(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
プランタリシンA、K、もしくはN、またはこれらの混合物から選択される少なくとも1つのプランタリシン、ならびにラクトバシラス・プランタルム  DSM23213およびラクトバシラス・ロシアエ  DSM23214乳酸菌を含み、あるいはこれらからなるバイオマスの合成のための、あるいはプランタリシンA、K、もしくはN、またはこれらの混合物から選択される1つまたは複数のプランタリシンの調製のための生物工学的方法であって、以下の工程、すなわち:
a)ラクトバシラス・プランタルム  DSM23213およびラクトバシラス・ロシアエDSM23214乳酸菌の培養増殖;
b)CDM、WFH、グレープマスト、乳清、果実産物抽出物、及び野菜産物抽出物からなる群から選択される基質の、工程a)に記載の乳酸菌の水性懸濁液との共接種;
c)インキュベーション;ならびに場合により、
d)乳酸菌細胞を取り出すための培養ブロスの遠心分離
を含み、またはこれらの工程からなる、方法。
【請求項２】
工程a)からの懸濁液の細胞密度が、各乳酸菌種について9.0Log cfu/mlであり、これが、基質体積に対して1〜4%の範囲の百分率で基質に添加される、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
インキュベーションが、30〜37℃の温度で、18〜24時間実施される、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
遠心分離が、4℃で、10,000×gで15分間実施される、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
乾燥または凍結乾燥による、工程d)で得られた上清の脱水のための工程e)をさらに含む、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
プランタリシンA、K、もしくはN、またはこれらの混合物から選択される少なくとも1つのプランタリシン、ならびにラクトバシラス・プランタルム  DSM23213およびラクトバシラス・ロシアエ  DSM23214乳酸菌を含み、あるいはこれらからなる、バイオマス。
【請求項７】
1つまたは複数の医薬として許容可能な賦形剤および/またはアジュバントと共に、活性成分として請求項6に記載のバイオマスを含み、またはこれらからなる医薬品組成物または美容組成物。
【請求項８】
表皮または腸壁の関門機能を増大させるための薬物を調製するための、プランタリシンA、ラクトバシラス・プランタルム  DSM23213およびラクトバシラス・ロシアエ  DSM23214乳酸菌を含むかもしくはこれらからなる、バイオマス、または1つもしくは複数の医薬として許容可能な賦形剤および/もしくはアジュバントと共に、活性成分として前記バイオマスを含むかもしくはこれらからなる組成物の使用。
【請求項９】
創傷治癒用の薬物を調製するための、プランタリシンA、ラクトバシラス・プランタルム  DSM23213およびラクトバシラス・ロシアエ  DSM23214乳酸菌を含むかもしくはこれらからなる、バイオマス、または1つもしくは複数の医薬として許容可能な賦形剤および/もしくはアジュバントと共に、活性成分として前記バイオマスを含むかもしくはこれらからなる組成物の使用。
【請求項１０】
ラクトバシラス・プランタルム  DSM23213もしくはラクトバシラス・ロシアエDSM23214乳酸菌、またはこれらの混合物。
【請求項１１】
表皮の関門機能を増大させるための薬物を調製するための、プランタリシンAの使用。
【請求項１２】
創傷治癒用の薬物を調製するための、プランタリシンAの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プランタリシンを含むバイオマスを調製するための方法、および医療分野におけるその使用に関する。特に、本発明は、プランタリシンA、NもしくはK、またはこれらの混合物、あるいは調製のために使用される乳酸菌と関連した上述したプランタリシンの1つまたは複数を含有するバイオマスを調製するための方法、および腸細胞またはヒト表皮ケラチノサイトの関門機能を刺激するためのこれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
表皮および腸壁は、外部環境およびその中の有害物に対して関門機能を果たすことが知られている。表皮および腸壁の関門機能は、様々な要因のために弱められる場合がある。表皮関門機能の変化をより頻繁にもたらす条件の1つは、様々に源を発する環境要因への曝露である。いずれにせよ、通常の条件下で、表皮は、「定常状態」の達成および適切なトレランス度(tolerance grade)をもたらす適応を通じて潜在的な外因性傷害に適応することができる。刺激性の界面活性剤および化学物質(有機溶媒、石けん、界面活性剤溶液)による表皮の連続的な侵襲は、例えば、表皮表面膜の脂質成分のみでなく、角質層細胞間の脂質成分にも損傷を与える場合があり、関門機能の劣化をもたらす。
【０００３】
これは、経表皮水分喪失の増大、角質層の軽症の剥離および弾性損失、場合によりその後の小さい連続的な表面溶解の形成を特徴とする軽度の皮膚炎をもたらす。この穏やかな刺激性条件は、亜臨床的であることが多く、脂質合成の増大および基底ケラチノサイト増殖活性の刺激を通じて、新しい平衡状態および関門機能回復を実現させる回復プロセスを誘発する。
【０００４】
皮膚バリアがもはや適切に内因性防御機能を十分に果たさない場合、起炎性(flogogenic)メディエーターおよびフリーラジカルのインサイツでの生成をもたらすサイトカイン放出によって誘発される炎症性皮膚病態の発症のリスクが増大する。後者は、直接のDNAおよびタンパク質傷害の酸化的機構による生成に加えて、真皮細胞膜の過酸化を引き起こす場合がある。
【０００５】
表皮は、血管を含まないが、いずれにせよ、生理学的な平衡状態および角質組織完全性に欠かせない少しの水分量を含む。真皮毛細血管からの水は、真皮-表皮接合部、および角質細胞列(corneocyte row)中のチャネルを通じて、ほとんどの組織と同様のレベル、すなわち、深いゾーン(緻密な角質)において約60〜70%、およびより表面の領域(分離した角質)において10〜35%まで流れる。空気と接触するより外側の部分においても、表皮が水分リザーバを維持することができるという事実は、高吸湿性粒子の存在から生じる、2つの特定の機能、すなわち、体液の蒸発を防止するバリア活性、および角質層の包括的な親水性活性(水保持能力)に基づく。分離した角質層の最も薄い角質細胞層、およびヒドロ脂質重複膜(hydrolipid overlapping film)の漸進的ストリッピングに基づく実験では、関門機能は著しく影響されないことが実証されたが、他方では、関門機能は、フィラグリン緻密化ケラチンクラスターおよび剛性タンパク質(rigid protein)エンベロープからなる角質細胞れんがを有するセメント壁(cemented wall)構造が周知である、下にある緻密な角質層のより深い層を除去することによって徐々に劣化する。電子顕微鏡法によって、角質細胞は、修飾された接着斑(desmosomial)板(コルネオソーム)によってしっかりと密封され、角質細胞間コンクリート(intercorneocyte concrete)として知られる脂質接着層(lipid adhesive)内に埋め込まれ、柔軟でほぼ貫通不可能なバリアの膜を生じていることが示された。ストレスの多い条件は、場合により、皮膚バリアに急性的または慢性的に影響し、このストレスの多い条件に対して、皮膚バリアの不全が傷害性の急性病毒起源に独立して発生する場合、体は、効率を監視し、回復させる表皮の能力をもたらす一連の恒常性機構を発生させる。表皮は、一般に乾燥気候において起こるような、低水分の空気に長く曝されることによって誘導される慢性の皮膚のストレスに対して、全体として、基底細胞の増殖増大、および結果として起こる角質層および表皮の厚さ増加をもたらす、補償的な適応性のある現象を通じて応答する。オドランド小体および角質細胞間脂質の生成およびエキソサイトーシシス(通常の組成の維持)も、表皮が水資源をより良好な方法で保持することができるように増大する。いずれにしても、水分の欠乏は、角質細胞間コンクリートの液体-脂質層別化に関して相変化をもたらし、引き続いて結晶化をもたらす。結果として、筋肉-関節移動および外因性の動的刺激によって誘導される静止摩擦に関して適応性がより低くなり、硬直が起こり、したがって、軽い微小病変(easy microlesion)が発生する。同様の適応性のある応答の別の含意は角質増殖からなり、増殖層の増大は、角質細胞の対応する、より速い剥離速度によって釣り合いが取れず、この増殖層は、薄くそがれるのではなく、角質の塊状のクラスター中に埋まったままであり、大きな鱗屑としてのみ剥がれる。さらに、慢性の環境ストレスは、真皮肥満細胞の肥大および脱顆粒に関連して、炎症組織の局面を伴ったサイトカインカスケードを活性化する。これは、冬に観察されるような炎症性皮膚病の増悪を説明することができる。表皮バリアに対するあらゆる急性傷害は、関与する皮膚細胞によるサイトカイン応答を誘導し、その効果はケラチノサイト��よび下にある真皮に反映され、関門機能の回復、表皮表面のテクスチャリング、およびとりわけ、真皮の緻密度および膨圧の改善に基づく繊維芽細胞の活性の刺激を目的とする重要な形態的および機能的結果をもたらす。
【０００６】
実際に、関門機能を回復させるために使用される方法は、関門機能の変化から生じる不十分な皮膚防御を未然に防ぐのに適した回復物質およびヒドロレギュレート物質(hydroregulating substance)の使用に基づく。これらの物質は、水分補給活性および再構築活性を伴う化合物である。多くの皮膚美容(dermocosmetic)製品は、皮膚の水分補給を可能にし、その回復機能によって皮膚再生を助ける。しかしこれらは、粗面の単純な「美容マスキング」を通じて作用し、皮膚の形態機能的な完全性の回復を目的とする修復および再生活性を通じて発揮しなければならないいずれの真の治療効果も有さない。
【０００７】
