(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテアーゼ切断部位Ｒ１ＳＫ３Ｒ４が、非塩基性アミノ酸およびヒスチジンから選択されるいずれかのアミノ酸によって、少なくともヒト野生型ｐｒｏＮＧＦ配列（配列番号１）の１０１位および１０３位に対応するＲ１位およびＫ３位で置換され、配列番号５を有する、ｐｒｏＮＧＦ変異体。
【請求項２】
原核細胞における組換え発現によって得られる、請求項１に記載のｐｒｏＮＧＦ変異体。
【請求項３】
大腸菌における組換え発現によって得られる、請求項２に記載のｐｒｏＮＧＦ変異体。
【請求項４】
（ｉ）請求項１〜３のいずれかに記載されるｐｒｏＮＧＦ変異体を提供すること、および
（ｉｉ）活性なヒトβ−ＮＧＦを得るために前記ｐｒｏＮＧＦ変異体を切断すること
を含む、生物学的に活性なヒトβ−ＮＧＦを調製する方法。
【請求項５】
下記の工程：
ａ．請求項１〜３のいずれかに記載されるｐｒｏＮＧＦ変異体を変性溶液における封入体の可溶化によって溶解する工程、
ｂ．前記ｐｒｏＮＧＦ変異体を、前記変性されたｐｒｏＮＧＦが生物学的に活性な立体配座を取るリフォールディング溶液に移す工程、
ｃ．前記リフォールディングされたｐｒｏＮＧＦ変異体を精製する工程、
ｄ．前記ｐｒｏＮＧＦ変異体のプロ配列を、前記活性なβ−ＮＧＦを得るために切断する工程
を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記変性溶液が、（ｉ）カオトロピック物質、（ｉｉ）キレーター、（ｉｉｉ）緩衝剤および（ｉｖ）還元剤を含有する溶液を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記変性溶液が、
ｉ．      １Ｍ〜８ＭのグアニジウムＨＣｌ、
ｉｉ．    ０．０１Ｍ〜１ＭのＴｒｉｓ、
ｉｉｉ．  １ｍＭ〜５０ｍＭのＥＤＴＡ、
ｉｖ．    グルチオン（ＧＳＨ）またはシステインから選択される１ｍＭ〜１００ｍＭを含み、
ｖ．      ｐＨ７．０〜１０．０
である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記変性溶液が、
ｉ．    ４Ｍ〜６ＭのグアニジウムＨＣｌ、
ｉｉ．    ０．０１Ｍ〜１ＭのＴｒｉｓ、
ｉｉｉ．  １ｍＭ〜５０ｍＭのＥＤＴＡ、
ｉｖ．    グルチオン（ＧＳＨ）またはシステインから選択される１ｍＭ〜１００ｍＭを含み、
ｖ．      ｐＨ７．０〜１０．０
である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記変性溶液が、
ｉ．      ４ＭのグアニジウムＨＣｌ、
ｉｉ．    ０．１ＭのＴｒｉｓ、
ｉｉｉ．  １０ｍＭのＥＤＴＡ
ｉｖ．    ５ｍＭのＧＳＨまたはシステインを含み、
ｖ．      ｐＨ８．０
である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記リフォールディング溶液が、
ｉ．      ０．５Ｍ〜１．０Ｍのシャペロン、
ｉｉ．    １ｍＭ〜１０ｍＭの金属キレーター、
ｉｉｉ．  ０．１ｍＭ〜１０ｍＭのレドックスシャフリング系を含み、
ｉｖ．    ｐＨ８．０〜ｐＨ１１．０
である、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
前記リフォールディング溶液が、
ｉ．      ０．７５Ｍのアルギニン、
ｉｉ．    ５ｍＭのＥＤＴＡ
ｉｉｉ．  １ｍＭのＬ−シスチンおよび５ｍＭのＬ−システイン、または、１ｍＭのＧＳＳＧ（酸化型グルタチオン）および５ｍＭのＧＳＨ（還元型グルタチオン）を含み、
ｉｖ．    ｐＨ９．５
である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記リフォールディングがパルス再生として行われる、請求項５および７〜１１に記載の方法。
【請求項１３】
パルス再生期間中の最終的リフォールディング体積に関して、グアニジウムＨＣｌの濃度が０．３Ｍを超えず、かつ、パルスあたりのタンパク質濃度が５０μｇ／ｍｌを超えてない、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ｐｒｏＮＧＦ変異体が混合モードのクロマトグラフィーにより精製される、請求項５に記載の方法。
【請求項１５】
前記クロマトグラフィーカラムが、合成された親和性リガンドを有する混合モード物質カラムである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
混合モード物質カラムが、４−メルカプト−エチル−ピリジン（ＭＥＰ）、ヘキシルアミノ（ＨＥＡ）、フェニルプロピルアミノ（ＰＰＡ）、２−メルカプト−５ベンゾイミダゾールスルホ酸（ＭＢＩ）、Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣ（ＧＥＨＣ）、Ｎ−ベンジル−Ｎ−メチルエタノールアミン（ＧＥＨＣ）、ＣＨＴヒドロキシアパタイトまたはＣＨＴフルオロアパタイトを有するカラムである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
混合モード物質カラムが、４−メルカプト−エチル−ピリジン（ＭＥＰ）を有するカラムである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ｐｒｏＮＧＦ変異体のプロ形態がプロテアーゼによって切断される、請求項５〜１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ｐｒｏＮＧＦ変異体の前記プロ形態がセリンプロテアーゼによって切断される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ｐｒｏＮＧＦ変異体の前記プロ形態がトリプシンによって切断される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
トリプシン対ｐｒｏＮＧＦ変異体の比率が１：２００〜１：１００，０００である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
トリプシン対ｐｒｏＮＧＦ変異体の前記比率が重量あたり１：５，０００〜１：２０，０００である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
トリプシン対ｐｒｏＮＧＦ変異体の前記比率が１：１０，０００（ｗ／ｗ）である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
β−ＮＧＦを精製するさらなる工程をさらに含む、請求項４〜２３に記載の方法。
【請求項２５】
β−ＮＧＦをカラムクロマトグラフィーによって精製する工程をさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
β−ＮＧＦを、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰカラムによって精製するさらなる工程をさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ヒトβ−ＮＧＦを製造するための、請求項１〜３のいずれかに記載されるｐｒｏＮＧＦ変異体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生来的なプロテアーゼ切断部位における置換を有する新規なｐｒｏＮＧＦ変異体に関連する。本発明はさらに、生物学的に活性なヒトβ−ＮＧＦを不活性な不溶性ｐｒｏＮＧＦ変異体から製造する方法、および、ヒトβ−ＮＧＦを製造するためのｐｒｏＮＧＦ変異体の使用を開示する。
【背景技術】
【０００２】
神経成長因子（β−ＮＧＦ）は、非常に重要な役割をニューロン（感覚系および交感神経系）の成長および生存において果たす神経栄養因子である（Ｌｅｖｉ−Ｍｏｎｔａｌｃｉｎｉ，Ｒ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３７（１９８７）、１１５４；Ｔｈｏｅｎｅｎ，Ｈ．他、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．、６０（１９８０）、１２８４；Ｙａｎｋｎｅｒ，Ｂ．Ａ．他、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５１（１９８２）、８４５）。β−ＮＧＦは、安定な二量体タンパク質構造を取る成長因子のシステインノットスーパーファミリー（ｃｙｓｔｅｉｎｅ−ｋｎｏｔ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙに属する。そのうえ、β−ＮＧＦは、中枢神経系のコリン作動性ニューロンの成長、分化および活力を促進させる（Ｈｅｆｔｉ、Ｆ．Ｊ．、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．、２５（１９９４）、１４１８）。組換えヒト神経成長因子についての可能な治療的適応症には、末梢感覚神経障害、例えば、糖尿病に伴う末梢感覚神経障害、または、ＡＩＤＳ治療における起こり得る副作用としての末梢感覚神経障害が含まれる。β−ＮＧＦについての他の適応症には、中枢神経障害、例えば、アルツハイマー病がある。この場合、記憶の喪失は、コリン作動性ニューロンが失われることの結果である。β−ＮＧＦはまた、ヒトの皮膚潰瘍および角膜潰瘍の処置において効果的であることが見出されている（Ｂｅｒｎａｂｅｉ他、Ｌａｎｃｅｔ、１９９９；Ｌａｍｂｉａｓｅ他、ＮＥＪＭ、１９９８）。そのうえ、β−ＮＧＦはまた、網膜細胞を緑内障の実験的動物モデルにおいて変性およびアポトーシスから保護すること、ならびに、緑内障に冒された少数の患者において視覚機能を改善することが示されている（Ｌａｍｂｉａｓｅ  Ａ他、ＰＮＡＳ、２００９）。
【０００３】
成熟型のヒトβ−ＮＧＦは、２４１個のアミノ酸からなるプレプロタンパク質（ｐｒｅｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎ）として翻訳されるアミノ酸が１１８個のタンパク質である。アミノ酸が１８個のシグナルペプチド（プレペプチド）が、小胞体（ＥＲ）内に移行する期間中に切断される。生じたプロタンパク質（ｐｒｏＮＧＦ）は、プロ配列をプロテアーゼ切断により除くことによってそのＮ末端でプロセシングされる。成熟型のヒトＮＧＦは、齧歯類（マウスおよびラット）のβ−ＮＧＦに対する大きな程度の同一性（約９０％）を示す。臨床研究または治療的使用のためには、β−ＮＧＦは高濃度で与えられなければならない。マウスの顎下腺がβ−ＮＧＦの天然の供給源である。しかしながら、これらのβ−ＮＧＦ調製物は種々の二量体の不均一な混合物であり、したがって、治療的使用には適していない。さらに、このタンパク質のヒト形態を患者に投与することが望ましい。しかしながら、ヒト組織においては、神経栄養因子は低濃度で存在するだけである。
【０００４】
