(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
a. DNA切断剤を、該DNA切断剤が細胞内のゲノムDNAを切断するような条件下で、該ゲノムDNAを有する該細胞に導入する段階であって、該ゲノムDNAの異なる領域が該剤によって異なる程度で切断され、該細胞はインサイチューで該DNA切断剤により処理され、それにより、切断されたDNA領域およびインタクトなDNA領域が生成される、段階；ならびに
b. 該DNAを、サイズ分離によって濃縮する段階であって、該DNAが10〜500 bpの断片について濃縮される、段階；ならびに
c. 該濃縮されたDNAにおける少なくとも1つのDNA領域のインタクトなコピーもしくは切断されたコピーの存在、非存在もしくは量を検出するか、または該濃縮されたDNAにおける少なくとも1つのインタクトなDNA領域もしくは切断されたDNA領域のクローニング、単離もしくはヌクレオチド配列の決定を行う段階であって、該検出する段階が、少なくとも1つのDNA領域を増幅すること、及び／又は、少なくとも1つのDNA領域のヌクレオチド配列の決定を行うことを含む、段階
を含む、染色体DNAを分析するための方法。
【請求項２】
段階aの前または段階aと同時に、細胞の細胞膜を透過処理するかまたは破壊する段階を含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
段階aが、前記細胞内で異種発現カセットから前記DNA切断剤を発現させ、それにより該DNA切断剤を該細胞に導入することを含む、請求項1記載の方法。
【請求項４】
検出する段階が、前記少なくとも1つのDNA領域のインタクトなコピーの量を検出することを含む、請求項1記載の方法。
【請求項５】
増幅する段階がリアルタイムPCRを含む、請求項1記載の方法。
【請求項６】
ヌクレオチド配列の決定が、DNAポリメラーゼの反応速度をモニタリングすることを含む、請求項1記載の方法。
【請求項７】
ヌクレオチド配列の決定が、（1）前記ヌクレオチド配列の決定、および（2）配列決定されたヌクレオチドが修飾されているかどうかの決定を同時に行うことを含む、請求項1記載の方法。
【請求項８】
検出する段階が、前記濃縮されたDNAを複数の核酸プローブとハイブリダイズさせること、および該濃縮されたDNAと該核酸プローブとのハイブリダイゼーションを検出することを含む、請求項1記載の方法。
【請求項９】
前記核酸プローブが固体支持体と連結されている、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
前記固体支持体が、マイクロアレイおよびビーズからなる群より選択される、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
検出する段階が、前記少なくとも1つのDNA領域の切断されたコピーの量を検出することを含む、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
前記DNA切断剤が、DNアーゼおよび制限酵素より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項１３】
検出する段階が、前記インタクトなDNAまたは切断されたDNAを、固体支持体と連結された核酸とハイブリダイズさせることを含む、請求項1記載の方法。
【請求項１４】
前記少なくとも1つのDNA領域のインタクトなコピーまたは切断されたコピーの量が、該DNA領域のコピーの総数と比較される、請求項1記載の方法。
【請求項１５】
前記少なくとも1つのDNA領域のインタクトなコピーまたは切断されたコピーの量が、第2の細胞内の該少なくとも1つのDNA領域のすべてのコピー、インタクトなコピーまたは切断されたコピーの量と比較される、請求項1記載の方法。
【請求項１６】
a. DNA修飾剤を、該DNA修飾剤が細胞内のゲノムDNAを修飾するような条件下で、該ゲノムDNAを有する該細胞に導入する段階であって、該ゲノムDNAの異なる領域が該剤によって異なる程度で修飾され、それにより、修飾されたDNA領域および修飾されていないDNA領域が生成される、段階；
b.段階aの前または段階aと同時に、細胞の細胞膜を破壊し、それによって細胞の構造がインタクトなままでは保たれないように細胞膜の完全性を低減させる段階；
c. 該細胞内の、または該細胞から単離された該ゲノムDNAをDNA切断剤と接触させる段階であって、該ゲノムDNAの異なる領域が該DNA切断剤によって異なる程度で切断され、それにより、切断されたDNA領域およびインタクトなDNA領域が生成される、段階；
d. 該DNAを、サイズ分離によって濃縮する段階であって、該DNAが10〜500 bpの断片について濃縮される、段階；ならびに
e. 該濃縮されたDNAにおける少なくとも1つのDNA領域のインタクトなコピーもしくは切断されたコピーの存在、非存在もしくは量を検出するか、または該濃縮されたDNAにおける少なくとも1つのインタクトなDNA領域もしくは切断されたDNA領域のクローニング、単離もしくはヌクレオチド配列の決定を行う段階
を含む、染色体DNAを分析するための方法。
【請求項１７】
段階aの後に、修飾されたDNAに特異的に結合する親和性物質と前記DNAを接触させることにより、修飾されたDNA領域または修飾されていないDNA領域について該DNAを濃縮する段階をさらに含む、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
前記修飾がDNAメチル化である、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
前記親和性物質が、メチル化されたDNAに特異的に結合する抗体またはタンパク質である、請求項17記載の方法。
【請求項２０】
濃縮する段階が段階aと段階dの間に行われる、請求項16記載の方法。
【請求項２１】
濃縮する段階が段階dと段階eの間に行われる、請求項16記載の方法。
【請求項２２】
前記修飾剤がDNAメチルトランスフェラーゼである、請求項16記載の方法。
【請求項２３】
前記DNAメチルトランスフェラーゼがDNA中のアデノシンをメチル化する、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
前記DNA切断剤がアデノシンメチル化感受性制限酵素である、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
前記アデノシンメチル化感受性制限酵素が、DpnI、DpnII、MboIおよびSau3AIからなる群より選択される、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
前記DNAメチルトランスフェラーゼがDNA中のシトシンをメチル化する、請求項22記載の方法。
【請求項２７】
前記DNA切断剤がシトシンメチル化感受性制限酵素である、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
前記シトシンメチル化感受性制限酵素が、AatII、AciI、AclI、AgeI、AluI、AscI、AseI、AsiSI、BbeI、BsaAI、BsaHI、BsiEI、BsiWI、BsrFI、BssHII、BssKI、BstBI、BstNI、BstU I、ClaI、EaeI、EagI、FauI、FseI、HhaI、HinP1I、HinCII、HpaII、Hpy99I、HpyCH4IV、KasI、MboI、MluI、MapA1I、McrBC、MspI、NaeI、NarI、No I、PmlI、PstI、Pv I、RsrII、SacII、SapI、Sau3AI、SflI、SfoI、SgrAI、SmaI、SnaBI、TscI、XmaIおよびZraIからなる群より選択される、請求項27記載の方法。
【請求項２９】
検出する段階が、前記少なくとも1つのDNA領域のインタクトなコピーの量を検出することを含む、請求項16記載の方法。
【請求項３０】
前記少なくとも1つのDNA領域を増幅する段階を含む、請求項16記載の方法。
【請求項３１】
増幅する段階がリアルタイムPCRを含む、請求項30記載の方法。
【請求項３２】
検出する段階が、前記少なくとも1つのDNA領域の切断されたコピーの量を検出することを含む、請求項16記載の方法。
【請求項３３】
検出する段階が、前記濃縮されたDNAにおける少なくとも1つのインタクトなDNA領域または切断されたDNA領域のヌクレオチド配列の決定を行うことを含む、請求項16記載の方法。
【請求項３４】
ヌクレオチド配列の決定が、DNAポリメラーゼの反応速度をモニタリングすることを含む、請求項33記載の方法。
【請求項３５】
ヌクレオチド配列の決定が、（1）ヌクレオチド配列の決定、および（2）配列決定されたヌクレオチドが修飾されているかどうかの決定を同時に行うことを含む、請求項33記載の方法。
【請求項３６】
検出する段階が、前記濃縮されたDNAを複数の核酸プローブとハイブリダイズさせること、および該濃縮されたDNAと該核酸プローブとのハイブリダイゼーションを検出することを含む、請求項16記載の方法。
【請求項３７】
前記核酸プローブが固体支持体と連結されている、請求項36記載の方法。
【請求項３８】
前記固体支持体が、マイクロアレイおよびビーズからなる群より選択される、請求項37記載の方法。
【請求項３９】
前記DNA切断剤が、DNアーゼおよび制限酵素より選択される、請求項16記載の方法。
【請求項４０】
検出する段階が、インタクトなDNAまたは切断されたDNAを、固体支持体と連結された核酸とハイブリダイズさせることを含む、請求項16記載の方法。
【請求項４１】
前記少なくとも1つのDNA領域のインタクトなコピーまたは切断されたコピーの量が、該DNA領域のコピーの総数と比較される、請求項16記載の方法。
【請求項４２】
前記少なくとも1つのDNA領域のインタクトなコピーまたは切断されたコピーの量が、第2の細胞内の該少なくとも1つのDNA領域のすべてのコピー、インタクトなコピーまたは切断されたコピーの量と比較される、請求項16記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連特許出願の相互参照
本出願は、2010年9月10日に提出された米国仮特許出願第61／381,847号の優先権の恩典を主張し、それはあらゆる目的で参照により本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
細胞内のほとんどのDNAは、一群のヒストンタンパク質の周りにパッケージングされ、ヌクレオソームとして知られる構造をとる。このヌクレオソームDNAは、DNAを緻密に凝縮させるらせん状構造へとさらにパッケージングされうる。この緻密なパッケージングは、転写因子および転写機構へのDNAのアクセスを制限しうる。このような様式でパッケージングされたゲノムDNAは時にクロマチンと称される。
【０００３】
クロマチンは、DNAが疎にパッケージングされ、アクセス可能であり、常にではないが一般に転写能力があるユークロマチンと、DNAが緻密にパッケージングされ、アクセス不能であり、常にではないが一般的には転写的にサイレントであるヘテロクロマチンという、2つの主なグループに分類される。
【０００４】
これらの2つのクロマチン状態間の推移を制御するものはエピジェネティクスである。エピジェネティックな事象には主にDNAメチル化およびヒストン修飾の2つがある。これらの事象は、DNAがどのようにパッケージングされるか、およびDNAが転写に関して活性であるかそれともサイレントであるかに影響を及ぼす。
[先行技術文献]
【特許文献１】国際公開第２０１０／０６５２６６号
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、染色体DNAを分析するための方法を提供する。いくつかの態様において、本方法は以下の段階を含む：
a. DNA切断剤を、該DNA切断剤が細胞内のゲノムDNAを切断するような条件下で、該ゲノムDNAを有する該細胞に導入する段階であって、該ゲノムDNAの異なる領域が該剤によって異なる程度で切断され、それにより、切断されたDNA領域およびインタクトなDNA領域が生成される、段階；ならびに
b. 該DNAを、インタクトなDNAまたは切断されたDNAのいずれかについて濃縮する段階であって、それにより、濃縮されたDNAが生成される、段階；ならびに
c. 該濃縮されたDNAにおける少なくとも1つのDNA領域のインタクトなコピーもしくは切断されたコピーの存在、非存在もしくは量を検出するか、または該濃縮されたDNAにおける少なくとも1つのインタクトなDNA領域もしくは切断されたDNA領域のクローニング、単離もしくはヌクレオチド配列の決定を行う段階。
【０００６】
いくつかの態様において、本方法は、段階aの前または段階aと同時に、細胞の細胞膜を透過処理するかまたは破壊する段階を含む。
【０００７】
いくつかの態様において、段階aは、細胞内で異種発現カセットからDNA切断剤を発現させ、それによりDNA切断剤を細胞に導入することを含む。
【０００８】
いくつかの態様において、検出する段階は、少なくとも1つのDNA領域のインタクトなコピーの量を検出することを含む。
【０００９】
いくつかの態様において、本方法は少なくとも1つのDNA領域を増幅する段階を含む。いくつかの態様において、増幅する段階はリアルタイムPCRを含む。
【００１０】
いくつかの態様において、検出する段階は、少なくとも1つのDNA領域のヌクレオチド配列の決定を含む。いくつかの態様において、ヌクレオチド配列の決定は、DNAポリメラーゼの反応速度のモニタリングを含む。いくつかの態様において、ヌクレオチド配列の決定は、（1）ヌクレオチド配列の決定、および（2）配列を決定されたヌクレオチドが修飾されているかどうかの決定を同時に行うことを含む。
【００１１】
いくつかの態様において、検出する段階は、濃縮されたDNAを複数の核酸プローブとハイブリダイズさせること、および濃縮されたDNAと核酸プローブとのハイブリダイゼーションを検出することを含む。いくつかの態様において、核酸プローブは固体支持体と連結されている。いくつかの態様において、固体支持体は、マイクロアレイおよびビーズからなる群より選択される。
【００１２】
いくつかの態様において、検出する段階は、少なくとも1つのDNA領域の切断されたコピーの量を検出することを含む。
【００１３】
いくつかの態様において、DNA切断剤は、DNアーゼおよび制限酵素より選択される。
【００１４】
いくつかの態様において、検出する段階は、インタクトなDNAまたは切断されたDNAを、固体支持体と連結された核酸とハイブリダイズさせることを含む。
【００１５】
いくつかの態様において、濃縮する段階はDNAをサイズ選択することを含む。いくつかの態様において、DNAは10〜500 bpの断片について濃縮される。いくつかの態様において、DNAは500 bp超の断片について濃縮される。
【００１６】
いくつかの態様において、少なくとも1つのDNA領域のインタクトなコピーまたは切断されたコピーの量は、当該DNA領域のコピーの総数と比較される。
【００１７】
いくつかの態様において、少なくとも1つのDNA領域のインタクトなコピーまたは切断されたコピーの量は、第2の細胞内の当該少なくとも1つのDNA領域のすべてのコピー、インタクトなコピーまたは切断されたコピーの量と比較される。
【００１８】
本発明はまた、染色体DNAを分析するための方法を提供する。いくつかの態様において、本方法は以下の段階を含む：
a. DNA修飾剤を、該DNA修飾剤が細胞内のゲノムDNAを修飾するような条件下で、該ゲノムDNAを有する該細胞に導入する段階であって、該ゲノムDNAの異なる領域が該剤によって異なる程度で修飾され、それにより、修飾されたDNA領域および修飾されていないDNA領域が生成される、段階；ならびに続いて
