(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
改変ＳＤ配列を有する標的遺伝子と；当該改変ＳＤ配列と相補的な改変アンチＳＤ配列を有する複数個のｒｒｎオペロンと；改変されていないアンチＳＤ配列を有するｒｒｎオペロン、とを有するバチルス属細菌であって、
該改変ＳＤ配列がＣＣＴＣＣであり、かつ該改変アンチＳＤ配列がＧＧＡＧＧである、
バチルス属細菌。
【請求項２】
前記改変アンチＳＤ配列を有する複数個のｒｒｎオペロンが、少なくともｒｒｎＩオペロン及びｒｒｎＯオペロンである請求項１に記載のバチルス属細菌。
【請求項３】
前記改変アンチＳＤ配列を有する複数個のｒｒｎオペロンが、ｒｒｎＩオペロン、ｒｒｎＯオペロン及びｒｒｎＥオペロンである請求項１に記載のバチルス属細菌。
【請求項４】
前記改変されていないアンチＳＤ配列を有するｒｒｎオペロンがｒｒｎＪオペロンである請求項２又は３に記載のバチルス属細菌。
【請求項５】
前記ｒｒｎＪオペロンを２個有する、請求項４に記載のバチルス属細菌。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のバチルス属細菌を培養する工程を含む目的遺伝子産物の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改変リボゾームをコードする改変ｒＲＮＡオペロンを有する微生物と、当該微生物を用いた目的遺伝子産物の生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
リボゾームは遺伝子からタンパク質への翻訳が行われる場所であり、細菌においてはｒＲＮＡオペロン（ｒｒｎ）によってコードされている。ｒｒｎオペロンには、１６Ｓ、２３Ｓ、５Ｓという３つのｒＲＮＡサブユニットが順にコードされている。細菌ゲノム中でのｒｒｎオペロンのコピー数は種によって様々であり、ある種のマイコプラズマのようにわずか１コピーのものから、大腸菌のように７コピーのものや、枯草菌のように１０コピーのものまで存在する。
【０００３】
しかし、この細菌ゲノム中でのｒｒｎのコピー数は、当該細菌の成長速度や生理活動の高さを直接反映しているわけではない。例えば、ｒｒｎオペロンのコピー数が増えても成長や生理活動量が増加するとは限らず、他方ｒｒｎオペロンを一部削除しても成長や生理活動に大きな影響はない。このことから、細菌の生存にとってゲノム中に複数存在するｒｒｎオペロンが同時に全て機能する必要はなく、むしろ細菌はその時々の生育環境の変化にあわせて複数のｒｒｎオペロンを使い分けていると推定される（非特許文献１）。
上記非特許文献１にはまた、１０種類のｒｒｎオペロンのうちのいずれか１種を１コピーのみ有する枯草菌株を作製し、それらの成長速度と胞子形成の頻度を調べた結果、各株間で胞子形成能が大きく異なっていたことを報告している。この知見は、複数のｒｒｎオペロンが異種性（heterogeneity）であり、各々が異なる生育局面で異なる機能を担っているという考え方を支持する。
【０００４】
このようなｒｒｎオペロンの異種性や機能を鑑みると、細菌におけるｒｒｎオペロンのコピー数とその成長速度や遺伝子発現能との間に相関性を見出すことはできない。
【０００５】
シャイン・ダルガノ配列（Shine-Dalgarno sequence：以下、ＳＤ配列）は、原核生物のｍＲＮＡの開始コドン上流に認められる共通配列（代表的には、−ＧＧＡＧＧ−）であり、これが、ｒｒｎオペロンの１６ＳｒＲＮＡの配列の３’末端領域に存在する相補的なアンチＳＤ配列（代表的には、−ＣＣＵＣＣ−）と対合することによって、ｍＲＮＡとリボゾームが結合し、翻訳が開始される。
佐藤ら（非特許文献２及び３）は、１０コピーのｒｒｎオペロンのうちの１つのアンチＳＤ配列を改変した枯草菌株で、改変したＳＤ配列を有するクロラムフェニコール耐性遺伝子（ｃａｔ）の翻訳効率を調べた結果、改変株では、翻訳効率の低下したＳＤ配列を有するｃａｔ遺伝子を持つにもかかわらず、クロラムフェニコール耐性が向上したことを示した。
【０００６】
しかし、翻訳効率を向上させるために具体的にどのようにアンチＳＤ配列を改変すればよいかは明らかではなかった。
さらに、非特許文献４及び５によれば、改変ｒｒｎオペロンのコピー数を増やしても翻訳効率は増加しないと考えられており、一方で改変ｒｒｎオペロンを増やせば、細菌の通常の蛋白合成能が低下して生命活動に影響を及ぼす可能性があるため、アンチＳＤ配列の改変が必ずしも目的蛋白質の生産性向上につながるかどうかは明らかではなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Nanamiya et al. (2010) Microbiology 156:2977-2982
【非特許文献２】佐藤ら、日本農芸化学会２００６年度大会  大会講演要旨集、2006年3月5日発行、119頁
【非特許文献３】七宮ら、2006年度グラム陽性細菌のゲノム生物学研究会  プログラム＆要旨集、2006年8月31日、pp16
【非特許文献４】Ellwood & Nomura (1980) J. Bacteriol. 143:1077-1080
【非特許文献５】Widom et al. (1988) J. Bacteriol. 170:605-610
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、改変リボゾームをコードする改変ｒｒｎオペロンを有する細菌、ならびに当該細菌を用いた標的遺伝子の発現制御方法及び目的遺伝子産物の生産方法に関する。
【０００９】
ＳＤ配列又はアンチＳＤ配列の改変によって、細菌の成長や遺伝子発現を制御できる可能性がある。しかし、各ｒｒｎオペロンは上述のように各々異なる機能を担っているため、特定のｒｒｎの改変が細菌の正常な生命活動に影響を及ぼしてその生存率や生理的活動を下げる可能性が考えられた。そのため、ＳＤ配列又はアンチＳＤ配列の改変によって細菌の成長や遺伝子発現の制御を満足に行うことができるか否か、あるいは如何なる改変を施せばよいかは不明であった。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、遺伝子特異的に発現を制御することのできる微生物株の作製を試みた結果、改変されたＳＤ配列を有する標的遺伝子と、当該改変ＳＤ配列に相補的な改変されたアンチＳＤ配列を有するｒｒｎオペロンとに加え、さらに、改変されていないインタクトなアンチＳＤ配列を有するｒｒｎオペロンを有する細菌により、当該標的遺伝子の発現を特異的に制御することが可能であることを見出した。
【００１１】
すなわち、本発明は以下を提供する。
（１）改変ＳＤ配列を有する標的遺伝子と；当該改変ＳＤ配列と相補的な改変アンチＳＤ配列を有する複数個のｒｒｎオペロンと；改変されていないアンチＳＤ配列を有するｒｒｎオペロン、とを有する細菌。
（２）前記改変ＳＤ配列が、前記改変されていないアンチＳＤ配列と８０％以上の配列同一性を有する（１）記載の細菌。
（３）前記改変ＳＤ配列が、ＣＣＴＣＣである（１）又は（２）記載の細菌。
（４）前記改変アンチＳＤ配列が、ＧＧＡＧＧである（１）〜（３）のいずれか１に記載の細菌。
（５）バチルス属細菌である（１）〜（４）のいずれか１に記載の細菌。
（６）前記改変アンチＳＤ配列を有する複数のｒｒｎオペロンが、少なくともｒｒｎＩオペロン及びｒｒｎＯオペロンである（５）に記載の細菌。
（７）前記改変アンチＳＤ配列を有する複数のｒｒｎオペロンが、ｒｒｎＩオペロン、ｒｒｎＯオペロン及びｒｒｎＥオペロンである（５）に記載の細菌。
（８）前記改変されていないアンチＳＤ配列を有するｒｒｎオペロンがｒｒｎＪオペロンである（６）又は（７）に記載の細菌。