プロ配列は、成熟型タンパク質とは別個のドメインである（プロ配列が太字で示される図１における配列データを参照のこと）。これら２つのドメインが、ヒトｐｒｏＮＧＦ配列（配列番号１）の１０１位〜１０４位に位置するＡｒｇ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇタイプの塩基性アミノ酸標的配列を有する露出したプロテアーゼ切断部位によって隔てられている。このモチーフは自然界では、セリンエンドプロテアーゼのフリンのための切断部位である。加えて、この切断部位は、他の適するプロテアーゼによって、好ましくは、アミノ酸のアルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）の後での切断の基質特異性を有するプロテアーゼによって特異的にプロセシングされる場合がある。例えば、プロテアーゼのトリプシンは、塩基性アミノ酸の後で、例えば、リシン（Ｌｙｓ、Ｋ）またはアルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）などの後で切断する。
【０００５】
生物学的に活性なβ−ＮＧＦをその不活性なプロ形態から調製するための様々な方法がこの技術分野では広く知られている。例えば、欧州特許第０９９４１８８Ｂ１号明細書は、生物学的に活性なβ−ＮＧＦを、難溶性の不活性なプロ形態から調製するための方法を記載する。この方法によれば、β−ＮＧＦを、変性溶液に可溶化された不溶性かつ不活性な組換えられたｐｒｏＮＧＦから得ることができる。その後で、可溶化されたｐｒｏＮＧＦが非変性溶液または弱変性溶液に移される。変性されたｐｒｏＮＧＦは、生来的なβ−ＮＧＦに存在するジスルフィド結合によって決定されるような生物学的に活性な立体配座を取る。続いて、ｐｒｏＮＧＦのプロ配列が切断され、それにより、活性なβ−ＮＧＦが得られる。
【０００６】
ヒトｐｒｏＮＧＦは、生来的なプロテアーゼ（フリン）切断部位Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇを含有しており、したがって、下記の配列モチーフを有する：Ｒ１ＳＫ３Ｒ４。特異的な製造プロセスのために、例えば、「医薬品適正製造基準」（ＧＭＰ）の品質レベルを必要とする製造プロセスのために、材料（例えば、酵素など）は高品質で提供されなければならない。プロテアーゼのフリンは現在、ＧＭＰ規格のプロテアーゼとして入手することができない。
【０００７】
したがって、代替プロテアーゼ、すなわち、トリプシン（ＥＣ３．４．２１．４）が、ｐｒｏＮＧＦを切断して、成熟型β−ＮＧＦタンパク質を生じさせるために選ばれた。セリンプロテアーゼのトリプシンはペプチド鎖を塩基性アミノ酸のアルギニンまたはリシンのカルボキシル側で切断する。ヒトｐｒｏＮＧＦでは、ヒトｐｒｏＮＧＦにおける自然界で存在する切断部位は塩基性アミノ酸の３つの位置を含有する（配列番号１の１０１位、１０３位および１０４位；それぞれＲ１、Ｋ３およびＲ４として本明細書中では示される）。したがって、トリプシンによるｐｒｏＮＧＦの切断では、まさしく切断がどこで生じるかに依存して、数多くの異なる切断された生成物がもたらされる場合がある。典型的な切断生成物が、ＳＫ３Ｒ４−β−ＮＧＦおよびＲ４−β−ＮＧＦならびに成熟型ＮＧＦである。β−ＮＧＦタンパク質の二量体化は、その後の工程において精製されなければならないより多数の（６種までの）不均質な生成物をもたらすことになるので（図２ａを参照のこと）、この問題が悪化する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】欧州特許第０９９４１８８Ｂ１号明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｌｅｖｉ−Ｍｏｎｔａｌｃｉｎｉ，Ｒ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３７（１９８７）、１１５４
【非特許文献２】Ｔｈｏｅｎｅｎ，Ｈ．他、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．、６０（１９８０）、１２８４
【非特許文献３】Ｙａｎｋｎｅｒ，Ｂ．Ａ．他、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５１（１９８２）、８４５
【非特許文献４】Ｈｅｆｔｉ、Ｆ．Ｊ．、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．、２５（１９９４）、１４１８
【非特許文献５】Ｂｅｒｎａｂｅｉ他、Ｌａｎｃｅｔ、１９９９
【非特許文献６】Ｌａｍｂｉａｓｅ他、ＮＥＪＭ、１９９８
【非特許文献７】Ｌａｍｂｉａｓｅ  Ａ他、ＰＮＡＳ、２００９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の技術的課題およびその解決
βＮＧＦを製造するための様々な方法が先行技術において記載されている。しかしながら、現在利用可能な製造プロセスは、不均質なβ−ＮＧＦ生成物およびβ−ＮＧＦの低い収率などのいくつかの欠点を有している。
【００１１】
β−ＮＧＦを製造するためのトリプシンによる野生型ｐｒｏ−ＮＧＦの切断は、切断されたβ−ＮＧＦの十分な収率を得るために非常に多量の当該酵素を使用することを必要とし、その効率が低いことが示されている。このことは、その後の精製プロセスに影響を及ぼす欠点をいくつか有する。第一に、切断の選択性がさらに低下し、これにより、いくつかの消化生成物がもたらされる。第二に、酵素はタンパク質の最終サンプルにおいて存在してはならないので、β−ＮＧＦから酵素を除くことが必要である。このことは、多量に存在するトリプシンを除くためのいくつかの精製手順を暗示させる。したがって、先行技術の手順における切断酵素としてのトリプシンの使用では、β−ＮＧＦの非常に低い収率または当該タンパク質の様々な精製問題のいずれもが引き起こされる。
【００１２】
言うまでもないことであるが、β−ＮＧＦを上記のような欠点を伴うことなく製造する方法がこの技術分野では依然として求められている。したがって、高品質、高効率および高収率で得られるためにβ−ＮＧＦを製造する新規な方法を提供することが、本発明の課題である。さらに、β−ＮＧＦの高い収率をもたらし、効率的であり、影響を受けにくく、規模変更が可能であり、かつ、再現性がある、β−ＮＧＦのための製造プロセスを提供することも、本発明の課題である。
【００１３】
本発明の利点は、β−ＮＧＦを新規なｐｒｏＮＧＦ変異体から製造することである。この新規なｐｒｏＮＧＦ変異体はプロテアーゼによる不均質な消化を防止し、したがって、不均質なβ−ＮＧＦ生成物を防止するので、この新規な変異体は、均質なβ−ＮＧＦ生成物を良好な収率でもたらす。本発明の課題は、本発明のｐｒｏＮＧＦ変異体、および、β−ＮＧＦを本発明によって記載されるようにこのｐｒｏＮＧＦ変異体から製造する方法を提供することによって解決される。
【００１４】
新規な変異体は、野生型と比較して、本発明の変異型ｐｒｏＮＧＦにおける関連部位でのトリプシンによる切断の効率について予想外かつ顕著な増大をもたらす。このことは、野生型に対して使用されるべき量と比較して、極めて少ない量のプロテアーゼ（トリプシン）を使用することを可能にし、結果として、βＮＧＦから酵素自体および切断の副生成物を除くという課題を軽減する。
【００１５】
独立請求項の主題によって、上記の課題が解決され、かつ、利点が達成される。本発明の好ましい実施形態が、従属請求項において、同様にまた、下記の記載、実施例および図において含まれる。
【００１６】
上記概説は、本発明によって解決されるすべての課題を必ずしも記載していない。さらなる課題、および、これらがどのように解決されるかが、本出願を検討した後で当業者には明らかであるかもしれない。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
第１の局面において、本発明は、プロテアーゼ切断部位Ｒ１ＳＫ３Ｒ４が、非塩基性アミノ酸およびヒスチジンから選択されるアミノ酸によって、少なくともヒト野生型ｐｒｏＮＧＦ配列（配列番号１）の１０１位および１０３位に対応するＲ１位およびＫ３位で置換されるｐｒｏＮＧＦ変異体に関連する。
【００１８】
第２の局面において、本発明は、生来的なプロテアーゼ切断部位Ｒ１ＳＫ３Ｒ４において、少なくともヒト野生型ｐｒｏＮＧＦ配列（配列番号１）の１０１位および１０３位に対応するＲ１位およびＫ３位で置換される不活性な不溶性ｐｒｏＮＧＦ変異体から、生物学的に活性なヒトβ−ＮＧＦを調製する方法であって、（ｉ）本発明によるｐｒｏＮＧＦ変異体を提供すること、および、（ｉｉ）活性なヒトβ−ＮＧＦを得るために前記ｐｒｏＮＧＦ変異体を切断することを含む方法に関連する。
【００１９】
具体的には、本発明は下記のプロセスに関連する：
ａ．ｐｒｏＮＧＦ変異体を変性溶液に溶解すること；
ｂ．前記ｐｒｏＮＧＦ変異体を、前記変性されたｐｒｏＮＧＦが生物学的に活性な立体配座を取るリフォールディング溶液に移すこと；
ｃ．前記ｐｒｏＮＧＦ変異体を前記リフォールディング溶液から精製すること；
ｄ．前記ｐｒｏＮＧＦ変異体のプロ配列を、前記活性なβ−ＮＧＦを得るために切断すること。
【００２０】
本発明の第３の局面は、少なくともヒト野生型ｐｒｏＮＧＦ（配列番号１）の１０１位〜１０４位における生来的なプロテアーゼ切断部位Ｒ１ＳＫ３Ｒ４の１０１位でのアルギニンおよび１０３位でのリシンがヒトβ−ＮＧＦの調製のために非塩基性アミノ酸によって置換されるｐｒｏＮＧＦ変異体の使用に関連する。
【００２１】
本発明のさらなる局面は、少なくともヒト野生型ｐｒｏＮＧＦ（配列番号１）の１０１位〜１０４位における生来的なプロテアーゼ切断部位Ｒ１ＳＫ３Ｒ４の１０１位でのアルギニンおよび１０３位でのリシンが、非塩基性アミノ酸およびヒスチジンから選択されるアミノ酸によって置換されるｐｒｏＮＧＦ変異体から製造されるβ−ＮＧＦと、医薬的に許容されるキャリアまたは希釈剤とを含む医薬組成物に関連する。
【００２２】
上記概要は本発明のすべての特徴を必ずしも記載していない。他の実施形態が下記の詳細な説明の検討から明らかになるであろう。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
定義
本発明を下記で詳しく記載する前に、本発明は、本明細書中に記載される特定の方法論、プロトコルおよび試薬に限定されないことを理解しなければならない。なぜならば、これらは変化する場合があるからである。本明細書中で使用される用語は、特定の実施形態を記載するという目的のためだけであり、また、添付されている請求項によってのみ限定されるであろう本発明の範囲を限定するために意図されないこともまた理解しなければならない。別途定義される場合を除き、本明細書中で使用されるすべての技術的用語および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。
【００２４】
本明細書および下記の請求項を通して、文脈が別途要求する場合を除き、単語“ｃｏｍｐｒｉｓｅ”（含む）および変化形（例えば、“ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ”および“ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ”など）は、言及された整数または工程または整数群または工程群を含み、何らかの他の整数または工程または整数群または工程群を除外しないことを意味することが理解されるであろう。
【００２５】
いくつかの文書（例えば、特許、特許出願、科学刊行物、説明書など）が本明細書の本文中を通して引用される。本明細書中のいかなる開示も、先行発明の開示に本発明が先行する資格がないことを認めるものとして解釈されないものとする。
【００２６】
配列：本明細書中で参照されるすべての配列が、その全内容および全開示により本明細書の一部である添付された配列表において開示される。
【００２７】