b. 該細胞内の、または該細胞から単離されたゲノムDNAをDNA切断剤と接触させる段階であって、該ゲノムDNAの異なる領域が該DNA切断剤によって異なる程度で切断され、それにより、切断されたDNA領域およびインタクトなDNA領域が生成される、段階；ならびに
c. 該DNAを、インタクトなDNAまたは切断されたDNAのいずれかについて濃縮する段階であって、それにより、濃縮されたDNAが生成される、段階；ならびに
d. 該濃縮されたDNAにおける少なくとも1つのDNA領域のインタクトなコピーもしくは切断されたコピーの存在、非存在もしくは量を検出するか、または該濃縮されたDNAにおける少なくとも1つのインタクトなDNA領域もしくは切断されたDNA領域のクローニング、単離もしくはヌクレオチド配列の決定を行う段階。
【００１９】
いくつかの態様において、段階aの後に、本方法は、修飾されたDNAに特異的に結合する親和性物質とDNAを接触させることにより、修飾されたDNA領域または修飾されていないDNA領域についてDNAを濃縮する段階をさらに含む。いくつかの態様において、修飾はDNAメチル化である。
【００２０】
いくつかの態様において、親和性物質は、メチル化されたDNAに特異的に結合する抗体またはタンパク質である。
【００２１】
いくつかの態様において、濃縮する段階は段階aと段階cの間に行われる。いくつかの態様において、濃縮する段階は段階cと段階dの間に行われる。
【００２２】
いくつかの態様において、修飾剤はDNAメチルトランスフェラーゼである。いくつかの態様において、DNAメチルトランスフェラーゼはDNA中のアデノシンをメチル化する。いくつかの態様において、DNA切断剤はアデノシンメチル化感受性制限酵素である。
【００２３】
いくつかの態様において、アデノシンメチル化感受性制限酵素は、DpnI、DpnII、MboIおよびSau3AIからなる群より選択される。
【００２４】
いくつかの態様において、DNAメチルトランスフェラーゼはDNA中のシトシンをメチル化する。いくつかの態様において、DNA切断剤はシトシンメチル化感受性制限酵素である。いくつかの態様において、シトシンメチル化感受性制限酵素は、AatII、AciI、AclI、AgeI、AluI、AscI、AseI、AsiSI、BbeI、BsaAI、BsaHI、BsiEI、BsiWI、BsrFI、BssHII、BssKI、BstBI、BstNI、BstU I、ClaI、EaeI、EagI、FauI、FseI、HhaI、HinP1I、HinCII、HpaII、Hpy99I、HpyCH4IV、KasI、MboI、MluI、MapA1I、McrBC、MspI、NaeI、NarI、No I、PmlI、PstI、Pv I、RsrII、SacII、SapI、Sau3AI、SflI、SfoI、SgrAI、SmaI、SnaBI、TscI、XmaIおよびZraIからなる群より選択される。
【００２５】
いくつかの態様において、本方法は、段階aの前または段階aと同時に、細胞の細胞膜を透過処理するかまたは破壊する段階を含む。
【００２６】
いくつかの態様において、段階aは、細胞内で異種発現カセットからDNA切断剤および/またはDNA修飾剤を発現させ、それによりDNA切断剤および/またはDNA修飾剤を細胞に導入することを含む。
【００２７】
いくつかの態様において、検出する段階は、少なくとも1つのDNA領域のインタクトなコピーの量を検出することを含む。
【００２８】
いくつかの態様において、本方法は少なくとも1つのDNA領域を増幅する段階を含む。いくつかの態様において、増幅する段階はリアルタイムPCRを含む。
【００２９】
いくつかの態様において、検出する段階は、少なくとも1つのDNA領域の切断されたコピーの量を検出することを含む。
【００３０】
いくつかの態様において、検出する段階は、濃縮されたDNAにおける少なくとも1つのインタクトなDNA領域または切断されたDNA領域のヌクレオチド配列の決定を行うことを含む。いくつかの態様において、ヌクレオチド配列の決定は、DNAポリメラーゼの反応速度のモニタリングを含む。いくつかの態様において、ヌクレオチド配列の決定は、（1）ヌクレオチド配列の決定、および（2）配列決定されたヌクレオチドが修飾されているかどうかの決定を同時に行うことを含む。
【００３１】
いくつかの態様において、検出する段階は、濃縮されたDNAを複数の核酸プローブとハイブリダイズさせること、および濃縮されたDNAと核酸プローブとのハイブリダイゼーションを検出することを含む。いくつかの態様において、核酸プローブは固体支持体と連結されている。いくつかの態様において、固体支持体は、マイクロアレイおよびビーズからなる群より選択される。
【００３２】
いくつかの態様において、DNA切断剤は、DNアーゼおよび制限酵素より選択される。
【００３３】
いくつかの態様において、検出する段階は、インタクトなDNAまたは切断されたDNAを、固体支持体と連結された核酸とハイブリダイズさせることを含む。
【００３４】
いくつかの態様において、濃縮する段階は、DNAをサイズ選択することを含む。いくつかの態様において、DNAは10〜500 bpの断片について濃縮される。いくつかの態様において、DNAは500 bp超の断片について濃縮される。
【００３５】
いくつかの態様において、少なくとも1つのDNA領域のインタクトなコピーまたは切断されたコピーの量は、当該DNA領域のコピーの総数と比較される。
【００３６】
いくつかの態様において、少なくとも1つのDNA領域のインタクトなコピーまたは切断されたコピーの量は、第2の細胞内の当該少なくとも1つのDNA領域のすべてのコピー、インタクトなコピーまたは切断されたコピーの量と比較される。
【００３７】
定義
細胞膜を「透過処理すること」とは、本明細書で用いる場合、修飾剤が細胞内に入ることを可能にするように細胞膜の完全性を低減させることを指す。透過処理された細胞膜を有する細胞は一般に細胞膜を保ち、そのため細胞の構造は実質的にインタクトなままに保たれる。対照的に、細胞膜を「破壊すること」とは、本明細書で用いる場合、細胞の構造がインタクトなままでは保たれないように細胞膜の完全性を低減させることを指す。例えば、細胞膜を非イオン性界面活性剤と接触させることは、細胞膜を除去および／または溶解させ、それにより、少なくともいくらかの染色体構造を保っているゲノムDNAに対する修飾剤のアクセスを可能にする。
【００３８】
「DNA修飾剤」とは、本明細書で用いる場合、DNAを検出可能な様式に改変するが、それ自身はDNAを切断しない分子のことを指す。修飾は、例えば、DNAへの化学部分の付加またはDNAからの化学部分の除去である。DNA切断を引き起こさないDNA修飾剤には、DNAメチラーゼまたはメチルトランスフェラーゼが非限定的に含まれる。
【００３９】
「DNA切断剤」とは、本明細書で用いる場合、DNAを切断する分子のことを指す。DNA切断剤は、例えば、DNAのニッキングまたは切断を引き起こし得る。
【００４０】
「DNA領域」とは、本明細書で用いる場合、ゲノムDNA内部の関心対象の標的配列のことを指す。DNA領域は、関心対象であって用いるDNA修飾剤がアクセス可能である、任意の長さでありうる。いくつかの態様において、DNA領域は単一塩基対を含みうるが、ゲノムDNA内部の短い配列セグメント（例えば、2〜100、2〜500、50〜500bp）またはより長いセグメント（例えば、100〜10,000、100〜1000または1000〜5000bp）でもあり得る。いくつかの態様において、DNA領域内のDNAの量は、PCR反応において増幅させようとする配列の量によって決まる。例えば、標準的なPCR反応は一般に約35〜5000塩基対を増幅することができる。あるいは、DNA領域は、遺伝子または染色体の関心対象の領域であり得る。
【００４１】
異なる「程度」の修飾とは、複数の試料間での、または1つもしくは複数の試料中の2つもしくはそれ以上のDNA領域間での、1つまたは複数のDNA領域の修飾されたコピー数（実際の数または相対数）が異なることを指す。例えば、2つのDNA領域（便宜上「領域A」および「領域B」と呼ぶ）の100個のコピーがそれぞれ、ある細胞内の染色体DNA上に存在するならば、異なる程度での修飾の一例は、領域Aの10個のコピーが修飾され、一方、領域Bの70個のコピーが修飾された場合であると考えられる。
【００４２】
「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」または「核酸」という用語は、リボース核酸（RNA）もしくはデオキシリボース核酸（DNA）の重合体またはそれらの類似体に対応しうる、単量体の重合体のことを互換的に指す。これには、RNAおよびDNA、さらにはそれらの修飾形態、ペプチド核酸（PNA）、ロックド核酸（locked nucleic acid, LNA（商標））といったヌクレオチドの重合体が含まれる。ある用途において、核酸は、複数の種類の単量体、例えば、RNAサブユニットおよびDNAサブユニットの両方を含む重合体でありうる。
【００４３】
核酸は典型的には一本鎖または二本鎖であり、一般にホスホジエステル結合を含むが、場合によっては、本明細書で概説するように、代替的な骨格を有しうる核酸類似体が含められ、これには例えば、ホスホルアミド（Beaucage et al.（1993）Tetrahedron 49（10）:1925およびその中の参考文献；Letsinger（1970）J. Org. Chem. 35:3800；Sprinzl et al.（1977）Eur. J. Biochem. 81:579；Letsinger et al.（1986）Nucl. Acids Res. 14: 3487；Sawai et al.（1984）Chem. Lett. 805；Letsinger et al.（1988）J. Am. Chem. Soc. 110:4470；およびPauwels et al.（1986）Chemica Scripta 26:1419）、ホスホロチオエート（Mag et al.（1991）Nucleic Acids Res. 19:1437および米国特許第5,644,048号）、ホスホロジチオエート（Briu et al.（1989）J. Am. Chem. Soc. 111:2321）、O-メチルホスホロアミダイト結合（O-methylphophoroamidite linkage）（Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press（1992））、ならびにペプチド核酸骨格および結合（Eghoim（1992）J. Am. Chem. Soc. 114:1895；Meier et al.（1992）Chem. Int. Ed. Engl. 31:1008；Nielsen（1993）Nature 365:566；およびCarlsson et al.（1996）Nature 380:207）が非限定的に含まれ、これらの参考文献はそれぞれ参照により組み入れられる。他の類似体核酸には、正に荷電した骨格（Denpcy et al.（1995）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:6097）；非イオン性骨格（米国特許第5,386,023号、第5,637,684号、第5,602,240号、第5,216,141号および第4,469,863号；Angew（1991）Chem. Intl. Ed. English 30: 423；Letsinger et al.（1988）J. Am. Chem. Soc. 110:4470；Letsinger et al.（1994）Nucleoside & Nucleotide 13:1597；Chapters 2 and 3, ASC Symposium Series 580, "Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Ed. Y. S. Sanghvi and P. Dan Cook；Mesmaeker et al.（1994）Bioorganic & Medicinal Chem. Lett. 4: 395；Jeffs et al.（1994）J. Biomolecular NMR 34:17；Tetrahedron Lett. 37:743（1996））、および、米国特許第5,235,033号および第5,034,506号ならびにChapters 6 and 7, ASC Symposium Series 580, Carbohydrate Modifications in Antisense Research, Ed. Y. S. Sanghvi and P. Dan Cookに記載されたものを含む非リボース骨格を有するものが含まれ、これらの参考文献はそれぞれ参照により組み入れられる。1つまたは複数の炭素環式糖を含む核酸も、核酸の定義の範囲に含まれる（Jenkins et al.（1995）Chem. Soc. Rev. pp169-176、これは参照により組み入れられる）。いくつかの核酸類似体は、例えば、Rawls, C & E News Jun. 2, 1997 page 35にも記載されており、これは参照により組み入れられる。リボース-リン酸骨格のこれらの修飾は、標識部分などの追加部分の付加を容易にするため、または生理的環境におけるそのような分子の安定性および半減期を変更するために行ってもよい。
【００４４】
核酸中に典型的に認められる、天然に存在する複素環式塩基（例えば、アデニン、グアニン、チミン、シトシンおよびウラシル）に加えて、核酸類似体にはまた、天然に存在しない複素環式塩基または他の修飾塩基も含まれ、その多くは本明細書中に記載されているか、そうでなければ参照されている。特に、天然に存在しない多くの塩基は、例えば、Seela et al.（1991）Helv. Chim. Acta 74:1790, Grein et al.（1994）Bioorg. Med. Chem. Lett. 4:971-976、およびSeela et al.（1999）Helv. Chim. Acta 82:1640にさらに記載されており、これらはそれぞれ参照により組み入れられる。さらに例を挙げるならば、融解温度（Tm）変更因子として作用するヌクレオチド中に用いられるある種の塩基が任意で含められる。例えば、これらのいくつかには、7-デアザプリン（例えば、7-デアザグアニン、7-デアザアデニンなど）、ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン、プロピニル-dN（例えば、プロピニル-dU、プロピニル-dCなど）などが含まれる。例えば、参照により組み入れられる、Seelaに対して1999年11月23日に発行された「7-デアザ-2'-デオキシグアノシンヌクレオチドの合成」と題する米国特許第5,990,303号を参照のこと。他の代表的な複素環式塩基には、例えば、ヒポキサンチン、イノシン、キサンチン；2-アミノプリン、2,6-ジアミノプリン、2-アミノ-6-クロロプリン、ヒポキサンチン、イノシンおよびキサンチンの8-アザ誘導体；アデニン、グアニン、2-アミノプリン、2,6-ジアミノプリン、2-アミノ-6-クロロプリン、ヒポキサンチン、イノシンおよびキサンチンの7-デアザ-8-アザ誘導体；6-アザシトシン；5-フルオロシトシン；5-クロロシトシン；5-ヨードシトシン；5-ブロモシトシン；5-メチルシトシン；5-プロピニルシトシン；5-ブロモビニルウラシル；5-フルオロウラシル；5-クロロウラシル；5-ヨードウラシル；5-ブロモウラシル；5-トリフルオロメチルウラシル；5-メトキシメチルウラシル；5-エチニルウラシル；5-プロピニルウラシルなどが含まれる。
【００４５】