（９）（１）〜（８）のいずれか１に記載の細菌を培養する工程を含む目的遺伝子産物の生産方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、目的遺伝子産物を効率よく生産することができる細菌を提供することができる。また本発明によれば、標的遺伝子の発現を、それ以外の遺伝子の発現に影響を与えることなく制御することができるため、個々の遺伝子やその発現産物の発現や機能の精密な解析を可能にする優れた評価系を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ｒｒｎＪ+Ｊ+株ゲノムにおけるｒｒｎＪ遺伝子の概要。
【図２】ｒｒｎオペロン改変株の構築手順の概要。
【図３】改変ＳＤ配列を有するプラスミドの構築手順の概要。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本明細書において、アミノ酸配列及び塩基配列の同一性は、Lipman-Pearson法 (Science, 227, 1435, (1985))によって計算することができる。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win（ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Search homology）プログラムを用いて、Unit size to compare（ktup）を２として解析を行うことにより算出される。
【００１５】
本明細書において、「ｒｒｎ」又は「ｒｒｎオペロン」とは、リボゾームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）をコードするオペロンを指す。細菌ゲノムに存在するｒｒｎのコピー数は、菌種によって、１コピーのみから１０コピー以上まで様々である。各細菌におけるｒｒｎについての情報は、データベース[http://ribosome.mmg.msu.edu/rrndb/]から入手可能である。
枯草菌（Bacillus subtilis）の場合、ゲノム上に１０コピーの異なるｒｒｎが存在し、それぞれｒｒｎＡ、ｒｒｎＢ、ｒｒｎＤ、ｒｒｎＥ、ｒｒｎＧ、ｒｒｎＨ、ｒｒｎＩ、ｒｒｎＪ、ｒｒｎＯ、ｒｒｎＷとして知られている。上記１０個のｒｒｎの塩基配列及びゲノム上での位置は公知である（Nanamiya et al. Microbiology (2010) 156:2944-2952、あるいはＪＡＦＡＮ（Japan Functional Analysis Network for Bacillus subtilis）により公開されている枯草菌ＯＲＦデータベース（ＢＳＯＲＦ  ＤＢ）[http://bacillus.genome.ad.jp/]）。
上記１０個のｒｒｎは、枯草菌等のバチルス属細菌において高度に保存されており、各ｒｒｎの配列は、いずれも類似性が高く且つ高度に保存されたアンチＳＤ配列を有する。
【００１６】
本明細書において、「ＳＤ配列」とは、原核生物のｍＲＮＡの開始コドン上流に位置するシャイン・ダルガノ配列（Shine-Dalgarno sequence）、又はこれに対応するゲノム上の配列を指し、文脈によって使い分けられる。ｍＲＮＡに関して「ＳＤ配列」というときは前者を指し、ゲノム上の遺伝子配列に関して「ＳＤ配列」というときは後者を指す。
ＳＤ配列としては、例えば遺伝子配列上の配列としては、開始コドンのおよそ６〜１４ｂｐ上流に位置する配列ＧＧＡＧＧ等が挙げられる。
【００１７】
本明細書において、「アンチＳＤ配列」とは、原核生物の１６ＳｒＲＮＡの３’末端付近に位置するアンチ・シャイン・ダルガノ配列（Anti-Shine-Dalgarno sequence）、又はこれに対応するゲノム上の配列を指し、文脈によって使い分けられる。ｒＲＮＡに関して「アンチＳＤ配列」というときは前者を指し、ゲノム上の遺伝子配列やオペロンに関して「アンチＳＤ配列」というときは後者を指す。
アンチＳＤ配列としては、ｒＲＮＡ上の配列の場合、例えば、１６ＳｒＲＮＡの３’末端付近に位置する配列ＣＣＵＣＣ等が知られている（McLaughlin et al. (1981) J. Biol. Chem. 256:11283-91、「遺伝子」第８版、B. Lewin 著、東京化学同人、１２８−１３０）。したがって、遺伝子配列の場合のアンチＳＤ配列としては、例えば、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の３’末端付近に位置する配列ＣＣＴＣＣ等が挙げられる。
【００１８】
本明細書において、ＳＤ配列又はアンチＳＤ配列が「改変されていない」又は「インタクト」である場合、上記に挙げたＳＤ配列又はアンチＳＤ配列であり得る。
【００１９】
本明細書において、２つの配列が「相補的」である場合、それらの配列は完全に（１００％）相補的（互いの塩基の間にミスマッチが全くない）であってもよく、又は２個以下の塩基のミスマッチを含む配列であってもよい。好ましくは、相補的な配列間のミスマッチは１個以下である。さらに好ましくは、相補的な配列は完全に相補的である。
【００２０】
本発明の細菌は、改変ＳＤ配列を有する標的遺伝子と；当該改変ＳＤ配列と相補的な改変アンチＳＤ配列を有する複数個のｒｒｎオペロンと；改変されていないアンチＳＤ配列を有するｒｒｎオペロン、とを有する。
上記改変ＳＤ配列は、好ましくは、上記改変されていないアンチＳＤ配列と６０％以上の配列同一性を有し、より好ましくは８０％以上の配列同一性を有し、さらに好ましくは１００％の配列同一性を有する。
したがって、上記改変アンチＳＤ配列は、好ましくは、上記改変されていないアンチＳＤ配列の相補配列と６０％以上の配列同一性を有し、より好ましくは８０％以上の配列同一性を有し、さらに好ましくは１００％の配列同一性を有する。
【００２１】
本発明の細菌は、任意の細菌を親株にしてこれを改変することによって得ることができる。親細菌の種及び菌株は特に限定されないが、好ましくはバチルス属細菌が挙げられ、より好ましくは枯草菌（Bacillus subtilis）168株及びその変異株が挙げられる。
【００２２】
本発明の細菌がバチルス属細菌である場合、上記改変アンチＳＤ配列を有する複数個のｒｒｎオペロンは、１０種のｒｒｎオペロン、すなわちｒｒｎＡ、ｒｒｎＢ、ｒｒｎＤ、ｒｒｎＥ、ｒｒｎＧ、ｒｒｎＨ、ｒｒｎＩ、ｒｒｎＪ、ｒｒｎＯ及びｒｒｎＷから選ばれるｒｒｎオペロンであればよく、好ましくはｒｒｎＩオペロン、ｒｒｎＯオペロン及びｒｒｎＥオペロンから選ばれる。当該複数個のｒｒｎオペロンは、複数個の同じ種類のｒｒｎオペロンであっても、異なる種類のｒｒｎオペロンの組み合わせであってもよい。
当該複数個のｒｒｎオペロンは、好ましくは少なくともｒｒｎＩオペロンを含み、より好ましくは少なくともｒｒｎＩ及びｒｒｎＯオペロンを含み、さらに好ましくはｒｒｎＩ、ｒｒｎＯオペロン及びｒｒｎＥオペロンを含み、なお好ましくはｒｒｎＩ、ｒｒｎＯオペロン及びｒｒｎＥオペロンからなる。
【００２３】
また本発明の細菌がバチルス属細菌である場合、上記改変されていないアンチＳＤ配列を有するｒｒｎオペロンは、上記１０種のｒｒｎオペロンのうちのいずれか１以上であればよいが、改変アンチＳＤ配列を有するｒｒｎオペロンとは異なる種類のｒｒｎオペロンであることが好ましく、例えば、ｒｒｎＪオペロンが好ましい例として挙げられる。また好ましい例として、本発明の細菌は、上記改変されていないアンチＳＤ配列を有するｒｒｎオペロンとしてｒｒｎＪオペロンのみを有する。
【００２４】
本発明の細菌は、上記改変アンチＳＤ配列を有するｒｒｎオペロン及び改変されていないアンチＳＤ配列を有するｒｒｎオペロンを、各ｒｒｎのタイプごとに１コピーずつ有していればよいが、各々１コピー以上有していてもよい。
【００２５】