用語「約」は、数値に関連して使用されるとき、示された数値よりも５％小さい下限を有し、かつ、示された数値よりも５％大きい上限を有する範囲に含まれる数値を包含することが意味される。
【００２８】
用語「ｐｒｏＮＧＦ」または用語「ｐｒｏ−ＮＧＦ」はヒトβ−ＮＧＦのプロ形態を示す。完全なヒトｐｒｏＮＧＦ配列が配列番号１において定義される（図１ａ）。成熟型β−ＮＧＦを得るために、プロペプチドのｐｒｏＮＧＦはプロテアーゼによって切断されなければならない。β−ＮＧＦのプロ配列は成熟型β−ＮＧＦとは別個のドメインである。これら２つのドメインの間には、配列番号１の１０１位〜１０４位における生来的なプロテアーゼ切断部位Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ（これは本明細書中ではＲ１ＳＫ３Ｒ４（配列番号９）として示される）が存在する。この切断部位は、適するプロテアーゼによって、具体的にはフリンプロテアーゼによって特異的に切断される場合がある。
【００２９】
用語「ｐｒｏＮＧＦ変異体」または用語「ｐｒｏＮＧＦムテイン」は、アミノ酸の置換によるヒトβ−ＮＧＦのプロ形態の改変体を示す。本発明のｐｒｏＮＧＦムテインは、非塩基性アミノ酸およびヒスチジンから選択されるアミノ酸によって、生来的なプロテアーゼ切断部位Ｒ１ＳＫ３Ｒ４（配列番号９）において、少なくともヒト野生型ｐｒｏＮＧＦ配列（配列番号１）の１０１位および１０３位に対応するＫ３位およびＲ１位の両方で置換される。
【００３０】
本発明の好ましい実施形態において、（１０３位に対応する）位置Ｋ３におけるアミノ酸のリシンがアラニンにより置換される（図１ｄ、配列番号４；図１ｅ、配列番号５；図１ｇ、配列番号８を参照のこと）。
【００３１】
本発明の別の好ましい実施形態において、（１０１位に対応する）位置Ｒ１におけるアミノ酸のアルギニンがバリンにより置換される（図１ｂ、配列番号２；図１ｅ、配列番号５；図１ｇ、配列番号８を参照のこと）。
【００３２】
本発明の別の実施形態において、野生型ｐｒｏＮＧＦ配列（配列番号１）の１０４位に対応するアミノ酸のアルギニンＲ４もまた、βＮＧＦを得るためのタンパク質分解的切断によるｐｒｏＮＧＦのプロセシングを可能にするいずれかのアミノ酸によって、好ましくは塩基性アミノ酸（例えば、アルギニンまたはリシンなど）によって置換される場合がある。例えば、位置Ｒ４におけるアラニンの存在により、βＮＧＦへのｐｒｏＮＧＦのプロセシングが回避される。したがって、本発明の変異体はアラニンを１０４位に含有することができない。
【００３３】
（表１）
表１．ｐｒｏＮＧＦおよびｐｒｏＮＧＦムテインのプロテアーゼ切断部位
（Ｘは、ＡｒｇまたはＬｙｓでないいずれかのアミノ酸を示す）
配列番号    プロテアーゼ切断部位（配列番号１の１０１位〜１０４位）
１          ＲＳＫＲ（野生型）（配列番号９）
２          ＶＳＸＲ（配列番号１０）
３          ＸＳＸＲ（配列番号１１）
４          ＸＳＡＲ（配列番号１２）
５          ＶＳＡＲ（配列番号１３）
６          ＲＸＫＲ
７          ＸＸＸＲ（配列番号１４）
８          ＶＸＡＲ（配列番号１５）
【００３４】
用語「非塩基性アミノ酸」は、どのようなアミノ酸であれ、正に帯電しないアミノ酸を示す。この用語は、塩基性アミノ酸以外のアミノ酸残基を示す。この用語は、正の側鎖を有するアミノ酸であるアミノ酸のリシンまたはアルギニンを除外する。非塩基性アミノ酸は、負に帯電するアミノ酸のグルタミン酸およびアスパラギン酸、極性の非荷電側鎖を有するアミノ酸（セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン）、疎水性側鎖を有するアミノ酸（アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン）、ならびに、アミノ酸のシステイン、グリシンおよびプロリンである。
【００３５】
用語「生物学的に活性なｐｒｏ−ＮＧＦ」または用語「生物学的に活性な立体配座を有するｐｒｏＮＧＦ」は、ｐｒｏ−ＮＧＦの生物学的活性を示す。ｐｒｏ−ＮＧＦの生物学的に活性な立体配座は、天然のβ−ＮＧＦに存在するジスルフィド架橋の存在によって決定される。活性が、例えば、Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ他（１９９４、Ｂｌｏｏｄ、８３：１４７９〜１４８５、１９９４；これは参照によって本明細書中に組み込まれる）によって記載されるようなアッセイに従って求められる場合がある。実施例１１は、ＴＦ１細胞増殖の刺激によるｐｒｏＮＧＦの生物学的活性のためのアッセイを記載する。
【００３６】
用語「β−ＮＧＦ」は成熟型のβ−神経成長因子を示し、好ましくはヒト由来の成熟型のβ−神経成長因子を示す。成熟型のβ−神経成長因子についての配列が、１０５位から始まって図１に示される（配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４および配列番号５、配列番号７および配列番号８）。
【００３７】
用語「β−ＮＧＦの活性」または用語「生物学的に活性なβ−ＮＧＦ」は、β−ＮＧＦの生物学的活性を意味する。生物学的に活性なβ−ＮＧＦが二量体の形態で存在する。β−ＮＧＦは、生物学的に活性な立体配座を有するためには二量体形態で存在しなければならない。β−ＮＧＦの生物学的に活性な立体配座の必要条件は、シスチンノットに対するジスルフィド架橋の正しい形成である。活性が、例えば、ＤＲＧアッセイ（後根神経節アッセイ）に従って求められる場合がある。例えば、Ｌｅｖｉ−Ｍｏｎｔａｌｃｉｎｉ，Ｒ．他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、１４（１９５４）、４９、および、Ｖａｒｏｎ，Ｓ．他、Ｍｅｔｈ．ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３（１９７２）、２０３を参照のこと。このアッセイでは、ニワトリ胚の解剖された後根神経節に由来する感覚ニューロンの刺激および生存が神経突起の形成によってモニターされる。
【００３８】
用語「置換（“ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ”または“ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ”）」は、アミノ酸を置き換えることによるヒトβ−ＮＧＦのプロ形態の改変を示す。この用語は、例えば、化学基または残基を置換するか、あるいは、化学基または残基を元のアミノ酸に付加することによるアミノ酸の化学的改変を含む。選択されたアミノ酸を改変する工程は、好ましくは遺伝子レベルでの変異誘発によって行われる。好ましくは、ｐｒｏＮＧＦの改変は、ｐｒｏＮＧＦに属するＤＮＡを変化させるための遺伝子工学の方法によって行われる。改変は、遺伝物質のただ１つの塩基ヌクレオチドが別のヌクレオチドにより置き換えられることが引き起こされる変異である。点変異により、野生型配列と比較して異なるアミノ酸をコードする。好ましくは、改変されたｐｒｏＮＧＦタンパク質の発現がその後、原核生物または真核生物において行われ、最も好ましくは原核生物において行われる。
【００３９】
用語「変性する」または用語「変性」は、タンパク質の折り畳み構造が変化させられるプロセスを示す。この用語は、ｐｒｏＮＧＦまたはｐｒｏＮＧＦムテインの三次構造を解きほどくことを示す。折り畳み構造の変化は、特定の化学的因子または物理的因子にさらされることに起因する。結果として、タンパク質の元の性質のいくつか、とりわけ、その生物学的活性が低下し、または除かれる。変性プロセスに起因して、タンパク質は生物学的に不活性になる。さらに、変性タンパク質は、生物学的機能の喪失、溶解性の喪失および／または凝集を含めて、広範囲の様々な特徴を示すことができる。
【００４０】
用語「リフォールディングする」または用語「再生する」または用語「再生」は、タンパク質構造がその生来的な機能的折り畳みまたは立体配座を取るプロセスを示す。再生プロセスまたはリフォールディングプロセスに起因して、タンパク質は生物学的に活性になる。
【００４１】
用語「組換え」は、ＤＮＡを、当該ＤＮＡによってコードされるタンパク質を好適な宿主において発現させるためにベクターにクローン化することを示す。宿主は好ましくは原核生物であり、最も好ましくは細菌である。「組換え発現」は、本明細書中で使用される場合、ｐｒｏＮＧＦまたはｐｒｏＮＧＦムテインを原核生物宿主細胞において発現させることを示し、例えば、組換えタンパク質を発現させるために好適である大腸菌が使用され得る。
【００４２】
用語「可溶性（の）」は、何らかの溶媒に溶解しやすいタンパク質を示す。
【００４３】
用語「不溶性（の）」は、何らかの溶媒に溶解し難いタンパク質を示す。
【００４４】
発明の説明
本発明のｐｒｏＮＧＦ変異体
本発明の第１の実施形態において、本発明は、プロテアーゼ切断部位Ｒ１ＳＫ３Ｒ４が、非塩基性アミノ酸およびヒスチジンから選択されるアミノ酸によって、少なくともヒト野生型ｐｒｏＮＧＦ配列（配列番号１）の１０１位および１０３位に対応するＲ１位およびＫ３位で置換されるｐｒｏＮＧＦ変異体を提供する。言い換えれば、少なくともヒト野生型ｐｒｏＮＧＦ配列（配列番号１）の１０１位〜１０４位における生来的なプロテアーゼ切断部位Ｒ１ＳＫ３Ｒ４の１０１位でのアルギニンＲ１および１０３位でのリシンＫ３が、アルギニンまたはリシンでないいずれかのアミノ酸によって置換される。
【００４５】
ヒト野生型ｐｒｏＮＧＦ（配列番号１）において、生来的なプロテアーゼ切断側はアミノ酸位置１０１〜１０４を示す（ＡｒｇＳｅｒＬｙｓＡｒｇ、ＲＳＫＲ、配列番号９）。野生型ｐｒｏＮＧＦ配列の１０３位におけるアミノ酸のリシンＫ３および１０１位におけるアミノ酸のアルギニンＲ１が、特にβ−ＮＧＦを製造するための改善された性質を有するｐｒｏＮＧＦを生じさせるために、ＡｒｇまたはＬｙｓでないいずれかのアミノ酸により置き換えられる。上記で特定された目的を達成するために、すなわち、β−ＮＧＦを製造するための改善された特徴を有するムテインを生じさせるために、アルギニン（Ｒ１）またはリシン（Ｋ３）が、すべての自然界に存在するアミノ酸によって、または、人工アミノ酸によって同様に置換される場合がある。ただし、この場合、そのようなアミノ酸はトリプシンのための切断部位を構成しない。
【００４６】
本発明によれば、残基１０１〜残基１０３に対応する１つまたは複数の位置に対するアミノ酸改変が、塩基性アミノ酸を非塩基性アミノ酸により置き換える置換である場合がある。これらの置換を、特にβ−ＮＧＦを製造するための本発明によるｐｒｏＮＧＦ変異体を作出するために使用することができる。変異体は、少なくともＡｒｇ１０１およびＬｙｓ１０３の位置における置換を含む。これらのアミノ酸残基が非塩基性アミノ酸またはヒスチジンによって置き換えられる。具体的には、本発明の変異体は、Ａｒｇ１０１ＶａｌおよびＬｙｓ１０３Ａｌａの置換を有する。例えば、前記天然型非塩基性アミノ酸が、自然界に存在するアミノ酸残基のアラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンからなる群から選択される場合がある。
【００４７】
