(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程：
(a)多能性幹細胞を浮遊培養して網膜前駆体細胞に分化誘導する工程；
(b)前記工程(a)で得られた網膜前駆体細胞を浮遊培養して網膜神経節細胞に分化誘導する工程；および
(c) 前記工程(b)で得られた網膜神経節細胞を接着培養して軸索を伸長させる工程;
を含む、軸索が伸長した網膜神経節細胞の作製方法。
【請求項２】
多能性幹細胞が、人工多能性幹細胞（iPS細胞）または胚性幹細胞（ES細胞）である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
接着培養を、神経栄養因子を含む培地で行う、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
接着培養を、細胞と同じ高さの培地中で行う、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の方法であって、多能性幹細胞がヒト多能性幹細胞である方法により得られた、軸索流が認められる軸索が伸長したヒト網膜神経節細胞の培養物。 
【請求項６】
請求項５に記載のヒト網膜神経節細胞の培養物を含む細胞製剤。
【請求項７】
請求項５に記載のヒト網膜神経節細胞の培養物を含む細胞シート。
【請求項８】
請求項５に記載のヒト網膜神経節細胞の培養物に被験物質を接触させ、該網膜神経節細胞に対する該被験物質の保護または再生効果を評価することを特徴とする、網膜神経保護薬または網膜神経再生薬のスクリーニング方法。
【請求項９】
網膜神経節細胞を障害する眼疾患の治療に用いるための請求項６に記載の細胞製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、網膜神経節細胞の作製方法、より詳細には、軸索が伸長した網膜神経節細胞を多能性幹細胞から分化誘導し、作製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、緑内障は先進国における主要な失明原因の一つとして挙げられており、２００２年のＷＨＯの統計では、ＷＨＯの基準による失明患者は、全世界で３７００万人であり、そのうち１２％の４５０万人が緑内障による失明とされている。日本においても視覚障害者の約２０％が緑内障によるもので、失明原因の一位を占めている。しかも、４０歳以上の日本人の緑内障有病率は約５％であるという調査結果があり、また緑内障の有病率は、年齢とともに増加していくことが知られていることから、高齢化社会を迎える今後、ますます患者数が増加していくことが予想される。緑内障の病態は視神経乳頭陥凹に伴う網膜神経節細胞の細胞死であるので、その治療には網膜神経節細胞を保護することに焦点が絞られている。網膜神経節細胞の保護のためにとられる手段としてはまず眼圧の下降であり、点眼薬による眼圧下降が緑内障治療のための第一の選択となっている。しかしながら、点眼薬は眼圧下降にある程度の成果はあげているものの、眼圧下降だけでは緑内障の進行を十分に止めることができない例も多く認められ、また、点眼薬はあくまで進行を予防するにとどまり、根本的な治療を達成できるものでもない。【０００３】
従って、網膜神経節細胞そのものを作製し、死滅した網膜神経節細胞を補充することによって緑内障などの網膜神経節細胞の細胞死による眼疾患を根本的に治療する細胞補充療法の確立が急務である。このような細胞補充療法を含む再生医療技術分野において、幹細胞技術の進歩により、マウスやヒトのES細胞やiPS細胞から網膜や水晶体等の眼の組織や細胞を誘導することが可能となっており、将来的にはこれらの誘導された眼の組織や細胞の移植により従来有効な治療法がなかった緑内障をはじめとする眼疾患の治療が可能となることが期待されている。【０００４】
これまでに多能性幹細胞から網膜組織を分化誘導する方法について幾つかの試みがある。例えば、非特許文献１には、ヒトES細胞を三次元培養することによって網膜全層を再生することに成功したことが報告されている。本文献では、ヒトES細胞から誘導開始30日後に網膜神経節細胞が誘導され、網膜神経節細胞のマーカーであるBrn3bの免疫染色によって網膜内層に網膜神経節細胞が同定されたこと、さらに培養を100日間以上継続すると、網膜視細胞までもが誘導されてくることが確認できたことが記載されている。しかしながら、本文献に記載の方法では網膜全層の再生には成功しているものの、網膜神経節細胞に連なる軸索の伸長には至っていない。また、非特許文献２には、iPS細胞の三次元培養と二次元培養を繰り返し行って、眼胞様構造を作り出した後、それを浮遊状態で三次元培養を継続することで、網膜を構成する各細胞成分になる網膜前駆細胞を誘導する方法が記載されている。しかしながら、この方法では網膜の層構造は形成できておらず、また網膜を構成する各細胞成分の誘導率は低く、網膜神経節細胞についても軸索の伸長には至っていない。さらに、特許文献１には、多能性幹細胞から浮遊培養により分化誘導した網膜組織に含まれる網膜前駆細胞にNotchシグナル経路阻害物質を作用させることよって網膜層特異的神経細胞の製造方法が記載されているが、製造された網膜組織に確認された細胞には神経節細胞は一部含まれているもののその大半は視細胞であった。【０００５】
再生医療を行う際、考慮しなければいけないことは、まずその細胞の完全性である。網膜神経節細胞に特異的なマーカーに対する免疫染色が陽性であったり、そのマーカー遺伝子の発現が認められても、軸索の伸長がなければ治療に応用できる可能性が低い。よって、これまでに知られている方法では、臨床上応用できる軸索が伸長して整った網膜神経線維層を再生するには至っていない。また、誘導率や誘導までの日数においても実用上満足できるものではない。【０００６】
一方、緑内障に代表される網膜視神経障害の治療剤の開発において、遺伝性高眼圧緑内障マウス（DBA/2Jマウス）、薬剤誘発障害マウス、種々の遺伝子ノックアウト・変異導入マウスなどの疾患モデル動物が確立されている。しかしながら、これらの疾患モデル動物は、飼育や管理に手間がかかること、ヒト細胞とは異なる点も多く、薬物などの治療効果の判定は確実とはいえないなどの問題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第2013/077425号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Nakano T, Ando S, Takata N, Kawada M, Muguruma K, Sekiguchi K, Saito K, Yonemura S, Eiraku M, Sasai Y, Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell 10, 771-785 (2012)
【非特許文献２】Meyer, J.S. et al. Optic vesicle-like structures derived from human pluripotent stem cells facilitate a customized approach to retinal disease treatment. Stem cells 29, 1206-1218, (2011).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、多能性幹細胞から臨床応用可能な形態の網膜神経節細胞を分化誘導する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、多能性幹細胞から浮遊培養より分化誘導した細胞塊を、血清濃度と神経分化誘導因子を調整しつつ浮遊培養を継続して神経前駆体細胞への分化誘導を促進した後、接着培養に移行させること、浮遊培養および接着培養の培養条件（培地成分や濃度）を適正化することにより、分化誘導開始から短期間(ヒト幹細胞の場合40日間）で、かつ高い誘導率(約90％以上)で、実際の臨床にも応用可能な形態である、長さ１〜２ｃｍに及ぶ長い軸索が伸長した網膜神経節細胞を取得することに成功した。また、この網膜神経節細胞をレシピエント網膜に移植したところ、網膜内に生着し、その中に軸索の伸長が観察された。さらに、この網膜神経節細胞には、網膜神経節細胞または軸索に固有のマーカー分子がすべて発現していること、当該軸索が各種ニューロフィラメント、Tau等を含む特徴的な構造体を有し、軸索流（順行性、逆行性）、電気生理反応（活動電位および活動電流）の機能を有することも確認され、網膜視神経障害の治療剤のスクリーニング系のツールとして十分に機能し活用できるという知見を得た。本発明はかかる知見により完成されたものである。【００１１】
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）以下の工程：
(a)多能性幹細胞を浮遊培養して網膜前駆体細胞に分化誘導する工程；
(b)前記工程(a)で得られた網膜前駆体細胞を浮遊培養して網膜神経節細胞に分化誘導する工程；および
(c) 前記工程(b)で得られた網膜神経節細胞を接着培養して軸索を伸長させる工程;
を含む、軸索が伸長した網膜神経節細胞の作製方法。
（２）多能性幹細胞が、人工多能性幹細胞（iPS細胞）または胚性幹細胞（ES細胞）である、（１）に記載の方法。
（３）接着培養を、神経栄養因子を含む培地で行う、（１）または（２）に記載の方法。
（４）接着培養を、細胞と同じ高さの培地中で行う、（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）（１）〜（４）のいずれかに記載の方法により得られた、軸索が伸長した網膜神経節細胞の培養物。
（６）（５）に記載の網膜神経節細胞の培養物を含む細胞製剤。
（７）（５）に記載の網膜神経節細胞の培養物を含む細胞シート。
（８）（５）に記載の網膜神経節細胞の培養物に被験物質を接触させ、網膜神経節細胞に対する該被験物質の保護または再生効果を評価することを特徴とする、網膜神経保護薬または網膜神経再生薬のスクリーニング方法。
（９）（５）に記載の網膜神経節細胞の培養物の治療上有効量を哺乳動物に投与することを含む、網膜神経節細胞を障害する眼疾患の治療方法。
（１０）網膜神経節細胞を障害する眼疾患が、緑内障性疾患、先天性視神経萎縮、視神経低形成、虚血性障害、または網膜疾患から選ばれる、（９）に記載の治療方法。
（１１）網膜神経節細胞を障害する眼疾患の治療における使用のための、（５）に記載の網膜神経節細胞の培養物。
(１２) 網膜神経節細胞を障害する眼疾患が、緑内障性疾患、先天性視神経萎縮、視神経低形成、虚血性障害、または網膜疾患から選ばれる、（１１）に記載の培養物。
（１３）網膜神経節細胞を障害する眼疾患の治療用細胞製剤を製造するための、（５）に記載の網膜神経節細胞の培養物の使用。
（１４) 網膜神経節細胞を障害する眼疾患が、緑内障性疾患、先天性視神経萎縮、視神経低形成、虚血性障害、または網膜疾患から選ばれる、（１３）に記載の使用。【００１２】
本願は、２０１４年８月８日に出願された日本国特許出願２０１４−１６２３７０号、および２０１４年１１月１２日に出願された日本国特許出願２０１４−２３０１５７号の優先権を主張するものであり、該特許出願の明細書に記載される内容を包含する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の方法によれば、実際の臨床にも応用可能な形態である、軸索が伸長した網膜神経節細胞を多能性幹細胞から短期間に高効率で、しかも外部から遺伝子を挿入することなく簡便に作製できる。本発明の方法により作製された網膜神経節細胞は、網膜神経の損傷部位へ移植する細胞補充療法に用いることができる。また、当該網膜神経節細胞を用いた細胞補充療法は、現在ヒトヘの応用が開始されている網膜色素上皮細胞や、今後期待される視細胞を用いた細胞補充療法と比較し、網膜神経節細胞が網膜内層に存在し、硝子体腔のすぐ傍にあるため、細胞の供給が容易でかつ網膜剥離等のリスクもなく有利である。また、当該網膜神経節細胞を用いることにより、緑内障治療薬等の薬剤（例えば、網膜神経細胞死を遅らせる「網膜神経保護薬」または網膜神経可塑性または再生を促す「網膜神経再生薬」）のスクリーニングをin vitroで簡便かつ迅速に行うことができるので、実験動物の飼育や病理標本の作製、免疫染色などを行う実験動物を用いる薬剤スクリーニングに伴う時間・労力・費用が大幅に削減できる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ヒトiPS(hiPS)細胞から網膜神経節細胞を分化誘導する方法の模式図および分化誘導開始後の各時点（6、18、24、30日目）における胚様体の位相差顕微鏡写真を示す（スケールバー500μm)。
【図２】ヒトiPS(hiPS)細胞から分化誘導した胚様体(分化誘導開始後24日目）の抗Rx抗体による免疫染色像を示す。
【図３】ヒトiPS(hiPS)細胞から分化誘導した胚様体（分化誘導開始後40日目、接着培養開始後13日目）の実体顕微鏡(100倍)写真を示す。
【図４】ヒトiPS(hiPS)細胞から分化誘導した胚様体（分化誘導開始後40日目、接着培養開始後13日目）の抗Brn3b抗体による免疫染色像を示す。
【図５】ヒトiPS細胞から分化誘導した胚様体の網膜分化関連マーカー遺伝子（Brn3b、Rx、Pax6）の発現量の経時変化を示す。
【図６】マウスES(mES)細胞から分化誘導した胚様体（分化誘導開始後18日目、接着培養開始後5日目）の実体顕微鏡(100倍)写真を示す。
【図７】マウスES(mES)細胞から分化誘導した胚様体（分化誘導開始後18日目、接着培養開始後5日目）の抗Brn3b抗体による免疫染色像を示す。
【図８】マウスES細胞から分化誘導した胚様体の網膜分化関連マーカー遺伝子（Brn3b、Rx、Pax6）の発現量の経時変化を示す。
【図９】本発明の方法によりヒトiPS細胞から作製された網膜神経節細胞に対する神経抑制因子(Sema3A)の徐放試験の結果を示す。