DNA切断剤またはDNA修飾剤に対するDNA領域の「アクセス可能性」とは、本明細書で用いる場合、細胞の染色体内の特定のDNA領域が、特定のDNA切断剤またはDNA修飾剤によって接触されて修飾される能力のことを指す。本発明の範囲を限定することは意図しないが、DNA領域を含む特定のクロマチン構造は、DNA切断剤またはDNA修飾剤が特定のDNA領域を切断または修飾する能力に影響を及ぼすと考えられている。例えば、DNA領域がヒストンタンパク質の周りに巻き付けられていることもあり、さらに、関心対象のDNA領域に対するDNA切断剤またはDNA修飾剤のアクセスを防止または抑制するさらなるヌクレオソーム構造を有することもある。したがって、アクセス可能性は、切断または修飾の量に応じて検出することができる。2つのDNA領域間の相対的なアクセス可能性は、2つの領域間の切断または修飾レベルの比較（例えば、その比率の算出）によって決定することができる。
【００４６】
「異種配列」または「異種核酸」とは、本明細書で用いる場合、特定の宿主細胞にとって異質な供給源に由来するもの、または、同じ供給源由来なら、その原型から修飾されているものである。したがって、細胞内の異種発現カセットは、例えば、染色体DNAではなく発現ベクター由来のヌクレオチド配列と連結されることによって、異種プロモーターと連結されることによって、レポーター遺伝子と連結されることによってなど、特定の宿主細胞にとって内因性ではない発現カセットである。
[本発明1001]
a. DNA切断剤を、該DNA切断剤が細胞内のゲノムDNAを切断するような条件下で、該ゲノムDNAを有する該細胞に導入する段階であって、該ゲノムDNAの異なる領域が該剤によって異なる程度で切断され、それにより、切断されたDNA領域およびインタクトなDNA領域が生成される、段階；ならびに
b. 該DNAを、インタクトなDNAまたは切断されたDNAのいずれかについて濃縮する段階であって、それにより、濃縮されたDNAが生成される、段階；ならびに
c. 該濃縮されたDNAにおける少なくとも1つのDNA領域のインタクトなコピーもしくは切断されたコピーの存在、非存在もしくは量を検出するか、または該濃縮されたDNAにおける少なくとも1つのインタクトなDNA領域もしくは切断されたDNA領域のクローニング、単離もしくはヌクレオチド配列の決定を行う段階
を含む、染色体DNAを分析するための方法。
[本発明1002]
段階aの前または段階aと同時に、細胞の細胞膜を透過処理するかまたは破壊する段階を含む、本発明1001の方法。
[本発明1003]
段階aが、前記細胞内で異種発現カセットから前記DNA切断剤を発現させ、それにより該DNA切断剤を該細胞に導入することを含む、本発明1001の方法。
[本発明1004]
検出する段階が、前記少なくとも1つのDNA領域のインタクトなコピーの量を検出することを含む、本発明1001の方法。
[本発明1005]
前記少なくとも1つのDNA領域を増幅する段階を含む、本発明1001の方法。
[本発明1006]
増幅する段階がリアルタイムPCRを含む、本発明1005の方法。
[本発明1007]
検出する段階が、前記少なくとも1つのDNA領域のヌクレオチド配列の決定を行うことを含む、本発明1001の方法。
[本発明1008]
ヌクレオチド配列の決定が、DNAポリメラーゼの反応速度をモニタリングすることを含む、本発明1007の方法。
[本発明1009]
ヌクレオチド配列の決定が、（1）前記ヌクレオチド配列の決定、および（2）配列決定されたヌクレオチドが修飾されているかどうかの決定を同時に行うことを含む、本発明1007の方法。
[本発明1010]
検出する段階が、前記濃縮されたDNAを複数の核酸プローブとハイブリダイズさせること、および該濃縮されたDNAと該核酸プローブとのハイブリダイゼーションを検出することを含む、本発明1001の方法。
[本発明1011]
前記核酸プローブが固体支持体と連結されている、本発明1010の方法。
[本発明1012]
前記固体支持体が、マイクロアレイおよびビーズからなる群より選択される、本発明1011の方法。
[本発明1013]
検出する段階が、前記少なくとも1つのDNA領域の切断されたコピーの量を検出することを含む、本発明1001の方法。
[本発明1014]
前記DNA切断剤が、DNアーゼおよび制限酵素より選択される、本発明1001の方法。
[本発明1015]
検出する段階が、前記インタクトなDNAまたは切断されたDNAを、固体支持体と連結された核酸とハイブリダイズさせることを含む、本発明1001の方法。
[本発明1016]
濃縮する段階が、前記DNAをサイズ選択することを含む、本発明1001の方法。
[本発明1017]
前記DNAが10〜500 bpの断片について濃縮される、本発明1016の方法。
[本発明1018]
前記DNAが500 bp超の断片について濃縮される、本発明1016の方法。
[本発明1019]
前記少なくとも1つのDNA領域のインタクトなコピーまたは切断されたコピーの量が、該DNA領域のコピーの総数と比較される、本発明1001の方法。
[本発明1020]
前記少なくとも1つのDNA領域のインタクトなコピーまたは切断されたコピーの量が、第2の細胞内の該少なくとも1つのDNA領域のすべてのコピー、インタクトなコピーまたは切断されたコピーの量と比較される、本発明1001の方法。
[本発明1021]
a. DNA修飾剤を、該DNA修飾剤が細胞内のゲノムDNAを修飾するような条件下で、該ゲノムDNAを有する該細胞に導入する段階であって、該ゲノムDNAの異なる領域が該剤によって異なる程度で修飾され、それにより、修飾されたDNA領域および修飾されていないDNA領域が生成される、段階；ならびに続いて
b. 該細胞内の、または該細胞から単離された該ゲノムDNAをDNA切断剤と接触させる段階であって、該ゲノムDNAの異なる領域が該DNA切断剤によって異なる程度で切断され、それにより、切断されたDNA領域およびインタクトなDNA領域が生成される、段階；ならびに
c. 該DNAを、インタクトなDNAまたは切断されたDNAのいずれかについて濃縮する段階であって、それにより、濃縮されたDNAが生成される、段階；ならびに
d. 該濃縮されたDNAにおける少なくとも1つのDNA領域のインタクトなコピーもしくは切断されたコピーの存在、非存在もしくは量を検出するか、または該濃縮されたDNAにおける少なくとも1つのインタクトなDNA領域もしくは切断されたDNA領域のクローニング、単離もしくはヌクレオチド配列の決定を行う段階
を含む、染色体DNAを分析するための方法。
[本発明1022]
段階aの後に、修飾されたDNAに特異的に結合する親和性物質と前記DNAを接触させることにより、修飾されたDNA領域または修飾されていないDNA領域について該DNAを濃縮する段階をさらに含む、本発明1021の方法。
[本発明1023]
前記修飾がDNAメチル化である、本発明1022の方法。
[本発明1024]
前記親和性物質が、メチル化されたDNAに特異的に結合する抗体またはタンパク質である、本発明1021の方法。
[本発明1025]
濃縮する段階が段階aと段階cの間に行われる、本発明1021の方法。
[本発明1026]
濃縮する段階が段階cと段階dの間に行われる、本発明1021の方法。
[本発明1027]
前記修飾剤がDNAメチルトランスフェラーゼである、本発明1021の方法。
[本発明1028]
前記DNAメチルトランスフェラーゼがDNA中のアデノシンをメチル化する、本発明1027の方法。
[本発明1029]
前記DNA切断剤がアデノシンメチル化感受性制限酵素である、本発明1028の方法。
[本発明1030]
前記アデノシンメチル化感受性制限酵素が、DpnI、DpnII、MboIおよびSau3AIからなる群より選択される、本発明1029の方法。
[本発明1031]
前記DNAメチルトランスフェラーゼがDNA中のシトシンをメチル化する、本発明1027の方法。
[本発明1032]
前記DNA切断剤がシトシンメチル化感受性制限酵素である、本発明1031の方法。
[本発明1033]
前記シトシンメチル化感受性制限酵素が、AatII、AciI、AclI、AgeI、AluI、AscI、AseI、AsiSI、BbeI、BsaAI、BsaHI、BsiEI、BsiWI、BsrFI、BssHII、BssKI、BstBI、BstNI、BstU I、ClaI、EaeI、EagI、FauI、FseI、HhaI、HinP1I、HinCII、HpaII、Hpy99I、HpyCH4IV、KasI、MboI、MluI、MapA1I、McrBC、MspI、NaeI、NarI、No I、PmlI、PstI、Pv I、RsrII、SacII、SapI、Sau3AI、SflI、SfoI、SgrAI、SmaI、SnaBI、TscI、XmaIおよびZraIからなる群より選択される、本発明1032の方法。
[本発明1034]
段階aの前または段階aと同時に、細胞の細胞膜を透過処理するかまたは破壊する段階を含む、本発明1021の方法。
[本発明1035]
段階aが、前記細胞内で異種発現カセットから前記DNA切断剤および/またはDNA修飾剤を発現させ、それにより該DNA切断剤および/またはDNA修飾剤を該細胞に導入することを含む、本発明1021の方法。
[本発明1036]
検出する段階が、前記少なくとも1つのDNA領域のインタクトなコピーの量を検出することを含む、本発明1021の方法。
[本発明1037]
前記少なくとも1つのDNA領域を増幅する段階を含む、本発明1021の方法。
[本発明1038]
増幅する段階がリアルタイムPCRを含む、本発明1037の方法。
[本発明1039]
検出する段階が、前記少なくとも1つのDNA領域の切断されたコピーの量を検出することを含む、本発明1021の方法。
[本発明1040]
検出する段階が、前記濃縮されたDNAにおける少なくとも1つのインタクトなDNA領域または切断されたDNA領域のヌクレオチド配列の決定を行うことを含む、本発明1021の方法。
[本発明1041]
ヌクレオチド配列の決定が、DNAポリメラーゼの反応速度をモニタリングすることを含む、本発明1040の方法。
[本発明1042]
ヌクレオチド配列の決定が、（1）ヌクレオチド配列の決定、および（2）配列決定されたヌクレオチドが修飾されているかどうかの決定を同時に行うことを含む、本発明1040の方法。
[本発明1043]
検出する段階が、前記濃縮されたDNAを複数の核酸プローブとハイブリダイズさせること、および該濃縮されたDNAと該核酸プローブとのハイブリダイゼーションを検出することを含む、本発明1021の方法。
[本発明1044]
前記核酸プローブが固体支持体と連結されている、本発明1043の方法。
[本発明1045]
前記固体支持体が、マイクロアレイおよびビーズからなる群より選択される、本発明1044の方法。
[本発明1046]
前記DNA切断剤が、DNアーゼおよび制限酵素より選択される、本発明1021の方法。
[本発明1047]
検出する段階が、インタクトなDNAまたは切断されたDNAを、固体支持体と連結された核酸とハイブリダイズさせることを含む、本発明1021の方法。
[本発明1048]
濃縮する段階が、前記DNAをサイズ選択することを含む、本発明1021の方法。
[本発明1049]
前記DNAが10〜500 bpの断片について濃縮される、本発明1048の方法。
[本発明1050]
前記DNAが500 bp超の断片について濃縮される、本発明1048の方法。
[本発明1051]
前記少なくとも1つのDNA領域のインタクトなコピーまたは切断されたコピーの量が、該DNA領域のコピーの総数と比較される、本発明1021の方法。
[本発明1052]
前記少なくとも1つのDNA領域のインタクトなコピーまたは切断されたコピーの量が、第2の細胞内の該少なくとも1つのDNA領域のすべてのコピー、インタクトなコピーまたは切断されたコピーの量と比較される、本発明1021の方法。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】図1Aは、細胞をインサイチューでヌクレアーゼにより処理して、アクセス可能なクロマチンを消化すること；アクセス不能なクロマチン領域は消化に対して抵抗性であることを図示している。図1Bは、アクセス可能なクロマチン領域は、サイズが相対的に小さいものと考えられること；アクセス不能なクロマチン領域は相対的に大きいものと考えられることを図示している。図1Cは、精製されたDNAがサイズによって分画されることを図示している。低分子量（MW）のDNA画分は、主にアクセス可能なクロマチンを含有するものと考えられる。高分子量のDNA画分は、アクセス不能なクロマチンが濃縮されるものと考えられる。この態様はアクセス可能性を検出するためのDNA切断剤の使用に基づくことに留意されたい。DNA修飾剤を用いてアクセス可能性を試験する態様の、すべてではないが、いくつかにおいて、高分子量DNAがアクセス可能なクロマチンに相当し、かつ低分子量DNAがアクセス不能なクロマチンに相当しうる。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
詳細な説明
I．序論
本発明は、DNA切断剤またはDNA修飾剤に対するクロマチン中のDNAのアクセス可能性に基づきゲノムDNAに切断部位を導入することを伴う方法を提供する。DNA修飾剤が用いられる場合には、それに続いて修飾感受性のDNA切断剤を用いて切断部位を導入する。いずれの場合にも、切断後、DNAを今度は、切断されたDNAまたは切断されていないDNAについて（例えば、サイズ選択または他の手段により）濃縮し、その後、分析することができる。切断されたDNAまたは切断されていないDNAは、異なるクロマチン構造、それ故に、DNA切断剤に対する異なるアクセス可能性を有するクロマチンに由来したDNAに相当する。
【００４９】
いくつかの態様において、本発明は、インタクトなクロマチンにおける（例えば、インタクトな核における）ゲノムDNAを切断することによってクロマチン構造の分析を可能にし、その際にクロマチンの構造がクロマチンDNAの差次的な切断を、クロマチン構造に依存してもたらす。したがって、クロマチンにおけるDNA切断剤のアクセス可能性に基づき、異なるDNA領域が、より頻繁にまたはそれほど頻繁にではなく切断され、相対的に異なるサイズの断片を生ずるものと考えられる。切断されたDNAを今度は、切断されたDNAまたは切断されていないDNAについて（例えば、サイズ選択または他の手段により）濃縮し、その後、分析することができる。相対的により大きなまたは小さなDNA断片を選択することにより、DNA切断剤に対して、それぞれ、相対的にアクセス不能またはアクセス可能であったDNAを選択および濃縮し、それにより、DNAに対する剤のアクセス可能性によって規定されるある種のクラスのクロマチン構造のDNAについて濃縮することができる。濃縮されたら、少なくとも1つのDNA領域を検出し、クローニングし、配列決定し、定量し、またはそれ以外の方法で分析することができる。本方法は特定のクラスのヌクレオチド配列を濃縮するので、本方法は、ゲノム規模でのクロマチン分析に、すなわち、異なる細胞においてまたは異なる刺激に応答してゲノムの全体で起こるクロマチン変化の多様さをモニタリングするために特に有用である。DNA配列は特定のサイズについて濃縮されているので、このDNAを、例えば、ポリメラーゼの反応速度の分析を伴う方法、ならびにヌクレオチド配列およびヌクレオチドのメチル化状態の同時検出を可能にする方法を含む、「次世代」配列決定において好都合に用いることができる。実に、次世代配列決定法の速度および費用低減は、本明細書に記載されている方法を次世代配列決定法で用いて、試料中のすべてまたは典型的なコピー数の配列を決定することにより試料中の配列のコピー数を絶対的にまたは相対的に定量できるようなものである。さらに、DNAをコピーするDNA増幅または他のプロセスなしでの濃縮は、必要ならDNAにおけるメチル化または他の検出可能なDNA修飾の同時検出を可能にする。
【００５０】
