(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
スターター培養物及びラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）菌株を含む乳製品を調製するために適切な組成物であって、前記ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）菌株が、受託番号DSM24616としてドイツ微生物・培養細胞コレクション（DSMZ）に寄託されたラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）CHCC12697、又はその変異体菌株であり、前記変異体菌株が、出発材料として前記寄託された菌株を用いることにより得られ、前記変異体菌株が、ジアセチル生成に関して母菌株と同じ性質を有する、組成物。
【請求項２】
前記スターター培養物が、好熱性スターター培養物である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記スターター培養物が、ラクトコッカス（Lactococcus）、ストレプトコッカス（Streptococcus）及びラクトバチルス（Lactobacillus）属から成る群から選択される、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
乳製品の調製のための請求項１〜３の何れか１項に記載の組成物の使用。
【請求項５】
前記乳製品が、発酵乳製品である、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
前記発酵乳製品が、ヨーグルトである、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
前記乳製品が、チーズである、請求項４に記載の使用。
【請求項８】
前記乳製品が、少なくとも０．７５ｐｐｍのジアセチルを含む、請求項４〜７の何れか１項に記載の使用。
【請求項９】
前記乳製品が、少なくとも１．５ｐｐｍのジアセチルを含む、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
乳製品の製造方法であって、以下のステップ：
ａ）請求項１〜３の何れか１項に記載の組成物で乳基質を接種し；
ｂ）前記乳基質を発酵し；
ｃ）任意により、前記乳基質に追加の微生物及び/又は添加剤を添加し；
ｄ）任意により、前記乳基質を後処理し；及び
ｅ）任意により、前記乳製品を充填する、
ことを含む、方法。
【請求項１１】
ステップｂ）が、３５℃以上の温度で前記乳基質を発酵することを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
受託番号DSM24616としてドイツ微生物・培養細胞コレクション（DSMZ）に寄託されたラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）CHCC12697菌株、又は出発材料として前記寄託された菌株を用いることにより得られ、そしてジアセチル生成に関して母菌株と同じ性質を有するその変異体菌株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくとも１つのスターター培養物、及び乳製品のレオロジーに負の影響を与えないで、乳製品に、増強されたクリーミーフレーバーを付与することができるラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）菌株を含む、乳製品を調製するために適切な組成物に関する。さらに、本発明は、高含有率のジアセチルを有する乳製品、例えば、低脂肪のヨーグルト又はチーズの製造方法に関する。そのような乳製品の製造のために有用なラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）菌株はまた、本発明の一部である。
【背景技術】
【０００２】
酪農業界では、低脂肪含有率又は脂肪不含有の製品は、消費者からの需要の増加を抱えている。しかしながら、そのような低脂肪乳製品はしばしば、クリーミーフレーバーの不足を抱えている。
【０００３】
ジアセチルは高付加価値製品であり、そしてそれは、マーガリン及びオイルベースの製品のような製品に添加されるバター風味産生化合物として酪農業界では使用されている。
【０００４】
ヘテロ乳酸菌は、主生成物としてラクテートと共に、副産物としてジアセチル／アセトインを形成する。その細胞は、ピルビン酸オキシダーゼにより、ピルビン酸塩及びチアミンピロリン酸塩から活性アセトアルデヒドを形成する。その活性アセトアルデヒドは、別の分子のピルビン酸塩と縮合し、そしてα−アセトラクテートシンターゼを形成する。ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）におけるジアセチルの形成は十分には理解されておらず、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス次亜種ジアセチラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis）においては、α−アセトラクテートは、αアセトラクテートオキシダーゼによりジアセチルに酸化されることが示唆されている（Jyoti et al. 2003）。アセトインは、α−アセトラクテートの脱カルボキシル化により直接的に形成される。アセトイン形成は、アセトインへのジアセチルの不可逆的ジアセチルレダクターゼにより生じ得る。
【０００５】
ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）は、ジアセチル及びアセトインのようなフレーバー化合物を生成するために使用され得るヘテロ乳酸細菌である（Jyoti et al. 2003）。生成されるジアセチルのレベルは、菌株、及びそれが増殖される基質に依存する。
【０００６】
米国特許第4,867,992号及び第5,236,833号は、それぞれ、コーヒー基質及びペクチン基質を、乳酸産生細菌と共に発酵することによるジアセチルの製造方法に関する。
【０００７】
ジアセチル及び／又はアセトインの調製、濃縮、及び食品へのその添加は、実質的な費用に結び付く。
【０００８】
米国特許第4,678,673号は、ジアセチル及びアセトインを生成するラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）菌株と共に発酵される脂肪種子製品を対象とする。発酵脂肪種子製品は、バター又は乳様フレーバーを有する。乳製品へのラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）の使用は言及されていない。
【０００９】
従って、ジアセチル及び／又はアセトインの高価な添加を伴わないで、改善されたクリーミーフレーバーを有する乳製品を製造する方法の必要性が存在する。
【発明の概要】
【００１０】
ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）の菌株の存在下により付与される増強されたクリーミーフレーバーにより改良された乳製品を調製するための組成物及び方法を提供することが本発明の目的である。
【００１１】
乳製品、例えばヨーグルト又はチーズに、増強されたクリーミーフレーバーを付与できることに関して、改善された性質を有する新規ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）菌株を提供することが本発明の別の目的である。
【００１２】
