(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
歯周炎の原因細胞である歯周炎患者の歯肉に由来するコラーゲン分解能の高い線維芽細胞（以下、アグレッシブ線維芽細胞という。）の特定方法であって、
歯肉由来の線維芽細胞において、
ＲＵＮＸ２のＰ１プロモーターからの発現量及び／又はＤＬＸ５の発現量が所定の値より低いことを特徴とする特定方法。
【請求項２】
請求項１記載のアグレッシブ線維芽細胞の特定方法であって、
さらに、ＦＬＴ１発現量が所定の値より高いことを特徴とする特定方法。
【請求項３】
請求項１又は２記載のアグレッシブ線維芽細胞の特定方法であって、
前記発現量は、遺伝子及び／又はタンパク質の発現量を測定することを特徴とする特定方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項記載のアグレッシブ線維芽細胞の特定方法であって、
前記発現量を配列番号２及び４のプライマーセット、配列番号７及び８のプライマーセット、配列番号９及び１０のプライマーセットの少なくとも1つ以上により測定することを特徴とする特定方法。
【請求項５】
歯周炎治療薬のスクリーニング方法であって、
歯周炎患者の歯肉に由来するコラーゲン分解能の高い線維芽細胞（以下、アグレッシブ線維芽細胞という。）に被験物質を接触させ、
ＲＵＮＸ２のＰ１プロモーターからの発現量及び／又はＤＬＸ５の発現量の増加を指標とすることを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項６】
請求項５記載のスクリーニング方法であって、
さらに、ＦＬＴ１の発現量低下を指標とすることを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項７】
請求項５又は６記載のスクリーニング方法であって、
前記発現量は、遺伝子及び／又はタンパク質の発現量を測定することを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項８】
請求項５〜７のいずれか１項記載のスクリーニング方法であって、
前記発現量を配列番号２及び４のプライマーセット、配列番号７及び８のプライマーセット、配列番号９及び１０のプライマーセットの少なくとも1つ以上により測定することを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項９】
歯周炎の検査方法であって、
患者から採取された歯肉由来の線維芽細胞のＲＵＮＸ２のＰ１プロモーターからの発現量及び／又はＤＬＸ５の発現量を測定し、
所定の値より低い場合に歯周炎のリスクが高いと判定することを特徴とする検査方法。
【請求項１０】
請求項９記載の検査方法であって、
さらに、ＦＬＴ１発現量が所定の値より高い場合に歯周炎のリスクが高いと判定することを特徴とする検査方法。
【請求項１１】
請求項９又は１０記載の検査方法であって、
前記発現量は、遺伝子及び／又はタンパク質の発現量であることを特徴とする検査方法。
【請求項１２】
請求項９〜１１のいずれか１項記載の検査方法であって、
前記発現量を配列番号２及び４のプライマーセット、配列番号７及び８のプライマーセット、配列番号９及び１０のプライマーセットの1つ以上により定量することを特徴とする検査方法。
【請求項１３】
歯周炎の診断キットであって、
少なくとも配列番号２及び４のプライマーセット、又は配列番号７及び８のプライマーセットと、
定量に必要な試薬を含むことを特徴とする検査キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規の分子マーカーを用いた歯周炎原因細胞の判別方法、及び歯周炎治療薬のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
歯周病はう蝕とともに、歯の二大疾患である。歯周病は歯肉炎と歯周炎とに分けられるが、最終的な歯の喪失に至るのは、いわゆる歯槽膿漏といわれる歯周炎である。歯周病は世界で最も多い疾患であるともいわれ、我が国でも成人の約８割が罹患しているとされる。歯喪失の４２％は歯周炎によると報告されており、歯喪失の重要な原因でもある。
【０００３】
保持歯数は全身の健康状態とも密接に関連することが指摘されており、歯周炎の治療と予防は歯科分野だけではなく、医療全般の問題ともなる。歯科保健の分野では、高齢者においても歯の喪失が１０歯以下であれば、食生活に大きな支障を生じないとの研究に基づき、「８０歳になっても自分の歯を２０本以上保とう」という８０２０（ハチマル・ニイマル）運動が提唱、推進されている。８０２０運動は１９８９年より、厚生省（当時）と日本歯科医師会が推進している運動である。しかしながら、２０１１年の調査では達成率は３８．３％であり、前回調査時（２００５年）の２４．１％に比べ大幅に達成率が上昇しているとはいえ、いまだに低い数値を推移している。
【０００４】
歯周炎の原因は、これまで歯肉炎同様、細菌感染であると考えられていたことから、現在の治療法としては、抗菌、抗炎症などの対症療法が主流である。また、プラークコントロール、スケーリング等の歯周基本治療、外科的に歯周ポケットの深さを減少させる手術が行われている。
【０００５】
歯肉炎は歯磨きの習慣と相関があり、歯肉炎の原因は歯に付いた細菌性プラークであるという研究結果から、細菌が原因であると考えられる（非特許文献１）。しかしながら、コッホの４原則を満たす歯周病菌が単離されておらず、動物モデルを作ることができないこと、細菌感染が原因であることが明らかになっている歯肉炎から歯周炎に移行する患者は１５％程度しかいないこと、歯を磨く習慣のある集団と磨かない集団とで、重度歯周炎の罹患率が変わらない等、歯周炎の原因は細菌であると考えると説明のつかないことが多い。