【図１０】図１０Ａは、ヒトiPS細胞から分化誘導開始後の6日目(D6)、18日目(D18)、24日目(D24)、34日目(D34)における網膜形成に関与する転写因子(Rx、Six3、Pax6、Chx10、Math5、Brn3b、Crx、Syntaxin、Calbindin、PKCα、Mitf）のRT-PCRによる発現解析結果を示す（エラーバー：３回の独立した試験の平均±SD、縦軸：片対数目盛)。mRNA発現量はHPRT1の発現量に対して補正し、分化誘導開始後0日目のmRNA発現量を1とする相対量で表す。図１０Ｂは、ヒトiPS細胞から分化誘導開始後24日目(D24)および34日目（D34)の胚様体(EB)上の眼胞(OV）におけるRx、Pax6、Math5、Brn3b、およびCrxの免疫染色像を示す（スケールバー：100μm）。
【図１１】図１１Ａおよび図１１Ｂは、胚様体(EB)から突き出した眼胞(OV）に対応する細胞クランプの外側辺縁部から放射した軸索のHE染色像を示す（図１１Ａ：水平面、図１１Ｂ:垂直面、スケールバー：80μm）。図１１Ｃは、図１１Ｂのｃの部分に対応する網膜神経節細胞の細胞体の電子顕微鏡写真を示す（矢印：粗面小胞体、三角矢印：軸索投射、スケールバー：5μm）。図１１Ｄは、図１１Ｂのｄの部分に対応する網膜神経節細胞の軸索の電子顕微鏡写真を示す（スケールバー：5μm）。
【図１２】図１２Ａは、ヒトiPS細胞から分化誘導開始後34日目の胚様体における網膜神経節細胞特異的マーカー（Brn3b、Math5、Islet1、Sncg、Tuj1)のRT-PCRによる発現解析結果を示す（エラーバー：３回の独立した試験の平均±SD。縦軸：片対数目盛）。mRNA発現量はHPRT1の発現量に対して補正し、分化誘導開始後0日目のmRNA発現量を1とする相対量で表す。図１２Ｂは、ヒトiPS細胞から分化誘導開始後34日目の胚様体における網膜神経節細胞特異的マーカー（Brn3b、Math5、Islet1、Sncg、Tuj1)の免疫染色像を示す（スケールバー：100μm）。
【図１３】図１３Ａは、ヒトiPS細胞から分化誘導開始後34日目の胚様体の３つの領域（RGCR：網膜神経節細胞領域、OVR：眼胞領域、MBEB：胚様体主要体）の電子顕微鏡写真を示す（スケールバー：100μm）。図１３Ｂは、上記の網膜神経節細胞の３つの領域（RGCR：網膜神経節細胞領域、OVR：眼胞領域、MBEB：胚様体主要体）における網膜神経マーカー（Brn3b、Islet1、Chx10、Crx)のRT-PCRによる発現解析結果を示す（エラーバー：３回の独立した試験の平均±SD。縦軸：片対数目盛)。mRNA発現量はHPRT1の発現量に対して補正し、誘導開始後0日目のmRNA発現量を1とする相対量で表す。
【図１４】図１４Ａは、ヒトiPS細胞から分化誘導開始後34日目(D34)および50日目(D50)の胚様体におけるニューロフィラメントマーカー（Tau、NFL、NFM、NFH)のRT-PCRによる発現解析結果を示す。mRNA発現量はHPRT1の発現量に対して補正し、分化誘導開始後34日目のNFHのmRNA発現量を1とする相対量で表す。図１４Ｂは、ヒトiPS細胞から分化誘導開始後34日目(D34)の胚様体におけるニューロフィラメントマーカー（Tau、NFL/NFM、NFH)の免疫染色像を示す（スケールバー：100μm）。
【図１５】図１５は、ヒトiPS細胞から分化誘導開始後34日目の胚様体（GFP（対照）、NTRK1、ミトコンドリア特異的蛋白をエレクトロポレーションにて細胞体に導入し、コレラトキシンをマイクロピペットでコロニー辺縁の細胞体が主に分布する領域に注入。）の順行性軸索流の観察結果を示す。
【図１６】図１６は、ヒトiPS細胞から分化誘導した網膜神経節細胞の電気生理学的分析結果を示す。図１６Ａは、ルシファーイエローCH染色した網膜神経節細胞の顕微鏡写真を示す（三角矢印：樹状プロセス、矢印：軸索プロセス）。図１６Ｂは、網膜神経節細胞の活動電位記録（全細胞記録：whole-cell recording)を示す。図１６Ｃは、網膜神経節細胞の活動電流記録を示す（上のパネル：活動電流、真ん中のパネル：テトロドトキシンによる減弱、下のパネル:洗浄による回復、スケールバー：30μm）。
【図１７】図１７Ａは、緑内障の細胞モデルの実体顕微鏡像およびアポトーシス染色像を示す。図１７Ｂは、緑内障の細胞モデルにおけるアポトーシス関連マーカー（Bax、Caspase3)のRT-PCRによる発現解析結果を示す。
【図１８】図１８は、緑内障の細胞モデルに対する神経栄養因子(BDNF、CNTF)の効果を、アポトーシス関連マーカー（Bax、Caspase8、Bcl2)のRT-PCRによる発現解析により評価した結果を示す。
【図１９】図１９Ａは、無虹彩症・視神経形成不全疾患の細胞モデルの実体顕微鏡像を示す(c.774+1G>T変異：無虹彩症(Pax6変異）疾患iPS細胞より分化誘導した細胞、Q227X：無虹彩症(Pax6変異）疾患iPS細胞より分化誘導した細胞、コントロール：正常iPS細胞より分化誘導した細胞）。図１９Ｂは、無虹彩症・視神経形成不全疾患の細胞モデルにおける網膜神経節細胞形成遺伝子（Brn3b、Math5)のRT-PCRによる発現解析結果を示す(c.774+1G>T変異：無虹彩症(Pax6変異）疾患iPS細胞より分化誘導した細胞、Q227X：無虹彩症(Pax6変異）疾患iPS細胞より分化誘導した細胞、コントロール：正常iPS細胞より分化誘導した細胞）。
【図２０】図２０Ａは、無虹彩症（c.774＋1G>T変異）疾患の細胞モデルに対する神経栄養因子(BDNF、CNTF)の効果（軸索の成長促進）を顕微鏡観察により評価した結果を示す。図２０Ｂは、無虹彩症（c.774＋1G>T変異）疾患の細胞モデルに対する神経栄養因子(BDNF、CNTF)の効果を、網膜神経節細胞形成の転写因子（Brn3b、Math5、Islet1、Tuj1）および網膜神経線維の構造遺伝子（Tau、NFL）のRT-PCRによる発現解析により評価した結果を示す。
【図２１】図２１Ａは、ヒトiPS細胞から作製した網膜神経節細胞（正常細胞モデル）に対する神経栄養因子(BDNF、CNTF)の効果（軸索の成長促進）を顕微鏡観察により評価した結果を示す。図２１Ｂは、ヒトiPS細胞から作製した網膜神経節細胞（正常細胞モデル）に対する神経栄養因子(BDNF、CNTF)の効果を、網膜神経節細胞特異的マーカー（Brn3b）のRT-PCRによる発現解析により評価した結果を示す。
【図２２】図２２Ａは、ヒトiPS細胞から作製した網膜神経節細胞（正常細胞モデル）に対する神経抑制因子(Sema3A)の効果（軸索の成長抑制）を顕微鏡観察により評価した結果を示す。図２２Ｂは、ヒトiPS細胞から作製した網膜神経節細胞（正常細胞モデル）に対する神経抑制因子(Sema3A)の効果を、網膜神経節細胞特異的マーカー（Brn3b）のRT-PCRによる発現解析により評価した結果を示す。
【図２３】図２３は、本発明の方法により作製した網膜神経節細胞のマウス眼内への移植試験結果を示す。
【図２４】図２４Ａは、ヒトES(hES)細胞から分化誘導した胚様体（分化誘導開始後30日目、接着培養開始後3日目）の実体顕微鏡(40倍)写真を示す。図２４Ｂは、ヒトES(hES)細胞から分化誘導開始後24日目と34日目（接着培養開始後7日目)の胚様体における網膜分化に関与する転写因子(Rx、Pax6、Chx10、Brn3b）のRT-PCRによる発現解析結果を示す。mRNA発現量はHPRT1の発現量に対して補正し、分化誘導開始後0日目のmRNA発現量を1とする相対量で表す。
【図２５】図２５Ａは、マウスiPS(miPS)細胞から分化誘導した胚様体（分化誘導開始後22日目、接着培養開始後8日目）の実体顕微鏡(40倍)写真を示す。図２５Ｂは、マウスiPS(miPS)細胞)細胞から分化誘導開始14日目（接着培養開始時）の胚様体における網膜分化に関与する転写因子(Rx、Pax6、Chx10、Math5、Brn3a、Brn3b）のRT-PCRによる発現解析結果を示す。mRNA発現量はHPRT1の発現量に対して補正し、分化誘導開始後0日目のmRNA発現量を1とする相対量で表す。
【図２６】図２６は、マウスES(mES)細胞またはマウスiPS(miPS)細胞から分化誘導した網膜神経節細胞の順行性軸索流の観察結果を示す（コレラトキシンを眼胞の中央部に投与後10分、30分）。
【図２７】図２７は、ルシファーイエローCH染色した網膜神経節細胞（マウスES(mES)細胞またはマウスiPS(miPS)細胞から分化誘導）の顕微鏡写真（三角矢印：樹状プロセス、矢印：軸索プロセス）及び活動電位記録（全細胞記録：whole-cell recording)を示す。
【図２８】図２８は、ヒトiPS(hiPS)細胞から分化誘導した網膜神経節細胞の順行性軸索流の観察結果を示す（コレラトキシンを眼胞の中央部に投与後10分、1時間、2時間）。
【図２９】図２９は、ヒトES(hES)細胞から分化誘導した網膜神経節細胞の順行性軸索流の観察結果を示す（コレラトキシンを眼胞の中央部に投与後10分、1時間、2時間）。
【図３０】図３０は、ヒトES細胞から分化誘導した網膜神経節細胞の電気生理学的分析結果を示す。図３０Ａは、パッチクランプの電極を刺した細胞の電子顕微鏡写真を示す。図３０Ｂは、電気生理反応検出後にプロシオンイエロー染色した網膜神経節細胞の顕微鏡写真を示す。図３０Ｃは、網膜神経節細胞の活動電位記録（全細胞記録：whole-cell recording)を示す。図３０Ｄは、網膜神経節細胞の活動電流記録を示す（上のパネル：活動電流、真ん中のパネル：テトロドトキシンによる減弱、下のパネル:洗浄による回復）。
【図３１−１】ヒトiPS細胞から網膜神経節細胞を分化誘導する条件の比較検討結果を示す（Ａ．接着培養への移行日(18日目、27日目、35日目）、Ｂ．接着培養の培地量（250μl、400μl)、Ｃ．接着時の胚様体からの眼胞の切り出しの有無）。
【図３１−２】ヒトiPS(hiPS)細胞から網膜神経節細胞を分化誘導する条件の比較検討結果を示す（Ｄ．神経栄養因子(BDNF）の添加(+、-）、Ｅ．レチノイン酸（RA)の添加(+、-）、Ｆ．浮遊培養時の酸素濃度）。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下に、本発明について詳細に述べる。
１．軸索が伸長した網膜神経節細胞の作製方法
本発明は、軸索が伸長した網膜神経節細胞の作製方法であって、該方法は、(a)多能性幹細胞を浮遊培養して網膜前駆体細胞に分化誘導する工程、(b)前記工程(a)で得られた網膜前駆体細胞を浮遊培養して網膜神経節細胞に分化誘導する工程、および、(c) 前記工程(b)で得られた網膜神経節細胞を接着培養して軸索を伸長させる工程を含む。
【００１６】
本発明において「多能性幹細胞」とは、外胚葉、中胚葉および内胚葉に由来する生体に存在するすべての細胞に分化する能力（多分化能）を有し、かつ、増殖能をも併せもつ幹細胞をいう。本発明において使用する多能性幹細胞には、人工多能性幹細胞（Induced Pluripotent Stem cell；iPS細胞）、胚性幹細胞（ES細胞)、体性幹細胞(組織特異性幹細胞）、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹細胞(ntES細胞）、精子幹細胞（GS細胞）、胚性生殖細胞（EG細胞）、成人型多能性幹細胞（MAPC細胞）などが含まれるが、iPS細胞、ES細胞が好ましい。
【００１７】
本発明において使用する「多能性幹細胞」は、哺乳動物由来であることが好ましい。哺乳動物としては、例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ウシなどが挙げられる。
【００１８】
本発明において「人工多能性幹細胞」（iPS細胞)とは、特定の再プログラミング（初期化）因子を、DNA又はタンパク質の形態で皮膚細胞等の体細胞に導入することによって作製することができる、胚性幹細胞（ES細胞)と同様の多分化能と自己複製による増殖能を有する体細胞由来の人工の幹細胞をいう。
【００１９】
iPS細胞は、Yamanakaらによってマウス線維芽細胞にOCT3/4、SOX2、KLF4、及びC-MYC の４つの因子を導入することにより初めて樹立され（K. Takahashi and S. Yamanaka (2006) Cell, 126:663-676）、その後、同様の４つの因子をヒト繊維芽細胞に導入することにより、ヒトiPS細胞も樹立された（K. Takahashi et al. (2007), Cell, 131:861-872）。また、４つの因子のうち、C-MYCを含まない方法（M. Nakagawa et al., (2008) Nat. Biotechnol. 26:101-106)、４つの因子の一部を他の因子に変更する方法、４つの因子に他の因子を追加する方法などでもiPS細胞も樹立に成功している（J. Yu et al. (2007), Science, 318:1917-1920等）。
【００２０】
これらの再プログラミング（初期化）因子は、タンパク質の形態で、例えばリポフェクション、細胞膜透過性ペプチドとの結合、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入してもよく、あるいは、DNAの形態で、例えば、ウイルス、プラスミド、人工染色体などのベクター、リポフェクション、リポソームを利用する手法、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入してもよい。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスベクターなどが挙げられる。人工染色体ベクターとしては、例えばヒト人工染色体(HAC)、酵母人工染色体(YAC)、細菌人工染色体(BAC、PAC)ベクターなどが挙げられる。プラスミドとしては、哺乳動物細胞用プラスミドが使用でき、ベクターには、初期化因子が発現可能なように、プロモーター、エンハンサー、リボゾーム結合配列、ターミネーター、ポリアデニル化サイトなどの制御配列を含むことができる。また、必要に応じて、薬剤耐性遺伝子(例えばカナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子など）、チミジンキナーゼ遺伝子、ジフテリアトキシン遺伝子などの選択マーカー配列、緑色蛍光タンパク質(GFP)、βグルクロニダーゼ(GUS)、FLAGなどのレポーター遺伝子配列などを含むことができる。また、上記ベクターには、体細胞への導入後、再プログラミング因子をコードする遺伝子、またはプロモーターと結合する再プログラミング因子をコードする遺伝子、を共に切除するために、それらの遺伝子の各末端にLoxP配列を有してもよい。
