(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の一般式（Ｉ）又は（II）のペプチド化合物：
Ｒa−Ｒ1−Ｒ2−Ｒ3−Ｒ4−Ｒb（Ｉ）又はＲa−Ｒ4−Ｒ3−Ｒ2−Ｒ1−Ｒb（II）
ここで、
‐Ｒaは、アミノ酸Ｒ1又はＲ4のＮ末端第１級アミノ基を表しており、遊離しているか、又は、保護基で置換されており、
‐Ｒbは、アミノ酸Ｒ1又はＲ4のＣ末端カルボキシル基のヒドロキシル基を表しており、遊離しているか、又は、保護基で置換されており、
‐Ｒ1−Ｒ2−Ｒ3−Ｒ4又はＲ4−Ｒ3−Ｒ2−Ｒ1は、ＨＡＤＤ，ＫＡＤＤ，ＤＤＡＫ，ＲＡＤＤ，ＤＤＡＲ，ＫＡＥＤ，ＤＥＡＫ，ＲＡＥＤ，ＤＥＡＲ，ＨＡＤＥ，ＥＤＡＨ，ＫＡＤＥ，ＥＤＡＫ，ＲＡＤＥ，ＥＤＡＲ，ＨＡＥＥ，ＥＥＡＨ，ＫＡＥＥ，ＥＥＡＫ，ＲＡＥＥ及びＥＥＡＲを表している。
【請求項２】
Ｒ1−Ｒ2−Ｒ3−Ｒ4又はＲ4−Ｒ3−Ｒ2−Ｒ1がＨＡＥＥ，ＥＤＡＲ，ＥＥＡＨ，ＥＥＡＫ，ＥＥＡＲ，ＨＡＤＤ，ＨＡＤＥ，ＫＡＤＤ，ＫＡＥＥ，ＲＡＤＤ，ＲＡＤＥ，ＲＡＥＥ，ＤＤＡＫ，ＫＡＥＤ，ＤＥＡＲ又はＫＡＤＥを表している、一般式（Ｉ）又は（II）の化合物から選ばれることを特徴とする、
請求項１に記載のペプチド化合物。
【請求項３】
Ｒ1−Ｒ2−Ｒ3−Ｒ4又はＲ4−Ｒ3−Ｒ2−Ｒ1がテトラペプチドＨＡＤＤ，ＤＤＡＫ，ＲＡＤＤ，ＫＡＥＤ，ＤＥＡＲ，ＫＡＤＥ，ＨＡＥＥ及びＲＡＥＥのうちの１つを表している、一般式（Ｉ）又は（II）の化合物から選ばれることを特徴とする、
請求項２に記載のペプチド化合物。
【請求項４】
Ｒ1−Ｒ2−Ｒ3−Ｒ4又はＲ4−Ｒ3−Ｒ2−Ｒ1が２つのテトラペプチドＨＡＥＥ及びＲＡＤＤうちの１つのテトラペプチドを表している、一般式（Ｉ）又は（II）の化合物から選ばれることを特徴とする、
請求項２に記載のペプチド化合物。
【請求項５】
純度が９８％以上であり、
前記アミノ酸Ｒ1，Ｒ2，Ｒ3及びＲ4が天然異性体Ｌであり、かつ、
Ｒa及びＲbが前記保護基を表していることを特徴とする、
請求項１〜４の何れか１項に記載のペプチド化合物
【請求項６】
式Ａｃ‐ＨＡＥＥ‐ＮＨ2又はＡｃ‐ＲＡＤＤ‐ＮＨ2に一致することを特徴とする、
請求項１〜５の何れか１項に記載のペプチド化合物。
【請求項７】
請求項１〜６の何れか１項に記載のペプチド化合物を含む薬剤。
【請求項８】
前記ペプチド化合物のＲ1−Ｒ2−Ｒ3−Ｒ4又はＲ4−Ｒ3−Ｒ2−Ｒ1が、テトラペプチドＨＡＥＥ又はＲＡＤＤを表している、
請求項７に記載の薬剤。
【請求項９】
請求項１〜６の何れか１項に記載のペプチド化合物の少なくとも１つを含む作用物質を含む、医薬組成物。
【請求項１０】
前記ペプチド化合物のＲ1−Ｒ2−Ｒ3−Ｒ4又はＲ4−Ｒ3−Ｒ2−Ｒ1が、テトラペプチドＨＡＥＥ又はＲＡＤＤである、
請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
非経口投与、経皮的投与又は経粘膜投与のための、生理学的に許容されるキャリアーをさらに含む、請求項９又は１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記キャリアーが、血管内、筋肉内、皮下、髄腔内又は脳脊髄への投与に適していることを特徴とする、
請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
アミロイド斑の形成が起こる疾患の治療用の、
請求項１１又は１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
神経変性疾患の治療用の、
請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
アルツハイマー病の治療用の、
請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
請求項１〜６の何れか１項に記載のペプチド化合物を含み、前記ペプチド化合物をアミロイド‐βペプチドと結合させることによって、Ｚｎ（II）イオンとアミロイド‐βペプチドとの結合を低減する医薬組成物。
【請求項１７】
前記ペプチド化合物のＲ1−Ｒ2−Ｒ3−Ｒ4又はＲ4−Ｒ3−Ｒ2−Ｒ1が、テトラペプチドＨＡＥＥ又はＲＡＤＤを表している、
請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
請求項１〜６の何れか１項に記載のペプチド化合物を含み、前記ペプチド化合物をアミロイド‐βペプチドと結合させることによって、Ｚｎ（II）イオンの存在下においてアミロイド‐βペプチドの重合及び／又は凝集を低減する医薬組成物。
【請求項１９】
前記ペプチド化合物のＲ1−Ｒ2−Ｒ3−Ｒ4又はＲ4−Ｒ3−Ｒ2−Ｒ1が、テトラペプチドＨＡＥＥ又はＲＡＤＤを表している、
請求項１８に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特に、アミロイド‐βペプチドと結合するのに有用な、及び／又は、特に前記アミロイドペプチドのアミロイド斑の形への重合を阻害することによって、アミロイド斑の形成を抑制又は低減するのに有用な、新規のペプチド化合物に関する。
【０００２】
また、本発明は、神経変性疾患、特にアルツハイマー病の治療目的の薬剤としての使用、又は、神経変性疾患、特にアルツハイマー病の治療目的の薬剤の調合又は決定（preparing or determining a drug）のための使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
アルツハイマー病は、神経変性疾患、特に高齢者の神経変性疾患であり、その疾患の初めに５〜１５年の期間にわたって生じる、長く且つ不可逆の知能低下と、その疾患のそれに続く段階における精神運動機能の喪失と、によって特徴付けられる。
【０００４】
アルツハイマー病は、ジェンダー又はライフスタイルに関わらず、５５歳を超える高齢者の認知症の最も多い原因の一つである［１］。
【０００５】
ある患者にとっては、アルツハイマー病は遺伝的な機能障害に関係しているかもしれないが、しかし、患者の大部分にとっては、アルツハイマー病は特定できる理由なく散発的に起こる［２］。
【０００６】
今日に至るまで、散発型又は遺伝型のアルツハイマー病を治療するための治療法は存在していない。アルツハイマー病が、老化作用による必然的な結果ではなく、アミロイド‐βペプチド（以下、「Ａβ」）の凝集（aggregation）という異常現象によって引き起こされるということが、現在よく知られている［３，４］。
【０００７】
Ａβは、アミロイドのタンパク質前駆体（a protein precursor of the amyloid）（以下、「ＡＰＰ」と記載する。）の連続的な開裂の後で形成する、３９〜４３個のアミノ酸を有するペプチド（スイスプロット  ＩＤ  Ｐ０５０６７）である。Ａβペプチドは、血液又は脳脊髄液のような体液中に発見される化合物であり、それは体液中に０．５〜５ｎＭの低濃度で存在し、これは健常者でもアルツハイマー病に冒された患者でも同じである［５，６］。
【０００８】