【０００６】
図１Ａは歯周組織を模式的に示したものであり、左半分は健康な歯の状態を、右半分は歯周炎に罹患した歯の状態を示したものである。歯根と歯槽骨の間には、歯根膜というコラーゲン線維でできた靭帯が存在し、歯根と歯槽骨を強固につなげている。歯周炎によって歯槽骨のミネラル分は吸収されるが（図１Ａ右、歯周炎の部分参照）、それだけでは歯根膜は失われない。また、歯を失うことにもならない。歯喪失につながるのは、いわゆる歯周ポケットの部分から、歯根膜が溶解することにより、歯と骨との間のコラーゲンによる付着がなくなり、歯根と歯槽骨の間に上皮細胞が入り込み、やがて根尖まで到達することが原因となる。
【０００７】
本発明者らは、歯周炎の研究の過程で、重度歯周炎患者の歯肉由来の線維芽細胞をコラーゲンゲル三次元細胞培養法によって培養を行うと、培地であるゲルのコラーゲンが分解され小さくなるということを見出した。図１Ｂに重度歯周炎患者、軽度歯周炎患者、健常者の歯肉から単離した歯肉線維芽細胞を三次元ゲルで培養した結果を示している。重度歯周炎患者の歯肉由来の線維芽細胞を三次元細胞培養すると、矢印で示したように、培地のコラーゲンが分解され、小さくゲルが収縮する。本願発明者らは、このコラーゲン分解能の高い線維芽細胞をアグレッシブ線維芽細胞と名付けて、以下の理由から歯周炎の主因である可能性が高いと考えている。
（１）現在までに５０症例以上の歯周炎患者より、アグレッシブ線維芽細胞の単離を試みているが、すべての歯周炎患者歯肉からアグレッシブ線維芽細胞は単離できている。
（２）アグレッシブ線維芽細胞はコラーゲン分解能が高いことから、歯と骨との間に存在するコラーゲンを主成分とする歯根膜を分解する原因となっていると考えられる。
（３）プラーク付着量が少なく、炎症の程度は軽いが、付着の急速な消失が起こる疾患である侵襲性歯周炎罹患歯肉からは、コラーゲン分解能の非常に高いアグレッシブ線維芽細胞が分離できる。
（４）歯周炎では、同じ歯でも病態がとくに進行した部分がある。これを歯周炎の部位特異性というが、アグレッシブ線維芽細胞が存在することで歯周炎の部位特異性を説明できる。
【０００８】
上記の理由から、アグレッシブ線維芽細胞が歯周炎の一因であると考えられる。そして、本発明者らはすでに歯周組織破壊を抑制、改善する有効成分をスクリーニングする方法を開示するとともに、コラーゲン分解阻害剤を有効成分とする治療薬を開発している（特許文献１、２）。
【０００９】
しかしながら、アグレッシブ線維芽細胞を特定するのには培養時間が長期にわたり必要であることから、短時間でアグレッシブ線維芽細胞を特定する方法が望まれていた。また、新しい治療薬、診断方法等を提供するためにアグレッシブ線維芽細胞で特異的な発現パターンを示す遺伝子の解析も望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２０１０−２２０５６１号公報
【特許文献２】特開２０１１−２５６１３６号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｌoeｅ et al., 1965, J. Periodontol., Vol.36,pp.177-187
【非特許文献２】Ohshima et al., 1994, J. Periodontal.Res., Vol.29, pp.421-429
【非特許文献３】Ohshima et al., 2008, J. Periodontol., Vol.79, pp.912-918
【非特許文献４】Ohshima et al., 2010, J. Dent. Res., Vol.89(11), pp.1315-1321
【非特許文献５】Chang, H.Y.et al., 2002, PNAS,Vol.90(20), pp.12877-12882
【非特許文献６】Lipson,D., et al., Nat.Biotechnol. 2009 Vol.27, pp.652-658
【非特許文献７】Komori, T., et al., 1997, Cell, Vol.89(5), p.755-764
【非特許文献８】Camilleri S., et al., 2006, Eur. J. Oral. Sci., Vol.114, pp.361-373
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、歯周炎の原因細胞であるアグレッシブ線維芽細胞のマーカーを探索し、当該マーカーの発現を指標として、歯周炎原因細胞を特定するとともに、新たな治療薬を探索するためのスクリーニング方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、以下に示すアグレッシブ線維芽細胞の特定方法、歯周炎の治療薬のスクリーニング方法、検査方法、及び検査キットに関する。
（１）歯周炎の原因細胞であるアグレッシブ線維芽細胞の特定方法であって、
ＲＵＮＸ２のＰ１からの発現量及び／又はＤＬＸ５の発現量が所定の値より低いことを特徴とする特定方法。
（２）上記（１）記載のアグレッシブ線維芽細胞の特定方法であって、
さらに、ＦＬＴ１発現量が所定の値より高いことを特徴とする特定方法。
（３）上記（１）又は（２）記載のアグレッシブ線維芽細胞の特定方法であって、
