(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ストレスタンパク質とペプチドとの間で形成されるストレスタンパク質複合体の製造方法であり、該方法は、
（ｉ）細胞を培養するステップと：
（ｉｉ）前記細胞を、異なるタイプの少なくとも２種のストレス誘導刺激、ここで、前記少なくとも２種のストレス誘導刺激は、少なくとも（ｉ）熱、及び（ｉｉ）呼吸のストレス又は酸に基づくストレスを含む、に曝すステップと：
（ｉｉｉ）前記細胞から前記ストレスタンパク質複合体を精製するステップと：
を含む、方法。
【請求項２】
前記少なくとも２種のストレス誘導刺激は、呼吸のストレスを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記呼吸のストレスは、前記培養した細胞が曝される酸素量を、前記細胞の通常の生理学的な生育又はホメオスタシスを生じさせる酸素量から減少させることを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記少なくとも２種のストレス誘導刺激は、前記酸に基づくストレスを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記酸に基づくストレスは、前記培養した細胞が曝されるｐＨを、前記細胞の通常の生理学的な生育又はホメオスタシスを生じさせるｐＨから減少させることを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞は、グラム陽性の原核細胞、又はグラム陰性の原核細胞である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞は、ナイセリア属（Neisseria）、及びマイコバクテリア属（Mycobacterium）から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞は、連鎖球菌（Streptococcus）である、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞は、嫌気性の病原性細胞であり、前記呼吸のストレスは前記培養した細胞が曝される酸素量を増加させることを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞が、クロストリジウム（Clostridium）である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ストレスタンパク質複合体を精製するステップは、
−前記ストレスタンパク質複合体を含む清澄化した細胞可溶化物を提供するステップと、
−前記清澄化した細胞可溶化物をイオン交換を用いる精製に供し、ここで、イオン交換の間、前記清澄化した細胞可溶化物は標的のストレスタンパク質複合体のｐＩから２以内のｐＨに緩衝され、また、前記ストレスタンパク質複合体を溶離するために塩勾配が用いられる、ステップと、
−前記ストレスタンパク質複合体を含む濃縮した調製物を得るステップと
を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ストレスタンパク質複合体はＧｒｏＥｌ及びＤｎａＫを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ストレスタンパク質複合体は、５０ＫＤａ〜９００ＫＤａの範囲の分子量を有する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、熱ショックタンパク質の生産方法に関する。本発明は、更に、本発明の方法に従って生産された熱ショックタンパク質の、感染症及び癌の症状の予防及び治療のためのワクチン組成物の調製における使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
熱ショックタンパク質（ｈｓｐｓ、ＨＳＰｓ）は植物及び動物界を通じて広く分布する高保存性のタンパク質のファミリーである。主な熱ショックタンパク質は、その分子量に基づいて、６つの異なるファミリーにグループ化される：小分子ｐ２０−３０ｋＤａ）；ｈｓｐ４０；ｈｓｐ６０；ｈｓｐ７０；ｈｓｐ９０；及びｈｓｐ１００。熱ショックタンパク質は原核及び真核細胞の両方で普遍的に発現され、それらはポリペプチドのフォールディング及びアンフォールディング中にシャペロンとして機能する。熱ショックタンパク質の更なる役割は、ある細胞区画から別の区画へとペプチドを介添えし、疾患細胞の場合、熱ショックタンパク質はウイルスの又は腫瘍関連ペプチドを免疫系に対する提示のために細胞表面へとペプチドを介添えすることも知られている。
【０００３】
熱ショックタンパク質は元来、熱ストレスに曝された細胞において同定されたものの、それらの生産は、感染、浸透圧ストレス、サイトカインストレス、及び同等物等の多くの他の形のストレスから生じ得る。従って、熱ショックタンパク質は、それらの発現が熱ストレスのみにより生じるものでないことに基づいて、一般にストレスタンパク質（ＳＰｓ）とも称される。しかしながら、異なるストレス刺激により誘導される遺伝子の転写解析により、細胞を異なったストレス誘導刺激に曝した後に、決まったセットの遺伝子が誘導されることが示される（Bacon & Marsh (2007) Curr. Mol. Med. 7:277-86）。更に、個々のストレスレギュロンは、独立に誘導され(vanBogelen et al. (1987) J.Bact. 169:26-32、及びWilkes et al. (2009) Applied and Environmental Microbiol. 75:981-990）、制御される（Holmes et al. (2010) Microbiology 156:158-166）。特に、vanBogelenは、異なったストレス誘導刺激は、決まった熱ショックタンパク質遺伝子が発現される要因となり、これらの遺伝子の特異的な発現は、４つのストレス誘導刺激を試験したときに、あるタイプのストレス誘導刺激のみから生じることを示す。
【０００４】
熱ショックタンパク質はそれ自体、ワクチン組成物中で抗原決定基として用いることができる一方、熱ショックタンパク質とペプチド、特に、抗原ペプチド断片との間で形成される複合体は、被験者に投与されたときに免疫反応の向上を生じる。更に、熱ショックタンパク質は、恒常的に生産される熱ショックタンパク質複合体、又は誘導された熱ショック複合体のいずれかに分類することができる複合体を産生することができることが知られている。恒常的に生産される熱ショックタンパク質複合体は、通常の恒常的条件下で生産される熱ショックタンパク質を含むものである。実際、熱ショックタンパク質複合体は、細胞がストレスの条件に曝されたときに生産される。ストレス状態では、細胞はストレスタンパク質の生産を上方制御し、これらの上方制御された熱ショックタンパク質は誘導された熱ショックタンパク質として知られている。更に、これらの誘導された熱ショックタンパク質はペプチド断片と複合体を形成し、この複合体は細胞がストレスの条件下にないときに形成される複合体よりも免疫原性が高いと見られる。かかる誘導された熱ショックタンパク質複合体の、恒常的な熱ショックタンパク質複合体に対する免疫原性の向上は、国際公開第０１／１３９４３号において示されている。理論に束縛されることを望むものではないが、発明者らは、誘導された熱ショックタンパク質複合体を用いて観察される免疫原性の向上は、実際の複合体のストレスタンパク質の構成要素が異なっていることによるもののではなく、細胞内のタンパク質がアンフォールド又は変性する要因となるストレス条件によるものであると予想する。そのため、熱ショックタンパク質は、アンフォールディングを予防する、又はリフォールドするためにタンパク質又はタンパク質断片と複合体を形成すると共に、細胞の抗原プロセッシング経路の一部としてタンパク質断片と複合体を形成する。
【０００５】
抗原決定基として熱ショックタンパク質複合体（ストレスタンパク質複合体とも称される）を含むワクチン組成物は、広く知られている。かかるワクチンは、感染及び疾患に対する広範な防御的な免疫を与える見込みを示すといった、大きな可能性を有している。熱ショックタンパク質複合体は、特定の癌に対するワクチンとして有効であることも広く記載されている。熱ショックＢＣＧ−細胞から単離された、病原体由来のストレスタンパク質複合体は、ワクチンを受けた宿主において、Ｔ−ヘルパー１（Ｔｈ１）リンパ球が介在する免疫反応を誘導し、肺結核のマウスのエアロゾル投与モデルにおいて、生の投与に対する防御的な免疫を与える（国際公開第０１／１３９４４号）。更に、国際公開第０２／２００４５号、国際公開第００／１０５９７号、及び国際公開第０１／１３９４３号において、病原体又は病原から単離されたストレスタンパク質複合体は、感染症に対するワクチン中の抗原決定基として有効であることを示す。
【０００６】
感染症の治療及び予防のためのストレスタンパク質複合体を含むワクチン組成物の生産に対する様々なアプローチがある。国際公開第９５／２４９２３号は、宿主の真核細胞に由来する熱ショックタンパク質、及び病原に由来する抗原性ペプチド断片を含む、恒常的な熱ショックタンパク質複合体を開示する。国際公開第０１／１３９４３号は、熱、又は腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）等のサイトカイン等の刺激を含むストレスの使用後に誘導される、熱ショックタンパク質複合体を開示する。このストレスタンパク質は、宿主細胞に由来するストレスタンパク質、又は代わりに、侵入した病原に由来するストレスタンパク質を含むことができ、ここで、ストレスタンパク質は侵入した病原に由来するペプチドに複合される。国際公開第０１／１３９４４号は、刺激を含むストレスに曝された病原の後に生産されるストレスタンパク質複合体、ここで、ストレスタンパク質及び関連ペプチド断片は直接的に病原に由来する、を開示する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開公報第０１／１３９４３号
【特許文献２】国際公開公報第０１／１３９４４号
【特許文献３】国際公開公報第０２／２００４５号
【特許文献４】国際公開公報第００／１０５９７号
【特許文献５】国際公開公報第０１／１３９４３号
【特許文献６】国際公開公報第９５／２４９２３号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Bacon & Marsh (2007) Curr. Mol. Med. 7:277-86
