(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細菌培養から精製され、ＡｐｘＩ、ＡｐｘＩＩ及びＡｐｘＩＩＩから成る群より選択される１以上の毒素内リピート（repeats in toxin）と複合体を形成したリポ多糖を含む豚胸膜肺炎に対するワクチンであって、ポリミキシンを含み、リポ多糖により引き起こされる内毒素ショック症状を減少させ、更にアクチノバチルス・プルロニューモニアの４２ｋＤの外膜タンパク質を含むことを特徴とする前記ワクチン。
【請求項２】
ワクチンが投与量当たり２０００ＩＵ未満のポリミキシンを含むことを特徴とする請求項１記載のワクチン。
【請求項３】
ワクチンが投与量当たり１０００ＩＵ未満のポリミキシンを含むことを特徴とする請求項２記載のワクチン。
【請求項４】
ワクチンが投与量当たり５００ＩＵ未満のポリミキシンを含むことを特徴とする請求項３記載のワクチン。
【請求項５】
ポリミキシンがポリミキシンＢであることを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載のワクチン。
【請求項６】
リポ多糖がアクチノバチルス・プルロニューモニア由来であることを特徴とする請求項１乃至５のいずれかに記載のワクチン。
【請求項７】
リポ多糖を取得すること、当該リポ多糖を薬学的に許容可能な担体と混合すること及びポリミキシンの添加によって当該リポ多糖を無毒化することを含む豚胸膜肺炎に対するワクチンを取得する方法であって、該ワクチンが更にアクチノバチルス・プルロニューモニアの４２ｋＤの外膜タンパク質を含み、リポ多糖がＡｐｘＩ、ＡｐｘＩＩ及びＡｐｘＩＩＩから成る群より選択される１以上の毒素内リピート（repeats in toxin）と複合体を形成していることを特徴とする前記方法。
【請求項８】
ワクチン投与量当たり最大２０００ＩＵに達するようにポリミキシンを添加することを特徴とする請求項７記載の方法。
【請求項９】
ワクチン投与量当たり最大１０００ＩＵに達するようにポリミキシンを添加することを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１０】
ワクチンの投与量当たり最大５００ＩＵに達するようにポリミキシンを添加することを特徴とする請求項９記載の方法。
【請求項１１】
リポ多糖を担体と混合するときにポリミキシンを添加することを特徴とする請求項７乃至１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
対象動物への投与前にポリミキシンをワクチンに添加することを特徴とする豚胸膜肺炎に対するワクチンを投与する時の内毒素ショック症状を減少させるためのポリミキシンの使用であって、該ワクチンが更にアクチノバチルス・プルロニューモニアの４２ｋＤの外膜タンパク質及びＡｐｘＩ、ＡｐｘＩＩ及びＡｐｘＩＩＩから成る群より選択される１以上の毒素内リピート（repeats in toxin）と複合体を形成しているリポ多糖を含むことを特徴とする前記使用。
【請求項１３】
請求項１乃至６のいずれかに記載のワクチンを投与することを含む、豚胸膜肺炎に対するリポ多糖を含有するワクチンを投与する時の内毒素ショック症状を減少させるための方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は養豚業に著しい経済的損失をもたらす世界中に広がった疾病、豚胸膜肺炎に対するワクチンに関する。豚胸膜肺炎の病原体は、パスツレラ科に属するグラム陰性細菌、アクチノバチルス・プルロニューモニア（Actinobacillus pleuropneumoniae：ＡＰＰ）である。この疾病は空気経路又は感染豚との直接接触によって伝染し、出血性、繊維素性及び壊死性の肺病変によって特徴づけられる。