(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）インスリン受容体もしくは（ｉｉ）インスリンおよびインスリン受容体を含む複合体、または（ｉ）および（ｉｉ）の両方に対して１０−５Ｍ以下の平衡解離定数ＫＤで結合し、インスリンとインスリン受容体の間の結合親和性を少なくとも３倍弱めることができるモノクローナル抗体であって、（ｉ）または（ｉｉ）にアロステリックに結合する、モノクローナル抗体。
【請求項２】
前記インスリンとインスリン受容体の間の結合親和性を３倍〜５００倍弱めることができる、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記インスリンとインスリン受容体の間の結合親和性を１０００倍まで弱めることができる、請求項１記載の抗体。
【請求項４】
結合親和性が、ＫＡ、ＫＤ、オン速度のオフ速度に対する比率、またはオフ速度のオン速度に対する比率のいずれかの１つである、請求項１に記載の抗体。
【請求項５】
インスリンシグナル伝達活性のＥＣ５０を２倍〜１０００倍増加させる、請求項１に記載の抗体。
【請求項６】
ｐＡＫＴアッセイにおいて、インスリンシグナル伝達活性のＥＣ５０を２倍〜１０００倍増加させる、請求項５に記載の抗体。
【請求項７】
配列番号２７９、２４１、２５８、１５５、および２２８からなる群より選択される重鎖可変領域ならびに配列番号１３９、１０３、１１９、８、および８９からなる群より選択される軽鎖可変領域を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項８】
（ａ）Ａｂ０８１（配列番号２７９）、Ａｂ０６１（配列番号２４１）、Ａｂ０７０（配列番号２５８）、Ａｂ０２０（配列番号１５５）、Ａｂ０５２（配列番号２２８）、Ａｂ０８７（配列番号１６９）、Ａｂ０１９（配列番号１６０）、Ａｂ０８８（配列番号１５３）、Ａｂ０８９（配列番号１５４）、Ａｂ０５０（配列番号２２６）、Ａｂ０５５（配列番号２３１）、Ａｂ０５７（配列番号２３３）、Ａｂ０６３（配列番号２４４）、Ａｂ０６５（配列番号２４６）、Ａｂ０７２（配列番号２６０）、Ａｂ０７４（配列番号２６２）のいずれかの重鎖可変領域、ならびに
Ａｂ０８１（配列番号１３９）、Ａｂ０６１（配列番号１０３）、Ａｂ０７０（配列番号１１９）、Ａｂ０２０（配列番号８）、Ａｂ０５２（配列番号８９）、Ａｂ０８７（配列番号１８）、Ａｂ０１９（配列番号１）、Ａｂ０８８（配列番号２）、Ａｂ０８９（配列番号４）、Ａｂ０５０（配列番号８７）、Ａｂ０５５（配列番号９２）、Ａｂ０５７（配列番号９４）、Ａｂ０６３（配列番号１０５）、Ａｂ０６５（配列番号１０７）、Ａｂ０７２（配列番号１２１）、およびＡｂ０７４（配列番号１２３）のいずれかの軽鎖可変領域；あるいは
（ｂ）Ａｂ０８１（配列番号２７９）、Ａｂ０６１（配列番号２４１）、Ａｂ０７０（配列番号２５８）、Ａｂ０２０（配列番号１５５）、Ａｂ０５２（配列番号２２８）、Ａｂ０８７（配列番号１６９）、Ａｂ０１９（配列番号１６０）、Ａｂ０８８（配列番号１５３）、Ａｂ０８９（配列番号１５４）、Ａｂ０５０（配列番号２２６）、Ａｂ０５５（配列番号２３１）、Ａｂ０５７（配列番号２３３）、Ａｂ０６３（配列番号２４４）、Ａｂ０６５（配列番号２４６）、Ａｂ０７２（配列番号２６０）、Ａｂ０７４（配列番号２６２）のいずれかの３つの重鎖ＣＤＲ、ならびに
Ａｂ０８１（配列番号１３９）、Ａｂ０６１（配列番号１０３）、Ａｂ０７０（配列番号１１９）、Ａｂ０２０（配列番号８）、Ａｂ０５２（配列番号８９）、Ａｂ０８７（配列番号１８）、Ａｂ０１９（配列番号１）、Ａｂ０８８（配列番号２）、Ａｂ０８９（配列番号４）、Ａｂ０５０（配列番号８７）、Ａｂ０５５（配列番号９２）、Ａｂ０５７（配列番号９４）、Ａｂ０６３（配列番号１０５）、Ａｂ０６５（配列番号１０７）、Ａｂ０７２（配列番号１２１）、およびＡｂ０７４（配列番号１２３）のいずれかの３つの軽鎖ＣＤＲ；あるいは
（ｃ）重鎖もしくは軽鎖ＣＤＲのいずれかの１つ、２つ、もしくは３つの中に、１つまたは２つの変異が含まれる、（ｂ）に記載の３つの重鎖ＣＤＲおよび３つの軽鎖ＣＤＲ；あるいは
（ｄ）Ａｂ０８１（配列番号２７９、１３９）、Ａｂ０６１（配列番号２４１、１０３）、Ａｂ０７０（配列番号２５８、１１９）、Ａｂ０２０（配列番号１５５、８）、Ａｂ０５２（配列番号２２８、８９）、Ａｂ０８７（配列番号１６９、１８）、Ａｂ０１９（配列番号１６０、１）、Ａｂ０８８（配列番号１５３、２）、Ａｂ０８９（配列番号１５４、４）、Ａｂ０５０（配列番号２２６、８７）、Ａｂ０５５（配列番号２３１、９２）、Ａｂ０５７（配列番号２３３、９４）、Ａｂ０６３（配列番号２４４、１０５）、Ａｂ０６５（配列番号２４６、１０７）、Ａｂ０７２（配列番号２６０、１２１）、およびＡｂ０７４（配列番号２６２、１２３）のいずれかの６つのＣＤＲ全て
を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項９】
Ａｂ０６１（配列番号２４１、１０３）、Ａｂ０７４（配列番号２６２、１２３）、Ａｂ０８１（配列番号２７９、１３９）、Ａｂ０２０（配列番号１５５、８）、Ａｂ０１９（配列番号１６０、１）、Ａｂ０８７（配列番号１６９、１８）、Ａｂ０８８（配列番号１５３、２）、およびＡｂ０８９（配列番号１５４、４）からなる群より選択されるいずれか１つ、２つ、３つまたは全ての抗体と７０％以上の競合を示す、請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１０】
ヒト受容体または複合体に結合し、マウス受容体または複合体に結合しない、請求項９に記載の抗体。
【請求項１１】
配列番号１５１〜３０３に示される少なくとも１つの重鎖ＣＤＲ  ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１２】
配列番号１５１〜３０３の重鎖可変領域を含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１３】
配列番号１〜１５０に示される少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲ  ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、またはＬＣＤＲ３を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１４】
配列番号１〜１５０の軽鎖可変領域を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１５】
ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４重鎖定常領域をさらに含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１６】
ヒト軽鎖定常領域をさらに含む、請求項１５に記載の抗体。
【請求項１７】
可変重鎖が配列番号２７９、２５８または２４１に示され、かつ可変軽鎖が配列番号１３９、１１９または１０３に示される、請求項１に記載の抗体。
【請求項１８】
配列番号２７９、２５８または２４１に示される３つの重鎖ＣＤＲおよび配列番号１３９、１１９または１０３に示される３つの軽鎖ＣＤＲを含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項１９】
可変重鎖が配列番号２７９に示され、かつ可変軽鎖が配列番号１３９に示される、請求項１に記載の抗体。
【請求項２０】
配列番号２７９に示される３つの重鎖ＣＤＲおよび配列番号１３９に示される３つの軽鎖ＣＤＲを含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項２１】
ヒト抗体である、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項２２】
疎水性の成分に結合している、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項２３】
無菌の薬学的に許容可能な希釈剤を請求項１〜２２のいずれか１項に記載の抗体に添加する工程を含む、無菌の医薬組成物を調製する方法。
【請求項２４】
請求項１〜２２のいずれか１項に記載の抗体および無菌の薬学的に許容可能な希釈剤を含む、無菌の組成物。
【請求項２５】
低血糖またはインスリン感受性の治療に有効な量の請求項１〜１０および１７〜２０のいずれか一項に記載の抗体を含む、高インスリン血症またはインスリンシグナル伝達過剰に関連する状態の治療のための医薬組成物。
【請求項２６】
状態が、癌、インスリノーマ、カポジ肉腫、インスリン過剰摂取、低血糖、膵島細胞症（ＫＡＴＰ−Ｈｌびまん性疾患、ＫＡＴＰ−Ｈｌ限局性疾患、または「ＰＨＨＩ」）、ＧＤＨ−Ｈｌ（高インスリン症／高アンモニア血症症候群（ＨＩ／ＨＡ）、ロイシン過敏性低血糖症、またはジアゾキシド感受性低血糖）、島細胞調節不全症候群、乳幼児特発性低血糖症、乳幼児持続性高インスリン性低血糖症（ＰＨＨＩ）、先天性の高インスリン症、腎不全（急性または慢性）による低血糖、および慢性腎臓病による低血糖からなる群より選択される、請求項２５に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２００９年９月２５日出願の米国特許仮出願第６１／２４６，０６７号、２０１０年２月１９日出願の米国特許仮出願第６１／３０６，３２１号、および２０１０年６月２５日出願の米国特許仮出願第６１／３５８，７４９号の優先権の利益を主張するものであり、これらの出願はそれぞれその全体が参照によって組み込まれる。
【０００２】
発明の分野 
本開示は、インスリン−インスリン受容体シグナル伝達複合体の新規モジュレーターおよび／またはアゴニスト、およびこのようなモジュレーターおよび／またはアゴニストの選別方法に関する。このようなモジュレーターおよび／またはアゴニストは、例えば、２型糖尿病、肥満症、高血糖、高インスリン血症、インスリン過剰摂取、慢性腎臓疾患、１型糖尿病、インスリン抵抗性ならびにインスリン抵抗性を特徴とする疾患状態および容態に罹患している哺乳動物対象の治療、または前述の危険にさらされている対象に対する発症の防止に使うことができる。
【背景技術】
【０００３】
本開示は、インスリン−インスリン受容体シグナル伝達複合体の新規モジュレーターおよび／またはアゴニスト、このようなモジュレーターおよび／またはアゴニストの選別方法およびインスリンの異常な産生および／または利用を特徴とする疾患状態および容態の治療または予防へのこのようなモジュレーターおよび／またはアゴニストの使用に関する。
【０００４】
ペプチドホルモンであるインスリンは、グルコース恒常性および細胞増殖の主要制御因子である。インスリン作用の第１ステップは、膜内在性糖タンパク質で、ＣＤ２２０またはＨＨＦ５とも呼ばれるインスリン受容体（ＩＮＳＲ）へのホルモンの結合である。ＩＮＳＲは、チロシンキナーゼ増殖因子受容体スーパーファミリーに属し、インスリンに結合する２つの細胞外αサブユニット、および固有のチロシンキナーゼ活性を有する２つの膜貫通型βサブユニットから成る。ＩＮＳＲのアミノ酸配列は、米国特許第４，７６１，３７１号（特許文献1）中、およびＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿０００１９９．２として記載されている。ＩＮＳＲは、２つのアイソフォーム、すなわちＩＮＳＲ−ＡおよびＩＮＳＲ−Ｂとして発現する。ヒトＩＮＳＲのインタクトホモダイマー外部ドメイン断片の３次元構造がＸ−線結晶学を使って明らかにされている（ＷＯ０７／１４７２１３（特許文献2））。ＩＮＳＲアイソフォームもまた、ＩＮＳＲ−Ａ／ＩＮＳＲ−Ｂ、およびハイブリッドＩＮＳＲ／ＩＧＦ−１Ｒ受容体ヘテロダイマーを形成するが、生理学および疾患におけるそれの役割は未だ完全にはわかってはいない（Ｂｅｌｆｉｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｒｅｖ．、３０（６）：５８６−６２３、２００９（非特許文献1））。
【０００５】
インスリンがＩＮＳＲに結合すると、受容体がチロシン自己リン酸化により活性化され、ＩＮＳＲチロシンキナーゼがインスリン受容体基質−１（ＩＲＳ−１）を含む種々のエフェクター分子をリン酸化し、ホルモン作用をもたらす（Ｕｌｌｒｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ、Ｎａｔｕｒｅ  ３１３：７５６−７６１、１９８５（非特許文献2）；Ｇｏｌｄｆｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ８：２３５−２５５、１９８７（非特許文献3）；Ｗｈｉｔｅ  ａｎｄ  Ｋａｈｎ、Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１−４、１９９４（非特許文献4））。ＩＲＳ−１結合およびリン酸化は、最終的に筋細胞および脂肪組織を含むインスリン応答性組織の外膜上の高親和性グルコース輸送体（Ｇｌｕｔ４）分子を増加させ、その結果、血液からのグルコースのこれらの組織への取り込みの増加をもたらす。Ｇｌｕｔ４は、細胞内小胞から細胞表面へ移され、そこでグルコースの細胞内への輸送を媒介することができる。ＩＮＳＲシグナル伝達の減少は、細胞によるグルコースの取り込みの減少、高血糖（循環グルコースの増加）、および結果として生じる全ての続発症につながる。
【０００６】
グルコース取り込みの減少は、インスリン抵抗性を生じ、これは生理的な量のインスリンでは、細胞または組織からの正常なインスリン応答を得るのに不十分である状態をいう。極度のインスリン抵抗性は糖尿病に関連し、一方、より程度の軽いインスリン抵抗性は、また、約３０〜４０％の非糖尿病性個体に存在する多くの疾患状態および容態に関連している（Ｗｏｏｄｓ  ｅｔ  ａｌ、Ｅｎｄ、Ｍｅｔａｂ  ＆  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ-Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ９：１８７−１９８、２００９（非特許文献5）に概説あり）。
【０００７】
糖尿病およびインスリン抵抗性に対する現在の治療は、インスリン分泌の改善、グルコース産生の低減、およびインスリン作用の強化を指向している。
【０００８】
近年、２型糖尿病の治療に関し様々な薬理学的手法が存在する（Ｓｃｈｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ、２２（９）：１５６８−１５７７、１９９９（非特許文献6）；Ｚａｎｇｅｎｅｈ  ｅｔ  ａｌ、Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎ．Ｐｒｏｃ．７８：４７１−４７９、２００３（非特許文献7）；Ｍｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ、Ｍｅｄ  Ｒｅｓ  Ｒｅｖ  ２９（１）：１２５−１９５、２００９（非特許文献8））。それらは異なる作用モードを有する：１）スルホニル尿素（例えば、グリメピリド、グリセンチド、スルホニル尿素、ＡＹ３１６３７）は、基本的にインスリン分泌を刺激する；２）ビグアナイド（例えば、メトホルミン）は、グルコース利用を促進し、肝臓グルコース産生を減らし、腸のグルコース産出を減らすことにより作用する；３）αグルコシダーゼ阻害剤（例えば、アカルボース、ミグリトール）は、炭水化物消化を遅らせ、その結果、腸からの吸収を遅くし食後の高血糖を減らす；４）チアゾリジンジオン（例えば、トログリタゾン、ピオグリタゾン、ロシグリタゾン、グリピジド、バラグリタゾン、リボグリタゾン、ネトグリタゾン、トログリタゾン、エングリタゾン、ＡＤ５０７５、Ｔ１７４、ＹＭ２６８、Ｒ１０２３８０、ＮＣ２１００、ＮＩＰ２２３、ＮＩＰ２２１、ＭＫ０７６７、シグリタゾン、アダグリタゾン、ＣＬＸ０９２１、ダルグリタゾン、ＣＰ９２７６８、ＢＭ１５２０５４）は、インスリン作用を強化し、その結果、末梢組織でのグルコース利用を促進する；５）グルカゴン様ペプチドおよびアゴニスト（例えば、エキセンディン）または、その安定剤（例えば、シタグリプチン等のＤＰＰ４阻害剤）は、グルコース刺激性インスリン分泌を増強する；および６）インスリンまたはその類似体（例えば、ＬＡＮＴＵＳ（登録商標））は、組織のグルコース利用を刺激し、肝臓グルコース産出を阻害する。上述の薬理学的手法は、個別にまたは併用療法として利用可能である。しかし、それぞれの手法は、限界および有害作用がある。時間とともに、高いパーセンテージの２型糖尿病対象で、これらの試薬に対する反応がなくなる。６３％の２型糖尿病対象が米国糖尿病協会の勧告値である７％未満のグローバルＨｂＡ１ｃレベルに到達せず、その結果、合併症発症の高リスクにさらされている。さらに、対象は、ほとんどいつも、膵臓機能減退の段階を経て症状が進行する。インスリン治療は、通常、食事や運動の後に行われ、経口投薬は、適切に血糖を制御できていない。インスリン治療の欠点は、薬剤注射が必要であること、低血糖の可能性があること、および体重増である。従って、未だ新規抗糖尿病薬に対する差し迫った要求がある。
【０００９】
ヒトＩＮＳＲに結合する抗体が次の文献で報告されている：Ｓｏｏｓ  ｅｔ  ａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２３５：１９９−２０８、１９８６（非特許文献9）；Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２４２：１２３−１２９、１９８７（非特許文献10）；Ｐｒｉｇｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５（１７）：９９７０−９９７７、１９９０（非特許文献11）；Ｂｒｉｎｄｌｅ  ｅｔ  ａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２６８：６１５−６２０、１９９０（非特許文献12）；Ｓｔｅｅｌｅ−Ｐｅｒｋｉｎｓ  ａｎｄ  Ｒｏｔｈ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５（１６）：９４５８−９４６３、１９９０（非特許文献13）；ＭｃＫｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ、Ｎａｔｕｒｅ  ４４３（１４）：２１８−２２１（非特許文献14）；Ｂｏａｄｏ  ｅｔ  ａｌ、Ｂｉｏｔｅｃｈ  ａｎｄ  ＢｉｏＥｎｇ．９６（２）：３８１−３９１（非特許文献15）；ＷＯ０４／０５００１６（特許文献3）；Ｒｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７９：７３１２−７３１６、１９８２（非特許文献16）；Ｍｏｒｇａｎｅｔａｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：３２８−３３２、１９８６（非特許文献17）；Ｌｅｂｒｕｎ  ｅｔ  ａｌ、Ｊ．Ｂｌ．Ｃｈｅｍ．２６８（１５）：１１２７２−１１２７７、１９９３（非特許文献18）；Ｆｏｒｓａｙｅｔｈ  ｅｔ  ａｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：３４４８−３４５１、１９８７（非特許文献19）；Ｆｏｒｓａｙｅｔｈ  ｅｔ  ａｌ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２（９）：４１３４−４１４０（非特許文献20）、Ｇｏｏｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ、Ｊ．Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｒｅｓ．１４（６−８）、３８１−３９８、１９９４（非特許文献21）；Ｇａｎｄｅｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．２８８：１９５−２０５、１９９２（非特許文献22）；Ｓｐａｓｏｖ  ｅｔ  ａｌ、Ｂｕｌｌ．ｏｆ  Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．ａｎｄ  Ｍｅｄ．１４４（１）：４６−４８、２００７（非特許文献23）；ＥＰ２０３６５７４Ａ１（特許文献4）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許第４，７６１，３７１号
【特許文献２】ＷＯ０７／１４７２１３
【特許文献３】ＷＯ０４／０５００１６
【特許文献４】ＥＰ２０３６５７４Ａ１
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｂｅｌｆｉｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｒｅｖ．、３０（６）：５８６−６２３、２００９
【非特許文献２】Ｕｌｌｒｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ、Ｎａｔｕｒｅ  ３１３：７５６−７６１、１９８５
【非特許文献３】Ｇｏｌｄｆｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ８：２３５−２５５、１９８７
【非特許文献４】Ｗｈｉｔｅ  ａｎｄ  Ｋａｈｎ、Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１−４、１９９４
【非特許文献５】Ｗｏｏｄｓ  ｅｔ  ａｌ、Ｅｎｄ、Ｍｅｔａｂ  ＆  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ-Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ９：１８７−１９８、２００９
【非特許文献６】Ｓｃｈｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ、２２（９）：１５６８−１５７７、１９９９
【非特許文献７】Ｚａｎｇｅｎｅｈ  ｅｔ  ａｌ、Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎ．Ｐｒｏｃ．７８：４７１−４７９、２００３
【非特許文献８】Ｍｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ、Ｍｅｄ  Ｒｅｓ  Ｒｅｖ  ２９（１）：１２５−１９５、２００９
【非特許文献９】Ｓｏｏｓ  ｅｔ  ａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２３５：１９９−２０８、１９８６
【非特許文献１０】Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２４２：１２３−１２９、１９８７
【非特許文献１１】Ｐｒｉｇｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５（１７）：９９７０−９９７７、１９９０
【非特許文献１２】Ｂｒｉｎｄｌｅ  ｅｔ  ａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２６８：６１５−６２０、１９９０
【非特許文献１３】Ｓｔｅｅｌｅ−Ｐｅｒｋｉｎｓ  ａｎｄ  Ｒｏｔｈ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５（１６）：９４５８−９４６３、１９９０
【非特許文献１４】ＭｃＫｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ、Ｎａｔｕｒｅ  ４４３（１４）：２１８−２２１；
【非特許文献１５】Ｂｏａｄｏ  ｅｔ  ａｌ、Ｂｉｏｔｅｃｈ  ａｎｄ  ＢｉｏＥｎｇ．９６（２）：３８１−３９１
【非特許文献１６】Ｒｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７９：７３１２−７３１６、１９８２
【非特許文献１７】Ｍｏｒｇａｎｅｔａｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：３２８−３３２、１９８６
【非特許文献１８】Ｌｅｂｒｕｎ  ｅｔ  ａｌ、Ｊ．Ｂｌ．Ｃｈｅｍ．２６８（１５）：１１２７２−１１２７７、１９９３
【非特許文献１９】Ｆｏｒｓａｙｅｔｈ  ｅｔ  ａｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：３４４８−３４５１、１９８７
【非特許文献２０】Ｆｏｒｓａｙｅｔｈ  ｅｔ  ａｌ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２（９）：４１３４−４１４０
【非特許文献２１】Ｇｏｏｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ、Ｊ．Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｒｅｓ．１４（６−８）、３８１−３９８、１９９４
【非特許文献２２】Ｇａｎｄｅｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．２８８：１９５−２０５、１９９２
【非特許文献２３】Ｓｐａｓｏｖ  ｅｔ  ａｌ、Ｂｕｌｌ．ｏｆ  Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．ａｎｄ  Ｍｅｄ．１４４（１）：４６−４８、２００７
【発明の概要】
【００１２】
本開示は、ポリペプチド結合剤、例えば、抗体またはその断片に関し、これらは、インスリンに複合化していないＩＮＳＲの細胞外の領域に結合、インスリンと複合化したＩＮＳＲに結合、またはその両方に結合することにより、インスリン−ＩＮＳＲシグナル伝達複合体を調節および／または刺激する。ＩＮＳＲは、膜結合細胞表面受容体である。
【００１３】
一態様では、本発明は、インスリンおよびインスリン受容体（ＩＮＳＲ）の間の結合親和性または結合速度パラメーターを約５倍〜２００倍強化できる、１０−５Ｍ以下の平衡解離定数ＫＤでインスリン受容体および／またはインスリンおよびインスリン受容体を含む複合体に結合する抗体を提供する。一実施形態では、抗体は、インスリンとインスリン受容体の間の結合親和性または結合速度パラメーターを約１．５倍〜約１００倍、または約２倍〜２５倍強化できる。さらに、調節は約２倍〜約５０倍、または約１．５倍〜約２５倍、または約１．５倍〜約５０倍、例えば、少なくとも１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍または２０倍、または１００倍まで、または９０倍まで、または８０倍まで、または７０倍まで、または６０倍まで、または５０倍まで、または４０倍まで、または３０まで、または２０倍まで、または１０倍まで、であることが意図されている。さらなる実施形態では、抗体は、結合親和性または結合速度パラメーターを１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５もしくは１００倍以上、またはこれらのいずれかの間の任意の範囲で強化する。一部の実施形態では、結合親和性は、ＫＡ、ＫＤ、オン速度をオフ速度で割った比率、またはオフ速度をオン速度で割った比率のいずれかである。代表的な具体的実施形態では、抗体は、ＫＡを所望の倍数だけ増加させ、またはＫＤを所望の倍数だけ減少させ、またはオン速度のオフ速度に対する比率を所望の倍数だけ増加させ、またはオフ速度のオン速度に対する比率を所望の倍数だけ減少させる。一部の実施形態では、結合速度パラメーターはオン速度またはオフ速度である。代表的な具体的実施形態では、抗体はオン速度を増加させ、またはオフ速度を減少させる。あるいは、結合親和性が検出可能なほどにはすなわち大きくは変化しない一部の実施形態では、オン速度の増加およびオフ速度の増加は、シグナル伝達経路をマイトジェンシグナル伝達から代謝シグナル伝達（グルコース取り込み）の方へ変化させ得る。
【００１４】
一実施形態では、インスリンおよびＩＮＳＲ間の結合親和性を強化する抗体は、正のモジュレーターである。
【００１５】
別の態様では、抗体はアゴニストである。
【００１６】
関連する態様では、インスリンに依存しないでＩＮＳＲを活性化する抗体は、アロステリックアゴニストである。特定の実施形態では、本発明は、少なくとも１０−５、１０−６、１０−７、１０−８、１０−９Ｍの親和性でインスリン受容体に結合し（ａ）ｐＡＫＴアッセイで測定した場合にインスリンの最大アゴニスト活性の２０％〜８０％の最大アゴニスト活性を示し、（ｂ）インスリンが存在する場合、ＩＮＳＲに対するインスリンのＥＣ５０を２倍を超えては変化させず、かつ（ｃ）インスリンが存在する場合、ＩＮＳＲに対するインスリンのＫＤを２倍を超えては変化させない、アロステリックアゴニスト抗体を提供する。
【００１７】
関連する実施形態では、アロステリックアゴニストは、インスリンの最大アゴニスト応答の８０％以下、例えば、１５％〜８０％、２０〜６０％、２０％〜４０％または１５％〜３０％である最大アゴニスト応答を示す。特定の実施形態では、インスリンの最大アゴニスト応答の少なくとも約１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％；および４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％または８０％までの最大アゴニスト応答で抗体恒常的にＩＮＳＲを活性化する。可能な組み合わせのそれぞれを列挙していないが、これらの範囲のいずれかの端点の任意の組み合わせが意図されていることは理解されよう。
【００１８】
別の態様では、本発明は、インスリンとインスリン受容体の間の結合親和性または結合速度パラメーターを約１．５倍〜１００倍弱めることができる、１０−５Ｍ以下の平衡解離定数ＫＤでインスリン受容体および／またはインスリンおよびインスリン受容体を含む複合体に結合する、抗体を提供する。一実施形態では、抗体は、インスリンとインスリン受容体の間の結合親和性または結合速度パラメーターを、約２倍〜２５倍、または１．５倍〜２５倍、または２倍〜５０倍弱めることができる。調節は、約２倍〜約５０倍、または約１．５倍〜約２５倍、または約１．５倍〜約５０倍、例えば、少なくとも１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍または２０倍、または１００倍まで、または９０倍まで、または８０倍まで、または７０倍まで、または６０倍まで、または５０倍まで、または４０倍まで、または３０倍まで、または２０倍まで、または１０倍まで、であることが意図されている。さらなる実施形態では、抗体は、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００倍以上、またはこれらの値のいずれかの間の任意の範囲で結合親和性または結合速度パラメーターを弱める。一部の実施形態では、結合親和性は、ＫＡ、ＫＤ、オン速度をオフ速度で割った比率、またはオフ速度をオン速度で割った比率のいずれかの１つである。代表的な具体的実施形態では、抗体は、所望の倍数だけＫＡを減少させ、または所望の倍数だけＫＤを増加させ、またはオン速度のオフ速度に対する比率を所望の倍数だけ減少させ、またはオフ速度のオン速度に対する比率を所望の倍数だけ増加させる。一部の実施形態では、結合速度パラメーターは、オン速度またはオフ速度である。代表的な具体的実施形態では、抗体は、オン速度を減少させまたはオフ速度を増加させる。
【００１９】
一実施形態では、インスリンおよびＩＮＳＲの間の結合親和性を弱める抗体は、負のモジュレーターである。一部の具体的実施形態では、インスリンおよびＩＮＳＲの間の結合親和性を弱める抗体はアンタゴニストである。
【００２０】
また別の実施形態では、インスリンとインスリン受容体の間の結合親和性または結合速度パラメーターを強化するまたは弱める抗体は、少なくとも１つの配列番号１５１〜３０３に示す重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）を含む。関連する実施形態では、抗体は、配列番号１５１〜３０３の成熟重鎖可変領域を含む。上記抗体のいずれかは、さらに、適切なヒトまたヒトコンセンサスまたはヒト由来定常領域、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４またはその複合型を含むことが意図されている。
【００２１】
さらなる実施形態では、インスリンとインスリン受容体の間の結合親和性または結合速度パラメーターを強化するまたは弱める抗体は、少なくとも１つの配列番号１〜１５０に示される軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、またはＬＣＤＲ３）を含む。さらに別の実施形態では、抗体は、配列番号１〜１５０の成熟軽鎖可変領域を含む。上記抗体のいずれかは、さらに、ヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常領域を含むことが意図されている。
【００２２】
一実施形態では、抗体は、インスリン受容体に結合する。関連する実施形態では、抗体は、ＩＮＳＲのαサブユニットに結合する。さらなる実施形態では、抗体は、ＩＮＳＲのβサブユニットに結合する。またさらなる別の実施形態では、抗体は、受容体のαおよびβサブユニットに結合する。関連する実施形態では、抗体は、インスリン／インスリン受容体複合体に結合する。別の実施形態では、インスリン／ＩＮＳＲ複合体に結合する抗体は、単独インスリン受容体、例えば、インスリンが無い場合、または単独インスリンに対して検出可能なほどには結合しない。 
【００２３】
別の態様では、本発明は、インスリン受容体および／またはインスリンおよびインスリン受容体を含む複合体に１０−５Ｍ以下の平衡解離定数ＫＤで特異的に結合する抗体を提供し、この抗体は、少なくとも１つの配列番号１５１〜３０３の重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）を含む。関連する実施形態では、抗体は、配列番号１５１〜３０３の重鎖可変領域を含む。上記抗体のいずれかは、さらに、適切なヒトまたはヒトコンセンサスまたはヒト由来定常領域、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４またはそれらの複合型を含むことが意図されている。
【００２４】
さらなる実施形態では、インスリン受容体および／またはインスリンおよびインスリン受容体を含む複合体に１０−５Ｍ以下の平衡解離定数ＫＤで特異的に結合する抗体は、少なくとも１つの配列番号１〜１５０に示される軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、またはＬＣＤＲ３）を含む。さらに別の実施形態では、抗体は、配列番号１〜１５０の軽鎖可変領域を含む。上記抗体のいずれかは、さらに、ヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常領域を含むことが意図されている。
【００２５】
上記抗体のいずれかは、１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つのＣＤＲを含むことが意図されている。一実施形態では、抗体は、１つ、２つ、または３つの配列番号１５１〜３０３に示される重鎖ＣＤＲを含む。別の実施形態では、抗体は、１つ、２つ、または３つのＣＤＲ配列番号１〜１５０に示される軽鎖を含む。
【００２６】
一実施形態では、抗体は、インスリン受容体に結合する。関連する実施形態では、抗体は、インスリン／ＩＮＳＲ複合体に結合する。別の実施形態では、インスリン／ＩＮＳＲ複合体に結合する抗体は、単独インスリン受容体または単独インスリンには、検出可能なほどには結合しない。
【００２７】
リン酸化ＡＫＴアッセイで、インスリンおよびインスリン受容体の結合親和性または結合速度パラメーターを強化する抗体は、インスリン受容体を、任意で、インスリンの最大シグナルの少なくとも１０％活性化することもさらに意図されている。関連する実施形態では、ＩＮＳＲは、インスリンの最大シグナルの少なくとも１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、または８０％だけ活性化される。別の実施形態では、インスリン／ＩＮＳＲの結合親和性または結合速度パラメーターを強化する抗体は、任意で、リン酸化ＡＫＴアッセイにおいて、インスリンの最大シグナルの１０％未満だけ活性化する。関連する実施形態では、ＩＮＳＲは、インスリンの最大シグナルの９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％未満だけ活性化される。一部の実施形態では、ＩＮＳＲは、検出可能なほどには抗体によって活性化されない。
【００２８】
抗体が、インスリン抵抗性に関連する高血糖、高血糖症または障害を有する対象の空腹時血糖値を正常な範囲のグルコース値に下げることがさらに意図されている。一実施形態では、正の調節抗体またはアゴニストは、対象の空腹時血糖値を約１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％以上下げる。
【００２９】
一実施形態では、抗体は、抗体またはその断片、または抗体の抗原結合ドメインを含むポリペプチドを指す。代表的抗体または抗体断片には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、多特異性抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ドメイン抗体（ｄＡｂ）、相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、ＣＤＲ−グラフト化抗体、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体断片、キメラ抗体、二重特異性抗体（ダイアボディ：ｄｉａｂｏｄｙ）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、直鎖抗体；キレート化組換え抗体、トリボディ（ｔｒｉｂｏｄｙ）またはバイボディ（ｂｉｂｏｄｙ）、細胞内抗体、ナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ）、小モジュール免疫薬剤（ＳＭＩＰ）、抗原結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質、ラクダ科化抗体、ＶＨＨ含有抗体、またはこれらの変異体もしくは誘導体、およびポリペプチドに対し少なくとも特異的抗原結合を付与するの十分な免疫グロブリンの一部、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つのＣＤＲ配列、を含むポリペプチド、が挙げられる。一実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体である。関連する実施形態では、抗体はヒト抗体である。
【００３０】
一部の具体的実施形態では、本発明は、げっ歯類抗体、すなわち、げっ歯類（例えば、マウス、ラット）細胞のハイブリドーマにより産生された抗体を除外する。ハイブリドーマによって産生されたにせよ、組換えによって産生されたにせよ、このような抗体は、げっ歯類フレームワークアミノ酸配列を有し、人に投与した場合、免疫原性を有するであろう。一部の具体的実施形態では、本発明は、次の文献の開示されているいずれのげっ歯類抗体をも除外する（これらの文献は、この参照によってその全体が組み込まれる）：Ｓｏｏｓ  ｅｔ  ａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２３５：１９９−２０８、１９８６；Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２４２：１２３−１２９、１９８７；Ｐｒｉｇｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５（１７）：９９７０−９９７７、１９９０；Ｂｒｉｎｄｌｅ  ｅｔ  ａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２６８：６１５−６２０、１９９０；Ｓｔｅｅｌｅ−Ｐｅｒｋｉｎｓ  ａｎｄ  Ｒｏｔｈ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５（１６）：９４５８−９４６３、１９９０；ＭｃＫｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ、Ｎａｔｕｒｅ  ４４３（１４）：２１８−２２１；Ｂｏａｄｏ  ｅｔ  ａｌ、Ｂｉｏｔｅｃｈ  ａｎｄ  ＢｉｏＥｎｇ．９６（２）：３８１−３９１；ＷＯ０４／０５００１６；Ｒｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７９：７３１２−７３１６、１９８２；Ｍｏｒｇａｎ  ｅｔ  ａｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８３：３２８−３３２、１９８６；Ｌｅｂｒｕｎ  ｅｔ  ａｌ、Ｊ．Ｂｌ．Ｃｈｅｍ．２６８（１５）：１１２７２−１１２７７、１９９３；Ｆｏｒｓａｙｅｔｈ  ｅｔ  ａｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：３４４８−３４５１、１９８７；Ｆｏｒｓａｙｅｔｈ  ｅｔ  ａｌ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２（９）：４１３４−４１４０、Ｇｏｏｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ、Ｊ．Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｒｅｓ．１４（６−８）、３８１−３９８、１９９４；Ｇａｎｄｅｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．２８８：１９５−２０５、１９９２；Ｓｐａｓｏｖ  ｅｔ  ａｌ、Ｂｕｌｌ．ｏｆ  Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．ａｎｄ  Ｍｅｄ．１４４（１）：４６−４８、２００７；ＥＰ２０３６５７４Ａ１。しかし、本発明は、このようなげっ歯類抗体のヒト化バージョン、このようなヒト化抗体を使った治療方法、およびこのようなヒト化抗体を含む無菌の医薬組成物を含んでもよい。一部の具体的実施形態では、本発明は、Ｂｏａｄｏ  ｅｔ  ａｌ、Ｂｉｏｔｅｃｈ  ａｎｄ  ＢｉｏＥｎｇ．９６（２）：３８１−３９１またはＷＯ０４／０５００１６で、報告されているヒト化抗体８３〜１４を除外する。
【００３１】
代表的実施形態では、本発明で、以下が意図されている：
【００３２】
それぞれ配列番号１５１〜３０３および配列番号１〜１５０のいずれかのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、またはＬＣＤＲ３の内の任意の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つを保持し、任意で、このようなＣＤＲ中に１つまたは２つの変異、例えば、保存的または非保存的置換を含み、かつ任意で、表３で示すように対を形成しているモノクローナル抗体；
【００３３】
配列番号１５１〜３０３のいずれかの１つのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、または重鎖可変領域の全てを保持し、任意で、このようなＣＤＲのいずれかに１つまたは２つの変異を含み、任意で、適切な任意の重鎖定常領域、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、もしくはＩｇＥまたはそれらの複合型をさらに含むモノクローナル抗体；
【００３４】
配列番号１〜１５０のいずれかの１つのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、または軽鎖可変領域の全てを保持し、任意で、このようなＣＤＲのいずれかの１つに、１つまたは２つの変異を含み、任意で、任意の適切な軽鎖定常領域、例えば、カッパまたはラムダ軽鎖定常領域をさらに含むモノクローナル抗体；
【００３５】
配列番号１〜３０３に示され、かつ表３で示すように対を形成している、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体の精製品；
【００３６】
配列番号１〜３０３に記載の可変領域、例えば、Ｘ−線結晶学または他の生物物理学的または生物化学的技術、例えば、重水素交換質量分析、アラニンスキャニングおよびペプチド断片ＥＬＩＳＡ、により決定されるような可変領域を含む抗体と同じＩＮＳＲの直鎖または３次元エピトープに結合したモノクローナル抗体；
【００３７】
任意で表３で示すように対を形成している、ヒトＩＮＳＲとの結合に対して、約７５％超、約８０％超、または約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％もしくは９５％超、配列番号１〜３０３に記載の可変領域を含む抗体と競合するモノクローナル抗体。
【００３８】
一部の実施形態では、抗体は、配列番号１〜３０３に記載の可変領域を含む抗体の３つの軽鎖ＣＤＲ全て、３つの重鎖ＣＤＲ全て、または６つのＣＤＲ全てを含む。一部の代表的実施形態では、１つの抗体由来の２つの軽鎖ＣＤＲを異なる抗体由来の第３の軽鎖ＣＤＲと組み合わせることができる。あるいは、１つの抗体由来のＬＣＤＲ１が、これらＣＤＲが高度に相同であり場合には、特に、異なる抗体抗体由来のＬＣＤＲ２およびさらに別の抗体由来のＬＣＤＲ３と組み合わせることができる。同様に、１つの抗体由来の２つの重鎖ＣＤＲを異なる抗体由来の第３の重鎖ＣＤＲと組み合わせることができる；または１つの抗体由来のＨＣＤＲ１が、これらＣＤＲが高度に相同であり場合には、特に、異なる抗体抗体由来のＨＣＤＲ２およびさらに別の抗体由来のＨＣＤＲ３と組み合わせることができる。
【００３９】
コンセンサスＣＤＲも、使用可能である。本明細書に由来するコンセンサスＣＤＲのいずれかの１つを、本明細書記載の抗体のいずれかの同じ鎖（例えば、重鎖または軽鎖）由来の２つの他のＣＤＲと組み合わせて、例えば、適切な重鎖または軽鎖可変領域を形成してもよい。
【００４０】
別の態様では、本発明は、本明細書記載の抗体の変異体または誘導体を提供する。例えば、一実施形態では、抗体は、本明細書記載の検出可能成分で標識付けされている。さらなる実施形態では、抗体は、本明細書記載の疎水性の成分に結合されている。
【００４１】
抗体の変異体には、本明細書で提供されているアミノ酸配列に対するアミノ酸挿入、欠失または置換、例えば、保存的または非保存的置換を含む、変異または変化を有する抗体が含まれる。
【００４２】
一部の実施形態では、配列番号１５１〜３０３に示される重鎖可変領域に対し、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上同一のアミノ酸配列および／または配列番号１〜１５０に示される軽鎖可変領域に対し、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上一致するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、その抗体がＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２またはＣＤＲＬ３のうち少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは全てをさらに含む抗体が提供される。一部の実施形態では、軽鎖可変領域に対しある割合の同一性を有するアミノ酸配列は、１つ、２つまたは３つの軽鎖ＣＤＲを含むことができる。他の実施形態では、重鎖可変領域に対しある割合の同一性を有するアミノ酸配列は、１つ、２つまたは３つの重鎖ＣＤＲを含むことができる。
【００４３】
本発明の抗体は、抗体のＣＤＲ領域で、１つ、または２つ以上のアミノ酸置換、例えば、保存的置換、を持つことができることが意図されている。
【００４４】
関連する実施形態では、フレームワークの残基が変えられている。変更可能な重鎖フレームワーク領域は、Ｈ−ＦＲ１、Ｈ−ＦＲ２、Ｈ−ＦＲ３およびＨ−ＦＲ４と名付けられた重鎖ＣＤＲ残基を取り囲む領域内にあり、変更可能な軽鎖フレームワーク領域の残基は、Ｌ−ＦＲ１、Ｌ−ＦＲ２、Ｌ−ＦＲ３、およびＬ−ＦＲ４と名付けられた軽鎖ＣＤＲ残基を取り囲む領域内にある。フレームワーク領域内のアミノ酸は、例えば、ヒトフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワーク中で特定された任意の適切なアミノ酸で置換可能である。
【００４５】
本発明では、いずれか１つの配列番号１５１〜３０３のアミノ酸配列に融合したいずれか１つの配列番号１〜１５０のアミノ酸配列を、任意で、表３に示される重鎖／軽鎖可変領域として対を形成して含み、または少なくとも配列番号１〜１５０および配列番号１５１〜３０３の一部を含むその断片を、任意で、表３に示される対を形成して含む精製ポリペプチドを提供することがさらに意図され、そのポリペプチドは、インスリン受容体、インスリンまたはインスリン／インスリン受容体複合体に結合している。
【００４６】
いずれか１つの配列番号１〜３０３中の抗原結合断片の全部または一部を含むポリペプチドを含む本発明の抗体は、例えば、ＫＤ値で、任意で表面プラズモン共鳴法で測定して、１０−５、１０−６、１０−７、１０−８、１０−９Ｍまたはそれ以下（小さい値が高い結合親和性を示す）のインスリン受容体、インスリンまたはインスリン／ＩＮＳＲの複合体に対する結合親和性を保持することが意図されている。
【００４７】
一部の前述の実施形態では、本発明では、インスリンとインスリン受容体の間の結合親和性を約５倍〜５００倍強化することができる、１０−５Ｍ以下の平衡解離定数ＫＤでインスリン受容体および／またはインスリンおよびインスリン受容体を含む複合体に結合する抗体が考慮されている。一実施形態では、抗体は、以下の平衡解離定数ＫＤ結合特性を特徴とする：（ｉ）前記抗体は、約１０−５Ｍ、１０−６、１０−７、１０−８、１０−９１０−１０、１０−１１Ｍまたはそれ以下の平衡解離定数ＫＤでインスリン（Ｃ１）およびインスリン受容体（Ｃ２）を含む複合体に結合する；さらに（ｉｉ）Ｋ［Ｃ１Ｃ２］Ａ、Ｋ［ＡＣ２］Ｃ１、またはＫ［ＡＣ１］Ｃ２のいずれかは、ＫＡＣ２またはＫＡＣ１のいずれかより少なくとも約５倍小さい。関連する実施形態では、Ｋ［Ｃ１Ｃ２］Ａ、Ｋ［ＡＣ２］Ｃ１、またはＫ［ＡＣ１］Ｃ２のいずれかは、ＫＡＣ２またはＫＡＣ１のいずれかよりは約５倍〜２００倍小さい。
【００４８】
一部の実施形態では、抗体は、インスリン／インスリン受容体複合体に結合する。さらなる実施形態では、抗体は、複合化されない形で単独インスリン受容体に結合する。関連する実施形態では、抗体は、単独インスリン受容体には、例えばインスリンのない場合、検出可能なほどには結合しない。特定の実施形態では、抗体は、インスリンとインスリン受容体の間の結合親和性を、少なくとも約５倍、任意で約２００倍まで、任意で約１００倍まで強化することができる。一部の実施形態では、結合親和性は、ＫＡ、ＫＤ、オン速度のオフ速度に対する比率、またはオフ速度のオン速度に対する比率のいずれかの１つであることが提供される。
【００４９】
一部の実施形態では、抗体本明細書記載のいずれかの抗体に対し、結合親和性または結合速度パラメーターの差は、約１．５倍〜約１０００倍、または約１．５倍〜約５００倍、約１．５倍〜約１００倍、または約２倍〜２５倍、または約２倍〜約５０倍、または約１．５倍〜約２５倍、または約１．５倍〜約５０倍、約５倍〜約５００倍、または約５倍〜約２００倍、例えば、少なくとも約１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍または２０倍、または５００倍まで、または２００倍まで、または１５０倍まで、または１００倍まで、または９０倍まで、または８０倍まで、または７０倍まで、または６０倍まで、または５０倍まで、または４０倍まで、３０倍まで、２０倍まで、または１０倍まで、または５倍までまたは３倍までの範囲である。
【００５０】
一部の実施形態では、本発明は、例えば、１０−５、１０−６、１０−７、１０−８、１０−９１０−１０、１０−１１Ｍまたはそれ以下のＫＤの親和性でインスリン受容体に結合し、任意でｐＡＫＴアッセイで測定した場合にインスリンの最大アゴニスト活性の２０％〜１００％の最大アゴニスト活性を示す、アゴニスト抗体を提供する。関連する態様では、本発明は、例えば、１０−５、１０−６、１０−７、１０−８、１０−９１０−１０、１０−１１Ｍまたはそれ以下のＫＤ．の親和性でインスリン受容体に結合し、さらに（ａ）ｐＡＫＴアッセイで測定してインスリンの最大アゴニスト活性の２０％〜８０％の最大アゴニスト活性を示し、（ｂ）インスリンが存在する場合は、インスリンのＩＮＳＲに対するＥＣ５０を２倍または３倍を超えて変化させず、また、（ｃ）インスリンが存在する場合は、インスリンのＩＮＳＲに対するＫＤを２倍または３倍を超えて変化させない、アロステリックアゴニスト抗体が意図されている。一部の実施形態では、結合親和性が、ＫＡ、ＫＤ、オン速度のオフ速度に対する比率、またはオフ速度のオン速度に対する比率のいずれかであることが提供される。
【００５１】
特定の実施形態では、上述の抗体のいずれも、また、弱いアゴニスト活性を示し、例えば、リン酸化ＡＫＴアッセイを使って任意で測定して、インスリンの最大シグナルの少なくとも１０％だけインスリン受容体を活性化することができることが意図されている。さらなる実施形態では、抗体は、リン酸化ＡＫＴアッセイを使って任意で測定して、インスリンの最大シグナルの１０％未満だけインスリン受容体を活性化する。
【００５２】
一部の実施形態では、抗体は、配列番号、２８１、２７８、２７７、２０９、２７５、２２３、２８４、２７６、および２３６に示される成熟重鎖可変領域配列からなる群より選択される重鎖可変領域ならびに配列番号１４１、１３８、１３７、３５、１３５、５７、１４４、１３６、および９８に示される成熟軽鎖変数配列からなる群より選択される軽鎖可変領域を、任意で表３に示す対を形成して、含む。
【００５３】
別の実施形態では、抗体は、（ａ）任意で表３で示すように対を形成している、Ａｂ００６、Ａｂ０３０、Ａｂ００４、Ａｂ０１３、Ａｂ００９、Ａｂ００７、Ａｂ０１１、Ａｂ００１、Ａｂ０１２、Ａｂ０１０、Ａｂ００３、Ａｂ００８、Ａｂ００２、Ａｂ００５、Ａｂ０７６、Ａｂ０７７、Ａｂ０７９、Ａｂ０８０、Ａｂ０８３、Ａｂ０５９、Ａｂ０７８、Ａｂ０８５の、または配列番号２９１、１９６、２３９、２６７および２７１に示される領域のいずれかの重鎖可変領域ならびにＡｂ００６、Ａｂ０３０、Ａｂ００４、Ａｂ０１３、Ａｂ００９、Ａｂ００７、Ａｂ０１１、Ａｂ００１、Ａｂ０１２、Ａｂ０１０、Ａｂ００３、Ａｂ００８、Ａｂ００２、Ａｂ００５、Ａｂ０７６、Ａｂ０７７、Ａｂ０７９、Ａｂ０８０、Ａｂ０８３、Ａｂ０５９、Ａｂ０７８、Ａｂ０８５の、または配列番号７６、８０、１０１、１２８、および１３２に示される領域のいずれかの軽鎖可変領域、好ましくは、それらの成熟部分、または（ｂ）任意で表３で示すように対を形成している、Ａｂ００６、Ａｂ０３０、Ａｂ００４、Ａｂ０１３、Ａｂ００９、Ａｂ００７、Ａｂ０１１、Ａｂ００１、Ａｂ０１２、Ａｂ０１０、Ａｂ００３、Ａｂ００８、Ａｂ００２、Ａｂ００５、Ａｂ０７６、Ａｂ０７７、Ａｂ０７９、Ａｂ０８０、Ａｂ０８３、Ａｂ０５９、Ａｂ０７８、Ａｂ０８５の、または配列番号２９１、１９６、２３９、２６７および２７１に示される領域のいずれかの１つ、２つもしくは３つの重鎖ＣＤＲおよび／またはＡｂ００６、Ａｂ０３０、Ａｂ００４、Ａｂ０１３、Ａｂ００９、Ａｂ００７、Ａｂ０１１、Ａｂ００１、Ａｂ０１２、Ａｂ０１０、Ａｂ００３、Ａｂ００８、Ａｂ００２、Ａｂ００５、Ａｂ０７６、Ａｂ０７７、Ａｂ０７９、Ａｂ０８０、Ａｂ０８３、Ａｂ０５９、Ａｂ０７８、Ａｂ０８５の、または配列番号７６、８０、１０１、１２８、および１３２に示される領域のいずれかの１つ、２つもしくは３つの軽鎖ＣＤＲであって、任意で、いずれか１つ、２つまたは３つのこのような重鎖または軽鎖ＣＤＲに、１つまたは２つの変異、例えば、保存的または非保存的置換が含まれる、重鎖および／または軽鎖ＣＤＲ；または（ｃ）任意で表３で示すように対を形成している、Ａｂ００６、Ａｂ０３０、Ａｂ００４、Ａｂ０１３、Ａｂ００９、Ａｂ００７、Ａｂ０１１、Ａｂ００１、Ａｂ０１２、Ａｂ０１０、Ａｂ００３、Ａｂ００８、Ａｂ００２、Ａｂ００５、Ａｂ０７６、Ａｂ０７７、Ａｂ０７９、Ａｂ０８０、Ａｂ０８３、Ａｂ０５９、Ａｂ０７８、Ａｂ０８５または配列番号７６、８０、１０１、１２８、１３２、２９１、１９６、２３９、２６７、および２７１に示される可変領域を有するいずれかの抗体の６つのＣＤＲ全て、を含む。
【００５４】
他の実施形態では、本発明は、本明細書記載のいずれかの抗体と、例えば、少なくとも７０％、７５％、または８０％の競合を行う抗体を提供する。特定の実施形態では、抗体は、Ａｂ０７９、Ａｂ０７６、Ａｂ０８３、Ａｂ０８０、Ａｂ０６２、Ａｂ０２０、Ａｂ０１９、Ａｂ０８８、およびＡｂ０８９からなる群より選択されるいずれか１つ、２つ、３つまたは全ての抗体に対して７０％以上の競合、例えば、少なくとも７５％または少なくとも８０％競合を示し、さらに、任意でＡｂ０８６、Ａｂ０６４、Ａｂ００１、およびＡｂ０１８からなる群より選択されるいずれか１つ、２つ、３つまたは全ての抗体に対して３０％以上の競合を示す。任意で、抗体は、１つまたは複数のＡｂ０６２およびＡｂ０８６と競合せず、また、任意で、ヒトおよびマウスの両方のインスリン受容体または複合体に結合することができる。
【００５５】
関連する実施形態では、抗体は、Ａｂ０４０、Ａｂ０６２、Ａｂ０３０、Ａｂ００１、およびＡｂ０１８からなる群より選択されるいずれか１つ、２つ、３つまたは全ての抗体に対して７０％以上の競合、例えば、少なくとも７５％または少なくとも８０％の競合を示し、さらに、任意で、Ａｂ０３７、Ａｂ０７８、Ａｂ０８３、Ａｂ０８０、およびＡｂ０８５からなる群より選択されるいずれか１つ、２つ、３つまたは全ての抗体に対して３０％以上の競合を示す。関連する実施形態では、抗体は、Ａｂ０５３、Ａｂ０６４、８３−７、Ａｂ０１９、Ａｂ０８８、およびＡｂ０８９からなる群より選択されるいずれか１つ、２つ、または３つ以上の抗体に対して競合しない。任意で、抗体は、ヒトおよびマウスの両方のインスリン受容体または複合体に結合する。別の実施形態では、抗体は、Ａｂ０６４、Ａｂ０６２、Ａｂ０８５、およびＡｂ０７８からなる群より選択されるいずれか１つ、２つ、３つまたは全ての抗体に対して７０％以上の競合、例えば、少なくとも７５％または少なくとも８０％の競合を示す。任意で、抗体は、Ａｂ０７７、Ａｂ００１、Ａｂ０１８、Ａｂ０３０、Ａｂ０３７、Ａｂ０７９、Ａｂ０７６、Ａｂ０８３、Ａｂ０１９、Ａｂ０８８、Ａｂ０８９、およびＡｂ０４０からなる群より選択されるいずれか１つ、２つ、または３つ以上の抗体に対して競合を示さない。任意で、抗体は、ヒトおよびマウスの両方のインスリン受容体または複合体に結合する。
【００５６】
さらなる態様では、本発明は、インスリンとインスリン受容体の間の結合親和性を少なくとも約３倍、任意で、１０００倍まで弱めることができる、１０−５Ｍ以下の平衡解離定数ＫＤでインスリン受容体および／またはインスリンおよびインスリン受容体を含む複合体に結合する、抗体を提供する。特定の実施形態では、抗体は、前記インスリンおよびインスリン受容体の間の親和性を約３倍〜５００倍弱める。一部の実施形態では、結合親和性は、ＫＡ、ＫＤ、オン速度のオフ速度に対する比率、またはオフ速度のオン速度に対する比率のいずれかの１つである。
【００５７】
一部の実施形態では、本明細書記載のいずれかの抗体に対し、結合親和性または結合速度パラメーターの差は、約１．５倍〜約１０００倍、または約１．５倍〜約５００倍、約１．５倍〜約１００倍、または約２倍〜２５倍、または約２倍〜約５０倍、または約１．５倍〜約２５倍、または約１．５倍〜約５０倍、約５倍〜約５００倍、または約５倍〜約２００倍、例えば、少なくとも約１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍または２０倍、または５００倍まで、または２００倍まで、または１５０倍まで、または１００倍まで、または９０倍まで、または８０倍まで、または７０倍まで、または６０倍まで、または５０倍まで、または４０倍まで、３０倍まで、２０倍まで、または１０倍まで、または５倍まで、または３倍まで、の範囲である。
【００５８】
関連する実施形態では、抗体は、インスリンシグナル伝達活性のＥＣ５０を、任意でｐＡＫＴアッセイにおいて、約２倍〜１０００倍増加させる。特定の実施形態では、抗体は、ＥＣ５０を少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０または１０００倍増加させる。
【００５９】
特定の実施形態では、抗体は、任意で表３で示すように対を形成している、配列番号２４１、２７９、２５８、１５５、および２２８に示される成熟重鎖可変領域配列からなる群より選択される重鎖可変領域、ならびに、配列番号１０３、１３９、１１９、８、および８９に示される成熟軽鎖可変領域配列からなる群より選択される軽鎖可変領域を、含む。
【００６０】
さらなる実施形態では、抗体は、（ａ）Ａｂ０８７、Ａｂ０１９、Ａｂ０８８、Ａｂ０８９、Ａｂ０２０、Ａｂ０５０、Ａｂ０５２、Ａｂ０５５、Ａｂ０５７、Ａｂ０６１、Ａｂ０６３、Ａｂ０６５、Ａｂ０７０、Ａｂ０７２、Ａｂ０７４、Ａｂ０８１のいずれかの重鎖可変領域およびＡｂ０８７、Ａｂ０１９、Ａｂ０８８、Ａｂ０８９、Ａｂ０２０、Ａｂ０５０、Ａｂ０５２、Ａｂ０５５、Ａｂ０５７、Ａｂ０６１、Ａｂ０６３、Ａｂ０６５、Ａｂ０７０、Ａｂ０７２、Ａｂ０７４、Ａｂ０８１のいずれかの軽鎖可変領域、好ましくはその成熟部分、または（ｂ）Ａｂ０８７、Ａｂ０１９、Ａｂ０８８、Ａｂ０８９、Ａｂ０２０、Ａｂ０５０、Ａｂ０５２、Ａｂ０５５、Ａｂ０５７、Ａｂ０６１、Ａｂ０６３、Ａｂ０６５、Ａｂ０７０、Ａｂ０７２、Ａｂ０７４、Ａｂ０８１のいずれかの１つ、２つもしくは３つの重鎖ＣＤＲおよび／またはＡｂ０８７、Ａｂ０１９、Ａｂ０８８、Ａｂ０８９、Ａｂ０２０、Ａｂ０５０、Ａｂ０５２、Ａｂ０５５、Ａｂ０５７、Ａｂ０６１、Ａｂ０６３、Ａｂ０６５、Ａｂ０７０、Ａｂ０７２、Ａｂ０７４、Ａｂ０８１のいずれかの１つ、２つもしくは３つの軽鎖ＣＤＲであって、任意で、いずれか１つ、２つまたは３つのこのような重鎖または軽鎖ＣＤＲに、１つまたは２つの変異、例えば、保存的または非保存的置換が含まれる、重鎖および／または軽鎖ＣＤＲ；または（ｃ）Ａｂ０８７、Ａｂ０１９、Ａｂ０８８、Ａｂ０８９、Ａｂ０２０、Ａｂ０５０、Ａｂ０５２、Ａｂ０５５、Ａｂ０５７、Ａｂ０６１、Ａｂ０６３、Ａｂ０６５、Ａｂ０７０、Ａｂ０７２、Ａｂ０７４、Ａｂ０８１のいずれかの抗体の６つのＣＤＲ全て、を含む。
【００６１】
さらなる実施形態では、本発明は、上記の抗体と競合する抗体を提供し、そこでは、抗体は、Ａｂ０７９、Ａｂ０７６、Ａｂ０８３、Ａｂ０８０、Ａｂ０６２、およびＡｂ０２０、Ａｂ０１９、Ａｂ０８８、Ａｂ０８９からなる群より選択されるいずれか１つ、２つ、３つまたは全ての抗体に対して、７０％以上の競合、例えば、少なくとも７５％または少なくとも８０％の競合を示す。任意で、抗体は、Ａｂ０６２、Ａｂ０８６、Ａｂ００１、Ａｂ０１８、Ａｂ０３０、Ａｂ０３７、Ａｂ０６４からなる群より選択されるいずれか１つ、２つ、または３つ以上の抗体と競合を示さす；さらに、任意で、抗体は、ヒト反応性のみを示し、マウスインスリン受容体または複合体とは結合しない。
【００６２】
一実施形態では、本発明は、アゴニストである抗体を適用し、抗体は、表３で示すように対を形成している、配列番号１９５、２２０、３０３、１９７、２０８、２４３、２４５および２５１に示される成熟重鎖可変領域配列からなる群より選択される重鎖可変領域ならびに配列番号７７、５０、９０、８４、３４、１０４、１０６および１１２に示される成熟軽鎖可変領域配列からなる群より選択される軽鎖可変領域を、含む。
【００６３】
関連する実施形態では、抗体は、（ａ）任意で表３で示すように対を形成している、配列番号２５２、２５３、２６３、２６５および２６９に示されるＡｂ０２１、Ａｂ０２９、Ａｂ０２２、Ａｂ０１７、Ａｂ０２３、Ａｂ０２４、Ａｂ０２５、Ａｂ０２６、Ａｂ０３１、Ａｂ０３５、Ａｂ０２７、Ａｂ０３６、Ａｂ０３７、Ａｂ０２８、Ａｂ０３８、Ａｂ０３９、Ａｂ０４０、Ａｂ０４１、Ａｂ０４２、Ａｂ０３２、Ａｂ０４３、Ａｂ０４４、Ａｂ０４５、Ａｂ０４６、Ａｂ０４７、Ａｂ０１８、Ａｂ０３３、Ａｂ０４８、Ａｂ０１４、Ａｂ０１５、Ａｂ０４９、Ａｂ０３４、Ａｂ０５１、Ａｂ０５３、Ａｂ０５４、Ａｂ０５６、Ａｂ０５８、Ａｂ０６２、Ａｂ０６４、Ａｂ０６６、Ａｂ０６７、Ａｂ０６８、Ａｂ０８６、Ａｂ０６９、Ａｂ０７１、Ａｂ０７３、Ａｂ０７５、Ａｂ０８２、Ａｂ０８４のいずれかの重鎖可変領域、ならびにＡｂ０２１、Ａｂ０２９、Ａｂ０２２、Ａｂ０１７、Ａｂ０２３、Ａｂ０２４、Ａｂ０２５、Ａｂ０２６、Ａｂ０３１、Ａｂ０３５、Ａｂ０２７、Ａｂ０３６、Ａｂ０３７、Ａｂ０２８、Ａｂ０３８、Ａｂ０３９、Ａｂ０４０、Ａｂ０４１、Ａｂ０４２、Ａｂ０３２、Ａｂ０４３、Ａｂ０４４、Ａｂ０４５、Ａｂ０４６、Ａｂ０４７、Ａｂ０１８、Ａｂ０３３、Ａｂ０４８、Ａｂ０１４、Ａｂ０１５、Ａｂ０４９、Ａｂ０３４、Ａｂ０５１、Ａｂ０５３、Ａｂ０５４、Ａｂ０５６、Ａｂ０５８、Ａｂ０６２、Ａｂ０６４、Ａｂ０６６、Ａｂ０６７、Ａｂ０６８、Ａｂ０８６、Ａｂ０６９、Ａｂ０７１、Ａｂ０７３、Ａｂ０７５、Ａｂ０８２、Ａｂ０８４または配列番号７、１１３、１１４、１２４、１２６および１３０に示される領域のいずれかの軽鎖可変領域、好ましくはその成熟部分、または（ｂ）任意で表３で示すように対を形成している、Ａｂ０２１、Ａｂ０２９、Ａｂ０２２、Ａｂ０１７、Ａｂ０２３、Ａｂ０２４、Ａｂ０２５、Ａｂ０２６、Ａｂ０３１、Ａｂ０３５、Ａｂ０２７、Ａｂ０３６、Ａｂ０３７、Ａｂ０２８、Ａｂ０３８、Ａｂ０３９、Ａｂ０４０、Ａｂ０４１、Ａｂ０４２、Ａｂ０３２、Ａｂ０４３、Ａｂ０４４、Ａｂ０４５、Ａｂ０４６、Ａｂ０４７、Ａｂ０１８、Ａｂ０３３、Ａｂ０４８、Ａｂ０１４、Ａｂ０１５、Ａｂ０４９、Ａｂ０３４、Ａｂ０５１、Ａｂ０５３、Ａｂ０５４、Ａｂ０５６、Ａｂ０５８、Ａｂ０６２、Ａｂ０６４、Ａｂ０６６、Ａｂ０６７、Ａｂ０６８、Ａｂ０８６、Ａｂ０６９、Ａｂ０７１、Ａｂ０７３、Ａｂ０７５、Ａｂ０８２、Ａｂ０８４または配列番号２５２、２５３、２６３、２６５および２６９に示される領域のいずれかの１つ、２つもしくは３つの重鎖ＣＤＲおよび／またはＡｂ０２１、Ａｂ０２９、Ａｂ０２２、Ａｂ０１７、Ａｂ０２３、Ａｂ０２４、Ａｂ０２５、Ａｂ０２６、Ａｂ０３１、Ａｂ０３５、Ａｂ０２７、Ａｂ０３６、Ａｂ０３７、Ａｂ０２８、Ａｂ０３８、Ａｂ０３９、Ａｂ０４０、Ａｂ０４１、Ａｂ０４２、Ａｂ０３２、Ａｂ０４３、Ａｂ０４４、Ａｂ０４５、Ａｂ０４６、Ａｂ０４７、Ａｂ０１８、Ａｂ０３３、Ａｂ０４８、Ａｂ０１４、Ａｂ０１５、Ａｂ０４９、Ａｂ０３４、Ａｂ０５１、Ａｂ０５３、Ａｂ０５４、Ａｂ０５６、Ａｂ０５８、Ａｂ０６２、Ａｂ０６４、Ａｂ０６６、Ａｂ０６７、Ａｂ０６８、Ａｂ０８６、Ａｂ０６９、Ａｂ０７１、Ａｂ０７３、Ａｂ０７５、Ａｂ０８２、Ａｂ０８４または配列番号７、１１３、１１４、１２４、１２６および１３０に示される領域のいずれかの１つ、２つまたは３つの軽鎖ＣＤＲであって、任意で、いずれか１つ、２つまたは３つのこのような重鎖または軽鎖ＣＤＲに、１つまたは２つの変異、例えば、保存的または非保存的置換が含まれる、重鎖および／または軽鎖ＣＤＲ；（ｃ）任意で表３で示すように対を形成している、Ａｂ０２１、Ａｂ０２９、Ａｂ０２２、Ａｂ０１７、Ａｂ０２３、Ａｂ０２４、Ａｂ０２５、Ａｂ０２６、Ａｂ０３１、Ａｂ０３５、Ａｂ０２７、Ａｂ０３６、Ａｂ０３７、Ａｂ０２８、Ａｂ０３８、Ａｂ０３９、Ａｂ０４０、Ａｂ０４１、Ａｂ０４２、Ａｂ０３２、Ａｂ０４３、Ａｂ０４４、Ａｂ０４５、Ａｂ０４６、Ａｂ０４７、Ａｂ０１８、Ａｂ０３３、Ａｂ０４８、Ａｂ０１４、Ａｂ０１５、Ａｂ０４９、Ａｂ０３４、Ａｂ０５１、Ａｂ０５３、Ａｂ０５４、Ａｂ０５６、Ａｂ０５８、Ａｂ０６２、Ａｂ０６４、Ａｂ０６６、Ａｂ０６７、Ａｂ０６８、Ａｂ０８６、Ａｂ０６９、Ａｂ０７１、Ａｂ０７３、Ａｂ０７５、Ａｂ０８２、Ａｂ０８４の、または配列番号７、１１３、１１４、１２４、１２６、１３０、２５２、２５３、２６３、２６５および２６９に示されるいずれかの抗体の６つのＣＤＲ全て、を含む。
【００６４】
関連する実施形態では、本発明は、標的との結合に関して上記抗体と競合する抗体を提供し、抗体は、Ａｂ０３０、Ａｂ０３７、Ａｂ０５３、Ａｂ００１、Ａｂ０１８、Ａｂ０６４、Ａｂ０４０からなる群より選択されるいずれか１つ、２つ、３つまたは全ての抗体に対して７０％以上の競合、例えば、少なくとも７５％または少なくとも８０％の競合を示し、さらに、任意で、Ａｂ０８５およびＡｂ０８６からなる群より選択されるいずれか１つ、２つ、３つまたは全ての抗体に対して、３０％以上の競合を示す。任意で、抗体は、Ａｂ０７９、Ａｂ０７６およびＡｂ０８８からなる群より選択されるいずれか１つ、２つ、または３つ以上の抗体に対して、競合を示さず；ならびに任意で、ヒトおよびマウス両方のインスリン受容体または複合体に結合する。
【００６５】
別の態様では、本発明は、抗体および本発明のポリペプチドをコードしたポリヌクレオチド、このようなポリヌクレオチドを含むベクター、このようなポリヌクレオチドまたはベクターを含有する宿主細胞、ならびに本発明の抗体およびポリペプチドを産生する方法を提供する。この方法は、このような宿主細胞を適切な条件下培地中で成長させ、任意で、宿主細胞または培地からコード化抗体またはポリペプチドを単離し、任意で、続けて、例えば、本明細書記載の、抗体またはポリペプチドのさらなる精製を行うことを含む。
【００６６】
本明細書記載の特性を有する抗体は、ＩＮＳＲに対する結合およびインスリン／ＩＮＳＲ複合体の調節を測定する選別方法を使って単離可能である。
【００６７】
一実施形態では、本発明は、シグナル伝達複合体の第２の成分（Ｃ２）に対する第１の成分（Ｃ１）の結合を強化する正の調節抗体を提供し、前記抗体は、次の平衡解離定数ＫＤの結合特性を特徴とする：（ｉ）前記抗体は、約１０−５Ｍ以下、例えば、１０−６Ｍ以下、または１０−７Ｍ以下、または１０−８Ｍ以下の平衡解離定数ＫＤで、Ｃ１、Ｃ２、またはＣ１およびＣ２（Ｃ１Ｃ２）を含む複合体のいずれかの１つに結合する；および（ｉｉ）Ｋ［Ｃ１Ｃ２］Ａ、Ｋ［ＡＣ２］Ｃ１、またはＫ［ＡＣ１］Ｃ２のいずれかは、ＫＡＣ２またはＫＡＣ１のいずれかよりも少なくとも約５０％（１．５倍）小さい。一部の実施形態では、Ｋ［Ｃ１Ｃ２］Ａ、Ｋ［ＡＣ２］Ｃ１、またはＫ［ＡＣ１］Ｃ２のいずれかは、ＫＡＣ２またはＫＡＣ１のいずれかよりも約１．５倍〜約１００倍小さい；または約２倍〜２５倍、または約２倍〜約５０倍、または約１．５倍〜約２５倍、または約１．５倍〜約５０倍、例えば、少なくとも約１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍または２０倍、または約１００倍まで、または約９０倍まで、または約８０倍まで、または約７０倍まで、または約６０倍まで、または約５０倍まで、または約４０倍まで、または約３０倍まで、または約２０倍まで、または約１０倍まで、小さい。一部の実施形態では、Ｋ［Ｃ１Ｃ２］Ａ、Ｋ［ＡＣ２］Ｃ１、またはＫ［ＡＣ１］Ｃ２のいずれかは、少なくともＫＡＣ２またはＫＡＣ１の両方よりも約１．５倍小さい；または１．５倍〜約１００倍小さい、または約２倍〜２５倍、または約２倍〜約５０倍、または約１．５倍〜約２５倍、または約１．５倍〜約５０倍、例えば、少なくとも約１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍または２０倍、または約１００倍、または約９０倍まで、または約８０倍まで、または約７０倍まで、または約６０倍まで、または約５０倍まで、または約４０倍まで、または約３０倍まで、または約２０倍まで、または約１０倍まで、小さい。
【００６８】
一部の実施形態では、本発明は、シグナル伝達複合体の第２の成分（Ｃ２）に対する第１の成分（Ｃ１）の結合を弱める負の調節抗体を提供し、前記抗体は、次の平衡解離定数ＫＤの結合特性を特徴とする：（ｉ）前記抗体は、約１０−５Ｍ以下、例えば、１０−６Ｍ以下、または１０−７Ｍ以下、または１０−８Ｍ以下の平衡解離定数ＫＤで、Ｃ１、Ｃ２、またはＣ１およびＣ２（Ｃ１Ｃ２）を含む複合体のいずれかの１つに結合する；および（ｉｉ）ＫＡＣ２またはＫＡＣ１のいずれかは、Ｋ［Ｃ１Ｃ２］Ａ、Ｋ［ＡＣ２］Ｃ１、またはＫ［ＡＣ１］Ｃ２のいずれかよりも少なくとも約５０％（１．５倍）小さい。一部の実施形態では、ＫＡＣ２またはＫＡＣ１のいずれかは、Ｋ［Ｃ１Ｃ２］Ａ、Ｋ［ＡＣ２］Ｃ１、またはＫ［ＡＣ１］Ｃ２のいずれかよりも少なくとも約１．５倍〜１００倍小さい；または約２倍〜２５倍、または約２倍〜約５０倍、または約１．５倍〜約２５倍、または約１．５倍〜約５０倍、例えば、少なくとも約１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍または２０倍、または約１００倍まで、または約９０倍まで、または約８０倍まで、または約７０倍まで、または約６０倍まで、または約５０倍まで、または約４０倍まで、または約３０倍まで、または約２０倍まで、または約１０倍まで、小さい。一部の実施形態では、ＫＡＣ２またはＫＡＣ１のいずれかは、Ｋ［Ｃ１Ｃ２］Ａ、Ｋ［ＡＣ２］Ｃ１、またはＫ［ＡＣ１］Ｃ２の全てよりも少なくとも約１．５倍小さい；または１．５倍〜約１００倍小さい、または約２倍〜２５倍、または約２倍〜約５０倍、または約１．５倍〜約２５倍、または約１．５倍〜約５０倍、例えば、少なくとも約１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍または２０倍、または約１００倍まで、または約９０倍まで、または約８０倍まで、または約７０倍まで、または約６０倍まで、または約５０倍まで、または約４０倍まで、または約３０倍まで小さい、または約２０倍まで、または約１０倍まで、小さい。