例えば、本発明の細菌は、改変アンチＳＤ配列を有するｒｒｎオペロンとして、好ましくは少なくともｒｒｎＩ及びｒｒｎＯオペロン、より好ましくはｒｒｎＩ、ｒｒｎＯオペロン及びｒｒｎＥオペロンを有し、且つ記改変されていないアンチＳＤ配列を有するｒｒｎオペロンとしてｒｒｎＪオペロンのみを有していればよく、その他のｒｒｎオペロンを有さなくともよい。
また例えば、本発明の細菌は、各１コピーの改変アンチＳＤ配列を有するｒｒｎＩ及びｒｒｎＯオペロンと、２コピーの改変されていないアンチＳＤ配列を有するｒｒｎＪオペロンとを有し、他のｒｒｎオペロンを有していない細菌であり得る。
また例えば、本発明の細菌は、各１コピーの改変アンチＳＤ配列を有するｒｒｎＩ、ｒｒｎＯオペロン及びｒｒｎＥオペロンと、２コピーの改変されていないアンチＳＤ配列を有するｒｒｎＪオペロンとを有し、他のｒｒｎオペロンを有していない細菌であり得る。
【００２６】
本願実施例では枯草菌１６８株の１０個のｒｒｎオペロンのうちｒｒｎＪを除く９個が欠失し、且つ当該ｒｒｎＪを２個有する株であるrrnJ+J+(ΔrrnHG1 ΔrrnO1 ΔrrnD1 ΔrrnE1 ΔrrnB2 ΔrrnA1 ΔrrnI2 ΔrrnW2）（Nanamiya et al. (2010) Microbiology 156, 2944-2952のSupplementary material中に記載されている。下記参考例２も参照のこと）を元株（RIK530株）として目的の変異株を調製している。ｒｒｎＪオペロンの５’側先頭付近の配列とｒｒｎＪオペロン３’側下流の配列に共通配列（AACAAAATGATCTTTGAAAACTAAACAAGACAAAACGTACCTGTT：配列番号９５）が存在する。ｒｒｎＪ以外の９個のｒｒｎオペロンを欠失した枯草菌１６８株のゲノムの複製過程における共通配列間での相同組換えにより、ｒｒｎＪを２個有する株であるrrnJ+J+が出現すると推察される。rrnJ+J+株ゲノムにおけるｒｒｎＪ遺伝子の概要を図１に示す。
rrnJ+J+株はｒｒｎＪ以外の９個のｒｒｎオペロンを欠失した枯草菌１６８株において、増殖性が回復した変異体として見出された。ｒｒｎオペロンの欠失はｒｒｎオペロン以外の遺伝子の変異では補うことができないため、増殖性はｒｒｎＪオペロンの多コピー化でのみ回復されるものと推察される。従って、Nanamiya et al. (2010) Microbiology 156, 2944-2952に記載の方法によりｒｒｎＪ以外の９個のｒｒｎオペロンを欠失した枯草菌１６８株より増殖に優れた株を選抜することにより、rrnJ+J+株を再現良く取得することがでる。
【００２７】
本発明の細菌は、細菌内に改変ＳＤ配列を有する標的遺伝子と改変アンチＳＤ配列を有する複数個のｒｒｎオペロンと、改変されていないアンチＳＤ配列を有するｒｒｎオペロンとを構築することによって作製することができる。
本発明の細菌において、上記標的遺伝子は、当該細菌が生来有する遺伝子であってもよく、外来遺伝子又は異種遺伝子であってもよい。また本発明の細菌において、上記ｒｒｎオペロンは、当該細菌が生来有するオペロンであってもよく、天然に生じた突然変異によって新たに構築されたオペロンであってもよく、又は外部から導入したものでもよい。
したがって、上記改変ＳＤ配列及び上記改変アンチＳＤ配列は、当該細菌が生来有するＳＤ配列若しくはアンチＳＤ配列を改変して作製されたものであってもよく、天然に生じた改変ＳＤ配列若しくはアンチＳＤ配列であってもよく、又は細胞外から導入された改変されたＳＤ配列若しくはアンチＳＤ配列であってもよい。
【００２８】
上記改変ＳＤ配列を有する標的遺伝子は、細菌細胞のゲノム内の標的遺伝子のＳＤ配列を改変するか、あるいは改変ＳＤ配列を有する標的遺伝子を含むＤＮＡ断片を外部から細菌ゲノム内に組み込むか、またあるいは改変ＳＤ配列を有する標的遺伝子を含むＤＮＡ断片を含有するプラスミドベクター等を細菌内に導入することによって、構築することができる。あるいは、天然に生じた突然変異によって得られた改変ＳＤ配列を有する標的遺伝子であってもよい。
【００２９】
上記改変アンチＳＤ配列を有するｒｒｎオペロンは、細菌細胞のゲノム内の適当なｒｒｎオペロンのアンチＳＤ配列を改変するか、あるいは改変アンチＳＤ配列を有するｒｒｎオペロンを含むＤＮＡ断片を外部から細菌ゲノム内に組み込むか、またあるいは改変アンチＳＤ配列を有するｒｒｎオペロンを含むＤＮＡ断片を含有するプラスミドベクター等を細菌内に導入することによって、構築することができる。あるいは、天然に生じた突然変異によって得られた改変アンチＳＤ配列を有するｒｒｎオペロンであってもよい。
【００３０】
上記改変されていないアンチＳＤ配列を有するｒｒｎオペロンとしては、細菌が生来有するインタクトなｒｒｎオペロンを利用すればよい。あるいは、改変されていないアンチＳＤ配列を有するｒｒｎオペロンを含むＤＮＡ断片を外部から細菌ゲノム内に組み込むか、又は当該ＤＮＡ断片を含有するプラスミドベクター等を細菌内に導入することによって、構築することができる。またあるいは、天然に生じた突然変異によって得られた改変されていないアンチＳＤ配列を有するｒｒｎオペロンであってもよい。
【００３１】
さらに本発明の細菌においては、必要に応じて、細菌が生来有するインタクトなｒｒｎオペロンの一部又は全部が削除されていてもよい。全部を削除する場合は、改変されていないアンチＳＤ配列を有するｒｒｎオペロンを外部から導入するか、又は天然に生じた突然変異によって構築したｒｒｎオペロンを利用することが望ましい。
【００３２】
改変ＳＤ配列を含むＤＮＡ断片、及び改変ＳＤ配列を有する標的遺伝子配列を含むＤＮＡ断片は、例えば、細菌ゲノムを鋳型とし、改変ＳＤ配列を含むプライマーを用いてＰＣＲを行うことによって作製することができる。同様の手順で、改変アンチＳＤ配列を含むＤＮＡ断片、及び改変アンチＳＤ配列を有するｒｒｎ配列を含むＤＮＡ断片を作製することができる。
【００３３】
得られたＤＮＡ断片を、適当な手順で細菌ゲノム内に組み込むか、あるいは任意の発現ベクターに組み込んだ後当該ベクターを細菌内に導入することにより、細菌内に改変ＳＤ配列を有する標的遺伝子や改変アンチＳＤ配列を有するｒｒｎが構築される。
ＤＮＡ配列の改変、所望の配列を有するＤＮＡ断片の構築、ＤＮＡ断片のベクターへの組み込み、ベクターの細菌細胞への導入、およびＤＮＡ断片の細菌ゲノム内への導入の手順は、当業者に周知である。
【００３４】
例えば、標的遺伝子又はｒｒｎを含むＤＮＡ断片を細菌ゲノム内に組み込むには、相同組換え法を用いることができる。すなわち、組み込み先のゲノム領域の相同配列と導入したい標的遺伝子又はｒｒｎオペロンとを含むＤＮＡ断片をＰＣＲ等によって作製し、これをプラスミドベクターにクローニングし、得られた組換えプラスミドを細菌内に取り込ませ、プラスミド上の当該相同配列と当該ゲノム領域との間で相同組換えを起こさせることによって、細菌ゲノム上に標的遺伝子又はｒｒｎオペロンを組み込むことができる。
【００３５】
同様の手順で、細菌ゲノム上のｒｒｎオペロンを削除することが可能である。すなわち、削除したいｒｒｎの上流及び下流領域のＤＮＡ断片をＰＣＲ等によって作製し、これらをプラスミドに組み込み、連結させる。得られた組換えプラスミドを細菌内に取り込ませ、当該プラスミド上の領域とゲノム上のｒｒｎの上流及び下流領域との間で相同組換えを起こさせることによって、細菌ゲノム上のｒｒｎ領域を削除することができる。
【００３６】
同様に相同組換え法を用いて、改変ＳＤ配列又はアンチＳＤ配列のみを細菌ゲノム上の標的遺伝子内又はｒｒｎオペロン内の所望の位置に組み込むことができる。
【００３７】
