(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳由来塩基性タンパク質画分及び／又は乳由来塩基性タンパク質画分分解物と、イソフラボン類及び／又はその代謝物を有効成分とし、
前記乳由来塩基性タンパク質画分は、前記乳由来塩基性タンパク質画分の全重量基準で、９５重量％以上のタンパク質と、脂肪と、灰分とを含み、
前記タンパク質が、ソジウムドデシルサルフェート−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ-ＰＡＧＥ）換算分子量が３,０００〜８０,０００範囲の数種のタンパク質よりなり、
前記タンパク質が４３重量％程度のラクトフェリンと４６重量％程度のラクトパーオキシダーゼを含み、
前記タンパク質のアミノ酸組成が、塩基性アミノ酸を、前記タンパク質の全重量基準で１５重量％以上含有し、
前記イソフラボン類が４７％程度のゲニスチンと２３％程度のダイジンと１０％程度のダイゼインと９％程度のゲニステインと２．５％程度のグリシチンを含み、
前記乳由来塩基性タンパク質画分及び／又は乳由来塩基性タンパク質画分分解物と、前記イソフラボン類及び／又はその代謝物の比率が、３０：７０〜７０：３０であることを特徴とする骨強化剤。
【請求項２】
前記イソフラボン類が大豆由来であることを特徴とする請求項１に記載の骨強化剤。
【請求項３】
前記イソフラボンの代謝物が、エクオールであることを特徴とする請求項１又は請求項２のいずれか１項に記載の骨強化剤。
【請求項４】
請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の骨強化剤を含むことを特徴とする骨強化用食品、骨強化用栄養組成物、骨強化用飼料又は骨強化用医薬品。
【請求項５】
前記乳由来塩基性タンパク質画分が、乳又は乳由来の原料を陽イオン交換樹脂に接触させて塩基性タンパク質を吸着させ、この樹脂に吸着した画分を塩濃度０．１Ｍ〜１．０Ｍの溶出液で溶出して得られることを特徴とする請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の骨強化剤の製造方法。
【請求項６】
前記乳由来塩基性タンパク質画分分解物が、乳由来塩基性タンパク質画分を、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン及びパンクレアチンよりなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質分解酵素を用いて分解したものであることを特徴とする請求項１から請求項３に記載の骨強化剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、塩基性タンパク質画分及び／又は塩基性タンパク質画分分解物とイソフラボン類及び／又はその代謝物を有効成分とする、骨密度を増加させる作用や骨を強化する作用に優れ、骨粗鬆症や骨折治療、リウマチ、関節炎などの種々の骨疾患の予防や治療に有効で、安定性及び安全性に優れた骨強化剤に関する。本発明は、さらに該骨強化剤を含有する、骨強化用飲食品、骨強化用栄養組成物、骨強化用飼料又は骨強化用医薬品に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、世界的規模で、高齢化等に伴い、骨粗鬆症や骨折あるいは腰痛などの種々の骨に関連する疾患が増加しており、大きな社会問題となっている。これは、カルシウムの摂取不足やカルシウム吸収能力の低下、閉経後のホルモンのアンバラスなどが原因であるとされている。骨粗鬆症や骨折、腰痛などの種々の骨疾患を予防するためには、若齢期から骨芽細胞による骨形成を促進して体内の骨量をできるだけ増加させ、最大骨量や骨強度（骨密度＋骨質）を高めることが有効であるとされている。なお、骨質とは、骨の微細構造や代謝回転、微小骨折、石灰化を指すものである。また、骨はバランスのとれた吸収と形成を絶えず繰り返している（リモデリング）が、閉経後のホルモンのバランス変化等により、骨吸収が骨形成を上回り、これが骨粗鬆症や骨折、腰痛などの種々の骨疾患の原因となる。したがって、骨密度や骨強度を一定に保つことにより、結果的に骨を強化することが可能である。
【０００３】