【００６９】
具体的実施形態では、Ｃ１およびＣ２は、インスリンおよびインスリン受容体からなる群より選択される。
【００７０】
別の態様では、本発明は、無菌の医薬組成物を調製する方法が意図され、該方法は、本発明の抗体に無菌の薬学的に許容可能な希釈剤を添加することを含む。任意で、少量の防腐剤、例えば、殺菌剤または静菌剤も組成物に包含される。
【００７１】
また、本発明の抗体および無菌の薬学的に許容可能な希釈剤を含む無菌の組成物も意図されている。
【００７２】
本発明は、本発明の抗体が、ＩＮＳＲおよびインスリンまたはインスリン類似体またはインスリン模倣剤の間の結合を調節することもさらに意図されている。本発明の抗体は、望ましい生物学的性質を呈することが好ましく、このような性質には、これに限定されないが、動物モデルでインビトロまたはインビボグルコース取り込みの強化、および好ましくは外因性のインスリンによるグルコース取り込み誘導の強化、が含まれる。一部の実施形態では、抗体は、グルコース取り込みの比率または全体量、またはその両方を増加させることができる。
【００７３】
さらなる態様では、本発明は、インスリン抵抗性に関連した障害の治療方法を意図し、該方法は、それを必要としている対象に、インスリン抵抗性の治療に有効な量の本発明の正の調節抗体またはアゴニスト抗体を投与することを含む。関連する実施形態では、治療は、グルコース取り込みを強化する。さらなる実施形態では、強化グルコース取り込みは、グルコース取り込みの比率の増加、グルコース取り込みの全体量の増加、またはその両方からなる群より選択される。治療では、高い血糖値、高血糖症またはインスリン抵抗性関連障害の対象の空腹時血糖値を下げ、空腹時血糖値の正常な範囲に戻すことがさらに意図されている。関連する実施形態では、空腹時血糖が、未治療対象に比べ約１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％以上減少する。
【００７４】
関連する態様では、治療は、高いＨｂＡ１ｃレベルを下げるが、この高いＨｂＡ１ｃレベルは、先行する数ヶ月間にわたる期間の高いグルコース値のマーカーであり、糖尿病の兆候である。さらなる実施形態では、治療は、耐糖能障害を改善する。一実施形態では、耐糖能は、糖負荷試験（ＧＴＴ）により測定される。
【００７５】
他の実施形態では、治療は、対象の体重増を、遅らせ、減らし、または正常化する。一実施形態では、治療は、未治療対象に比べ、体重増を、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％または５０％減らすまたは遅らせる。一部の実施形態では、治療は、対象の体重減少を、遅らせ、減らし、または正常化する。一実施形態では、治療は、未治療対象に比べ、体重減少を、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％または５０％減らすまたは遅らせる。
【００７６】
関連する態様では、本明細書記載の抗体またはポリペプチドは、対象の体重減少を促進しまたは誘導することが意図されている。一実施形態では、本発明は、本明細書記載の調節抗体、その断片またはポリペプチドの投与により体重減少を促進し、または誘導する方法を提供する。一実施形態では、調節抗体は、正のモジュレーターまたは部分アゴニストである。関連する実施形態では、調節抗体は、負のモジュレーターである。
【００７７】
特定の実施形態では、治療により、さらに、脂質異常症、高血漿トリグリセリド、高ＨＯＭＡ−ＩＲ、高血漿非エステル化コレステロール、血漿総コレステロール高血漿インスリン（インスリン抵抗性を示す）、低非ＨＤＬ／ＨＤＬコレステロール比率（または低総コレステロール／ＨＤＬコレステロール比率）、および高血漿レプチン濃度（レプチン抵抗性を示す）からなる群より選択される１つ、２つ、または３つ以上の糖尿病、またはインスリン抵抗性の症状の改善がもたらされる。
【００７８】
さらに、治療の効果は、詳細な説明のところで記載した因子を使ったインビトロおよびインビボ分析を使って測定されることも提供される。
【００７９】
一実施形態では、インスリン抵抗性関連障害は、高血糖、糖尿病前症、代謝症候群（インスリン抵抗性症候群とも呼ばれる）、２型糖尿病、多嚢胞性卵巣症候群（ＰＣＯＳ）、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、脂肪症、肥満症、脂質異常症、ラブソン・メンデンホール症候群、ドナヒュー症候群または妖精症からなる群より選択される。
【００８０】
別の態様では、本発明は、インスリンシグナル伝達過剰として現れる高インスリン血症、異常産生および／またはインスリン感受性に関連した状態または障害の治療方法を提供し、該方法は、それを必要としている対象に、インスリン過剰産生および／または感受性を治療するのに有効な量の本発明の負の調節抗体またはアンタゴニスト抗体を投与することを含む。一実施形態では、インスリン感受性関連障害は、癌、カポジ肉腫、インスリノーマ、糖尿病性腎症、低血糖、膵島細胞症（ＫＡＴＰ−Ｈｌびまん性疾患、ＫＡＴＰ−Ｈｌ限局性疾患、または「ＰＨＨＩ」）、ＧＤＨ−Ｈｌ（高インスリン症／高アンモニア血症症候群（ＨＩ／ＨＡ）、ロイシン過敏性低血糖症、またはジアゾキシド感受性低血糖）、島細胞調節不全症候群、乳幼児特発性低血糖症、乳幼児持続性高インスリン性低血糖症（ＰＨＨＩ）、および先天性の高インスリン症、インスリン過剰摂取、腎不全による低血糖（急性または慢性）、および、例えば、ＩＩＩ、ＩＶまたはＶ型慢性腎臓病からなる群より選択される。
【００８１】
本明細書記載のいずれかの障害の治療用の薬剤の調製における、インスリン−ＩＮＳＲシグナル伝達相互作用を調節する前述の本発明のいずれかの抗体またはポリペプチドの使用も、また、意図されている。注射基、例えば、単独使用または薬剤充填済み注射器、無菌のシール容器、例えば、バイアル、ボトル、容器（ｖｅｓｓｅｌ）、および／または前述のいずれかの抗体またはポリペプチドを、任意で、適切な使用説明書と共に、含むキットまたはパッケージ、もまた、意図されている。
【００８２】
前述の本発明のいずれかの抗体またはポリペプチドは、補助治療として、当技術分野で既知のまたは本明細書記載のいずれかの抗糖尿病薬を同時に投与してもよい。前述の本発明のいずれかの抗体またはポリペプチドを他の抗糖尿病薬と一緒に含む組成物もまた、意図されている。
【００８３】
多くの抗糖尿病薬が当技術分野で既知であり、これには、１）スルホニル尿素（例えば、グリメピリド、グリセンチド、スルホニル尿素、ＡＹ３１６３７）；２）ビグアナイド（例えば、メトホルミン）；３）αグルコシダーゼ阻害剤（例えば、アカルボース、ミグリトール）；４）チアゾリジンジオン（例えば、トログリタゾン、ピオグリタゾン、ロシグリタゾン、グリピジド、バラグリタゾン、リボグリタゾン、ネトグリタゾン、トログリタゾン、エングリタゾン、ＡＤ５０７５、Ｔ１７４、ＹＭ２６８、Ｒ１０２３８０、ＮＣ２１００、ＮＩＰ２２３、ＮＩＰ２２１、ＭＫ０７６７、シグリタゾン、アダグリタゾン、ＣＬＸ０９２１、ダルグリタゾン、ＣＰ９２７６８、ＢＭ１５２０５４）；５）グルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ）およびＧＬＰ類似体またはＧＬＰ−１受容体のアゴニスト（例えば、エキセンディン）またはその安定剤（例えば、シタグリプチン等のＤＰＰ４阻害剤）；な旅に６）インスリンまたは類似体またはその模倣剤（例えば、ＬＡＮＴＵＳ（登録商標））が含まれる（これらに限定されない）。
【００８４】
関連する態様では、本発明は、本明細書記載の抗体を使ってインスリン抵抗性またはインスリン感受性を診断する方法を提供する。一実施形態では、方法は、本明細書記載のインスリン受容体抗体を使って対象由来の試料のインスリンまたはインスリン受容体のレベルを測定することを含み、これによりインスリンまたは遊離インスリン受容体のレベルの増加、または膜結合インスリン受容体のレベルの減少により、対象が糖尿病またはインスリン抵抗性に罹患しているかまたはその危険があることが示され、さらに、任意で、糖尿病治療薬を、前記糖尿病またはインスリン抵抗性に罹患しているまたはその危険がある対象に投与することを含む。別の実施形態では、方法は、本明細書記載のインスリン受容体抗体を使って対象由来の試料のインスリン受容体のレベルを測定することを含み、これにより遊離インスリン受容体の増加、または膜結合インスリン受容体の減少により、対象が癌を罹患しているまたはその危険性があることが示され、さらに、任意で、癌治療薬を前記対象に投与することを含む。
【００８５】
別の態様では、本発明は、インスリンの本明細書記載のインスリン受容体に対する結合を調節する抗体を特定する方法を提供する。
【００８６】
本明細書記載のそれぞれの特徴または実施形態、または組み合わせは、本発明のいずれかの態様の非限定的な説明のための例であり、それ自体、本明細書記載の他のいずれかの特徴または実施形態、または組み合わせと組み合わせ可能であることが意図されていることは理解されよう。例えば、特徴が「一実施形態」、「一部の実施形態」、「さらなる実施形態」、「代表的な具体的実施形態では」、および／または「別の実施形態」等の用語で説明されている場合、のタイプの実施形態のそれぞれは、全ての可能な組み合わせをリストすることを必要とせずに、本明細書記載の他のいずれかの特徴と組み合わされる、または特徴の組み合わせであることが意図されている特徴の非制限的例である。このような特徴または特徴の組み合わせは、本発明の全ての態様に当てはまる。同様に、ある方法が、ある種の特性を特徴とする抗体等のポリペプチド結合剤を特定することを説明する場合、これらの特性を特徴とするポリペプチド結合剤も、また、本発明により意図されている。範囲内に入る値の例が開示される場合、これらの例のいずれも、範囲中の取り得る端点として意図され、このような端点の間のいずれかおよび全ての数値が意図され、さらに上側および下側端点のいずれかおよび全ての組み合わせが想定されている。
[本発明1001]
（ｉ）インスリン受容体もしくは（ｉｉ）インスリンおよびインスリン受容体を含む複合体、または（ｉ）および（ｉｉ）の両方に対して10−5Ｍ以下の平衡解離定数ＫＤで結合し、インスリンとインスリン受容体の間の結合親和性を約5倍〜200倍強化することができる、抗体。
[本発明1002]
10−5、10−6、10−7、10−8、10−9、10−10、または10−11Ｍ以下の親和性でインスリン受容体に結合し、（ａ）ｐＡＫＴアッセイで測定した場合にインスリンの最大アゴニスト活性の20％〜80％の最大アゴニスト活性を示し、（ｂ）存在する場合、インスリンのＩＮＳＲに対するＥＣ50を2倍を超えては変化させず、かつ（ｃ）存在する場合、インスリンのＩＮＳＲに対するＫＤを2倍を超えては変化させない、アロステリックアゴニスト抗体。
[本発明1003]
10−5、10−6、10−7、10−8、10−9、10−10、または10−11Ｍ以下の親和性でインスリン受容体に結合し、任意で、ｐＡＫＴアッセイで測定した場合にインスリンの最大アゴニスト活性の20％〜100％の最大アゴニスト活性を示す、アゴニスト抗体。
[本発明1004]
（ｉ）インスリン受容体もしくは（ｉｉ）インスリンおよびインスリン受容体を含む複合体、または（ｉ）および（ｉｉ）の両方に対して10−5Ｍ以下の平衡解離定数ＫＤで結合し、インスリンとインスリン受容体の間の結合親和性を少なくとも約3倍、任意で1000倍まで、弱めることができる、抗体。
[本発明1005]
以下の平衡解離定数ＫＤの結合特性を特徴とする、本発明1001の抗体：
（ｉ）該抗体が、約10−5Ｍ、10−6、10−7、10−8、10−9、10−10、または10−11Ｍ以下の平衡解離定数ＫＤで、インスリン（Ｃ1）およびインスリン受容体（Ｃ2）を含む複合体に結合し；かつ
（ｉｉ）Ｋ［Ｃ1Ｃ2］Ａ、Ｋ［ＡＣ2］Ｃ1、またはＫ［ＡＣ1］Ｃ2のいずれかがＫＡＣ2またはＫＡＣ1のいずれかより少なくとも約5倍低い。
[本発明1006]
Ｋ［Ｃ1Ｃ2］Ａ、Ｋ［ＡＣ2］Ｃ1、またはＫ［ＡＣ1］Ｃ2のいずれかが、ＫＡＣ2またはＫＡＣ1のいずれかより約5倍〜200倍低い、本発明1005の抗体。
[本発明1007]
インスリン受容体に結合する、本発明1001および1005〜1006のいずれかの抗体。
[本発明1008]
インスリン／インスリン受容体複合体に結合する、本発明1001および1005〜1006のいずれかの抗体。
[本発明1009]
インスリン受容体単独には検出可能なほどには結合しない、本発明1001、1005〜1006および1008のいずれかの抗体。
[本発明1010]
インスリンとインスリン受容体の間の結合親和性を約5倍〜25倍強化することができる、本発明1001、1005〜1009のいずれかの抗体。
[本発明1011]
結合親和性がＫＡ、ＫＤ、オン速度のオフ速度に対する比率、またはオフ速度のオン速度に対する比率のいずれかの1つである、本発明1010の抗体。
[本発明1012]
任意でリン酸化ＡＫＴアッセイにおいて、インスリンの最大シグナルの少なくとも10％、インスリン受容体を活性化する、本発明1001〜1008および1010〜1011のいずれかの抗体。
[本発明1013]
任意でリン酸化ＡＫＴアッセイにおいて、インスリンの最大シグナルの10％未満、インスリン受容体を活性化する、本発明1001〜1008および1010〜1011のいずれかの抗体。
[本発明1014]
配列番号281、278、277、209、275、223、284、276、および236からなる群より選択される重鎖可変領域および配列番号141、138、137、35、135、57、144、136、および98からなる群より選択される軽鎖可変領域を含む、本発明1001、1003、または1005〜1013のいずれかの抗体。
[本発明1015]
（ａ）Ａｂ006、Ａｂ030、Ａｂ004、Ａｂ013、Ａｂ009、Ａｂ007、Ａｂ011、Ａｂ001、Ａｂ012、Ａｂ010、Ａｂ003、Ａｂ008、Ａｂ002、Ａｂ005、Ａｂ076、Ａｂ077、Ａｂ079、Ａｂ080、Ａｂ083、Ａｂ059、Ａｂ078、Ａｂ085、もしくは配列番号291、196、239、267および271に示される領域のいずれかの重鎖可変領域、ならびにＡｂ006、Ａｂ030、Ａｂ004、Ａｂ013、Ａｂ009、Ａｂ007、Ａｂ011、Ａｂ001、Ａｂ012、Ａｂ010、Ａｂ003、Ａｂ008、Ａｂ002、Ａｂ005、Ａｂ076、Ａｂ077、Ａｂ079、Ａｂ080、Ａｂ083、Ａｂ059、Ａｂ078、Ａｂ085、もしくは配列番号76、80、101、128、および132に示される領域のいずれかの軽鎖可変領域、あるいは
（ｂ）Ａｂ006、Ａｂ030、Ａｂ004、Ａｂ013、Ａｂ009、Ａｂ007、Ａｂ011、Ａｂ001、Ａｂ012、Ａｂ010、Ａｂ003、Ａｂ008、Ａｂ002、Ａｂ005、Ａｂ076、Ａｂ077、Ａｂ079、Ａｂ080、Ａｂ083、Ａｂ059、Ａｂ078、Ａｂ085、もしくは配列番号291、196、239、267および271に示される領域のいずれかの1つ、2つもしくは3つの重鎖ＣＤＲおよび／またはＡｂ006、Ａｂ030、Ａｂ004、Ａｂ013、Ａｂ009、Ａｂ007、Ａｂ011、Ａｂ001、Ａｂ012、Ａｂ010、Ａｂ003、Ａｂ008、Ａｂ002、Ａｂ005、Ａｂ076、Ａｂ077、Ａｂ079、Ａｂ080、Ａｂ083、Ａｂ059、Ａｂ078、Ａｂ085、もしくは配列番号76、80、101、128、および132に示される領域のいずれかの1つ、2つもしくは3つの軽鎖ＣＤＲであって、任意で該重鎖または軽鎖ＣＤＲのいずれかの1つ、2つまたは3つの中に1つまたは2つの変異、例えば、保存的または非保存的置換が含まれる、重鎖ＣＤＲおよび／または軽鎖ＣＤＲ；あるいは
（ｃ）Ａｂ006、Ａｂ030、Ａｂ004、Ａｂ013、Ａｂ009、Ａｂ007、Ａｂ011、Ａｂ001、Ａｂ012、Ａｂ010、Ａｂ003、Ａｂ008、Ａｂ002、Ａｂ005、Ａｂ076、Ａｂ077、Ａｂ079、Ａｂ080、Ａｂ083、Ａｂ059、Ａｂ078、Ａｂ085、もしくは配列番号76、80、101、128、132、291、196、239、267、および271のいずれかの6つのＣＤＲ全て
を含む、本発明1001、1003、または1005〜1014のいずれかの抗体。
[本発明1016]
Ａｂ079、Ａｂ076、Ａｂ083、Ａｂ080、Ａｂ062、およびＡｂ020、Ａｂ019、Ａｂ088、およびＡｂ089からなる群より選択されるいずれか1つ、2つ、3つ、または全ての抗体と70％以上の競合を示し、かつ任意で、Ａｂ086、Ａｂ064、Ａｂ001、およびＡｂ018からなる群より選択されるいずれか1つ、2つ、3つ、または全ての抗体と30％以上の競合を示す、本発明1001、1002、1003および1005〜1015のいずれかの抗体。
[本発明1017]
Ａｂ040、Ａｂ062、Ａｂ030、Ａｂ001、およびＡｂ018からなる群より選択されるいずれか1つ、2つ、3つ、または全ての抗体と70％以上の競合を示し、かつ任意で、Ａｂ037、Ａｂ078、Ａｂ083、Ａｂ080、およびＡｂ085からなる群より選択されるいずれか1つ、2つ、3つ、または全ての抗体と30％以上の競合を示す、本発明1001、1002、1003および1005〜1015のいずれかの抗体。
[本発明1018]
Ａｂ064、Ａｂ062、Ａｂ085、およびＡｂ078からなる群より選択されるいずれか1つ、2つ、3つ、または全ての抗体と70％以上の競合を示す、本発明1001、1003、1005〜1006および1008〜1009のいずれかの抗体。
[本発明1019]
前記インスリンとインスリン受容体の間の結合親和性を約3倍〜500倍弱めることができる、本発明1004の抗体。
[本発明1020]
結合親和性が、ＫＡ、ＫＤ、オン速度のオフ速度に対する比率、またはオフ速度のオン速度に対する比率のいずれかの1つである、本発明1004の抗体。
[本発明1021]
任意でｐＡＫＴアッセイにおいて、インスリンシグナル伝達活性のＥＣ50を約2倍〜1000倍増加させる、本発明1004の抗体。
[本発明1022]
配列番号241、279、258、155、および228からなる群より選択される重鎖可変領域ならびに配列番号103、139、119、8、および89からなる群より選択される軽鎖可変領域を含む、本発明1004または1019〜1021のいずれかの抗体。
[本発明1023]
（ａ）Ａｂ087、Ａｂ019、Ａｂ088、Ａｂ089、Ａｂ020、Ａｂ050、Ａｂ052、Ａｂ055、Ａｂ057、Ａｂ061、Ａｂ063、Ａｂ065、Ａｂ070、Ａｂ072、Ａｂ074、Ａｂ081のいずれかの重鎖可変領域およびＡｂ087、Ａｂ019、Ａｂ088、Ａｂ089、Ａｂ020、Ａｂ050、Ａｂ052、Ａｂ055、Ａｂ057、Ａｂ061、Ａｂ063、Ａｂ065、Ａｂ070、Ａｂ072、Ａｂ074、Ａｂ081のいずれかの軽鎖可変領域、あるいは
（ｂ）Ａｂ087、Ａｂ019、Ａｂ088、Ａｂ089、Ａｂ020、Ａｂ050、Ａｂ052、Ａｂ055、Ａｂ057、Ａｂ061、Ａｂ063、Ａｂ065、Ａｂ070、Ａｂ072、Ａｂ074、Ａｂ081のいずれかの1つ、2つもしくは3つの重鎖ＣＤＲおよび／またはＡｂ087、Ａｂ019、Ａｂ088、Ａｂ089、Ａｂ020、Ａｂ050、Ａｂ052、Ａｂ055、Ａｂ057、Ａｂ061、Ａｂ063、Ａｂ065、Ａｂ070、Ａｂ072、Ａｂ074、Ａｂ081のいずれかの1つ、2つもしくは3つの軽鎖ＣＤＲであって、任意で該重鎖または軽鎖ＣＤＲのいずれかの1つ、2つまたは3つの中に1つまたは2つの変異、例えば、保存的または非保存的置換が含まれる、重鎖ＣＤＲおよび／または軽鎖ＣＤＲ；あるいは
（ｃ）Ａｂ087、Ａｂ019、Ａｂ088、Ａｂ089、Ａｂ020、Ａｂ050、Ａｂ052、Ａｂ055、Ａｂ057、Ａｂ061、Ａｂ063、Ａｂ065、Ａｂ070、Ａｂ072、Ａｂ074、Ａｂ081のいずれかの6つのＣＤＲ全て
を含む、本発明1004または1019〜1022のいずれかの抗体。
[本発明1024]
Ａｂ079、Ａｂ076、Ａｂ083、Ａｂ080、Ａｂ062、およびＡｂ020、Ａｂ019、Ａｂ088、Ａｂ089からなる群より選択されるいずれか1つ、2つ、3つまたは全ての抗体と70％以上の競合を示し、任意で、ヒト受容体または複合体に結合し、マウス受容体または複合体に結合しない、本発明1004および1019〜1023のいずれかの抗体。
[本発明1025]
配列番号195、220、303、197、208、243、245および251からなる群より選択される重鎖可変領域ならびに配列番号77、50、90、84、34、104、106および112からなる群より選択される軽鎖可変領域を含む、本発明1002または1003の抗体。
[本発明1026]
（ａ）Ａｂ021、Ａｂ029、Ａｂ022、Ａｂ017、Ａｂ023、Ａｂ024、Ａｂ025、Ａｂ026、Ａｂ031、Ａｂ035、Ａｂ027、Ａｂ036、Ａｂ037、Ａｂ028、Ａｂ038、Ａｂ039、Ａｂ040、Ａｂ041、Ａｂ042、Ａｂ032、Ａｂ043、Ａｂ044、Ａｂ045、Ａｂ046、Ａｂ047、Ａｂ018、Ａｂ033、Ａｂ048、Ａｂ014、Ａｂ015、Ａｂ049、Ａｂ034、Ａｂ051、Ａｂ053、Ａｂ054、Ａｂ056、Ａｂ058、Ａｂ062、Ａｂ064、Ａｂ066、Ａｂ067、Ａｂ068、Ａｂ086、Ａｂ069、Ａｂ071、Ａｂ073、Ａｂ075、Ａｂ082、Ａｂ084、もしくは配列番号252、253、263、265および269に示される領域のいずれかの重鎖可変領域、ならびにＡｂ021、Ａｂ029、Ａｂ022、Ａｂ017、Ａｂ023、Ａｂ024、Ａｂ025、Ａｂ026、Ａｂ031、Ａｂ035、Ａｂ027、Ａｂ036、Ａｂ037、Ａｂ028、Ａｂ038、Ａｂ039、Ａｂ040、Ａｂ041、Ａｂ042、Ａｂ032、Ａｂ043、Ａｂ044、Ａｂ045、Ａｂ046、Ａｂ047、Ａｂ018、Ａｂ033、Ａｂ048、Ａｂ014、Ａｂ015、Ａｂ049、Ａｂ034、Ａｂ051、Ａｂ053、Ａｂ054、Ａｂ056、Ａｂ058、Ａｂ062、Ａｂ064、Ａｂ066、Ａｂ067、Ａｂ068、Ａｂ086、Ａｂ069、Ａｂ071、Ａｂ073、Ａｂ075、Ａｂ082、Ａｂ084、もしくは配列番号7、113、114、124、126および130に示される領域のいずれかの軽鎖可変領域、あるいは
（ｂ）Ａｂ021、Ａｂ029、Ａｂ022、Ａｂ017、Ａｂ023、Ａｂ024、Ａｂ025、Ａｂ026、Ａｂ031、Ａｂ035、Ａｂ027、Ａｂ036、Ａｂ037、Ａｂ028、Ａｂ038、Ａｂ039、Ａｂ040、Ａｂ041、Ａｂ042、Ａｂ032、Ａｂ043、Ａｂ044、Ａｂ045、Ａｂ046、Ａｂ047、Ａｂ018、Ａｂ033、Ａｂ048、Ａｂ014、Ａｂ015、Ａｂ049、Ａｂ034、Ａｂ051、Ａｂ053、Ａｂ054、Ａｂ056、Ａｂ058、Ａｂ062、Ａｂ064、Ａｂ066、Ａｂ067、Ａｂ068、Ａｂ086、Ａｂ069、Ａｂ071、Ａｂ073、Ａｂ075、Ａｂ082、Ａｂ084、もしくは配列番号252、253、263、265および269に示される領域のいずれかの1つ、2つもしくは3つの重鎖ＣＤＲおよび／またはＡｂ021、Ａｂ029、Ａｂ022、Ａｂ017、Ａｂ023、Ａｂ024、Ａｂ025、Ａｂ026、Ａｂ031、Ａｂ035、Ａｂ027、Ａｂ036、Ａｂ037、Ａｂ028、Ａｂ038、Ａｂ039、Ａｂ040、Ａｂ041、Ａｂ042、Ａｂ032、Ａｂ043、Ａｂ044、Ａｂ045、Ａｂ046、Ａｂ047、Ａｂ018、Ａｂ033、Ａｂ048、Ａｂ014、Ａｂ015、Ａｂ049、Ａｂ034、Ａｂ051、Ａｂ053、Ａｂ054、Ａｂ056、Ａｂ058、Ａｂ062、Ａｂ064、Ａｂ066、Ａｂ067、Ａｂ068、Ａｂ086、Ａｂ069、Ａｂ071、Ａｂ073、Ａｂ075、Ａｂ082、Ａｂ084、もしくは配列番号7、113、114、124、126および130に示される領域のいずれかの1つ、2つもしくは3つの軽鎖ＣＤＲであって、任意で該重鎖または軽鎖ＣＤＲのいずれかの1つ、2つまたは3つの中に1つまたは2つの変異、例えば、保存的または非保存的置換が含まれる、重鎖ＣＤＲおよび／または軽鎖ＣＤＲ；あるいは
（ｃ）Ａｂ021、Ａｂ029、Ａｂ022、Ａｂ017、Ａｂ023、Ａｂ024、Ａｂ025、Ａｂ026、Ａｂ031、Ａｂ035、Ａｂ027、Ａｂ036、Ａｂ037、Ａｂ028、Ａｂ038、Ａｂ039、Ａｂ040、Ａｂ041、Ａｂ042、Ａｂ032、Ａｂ043、Ａｂ044、Ａｂ045、Ａｂ046、Ａｂ047、Ａｂ018、Ａｂ033、Ａｂ048、Ａｂ014、Ａｂ015、Ａｂ049、Ａｂ034、Ａｂ051、Ａｂ053、Ａｂ054、Ａｂ056、Ａｂ058、Ａｂ062、Ａｂ064、Ａｂ066、Ａｂ067、Ａｂ068、Ａｂ086、Ａｂ069、Ａｂ071、Ａｂ073、Ａｂ075、Ａｂ082、Ａｂ084、もしくは配列番号7、113、114、124、126、130、252、253、263、265および269に示される領域のいずれかの6つのＣＤＲ全て
を含む、本発明1002または1003の抗体。
[本発明1027]
Ａｂ030、Ａｂ037、Ａｂ053、Ａｂ001、Ａｂ018、Ａｂ064、Ａｂ040からなる群より選択されるいずれか1つ、2つ、3つまたは全ての抗体と70％、75％または80％以上の競合を示し、任意でＡｂ085およびＡｂ086からなる群より選択されるいずれか1つ、2つ、3つまたは全ての抗体と30％以上の競合を示す、本発明1002、1003、1025、および1026のいずれかの抗体。
[本発明1028]
配列番号151〜303に示される少なくとも1つの重鎖ＣＤＲ  ＨＣＤＲ1、ＨＣＤＲ2およびＨＣＤＲ3を含む、本発明1001〜1027のいずれかの抗体。
[本発明1029]
配列番号151〜303の重鎖可変領域を含む、本発明1001〜1028のいずれかの抗体。
[本発明1030]
配列番号1〜150に示される少なくとも1つの軽鎖ＣＤＲ  ＬＣＤＲ1、ＬＣＤＲ2、またはＬＣＤＲ3を含む、本発明1001〜1029のいずれかの抗体。
[本発明1031]
配列番号1〜150の軽鎖可変領域を含む、本発明1001〜1030のいずれかの抗体。
[本発明1032]
ヒトＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3、またはＩｇＧ4重鎖定常領域をさらに含む、本発明1001〜1031のいずれかの抗体。
[本発明1033]
ヒト軽鎖定常領域をさらに含む、本発明1032の抗体。
[本発明1034]
（ｉ）インスリン受容体もしくは（ｉｉ）インスリンおよびインスリン受容体を含む複合体、または（ｉ）および（ｉｉ）の両方に特異的に結合し、配列番号151〜303のＨＣＤＲ1、ＨＣＤＲ2およびＨＣＤＲ3の少なくとも1つを含み、10−5Ｍ以下の平衡解離定数ＫＤを有する、抗体。
[本発明1035]
配列番号151〜303の重鎖可変領域を含む、本発明1034の抗体。
[本発明1036]
配列番号1〜150のＬＣＤＲ1、ＬＣＤＲ2、またはＬＣＤＲ3の少なくとも1つをさらに含む、本発明1034の抗体。
[本発明1037]
1つ、2つ、3つ、4つ、5つまたは6つのＣＤＲを含む、本発明1034〜1036のいずれかの抗体。
[本発明1038]
配列番号151〜303に示される1つ、2つまたは3つの重鎖ＣＤＲを含む、本発明1034〜1037のいずれかの抗体。
[本発明1039]
配列番号1〜150に示される1つ、2つまたは3つの軽鎖ＣＤＲを含む、本発明1037〜1038のいずれかの抗体。
[本発明1040]
配列番号1〜150の軽鎖可変領域を含む、本発明1034の抗体。
[本発明1041]
ヒトＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3またはＩｇＧ4の定常領域をさらに含む、本発明1034〜1040のいずれかの抗体。
[本発明1042]
インスリン受容体に結合する、本発明1034〜1041のいずれかの抗体。
[本発明1043]
インスリン／インスリン受容体複合体に結合する、本発明1034〜1041のいずれかの抗体。
[本発明1044]
インスリン受容体単独には検出可能なほどには結合しない、本発明1043の抗体。
[本発明1045]
高血糖の対象の空腹時血糖値を正常なグルコース値に向けて低下させる、本発明1001〜1003、1005〜1018、および1025〜1044のいずれかの抗体。
[本発明1046]
任意でリン酸化ＡＫＴアッセイにおいて、インスリンの最大シグナルの少なくとも10％、インスリン受容体を活性化する、本発明1034〜1044のいずれかの抗体。
[本発明1047]
任意でリン酸化ＡＫＴアッセイにおいて、インスリンの最大シグナルの10％未満、インスリン受容体を活性化する、本発明1034〜1044のいずれかの抗体。
[本発明1048]
モノクローナル抗体である、前記本発明のいずれかの抗体。
[本発明1049]
ヒト抗体である、前記本発明のいずれかの抗体。
[本発明1050]
疎水性の成分に結合している、本発明1001〜1049のいずれかの抗体。
[本発明1051]
無菌の薬学的に許容可能な希釈剤を本発明1001〜1050のいずれかの抗体に添加する工程を含む、無菌の医薬組成物を調製する方法。
[本発明1052]
本発明1001〜1050のいずれかの抗体および無菌の薬学的に許容可能な希釈剤を含む、無菌の組成物。
[本発明1053]
インスリン抵抗性を治療するのに有効な量の本発明1001、1002、1003、1005〜1018および1025〜1050のいずれかの抗体を投与する工程を含む、インスリン抵抗性関連障害の治療方法。
[本発明1054]
障害が、高血糖、糖尿病前症、代謝症候群（インスリン抵抗性症候群とも呼ばれる）、2型糖尿病、多嚢胞性卵巣疾患（ＰＣＯＳ）、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、脂肪症、肥満症、脂質異常症、ラブソン・メンデンホール症候群、ドナヒュー症候群または妖精症からなる群より選択される、本発明1053の方法。
[本発明1055]
治療がグルコース取り込みを強化する、本発明1054の方法。
[本発明1056]
強化されたグルコース取り込みが、グルコース取り込み速度の増加、グルコース取り込みの総量の増加、または両方からなる群より選択される、本発明1055の方法。
[本発明1057]
治療が、未治療対象と比べて、対象の体重増を遅延または低減させる、本発明1056の方法。
[本発明1058]
治療が、未治療対象と比べて、ＨｂＡ1ｃレベルの減少をもたらす、本発明1053の方法。
[本発明1059]
治療が、糖負荷試験の改善、または糖負荷試験の際に2時間グルコース値の減少をもたらす、本発明1053の方法。
[本発明1060]
治療が、脂質異常症、血漿トリグリセリド、ＨＯＭＡ−ＩＲ、血漿非エステル化コレステロール、血漿総コレステロール、血漿インスリン、非ＨＤＬ／ＨＤＬコレステロール比率、総／ＨＤＬコレステロール比率、ベータ細胞機能および血漿レプチン濃度からなる群より選択されるインスリン抵抗性関連症状の改善をもたらす、本発明1053の方法。
[本発明1061]
低血糖またはインスリン感受性の治療に有効な量の本発明1004および1019〜1024のいずれかの抗体を投与する工程を含む、高インスリン血症またはインスリンシグナル伝達過剰に関連する状態の治療方法。
[本発明1062]
状態が、癌、インスリノーマ、カポジ肉腫、インスリン過剰摂取、低血糖、膵島細胞症（ＫＡＴＰ−Ｈｌびまん性疾患、ＫＡＴＰ−Ｈｌ限局性疾患、または「ＰＨＨＩ」）、ＧＤＨ−Ｈｌ（高インスリン症／高アンモニア血症症候群（ＨＩ／ＨＡ）、ロイシン過敏性低血糖症、またはジアゾキシド感受性低血糖）、島細胞調節不全症候群、乳幼児特発性低血糖症、乳幼児持続性高インスリン性低血糖症（ＰＨＨＩ）、先天性の高インスリン症、腎不全（急性または慢性）による低血糖、および慢性腎臓病による低血糖からなる群より選択される、本発明1061の方法。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】インスリンの存在および非存在下でＩＮＳＲ発現ＩＭ−９細胞に対する試験抗体結合を示すＩＮＳＲ受容体占有選別の代表的結果を示す。
【図２】インスリン受容体に対するインスリンの結合に与える試験抗体の効果を示すビオチン化リガンドスクリーンの代表的結果を示す。
【図３】試験抗体のインスリン依存性ｐＩＲＳ−１リン酸化調節能力の測定アッセイの結果を示す。
【図４】異なる機能クラス由来の代表的抗体のＩＮＳＲに対する結合を示すｐＩＲＳ−１活性アッセイの結果である。Ａ）正のモジュレーター；Ｂ）顕著なアゴニズムを有する正のモジュレーター；Ｃ）非モジュレーター；Ｄ）アゴニスト抗体；Ｅ）負のモジュレーター。
【図５】代表的抗体のｐＩＲＳ−１アッセイにより求めたＥＣ５０を＋Ａｂ／−Ａｂ比率によってランク付けしたインスリンＥＣ５０値を示す表である。
【図６】代表的抗体のｐＡＫＴアッセイの結果である：Ａ）非常に低いアゴニズムを有する正のモジュレーター；Ｂ）アゴニズムを有する正のモジュレーター；Ｃ）アゴニスト抗体；Ｄ）８３−７；Ｅ）抗体が無い場合のインスリンおよびバックグラウンド応答。
【図７】代表的試験抗体のアゴニズムおよびマウス交差反応特性を示す表である（ｎｄ＝未測定）。
【図８】４種の異なる濃度の正のモジュレーターＩＮＳＲ抗体による作用を受けたインスリン用量反応の感受性（ＥＣ５０、ＥＣ５０の倍率変化）および協同性（傾き）の変化を示すｐＡＫＴアッセイ結果である。図８Ａは、グラフによる、また図８Ｂは、表形式による結果の表示である。
【図９】正のモジュレーター抗体によるインスリン依存性グルコース取り込みの強化を示す。３Ｔ３−Ｌ１細胞への３Ｈ−２−デオキシグルコースの取り込みが、１０μｇ／ｍｌ試験抗体Ａｂ００１または抗ＫＬＨアイソタイプ対照の存在下、０．８ｎＭインスリンにより誘導された。
【図１０】高脂肪食摂取し、部分アゴニスト抗ＩＮＳＲ抗体で治療した２０週齢ＤＩＯマウスの血糖値を示す：Ａ．グルコース値の線グラフ。Ｂ．部分アゴニスト抗ＩＮＳＲ抗体の注射後、統計的に有意な血糖の減少を示すグルコース値のバーチャート。
【図１１】部分アゴニスト抗ＩＮＳＲ抗体の投与により、ＤＩＯマウスの血糖調節が改善されることを示す：Ａ．糖負荷試験時間経過；Ｂ．空腹時血糖値；Ｃ．糖負荷試験；曲線下面積（ＡＵＣ）。
【図１２】正のモジュレーター抗ＩＮＳＲ抗体がＤＩＯマウスのインスリン感受性を改善することを示す：Ａ．インスリン抵抗性試験時間経過；Ｂ．空腹時血糖値；Ｃ．インスリン抵抗性試験；曲線下面積（ＡＵＣ）。
【図１３】正のモジュレーター抗ＩＮＳＲ抗体がＤＩＯマウスの血糖調節を改善することを示す：Ａ．糖負荷試験時間経過；Ｂ．空腹時血糖値；Ｃ．糖負荷試験；曲線下面積（ＡＵＣ）。
【図１４】正のモジュレーターおよび部分アゴニスト抗ＩＮＳＲ抗体がＤＩＯマウスのトリグリセリドおよびコレステロールレベルを改善することを示す。血漿トリグリセリドおよびコレステロールレベルは、Ａｂ００１、Ａｂ０３７またはアイソタイプ対照を腹腔内（ＩＰ）注入した３０週齢ＤＩＯマウスで測定した（１０ｍｇ／ｋｇ；＊アイソタイプ対照／ＨＦＤに対しｐ＜０．０５）：Ａ．血漿トリグリセリドレベル；Ｂ．血漿コレステロールレベル。
【図１５】正のモジュレーターおよび部分アゴニスト抗ＩＮＳＲ抗体投与後のＤＩＯマウスでの血糖調節の改善を示す。血糖調節測定値は、Ａｂ００１、Ａｂ０３７、Ａｂ０８３、Ａｂ０８５またはアイソタイプ対照を腹腔内（ＩＰ）注入したＤＩＯマウスで求めた（１０ｍｇ／ｋｇ；＊アイソタイプ対照／ＨＦＤに対しｐ＜０．０５）：Ａ．糖負荷試験時間経過；Ｂ．糖負荷試験；曲線下面積（ＡＵＣ）；Ｃ．空腹時血糖値。
【図１６】正のモジュレーターおよび部分アゴニスト抗ＩＮＳＲ抗体が、ｍＡｂで４週間治療した１８週齢ＤＩＯマウスの血糖パラメーター、インスリン抵抗性および／または脂質異常症を改善することを示す。Ａｂ００１、Ａｂ０３７、Ａｂ０８３、Ａｂ０８５またはアイソタイプ対照を４週間腹腔内（ＩＰ）注入したＤＩＯマウス（１０ｍｇ／ｋｇ；＊アイソタイプ対照／ＨＦＤに対しｐ＜０．０５）の血漿の分析を行った。Ａ．血漿グルコース値；Ｂ．血漿インスリンレベル；Ｃ．ＨＯＭＡ−ＩＲ；Ｄ．血漿トリグリセリドレベル；Ｅ．血漿非エステル化コレステロールレベル；Ｆ．血漿総コレステロールレベル；Ｇ．血漿非ＨＤＬコレステロールレベル；Ｈ．血漿非ＨＤＬ／ＨＤＬコレステロール比率。
【図１７】Ａｂ００１、Ａｂ０３７、Ａｂ０８３、Ａｂ０８５またはアイソタイプ対照を３週間腹腔内注入した１８週齢ＤＩＯマウスの体重測定による評価で、正のモジュレーターおよび部分アゴニスト抗ＩＮＳＲ抗体が、ＤＩＯマウスの体重増を減少させたことを示す（１０ｍｇ／ｋｇ；＊アイソタイプ対照／ＨＦＤに対しｐ＜０．０５）：Ａ．投与前体重に対する体重の変化率（％）；Ｂ．投与前体重に対する体重の変化率（％）：曲線下面積。
【図１８】Ａｂ００１（１ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇ）、Ａｂ０３７（１０ｍｇ／ｋｇ）またはアイソタイプ対照（１ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇ）を１４週間腹腔内（ＩＰ）注入した５週齢ｄｂ／ｄｂマウスの体重測定により分析したｄｂ／ｄｂマウス体重増の正のモジュレーターおよび部分アゴニスト抗ＩＮＳＲ抗体誘導正常化を示す（＊アイソタイプ対照に対しｐ＜０．０５）：Ａ．調査３５日目までの投与前体重に対する体重変化率（％）；Ｂ．調査３５日目の体重に対する体重変化率（％）；Ｃ．調査３５日目までの投与前体重に対する体重変化率（％）：曲線下面積；Ｄ．調査３５日目の体重に対する体重変化率（％）：曲線下面積。
【図１９】Ａｂ００１（１ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇ）、Ａｂ０３７（１０ｍｇ／ｋｇ）またはアイソタイプ対照（１ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇ）を１４週間腹腔内（ＩＰ）注入した５週齢ｄｂ／ｄｂマウスの血糖調節測定を使った評価で、正のモジュレーター抗体がｄｂ／ｄｂマウスの空腹時血糖およびＨｂＡ１ｃを減少させることを示す（＊同用量のアイソタイプ対照に対しｐ＜０．０５）：Ａ．空腹時血糖値；Ｂ．％ＨｂＡ１ｃレベル。
【図２０】正のモジュレーター抗体の投与により、ｄｂ／ｄｂマウスの脂質異常症が改善されることを示す。Ａｂ００１（１ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇ）、Ａｂ０３７（１０ｍｇ／ｋｇ）またはアイソタイプ対照（１ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇ）を１４週間腹腔内（ＩＰ）投与した５週齢ｄｂ／ｄｂマウス由来の血漿の分析を行った（＊同用量のアイソタイプ対照に対しｐ＜０．０５）。Ａ．血漿インスリンレベル；Ｂ．血漿トリグリセリドレベル；Ｃ．血漿非エステル化コレステロールレベル；Ｄ．血漿総コレステロールレベル；Ｅ．血漿非ＨＤＬコレステロールレベル；Ｆ．血漿非ＨＤＬ／ＨＤＬコレステロール比率。
【図２１】正のモジュレーター抗体の投与により、ｄｂ／ｄｂマウスの空腹時血糖が減少することを示す。Ａｂ００１（１ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇ）、Ａｂ０３７（１０ｍｇ／ｋｇ）またはアイソタイプ対照（１ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇ）を１４週間腹腔内（ＩＰ）注入した５週齢ｄｂ／ｄｂマウスの空腹時血糖評価を毎週行った（＊同用量のアイソタイプ対照に比較してＡｂ０８５に対しｐ＜０．０５）。
【図２２】Ａｂ００１、Ａｂ０３７、Ａｂ０８３、Ａｂ０８５またはアイソタイプ対照を４週間腹腔内（ＩＰ）注入した５週齢ｄｂ／ｄｂマウス由来の血漿分析による評価で、正のモジュレーター抗体がインスリン抵抗性を改善することを示し（１０ｍｇ／ｋｇ；＊同用量のアイソタイプ対照に対しｐ＜０．０５）、また、４週後のインスリン抵抗性指数（ＨＯＭＡ−ＩＲ）を示す。
【図２３】正のモジュレーターおよび部分アゴニスト抗ＩＮＳＲ抗体が、ＭＬＤＳ／ＨＦＤマウスの血糖調節を改善することを示す。血糖調節測定は、Ａｂ００１、Ａｂ０３７またはアイソタイプ対照を腹腔内（ＩＰ）注入した１０週齢ＭＬＤＳ／ＨＦＤマウスを使って行った（１０ｍｇ／ｋｇ；＊アイソタイプ対照に対しｐ＜０．０５）：Ａ．糖負荷試験時間経過；Ｂ．糖負荷試験；曲線下面積（ＡＵＣ）；Ｃ．空腹時血糖値。
【図２４】部分アゴニスト抗体の投与により、摂食ＭＬＤＳ／ＨＦＤマウスの血糖およびＨｂＡ１ｃが減少することを示す。血糖調節測定は、Ａｂ００１、Ａｂ０３７またはアイソタイプ対照を６週間腹腔内（ＩＰ）注入した１０週齢ＭＬＤＳ／ＨＦＤマウスを使って行った（１０ｍｇ／ｋｇ；＊アイソタイプ対照に対しｐ＜０．０５）：Ａ．Ｆｅｄ血糖レベル；Ｂ．％ＨｂＡ１ｃレベル。
【図２５】正のモジュレーターおよび／または部分アゴニスト抗ＩＮＳＲ抗体が、ＭＬＤＳ／ＨＦＤマウスのインスリン、レプチンおよび非ＨＤＬ／ＨＤＬコレステロールレベルを部分的に修正することを示す。血漿コレステロール、インスリンおよびレプチン濃度は、Ａｂ００１、Ａｂ０３７またはアイソタイプ対照を６週間腹腔内（ＩＰ）注入した１０週齢ＭＬＤＳ／ＨＦＤマウスを使って測定した（１０ｍｇ／ｋｇ；＊アイソタイプ対照に対しｐ＜０．０５）：Ａ．血漿非ＨＤＬ／ＨＤＬコレステロール比率；Ｂ．血漿インスリンレベル；Ｃ．血漿レプチン濃度。
【図２６】正のモジュレーターおよび部分アゴニスト抗ＩＮＳＲ抗体が、ＭＬＤＳ／ＨＦＤマウスの体重に影響を与えないことを示す。体重測定は、Ａｂ００１、Ａｂ０３７またはアイソタイプ対照を６週間腹腔内（ＩＰ）注入した１０週齢ＭＬＤＳ／ＨＦＤマウス（１０ｍｇ／ｋｇ；）を使って行い、また、結果は、投与前体重に対する体重の変化率（％）で表した。
【図２７】正のモジュレーターおよび部分アゴニスト抗ＩＮＳＲ抗体が、ＭＬＤＳ／ＨＦＤマウスの血糖調節を改善することを示す。糖負荷試験（ＧＴＴ）は、Ａｂ００１、Ａｂ０８３、Ａｂ０８５、Ａｂ０３７またはアイソタイプ対照を３週間腹腔内（ＩＰ）注入した１０週齢ＭＬＤＳ／ＨＦＤマウスを使って行った（１０ｍｇ／ｋｇ；＊アイソタイプ対照に対しｐ＜０．０５）：Ａ．糖負荷試験時間経過Ｂ．糖負荷試験；曲線下面積（ＡＵＣ）。
【図２８】正のモジュレーターおよび部分アゴニスト抗ＩＮＳＲ抗体が、ＭＬＤＳ／ＨＦＤマウスの血糖調節を改善することを示す。このデータは、Ａｂ００１、Ａｂ０８３、Ａｂ０８５、Ａｂ０３７またはアイソタイプ対照を６週間腹腔内（ＩＰ）注入した１０週齢ＭＬＤＳ／ＨＦＤマウスの空腹時血糖評価を毎週行って求めた（１０ｍｇ／ｋｇ；＊アイソタイプ対照に比較してＡｂ０８３およびＡｂ０３７についてｐ＜０．０５）。
【図２９】正のモジュレーターおよび部分アゴニスト抗ＩＮＳＲ抗体が、ＭＬＤＳ／ＨＦＤマウスの脂質異常症を改善することを示す。Ａｂ００１、Ａｂ０８３、Ａｂ０８５、Ａｂ０３７またはアイソタイプ対照を６週間腹腔内（ＩＰ）注入した１０週齢ＭＬＤＳ／ＨＦＤマウス由来の血漿分析を行った（１０ｍｇ／ｋｇ；＊アイソタイプ対照に対しｐ＜０．０５）。Ａ．血漿トリグリセリドレベル；Ｂ．血漿遊離脂肪酸レベル；Ｃ．血漿非エステル化コレステロールレベル；Ｄ．血漿総コレステロールレベル；Ｅ．血漿非ＨＤＬコレステロールレベル；Ｆ．血漿非ＨＤＬ／ＨＤＬコレステロール比率。
【図３０】正のモジュレーターおよび部分アゴニスト抗ＩＮＳＲ抗体が、ＭＬＤＳ／ＨＦＤマウスの血糖調節（ＨｂＡ１ｃ）を改善することを示す。データは、Ａｂ００１、Ａｂ０８３、Ａｂ０８５、Ａｂ０３７またはアイソタイプ対照を６週間腹腔内（ＩＰ）注入した１０週齢ＭＬＤＳ／ＨＦＤマウスの血液ＨｂＡ１ｃ評価を行うことにより求めた（１０ｍｇ／ｋｇ；＊アイソタイプ対照に対してＡｂ０８３およびＡｂ０３７についてｐ＜０．０５）。
【図３１】正のモジュレーターおよび部分アゴニスト抗ＩＮＳＲ抗体は、通常、ＭＬＤＳ／ＨＦＤマウスの体重に影響を与えないことを示す。データは、Ａｂ００１、Ａｂ０８３、Ａｂ０８５、Ａｂ０３７またはアイソタイプ対照を６週間腹腔内（ＩＰ）注入（１０ｍｇ／ｋｇ）した１０週齢ＭＬＤＳ／ＨＦＤマウスの体重測定により求めた。
【図３２】正のモジュレーターおよび部分アゴニスト抗ＩＮＳＲ抗体が、インビボでインスリンシグナル伝達を強化することを示す。１０週齢Ｃ５６ＢＬ／６雄マウスに、Ａｂ０８３、Ａｂ０８５、Ａｂ０３７またはアイソタイプ対照を２４時間注入し（１０ｍｇ／ｋｇ）、インスリン急速投与後、肝臓（Ａ）および筋肉（Ｂ）ＩＮＳＲチロシンリン酸化に与える効果をＥＬＩＳＡを使って測定した。
【図３３】ＩｇＧ２定常領域で再フォーマットしたＩＮＳＲ特異的抗体の結合特性を示す表である。
【図３４】内在性リガンドと比較して（Ａ）、またはアロステリックアゴニスト抗体の存在または非存在下のリガンドによる活性化（Ｂ）に対する用量反応と比較して、部分的アロステリックアゴニスト抗ＩＮＳＲ抗体の用量反応を示す。
【図３５】内在性リガンドの用量反応と比較して（Ａ）、または正のモジュレーター抗体の存在および非存在下の内在性リガンドの用量反応（Ｂ）と比較した、正のモジュレーター抗体の用量反応を示す。
【図３６】内在性リガンドインスリンに対する一連のアロステリック部分アゴニスト単独の活性化パラメーターを示す。Ｓｅｒ４７３位置のＡｋｔリン酸化率の測定からデータを得た。
【図３７】陰性対照抗体の存在下の内在性リガンドの最大応答に対する、１０μｇ／ｍｌアロステリック部分アゴニスト抗体の存在下のインスリンの活性化特性を示す。Ｓｅｒ４７３位置のＡｋｔリン酸化率の測定からデータを得た。
【図３８】親ＣＨＯ−Ｋ１細胞、ヒトインスリン受容体を発現しているＣＨＯ−Ｋ１細胞、およびマウスインスリン受容体を発現しているＣＨＯ−Ｋ１細胞に対するインスリンが無い場合または準最大濃度のインスリンの存在下の抗体によるｐＡｋｔ活性化を示す。ｐＡｋｔ活性に対するアゴニズムをわずかに持つかまたはそれが無い感作物質Ａｂ（Ａｂ０７７、Ａｂ０７８、Ａｂ０８５）の効果を示す（インスリンが無い場合は、５０μｇ／ｍｌ抗体でｐＡｋｔ活性化は１０％未満）。
【図３９】親ＣＨＯ−Ｋ１細胞、ヒトインスリン受容体を発現しているＣＨＯ−Ｋ１細胞、およびマウスインスリン受容体を発現しているＣＨＯ−Ｋ１細胞に対するインスリンが無い場合または準最大濃度のインスリンの存在下の抗体によるｐＡｋｔ活性化を示す。ｐＡｋｔ活性に対する弱から中等度のアゴニズムを持つ感作物質Ａｂ（Ａｂ００１、Ａｂ０７９、Ａｂ０８３）の効果を示す（インスリンが無い場合は、５０μｇ／ｍｌ抗体で１０〜２０％のｐＡｋｔ活性化）。
【図４０】親ＣＨＯ−Ｋ１細胞、ヒトインスリン受容体を発現しているＣＨＯ−Ｋ１細胞、およびマウスインスリン受容体を発現しているＣＨＯ−Ｋ１細胞に対するインスリンが無い場合または準最大濃度のインスリンの存在下の抗体によるｐＡｋｔ活性化を示す。ｐＡｋｔ活性に対する中等度のアゴニズムを持つ感作物質Ａｂ（Ａｂ０８０）の効果を示す（インスリンが無い場合は、５０μｇ／ｍｌ抗体で２０％超のｐＡｋｔ活性化）。
【図４１】固定した濃度の感作抗ＩＮＳＲ抗体の存在下、ヒトＩＮＳＲ（ＡとＣ）またはマウスＩＮＳＲ（Ｂ）を発現しているＣＨＯ細胞のインスリン依存性ｐＡｋｔ活性化を示す。
【図４２】インスリン単独に比較してインスリンが無い場合の、ヒトＩＮＳＲ（Ａ）またはマウスＩＮＳＲ（Ｂ）を発現しているＣＨＯ細胞のアロステリック部分アゴニスト抗体によるｐＡｋｔ活性化を示す。
【図４３】固定した濃度のアロステリック部分アゴニスト抗体の存在下の、ヒトＩＮＳＲを発現しているＣＨＯ細胞のインスリン依存性ｐＡｋｔ活性化の結果を示す。
【図４４】（Ａ）ヒトＩＮＳＲ、または；（Ｂ）マウスＩＮＳＲを発現しているＣＨＯＫ１細胞を使って抗体８３〜７およびＡｂ００１に対するｐＡＫＴアッセイの結果を示す。
【図４５】推定インスリン受容体濃度に対してプロットした遊離インスリン率（％）を示す。インスリンレベルを５０ｐＭに固定し、２５μｇ／ｍＬ（１６７ｎＭ）で試験したＡｂ０７８を除いて、他の全クローンに対し、抗体濃度を１０μｇ／ｍＬ（６７ｎＭ）とした。示したカーブは、ＥＣ５０の計算に使った非線形回帰プリズムでのあてはめによるものである。
【図４６】推定インスリン受容体濃度に対してプロットした遊離インスリン率（％）を示す。インスリンレベルを５０ｐＭに固定し、全クローンに対し、抗体濃度を１０μｇ／ｍＬ（６７ｎＭ）とした。示したカーブは、ＥＣ５０の計算に使った非線形回帰プリズムでのあてはめによるものである。
【図４７】抗ＩＮＳＲ抗体Ａｂ０８５の存在下、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞へのインスリン媒介脂肪酸取り込みのＴＮＦα−誘導脱感作を示す。
【図４８】精製した正のモジュレーター抗ＩＮＳＲ抗体Ａｂ００１、Ａｂ０３７、Ａｂ０７７、Ａｂ０７９、ＡＢ０８０、Ａｂ０８３のヒトＩＮＳＲに与えるｐＡＫＴアッセイによる効果を示す。
【図４９】精製した正のモジュレーター抗ＩＮＳＲ抗体Ａｂ００１、Ａｂ０３７、Ａｂ０７７、Ａｂ０７９、ＡＢ０８０、Ａｂ０８３のマウスＩＮＳＲに与えるｐＡＫＴアッセイによる効果を示す。
【図５０】精製アゴニスト抗体Ａｂ０３７、Ａｂ０３０、Ａｂ０５３およびＡｂ０６２のヒトＩＮＳＲに対するｐＡＫＴ相対％を示す。
【図５１】精製アゴニスト抗体Ａｂ０３７、Ａｂ０３０、Ａｂ０５３およびＡｂ０６２のマウスＩＮＳＲに対するｐＡＫＴ相対％を示す。
【図５２】精製した抗ＩＮＳＲ抗体Ａｂ０３０、Ａｂ０３７、Ａｂ０５３、Ａｂ００１、Ａｂ０７９、ＡＢ０８０およびＡｂ０８３がサルＩＮＳＲの活性化後、ＡＫＴリン酸化（ｐＡＫＴ相対％）誘導可能であることを示す。
【図５３】ヒトＩＮＳＲを発現しているＣＨＯＫ１細胞で測定した、負のモジュレーター抗体Ａｂ０６１、Ａｂ０７０およびＡｂ０８１のｐＡＫＴ相対％を示す。
【図５４】インスリン受容体抗体の交差反応性を示す表で、ヒトインスリン受容体に結合する特定の抗体は、また、ウサギおよびカニクイザルインスリン受容体にも結合すること、およびこの結合がインスリンの存在により調節されることを示している。
【発明を実施するための形態】
【００８８】
発明の詳細な説明
本発明は、インスリン受容体（ＩＮＳＲ）またはインスリン受容体−インスリン複合体に対し特異的な抗体、および異常グルコース値に関連した障害、例えば、高血糖または低血糖、異常インスリンレベルまたは異常インスリン感受性、例えば、インスリン抵抗性の障害もしくはインスリン感受性の障害、の治療におけるその使用を提供する。これらの抗体は、ＩＮＳＲ−ＩＮＳシグナル伝達複合体成分の結合および解離に対する動力学的速度定数を変えることにより、またはシグナル伝達複合体の構造の状態を変える、例えば、遷移に結合してシグナル伝達の活性を加速する、等のことを含む他の機序により、ＩＮＳＲの細胞応答に与える正または負の効果を誘導することができる。
【００８９】
シグナル伝達複合体の調節により、シグナル入力に対する感受性の増加または減少およびシグナル伝達の随伴性増加または減少が生ずることができる。モジュレーター抗体の投与は、細胞経路の感受性および／または細胞応答の絶対的レベルを増加または減少させる。本発明のモジュレーターは、その特性に応じ、モジュレーター、増強剤、制御因子、エフェクターまたは感作物質として機能することができる。
【００９０】
多くの抗体医薬は、細胞表面受容体またはその同族リガンドに結合することによりシグナル伝達経路をブロックし、受容体に結合し受容体を活性化するリガンドの能力を排除するように作用する。このようなブロッキング薬剤は、受容体−リガンド複合体の形成を妨害することによりその効果を化学量論的に媒介する。
【００９１】
一部の疾患の治療を成功させるためには、受容可能な副作用プロファイルで正常な生理的状態に回復させるために、シグナル伝達経路の完全な抑制よりもむしろ減弱化が必要となり得る。本発明で提供される抗体は、このような利点を提供することが期待されている。
【００９２】
他の治療薬は、細胞表面受容体に結合することにより細胞シグナル伝達経路に影響を与え、受容体の活性を変える。このような直接アゴニスト薬剤は、天然リガンドの活性の模倣によりその効果を媒介することができ、その結果、固有の活性を有する、すなわち、それらは、その効果を媒介するためのリガンドの存在を必要としない。さらに、この治療薬は、リガンドに結合することにより細胞シグナル伝達経路に影響を与える。このような間接的アゴニスト薬剤は、リガンド安定性または結合価を変えることによりその効果を媒介できる。
【００９３】
生物学的プロセスは、通常、二者択一的というより連続的に調節されており、この結果、多くの場合、完全な経路遮断または刺激に比べ、経路活性の調節の方がより適切な治療の戦略となりうる。完全な経路遮断または刺激でなく、経路活性の調節に関する機能的な、細胞ベース選別を行うことは、困難であり、ハイスループットな方式で簡単に行うことはできない。なぜなら、このような選別は、通常、既知の濃度の試験化合物が必要であり、また、試験化合物調製におけるどのような不純物にも敏感である可能性があるからである。特に、経路活性の調節のためのハイスループットな機能的細胞ベース選別を実行する能力は、細胞内環境に入ることができない細胞非透過性の分子に対しては、また、特に、種々の発現レベル、純度および使用する産生系の安定性を有する可能性のある組換え型生物学的分子に対しては、制限されている。さらに、一部の結合相互作用では、機能的選別の際に測定するシグナル伝達産物（例えば、デコイ受容体の場合は、デコイ基質、または標的の不活性型）が無い場合もあり、これらの相互作用を撹乱する試薬を特定することを難しくする。
【００９４】
本発明は、これらの欠点を克服し、正および負のＩＮＳＲ活性モジュレーターおよび所望の効力の薬剤をハイスループットな方式で特定する手段を提供する。また、本発明は、所望の範囲の活性の調節ができるＩＮＳＲ活性の正および負モジュレーターを提供し、また、これらのモジュレーターがグルコース取り込みを変えて所望の生物学的効果を発揮することを示すデータを提供する。
【００９５】
定義
用語の「化合物」は、有機または無機の、内在性または外因性の任意の化学化合物を指し、これに限定されないが、ポリペプチド、タンパク質、ペプチド、小分子、核酸（例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡ）、炭水化物、脂質、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、ペプチド模倣薬、ポリケチドおよびそれらの誘導体、構造類似体または組み合わせを含む。「内在性」は、哺乳動物中で天然に存在することを意味し、一方、「外因性」は、哺乳動物中で天然には存在しない、例えば、投与した外来の化合物、を意味する。
【００９６】
用語の「ポリペプチド結合剤」は、抗原、例えば、標的もしくはそのシグナル伝達相手に特異的に結合可能な、または測定可能な結合親和性で抗原と結合可能なポリペプチドを指す。ポリペプチド結合剤の例には、任意で他のペプチド成分または非ペプチド成分に結合している、抗体、ペプチボディ、ポリペプチドおよびペプチドが含まれる。ポリペプチド結合剤が結合できる抗原には、抗体応答を誘発可能な、または非特異的結合より大きい検出可能な結合親和性でポリペプチド結合剤に結合可能な任意のタンパク質性または非タンパク質性分子が含まれる。調節ポリペプチド結合剤が結合する抗原には、標的、標的のシグナル伝達相手、および／または標的およびそのシグナル伝達相手を含む複合体を含んでもよい。
【００９７】
用語の「抗体」は、最も広範な意味で使用され、完全に組み立てられた抗体、四量体の抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、抗原に結合可能な抗体断片（例えば、Ｆａｂ'、Ｆ'（ａｂ）２、Ｆｖ、単鎖抗体、二重特異性抗体）、および所望の生物活性を示す限り、前述のものを含む組換え型ペプチド、が含まれる。「免疫グロブリン」または「四量体の抗体」は、２つの重鎖および２つの軽鎖から構成される四量体の糖タンパク質で、それぞれが可変領域および定常領域を含む。抗原結合部分は、インタクト抗体の組換ＤＮＡ技術または酵素的もしくは化学的開裂によって作ることができる。抗体断片または抗原結合部分には、特に、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ドメイン抗体（ｄＡｂ）、相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、ＣＤＲグラフト化抗体、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体断片、キメラ抗体、二重特異性抗体、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、直鎖抗体；キレート化組換え抗体、トリボディまたはバイボディ、細胞内抗体、ナノボディ、小モジュール免疫薬剤（ＳＭＩＰ）、抗原結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質、ラクダ科化抗体、ＶＨＨ含有抗体、またはそれらの変異体もしくは誘導体、および抗体が所望の生物活性を維持している限りは、ポリペプチドに対し特異的抗原結合を付与するのに十分な、少なくとも免疫グロブリンの一部、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つのＣＤＲ配列、を含むポリペプチド、が含まれる。
【００９８】
「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体、すなわち、それぞれの抗体を含む集団が少量存在する可能性のある天然変異を除いて同等である集団から得た抗体を指す。
【００９９】
本明細書で使われる「抗体変異体」は、天然抗体可変領域ドメインの可変領域に少なくとも１つのアミノ酸の置換、欠失、または挿入を含む抗体ポリペプチド配列を指す。変異体は、未修飾抗体に対し実質的に相同、または実質的に同等であり得る。
【０１００】
本明細書で使われる「キメラ抗体」は、通常、異なる種を起源とする２つの異なる抗体（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号参照）由来の配列を含む抗体を指す。最もよくあるものとしては、キメラ抗体は、ヒトおよびげっ歯類抗体断片、多くは、ヒト定常領域およびマウス可変領域を含む。
【０１０１】
「中和抗体」は、結合する抗原の生物学的機能を無くするか大きく減らすことができる抗体分子である。従って、「中和」抗体は、生物学的機能、例えば、酵素活性、リガンド結合、または細胞内のシグナル伝達、を無くすか大きく減らすことができる。
【０１０２】
「単離」抗体は、天然環境の成分から特定、分離、回収されている抗体である。その天然環境の混入成分は、診断または治療上の抗体の使用を妨害する可能性のある物質で、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を含みうる。好ましい実施形態では、抗体は、（１）ローリー法で測定して、抗体の９５重量％超に、最も好ましくは９９重量％超に、（２）スピニング−カップ配列決定機器を使って、少なくともＮ末端もしくは内部アミノ酸配列の１５残基を得るのに十分な程度に、または（３）還元もしくは非還元条件下、クマシー・ブルーもしくは、完全な銀色染色を使って、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより均質性が得られるまで、精製される。抗体の天然環境の少なくとも１つの要素が存在しないので、単離抗体には、組換え型細胞内のインサイツ抗体が含まれる。しかし、通常は、単離抗体は、少なくとも１つの精製ステップにより調製される。
【０１０３】
本明細書で使われる「重鎖可変領域」は、前記抗体重鎖可変ドメインの少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む抗体分子の領域を指す。重鎖可変領域は、１つ、２つまたは３つの前記重鎖のＣＤＲを含んでもよい。
【０１０４】
本明細書で使われる「軽鎖可変領域」は、前記抗体軽鎖可変ドメインの少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む抗体分子の領域を指す。軽鎖可変領域は、１つ、２つまたは３つの前記軽鎖（抗体に依存して、カッパまたはラムダ軽鎖どちらであってもよい）のＣＤＲを含んでもよい。
【０１０５】
本明細書で使われる、「特異的結合」が「抗原特異的」である、抗原標的「に対して特異的」である、または抗原と「免疫反応性」である抗体は、類似配列の他の抗体より大きい親和性で抗原と結合する本発明の抗体またはポリペプチド結合剤を指す。一態様では、本発明のポリペプチド結合剤、またはその断片、変異体、もしくは誘導体は、他の種、すなわち、非ヒトの類似の抗原に対する結合親和性と比べて、ヒト抗原に大きな親和性で結合する。しかし、標的のオルソログを認識し、それに結合するポリペプチド結合剤は、本発明の範囲内にある。
【０１０６】
例えば、その同族抗原「に対し特異的な」抗体またはその断片であるポリペプチド結合剤は、抗体の可変領域が検出可能な優先度により所望の抗原を認識し、結合することを示す（例えば、所望の抗原がポリペプチドの場合、ファミリーメンバー間の局所的配列同一性、相同性、または類似性の存在の可能性があるにもかかわらず、抗体の可変領域は、結合親和性の測定可能な差により抗原ポリペプチドと同じファミリーの既知のポリペプチドを区別することができる）。特異的抗体は、また、他のタンパク質（例えば、ＥＬＩＳＡ技術における黄色ブドウ球菌タンパク質Ａまたは他の抗体）と抗体の可変領域以外の配列、特に、分子の定常領域の配列との相互作用を通して作用することができることは理解できよう。本発明の方法で使用するための、ポリペプチド結合剤、例えば抗体、の結合特異性を測定するアッセイは、当技術分野でよく知られ、日常的に使用されている。このようなアッセイの包括的な考察に関しては、Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｄｓ）、抗体：実験マニュアル；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８８）、Ｃｈａｐｔｅｒ６、を参照のこと。本発明で使用する抗体は、当技術分野で既知のいずれかの方法を使って産生できる。
【０１０７】
用語の「エピトープ」は、１つまたは複数の抗原結合領域にあるにより認識され、結合されることができる任意の分子の一部を指す。エピトープは、通常、分子の化学的に活性な表面群、例えば、アミノ酸または炭水化物側鎖からなり、また、特異的３次元構造特性ならびに特異的電荷特性を有する。本明細書で使われるエピトープは、連続していても、そうでなくてもよい。
【０１０８】
ポリペプチド結合剤および本発明のポリペプチドとの関連で使われる場合、用語の「誘導体」は、ユビキチン化、治療薬または診断薬に結合、標識化（例えば、放射性核種または種々の酵素で）、共有結合のポリマー付加、例えば、ペグ化（ポリエチレングリコールで誘導体化）およびオルニチン等のアミノ酸の化学合成による挿入または置換（ヒトタンパク質においては、通常は起こらない）、等の技術により修飾されたポリペプチドを指す。誘導体は、本発明の非誘導体化分子の結合特性を維持している。
【０１０９】
「検出可能成分」または「標識」は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、または化学的手段により検出可能な組成物を指す。例えば、有用な標識には、３２Ｐ、３５Ｓ、蛍光染料、高電子密度試薬、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡで通常使われるような）、ビオチン−ストレプトアビジン、ジゴキシゲニン、ハプテンおよび抗血清またはモノクローナル抗体が適用できるタンパク質、または別の標識核酸分子に相補的な配列の核酸分子、含まれる。検出可能成分は、検体の検出可能成分に結合した量の定量に使用可能な放射性、発色性、または蛍光シグナル等の、測定可能シグナルを生成することが多い。
【０１１０】
「ペプチド」または「オリゴペプチド」は、短いアミノ酸配列、通常、３〜１００アミノ酸残基の長さで、また、単独でまたは天然アミノ酸残基と組み合わせてペプチドに特定の立体構造特異性または特定の生物活性、例えば、蛋白質分解抵抗性を付与することができる天然のアミノ酸残基および残基の非天然類似体を含む。ペプチドは、ペプチド配列の反復を含み、ヘッドトゥーテールまたはヘッドトゥーヘッド配置アミノ酸配列の２、３、４、５、６、７、８、９、または１０以上の複製を含んでもよい。ペプチドは、非ペプチド成分、例えば、［伸張部］に結合してもよい。ペプチドには、二量体、三量体または、例えば、ＰＥＧ等の他の高分子または非高分子成分への結合により形成された、より高次の多量体が含まれる。
【０１１１】
「ポリペプチド」は、よりさらに長いアミノ酸配列で、通常、１００以上のアミノ酸残基の長さであり、また、単独でまたは天然アミノ酸残基と組み合わせてペプチドに特定の立体構造特異性または特定の生物活性、例えば、蛋白質分解抵抗性を付与することができる天然のアミノ酸残基および残基の非天然類似体を含む。
【０１１２】
本明細書で使われる「ペプチボディ」は、全または一部の免疫グロブリン（Ｉｇ）定常領域に融合した１つまたは複数のペプチドを含む融合体ポリペプチドである。例えば、米国特許第６，６６０，８４３号を参照のこと。ペプチドは、天然または組換えにより調製した、または化学的に合成した抗原に結合するいずれかのペプチドであってもよい。ペプチドは、ペプチド配列の反復を含み、ヘッドトゥーテールまたはヘッドトゥーヘッド配置アミノ酸配列の２、３、４、５、６、７、８、９、または１０以上の複製を含んでもよい。Ｉｇ定常領域の一部は、少なくとも１つの定常領域ドメイン（例えば、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、および／またはＣＨ４）、複数のドメイン（例えば、ＣＨ３を伴ったＣＨ２）、複数のドメインの複製（例えば、ＣＨ２−ＣＨ２）、所望の活性、例えば、循環中の免疫グロブリンの半減期延長に関与するサルベージ受容体（ｓａｌｖａｇｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）エピトープを維持する定常領域の任意の断片、またはそれらの任意の組み合わせを含んでもよい。
【０１１３】
「小」分子または「小」有機分子は、本明細書では、約１０００ダルトン以下の分子量を有する非高分子有機化学化合物として定義されている。
【０１１４】
本明細書で使用される「シグナル伝達複合体」は、細胞性シグナル伝達を媒介するタンパク質および／または内在性または外因性化合物の構築物である。シグナル伝達複合体の例には、これに限定されないが、膜結合受容体に結合したリガンド、シグナルカスケードに関与する生化学的反応の伝搬に関連する基質または任意の細胞性分子に結合した酵素が含まれる。シグナル伝達複合体には、また、共受容体、補助因子、足場タンパク質、アロステリックモジュレーターおよび細胞性シグナル伝達に関与する多くの他のタイプのタンパク質および分子、を含み得る。シグナル伝達複合体は、一時的にも、または永続するようにも形成可能である。シグナル伝達複合体の分子成分または成分は、時間経過と共に変化可能であり、また、各成分および細胞環境の活性化状態に依存しうる。シグナル伝達複合体に対し、伝達活性のわずかな変化、完全な不活性化および恒常的活性化または正および負両方の調節を含む、複合体に対する多様な効果を誘導する化学修正および調節を行うことが可能である。
【０１１５】
本明細書で使用される用語の「治療有効量」は、異常な（例えば、異常に高いまたは異常に低い）シグナル伝達複合体のシグナル伝達に関連した疾患の症状または徴候を回復させる、または和らげるために有効な本発明の標的特異的組成物の量を示している。
【０１１６】
本明細書で使用される「結合」は、１つまたは複数の、水素結合、ファンデルワールス、イオン双極子および疎水性相互作用を含む弱い力および強い力のイオン結合から成る非共有結合の相互作用の特異的ネットワークから生ずる、２つ以上の異なる分子実体間の物理的結合である。結合のレベルまたは度合いは、親和性の観点から測定できる。親和性は、平衡結合定数または動力学的結合速度パラメーターにより決まる２つ以上の異なる分子実体間の結合相互作用強度の想定値である。適切な定数またはパラメータおよびその測定単位の例には、当技術分野でよく知られており、これに限定されないが、例えば、次のものが含まれる：平衡会合定数（ＫＡ）、約１０５Ｍ−１以上、約１０６Ｍ−１以上、約１０７Ｍ−１以上、約１０８Ｍ−１以上、約１０９Ｍ−１以上、約１０１０Ｍ−１以上、約１０１１Ｍ−１以上または約１０１２Ｍ−１以上；平衡解離定数（ＫＤ）、例えば、約１０−５Ｍ以下、または約１０−６Ｍ以下、または約１０−７Ｍ以下、または約１０−８Ｍ以下、または約１０−９Ｍ以下、または約１０−１０Ｍ以下、または約１０−１１Ｍ以下、または約１０−１２Ｍ以下；オン速度（例えば、ｓｅｃ−１、ｍｏｌ−１）およびオフ速度（例えば、ｓｅｃ−１））。ＫＡの場合には、大きい値は、「より強い」または「強化された」結合親和性を意味し、一方ＫＤの場合には、より小さい値は、「より強い」または「強化された」結合親和性を意味する。本明細書で使用される「強化された」結合速度パラメーターは結合維持時間の増加、より強い会合またはより弱い解離を意味する。本明細書で使用される「弱くなった」結合速度パラメーターは、結合維持時間の減少、より弱い会合またはより強い解離を意味する。オン速度の場合には、大きい値は、より速いまたはより回数の多い会合を意味し、従って、通常、結合親和性の強化が生ずる。オフ速度の場合には、小さい値は、通常、より少ない解離を示し、従って、通常、より強い結合親和性を生ずる。しかし、以降でさらに詳細に説明するように、結合親和性を示すのは、オン速度とオフ速度の比率である。
【０１１７】
シグナル伝達複合体の２つの化合物の間、例えば、抗体と抗原の間、または第１と第２の成分の間の親和性は、直接または間接的に測定可能である。親和性の間接的測定は、親和性を示すおよび／またはそれに比例する代用特性を使って行うことができる。このような代用特性には、第１成分の第２成分に対する見かけの結合親和性の予測となる、またはそれと相関関係がある、シグナル伝達複合体の第１成分の第２成分への結合量またはレベル、または第１の成分または第２は成分の生物物理学的特性が含まれる。具体的な例には、第１または第２の成分の亜飽和濃度での第１成分の第２成分への結合量またはレベルの測定が含まれる。測定可能な他の生物物理学的特性には、これに限定されないが、正味分子電荷、回転活性、拡散速度、融解温度、静電的ステアリング（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ  ｓｔｅｅｒｉｎｇ）、または第１および第２成分の１つまたは両方の高次構造が挙げられる。さらに他の測定可能な生物物理学的特性には、温度、ｐＨ、またはイオン強度の変動の影響に対する結合相互作用の安定性の測定が含まれる。
【０１１８】
測定される親和性は、測定に使った正確な条件に依存し、この条件には、多くの他の因子の中でも、結合成分の濃度、アッセイ準備、結合成分の価数、緩衝液組成物、ｐＨ、イオン強度および温度ならびに結合反応に加えた添加成分、例えば、アロステリックモジュレーターおよび制御因子が含まれる。定量的および定性的方法は、絶対的および相対的結合相互作用強度の測定に使用可能である。
【０１１９】
見かけの親和性は、アロステリックモジュレーター、阻害剤、結合成分価数、等の結合反応の条件または成分により親和性が変化する条件の下の、２つ以上の異なる分子実体間の結合相互作用強度の測定値である。
【０１２０】
本明細書で使用される「亜飽和濃度」は、他の成分の全ての結合部位を占有するために必要な濃度未満の結合反応の１つの成分の結合親和性ＫＤおよび／または濃度よりかなり低い結合反応の１つまたは複数の成分の濃度である。亜飽和条件下では、かなりの割合の１つの結合反応の結合成分が、利用可能な結合部位を有する。
【０１２１】
本明細書で使用される「生物物理学的アッセイ」は、絶対定期または相対的な方法で、少なくとも２つの化合物間の結合、会合、解離、結合親和性、結合レベル、または結合速度パラメーターを測定するいずれかの方法である。生物物理学的アッセイは、通常、インビトロで、精製結合成分、未精製成分、細胞結合成分ならびに精製および細胞結合成分の組み合わせを使って行うことができる。
【０１２２】
「アゴニスト」は、受容体に結合し、受容体のシグナル伝達を活性化するリガンドまたは薬剤のタイプを記載するために使われる用語である。受容体が活性を変える能力は（アゴニスト効力としても知られている）は、受容体に同様に結合するが、受容体のシグナル伝達を活性化しない、受容体リガンドの一タイプであるアンタゴニストとアゴニストとを区別する特性である。アゴニストの効力は、受容体の活性の増加を起こす正であっても、または受容体の活性を減少させる負であってもよい。完全なアゴニストは、受容体に結合して活性化し、その受容体で完全な効力を示す。部分アゴニストも同様に所定の受容体に結合して活性化するが、受容体に対し、完全アゴニストに比べ部分的効力しか有さない。逆アゴニストは、同じ受容体結合部位にその受容体に対するアゴニストとして結合し、受容体の恒常的な活性を逆転させる試薬である。逆アゴニストは、受容体アゴニストの逆の薬理学的効果を与える。コアゴニストは、他のコアゴニストと共に働き、共に所望の効果を生み出す。