一方、アルツハイマー病の進行は、患者の脳における、いわゆるアミロイド斑の細胞外蓄積又は細胞外沈着によって特徴づけられる。これらのアミロイド斑は、二重体のペプチドＡβモノマーと、さらにより大きいサイズの溶解性オリゴマーとの立体配座（conformation）に由来し、さらに、不溶性のフィブリル状のβシート凝集体の形（それは最終的にアミロイド斑を引き起こす）のペプチドＡβモノマー及び溶解性オリゴマーの凝集に由来する。
【０００９】
しかし、アミロイド斑の形成の現象及びアルツハイマー病の要因の正確な分子メカニズムは、今日まで部分的に解明されないままである。
【００１０】
ある研究は、本質的に高いアミロイド生成性の潜在力を、ＡβペプチドのＣＯＯＨ端のアミノ酸１７〜４２個の断片に帰するものとみなしている［９］。他の研究では、ＡβペプチドのＮＨ2端領域からのＡβペプチドのアミノ酸１〜１６個の断片がアルツハイマー病の発症に関係することを除外していない［１０］。
【００１１】
今日でも、この利用可能な資料（data）全体では、以下の理由により、ペプチドＡβの１〜１６Ｎ末端領域が、確かに、アミロイド斑の形成の現象において最も決定的で確実な方法に関係する領域であると考えられるかもしれない。
【００１２】
まず第１に、ラットにはアルツハイマー病がないけれども、前記領域は、ラットにおいてＡβペプチドの３つの突然変異体を含んでおり、ラットのＡβペプチドを他の哺乳類のＡβペプチドから区別している。
【００１３】
１〜１６Ｎ末端領域は、亜鉛（Ｚｎ）及び銅（Ｃｕ）がＡβペプチドと結合する結合ドメインとして確認されている［１１〜１４］。現在、アミロイド斑は、二価金属、特に亜鉛の異常な高濃度によって特徴づけられている［１５］。いくつかの研究実験は、体内（in vivo）及び体外（in vitro）の両方で、高い亜鉛濃度がＡβペプチドの沈殿を引き起こし、それがアミロイド斑の形成につながるということを示している。また、高い亜鉛濃度を有するニューロンの環境下において、アミロイド斑がより著しく形成するということも証明されている［１６〜２０］。
【００１４】
これが、Ａβペプチドと亜鉛との相互作用を阻止することが、アミロイド斑の形へのペプチドＡβの凝集を減少させることにつながり、そしてそれと関係する発症を抑制すると、現在考えられている理由である。それゆえ、米国特許第６，００１，８５２では、アルツハイマー病の治療のための薬剤として、亜鉛キレート剤であるクリオキノール（CLIOQUINOL）が提案されている。しかし、体内における亜鉛の標準のホメオスタシスへの干渉を避けるために、亜鉛キレート剤の使用は、亜鉛がＡβペプチドと結合する結合ドメインの領域において、特定の標的を必要とする。
【００１５】
他の研究［２１〜３０］では、ニコチン酸アセチルコリンのレセプターが、アミロイド斑の形成によって誘導される、コリン作動系及び認知体系の損傷（failures）と関連する神経毒性の主要標的（main target）としての役割を果たすことが示されている。これが、米国特許７，０１８，７９７において、アミロイドβペプチドがα‐７ニコチン酸アセチルコリンのレセプターと結合することを抑制することによって神経変性疾患を治療する方法が提案された理由である。米国特許７，０１８，７９７において、ナフタレン由来の化合物、特に５，８‐ジヒドロキシ‐トランス‐２‐ジ（Ｎプロピルアミノ）‐３‐メチル‐１，２，３，４‐テトラヒドロナフタレン（5,8-dihydroxy-trans-2-di(N-propylamino)-3-methyl-1,2,3,4-tetrahydronaphthalene）が、Ａβペプチドとα−７ニコチン酸アセチルコリンのレセプターとの結合を抑制するかもしれない化合物として、とりわけ提案されている。
【００１６】
他の研究では、Ａβペプチド（ＨＨＱＫ，ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．２７）の１３〜１５のアミノ酸の領域の、ヘパラン硫酸（ミクログリア細胞の結合分子であり、グリコサミノグリカンに分類される）との結合による、脳のミクログリア細胞との相互作用を説明している。ミクログリア細胞のグリコサミノグリカン分子の表面上でのＡβペプチドの結合は、Ａβペプチドのオリゴマーの形成を誘導する。トラミプロセート（Tramiprosate）の分子はグリコサミノグリカンによく似ており、Ａβペプチドのオリゴマー化のプロセスを抑制する［３１〜３６］。
【００１７】
米国特許７，３１４，７２４では、Ａβペプチドと結合可能でかつＡβペプチドを単量体状態に保持できる可溶型のラミニン及びその断片（＞１０Ｋｄａ）のアルツハイマー病に対する薬剤としての使用が、提案されている。
【００１８】
Ａβペプチドとニコチン酸アセチルコリンのレセプターとのより具体的な相互作用メカニズムは、ラミニンと同様に、説明されていない。
【００１９】
スミスクライン  ビーチャム（SmithKline Beecham）の特許のＷＯ  ９３／１３７８９は、両端がプロテクトされたオリゴペプチドを含む複雑な化学式の化合物であって、その一般式が、化学結合によって互いに結合された２つのヘキサペプチド又はヘプタペプチドを包含している化合物について説明している。この文献で説明されている化合物の使用は、感染症から体を保護するための造血の刺激、より具体的には骨髄造血のシステムの刺激に関するものであり、前記化合物の作用機構については説明されていない。
【００２０】
米国２００４／２１４１６５は、ミコバクテリアのタンパク質排出システムについて説明している。４個のＨＡＥＤアミノ酸の配列番号６４６は、単に、タンパク質排出プロセスに関与するミコバクテリアのタンパク質の１つの末端部の配列である。しかし、このＨＡＥＤ配列は、米国２００４／２１４１６５においては、個別に単離されたオリゴペプチドの化学式として説明されておらず、ましてさらに有力な理由はなく、治療的に活性なペプチドとして説明されていない。
【００２１】
欧州２  １３０  ５５０では、ＤＥＡＨ配列（ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．３９）は、ヘリカーゼＲＮＡタンパク質、それは単核血球によるサイトカインの製造において活性を有している、のパターンであるとして説明されている。しかし、ＥＰ２  １３０  ５５０では、ＤＥＡＨテトラペプチドは単離された化合物として説明されておらず、まして保護された化合物としては説明されておらず、さらにましてそれ自体が活性を有する化合物としては説明されていない。
【００２２】
ジャーナル・オブ・デイリーサイエンス第９０巻、４９９６‐４９７３、２００７年（J. Dairy Sci. 90:4966-4973 of 2007）のゴメス‐ルイス（Gomez-Ruiz）らの論文には、ＥＤＡＫペプチドと、乳酸杆菌属の酵素又は人工的にチーズに添加された酵素による発酵により起こるミルクプロテインの分解から生じるチーズから入手できる生成物とが説明されている。この論文は、この単離されて精製されたテトラペプチドで、まして保護基によって保護されたテトラペプチドが、すなわちチーズとの混合物外に、単独で取り出される化合物（a compound of interest taken separately）でよいことを開示も示唆もしておらず、まして、そのテトラペプチドがそれ自体活性を有する化合物であってもよいことも開示も示唆もしていない。
【００２３】
