ｍｇ／ｍｌプロテイン）または組織標本（２ｍｇ／ｍｌプロテイン）は、５μＭのクロルジリン及びパルギリン、及び不特定のバインドチューブ（ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｕｂｅ）で１ｍＭのセミカルバジドとも３７°Ｃで３０分間プレインキュベートされた。［７−１４Ｃ］−ベンジルアミンを基質として含む０．２ｍＭナトリウム−リン酸塩緩衝液（ｐＨ７．４）の最終量２００μｌ中でアッセイを３７°Ｃで１時間実施した。触媒酵素活性反応アッセイを停止し、以前にＪａａｋｋｏｌａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，  １５５，  ６）に記載された通りに処理した。プロテイン濃度はＢｒａｄｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｒａｄｆｏｒｄ，  Ｍ．  Ｍ．，  １９７６，  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ７２，  ２４８）に従ってウシ血清アルブミンを用いてアッセイされた。
【００６４】
この結果によれば、ＢＴＴ−１０２９による治療は、ＣＣｌ４によって引き起こされる肝線維症を予防することに加え、当該肝臓試料のＳＳＡＯ活性を著しく低下させることが分かった。
【００６５】
［実施例２］
〔腎傷害のマウスモデルにおけるＶＡＰ−１阻害剤の腎保護効果〕
四塩化炭素に多く曝されると肝臓と腎臓の両方が損傷する。したがって、腎障害に対するＶＡＰ−１の効果を見るために、実施例１に記載されたＣＣｌ４が投与された動物の腎臓が採取・分析された。
【００６６】
腎臓は４％のパラホルムアルデヒド中に固定されて、パラフィンに埋め込まれ、４μｍ切片に切り分けられた。組織病理学的分析はシリウスレッド及びＨ＆Ｅ染色切片上で行われた。染色は標準的な手順で行われた。シリウスレッド線維の量はソフトウェアＩｍａｇｅ  Ｊを用いた限界値分析によって定量化された。
【００６７】
統計ＡＮＯＶＡがＳＰＳＳ  ｆｏｒ  Ｗｉｎｄｏｗｓバージョン１１．０を用いて行われた。チューキーＨＳＤの最小有意差ポストホックテストがその後に続く一元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）を用いて２つ以上の可変群に基づき試料の有意性を分析した。
【００６８】
ＣＣｌ４を投与されたマウスは部分的及び全体的な変化と共に巣状糸球体変化を見せた。Ｈ＆Ｅ染色はさまざまな病変（例えば、メサンギウム細胞過形成、先端領域の癒着や硬化）を示した。しかしながら、糸球体係蹄が全体的に崩壊し糸球体の断片のみが残る状態が主に見られた（データ示されず）。興味深いことに、ＶＡＰ−１ノックアウトマウス及びＢＴＴ−１０２９投与マウスは糸球体病変から完全に保護された（図６）。
【００６９】
線維症の兆候としての糸球体周辺のコラーゲンの蓄積はシリウスレッド染色でアッセイされた。Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＣＣｌ４を投与すると糸球体係蹄周辺のコラーゲンの蓄積がほぼ２倍になった。興味深いことに、ＶＡＰ−１が欠損またはＶＡＰ−１阻害剤を投与されたマウスは、対照と同様、コラーゲンの堆積の大幅な減少を示した（図７）。この結果によれば、ＣＣｌ４によって引き起こされた腎障害におけるＶＡＰ−１の保護的な役割は明らかである。
【００７０】
［実施例３］
〔ＣＯＰＤのマウスモデルにおけるＶＡＰ−１阻害剤の効果〕
タバコ煙によるＣＯＰＤのマウスモデルがＣＯＰＤ治療におけるＶＡＰ−１阻害剤の効果を評価するために用いられた。
【００７１】