【００２１】
本発明において使用する「iPS細胞」は、由来、導入する初期化因子、導入方法などは特に限定されず、本発明の目的を損なわない限りにおいて、公知の方法で作製されるiPS細胞のすべてを含むが、由来はヒト由来が好ましく、当該iPS細胞から分化誘導された網膜神経節細胞を必要とする患者由来がより好ましい。
【００２２】
本発明において使用する「iPS細胞」は、上記の当分野で実施されている公知の方法で作製してもよいが、理研バイオリソースセンター(RIKEN BRC)などの公的機関から入手することも可能である。
【００２３】
本発明において「胚性幹細胞」（ES細胞という)とは、ヒトやマウスなどの哺乳動物の初期胚（例えば胚盤胞）の内部細胞塊から樹立された、多能性と自己複製による増殖能を有する幹細胞をいう。
【００２４】
ES細胞もまた、前述の哺乳動物由来のものであることが好ましいが、入手の容易性からマウス由来のES細胞が好ましく、ヒトの治療には、ヒト由来のES細胞が好ましい。
【００２５】
ES細胞は公的機関より提供され、または市販されているES細胞株を使用することができる。マウス由来ES細胞としては、C57/BL6細胞、EB3細胞、E14細胞、D3細胞、CCE細胞、R1細胞、129SV細胞、J1細胞、RF8細胞等が挙げられ、理研バイオリソースセンター(RIKEN BRC)、ATCC(American Type Culture Collection)、大日本住友製薬株式会社（大阪、日本）等から入手可能である。ヒトES細胞については京都大学再生医科学研究所付属幹細胞医学研究センター、WiCell Research Institute（マディソン、米国）等から入手可能である。
【００２６】
本明細書において「胚様体」（Embryoid Body: EB）とは、多能性幹細胞を培養することにより形成される細胞の集合体（細胞塊）をいい、網膜前駆体細胞を含む細胞塊、網膜神経節細胞を含む細胞塊、軸索が伸長した網膜神経節細胞を含む細胞塊のすべての状態の細胞塊を指すものとする。
【００２７】
本発明の方法によって多能性幹細胞より作製される「軸索が伸長した網膜神経節細胞」は、軸索の伸長と、その特異的マーカーであるBrn3bにより特徴づけられる。網膜神経節細胞は、網膜を構成する細胞の一つで、生体内の網膜では、視細胞、水平細胞、双極細胞、アマクリン細胞、神経節細胞、ミュラー細胞の順で外側から内側に層状に並んでいる。また、本明細書にいう「軸索が伸長した」とは、網膜神経節細胞の細胞体から1本の長い軸索が伸長するとともに、それぞれの細胞から伸長した軸索が同方向に伴行している形態をいう。
【００２８】
本発明の方法によって多能性幹細胞より作製される「軸索が伸長した網膜神経節細胞」は、それを含む培養物として提供される。この培養物に含まれる細胞塊の「軸索が伸長した網膜神経節細胞」の割合は、80％以上が好ましく、85％以上がより好ましく、90％以上がさらに好ましく、95％以上が最も好ましい。
【００２９】
以下、本発明の網膜神経節細胞の作製方法を具体的に説明する。
工程(a)：
工程(a)では多能性幹細胞を浮遊培養して網膜前駆体細胞に分化誘導する。多能性幹細胞として使用するiPS細胞やES細胞を維持する場合は、MEF（マウス胎児線維)、SNL、SNLP等のフィーダー細胞上で、適当な培地（市販のiPS細胞用培地や、ES細胞用培地等）を用いればよい。
【００３０】
工程(a)で得られる「網膜前駆体細胞」は、視細胞、水平細胞、双極細胞、アマクリン細胞、神経節細胞のいずれかの成熟な網膜細胞に分化しうる前駆体細胞をいう。
【００３１】
工程(a)で行なわれる「浮遊培養」とは、培養器に対して非接着性の条件下で行う三次元培養をいい、凝集浮遊培養が好ましい。凝集浮遊培養では、多能性幹細胞の細胞塊を形成し、この細胞塊から目的細胞への分化誘導を起こすことができる。凝集浮遊培養は、無血清凝集浮遊培養法（SFEB：Serum-free Floating culture of Embryoid Bodies-like aggregates; Watanabe K., Sasai Y., et.al. (2005) Nature Neuroscience 8(3) 288-296.)、胚様体培養法（Keller et al., (1995) Curr. Opin. Cell Biol. 7, 862-869）、これらの改変法により行うことができ、SFEB法のような、血清を含まない培地での胚様体の培養が好ましい。
【００３２】
浮遊培養で用いられる培養器は、特に限定されないが、例えば、フラスコ、ディッシュ、マイクロプレート、チャンバー、チューブ、ローラーボトルが挙げられる。浮遊培養で使用するこれらの培養器は、細胞非接着性であることが好ましい。よって、培養器は、疎水性の材質を用いるか、表面に細胞の吸着を阻止するためのコーティング剤（例えば、ポリヒドロキシエチルメタクリレート共重合体等）で被覆することが好ましい。
【００３３】
浮遊培養の培養温度、CO2濃度等の培養条件は、使用する幹細胞の種類によって適宜設定できる。培養温度は例えば約30〜40℃、好ましくは約37℃であり、CO2濃度は、例えば約1〜10％、好ましくは約5％である。
【００３４】
浮遊培養は、使用する多能性幹細胞の種類により異なるが、ヒト由来の場合は、基本的には上記のSFEB法をRhoキナーゼ阻害剤の培地に添加することにより改良したSFEBq（Serum-free Floating culture of Embryoid Bodies-like aggregates with quick)法に従って行うことができる。
【００３５】
工程(a）の培養日数は、使用する多能性幹細胞の種類により異なるが、培養開始日を分化誘導開始0日として培養日数をカウントした場合、ヒト多能性幹細胞の場合は分化誘導開始後18日目まで、マウス多能性幹細胞の場合は分化誘導開始後7日目まで行う。これらの培養日数はあくまで例示であり、上記の日数を基準として1〜3日以内の範囲で変更できる。
【００３６】
より具体的には、ヒト多能性幹細胞の場合は、多能性幹細胞の凝集塊を無血清培地（培地１）で形成させた後、その細胞凝集塊を、基底膜標品を含む無血清培地（培地２）で培養し、さらに基底膜標品を含む血清培地（培地３）で培養する。培養開始日を分化誘導開始0日として培養日数をカウントした場合、培地１での培養は、分化誘導開始後１〜2日目まで、培地２での培養は分化誘導開始後2〜12日目まで、培地３での培養は、分化誘導開始後12日目〜18日目まで行う。なお、各培地における培養日数も適宜変更してもよい。また、マウス多能性幹細胞の場合、基底膜標品を含む無血清培地（培地２）でのみ分化誘導開始後７日目まで行う。
【００３７】
本発明において、工程(a）で使用する上記培地１、２、３を「網膜分化培地」という。工程(a)の「網膜分化培地(RDM培地）」は、動物細胞の培養に用いられる培地を基本培地として調製することができる。基本培地としては、細胞の生存に必要な成分（無機塩、アミノ酸、グルコース、ビタミンなど）を含み、当業者公知の基本培地であれば特に限定はされない。そのような基本培地としては、例えば、Dulbecco's Modified Eagle's Medium (D-MEM)培地、Dulbecco's Modified Eagle's Medium:Nutient Mixture F-12(D-MEM/F-12) 培地、Glasgow MEM（G-MEM)培地、Basal Medium Eagle (BME)培地、Minimum Essential Medium(MEM)培地、Eagle's minimal essential medium(EMEM)培地、Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)培地、RPMI 1640培地、Medium 199培地、αMEM培地、ハム培地、Fischer培地、およびこれらの混合培地などが挙げられる。
【００３８】
また、培地１、２の「無血清培地」とは、上記の基本培地に無調整又は未精製の動物血清を含まない培地をいう。「無血清培地」は、血清代替物を含んでいてもよい。そのような「血清代替物」としては、KSR(Knockout serum replacement）、コラーゲン前駆体、アルブミン、トランスフェリン、インスリン、プロゲステロン、プトレスシン、微量元素(セレン酸ナトリウム等）、およびこれらの混合物が挙げられ、神経系細胞の培養に汎用されている、KnockOut Serum ReplacementTM（KSR, Invitrogen社製）、N2サプリメントTM（Gibco社製等）、B27サプリメントTM（Gibco社製等）、Chemically-defined Lipid concentrated（Gibco社製）等が好適に用いられる。
【００３９】
上記培地２、３に使用する「基底膜標品」とは、その上に基底膜形成能を有する所定の細胞を播種・培養した場合に、細胞の形態、分化、増殖、運動、機能発現などを制御する機能を有する基底膜成分を含む標品をいう。基底膜標品としては、基底膜成分として公知のラミニン、IV型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチンなどの細胞外マトリックス分子を含む市販品（例えば、BD Bioscience社の「マトリゲルTM」）を用いることができる。培地中の基底膜標品の濃度としては、例えばマトリゲルを用いる場合には、約0.1〜5%が好ましく、約0.5〜2%がより好ましい。
【００４０】
培地３の「血清培地」とは、上記の基本培地に動物血清を含む培地をいい、例えば牛血清、牛胎児血清、ウマ血清、ヒト血清等など哺乳動物の血清などを使用することができる。培地中の血清濃度については、約0.1〜10%が好ましく、約1〜10%がより好ましく、約1〜5%がさらに好ましい。
【００４１】
工程(a)の網膜分化培地における多能性幹細胞の濃度は、多能性幹細胞の均一な凝集体(細胞塊)が形成される限り、特に限定はされないが、例えば96ウェルマイクロプレートを用いてヒト多能性幹細胞を浮遊培養する場合、1ウェルあたり約1×10３〜3×10４細胞が好ましく、約5×10３〜約2×10４細胞がより好ましく、約9×10３細胞がさらに好ましい。
【００４２】
また、上記の基本培地には、細胞の分化誘導、増殖、維持に必要な成分を添加してもよい、そのような成分としては、例えば、非必須アミノ酸（グリシン、セリン、グルタミン等）、グルタミン代替品（GlutaMAXTM等）、ピルビン酸、増殖因子(FGF、PDGF、TGF-β、EGF等）などのサイトカイン、還元剤（２−メルカプトエタノール、3'-チオールグリセロール等）、抗生物質（ストレプトマイシン、ペニシリン等）、ビタミン類（アスコルビン酸、ｄ−ビオチン等）、緩衝剤(HEPES等）、抗酸化剤を含有できる。
【００４３】
工程(a)の分化誘導に好適な成分としては、KSR等の血清代替物、非必須アミノ酸、2-メルカプトエタノール、ピルビン酸ナトリウム等が挙げられる。従って、培地1として、市販のKSRを適量添加した無血清培地（G-MEM又はD-MEM、0.1mM 2−メルカプトエタノール、0.1mM非必須アミノ酸Mix、1mMピルビン酸ナトリウム）を使用することが好ましい。無血清培地におけるKSRの濃度は、例えばヒトiPS細胞を使用する場合は、約1〜20％が好ましく、約10〜20％がより好ましい。
【００４４】
多能性幹細胞がヒト由来の場合、培地１に、分散による細胞死抑制作用を有するROCK(Rho-associated Coiled-coil forming Kinase)阻害剤を添加する。ROCK阻害剤（Rhoキナーゼ阻害剤）としては、例えば、［(R)-(＋)- トランス-N-(4-ピリジル)-4-(1-アミノエチル)-シクロヘキサンカルボキサミド二塩酸塩］（Y-27632)、1-(5-イソキノリンスルホニル）ホモピペラジン二塩酸塩（Fasudil；HA-1077）などが知られている(K. Watanabe et al., Nat. Biotech., 25:681-686 (2007))。なかでもY-27632が好ましく、市販品（例えば、和光純薬工業社製）を用いることができる。培地中のROCK阻害剤の濃度は、幹細胞の細胞死を抑制して生存率を向上させることできる限り特に限定はされないが、約1μM〜50μMが好ましく、約5μM〜30μMがより好ましい。
【００４５】
また、多能性幹細胞がヒト由来の場合、培地１にWntシグナル阻害剤を添加する。Wntシグナル阻害剤は、Wntにより媒介されるシグナル伝達を抑制し得るものである限り特に限定されず、例えば、IWR-1-endo（IWR-1e）、IWP-2、Dkk1、Cerberus蛋白、Wnt受容体阻害剤、可溶型Wnt受容体、Wnt抗体などが挙げられる。培地中のWntシグナル阻害剤の濃度は、多能性幹細胞の胚様体が形成することが可能であれば特に限定はされないが、例えばIWR-1e等の通常のWntシグナル阻害剤の場合は、約0.1μM 〜100μMが好ましく、約1μM〜10μMがより好ましい。
【００４６】
培地２は、培地１に基底膜標品を添加したものでもよく、新たな無血清培地に基底膜標品を添加したものでもよい。なお、ROCK阻害剤は、培地１での培養完了時に除去することが好ましい。
【００４７】
培地３は、前記の無血清培地（G-MEM又はD-MEM、0.1mM 2−メルカプトエタノール、0.1mM非必須アミノ酸Mix、1mMピルビン酸ナトリウム）に血清を添加した新たな培地が好ましい。
【００４８】