あるいは、一部のDNA領域は修飾を含有するが、他のDNA領域は含有しないような、または少なくとも、一部のDNA領域が他のDNA領域よりも相対的に多くの修飾を有するようなクロマチン構造依存的な様式で、インタクトなクロマチンのDNAにDNA修飾を導入することができる。この場合、特定のDNA領域における修飾の相対存在度は、少なくとも部分的にクロマチン構造と相関関係にあると考えられ、したがって、導入される修飾の相対数は、修飾剤に対するクロマチン中の当該DNA領域の相対的なアクセス可能性と相関関係にある。修飾されたDNA領域を、その後、修飾選択的な様式でDNAを切断するDNA切断剤により切断することができ、例えば、該剤は修飾を有するDNAのみを切断し、または該剤は修飾を欠いているDNAのみを切断する。これらの態様において、クロマチン特異的な様式でDNA修飾が既に挿入されているので、DNA切断剤は当該DNAを単離されたDNAとして、すなわち、必ずしもそうとは限らないが、天然のクロマチン構造の一部として切断することができる。得られたDNA断片のサイズ選択により、選択される相対サイズに依存して、および用いられるDNA切断剤に依存してクロマチン中の相対的にアクセス可能なまたはアクセス不能なDNA領域が選択されるものと考えられる。DNA切断剤のみとの関連で上記に論じられているように、濃縮されたクラスのヌクレオチド配列を検出し、クローニングし、配列決定し、定量し、またはそれ以外の方法で分析することができる。少なくとも1つのDNA領域をこのように分析することができ、いくつかの態様において、本方法はゲノム規模でのクロマチン分析のために用いられる。DNA配列は特定のサイズについて濃縮されているので、このDNAを、例えば、ポリメラーゼの反応速度の分析を伴う方法、ならびにヌクレオチド配列およびヌクレオチドのメチル化状態の同時検出を可能にする方法を含む、「次世代」配列決定において好都合に用いることができる。繰り返すが、必要なら、メチル化または他のDNA修飾を、配列決定で、または配列決定の一部として同時に検出することができる。
【００５１】
いくつかの態様において、DNA切断剤またはDNA修飾剤が導入される核は細胞内にあり、DNA切断剤またはDNA修飾剤は細胞に導入される。あるいは、DNA切断剤またはDNA修飾剤は、細胞の核に直接導入される。例えば、核は単離された核であることができ、DNA切断剤またはDNA修飾剤を、単離された核に導入することができる。
【００５２】
本発明の方法は、細胞の細胞膜を透過処理するかまたは破壊する段階を含むことができ、それにより、細胞中および核DNAへのDNA切断剤またはDNA修飾剤の導入が向上される。細胞膜の透過処理または破壊は、DNA切断剤またはDNA修飾剤を細胞に導入する前に行われてもよく、あるいは細胞膜の透過処理または破壊は、DNA切断剤またはDNA修飾剤の導入と同時に行われてもよい。
【００５３】
いくつかの態様において、透過処理剤の除去後に、任意で緩衝液の交換とともに、DNA切断剤またはDNA修飾剤を、透過処理を行った細胞と接触させる。または、いくつかの態様において、1つまたは複数の中間段階を省いて（例えば、緩衝液の交換、細胞の洗浄などを省いて）、DNA切断剤またはDNA修飾剤をゲノムDNAと接触させる。上述した通り、この後者のアプローチは、手間のかかる作業および必要な時間の量を減らすために好都合であり得、さらに、アッセイにおける誤りやコンタミネーションをもたらす可能性のある原因も減らす。
【００５４】
用いるDNA切断剤またはDNA修飾剤の量、ならびにDNA切断剤またはDNA修飾剤との反応時間は、用いる剤に依存すると考えられる。当業者は、用いる剤に応じて条件をどのように調整すべきかを認識しているであろう。一般に、DNAの切断段階または修飾段階の条件は、「完全な」消化が達成されないように調整する。したがって、例えば、いくつかの態様において、修飾段階の条件は、陽性対照‐すなわち、修飾がアクセス可能であって、生じる対照‐が、100％未満ではあるが高いレベル、例えば、80〜95％、80〜99％、85〜95％、90〜98％などで生じるように設定される。
【００５５】
III. 細胞の透過処理および破壊
本明細書に記載されている方法は、少なくともDNA切断剤および/またはDNA修飾剤と、クロマチン構造を保持しているゲノムDNAとを接触させる段階を伴う。これは、例えば、該剤と、インタクトな（および任意で透過処理されていてもよい）核内のゲノムDNAとを接触させることによって達成することができる。いくつかの態様において、核内DNAはインタクトな細胞内にある。あるいは、核は単離された核であってもよく、すなわち、細胞の残部から単離されていてもよい。
【００５６】
細胞膜は、当技術分野において公知の任意の方法で透過処理すること、または破壊することができる。本明細書で説明しているように、本方法は、DNAの単離の前にゲノムDNAを接触させることを伴い、それ故に、細胞膜の透過処理または破壊の方法は、ヌクレオソームまたはクロマチンの構造が破壊されるように細胞のゲノムDNAの構造を破壊することはないと考えられる。
【００５７】
いくつかの態様においては、細胞膜を、細胞膜を透過性にするかまたは破壊する剤と接触させる。リゾ脂質は、細胞膜を透過性にする例示的なクラスの剤である。例示的なリゾ脂質には、リゾホスファチジルコリン（当技術分野においてリゾレシチンとしても公知である）またはモノパルミトイルホスファチジルコリンが非限定的に含まれる。種々のリゾ脂質が、例えば、WO／2003／052095号にも記載されている。
【００５８】
非イオン性界面活性剤は、細胞膜を破壊する例示的なクラスの剤である。例示的な非イオン性界面活性剤には、NP40、Tween 20およびTriton X-100が非限定的に含まれる。
【００５９】
本発明の1つの局面は、透過処理剤とDNA切断剤またはDNA修飾剤との同時送達である。したがって、いくつかの態様においては、両方の剤を含む緩衝液を細胞と接触させる。緩衝液は、細胞クロマチンの構造を維持させながら両方の剤の活性を維持させるのに適合しているべきである。
【００６０】
または、エレクトロポレーションまたは微粒子銃法を、DNA修飾剤が細胞内に導入され、従ってゲノムDNAと接触しうるように、細胞膜を透過処理するために用いることもできる。多岐にわたるエレクトロポレーション法が周知であり、本明細書に記載されたDNA修飾剤の送達用に適合させることができる。例示的なエレクトロポレーション法には、WO／2000／062855号に記載されたものが非限定的に含まれる。微粒子銃法には、米国特許第5,179,022号に記載されたものが非限定的に含まれる。
【００６１】
II．一般的方法
種々の真核生物細胞を本発明に用いることができる。いくつかの態様において、細胞は、ヒトの、または非ヒトの哺乳動物細胞を非限定的に含む動物細胞である。非ヒト哺乳動物細胞には、霊長動物細胞、マウス細胞、ラット細胞、ブタ細胞およびウシ細胞が非限定的に含まれる。いくつかの態様において、細胞は植物細胞または（非限定的に酵母を含む）真菌細胞である。細胞は、例えば、培養初代細胞、不死化培養細胞であってもよく、または生検試料もしくは組織試料に由来し、任意で培養した上でアッセイする前に分裂するように刺激したものでもよい。培養細胞は、透過処理および／またはDNA修飾の段階の前および／または最中に、浮遊していてもよく、または付着していてもよい。細胞が動物組織、生検試料などに由来してもよい。例えば、細胞は腫瘍生検試料に由来しうる。
【００６２】
本方法は、あるDNA領域に対するアクセス可能性を、その同じ領域からの転写と関連づけることを含みうる。いくつかの態様においては、アクセス可能性と遺伝子発現との間の相関関係を決定するために実験を行い、その後に特定のDNA領域に対するDNA切断剤またはDNA修飾剤のアクセス可能性を用いて、そのDNA領域からの転写を予測することができる。いくつかの態様においては、DNA領域からの転写、およびDNA切断剤またはDNA修飾剤に対するその領域のアクセス可能性を、両方とも決定する。転写を測定するための多岐にわたる方法が公知であり、それにはノーザンブロット法、RT-PCR、およびRT-qPCRが非限定的に含まれる。
【００６３】
いくつかの態様においては、ある領域のDNAメチル化状態を、DNA切断剤またはDNA修飾剤に対するDNA領域のアクセス可能性と関連づけることができる。いくつかの態様においては、アクセス可能性とその領域におけるDNAメチル化との相関関係を決定するために実験を行い、その後に特定のDNA領域に対するDNA切断剤またはDNA修飾剤のアクセス可能性を利用して、そのDNA領域からのDNAメチル化を予測することができる。いくつかの態様においては、DNA領域のメチル化、およびDNA修飾剤に対するその領域のアクセス可能性を、両方とも決定する。DNAメチル化を測定するための多岐にわたる方法が公知であり、それには、バイサルファイトの使用（例えば、配列決定において、および／またはメチル化感受性制限酵素との組み合わせで（例えば、Eads et al., Nucleic Acids Research 28（8）: E32（2002）を参照）および高分解能融解アッセイ（HRM）（例えば、Wodjacz et al, Nucleic Acids Research 35（6）:e41（2007）を参照）が非限定的に含まれる。
【００６４】
DNAの修飾および/または切断ならびに切断されたDNAまたは切断されていないDNAの濃縮の後に、細胞のゲノム中の第1のDNA領域と第2のDNA領域との間の量または他の物理的特徴の比較がなされ得る。代替的に、または加えて、2つの異なる細胞における第1のDNA領域の量または他の物理的特徴を比較することもできる。例えば、2つの細胞は、罹患しているおよび健常な細胞または組織、異なる細胞型、異なる発生段階（幹細胞または始原細胞を非限定的に含む）などであってよい。このようにして、本発明の方法を用いることにより、細胞間のクロマチン構造の違いを検出すること、および／または1つの細胞内の2つもしくはそれ以上のDNA領域（例えば、遺伝子）間の相対的なクロマチン構造を決定することができる。加えて、同じ細胞または異なる細胞における特定の領域のクロマチン構造に対する薬物刺激、化学刺激または環境的刺激の影響を決定することもできる。
【００６５】
IV．DNA切断剤
A．制限酵素
いくつかの態様において、DNA切断剤は制限酵素である。したがって、これらの態様において、ゲノムDNAに導入される切断部位は、配列特異的な一本鎖（例えば、ニック）または二本鎖切断事象である。多岐にわたる制限酵素が公知であり、本発明に用いることができる。
【００６６】
あらゆる種類の制限酵素を用いることができる。I型酵素はDNAを、それらの認識配列から離れたところでランダムに切断する。II型酵素はDNAを、それらの認識配列の付近または内部の所定の位置で切断する。いくつかのII型酵素はDNAを、それらの認識配列の内部で切断する。II-S型酵素は、それらの認識配列の外側のうち片側を切断する。より正確には「IV型」と呼ばれる第3の主な種類のII型酵素は、それらの認識配列の外側を切断する。例えば、連続配列を認識するもの（例えば、AcuI：CTGAAG）は、片側のみを切断する；不連続配列を認識するもの（例えば、BcgI：CGANNNNNNTGC）は両側を切断し、その認識配列を含む小さな断片を遊離させる。III型はそれらの認識配列の外側を切断し、切断を遂行するためには、そのような配列が反対向きで2つ同一のDNA分子内に必要である。
【００６７】
本発明の方法は、あらゆる種類の制限酵素または他のDNA切断酵素と用いるために適合させることができる。いくつかの態様において、酵素は、認識配列の比較的付近（例えば、5、10または20塩基対以内）を切断する。そのような酵素は、切断を達成するためにアクセス可能でなければならないDNAの範囲が認識配列それ自体よりも長く、それ故に「緻密」なクロマチン構造内にないDNAをより広範な範囲で含みうるため、クロマチン構造をアッセイする上で特に有用な可能性がある。認識配列の外側を切断する例示的な酵素には、例えば、II-S型酵素、III型酵素およびIV型酵素が含まれる。II-S型制限酵素には、MnlI、FokIおよびAlwIが非限定的に含まれる。
【００６８】
いくつかの態様においては、複数（例えば、2つ、3つ、4つなど）の制限酵素を用いる。酵素の組み合わせは、すべてが1つの型由来である酵素の組み合わせを含んでもよく、または異なる型の混合物であってもよい。
【００６９】
本明細書に記載した通りに、インタクトなまたは切断されたDNAを、その後に別々に検出して定量し、DNA領域のインタクトなおよび／または切断されたコピーの数を決定する。
【００７０】
いくつかの態様においては、透過処理剤または膜破壊剤を、制限酵素の前に添加する。いくつかの態様においては、制限酵素と透過処理剤または破壊剤とを同時に添加する（例えば、適切な緩衝液中に、またはそれとともに）。仮に両方の剤を最初に同時に細胞と接触させない場合でも、透過処理は持続的過程であるため、透過処理とDNA切断剤への接触とを同時に行うことを依然として達成することができる。したがって、例えば、透過処理剤の添加のすぐ後に（透過処理が実質的に完了する前に）DNA切断剤を添加することは、透過処理および細胞をDNA切断剤と接触させることを「同時に」行うことと見なすことができる。「同時に」とは、透過処理剤の添加と切断剤の添加との間に中間的な操作（緩衝液の交換、遠心処理などを非限定的に含む）を行わないことを意味する。
【００７１】
いくつかの態様においては、0.5％リゾレシチン（w／v）、50mM NaCl、10mM Tris-HCl pH 7.4、10mM MgCl2、1mM DTT、100ug／ml BSAおよび0〜500単位／mlのMnlI（または他の制限酵素）を用いる。いくつかの態様においては、0.25％リゾレシチン（w／v）、50mM NaCl、10mM Tris-HCl pH 7.4、10mM MgCl2、1mM DTT、100ug／ml BSAおよび0〜500単位／mlのMnlI（または他の制限酵素）を用いる。いくつかの態様においては、0.75％リゾレシチン（w／v）、50mM NaCl、10mM Tris-HCl pH 7.4、10mM MgCl2、1mM DTT、100ug／ml BSAおよび0〜500単位／mlのMnlI（または他の制限酵素）を用いる。いくつかの態様においては、1％リゾレシチン（w／v）、50mM NaCl、10mM Tris-HCl pH 7.4、10mM MgCl2、1mM DTT、100ug／ml BSAおよび0〜800単位／mlのMnlI（または他の制限酵素）を用いる。
【００７２】
透過処理および消化の後に、任意で同時に溶解／停止用緩衝液および／または温度上昇を加えることにより、消化を任意で停止させて、細胞を溶解する。例示的な溶解／停止用緩衝液には、反応を停止させて細胞を溶解するのに十分なキレート剤および界面活性剤が含まれうる。例えば、いくつかの態様において、溶解／停止用緩衝液は、100mM Tris-HCl pH 8、100mM NaCl、100mM EDTA、5％ SDS（w／v）および3mg／mlのプロテイナーゼKを含む。いくつかの態様において、溶解／停止用緩衝液は、100mM Tris-HCl pH 8、100mM NaCl、100mM EDTA、1％ SDS（w／v）および3mg／mlのプロテイナーゼKを含む。いくつかの態様において、溶解／停止用緩衝液は、200mM Tris-HCl pH 8、100mM NaCl、500mM EDTA、5％ SDS（w／v）および5mg／mlのプロテイナーゼKを含む。
【００７３】
B．DNアーゼ
いくつかの態様においては、DNAに配列非特異的な様式で切れ目またはニックを入れる酵素をDNA修飾剤として用いる。したがって、いくつかの態様において、DNA切断剤は配列非特異的エンドヌクレアーゼ（本明細書では「DNアーゼ」とも称する）である。
【００７４】
あらゆる配列非特異的エンドヌクレアーゼ（例えば、DNアーゼI、II、III、IV、V、VI、VIIのいずれか）を、本発明に従って用いることができる。例えば、DNアーゼIを非限定的に含む、あらゆるDNアーゼを用いることができる。用いるDNアーゼには、天然に存在するDNアーゼ、さらには改変DNアーゼが含まれうる。改変DNアーゼの一例はTURBO DNアーゼ（Ambion）であり、これは「活性亢進」および塩耐性を可能にする突然変異を含む。例示的なDNアーゼには、ウシ膵臓DNアーゼI（例えば、New England Biolabsから入手可能）が非限定的に含まれる。あるいは、二本鎖DNアーゼ（dsDNアーゼ）を用いることができる。dsDNアーゼの例としては、例えば、Nilsen et al., PLoS ONE 5（4）: el0295（2010）を参照のこと。