細菌は、その細胞密度および/または生態系内に存在する他の微生物細胞種の数を含めた、環境条件の変化に対する応答としてシグナル分子を放出および検出するのに適していることが最近概説された(Sturmeら、2007、「Making sense of quorum sensing in lactobacilli: a special focus on Lactobacillus plantarum WCFS1」、Microbiology 153:3939〜3947)。乳酸菌に関しては、これらの応答は、「クオラムセンシング」(QS)機構によって起こり、LuxS酵素活性を使用して合成される2型(AI-2、主にフラノン誘導体)自己誘導物質と命名されたシグナル分子(MillerおよびBassler、2003、「LuxS quorum sensing: more than just a numbers game」、Curr Opin Microbiol 6: 191〜197)、またはペプチドフェロモンもしくはペプチド自己誘導物質と命名されたシグナル分子(AIP)(Nakayamaら、2001、「Gelatinase biosynthesis-activating pheromone: a peptide lactone that mediates a quorum sensing in Enterococcus faecalis」、Mol Microbiol 41: 145〜154)を含む。L.プランタルム(L. plantarum)WCFS1ゲノムは、「クオラムセンシング」機構に関与する他の機能をコードする他の遺伝子と一緒に、AIPペプチドをコードする多数の遺伝子を含有することが最近証明された(Sturmeら、2007、「Making sense of quorum sensing in lactobacilli: a special focus on Lactobacillus plantarum WCFS1」、Microbiology 153: 3939〜3947)。いくつかの研究により、プランタリシン型ペプチドフェロモンの合成を目的とする系は、種内細胞間コミュニケーション機構に関与していることが証明された。この場合、ペプチドフェロモンは、分子合成種の細胞密度を測定するための手段として使用される(Diepら、1994、「The gene encoding plantaricin A, a bacteriocin from Lactobacillus plantarum C11, is located on the same transcription unit as an agr-like regulatory system」、Appl Environ Microbiol 60:160〜166)。他の研究でも、プランタリシン型ペプチドフェロモンが種間細胞コミュニケーションの機構に関与し得ることが証明された。特に、競合的な微生物の存在は、微生物の拮抗作用の機構に関与する調節系を活性化することができる(Maldonadoら、2004、「Production of plantaricin NC8 by Lactobacillus plantarum NC8 is induced in the presence of different types of Gram-positive bacteria」、Arch Microbiol 181:8〜16)。細胞高密度での他の微生物種の存在下で、ペプチドフェロモンは、バクテリオシン型抗微生物性化合物(例えば、プランタリシンA、K、およびN)として特異的に作用するシグナル分子の合成をもたらす、代謝調節の複雑な現象を伴うリン酸化反応のカスケードシリーズを促進する(Haugeら、1998、「Plantaricin A is an ampkiphilic α-helical bacteriocin-like pheromone which exerts antimicrobial and pheromone activities through different mechanisms」、Biochemistry 37:16026〜16032)。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Sturmeら、2007、「Making sense of quorum sensing in lactobacilli: a special focus on Lactobacillus plantarum WCFS1」、Microbiology 153:3939〜3947
【非特許文献２】MillerおよびBassler、2003、「LuxS quorum sensing: more than just a numbers game」、Curr Opin Microbiol 6: 191〜197
【非特許文献３】Nakayamaら、2001、「Gelatinase biosynthesis-activating pheromone: a peptide lactone that mediates a quorum sensing in Enterococcus faecalis」、Mol Microbiol 41: 145〜154
【非特許文献４】Diepら、1994、「The gene encoding plantaricin A, a bacteriocin from Lactobacillus plantarum C11, is located on the same transcription unit as an agr-like regulatory system」、Appl Environ Microbiol 60:160〜166
【非特許文献５】Maldonadoら、2004、「Production of plantaricin NC8 by Lactobacillus plantarum NC8 is induced in the presence of different types of Gram-positive bacteria」、Arch Microbiol 181:8〜16
【非特許文献６】Haugeら、1998、「Plantaricin A is an ampkiphilic α-helical bacteriocin-like pheromone which exerts antimicrobial and pheromone activities through different mechanisms」、Biochemistry 37:16026〜16032
【非特許文献７】Fujiyaら、2007、「The Bacillus subtilis quorum-sensing molecule CSF contributes to intestinal homeostasis via OCTN2, a host cell membrane transporter」、Cell Host Microbe 1:299〜308
【非特許文献８】Gobbetti、1998、「The sourdough microflora: interactions of lactic acid bacteria and sourdoughs」、Trends Food Sci Technol 9:267〜274
【非特許文献９】Di Cagnoら、2010、「Quorum sensing in sourdough Lactobacillus plantarum DC400 (DSM 23213): induction of plantaricin A (PlnA) under co-cultivation with other lactic acid bacteria and effect of PlnA on bacterial and Caco-2 cells」、Proteomics  近刊
【非特許文献１０】Zwieteringら、1990、「Modelling of bacterial growth curve」、Appl Environ Microbiol 56:1875〜1881
【非特許文献１１】De Angelisら、2005、Biochim. Biophys. Acta、1762:80〜93
【非特許文献１２】Biniら、1997、「Protein expression profiles in human breast ductal carcinoma and histologically normal tissue」、Electrophoresis、18:2831〜2841
【非特許文献１３】National Center for Biotechnology Information、Bethesda、MD、USA; ProFound、http://www.prowl.rockefeller.edu/cgibin/ProFound
【非特許文献１４】Di Cagnoら、2009、「Synthesis of γ-amino butyric acid (GABA) by Lactobacillus plantarum DSMZ19463: functional grape must beverage and dermatological application」、Appl Biotechnol Microbiol DOI: 10.1007/s00253-009-23704
【非特許文献１５】Ballsら、1987、「Approaches to validation alternative methods in toxicology」、In: Goldber A.M.(編)、N.Y. Academic Press、45〜58頁
【非特許文献１６】Di Cagnoら、2007、「Cell-cell communication in sourdough lactic acid bacteria: a protomic study in Lactobacillus sanfranciscensis CB1」、Proteomics 7:2430〜2446
【非特許文献１７】Kolodkin-Galら、2007、「A linear pentapeptide is a quorum-sensing factor required for mazef-mediated cell death in Escherichia coli」、Science 318:652〜655
【非特許文献１８】Sambuyら、2005、「The Caco-2 cell line as a model of the intestinal barrier: influence of cell and culture-related factors on Cao-2 cell functional characteristics」、Cell Biol Toxicol 21:1〜26
【非特許文献１９】Perry, V.P.、Sanford, K.K.、Evans, V.J.、Hyatt, G.W.、Earle, W.R.、1957、「Establishment of clones of epithelial cells from human skin」、J Natl Cancer Inst、18 (5): 709〜717
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