多能性幹細胞がヒト由来の場合、培地３には、網膜前駆体細胞(Rx陽性)の生成促進のために、Shh（ソニックヘッジホッグ）シグナル活性剤と、Wntシグナル活性剤を添加する。
【００４９】
Shhシグナル活性剤としては、Shhにより媒介されるシグナル伝達を増強し得るものである限り特に限定されない。Shhシグナル活性剤としては、例えば、ヘッジホッグ（Hedgehog）ファミリーに属するタンパク質（例えば、Shh）、Shh受容体、Shh受容体アゴニスト、Purmorphamine、SAGなどが挙げられる。培地中のShhシグナル活性化剤の濃度は、例えばSAGの場合、約0.1nM〜10μMが好ましく、約10 nM〜1μMがより好ましい。
【００５０】
Wntシグナル活性剤としては、代表的には、GSK3β阻害剤として知られているものが相当し、例えば、インジルビン誘導体であるBIO（GSK-3βインヒビターIX；6-ブロモインジルビン3'-オキシム）、マレイミド誘導体であるSB216763（3-(2,4-ジクロロフェニル)-4-(1-メチル-1H-インドール-3-イル)-1H-ピロール-2,5-ジオン）、フェニルαブロモメチルケトン化合物であるGSK-3βインヒビターVII（4-ジブロモアセトフェノン）、CHIR99021、6-［（2-｛［4-（2,4-ジクロロフェニル）-5-（4-メチルイミダゾール-2-イル）ピリミジン-2-イル］アミノ｝エチル）アミノ］ピリジン-3-カルボニトリル（WO1999/65897）、および、細胞膜透過型のリン酸化ペプチドであるL803-mts（GSK-3βペプチドインヒビター；Myr-N-GKEAPPAPPQSpP-NH2)などが挙げられる。培地中のWntシグナル活性剤の濃度は、例えばCHIR99021の場合、約0.1μM〜100μMが好ましく、約1μM〜30μMがより好ましい。
【００５１】
Shhシグナル活性剤及びWntシグナル活性化剤は、培地３での培養開始と同時に添加してもよく、培地３での培養開始後２〜３日後に添加してもよい。
【００５２】
工程(a)により多能性幹細胞から網膜前駆体細胞に分化誘導されたことの確認は、網膜前駆体細胞に特異的に発現するマーカーにより行うことができる。網膜前駆体細胞のマーカーとしてはRx、Pax6、Chx10、Six3が挙げられ、これらのマーカーの1種または２種以上を組み合わせて確認すればよい。マーカーの発現の確認は、マーカータンパク質の免疫染色や、RT-PCR法によるマーカー遺伝子の発現量の測定によって行うことができる。
【００５３】
工程(b)：
工程(b)では、工程(a)で得られた網膜前駆体細胞をさらに浮遊培養して網膜神経節細胞に分化誘導する。本工程により、網膜前駆体細胞を網膜神経節細胞に成熟させることができる。工程(b)では、前記工程(a)で得られた網膜前駆体細胞を無血清培地（無血清網膜成熟培地）で浮遊培養をした後、血清培地（血清網膜成熟培地）でさらに培養する。本発明において、工程(b）で使用する上記の無血清網膜成熟培地および血清網膜成熟培地を「網膜成熟培地(RMM培地）」という。工程(b）の浮遊培養の培養日数は、使用する多能性幹細胞の種類により異なる。ヒト多能性幹細胞の場合は、無血清網膜成熟培地での培養は、分化誘導開始後18日目〜24日目まで、血清網膜成熟培地における培養は、分化誘導開始後24日目〜26日目まで行う。マウス多能性幹細胞の場合は、無血清網膜成熟培地での培養は、分化誘導開始後7日目〜10日目まで、血清網膜成熟培地における培養は、分化誘導開始後10日目〜13日目まで行う。これらの培養日数はあくまで例示であり、上記の日数を基準として1〜3日以内の範囲で変更できる。
【００５４】
「網膜成熟培地」は、前述の基本培地を使用することができるが、本工程の基本培地はD-MEM/F-12が好ましい。無血清網膜成熟培地には、血清代替物を添加してもよく、前述の血清代替物を用いることができるが、N2サプリメントが好ましい。また、血清網膜成熟培地における血清濃度は、約0.1〜1%が好ましく、約0.5〜1%がより好ましい。血清網膜成熟培地には、神経分化誘導因子として、レチノイン酸等を添加する。
【００５５】
工程(b）の浮遊培養で用いられる培養器、浮遊培養の培養温度、CO2濃度等の培養条件は、工程(a）と同じである。また、工程(b)の浮遊培養において、高酸素濃度（40％）では、視細胞や色素上皮に分化しやすいため、O2濃度は通常大気酸素濃度（約20％）であることが好ましい。
【００５６】
工程(b)により網膜前駆体細胞から網膜神経節細胞に分化誘導されたことの確認は、網膜神経節細胞に特異的に発現するマーカーであるBrn3b、Math5、Sncg、Islet1、Tuj1等の発現、好ましくはBrn3bの発現の確認により行うことができる。マーカーの発現の確認は、マーカータンパク質の免疫染色や、RT-PCR法によるマーカー遺伝子の発現量の測定によって行うことができる。
【００５７】
工程(c)：
工程(c)では、工程(b)で得られた網膜神経節細胞を接着培養に移行させ、さらに培養する。本工程により、軸索が伸長した網膜神経節細胞を形成できる。工程(b)から工程(c)に移行する際に、網膜神経節細胞を含む細胞塊は眼胞様組織を形成しているが、切り出しを行うことなく、細胞塊をそのまま接着培養に供することができる。ここで、眼胞様組織を切り出して接着培養させると分化が不良となることから、細胞塊は眼胞様組織を切り出さずに接着培養させることが好ましい。本発明において、工程(c)で使用する培地は「神経維持培地」という。接着培養への移行時期は、ヒト多能性幹細胞の場合は、分化誘導開始後26日目〜30日目、好ましくは26日目〜28日目、マウス多能性幹細胞の場合は、分化誘導開始後12日目〜14日目であるが、これはあくまで例示であって、1日〜3日は前後してもよい。この接着培養への移行時期は重要であって、上記の時期より前又は後であると、軸索が伸長した網膜神経節細胞の割合が低下する。培養日数は、ヒト多能性幹細胞の場合、分化誘導開始後26日目〜40日目まで行い、マウス多能性幹細胞の場合、分化誘導開始後12日目〜20日目まで行う。培養日数および培養終了時もあくまで例示であって、適宜変更できる。
【００５８】
接着培養に使用する容器は、細胞が付着し、伸展および増殖できるように、その表面を、ゼラチン、ラミニン、コラーゲン、ポリ−Ｄ−リジン、ポリオルニチン、フィブロネクチン、ビトロネクチンで被覆されていてもよい。
【００５９】
「神経維持培地」は、前述の基本培地を用いることができるが、本工程の基本培地はD-MEM/F-12が好ましい。「神経維持培地」は、血清培地であり、培地中の血清濃度については、約1〜10%が好ましく、約5〜10%がより好ましい。血清濃度は、この範囲で段階的に上げていってもよく、一定であってもよい。また「神経維持培地」には軸索伸長を促進する神経栄養因子を添加することができる。神経栄養因子としては、例えば、BDNF、Neurotrophin-3、-4、などが挙げられるが、BDNFが好ましい。また、その他の増殖因子（例えば、FGF等）や添加物(N2サプリメント）を含有してもよい。ただし、神経維持培地には、レチノイン酸の添加を続けると軸索が伸長しても一定時間経過すると阻害されるのでレチノイン酸を含まないことが好ましい。
【００６０】
工程(c）の接着培養は、培地量が細胞塊の高さを超える量では細胞塊の接着が阻害されやすいため、培養器への確実な接着による軸索の伸長の達成と、細胞塊の表面の乾燥による損傷防止の観点から、培地量は、培養器に接着させた細胞塊と同じ高さであることが好ましい。その他の培養条件は、通常の細胞培養で用いられる条件、例えば、培養温度は約30〜40℃、好ましくは約37℃であり、CO2濃度は、約1〜10％、好ましくは約5％である。
【００６１】
工程(c）において、軸索が伸長した網膜神経節細胞は、光学顕微鏡や実体顕微鏡により確認することができる。また、同時に網膜神経節細胞のマーカーであるBrn3b、Math5、Sncg、Islet1、Tuj1等の発現、好ましくはBrn3bの発現の確認を行ってもよい。網膜神経節細胞に最も固有なBrn3bとMath5は胚様体最表層にみられるので、この最表層を分離することにより、網膜神経節細胞を純粋に取り出すこともできる。
【００６２】
２．再生医療への利用
本発明の方法によって作製された軸索が伸長した網膜神経節細胞は、網膜神経節細胞を障害する眼疾患を治療するための再生医療材料、例えば、細胞製剤または細胞シートとして用いることができる。
【００６３】
ここで、網膜神経節細胞を障害する眼疾患には、例えば、緑内障性疾患、先天性視神経萎縮、視神経低形成、虚血性障害、網膜疾患等などが含まれ、具体的には、緑内障(緑内障性視野狭窄、緑内障性視神経萎縮)、常染色体優性視神経萎縮、レーベル遺伝性視神経症（レーベル病）、特発性視神経炎、無虹彩症に伴う視神経形成不全、視神経脊髄炎（脱髄）、多発性硬化症（脱髄）、虚血性視神経症、網膜中心動脈閉塞症、網膜動脈分枝閉塞症、網膜中心静脈閉塞症、網膜静脈分枝閉塞症、外傷または薬物による視神経障害、糖尿病性視神経症、未熟児網膜症、網膜剥離等が挙げられるが、これらに限定はされない。
【００６４】
本発明の細胞製剤は、上記の方法で作製された網膜神経節細胞の培養物を含んでいればよく、必要より患部への接触を促進または補助するための物質を含むこともできる。例えば、そのような物質としては、マトリゲルTM等の細胞外マトリックス、コラーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、カドヘリン、インテグリン、セレクチン、RGDペプチドに代表される細胞接着ペプチドを挙げることができる。本発明の細胞製剤は、例えば注射剤や注入剤などの剤形に製剤化し、網膜内に局所投与する方法などにより投与できる。
【００６５】
また、本発明の方法で作製された網膜神経節細胞を重層して細胞シートを作製することができる。本発明の方法で作製された網膜神経節細胞は、単に網膜神経節細胞が集まった細胞塊ではなく、軸索が伸長した網膜神経節細胞により形成された細胞層を有し、細胞間相互作用が保持されているので、網膜神経節細胞の培養物のまま、直接患部に移植することができる。
【００６６】
また、前記工程(c)の接着培養においては、培養表面上に細胞を剥離・回収を容易にする被覆層を備えた培養器を用いることによって効率的に細胞シートを作製することができる。培養器に備えた被覆層上に細胞を播種して培養を行うことにより、被覆層の表面に細胞シートが形成される。その後、被覆層の性質（温度応答性、酵素分解性）に基づき培養表面と細胞シートの間を離間させ、細胞シートを培養器から容易に剥離・回収することができる。このような被覆層としては、被覆層そのものが分解又は消滅可能なものを挙げることができ、例えば、温度反応性ポリマー（ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（PIPAA)等）、コラーゲンゲル等を挙げることができる。
【００６７】
３．網膜神経保護薬または網膜神経再生薬のスクリーニングへの利用
本発明の方法で作製された網膜神経節細胞は、例えば網膜神経保護薬または網膜神経再生薬のスクリーニングに利用できる。スクリーニングには、上記の方法で作製された網膜神経節細胞（正常細胞モデル）を用いることができるが、網膜神経疾患や損傷を再現した網膜神経節細胞（視神経疾患細胞モデル）を用いることもできる。視神経疾患細胞モデルの作製は、例えば、非遺伝性疾患細胞モデルの場合、iPS細胞またはES細胞より作製した上記の正常細胞モデルをストレス条件（例えば、加圧、低酸素、伸展、起炎物質）下において網膜神経に障害を与えることにより作製できる。例えば、加圧条件下で作製した網膜神経節細胞は緑内障の細胞モデル、低酸素条件で作製した網膜神経節細胞は虚血視神経症の細胞モデル、伸展条件下で作製した網膜神経節細胞は外傷の細胞モデルとして用いることができる。また、遺伝性疾患細胞モデルの場合は、遺伝性視神経疾患の患者から樹立したiPS細胞や正常iPS細胞を人工的に遺伝子改変することによって疾患の再現を行ったiPS細胞(疾患特異的iPS細胞）から本発明の方法で網膜神経節細胞を分化誘導することにより作製できる。ここで、遺伝性視神経疾患としては、例えば、Pax6遺伝子変異（Pax6 ナンセンス変異）による先天性無虹彩症にともなう視神経形成不全、OPA1遺伝子変異（c.2708delTTAG高頻度変異）による常染色体優性視神経萎縮、ミトコンドリア遺伝子変異（G117788A高頻度変異）によるレーベル遺伝性視神経症（レーベル病）等が挙げられる。これらの細胞モデルに被験物質を接触させ、網膜神経節細胞に対する該被験物質の保護または再生効果を評価することに行うことができる。被験物質が網膜神経節細胞に対する保護または再生作用を有するか否かの判定は、例えば、網膜神経節細胞と被験物質を接触させ、一定時間経過後の細胞の生死、軸索の伸長の促進または抑制、軸索流・電気生理反応（活動電位および活動電流）の変化、分子マーカー（アポトーシス関連遺伝子など）の発現の解析によって行うことができる。被験物質と網膜神経節細胞を接触させる方法については特に制限はなく、当業者に公知の任意の方法により行うことができる。例えば、網膜神経節細胞を含む培地に被験物質を添加した後、被験物質の存在下で該細胞を一定時間培養する方法でよい。また、接触は、ストレス条件（例えば、加圧、低酸素、起炎物質）下で行うこともできる。また、上記のスクリーニング方法と同手法にて、化学物質等による網膜神経節細胞の軸索成長阻害の判定試験を行うことも可能である。
【００６８】
本発明のスクリーニング方法の対象となる被験物質の種類は特に限定されない。例えば、動・植物組織の抽出物もしくは微生物培養物等の複数の化合物を含む混合物、またそれらから精製された標品；天然に生じる分子(例えば、アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、核酸、脂質、ステロイド、糖タンパク質、プロテオグリカンなど）；あるいは天然に生じる分子の合成アナログ又は誘導体(例えば、ペプチド擬態物など)；及び天然に生じない分子(例えば、コンビナトリアルケミストリー技術等を用いて作成した低分子有機化合物)；ならびにそれらの混合物などを挙げることができる。また、被験物質としては単一の被験物質を独立に試験しても、いくつかの候補となる被験物質の混合物（ライブラリーなどを含む）について試験をしてもよい。複数の被験物質を含むライブラリーとしては、合成化合物ライブラリー、ペプチドライブラリーなどが挙げられる。