前記発現量は、遺伝子及び／又はタンパク質の発現量を測定することを特徴とする特定方法。
（４）上記（１）〜（３）のいずれか記載のアグレッシブ線維芽細胞の特定方法であって、
前記発現量を配列番号２及び４のプライマーセット、配列番号７及び８のプライマーセット、配列番号９及び１０のプライマーセットの少なくとも1つ以上により測定することを特徴とする特定方法。
（５）歯周炎治療薬のスクリーニング方法であって、
細胞に被験物質を接触させ、
ＲＵＮＸ２のＰ１からの発現量及び／又はＤＬＸ５の発現量の増加を指標とすることを特徴とするスクリーニング方法。
（６）上記（５）記載のスクリーニング方法であって、
さらに、ＦＬＴ１の発現量の低下を指標とすることを特徴とするスクリーニング方法。
（７）上記（５）又は（６）記載のスクリーニング方法であって、
前記細胞はアグレッシブ線維芽細胞であることを特徴とするスクリーニング方法。
（８）上記（５）〜（７）のいずれか記載のスクリーニング方法であって、
前記発現量は、遺伝子及び／又はタンパク質の発現量を測定することを特徴とするスクリーニング方法。
（９）上記（５）〜（８）のいずれか記載のスクリーニング方法であって、
前記発現量を配列番号２及び４のプライマーセット、配列番号７及び８のプライマーセット、配列番号９及び１０のプライマーセットの少なくとも1つ以上により測定することを特徴とするスクリーニング方法。
（１０）歯周炎の検査方法であって、
患者から採取された検体のＲＵＮＸ２のＰ１からの発現量及び／又はＤＬＸ５の発現量を測定し、
所定の値より低い場合に歯周炎のリスクが高いと判定することを特徴とする検査方法。
（１１）上記（１０）記載の検査方法であって、
さらに、ＦＬＴ１の発現量が所定の値より高い場合に歯周炎のリスクが高いと判定することを特徴とする検査方法。
（１２）上記（１０）又は（１１）記載の検査方法であって、
前記発現量は、遺伝子及び／又はタンパク質の発現量であることを特徴とする検査方法。
（１３）上記（１０）〜（１２）のいずれか記載の検査方法であって、
前記発現量を配列番号２及び４記載のプライマーセット、配列番号７及び８のプライマーセット、配列番号９及び１０のプライマーセットの1つ以上により定量することを特徴とする検査方法。
（１４）歯周炎の診断キットであって、
配列番号２及び４のプライマーセット、配列番号７及び８のプライマーセット、配列番号９及び１０のプライマーセットの少なくとも1つ以上のプライマーセットと、
定量に必要な試薬を含むことを特徴とする検査キット。
【発明の効果】
【００１４】
新規の歯周炎原因細胞であるアグレッシブ線維芽細胞の新しい遺伝子マーカーを見出したことにより、これらの発現を指標としてアグレッシブ線維芽細胞を迅速に選別することが可能となる。また、歯周炎の治療薬をスクリーニングすることが可能となる。さらに、新たな検査方法、検査キットを作製することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１Ａは、健康な歯周組織及び歯周炎の歯周組織を模式的に示す。図１Ｂ及び図１Ｃは、歯周炎患者、又は健常者から単離された線維芽細胞を三次元細胞培養したコラーゲンゲルの収縮の程度を示す写真である。
【図２】図２Ａは種々の線維芽細胞の相関プロット、図２Ｂは、アグレッシブ線維芽細胞と歯根膜線維芽細胞のＭＡプロットを示す図。
【図３】図３Ａは、アグレッシブ線維芽細胞、正常歯肉線維芽細胞のＭＡプロットを示す図。図３Ｂは、歯周病患者のアグレッシブ線維芽細胞、正常歯肉線維芽細胞のＲＵＮＸ２のＰ１プロモーター、Ｐ２プロモーターからの遺伝子発現プロファイルを示す図。
【図４】種々の初代培養線維芽細胞でのＲＵＮＸ２のＰ１プロモーター、Ｐ２プロモーターからの遺伝子発現プロファイルを示す図。
【図５】同一の歯周病患者のアグレッシブ線維芽細胞、正常歯肉線維芽細胞のＤＬＸ５、ＲＵＮＸ２のＰ１プロモーター、Ｐ２プロモーターからの遺伝子発現プロファイルを示す図。
【図６】アグレッシブ線維芽細胞、正常歯肉線維芽細胞、歯根膜線維芽細胞におけるＲＵＮＸ２Ｐ１、Ｐ２プロモーターからの発現、ＦＬＴ１、ＤＬＸ５の発現を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明者らは、アグレッシブ線維芽細胞に特異的に発現しているマーカーを探索することによって、三次元細胞培養を行わずにアグレッシブ線維芽細胞を特定する方法を開発した。さらに、アグレッシブ線維芽細胞に特異的なマーカーを見出したことから、これらマーカーの発現を指標として、歯周炎治療薬のスクリーニングを行うことができる。
【００１７】
具体的には、本発明のマーカーを用いて特定したアグレッシブ線維芽細胞に、候補化合物を接触させ、各マーカー遺伝子の変化を測定することにより、治療薬の候補となる化合物のスクリーニングを行う。
【００１８】
三次元細胞培養法を経ずにアグレッシブ線維芽細胞を特定することによって、非常に短期間で歯周炎の原因細胞を特定することができるため、歯周炎治療薬のスクリーニングを行うことが容易となる。また、歯周炎のリスクが高い患者の判定を行うことができる。本発明において、歯周炎のリスクが高いとは、現在、及び将来の歯周炎のリスクを含む。
【００１９】