本発明はまた、本発明の細菌を培養する工程を含む目的遺伝子産物の生産方法を提供する。当該方法において、本発明の細菌に含まれる改変ＳＤ配列を有する標的遺伝子とは、目的遺伝子産物をコードする遺伝子である。目的遺伝子は、細菌が生来有する遺伝子であっても、異種遺伝子であってもよい。当該目的遺伝子としては、タンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子が挙げられる。当該目的遺伝子は、ゲノム上に存在していても細胞内に導入されたプラスミドベクター等のベクター上に存在していてもよいが、好ましくはベクター上にあり、より好ましくは発現ベクター上に存在する。
【００３８】
本発明の方法においては、本発明の細菌を、同化性の炭素源、窒素源、その他の必須成分を含む培地に接種し、通常の培養法にて培養する。培養されている細菌内では、改変アンチＳＤ配列を有するｒｒｎによって、改変ＳＤ配列を有する目的遺伝子が特異的に翻訳されるため、目的遺伝子産物が効率よく生産される。次いで、当該目的遺伝子産物を培養物から採取・精製すればよい。培養に使用される培地の組成及び培養条件、目的遺伝子産物の採取及び精製等の手順については、使用する細菌、ベクターの種類、目的遺伝子産物の種類等にしたがって、当業者が適宜選択することができる。
【００３９】
上記目的遺伝子がコードするタンパク質又はポリペプチドとしては、特に限定されず、洗剤、食品、繊維、飼料、化学品、医療、診断など各種産業用酵素や、生理活性ペプチドなどが含まれる。また、産業用酵素の機能別には、酸化還元酵素（Ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ）、転移酵素（Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、加水分解酵素（Ｈｙｄｒｏｌａｓｅ）、脱離酵素（Ｌｙａｓｅ）、異性化酵素（Ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）、合成酵素（Ｌｉｇａｓｅ／Ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）等が含まれるが、好適にはセルラーゼ、α−アミラーゼ、プロテアーゼ等の加水分解酵素、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(ＣＡＴ)等の転移酵素が挙げられる。
【００４０】
セルラーゼの具体例としては、多糖加水分解酵素の分類（Bernard H. (1991) Biochem.J. 280:309-316）中でファミリー５に属するセルラーゼが挙げられ、中でも微生物由来、例えば、バチルス属細菌由来のセルラーゼが挙げられる。より具体的な例として、配列番号２及び配列番号４で示されるアミノ酸配列からなる、それぞれバチルス  エスピーＫＳＭ−Ｓ２３７株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８７５）又はバチルス  エスピーＫＳＭ−６４株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２８８６）由来のアルカリセルラーゼや、当該アミノ酸配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、なお好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるセルラーゼが挙げられる。
【００４１】
α−アミラーゼの具体例としては、微生物由来のα−アミラーゼが挙げられ、バチルス属細菌由来の液化型アミラーゼが好ましい。より具体的な例として、配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるバチルス  エスピーＫＳＭ−Ｋ３８株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６９４６）由来のアルカリアミラーゼや、当該アミノ酸配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、なお好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるアミラーゼが挙げられる。
【００４２】
プロテアーゼの具体例としては、微生物由来、特にバチルス属細菌由来のセリンプロテアーゼや金属プロテアーゼ等が挙げられる。より具体的な例として、配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるバチルス  クラウジ（Bacillus clausii）ＫＳＭ−Ｋ１６株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３３７６）由来のアルカリプロテアーゼや、当該アミノ酸配列と７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるプロテアーゼが挙げられる。
【００４３】
クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(ＣＡＴ)は、アセチル-ＣｏＡのアセチル基をクロラムフェニコールの３位に転移する酵素である。具体的には、配列番号７で示されるアミノ酸配列からなるStaphylococcus aureus由来のＣＡＴや、当該アミノ酸配列と７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有し、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。
【００４４】
上記タンパク質又はポリペプチドをコードする目的遺伝子は、改変ＳＤ配列に加えて、その上流に位置する当該遺伝子の転写、翻訳、分泌に関わる制御領域、即ち、プロモーター及び転写開始点を含む転写開始制御領域、リボソーム結合部位及び開始コドンを含む翻訳開始領域、並びに分泌シグナルペプチド領域から選ばれる１以上の領域と作動可能に連結されていることが望ましい。特に、転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる３領域が連結されていることが好ましく、更に分泌シグナルペプチド領域がバチルス属細菌のセルラーゼ遺伝子由来のものであり、転写開始領域及び翻訳開始領域が当該セルラーゼ遺伝子の開始コドンから始まる長さ０．６〜１ｋｂの上流領域であるものが、目的のタンパク質又はポリペプチド遺伝子と作動可能に連結されていることが望ましい。例えば、特開２０００−２１００８１号公報や特開平４−１９０７９３号公報等に記載されているバチルス属細菌、すなわちＫＳＭ−Ｓ２３７株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８７５）、ＫＳＭ−６４株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２８８６）由来のセルラーゼ遺伝子の転写開始制御領域、翻訳開始領域及び分泌シグナルペプチド領域が目的のタンパク質又はポリペプチドの構造遺伝子と作動可能に連結されていることが望ましい。
【００４５】
より具体的には配列番号１で示される塩基配列の塩基番号１〜６５９の塩基配列、配列番号３で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号１〜６９６の塩基配列、また当該塩基配列に対して７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡ断片、或いは上記いずれかの塩基配列の一部が欠失した塩基配列からなるＤＮＡ断片が、改変ＳＤ配列に加えて、上記タンパク質又はポリペプチドをコードする目的遺伝子の構造遺伝子と作動可能に連結されていることが望ましい。尚、ここで、上記塩基配列の一部が欠失した塩基配列からなるＤＮＡ断片とは、上記塩基配列の一部を欠失しているが、遺伝子の転写、翻訳、分泌に関わる機能を保持しているＤＮＡ断片を意味する。
【００４６】