【００６９】
４．難治性視神経疾患解析への利用
遺伝性視神経障害（常染色体優性視神経萎縮やレーベル病、無虹彩症に伴う視神経形成不全等）は、その発症機構、疾患関連分子が不明な難治性視神経疾患である。このような疾患の患者から樹立したiPS細胞や正常iPS細胞を人工的に遺伝子改変することによって疾患の再現を行ったiPS細胞(疾患特異的iPS細胞）から本発明の方法によって網膜神経節細胞に分化誘導する過程と、健常者から樹立したiPS細胞から本発明の方法によって網膜神経節細胞に分化誘導する過程とを比較することにより、当該疾患の発症機構、疾患関連分子の解析、疾患の原因病態の解明などができる。
【実施例】
【００７０】
以下、実施例によって本発明を更に具体的に説明する。ただし、これらの実施例は本発明を限定するものでない。【００７１】
（実施例１）ヒトiPS細胞からの網膜神経節細胞の作製
１．方法
(1) ヒトiPS細胞から網膜前駆体細胞への分化誘導
ヒトiPS細胞は、理化学研究所バイオリソースセンター(BRC)から提供されたヒト皮膚由来iPS細胞409B2株を使用した(Okita et al. (2011) A more efficient method to generate integration-free human iPS cells, Nat. Methods)。ヒトiPS細胞から網膜前駆体細胞への分化誘導は、マトリゲル濃度とFBS濃度を変更する以外は文献（Nakano T et al., Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell 10, 771-785 (2012))に記載のSFEBq（Serum-free Floating culture of Embryoid Body-like aggregates with quick reaggregation）法に基本的に従い、次のようにして行った。【００７２】
マイトマイシン（MMC）処理したMEF支持細胞をシャーレに播種し、このMEF支持細胞上に上記ヒトiPS細胞を播種し、10ng/ml組み換えヒトbFGF（インビトロジェン）を添加したiPS細胞培養用培地（リプロセル）中で4日間培養した。このiPS細胞を、トリプシン処理により剥がして回収し、ゼラチンでコートした10cmシャーレに移して30分間放置した。細胞を回収後、網膜分化培地RDM[G-MEM培地に20% KSR、0.1mM 2-メルカプトエタノール、0.1mM非必須アミノ酸添加物、１mM ピルビン酸ナトリウム、20μM Y-27632(ROCK阻害剤）、3μM IWR-1e（Wntシグナル阻害剤）、100U/ml ペニシリン、100μg/ml ストレプトマイシンを添加］100μlに対して10000個懸濁し、非接着処理を施した96ウェルプレートに1ウェルあたり9000個播種し、37℃、5%CO2で浮遊培養を開始した（以降、この浮遊培養開始時点を分化誘導開始0日目として培養日数をカウントする）。分化誘導開始後2日目（Day2)にマトリゲル（BD Bioscience)を終濃度0.5%になるように添加し、12日目（Day12)に上記の網膜分化培地の組成からY-27632、IWR-1eを除き、FBS(終濃度1%)を加えた血清培地に交換した。15日目にWntシグナル活性剤CHIR99021（終濃度3μM)、Shhシグナル活性剤SAG(終濃度100nM)を同培地に加え、さらに3日間培養した。【００７３】
(2) 網膜前駆体細胞の成熟（網膜前駆体細胞から網膜神経節細胞への分化誘導）
18日目（Day18)に無血清網膜成熟培地RMM[GlutaMAX含有D-MEM/F12、N2サプリメント(Life Technologies)]に交換し、24日目まで同培地にて浮遊培養を続けた。24日目にFBS(終濃度1％)、レチノイン酸(0.5μM)を添加した網膜成熟培地[GlutaMAX含有D-MEM/F12、N2サプリメント(Life Technologies)]に交換し、その後3日間浮遊培養を継続した。なお、本浮遊培養は、大気酸素濃度下で行った。【００７４】
(3) 軸索の伸長
27日目に、浮遊培養を終了し、ポリ-D-リシンとラミニンをコーティングした24ウェルプレートに眼胞(OV)を胚様体の本体（main body)につけたままの状態で胚様体を移して接着培養を開始した。接着培養は、BDNF(終濃度100ng/ml)を添加した神経維持培地［GlutaMAX含有D-MEM/F12、N2サプリメント(Life Technologies）、1% FBS]を用いて行い、培地中のFBSの濃度を、30日目に5%、35日目に10%と順次高めていき、40日目（接着培養開始後13日目）まで行った。接着培養時の培地量は細胞と同じ程度の高さ（約250μl)になるように維持した。
以上の(1)〜(3)の工程を含むヒトiPS細胞からの網膜神経節細胞の作製方法の模式図を図１に示す。【００７５】
(4) 免疫染色
24日目、40日目に、細胞をPFAで固定化した後、3％BSAでブロッキングした（室温60分）。その後、一次抗体［24日目は抗Rx抗体（Thermo Scientific社製）、40日目は抗Brn3b抗体（Santa Cruz社製)]と一晩反応させた後、TBSで洗浄し、二次抗体（Alexa Fluor-555）と反応させた。【００７６】
(5) マーカー（Brn3b、Rx、Pax6）遺伝子の発現量の経時変化
分化誘導過程におけるマーカー（Brn3b、Rx、Pax6）遺伝子の経時変化を調べた。具体的には、分化誘導開始から経時的（6、12、18、24、30、40日目）に細胞を回収し、PBS(-)にて2回洗浄し、RNeasy Mini Kit (キアゲン)によって細胞からRNAを抽出した。2-STEPリアルタイムPCRキット(タカラバイオ)を用いて、RNAをcDNAに逆転写後、StepOnePlusリアルタイムPCRシステム(ライフテクノロジーズ)により、下記のプライマーセットを用いてリアルタイムPCR(95℃:15秒間、60℃:30秒間、40cycles)を実施し、Brn3b遺伝子、Rx遺伝子、Pax6遺伝子の発現量を測定した。【００７７】
ヒトBrn3b遺伝子増幅用プライマーセット
フォワード：5'-TGACACATGAGCGCTCTCACTTAC-3'（配列番号1）
リバース：5'-ACCAAGTGGCAAATGCACCTA-3'（配列番号2)
ヒトRx遺伝子増幅用プライマーセット
フォワード：5'-CCGTCCCTAAGCGTGCTTTC-3'（配列番号3）
リバース：5'-ACTGGGAGCTTCACTAATTTGCTCA-3'（配列番号4）
ヒトPax6遺伝子増幅用プライマーセット
フォワード：5'-TTTAAAGATCCTGGAGGTGGACATA-3'（配列番号5)
リバース：5'-GCTCAGGTGCTCGGGTTCTA-3'（配列番号6）
mRNAの発現量をHPRT遺伝子の発現量で補正し、分化誘導開始日の発現量を1とした相対発現量の値を算出した。【００７８】
２．結果
図２は、分化誘導開始後24日目の胚様体の抗Rx抗体による免疫染色像を示す。分化誘導開始後24日目には、網膜前駆体である眼胞の存在が確認できた。【００７９】
図３に、分化誘導開始後40日目（接着培養開始後13日目）の胚様体の実体顕微鏡像を示す。接着培養開始翌日にはすでに軸索の伸長が確認でき、分化誘導開始後40日目（接着培養開始後13日目）にはプレートに接着した胚様体の周囲から1cm程度の軸索が放射状に伸長していることが確認できた。また、軸索が伸長した網膜神経節細胞への誘導率を、接着させた胚様体の個数に対する軸索の伸長が確認できた胚様体の個数の割合により求めたところ、80〜90％であった。【００８０】
図４に、分化誘導開始後40日目（接着培養開始後13日目）の胚様体の抗Brn3b抗体による免疫染色像を示す。分化誘導開始後40日目には網膜神経節細胞(Brn3b陽性細胞）の存在が確認できた。【００８１】
図５に、マーカー（Brn3b、Rx、Pax6）遺伝子の発現量の経時変化を示す。網膜前駆体細胞のマーカー遺伝子であるRx、Pax6遺伝子は分化誘導開始後の初期の段階から発現が認められ、網膜神経節細胞のマーカー遺伝子であるBrn3bの発現量は分化誘導開始後18日目以降から急減に上昇し、分化誘導開始後40日目（接着培養開始後13日目）で最高値を示した。【００８２】
（実施例２）マウスES細胞からの網膜神経節細胞の作製
１．方法
(1) マウスES細胞から網膜前駆体細胞への分化誘導
マウスES細胞は、GFP-expressing LB10 Mouse Embryonic Stem Cell GSC-5003(コスモバイオ)を用いた。マウスES細胞から網膜前駆体細胞への分化誘導は、文献(Eiraku M, Sasai Y. Mouse embryonic stem cell culture for generation of three-dimensional retinal and cortical tissues. Nat Protoc. 2011 7(1):69-79.)に従って次のようにして行った。【００８３】
マイトマイシン（MMC）処理したMEF支持細胞をシャーレに播種し、このMEF支持細胞上に上記マウスES細胞を播種し、マウスES細胞培養用培地（Knockout DMEM培地に15%KSR、0.05mM 2-メルカプトエタノール、0.1mM非必須アミノ酸添加物、0.01v/v％GlutaMax、0.001v/v％LIF (Wako)を添加）中で培養した。培養液は毎日交換し、3日毎に細胞を継代した。最終の継代後3日目の上記マウスES細胞をトリプシン処理により剥がして回収し、ゼラチンでコートした10cmシャーレに移して30分間放置した。細胞を回収後、網膜分化培地［G-MEM培地に1.5% KSR、0.1mM 2-メルカプトエタノール、0.1mM非必須アミノ酸添加物、１mM ピルビン酸ナトリウムを添加］100μlに対して5000個懸濁し、非接着処理を施した96ウェルプレートに1ウェルあたり4500個播種し、37℃、5%CO2で浮遊培養を開始した（以降、この浮遊培養開始時点を分化誘導開始0日目として培養日数をカウントする）。分化誘導開始後1日目にマトリゲルを終濃度2.0%になるように添加し、7日目まで同培地にて浮遊培養した。【００８４】
(2) 網膜前駆体細胞の成熟（網膜前駆体細胞から網膜神経節細胞への分化誘導）
7日目に無血清網膜成熟培地[GlutaMAX含有D-MEM/F12、N2サプリメント(Life Technologies)]に交換し、10日目まで同培地にて浮遊培養を続けた。10日目の段階でFBS(終濃度1％)、レチノイン酸(0.5μM)を添加した網膜成熟培地[GlutaMAX含有D-MEM/F12、N2サプリメント(Life Technologies)]に交換し、その後3日間浮遊培養を継続した。【００８５】
(3) 軸索の伸長
13日目に、浮遊培養を終了し、ポリ-D-リシンとラミニンをコーティングした24ウェルプレートに胚様体を移して接着培養を開始した。接着培養は、神経維持培地[GlutaMAX含有D-MEM/F12、N2サプリメント(Life Technologies）、5% FBS、100ng/ml BDNF]を用いて行い、20日目（接着培養開始後7日目）まで行った。接着培養時の培地量は細胞と同じ程度の高さになるように維持した。【００８６】
(4) 免疫染色
18日目に、細胞をPFAで固定化した後、3％BSAでブロッキングした（室温60分）。その後、一次抗体［抗Brn3b抗体（Santa Cruz社製)]と一晩反応させた後、TBSで洗浄し、二次抗体（Alexa Fluor-555）と反応させた。【００８７】
(5) マーカー（Brn3b、Rx、Pax6）遺伝子の発現量の経時変化
分化誘導過程におけるマーカー（Brn3b、Rx、Pax6）遺伝子の経時変化を調べた。具体的には、分化誘導開始から経時的（7、10、14、20日目）に細胞を回収し、PBS(-)にて2回洗浄し、RNeasy Mini Kit (キアゲン)によって細胞からRNAを抽出した。2-STEPリアルタイムPCRキット(タカラバイオ)を用いて、RNAをcDNAに逆転写後、StepOnePlusリアルタイムPCRシステム(ライフテクノロジーズ)により、下記のプライマーセットを用いてリアルタイムPCR(95℃:15秒間、60℃:30秒間、40cycles)を実施し、Brn3b遺伝子、Rx遺伝子、Pax6遺伝子の発現量を測定した。【００８８】
マウスBrn3b遺伝子増幅用プライマーセット
フォワード：5'-ATCGTCTCCCAGAGTAAGAGC-3'（配列番号7）
リバース：5'-CACGGGATGGTGTTCATGG-3'（配列番号8)
マウスRx遺伝子増幅用プライマーセット
フォワード：5'-CGACGTTCACCACTTACCAA-3'（配列番号9）
リバース：5'-TCGGTTCTGGAACCATACCT-3'（配列番号10）
マウスPax6遺伝子増幅用プライマーセット
フォワード：5'-TACCAGTGTCTACCAGCCAAT-3'（配列番号11)
リバース：5'-TGCACGAGTATGAGGAGGTCT-3'（配列番号12）
mRNAの発現量をHPRT遺伝子の発現量で補正し、分化誘導開始日の発現量を1とした相対発現量の値を算出した。【００８９】
２．結果
図６に、分化誘導開始後18日目（接着培養開始後5日目）の胚様体の実体顕微鏡像を示す。ヒトiPS細胞の場合と同様に、プレートに接着した胚様体の周囲から1cm程度の軸索が放射状に伸長していることが確認できた。【００９０】
図７に、分化誘導開始後18日目（接着培養開始後5日目）の胚様体の抗Brn3b抗体による免疫染色像を示す。ヒトiPS細胞の場合と同様に、網膜神経節細胞(Brn3b陽性細胞）の存在が確認できた。【００９１】