本発明において、発現とは特に断らない限り、遺伝子及び／又はタンパク質の発現を指す。遺伝子であっても、タンパク質であっても、定量的に測定することができれば、どのような方法を用いてもよい。遺伝子発現は定量的ＰＣＲ法によって、タンパク質発現は、抗体によって測定することができる。定量的ＰＣＲ法は、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ法、ＴａｑＭａｎプローブ法、ＲＴ-ＰＣＲ法等、公知の方法を用いることができる。また、タンパク質は、ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ法等公知の方法によって定量することができる。ｍＲＮＡ、タンパク質を測定することにより、感度よくマーカーを測定することができる。
【００２０】
患者から採取された細胞とは、患者から歯周外科手術の際に切除されて不要となった歯肉や、抜去歯より得られた組織だけではなく、これら組織を培養して得られたた培養細胞も含まれる。
【００２１】
以下、実施例を交えながら本発明を詳細に説明する。
【実施例１】
【００２２】
≪アグレッシブ線維芽細胞の特定≫
１．歯肉線維芽細胞の調製
歯肉線維芽細胞はＯｈｓｈｉｍａらの方法（非特許文献２）に基づいて単離した。具体的には、歯周外科手術の際に切除され不要となった歯肉片又は抜去歯より組織を得て細切後、組織片をプレートに静置し、組織片より外生した細胞を第１代として、第６代目までの継代細胞を以下の実験に用いた。培養は、α−ｍｉｎｉｍｕｍ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｍｅｄｉｕｍ（α−ＭＥＭ、Ｗａｋｏ社製）に１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ社製）、及び１％Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｉｎｅ／Ｎｅｏｍｙｃｉｎ溶液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｇｉｅｓ社製）を添加した培養液を用いて、３７℃、５％ＣＯ２の湿潤条件下で行った。継代は細胞がコンフルエントに達した時点で、０．０５％ｔｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡ溶液(Ｗａｋｏ社製)を用いて細胞を剥離し、面積比が1：３になるようにプレート、又はフラスコに播種して行った。
【００２３】
２．歯肉上皮細胞の調製
歯肉上皮細胞はＯｈｓｈｉｍａらの方法（非特許文献３）に基づいて単離した。具体的には、歯周外科手術の際に切除され不要となった歯肉片をＤｉｓｐａｓｅ  Ｉ（合同酒精（株）社製）処理した後、上皮組織部分を結合組織部分から剥離した。上皮組織を細切後、組織片をプレートに静置し、組織片から外生した細胞を第１代として、第４〜８代目までの継代細胞を以下の実験に用いた。
【００２４】
培養はＩ型コラーゲンがコートされたプレート、又はフラスコ（住友ベークライト社製）を用い、Ｅｐｉ  Ｌｉｆｅ  ｍｅｄｉｕｍ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｇｉｅｓ社製）に添加剤Ｓ７（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｇｉｅｓ社製）及び１％Ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ／Ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｇｉｅｓ社製）を加えた培地を用いた。細胞がコンフルエントに達した時点で、０．０５％ｔｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡ溶液を用いて細胞を剥離し継代培養を行った。
【００２５】
３．三次元細胞培養によるコラーゲン分解能の高い歯肉線維芽細胞の培養
歯肉線維芽細胞を歯肉上皮細胞とともに培養することによって、そのコラーゲン分解能が増強する。コラーゲンゲルの構築方法、三次元細胞培養方法については論文（非特許文献４）に詳しく記載しているが、以下に方法の概要を記載する。
【００２６】
セルマトリックスｔｙｐｅ  Ｉ−Ａ（新田ゼラチン社製）、５×ＤＭＥＭ（新田ゼラチン社製）、再構成用緩衝液（新田ゼラチン社製）を混合して、コラーゲン混合溶液を作製した。ここに、上記継代培養した歯肉線維芽細胞をトリプシンで分散させ、ＦＢＳに浮遊させて懸濁した後、細胞数２．０〜２．５×１０５個をコラーゲン混合溶液に混和後、６穴プレートに播種して３７℃インキュベーターで３０分間静置しゲル化させた。
【００２７】
次に、上記で硬化させたゲル上に、上記継代培養した歯肉上皮細胞をトリプシンで分散させた後に細胞数２．０〜２．５×１０５個で播種し単層を形成させ、コラーゲンゲルを構築した。
【００２８】
図１Ｃには、２症例の歯周炎患者と健常者から単離した細胞を三次元細胞培養した結果を示している。通常、コラーゲンゲルを構築した翌日ゲルをプレートから剥がしゲルを浮遊させ、３〜４日でゲルの収縮が起こり、アグレッシブ線維芽細胞と正常歯肉線維芽細胞との区別が可能となる。図１Ｃに示すように、歯周炎患者の歯肉片より得られた線維芽細胞では、コラーゲン分解能が高いアグレッシブ線維芽細胞が必ず含まれている。三次元細胞培養によって選択されたコラーゲン分解能の高い細胞をアグレッシブ線維芽細胞としてプレート、フラスコ等で培養したものを用いて以下の解析を行った。なお、これらは初代培養細胞であることから、アグレッシブ線維芽細胞を単離しているのではなく、アグレッシブ線維芽細胞の多い群を選択していることになる。また、コラーゲン分解能が低い細胞群にはアグレッシブ線維芽細胞は混在しておらず、ほとんどが正常歯肉線維芽細胞であると考えられる。
【実施例２】