【非特許文献２】vanBogelen et al. (1987) J.Bact. 169:26-32
【非特許文献３】Wilkes et al. (2009) Applied and Environmental Microbiol. 75:981-990
【非特許文献４】Holmes et al. (2010) Microbiology 156:158-166
【発明の概要】
【０００９】
鋭意実験したところ、発明者らは驚くべきことに、複数のストレス誘導刺激、典型的には熱のストレス及び呼吸のストレス、又は熱のストレス及び酸に基づくストレスを用いる、誘導された熱ショックタンパク質複合体の生産が、細胞中で生産される誘導されたストレスタンパク質複合体の量を、１つのタイプのストレス誘導刺激に曝した後に生産される誘導されたストレスタンパク質複合体と比較して、向上させることを見出した。具体的には、発明者らは、１つ又は複数の細胞を複数のストレス刺激に曝した後に生産される、熱ショックタンパク質−ペプチド複合体（ＨｓｐＣｓ）の量が、生産される熱ショックタンパク質−ペプチド複合体の数で、４倍の増加を生じ得ることを見出した。大量の熱ショックタンパク質複合体が、予防又は治療用ワクチンの大量生産に必要とされるため、より高い収量での熱ショックタンパク質−ペプチド複合体の産生は、商業的に非常に重要である。更に、発明者らは驚くべきことに、熱のストレス及び呼吸のストレス、又は熱のストレス及び酸に基づくストレス等の複数のストレス誘導刺激を用いて誘導される熱ショックタンパク質−ペプチド複合体が、熱ショックのみ等の１つのストレス誘導刺激を用いて生産される、誘導された熱ショックタンパク質複合体と比較してより免疫原性があることを同定した。
【００１０】
本発明の第一の態様によれば、ストレスタンパク質とペプチドとの間で形成されるストレスタンパク質複合体の製造方法を提供し、該方法は、
（ｉ）細胞を培養するステップと：
（ｉｉ）前記細胞を複数のストレス誘導刺激に曝すステップと：
（ｉｉｉ）前記細胞から前記ストレスタンパク質複合体を精製するステップと：
を含むか、又は実質的にこれらのステップのみからなるか、又はこれらのステップのみからなる。
【００１１】
特定の実施形態では、ペプチドはペプチド断片である。特定の実施形態では、ペプチドは抗原ペプチド、又は抗原ペプチド断片である。特定の実施形態では、一般的には感染症を生じさせるペプチドは病原体、原核生物（例えば、グラム陽性バクテリア又は陰性バクテリア）、原生生物、ウイルス、寄生虫、又は菌類に由来する。
【００１２】
特定の実施形態では、ペプチドはバクテリアに由来し、該バクテリアは、大腸菌類（Escherichia）、連鎖球菌（Streptococcus）、ブドウ球菌（Staphylococcus）、ボルデテラ属（Bordetella）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）、マイコバクテリア属（Mycobacterium）、ナイセリア属（Neisseria）、ヘモフィルス属（Haemophilus）、放線菌（Actinomycetes）、放線菌（Streptomycetes）、ノカルジア属（Nocardia）、エンテロバクター属（Enterobacter）、エルシニア属（Yersinia）、フランシセラ属（Fancisella）、パスツレラ菌（Pasturella）、モラクセラ属（Moraxella）、アシネトバクター属（Acinetobacter）、エリシペロスリクス属（Erysipelothrix）、ブランハメラ属（Branhamella）、アクチノバチルス属（Actinobacillus）、ストレプトバチルス属（Streptobacillus）、リステリア属（Listeria）、カリマトバクテリウム属（Calymmatobacterium）、ブルセラ属（Brucella）、桿菌（Bacillus）、クロストリジウム属（Clostridium）、トレポネーマ属（Treponema）、サルモネラ菌（Salmonella）、クレブシエラ菌（Kleibsiella）、ビブリオ属（Vibrio）、プロテウス属（Proteus）、エルウィニア属（Erwinia）、エルウィニア属（Borrelia）、レプトスピラ属（Leptospira）、スピリルム属（Spirillum）、カンピロバクター属（Campylobacter）、赤痢菌（Shigella）、レジオネラ属（Legionella）、シュードモナス属（Pseudomonas）、エロモナス属（Aeromonas）、リケッチア属（Rickettsia）、クラミジア属（Chlamydia）、ボレリア属（Borrelia）、及びマイコプラズマ属（Mycoplasma）からなる群から選択される。
【００１３】
特定の実施形態では、ペプチドはウイルスに由来し、ウイルスは、ヒト免疫不全ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ヒトパピローマウイルス、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス、呼吸器多核体ウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、西ナイルウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、リフトバレー熱ウイルス、インフルエンザウイルス、コロナウイルス、ライノウイルス、アデノウイルス、ＳＩＶ、ロタウイルス、ヒトパピローマウイルス感染症、アルボウイルス、麻疹ウイルス、ポリオウイルス、風疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、パポーバウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、水痘ウイルス、ハンタウイルス、及びサイトメガロウイルスからなる群から選択される。
【００１４】
特定の実施形態では、ペプチドは腫瘍特異性抗原である。
【００１５】
特定の実施形態では、細胞を複数のストレス誘導刺激に曝すステップは、少なくとも２つのストレス誘導刺激に曝すことを含む。典型的には、細胞は異なるタイプの２つのストレス誘導刺激に曝されるが、異なるタイプの３つ以上のストレス誘導刺激に曝されてもよい。特定の実施形態では、ストレス誘導刺激は、これらに限定されないが、熱ストレス、呼吸のストレス（酸素飢餓又は添加）、酸化的ストレス（Ｈ２Ｏ２、Ｆｅ）、ｐＨ変化等の酸に基づくストレス、重金属ストレス、浸透圧ストレス、代謝物制限、及び炭素又は鉄制限等の栄養飢餓からなる群から選択される少なくとも２つのストレス誘導刺激を含む。特定の実施形態では、ストレス誘導刺激は、熱ストレス、及び少なくとも１つの呼吸のストレス、酸化的ストレス（Ｈ２Ｏ２、Ｆｅ）、酸に基づくストレス（ｐＨ４）、重金属ストレス、浸透圧ストレス、代謝物制限、及び炭素又は鉄制限等の栄養飢餓、並びに、特に、熱ストレス及び呼吸のストレス、又は熱ストレス及び酸に基づくストレスとすることができる。典型的には、刺激を含む少なくとも２つのストレスが連続的に細胞に与えられる。特定の実施形態では、刺激を含む少なくとも２つのストレスは連続的に与えられる。
【００１６】
故に、特定の実施形態では、本発明はストレスタンパク質と抗原ペプチドとの間で形成される複合体の製造方法を提供し、該方法は、
（ｉ）細胞を培養するステップと：
（ｉｉ）前記細胞を熱ストレスに曝すステップと：
（ｉｉｉ）前記細胞を呼吸のストレスに曝すステップと：
（ｉｖ）前記細胞から前記熱ショックタンパク質複合体を精製するステップと：
を含むか、又は実質的にこれらのステップのみからなるか、又はこれらのステップのみからなる。
【００１７】
典型的には、細胞は熱ストレス及び呼吸のストレスに同時に曝される。
【００１８】
代わりの実施形態では、本発明はストレスタンパク質と抗原ペプチドとの間で形成される複合体の製造方法を提供し、該方法は、
（ｉ）細胞を培養するステップと：
（ｉｉ）前記細胞を熱ストレスに曝すステップと：
（ｉｉｉ）前記細胞を酸に基づくストレスに曝すステップと：
（ｉｖ）前記細胞から前記熱ショックタンパク質複合体を精製するステップと：
を含むか、又は実質的にこれらのステップのみからなるか、又はこれらのステップのみからなる。
【００１９】
典型的には、細胞は熱ストレス及び酸に基づくストレスに同時に曝される、すなわち、細胞は熱ストレス及び酸に基づくストレスに一緒に曝される。
【００２０】
典型的には、熱ストレス又は熱ショックは、培養した細胞が曝される熱を細胞の通常の生育温度よりも約５〜１０℃高い温度まで増加させることを含む。従って、細胞が一般的に３７℃で生育される場合、熱ストレスは細胞が曝される温度を約４４℃まで増加させることを含んでよい。特定の実施形態では、温度の増加は、培養器内の温度を上昇させることによって達成され、例えば、培養した細胞を増殖させるために約４２℃〜４４℃で用いることができる。特定の実施形態では、温度増加は１分当たり約０．２５℃〜０．５℃（０．２５℃〜０．５℃／分）で、通常の生育温度から温度を増加させることによって達成される。特定の実施形態では、細胞は、約３０分から２．５時間の範囲の時間熱ストレスにされる。特定の実施形態では、熱ストレスは典型的には１〜２時間生じさせる。
【００２１】
特定の実施形態では、呼吸のストレスは、培養した細胞が曝される酸素量を減少させることに関する。典型的には、これは、細胞の通常の生理学的な生育又はホメオスタシスを生じさせる酸素量から、培養した細胞への酸素の供給を制限することを含む。特定の実施形態では、これは、培養物の温度が上がるに従ってカスケードの溶存酸素分圧（ＤＯＴ）の制御を取り除くことによって達成され得る。好適な実施形態では、溶存酸素分圧は、撹拌速度を手動で低減することによって、例えば、約３２０〜３５０ｒｐｍにまで、更に制限され得る。Clark et al., (1985) Biotechnology and Bioengineering, 27:1507-1511は、溶存酸素分圧がどのように培養器中で撹拌速度により制御され得るかについて開示する。更なる実施形態では、酸素制限は培養器の部分的な又は完全な二酸化炭素又は窒素での置換により達成される。特定の好適な実施形態では、呼吸のストレスは培養器内で細胞に与えられる。特定の実施形態では、呼吸のストレスは培養した細胞が曝される酸素量を増加させることに関する。
【００２２】