原核細胞および真核細胞相互の細胞コミュニケーションの機構はある程度解明されているが、細菌の「クオラムセンシング」機構に関与するシグナル分子(例えば、ペプチドフェロモン)と、ヒト腸粘膜の細胞との間の相互作用に関して、非常に限られた文献しか存在しない。ユニークな例は、コンピテンス現象(competence phenomenon)および胞子形成現象に関与する分子として、枯草菌(Bacillus subtilis)プロバイオティック微生物によって合成されるCSFペンタペプチドである(Fujiyaら、2007、「The Bacillus subtilis quorum-sensing molecule CSF contributes to intestinal homeostasis via OCTN2, a host cell membrane transporter」、Cell Host Microbe 1:299〜308)。前記ペンタペプチドは、p38 MAPキナーゼ、Bキナーゼ(Akt)、および低温耐性を誘導するのに適しており、したがって、腸レベルでの酸化的損傷の予防を促進し、関門機能を強固にすることが実証された。さらに、現在の技術水準において、ヒト表皮に関して、細菌細胞間コミュニケーションの機構に関与するシグナル分子の効果に注目した刊行物または特許はまったく存在しない。
【００１０】
本発明の著者らは今や、プランタリシン、特にプランタリシンAは、ヒト表皮およびその上腸細胞において、ケラチノサイトの関門機能に対して正の効果を発揮することを発見した。
【００１１】
細菌単一培養(種内)を使用するプランタリシン調製のための方法についての研究は公知である。しかし、対象の微生物の培養は、治療目的用のシグナル分子を調製するために、工業レベルでスケールアップされるのに、複雑であまりに高価な培地中で実施される。
【００１２】
本発明の著者らは今や、公知技術によって得られる収率より高い収率を得るのに適した2つの特定の乳酸菌の共培養を使用する、プランタリシンを調製するための方法を開発した。特に、L.ロシアエ(L. rossiae) DPPMA174(番号DSM23214で2009年12月21日に、DSMZに寄託)との共培養としてのL.プランタルム  DC400(番号DSM23213で2009年12月21日に、DSMZに寄託)の培養は、プランタリシン型ペプチドフェロモン(特にプランタリシンA)の合成を活性化するのに適しており、L.プランタルム  DC400単一栽培(DSM23213)の存在下におけるものより約50倍高い濃度を得る。さらに、「天然サワードウ」によっても単離される、乳酸菌の他の種とのL.プランタルム  DC400(DSM23213)培養は、L.ロシアエと共同した場合のように、ペプチドフェロモンの合成を刺激するのに適していないことが証明された。本発明によるプロセスの別の重要な態様は、乳酸菌の実験室培養に通常使用される培地中だけでなく、グレープマスト、乳清、および果実および植物性産物からの水性抽出物でも実行可能であることである。
【００１３】
公知技術によれば、どの刊行物または特許にも、焼いた、パン種で膨らませた製品の生産に使用される「天然サワードウ」のような、同じ栄養生態系で行われる2つの乳酸菌(例えば、L.プランタルムおよびL.サンフランシスセンシス(L. sanfranciscensis))の共培養に対する応答機構としてのプランタリシンA型(PlnA)合成は開示されていない。さらに、文献によれば、単一培養条件(種内)に対する共培養(種間)におけるプランタリシンAの合成の増大は報告されていない。さらに、上記に報告したように、公知の方法によれば、非常に高価で複雑な培地が使用される。
【００１４】
さらに、L.プランタルム  DC400(DSM23213)およびL.ロシアエ  DPPMA174(DSM23214)乳酸菌と関連した1つまたは複数のプランタリシンを含む、本発明の方法によって得られるバイオマスは、表皮または腸壁のレベルでの関門機能の増強において、プランタリシン単独より高い有効性を発揮することが以外にも発見された。
【００１５】
本発明による乳酸菌は、ラクトバシラス(Lactobacillus)種に属し、南イタリアにおける一般的なパン生産のための「天然サワードウ」から単離された。
【００１６】
CDM(既知組成培地)、WFH(小麦粉加水分解物)(Gobbetti、1998、「The sourdough microflora: interactions of lactic acid bacteria and sourdoughs」、Trends Food Sci Technol 9:267〜274)、グレープマスト(1%の可溶性炭水化物で希釈、0.5%のマルトース、および0.5%のサワードウ抽出物、pH5.6を添加)、乳清(0.5%のマルトース、および0.5%のサワードウ抽出物、pH5.6を添加)、または野菜および果実製品の水性抽出物(0.5%のマルトース、および0.5%のサワードウ抽出物、pH5.6を添加)中で前記2つの細菌を、30〜37℃で18〜24時間共培養する工程を伴う生物工学プロトコールが標準化され、最適化された。培養の最後に、細胞を遠心分離によってブロス培養液から取り出すことができ、または取り出さなくてもよく、次いで、上清は、乾燥または凍結乾燥による脱水プロセスにかけられる。
【００１７】
プランタリシンAに基づく配合物を配合するための生物工学プロトコールのスキームを以下に記載する。
9.0log ufc/mlの細胞密度での、30℃で24時間の乳酸菌培養物の増殖、洗浄、水中での懸濁、および培地(CDM、WFH、グレープマスト、乳清、果実および植物性産物の水性抽出物)の共接種(1〜4%)
↓
30〜37℃で18〜24時間の培養
↓
遠心分離による細胞の取り出し
↓
乾燥または凍結乾燥による上清の脱水
↓
皮膚ケア製品用途のための配合物の配合
【００１８】
上記前記基質のいずれかでの共培養条件下で、L.プランタルム  DC400(DSM23213)およびL.ロシアエ  DPPMA174(DSM23214)の培養が実施される場合、2.5〜4.0μg/mLの濃度でプランタリシンAの合成が検出された。単一培養条件下で、L.プランタルム  DC400(DSM23213)によって合成されるプランタリシンAの濃度は、約0.06μg/mLである。他の乳酸菌種(例えば、ペディオコッカス・ペントサセウス(Pediococcus pentosaceus)、ラクトバシラス・ペントサス(Lactobacillus pentosus)、ラクトバシラス・ブレビス(Lactobacillus brevis)、ラクトバシラス・ロシアエ、ラクトバシラス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus))との共培養条件下で、プランタリシンAの合成は、著しくより低い。L.ロシアエ  DPPMA174(DSM23214)との共培養条件下で、プランタリシンK型およびN型のような他のペプチドフェロモンの合成が検出されたが、プランタリシンAより低い濃度、特に0.02〜0.06μg/mlの範囲内であった。1つの可能な配合によって、2.5μg/mlのプランタリシンAの適用により、再生表皮モデル(SkinEthic(登録商標))および経上皮電気抵抗(TEER)アッセイを使用して証明されたように、関門機能が刺激された。同様の結果が、腸粘膜を再生するのに適したCaco-2/TC7腸細胞を使用して得られた。
【００１９】
微生物学的な、クロマトグラフィー技法、ならびに細胞培養でのインビトロおよびエキソビボアッセイを使用して実施される相補的な分析によれば、L.プランタルム  DC400(DSM23213)およびL.ロシアエ  DPPMA174(DSM23214)の共培養は、先の研究において使用されておらず、本発明によれば、(i)単一生態系内で他の乳酸菌群集の存在下において検出可能でない濃度での種間細胞コミュニケーション機構に関与するシグナル分子の合成、(ii)やはり低費用基質を使用するプランタリシンA、および他のプランタリシン(KおよびN)の合成、ならびに(iii)表皮および腸細胞レベルでの関門機能を増強する保護効果を可能にし、したがって、原核細胞によって合成されるシグナル分子は、真核細胞によっても検出されることを実証する。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
したがって、プランタリシンA、K、もしくはN、好ましくはA、またはこれらの混合物から選択される少なくとも1つのプランタリシン、ならびにラクトバシラス・プランタルムDSM23213およびラクトバシラス・ロシアエDSM23214乳酸菌を含み、あるいはこれらからなるバイオマスの合成のため、あるいはプランタリシンA、K、もしくはN、好ましくはA、またはこれらの混合物から選択される1つまたは複数のプランタリシンの調製のための生物工学的方法は、本発明の具体的な目的であり、前記方法は、以下の工程を含み、または以下の工程からなる:
a)ラクトバシラス・プランタルムDSM23213およびラクトバシラス・ロシアエDSM23214乳酸菌の培養増殖;
b)CDM、WFH、グレープマスト、乳清、または果実および植物性産物抽出物からなる群から選択される基質の、工程a)に記載の乳酸菌の水性懸濁液との共接種;
c)インキュベーション;ならびに場合により、
d)乳酸菌細胞を取り出すための培養ブロスの遠心分離。
【００２１】
特に、工程a)からの懸濁液の細胞密度は、各乳酸菌種について約9.0Log ufc/mlとすることができ、これは、基質体積に基づいて1〜4%の範囲の百分率で基質に添加される。インキュベーション工程は、30〜37℃、好ましくは30℃の温度で、18〜24時間、好ましくは18時間実施することができ、一方、遠心分離は、10000×gで、4℃で15分間実施することができる。
【００２２】
本発明によるプロセスは、乾燥または凍結乾燥による、工程d)から得られる上清の脱水のための工程e)をさらに含むことができる。
【００２３】
プランタリシンA、K、もしくはN、好ましくはA、またはこれらの混合物からなる少なくとも1つのプランタリシン、ならびにラクトバシラス・プランタルムDSM23213およびラクトバシラス・ロシアエDSM23214乳酸菌を含み、またはこれらかなる上記プロセスによって入手可能な、または得られるバイオマスは、本発明のさらなる目的である。
【００２４】
本発明はさらに、1つまたは複数の医薬として許容可能な賦形剤および/またはアジュバントと共に、活性成分として上記に定義したようなバイオマスを含み、またはこれらからなる医薬品組成物または美容組成物に関する。
【００２５】
本発明の特定の態様はさらに、表皮もしくは腸壁の関門機能を増大させるため、または創傷治癒用の薬物を調製するための、上記に定義したようなバイオマスまたは組成物の使用に関する。