【０１２３】
競合的、またはオルソステリックアゴニストは、リガンドとして、同じ結合部位（活性部位）で可逆的に受容体に結合し、そのために、受容体の同じ結合部位のリガンドと競合になる。
【０１２４】
異なる態様では、本明細書で開示の抗体は、アロステリックアゴニストとして作用する。それらは、活性なインスリン結合部位とは異なるＩＮＳＲの部位に結合し、インスリンとＩＮＳＲの結合親和性を２倍を超えるほどには大きくは変化させない。それらは、また、ＩＮＳＲのインスリン活性化のＥＣ５０を大きくは変化させず、例えば、ＥＣ５０を２倍に満たない程度だけ変化させる。このような抗体は、インスリンの最大アゴニスト応答の８０％以下、例えば、１５％〜８０％、２０〜６０％、２０％〜４０％または１５％〜３０％、の最大アゴニスト応答でＩＮＳＲを恒常的に活性化する。特定の実施形態では、抗体は、インスリンの最大アゴニスト応答の少なくとも約１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％；および４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、または８０％までの最大アゴニスト応答でＩＮＳＲを恒常的に活性化する。それぞれの可能な組み合わせを列挙することなく、これらのいずれかの範囲の端点の任意の組み合わせも意図されていることは理解されよう。一部の実施形態では、最大アゴニスト応答は、ＡＫＴアッセイより測定される。さらなる実施形態では、本発明は、１０−５、１０−６、１０−７、１０−８、１０−９、１０−１０、または１０−１１Ｍ以下の親和性でインスリン受容体に結合するアロステリックアゴニスト抗体を提供する。本発明の理論にとらわれずに、アロステリックアゴニストの弱いアゴニスト活性は、天然の基底インスリン分泌レベルの効果を模倣するのに役立ち、一方、外因的に投与されたインスリンに対し、その正常なグルコース低減効果を許容する。特定の実施形態では、アロステリックアゴニストは、部分アロステリックアゴニストである。アンタゴニストは、アゴニストによる活性から受容体を遮断する。選択的アゴニストは、ある特定のタイプの受容体に対し選択的である。アゴニストは、さらに、上述のタイプのいずれかであってもよい。
【０１２５】
アゴニストの効力、通常、ＥＣ５０値の逆数で定義される。これは、所与のアゴニストに対し、最大生物学的応答の半分を誘発するのに必要なアゴニストの濃度を測定することにより計算できる。ＥＣ５０が小さいほど、アゴニストの効力は大きくなる。
【０１２６】
受容体の「アンタゴニスト」は、受容体に結合時にそれ自体で生物学的応答を誘発しないが、アゴニスト媒介応答を遮断するか弱めるタイプの受容体リガンドまたは薬剤である。アンタゴニストは、親和性はあってもよいが、それの同族受容体に対し効力は無く、結合により相互作用を破壊し、受容体に対するアゴニストまたは逆アゴニストの機能を阻害する。アンタゴニストは、受容体の活性部位またはアロステリック部位に結合することによりその効果を媒介し、または通常は受容体の活性の生物学的調節に関与しないユニークな結合部位と相互作用できる。アンタゴニスト活性は、アンタゴニスト-受容体複合体の長寿命に依存して、可逆的でも、不可逆的でもありうるが、この長寿命は、今度は、アンタゴニスト受容体結合の性質に依存する。大抵のアンタゴニストは、受容体の構造的に決まった結合部位で、内在性リガンドまたは基質と競合することによりその効力を得ている。
【０１２７】
アンタゴニストは、結合している受容体を活性化する効力は示さない。しかし、結合するとするとすぐに、アンタゴニストは、アゴニスト、逆アゴニストおよび部分アゴニストの機能を阻害し得る。機能的アンタゴニスト試験では、用量反応曲線により、アゴニストの活性を逆転するアンタゴニストの濃度範囲の能力の効果を測定する。アンタゴニストの効力は、通常はそのＩＣ５０値から求められる。これは、所与のアンタゴニストに対し、アゴニストの最大生物学的応答抑制の半分を誘発するのに必要なアンタゴニストの濃度を測定して、計算できる。ＩＣ５０がより小さければ、アンタゴニストの効力はより大きくなる。
【０１２８】
競合的、またはオルソステリック、アンタゴニストは、受容体を活性化しないで、リガンドまたはアゴニストと同じ結合部位（活性部位）で可逆的に受容体に結合し、その結果、アゴニストと受容体の同じ結合部位に対し競合する。非競合的、またはロステリック、アンタゴニストは、アゴニストとは別の結合部位に結合し、別の結合部位経由でその受容体に作用を行使する。従って、アゴニストと結合に関しては競合しない。不競合的アンタゴニストは、別のアロステリック結合部位への結合の前に、アゴニストによる受容体活性化が必要であるという点で、非競合的アンタゴニストとは異なる。
【０１２９】
「インスリン抵抗性」は、生理的な量のインスリンでは、細胞または組織からの正常なインスリン応答が得られない状態を表現する。
【０１３０】
「インスリン感作物質」は、細胞または組織インスリン感受性を増加させ、所与の亜飽和濃度のインスリンに対し、より大きなレベルのグルコース取り込みを生させる化合物または薬剤である。
【０１３１】
利点 
本発明は、ＩＮＳＲの細胞外の領域に結合することにより、インスリン−ＩＮＳＲシグナル伝達複合体を調節する治療薬を開発できるという発見に関する。新規選択および選別方法を採用して、例えば、ＩＮＳＲの細胞外の領域を標的にし、増強するインスリン作用を強化するインスリン感作物質、を特定する。特に、本明細書で特定された一部の抗体は、ＩＮＳＲの細胞外領域に結合し、インスリン−ＩＮＳＲシグナル伝達複合体を正または負に調節する非アゴニスト抗体である。
【０１３２】
本発明は、現存する治療に比べ独特の利点を提供するインスリン−ＩＮＳＲシグナル伝達複合体モジュレーターを包含する。これらは、インスリンの全範囲の作用の誘導を許容し、一方で、望まれない副作用を最小限に抑えることができるＩＮＳＲのレベルで作用する。ＩＮＳＲアゴニズムの回避では、機能性低血糖のリスクを減らすべきである。さらに、より正確なグルコース値の制御が達成される可能性がある。従って、血糖レベルが増加する場合は、インスリンレベルの増大につながり、このようなモジュレーターがより大きなこうかを有する可能性がある。ＩＮＳＲの細胞外の領域の標的化により、内在性または外因性のインスリン、インスリン類似体またはインスリン模倣剤の効果を調節するインスリン−ＩＮＳＲシグナル伝達複合体モジュレーターのような生物学的分子の使用が可能となる；これらには、半減期の改善、投与量または投与頻度の低減、毒性の低減および製造の容易さが増す、等の利点があると思われる。本発明は、末梢インスリン抵抗性を低下させ、血糖調節を改善するインスリン−ＩＮＳＲシグナル伝達複合体モジュレーターを包含する。モジュレーターの感作効果は、インスリンレベルが、外因性のインスリン治療が無い場合は適切なグルコース取り込みを刺激するのに十分な多さではないレベルの対象の末梢組織によるグルコース取り込みレベルの改善を可能にすべきである。従って、本発明の抗体の投与は、他の薬剤に代えて、または他の抗糖尿病薬に対する補助治療として、インスリン抵抗性の初期段階で使用可能である。他の抗糖尿病薬に対する補助治療として投与する場合は、本発明の抗体は、正常な範囲近くに血糖レベルを維持するのに必要な抗糖尿病薬の合計毎日量を減らすことができる、または抗糖尿病薬の投薬頻度を減らすことができる、または、例えば、高血糖の発症をより少なくして、または最大高血糖（観察される最高異常グルコース値の減少）のレベルを減らして、同じ用量および／または頻度で血糖調節の改善を行うことができる。
【０１３３】
インスリン受容体（ＩＮＳＲ）
ＩＮＳＲは、刺胞動物や昆虫のような原始的な生物中で見つかったチロシンキナーゼ受容体である。高度な生物では、これはグルコース恒常性のために必須である。また、マウスのノックアウト研究により、ＩＮＳＲは、脂肪生成、血管新生、肝臓グルコース合成の調節およびグルコース誘導膵臓インスリン分泌に重要であることが示された（Ｋｉｔａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、６５：３１３−３３２２００３）。ＩＮＳＲシグナル伝達は、また、食物摂取、末梢脂肪沈着および生殖内分泌軸の調節ならびに学習および記憶に関与する脳に重要である（Ｗａｄａ  ｅｔ  ａｌ、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．９９：１２８−１４３、２００５）。機能障害性ＩＮＳＲシグナル伝達は、Ｉ型およびＩＩ型糖尿病、痴呆および癌を含む疾患に関連付けられている。 
【０１３４】
インスリン様増殖因子受容体（ＩＧＦＲ−１）と密接に関連しているドメインは、ＩＮＳＲと高い（４７〜６７％）アミノ酸同一性を示す。構造では類似であるが、ＩＧＦ−ＩＲとＩＮＳＲは、異なる生理的な機能を果たす。ＩＧＦ−ＩＲは、肝臓を除くほとんど全ての正常な成人組織中で発現する。肝臓は、それ自身ＩＧＦ−Ｉ産生の主要部位である。ＩＮＳＲは、主に代謝機能に関与し、一方、ＩＧＦ−ＩＲは、増殖と分化を媒介する（Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ、Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．５７：１０５０−１０９３、２０００）。
【０１３５】
ＩＮＳＲは、２つのスプライス変異体アイソフォーム、ＩＮＳＲ−ＡおよびＩＮＳＲ−Ｂとして存在し、これらは、エキソン１１によりコードされている１２アミノ酸をそれぞれ欠いているか、または含んでいる。より長い変異体、ＩＮＳＲ−Ｂ、は、代謝応答シグナル伝達に関与するアイソフォームである。対照的に、主に分裂促進的応答シグナルを伝達するＩＮＳＲ−Ａは、選択的にいくつかの癌中で発現するアイソフォームで（Ｄｅｎｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．、Ｈｏｒｍ．Ｍｅｔａｂ．Ｒｅｓ．３５：７７８−７８５、２００３）、また、インスリン様増殖因子２（ＩＧＦ−ＩＩ）と高親和性で結合することができる（Ｄｅｎｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１８：２５０２−２５１２、２００４）。
【０１３６】
成熟ヒトＩＮＳＲは、２つのαサブユニットおよび２つのβサブユニット（鎖）を含むホモダイマーである。αおよびβ鎖は、単一遺伝子によってコードされており、残基７２０〜７２３の位置のフューリン開裂部位にある１３７０アミノ酸前駆物質の翻訳後開裂により生じている。α−鎖およびβ−鎖の１９４残基は、ＩＮＳＲの細胞外部分を含む。単一の膜貫通型配列およびチロシンキナーゼを含む４０３残基細胞質ドメインがある。各外部ドメインモノマーのＮ末端側の半分は、約１５０アミノ酸のサイズのシステインリッチ領域（ＣＲ）で分離された、約１５０アミノ酸の２つの相同ロイシンリッチ反復ドメイン（Ｌ１およびＬ２）からなる。各外部ドメインモノマー（約４６０残基）のＣ末端側の半分は、３つのフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（ＦｎＩＩＩ−１、ＦｎＩＩＩ−２およびＦｎＩＩＩ−３）から成る。ＦｎＩＩＩ−２ドメインは、約１２０残基の挿入ドメイン（ＩＤ）を含み、その中に成熟受容体のαおよびβ鎖を生成するフューリン開裂部位がある。細胞内部で、各モノマーは、２つの調節の領域が隣接するチロシンキナーゼ触媒ドメイン（膜近傍領域およびＣ末端）を含み、このドメインは、シグナル伝達分子のためのホスホチロシン結合部位を含む（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ、Ａｃｔａ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９２：３−９、２００８）。   
【０１３７】
インスリン結合の現在のモデルでは、基礎状態で、ＩＮＳＲホモダイマーは、各モノマー上に２つの同じ対の結合部位（部位１および部位２と呼ぶ）を含む（Ｄｅ  Ｍｅｙｔｓ、Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ、２６：１３５１−１３６２、２００４）ことが提案されている。１つのα−サブユニット上の低親和性部位へのインスリンの結合（部位１）に、結合インスリンと第２のＩＮＳＲα−サブユニット（部位２）の別の領域の間の第２の結合イベントが続く。この２つのαサブユニット間のリガンド媒介架橋結合が、シグナル伝達を起こす高親和性状態を生成する。対照的に、そのＣ末端で繋ぎ止められていない可溶のＩＮＳＲ外部ドメインは、高親和性受容体−リガンド複合体を生成できない。それは、２つのインスリン分子を同時にその２つの部位１で結合することができるが、親和性は低い（Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ、Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．５７：１０５０−１０９３、２０００）。部位１は、Ｌ１ドメインの中央部のβ−シートおよびα−鎖の最後の１６残基（ＣＴペプチドと呼ばれる）由来の配列からなると考えられている。部位２は、大抵ＦｎＩＩＩ−１およびＦｎＩＩＩ−２の接合部にループを含む。インスリン結合は、インスリンおよびその受容体の両方の構造変化を伴うと考えられている（Ｗａｒｄ  ａｎｄ  Ｌａｗｒｅｎｃｅ、ＢｉｏＥｓｓａｙｓ  ３１：４２２−４３４、２００９）。
【０１３８】
インスリン分子が受容体に結合し、その作用を及ぼすとすぐに、インスリンは、細胞外の環境に放出されるか、または細胞によって分解されうる。通常、分解は、インスリン−ＩＮＳＲ複合体のエンドサイトーシスを伴い、続いて、インスリン分解酵素が作用する。大抵のインスリン分子は、肝臓細胞により分解される。典型的なインスリン分子は、循環系への最初の放出から約７１分で最終的に分解されると推定されている（Ｄｕｃｋｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ、Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．１９（５）：６０８-２４、１９９８）。
【０１３９】
インスリンシグナル伝達
インスリンは、分子のシグナル伝達ネットワークを誘導し、ＩＮＳＲから代謝および増殖に関与するエフェクタータンパク質に情報を運ぶ。ＩＮＳＲに結合しているインスリンは、内因性チロシンキナーゼ活性の活性化を促進する立体構造変化を誘導し、ＩＮＳＲβ−サブユニットの自己リン酸化をもたらす。インスリン受容体基質（ＩＲＳ）タンパク質は、リン酸化ＩＮＳＲとの相互作用を通じて細胞膜へ補充され、また、これらもチロシン残基でリン酸化され、別のシグナル伝達タンパク質の複合体への補充を促進し、２つの主要経路（１）主に代謝を調節し、増殖に対しわずかに影響を与えるＰＩ３キナーゼ／ＰＤＫ１／ＰＫＢ経路、および（２）主に細胞増殖を調節するＲａｓ／ＥＲＫ分裂促進的経路、によりシグナル伝達をもたらす。
【０１４０】
特定の市販インスリン類似体は、培養した癌細胞中でＩＧＦ−１様分裂促進的および抗アポトーシス性活性を示し、ヒトでの長期的安全性に疑念が生じていることが報告されている（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｍｅｔａｂ  Ｒｅｓ  Ｒｅｖ２５：４１−４９、２００９）。従って、代謝と分裂促進的ＩＮＳＲシグナル伝達の間のバランスを変えない、または分裂促進的ＩＮＳＲシグナル伝達に対し優先的代謝シグナル伝達を促進するＩＮＳＲアゴニストを得ることが望ましいと思われる。
【０１４１】
抗体モジュレーターの特定方法
本発明は、シグナル伝達複合体の第１および第２成分、例えば、インスリン受容体等の受容体およびそのリガンドインスリン、の間の結合を調節するポリペプチド結合剤候補、例えば、抗体、を特定する方法を提供する。
【０１４２】
本発明の理論に拘泥することなく、本開示は、シグナル伝達複合体の２つの成分（第１の成分、Ｃ１および第２の成分、Ｃ２）間の相互作用のモジュレーター（Ｍ）による速度論的摂動は、数学的に次のように記述できることを示す：
0005849050.tif 000002
ここで、成分間の結合平衡定数（Ｋ’Ｃ１Ｃ２）の変化は、成分間の平衡定数（ＫＣ１Ｃ２）、モジュレーター濃度（Ｍ）、複合体に対するモジュレーター親和性（Ｋ［Ｃ１Ｃ２］Ｍ）および第１成分に対するモジュレーター親和性（ＫＭＣ１）または第２成分に対するモジュレーター親和性（ＫＭＣ２）、の関数である。
【０１４３】
シグナル伝達複合体が受容体−リガンド複合体、およびモジュレーターが抗体の場合は、受容体−リガンド相互作用の抗体による速度論的摂動は、数学的に次のように記述できる：
0005849050.tif 000003
ここで受容体−リガンド結合平衡定数（Ｋ’ＲＬ）の変化は、受容体−リガンド平衡定数（ＫＲＬ）、抗体濃度（Ａ）、複合体に対する抗体親和性（Ｋ［ＲＬ］Ａ）および受容体に対する抗体親和性（ＫＡＲ）またはリガンドに対する抗体親和性（ＫＡＬ）の関数である。
【０１４４】
モジュレーターは、そのシグナル伝達相手に対する標的の結合親和性または結合速度パラメーターが弱められる、または強化される様な形で、標的、またはそのシグナル伝達相手、または標的とシグナル伝達相手との複合体に結合する。例えば、標的が受容体またはリガンドの場合は、リガンドのその受容体に対する結合親和性または結合速度パラメーターが、モジュレーターの存在下で弱められる、または強化される。Ｋ［Ｃ１Ｃ２］Ｍが充分に大きい場合は、Ｋ’Ｃ１Ｃ２が無限大に近づくために、完全な遮断活性を有するモジュレーターは、この分析で境界条件を表す。このモデルの１つの意味は、モジュレーター濃度（［Ｍ］）が、結合リガンドで飽和状態のモジュレーター／抗原相互作用の平衡解離定数（ＫＤ）よりも充分に大きい場合は、シグナル伝達調節の度合いは、モジュレーター濃度と無関係であることである。従って、［Ｍ］＞ＫＤ（モジュレーターとその抗原の間のＫＤ）の場合、相互作用の調節は、成分に対する複合体の親和性の比率に関係する。
【０１４５】
本開示は、モジュレーターの標的および／またはそのシグナル伝達相手との相互作用の生物物理学的性質は、モジュレーターの標的シグナル伝達経路に対する機能的効果を予測するために使用できることを示す。従って、シグナル伝達経路を変えるモジュレーターは、非複合化型に対する複合化型における標的（および／またはそのシグナル伝達相手）に対するその相対的親和性に基づいて特定可能である。本発明は、シグナル伝達複合体の２つの成分（第１成分、Ｃ１および第２成分、Ｃ２）間のモジュレーター（Ｍ）による相互作用の速度論的摂動が下記のように予測できることを意図している：
K[C1C2]M またはK[MC2]C1 またはK[MC1]C2 < KMC2 またはKMC1   正の調節をもたらす 
K[C1C2]M またはK[MC2]C1 またはK[MC1]C2 = KMC2 またはKMC1    調節しない
K[C1C2]M またはK[MC2]C1 またはK[MC1]C2 > KMC2 またはKMC1   負の調節をもたらす
【０１４６】
シグナル伝達複合体が受容体（Ｒ）−リガンド（Ｌ）複合体で、動力学的モジュレーターが抗体（Ａ）である場合は、速度論的摂動は、次のように予測できる：
K[RL]A またはK[AL]R またはK[AR]L < KAL またはKAR    正の動力学的調節をもたらす
K[RL]A またはK[AL]R またはK[AR]L = KAL またはKAR     動力学的調節なし
K[RL]A またはK[AL]R またはK[AR]L > KAL またはKAR    負の動力学的調節をもたらす
【０１４７】
一部の実施形態では、抗体（Ａ）等のモジュレーターは、結合相互作用、例えば、第１または第２成分のいずれかの所与の亜飽和濃度（例えば、リガンド（Ｌ）の濃度）の受容体（Ｒ）−リガンド（Ｌ）相互作用、を変えるその能力により特定できる。モジュレーター抗体またはポリペプチドは、５００ｐＭ相互作用から１０ｐＭ（正のモジュレーター）または１０ｎＭ（負のモジュレーター）までの受容体リガンド相互作用の親和性および対応する用量反応を効果的にシフトさせる可能性がある。一部の実施形態では、モジュレーターは、所与のリガンド濃度で、より高いレベルのＲ−Ｌ結合を生成し、アッセイ曲線を左へ（正の調節）シフトさせる。他の実施形態では、モジュレーターは、所与のリガンド濃度で、より低いレベルのＲ−Ｌ結合を生成し、アッセイ曲線を右へ（負の調節）シフトさせる。一部の実施形態では、シフトは一定である。他の実施形態では、他の因子、例えば、複合体中のアクセサリータンパク質、受容体内部移行、等の関与を反映して、シフトは一様でない。
【０１４８】
モジュレーターおよび標的、そのシグナル伝達相手および／または標的およびそのシグナル伝達相手を含む複合体の間の相互作用の結合特性は、通常、動力学的モジュレーターの標的シグナル伝達経路に与える機能的効果を予測するものである。調査対象標的に依存して、特定の他の因子を考慮する必要がある可能性がある。これら他の因子には、次の項目が含まれる：（１）動力学的モジュレーターの濃度、標的の濃度、および／またはそのシグナル伝達相手の濃度（例えば、モジュレーター濃度（［Ｍ］）が、モジュレーターとその抗原の間の結合のＫＤよりもかなり大きい場合、予測は最適化される）、（２）使用されるモジュレーターの構造型、例えば、一価対二価（ｄｉｖａｌｅｎｔ）または二価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）、（３）標的の高次構造を制限するおよび／または標的の活性化を起こすことができる標的内／間架橋、（４）構築または結合を変えるモジュレーターの能力、またはシグナル伝達複合体の追加成分を立体的もしくはアロステリック機序により変えるモジュレーターの能力、（５）「ボトルネック」を導入する疾患によるシグナル経路の変化、等のシグナル伝達経路特異的特性、（６）シグナル伝達経路の負の／正のフィードバック調節、（７）シグナル伝達複合体の成分のクリアランス／内部移行割合の変化、（８）リガンド結合および活性化を切り離すまたは異なるように変える、例えば、モジュレーターがリガンド結合を強化するが、受容体を脱感作状態にする、またはモジュレーターがリガンド結合を弱めるが、その活性化している受容体中の立体構造変化を誘導する、等の標的の変化。
【０１４９】
一部の態様では、本発明は、試験ポリペプチド試薬の存在または非存在下での、シグナル伝達複合体の第２の成分に対する、シグナル伝達複合体の第１の成分の特異的結合を測定する方法を提供する。これらの態様では、特異的結合は、第１または第２成分の亜飽和濃度である場合に観察するのが好ましい。一部の好ましい実施形態では、第１または第２成分の濃度を減らし亜飽和条件にすることができる。
【０１５０】
一部の態様では、本発明は、複合化および非複合化型における、試験ポリペプチド結合剤、例えば、抗体、の標的および／またはそのシグナル伝達相手に対する特異的結合を測定する方法を提供する。これらの態様では、特異的結合は、試験ポリペプチド結合剤の亜飽和濃度である場合に観察するのが好ましい。一部の好ましい実施形態では、試験ポリペプチド結合剤の濃度を減らし亜飽和条件にすることができる。
【０１５１】
一部の実施形態では、試験ポリペプチド試薬が無い場合の試験は、好ましくは、試験ポリペプチド試薬と類似の構造の種類の化合物であるが、試験されるシグナル伝達複合体に対し効果の無い異なる抗原に結合する対照化合物を使って行った。例えば、試験抗体に対する対照は、無関係の抗原、例えば、スカシ貝ヘモシアニン（ＫＬＨ）に結合するアイソタイプ適合抗体であってもよい。
【０１５２】
所与の亜飽和濃度Ｃ１の正のモジュレーターに対し、より大きいＣ１親和性が、正のモジュレーターの存在下のＣ１のＣ２に対する結合の、より大きいシグナルとして反映される。モジュレーターの優先的結合は、Ｃ１単独またはＣ２単独のシグナルに比べ、Ｃ１およびＣ２を含む複合体のより大きいシグナルとして反映される。一部の態様ではモジュレーターのＣ１とＣ２の複合体に対する結合はあるが、Ｃ１単独またはＣ２単独に対する測定可能な結合はない。
【０１５３】
所与の亜飽和濃度Ｃ１の負のモジュレーターに対し、より低いＣ１親和性が、モジュレーターの存在下のＣ１のＣ２に対する結合の、より小さいシグナルとして反映される。モジュレーターの優先的結合は、Ｃ１およびＣ２の複合体に対するモジュレーターの結合のシグナルに比べ、Ｃ１単独またはＣ２単独の結合に対するより大きいシグナルとして反映される。
【０１５４】
本発明は、シグナル伝達複合体の第１と第２の成分の間の得結合を調節するポリペプチド結合剤候補、例えば、抗体、を特定する方法を提供する。一部の実施形態では、第１と第２の成分は、ポリペプチドである。代表的な具体的実施形態では、第１と第２の成分は内在性である。
【０１５５】
一態様では、調節抗体候補を特定する方法には、以下が含まれる：（ａ）試験ポリペプチド結合剤、例えば、抗体の存在下、前記第１の成分の前記第２の成分に対する結合親和性または結合速度パラメーターの測定、（ｂ）前記試験ポリペプチド結合剤が無い場合の、前記第１の成分の前記第２の成分に対する結合親和性または結合速度パラメーターの測定；および（ｃ）前記試験ポリペプチド結合剤が、工程（ａ）および（ｂ）で測定して結合親和性または結合速度パラメーターで少なくとも１．５倍の差を示す場合、前記試験ポリペプチド結合剤の調節薬剤候補としての特定。一部の実施形態では、結合親和性または結合速度パラメーターの差は、約１．５倍（すなわち５０％）〜約１０００倍、または約１．５倍〜約１００倍、または約２倍〜２５倍、または約２倍〜約５０倍、または約１．５倍〜約２５倍、または約１．５倍〜約５０倍の範囲である。
【０１５６】
一部の実施形態では、試験ポリペプチド結合剤は、試験ポリペプチド試薬が、前記第１成分および前記第２成分の間の結合親和性または結合速度パラメーターを高める場合は、正のモジュレーター候補として特定される。他の実施形態では、試験ポリペプチド試薬が、前記第１成分および前記第２成分間の結合親和性または結合速度パラメーターを小さくする場合は、負のモジュレーター候補として特定される。
【０１５７】
特定の結合親和性値または結合速度パラメーター値の変化（増加または減少）が、「強化された」（またはより強い）、または「弱くなった」（またはより弱い）結合親和性または結合速度パラメーターを示すかどうかは、パラメータ値およびその単位に依存し、このことは当技術分野でよく知られている。例えば、パラメータＫＡの場合には、より大きい値は、「強化された」結合親和性を意味し、ＫＡの約１０６Ｍ−１は、ＫＡの約１０５Ｍ−１よりも強い。別の例として、パラメータＫＤの場合には、より小さい値は、「強化された」結合親和性を意味し、ＫＤの約１０−６Ｍは、ＫＤの約１０−５Ｍよりも強い。逆に、ＫＡの場合には、より小さい値は、「弱くなった」結合親和性を意味し、ＫＡの約１０５Ｍ−１は、ＫＡの約１０６Ｍ−１に比べて弱くなった結合親和性である。別の例として、ＫＤの場合には、より大きい値は、「弱くなった」結合親和性を意味し、ＫＤの約１０−５Ｍは、ＫＤの約１０−６Ｍに比べ、弱くなった結合親和性である。 
【０１５８】
本明細書で使われる「強化された」結合速度パラメーターは、結合維持時間の増加、より強い会合または、より弱い解離を意味する。本明細書で使われる「弱くなった」結合速度パラメーターは、結合維持時間の減少、より弱い会合または、より強い解離を意味する。
【０１５９】
結合親和性は、また、オン速度およびオフ速度の結合速度パラメーターの比率によっても決定可能である。通常、オン速度の場合は、より大きい値は、より速い、またはより強い会合またはより長い結合維持時間を意味し、通常は、より強い結合親和性を生ずる。逆に、より小さいオン速度値は、より遅いまたはより弱い会合または短くなった結合維持時間を意味し、通常は、より弱い結合親和性を生ずる。一般的に、オフ速度の場合は、より大きい値は、より速い解離または短くなった結合維持時間を意味し、通常は、より弱い結合親和性を生ずる。逆に、より小さいオフ速度値は、より遅い解離または短くなった結合維持時間を意味し、通常は、より強い結合親和性を生ずる。これは、オフ速度のオン速度に対する比率、またはオン速度のオフ速度に対する比率が、下記の式で示すように結合親和性を示すことが理由である：
0005849050.tif 000004
ここで
0005849050.tif 000005
。
【０１６０】
結合親和性が検出可能なほど、または顕著に変化しない場合でも、結合維持時間の変化、すなわち、増加したオン速度もしくは減少したオフ速度により増加した結合維持時間、または減少したオン速度もしくは増加したオフ速度により減少した結合維持時間は、尚、シグナル伝達経路の特異的活性化を生ずる可能性がある。例えば、受容体が、２つの異なる経路を活性化できる場合の一部の例では、各経路は、完全な効果に必要な受容体活性化の程度が異なる。１つのシグナル伝達経路では、低いレベルの受容体活性化または結合維持時間で完全に活性化され、一方、第２の経路の完全活性化には、より高いレベルの受容体活性化または結合維持時間が必要である。
【０１６１】
結合特性と機能的効果の予測相関を下表に示す。
0005849050.tif 000006
【０１６２】
抗ＩＮＳＲ抗体の機能的効果がその結合特性と相関することを示すデータの説明のための例を次の表に示す。
0005849050.tif 000007
【０１６３】
従って、モジュレーターおよび標的、そのシグナル伝達相手および／または標的およびそのシグナル伝達相手を含む複合体の間の相互作用の結合特性は、通常、モジュレーターポリペプチドの標的シグナル伝達経路に対する機能的効果の予測となる。
【０１６４】
別の態様では、調節抗体候補を特定する方法には、次が含まれる：（ａ）（ｉ）前記第２成分の存在下、試験ポリペプチド結合剤、例えば、抗体、の前記第１成分に対する結合親和性または結合速度パラメーターの測定、または（ｉｉ）前記第１成分の存在下、試験ポリペプチド結合剤の前記第２成分に対する結合親和性または結合速度パラメーターの測定；および（ｂ）（ｉ）前記第２成分が存在しない場合に、前記試験ポリペプチド結合剤の前記第１成分に対する結合親和性または結合速度パラメーターの測定、または（ｉｉ）前記第１成分が存在しない場合に、前記試験ポリペプチド結合剤の前記第２成分に対する結合親和性または結合速度パラメーターの測定；および（ｃ）工程（ａ）および（ｂ）で測定して、前記試験ポリペプチド結合剤が、結合親和性または結合速度パラメーターの少なくとも１．５倍（すなわち５０％）の差を示す場合に、前記試験ポリペプチド結合剤を動力学的調節薬剤候補として特定する。
【０１６５】
一部の実施形態では、工程（ａ）で測定して、結合親和性または結合速度パラメーターが、工程（ｂ）で測定した結合親和性または結合速度パラメーターよりも、少なくとも１．５倍（すなわち、５０％）強い場合は、試験ポリペプチド結合剤は、正のモジュレーター候補として特定される。具体的実施形態では、工程（ａ）で測定した結合親和性または結合速度パラメーターが、工程（ｂ）で測定したものに比べ、約１．５倍（すなわち、５０％）〜約１０００倍強い（工程（ｂ）に対する工程（ａ）で比較して）、または約１．５倍〜約１００倍、または約２倍〜２５倍、または約２倍〜約５０倍、または約１．５倍〜約２５倍、または約１．５倍〜約５０倍、例えば、少なくとも１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍または２０倍、または５００倍、または２００倍、または１５０倍、または１００倍、または９０倍まで、または８０倍まで、または７０倍まで、または６０倍まで、または５０倍まで、または４０倍まで、３０倍まで、２０倍まで、または１０倍まで強い。
【０１６６】
他の実施形態では、試験ポリペプチド結合剤は、工程（ｂ）で測定した結合親和性または結合速度パラメーターが、工程（ａ）で測定した結合親和性または結合速度パラメーターよりも少なくとも１．５倍（すなわち、５０％）強い場合は、負のモジュレーター候補として特定される。具体的実施形態では、工程（ｂ）で測定した結合親和性または結合速度パラメーターが、工程（ａ）で測定したものに比べ、約１．５倍（すなわち５０％）〜約１０００倍強い（工程（ａ）に対する工程（ｂ）で比較して）、または約１．５倍〜約１００倍、または約２倍〜２５倍、または約２倍〜約５０倍、または約１．５倍〜約２５倍、または約１．５倍〜約５０倍、例えば、少なくとも１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍または２０倍、または５００倍まで、または２００倍まで、または１５０倍まで、または１００倍まで、または９０倍まで、または８０倍まで、または７０倍まで、または６０倍まで、または５０倍まで、または４０倍まで、または３０倍まで、２０倍まで、または１０倍まで強い。
【０１６７】
一部の実施形態では、試験ポリペプチド結合剤の第１成分単独に対する結合親和性または結合速度パラメーターが、測定される。一部の実施形態では、試験ポリペプチド結合剤の第２成分単独に対する結合親和性または結合速度パラメーターが、測定される。
【０１６８】
一部の実施形態では、（Ａ）第１および第２成分を含む複合体に対する試験ポリペプチド結合剤の結合親和性または結合速度パラメーター、任意でＫ［Ｃ１Ｃ２］Ｍ、（Ｂ）ポリペプチド結合剤および第２成分を含む複合体に対する第１成分の結合親和性または結合速度パラメーター、任意でＫ［ＭＣ２］Ｃ１、または（Ｃ）ポリペプチド結合剤および第１成分を含む複合体に対する第２成分の結合親和性または結合速度パラメーター、任意でＫ［ＭＣ１］Ｃ２からなる群より選択される１つまたは複数の結合親和性または結合速度パラメーターが、（１）第２成分単独に対する試験ポリペプチド結合剤の結合親和性または結合速度パラメーター、任意でＫＭＣ２、または（２）第１成分単独に対する試験ポリペプチド結合剤の結合親和性または結合速度パラメーター、任意でＫＭＣ１からなる群より選択される１つまたは複数の結合親和性または結合速度パラメーターより少なくとも約１．５倍強い場合は、試験ポリペプチド結合剤は、正のモジュレーターとして特定される。一部の実施形態では、（Ａ）、（Ｂ）または（Ｃ）のいずれかの１つまたは複数の特異的結合親和性または結合速度パラメーターが、（１）または（２）のいずれかの１つまたは複数の結合親和性または結合速度パラメーターより約１．５倍（すなわち、５０％）〜約１０００倍強い；あるいは、約１．５倍〜約１００倍強い、または約２倍〜２５倍、または約２倍〜約５０倍、または約１．５倍〜約２５倍、または約１．５倍〜約５０倍、例えば、少なくとも１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍または２０倍、または５００倍まで、または２００倍まで、または１５０倍まで、または１００倍まで、または９０倍まで、または８０倍まで、または７０倍まで、または６０倍まで、または５０倍まで、または４０倍まで、３０倍まで、２０倍まで、または１０倍まで強い。例えば、一部の実施形態では、（Ａ）、（Ｂ）または（Ｃ）のいずれかの１つまたは複数の結合親和性または結合速度パラメーターが、（１）および（２）の両方の結合親和性または結合速度パラメーターより強い。一部の実施形態では、（１）の結合親和性または結合速度パラメーターが、（２）の結合親和性または結合速度パラメーターより強い。他の実施形態では、（２）の結合親和性または結合速度パラメーターが、（１）の結合親和性または結合速度パラメーターより強い。一部の実施形態では、２つ以上の結合親和性または結合速度パラメーターが測定され、例えば、オフ速度およびオン速度、またはＫＡおよびＫＤ、またはそれらの任意の組み合わせが、比較される。
【０１６９】
具体的実施形態では、測定された結合親和性が平衡解離定数ＫＤである場合、Ｋ［Ｃ１Ｃ２］Ｍ、Ｋ［ＭＣ２］Ｃ１、またはＫ［ＭＣ１］Ｃ２のいずれかが、ＫＭＣ２またはＫＭＣ１のいずれかよりも、低く、例えば、約１．５倍〜１０００倍小さい。同様に、測定した結合親和性がオフ速度である場合、（Ａ）［Ｃ１Ｃ２］およびＭ、または（Ｂ）［ＭＣ２］およびＣ１、または（Ｃ）［ＭＣ１］およびＣ２の間のいずれかのオフ速度が、（１）ＭおよびＣ２または（２）ＭおよびＣ１の間のオフ速度のいずれかより低く、例えば、約１．５倍〜１０００倍小さい。代表的一実施形態では、Ｋ［Ｃ１Ｃ２］Ｍは、約１．５倍〜１０００倍ＫＭＣ２より小さい。別の代表的実施形態では、Ｋ［ＭＣ２］Ｃ１は、約１．５倍〜１０００倍ＫＭＣ２より小さい。別の代表的実施形態では、Ｋ［ＭＣ１］Ｃ２は、約１．５倍〜１０００倍ＫＭＣ２より小さい。別の代表的実施形態では、Ｋ［Ｃ１Ｃ２］Ｍは、約１．５倍〜１０００倍ＫＭＣ１より小さい。別の代表的実施形態では、Ｋ［ＭＣ２］Ｃ１は、約１．５倍〜１０００倍ＫＭＣ１より小さい。さらに別の代表的実施形態では、Ｋ［ＭＣ１］Ｃ２は、約１．５倍〜１０００倍ＫＭＣ１より小さい。（１）ＭおよびＣ２または（２）ＭおよびＣ１の間のそれぞれのオフ速度と比較して、（Ａ）［Ｃ１Ｃ２］およびＭ、または（Ｂ）［ＭＣ２］およびＣ１、または（Ｃ）［ＭＣ１］およびＣ２の間のそれぞれのオフ速度に対して、類似の例を予測することができる。 
【０１７０】
逆に、測定された結合親和性が平衡会合定数ＫＡの場合には、Ｋ［Ｃ１Ｃ２］Ｍ、Ｋ［ＭＣ２］Ｃ１、またはＫ［ＭＣ１］Ｃ２のいずれかは、ＫＭＣ２またはＫＭＣ１のいずれかよりも高く、例えば、約１．５倍〜１０００倍大きい。同様に、測定された結合親和性がオン速度の場合には、（Ａ）［Ｃ１Ｃ２］およびＭ、または（Ｂ）［ＭＣ２］およびＣ１、または（Ｃ）［ＭＣ１］およびＣ２間のいずれかのオン速度が、（１）ＭおよびＣ２または（２）ＭおよびＣ１間のいずれかのオン速度よりも高く、例えば、約１．５倍〜１０００倍大きい。一代表的実施形態では、Ｋ［Ｃ１Ｃ２］Ｍは、約１．５倍〜１０００倍ＫＭＣ２より大きい。別の代表的実施形態では、Ｋ［ＭＣ２］Ｃ１は、約１．５倍〜１０００倍ＫＭＣ２より大きい。別の代表的実施形態では、Ｋ［ＭＣ１］Ｃ２は、約１．５倍〜１０００倍ＫＭＣ２より大きい。別の代表的実施形態では、Ｋ［Ｃ１Ｃ２］Ｍは、約１．５倍〜１０００倍ＫＭＣ１より大きい。別の代表的実施形態では、Ｋ［ＭＣ２］Ｃ１は、約１．５倍〜１０００倍ＫＭＣ１より大きい。さらに別の代表的実施形態では、Ｋ［ＭＣ１］Ｃ２は、約１．５倍〜１０００倍ＫＭＣ１より大きい。（１）ＭおよびＣ２または（２）ＭおよびＣ１の間のそれぞれのオン速度と比較して、（Ａ）［Ｃ１Ｃ２］およびＭ、または（Ｂ）［ＭＣ２］およびＣ１、または（Ｃ）［ＭＣ１］およびＣ２の間のそれぞれのオン速度に対して、類似の例を予測することができる。
【０１７１】
一部の実施形態では、（１）第２成分単独に対する試験ポリペプチド結合剤の結合親和性または結合速度パラメーター、任意でＫＭＣ２、または（２）第１成分単独に対して試験ポリペプチド結合剤の結合親和性または結合速度パラメーター、任意でＫＭＣ１からなる群より選択される１つまたは複数の結合親和性または結合速度パラメーターが、（Ａ）第１および第２成分を含む複合体に対する試験ポリペプチド結合剤の結合親和性または結合速度パラメーター、任意でＫ［Ｃ１Ｃ２］Ｍ、（Ｂ）ポリペプチド結合剤および第２成分を含む複合体に対する第１成分の結合親和性または結合速度パラメーター、任意でＫ［ＭＣ２］Ｃ１、または（Ｃ）ポリペプチド結合剤および第１成分を含む複合体に対する第２成分の結合親和性または結合速度パラメーター、任意でＫ［ＭＣ１］Ｃ２からなる群より選択される１つまたは複数の結合親和性または結合速度パラメーターよりも少なくとも約１．５倍強い場合は、試験ポリペプチド結合剤は、負のモジュレーター候補として特定される。一部の実施形態では、（１）または（２）のいずれかの１つまたは複数の特異的結合親和性または結合速度パラメーターが、（Ａ）、（Ｂ）または（Ｃ）のいずれかの１つまたは複数の結合親和性または結合速度パラメーターよりも約１．５倍（すなわち、５０％）〜約１０００倍強い；あるいは、約１．５倍〜約１００倍強い、または約２倍〜２５倍、または約２倍〜約５０倍、または約１．５倍〜約２５倍、または約１．５倍〜約５０倍、例えば、少なくとも１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍または２０倍、または５００倍まで、または２００倍まで、または１５０倍まで、または１００倍まで、または９０倍まで、または８０倍まで、または７０倍まで、または６０倍まで、または５０倍まで、または４０倍まで、３０倍まで、２０倍まで、または１０倍まで強い。一部の実施形態では、（１）または（２）のいずれかの結合親和性または結合速度パラメーターが、（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）の全ての結合親和性または結合速度パラメーターより強い。一部の実施形態では、（１）の結合親和性または結合速度パラメーターが、（２）の結合親和性または結合速度パラメーターよりも強い。他の実施形態では、（２）の結合親和性または結合速度パラメーター（１）の結合親和性または結合速度パラメーターよりも強い。一部の実施形態では、２つ以上の結合親和性または結合速度パラメーターが測定され、また、例えば、オフ速度とオン速度、またはＫＡとＫＤ、またはこれらのいずれかの組み合わせが、比較される。
【０１７２】
具体的実施形態では、測定される結合親和性が、平衡解離定数ＫＤの場合は、ＫＭＣ２またはＫＭＣ１のいずれかが、Ｋ［Ｃ１Ｃ２］Ｍ、Ｋ［ＭＣ２］Ｃ１、またはＫ［ＭＣ１］Ｃ２のいずれかよりも低く、例えば、約１．５倍〜１０００倍小さい。同様に、測定される結合親和性が、オフ速度の場合には、（１）ＭとＣ２または（２）ＭとＣ１の間のいずれかのオフ速度が、（Ａ）［Ｃ１Ｃ２］とＭ、または（Ｂ）［ＭＣ２］とＣ１、または（Ｃ）［ＭＣ１］とＣ２の間のいずれかのオフ速度よりも小さい、例えば、約１．５倍〜１０００倍小さい。一代表的実施形態では、ＫＭＣ２は、約１．５倍〜１０００倍Ｋ［Ｃ１Ｃ２］Ｍより小さい。別の代表的実施形態では、ＫＭＣ２は、約１．５倍〜１０００倍Ｋ［ＭＣ２］Ｃ１より小さい。別の代表的実施形態では、ＫＭＣ２は、約１．５倍〜１０００倍Ｋ［ＭＣ１］Ｃ２より小さい。別の代表的実施形態では、ＫＭＣ１は、約１．５倍〜１０００倍Ｋ［Ｃ１Ｃ２］Ｍより小さい。別の代表的実施形態では、ＫＭＣ１は、約１．５倍〜１０００倍Ｋ［ＭＣ２］Ｃ１より小さい。さらに別の代表的実施形態では、ＫＭＣ１は、約１．５倍〜１０００倍Ｋ［ＭＣ１］Ｃ２より小さい。（Ａ）［Ｃ１Ｃ２］とＭ、または（Ｂ）［ＭＣ２］とＣ１、または（Ｃ）［ＭＣ１］とＣ２の間のそれぞれのオフ速度と比較して、（１）ＭとＣ２または（２）ＭとＣ１の間のそれぞれのオフ速度に対して、類似の例を予測することができる。
【０１７３】
逆に、結合親和性が平衡会合定数ＫＡである場合、ＫＭＣ２またはＫＭＣ１のいずれかが、Ｋ［Ｃ１Ｃ２］Ｍ、Ｋ［ＭＣ２］Ｃ１、またはＫ［ＭＣ１］Ｃ２のいずれかよりも高く、例えば、約１．５倍〜１０００倍大きい。同様に、測定される結合親和性がオン速度である場合、（１）ＭとＣ２または（２）ＭとＣ１の間のいずれかのオン速度が、（Ａ）［Ｃ１Ｃ２］とＭ、または（Ｂ）［ＭＣ２］とＣ１、または（Ｃ）［ＭＣ１］とＣ２間のいずれかのオン速度よりも高く、例えば、約１．５倍〜１０００倍大きい。一代表的実施形態では、ＫＭＣ２は、約１．５倍〜１０００倍Ｋ［Ｃ１Ｃ２］Ｍより大きい。別の代表的実施形態では、ＫＭＣ２は、約１．５倍〜１０００倍Ｋ［ＭＣ２］Ｃ１より大きい。別の代表的実施形態では、ＫＭＣ２は、約１．５倍〜１０００倍Ｋ［ＭＣ１］Ｃ２より大きい。別の代表的実施形態では、ＫＭＣ１は、約１．５倍〜１０００倍Ｋ［Ｃ１Ｃ２］Ｍより大きい。別の代表的実施形態では、ＫＭＣ１は、約１．５倍〜１０００倍Ｋ［ＭＣ２］Ｃ１より大きい。さらに別の代表的実施形態では、ＫＭＣ１は、約１．５倍〜１０００倍Ｋ［ＭＣ１］Ｃ２より大きい。（Ａ）［Ｃ１Ｃ２］とＭ、または（Ｂ）［ＭＣ２］とＣ１、または（Ｃ）［ＭＣ１］とＣ２の間のそれぞれのオン速度と比較して、（１）ＭとＣ２または（２）ＭとＣ１の間のそれぞれのオン速度に対して、類似の例を予測することができる。
【０１７４】
特定の実施形態では、モジュレーターは、抗体であり、Ｃ１とＣ２は、インスリンおよびインスリン受容体からなる群より選択される。
【０１７５】
これらの実施形態のいずれかでは、試験ポリペプチド結合剤および第２成分は、複数の異なる濃度の前記第１成分と接触可能である。これらの実施形態のいずれかでは、試験ポリペプチド結合剤および第１成分は、複数の異なる濃度の前記第２成分と接触可能である。これらの実施形態のいずれかでは、複数の異なる濃度の試験ポリペプチド結合剤は、前記第１成分および前記第２成分と接触可能である。
【０１７６】
試験ポリペプチド結合剤の第１成分と第２成分の間の結合相互作用に対する効果が測定される場合は、一部の具体的実施形態で試験ポリペプチド結合剤に対する抗原が、第１成分、例えば、リガンドである場合、試験ポリペプチド結合剤は、第１成分の濃度に比較して、飽和濃度である。あるいは、試験ポリペプチド結合剤に対する抗原が第２成分、例えば、受容体である場合、試験ポリペプチド結合剤は、第２成分の濃度に比較して、飽和濃度である。一部の実施形態では、試験ポリペプチド結合剤の濃度は、第１成分および第２成分を含む複合体に対する試験ポリペプチド結合剤のＫＤよりも大きいか、または等しい。さらなる実施形態では、第２成分の濃度は、第１成分、例えば、リガンドに対する試験ポリペプチド結合剤のＫＤ未満である。またさらなる実施形態では、第１成分、例えば、リガンド、の濃度は、第１成分の第２成分、例えば、受容体、に対する結合に関し、亜飽和濃度である。一部の実施形態では、第１成分、例えば、リガンド、の濃度は、第１成分の第２成分との相互作用に関し、約ＥＣ２０〜ＥＣ８０の範囲内である。一部の実施形態では、１つまたは複数の濃度の試験ポリペプチド結合剤が、１つまたは複数の濃度の第２成分、例えば、受容体の存在下、複数の異なる濃度の第１成分、例えば、リガンド、と接触する。一部の実施形態では、１つまたは複数の濃度の試験ポリペプチド結合剤が、１つまたは複数の濃度の第１成分、例えば、リガンドの存在下複数の異なる濃度の第２成分、例えば、受容体と接触する。
【０１７７】
複合化／非複合化標的および／またはシグナル伝達相手に対する試験ポリペプチド結合剤の特異的結合を、正のモジュレーターを特定する目的で判定する場合、一部の実施形態では、第１成分および第２成分を含む複合体に対して、試験ポリペプチド結合剤は、飽和濃度である。一部の実施形態では、第１成分、例えば、リガンド、および第２成分、例えば、受容体を含む複合体に対し、試験ポリペプチド結合剤の濃度は、試験ポリペプチド結合剤のＫＤより大きいか等しい。さらなる実施形態では、第１成分、例えば、リガンドに対して、第２成分、例えば、受容体の濃度は、第２成分、例えば、受容体のＫＤより大きい。さらなる実施形態では、第２成分、例えば、受容体に対し、第１成分、例えば、リガンドの濃度は、飽和濃度である。またさらなる実施形態では、第１成分および第２成分を含む複合体に対して、試験ポリペプチド結合剤は、亜飽和濃度である。一部の実施形態では、第１成分の第２成分との相互作用に関して、ポリペプチド結合剤の濃度は、約ＥＣ２０〜ＥＣ８０の範囲内にある。一部の実施形態では、第１成分、例えば、リガンドに対して、第２成分、例えば、受容体の濃度は、第２成分、例えば、受容体のＫＤより大きい。一部の実施形態では、第２成分、例えば、受容体の濃度に対して、第１成分、例えば、リガンドの濃度は、飽和濃度である。
【０１７８】
複合化／非複合化標的および／またはシグナル伝達相手に対する試験ポリペプチド結合剤の特異的結合を、負のモジュレーターを特定する目的で判定する場合で、一部の実施形態で、試験ポリペプチド結合剤が結合する抗原が、第１成分、例えば、リガンドである場合は、第１成分に対して、試験ポリペプチド結合剤は、亜飽和濃度である。試験ポリペプチド結合剤が結合する抗原が、第２成分、例えば、受容体である場合、第２成分に対し、試験ポリペプチド結合剤は亜飽和濃度である。さらなる実施形態では、第１成分の第２成分との相互作用に関し、ポリペプチド結合剤の濃度は、約ＥＣ２０〜ＥＣ８０の間にある。さらなる実施形態では、第１成分、例えば、リガンドに対して、第２成分、例えば、受容体の濃度は、第２成分、例えば、受容体のＫＤより大きい。さらなる実施形態では、第２成分、例えば、受容体に対して、第１成分、例えば、リガンドの濃度は、飽和濃度である。
【０１７９】
一部の実施形態では、方法は、（ａ）第１成分、（ｂ）第２成分、または（ｃ）第１成分および第２成分を含む複合体のいずれかの１つとの結合親和性に関する、複数の試験ポリペプチド結合剤、例えば、抗体、のアッセイをさらに含む。一部の具体的実施形態では、ポリペプチド結合剤は、例えば、約１０−５Ｍ以下、または約１０−６Ｍ以下、または約１０−７Ｍ以下、または約１０−８Ｍ以下（小さいＫＤは、より強い結合親和性を意味する）の平衡解離定数ＫＤを特徴とする結合親和性を有する。一部の実施形態では、選別された複数の試験ポリペプチド結合剤は、親ポリペプチド結合剤に１つまたは複数の異なる変異を導入して作られた親ポリペプチド結合剤の変異体である。
【０１８０】
さらなる実施形態では、ポリペプチド結合剤は、デコイ受容体、クリアランス受容体、または別のシグナル経路成分、等の異なる結合相手と比べて、第１または第２成分に対する効果の選択性で選別できる。このような方法は、第１または第２成分が結合相手ではない別の結合相手に対する第１または第２成分の結合親和性または結合速度パラメーターを大きく変化させないポリペプチド結合剤を特定することを含むことができる。一部の実施形態では、ポリペプチド結合剤の存在により、異なる結合相手に対する第１または第２成分の結合親和性または結合速度パラメーターが、５倍以下、または１０倍以下、または２０倍以下、または３０倍以下、または４０倍以下、または５０倍以下、変化する。
【０１８１】
前述の方法のいずれも、試験ポリペプチド結合剤の存在または非存在下の、シグナル伝達複合体によるシグナル伝達媒介レベルの測定、および試験ポリペプチド結合剤が、追加的にアゴニスト、部分アゴニスト、アンタゴニストまたは部分アンタゴニストであるか否かの判定をさらに含むことができる。アンタゴニズムまたはアゴニズムは、リン酸化アッセイ、イオンフラックスアッセイ、分子輸送アッセイ、または遺伝子発現アッセイ（これらに限定されない）でのシグナル伝達を含む、当技術分野で既知のいずれかのインビトロでまたはインビボアッセイで測定できる。
【０１８２】
一部の実施形態では、試験ポリペプチド結合剤は、第１成分、例えば、リガンドの第２成分、例えば、受容体との相互作用の用量反応曲線をシフト（正に、または負に）させる。シフトは、ＥＣ５０の少なくとも約１．５倍、例えば、約１．５倍〜約１００倍の増加または減少として現れうる。一部の実施形態では、試験ポリペプチド結合剤は、シグナル伝達複合体の第１および第２成分の相互作用により生成された最大アゴニスト応答シグナルを大きくは変えない。他の実施形態では、試験ポリペプチド結合剤それ自体、アンタゴニスト（例えば、前記シグナル伝達複合体により生成された最大アゴニスト応答シグナル伝達を減少させる）またはアゴニスト（例えば、前記シグナル伝達複合体により生成された最大アゴニスト応答シグナル伝達を増加させる）として作用する。
【０１８３】
試験ポリペプチド結合剤がアンタゴニストまたは部分アンタゴニストとして作用する場合は、最大アゴニスト応答を、例えば、約１．５倍〜約１００倍、または約２倍〜約２５倍、または約１．５倍〜約５０倍減少させることができる；または、約１０％、２５％、５０％（１．５倍）、７５％、２倍、３倍、または４−、５−、６−、７−、８−、９−または１０倍減少させることができる。あるいは、試験ポリペプチド結合剤が、アゴニストまたは部分アゴニストとして作用する場合、最大アゴニスト応答を、例えば、少なくとも約１０％、２５％、５０％（１．５倍）、７５％、２倍、３倍、または４−、５−、６−、７−、８−、９−または１０倍増加させることができる。さらに、試験ポリペプチド結合剤が、アンタゴニストまたは部分アンタゴニストとして作用する場合、ＩＣ５０は、１ｘ１０−５以下とすることができる。試験ポリペプチド結合剤は、さらに望ましい特性を示すことができ、例えば、試験ポリペプチド結合剤は、前記第１成分、または前記第２成分、または第１および第２成分を含む前記シグナル伝達複合体のクリアランスを大きく減少させない。
【０１８４】
調節試薬、例えば、動力学的調節試薬、を特定する方法、が、２００９年９月２５日出願、同時係属の共有米国特許出願第６１／２４６，０７９号、２０１０年２月１９日出願の米国特許出願第６１／３０６，３２４号、および２０１０年９月２４日出願の国際公開特許出願番号 __________、（整理番号２７１２９／４１７２６）、でさらに記載されている。
【０１８５】
試験ポリペプチド結合剤は、さらに望ましい特性を示すことができ、例えば、試験ポリペプチド結合剤は、前記第１成分、または前記第２成分、または第１および第２成分を含む前記シグナル伝達複合体のクリアランスを大きく減少させない。
【０１８６】
関連する態様では、本発明は、インスリン／インスリン受容体シグナル伝達複合体のモジュレーターおよび上述または本出願の他の場所のいずれかの方法で特定された抗体または他のモジュレーターを特定する方法を提供する。
【０１８７】
抗体のタイプとソース
本発明は、インスリン、インスリン受容体またはインスリン／インスリン受容体複合体に結合する標的特異的抗体を包含する。代表的実施形態では、本発明の標的特異的抗体は、ヒトカッパ（κ）またはヒトラムダ（λ）軽鎖もしくはそれ由来のアミノ酸配列、またはヒト重鎖もしくはそれ由来の配列、または単鎖、二量体、四量体もしくは他の形の重鎖と軽鎖の両方一緒のもの、を含んでもよい。一部の実施形態では、標的特異的免疫グロブリンの重鎖と軽鎖は、異なるアミノ酸分子である。他の実施形態では、同じアミノ酸分子が、標的特異的抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む。
【０１８８】
用語の「抗体」は、最も広範な意味で使用され、完全集合抗体、四量体の抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、ヒトおよびヒト化抗体、抗原に結合可能な抗体断片（例えば、Ｆａｂ'、Ｆ'（ａｂ）２、Ｆｖ、単鎖抗体、二重特異性抗体）、および所望の生物活性を示す限り、前述のものを含む組換え型ペプチド、が含まれる。「免疫グロブリン」または「四量体の抗体」は、２つの重鎖および２つの軽鎖から構成される四量体の糖タンパク質で、それぞれが可変領域および定常領域を含む。抗原結合部分は、インタクト抗体の組換ＤＮＡ技術または酵素的もしくは化学的開裂によって作ることができる。抗体断片または抗原結合部分には、特に、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ドメイン抗体（ｄＡｂ）、相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体断片、キメラ抗体、二重特異性抗体、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、直鎖抗体；キレート化組換え抗体、トリボディまたはバイボディ、細胞内抗体、ナノボディ、小モジュール免疫薬剤（ＳＭＩＰ）、抗原結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質、ラクダ科化抗体、ＶＨＨ含有抗体、またはそれらの変異体もしくは誘導体、および抗体が所望の生物活性を維持している限りは、ポリペプチドに対し特異的抗原結合を付与するのに十分な、少なくとも免疫グロブリンの一部を含むポリペプチド、が含まれる。
【０１８９】
天然の免疫グロブリンでは、各各四量体は、２つの同等な対のポリペプチド鎖からなり、各対は、１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）および１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各重鎖のアミノ末端部分は、主に抗原認識に関与する約１００〜１１０以上のアミノ酸の可変領域を含む。各重鎖のカルボキシ末端部分は、主にエフェクター機能に関与する定常領域を定める。ヒト軽鎖は、カッパ（κ）およびラムダ（λ）軽鎖に分類される。重鎖は、ミュー（μ）、デルタ（Δ）、ガンマ（γ）、アルファ（α）、およびイプシロン（ε）に分類され、抗体のアイソタイプをそれぞれ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥとして規定する。軽鎖および重鎖内で、可変領域と定常領域は、約１２以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって結合され、また、重鎖は約１０以上のアミノ酸の「Ｄ」領域も含む。一般的な説明は、「免疫学の基礎、７章」（Ｐａｕｌ、Ｗ．、ｅｄ．、２ｎｄ  ｅｄ．Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．（１９８９））（参照によってその全体が目的に応じ組み込まれる）を参照のこと。各軽／重鎖対の可変領域は、インタクト免疫グロブリンが２つの結合部位を有するように抗体結合部位を形成する。
【０１９０】
各重鎖は、１つの末端で可変ドメイン（ＶＨ）、とそれに続く多くの定常領域を有する。各軽鎖は、１つの末端で可変ドメイン（ＶＬ）、もう一つの末端で定常領域を有する；軽鎖の定常領域は、重鎖の第１の定常領域と整列し、軽鎖可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと整列している。特定のアミノ酸残基は、軽鎖と重鎖可変ドメインの間の境界を形成していると考えられている（Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７、１９８７）。
【０１９１】
免疫グロブリン可変ドメインは、比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）とこれに結合した３つの高頻度可変性領域、すなわちＣＤＲ、からなる同じ一般構造を示す。Ｎ末端末端からＣ末端にかけ、軽鎖および重鎖両方とも、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４ドメインを含む。各ドメインへのアミノ酸の割り付けは、Ｋａｂａｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（アメリカ国立衛生研究所、ベゼズダ、メリーランド（１９８７および１９９１））、またはＣｈｏｔｈｉａ  ＆  Ｌｅｓｋ、（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７、１９８７）；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．、（Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７８−８８３、１９８９）に従っている。
【０１９２】
抗体の高頻度可変性領域は、抗体のＣＤＲアミノ酸残基と呼ばれ、抗原結合に関与する。高頻度可変性領域は、ＣＤＲ［すなわち、：Ｋａｂａｔｅｔａｌ．、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５ｔｈＥｄ．公衆衛生局、アメリカ国立衛生研究所、ベゼズダ、メリーランド（１９９１）の記載に従って、軽鎖可変ドメイン中の残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）および８９〜９７（Ｌ３）ならびに重鎖可変ドメイン中の３１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）および９５〜１０２（Ｈ３）］からのアミノ酸残基、および／または高頻度可変性ループ（すなわち、［Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）］の記載に従って、軽鎖可変ドメイン中の残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）および９１〜９６（Ｌ３）ならびに重鎖可変ドメイン中の２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）および９６〜１０１（Ｈ３））からのアミノ酸残基を含む。しかし、個々の抗体の配列が特定されるときには、ＣＤＲ残基の実際の位置は、上述の予測残基とは変化してもよいことは当業者には理解されている。
【０１９３】
フレームワークまたはＦＲ残基は、高頻度可変性領域残基以外の可変ドメイン残基である。
【０１９４】
それらの重鎖の定常領域のアミノ酸配列に依存して、免疫グロブリンは、異なるクラス、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭに割り当てられ、これらはさらにサブクラスまたはアイソタイプ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２に分けることができる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および３次元構造は、よく知られている。異なるアイソタイプは、異なるエフェクター機能をもつ；例えば、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３アイソタイプは、ＡＤＣＣ活性を有する。本発明の抗体は、定常領域を含む場合、これらのサブクラスまたはアイソタイプのいずれかでありうる。
【０１９５】
代表的実施形態では、本発明の抗体は、ヒトカッパ（κ）またはヒトラムダ（λ）軽鎖もしくはそれら由来のアミノ酸配列、またはヒト重鎖もしくはそれら由来の配列、または単鎖、二量体、四量体または他の形の重鎖および軽鎖の両方一緒のものを含んでもよい。
【０１９６】
モノクローナル抗体は、実質的に均質な抗体集団から得た抗体を指す。モノクローナル抗体は、異なる決定因子（エピトープ）に対する異なる抗体を含む、従来の（ポリクローナル）抗体調製とは対照的に、通常、高度に特異的で、単一抗原性部位に対して指向させて作ることができる。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、均質培養により、異なる特異性と特性を有する他の免疫グロブリンの混入がないように合成されるという利点がある。
【０１９７】
本発明に従って使われるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、（Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５−７、１９７５）によって最初に記載された、ハイブリドーマ法により、または組換えＤＮＡ法（例えば米国特許第４，８１６，５６７号、参照）により作製できる。モノクローナル抗体は、また、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、（Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８、１９９１）およびＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．、（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７、１９９１）に記載された技術を使って、ファージ抗体ライブラリーから単離することができる。
【０１９８】
ハイブリドーマ方法では、マウスまたは他の適切な宿主動物、例えば、ハムスターまたはマカクザル、に免疫して、免疫に使われるタンパク質に特異的に結合する抗体を産生する、または産生できるリンパ球を誘発する（Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ；抗体：実験マニュアル、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）。
【０１９９】
抗体の組換え産生
また、本発明は、本発明の抗体をコードした核酸分子を包含する。一部の実施形態では、異なる核酸分子が、抗原特異的抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードする。他の実施形態では、同じ核酸分子が、抗原特異的抗体の重鎖および軽鎖可変領域をコードする。
【０２００】
本発明のモノクローナル抗体をコードしたＤＮＡは、従来の方法を使って（例えば、モノクローナル抗体の重鎖と軽鎖をコードした遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使って）、抗体を分泌するハイブリドーマ細胞から単離し、配列決定できる。配列決定は、通常、関心対象の遺伝子またはｃＤＮＡの少なくとも一部の単離が必要である。通常は、これには、モノクローナル抗体をコードしたＤＮＡのクローニングまたは好ましくは、モノクローナル抗体をコードしたｍＲＮＡ（すなわち、ｃＤＮＡ）が必要である。クローニングは、標準的な方法を使って行う（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）「分子クローニング：研究室ガイド」、Ｖｏｌ１〜３、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓを参照。この文献は、参照により本明細書に組み込まれる）。例えば、ｃＤＮＡライブラリーは、ポリＡ＋ｍＲＮＡ、好ましくは膜結合ｍＲＮＡ、およびヒト免疫グロブリンポリペプチド遺伝子配列に特異的なプローブを使って選別されたライブラリーの逆転写により構築できる。ヌクレオチドプローブ反応および他のヌクレオチドハイブリダイゼーション反応を、特定条件下相互にハイブリダイズするポリヌクレオチドの特定を可能とする条件で行った。ハイブリダイゼーション条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ｅｔ  ａｌ．、（Ｅｄｓ．）、分子クローニング：実験マニュアル、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）、ｐｐ．９．４７−９．５１、に記載のように計算できる。
【０２０１】
好ましい実施形態では、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、目的の免疫グロブリン遺伝子セグメント（例えば、軽鎖可変セグメント）をコードしたｃＤＮＡ（または完全長ｃＤＮＡの一部）を増幅する。増幅された配列は、いずれかの適切なベクター、例えば、発現ベクター、ミニ遺伝子ベクター、またはファージディスプレイベクター、に容易に挿入できる。目的の免疫グロブリンポリペプチドの一部の配列を決定できる限り、使用した特定のクローニング方法は、重大ではないことは理解されよう。本明細書で使われる、「単離された」核酸分子または「単離された」核酸の配列は、（１）通常は核酸の天然ソースに付随する少なくとも１つの混入核酸分子が特定され、分離されている、または（２）クローン化、増幅、標識、または他の方法でバックグラウンド核酸と区別され、の目的の核酸配列が決定できる、核酸分子を単離されていると見なすことができる。単離された核酸分子は、天然に認められる形または状態以外のものである。従って、単離された核酸分子は、天然の細胞中に存在する核酸分子とは区別される。しかし、単離された核酸分子には、例えば、核酸分子が天然細胞の染色体位置とは異なる位置にある、抗体をいつも発現する細胞中に含まれる核酸分子が含まれる。
【０２０２】
クローニングおよび配列決定に使われるＲＮＡの１つのソースは、遺伝子導入マウスからＢ細胞を得て、Ｂ細胞を不死化細胞に融合したハイブリドーマである。あるいは、ＲＮＡは、免疫動物のＢ細胞（または全脾臓）から単離することができる。ハイブリドーマ以外のソースが使われる場合は、特異的結合特性を有する免疫グロブリンまたは免疫グロブリンポリペプチドをコードした配列を選別することが望ましい。このような選別の１つの方法は、ファージディスプレイ技術を使用することである。ファージディスプレイは、本明細書でさらに記載されており、また、当技術分野ではよく知られている。例えば、Ｄｏｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、ＷＯ９１／１７２７１、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．、ＷＯ９２／０１０４７、およびＣａｔｏｎ  ａｎｄ  Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉ、（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７：６４５０−５４（１９９０））を参照のこと。これらは、参照により、本明細書に組み込まれる。一実施形態では、免疫遺伝子導入マウス由来のｃＤＮＡ（例えば、全脾臓ｃＤＮＡ）を単離し、ポリメラーゼ連鎖反応を使って、免疫グロブリンポリペプチドの一部、例えば、ＣＤＲ領域、をコードしたｃＤＮＡ配列を増幅し、増幅された配列をファージベクターに挿入する。目的のペプチド、例えば、所望の結合特性を有する可変領域ペプチド、をコードしたｃＤＮＡが、標準的ファージディスプレイ技術、例えば、パニング、により特定される。
【０２０３】
次に、増幅またはクローン化核酸の配列を決定する。典型的には、免疫グロブリンポリペプチドの全体可変領域をコードした配列が決定さるが、しかし、この方法は、可変領域の一部、例えば、ＣＤＲをコードした部分、のみの配列を決定するのに適している場合が多いと思われる。通常は、配列決定された部分は、少なくとも３０塩基長で、さらによく行われるものとしては、可変領域の少なくとも約３分の１または少なくとも約半分の長さが、配列決定される。
【０２０４】
ｃＤＮＡライブラリーから単離したクローンで、または、ＰＣＲを使う場合には、増幅した配列のサブクローニング後、または増幅セグメントの直接ＰＣＲシーケンシングによって、配列決定を行うことができる。配列決定は標準的な方法を使って行われる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）「分子クローニング：研究室ガイド」、Ｖｏｌ１−３、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、およびＳａｎｇｅｒ、Ｆ．ｅｔ  ａｌ．（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７４：５４６３−５４６７、を参照のこと。これら文献は、参照により本明細書に組み込まれる）。クローン化核酸の配列を、ヒト免疫グロブリン遺伝子およびｃＤＮＡの報告された配列と比較することにより、当業者なら、配列決定された領域に応じて、容易に、（ｉ）ハイブリドーマ免疫グロブリンポリペプチド（重鎖のアイソタイプ含む）の生殖系列セグメントの使用および（ｉｉ）Ｎ領域付加および体細胞変異プロセスから生じた配列を含む、重鎖および軽鎖可変領域の配列、を決定することができる。免疫グロブリン遺伝子配列情報の１つのソースは、国立バイオテクノロジー情報センター、国立医学図書館、国立衛生研究所、ベセズダ、メリーランド州、である。
【０２０５】
単離されるとすぐに、ＤＮＡは、発現ベクターに挿入され、次に、他の方法では免疫グロブリンタンパク質を産生しない大腸菌細胞、サルコス細胞、ヒト胎児由来腎臓２９３細胞（例えば、２９３Ｅ細胞）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはミエローマ細胞、等の宿主細胞に形質移入して、組換え型宿主細胞中にモノクローナル抗体の合成物を得る。抗体の組換え産生は、当技術分野でよく知られている。
【０２０６】
発現制御配列は、特定の宿主生物体の機能的に連結されたコード配列の発現に必要なＤＮＡ配列を指す。原核生物に適した制御配列には、例えば、プロモーター、遷移選択でオペレーター配列、およびリボソーム結合部位が含まれる。真核細胞は、プロモータ、ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサーを利用することが知られている。
【０２０７】
別の実施形態では、目的の免疫グロブリンのアミノ酸配列は、直接タンパク質シーケンシングによって決定することができる。適切なコード化ヌクレオチド配列は、ユニバーサルコドン表に従って設計できる。
【０２０８】
所望の抗体のアミノ酸配列変異体は、コード化ＤＮＡに適切なヌクレオチド改変を導入するか、または、ペプチド合成によって調製可能である。このような変異体には、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基の欠失、および／または残基への挿入、および／または残基の置換、が含まれる。最終構築物が所望の特性を有する限りにおいて、欠失、挿入、および置換のいずれの組み合わせを行っても、最終構築物を得られる。アミノ酸の改変は、また、グリコシル化部位の数または位置を変える、等のように、抗体の翻訳後プロセスも変えることができる。
【０２０９】
抗体のアミノ酸配列変異体をコードした核酸分子は、当技術分野で既知種々の方法で調製可能である。これらの方法には、これに限定されないが、天然ソースからの単離（天然アミノ酸配列変異体の場合）またはオリゴヌクレオチド媒介（または部位特異的な）変異生成、ＰＣＲ変異生成、および抗体の初期調製変異体または非変異体バージョンのカセット変異導入による調製、がある。