更なる目的は、以下で明らかになるであろうし、そしてさらに、他は、本発明が関与する当業者に明らかであろう。
【００１３】
本明細書の実施例から分かるように、受託番号DSM24616としてGerman Collection of Microorganisms and Cell Cultures（DSMZ）に寄託されたラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）CHCC12697は、ジアセチル及びアセトインを生成し、それにより、乳製品のレオロジー及び後酸性化に実質的に悪影響を与えないで、乳製品に増強されたクリーミーフレーバーを付与する。
【００１４】
従って、本発明の第１態様は、少なくとも１つのスターター培養物及びラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）菌株を含む、乳製品の製造のための組成物に関する。
【００１５】
より好ましい実施形態によれば、ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）菌株は、受託番号DSM24616としてGerman Collection of Microorganisms and Cell Cultures（DSMZ）に寄託されたラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）CHCC12697又はその変異体菌株であり、ここで前記変異体菌株は、出発材料として前記寄託された菌株を用いることにより得られる。
【００１６】
本発明の第２態様は、乳製品の製造のための本発明の第１態様の組成物の使用に関する。
【００１７】
本発明の第３態様は、乳製品の製造方法を対象とし、前記方法は、以下のステップ：
ａ）本発明の第１態様の組成物で乳基質を接種し；
ｂ）前記乳基質を発酵し；
ｃ）任意により、前記乳基質に追加の微生物及び/又は添加剤を添加し；
ｄ）任意により、前記乳基質を後処理し；及び
ｅ）任意により、前記乳製品を充填する
ことを含む。
【００１８】
本発明の第４態様は、本発明の第３態様の方法により得られる乳製品に関する。
【００１９】
本発明の第５態様は、受託番号DSM24616としてGerman Collection of Microorganisms and Cell Cultures（DSMZ）に寄託されたラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）CHCC12697又は出発材料として前記寄託された菌株を用いることにより得られるその変異体菌株に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、ヨーグルトについての発酵時間（ｐH４．５５に達する時間）を示す。ヨーグルトは、０％のラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）CHCC12697（１）、７．５％のラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）CHCC12697（２）、及び１５％のラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）CHCC12697（３）を含む、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）及びラクトバチルス・ブルガリカス（Lactobacillus bulgaricus）の複数菌株を含む乳酸菌培養物により製造される。標準偏差値は、３回の反復試験から計算される。
【図２】図２は、４２日間にわたってのヨーグルトのｐHの進行を示す。ヨーグルトは、０％のラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）CHCC12697（１）、７．５％のラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）CHCC12697（２）、及び１５％のラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）CHCC12697（３）を含む、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）及びラクトバチルス・ブルガリカス（Lactobacillus bulgaricus）の複数菌株を含む乳酸菌培養物により製造される。標準偏差値は、３回の反復試験から計算される。
【図３】図３は、ヨーグルトについてのレオロジー測定を示す。ヨーグルトは、０％のラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）CHCC12697（１）、７．５％のラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）CHCC12697（２）、及び１５％のラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）CHCC12697（３）を含む、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）及びラクトバチルス・ブルガリカス（Lactobacillus bulgaricus）の複数菌株を含む乳酸菌培養物により製造される。標準偏差値は、３回の反復試験から計算される。
【図４】図４は、ヨーグルトにおけるジアセチルを示す。ヨーグルトは、０％のラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）CHCC12697（１）、７．５％のラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）CHCC12697（２）、及び１５％のラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）CHCC12697（３）を含む、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）及びラクトバチルス・ブルガリカス（Lactobacillus bulgaricus）の複数菌株を含む乳酸菌培養物により製造される。標準偏差値は、２回の反復試験から計算される。
【図５】図５は、ミルクにおいて４３℃でヨーグルトバックグラウンド（ストレプトコッカス・サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）及びラクトバチルス・ブルガリカス（Lactobacillus bulgaricus）（合計0.007g／ｌで接種された））におけるラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）CHCC12534（0.003g／ｌで接種された）又はラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）CHCC12697（0.003ｇ／ｌで接種された）の単一菌株との発酵の後の発酵乳における揮発性化合物（VOC）の濃度を示す。
【図６】図６は、ミルクにおいて４３℃でヨーグルトバックグラウンド（ストレプトコッカス・サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）及びラクトバチルス・ブルガリカス（Lactobacillus bulgaricus）（合計0.007g／ｌで接種された））におけるラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）CHCC12534（0.003g／ｌで接種された）又はラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）CHCC12697（0.003ｇ／ｌで接種された）菌株との発酵の後の発酵乳における揮発性化合物（VOC）の濃度を示す。
