(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
望ましくないほど高い空腹時血清グルコース濃度を低下させるための経腸投与用の医薬製剤であって、前記製剤が、サケカルシトニンまたはサケカルシトニンと少なくとも９０％の相同性を有し、アミノ酸の付加、置換または欠失により修飾され、かつ、カルシトニン受容体に結合しそれを活性化させる能力を保持している修飾サケカルシトニンである活性化合物を含む、製剤。
【請求項２】
前記活性化合物がカルシトニンである請求項１に記載の製剤。
【請求項３】
前記活性化合物が、一般式：
ＣＸ１Ｘ２ＬＳＴＣＸ３ＬＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ１７Ｘ１８Ｘ１９Ｘ２０Ｘ２１ＧＸ２２Ｘ２３Ｘ２４Ｐ（配列番号１１）
（式中、
Ｘ１は、Ａ、Ｇ、またはＳであり、
Ｘ２は、ＮまたはＳであり、
Ｘ３は、ＭまたはＶであり、
Ｘ４は、ＧまたはＳであり、
Ｘ５は、Ｔ、Ｋ、またはＡであり、
Ｘ６は、ＬまたはＹであり、
Ｘ７は、Ｔ、Ｓ、またはＷであり、
Ｘ８は、Ｑ、Ｋ、またはＲであり、
Ｘ９は、Ｄ、Ｅ、またはＮであり、
Ｘ１０は、ＦまたはＬであり、
Ｘ１１は、ＮまたはＨであり、
Ｘ１２は、ＫまたはＮであり、
Ｘ１３は、ＦまたはＬであり、
Ｘ１４は、ＨまたはＱであり、
Ｘ１５は、ＴまたはＲであり、
Ｘ１６は、ＦまたはＹであり、
Ｘ１７は、ＰまたはＳであり、
Ｘ１８は、Ｑ、ＧまたはＲであり、
Ｘ１９は、Ｔ、ＩまたはＭであり、
Ｘ２０は、Ａ、Ｎ、Ｄ、Ｓ、またはＧであり、
Ｘ２１は、Ｉ、Ｔ、ＶまたはＦであり、
Ｘ２２は、Ｖ、Ｓ、Ａ、またはＰであり、
Ｘ２３は、ＧまたはＥであり、
Ｘ２４は、ＡまたはＴである）
の活性化合物である請求項１または２に記載の製剤。
【請求項４】
前記活性化合物が、式：
ＣＳＮＬＳＴＣＶＬＧＸ５ＬＸ７ＱＸ９ＬＨＫＬＱＴＹＰＸ１８ＴＮＴＧＸ２２ＧＴＰ（配列番号１２）
（式中、
Ｘ５は、ＴまたはＫであり、
Ｘ７は、ＴまたはＳであり、
Ｘ９は、ＤまたはＥであり、
Ｘ１８は、ＱまたはＲであり、
Ｘ２２は、Ｖ、Ｓ、またはＡである）
の活性化合物である請求項３に記載の製剤。
【請求項５】
前記活性化合物が、経口投与用の担体とともに処方されている請求項１〜４のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項６】
前記担体が、前記活性化合物の経口生物学的利用能を増加させる請求項５に記載の製剤。
【請求項７】
前記担体が、５−ＣＮＡＣ、ＳＮＡＤ、またはＳＮＡＣを含む請求項５に記載の製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖尿病（１型および２型）およびメタボリックシンドロームの治療のための材料および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
世界的に見て、約２億５千万人の糖尿病患者が存在し、その数は次の２０年には２倍になると予想されている。この集団の９０％超が２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）を患っている。Ｔ２ＤＭに罹患しているかまたは顕性Ｔ２ＤＭの前段階にいる人の５０〜６０％だけしか現在は診断されていないと推定されている。
【０００３】
Ｔ２ＤＭは、炭水化物および脂肪の代謝異常を特徴とする異種疾患である。Ｔ２ＤＭの原因は多因子性であり、それには筋組織、肝組織、膵組織および脂肪組織などの組織においてβ細胞機能およびインスリン感受性に影響を及ぼす遺伝的要素と環境的要素の両方が含まれる。結果としてインスリン分泌障害が観察され、β細胞機能および慢性インスリン抵抗性の進行性の低下が平行して起こる。膵内分泌部が末梢インスリン抵抗性を代償できないことにより血糖値の上昇および臨床的糖尿病の発症がもたらされる。インスリン媒介性のグルコース取り込みに対する組織抵抗性は、現在、Ｔ２ＤＭの主な病態生理学的決定因子と認識されている。
【０００４】
Ｔ２ＤＭの最適な治療介入のための成功基準は、血糖値を下げることであり、このことは、より低いピークグルコース濃度およびより速いクリアランスで説明される血糖値の慢性的低下と食物摂取後の高グルコース濃度を許容する能力の増大の両方であり得る。これらの状況は両方ともβ細胞のインスリンの産生量および機能に及ぼす負担が少ない。
【０００５】
Ｔ２ＤＭ制御へのアプローチは、食物の経口摂取を受けて腸の内分泌細胞により産生され、インスリン産生を刺激するインクレチンホルモン、グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）およびグルコース依存性インスリン分泌刺激ポリペプチド（ＧＩＰ）の使用である。ＧＬＰ−１は、インビボでの半減期が非常に短いために糖尿病の臨床治療としては役に立たない。インクレチンの薬理学的合成例はエクセナチドおよびリラグルチドであり、それらはヒトＧＬＰ−１に類似する生物学的特性を示すが、より長い半減期をもたらす。しかしこれらのＧＬＰ−１類似体は、いくつかの有害作用、例えば膵炎の稀であるが危険な副作用および心血管系への影響などに関連している。
【０００６】
１９８８年の出願に関連する欧州特許ＥＰ０３０９１００号は、アミリンがインスリンとともに分泌され得ることを示し、このことに基づいて、アミリン自体およびインスリンなどのアミリンアゴニストを含む、１型糖尿病を治療するための非経口組成物を示唆している。アミリンに関して示唆された役割は、インスリン治療の効果として生じる低血糖を防ぐことである。アミリンは、グリコーゲン合成の速度を低下させると言われている。
【０００７】
Ｇｏｍｅｚ−Ｆｏｉｘ  ｅｔ  ａｌ．は、アミリンおよびＣＧＲＰが、ラットの単離肝細胞において抗インスリン作用を及ぼすことを報告し、アミリンおよびＣＧＲＰがインスリン分泌を阻害するという前の報告を補った。
【０００８】
ＷＯ８９／０６１３５は、アミリンの作用を遮断する化合物（アミリンアンタゴニスト）が２型糖尿病を治療する際に有用であることを示唆している。アミリンアンタゴニストとして使用することのできる化合物は、アミリンアゴニストを架橋したものである。アミリンは、膵臓のβ細胞により少ないインスリンを放出させる作用を有し、骨格筋において筋肉細胞にインスリンシグナルを無視させることによる基礎およびインスリン刺激性の両方のグリコーゲン合成の大幅な低下も引き起こすと言われている。
【０００９】
ＷＯ９３／１０１４６は、１型糖尿病を治療するための非経口剤および低血糖を治療するための非経口剤としての特定のアミリンアゴニストを開示している。１型糖尿病において、アミリン濃度は大幅に低下しているか存在しないと言われている。この場合もやはり、アミリンアゴニストがインスリン治療により誘発される低血糖を防ぐ働きをすることが示唆される。
【００１０】
欧州特許ＥＰ０７１７６３５Ｂ１号／ＷＯ９５／０７０９８は、アミリンが高血糖作用を有することを認めているが、それはまた胃運動を低下させて胃排出を遅らせることもできるので、食後の血漿グルコース濃度を増加させるよりもむしろ低下させることを開示している。従って、この文献は、この目的のためのアミリンアゴニストを教示するが、カルシトニンを明確に除外する。
【００１１】
米国特許第７３９９７４４号は、体脂肪を調節するためのアミリンまたはアミリンアゴニストの使用を開示している。試験では、浸透圧ポンプによってラットに送達されたアミリンは、高脂肪食を与えられたラットにおいて体重増加の低下を引き起こした。硬骨魚類カルシトニンを含むカルシトニンは、適したアゴニストの一例として示されているが、それらの使用に関するデータは示されていない。
【００１２】
従って、注射可能なアミリンは、食後のグルカゴン分泌および胃排出を強力に阻害し、食物摂取を減少させ、それにより炭水化物吸収を生理学的に調節するので、現在、Ｔ２ＤＭ血糖コントロールの実行可能なアプローチとして見なされている。アミリン類似体の１つであるプラムリンチド（またはシムリン）は、同様にインスリンを使用する１型糖尿病患者および２型糖尿病患者の治療に認可されている。プラムリンチド治療により、糖尿病患者において平均血糖値が低下し、食後の血糖の病理学的上昇が実質的に低減される。プラムリンチド治療はまた、体重減少ももたらし、患者がより少ないインスリンを使用することを可能にする。米国特許出願公開第２００９／００１８０５３号は、糖尿病治療のために胃腸管でプラムリンチドを放出するためのプラムリンチドの腸溶コーティング製剤を簡潔に提案している。
【００１３】
アミリンは、カルシトニン、α−カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ａＣＧＲＰ）、βＣＧＲＰ、アドレノメデュリン（ａｄｒｅｎｏｍｏｄｕｌｌｉｎ）、およびアミリンからなるカルシトニンファミリーの一部である。この独特のペプチドの群は、Ｎ末端のジスルフィド架橋環を有する保存された三次構造を共有している［Ｈａｙ  ２００３  Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ］。哺乳動物において、これらのペプチドは、２つの密接に関連したＩＩ型ＧＰＣＲ（カルシトニン受容体およびカルシトニン受容体様受容体）および３つの特有の受容体活性調節タンパク質（ＲＡＭＰ）を通じて信号を伝達する［Ｈａｙ  Ｒｅｇｕｌ  Ｐｅｐｔ  ２００３］。その結果、受容体の共有および分岐進化に起因して、これらの小型のシグナル伝達分子のいずれかを使用することにより、より多面的な効果を複数の器官に誘発することができる。
【００１４】
カルシトニン（ＣＴ）は、甲状腺において濾胞傍細胞（Ｃ−細胞）により産生され、血清中の過剰なカルシウムに応答して分泌される天然のペプチドホルモンである。ＣＴは、破骨細胞表面でその受容体と直接結合することにより破骨細胞性吸収を低下させる。ＣＴは、骨粗しょう症、悪性腫瘍随伴性高カルシウム血症、パジェット病の治療に認可されており、それらは全て骨代謝回転の加速を伴う。カルシトニンの経口形態は、最近文献に記載されている。
【００１５】
動物およびヒト（ただし、おそらく１型糖尿病患者を除く）においてカルシトニンの投与により生じる糖尿病誘発性の作用がこれまでに多数報告されている。
【００１６】
まず、動物試験およびインビトロ試験を見ると、１９７４年にＬｕｐｕｌｅｓｃｕは、注射によりウサギに投与し大用量（１ヶ月あたり６００ＭＲＣ  Ｕまたは１用量５０ＭＲＣ  Ｕ）の合成サケカルシトニンが、その投与が１ヶ月の間１回だけであろうと１日３回であろうと、絶食後に測定したグルコース濃度の著しい低下を生じたと報告した。この機構は理解されておらず、糖負荷試験後または通常の摂食の間／後のグルコース濃度への影響の研究はなされていない。彼らは、Ａｌｄｒｅｄ  ｅｔ  ａｌ．１９６８による、ブタカルシトニンをラット、ウサギ、またはマウスに投与した場合に同様の結果は見出されなかったと認識している。
【００１７】
Ｇｒｅｅｌｅｙは、１９８９年にラットにおいてサケカルシトニンを脳室内投与するとグルコース刺激インスリン放出が増加したが、グルコース血漿中濃度は全くインスリンだけに依存するのではなく、その他の研究（下記）から、インスリンを増加させることに加えて、カルシトニンは、グルコース濃度の増加を生じるためにインスリンの増加よりも優勢なグルカゴン濃度も増加させることが示唆されると報告した。
【００１８】
Ｐｉｔｔｎｅｒは、１９９７年にアミリン、カルシトニン遺伝子関連ペプチドまたはラットもしくはサケカルシトニンをラット肝細胞およびその他の細胞で試験した場合のわずかな効果を報告した。
【００１９】
Ｙｏｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．は、１９９５年にラットおよびマウスにおいて、静脈内ボーラス投与としてのサケカルシトニンは空腹時血糖値の上昇を生じ、ラットカルシトニンはそれよりも効果が低いことを報告した。低血糖のラットにおいて、カルシトニンはグルカゴンより大きい血糖の回復をもたらし、組み合わせて相乗的にグルカゴンによりもたらされる血糖の回復を増加させた。
【００２０】
Ｙｏｕｎｇは、２００５年に動物におけるグルコース濃度および乳酸濃度へのアミリンおよび、それよりも程度は低いが、サケカルシトニンの作用を詳細にまとめた。絶食動物に非経口投与されたアミリンおよびサケカルシトニンは両方ともグルコース濃度の上昇をもたらし、カルシトニンのほうが大きいグルコース上昇作用をもたらしたが、この作用はヒトにおいては軽度または不在であると彼は報告した。また、ラットにおいて経口ブドウ糖負荷試験の直前に非経口投与されたアミリンが、グルコースの上昇を引き下げたと彼は報告した。従って、この点において、非経口カルシトニンが経口糖負荷試験においてグルコース最大値の増加をもたらすことは十分に確立されているので、アミリンおよびサケカルシトニンがラットにおいて異なった挙動をしていることは明らかである。
【００２１】
Ｃｈｅｌｉｋａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．は、２００７年に食欲抑制物質を動物に注入または反復注射により慢性投与しても食物摂取または体重への永続効果を生じなかったことを報告した。サケカルシトニンの急性非経口投与はラットまたはマウスにおいて短期の食物摂取の減少を強力に誘発したが、その効果は３日間しか続かなかった。
【００２２】
しかし、Ｂｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．は、２００８年に、非経口サケカルシトニンが、５日の投与期間中アカゲザルにおいて食物摂取を低下させたことを報告した。
【００２３】
次に、ヒトにおける研究を見ると、Ｚｉｅｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９７２）は、健常な被験者における合成ヒトカルシトニンの注入により、グルコース同化およびインスリン分泌量の著しい機能障害が生じたことを報告した。
【００２４】
Ｂｌａｈｏｓ  ｅｔ  ａｌ．は、１９７６年に、健常なボランティアにおける筋肉内サケカルシトニンにより、朝絶食の間の血糖の低下が抑制され、糖負荷試験が損なわれたことを報告した。
【００２５】
Ｐｅｔｒａｌｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９７９）は、ヒトでの潜在性糖尿病の場合、サケカルシトニンの注入がインスリンの血清レベルを低下させ、血糖を増加させる能力があることが証明されたことを報告した。
【００２６】
Ｇｉｕｇｌｉａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．１９８０は、急性カルシトニン投与が正常、肥満および糖尿病前症のヒト被験体において耐糖性を損なうことは既に立証されているが、インスリン依存性糖尿病患者に静脈内注入により投与されたサケカルシトニンが、アルギニン耐性試験において通常見られるグルコース上昇を消滅させ、カルシトニンの注入が停止するとグルコース濃度は即時にリバウンドしたことを報告した。
【００２７】
Ｇａｔｔｅｒｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９８０）は、骨パジェット病患者に投与したサケカルシトニンまたはヒトカルシトニンの注射が、血清グルコースの中程度の即時上昇および血清インスリンのわずかな低下を誘発したことを報告した。
【００２８】
Ｐａｓｓａｒｉｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）は、合成サケカルシトニンのヒトへの筋肉内投与により、正常なヒトにおいて糖負荷試験に応答して悪化をもたらし、ＩＧＴをもつ被験体において耐糖性の障害をさら引き起こすことを報告した。約２倍の血漿グルコース曲線下積分グルコース面積が観察された。
【００２９】
Ｓｔａｒｋｅ  ｅｔ  ａｌ．は、１９８１年に正常ヒトボランティアにおいて、注入されたサケカルシトニンが、循環グルカゴン濃度の低下および血清インスリンの低下を生じさせ、グルカゴンの低下に起因するグルコースの予測された低下の正味の作用が、インスリンの低下の作用により隠されていることを報告した。しかし、インスリン依存性糖尿病患者において、サケカルシトニンは、グルカゴンの低下とともにグルコース濃度の低下を生じた。
【００３０】
Ｇｉｕｇｌｉａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２）は、骨パジェット病または著しい骨粗しょう症の患者へのサケカルシトニンの１日あたり１００ＭＲＣ単位の長期（２ヶ月）投与の結果を報告した。耐糖性は、治療により著しく悪化しなかった（しかしピークグルコースの有意でない上昇が見られる）が、基礎血漿グルコースの有意な増加があった。グルコース投与に対するインスリン応答の最初の１０分はカルシトニンにより減弱された。
【００３１】
Ｇｉｕｓｔｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）は、毎日２回、１００ＭＲＣ単位のサケカルシトニンの短期（１５日）の筋肉内投与の効果を、骨パジェット病、特発性骨粗しょう症またはズデック骨形成異常症（Ｓｕｄｅｃｋ’ｓ  ｏｓｔｅｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）の患者において調査した。一部の患者は、インスリン非依存性糖尿病患者であり、抗糖尿病治療を受けていた。短期の筋肉内ｓＣＴ処置が、混合食刺激後に糖質代謝の目に見えるほどの変化を引き起こさないように見えた。含まれる３名の糖尿病患者では、夜間の有意でないグルコース濃度の低下が観察された。
【００３２】
Ｚｏｆｋｏｖａ（１９８７、Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．）は、ＯＧＴＴの最中に静脈内注射により投与された１００Ｕのカルシトニンが、最初により緩やかな血糖値の上昇があった後に、血糖値の上昇の持続を引き起こしたことを見出した。このことは、肝臓におけるグルコース吸収および代謝の妨害に起因するとして説明された。インスリン分泌へのカルシトニンの抑制作用も観察された。
【００３３】
Ｚｏｆｋｏｖａ（１９８７−Ｈｏｒｍ．Ｍｅｔａｂｏｌ．Ｒｅｓ．）は、２種類の用量（５０Ｕおよび１００Ｕ）のサケカルシトニンの健常なボランティアにおけるグルコース血中濃度に対する影響を考察し、両方の用量レベルでちょうど上記した結果と同様の結果を見出した。
【００３４】
Ｍａｎｇｉａｆｉｃｏ（１９８８）は、１００Ｕ／日で投与されたニフェジピンとサケカルシトニンとの組合せが、３週間のプログラムで、高血圧症またはインスリン非依存性糖尿病もしくは耐糖能異常の被験体において常に統計学的に有意な血糖の上昇を生じたことを見出した。
【００３５】
Ｊｏｎｄｅｒｋｏ（１９８９）は、十二指腸潰瘍の患者において、６２．２６ｐｍｏｌ／ｋｇのサケカルシトニンにより食後のインスリン放出がなくなり、カルシトニン注入の間、血清グルコースが平行して上昇したことを見出した。
【００３６】
Ｙｏｕｎｇ（２００５）は、食事という状況で、アミリンの投与がラット、イヌおよびヒトにおいて血漿グルコースの上昇を抑止したが、食事の不在下では、アミリンの投与はげっ歯類において血漿グルコースの上昇に関連したが、ヒトにおいては関連しなかったことを報告した。
【発明の概要】
【００３７】
要約すると、上記で言及されるインスリン非依存性糖尿病または耐糖能異常に罹患しているヒトへの非経口投与の効果の研究により、そのようなカルシトニン投与は治療効果がないことが結論的に示される。
【００３８】
本発明者らは、経腸投与されたＣＴが高血糖状態を改善し、改良された血糖コントロールをもたらすことができるかどうかを調査した。本発明者らは、Ｔ２ＤＭの数種類の特徴を示す食事誘発性肥満ラット（ＤＩＯ）において、サケＣＴの経口製剤の推定効果を十分確立されたＰＰＡＲ−γアゴニストロシグリタゾンの推定効果と比較した。最終的に、本発明者らは、健常成体ラットにおいてグルコース処理に対するカルシトニンの効果を調査した。本発明者らは、予想外にも、カルシトニンの経口投与が、下に記載され説明されるように、注射または注入されたカルシトニンに関して既に開示されている効果と本質的に反対の効果を生じることを見出した。対照的に、例えば同様に経口投与または注射に利用可能であるインスリンは、どの経路が使用されても同じ種類の効果を提供する。
【００３９】
従って、本発明は、１型糖尿病、２型糖尿病、もしくはメタボリックシンドロームを治療するための、またはインスリン抵抗性を緩和するための、または望ましくないほど高い空腹時血清グルコース濃度を低下させるための、または望ましくないほど高いピーク血清グルコース濃度を低下させるための、または望ましくないほど高いピーク血清インスリン濃度を低下させるための経腸投与用の医薬製剤を提供し、その製剤は、アミリン以外のカルシトニンファミリーメンバー、修飾アミリン以外の修飾カルシトニンファミリーメンバー、またはカルシトニン受容体アゴニストである活性化合物を含む。この製剤は、前記活性化合物の効果的な経腸投与を可能にするのに役立つ担体も含み得る。
【００４０】
好ましくは、前記製剤は、消化管への経口投与のために処方される。
【００４１】
好ましくは、活性化合物は、カルシトニン、最も好ましくはサケカルシトニンである。
【００４２】
活性化合物は、アミリン以外のカルシトニンメンバーと少なくとも７５％のアミノ酸相同性を有し、かつ、アミノ酸の付加、置換または欠失により前記カルシトニンファミリーメンバーに対して修飾され、かつ、カルシトニン受容体に結合しそれを活性化させる能力を保持している修飾カルシトニンファミリーメンバーであってよい。
【００４３】
好ましくは、前記担体は、５−ＣＮＡＣを含む。
【００４４】
本発明には、１型糖尿病、２型糖尿病、もしくはメタボリックシンドロームの治療方法であって、アミリン以外のカルシトニンファミリーメンバー、修飾アミリン以外の修飾カルシトニンファミリーメンバー、またはカルシトニン受容体アゴニストである活性化合物、および任意選択的に前記活性化合物の効果的な経腸投与を可能にするのに役立つ担体を含む薬剤的有効量の医薬製剤を該状態の治療のために、治療を必要とする患者に経腸投与するステップを含む治療方法が含まれる。前記方法には、患者が前記状態に罹患しているかどうかを決定する予備的ステップ、および／または前記患者において状態を緩和するのに前記治療がどの程度効果的であるかを決定する（例えばいずれの場合にも経口ブドウ糖負荷試験または安静時血糖値を実施する）その後のステップが含まれ得る。
【００４５】
体重を減少させ、または体重増加を回避するために、患者の体重の管理を改良するため、活性化合物は、少なくとも１日２回、例えば１日２〜４回投与されることが好ましい。活性化合物の製剤は、投与スケジュールに適切な単位剤形を含んでよい。活性化合物は、糖尿病またはメタボリックシンドロームの治療を受けている患者の体重を管理する目的で投与されてよい。
【００４６】
経口経腸製剤は、口内で保持して舌下経路または頬側経路を経て血流に移動させる製剤とは対照的に、後に胃の下の腸で放出され、従って門脈を経て肝臓へ送達されるための嚥下による経口摂取のためのものである。
【００４７】
理論に縛られるものではないが、本発明者らが本明細書に報告する、カルシトニンが非経口投与されたかまたは経腸投与されたかによる、カルシトニンの効果の著しい変化は、カルシトニンを胃吸収の後に門脈を経て直ちに肝臓に運ぶ経腸投与に起因しており、カルシトニンが静脈内または筋肉内投与された場合よりもはるかに高い濃度のカルシトニンに曝露されている肝臓における受容体に導き得ると本発明者らは推測する。経腸投与されたカルシトニンが辿る肝臓への直行経路により、カルシトニンの短い半減期（ＧＬＰ−１の半減期に類似）にも関わらず、抗高血糖作用を得ることができる。カルシトニンの注入投与と経口投与の間の事実上の逆転の根底にある機構は、十分に高濃度では、カルシトニンは通常アミリンが作用する受容体でアゴニストとしての機能を果たす能力があり、従ってアミリンのような作用を生じることができるが、低い濃度では、カルシトニンは高血糖作用を生じるその他の受容体でのみ効果的であるということであり得る。しかしその他の説明も可能である。例えば、その説明は、経口投与されるとこれらの薬剤は、注射されたカルシトニンの作用する受容体とは異なるカルシトニン受容体、例えば腸管自体の受容体で直接作用するということであり得る。
【００４８】
カルシトニンは、広範囲の種にわたって高度に保存されている。カルシトニンの配列の例を下に示す。
ヒト      ＣＧＮＬＳＴＣＭＬＧＴＹＴＱＤＦＮＫＦＨＴＦＰＱＴＡＩＧＶＧＡＰ  配列番号１
サケ      ＣＳＮＬＳＴＣＶＬＧＫＬＳＱＥＬＨＫＬＱＴＹＰＲＴＮＴＧＳＧＴＰ  配列番号２
マウス    ＣＧＮＬＳＴＣＭＬＧＴＹＴＱＤＬＮＫＦＨＴＦＰＱＴＳＩＧＶＥＡＰ  配列番号３
ニワトリ  ＣＡＳＬＳＴＣＶＬＧＫＬＳＱＥＬＨＫＬＱＴＹＰＲＴＤＶＧＡＧＴＰ  配列番号４
ウナギ    ＣＳＮＬＳＴＣＶＬＧＫＬＳＱＥＬＨＫＬＱＴＹＰＲＴＤＶＧＡＧＴＰ  配列番号５
ラット    ＣＧＮＬＳＴＣＭＬＧＴＹＴＱＤＬＮＫＦＨＴＦＰＱＴＳＩＧＶＧＡＰ  配列番号６
ウマ      ＣＳＮＬＳＴＣＶＬＧＴＹＴＱＤＬＮＫＦＨＴＦＰＱＴＡＩＧＶＧＡＰ  配列番号７
イヌ−１  ＣＳＮＬＳＴＣＶＬＧＴＹＳＫＤＬＮＮＦＨＴＦＳＧＩＧＦＧＡＥＴＰ  配列番号８
イヌ−２  ＣＳＮＬＳＴＣＶＬＧＴＹＴＱＤＬＮＫＦＨＴＦＰＱＴＡＩＧＶＧＡＰ  配列番号９
ブタ      ＣＳＮＬＳＴＣＶＬＳＡＹＷＲＮＬＮＮＦＨＲＦＳＧＭＧＦＧＰＥＴＰ  配列番号１０
【００４９】
従って、本発明において使用するために好ましい材料は、一般式：
ＣＸ１Ｘ２ＬＳＴＣＸ３ＬＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ１７Ｘ１８Ｘ１９Ｘ２０Ｘ２１ＧＸ２２Ｘ２３Ｘ２４Ｐ
配列番号１１
（式中、
Ｘ１は、Ａ、Ｇ、またはＳであり；好ましくはＳであり、