このような現状から、骨を強化する目的で、炭酸カルシウムやリン酸カルシウム、乳酸カルシウムなどのカルシウム塩ならびに乳清カルシウムや牛骨粉、卵殻などの天然カルシウム剤を、それぞれ単独で医薬品や飲食品、飼料などに添加して摂取する、あるいは、これらのカルシウム剤をカゼインホスホペプチドやオリゴ糖などのカルシウム吸収促進効果を有する物質と共に医薬品や飲食品、飼料などに添加して摂取している。しかしながら、これらのカルシウム塩や天然カルシウム剤を飲食品に添加して摂取した場合、カルシウムの吸収率は50％以下であり、半分以上のカルシウムが吸収されず体外に排出されてしまうといわれている。また、体内に吸収されたカルシウムも、その形態や同時に摂取される他の栄養成分の種類によって骨への親和性が異なるので、必ずしも骨代謝の改善や骨強化作用を示さないこともある。
【０００４】
その他、骨粗鬆症治療や骨強化のための医薬として、女性ホルモン製剤や活性型ビタミンＤ3製剤 やビタミンＫ2製剤、ビスフォスフォネート製剤、カルシトニン製剤などが知られており、抗ＲＡＮＫＬ抗体などの新薬開発が進められている。しかし、これらの医薬品を用いた場合、耳鳴り、頭痛、食欲不振などの副作用を伴うことがある。さらに、これらの物質は安全性及びコストなどの面から、現在のところ飲食品に添加することができない状況にある。したがって、骨粗鬆症や骨折、腰痛などの種々の骨疾患の疾病の性質から、長期的に経口摂取することができ、骨密度や骨強度を高め、それらの予防または治療効果が期待できるような骨強化剤や該骨強化剤を含有する飲食品、飼料の開発が望まれている。
【０００５】
上記のような骨強化剤としては、例えば特許文献１に記載されるような乳由来の塩基性タンパク質画分（以下、「乳由来塩基性タンパク質画分」という。）や、乳由来塩基性タンパク質画分をタンパク質分解酵素で分解して得られる塩基性タンパク質画分分解物（以下、「乳由来塩基性タンパク質画分分解物」という。）が報告されている。
【０００６】
一方、イソフラボン類は、大豆などのマメ科の植物やクローバー類に含まれるフラボノイドの一種であり、ゲニステインやダイゼインなどのイソフラボン類には、抗酸化作用やコレステロール低下作用、高血圧改善作用、血管新生阻害作用があることが知られている（特許文献2、非特許文献1）。また、ゲニステインやダイゼイン、ダイゼインの代謝物であるエクオールには、骨量の減少を抑制し、骨粗鬆症を予防する効果があることが知られている（非特許文献１、非特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平８−１５１３３１
【特許文献２】特表２００９−５３３３１９
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】化学と生物 2008; 46: 872-878
【非特許文献２】Journal of Nutrition. 2010; 140: 1373S-1376S
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、安全性が高く、骨粗鬆症や骨折、リウマチ、関節炎などの種々の骨疾患の予防や治療に有用である骨強化剤を提供することを課題とする。また、本発明は、骨強化剤を配合した骨強化用飲食品、骨強化用栄養組成物、骨強化用飼料又は骨強化用医薬品を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記の課題を解決するため鋭意検討を進めたところ、乳由来塩基性タンパク質画分及び／又は乳由来塩基性タンパク質画分分解物とイソフラボン及び／又はその代謝物を同時に摂取することにより、それぞれ単独で摂取した場合よりも、相乗的な骨強化作用を示すことを見出した。
【００１１】
すなわち本発明は、以下の様態を含むものである。
（１）乳由来塩基性タンパク質画分及び／又は乳由来塩基性タンパク質画分分解物と、イソフラボン類及び／又はその代謝物を有効成分とする骨強化剤。
（２）前記乳由来塩基性タンパク質画分分解物が、乳由来塩基性タンパク質画分を、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン及びパンクレアチンよりなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質分解酵素を用いて分解したものである（１）に記載の骨強化剤。
（３）前記乳由来塩基性タンパク質画分が、そのアミノ酸組成中に塩基性アミノ酸を１５重量％以上含有している画分である（１）又は（２）に記載の骨強化剤。