病像は最急性から慢性の範囲にわたり、無症候性の保菌豚は未感染の群れに持ち込まれると疾病を伝染し得る。莢膜多糖及びリポ多糖（ＬＰＳ）のＯ−側鎖成分に基づき、１５の血清型が特定されている。アクチノバチルス・プルロニューモニアに関する血清型別及び他の遺伝型分類法は、サーベイランス及び疫学調査に対し大いに貢献してきた。これらの手段は、病原性型の細菌の根絶に向けた制御プログラムにおける意志決定に対し重要な情報を提供する。北米では血清型１、５及び７が最も優勢であると報告されており、一方、血清型２及び９がヨーロッパでは最も一般的に単離され、オーストラリアの豚では血清型１５が優勢な単離株である。
【０００２】
Ａ．プルロニューモニアについて特定された病原性因子には、ＬＰＳ、莢膜多糖、Ａｐｘ毒素Ｉ−ＩＶ（いわゆる毒素内リピート（ｒｅｐｅａｔｓ  ｉｎ  ｔｏｘｉｎ）即ちＲＴＸ毒素）、外膜タンパク質（ＯＭＰ）及び種々の鉄獲得系が含まれる。しかし本細菌の病原性機構がはっきりしないために、各成分の感染過程に対する総体的な貢献は明らかでない。Ａ．プルロニューモニアに対する現在のところ利用できるワクチンのほとんど全ては、任意に外膜画分を配合した不活化全菌体バクテリンか又はＡｐｘ毒素とタンパク質のサブユニットの組み合せである。いずれにせよ、好ましくは種々の血清型を越えて適切な防御を得るためには、リポ多糖（ＬＰＳ）がワクチン中に存しなければならいないという見方が一般的となった（Ｊｕｌｉｅｎ  Ｇｏｕｒｅ等、ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ誌、２００９年，第１０巻：８８ページ（２００９年２月２４日発行）；Ｄｕｂｒｅｕｉｌ等、Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｒｅｖｉｅｗｓ誌、第１巻第２号；７３−９３ページ、２０００年１２月）。１９８０年代以降は、単独のリポ多糖に基づくワクチンが既に疾病の感染レベル又は疾病の病像を減少するうえで明白な効果を有し交差防御を誘導することが、より強固に認識されてきた（Ｆｅｎｗｉｃｋ等、ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ誌、第４７巻、第９号、１９８６年９月；Ｒａｐｐ等、Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ誌、１９８８年、第２９巻、第７号、５８５−５８７ページ；Ｒｉｏｕｘ等、Ｃｏｍｐａｒａｒｉｖｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ＆  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ誌、第２０巻第１号：６３−７４ページ、１９９７年１月）。
【０００３】
リポ多糖のゆゆしき不利益は、内毒素の特性を有することであり、そのために
例えば嗜眠、下痢、嘔吐、食欲不振又は死亡等の望まれない多くの副作用を伴う。それ故に直ちに、ワクチン中のＬＰＳ含量を低減又はＬＰＳを無毒化する要求が生じる。しかし十分なＡＰＰワクチンはＬＰＳの存在に依存しており、従って一般に知られている通り、ＬＰＳの含有量を低下させるとワクチンの効力を本質的に減少させる。又、ＬＰＳの内毒素の性質を減少させしかも効果的なＡＰＰワクチンを達成するために、種々の試みが成されてきた。Ｒｉｏｕｘ等（上記）は、無毒化ＬＰＳのＡＰＰに対するワクチンの効力への影響を研究し、（非無毒化）ＬＰＳにより免疫したマウスは防御されたが、一方、無毒化ＬＰＳに基づくワクチンはマウスを防御することができなかったと結論づけた（Ｒｉｏｕｘの刊行物７１ページ、第三段落を参照）。この研究は豚で繰り返して行われた（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｉｎ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９８年、第６５巻、１６５−１６７ページ）。市販のバクテリンワクチン（非無毒化ＬＰＳを含有）は、野生型ＡＰＰの攻撃感染に対し良好な防御を示すことが明らかとなった。無毒化ＬＰＳに基づくワクチンは、はるかに効果が弱いと思われた（６０％の豚が依然として肺病変を有した）。実際、このことは無毒化されるとＬＰＳははるかに免疫原性が低下するという共通の理解と一致している。