Ｘ２は、ＮまたはＳであり；好ましくはＮであり、
Ｘ３は、ＭまたはＶであり；好ましくはＶであり、
Ｘ４は、ＧまたはＳであり；好ましくはＧであり、
Ｘ５は、Ｔ、Ｋ、またはＡであり；好ましくはＴまたはＫであり、最も好ましくはＫであり、
Ｘ６は、ＬまたはＹであり、好ましくはＬであり、
Ｘ７は、Ｔ、Ｓ、またはＷであり、好ましくはＴまたはＳであり、最も好ましくはＳであり、
Ｘ８は、Ｑ、Ｋ、またはＲであり、好ましくはＱであり、
Ｘ９は、Ｄ、Ｅ、またはＮであり、好ましくはＤまたはＥであり、最も好ましくはＥであり、
Ｘ１０は、ＦまたはＬであり、好ましくはＬであり、
Ｘ１１は、ＮまたはＨであり、好ましくはＨであり、
Ｘ１２は、ＫまたはＮであり、好ましくはＫであり、
Ｘ１３は、ＦまたはＬであり、好ましくはＬであり、
Ｘ１４は、ＨまたはＱであり、好ましくはＱであり、
Ｘ１５は、ＴまたはＲであり、好ましくはＴであり、
Ｘ１６は、ＦまたはＹであり、好ましくはＹであり、
Ｘ１７は、ＰまたはＳであり、好ましくはＰであり、
Ｘ１８は、Ｑ、ＧまたはＲであり、好ましくはＱまたはＲであり；最も好ましくはＲであり、
Ｘ１９は、Ｔ、ＩまたはＭであり、好ましくはＴであり、
Ｘ２０は、Ａ、Ｎ、Ｄ、Ｓ、またはＧであり、好ましくはＮであり、
Ｘ２１は、Ｉ、Ｔ、ＶまたはＦであり、好ましくはＴであり、
Ｘ２２は、Ｖ、Ｓ、Ａ、またはＰであり、好ましくはＶ、Ｓ、またはＡであり、最も好ましくはＳであり、
Ｘ２３は、ＧまたはＥであり、好ましくはＧであり、
Ｘ２４は、ＡまたはＴであり、好ましくはＴである）
を有する。
【００５０】
従って、材料は、式：
ＣＳＮＬＳＴＣＶＬＧＸ５ＬＸ７ＱＸ９ＬＨＫＬＱＴＹＰＸ１８ＴＮＴＧＸ２２ＧＴＰ
配列番号１２
（式中、
Ｘ５は、ＴまたはＫであり、より好ましくはＫであり、
Ｘ７は、ＴまたはＳであり、より好ましくはＳであり、
Ｘ９は、ＤまたはＥであり、より好ましくはＥであり、
Ｘ１８は、ＱまたはＲであり、より好ましくはＲであり、
Ｘ２２は、Ｖ、Ｓ、またはＡであり、より好ましくはＳである）
のものが好ましい。
【００５１】
サケカルシトニンが最も好ましい。
【００５２】
さらに、カルシトニンは、アミリン、カルシトニン遺伝子関連ペプチド、アドレノメデュリン、インターメジン、カルシトニン遺伝子関連ペプチドＩＩおよびカルシトニン受容体刺激ペプチド１、カルシトニン受容体刺激ペプチド２、カルシトニン受容体刺激ペプチド３、カルシトニン受容体刺激ペプチド４およびカルシトニン受容体刺激ペプチド５を含むペプチドホルモンのファミリーメンバーであると認識されている。これらのうちでＣＲＳＰ−１がその他のカルシトニン受容体刺激ペプチドよりも本発明での使用に好ましい。
【００５３】
これらのカルシトニンファミリーメンバーは、かなりの程度のアミノ酸配列相同性ならびに構造的類似性を共有する。これらには、アミノ末端の６アミノ酸または７アミノ酸のジスルフィド架橋ループ、カルボキシ末端に存在するＣ末端がアミド化された芳香族残基、および残基８〜１８または残基８〜２２からの予測された両親媒性αヘリックス構造の領域が含まれる。
【００５４】
様々な種由来のカルシトニンファミリーのその他のメンバーのアミノ酸配列は次の通りである。
アミリン
ヒト    ＫＣＮＴＡＴＣＡＴＱＲＬＡＮＦＬＶＨＳＳＮＮＦＧＡＩＬＳＳＴＮＶＧＳＮＴＹ  配列番号１３
マウス  ＫＣＮＴＡＴＣＡＴＱＲＬＡＮＦＬＶＲＳＳＮＮＬＧＰＶＬＰＰＴＮＶＧＳＮＴＹ  配列番号１４
カルシトニン遺伝子関連ペプチド
ヒト    ＡＣＤＴＡＴＣＶＴＨＲＬＡＧＬＬＳＲＳＧＧＶＶＫＮＮＦＶＰＴＮＶＧＳＫＡＦ  配列番号１５
ブタ    ＳＣＮＴＡＴＣＶＴＨＲＬＡＧＬＬＳＲＳＧＧＭＶＫＳＮＦＶＰＴＤＶＧＳＥＡＦ  配列番号１６
アドレノメデュリン
ヒト    ＴＱＡＱＬＬＲＶＧＣＶＬＧＴＣＱＶＱＮＬＳＨＲＬＷＱＬＭＧＰＡＧＲＱＤＳＡＰＶＤＰＳＳＰＨＳＹ  配列番号１７
ブタ    ＹＲＱＳＭＮＮＦＱＧＬＲＳＦＧＣＲＦＧＴＣＴＶＱＫＬＡＨＱＩＹＱＦＴＤＫＤＫＤＧＶＡＰＲＳＫＩＳＰＱＧＹ  配列番号１８
インターメジン
ヒト    ＶＧＣＶＬＧＴＣＱＶＱＮＬＳＨＲＬＷＱＬＭＧＰＡＧＲＱＤＳＡＰＶＤＰＳＳＰＨＳＹ  配列番号１９
カルシトニン遺伝子関連ペプチドＩＩ
ウシ    ＡＣＮＴＡＴＣＶＴＨＲＬＡＧＬＬＳＲＳＧＧＭＶＫＳＮＦＶＰＴＮＶＧＳＫＡＦ  配列番号２０
ヒト    ＡＣＮＴＡＴＣＶＴＨＲＬＡＧＬＬＳＲＳＧＧＭＶＫＳＮＦＶＰＴＮＶＧＳＫＡＦ  配列番号２１
カルシトニン受容体刺激ペプチド１
ヒト    ＡＣＮＴＡＴＣＭＴＨＲＬＡＧＷＬＳＲＳＧＳＭＶＲＳＮＬＬＰＴＫＭＧＦＫＩＦＮＧＰＲＲＮＳＷＦ  配列番号２２
ヤギ    ＡＣＮＴＡＴＣＭＴＨＲＬＡＧＷＬＳＲＳＧＳＭＶＲＳＮＬＬＰＴＫＭＧＦＫＩＦＳＧＰＲＫＮＦＷＦ  配列番号２３
イヌ    ＳＣＮＳＡＴＣＶＡＨＷＬＧＧＬＬＳＲＡＧＳＶＡＮＴＮＬＬＰＴＳＭＧＦＫＶＹＮ  配列番号２４
ヒツジ  ＡＣＮＴＡＴＣＭＴＨＲＬＡＧＷＬＳＲＳＧＳＭＶＲＳＮＬＬＰＴＫＭＧＦＫＩＦＳＧＰ  配列番号２５
ウシ    ＡＣＮＴＡＴＣＭＴＨＲＬＡＧＷＬＳＲＳＧＳＭＶＲＳＮＬＬＰＴＫＭＧＦＫＩＦＮＧＰ  配列番号２６
ブタ    ＳＣＮＴＡＴＣＭＴＨＲＬＶＧＬＬＳＲＳＧＳＭＶＲＳＮＬＬＰＴＫＭＧＦＫＶＦＧ  配列番号２７
ウマ    ＳＣＮＴＡＳＣＬＴＨＲＬＡＧＬＬＳＳＡＧＳＭＡＮＳＮＬＬＰＴＥＭＧＦＫＶＳ  配列番号２８
カルシトニン受容体刺激ペプチド２
イヌ    ＳＳＣＫＤＧＰＣＶＴＮＲＬＥＧＷＬＡＲＡＥＲＭＶＫＮＴＦＭＰＴＤＶＤＰＥＡＦＧＨＱＨＫＥＬＡＡ  配列番号２９
ヤギ    ＳＣＮＲＡＴＣＶＴＨＫＭＡＧＳＬＳＲＳＧＳＥＩＫＲＮＦＭＳＴＮＶＧＳＫＡＦＧＱ  配列番号３０
ブタ    ＳＣＮＴＡＳＣＶＴＨＫＭＴＧＷＬＳＲＳＧＳＶＡＫＮＮＦＭＰＴＮＶＤＳＫＩＬ  配列番号３１
カルシトニン受容体刺激ペプチド３
イヌ    ＳＳＣＫＤＧＰＣＶＴＮＲＬＥＧＷＬＡＲＡＥＲＭＶＫＮＴＦＭＰＴＤＶＤＰＥＡＦＧＨＱＨＫＥＬＡＡ  配列番号３２
ブタ    ＳＣＮＴＡＩＣＶＴＨＫＭＡＧＷＬＳＲＳＧＳＶＶＫＮＮＦＭＰＩＮＭＧＳＫＶＬ  配列番号３３
カルシトニン受容体刺激ペプチド４
イヌ    ＳＳＣＫＤＧＰＣＶＴＮＲＬＥＧＷＬＡＲＡＥＲＭＶＫＮＴＦＭＰＴＤＶＤＰＥＡＦＧＨＱＨＫＥＬＡＡ  配列番号３４
カルシトニン受容体刺激ペプチド５
イヌ    ＳＳＣＫＤＧＰＣＶＴＮＲＬＥＧＷＬＡＲＡＥＲＭＶＫＮＴＦＭＰＴＨＶＤＰＥＤＦＧＨＱＨＫＥＬＡＡ  配列番号３５
【００５５】
異なる遺伝子により発現され、異なる前駆体ペプチドから誘導されてはいるが、イヌ由来の成熟ペプチドＣＲＳＰ−２、ＣＲＳＰ−３およびＣＲＳＰ−４が同じであることは注意したほうがよいかもしれない。
【００５６】
カルシトニンファミリーのいくつかのメンバーの配列も図６および図７に示される。図６では、空白は当該アミノがラットアミリンの配列に示されるものと同じであることを示し、印字されたアミノ酸コードは配列が示された位置でそのアミノ酸を有することを示し、灰色で塗りつぶされたボックスは、カルシトニンがアミリン残基２３〜２７に相当するアミノ酸を有さないことを示す。図７では、太枠内の部分は完全に相同であり（欠失を除く）、灰色の部分は所与の配列のそれらの位置にアミノ酸が存在しないことを示す。
【００５７】
異なるファミリーメンバーは、相当な程度まで、カルシトニンにより活性化された同じ受容体に結合し、それを活性化する能力がある、すなわちカルシトニン受容体（ＣＴ受容体）のアゴニストの機能を果たす能力がある。大部分のＧタンパク質共役受容体とは違って、ＣＴ受容体は、３つの１回膜貫通型受容体活性調節タンパク質（ＲＡＭＰ）の１つに結合することにより修飾され得る。
【００５８】
本明細書において、用語「ＣＴ受容体アゴニスト」とは、下に定義される「試験プロトコール」の少なくとも１つにより実証できる方法でＣＴ受容体に結合し、それを活性化する能力のあるあらゆる化合物、特にペプチドをさす。
【００５９】
用語「カルシトニンファミリーメンバー」とは、あらゆる種において天然に存在するカルシトニン、アミリン、カルシトニン遺伝子関連ペプチド、アドレノメデュリン、インターメジン、カルシトニン遺伝子関連ペプチドＩＩおよびカルシトニン受容体刺激ペプチド１のいずれかをさす。
【００６０】
用語「修飾カルシトニンファミリーメンバー」とは、天然配列に対して修飾されたいずれかのカルシトニンファミリーメンバーのアミノ酸配列を有する化合物であって、問題の化合物がＣＴ受容体アゴニストであるように修飾された化合物をさす。修飾は、、ＣＴ受容体での化合物のアゴニスト作用を増大させるため、化合物の生物学的半減期を増加させるため、または、その貯蔵安定性を増加させることなどによって製薬用途のための化合物の薬剤処方を支援するためを含む様々な理由で行ってよい。
【００６１】
個々のカルシトニンファミリーメンバーの名称、例えば「カルシトニン」とは、特に断りのない限り、任意の種由来の任意の天然に存在するかかるファミリーメンバーをさし、そのカルシトニン配列を上記で示した種の各々を含む。
【００６２】
個々のカルシトニンファミリーメンバーの名称に付随する用語「修飾」とは、天然配列に対して修飾された、問題になっているカルシトニンファミリーメンバーのアミノ酸配列を有する化合物であって、問題の化合物がＣＴ受容体アゴニストであるように修飾された化合物をさす。
【００６３】
本発明で使用するための修飾カルシトニンファミリーメンバーは、修飾アミリンを除外する、従ってアミリンとの相同性が５０％以下、好ましくは３０％以下であるべきである。図５から、サケカルシトニンは、その３２アミノ酸構成においてカルシトニンの３７アミノ酸のうち１０アミノ酸しか有さず、そのため１０／３２＊１００％、すなわち２７％のアミリンとの相同性を有することが観察される。カルシトニンが「あまりにアミリンのよう」になる程度までのカルシトニンの修飾は除外される。
【００６４】
修飾カルシトニンファミリーメンバーにおいて上記のアミノ酸配列修飾を受けることは、天然または非天然アミノ酸による付加、欠失、または置換であり得る。好ましくは、修飾配列は、問題になっているカルシトニンファミリーメンバーの天然配列と少なくとも７５％相同であり、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％相同である。
【００６５】
従って、本発明には、活性化合物が、アミリン以外のカルシトニンメンバーと少なくとも７５％のアミノ酸相同性を有し、アミノ酸の付加、置換または欠失により前記カルシトニンファミリーメンバーに対して修飾され、カルシトニン受容体に結合しそれを活性化させる能力を保持している修飾カルシトニンメンバーである製剤が含まれる。
【００６６】
種の中で、本発明で使用するためのカルシトニンファミリーメンバーに好ましい順序は、硬骨魚類＞鳥類＞非ヒト哺乳類＞ヒトである。
【００６７】
カルシトニンファミリーメンバーは、天然に存在するならば天然であってよく、または合成されてもよく（組換え型を含む）、天然に存在しないならば合成されてよい。
【００６８】
天然に存在するカルシトニンの中で、サケカルシトニンが特に好ましい。
【００６９】
［試験プロトコール］
候補化合物がカルシトニン受容体アゴニストかどうかを決定するため、４つの試験プロトコールを開発した。
【００７０】
ＣＯＳ−７細胞を、７５ｃｍ２フラスコ中で８０％コンフルエンスまで増殖させる。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製ｐｃＤＮＡ３．１（＋）を、細胞に受容体コード配列をトランスフェクトするために使用する。７．８μＬのＦｕＧｅｎｅ６試薬を用いて、細胞を３００ｎｇのｐｃＤＮＡ−ＣＴＲ構築物のみでトランスフェクトし（試験プロトコール１）、または３００ｎｇのｐｃＤＮＡ−ＣＴＲ構築物および１μｇのｐｃＤＮＡ−ＲＡＭＰ−１でコトランスフェクトし（試験プロトコール２）、またはｐｃＤＮＡ−ＲＡＭＰ−２（試験プロトコール３）、またはｐｃＤＮＡ−ＲＡＭＰ−３（試験プロトコール４）でトランスフェクトする。
【００７１】
ｐｃＤＮＡ−ＣＴＲ構築物に組み込まれるＣＴＲ  ＤＮＡの配列は、遺伝子バンク番号ＣＡＬＣＲ：ＮＭ  ００１７４２でヒトカルシトニン受容体ｃＤＮＡに与えられるものである。ｐｃＤＮＡ−ＲＡＭＰ構築物に組み込まれるＲＡＭＰ  １  ＤＮＡ、ＲＡＭＰ  ２  ＤＮＡおよびＲＡＭＰ  ３  ＤＮＡの配列は、次の特定の遺伝子バンク番号で与えられるヒトＲＡＭＰ配列である。
ＲＡＭＰ１：ＮＭ  ００５８５５
ＲＡＭＰ２：ＮＭ  ００５８５４
ＲＡＭＰ３：ＮＭ  ００５８５６
【００７２】
４８時間後、細胞をトリプシン処理により浮遊させ、５００×ｇで遠心し、シクラーゼ緩衝液（０．１％（重量／体積）ＢＳＡおよび１ｍＭのＩＢＭＸを含有するＤＭＥＭ）に再懸濁する。細胞（５×１０５）を、１．５ｍｌエッペンドルフチューブに分注し、３７℃にて２０分間プレインキュベートする。その後、アゴニストの不在下（基底）、または漸増濃度のアゴニスト、すなわち１００マイクロモラー、１マイクロモラー、０．０１マイクロモラーの存在下で、細胞を１８分間インキュベートする。陽性対照としてこの系の最大ｃＡＭＰ蓄積を決定するために、フォルスコリン１ｍＭを含める。