図８に、マーカー（Brn3b、Rx、Pax6）遺伝子の経時変化を示す。網膜前駆体細胞のマーカー遺伝子であるRx、Pax6遺伝子は分化誘導開始後の初期の段階から発現が認められ、網膜神経節細胞のマーカー遺伝子であるBrn3bの発現量は分化誘導開始後20日目には上昇した。【００９２】
（実施例３）網膜神経節細胞に対する神経抑制因子の徐放試験
実施例１の分化誘導開始後27日目に、浮遊培養を終了し、ポリ-D-リシンとラミニンをコーティングした6ウェルプレートに胚様体を移して接着させ、BDNF(終濃度100ng/ml)を添加した神経維持培地［GlutaMAX含有D-MEM/F12、N2サプリメント(Life Technologies）、1% FBS］を用いて接着培養を開始した。接着培養開始後2日目に神経成長阻害物質セマフォリン3A(SemaA)の除放試験を開始した。まずメドジェル SP P15 (メドジェル)を100μg/μl Sema3A 30μlに浸し、4℃で60分放置した。キムワイプの上にメドジェルを載せて余分な溶液を除去した後、胚様体から5mm程度離れたところに置いた。その後3日置きに100μg/μl Sema3A 10μlをメドジェルの上から添加した。徐放試験開始9日後、実体顕微鏡で観察した。結果を図９に示す。セマフォリン3A(SemaA)側の軸索の伸長が顕著に阻害されることが確認できた。よって、本発明の方法により作製された網膜神経節細胞は、その軸索の変化を指標として、神経抑制因子に対する網膜神経節細胞の動態評価に用いることが可能である。【００９３】
以降の実施例４〜８、１３においてリアルタイムRT-PCRによる遺伝子発現解析に用いたプライマー、および免疫染色試験に用いた抗体のリストを下記表１および表２にまとめて示す。【００９４】
【表１】
0006039128.tif 000002
【表２】
0006039128.tif 000003
【００９５】
（実施例４）網膜形成に関連する転写因子の発現解析
１．方法
（１）リアルタイムRT-PCR
全RNA をRNeasy Mini Kit (キアゲン)を用いて細胞から抽出した。各RNA 試料中のmRNAの発現量をStepONE Sequence Detection System (アプライドバイオシステムズ社)を用いて測定した。逆転写ポリメラーゼ鎖反応(RT-PCR)をOne Step SYBRTM PrimeScriptTM PLUS RT-PCR Kit (タカラバイオ）を用いて行った。前記プライマー（表１）を用いてリアルタイムPCRを行い、網膜形成に関連する転写因子としてRx、Pax6、Chx10、Six3、Brn3b、Crx、Syntaxin、Calbidin、PKCα、Math5、Mitfの各遺伝子の発現量を経時的に測定した。PCRの条件は、42℃5分保持後、95℃10秒、続いて、95℃5秒、60℃31秒を40サイクルとした。mRNAの発現量は、Ct(Threshold cycle)値によって評価した。Ct値は、まずHPRT1の発現量で補正し、分化誘導開始0日目（浮遊培養開始時点）のmRNAの発現量を１とした相対量で表した。【００９６】
（２）免疫染色
ヒトiPS細胞から分化誘導開始後24日目の浮遊胚様体(EB)上の眼胞（OV)、および分化誘導開始後34日目の細胞（胚様体(EB)を接着培養に移行し、眼胞（OV)から分化誘導した細胞）クランプの突出部のRx、Pax6、Brn3b、Math5およびCrxの免疫染色を以下のようにして実施した。標品（凍結細胞切片または全細胞）を4% パラホルムアルデヒド(pH 7.0)に室温で20分間固定した。PBSで2回洗浄後、標品を0.1% Triton X-100と室温で15分間インキュベートし、PBSで各5分間3回洗浄した。次に、標品を3% BSAと室温で30分間インキュベートした後、第１抗体（表２）を４℃で16時間反応させた。第２抗体反応を対応する種特異的Alexa Fluor-488-結合抗体(1:500、インビトロジェン)と室温にて1時間暗室でインキュベートすることによって行った。PBSで各5分間4回洗浄した後、標品をProLong Gold Antifade Reagent with DAPI（インビトロジェン)で染色し、IX71 倒立型リサーチ顕微鏡(オリンパス)または BZ-9000E (キーエンス)を用いて観察した。【００９７】
２．結果
上記転写因子の発現解析結果を図１０に示す。網膜ホメオボックス遺伝子であるRx、およびペアボックス遺伝子であるPax6は、眼形成転写因子群(eye-field transcription factors)に属し、最も初期段階の網膜形成(retinogenesis)に重要であることが知られている。Rxは、胚様体(EB)が成熟して形成される時期である分化誘導開始後6日目（Day6)にアップレギレーションが明確に始まり、眼胞(OV)が成長し始める時期である18日目(Day18)にピークとなった。その後、Rxの下流遺伝子であるPax6のアップレギレーションが続いた（図１０Ａ）。【００９８】
Math5は、Pax6による直接的な制御下でpost-mitotic 網膜前駆体細胞において発現し、網膜神経節細胞(RGC)形成を制御することが知られている。マウスではMath5変異は網膜神経節細胞の欠落が認められ、ヒトでは、視神経無形成(optic nerve aplasia)を示すことが報告されている。また、最も信頼性のあるRGCマーカーとして知られているBrn3bは、転写因子のPOU-ドメインファミリーの一つであり、Math5によって制御されている。Brn3bは、非-RGC細胞型への分化の抑制因子として機能することによってRGC 細胞の運命を決定するものとされており、その分化プロセスでは、LIM-ホメオドメインファクターであるIslet1が共制御因子として働いている。本解析において、Brn3bの発現量は分化誘導開始後18日目（Day18)までは比較的低かったが、その後、Math5の発現の増加に続いて、眼胞（OV)が浮遊した胚様体（EB)から成長してくる時期である24日目まで飛躍的に増加した（図１０Ａ）。【００９９】
Chx10は、網膜前駆体細胞の増殖に関与し、最初はすべての網膜前駆体細胞において発現しているが、のちには、網膜双極細胞に限定されることが知られている。本解析において、Chx10の発現は分化誘導開始から18日目(Day18)に明らかとなり、胚様体の接着培養開始後、網膜神経節細胞および軸索が伸長してくる時期である少なくとも34日目(Day34)まで続いた。また、Crxは、光受容体系列の未成熟および成熟細胞において発現が制限されることが知られているが、CrxもまたChx10の発現に続いて分化誘導開始から18日目(Day18)に発現し始めた（図１０Ａ）。【０１００】
アマクリン細胞はRGC分化直後に分化し始める。本解析において、アマクリン細胞マーカーとして知られているSyntaxinが、Brn3bの発現に続き、遅れて発現した。網膜形成（retinogenesis）の後期段階で成長する水平細胞マーカーであるCalbindin及び双極細胞マーカーであるPKCαは、分化誘導開始後34日目（Day34)までほとんど発現しなかった。これらの遺伝子発現の経時変化はヒト網膜形成におけるそれらとまったく一致していた。【０１０１】
小眼球症（microphthalmia）関連転写因子ならびにメラノサイトと網膜色素上皮細胞(RPE)成長の主要制御因子であるMitfは、本解析ではほとんど発現しなかった。これは、本発明の方法が、ヒトiPS細胞を網膜神経系に分化誘導するが、網膜色素上皮細胞(RPE)系には分化誘導しないことを示すものである。【０１０２】
免疫染色では、眼胞（OV）とクランプの両方にRxとPax6の発現が認められた。最も典型的なRGCマーカーであるBrn3b及びMath5の発現はクランプ内のみであり、その辺縁部分に局在化していた。一方、Crxの発現はクランプ内にわずかに認められるだけであった（図１０Ｂ)。【０１０３】
（実施例５）ヒトiPS細胞から分化誘導した網膜神経節細胞の構造解析
（１）光学顕微鏡所見
(方法）
標品を4％パラホルムアデヒド含有100 mM リン酸緩衝液に4℃で3時間固定し、水にて洗浄し、アルコール／キシレンの等級系列で脱水し、パラフィンに包埋した。各ブロックを連続的に3μmの厚さに切断した。脱パラフィンした切片をヘモキシリン及びエオシンでHE染色した。【０１０４】
(結果）
分化誘導開始後26〜29日にディッシュに接着させた眼胞（OV）は、形状が平たくなり、ディッシュは細胞で満たされ、ディッシュ表面には外側辺縁部分から多くの軸索が放射状に伸びた。クランプ内の細胞は明らかに胚様体の本体(main body)の細胞とは異なっており、小さな細胞で満たされていた。クランプ内の細胞は、鮮明な細胞質と核を有する比較的大きな細胞体（範囲：16.1-23.6μm、平均：21.6μm、n=10)で、紡錘型から丸型の形状を有しており、際立った軸索を伴う場合もあった。これらの所見は、細胞体の大きさが12-25μの範囲にあるin vivoの網膜神経節細胞（RGC)と一致していた。注目すべきは、周辺に位置する幾つかの細胞はニッスル小体（Nissl body)を有しており、それは網膜神経節細胞(RGC)の特徴であると考えられた。軸索はエオシン好性であり、分枝はほとんどなく、in vivoにおける視神経乳頭に向かって成長するRGCの軸索と同じようにまっすぐ放射状に成長していることが確認された（図１１Ａ、Ｂ）。【０１０５】
（２）透過型電子顕微鏡所見
(方法）
標品を2% グルタルアルデヒド含有100 mMカコジル酸緩衝液中で2時間、続いて、1% 酸化オスミウム含有100 mMカコジル酸緩衝液中で1時間固定した。それらをアルコール／キシレンの等級系列で脱水し、酸化プロピレンで満たし、エポキシ樹脂に包埋した。代表的領域の超薄切片を酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛で染色し、JEM-1200EX (日本電子株式会社製)で観察した。【０１０６】
(結果）
分化誘導開始後35日目の試料の電子顕微鏡観察では、軸索を有する網膜神経節細胞（RGC）は比較的大きく（範囲：16.0-24.1μm、平均：20.6μm、n=10)、クランプの辺縁部分で重層化することが確認できた。これらのRGCは、際立った粗面の小胞体（図１１Ｃ、矢印部分）を含んでいた。軸索小丘（axon hillock）から伸展した軸索（図１１Ｃ、三角矢印部分）は、多くの神経細管(neurotubules)を有するが粗面小胞体を有さない特徴的な円錐形の細胞体を示し、in vivoの網膜神経節細胞（RGC)と一致していた。軸索の直径は様々であり（範囲：1.7-2.2μm、平均：1.8μm、n=10)、ミエリン化されておらず、網膜神経線維層や篩板（lamina cribrosa）の前方にある視神経における軸索のそれらと一致するという所見が得られた（図１１Ｄ)。【０１０７】
（実施例６）網膜神経節細胞(RGC)特異的マーカーの発現と分布の確認
眼胞（OV)から分化したクランプの辺縁部分にある軸索を伴った細胞が網膜神経節細胞（RGC)であることを確認するために、RGCに関連する典型的なマーカーであるBrn3b、Math5、Islet1、γ-synuclein (Sncg)、及びβ3-tublin (Tuj1)の発現と分布について試験した。ヒトiPS細胞から分化誘導開始後34日目（Day34）において抽出した全RNAのリアルタイムPCR（プライマーは前記表１参照）では、Brn3b、Math5、Islet1、Sncg、及びTuj1の発現量が30倍以上増加した。これらのマーカー群のなかでも、最もRGCに特異的なBrn3bは、分化誘導開始後1日目（Day1）と34日目（Day34）との比較において、ほぼ3000倍増加した(図１２Ａ)。【０１０８】
分化誘導開始後34日目におけるBrn3b、Math5、Islet1、Sncg、及びTuj1に対する免疫染色では、クランプの周辺部位においてTuj1以外のすべてのマーカーが陽性染色を示し、初期(incipient)のRGC層であると考えられた。Brn3bの上流側転写因子であるMath5及びもう一つのRGCマーカーであって、ニューロフィラメント集積に寄与するSncgが、クランプの辺縁部分に同様な分布が見られた。【０１０９】
RGC及びアマクリン細胞のマーカーであるIslet1は、クランプの辺縁部分において、さらには内部に向かって陽性であり、これはアマクリン細胞もまた成長していることを示す。Brn3b-陽性細胞は明らかにディッシュの表面でクランプの最外側の辺縁部分に局在化していたことが注目される。これは、長い放射状の軸索がクランプの周辺部位から発していること、そして辺縁部分が網膜神経節細胞領域（RGCR)であることを示すものである(図１２Ｂ)。【０１１０】
RGCRと考えられる中に局在化したRGCの存在をさらに確認するために、接着培養した構造複合体を３つの部分（網膜神経節細胞領域（RGCR）、眼胞領域（OVR）、胚様体主要体（MBEB））に機械的に分割した（図１３Ａ)。Brn3bがMBEBよりもRGCRにおいてほとんど4倍高い発現量を示した(図１３Ｂ)。さらに、視細胞マーカーであるCrx発現はRGCRにおいて全般的に抑制されていた(図１３Ｂ)。これらの結果は明らかにRGCRが高度に神経節細胞系列に特定されることを証明するものである。Islet1(網膜神経節細胞及びアマクリン細胞のマーカー）もまた、RGCR及びOVRの両方でアップレギレートした(図１３Ｂ)。これらの結果を総合すると、Islet1-陽性/Brn3b-陰性細胞がアマクリン細胞へと分化するのに対して、Brn3b及びそのコアクターであるIslet1はRGCRにおけるRGC成長に関与しているといえる。また、単離したRGCRはOVRから分離後、約10日間生存することが確認され、これは、豊富な軸索の成長後、RGCの機械的精製が可能であることを示唆するものである。【０１１１】
（実施例７）軸索のニューロフィラメントの確認