【０００４】
本発明の目的は、市販の利用可能なワクチンに匹敵する効力を有するが、しかしそれに伴う内毒素ショック症状が著しく軽減されたワクチン、特に有効量のワクチン投与後に豚に下痢、嘔吐及び呼吸促迫の兆候を全く、または殆ど示さない、豚胸膜肺炎に対するワクチンを提供することである。
【０００５】
前述の目的を達成するために、リポ多糖を含むことに基づいてワクチンを考案した。ここで、リポ多糖に起因する内毒素ショック症状を減少させるために、ワクチンは付加的にポリミキシンを含む。驚いたことに、ポリミキシンによるＬＰＳの無毒化は、ＬＰＳの免疫原性に著しい負の効果を与えず、従ってワクチンの効力にもそうであることが見出された。ポリミキシンを使用することによって、ワクチンの効力を十分なレベルに維持すると同時に、下痢、嘔吐及び呼吸促迫等の内毒素ショック症状が顕著に減少され得ると考えられる。特に、本ワクチンはポリミキシン無添加のワクチンと同等の効力さえ有し得ると考えられる。
【０００６】
本発明における意味においてワクチンとは、宿主中の微生物又はその代謝過程（微生物体内か又は微生物によって誘導された過程）を妨害する抗体の誘導によって、微生物による感染又はその感染によって引き起こされる疾病若しくは障害の臨床症状を防止又は減少することを目標にする構成物である。ワクチンは、基本抗原として微生物のサブユニット（例えばＬＰＳ等）を含んでもよいし、又、弱毒化又は殺した全細胞の微生物菌体、又は例えば微生物の代謝物（分泌毒素等）を含んでもよい。ワクチンは、免疫学的に有効量の抗原（即ち野生型の微生物による攻撃感染の負の効果を少なくとも減少させるために標的動物の免疫系を十分に刺激することが可能な量）を含有し、典型的には水（しばしばリン酸緩衝食塩水）を含有する液体等の薬学的に許容可能な担体と組み合わされ、また、ワクチンの使用目的又はワクチンに求められる性質に応じて免疫賦活剤（アジュバント）、安定剤、粘度調整剤又は他の成分を含有していてもよい。又、ワクチンが複数の野生型の微生物に対し防御するように、追加の他の微生物の抗原が存在してもよい。
【０００７】
ポリミキシンは抗細菌特性を有する、バチルス・ポリミキサ（Ｂ．アエロスポラ）から単離又は人為的に生産することができる化合物であり、また、それから直接的に誘導可能な抗細菌特性を有する化合物である。Ｂ．ポリミキサによって産生されるポリミキシンは、長い疎水性尾部を有する１個の環状ペプチドからなる共通構造を有する。代表的なポリミキシン類は、ポリミキシンＡ（アエロスポリンとも称される）、ポリミキシンＢ（しばしばポリミキシンとも称される）、ポリミキシンＥ（コリスチンとも称される）ポリミキシンＭ（マッタシンとしても知られる）及びポリミキシンノナペプチドである。
【０００８】