本明細書において、プロモーターと遺伝子、又はプロモーターと遺伝子と分泌シグナルとの「作動可能な連結」とは、プロモーターが遺伝子の転写を誘導し得るように、又は遺伝子にコードされたタンパク質が分泌シグナルにより分泌されるように、連結されていることをいう。プロモーターと遺伝子、又はプロモーターと遺伝子と分泌シグナルとの「作動可能な連結」の手順は当業者に周知である。
【実施例】
【００４７】
以下、実施例を示し、本発明をより具体的に説明する。
【００４８】
実施例１
１．改変ｒｒｎを有する変異細菌株の構築
枯草菌１６８株の１０個のｒｒｎオペロンのうちｒｒｎＪを除く９個が欠失し、且つ当該ｒｒｎＪを２個有する株であるrrnJ+J+(ΔrrnHG1 ΔrrnO1 ΔrrnD1 ΔrrnE1 ΔrrnB2 ΔrrnA1 ΔrrnI2 ΔrrnW2)（Nanamiya et al. (2010) Microbiology 156, 2944-2952のSupplementary material中に記載されている。下記参考例２も参照のこと）を元株（RIK530株）として以下の変異株を構築した。変異株構築に用いたプライマーを表１に示し、構築手順の概要を図２に示す。
【００４９】
【表１】
0005847458.tif 000002
【００５０】
１）RIK1140（ΔtrpB'A'::PrrnOcatpt1 SD10(CCTCC) erm hisC101）株の構築
RIK213株（trpB'A'::PrrnOkan196(am) erm hisC101）(Nanamiya et al. (2010) Microbiology 156:2944-2952、下記参考例１も参照)のＤＮＡを鋳型としてＴＲＰＦプライマーとＰＲＯＣＲプライマー、及びＰＲＯＣＦプライマーとＴＲＰＲプライマーをそれぞれ用いてトリプトファン合成遺伝子領域を増幅した。次に、pC194（Horinouchi, S. et al. ( 1982) J. Bacteriol. 150:815-825、Bacillus Genetic Stock Center [http://www.bgsc.org/]より入手可能）を鋳型として、ＣＡＴＦプライマーとＣＡＴＲプライマーを用いてクロラムフェニコール耐性遺伝子を増幅した。得られた３断片を鋳型としてＴＲＰＦプライマーとＴＲＰＲプライマーを用いてPrrnOcatpt1 erm ＤＮＡ断片を作製した。次に、PrrnOcatpt1 erm ＤＮＡ断片をRIK213株に形質転換し、クロラムフェニコール耐性である形質転換体を選択した。RIK1140株にPrrnOcatpt1 ermが導入されていることをＰＣＲとシークエンシングにより確認した。
【００５１】
２）RIK1211（ΔrrnHG1ΔrrnW2ΔrrnO1ΔrrnD1ΔrrnE1ΔrrnB2ΔrrnA1ΔrrnI2ΔtrpB'A'::PrrnOcatpt1 SD10(CCTCC) erm hisC101）株の構築
RIK1140株のＤＮＡを鋳型としてＴＲＰＦプライマーとＣＡＴＳＤＲプライマー、及びＣＡＴＳＤＦプライマーとＴＲＰＲプライマーを用いてトリプトファン合成遺伝子領域を増幅した。得られた２断片を鋳型としてＴＲＰＦプライマーとＴＲＰＲプライマーを用いてtrpB'A'::PrrnOcatpt1 SD10(CCTCC) erm hisC101断片を作製した。得られたtrpB'A'::PrrnOcatpt1 SD10(CCTCC) erm hisC101断片をRIK530株に形質転換し、エリスロマイシン耐性である形質転換体を選択した。RIK1211株にtrpB'A'::PrrnOcatpt1 SD10(CCTCC) erm hisC101が導入されていることをＰＣＲとシークエンシングにより確認した。
【００５２】
３）RIK1196（ΔrrnHG1ΔrrnW2ΔrrnO1ΔrrnD1ΔrrnE1ΔrrnB2ΔrrnA1ΔtrpB'A'::PrrnOcatpt1SD10(CCTCC) erm hisC101 rrnIanti-SD10 (GGAGG)）株の構築
ｒｒｎＩ領域内の野生型アンチＳＤ配列ＣＣＴＣＣ（rrnIanti-SD）を改変アンチＳＤ配列ＧＧＡＧＧ（rrnIanti-SD10）に改変するため、RIK542株（Nanamiya et al. (2010) Microbiology. 156:2977-2982、下記参考例３も参照）のＤＮＡを鋳型としてＲＲＮＩＦプライマーとＲＲＮＩＳＤＲプライマー、及びＲＲＮＩＳＤＦプライマーとＲＲＮＩＲプライマーをそれぞれ用いてｒｒｎＩ領域を増幅した。次に、得られた２断片を鋳型としてＲＲＮＩＦプライマーとＲＲＮＩＲプライマーを用いて、rrnIanti-SD10を有するＤＮＡ断片を作製した。得られたＤＮＡ断片をRIK1211株に形質転換し、クロラムフェニコール耐性である形質転換体を選択した。RIK1196株に改変アンチＳＤ（anti-SD10）配列を有するｒｒｎＩが導入されていることをシークエンシングにより確認した。
【００５３】
４）RIK1229（ΔrrnHG1ΔrrnW2ΔrrnO1ΔrrnD1ΔrrnE1ΔrrnB2ΔrrnA1 rrnIanti-SD10 (GGAGG) hisC101）株の構築
枯草菌W168株（Nakamura et al. (1999) Int. J. Syst. Bacteriol. 49:1211-1215、Bacillus Genetic Stock Center [http://www.bgsc.org/]より入手可能）のＤＮＡを鋳型としてＴＲＰＦ２プライマーとＴＲＰＲ２プライマーを用いてトリプトファン合成遺伝子領域を増幅した。得られたＤＮＡ断片をRIK1196株に形質転換し、トリプトファン非要求性、ヒチジン要求性、および、クロラムフェニコール感受性、エリスロマイシン感受性を示す形質転換体を選択した。RIK1229株に野生型のトリプトファン合成遺伝子が導入されたことをＰＣＲとシークエンシングにより確認した。
【００５４】
５）RIK1215（ΔrrnHG1ΔrrnW2ΔrrnO1ΔrrnD1ΔrrnB2ΔrrnA1ΔrrnI2 rrnEanti-SD10 (GGAGG)ΔtrpB'A'::PrrnOcatpt1 SD10 (CCTCC) erm hisC101）株の構築
ｒｒｎＥ領域内の野生型アンチＳＤ配列ＣＣＴＣＣ（rrnEanti-SD）を改変アンチＳＤ配列ＧＧＡＧＧ（rrnEanti-SD10）に改変するため、RIK545株（Nanamiya et al. (2010) Microbiology 156:2977-2982、下記参考例５も参照)のＤＮＡを鋳型としてＲＲＮＥＦプライマーとＲＲＮＥＳＤＲプライマー、及びＲＲＮＥＳＤＦプライマーとＲＲＮＥＲプライマーをそれぞれ用いてｒｒｎＥ領域を増幅した。次に、得られた２断片を鋳型としてＲＲＮＥＦプライマーとＲＲＮＥＲプライマーを用いて、rrnEanti-SD10を有するＤＮＡ断片を作製した。得られたＤＮＡ断片をRIK1211株に形質転換し、クロラムフェニコール耐性である形質転換体を選択した。RIK1215株に改変アンチＳＤ（anti-SD10）配列を有するｒｒｎＥが導入されていることをシークエンシングにより確認した。
【００５５】
６）RIK1257（ΔrrnHG1ΔrrnW2ΔrrnO1ΔrrnD1ΔrrnB2ΔrrnA1ΔrrnI2 rrnEanti-SD10 (GGAGG) ydhU+::PrrnOkanΔtrpB'A'::PrrnOcatpt1 SD10 (CCTCC) erm hisC101）株の構築