【００２９】
≪理研ＦＡＮＴＯＭ５による解析≫
様々な組織から単離した線維芽細胞は同じような形状をしているものの、トランスクリプトーム解析を行うと、各組織で特徴的な遺伝子発現をしていることが知られている（非特許文献５）。歯肉線維芽細胞についても解析が行われているが、２つの遺伝子のみについて特徴づけられているにすぎず、歯肉線維芽細胞の遺伝子発現パターンの特徴は明らかとはいえない。そこで、ＦＡＮＴＯＭ５において、歯肉線維芽細胞のＣＡＧＥ法による解析を行った。
【００３０】
ＦＡＮＴＯＭ（Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ＡＮｎｏＴａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃＤＮＡ）５プロジェクトは、理化学研究所による国際コンソーシアムによるものであり、様々な種類のヒト細胞を使って、転写開始部位の系統的マッピングに取り組む国際的なプロジェクトである。
【００３１】
ＦＡＮＴＯＭプロジェクトは、ゲノムの転写制御ネットワークを理解するために、遺伝子の発現プロファイルをＣＡＧＥ法（Ｃａｐ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）によって得て解析を行っている。ＣＡＧＥ法は、ｍＲＮＡの５´末端から約２０塩基のタグ配列を切り出し、塩基配列を決定する手法である。ＣＡＧＥ法は、個々のプロモーターについての遺伝子発現を解析できる手法である。また、次世代シーケンサーと組み合せることにより、ゲノムワイドに遺伝子発現を定量解析できる唯一の技術であり、理論的には１０細胞に１コピー以下しか発現していないＲＮＡを９９．９％の精度で捉えることができると言われている。
【００３２】
１．ＲＮＡの採取
ＲＮＡはＴＲＩｚｏｌ（商標、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて抽出した。抽出したＲＮＡは、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを用いてクォリティを確認した。
【００３３】
２．ＣＡＧＥライブラリーの作製
最初にＦｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡをＲＮＡから作製した。５μｇのＲＮＡを５００ｎｇのランダムＮ１５プライマー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）と混ぜ、６５℃５分、熱変性を行いその後冷却した。ＲＴ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を加え、２５℃３０秒、４２℃３０分、５０℃１０分、５６℃１０分、６０℃１０分で反応を行い、４℃に冷却した。ｃＤＮＡ／ＲＮＡはＡｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＲＮＡＣｌｅａｎＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）により精製し溶解した。
【００３４】
次に酸化反応とビオチン化を行った。ｃＤＮＡ／ＲＮＡ混合物に２μＬの１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）と２μＬの２５０ｍＭ過ヨウ素酸ナトリウムを加え氷上、暗室にて４５分静置した。２μＬの４０％グリセロールと１４μＬの１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）を混合し反応を止めた。ｃＤＮＡ／ＲＮＡ混合物はＡｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＲＮＡＣｌｅａｎＸＰにより精製した。４μＬの１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）と１μＬの１５０ｍＭビオチン（ロングアーム）ヒドラジド（ＶＥＣＴＯＲ  Ｌａｂ社製）を加え、３７℃２時間、暗所に静置した。１２μＬのイソプロパノールを加え、ビオチン化した産物はＡｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＲＮＡＣｌｅａｎＸＰにて精製した。相補的ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  ｓｔｒａｎｄにより保護されない一本鎖ＲＮＡ領域はＲＮａｓｅ１（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を加え分解した。
【００３５】
次にＣａｐ−ｔｒａｐｐｉｎｇとｒｅｌｅａｓｅを行った。ＭＰＧ  ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｂｅａｄ  ｓｌｕｒｒｙ（ＴａｋａｒａＢｉｏ社製）をｔＲＮＡ  （Ｓｉｇｍａ社製）を用いて氷上３０分間静置しｐｒｅ−ｂｌｏｃｋｉｎｇを行った。その後ｂｕｆｆｅｒ１（４．５Ｍ塩化ナトリウム、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）で洗浄を行い、５０μｇのｔＲＮＡを含むｂｕｆｆｅｒ１に懸濁した。
【００３６】