１０１位および１０３位における置換のためのアミノ酸は、塩基性（正荷電の）アミノ酸のアルギニン（Ａｒｇ）およびリシン（Ｌｙｓ）からは選択されない。同様に、あまり好ましくないものは、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、あるいは、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、システイン（Ｃｙｓ）、プロリン（Ｐｒｏ）またはトリプトファン（Ｔｒｐ）のアミノ酸である。自然界では、セリン（Ｓｅｒ）がヒトｐｒｏＮＧＦ野生型配列の１０２位に存在している。１０２位におけるＸ（配列番号７および配列番号８）は好ましくは、自然界ではヒトｐｒｏＮＧＦ配列の１０２位に存在しているセリン（Ｓｅｒ）から選択されるが、非塩基性アミノ酸でなければならない（すなわち、アルギニンまたはリシンであってはならない）いずれかの他のアミノ酸から選択される場合もある。１０２位におけるアミノ酸が非塩基性アミノ酸であること（すなわち、ＡｒｇまたはＬｙｓでないこと）が重要である。
【００４８】
野生型ヒトｐｒｏＮＧＦ配列の１０４位におけるアミノ酸は好ましくは、自然界ではヒトｐｒｏＮＧＦ配列の１０４位に存在しているアルギニン（Ａｒｇ）であるが、βＮＧＦを得るためのタンパク質分解的切断によるｐｒｏＮＧＦのプロセシングを可能にするいずれかの他のアミノ酸によって、好ましくは塩基性アミノ酸によって、より好ましくはリシンによって置換される場合もある。
【００４９】
例えば、野生型ヒトｐｒｏＮＧＦの１０４位におけるアラニンの存在により、βＮＧＦへのｐｒｏＮＧＦのプロセシングが回避される。したがって、１０４位におけるＡｌａは除外される。
【００５０】
表２には、ｐｒｏＮＧＦのプロテアーゼ切断部位のための好ましい置換がまとめられている。
【００５１】
（表２Ａ）
表２Ａ．野生型ｐｒｏＮＧＦの１０１位〜１０４位における好ましいアミノ酸
星印（＊）は、プロテアーゼ切断部位（野生型ｐｒｏＮＧＦ、配列番号１）における自然界に存在するアミノ酸を示す。
１０１    Ｖａｌ、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｈｉｓ、Ｃｙｓ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ
１０２    Ｓｅｒ＊、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｃｙｓ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ
１０３    Ａｌａ、Ｖａｌ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｈｉｓ、Ｃｙｓ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ
１０４    Ａｒｇ＊、Ｌｙｓ
【００５２】
Ｃｙｓ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、ＩｌｅおよびＬｅｕのアミノ酸は、１０１位、１０２位および１０３位におけるあまり好ましくない置換である。
【００５３】
（表２Ｂ）
表２Ｂ．野生型ｐｒｏＮＧＦの１０１位〜１０４位における最も好ましいアミノ酸
１０１    Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｈｉｓ
１０２    Ｓｅｒ＊、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｈｉｓ
１０３    Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｈｉｓ
１０４    Ａｒｇ＊、Ｌｙｓ
【００５４】
ＡｒｇまたはＬｙｓでないいずれかのアミノ酸が、ｐｒｏＮＧＦムテインの１０１位、１０２位および１０３位に存在すること、ならびに、塩基性アミノ酸（ＡｒｇまたはＬｙｓ）がｐｒｏＮＧＦムテインの１０４位に存在することが不可欠である。驚くべきことに、１０１位および１０３位における２つのアミノ酸置換がとりわけβ−ＮＧＦ製造の高い効率をもたらすことが示された。
【００５５】
本発明の最も好ましいｐｒｏＮＧＦ変異体の配列（配列番号５）において、ヒト野生型ｐｒｏＮＧＦの１０１位における好ましい置換後アミノ酸がバリンであり、ヒト野生型ｐｒｏＮＧＦの１０３位における好ましい置換後アミノ酸がアラニンであり、ヒト野生型ｐｒｏＮＧＦの１０２位における好ましい置換後アミノ酸がセリンであり、ヒト野生型ｐｒｏＮＧＦの１０４位における好ましい置換後アミノ酸がアルギニンである。本発明の特に好ましい実施形態において、本発明のｐｒｏＮＧＦ変異体は、配列番号５の配列に対応する配列を有する。
【００５６】
本発明はまた同様に、本明細書中に記載されるｐｒｏＮＧＦ変異体をコードする核酸に関する。
【００５７】
ヒトβ−ＮＧＦを本発明のｐｒｏＮＧＦ変異体から調製する方法
第２の局面において、本発明は、生来的なプロテアーゼ切断部位Ｒ１ＳＫ３Ｒ４（配列番号９）において、ヒト野生型ｐｒｏＮＧＦ配列（配列番号１）の１０１位および１０３位（Ｒ１およびＫ３）で置換される不活性な不溶性ｐｒｏＮＧＦ変異体から、生物学的に活性なヒトβ−ＮＧＦを調製する方法であって、生来的なプロテアーゼ切断部位Ｒ１ＳＫ３Ｒ４において、ヒト野生型ｐｒｏＮＧＦ配列の１０１位および１０３位（Ｒ１およびＫ３）が置換されるｐｒｏＮＧＦ変異体を提供すること、および、活性なヒトβ−ＮＧＦを得るために前記ｐｒｏＮＧＦ変異体を切断することを含む方法に関連する。
【００５８】
好ましくは、ｐｒｏＮＧＦ変異体は原核生物細胞における組換え発現によって得られる。様々な好適な細菌株がこの技術分野では広く知られており（例えば、大腸菌、バチルス属細菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）およびサルモネラ属細菌）、また、そのような発現系のための様々なキットが市販されている。組換え発現のための好ましい宿主細胞が大腸菌であり、例えば、大腸菌ＢＬ２１、大腸菌ＪＭ１０８／１０９（Ｋ１２）、大腸菌ＪＭ１０６、大腸菌ＪＭ８３および大腸菌ＴＢ１ならびにそれらの誘導体である。組換えタンパク質の発現のために好適であるどのような他の大腸菌株もまた使用され得る。
【００５９】
ポリヌクレオチドが、原核生物宿主細胞における本発明の融合タンパク質の発現を可能にする発現制御配列に機能的に連結される。そのような発現制御配列は当業者に知られており、かつ、遺伝子発現を行わせるか、または、他の場合には遺伝子発現を調節する誘導可能なプロモーターおよび非誘導性プロモーター、オペレーター、リプレッサーならびに他のエレメントが含まれるが、これらに限定されない。そのような調節エレメントには、例えば、Ｔ７プロモーター、ＴＡＣプロモーター、ＰＢＡＤプロモーター、ＬＡＣプロモーター、ＬａｃＩリプレッサー、ＬａｃＩＱリプレッサーが含まれる。
【００６０】
ｐｒｏＮＧＦ変異体の配列が、好適なベクターによって原核生物宿主細胞に導入される。好適なベクターは、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＭＡＬ、ｐＵＣ１９およびすべての誘導体が可能であるかもしれないが、これらに限定されない。原核生物宿主細胞には、例えば、本発明のポリヌクレオチド分子を含有するプラスミドＤＮＡ発現ベクター、組換えバクテリオファージＤＮＡ発現ベクターまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターにより形質転換することができる原核生物細胞、例えば、細菌（例えば、大腸菌または枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））などが含まれるが、これらに限定されない。本発明の１つの実施形態において、プラスミドベクターが使用される。例えば、決して限定されるものではないが、欧州特許第１６９７５２３Ｂ１号明細書に記載されるプラスミドベクターが使用される場合がある（これは参照によって本明細書中に組み込まれる）。
【００６１】
ｐｒｏＮＧＦムテインを発現させるために、下記のａ〜ｇを含有する発現ベクターが使用される：
ａ．転写を導くための強力なプロモーター（例えば、ｔａｃプロモーターまたはＴ７プロモーター）、
ｂ．ｐｒｏＮＧＦまたはｐｒｏＮＧＦムテインのためのコード配列、
ｃ．転写／翻訳ターミネーター（例えば、バクテリオファージラムダのｔ０−ターミネーター）、
ｄ．第１の選択マーカー遺伝子、例えば、抗生物質抵抗性をコードする遺伝子（例えば、カナマイシン抵抗性、ｋａｎ）、
ｅ．第２の選択マーカー遺伝子、例えば、ｐｒｏＢおよび／またはｐｒｏＡをコードする遺伝子、
ｆ．リプレッサー遺伝子（例えば、ｌａｃＩ遺伝子）、
ｇ．高コピー数の複製起点。
【００６２】
本発明の１つの実施形態において、自社開発の発現ベクター（Ｓｃｉｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ＧｍｂＨ、好適な発現ベクターの構造については欧州特許第１６９７５２３Ｂ１号明細書を参照のこと）または市販のベクターがクローニングのために使用される場合がある。本発明の方法において使用され得るベクターに関する一般的情報に関しては、上記の詳細が参照される。しかしながら、好適なベクターはどれもが、この技術分野において知られているように使用され得る。
【００６３】
原核生物宿主細胞を形質転換するための好適なベクターについての一例としての自社開発の発現ベクターｐＳＣＩＬ１０１の構造が下記に示される：
【化１】
0006039146.tif 000002
【００６４】
ｐｒｏＮＧＦ変異体を調製する方法は下記の初期工程を含む：
ｉ．      ｐｒｏＮＧＦムテインをコードする核酸を調製する工程
ｉｉ．    前記核酸を原核生物発現ベクターに導入する工程
ｉｉｉ．  前記発現ベクターを宿主細胞に導入する工程
ｉｖ．    前記宿主細胞を培養する工程
ｖ．      前記宿主細胞を好適な培養条件に供する工程。
【００６５】
原核生物宿主細胞におけるその発現に起因して、ｐｒｏＮＧＦムテインはその不活性な不溶性形態の形態である。
【００６６】
好ましい実施形態において、β−ＮＧＦを本発明によるｐｒｏＮＧＦ変異体から製造する方法は下記の工程を含む：
ａ．生来的なプロテアーゼ切断部位Ｒ１ＳＫ３Ｒ４において、ヒト野生型ｐｒｏＮＧＦ配列（配列番号１）の１０１位および１０３位に対応するＲ１位およびＫ３位が置換される前記ｐｒｏＮＧＦ変異体を、変性溶液における封入体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ  ｂｏｄｉｅｓ）の可溶化によって溶解する工程；
ｂ．前記ｐｒｏＮＧＦ変異体を、前記変性されたｐｒｏＮＧＦが生物学的に活性な立体配座を取るリフォールディング溶液に移す工程；
ｃ．前記ｐｒｏＮＧＦ変異体を前記リフォールディング溶液から精製する工程；
ｄ．前記ｐｒｏＮＧＦ変異体のプロ配列を、前記活性なβ−ＮＧＦを得るために切断する工程。
【００６７】
下記において、β−ＮＧＦを本発明によるｐｒｏＮＧＦ変異体から製造するための方法の好ましい工程が議論される。
【００６８】
工程ａ．ｐｒｏＮＧＦ変異体の可溶化
工程ａ）は、生来的なプロテアーゼ切断部位Ｒ１ＳＫ３Ｒ４において、ヒト野生型ｐｒｏＮＧＦ配列（配列番号１）の１０１位および１０３位に対応するＲ１位およびＫ３位が置換されるｐｒｏＮＧＦ変異体を、変性溶液における封入体の可溶化によって溶解することに対応する。工程ａ）における本発明のｐｒｏＮＧＦ変異体は通常、原核生物宿主細胞におけるその発現に起因して、その不活性な不溶性形態の形態であることは特筆される。不良な溶解性を示す不活性なｐｒｏＮＧＦが、原核生物の細胞質ゾルにおけるタンパク質の過剰発現の期間中に形成される。この場合、組換えによって調製されるｐｒｏＮＧＦは、不溶性の凝集形態で細胞質に留まる。これらのタンパク質凝集物、その単離、同様にまた、それらの精製が、例えば、Ｍａｒｓｔｏｎ，Ｆ．Ａ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、２４０（１９８６）に記載される。