【００７５】
DNアーゼ処理後、当該DNAの精製、および切断されたDNAまたは切断されていないDNAについての濃縮（例えば、サイズ選択または濃縮）を行うことができ、続いて、当該DNAの検出および/または定量を行うことができる。任意で、DNA領域のインタクトなおよび／または切断されたコピーの数を、本明細書に記載した通りに決定することができる。
【００７６】
いくつかの態様においては、透過処理剤または膜破壊剤を、DNアーゼの前に添加する。いくつかの態様においては、DNアーゼと透過処理剤または破壊剤とを同時に添加する（例えば、適切な緩衝液とともに）。いくつかの態様において、透過処理／消化用緩衝液は、0.25％リゾレシチン（w／v）、10mM Tris-HCl pH 7.4、2.5mM MgCl2、0.5mM CaCl2および0〜200単位／mlのDNアーゼIを含む。いくつかの態様において、透過処理／消化用緩衝液は、0.5％リゾレシチン（w／v）、10mM Tris-HCl pH 7.4、2.5mM MgCl2、0.5mM CaCl2および0〜200単位／mlのDNアーゼIを含む。いくつかの態様において、透過処理／消化用緩衝液は、0.75％リゾレシチン（w／v）、10mM Tris-HCl pH 7.4、2.5mM MgCl2、0.5mM CaCl2および0〜500単位／mlのDNアーゼIを含む。いくつかの態様において、透過処理／消化用緩衝液は、0.25％リゾレシチン（w／v）、10mM Tris-HCl pH 7.4、2.5mM MgCl2、0.5mM CaCl2および0〜500単位／mlのDNアーゼIを含む。透過処理および溶解は、例えば、制限酵素に関して上述した通りに停止させることができる。
【００７７】
他の箇所で考察しているように、DNアーゼまたは他の一般的なDNA切断剤の使用を、一方が標的であり、もう一方が、試験条件のいずれにおいても概ね常にアクセス可能であるかまたは概ね常にアクセス不能であるDNA領域である、少なくとも2つの異なるDNA領域間の切断の程度をモニターすることによって向上させることができる。そのような遺伝子の例は本明細書中の他の箇所で考察されており、公知であるかまたは同定することができる。例えば、「ハウスキーピング」遺伝子を範囲に含むDNA領域は概ね常にアクセス可能である。続いて、対照と比較した残りの標的の相対量を用いて、標的DNA領域での相対的なクロマチン構造を決定することができる。
【００７８】
C. DNA切断剤の使用
上記のように、DNA切断剤を核内のインタクトなクロマチンと接触させることができる。あるいは、DNA切断剤は、クロマチンをDNA修飾剤と接触させた後に用いることもできる。後者の場合、DNA切断剤をクロマチンと接触させる必要はないが、代わりに、より典型的には、DNA修飾剤との接触後に細胞/核から精製された精製DNAとDNA切断剤を接触させる。
【００７９】
用いられるDNA切断剤の種類は、どの切断剤がクロマチンと接触されるかに依るものと考えられる。クロマチンDNAがDNA切断剤と接触される状況では、任意のDNA切断剤を、通常、所望のように用いることができる。しかしながら、クロマチンDNAがDNA修飾剤と接触される態様では、その後に用いられるDNA切断剤は、DNAにおける修飾の有無に依存してDNAを選択的に切断する剤であろう。したがって、例えば、修飾がシトシンメチル化である場合、DNA切断剤は、シトシンメチル化の有無に依存してDNAを選択的に切断するであろう。修飾がアデノシンメチル化である場合、DNA切断剤は、アデノシンメチル化の有無に依存してDNAを選択的に切断するであろう。いくつかの態様において、DNA修飾剤の後に、修飾を有するDNAを選択的に切断するDNA切断剤でDNA（任意で精製されていてもよいDNA）を切断することが行われる。あるいは、いくつかの態様において、DNA修飾剤の後に、修飾を欠いているDNAを選択的に切断するDNA切断剤でDNA（任意で精製されていてもよいDNA）を切断することが行われる。
【００８０】
いくつかの態様において、DNA修飾は、DNAメチル化（例えば、アデノシンメチル化（例えば、6-メチルアデノシン）、シトシンメチル化（例えば、5-メチルシトシン、もしくはこの修飾を導入かつ認識するために酵素を利用できる場合、4-メチルシトシン）、または他のヌクレオチドメチル化）である。これらの態様においては、メチル化感受性制限酵素または他のメチル化感受性の剤を用いて、DNAをメチル化依存的な様式でまたはメチル化感受性の様式で切断することができる。例示的なメチル化感受性制限酵素（すなわち、メチル化が存在しないならDNAを切断する酵素）としては、例えば、シトシンメチル化感受性制限酵素およびアデノシンメチル化感受性制限酵素が挙げられる。例示的なメチル化感受性制限酵素（すなわち、メチル化が存在しないならDNAを切断する酵素）としては、例えば、シトシンメチル化感受性制限酵素（例えば、AatII、AciI、AclI、AgeI、AluI、AscI、AseI、AsiSI、BbeI、BsaAI、BsaHI、BsiEI、BsiWI、BsrFI、BssHII、BssKI、BstBI、BstNI、BstU I、ClaI、EaeI、EagI、FauI、FseI、HhaI、HinP1I、HinCII、HpaII、Hpy99I、HpyCH4IV、KasI、MboI、MluI、MapA1I、MspI、NaeI、NarI、No I、PmlI、PstI、Pv I、RsrII、SacII、SapI、Sau3AI、SflI、SfoI、SgrAI、SmaI、SnaBI、TscI、XmaIおよびZraI）ならびにアデノシンメチル化感受性制限酵素（例えば、DpnII）が挙げられる。例示的なメチル化依存性制限酵素（すなわち、メチル化が存在するならDNAを切断する酵素）としては、例えば、シトシンメチル化依存性制限酵素（例えば、McrBC、GlaIおよびBlsI）ならびにアデノシンメチル化依存性制限酵素（例えば、DpnI）が挙げられる。
【００８１】
IV. DNA修飾剤
本発明のいくつかの態様において、DNA修飾剤はクロマチンDNAに対する共有結合修飾を生成させる。
【００８２】
a. メチルトランスフェラーゼ
いくつかの態様において、本発明のDNA修飾剤はメチルトランスフェラーゼである。
【００８３】
種々のメチルトランスフェラーゼが当技術分野において公知であり、本発明に用いることができる。いくつかの態様において、用いるメチルトランスフェラーゼはDNA中のアデノシンに対してメチル部分を付加する。そのようなメチルトランスフェラーゼの例には、DAMメチルトランスフェラーゼが非限定的に含まれる。アデノシンは真核生物細胞ではメチル化されないため、特定のDNA領域におけるメチル化アデノシンの存在は、DAMメチルトランスフェラーゼ（または類似の活性を有する他のメチルトランスフェラーゼ）がDNA領域にアクセス可能であったことを指し示している。アデノシンのメチル化は、例えば、認識配列がメチル化アデノシンを含む制限酵素を用いて検出することができる。そのような酵素の一例には、DpnIが非限定的に含まれる。続いて、当該DNAを、切断されたDNAまたは切断されていないDNAについて濃縮することができ、所望の場合は、本明細書に記載した通りに（例えば、インタクトなDNAは増幅されるが切断されたDNAはそうでないように、またはLM-PCRを用いて、切断されたDNAは増幅するがインタクトなDNAは増幅しないように）定量することができる。
【００８４】
いくつかの態様において、メチルトランスフェラーゼは、非限定的にGC配列を含むシトシンをメチル化する。そのようなメチルトランスフェラーゼの例には、MCviPIが非限定的に含まれる。例えば、Xu et al., Nuc. Acids Res. 26（17）: 3961-3966（1998）を参照のこと。GC配列は真核生物細胞ではメチル化されないため、特定のDNA領域におけるメチル化GC配列の存在は、DNA修飾剤（すなわち、GC配列中のシトシンをメチル化するメチルトランスフェラーゼ）がDNA領域にアクセス可能であったことを指し示している。メチル化GC配列は、任意のさまざまな手法を用いて同定することができる。他の箇所で述べたように、いくつかの態様において、ヌクレオチドのヌクレオチド配列とメチル化状態とを、例えば鋳型依存的なポリメラーゼの反応速度をモニタリングすることにより、同時に決定することができる。
【００８５】
いくつかの態様において、メチルトランスフェラーゼは、CG（「CpG」としても知られる）配列中のシトシンをメチル化する。そのようなメチルトランスフェラーゼの例には、M.SssIが非限定的に含まれる。そのようなメチルトランスフェラーゼの使用は一般に、典型的にはメチル化されないDNA領域に対する使用に限定される。これは、CG配列が真核生物細胞では内因性にメチル化され、それ故に、メチル化が稀であるようなDNA領域を除き、CG配列が内因性メチルトランスフェラーゼではなく修飾剤によってメチル化されると想定することは一般に不可能であるためである。GC配列の場合と同様に、CG配列のメチル化は、得られるDNAをシトシンメチル化に感受性または依存性の制限酵素によって切断することと、切断されたDNAまたは切断されていないDNAについて濃縮することとを含む方法によって検出することができる。
【００８６】
b．化学物質
いくつかの態様において、DNA修飾剤はDNA修飾性化学物質である。大部分のDNA修飾性化学物質はクロマチンと比較して相対的に小さいため、融合パートナーを伴わないDNA修飾性化学物質の使用は、異なるDNA領域のアクセス可能性の程度に仮に違いがあるにしてもわずかであると考えられることから、状況によっては有効でない。このため、いくつかの態様において、DNA修飾剤は、DNA修飾性化学物質と連結された立体障害を有する分子を含む。立体障害を有する分子は、クロマチン構造に応じてDNA修飾剤のアクセス可能性に違いをもたらす任意のタンパク質または他の分子でありうる。これは例えば、結果を、本明細書に記載したDNアーゼまたは制限酵素を用いた結果と比較することによって検討することができる。
【００８７】
いくつかの態様において、立体障害を有する分子は、少なくとも5、7、10または15kDのサイズであると考えられる。おそらく当業者は、立体障害を備える分子としてポリペプチドを用いることが好都合であると判断するであろう。DNA修飾剤がDNAを修飾する能力を著しく妨害することのない任意のポリペプチドを用いることができる。いくつかの態様において、ポリペプチドは、以下でさらに詳細に考察している二本鎖配列非特異的な核酸結合ドメインである。
【００８８】
本発明のDNA修飾性化学物質は、立体障害を有する分子と直接連結させること、またはリンカーを介して連結させることができる。種々のホモおよびヘテロ二官能性リンカーが公知であり、この目的に用いることができる。
【００８９】
例示的なDNA修飾性化学物質には、ヒドラジン（および、例えば、Mathison et al., Toxicology and Applied Pharmacology 127（1）:91-98（1994）に記載されているようなその誘導体）および硫酸ジメチルが非限定的に含まれる。いくつかの態様において、ヒドラジンはDNA中のグアノシンにメチル基を導入するか、他の様式でDNAを損傷させる。いくつかの態様において、硫酸ジメチルはグアニンをメチル化するか、または、グアニン中に存在するイミダゾール環を開裂させることにより、DNA中のグアニンの塩基特異的切断をもたらす。
【００９０】
DNA修飾性化学物質による修飾の検出は、生じたDNA修飾の種類に依存すると考えられる。いくつかの態様において、硫酸ジメチルまたはヒドラジンによる修飾を検出するために、DNAをピペリジンにより高温（90℃）で処理する。DNAはDNA修飾部位で切断を受け、DNAは無傷または無傷でない領域について濃縮され、本明細書に記載したヌクレアーゼ切断を検出するのと同じ様式で当該切断を検出することができる。
【００９１】
V．DNA切断剤またはDNA修飾剤を改良するためのDNA結合ドメイン
いくつかの態様においては、本発明のDNA修飾剤または切断剤を、二本鎖配列非特異的な核酸結合ドメイン（例えば、DNA結合ドメイン）と融合させるかまたは他の様式で連結させる。DNA修飾剤または切断剤がポリペプチドである場合には、二本鎖配列非特異的な核酸結合ドメインを、例えば、DNA修飾剤または切断剤とのタンパク質融合物として、組換えDNA技術を介して合成することができる。二本鎖配列非特異的な核酸結合ドメインは、二本鎖核酸と配列非依存的な様式で結合するタンパク質またはタンパク質の定まった領域であり、すなわち結合は、特定の配列に対する全体的な選好性を示さない。いくつかの態様において、二本鎖核酸結合タンパク質は、二本鎖核酸に対して一本鎖核酸よりも10倍またはそれ以上高い親和性を示す。二本鎖核酸結合タンパク質は、本発明のいくつかの態様において耐熱性である。そのようなタンパク質の例には、古細菌小型塩基性DNA結合タンパク質Sac7dおよびSso7d（例えば、Choli et al., Biochimica et Biophysica Acta 950:193-203, 1988；Baumann et al., Structural Biol. 1:808-819, 1994；およびGao et al, Nature Struc. Biol. 5:782-786, 1998を参照）、古細菌HMf様タンパク質（例えば、Stanch et al., J. Molec. Biol. 255:187-203, 1996；Sandman et al., Gene 150:207-208, 1994を参照）、およびPCNA相同体（例えば、Cann et al., J. Bacteriology 181:6591-6599, 1999；Shamoo and Steitz, Cell:99, 155-166, 1999；De Felice et al., J. Molec. Biol. 291, 47-57, 1999；およびZhang et al., Biochemistry 34:10703-10712, 1995を参照）が非限定的に含まれる。DNA結合ドメインに関するそのほかの情報については、欧州特許第1283875B1も参照のこと。
【００９２】
Sso7dおよびSac7d
Sso7dおよびSac7dは、それぞれ超好熱性古細菌スルホロブス・ソルファタリカス（Sulfolobus solfataricus）およびS.アシドカルダリウス（S. acidocaldarius）に由来する小型（約7,000kd MW）の塩基性染色体タンパク質である。これらのタンパク質はリジンに富み、高い耐熱性、酸安定性および化学安定性を有する。それらはDNAと配列非依存的な様式で結合し、結合すると、DNAのTMをいくつかの条件下では最大40℃上昇させる（McAfee et al., Biochemistry 34:10063-10077, 1995）。これらのタンパク質およびそれらの相同体は、典型的には、高温でゲノムDNAを安定化させることに関与すると考えられている。
【００９３】
HMF様タンパク質
HMfファミリーの古細菌ヒストンは、DNAと直接相互作用すると考えられている真核生物H4ヒストンとアミノ酸配列および構造の両方の点で相同性がある。HMfファミリータンパク質は溶液中で安定な二量体を形成し、いくつかのHMf相同体が耐熱性種（例えば、メタノテルムス・フェルビダス（Methanothermus fervidus）およびパイロコッカス属GB-3a菌株）から同定されている。HMfファミリータンパク質は、Taq DNAポリメラーゼまたは固有の処理能力が低い任意のDNA修飾酵素と結合させると、その酵素がDNA基質に沿ってスライドする能力を強化し、それ故にその処理能力を高める。例えば、二量体HMfファミリータンパク質を、Taq DNAポリメラーゼのN末端に、例えば化学修飾を介して共有結合で連結させ、それによりそのポリメラーゼの処理能力を改善することができる。