【００７３】
インキュベーションの後、細胞内セカンドメッセンジャーであるｃＡＭＰの反応定量化をｃＡＭＰ−ＥＩＡキットプロトコール（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ＵＳ）に従って行う。
【００７４】
試験化合物は、４つの試験プロトコールのいずれかにおいて、それが、１０マイクロモラーの濃度で、ビヒクル対照（０．１％（重量／体積）ＢＳＡおよび１ｍＭイソブチルメチルキサンチン（ＩＢＭＸ）を含有するＤＭＥＭ）よりも５０％を超えて多くのｃＡＭＰの産生を誘導するならば、ＣＴＲアゴニストと見なされる。ｓＣＴは、１マイクロモラーを使用した場合でさえも、（少なくとも試験プロトコール１において）陰性対照と比較して１０倍以上の誘導をもたらすことになる。従って、好ましくは、本発明で使用するための化合物は、試験プロトコール少なくとも１つにおいて、少なくとも１００％（すなわち、２倍）の誘導、好ましくは少なくとも５倍の誘導を提供する。あるいは、本発明で使用するための化合物は、少なくとも１つの前記プロトコールにおいてｓＣＴにもたらされる少なくとも２５％の誘導、好ましくはｓＣＴにより与えられる少なくとも５０％の誘導を提供する。
【００７５】
好ましいＣＴＲアゴニストは、少なくとも２つの前記アッセイ（好ましくは試験プロトコール１および２または１および４）、好ましくは３つの試験プロトコール（好ましくは１、２および４）および最も好ましくは４つ全ての試験プロトコールで陽性の結果を生じる。あるいは、試験プロトコール１において試験化合物によりもたらされる応答は、試験プロトコール２〜４のいずれかにおいて試験化合物によりもたらされる応答よりも、少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも１００％大きいことが好ましい。
【００７６】
本発明で使用することのできる修飾カルシトニンの例は、米国特許第５，５３６，８１２号に見出される。よって、カルシトニンのＣ末端プロリン−アミドは、ホモセリンアミド（Ｈｓｅ−ＮＨ２）で置換され（置き換えられ）てよい。このように修飾されたサケカルシトニンまたはウナギカルシトニンは特に好ましい。
【００７７】
カルシトニンまたはその他のカルシトニンファミリーメンバーは、ＧＢ１，５９０，６４５号に教示されるように、Ｃｙｓ−Ｃｙｓ環要素をより安定した構造に置き換えることにより（例えば、第１および第２のこれらのＣｙｓ残基（通常、１番目および７番目のアミノ酸）をアミノスベリン酸に置き換えることにより得られるように）修飾されてよく、それによってｓＣＴは、
【化１】
0005993147.tif 000002
配列番号３６
となる。
【００７８】
欧州特許ＥＰ０４６４５４９号に記載されるように、カルシトニン受容体アゴニストとして作用するカルシトニン類似体ペプチドは、一般式：
ＣＸ１ＮＬＳＴＣＸ２ＬＧＸ３Ｘ４Ｘ５ＧＸ６Ｘ７Ｘ８ＬＸ９Ｘ１０ＴＸ１１ＰＸ１２ＴＸ１３Ｘ１４ＧＸ１５ＧＸ１６Ｐ−Ｘ１７
配列番号３７
（式中、Ｘ１は、Ｓｅｒ、ＧｌｙまたはＡｌａであり、Ｘ２は、ＶａｌまたはＭｅｔであり、Ｘ３は、ＴｈｒまたはＬｙｓであり、Ｘ４は、ＴｙｒまたはＬｅｕであり、Ｘ５は、ＴｈｒまたはＳｅｒであり、Ｘ６は、ＡｓｐまたはＧｌｕであり、Ｘ７は、ＰｈｅまたはＬｅｕであり、Ｘ８は、ＡｓｎまたはＨｉｓであり、Ｘ９は、Ｔｙｒ、ＰｈｅまたはＬｅｕであり、Ｘ１０は、ＨｉｓまたはＧｌｎであり、Ｘ１１は、ＴｙｒまたはＰｈｅであり、Ｘ１２は、ＧｌｎまたはＡｒｇであり、Ｘ１３は、Ａｌａ、Ｓｅｒ、ＡｓｎまたはＡｓｐであり、Ｘ１４は、Ｉｌｅ、ＴｈｒまたはＶａｌであり、Ｘ１５は、Ｖａｌ、ＳｅｒまたはＡｌａであり、Ｘ１６は、Ａｌａ、ＴｈｒまたはＶａｌであり、かつ、Ｘ１７は、アミド化ホモセリン、１〜２０個の炭素原子または随意のポリペプチド鎖を含有し、アミド化ホモセリンをＣ末端に含有する第一級アルキルアミンと反応したホモセリン−ラクトンである）
のものであってよい。
【００７９】
あるいは、カルシトニン類似体は、ヒトカルシトニンのもののようなＮ末端とＣ末端の両方に１０のアミノ酸配列、およびサケカルシトニンの１２アミノ酸中央領域を有する、配列ＰＯ−１（ＣＧＮＬＳＴＣＭＬＧＫＬＳＱＥＬＨＫＬＱＴＹＰＱＴＡＩＧＶＧＡＰ−ＮＨ２  配列番号３８）、またはＰＯ−２３（［シクロ−Ａｓｐ１、Ｌｙｓ７］−［ｄｅｓ−Ｇｌｙ２］−［Ｌｅｕ８］−ＰＯ−１）、またはＰＯ−２９（［Ａｓｐ１５、Ａｓｎ１７、Ｐｈｅ１９、Ｈｉｓ２０］−ＰＯ−２３）を有してよい。ＰＯ−２３は、物理化学的安定性を高めるために、Ａｓｐ−Ｌｙｓペプチド結合からなる環構造と置き換えたＰＯ−１のＮ末端Ｃｙｓ−Ｃｙｓ  Ｓ−Ｓ結合を有する。ＰＯ−２３分子の中央領域のＰＯ−２９は修飾されてヒトカルシトニンに酷似している。
【００８０】
カルシトニン受容体アゴニストの特性を有する多くのその他の修飾カルシトニンが文献において公知である。
【００８１】
本発明で用いるために挙げられるカルシトニン受容体アゴニストには、「小分子」（非ペプチド）アゴニストが含まれる。これらは、例えばドラッガビリティ（ｄｒｕｇｇａｂｉｌｉｔｙ）についての従来の規則を満たすことが好ましく、そして好ましくは、ＭＷ≦５００、ｌｏｇＰ（ｎ−オクタノールと水との間のその分配係数の対数ｌｏｇ（Ｃオクタノール／Ｃ水））≦５、水素結合ドナーが５以下、水素結合アクセプター（Ｎ原子とＯ原子の合計）が１０以下、および、任意選択的に一方または両方の極性表面積≦１４０  Ａ２（または水素結合ドナーとアクセプターの合計が１２以下）、および回転可能な結合が１０以下の５のうちの少なくとも４を有する。
【００８２】
本発明で使用するために適した剤形としては、錠剤、ミニタブレット、カプセル剤、顆粒剤、ペレット、粉末、発泡性固体および噛み砕くことのできる固体製剤が挙げられる。かかる製剤には、好ましくは加水分解されたゼラチンまたは低分子量ゼラチンであるゼラチンが含まれてよい。かかる製剤は、カルシトニンまたはその断片もしくはコンジュゲートおよび加水分解されたゼラチンまたは低分子量ゼラチンを含む均質な水溶液を凍結乾燥し、得られる固体材料を前記経口医薬製剤に入れてさらに処理することにより得ることができ、このとき、該ゼラチンは、１０００〜１５０００ダルトンの平均分子量を有し得る。かかる製剤には、５−ＣＮＡＣまたは本明細書に開示されるその他の化合物などの保護担体化合物が含まれてよい。
【００８３】
錠剤およびカプセル剤などの経口製剤が好ましいが、本発明で使用するための組成物は、坐剤または同類のものの形態をとってよい。カルシトニン、例えばサケカルシトニンの経口送達は、一般に、簡便であり、比較的簡単で一般に無痛であり、その他の送達形態と比較してより大きい患者のコンプライアンスが得られるので、最適な送達経路である。しかし、生物学的、化学的および物理的な障壁、例えば胃腸管におけるｐＨの変動、強力な消化酵素、および活性剤不透過性の胃腸膜などは、カルシトニン、例えばサケカルシトニンの哺乳動物への経口送達を問題のあるものにする、例えば、哺乳動物においては甲状腺の濾胞傍細胞により分泌され、鳥類および魚類においては鰓後腺により分泌される長鎖ポリペプチドホルモンであるカルシトニンの経口送達は、胃腸管におけるカルシトニンの不十分な安定性のほかにカルシトニンが腸壁を通じて血流に容易に輸送されないことにも少なくとも一部起因して、当初は難しいものだと分かった。しかし、適した経口製剤を下に記載する。
【００８４】
カルシトニンおよびその他のファミリーメンバーは、適した担体化合物と混合することにより経腸、特に経口投与用に処方することができる。単独でまたは水溶液／懸濁液中で経口投与されると、それは骨を救う作用を生じることには効果がない。適した担体化合物としては、米国特許第５，７７３，６４７号および米国特許第５８６６５３６号に記載されるものが挙げられ、これらの中でも、５−ＣＮＡＣ（Ｎ−（５−クロロサリチロイル）−８−アミノカプリル酸、その二ナトリウム塩が一般的）が特に効果的である。その他の好ましい担体または送達剤は、ＳＮＡＤ（１０−（２−ヒドロキシベンズアミド）デカン酸のナトリウム塩）およびＳＮＡＣ（Ｎ−（８−［２−ヒドロキシベンゾイル］アミノ）カプリル酸のナトリウム塩）である。加えて、ＷＯ００／０５９８６３は、式Ｉ
【化２】
0005993147.tif 000003
（式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、独立に、水素、−ＯＨ、−ＮＲ６Ｒ７、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、またはＣ１〜Ｃ４アルコキシであり、
Ｒ５は、置換もしくは非置換Ｃ２〜Ｃ１６アルキレン、置換もしくは非置換Ｃ２〜Ｃ１６アルケニレン、置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ１２アルキル（アリーレン）、または置換もしくは非置換アリール（Ｃ１〜Ｃ１２アルキレン）であり、かつ、Ｒ６およびＲ７は、独立に、水素、酸素、またはＣ１〜Ｃ４アルキルである）
の二ナトリウム塩、ならびにその水和物および溶媒和物を、活性剤、例えばカルシトニン、例えばサケカルシトニンなどの経口送達に特に有効であるとして開示し、これらは本発明において使用され得る。
【００８５】
サケカルシトニンの好ましい経腸製剤および任意選択的に微粒子化した５−ＣＮＡＣは、Ｗ０２００５／０１４０３１に記載される通りであり得る。
【００８６】
カルシトニンおよびその他のファミリーメンバーは、Ｂｏｎｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｌｉｍｉｔｅｄ社のＣａｐｓｉｔｏｎｉｎ製品に用いられる方法を用いて経口投与用に処方することができる。これらには、Ａｘｃｅｓｓ製剤（Ａｘｃｅｓｓ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ）に組み込まれる方法を挙げることができる。より詳細には、有効成分は、胃の中を通過することに耐えることができる腸溶カプセルに被包されてよい。これは、活性化合物を、例えばＷＯ０２／０２８４３６に記載されるような親水性の芳香族アルコール吸収促進剤とともに含んでよい。公知の方法では、腸溶コーティングは、ｐＨ感受性の様式で、例えば３〜７のｐＨで透過性となり得る。ＷＯ２００４／０９１５８４も、芳香族アルコール吸収促進剤を用いる適した製剤方法を記載している。
【００８７】
カルシトニンまたはその他のファミリーメンバーは、Ｕｎｉｇｅｎｅ  Ｅｎｔｅｒｉｐｅｐ（登録商標）製品で用いられる方法を用いて処方されてよい。これには、米国特許第５，９１２，０１４号、米国特許第６，０８６，９１８号または米国特許第６、６７３，５７４号に記載される方法を挙げることができる。特に、それには、カルシトニンまたはその他のファミリーメンバーの、ＨＩＶ  ＴＡＴタンパク質のタンパク質形質導入ドメインなどの膜トランスロケーターとのコンジュゲーション、１以上のプロテアーゼ阻害剤および／またはｐＨ低下剤および／または耐酸性保護ビヒクルおよび／または吸収促進剤（界面活性剤であってよい）との併用製剤（ｃｏｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）の使用が含まれてよい。
【００８８】
カルシトニンまたはその他のファミリーメンバーは、Ｏｒａｍｅｄ社製品で見られる方法を用いて処方されてよく、それには、ＷＯ２００７／０２９２３８に見られるかまたは米国特許第５，１０２，６６６号に記載されるω−３脂肪酸を含む製剤を挙げることができる。
【００８９】
一般に、これらの担体または送達剤の製薬学的に許容される塩（特に一ナトリウム塩または二ナトリウム塩）、溶媒和物（例えばアルコール溶媒和物）、および水和物を使用してよい。
【００９０】