ydhU遺伝子の上流領域にｒｒｎＯプロモーターを有するカナマイシン耐性遺伝子（PrrnOkan）を導入するため、RIK211株（Nanamiya et al. (2010) Microbiology 156:2977-2982、下記参考例1も参照）を鋳型としてPrrnOkan領域をＲＲＮＯＰＦプライマーとＫＭＲプライマーを用いて増幅した。次に、ydhU遺伝子の上流領域を野生株のＤＮＡを鋳型としてＹＤＨＵＵＰＦプライマーとＹＤＨＵＵＰＲプライマー、及びＹＤＨＵＤＦプライマーとＹＤＨＵＤＲプライマーをそれぞれ用いて増幅した。得られた２種のＤＮＡ断片とPrrnOkan遺伝子を鋳型として、ＹＤＨＵＵＰＦプライマーとＹＤＨＵＤＲプライマーを用いてydhU遺伝子の上流領域にカナマイシン耐性遺伝子が導入されたＤＮＡ断片（ydhU+::PrrnO-kan）を作製した。ydhU+::PrrnO-kan ＤＮＡ断片をRIK1215株に形質転換し、カナマイシン耐性である形質転換体を選択した。RIK1257株にydhU+::PrrnO-kanが導入されていることをＰＣＲとシークエンシングにより確認した。
【００５６】
７）RIK1226（ΔrrnHG1ΔrrnW2ΔrrnE1ΔrrnD1ΔrrnB2ΔrrnA1ΔrrnI2 rrnOanti-SD10 (GGAGG)ΔtrpB'A'::PrrnOcatpt1 SD10 (CCTCC) erm hisC101）株の構築
ｒｒｎＯ領域内の野生型アンチＳＤ配列ＣＣＴＣＣ（rrnOanti-SD）を改変アンチＳＤ配列ＧＧＡＧＧ（rrnOanti-SD10）に改変するため、RIK543株(Nanamiya et al. (2010) Microbiology 156:2977-2982、下記参考例４も参照)のＤＮＡを鋳型としてＲＲＮＯＦプライマーとＲＲＮＯＳＤＲプライマー、ＲＲＮＯＳＤＦプライマーとＲＲＮＯＲプライマーをそれぞれ用いてｒｒｎＯ領域を増幅した。次に、得られた２断片を鋳型としてＲＲＮＯＦプライマー、ＲＲＮＯＲプライマーを用いて、rrnOanti-SD10を有するＤＮＡ断片を作製した。得られたＤＮＡ断片をRIK1211株に形質転換し、クロラムフェニコール耐性である形質転換体を選択した。RIK1226株に改変アンチＳＤ（anti-SD10）配列を有するｒｒｎＯが導入されていることをシークエンシングにより確認した。
【００５７】
８）RIK1224（ΔrrnHG1ΔrrnW2ΔrrnE1ΔrrnD1ΔrrnB2ΔrrnA1ΔrrnI2 rrnOanti-SD10 (GGAGG)ΔtrpB'A'::PrrnOcatpt1 SD10 (CCTCC) erm hisC101  yaaC::spc）株の構築
yaaC遺伝子の上流部分をＹＡＡＣ−Ｆ１プライマーとＹＡＡＣ−Ｒ１プライマーを用いて、下流部分をＹＡＡＣ−Ｆ２プライマー、ＹＡＡＣ−Ｒ２プライマーを用いて、それぞれ増幅した。次に、プラスミドpDG1727（Guerout-Fleury et al. (1995) Gene. 167:335-336、Bacillus Genetic Stock Center [http://www.bgsc.org/]より入手可能）のスペクチノマイシン耐性遺伝子を鋳型とし、スペクチノマイシン耐性遺伝子をＳＰＣ−ＦプライマーとＳＰＣ−Ｒプライマーを用いて増幅した。得られた３断片を鋳型としてＹＡＡＣ−Ｆ１プライマーとＹＡＡＣ−Ｒ２プライマーを用いて増幅し、yaaC::spc ＤＮＡ断片を作製した。当該yaaC::spc ＤＮＡ断片をRIK1226株に形質転換し、スペクチノマイシン耐性である形質転換体を選択した。RIK1224株にyaaC::spc変異が導入されていることをＰＣＲとシークエンシングにより確認した。
【００５８】
９）RIK1246（ΔrrnHG1ΔrrnW2ΔrrnO1ΔrrnD1ΔrrnE1ΔrrnB2ΔrrnA1 rrnOanti-SD10 (GGAGG) rrnI anti-SD10 (GGAGG)ΔtrpB'A'::PrrnOcatpt1 SD10 (CCTCC) erm hisC101 yaaC::spc）株の構築
RIK1224から抽出した染色体ＤＮＡをRIK1229株に形質転換し、スペクチノマイシン耐性である形質転換体を選択した。RIK1246株にｒｒｎＯ領域が導入されていることをＰＣＲとシークエンシングにより確認した。
【００５９】
１０）RIK1267（ΔrrnHG1ΔrrnW2ΔrrnD1ΔrrnB2ΔrrnA1 rrnOanti-SD10 (GGAGG) rrnI anti-SD10 (GGAGG)rrnE anti-SD10 (GGAGG) yaaC::spc ydhU+::PrrnO-kan hisC101）株の構築
RIK1257株から抽出した染色体ＤＮＡをRIK1246株に形質転換し、カナマイシン耐性である形質転換体を選択した。RIK1267株にｒｒｎＥ領域が導入されていることをＰＣＲとシークエンシングにより確認した。
【００６０】
２．改変ＳＤ配列を有する標的遺伝子発現プラスミドpHYS237(pHYS237-SD10)の構築
バチルス エスピー（Bacillus sp.）KSM-S237株（FERM BP-7875）由来のアルカリセルラーゼ遺伝子（特開２０００−２１００８１号公報）断片（３．１ｋｂ）がシャトルベクターpHY300PLKのBamHI制限酵素切断点に挿入された組換えプラスミドpHY-S237のアルカリセルラーゼ遺伝子のＳＤ配列ＧＧＡＧＧを改変ＳＤ配列ＣＣＴＣＣに改変したプラスミドpHY237-SD10を、以下のように構築した。プラスミド構築に用いたプライマーを表２に示し、構築手順の概要を図３に示す。
【００６１】
【表２】
0005847458.tif 000003
【００６２】
１）pHYS237-EIの構築
バチルス エスピー（Bacillus sp.）ＫＳＭ−Ｓ２３７株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８７５）由来のアルカリセルラーゼ遺伝子（特開２０００−２１００８１号公報）の断片（３．１ｋｂ）がシャトルベクターpHY300PLKのBamHI制限酵素切断点に挿入された組換えプラスミドであるpHYS237をEcoRI処理した後、アガロースゲル電気泳動を行い、６．２ｋｂのＤＮＡ断片をゲルから切り出した。当該ＤＮＡ断片をプラスミド精製キットHigh Pure PCR Product Purification Kit (Roche)を用いて精製し、この精製したＤＮＡを、LigationHigh（TOYOBO）を用いてライゲーションし、得られたプラスミドベクターをE. coli HB101株に形質転換した。形質転換体から、プラスミドpHYS237-EIを抽出した（図３（１））。
【００６３】
２）改変ＳＤ配列を含むＰＣＲ断片の調製
pHYＳ237を鋳型にｐｈｙＵＰｆとｃｅｌＳＤ１０ｆのプライマーセットを用いてＰＣＲ断片（Ａ）を調製した。上記ＤＮＡを鋳型とし、Ｓ２３７ＳＤ１０ｒ及びＳ２３７ＤＮｒのプライマーセットを用いて、断片（Ｂ）をＰＣＲにより増幅した。次に、断片（Ａ）と断片（Ｂ）を鋳型とし、ｐｈｙＵＰｆ２およびＳ２３７ＤＮｒ２のプライマーセットを用いたＰＣＲにより断片（Ｃ）を増幅した（図３（２））。
【００６４】
３）pHYS237-SD10の構築
１）で作製したプラスミドpHYS237-EIと２）で作製したＤＮＡ断片（Ｃ）とを制限酵素EcoRIを用いて消化し、それぞれ線状化したベクター（６．２ｋｂ）及びインサート（１．８ｋｂ）として精製した。次に、得られた当該ベクターとインサートをLigation  High（TOYOBO）を用いて連結した後、得られたベクターを用いてE. coli HB101の形質転換を行った。得られた形質転換体からプラスミドを抽出し、pHYS237-SD10とした（図３（３））。
【００６５】
４）組換え細菌株の作製
３）で得られたプラスミドpHYS237-SD10を、プロトプラスト形質転換法によってRIK530株、RIK1196株、RIK1246株、RIK1267株のそれぞれに導入し、組換え細菌株を作製した。
【００６６】
試験例１  アルカリセルラーゼ分泌生産評価