【００２６】
ラクトバシラス・プランタルム  DSM23213もしくはラクトバシラス・ロシアエDSM23214乳酸菌、またはこれらの混合物は、本発明のさらなる目的である。
【００２７】
さらに、本発明は、表皮もしくは腸壁の関門機能を増大させるため、または創傷治癒用の薬物を調製するための、プランタリシンA、K、またはN、好ましくはAから選択される1つまたは複数のプランタリシンの使用に関する。
【００２８】
これから本発明を、特に添付の図面を参照して、本発明の好適な実施形態に従って、例示的であるが限定的でない方法によって説明する。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１Ａ】ラクトバシラス・プランタルム  DC400(DSM23213)およびラクトバシラス・ロシアエ  DPPMA174(DSM23214)の共培養によって得られたブロス培養液からの遊離細胞上清の、エレクトロスプレーイオン化(ESI)イオントラップMS(ナノ-ESI/MS-MS)結合多次元HPLC(MDLC)分析の結果を示す図である。
【図１Ｂ】プランタリシンAに対するm/z比を用いた特定の捕捉時間に基づく、図1aの実際のクロマトグラムから得られるクロマトグラムを示す図である。
【図１Ｃ】図1aのクロマトグラムで得られたような、1493.7m/z比に基づく種を検出するMS/MSスペクトルを示す図である。
【図２】ラクトバシラス・プランタルム  DC400(DC400)、L.プランタルムDPPMA20(DPPMA20)、ラクトバシラス・ペントサス  12H5(12H5)、ラクトバシラス・ロシアエ  DPPMA174(DPPMA174)、およびペディオコッカス・ペントサセウス2XA£(2XA3)単一培養、ならびにL.プランタルム  DC400のL.プランタルム  DPPMA20(DC400-DPPMA20)、L.ペントサス  12H5(DC400-12H5);L.ロシアエ  DPPMA174(DC400-DPPMA174)、またはP.ペントサセウス(P. pentosaceus) 2XA3(DC400-2XA3)との共培養から合成されるプランタリシンAの濃度を示す図である。データは、3つの三つ組実験の平均である。
【図３】ラクトバシラス・ロシアエ  DPPMA174の増殖動態を示す図である。単一培養(●);ラクトバシラス・プランタルム  DC400との共培養(○);精製されたプランタリシンA(2.5μg/ml)を用いた単一培養(△);および化学合成されたプランタリシンA(2.5μg/ml)を用いた単一培養(▲)。精製されたプランタリシンAは、L.プランタルム  DC400およびL.ロシアエ  DPPMA174の共培養によって合成されたものに対応する。データは、3つの三つ組実験の平均である。
【図４】18時間培養した後のラクトバシラス・ロシアエ  DPPMA174発現タンパク質の電気泳動二次元分析に関係するゲルの一部を示す図である。パネルA、単一培養;パネルB、ラクトバシラス・プランタルム  DC400との共培養;およびパネルC、精製されたプランタリシンA(2.5μg/ml)の存在下での単一培養。楕円形または三角形で印をつけた番号は、L.プランタルム  DC400、または精製されたプランタリシンAを用いた培養における発現レベルの増減を示すタンパク質を指す。ひし形または二重三角で印をつけた番号は、L.プランタルム  DC400との共培養のみにおける発現レベルの増減を示すタンパク質を指す。
【図５】それぞれ、PBS緩衝液、プランタリシンA(2.5μg/ml)、または2.5μg/mlのプランタリシンAを含有するバイオマスに0時間および24時間曝した後の、再生表皮(SkinEthic(登録商標))の経上皮電気抵抗(TEER)(Ω×cm2)を示す図である。データは、3つの三つ組実験の平均である。
【図６】ラクトバシラス・プランタルム  DC400(DC400)単一培養によって、またはラクトバシラス・ロシアエ  DPPMA174(DC400-DPPMA174)との共培養によって産生された、精製されたプランタリシンA(2.5μg/ml)を用いて24、48、および72時間インキュベートした後のニュートラルレッド吸収として測定されたCaco2/TC7細胞生存能を示す図である。プランタリシンAに関するクロマトグラフィー条件によって溶出したL.ロシアエ  DPPMA174単一培養の精製画分を、陰性対照(DPPMA174)として使用した。別の陰性対照は、DMEM培地(DMEM)である。化学合成されたプランタリシンA(2.5μg/ml)を陽性対照(PlnA)として使用した。データは、3つの三つ組実験の平均である。アステリスクは、陰性対照に対する有意な差異(P<0.01)を示す。
【図７】γ-インターフェロン(IFN-γ)(1000U/ml)単独、およびIFN-γ+精製されたプランタリシンA(2.5μg/ml)(IFN-γ+DC400-DPPMA174)を用いて24、48、および72時間インキュベートした後のニュートラルレッドの吸収として測定されたCaco2/TC7細胞生存能を示す図である。精製されたプランタリシンは、ラクトバシラス・プランタルム  DC400およびラクトバシラス・ロシアエ  DPPMA174共培養からのものである。DMEM培地培養物を陰性対照(DMEM)として使用した。IFN-γを伴った化学合成されたプランタリシンA(2.5μg/ml)を、陽性対照(PlnA)として使用した。データは、3つの三つ組実験の平均である。アステリスクは、陰性対照に対する有意な差異(P<0.01)を示す。
【図８】24時間および48時間インキュベートした後のCaco2/TC7細胞の経上皮電気抵抗(TEER)(Ω×cm2)を示す図である。インキュベーションは、ラクトバシラス・プランタルム  DC400(DC400)単一培養からのプランタリシンA(2.5μg/ml);L.プランタルム  DC400およびラクトバシラス・ロシアエ  DPPMA174(DC400-DPPMA174)共培養からの精製されたプランタリシンA(2.5μg/ml);化学合成されたプランタリシンA(2.5μg/ml)(PlnA);γ-インターフェロン(IFN-γ)(1000U/ml)およびL.プランタルム  DC400とL.ロシアエ  DPPMA174の共培養からの精製されたプランタリシンA(IFN-γ+DC400-DPPMA174);ならびにIFN-γおよび化学合成されたプランタリシンA(PlnA+IFN-γ)を用いて実施した。DMEM培地(DMEM)を陰性対照として使用した。データは、3つの三つ組実験の平均である。アステリスクは、陰性対照に対する有意な差異(P<0.01)を示す。
【図９】それぞれ、対照、プランタリシンA、またはプランタリシンA含有バイオマスで処置したケラチノサイトに対する創傷治癒アッセイの結果を示す図である。
【図１０】対照、プランタリシンA、またはプランタリシンA含有バイオマスで処置した創傷の局限同士の間の距離を示す図である。
【図１１】対照、プランタリシンA、またはプランタリシンA含有バイオマスで処置した創傷についての治癒の増大率を示す図である。
【図１２ａ】考慮された異なる時間間隔での、カット後に共培養されたプランタリシン(a)、および合成プランタリシン(b)を用いて処置された、ヒト2544NCTCケラチノサイト単層の代表的な画像を示す図である。単層カットは、200μlのピペットチップを使用して実施した。細胞は、共培養されたプランタリシンおよび合成プランタリシンを用いて、独立して、かつ0.1、1、および10μg/mlの濃度で処置した。
【図１２ｂ】考慮された異なる時間間隔での、カット後に共培養されたプランタリシン(a)、および合成プランタリシン(b)を用いて処置された、ヒト2544NCTCケラチノサイト単層の代表的な画像を示す図である。単層カットは、200μlのピペットチップを使用して実施した。細胞は、共培養されたプランタリシンおよび合成プランタリシンを用いて、独立して、かつ0.1、1、および10μg/mlの濃度で処置した。
【図１３】共培養されたプランタリシン(0.1、1、および10μg/ml)を用いて処置した後のカット領域を通じて遊走した細胞の百分率を示す図である。遊走の百分率は、カットして0、4、8、12、24、48、および72時間後の2つのカットラインの間のクリアな領域を測定して求めた。バーは、2つの三つ組の独立した実験の平均±標準誤差を表す。
【図１４】合成プランタリシン(0.1、1、および10μg/ml)で処置した後の開始時での、カット領域を通じて遊走した細胞の百分率を示す図である。遊走の百分率は、初期のクリアな領域と比較して、カットして0、4、8、12、24、48、および72時間後の2つのカットラインの間のクリアな領域を測定して求めた。バーは、2つの三つ組の独立した実験の平均±標準誤差を表す。
【図１５】共培養されたプランタリシン(0.1、1、および10μg/ml)を用いて、ヒトNCTC2544ケラチノサイト単層を処置した後の、初期のカット領域に対するクリアな領域の百分率を示す図である。遊走の百分率は、初期のクリアな領域と比較して、カットして0、4、8、12、24、48、および72時間後の2つのカットラインの間のクリアな領域を測定して求めた。バーは、2つの三つ組の独立した実験の平均±標準誤差を表す。
【図１６】合成プランタリシン(0.1、1、および10μg/ml)を用いて、ヒトNCTC2544ケラチノサイト単層を処置した後の、初期のカット領域に対するクリアな領域の百分率を示す図である。百分率は、初期のクリアな領域と比較して、カットして0、4、8、12、24、48、および72時間後の2つのカットラインの間のクリアな領域を測定して求めた。バーは、2つの三つ組の独立した実験の平均±標準誤差を表す。
【図１７】200μlのピペットチップのカット部を有するように切開された、ヒトNCTC2544ケラチノサイト単層におけるTGFβ1の発現に対する、共培養されたプランタリシン(0.1、1、および10μg/ml)、合成プランタリシン(0.1、1、および10μg/ml)、およびコンネクチビン(Connectivine)の効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
実施例１
プランタリシン型ペプチドフェロモンの合成および精製、ならびに表皮およびCaco-2細胞に対するその効果の試験
「天然サワードウ」から先に単離された、Collezione di Colture del Dipartimento di Protezione delle Piante e Microbiologia Applicata dell'Universita degli Studi di BariからのL.プランタルム  DC400(DSM23213)およびL.ロシアエ  DPPMA174(DSM)を、通常の成分に加えて5%のマルトースおよび10%のサワードウ水-最終pH5.6を含有する改良MRS培地(mMRS)中で、30℃で24時間増殖させた。