（４）前記乳由来塩基性タンパク質画分が、乳又は乳由来の原料を陽イオン交換樹脂に接触させて塩基性タンパク質を吸着させ、この樹脂に吸着した画分を塩濃度０．１Ｍ〜１．０Ｍの溶出液で溶出して得られる画分である（１）又は（２）に記載の骨強化剤。
（５）前記イソフラボン類がゲニステイン、ゲニスチン、ダイゼイン、ダイジン、グリシチン、グリシテイン、エストラジオールならびにそのアナログやアグリコンから選択されるいずれか１種以上であることを特徴とする（１）に記載の骨強化剤。
（６）前記イソフラボン類が大豆由来であることを特徴とする（１）に記載の骨強化剤。
（７）前記イソフラボン類の代謝物が、エクオールであることを特徴とする（１）に記載の骨強化剤。
（８）前記乳由来塩基性タンパク質画分及び／又は乳由来塩基性タンパク質画分分解物と、前記イソフラボン類及び／又はその代謝物の比率が、３０：７０〜７０：３０であることを特徴とする（１）に記載の骨強化剤。
（９）（１）乃至（８）のいずれかに記載の骨強化剤を含むことを特徴とする骨強化用飲食品、骨強化用栄養組成物、骨強化用飼料又は骨強化用医薬品。
（１０）乳由来塩基性タンパク質画分及び／又は乳由来塩基性タンパク質画分分解物と、イソフラボン類及び／又はその代謝物を同時に摂取することによる骨強化方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の骨強化剤は、乳由来塩基性タンパク質画分及び／又は乳由来塩基性タンパク質画分分解物とイソフラボン類及び／又はその代謝物を有効成分とし、骨密度を増加させる作用や骨強化作用が顕著であり、骨粗鬆症や骨折、リウマチ、関節炎などの種々の骨疾患の予防や治療に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】乳塩基性タンパク質とイソフラボン併用時の骨吸収抑制活性を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の特徴は、乳由来塩基性タンパク質画分及び／又は乳由来塩基性タンパク質画分分解物とイソフラボン類及び／又はその代謝物を有効成分とすることにある。本発明で用いる乳由来塩基性タンパク質画分は、牛乳、人乳、山羊乳、羊乳など哺乳類の乳から得られるものであり、また、本発明で用いる乳由来塩基性タンパク質画分分解物は、乳由来塩基性タンパク質画分にタンパク質分解酵素を作用させて得ることができるものである。
【００１５】
本発明で用いる乳由来塩基性タンパク質画分は、次の性質を有している。
１) ソジウムドデシルサルフェート−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によると分子量３，０００〜８０，０００の範囲の数種のタンパク質よりなる。
２) ９５重量％以上がタンパク質であって、その他少量の脂肪、灰分を含む。
３) タンパク質は主としてラクトフェリン及びラクトパーオキシダーゼよりなる。
４) タンパク質のアミノ酸組成は、リジン、ヒスチジン、アルギニン等の塩基性アミノ酸を１５重量％以上含有する。
【００１６】
このような乳由来塩基性タンパク質画分は、例えば、脱脂乳や乳清などの乳原料を陽イオン交換樹脂と接触させて塩基性タンパク質を吸着させ、この樹脂に吸着した塩基性タンパク質画分を０．１Ｍ〜１Ｍの塩濃度の溶出液で溶出し、この溶出画分を回収して、逆浸透（ＲＯ）膜や電気透析（ＥＤ）法などにより脱塩及び濃縮し、必要に応じて乾燥することにより得ることができる。また、このほかにも、乳又は乳由来の原料を陽イオン交換体に接触させて塩基性タンパク質を吸着させた後、この陽イオン交換体に吸着した塩基性タンパク質画分を、ｐＨ５を越え、イオン強度０．５を越える溶出液で溶出して得る方法（特開平５−２０２０９８号公報）、アルギン酸ゲルを用いて得る方法（特開昭６１−２４６１９８号公報）、無機の多孔性粒子を用いて乳清から得る方法（特開平１−８６８３９号公報）、硫酸化エステル化合物を用いて乳から得る方法（特開昭６３−２５５３００号公報）などが知られており、本発明では、このような方法で得られた塩基性タンパク質画分を用いることができる。
【００１７】
さらに、本発明で用いる乳由来塩基性タンパク質画分分解物は、例えば、上記の方法で得られた乳由来塩基性タンパク質画分にペプシン、トリプシン、キモトリプシンなどのタンパク質分解酵素を作用させ、さらに必要に応じ、パンクレアチンなどのタンパク質分解酵素を作用させることにより、平均分子量４，０００以下のペプチド組成物として得ることができる。
【００１８】