【０２１０】
また、本発明は、任意で、宿主細胞、ベクターおよび核酸を含む宿主細胞に認識される制御配列に機能的に連結されている、本発明の抗体をコードした単離核酸、および宿主細胞を培養して核酸を発現させ、任意で、宿主細胞培養なたは培地から抗体を回収する、抗体の産生のための組換え技術、を提供する。抗体産生用の種々のシステムおよび方法が、Ｂｉｒｃｈ  ＆  Ｒａｃｈｅｒ（Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．６７１−６８５（２００６））で概説されている。
【０２１１】
抗体の組換え産生のため、その抗体をコードした核酸を単離し、さらなるクローニングのために（ＤＮＡの増幅）または発現のために、複製可能ベクターに挿入される。モノクローナル抗体をコードしたＤＮＡは、容易に単離され、従来の方法を使って（例えば、抗体の重鎖と軽鎖をコードした遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使って）配列決定される。多くのベクターは、入手可能である。ベクターの成分には、通常、これに限定されないが、次の内の１つまたは複数が含まれる：シグナル配列、複製起点、１つまたは複数の選択的マーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、および転写終止配列。
【０２１２】
本明細書のベクター中のＤＮＡのクローニングまたは発現用として適切な宿主細胞は、原核生物、酵母、または高等真核生物細胞である。この目的のために適切な原核生物には、真正細菌、例えば、グラム陰性またはグラム陽性菌、例えば、腸内細菌科、例えば、大腸菌類、例えば、大腸菌、エンテロバクター、エルウィニア、クレブシエラ、プロテウス属、サルモネラ、例えば、ネズミチフス菌、セラチア、例えば、セラチア菌、および赤痢菌属、ならびに桿菌、例えば、枯草菌、およびバチルスリケニホルミス（例えば、バチルスリケニホルミス４１Ｐ（１９８９年４月１２日発行のＤＤ２６６，７１０で開示））、シュードモナス、例えば、緑膿菌およびストレプトマイセス、が挙げられる。１つの好ましい大腸菌クローニング宿主は、大腸菌２９４（ＡＴＣＣ３１，４４６）であるが、他の菌株、例えば、大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１，５３７）、および大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７，３２５）も適合する。これらの例は、限定するというよりは、説明のためのものである。
【０２１３】
原核生物に加えて、真核生物微生物、例えば、繊維状菌類または酵母も、抗体をコードしたベクター用の適切なクローニングまたは発現宿主である。出芽酵母、または一般的なパン酵母は、下等真核生物宿主微生物の中で最も普通に使われる。しかし、多くの他の属、種、および株が、一般に入手可能で、本明細書で使用可能で、分裂酵母；例えば、ルイベロミセス・ラクチス、クリヴェロマイセス・フラギリス（ＡＴＣＣ１２，４２４）、クルイベロマイセスブルガリカス（ＡＴＣＣ１６，０４５）、クルベロミセス・ウィケラミイ（ＡＴＣＣ２４，１７８）、クルベロミセスワルチイ（ＡＴＣＣ５６，５００）、クルイベロマイセスドロソフィラム（ＡＴＣＣ３６，９０６）、クリュイベロミセス・テモトレランス、およびクリュイベロミセス・マルシアヌス、等のクリベロマイセス宿主；ヤロウイア属（ＥＰ４０２，２２６）；ピチア・パストリス（ＥＰ１８３，０７０）；カンジダ；トリコデルマ・リージア（ＥＰ２４４，２３４）；アカパンカビ；シュワニオミセスオキシデンタリス、等のシュワニオミセス属；および、例えば、パンカビ、アオカビ類、トリポクラジウム、等の糸状菌類、ならびに偽巣性コウジ菌およびクロコウジカビ、等のアスペルギルス宿主、が挙げられる。
【０２１４】
グリコシル化抗体の発現用の適切な宿主細胞は、多細胞生物から得られる。無脊椎動物細胞の例には、植物および昆虫細胞が含まれる。ヨトウガ（イモムシ）、ネッタイシマカ（蚊）、ヒトスジシマカ（蚊）、キイロショウジョウバエ（ショウジョウバエ）、およびカイコ、等宿主由来の、多くのバキュロウイルス株および変異体ならびに対応する許容される昆虫宿主細胞が特定されている。トランスフェクション用の種々のウイルス株が公的に入手可能であり、例えば、オートグラファ・カリフォルニカＮＰＶのＬ−１変異体およびカイコＮＰＶのＢｍ−５株、ならびに本発明の明細書にあるウイルスとして、特にヨトウガ細胞のトランスフェクション用に、使用可能なウイルスが挙げられる。
【０２１５】
綿、トウモロコシ、ジャガイモ、ダイズ豆、ペチュニア、トマト、タバコ、アオウキクサ属、および他の植物細胞の植物細胞培養物も宿主として使用可能である。
【０２１６】
有用な哺乳動物宿主細胞株の例には、ＣＨＯＫ１細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ６１）、ＤＸＢ−１１、ＤＧ−４４、およびチャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂｅｔａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７：４２１６（１９８０））を含むチャイニーズハムスター卵巣細胞；ＳＶ４０（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣＣＲＬ１６５１）によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１系統；ヒト胚腎臓系統（２９３または増殖のために懸濁培養液中でサブクローニングされた２９３細胞、（Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．３６：５９、１９７７）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣＣＣＬ１０）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ、（Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１、１９８０）；サル腎臓細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）；水牛ラット肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ヒト肝臓細胞（ＨｅｐＧ２、ＨＢ８０６５）；マウス房腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．ＹＡｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８（１９８２））；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒト肝細胞腫系統（ＨｅｐＧ２）、が挙げられる。
【０２１７】
宿主細胞は、抗体産生のために形質転換されるか、または上述の発現またはクローニングベクターを形質移入され、さらに、形質転換体を選択して、または所望の配列をコードした遺伝子を増幅して、プロモーター誘導のための必要に応じて改質された通常の栄養素培地中で培養される。さらに、選択マーカーによって分離された転写ユニットの多数の複製を有する新規ベクターおよび形質移入された細胞株が、所望の抗原に結合する抗体の発現のために、特に有用で、好ましい。
【０２１８】
所望の抗体核酸配列を含む宿主細胞を種々の培地中で培養できる。市販品で入手可能な培地、例えば、ハムＦ１０培地（シグマ）、最小必須培地（（ＭＥＭ）、（シグマ）、ＲＰＭＩ−１６４０（シグマ）、およびダルベッコ変法イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、シグマ）は、宿主細胞培養に適している。さらに、Ｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．、（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４、１９７９）、Ｂａｒｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５（１９８０）、米国特許４，７６７，７０４；４，６５７，８６６；４，９２７，７６２；４，５６０，６５５；もしくは５，１２２，４６９；ＷＯ９０１０３４３０；ＷＯ８７／００１９５；または米国再発行特許３０，９８５に記載のいずれかの培地が宿主細胞用の培地として使用できる。これらの培地のいずれも、必要に応じ、ホルモンおよび／または他の増殖因子（インスリン、トランスフェリン、または上皮増殖因子、等）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸塩、等）、緩衝液（ヘペス、等）、ヌクレオチド（アデノシンおよびチミジン、等）、抗生物質（ゲンタマイシン（登録商標）薬剤、等）、微量成分（マイクロモルレンジで最終濃度中に通常存在する無機化合物として定義される）、およびグルコースまたは相当するエネルギーソースで補充してもよい。任意の他に必要な補充剤もまた、当業者には既知の適切な濃度で添加することができる。培養条件、例えば、温度、ｐＨ、等、は、発現用に選んだ宿主細胞で前に使用したものであり、当業者には明らかであろう。
【０２１９】
組換え技術を使う場合には、抗体は、微生物の培養由来のものを含め、細胞周辺腔中で細胞内産生するか、または培地中へ直接分泌させることができる。抗体が細胞内で産生される場合は、第１ステップとして、粒子状の壊死組織片、宿主細胞または溶解断片を、例えば、遠心分離または限外濾過により除去する。Ｂｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１−４３、１９８８；ＩＣＳＵ  Ｓｈｏｒｔ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  １０：１０５（１９９０）；およびＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：４５７−４６１（１９９３）には、大腸菌の細胞周辺腔に分泌された抗体を単離する方法が記載されている。［（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３−１６７（１９９２）も参照のこと］。
【０２２０】
微生物または哺乳動物細胞から調製された抗体体組成は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー陽イオンまたは陰イオン交換クロマトグラフィー、および親和性クロマトグラフィーを使って精製できるが、親和性クロマトグラフィーが好ましい精製技術である。タンパク質Ａの親和性リガンドとしての適合性は、抗体中に存在するいずれかの免疫グロブリンＦｃドメインの種およびアイソタイプに依存する。タンパク質Ａは、ヒトγ１、γ２、またはγ４重鎖に基づく抗体の精製に使用できる（Ｌｉｎｄｍａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１−１３、１９８３）。タンパク質Ｇは、全てのマウスアイソタイプおよびヒトγ３用に推奨されている（Ｇｕｓｓ  ｅｔ  ａｌ．、ＥＭＢＯＪ．５：１５６７１５７５（１９８６））。親和性リガンドが結合する担体は、アガロースが最もよく使われるが、他の担体も適用可能である。機械的に安定な担体、例えば、気孔制御ガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンは、アガロースを使った場合より速い流量およびより短い処理時間を可能にする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合には、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ  ＡＢＸ（登録商標）樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ、Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ、Ｎ．Ｊ．）が精製に有用である。タンパク質精製用の他の技術、例えば、イオン交換カラム分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカクロマトグラフィー、ヘパリンセファロースクロマトグラフィー（登録商標）陰イオンまたは陽イオン交換樹脂（ポリアスパラギン酸カラム、等）クロマトグラフィー、等電点電気泳動、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および硫酸アンモニウム沈殿もまた、回収する抗体に応じて、適用可能である。
【０２２１】
本発明の抗体
本発明は、インスリン、インスリン受容体および／またはインスリン／インスリン受容体複合体に結合する標的特異的抗体包含し、好ましくは、インスリン受容体のシグナル伝達および／またはグルコース値とグルコース取り込みに与えるその効果を変える（例えば、増加または減少させる）。代表的実施形態では、本発明の標的特異的抗体は、ヒトカッパ（κ）またはヒトラムダ（λ）軽鎖もしくはそれら由来のアミノ酸配列、またはヒト重鎖もしくはそれ由来の配列、または単鎖、二量体、四量体もしくは他の形の重鎖と軽鎖の両方一緒のものを含むことができる。一部の実施形態では、標的特異的免疫グロブリン重鎖と軽鎖は、異なるアミノ酸分子である。他の実施形態では、同じアミノ酸分子が、標的特異的抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む。
【０２２２】
一部の実施形態では、抗標的抗体のアミノ酸配列は、配列番号１〜１５０の抗体またはその変異体の成熟（すなわち、シグナル配列の欠けている）軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列の１つまたは複数のＣＤＲを含む。一部の実施形態では、ＶＬは、前述の抗体のいずれかの１つの軽鎖のＣＤＲ１の開始からＣＤＲ３の末端までのアミノ酸配列を含む。
【０２２３】
一実施形態では、標的特異的抗体は、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）を含み、それぞれは、配列番号１〜１５０に記載のＶＬ領域のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する抗体のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域から独立に選択される。一態様では、軽鎖ＣＤＲ１は、残基２４〜３６内にあり、ＣＤＲ２は、残基５０〜５６内にあり、ＣＤＲ３は、残基８９〜１０１内にある（Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングによる）。標的特異的抗体のポリペプチドは、配列番号１〜１５０からなる群より選択されるＶＬ領域のアミノ酸配列を有する抗体のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を含むことができる。
【０２２４】
一部の実施形態では、標的特異的抗体は、配列番号１５１〜３０３に示される抗体またはその変異体の成熟（すなわち、シグナル配列を欠く）重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列の１つまたは複数のＣＤＲを含む。一部の実施形態では、ＶＨは、前述の抗体の重鎖のいずれかの１つのＣＤＲ１の開始からＣＤＲ３の末端までのアミノ酸配列を含む。
【０２２５】
一実施形態では、標的特異的抗体は、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）を含み、それぞれは、配列番号１５１〜３０３に記載のＶＨ領域のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を有する抗体のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域から独立に選択される。標的特異的抗体は、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３を含み、それぞれは、配列番号１５１〜３０３に記載のＶＨ領域のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を有する抗体のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域から独立に選択されることがさらに意図される。一態様では、重鎖ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングに従い位置づけされ、ＣＤＲ１は、残基２６〜３５内であり、ＣＤＲ２は、残基５０〜５８内であり、ＣＤＲ３は、残基９５〜１１１または９７〜１１８内である。標的特異的抗体のポリペプチドは、配列番号１５１〜３０３からなる群より選択されるＶＨ領域のアミノ酸配列を有する抗体のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を含むことができる。
【０２２６】
表１と２および配列番号１〜３０３のＣＤＲは、ＩＭＧＴ  ｓｙｓｔｅｍ、ＬｅＦｒａｎｃ  ｅｔ  ａｌ  ＩＭＧＴ、ｔｈｅ  ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ  ＩＭＭＵＮＯＧＥＮＥＴＩＣＳ  ＩＮＦＯＲＭＡＴＩＯＮ  ＳＹＳＴＥＭ（登録商標）、Ｎｕｃｌ．Ａｃ．Ｒｅｓ．３３  Ｄ５９３−５９７（２００５）に従って決定された。
【０２２７】
別の実施形態では、抗体は、前述の成熟軽鎖可変領域および成熟重鎖可変領域を表３に示すように対で含む。別の実施形態では、本発明は、モノクローナル抗体の精製調製物を意図し、配列番号１〜３０３に記載のいずれかの抗体の軽鎖可変領域および重鎖可変領域を、表３に示すように対で含む。
【０２２８】
代表的実施形態では、本発明は、以下を意図する：
【０２２９】
１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つの配列番号１５１〜３０３および配列番号１〜１５０のいずれかをそれぞれ保持し、任意でこれらのＣＤＲのいずれかに１つまたは２つの変異、例えば、保存的または非保存的置換、を、任意で表３に示す対を形成して含む、モノクローナル抗体； 
【０２３０】
全てのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、または配列番号１５１〜３０３のいずれかの１つの重鎖可変領域を保持し、任意で、このようなＣＤＲのいずれかの１つまたは２つの変異をさらに含み、また、任意で、いずれかの適切な重鎖定常領域、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、もしくはＩｇＥ、そのヒト配列、またはそれらの複合型またはそのヒトコンセンサスをさらに含むモノクローナル抗体；
【０２３１】
全てのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、または配列番号１〜１５０のいずれかの１つの軽鎖可変領域を保持し、任意で、このようなＣＤＲのいずれかの１つまたは２つの変異をさらに含み、また、任意で、いずれかの適切な軽鎖定常領域、例えば、カッパまたはラムダ軽鎖定常領域、そのヒト配列、またはそれらの複合型またはそのヒトコンセンサスをさらに含むモノクローナル抗体；
【０２３２】
例えば、Ｘ線結晶解析または重水素交換質量分析、アラニンスキャニングおよびペプチド断片ＥＬＩＳＡ、等の他の生物物理学的または生化学的技術により測定して、配列番号１〜３０３に記載の可変領域を含む抗体と同じ直鎖またはＩＮＳＲの３次元エピトープに結合するモノクローナル抗体；
【０２３３】
ヒトＩＮＳＲへの結合に対し、約７５％超、約８０％超、または約８１％超、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％または９５％、まで配列番号１〜３０３に記載の可変領域を含む抗体と競合するモノクローナル抗体。
【０２３４】
一部の実施形態では、抗体は、軽鎖および重鎖の３つの軽鎖ＣＤＲ全て、３つの重鎖ＣＤＲ全て、または６つのＣＤＲ全てを、表３に示す対を形成して含む。一部の代表的実施形態では、ある抗体由来の２つの軽鎖ＣＤＲを、異なる抗体由来の第３の軽鎖ＣＤＲと組み合わせることができる。あるいは、１つの抗体由来のＬＣＤＲ１を、異なる抗体由来のＬＣＤＲ２およびさらに別の抗体由来のＬＣＤＲ３と組み合わせることができる（ＣＤＲが高い相同性を有する場合は特に）。同様に、ある抗体由来の２つの重鎖ＣＤＲを、異なる抗体由来の第３の重鎖ＣＤＲと組み合わせることができる；または、１つの抗体由来のＨＣＤＲ１を、異なる抗体由来のＨＣＤＲ２およびさらに別の抗体由来のＨＣＤＲ３と組み合わせることができる（ＣＤＲが高い相同性を有する場合は特に）。
【０２３５】
コンセンサスＣＤＲも使用できる。本明細書からのいずれかの１つのコンセンサスＣＤＲを、任意の抗体の同じ鎖（例えば、重鎖または軽鎖）由来の２つの他のＣＤＲと組み合わせて、例えば、適切な重鎖または軽鎖可変領域を形成することができる。
【０２３６】
一部の実施形態では、配列番号１４８〜２８４に記載の重鎖可変領域に少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上および／または配列番号１〜１５０に記載の軽鎖可変領域に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つの、または全てのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２またはＣＤＲＬ３をさらに含む抗体が提供される。一部の実施形態では、軽鎖可変領域に対し、一定割合の同一性を有するアミノ酸配列は、１つ、２つ、または３つの軽鎖ＣＤＲを含んでもよい。他の実施形態では、重鎖可変領域に対し、一定割合の同一性を有するアミノ酸配列は、１つ、２つ、または３つの重鎖ＣＤＲを含んでもよい。
【０２３７】
本発明の抗体は、抗体のＣＤＲ領域中に１つ、または２つ以上のアミノ酸置換、例えば、非保存的または保存的置換を持つことができることが意図されている。
【０２３８】
関連する実施形態では、フレームワークの残基は、変えられる。重鎖フレームワーク領域は、Ｈ−ＦＲ１、Ｈ−ＦＲ２、Ｈ−ＦＲ３およびＨ−ＦＲ４と命名された領域内にあり、この領域は、重鎖ＣＤＲ残基を取り囲んでいる。また、変更可能な軽鎖フレームワーク領域の残基は、Ｌ−ＦＲ１、Ｌ−ＦＲ２、Ｌ−ＦＲ３およびＬ−ＦＲ４と命名された領域内にあり、この領域は、軽鎖ＣＤＲ残基を取り囲んでいる。フレームワーク領域内のアミノ酸は、例えば、ヒトフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークで特定されたいずれかの適切なアミノ酸で置換可能である。
【０２３９】
本発明では、配列番号１５１〜３０３のいずれかの１つのアミノ酸配列に融合した配列番号１〜１５０のいずれかのアミノ酸配列を、任意で表３に記載した重鎖／軽鎖可変領域の対として含む、または配列番号１〜１５０および配列番号１５１〜３０３の少なくとも一部を含むそれらの断片を任意で表３に示す対で含む、精製されたポリペプチドで、結合インスリン受容体、インスリンまたはインスリン／インスリン受容体複合体に結合するポリペプチドを提供することがさらに意図されている。
【０２４０】
別の態様では、本発明は、少なくとも１つの本明細書記載の軽鎖可変領域のＣＤＲを含み、その軽鎖可変領域が、配列番号１〜１５０に記載のＬＣＤＲ配列に対し少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む精製ポリペプチドを提供する。一実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１〜１５０に記載のＬＣＤＲのいずれかに対して、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一でありうる。さらなる態様では、本発明は、少なくとも１つの本明細書記載の重鎖可変領域のＣＤＲを含み、その重鎖可変領域が、配列番号１５１〜３０３に記載のＨＣＤＲ配列に対し少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む精製ポリペプチドを提供する。一実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１５１〜３０３に記載のＨＣＤＲのいずれかに対して、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一でありうる。
【０２４１】
抗体重鎖および軽鎖のＣＤＲは、抗体結合親和性を改善することができ、例えば、親和性成熟により得られる変異体アミノ酸配列を含むことが、さらに意図されている。一態様では、本発明の抗体は、配列番号１５１〜３０３に記載の親抗体配列のＨＣＤＲ２に対して約３５％同一性を有する重鎖ＨＣＤＲ２配列を含むことが意図されている。関連する態様では、本発明の抗体は、配列番号１５１〜３０３に記載の親抗体配列のＨＣＤＲ３に対して約５０％同一性を有する重鎖ＨＣＤＲ３配列を含むことが意図されている。
【０２４２】
一実施形態では、本発明は、配列番号１〜１５０および１５１〜３０３のいずれかの１つに記載の可変領域アミノ酸配列を有する機能的断片を含む抗原結合化合物を提供する。関連する実施形態では、上述の抗原結合化合物は、完全集合四量体抗体、ポリクローナル抗体、ヒトＥＮＧＩＮＥＥＲＥＤ（登録商標）抗体を含むモノクローナル抗体；ヒト化抗体；ヒト抗体；キメラ抗体；多特異性抗体、抗体断片、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２；Ｆｖ；ｓｃＦｖまたは単鎖抗体断片；ダイアボディ；トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、直鎖抗体；キレート化組換え抗体、トリボディまたはバイボディ、細胞内抗体、ナノボディ、小モジュール免疫薬剤（ＳＭＩＰ）、結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質、ラクダ科化抗体、ＶＨＨ含有抗体、または１つまたは複数の本発明のＣＤＲ配列を含み、所望の生物活性を示すいずれかの抗体の変異体または誘導体からなる群より選択される。本発明の抗原結合化合物は、表面プラズモン共鳴法で測定して、１０−５、１０−６、１０−７、１０−８、１０−９、１０−１０、１０−１１Ｍまたはそれ以下の結合親和性を有することが好ましい。
【０２４３】
一態様では、本発明の抗体は、アミノ酸配列の配列番号１５１〜３０３および配列番号１〜１５０に記載の、それぞれ重鎖可変領域または軽鎖可変領域を、表３の対を形成して、含む。抗体は、上記アミノ酸配列に記載の抗体の全てまたは一部を含むことができることが意図されている。一実施形態では、抗体は、配列番号１５１〜３０３の重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３の少なくとも１つ、または配列番号１〜１５０の軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３の少なくとも１つを、表３の対を形成して、含む。
【０２４４】
一実施形態では、重鎖は、重鎖ＣＤＲ３配列として特定されるアミノ酸配列を含む。このような「重鎖ＣＤＲ３配列」（ＨＣＤＲ３）は、表２および配列番号１５１〜３０３に記載の重鎖ＣＤＲ３配列として特定されるアミノ酸配列を含む。あるいは、ＨＣＤＲ３配列は、表２に特定のいずれかのＨＣＤＲ３アミノ酸配列に比較して、１つまたは複数のアミノ酸改変、すなわち、置換、挿入または欠失、を含むアミノ酸配列を含む。好ましい置換には、表２の別のＨＣＤＲ３内の対応する位置にあるアミノ酸への置換が含まれる。あるいは、ＨＣＤＲ３配列は、本明細書記載のＨＣＤＲ３のコンセンサスアミノ酸配列を含むこともできる。
【０２４５】
あるいは、上述の本発明のＨＣＤＲ３配列を含む重鎖は、配列番号１５１〜３０３および表２でＨＣＤＲ２として特定されるいずれかのアミノ酸配列を含む本発明の「重鎖ＣＤＲ２配列」（ＨＣＤＲ２）、配列番号１５１〜３０３および表２で特定されるいずれかのＨＣＤＲ２に比較して１つまたは複数のアミノ酸改変を含み、好ましくは、表２の別のＨＣＤＲ２内の対応する位置にあるアミノ酸への置換を含むアミノ酸配列、または本明細書記載のＨＣＤＲ２のコンセンサス配列、をさらに含むことができる。
【０２４６】
上述の本発明の重鎖ＣＤＲ３配列を含む重鎖は、また、（ａ）上述の本発明の重鎖ＣＤＲ１配列および（ｂ）上述の本発明の重鎖ＣＤＲ２配列、の両方を含むこともできる。
【０２４７】
本発明の一態様では、下記の本発明のいずれかの１つ、２つ、および／または３つの重鎖ＣＤＲ配列を含む重鎖を含む標的抗原に結合する抗体が提供される。
【０２４８】
上述のいずれかの重鎖ＣＤＲ配列は、また、ＣＤＲのどちらかの末端に付加したアミノ酸を含むこともできる。アミノ酸類似体を含む変異体または誘導体の親和性成熟または調製を含む、本発明の抗体および抗原結合化合物の変異体および誘導体の調製は、本明細書でさらに詳細に記載される。代表的変異体には、アミノ酸配列内の対応するアミノ酸の保存的または非保存的置換またはヒト抗体配列の対応するアミノ酸によるアミノ酸の置換が含まれる。
【０２４９】
いずれか１つの上述の重鎖を含む抗体は、軽鎖、好ましくは標的抗原に結合する軽鎖、最も好ましくは下記の本発明の軽鎖ＣＤＲ配列を含む軽鎖をさらに含むことができる。 
【０２５０】
本発明の別の態様では、下記の本発明のいずれかの１つ、２つ、および／または３つの軽鎖ＣＤＲ配列を含む軽鎖を含む標的抗原に結合する抗体を提供する。
【０２５１】
好ましくは、軽鎖は、軽鎖ＣＤＲ３配列として特定されたアミノ酸配列を含む。このような「軽鎖ＣＤＲ３配列」（ＬＣＤＲ３）は、表１および配列番号１〜１５０内の軽鎖ＣＤＲ３配列として特定されるアミノ酸配列を含む。あるいは、軽鎖ＣＤＲ３配列は、表１に特定のいずれかの軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列に比較して、１つまたは複数のアミノ酸改変、すなわち、置換、挿入または欠失、を含むアミノ酸配列を含む。好ましい置換には、表１の別の軽鎖ＣＤＲ３内の対応する位置にあるアミノ酸への置換が含まれる。あるいは、軽鎖ＣＤＲ３配列は、表１に示す軽鎖ＣＤＲ３のコンセンサスアミノ酸配列を含むこともできる。
【０２５２】
上述の本発明の軽鎖ＣＤＲ３配列を含む軽鎖は、配列番号１〜１５０または表１で軽鎖ＣＤＲ１として特定されるいずれかのアミノ酸配列を含む本発明の「軽鎖ＣＤＲ１配列」、配列番号１〜１５０または表１で特定されるいずれかの軽鎖ＣＤＲ１に比較して１つまたは複数のアミノ酸改変を含み、好ましくは、表１の別の軽鎖ＣＤＲ１内の対応する位置にあるアミノ酸への置換を含むアミノ酸配列、または本明細書記載の軽鎖ＣＤＲ１のコンセンサス配列、をさらに含むことができる。
【０２５３】
あるいは、上述の本発明の軽鎖ＣＤＲ３配列を含む軽鎖は、配列番号１〜１５０または表１で軽鎖ＣＤＲ２として特定されるいずれかのアミノ酸配列を含む本発明の「軽鎖ＣＤＲ２配列」、表１で特定されるいずれかの軽鎖ＣＤＲ２に比較して１つまたは複数のアミノ酸改変を含み、好ましくは、配列番号１〜１５０または表１の別の軽鎖ＣＤＲ２内の対応する位置にあるアミノ酸への置換を含むアミノ酸配列、または表１に示す軽鎖ＣＤＲ２のコンセンサス配列、をさらに含むことができる。
【０２５４】
関連する態様では、本発明では、少なくとも１つの配列番号１５１〜３０３のＨＣＤＲまたは配列番号１〜１５０のＬＣＤＲを含み、重鎖可変領域のフレームワーク領域および軽鎖可変領域のフレームワーク領域が、ヒト抗体由来のフレームワーク領域を含む精製ポリペプチドが意図されている。別の実施形態では、重鎖可変領域のフレームワーク領域および軽鎖可変領域のフレームワーク領域が、アミノ酸置換によって、ヒト抗体配列に対し、より高い相同性となるように化学的に改変される。例えば、各重鎖フレームワーク領域（Ｈ−ＦＲ１〜４）内で、少なくとも１つの、少なくとも２つの、少なくとも３つの、少なくとも４つの、少なくとも５つの、または少なくとも６つのマウス重鎖可変領域のネイティブフレームワーク領域残基が、アミノ酸置換により改変され、軽鎖フレームワーク領域（Ｌ−ＦＲ１〜４）内で、少なくとも１つの、少なくとも２つの、少なくとも３つの、少なくとも４つの、少なくとも５つの、または少なくとも６つのマウス軽鎖可変領域のネイティブフレームワーク領域残基が、アミノ酸置換により改変されることが意図されている。
【０２５５】
上述の本発明の軽鎖ＣＤＲ３配列を含む軽鎖は、また、（ａ）上述の本発明の軽鎖ＣＤＲ１配列および（ｂ）上述の本発明の軽鎖ＣＤＲ２配列を含むこともできる。
【０２５６】
いずれか１つの上述の軽鎖可変領域を含む抗体は、重鎖可変領域を、任意で表３の対を形成して、好ましくは標的抗原に結合する重鎖可変領域を、最も好ましくは上述の本発明の重鎖ＣＤＲ配列を含む重鎖可変領域をさらに含むことができる。
【０２５７】
一態様では、抗体は、インスリン受容体またはインスリンおよびインスリン受容体を含む複合体と１０−５Ｍ以下の平衡解離定数ＫＤで結合し、インスリンとインスリン受容体の間の結合親和性を約５倍〜２００倍まで強化することができる。一実施形態では、抗体は、例えば、インスリンとインスリン受容体の間の結合親和性を強化する正のモジュレーター抗体である。一部の実施形態では、正のモジュレーター抗体には、これに限定されないが、Ａｂ００６、Ａｂ０３０、Ａｂ００４、Ａｂ０１３、Ａｂ００９、Ａｂ００７、Ａｂ０１１、Ａｂ００１、Ａｂ０１２、Ａｂ０１０、Ａｂ００３、Ａｂ００８、Ａｂ００２、Ａｂ００５、Ａｂ０７６、Ａｂ０７７、Ａｂ０７９、Ａｂ０８０、Ａｂ０８３、Ａｂ０５９、Ａｂ０７８、Ａｂ０８５または表１および２に記載の、もしくは配列番号７６、８０、１０１、１２８、１３２および配列番号２９１、１９６、２３９、２６７、２７１に記載の抗体可変領域中のいずれかの１つの上記抗体に対応する１つまたは複数のＣＤＲを含むいずれかのポリペプチドが挙げられる。
【０２５８】
さらなる実施形態では、正のモジュレーター抗体は、インスリン受容体、インスリン／インスリン受容体複合体に結合するか、またはインスリン受容体およびインスリン／インスリン受容体複合体の両方に結合する。関連する実施形態では、インスリン受容体またはインスリン／インスリン受容体複合体、または両方に結合する正のモジュレーター抗体には、これに限定されないが、Ａｂ００６、Ａｂ０３０、Ａｂ００４、Ａｂ０１３、Ａｂ００９、Ａｂ００７、Ａｂ０１１、Ａｂ００１、Ａｂ０１２、Ａｂ０１０、Ａｂ００３、Ａｂ００８、Ａｂ００２、Ａｂ００５、Ａｂ０７６、Ａｂ０７７、Ａｂ０７９、Ａｂ０８０、Ａｂ０８３または表１および２に記載の、もしくは配列番号７６、８０、１０１および配列番号２９１、１９６、２３９に記載の抗体可変領域中のいずれかの１つの上記抗体に対応する１つまたは複数のＣＤＲを含むいずれかのポリペプチドが挙げられる。
【０２５９】
さらなる実施形態では、正のモジュレーター抗体は、インスリン／インスリン受容体複合体に結合するが、非複合化インスリン受容体に対しては、検出可能なほどは結合しない。関連する実施形態では、インスリン／インスリン受容体複合体に結合する正のモジュレーター抗体には、これに限定されないが、Ａｂ０５９、Ａｂ０７８、Ａｂ０８５または表１および２に記載の、もしくは配列番号１２８、１３２および配列番号２６７と２７１に記載の抗体可変領域中のいずれかの１つの上記抗体に対応する１つまたは複数のＣＤＲを含むいずれかのポリペプチドが挙げられる。
【０２６０】
関連する態様では、抗体は、アゴニスト抗体である。一実施形態では、抗体は、インスリン受容体と、１０−５、１０−６、１０−７、１０−８、１０−９１０−１０、１０−１１Ｍまたはそれ以下の親和性で結合し、任意で、ｐＡＫＴアッセイで測定した場合にインスリンの最大アゴニスト活性の２０％〜１００％の最大アゴニスト活性を示すアゴニスト抗体である。さらなる実施形態では、抗体は、インスリン受容体と、１０−５、１０−６、１０−７、１０−８、１０−９１０−１０、１０−１１Ｍまたはそれ以下の親和性で結合し、（ａ）ｐＡＫＴアッセイで測定した場合にインスリンの最大アゴニスト活性の２０％〜８０％の最大アゴニスト活性を示し、（ｂ）存在する場合は、インスリンのＩＮＳＲに対するＥＣ５０を２倍超までは変えず、かつ（ｃ）存在する場合は、インスリンのＩＮＳＲに対するＫＤを２倍超までは変えないアロステリックアゴニスト抗体である。
【０２６１】
特定の実施形態では、アゴニスト抗体には、これに限定されないが、Ａｂ０２１、Ａｂ０２９、Ａｂ０２２、Ａｂ０１７、Ａｂ０２３、Ａｂ０２４、Ａｂ０２５、Ａｂ０２６、Ａｂ０３１、Ａｂ０３５、Ａｂ０２７、Ａｂ０３６、Ａｂ０３７、Ａｂ０２８、Ａｂ０３８、Ａｂ０３９、Ａｂ０４０、Ａｂ０４１、Ａｂ０４２、Ａｂ０３２、Ａｂ０４３、Ａｂ０４４、Ａｂ０４５、Ａｂ０４６、Ａｂ０４７、Ａｂ０１８、Ａｂ０３３、Ａｂ０４８、Ａｂ０１４、Ａｂ０１５、Ａｂ０４９、Ａｂ０３４、Ａｂ０５１、Ａｂ０５３、Ａｂ０５４、Ａｂ０５６、Ａｂ０５８、Ａｂ０６２、Ａｂ０６４、Ａｂ０６６、Ａｂ０６７、Ａｂ０６８、Ａｂ０８６、Ａｂ０６９、Ａｂ０７１、Ａｂ０７３、Ａｂ０７５、Ａｂ０８２、Ａｂ０８４または表１および２に記載の、もしくは配列番号７、１１３、１１４、１２４、１２６、１３０ならびに配列番号１６４、２５２、２５３、２６３、２６５および２６９に記載の抗体可変領域中のいずれかの１つの上記抗体に対応する１つまたは複数のＣＤＲを含むいずれかのポリペプチドが挙げられる。
【０２６２】
さらなる態様では、抗体は、インスリン受容体またはインスリンおよびインスリン受容体を含む複合体と１０−５Ｍ以下の平衡解離定数ＫＤで結合し、インスリンとインスリン受容体の間の結合親和性を少なくとも約３倍、任意で１０００倍、弱めることができる。一実施形態では、抗体は、インスリンとインスリン受容体の間の結合親和性を弱める負のモジュレーター抗体である。関連する実施形態では、負のモジュレーター抗体には、これに限定されないが、次の抗体が含まれる：Ａｂ０８７、Ａｂ０１９、Ａｂ０８８、Ａｂ０８９、Ａｂ０２０、Ａｂ０５０、Ａｂ０５２、Ａｂ０５５、Ａｂ０５７、Ａｂ０６１、Ａｂ０６３、Ａｂ０６５、Ａｂ０７０、Ａｂ０７２、Ａｂ０７４およびＡｂ０８１。
【０２６３】
さらなる態様では、抗体は、インスリン受容体またはインスリン／インスリン受容体複合体との結合に関し、いずれかの本明細書記載の抗体と競合する抗体である。特定の実施形態では、抗体は、部分的な競合を示す。関連する実施形態では、部分的競合は、約３０％〜７０％、約３０％〜８０％、または約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、または８０％の競合である。一部の実施形態では、抗体は、完全な競合を示す。一実施形態では、完全な競合は、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％を超える競合である。抗体競合を測定する代表的アッセイには、これに限定されないが、本明細書および当技術分野で記載されている受容体負荷アッセイおよびエピトープビニングアッセイがある。
【０２６４】
一実施形態では、抗体は、Ａｂ０７９、Ａｂ０７６、Ａｂ０８３、Ａｂ０８０、Ａｂ０６２、Ａｂ０２０、Ａｂ０１９、Ａｂ０８８、およびＡｂ０８９からなる群より選択されるいずれか１つ、２つ、３つまたは全ての抗体と７０％以上の競合を示し、任意で、Ａｂ０８６、Ａｂ０６４、Ａｂ００１、およびＡｂ０１８からなる群より選択されるいずれか１つ、２つ、３つまたは全ての抗体と３０％以上の競合を示す。さらなる実施形態では、抗体は、任意で、１つまたは複数のＡｂ０６２およびＡｂ０８６と競合しない。特定の実施形態では、抗体は、ヒトおよびマウス両方のインスリン受容体または複合体と結合する。
【０２６５】
さらなる実施形態では、本明細書記載の抗体と競合する抗体は、Ａｂ０４０、Ａｂ０６２、Ａｂ０３０、Ａｂ００１、およびＡｂ０１８からなる群より選択されるいずれか１つ、２つ、３つまたは全ての抗体と７０％以上の競合を示し、任意で、ＡＢ０３７、Ａｂ０７８、ＡＢ０８３、ＡＢ０８０、およびＡＢ０８５からなる群より選択されるいずれか１つ、２つ、３つまたは全ての抗体と３０％以上の競合を示す。関連する実施形態では、抗体は、Ａｂ０５３、Ａｂ０６４、８３−７、Ａｂ０１９、Ａｂ０８８、およびＡｂ０８９と競合しない。任意で、抗体は、ヒトおよびマウスインスリン受容体または複合体と結合する。
【０２６６】
さらなる実施形態では、本明細書記載の抗体と競合する抗体は、Ａｂ０３０、Ａｂ０３７、Ａｂ０５３、Ａｂ００１、Ａｂ０１８、Ａｂ０６４、Ａｂ０４０からなる群より選択されるいずれか１つ、２つ、３つまたは全ての抗体と７０％以上の競合を示し、任意で、Ａｂ０８５およびＡｂ０８６からなる群より選択されるいずれか１つ、２つ、３つまたは全ての抗体と３０％以上の競合を示す。任意で、抗体は、Ａｂ０７９、Ａｂ０７６およびＡｂ０８８と競合を示さず、また、任意で、抗体は、ヒトおよびマウスの両方のインスリン受容体または複合体と結合する。
【０２６７】
さらなる実施形態では、本明細書記載の抗体と競合する抗体は、Ａｂ０６４、Ａｂ０６２、Ａｂ０８５、およびＡｂ０７８からなる群より選択されるいずれか１つ、２つ、３つまたは全ての抗体と７０％以上の競合を示し、任意で、Ａｂ０７７、Ａｂ００１、Ａｂ０１８、Ａｂ０３０、Ａｂ０３７、Ａｂ０７９、Ａｂ０７６、Ａｂ０８３、Ａｂ０１９、Ａｂ０８８、Ａｂ０８９、およびＡｂ０４０と競合を示さない。任意で、抗体は、ヒトおよびマウスのインスリン受容体または複合体と結合する。
【０２６８】
さらなる実施形態では、本明細書記載の抗体と競合する抗体は、Ａｂ０７９、Ａｂ０７６、Ａｂ０８３、Ａｂ０８０、Ａｂ０６２、Ａｂ０２０、Ａｂ０１９、Ａｂ０８８、Ａｂ０８９からなる群より選択されるいずれか１つ、２つ、３つまたは全ての抗体と７０％以上の競合を示す。任意で、抗体は、Ａｂ０６２、Ａｂ０８６、Ａｂ００１、Ａｂ０１８、Ａｂ０３０、Ａｂ０３７、Ａｂ０６４と競合を示さない；また、任意で、抗体は、ヒトとのみ反応性があり、マウスインスリン受容体または複合体に結合しない。
【０２６９】
さらなる実施形態では、抗体は、任意の抗体と３０％以上の競合を示す。任意で、抗体は、Ａｂ０６１と３０％以上の競合を示し、任意で、Ａｂ０１９およびＡｂ０７４と３０％未満の競合を有し、任意で、Ａｂ０８８と競合しない。任意で、抗体は、ヒトおよびマウスのインスリンの両方の受容体または複合体と結合する。
【０２７０】
またさらなる別の実施形態では、抗体は、配列番号２８１、２７８、２７７、２０９、２７５、２２３、２８４、２７６、および２３６からなる群より選択される重鎖可変領域を含み、また、配列番号１４１、１３８、１３７、３５、１３５、５７、１４４、１３６、および９８からなる群より選択される軽鎖可変領域を含む。
【０２７１】
またさらなる別の実施形態では、抗体は、配列番号１９５、２２０、３０３、１９７、２０８、２４３、２４５および２５１からなる群より選択される重鎖可変領域を含み、また、配列番号７７、５０、９０、８４、３４、１０４、１０６および１１２からなる群より選択される軽鎖可変領域を含む。
【０２７２】
またさらなる別の実施形態では、抗体は、配列番号２４１、２７９、２５８、１５５、および２２８からなる群より選択される重鎖可変領域を含み、また、配列番号１０３、１３９、１１９、８、および８９からなる群より選択される軽鎖可変領域を含む。
【０２７３】
本発明の抗体核酸
また、本発明は、上述の標的特異的抗体をコードした核酸分子を包含する。一部の実施形態では、異なる核酸分子が、標的特異的抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードする。他の実施形態では、同じ核酸分子が、標的特異的抗体の重鎖および軽鎖可変領域をコードする。一実施形態では、核酸は、本発明の標的特異的抗体をコードする。
【０２７４】
一態様では、本発明の核酸分子は、配列番号１〜１５０のいずれかの１つまたはその一部に示されるＶＬアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。関連する態様では、ＶＬアミノ酸配列は、コンセンサス配列である。一部の実施形態では、核酸は、前記抗体の軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列をコードする。一部の実施形態では、前記一部は、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３を含む近接する部分である。一実施形態では、前記一部は、少なくとも１つの、２つまたは３つの軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３領域を含む。
【０２７５】
一部の実施形態では、核酸分子は、配列番号１〜１５０に示されるＶＬアミノ酸配列に対し、少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％同一であるＶＬアミノ酸配列をコードする。本発明の核酸分子は、高ストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸を含む。
【０２７６】
本発明の核酸分子は、配列番号１５１〜３０３のいずれかの１つ、またはその一部のＶＨアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むことが意図されている。関連する態様では、ＶＨアミノ酸配列は、コンセンサス配列である。一部の実施形態では、核酸は、前記抗体の重鎖ＣＤＲのアミノ酸配列をコードする。一部の実施形態では、前記一部は、重鎖ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３を含む隣接する部分である。一実施形態では、前記一部は、少なくとも１つ、２つ、または３つの重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３領域を含む。
【０２７７】
一部の実施形態では、核酸分子は、配列番号１５１〜３０３に示されるＶＨアミノ酸配列に対し、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるＶＨアミノ酸配列をコードする。本発明の核酸分子は、高ストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸を含む。
【０２７８】
本発明の核酸は、配列番号１〜３０３に示される重鎖または軽鎖可変領域を含み、任意で、表３に示す対を形成した、完全長抗体の軽鎖または重鎖をコードすることが意図されている。この場合、完全長軽鎖または完全長重鎖は、軽鎖定常領域または重鎖定常領域をそれぞれ含む。
【０２７９】
本発明では、上述の本発明の抗原結合領域を含む変異体およびポリペプチドをコードした核酸がさらに意図されている。
【０２８０】
本発明の抗体をコードしたポリヌクレオチドを調製および単離する方法は、当業者にはよく知られている。本発明によるポリヌクレオチドは、確立され組換ＤＮＡ技術により、いずれかの種々の他のヌクレオチド配列に結合できる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．、（２ｄＥｄ．；１９８９）「分子クローニング：実験マニュアル」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、を参照）。ポリペプチドに結合するための有用なヌクレオチド配列には、各種ベクター、例えば、プラスミド、コスミド、ラムダファージ誘導体、ファージミド、等があり、当技術分野でよく知られている。従って、本発明は、また、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターおよびポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する。一般的に、ベクターは、宿主細胞のために、少なくとも１つの生物体中で機能できる複製起点、簡便な制限エンドヌクレアーゼ部位、および選択可能マーカーを含む。本発明によると、ベクターには、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター、シーケンシングベクター、およびレトロウイルスベクターが含まれる。本発明によると、宿主細胞は、原核生物または真核細胞でもよく、また、単細胞生物体でも、多細胞生物体の一部でもよい。多数の適切なベクターおよびプロモーターが当業者には既知であり、本発明の組換え型構築物生成の目的には、市販品として入手可能である。
【０２８１】
種々の発現ベクター／宿主系が、コード配列の組み込み、および発現に利用可能である。これらには、これに限定されないが、組換え型バクテリオファージ、プラスミド、ファージミド、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌等の微生物；酵母発現ベクターで形質転換された酵母；ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）を形質移入された、または細菌発現ベクター（例えば、ＴｉまたはｐＢＲ３２２プラスミド）で形質転換された植物細胞系；また、動物細胞系も、含まれる。組換え型タンパク質産生に有用な哺乳動物細胞には、これに限定されないが、ＶＥＲＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、コス細胞（ＣＯＳ−７、等）、ＷＩ３８、ＢＨＫ、ＨｅｐＧ２、３Ｔ３、ＲＩＮ、ＭＤＣＫ、Ａ５４９、ＰＣ１２、Ｋ５６２およびＨＥＫ２９３細胞がある。
【０２８２】
ポリヌクレオチド変異体および抗体断片は、生物学的に活性な断片、変異体、または天然抗体と同じまたは類似の生物活性を有する天然抗体分子の変異体をコードする技術を持った作業者により容易に生成できる。これは、抗体重鎖および軽鎖領域、等をコードしたＤＮＡのＰＣＲ技術、切断および消化により行うことができる。例えば、当技術分野でよく知られたＰＣＲおよび他の技術を使った点変異生成は、アミノ酸残基が、抗体活性に関連する特定の活性に重要である特殊性を特定するために採用可能である。従って、当業者なら、ＤＮＡ鎖中に１つの塩基改変を作り、改変コドンおよびミスセンス変異を生成できるであろう。
【０２８３】
抗体断片
抗体断片は、インタクト完全長抗体の一部、好ましくは、インタクト抗体の抗原結合または可変領域を含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片；二重特異性抗体；直鎖抗体；単鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）；多特異性抗体断片、例えば、二重特異性、三重特異性、等の抗体（例えば、二重特異性抗体、トリアボディ、テトラボディ）；ミニボディ；キレート化組換え抗体；トリボディまたはバイボディ；細胞内抗体；ナノボディ；小モジュール免疫薬剤（ＳＭＩＰ）、結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質；ラクダ科化抗体；ＶＨＨ含有抗体；および抗体断片から形成される他のポリペプチドが含まれる。例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ＆  Ｈｕｄｓｏｎ（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３（９）１１２６−３６（２００５））を参照のこと。
【０２８４】
抗体のパパイン消化により、２つの同一の「Ｆａｂ」断片と呼ばれる一価の抗原結合断片が産生される。これは、単一の抗原結合部位、および残りの「Ｆｃ」断片をそれぞれ有するＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨドメインからなり、その名称は、容易に結晶化するその能力を反映している。ペプシン処理により、Ｆ（ａｂ’）２断片の二価の断片が得られ、ヒンジ部でジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂ断片からなり、これらのＦａｂ断片にある２つの「単鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含み、これらのドメインは、単一ポリペプチド鎖中に存在する。好ましくは、Ｆｖポリペプチドは、ＶＨおよびＶＬドメインの間に、抗原結合のために望ましい構造をＦｖが形成するのを可能にするポリペプチドリンカーをさらに含み、ＶＬおよびＶＨ領域が対をなして、合成リンカーを介して一価分子を形成し、それらに単一タンパク質鎖を作らせる単鎖抗体（ｓｃＦｖ）を生ずる（Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６、１９８８、およびＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：５８７９−５８８３、１９８８）。ｓｃＦｖの概説は、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ、「モノクローナル抗体の薬理学」、ｖｏｌ．ｌ１３、Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅｅｄｓ．、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）、を参照のこと。Ｆｄ断片は、ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなる。
【０２８５】
別の抗体断片には、ＶＨドメインからなるドメイン抗体（ｄＡｂ）断片（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６、１９８９）が含まれる。二重特異性抗体は、内部のＶＨおよびＶＬドメインが単一のポリペプチド鎖上に発現しているが、しかし、同じ鎖上の２つのドメインの間の対形成を許容するには短すぎるリンカーを使っているため、ドメインに別の鎖の相補的なドメインと対を形成させ、２つの抗原結合部位を作っている二価の抗体である（例えば、欧州特許ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ９３／１１１６１；Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：６４４４−６４４８、１９９３、およびＰｏｌｊａｋ  ｅｔ  ａｌ．、構造２：１１２１−１１２３、１９９４）を参照のこと。二重特異性抗体は、二重特異性、または単一特異性でありうる。
【０２８６】
軽鎖を欠く機能的重鎖抗体は、テンジクザメ（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  ３７４：１６８−７３、１９９５）、オオセ（Ｎｕｔｔａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．３８：３１３−２６、２００１）およびラクダ、ヒトコブラクダ、アルパカおよびラマ、等のラクダ科（Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  ３６３：４４６−８、１９９３；Ｎｇｕｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７５：４１３、１９９８）、中に天然に存在する。これらの動物では、抗原結合部位は、単一ドメイン、ＶＨＨドメイン、に縮小されている。これらの抗体は、重鎖可変領域のみを使って抗原結合領域を形成する、すなわち、これらの機能的抗体は、構造Ｈ２Ｌ２を有する重鎖のみのホモダイマーである（「重鎖鎖抗体」または「ＨＣＡｂ」と呼ばれる）。ラクダＶＨＨは、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインを含み、ＣＨ１ドメインを欠くＩｇＧ２およびＩｇＧ３定常領域と組み換えると報告されている（Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．、同上）。例えば、ラマＩｇＧ１は、その中のＶＨが、ヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む定常領域と組み換える従来の（Ｈ２Ｌ２）抗体アイソタイプであるが、一方、ラマＩｇＧ２およびＩｇＧ３は重鎖のみのアイソタイプで、ＣＨ１ドメインを欠き、軽鎖を含まない。ラクダＶＨＨドメインは、抗原に高親和性で結合し（Ｄｅｓｍｙｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：２６２８５−９０、２００１）、溶液中で高安定性を有することが明らかになっている（Ｅｗｅｒｔｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４１：３６２８−３６、２００２）。古典的ＶＨのみの断片は、可溶性のある形態で産生するのは困難であるが、フレームワーク残基を、よりＶＨＨ様に改変すると、溶解度の改善および特異的結合が得られる（例えば、Ｒｅｉｃｈｍａｎ、ｅｔ  ａｌ．、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９９９、２３１：２５−３８．）。ラクダ重鎖を有する抗体を生成する方法は、例えば、米国特許公開公報第２００５０１３６０４９号および２００５００３７４２１号、に記載されている。
【０２８７】
抗体重鎖の可変ドメインは、１５ｋＤａの分子量を有し、ナノボディ（Ｃｏｒｔｅｚ−Ｒｅｔａｍｏｚｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６４：２８５３−５７、２００４）と呼ばれている。ナノボディライブラリーは、Ｃｏｎｒａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．、（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  ４５：２８０７−１２、２００１）に記載のように免疫ヒトコブラクダから、またはＲｅｖｅｔｓ  ｅｔ  ａｌ、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．５（１）：１１１−２４（２００５）、に記載のように組換え方法を使って、産生することができる。
【０２８８】
二重特異性Ｆａｂ−ｓｃＦｖ（「バイボディ」）および三重特異性Ｆａｂ−（ｓｃＦｖ）（２）（「トリボディ」）の産生は、Ｓｃｈｏｏｎｊａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５：７０５０−５７、２０００）およびＷｉｌｌｅｍｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  ＢＡｎａｌｙｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．７８６：１６１−７６、２００３）、に記載されている。バイボディまたはトリボディに関しては、１つまたは両方のＶＬ−ＣＬ（Ｌ）およびＶＨ−ＣＨ１（Ｆｄ）鎖にｓｃＦｖ分子を融合する；例えば、トリボディを産生するには、２つのｓｃＦｖをＦａｂのＣ末端に融合し、一方、バイボディの場合は、１つのｓｃＦｖをＦａｂのＣ末端に融合する。 
【０２８９】
ペプチドリンカー（ヒンジレス）またはＩｇＧヒンジを介した、ｓｃＦｖのＣＨ３への融合を含む「ミニボディ」は、Ｏｌａｆｓｅｎ、ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ．２００４Ａｐｒ；１７（４）：３１５−２３、に記載されている。
【０２９０】
細胞内抗体は、細胞内発現を示し、細胞内のタンパク質機能を操作できる単鎖抗体である（Ｂｉｏｃｃａ、ｅｔ  ａｌ．、ＥＭＢＯＪ．９：１０１-１０８、１９９０；Ｃｏｌｂｙ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１０１：１７６１６−２１、２００４）。抗体構築物を細胞内の領域に保持する細胞シグナル配列を含む細胞内抗体は、Ｍｈａｓｈｉｌｋａｒ  ｅｔ  ａｌ（ＥＭＢＯ  Ｊ  １４：１５４２−５１、１９９５）およびＷｈｅｅｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１７：１７３３−５．２００３）、に記載のように産生可能である。細胞透過抗体は、タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）が単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）抗体と融合した細胞透過性抗体である。Ｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、（Ｍｅｄ  Ｈｙｐｏｔｈｅｓｅｓ．６４：１１０５−８、２００５）。 
【０２９１】
抗原に特異的なＳＭＩＰまたは結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質である抗体が、さらに意図されている。これらの構築物は、抗体エフェクター機能実行に必要な免疫グロブリンドメインに融合した抗原結合ドメインを含む単鎖ポリペプチドである。例えば、ＷＯ０３／０４１６００、米国公開特許公報第２００３０１３３９３９号および同第２００３０１１８５９２号、を参照のこと。
【０２９２】
１つまたは複数のＣＤＲを、共有結合か、または非共有結合で分子に組み込み、それをイムノアドヘシンにすることができる。イムノアドヘシンは、より大きなポリペプチド鎖の一部としてＣＤＲを組み込む事ができ、ＣＤＲを別のポリペプチド鎖に共有結合でき、または非共有結合でＣＤＲに組み込む事ができる。ＣＤＲは、イムノアドヘシンを特定の目的抗原に特異的に結合させる。
【０２９３】
またさらなる別の実施形態では、抗体または抗原結合化合物は、定常領域および１つまたは複数のヒト抗体配列の重鎖および軽鎖可変フレームワーク領域を含む。関連する実施形態では、抗体は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４の修飾または未修飾定常領域を含む。
【０２９４】
あるいは、抗体断片は、タンパク質足場に融合することができる。タンパク質足場のライブラリーには、これに限定されないが、アドネクチン、アフィボディ、アンチカリン、ＤＡＲＰｉｎ、操作したＫｕｎｉｔｚ型阻害剤、テトラネクチン、Ａ−ドメインタンパク質、リポカリン、反復タンパク質、例えば、アンキリン反復タンパク質、免疫タンパク質、α２ｐ８ペプチド、昆虫デフェンシンＡ、ＰＤＺドメイン、カリブドトキシン、ＰＨＤフィンガー、ＴＥＭ−１β−ラクタマーゼ、フィブロネクチンタイプＩＩＩドメイン、ＣＴＬＡ−４、Ｔ細胞レセプター、ノッティン、ネオカルチノスタチン、炭水化物結合モジュール４−２、緑色蛍光タンパク質、チオレドキシン（Ｇｅｂａｕｅｒ  ＆  Ｓｋｅｒｒａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１３：２４５−５５（２００９）；Ｇｉｌｌ  ＆  Ｄａｍｌｅ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ  １７：６５３−５８（２００６）；Ｈｏｓｓｅ  ｅｔ  ａｌ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．１５：１４−２７（２００６）；Ｓｋｅｒｒａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ  １８：２９５−３−４（２００７））。
【０２９５】
従って、抗体の重鎖可変領域または軽鎖可変領域の１つ、２つおよび／または３つのＣＤＲを含む種々の組成物は、当技術分野で既知の技術により産生可能である。
【０２９６】
多特異性抗体
一部の実施形態では、同じまたは異なる分子の少なくとも２つの異なるエピトープに対し結合特異性を有する多特異性（例えば、二重特異性）の本発明の抗体を産生することが望ましいことがありうる。代表的二重特異性抗体は、抗原の２つの異なるエピトープに結合できる。あるいは、抗原特異的抗体アームを、細胞の防護機序を所望の抗原に集中させるように、Ｔ細胞受容体分子（例えば、ＣＤ２またはＣＤ３）、等の細胞表面分子、またはＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）、等のＩｇＧのＦｃ受容体（ＦｃγＲ）に結合するアームと結合させることができる。また、二重特異性抗体は、所望の抗原を発現、または取り込む細胞のところに細胞障害性の試薬を局在化させるために使用することもできる。これらの抗体は、抗原結合アームおよび細胞障害性の試薬（例えば、サポリン、抗インターフェロン−６０、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレザトまたは放射性同位元素ハプテン）に結合するアームを持つ。二重特異性抗体は、完全長抗体または抗体断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重特異性抗体）として調製可能である。
【０２９７】
二重特異性抗体作製の別の方法によって、抗体分子対間の境界は、組換え型細胞培養から回収されるヘテロダイマーの割合を最大にするように操作できる。好ましい界面は、少なくとも抗体定常領域のＣＨ３ドメインの一部を含む。この方法では、第１の抗体分子界面由来の１つまたは複数の小さなアミノ酸側鎖が、大きな側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）と置換される。大きなアミノ酸側鎖を小さな側鎖（例えば、アラニンまたはトレオニン）で置き換えることにより、大きな側鎖に対する同等または類似サイズの埋め合わせ用の「空隙」が、第２の抗体分子の界面上に形成される。これが、他の望まれないホモダイマー等の最終産物よりもヘテロダイマーの収率を増やす機序を提供する。ＷＯ９６／２７０１１（１９９６年９月６日刊行）を参照のこと。
【０２９８】
二重特異性抗体は、架橋または「ヘテロ結合」抗体を含む。例えば、ヘテロ結合の１つの抗体は、アビジン結合し、もう一つの抗体はビオチンに結合できる。ヘテロ結合抗体は、任意の従来の架橋法を使って作製できる。適切な架橋剤は、当技術分野でよく知られており、米国特許第４，６７６，９８０号で、多くの架橋技術と一緒に開示されている。
【０２９９】
抗体断片から二重特異性抗体を生成する技術は、また、文献に記載されている。例えば、二重特異性抗体は、化学連鎖を使って調製可能である。Ｂｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．、（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：８１−８３、１９８５）には、インタクト抗体がタンパク分解により切断されてＦ（ａｂ’）２断片を生成する方法が記載されている。これらの断片は、ジチオール錯化剤亜ヒ酸ナトリウムの存在下還元されて、隣接ジチオールを安定化し、分子内ジスルフィド形成を防ぐ。生成したＦａｂ’断片は、次に、チオニトロベンゾアート（ＴＮＢ）誘導体に変換される。次に、１つのＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体は、メルカプトエチルアミンの還元によりＦａｂ’−チオールに再変換され、等モル量の他のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合されて、二重特異性抗体が形成される。産生した二重特異性抗体は、酵素の選択的固定化用の試薬として使用できる。またさらなる実施形態では、大腸菌から直接回収されたＦａｂ’−ＳＨ断片は、インビトロで化学的にカップリングされて、二重特異性抗体を形成することができる（Ｓｈａｌａｂｙ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：２１７−２２５（１９９２））。
【０３００】
Ｓｈａｌａｂｙ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：２１７−２２５（１９９２）には、完全ヒト化二重特異性抗体Ｆ（ａｂ’）２分子の産生について記されている。各Ｆａｂ’断片は、別々に大腸菌から分泌され、直接インビトロ化学カップリングを行い、二重特異性抗体が形成される。このように形成された二重特異性抗体は、ＨＥＲ２受容体を過剰発現している細胞および正常なヒトＴ細胞に結合でき、さらに、ヒト乳房腫瘍抗原に対するヒト細胞障害性のリンパ球の溶菌活性を誘発する。
【０３０１】
また、二重特異性抗体断片を組換え型細胞培養から直接作製および単離する種々の技術が記載されている。例えば、二重特異性抗体は、ロイシンジッパーを使って産生されている（Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−１５５３、１９９２）。ＦｏｓおよびＪｕｎタンパク質由来のロイシンジッパーペプチドが、遺伝子融合により２つの異なる抗体のＦａｂ’部分に結合された。抗体ホモダイマーは、ヒンジ部で還元され、モノマーを形成し、次に、再酸化されて抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法は、また、抗体ホモダイマーの産生にも適用可能である。Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：６４４４−４８、１９９３）により記載されている「ダイアボディ」技術は、二重特異性抗体断片作製の代替機序を提供した。
【０３０２】
断片は、リンカーによって軽鎖可変領域（ＶＬ）に結合した重鎖可変領域（ＶＨ）を含むが、同じ鎖上の２つのドメイン間で対形成を許容するにはあまりにも接近しすぎている。従って、１つの断片のＶＨおよびＶＬドメインは、別の断片の相補的なＶＬおよびＶＨドメインと対形成することを強いられ、その結果、２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）二量体を使って二重特異性抗体断片を作る別の戦略も報告されている。Ｇｒｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５３６８（１９９４）を参照のこと。
【０３０３】
あるいは、二重特異性抗体は、Ｚａｐａｔａ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８：１０５７−６２（１９９５）に記載のように産生した「直鎖抗体」であってもよい。直鎖抗体は、１対の抗原結合領域を形成する１対の直列型Ｆｄセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む。直鎖抗体は、二重特異性または単一特異性とすることが可能である。
【０３０４】
さらなる実施形態では、二重特異性抗体は、キレート化組換え抗体（ＣＲＡｂ）であってもよい。キレート化組換え抗体は、抗原の隣接および非重畳エピトープを認識し、充分に柔軟で同時に両方のエピトープに結合できる（Ｎｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．、ＪＭｏｌＢｉｏｌ．２４６：３６７−７３、１９９５）。
【０３０５】
また、３価以上の抗体も意図されている。例えば、三重特異性抗体が調製できる（Ｔｕｔｔ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０、１９９１）。
【０３０６】
キメラおよびヒト化抗体
キメラまたはヒト化抗体は、ヒトにおいては、親のマウスモノクローナル抗体より免疫原性が小さいために、ヒトの治療に使って、アナフィラキシーのリスクをはるかに少なくできる。
【０３０７】
マウスモノクローナル抗体のＩｇ可変領域がヒトＩｇ定常領域に融合したキメラモノクローナル抗体を、当技術分野で既知の標準的方法を使って得ることができる（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１、６８４１−６８５５（１９８４）；および、Ｂｏｕｌｉａｎｎｅ  ｅｔ  ａｌ、Ｎａｔｕｒｅ  ３１２、６４３−６４６、（１９８４））を参照のこと。一部のキメラモノクローナル抗体は、ヒトでは免疫原性が小さいことがわかったが、マウス可変Ｉｇ領域は、それでも大きなヒト抗マウス応答を導くことができる。
【０３０８】