【００９４】
当業者は、当技術分野において公知であるその他の二本鎖配列非特異的な核酸結合ドメインを認知していると考えられ、それらを本明細書に記載したように用いることもできる。
【００９５】
VI．クロマチンDNAの修飾または切断段階後のDNAの単離
上記のように、いくつかの態様においては、クロマチンについてのDNA修飾／切断段階の後に、利用可能な任意の方法に従ってゲノムDNAを細胞から単離する。その後の濃縮および定量段階のために許容しうる純度のDNAがもたらされる限り、本質的にあらゆるDNA精製手順を用いることができる。例えば、標準的な細胞溶解試薬を、細胞を溶解するために用いることができる。任意でプロテアーゼ（プロテイナーゼKを非限定的に含む）を用いることができる。DNAは、当技術分野において公知である通りに混合物から単離することができる。いくつかの態様においては、フェノール／クロロホルム抽出を用い、DNAをその後に（例えば、エタノールにより）沈殿させて、精製する。いくつかの態様においては、必要に応じて（例えば、RNアーゼにより、またはDNA精製カラムにより）RNAを除去または分解する。
【００９６】
DNA精製の後、DNAを、切断されたDNAまたは切断されていないDNAについて濃縮することができる。これは、例えば、DNAサイズ選択によって達成することができる。これは、例えば、クロマチンにおけるDNA切断剤または修飾剤に対してアクセス可能な領域を含むDNAを濃縮するのに有用である。該剤に対してアクセス可能な領域は、以下のように特徴付けられるものと考えられる：
クロマチンに接触されるDNA切断剤に関しては、より短い断片もしくは断片なし；または
クロマチンに接触される修飾剤と修飾依存性DNA切断剤との組み合わせに関しては、より短い断片もしくは断片なし；または
クロマチンに接触される修飾剤と修飾感受性のDNA切断剤との組み合わせに関しては、より長い断片。
同様に、クロマチンにおける該剤または修飾剤に対してアクセス可能ではない領域は、以下のように特徴付けられるものと考えられる：
クロマチンに接触されるDNA切断剤に関しては、より長い断片もしくはインタクトな領域；または
クロマチンに接触される修飾剤と修飾感受性のDNA切断剤との組み合わせに関しては、より長い断片もしくはインタクトな領域；または
クロマチンに接触される修飾剤と修飾依存性DNA切断剤との組み合わせに関しては、より短い断片もしくは断片なし。
【００９７】
断片の濃縮は、例えば、特定の剤のアクセス可能性（例えば、クロマチン構造）について濃縮される核酸の集団の生成において有用である。この集団を今度は、そのような核酸が濃縮されているライブラリーのために用いることができ、またはそのような核酸が濃縮されているライブラリーを生成するために用いることができる。ライブラリーは、例えば、当技術分野において公知のようにファージ、ウイルス、プラスミドまたは他の構築体として維持することができる。
【００９８】
特定のクロマチン構造に対する断片濃縮（例えば、断片のサイズ選択による）の利点は、任意により少ない介入段階でまたはさらなる介入段階なしで、ヌクレオチド配列の決定を可能にすることである。濃縮された集団における断片のすべてのまたは代表の選択物を配列決定することによって、容易に、集団においてどの配列が濃縮されているかを評価し、それにより、必要ならゲノム規模での分析をもたらすことができる。標準的なSangerダイデオキシ法または他のヌクレオチド配列決定法を使用できるが、濃縮された断片の配列決定は高速大量処理の配列決定、例えば、HiSeq（商標）、MiSeq（商標）またはGenome Analyzer配列決定（それぞれIlluminaより利用可能）、SOLiD（商標）またはIon Torrent（商標）配列決定（それぞれLife Technologiesより利用可能）および454（商標）配列決定（Roche Diagnosticsより）のような「次世代配列決定法」が用いられる場合、特に有効でありうる。例えば、高速大量処理の配列決定において、複数の鋳型および複数のプライマーを用いた並行配列決定反応により、ゲノムまたはゲノムの大部分の迅速な配列決定が可能になる。例えば、WO 03/004690、WO 03/054142、WO 2004/069849、WO 2004/070005、WO 2004/070007、WO 2005/003375、WO0006770、WO0027521、WO0058507、WO0123610、WO0157248、WO0157249、WO02061127、WO03016565、WO03048387、WO2004018497、WO2004018493、WO2004050915、WO2004076692、WO2005021786、WO2005047301、WO2005065814、WO2005068656、WO2005068089、WO2005078130、およびSeo, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA（2004）101:5488-5493を参照されたい。さらに、DNAポリメラーゼの反応速度を鋳型依存的な様式でモニターするヌクレオチド配列の決定はまた、サイズ選択法で特に有用である。これは、配列決定を用いて、ヌクレオチドおよびメチル化（または他の検出可能な修飾）状態を同時に評価する場合においてはさらに有益である。そのような場合、DNAを増幅またはコピーすることができず（それによってはメチル化が除去されよう）、それ故に、濃縮によって、同じアッセイ法のなかでメチル化または他の修飾を評価しながら、ある特定のクラス（濃縮されたクラス）のクロマチンの配列を分析し、かつ任意で定量することが可能になる。ヌクレオチド配列およびヌクレオチド修飾状態の決定はまた、例えば、DNA修飾剤がクロマチンと接触されており、それにより、アクセス可能なクロマチン構造およびアクセス不能なクロマチン構造に対応する、それぞれ、修飾されたDNA領域および修飾されていないDNA領域が生成される場合においても有用である。
【００９９】
いくつかの態様において、濃縮されたDNA断片は単一分子リアルタイム（SMRT）配列決定により配列決定される。SMRT配列決定は、単一のDNAポリメラーゼ分子がリアルタイムで認識され、その間に、それらが鋳型核酸鎖と相補的な蛍光標識ヌクレオチドの取り込みを触媒することによる方法である。SMRT配列決定の方法は、当技術分野において公知であり、Flusberg et al., Nature Methods, 7:461-465（2010）によって最初に記載されており、これはすべての目的で参照により本明細書に組み入れられる。
【０１００】
簡潔に言えば、SMRT配列決定では、ヌクレオチドの取り込みが蛍光のパルスとして検出され、その色によりそのヌクレオチドが特定される。パルスは、ポリメラーゼがDNA鋳型中の次の塩基へ移行する前に、ヌクレオチドの末端に連結されている蛍光体がポリメラーゼによって切断される場合に止まる。蛍光パルスは発光スペクトルにより、ならびにパルスの持続時間（「パルス幅」）および連続パルス間の間隔（「パルス間隔時間」または「IPD」）により特徴付けられる。パルス幅は、ヌクレオチド結合後、蛍光体放出までのすべての動的段階と相関関係にあり、IPDは、ヌクレオチド結合およびポリメラーゼ移行の反応速度と相関関係にある。このように、SMRT配列決定において蛍光パルスを測定することにより、DNAポリメラーゼの反応速度をモニターすることができる。
【０１０１】
蛍光標識された各ヌクレオチド（すなわち、アデニン、グアニン、チミンおよびシトシン）に特徴的な蛍光パルスの差異を測定することに加えて、非メチル化塩基と対比してメチル化塩基の差異を測定することもできる。例えば、メチル化塩基の存在は、メチル化塩基のIPDをその非メチル化対応物と比べて変化させる（例えば、非メチル化アデノシンと比べてメチル化アデノシン）。さらに、メチル化塩基の存在は、メチル化塩基のパルス幅をその非メチル化対応物と比べて変化させ（例えば、非メチル化シトシンと比べてメチル化シトシン）、さらに、異なる修飾は、異なるパルス幅を有する（例えば、5-ヒドロキシメチルシトシンは5-メチルシトシンよりも顕著な変化範囲を有する）。このように、各種の非修飾塩基および修飾塩基は、ある状況下でのIPDおよびパルス幅のその組み合わせに基づき、固有のサインを有する。SMRT配列決定の感度は、溶液条件、ポリメラーゼ変異、およびヌクレオチドの動態サインを活用するアルゴリズム法の最適化、ならびに隣接したメチルシトシン塩基を分解するのを補助するデコンボリューション法によってさらに向上することができる。
【０１０２】
あるいは、サイズ選択を行って、1つまたは複数の特定のDNA領域の検出を補助することができる。関心対象のDNA領域が公知である場合、サイズ分画またはサイズ選択を用いて、配列の分解が存在するかどうかを検出することができる（例えば、DNA断片が無傷か、相対的に長いか、または断片化されているか、および相対的に短いかどうかを検出することにより）。例えば、いくつかの態様において、DNAは、ゲノムDNAにおける関心対象のDNA領域を含む部分について（またはゲノムDNAにおける関心対象のDNA領域を含む部分について濃縮されたライブラリーから）単離され、任意の公知の方法によるサイズ分離に供される。核酸サイズ分離技術の例としては、アガロースもしくはポリアクリルアミドゲル電気泳動（例えば、Quertermous, Curr. Protoc. Mol. Biol., Chapter 5:Unit 5.4（May 2001））、スクロース勾配（例えば、Weis and Quertermous, Curr. Protoc. Mol. Biol., Chapter 5:Unit 5.3（May 2001））、またはカラムに基づくゲル電気泳動が挙げられるが、これらに限定されることはない。
【０１０３】
選択されるDNA断片のサイズは、用いられる特定の剤および望まれる目標に依って異なるであろう。いくつかの態様において、より小さな断片が選択されよう。例えば、いくつかの態様において、DNAは10〜500塩基対、10〜1000塩基対、または他の範囲の断片について選択される。いくつかの態様において、より大きな断片が選択されよう。例えば、いくつかの態様において、DNAは、100、500もしくは1000塩基対、または500から1000もしくは2000もしくは3000塩基対を含むが、これらに限定されない、他のサイズよりも長い断片について選択される。あるいは、中間的な断片、すなわち、最も大きくもまたはより小さくもない断片を選択することができる。
【０１０４】
いくつかの態様においては、インタクトな、修飾された、または修飾されていない（任意で上記のように濃縮された）DNAを単離して、ライブラリーへとクローニングする。場合によっては、1つまたは複数の特定のインタクトな、修飾された、または修飾されていない配列を単離および／またはクローニングする。または、インタクトな、修飾された、または修飾されていないDNA領域を有する試料を用いて、そのような領域に関して濃縮されたライブラリーを調製する。DNA切断剤との接触後にインタクトなDNAは、その剤に対して、よりアクセス可能性が低かったDNAを表す。同様に、DNA修飾剤との接触後に修飾されていないDNAは、よりアクセス可能性の低いDNAを表す。その反対に、修飾されたDNAは、修飾剤に対して、よりアクセス可能性が高かったDNAを表す。上記の態様のいくつかにおいては、クローニングの前に、インタクトなDNAを切断されたDNAから精製し（例えば、分離し）、かつ／または修飾されたDNAを修飾されていないDNAから精製し、それにより、1つのクラスのDNAに関してのクローニングプールを濃縮する。修飾された／修飾されていないDNAに関する濃縮は、修飾の性質に応じて異なると考えられる。いくつかの態様においては、修飾された（または修飾されていないDNA）と特異的に結合する親和性物質を用いて、修飾されたDNAを修飾されていないDNAから分離する。
【０１０５】
いくつかの態様においては、サブトラクティブライブラリーを作製する。例えば、本発明の方法においてインタクトな、修飾された、または修飾されていない罹患細胞DNA領域に関して濃縮されたライブラリーを作製し、その後に健常細胞由来の対応するライブラリーを用いてサブトラクションして、それにより、両方とも無傷であるか、修飾されているか、または修飾されておらず、かつ特定の疾患に対して特異的である、差次的なDNA配列ライブラリーを作製することができる。癌細胞を非限定的に含む、任意の罹患細胞を用いることができる。代替的なサブトラクティブ戦略を、例えば、異なる細胞型、細胞時期、薬物治療などの間で用いることもできる。
【０１０６】
VII. DNAの物理的特徴の検出
細胞とDNA修飾剤またはDNA切断剤との接触、それに続く切断されたDNAまたは切断されていないDNAの濃縮の後に、DNAの任意のさまざまな物理的特徴を検出することができる。物理的特徴には、DNAメチル化、融解温度、GC含有量、ヌクレオチド配列、およびポリヌクレオチドとハイブリダイズする能力が含まれるが、これらに限定されることはない。そのような特徴を検出するための種々の方法が公知であり、用いることができる。いくつかの態様において、DNA修飾/切断の段階の後に、決定される物理的特徴は、DNAフットプリンティング（例えば、DNAの特定の領域に対する1つまたは複数の特定のタンパク質の能力）を決定することを含まない。例えば、1つの非限定的な態様において、例えばqPCRを用いるインタクトなDNAの定量は、DNAフットプリンティングを含まない。いくつかの態様において、1つまたは複数のDNA配列のヌクレオチド配列が決定される。配列決定は、標準的なダイデオキシヌクレオチドに基づく配列決定を用いて、または高速大量処理もしくは次世代の配列決定（SMRT配列決定を含むが、これに限定されない）を用いて行うことができる。あるいは、種々の濃縮画分におけるゲノムDNA領域の特定は、ポリヌクレオチドプローブが固体支持体（例えば「チップ」）と連結されている態様を含むが、これに限定されない、ハイブリダイゼーションによって検出することができる。
【０１０７】
いくつかの態様において、物理的特徴はDNAメチル化である。例えば、相対的にアクセス可能なDNAがDNA切断剤によって切断されれば、残りのインタクトなDNA（アクセス可能性がより低いDNAに相当する）について単離および濃縮し、続いてメチル化状態に関して分析することができる。非常にさまざまなDNAメチル化検出方法が公知である。いくつかの態様においては、DNA修飾剤または切断剤との接触後に、DNAをバイサルファイトと接触させ、それにより、DNA中のメチル化されていないシトシンをウラシルに変換する。続いて、特定のDNA領域のメチル化を、本明細書で考察したものを含む、任意のさまざまなメチル化検出方法によって決定することができる。いくつかの態様において、高分解能融解アッセイ（HRM）を用いて、バイサルファイト変換後のメチル化状態を検出する。この方法では、バイサルファイト変換後にDNA領域を増幅し、その結果得られたアンプリコンの融解温度を決定する。融解温度はシトシンがバイサルファイトによって変換されたか否か（およびその後に増幅反応において「T」としてコピーされたか否か）に応じて異なると考えられるため、アンプリコンの融解温度をメチル化含有量と相関させることができる。
【０１０８】
VIII．標的DNA領域
DNA領域は、ゲノムDNA内部の関心対象の標的配列である。細胞のゲノムDNA中の任意のDNA配列を、本明細書に記載した通りに、DNA修飾剤または切断剤のアクセス可能性に関して評価することができる。例えば、複数の異なる細胞型において、処理していない細胞と薬物刺激、化学刺激もしくは環境的刺激に曝露された細胞との間で、または正常組織と罹患組織との間で異なるアクセス可能性を呈する、関心対象のDNA領域を同定するために、DNA領域をスクリーニングする。したがって、いくつかの態様において、本発明の方法は、アクセス可能性の変化が疾患（またはその欠如）のマーカーとして作用するDNA領域を同定するために用いられる。例示的な疾患には、癌が非限定的に含まれる。癌でない細胞と比較して癌細胞において変化したDNAメチル化および／またはクロマチン構造を有する数多くの遺伝子が記載されており、したがって、本明細書に記載の方法によって、例えば癌の予後予測および診断について分析することができる。いくつかの態様において、人工多能性幹細胞（iPS細胞）および胚性幹細胞を非限定的に含む幹細胞の多能性が、クロマチンのアクセス可能性を利用して評価される。