【００３１】
24時間培養した細胞を、遠心分離(4℃で15分間、10,000×g)によって収集し、50mMのリン酸緩衝液、pH7.0で2回洗浄し、9.0log ufc/mlの細胞密度で水中に再懸濁し、WFH培地上で、単一培養または共培養条件下で接種した(各種について4%)(Gobbetti、1998、「The sourdough microflora: interactions of lactic acid bacteria and sourdoughs」、Trends Food Ski Technol 9:267〜274)。培養基質としてグレープマスト(1%の可溶性炭水化物で希釈、0.5%のマルトース、および0.5%のサワードウ抽出物、pH5.6を添加)、乳清(先の組込み(integration)を参照)、または野菜および果実製品の水性抽出物(先の組込みを参照)を使用して、同じ手順を適用し、同じ結果を得、連続的に記載した。インキュベーションは、30℃で18時間実施する。遠心分離(4℃で10分間、10,000×g)によって細胞を取り出した後、単一培養および共培養の上清に、トリフルオロ酢酸(0.05%)を添加し、10,000×gで10分間遠心分離した。上清を0.22μmの孔のフィルターを使用して濾過した。HPLC分析は、214nmで作動する検出器を備えたAKTA Purifier(GE Healthcare)装置を使用し、逆相C18XTerraカラム(Waters、Mildford)を使用して実施した。水、2-プロパノール、およびトリフルオロ酢酸(0.05%)の混合物を移動相として使用した。すべてのA型プランタリシン含有画分を、ESI-イオントラップMS質量分析計結合多次元クロマトグラフ(MDLC)を使用して分析した。プランタリシンA、K、およびNを同定および定量化するための分析条件は、Di Cagnoら(Di Cagnoら、2010、「Quorum sensing in sourdough Lactobacillus plantarum DC400 (DSM 23213): induction of plantaricin A (PlnA) under co-cultivation with other lactic acid bacteria and effect of PlnA on bacterial and Caco-2 cells」、Proteomics  近刊)に従う。
【００３２】
(2)ラクトバシラス・ロシアエ  DPPMA174(DSM23214)の増殖動態
L.ロシアエ  DPPMA174(DSM23214)の増殖動態学的データは、Gompertzの式を使用して処理し、引き続いて修正した(Zwieteringら、1990、「Modelling of bacterial growth curve」、Appl Environ Microbiol 56:1875〜1881)。細胞計数は、SDB培地上に30℃で48時間プレーティングすることによって実施した。細胞生存能ならびに損傷および/または死亡した細胞の数は、LIVE/DEAD bacLight Bacterial Viabilityキット(Molecular Probes, INc、Cambridge)によって求めた。
【００３３】
(3)二次元電気泳動分析およびタンパク質同定
単一培養または共培養されたL.ロシアエ  DPPMA174(DSM23214)由来の細胞質タンパク質の二次元電気泳動分析は、インモビリン(-ポリアクリルアミドシステム(De Angelisら、2005、Biochim. Biophys. Acta、1762:80〜93)を使用して実施した。各条件について4つのゲルを分析し、データを、Biniら(Biniら、1997、「Protein expression profiles in human breast ductal carcinoma and histologically normal tissue」、Electrophoresis、18:2831〜2841)による手順に従って標準化した。
【００３４】
タンパク質同定は、LC-ESI-MS/MS分析、および得られた配列の様々なデータベース(National Center for Biotechnology Information、Bethesda、MD、USA; ProFound、http://www.prowl.rockefeller.edu/cgibin/ProFound)に対する比較を使用して実施した。
【００３５】
(4)再生表皮に対するアッセイおよびTEER(経上皮電気抵抗)測定
再生ヒト表皮SkinEthic(登録商標)(再生ヒト表皮)は、多層ヒト表皮からの通常のケラチノサイトからなる。これは、空気-液体界面で、不活性な多孔質ポリカーボネート支持体上で、子ウシ血清を添加することなく、17日間既知組成培地(MCDM153)中でヒトケラチノサイトを培養して、完全に分化した表皮である。この増殖工程において、形態的な分析は、10を超える緻密な細胞層からなる多層状の生存可能な表皮および角質層を示す。再生ヒト表皮SkinEthic(登録商標)は、以前に記載されたプロトコール(Di Cagnoら、2009、「Synthesis of γ-amino butyric acid (GABA) by Lactobacillus plantarum DSMZ19463: functional grape must beverage and dermatological application」、Appl Biotechnol Microbiol DOI: 10.1007/s00253-009-23704)に従って使用した。
【００３６】
TEER測定は、Millicell-ERS Volthommeterを使用して実施した(Di Cagnoら、2010、「Quorum sensing in sourdough Lactobacillus plantarum DC400: induction of plantaricin A (PlnA) under co-cultivation with other lactic acid bacteria and effect of PlnA on bacterial and Caco-2 cells」、Proteomics  近刊)。
【００３７】
(5)Caco-2/TC7細胞についてのアッセイ
ヒトCaco-2/TC7細胞(TC7クローン)を、子ウシ血清(10%)、非必須アミノ酸(1%)、ゲンタマイシン/ストレプトマイシン(50μg/ml)、グルタミン(2mM)、および4-2-ヒドロキシエチル-1-ピペラジニル-エタンスルホン酸(1%)を添加したダルベッコ培地(DMEM)中で培養した(Di Cagnoら、2010、「Quorum sensing in sourdough Lactobacillus plantarum DC400: induction of plantaricin A (PlnA) under co-cultivation with other lactic acid bacteria and effect of PlnA on bacterial and Caco-2 cells」、Proteomics  近刊)。細胞生存能は、ニュートラルレッド色素を使用する吸収アッセイを用いて求めた(Ballsら、1987、「Approaches to validation alternative methods in toxicology」、In: Goldber A.M.(編)、N.Y. Academic Press、45〜58頁)。様々な配合物で24〜72時間処置した後、細胞をPBS緩衝液で洗浄し、ニュートラルレッド溶液(33mg/l)を用いて37℃で4時間インキュベートした。引き続いて、細胞をPBS緩衝液で再び洗浄し、溶解液(1%の酢酸を含有する水中、50%のエタノール)で処理した。プレートの読みは、Novapathプレートリーダー(Biorad、Hercules、CA)を使用して実施した。(Di Cagnoら、2010、「Quorum sensing in sourdough Lactobacillus plantarum DC400: induction of plantaricin A (PlnA) under co-cultivation conditions with other lactic acid bacteria and effect of PlnA on bacterial and Caco-2 cells」、Proteomics近刊).
【００３８】
TEER測定のために、Caco-2/TC7細胞を、24ウェルプレートおよびポリエチレンフィルター(0.4μmの孔)中でインキュベートした(7.5×104細胞/ml)。処置の前に、細胞を37℃で21日間インキュベートした。様々な配合物を用いた処置を、18、24、および48時間実施した。したがって、細胞層の完全性をTEER測定によって判定した。
【００３９】
結果
(1)プランタリシン型ペプチドフェロモンの合成および精製
WFH培地培養中で18時間増殖させた後、L.プランタルム  DC400(DSM23213)単一培養の細胞密度は、9.27±0.18log ufc/mlであった。μmaxおよびλ値は、それぞれ、約0.27log ufc/ml/時間、および3.77時間であった。乳酸菌の細胞密度は、9.0±0.05(L.ブレビスCR13)から9.43±0.31log ufc/ml(L.プランタルムDPPMA20)まで変化した。μmax値は、0.11±0.05(L.ペントサス12H5)から0.15±0.04log ufc/ml/時間(L.プランタルムDPPMA20)まで変化し、ならびにλ値は、0.37±0.07(P.ペントサセウス2XA3)から4.20±0.36時間(L.ロシアエ  DPPMA174(DSM23214))まで変化した。単一培養と比較して、微生物を他の乳酸菌とともに共培養した場合、L.プランタルム  DC400(DSM23213)の細胞密度は、著しく変化しなかった(P>0.05)(9.06±0.34 - 9.28±0.42log ufc/ml)。L.プランタルムDPPMA20、ラクトバシラス・パラリメンタリウス(Lactobacillus paralimentarius)8D、L.ペントサス12H5、ラクトバシラス・ロイテリ(Lactobacillus reuteri)、およびワイセラ・シバリア(Weissella cibaria)10XA16の細胞収率も、共培養条件によって調整されなかった。反対に、L.ロシアエ  DPPMA174(DSM23214)およびP.ペントサセウス2XA3の細胞密度は、単一培養条件と比較して著しく減少する(P<0.05)(約8.08および8.39log cfu/ml)。一般に、L.プランタルム  DC400(DSM23213)と共培養される場合、μmax値は、すべての乳酸菌で減少する。L.プランタルムDPPMA20を例外として、λ潜伏期もすべての乳酸菌で増大する。L.プランタルム  DC400(DSM23213)共培養の結果として阻害を示した乳酸菌株(L.ロシアエ  DPPMA174(DSM23214)およびP.ペントサセウス2XA)、ならびに共培養条件によって影響されなかったいくつかの株(L.プランタルムDPPMA20およびL.ペントサス12H5)を、引き続く実験で使用した。