ヒト化抗体は、例えば、下記を含む種々の方法で実現可能である：（１）非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）のヒトフレームワークおよび定常領域への移植（当技術分野では、「ＣＤＲ移植（ＣＤＲ  ｇｒａｆｔｉｎｇ）」によるヒト化と呼ばれるプロセス）（２）全体非ヒト可変ドメインの移植であるが、表面残基の置換によりヒト様表面で移植ドメインを「覆い隠す（ｃｌｏａｋｉｎｇ）」（当技術分野で「ベニアリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ：見せかけ）」と呼ばれているプロセス）、または、代替法として、（３）抗原結合またはタンパク質折り畳みに悪影響を与えないが、ヒト環境で免疫原性を低下させそうだと判断された位置のヒトアミノ酸の置換（当技術分野でＨＵＭＡＮ  ＥＮＧＩＮＥＥＲＥＤ（登録商標）と呼ばれているプロセス）。本発明では、ヒト化抗体は、「ヒト化」、「ベニア化（ｖｅｎｅｅｒｅｄ）」および「ＨＵＭＡＮＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ（登録商標）」抗体を全て含む。これらの方法は、例えば、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２５２５（１９８６）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、Ｕ．Ｓ．Ａ．、８１：６８５１−６８５５（１９８４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ｏｉ、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、４４：６５−９２（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６（１９８８）；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．２８：４８９−４９８（１９９１）；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：１６９−２１７（１９９４）；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．４：７７３−７８３（１９９１）；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ  ｅｔ  ａｌ．米国特許第５，７６６，８８６号；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ  ｅｔ  ａｌ．、（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  ７：８０５−８１４、１９９４）で開示されている。これらの文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０３０９】
遺伝子導入動物由来ヒト抗体
また、抗原に対するヒト抗体は、内部での免疫グロブリン産生が無く、ヒト免疫グロブリン座位を含むように操作される遺伝子導入動物を使っても産生可能である。例えば、ＷＯ９８／２４８９３には、動物が、内在性重鎖と軽鎖座位の不活性化のために機能的内在性免疫グロブリンを産生しないヒトＩｇ座位を有する遺伝子導入動物が開示されている。ＷＯ９１／００９０６には、また、免疫原に対する免疫応答を開始することができる遺伝子導入非霊長類哺乳動物宿主が開示され、この宿主は、抗体は、霊長類定常領域および／または可変領域を有し、座位をコードした内在性免疫グロブリンが置換または不活化されている。ＷＯ９６／３０４９８および米国特許第６，０９１，００１号には、哺乳動物中の免疫グロブリン座位を改変する、例えば、全てまたは一部の定常もしくは可変領域を置き換えて改変抗体分子を形成する、Ｃｒｅ／Ｌｏｘシステムの使用が開示されている。ＷＯ９４／０２６０２には、不活化内在性Ｉｇ座位および機能性ヒトＩｇ座位を有する非ヒト哺乳動物宿主が開示されている。米国特許第５，９３９，５９８号には、内在性重鎖を欠き、１つまたは複数の異種定常領域を含む外因性の免疫グロブリン座位を発現する遺伝子導入マウスを作る方法が開示されている。また、米国特許第６，１１４，５９８号、６，６５７，１０３号および６，８３３，２６８号も参照のこと。
【０３１０】
上述の遺伝子導入動物を使って、選択抗原に対する免疫応答を生成させ、細胞産生抗体を動物から取り出して、ヒトモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを産生するために使用できる。免疫化プロトコル、アジュバント、等は当技術分野では既知で、例えば、遺伝子導入マウスの免疫化に使用される（ＷＯ９６／３３７３５）。この特許では、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦａ、ヒトＣＤ４、Ｌセレクチン、ｇｐ３９、および破傷風毒素を含む種々の抗原に対するモノクローナル抗体が開示されている。モノクローナル抗体に対し、対応するタンパク質の生物活性または生理的な効果を阻害または中和する能力を試験することができる。ＷＯ９６／３３７３５では、ＩＬ−８で免疫し、好中球のＩＬ−８誘導機能を遮断した遺伝子導入マウスの免疫細胞由来のＩＬ−８に対するモノクローナル抗体が開示されている。遺伝子導入動物を免役するために使われる抗原に対し特異性を有するヒトモノクローナル抗体も、ＷＯ９６／３４０９６および米国公開特許第２００３０１９４４０４号；および米国公開特許第２００３００３１６６７号、で開示されている。
【０３１１】
モノクローナル抗体の作製に有用なさらなる遺伝子導入動物には、米国特許第５，７７０，４２９号、およびＦｉｓｈｗｉｌｄ、ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８４５−８５１（１９９６））に記載のＭｅｄａｒｅｘ  ＨｕＭＡｂ−ＭＯＵＳＥ（登録商標）があり、これは、ヒト抗体の重鎖と軽鎖をコードする非再配列ヒト抗体遺伝子由来の遺伝子配列を含む。ＨｕＭＡｂ−ＭＯＵＳＥ（登録商標）の免疫化により、抗原に対する完全ヒトモノクローナル抗体の産生が可能となる。
【０３１２】
また、Ｉｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．４：９１−１０２（２００２））には、メガベースサイズのヒトＤＮＡセグメントを含み、また全体ヒト免疫グロブリン（ｈＩｇ）座位を組み込むＴｒａｎｓＣｈｒｏｍｏ  Ｍｏｕｓｅ（ＴＣＭＯＵＳＥ（登録商標））が記載されている。ＴＣＭＯＵＳＥ（登録商標）は、ＩｇＧの全サブクラス（ＩｇＧ１−Ｇ４）を含む、ｈＩｇの充分に多様性のあるレパートリーを有する。ＴＣＭＯＵＳＥ（登録商標）の種々のヒト抗原での免疫化により、ヒト抗体を含む抗体の応答が生ずる。
【０３１３】
Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｙｅａｒｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、７：３３（１９９３）；および米国特許第５，５９１，６６９号、５，５８９，３６９号、５，５４５，８０７号；および米国公開特許公報第２００２０１９９２１３号、も参照のこと。米国公開特許公報第２００３００９２１２５号には、動物の免疫応答を所望のエピトープに偏らせる方法が記載されている。また、ヒト抗体は、インビトロで活性化したＢ細胞により産生させることもできる（米国特許第５，５６７，６１０号および５，２２９，２７５号参照）。
【０３１４】
ディスプレイ法によるヒト抗体
組換え型ヒト抗体遺伝子のレパートリーを作製する技術、および、繊維状バクテリオファージの表面へのコード化抗体断片のディスプレイ技術の開発により、ヒト抗体を直接作製する手段が提供された。ファージ法により産生された抗体は、細菌中の抗原結合断片（通常は、ＦｖまたはＦａｂ断片）として産生され、従ってエフェクター機能が欠けている。エフェクター機能は、２つの戦略の内の１つにより導入可能である：断片を、哺乳動物細胞中で発現用の完全な抗体へ作り替える、または、エフェクター機能を開始させることができる第２の結合部位を有する二重特異性抗体断片へ作り替える。
【０３１５】
本発明では、抗原特異的抗体またはその抗原結合部分を産生する方法が意図され、該方法は、ファージ上にヒト抗体のライブラリーを合成し、抗原またはその一部でライブラリーを選別し、抗原に結合するファージを単離し、さらに、ファージから抗体を得ることを含む。例として、ファージディスプレイ法で使用する抗体のライブラリーを調製する１つの方法は、ヒト免疫グロブリン配座を含む非ヒト動物を抗原またはその抗原性部分で免疫化して免疫応答を引き起こし、免疫した動物から抗体産生細胞を抽出し；抽出した細胞からＲＮＡを単離し、ＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを産生し、プライマーを使ってｃＤＮＡを増幅して、ｃＤＮＡをファージディスプレイベクターに挿入して抗体をファージ上に発現させることを含む。本発明の組換え型抗原特異的抗体は、このような方法で得ることができる。別の例では、抗体産生細胞が非免疫動物から抽出され、抽出細胞から単離され、ｃＤＮＡを産生するために逆転写されたＲＮＡは、プライマー使って増幅され、ファージディスプレイベクターに挿入されて、抗体がファージ上に発現する。ファージディスプレイ法は、繊維状バクテリオファージの表面に抗体レパートリーをディスプレイし、次に、目的抗原への結合によりファージを選択することにより免疫選択を模倣する。１つのこのような技術が、ＷＯ９９／１０４９４に記載されており、ここでは、このような手法を使って、ＭＰＬおよびｍｓｋ受容体に対する、高親和性および機能的アゴニスト抗体が単離される。本発明の抗体は、組換え型コンビナトリアル抗体ライブラリー、好ましくは、ヒトリンパ球由来のｍＲＮＡから調製したヒトＶＬおよびＶＨｃＤＮＡを使って調製されたｓｃＦｖファージディスプレイライブラリー、の選別により単離することができる。このようなライブラリーの調製と選別の方法は、当技術分野で既知である。例えば、米国特許第５，９６９，１０８号、を参照のこと。ファージディスプレイライブラリー生成用の市販品として入手可能なキットがある（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｈａｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓｙｓｔｅｍ、カタログ番号２７−９４００−０１；およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＳｕｒｆＺＡＰ（登録商標）ファージディスプレイキット、カタログ番号２４０６１２）。また、抗体ディスプレイライブラリーの生成と選別に使うことができる他の方法および試薬がある（例えば、Ｌａｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．米国特許第５，２２３，４０９号；Ｋａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．ＰＣＴ公開特許公報ＷＯ９２／１８６１９；Ｄｏｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．ＰＣＴ公開特許公報ＷＯ９１／１７２７１；Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．公開特許公報ＷＯ９２／２０７９１；Ｍａｒｋｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．ＰＣＴ公開特許公報ＷＯ９２／１５６７９；Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．公開特許公報ＷＯ９３／０１２８８；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．ＰＣＴ公開特許公報ＷＯ９２／０１０４７；Ｇａｒｒａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．公開特許公報ＷＯ９２／０９６９０；Ｆｕｃｈｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７０−１３７２；Ｈａｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ３：８１−８５；Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ（１９９０）３４８：５５２−５５４；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）ＥＭＢＯＪ１２：７２５−７３４；Ｈａｗｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６：８８９−８９６；Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８；Ｇｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：３５７６−３５８０；Ｇａｒｒａｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７３−１３７７；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎｕｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  １９：４１３３−４１３７；およびＢａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：７９７８−７９８２、を参照のこと）。 
【０３１６】
一実施形態では、所望の結合特性を有する抗原特異的ヒト抗体を単離するために、ヒトＶＨおよびＶＬライブラリーを選別し、所望の特異性を持つ抗体断片を選択する。この方法で使われる抗体ライブラリーは、好ましくは、本明細書記載のように、また当技術分野において調製し選別されるｓｃＦｖライブラリーが好ましい（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．、ＰＣＴ  公開公報 ＷＯ９２／０１０４７、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．、（Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４（１９９０））；およびＧｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．、（ＥＭＢＯ  Ｊ  １２：７２５−７３４（１９９３））。ｓｃＦｖ抗体ライブラリーは、抗原を使って選別されるのが好ましい。
【０３１７】
あるいは、抗体のＦｄ断片（ＶＨ−ＣＨ１）および軽鎖（ＶＬ−ＣＬ）を、ＰＣＲにより別々にクローニングして、無作為に組み換えてコンビナトリアルファージディスプレイライブラリーを作り、次に、特定の抗原への結合により選択できる。Ｆａｂ断片をファージ表面に発現、すなわち、それら断片をコードした遺伝子に物理的に結合させる。従って、抗原結合によるＦａｂの選択は、同時に、Ｆａｂをコードした配列を選択しており、その後、増幅することができる。抗原結合と再増幅を数回繰り返す、パニングと名付けられる方法、により抗原特異的Ｆａｂが濃縮され、最終的に単離される。
【０３１８】
１９９４に、「誘導選択（ｇｕｉｄｅｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）」と呼ばれる、抗体のヒト化に手法が記載された。誘導選択は、マウスモノクローナル抗体のヒト化に対しファージディスプレイ法の能力を利用する（Ｊｅｓｐｅｒｓ、Ｌ．Ｓ．、ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２、８９９−９０３（１９９４）を参照）。このために、マウスモノクローナル抗体のＦｄ断片が、ヒト軽鎖ライブラリーと組み合わせて提示され、次に、得られたハイブリッドＦａｂライブラリーを抗原で選択することができる。それにより、マウスＦｄ断片はテンプレートを提供し、選択をガイドする。その後、選択されたヒト軽鎖は、ヒトＦｄ断片ライブラリーと組み合わされる。得られたライブラリーの選択により、完全なヒトＦａｂが得られる。
【０３１９】
ファージディスプレイライブラリーからヒト抗体を誘導する種々の方法が記述されている（例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ、２２２：５８１−５９７（１９９１）；米国特許第５，５６５，３３２号および５，５７３，９０５号；Ｃｌａｃｋｓｏｎ、Ｔ．、ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ、Ｊ．Ａ．、ＴＩＢＴＥＣＨ  １２、１７３−１８４（１９９４）を参照）。特に、ファージディスプレイライブラリー由来の抗体のインビトロ選択と取得は、強力なツールになっている（Ｂｕｒｔｏｎ、Ｄ．Ｒ．、ａｎｄＢａｒｂａｓＩＩＩ、Ｃ．Ｆ．、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５７、１９１−２８０（１９９４）；Ｗｉｎｔｅｒ、Ｇ．、ｅｔ  ａｌ．、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２、４３３−４５５（１９９４）；米国公開特許公報第２００２０００４２１５号およびＷＯ９２／０１０４７；米国公開特許公報第２００３０１９０３１７号；および米国特許第６，０５４，２８７号および５，８７７，２９３号を参照のこと。
【０３２０】
Ｗａｔｋｉｎｓ、「分子生物学における「キャプチャーリフト（Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｌｉｆｔ）」法によるファージ発現抗体ライブラリーの選別、抗体ファージディスプレイ：方法とプロトコル１７８：１８７−１９３（２００２）、および２００３年３月６日刊行の米国公開特許公報第２００３００４４７７２号には、キャプチャーリフトによるファージ発現抗体ライブラリーまたは他の結合分子を選別する方法が記載されており、この方法には、固体支持体上への候補結合分子の固定化が含まれる。
【０３２１】
Ｆｖ断片は、ファージタンパク質との融合体（例えば、Ｍ１３遺伝子ＩＩＩとの）として発現した１つの鎖の結合によって、可溶性断片として発現した相補的な鎖と共に、ファージ表面上に提示される。ファージは、クラスＩファージ：ｆｄ、Ｍ１３、ｆ１、Ｉｆ１、ｌｋｅ、ＺＪ／Ｚ、Ｆｆ、の内の１つ、およびクラスＩＩファージ：Ｘｆ、Ｐｆ１およびＰｆ３、の内の１つ、等の繊維状ファージでありうることが意図されている。ファージは、Ｍ１３、またはｆｄもしくはその誘導体であってもよい。
【０３２２】
最初のヒトＶＬおよびＶＨセグメントが選択されると、最初に選択されたＶＬとＶＨセグメント対とは異なる対が抗原結合に対して選別される「混合と整合（ｍｉｘ  ａｎｄ  ｍａｔｃｈ）」実験を行い、好ましいＶＬ／ＶＨ対の組み合わせの選別を行うことができる。さらに、抗体の質をさらに改善するために、好ましいＶＬ／ＶＨ対のＶＬおよびＶＨセグメントを、天然免疫応答の間の抗体の親和性成熟に関与するインビボ体細胞変異プロセスに類似のプロセスで、好ましくは、ＶＨおよび／またはＶＬのいずれかのＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３領域の範囲内で、無作為に変異させることができる。このインビトロ親和性成熟は、それぞれ、ＶＨＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３、またはＶＬＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３に相補的なＰＣＲプライマーを使って、ＶＬおよびＶＨ領域を増幅することにより達成できる。この場合、生成ＰＣＲ産物が、ＶＨおよび／またはＶＬＣＤＲ３領域にランダム変異が導入されているＶＬおよびＶＨセグメントをコードするように、このプライマーには、特定位置の４つのヌクレオチド塩基のランダム混合物が「添加されて（ｓｐｉｋｅｄ）」いる。これらの無作為に変異させたＶＬおよびＶＨセグメントは、抗原への結合に関し、再選別することができる。
【０３２３】
組換え型免疫グロブリンディスプレイライブラリーからの抗原特異的抗体の選別と単離に続いて、選択抗体をコードした核酸をディスプレイパッケージから（例えば、ファージゲノムから）回収し、標準的組換ＤＮＡ技術により、他の発現ベクターに再クローニングすることができる。所望なら、核酸をさらに操作して、下記に示すように、本発明の他の抗体型を産生することができる。コンビナトリアルライブラリーの選別により単離した組換え型ヒト抗体を発現させるために、その抗体をコードしたＤＮＡを組み換え体発現ベクターに挿入し、本明細書記載のように、哺乳動物宿主細胞中に導入される。
【０３２４】
ファージディスプレイ法を、細菌または宿主細胞の変異誘発株を使って行うことができることが意図されている。変異誘発株は、その親のＤＮＡに比較して、ＤＮＡを細胞中で変異させて複製させるという遺伝的欠損を有する宿主細胞である。変異誘発株の例は、ＮＲ９０４６  ｍｕｔ  Ｄ５およびＮＲ９０４６  ｍｕｔ  Ｔ１である。
【０３２５】
ファージディスプレイ法を、ヘルパーファージを使って行うことができることが意図されている。これは、不完全ファージゲノムを含む細胞を感染させるために使用し、また、欠損を補完する機能を有するファージである。不完全ファージゲノムは、一部の機能をコードした遺伝子配列が取り除かれたファージミドまたはファージであってもよい。ヘルパーファージの例は、Ｍ１３Ｋ０７、Ｍ１３Ｋ０７遺伝子ＩＩＩｎｏ．３、ハイパーファージ；およびカプシッドタンパク質融合結合分子を提示しているまたはコードしているファージ、である。
【０３２６】
また、抗体は、ＷＯ９２／０１０４７で開示のように、階層的二重組み合わせ手法（ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ  ｄｕａｌ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ）使って、ファージディスプレイ選別法により作製できる。この特許では、Ｈ鎖またはＬ鎖クローンを含むそれぞれのコロニーを使って他の鎖（ＬまたはＨ）をコードしたクローンの完全ライブラリーに感染させ、得られた２つの鎖に特異的な結合メンバーを、本明細書に記載のようなファージディスプレイ法によって選択する。この技術は、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ、（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０：７７９−７８３（１９９２））にも、開示されている。
【０３２７】
ウイルス、酵母、微生物および哺乳動物細胞の表面上にポリペプチドを提示する方法も、抗原特異的抗体を特定するために使用されている。例えば、米国特許第５，３４８，８６７号；５，７２３，２８７号；６，６９９，６５８号；Ｗｉｔｔｒｕｐ、Ｃｕｒｒ  Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１２：３９５−９９（２００１）；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２１（１）４５−５２（２００３）；Ｓｕｒｇｅｅｖａ  ｅｔ  ａｌ、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５８：１６２２−５４（２００６）、を参照のこと。抗体ライブラリーを酵母タンパク質、例えば、アグルチニン、に結合させて、免疫系のＢ細胞による抗体の表面ディスプレイを効果的に模倣することができる。
【０３２８】
ファージディスプレイ方法に加えて、抗体は、リボソームディスプレイおよびｍＲＮＡディスプレイを含むインビトロディスプレイ法を使って単離できる（Ａｍｓｔｕｔｚ  ｅｔ  ａｌ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１２：４００−０５（２００１））。リボソームディスプレイを使ったポリペプチドの選択は、Ｈａｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．、（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９４：４９３７−４９４２（１９９７））およびＫａｗａｓａｋｉに対し発行された米国特許第５，６４３，７６８号および５，６５８，７５４号、に記載がある。リボソームディスプレイもまた、急速大量抗体変異分析に有用である。選択的変異生成手法もまた、リボソームディスプレイ技術を使って選択できる活性改善抗体の産生方法を提供する。
【０３２９】
改変グルコシル化
また、親抗体に対して修飾グリコシル化パターンを有する、例えば、抗体にあるべき１つまたは複数の炭水化物成分が欠如したおよび／または抗体に存在しない１つまたは複数のグリコシル化部位を付加した抗体変異体も産生可能である。
【０３３０】
抗体のグリコシル化は、通常、Ｎ結合型またはＯ結合型である。Ｎ結合型は、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物成分の結合を指す。トリペプチド配列であるアスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−トレオニン（Ｘは、プロリン以外の任意のアミノ酸）は、炭水化物成分のアスパラギン側鎖への酵素結合のための認識配列である。ポリペプチド中のこれらいずれかのトリペプチド配列の存在により、潜在的グリコシル化部位が形成される。従って、Ｎ結合型グリコシル化部位は、１つまたは複数のこれらトリペプチド配列を含むようにアミノ酸配列を変更することにより、抗体に付加できる。Ｏ結合型グリコシル化は、糖であるＮ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースのヒドロキシアミノ酸のいずれか、最も一般的には、セリンもしくはトレオニン、への結合を指すが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリシンも使用可能である。Ｏ結合型グリコシル化部位は、１つまたは複数のセリンまたはトレオニン残基を元の抗体配列へ挿入または置換することにより抗体に付加することもできる。
【０３３１】
Ｆｃグリカンは、ＩｇＧのＦｃ受容体とＣ１ｑへの結合に影響を与えるため、ＩｇＧエフェクター機能に対し重要である。修飾Ｆｃグリカンおよび改変エフェクター機能を有する抗体変異体を産生可能である。例えば、シアル酸、コアフコース、二分したＮ−アセチルグルコサミン、およびマンノース残基、等の修飾末端糖を有する抗体は、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体に対する改変結合および改変ＡＤＣＣ活性を有することができる。さらなる例では、修飾末端ガラクトース残基を有する抗体は、Ｃ１ｑに対する改変結合および改変ＣＤＣ活性を有することができる（Ｒａｊｕ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：４７１−７８（２００８）。
【０３３２】
また、ＡＤＣＣ活性の改善を示すフコシル化のない、または減少した抗体分子も意図されている。これを達成するための種々の方法が当技術分野で知られている。例えば、ＡＤＣＣエフェクター活性は、抗体分子のＦｃγＲＩＩＩ受容体に対する結合により媒介され、この結合は、ＣＨ２ドメインのＡｓｎ−２９７にあるＮ結合型グリコシル化の炭水化物構造に依存することが示されている。非フコシル化抗体は、この受容体に増加した親和性で結合し、ネイティブのフコシル化抗体よりもさらに効率的にＦｃγＲＩＩＩ媒介エフェクター機能を誘導する。例えば、ＣＨＯ細胞中での、α−１，６−フコシルトランスフェラーゼ酵素がノックアウトされている非フコシル化抗体の組換え産生では、ＡＤＣＣ活性が１００倍増加した抗体が得られる（Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４−２２（２００４））。類似の効果は、フコシル化経路この酵素または他の酵素の活性を減少させることにより、例えば、ｓｉＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡ処理、酵素をノックアウトするように操作された細胞株、または選択的グリコシル化阻害剤を使った培養によって、得ることができる（Ｒｏｔｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６：１１１３−２３（１９８９））。一部の宿主細胞株、例えば、Ｌｅｃ１３またはラットハイブリドーマＹＢ２／０細胞株は、低フコシル化レベルの抗体を天然に産生する（Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３−４０（２００２）；Ｓｈｉｎｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７８：３４６６−７３（２００３））。例えば、ＧｎＴＩＩＩ酵素を過剰発現している細胞中での組換え抗体産生による、二分した炭水化物レベルの増加も、ＡＤＣＣ活性を増加させることがわかっている（Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：１７６−８０（１９９９））。２つのフコース残基の内のいずれかの１つが存在しないだけで、ＡＤＣＣ活性を増加させるには充分であると予測されている（Ｆｅｒｒａｒａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．９３：８５１−６１（２００６））。
【０３３３】
改変エフェクター機能を有する変異体
抗体の他の修飾も意図されている。一態様では、例えば、癌治療での抗体の有効性を強化するために、エフェクター機能に関して本発明の抗体を修飾することが望ましことがありうる（Ｎａｔｓｕｍｅ  ｅｔ  ａｌ、Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｄｅｖ'ｔ  ＆  Ｔｈｅｒ．３：７−１６（２００９）。代表的エフェクター機能には、Ｃｌｑ結合；ＣＤＣ；Ｆｃ受容体結合；ＡＤＣＣ；食作用；細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体；ＢＣＲ）の発現低下、等がある。エフェクター機能を修飾する１つの方法では、システイン残基をＦｃ領域に導入し、それにより、この領域内の鎖間ジスルフィド結合形成を可能とする。このようにして得られたホモダイマー抗体は、細胞内部移行能力および／または補体媒介細胞殺作用の増加および抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）の改善ができる。Ｃａｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、（Ｊ．Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１７６：１１９１−１１９５（１９９２））およびＳｈｏｐｅｓ、Ｂ．（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：２９１８−２９２２（１９９２））を参照のこと。抗腫瘍活性が強化されたホモ二量体抗体は、また、Ｗｏｌｆｆ  ｅｔ  ａｌ．、（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５３：２５６０−２５６５（１９９３））に記載のように、ヘテロ二機能性架橋剤を使って調製可能である。あるいは、二重Ｆｃ領域を有する抗体を操作して、補体溶解およびＡＤＣＣ能力を強化することができる。Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、（Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ３：２１９−２３０（１９８９））を参照のこと。さらに、ＣＤＲ内の配列がＭＨＣクラスＩＩへの抗体の結合の原因になり、望まれないヘルパーＴ細胞応答を誘導することが示されている。保存的置換により、望まれないＴ細胞応答を誘発する能力を失っても結合活性を抗体に維持させることができる。Ｓｔｅｐｌｅｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．、（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．８５：４８５２−５６（１９９８））も参照のこと。この文献には、マウス可変領域がヒトガンマ１、ガンマ２、ガンマ３、およびガンマ４定常領域と結合するキメラ抗体が記載されている。
【０３３４】
本発明の特定の実施形態では、例えば、腫瘍浸透を増加させるために、無傷抗体よりも、抗体断片の使用が望ましいことがありうる。この場合、抗体の血清半減期を増加させるために、抗体断片を修飾する、例えば、ＰＥＧまたは多糖ポリマーを含む他の水溶性ポリマー、等の分子を抗体断片に付加して、半減期を増加させる、ことが望ましいことがありうる。これは、また、例えば、サルベージ受容体結合エピトープの抗体断片への組み込みによって（例えば、抗体断片中の適切な領域の変異によって、または、例えば、ＤＮＡまたはペプチド合成により、エピトープをペプチドタグに組み込み、次に、どちらかの末端または中央で抗体断片に融合することによって、）達成できる（例えば、ＷＯ９６／３２４７８を参照）。
【０３３５】
サルベージ受容体結合エピトープは、いずれか１つまたは複数のアミノ酸残基をＦｃドメインの１つまたは２つのループから抗体断片の類似の位置へ移している領域を構成するのが好ましい。Ｆｃドメインの１つまたは２つのループから３つ以上の残基を移すと、さらに好ましい。Ｆｃ領域（例えば、ＩｇＧ）のＣＨ２ドメインからエピトープを取り出し、抗体のＣＨ１、ＣＨ３、もしくはＶＨ領域または２つ以上のこのような領域に移すと、またさらに好ましい。あるいは、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインからエピトープを取り出し、抗体断片のＣＬ領域もしくはＶＬ領域、または両方に移す。ＷＯ９７／３４６３１およびＷＯ９６／３２４７８も参照のこと。これらの特許には、Ｆｃ変異体およびそれらのサルベージ受容体との相互作用について記載されている。
【０３３６】
従って、本発明の抗体は、ヒトＦｃ部分、ヒトコンセンサスＦｃ部分、またはＦｃサルベージ受容体と相互作用する能力を保持するその変異体を含む。このような変異体には、ジスルフィド結合に関与するシステインが修飾または除去されている、および／またはメチオニンがＮ−末端に付加されている、および／または１つまたは複数のＮ末端２０アミノ酸が除去されている、および／または補体と相互作用する領域、例えば、Ｃ１ｑ結合部位、が除去されている、および／またはＡＤＣＣ部位が除去されている［例えば、Ｓａｒｍａｙ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９：６３３−９（１９９２）を参照］、変異体が含まれる。
【０３３７】
以前の研究では、ヒトおよびマウスＩｇＧのＦｃＲに対する結合部位を主にＩｇＧ残基２３３〜２３９からなる低ヒンジ部に位置づけていた。他の研究では、追加の広範なセグメント、例えば、ヒトＦｃ受容体ＩのＧｌｙ３１６〜Ｌｙｓ３３８、ヒトＦｃ受容体ＩＩＩのＬｙｓ２７４〜Ａｒｇ３０１およびＴｙｒ４０７〜Ａｒｇ４１６、を提案し、または低ヒンジ部以外のわずかな特異的残基、例えば、マウスＦｃ受容体ＩＩと交互作用するマウスＩｇＧ２ｂのＡｓｎ２９７およびＧｌｕ３１８を見出した。ヒトＦｃ受容体ＩＩＩＡに結合したヒトＩｇＧ１Ｆｃ断片の３．２Å分解能結晶構造の報告では、Ｆｃ受容体ＩＩＩＡに対する結合に関与するものとして、ＩｇＧ１残基Ｌｅｕ２３４〜Ｓｅｒ２３９、Ａｓｐ２６５〜Ｇｌｕ２６９、Ａｓｎ２９７〜Ｔｈｒ２９９、およびＡｌａ３２７〜Ｉｌｅ３３２を図示している。低ヒンジ部（Ｌｅｕ２３４〜Ｇｌｙ２３７）に加えて、ＩｇＧＣＨ２ドメインループＦＧ（残基３２６〜３３０）およびＢＣ（残基２６５〜２７１）中の残基がＦｃ受容体ＩＩＡとの結合に対しある種の役割を有する可能性が、結晶構造に基づいて示唆されている。Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．、（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７６：６５９１−６０４（２００１））参照。本文献は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。Ｆｃ受容体結合部位内の残基の変異は、改変エフェクター機能、例えば、改変ＡＤＣＣまたはＣＤＣ活性、または改変半減期、につながる可能性がある。上述のように、潜在的変異には、アラニンによる置換、保存的置換、非保存的置換、または異なるＩｇＧサブクラスの同じ位置の対応するアミノ酸残基による置換（例えば、ＩｇＧ１残基のその位置の対応するＩｇＧ２残基による置き換え）を含む１つまたは複数の残基の挿入、欠失または置換がある。
【０３３８】
Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．は、全てのヒトＦｃ受容体との結合に関与するＩｇＧ１残基は、ヒンジの近位にあるＣＨ２ドメイン中に位置し、次の２つのカテゴリーに入ることを報告した：１）Ｌｅｕ２３４〜Ｐｒｏ２３８、Ａｌａ３２７、およびＰｒｏ３２９（あるいは、Ａｓｐ２６５）を含む、全てのＦｃＲと直接交互作用することができる位置；２）炭水化物特性に影響を与える位置、またはＡｓｐ２６５およびＡｓｎ２９７を含む位置。Ｆｃ受容体ＩＩに対する結合に対し影響された追加のＩｇＧ１残基は、次の通り：（最大の影響）Ａｒｇ２５５、Ｔｈｒ２５６、Ｇｌｕ２５８、Ｓｅｒ２６７、Ａｓｐ２７０、Ｇｌｕ２７２、Ａｓｐ２８０、Ａｒｇ２９２、Ｓｅｒ２９８、および（少ない影響）Ｈｉｓ２６８、Ａｓｎ２７６、Ｈｉｓ２８５、Ａｓｎ２８６、Ｌｙｓ２９０、Ｇｌｎ２９５、Ａｒｇ３０１、Ｔｈｒ３０７、Ｌｅｕ３０９、Ａｓｎ３１５、Ｌｙｓ３２２、Ｌｙｓ３２６、Ｐｒｏ３３１、Ｓｅｒ３３７、Ａｌａ３３９、Ａｌａ３７８、およびＬｙｓ４１４。Ａ３２７Ｑ、Ａ３２７Ｓ、Ｐ３２９Ａ、Ｄ２６５ＡおよびＤ２７０Ａは、結合を弱めた。全ＦｃＲに対する上記の残基に加えて、Ｆｃ受容体ＩＩＩＡに対する結合を４０％以上弱める別のＩｇＧ１残基には次のものがある：：Ｓｅｒ２３９、Ｓｅｒ２６７（グリシンのみ）、Ｈｉｓ２６８、Ｇｌｕ２９３、Ｇｌｎ２９５、Ｔｙｒ２９６、Ａｒｇ３０１、Ｖａｌ３０３、Ｌｙｓ３３８、およびＡｓｐ３７６。ＦｃＲＩＩＩＡに対する結合を改善する変異体には、Ｔ２５６Ａ、Ｋ２９０Ａ、Ｓ２９８Ａ、Ｅ３３３Ａ、Ｋ３３４Ａ、およびＡ３３９Ｔが含まれる。Ｌｙｓ４１４は、ＦｃＲＩＩＡおよびＦｃＲＩＩＢに対する結合の４０％減少を示し、Ａｒｇ４１６はＦｃＲＩＩＡおよびＦｃＲＩＩＩＡに対し３０％減少、Ｇｌｎ４１９はＦｃＲＩＩＡに対し３０％減少およびＦｃＲＩＩＢに対し４０％減少、さらにＬｙｓ３６０はＦｃＲＩＩＩＡに対し２３％の改善を示した。Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．、（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．３０：４８７-４９０、２００１）も参照のこと。本文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。また、本文献は、ＩｇＧ１のＦｃ領域中のいくつかの位置が、特異的Ｆｃガンマ受容体（Ｒ）に対してのみ得結合を改善する、または同時に、１つのタイプのＦｃガンマＲに対する結合を改善し、別のタイプに対する結合を弱めることを見出したことを記載している。ＦｃガンマＲＩＩＩａに対する結合を改善した選択ＩｇＧ１変異体を、次にインビトロ抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）アッセイで試験し、末梢血単核細胞またはナチュラルキラー細胞が使用される場合、ＡＤＣＣが強化されていることが示された。
【０３３９】
例えば、米国特許第６，１９４，５５１号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）には、ヒトＩｇＧＦｃ領域の、アミノ酸位置３２９、３３１または３２２（Ｋａｂａｔナンバリングによる）に変異を含む改変エフェクター機能を有する変異体が記載されており、一部の変異は、Ｃ１ｑ結合またはＣＤＣ活性の減少を示す。別の例として、米国特許第６，７３７，０５６号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）には、改変エフェクターまたはＦｃガンマ受容体結合を有する変異体が記載されている。この変異には、ヒトＩｇＧＦｃ領域の、次のアミノ酸位置の変異が含まれる：２３８、２３９、２４８、２４９、２５２、２５４、２５５、２５６、２５８、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９４、２９５、２９６、２９８、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１２、３１５、３２０、３２２、３２４、３２６、３２７、３２９、３３０、３３１、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３４０、３６０、３７３、３７６、３７８、３８２、３８８、３８９、３９８、４１４、４１６、４１９、４３０、４３４、４３５、４３７、４３８または４３９（Ｋａｂａｔナンバリングによる）。この内の一部は、ＡＤＣＣまたはＣＤＣ活性の減少に関連する受容体結合プロファイルを示す。これらの中で、２３８、２６５、２６９、２７０、３２７または３２９のアミノ酸位置の変異は、ＦｃＲＩに対する結合を弱めると記載されており、２３８、２６５、２６９、２７０、２９２、２９４、２９５、２９８、３０３、３２４、３２７、３２９、３３３、３３５、３３８、３７３、３７６、４１４、４１６、４１９、４３５、４３８または４３９のアミノ酸位置の変異は、ＦｃＲＩＩに対する結合を弱めると記載されており、さらに、２３８、２３９、２４８、２４９、２５２、２５４、２６５、２６８、２６９、２７０、２７２、２７８、２８９、２９３、２９４、２９５、２９６、３０１、３０３、３２２、３２７、３２９、３３８、３４０、３７３、３７６、３８２、３８８、３８９、４１６、４３４、４３５または４３７のアミノ酸位置の変異は、ＦｃＲＩＩＩに対する結合を弱めると記載されている。
【０３４０】
米国特許第５，６２４，８２１号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）には、マウス抗体のＣｌｑ結合活性は、重鎖のアミノ酸残基３１８、３２０または３２２を変異させることで変えることができ、また、残基２９７（Ａｓｎ）の置換により溶菌活性が除かれることが報告されている。
【０３４１】
米国公開特許公報第２００４０１３２１０１号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）には、次のアミノ酸位置の変異を有する変異体が記載されている：２４０、２４４、２４５、２４７、２６２、２６３、２６６、２９９、３１３、３２５、３２８、または３３２（Ｋａｂａｔナンバリングによる）または２３４、２３５、２３９、２４０、２４１、２４３、２４４、２４５、２４７、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６９、２９６、２９７、２９８、２９９、３１３、３２５、３２７、３２８、３２９、３３０、または３３２（Ｋａｂａｔナンバリングによる）。このうち、２３４、２３５、２３９、２４０、２４１、２４３、２４４、２４５、２４７、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６９、２９６、２９７、２９８、２９９、３１３、３２５、３２７、３２８、３２９、３３０、または３３２の位置の変異はＡＤＣＣ活性またはＦｃガンマ受容体に対する結合を減少させる可能性がある。
【０３４２】
Ｃｈａｐｐｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．８８：９０３６−４０（１９９１））（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）は、ＩｇＧ１の細胞親和性活性は、その重鎖ＣＨ２ドメインの内因特性であることを報告した。ＩｇＧ１の２３４〜２３７のいずれかのアミノ酸残基の単一点変異は、その活性を大きく低下させるか、または消失させる。完全結合活性を回復させるには、全てのＩｇＧ１残基２３４〜２３７（ＬＬＧＧ）のＩｇＧ２およびＩｇＧ４への置換が必要であった。全ＥＬＬＧＧＰ配列（残基２３３〜２３８）を含むＩｇＧ２抗体は、野性型ＩｇＧ１より活性が高いことが明らかになった。
【０３４３】
Ｉｓａａｃｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：３８６２−９（１９９８））（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）は、ＦｃガンマＲ結合に対する重要なモチーフ（グルタメート２３３〜プロリン、ロイシン／フェニルアラニン２３４〜バリン、およびロイシン２３５〜アラニン）内での変異は、標的細胞の枯渇を完全に防止したと報告している。グルタメート３１８〜アラニンの変異は、除去したマウスＩｇＧ２ｂのエフェクター機能を取り除き、ヒトＩｇＧ４の効力も減少させた。
【０３４４】
Ａｒｍｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．４０：５８５−９３（２００３））（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）は、活性化受容体、ＦｃガンマＲＩＩａ、と野生型ＩｇＧ１よりも少なくとも１０倍低い効率で反応するが、阻害受容体、ＦｃガンマＲＩＩｂ、に対する結合は、４倍低下させるに過ぎないＩｇＧ１変異体を特定した。アミノ酸２３３〜２３６の領域中、および／またはアミノ酸位置３２７、３３０および３３１で変異をさせた。ＷＯ９９／５８５７２（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）も参照のこと。
【０３４５】
Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２６９：３４６９−７４（１９９４））（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）は、ＩｇＧ１  Ｐｒｏ３３１〜Ｓｅｒの変異は、Ｃ１ｑ結合を顕著に低下させ、実質的に溶菌活性を除去したことを報告した。対照的に、ＩｇＧ４中のＰｒｏのＳｅｒ３３１による置換により、ＩｇＧ４  Ｐｒｏ３３１変異体に部分的溶菌活性（４０％）が付与された。
【０３４６】
Ｓｃｈｕｕｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．３８：１−８（２００１））（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）は、重鎖間結合形成に関与する１つのヒンジシステインＣｙｓ２２６のセリンへの変異により、より安定な重鎖間結合が生ずることを報告した。また、ＩｇＧ４ヒンジ配列Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−ＣｙｓのＩｇＧ１ヒンジ配列Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓへの変異により、重鎖間の共有結合の相互作用が著しく安定化する。
【０３４７】
Ａｎｇａｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０：１０５−８（１９９３））（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）は、ＩｇＧ４のアミノ酸位置２４１のセリンをプロリン（ＩｇＧ１およびＩｇＧ２のその位置で見つかった）に変異させることにより、元のキメラＩｇＧ４に比べ、均質な抗体の産生、ならびに血清半減期延長および組織分布の改善につながることを報告している。
【０３４８】
共有結合修飾
本発明のポリペプチド結合剤、例えば、抗体、の共有結合修飾もまた、本発明の範囲に含まれる。それらは、該当する場合は、ポリペプチド結合剤の化学合成または酵素的もしくは化学的開裂によって、作製可能である。他のタイプのポリペプチド結合剤の共有結合修飾が、ポリペプチド結合剤の標的アミノ酸残基を選択側鎖またはＮもしくはＣ末端残基と反応可能な有機誘導体化試薬と反応させることにより導入される。
【０３４９】
システイニル残基は、通常、クロロ酢酸またはクロルアセトアミド等のα−ハロアセタート（および対応するアミン）と反応させ、カルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を得る。また、システイニル残基は、ブロモトリフルオロアセトン、α−ブロモ−β−（５−イミドゾイル）プロピオン酸、クロロアセチルリン酸、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル２−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロロメルクリベンゾアート、２−クロロメルクリ−４−ニトロフェノール、またはクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾールとの反応により誘導体化される。
【０３５０】
ヒスチジル残基は、ジエチルピロカルボナートとｐＨ５．５〜７．０で反応させることにより誘導体化される。理由は、この試薬がヒスチジル側鎖に対し比較的特異的であるためである。パラ−ブロモフェナシルブロミドも有用である；反応は、０．１Ｍナトリウムカコジラート中でｐＨ６．０で行うのが好ましい。
【０３５１】
リシニルおよびアミノ末端残基をコハク酸または他のカルボン酸無水物と反応させる。これらの試薬による誘導体化は、リシニル残基の電荷を逆転させる効果がある。α−アミノ含有残基を誘導体化する他の適切な試薬には、メチルピコリンイミダート等のイミドエステル、ピリドキサールホスファート、ピリドキサール、クロロボロヒドリド、トリニトロベンゼンスルホン酸、Ｏ−メチルイソ尿素、２，４−ペンタンジオン、およびグリオキシラートとのトランスアミナーゼ触媒反応がある。
【０３５２】
アルギニル残基は、１つまたはいくつかの従来の試薬との反応で修飾される。この試薬には、フェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオン、およびニンヒドリンが含まれる。アルギニン残基の誘導体化には、グアニジン官能基の高いｐＫａのために、アルカリ性条件下で反応を行うことが必要である。さらに、これらの試薬は、リシン基ならびにアルギニンε−アミノ基と反応できる。
【０３５３】
チロシル残基の特異的修飾は、芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応により、スペクトル標識をチロシル残基中に導入する特定の目的をもって行われる。大抵は、Ｎ−アセチルイミジゾールおよびテトラニトロメタンを使って、それぞれ、Ｏ−アセチルチロシル種および３−ニトロ誘導体を生成する。チロシル残基は、１２５Ｉまたは１３１Ｉを使ってヨウ素化され、ラジオイムノアッセイに使用する標識タンパク質が調製される。
【０３５４】
カルボキシル側鎖（アスパルチルまたはグルタミル）は、カルボジイミド（Ｒ−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ’）との反応により選択的に修飾される。前式中、ＲおよびＲ’は異なるアルキル基、例えば、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドである。さらに、アスパルチルおよびグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応により、アスパラギニルおよびグルタミニル残基に変換される。
【０３５５】
グルタミニルおよびアスパラギニル残基は、脱アミド化され、それぞれ対応するグルタミルおよびアスパルチル残基になることが多い。これらの残基は、中性または塩基性条件下で脱アミド化される。これらの残基の脱アミド化型は、本発明の範囲に入る。
【０３５６】
他の修飾には、プロリンおよびリシンのヒドロキシル化、セリルまたはスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、メリシン、アルギニン、およびヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、「タンパク質：構造と分子特性」、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ｐｐ．７９−８６（１９８３））、Ｎ末端アミンのアセチル化、および任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化、が挙げられる。
【０３５７】
別のタイプの共有結合修飾には、グリコシドのポリペプチド結合剤への、化学的、または酵素的カップリングが含まれる。これらの方法は、ＮまたはＯ結合型グリコシル化に対するグリコシル化能力を有する宿主細胞中でのポリペプチド結合剤生成が必要ではないという点で、有利である。使用される結合モードに応じて、糖が、（ａ）アルギニンおよびヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）システインの場合のような遊離スルフヒドリル基、（ｄ）セリン、トレオニン、もしくはヒドロキシプロリンの場合のような遊離ヒドロキシル基、（ｅ）フェニルアラニン、チロシン、もしくはトリプトファンの場合のような芳香族残基、または（ｆ）グルタミンのアミド基、に結合できる。これらの方法は、ＷＯ８７／０５３３０およびＡｐｌｉｎ  ａｎｄ  Ｗｒｉｓｔｏｎ、（ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、ｐｐ．２５９−３０６（１９８１））に記載されている。
【０３５８】
ポリペプチド結合剤に存在するいずれかの炭水化物成分の除去は、化学的にまたは酵素的に行うことができる。化学的脱グリコシル化には、ポリペプチド結合剤を化合物トリフルオロメタンスルホン酸、または等価化合物に曝す必要がある。この処理により、連結糖（ｌｉｎｋｉｎｇ  ｓｕｇａｒ）（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）以外のほとんどの、または全ての糖の開裂が生ずるが、一方、ポリペプチド結合剤は、そのまま残される。化学的脱グリコシル化については、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎ、ｅｔ  ａｌ．、（Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２５９：５２（１９８７））およびＥｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．、（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８：１３１（１９８１））に記載がある。Ｔｈｏｔａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．、（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３８：３５０（１９８７））により記載されているように、ポリペプチド結合剤の炭水化物成分の酵素的開裂は、種々のエンドおよびエキソグリコシダーゼの使用により行うことができる。
【０３５９】
ポリペプチド結合剤の別のタイプの共有結合修飾には、ポリペプチド結合剤の種々の疎水性の成分または非タンパク質性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリオキシエチル化ソルビトール、ポリオキシエチル化グルコース、ポリオキシエチル化グリセリン、ポリオキシアルキレン、またはデキストラン等の多糖ポリマー、の１つへの結合を含む。このような方法は、当技術分野で既知であり、例えば、米国特許第４，６４０，８３５号；４，４９６，６８９号；４，３０１，１４４号；４，６７０，４１７号；４，７９１，１９２号；４，１７９，３３７号；４，７６６，１０６号；４，１７９，３３７号；４，４９５，２８５号；４，６０９，５４６号または欧州特許第ＥＰ３１５４５６号を参照のこと。
【０３６０】
誘導体
誘導体は、ユビキチン化、標識化（例えば、放射性核種または種々の酵素で）、ペグ化（ポリエチレングリコールで誘導体化）等の共有結合ポリマー結合およびオルニチン等のアミノ酸の化学合成による挿入または置換のような技術により化学的に修飾された、抗体を含む、ポリペプチド結合剤を指す。本発明の抗体等のポリペプチド結合剤の誘導体は、また、治療薬として有用であり、本発明の方法により産生可能である。
【０３６１】
複合化成分は、例えば、放射性のヌクレオチド、またはストレプトアビジンにより認識されるビオチン化されたヌクレオチドの組み込みのように、共有結合で、またはイオン、ファンデルワールスまたは水素結合によりポリペプチド結合剤に組み込む、または結合することができる。
【０３６２】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、ポリペプチド結合剤に結合し、より長いインビボの半減期を提供できる。ＰＥＧ基は、任意の都合のよい分子量でよく、また、直鎖でも分岐でもよい。ＰＥＧの平均分子量は、好ましくは、約２キロダルトン（「ｋＤ」）〜約１００ｋＤａ、より好ましくは約５ｋＤａ〜約５０ｋＤａ、最も好ましくは約５ｋＤａ〜約１０ｋＤａの範囲である。ＰＥＧ基は、通常、ＰＥＧ成分の天然または操作反応基（例えば、アルデヒド、アミノ、チオール、またはエステル基）からポリペプチド結合剤の反応基（例えば、アルデヒド、アミノ、またはエステル基）へのアシル化または還元アルキル化によって本発明のポリペプチド結合剤に結合される。ポリペプチド結合剤へのＰＥＧ成分の付加は、当技術分野でよく知られた技術を使って行うことができる。例えば、国際公開番号ＷＯ９６／１１９５３および米国特許第４，１７９，３３７号参照のこと。
【０３６３】
ポリペプチド結合剤とＰＥＧの連結反応は、通常、水相で起こり、逆相分析ＨＰＬＣにより容易にモニターできる。ペグ化物質を、分取ＨＰＬＣにより精製し、分析ＨＰＬＣ、アミノ酸分析およびレーザー脱離質量分析により特性解析を行う。
【０３６４】
抗体複合体
ポリペプチド結合剤は、その「裸の（ｎａｋｅｄ）」または非複合化形態で投与してもよく、または他の治療または診断薬に直接複合化してもよく、またはこのような他の治療または診断薬を含む担体ポリマーに間接的に複合化してもよい。一部の実施形態では、ポリペプチド結合剤は、化学療法剤、薬剤、増殖阻害剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物または動物起源の酵素的に活性毒素、またはそれらの断片）、または放射性同位元素（すなわち、放射性複合体（ｒａｄｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ））等の細胞障害性の試薬に複合化される。適切な化学療法剤には：ダウノマイシン、ドキソルビシン、メトトレザト、およびビンデシンが含まれる（Ｒｏｗｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．、（１９８６）同上文献）。適切な毒素には次のものが含まれる：ジフテリア毒素等の細菌性毒素；リシン等の植物毒素；ゲルダナマイシン等の小分子分子毒素（Ｍａｎｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌＪ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．９２（１９）：１５７３−８１（２０００）；Ｍａｎｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ  １０：１０２５−１０２８（２０００）；Ｍａｎｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１３．７８６−９１（２００２））、マイタンシノイド（ＥＰ１３９１２１３；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：８６１８−２３（１９９６））、オーリスタチン（Ｄｏｒｏｎｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２１：７７８−８４（２００３）およびカリチアマイシン（Ｌｏｄｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：２９２８（１９９８）；Ｈｉｎｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：３３３６−３３４２（１９９３））。
【０３６５】
ポリペプチド結合剤は、放射性同位体、親和標識（例えば、ビオチン、アビジン、等）、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、等）蛍光または発行もしくは生物発光標識（例えば、ＦＩＴＣまたはローダミン、等）、常磁性原子、等の使用により、検出可能な程度に標識付けできる。これらの標識化を行う方法は、当技術分野でよく知られている；例えば、（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇｅｒ、Ｌ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．１８：３１５（１９７０）；Ｂａｙｅｒ、Ｅ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．６２：３０８（１９７９）；Ｅｎｇｖａｌ、Ｅ．ｅｔ  ａｌ．、Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０９：１２９（１９７２）；Ｇｏｄｉｎｇ、Ｊ．Ｗ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１３：２１５（１９７６））を参照のこと。
【０３６６】
ポリペプチド結合剤成分の複合については、米国特許第６，３０６，３９３号に記載されている。また、一般的技術については、Ｓｈｉｈ  ｅｔ  ａｌ．、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４１：８３２−８３９（１９８８）；Ｓｈｉｈ  ｅｔ  ａｌ．、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４６：１１０１−１１０６（１９９０）；およびＳｈｉｈ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第５，０５７，３１３号に記載されている。一般的方法は、酸化された炭水化物部分を含むポリペプチド結合剤成分を担体ポリマーと反応させることを含み、この担体ポリマーは、少なくとも１つの遊離アミン官能基を有し、複数の薬剤、毒素、キレート剤、ホウ素付加試薬、または他の治療薬と一緒に添加される。この反応は、初期シッフ塩基（イミン）結合を生成し、これは第二級アミンに還元されて安定化し、最終複合体を形成する。
【０３６７】
担体ポリマーは、例えば、少なくとも５０アミノ酸残基のアミノデキストランまたはポリペプチドであってもよい。薬剤または他の試薬を担体ポリマーに複合化する種々の技術が当技術分野で知られている。ポリペプチド担体は、アミノデキストランの代わりに使用可能であるが、ポリペプチド担体は、鎖中に少なくとも５０アミノ酸残基、好ましくは１００〜５０００アミノ酸残基、を持たなくてはならない。少なくとも一部のアミノ酸は、リジン残基またはグルタメートまたはアスパルタート残基でなければならない。リジン残基の突き出たアミンおよび突き出たグルタミンとアスパルタートのカルボキシラートは、薬剤、毒素、免疫調節物質、キレート剤、ホウ素付加試薬または他の治療薬を取り付けるには好都合である。適切なポリペプチド担体の例には、ポリリジン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、それらのコポリマー、および得られた坦持担体および複合体に望ましい溶解特性を与えるためのこれらのアミノ酸と他のもの、例えば、セリン、の混合ポリマー、が挙げられる。
【０３６８】
あるいは、複合化ポリペプチド結合剤は、ポリペプチド結合剤を治療薬を伴った成分と直接複合化して調製できる。一般的手法は、治療薬が酸化されたポリペプチド結合剤成分に直接結合している以外は、複合化の間接的方法と類似である。例えば、ポリペプチド結合剤の炭水化物成分を、ポリエチレングリコールに結合させて半減期を延長できる。
【０３６９】
あるいは、治療薬を、ジスルフィド結合形成を介して、またはヘテロ二機能性架橋剤、例えば、Ｎ−スクシニル３−（２−ピリジルジチオ）プロプリオナート（ＳＰＤＰ）を使って、還元抗体成分のヒンジ部に結合することができる。Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ５６：２４４（１９９４）。このような複合化の一般的技術は、当技術分野でよく知られている。例えば、Ｗｏｎｇ、「タンパク質複合化および架橋の化学」（ＣＲＣＰｒｅｓｓ  １９９１）；Ｕｐｅｓｌａｃｉｓ  ｅｔ  ａｌ．、「モノクローナル抗体：原理と応用」の中の「化学的方法による抗体の修飾」、Ｂｉｒｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）、ｐａｇｅｓ  １８７−２３０（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃ．１９９５）；Ｐｒｉｃｅ、「モノクローナル抗体：産生、エンジニアリングおよび臨床的応用」の中の「合成ペプチド由来抗体の産生およびキャラクタリゼーション」、Ｒｉｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）、ｐａｇｅｓ  ６０−８４（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５）を参照のこと。種々の二官能性タンパク質結合試薬が当技術分野で既知で、例えば、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチルアジプイミダートＨＣＬ等）、活性エステル（ジスクシンイミジルスベラート等）、アルデヒド（グルタルアルデヒド等）、ビスアジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン等）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン等）、ジイソシアナート（トリエン２，６−ジイソシアナート等）、およびビス活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン等）、が挙げられる。
【０３７０】
抗体融合タンパク質
抗体融合タンパク質の作製方法は当技術分野でよく知られている。例えば、米国特許第６，３０６，３９３号を参照。インターロイキン２成分を含む抗体融合タンパク質は、Ｂｏｌｅｔｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｎｎ．Ｏｎｃｏｌ．６：９４５（１９９５）、Ｎｉｃｏｌｅｔ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２：１６１（１９９５）、Ｂｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：７８２６（１９９６）、Ｈａｎｋ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２：１９５１（１９９６）、およびＨｕ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６：４９９８（１９９６）に記載されている。さらに、Ｙａｎｇｅｔａｌ．、（Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ６：１２９（１９９５））、は、Ｆ（ａｂ’）２断片および腫瘍壊死因子α成分を含む融合タンパク質について記載している。抗体融合タンパク質のさらなる例は、Ｐａｓｔａｎ  ｅｔ  ａｌ、Ｎａｔ．Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ  ６：５５９−６５（２００６）に記載がある。
【０３７１】
組換え型分子が１つまたは複数の抗体成分および毒素または化学療法剤を含む抗体毒素融合タンパク質の作成方法もまた、当業者には既知である。例えば、抗体−緑膿菌外毒素Ａ融合タンパク質が、Ｃｈａｕｄｈａｒｙ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  ３３９：３９４（１９８９）、Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：８６１６（１９９１）、Ｂａｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：５８６７（１９９２）、Ｆｒｉｅｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：３０５４（１９９３）、Ｗｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎ．６０：１３７（１９９５）、Ｆｏｍｉｎａｙａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１０５６０（１９９６）、Ｋｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５：２８７２（１９９６）、およびＳｃｈｍｉｄｔ  ｅｔ  ａｌ．、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎ．６５：５３８（１９９６）により記載されている。ジフテリア毒素成分を含む抗体−毒素融合タンパク質が、Ｋｒｅｉｔｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ７：５５３（１９９３）、Ｎｉｃｈｏｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：５３０２（１９９３）、Ｔｈｏｍｐｓｏｎｅｔａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２８０３７（１９９５）、およびＶａｌｌｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｌｏｏｄ  ８８：２３４２（１９９６）により記載されている。Ｄｅｏｎａｒａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｔｕｍｏｒ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  １：１７７（１９９５）、は、リボヌクレアーゼ成分を有する抗体−毒素融合タンパク質を記載し、一方、Ｌｉｎａｒｄｏｕ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４−２５：２４３（１９９４）、はデオキシリボヌクレアーゼＩ成分を含む抗体−毒素融合タンパク質を作製した。ゲロニンが、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．の抗体−毒素融合タンパク質の毒素成分として使用された（Ａｂｓｔｒａｃｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ２０９ｔｈ  ＡＣＳ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ、Ａｎａｈｅｉｍ、Ｃａｌｉｆ．、Ａｐｒ．２−６、１９９５、Ｐａｒｔ  １、ＢＩＯＴ００５）。さらなる例では、Ｄｏｈｌｓｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：８９４５（１９９４）、が、ブドウ状球菌エンテロトキシンＡを含む抗体−毒素融合タンパク質を報告した。
【０３７２】
融合タンパク質の調整に採用される適切な毒素の例には、リシン、アブリン、リボヌクレアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼＩ、ブドウ状球菌エンテロトキシン−Ａ、ヨウシュヤマゴボウ抗ウィルス蛋白質、ゲロニン、ジフテリア菌毒素、緑膿菌外毒素、およびシュードモナス菌体内毒素がある。例えば、Ｐａｓｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｅｌｌ  ４７：６４１（１９８６）、およびＧｏｌｄｅｎｂｅｒｇ、ＣＡ−−Ａ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃｉａｎｓ  ４４：４３（１９９４）を参照。他の適切な毒素は、当業者には既知である。
【０３７３】
本発明の抗体は、また、抗体を、プロドラッグ（例えば、ペプチジル化学療法剤（ＷＯ８１／０１１４５参照））を活性抗癌剤に変換するプロドラッグ活性化酵素に複合化することによりＡＤＥＰＴとしても使用できる。例えば、ＷＯ８８／０７３７８および米国特許第４，９７５，２７８号を参照のこと。