【図７】図７は、７週間の熟成の後、ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）CHCC12697（0.02％（ｗ／ｗ）で接種された）の添加を伴って（LBArh12697）又は添加なしで（付加物なし）のゴーダ40＋チーズにおけるジアセチルフレーバーの官能評価を示す。結果は、９５％最下位距離間隔（Least Significant Distance intervals)で平均官能値として示される。
【図８】図８は、７週間の熟成の後、ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）CHCC12697（0.02％（ｗ／ｗ）で接種された）の添加を伴って（LBArh12697）又は添加なしで（付加物なし）のゴーダ40＋チーズに検出されるジアセチル臭の官能評価を示す。結果は、９５％最下位距離間隔で平均官能値として示される。
【図９】図９は、７週間の熟成の後、ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）CHCC12697（0.02％（ｗ／ｗ）で接種された）の添加を伴って（LBArh12697）又は添加なしで（付加物なし）のゴーダ40＋チーズに検出されるジアセチルの量を示す。結果は、標準偏差間隔で平均ジアセチル値（シグナル／ノイズ比）として表された。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
定義
本明細書において使用される場合、用語「乳酸菌」（lactic acid bacterium）とは、優先的に生成される酸として乳酸、酢酸及びプロピオン酸を包含する酸の生成を伴って、糖を発酵する、グラム陽性微好気性又は嫌気性細菌を示す。産業的に最も有用な乳酸菌は、ラクトコッカス属（Lactococcus spp.）、ストレプトコッカス属（Streptococcus spp.）、ラクトバチルス属（Lactobacillus spp.）、ロイコノストック属（Leuconostoc spp.）、シュードロイコノストック属（Pseudoleuconostoc spp.）、ペディオコッカス属（Pediococcus spp.）、ブレビバクテリウム属（Brevibacterium spp.）、エンテロコッカス属（Enterococcus spp.）及びプロピオン菌属（Propionibacterium spp.）を包含する「ラクトバチルス目（Lactobacillales）」内に見出される。さらに、厳格な嫌気性菌、ビフィズス菌、すなわちビフィドバクテリウム属（Bifidobacterium spp.）のグループに属する乳酸産生細菌は一般的に、乳酸菌のグループに包含される。それらは頻繁に、単独で又は他の乳酸菌と組合して、食品培養物として使用される。
【００２２】
ラクトバチルス属（Lactobacillus spp.）及びストレプトコッカス・サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）の種を包含する乳酸菌は、通常、多量のスターター増殖のための凍結又は凍結乾燥培養物として、又は乳製品、例えば発酵乳製品又はチーズの製造のために発酵容器又はタンク中の直接的接種のために意図された、いわゆる「直接タンク設定」（Direct Vat Set）（DVS）培養物として、酪農産業に供給される。そのような乳酸菌培養物は一般的に、「スターター培養物（starter cultures）又は「スターター」（starters）として言及される。
【００２３】
用語「中温菌」（mesophile）とは、本明細書において使用される場合、中位の温度（１５℃〜４０℃）で最も増殖する微生物を言及する。産業的に最も有用な中温菌は、ラクトコッカス属（Lactococcus spp.）及びロイコノストック属（Leuconostoc spp.）を包含する。用語「中温発酵」（mesophilic fermentation）とは、本明細書において使用される場合、約１２℃〜約３５℃の温度での発酵を言及する。用語「中温乳製品」（mesophilic dairy products）とは、中温スターター培養物の中温発酵により調製される乳製品を言及し、そしてバターミルク、サワーミルク、培養ミルク、スメタナ（smetana）、サワークリーム及びフレッシュチーズ、例えばクォーク、トバログ（trarog）及びクリームチーズのような乳製品を包含する。
【００２４】
用語「好熱性」（thermophile）とは、本明細書において使用される場合、４３℃以上の温度で最良に増殖する微生物を言及する。産業的に最も有用な好熱性細菌は、ストレプトコッカス属及びラクトバチルス属を包含する。用語「好熱性発酵」（thermophilic fermentation）とは、本明細書において使用される場合、約３５℃以上の温度での発酵を言及する。用語「好熱性乳製品（thermophilic dairy product）とは、好熱性スターター培養物の好熱性発酵により調製される乳製品を言及し、そしてヨーグルトのような乳製品を包含する。
【００２５】
用語「ミルク」（milk）とは、哺乳類、例えば牛、羊、ヤギ、バッファロー又はラクダを搾乳することにより得られる乳分泌物として理解されるべきである。好ましい実施形態によれば、ミルクは牛乳である。用語ミルクはまた、植物材料、例えば豆乳から製造されるタンパク質／脂肪溶液も包含する。
【００２６】
用語「乳基質」（milk substrate）とは、本発明の方法に従って発酵にゆだねられ得るいずれかの原料及び／又は加工乳材料であり得る。従って、有用な乳基質としては次のものを挙げることができるが、但しそれらだけには制限されない：タンパク質を含む何れかの乳又は乳様製品、完全又は低脂肪ミルク、スキムミルク、バターミルク、再構成乳粉末（reconstituted milk powder）、練乳、粉乳、ホエー、ホエー浸透物（whey permeate）、ラクトース、ラクトースの結晶化からの母液、ホエータンパク質濃縮物又はクリームの溶液／懸濁液。明らかに、乳基質は、いずれかの哺乳類に起源することができ、例えば実質的に純粋な哺乳類乳又は再構成乳粉末であり得る。
【００２７】
発酵の前、乳基質は、当業者において知られている方法に従って、均質化され、そして低温殺菌され得る。
【００２８】
「均質化する」（homogenizing）とは、本明細書において使用される場合、可溶性懸濁液又はエマルジョンを得るための集中的混合を意味する。均質化が発酵の前に実施される場合、それは乳脂肪が、ミルクからもはや分離しないように、より小さなサイズに分解するために実施される。これは、小さな開口部を通してミルクに高圧力をかけることにより達成され得る。
【００２９】
「低温殺菌する」（pasteurizing）とは、本明細書において使用される場合、生存生物、例えば微生物の存在を低めるか又はそれを排除するための乳基質の処理を意味する。好ましくは、低温殺菌は、特定温度で特定時間、維持することにより達成される。その特定温度は通常、加熱により達成される。温度及び持続時間は、一定の細菌、例えば有害な細菌を殺害するか又は不活性化するために選択され得る。急速冷却ステップが続くことができる。
【００３０】