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスは１１日間連続して日に一度タバコ煙（ＴＳ）に曝され、最後のＴＳ曝露の後、２４時間肺炎症になった。１１日後、反応はマクロファージ、上皮細胞、好酸球、好中球及びリンパ球の大幅な増加から構成された。
【００７２】
マウスは無作為に検証群（数＝１０）に分けられ、１、３、６及び９日目にＴＳ曝露後４時間でビヒクル（５ｍｌ／ｋｇ  ＰＢＳ  ｐＨ７．４＋０．１％ポリソルベート８０）またはマウスモノクローナル抗ＶＡＰ−１抗体（ビヒクル中３ｍｇ／ｋｇまたは９ｍｇ／ｋｇのＢＴＴ−１０２９）を静脈注射により投与された。別の群（数＝１０）はビヒクルを静脈注射され、同等の時間空気に曝された。さらに２つのマウス群（数＝１０）は、ＴＳ曝露前１時間に１１日間連続で１日１回、別のビヒクル（０．５％カルボキシメチルセルロース、滅菌水中のナトリウム塩（ＣＭＣ））または対照化合物（０．５％ＣＭＣ中の５ｍｇ／ｋｇロフルミラスト）を経口で投与した。最後の群（数＝１０）は経口ビヒクル（０．５％  ＣＭＣ）を投与され、同等の時間空気に曝された。
【００７３】
結果は全て各動物毎にデータ点として示され、各群毎に平均値が計算された。正常性テストが陽性だった場合、投与グループ間の有意性をテストするために、データはまず一元分散分析検定（ＡＮＯＶＡ）にかけられ、その後多重比較のためにボンフェローニ補正された。０．０５以下の「ｐ」値は統計的に有意と見なされた。
【００７４】
また、データは全て当分散性に関するバートレット検定にかけられた。大部分の検証に関し、分散は一般に等しかったが、この検証において起こったように、時々いくつかの投与群は陽性を示すことがある。したがって、ノンパラメトリック解析も用いられた。データが正常に分布する場合、パラメトリック解析（ＡＮＯＶＡ）が引用された。
【００７５】
阻害率は以下の式を用いたセルデータについて、Ｅｘｃｅｌ表内で自動的に計算された。
【００７６】
【数１】
0006009355.tif 000002
【００７７】
ＢＴＴ−１０２９は、検証日−１、３、６及び９日目のＴＳ曝露後４時間に９及び３ｍｇ／ｋｇで静脈注射された場合、ＢＡＬ中のＴＳ誘発性細胞の増加を大幅に低下させた（それぞれ３８％及び３３％の阻害、共にｐ＜０．００１）（図８）。これは、マクロファージ（阻害率２９％及び２２％、それぞれｐ＜０．０１及びｐ＜０．０５）、好中球（阻害率６６％及び５９％、共にｐ＜０．００１）、リンパ球（阻害率６９％及び５４％、共にｐ＜０．００１）、及び好酸球（阻害率９３％及び６５％、それぞれｐ＜０．００１及びｐ＜０．０１）が著しく減少したことによるものであった。
【００７８】
参照化合物ロフルミラストもまた、ＴＳ曝露前１時間に経口で１日１回投与される場合、細胞の総数を大幅に削減した（４１％、ｐ＜０．００１）（図９）。これは好中球（６３％、ｐ＜０．００１）、好酸球細胞（５１％、ｐ＜０．０１）及びリンパ球（６５％、ｐ＜０．００１）が著しく減少したことによるものであった。この検証において、ロフルミラストはＢＡＬ中に発見されたマクロファージ及び好酸球の数を大幅には削減しなかった。
【００７９】
［実施例４］
〔血管壁の新生内膜及び内側線維症に対するＶＡＰ−１阻害剤の効果〕
新生内膜及び内側肥厚はアテローム性動脈硬化症の進行における初期かつ重要な病気であり、最狭窄の重要な因子である。肥厚は血管壁の新生内膜及び中膜における線維性の変化を伴う。本検証では、安価なウェスタン飼料を与えられたＡｐｏＥ３ライデンマウスの大腿動脈におけるカフ誘発性新生内膜肥厚（カフ誘発性狭窄）に対する小分子ＳＳＡＯ阻害剤（モフェジリン、ＢＴＴ−２０８９）の全身投与（連日腹腔内注射による）の効果を評価することにより、線維性疾患における阻害ＳＳＡＯの役割を評価した。
【００８０】