【００４０】
以前の結果と一致して、L.ロシアエ  DPPMA174(DSM23214)生細胞の数は、単一培養からL.プランタルム  DC400(DSM23213)との共培養条件で、9.0±0.28から8.32±0.25log  小細胞/mlに減少する。生存可能で培養可能な細胞の数は、有意な差異を示さなかった(P>0.05)。やはり単一培養条件を参照して、死亡または損傷したL.ロシアエ  DPPMA174(DSM23214)細胞の数は、L.プランタルム  DC400(DSM23213)との共培養条件で著しく(P<0.05)増加した。培養可能なP.ペントサセウス細胞の数も、乳酸菌がL.プランタルム  DC400(DSM23213)と共培養された場合、著しく(P<0.05)減少する。
【００４１】
細胞を取り出した後、単一培養上清および共培養上清を、ナノ-ESI/MS-MS質量分析結合MDLC分析を使用するプランタリシン型ペプチドフェロモンの測定に使用する。図1aは、L.プランタルム  DC400(DSM23213)およびL.ロシアエ  DPPMA174(DSM23214)共培養試料のフルスキャンクロマトグラムを示す。基質の複雑性のために、いくつかの種を同定することが可能であったが、反対に、隣接するピークの完全な分離を実施することは困難であった。しかし、特定のm/z値に対応したシグナルろ過(signal filtration)によって、共溶出された種を分離することが可能であった。同定された種の例を図1bに報告する。MS/MSスペクトルをそれぞれの種について得た。例えば、図1cは、L.プランタルム  DC400(DSM23213)およびL.ロシアエ  DPPMA174(DSM23214)共培養からの試料について選択された、1493.7m/z値に対応するスペクトルを示す。NCBInrデータベースでの配列検索のために、以下のパラメータを特定した:属(ラクトバシラス)、イオン認識のためのm/zトレランス比(tolerance ratio)、(0.2Da)、および分析のために使用した計測装置。プランタリシンA(配列番号:1 Lys-Ser-Ser-Ala-Tyr-Ser-Leu-Gln-Met-Gly-Ala-Thr-Ala-Ile-Lys-Gln-Val-Lys-Lys-Leu-Phe-Lys-Lys-Trp-Gly-Trp)の存在が、L.プランタルム  DC400(DSM23213)単一培養およびDPPMA20単一培養の両方、ならびにDC400株が他の乳酸菌と培養されたすべての共培養について観察された。
【００４２】
以前の結果に基づいて、単一培養および共培養からの試料を、他のペプチド汚染を除外するために、4回のクロマトグラフィーの実施を使用して精製し、ナノ-ESI-MSを使用してさらに分析した。L.プランタルム  DC400(DSM23213)で合成されたプランタリシンAの濃度を、逆相C18XTerraカラム(Waters、Mildford)およびOPA法を使用して、クロマトグラフィー分析によって求めた。図2は、様々な条件下でのプランタリシンAの濃度を示す。ペプチドフェロモンの合成収率が、単一培養(約0.06μg/ml)からL.ロシアエ  DPPMA174(DSM23214)の存在下での共培養条件(約2.5μg/ml)で増大するのを観察することが可能である。ある特定の実験条件下で、プランタリシンAの濃度は約4.0μg/mlである。他の乳酸菌種との共培養条件下でもプランタリシンAの産生が観察されたが、得られた量は、L.プランタルム  DC400(DSM23213)およびL.ロシアエ  DPPMA74(DSM23214)共培養より著しく低い。
【００４３】
この結果は、ペプチドフェロモンの合成は、シグナル分子の放出を誘導するのに適した特定の微生物相互作用の存在下で特異的であることを証明する。プランタリシンAの合成は、中間の指数増殖期(約7時間)の間に始まり、最大で指数相(約12時間)の最後まで増大する。より低い濃度、すなわち、約0.02-0.06mg/mlであるが、K型およびN型プランタリシンも、L.プランタルム  DC400(DSM23213)およびL.ロシアエ  DPPMA174(DSM23214)共培養においてのみ観察された。共培養の基質としてCDM、グレープマスト、乳清、または果実および植物性産物の水性抽出物を使用して、同じ結果が得られた。
【００４４】
(2)ラクトバシラス・ロシアエ  DPPMA174(DSM23214)の増殖動態
L.ロシアエ  DPPMA174(DSM23214)を、2.5μg/mlの精製された、または化学合成されたプランタリシンAを添加したWFH培地上で培養した。図3において、精製されたプランタリシンAの存在は、細胞数の顕著な減少、すなわち、9.18±0.26(単一培養条件下)から8.4±0.14log ufc/mlをもたらしたことが観察される。同様の結果が、化学合成されたプランタリシンAを使用して得られた。両方のこれらの場合において、L.プランタルム  DC400(DSM23213)およびL.ロシアエ  DPPMA174(DSM23214)共培養について見出されたものと同様の結果が観察された。培養が精製された、または化学合成されたプランタリシンAの存在下で実施された場合の損傷または死亡したL.ロシアエ  DPPMA174(DSM23214)細胞数は、DPPMA174(DSM23214)単一培養より著しく(P<0.05)高かった(約8.80±0.14対6.08±0.22log細胞/ml)。
【００４５】
得られたデータは、L.ロシアエ  DPPMA174(DSM23214)に対するL.プランタルム  DC400(DSM23213)の阻害効果は、プランタリシンA、およびおそらく、同じ化学的クラスに属する他のペプチドフェロモンの合成から生じることを示す。
【００４６】
(3)L.ロシアエ  DPPMA174(DSM23214)のタンパク質発現レベルの変動
単一培養と比較して、L.プランタルム  DC400(DSM2323)との共培養、または精製されたプランタリシンAの存在下で培養されたL.ロシアエ  DPPMA174(DSM23214)の細胞質ゾル抽出物の二次元電気泳動分析は、それぞれ、51および27タンパク質の発現レベルの変動を示す。プランタリシンAの存在下で高発現したすべてのタンパク質は、共培養条件下でも高発現した。例として、図4は、単一培養、L.プランタルムDC440との共培養、および精製されたプランタリシンAの存在下での単一培養条件を指すゲルの一部を示す。より高発現したタンパク質のいくつかは、質量分析を使用して同定され、タンパク質生合成(セリル-tRNA合成酵素)、エネルギー代謝(グルコース-6-リン酸脱水素酵素、ホスホグリセレートムターゼ、アセトアルデヒド-CoA脱水素酵素、6-ホスホ-グルコネート脱水素酵素、およびβ-ホスホ-gluco-ムターゼ)、タンパク質およびアミノ酸の異化(ATP依存性ClpプロテイナーゼおよびRアミノペプチダーゼ)、環境ストレス応答(GroEL、GroES、S2、およびS5リボソームタンパク質)、ならびに酸化還元電位恒常性(NADHオキシダーゼ)に関与することが見出された。これらのタンパク質の大部分は、環境ストレス条件に対する応答および/または細胞コミュニケーション機構として、他の乳酸菌においても同定された(Di Cagnoら、2007、「Cell-cell communication in sourdough lactic acid bacteria: a protomic study in Lactobacillus sanfranciscensis CB1」、Proteomics 7:2430〜2446)。特に、グルコース-6-リン酸脱水素酵素は、大腸菌(Escherichia coli)細胞のプログラム死の機構におけるフラトリサイド(fratricide)ペンタペプチドの放出を触媒する(Kolodkin-Galら、2007、「A linear pentapeptide is a quorum-sensing factor required for mazef-mediated cell death in Escherichia coli」、Science 318:652〜655)。
【００４７】
得られた結果は、プランタリシンA合成の結果としてのL.ロシアエ  DPPMA174(DSM23214)の阻害効果は、細胞コミュニケーション機構に基づき、おそらく、標的微生物の死をもたらす応答を誘発するのに適していることを示す。これらの結果は、シグナル分子の殺菌価(bactericidal valence)を証明する。
【００４８】
(4)再生表皮についてのアッセイおよびTEER(経上皮電気抵抗)測定
2.5μg/mlのプランタリシンA濃度を伴うプランタルム  DC400(DSM23213)およびL.ロシアエ  DPPMA174(DSM23214)共培養からのバイオマス試料、ならびに2.5μg/mlの同じ濃度の共培養由来の精製されたプランタリシンAの両方を、SkinEthic(登録商標)モデルによる再生ヒト表皮の処置についてアッセイした。このモデルは、科学界によって広く使用され、認められている(Di Cagnoら、2009、「Synthesis of γ-amino butyric acid (GABA) by Lactobacillus plantarum DSMZ19463: functional grape must beverage and dermatological application」、Appl Biotechnol Microbiol DOI: 10.1007/S00253-009-23704)。24時間処置した後、TEER測定を実施した。このタイプの分析は、国際的な科学界によって広く認められており、角質層の完全性、および関門機能を参照として採用して組織腐食を評価する。特に、この評価を使用して、角質層レベルでの層状の緻密な構造の存在、タイトな完全な(integral)接合部、および表皮の厚さについての情報を得ることが可能である。これらの要因は、全体として効率的な関門機能を定義する。図5は、プランタリシン含有バイオマス、および対象の共培養由来の精製されたプランタリシンAの存在の両方において、TEER値の有意な増大(P<0.05)が起こり、したがって、皮膚レベルでのこの分子の保護活性を実証する。同じ結果が、化学合成されたプランタリシンAを使用して得られた。