本発明の医薬組成物は、一般に、送達有効量の５−ＣＮＡＣなどの担体、すなわち、所望の効果のためにカルシトニンを送達するのに十分な量を含む。一般に、５−ＣＮＡＣなどの担体は、全組成の２．５重量％〜９９．４重量％、より好ましくは２５重量％〜５０重量％の量で存在する。本発明に従う医薬組成物の経口投与は、規則的に（例えば毎日もしくは週単位で１回以上）、間欠的に（例えば１日もしくは１週間の間に不規則的に）、または周期的に（例えば規則的に数日もしくは数週の期間の投与の後に投与しない期間が続く）達成することができる。本発明の医薬組成物の剤形は、任意の公知の形態、例えば液体または固体の剤形であってよい。液体剤形には、溶液乳剤、懸濁剤、シロップ剤およびエリキシル剤が含まれる。カルシトニンおよび５−ＣＮＡＣなどの担体に加えて、液体製剤には、当技術分野で慣用される不活性賦形剤、例えばエタノールなどの可溶化剤；綿実油、ヒマシ油およびゴマ油などの油；湿潤剤；乳化剤；沈殿防止剤；甘味料；香味料；および水などの溶媒なども含まれ得る。固体剤形には、カプセル剤、軟ゲルカプセル剤、錠剤、カプレット、粉剤、顆粒剤またはその他の固体経口剤形が含まれ、それらは全て当技術分野で周知の方法により調製することができる。医薬組成物は、習慣的に用いられる量で添加剤をさらに含んでよく、それには、限定されるものではないが、ｐＨ調整剤、防腐剤、香味剤、味覚マスキング剤、香料、保湿剤、等張化剤（ｔｏｎｉｃｉｆｉｅｒ）、着色剤、界面活性剤、可塑剤、ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤、流動助剤、圧縮助剤、可溶化剤、賦形剤、微晶質セルロースなどの希釈剤、例えばＦＭＣコーポレーションより供給されるＡｖｉｃｅｌ  ＰＨ  １０２、またはそれらの任意の組合せが含まれる。その他の添加剤としては、リン酸緩衝塩、クエン酸、グリコール、およびその他の分散剤を挙げることができる。組成物には、１以上の酵素阻害剤、例えばアクチノニンまたはエピアクチノニンおよびその誘導体、アプロチニン、トラジロールおよびボーマン・バークインヒビターも含めてよい。さらに、輸送阻害剤、すなわち、ケトプロフィン（Ｋｅｔｏｐｒｏｆｉｎ）などのｐ糖タンパク質（［ｒｈｏ］−  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）が、本発明の組成物中に存在してよい。本発明の固体医薬組成物は、従来の方法により、例えば、カルシトニン、５−ＣＮＡＣなどの担体、および任意のその他の構成成分の混合物を混ぜ合わせ、混練し、カプセル剤に充填するかまたは、カプセル剤に充填する代わりに、成形した後にさらに錠剤成形または圧縮成形して錠剤を得ることにより、調製することができる。さらに、固体分散体を公知の方法により形成し、その後にさらに加工して錠剤またはカプセル剤を形成してよい。好ましくは、本発明の医薬組成物中の構成成分は、固体剤形の全体にわたって均質的にまたは均一に混合される。
【００９１】
あるいは、活性化合物は、前記担体とのコンジュゲートとして処方されてよく、米国特許出願公開第２００３／００６９１７０号に記載されるオリゴマー、例えばサケカルシトニンとともに形成される場合にはＣＴ−０２５として公知の
【化３】
0005993147.tif 000004
であってよい。かかるコンジュゲートは、それに記載されるように脂肪酸および胆汁酸塩と組み合わせて投与され得る。
【００９２】
例としてＭａｎｓｏｏｒ  ｅｔ  ａｌ．に記載されるように、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）とのコンジュゲートを用いてよい。
【００９３】
あるいは、活性化合物をニトロソ−Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−ペニシラミン（ＳＮＡＰ）およびＣａｒｂｏｐｏｌ溶液と、またはタウロコール酸およびＣａｒｂａｐｏｌ溶液と混合して粘膜付着性乳剤を形成することができる。
【００９４】
活性化合物は、Ｐｒｅｇｏ  ｅｔ  ａｌ．に開示されるようなキトサンナノカプセル（任意選択的にＰｒｅｇｏ  Ｐｒｅｇｏ  Ｃ、Ｔｏｒｒｅｓ  Ｄ、Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｍｅｇｉａ  Ｅ、Ｎｏｖｏａ−Ｃａｒｂａｌｌａｌ  Ｒ、Ｑｕｉｎｅｏａｅ  Ｅ、Ａｌｏｎｓｏ  ＭＪ．のようにＰＥＧ修飾されてよい）またはキトサンまたはＧａｒｃｉａ−Ｆｕｅｎｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．に開示されるようなＰＥＧ被覆脂質ナノ粒子に添加することにより処方されてよい。この目的のためのキトサンナノ粒子は、Ｇｕｇｇｉ  ｅｔ  ａｌ．に記載されるようにイミノチオラン修飾されていてよい。それらはＤｏｇｒｕ  ｅｔ  ａｌ．に記載されるように水／油／水乳濁液中に処方することができる。活性化合物の生物学的利用能は、Ｓｉｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ．またはＳｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．に記載されるように、タウロデオキシコール酸またはラウロイルカルニチンを使用することにより増大させることができる。一般に、担体として適したナノ粒子は、ｄｅ  ｌａ  Ｆｕｅｎｔｅ  ｅｔ  ａｌ．において考察され、本発明で使用され得る。
【００９５】
経口製剤に適したその他の戦略としては、Ｃｈｉａｓｍａ  Ｌｔｄ社のＷＯ２００５／０９４７８５に記載される一過性透過性エンハンサー（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ｅｎｈａｎｃｅｒ）（ＴＰＥ）系の使用が挙げられる。ＴＰＥは、疎水性媒体中の固体親水性粒子の油性懸濁液を利用して、薬剤分子を不適な胃腸（ＧＩ）環境による不活性化から保護し、同時に胃腸（ＧＩ）壁に作用してそのカーゴ薬剤分子の浸透を誘導する。
【００９６】
さらに、米国特許出願公開第２００８／０２００５６３号に記載されるように、グルタチオンまたは多数のチオール基を含有する化合物を使用して粘膜での排出ポンプの作用を阻害することが挙げられる。かかる技法の実際的な例は、Ｃａｌｉｃｅｔｉ，Ｐ．Ｓａｌｍａｓｏ，Ｓ．，Ｗａｌｋｅｒ，Ｇ．ａｎｄ  Ｂｅｒｎｋｏｐ−Ｓｃｈｎｕｒｃｈ，Ａ．（２００４）’Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｏｒａｌ  ｉｎｓｕｌｉｎ−ＰＥＧ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ．’  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，２２，３１５−３２３に、Ｇｕｇｇｉ，Ｄ．，Ｋｒａｕｌａｎｄ，Ａ．Ｈ．，ａｎｄ  Ｂｅｒｎｋｏｐ−Ｓｃｈｎｕｅｒｃｈ，Ａ．（２００３）’Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｖｉａ  ｔｈｅ  ｓｔｏｍａｃｈ：ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｏｒａｌ  ｄｏｓａｇｅ  ｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ｓａｌｍｏｎ  ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ’．Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．９２，１２５−１３５に、およびＢｅｒｎｋｏｐ−Ｓｃｈｎｕｅｒｃｈ，Ａ．，Ｐｉｎｔｅｒ，Ｙ．，Ｇｕｇｇｉ，Ｄ．，Ｋａｈｌｂａｃｈｅｒ，Ｈ．，Ｓｃｈｏｅｆｆｍａｎｎ，Ｇ．，Ｓｃｈｕｈ，Ｍ．，Ｓｃｈｍｅｒｏｌｄ，Ｉ．，Ｄｅｌ  Ｃｕｒｔｏ，Ｍ．Ｄ．，Ｄ’Ａｎｔｏｎｉｏ，Ｍ．，Ｅｓｐｏｓｉｔｏ，Ｐ．ａｎｄ  Ｈｕｃｋ，Ｃｈ．（２００５）’Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｔｈｉｏｌａｔｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ａｓ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｍａｔｒｉｘ  ｉｎ  ｏｒａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ’−Ｐｒｏｏｆ  ｏｆ  ｃｏｎｃｅｐｔ．Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ，１０６，２６−３３にも記載されている。
【００９７】
活性化合物は、ＷＯ２００４／０８４８７０に記載されるシームレスのミクロスフェアに処方されてよく、ここでは活性薬剤成分が乳濁液、マイクロエマルジョンまたは懸濁液として可溶化されていて、ミニスフィアに処方され、従来のまたは新規のコーティング技術により可変的に被覆されている。そのため、経口投与されると胃腸管に沿って特定の位置へ特定の速度で活性薬剤の所定の即時または持続放出をもたらす、「事前に可溶化された」形態の被包薬剤である。基本的に、薬剤の事前可溶化は、その動的特性の予測可能性を高め、同時に透過性および薬剤安定性を強化する。
【００９８】
米国特許出願公開第２００９／００７４８２４号に記載されるキトサン被覆ナノカプセルを用いてよい。このナノカプセルは胃液の作用に対して安定であるため、この技術によって投与される活性分子はナノカプセルの内側で保護される。さらに、この系の粘膜付着性は、腸壁への付着時間を向上させ（これらの系の胃腸管通過の遅延が立証されている）、活性分子のより効果的な吸収を促進する。
【００９９】
ＴＳＲｌ社により開発された方法を使用してよい。これらには、正電荷と負電荷の両方を有する天然由来のコラーゲン抽出物であるゼラチンが、レシチンミセル中に含まれる有効成分の粒子を被覆し、それらの集合または凝集を防止する、親水性可溶化技術（ＨＳＴ）が含まれる。この結果、極性相互作用を通じて疎水性薬剤粒子の改良された水和性がもたらされる。加えて、両親媒性のレシチンは、溶解流体と粒子表面との間の表面張力を低下させる。
【０１００】
有効成分は、賦形剤としてのククルビツリル（ｃｕｃｕｒｂｉｔｕｒｉｌｓ）とともに処方されてよい。
【０１０１】
あるいは、Ｍｅｒｒｉｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社のＧＩＰＥＴ技術を用いて、米国特許出願公開第２００７／０２３８７０７号に記載される中鎖脂肪酸もしくは中鎖脂肪酸誘導体または米国特許第７２６８２１４号に記載される膜移行ペプチドであってよい吸収促進剤とともに有効成分を含有する腸溶コーティング錠を製造してもよい。
【０１０２】
経口投与用薬剤カプセル内に収容された、膨張性パウチの内部の制御放出剤形からなるＧＩＲＥＳ（商標）技術を用いることもできる。カプセル剤の溶解時に、ガス発生システムが胃でパウチを膨らませる。臨床試験では、パウチは１６〜２４時間胃に保持されることが示された。
【０１０３】
あるいは、活性剤を胃での酵素分解に耐えさせ、その吸収を促進させる保護修飾因子に活性剤をコンジュゲートすることができる。活性剤は、精製後に結晶化し凍結乾燥させて乾燥活性薬剤成分となる単分散の短鎖メトキシポリエチレングリコール糖脂質誘導体と共有結合的にコンジュゲートさせてよい。かかる方法は、米国特許第５４３８０４０号およびｗｗｗ．ｂｉｏｃｏｎ．ｃｏｍに記載されている。
【０１０４】
また、活発な送達のために肝臓指向性ベシクル（ＨＤＶ）を用いてもよい。ＨＤＶは、活性剤を封入するリポソーム（直径１５０ｎｍ以下）からなってよく、該リポソームは肝細胞ターゲティング分子をそれらの脂質二重層に含有する。ターゲティング分子は、封入された活性剤の肝細胞への送達を指示し、従って比較的微量の活性剤が効果をもたらすために必要である。かかる技術は、米国特許出願公開第２００９／００８７４７９号およびさらにｗｗｗ．ｄｉａｓｏｍｅ．ｃｏｍに記載されている。
【０１０５】
インスリンに関して米国特許出願公開第２００２／０１１５５９２号に記載されるように、任意選択的に長鎖ＰＥＧ種と混合されている中鎖部分グリセリドに関連して、アルコールおよび補助溶媒を含む実質的に非水性の親水性媒体をさらに含有する組成物に活性剤を組み込むことができる。
【０１０６】
あるいは、Ｓｈｅｎ  Ｚ，Ｍｉｔｒａｇｏｔｒｉ  Ｓ，Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．２００２  Ａｐｒ；１９（４）：３９１−５’Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｐａｔｃｈｅｓ  ｆｏｒ  ｏｒａｌ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ’に記載されるような腸管パッチを使用してもよい。
【０１０７】
米国特許第７１８９４１４号に記載される疎水性ポリマーと混合したヒドロゲルから形成される被浸食性マトリックスに活性剤を組み込んでよい。
【０１０８】
処置されるヒト成人に適したカルシトニンの経口投与量レベルは、０．０５〜５ｍｇ、好ましくは約０．１〜２．５ｍｇの範囲であり得る。
【０１０９】
カルシトニン受容体アゴニストの投与量は、カルシトニンについて上記されたのと同じであってよく、任意選択的に、上記の試験プロトコールにおいてカルシトニン自体と比較した、アゴニストの相対アゴニスト効力に従って調整されてよい。
【０１１０】
患者の投薬処置の頻度は、毎日１〜６回、例として毎日２〜４回であってよい。処置は、望ましくは、長期間の少なくとも６週、好ましくは少なくとも６ヶ月、好ましくは少なくとも１年、および任意選択的に生涯にわたって継続される。
【０１１１】
当該状態のための併用療法は、本発明に従う組成物および１以上のその他の薬物療法の別個の投与を用いて実施してよい。あるいは、本発明に従う組成物は、１以上のその他の薬物療法を併用投与のために取り込んでよい。