米国化学会誌、１９９５年、１１７、５４１９−５４２０５（J. Am. Chem. Soc. 1995, 117, 5419-54205）のチュウ（Chu）らの論文には、テトラペプチドを分光分析によって同定するための方法が説明されている。これらのテトラペプチドは、レセプター、すなわちバンコマイシンと結合している状態として、単に、保護されたテトラペプチドのＮ末端で同定される。ＤＤＡＨテトラペプチドは、単に実験で用いられたペプチドの一つであり、操作（manipulation）の結果を明らかにするために選択されたものである。前記論文には、このＤＤＡＨテトラペプチドの活性については特に記載されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２４】
本発明の目的は、神経変性疾患障害に関する疾患、及び／又は、アミロイドβペプチドの重合又は凝集によるアミロイド斑の形成に関係する疾患を、治療又は抑制する薬剤を決定する又は作製する際に用いることができる新規の化合物を提供することである。
【００２５】
より具体的には、本発明の目的は、アミロイド‐βペプチドとＺｎ（II）イオンとの相互作用を抑制できる新規の化合物を提供することである。実際、アミロイド‐βペプチドの凝集又は重合によるアミロイド斑の形成が、アミロイド‐βペプチドの亜鉛錯体（complexes of zinc with amyloid-β peptide）の形成によって誘発されて、亜鉛が多少この凝集又は重合の補助因子として機能することは、公知である。
【００２６】
より具体的には、本発明の目的は、アミロイド‐β斑の形成を抑制でき、かつ、アルツハイマー病又はアミロイド斑の形成に関係する他の変性疾患の治療又は抑制を可能とする、新規の化合物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２７】
これを実施するために、本発明は、以下の一般式（Ｉ）又は（II）のペプチド化合物を提供する：
Ｒa−Ｒ1−Ｒ2−Ｒ3−Ｒ4−Ｒb（Ｉ）又はＲa−Ｒ4−Ｒ3−Ｒ2−Ｒ1−Ｒb（ＩＩ）
ただし、
−Ｒ1は、アミノ酸Ｈ，Ｒ又はＫ残基；
−Ｒ2は、アミノ酸Ａ残基；
−Ｒ3は、アミノ酸Ｅ又はＤ残基；
−Ｒ4は、アミノ酸Ｅ又はＤ酸基；
−Ｒaは、アミノ酸Ｒ1又はＲ4のＮ末端第１級アミノ基（N-terminal primary amino function）を示しており、遊離している（free）か、それとも保護基（望ましくはアセチル基（Ａｃ））で置換されており、
−Ｒbは、アミノ酸Ｒ1又はＲ4のＣ末端カルボキシル基のヒドロキシル基（the hydroxyl function of the C-terminal carboxyl group）を示しており、遊離している（free）か、それとも保護基（望ましくは、ＮＨ2基、ＮＨＲ基又はＮＲＲ基（ここで、ＲはＣ1−Ｃ4アルキル鎖を示す）、すなわちアミド型のグループに一致し、望ましくはアミド基（ＮＨ2））で置換されている。
【００２８】
本発明に係るペプチド化合物は、単独で単離され及び精製された、好ましくは純度９８％（より好ましくは純度９９％）以上の化合物で、残部はとりわけ他のペプチドで形成されていてもよい、と解される。
【００２９】
知られているように、そして好ましくは、アミノ酸Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4はそれらの自然な異性体Ｌ型で構成されているであろうが、しかし、アミノ酸Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4はＤ型の類似体であってもよい。
【００３０】
より好ましくは、本発明に係るペプチド化合物が、９８％よりも高いＬ型異性体の純度を有し、好ましくは９９％以上のＬ型異性体の純度を有することであろう。
【００３１】
発明者らは、テトラペプチドがアミロイド‐βの１１〜１４領域のＥＶＨＨサイト（ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．２８）と結合することによる異なるアミノ酸を特定し、一方で、イオン的に反対の符号（ionically of opposite sign）、すなわち、Ｒ1は位置１１のアミノ酸Ｅ（グルタミン酸塩（glutamate））と、Ｒ3及びＲ4はそれぞれ位置１３及び１４のアミノ酸Ｈ（ヒスチジン）と、すなわちＺｎ（II）イオンとアミロイド‐βとの結合において電位的に関係するサイト（potentially involved site）のうちの３つと、それぞれ強いイオン結合を形成し得るアミノ酸Ｒ1、Ｒ3及びＲ4と、アミノ酸Ｖと最も強い疎水性効果を形成し得る疎水性アミノ酸Ａ（アラニン）とを特定することによって、これらのテトラペプチドを決定している。
【００３２】
それによって定義されたテトラペプチドは、アミロイド‐βの１１〜１４領域のＥＶＨＨ標的と、平行（式Ｉ）及び逆平行（式II）の非共有結合性相互作用を形成する。ＥＶＨＨ標的領域の４つのアミノ酸のうちの３つが、強い荷電基（charged group）を有しているという事実を考慮して、これら３つのアミノ酸とのイオン相補性（ionic complementarity）を有するアミノ酸が好ましいとされ、その一方で、アミノ酸Ｒ2の選択は、アラニン及びバリンの側鎖間の立体相補性（steric complementarity）と、さらにＶとＡとの疎水性接触、Ｅ及びＨとのイオン結合によるさらなる安定化を考慮することによって行われた。
【００３３】
発明者らは、上記のとおり定義された、３つのＺｎ（II）イオンキレート剤（すなわち、位置１１、１３及び１４のアミノ酸）と結合しているテトラペプチドが、位置６、１１、１３及び１４から選択される（とりわけ、９〜１１、１０〜１２、１１〜１３、１２〜１４、１３〜１５、１４〜１６、１１〜１６、５〜１４及び９〜１４の領域から選択される）１〜４個のＺｎ（II）キレート剤を含んでいる、異なるサイズの関連する標的と比較すると、最適な妥協（an optimal cpmpromise）に相当するということと、さらに、他の定義基準（とりわけ、ペプチドサイズ）に相当する、すなわち、Ｚｎ（II）イオンを結合するためのドメインを有するテトラペプチドをアミロイド‐βペプチド（Ａβ）と結合させることによって、Ｚｎ（II）イオンとアミロイド‐βペプチド（Ａβ）との結合の抑制と、アミロイド‐βペプチドのオリゴマー化の抑制とのための体内での前記化合物の使用の可能性の最適な妥協（an optimal cpmpromise）に相当するということとを、実験的に証明した。
【００３４】
相互作用力は、位置６における結合によって損なわれているようである。逆に、位置６及び１１、又は、位置１３及び１４の２つのサイトだけをカバーしている標的は、Ｚｎ（II）イオンの結合を抑制するのには不十分である。
【００３５】
本発明に係るテトラペプチドの他の利点は、テトラペプチドが強く電荷を帯びており、それによって血液脳関門（blood-brain barrier）を通過する能力が促進されるということである。
【００３６】
本発明に係るペプチド化合物は、それゆえ、特に表１に明示された式Ｉ及びIIの配列Ｒ1-Ｒ2-Ｒ3-Ｒ4及びＲ4-Ｒ3-Ｒ2-Ｒ1を含んでいる。以下、明細書に追加された配列表の配列ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．１〜２４において繰り返される。
【００３７】
【表１】