特定の実施形態では、酸に基づくストレス又は酸のストレスは、培養した細胞のｐＨを、細胞が培養される通常のｐＨ以下のｐＨに減少させることを含み、ここで、通常のｐＨは細胞の通常の生理学的な生育又はホメオスタシスを生じさせるｐＨである。特定の実施形態では、ｐＨは５．５、５、４．５又は４まで下げられる。ｐＨは、酸、例えば、塩酸を細胞に加えることによって下げることができる。特定の実施形態では、酸に基づくストレスは培養器中で細胞に与えられる。
【００２３】
細胞は、複数のストレス誘導刺激に同時に又は連続的に曝されてよい。従って、特定の実施形態では、細胞は、呼吸のストレス又は酸に基づくストレス等の第二のストレスに曝される前に熱ストレスに曝される。更なる実施形態では、細胞は、熱ストレス、及び呼吸のストレス又は酸に基づくストレス等の第二のストレスに同時に曝される。更なる実施形態では、細胞は、呼吸のストレス又は酸に基づくストレス等の別のストレスに初めに曝され、その後熱ストレスに曝される。
【００２４】
ストレスの好適な組み合わせは、ストレス誘導刺激を与えるための標準的な方法を用い、その後、ＧｒｏＥＬ及びＤｎａＫ等のストレスタンパク質の誘導を定量化することによって、決定することができる。典型的には、ストレスの好適な組み合わせは、ＧｒｏＥＬ及びＤｎａＫの両方の誘導を増加させる。ストレスタンパク質の誘導を定量するために用いることができる標準的な方法は、タンパク質のゲル分析、濃度測定、免疫ブロッティング、及びＥＬＩＳＡを含む。
【００２５】
（病原細胞）
特定の実施形態では、細胞は病原細胞である。特定の実施形態では、病原細胞は非哺乳細胞、特に、グラム陽性又はグラム陰性バクテリアとし得る原核細胞である。特定の更なる実施形態では、病原細胞は微生物細胞、原生動物細胞、寄生虫細胞である。
【００２６】
特定の実施形態では、原核細胞は、これらに限定されないが、大腸菌類（Escherichia）、連鎖球菌（Streptococcus）、ブドウ球菌（Staphylococcus）、ボルデテラ属（Bordetella）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）、マイコバクテリア属（Mycobacterium）、ナイセリア属（Neisseria）、ヘモフィルス属（Haemophilus）、放線菌（Actinomycetes）、放線菌（Streptomycetes）、ノカルジア属（Nocardia）、エンテロバクター属（Enterobacter）、エルシニア属（Yersinia）、フランシセラ属（Fancisella）、パスツレラ菌（Pasturella）、モラクセラ属（Moraxella）、アシネトバクター属（Acinetobacter）、エリシペロスリクス属（Erysipelothrix）、ブランハメラ属（Branhamella）、アクチノバチルス属（Actinobacillus）、ストレプトバチルス属（Streptobacillus）、リステリア属（Listeria）、カリマトバクテリウム属（Calymmatobacterium）、ブルセラ属（Brucella）、桿菌（Bacillus）、クロストリジウム属（Clostridium）、トレポネーマ属（Treponema）、サルモネラ菌（Salmonella）、クレブシエラ菌（Kleibsiella）、ビブリオ属（Vibrio）、プロテウス属（Proteus）、エルウィニア属（Erwinia）、エルウィニア属（Borrelia）、レプトスピラ属（Leptospira）、スピリルム属（Spirillum）、カンピロバクター属（Campylobacter）、赤痢菌（Shigella）、レジオネラ属（Legionella）、シュードモナス属（Pseudomonas）、エロモナス属（Aeromonas）、リケッチア属（Rickettsia）、クラミジア属（Chlamydia）、ボレリア属（Borrelia）、及びマイコプラズマ属（Mycoplasma）からなる群から選択されるバクテリアである。
【００２７】
特定の実施形態では、バクテリアは、Neisseria（例えば、N. meningitidis MC58）、Mycobacteria、Clostridium（例えば、Clostridium difficile）、Saccharomyces（例えば、S. cerevisiae）、及びStreptococcus、例えば、S. Pneumoniaeからなる群から選択される。熱ストレス及び呼吸のストレスの組み合わせは、Neisseria、Mycobacteria、Saccharomyces及びClostridiumにおいて、１つのタイプのストレス誘導刺激のみに曝した細胞から得られるストレスタンパク質複合体と比較して、より高いレベルのストレスタンパク質複合体が生じることを示した。従って、特定の実施形態では、細胞は、Neisseria（例えば、N. meningitidis MC58）、Mycobacteria、Saccharomyces（例えば、S. cerevisiae）又はClostridium（例えば、Clostridium difficile）であり、複数のストレス誘導刺激は熱ストレス及び呼吸のストレスを含む。熱ストレス及び酸に基づくストレスの組み合わせは、S. pneumoniaeにおいて、１つのタイプのストレス誘導刺激のみに曝した細胞から得られるストレスタンパク質複合体と比較して、より高いレベルのストレスタンパク質複合体が生じることを示した。従って、特定の実施形態では、細胞はStreptococcus、例えば、S. pneumoniaeであり、複数のストレス誘導刺激は熱ストレス及び酸に基づくストレスを含む。２つの異なるタイプのストレス誘導刺激に曝された細胞から得られたストレスタンパク質複合体も、１つのタイプのストレス誘導刺激のみに曝した細胞から得られるストレスタンパク質複合体と比較して、免疫原性が向上することを示した。
【００２８】
（好気性細胞）
特定の実施形態では、細胞は好気性細胞、例えば、病原性の好気性細胞である。培養物中における通常の細胞の生育中、細胞は酸素の最適条件がある。例えば、好気性細胞は生育及び生存のために酸素を必要とする。酸素レベルの欠乏は、好気性細胞の成長する能力を制限する。生育培地中に酸素が存在しないと細胞死を生じる可能性が高い。あらゆる特定の細胞は好適な溶存酸素分圧（ＤＯＴ）、培養物中で生育及び恒常の細胞に提供される酸素供給、を有する。例えば、細胞培養物は１０％超５０％以下の範囲の溶存酸素分圧（ＤＯＴ）で生育することができる。特定の実施形態では、溶存酸素分圧（ＤＯＴ）を約２０％超又は約３０％超のレベルで提供することができる。
【００２９】
（通性嫌気性細胞）
特定の実施形態では、細胞は通性嫌気性細胞、例えば、病原性の通性嫌気性細胞である。通性嫌気性生物は、通常好気性呼吸によりＡＴＰを生産する生物である。しかしながら、酸素が存在しないとき、通性嫌気性菌は発酵に転換する。そのため、酸素存在下において、通性嫌気性菌は生存する一方、絶対嫌気性菌は死滅する。更に、生育環境中の酸素濃度及び発酵材料は、通性嫌気性生物がエネルギーを作り出すために好気性呼吸か発酵かいずれを用いるかに影響する。そのため、酸素レベルの欠乏は通性嫌気性生物の生育する能力を制限する。しかしながら、生育培地又は環境中において酸素が存在しないと、嫌気性の生育に転換する。従って、通性嫌気性細胞を呼吸のストレスに曝すことは、呼吸のストレスを誘導するために細胞が曝される溶存酸素分圧（ＤＯＴ）を注意深く管理することに関わる。呼吸のストレスを与えることは、生育環境から発酵材料を取り除くこととも関係し得る。
【００３０】
（嫌気性細胞）
特定の実施形態では、細胞は嫌気性細胞、例えば、病原性の嫌気性細胞である。本発明の特定の実施形態では、ストレスタンパク質複合体は、酸素の存在下で生育できない嫌気性病原（絶対嫌気性菌）、特に、嫌気性バクテリアに由来してよい。従って、絶対嫌気性菌に呼吸のストレスを与えることは、ストレス誘導刺激に繋がる酸化的ストレスを与えるために、酸素が培養培地から除去されるというよりも培養培地に与えられることを必要とする。そのため、嫌気性細胞培養物は、１０％超５０％以下の範囲の溶存酸素分圧（ＤＯＴ）の存在下で生育することによって、呼吸のストレスに曝されてよい。特定の好適な実施形態では、溶存酸素分圧（ＤＯＴ）は約２０％〜約３０％で提供されてよい。
【００３１】
従って、特定の実施形態では、ストレスタンパク質と、嫌気性病原に由来する抗原ペプチド又は抗原ペプチド断片との間で形成される複合体の製造方法を提供し、該方法は、
（ｉ）酸素が存在しない環境において嫌気性病原性細胞を培養するステップと：
（ｉｉ）前記細胞を熱ストレスに曝すステップと：
（ｉｉｉ）前記細胞を呼吸のストレスに更に曝すステップ、該ストレスは培養した細胞が曝される酸素量を増加することを含む、と：
（ｉｖ）前記嫌気性病原性細胞から前記ストレスタンパク質複合体を精製するステップと：
を含むか、又は実質的にこれらのステップのみからなるか、又はこれらのステップのみからなる。
【００３２】
特定の実施形態では、前記細胞は、熱ストレス及び呼吸のストレスに同時に曝される、すなわち、細胞は熱ストレス及び呼吸のストレスに一緒に曝される。
【００３３】
特定の実施形態では、窒素が酸素の欠乏を補うために培養培地中に存在し得る。
【００３４】
（癌細胞）
特定の実施形態では、細胞は癌細胞である。従って、特定の実施形態では、本発明は、ストレスタンパク質と抗原ペプチドとの間で形成される複合体の製造方法を提供し、該方法は、
（ｉ）癌細胞を培養するステップと：
（ｉｉ）前記細胞を熱ストレスに曝すステップと：
（ｉｉｉ）前記細胞を呼吸のストレス又は酸に基づくストレスに曝すステップ：
（ｉｖ）前記癌細胞から熱ショックタンパク質複合体を精製するステップと：
を含むか、又は実質的にこれらのステップのみからなるか、又はこれらのステップのみからなる。
【００３５】
典型的には、前記細胞は、熱ストレス及び酸に基づくストレス又は呼吸のストレスに同時に曝される、すなわち、細胞は熱ストレス又は呼吸のストレスに一緒に曝される。
【００３６】
（遺伝子組み換え細胞）
特定の実施形態では、本発明は、例えば、ｈｓｐＲ及び／又はｈｒｃＡを欠損させることによって熱ショックタンパク質を恒常的に発現させるように遺伝子組み換えされた１種又は複数種の細胞に拡張される。この細胞は本発明に従って、１つ又は複数の追加的なストレス誘導刺激に更に曝されてよい。典型的な追加的なストレス誘導刺激は、酸素制限等の呼吸のストレス、ｐＨストレス（例えば、ｐＨ４での酸のストレス）、及び炭素又は鉄制限等の代謝物制限を含む。
【００３７】