網膜神経節細胞領域（RGCR）から発する見かけ上の軸索が典型的な軸索を構成することを確認するために、Tau及びニューロフィラメント（NF)を免疫染色した(図１４Ｂ)。すべてのニューロフィラメント成分（ニューロフィラメント軽鎖(NFL)、ニューロフィラメント中鎖(NFM)、ニューロフィラメント重鎖(NFH)の経時的発現（分化誘導開始から34日目（Day 34)および50日目（Day 50)）を平行して観察した。微小管、ニューロフィラメント（NF)、微小管−関連タンパク質(MAP)、及びアクチンは軸索の成長において重要な役割を果たしている。また、MAPであるTauは、微小管の重合化、安定化、及び組織化に寄与し、軸索成長及び効率的な軸索輸送を促進することが知られている。本実施例において検出された軸索は明確にTauに対して染色され、軸索輸送を証明できた。【０１１２】
ニューロフィラメントはニューロンの中間径フィラメント(intermediate filament)であり、特に中枢神経系（CNS)軸索において豊富であり、そこでは４つのサブユニット、すなわち、ニューロフィラメント軽鎖（NFL)、ニューロフィラメント中鎖（NFM)、ニューロフィラメント重鎖（NFH)、及びα-インターネキシンからなるヘテロポリマーとして発生することが知られている。ニューロフィラメントは、放射状の軸索成長と軸索径(axon calibre)の維持において重要な働きを有し、伝達作用ポテンシャル能を有すること、NFL及びNFMはいずれも網膜形成の初期に現れるが、NFHの合成は遅れることが知られている。本実施例においては、Tau、NFL、NFMは分化誘導開始後34日目（Day34)で既に高度に発現し、50日目（Day50)までその発現が続くことが確認された。一方、NFHの発現は分化誘導開始後34日目（Day34)では極めて低く、50日目（Day50)まで徐々に増加した(図１４Ａ)。免疫染色では、34日目の標品はTau、NFL、NFM に対して陽性染色を示したが、NFHに対して弱い染色を示し、発現経時変化試験と一致した(図１４Ｂ)。【０１１３】
（実施例８）軸索の機能解析
（１）軸索流の観察
（方法）
RGCおよびその軸索は、ミトコンドリアが豊富であること、および、他の神経細胞と同様に、軸索輸送によって恒常性を維持することが知られている。NTRK1は神経成長因子のレセプターであって、神経栄養チロシンキナーゼ受容体ファミリーの一員であり、RGC、特にその細胞が損傷を受けたときに発現することが知られている。【０１１４】
これらの二つのファクター、NTRK1およびミトコンドリアをトレーサーとして用い、GFP-NTRK1とCMVプロモーターで構成されるプラスミドベクター、およびmcherry-ミトコンドリアとCMVプロモーターで構成されるプラスミドベクターをそれぞれエレクトロポレーションによって、ヒトiPS細胞から分化誘導開始後34日目(D34)のRGCの細胞体に直接導入し、順行性高速軸索輸送を測定した。【０１１５】
具体的な試験手順を示す。NTRK1 発現ベクター(RG213091; オリジン)、pPAmCherry-Mito Vector (タカラバイオ）、及びpcDNATM6.2/C-EmGFP Vector (インビトロジェン）を培養細胞にエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションのために、プラチナ電極付きのNEPA21 (NEPAGENE)を用いた。培養コロニーを鋭利なガラス製ピペットを用いてファストグリーン染色DNA溶液とともにインジェクトし、電極間に設置し、そして電圧パルス（ポアリングパルス:電圧100 V, 幅2.5 ms, 間隔50 ms, 2回; トランスファーパルス: 電圧20V, 幅50 ms, 間隔50 ms, 5回）をかけてエレクトロポレーションした。培養細胞を湿式インキュベータ内で成育させた。観察はIX71 倒立型リサーチ顕微鏡(オリンパス)で行った。また、軸索輸送を経時観察するために、軸索輸送のトレーサとして知られているAlexa-Fluo-555結合コレラトキシンを投与した。【０１１６】
（結果）
軸索輸送は２つの特徴的な流れ（slow 及びfast）を示し、それらの両方が順行性および逆行性成分を有していた。幾つかの軸索に、導入から約7〜10時間後に順行性軸索流が認められた。NTRK1およびミトコンドリアは、軸索および細胞体において発現していた。軸索におけるこれらの存在は、順行性高速軸索輸送を示すものである(図１５左）。また、コレラトキシンをマイクロピペットでコロニー辺縁の細胞体が主に分布する領域に注入し、細胞体に取り込ませたところ、順行性軸索輸送(fast slow)がRGCRに明確に観察され、コレラトキシン注入後2時間以内に順行性軸索輸送によって細胞体から軸索の周辺領域まで輸送された（図１５右）。【０１１７】
（２）電気生理学的記録
（方法）
本発明の方法によってヒトiPS細胞より分化誘導した網膜神経節細胞（RGC）が活動電位を発生するかどうかを測定した。コロニーを１枚の混合セルロースエステル性フィルターペーパー(0.2 μm ポアサイズ; アドバンテック)上で１週間培養した。コロニーを載せたフィルターペーパーを培地から除去した後、コロニーを強固に固着させるために、フィルターの底に吸引を行った。厚さ200 μmの切片を垂直に組織チョッパーで切断し、少量のシリコングリース(Dow Corning)を付けた1.5 mL容量の記録チャンバーのガラス底に固定した。すべての試験をThermoClamp-1 (Automate Scientific)を用いて生理学的温度（35-37℃）に維持した。チャンバーを細胞外溶液（120 mM NaCl、3 mM KCl、2.5 mM CaCl2、1 mM MgCl2、10 mM グルコース、25 mM NaHCO3を含有。95/5% O2/CO2で平衡化。pH7.4）を連続的に1.5 mL/minにて潅流した。全細胞パッチクランプ記録を培養コロニーの外周囲に位置する網膜神経節細胞から作成した。記録はpCLAMP 9.2 software (Molecular Devices)を用いるAxopatch 200B amplifier (Molecular Devices)で実施した。切片調製物は、DIC optics 及び 60× 水浸対物レンズを備えた正立顕微鏡(BX50WI; オリンパス)を用いて可視化した。電圧または電流トレースはローパスフィルター（ベッセル（Bessel）、コーナー周波数10 kHz)し、Digidata 1322A インターフェース(Molecular Devices)を用いて20-50 kHzでサンプリングした。電圧依存Na+電流を漏出および静電電流減算(P/-5 protocol)で測定し、3回の試行結果の平均を求めた。幾つかの試験では、電圧依存Na+チャネルをブロックするために細胞外溶液に1 μM テトラトキシン(TTX)を添加した。記録ピペット(6-8 MΩ) を細胞内溶液（120 mM グルコン酸カリウム, 6 mM KCl, 2 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 5 mM EGTA, 10 mM HEPES, 4 mM Na2ATP, 及び 0.5 mM GTP含有；pH 7.2)で満たした。すべての試験において、ルシファーイエロ-CH二リチウム塩(LY; 0.05%)を細胞内溶液に添加して、記録した細胞の形態を可視化した。液間電位差(-11 mV)を補正した。平均直列抵抗(Rs)は29.4±4.77 MΩ(n = 5)であった。Rsは40 %だけ補正した。Rs>35 MΩのデータを分析から除外した。記録中の平均膜静電容量（average membrane capacitance）は7.20 ± 2.84 pF (n = 5)であった。電流および電圧データをpCLAMP 9.2 software を用いて取得し、特注パーソナルコンピユータ(Physio-Tech)に保存した。解析はClampfit 9.2 (Molecular Devices) 及び OriginPro 8J (OriginLab)で行った。LY注入細胞の画像を、高精度カラーカメラ(HCC-600; Flovel)を用いてキャプチャし、INFO.TV Plus software (Infocity)を用いて保存した。画像の明るさ及びコントラストを調節し、Photoshop CS6 software (Adobe Systems)を用いて深さの異なる切片調製物から得られた他の画像の一部にペーストすることによって補完した。すべてのデータをmean ± SDとして示した。【０１１８】
（結果）
各網膜神経節細胞（RGC）は、フィルターペーパー側に伸びる長い軸索プロセスを有し、樹状プロセスを有していた(図１６Ａ)。軸索プロセスを伴う細胞の電気生理学的分析では、電流クランプモード内の記録ピペットを通した電流インジェクションに応答して連続的な活動電位を示した（５細胞中４細胞）(図１６Ｂ)。残留膜電位および第１活動電位の増幅はそれぞれ-81.8 ± 26.8 mV 及び 56.8 ± 24.6 mVであった (n = 4)。また、活動電位を発生した細胞は、外向き電流（outward current）に続いて、テトロドトキシン(TTX)-感受性、ナトリウム依存性の最大増幅電流（1,248 ± 573 pA (n = 4)）を示した(図１６Ｃ）。【０１１９】
（実施例９）緑内障の細胞モデルの作製およびその有効性確認
（１）緑内障の細胞モデルの作製
実施例１と同様にしてヒトiPS細胞から網膜神経節細胞への分化誘導を行い、浮遊培養を終了した胚様体を、24ウェルプレートに移して神経維持培地［GlutaMAX含有D-MEM/F12、N2サプリメント(Life Technologies）、1% FBS]を用いて接着培養を行い、接着培養開始から6日目（分化誘導開始から33日目）に、軸索が伸長した網膜神経節細胞（RGC)コロニーを加圧培養装置に移した。60mmHgの加圧条件下で12時間培養後、コロニーを回収し、RNeasy Mini Kit (キアゲン)によって細胞からRNAを抽出し、RNAをcDNAに逆転写後、StepOnePlusリアルタイムPCRシステム(ライフテクノロジーズ)により、下記のプライマーセットを用いてリアルタイムPCR(95℃:15秒間、60℃:30秒間、40cycles)を実施し、アポトーシス関連遺伝子であるBax遺伝子、Caspase 3またはCaspase 8遺伝子、Bcl2遺伝子の発現量を測定した。またアポトーシスの免疫染色（TUNEL)はApopTag plus fluorescein in situ apoptosis detection kit(メルクミリボア)を使用し、添付のプロトコルに従って実施した。【０１２０】
Bax遺伝子増幅用プライマーセット
フォワード：5'- CCCGAGAGGTCTTTTTCCGAG -3'（配列番号51）
リバース：5'- CCAGCCCATGATGGTTCTGAT -3'（配列番号52)
Caspase 3遺伝子増幅用プライマーセット
フォワード：5'- CATGGAAGCGAATCAATGGACT -3'（配列番号53）
リバース：5'- CTGTACCAGACCGAGATGTCA -3'（配列番号54)
Caspase 8遺伝子増幅用プライマーセット
フォワード：5'-CTCCCCAAACTTGCTTTATG -3'（配列番号55）
リバース：5'-AAGACCCCAGAGCATTGTTA -3'（配列番号56)
Bcl2遺伝子増幅用プライマーセット
フォワード：5'- GGTGGGGTCATGTGTGTGG -3'（配列番号57）
リバース：5'- CGGTTCAGGTACTCAGTCATCC -3'（配列番号58)【０１２１】
加圧しないRGC（コントロール）に比べて、60mmHg連続加圧を12時間行ったRGCでは、軸索が消失し、TUNEL法によりアポトーシス細胞の顕著な増加が認められた（図１７Ａ）。また、RT-PCR解析ではアポトーシス促進遺伝子 (Bax遺伝子、Caspase 3遺伝子)の発現亢進が認められた（図１７Ｂ）。【０１２２】
（２）神経栄養因子の効果確認
実施例１と同様にしてヒトiPS細胞から網膜神経節細胞への分化誘導を行い、浮遊培養を終了した胚様体を、24ウェルプレートに移して神経維持培地［GlutaMAX含有D-MEM/F12、N2サプリメント(Life Technologies）、1% FBS]を用いて接着培養を行い、接着培養開始から4日目（分化誘導開始から31日目）に、上記神経維持培地に100ng/ml神経栄養因子［Brain-derived neurotrophic factor(以下、BDNFと記載)、Ciliary neurotrophic factor(以下、CNTFと記載)］を添加した培地に交換し、軸索が伸長した網膜神経節細胞（RGC)コロニーを加圧培養装置に移した。60mmHgの加圧条件下12時間培養後、コロニーを回収し、RNeasy Mini Kit (キアゲン)によって細胞からRNAを抽出し、（１）と同様にしてRT-PCRによりBax遺伝子、Caspase 3またはCaspase 8遺伝子、Bcl2遺伝子の発現量を測定した。【０１２３】
コントロール(無投与)と比較して、BDNFおよびCNTF投与により顕著にアポトーシス促進遺伝子(Bax遺伝子、Caspase 8遺伝子)の発現抑制、アポトーシス抑制遺伝子(Bcl2遺伝子)の発現亢進が認められた（図１８）。【０１２４】
（実施例１０）先天無虹彩症・視神経形成不全の細胞モデルの作製およびその有効性確認
（１）先天無虹彩症・視神経形成不全の細胞モデルの作製
Pax6遺伝子の変異が認められた2例(症例1、症例2）について、手術中に得られた結膜組織から先天無虹彩に伴う視神経形成不全の疾患iPS細胞を作製した。それぞれの変異は、症例1はExon 5の 3' splicing defect c.774+1G>T、症例2はQ277Xで、いずれもナンセンス変異であった。iPS細胞は、OCT3/4、SOX2、KLF4、及びC-MYC の４つの因子（Yamanakaら）を導入して、通常通りの方法で作製した。この疾患iPS細胞を用いて、実施例１と同様にして網膜神経節細胞への分化誘導を行い、浮遊培養を終了した胚様体を、24ウェルプレートに移して神経維持培地［GlutaMAX含有D-MEM/F12、N2サプリメント(Life Technologies）、1% FBS]を用いて接着培養を行った。接着培養開始から8日目（分化誘導開始から35日目）に、実施例１と同様にして、網膜神経節細胞（RGC)コロニーの顕微鏡観察を行い、網膜神経節細胞形成遺伝子（Brn3b遺伝子およびMath5遺伝子）の発現量をRT-PCR法にて測定した。【０１２５】