【０１０９】
いくつかの態様において、DNA領域は、特定の細胞の罹患状態または発生状態に応じて、アクセス可能性に差異を伴うことが判明している。これらの態様において、本発明の方法は、診断ツールまたは予後予測ツールとして用いることができる。本発明の方法を用いて診断または予後予測がひとたび確定されれば、その診断または予後予測を考慮して、治療レジメンを設定すること、または既存の治療レジメンを変更することができる。例えば、本発明の方法に従った癌細胞の検出は、癌細胞が検出された個体に対する化学療法薬および／または放射線の投与につながりうる。
【０１１０】
種々のDNA領域を、研究目的で、および／または試薬が予想通りに機能することを確認するための対照DNA領域として、検出することができる。例えば、いくつかの態様においては、ある動物の本質的にすべての細胞においてアクセス可能であるDNA領域をアッセイする。そのようなDNA領域は、例えば、アクセス可能性に関する陽性対照として有用である。そのようなDNA領域は、例えば、構成的であるかまたはほぼ構成的である遺伝子の内部または近傍に見いだすことができる。そのような遺伝子には、一般に「ハウスキーピング」遺伝子と呼ばれるもの、すなわち、基本的な生物機能を維持するためにその発現が必要とされる遺伝子が含まれる。そのような遺伝子の例には、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）およびβアクチン（ACTB）が非限定的に含まれる。DNA領域には、任意でプロモーターの少なくとも一部分を含む、そのような遺伝子の全体または一部分が含まれうる。
【０１１１】
いくつかの態様において、DNA領域は、ある動物のほとんどの細胞においてアクセス不能であるDNAの少なくとも一部分を含む。そのようなDNA領域は、例えば、アクセス可能性に関する陰性対照として有用である。この文脈における「アクセス不能な」とは、そのコピーが、DNA領域のコピーの20％前後を上回らない割合でしか修飾されないDNA領域のことを指す。そのような遺伝子配列の例には、「異質染色質」性として一般に認識されているものが含まれ、極めて特定の細胞型のみで発現される（例えば、組織特異的または臓器特異的な様式で発現される）遺伝子が含まれる。（特定の細胞型を除いて）一般にアクセス不能である例示的な遺伝子には、ヘモグロビン-β鎖（HBB）、免疫グロブリン軽鎖κ（IGK）、およびロドプシン（RHO）が非限定的に含まれる。
【０１１２】
いくつかの態様において、DNA領域は、細胞の罹患状態に応じて異なるアクセス可能性を有するか、またはさもなければ細胞の型または生育環境に応じてさまざまなアクセス可能性を有する、遺伝子配列である。例えば、ある種の遺伝子は、癌でない細胞では一般にアクセス不能であるが、癌細胞ではアクセス可能である。さまざまなアクセス可能性を有する遺伝子には、例えば、グルタチオン-s-トランスフェラーゼπ（GSTP1）が含まれる。
【０１１３】
いくつかの態様において、本発明のDNA領域は、以下の遺伝子の1つまたは複数からの遺伝子配列（例えば、プロモーター配列）から選択される：1型カドヘリン1（E-カドヘリン）、シトクロムP450-1A1（CYP1A1）、Ras関連ドメインファミリー1A（RASSF1A）、p15、p16、細胞死関連プロテインキナーゼ1（DAPK）、腺腫性結腸ポリポーシス（APC）、メチルグアニン-DNAメチルトランスフェラーゼ（MGMT）、乳癌1遺伝子（BRCA1）およびhMLH。
【０１１４】
いくつかの態様において、DNA領域は、例えば、異なる細胞型の間、異なる条件の間、正常細胞と罹患細胞との間などで異なるアクセス可能性を有する領域を同定するために、ランダムに選択される。
【０１１５】
IX. 標的遺伝子座のコピーの定量
DNA修飾を定量するための方法は、ゲノムDNAに導入されるDNA修飾の種類に依存すると考えられる。いくつかの態様において、濃縮されたDNA（例えば、アクセス可能なまたはアクセス不能なDNAに相当する、サイズ選択された核酸断片）を、上記の配列決定技術を用いて検出および定量することができる。例えば、試料中のすべての配列または典型的なコピー数の配列を配列決定し、それにより、濃縮されたクラスのヌクレオチドの量および配列情報を提供することができる。いくつかの態様において、上記と同様に、配列決定によってメチル化を同時に決定することができる。
【０１１６】
いくつかの態様において、濃縮されたDNAは、1つまたは複数の核酸とハイブリダイズされる。いくつかの態様において、当該核酸は、固体支持体（例えば、マイクロアレイまたはビーズ）と連結されている。これらの態様は、複数の濃縮された配列を同時にマイクロアレイとハイブリダイズさせることができ、続いてハイブリダイゼーションを検出および定量することができるので、ゲノム規模での分析に特に有用である。例えば、Nimblegen（商標）Sequence Capture technologyを参照されたい。本明細書に記載されている態様のいくつかにおいて、核酸アダプターが濃縮DNAにライゲートされるかまたは別の方法で連結され、それにより、濃縮DNAの好都合な増幅および/または配列決定を可能にする。
【０１１７】
いくつかの態様において、二本鎖DNA切断事象（例えば、制限酵素もしくはDNアーゼによって導入されるような、または、メチルトランスフェラーゼ処理後もしくは本明細書に記載されたDNA修飾性化学物質による修飾後に、例えばメチル化感受性もしくはメチル化依存性制限酵素によって続いて導入されるような修飾）を、関心対象のDNA領域を含むアンプリコンを生成するように設計された増幅反応を用いて好都合に検出することができる。配列特異的制限酵素を用いた場合のような定まった部位での切断事象の場合には、潜在的な切断部位にまたがるアンプリコンが生成されるようにプライマーを設計する。インタクトなDNAのみが増幅されると考えられる。全DNAの量も判明しているならば、切断されたDNAの量を、全DNAとインタクトなDNAとの間の差として計算することができる。DNAの総量は、当技術分野において公知である任意のDNA定量法に従って決定することができる。いくつかの態様において、全DNAの量は、修飾とは無関係にDNAを増幅するプライマーのセットを設計することにより、好都合に決定することができる。これは例えば、同じ遺伝子領域内または別のDNA領域内にある、潜在的な切断部位をまたがないプライマーを設計することによって達成することができる。DNアーゼIなどの配列非特異的ヌクレアーゼを用いる場合のような不定部位での切断事象の場合には、アクセス不能な参照遺伝子の使用を内部対照として組み入れるべきである。
【０１１８】
以下により詳細に考察するように、定量的増幅（例えばリアルタイムPCRを含む）方法は、DNA領域のインタクトなコピーの量の決定を可能にし、さまざまな対照とともに用いる場合、細胞におけるコピーの総数と比較してインタクトなDNAの相対量を決定するために用いることができる。従って、DNA領域の修飾もしくは切断されたコピーまたは修飾もしくは切断されていないコピーの実際の数または相対数（例えば、コピーの総数に対して相対的、または第2のDNA領域の修飾されたコピーまたは修飾されていないコピーの数に対して相対的）を、算出することができる。
【０１１９】
本発明のいくつかの態様において、DNA領域の修飾されたコピーの数は、切断されたDNAまたは切断されていないDNAの濃縮の後に直接決定される。例えば、特定の付着末端または平滑末端の存在時にのみ起こると考えられる特定のライゲーション事象を検出することなどにより、制限酵素切断を検出して定量することができる。例えば、制限酵素によって生成される付着末端に対して相補的な付着末端を含む核酸アダプターを、切断されたゲノムDNAとライゲートさせることができる。続いて、（例えば、定量的増幅方法により）ライゲーション事象の数を検出して定量することができる。
【０１２０】
いくつかの態様においては、ライゲーション媒介PCR（LM-PCR）を用いて、DNA領域の切断されたコピーの数を定量する。LM-PCRの方法は当技術分野において公知であり、Pfeifer et al., Science 246: 810-813（1989）において最初に記載されている。LM-PCRは、必要に応じて、定量的結果のためにリアルタイムで行うことができる。
【０１２１】
定量的増幅方法（例えば、定量的PCRまたは定量的線形増幅）は、核酸テンプレートを増幅し、増幅されたDNAの量を直接的または間接的に（例えば、Ct値を決定して）決定し、続いて増幅サイクル数に基づいて最初のテンプレートの量を算出することを伴う。反応を用いたDNA遺伝子座の増幅は周知である（米国特許第4,683,195号および第4,683,202号；PCR PROTOCOLS: A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS（Innis et al., eds, 1990）を参照）。典型的には、PCRを用いてDNAテンプレートを増幅する。しかし、代替的な増幅方法も記載されており、それらの代替的な方法がそれらの方法が切断されたDNAを増幅するよりも高い程度でインタクトなDNAを増幅する限り、それを用いることもできる。定量的増幅の方法は、例えば、米国特許第6,180,349号；第6,033,854号；および第5,972,602号、さらには例えば、Gibson et al., Genome Research 6:9951001（1996）；DeGraves, et al., Biotechniques 34（1）:106-10, 112-5（2003）；Deiman B, et al., Mol Biotechnol. 20（2）:163-79（2002）に記載されている。増幅は「リアルタイム」でモニターすることができる。
【０１２２】
いくつかの態様において、定量的増幅は、増幅（例えば、PCR）反応のサイクルにおけるテンプレートのコピーを表すシグナル（例えば、プローブの蛍光）のモニタリングに基づく。PCRの初期サイクルでは、形成されるアンプリコンの量が、アッセイから測定可能であるシグナル出力を支持しないため、非常に弱いシグナルしか観察されない。初期サイクルの後には、形成されるアンプリコンの量が増加するため、シグナル強度は測定可能なレベルまで増大し、PCRが非対数期に入る後期のサイクルではプラトーに達する。シグナル強度対サイクル数のプロットを通じて、測定可能なシグナルがPCR反応から得られる特定のサイクルを推定し、それを用いてPCRの開始前の標的の量を逆算することができる。この方法によって決定される特定のサイクル数は、典型的には、サイクル閾値（Ct）と呼ばれる。例示的な方法は、例えば、Heid et al. Genome Methods 6:986-94（1996）に、加水分解プローブに関連して記載されている。
【０１２３】
増幅産物の検出のための1つの方法は、5'-3'エキソヌクレアーゼ「加水分解」PCRアッセイ（TaqMan（商標）アッセイとも呼ばれる）である（米国特許第5,210,015号および第5,487,972号；Holland et al., PNAS USA 88: 7276-7280（1991）；Lee et al., Nucleic Acids Res. 21: 3761-3766（1993））。このアッセイは、増幅反応の間に、二重標識された蛍光発生プローブ（「TaqMan（商標）」プローブ）のハイブリダイゼーションおよび切断によって特定のPCR産物の蓄積を検出する。蛍光発生プローブは、蛍光レポーター色素およびクエンチャー色素の両方で標識されたオリゴヌクレオチドからなる。PCRの間に、このプローブは、増幅されるセグメントとそれがハイブリダイズした場合に、しかもその場合にのみ、DNAポリメラーゼの5'-エキソヌクレアーゼ活性によって切断される。プローブの切断は、レポーター色素の蛍光強度の増加を生じさせる。
【０１２４】
エネルギー転移の使用に依拠して増幅産物を検出する別の方法は、Tyagi and Kramer, Nature Biotech. 14:303-309（1996）に記載された「ビーコンプローブ」法であり、これは米国特許第5,119,801号および第5,312,728号の主題でもある。この方法は、ヘアピン構造を形成することができるオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを用いる。ハイブリダイゼーションプローブの一方の末端（5'末端または3'末端かのいずれか）にはドナー蛍光体があり、もう一方の末端にはアクセプター部分がある。TyagiとKramerの方法の場合には、このアクセプター部分はクエンチャーであり、すなわち、アクセプターはドナーによって放出されたエネルギーを吸収するが、その後に自ら蛍光を発することはない。したがって、ビーコンがオープン構造である場合はドナー蛍光体の蛍光を検出しうるが、ビーコンがヘアピン（閉鎖）構造である場合はドナー蛍光体の蛍光は消光する。PCRに用いる場合、PCR産物の一方の鎖とハイブリダイズする分子ビーコンプローブはオープン構造であり、蛍光が検出されるが、ハイブリダイズしないままのものは蛍光を発しないと考えられる（Tyagi and Kramer, Nature Biotechnol. 14: 303-306（1996））。その結果、蛍光の量はPCR産物の量が増加するにつれて増加し、それ故にPCRの進行の尺度として用いることができる。当業者は、その他の定量的増幅法も利用可能であることを認識しているであろう。
【０１２５】
核酸の定量的増幅を行うためのさまざまな他の手法も公知である。例えば、いくつかの方法は、オリゴヌクレオチドが標的核酸とハイブリダイズした場合に蛍光の変化が生じるように構築されている1つまたは複数のプローブオリゴヌクレオチドを用いる。例えば、そのような1つの方法は、2つのオリゴプローブをアンプリコンとアニーリングさせる、蛍光共鳴エネルギー転移（FRET）を利用する二重蛍光体アプローチ、例えば、LightCycler（商標）ハイブリダイゼーションプローブである。オリゴヌクレオチドは、効率的なエネルギー転移に適合する距離で隔てられた蛍光体と頭-尾方向でハイブリダイズするように設計される。核酸と結合するかまたは伸長産物に組み入れられた場合にシグナルを発するように構築された標識オリゴヌクレオチドの他の例には、以下が含まれる：Scorpions（商標）プローブ（例えば、Whitcombe et al., Nature Biotechnology 17:804-807, 1999および米国特許第6,326,145号）、Sunrise（商標）（またはAmplifluor（商標））プローブ（例えば、Nazarenko et al., Nuc. Acids Res. 25:2516-2521, 1997および米国特許第6,117,635号）、および、クエンチャーがなくてもシグナル低下をもたらす二次構造を形成し、かつ標的とハイブリダイズした場合に増大したシグナルを発するプローブ（例えば、Lux probes（商標））。
【０１２６】
他の態様においては、二本鎖DNA中に挿入された時にシグナルを生じるインターカレート剤を用いうる。例示的な剤には、SYBR GREEN（商標）、SYBR GOLD（商標）およびEVAGREEN（商標）が含まれる。これらの剤はテンプレート特異的ではないため、シグナルはテンプレート特異的増幅に基づいて生成されると想定される。テンプレート配列の融解点は一般に、例えばプライマー-ダイマーなどよりもはるかに高いと考えられるため、このことはテンプレートの関数としてシグナルをモニターすることによって確認することができる。