原核の熱ショックタンパク質ファミリーである、ＤｎａＪ、ＤｎａＫ、ＧｒｏＥＬ、及びＧｒｏＥＳはオペロンにコードされており、オペロン中の最初の遺伝子はオペロン中に含まれる熱ショックタンパク質遺伝子の発現を抑制する制御遺伝子である。例えば、Streptomyces及びHelicobacterでは、ｈｓｐＲ遺伝子の発現はＤｎａＪ及びＤｎａＫの発現を抑制する。そのため、ｈｓｐＲ遺伝子の欠損は熱ショックタンパク質を恒常的に発現する遺伝子組み換え微生物を生じる（Bucca et al. (2003) Mol. Microbiol 50(1)153-166参照）。しかしながら、２種の主要な熱ショックタンパク質ファミリーであるＤｎａＫ及びＧｒｏＥＬは２種の異なるレギュロンであるｈｓｐＲ及びｈｒｃＡにより制御されることに注意されたい。これらの熱ショックレギュロン、ｈｓｐ７０／ＤｎａＫレギュロンはｈｓｐＲの制御下にあり、ｈｓｐ６０／ｇｒｏＥＬレギュロンはｈｒｃＡの制御下にある。これらの遺伝子両方の欠損がＤｎａＫ及びＧｒｏＥＬ熱ショックタンパク質の発現の両方を最大限に上方制御するために必要とされる（Holmes et al. (2010) Microbiology 156:158-166、及びAravindhan V. et al. (2009) FEMS Microbial Lett. 292 42-49）。同族のオペロンは、Streptomyces及びMycobacterium tuberculosの他の株を含む、多数の近年配列同定された微生物、及び一般的に用いられる関連ワクチン株であるＢＣＧにおいて同定されている。
【００３８】
他のリプレッサー遺伝子も他のストレスタンパク質の発現を制御してよく、これらはストレスタンパク質を恒常的に発現する遺伝子組み換え微生物を提供するために遺伝子組み換えしてよい。これらは、特に限定されないが、転写制御遺伝子σ、ｒｈｏ、及びストレス遺伝子制御タンパク質遺伝子であるｈｒｃＡ、ＭｅｒＲ及びＨｍｒＲを含む。
【００３９】
従って、本発明は、熱ショックタンパク質の発現を制御する少なくとも１つのリプレッサー遺伝子をノックアウト又は無能にするように遺伝子組み換えされた遺伝子組み換え型の病原の使用に拡張し得る。ここで、遺伝子組み換え型の病原は、ワクチン組成物中で抗原決定基として用いるための誘導された熱ショックタンパク質複合体を単離及び／又は精製する前に、呼吸のストレス又は酸のストレスに曝される。
【００４０】
特定の実施形態では、異種のタンパク質を発現するように遺伝子組み換えされた１種又は複数種の細胞は、癌細胞に由来する。代わりの実施形態では、細胞は宿主中で感染症を生じる病原に由来する異種のタンパク質を発現するように遺伝子組み換えされた細胞である。
【００４１】
（感染細胞）
特定の実施形態では、細胞は、病原体に感染した宿主細胞である。複合体は、侵入した病原由来のペプチド断片と複合した宿主細胞由来の熱ショックタンパク質から、又は、両方とも侵入した病原に由来する熱ショックタンパク質及びペプチド断片から、形成し得る。
【００４２】
従って、本発明の特定の実施形態では、熱ショックタンパク質とペプチド断片との間で形成される複合体の製造方法であり、該方法は、
（ｉ）病原に感染した細胞を培養するステップと：
（ｉｉ）前記細胞を複数のストレス誘導刺激に曝すステップと：
（ｉｉｉ）前記培養した細胞から熱ショックタンパク質複合体を精製するステップと：
を含むか、又は実質的にこれらのステップのみからなるか、又はこれらのステップのみからなる。
【００４３】
特定の実施形態では、複数のストレス誘導刺激は、細胞に同時に与えられ、熱ストレス及び呼吸のストレス、又は熱ストレス及び酸に基づくストレスを含み得る、少なくとも２つのストレス誘導刺激を含む。
【００４４】
本発明の方法は、有利には、精製した熱ショックタンパク質複合体の混合物を提供し、この熱ショックタンパク質複合体の混合物は異なるサブタイプの熱ショックタンパク質を含む。すなわち、熱ショックタンパク質複合体の熱ショックタンパク質要素は熱ショックサブタイプの異なるファミリーの熱ショックタンパク質としてよい。例えば、特に限定されないが、ＨＳＰ６０，ＨＳＰ７０、及び／若しくはＨＳＰ９０から選択されるクラス、又は真核細胞若しくは病原性細胞中に存在するあらゆる他の熱ショックタンパク質のクラスに由来する熱ショックタンパク質の複合体があってもよい。特定の実施形態では、熱ショックタンパク質複合体は、ＧｒｏＥＬ（哺乳類細胞におけるＨＳＰ６０に相当する原核の熱ショックタンパク質）の熱ショックタンパク質及び／又はＤｎａＫ（哺乳類細胞におけるＨＳＰ７０に相当する原核の熱ショックタンパク質）の熱ショックタンパク質ファミリーを含むか、これらのみからなることが好ましい。従って、本発明の特定の実施形態では、本発明において用いられる精製方法は、熱ショックタンパク質要素としてＤｎａＫ及びＧｒｏＥＬを含むタンパク質複合体を精製するために、用いられる。
【００４５】
（熱ショックタンパク質の誘導及び精製）
特定の実施形態では、熱ショックタンパク質複合体は、例えば、ストレス誘導刺激に曝された、病原細胞、癌細胞又は病原に感染した細胞等の細胞から得られた細胞可溶化物から、精製又は単離される。
【００４６】
典型的には、ストレスタンパク質複合体は異なる熱ショックタンパク質のクラスの熱ショックタンパク質を含む。特定の実施形態では、熱ショックタンパク質は、ＤｎａＫ及び／又はＧｒｏＥＬサブタイプのものである。単離及び／又は精製された熱ショックタンパク質複合体、又はそれらを含む調製物若しくは混合物は、その後一般的に、ストレスタンパク質複合体が由来する病原又は癌の細胞に対する、又はストレスタンパク質複合体が由来する細胞に感染する病原に対する、免疫反応及び関連の防御的免疫性を誘導するワクチン組成物中で、抗原決定基として用いられる。
【００４７】
特定の実施形態では、熱ショックタンパク質複合体を精製するステップは、
（ｉ）細胞培養物由来の清澄化した細胞可溶化物を提供し、ここで、前記細胞可溶化物はストレスタンパク質複合体を含む、ステップと：
（ｉｉ）前記細胞可溶化物をイオン交換を用いる精製に供し、ここで、前記細胞可溶化物は標的のストレスタンパク質複合体のｐＩから２以内のｐＨに緩衝され、また、前記ストレスタンパク質複合体を溶離するために塩勾配が用いられる、ステップと、
（ｉｉｉ）前記熱ショックタンパク質複合体を含む濃縮した調製物を得るステップと
を含む。
【００４８】
特定の実施形態では、緩衝剤（バッファ）は、約０．１ｍＭ〜１００ｍＭの濃度で与えることができる２価カチオンを含む。特定の実施形態では、２価カチオンはマグネシウム塩及び／又はマンガン塩である。特定の実施形態では、緩衝剤は、約０．１ｍＭ〜１００ｍＭの濃度で与えることができるＡＤＰ（アデノシン  ジホスフェート）を更に含む。
【００４９】
特定の実施形態では、熱ショックタンパク質複合体はＤｎａＫ及び／又はＧｒｏＥＬのクラスの熱ショックタンパク質を含む。
【００５０】
（ワクチン組成物）
典型的には、前述の本発明の態様により得られる精製した熱ショックタンパク質複合体は、ストレスタンパク質複合体が由来する病原に対する免疫反応を生じさせる際に用いられるワクチン組成物中で抗原決定基として用いられ得る。
【００５１】
更なる様々な態様では、本発明は、本発明の方法により得られる熱ショックタンパク質複合体を含む、ワクチン組成物、又は免疫反応を仲介又は誘導する組成物に拡張される。ワクチン組成物は、病原に対する防御的な免疫性を与えるために、典型的には哺乳類、特にヒトに投与される。しかしながら、異なる種由来のストレスタンパク質間において高いレベルのホモロジーが認められるため、ワクチン組成物は広範な動物をワクチン接種するために用いることができる。
【００５２】
このように、本発明の更なる態様は、抗原決定基として、本発明の方法により得られる精製した熱ショックタンパク質複合体を含むワクチン組成物を提供する。
【００５３】
更なる特定の態様では、本発明は、医薬に用いるための、本発明に従うワクチン組成物、又は、精製及び／又は単離した本発明の方法を用いて得られる熱ショックタンパク質複合体の混合物を提供する。
【００５４】
更なる特定の態様では、本発明は、感染症又は癌若しくは悪性の症状の予防又は治療のための医薬の調製における、前述の本発明の態様のいずれかに従って製造された熱ショックタンパク質複合体の使用を提供する。
【００５５】
更なる特定の態様では、本発明は、感染症又は癌若しくは悪性の症状の予防又は治療のためのワクチン組成物における、熱ショックタンパク質複合体の使用を提供する。
【００５６】
特定の実施形態では、熱ショックタンパク質複合体、又はそれを含むワクチン組成物は、予防用ワクチンとして投与される。更なる特定の実施形態では、精製したストレスタンパク質複合体又はそれを含むワクチン組成物は治療用ワクチンとして投与される。
【００５７】
更なる様々な態様では、本発明は、被験者が以前に、典型的には、感染又は以前の一次ワクチンの投与により、曝された病原若しくは癌の抗原に対して宿主中で生じる免疫反応を高めるためのワクチン補助剤として用いるための、熱ショックタンパク質複合体、又はそれを含む調製物若しくは混合物、又はそれを含むワクチン組成物に拡張される。
【００５８】
本発明の組成物は、凍結乾燥、又は水性、すなわち、溶液若しくは懸濁液の形としてよい。このタイプの液体製剤は、水性溶媒で再構成する必要なく、組成物をそのパッケージ化された形から直接投与することができ、これにより注射に理想的である。組成物はバイアルに入れることができ、又は充填済みのシリンジに入れることができる。シリンジは針を伴って又は伴わずに提供されてよい。シリンジは組成物の１回の用量を含む一方、バイアルは１回又は複数回の用量（例えば、２回の用量）を含んでよい。
【００５９】
更なる様々な態様では、本発明は、本発明の精製した熱ショックタンパク質複合体、又はそれを含む調製物若しくは混合物を、少なくとも１種の薬学的に許容可能な賦形剤、キャリア、又は希釈剤と混合するステップを含む、ワクチン組成物の製造方法を提供する。
【００６０】