【００４９】
現在の最新技術によれば、細菌細胞コミュニケーション機構に関与するペプチドフェロモンの適用のこの最初の例は、表皮ヒト細胞によって感知されるのに適しており、関門機能の刺激をもたらす。
【００５０】
(5)Caco-2/TC7細胞についてのアッセイ
Caco-2/TC7細胞の生存能を、ニュートラルレッド色素吸着能力として評価した。DMEM培地(陰性対照)と比較して、精製されたプランタリシンA(2.5g/ml)を用いた24〜72時間のインキュベーションは、Caco-2/TC7細胞の生存能を著しく増大させた(図6)。同じ結果を、化学合成されたプランタリシンAを使用して得た。プランタリシンAに使用した同じクロマトグラフィー条件によって溶出した、L.ロシアエ  DPPMA174(DSM23214)単一培養で精製した画分に由来する試料を使用する処置によって、誘導はまったく観察されなかった。予期されたように、Caco-2/TC7細胞のγ-インターフェロン(IFN-γ)への曝露は、顕著な生存能減少をもたらした(P<0.05)(図7)。反対に、IFN-γの負の効果は、精製された、または化学合成されたプランタリシンAを用いた同時の処置の存在下で完全に排除される。精製されたプランタリシンAの添加は、Caco-2/TC7細胞についてのTEER値の顕著な増大(P<0.05)をもたらした(図8)。同じ結果が、Caco-2/TC7細胞を使用して観察された。DMEM培地と比較して、IFN-γの添加により、TEER値が著しく(P<0.05)低減した。しかし、精製された、または化学合成されたプランタリシンAの添加により、この場合も、負の効果が排除された。
【００５１】
Caco-2/TC7細胞は、腸粘膜をシミュレートするためにインビトロで最も使用される系の1つである。腸粘膜の腫瘍起源であるが、前記細胞は、成熟した腸細胞に自発的に分化させ、刷子縁酵素を発現させるのに適している。培養条件下で、Caco-2/TC7細胞は、完全性がTEER測定によって判定される、タイトな細胞間接合部を含めた形態学的および機能的特性を発展させるのに適している(Sambuyら、2005、「The Caco-2 cell line as a model of the intestinal barrier: influence of cell and culture-related factors on Cao-2 cell functional characteristics」、Cell Biol Toxicol 21:1〜26)。この試験の結果は、精製された、L.プランタルム  DC400(DSM23213)およびL.ロシアエ  DPPMA174(DSM23214)共培養に由来する、または化学合成されたプランタリシンAは、腸粘膜の関門機能を刺激し、γ-インターフェロン処置の負の効果を防止するのに適していることを実証する。
【００５２】
(6)プランタリシンAを合成するための生物工学プロトコール、および皮膚科学的分野におけるその使用の開発
本文の他の部分で上記に概略したように、プランタリシンAを合成するための生物工学的方法、および皮膚科学的分野におけるその使用を開発した。前記プロセスは:
a)mMRS培地上の純粋な培養液中でのL.プランタルム  DC400(DSM23213)およびL.ロシアエ  DPPMA174(DSM23214)の培養;
b)細胞収集、洗浄、WFH、CDM、グレープマスト、乳清、または培地としての養分利用可能性のために適切にインテグレートしている野菜もしくは果実の水性抽出物中での再懸濁;
c)30〜37℃、好ましくは30℃で、18〜24時間、好ましくは24時間の共培養インキュベーション;
d)遠心分離による細胞分離。プロセスの変形によれば、配合物は、乳酸菌細胞を含有することもできる;
e)乾燥または凍結乾燥プロセスによる配合物の脱水;
f)皮膚用配合物の生産
を含む。
【００５３】
実施例２
創傷治癒における本発明によるバイオマスおよびプランタリシンAの効果についての試験
方法
培養したヒトケラチノサイトを、プランタリシンA(2.5μg/ml)またはプランタリシンA含有バイオマスとともに1時間インキュベートした。
【００５４】
インキュベーションの最後に、細胞を洗浄し、培地を復元した。
【００５５】
創傷治癒
試験は、損傷境界を越えて遊走し、したがって「外傷を治癒する」ケラチノサイトの能力を促進または促進しないかにおける処置効果が評価されるように、細胞単層の連続性の機械的な中断を実施する工程からなる。
【００５６】
この目的のために、上述したように処置したケラチノサイト単層を、刺激を施した後にさらに24時間にわたってインキュベートし、次いで固定し、ヘマトキシリン/エオシン染色を使用して染色した。画像を、5倍対物レンズを使用して、光学顕微鏡で観察した。
【００５７】
各画像について、最大細胞遊走限界およびこの限界の間の距離またはギャップをそれぞれ検出および計算した(図9〜10)。
【００５８】
結果
図9において、創傷治癒アッセイの結果を報告する。細胞連続性の中断後に24時間インキュベートした後に、刺激されなかったケラチノサイト単層(対照)は、創傷の縁から及ぶいくつかの細胞を示す。しかし、細胞がヒアルロン酸で刺激される場合、細胞遊走は特に明らかである。この場合、実際に、外傷部のギャップは処置されなかった細胞(対照)より狭く、創傷治癒についての細胞遊走能力を立証している。
【００５９】
細胞遊走能力を分析的に見積もるために、図10に報告するように、創傷の縁に輪郭を描き、これらを測定および分析した。
【００６０】
プランタリシンAまたはプランタリシンA含有バイオマスでインキュベートされたケラチノサイトは、対照細胞と比較して、創傷の縁の間のギャップを低減する。対照と比較した治癒率の増大を図11に報告する。
【００６１】
アッセイシステム:ヒト再生表皮
使用した表皮モデルは、Skinethic(登録商標)Laboratories、Nice(フランス)によって作製され、120μのバッチ平均厚さを有する、分化17日目からの0.5cm2の試料として使用される(角質層および生き生きした表皮(vital epidermis)).
【００６２】
完全に分化した表皮は、空気-液体界面で、多孔質ポリカーボネート不活性支持体上で、子ウシ血清を添加することなく、17日にわたって既知組成培地(MCDB153)中で培養したヒトケラチノサイトから得る;この分化段階で、形態的な分析は、多層の生き生きした表皮および10を超える緻密な細胞層からなる角質層を示す。
【００６３】
TEER測定
経上皮電気抵抗(TEER)は、皮膚の関門機能性の直接の測定法である。これは、厚さおよび構造の両方から全体として生じる組織の抵抗を反映する。これは、タイトな接合部レベル、外側の物質の貫通を保護する2層脂質構造での細胞間接触の完全性を反映する。
【００６４】
TEERは、パラメータ、すなわちラット皮膚電気抵抗(B40)を区別するアッセイであり、エンドポイントとして角質層の完全性および関門機能を考慮する腐食性評価のためのEUが認証した試験である。
【００６５】
これは、インビボで測定される場合、経表皮水喪失の尺度であるTEWLに反比例する。より高いTEWLは、関門機能のより高い損傷に対応し、一方、より高いTEERは、関門機能のより低い損傷に対応する。
【００６６】
挿入の間、PBS 1mlが投与され、経上皮電気抵抗がMillicell-ERS計測器(範囲  0〜20kΩ)を使用して測定される。
【００６７】
様々な測定を各組織について実施した。
【００６８】
図5は、3回の測定を3つの組織それぞれについて実施した、3つの組織についての平均を指すTEER値を示す。
【００６９】
TEER値に関して、以下の特性が重要である:角質層レベルでの層状の緻密な構造の存在、完全なタイトな接合部、および効率的な関門機能を全体として規定する表皮の厚さ。どの組織も、t=0およびt=24時間での測定を含む自己参照である。
【００７０】
得られた結果は特に興味深く、実際に、プランタリシンAおよびプランタリシンA含有バイオマスの存在の両方において、TEERの顕著な増大が明らかである。
【００７１】
この増大は、表皮の厚さの増大、ならびにタイトな接合部レベルでの角質層のより良好な緻密度および完全性の両方の誘導された結果である。
【００７２】
実施例３
プランタリシンA:皮膚の関門機能の維持および回復のためのその役割についての試験
この試験は、以下の目的が達成されるためのL.プランタルム  DC400(DSM23213)およびL.ロシアエ  DPPMA174(DSM23214)共培養によって得られるプランタリシンAの使用に基づく:
【００７３】
陽性対照(処置されていない細胞)および市販の/公知活性の陰性対照と比較したヒトケラチノサイト単層(NCTC2544)の遊走および増殖に対する効果の試験を通じた、創傷修復に対するバイオマス効果の評価。処置を、3つの連続の時間(24、48、72時間)で、様々な濃度の対象のプランタリシン(細胞毒性アッセイを使用する測定後)で実施する。
【００７４】
リアルタイムPCRによる、陽性対照(処置されていない細胞)および市販の/公知活性の陰性対照と比較したIL-8、KGF(ケラチノサイト増殖因子)、TGF-β1(トランスフォーミング増殖因子-β)のようなメディエーター調節を評価する、考慮された時間および濃度での細胞損傷応答の分析。
【００７５】
物質および方法
細胞培養
使用した細胞株は、1%のペニシリンおよびストレプトマイシンの存在下で、10%の子ウシ血清(FBS)、2mMのL-グルタミン、1%の非必須アミノ酸を添加したMEM(最小必須培地)培地中、5%のCO2の高湿度雰囲気中で、37℃でインキュベートした、滅菌したフラスコ内で培養したヒトNCTC2544ケラチノサイト細胞株(Perry, V.P.、Sanford, K.K.、Evans, V.J.、Hyatt, G.W.、Earle, W.R.、1957、「Establishment of clones of epithelial cells from human skin」、J Natl Cancer Inst、18 (5): 709〜717)である。細胞は、単層として培養プレート表面に接着してインビトロで増殖する。
【００７６】
創傷治癒による経時的な組織損傷治療に対する試験
方法の原理:
実験は第1にコンフルエントな細胞単層の成長を伴う。引き続いて、カットが実施され、生じた「ギャップ」を、細胞が徐々に移動して損傷を修復する際に顕微鏡を使用して観察する。
【００７７】
この瘢痕形成プロセス(前記「治癒」)は、細胞株、創傷条件、および程度に応じて数時間から1日を超えて続く場合がある。