上記実施例１で得られたRIK530株、RIK1196株、RIK1246株及びRIK1267株由来の組換え菌株を１０ｍＬのＬＢ培地で一夜３７℃で振盪培養し、更にこの培養液０．０５ｍＬを５０ｍＬの２×Ｌ−マルトース培地（２％トリプトン、１％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、７．５％マルトース、７．５ｐｐｍ硫酸マンガン４−５水和物、１５ｐｐｍテトラサイクリン）に接種し、３０℃にて３日間振盪培養を行った。遠心分離によって菌体を除いた培養液上清のアルカリセルラーゼ活性を測定し、培養によって菌体外に分泌生産されたアルカリセルラーゼの量を求めた。
セルラーゼ活性測定については、１／７．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、和光純薬)で適宜希釈したサンプル溶液５０μＬに０．４ｍＭ p-nitrophenyl-β-D-cellotrioside(生化学工業)を５０μＬ加えて混和し、３０℃にて反応を行った際に遊離するｐ−ニトロフェノール量を４２０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ４２０ｎｍ）変化により定量した。１分間に１μｍｏｌのｐ-ニトロフェノールを遊離させる酵素量を１Ｕとした。
【００６７】
組換え菌株のアルカリセルラーゼの分泌生産能を表３に示す。表３において、セルラーゼの分泌生産能は、RIK1196株にpHYS237-SD10を導入した組換え菌株の生産量を１００としたときの相対値で示している。
【００６８】
【表３】
0005847458.tif 000004
【００６９】
以下、実施例に用いた菌株の作製方法を参考例として記載する。菌株の作製に使用したプライマーを表４および表５に示す。
【００７０】
参考例１  RIK213株（trpB'A'::PrrnOkan erm hisC101）の構築
hisC101は、hisC遺伝子内におけるQ318amber変異を表し、この変異はヒスチジン要求性を示す。またtrpC2変異（トリプトファン要求性）と連鎖しているため、枯草菌の遺伝的マーカーとして使用されている。先ず、trpC2変異とhisC101変異を有し、且つtrpBの+1011位からtrpAの+69位までが欠失した168株のtrpB領域とtrpA領域の間にカナマイシン耐性遺伝子とエリスロマイシン耐性遺伝子をタンデムに導入した。カナマイシン耐性遺伝子はpUB110由来であり、rrnOプロモーターを連結した（PrrnOkan）。エリスロマイシン耐性遺伝子はpMutin由来の遺伝子を用いた。次に、カナマイシン耐性遺伝子にK196amber変異を導入し、カナマイシン感受性であり且つエリスロマイシン耐性を有するRIK213株（trpB'A'::PrrnOkan196(am) erm hisC101）を構築した。また、エリスロマイシン耐性遺伝子内にY190Ocher変異を導入した、カナマイシン耐性、且つエリスロマイシン感受性を示すRIK211（trpB'A'::PrrnOkan erm190(oc) hisC101）株を構築した（Nanamiya et al. (2010) Microbiology 156:2977-2982）。
【００７１】
参考例２  RIK530株の構築
１）ｒｒｎＨＧの欠失
枯草菌１６８株を鋳型にし、ｒｒｎＨＧ領域の上流領域、下流領域をそれぞれｒｒｎＨＧＵＦプライマーとｒｒｎＨＧＵＲプライマー、ｒｒｎＨＧＤＦプライマーとｒｒｎＨＧＤＲプライマーを用いてＰＣＲにて増幅した。得られた断片をpBR322プラスミドに挿入したプラスミド（ptRNA）を調製した。さらにクロラムフェニコール耐性遺伝子（cat）を導入したプラスミドを調製し（ptRNA-Cm）、ptRNA-Cmを用いてゲノム上のrrnHG領域と相同組換えを行なった。次に、ptRNAからrrnHGの上流−下流領域を含むＤＮＡ断片を切り出し、カナマイシン耐性遺伝子及び温度感受性変異を有するrepU遺伝子とプラスミド上で連結し、これをゲノム内のptRNA-Cm領域と組換えた。ＬＢ培地で３０℃で培養し、カナマイシン耐性及びクロラムフェニコール感受性を指標に株を選択し、rrnHG欠失株（ΔrrnHG1）を得た（Nanamiya et al. (2010) Microbiology 156:2977-2982）。
【００７２】
２）ｒｒｎＯの欠失
ｒｒｎＯ領域の上流領域、下流領域をそれぞれ、ｒｒｎＯＵＦプライマーとｒｒｎＸＵＲｃａｔプライマー、ｒｒｎＸＤＦｃａｔプライマーとｒｒｎＯＤＲプライマーを用いて増幅した。次に、ＣＡＴ−Ｆ２プライマー、ＣＡＴ−Ｒ２プライマーを用いてpC194のcat遺伝子を増幅した。得られた３断片をｒｒｎＯＵＦプライマー、ｒｒｎＯＤＲプライマーを用いてＳＯＥ−ＰＣＲを行いｒｒｎＯ領域の上流領域、cat遺伝子、及び下流領域の順に連結されたrrnO::catpt1DNA断片を構築し、枯草菌ゲノムに導入した（ΔrrnO::catpt1）。次に、ｒｒｎＯを欠失するため、ｒｒｎＯ領域の上流領域、下流領域をそれぞれ、ｒｒｎＯＵＦプライマーとｒｒｎＸＵＲプライマー、ｒｒｎＸＤＦプライマーとｒｒｎＯＤＲプライマーにて増幅後、得られた２断片をｒｒｎＯＵＦプライマー、ｒｒｎＯＤＲプライマーで連結し、ΔrrnO ＤＮＡ断片を調製した。また、R211株を鋳型として、ｔｒｐＢＡＵＦプライマー及びｔｒｐＢＡＤＲプライマーを用いてtrpB'A'::PrrnOkan erm190(oc)ＤＮＡ断片を調製した。得られた、ΔrrnO ＤＮＡ断片とtrpB'A'::PrrnOkan erm190(oc)ＤＮＡ断片をΔrrnHG1ΔrrnO::catpt1 trpB'A'::PrrnOkan196(am) erm 株に対して形質転換を行い、ペニシリン濃縮の手法を用いて、カナマイシン耐性を有し、クロラムフェニコール感受性となった株、すなわちcat遺伝子が除かれたΔrrnO株を得た（Nanamiya et al. (2010) Microbiology 156:2977-2982）。
【００７３】
３）ｒｒｎＤ、Ｅ、Ｂの欠失
ｒｒｎＯと同様にｒｒｎＤ、Ｅ、及びＢを欠失した。はじめに、それぞれのｒｒｎにcatpt1変異を導入するため、各ｒｒｎの上流、下流領域を以下のプライマーで増幅した。ｒｒｎＤの上流、下流領域は、ｒｒｎＤＵＦプライマーとｒｒｎＸＵＲｃａｔプライマー及びｒｒｎＸＤＦｃａｔプライマーとｒｒｎＤＤＲプライマーを、ｒｒｎＥの上流、下流領域は、ｒｒｎＥＵＦプライマーとｒｒｎＸＵＲｃａｔプライマー及びｒｒｎＸＤＦｃａｔプライマーとｒｒｎＥＤＲプライマーを、ｒｒｎＢの上流、下流領域は、ｒｒｎＢＵＦプライマーとｒｒｎＸＵＲｃａｔプライマー及びｒｒｎＸＤＦｃａｔプライマーとｒｒｎＢＤＲプライマーを用いた。
次に、ΔrrnD1、ΔrrnE1、及びΔrrnB2をそれぞれ有するＤＮＡ断片を構築するため、ｒｒｎＤの上流、下流領域を、ｒｒｎＤＵＦプライマーとｒｒｎＸＵＲプライマー及びｒｒｎＸＤＦプライマーとｒｒｎＤＤＲプライマー、ｒｒｎＥの上流、下流領域を、ｒｒｎＥＵＦプライマーとｒｒｎＸＵＲプライマー及びｒｒｎＸＤＦプライマーとｒｒｎＥＤＲプライマー、ｒｒｎＢの上流、下流領域を、ｒｒｎＢＵＦプライマーとｒｒｎＸＵＲプライマー及びｒｒｎＸＤＦプライマーとｒｒｎＢＤＲプライマーを用いて増幅した。得られたＤＮＡ断片を用いて、ΔrrnD1、ΔrrnE1、及びΔrrnB2断片を調製した後、ｒｒｎＯの欠失方法と同様にcatpt1遺伝子を除き、ΔrrnO、ΔrrnD、ΔrrnB2 株を構築した（Nanamiya et al. (2010) Microbiology 156:2977-2982）。
【００７４】
４）ｒｒｎＡの欠失