本発明で用いるイソフラボン類及び／又はその代謝物を得る方法は特に限定されないが、例えば特開平１１−９２２１やＷＯ２００５／０４６７０２に記載の方法によって得ることができる。これらの方法では、大豆から大豆胚芽を抽出したものや、その大豆胚芽を熱抽出した後に液体クロマトグラフィーによりイソフラボン類の純度を高めている。また、イソフラボン類のアグリコンは、イソフラボン類を精製する際に、酸加熱やβ−グルクロニダーゼを用いて加水分解すること等によって得ることが可能である。さらに、エクオールは、ダイゼインにＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｒｖｉｅａｅなどの腸内細菌を作用させて調製することが可能である。また、本発明におけるイソフラボン類は、大豆などのマメ科の植物やムラサキツメクサなどのクローバー類やそれらから調製した納豆や味噌、醤油、テンペ等の食品の形態からも調製することが可能である。
【００１９】
本発明の乳由来塩基性タンパク質画分及び／又は乳由来塩基性タンパク質画分分解物とイソフラボン類及び／又はその代謝物は、そのまま骨強化剤として使用してもよいが、必要に応じて、常法に従い、粉末剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、ドリンク剤等に製剤化して用いることも出来る。また、さらに、様々な実験的ならびに工業的方法により得られたイソフラボン類及び／又はその代謝物と乳由来塩基性タンパク質画分及び／又は乳由来塩基性タンパク質画分分解物についても、そのまま骨強化剤として使用することも可能であり、そのまま乾燥しても使用できる。また、常法に従い、製剤化して用いることもできる。
【００２０】
本発明では、乳由来塩基性タンパク質画分及び／又は乳由来塩基性タンパク質画分分解物とイソフラボン類及び／又はその代謝物を配合する方法に特に制限はないが、例えば、溶液中で添加、配合するには、乳由来塩基性タンパク質画分及び／又は乳由来塩基性タンパク質画分分解物とイソフラボン類及び／又はその代謝物を脱イオン水に懸濁あるいは溶解し、必要に応じて、乳化剤や安定剤を加えた後に、撹拌混合した後、医薬品、飲食品や飼料の形態に調製して使用する。撹拌混合の条件としては、乳由来塩基性タンパク質画分及び／又は乳由来塩基性タンパク質画分分解物とイソフラボン類及び／又はその代謝物が均一に混合されればよく、ウルトラディスパーサーやＴＫホモミクサー等を使用して撹拌混合することも可能である。また、その溶液は、医薬品、飲食品や飼料に使用しやすいように、必要に応じて、RO膜等での濃縮や、凍結乾燥して使用することができる。本発明では、医薬品、飲食品や飼料の製造に通常使用される殺菌処理が可能であり、粉末状であっては乾熱殺菌も可能である。従って、本発明の乳由来塩基性タンパク質画分及び／又は乳由来塩基性タンパク質画分分解物とイソフラボン類及び／又はその代謝物を含有する液状、ゲル状、粉末状、顆粒状等様々な形態の医薬品、飲食品や飼料を製造することができる。さらに、これらを製剤化した後に、これを栄養剤やヨーグルト、乳飲料、ウエハース等の飲食品、栄養組成物、飼料及び医薬品に配合することも可能である。
【００２１】
本発明の骨強化用飲食品、骨強化用栄養組成物、骨強化用飼料及び骨強化用医薬品とは、この乳由来塩基性タンパク質画分及び／又は乳由来塩基性タンパク質画分分解物とイソフラボン類及び／又はその代謝物のみを含む場合の他に、安定剤や糖類、脂質、フレーバー、ビタミン、ミネラル、フラボノイド、ポリフェノール等、他の飲食品、飼料及び医薬に通常含まれる原材料等を含有することができる。また、乳由来塩基性タンパク質画分及び／又は乳由来塩基性タンパク質画分分解物とイソフラボン類及び／又はその代謝物に加えて、他の骨強化作用を示す成分、例えば、ビタミンＤやビタミンＫ、ホエイタンパク質加水分解物等とともに使用することも可能である。
また、そのような骨強化用飲食品、骨強化用栄養組成物、骨強化用飼料又は骨強化用医薬品を原材料として、他の飲食品等に通常含まれる原材料等を配合して調製することも可能である。
【００２２】