0005947801.tif 000002
【００３８】
アミロイド‐βペプチドの１〜１６領域の断片に対応するリガンドを有するこれらのテトラペプチドの親和力が、実施例１〜３で解離定数Ｋｄを計算することによって試験された。それらの解離定数は、試験された次の他のペプチド（この定義に入らないテトラペプチド、トリペプチド、ヘキサペプチド又はデカペプチド）の解離定数よりも１０4倍小さかった。
【００３９】
知られているように、前記保護基は、体内の製薬学的用途（pharmaceutical use）に適合する基である。保護基の機能は、ペプチドのアミノ末端及びカルボキシル末端の電荷を中性にすることである。さらに具体的には、Ｎ末端がホルミル基（ＨＣＯ-）又はアセチル基（ＣＨ3ＣＯ-）で保護されていてよく、Ｃ末端が−ＮＨ2基、−ＮＨＲ基、−ＮＲＲ基（ここで、ＲはＣ1−Ｃ4アルキル基）、又はさらに−Ｏ−Ｒ基（ここで、ＲはＣ1−Ｃ4アルキル又はアルキルアミン）で例えば-ＯＣＨ3、−ＯＣＨ2ＣＨ3又は−ＯＣＨ2ＣＨ2ＮＨ2で保護されていてよい。
【００４０】
次のことを念頭においておく：
‐無極性基を有する疎水性アミノ酸は、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、プロリン（Ｐ）及びトリプトファン（Ｗ）である。
‐極性基を有する疎水性アミノ酸は、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）トレオニン（Ｔ）、システイン（Ｃ）、チロシン（Ｙ）、アスパラギン（Ｎ）及びグルタミン（Ｑ）である。
‐中性（酸性）ｐＨで負に帯電している基を有するアミノ酸は、アスパラギン酸（Ｄ）及びグルタミン酸（Ｅ）である。
‐中性（塩基性）ｐＨで正に帯電している基を有するアミノ酸は、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）及びヒスチジン（Ｈ）である。
【００４１】
天然のαアミノ酸は、全てキラルであるので、グリシンを除いて光学的に活性であり、そしてフィッシャー立体配置に準ずるＬ型立体配置又はカーン・インゴルド・プレローグ表記法に準ずるＳ型立体配置である。
【００４２】
３つの重要なタイプの相互作用が、ペプチド間の結合、又は、ペプチド骨格のＣＯ基とＮＨ基との間で水素ブリッジが形成された結果生じるαへリックス又はβ折り畳みシートにおける、ペプチドの二次構造間の結合において起こる。すなわち、：
‐疎水性効果：アミノ酸で、その基が疎水性であるものは、タンパク質を取り囲んでいる水分子に対してよりも、アミノ酸自体に対してより高い親和性を有する。逆に、親水性のアミノ酸は、自身が水と接するように配列する傾向にある。
‐イオン結合：基は、それは正に帯電しているのだが、負に帯電している基とイオン結合を形成する。
‐イオン結合の結果得られる相互作用及び疎水性効果によって得られる相互作用よりも強くない相互作用を有する水素結合
【００４３】
好ましくは、本発明に係るペプチド化合物は、式（Ｉ）又は（II）の化合物から選択されるだろう。これらの式において、Ｒ1-Ｒ2-Ｒ3-Ｒ4又はＲ4-Ｒ3-Ｒ2-Ｒ1は、それぞれ、ＨＡＥＥ，ＥＤＡＲ，ＥＥＡＨ，ＥＥＡＫ，ＥＥＡＲ，ＨＡＤＥ，ＫＡＤＤ，ＫＡＥＥ，ＲＡＤＤ，ＲＡＤＥ，ＲＡＥＥ，ＨＡＤＤ，ＤＤＡＫ，ＫＡＥＤ，ＤＥＡＲ又はＫＡＤＥを表している。これらのペプチドは、配列ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．１，３，４，５，９，１２，１３，１５，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３及び２４と異なる順番に相当する。
【００４４】
上記のテトラペプチドは、アミロイド‐βの１〜１６領域の断片との相互作用の解離定数Ｋｄを有している。その解離定数Ｋｄは、以下の実施例１〜３で計算されたように、試験された他のペプチドよりも低い。
【００４５】
より好ましくは、本発明に係るペプチド化合物が、式中のＲ1-Ｒ2-Ｒ3-Ｒ4又はＲ4-Ｒ3-Ｒ2-Ｒ1が次のテトラペプチド：ＨＡＤＤ，ＤＤＡＫ，ＲＡＤＤ，ＫＡＥＤ，ＤＥＡＲ，ＫＡＤＥ，ＨＡＥＥ及びＲＡＥＥの中の１つを表している、式（Ｉ）又は（II）の化合物の中から選択されることである。それらの化合物は、実施例１〜３で計算されたように、試験された他のペプチドよりもより一層低い解離定数Ｋｄを有している。
【００４６】
より好ましくは、本発明に係るペプチド化合物が、式中のＲ1-Ｒ2-Ｒ3-Ｒ4又はＲ4-Ｒ3-Ｒ2-Ｒ1が２つのテトラペプチドＨＡＥＥ及びＲＡＤＤの１つを表している、式（Ｉ）又は（II）の化合物から選択されることである。
‐Ｒ1はアミノ酸Ｈの残基である。
‐Ｒ2はアミノ酸Ａの残基である。
‐Ｒ3はアミノ酸Ｅの残基である。
‐Ｒ4はアミノ酸Ｅの残基である。
【００４７】
最も好ましいペプチド化合物は、式Ａｃ−ＨＡＥＥ−ＮＨ2及びＡｃ−ＲＡＤＤ−ＮＨ2と一致するものである。
【００４８】
アミロイド‐βの１〜１６領域の断片に対応するリガンドを備えたこれらペプチドの両方の相互作用の解離定数Ｋｄは、実施例１において、試験された全てのペプチドの中で最も低かった。
【００４９】
これらのペプチド化合物は共に、また、Ｚｎ（II）イオンの生理学的濃度下、特に１００〜４００μＭの濃度下で前記アミロイド‐βペプチドと結合することによって、Ｚｎ（II）イオンとアミロイド‐βペプチドとの結合を抑制することと、斑状のアミロイド‐βペプチドの重合又は凝集を抑制することとについて、最も有効な化合物と考えられる。しかし、とりわけ、これらのペプチド化合物は共に、マウスの生体内モデルにおいてアミロイド斑の形成を抑制する特性を有していて、以下の実施例で報告されたように最も有効な化合物である。
【００５０】
本発明の対象（the object of the present invention）は、また、本発明に係るペプチド化合物をアミロイド‐βペプチドと結合させることによってＺｎ（II）イオンがアミロイド‐βペプチドと結合することを低減又は抑制するための、本発明に係るペプチド化合物の使用である。
【００５１】
さらにより詳しくは、本発明の対象は、Ｚｎ（II）イオンの存在下、より詳しくはＺｎ（II）イオンの生理学的濃度、特に１００〜４００μＭで、本発明に係るペプチド化合物をアミロイド‐βペプチドと結合させることによって、アミロイド‐βペプチドの重合及び／又は凝集を低減又は抑制するための、本発明に係るペプチド化合物の使用である。
【００５２】
したがって、本発明は、アミロイド斑の形成に関係する疾患を治療するための、本発明に係るペプチド化合物の使用を提供する。
【００５３】
また、本発明の対象は、本発明に係るペプチド化合物の薬剤として、特に神経変性疾患の治療のための薬剤として、好ましくはアルツハイマー病の治療のための薬剤としての使用である。
【００５４】
また、本発明の対象は、本発明に係る使用において有用な組成物であり、その組成物のための作用物質（active substance）が、本発明に係るペプチド化合物であるＲ1-Ｒ2-Ｒ3-Ｒ4又はＲ4-Ｒ3-Ｒ2-Ｒ1の少なくとも１つの残基を含んでいる、組成物である。
【００５５】
前記作用物質は、生体内で分解可能な結合を介して結合されており、それによって作用モノマーであるテトラペプチドを長時間にわたって放出可能な、配列Ｒ1-Ｒ2-Ｒ3-Ｒ4又はＲ4-Ｒ3-Ｒ2-Ｒ1のいくつかのモノマーからなるマルチマーであってもよい。