【００６９】
これらの不活性なタンパク質凝集体（封入体）を単離するために、原核生物細胞が発酵後に破砕される。細胞破砕が、従来の方法によって、例えば、高圧均質化、超音波処理またはリゾチームによって行われる場合がある（Ｒｕｄｏｌｐｈ，Ｒ．他（１９９７）、Ｆｏｌｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔ．Ｅ．（編）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、５７頁〜９９頁）。
【００７０】
さらに、封入体が可溶化される。封入体（ＩＢ）は、通常的には欠陥タンパク質または不完全に折り畳まれたタンパク質の蓄積物である。組換えタンパク質が過度に発現される場合、封入体が細胞（例えば、細菌細胞、例えば、大腸菌など）の内部で生じる。本発明に従って用いられる封入体は好ましくは、ｐｒｏＮＧＦムテインを含む。このことは、封入体が、（タンパク質の総量に基づいて）少なくとも６０ｗｔ．％、少なくとも７０ｗｔ．％、少なくとも８０ｗｔ．％または少なくとも９０ｗｔ．％のｐｒｏ−ＮＧＦを含有することを意味する。
【００７１】
本発明は、そのｐｒｏＮＧＦムテインを製造するための方法であって、折り畳まれていない不活性な不溶性のｐｒｏＮＧＦムテインまたはその誘導体を含む封入体が変性緩衝液（溶液）において可溶化される方法を提供する。
【００７２】
工程ａ）の変性溶液は好ましくは、（ｉ）カオトロピック物質、（ｉｉ）キレーター、（ｉｉｉ）緩衝剤および（ｉｖ）還元剤を含有する溶液を含む。
【００７３】
変性緩衝液は、少なくとも１つのカオトロピック物質（剤）を含む。秩序のある水素架橋結合を水中において解く化学物質が、カオトロピックと呼ばれる。水素架橋結合がこじ開けられるので、カオトロピック物質は水の構造を妨害し、無秩序（エントロピーの増大）を確実にする。この理由は、溶媒和のために必要であるＨ２Ｏかご構造の形成が妨げられるからである。アミノ酸の場合、アミノ酸は疎水性効果を低下させ、タンパク質に対する変性作用を有する。なぜならば、タンパク質折り畳みの駆動力は、疎水性アミノ酸が水中において集合して一緒になることであるからである。一般には、どのような物質であれ、疎水性効果を可溶化緩衝液において発揮し、したがって、タンパク質に対する変性作用を有する物質を、カオトロピック物質として用いることができる。カオトロピック物質は一般に、塩または低分子量化合物である（例えば、尿素など）。カオトロピック物質は、疎水性基（例えば、アルキル基など）を分子中に全く含有しないので、界面活性剤とは明確に区別される。一般に、カオトロピック作用には、タンパク質（この場合にはプレトロンビン）の溶解性における改善が伴う。
【００７４】
本発明の好ましい実施形態において、カオトロピック化合物が、グアニジウム塩（具体的にはグアニジウム塩酸塩およびチオシアン酸グアニジウム）、ヨウ化物、バリウム塩、チオシアン酸塩、尿素および過塩素酸塩から選ばれる。
【００７５】
カオトロピック化合物は従来的な量で用いられる。例えば、４Ｍ〜８Ｍのグアニジウム塩酸塩または４Ｍ〜９Ｍの尿素を用いることができる。
【００７６】
変性緩衝液は還元剤化合物を含む；例えば、ジスルフィド化合物、例えば、グルタチオン（ＧＳＨ）などである。ジスルフィド化合物は、封入体中のポリペプチドのシステインのチオール基（−ＳＨ）との混合ジスルフィドを形成することができる。ジスルフィドが溶液に加えられる。ジスルフィドは、封入体によって含まれ、かつ、場合によってはジスルフィド架橋を含むタンパク質を指定しない。好ましくは、ジスルフィドは真のペプチドでない。好ましくは、ジスルフィドは低分子量化合物である。分子量は、例えば、２，０００ｇ／ｍｏｌ未満または１，０００ｇ／ｍｏｌ未満である。ジスルフィドが、例えば、５ｍＭ〜１Ｍの濃度で、特に１０ｍＭ〜０．５Ｍの濃度で用いられる。
【００７７】
本発明の好ましい実施形態において、ジスルフィド化合物はグルタチオンジスルフィドである。グルタチオン（ＧＳＨ）は、γ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−システイニルグリシンでもあり、グルタミン酸、システインおよびグリシンの３つのアミノ酸から形成される擬トリペプチド（ｐｓｅｕｄｏ−ｔｒｉｐｅｐｔｉｄｅ）である。ＧＳＨが原核生物および真核生物の両方の細胞質に存在しており、ジスルフィド架橋の形成に関与している。ＧＳＨは、ジスルフィド架橋を含有する二量体ＧＳＳＧと平衡状態にある。グルタチオンは、ジスルフィド交換反応において、２つのポリペプチドまたは１つのポリペプチドに由来するシステイン（Ｒ−ＳＨおよびＲ’−ＳＨ）と反応する：
Ｒ−ＳＨ＋ＧＳＳＧ  →  Ｒ−Ｓ−Ｓ−Ｇ＋ＧＳＨ。
【００７８】
ＲＳＳＧは混合ジスルフィドと呼ばれる。ＲＳＳＧはポリペプチドのさらなるシステインと反応し、その結果として、ジスルフィド架橋が２つのシステインの間で得られる。
Ｒ−Ｓ−Ｓ−Ｇ＋ＨＳ−Ｒ’  →  Ｒ−Ｓ−Ｓ−Ｒ’＋ＧＳＨ。
【００７９】
グルタチオンが細胞質ゾルにおいて還元型形態（ＧＳＨ）で酵素により保たれる。したがって、細胞質ゾルにおける「還元性条件」が参照される。様々な条件が、含まれるジスルフィド化合物が上記の反応によるジスルフィド架橋の形成を触媒するように可溶化緩衝液において確立される。ＧＳＳＧが、例えば、１０ｍＭ〜０．５Ｍの濃度で用いられる。
【００８０】
代替では、還元剤（レダクタント）として、システインが使用されるかもしれない。
【００８１】
本発明の好ましい実施形態において、変性溶液はＴｒｉｓ緩衝液である。
【００８２】
変性溶液は、さらなる従来の添加剤を含むことができる（例えば、ＥＤＴＡまたは塩）。可溶化緩衝液のｐＨが、例えば、７〜１０の間であり、好ましくはｐＨ８である。可溶化は好ましくは、機械的に、例えば、従来の均質化装置を用いて、または、超音波により助けられる。可溶化後、残留する固形物が好ましくは分離除去される。上清が可溶化ｐｒｏ−ＮＧＦを含む。
【００８３】
本発明の１つの実施形態において、変性溶液は下記のものを含む：
ｉ．      グアニジウムＨＣｌ、１Ｍ〜８Ｍ（好ましくは４Ｍ〜６Ｍ、最も好ましくは４Ｍ）、ＧＳＨまたはシステイン、１ｍＭ〜１００ｍＭ（好ましくは５ｍＭ）
ｉｉ．    Ｔｒｉｓ、０．０１Ｍ〜１Ｍ（好ましくは０．１Ｍ）
ｉｉｉ．  ＥＤＴＡ、１ｍＭ〜５０ｍＭ（好ましくは１０ｍＭ）
ｉｖ．    ｐＨ７．０〜１０．０（好ましくはｐＨ８．０）
【００８４】
グアニジウムＨＣｌの濃度は、ほとんどの場合において、ｐｒｏＮＧＦムテインの完全な変性のために４Ｍで十分である。
【００８５】
工程ｂ：ｐｒｏＮＧＦ変異体のリフォールディング
ｐｒｏＮＧＦ変異体を封入体から可溶化した後、タンパク質をその生来的な立体配座にリフォールディングすることが必要である。リフォールディングプロセスのために、競合反応である誤った折り畳みおよび凝集を最小限に抑えることが重要である。凝集を防止するために、リフォールディングは、非常に低いタンパク質濃度で行われる。これは、タンパク質の凝集が、高いタンパク質濃度で優勢であるからである。工程ｂ）において、ｐｒｏＮＧＦ変異体を、変性されたｐｒｏＮＧＦが生物学的に活性な立体配座を取るリフォールディング緩衝液に移すことが行われる。生物学的に活性な立体配座が、天然のβ−ＮＧＦに存在するジスルフィド架橋の存在によって決定される可能性がある。
【００８６】
本発明の好ましい実施形態において、可溶化されたｐｒｏＮＧＦ変異体が、少なくとも１つのシャペロン、少なくとも１つの金属キレーターおよびレドックスシャフリング系を含有するリフォールディング溶液において再生される。
【００８７】
好ましい実施形態において、本発明による方法は、下記のｉ〜ｉｖを含む工程ｂ）におけるリフォールディング溶液を使用する：
ｉ．      シャペロン、好ましくはアルギニン、０．５Ｍ〜１．０Ｍ、好ましくは０．７５Ｍ；
ｉｉ．    金属キレーター、好ましくはＥＤＴＡ、１ｍＭ〜１０ｍＭ、好ましくは５ｍＭ；
ｉｉｉ．  レドックスシャフリング系、０．１ｍＭ〜１０ｍＭ、好ましくは、１ｍＭのＬ−シスチンおよび５ｍＭのＬ−システイン、または、１ｍＭのＧＳＳＧ（酸化型グルタチオン）および５ｍＭのＧＳＨ（還元型グルタチオン）；
ｉｖ．    ｐＨ８．０〜ｐＨ１１．０、好ましくはｐＨ９．５。
【００８８】
代替となるレドックスシャフリング系、例えば、シスタミン／システアミンなどが使用され得るかもしれない。
【００８９】
本発明の好ましい実施形態において、折り畳み補助剤はアルギニンである。タンパク質の折り畳みを促進させる化合物を「折り畳み補助剤」として一般に用いることができる。そのような様々な化合物が当業者には知られている。折り畳み補助剤は様々な様式で折り畳みを助けることができる。アルギニンは、誤って折り畳まれた中間体を脱安定化し、その結果、これらが少なくとも部分的に（熱力学的終端物から）から再び解きほどかれ、したがって、再び正しく折り畳まれ得ると推測される。他方で、グリセロールは通常、タンパク質を安定化する。折り畳まれたｐｒｏ−ＮＧＦムテインの絶対的収率を、本発明による方法において、折り畳み補助剤を使用しない方法と比較して、（折り畳みのために用いられるｐｒｏ−ＮＧＦの総量に基づいて）５％超、特に１０％超または２０％超増大させる化合物が、特に折り畳み補助剤として好適である。
【００９０】
リフォールディングは好ましくは、８〜１１の間のｐＨにおいて行われ、特にｐＨ９．５において行われる。
【００９１】
リフォールディング容器におけるタンパク質濃度を増大させるために、パルス再生が行われた。パルス回数を限定するものは、グアニジウムＨＣｌ濃度であり、０．３Ｍを超えてはならない。パルスあたりのタンパク質濃度は、最終的なリフォールディング体積に関して５０μｇ／ｍｌを超えてはならない。
【００９２】
本発明の好ましい実施形態において、可溶化物（ｓｏｌｕｂｉｌｉｓａｔｅ）が、数日間にわたって数回に分けて、または連続して、折り畳み回分処理反応に加えられる。好ましくは、可溶化物が可溶化物への迅速希釈によって「パルス再生」において加えられる。この関連において、例えば、決して限定されるものではないが、少なくとも６回のパルスが、例えば、２４時間の時間間隔で行われ得るかもしれない。パルスの回数は、可溶化回分処理物を加えた後で、未だ折り畳まれていないタンパク質の濃度が高すぎないように設定される。これは、そうでない場合には、凝集物が得られるからである。例えば、それぞれのパルスにより、０，０５ｇ／ｌ〜０，２ｇ／ｌのタンパク質、好ましくは０．１ｇ／ｌのタンパク質が、（可溶化物を加えた後の折り畳み回分処理反応におけるタンパク質濃度に依存して）折り畳み回分処理反応に新たに移される。例えば、それぞれのリフォールディング工程は、少なくとも１時間〜２時間を要する。
【００９３】
リフォールディング後、リフォールディング反応液は、カラムにロードする前に清澄化される必要がある。これを、どのような方法であれ、この技術分野において知られている方法によって行うことができ、例えば、ろ過によって行うことができる。
【００９４】