方法：４０匹の雄のＡｐｏＥ３＊ライデンマウス（１２週齢）に外科的カフ設置前に３週間軽く高コレステロール血症食餌を与えた。処置は、１）ビヒクル、２）飲料水に溶解されたデキサメタゾン（９ｍｇ／ｌ）、３）ＢＴＴ−２０８９  （１０  ｍｇ／ｋｇ）、４）ＢＴＴ−２０８９（３０  ｍｇ／ｋｇ）を連日腹腔内注射するものであり、これらは全て手術１日前から始まり、実験期間中継続した。０日目に手術が実施され、非収縮カフ（長さ２から３ｍｍ）がマウスの大腿動脈に巻かれた。組織形態計測分析のために２週間後に各群１０匹のマウスを処分し、促進された動脈硬化病変及び新生内膜形成の阻害性を定量化した。ＮａＣｌ０．９％投与対照群に比べ、デキサメタゾン投与陽性対照群及びＢＴＴ−２０８９投与群の両方において、中膜及び新生内膜形成の大幅な減少が確認された（図１０及び１１）。このことは、対照群に比べてＳＳＡＯ阻害剤投与群のＨＰＳ染色血管セグメントの例において内腔の大きさが増大したことに表された（図１２）。
【００８１】
同じモデルでの第２の検証はＢＴＴ−２０８９とは異なる化学的分類の別のＳＳＡＯ阻害剤で行われた。このヒドラジン系阻害剤（ＢＴＴ−２０７９）は連日腹腔内注射により１０ｍｇ／ｋｇのレベルで投与され、ＢＴＴ−２０８９（３０ｍｇ／ｋｇ）と比べられた。デキサメタゾン対照群を省略したことを除き、他のあらゆる点において検証は同様に行われた。モフェジリン（ＢＴＴ−２０８９）を３０ｍｇ／ｋｇ有するＳＳＡＯによる阻害（腹腔内、連日）は、有益な効果をもたらし、ＳＳＡＯ阻害後、新生内膜形成及び管腔狭窄率が大幅に減少した。ＳＳＡＯ阻害剤ＢＴＴ−２０７９（１０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内、連日）が投与された群においても新生内膜形成が大幅に減少する結果となった。どの群の間においても、血管壁、中膜及び管腔部分における大幅な変化は見られなかった。ＢＴＴ−２０７９（１０ｍｇ／ｋｇ）及びＢＴＴ−２０８９（３０ｍｇ／ｋｇ）の内膜中膜率は対照群に比べ大幅に低下したが、管腔狭窄率は対照群に比べてＢＴＴ−２０８９（３０ｍｇ／ｋｇ）群においてのみ大幅に低下した。血管完全性は影響を受けなかった。
【００８２】
これらの検証によれば、対照投与群と比べＡｐｏＥ３ライダンマウスカフモデルではＳＳＡＯ阻害剤の全身投与により新生内膜肥厚（新生内膜線維症）が減少することが示される。
【００８３】
［実施例５］
〔肺線維症のマウスモデルにおけるＶＡＰ−１阻害剤の効果〕
ブレオマイシン誘発性肺線維症は、肺線維症を検証するための確立した再現可能なマウスモデルである。
【００８４】
８週齢の雄のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスにアルゼット・オスミウムミニポンプでブレオマイシン（１００ｍｇ／ｋｇ）を７日間全身投与し、肺障害を引き起こした。非肺毒性がポンプ注入後７から２１日間確認された。病理組織学的に評価したところ、２１日目までに１２から１５％の線維症が肺に存在した。その後、呼吸数の増加や体重の劇的な減少によって確認されるであろう臨床的肺障害が起こり、結果、４２日以内に死に至った（その前に処分されない場合）。
【００８５】
マウスは無作為に各検証群に分けられ、ＶＡＰ−１阻害剤あるいは参照化合物といったビヒクルを０日目から２８日目まで１日３回点滴注射により投与された。各群のマウスの半数は２１日目に処分され、残りの半数は２８日目に処分された。
【００８６】
解剖において、肺は固定され（１０％中性緩衝ホルマリン）、線維症病変の判断のために組織病理学的に処理された。組織切片をＨ＆Ｅ及びマッソン・トリクロームで染色し、線維症を確認した。各マウス毎にコンピュータ支援画像解析で肺全体に対する線維症の肺部分の割合が定量化された。
【００８７】
適当なポストホックテストがその後に続く一元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）を用いて２つ以上の可変群に基づき試料の有意性を分析した。
【００８８】