ポリミキシンは、グラム陰性菌を含有する免疫原性組成物中のリポ多糖を無毒化するために首尾よく使用することができることが既に記載されていることに留意する。例えば、Ｃｏｏｐｅｒｓｔｏｃｋ等は、「Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ」誌、１９８１年７月号、３１５−３１８ページにおいて、ポリミキシンＢを使用することによって、数種類のグラム陰性菌（即ち、百日咳菌、大腸菌、インフルエンザ菌及び緑膿菌）の懸濁液の内毒素活性が著しく減少したことを開示している。しかしＣｏｏｐｅｒｓｔｏｃｋは、「ポリミキシン処理された細菌の免疫原性が無傷のままかどうか明らかでない」こと、及び「免疫電気泳動系に前もって形成された抗体に結合するための数種類の．．．外膜成分の能力が、全細菌又は単離した膜の高濃度のポリミキシンＢ処理後に部分的に失われた」ことに明確に言及している。換言すれば、無毒化ＬＰＳの免疫原性には深い疑いをかけられており、少なくともこれらの特性の一部の消失が予知されていた。
【０００９】
実際、Ｂａｎｎａｔｙｎｅ等もまた、ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｙｇｉｅｎｅ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）誌、１９８１年、第８７巻、３７７−３８１ページにおいて、１ｍｌ当たり５０００μｇの濃度（ワクチンの投与量１回分当たり約４２、０００国際単位に等しい）のポリミキシン（ポリミキシンＢ硫酸塩）が、ＬＰＳの毒性効果を抑制することに成功したことを開示している。しかし彼はまた「しかしながら、このようなポリミキシン含有ワクチンには疑念が残る。最も重要なことは、内毒素含有量の減少が感染防御抗原の総量の減少を付随するかどうか、及び防御効力の低下と関連するかどうかである」と述べている。数年後、Ｌａｒｔｅｒ等は（ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｏｆ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ誌、第１３８巻、１９８４年３月号）、百日咳ワクチンにおいて、百日咳ワクチンとポリミキシンを同時に接種された（投与１回分当たり１５０、０００ＩＵ以上）動物の抗体力価がかなり低く、より緩徐に上昇するか又は全く存在しないことを実際に見出した。
【００１０】
１９８０年代初期のこれらの研究結果が、その中でＬＰＳが優位な役割を果たす有効なＡＰＰワクチンに対し、何故ポリミキシンによる無毒化が安全でしかも有効なワクチンを得るために合理的な成功の見込みがあるとは信じられなかったのかを説明しているかもしれない。このことは、必須成分としてＬＰＳを含むＡＰＰワクチンでの現在のポリミキシンの応用に至るまで、前述の知見以来２５年以上が過ぎ去ったという事実によって強く支持される。
【００１１】
一実施態様においてワクチンは、一以上の毒素内リピートと組み合わせて、細菌培養液（即ち、細胞小器官、核、細胞壁成分等の他の細胞成分と比較して濃縮されている）から精製されたリポ多糖を含む。バクテリンに基づくＡＰＰワクチンは、複合体の形態のＬＰＳ−とＡｐｘサブユニットの組合せに基づくワクチンよりも低い防御しか提供しないことが知られている。従って、一以上のＡｐｘ毒素と複合体を形成した、細菌培養液から精製したＬＰＳを含む当該組合せサブユニットワクチンが好ましい。ＬＰＳとこれら毒素との間の特異的結合が毒素の改良された免疫原性において主要な役割をはたすことは知られているが（Ｒａｍｊｅｅｔ等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ誌、２００８年、第７０巻第１号、２２１−２３５ページ）、そのことが当該組合せサブユニットワクチンの改良された防御を説明しているかもしれない。驚いたことに、ポリミキシンを含む組合せサブユニットワクチンがポリミキシンを含まない組合せサブユニットワクチンと同等の防御を提供することより、その強いＬＰＳ結合特性にもかかわらずポリミキシンは、このＬＰＳ−毒素複合体にネガティブに干渉するようには思われないことが今や見出された。毒素内リピートは、例えばＥＰ第４５３０２４号により知られたものであってもよい。又、他の毒素内リピートＡｐｘＩＩ又はＡｐｘＩＶのいかなるものが存在してもよい。これは防御すべきＡＰＰの血清型に依存する。アクチノバチルス・プルロニューモニアの次に、Ａｐｘ毒素（Ｉ及びＩＩ）がアクチノバチルス・スイスによっても産生されることが知られている。後者の毒素は、この実施態様に従ってワクチンに使用することもできる。好ましくはＡｐｘＩ、ＡｐｘＩＩ及びＡｐｘＩＩＩの中の一以上の毒素がワクチンに含まれ、より好ましくはこれらのそれぞれが含まれる。