本発明の方法における「発酵」（fermentation）とは、微生物の作用を通しての炭水化物のアルコール又は酸への変換を意味する。好ましくは、本発明の方法における発酵は、ラクトースの乳酸への変換を包含する。
【００３１】
乳製品の製造に使用される発酵工程は良く知られており、そして当業者は、適切な工程条件、例えば温度、酸素、微生物の量及び特性、及び工程時間をいかにして選択するかを知っているであろう。明らかに、発酵条件は、本発明の達成を支持し、すなわち固体形（例えば、チーズ）又は液体形（例えば、発酵乳製品）で乳製品を得るよう選択される。
【００３２】
本明細書において、用語「剪断応力」（shear stress）は粘度を決定する。粘度（単位はPa sである）は、剪断応力（Pa）／剪断速度（１／ｓ）として定義される。剪断応力値は、本明細書において、剪断速度＝３００ 1／sで標準として報告される。官能実験は、レオロジー測定値と官能粘度／口での濃厚さ（mouth thickness）との間の最良な相互関係が、３００ １／sの剪断速度で測定される粘度を用いる場合に見出されることを示した（データは示されていない）。
【００３３】
本明細書において、用語「変異体」（mutant）とは、例えば遺伝子工学、放射線、UV光及び／又はゲノムに変化を誘導する化学的処理及び／又は方法により、本発明の菌株から誘導される菌株として理解されるべきである。好ましくは、変異体は、機能的に同等の変異体、例えば母菌株と実質的に同じか又は改良された性質（例えば、ジアセチル生成、粘度、ゲル剛性、マウスコーティング、風味、後酸性化、酸性化速度及び／又はファージ堅牢性（phage robustness）に関する）を有する変異体である。そのような変異体は、本発明の一部である。特に、用語「変異体」（mutant）とは、いずれかの従来使用される突然変異誘導処理、例えば化学的変異原、例えばエタンメタンスルホネート（EMS）又はN−メチル−N′−ニトロ−N−ニトログアニジン（NTG）、UV光に、本発明の菌株をゆだねることにより得られる菌株又は自発的に発生する菌株を意味する。変異体は、数回の突然変異誘導処理（単一の処理は１つの突然変異誘導ステップ、続いてスクリーニング／選択ステップを含むものとして理解されるべきである）にゆだねられ得るが、しかし現在、好ましくは、２０以下、又は１０以下、又は５以下の処理（又はスクリーニング／選択ステップ）が実施される。現在、好ましい変異体においては、細菌ゲノムにおける、５％以下又はさらに、０．１％以下のヌクレオチドが、母菌株と比較して、別のヌクレオチドにより変更され、又は欠失されている。
【００３４】
本発明の記載において（特に、以下の特許請求の範囲において）、用語「不定冠詞」（ａ及びan）及び「定冠詞」（the）及び類似する参照は、特にことわらないか又は明確に矛盾しない限り、単数及び複数の両方に及ぶものとして解釈されるべきである。用語「含む」（comprising）、「有する」（having）、「含む」（including）及び「含む」（containing）とは、特にことわらない限り、開放端用語（すなわち、「含むが、但しそれらだけには限定されない」（including, but not limited to）として解釈されるべきである。値の範囲の列挙は、本明細書において、特にことわらない限り、範囲内にある各値を個々に参照する簡単な方法として役立つよう単に意図されており、そして各値は、それが本明細書に個々に引用されているかのように、本明細書中に組込まれる。本明細書に記載されるすべての方法は、特にことわらない又は明らかに矛盾しない限り、いずれかの適切な順序で実施される。本明細書で提供される、いずれか及びすべての実施例、又は典型的な用語（例えば、「例えば」（such as））は、本発明をより明らかにすることを意図しており、そして特にことわらない限り、本発明の範囲を制限するものではない。本明細書における用語は、本発明の実施に不可欠ないずれかの請求されていない要素を示すものとして解釈されるべきではない。
【００３５】
本発明の実施及び態様
本発明者等は驚くべきことに、スターター培養物の他に、ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）の菌株により乳基質を接種し、そして発酵することにより、乳製品の質感、発酵時間及び後酸性化に負の影響を与えないで、得られる乳製品に心地よいクリーミーなフレーバーを付与することが可能である。
【００３６】
増強されたクリーミーフレーバーは、受託番号DSM24616としてGerman Collection of Microorganisms and Cell Cultures（DSMZ）に寄託されたラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）CHCC12697の存在下で、中温（26℃〜30℃）及び好熱性（43℃）発酵工程により調製される乳製品で検出された。
【００３７】
用語「増強されたクリーミーフレーバー」（enhanced creamy flavor）とは、製品中のジアセチル及び／又はアセトインの含有率が高められ、そして／又は官能パネルにより決定される場合の製品のクリーミーフレーバーが、本発明のラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）菌株を含まない製品に比較して、増強されることを意味する。
【００３８】
理論に束縛されるものではないが、本発明のラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）菌株により乳製品に付与される増強されたクリーミーフレーバーは、ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）菌株によるジアセチル及び／又はアセトインの増強された製造によるものであると思われる。
【００３９】
好ましい実施形態によれば、乳製品は、本発明のラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）菌株が発酵に使用されていない場合、クリーミーフレーバーを実質的に欠いている低脂肪／非脂肪発酵乳製品である。
【００４０】
本明細書に記載されるようなラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）菌株は、少なくとも１つのスターター培養物及びラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）菌株を含む乳製品の製造のための組成物において有用である。
【００４１】
典型的には、そのような組成物は、濃縮された形、例えば典型的には、組成物１ｇ当たり１０4〜１０12ｃｆｕ（コロニー形成単位）、例えば組成物１ｇ当たり少なくとも１０4ｃｆｕ、例えば少なくとも１０5ｃｆｕ／ｇ、例えば少なくとも１０6ｃｆｕ／ｇ、例えば少なくとも１０7ｃｆｕ／ｇ、例えば少なくとも１０9ｃｆｕ／ｇ、例えば少なくとも１０10ｃｆｕ／ｋｇ、例えば少なくとも１０11ｃｆｕ／ｇで存在する、生存細胞の濃度を有する、凍結され、乾燥され又は凍結乾燥された濃縮物形における細菌を含む。従って、本発明の抗菌組成物は好ましくは、凍結され、乾燥され、又は凍結乾燥された形で、例えば直接タンク設定（Direct Vat Set）（DVS）培養物として存在する。しかしながら、本明細書において使用される場合、抗菌組成物はまた、凍結され、乾燥され、又は凍結乾燥された細胞濃縮物を、液体媒体、例えば水又はPBS緩衝液に懸濁した後に含まれる液体でもあり得る。本発明の抗菌組成物が懸濁後である場合、生存細胞の濃度は、組成物１ｍｌ当たり１０4〜１０12ｃｆｕ（コロニー形成単位）、例えば組成物１ｍｌ当たり少なくとも１０4ｃｆｕ、例えば少なくとも105 cfu/ml、例えば少なくとも１０6ｃｆｕ／ｍｌ、例えば少なくとも１０7ｃｆｕ／ｍｌ、例えば少なくとも１０8ｃｆｕ／ｍｌ、例えば少なくとも１０9ｃｆｕ／ｍｌ、例えば少なくとも１０10ｃｆｕ／ｍｌ、例えば少なくとも１０11ｃｆｕ／ｍｌである。