対照との比較における統計学的に有意なスコアの低下により明示されるように、肺線維症を軽減することができる。
【００８９】
［実施例６］
〔糖尿病性腎疾患のマウスモデルにおけるＶＡＰ−１阻害剤の腎保護効果〕
糖尿病は進行性の腎線維症を伴う糖尿病性腎症（ＤＮ）を引き起こすことがあり、結果、機能する腎体積が減少する。腎線維症に対する抗ＶＡＰ−１抗体及びＳＳＡＯ阻害剤の効果を評価するに際し、十分に確立した糖尿病性腎疾患のＤｂ／ｄｂ糖尿病マウスモデルが採用された。
【００９０】
これらの実験の詳細は全て（飼育場所、実験法、及び動物の処分）、実験動物の管理と使用に関する指針（Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ）（ナショナルアカデミープレス、ワシントン、１９９６）に全般的に基づき行われた。
【００９１】
被験物質であるＳＳＡＯ阻害剤ＢＴＴ−２０７９は、糖尿病性腎症のマウスモデルで見込まれる腎保護効果に関して評価された。糖尿病が十分に確立したとき、１５週齢のｄｂ／ｄｂマウス（ＢＫＳ  Ｃｇ−Ｌｅｐｒ  ｄｂ／Ｌｅｐｒ  ｄｂ）に４２日間連続して１日１回被験物質及びビヒクルを腹膜内投与（ＩＰ）した。Ｄｂ／ｍマウスは痩せ型の正常対照を成す。ｄｂ／ｄｂマウスは、ｄｂ／ｍマウスと比較すると、腎機能の低下を意味する血漿クレアチンの上昇に加え、高血糖や脂質異常症（ＬＤＬ、総コレステロール及びトリグリセリド）を示した。糖尿病マウスは、肥満、多尿症、タンパク尿及び尿細管ナトリウムイオン再吸収の低下を示す尿中ナトリウムイオン排泄率の上昇を伴った。内因性クレアチニン・クリアランス（ＣＣｒ）（糸球体濾過率の推定値）は、ｄｂ／ｍマウスに対し糖尿病マウスにおいて低下する傾向にあった。
【００９２】
雄のｄｂ／ｄｂ非インスリン依存性糖尿病マウスは以下で概説されるように各投与グループに割り当てられた。
【００９３】
【表１】
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【００９４】
生存段階終了時に組織の採集及び保存を含む剖検を実施した。３２匹の動物全ての右腎が１０％中性緩衝ホルマリンに固定された。長手部分を切り取ってパラフィンブロックに処理し、３ミクロンに切断した後過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）で染色して光学顕微鏡検査で評価した。下記プロトコルで概説される半定量スコアリングスキームに基づき、腎臓あたり５０個の糸球体においてメサンギウム基質の拡大がスコアリングされた。
【００９５】
以下の分類に基づき、各腎臓の５０個の糸球体においてメサンギウム基質の拡大がスコアリングされた。
【００９６】
ミニマル  ：グレード１、基質に占められる糸球体体積が０から２５％
マイルド  ：グレード２、基質に占められる糸球体体積が２５から５０％
モデラート：グレード３、基質に占められる糸球体体積が５０から７５％
シビア    ：グレード４、基質に占められる糸球体体積が７５から１００％
【００９７】
各グループの全動物に関するメサンギウム基質スコアを合計してそのグループの動物の総数で割ることにより、各グループ毎の平均メサンギウム基質拡大スコアを導き出した。グループ平均メサンギウム基質拡大スコアが以下の表に示される。
【００９８】
【表２】
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【００９９】
正常な動物において糸球体メサンギウム基質はほとんど見ることはできなかったが、メサンギウム基質の拡大は糖尿病のようなさまざまな疾患状態に特有のものである。メサンギウム基質は基底膜や関連するポリアニオン系プロテオグリカンや他の分子を含み、これらは過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）法により赤から紫に染色される。したがって、糸球体のＰＡＳ陽性物質の量は存在するメサンギウム基質の量の尺度となる。