好ましい実施形態において、正しく折り畳まれたｐｒｏ−ＮＧＦ変異体を製造するための方法は下記の工程を含む：ａ）不溶性のｐｒｏＮＧＦ変異体を含む封入体が、上記で記載されるような変性溶液において可溶化される工程、およびｂ）その後、可溶化されたｐｒｏ−ＮＧＦが、上記で記載されるようなリフォールディング溶液緩衝液において再生される工程。
【００９５】
本発明の好ましい実施形態において、変性溶液および／またはリフォールディング溶液は結果として、界面活性剤を何ら含有しない。界面活性剤の使用は、ｐｒｏ−ＮＧＦムテインの可溶化および／または折り畳みのために必要ないことが見出されている。このことは好都合である。これは、ある種の界面活性剤は、医薬製造物がほんの少量でも含んではならず、または、ほんの少量でしか含んではならず、したがって、費用のかかる様式で除去しなければならない化学物質であるからである。したがって、本発明による方法は、そのような界面活性剤（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００またはＢｒｉｊ−５８）が、タンパク質を折り畳むために用いられるＳｏｅｊｉｍａ他（２００１）の方法と比較して好都合である。言い換えれば、界面活性剤が、本発明による製造方法全体において何ら使用されず、したがって、本製造方法は界面活性剤非存在である。
【００９６】
工程ｃ：クロマトグラフィーによるｐｒｏＮＧＦ変異体の精製
変性および続くリフォールディングを伴う本発明による方法を行うことによって、折り畳まれたｐｒｏ−ＮＧＦムテインの水溶液が得られる。折り畳まれたｐｒｏ−ＮＧＦムテインは続いて、知られている方法によってさらに精製することができる。
【００９７】
好ましい実施形態において、ｐｒｏＮＧＦ変異体が、クロマトグラフィー精製により、具体的には混合モードのクロマトグラフィーによってリフォールディング溶液（例えば、非変性溶液または弱変性溶液）から精製される（本発明のｐｒｏＮＧＦ変異体からβＮＧＦを製造する方法の工程ｃ）。クロマトグラフィーのための最も好ましいカラムが、合成された親和性リガンドを有するカラムであり、好ましくは４−メルカプト−エチル−ピリジンを有するカラム（ＭＥＰ  Ｈｙｐｅｒｃｅｌｌ；Ｐａｌｌ）である。この媒体の利点は、結合がイオン強度に依存せず、塩スタッキングが必要でなく、かつ、プロセスを固定するためのより大きい流速が可能であるということである。さらに、溶出がｐＨ変化によって行われる。
【００９８】
他の混合モード物質カラムが知られており、使用され得るかもしれない。例えば、限定されるものではないが、ＭＥＰ（Ｐａｌｌ；親和性リガンドが４−メルカプトエチルピリジンである）、ＨＥＡ（Ｐａｌｌ；親和性リガンド：ヘキシルアミノ）、ＰＰＡ（Ｐａｌｌ、親和性リガンド：フェニルプロピルアミノ）、ＭＢＩ（Ｐａｌｌ；親和性リガンド：２−メルカプト−５ベンゾイミダゾールスルホ酸）、Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣ（ＧＥＨＣ）、Ｃａｐｔｏ  ａｄｈｅｒｅ（ＧＥＨＣ；親和性リガンド：Ｎ−ベンジル−Ｎ−メチルエタノールアミン）、ＣＨＴヒドロキシアパタイト（ＢｉｏＲａｄ）、ＣＨＴフルオロアパタイトがある。ＭＥＰカラム、ＨＥＡカラム、ＰＰＡカラムおよびＭＢＩカラムは疎水性結合を有し、これに対して、Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣは、混合モード官能性を有するカチオン交換体であり、Ｃａｐｔｏ  ａｄｈｅｒｅは、混合モード官能性を有するアニオン交換体である。ＢｉｏＲａｄ社のカラムは、疎水性成分を有するイオン交換カラムである。ここに列挙されない他の混合モード物質カラムはどれもがまた、ｐｒｏＮＧＦ変異体を精製するために使用され得る。
【００９９】
工程ｄ：β−ＮＧＦへのｐｒｏＮＧＦの切断
ｐｒｏＮＧＦはβ−ＮＧＦの前駆体である。したがって、本発明のｐｒｏＮＧＦ変異体からβ−ＮＧＦを製造する方法の工程ｄ）において、ｐｒｏＮＧＦ変異体のプロ配列が、活性なβ−ＮＧＦを得るために切断される。
【０１００】
トリプシン様の基質特異性を有するプロテアーゼは、タンパク質を、タンパク質分子の活性な部分を消化することなく切断する。トリプシン様プロテアーゼはペプチド結合を正荷電アミノ酸（例えば、アルギニンまたはリシンなど）の後で切断する。トリプシン様プロテアーゼとして、いくつかのセリンプロテアーゼ（セリンエンドペプチダーゼ）が、β−ＮＧＦを生じさせるためのｐｒｏＮＧＦのプロセシングのために検討される。好ましくは、セリンプロテアーゼのトリプシンがプロ配列の切断のために使用されるが、他のプロテアーゼが代わりに使用されてもよい。
【０１０１】
切断はトリプシンそのものに限定されるのではなく、トリプシン様の基質を有する他のプロテアーゼも同様に伴う場合があることは特筆される。一般に、ｐｒｏＮＧＦ対トリプシン（または他のプロテアーゼ）の比率が適切に調節されるならば、正しく折り畳まれた成熟型β−ＮＧＦはこのプロテアーゼによって切断されないであろう。対照的に、変性タンパク質、同様にまた、折り畳み中間体は、プロテアーゼによる攻撃を受けやすい配列を露出する。
【０１０２】
好ましくは、β−ＮＧＦへのｐｒｏＮＧＦ変異体の切断のために、トリプシン（または他のプロテアーゼ）のｐｒｏＮＧＦ変異体に対する比率は重量比で１：２００〜１：１００，０００であり、より好ましくは１：５，０００〜１：２０，０００であり、１：１０，０００（ｗ／ｗ）の比率が最も好ましい。最も好ましい実施形態においては、切断が室温で８時間〜２３時間行われ、１８時間が最も好ましい。本発明において使用される条件のもとでは、ｐｒｏＮＧＦ変異体が完全に切断され、副生成物がほとんど形成されない。凝集は何ら認められなかった。
【０１０３】
実施例において明確に記載されるように、本発明者らは、本発明のｐｒｏＮＧＦ変異体に導入されたアミノ酸改変により、望まれない切断部位におけるタンパク質の切断が回避されるだけでなく、予想外にも、野生型ｐｒｏＮＧＦの切断効率と比較して、トリプシンの切断の効率における大きな増大がもたらされ、これにより、切断を、非常に純粋な生成物を得るための非常に選択的な条件のもとで行うことが可能になることを見出している。
【０１０４】
詳しくは、実験データは、既に非常に低いトリプシン／タンパク質比（例えば、１：１００，０００など）において、本発明のｐｒｏＮＧＦ変異体（配列番号５）は非常に高純度の組換えヒトβ−ＮＧＦを高い切断収率（約８５％）でもたらすことを明瞭に示す。さらに、同じトリプシン／タンパク質比での野生型ｐｒｏＮＧＦ（配列番号１）は低い切断収率（約５％）を示す。満足できる収率は、はるかにより大きいトリプシン／タンパク質比（１／２５０）においてのみ得られるが、これには、過剰消化に起因する低い選択率および大きい生成物分解が伴う。
【０１０５】
工程ｅ：β−ＮＧＦのさらなる精製
本発明のｐｒｏＮＧＦ変異体から製造されるβ−ＮＧＦはさらに、例えば、いくつかのクロマトグラフィー方法によって精製される。さらなる精製工程が、トリプシンおよびトリプシン消化の生成物関連不純物をβ−ＮＧＦから分離するために要求される。精製工程は、ＨＣＰ、エンドトキシンおよびＤＮＡを減少させなければならない。タンパク質精製のためにこの技術分野で知られている方法はどれも使用することができる。最も好ましいものがクロマトグラフィー精製であり、例えば、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（例えば、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ）を用いたクロマトグラフィー精製である。
【０１０６】
ｐｒｏＮＧＦから製造される最終生成物のβ−ＮＧＦを、その純度に関して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ｒｐ−ＨＰＬＣ、ＳＥ−ＨＰＬＣおよびＩＥＸ−ＨＰＬＣによって分析した。ＨＰＬＣ分析により、少なくとも９７％のβ−ＮＧＦの純度が明らかにされた。
【０１０７】
本発明の好ましい実施形態において、β−ＮＧＦを得るために好適なｐｒｏ−ＮＧＦムテインを製造するための方法は下記の工程を含む：
ａ）置換されたプロテアーゼ切断部位を有する組換えｐｒｏ−ＮＧＦ変異体の原核生物細胞における発現；
ｂ）ｐｒｏ−ＮＧＦムテイン含有封入体の単離；
ｃ）封入体を、（ｉ）カオトロピック物質、（ｉｉ）キレーター、（ｉｉｉ）緩衝剤および（ｉｖ）還元剤を少なくとも含む好適な変性緩衝液と混合すること；
ｄ）シャペロン、金属キレーターおよびレドックスシャフリング系を少なくとも含むリフォールディング溶液におけるリフォールディング；
ｅ）リフォールディングされたｐｒｏ−ＮＧＦ変異体の精製；
ｆ）プロテアーゼ（例えば、トリプシンなど）を用いた、β−ＮＧＦから活性形態への切断；
ｇ）β−ＮＧＦの単離および精製。
【０１０８】
β−ＮＧＦを製造するためのｐｒｏＮＧＦの使用
第３の局面において、本発明は、ヒトβ−ＮＧＦを製造するための本発明のｐｒｏＮＧＦ変異体の使用に関する。
【０１０９】
本発明のｐｒｏＮＧＦ変異体から得られるβＮＧＦの医薬組成物
さらなる局面において、本発明は、生来的なプロテアーゼ切断部位Ｒ１ＳＫ３Ｒ４において、上記で記載されるようなヒト野生型ｐｒｏＮＧＦ配列（配列番号１）の１０１位および１０３位（Ｋ３およびＲ１）が置換されるｐｒｏＮＧＦ変異体から得られるβＮＧＦと、医薬的に許容されるキャリアとを含む医薬組成物に関する。
【０１１０】
本発明の１つの実施形態において、医薬的活性なβ−ＮＧＦが遺伝子治療法によって患者に投与される。遺伝子治療において、遺伝子（この場合には、β−ＮＧＦをコードする遺伝子）を患者に導入するために好適である２つの基本的な方法が利用可能である。
【０１１１】
エクスビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）適用において、β−ＮＧＦをコードする医薬的活性な遺伝子がベクターによって体細胞に導入され（この場合、体細胞は好ましくは、グリア細胞である）、この方法で処理された細胞がその後、例えば、マイクロ粒子またはナノ粒子によって患者に再導入される。特に好ましいものが、細胞ゲノムにおけるβ−ＮＧＦ遺伝子の特異的な組み込みである。
【０１１２】
インビボ遺伝子治療において、β−ＮＧＦ遺伝子が体内の標的細胞にベクターによって輸送され、例えば、一方では標的細胞に感染する場合があり、したがって、医薬的活性なβ−ＮＧＦ遺伝子を導入することができるが、他方では標的細胞内で自身を複製することができないウイルスによって輸送される。この取り組みでは、細胞膜と融合し得るナノ粒子またはマイクロ粒子、例えば、リポソームが、ベクターとして同様に使用される場合がある。
【０１１３】
β−ＮＧＦ遺伝子のためのベクターとして、宿主細胞に特異的に感染することができるか、または、標的細胞において抗原と免疫反応するウイルスまたは抗体が一例として使用され得る。ウイルスビヒクルとして、レトロウイルスが一例として使用されるかもしれない。さらに、アデノウイルスまたはワクシニア系ベクター、例えば、改変ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）を使用することが可能である。
【０１１４】
当業者は、常法的な検討に基づいて、好適な配合物を選択することができるであろうし、また、本発明の医薬組成物を患者に投与するための好適な形態を選定するであろう。例えば、医薬組成物は１つまたは複数の医薬的に許容される成分（例えば、キャリアまたは希釈剤）を含み得る。これらの種類の物質の中には、フィラー、塩、緩衝剤、安定剤、浸透強化剤および他の広く知られている材料が挙げられ得る。本発明の医薬組成物を配合するための様々な技術が、広く知られている標準的な教本において、例えば、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、最新版）に見出され得る。