【００４２】
組成物はさらに、追加の成分として、凍結防止剤及び／又は従来の添加剤、例えば栄養物、例えば酵母抽出物、糖及びビタミン、例えばビタミンＡ，Ｃ，Ｄ，Ｋ又はビタミンＢファミリーのビタミンを含むことができる。本発明の組成物に添加される適切な凍結防止剤は、微生物の耐寒性を改善する成分、例えばマンニトール、ソルビトール、トリポリリン酸ナトリウム、キシリトール、グリセロール、ラフィノース、マルトデキストリン、エリトリトール、トレイトール、トレハロース、グルコース及びフルクトースである。他の添加剤としては、炭水化物、風味剤、鉱物、酵素（例えば、レンネット、ラクターゼ及び／又はホスホリパーゼ）を挙げることができる。
【００４３】
スターター培養物として混合培養物を適用することは、乳酸菌発酵工程においては通常であるので、組成物は、ある実施形態によれば、同じ種に属するか、又は異なった種に属する複数菌株を含むであろう。スターター培養物における乳酸菌のそのような有用な組合せの典型的な例は、ラクトバチルス・ブルカリカス（Lactobacillus bulgaricus）菌株及びストレプトコッカス・サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）菌株の混合物である。
【００４４】
本発明の好ましい実施形態によれば、スターター培養物は、好熱性スターター培養物であり、そして組成物は好熱性発酵のために適切である。
【００４５】
別の好ましい実施形態によれば、スターター培養物は、ストレプトコッカス属（Streptococcus）及びラクトバチルス属（Lactobacillus）から成る群から選択される。好ましい実施形態によれば、スターター培養物は、少なくとも１つのラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）菌株を含む。スターター培養物は、当業者において知られている、いずれかのラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）、例えばラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリス（Lactococcus lactis subsp. cremoris）、ラクトコッカス・ラクティス亜種ホルダニアエ（Lactococcus lactis subsp. hordniae）、又はラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis）からの菌株を含むことができる。さらに別の好ましい実施形態によれば、スターター培養物はラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリス（Lactococcus lactis subsp. cremoris）菌株及びラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis）菌株を含む。組成物は、増強されたクリーミーフレーバーを有する乳製品の調製のために使用され得る。
【００４６】
好ましい実施形態によれば、乳製品は、発酵乳製品、例えばヨーグルトである。別の好ましい実施形態によれば、乳製品はチーズである。
【００４７】
好ましい実施形態によれば、乳製品は少なくとも０．７５ｐｐｍのジアセチル、例えば少なくとも１．０ｐｐｍのジアセチル、例えば少なくとも１．５ｐｐｍのジアセチルを含む。中温性乳製品は、約０．７５ｐｐｍ〜３．００ｐｐｍのジアセチル、より好ましくは約１．００〜２．５０ｐｐｍのジアセチル及び最も好ましくは約１．５ｐｐｍ〜２ｐｐｍのジアセチルを含むことができる。好ましい実施形態によれば、中温性乳製品は、１．５ｐｐｍ以上のジアセチルを含む。当業者は、本発明の乳製品におけるジアセチルの含有率を決定するための多くの方法を認識しているであろう。例えば、その含有率は、適切なクロマトグラフィー方法、例えば静的ヘッドスペースガスクロマトグラフィー（ＨＳＧＣ）により決定され得る。
【００４８】
前述のように、本発明の態様は、以下のステップ：
ａ）本発明の第１態様の組成物で乳基質を接種し；
ｂ）前記乳基質を発酵し；
ｃ）任意により、前記乳基質に追加の微生物及び/又は添加剤を添加し；
ｄ）任意により、前記乳基質を後処理し；及び
ｅ）任意により、前記乳製品を充填する
ことを含む、クリーミーフレーバーを有する乳製品の製造方法に関する。
【００４９】
上記のように、ステップａ）に使用される乳基質は、本発明の方法に従って発酵にゆだねられ得る何れかの原料及び／又は加工乳材料であり得る。
【００５０】
乳基質はいずれかの適切な方法により、上記組成物で接種され得る。例えば、乳基質は、直接的な接種により発酵容器中に接種され得る。
【００５１】
１つの好ましい実施形態によれば、ステップｂ）は、約３７℃以上の温度で乳基質を発酵することを含む。発酵は好ましくは、約３８℃〜約４５℃、より好ましくは約３９℃〜約４２℃の温度で実施される。別の好ましい実施形態によれば、乳基質は、約４０℃で発酵される。乳製品の製造に使用される発酵工程は、良く知られており、そして当業者は、適切な工程条件、例えば温度、酸素、微生物の量及び特性、及び工程時間をいかにして選択するかを知っている。明らかに、発酵条件は、改善されたフレーバー及び高質感を有する乳製品の製造に適切な発酵乳製品を得るために選択される。
【００５２】
さらなる微生物及び／又は添加剤は、ステップｂ）において乳基質の発酵の前、間又は後に乳基質に添加され得る。乳基質に添加され得る微生物は、乳製品の性質に、好都合な態様で寄与するであろう。例えば、微生物は、乳製品におけるジアセチル製造、粘度、ゲル剛性、マウスコーティング、風味、後酸性化及び／又は酸性化速度を改善するか又は支持することができる。任意により、他の成分、例えば着色剤、安定化剤、例えばペクチン、澱粉、変性澱粉、ＣＭＣ等；多価不飽和脂肪酸、例えばオメガ−３脂肪酸が乳基質に添加され得る。そのような成分は、製造工程の間、いずれかの時点で、例えば発酵の前又は後で添加され得る。
【００５３】
乳基質はさらに、所望する乳製品を製造するのに必要な、いずれかの手段により後処理され得る。例えば、さらなる成分、例えば抗凍結剤及び／又は従来の添加剤、例えば栄養物、例えば酵母抽出物、糖及びビタミンが、乳基質に添加され得る。さらに、乳基質は均質化されるか、又は熱処理され、すなわち低温殺菌され得る。
【００５４】
乳製品は、当業者において知られている何れかの適切な手段で充填され得る。例えば乳製品は、例えば２５〜１５００ｍｌの範囲の容積を有する密封容器に充填され得る。乳製品は、製造工程の間、いずれかの時点でも充填され得、例えば接種ステップの次に充填され、そして次に、その充填下で発酵され得る。
【００５５】
本発明の方法により得られる乳製品は、典型的な例として、ヨーグルト、サワークリーム、チーズ及びバターミルクのような製品を包含する。上記方法により得られる乳製品もまた、本発明の一部である。
【００５６】
好ましい実施形態によれば、乳製品は、発酵乳製品である。好ましくは、発酵乳製品はヨーグルトである。
【００５７】
さらに別の好ましい実施形態によれば、乳製品はチーズである。
【００５８】
好ましい実施形態によれば、乳製品は、少なくとも０．７５ｐｐｍのジアセチル、例えば少なくとも１．０ｐｐｍのジアセチル、例えば少なくとも１．５ｐｐｍのジアセチルを含む。
【００５９】