【００１２】
一実施態様においてワクチンは投与１回分当たり２０００ＩＵ未満のポリミキシンを含む。驚いたことに、内毒素症状の有効な減少は、２０００ＩＵ／投与１回分程度の少量の使用によって達成することができることが見出された（例えば、投与１回分４ｍｌに対しワクチン１ｍｌ当たりポリミキシンＢ硫酸塩約６０μｇを添加することによって達成することができる）。前掲の参考文献において、ワクチン接種時の有効量は、投与１回分当たりポリミキシン４２，０００〜１６０，０００ＩＵの範囲にあり、それはほぼ保存料としてのポリミキシン使用のための範囲である（メルク獣医マニュアル第９版、２００５年編をも参照、動物１０ｋｇに対し投与１回分当たり少なくとも５０，０００ＩＵの投与量を推奨している）。出願人は、驚いたことにわずか一画分（５％未満）のみが内毒素ショック症状を減少するのに十分であるらしいことを見出した。ポリミキシンは一般的に無期限に安定ではないので、ワクチン中に存する量は添加された量未満、製剤１年後に測定すれば典型的には添加量の５０乃至８０％の間であるだろう。臨床症状を減少するために必要なだけの少量のポリミキシンが使用できることに留意する。例えば、ワクチン中のＬＰＳに余り耐性のない豚の品種においては、投与１回分当たり約１５〜３０ＩＵの量は内毒素ショック症状を十分に減少するうえで有効であるかもしれない。このような低量での明白な効果は、実験的に確証されてきた。最少有効量は、豚の品種に依存するだけでなく、要求される臨床症状の減少、ワクチン中のＬＰＳ含量、ポリミキシンの種類等にも依存し得ることに留意する。一実施態様において、ワクチンは投与１回分当たり１０００ＩＵ未満、又は５００ＩＵ未満しか含まない。
【００１３】
一実施態様において、リポ多糖はアクチノバチルス・プルロニューモニア由来である。実際のところ周知の通り、豚胸膜肺炎に対するワクチン中で有効であるために、ワクチン中のＬＰＳがＡＰＰ菌から抽出される必要は無い。ＬＰＳは例えば大腸菌由来であってもよく、宿主細菌、動物細胞又は他の種類の宿主において組換えで発現されてもよい。しかし、発明者等はＡＰＰ由来のＬＰＳが非常に良好なワクチン接種の結果を示すことを見出した。当該ＬＰＳはＡＰＰ菌から直接抽出してもよいし、また適切な宿主によって発現してもよい。
【００１４】
一実施態様においてワクチンは、ＥＰ第４５３０２４号により知られた通り、アクチノバチルス・プルロニューモニアの４２ｋＤの外膜タンパク質を含む。
【００１５】
また本発明は、リポ多糖を取得する方法、リポ多糖を薬学的に許容可能な担体と混合する方法及びポリミキシンを添加することによってリポ多糖を無毒化する方法を含む、豚胸膜肺炎に対するワクチンを取得するための方法に関する。無毒化（ｄｅｔｏｘｉｆｙｉｎｇ）とは、少なくとも内毒素ショック症状、特に下痢、嘔吐及び呼吸促迫を減少するのに適した量のポリミキシンを添加することを意味する。好ましくは所期のワクチン投与量ごとに２０００未満、又はさらに１０００又は５００ＩＵ未満のポリミキシンを使用する。一実施態様においてポリミキシンは、リポ多糖を担体と混合するときに添加する。
【００１６】
本発明は、本発明によるワクチン投与を含む、リポ多糖を含有する豚胸膜肺炎に対するワクチンを投与した時の、内毒素ショック症状を減少するための方法にも関する。
【００１７】
本発明を以下の実施例を用いて説明する。