【０１１２】
本発明に従う併用療法には、インスリン、ＧＬＰ−２、ＧＬＰ−１、ＧＩＰ、もしくはアミリン、または一般にその他の抗糖尿病薬とともに説明されるような活性化合物の組合せが含まれる。よって、併用製剤を含む併用療法は、インスリン感受性改善薬を用いてよく、インスリン感受性改善薬には、ビグアナイド類、例えばメトホルミン、ブホルミンおよびフェンホルミンなど、ＴＺＤ類（ＰＰＡＲ）、例えばピオグリタゾン、リボグリタゾン、ロシグリタゾンおよびトログリタゾンなど、二重ＰＰＡＲアゴニスト類、例えばアレグリタザル（Ａｌｅｇｌｉｔａｚａｒ）、ムラグリタザル（Ｍｕｒａｇｌｉｔａｚａｒ）およびテサグリタザルなど、または、スルホニル尿素類、例えばカルブタミド、クロルプロパミド、グリクラジド、トルブタミド、トラザミド、グリピジド、グリベンクラミド、グリブリド、グリキドン、グリクロピラミドおよびグリメピリドなど、メグリチニド類／グリニド類（Ｋ＋）、例えばナテグリニド、レパグリニドおよびミチグリニドなど、ＧＬＰ−１類似体、例えばエクセナチド、リラグルチドおよびアルビグルチドなど、ＤＰＰ−４阻害剤、例えばアログリプチン、リナグリプチン、サクサグリプチン、シタグリプチンおよびビルダグリプチンなど、インスリン類似体もしくは特殊な製剤、例えば（即効型）インスリンリスプロ、インスリンアスパルト、インスリングルリジン、（長時間作用型）インスリングラルギン、インスリンデテミル）、吸入可能なインスリンエクスベラおよびＮＰＨインスリンなどを含む分泌促進薬、ならびに、α−グルコシダーゼ阻害剤類、例えばアカルボース、ミグリトールおよびボグリボースなど、アミリン類似体、例えばプラムリンチドなど、ＳＧＬＴ２阻害剤、例えばダパグリフロジン、レモグリフロジンおよびセルグリフロジンなどを含むその他の薬剤、ならびにベンフルオレックスおよびトルレスタットを含む種々の薬剤が含まれる。
【０１１３】
本発明者らは、経腸投与されたカルシトニンファミリーメンバー、特にカルシトニン自体の、インスリン抵抗性に罹患している患者においてグルコース濃度を改善する効果が、カルシトニンが、骨格筋および肝臓で、それぞれ血清グルコースを上昇させるかまたは低下させるという点で反対の効果を与えること、および、経腸投与がカルシトニンを肝臓に選択的に送達するのに対して非経口投与は骨格筋で作用することを好むことに基づいて説明可能であり得ると仮定する。骨格筋で作用する際、カルシトニンはグルコースの消費を促進し、そのため乳酸塩を産生し、乳酸塩は肝臓に移動して、肝臓によるグルコースの産生をシグナル伝達することを本発明者らは示唆する。一方、カルシトニンは肝臓で作用してグルコースを貯蔵するためにグリコーゲンの産生を引き起こす。
【０１１４】
この理論は、その他の全ての報告される動物実験で得られる結果とは対照的に、非常に高用量の注入カルシトニンが血漿グルコースの低下をもたらした、Ｌｕｐｕｌｅｓｃｕにおいて報告される異常な結果を説明することができる。使用される非常に高い用量が、肝臓においてカルシトニンの受容体を活性化させるために十分であったため、その他の実験で見られる骨格筋の応答を圧倒するものと本発明者らは示唆する。
【０１１５】
活性化合物は、カルシトニン受容体アゴニストであってよい。これらの多くは当技術分野で公知であり、それらは本来ペプチドではなくむしろ合成小分子である。その他の公知のカルシトニン受容体アゴニストは、カルシトニン模倣ペプチドである。両方の種類の例は以下に開示されている。
【０１１６】
本発明に従う使用のためのカルシトニン受容体アゴニストとしては、一般式
【化４】
0005993147.tif 000005
（式中、Ｒ１はＨ、ヒドロキシル基、１〜４Ｃアルキルオキシ基または７〜１０Ｃアラルキルオキシ基であり、Ｒ２およびＲ３は、各々、１〜４Ｃアルキル基であり、Ｒ４およびＲ５は、各々、Ｈ、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、１〜４Ｃアルキル基、７〜１０Ｃアラルキル基、１〜４Ｃアルキルオキシ基、７〜１０Ｃアラルキルオキシ基、１〜７Ｃアシルオキシ基、アミノ基、１〜４Ｃアルキルアミノ基、１７〜１０Ｃアラルキルアミノ基、１〜７Ｃアシルアミノ基、カルボキシル基、１〜４Ｃアルキルオキシカルボニル基、７〜１０Ｃアラルキルオキシカルボニル基、少なくとも１つの置換基を有することのできるカルバモイル基、アシル基またはスルファモイル基である）
および薬理学的に許容されるそれらの塩を含む特開２００１−２９４５７４号のものが挙げられる。
【０１１７】
好ましい化合物（ＳＵＮ  Ｂ８１５５）は、式
【化５】
0005993147.tif 000006
の１つである。
【０１１８】
本発明に従う使用のためのカルシトニンミメティクスとしては、ＷＯ９９／３７６０４に記載されるものが挙げられる。そこには、式
【化６】
0005993147.tif 000007
（式中、Ｒ１およびＲ２は、各々、独立に、水素、１〜６個の炭素原子を有するアルキル、１〜６個の炭素原子を有するアルケニル、アリール、置換アリール、アルキルアリール、置換アルキルアリール、炭素環、置換炭素環、複素環、置換複素環、およびそれらの組合せからなる群から選択されるメンバーであり、その組合せは、融合または共有結合され、置換基は、ハロゲン、ハロアルキル、ヒドロキシ、アリールオキシ、ベンジルオキシ、アルコキシ、ハロアルコキシ、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アシルオキシ、アシル、アルキルおよびアリールからなる群から選択され、
Ｒ３は、２，５二置換アリールであり、
Ｒ４およびＲ５は、各々独立に、水素および１〜６個の炭素原子を有するアルキルからなる群から選択されるか、または一緒になって、飽和もしくは不飽和５員環、飽和もしくは不飽和６員環および飽和もしくは不飽和７員環からなる群から選択される環を形成し；
ＺおよびＸは、各々独立に、基ＮＨ、Ｏ、Ｓ、またはＮＲから選択され、この際、Ｒは、１〜６個の炭素原子の低級アルキル基であり、
ｎおよびｍは、各々独立に、０から６の整数である）
の化合物が記載されている。
【０１１９】
これらには、式
【化７】
0005993147.tif 000008
（式中、Ｒ１およびＲ２は、各々独立に、水素、１〜６個の炭素原子を有するアルキル、１〜６個の炭素原子を有するアルケニル、アリール、置換アリール、アルキルアリール、置換アルキルアリール、炭素環、置換炭素環、複素環、置換複素環、およびそれらの組合せからなる群から選択され、その組合せは、融合または共有結合され、置換基は、ハロゲン、ハロアルキル、ヒドロキシ、アリールオキシ、ベンジルオキシ、アルコキシ、ハロアルコキシ、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アシルオキシ、アシル、アルキルおよびアリールからなる群から選択され、
Ｓ１、Ｓ３およびＳ４は、各々独立に、水素、ハロゲン、ハロアルキル、ヒドロキシ、アリールオキシ、ベンジルオキシ、アルコキシ、ハロアルコキシ、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アシルオキシ、アシル、アルキルおよびアリールからなる群から選択され、
Ｓ２およびＳ５は、各々独立に、アルキルまたはアリールである）
の化合物が含まれる。
【０１２０】
特に、好適には、Ｒ１は、４−エトキシベンジル、１−エチル−インドリルメチル、ベンジル、４−アロキシベンジル（ａｌｌｏｘｙｂｅｎｚｙｌ）、１−アリル−インドリルメチル、４−クロロベンジル、４−フルオロベンジル、４−ヨードベンジル、２−ナフチルメチルまたはフェニルであり、
Ｒ２は、エチル、アリル、ベンジルまたは２−ナフチルメチルであり、
Ｓ２およびＳ５は、ｔ−ブチルである。
【０１２１】
使用することのできる化合物のさらなる例は、米国特許第７，３９６，９３６号に見出される。これらには、式：
【化８】
0005993147.tif 000009
（式中、
Ｘは、ＮまたはＮＯであり、
Ｙは、二価の置換もしくは非置換アリール、ヘテロシクリル、またはシクロアルキル基であり、
Ｚは、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ５、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ６Ｒ７、−ＮＲ６Ｃ（Ｏ）Ｒ５、−ＮＲ６Ｃ（Ｏ）ＮＲ６Ｒ７、−Ｃ（Ｏ）Ｒ５、−ＮＲ６Ｒ７、−〇Ｒ８、−ＳＯ２ＮＲ６Ｒ７、−ＮＲ６ＳＯ２Ｒ５、または−Ｓ（Ｏ）ｍＲ５であり、
Ｒ１は、−Ｈ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ９、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１０Ｒ１１、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ９、または−ＮＲ１０Ｃ（Ｏ）Ｒ９であり、
Ｒ２は、−（Ｃ１〜２アルキル）−Ｒ１２であり、この際、Ｃ１〜２アルキルは置換されているか非置換であり、
Ｒ３は、Ｃ２〜６分枝もしくは非分枝アルキル基であり、任意選択的に１以上のＦで置換され、
Ｒ４ａおよびＲ４ｂは、各々独立に、−Ｈまたは置換もしくは非置換Ｃ１〜４アルキル基であり、
Ｒ５は、置換もしくは非置換アラルキル、へテロアラルキル、ヘテロシクリルアルキル、またはシクロアルキルアルキル基であり、
Ｒ６およびＲ７は、各々独立に、−Ｈまたは置換もしくは非置換アラルキル、へテロアラルキル、ヘテロシクリルアルキル、またはシクロアルキルアルキル基であり、あるいは、Ｒ６およびＲ７は、同じ原子に結合した場合、一緒に置換もしくは非置換ヘテロシクリル基を形成し、
Ｒ８は、置換もしくは非置換、分枝もしくは非分枝のＣ２〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、またはＣ７〜１０アラルキル基であり、
Ｒ９は、−Ｈまたは置換もしくは非置換アルキル、ヘテロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、またはヘテロシクリルアルキル基であり、
Ｒ１０およびＲ１１は、各々独立に、−Ｈまたは置換もしくは非置換アルキル、ヘテロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、またはヘテロシクリルアルキル基であり、あるいはＲ１０およびＲ１１は、同じ原子に結合した場合、一緒に置換もしくは非置換ヘテロシクリル基を形成し、
Ｒ１２は、置換もしくは非置換シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール基であるか、または非置換アルキル基であり、
ｍは、０、１または２である）
の化合物、その立体異性体、その互変異性体、その溶媒和物、そのプロドラッグ、およびその製薬学的に許容される塩が含まれる。
【０１２２】
例えば、５−カルバモイル−２−［２−（４−フルオロ−フェニル）−エチル］−４−｛４−［（フラン−２−イルメチル）−カルバモイル］−フェニル｝−６−プロピル−ニコチン酸エチルエステル、
５−カルバモイル−２−（２−シクロヘキシル−エチル）−４−｛４−［（フラン−２−イルメチル）−カルバモイル］−フェニル｝−６−イソブチル−ニコチン酸エチルエステル、
５−カルバモイル−２−［２−（４−フルオロ−フェニル）−エチル］−４−｛４−［（フラン−２−イルメチル）−カルバモイル］−フェニル｝−６−イソブチル−ニコチン酸エチルエステル、
５−カルバモイル−２−（２−シクロヘキシル−エチル）−４−｛４−［（フラン−２−イルメチル）−カルバモイル］−フェニル｝−６−プロピル−ニコチン酸エチルエステル；
５−カルバモイル−２−［２−（４−フルオロ−フェニル）−エチル］−６−プロピル−４−｛４−［（ピリジン−３−イルメチル）−カルバモイル］−フェニル｝−ニコチン酸エチルエステル、
５−カルバモイル−２−（２−シクロヘキシル−エチル）−６−プロピル−４−｛４−［（ピリジン−３−イルメチル）−カルバモイル］−フェニル｝−ニコチン酸エチルエステル、
２−［２−（４−フルオロ−フェニル）−エチル］−４−｛４−［（フラン−２−イルメチル）−カルバモイル］−フェニル｝−６−イソブチル−ピリジン−３，５−ジカルボン酸ジアミド、
５−カルバモイル−６−エチル−２−［２−（４−フルオロ−フェニル）−エチル］−４−｛４−［（フラン−２−イルメチル）−カルバモイル］−フェニル｝−ニコチン酸エチルエステル、および
５−カルバモイル−２−［２−（４−フルオロ−フェニル）−エチル］−６−イソブチル−４−｛４−［（ピリジン−３−イルメチル）−カルバモイル］−フェニル｝−ニコチン酸エチルエステルが挙げられる。
【０１２３】
その上、活性化合物は、ＷＯ９８／３７０７７に記載される通りであってよい。従って、それは式
【化９】
0005993147.tif 000010
（式中、