【０１００】
各動物から得た５０個の糸球体は２００倍で評価され、前述のスコア分類を用いて拡大したメサンギウム基質がスコアリングされた。動物毎に評価された糸球体毎のスコアを合計してグループ平均メサンギウム基質拡大スコアを計算した。その後、当該グループの全動物に関するメサンギウム基質拡大スコアを合計してグループ毎の動物総数で割り、グループ平均メサンギウム基質拡大スコアを求めた。これらのデータによれば、ｄｂ／ｄｂ非インスリン依存性糖尿病マウス（グループ２）において、グループ平均メサンギウム基質拡大スコアと比べると、ＢＴＴ−２０７９（５及び１５ｍｇ／ｋｇ）の投与によってメサンギウム基質拡大スコアは投与量に基づき低下した。
【０１０１】
腎線維症に対する抗ＶＡＰ−１抗体及びＳＳＡＯ阻害剤の効果を評価するために、他の十分に確立した糖尿病性腎疾患のマウスモデルとして１）ストレプトゾトシン誘発性糖尿病マウスモデル及び２）片側尿管閉塞・腎線維症モデルが採用された。
【０１０２】
１）ストレプトゾトシン誘発性糖尿病マウスモデル６から７週齢の雄のマウス（体重２０から２５ｇ）をトレプトゾトシン（ＳＴＺ）注射前の６時間絶食させる。糖尿病を誘発するために、新たに混合されたＳＴＺ（クエン酸ナトリウム緩衝剤中７ｍｇ／ｍｌ）を飢餓状態にしておいたマウスに５５ｍｇ／ｋｇの量で腹腔内注射する。糖尿病の誘発を完了するために、各マウスは５日間連続でＳＴＺ注射を１回受けるようにこの手順は繰り返される。最後のＳＴＺ注射から１週間後に、非空腹時血糖が２８０ｍｇ／ｄＬ未満のマウスは、通常糖尿病を十分に進行させ重篤な腎障害を引き起こさないことから、実験から排除される。
【０１０３】
全マウスはビヒクルまたは被験物質を３週連続１日おきに適当量腹腔内投与される。全動物は通常の研究用のエサ及び水を自由裁量で与えられる。
【０１０４】
血清化学レベルが酵素法（ムタローゼ−ＧＯＤ）により血液試料から決定される。腎障害は、尿中アルブミン排泄率及びクレアチニン・クリアランスの測定により生化学的に評価され、さらには、マッソントリクローム及び過ヨウ素酸シッフ染色により組織学的に評価される。
【０１０５】
２）片側尿管閉塞-腎線維症モデル全マウスは術前５日間及び術後７日間ビヒクルまたは被験物質を腹腔内投与される。阻害剤及びビヒクルがＳＳＡＯの阻害に適当な量で１日おきに注射される。全動物は通常の研究用のエサ及び水を自由裁量で与えられる。
【０１０６】
６から７週齢の雄のマウス（体重２０から２５ｇ）にイソフルラン（２−クロロ−２−（ジフルオロメトキシ）−１，  １，１−トリフルオロ−エタン）吸入で麻酔をかけ、術前に０．０５から０．１ｍｇ／ｋｇのブプレノルフィンを皮下注射する。マウスは片側尿管閉塞（ＵＵＯ）の処置を受けるかあるいは擬似手術を受ける。ＵＵＯ処置されたマウスでは、逆行性尿路感染を予防するために左尿管を４から０の絹縫合糸で２箇所結紮し、結紮箇所間で切断する。マウスは術後７日目に処分される。
【０１０７】
腎障害は、尿中アルブミン排泄率及びクレアチニン・クリアランスの測定により生化学的に評価され、さらには、マッソントリクローム及び過ヨウ素酸シッフ染色により組織学的に評価される。
【０１０８】
投与群とビヒクル群との有意な差異を確認するために、一元位置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）及びダネット検定が全検証で用いられる。差異は＊Ｐ＜０．０５で有意と見なされる。
【０１０９】
対照との比較における統計学的に有意なスコアの低下により明示されるように、腎線維症を軽減することができる。
【０１１０】
［実施例７］
〔糖尿病性腎症に対する抗線維症治療〕
糖尿病性腎症は最終ステージの腎疾患及び線維症（特に間質性線維症）に共通の原因であり、糖尿病の腎臓の主要な病理学的特徴である。臨床的検証により、ＶＡＰ−１阻害剤が糖尿病の患者の腎症を低減し腎機能をもたせることが可能か否か判断可能である。