ビオチン化したｃＤＮＡ／ＲＮＡ混合物はブロッキングしたビーズにより精製した。５０℃３０分で結合させ、ｂｕｆｆｅｒ１で１回、ｂｕｆｆｅｒ２（０．３Ｍ塩化ナトリウム、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）で１回、ｂｕｆｆｅｒ３（１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．４％ドデシル硫酸ナトリウム、０．５Ｍ酢酸ナトリウム、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５）で２回、ｂｕｆｆｅｒ４（１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５Ｍ酢酸ナトリウム、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５）で２回洗浄を行った。ＣａｐｔｕｒｅされたｃＤＮＡは熱ショックとＲＮａｓｅＩ処理によりｒｅｌｅａｓｅした。ビーズはＲＮａｓｅＩ  ｂｕｆｆｅｒに溶解し、５分間９５°Ｃで処理後すぐに氷上に静置した。ＲＮＡは３７℃１５分のＲＮａｓｅ処理により取り除いた。
【００３７】
Ｃａｐ−ｔｒａｐｐｅｄされたｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡはＡｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）により生成した。ｃＤＮＡのクォリティはＯｌｉＧｒｅｅｎ  ｓｓＤＮＡ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）により評価した。一般的には５μｇのＲＮＡから１０-２０ｎｇのＣＡＧＥ  ｌｉｂｒａｒｙが作製される。
【００３８】
次にｐｏｌｙ（ｄＡ）  ｔａｉｌｉｎｇ反応を行った。１０ｎｇのｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＣＡＧＥ  ｌｉｂｒａｒｙを９５℃５分にて熱変性させた後、急速冷却を行った。変性させた混合物にＴｅｒｍｉｎａｌ  Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ｄＡＴＰ、ＢＳＡ（ＮＥＢ社製）を加え３７℃１時間で反応させ、７０℃１０分で酵素を不活化させ４℃に冷却した。ｐｏｌｙ（Ａ）ｔａｉｌｉｎｇ反応後、反応液を９５℃５分で熱変性させ、急速冷却を行った。次に０．５μＬの２００μＭ  ｂｉｏｔｉｎ−ｄｄＡＴＰを含むｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｍｉｘｔｕｒｅを作製し、変性させたｐｏｌｙ−ａｄｅｎｙｌａｔｅｄ  ｍｉｘｔｕｒｅに加え３７℃１時間反応させた後、７０℃２０分で酵素を不活化し４℃に冷却した。２ｐＭのＣａｒｒｉｅｒ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ（５′−ＴＣＡＣＴＡＴＴＧＴＴＧＡＧＡＡＣＧＴＴＧＧＣＣＴＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＣＧＣＧＣＧＧＴ［ｄｄＣ］−３′）（配列番号１）を不活化した反応液に加え、サンプルのモル濃度をＨｅｌｉｃｏｓ  ＯｐｔｉＨｙｂ  ａｓｓａｙ（Ｈｅｌｉｃｏｓ社製）により測定した。
【００３９】
次にＨｅｌｉＳｃｏｐｅによるシーケンシングを行った。上述のように処理を行ったテンプレートをマニュアルに従ってシーケンシングを行った。次に得られたシーケンスのｒａｗリードのフィルタリングとアライメントを行った。フィルタリングはＬｉｐｓｏｎらの手法を応用して行った（非特許文献６）。本法では２０ｎｔから７０ｎｔのリードのみを使用し、アライメントスコアが３．５以上のリードは除外した。Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓはＵＣＳＣ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒ  ｄａｔａｂａｓｅのヒトゲノムアセンブリのｈｇ１９とヒトリボソームＤＮＡの反復配列を用いた（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｕ１３３６９）。各々のリードは  ｈｅｌｉｓｐｈｅｒｅ−０．１４．ａ０１５  ｐａｃｋａｇｅ  のｉｎｄｅｘＤＰｇｅｎｏｍｉｃを用いてアライメントを行った。  遺伝子発現はＲｅｆＳｅｑの５′末端の５００ｂｐ以内のアラインされたリードの数を測定した。各細胞のリードカウントはＦＡＮＴＯＭ５  Ｔａｂｌｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｔｏｏｌから取得した。
【００４０】
図２Ａは各種線維芽細胞と歯肉線維芽細胞の相関プロットを示す。図中の略号は以下の線維芽細胞を示し、かっこ内の数字は、解析に用いた線維芽細胞の数を示す。ＧＦ：gingival fibroblast（歯肉線維芽細胞（６））、ＡＡＦ：aortic  adventitial fibroblast（大動脈外膜線維芽細胞（３））、ＣＦ：cardiac  fibroblast（心臓線維芽細胞（６））、ＣＰＦ：choroid plexus fibroblast（脈絡膜線維芽細胞（３））、ＣｏｎＦ：conjunctival fibroblast（結膜線維芽細胞（２））、ＤＦ：dermal  fibroblast（皮膚線維芽細胞（６））、ＬＦ：lung fibroblast（肺線維芽細胞（３））、ＬｙｍＦ：lymphatic fibroblast（リンパ管線維芽細胞（３））、ＭＦ：mammary  fibroblast（乳腺線維芽細胞（３））、ＰＬＦ：periodontal
