(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプルを保存する方法であって、当該方法が、
ａ）セルロース又はガラス繊維に共有結合したリガンドを含む紙基材であって、リガンドが負荷電基を含んでいる紙基材を用意する工程と、
ｂ）紙基材上に１種以上の検体及び１種以上の夾雑物を含有するサンプルを適用する工程と、
ｃ）紙基材上のサンプルを乾燥する工程と、
ｄ）紙基材の少なくとも一部分を抽出して検体の溶液を調製する工程と
を含んでおり、前記リガンドがさらに１以上の芳香族又はヘテロ芳香族環構造を含み、前記１種以上の検体がタンパク質を含む、サンプル保存方法。
【請求項２】
さらに、工程ｃ）の後に、
ｃ'）サンプルを含有する紙基材を２４時間以上、例えば１週間以上又は１ヶ月以上保存する工程、
ｃ''）サンプルを含有する紙基材から所定の領域を１つパンチでくり抜くか切り取る工程及びｄ）所定の領域から抽出する工程、及び
ｃ'''）紙基材を洗浄する工程
の１以上の工程を含む、請求項１記載のサンプル保存方法。
【請求項３】
さらに、ｅ）前記溶液を検体の濃度、構造的完全性及び／又は生物活性について分析する工程を含んでおり、工程ｅ）が、任意には、前記溶液を質量分析法、イムノアッセイ又はバイオアッセイにより分析することを含んでいるか、及び／又は工程ｄ）で調製された溶液中の検体濃度の総夾雑物濃度に対する比が、任意には、サンプルの約２倍以上である、請求項１又は請求項２記載のサンプル保存方法。
【請求項４】
サンプルが生体液、例えば血液を含んでいるか、及び／又は夾雑物がリン脂質を含んでおり、工程ｄ）で調製された溶液中の検体濃度の総リン脂質濃度に対する比が、任意には、サンプル中の約２倍以上である、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載のサンプル保存方法。
【請求項５】
１種以上の夾雑物が、荷電基を含有し、リガンドに含有される荷電基と反対の正味電荷をもつ、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載のサンプル保存方法。
【請求項６】
工程ａ）が、ベース紙をリガンド前駆体試薬と反応させてリガンドを有する紙基材を形成することをさらに含む、請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載のサンプル保存方法。
【請求項７】
工程ａ）が、
ａ'）繊維パルプをリガンド前駆体試薬と反応させて共有結合リガンドを有する本質的に未変化の繊維を得ることと、
ａ''）連続式ウェブ抄紙機により、共有結合リガンドを有する本質的に未変化の繊維を９０重量％以上含有する紙ウェブを製造すること
をさらに含む、請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載のサンプル保存方法。
【請求項８】
紙基材が、５０μｍｏｌ／ｇ以上、例えば８６μｍｏｌ／ｇ以上、２００μｍｏｌ／ｇ以上、９００μｍｏｌ／ｇ以上、５０〜２０００μｍｏｌ／ｇ、８６〜２０００μｍｏｌ／ｇ、２００〜２０００μｍｏｌ／ｇ、９００〜２０００μｍｏｌ／ｇ又は２００〜１０００μｍｏｌ／ｇのリガンドを有する、請求項１乃至請求項７のいずれか１項記載のサンプル保存方法。
【請求項９】
少なくとも１箇所の指定サンプル適用領域を有する紙を含むサンプル適用基材であって、前記紙が、化学的に導入されたリガンドであってセルロース又はガラス繊維に共有結合したリガンドを含んでいて、リガンドが負荷電基を含んでおり、リガンドがさらに１以上の芳香族又はヘテロ芳香族環構造を含む、サンプル適用基材。
【請求項１０】
前記紙が、５０μｍｏｌ／ｇ以上、例えば８６μｍｏｌ／ｇ以上又は１００μｍｏｌ／ｇ以上のリガンドを含有する、請求項９記載のサンプル適用基材。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サンプル保存方法、特に紙基材上へのサンプル保存方法に関する。本発明はまた、サンプル保存用の紙基材及びこのような基材の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体物質の分析及び／又は保存において紙基材の使用が増加している。１つの使用分野は、薬物動態研究、例えば創薬プログラムでの大量の血液サンプルを迅速に分析する必要性が増加してきていることを懸念している。このような使用には、紙が十分な機械的特性と保存後に分析及び／又はさらに処理することができるように対象となる生体物質を保持する能力とを兼ね備えることが明らかに望ましい。このような紙の例には、ＦＴＡ及びＦＴＡ  Ｅｌｕｔｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社の一部であるＷｈａｔｍａｎ社製）として知られているものがあり、例えば、米国特許第５７５６１２６号及び同第５９３９２５９号に記載されている。これらの紙は、化学物質で含浸されて、ある検体、特に核酸の、サンプルを保存したり、さらなる処理を容易にしたりしている。