【０１１１】
糸球体濾過率（ＧＦＲ）が２０から７５ｍｌ／ｍｉｎ／１．７３ｍ２であり、タンパク尿が３００ｍｇ／日より多く、血圧が１４０／９０以下であって、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害薬またはアンジオテンシン受容体拮抗薬（ＡＲＡ）を常用する、１型または２型糖尿病の成人患者が検証に参加した。患者はＶＡＰ−１阻害剤を有効レベルで投与されるか、あるいは、適切な投与計画（１日１回またはそれ以下の頻度）でプラセボを１年間投与された。患者は無作為にプラセボまたはＶＡＰ−１阻害剤グループに分けられた。検証中、患者は、空腹時血糖及び尿糖値、血圧、臨床化学等のパラメータについて定期的にモニタリングされた。追加的な血液試料を取り出し、糖尿病の際上昇したり、疾患の進行に関連すると思われる血清ＶＡＰ−１  ＳＳＡＯレベルを測定してもよい。さらに、血清試料中のメチルアミンレベルを評価してもよい。メチルアミンの上昇はＶＡＰ−１  ＳＳＡＯ活性阻害のバイオマーカーである。糖尿病の状態をモニタリングするために、自宅で定期的に血圧及び血糖をチェックし、その値を記録することが患者に求められた。適当量のインスリン投与により、このように患者の糖尿病の良好な管理を維持することができた。
【０１１２】
糖尿病性腎症に対するケア（ＡＣＥ阻害剤及び／またはＡＲＡでの治療、血圧の目標値が１３０／８０未満の降圧療法、及びＨｂＡ１Ｃの目標値が適当に定められた厳しい血糖コントロール等）に関する現行基準に基づき患者は維持された。
【０１１３】
腎機能はＧＦＲによって評価され、基線から検証期間の終わりまでの腎機能の変化を検証の主要評価項目としてもよい。第２の主要評価項目としては、検証期間を通しての尿中アルブミン排泄の変化率が挙げられる。
【０１１４】
［実施例８］
〔線維性疾患の診断マーカーとしてのＶＡＰ−１〕
本実施例では、免疫組織化学試験により、線維化中隔（ｆｉｂｒｏｔｉｃ  ｓｅｐｔａ）がかなり高いレベルの肝硬変において肝ＶＡＰ−１発現が増加することが分かった（図１３から１５）。多色共焦点顕微鏡検査により肝星細胞及び筋線維芽細胞におけるＶＡＰ−１発現が明らかにされた（図１６）。培養されたヒト肝星細胞（ＨＳＣｓ）を用いて、体内ＨＳＣｓによるｓＶＡＰ−１の発現及び分泌が確認された。これらの結果は線維成長におけるＶＡＰ−１の潜在的な役割を示唆した。
【０１１５】
血清ｓＶＡＰ−１レベルは、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）の患者１３８人の矛盾なく定められたコホート（ｗｅｌｌ−ｄｅｆｉｎｅｄ  ｃｏｈｏｒｔ）に対応しかつ等級付られた肝組織像（クライナー分類法（Ｋｌｅｉｎｅｒ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ））を用いて測定された。ｓＶＡＰ−１レベルは肝組織像（脂肪症、炎症、線維症）、代謝パラメータ及び肝損傷に関して評価された（表３）。
【０１１６】
【表３】
0006009355.tif 000005
【０１１７】
ＢＭＩ＝肥満度指数、ＨＯＭＡ−ＩＲ＝インスリン抵抗性の恒常性モデル評価、ＡＳＴ＝アスパラギン酸トランスアミナーゼ、ＡＬＴ＝アラニントランスアミナーゼ、ＡＬＰ＝アルカリホスファターゼ、ＧＧＴ＝ガンマグルタミルトランスフェラーゼ、ＣＲＰ＝Ｃ反応性タンパク
【０１１８】
ｓＶＡＰ−１レベルは健常人（３００−５００ｎｇ／ｍｌ）と比べＮＡＦＬＤコホート（平均＋／−ＳＤ；９４５．９＋／−４５７．６ｎｇ／ｍｌ）において大幅に上昇した。最高値は重篤な肝線維症（ステージＦ２から４）の患者に見られ、ｓＶＡＰ−１レベルと線維症ステージ間には明確な線形傾向があった（図１７）。
【０１１９】