ligament  fibroblast（歯根膜線維芽細胞（６））、ＰＡＦ：pulmonary artery  fibroblast（肺動脈線維芽細胞（１））、ＶＭＦ：villus mesenchymal  fibroblast（絨毛間葉線維芽細胞（３））。
【００４１】
各線維芽細胞のサンプル間のＣＡＧＥ  ｔａｇカウントの相関をＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒのｐａｃｋａｇｅであるＣＡＧＥの中のｐｌｏｔＣｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ機能を用いて計算した。相関係数はＰｅａｒｓｏｎの相関係数であり、相関係数が高いほど遺伝子発現が似ていることを示す。
【００４２】
歯肉線維芽細胞（ＧＦ）は、線維芽細胞の中では、歯根膜線維芽細胞（ＰＬＦ）と発現している遺伝子の発現パターンの相関が高い。そこで、歯肉線維芽細胞の遺伝子発現を特徴づけるために歯肉線維芽細胞と、歯根膜線維芽細胞を除く他の線維芽細胞すべての遺伝子発現プロファイルを比較した。比較にはＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒのパッケージであるｅｄｇｅＲを用いて行った。各々の遺伝子発現量をＭＡプロットにより、ＦＤＲ（Ｆａｌｓｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｒａｔｅ）＜０．０５に設定し、信頼領域の高い領域について比較を行った（図２Ｂ）。
【００４３】
ＦＤＲ＜０.０５の条件では、歯肉線維芽細胞での遺伝子発現が、他の線維芽細胞に対して、４１４８ピーク、１０７６遺伝子の発現が増加していることが認められた。また、歯肉線維芽細胞での発現が減少しているものは５１４ピーク、２５０遺伝子であった。このうち、発現の変化が顕著であったものを大きなドットで示している。
【実施例３】
【００４４】
≪アグレッシブ線維芽細胞に特徴的な遺伝子発現≫
３名の同一の患者から得られたアグレッシブ線維芽細胞、及び健常者とコラーゲン分解能に差が見られない歯肉線維芽細胞（以下、正常歯肉線維芽細胞と記載することもある。）を用いて、遺伝子発現プロファイルをＲのパッケージであるｅｄｇｅＲにより解析した。各々の遺伝子発現量をＭＡプロットにより、ＦＤＲ＜０．０５に設定し、信頼領域の高い領域について比較を行った（図３Ａ）。ＦＤＲ＜０．０５を満たすものが１０３ピーク、４２遺伝子認められた。アグレッシブ線維芽細胞で発現が上昇しているものが７１ピーク、２９遺伝子、低下しているものが３２ピーク、１３遺伝子認められた。実施例２で同定された歯肉線維芽細胞に特異的な発現を示す遺伝子のうちＲＵＮＸ２のＰ１プロモーターからの発現とＤＬＸ５の発現がアグレッシブ線維芽細胞においてＣＡＧＥピークの低下を認めた。
【００４５】
個々のアグレッシブ線維芽細胞、および正常歯肉線維芽細胞のＣＡＧＥピークのプロファイルをＺＥＮＢＵデータベースにて確認したところいずれのドナーから得られた細胞においても、ＲＵＮＸ２のＰ１プロモーターのＣＡＧＥピークの発現に差が見られた。アグレッシブ線維芽細胞では、Ｐ１プロモーターからの発現が抑制されているのに対し、正常歯肉線維芽細胞からの発現は抑制されていなかった。また、Ｐ２プロモーターからの発現は、アグレッシブ線維芽細胞、正常歯肉線維芽細胞で発現の差が見られるドナーはいなかった。図３Ｂに結果を示す。
【００４６】
ＲＵＮＸ２は、ｒｕｎｔホモロジードメインを備える転写因子であり、骨芽細胞の分化と骨形成のマスター遺伝子として作用することが知られている（非特許文献７）。ＲＵＮＸ２の突然変異は、鎖骨頭蓋骨異形成症（ｃｌｅｉｏｃｒａｎｉａｌ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ、ＣＣＤ）を引き起こす。ＣＣＤの症状として見られる歯の形成異常は、歯の形成に関与する細胞におけるＲＵＮＸ２の異常が関与していると考えられている。
【００４７】
したがって、得られた歯肉線維芽細胞のＲＵＮＸ２のＰ１プロモーターからの遺伝子発現を解析することにより、アグレッシブ線維芽細胞、正常歯肉線維芽細胞を識別することができる。
【実施例４】
【００４８】
《ＲＵＮＸ２  Ｐ１プロモーターからの発現、ＤＬＸ５》
次に、種々の線維芽細胞を用いて、ＲＵＮＸ２のＰ１プロモーター、Ｐ２プロモーターからの発現を定量的ＰＣＲにより解析した。用いた細胞は下記のとおりである。本発明者らが歯周炎患者から得た以下の４つの初代培養細胞、ＧＦＨ２：歯肉線維芽細胞、ＧＦＨ３−１：歯肉線維芽細胞、ＰＬＨ２：歯根膜線維芽細胞、ＰＬ２９：歯根膜線維芽細胞、及び購入した以下の４つの細胞株、ＮＢ１ＲＧＢ：正常皮膚線維芽細胞、ＮＨＬＦ：正常成人肺線維芽細胞、ＷＩ−３８：胎児肺線維芽細胞株、ＨＦＬ−１：胎児肺線維芽細胞株からＲＮＡを精製して解析に用いた。
【００４９】
ＲＮＡはＲＮＡｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）にて回収し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡを合成した。定量ＲＴ−ＰＣＲはＭｘ−３０００Ｐ  ｑＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）とＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  （Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いた。遺伝子発現レベルはｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＧＡＰＤＨ）により正規化を行った。