【０３７４】
ＡＤＥＰＴに有用な免疫複合体の酵素成分には、より活性な細胞障害性の形態に変換するようにプロドラッグに対して作用することができる任意の酵素が含まれる。
【０３７５】
本発明に有用な酵素には、これに限定されないが、：アルカリホスファターゼ；アリールスルファターゼ；シトシンデアミナーゼ、５−フルオロウラシル；セラチアプロテアーゼ、サーモリシン、スブチリシン、カルボキシペプチダーゼおよびカテプシン（カテプシンＢおよびＬ、等）等のプロテアーゼ；Ｄ−アラニルカルボキシペプチダーゼ、；β−ガラクトシダーゼおよびノイラミニダーゼ等の炭水化物開裂酵素；β−ラクタマーゼ；およびペニシリンＶアミダーゼまたはペニシリンＧアミダーゼ等のペニシリンアミダーゼ、が含まれる。あるいは、当技術分野でアブザイムとしても知られる、酵素活性を有する抗体が、本発明のプロドラッグを遊離活性薬剤に変換するのに使用できる（例えば、Ｍａｓｓｅｙ、Ｎａｔｕｒｅ  ３２８：４５７−４５８（１９８７）を参照）。抗体−アブザイム複合体は、本明細書記載のようにアブザイムを腫瘍細胞集団に送達することを目的として調整可能である。
【０３７６】
上記酵素は、上記で考察したヘテロ二機能性架橋試薬の使用、等の当技術分野でよく知られた技術により抗体に共有結合することができる。あるいは、少なくとも機能的に活性な本発明の酵素の一部に結合した少なくとも本発明の抗体の抗原結合領域を含む融合タンパク質が、当技術分野でよく知られた組換ＤＮＡ技術を使って構築可能である（例えば、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６０４−６０８（１９８４）参照）。
【０３７７】
アミノ酸配列変異体の調製
１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、および／または６つの抗体またはポリペプチド結合剤のＣＤＲを含む修飾ポリペプチド組成物が生成され、その組成物では、抗原に対する特異性または親和性を増加させ、または標的とそのシグナル伝達相手との間の結合親和性の調節を増加させるように、ＣＤＲまたは非ＣＤＲ領域が改変されることが意図されている。例えば、抗体ＣＤＲ内の部位は、通常、系統的に修飾される。例えば、最初、保存的選択による置換（例えば、疎水性のアミノ酸による非同一疎水性アミノ酸の置換）、次いでさらに類似性の少ない選択による置換（例えば、帯電アミノ酸を疎水性のアミノ酸で置換）、さらに、標的部位で欠失または挿入を作る。ＣＤＲ内での保存的置換により可変領域に対し生物活性を保持させることが意図されている。例えば、ＣＤＲ周辺の保存フレームワーク配列を使って、これらのコンセンサス配列に相補的なＰＣＲプライマーが生成され、プライマー領域の間に位置する抗原特異的ＣＤＲ配列が増幅される。ヌクレオチドおよびポリペプチド配列をクローニングし、発現させる技術は、当技術分野で確立されている［例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．、「分子クローニング：実験マニュアル」、２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）を参照］。増幅されたＣＤＲ配列は、適切なプラスミドに連結される。１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、および／または６つのクローン化ＣＤＲを含むプラスミドは、任意でＣＤＲに結合する領域をコードした追加のポリペプチドを含む。
【０３７８】
修飾ＣＤＲを含むポリペプチド結合剤は、元の抗原に対する結合親和性で選別される。さらに、抗体またはポリペプチドは、抗原の活性を中和する能力をさらに試験される。例えば、本発明の抗体は、標的の生物活性を妨げる能力を判定する実施例で示すように、分析することができる。
【０３７９】
修飾は、下記でさらに詳細に記載した保存的または非保存的アミノ酸置換によって行うことができる。「挿入」または「欠失」は、好ましくは約１〜２０アミノ酸、さらに好ましくは１〜１０アミノ酸、の範囲内にある。変位は、抗体ポリペプチド分子中のアミノ酸の置換を、組換ＤＮＡ技術を使って系統的に行い、得られた組換え型変異体の活性をアッセイすることにより導入可能である。核酸の改変は、異なる種由来の核酸の異なる部位（可変位置）または高度保存領域（定常領域）で作ることができる。抗体配列を改変し、本発明に有用な抗体ポリペプチド組成物を発現させる方法は、以下で詳細に記述される。
【０３８０】
アミノ酸配列挿入は、１つの残基から１００以上の残基を含むポリペプチドの長さの範囲のアミノ−および／またはカルボキシル−末端融合体、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例には、Ｎ末端メチオニル残基またはエピトープタグを有する抗体またはサルベージ受容体エピトープに融合した抗体（抗体断片を含む）が含まれる。抗体分子の他の挿入変異体には、抗体血清半減期を増加させるポリペプチドへの、例えば、Ｎ末端またはＣ末端での、融合体、が含まれる。
【０３８１】
用語の「エピトープタグを付けた（ｅｐｉｔｏｐｅ  ｔａｇｇｅｄ）」は、エピトープタグに融合された抗体を指す。エピトープタグポリペプチドは、対抗抗体が作られるエピトープを提供するのに十分な残基を有するが、充分に短いため、抗体の活性を妨害しない。エピトープタグは、抗体が他のエピトープと交差反応しないように充分にユニークであるのが好ましい。適切なタグポリペプチドは、一般的には、少なくとも６アミノ酸残基を有し、通常は、約８〜５０アミノ酸残基の間（好ましくは約９〜３０残基の間）である。例には、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）タグポリペプチドおよびその抗体１２ＣＡ５（Ｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：２１５９−２１６５（１９８８））；ｃ−ｍｙｃタグならびにそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７および９Ｅ１０抗体（Ｅｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３６１０−１６（１９８５））；ならびに単純疱疹ウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）タグおよびその抗体（Ｐａｂｏｒｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ３：５４７−５３（１９９０））が含まれる。他の代表的タグは、通常は、およそ６ヒスチジン残基の、ニッケルキレート化を使って、そのように標識付けした化合物の単離を可能とするポリヒスチジン配列である。当技術分野でよく知られ、日常的に使用されているＦＬＡＧ（登録商標）タグ（Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）のような、他の標識とタグは、本発明に包含される。
【０３８２】
本明細書で使われる用語の「サルベージ受容体結合エピトープ」は、ＩｇＧ分子のインビボ血清半減期の増加に関与するＩｇＧ分子（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）のＦｃ領域のエピトープを指す。
【０３８３】
別のタイプの変異体は、アミノ酸置換変異体である。これらの変異体は、抗体分子中の少なくとも１つのアミノ酸残基が取り除かれ、異なる残基がその位置に挿入されている。高頻度可変性もしくはＣＤＲ領域またはフレームワーク領域のいずれか内の置換変異生成が意図されている。保存的置換には、アミノ酸のそのクラスの別のメンバーによる置換が含まれる。非保存的置換は、これらのクラスの１つを別のクラスのメンバーで置換することを含む。
【０３８４】
保存的アミノ酸置換は、当該残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性、および／または両親媒性の類似性に基づいて行われる。例えば、非極性（疎水性の）アミノ酸には、アラニン（Ａｌａ、Ａ）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）、バリン（Ｖａｌ、Ｖ）、プロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）、トリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）、およびメチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）が含まれる；極性が中性のアミノ酸には、グリシン（グリシン、Ｇ）、セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）、トレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）、システイン（Ｃｙｓ、Ｃ）、チロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）、アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）、およびグルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）が含まれる；陽性帯電（塩基性）アミノ酸には、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、リシン（Ｌｙｓ、Ｋ）、およびヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）が含まれる；さらに陰性帯電（酸性の）アミノ酸には、アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）およびグルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）が含まれる。
【０３８５】
抗体の固有の高次構造維持に関与しないいずれのシステイン残基も置換可能で、通常、セリンに置換され、分子の酸化安定性を改善し、異常架橋を防ぐ。逆に、システイン結合を抗体に追加してその安定性を改善することができる（抗体がＦｖ断片のような抗体断片の場合は特に）。
【０３８６】
親和性成熟
親和性成熟は、通常、親抗体のＣＤＲ内に置換を有する抗体変異体を調製および選別し、親抗体に比較して高い結合親和性等の改善された生物学的特性を有する変異体を選択することを含む。このような置換変異体を生成するのに便利な方法がファージディスプレイを使った親和性成熟である。手短に述べると、いくつかの高頻度可変性領域部位（例えば、６〜７部位）を変異させ、各部位で全ての可能性のあるアミノ置換を生成する。このようにして得られた抗体変異体は、各粒子中にパッケージされたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物に対する融合体として、一価形式で、繊維状ファージ粒子から提示される。ファージディスプレイされた変異体は、次に、その生物活性（例えば、結合親和性）で選別される。例えば、ＷＯ９２／０１０４７、ＷＯ９３／１１２３６６、ＷＯ９５／１５３８８およびＷＯ９３／１９１７２を参照のこと。
【０３８７】
現行の抗体親和性成熟方法は、２つの変異生成カテゴリー：確率的および非確率的、に属する。エラープローンＰＣＲ、変異誘発細菌株（Ｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６０、３５９−６８（１９９６））、および飽和変異誘発法（Ｎｉｓｈｉｍｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１２８１３−２０（２０００）；Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ、Ｐ．Ｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７８、２６９−８５（２００２））は、典型的な確率的変異生成方法の例である（Ｒａｊｐａｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１０２：８４６６−７１（２００５））。非確率的技術としては、アラニンスキャニングまたは部位特異的変異誘発が、特異的変異体の限定された収集物を得るためによく使われる。いくつかの方法は、下記でさらに詳細に説明する。
【０３８８】
パニング法による親和性成熟-組換え型抗体の親和性成熟を通常の方式で、抗原の量を徐々に減らしながら候補抗体の数回のパニングにより行う。各回毎の抗原量を減らすことにより、抗原に対する最も大きい親和性を有する抗体が選択され、その結果、出発物質の大きなプールから高親和性抗体が得られる。パニングによる親和性成熟は、当技術分野でよく知られ、例えば、Ｈｕｌｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５０：１６３−７１（２００１））に記載されている。ファージディスプレイ法を使った親和性成熟の方法は、本明細書野別のところで記載され、当技術分野で既知である（例えば、Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．９７：２０２９−３４（２０００）参照）。
【０３８９】
ルックスルー変異誘発−ルックスルー変異誘発（ＬＴＭ）（Ｒａｊｐａｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１０２：８４６６−７１（２００５））は、抗体結合部位の急速マッピング方法を適用する。ＬＴＭでは、２０の天然アミノ酸により提供される主要側鎖の化学の内の代表的な、９つのアミノ酸が選択され、抗体の６つのＣＤＲ全ての位置で、機能的側鎖の結合に対する寄与を分析する。ＬＴＭは、各「野性型」残基が、９つの選択アミノ酸の内の１つにより系統的に置換されるＣＤＲ内の一連の位置における単一変異を生成する。変異ＣＤＲは、組み合わされて、全変異体の量的ディスプレイに対する制約なしに複雑さとサイズが拡大できる、コンビナトリアル単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）ライブラリーを生成する。正の選択後、より大きい結合親和性を有するクローンが配列決定され、有益な変異がマッピングされる。
【０３９０】
エラープローンＰＣＲ-エラープローンＰＣＲには、異なる選択ラウンド間の核酸の無作為化が含まれる。使ったポリメラーゼの内因性エラー率のため、無作為化が起こる率は低いが、転写中の高い内因性エラー率を有するポリメラーゼ（Ｈａｗｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２２６：８８９−９６（１９９２））を使ったエラープローンＰＣＲにより改善することができる（Ｚａｃｃｏｌｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８５：７７５−７８３（１９９９））。変異サイクル後、抗体に対しさらに大きい結合親和性を有するクローンが、当技術分野のルーチン的方法を使って選択される。
【０３９１】
ＤＮＡシャフリング−核酸シャフリングは、インビトロまたはインビボでより短いまたは小さいプールのポリヌクレオチドを相同組換えし、変異体ポリヌクレオチドを産生する方法である。ＤＮＡシャフリングは、米国特許第６，６０５，４４９号、６，４８９，１４５号、ＷＯ０２／０９２７８０およびＳｔｅｍｍｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１：１０７４７−５１（１９９４）に記載されている。一般的に、ＤＮＡシャフリングは、３ステップ：シャッフルされる遺伝子のデオキシリボヌクレアーゼＩを用いた断片化、断片のランダムハイブリダイゼーション、およびＤＮＡポリメラーゼの存在下でのＰＣＲによる断片化遺伝子の再構築または挿入（ｓｅｘｕａｌ  ＰＣＲ）、ならびに再構築した産物の従来のＰＣＲによる増幅からなる。
【０３９２】
ＤＮＡシャフリングは、インバース連鎖反応であるという点でエラープローンＰＣＲとは異なる。エラープローンＰＣＲでは、ポリメラーゼ開始部位の数と、分子の数は、指数的に増加する。対照的に、ランダムポリヌクレオチドの核酸再構築またはシャフリングでは、開始部位の数およびランダムポリヌクレオチドの数（サイズではなく）は、時間と共に減少する。
【０３９３】
抗体の場合には、ＤＮＡシャフリングは、例えば、全てのＣＤＲ１と全てのＣＤＲ２、およびこれらとさらに全てのＣＤＲ３との自由な組み合わせの結合を可能にする。複数の配列ファミリーが同じ反応でシャッフル可能であることが意図されている。さらに、シャフリングは、通常、相対的順序を保存し、例えば、ＣＤＲ２の位置にＣＤＲ１が認められることはない。まれにシャッフルされたものが多くの最良（例えば、最高の親和性）のＣＤＲを含むことがあり、これらは、その優れた親和性に基づいて選択されうる。
【０３９４】
ＤＮＡシャフリングで使用できるテンプレートポリヌクレオチドは、ＤＮＡでも、ＲＮＡでもよい。組換えまたは再構築するのに、それは、遺伝子のサイズに応じて、多様な長さでよく、または短いもしくは小さいポリヌクレオチドでもよい。好ましくは、テンプレートポリヌクレオチドは、５０ｂｐ〜５０ｋｂである。テンプレートポリヌクレオチドは、二重鎖が必要であることが多い。
【０３９５】
テンプレートポリヌクレオチドに対し同一の領域、およびテンプレートポリヌクレオチドに対し異種構造の領域を有する単鎖または二重鎖核酸ポリヌクレオチドを、遺伝子選択の初期ステップの間に、テンプレートポリヌクレオチドに添加可能であることが意図されている。また、２つの、異なるが関連しているポリヌクレオチドテンプレートを、初期ステップの間に、混合することができることも意図されている。 
【０３９６】
アラニンスキャニング−アラニンスキャニング変異誘発を行って、抗原結合に大きく寄与する高頻度可変性領域残基を特定することができる：Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ、（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１０８１−１０８５（１９８９））。標的残基の残基または基は、特定され（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、およびｇｌｕ等の帯電残基）、さらに中性または負に帯電したアミノ酸（最も好ましくはアラニンまたはポリアラニン）により置換され、アミノ酸と抗原との相互作用に影響を与える。次に、置換に対する機能的感受性を示すこれらのアミノ酸位置が、追加のまたは他の変異体を置換部位に、または置換用に導入することにより、精密化される。
【０３９７】
コンピュータ支援設計−あるいは、またはさらに、抗原−抗体複合体の結晶構造を分析し、抗体と抗原の間の接触点を特定する、またはコンピュータソフトウェアを使って、このような接触点のモデル化をすることは有益であろう。このような接触残基および隣接残基は、本明細書で詳述される技術による置換の候補である。このような変異体が生ずるとすぐに、変異体パネルは、本明細書記載の選別に供され、１つまたは複数の関連アッセイにおける優れた特性の抗体が、さらなる展開のために選択できる。
【０３９８】
医薬組成物の製剤
本発明のポリペプチド結合剤をヒトまたは試験哺乳動物に投与するために、ポリペプチド結合剤を１つまたは複数の無菌の薬学的に許容可能な担体を含む無菌の組成物に処方するのが好ましい。語句の「薬学的または薬理学的に受容可能な」は、下記に示すような当技術分野でよく知られた経路を使って投与する場合、アレルギー性、または他の有害反応を生じない分子実体および組成物を指す。「薬学的に許容可能な担体」には、いずれか、および全ての臨床的に使用できる溶剤、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張性および吸収遅延剤、等が含まれる。
【０３９９】
ポリペプチド結合剤は、非経口、皮下、腹腔内、肺内、および鼻腔内、ならびに、局所治療のために所望なら、病巣内投与、を含むいずれかの適切な手段により登用される。非経口注入には、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮内または皮下投与、が含まれる。好ましくは、投薬は、１つには、投与が短期か慢性かにも依存するが、注射、最も好ましくは静脈内または皮下注射、により与えられる。局所的、特に経皮、経粘膜的、直腸、経口または、例えば、所望の部位近くに置かれたカテーテルによる局所投与、を含む他の投与方法も、意図されている。
【０４００】
本発明のポリペプチド結合剤を有効成分として含む本発明の医薬組成物は、投与経路に応じて、無菌の薬学的に許容可能な担体または添加物を含むことができる。このような担体または添加物の例には、水、薬学的に受容可能な有機溶媒、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、ナトリウムアルギナート、水−可溶のデキストラン、カルボキシメチルデンプンナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンゴム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、薬学的に許容可能な界面活性剤、等が挙げられる。使用される添加物は、これに限定されないが、必要に応じ、また本発明の剤形に応じて、上記またはこれらの組み合わせから選択される。溶液または乳剤に対しては、適切な担体には、例えば、食塩水および緩衝溶媒を含む、水溶液またはアルコール／水の溶液、乳剤または懸濁液、が挙げられる。非経口の賦形剤には、塩化ナトリウム溶液、デキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウムリンゲル液、乳酸リンゲル液または不揮発性油を含むことができる。静脈内用賦形剤には、種々の添加物、防腐剤、または体液、栄養素または電解質補充液を含むことができる。種々の水性担体、例えば、無菌のリン酸塩緩衝食塩水溶液、静菌性水、水、緩衝水、０．４％食塩水、０．３％グリシン、等のが適切で、安定性向上のための他のタンパク質、例えば、軽く化学的修飾、等を受けたアルブミン、リポタンパク質、グロブリン、等、を含んでもよい。
【０４０１】
ポリペプチド結合剤の治療用製剤は、所望の純度のポリペプチド結合剤を、任意選択の凍結乾燥した製剤または水溶液の形態の生理学的に受容可能な担体、賦形剤または安定剤（「レミントンの薬学」第１６版、Ｏｓｏｌ、Ａ．Ｅｄ．（１９８０））、と混合して、貯蔵用として調製される。受容可能な担体、賦形剤、または安定剤は、用いられる用量と濃度でレシピエントに非毒性であり、次のものが含まれる：リン酸塩、クエン酸塩、スクシナートおよび他の有機酸、等の緩衝剤；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンザルコニウムクロリド、ベンゼトニウムクロリド；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルまたはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール、等）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン；親水性高分子、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリシン；単糖類、二糖類、およびグルコース、マンノース、またはデキストリンを含む他の炭水化物；キレート化剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖、例えば、ショ糖、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール；塩成形対イオン、例えば、ナトリウム；金属複合体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）；および／または非イオン性界面活性剤、例えば、ツイーン（登録商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）。
【０４０２】
また、有効成分は、例えば、コアセルベーション技術または界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えば、コロイド状薬剤デリバリーシステム（例えば、リポソーム、アルブミン微粒子、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）またはマクロエマルジョン中の、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ（メチルメタシラート）マイクロカプセル、中に封入することもできる。このような技術は、「レミントンの薬学」第１６版、Ｏｓｏｌ、Ａ．Ｅｄ．（１９８０）、で開示されている。
【０４０３】
インビボ投与に使われる製剤は、無菌でなければならない。これは、無菌濾過膜を使った濾過により、容易に達成できる。
【０４０４】
水性懸濁液は、水性懸濁液の製造に適した賦形剤との混合物中に活性化合物を入れることができる。このような賦形剤は、懸濁剤、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムアルギナート、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴムおよびアカシアゴムである；分散剤または湿潤剤は、天然ホスファチド、例えば、レシチン、またはアルキレン酸化物と脂肪酸の縮合物、例えば、ステアリン酸ポリオキシエチレン、またはエチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールの縮合物、例えば、ヘプタデカエチル−エネオキシセタノール、またはエチレンオキシドと脂肪酸由来の部分エステルの縮合物およびヘキシトール、例えば、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレアート、またはエチレンオキシドと脂肪酸由来の部分エステルの縮合物およびヘキシトール無水物、例えば、ポリエチレンソルビタンオレイン酸モノエステル、であってもよい。また、水性懸濁液は、１つまたは複数の防腐剤、例えば、エチル、またはｎ−プロピル、ｐ−ヒドロキシベンゾアートを含んでもよい。
【０４０５】
本発明の抗体は、貯蔵用に凍結乾燥され、使用の前に、適切な担体中で再構成される。この技術は、従来の免疫グロブリンで有効であることが明らかになった。任意の適切な凍結乾燥および再構成技術が使用できる。凍結乾燥および再構成は、程度の差はあれ、抗体活性の減少をもたらし、これを補償するために、使用量の調製が必要であることは、当業者なら理解するであろう。
【０４０６】
水添加による水性懸濁液の調製に適した分散可能な粉末および粒剤は、分散剤または湿潤剤、懸濁剤および１つまたは複数の防腐剤を含んだ混合物中に入った活性化合物として提供される。適切な分散剤または湿潤剤および懸濁剤は、すでに上で例示されている。
【０４０７】
これらの製剤中のポリペプチド結合剤の濃度は、広範に、例えば、重量で、約０．５％未満から、通常は、１％または少なくとも約１％から１５または２０％まで、変えることができ、主に、液量、粘度、等、特定の選択投与モードに応じて、選択される。従って、非経口の注射用の典型的な医薬組成物は、１ｍｌ無菌緩衝水、および５０ｍｇのポリペプチド結合剤を含むように作ることができる。静脈内注入用の典型的組成物は、２５０ｍｌの無菌リンゲル溶液、および１５０ｍｇのポリペプチド結合剤を含むように作ることができる。実際の非経口投与可能組成物の調製方法は、当業者には既知または明らかであると思われ、また、例えば、「レミントンの薬学」第１５版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．（１９８０）にさらに詳細に記載されている。ポリペプチド結合剤の効果的投与量は、１ｋｇ体重、１投与あたり０．０１ｍｇ〜１０００ｍｇの範囲である。
【０４０８】
医薬組成物は、無菌注射可能溶液または分散液の即時調製用の無菌の注射可能水性、油性の懸濁液、分散液または無菌粉末の形態であってもよい。懸濁液は、上述のこれらの適切な分散剤または湿潤剤および懸濁剤を使った既知の技術により処方できる。無菌の注射可能製剤は、また、無毒の非経口的に許容可能な希釈剤または溶媒中の、例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液としての、無菌の注射可能溶液または懸濁液であってもよい。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセリン、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール、等）、適切なこれらの混合物、植物油、リンゲル溶液および等張性塩化ナトリウム溶液を含む溶媒または分散媒であってもよい。さらに、無菌の、不揮発性油は、溶媒または懸濁剤として、従来法で採用されている。この目的のために、合成モノまたはジグリセリドを含む、任意のブランドの不揮発性油が採用可能である。さらに、オレイン酸、等の脂肪酸は、注射剤の製剤に使用される。
【０４０９】
全ての場合で、形態は無菌でなければならず、また、容易に注射できる特性（ｅａｓｙ  ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）がある程度に流動性がなければならない。固有の流動度は、例えば、レシチン等によるコーティングの使用により、分散の場合には必要粒形の維持により、また、界面活性剤の使用により、維持できる。製造および貯蔵の条件下安定でなければならず、また、細菌および真菌、等の微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。微生物の作用の予防は、種々の抗菌薬および抗真菌薬、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール、等、により行うことができる。多くの場合、等張性試薬、例えば、糖または塩化ナトリウム、を含むことが望ましい。注射可能組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる試薬、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン、を含む組成物の使用により達成できる。
【０４１０】
投与に有用な組成物は、取り込みまたは吸収増強剤と共に処方し、その有効性を増加させることができる。このようなエンハンサーには、例えば、サリチル酸塩、グリココラート／リノレアート、グリコラート、アプロチニン、バシトラシン、ＳＤＳ、カプラート、等が含まれる。例えば、Ｆｉｘ（Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．、８５：１２８２−１２８５（１９９６））およびＯｌｉｙａｉ  ａｎｄ  Ｓｔｅｌｌａ（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．、３２：５２１−５４４（１９９３））を参照のこと。
【０４１１】
生物物理学的アッセイ
複合体生物学的イベントは、それらを統計力学、熱力学および化学反応速度論の観点から理解される相互作用ユニットの系とみなす分子生物物理学的手法を介して調査できる。
【０４１２】
特定の実施形態では、本発明のアッセイは、検出可能成分を用いることができる。検出可能成分は、検体中の結合した検出可能成分または標識の定量に使用可能な、直接、間接的に測定可能なシグナル、例えば、放射性、発色性、発光、蛍光シグナル、を生成できるいずれか１つであってもよい。当技術分野で既知の検出可能標識には、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、または１２５Ｉ、等の放射性同位元素、電気化学発光標識（基体に結合したルテニウム（Ｒｕ）ベース触媒、等）、発光または生物発光標識（例えば、ユウロピウム、バナジウム）、蛍光または、フルオレセインイソチオシアナート、ローダミン、またはルシフェリン等の化学発光化合物、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはセイヨウワサビペルオキシダーゼ、等の酵素）、コロイド状金、着色ガラスまたはプラスチックビーズ（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックス、等）等の比色分析標識、常磁性原子または磁性試薬、高電子密度試薬、蛍光染料含有ナノまたはミクロビーズ、ナノ結晶、量子ドット、量子ビーズ、ナノタグ、蛍光標識を持ったデンドリマー、マイクロトランスポンダ−、電子ドナー分子もしくは分子構造、または光反射粒子、が含まれる。微粒子は、ナノ結晶または量子ドットであってもよい。ナノ結晶は、光のフォトンを吸収し、次いで、異なる波長でフォトンを再放射する物質である（フルオロフォア）。さらに、別の蛍光標識、または二次抗体を、ナノ結晶に複合化可能である。ナノ結晶は、市販品としてインビトロゲンやＥｖｉｄｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｔｒｏｙ、Ｎ．Ｙ．）から入手可能である。他の標識には、（Ｅ）−５−［２−（メトキシカルボニル）エテニル］シチジンがあり、これは、非蛍光分子であるが、紫外線（ＵＶ）照射を受けて強力な蛍光シグナルを出す生成物の３−β−Ｄ−リボフラノシル−２，７−ジオキソピリド［２，３−ｄ］ピリミジンが得られる。バーコード標識は、米国公開特許公報ＵＳ２００７００３７１９５に記載がある。
【０４１３】
競合的結合アッセイ、直接、間接的サンドイッチ法、免疫沈降アッセイ、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、電気免疫測定法、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）、およびナノ粒子由来技術（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）等の当技術分野で既知の種々のアッセイ方法が本発明に採用可能である。
【０４１４】
競合的結合アッセイは、標識標準（例えば、ポリペプチド結合剤が結合する抗原またはその断片）の、試験検体中の抗原とのポリペプチド結合剤に対する結合に関し競合する能力に依存する。試験検体中の抗原の量は、抗体と結合する標準の量に逆比例する。結合している標準の量の測定を促進するため、結合している抗原が非結合抗原から容易に分離できるように、抗体は、通常、競合の前、または後で不溶化される。別の実施形態では、競合的結合アッセイで、標識ポリペプチド結合剤の非標識ポリペプチド結合剤との抗原またはその断片に対する結合に関し、競合する能力が測定される。
【０４１５】
サンドイッチ法には、通常、それぞれが、検出されるおよび／または定量されるタンパク質の異なる免疫原性部分、またはエピトープに結合できる２つの抗体の使用が含まれる。サンドイッチ法では、検体中の分析物は、通常は、固相に固定化されている第１のポリペプチド結合剤に結合され、その後、第２のポリペプチド結合剤が分析物に結合し、その結果、３つの部分により構成される不溶性の複合体が形成される。例えば、米国特許第４，３７６，１１０号を参照。第２のポリペプチド結合剤は、それ自身、検出可能成分で標識して（直接サンドイッチ法）、または検出可能成分で標識した抗免疫グロブリン抗体を使って（間接サンドイッチ法）測定できる。例えば、１つのタイプのサンドイッチ法は、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）で、この場合、検出可能成分が酵素である。例えば、「分子生物学の最新プロトコル」１８章、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、ｅｄｓ．、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ（１９９５）、を参照のこと。
【０４１６】
アッセイ方法さらに他の例には、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）発光がある。例えば、１つの化合物をＦＲＥＴドナー分子で標識付けし、その結合相手をＦＲＥＴレセプター分子で標識付けする、等。結合相手間に結合が生じると、ＦＲＥＴドナーとＦＲＥＴレセプター分子は、近接状態になり、ある特定の波長で蛍光を発光する。狭帯域フィルターを使って、標識の波長以外の全ての波長を遮断することができる。ＦＲＥＴ分子対は、当技術分野で市販品として入手可能であり（例えば、インビトロゲンから）、メーカーのプロトコルに従って使用できる。ＦＲＥＴ発光は、ＣＣＤカメラ等の光学的画像処理技術を使って検出される。
【０４１７】
アッセイ方法のさらに別の例には、例えば、ＷＯ／０６／０８６８８３に記載のバイオセンサーを使った、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）がある。
【０４１８】
別のタイプのアッセイには、電子ドナーによる標識化が含まれる。１つの分子が電子ドナーで標識付けされ、相互作用分子が電気接点に結合される、等。結合相手間に結合が起こると、標識は、電気接点に電子を与える。例えば、Ｇｈｉｎｄｉｌｉｓ、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  Ｔｒａｎｓ．２８：８４−９、（２０００）およびＤａｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔ  Ｐｒｅｖ．２９：２３３−４０（２００５）、を参照。この文献は、電気免疫測定の方法について記載している。次に、電子接触がＡからＤ（アナログからデジタル）への変換器により読み取られ、定量される。電子カウントが多ければ多いほど、多くの相互作用が起きたことになる。
【０４１９】
単一分子検出の可能な標識の一実施形態は、光学的レポーターとしてのプラズモン共鳴粒子（ＰＲＰ）の使用である。この方法は、Ｓｃｈｕｌｔｚ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９７：９９６−１００１（２０００）に記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。ＰＲＰは、金属のナノ粒子、例えば、直径４０〜１００ｎｍで、金属中の伝導電子の集団共鳴のために光を散乱する（すなわち、表面プラズモン共鳴）。ナノ粒子に関連したプラズモン共鳴の振幅、ピーク波長、およびスペクトルバンド幅は、粒子のサイズ、形、および材料組成、ならびに局所環境に依存する。調製中にこれらのパラメーターを動かすことにより、ＰＲＰは、可視範囲のどこかにスペクトルの散乱ピークを持つように作ることができる。球状のＰＲＰに対しては、ピーク散乱波長と散乱効率の両方が半径の増加と共に増加し、異なった色の標識を作る手段を提供している。例えば、銀色の球の集団が、調製中に球の最終半径を調節することにより、ピーク散乱波長が目的波長の数ナノメーター以内に入るように、再現性よく調製可能である。ナノサイズでもＰＲＰは明るいので、単一分子検出用の指標として使われる；すなわち、視野内の結合ＰＲＰの存在は、単一結合イベントを示している可能性がある。表面プラズモン共鳴法検出器システムの例は、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイシステムである。例えば、Ｍａｌｍｑｕｉｓｔ、Ｊ  Ｍｏｌｅｃ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ、７：１−７（１９９４）を参照のこと。
【０４２０】
分子相互作用は、また、ナノ粒子由来技術を使って検出できる。例えば、金ナノ粒子消光について記載のＡｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ．７８：１１０４−６（２００６）；抗体検出におけるＳｉＯ（２）／Ａｕナノ粒子界面について記載のＴａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｓｅｎｓ  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．２００５  Ｎｏｖ  ３０；および、固体基質室温リン光イムノアッセイ（ＳＳ−ＲＴＰ−ＩＡ）での使用のためのジブロモフルオレセインを含むシリコンジオキシドナノ粒子について記載のＬｉｅｕ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．３０７：３４−４０（２００５）、を参照のこと。
【０４２１】
ＫｉｎＥｘＡアッセイ（結合平衡除外法）も、また、抗原に対する調節抗体の親和性を測定するのに有用である。代表的ＫｉｎＥｘＡアッセイは、実施例２０に記載されている。例えば、ＫｉｎＥｘＡアッセイでは、細胞培地中の非常に低いレベルのリガンドを測定できる。このアッセイは、細胞培地のリガンド欠乏レベルを測定することにより、同族受容体を発現している細胞に対するリガンドの結合の測定を可能にする。リガンドが細胞に結合するに従い、細胞培地中のリガンドの濃度が低下する。受容体を発現している細胞の滴定を使って、遊離リガンドの割合を測定することにより、ＫｉｎＥｘＡソフトウェア（Ｓａｐｉｄｙｎｅ、Ｂｏｉｓｅ  ＩＤ）を使って、リガンド−受容体相互作用の親和性が評価される。このアッセイは、種々の抗受容体抗体によって示されるリガンド結合活性の調節度合を測定するために使用される。
【０４２２】
１つまたは複数の第１成分、第２成分およびポリペプチド結合剤が溶液になっている場合のアッセイで、または１つまたは複数の第１成分、第２成分およびポリペプチド結合剤が固相に結合している（共有結合でまたは非共有結合で）場合のアッセイで、または１つまたは複数の第１成分、第２成分およびポリペプチド結合剤が細胞表面上に発現している場合のアッセイで、前記のいずれかの結合親和性または結合速度パラメーターの測定を実行することができる。第１および／または第２成分は、それぞれ、それ自体が複数の化合物の複合体であってもよい。
【０４２３】
投与法および用量
一態様では、本発明の方法は、医薬組成物を投与する工程を含む。
【０４２４】
本発明の方法を、治療薬を哺乳動物対象に直接または間接的に導入するために、これに限定されないが、注射、経口摂取、鼻腔内、局所的、経皮、非経口、吸入噴霧、腟、または直腸の投与、を含む、医学的に受容可能ないずれかの手段を使って行った。本明細書で使われる用語の非経口には、皮下、静脈内、筋肉内、および嚢内注射、ならびにカテーテルまたは注入法が含まれる。皮内、乳腺内、腹腔内、鞘内、眼球後、肺内注射および／または特定の部位での外科的移植、による投与も同様に意図されたている。適切な送達装置には、インスリンの送達用に開発されたものも含むことができる（例えば、Ｏｗｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ  Ｄｉａｂｅｔｉｃ  Ｍｅｄ．２０（１１）：８８６−８９８、２００３、を参照）。
【０４２５】
一実施形態では、部位への直接注射により、または製剤を内部に送達できる持続送達または徐放機序を介して、治療が必要な癌の部位または罹患した組織に投与が行われる。例えば、組成物（例えば、可溶のポリペプチド、抗体、または小分子）の持続送達できる生分解性微粒子またはカプセル剤または他の生分解性高分子形態も、部位に埋め込まれた本発明の製剤に含むことができる。
【０４２６】
治療用組成物は、また、対象の複数部位に対して送達できる。複数の投与を同時に行うことができ、また、ある期間にわたって投与できる。特定の場合では、治療組成物を連続的流れで提供することが有益である。別の治療では、ある期間をベースに、例えば、毎時間、毎日、毎週、２週毎に、３週毎に、または毎月、投与できる。
【０４２７】
また、本発明では、本明細書記載のように第２の試薬と併せた抗体組成物、等の複数の試薬の投与が意図されている。
【０４２８】
所与の投与量中の抗体組成物の量は、治療薬が投与される予定の個体の大きさ、ならびに治療される障害の特性に応じて変化する。代表的は治療では、約１ｍｇ／日、５ｍｇ／日、１０ｍｇ／日、２０ｍｇ／日、５０ｍｇ／日、７５ｍｇ／日、１００ｍｇ／日、１５０ｍｇ／日、２００ｍｇ／日、２５０ｍｇ／日、５００ｍｇ／日または１０００ｍｇ／日を投与することが必要となり得る。これらの濃度は、単一剤形として、または複数の１回量に分けて投与することができる。最初は動物モデルで、次に臨床試験での標準的用量−反応試験により、特定の疾患状態および対象集団に対する最適投与量が明らかになる。
【０４２９】
併用療法
一実施形態では、本発明の抗体は、本明細書記載の疾患または障害の治療に有用な第２の試薬と共に投与される。抗体を一緒に組み合わせることにより、標的ポリペプチドで治療される状態または障害に対するさらに改善された効力を提供するように、標的抗原の異なるエピトープに対する２つ以上の抗体を混合できることが意図されている。１つまたは複数の本発明の抗体を含む組成物は、標的ポリペプチドで治療される状態または障害に罹っている、または罹りやすいヒトまたは哺乳動物に投与できる。
【０４３０】
２つの治療薬の同時投与は、試薬がその治療効果を発揮する間の時間内に時間的オーバーラップがある限り、試薬が同じ時間、または同じ経路で投与される必要はない。同時また逐次投与は、異なる日または週の投与が意図されている。
【０４３１】
第２の試薬は、抗糖尿病薬、サイトカイン、増殖因子、他の抗炎症性薬、抗血液凝固薬、血圧を低下または減らす試薬、コレステロール、トリグリセリド、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、もしくはリポタンパク質（ａ）またはＨＤＬを増やす試薬、コレステロール調節タンパク質のレベルを増加または減少させる試薬、抗腫瘍性薬剤もしくは分子、等の他の治療薬であってもよい。過剰増殖障害、例えば、癌または腫瘍、の対象に対しては、放射線療法、化学療法、光線力学的治療、または手術、等の第２の治療方法との組み合わせも意図されている。
【０４３２】
代表的抗糖尿病薬には、次のものが含まれるが、これに限定されない：１）スルホニル尿素（例えば、グリメピリド、グリセンチド、スルホニル尿素、ＡＹ３１６３７）；２）ビグアナイド（例えば、メトホルミン）；３）αグルコシダーゼ阻害剤（例えば、アカルボース、ミグリトール）；４）チアゾリジンジオン（例えば、トログリタゾン、ピオグリタゾン、ロシグリタゾン、グリピジド、バラグリタゾン、リボグリタゾン、ネトグリタゾン、トログリタゾン、エングリタゾン、ＡＤ５０７５、Ｔ１７４、ＹＭ２６８、Ｒ１０２３８０、ＮＣ２１００、ＮＩＰ２２３、ＮＩＰ２２１、ＭＫ０７６７、シグリタゾン、アダグリタゾン、ＣＬＸ０９２１、ダルグリタゾン、ＣＰ９２７６８、ＢＭ１５２０５４）；５）グルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ）およびＧＬＰ類似体またはＧＬＰ−１受容体のアゴニスト（例えば、エキセンディン）またはその安定剤（例えば、シタグリプチン等のＤＰＰ４阻害剤）；ならびに６）インスリンまたは類似体もしくはその模倣剤（例えば、ＬＡＮＴＵＳ（登録商標））。
【０４３３】
本発明の抗体および第２の試薬は、同時に同じ製剤で与えられることが意図されている。さらに、試薬は、別の製剤で投与され、また、同時に投与されることも意図されている（同時とは、相互の試薬が３０分以内に投与されることを指す）。
【０４３４】
別の態様では、第２の試薬は、抗体組成物の投与の前に投与される。投与の前とは、抗体を使った治療の１週間前から抗体投与の３０分前までの範囲内の第２の試薬の投与を指す。さらに、第２の試薬が、抗体組成物の投与の後で投与されることも意図されている。後の投与は、抗体治療後３０分から抗体投与後１週間までの投与を意味する。
【０４３５】
さらに、適切であれば、他の補助治療薬が投与されてもよいことも意図されている。例えば、対象は、適切な糖尿病性食事または食物プラン、外科的治療、または照射治療を受けてもよい。
【０４３６】
従来の治療薬が本発明の治療薬と組み合わせて投与される場合、投与量が変わりうることも明らかであろう。
【０４３７】
使用方法
ＩＮＳＲアゴニスト／正のモジュレーター治療薬の効能
別の実施形態では、本発明は、それを必要としている対象に標的特異的抗体を投与することにより標的活性を阻害する方法を提供する。いずれのタイプの本明細書記載の抗体も、使用可能である。代表的実施形態では、標的特異的抗体は、ヒト、キメラまたはヒト化抗体である。別の代表的実施形態では、標的はヒトであり、対象はヒトの対象である。あるいは、対象は、標的特異的抗体が交差反応する標的タンパク質を発現している哺乳動物であってもよい。抗体は、獣医学的目的で、またはヒトの疾患の動物モデルとして、抗体が交差反応する標的タンパク質を発現している非ヒト哺乳動物（すなわち、霊長類）に投与してもよい。このような動物モデルは、本発明の標的特異的抗体の治療効力を評価するために有用でありうる。
【０４３８】
インスリン抵抗性は、生理的な量のインスリンでは、細胞または組織から正常なインスリン応答を生成するのに不十分である状態を言い表す。インスリン抵抗性は、多くの疾病状態及び容態に関係し、非糖尿病性個体の約３０〜４０％に存在する。これらの疾病状態及び容態には、これに限定されないが、糖尿病前症、代謝症候群（インスリン抵抗性症候群とも呼ばれる）、２型糖尿病、多嚢胞性卵巣症候群（ＰＣＯＳ）および非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）（Ｗｏｏｄｓ  ｅｔ  ａｌ、Ｅｎｄ、Ｍｅｔａｂ  ＆  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ-Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ９：１８７−１９８、２００９、に概説がある）、が含まれる。
【０４３９】
糖尿病前症は、耐糖能障害（ＩＧＴ）または空腹時血糖異常（ＩＦＧ）を特徴とする耐糖能異常の状態である。糖尿病前症の対象は、インスリン抵抗性であり、顕性２型糖尿病にさらに進行する危険が高い。代謝症候群は、関連形質群であり、これに限定されないが、高インスリン血症、耐糖能異常、肥満症、腹部または上半身部分への脂肪の再分布、高血圧症、線維素溶解不全（ｄｙｓｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ）、ならびに高トリグリセリド、低ＨＤＬコレステロール、および小形緻密ＬＤＬ粒子を特徴とする脂質異常症が含まれる。インスリン抵抗性は、各形質に結びついており、代謝症候群とインスリン抵抗性は、相互に密接に関連していることを示唆している。代謝症候群という診断は、２型糖尿病が将来進展する高いリスクを示すものであり、また、心臓発作、脳卒中、および末梢血管疾患の原因となるアテローム性動脈硬化が加速されている結果である。
【０４４０】
真性糖尿病は、ヒトの代謝障害で、有病率は、母集団中の約１％である（Ｆｏｓｔｅｒ、Ｄ．Ｗ．、「ハリソン内科学」、１１４章、ｐｐ．６６１−６７８、第１０版、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。疾患は、それ自体、最終的に、眼、腎臓、神経、および血管を含むいくつかの器官系に関連する、重篤な、長期的および消耗性の合併症につながる一連のホルモン誘導代謝異常として現れる。病理学的には、疾患は、電子顕微鏡下で実証可能な基底膜の病変を特徴とする。真性糖尿病は、２つの臨床的症候群、１型および２型糖尿病に分けることができる。
【０４４１】
１型、またはインスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）は、若年性開始型とも呼ばれ、慢性自己免疫疾患で、インスリンを産生するランゲルハンス島中のベータ細胞の大幅な減少を特徴とする。これらの細胞は、漸進的に破壊されるので、分泌インスリンの量は減少し、分泌インスリンの量が正常な血糖値に必要な量未満に低下すると、最終的に、高血糖（血液中の異常に高いレベルのグルコース）の原因となる。この免疫応答に対する明確なトリガーはわかっていないが、ＩＤＤＭの対象は、膵臓ベータ細胞中で発現したタンパク質に対する高いレベルの抗体を有する。しかし、高いレベルのこれらの抗体を有する全ての対象が、ＩＤＤＭを発症するとは限らない。１型糖尿病対象は、特徴的に、増大したグルカゴンと共に、非常に低いまたは測定不能レベルの血漿インスリンを示す。明確な病因学が何であれ、大抵の１型対象は、インスリンに対する抗体、ランゲルハンス島細胞の細胞質に対する抗体原、および酵素グルタミン酸デカルボキラーゼに対する抗体を含む、自らの膵臓細胞を標的にした循環抗体を有する。ベータ細胞（インスリン産生細胞）を特異的に標的にした免疫応答は、１型糖尿病につながる。１型糖尿病対象に対する現行の治療は、インスリンの注射であり、また、ベータ細胞障害が原因の天然インスリンの欠乏により生じた高血糖を最小限にするための、食事の改善も含まれる。また、食事は、ホルモンの低血糖効果を相殺するために、インスリン投与に関しても改善される。
【０４４２】
２型糖尿病（非インスリン依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）、成人（ｍａｔｕｒｉｔｙ）発症型、成人（ａｄｕｌｔ）発症型とも呼ばれる）は、筋肉、脂肪および肝臓細胞がインスリンに対し正常に反応しない場合に発症する。この反応に対する失敗（インスリン抵抗性と呼ばれる）は、これらの細胞上のインスリン受容体数の減少、または細胞内のシグナル伝達経路の機能不全、またはこれらの両方に起因する可能性がある。ベータ細胞は、最初、インスリン産生を増やすことにより、このインスリン抵抗性を補償する。時間とともに、これらの細胞は、正常なグルコース値を維持するのに十分なインスリンを産生できなくなり、２型糖尿病への進行を示す。２型糖尿病は、高脂肪食、運動不足、および老化を含む、遺伝および獲得リスク因子の組み合わせにより引き起こされる。糖尿病性集団の９０％超が、２型糖尿病に罹患し、発生率は上昇し続け、世界中の死亡率、罹患率および保健医療費の主要な原因になりつつある（Ａｍｏｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｄｉａｂｅｔｉｃ  Ｍｅｄ．１４：Ｓ１−８５、１９９７）。
【０４４３】
２型糖尿病は、グルコースと脂質代謝における欠陥を特徴とする多因子疾患である。典型的には、空腹時血漿グルコース値、遊離脂肪酸レベルおよびトリグリセリドレベルの増加、ならびにＨＤＬ／ＬＤＬの比率の減少を含む多くの代謝パラメータの変動がある。前に考察したように、糖尿病の主要な根本原因の１つは、末梢組織、主に筋肉と脂肪、中のインスリン抵抗性の増加であると考えられる。２型糖尿病の原因は、よくわかっていない。インスリンの作用に対する標的組織の抵抗およびインスリン分泌の減少（「β細胞機能不全」）の両方が起こると考えられている。グルコース恒常性のための主要インスリン応答性組織は、肝臓であり、そこで、インスリンがグリコーゲン合成を刺激し、糖新生を阻害する；また、筋肉であり、そこで、インスリンがグルコース取り込みを刺激し、さらにグリコーゲンがグルコース取り込みを刺激し、脂肪分解を阻害する。従って、糖尿病性状態の結果として、血液中に高いレベルのグルコースがあり、それがグルコース媒介細胞毒性およびその後の罹患（腎障害、神経障害、網膜症、等）の原因となる可能性がある。インスリン抵抗性は、２型糖尿病の発症と相関性が強い。
【０４４４】
最近、種々の２型糖尿病の薬理学的治療手法が登場している（Ｓｃｈｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ、２２（９）：１５６８−１５７７、１９９９；Ｚａｎｇｅｎｅｈ  ｅｔ  ａｌ、Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎ．Ｐｒｏｃ．７８：４７１−４７９、２００３；Ｍｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ、Ｍｅｄ  Ｒｅｓ  Ｒｅｖ  ２９（１）：１２５−１９５、２００９）。それらは、異なる作用様式を経由して作用する：１）スルホニル尿素（例えば、グリメピリド、グリセンチド、スルホニル尿素、ＡＹ３１６３７）は、基本的にインスリン分泌を刺激する；２）ビグアナイド（例えば、メトホルミン）は、グルコース利用を促進して、肝臓グルコース産生を減らし、腸のグルコース産生量を減らすことにより作用する；３）αグルコシダーゼ阻害剤（例えば、アカルボース、ミグリトール）は、炭水化物消化、および結果的に腸からの吸収を減速させ、食後の高血糖を低減する；４）チアゾリジンジオン（例えば、トログリタゾン、ピオグリタゾン、ロシグリタゾン、グリピジド、バラグリタゾン、リボグリタゾン、ネトグリタゾン、トログリタゾン、エングリタゾン、ＡＤ５０７５、Ｔ１７４、ＹＭ２６８、Ｒ１０２３８０、ＮＣ２１００、ＮＩＰ２２３、ＮＩＰ２２１、ＭＫ０７６７、シグリタゾン、アダグリタゾン、ＣＬＸ０９２１、ダルグリタゾン、ＣＰ９２７６８、ＢＭ１５２０５４）は、インスリン作用を高め、結果として、末梢組織中のグルコース利用を促進する；５）グルカゴン様ペプチドおよびアゴニスト（例えば、エキセンディン）またはその安定剤（例えば、シタグリプチン等のＤＰＰ４阻害剤）は、グルコース刺激性インスリン分泌を増強する；さらに６）インスリンまたはその類似体（例えば、ＬＡＮＴＵＳ（登録商標））は、組織のグルコース利を刺激し、肝臓グルコース生産を阻害する。上述の薬理学的手法は、それぞれに、または併用療法として利用可能である。しかし、各手法は、限界と有害作用がある。高い比率の２型糖尿病対象で、時間経過と共に、これらの試薬に対する反応がなくなる。６３％の２型糖尿病対象が、グローバルＨｂＡ１ｃレベル＜７％（米国糖尿病協会の勧告値）が到達できず、その結果、合併症を発症する危険性が高い。さらに、ほとんどいつでも、対象は、膵臓機能の減退ステージ経て病気が進行していく。インスリン治療は、通常は、食事、運動後開始され、経口投薬は、適切に血糖をコントロールするのに失敗した。インスリン治療の欠点は、薬剤注射の必要なこと、低血糖になる可能性があること、および体重増である。従って、未だ、新規抗糖尿病薬に対する緊急の必要性がある。
【０４４５】
Ｓｃｈａｆｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．は、ファージディスプレイを使って、ＩＮＳＲ上の２つの離れたホットスポットに対する一連のペプチド結合を特定した。これらは、共有結合によりホモダイマーまたはヘテロダイマーを形成する場合、アゴニストまたはアンタゴニスト活性を示した（Ｓｃｈaｆｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１００（８）：４４３５−４４３９、２００３）。
【０４４６】
２型糖尿病治療用のさらなる薬理学的手法は、ＩＮＳＲを活性化できる、またはＩＮＳＲ活性化をインスリンにより強化できる非ペプチド小分子の使用である（Ｍｏｌｌｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ  ４１４：８２１−８２７）。このような分子は、特定するのに捕まえにくいことがわかったが、２つのグループが例を報告しＬ７８３２８１（ＤＭＡＱ−Ｂ１、Ｌ７）、その誘導体、化合物２は、ＩＮＳＲチロシンキナーゼを活性化する小分子の選別から特定されたインスリン模倣剤である（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ、Ｓｃｉｅｎｃｅ２８４：９７４−９７７、１９９９；Ｑｕｒｅｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５（４７）：３６５９０−３６５９５、２０００）。ＴＬＫ１６９９８およびＴＬＫ１９７８０は、単離された、天然に発現したヒトＩＮＳＲの自己リン酸化を増加させる能力により特定されたインスリン感作物質である（Ｍａｎｃｈｅｍ  ｅｔ  ａｌ、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５０：８２４−８３０、２００１；Ｐｅｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７（４６）：４３５６５−４３５７１、２００２）。Ｌ７８３２８１およびＴＬＫ１６９９８の両方は、ＩＮＳＲ  β−サブユニットの細胞内の部分に作用し、β−サブユニットの自己リン酸化、および続く下流シグナル伝達を強化することにより、インスリン抵抗性細胞でのインスリン作用を増強する（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５０：２３２３−２３２８、２００１）。化合物２およびＴＬＫ１６９９８は、高用量で連続的に投与された場合、糖尿病のマウスモデルの血糖値を下げることが示された（Ｓｔｒｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４５（１１）：５２５９−５２６８、２００４；Ｍａｎｃｈｅｍ  ｅｔ  ａｌ、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５０：８２４−８３０、２００１）。しかし、これらの化合物のいずれも、臨床試験にはいっていないように見える。ＩＮＳＲチロシンキナーゼドメインを標的にする試薬は、他の分子の非特異的活性化相同性チロシンキナーゼドメインによる副作用があることが予測される。ＩＮＳＲβ−サブユニットの細胞内の部分は、抗体のような、細胞中への拡散ができない大きな分子にとって適切な標的ではない。
【０４４７】
インスリン抵抗性糖尿病対象の血清由来のポリクローナル自己抗体が特定され、インスリン作用を調査するためにプローブとして使われる。インビトロで組織に曝した場合、これらの自己抗体は、ＩＮＳＲへのインスリン結合を阻害し、二価の（一価ではない）型が、インスリン様生物学的影響をもたらした（Ｋａｈｎ  ｅｔ  ａｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７５（９）：４２０９−４２１３、１９７８；Ｈｅｆｆｅｔｚ  ａｎｄ  Ｚｉｃｋ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１（２）：８８９−８９４、１９８６）。
【０４４８】
Ｊａｃｏｂｓ  ａｎｄ  Ｃｕａｔｒｅｃａｓａｓは、２つのウサギポリクローナル抗体について記載し、報告した。他の研究者によって作られた、これらの抗体、ならびに多くのポリクローナル抗体が、種々のインスリン様効果を媒介することができる（Ｊａｃｏｂｓ  ａｎｄ  Ｃｕａｔｒｅｃａｓａｓ、ＣＩＢＡ  Ｆｏｕｎｄ．Ｓｙｍｐ．９０：８２−９０、１９８２）ことを報告した。
【０４４９】
Ｋｕｌｌ  ｅｔ  ａｌは、３つのマウスモノクローナル抗体、αＩＲ−１、αＩＲ−２およびαＩＲ−３ならびにポリクローナル、Ａ４１０、および、インスリンおよびソマトメジンＣ（ＩＧＦ−１）受容体の免疫化学的交差反応性を調査するため、ならびに、インスリンおよびソマトメジンＣ（ＩＧＦ−１）受容体のサブユニットを特定するためのそれらの使用について報告した（Ｋｕｌｌ  ｅｔ  ａｌ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８（１０）：６５６１−６５６６、１９８３）。また、Ｈｅｒｒｅｒａ  ｅｔ  ａｌは、抗体（ウサギポリクローナル抗ＩＮＳＲペプチド抗体Ｐ４およびＰ５）を作り、ヒトＩＮＳＲおよびＩＧＦ−１受容体の間の関係を試験した（Ｈｅｒｒｅｒａ  ｅｔ  ａｌ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１（６）：２４８９−２４９１、１９８６）。
【０４５０】
ＩＮＳＲに対するインスリン（インスリン類似体またはＩＮＳＲアゴニスト）のオン速度を増加させるか、またはオフ速度を減少させる正のモジュレーター抗体は、受容体結合インスリン（インスリン類似体またはＩＮＳＲアゴニスト）の結合維持時間の増加、ＩＮＳＲ内部移行速度の変化および／またはＩＮＳＲにより活性化または不活化されたシグナル伝達タンパク質のリン酸化度合いの変化、を起こすことができる。これらの変化は、インスリン（インスリン類似体またはＩＮＳＲアゴニスト）の代謝および分裂促進的活性、ならびに外因性のインスリン（インスリン類似体またはＩＮＳＲアゴニスト）の投与レベルと頻度を大きく変えることができる。
【０４５１】
受容体に対するインスリン（インスリン類似体またはＩＮＳＲアゴニスト）のオン速度を増加させるか、またはオフ速度を減少させる負の調節抗体は、受容体結合インスリン（インスリン類似体またはＩＮＳＲアゴニスト）の結合維持時間の減少、ＩＮＳＲ内部移行速度の変化および／またはＩＮＳＲにより活性化または不活化されたシグナル伝達タンパク質のリン酸化度合いの変化、を起こすことができる。これらの変化は、インスリン（インスリン類似体またはＩＮＳＲアゴニスト）の代謝および分裂促進的活性、ならびに外因性のインスリン（インスリン類似体またはＩＮＳＲアゴニスト）の投与レベルと頻度を大きく変えることができる。
【０４５２】
正に調節する本発明の抗体を投与された糖尿病対象は、治療を受けていない対象に比べ、血糖値、糖負荷試験、および他のインスリン感受性の測定値の改善があることが意図されている。例えば、本発明の正のモジュレーター抗体の投与により、高い血糖値を正常なグルコース値（米国糖尿病協会による空腹時血糖値で約７０ｍｇ／ｄＬ〜１２５ｍｇ／ｄＬ）に減らすことが期待される。一実施形態では、本発明の抗体の投与により、抗体治療を受けていない対象と比べて、血糖値が約１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、または４０％以上減少する。
【０４５３】
世界保健機関および米国糖尿病協会（ＡＤＡ）の基準によると、正常な耐糖能は、７５ｇの経口グルコース摂取２時間後に測定して、１４０ｍｇ／ｄＬ未満のグルコース値と定義されている。耐糖能障害は、７５ｇ経口グルコース摂取後の２時間血糖値が１４０〜１９９ｍｇ／ｄＬ（７．８〜１１．０ｍｍｏｌ）と定義されている。２時間後のグルコースが（正常健康対象に比べ）高いが、２型糖尿病と診断される場合より低い場合は、対象は耐糖能障害があるといわれる。耐糖能障害の対象は、空腹時グルコース値が正常であるか、または少し高いだけという可能性もある。一実施形態では、本発明の抗体の投与により、抗体治療を受けていない対象に比べ、２時間グルコース値（７５ｇ経口グルコース服用後）が、約１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％以上減少する。
【０４５４】
また、ＡＤＡは、７％未満の成人ヘモグロビンＡ１ｃの目標レベル値を推奨している。小児に対しては、ＡＤＡは、より高いＡ１ｃ目標レベルを推奨している。６才未満の小児では、推奨レベルは、７．５％〜８．５％である。６〜１２差異の小児では、推奨レベルは、８％未満である。１３〜１９才のティーンエイジャーに対しての推奨レベルは、７．５％未満である。Ａ１ｃは、測定の２〜３ヶ月間に血糖値が目標範囲内に維持されているかどうかを知る尺度である（米国糖尿病協会、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ、２８（１）：１８６-２１２、２００５．）。糖尿病を治療するための本発明の抗体の投与は、非糖尿病性個体で観察される値までＡ１ｃレベルを減らすことが意図されている。一実施形態では、本発明の抗体の投与により、対象のＡ１ｃレベルが、絶対ＨｂＡ１ｃパーセンテージによる測定で、少なくとも０．５％、０．７％、１．０％または１．５％減少する。
【０４５５】
膵臓ランゲルハンス島中のベータ細胞は、血液中のグルコースレベルを制御するインスリン、ホルモンを．作り、放出する。膵臓により維持されたインスリンのベースラインレベルがあるが、貯蔵したインスリンの放出により、血糖の急上昇に素早く対応することができ、また同時に、さらに多くのインスリンを産生する。応答時間は極めて早い。１型糖尿病では、進行性かつ広範なベータ細胞の減少により、分泌インスリンレベルの減少が起こり、最終的に、高血糖（血液中の異常に高いグルコース値）の原因となる。２型糖尿病では、ベータ細胞は、最初は、インスリン産生の増加により対象のインスリン抵抗性に対応して補償するが、時間経過と共に、細胞は、正常なグルコース値を維持するのに十分なインスリンを産生できなくなる。標的組織のインスリン作用に対する抵抗およびベータ細胞機能不全も幾分関係したインスリン分泌の減少の両方が生ずると考えられている。グルコース取り込みおよび他の糖尿病性症状を改善する本明細書記載の抗体またはポリペプチドの投与は、それを必要としている対象のベータ細胞機能を改善するのにも有用である。このような改善には、これに限定されないが、ベータ細胞生存率の維持もしくはベータ細胞の代謝回転の減少、ベータ細胞増殖の増加、またはインスリン分泌の増強、が挙げられる。ベータ細胞機能改善のさらなる方法およびその結果は、共有ＷＯ２０１０／０２８２７３に開示されている。
【０４５６】
特定の実施形態では、正の調節抗体または部分アゴニスト抗体による治療で、高血漿トリグリセリド、高血漿非エステル化コレステロール、高血漿総コレステロール、高血漿インスリン（インスリン抵抗性の徴候）、高ＨＯＭＡ−ＩＲ、高非ＨＤＬ／ＨＤＬコレステロール比率（または高総コレステロール／ＨＤＬコレステロール比率）、ベータ細胞機能の改善、および高血漿レプチン濃度（レプチン抵抗性の徴候）からなる群より選択される１つ、２つ、または３つ以上の糖尿病またはインスリン抵抗の性の症状の改善が得られる。高レベルが糖尿病、インスリン抵抗性または心臓血管合併症の危険の増加の徴候である場合は、「改善」は、レベルの減少、等として現れる。本明細書の「改善」は、健康な対象でみられるレベルを目指したレベルの正常化を指す。
【０４５７】
試験により測定される「正常な」レベルは、検査室毎に変動し、各検査室は自分たちの正常な範囲を定めているけれども、一般的に、正常なトリグリセリドレベルは、糖尿病に関し１５０ｍｇ／ｄｌ未満（境界域高値１５０〜１９９ｍｇ／ｄＬ）；正常なコレステロールレベルは２００ｍｇ／ｄＬ未満、正常または目標非ＨＤＬ／ＨＤＬコレステロール比率は、約＜３．２５（＜１３０ｍｇ／ｄＬ非ＨＤＬ目標値、および＞４１ｎｇ／ｄＬＨＤＬ目標値に基づいて）、空腹時インスリンの正常または目標範囲は、約５〜２０μＵ／ｍ、およびレプチンの正常または目標範囲（また、通常、肥満度指数（ＢＭＩ）または高インスリン血症に関係する）は、３〜２５ｎｇ／ｍｌであり、例えば、３ｎｇ／ｍＬは、正常な代謝機能に必要なレベルのように思われ、２０〜２５ｎｇ／ｍＬは、疾患に関係すると思われる。一部の実施形態では、治療は、上記症状のいずれかの１つまたは複数の、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％以上を正常化する。
【０４５８】
多嚢胞性卵巣症候群（ＰＣＯＳ）は、最も一般的な婦人科内分泌障害で、出産可能年齢の女性の約５〜１０％にあらわれる。臨床的症状には、月経障害、肥満症、不妊症および多毛症が含まれる。ＰＣＯＳのインスリン抵抗性は、シグナル伝達のインスリン結合後欠陥が原因である。未知のキナーゼによるＩＮＳＲおよびインスリン受容体基質（ＩＲＳ）−１セリン過剰リン酸化がこの欠陥に関与している。ＰＣＯＳの女性の骨格筋中で分裂促進的シグナル伝達が増強されているのが観察された（Ｃｏｒｂｏｕｌｄ  ｅｔ  ａｌ、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５５：７５１−５９、２００６）。従って、ＩＮＳＲに結合するインスリンのアゴニストおよび／または正のモジュレーターは、ＰＣＯＳ関連障害および症状の治療および／または発症の可能性低減に有用である可能性がある。アゴニストおよび／または代謝シグナル伝達に対し分裂促進的比率を増加させないＩＮＳＲに結合するインスリンの正のモジュレーターは、特に、ＰＣＯＳ治療に有用である可能性がある。
【０４５９】
非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）は、単純脂肪症（脂肪浸潤）からＮＡＳＨを経て硬変および肝細胞癌まで含む一連の病理学の一部（ＮＡＦＬＤとして知られている）である（Ｆａｒｒｅｌｌ  ａｎｄ  Ｌａｒｔｅｒ、Ｈｅｐａｔｏｌ．４３、Ｓ９９−１１２、２００６）。インスリン抵抗性は、肝臓中の脂肪蓄積に関連し、現在この器官は、インスリン抵抗性の対象の主要標的と認識されている。全成人の約２０％がＮＡＦＬＤであり、成人の２〜３％がＮＡＳＨに罹っていると推計されている。ＮＡＳＨの対象の１／３もが、長い追跡調査の間に硬変を進行させていく。肝臓疾患は、２型糖尿病の重要な合併症である。
【０４６０】