単変量相関解析（ｕｎｉｖａｒｉａｔｅ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ）により、ｓＶＡＰ−１レベルと組織学的な線維症ステージとの間に有意的な相関関係が確認された（ｒ＝０．４３、ｐ＝０．００００００３）（表４）。また、変数減少を伴う多重ロジスティック回帰において線維症ステージはｓＶＡＰ−１レベルに影響する最も重要な独立因子だった（表５）。
【０１２０】
【表４】
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【０１２１】
ｒ値はピアソン順位相関（Ｐｅａｒｓｏｎ  ｒａｎｋ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ）を示す。
【０１２２】
【表５】
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【０１２３】
重篤な肝線維症（ステージＦ２−４）に関連する因子の単変量及び多変量解析は共に、ｓＶＡＰ−１レベルが肝損傷の標準的なバイオマーカー（例えば、肝酵素やＡＳＴ／ＡＬＴ率）より有意であることを示唆した（図６及び７）。
【０１２４】
【表６】
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【０１２５】
【表７】
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【０１２６】
コホートにおいて、ｓＶＡＰ−１レベルが重篤な肝線維症（ステージＦ２−４）の存在を予測する単独のバイオメーターとして用いられた場合、１０００ｎｇ／ｍｌ以上のレベルが陽性の予測値８８．９％を示した。重篤な線維症（Ｆ２−４）、進行性の線維症（Ｆ３−４）及び肝硬変（Ｆ４）を予測する受信者動作特性曲線下面積（ＡＵＲＯＣ）は、それぞれ０．７１（９５％  ＣＩ  ０．６２−０．８０），  ０．６８  （９５％  ＣＩ  ０．５８−０．７８）  ａｎｄ  ０．７５  （９５％  ＣＩ  ０．５８−０．９２）だった（図１８）。
【０１２７】
さらに、結果は、他の臨床的かつ生化学的なパラメータと組み合わせることによって、肝線維症を予測するｓＶＡＰ−１の感度及び特異性プロフィールを改善できる可能性を示唆した。多変量解析（ｓＶＡＰ−１、糖尿病の状態及びＡＳＴ／ＡＬＴ率）による肝線維症に独立に関連する因子の線維症スコア（回帰方程式から算出）では、重篤な線維症（Ｆ２−４）、進行性の線維症（Ｆ３−４）及び肝硬変（Ｆ４）を予測するＡＵＲＯＣが０．７９（９５％  ＣＩ  ０．７１−０．８７）、０．８０（９５％  ＣＩ  ０．７１−０．８８）及び０．８９（９５％  ＣＩ  ０．７４−１．０２）であった（図１９）。
【０１２８】
ＶＡＰ−１タンパク質はＳＳＡＯ（セミカルバジド感受性アミンオキシダーゼ）と呼ばれるモノアミンオキシダーゼ酵素活性を有する。ＳＳＡＯ酵素活性はＶＡＰ−１タンパク質において不可欠な部分であることから、体液中のｓＶＡＰ−１レベルも体（血清又は血漿などの）液中のＳＳＡＯ活性量を測定により決定することができる。ＳＳＡＯはベンジルアミンやメチルアミンといたＳＳＡＯ基質に作用するヒト血清及び血漿における主要なモノアミンオキシダーゼ活性である。したがって、ＳＳＡＯ活性は肝線維症に対する同等のマーカーとして用いられてもよい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１７】
0006009355.tif 000022
【図１８】
0006009355.tif 000023
【図１９】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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