ｒｒｎＡの欠失は、rrnA-16Sの下流に存在するtrnAIleとtrnAAlaを残して構築した。まず、ΔrrnO1::catpt1株と同様にrrnA-16S領域にcatpt1遺伝子を導入した。次に、rrnAプロモーター領域、catpt1遺伝子、ｔＲＮＡ遺伝子を含む領域、及びrrnA−5Sの下流領域を、それぞれｒｒｎＡＵＦプライマーとｒｒｎＡＴＲＲプライマー、ｒｒｎＡ２３ＳＤＦプライマーとｒｒｎＡＤＲプライマーを用いて増幅した。得られた２種のＤＮＡ断片をｒｒｎＡＵＦプライマーとｒｒｎＡＤＲプライマーを用いて増幅し、rrnA1::catpt1（trnA-Ile、Ala）ＤＮＡ断片を構築した。得られたＤＮＡ断片をΔrrnHG1、ΔrrnO1、trpB'A'::PrrnOkan196(am) erm hisC101株に形質転換し、クロラムフェニコール耐性である形質転換体を選択した。次に、catpt1遺伝子を除くため、ΔrrnA1::catpt1株のcatpt1遺伝子の上流領域、下流領域、およびrrnA-5Sの下流領域を、それぞれをｒｒｎＡＵＦプライマーとｒｒｎＡＵＲプライマー、ｒｒｎＡＴＲＦプライマーとｒｒｎＡＴＲＲプライマー、ｒｒｎＡ２３ＳＤＦプライマーとｒｒｎＡＤＲプライマーを用いて増幅し、得られた３断片をｒｒｎＡＵＦプライマー、ｒｒｎＡＤＲプライマーにて連結した。得られたＤＮＡ断片をｒｒｎＯ欠失と同様の手法を用いてcatpt1遺伝子を除いた。ΔrrnA1変異をΔrrnHG1ΔrrnO1ΔrrnD1 ΔrrnE1ΔrrnB2株に導入するため、はじめにΔrrnA1:: catpt1変異を導入し、His＋マーカーと同時に形質転換を行なった（Nanamiya et al. (2010) Microbiology 156:2977-2982）。
【００７５】
５）ｒｒｎＩの欠失
ΔrrnHG1株から抽出したＤＮＡを鋳型にｒｒｎＩの上流領域、下流領域をそれぞれｒｒｎＩＵＦプライマーとｒｒｎＸＵＲｃａｔプライマー、ｒｒｎＸＤＦｃａｔプライマー、ｒｒｎＸＵＲプライマーを用いて増幅した。ΔrrnO1::catpt1株構築時と同様に、ΔrrnI::catpt1変異を、ΔrrnHG1 ΔrrnO1 ΔrrnD1 ΔrrnE1 trp trpB'A'::PrrnOkan196(am)erm hisC101株に導入した。次に、ｒｒｎＩ欠失株を構築するため、ΔrrnHG1株から抽出したDNAを鋳型に、ｒｒｎＩＵＦプライマー、ｒｒｎＩＵＲプライマー、ｒｒｎＸＤＦプライマー、ｒｒｎＩＤＲプライマーでＤＮＡ断片を増幅し、ｒｒｎＯ欠失株の作成方法と同様にｒｒｎＩを欠失した。
ΔrrnHG1ΔrrnO1 ΔrrnD1ΔrrnE1ΔrrnB2ΔrrnA1株からrrnIを欠失（ΔrrnI2）させるためには、ΔrrnI::catpt1を導入し、その後、ΔrrnI2とTrp+マーカーを同時に形質転換した（Nanamiya et al. (2010) Microbiology 156:2977-2982）。
【００７６】
６）ｒｒｎＷの欠失
ｒｒｎＷの上流領域、下流領域をそれぞれｒｒｎＷＵＦプライマーとｒｒｎＷＵＲｃａｔプライマー、ｒｒｎＷＤＦｃａｔプライマー、ｒｒｎＷＤＲプライマーを用いて、また、ＣＡＴ−Ｆ２プライマーとＣＡＴ−Ｒプライマーを用いてcat遺伝子を増幅し、ΔrrnO1::catpt1と同様に、ΔrrnW::catpt1を作製した。次に、ｒｒｎＷＵＦプライマー、ｒｒｎＷＵＲプライマー、ｒｒｎＷＤＦプライマー、ｒｒｎＷＤＲプライマーを用いて増幅し、ｒｒｎＯ欠失株の作成方法と同様の手法を用いて、ｒｒｎＷを欠失した（Nanamiya et al. (2010) Microbiology 156:2977-2982）。
【００７７】
７）rrnJ+J+株（ΔrrnHG1ΔrrnO1ΔrrnD1ΔrrnE1ΔrrnB2ΔrrnA1ΔrrnI2ΔrrnW2  rrnJ+J+ hisC101)の構築
Δrrn9 rrnJ+株構築の過程で自然突然変異によりｒｒｎＪが重複した、rrnJ+J+株が得られ、株をRIK530として取得した（Nanamiya et al. (2010) Microbiology 156:2977-2982）。
【００７８】
参考例３  RIK542株の構築
ｒｒｎＩオペロンのみを有する株を構築するため、ΔrrnHG1ΔrrnO1ΔrrnE1ΔrrnD1ΔrrnB2ΔrrnA1ΔrrnW2::catpt1  trpB'A'::PrrnOkan196(am) erm and hisC101 株に対し６）の方法と同様にΔrrnW2::catpt1 のcatpt1遺伝子を除去した。次に、trpB'A'::PrrnOkan erm190(oc) 遺伝子を除去した後、ΔrrnJ1::cat、trpC2変異を導入し、RIK542株(ΔrrnHG1 ΔrrnO1ΔrrnE1ΔrrnD1 ΔrrnB2 ΔrrnA1 ΔrrnW2 ΔrrnJ1::cat trpC2)を構築した。（Nanamiya et al. (2010) Microbiology 156:2977-2982）。
【００７９】
参考例４  RIK543株の構築
ｒｒｎＯオペロンのみを有する株は以下の方法で構築した。はじめに、ｒｒｎＯプロモーターの下流にcatpt1遺伝子を導入したrrnO2+::catpt1をΔrrnHG1ΔrrnO1ΔrrnD1ΔrrnE1ΔrrnB2ΔrrnA1ΔrrnI2ΔrrnW2  rrnJ+J+ hisC101株へ導入した。rrnO2+::catpt1遺伝子断片は、ｒｒｎＯ−ｃａｔＦ１プライマーとｒｒｎＯ−ｃａｔＲ１プライマー、ｒｒｎＯ−ｃａｔＦ２プライマーとｒｒｎＸ−ｃａｔＲ２プライマー、ＣＡＴ−Ｆ２プライマーとＣＡＴ−Ｒプライマーを用いて増幅し、得られた３断片をｒｒｎＯ−ｃａｔＦ１プライマーとｒｒｎＸ−ｃａｔＲ２プライマーで連結した。次に、ｒｒｎＯオペロンを有し、かつtrpC2変異を有する染色体ＤＮＡを供与ＤＮＡに用い、rrnO2+::catpt1 ΔrrnHG1ΔrrnD1ΔrrnE1ΔrrnB2ΔrrnA1ΔrrnI2ΔrrnW2  rrnJ+J+ hisC101株に形質転換を行い、rrnO2+::catpt1とｒｒｎＯオペロンを置換した。次に、ｒｒｎＪオペロンにcat遺伝子を導入するため、ｒｒｎＪの上流領域、下流領域をそれぞれｒｒｎＪＵＦプライマーとｒｒｎＪＵＲｃａｔプライマー、ｒｒｎＪＤＦｃａｔプライマーとｒｒｎＪＤＲプライマーを用いて、及び、cat遺伝子をＣＡＴ−Ｆ２プライマー、ＣＡＴ−Ｒプライマーを用いて増幅した。得られた３断片をｒｒｎＪＵＦプライマー、ｒｒｎＪＤＲプライマーを用いて連結後、形質転換を行いRIK543株（ΔrrnHG1ΔrrnD1ΔrrnE1ΔrrnB2ΔrrnA1ΔrrnI2ΔrrnW2ΔrrnJ::cat trpC2）を得た（Nanamiya et al. (2010) Microbiology 156:2977-2982、Natori et al. (2009) J. Bacteriol. 191:4555-4561）。
【００８０】
参考例５  ＲＩＫ５４５株の構築
ｒｒｎＥオペロンのみを有する株は、参考例４と同様に行なった。rrnE2+::catpt1は、ｒｒｎＥ−ｃａｔＦ１プライマーとｒｒｎＥ−ｃａｔＲ１プライマー、ｒｒｎＥ−ｃａｔＦ２プライマーとｒｒｎＸ−ｃａｔＲ２プライマーを用いて増幅し、cat遺伝子と連結することで構築した（Nanamiya et al. (2010) Microbiology 156:2977-2982、Natori et al. (2009) J. Bacteriol. 191: 4555-4561）。
【００８１】
【表４】
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【００８２】
【表５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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