本発明の第５態様は、受託番号DSM24616としてGerman Collection of Microorganisms and Cell Cultures（DSMZ）に寄託されたラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）CHCC12697菌株に関する。この菌株とは別に、本発明はまた、それに由来した変異体にも関し、すなわちそれらは、寄託された菌株CHCC12697を、出発材料として用いることにより得られた。変異体菌株は、例えば遺伝子工学、放射線、UV光、化学的処理及び／又はゲノムの変化を誘導する方法により、CHCC12697から誘導され得る。本発明の変異体は、酢酸塩、アセトアルデヒド、ジアセチル及び／又はアセトインの生成レベルの点で、母菌株と同じ特性を実質的に有する。好ましくは、変異体は、実質的に、少なくとも８０％又はそれ以上、少なくとも９０％又はそれ以上、少なくとも９５％又はそれ以上、又はさらに１００％まで又はそれ以上の酢酸塩、アセトアルデヒド、ジアセチル及び／又はアセトインを、その母菌株に比較して生成する。
【００６０】
出発材料として、寄託された菌株を用いることにより、当業者は、従来の突然変異誘導又は再単離技法により、本明細書に記載される関連する特徴及び利点を保持する、さらなる変異体又はその誘導体を日常的に得ることができることは、当業者に明らかである。従って、第１態様の用語「その変異体」（mutant thereof）とは、出発材料として寄託された菌株を用いることにより得られる変異体菌株に関する。
本発明の実施形態が、非制限的例により、下記に記載される。
【実施例】
【００６１】
実施例１：酸性化されたボイルドミルクにおける高アセトインレベルを有する高熱性ラクトバチルス属（Lactobacillus spp.）のスクリーニング
１７６のラクトバチルス種（Lactobacillus sp.）菌株の選択を、約２４時間、３０℃、３７℃、４０℃及び４３℃で、ボイルドミルクを酸性化する能力について試験した。３７℃インキュベーション由来の酸性化されたボイルドミルクを、実施例５に記載のようにして、ヘッドスペースガスクロマトグラフィーにより、発酵の後、揮発性有機化合物（VOC）について直接試験した。CHCC12697の名称の菌株が、高レベルのアセトイン（１３５ｐｐｍ）及びまた、かなり高レベルのアセトアルデヒド（８ｐｐｍ）を生成することが見出された（データは示されていない）。この菌株は、中温温度（３０〜３７℃）及び好熱性温度（４０〜４３℃）の両者で、ボイルドミルクを酸性化することを観察した。この菌株はまた、４０及び４３℃で、２％グルコース、又は２％ラクトース、又は２％フルクトース又は２％ガラクトースにより補充されたＭＲＳブイヨンにおいて高ＯＤに増殖することを観察した。その菌株は、抗生物質に対して耐性ではなかった。部分的１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列決定は、その菌株がラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）であったことを示した。
【００６２】
実施例２：ヨーグルトの製造方法
スキムミルク（DanMaelk, Aria）を、２％スキムミルク粉末（Aria）により強化し、そして９０℃で２０分間、熱処理した。この溶液を、バックグラウンドスターター培養物及びラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）CHCC12697菌株で接種するか、又はラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）CHCC12697菌株なしで接種した。
【００６３】
ヨーグルトを製造するために使用されるバックグラウンドスターター培養物を、０．０２％の割合で接種された、凍結直接タンク設定（Direct Vat Set）（F-DVS）形態において、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）及びラクトバチルス・ブルカリカス（Lactobacillus bulgaricus）の複数菌株から構成した。F−DVS形態におけるラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）菌株を、結果のセクションに記載される量で、バックグラウンドスターター培養物に添加した。接種で、細胞数は、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）及びラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）菌株について１×１０10cfu／ｇ以上、及びラクトバチルス・ブルガリカス（Lactobacillus bulgaricus）菌株について１×１０8cfu／g以上であった。
【００６４】
接種された溶液を４３℃に加熱し、そしてｐＨ４．５５まで発酵した。ｐＨ４．５５に達する時間は、図１に示される発酵時間である。ｐＨ４．５５に達すると、ヨーグルトを、２バールの圧力で、２５℃で、後処理ユニットによりポンプで送り、そしてプラスチックカップ中に満たし、次に冷蔵下に置いた。レオロジー測定を、１日の冷蔵の後に行った。ヨーグルト中のｐＨの進行を、１，１４，２８及び４２日の冷蔵の後に測定した。ジアセチル測定を、７日の冷蔵の後に行った。
【００６５】
実施例３：ｐＨの進行を測定するための方法
分析の日（１、１４、２８及び４２日の冷蔵の後）、ヨーグルトを含む１つのプラスチックカップを、冷蔵から取り、そしてｐＨ計（ｐＨＭ２４０、ＭｅｔｅｒＬａｂ）を用いて、ｐＨを測定した。測定の前、ｐＨ計を校正した（７．００及び４．０１の緩衝液による２点校正）。サンプルとして、校正のために使用される緩衝液は冷貯蔵された。図２は、ｐＨの進行を示す。
【００６６】
実施例４：ゲル硬度及び粘度の測定方法
ゲル硬度を、自動サンプル交換装置を備えたAnton Paarレオメーター（Physica DSR Rheometer＋ASC）を用いて測定した。測定ボブを、２０ｍｌのヨーグルトサンプルを含む測定カップに配置し、それを手動撹拌し、そして１３℃に加熱した。ボブをヨーグルトサンプルに配置した後、待機時間を適用した。待機することにより、カップにボブを配置することにより壊れた構造のほとんどが再構築した。次に、ゲル硬度を、振動により測定した。ここで、菌株は、０．３％で一定に保持され、そして周波数を０．５ヘルツから３０ヘルツに高めた。それらの測定から、弾性率（G′）及び粘性率（G’’）が、計算され得、そしてそれから、複素弾性率（G*）が得られた。
【００６７】
【数１】
0006018171.tif 000002
【００６８】
１ヘルツでのG*は、ゲル硬度に相関し、そして異なったサンプルの比較のために使用した（図３）。
【００６９】
同じ装置（Anton Paarレオメーター）を用いて、粘度を、１０秒ごとの測定点（剪断応力）を伴って、0.2707 1/sから300 1/sに剪断速度を高めることにより測定した。次に、剪断速度を、１０秒ごとの測定点を伴って、275 1/sから0.2707 1/sに低めた。製品の粘度はフロー曲線測定において、300 1/sでの剪断応力に相関し、そして図３に示した。
【００７０】
実施例５：揮発性化合物（ＶＯＣ）の測定方法
ヨーグルトサンプルを、複雑なマトリックス中の揮発物を分析するための強力技法である静的ヘッドスペースガスクロマトグラフィー（ＨＳＧＣ）により分析した。その設定は、フレームイオン化検出器（ＦＩＤ）と共にガスクロマトグラフに連結される静的ヘッドスペースサンプラーから成った。使用される装置（カラムを含む）及びソフトウェアを以下に列挙する：