【０１２７】
いくつかの態様において、DNA領域の量は、試料中のヌクレオチド配列のコピーを決定し、続いて試料中の同じ配列を有するコピーの相対数または絶対数を決定することによって決定される。
【０１２８】
本発明の方法による切断もしくは修飾された（または切断もしくは修飾されていない）DNA領域の定量は、いくつかの態様において、DNA領域の切断もしくは修飾されたコピーまたは修飾もしくは切断されていないコピーの、その同じ領域のコピーの総数と比較した相対量（例えば、比またはパーセンテージなどの標準化された値）を決定することによって、さらに改良することができる。いくつかの態様において、1つのDNA領域の切断もしくは修飾されたコピーまたは修飾もしくは切断されていないコピーの相対量を、第2の（またはそれ以上の）DNA領域の切断もしくは修飾されたコピーまたは修飾もしくは切断されていないコピーの数と比較する。いくつかの態様において、2つまたはそれ以上のDNA領域の間で比較する場合には、各DNA領域の切断もしくは修飾されたコピーまたは修飾もしくは切断されていないコピーの相対量を、まず、DNA領域のコピーの総数に対して標準化する。または、同じ試料から得られる場合には、いくつかの態様において、各DNA領域のコピーの総数はおおよそ同じであると仮定し、そのため2つまたはそれ以上のDNA領域の間で比較する場合に、各値をコピーの総数に対してまず標準化することなしに、切断もしくは修飾されたコピーまたは修飾もしくは切断されていないコピーの相対量（例えば、比またはパーセンテージ）を各DNA領域間で決定することもできる。
【０１２９】
いくつかの態様においては、切断もしくは修飾されたコピーまたは修飾もしくは切断されていないコピーの実際の量または相対量（例えば、全DNAとの対比）を、対照値と比較する。対照値は、例えば、特定のDNA領域に対するアクセス可能性が特定の値を上回るかそれ未満であるかを知りたい場合に、好都合に用いることができる。例えば、特定のDNA領域が正常細胞では典型的にはアクセス可能であるが罹患細胞ではアクセス不能である（またはその反対の）状況では、切断もしくは修飾されたコピーまたは修飾もしくは切断されていないコピーの実際の数または相対数を、単に、（例えば、20％超またはそれ未満が修飾されているかまたは修飾されていない、80％超またはそれ未満が修飾されているかまたは修飾されていない、などの）対照値と比較してもよい。または、対照値が、対照DNA領域に関する過去データまたは予想されるデータであってもよい。これらの場合には、対照DNA領域の実際の量または相対量を（任意で数回）決定し、その結果得られたデータを用いて、関心対象のDNA領域に関して決定された切断もしくは修飾されたコピーまたは修飾もしくは切断されていないコピーの実際の数または相対数と比較することのできる対照値を作成することができる。
【０１３０】
本明細書に記載された方法のための計算は、コンピュータベースの計算およびツールを含みうる。これらのツールは、従来設計の汎用コンピュータシステム（本明細書では「ホストコンピュータ」と称する）によって実行可能なコンピュータプログラムの形態で提供されることが好都合である。ホストコンピュータは数多くのさまざまなハードウェア構成部分を用いて構成されてよく、さまざまな寸法および方式で製造することができる（例えば、デスクトップPC、ラップトップ、タブレットPC、ハンディ型コンピュータ、サーバー、ワークステーション、大型汎用コンピュータ）。モニター、キーボード、ディスクドライブ、CDおよび／またはDVDドライブなどの標準的な構成部品が含まれてもよい。ホストコンピュータをネットワークに結びつける場合、接続は任意の適した伝達媒体（例えば、有線媒体、光媒体および／または無線媒体）ならびに任意の適した通信プロトコル（例えば、TCP/IP）を介して提供されうる；ホストコンピュータが適したネットワーク用ハードウェア（例えば、モデム、イーサネットカード、WiFiカード）を含んでもよい。ホストコンピュータは、UNIX、Linux、Microsoft Windows、MacOSまたは任意の他のオペレーティングシステムを含む、さまざまなオペレーティングシステムの任意のものを実行してよい。
【０１３１】
本発明の実行局面に関するコンピュータコードは、PERL、C、C＋＋、Java、JavaScript、VBScript、AWK、または、ホストコンピュータ上で実行されうるか、もしくはホストコンピュータ上で実行されるようにコンパイルされうる、任意の他のスクリプト言語またはプログラム言語を含むさまざまな言語で記述されうる。また、コードを、アセンブリ言語またはマシン言語のような低水準言語で記述するかまたは分散させてもよい。
【０１３２】
ホストコンピュータシステムは、ユーザーがツールの動作を制御するインターフェースを好都合に提供する。本明細書に記載された例において、ソフトウェアツールはスクリプト（例えば、PERLを用いる）として実行され、その遂行はユーザーにより、LinuxまたはUNIXなどのオペレーティングシステムの標準的なコマンドラインインターフェースから開始される。当業者は、コマンドをオペレーティングシステムに対して適宜適合させうることを認識しているであろう。他の態様において、ユーザーがポインティングデバイスを用いて動作を制御することを可能にするグラフィカルユーザーインターフェースが提供されてもよい。したがって、本発明は、いかなる特定のユーザーインターフェースにも限定されない。
【０１３３】
本発明のさまざまな特徴を組み入れたスクリプトまたはプログラムを、記憶および／または伝達のために、さまざまなコンピュータ可読媒体上に符号化して記録してもよい。適した媒体の例には、磁気ディスクまたはテープ、コンパクトディスク（CD）またはDVD（デジタル多目的ディスク）などの光学記憶媒体、フラッシュメモリー、ならびにインターネットを含む種々のプロトコルに準拠する有線、光および／または無線ネットワークを介した伝達用に適合化されたキャリア信号が含まれる。
【０１３４】
X. キット
本発明はまた、本発明のアクセス可能性およびサイズ選択または他の濃縮のアッセイを行うためのキットも提供する。キットは、書面による使用説明書、または電子的な使用説明書（例えば、CD-ROMまたはDVD上）を任意で含んでもよい。本発明のキットは、例えば、DNA修飾剤および/またはDNA切断剤、ならびに核酸サイズ選択ができる装置（サイズ排除カラム、ゲルろ過、またはサイズによって核酸を分類する他のカラムを含むが、これらに限定されない）を含んでもよい。キットは、任意で細胞透過処理剤および/または細胞破壊剤を含んでもよい。DNA修飾剤には、例えば、メチルトランスフェラーゼまたはDNA修飾性化学物質を含む、本明細書中に詳細に記載されたものが含まれうる。DNA切断剤には、例えば、制限酵素、DNアーゼ、またはDNA切断性化学物質が含まれうる。本発明のキットは、透過処理剤およびDNA修飾剤ならびに/またはDNA切断剤を、同じバイアル/容器内（およびそれ故に同じ緩衝液中）に含んでもよい。あるいは、透過処理剤ならびにDNA修飾剤および/またはDNA切断剤が別々のバイアル/容器内にあってもよい。
【０１３５】
本発明のキットはまた、1つまたは複数の対照細胞および/または核酸も含みうる。例示的な対照核酸には、例えば、ある動物の本質的にすべての細胞においてアクセス可能である（例えば、ハウスキーピング遺伝子配列またはそのプロモーター）か、またはある動物のほとんどの細胞においてアクセス不能であるかのいずれかである遺伝子配列を含むものが含まれる。いくつかの態様において、本キットは、そのような遺伝子配列を増幅するためのプライマーの1つまたは複数のセットを（遺伝子配列または細胞がキットに実際に含まれるか否かにかかわらず）含む。例えば、いくつかの態様において、本キットは、DNA修飾剤、DNA切断剤、ならびに細胞透過処理剤および/または細胞破壊剤、ならびに対照DNA領域を増幅するための1つまたは複数のプライマーセット（本明細書に記載される対照遺伝子を含むが、これに限定されることはない）、ならびに任意で、第2のDNA領域（例えば標的DNA領域）を増幅するための1つまたは複数のプライマーセットを含む。
【０１３６】
いくつかの態様において、本発明のキットは、以下のもののうち1つまたは複数を含む：
（i）  メチルトランスフェラーゼもしくは他のDNA修飾剤；ならびに/または
（ii） DNA切断剤; ならびに
（iii）細胞膜の透過処理剤もしくは破壊剤；
（iv） 修飾剤によるさらなる修飾を防止することのできる「停止」用溶液；
（v）  核酸の抽出および/もしくは精製のための材料（例えば、ゲノムDNAの精製および/もしくは「停止」用溶液の成分のような非DNA成分の除去のためのスピンカラム）；
（vi） DNAの配列決定のための試薬（例えば、単分子リアルタイム配列決定試薬もしくはナノポア配列決定試薬）もしくはDNAを定量的に増幅する（例えば、qPCR）ための試薬；ならびに
（vii）核酸サイズ選択のできる機器（例えば、サイズ排除カラムもしくはゲルろ過カラム）のための1つもしくは複数の試薬。
【実施例】
【０１３７】
以下の実施例は、特許請求する本発明を限定するためではなく、それを例示するために提供される。
【０１３８】
実施例1：
全ゲノムDNAを未処理の透過処理細胞から単離し、透過処理細胞をヌクレアーゼ（DNアーゼI、20分、37℃）で処理した。次に、当該細胞由来のDNAを単離し、3%アガロースゲル上で分画した。Qiagenゲル抽出DNA精製キットを用いて標準的な手順により、100〜400 bpのサイズ範囲内のDNAをゲルから抽出した。サイズ選択したDNAの一部分をAgilent Bioanalyzerで分析した。DNAの大部分はサイズが100〜500 bpであり、サイズ選択プロトコルが予想通りにうまくいったことが実証された。
【０１３９】
分画されたDNAからいくつかの遺伝子配列を増幅させて、その相対存在度を決定した。既知の異なるアクセス可能性を有する遺伝子を用いて、この方法を検証した。下記表は、サイズ選択したDNA試料中の遺伝子プロモーターを分析するリアルタイムPCRの結果をまとめたものである。
0005917519.tif 000002
【０１４０】
上記表中のDNAレベルは、その量が、100%に設定したGAPDHプロモーターDNAの存在度と相対的であるように標準化した。このデータから、アクセス可能な遺伝子プロモーターに対応するDNAが、アクセス不能な遺伝子プロモーターに対応するDNAの量と比べて高度に濃縮されていることが示唆される。また、（Hela細胞における）部分的にアクセス可能な遺伝子プロモーターに対応するDNAがアクセス不能な遺伝子プロモーターDNAと比べて、サイズ選択した試料において濃縮されている。このデータは予想されたものであり、アクセス可能なクロマチンに対応するDNAが、サイズ選択されたDNA試料において高度に濃縮されていることを示している。
【０１４１】
サイズ選択したHela DNA試料の次世代配列決定の結果をまた、UCSCゲノムブラウザで調べた。このデータを、他の技術（Digital DNaseおよびDNase-Seqレーン）によりゲノム規模でアクセス可能なクロマチン領域をマッピングしている公的に入手可能なデータと比較した。サイズ選択したDNAに対するピークは、他の技術によるピークとよく相関しており、よく特徴付けられた他の現行の技術と同様に、サイズ選択したDNAによる方法によっても、アクセス可能なクロマチン領域がマッピングされることが実証された。
【０１４２】
実施例2（理論実験例（prophetic example））：
DNA修飾剤による修飾に対するクロマチン領域のアクセス可能性を、4種の細胞株でさまざまなアクセス可能性レベルの4種の遺伝子について調べる。DAMメチルトランスフェラーゼは、GATCモチーフの6'位でアデニンをメチル化する細菌酵素である。透過処理した細胞をDAMメチルトランスフェラーゼによりインサイチューで処理して、アクセス可能なクロマチンを修飾する；対照細胞は透過処理用緩衝液のみで処理する。DNAを精製し、DAM修飾されていないGATCモチーフのみを消化するメチル化感受性制限酵素DpnIIで消化する；対照反応では緩衝液のみで処理する。4種の遺伝子、すなわちロドプシン（RHO）、β-2ミクログロブリン（B2M）、P14およびH-カドヘリン（CDH13）におけるDNA修飾を、4種の細胞株：HeLa、PC3、LNCaPおよびHCT15を用いて分析する。
【０１４３】
DpnIIで切断されたDNAをサイズ選択段階に供し（例えば、サイズ排除スピンカラムに適用し）、それにより、少なくとも所定のDNA断片を選択する（それにより、混合物から、アクセス可能な配列に相当する、より小さな、切断された断片を除去する）。このDNAをその後、配列決定（例えば、SMRT配列決定）に供し、それにより、統計的に関係がある数の断片を配列決定して、サイズ選択された試料中にどの断片が存在するかを決定する。
【０１４４】
選択したゲノム領域のDpnII消化を、当技術分野において公知の定量的PCR（qPCR）法を用いても評価する。B2M、RHO、p14およびCDH13プロモーターに特異的なプライマーを用いてDNA試料を増幅させる。増幅領域のそれぞれに、1箇所のDAM修飾部位（GATC）が存在していた。
【０１４５】
B2Mプロモーターの分析
B2Mは、すべての細胞株において構成的に発現されるハウスキーピング遺伝子である。すべての細胞株において、＋DAM/＋DpnII試料は、無DAM/＋DpnII試料と比べてB2M配列をほとんどまたは全く含まない。これは、DAMがB2Mプロモーターを修飾し、それをDpnII消化から保護することを示しており、B2Mプロモーターがすべての細胞株においてアクセス可能であることを示唆している。
【０１４６】
RHOプロモーターの分析
RHOは、分析されるすべての細胞株において発現されておらず、そのプロモーターはアクセス不能なクロマチン立体配置の中にある。すべての細胞株において、＋DAM/＋DpnII試料は、無DAM/＋DpnII試料とおおよそ同じ量の、RHO配列を有する断片を含む。これは、RHOプロモーターがDpnII消化から保護されることを示しており、RHOプロモーターの位置がアクセス不能なクロマチン内にあることと一致している。
【０１４７】
p14プロモーターの分析
p14はHCT15細胞において発現されておらず、そのプロモーターはアクセス不能である。p14はHela、PC3およびLNCaP細胞において発現されており、そのプロモーターはアクセス可能である。HCT15細胞株において、＋DAM/＋DpnII試料は、無DAM/＋DpnII試料とおおよそ同じ量の、p14配列を有する断片を含む。しかしながら、Hela、PC3およびLNCaP細胞において、＋DAM/＋DpnII試料は、無DAM/＋DpnII試料と比べてp14配列をほとんどまたは全く含まない。
【０１４８】
CDH13プロモーターの分析
CDH13はHela細胞において高度に発現されており、そのプロモーターはアクセス可能である。CH13はPC3、LNCaPおよびHCT15細胞において十分に発現されておらず、そのプロモーターはアクセス不能である。HCT15細胞株において、＋DAM/＋DpnII試料は、無DAM/＋DpnII試料と比べてCDH13配列をほとんどまたは全く含まない。しかしながら、Hela、PC3およびLNCaP細胞において、＋DAM/＋DpnII試料は、無DAM/＋DpnII試料とおおよそ同じ量の、CDH13配列を有する断片を含む。
【０１４９】
本明細書に記載された例および態様が例示のみを目的としていること、ならびにそれらを考慮してさまざまな改変および変更が当業者には想起されると考えられ、それらが本出願の趣旨および範囲ならびに添付の特許請求の範囲に含まれることは、理解されるであろう。本明細書中に引用された刊行物、特許および特許出願はすべて、それらの全体が、あらゆる目的で参照により組み入れられる。
【図１】
0005917519.tif 000003
【配列表】
0005917519000001.app