【０１１５】
本発明において記載されるような製造方法によって得られるβＮＧＦの投薬量は、注入によって投与されるならば、０．１μｇ／ｋｇ体重〜５００μｇ／ｋｇ体重の範囲であるかもしれず、また、注射によって投与されるならば、２μｇ／ｋｇ体重〜２ｍｇ／ｋｇ体重であるかもしれない。
【図面の簡単な説明】
【０１１６】
【図１】本発明のｐｒｏ−ＮＧＦおよびｐｒｏ−ＮＧＦ変異体の配列を示す。太字で示されるのが、ヒトβ−ＮＧＦのプロ形態の配列である。太字で示される下線部がプロテアーゼ（トリプシン）切断部位である（配列番号１のアミノ酸１０１〜アミノ酸１０４；トリプシン切断部位が、アミノ酸１０１〜アミノ酸１０２の間（Ｒ１）、アミノ酸１０３〜アミノ酸１０４の間（Ｋ３）、および、アミノ酸１０４〜アミノ酸１０５の間（Ｒ４）である）。配列中のＸは任意のアミノ酸であることが可能である。図１ａは、プロテアーゼ切断部位ＲＳＫＲ（配列番号９）を有するヒトｐｒｏＮＧＦの配列（配列番号１）を示す。図１ｂは、プロテアーゼ切断部位ＶＳＸＲ（配列番号１０）を有する本発明のｐｒｏＮＧＦ変異体の配列（配列番号２）を示す。図１ｃは、プロテアーゼ切断部位をＸＳＸＲ（配列番号１１）に変異させた本発明のｐｒｏＮＧＦ変異体の配列（配列番号３）を示す。図１ｄは、プロテアーゼ切断部位をＸＳＡＲ（配列番号１２）に変異させた本発明のｐｒｏＮＧＦ変異体の配列（配列番号４）を示す。図１ｅは、プロテアーゼ切断部位をＶＳＡＲ（配列番号１３）に変異させた本発明のｐｒｏＮＧＦ変異体の配列（配列番号５）を示す。図１ｆは、プロテアーゼ切断部位をＸＸＸＲ（配列番号１４）に変異させた本発明のｐｒｏＮＧＦ変異体の配列（配列番号７）を示す。図１ｇは、プロテアーゼ切断部位をＶＸＡＲ（配列番号１５）に変異させた本発明のｐｒｏＮＧＦ変異体の配列（配列番号８）を示す。図１ｈは、プロテアーゼ切断部位の配列（配列番号６、９〜１５）を示す。
【図２】β−ＮＧＦへのｐｒｏＮＧＦまたはｐｒｏＮＧＦ変異体のプロセシングを示す。図２ａは、生来的なフリン切断部位ＲＳＫＲを有する野生型ｐｒｏＮＧＦを使用することによるトリプシン切断の後の６つのβＮＧＦ切断生成物を示す。図は、βＮＧＦへの野生型ｐｒｏＮＧＦの切断により、多くの異なる切断生成物の不均質な混合物が生じることを明瞭に示す。図２ｂは、生来的なフリン切断部位の欠失を有するｐｒｏＮＧＦ変異体ＳＰ１７４−１０１（配列番号５）を使用することによるトリプシン切断の後における生来型βＮＧＦの切断生成物を示す。プロテアーゼ切断部位ＲＳＫＲ（配列番号９）が、ＶＳＡＲ（配列番号１２）の部位を生じさせるために２つのアミノ酸によって置換された。この部位は１０４位におけるアミノ酸のアルギニンの後でプロテアーゼによって切断され得るだけである；トリプシンは（３つの切断部位の代わりに）１つの切断部位で切断することができるだけである。図は、β−ＮＧＦへの変異型ｐｒｏＮＧＦ  ＳＰ１７４−１０１（配列番号５）の切断により、１つだけの均質な切断生成物（β−ＮＧＦ）が生じることを明瞭に示す。
【図３】ｐｒｏＮＧＦ変異体ＳＰ１７４−１０１（配列番号５）のリフォールディングを野生型ｐｒｏＮＧＦと比較して示す。図は、野生型ｐｒｏＮＧＦのリフォールディング収率（実線）と、プロテアーゼ切断部位をＶＳＡＲに変異させたｐｒｏＮＧＦ変異体のリフォールディング収率（破線）とを比較する。野生型ｐｒｏＮＧＦおよび変異型ｐｒｏＮＧＦのリフォールディング効率が同一であることを図から明瞭に認めることができる。
【図４】プロテアーゼ切断部位をＶＳＡＲ（配列番号５）に変異させたｐｒｏＮＧＦ変異体ＳＰ１７４−１０１の、ＭＥＰ  ＨｙｐｅｒＣｅｌカラムによる精製を示す。図は、リフォールディングおよびろ過が行われたｐｒｏＮＧＦ変異体のＭＥＰ  ＨｙｐｅｒＣｅｌ精製の溶出プロフィルを示す。
【図５】プロテアーゼ切断部位をＶＳＡＲ（配列番号５）に変異させたｐｒｏＮＧＦ変異体ＳＰ１７４−１０１のトリプシンによる切断を示す。図は、トリプシン切断の分画物のクーマシー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。ｐｒｏＮＧＦ変異体のトリプシン切断生成物をレーン４〜レーン７において認めることができる。図は、精製されたｐｒｏＮＧＦ変異体が１つだけの切断生成物（β−ＮＧＦ）をもたらすことを明瞭に示す。
【図６】β−ＮＧＦの精製を示す。図は、トリプシン切断の後における、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰカラムのプロフィルを示す。トリプシン消化反応液を、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰカラムにロードした。溶出を３工程で行った（ａ．２５％の２５ｍＭリン酸ナトリウム、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．５（緩衝液Ｂ）；ｂ．２５％から５０％への緩衝液Ｂの直線グラジエントで；ｃ．１００％の緩衝液Ｂ（流速、６０ｃｍ／ｈ））。
【実施例】
【０１１７】
下記の実施例が、本発明の方法および組成物がどのように構成され、また、使用されるかの完全な開示および記載を当業者に提供するように提示される。下記の実施例は、本発明者らが発明と見なすことの範囲を限定するために意図されない。様々な努力が、使用されている数字に関して正確性を確保するためになされているが、いくらかの実験誤差およびずれを認めなければならない。別途示される場合を除き、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏度であり、圧力は大気圧または大気圧付近である。
【０１１８】
実施例１．１０１位〜１０４位でのプロテアーゼ切断部位（Ｒ１ＳＫ３Ｒ４）における野生型ｐｒｏＮＧＦの置換
ヒトｐｒｏ−ＮＧＦ（配列番号１）の１０１位および１０３位に対応するアルギニンＲ１およびリシンＫ３の置換を、当業者に知られている方法によって合成遺伝子を使用してＤＮＡレベルで実現した。１０２位におけるセリンは未変化のままであったか、または、ヒトｐｒｏ−ＮＧＦ（配列番号１）の１０２位の置換もまた、当業者に知られているような方法によって合成遺伝子を使用してＤＮＡレベルで実現した。１０４位に対応するリシンＫ４は置換されなかった。配列を図１に示す。
【０１１９】
実施例２．原核生物細胞におけるｐｒｏＮＧＦ変異体ＳＰ１７４−１０１（配列番号５）の組換え発現
ｒｈ−ｐｒｏＮＧＦの発現のために使用される細菌宿主の大腸菌ＪＭ１０８（ＤＳＭＺ５５８５；Ｆ−  ｔｈｉ  Δ（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ）  ｅｎｄＡＩ  ｇｙｒＡ９６、ｒｅｌＡ１  ｐｈｘ  ｈｓｄＲ１７  ｓｕｐＥ４４  ｒｅｃＡ）はプロリン要求性であり、これは、ｐＳＣＩＬ１０１の名称を有するプラスミドの使用によって中和された。プラスミドｐＳＣＩＬ１０１はプラスミドｐＳＣＩＬ００８に基づく（国際公開第０５０６１７１６号パンフレットを参照のこと）。この菌株はチアミンを合成することができない（Ｖｉｅｉｒａ＆Ｍｅｓｓｉｎｇ、１９８２、Ｇｅｎｅ、Ｏｃｔ；１９（３）：２５９〜６８）。配列番号５で示されるｐｒｏ−ＮＧＦ変異体が、ｐＳＣＩＬ１０１に置かれるｔａｃプロモーターの制御のもとで発現させられる。この場合に使用されるベクターｐＳＣＩＬ１０１は、カナマイシン抵抗性を有する高コピー型プラスミドである。発現を、規定された無機塩培地で行い、ＩＰＴＧの添加によって誘導する。ｐｒｏ−ＮＧＦ変異体が封入体（ＩＢ）の形態で細胞質ゾルに堆積する。
【０１２０】
細胞株：
・宿主株、例えば、大腸菌ＨＭＳ１７４（Ｋ１２）または同ＪＭ１０８（Ｋ１２）
・ｐｒｏＮＧＦ変異体ＳＰ１７４−１０１（配列番号５）
・ｔａｃプロモーター（ＩＰＴＧ誘導）
・ＣｏｌＥ１レプリコン
・カナマイシン抵抗性
・ｐｒｏＢＡ選抜
・自社開発のベクターシステムｐＳＣＩＬ１０１（例えば、国際公開第０５／０６１７１６号パンフレットを参照のこと）
【０１２１】
実施例３．発酵
この発酵の目的は、その後のプロセス工程のための生成物およびバイオマスを得ることであった。発酵プロセス期間中の標的タンパク質の過剰発現をモニターするために、サンプルを誘導の前後でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
・抗生物質を含まない無機塩培地
・回分期μ≒０．２５ｈ−１（ＯＤｅｎｄ＝１８）
・流加培養期Ｉ、μｓｅｔ＝０．１８ｈ−１による指数関数的供給
・流加培養期ＩＩ：一定の供給速度
・誘導時ＯＤＩｉｎｄ＝６０±５
・１．０ｍＭ  ＩＰＴＧ
・誘導時間  ５ｈ
・最終ＯＤ＝８２±４
・プロセス時間  ２８．５ｈ±１．２５
・プラスミド安定性  １００％
・収量：４０ｍｇ／ｇのｐｒｏＮＧＦ；１，２ｇ／Ｌ±０．２ｇ／ＬのｐｒｏＮＧＦ
【０１２２】
実施例４．ＳＰ１７４−１０１を含有する封入体の一次回収
細菌細胞中に、組換えタンパク質が凝集物の形態で存在する。ｐｒｏ−ＮＧＦムテインの発現がＩＢの形態で生じた。細胞破壊およびＩＢ調製を標準的プロトコルに従って行った。細胞破壊およびＩＢ調製は、およそ２００ｇまでのバイオマスを処理することであれば実験室スケールで行うことができる。ｐｒｏＮＧＦムテインを含有するこれらの「封入体」の調製を、Ｒｕｄｏｌｐｈ，Ｒ．他（１９８７）；Ｆｏｌｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔ．Ｅ．（編）：Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、５７頁〜９９頁）に従って、また、欧州特許第０９９４１８８Ｂ１号明細書に従って行った。細胞破砕のために、細胞ペレットを好適な緩衝液に再懸濁し、続いて、細胞を、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡにおける高圧均質化を使用して破砕した。
【０１２３】
実施例５．ｐｒｏＮＧＦ変異体ＳＰ１７４−１０１を変性溶液に溶解すること（封入体の可溶化）
封入体を、（ｉ）カオトロピック剤、（ｉｉ）キレーター、（ｉｉｉ）緩衝剤および（ｉｖ）還元剤の溶液を含む変性溶液において可溶化した。可溶化のために、グアニジウムＨＣｌ（ＧｕａＨＣｌ）を４．０Ｍ〜６．０Ｍの濃度範囲で試験した。可溶化緩衝液を封入体スラリー（ＩＢスラリー）と種々の比率で混合した。すべての実験が５ｍＭの最終システイン濃度を有し、室温で行った。結果をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した（データは示されず）。実験により、４ＭのＧｕａＨＣｌの濃度が封入体の完全な可溶化のために十分であったことが明らかにされた。封入体スラリー対緩衝液の比率は１＋１．２５（ｖ／ｖ）（ＩＢスラリー：緩衝液）である。封入体を可溶化するための変性溶液の最終的条件は下記の通りであった：
ｉ．      ４ＭのグアニジウムＨＣｌ
ｉｉ．    ０．１ＭのＴｒｉｓ
ｉｉｉ．  １０ｍＭのＥＤＴＡ
ｉｖ．    ５ｍＭのシステイン
ｖ．      ｐＨ８．０
【０１２４】
可溶化物を標準的手順に従う深層ろ過によって清澄化する。
【０１２５】