本発明の一実施形態では、特に限定されないが、百日咳菌、破傷風菌、クロストリジウム・ディフィシル、ジフテリア菌、ヘモフィルス・エジプチウス、結核菌、らい菌、チフス菌、肺炎球菌、コレラ菌、及びナイセリア髄膜炎菌を含む群から選択される病原性バクテリアによる感染により生じるような、病原性症状の治療又は予防のための医薬における、ワクチン組成物の使用を提供する。本発明の更なる実施形態では、インフルエンザ、肝炎、ヘルペス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）、ポリオーマ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタイン・バー・ウイルス（ＥＢＶ）、ロタウイルス、ノロウイルス、コロナウイルス、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、呼吸器多核体ウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、西ナイルウイルス（ＷＮＶ）、セントルイス脳炎ウイルス（ＳＬＥＶ）、リフトバレー熱ウイルス（ＲＶＦＶ）、インフルエンザウイルス、コロナウイルス、ライノウイルス、アデノウイルス、サル免疫不全ウイルス、ロタウイルス、アルボウイルス、麻疹ウイルス、ポリオウイルス、風疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、パポーバウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、水痘ウイルス、ハンタウイルス、及びサイトメガロウイルスを含む群から選択される病原性又は癌のウイルスによる感染により生じるような、病原性症状の治療又は予防のための医薬における、ワクチン組成物の使用を提供する。
【００６１】
本発明のまた更なる実施形態では、癌及び腫瘍細胞の治療又は予防のための医薬におけるワクチン組成物の使用を提供する。
【００６２】
加えて、本発明のまた更なる態様は、被験者、典型的にはヒトを、百日咳菌、破傷風菌、クロストリジウム・ディフィシル、ジフテリア菌、ヘモフィルスインフルエンザb菌、結核菌、ハンセン菌、チフス菌、コレラ菌、肺炎球菌、髄膜炎菌、並びに、病原及び癌のウイルスにより生じる疾患に対して免疫する方法に拡張され、該方法は免疫防御可能な用量の本発明のワクチンを宿主に投与することを含む。
【００６３】
各ワクチン用量中の抗原の量（すなわち、抗原決定基）は、ワクチン接種された被験者において大きな副作用なく免疫保護の反応を誘導する量として、選択される。抗原の量は、どの特定の免疫原が用いられるか、及びどのように提示されるかに依存して変動する。しかしながら、本発明の精製した混合物に対して生じる免疫反応の高まりは、同じ量の従来の製造方法を用いて得られるタンパク質複合体を含むワクチン組成物と比較したときに、本発明の方法を用いて製造された混合物に対して高まった免疫反応が生じる、ことを意味する。
【００６４】
本発明は、感染症又は癌若しくは腫瘍の症状に由来する病原に対する免疫を誘導するために、非患者をワクチン接種する方法における本発明の熱ショックタンパク質複合体の使用を更に提供する。
【００６５】
本発明のまた更なる態様は、病原由来の感染症又は癌の症状に対して被験者にワクチン接種する方法を提供し、
該方法は、
−抗原決定基として、本発明のいずれか１つの方法により提供される熱ショックタンパク質複合体、ここで、前記熱ショックタンパク質複合体は、防御的免疫が所望される、熱ショック及び呼吸若しくは酸に基づくストレス誘導刺激に曝された、癌細胞、病原性細胞、又は病原に感染した若しくは異種の抗原を発現する細胞に由来する、を含み、且つ、混合物として、異なる熱ショックタンパク質のタイプを含む、ワクチン組成物を提供するステップと、
−被験者中で熱ショックタンパク質複合体に対して免疫反応を引き起こさせるのに十分な、治療的に有効又は予防的に有効量の熱ショックタンパク質複合体を含むワクチン組成物を、被験者に投与するステップと
を含む。
【００６６】
本願明細書で用いられるように、「ワクチン組成物」という用語は、後の投与、病原感染、又は発癌に良好に反応することができるように免疫系を刺激する抗原決定基を含むあらゆる組成物を含む。
【００６７】
特定の実施形態では、被験者は動物、典型的にはヒトである。本発明の方法は、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、及びトリ等の他の動物の治療のためのワクチン組成物中で、精製したストレスタンパク質複合体を用いることもできる。
【００６８】
特定の実施形態では、本発明の誘導された熱ショックタンパク質複合体が由来する病原微生物は、それが疾患又は感染を引き起こすことを根拠に選択することができる。本発明により提供されるワクチン組成物は予防用又は治療用のいずれかに用いることができる。しかしながら、発明者らは、この組成物が、生産の経済性、並びにペプチド又はペプチド及び熱ショックタンパク質が由来する病原に対する防御的な免疫反応を誘導する能力のため、予防用ワクチンとして特に有用となり得ることを理解する。
【００６９】
発明者らは、驚くべきことに、本発明の方法を用いて得られる熱ショックタンパク質複合体が「補助」ワクチンとして用いる、ここで、補助ワクチンは病原又は癌の症状に対して被験者中で生じる免疫を高める、ことができることを同定した。初回免疫は生又は弱毒化ワクチンを用いたワクチン接種により与えられ、抗原決定基はストレスタンパク質−ペプチド複合体である。
【００７０】
従って、本発明のまた更なる態様は、病原由来の感染症又は癌の症状に対する被験者中の防御的な免疫反応を補助する方法を提供し、ここで、防御的な免疫反応は、生若しくは弱毒化ワクチン、又は免疫性が所望される病原に由来するペプチドを含むストレスタンパク質複合体の以前の投与により、誘導される、該方法は、
−熱ショックタンパク質複合体、又は前述の本発明の方法のいずれかに従って調製される複合体、精製した熱ショックタンパク質複合体、又は病原に感染した細胞若しくは防御的な免疫が所望される病原に由来する複合体を含み、且つ、異なるストレスタンパク質タイプを混合物として含む組成物を提供するステップと、
−ストレスタンパク質複合体に対して被験者中で免疫反応を引き起こすのに十分な量で被験者に前記組成物を投与するステップと、
を含む。
【００７１】
更なる特定の実施形態では、本発明のワクチンを含む熱ショックタンパク質複合体は、他のサブユニット、複数のサブユニット、炭水化物結合型ワクチンで以前に免疫された動物における免疫反応を補助するために用いることができる。更なる特定の実施形態では、本発明の熱ショックタンパク質複合体ワクチンは、核酸又は生ワクチンで以前に免疫された動物における標的抗原に対する免疫反応を補助するために用いることができる。更なる特定の実施形態では、本発明の熱ショックタンパク質複合体ワクチンは、病原又は癌特異的抗原に対して以前に免疫された被験者中で生じる免疫反応の補助を提供する。
【００７２】
更なる特定の態様では、本発明は、動物で免疫反応を補助する際に用いるための本発明の方法により誘導された熱ショックタンパク質複合体を含むワクチン組成物に拡張され、ここで、動物は、少なくとも１つの病原由来の抗原、病原、特に弱毒化した病原、又は癌特異的抗原を含むワクチン組成物で、以前にワクチン接種される。
【００７３】
更なる特定の態様では、本発明は、動物で免疫反応を補助する際に用いるための本発明により製造された熱ショックタンパク質複合体を含むワクチン組成物に拡張され、ここで、動物は、熱ショックタンパク質複合体が由来するものと同じ又は関連の細胞に由来する、病原又は癌の抗原に以前に曝される。
【００７４】
更なる特定の態様では、本発明は、精製した本発明のストレスタンパク質複合体でパルスされる樹状細胞（ＤＣｓ）等の細胞ワクチンの調製のための組成物を提供する。かかるパルス樹状細胞の被験者への投与は、熱ショックタンパク質複合体に対して向けられるＴ細胞が介在する反応を生じる。かかる治療は、癌又は腫瘍の症状を有する被験者を治療する場合に、特に効果的となり得る。かかる実施形態では、典型的には熱ショックタンパク質複合体は癌細胞に由来する。
【００７５】
更なる特定の態様では、本発明のワクチン組成物は、免疫反応を誘導するための組成物で、又は免疫反応を引き起こす組成物で、置き換えることができ、ここで、組成物は典型的には本願明細書に記載されるワクチン組成物中で用いられるものと同じ抗原決定基を含む。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】図１Ａは、熱ショック及び酸素制限（呼吸のストレス）の両方でストレスを受けた細胞に由来する熱ショックタンパク質の誘導の時間経過を示す。レーン２は誘導前のタンパク質レベルを示し、レーン３〜７は、０〜２時間のストレス誘導を３０分間隔で示す。タンパク質（ＧｒｏＥＬ及びＤｎａＫ）の量の増加を、レーン３〜７における６０及び７０ｋＤａのバンドに見ることができ、これらはＧｒｏＥＬ（７０ｋＤａ）及びＤｎａＫ（６０ｋＤａ）の量の増加を示す。レーン８及び９は、ｈｓｐ６０及びｈｓｐ７０標準の量の増加を、そしてこれらが誘導される主要な熱ショックタンパク質であることを示し。レーン１及び１１は分子量（ＭＷ）マーカーを含む。図１Ｂは、熱ショックのみ（レーン１）後と、熱ショック及び呼吸のストレス（酸素制限）（レーン２）後とにおける、熱ショックタンパク質産生の比較を示す。レーンＭＷは、分子量マーカーを示し、「Ｈｓｐ  ｓｔｄ」とマークされたレーンは精製したｈｓｐ６０及びｈｓｐ７０タンパク質を示す。レーン１及び２の比較により、レーン２では相当に高いレベルの熱ショックタンパク質の誘導が有ることが示された。これは、ｈｓｐ６０及びｈｓｐ７０マーカーレーン（Ｈｓｐ  ｓｔｄｓ）において見られるバンドに相当する、相当に濃いバンドの存在により表される。
【図２−１】図２（Ａ〜Ｆ）は、蛍光ラベルされた臨床的に意義のあるＮｅｉｓｓｅｒｉａｌ株の抗原−依存的オプソニン化貪食作用（ＯＰＡ）によりアッセイされる、熱ショックのみ（グループ１及び２）、熱ショック及び呼吸のストレスの組み合わせ（グループ３）に、曝された細胞に由来する熱ショックタンパク質複合体に対する免疫反応を示す（パネルＡ〜Ｆ）。ポジティブコントロール（カラム１）は同族株由来の外膜ベシクル（ＯＭＶ）調製物でワクチン接種した動物由来の血清を用いた結果を示す。グループ１は、熱ストレス誘導刺激のみを用いて生産され、ＨＥＰＥＳベースの緩衝剤を用いてイオン交換により精製された複合体でワクチン接種した動物由来の血清を用いた結果を示す。グループ２は、熱ストレス誘導刺激のみを用いて生産され、Ｔｒｉｓベースの緩衝剤を用いてイオン交換により精製された、複合体でワクチン接種した動物由来の血清を用いた結果を示す。グループ３は、熱ショック及び呼吸のストレス刺激の組み合わせを用いて生産され、グループ２において用いられたのと同じＴｒｉｓ緩衝剤により精製された、複合体でワクチン接種した動物由来の血清を用いた結果を示す。