正常iPS細胞から同様にして分化誘導したRGC（コントロール）に対し、疾患iPS細胞から分化誘導したRGCは軸索の伸長が極めて悪かった（図１９Ａ）。また、RT-PCR解析によれば、正常iPS細胞から分化誘導したRGC（コントロール）に比べて、疾患iPS細胞から分化誘導したRGCでは網膜神経節細胞形成遺伝子（Brn3b遺伝子およびMath5遺伝子）の発現抑制が認められた（図１９Ｂ）。【０１２６】
（２）神経栄養因子の効果（神経伸長回復）確認
上記症例１の無虹彩症（c.774＋1G>T変異）疾患iPS細胞または正常iPS細胞から、実施例１と同様にして網膜神経節細胞への分化誘導を行い、浮遊培養を終了した胚様体を、24ウェルプレートに移して神経維持培地［GlutaMAX含有D-MEM/F12、N2サプリメント(Life Technologies）、1% FBS]を用いて接着培養を行った。接着培養開始から4日目（分化誘導開始から31日目）に、上記神経維持培地に100ng/ml神経栄養因子（BDNF、CNTF）を添加した培地に交換し、10日間培養した後、網膜神経節細胞（RGC)コロニーの実体顕微鏡により軸索伸長を観察した。また、網膜神経節細胞形成の転写因子（Brn3b、Math5、Islet1、Tuj1）および網膜神経線維の構造遺伝子（Tau、NFL）の発現量をRT-PCR法にて測定した。【０１２７】
正常iPS細胞由来の網膜神経節細胞よりは不良であったものの、BDNFまたはCNTFを投与すると、軸索の伸長は、無投与の無虹彩症（c.774＋1G>T変異）疾患iPS細胞由来の網膜神経節細胞（コントロール）より良好な伸長がみられた（図２０Ａ）。【０１２８】
RT-PCRでは、BDNF投与によりBrn3b、Math5、Islet1、Tuj1、Tau、NFLのすべてが、CNTF投与によりBrn3b、Tuj1、Tau、NFLの発現上昇が認められた。網膜神経節細胞形成の転写因子が上昇したことから（図２０Ｂ）、BDNFとCNTFは網膜神経節細胞形成遺伝子群よりも上流の網膜形成遺伝子群に作用するものと考えられる。【０１２９】
（実施例１１）神経栄養因子または神経抑制因子の軸索伸長に対する影響
実施例１と同様にしてヒトiPS細胞（正常）から網膜神経節細胞への分化誘導を行い、浮遊培養を終了した胚様体を、24ウェルプレートに移して神経維持培地［GlutaMAX含有D-MEM/F12、N2サプリメント(Life Technologies）、1% FBS]を用いて接着培養を行った。接着培養開始から4日目（分化誘導開始から31日目）に、上記神経維持培地に100ng/ml神経栄養因子（BDNF、CNTF）または神経抑制因子(Sema3A)を添加した培地に交換し、10日間培養した後、実施例１と同様にして、網膜神経節細胞（RGC)コロニーの顕微鏡観察を行い、Brn3b遺伝子の発現量をRT-PCR法にて測定した。【０１３０】
BDNFとCNTFを投与すると、軸索はコントロール（無投与）より良好な伸長がみられた（図２１Ａ）。また、コントロール（無投与）と比較してBDNFおよびCNTF投与により顕著に網膜神経節細胞特異的マーカーであるBrn3b遺伝子の発現亢進が認められた（図２１Ｂ）。【０１３１】
一方、Sema3Aを投与すると、軸索の伸長がコントロール（無投与）より顕著に阻害された（図２２Ａ）。また、コントロール（無投与）と比較して顕著に網膜神経節細胞特異的マーカーであるBrn3b遺伝子の発現抑制が認められた（図２２Ｂ）。【０１３２】
以上の結果から、本発明の方法により作製された網膜神経節細胞は、その軸索の伸長や網膜神経節細胞特異的マーカー（Brn3b遺伝子)を指標として、網膜神経節細胞の保護または再生作用のある薬剤のスクリーニングや神経抑制因子に対する網膜神経節細胞の動態評価試験に用いることが可能である。【０１３３】
（実施例１２）網膜神経節細胞移植マウスにおける生着性および機能確認
（方法）
実施例２と同様にしてGFPマウス由来のES細胞から分化誘導した網膜神経節細胞（RGC)を、B6マウスまたはWisterラットの眼内（硝子体腔）に移植した。いずれの動物も、24-36時間前に片眼（右眼）を、結膜を切開し、眼球後方の視神経を露出し、ピンセットで挫滅して、視神経障害モデルを作製した。ラットでは移植1日前から移植後1週間まで、CyclosporinA筋注20mg/kg/dayを行い、マウスでは免疫抑制処置を行わなかった。移植するコロニーは、実施例２に記載の方法に従い、浮遊培養を行った胚様体を接着培養に移行後1〜3日で軸索が伸び始めた時期のものを選択した。【０１３４】
ガス麻酔導入後、右眼とその周囲をイソジン液で消毒し、結膜を切開し、毛様体と思われる部位の強膜を25G針で切開した。ピンセットを用いて、コロニーを強膜創から硝子体内に挿入し、10-0ナイロン糸で強膜を縫合し、9-0シルク糸で結膜を縫合し、抗生物質の軟膏を塗布して、手術を終了した。移植後7〜10日に、動物を深麻酔によって安楽死させ、右眼球を摘出して、4%パラフォルムアルデヒドで固定した。毛様体部で眼球を360度切開して、前眼部と水晶体をはずし、カップ状の後眼部の網膜を蛍光実体顕微鏡で観察した。GFPが観察された標本は、凍結切片を作製し、蛍光顕微鏡で観察した。【０１３５】
（結果）
蛍光実体顕微鏡で、網膜上にGFP陽性の組織が観察された。凍結切片の蛍光顕微鏡観察では、GFP陽性の網膜神経節細胞（RGC)が網膜内に生着し、さらに網膜内に軸索の伸長が認められた（図２３）。【０１３６】
（実施例１３）ヒトES細胞からの網膜神経節細胞の作製および解析
ヒトiPS細胞に代えて、ヒトES細胞（理化学研究所バイオリソースセンター(BRC)より入手）を用いる以外は、実施例１と同様にして網膜神経節細胞への分化誘導を行った。図２４Ａに分化誘導開始後30日目（接着培養開始後3日目）の胚様体の実体顕微鏡像を示す。ヒトES細胞からの分化誘導においても、胚様体の周囲から軸索が放射状に伸長していることが確認できた。また、分化誘導開始後24日目、34日目（接着培養開始後7日目）における網膜分化に関与する転写因子(Rx、Pax6、Chx10、Brn3b）の発現量を、実施例１と同様の条件にてリアルタイムPCR（プライマーは前記表１参照）によって測定した。その結果、いずれの転写因子も分化誘導後24日目において発現が認められたが、RGCに特異的なマーカー遺伝子であるBrn3bの発現量は接着培養細胞移行後に顕著に増加した(図２４Ｂ）。【０１３７】
（実施例１４）マウスiPS細胞からの網膜神経節細胞の作製および解析
マウスES細胞に代えて、マウスiPS細胞（理化学研究所バイオリソースセンター(BRC)より入手）を用いる以外は、実施例２と同様(ただし、接着培養開始は14日目、96ウェルプレートに1ウェルあたり4000個播種、分化誘導開始後1日目に添加するマトリゲルを終濃度1.0%に変更）にして網膜神経節細胞への分化誘導を行った。図２５Ａに分化誘導開始後22日目（接着培養開始後8日目）の胚様体の実体顕微鏡像を示す。マウスiPS細胞からの分化誘導においても、胚様体の周囲から軸索が放射状に伸長していることが確認できた。また、分化誘導開始後14日目（接着培養開始時）における網膜分化に関与する転写因子(Rx、Pax6、Chx10、Math5、Brn3a、Brn3b）の発現量を、実施例２と同様の条件にてリアルタイムPCR（プライマーは下記参照）によって測定したところ、いずれの転写因子も発現が認められたが、マウスでは、Brn3bよりもBrn3aの発現量が大きいことが特徴的であった(図２５Ｂ）。【０１３８】
マウスBrn3b遺伝子増幅用プライマーセット
フォワード：5'-ATCGTCTCCCAGAGTAAGAGC-3'（配列番号7）
リバース：5'-CACGGGATGGTGTTCATGG-3'（配列番号8)
マウスRx遺伝子増幅用プライマーセット
フォワード：5'-CGACGTTCACCACTTACCAA-3'（配列番号9）
リバース：5'-TCGGTTCTGGAACCATACCT-3'（配列番号10）
マウスPax6遺伝子増幅用プライマーセット
フォワード：5'-TACCAGTGTCTACCAGCCAAT-3'（配列番号11)
リバース：5'-TGCACGAGTATGAGGAGGTCT-3'（配列番号12）
マウスChx10遺伝子増幅用プライマーセット
フォワード：5'-CGATTCCGAAGATGTTTCCTCC -3'（配列番号59）
リバース：5'-ATCTGGGTAGTGGGCTTCATT -3'（配列番号60)
マウスMath5遺伝子増幅用プライマーセット
フォワード：5'-ATCACCCCTACCTCCCTTTCC -3'（配列番号61）
リバース：5'-CGAAGAGCCTCTGCCCATA -3'（配列番号62）
マウスBrn3a遺伝子増幅用プライマーセット
フォワード：5'-AGGCCTATTTTGCCGTACAA -3'（配列番号63）
リバース：5'-CGTCTCACACCCTCCTCAGT-3'（配列番号64）【０１３９】
上記のマウスiPS細胞から分化誘導した網膜神経節細胞(RGC)および実施例２のマウスES細胞から分化誘導した網膜神経節細胞(RGC)の軸索の解析を以下のようにして行った。
（軸索輸送観察）
軸索輸送を経時観察は、Alexa-Fluo-555結合コレラトキシン(ライフテクノロジーズ)をマウスiPS細胞またはES細胞から分化誘導した網膜神経節細胞(RGC)の眼胞の中央部に注入することによって行った。観察は、IX71倒立型顕微鏡（オリンパス）で行った。低速度撮影による解析(time lapse analysis)はコレラトキシン注入直後からDeltaVision ELITE (コーンズテクノロジー）を用いて行った。マウスES細胞から分化誘導したRGC及びマウスiPS細胞から分化誘導したRGCのいずれにも順行性軸索輸送が観察され、注入されたコレラトキシンは順行性軸索輸送によって軸索の周辺領域まで輸送された（図２６）。【０１４０】
（電気生理学的記録）
電気的生理学記録は、記録中の平均膜静電容量をマウスiPS細胞から分化誘導した RGC(n=3)については11±9.2pF、マウスES細胞から分化誘導したRGC(n=3)については12±5.7pFに変更する以外は、実施例８（２）と同様にして行った。マウスES細胞から分化誘導したRGC及びマウスiPS細胞から分化誘導したRGCはいずれも、フィルターペーパー側に伸びる長い軸索プロセスを有し、樹状プロセスを有していた(図２７上)。軸索プロセスを伴う細胞の電気生理学的分析では、電流クランプモード内の記録ピペットを通した電流インジェクションに応答して連続的な活動電位を示した(図２７下）。【０１４１】
（実施例１５）ヒトiPS細胞から分化誘導した網膜神経節細胞の軸索流の観察
実施例１と同様にしてヒトiPS細胞から分化誘導した網膜神経節細胞した網膜神経節細胞(RGC)の軸索輸送観察を実施例１４と同様にして行った。眼胞の中央部に注入したコレラトキシンは、順行性軸索輸送によって軸索の周辺領域まで輸送された（図２８）。【０１４２】
（実施例１６）ヒトES細胞から分化誘導した網膜神経節細胞の軸索流の観察・電気生理学的記録
実施例１３と同様にしてヒトES細胞から分化誘導した網膜神経節細胞(RGC)の軸索輸送観察を実施例１４と同様にして行った。眼胞の中央部に注入したコレラトキシンは、順行性軸索輸送によって軸索の周辺領域まで輸送された（図２９）。電気的生理学記録は、実施例８（２）と同様にして行った。ヒトES細胞から分化誘導したRGCもまた、フィルターペーパー側に伸びる長い軸索プロセスを有し、樹状プロセスを有していた(図３０Ａ、Ｂ)。軸索プロセスを伴う細胞の電気生理学的分析では、電流クランプモード内の記録ピペットを通した電流インジェクションに応答して連続的な活動電位を示した(図３０Ｃ）。また、活動電位を発生した細胞は、外向き電流（outward current）に続いて、テトロドトキシン(TTX)感受性を示した(図３０Ｄ）。【０１４３】
（実施例１７）網膜神経節細胞の製造条件の比較検討
実施例１のヒトiPS細胞からの網膜神経節細胞(RGC)の作製における諸条件を変更し、分化誘導と軸索伸長を観察した。条件としては、接着培養への移行日(18日目、27日目、35日目）、接着培養の培地量（250μl、400μl)、接着培養時の胚様体(EB)からの眼胞（OV)の切り出し（有り、無し）、神経維持培地への神経栄養因子(BDNF）の添加（+、-）、神経維持培地へのレチノイン酸（RA)の添加（+、-）、浮遊培養時の酸素濃度（高酸素濃度（40％）、正常（室内）酸素濃度）について検討した。結果を図３１−１、３１−２に示す。実施例１と異なる条件［接着日：18日目及び35日目、培地量：400μl、眼胞（OV)の切り出し：有り、BDNF：無添加(-)、RA：添加(+)、酸素濃度：高酸素濃度（40％）］よりも、実施例１の培養条件［接着日：27日目、培地量：250μl、眼胞（OV)の切り出し：無し、BDNF：添加(+)、RA：添加(-)、酸素濃度：正常（室内）酸素濃度］が、RGCへの分化、および軸索の伸長が良好であった。
【産業上の利用可能性】
【０１４４】
本発明は、緑内障など網膜神経節細胞を障害する眼疾患の治療を目的とした再生医療材料の製造分野において利用できる。【０１４５】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書に組み入れるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１−１】
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【図３１−２】
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【配列表】
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