【００５０】
用いたプライマーは下記のとおりである。なお、Ｆはｆｏｒｗａｒｄ、Ｒはｒｅｖｅｒｓｅを示す。結果を図４に示す。
ＲＵＮＸ２  Ｐ１  Ｆ：ＴＧＧＣＡＴＣＡＡＡＣＡＧＣＣＴＣＴＴＣＡＧ（配列番号２）
ＲＵＮＸ２  Ｐ２  Ｆ：ＧＴＧＡＴＧＣＧＴＡＴＴＣＣＣＧＴＡＧ（配列番号３）
ＲＵＮＸ２  共通  Ｒ：ＧＧＣＴＣＡＣＧＴＣＧＣＴＣＡＴＴＴＴＧ（配列番号４）
ＧＡＰＤＨ  Ｆ：ＧＧＴＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣＡＡＣＧＧＡ（配列番号５）
ＧＡＰＤＨ  Ｒ：ＧＡＧＧＧＡＴＣＴＣＧＣＴＣＣＴＧＧＡＡＧＡ（配列番号６）
【００５１】
ＣＡＧＥデータから推測されていたように、ＲＵＮＸ２のＰ１プロモーター由来の転写産物は歯肉線維芽細胞、および歯根膜線維芽細胞において特異的に発現していた。一方でＰ２プロモーター由来の転写産物はすべての線維芽細胞において一様に発現していることが分かった。したがって、ＲＵＮＸ２  Ｐ１プロモーターからの発現を指標にアグレッシブ線維芽細胞を特定することが可能である。
【実施例５】
【００５２】
≪アグレッシブ線維芽細胞に特徴的な遺伝子発現、ＤＬＸ５、ＦＬＴ１≫
ＲＵＮＸ２は、骨形成に関わるマスター調節因子であり、その上流の遺伝子であるＤＬＸ５（Ｄｉｓｔａｌ−ｌｅｓｓ  ｈｏｍｅｏｂｏｘ  ５）の転写調節を行うことが知られている（非特許文献８）。また、ＤＬＸ５は、骨芽細胞の最終的な分化に関与することが知られている。そこで、２例の歯周炎患者由来の細胞を用いて、ＤＬＸ５、ＲＵＮＸ２のＰ１プロモーター、Ｐ２プロモーターからの遺伝子発現に関して解析を行った。Ｓｙｂｒ  ｐｒｅｍｉｘ（Ｔａｋａｒａ社製）により定量ＲＴ−ＰＣＲを行い、リアルタイム機器（ＴＰ−９００、Ｔａｋａｒａ社製）を用いた。ＤＬＸ５のプライマーは下記の配列を用いた。
ＤＬＸ５  Ｆ：ＣＡＡＣＴＴＴＧＣＣＣＧＡＧＴＣＴＴＣＡ（配列番号７）
ＤＬＸ５  Ｒ：ＧＴＴＧＡＧＡＧＣＴＴＴＧＣＣＡＴＡＧＧＡＡ（配列番号８）
結果は、実施例４と同様にＧＡＰＤＨにより正規化を行っている。結果を図５に示す。
【００５３】
ＤＬＸ５の発現は、アグレッシブ線維芽細胞では、正常歯肉線維芽細胞に比べて発現が抑制されていた。また、ＲＵＮＸ２Ｐ１プロモーターからの発現は、上記解析結果と同様に、アグレッシブ線維芽細胞では抑制されているのに対して、Ｐ２プロモーターからの発現は顕著な差が見られなかった。
【００５４】
次に、アグレッシブ線維芽細胞（ＧＦ）、正常歯肉線維芽細胞（ＰＧＦ）、歯根膜線維芽細胞（ＰＬ）を用いて、ＲＵＮＸ２のＰ１プロモーター、Ｐ２プロモーター、ＤＬＸ５、及びＦＬＴ１の発現に差が見られるか定量的ＰＣＲにより解析を行った。ＦＬＴ１（Ｆｍｓ−ｌｉｋｅ  Ｔｙｒｏｓｉｎｅ  Ｋｉｎａｓｅ  １、ＶＥＧＦＲ-１）は、３次元ゲルを用いて細胞を培養した場合に、アグレッシブ線維芽細胞での発現が、正常歯肉線維芽細胞での発現と比較して有意に増強していた遺伝子である。各細胞でのＧＡＰＤＨの発現を１とし、発現を正規化した。用いたＦＬＴ１のプロモーターは下記のとおり。
ＦＬＴ１  Ｆ：ＣＴＧＴＣＡＴＧＣＴＡＡＴＧＧＴＧＴＣＣＣ（配列番号９）
ＦＬＴ１  Ｒ：ＴＧＣＴＧＣＴＴＣＣＴＧＧＴＣＣＴＡＡＡＡＴＡ（配列番号１０）
結果を図６に示す。
【００５５】
ＲＵＮＸ２のＰ１プロモーター、ＤＬＸ５の発現は、アグレッシブ線維芽細胞（ＧＦ）では、正常歯肉線維芽細胞（ＰＧＦ）、歯根膜線維芽細胞（ＰＬ）と比較して、有意に減少していた。一方、ＦＬＴ１の発現は、アグレッシブ線維芽細胞（ＧＦ）では、正常歯肉線維芽細胞（ＰＧＦ）、歯根膜線維芽細胞（ＰＬ）と比較して、有意に増加していた。したがって、正常歯肉線維芽細胞、歯根膜線維芽細胞でのこれら遺伝子の発現量を基準としてアグレッシブ線維芽細胞であるかを判断することができる。例えば、正常歯肉線維芽細胞、歯根膜線維芽細胞での遺伝子発現量の平均値を基準として、ＲＵＮＸ２のＰ１プロモーターからの発現量、ＤＬＸ５の発現量が低い細胞、又はＦＬＴ１の発現量が高い細胞をアグレッシブ線維芽細胞であると判断することができる。また、正常歯肉線維芽細胞、歯根膜線維芽細胞でのこれら遺伝子発現量の平均値を所定の値とすることにより、アグレッシブ線維芽細胞を特定したり、検査の閾値として用いることができる。
【００５６】
以上の結果から、アグレッシブ線維芽細胞では、正常歯肉線維芽細胞と比較して、ＲＵＮＸ２のＰ１プロモーターからの発現、ＤＬＸ５の発現は減少し、ＦＬＴ１の発現は増加していることが明らかである。したがって、これらの遺伝子発現をマーカーとしてアグレッシブ線維芽細胞を選別可能となる。また、診断薬としての応用も可能となる。さらに、これら遺伝子発現を指標として新たな歯周炎の医薬をスクリーニングすることができる。
【図１】
0006009023.tif 000002
【図２】
0006009023.tif 000003
【図３】
0006009023.tif 000004
【図４】
0006009023.tif 000005
【図５】
0006009023.tif 000006
【図６】
0006009023.tif 000007
【配列表】
0006009023000001.app