骨強化用飲食品、骨強化用栄養組成物、骨強化用飼料及び骨強化用医薬品における乳由来塩基性タンパク質画分及び／又は乳由来塩基性タンパク質画分分解物とイソフラボン類及び／又はその代謝物の配合量に特に制限はないが、成人一人一日あたり、乳由来塩基性タンパク質画分あるいは乳由来塩基性タンパク質画分分解物を１ｍｇ以上、イソフラボン類及び／又はその代謝物を２ｍｇ以上、経口的に摂取させることが望ましく、そのためには、飲食品、飼料及び医薬の形態にもよるが、乳由来塩基性タンパク質画分あるいは乳由来塩基性タンパク質画分分解物を１００ｇあたり０．０５〜２００ｍｇ、イソフラボン類及び／又はその代謝物を全質量に対して一般に０．００１〜１０％（重量/重量）、好ましくは０．１〜５％（重量/重量）含有させることが好ましい。また、乳由来塩基性タンパク質画分及び／又は乳由来塩基性タンパク質画分分解物と、イソフラボン類及び／又はその代謝物の配合比率は、特に限定されるものではないが、３０：７０〜７０：３０の割合で配合することがより好ましい。
【００２３】
本発明の骨強化剤は、上記の有効成分に適当な助剤を添加して任意の形態に製剤化して、経口投与が可能な骨強化組成物とすることができる。製剤化に際しては、通常使用される充填剤、増量剤、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤等の希釈剤又は賦形剤を用いることができる。賦形剤としては、例えばショ糖、乳糖、デンプン、結晶性セルロース、マンニット、軽質無水珪酸、アルミン酸マグネシウム、合成珪酸アルミニウム、メタ珪酸アルミン酸マグネシウム、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸水素カルシウム、カルボキシルメチルセルロースカルシウム等の1種又は２種以上を組み合わせて加えることができる。
【００２４】
以下に実施例及び試験例を示し、本発明について詳細に説明するが、これらは単に例示するのみであり、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００２５】
陽イオン交換樹脂のスルホン化キトパール（富士紡績株式会社製）４００ｇを充填したカラム（直径５ｃｍ×高さ３０ｃｍ）を脱イオン水で十分洗浄した後、このカラムに未殺菌脱脂乳４０リットル(ｐＨ ６．７)を流速２５ｍｌ／ｍｉｎで通液した。通液後、このカラムを脱イオン水で十分洗浄し、０．９８Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０２Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ７．０）で樹脂に吸着した塩基性タンパク質画分を溶出した。そして、この溶出液を逆浸透（ＲＯ）膜により脱塩して、濃縮した後、凍結乾燥して粉末状の乳由来塩基性タンパク質画分２１ｇを得た（実施例品１）。得られた乳由来塩基性タンパク質画分について、ソジウムドデシルサルフェート−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(ＳＤＳ−ＰＡＧＥ)により測定したところ、分子量は３，０００〜８０，０００の範囲に分布しており、成分組成は表１に示すとおりであった。また、６Ｎ塩酸で１１０℃、２４時間加水分解した後、アミノ酸分析装置（Ｌ−８５００型、日立製作所製）でそのアミノ酸組成を分析した結果を表２に示した。さらに、ＥＬＩＳＡ法により、そのタンパク質組成を分析したところ、表３に示すように、４０％以上のラクトフェリン及びラクトパーオキシダーゼが含まれていた。
【００２６】
【表１】
0006009181.tif 000002
【００２７】
【表２】
0006009181.tif 000003
【００２８】
【表３】
0006009181.tif 000004
【実施例２】
【００２９】
陽イオン交換樹脂のＳＰトーヨーパール（東ソー株式会社製）３０ｋｇを充填したカラム（直径１００ｃｍ×高さ１０ｃｍ）を脱イオン水で十分洗浄した後、このカラムに１２１℃で３０秒間加熱殺菌したチーズホエー３ｔ(ｐＨ６．２)を流速１０リットル／ｍｉｎで通液した。通液後、このカラムを脱イオン水で十分洗浄し、０．９Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ５．７）で樹脂に吸着した塩基性タンパク質画分を溶出した。そして、この溶出液を電気透析（ＥＤ）法により脱塩し、濃縮した後、凍結乾燥して粉末状の乳由来塩基性タンパク質画分１８３ｇを得た（実施例品２）。
【実施例３】
【００３０】
実施例１で得られた乳由来塩基性タンパク質画分５０ｇを蒸留水１０リットルに溶解した後、１％パンクレアチン（シグマ社製）を添加し、３７℃で２時間反応させた。反応後、８０℃で１０分間加熱処理して酵素を失活させた後、乳由来塩基性タンパク質画分分解物４８．３ｇを得た（実施例品３）。