【００５６】
知られているように、本発明に係るペプチド化合物は、エステルまたは生理学的に許容される塩の誘導体（physiologically acceptable salt derivatives）の形で調合（formulate）されてもよい。
【００５７】
さらに詳しくは、本発明の対象は、本発明に係る組成物、又は、本発明に係るペプチド化合物のＲ1-Ｒ2-Ｒ3-Ｒ4又はＲ4-Ｒ3-Ｒ2-Ｒ1残基の少なくとも１つ含む作用物質を、生理学的に許容されるキャリアーと共に含む医薬組成物であって、好ましくは非経口的、経皮的又は経粘膜的に投与される医薬組成物である。
【００５８】
さらに詳しくは、本発明に係る医薬組成物は、注入可能、特に血管内、筋肉内、皮下、髄腔内又は脳脊髄に注入可能なように調合（formulate）されるだろう。
【００５９】
本発明に係るペプチド化合物が脳の標的細胞に到達するまで分解に耐え得るように調合されるならば、経口の、バッカルの、経鼻の、直腸の又は局所的な経路での他のやり方の投与が是認されてもよい。
【００６０】
より好ましくは、前記組成物がフリーズドライ状であることであろう。
【００６１】
より詳しくは、本発明に係る組成物において、前記ペプチド化合物の濃度は２０〜２０００μＭである。以下の実施例は、本発明に係るペプチド化合物の効率を、本発明の限定として解釈されるべきでない例示を単に示して、説明及び実証している。
【００６２】
本発明の他の特徴及び利点は、以下の実施例の観点から明らかになるであろう。
【発明を実施するための形態】
【００６３】
図１は、異なる濃度（すなわち、曲線Ａ＝２μＭ、曲線Ｂ＝５μＭ、曲線Ｃ＝１０μＭ、曲線Ｄ＝１５μＭ、曲線Ｅ＝２０μＭ、曲線Ｆ＝２５μＭ及び曲線Ｇ＝０μＭ）において、実施例１の装置を用いてさらに実施例１の手順に従って実験した際の、ペプチドＡｃ−ＨＡＥＥ−ＮＨ2とアミロイド‐βの１〜１６領域に対応するリガンドとの結合を表す動的曲線（kinetic curves）を示す。
【００６４】
図２〜９は、実施例３の装置を用い、実施例３の手順に従って、さらに実施例１のものよりも精製された前記テトラペプチドを用いて実験した際の、配列ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．１，４，５，９，１２，１５，１９及び２３のそれぞれのペプチドの結合を表す動的曲線（knetic curves）を示している。
【００６５】
実施例１及び３において報告されているように、縦軸（ＲＵ＝反応単位（Response unit））における分光計の反応単位の時間に対する変化によって、テトラペプチドとアミロイド‐βペプチドの領域１〜１６の断片との結合の解離定数Ｋｄを計算することができる。
【００６６】
実施例１：テトラペプチドＡｃ−ＨＡＥＥ−ＮＨ2（ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．１９）とアミロイド‐βペプチドの１〜１６領域に対応する固定化ペプチド断片との結合
分析は、テトラペプチドＡｃ−ＨＡＥＥ−ＮＨ2とアミロイド‐βペプチドの１〜１６領域に対応する固定化ペプチド断片との結合の、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分光法によって実施された。
【００６７】
この分析によって、ペプチドの固定化リガンドとの相互作用の解離定数Ｋｄを算出することができ、リガンドとの相互作用によってＫｄの値がより一層小さくなり、それゆえ形成された相互作用錯体（interaction complex）の安定性が高くなると理解される。これらの方法において、もしＫｄが１０-4Ｍ以下であれば、重要で特異的な相互作用（a significant specific interaction）が存在すると考えられる。一方、もしＫｄが１０-3Ｍ以上であれば、重要な結合又は相互作用はないと考えられる。
【００６８】
表面プラズモン共鳴は物理的現象であり、金属層の表面に吸着したレセプター上へのリガンドの結合を測定する方法としての使用で主に知られている。リガンドがレセプターと結合した場合に、ＳＰＲ検出システムは、結合部分近辺の屈折率の変化を測定する。
【００６９】
表面プラズモン共鳴分光法の原理は、永田和宏及び半田宏共著、シュプリンガーフェアラーク東京、２０００（Nagata, K., and Handa, H. (eds), Springer-Verlag, Tokyo, 2000）、に記載されている。
【００７０】
より詳しくは、ＳＰＲ分光法システム、例えばビアコア（BIACORE）のバイオセンサを適用した場合において、チップタイプのセンサ表面へのリガンドの固定化後、ここでの場合はアミロイド‐β断片の固定化後に、検体試料（analyte reagent）が、マイクロ流体チャネルのシステムを介して一定の流速で前記表面に注入される。光源から発光された分極光は、チップの金被覆表面（gold-covered surface）で反射され、それからダイオードリーダーによって検出される。リガンドと検体分子との結合に応じて、反射光の強度が異なる。分光計（ＲＵ＝反応単位（Response unit））の反応の変化により、相互作用の解離定数の計算が可能となる。
【００７１】
バイオセンサのチップは、ＧＥヘルスケア（米国）から入手された。ＳＰＲ分光法の実験は、ビアコア３０００機（BIACORE 3000 apparatus）によって実施された。アミロイド‐βペプチド断片（ＥＤＣ、ＮＨＳ、ＰＤＥＡ及びシステイン）を固定化するための試料は、ＧＥヘルスケア（米国）から入手された。チオール結合の形成によってペプチドリガンドを固定化するために用いられた緩衝液は、１０ｍＭのｐＨ４．５の酢酸ナトリウムであった。再生緩衝液は、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ及び３ｍＭのＥＤＴＡを備えた媒質と、０．００５％の界面活性剤Ｐ２０と、１５０ｍＭのｐＨ７．４のＮａＣｌとを含んでいるＨＢＳ緩衝液であった。固定化緩衝液は、反応性テトラペプチドＡｃ−ＨＡＥＥ−ＮＨ2のためのＺｎ（II）イオンを１００μＭで含む、５０ｍＭのｐＨ７．４のＨＢＳ緩衝液及びｐＨ６．８のＨＥＰＥＳ緩衝液であった。全ての緩衝液は使用前にフィルタ処理された。
【００７２】
リガンドのペプチド断片は、Ａｃ−ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱＫＧＧＧＧＣ−ＮＨ2であり、これは配列ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．２６に相当する。２１個のアミノ酸を備えたこのペプチドは、アミロイド‐βの結合ドメインのＮ末端の１６個のアミノ酸、すなわちＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱＫ（ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．２５）を含んでおり、この１６個のアミノ酸に４個のグリシンアミノ酸と１つのシスティンＣ末端が続いている。システインは、供給者の手順（the procedure of the supplier）に従いチオール結合によってチップ表面上にリガンドを結合させるのに必要である。4個のグリシンアミノ酸は、それゆえチップとリガンドとの間に結合テトラペプチド（「リンカー（linker）」）を形成する。さらに、それによって固定化されたリガンドは、前記表面に対して十分な柔軟性を有し、その結果テトラペプチド試料とリガンドとの相互作用の状態と確かによく似る。供給者であるＧＥヘルスケア（米国）によって供給されたセンサのハンドブックに説明されている条件下で、チオール結合を介する標準的な手順によって、このリガンドはバイオセンサのＣＭ５チップ上に結合される。