その後、タンパク質濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄの方法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ｍ．Ｍ．、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、７２（１９７６）、２４８）を使用して求めた。ｐｒｏＮＧＦムテインのタンパク質濃度は１０ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌの間であった。
【０１２６】
実施例６．ｐｒｏＮＧＦ変異体ＳＰ１７４−１０１を、変性されたｐｒｏＮＧＦが生物学的に活性な立体配座を取るリフォールディング緩衝液に移すこと
可溶化後、タンパク質をその生来的な立体配座でリフォールディングし、それにより、誤った折り畳みおよび凝集を最小限に抑えることが必要である。本発明による生物学的に活性なｐｒｏＮＧＦムテインを可溶化された材料から調製するために、これらを、ｐｒｏＮＧＦが生物学的に活性な立体配座を取るリフォールディング溶液に希釈した。
【０１２７】
ＩＢスラリーに基づく可溶化物のための最終的なリフォールディング溶液は下記のものを含んだ：
ｉ．      ０．７５Ｍのアルギニン
ｉｉ．    ５ｍＭのＥＤＴＡ
ｉｉｉ．  １ｍＭのＬ−シスチンおよび５ｍＭのＬ−システイン
ｉｖ．    ｐＨ９．５
【０１２８】
ＮＧＦが活性な立体配座で得られることを、成熟型ヒトβ−ＮＧＦに存在するジスルフィド架橋の存在によって確認した。
【０１２９】
リフォールディングプロセスにおけるタンパク質濃度を増大させるために、パルス再生を行った。パルスを５０μｇ／ｍｌのｐｒｏＮＧＦ変異体タンパク質あたり１時間毎に与えた。溶液におけるグアニジウムＨＣｌの濃度は０．３Ｍを超えてはならない。このことを達成するために、１５回のパルスが必要であった。清澄化されたリフォールディング後の画分をさらなるカラムへのロードの前にろ過した。
【０１３０】
リフォールディング反応の成績をｒｐ−ＨＰＬＣによってパルス毎にその後分析した。得られたピーク面積をパルスの回数に対してブロットした。ｒｐ−ＨＰＬＣのために、ガードカラム（例えば、２１４ＧＫ５４；３００Å；Ｖｙｄａｃ）を伴う逆相カラム（例えば、２１４ＭＳ５４、４．６×２５０ｍｍ；３００Å、５μｍ、Ｖｙｄａｃ）を使用した。操作用緩衝液は、０．０５％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含むＨ２Ｏ、および、０．０５％のＴＦＡを含むアセトニトリルであった。流速は１ｍＬ／分であった。結果を図３に示す。野生型ｐｒｏＮＧＦおよび変異型ｐｒｏＮＧＦのリフォールディング効率が同一であることを図３から認めることができる。
【０１３１】
実施例７．ｐｒｏＮＧＦ変異体ＳＰ１７４−１０１を混合モード物質カラムによりリフォールディング溶液から精製すること
合成された親和性リガンド、すなわち、４−メルカプト−エチル−ピリジン（ＭＥＰ）を有するカラムを使用した。溶出を、ｐＨ値を変化させることによって行った。さらに、溶出を、効率的なプロセス設計のために有利である低い塩濃度により行った。
【０１３２】
カラムを、０．７５Ｍのアルギニン、５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ９．５により平衡化した。清澄化されたリフォールディング反応液を、１Ｌのカラム媒体あたり５ｇのｐｒｏＮＧＦ変異体の最大負荷容量を有するＭＥＰ  ＨｙｐｅｒＣｅｌカラム（Ｐａｌｌ）に負荷した。洗浄工程において、ほとんどの不純物および非結合のタンパク質を、緩衝液の２ＭのＧｕａＨＣｌ、０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）および１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を使用することによって取り除いた。溶出を、５０ｍＭ酢酸塩（ｐＨ４．０）の０％から７０％への直線グラジエントで行った（流速、１２０ｃｍ／ｈ）。図４は、リフォールディングおよび精製が行われた、プロテアーゼ切断部位がＶＳＡＲに変異させられる本発明のｐｒｏＮＧＦ変異体（配列番号５）の、ＭＥＰ  ＨｙｐｅｒＣｅｌ精製の溶出プロフィルを示す。ＧｕａＨＣｌ洗浄工程において、「多くの」不純物が除かれた。「プール」において、約６０％〜７０％のｐｒｏＮＧＦ変異体が回収された。
【０１３３】
実施例８．活性なヒトβ−ＮＧＦを得るためにｐｒｏＮＧＦ変異体ＳＰ１７４−１０１を切断すること
β−ＮＧＦへのｐｒｏＮＧＦ変異体のトリプシン消化のために、プロテアーゼの活性を阻害しないリン酸塩緩衝液を使用した。リン酸ナトリウム緩衝液を２５ｍＭリン酸ナトリウムの最終濃度にＭＥＰ溶出液に加えた。ｐＨ値をｐＨ６．５に調節した。タンパク質分解のために、トリプシン（Ｒｏｃｈｅ、ＧＭＰ規格）を１：１０，０００（ｗ／ｗ）（トリプシン：ｐｒｏＮＧＦ）の比率で加えた。タンパク質分解を、室温での１８時間のインキュベーション時間を使用して行った。トリプシン消化の成績および収率を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ｒｐ−ＨＰＬＣおよびＵＶ／ＶＩＳ２８０ｎｍによって分析した。図５は、トリプシン切断の分画物のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。４％〜１２％のＢｉｓ／Ｔｒｉｓ−Ｇｅｌ（１ｍｍ、泳動緩衝液としての１×ＭＥＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を使用した。レーン５〜レーン７が、トリプシン切断生成物を、非切断のｐｒｏＮＧＦ変異体（ｒｈｐｒｏＮＧＦ＊、レーン３を参照のこと）および成熟型β−ＮＧＦ（ＮＧＦ、レーン８を参照のこと）と比較して示す。図は、精製されたｐｒｏＮＧＦ変異体が１つだけの切断生成物（β−ＮＧＦ）をもたらすことを明瞭に示す。β−ＮＧＦへのｐｒｏＮＧＦ変異体の完全な消化を認めることができた。
【０１３４】
実施例９．活性なβＮＧＦの精製
トリプシン消化後、β−ＮＧＦを、トリプシン、切断の副生成物およびさらなる不純物を取り除くために、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰカラムにロードした。ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰによる精製を図６に示す。
【０１３５】
カラムを２５ｍＭのリン酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ６．５）により平衡化した。トリプシン消化反応液を、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰカラム（１Ｌの媒体あたり２ｇのβ−ＮＧＦ）にロードし、非結合のタンパク質を平衡化緩衝液により洗浄した。溶出を３工程で行った（３ｃｖの２５％の２５ｍＭリン酸Ｎａ（ｐＨ６．５）／１Ｍ  ＮａＣｌ（緩衝液Ｂ）、２５％から５０％への緩衝液Ｂの直線グラジエントでの１０ｃｖ、および、３ｃｖの１００％の緩衝液Ｂ（流速、６０ｃｍ／ｈ））。
【０１３６】
図６はβ−ＮＧＦの精製を示す。図は、トリプシン切断を行った後における、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰカラムのプロフィルを示す。β−ＮＧＦの収率が８５％〜９５％であった（ピーク「サンプル溶出」）。
【０１３７】
実施例１０．変異型ＳＰ１７４−１０１および野生型のｐｒｏＮＧＦに対するトリプシンの切断効率
本手順をｐｒｏＮＧＦ変異体ＳＰ１７４−１０１（配列番号５）およびヒト野生型ｐｒｏＮＧＦ（配列番号１；ｒｈＰｒｏＮＧＦ）の両方について並行して適用した。
【０１３８】
５ｍＬの精製されたｒｈＰｒｏＮＧＦを２５ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ６．５）に対して透析した。透析後、０．０８ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度がＨＰＬＣ−ＵＶによって測定された。消化サンプルあたり、８０μｇのｐｒｏＮＧＦを用いた。タンパク質分解後、すべてのサンプルをＨＰＬＣ−ＵＶによって分析した。
【０１３９】
トリプシン／ｒｈＰｒｏＮＧＦ変異体の１／１０，０００（ｗ／ｗ）の質量比を使用し、一方、トリプシン／ｒｈＰｒｏＮＧＦ野生型の異なる質量比を使用した（表３を参照のこと）。トリプシン溶液として、１．０μｇ／ｍＬおよび１０μｇ／ｍＬを使用した。インキュベーションを室温で一晩（約１７時間）行った後、すべてのサンプルを分析した。コントロールのためのプロテアーゼ非添加のネズミイルカｒｈＰｒｏＮＧＦ変異体もまたインキュベーションした。
【０１４０】
【表３】
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【０１４１】
すべてのトリプシン消化物の成績および収率を、Ｖｙｄａｃ  ２１４ＭＳ  Ｃ４カラムを使用してＨＰＬＣ−ＵＶによって行った。
【０１４２】
表４は、トリプシン消化後に得られる切断収率を示す。実験データは、トリプシンによるｐｒｏＮＧＦ変異体（配列番号５）の切断が、非常に低いトリプシン／タンパク質比（１／１０，０００）する場合、ただ１つの生成物（β−ＮＧＦ）を大きい切断収率（約８５％）でもたらすことを明瞭に示す。これは、低いトリプシン／タンパク質比（１／１０，０００）での低い切断収率（約５％にすぎない）と、大きいトリプシン／タンパク質比（１／２５０）での（過剰消化された）大きい生成物分解とを示す野生型ｐｒｏＮＧＦ（配列番号１）の切断と比較することができる。
【０１４３】
【表４】
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【０１４４】
実施例１１．ＴＦ１細胞増殖の刺激によるｐｒｏＮＧＦの生物学的活性のための試験
ＴＦ１細胞（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＣＲＬ２００３）を標準的手順に従って培養した。試験培地（９０％の培地ＲＰＭＩ１６４０、１０％のウシ胎児血清ＦＢＳ、５０Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン）を細胞に加え、遠心分離した。ペレットを、３７℃で、試験培地に１．５・１０５細胞／ｍｌの密度で再懸濁した。細胞懸濁物をｐｒｏＮＧＦタンパク質の種々の濃度物（１０−１０Ｍ、３・１０−１０Ｍ、１０−９Ｍ、３・１０−９Ｍ、１０−８Ｍ、３・１０−８Ｍ、１０−７Ｍ、３・１０−７Ｍ、１０−６Ｍ、３・１０−６Ｍ、１０−５Ｍおよび３・１０−５Ｍ）と混合し、９６ウエルプレートで分析した。３７℃で４８時間のインキュベーションの後、細胞増殖試薬（例えば、ＷＳＴ−１、Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号１６４４８０７）を加え、プレートを、３７℃で４時間、再びインキュベーションした。吸収を４５０ｎｍで測定し、ＥＣ５０値を、好適なプログラム（例えば、Ｓｉｇｍａ−Ｐｌｏｔ  ２０００）を使用することによって求めた。
【図１】
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【図４】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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