HS-自動サンプラー: HS40XI, TurboMatrix 110, Perkin Elmer、
HS-ソフトウェア: HSControl v.2.00, Perkin Elmer、
GC:自動システム XL, Perkin Elmer、
GC-ソフトウェア: Turbochrom navigator, Perkin Elmer、
カラム: HP-FFAP 25 m x 0.20 mm x 0.33 μm, Agilent Technologies。
【００７１】
既知濃度の標準を用いて、応答係数（校正）を決定し、対照を用いて、応答係数が分析シリーズ内で及び中間シリーズで、及び時間（月）にわたって安定するよう制御した。サンプル及び対照中の揮発物の濃度（ｐｐｍ）を、標準からである応答係数を用いて、決定した。
【００７２】
サンプルを、１ｇのヨーグルトサンプルに、２００μｌの４ＮのＨ2ＳＯ4を添加することにより調製した。ジアセチル含有率を、図４に示す。
【００７３】
結果
図１〜４のグラフは、ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）CHCC12697菌株を伴って及びそれを伴わないで、乳酸菌培養物により製造されたヨーグルトにおいて得られた結果を要約する。
【００７４】
ヨーグルトを製造するために使用される乳酸菌培養物におけるラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）CHCC12697菌株の存在は、発酵時間（図１）、後酸性化（図２）又はヨーグルトのレオロジー特性（図３）に影響を及ぼさない。
【００７５】
ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）CHCC12697菌株がヨーグルトを製造するために使用される乳酸菌培養物に存在する場合、有意に高い量のジアセチルがヨーグルトに測定され得る（図４）。
【００７６】
実施例６：ヨーグルトの官能分析
ヨーグルト中のラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）CHCC12697の存在の効果を記録するために、クリーミーフレーバーの官能評価を、訓練パネルを用いて実施した。試験は、２−ＡＦＣ試験（ＡＦＣ：代替強制選択）／対比較試験として実施された。この試験は、２種のサンプルが１つの属性（この場合、クリーミーフレーバー）に焦点を当てて評価されるべきである場合、適切である。この試験は、目的が、ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）CHCC12697菌株の存在が増強されたクリーミーフレーバーをもたらすことを確認することであったので、一方的として見なされるべきである。
【００７７】
合計２０の供給から、評価者に、最高強度のクリーミーフレーバーを有するサンプル（２つのうち）を指摘してもらった。ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）CHCC12697菌株を含むヨーグルトを、最高強度のクリーミーフレーバーを有するものとして、２０の供給のうち１５において指摘した。この数は、有意差（ａ＝０．４５）を構成する。
【００７８】
２−ＡＦＣ試験（ＡＦＣ：代替強制選択）／対比較試験についての参照：Meilgaard M.C., Civille, G.V. & Carr, B.T. (2007). Sensory Evaluation Techniques, 4th Ed . Chapter 7 : Attribute Difference Tests: How does attribute X Differ Between Samples? pp. 105- 128. CRC Press。
【００７９】
実施例７：２種のラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）菌株により生成されるヨーグルト風味に関連する選択されたＶＯＣのスクリーニング
発酵乳製品における、それぞれラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）CHCC12697及びラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）CHCC12534の使用による、ヨーグルト風味に関連するＶＯＣのレベルに対する効果を決定するために、試験を、ミルク（０．１％脂肪、３．７％タンパク質及び４．８％ラクトース）におけるヨーグルト発酵条件（４３℃）で実施し、ここで菌株は、単独で、又はバックグラウンドとして、ヨーグルト培養物（ラクトバチルス・ブルカリカス（Lactobacillus bulgaricus）及びストレプトコッカス・サーモフィラス（Streptococcus thermophilus））を用いて試験された。アセトイン、アセトアルデヒド、エタノール及びジアセチルのレベルを、実施例５に記載されるように、１６時間の発酵の後に、決定した。
【００８０】
試験を、ミルク（０．１％脂肪、３．７％タンパク質及び４．８％ラクトース）、及びラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）CHCC12697及びラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）CHCC12534（１０ｇ／ｌ）の一晩の培養物を用いて、マイクロタイタープレート上で実施した。液体処理を、Multiprobe II PLUSロボット（Perkin Elmer）により行った。
【００８１】
【表１】
0006018171.tif 000003
【００８２】
CHCC12697及びCHCC12534の両者は、接種比率の半分以下でさえ、バックグラウンドとして使用されるヨーグルト培養物よりも有意に高いレベルのジアセチル及びアセトインを生成する。ヨーグルト培養物は、有意に高いアセトアルデヒドレベル（より高い接種比率）を生成する。CHCC12697及びCHCC12534のプロフィールは、単一菌株レベルで、お互い有意に異ならない（表１及び図５）。
【００８３】
【表２】
0006018171.tif 000004
【００８４】
ヨーグルトバックグラウンド培養物と共に発酵したCHCC12697（３０％の接種物）は、ヨーグルトバックグラウンドと共に発酵したCHCC12534（３０％の接種物）に比較して、及びバックグラウンド接種物のみに比較して、有意に高いレベルのアセトイン、アセトアルデヒド及びエタノールを生成する。ヨーグルトバックグラウンド培養物と共に発酵したCHCC12697及びCHCC12534（両者とも、３０％の接種物）は、有意に異なったレベルのジアセチルを生成しない（表２及び図６）。
【００８５】
ヨーグルト培養物における３０％のCHCC12697の添加は、表３に従ってVOCの上昇をもたらした。
【００８６】
【表３】
0006018171.tif 000005
【００８７】
実施例８：ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）CHCC12697を有するヨーグルトの官能性質
ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）CHCC12697を有するヨーグルトのゲル硬度、口での濃厚さ及びクリーミーフレーバーを分析するためにヨーグルトを、添加された２％スキムミルク粉末と共に均質化されたスキムミルクから、３L規模の容器において製造した。そのベースを、９２℃で２０分間、殺菌し、そして接種のために４３℃で冷却した。バックグラウンドスターター培養物（ストレプトコーカス・サーモフィラス(Streptococcus thermophilus)及びラクトバチルス・ブルガリカス(Lactobacillus bulgaricus)）を、０．０２％で接種した。ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）CHCC12697を、一晩の培養物（バッチ当たり１５ｇ）として添加した。
【００８８】
ヨーグルトをｐＨ４．５５まで発酵し、次に撹拌し、冷却し、そして２００ｍｌ容器に充填した。サンプルの官能評価を、５メンバーの官能パネルにより、７日後に行った。パネルは、サンプルの順位のための固定点（値０）を創造するために参照サンプル（フレーバー培養物は添加されていない）を使用した。次に、サンプルを、各記述について参照サンプルに比較して評価し、そしてすべての判断についての平均値を用いて、各記述についての平均値評点を得た（表４）。
【００８９】
【表４】
0006018171.tif 000006
【００９０】
ヨーグルトへのCHCC12697の添加は、高いゲル硬度、良好な口での濃厚さ及び増強されたクリーミーフレーバーをもたらした。
【００９１】
実施例９：ゴーダ４０＋チーズの製造方法
ゴーダ４０＋チーズを、１５０Lの殺菌された全乳から製造した（７２℃で２０秒）。ミルクを５℃に冷却し、そしてそれを、使用の前、３８％クリームとタンパク質レベル（３．４〜３．７％）（脂肪：タンパク質の比率）に応じて標準化した。その標準化を、ミルク中のタンパク質含有率及び乾燥物質で４０％脂肪を有する標的ゴーダチーズに基づいて計算した。
【００９２】
標準化の後、ミルクを、３２℃の前熟成温度まで、熱交換器において予備加熱し、そしてチーズバットにポンプで送った。ゆっくりした撹拌（２３５ｒｐｍ）を、レンネットがミルクに分散されるまで、続けた。
【００９３】
ゴーダ４０＋チーズを、表５におけるパラメーターを用いて製造した。
【００９４】
0.01 % (w/w) 酸性化培養物(CHN- 19, Chr. Hansen Α/S)、0.02% (w/w) レンネット (Chy-Max Plus, Chr.Hansen A/S)、0.01% (w/w) CaCl2 (34% 溶液) 及び 0.01% (w/w) 硝酸の添加物を、各チーズに添加した。０．０２％（ｗ／ｗ）の補助培養物（ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）CHCC12697）を１つのバットに添加し、７週間の熟成の後、ジアセチル臭及び風味に対する菌株の効果を試験した。
【００９５】
チーズを、１０℃で２２％塩水において２０時間、塩漬けした。チーズを被覆し、そしてプラスチックバッグに真空充填し、そして９℃で１週間、続いて１３℃で２週間及び９℃で２週間、貯蔵した。この後、ゴーダ４０＋を５℃で貯蔵した。
【００９６】
【表５】
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【００９７】
実施例１０：チーズの化学分析
ゴーダ４０＋チーズにおけるラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）CHCC12697の存在の効果を記録するために、それぞれジアセチル臭及び風味の官能評価を、訓練パネルを用いて実施した。
【００９８】
官能評価を、ランキング検定を用いて行った。サンプルを、官能評価の前、１３℃で保持した。サンプルは、蓋付きで、３行のランダム数字によりラベルされたプラスチックボックスにランダムに出された。チーズサンプルを、１−８の規模で評点をつけ、１は低強度の臭又は風味であり、そして８は高強度の臭い又は風味である。差異分析が各官能記述子に対して行われた。ANOVAの結果は、１２人の評価者により評価されるように、官能記述子の平均値を示すプロットにより説明された。プロットはまた、各平均の周りに間隔を示した。示される間隔は、Fisherの最小有意差（LSD）手順に基づく。それらは、２つの平均が同じである場合、それらの間隔は時間の９５．０％と重複するような手段で構成された。垂直方向に重ならない任意の間隔対は、統計学的有意差を有する平均値対を示す。
【００９９】
ゴーダ４０＋チーズへのラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）CHCC12697の添加は、ジアセチル臭及び風味の知覚を有意に高めた（図７及び８）。
【０１００】
実施例１１：チーズの化学分析
ゴーダ４０＋チーズにおけるラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）CHCC12697の存在の効果を記録するために、ジアセチル含有率の化学分析を、実施例５に記載のようにして（チーズのサンプル調製は除く）、ガスクロマトグラフィーを用いて実施した。
【０１０１】
チーズプラグを、使い捨ての３ｍｌの注射器を用いてサンプリングした。底をナイフにより除き、そして注射器をチーズ中に押し、「プラグ」（plug）を切断した。その「プラグ」を、２０ｍｌのヘッドスペースバイアルに移した。酸素感受性化合物の分析のために、バイアルを、キャップンより閉じる前、窒素によりフラッシュした。酸を、チーズサンプルに添加しなかった。
【０１０２】
ゴーダ４０＋チーズへのラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）CHCC12697の添加は、チーズにおけるジアセチルのレベルを有意に高めた（図９）。
【０１０３】
寄託及び専門家の解決策
出願人は、下記に言及される寄託された微生物が、特許が付与される日まで、専門家に利用可能にすることができることを要求する。
【０１０４】
ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）CHCC12697菌株は、German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH; DSMZ), Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweigに、２０１１年３月１日に寄託され、そして受託番号DSM24616を付与された。
【０１０５】
寄託物は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に従って行われた。
【０１０６】
参考文献：
Jyoti, B.D., Suresh, A.K., and Venkatesh, K.V. (2003) : Diacetyl production and growth of Lactobacillus rhamnosus on multiple substrates. World Journal of Microbiology &. Biotechnology 19 : 509-514。
米国特許第4,678,673号（Marshall et al.）
米国特許第4,867,992号 (Boniello et al.)
米国特許第5,236,833号 (Duboff et al.)
【図１】
0006018171.tif 000008
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図５】
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【図６】
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