【００７３】
全ての工程において適用された流速は５μｌ／ｍｉｎであった。カルボキシメチルデキストランマトリックスは、ｐＨ８．５の０．１Ｍのホウ酸ナトリウムの溶液に、１−エチル−３（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（1−ethyl-3(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide）（ＥＤＣ）とＮ‐ヒドロキシスクシンイミド（N−hydroxysuccinimide）（ＮＨＳ）との1対１の混合物、すなわち４００ｍＭのＥＤＣと１００ｍＮのＮＨＳを３０μｌが注入され、続いて、８０ｍＭのＰＤＥＡ（２−（２−ピリジニルジチオ−エタン−アミン(2−(2−pyridinyldithio)-ethane−amine)）が注入さることによって、活性化された。０．０５ｍｇ／ｍｌの酢酸ナトリウム緩衝液における溶液中のペプチドリガンドが、それから注入された。対照液体サンプル（control liquid sample）に対して約７００任意単位の反応単位（ＲＵ）の変化を示す表面を提供するために、ＣＭ５チップの表面で反応しなかったチオール基は、ｐＨ４の０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液における５０ｍＭのシステイン溶液で除去された。同じ手順に従って、対照液体をチップの表面と反応させた。
【００７４】
試料Ａｃ−ＨＡＥＥ−ＮＨ2は、７つの濃度、すなわち０、２、５、１０、１５、２０及び２５μＭに希釈されることによって調製され、そしてマルチチャネルモード（２０μＬ  クイックインジェクト、５μＬ／ｍｉｎ）で注入された。その結合を追跡するために、チップの表面は試料緩衝液に３３０秒間曝された。チップの表面は、再生緩衝液（２０μＬ）を注入することによって、それから再生された。対照レーンのデータは、固定化試料ペプチド（immobilized reagent peptides）に対応するレーンの生データから差し引かれた。次に、解離定数Ｋｄが、ＢＩＡ評価４．１プログラムにおいて濃度（Ｍ）に対して平衡（Req）での反応に設定された曲線から、公知の方法を用いて計算された。異なる濃度の７つの試料サンプルは、それゆえ、リガンドがチップの表面に固定された状態でチャネルに注入された。
【００７５】
対照の反応が差し引かれた後の、Ａｃ−ＨＡＥＥ−ＮＨ2の固定化ペプチドとの動的結合曲線が、図１に報告されている。
【００７６】
図１の曲線は、相互作用の解離定数の計算の可能性を付与し、前記解離定数は２．２×１０-8Ｍと評価された。
【００７７】
Ｚｎ（II）イオンの生理学的濃度（１００〜４００μＭ）での存在において、解離定数は実質的には変化しなかった。しかし、高濃度（１０ｍＭ）のＺｎ（II）イオンは、リガンドと試料との相互作用を抑制した。もし、Ｚｎ（II）イオンとＡβペプチドとの結合がマイクロモーラー（μＭ）のＫｄによって特徴づけられると考えられるならば、Ａβペプチド上への結合について試料Ａｃ−ＨＡＥＥ−ＮＨ2がＺｎ（II）イオンと競合すると推測される。しかし、Ａβペプチドに対する試料の親和性は、Ａβペプチドに対するＺｎ（II）イオンの親和性よりも大きく、その結果、ペプチドＡｃ−ＨＡＥＥ−ＮＨ2は、生理学的濃度でのＺｎ（II）イオンのペプチドＡβとの結合を抑制する。
【００７８】
より詳しくは、Ａβアミロイドに対し、Ａｃ−ＨＡＥＥ−ＮＨ2試料の親和性は、Ｚｎ（II）イオンの親和性よりも大きい。
【００７９】
実験によって、マイクロモーラーレベル（５００μＭ未満）でのＺｎ（II）イオンの生理学的濃度下では、ＨＡＥＥとアミロイド‐βの１〜１６断片との結合は、Ｚｎ（II）イオンの存在の有無によっては変化しないことが証明された。一方、より高濃度の、１ミリモーラー（ｍＭ）オーダーのＺｎ（II）イオンは、ＨＡＥＥとＡβの１〜１６ドメインとの相互作用を抑制する。これらのデータは、Ｚｎ（II）イオンが生理学的濃度である場合は、ＨＡＥＥが、標的ドメインに対してＺｎ（II）イオンよりも大きい親和性を有しており、そして、Ｚｎ（II）イオンとＡβとの相互作用を阻止することができる、ということを示している。
【００８０】
実施例２：比較例
アミロイド‐βの１〜１６領域に対応する標的ペプチドリガンドとの結合の実験は、実施例１で説明した手順に従って実施された。
【００８１】
１‐  上記の表１に列挙された２３個の他のテトラペプチドの全ては、同じ保護基Ｒa＝Ａｃ及びＲb＝ＮＨ2を備えている配列ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．１〜１８及び２０〜２４に対応しており、試験された。それらのテトラペプチドの解離定数Ｋｄは、１０-5〜１０-6Ｍであった。これらの解離定数は、亜鉛の１００〜４００μＭの生理学的濃度下では、実質的には変化しなかった。本発明に係るテトラペプチドで、最も低い解離定数Ｋｄを有しているもの（ＨＡＥＥを除く）は、ＥＤＡＲ，ＥＥＡＨ，ＥＥＡＫ，ＥＥＡＲ，ＨＡＤＥ，ＫＡＤＤ，ＫＡＥＥ，ＲＡＤＤ，ＲＡＤＥ，ＲＡＥＥ，ＨＡＤＤ，ＤＤＡＫ，ＫＡＥＤ，ＤＥＡＲ及びＫＡＤＥであった。
【００８２】
これらの値は、アミロイド‐βペプチドの１〜１６領域の標的リガンドとの強い結合に相当する。
【００８３】
２‐  １０個の異なるテトラペプチドの他の比較例は、表１のテトラペプチドに類似するものの、１つのアミノ酸がアラニン（Ａ）によって置換されており、すなわち次のテトラペプチド：ＡＡＥＥ，ＨＡＥＡ，ＨＡＡＥ，ＡＡＤＤ，ＨＡＡＤ，ＨＡＤＡ，ＡＡＤＥ，ＲＡＤＡ，ＲＡＡＥ及びＫＡＡＥである。これらのテトラペプチドは、それぞれ、配列ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．２９〜３８に対応しており、標的リガンドとの非特異性の又は重要でない相互作用に相当する非常に大きい解離定数、すなわち１０-3〜１０-4ＭのＫｄを有していた。
【００８４】
ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．２９はＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．２３から得られ、ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．２３において第１アミノ酸ＲがＡで置換されている。
【００８５】
ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．３０はＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．１９から得られ、ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．１９において最終アミノ酸ＥがＡで置換されている。