【図２−２】図２（Ａ〜Ｆ）は、蛍光ラベルされた臨床的に意義のあるＮｅｉｓｓｅｒｉａｌ株の抗原−依存的オプソニン化貪食作用（ＯＰＡ）によりアッセイされる、熱ショックのみ（グループ１及び２）、熱ショック及び呼吸のストレスの組み合わせ（グループ３）に、曝された細胞に由来する熱ショックタンパク質複合体に対する免疫反応を示す（パネルＡ〜Ｆ）。ポジティブコントロール（カラム１）は同族株由来の外膜ベシクル（ＯＭＶ）調製物でワクチン接種した動物由来の血清を用いた結果を示す。グループ１は、熱ストレス誘導刺激のみを用いて生産され、ＨＥＰＥＳベースの緩衝剤を用いてイオン交換により精製された複合体でワクチン接種した動物由来の血清を用いた結果を示す。グループ２は、熱ストレス誘導刺激のみを用いて生産され、Ｔｒｉｓベースの緩衝剤を用いてイオン交換により精製された、複合体でワクチン接種した動物由来の血清を用いた結果を示す。グループ３は、熱ショック及び呼吸のストレス刺激の組み合わせを用いて生産され、グループ２において用いられたのと同じＴｒｉｓ緩衝剤により精製された、複合体でワクチン接種した動物由来の血清を用いた結果を示す。
【図３】図３は、多数の異なるストレス刺激、すなわち、酸化的、浸透圧、重金属、及び酸のストレスでストレスを受けたＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ細胞由来のストレスタンパク質の誘導の時間経過を示す。熱ショックタンパク質（ｈｓｐ６０及びｈｓｐ７０）の量の増加を、熱ショック又は熱及び呼吸のストレスの組み合わせ、と組み合わせて用いるためのストレス誘導刺激を分析するための、ＧｒｏＥＬ及びＤｎａＫに対する抗体を用いたウェスタンブロットにおいて見ることができる。
【図４】図４は、熱及び酸のストレスの組み合わせで５又は１５分間のいずれかストレスを受けたＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ細胞由来のストレスタンパク質の誘導を示す。熱ショックは４２℃で一定であり、酸のショックはｐＨ４．５、５、及び５．５であった。熱ショック及びｐＨ５の最適な組み合わせは、レーン７及び８におけるｈｓｐ６０及びｈｓｐ７０に対する抗体を用いたウェスタンブロットの比較から決定することができ、１つのストレス誘導刺激のみに曝された細胞を示すレーン１〜４と比較して、ＧｒｏＥＬ及びＤｎａＫの両方の誘導の明らかな向上を示す。
【図５】図５は、蛍光ラベルされた臨床的に意義のあるＮｅｉｓｓｅｒｉａｌ株Ｒｘ１の抗原−依存的オプソニン化貪食作用（ＯＰＡ）によりアッセイされる、熱ストレスのみ（ＨＳワクチン）、又は熱及び酸のストレスの２つのストレスの組み合わせ（ＤＳワクチン）のいずれかに曝された細胞由来のストレスタンパク質複合体に対する免疫反応を示す。ポジティブコントロールは、同族株（Ｒｘ１）由来の殺処理した全細胞で免疫されたマウス由来の血清であり、１つのストレス（熱ショックのみ）由来の単離されたストレスタンパク質複合体は、２つのストレスワクチン（５０μｇ）よりも大きい用量（６８μｇ）で追加的に試験された。
【図６】図６は、蛍光ラベルされた臨床的に意義のある、異なる異種の血清型のＮｅｉｓｓｅｒｉａｌ株に対する酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によりアッセイされる、熱ストレスのみ（ＨＳワクチン）、又は熱及び酸のストレスの２つのストレスの組み合わせ（ＤＳワクチン）のいずれかに曝された細胞由来のストレスタンパク質複合体に対する免疫反応を示す。ポジティブコントロールは、Ｒｘ１株由来の殺処理した全細胞で免疫されたマウス由来の血清であり、１つのストレス（熱ショックのみ）由来の単離されたストレスタンパク質複合体は、２つのストレスワクチン（５０μｇ）よりも大きい用量（６８μｇ）で追加的に試験された。
【発明を実施するための形態】
【００７７】
本発明は、ストレスタンパク質−ペプチド複合体を提供し、ストレスタンパク質の生産は、細胞が、複数のストレス誘導刺激、典型的には、熱ショック及び呼吸のストレス、又は熱ショック及び酸に基づくストレスに曝された後に、誘導される。
【００７８】
発明者らは、少なくとも２つのストレス誘導刺激で細胞にストレスを与えると、相当高いレベルの熱ショックタンパク質の誘導が生じ、この産生の増加は、１つのストレス誘発刺激に曝された後に産生されるタンパク質レベルと比較して、少なくとも２倍の増加、好適には３又は４倍の増加を含むものとして、発明者らにより評価された。これは、熱及び呼吸のストレス等の異なるストレス誘導刺激について特に驚くべきことであり、なぜなら、これらは一般に異なる遺伝子及び転写の要素による制御を受けると考えられているためである。従って、原核細胞の熱ストレスに対する露出の後に、そのストレス誘導刺激に反応して産生される熱ショックタンパク質の量が、細胞の２番目のストレス誘導刺激に対する露出により、更に（また相当に）増加し得ることは、全く予測できないことである。
【００７９】
更に、発明者らは驚くべきことに、本発明の方法を用いて製造される熱ショックタンパク質複合体は、１つのストレス誘導刺激の後に得られる同様な複合体と比較して、又は、恒常的に産生されている熱ショックタンパク質複合体と比較して、免疫原性がより高いことを、同定した。従って、本発明の方法により製造された熱ショックタンパク質複合体は、当該技術分野で知られた標準的な製造方法を用いて製造されたものよりも、免疫原性が高く、改良したワクチン調製物を製造するために用いることができる。
【００８０】
（熱ショックタンパク質複合体）
特定の実施形態では、熱ショックタンパク質複合体は、ペプチド又はペプチド断片と複合化される熱ショックタンパク質を含む熱ショックタンパク質複合体（ＨｓｐＣ）とすることができる。特定の実施形態では、熱ショックタンパク質複合体は、精製されるべき細胞可溶化物に由来するいかなる適した熱ショックタンパク質ともすることができる。特定の実施形態では、熱ショックタンパク質は、特に限定されないが、hsp20-30kD；hsp40；hsp60；hsp70；hsp90；及びhsp100を含む群からのいずれか１つのファミリーから選択されてよい。特定の更なる実施形態では、ストレスタンパク質は、シャペロンタンパク質として分類されるタンパク質としてよい。かかるタンパク質は、特に限定されないが、DnaK、DnaJ、GroEL、GroES、hspX、acr2、AAA+、clpA/B、HtpG、TRIC、CCT、IbpA、IbpB、カルレティキュリン、hsp40、hsp70、hsp72、hsp90、grp94、grp75、BiP/grp78、grp75/mt、gp96、及び低分子量熱ショックタンパク質（ｈｓｐｓ）からなる群から選択されるタンパク質を含んでよい。特定の実施形態では、熱ショックタンパク質はＧｒｏＥＬ及び／又はＤｎａＫであることが好ましい。
【００８１】
特定の実施形態では、複合体の混合物が提供されるとき、これは、１つの特定のファミリー、例えば、ｈｓｐ７０又はｈｓｐ６０ファミリー、の熱ショックタンパク質を含んでよいが、混合物は異なるファミリーに由来する異なる熱ショックタンパク質複合体を含むことが好ましい。本発明の方法は、ぺプチドの同一性、分子量、又はサイズに関係なく、（抗原）ペプチドに複合化された熱ショックタンパク質を含むあらゆる複合体の精製方法を提供する。
【００８２】
特定の実施形態では、標的の熱ショックタンパク質複合体は、ストレスタンパク質遺伝子を恒常的に発現する、及び／又は抗原ペプチド又はペプチド断片等の異種のタンパク質を発現するように、遺伝子組み換えされた宿主細胞に由来する熱ショックタンパク質複合体を含む。特定の更なる実施形態では、細胞は、異種の遺伝子を発現する宿主細胞、例えば、興味の抗原遺伝子を含む発現ベクターコンストラクトを有する酵母細胞としてよい。また更なる実施形態では、細胞はヒト又は動物被験者に由来する癌細胞としてよい。
【００８３】
特定の更なる実施形態では、熱ショックタンパク質複合体（ＨｓｐＣ）を濃縮した調製物（ＨＥＰｓ）は、ＤｎａＫ、ＧｒｏＥＬ、ｈｓｐ６０、ｈｓｐ６５、ｈｓｐ７０、及びｈｓｐ９０等の異なるストレスタンパク質ファミリー又はクラス由来の熱ショックタンパク質を含み、このファミリーは本発明の方法を用いて混合物として共に精製される。
【００８４】
特定の更なる実施形態では、熱ショックタンパク質複合体（ＨｓｐＣ）を濃縮した調製物（ＨＥＰｓ）は特定の分子量の熱ショックタンパク質複合体としてよい。特定の実施形態では、ストレスタンパク質複合体は５０ＫＤａ〜９００ＫＤａの範囲の分子量を有する。
【００８５】
（ワクチン組成物の投与）
特定の実施形態では、本発明のワクチン組成物は、少なくとも１種のアジュバンドを更に含んでよい。特定の実施形態では、アジュバンドは、特に限定されないが、フロイントコンプリートアジュバント、フロイントインコンプリートアジュバント、Ｑｕｉｌ  Ａ、デトックス、ＩＳＣＯＭｓ、及びスクアレンからなる群から選択される。更なる適したアジュバンドは、ミネラルゲル、又は水酸化アルミニウム若しくはリン酸アルミニウム等のアルミニウム塩を含み、しかしながら、カルシウム、鉄若しくは亜鉛の塩としてもよく、又は、アシル化チロシン、若しくはアシル化糖の不溶性の懸濁液としてよく、又は、カチオン的若しくはアニオン的に誘導化されたサッカライド、ポリホスファゼン、生分解性微粒子、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、リピドＡ誘導体（例えば、毒性を低減したもの）、３−０−脱アシル化ＭＰＬ，Ｑｕｉｌ  Ａ、サポニン、ＱＳ２１、フロイントインコンプリートアジュバント（DifcoLaboratories、デトロイト、ミシガン州）、Ｍｅｒｃｋアジュバンド６５（Merck and Company, Inc.、米国）、AS-2、AS01、AS03、AS04、AS15（GSK、米国）、ＭＦ５９（Chiron、シエナ、イタリア）、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、生体接着剤及び粘膜付着剤、微小粒子、リポソーム、外膜ベシクル、ポリオキシエチレンエーテル製剤、ポリオキシエチレンエステル製剤、ムラミルペプチド、又はイミダゾキノリン化合物としてよい。
【００８６】
本発明のワクチン組成物又はストレスタンパク質複合体は、あらゆる適した経路により治療を必要とする被験者に対して投与されてよい。典型的には、組成物は非経口で投与される。非経口投与のために他の可能な例としては、特に限定されないが、静脈内、心臓内、動脈内、腹腔内、筋肉内、腔内、皮下、経粘膜、吸入、又は経皮を含む。投与経路は、更に、局所及び経腸、例えば、粘膜（肺を含む）、経口、経鼻、又は直腸を更に含んでよい。製剤は、液体、例えば、ｐＨ６．８〜７．６での非リン酸緩衝剤、又は凍結融解若しくは凍結乾燥させた粉末を含む生理食塩水としてよい。
【００８７】