肥満症および脂質異常症の各対象は、平均集団で観察されるものより低いインスリン感受性を示す。肥満症は、慢性疾患であり、広く蔓延していて、社会的不名誉なだけでなく、有害精神発達、皮膚病を含む、感染、静脈瘤、運動不抵抗性、真性糖尿病、インスリン抵抗性、高血圧症、高コレステロール血症、および冠動脈心疾患（Ｒｉｓｓａｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ、３０１：８３５−８３７、１９９０）、等の寿命の短期化や多くの医学上の問題と関連している。肥満症は、実験動物およびヒトで、インスリン抵抗性および糖尿病と相関性が強い。事実、肥満症とインスリン抵抗性は、後者は、通常、高インスリン血症または高血糖または両方が伴うが、２型糖尿病の顕著な特徴である。さらに、２型糖尿病は、２〜４倍の冠状動脈疾患のリスクが伴う。これらの重大な健康問題に関する数十年の研究にもかかわらず、肥満症およびインスリン抵抗性の病因はわかっていない。正のモジュレーター抗体および部分アゴニスト抗体は、糖尿病性動物で観察される体重増を減らすか、または遅らせる、すなわち、体重増を正常化できることが本明細書で開示される。抗体も肥満の対象の体重増に同じ効果があることが意図されている。ベータ細胞集団が枯渇し、大きな体重減少と消耗が起こることが多い糖尿病性動物の体重減少を、正のモジュレーター抗体の投与により、遅延または低減させる、すなわち、体重減少を正常化できることもまた示されている。
【０４６１】
一部の実施形態では、本明細書記載の正のモジュレーター抗体または部分アゴニスト抗体の投与により、対象の体重増を、未治療の対象と比べて、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％または５０％減らすか、または遅らせることができることも意図されている。
【０４６２】
別の実施形態では、本明細書記載の正のモジュレーター抗体または部分アゴニスト抗体の投与により糖尿病対象または少なくとも部分的なベータ細胞の減少を有する個体、等の個体の体重減少を、未治療の対象と比べて、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％または５０％減らすか、または遅らせることができることも意図されている。
【０４６３】
一部の実施形態では、本明細書記載の正のモジュラー抗体または部分アゴニスト抗体の投与により、未治療対象に比べ、体重減少を、例えば、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％または５０％促進または誘導できることが意図されている。
【０４６４】
ＨＩＶ対象の治療に使われるプロテアーゼ阻害剤は、インスリン抵抗性を含む一群の代謝障害の発生に関連している（Ｇｒａｈａｍ、ＪＡＩＤＳ２５：Ｓ４−Ｓ１１、２０００）。ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤誘導インスリン抵抗性は、糖尿病に移行し、最終的に命に関わるケトアシドーシスになる高血糖につながる（Ｃａｒｒｅｔａｌ、Ｌａｎｃｅｔ３５１：１８８１−１８８３、１９９８）。一部の対象に対し、これらの代謝副作用は、生命維持薬の使用を大きく制限する。Ｍｕｒａｔａ  ｅｔ  ａｌ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５（２７）：２０２５１−５４、２０００）は、少なくとも３つの市販ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤も、また、グルコース輸送体が３Ｔ３Ｌｌ脂肪細胞の細胞膜に局在化するのを阻害し、その後、これらの細胞によるグルコース取り込みが阻害されることを報告した。ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤による、細胞性グルコースの細胞への輸送の阻害は、プロテアーゼ阻害剤で治療されている診療室の一部の対象で観察されるグルコースおよび脂質の上昇と一致する。従って、ＩＮＳＲに結合するインスリンのアゴニストおよび／または正のモジュレーターは、ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤の代謝副作用の治療に対して有用となる可能性がある。
【０４６５】
インスリン抵抗性は、また、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染対象の病理学的特徴の１つであり、ＨＣＶ感染に関する種々の合併症およびイベントの発生に重要な役割を果たしている（Ｋａｗａｇｕｃｈｉ  ａｎｄ  Ｓａｔａ、ＷｏｒｌｄＪ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．１６：１９４３−５２、２０１０）。従って、ＩＮＳＲに結合するインスリンのアゴニストおよび／または正のモジュレーターは、ＨＣＶ感染に関連する合併症およびイベントの治療に有用である可能性がある。
【０４６６】
ＩＮＳＲシグナル伝達は、また、他の疾患においても役割を有する。例えば、ＩＮＳＲ／ＩＧＦ−１Ｒシグナル伝達は、アミロイドベータ代謝に関しある種の役割があると推測されている（Ｆｒｅｕｄｅ  ｅｔ  ａｌ、Ｃｕｒｒ．Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ  Ｒｅｓ．６（３）：２１３−２３、２００９）。ＩＲの活性化は、光受容体神経保護の必須要素であると見なされてきた（Ｒａｊａｌａ  ｅｔ  ａｌ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８３（２８）：１９７８１−９２、２００８）。インスリンシグナル伝達は、また、硬骨形成を推進すると推察されてきた（Ｒｏｓｅｎ  ａｎｄ  Ｍｏｔｙｌ、Ｃｅｌｌ  １４２：１９８−２００）。インスリン感作物質による治療は、慢性閉塞性肺疾患および真性糖尿病の両方の対象の肺機能を改善すると報告されている（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｔｕｂｅｒｃ．ＬｕｎｇＤｉｓ．１４（３）：３６２−６７、２０１０）。
【０４６７】
ＩＮＳＲ遺伝子ホモ接合変異を有する少数対象は、それがドナヒュー症候群または妖精症の原因になると説明されてきた。この常染色体劣性遺伝疾患は、全く非機能性インスリン受容体を生成する。これらの対象は、（しばしば隆起した）耳介低位、広がった鼻の穴、分厚い唇、および重度の成長遅延を有する。大抵の場合、これらの対象の予後は極めて不良で、生まれて１年以内に死亡する。ＩＮＳＲ遺伝子の他の変異は、それほど重篤でないラブソン・メンデンホール症候群の原因となる。この対象は、特徴的に異常な歯、増殖性歯肉炎（歯ぐき）および松果体の拡張がある。両疾患とも、グルコース値の変動を示す：食後、グルコースは、最初非常に高く、その後、急速に異常な低いレベルまで低下する（Ｌｏｎｇｏ  ｅｔ  ａｌ、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１１（１２）：１４６５-７５、２００２）。
【０４６８】
ＩＮＳＲアンタゴニスト／負のモジュレーターの治療薬の効能
ＩＮＳＲは、また、癌と関係付けられている。いくつかの疫学的調査により、高インスリン血症を特徴とするインスリン抵抗性状態は、乳房、前立腺、結腸および腎臓の細胞腫を含む多くの悪性腫瘍のリスクの増加と関連していることが示されてきた。ＩＮＳＲ、特にＩＮＳＲ−Ａ型は、いくつかのヒト悪性腫瘍中で高発現している。ＩＮＳＲはＩＧＦ−ＩＲと複合型受容体を形成し、これもまた、通常、癌中で高発現している。ＩＮＳＲ−Ａヘミダイマーを含むハイブリッド受容体は、ＩＧＦ−ＩならびにＩＧＦ−ＩＩおよびインスリンにも結合するという様な広範な結合特異性を有する。複合型受容体に結合することにより、インスリンは、特異的ＩＧＦ−ＩＲシグナル伝達経路を刺激することができる。ＩＮＳＲおよび／または複合型ＩＮＳＲ／ＩＧＦ−１Ｒ受容体に対して結合するインスリンのアンタゴニストおよび／または負のモジュレーターは、従って、新規癌治療薬として有用でる可能性がある（Ｂｅｌｆｉｏｒｅ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓｉｇｎ １３ （７）：６７１−６８６、２００７）。ＩＮＳＲは、ウイルス誘導カポジ肉腫腫瘍形成に必須であると報告されている（Ｒｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ、Ｏｎｏｇｅｎｅ  ２６：１９９５−２００５、２００７）。
【０４６９】
高インスリン血症は、血液中の異常に高いレベルのインスリンにより定義される状態である。高インスリン血症の原因には、インスリノーマおよびインスリン抵抗性が含まれ、これらは、先天性の高インスリン血症または他の状態、例えば、活性不足、肥満症、多嚢胞性卵巣症候群またはインスリン過剰摂取に起因する可能性がある。インスリノーマは、過剰量のインスリンを産生する膵臓の腫瘍である。高インスリンレベルは、低血糖症、または低い血中グルコース（糖質）の原因である。高インスリン血症は、誕生数時間後の新生児低血糖の最も多い原因である。このような状態の治療は、発作および神経学的後遺症の発症を防ぐために必要な場合が多い。
【０４７０】
インスリン過剰摂取は、例えば、：あまりにも多いインスリンの投与；適量インスリンの投与であるが、間違ったタイプ、例えば、長時間作用インスリンの代わりに短時間作用インスリンの投与；インスリン投与後、食事なかった、；または故意のインスリン過剰投与、によって引き起こされる可能性がある。
【０４７１】
一般的には、低血糖は、軽症であり得、不安や空腹、等の症状が起こるが、また、対象は重篤な低血糖の危険にさらされおり、発作、昏睡、さらに死亡でさえも生ずる可能性がある。対象が訴える低血糖関連の典型的な症状には、疲労、脱力、震えおよび空腹が含まれる。多くの対象は、低血糖の症状を防ぐために頻繁に食事をしなければならない。一部の対象は、低血糖による精神症状を発症する可能性がある。
【０４７２】
最近、インスリノーマまたは他の重篤な型の高インスリン血症の対象は、膵部分切除、等の手術により、またはジアゾキシドまたはソマトスタチン、等の一部のケースでインスリン産生を減らす薬剤の投与により治療されている。一部のケースでは、グルコースを連続的に注入する必要がある。ペプチドＩＮＳＲアンタゴニストが記載されているが（Ｓｃｈａｆｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ、ＢＢＲＣ３７６：３８０−３８３、２００８）、循環インスリンの効果を減らす現存する治療はない。ＩＮＳＲに結合するインスリンのアンタゴニストおよび／または負のモジュレーターは、手術の前に、または治療医療設備の一部として、インスリノーマの対象を安定化させるのに有用である可能性がある。また、アンタゴニストおよび／または負のモジュレーターは、カポジ肉腫の治療に有用である。
【０４７３】
さらに、米国で透析を受けている著しい数の対象（２５，０００〜１００，０００）が、腎不全（慢性腎疾患（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｋｉｄｎｅｙ  ｄｉｓｅａｓｅ）、慢性腎臓病（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｒｅｎａｌ  ｄｉｓｅａｓｅ）、慢性腎臓不全（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｋｉｄｎｅｙ  ｆａｉｌｕｒｅ）、慢性腎臓不全（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｒｅｎａｌ  ｆａｉｌｕｒｅ）、不治の慢性腎疾患（ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｋｉｄｎｅｙ  ｄｉｓｅａｓｅ））による低血糖を呈し、本明細書記載のＩＮＳＲのアンタゴニストまたは負のモジュレーターによる治療で利益を得ることができる。
【０４７４】
ＩＮＳＲに結合するインスリンのアンタゴニストおよび／または負のモジュレーターは、不安、異常な空腹、異常な疲労、過食、低血糖関連精神症状、および／または低血糖（低血糖関連発作、昏睡、および死亡を含む）の低減、等の、対象の高インスリン血症に関連する疾患および症状の治療および／または発症の可能性を減らすために有用である可能性がある。ＩＮＳＲに結合するインスリンのアンタゴニストおよび／または負のモジュレーターは、従って、次の種々のタイプの持続性高インスリン血症状態の治療に使うことができる：膵島細胞症（ＫＡＴＰ−Ｈｌびまん性疾患、ＫＡＴＰ−Ｈｌ限局性疾患、または「ＰＨＨＩ」）、ＧＤＨ−Ｈｌ（高インスリン症／高アンモニア血症症候群（ＨＩ／ＨＡ）、ロイシン過敏性低血糖症、またはジアゾキシド感受性低血糖）、島細胞調節不全症候群、乳幼児特発性低血糖症、乳幼児持続性高インスリン性低血糖症（ＰＨＨＩ）、先天性の高インスリン症、インスリノーマ、インスリン過剰摂取、腎不全による低血糖（急性または慢性）、および慢性腎臓病、例えば、ＩＩＩ、ＩＶまたはＶ型。
【０４７５】
ＩＮＳＲアゴニスト／正のモジュレーター診断薬の効能
インスリン受容体特異的抗体は、糖尿病診断用のツールとして使われてきた。米国特許第７，７３２，１５４号には、インスリン受容体サブユニットＡ（ＩＲ−Ａ）に対するポリクローナル抗体を糖尿病用診断薬として記載し、高レベルの遊離ＩＲ−Ａが、糖尿病および癌対象の血清中で検出されたことが報告されている。本明細書で開示のＩＮＳＲ抗体は、インスリン受容体、例えば、可溶性インスリン受容体−Ａ、または対象の検体中のインスリンレベルを測定し、ＩＮＳＲまたはインスリンのレベルが、対象の糖尿病またはインスリン抵抗性を示すか否を判断するのに有用である。別の健康な個体のこれらの因子の正常な許容可能なレベルと比べて、異なるレベルのインスリンまたはインスリン受容体を有する対象は、糖尿病またはインスリン抵抗性に罹っているか、またはその危険にさらされている可能性がある。本明細書で開示のＩＮＳＲ抗体は、また、対象の同じ検体中のインスリン受容体、例えば、可溶のインスリン受容体Ａ、またはインスリンレベルを測定し、ＩＮＳＲまたはインスリンのレベルが、対象の癌を示すか否かを判断するのに有用である。別の健康な個体のこれらの因子の正常な許容可能なレベルと比べて、異なるレベルのインスリンまたはインスリン受容体を有する対象は、癌があるか、またはその危険にさらされている可能性がある。
【０４７６】
一実施形態では、本発明は、本明細書記載のいずれかの抗体を使って、インスリン抵抗性またはインスリン感受性を診断する方法を提供する。一実施形態では、方法は、対象の検体中のインスリンまたはインスリン受容体、例えば、可溶のインスリン受容体-Ａのレベルを本明細書記載の抗体を使って、測定することを含み、この測定で異なるレベルのインスリンまたはインスリン受容体である場合は、対象が、糖尿病、インスリン抵抗性、インスリン感受性または癌に罹っているか、またはその危険にさらされていることを示す。また、糖尿病、インスリン抵抗性、インスリン感受性または癌に罹っているか、またはその危険にさらされている前記対象に治療薬を投与することを、任意で、前記方法に含めてもよい。特定の実施形態では、検体は生物試料である。一部の実施形態では、生物試料は、血液、血清、血漿、尿、乳頭分泌、脳脊髄液および腫瘍生検からなる群より選択される。検体中のインスリン受容体を測定する方法には、これに限定されないが、イムノアッセイ、競合阻害アッセイ、免疫沈降アッセイ、および本明細書記載の他のアッセイが含まれる。
【０４７７】
モジュレーター投与効果の測定に有用なアッセイ
正のまたは負のモジュレーター抗体の対象への投与効果は、インビボまたはインビトロで測定される。一実施形態では、インスリン／インスリン受容体活性を正の調節抗体が、対象のＨｂＡ１ｃ、コレステロール、ＬＤＬ、トリグリセリド、または非エステル化脂肪酸、およびＨＤＬのインビボレベルを減少させることが意図されている。これらの因子は、当業者にとっては、一般的な技術を使って測定される。
【０４７８】
正のモジュレーター抗体を受けている対象は、また、体重減少または体重増の減少、低血糖または高血糖性イベントの頻度および／または回数の減少、および、ＨＤＬ／ＬＤＬ比率、インスリン分泌、血糖調節（糖負荷試験ＧＴＴ）で測定して）、インスリン感受性（インスリン抵抗性試験（ＩＴＴ））で測定して）、ベータ−細胞機能（例えば、細胞量、インスリン分泌、Ｃ−ペプチドレベル、で測定して）、ベータ細胞休止状態、脂質異常症、の改善を示す可能性がある。
【０４７９】
インスリン抵抗性の改善は、次の肝臓、脂肪組織および／または筋肉：Ｐｃｋ１（ＰＥＰＣＫ）、Ｇ６ｐｃ（Ｇ６Ｐａｓｅ）、Ｓｒｅｂｆ１（ＳＲＥＢＰ−１）、Ｇｃｋ（ＧＫ）、Ｐｐａｒｇｃ１ａ（ＰＧＣ−１）、Ａｂｃａ１（ＡＢＣ−１）、Ａｃａｃａ（アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ）、ＩＬ１ｂ（ＩＬ−１ｂｅｔａ）、ＩＬ６（ＩＬ−６）、Ｔｎｆ（ＴＮＦ−α）、Ｃｃｌ２（ＭＣＰ−１）、Ｓｌｃ２ａ４（ＧＬＵＴ４）、Ｉｌ−１ｒｎ（ＩＬ−１ｒａ）、ＣＤ６８、ＳＡＡ１、ＳＡＡ２、ＦＡＳ（脂肪酸シンターゼ）、Ｅｍｒ１（Ｆ４／８０）、Ｉｒｓ１、Ｉｒｓ２、のいずれか中での正常化された遺伝子発現により測定される。上記は、当技術分野でよく知られた技術により測定される。
【０４８０】
インビトロアッセイも、また、インスリン／インスリン受容体活性のモジュレーター投与の効果を測定するために有用である。正のモジュレーター抗体は、ＧＬＵＴ４の細胞表面への転移の増加が起こることが期待される。細胞内の位置から細胞膜へのＧＬＵＴ４の転移測定方法は、例えば、米国特許第６，６３２，９２４号、米国公開特許第２００７／０１４１６３５号、米国公開特許第２００３／０１０４４９０号、およびＬｉｕ  ｅｔ  ａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．４１８（２）、４１３−２０（２００９）で提供されている。また、正のモジュレーターの効果は、肝臓、脂肪および／または筋細胞によるグルコース取り込みの増強を分析することにより、肝臓、脂肪および／または筋細胞培地からのグルコース欠乏の拡大を分析することにより、および分裂促進的に対する代謝ＩＮＳＲシグナル伝達の増加または不変の比率、ｐＡＫＴ活性化、およびｐＩＲＳ−１活性化、を測定することにより、評価できる。インスリン−ＩＮＳＲ相互作用の相対的ヒルスロープも測定可能である。しかし、一部の用量反応曲線は、検量線より急勾配、または、より緩い勾配である。急勾配はヒルスロープにより定量化でき、スロープファクターとも呼ばれる。標準的な傾斜の用量反応曲線は、１．０のヒルスロープである。急傾斜の曲線はより大きいスロープファクターを有し、より緩い傾斜の曲線は、小さなスロープファクターを有する。これらのファクターを分析する代表的アッセイを実施例に記載する。
【０４８１】
薬剤送達試薬としてのＩＮＳＲ抗体の使用
血液脳関門を通過してタンパク質および非ウイルス遺伝子治療薬を送達するために、ＩＮＳＲに対する抗体、８３−１４、を「分子トロイの木馬」を作ることを狙ってヒト化した。８３−１４結合は、ＩＮＳＲの急速な内部移行を促進する。従って、この特性または改良特性を有するさらなる抗体は、脳および中枢神経系へ薬剤を送達するのに有用である可能性がある（Ｂｏａｄｏ  ｅｔ  ａｌ、Ｂｉｏｔｅｃｈ  ａｎｄ  ＢｉｏＥｎｇ．９６（２）：３８１−３９１；ＷＯ０４／０５００１６）。
【０４８２】
キット
別の態様として、本発明には、本発明の方法を実施に際し、使用し易いようにまとめられた１つまたは複数の化合物または組成物を含むキットが含まれる。一実施形態では、このようなキットは、密封ビンまたは容器、等のラベルを添付した入れ物に詰めた、または方法を実施する際の化合物もしくは組成物の使用法を記載した容器に入れた、本明細書記載の化合物または組成物（例えば、インスリン受容体もしくはインスリン／インスリン受容体複合体特異的抗体単独、または第２の試薬と組み合わせて、含む組成物）を含む。化合物または組成物は、単位剤形としてまとめられるのが好ましい。キットには、個別の投与経路に応じて組成物を投与するために、または選別アッセイを行うために適した装置をさらに含めてもよい。キットは、抗体組成物の使用法を記載したラベルを含むのが好ましい。
【０４８３】
本発明のさらなる態様および詳細は、次の実施例から明らかになろう。これらの実施例は、説明のためのものであり、制限を意図するものではない。
【実施例】
【０４８４】
実施例１
抗体ファージディスプレイライブラリーから抗ＩＮＳＲ抗体の単離
（１）ファージパニングおよびレスキュー
Ａ．ナイーブ抗体ファージディスプレイライブラリー
ヒトインスリン受容体（ｈＩＮＳＲ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＭＮ）を、メーカーのプロトコルおよび１６倍モル過剰のビオチン試薬：スルフォＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を使って、ビオチン化した。ｈＩＮＳＲのビオチン化は、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）により確認した。
【０４８５】
最初のラウンドのファージパニングでは、ｓｃＦｖファージディスプレイライブラリー（ＢｉｏＩｎｖｅｎｔ、Ｌｕｎｄ、Ｓｗｅｄｅｎ）由来の１．６ｘ１０１１ｃｆｕのファージ粒子を１ｍｌの５％ミルク／ＰＢＳ（Ｔｅｋｎｏｖａ、Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ、ＣＡ）中で、ゆっくり回転させながら室温（ＲＴ）で１時間ブロッキングした。ストレプトアビジンコート磁性Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ−２８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｄｙｎａｌ  ＡＳ、Ｏｓｌｏ、Ｎｏｒｗａｙ）に対して、ブロッキングしたファージの３０分間の選択解除（ｄｅｓｅｌｅｃｔ）を２回行った。ビオチン−ｈＩＮＳＲ−ｈＩＮＳ複合体を形成するために、１００ｐモルのビオチン化ｈＩＮＳＲを、５％ミルク／ＰＢＳに溶解した過剰（２，１００ｐモル）ヒトインスリン（ｈＩＮＳ）（Ｓｉｇｍａ、ＭＯ）と共に、ゆっくり回転させながらＲＴで１時間プレインキュベートした。パニングの第２ラウンドでは、５０ｐモルのビオチン−ｈＩＮＳＲを１０５０ｐモルｈＩＮＳと一緒に使用した。パニングの最終ラウンドでは、２５ｐモルのビオチン−ｈＩＮＳＲを５２５ｐモルｈＩＮＳと共にインキュベートした。
【０４８６】
ビオチン−ｈＩＮＳＲ／ｈＩＮＳ溶液をブロッキングしたストレプトアビジンコート磁性Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ−２８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｄｙｎａｌ  ＡＳ、Ｏｓｌｏ、Ｎｏｒｗａｙ）と共に、ゆっくり回転させながら３０分間インキュベートし、ビオチン−ｈＩＮＳＲ−ｈＩＮＳ複合体を固定した。選択解除したファージを、ビオチン−ｈＩＮＳＲ−ｈＩＮＳストレプトアビジンビーズと共に、ＲＴで２時間インキュベートした。ｈＩＮＳＲをｈＩＮＳで飽和させるために、追加のｈＩＮＳ（２，１００ｐモル）をその溶液に添加した。ビーズを洗浄した。パニングの最初のラウンドでは、ビーズの素早い洗浄（すなわち、磁石を使い溶液からビースを取り出し、１ｍｌの洗浄緩衝液に再懸濁した）を、ＰＢＳ−０．１％ＴＷＥＥＮを使って３回行い、次に、ＰＢＳで３回行った。パニングの第２ラウンドでは、ビーズをＰＢＳ−０．１％ＴＷＥＥＮで素早く５回洗浄し、次に、ＰＢＳ−０．１％ＴＷＥＥＮで５分間（１ｍｌの洗浄緩衝液を使い、室温でゆっくり回転させながら）の１回の洗浄、さらにＰＢＳで５回の洗浄に続き、５分間のＰＢＳによる１回の洗浄を行った。パニングの第３ラウンドでは、ビーズをＰＢＳ−０．１％ＴＷＥＥＮで素早く４回洗浄し、次に、ＰＢＳ−０．１％ＴＷＥＥＮで５分間（１ｍｌの洗浄緩衝液を使い、室温でゆっくり回転させながら）の２回の洗浄、さらにＰＢＳで４回の素早い洗浄に続き、５分間のＰＢＳによる２回の洗浄を行った。
【０４８７】
ｈＩＮＳＲ−ｈＩＮＳ−結合ファージを１００ｍＭトリエチルアミン（ＴＥＡ）（ＲＴで３０分インキュベーション）で溶出し、次いで、１Ｍトリス塩酸（ｐＨ７．４）で中和した。溶出ファージを使ってＯＤ６００値が約０．５に達したとき、ＴＧ１細菌性細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＣＡ）に感染させた。３７℃で３０分間振盪なしで感染させ、さらに３７℃で３０分間、９０ｒｐｍで振盪を加えた後、細胞をペレット化し、１００ｕｇ／ｍｌアンピシリンおよび２％グルコースを補充した２ＹＴ培養液に再懸濁した。再懸濁細胞を１００ｕｇ／ｍｌカルベニシリンおよび２％グルコースを含む２ＹＴ寒天プレートに蒔き、３０℃で一晩インキュベートした。
【０４８８】
次に、感染多重度（ＭＯＩ）約１０でヘルパーファージＶＣＳＭ１３（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、ＭＡ）を使いファージをレスキューした。０．６のＯＤ６００、３７℃で３０分間、回転なしでヘルパーファージを感染させ、次に３７℃、１５０ｒｐｍで３０分間インキュベートした後、細胞ペレットを１００ｕｇ／ｍｌアンピシリンおよび５０ｕｇ／ｍｌカナマイシンを補充した２ＹＴ培養液に再懸濁し、３０℃で一晩増殖させた。厳格に遠心分離後、上清中のファージを回収し、次のパニングラウンドに使用した。ファージ選択により達成された濃縮度をモニターするために、３ラウンドのパニングについて、投入と産生ファージ量を滴定した。
【０４８９】
遺伝子ＩＩＩ除去および細菌性周辺質抽出物の生成
ｈＩＮＳＲ−ｈＩＮＳ複合体に対する結合に関してファージパニング産物ｓｃＦｖクローンを選別する前に、最初に、ｇｅｎｅＩＩＩ遺伝子を、ファージミドベクターから切除し、分泌型ｓｃＦｖの産生を可能とした。このため、第３パニングラウンドクローン産物プールのプラスミドミディプレップ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を制限酵素ＥａｇＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、ＭＡ）で消化させた。遺伝子ＩＩＩを含まない消化産物をＴ４ＤＮＡリガーゼ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、ＭＡ）で自己連結させ、ケミカルコンピテントＴＯＰ１０大腸菌細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を形質転換するのに使用した。次に、９６ウエルプレート中の個別形質転換コロニーならびに１：３容量比率の氷冷ＰＰＢ溶液（Ｔｅｋｎｏｖａ、Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ、ＣＡ）と再蒸留水（ｄｄＨ２Ｏ）、および２つのプロテアーゼ阻害剤混合物タブレット（Ｒｏｃｈｅ、ＩＮ）を使い、標準的方法に従って細菌性周辺質抽出物を生成させた。ライセート上澄みを下記のＥＬＩＳＡによりアッセイした。
【０４９０】
Ｂ．免疫抗体ファージディスプレイライブラリー
米国特許第６，０５７，０９８号に記載の方法に従って、ｈＩＮＳＲ−ｈＩＮＳ複合体による過免疫のマウスからＯｍｎｉｃｌｏｎａｌ（登録商標）ファージディスプレイライブラリーを生成した。免疫化物質は、約等モル量の組換え型ヒトインスリン（ｃａｔ＃Ｉ９２７８、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｉｎｃ．Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）および組換え型ヒトＩＮＳＲ（２８−９５６）（ｃａｔ＃１５４４−ＩＲ／ＣＦ、Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ、ＭＮ）からなる。複合体のタンパク質濃度は、およそ０．２４ｍｇ／ｍｌであった。米国特許第６，０５７，０９８号のプロトコルに従ってＯｍｎｉｃｌｏｎａｌ（登録商標）ライブラリーから得たただ１つのコロニーを、下記のＥＬＩＳＡアッセイで結合活性により選別した。
【０４９１】
（２）ｈＩＮＳＲ／ｈＩＮＳ複合体に関する抗体クローンのＥＬＩＳＡ選別
ＥＬＩＳＡ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ（登録商標）プレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）を３ｕｇ／ｍｌ  ｈＩＮＳＲのＰＢＳ溶液を使って４℃で一晩コートした。次いで、プレートを４００ｕｌ／ウエルの５％ミルク／ＰＢＳを使ってＲＴで１時間ブロッキングした。ｈＩＮＳＲ−ｈＩＮＳ複合体を含むウエルを作るために、５０ｕｌ／ウエルのｈＩＮＳ（２．１ｕＭ）をｈＩＮＳＲにＲＴで３０分間結合させた。また、細菌性周辺質抽出物を５％ミルク／ＰＢＳを用いて１時間ブロッキングし、次に、コートしたＥＬＩＳＡプレート（５０ｕｌ／ウエル）に添加して、ＥＬＩＳＡプレート上で、ｈＩＮＳＲまたはｈＩＮＳＲ−ｈＩＮＳ複合体に室温で２時間結合させた。マウス８３−７抗ｈＩＮＳＲ  ｍＡｂを陽性ＥＬＩＳＡ選別対照（Ｓｏｏｓ    ｅｔ  ａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２３５：１９９−２０８、１９８６）として使用した。結合ｓｃＦｖ断片をマウス抗ｃ−ｍｙｃ  ｍＡｂ（Ｒｏｃｈｅ、ＩＮ）により、室温で１時間検出し、続けて、ヤギ抗マウスＨＲＰ−複合化抗血清（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）により検出した。ＥＬＩＳＡ選別各ステージ後に、ＰＢＳ−０．１％ＴＷＥＥＮ−２０（Ｔｅｋｎｏｖａ、Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ、ＣＡ）で、３回の洗浄を行った。室温で１時間のインキュベーション後、ヤギ抗マウスＨＲＰ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）で正対照８３−７  ｍＡｂを検出した。色は、５０ｕｌ／ウエルの可溶性３．３’、５．５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質（ＥＭＤ  ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、ＮＪ）を使って、４５０ｎｍの光吸収により発色させ、１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４（５０ｕｌ／ウエル）で停止させた。
【０４９２】
結果
細菌性周辺質抽出物のＥＬＩＳＡ選別により、ファージパニング選択由来の複数のｈＩＮＳＲまたはｈＩＮＳＲ−ｈＩＮＳ複合体結合剤が特定された。ナイーブライブラリーから選択された４８％（１，４８８中の８６８）のクローンが、ｈＩＮＳＲまたはｈＩＮＳＲ−ｈＩＮＳ複合体に結合可能であった。免疫ライブラリーから選択された４３％（４６５中の２００）のクローンが、ｈＩＮＳＲまたはｈＩＮＳＲ−ｈＩＮＳ複合体に結合可能であった。選択クローン由来の周辺質抽出物は、また、ＦＡＣＳ（実施例２参照）によってもアッセイできる。選択クローンをＩｇＧ１またＩｇＧ２抗体として、再フォーマットした。選択ｓｃＦｖ断片の可変重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）を、ＰＣＲ増幅し、抗体定常領域遺伝子を含むプラスミドベクターに挿入して、標準的な方法を用いて２９３ＥＥＢＮＡヒト細胞に形質移入した。
【０４９３】
実施例２
ヒトインスリンの存在または非存在下のＩＮＳＲに対する抗体結合を測定するための受容体占有率による選別
この実施例は、ローサイトメトリー法（ＦＡＣＳ）に基づくアッセイを使用して、ヒトインスリン（ｈＩＮＳ）の存在または非存在下の細胞に対する特異的抗体結合の測定について記載している。アッセイでは、ＩＮＳ−ＩＮＳＲ結合のモジュレーターを特定するために、ファージディスプレイライブラリーから抗インスリン受容体（ＩＮＳＲ）抗体が選別された。
【０４９４】
ＩＭ−９細胞を、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）から入手しＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳ中で維持した。アッセイでの使用の前に、細胞を無血清ＲＰＭＩ１６４０で洗浄し、カウント後、ＲＰＭＩ１６４０＋０．５％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中の２ｘ１０６細胞／ｍｌに濃度を調整した。細胞を、この培地中で一晩培養し、「血清飢餓状態」と命名した。これらの細胞を１回洗浄し、０．５％ＢＳＡおよび０．０１％ナトリウムアジ化物（ＦＡＣＳ緩衝液）を含むＰＢＳ中に、２ｘ１０６細胞／ｍｌで再懸濁した。
【０４９５】
インスリンに曝した細胞を７０ｎＭヒトインスリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を補充したＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。細胞集団（＋ｈＩＮＳ）または（−ｈＩＮＳ）の両方を、４℃で３０分間インキュベートし、ＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄後、２ｘ１０６細胞／ｍｌでＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。２５μｌの細胞を、９６ウエルプレートに蒔き、２５μｌの抗体またはＰＰＥと混合し、氷上で１時間インキュベートした。
【０４９６】
次に、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄し、抗体の結合を、２５μｌの適切な蛍光色素複合化二次抗体を添加して検出した。最初のインキュベーションがｍｙｃタグ付き抗体含有ＰＰＥと共に行われる場合は、２５μｌの１／１０００希釈の抗ｃ−ｍｙｃ抗体（Ｒｏｃｈｅ）をウエルに添加し、細胞を氷上で３０分間インキュベートした。次に、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄し、抗ｃ−ｍｙｃの結合が、フィコエリトリン複合化抗マウスＩｇＧの添加により顕在化した。最後の氷上での１５分のインキュベーション後、細胞を洗浄し、ペレットをＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。細胞をＦＡＣＳＣＡＮ（登録商標）（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｍｉｌｉｐｉｔａｓ、ＣＡ）で分析し、データは、ＦＬＯＷＪＯ（登録商標）（Ｔｒｅｅｓｔａｒ、Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ）およびＭｉｃｒｏｓｏｆｔＥｘｃｅｌ（登録商標）の両方を使って解析した。
【０４９７】
このアッセイにより、４つのタイプの抗体の検出が可能となり、いくつかの例を図１に示す：
１．ヒトインスリン（ＩＮＳ／ＩＮＳＲ複合体に対してのみ結合）に曝された場合、ＩＭ−９細胞にのみ結合する抗体
２．ヒトインスリン（ＩＮＳ／ＩＮＳＲ複合体に優先的に結合）に曝された場合、ＩＭ−９細胞により多く結合する抗体
３．ヒトインスリン（非複合化ＩＮＳＲに優先的に結合）に曝された場合、ＩＭ−９細胞にあまり結合しない抗体
【０４９８】
ＩＮＳ／ＩＮＳＲ複合体に対する抗体結合：非複合化ＩＮＳＲに対する抗体結合の比率が、１．３より大きい場合は、抗体を、正のモジュレーターと予想される抗体として記録した。ＩＮＳ／ＩＮＳＲ複合体に対する抗体結合：非複合化ＩＮＳＲに対する抗体結合の比率が、０．６より小さい場合は、抗体を、負のモジュレーターと予想される抗体として記録した。ＩＮＳ／ＩＮＳＲ複合体に対する抗体結合：非複合化ＩＮＳＲに対する抗体結合の比率が、０．９より大きく、１．１より小さい場合は、抗体を、非モジュレーターと予想される抗体として記録した。
【０４９９】
実施例３
ＩＮＳＲに対するインスリンの結合に与える抗ＩＮＳＲ抗体の効果の測定のためのビオチン化リガンドの選別
この実施例は、抗ＩＮＳＲ抗体の存在または非存在下で、細胞に対する特異的リガンド（ヒトインスリン）結合を測定するためのＦＡＣＳベースアッセイの使用に関して記載する。ＩＮＳ−ＩＮＳＲ複合体のモジュレーターを特定するためのアッセイにより、ファージディスプレイライブラリーから抗ＩＮＳＲ抗体を選別した。
【０５００】
ＩＭ９細胞をアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）から入手し、ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳ中で維持した。アッセイでの使用の前に、細胞を無血清ＲＰＭＩ１６４０で洗浄し、計数後、ＲＰＭＩ１６４０＋０．５％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中の２ｘ１０６細胞／ｍｌに濃度を調整した。細胞を、この培地中で一晩培養し、「血清飢餓状態」と命名した。これらの細胞を１回洗浄し、０．５％ＢＳＡ（結合緩衝液）を含むＰＢＳ中に、２ｘ１０６細胞／ｍｌで再懸濁した。
【０５０１】
血清飢餓状態の細胞を、室温で１５分間ＩＮＳＲ抗体に前暴露し、次に、種々の濃度のＲ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓからから購入したビオチン化ヒトインスリンと共にさらに室温で３０分間インキュベートした。ビオチン化されたインスリンの結合は、ストレプトアビジン−フィコエリトリンの１／１００希釈物をこの混合物に添加して、さらに室温で１５分間インキュベートすることにより顕在化した。次に、細胞を結合緩衝液で１回洗浄し、０．５％ＢＳＡ、０．１％ナトリウムアジ化物および２％パラホルムアルデヒドを含む等容量のＰＢＳ中に再懸濁した。細胞をＦＡＣＳＣＡＮ（登録商標）（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｍｉｌｉｐｉｔａｓ、ＣＡ）で分析し、データは、ＦＬＯＷＪＯ（登録商標）（Ｔｒｅｅｓｔａｒ、Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ）およびＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ（登録商標）の両方を使って解析した。
【０５０２】
図２は、抗ＩＮＳＲ抗体の存在または非存在下の、異なるインスリン濃度でのＩＭ９細胞に対するビオチン化インスリンの結合を示す。抗体８３−７は、ビオチン化インスリンの結合を増強した；抗体ＭＡ−２０は、ビオチン化インスリンの結合を低下させた；対照マウスＩｇＧは、ビオチン化インスリンの結合に対し効果がなかった。
【０５０３】
実施例４
抗ＩＮＳＲ抗体のｐＩＲＳ−１リン酸化刺激能力の測定アッセイ
ＩＮＳＲによりリン酸化される基質タンパク質には、インスリン受容体基質１（ＩＲＳ−１）と呼ばれるタンパク質が含まれる。ｐＩＲＳ−１を形成すＩＲＳ−１リン酸化は、最終的にインスリン応答性組織の外膜上の高親和性グルコース輸送体（Ｇｌｕｔ４）分子の増加をもたらし、その結果、血液からこれらの組織へのグルコース取り込みの増加につながる。ｐＩＲＳ−１アッセイは、Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）技術プラットフォーム（Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｃｏｒｐ．、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）を使って開発された。２つの様式のアッセイが開発された：（ａ）固定インスリン濃度で試験抗体の滴定、および（ｂ）抗体固定濃度でのインスリンの滴定。複合化および非複合化ＩＮＳＲに対する特異的結合に基づいて選択された抗ＩＮＳＲ抗体を、アッセイにより試験しＩＮＳ−ＩＮＳＲ複合体シグナル伝達のモジュレーターを特定した。
【０５０４】
細胞処理と溶解
計数、遠心処理、ＰＢＳで１回洗浄し、約ＲＰＭＩ＋０．５％  Ｓｉｇｍａ  Ｃｏｈｎ  Ｖ  ＢＳＡ（ＲＰＭＩ中１０％ストック、濾過殺菌、４℃貯蔵）中に約２ｘ１０６細胞／ｍｌ濃度で再懸濁して、１６〜２０時間、ＩＭ−９細胞を血清飢餓状態にした。
【０５０５】
インスリン（Ｓｉｇｍａ  Ｉ−９２７８（１０ｍｇ／ｍｌ）１．７７ｍＭ４℃貯蔵液体ストック）希釈液の２Ｘ濃縮液をＲＰＭＩ＋０．５％ＢＳＡで調製した。標準的インスリン滴定には、例えば：６．２５ｎＭ、１．５６ｎＭ、０．３９ｎＭ、０．０９７ｎＭ、０．０２４ｎＭ、０．００６ｎＭ、０．００１５ｎＭ、０ｎＭ、の４倍系列希釈を含めてもよい。
【０５０６】
Ｍｉｌｌｉｐｌｅｘ  ＭＡＰ細胞内シグナル伝達緩衝液および検出キット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ｃａｔａｌｏｇ＃４８−６０２）およびＰｈｏｓｐｈｏ−ＩＲＳ−１ＭＡＰＭａｔｅｓ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ｃａｔａｌｏｇ＃４６−６２７）を採用し、メーカーのインストラクションに従ってｐＩＲＳ−１レベルの検出を行った。手短に述べれば、２Ｘ処理培地（０．５％ＢＳＡ＋／−試験抗体を含むＲＰＭＩ）を入れた５０ｕｌ／ウエルＶ底プレートを用意し、５０ｕｌ  ＲＰＭＩ＋０．５％ＢＳＡ中に再懸濁した１ｘ１０６細胞血清飢餓状態ＩＭ−９細胞を各ウエルに添加した。インスリン処理の前に、（ａ）後でインスリンの系列希釈を含むウエルに添加するための、単一抗体濃度のバルク抗体／細胞混合物として、または（ｂ）細胞を直接抗体系列希釈を含むウエルに添加し、０．１ｎＭインスリンに添加することにより、１５分間抗体前処理を行った。プレートを３７℃インキュベーター中に置き、処理時間（全体で１５分）の最後の３分間、ＲＴで１５００ｒｐｍの遠心分離を行った。上清を反転して取り出し、緩やかに吸い取りを行い、処理細胞ペレットを、マルチチャンネルピペットを使って下表４に従って調整した１００ｕｌ溶解緩衝液（不安定な成分、すなわち、プロテアーゼ阻害剤およびベンゾナーゼ、は使用直前に添加）を使って３回トリチュレートして溶解した。プレートを振盪器にＲＴで３０分間置き、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、ライセートを清澄化して、破砕中に発生したと思われる全ての気泡を除去した。５０ｕｌの清澄化ライセートを取り出し、検出キットの５０ｕＬアッセイ緩衝液−１（ＡＢ−１）中で１：１に希釈し、２〜３回破砕して混合した後、５０ｕｌを、希釈したビーズの２５ｕｌ／ウエルの上端にあるフィルタープレートメンブレンにロードした（下記参照）。
【０５０７】
（表４）溶解緩衝液成分
0005849050.tif 000008
【０５０８】
フィルタープレートメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃａｔａｌｏｇ＃ＭＡＢＶＮ１２５０）を２５μｌＡＢ−１／ウエルで前湿処理した。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ真空マニホールドを使って、メンブレンを乾燥しないように注意しながら、前湿処理に使った緩衝液をフィルタープレートから吸引し、全ての残っている液体をフィルタープレートの底から吸引した。２５μｌの１Ｘビーズ懸濁液を各ウエルに添加した（ｐＩＲＳ−１ビーズ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ｃａｔａｌｏｇ＃４６−６２７）は、２０Ｘ濃縮液からＡＢ−１緩衝液で希釈し、５秒間ずつ３回の、ボルテックス、あるいは、超音波処理により前調製した）。
【０５０９】
フィルタープレートウエルを、プレート封止剤で覆い、アルミニウムフォイルをかぶせて、光曝露を防いで、プレート振盪器を使い（Ｌａｂｌｉｎｅ、Ｂｅｌｌｃｏプレート振盪器または類似モデルで設定７〜８）、ＲＴで２時間、または４℃で一晩、インキュベートした。
【０５１０】
Ｌｕｍｉｎｅｘ検出
フィルタープレートを吸引し、底部から吸いとった。ウエルに残ったビーズを１００μｌのＡＢ−１で洗浄し、振盪器に１〜２分置いた。プレートを吸引し、洗浄工程を繰り返した。
【０５１１】
２０ＸストックからＡＢ−１緩衝液で希釈した１Ｘビオチン化検出抗体の２５μｌ／ウエルを添加し、振盪器を使ってＲＴで１時間インキュベートした。プレートを吸引し、底部から吸い出した。２５ＸストックからＡＢ−１緩衝液で希釈した１Ｘストレプトアビジンフィコエリトリンの２５μｌ／ウエルを加え、プレートを、振盪器を使って室温で１５分間インキュベートした。２５ｕｌの増幅緩衝液（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ｃａｔａｌｏｇ＃４８−６０２）を各ウエルに加え、プレートを、振盪器を使ってＲＴでさらに１５分間インキュベートした。プレートを吸引し、ビーズを１５０μＬのＬＡＢ−１に再懸濁して、Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）装置で読み取った。
【０５１２】
結果
図３は、固定濃度の代表的試験抗体の存在下のインスリンの滴定によるｐＩＲＳ−１アッセイ結果を示す。ＭＦＩは、カーブ最適フィットが１００％に調整されるように正規化した。一部の抗体（正のモジュレーター）は、インスリン滴定曲線を左へシフトさせた。他の抗体（負のモジュレーター）は、インスリン滴定曲線を右へシフトさせた。多様な大きさの調節が観察された。図３のデータは、抗体が、インスリン感受性の９倍までの増加または２４倍までの減少を作り出すことを示す。
【０５１３】
図４は、ｐＩＲＳ−１アッセイデータに基づく、種々の機能クラスの抗体の代表的な例を示す。それぞれのケースで、次の２つのモードのアッセイ結果を示す：（ｉ）固定抗体濃度化でのインスリンの滴定、および（ｉｉ）固定インスリン濃度下での試験抗体の滴定。
【０５１４】
図５は、固定濃度の種々の試験抗体の存在または非存在下のｐＩＲＳ−１アッセイによるインスリンＥＣ５０値を示す表である。結果は、ＥＣ５０比率＋Ａｂ／−Ａｂに従ってランクづけした。
【０５１５】
実施例５
抗ＩＮＳＲ抗体のＡＫＴおよびＭＡＰＫのＩＮＳＲ誘導リン酸化に与える効果の測定
ＩＮＳＲは、インスリン結合後、自己リン酸化を行い、続いて、細胞内のタンパク質、例えば、インスリン受容体基質（ＩＲＳ）ファミリーメンバー、Ｓｈｃ、およびＧａｂ１のリン酸化を触媒するチロシンキナーゼである。これらの各タンパク質は、ＰＩ（３）Ｋ／ＡＫＴおよびＭＡＰキナーゼ（ＭＡＰＫ）経路を含む種々のシグナル伝達経路の活性化をもたらす下流シグナル伝達分子の補充のための結合部位として機能する。これらの経路は、最終的には、細胞増殖および分化、遺伝子発現、グリコーゲン、タンパク質および脂質合成、ならびにグルコース代謝を協調して調節する。
【０５１６】
ＩＮＳ／ＩＮＳＲ複合体を介したシグナル伝達への試験抗体の効果は、ＩＮＳＲシグナル伝達経路に特異的な特定の細胞内タンパク質、例えば、ＡＫＴおよびＭＡＰＫ（ＥＲＫ１／２）、のインスリン誘導セリンまたはチロシンリン酸化を強化する抗体の能力を評価することにより測定できる。これらのタンパク質のリン酸化は、電気化学発光、ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、および当技術分野で既知の他の技術により測定および定量できる。
【０５１７】
この実施例のアッセイでは、ヒトまたはマウスＩＮＳＲを発現するように操作された、ＣＨＯＫ１細胞を使用した。これらの細胞は、ＣＨＯ細胞（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）用ＥＸ−ＣＥＬＬ３０２無血清培地、２ｍＭＬ−グルタミン、および０．４ｍｇ／ｍＬ  ＧＥＮＥＴＩＣＩＮ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を含む増殖培地中で維持した。親ＣＨＯＫ１細胞は、対照として使用し、ＧＥＮＥＴＩＣＩＮ（登録商標）を含まない増殖培地中で維持した。
【０５１８】
アッセイの前日、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２ｍＭＬ−グルタミン、０．４ｍｇ／ｍＬ  ＧＥＮＥＴＩＣＩＮ（登録商標）、および０．５％ＢＳＡを含む飢餓培地中に、１ｘ１０６細胞／ｍＬの濃度で再懸濁し、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーター中で１６〜２０時間インキュベートした。ＧＥＮＥＴＩＣＩＮ（登録商標）を含まない飢餓培地中で、親ＣＨＯＫ１細胞をインキュベートした。翌日、細胞を、０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳに再懸濁し、１ｘ１０５細胞を、９６−ウエルプレートのウエルに添加した。インスリン添加の約１０分前に、０、１、または１０ｕｇ／ｍｌの試験抗体を加えた。３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで５〜６０分インキュベーション後、処理細胞を遠心分離し、２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１％トリトンＸ−１００、１０ｍＭ  ＮａＦ、ホスファターゼ阻害剤混合物１および２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ならびにＣｏｍｐｌｅｔｅ  Ｍｉｎｉプロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を含む緩衝液に、４℃で振盪を加えながら１時間溶解した。４８５ｘｇで３分間遠心分離して、ライセートを清澄化した。ＭｅｓｏＳｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｍｕｌｔｉ−ｓｐｏｔ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を使って、電気化学発光によりライセート中に存在するリン酸化ＡＫＴまたはＭＡＰＫの量を定量した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）ソフトウェアを使ってデータを解析し、４−パラメータロジスティック方程式によりＥＣ５０値を計算した。
【０５１９】
アゴニスト活性の分析のために、アッセイを以下のように行った。アッセイ前日、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２ｍＭＬ−グルタミン、０．４ｍｇ／ｍＬ  ＧＥＮＥＴＩＣＩＮ（登録商標）、および０．５％ＢＳＡを含む飢餓培地に、１ｘ１０６細胞／ｍＬの濃度で再懸濁して、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで１６〜２０時間インキュベートした。ＧＥＮＥＴＩＣＩＮ（登録商標）を含まない飢餓培地中で、親ＣＨＯＫ１細胞をインキュベートした。翌日、０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳに細胞を再懸濁し、１ｘ１０５細胞を９６−ウエルプレートのウエルに添加した。３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで５〜６０分試験抗体をインキュベーション後、処理細胞を遠心分離し、２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１％トリトンＸ−１００、１０ｍＭ  ＮａＦ、ホスファターゼ阻害剤混合物１および２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ならびにＣｏｍｐｌｅｔｅ  Ｍｉｎｉプロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を含む緩衝液に、４℃で振盪を加えながら１時間溶解した。４８５ｘｇで３分間遠心分離して、ライセートを清澄化した。ＭｅｓｏＳｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｍｕｌｔｉ−ｓｐｏｔ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を使って、電気化学発光によりライセート中に存在するリン酸化ＡＫＴまたはＭＡＰＫの量を定量した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．、ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ）ソフトウェアを使ってデータを解析し、４−パラメータロジスティック方程式によりＥＣ５０値を計算した。
【０５２０】
図６は、次の代表的抗体のｐＡＫＴアッセイ結果である：（Ａ）正のモジュレーター（増加インスリン誘導シグナル伝達の増加）；（Ｂ）アゴニズムを伴う正のモジュレーター（インスリン誘導シグナル伝達の増加およびインスリン非依存性シグナル伝達の増加）（Ｃ）非モジュレーター（インスリン誘導シグナル伝達に有意な効果なし）；（Ｄ）アゴニスト（インスリンとは無関係にシグナル伝達が増加；調節活性を有する可能があるかまたはない）（Ｅ）負のモジュレーター（インスリン誘導シグナル伝達の減少）。また、アッセイ結果は、抗体が、機能的交差反応性、すなわち、ヒトおよびマウス両方のＩＮＳＲ媒介シグナル伝達に対する効果、を有するか否かについても示している。
【０５２１】
実施例６
抗ＩＮＳＲ抗体は種々のアゴニズムを示す
実施例４のｐＩＲＳ−１アッセイおよび実施例５のｐＡＫＴアッセイを、選択抗ＩＮＳＲ抗体のアゴニズムの度合の測定に使用した。抗体またはインスリンの滴定を使うよりはむしろ、インスリンの非存在下、５μｇ／ｍｌの抗ＩＮＳＲ抗体をアッセイに添加した。インスリン（アゴニズム）の非存在下、アッセイで、ＩＮＳＲを介したシグナル伝達の抗体誘導活性化レベルを測定した。
【０５２２】
図７は、選択抗体が一連のアゴニズムを示すことを例証する、一覧にした結果である。
【０５２３】
実施例７
正のモジュレーターＩＮＳＲ抗体によりもたらされた、ＩＮＳＲに結合するインスリンの協同性の変化
種々の抗体濃度を使い、系列希釈のインスリンを添加して、１つの正のモジュレーター抗体に対して実施例５のｐＡＫＴアッセイを行った。結果は、図８に示す。図８Ａは、特異的濃度の抗体およびインスリンの存在下、ＩＮＳＲ結合の用量反応があることを示す。図８Ｂは、種々の濃度の抗体の存在下の、インスリン−ＩＮＳＲ相互作用の相対的ヒルスロープを示す。
【０５２４】
実施例８
正のモジュレーターＩＮＳＲ抗体によるグルコース取り込みの増強
３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞のグルコース取り込みに与える正のモジュレーターＩＮＳＲ抗体の効果を測定した。インスリン治療の際は、ＩＮＳＲがリン酸化され、シグナル伝達経路を活性化し、脂肪細胞（脂肪）または筋細胞（筋肉）中のグルコース輸送体４（ＧＬＵＴ４）によるグルコース取り込みの増加につながる。測定グルコース取り込みの測定により、インスリン感受性に対する関連するエンドポイントアッセイが提供される。
【０５２５】
ＧＬＵＴ４の基質として３Ｈ−２−デオキシグルコースを使ったアッセイを採用した（Ｚｅｎ−Ｂｉｏ、Ｉｎｃ．、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｐａｒｋ、ＮＣ）。手短に述べれば、３Ｔ３−Ｌ１前駆脂肪細胞を９６ウエルイソプレート中で分化した。成熟後、細胞をアッセイ緩衝液で２回洗浄し、細胞をアッセイ緩衝液中で４時間静置した。細胞を抗ＩＮＳＲ抗体、または対照抗体（１０ｕｇ／ｍｌ）、および連続的濃度のインスリン、または０．８ｎＭのインスリン、で１５分間処理した。１５分後、３Ｈ−２−デオキシグルコース混合物を添加することによりグルコース取り込みを開始し、細胞を３７℃、５％ＣＯ２で１０分間インキュベートした。１０分後、細胞をＰＢＳで洗浄し、溶解後、シンチレーション液と混合した。各ウエルのＣＰＭを測定した。サイトカラシンＢ（１０μＭ）を陰性対照として使った。
【０５２６】
図９に結果を示す。図９は、正のモジュレーター抗体によるインスリン依存性グルコース取り込みの増強を示す。正のモジュレーター抗体は、インスリン単独に比べ、１０μｇ／ｍｌ試験抗体Ａｂ００１の存在下、３Ｔ３−Ｌ１細胞による３Ｈ−２−デオキシグルコース取り込みの約２倍の増加をもたらす。
【０５２７】
これらの結果は、正のモジュレーター抗体が、インビボグルコース取り込みの誘導およびインスリン抵抗性を示す対象の治療に有用であることを示唆している。
【０５２８】
実施例９
細胞培地中のグルコース欠乏に与える抗ＩＮＳＲ抗体の効果の測定
細胞培地のグルコース欠乏は、グルコース取り込みの代用測定として使用することができる。抗ＩＮＳＲ抗体が培地のグルコース欠乏に与える効果を以下のように測定した。
【０５２９】
グルコース欠乏を測定するために、Ｗａｋｏ  ａｕｔｏｋｉｔグルコース（Ｃａｔ＃４３９−９０９０１、Ａｕｔｏｋｉｔ  Ｃ）をメーカーの説明書に従って使用した。手短に述べれば、２４または９６ウエルプレート中のＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳで接着するように適合されたＣＨＯＫ１細胞株を適切な濃度で播種する。使用前に、細胞を０．５％ＢＳＡＤＭＥＭ（無グルコース）中で、一晩グルコースおよび血清飢餓状態にする。飢餓培地を吸引し、試験抗体またはアイソタイプ対照抗体の存在下または非存在下で次記を含む培地を添加した：グループ１、ＤＭＥＭ無グルコース４部：ＤＭＥＭ高グルコース（０．９ｍｇ／ｍＬ）１部；グループ２、ＤＭＥＭ無グルコース４部：ＤＭＥＭ高グルコース（０．９ｍｇ／ｍＬ）＋インスリン１部。それぞれ所望の時点で、各ウエル毎２ｕＬの培地検体を取り出し、１１８μＬのＷａｋｏ作業溶液を添加する。一部の実施形態では、検体は０、１、２−５、５、１０、および２４時間目に採取する。グルコース取り込みを吸光度５０５ｎｍおよび６００ｎＭでＦＬＥＸＳＴＡＴＩＯＮを使って評価した。グルコースの量は、次のように測定する：［類似検体に対する平均読み値］／［基準に対する平均読み値］。細胞数は、実験の前と終了時点で測定し、細胞増殖のために正規化する。
【０５３０】
実施例１０
抗ＩＮＳＲ抗体の分裂促進的および代謝ＩＮＳＲシグナル伝達のバランスに与える効果の測定
ＩＮＳＲは、次の２つの主要経路により信号伝達を行う：（１）主に代謝を制御し、増殖に幾分影響するＰＩ３キナーゼ／ＰＤＫ１／ＰＫＢ経路、および（２）主に細胞増殖を制御するＲａｓ／ＥＲＫ分裂促進的経路。抗ＩＮＳＲ抗体が分裂促進的と代謝ＩＮＳＲシグナル伝達の間のバランスに与える効果を当技術分野で記載されているようにして測定する。例えば、Ｊｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｖｉｔａｍ  Ｈｏｒｍ．８０：５１−７５、２００９）、Ｄｅ  Ｍｅｙｔｓ  ａｎｄ  Ｓｈｙｍｋｏ、（Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｆｏｕｎｄ．Ｓｙｍｐ．２２７：４６-５７、２０００）；およびＲａｋａｔｚｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５２：２２２７-２２３８、２００３）を参照のこと。
【０５３１】
実施例１１
抗ＩＮＳＲ抗体のインビボでの効果の測定
マウスＩＮＳＲと交差反応するとわかった抗ＩＮＳＲ抗体を多くのインビボモデル中で測定する。ＤＩＯモデルでは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｂ６）雄マウス（Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｍａｉｎｅ）に高脂肪食事（ＨＦＤ）を１２週間摂食させ、肥満で、軽度から中程度の高血糖および耐糖能障害になっている。このモデルを使ってＩＮＳＲ抗体のインスリン感受性に影響する能力を厳重に制御した設定下で評価する。このシステムは、また、正常状態と病気の状態の下のＩＮＳＲ作用および調節の直接比較を可能とする。この実験では、ＤＩＯまたは同年齢のＢ６マウスに、インスリン抵抗性試験（ＩＴＴ）での所定の準最大用量のインスリンの投与の２４時間前に、ＩＮＳＲ抗体を投与する。対照ＩｇＧまたは最大インスリンは、それぞれ、陰性および陽性対照の役割をする。インスリンに対する応答性は、血漿グルコースの測定により評価する；６０分間にわたるグルコースのより大きな減少は、ＩＮＳＲ応答の増加を示唆する。別の試験で、ＤＩＯまたはＢ６マウスには、糖負荷試験（ＧＴＴ）の２４時間前に抗体を投与する。この測定により、低下した空腹時グルコースおよび曲線下面積（ＡＵＣ）は、インスリン感受性の改善を示す。
【０５３２】
２匹のマウスモデルを使って、２型糖尿病の進行に与えるＩＮＳＲ抗体の影響を評価する。ｏｂ／ｏｂマウス（Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＭＥ）は、レプチン欠乏であり、肥満で、代償性高インスリン血症により軽度の高血糖になっているに過ぎない。このモデルでは、動物は、６週齢の最初にＩＮＳＲ抗体または以前これらの動物で血糖調節を改善することが示された試薬のロシグリタゾン（ＰＰＡＲ−ガンマアゴニスト）の投与を受ける。ＤＩＯ調査の場合のように、ＩＴＴおよびＧＴＴにより、血糖調節を２週毎に６週間評価する。さらに、ヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）、長期高血漿グルコースの主要指標、および脂質パネルを調査の最後に評価する。第２のモデルのストレプトゾトシン（ＳＴＺ）／ＨＦＤモデルでは、Ｓｗｉｓｓ  Ａｌｂｉｎｏマウス（Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｍａｉｎｅ）中の膵臓ベータ細胞が複数の低用量のストレプトゾトシンにより除去されており、一方、インスリン抵抗性は、ＨＦＤ給餌により誘導される。このモデルでは、動物は、膵臓インスリン産生機能障害（後期Ｔ２Ｄに類似の状況）（Ｄａｋｓｈｉｎａｍｏｏｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ６０：１１６７−７３（２００８））による極度の高血糖である。ＳＴＺ／ＨＦＤ動物は、治療され、ｏｂ／ｏｂモデルと類似の方式で評価され、ＩＮＳＲ抗体の疾患進行に対する効果を測定される。
【０５３３】
実施例１２
部分アゴニスト抗ＩＮＳＲ抗体がＤＩＯマウスの血糖調節に与える効果
食事誘導肥満症（ＤＩＯ）モデルでは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、高脂肪食事（ＨＦＤ）を約１２〜１４週摂食後、インスリン抵抗性となる可能性がある。インビトロで部分アゴニストまたは正のモジュレーターとして振る舞うと実証された抗ＩＮＳＲ抗体は、このモデルで評価され、これらの抗体が、インビボでインスリン感受性および／または血糖調節を改善するかどうかが判断される。
【０５３４】
部分アゴニスト抗ＩＮＳＲ抗体が空腹時血糖を低減するかどうかを判断するために、２０週齢ＤＩＯマウス（ＨＦＤを１４週摂食；ｎ＝８／群）を５時間絶食させ、静脈内に部分アゴニスト抗体Ａｂ０３０およびＡｂ０３７、またはアイソタイプ対照（５ｍｇ／ｋｇ）を投与した。別の対照調査では、ＤＩＯマウスをインスリン（０．５Ｕ／ｋｇ）で治療、または正常な食事（ＮＤ）摂食した同年齢マウスに、アイソタイプ対照（５ｍｇ／ｋｇ）を投与した。注射前（時間＝０）、ならびに投与後１、２および４時間目に血糖検体を採取した。同年齢対照に比べ、血糖増加がＤＩＯマウス（ＨＦＤ−ｆｅｄ／アイソタイプ対照）の１時間時点で観察され、ＨＦＤ給餌動物のインスリン抵抗性と一致する（図１０Ａ）。インスリンまたはどちらかの部分アゴニスト抗体の投与により、統計的に有意な血糖の減少（ｐ＜０．０５；片側ｔ検定）が生じた（図１０Ｂ）。いずれの抗体も、いずれの時点でも低血糖を誘導しなかった（血糖値＜３６ｍｇ／ｄＬと定義して）。これらの結果は、抗ＩＮＳＲ部分アゴニスト抗体が、安全にまた効果的に空腹時血糖を低下させることを示唆している。
【０５３５】
部分アゴニスト抗ＩＮＳＲ抗体の血糖調節に対する効果をさらに評価するために、１８週齢ＤＩＯマウス（ＨＦＤを１２週摂食；ｎ＝８／群）に腹腔内（ＩＰ）にＡｂ０３７（０．１、１．０、または９ｍｇ／ｋｇ）またはアイソタイプ対照（１．０ｍｇ／ｋｇ）を注射した。別の対照として、同年齢の対照マウスにアイソタイプ対照（１．０ｍｇ／ｋｇ）を投与、またはＤＩＯ動物にインスリン（０．７５Ｕ／ｋｇ；ＩＰ）を投与した。動物を１６時間絶食させ（抗体投与約８時間後開始）、グルコース（１．０Ｕ／ｋｇ）を注入し、血糖を２時間にわたり追跡することにより、抗体投与２４時間後（インスリン後３０分）糖負荷試験（ＧＴＴ）を行った。この実験では、ＨＦＤは、空腹時グルコースに（図１１Ｂ）または急速投与後ピークグルコースに（図１１Ａ）有意な影響を与えなかった。それにも拘わらず、ＤＩＯマウスでは、部分アゴニスト抗体は、１．０ｍｇ／ｋｇ以上投与の場合アイソタイプ対照に比べて空腹時血糖を有意に低下させ（図１１Ｂ）、また、９．０ｍｇ／ｋｇ投与でＧＴＴ曲線下面積（ＡＵＣ）を減少させた（図１１Ｃ）。
【０５３６】
この結果は、抗ＩＮＳＲ部分アゴニスト抗体が空腹時グルコースを低減でき、血糖調節をインビボで改善できることを示している。
【０５３７】
実施例１３
正のモジュレーター抗ＩＮＳＲ抗体がＤＩＯマウスの血糖調節に与える効果
正のモジュレーター抗ＩＮＳＲ抗体がインビボでインスリン感受性を改善するか否かを判断するために、１８週齢ＤＩＯマウス（ｎ＝８／群）にＡｂ００１（正のモジュレーター）（０．１、１．０または１０ｍｇ／ｋｇ）、部分アゴニスト抗体（Ａｂ０３７）（１０ｍｇ／ｋｇ）またはアイソタイプ対照（１．０ｍｇ／ｋｇ）のＩＰ注射により投与を行った。ＮＤ摂食同年齢マウスにアイソタイプ対照（１．０ｍｇ／ｋｇ）を投与し、別の対照として使用した（図１２Ａ）。５時間の絶食後インスリン（０．５Ｕ／ｋｇ）を投与し、血糖値を２時間にわたりモニタリングすることにより、２４時間後、インスリン抵抗性試験（ＩＴＴ）を行った。ＨＦＤは、通常の食事に比べ、空腹時グルコースに対し（図１２Ｂ）またはＩＴＴのＡＵＣ（図１２Ｃ）に対し有意な影響を与えなかった。また、部分アゴニスト抗体（Ａｂ０３７）の投与も正のモジュレーター抗体（Ａｂ００１）投与も、アイソタイプ対照治療ＤＩＯ動物（図１２Ｃ）と比べて、統計的に有意な低いＡＵＣＩＴＴをもたらさなかった。部分アゴニスト抗体Ａｂ０３７は空腹時グルコースを有意に低減したが、一方、正のモジュレーター抗体Ａｂ００１は、非統計的に有意な、空腹時グルコースの減少化傾向の用量依存性を誘導した。
【０５３８】
次の週に、追加の用量の抗体を投与後、同じ動物にＧＴＴを行った（図１３Ａ）。この調査では、対照摂食動物に比べ、ＨＦＤによる空腹時グルコース（図１３Ｂ）およびＧＴＴＡＵＣ（図１３Ｃ）の非統計的増加が生じた。アイソタイプ対照治療ＤＩＯマウスに比べ、部分アゴニスト抗体および正のモジュレーター抗体は、試験用量で空腹時グルコースの有意な低減があった。さらに、アイソタイプ対照に比べ、部分アゴニスト抗体および正のモジュレーター抗体の両方が１０ｍｇ／ｋｇでのＧＴＴのＡＵＣを有意に低減した。
【０５３９】
１８週齢ＤＩＯマウスに抗体（１０ｍｇ／ｋｇ；ｎ＝５／群）を週２回（ＢＩＷ）、１２週間のＩＰ投与で処置することにより、Ａｂ００１およびＡｂ０３７の脂質パラメーターに与える効果を試験した。この実験では、空腹時グルコース、ＧＴＴおよびＩＴＴに関して、２週間の調査（上述）と類似の効力を観察した。調査の終わりに血漿を集め、標準的ＥＬＩＳＡベースの技術を使って脂質を測定した。アイソタイプ対照に比べ、Ａｂ００１およびＡｂ０３７の両方が、ＤＩＯマウスの空腹時トリグリセリドおよび総コレステロールレベルを低下させ（ｐ＜０．０５；図１４Ａおよび１４Ｂ）、これらの抗体がインスリン抵抗性に関連する脂質調節不全を改善することがことを示唆している。
【０５４０】
１８週齢ＤＩＯマウス（ｎ＝１０／群）を使って、さらに２つの他の正のモジュレーター抗ＩＮＳＲ抗体をインビボでの血糖パラメーターの改善に関し評価した。この調査では、正のモジュレーター抗体Ａｂ０８３およびＡｂ０８５をＡｂ００１およびＡｂ０３７、ならびにアイソタイプ対照抗体に対して比較した。アイソタイプ対照抗体で処置したＮＤ摂食の同年齢群を追加の対照として使用した。全抗体に１０ｍｇ／ｋｇをＢＩＷでＩＰ投与した。抗体の３回目の投与の翌日、空腹時血糖を測定し、ＧＴＴ試験を行った。血糖調節は、同様に処置された同年齢ＮＤ摂食動物と比べて、アイソタイプ対照治療ＤＩＯマウスで大きく損なわれ、ＧＴＴ経時変化による評価および対応するＡＵＣ測定結果に反映されている（図１５Ａおよび１５Ｂ）。この実験では、Ａｂ０３７およびＡｂ０８３は、ＡＵＣを正常値と区別できないレベルまで改善し（ｐ＜０．０５ＨＦＤ／アイソタイプ対照と比較して）、一方、Ａｂ００１は、有意な改善をもたらさなかった。同様に、空腹時グルコースに関して、アイソタイプ対照治療ＤＩＯおよび同年齢ＮＤ摂食マウスの間で有意さが観察され、Ａｂ０３７およびＡｂ００１の両方が統計的に有意な正常化効果を発揮した（ｐ＜０．０５；図１５Ｃ）。Ａｂ０８３は、小さな、非統計的に有意な空腹時血糖の改善をもたらし、一方、Ａｂ０８５は、このパラメーターに関し何らの変化も誘発しなかった。
【０５４１】
抗ＩＮＳＲ抗体のインビボ機能に与える効果の別の測定は、恒常性モデル評価-インスリン抵抗性（ＨＯＭＡ−ＩＲ）によるものである。ＨＯＭＡ−ＩＲは、空腹時血漿グルコースおよび空腹時血漿インスリンレベルに基づき、インビボインスリン感受性の代用測定として開発された経験的数式である：ＨＯＭＡ−ＩＲ＝空腹時血漿インスリン（μＩＵ／ｍＬ）ｘ空腹時血漿グルコース（ｍｍｏｌ／Ｌ）／２２．５、または代わりに変換因子２２．５を組み込んだ式：インスリン（ｎｇ／ｍＬ）ｘグルコース（ｍＭ）、を使う。ＨＯＭＡ−ＩＲの例は、Ｏｗｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １５１：２５１５−２７、２０１０およびＭａｔｔｈｅｗｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ．２８：４１２−９、１９８５、に記載がある。
【０５４２】
投薬の４週後、血漿グルコース、インスリンおよび脂質を評価した。Ａｂ０８３およびＡｂ０３７は、この時点で、血漿グルコースを下げたが、一方、Ａｂ０８３およびＡｂ０８５は、インスリンを低下させた（ｐ＜０．０５；図１６Ａおよび１６Ｂ）。インスリン抵抗性のこのモデルでは、これらの効果は、ＨＯＭＡ−ＩＲ（ｐ＜０．０５；図１６Ｃ）により求められるＡｂ０８３およびＡｂ０８５に関するインスリン感受性の改善に置き換えられる。脂質に関しては、Ａｂ０８５は、トリグリセリドのみを有意に改善した（ｐ＜０．０５；図１６Ｄ）、一方、Ａｂ０８３およびＡｂ０３７は、非エステル化、総および非ＨＤＬコレステロールを有意に低下させた（ｐ＜０．０５；図１６Ｅ−Ｇ）。後者２つの抗体は、また、非ＨＤＬ／ＨＤＬコレステロール比率も改善した（図１６Ｈ）。Ａｂ００１は、総および非ＨＤＬコレステロールの両方を有意に改善した。
【０５４３】
驚くべきことに、全４つの抗体は、アイソタイプ対照と比べて、治療の３週間にわたり、体重をベースライン未満に下げることなく、ＤＩＯマウスの体重増を低下させた（図１７Ａおよび１７Ｂ）。これらの結果は、正のモジュレーター抗体Ａｂ０８３およびアゴニスト抗体Ａｂ０３７が、ＤＩＯマウスの耐糖能障害を矯正し、さらに、モジュレーター抗体Ａｂ０８３およびＡｂ０８５が、インスリン感受性を改善することを示しており、また、全４つの抗体が、ＨＦＤにより生じた体重増を減らす能力を有することを示唆している。
【０５４４】
これらの結果は、ＩＮＳＲに特異的な部分アゴニストおよび正のモジュレーター抗体は、糖尿病対象の血糖調節を改善することを示唆している。
【０５４５】
実施例１４
部分アゴニストおよび正のモジュレーター抗ＩＮＳＲ抗体がｄｂ／ｄｂマウスの血糖調節および疾患に与える効果
自発的Ｌｅｐｒｄｂ対立遺伝子のホモ接合マウスは、レプチン受容体機能が欠け、３〜４週齢から徐々にインスリン抵抗性および肥満になる。これらのマウスでは、約８〜１０週齢までインスリンレベルが上昇し、この時点で、動物は、極度のインスリン抵抗性および高インスリン型である。それにも拘わらず、この遺伝的背景で、約１０週齢後、無制御高血糖になり、膵臓ベータ細胞機能障害をもたらし、最終的にベータ細胞機能不全につながる。インビトロで部分アゴニストまたは正のモジュレーターとして行動することが示された抗ＩＮＳＲ抗体をこのモデルで評価し、これらの抗体がインビボでインスリン感受性、血糖調節および／または疾患進行を改善するかどうかを判断した。
【０５４６】