ＡおよびＢは、各々、独立に、アリール、置換アリール、炭素環、置換炭素環、複素環、置換複素環、およびそれらの組合せからなる群から選択されるメンバーであり、前記組合せは融合または共有結合され、前記置換基は、ハロゲン、ハロアルキル、ヒドロキシ、アリールオキシ、ベンジルオキシ、アルコキシ、ハロアルコキシ、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アシルオキシ、アシル、アルキルおよびアリールからなる群から選択され、Ｒ１およびＲ２は、各々、独立に、水素および１〜６個の炭素原子を有するアルキル基からなる群から選択されるか、または一緒に、飽和もしくは不飽和５員環、飽和もしくは不飽和６員環および飽和もしくは不飽和７員環からなる群から選択される環を形成し、Ｙ１およびＹ２は、各々独立に、−ＣＨ２−、−ＮＨＣ（Ｏ）−、−ＮＲＣ（Ｏ）−、−ＮＨＣ（Ｓ）−、−ＮＲＣ（Ｓ）−、−ＮＨＣ（＝ＮＨ）−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、および−Ｃ（Ｓ）−からなる群から選択される結合または二価のラジカルであり、式中のＲは、１〜６個の炭素原子の低級アルキル基であり、ｎは、０〜４の整数である）の化合物であり得る。
【０１２４】
適切な例としては、
【化１０】
0005993147.tif 000011
が挙げられる。
【０１２５】
用いることのできるペプチドに基づくミメティクスの中には、米国特許第５，６９８，５２１号のものがあり、それには、
アセチル−Ｔｒｐ−Ｘａａ１−Ｇｌｎ−Ｘａａ２−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｘａａ３−Ｌｅｕ−Ｘａａ４−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｘａａ５−Ｐｒｏ−Ｘａａ６−Ｘａａ７−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−ＣＯＯＨ、および
アセチル−Ｔｒｐ−Ｘａａ１−Ｇｌｎ−Ｘａａ２−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｘａａ３−Ｌｅｕ−Ｘａａ４−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｘａａ５−Ｐｒｏ−Ｘａａ６−Ｘａａ７−Ｐｈｅ−ＣＯＯＨ（配列番号２）
（式中、アセチルは、ＣＨ３ＣＯ−−であり、Ｘａａ１は、イソバリンであり、Ｘａａ２、３、４、５、および６は、２−アミノイソ酪酸であり、Ｘａａ７は、４−メチルプロリンである）のいずれかが含まれる。 
【０１２６】
本発明は、添付の図面を参照する次の実施例によってさらに説明され、図解される。
【図面の簡単な説明】
【０１２７】
【図１】全ての処置群での試験中の体重変化を示す図である。ａ）ビヒクルおよびロシグリタゾン群、ｂ）カルシトニンおよび５−ＣＮＡＣ処置群。
【図２】（パネルａおよびｄ中）ａ）ビヒクルおよびロシグリタゾン処置群およびｄ）カルシトニンおよび５−ＣＮＡＣ処置群に関する１２０分間にわたる経口ブドウ糖負荷試験（ＯＧＴＴ）の結果を示す図である。（パネルｂおよびｅ中）ｔ＝０に正規化した１２０分のＯＧＴＴの間のｂ）ビヒクルおよびロシグリタゾン処置群およびｅ）カルシトニンおよび５−ＣＮＡＣ処置群に関するグルコース濃度の相対変化を示す図である。（パネルｃおよびｆ中）棒グラフは、積分したＡＵＣを示す。
【図３】（パネルａおよびｄ中）ａ）ビヒクルおよびロシグリタゾン処置群およびｄ）５−ＣＮＡＣおよびカルシトニン処置群のＤＩＯラットで測定した、１２０分のＯＧＴＴの間の総インスリン濃度を示す図である。（パネルｂおよびｅ中）ｂ）ビヒクルおよびロシグリタゾン処置群およびｅ）５−ＣＮＡＣおよびカルシトニン処置群における、１２０分のＯＧＴＴの間のｔ＝０からのＤＩＯラットにおけるインスリン濃度の変化を示す図である。（パネルｃおよびｆ中）棒グラフは、積分したＡＵＣを示す。
【図４】カルシトニンおよび５−ＣＮＡＣで処置した健常な対照動物におけるＯＧＴＴの結果を示す図である。ａ）５−ＣＮＡＣおよびカルシトニン処置群においてモニタリングした総グルコース濃度。ｂ）５−ＣＮＡＣおよびカルシトニン処置における１２０分のＯＧＴＴの間にモニタリングしたグルコース濃度の相対変化、ｔ＝０に正規化。ｃ）積分したＡＵＣ。
【図５】図４のＯＧＴＴの間のインスリン濃度を示す図である。ａ）５−ＣＮＡＣおよびカルシトニン処置群においてモニタリングした総インスリン濃度。ｂ）５−ＣＮＡＣおよびカルシトニン処置群における１２０分のＯＧＴＴの間にモニタリングしたインスリン濃度の相対変化、ｔ＝０に正規化。ｃ）積分したＡＵＣ。
【図６】いくつかのアミリン様ペプチドのアミノ酸配列をアミリンと比較して示す図である（配列番号１、２、６、１０、４８〜５６）。
【図７】いくつかのアミリン受容体アゴニストのアミノ酸配列をアミリンと比較して示す図である（配列番号３９〜４７）。
【図８】実施例４で得られる結果を示す図であり、８週の処置期間中の経口サケカルシトニンの正常ラットにおける体重増加への効果を示す。データは平均値＋／−ＳＥＭとしてプロットされる。
【図９】実施例４で得られる結果を示す図であり、７週の処置期間中の経口サケカルシトニンのＯＶＸ誘発性体重増加からの部分的保護効果を示す。データは平均値＋／−ＳＥＭとしてプロットされる。
【図１０】実施例４で得られる結果を示す図であり、１日１回用量の経口サケカルシトニンが、８週の処置期間中のＯＶＸ誘発性体重増加を保護しないことを示す。データは平均値＋／−ＳＥＭとしてプロットされ、出発体重は正規化されている。
【図１１】実施例５で生成されたデータを示す図であり、パネルＡ〜Ｄは、ＳＮＡＣとともに処方されたｓＣＴの経口生物学的利用能を示す。
【図１２】実施例５で生成されたデータをさらに例示する図であり、ＳＮＡＣとともに処方されたｓＣＴの経口生物学的利用能を示す。
【実施例１】
【０１２８】
［ＤＩＯラットにおける経口ブドウ糖負荷試験に対する応答での５−ＣＮＡＣと組み合わせたサケカルシトニンの、ロシグリタゾンと比較した効果］
（材料および方法）
〈動物〉
合計４８匹の選択交配した雄ＤＩＯラットを使用した。実験の初めに、動物たちは３５週齢に到達し、そのうちの３１週が高脂肪食であった。ロシグリタゾンを、１０％のヒドロキシプロピルβ−シクロデキストリン（カタログ番号Ａ０３６７．０１００）に懸濁した。サケカルシトニン（ＣＴ）および５−ＣＮＡＣ（Ｎ−（５−クロロサリチロイル）−８−アミノカプリル酸）を、ＭｉｌｌｉＱ水に懸濁した。動物を、１５０ｍｇ／ｋｇ／日の５−ＣＮＡＣ、またはその量の５−ＣＮＡＣと２ｍｇ／ｋｇ／日のカルシトニンの組合せのいずれかの１日１回投与量で５週間処置するか、または、３ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇのロシグリタゾン（既知の抗糖尿病薬、陽性対照として使用）で処置した。
【０１２９】
７日、２１日および４２日に絶食時血清および尿試料を収集し、全身組織組成をＭＲスキャンにより評価した。４２日に、ラットにおいて経口ブドウ糖負荷試験（ＯＧＴＴ）を行ってグルコースホメオスタシスを評価した。１日に、動物を体重および全身体脂肪量（４−ｉｎ−１  ＥｃｈｏＭＲＩスキャナにより評価）に従って異なる処置群に階層化させた。これらの群を体重により３つのチームに無作為に分けた。
【０１３０】
投薬の初日を０日とした。動物に５ｍｌ／ｋｇを経口的に投与した。５ｍｌシリンジ（ｌｕｅｒ  ｌｏｃｋ（商標）．Ｂｅｃｔｏｎ社）に接続された胃管を用いる経口胃管栄養法によって、試験全体の間（０〜４２日）、化合物溶液を１日１回午前７：００〜午後２：００に投与した。
【０１３１】
〈体重増加〉
グリタゾンは体重増加を誘発することが知られているので、動物を継続的に秤量した。図１ａおよび１ｂに見られるように、ビヒクル群の動物は、実験を通じて一定の体重を維持した。対照的に、３ｍｇ／ｋｇのロシグリタゾンで処置したラットは、実験の経過の間、治療開始直後から始まる体重の有意な（ｐ＝０．０５）増加を示した。１０ｍｇ／ｋｇのロシグリタゾンで処置した動物も、ビヒクルのみを投与された動物の体重と比較して体重が有意に増加した（ｐ＝０．０００１）。ＣＴ処置群も５−ＣＮＡＣ群も、それらの体重に変化を示さなかった（ｐ＝０．８）。
【０１３２】
治療プログラムの間に増加した体重の分布を評価するため、終了後に動物をＭＲ分析に供した。２つのパラメータ、すなわち１）脂肪量の変化、および２）総水分量の変化を調査した。
【０１３３】
両方のロシグリタゾン用量は、ビヒクル群のラットおよび５−ＣＮＡＣ群のラットと比較して、総脂肪の有意な増加をもたらした（ｐ＜０．０００１）。しかし、ロシグリタゾン群と比較してＣＴ処置群の脂肪量の増加は有意に低いが（ｐ＜０．０００１）（表２参照）、５−ＣＮＡＣ群およびビヒクル群と比較して有意に高かった。どちらの処置も水分の蓄積をもたらさないと思われた。食物摂取のモニタリングにより、体重増加が食物摂取の増加により引き起こされるものでないことが示された（データは示さず）。
【０１３４】
（経口ブドウ糖負荷試験（ＯＧＴＴ））
異なる処置群でのグルコース処理を試験するため、経口ブドウ糖負荷試験（ＯＧＴＴ）を行った。ビヒクルのみを投与された動物のベースライン血漿グルコース濃度はロシグリタゾン処置群のそれよりも有意に高く（ＡＮＯＶＡ  ｐ＝０．０００５；Ｄｕｎｎｅｔｔ調整：ビヒクル対ロシグリタゾン３ｍｇ／ｋｇ  ｐ＝０．００６；ビヒクル対ロシグリタゾン１０ｍｇ／ｋｇ  ｐ＝０．０００３）、ロシグリタゾンが実際に基底グルコース濃度を低下させることが示された（図２ａ）。ＯＧＴＴの間、ビヒクル群の血漿グルコース濃度は１０．１ｍｍｏｌ／Ｌグルコースまで増加し、ＯＧＴＴの全期間の間上昇したままであり、モデル特性の１つとしてグルコースクリアランスの低下を示すＤＩＯラットについて予測したように、高血糖の状態が確立された。対照的に、ロシグリタゾン処置された動物は、予測したようにベースラインのときおよびＯＧＴＴの間良好なグルコース調節を示した（図２ａおよび２ｂ）。ＣＴ処置動物を５ＣＮＡＣ群と比較すると、ＣＴはピークグルコース濃度を大きく低下させた（図２ｃおよび２ｄ）。ＣＴ群では、ＯＧＴＴの１５分後に、ＯＧＴＴの間持続したレベルである最大値の８．２ｍＭまで血糖値が増加し、一方５−ＣＮＡＣ群ではグルコース濃度は６０分に９．８ｍＭのピーク濃度に達し、この増加はＯＧＴＴを通して持続した。
【０１３５】
血漿グルコースクリアランスの純変化の曲線下面積（ＡＵＣ）を用いて様々な治療戦略の効果を比較した。ロシグリタゾンおよびＣＴ処置は両方ともＯＧＴＴの間に有意なグルコースクリアランスの増加を引き起こした。１０ｍｇ／ｋｇのロシグリタゾンによる処置は、３ｍｇ／ｋｇのロシグリタゾンの効果の速度と比較して有意に速いグルコースクリアランスを示した。この変化のＡＵＣに対するＣＴの効果は、ロシグリタゾン群において見られる変化よりも著しく大きかった。
【０１３６】
血漿インスリン応答曲線は、異なる処置群の全ての動物について算出され、ＯＧＴＴの間の様々な時点のそれらの血漿インスリン濃度を反映していた。ビヒクル群はロシグリタゾンに対して約５．３４μｇ／Ｌのより高い基底インスリン濃度を有し、インスリン応答の増大はグルコースの注入１５分後に１１．９７μｇ／Ｌでピークに達した。初期応答の後、インスリン濃度は約８．４０μｇ／Ｌに低下し、この高インスリン性の状態は残りのＯＧＴＴの間も変わらないまま続いた（図３）。ロシグリタゾンは、ビヒクル群と比較した場合、基底インスリン濃度およびＯＧＴＴ誘導性インスリン濃度の両方を用量依存的に低下させた（図３ａおよびｂ）。ＣＴ処置は、５−ＣＮＡＣ群と比較した場合にインスリン応答の減弱をもたらし、グルコース注入１５分後にピークインスリン濃度を観察し、以後インスリン濃度は基底レベルの４．５３μｇ／Ｌに戻った。一方、５−ＣＮＡＣ処置群も１５分後にピークに達したが、そのレベルはＯＧＴＴを通じて高インスリン性の状態にとどまった。
【０１３７】
上記の結果を、変化のＡＵＣを図解する図３ｅにさらに反映させる。ここでは、ＣＴ処置は、ロシグリタゾンの作用よりも著しく大きい作用である、インスリン濃度の最も低い変化をもたらす。
【実施例２】
【０１３８】
［スプラーグドーリーラットにおける経口ブドウ糖負荷試験の応答に対する５−ＣＮＡＣと組み合わせたサケカルシトニンの効果］
（健常なラットにおけるＯＧＴＴ）
ＣＴがグルコース低下特性を有するかどうかをさらに調べるため、本発明者らは２０匹の（年齢および性別の一致する）痩せた対照スプラーグドーリーラットでＯＧＴＴを行い、そのうち１０匹を５−ＣＮＡＣ群に割り当て、１０匹をＣＴ処置群に割り当てた。ラットを、ＤＩＯラットのように同じ用量を用いて５週間毎日処置した。ＣＴ処置は、これらの動物において基底グルコース濃度を低下させた（図４ａ）。ＯＧＴＴの間、ビヒクル群は、１５分後に１０．１ｍｍｏｌ／ｌのピークグルコース濃度示し、その後グルコース濃度はベースラインの近くまで戻った。ＣＴによる処置は、この劇的なピークを防ぎ、グルコース濃度を低く維持してより速いクリアランスをもたらし、ＣＴ処置群において血糖コントロールおよび血糖クリアランスへの有益な効果を示した。とりわけ、ビヒクルとＣＴ処置動物の両方が、ｔ＝１２０分の実験の終わりに基底血糖値に達した。ＯＧＴＴの間の変化のＡＵＣ算出により、ＣＴ処置がグルコース濃度を強力に低下させることが確認された（図４ｃ）。