【実施例４】
【００３１】
大豆１３．５ｋｇから大豆胚芽を熱抽出した後、液体クロマトグラフィーによりイソフラボン類の純度が約９２％になるよう精製し、大豆イソフラボン３０ｇを得た（実施例品４）。この大豆イソフラボンには、ゲニステインが９．１％、ゲニスチンが４６．９％、ダイゼインが９．８％、ダイジンが２２．６％、グリシチンが２．５％、グリシテインが０．７％が含まれていた。
【実施例５】
【００３２】
実施例４で得られた大豆イソフラボン１５ｇに、β−グルクロニダーゼを作用させて、大豆イソフラボンのアグリコン１０ｇを得た（実施例品５）。
【実施例６】
【００３３】
実施例４で得られた大豆イソフラボン１２ｇに、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｒｖｉｅａｅを９６時間反応させて、エクオール含量が６．９％の大豆イソフラボン１０gを得た（実施例品６）。
【００３４】
［試験例１］
(動物実験)
実施例品１、２の乳由来塩基性タンパク質画分と実施例品４の大豆イソフラボン、実施例品６のエクオール含有の大豆イソフラボンを使用して、骨強化作用について評価した。実験には６週齢のＣ３Ｈ／ＨｅＪマウスを使用した。マウスを、生理食塩水を投与する群（Ａ群）、実施例品１の乳由来塩基性タンパク質画分をマウス体重１ｋｇあたり１ｍｇ投与する群（Ｂ群）、実施例品４の大豆イソフラボンをマウス体重１ｋｇあたり２．２ｍｇ投与する群（Ｃ群）、実施例品１の乳由来塩基性タンパク質画分をマウス体重１ｋｇあたり３ｍｇ投与する群（Ｄ群）、実施例品４の大豆イソフラボンをマウス体重１ｋｇあたり３．３ｍｇ投与する群（Ｅ群）、実施例品１の乳由来塩基性タンパク質画分と実施例品４の大豆イソフラボンを、それぞれマウス体重１ｋｇあたり１ｍｇと２．２ｍｇ同時に投与する群（Ｆ群）、実施例品２の乳由来塩基性タンパク質画分と実施例品６のエクオール含有の大豆イソフラボンを、それぞれマウス体重１ｋｇあたり１ｍｇと２．２ｍｇ同時に投与する群（Ｇ群）の７試験群（各群１０匹ずつ）にわけた。それぞれを毎日１回ゾンデで経口投与して２週間飼育した。実施例品１、４および実施例品１と４の混合物、実施例品２と６の混合物は、それぞれ生理食塩水に懸濁して、それぞれＢ〜Ｇ群に経口投与した。試験終了時に、マウスの右足の脛骨の骨密度を３ＤマイクロＸ線ＣＴ（（株）リガク）を用いて測定した。その結果を表４に示す。
【００３５】
【表４】
0006009181.tif 000005
【００３６】
この結果、２週間投与後の脛骨の骨密度は、実施例品１の乳由来塩基性タンパク質画分をマウス体重１ｋgあたり１ｍｇまたは３ｍｇ投与した群、実施例品４の大豆イソフラボンをマウス体重１ｋgあたり２．２ｍｇまたは３．３ｍｇ投与した群、実施例品１の乳由来塩基性タンパク質画分と実施例品４の大豆イソフラボンを、それぞれマウス体重１ｋgあたり１ｍｇと２．２ｍｇ同時に投与した群、実施例品２の乳由来塩基性タンパク質画分と実施例品６のエクオール含有の大豆イソフラボンを、それぞれマウス体重１ｋgあたり１ｍｇと２．２ｍｇ同時に投与した群では、対照群に比べ、有意に骨密度が上昇した。また、実施例品１の乳由来塩基性タンパク質画分と実施例品４の大豆イソフラボンを同時に投与すること、ならびに、実施例品２の乳由来塩基性タンパク質画分と実施例品６のエクオール含有の大豆イソフラボンを同時に投与することによって、それぞれ単独で投与した群より、有意に骨密度が上昇した。したがって、本発明の乳由来塩基性タンパク質画分とイソフラボン類を同時に投与した場合には、それぞれ単独で投与した場合より、相乗的に骨密度を高める効果があることがわかった。また、この骨強化作用は、乳由来塩基性タンパク質画分とイソフラボン類を、それぞれマウス体重１ｋｇあたり最低１ｍｇと最低２ｍｇ同時に投与した場合に認められることが明らかとなった。
【００３７】
［試験例２］
（動物実験）