極度の肥満症と組み合わされた進行性インスリン抵抗性およびベータ細胞機能不全の設定で、ｄｂ／ｄｂマウスを使用して、Ａｂ００１およびＡｂ０３７の活性を評価した。この実験では、Ａｂ００１（１ｍｇ／ｋｇもしくは１０ｍｇ／ｋｇ）、Ａｂ０３７（１０ｍｇ／ｋｇ）またはアイソタイプ対照抗体（１ｍｇ／ｋｇもしくは１０ｍｇ／ｋｇ）を５週齢ｄｂ／ｄｂマウス（ｎ＝１０／群）にＢＩＷでＩＰ投与した。追加の対照として、表現型的には正常な、同年齢ヘテロ接合同腹仔の群に１０ｍｇ／ｋｇのアイソタイプ対照抗体を同様に投与した。ＤＩＯモデルの場合と同様に、最初の治療の５週の間、アイソタイプ対照治療マウスに比べ、１０ｍｇ／ｋｇのＡｂ００１またはＡｂ０３７で治療した動物で体重増が有意に減少した（ｐ＜０．０５；図１８Ａおよび１８Ｃ）。重要なことに、１０週齢に相当する、５週間の治療後、膵臓ベータ細胞欠乏の結果により、通常ｄｂ／ｄｂマウスの重量減少が始まるこの時期に、両抗体が体重減少を少なくした（ｐ＜０．０５；図１８Ｂおよび１８Ｄ）。１０週間の治療後、Ａｂ００１またはＡｂ０３７の１０ｍｇ／ｋｇでの治療により、対応するアイソタイプ対照治療群と比べて、空腹時血糖の有意な改善が観察された（ｐ＜０．０５；図１９Ａ）。さらに、この時点で、ＨｂＡ１ｃが１ｍｇ／ｋｇＡｂ００１群で有意に減少し、また、１０ｍｇ／ｋｇのＡｂ００１群で、より少ない程度に減少した（ｐ＜０．０５；図１９Ｂ）。
【０５４７】
投薬の１４週後、血漿インスリンおよび脂質を評価した。この時点で、Ａｂ００１（１０ｍｇ／ｋｇ）およびＡｂ０３７の両方がある年齢（約２０週齢）で循環インスリンを増加させたが（ｐ＜０．０５；図２０Ａ）、この年齢では、これらの動物は、膵臓ベータ細胞機能不全になっていると予想され、両ｍＡｂがインスリン産物をインスリン不足動物中に貯蔵できることを示唆している。さらに、Ａｂ００１（１０ｍｇ／ｋｇ）は、血漿トリグリセリド、総コレステロール、非ＨＤＬコレステロール、非エステル化コレステロールおよび非ＨＤＬ／ＨＤＬコレステロール比率（ｐ＜０．０５；図２０Ｂ−Ｆ）を有意に改善した。非エステル化コレステロールの有意な減少およびトリグリセリド低下傾向がＡｂ０３７治療動物由来血漿で観察された（それぞれ、ｐ＜０．０５およびｐ＝０．０８；図２０Ｂおよび２０Ｃ）。
【０５４８】
興味深いことに、ＤＩＯモデルのケースと同様に、動物がインスリン抵抗性であるが、極度のベータ細胞欠乏が予測されない間に、体重増の減少が早期に起こる。しかし、この実験では、血糖調節および糖化ヘモグロビンのＡｂ００１誘導による変化は、後期相で起こり、この時期には、動物はベータ細胞機能不全であると予想される。さらに、この時期の間、両抗体は、病理学的体重減を減少させた。理論に拘泥するわけではないが、今結果は、重量および血糖調節に与える抗ＩＮＳＲ抗体の効果は、連携しているが別々に起こりうることを示唆している。これらのデータは、インスリン抵抗性およびベータ細胞欠乏の組み合わされた状態下で、Ａｂ００１が重量を正常化し、血糖調節を改善し、さらに、部分的に脂質異常症を修正することができることを示唆している。
【０５４９】
極度のインスリン抵抗性およびインスリン不足状態下で抗体の作用を評価するために、進行性膵臓ベータ細胞機能不全が現れると予測される１０週齢ｄｂ／ｄｂマウスに、Ａｂ００１、Ａｂ０３７、Ａｂ０８３、Ａｂ０８５またはアイソタイプ対照抗体の１０ｍｇ／ｋｇをＢＩＷで８週間ＩＰ投与して治療した。調査期間中、空腹時血糖を毎週測定した。この調査では、アイソタイプ対照に比較して、Ａｂ０８５が空腹時血糖を有意に減少させた（ｐ＜０．０５；図２１）。これは、Ａｂ０８５がインスリン抵抗性、低インスリン状態下の疾患を改善することを示す。
【０５５０】
極度のインスリン抵抗性が現れると予測される５週齢ｄｂ／ｄｂマウスのインスリン抵抗性の改善に関して、２つの別の正のモジュレーター抗ＩＮＳＲ抗体を評価した。マウスＡｂ００１、Ａｂ０３７、Ａｂ０８３、Ａｂ０８５またはアイソタイプ対照抗体の１０ｍｇ／ｋｇをＢＩＷで４週間ＩＰ投与して治療し、ベータ細胞機能不全の発症前に、抗体のインスリン抵抗性に与える効果を評価した。空腹時血漿グルコースおよび空腹時血漿インスリンを調査の終わりに測定し、ＨＯＭＡ−ＩＲを計算した。この調査では、アイソタイプ対照に比較して、Ａｂ０８３およびＡｂ０８５がインスリン抵抗性を有意に改善し（ｐ＜０．０５；図２２）、これらの抗体がこの糖尿病モデルでインスリン感受性を改善することを示した。
【０５５１】
実施例１５
部分アゴニストおよび正のモジュレーター抗ＩＮＳＲ抗体がＭＬＤＳ／ＨＦＤマウスの血糖調節および疾患に与える効果
頻  回低用量ストレプトゾトシン（ＭＬＤＳ）／ＨＦＤモデルでは、インスリン抵抗性は、６週齢ＩＣＲマウスにＨＦＤ（４０ｋｃａｌ％脂肪）を４週間給餌することにより実現され、この間、５回の一日量ストレプトゾトシン（第３週の間に、４０ｍｇ／ｋｇ）をＩＰ投与し部分的にベータ細胞機能を除去する。インビトロで部分アゴニストまたは正のモジュレーターとして機能することが示された抗ＩＮＳＲ抗体をこのモデルで評価し、これらの抗体がインビボでインスリン感受性、血糖調節および／または疾患進行を改善するかどうかを判断した。
【０５５２】
Ａｂ００１およびＡｂ０３７のインスリン抵抗性およびベータ細胞機能不全を組み合わせたモデルにおける疾患に対する効果を評価するために、ＭＬＤＳ／ＨＦＤマウス（ｎ＝１０／群）にＡｂ００１、Ａｂ０３７またはアイソタイプ対照抗体の１０ｍｇ／ｋｇをＢＩＷで６週間ＩＰ投与した。最初の投与の１週間後、同年齢の正常な動物と比べて、空腹時血糖の３倍増加がアイソタイプ対照治療の病気のマウスで観察され、糖尿病性表現型が獲得されたことが確認できた。この時点で、ＧＴＴを行い、Ａｂ００１およびＡｂ０３７の両方に対し、血糖調節の有意な改善が示された（ｐ＜０．０５；図２３Ａおよび２３Ｂ）。空腹時血糖は、また、Ａｂ０３７（ｐ＜０．０５）で治療したマウス群で有意な減少があったが、一方、Ａｂ００１による有意な変化は誘発されなかった（図２３Ｃ）。１週間後、給餌グルコースを評価した。空腹時グルコースと同様に、ＭＬＤＳ／ＨＦＤマウスの疾患が著しく高い給餌グルコース値により明らかで、これはＡｂ０３７により改善された（ｐ＜０．０５；図２４Ａ）。これらのＧＴＴの改善および給餌／空腹時グルコースと整合して、Ａｂ０３７は、投薬の６週間後、ＨｂＡ１ｃを約１．５％減少させた（ｐ＜０．０５；図２４Ｂ）。調査の終わりの血漿分析により、Ａｂ０３７治療は、血漿インスリンの統計的に有意な正常化および非ＨＤＬ／ＨＤＬコレステロール比率のより小さい減少をもたらし、一方、Ａｂ００１は、血漿レプチン濃度を有意に改善し、類似だがより小さい矯正的影響を血漿インスリンに対し与える（ｐ＜０．０５；図２５Ａ−Ｃ）ことを示した。このモデルは、ｄｂ／ｄｂモデルの場合のような一貫した、疾患関連重量変化を示さず、このモデルでは、Ａｂ００１もＡｂ０３７も、体重に影響を与えなかった（図２６）。これは、他のインビボモデルでこれらの抗体に関し観察された体重増の減少が、非特異的効果ではなかったことを示唆している。このデータは、Ａｂ０３７がＭＬＤＳ／ＨＦＤマウスの複数の疾患の徴候を改善し、一方、Ａｂ００１も、このモデルの障害性血糖調節の一部のパラメーターを修正することを示している。
【０５５３】
２つの別の正のモジュレーター抗ＩＮＳＲ抗体をインビボでの血糖パラメーターの改善に関し評価した。ＭＬＤＳ／ＨＦＤマウス（ｎ＝１０／群）にＡｂ００１、Ａｂ０３７、Ａｂ０８３、Ａｂ０８５またはアイソタイプ対照抗体の１０ｍｇ／ｋｇをＢＩＷで６週間ＩＰ投与した。治療の３週後、ＧＴＴを行い、アイソタイプ対照と比べて、Ａｂ０３７およびＡｂ０８３が血糖調節を完全に正常化することが示された（ｐ＜０．０５；図２７Ａおよび２７Ｂ）。空腹時血糖も、６週間の調査期間中、Ａｂ０３７またはＡｂ０８３で治療したマウスで有意に減少し（ｐ＜０．０５）、一方、Ａｂ００１またはＡｂ０８５では有意な変化は誘発されなかった（図２８）。調査の終わりに、血漿脂質評価した。Ａｂ０８３は、血漿トリグリセリド、非エステル化コレステロール、総コレステロール、非ＨＤＬコレステロール、非ＨＤＬ／ＨＤＬコレステロール比率および遊離脂肪酸を有意に改善した（ｐ＜０．０５；図２９Ａ−Ｆ）。さらに、Ａｂ００１は、総、非ＨＤＬおよび非エステル化コレステロール、ならびに非ＨＤＬ／ＨＤＬコレステロール比率を有意に減少させた。Ａｂ０３７は、非ＨＤＬコレステロール、非エステル化コレステロール、非ＨＤＬ／ＨＤＬコレステロール比率および遊離脂肪酸を改善した。この実験では、Ａｂ０８５は、遊離脂肪酸のみを有意に減少させた。ＧＴＴおよび空腹時グルコースの改善の観察結果と整合して、Ａｂ０３７およびＡｂ０８３は、投薬６週間後、ＨｂＡ１ｃを有意に減少させた（ｐ＜０．０５；図３０）。さらに、空腹時グルコースおよび耐糖能であまり効果を発揮しなかったが、特定の脂質パラメーターを改善したＡｂ００１およびＡｂ０８５が、また、ＨｂＡ１ｃも低減させた。前の実験の場合のように、このモデルでは、投薬の最初の３週間の間、体重増を減したＡｂ０８５（図３１）を除いて、いずれのｍＡｂも体重に有意に影響を与えなかった。このデータは、この体重無変化（ｗｅｉｇｈｔ  ｎｅｕｔｒａｌ）モデルで体重に影響を与えることなく、４つの試験抗体全てがＭＬＤＳ／ＨＦＤマウスの複数の疾患の徴候を改善することを示している。
【０５５４】
実施例１６
部分アゴニストおよび正のモジュレーター抗ＩＮＳＲ抗体の２４時間投与がインビボのＩＮＳＲリン酸化に与える効果
抗ＩＮＳＲ抗体の短期間投与による肝臓および筋肉、等のインスリン感受性組織のＩＮＳＲチロシンリン酸化の増加によって、抗体が生物学的に利用可能であり、インビトロで観察されたのと同様にインビボでＩＮＳＲに対し作用可能であることが確認される。この実験では、インビトロで部分アゴニストまたは正のモジュレーターであると特定された抗ＩＮＳＲ抗体をＣ５６ＢＬ／６雄マウスに２４時間投与し、これら抗体が基底ならびにインスリン誘導肝臓および筋肉ＩＮＳＲリン酸化に与える効果を評価した。
【０５５５】
ＩＮＳＲ部分アゴニストおよび正のモジュレーターが肝臓および筋肉のＩＮＳＲリン酸化を増加させるかどうかを判断するために、１０週齢Ｃ５６ＢＬ／６雄マウス（ｎ＝３）に抗ＩＮＳＲまたはアイソタイプ対照抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）を２４時間投与し、さらに、マウスにインスリン急速投与（１Ｕ／ｋｇ）またはＰＢＳの１０分間投与をして、ＥＬＩＳＡを使って、肝臓および筋肉のＩＮＳＲチロシンリン酸化に与える効果を測定した。リン酸化ＩＮＳＲ濃度濃度は、全体インスリン受容体濃度に対し正規化し、パーセンテージで表した。
【０５５６】
外因性のインスリン（１Ｕ／ｋｇ）は、肝臓においても筋肉においても、対照動物のＩＮＳＲリン酸化を有意に増加させなかった（増加させそうな傾向はあったが）（図３２Ａ、Ｂ）。しかし、肝臓では、Ａｂ０８３−およびＡｂ０３７−治療マウスでのインスリン刺激ＩＮＳＲリン酸化の有意な増加（ｐ＜０．０５）ならびに、ほぼ有意なＡｂ０８５−治療マウスでの増加（ｐ＝０．０７）が観察された（図３２Ａ）。この結果は、部分アゴニストおよび正のモジュレーター抗体がインビボでのインスリンに対する応答性を増加させることが可能であることを示唆している。興味深いことに、肝臓では、Ａｂ０８３は、基底状態（外因性のインスリンのない状態）でもＩＮＳＲリン酸化を有意に増加させ、Ａｂ０８３は、空腹時レベルの少ない内在性インスリンの存在下でもインスリンへの応答を感作することが可能であることを示唆している。
【０５５７】
抗ＩＮＳＲ部分アゴニストおよび正のモジュレーター抗体による最も顕著な効果は、筋肉で認められた。３つの抗ＩＮＳＲ抗体全ては、インスリン急速投与を受けたマウスのインスリンシグナル伝達を正に調節した一方で、対照動物に比較した場合、Ａｂ０８３およびＡｂ０８５（こちらの方が作用が大きい）もまた、内在性の、空腹時レベルのインスリンに対する筋肉ＩＮＳＲシグナル伝達を感作させた（図３２Ｂ）。
【０５５８】
これらの結果は、部分アゴニストおよび正のモジュレーター抗ＩＮＳＲ抗体の両方が、インビボでの肝臓および筋肉中のインスリン媒介シグナル伝達に対する応答性を改善することを示唆している。Ａｂ０３７の効果に比べ、抗体Ａｂ０８３およびＡｂ０８５は、相対的に低いインスリン濃度でＩＮＳＲを感作する。
【０５５９】
実施例１７
別の抗体ファージディスプレイライブラリー由来の抗ＩＮＳＲ抗体の単離
別のナイーブ抗体ライブラリーからＩＮＳＲ特異的抗体を選別した。
【０５６０】
（１）ファージパニングおよびレスキュー
ヒトインスリン受容体（ｈＩＮＳＲ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を実施例１に記載のようにビオチン化し、別のナイーブ抗体ファージディスプレイライブラリーのパニングに使用した。
【０５６１】
Ａ．ｓｃＦｖライブラリー
ｓｃＦｖナイーブライブラリー：ファージパニングの最初のラウンドで、ｓｃＦｖラムダファージディスプレイライブラリー由来の４．５ｘ１０１２ｃｆｕのファージ粒子またはｓｃＦｖカッパファージディスプレイライブラリー（ＸＯＭＡＬＬＣ、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、ＣＡ）由来の４．１２ｘ１０１２ｃｆｕのファージ粒子を、１ｍｌの５％ミルク／ＰＢＳ（Ｔｅｋｎｏｖａ、Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ、ＣＡ）中でゆっくり回転させながら室温（ＲＴ）で１時間ブロッキングした。これは、２つの別のパニング、ｓｃＦｖカッパおよびｓｃＦｖラムダ、を表している。ストレプトアビジンコート磁性Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ−２８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｄｙｎａｌ  ＡＳ、Ｏｓｌｏ、Ｎｏｒｗａｙ）に対して、ブロッキングしたファージの３０分の選択解除を２回行った。ビオチン−ｈＩＮＳＲ−ｈＩＮＳ複合体を形成するために、１０３ｐモルのビオチン化ｈＩＮＳＲを５％ミルク／ＰＢＳに溶解した過剰（２，１００ｐモル）のヒトインスリン（ｈＩＮＳ）（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）と共に、ＲＴで１時間ゆっくり回転させながらプレインキュベートした。第２ラウンドのパニングでは、５０ｐモルのビオチン−ｈＩＮＳＲを１０５０ｐモルｈＩＮＳと一緒に使用した。最終ラウンドのパニングでは、２５ｐモルのビオチン−ｈＩＮＳＲを５２５ｐモルｈＩＮＳと共にインキュベートした。
【０５６２】
Ｂ．Ｆａｂライブラリー
Ｆａｂナイーブライブラリー：最初のラウンドのファージパニングでは、２つの別のレスキューのＦａｂラムダライブラリー（ＸＯＭＡＬＬＣ、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、ＣＡ）由来の１．２ｘ１０１３ｃｆｕのファージ粒子もしくは１．８ｘ１０１３ｃｆｕのファージ粒子、または２つの別のレスキューのＦａｂカッパライブラリー（ＸＯＭＡＬＬＣ、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、ＣＡ）由来の７．２ｘ１０１２ｃｆｕのファージ粒子または１．８ｘ１０１３ｃｆｕのファージ粒子を、１ｍｌの５％ミルク／ＰＢＳ（Ｔｅｋｎｏｖａ、Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ、ＣＡ）中でゆっくり回転させながら室温（ＲＴ）で１時間ブロッキングした。これは、４つの別個のパニングを表している。ストレプトアビジンコート磁性Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ−２８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｄｙｎａｌ  ＡＳ、Ｏｓｌｏ、Ｎｏｒｗａｙ）に対して、ブロッキングしたファージの３０分の選択解除を２回行った。ビオチン−ｈＩＮＳＲ−ｈＩＮＳ複合体を形成するために、１０３ｐモルのビオチン化ｈＩＮＳＲを５％ミルク／ＰＢＳに溶解した過剰（２，１００ｐモル）のヒトインスリン（ｈＩＮＳ）（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）と共に、ＲＴで１時間ゆっくり回転させながらプレインキュベートした。第２ラウンドのパニングでは、５０ｐモルのビオチン−ｈＩＮＳＲを１０５０ｐモルｈＩＮＳと一緒に使用した。最終ラウンドのパニングでは、２５ｐモルのビオチン−ｈＩＮＳＲを５２５ｐモルｈＩＮＳと共にインキュベートした。
【０５６３】
ビオチン−ｈＩＮＳＲ／ｈＩＮＳ溶液を、ブロッキングしたストレプトアビジンコート磁性Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ−２８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｄｙｎａｌ  ＡＳ、Ｏｓｌｏ、Ｎｏｒｗａｙ）と共に３０分間、ゆっくり回転させながらインキュベートし、ビオチン−ｈＩＮＳＲ−ｈＩＮＳ複合体に固定化した。選択解除したファージを、ビオチン−ｈＩＮＳＲ−ｈＩＮＳストレプトアビジンビーズと共にＲＴで２時間インキュベートした。ｈＩＮＳＲをｈＩＮＳで飽和させるために、追加のｈＩＮＳ（２，１００ｐモル）を溶液に加えた。ビーズを洗浄した。最初のラウンドのパニングでは、０．５％ミルク−ＰＢＳ−０．１％ＴＷＥＥＮで素早く３回ビーズを洗浄し（すなわち、磁石を使ってビーズを溶液から取り出し、１ｍｌの洗浄緩衝液中に再懸濁した）、次に、０．５％ミルク−ＰＢＳによる３回の洗浄、続けて、ＰＢＳで１回の急速洗浄を行った。第２ラウンドのパニングでは、ビーズに対し、０．５％ミルク−ＰＢＳ−０．１％ＴＷＥＥＮで素早く５回洗浄し、続けて０．５％ミルク−ＰＢＳ−０．１％ＴＷＥＥＮによる５分の洗浄を１回（１ｍｌの洗浄緩衝液中、室温でゆっくり回転させながら）さらに０．５％ミルク−ＰＢＳによる５回の洗浄とその後の０．５％ミルク−ＰＢＳによる５分の洗浄を１回、およびＰＢＳでの１回の急速洗浄を行った。第３ラウンドのパニングでは、ビーズに対し、０．５％ミルク−ＰＢＳ−０．１％ＴＷＥＥＮを使っての４回の急速洗浄に続けて、０．５％ミルク−ＰＢＳ−０．１％ＴＷＥＥＮによる５分の洗浄を２回、さらに０．５％ミルク−ＰＢＳでの４回の急速洗浄とそれに続く、０．５％ミルク−ＰＢＳでの５分の洗浄を２回、その後のＰＢＳによる１回の急速洗浄を行った。
【０５６４】
Ｃ．溶出およびレスキュー
ｈＩＮＳＲ−ｈＩＮＳ−ストレプトアビジンビーズ結合ファージを、０．５ｍｌの１００ｍＭトリエチルアミン（ＴＥＡ）を使い、ＲＴでゆっくり回転させながら３０分間溶出した。ビーズを溶出液から分離した。溶出液を取り出し、０．５ｍｌの１Ｍトリス塩酸（ｐＨ７．４）で中和した。ビーズを１ｍｌの１Ｍトリス塩酸（ｐＨ７．４）で中和した。ビーズまたは溶出液由来の溶出ファージを、別々に使用し、ＯＤ６００が約０．５に達するとＴＧ１細菌性細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）に注入した。３７℃で３０分間の振盪なしでの感染、および３７℃で９０ｒｐｍの振盪を３０分間加えての感染後、細胞をペレット化し、１００ｕｇ／ｍｌカルベニシリンおよび２％グルコースを補充した２ＹＴ培養液中に再懸濁した。再懸濁細胞を１００ｕｇ／ｍｌカルベニシリンおよび２％グルコースを含む２ＹＴ寒天プレートに播種して、３０℃で一晩インキュベートした。
【０５６５】
次に、ヘルパーファージＭ１３ＫＯ７（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、ＭＡ）を使ってファージを約２０の感染多重度（ＭＯＩ）でレスキューした。０．５のＯＤ６００で３７℃、３０分間振盪無しでのヘルパーファージのＴＧ１細胞への感染、および１００ｒｐｍ振盪下の３７℃で３０分間のインキュベーション後、１００ｕｇ／ｍｌカルベニシリンおよび５０ｕｇ／ｍｌカナマイシン補充２ＹＴ培養液に細胞ペレットを再懸濁し、２５℃、２５０ｒｐｍで一晩増殖させた。厳密な遠心分離を行った後、上清中のファージを回収し、次のラウンドのパニングに使用した。第３ラウンドのパニングに対し、ファージ選択からの濃縮をモニターするために、投入と産生ファージの量を滴定した。
【０５６６】
（２）ヒトＩＮＳＲ／ｈＩＮＳまたはマウスＩＮＳＲ／ｈＩＮＳ複合体に対する抗体クローンのＦＡＣＳ選別
個別のコロニーを取り出し、９６ウエルプレートで増殖させ、１：３容量比率の氷冷ＰＰＢ溶液（Ｔｅｋｎｏｖａ、Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ、ＣＡ）とｄｄＨ２Ｏ、およびプロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を使う標準的方法により細菌性周辺質抽出物を生成するために使用した。ｈＩＮＳＲ／ｈＩＮＳまたはマウスＩＮＳＲ／ｈＩＮＳ複合体に対し、ライセート上清をＦＡＣＳでアッセイした。ここでは、ＩＭ−９細胞の代わりに、ｈＩＮＳＲまたはｍｕＩＮＳＲを形質移入したＣＨＯ−Ｋ１に適合させた懸濁液を使用し、インスリンに曝した細胞を７０ｎＭでなく１５０ｎＭのヒトインスリンを補充したＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁したことを除いて、実施例２で記載したプロトコルを使用した。このアッセイは、少なくとも次の６タイプの抗体検出を可能とした：
１．ヒトインスリンに曝された場合は、ｈＩＮＳＲ−ＣＨＯ細胞にのみ結合する抗体（種特異的方式でＩＮＳ／ＩＮＳＲ複合体だけに結合する）
２．ヒトインスリンに曝された場合は、ｍｕＩＮＳＲ−ＣＨＯ細胞にのみ結合する抗体（種特異的方式でＩＮＳ／ＩＮＳＲ複合体だけに結合する）
３．ヒトインスリンに曝された場合は、ｈＩＮＳＲ−ＣＨＯおよびｍｕＩＮＳＲ−ＣＨＯ細胞の両方に結合する抗体（種間交差反応方式でＩＮＳ／ＩＮＳＲ複合体のみに結合する）
４．ｈＩＮＳＲ−ＣＨＯ細胞にのみ結合する抗体（種特異的方式でＩＮＳＲだけに結合する）
５．ｍｕＩＮＳＲ−ＣＨＯ細胞にのみ結合する抗体（種特異的方式でＩＮＳＲだけに結合する）
６．ｈＩＮＳＲ−ＣＨＯおよびｍｕＩＮＳＲ−ＣＨＯ細胞の両方に結合する抗体（種間交差反応方式でＩＮＳＲだけに結合する）
【０５６７】
実施例２に記載のように抗体を記録した。単離抗体の軽鎖および重鎖配列の配列決定を行い、配列番号８７〜１４７（軽鎖）および配列番号２２３〜２８４（重鎖）に示す。
【０５６８】
結果
細菌性周辺質抽出物のＦＡＣＳ選別により、ヒト受容体または受容体／リガンド複合体、ｈＩＮＳＲもしくはｈＩＮＳＲ−ｈＩＮＳ、またはマウス受容体もしくは受容体／リガンド複合体、ｍｕＩＮＳＲもしくはｍｕＩＮＳＲ／ｈＩＮＳに結合する複数の抗体が特定された。これらのナイーブライブラリーから選択された３３パーセント（１，４８８中の４８４）のクローンがｈＩＮＳＲまたはｈＩＮＳＲ−ｈＩＮＳ複合体に結合可能であった。これらのナイーブライブラリーから選択された２５パーセント（１，４８８中の３７０）のクローンがｍｕＩＮＳＲまたはｍｕＩＮＳＲ−ｈＩＮＳ複合体に結合可能であった。１６パーセント（１，４８８中の２３４）のクローンがＦＡＣＳによりｈＩＮＳＲまたはｈＩＮＳＲ−ｈＩＮＳおよびｍｕＩＮＳＲまたはｍｕＩＮＳＲ／ｈＩＮＳ複合体の両方に結合した。
【０５６９】
選択したクローンをＩｇＧ２抗体として再フォーマットした。選択されたｓｃＦｖ断片の可変重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）をＰＣＲ増幅し、抗体定常領域遺伝子を含むプラスミドベクターに挿入し、標準的方法を使って２９３ＥＥＢＮＡヒト細胞に形質移入した。再フォーマットした抗体のｈＩＮＳＲまたはｈＩＮＳＲ−ｈＩＮＳまたはｍｕＩＮＳＲまたはｍｕＩＮＳＲ／ｈＩＮＳに対する結合を上述のＦＡＣＳにより評価した。結果を図３３に示す。
【０５７０】
結果は、特定の再フォーマット抗体が、マウスおよびヒトＩＮＳＲの両方に結合することを示す。また、図３３は、特定の再フォーマット抗体が、インスリンの存在および非存在下で、特異的にＩＮＳＲに結合し、従って、ＩＮＳＲに対するインスリンの結合を調節することが予想されることを示している。
【０５７１】
実施例１８
IＮＳＲに対するアロステリックアゴニスト抗体のパニング
受容体／リガンドの複合体に対し、遊離受容体より強い結合を示すアゴニスト抗体の選択によって、リガンドと非競合的であり、また、リガンドが受容体のオルソステリック部位へ結合するのを遮断しない、または弱めない抗体を特定できる可能性が高くなる。内在性結合部位とは異なる標的受容体の部位に結合するこのタイプの抗体は、アロステリックアゴニストとして知られている（Ｋｅｎａｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ、２７：２４７−２５９、２００７；Ｊａｈｎｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ．３６：１２８０−８７、２０００；Ｍａｙ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｔｏｘｉｃｏｌ．４７：１−５１、２００７）。
【０５７２】
アゴニスト抗体を選別する上述の方法は、また、アロステリックアゴニストを選別するのに有用である。受容体リガンド複合体に対する試験抗体の好ましい結合は、アロステリック活性と一致するが、一方で、遊離受容体に対する試験抗体の好ましい結合は、オルソステリック部位に対してインスリンと競合する抗体と一致する。選別は、全ての競合的アゴニストではないにしても、一部を除去することにより、アロステリックアゴニストに対する候補クローンのプールを濃縮するのに有用である。
【０５７３】
アロステリック抗体は、リガンドの結合親和性および効力を妨害する可能性がより少なく、従って、最大リガンドシグナル伝達またはリガンドに対する最大感受性を妨害する可能性がより少ない。アロステリック抗体は、弱い部分アゴニストから内在性リガンドと類似のアゴニズムレベルまでの様々なアゴニズムを示すことができる。部分アロステリックアゴニストは、内在性リガンドの最大応答よりもかなり小さい大きさの最大シグナル伝達応答を誘発すると思われる。持続性準最大シグナル活性化の方が最大シグナル活性化よりも好ましい一部の用途では、完全アゴニスト抗体よりも部分アゴニスト抗体が好ましい。部分アロステリックアゴニストおよび正のモジュレーター（感作物質）の間の区別できる特徴は、図３４および１７の用量反応曲線の比較から明らかであり、部分アロステリックアゴニスト（図３４）および正のモジュレーター（感作物質）抗体（図３５）に対して異なる結合曲線を示す。
【０５７４】
図３４Ａは、内在性リガンドに対する用量反応と比較して、部分アロステリックアゴニストからの用量反応の例を示す。また、図３４Ｂは、アロステリックアゴニストの存在または非存在下での、リガンドによる活性化を示す。図３５Ａは、内在性リガンドに対する用量反応と比較して、正のアロステリックモジュレーター抗体からの用量反応を示す。一方、図３５Ｂは、正のモジュレーター抗体の存在および非存在下での、内在性リガンドの用量反応曲線を示す。図３６は、内在性リガンドと比較して、一連の部分アロステリックアゴニストに対する活性化パラメーターを示す。部分アロステリックアゴニストによるシグナル活性化の性質は、同じ１次選別手法から得た正のモジュレーターの性質とは異なる。
【０５７５】
非競合的部分アロステリックアゴニスト抗体は、部分アゴニストおよび内在性リガンドの両方によって同時に別個のシグナル活性化を有するのに有益である場合に、競合的アゴニストよりも治療上の利点を提供することができる。例えば、理論に拘泥するつもりはないが、部分アロステリックアゴニストは、内在性リガンドレベルでの一過性の変動からの応答を依然として許容しながら、シグナル伝達経路の基底の活性化を高めるために使用できる。特定の例では、この種の部分アロステリックアゴニストが存在する条件の下、内在性リガンド用量反応は、ベースライン（恒常的または基底）シグナル伝達レベルの増加を示し、また、ほとんど、または全く有意な変化が無い内在性リガンドと比べて、リガンドＥＣ５０において、同じまたはより大きな最大応答を達成すると思われる。例えば、図３４Ｂは、部分アロステリックアゴニストの存在および非存在下の内在性リガンドの用量反応を示し、図３７は、陰性対照抗体の存在下の内在性リガンドに対する最大応答と比較して、存在部分アロステリックアゴニスト抗体の存在下のインスリンの最大活性化を示す。図３７は、部分アロステリックアゴニスト抗体Ａｂ０３７およびＡｂ０４０が、同じアッセイ内の陰性対照抗体と比べて、用量反応のＥＣ５０およびインスリンによるＡｋｔのＳｅｒ４７３の最大リン酸化にほとんど、または全く有意な影響を与えないことを立証している。
【０５７６】
実施例１９
抗ＩＮＳＲ抗体の機能クラスの例：Ａｋｔのインスリン誘導リン酸化に対する特異的効果
インスリン／インスリン受容体複合体を介したシグナル伝達に与える試験抗体の効果を、抗体がインスリン誘導Ａｋｔリン酸化を感作し、刺激する能力を評価することにより測定した。アッセイを実施例５に記載した方法を使って行った。示した全データで、パーセントｐＡｔｋ  ｐＳｅｒ４７３値は、相対的で、必ずしも絶対的細胞性ｐＡｋｔ  ｐＳｅｒ４７３レベルを表していない。
【０５７７】
図３８〜４０は、親のＣＨＯ−Ｋ１細胞、ヒトインスリン受容体を発現しているＣＨＯ−Ｋ１細胞およびマウスインスリン受容体を発現しているＣＨＯ−Ｋ１細胞に対する、インスリンが存在しない場合、または準最大濃度のインスリンの存在下のｐＡｋｔ抗体用量反応曲線を示す。インスリンが無い場合の抗体の滴定（中空記号）により、抗体アゴニズム活性の徴候が認められる。準最大レベルのインスリンの存在下の抗体の平行滴定（中実記号）により、アゴニズム活性に関する感作活性の徴候が認められる。ある値以上のｐＡｋｔレベルは、同じ抗体濃度のアゴニズム活性より大きいインスリンのＥＣ３０濃度（点線）に起因する。感作活性は、そのｐＡｋｔレベルの増加として観察される。インスリンが存在しない場合は、抗体Ａｂ０７７、Ａｂ０７８およびＡｂ０８５（図３８Ａ〜Ｃ）は、有意なアゴニズムを示さない。抗体Ａｂ００１、Ａｂ０７９およびＡｂ０８３は弱いアゴニストであり（図３９Ａ〜Ｃ）、また、抗体Ａｂ０８０は、中等度のレベルのアゴニズムを示す（図４０）。また、アッセイ結果は、抗体が機能的交差反応性を有するかどうか、すなわち、ヒトおよびマウスＩＮＳＲ媒介シグナル伝達の両方に対し効果があるかどうかを示している。ここで留意すべきは、ＦＡＣＳベースアッセイでＣＨＯ−Ｋ１細胞に発現したインスリン受容体に対する結合を評価の結果として、抗体Ａｂ０７８およびＡｂ０８５が、インスリンの存在下、インスリン受容体のみに結合する、すなわち、非占有インスリン受容体には検出可能なほどには結合しない、ことである。
【０５７８】
図４１Ａ〜Ｃは、ＩｇＧ２アイソタイプ対照抗体抗ＫＬＨ（実線）存在下のインスリンと比較して、固定濃度の感作抗体存在下のインスリン誘導ｐＡｋｔ活性化を示す。インスリンが存在しない場合の、インスリン用量反応滴定で使用した濃度での、抗体のｐＡｋｔ活性化レベルを点線で示す。アイソタイプ対照と比較して、感作抗体の存在下のインスリン誘導ｐＡｋｔ活性化のＥＣ５０値およびＥＣ５０値の倍率変化を表５に示す。
【０５７９】
（表５）感作物質抗体の存在下のｐＡｋｔのインスリン誘導活性化に関するＥＣ５０値
0005849050.tif 000009
【０５８０】
図４２Ａ〜Ｂは、インスリン単独に比較して、インスリンが無い場合の部分アロステリックアゴニスト抗体のｐＡｋｔ活性化作用を示す。抗体Ａｂ０３７、Ａｂ０５３およびＡｂ０６２は全て、ヒトまたはマウスインスリン受容体を発現しているＣＨＯ−Ｋ１細胞のインスリンよりも有意に少ない最大活性化プラトーを有するｐＡｋｔ活性のアゴニストとして作用する。また、アッセイ結果は、抗体が機能的交差反応性を示すかどうか、すなわち、ヒトおよびマウスインスリン受容体媒介シグナル伝達の両方に効果があるかどうかを示している。抗体ＥＣ５０値および最大活性化レベルを表６に示す。
【０５８１】
（表６）最大活性化レベルおよび部分アロステリックアゴニストのＥＣ５０値
0005849050.tif 000010
【０５８２】
図４３は、インスリン単独に比較して、固定濃度の部分アロステリックアゴニスト抗体の存在下のインスリン依存性ｐＡｋｔ活性化を示す。抗体のアゴニスト活性は、インスリン用量反応のベースラインの増加として観察される。アゴニスト抗体Ａｂ０３７およびＡｂ０５３は、インスリン感受性に対しほとんど効果がなく、これは、これらの抗体の存在下で、インスリンＥＣ５０およびヒル係数の有意な変化がないことに反映されている（表７参照）。Ａｂ０６２の存在下のインスリンのＥＣ５０が６．６倍高いので、抗体Ａｂ０６２は、インスリン感受性を低下させるように思われる（表７参照）。
【０５８３】
（表７）アゴニスト抗体の存在および非存在下のインスリン活性化パラメーター
0005849050.tif 000011
【０５８４】
実施例２０
抗ＩＮＳＲ抗体８３−７はｈＩＮＳＲに対するインスリン結合の正のモジュレーターではない
抗ＩＮＳＲ抗体８３−７は、前に、ヒトインスリン受容体に対し特異的であると認定されたが、しかし、８３−７抗体が、インスリン−インスリン受容体結合に対しどのような調節能力を有するかは示されなかった。インスリン−インスリン受容体相互作用を動力学的に調節する８３−７抗体の能力を評価するために、ＡＫＴのインスリン−誘導セリンリン酸化を８３−７の存在の下、測定した。
【０５８５】
抗体８３−７をコードするＶＨおよびＶＬ配列（ＭｃＫｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  ４４３：２１８−２２１、２００６）を合成し、抗体（ＩｇＧ１、ラムダ軽鎖）をＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ細胞中に過渡的に発現させた。プロテインＡ捕獲およびサイズ排除クロマトグラフィーを使って抗体を精製した。ＡＫＴのインスリン誘導セリンリン酸化を強化する８３−７の能力を実施例５に記載の方法を使って測定した。図４４は、（Ａ）ヒトＩＮＳＲ、または（Ｂ）マウスＩＮＳＲを発現しているＣＨＯＫ１細胞上の８３−７およびＡｂ００１に対するｐＡＫＴアッセイ結果を示す。抗体８３−７は、インスリン依存性ＩＮＳＲシグナル伝達を正に調節せず、ヒトＩＮＳＲに対するアゴニスト活性のみを示し、また、マウスＩＮＳＲに対するアゴニズムを示さなかった。対照的に、Ａｂ００１は、ヒトＩＮＳＲおよびマウスＩＮＳＲの両方に対し、インスリン依存性ＩＮＳＲシグナル伝達を約１０倍、正に調節した。
【０５８６】
実施例２１
ＩＮＳＲに対するインスリン結合親和性の抗ＩＮＳＲ抗体による調節の測定アッセイ
インスリン受容体に対するインスリンの結合に影響を与える調節抗体の能力を測定するために、無血清ＣＨＯＫ１細胞（ｈＩＮＳＲ８−ＣＨＯＫ１）の表面上に発現したヒトＩＮＳＲに結合する未修飾インスリンの親和性を、ＩＮＳＲに対するモノクローナル抗体の存在および非存在下で測定した。ＫｉｎＥｘＡアッセイを開発して、細胞培地中の非常に低いレベルのインスリンを測定した。このアッセイは、細胞培地からのインスリン欠乏のレベルを測定することにより、ＩＮＳＲを発現している細胞に対するインスリンの結合を測定可能とした。インスリンが細胞に結合するようになるにつれ、細胞培地中のインスリンの濃度が低下した。ＩＮＳＲ発現細胞の滴定を使い、遊離インスリンの割合を測定することにより、ＫｉｎＥｘＡソフトウェアを使って、ＩＮＳ−ＩＮＳＲ相互作用の親和性を推定することができる。このアッセイは、種々の抗ＩＮＳＲ抗体により示されるインスリン結合活性の調節の程度を測定するのに使用した。
【０５８７】
ｈＩＮＳＲ８−ＣＨＯＫ１細胞を一晩血清飢餓状態にし、次に、細胞をペレット化し、最高希釈に対する最終アッセイ濃度（５００μｇ／ｍＬＢＳＡおよび０．１％ナトリウムアジ化物（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含むＰＢＳアッセイ希釈緩衝液（Ｔｅｋｎｏｖａ、Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ  ＣＡ）中の３．５ｘ１０７および２．０ｘ１０７細胞／ｍＬの間）の２倍の濃度で再懸濁してアッセイ用の調製を行った。１０点希釈シリーズを作って、細胞の２倍系列希釈を調製し、また、非細胞対照も使用した。細胞懸濁液を各２ｍＬ容量ポリプロピレンアッセイチューブに分注した。これらの細胞懸濁液に、１ｍＬの４０ｕｇ／ｍＬ試験抗体（またはＡｂ０７８の１００ｕｇ／ｍＬ）を各チューブに添加し、穏やかに混合して、氷上で３０〜４５分間インキュベートした。使用した抗体を陰性対照ヒトＩｇＧ２抗ＫＬＨ抗体と比較して試験した。１ｍＬの２００ｐＭインスリンを各チューブに添加し、最終インスリン濃度の５０ｐＭ（３００ｐｇ／ｍＬ）を確立した（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）。検体を４℃で、一晩、１８時間インキュベートし、次に、遠心分離して細胞をペレット化し、上清を試験用に取り出した。
【０５８８】
抗インスリンモノクローナル抗体をコートしたビーズを使って、ＫｉｎＥｘＡ３０００分析を行った。２ｇのポリ（メチルメタクリル酸塩）（ＰＭＭＡ）ビーズ（Ｓａｐｉｄｙｎｅ、Ｂｏｉｓｅ、ＩＤ）を、６５ｕｇ／ｍＬのクローンＤ６Ｃ４マウス抗インスリンモノクローナル抗体（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ａｃｔｏｎ  ＭＡ）を含む９ｍＬのアッセイ緩衝ＰＢＳに懸濁した。ビーズを室温で６時間回転させ、次に、静置した。上清を５０ｍｇ／ｍＬＢＳＡ画分Ｖを含むＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）で置換後、４℃で一晩回転させた。使用した検出溶液は、１μｇ／ｍＬのストレプトアビジン−ＰＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を含む０．１５μｇ／ｍＬのビオチン化マウス抗インスリンクローンＤ３Ｅ７（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ａｃｔｏｎ  ＭＡ）を入れたアッセイ希釈緩衝液とした。ＫｉｎＥｘＡ３０００で、検体を０．２５ｍＬ／分で２４０秒間注入し、次に、緩衝液（０．０５％ナトリウムアジ化物含有ＰＢＳ）を流しながら６０秒間洗浄し、その後、２４０秒間検出溶液を注入し、続いて、最後の９０秒間洗浄を１ｍＬ／分で行った。操作の初期時点での電圧と終了近くの時点での電圧の差を測定し、親和性の計算に使用した。細胞上のＩＮＳＲ濃度を２．５ｘ１０５受容体／細胞と見積もった。親和性をＫｉｎＥｘＡソフトウェア（Ｓａｐｉｄｙｎｅ、Ｂｏｉｓｅ  ＩＤ）を使って測定し、ＥＣ５０値をプリズム（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＬａＪｏｌｌａＣＡ．）の非線形フィットを使って計算した。
【０５８９】
いくつかの抗ＩＮＳＲ抗体が細胞のインスリン親和性を高めた。他の抗体は、細胞のインスリン親和性に対し効果がなかった（表８）。１つの試験抗体は、細胞のインスリン親和性を約３倍低下させた。図４５は、推定インスリン受容体濃度に対してプロットした遊離インスリンパーセンテージを示す。２５μｇ／ｍＬ（１６７ｎＭ）で試験したＡｂ０７８を除く全クローンに対し、インスリンレベルを５０ｐＭ、抗体濃度を１０μｇ／ｍＬ（６７ｎＭ）に固定した。示した曲線は、ＥＣ５０の計算に使用した非線形回帰プリズムによるあてはめである。
【０５９０】
図４６は、推定インスリン受容体濃度に対してプロットした遊離インスリンパーセンテージを示す。全クローンに対し、インスリンレベルを５０ｐＭ、抗体濃度を１０μｇ／ｍＬ（６７ｎＭ）に固定した。示した曲線は、ＥＣ５０の計算に使用した非線形回帰プリズムによるあてはめである。
【０５９１】
（表８）インスリン親和性およびＥＣ５０の表
0005849050.tif 000012
【０５９２】
実施例２２
抗ＩＮＳＲ抗体の存在または非存在下のインスリン、ＩＧＦ−１、およびＩＧＦ−２媒介ＭＣＦ−７細胞増殖の測定アッセイ
インスリン、ＩＧＦ−１、およびＩＧＦ−２は、ＭＣＦ−７ヒト乳腺癌細胞の有糸分裂誘発を促進する。前の研究で、インスリン類似体がＩＮＳＲに結合後、代謝シグナル伝達に加えて、分裂促進的シグナル伝達を促進することが示された。本明細書記載の正のモジュレーターおよびアゴニスト抗ＩＮＳＲ抗体は、ＩＮＳＲ媒介代謝シグナル伝達の活性化と同時に、ＩＮＳＲ媒介分裂促進的シグナル伝達を促進することが予測された。インスリン媒介分裂促進的刺激に与える調節抗体の効果を、受容体を発現しているＭＣＦ−７細胞を使って測定した。
【０５９３】
ＭＣＦ−７細胞を、通常の維持用の１０％ＦＢＳおよび２ｍＭグルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充した４．５ｇ／Ｌのグルコースを含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養した。増殖アッセイでは、細胞を９６ウエル白色不透明マイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ３９１７）に、１ｘ１０４細胞／ウエルの密度で播種し、２４時間再付着させた。２４時間後、細胞を予熱したＰＢＳで２回洗浄し、インキュベートしたフェノールレッド不含の、０．１％ＦＢＳおよび２ｍＭグルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充した１ｇ／Ｌグルコースを含むＤＭＥＭ（「飢餓培地」と呼ぶ）中でさらに２４時間インキュベートした。インスリン（Ｓｉｇｍａ）、ＩＧＦ−１（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ）、およびＩＧＦ−２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を飢餓培地中で１０ｘストックとして調製し、１ｕＭからはじめて６４ｎＭまで５倍系列希釈（６希釈）して、２４時間の飢餓期間後に細胞に添加した。増殖因子と共に抗ＩＮＳＲ抗体を含むコインキュベーション実験に対しては、各抗体毎に飢餓培地で５０μｇ／ｍｌストックを調製し、増殖因子を添加して５ｕｇ／ｍｌの最終濃度にする前に細胞に加えた。３７℃で４８時間細胞をインキュベートし、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ発光細胞生存率アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使って細胞増殖を測定した。結果を表９に示す。
【０５９４】
（表９）ＭＣＦ−７増殖結果
0005849050.tif 000013
*抗体濃度@ 5ug/ml
【０５９５】
これらの結果は、驚くべきことに、抗ＩＮＳＲ抗体の存在下、いずれの上述の増殖因子に対しても、９５％信頼区間内で分裂促進的応答の有意な変化が観察されなかったことを示している。これらの抗体が交差反応し、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２に弱く結合する可能性はあるが、しかし、上記アッセイは、いかなる可能性な交差反応による結合も機能的効果を誘発しない、すなわち、受容体を介したシグナル伝達を促進しないことを立証している。このことは、抗体が、分裂促進的ＩＮＳＲ媒介シグナル伝達に対する代謝の比率を増加させることができることを示唆している。
【０５９６】
実施例２３
分化型３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞のインスリン抵抗性脂肪酸取り込みを反転させる抗ＩＮＳＲ抗体の効果
ＴＮＦαは、インスリン依存性脂肪酸取り込みを阻害することができる。ＴＮＦαは、インスリンシグナル伝達経路中間体、例えば、インスリン依存性グルコース取り込み経路の一部でもあるＩＲＳ−１等の不活化によりインスリン抵抗性の原因になることが知られている（Ｎｇｕｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０（４２）：３５３６１−７１、２００５；Ｌｕｃａ  ａｎｄ  Ｏｌｅｆｓｋｙ、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔ．５８２：９７−１０５、２００８）ため、抗ＩＮＳＲ抗体によるインスリン依存性脂肪酸取り込みのＴＮＦα抑制の反転が、インスリン依存性グルコース取り込みのＴＮＦα媒介抑制を反転するこれらの抗体の能力を示す。
【０５９７】
３Ｔ３−Ｌ１マウス胚性線維芽細胞は、脂肪細胞への分化を誘導でき、その後、それらは、インスリン媒介脂肪酸取り込みに対する応答性が高くなる。高脂肪給餌は、脂肪組織インスリン抵抗性の原因として確立されている。この状態をインビトロで調査するために、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞を、障害性インスリン受容体媒介シグナル伝達を生じ、最終的にインスリン刺激グルコース取り込みの減少につながる遊離脂肪酸（ＦＦＡ）で処置した。インスリン抵抗性に寄与する、ＦＦＡ処置により誘導される下流エフェクター分子の１つがＴＮＦαである。また、ＴＮＦαは、インスリン媒介脂肪酸取り込みを阻害し、抗ＩＮＳＲ抗体がインスリン抵抗性脂肪酸輸送を反転できるか否かを評価するための充分確立されたインビトロシステムを提供することが明らかになっている。
【０５９８】
３Ｔ３−Ｌ１細胞を、通常の維持用の１０％新生仔ウシ血清（ＮＣＳ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および２ｍＭグルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充した４．５ｇ／Ｌのグルコースを含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養した。細胞を９６ウエルマイクロタイタープレート中で脂肪細胞に分化させるために、次のプロトコルを使った：（１）−５日目に、２ｘ１０３細胞／ウエルを黒色／透明底９６ウエルプレート（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ３５３９４８）に播種し、（２）−２日目に、細胞は、培養密度にたしたが、そのままさらに２日間置き、（３）０日目に、分化培地を添加、（４）３日目に、培地を０．４２５ｕＭインスリンを含む通常の成長培地に交換し、（５）７日目に、培地を通常の成長培地に交換した。インスリン抵抗性を誘導するために、１０ｘストックのＴＮＦα（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を通常の成長培地中で調製し、分化プロセスの９日目に細胞に添加した。使用したＴＮＦαの作業濃度は、１〜１０ｎｇ／ｍｌであった。脂肪酸取り込みを１０日目の細胞で行った。使用した脂肪酸取り込みプロトコルを、次に示す。細胞を、０．２％脂肪酸遊離ＢＳＡ（ＦＡＦ−ＢＳＡ；シグマ）および２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で２回洗浄し、次に、３７℃のＨＢＳＳ中で１〜２時間血清飢餓状態にした。抗ＩＮＳＲ抗体または他の関連対照を１０ｘストックまたはＨＢＳＳ単独から添加し、３７℃で３０分間インキュベートして、インスリンを１０ｘストックから希釈して添加後、３７℃で３０分間インキュベートした。次に、等容量の再構成ＱＢＴ脂肪酸取り込みアッセイ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）ローディング緩衝液を添加し、３７℃で３時間までインキュベートして、プレートを蛍光プレートリーダーで読み取り、内部に取り込まれた蛍光脂肪酸類似体を測定した。
【０５９９】
図４７は、抗ＩＮＳＲ抗体Ａｂ０８５の存在下で、ＴＮＦαが、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞におけるインスリン媒介脂肪酸取り込みの脱感作を誘導することを示す。表１０は、脂肪酸取り込みに対する抗体の相対的ＥＣ５０を示し、Ａｂ０８５が脂肪酸取り込みに対するＥＣ５０を減少させることを立証している。抗ＩＮＳＲ抗体Ａｂ０８５の存在下、インスリン媒介脂肪酸取り込みのＴＮＦα誘導脱感作が、未処理対照の値まで完全に逆戻りさせられた。類似の結果がＡｂ０８３でも観察された。
【０６００】
（表１０）ＥＣ５０および９５％信頼区間値
0005849050.tif 000014
TNFα濃度@ 1.25 ng/ml 
Ab085濃度@ 50 ug/ml
【０６０１】
これらの結果は、正のモジュレーター抗体が、脂肪細胞の脂肪酸取り込みを増加させることができることを示し、このことは、抗体が、脂肪酸取り込みを増加により利益が得られる障害または状態を治療するのに有用であることを示唆している。
【０６０２】
実施例２４
インスリン依存性ｐＡｋｔ活性化による高度精製抗ＩＮＳＲ抗体のキャラクタリゼーション
機能的ｐＩＲＳ−１およびｐＡＫＴアッセイで、アッセイとアッセイ間の特定量の変動が顕著であった。タンパク質Ａ精製に追加してさらなる工程、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー、を使って試験抗体を精製し、約９５％超の純粋な抗体を生成した場合は、この変動は減らすことができるであろうと判断された。この精製工程は、機能的アッセイを妨害すると思われる凝集物および混入増殖因子を減らすか、または除去した。
【０６０３】
多くの高度精製抗ＩＮＳＲ抗体を、ヒトＩＮＳＲまたはマウスＩＮＳＲを発現しているＣＨＯＫ１細胞を使って、実施例５で記載したｐＡＫＴアッセイにより試験した。さらに、特定の抗ＩＮＳＲ抗体の、カニクイザルＩＮＳＲを形質移入されたＣＨＯＫ１細胞株（ＣＨＯＫ１−ｃｙｎｏＩＮＳＲ−４）に対する作用を試験した。
【０６０４】
正のモジュレーター抗ＩＮＳＲ抗体Ａｂ００１、Ａｂ０３７、Ａｂ０７７、Ａｂ０７９、ＡＢ０８０、Ａｂ０８３の効果をｐＡＫＴアッセイにより測定し、結果を図４８（ヒトＩＮＳＲ）および図４９（マウスＩＮＳＲ）に示す。
【０６０５】
アゴニスト抗体Ａｂ０３７、Ａｂ０３０、Ａｂ０５３およびＡｂ０６２のヒトＩＮＳＲおよびマウスＩＮＳＲに対する相対的％ｐＡＫＴをそれぞれ図５０および５１に示す。
【０６０６】
また、正のモジュレーター抗体およびアゴニスト抗体の相対的％ｐＡＫＴも、カニクイザルＩＮＳＲ４を発現しているＣＨＯＫ１細胞で測定した。図５２は、抗ＩＮＳＲ抗体Ａｂ０３０、Ａｂ０３７、Ａｂ０５３、Ａｂ００１、Ａｂ０７９、ＡＢ０８０およびＡｂ０８３が、サルＩＮＳＲの活性化の後、ＡＫＴリン酸化を誘導することができることを示している。
【０６０７】
さらに、ヒトＩＮＳＲを発現しているＣＨＯＫ１細胞で、負のモジュレーター抗体Ａｂ０６１、Ａｂ０７０およびＡｂ０８１のｐＡＫＴ相対％を測定した。結果を、表１１および図５３に示す。
【０６０８】
（表１１）
0005849050.tif 000015
【０６０９】
これらの結果は、負のモジュレーター抗体がインスリンのＥＣ５０を増加させ、場合によっては数百倍にもなることを示している。
【０６１０】
実施例２５
抗ＩＮＳＲ抗体の種間交差反応性の評価
この実施例は、種、例えば、毒物学的調査に使われることが多いウサギおよびカニクイザルの細胞に対するインスリン受容体抗体の結合を評価するためのＦＡＣＳベースアッセイの使用に関して記載する。ファージディスプレイライブラリー由来の抗ＩＮＳＲ抗体を、ヒト、ウサギおよびカニクイザルの末梢血単球に対する結合およびリガンド（インスリン）の存在または非存在下で、上に挙げた種の単球に対する特異的結合の両特性で選別した。
【０６１１】
カニクイザル全血を国立カリフォルニア霊長類研究センター（Ｄａｖｉｓ、ＣＡ）から入手し、ウサギ全血をＬｉｆｅ  Ｓｏｕｒｃｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、ＬＬＣ（Ｍｏｆｆｅｔｔ  Ｆｉｅｌｄ、ＣＡ）から入手した。ヒトＰＢＭＣをＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｒｅｄ  Ｃｒｏｓｓから入手したバフィーコート由来のフィコール・ハイパックを使って精製した。次に、カニクイザルおよびウサギＰＢＭＣを、フィコール・ハイパック勾配分離法（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使って精製した。アッセイでの使用に先立ち、精製ＰＢＭＣを凍結し、液体窒素中で貯蔵した。ヒト、カニクイザルおよびウサギＰＢＭＣを解凍し、ＦＡＣＳ緩衝液（０．５％ＢＳＡおよび０．１％ＮａＮ３のＰＢＳ中溶液）で洗浄した。細胞を調製するとすぐ、最終濃度２ｘ１０６細胞／ｍｌでＦＡＣＳ染色アッセイに使用した。
【０６１２】
特異的結合を調べるために、細胞をインスリンの存在または非存在下で、抗ＩＮＳＲ抗体の濃度を減少させながら４℃で１時間インキュベートし、ＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄した。抗ＩＮＳＲ抗体の結合は、ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ａｌｅｘａ６４７（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）の４℃で３０分間の添加により明らかになった。ＦＡＣＳ緩衝液２回洗浄後、単球集団を捕獲するために種々のマーカーで細胞を染色した。ヒトおよびカニクイザル細胞をＣＤ４５およびＣＤ１４で染色した。ウサギ細胞をＣＤ１１ｂおよびＣＤ１４で染色した。次いで、抗体を２０分間インキュベートし、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。次に細胞を２％パラホルムアルデヒドで固定し、次に、細胞分析に先立ち等容量のＦＡＣＳ緩衝液を添加した。細胞をＦＡＣＳｃａｎ（登録商標）（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）で解析し、データをＦｌｏＪｏ（登録商標）（Ｔｒｉｓｔａｒ、Ｐａｓｏ  Ｒｏｂｌｅｓ、ＣＡ）およびＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ５（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を使って解析した。
【０６１３】
ヒト、ウサギまたはカニクイザルＰＢＭＣで認められた結合は、適切な種のインスリン受容体を発現したＣＨＯ細胞株を生成し、上述の結合アッセイを繰り返すことにより確認された。図５４に示すデータは、ヒトインスリン受容体に結合した多くの抗体も、また、ウサギおよびカニクイザルインスリン受容体に結合し、さらに、この結合が、インスリンの存在により調節されることを示す。
【０６１４】
実施例２６
ヒトインスリンの存在および非存在下の抗ＩＮＳＲ抗体の親和性測定
血清飢餓ＣＨＯＫ１細胞（ｈＩＮＳＲ８−ＣＨＯＫ１）の表面に発現した組換え型ヒトＩＮＳＲに対する種々の抗ＩＮＳＲ抗体の親和性をインスリンの存在および非存在下で測定した。ＫｉｎＥｘＡアッセイを開発し、インキュベーション緩衝液中の非常に低レベルの抗体を測定した。このアッセイは、インキュベーション緩衝液の抗体の欠乏レベルを測定することにより、ＩＮＳＲを発現している細胞に対する抗体の結合の測定を可能とした。抗体が細胞に結合するに従い、緩衝液中の抗体濃度は低下した。ＩＮＳＲ発現細胞の滴定および遊離抗体割合の測定を行うことにより、ＫｉｎＥｘＡソフトウェアを使ってＩＮＳＲとの相互作用に対する抗体の親和性を推定することが可能である。このアッセイを使って、インスリンの存在および非存在下で試験抗体クローンの相対的親和性を測定し、細胞に対する抗体の結合のインスリン依存性調節を立証した。
【０６１５】
ｈＩＮＳＲ８−ＣＨＯＫ１細胞を一晩血清飢餓状態にし、次に、実施例２０に記載のようにアッセイの準備を行った。１ｍＬの４ｕｇ／ｍＬインスリンまたは緩衝液を各チューブの細胞に添加し、最終インスリン濃度の０または１７５ｎＭ（１μｇ／ｍＬ）にした。次に、１ｍＬの４０ｎｇ／ｍＬ抗体を各チューブに添加し、抗体濃度の１０ｎｇ／ｍＬまたは６６．６ｐＭを得た。検体を４℃で一晩１８時間インキュベートした後、遠心分離して細胞をペレット化し、上清をＫｉｎＥｘＡ試験用に取り出した。ＫｉｎＥｘＡ３０００分析を、（Ｆａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ  ＰＡ）でコートしたビーズを使って実施例２０記載のように実施した。使用した検出溶液は、Ｒ−ＰＥ−（Ｆａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ  ＰＡ）とした。８３−７マウス抗体に対指定は、上述のようにビーズをウサギ抗マウスＦ（ａｂ’）２抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ  ＰＡ）と結合させ、使用検出溶液をＲ−ＰＥ−（Ｆａｂ’）２断片ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ  ＰＡ）とした。細胞上のＩＮＳＲ濃度を２．５ｘ１０５受容体／細胞と推定し、ＩＮＳＲに対する二価の抗体結合を仮定した。
【０６１６】
インスリンの存在および非存在下での多くの抗ＩＮＳＲ抗体の親和性を表１２に示す。インスリンの存在および非存在下で、アゴニスト抗体Ａｂ０３７、Ａｂ０５３、およびＡｂ０６２は、インスリンとは独立した結合を有し、２倍未満の親和性シフトを示した。８３−７マウス抗体は、インスリンの存在下で、中程度の３倍の親和性シフトを有し、一方、正のモジュレーター抗体として、Ａｂ００１、Ａｂ０７９、Ａｂ０８０、およびＡｂ０８３は、インスリンの存在下で、Ａｂ０８０の１７倍からＡｂ００１の１００倍超までの範囲の、全て正の結合調節を示した。正のモジュレーターＡｂ０７７およびＡｂ０７８は、インスリンが無い場合は、他のクローンよりも弱い親和性であり、結果として、これらの「インスリンのない場合の」親和性は、受容体ソースとしての細胞の使用に対し許容された最大受容体濃度内に制限されるこのアッセイの範囲を超えた。インスリンが無い場合にも、これらのクローンで結合が観察されるが、それは、インスリンの存在下の場合より実質的に弱く、８３−７よりも遙かに大きな程度に調節されている（調節度合いはこれらのアッセイ条件では正確に見積もることができないが）。Ａｂ０８５は、結合インスリンが無い場合は、結合の証拠がほとんど認められないか、全く認められない状態であり、その結合はインスリン依存性と見なされる。
【０６１７】
（表１２）ｈＩＮＳＲ８−ＣＨＯＫ１細胞に対する抗体の親和性
0005849050.tif 000016
【０６１８】
実施例２７
抗ＩＮＳＲ抗体のエピトープビニング
多因子手法をエピトープビニング（ｅｐｉｔｏｐｅ  ｂｉｎｎｉｎｇ）に取り入れ、種々のＩＮＳＲ抗体が潜在的に類似のエピトープに結合するかどうか、またはそれらが特異的結合特性および異なるエピトープの認識を示すかどうかを判定した。競合的結合または「ビニング」実験、ならびに、インスリン受容体の異なるヒトおよびマウス種に結合する抗体の能力の分析、およびインスリンの存在および非存在下での結合の能力の分析を行った。これら全ては、抗体結合エピトープの潜在的類似性または差異を判定する因子である。インスリンの存在および非存在下で血清飢餓状態のｈＩＮＳＲ８−ＣＨＯＫ１細胞およびｍＩＮＳＲ−ＣＨＯＫ１細胞に対するビオチン化ＩｇＧの結合を解析することにより、フローサイトメトリーアッセイを行った。
【０６１９】
競合的結合アッセイのために、ｈＩＮＳＲ８−ＣＨＯＫ１細胞およびｍＩＮＳＲ−ＣＨＯＫ１細胞を一晩血清飢餓状態にし、実施例２０に記載のようにアッセイの準備をした。一部の実施形態では、細胞表面上の受容体の数を計算し、競合結合試験を実行するのが好都合である。例えば、ｈＩＮＳＲ８−ＣＨＯＫ１受容体発現レベルは、最初は、標準的細胞染色およびフローサイトメトリー技術によって測定される。手短に述べれば、飽和濃度のＭＡ−２０モノクローナルＡｂ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ  ＭＡ）で細胞を染色し、ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体に結合したＲ−フィコエリトリン（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ  ＰＡ）で検出し、次に、相対的蛍光をＢＤ  Ｑｕａｎｔｉｂｒｉｔｅ（登録商標）ＰＥビーズ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ  ＮＪ）と比較して結合したフィコエリトリン分子の推定値を求め、結合したフィコエリトリン分子の数に基づいてインスリン受容体の数を外挿することにより、この測定を行った。次に、この数を、Ｒａｔｈａｎａｓｗａｍｉ  ｅｔ  ａｌ、（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３７３：５２−６０、２００８）に記載のように、ＫｉｎＥｘＡ を使って、さらに試験し、精密化した。手短に述べれば、より多くの化学量論的に制限された用量反応を作り出す本明細書記載の親和性測定方法よりも遙かに高いリガンド濃度が使用できる抗体およびインスリン両方の結合を調査するＫｉｎＥｘＡ実験を行った。次に、これを未知のリガンドモデルおよび結合受容体濃度を確定するために使われるリガンド乗算パラメーターの決定結果を使ってＫｉｎＥｘＡソフトウェア（Ｓａｐｉｄｙｎｅ、Ｂｏｉｓｅ  ＩＤ）で解析した。このアッセイでは、例えば、血清飢餓状態のｈＩＮＳＲ８−ＣＨＯＫ１細胞は、約２５０，０００四量体ＩＮＳＲ受容体／細胞を発現すると推定される。抗体親和性に関しては、これは、受容体四量体当たり２抗体の化学量論を意味し、高親和性インスリン結合部位に対しては、１：１の四量体：インスリン比率を意味する。
【０６２０】
試験される抗体を標準的アミン化学反応および活性化ＰＥＧ４−ビオチン（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ  ＭＡ）を使ってビオチン化した。また、マウス抗体８３−７および８３−１４も試験した。これらの抗体は、それぞれ、ＣＲドメインのアミノ酸２３３〜２８１およびＩＮＳＲのＦｎＩＩＩ−Ｉドメインに結合すると報告されている（ＭｃＫｅｒｎｅｔａｌ、２００６；Ｎａｔｕｒｅ  ４４３：２１８−２１）。形質移入細胞を一晩血清飢餓状態にした後、細胞を、１μｇ／ｍＬインスリンの存在下で、ビオチン化抗体の滴定により染色した。細胞上で抗体を４℃で約３０分間インキュベートした。次に、検体をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、ストレプトアビジン−フィコエリトリン（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ、ＵＳＡ）を使ってビオチン化抗体を検出した。ビニング実験で使用したビオチン化抗体の濃度は、インスリンの存在下、ヒト細胞株に対し亜飽和であるが、それでも強いシグナルを有する濃度を基準に選択した。使用されるビオチン化抗体の濃度が実験で測定されるとすぐに、競合アッセイを以下のように実行した。
【０６２１】
細胞を一晩血清飢餓状態にし、次に、１μｇ／ｍＬヒトインスリンを含む場合と含まない場合の冷ＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁した。次に、細胞を６０ｕｇ／ｍＬのコールド、すなわち非標識競合抗体と１：１に混合して、４℃で約３０分間インキュベートして、３０ｕｇ／ｍＬのコールドＡｂ濃度にした。３倍濃度として１：２希釈でビオチン化抗体を添加し、４℃で約３０分間インキュベートした。次に、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、ストレプトアビジン−フィコエリトリンで検出して、ＦＡＣＳアナライザー（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ、ＳａｎＪｏｓｅ、ＣＡ）でアッセイした。
【０６２２】
非結合対照抗体または競合抗体と混合した場合には、ＭＦＩをビオチン化抗体間で比較した。結合の程度を、インスリンの存在または非存在化で、ヒトおよびマウス細胞株で測定した。各ビオチン化抗体を各コールド競合体に対して試験する場合は、マトリックス手法を用いた。同じ競合プロファイルを有する抗体は、同じビン（ｂｉｎ）にあると見なされる。表１３の代表的ビンのグループ化は、実質的に全てのクローンがこれらの条件下で最強結合を有していたものとして、インスリンの存在下のｈＩＮＳＲ８−ＣＨＯＫ１細胞から導かれる。表１３のクローンは、インスリン依存性およびマウス反応性、等の他の結合特性を反映させるように標識付けしている。
【０６２３】
実験の結果から、抗ＩＮＳＲ抗体の中から約７つの異なる競合ビンが得られた。ｈＩＮＳＲ８−ＣＨＯＫ１を使った上記の方法を使って、競合のない抗体は、３０％未満の競合を示すものとして定義し、部分競合は、３０％超から８０％未満の競合、さらに完全競合は、８０％超の競合と定義する。
【０６２４】
ヒトおよびマウス反応性のビン１にマップされる抗体は、ＡＢ０７９、ＡＢ０７６、ＡＢ０８３とは無競合、ＡＢ０８５およびＡＢ０８６とは部分から完全競合、さらにＡＢ０３０、ＡＢ０３７、ＡＢ０５３、ＡＢ００１、ＡＢ０１８、およびＡＢ０６４、ＡＢ０４０とは完全競合を示した。
【０６２５】
ヒトおよびマウス反応性のビン２の抗体は、ＡＢ０８６とは無競合で、ＡＢ０７８とは部分競合を示す以外は、ビン１の抗体と同じプロファイルを示した。
【０６２６】
ヒトおよびマウスＩＮＳＲの両方に結合するビン３の抗体は、Ａｂ０６２およびＡｂ０８６とは無競合、Ａｂ０８６、Ａｂ０６４、Ａｂ００１、Ａｂ０１８とは部分競合、さらにＡｂ０７９、Ａｂ０７６、Ａｂ０８３、Ａｂ０８０、Ａｂ０６２、およびＡｂ０２０、Ａｂ０１９、Ａｂ０８８、Ａｂ０８９とは完全競合を示した。
【０６２７】
ヒト受容体のみに結合するビン４の抗体は、Ａｂ０６２、Ａｂ０８６、Ａｂ００１、Ａｂ０１８、Ａｂ０３０、Ａｂ０３７、Ａｂ０６４とは無競合、さらにＡｂ０７９、Ａｂ０７６、Ａｂ０８３、Ａｂ０８０、Ａｂ０６２、およびＡｂ０２０、Ａｂ０１９、Ａｂ０８８、Ａｂ０８９とは完全競合を示した。
【０６２８】
ビン５の抗体は、ＡＢ０７７、ＡＢ００１、ＡＢ０１８、ＡＢ０３０、ＡＢ０３７、ＡＢ０７９、ＡＢ０７６、ＡＢ０８３、ＡＢ０１９、ＡＢ０８８、ＡＢ０８９、およびＡＢ０４０と無競合を示し、ＡＢ０６４、ＡＢ０６２、ＡＢ０８５、およびＡＢ０７８とは完全競合を示した。これらの抗体は、ヒトおよびマウス受容体の両方と反応する。
【０６２９】
ビン６の抗体は、ほとんど全ての試験したクローンと完全または部分競合を示した。クローンＡｂ０６１は、Ａｂ０１９と３０％未満の競合であり、クローンＡｂ０７４は、Ａｂ０８８と競合しなかった。これらの抗体は、ヒトおよびマウス受容体の両方と反応する。
【０６３０】
ビン７にグループ化された抗体は、Ａｂ０５３、Ａｂ０６４、８３−７、Ａｂ０１９、Ａｂ０８８、およびＡｂ０８９と競合せず、Ａｂ０３７、Ａｂ０７８、Ａｂ０８３、Ａｂ０８０、およびＡｂ０８５と部分競合を示した。また、Ａｂ０４０、Ａｂ０６２、Ａｂ０３０、Ａｂ００１、およびＡｂ０１８と完全競合を示した。これらの抗体は、ヒトおよびマウス受容体の両方と反応する。
【０６３１】
マウス８３−７クローンを含む競合ビン４は、マウス反応性に欠けた全てのクローンを含有した。抗体グループはそれらの機能特性と相互に関連があった。全てのヒトアゴニスト抗体は、ビン１にグループ化された。正のモジュレーター抗体は、Ａｂ００４の例外を除いて、ビン３とビン５にグループ化された。ビン３抗体は、ＩＮＳＲ−インスリン複合体およびＩＮＳＲ単独の両方に結合し、一方、ビン５抗体は、ＩＮＳＲ−インスリン複合体には結合するが、ＩＮＳＲ単独には結合しない。
【０６３２】
（表１３）エピトープビン
0005849050.tif 000017
【０６３３】
当業者なら上記説明用の実施例で述べられたような本発明における多くの変更および変化に気付くことが想定される。従って、添付の特許請求の範囲にある制限のみが、本発明に適用されるべきものである。
【図１】
0005849050.tif 000018
【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５】
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【図６Ａ】
0005849050.tif 000027
【図６Ｂ】
0005849050.tif 000028
【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
0005849050.tif 000030
【図６Ｅ】
0005849050.tif 000031
【図７】
0005849050.tif 000032
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１６Ｅ】
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【図１６Ｆ】
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【図１６Ｇ】
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【図１６Ｈ】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２０Ｅ】
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【図２０Ｆ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図２９Ｃ】
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【図２９Ｄ】
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【図２９Ｅ】
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【図２９Ｆ】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３−０１】
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【図３３−０２】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４−０１】
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【図５４−０２】
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【図５４−０３】
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【図５４−０４】
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【図５４−０５】
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【図５４−０６】
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【図５４−０７】
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【図５４−０８】
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【図５４−０９】
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【図５４−１０】
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【図５４−１１】
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【図５４−１２】
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【図５４−１３】
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【図５４−１４】
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【図５４−１５】
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【図５４−１６】
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【図５４−１７】
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【図５４−１８】
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【図５４−１９】
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【図５４−２０】
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【図５４−２１】
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【図５４−２２】
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【図５４−２３】
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【配列表】
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