【００１８】
［実験計画］
第一の研究において、６週令の１５０頭の特定病原体フリー（ＳＰＦ）豚を使用し、各５０頭からなる３群に分けた。各群は、６週令時に投与４ｍｌで筋肉内に一回接種した。群１は、ポリミキシン無添加の標準Ａｐｐワクチン（Ｐｏｒｃｉｌｉｓ  ＡＰＰ、Ｉｎｔｅｒｖｅｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＢＶ  Ｂｏｘｍｅｅｒ、オランダから入手可能）を接種した。本ワクチンは４２ｋＤの外膜タンパク質だけでなく２５単位（１ｍｌ当たり）の毒素内リピートＡｐｘＩ、ＩＩ及びＩＩＩも含有する。ＬＰＳは約５〜６ｘ１０５ＩＵ／ｍｌの量で存在する。群２は、３０μｇ／ｍｌの量（１ｍｌ当たり約２５０ＩＵ）のポリミキシンＢ（硫酸塩として）を添加した同じワクチンを接種した。群３は、同様に３０μｇ／ｍｌの量（１ｍｌ当たり約２５０ＩＵ）のポリミキシンＥ（硫酸塩として）を添加した同じ標準ワクチンを接種した。ポリミキシンは、ワクチン製剤の最終段階、即ち他の全ての抗原を担体Ｄｉｌｕｖａｃ  Ｆｏｒｔｅ（Ｉｎｔｅｒｖｅｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＢＶ  Ｂｏｘｍｅｅｒ、オランダから入手可能）と混合した直後に添加した。
【００１９】
接種２０時間前、接種直前及び接種２、４、７及び２４時間後に直腸温を測定した。特定臨床症状（内毒素ショックの徴候）に関し、群ごとに全動物を接種３０分及び１、２、４、７及び２４時間後にモニターした。特に次の症状、活動低下、振戦、咳嗽、下痢、嘔吐、呼吸数増加、腹式呼吸、呼吸困難及び死亡に関し動物を点検した。接種後２〜６日は日常点検だけを実施した。群２及び群３の温度と臨床症状を群１のこれらと比較した。
【００２０】
第二の研究において、異なる二つのポリミキシン濃度を試験した。この研究は、３処理群にそれぞれ無作為に１４頭割り当てた４２頭の豚に関し実施した。群１はＰｏｒｃｉｌｉｓ  ＡＰＰ（ポリミキシン無添加）を、群２はワクチン１ｍｌ当たりポリミキシンＢ３０μｇを添加した同じワクチンを、及び群３はワクチン１ｍｌ当たりポリミキシンＢ６０μｇを添加した同じワクチンを接種した。それ以外の実験設定は第一の研究と同様とした。
【００２１】
第三の研究において、ポリミキシンＢを含有するＬＰＳに基づくＡＰＰワクチンの効力を試験した。ポリミキシンＢは、最良のＬＰＳ結合特性を有するポリミキシンとして一般に知られており、従ってポリミキシンＢは理論的にはワクチンの効力に関して最も強い負の影響を与える。それゆえ、当該ポリミキシンと共に製剤化されたワクチンが有効であれば、このことは他のポリミキシンを用いても少なくとも同等に有効なワクチンを取得することができることの証拠となる。本研究用のワクチンは、標準Ｐｏｒｃｉｌｉｓ  ＡＰＰワクチンに対しワクチン１ｍｌ当たりポリミキシンＢ３０μｇを添加することよって製剤した。６及び１０週令時に豚１４頭をワクチン２ｍｌで筋肉内接種し、結果として投与量としてポリミキシン約５００ＩＵを接種した。豚７頭にプラセボワクチン（４０ｍＭトリス塩酸緩衝液）を接種した。ＯＭＰだけでなくＲＴＸ毒素ＡｐｘＩ、ＡｐｘＩＩ及びＡｐｘＩＩＩに対する抗体力価を１３週目に定量した。２回目の接種３週間後に、豚全頭をアクチノバチルス・プルロニューモニア血清型２によって攻撃感染した。
【００２２】