【００８６】
ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．３１はＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．１９から得られ、ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．１９において第３アミノ酸ＥがＡで置換されている。
【００８７】
ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．３２はＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．５から得られ、ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．５において第１アミノ酸ＲがＡで置換されている。
【００８８】
ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．３３はＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．７から得られ、ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．７において第３アミノ酸ＥがＡで置換されている。
【００８９】
ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．３４はＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．１から得られ、ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．１において最終アミノ酸ＤがＡで置換されている。
【００９０】
ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．３５はＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．１３から得られ、ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．１３において第１アミノ酸ＨがＡで置換されている。
【００９１】
ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．３６はＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．５から得られ、ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．５において最終アミノ酸ＤがＡで置換されている。
【００９２】
ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．３７はＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．２３から得られ、ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．２３において第３アミノ酸ＥがＡで置換されている。
【００９３】
ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．３８はＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．２１から得られ、ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．２１において第３アミノ酸ＥがＡで置換されている。
【００９４】
３‐  ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．１９（ＨＡＥＥ）のテトラペプチドに対応する１０個の異なるトリペプチドが試験された。その試験において、次の配列ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．５９〜６８：ＡＥＥ，ＨＡＥ，ＳＨＡ，ＧＨＡ，ＥＥＱ，ＡＨＡ，ＩＡＨ，ＦＳＨ，ＥＳＤ，ＩＳＨに対応する１、２又は３個のアミノ酸が除去された。トリペプチドＡＥＥは、前述の相補性の基準によれば１２〜１４領域の相補的トリペプチドに対応するといえるだろう。これらのトリペプチドは、Ａβペプチドの領域９〜１１、１０〜１２、１１〜１３、１２〜１４、１３〜１５及び１４〜１６に相補的であった。
【００９５】
これらの１０個の異なるトリペプチドも、１０-3〜１０-4Ｍの解離定数を有しており、これは標的との重要な又は特異的な相互作用の欠如を反映している。
【００９６】
４‐  さらに、１０個の異なるヘキサペプチド、それらは２つのアミノ酸がＮ末端又はＣ末端に加えられた、本発明に係る好ましいテトラペプチドＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．１９（ＨＡＥＥ）を含んでいるのだが、が試験された。すなわち、それらのヘキサペプチドは次のヘキサペプチドであった：ＨＡＥＥＳＤ，ＨＡＥＥＡＤ，ＨＡＥＥＳＥ，ＨＡＥＥＧＥ，ＨＡＥＥＱＥ，ＬＡＨＡＥＥ，ＩＡＨＡＥＥ，ＦＳＨＡＥＥ，ＬＧＨＡＥＥ，ＩＳＨＡＥＥ。これらのヘキサペプチドは、Ａβペプチドの１１〜１６及び９〜１４の領域に対して相補的であった。
【００９７】
これらの１０個のヘキサペプチドは、配列ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．３９〜４８における配列のリストで繰り返されており、１０-3〜１０-4Ｍの比較的高い解離定数Ｋｄを有していた。これは、アミロイド‐βの１〜１６領域のリガンドとの重要な又は特異的な相互作用の欠如を反映している。
【００９８】
これらの１０個のヘキサペプチドは全て、前述のイオン相互作用又は疎水性相互作用に従って、２個の付加的アミノ酸が、Ｎ末端伸長のためにアミロイド‐βのアミノ酸１５〜１６（ＱＫ）と相互作用し、及び、アミロイド‐βの領域９〜１０（ＧＹ）のアミノ酸ＧＹと相互作用するだろう配列に対応していた。
【００９９】
５‐  最後に、次の配列ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．４９〜５８における配列のリストから選択された１０個のデカペプチドが試験された：ＨＳＬＡＨＡＥＥＳＤ，ＫＮＩＡＨＡＥＥＡＤ，ＲＮＦＳＨＡＥＥＳＥ，ＫＱＬＧＨＡＥＥＧＥ，ＲＱＩＳＨＡＥＥＱＥ，ＤＤＨＳＬＡＨＡＥＥ，ＥＥＫＮＩＡＨＡＥＥ，ＥＥＲＮＦＳＨＡＥＥ，ＤＥＫＱＬＧＨＡＥＥ，ＤＥＲＱＩＳＨＡＥＥ。これらのデカペプチドは、１０-3〜１０-4Ｍの解離定数Ｋｄを有しており、これは標的との重要な又は特異的な相互作用の欠如を反映している。
【０１００】