特定の実施形態では、組成物は注射可能な組成物として提供される。静脈内注射のために、ストレスタンパク質複合体は、パイロジェンがなく、適したｐＨ、等張性及び安全性を有する、非経口で許容可能な水溶液の形とされる。当業者は、使用に係る適した溶液、例えば、塩化ナトリウム液、リンガー液、又は乳酸加リンガー液等の等張性ビヒクルを調製することができる。保存剤、安定化剤、緩衝剤、抗酸化剤、及び／又は他の添加剤を必要に応じて含めてよい。
【００８８】
特定の実施形態では、注射方法は、針のないものとすることができ、又は真皮を貫通する針を用いるものとしてもよい。特定の更なる実施形態では、ワクチンは経口投与に適したものであり、又は経皮的若しくは経肺的に投与することができる。特定の実施形態では、ワクチン組成物は予防用ワクチンとして投与される。特定の実施形態では、ワクチン組成物は治療用ワクチンとして投与される。また更なる実施形態では、ワクチン組成物は、一次免疫計画により与えられる、あらゆる以前に投与されたワクチンに対する補助ワクチンとして投与される。
【００８９】
前述の手法及びプロトコールの例、並びに本発明に従って用いることができる手法及びプロトコールは、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th edition, Gennaro, A.R., Lippincott Williams & Wilkins; 20th edition ISBN 0-912734-04-3 and Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems; Ansel, H.C. et al. 7th Edition ISBN 0-683305-72-7 に見つけることができ、その全体の開示は参照により本願明細書に組み入れられる。
【００９０】
本発明のワクチン組成物又は熱ショックタンパク質複合体は、微粒子、リポソーム、他の微粒子の送達システム、又は血液を含む特定の組織中に置かれる徐放性製剤により投与することもできる。
【００９１】
投与計画は、本発明の組成物の単回投与、又は該組成物の複数回投与を含んでよい。組成物は、本発明の組成物を投与して治療するべき症状の治療のために用いられる、他の治療薬及び医薬と一緒に又は別々に投与することができる。
【００９２】
実際の投与量、及び投与の速度及び時間経過は、治療対象の性質及び重症度に依存する。治療の処方、例えば、投与量の決定等は、究極的には一般的な実施者及び他の医者の責任及び範囲に属し、典型的には、治療される疾患、患者個人の症状、送達部位、投与方法、及び実施者に知られる他の要因を考慮に入れる。
【００９３】
（定義）
本願明細書に定義されるように、「ストレス誘導刺激」という用語は、刺激を受けた１つ又は複数の細胞内でストレス反応を誘導することが可能な刺激を意味する。本願明細書に定義されるように、「複数の（ｐｌｕｒａｌｉｔｙ  ｏｆ）ストレス誘導刺激」又は「複数の（ｍｕｌｔｉｐｌｅ）ストレス誘導刺激」という用語は、少なくとも２つのストレス誘導刺激を指し、２、３又はそれを超えるストレス誘導刺激を意味する。ストレス誘導刺激は、これに限定されないが、呼吸のストレス、栄養レベル制限下での培養、サイトカイン（腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）又はインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ））への露出、病原の浸透圧ショック（特に、高濃度の塩化ナトリウム等の電解質の培養培地への添加により定常的生育フェーズまで培養したとき）、酸に基づくストレス、ｐＨ変化、代謝物制限又は鉄若しくは炭素制限等の栄養飢餓、高圧下培養、重金属への露出及び酸化剤への露出を含むことができる。
【００９４】
特に定義しない限り、本願明細書で用いられるあらゆる技術的及び科学的用語は本発明の分野の当業者により一般的に理解される意味を有する。
【００９５】
本願明細書を通して、文脈によりそうではないことが明確に要求されない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」若しくは「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、又は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」若しくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」若しくは「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」等の変形は、記載された要素又は要素の群を意味すると解されるが、他の要素又は要素の群を除外するものではない。
【００９６】
本願明細書に定義されるように、「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」等の用語は、文脈によりそうではないことが明確に要求されない限り、単数及び複数を指す。従って、例えば、「（ａ）活性な薬剤」又は「（ａ）薬学的に活性な薬剤」は、１種の活性な薬剤と共に、２種以上の異なる活性な薬剤の組み合わせも含み、「（ａ）キャリア」という言い方は２種以上のキャリアの混合物と共に、１種のキャリア及びその同等物を含む。
【００９７】
本願明細書に定義されるように、「治療」という用語、及びこれに関連する「治療する」という用語は、ワクチン組成物の抗原決定基が由来する病原又は癌細胞に対する長期間の防御的な免疫性を与えるために、抗原決定基に対する防御的な免疫反応を誘導することを意味する。そのため、「治療」という用語は被験者に有益となり得るあらゆる投与計画を指す。治療は既存の症状についてのものとしてよく、又は予防的なもの（予防的治療）としてもよい。治療は、治療、軽減、又は予防の効果を含み得る。
【００９８】
本願明細書に用いられるように、「治療学的に有効量」という用語は、感染症又は癌の症状に対する防御的な免疫反応を誘導するために必要とされる、本発明のストレスタンパク質複合体又はワクチン組成物の量を意味する。本願明細書に用いられるように、「予防的に有効量」という用語は、感染症又は癌の症状の、初期の発症、進行又は再発を予防するために必要とされるストレスタンパク質複合体又はワクチン組成物の量に関する。「治療的」という用語は、被験者が完全に回復するまで治療されることを必ずしも意味しない。同様に、「予防的」という用語は被験者が最終的に疾患にかからないことを必ずしも意味しない。
【００９９】
本発明の文脈中の「被験者」は、ヒト、霊長類、及び家畜（例えば、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ロバ）等の哺乳類；マウス、ウサギ、ラット及びギニアブタ等の実験用動物；並びに、イヌ及びネコ等のペットを含み且つ網羅する。哺乳類はヒトであることが本発明の目的のために好ましい。「被験者」という用語は「患者」という用語と本願明細書において交換可能に用いられる。
【０１００】
本願明細書に用いられるように、「ｍｏｕｎｔ」、「ｍｏｕｎｔｅｄ」、「ｅｌｉｃｉｔ」又は「ｅｌｉｃｉｔｅｄ」という用語は、免疫反応に関連して用いられる場合には、被験者に投与されたワクチン組成物の抗原決定基に対して生じる免疫反応を意味する。典型的には、ワクチン組成物の抗原決定基は、単離及び／又は精製された本発明の方法を用いて得られたストレスタンパク質複合体を含む。
【０１０１】
本願明細書に用いられるように、「免疫反応」という用語は、Ｔ細胞の共刺激の調節により影響を受ける、Ｔ細胞介在及び／又はＢ細胞介在の免疫反応を含む。免疫反応は、抗体産生（体液性免疫反応）、及びマクロファージ等のサイトカイン反応性細胞の活性化等の、Ｔ細胞活性化により非直接的に影響を受ける免疫反応を更に含む。
【０１０２】
明細書中で言及されるあらゆる文献は参照により本願明細書に組み入れられる。本発明の範囲から逸脱することのない、記載される本願発明の実施形態に対する様々な変更及び変化は、当業者に明らかであろう。本発明は特定の好適な実施形態に関して記載されるが、請求される本発明はかかる特定の実施形態に不当に限定されるべきではないと理解されたい。実際、当業者に明らかな、明細書に記載される本発明を実施する方法の様々な変更は、本発明に含めることを意図する。この明細書中の先行技術への言及は、この先行技術がいずれかの国における技術常識の一部をなすことを何らかの形で示唆したことを認めたものとは理解されず、また理解されるべきではない。
【実施例】
【０１０３】
本発明を下記の実施例を参照して記載するが、これは例示の目的で提供されるものであり本発明を限定すると解されることを意図しない。
【０１０４】
（実施例１）グラム陰性菌における複数のストレス刺激によるストレスタンパク質の誘導及び免疫原性の向上
ナイセリア株（N. lactamica及びMC58）を、１００ｍＬのフランツ（Ｆｒａｎｔｚ）培地を含む５００ｍＬのバッフル無しの三角フラスコ中で、１８０ｒｐｍで１２時間撹拌しながら３７℃で初期培養し、その後、必須アミノ酸を添加した５４Ｌのフランツ培地を含む６０Ｌ培養器中に植菌した。培養物を、カスケードを最大５００ｒｐｍまで撹拌することによって溶存酸素分圧（ＤＯＴ）を＜３０％に維持しながら、３７℃で生育した。ＤＯＴをガルバニック溶存酸素プローブ（New Brunswick Scientific社）、又はレドックス・センサー（MettlerToledo社）を用いて測定した。最終培養物に、培養器の温度を０．２５〜０．５℃／分で４４℃まで上げることによって、熱ストレスを与えた。幾つかの培養物では、酸素制限（呼吸のストレス）により熱ショックに対する追加的ストレスを適用した。これを、培養物の温度が４４℃に向かって上がるに従ってカスケードの溶存酸素分圧（ＤＯＴ）の制御を取り除き、また、約３２０〜３５０ｒｐｍに撹拌速度を手動で低減することにより行った。生成物分析のためのサンプルを、ストレス前、ストレス０、１及び２時間後において採取し、熱ショックタンパク質を標準的な装置及びプロトコールを用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析及びウェスタンブロッティング（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）により分析した。
【０１０５】
得られた典型的な結果を図１に示す。図１は、組換え体スタンダードとの共泳動により同定し（図１Ａ、レーン８〜１０）、ウェスタンブロッティングにより確認されるように、熱ストレスに追加した呼吸のストレスの使用による、ＧｒｏＥＬ及びＤｎａＫの時間依存的な誘導（図１Ａ、レーン２〜７）を明確に示す。異種のストレス刺激の予想外の追加的効果が、熱ショックのみ（レーン１）に供された培養物と、熱及び呼吸のストレスの組み合わせ（レーン２）に供された培養物との直接比較（図１Ｂ）により、明確に示され、これは、主要な熱ショックタンパク質ファミリーのｈｓｐ６０及びｈｓｐ７０の明確な増加を示す。