【０１３９】
さらに、本発明者らはまた、ＯＧＴＴの間のインスリン濃度へのＣＴの効果をモニタリングした。ＯＧＴＴの間、ビヒクル処置群は、約３０分間持続したレベルである２．５μｇ／Ｌまでインスリン濃度を増加させることにより応答した。１２０分後、ビヒクル処置群のインスリン濃度は基底に戻った。ＣＴ処置動物は、約０．５μｇ／Ｌの少しの増加でＯＧＴＴに応答し、インスリン濃度はわずか６０分後に基底に戻った。０分から１２０分までの、対照と比較したビヒクル処置動物のインスリン濃度の変化は有意ではなかった（ｐ＝０．５３）、一方、変化のＡＵＣは、群間で有意であった（ｐ＝０．０８）。結果を図５ａおよび５ｂに示す。
【実施例３】
【０１４０】
［カルシトニン受容体アゴニストのスクリーニング］
（カルシトニンおよびアミリン受容体アゴニストアッセイ）
カルシトニン受容体（ＣＴＲ）およびアミリン受容体アゴニストを同定するため、本発明者らは、受容体増幅タンパク質（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）（ＲＡＭＰ）の不在下または存在下でＣＴＲをトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞を使用した。ＣＴＲは、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）であり、ＧＰＣＲのアゴニストをアッセイする多くの機会が得られ（１〜１２）、その中ではｃＡＭＰの誘導が有力なアッセイ候補である。ＣＯＳ−７細胞は、表現型的に有意なレベルの内因性ＲＡＭＰ、ＣＴ受容体、およびＣＬ（１３〜１５）を欠くという理由により選択された。かかる受容体成分の有意なバックグラウンド発現がなければ、定義された受容体サブタイプを正確に比較することができる。
【０１４１】
本発明者らは４つのアッセイを作成した。
１．ＲＡＭＰ１、ＲＡＭＰ２またはＲＡＭＰ３の不在下でＣＴＲを過剰発現させることによる、ＣＴＲに特異的なアッセイ。
２．ＲＡＭＰ１を含むがＲＡＭＰ２またはＲＡＭＰ３の不在下でＣＴＲを過剰発現させることによる、アミリン受容体を活性化させることに特異的なアッセイ。
３．ＲＡＭＰ２を含むがＲＡＭＰ１またはＲＡＭＰ３の不在下でＣＴＲを過剰発現させることによる、アミリン受容体を活性化させることに特異的なアッセイ。
４．ＲＡＭＰ３を含むがＲＡＭＰ１またはＲＡＭＰ２の不在下でＣＴＲを過剰発現させることによる、アミリン受容体を活性化させることに特異的なアッセイ。
【０１４２】
化合物は、ビヒクル対照と比較して５０％よりも多くのｃＡＭＰの有意な誘導により、（１ｍＭのＩＢＭＸの存在下であろうと不在下であろうと）特異的受容体の特異的誘導因子と見なされた。
【０１４３】
カルシトニン吸収配列およびアミリン受容体配列は、様々な種において、異なるスプライス変異体で、既に知られている（１６、１６〜３５）。
【０１４４】
受容体アゴニズムをアッセイするため、ウェルを７５ｃｍ２フラスコ中で８０％コンフルエンスまで増殖させた。７．８μＬのＦｕＧｅｎｅ６試薬を用いて、細胞に３００ｎｇのｐｃＤＮＡ−ＣＴＲ構築物およびｐｃＤＮＡ−ＲＡＭＰ−１、ｐｃＤＮＡ−ＲＡＭＰ−２またはｐｃＤＮＡ−ＲＡＭＰ−３のいずれか１μｇをコトランスフェクトした。４８時間後、細胞をトリプシン処理により浮遊させ、５００×ｇで遠心し、シクラーゼ緩衝液（０．１％（重量／体積）ＢＳＡおよび１ｍＭのＩＢＭＸを含有するＤＭＥＭ）に再懸濁した。細胞（５×１０５）を、１．５ｍｌエッペンドルフチューブに分注し、３７℃にて２０分間プレインキュベートした。その後、アゴニストの不在下（基底）または漸増濃度のアゴニストの存在下、細胞を１８分間インキュベートした。ペプチド．フォルスコリンを含めて、陽性対照としてこの系の最大ｃＡＭＰ蓄積を決定した。インキュベーションの後、Ｂｅｃｋｍａｎ微量遠心機で１２，０００×ｇにて４℃で１分間反応物を遠心した。細胞をＰＢＳで洗浄し、再び遠心した。０．５ｍｌ無水エタノールでｃＡＭＰを抽出した。試料を蒸発乾固させて、緩衝液（５０ｍＭ酢酸ナトリウム、１ｍＭテオフィリン）中で再構成した。ｃＡＭＰを検出するための特定のアッセイを用いてｃＡＭＰのレベルをアッセイした。例えば、細胞内セカンドメッセンジャーｃＡＭＰの定量をＥＩＡキットプロトコール（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ＵＳ）に従って行い、交互に試料のアセチル化に続くＲＩＡアプローチをその後に行った。非結合放射能を、０．２５％（重量／体積）ＢＳＡおよび０．２％（重量／体積）木炭を含有する１ｍｌの分離緩衝液［１００ｍＭリン酸水素二カリウム、１００ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．４］を用いて１５分間４℃にて抽出し、４，０００×ｇで１５分間の遠心分離により抗体結合放射能から分離した。上清を吸引し、ペレットをＰａｃｋａｒｄ  γカウンターで計数した。
【０１４５】
ＧＰＣＲアゴニストの同定のための代替アッセイ技法は、最近は（１〜１２）を含めて文献に広範囲に記載されているのでその分野の専門家により実行され得る。
【実施例４】
【０１４６】
［経口サケカルシトニンは、健常なスプラーグドーリーラットと、卵巣切除誘発性の体重増加の状態のスプラーグドーリーラットの両方において体重増加を低下させる。］
合計４０匹のラットを、２つの両側卵巣切除（ＯＶＸ）群および２つの正常群の４つの群に分割した。正常群およびＯＶＸ群の両方の動物を、１５０ｍｇ／ｋｇ／日の５−ＣＮＡＣか、またはサケカルシトニン２ｍｇ／ｋｇ／日と組み合わせたその量の５−ＣＮＡＣのいずれかの１日２回投与で７週間または８週間処置し、その間動物の体重を週１回モニタリングした。
【０１４７】
投薬の最初の日を０日とした。動物に５ｍｌ／ｋｇを経口投与した。実験全体の間、化合物溶液は１日２回投与され、最初の投与は午前７：００であり、２回目の投与は８時間後（午後３〜４時）であった。投薬は、５ｍｌシリンジに接続された胃管を用いる経口胃管栄養法によって行った。摂食は自由であった。
【０１４８】
図８に見られるように、正常ラットを１日２回経口サケカルシトニン処置すると、処置期間中に対照群において観察される自然な体重増加の減少がもたらされた。さらに、図９に見られるように、ＯＶＸ群では経口サケカルシトニン処置がＯＶＸ誘発性の体重の増加を部分的に防いだ。よって、経口サケカルシトニン処置は、１日２回投与した場合、食欲調節によって媒介される可能性の高い効果である体重増加の減少をもたらす。
【０１４９】
これに対して、投薬が１日１回であった同様の実験は、対照と比較して体重の低下がなかったことを示した。合計２０匹のラットを両側的に卵巣切除した（ＯＶＸ）。これらの動物を１日１回、１５０ｍｇ／ｋｇ／日の５−ＣＮＡＣのみ、または２ｍｇ／ｋｇ／日のカルシトニンと組み合わせたその量の５−ＣＮＡＣのいずれかで８週間処置し、その間、体重を週１回モニタリングした。摂食はこの場合も自由であった。
【０１５０】
投薬の最初の日を０日とした。動物に５ｍｌ／ｋｇを経口投与した。化合物溶液は、５ｍｌシリンジに接続された胃管を用いる経口胃管栄養法によって、全実験の間、午前７：００〜８：００の間に１日１回投与された。
【０１５１】
図１０に見られるように、動物に１日１回投与した場合に、ＯＶＸ誘発性体重増加への効果は観察されなかった。これは、１日１回処置された場合にＤＩＯラットにおいて体重増加が示されなかった実施例１のデータと十分に一致する。
【実施例５】
【０１５２】
［２型コラーゲンの吸収を低下させることによって示されるように、ＳＮＡＣとともに処方されたサケカルシトニンは生物学的に利用可能である。］
観察された経口ｓＣＴの効果が担体５−ＣＮＡＣを含む経口製剤に特異的に依存したかどうかを試験するため、２つの経口担体５−ＣＮＡＣおよびＳＮＡＣを用いる比較実験を実施した。ここで、ＣＴＸ−ＩＩにより測定される軟骨吸収の低下を、経口生物学的利用能、および、従って血糖コントロールの有効性の代理マーカーとして使用する。
【０１５３】
絶食ラットを、担体のみ（５−ＣＮＡＣまたはＳＮＡＣ）、ｓＣＴのみまたは担体（５−ＣＮＡＣまたはＳＮＡＣ）と組み合わせたｓＣＴの経口投与で処置した。血液採取を、ベースライン、経口投薬後１時間、３時間および６時間に行い、血清を単離した。その後血清試料中のＣＴＸ−ＩＩの濃度を測定した。
【０１５４】
ラットを体重に従って５つの群に無作為に分け、一晩絶食させた。ラットに、担体のみ（１５０ｍｇ／ｋｇ）（５−ＣＮＡＣまたはＳＮＡＣ）、サケカルシトニンのみ（２ｍｇ／ｋｇ）、または担体（１５０ｍｇ／ｋｇ）と一緒にサケカルシトニン（２ｍｇ／ｋｇ）を経口投与した。ベースライン、経口投薬後１時間、３時間および６時間に血液試料を尾静脈から採取した。血清を血液試料から単離し、無希釈の血清試料中のＣＴＸ−ＩＩ濃度を測定した。図１１、パネルＡ〜Ｄは、示された時点のＣＴＸ−ＩＩ濃度を示す。図１２は、全ての処置群について経時的に組み合わせた結果を示す。各群は６匹の動物を含んでいた。一元配置分散分析およびボンフェローニの多重比較検定を用いて統計分析を行って、複数の検定を調整した。エラーバーは、平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を示す。アスタリスクは＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１を示す。
【０１５５】
経口投薬の１時間後、ｓＣＴのみ、ｓＣＴと５−ＣＮＡＣ、およびｓＣＴとＳＮＡＣは全て、担体のみの２つの群と比較してＣＴＸ−ＩＩ濃度を有意に低下させたことが見出された（図１１、パネルＢ）。経口投薬の３時間および６時間後、ｓＣＴのみを投与された群がＣＴＸ−ＩＩ濃度をベースラインレベルまで戻したことが見出された（図１１、パネルＣおよびＤおよび図１２）。対照的に、ｓＣＴを５−ＣＮＡＣまたはＳＮＡＣと一緒に投与した場合、経口投薬の３時間後および６時間後の両方でＣＴＸ−ＩＩ濃度の継続的な低下が観察された（図１１、パネルＣおよびＤおよび図１２）。
【０１５６】
重要な知見は、ＣＴＸ−ＩＩ濃度は、ｓＣＴと５−ＣＮＡＣ、およびｓＣＴとＳＮＡＣの両方によって等しく十分に低下し、示されたどの時点でもこれら２つの群間に有意差は観察されなかったことである。これらの結果は、報告されるｓＣＴの効果が５−ＣＮＡＣに特異的に依存していないことを意味する。経口ｓＣＴの有意な長く続く効果は、担体を含有する経口製剤によって決まると結論付けることができるかもしれない。しかし、図１１および１２に見られるように、ｓＣＴと組み合わせた２つの異なる経口担体（５−ＣＮＡＣおよびＳＮＡＣ）は同等の結果を生じる。このことは、観察したｓＣＴの効果が１種類の特定の経口製剤に限定されないことを意味し、この知見はｓＣＴの血糖低下作用にまで及ぶと見込むことができる。
【０１５７】
本明細書において、明示的に別に示されない限り、「または」という語は、条件のうち１つだけが満たされることを必要とする「排他的論理和」の演算子（ｏｐｅｒａｔｏｒ）とは対照的に、述べられている条件のいずれかまたは両方が満たされる場合に真の値を返す演算子の意味で使用される。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語は、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」を意味するのではなく、「含有する（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の意味で使用される。上記で認識される全ての先行する教示は、参照することにより本明細書の一部をなすものとする。本明細書において先行するいかなる出版文書の認識も、その教示が本明細書の日付においてオーストラリアまたは他所において共通の一般知識であったことを承認または表明するものと解釈されるべきではない。
【０１５８】
［文献］
【表１】
0005993147.tif 000012
【表２】
0005993147.tif 000013
【表３】
0005993147.tif 000014
【表４】
0005993147.tif 000015
【表５】
0005993147.tif 000016
【表６】
0005993147.tif 000017
【表７】
0005993147.tif 000018
【図１】
0005993147.tif 000019
【図２】
0005993147.tif 000020
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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