実施例品３の乳由来塩基性タンパク質画分分解物と実施例品５の大豆イソフラボンのアグリコンを使用して、骨強化作用について評価した。実験には５１週齢のＳＤ系雌ラットを用いた。ラットを６匹ずつ５群に分け、４群は卵巣摘出手術を施し、残りの１群は疑似手術を施した。４週間の回復期間を設け、卵巣摘出手術を施したラットに実施例品３をラット体重１ｋｇあたり１ｍｇ（Ａ群）、実施例品５をラット体重１ｋｇあたり２．２ｍｇ（Ｂ群）、実施例品３と実施例品５を同時にラット体重１ｋgあたり、それぞれ１ｍｇと２．２ｍｇ（Ｃ群）になるよう１日１回ゾンデで経口投与する、あるは、いずれの実施例品も含まない溶媒である生理食塩水のみを１日１回ゾンデで経口投与（対照群）して１６週間飼育した。また、４週間の回復期間の後、疑似手術を施したラットには、対照群と同様に、生理食塩水のみを１日１回ゾンデで経口投与（疑似手術群）した。投与終了後（１６週目）に、ラットの右大腿骨の骨強度を骨強度測定装置（ＲＸ−１６００、アイテクノ）により測定した。その結果を表５に示す。
【００３８】
【表５】
0006009181.tif 000006
【００３９】
この結果、実施例品３の乳由来塩基性タンパク質画分分解物または実施例品５の大豆イソフラボンのアグリコンをラット体重１ｋgあたり、それぞれ１ｍｇ、２．２ｍｇ経口投与した群、実施例品３の乳由来塩基性タンパク質画分分解物と実施例品５の大豆イソフラボンのアグリコンを、それぞれラット体重１ｋgあたり１ｍｇと２．２ｍｇ同時に経口投与した群では、対照群に比べ、有意に骨破断強度が上昇した。また、実施例品３の乳由来塩基性タンパク質画分分解物と実施例品５の大豆イソフラボンのアグリコンを同時に投与した群では、それぞれ単独で投与した群に比べ、骨破断強度が有意に高く、その値は疑似手術群と同レベルであった。したがって、本発明の乳由来塩基性タンパク質画分分解物とイソフラボン類を同時に投与した場合には、それぞれ単独で投与した場合に比べ、相乗的に骨破断強度を高める効果があることがわかった。また、この骨強化作用は、乳由来塩基性タンパク質画分分解物とイソフラボン類を、それぞれラット体重１ｋｇあたり最低１ｍｇと最低２ｍｇ同時に投与した場合に認められることが明らかとなった。
【００４０】
[試験例３]
乳由来の塩基性タンパク質画分およびイソフラボン類の骨吸収抑制効果を調べるために、ピットアッセイを行なった。１０日齡のウサギの大腿骨を摘出し、軟組織を除去した後、５％ＦＢＳ（牛胎児血清）を含む培地中で機械的に細切し、破骨細胞を含む全骨髄細胞を２００，０００ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるよう象牙片上に撒き込み、試験サンプルを１０％添加して２日間培養した。そして、破骨細胞が象牙片を吸収してできた骨吸収窩（ピット）をヘマトキシリン染色し、その数をカウントした（瀬野悍二ら，研究テーマ別動物培養細胞マニュアル，ｐｐ．１９９−２００， １９９３） 。すなわち、ピット数が少ないということは、破骨細胞の活性が低下して骨吸収が抑制されたことを意味している。また、ピットアッセイで骨吸収抑制効果が示された物質は、動物実験でも骨吸収の抑制効果が示されており（Ｔｏｂａら、Ｂｏｎｅ， ｖｏｌ．２７， ｐ．４０３−４０８， ２０００）、一般的にピットアッセイは骨吸収抑制効果を調べる上で適した実験系である。試験サンプルは、実施例品１の乳由来塩基性タンパク質画分と実施例品４の大豆イソフラボンとの重量比が１００：０〜０：１００の範囲になるように配合し、かつ、実施例品１の乳由来塩基性タンパク質画分と実施例品４の大豆イソフラボンの合計が１００μｇ／ｍｌとなるように調製したものであり、それらを培地に添加した。また、対照として乳由来塩基性タンパク質画分とイソフラボン類のいずれをも含まない対照群（０:０）も設けた。その結果を図１に示す。
【００４１】
図１より、乳由来塩基性タンパク質画分とイソフラボン類のいずれをも含まない対照群に比較して、他のすべての群のピット数が有意に少ないことから、骨吸収抑制活性を有していることがわかった。また、乳由来塩基性タンパク質画分と大豆イソフラボンの重量比が１００:０〜８０:２０ならびに２０:８０〜０:１００の場合に比べ、乳由来塩基性タンパク質画分と大豆イソフラボンの重量比が７０:３０〜３０:７０の範囲の場合に有意にピット数が少なく、乳由来塩基性タンパク質または大豆イソフラボンをそれぞれ単独で添加する以上に骨吸収抑制活性を有していることが確認できた。さらに、本試験では、対照群を除く各群の乳由来塩基性タンパク質画分と大豆イソフラボンの合計重量は同様になるように調製して、それらの比を変えることで実験を行った。したがって、本試験例では、単なる相加効果ではなく、乳由来塩基性タンパク質画分とイソフラボン類とが相乗的に作用し、骨吸収を抑制することが明確に示された。
【実施例７】
【００４２】
（骨強化用錠剤の調製）