【０１０６】
ストレスを受けた細胞ペレットはＰＢＳ中で再懸濁され、Ｅｍｕｌｓｉｆｌｅｘ  Ｃ５  ホモジナイザーを用いてリンスされ、国際公開第２０１０／０２６４３２号公報に記載されるイオン交換クロマトグラフィーにより熱ショックタンパク質（ＨｓｐＣ）を濃縮したワクチン組成物複合体を調製するために用いた。ワクチンを８匹のマウスの群を免疫するために用い、国際公開第２０１０／０２６４３２号公報に記載される補体結合及びオプソニン化貪食作用アッセイを用いて抗体反応を機能に関して定量化した。得られた典型的な結果を図２に示す。図２は、免疫原决定基として、熱及び呼吸のストレスの両方に曝された培養物由来の熱ショックタンパク質複合体を含むワクチン組成物（グループ３）と、免疫原决定基として、熱ストレスのみに曝された培養物由来の熱ショックタンパク質複合体を含むワクチン組成物（グループ２）とを比較することによって導き出される免疫反応の向上を明確に示す。誘導された交差反応性の免疫原性を、いくつかの蛍光ラベルされた異種のＮｅｉｓｓｅｒｉａｌ株に対してアッセイし、ポジティブコントロールとしての同種のＯＭＶワクチンに対して標準化した。図２Ａ〜Ｆは、幅広いスペクトルの異種の血清型を網羅する、臨床的に重要なＮｅｉｓｓｅｒｉａｌ株、Ｍ０１−２４００１３、Ｍ０１−２４０１０１、Ｍ０１−２４０１４９、Ｍ０１−２４０１８５、及びＭ０１−２４０３５５、並びにＨ４４／７６−ＳＬ、に対して導き出される交差反応性の免疫原性の向上を示す。
【０１０７】
（実施例２）グラム陽性菌における複数のストレス刺激によるストレスタンパク質の誘導及び免疫原性の向上
マイコバクテリアのワクチン株である、ＢＣＧ  Ｄａｎｉｃｈ（Ｓｔａｔｅｎｓ  Ｓｅｒｕｍ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ社）を、０．１％Ｔｗｅｅｎ８０及びアンチフォームエマルションＣ（Ｓｉｇｍａ社）を添加したＳａｕｔｏｎ培地中で生育した。培養を、３７℃で、３６０ｒｐｍで振盪しながら、溶存酸素分圧（ＤＯＴ）を＞２０％に維持して、最大５００ｒｐｍまでカスケードを撹拌することによって、生育した２Ｌの培養物を用いて、３Ｌバイオリアクター（Ｂｒａｕｎ社）中で行った。最終培養物に、培養器の温度を０．２５〜０．５℃／分の速度で１時間に亘って４４℃に上昇させることによって、熱ストレス（熱ショック）を与えた。幾つかの培養物では、酸素制限（酸化的ストレス）を、培養物の温度が４４℃に向かって上がるに従ってカスケードの溶存酸素分圧（ＤＯＴ）の制御を取り除き、また、約３２０〜３５０ｒｐｍに撹拌速度を手動で低減することにより行った。
【０１０８】
得られた結果を、熱ストレスに追加した呼吸のストレスを使用による、主要な熱ショックタンパク質ＧｒｏＥＬ及びＤｎａＫの追加的な誘導を明確に示す。熱ショックタンパク質を濃縮したワクチン組成物を、国際公開第２０１０／０２６４３２号公報に記載されるイオン交換クロマトグラフィーを用いて、マウス及びウサギの群を免疫するために、調製した。抗体反応は再び、免疫された動物由来の血清を用いたウェスタンブロッティング及びＥＬＩＳＡによりアッセイされ、抗原決定基が熱及び呼吸のストレスの両方に曝された培養物由来の熱ショックタンパク質複合体を含むワクチン組成物により導き出される免疫反応の向上を示した。免疫原性の向上は、生きたＨ３７Ｒｖを用いたエアロゾル投与に対する保護の向上が得られ、２つのストレスを受けたＢＣＧ由来のワクチン組成物を用いて免疫されたマウスと１つのストレスを受けたものと比較して、肺のコロニー形成ユニットで更に０．８ログ（ｌｏｇ）の低減があった。
【０１０９】
（実施例３）通性嫌気性菌における複数のストレス刺激によるストレスタンパク質の誘導及び免疫原性の向上
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの実験株Ｒｘ１をＨｏｅｐｒｉｃｈ培地中で、ｐＨ７．５、３７℃で、５％ＣＯ２の雰囲気中の振盪培養器中で、生育した。培養物を、０．５ｍＬのマスターストック（ＯＤ：０．３）を用いて、４０ｍＬ培地に播種して、５０ｒｐｍで５〜６時間生育した（ＯＤ：０．２）。培養物をその後４０℃で３０〜６０分間の熱ショック、ＣＯ２源の除去による呼吸のショック、ｐＨ５に培養物を調節するためのＨＣｌの追加によるｐＨストレス、及び鉄制限を含む、刺激を誘導する複数のストレスに曝した。培養物のサンプルを、標準的な装置及びプロトコールを用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析及びウエスタンブロッティング（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）により熱ショックタンパク質の誘導に関して分析した。様々なストレス刺激によるＧｒｏＥＬ（ｈｓｐ６０）及びＤｎａＫ（ｈｓｐ７０）の誘導の比較（図３）を、最も有望な組み合わせを選択するために用いた。図４は、熱ショック及び酸のストレス（レーン８、９、及び１２、１３）の選択した組み合わせを用いて得られた結果を示し、ＧｒｏＥＬ及びＤｎａＫの両方の誘導の、熱ショック（レーン３）又は酸のストレス（レーン４〜６）のいずれかのみによる誘導に対する、明らかな向上を示す。
【０１１０】
熱ショックタンパク質を濃縮したワクチン組成物（ＨＥＰｓ）を、熱ショック又は熱及び酸のストレスの組み合わせの二重ストレスに曝したＲｘ１培養物から、国際公開第２００１／０２６４３２号公報に記載されるイオン交換クロマトグラフィーを用いて調製し、マウス群を免疫するために用いた。誘導された抗体反応は、免疫した動物由来の血清を用いた、ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ（図５）及びＯＰＡ（図６）によりアッセイされるように、複数の刺激からのワクチン組成物により生じる免疫反応の明らかな向上を示した。
【０１１１】
ＨＥＰｓを、４２℃での熱ショックのみ、又は熱及び酸（ｐＨ５）のショックの組み合わせの二重ストレスのいずれかに曝されたＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅから単離し、マウスを免疫するために用いた。１種のストレスからのＨＥＰワクチンを、二重ストレスからのワクチン（５０μｇ）よりも高い用量（６８μｇ及び５０μｇ）で用い、ポジティブコントロールとして殺処理した全病原のワクチンと比較した。２つのストレスにより誘導されたＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ細胞由来のＨＥＰワクチン（ＤＳワクチン）は、１種のストレスのワクチン（ＨＳワクチン）よりも免疫原性が明らかに高まること、これは後者を相当に高い用量で用いた場合であっても見られること（図５及び６）が示された。この免疫原性の向上は、ＯＰＡアッセイにより評価されるように、生じた抗体の親和性及び結合性において（図５）のみ見られるのでなく、異なる血清型の臨床的に意義のあるＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ株に対するＥＬＩＳＡにより評価されるように、産生した抗体の交差反応性において（図６）も見られる。２つのストレスに曝された細胞から単離されたＨＥＰワクチンにより誘導された免疫性の向上を示すために異種の株を用いた。７価ではなく現在市販されている１３価のワクチンの血清型（血清型１９Ａ）、及び、これらのワクチンには含まれず、肺炎球菌による疾病において臨床的な重要性が生じている、エスケープ変異体の血清型の両方を含む。２つのストレスのＨＥＰワクチンにより誘導された防御的な免疫の特性は、殺処理された全細胞のワクチンの使用により観察されるものと比較しても相当良好である。
【０１１２】
（実施例４）絶対嫌気性菌における複数のストレス刺激によるストレスタンパク質の誘導及び免疫原性の向上
クロストリジウム・ディフィシルの２種の毒による変異体の実験株をＴＹ培地中で、ｐＨ６．８、３７℃で、Ｈ２：ＣＯ２：Ｎ２（比率１０：１０：８０）の雰囲気、５０ｒｐｍの条件の振盪器中で生育してＯＤを０．５〜０．７とし、培養物をその後、周囲の雰囲気下、４４℃、２時間のインキュベーションにより熱及び呼吸のストレスの組み合わせに曝した。培養物のサンプルを、標準的な設備及びプロトコールを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析及びウェスタンブロッティングにより熱ショックタンパク質の誘導について分析した（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。熱ショックタンパク質を濃縮したワクチン組成物を国際公開第２００１／０２６４３２号に記載されるイオン交換カラムクロマトグラフィーを用いて調製して、マウスの群を免疫した。抗体反応は、ワクチン組成物により生じる免疫反応の向上を再び示し、抗原決定基は、ウェスタンブロッティング、及び上皮細胞培養物に対する細菌接着のブロッキングの滴定によりアッセイされるように、熱及び呼吸のストレスの両方に曝された培養物に由来する熱ショックタンパク質複合体を含む。
【０１１３】
（実施例５）真菌の微生物における複数のストレス刺激によるストレスタンパク質の誘導の向上
ＡＴＣＣ  ２０６０２のＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株を、Ｄｉｆｃｏ  ＹＭ生育培地中で、ｐＨ５、３０℃で、５ＬベンチトップＢｉｏＦｌｏ  ３１０培養器（New Brunswick Scientific）で、２８００ｒｐｍの撹拌速度により達成される３０％の溶存酸素濃度で、生育した。２４時間後、培養物を、１時間、酸素供給を停止し温度を４０℃まで上昇させることによって熱及び呼吸のストレスの組み合わせに曝した。培養物のサンプルを、標準的な設備及びプロトコールを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析及びウェスタンブロッティングにより熱ショックタンパク質の誘導について分析した（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図５】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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