【００７８】
実験手順
○  NCTC2544細胞を蒔き、37℃で5%のCO2とともに24時間培養する。
○  24時間後に、細胞増殖に対する血清効果を回避するために完全成長培地を無血清培地と置き換え、細胞を、37℃、5%のCO2でさらに24時間インキュベートする。
○  24時間後に、細胞単層を、200μlのピペットチップで穏やかにブラッシングし、約1mmの幅の水平の線の跡をつけることによって機械的に損傷させる。次いで単層を洗浄し、試験される物質を添加した後、37℃、5%のCO2で、72時間、プレートをインキュベートする。
○  細胞運動性に対する物質の効果を、位相差倒立顕微鏡を使用して評価し、様々な適切に選択された分析時間で画像を得る。
○  損傷治療は、画像処理ソフトウェア(Leica application Suite)を使用して、カットして0、4、8、12、24、48、72時間後に、カット部と2つの遊走前線との間のクリアな領域を測定して判定する。
○  各実験のすべてのデータは、0、4、8、12、24、48、および72時間での測定についてExcelで統計的に処理する。
【００７９】
リアルタイムPCRを使用するIL-8、KGF、TGF-β遺伝子発現の評価による細胞損傷応答の分析
手順は、3つの基本的な工程からなる:
I. 細胞からのトータルRNAの抽出
II. cDNAにおけるレトロ転写
III. リアルタイムPCR
【００８０】
I.細胞からのトータルRNAの抽出
1%のペニシリンおよびストレプトマイシンの存在下で、10%の子ウシ血清(FBS)、2mMのL-グルタミン、1%の非必須アミノ酸を添加したMEM(最小必須培地)培地中、5%のCO2の高湿度雰囲気中で、37℃でインキュベートした、培養フラスコ内で維持された、不死化されたNCTC2544ヒトケラチノサイト細胞株を使用する。細胞株を、200μlのピペットチップを使用してこすり、様々な時間および濃度で処置する。
【００８１】
II.cDNAにおけるRNAレトロ転写
このプロセスは、「High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit」(Applied Byosistem)を使用して抽出されたRNA試料の増幅を含む。
【００８２】
III.リアルタイムPCR
このプロセスは、特定のTaqman遺伝子アッセイ、および「TaqMan Universal PCR Master Mix with Amperase UNG 2X」キット(Applied Biosystem)を使用するcDNA増幅を含む。
【００８３】
陽性対照(処置されていない細胞)に対する標的遺伝子発現の可能な変動を求めるための相対的(relative type)定量化を、2-ΔΔCt法によるデータ正規化およびデータ分析のためのハウスキーピング遺伝子によって使用する。
【００８４】
結果
創傷治癒
創傷治癒アッセイによる共培養由来プランタリシンのヒトNCTC2544ケラチノサイトの遊走を変更する能力を評価した。
【００８５】
この試験は、合成プランタリシン、ならびにL.プランタルム  DC400およびL.ロシアエ  DPPMA174共培養由来プランタリシンの効果の比較による評価にも関係した。
【００８６】
細胞単層上のカットを、200μlのピペットチップを使用して実施し、2本のカットラインの間のギャップ内の細胞を完全に取り出した後、前記細胞を、以下の濃度、すなわち0.1-1-10μg/mlの合成プランタリシンおよび共培養プランタリシンで処置する。陽性対照および陰性対照(100μg/mlのコンネクチビン)も二重に試験した。
【００８７】
カット領域内の細胞遊走をモニターするために、同じカット領域上の画像を、時間0、ならびに4、8、12、24、48、および72時間後に取得した。
【００８８】
図12〜16は、NCTC2544細胞株遊走に対する共培養されたプランタリシン(0.1、1、および10μg/ml)(a)ならびに合成プランタリシン(0.1、1、および10μg/ml)(b)の効果についての時間的分析を示す。
【００８９】
図12は、試験された活性剤(active)ならびに陽性対照および陰性対照の両方についての、それぞれの考慮された時間(4時間間隔で)における瘢痕形成進行(Δμm/時間)を示す。
【００９０】
細胞瘢痕形成の初期段階の間、対照と試験された活性剤との間の細胞遊走において、時間0で意味のある差異を検出することは可能でない。図12aにおいて明らかなように、0.1μg/mlおよび1μg/mlの濃度の共培養されたプランタリシンは、対照と比較して細胞遊走を著しく加速するのに適していない。効果は、カットして4時間後にすでに著しく、最大72時間一定で著しいままである。10g/mlの濃度の共培養されたプランタリシンを用いた処置は、代わりに、すべての考慮された間隔について、陽性対照、すなわち処置されていない細胞に匹敵する組織損傷の治療を生じる。
【００９１】
合成プランタリシンの等価な濃度で、同じ時間的期間の細胞処置を用いて実施した同様の実験は、この場合も、プランタリシン(合成)を用いた処置は、陰性対照と比較して、2本のカットライン内の細胞遊走を促進するより大きい能力を有することを証明した。
【００９２】
特に、この場合も、細胞瘢痕形成の初期段階の間、2つの使用した対照および2つの試験下の活性剤の両方について、細胞遊走において、時間0で意味のある差異を検出することは可能でない。
【００９３】
図12bは、それぞれ0.1μg/mlおよび10μg/mlの濃度の合成プランタリシンは、カットして4時間後にすでに陽性対照および陰性対照の両方より高い細胞遊走の増大を生じさせ、最大72時間まで、考慮されたすべての時間間隔で一定のままであることを示す。10μg/mlの濃度の合成プランタリシンを用いた処置は、代わりに、陽性対照および陰性対照に匹敵する組織損傷の治療を生じる。すべての考慮された時間間隔において、陽性対照および陰性対照に対する共培養されたプランタリシンおよび合成プランタリシンを用いた処置の効果をより完全に構成し、分析するために、本発明者らは、画像解析から得られる測定を統計的に分析した。
【００９４】
図13および14は、それぞれ共培養されたプランタリシン(図13)および合成プランタリシン(図14)を用いた処置の両方について、陽性対照と比較した、2本のカットラインを通じて遊走した細胞の百分率としてデータを報告する。また、それぞれ2本のカットラインの面積および初期面積についての面積百分率として、結果を報告する(図15〜16)。
【００９５】
図13および14中で報告したチャートは、それぞれ陽性対照および陰性対照、共培養されたプランタリシン(0.1-1および10μg/ml)および合成プランタリシン(0.1-1および10μg/ml)についての、様々な考慮された時間間隔の間に遊走した細胞の百分率に関するデータを示す。画像処理から得られるデータと一致して、処置をして最初の8時間後に、陰性対照はカットの瘢痕形成活性を持続せず、陽性対照と同様の遊走した細胞の百分率を与える。
【００９６】
共培養されたプランタリシンに関して(図13)、一般論として、3つすべての使用した処置濃度で、最低濃度の処置でも、時間0から最大72時間の処置までの細胞遊走のより大きい増大を略述することが可能であることを断言することが可能である。
【００９７】
特に、10μg/mlの濃度の共培養されたプランタリシンを用いた処置は、72時間の処置後を除いてすべての考慮された時間間隔で最高の遊走百分率値を示すが、それぞれ165.56%、138.18%、134.64%、118.08%、139.07%、および149.04%の遊走した細胞の百分率値を有するこれらのデータは有意でない。
【００９８】
図14は、合成プランタリシンの等価な濃度で、様々な考慮された時間間隔での処置後の遊走した細胞の百分率を示す。
【００９９】
0.1μg/mlの濃度の合成プランタリシンを用いた処置は、すべての考慮された時間間隔について、遊走した細胞の最高の百分率値を生じ、開始時間から最大72時間の処置まで、それぞれ158.30%、115.15%、124.32%、141.82%、141.91%、および128.51%の値を有する。10μg/mlの濃度の合成プランタリシンを用いた処置は、0.1μg/mlの濃度の同じ活性剤を用いた処置と比較して、すべての考慮された時間間隔について、遊走した細胞の百分率をもたらすが、同時に、8時間から最大72時間の処置後の陰性対照と比較して、遊走した細胞の百分率のより高い上昇をもたらし、百分率の上昇はそれぞれ、+4.62%、+20.28%、+14.84%、および+7.47%である。反対に、1μg/mlの濃度の合成プランタリシンを用いた処置は、12時間および24時間の処置後のみ、陰性対照と比較して、遊走した細胞の百分率のより大きい上昇を生じ、それぞれ+9.86%および15.48%の百分率値である。
【０１００】
同じ濃度の共培養されたプランタリシンおよび合成プランタリシンを用いた細胞の処置は、すべての考慮された時間間隔において、陰性対照より高い遊走した細胞の百分率上昇をもたらさないが、共培養されたプランタリシンを用いて処置されたヒトNCTC2544ケラチノサイトに対する創傷治癒アッセイの結果と、同じ条件下での合成プランタリシンからの結果の比較は、共培養されたプランタリシンは、考慮された陰性対照と比較して、生じさせたカット領域を通じた細胞遊走についてより大きい効果を有することを実証することを可能にした。TGFβ1遺伝子は、瘢痕形成プロセスに最も関与する。
【０１０１】
創傷治癒モニタリングのために考慮されたすべての時間の中で、瘢痕形成評価から得られたデータの確認として、遺伝子発現の評価を、処置して8時間後に実施した。
【０１０２】
得られた結果により、瘢痕形成に対するコンネクチビンの顕著な効果が略述および確認される。
【０１０３】
合成プランタリシンについてのデータに関して、同じ濃度(1μg/mlおよび10μg/ml)で、共培養されたプランタリシンが遺伝子発現のより高い増大を刺激することを立証することが可能であっても、遺伝子発現は著しく増大し、バイオマス効果のさらなる確認であることが注目される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４（Ａ）】
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【図４（Ｂ）】
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【図４（Ｃ）】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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