表６に示す配合で原材料を混合後、常法により１ｇに成型、打錠して本発明の骨強化用錠剤を製造した。なお、この錠剤１ｇ中には、実施例品１の乳由来塩基性タンパク質画分が２５ｍｇ、実施例品４の大豆イソフラボンが５０ｍｇ含まれていた。
【００４３】
【表６】
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【実施例８】
【００４４】
（骨強化液状栄養組成物の調製）
実施例品３の乳由来塩基性タンパク質画分分解物２５ｇと実施例品５の大豆イソフラボンのアグリコン５０ｇを４，９２５ｇの脱イオン水に溶解し、５０℃まで加熱後、ＴＫホモミクサー（ＴＫ ＲＯＢＯ ＭＩＣＳ；特殊機化工業社製）にて、６，０００ｒｐｍで３０分間撹拌混合して、実施例品３の乳由来塩基性タンパク質画分分解物を２５ｇ／５ｋｇと実施例品５の大豆イソフラボンのアグリコンを５０ｇ／５ｋｇを含有する溶液を得た。この溶液５．０ｋｇに、カゼイン５．０ｋｇ、大豆タンパク質５．０ｋｇ、魚油１．０ｋｇ、シソ油３．０ｋｇ、デキストリン１７．０ｋｇ、ミネラル混合物６．０ｋｇ、ビタミン混合物１．９５ｋｇ、乳化剤２．０ｋｇ、安定剤４．０ｋｇ、香料０．０５ｋｇを配合し、２００ｍｌのレトルトパウチに充填し、レトルト殺菌機 (第１種圧力容器、ＴＹＰＥ: ＲＣＳ−４ＣＲＴＧＮ、日阪製作所製)で１２１℃、２０分間殺菌して、本発明の骨強化用液状栄養組成物５０ｋｇを製造した。なお、この骨強化用液状栄養組成物には、１００ｇあたり、実施例品３の乳由来塩基性タンパク質画分分解物が５０ｍｇ、実施例品５の大豆イソフラボンのアグリコンが１００ｍｇ含まれていた。
【実施例９】
【００４５】
（骨強化用飲料の調製）
脱脂粉乳３００ｇを４０８．５ｇの脱イオン水に溶解した後、実施例品２の乳由来塩基性タンパク質画分０．５ｇと実施例品５の大豆イソフラボンのアグリコン１ｇを溶解し、５０℃まで加熱後、ウルトラディスパーサー（ＵＬＴＲＡ−ＴＵＲＲＡＸ Ｔ−２５；ＩＫＡジャパン社製）にて、９，５００ｒｐｍで３０分間撹拌混合した。マルチトール１００ｇ、酸味料２g、還元水飴２０ｇ、香料２g、脱イオン水１６６ｇを添加した後、１００ｍｌのガラス瓶に充填し、９５℃、１５秒間殺菌後、密栓し、本発明の骨強化用飲料１０本（１００ｍｌ入り）を調製した。なお、この骨強化用飲料には、１００ｍｌあたり実施例品２の乳由来塩基性タンパク質画分が５０ｍｇと実施例品５の大豆イソフラボンのアグリコンが１００ｍｇ含まれていた。
【実施例１０】
【００４６】
（イヌ用骨強化飼料の調製）
実施例品１の乳由来塩基性タンパク質画分１ｋｇと実施例品６のエクオール含有の大豆イソフラボン２ｋｇを９７ｋｇの脱イオン水に溶解し、５０℃まで加熱後、ＴＫホモミクサー（ＭＡＲＫ ＩＩ １６０型；特殊機化工業社製）にて、３，６００ｒｐｍで４０分間撹拌混合して、実施例品１の乳由来塩基性タンパク質画分を１ｇ／１００ｇと実施例品６のエクオール含有の大豆イソフラボンを２ｇ／１００ｇ含有する溶液を得た。この溶液１０ｋｇに大豆粕１２ｋｇ、脱脂粉乳１４ｋｇ、大豆油４ｋｇ、コーン油２ｋｇ、パーム油２３．２ｋｇ、トウモロコシ澱粉１４ｋｇ、小麦粉９ｋｇ、ふすま２ｋｇ、ビタミン混合物５ｋｇ、セルロース２．８ｋｇ、ミネラル混合物２ｋｇを配合し、１２０℃、４分間殺菌して、本発明のイヌ用骨強化飼料１００ｋｇを製造した。なお、このイヌ用骨強化飼料には、１００ｇあたり、実施例品１の乳由来塩基性タンパク質画分が１００ｍｇと実施例品６のエクオール含有の大豆イソフラボンが２００ｍｇ含まれていた。
【実施例１１】
【００４７】
実施例品１の乳由来塩基性タンパク質画分とフジフラボンＰ４０（フジッコ株式会社、イソフラボン類含量４０％）を重量比２:５の割合で混合して（乳由来塩基性タンパク質画分:イソフラボン類＝１:１）、本発明の骨強化剤を得た。
【実施例１２】
【００４８】
実施例品２の乳由来塩基性タンパク質画分とソイアクト（キッコーマン株式会社、イソフラボン類含量３０％）を重量比１:２の割合で混合して（乳由来塩基性タンパク質画分:イソフラボン類＝５:３）、本発明の骨強化剤を得た。
【実施例１３】
【００４９】
実施例品１の乳由来塩基性タンパク質画分３００ｍｇを無調整豆乳（株式会社紀文フードケミファ、イソフラボン類含量２１０ｍｇ／Ｌ）１Ｌに混合し（乳由来塩基性タンパク質画分:イソフラボン類＝１０:７）、攪拌した後、 １２０℃で４秒の加熱殺菌を行って、本発明の骨強化剤を得た。
【図１】
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