これらのデカペプチドも、本発明に係る好ましいテトラペプチドであるＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．１９（ＨＡＥＥ）を取り込んでおり、ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．４９〜５３のＮ末端に２個の付加的アミノ酸及びＣ末端に４個の付加的アミノ酸を備えており、ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．５４〜５８に６個の付加的アミノ酸を備えている。デカペプチドＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．４９〜５８は、全て、ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．４９〜５３についてはアミロイド‐βの７〜１０及び１５〜１６領域のアミノ酸と相互作用し得ると考えられ、ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．５４〜５８についてはアミロイド‐βの５〜１０領域のアミノ酸と相互作用し得ると考えられている付加的アミノ酸を含んでおり、Ａβペプチドの５〜１４領域を標的としていた。
【０１０１】
試験された上記セクション１〜５の全てのペプチドは、Ｎ末端アミノ基の保護基であるＲa＝Ａｃと、Ｃ末端カルボキシル基のヒドロキシル基の保護基であるＲb＝ＮＨ2を含んでいた。
【０１０２】
実施例３：本発明に係るテトラペプチドと、アミロイド‐βペプチドの１〜１６領域に対応する固定化ペプチド断片との結合
実施例１で説明された結合試験が、以下の重要な相違点を除いて、同じ材料、反応及び手順を用いて再現された：
‐適用されたビアコア機（BIACORE apparatus）は、ビアコアＴ１００機（BIACORE T100 apparatus）であった。このビアコアＴ１００機は、検出器に検体を注入する際のガス抜きシステムを含んでいることと、ＣＭ５チップ上の固定化リガンド／検体の分子間複合体（immobilized ligand/analyte intermolecular complexes）の検出方法がより正確であることとにより、ビアコア３０００よりも正確な結果を生じさせる。
‐使用された本発明に係るテトラペプチドは、ＨＰＬＣデータによりＬ異性体が９９％以上となるまで精製されて、合成の際に、Ｄ異性体が形成されないように抑制された、及び／又は、除去された。実施例１では、テトラペプチドは９８％のＬ異性体を含んでいるだけであった。
‐本発明に係るテトラペプチドの適用された濃度は、５０、１００、２００、５００、１，０００、１，５００及び２，０００μＭであった。
‐これらの実験は、亜鉛無しで実施された。
‐ＣＭ５チップの表面は、対照液体サンプル（control liquid sample）に対して約１，０２３任意単位の反応単位（ＲＵ）の変化を示す表面を提供した。
【０１０３】
図２〜９の動的曲線によれば、先の出願（特に、参考文献［３９］参照）で説明されている方法に従って、解離定数Ｋｄを計算できる。すなわち、前記曲線によってｋon及びｋoff定数を次の式で計算できる：
ｄＲ／ｄｔ＝ｋonＣ（Ｒｍａｘ−Ｒ）−ｋoffＲ
ここで、
‐Ｒは、縦軸における反応を示し、
‐Ｃは、検体の濃度を示し、
‐Ｒｍａｘは、Ｒの理論上の最大値を示し、
解離定数Ｋｄは式Ｋｄ＝ｋoff／ｋonによって求められる。
【０１０４】
表２に、配列ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．１，４，５，９，１２，１５，１９及び２３のテトラペプチドについて計算された解離定数Ｋｄの値、それらは最小値であるが、が示されている。
【０１０５】
【表２】
0005947801.tif 000003
【０１０６】
この場合、配列ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．５及び１９を含む検体が、最も低い解離定数Ｋｄを有し、その値は１０-4〜１０-5Ｍの間に含まれていた。
【０１０７】
配列ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．１、４、９、１２、１５及び２３の他の６個のテトラペプチドは、１０-3〜１０-2Ｍの間に含まれるＫｄ値を示した。
【０１０８】
このモデルに係る他のテトラペプチドは、１０-2Ｍよりも大きい解離定数Ｋｄを示した。
【０１０９】
実施例４：重合又は凝集によるアミロイド‐β斑の形成の阻害
アミロイド斑の形成におけるＡβペプチドの凝集現象は、クオリティ・コントロールド・バイオケミカルズ社・米国（QUALITY CONTROLLED BIOCHEMICALS Inc. USA）の「シンタロイド  スクリーニング  プレート（SYNTHALOID SCREENING PLATE）（登録商標）」キットを用いることによって体外で（in vitro）実証されて、Ａβペプチドの結晶化中心で被覆された斑と、凝集を検出するために蛍光マーカーでマークされたＡβペプチドを利用している（３７、３８）。
【０１１０】
完全なβペプチド（complete β peptide）１〜４０が用いられた。それらは、ｐＨ７．４、ＢＳＡ０．１％及びＦＣＳ１０％の５０ｍＭのＨＥＰＥＳ媒質を含む緩衝液において蛍光マーカーによってマークされた。この緩衝液は、もともと、生理学的濃度のＺｎ（II）イオンと、プロテアーゼの阻害剤とを含んでいた。前記プレートは、９６ウェルを含むプレートであり、そのウェルの中に、１００μＬの濃度１００ｎＭのマークされたＡβペプチド（１〜４０）が注がれた。それらは、インキュベートのために、ウェルにおいて室温で３時間放置された。
【０１１１】
Ａβペプチドの凝集現象についての本発明に係るテトラペプチドの効果を調べるために、あるウェルにおいて、本発明に係るテトラペプチドＡＣ−ＨＡＥＥ−ＮＨ2及びＡｃ−ＲＡＤＤ−ＮＨ2が、ウェルに応じて異なる濃度で導入された（０，５，１０，２０，４０，８０，１００及び１５０μＭ）。
【０１１２】
これを実施するために、インキュベーションの終わりに、上記の緩衝液を用いることによって、ウェル中の未結合のタンパク質が３回の洗浄によって除去された。凝集体の形で結合されたタンパク質で、ウェルに結合されたものの量は、蛍光強度を測定することによって測定された。
【０１１３】
本発明に係るテトラペプチドＨＡＥＥ及びＲＡＤＤは、実際に、抑制濃度ＩＣ50が２０μＭで、Ａβペプチドの凝集を阻害する。なお、濃度ＩＣ50とは、ウェルに導入されたＡβペプチドの５０％の凝集が抑制されるであろう濃度を表している。
【０１１４】
「シンタロイド  スクリーニング  プレート（SYNTHALOID SCREENING PLATE）（登録商標）」のキットの使用者マニュアルに記載されている試験に従い、もしある化合物のＩＣ50濃度が１００μＭよりも低ければ、その化合物が固体支持体上へのタンパク質の結合を阻害すると考えられる。
【０１１５】
長年の研究によって、濃度２０，４０，８０，１００及び１５０μＭのＨＡＥＥ及びＲＡＤＤテトラペプチドと共に行われるアミロイド凝集体の１時間以上の長時間のインキュベーションは、さらに、アミロイド凝集体の不可逆の解離を引き起こすことが証明されている。
【０１１６】
書誌参照
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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