第四の研究において、発明者等はワクチンの安全性を試験した。この研究では、アクチノバチルス・プルロニューモニアの発酵バッチの後処理工程の間にポリミキシンを添加し、最終的にワクチン中で極めて低いポリミキシン含有量（約２〜４μ／ｍｌ）に達する。本研究において、それぞれの培養液の発酵ブロスの上清１ｍｌ当たりポリミキシンＢ又はポリミキシンＥ硫酸塩３０μｇを添加することによってワクチンを調製し、その後毒素ＡｐｘＩ、ＩＩ、ＩＩをＬＰＳと配合し、そしてこれらの上清から４２ｋＤのＯＭＰを単離した。これらの単離したサブユニットを、ワクチン１ｍｌ当たり毒素及びＯＭＰ約２５単位及びＬＰＳ約１ｘ１０６ＩＵに達するようにＤｉｌｕｖａｃ  ｆｏｒｔｅ中に製剤した。これらのワクチン中で、１ｍｌ当たりポリミキシンＥ約２２ＩＵ（２．６μｇ／ｍｌ）及びポリミキシンＢ約３５ＩＵ（４．２μ／ｍｌ）のポリミキシン濃度が確認された。安全性を試験するために、６週令のＳＰＦ豚１０頭からなる２群にそれぞれのワクチン４ｍｌを接種した。臨床症状を第一の研究と同様に評価した。
【００２３】
［結果］
どのポリミキシン類にも直腸温に関する著しい効果はなかった。しかし、内毒素ショック症状に関して著しい効果があった。下記の表１に群ごとの症状の概略を示す。群１において、嘔吐（６０％）及び呼吸数増加（６６％）のように、典型的な臨床症状が動物の半数以上に観察された。この群では豚２頭（４％）が内毒素ショックの結果として死亡した。対照的に、群２及び３においては非常に軽い症状だけが観察された。両群において豚の２％（動物５０個体中の１個体）が嘔吐症状だった。さらに群３の豚の２％では、呼吸数増加が認められた。従って、ポリミキシンはＡＰＰワクチン中のＬＰＳによって引き起こされる重篤な内毒素ショック症状を減少するために適していることが結論づけられた。
【００２４】
表１．種々のＡＰＰワクチン接種後の内毒素ショック症状
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表２は第二の研究の結果を示す。群１（標準ワクチン）において、嘔吐（５４％）及び呼吸数増加（１５％）のような典型的な臨床症状が観察された。群２及び３において、軽度の症状が観察されるか殆ど症状が観察されなかった。これらの結果に基づいて、ワクチン１ｍｌ当たりわずか６０μｇ又は３０μｇ／ｍｌのポリミキシンの添加でも、ＬＰＳが重篤な内毒素ショック症状を誘発することを殆ど完全に阻止するために有効であることが結論づけられる。
【００２５】
表２．種々のＡＰＰワクチン接種後の内毒素ショック症状
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第三の研究において、ポリミキシンＢを含有するワクチンにより良好な効力の結果（ポリミキシンを除いては同様の薬剤処方を有する標準Ｐｏｒｃｉｌｉｓ  ＡＰＰワクチンにより得られる結果と同等の結果）が得られた。結果を表３に要約する。対照群においては動物のほぼ６０％が死亡したが、一方接種した群の動物は攻撃感染に対し全てが防御された。後者の群の力価は、ポリミキシン不含の標準Ｐｏｒｃｉｌｉｓ  ＡＰＰワクチンにより得られる力価に匹敵した（「ｎ．ｄ．」は試験において不検出であることを意味する）。ポリミキシンＢを含有するＡＰＰワクチンによる非常に良好な結果、及び同ポリミキシンが一番強いＬＰＳ結合特性を有するという事実を考慮すれば、他のポリミキシンに関して少なくとも同等の効果を有するワクチンが取得可能であることが分かる。
【００２６】
表３．ポリミキシンＢ含有ワクチンの平均効力結果
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第四の研究において、１ｍｌ当たり約２０ＩＵくらい少量のポリミキシンを含むワクチンによってさえ良好な安全性の結果が得られることが示された。平均データを表４に示す。遥かに高含量のポリミキシンが並存しても良好な効力の結果を得ることができることを考慮すれば（研究３を参照）、第四の研究のワクチンによって良好な効果の結果が同様に得られることは明らかである。
【００２７】
表４．種々のＡＰＰワクチン接種後の内毒素ショック症状
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