【０００３】
しかしながら、さらに、検体が紙上に保持されている間又は抽出された後、検体に適当な分析法、例えば質量分析法又はイムノアッセイを、紙のコーティングに含有されている化学成分からの妨害をプロセス中に受けずに施せることが必要である。したがって、例えば、適当な紙、具体的にはＦＴＡ及びＦＴＡ  Ｅｌｕｔｅとして販売されているものに用いるコーティングは、組成物が異なり、これらの化学物質の特性を覚えておき、基材、検体及び分析法の適当な組合せを注意深く選択することが必要である。血液などのサンプルの場合、検出される検体、例えば試験される薬物は、非常に少量で存在し、あるコーティング薬の存在で容易にマスクされることがある。さらに、多くの薬剤的に重要な検体、特にタンパク質及び他の生体高分子は、回収率の低下及び／又は生物活性の損失をもたらす変性、分解及びその他の破壊的な現象に対して非常に敏感である。核酸の安定化のために導入する化学薬品は、必ずしもタンパク質を安定化せず、場合によっては、それらはタンパク質の安定性に悪影響をもたらすこともある。
【０００４】
英国特許出願公開第２０１６４７３号及び国際公開第２００３／０１６３５６号に荷電基で置換されたセルロース繊維が記載されている。しかしながら、これらの繊維を生体サンプルの保存に用いることは示唆されず、置換反応は、繊維の実質的な分解を引き起こす条件で行われ、紙の工業生産に不適当である。連続式ウェブ抄紙機からのデータは示されていない。
【０００５】
したがって、分析を妨害するおそれのある化学薬品が存在しないサンプル保存処理をした基材を用いることが望ましい。９０３、３１ＥＴＦ紙（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社の一部であるＷｈａｔｍａｎ社製）などの普通の未処理セルロース紙を血液サンプルの保存に用いるが、これらは、例えば敏感なタンパク質の、必ずしも所望の添加回収率及び生物活性を与えない。したがって、優れたサンプル保存方法及び優れた性能をもつサンプル保存基材が必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第６３０９８８７号
【発明の概要】
【０００７】
本発明の１態様は、生物活性の検体の回収率が高く、夾雑物の濃度が低い、保存サンプルの溶液を提供することである。これは請求項１に記載した方法により実現される。
【０００８】
１つの利点は、敏感なタンパク質検体の回収率を高くできることである。さらなる利点は、例えば、リン脂質夾雑物からの妨害を低減できること、かつ均一なサンプルスポットを紙基材上に形成できることである。
【０００９】
本発明の他の態様は、サンプルを受け入れ、サンプルの乾燥後、溶液の生物活性検体の回収率を高くし、溶液の夾雑物の濃度を低くできる基材を提供することである。これは請求項２２に記載したサンプル適用基材により実現される。
【００１０】
本発明のさらなる態様は、サンプルを受け入れ、サンプルの乾燥後、溶液の生物活性検体の回収率を高くし、溶液の夾雑物の濃度を低くできる官能性紙基材の製造方法を提供することである。これは請求項２９に記載した方法により実現される。
【００１１】
従属請求項に、本発明のさらなる適当な実施形態を記載する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の異なるリガンドを有する紙にメチレンブルー色素を適用し、適用したスポットでのメチレンブルー色素の分布を示す写真である。
【図２】本発明の異なるリガンドを有する紙にオレンジＩＩ色素を適用し、適用したスポットでのオレンジＩＩ色素の分布を示す写真である。
【図３】リガンド有無の紙にメチレンブルー及びオレンジＩＩ色素を適用し、適用したスポットでのメチレンブルー及びオレンジＩＩ色素の分布を示す写真である。
【図４】アゾレクチン（リン脂質の混合物）の正イオン質量スペクトルである。
【図５】ＭｅＯＨ：ＣＨ2Ｃｌ2（７０：３０）で洗浄後のセルロース繊維（３１ＥＴＦ）の正イオン質量スペクトルである。
【図６】アゾレクチンを含浸した本発明のリガンドを有するスルホキシエチルセルロース基材の、ＭｅＯＨ：ＣＨ2Ｃｌ2（７０：３０）での洗浄後の正イオン質量スペクトルである。
【図７】アゾレクチンを含浸した本発明のリガンドを有するＤＥＡＥセルロース基材の、ＭｅＯＨ：ＣＨ2Ｃｌ2（７０：３０）での洗浄後の正イオン質量スペクトルである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
定義
本明細書で用いる用語「紙」は繊維ウェブ又はシート材料を意味する。紙は繊維、例えばセルロース又はガラス繊維及び所望により他の成分、例えば粒状フィラー、湿潤紙力又は乾燥紙力増強剤、保持剤などを含有する。
【００１４】
本明細書で用いる用語「検体」は、検出、定量化、分析、同定及び／又は評価を受ける物質又は検出、定量化、分析、同定及び／又は評価を受ける予定である物質を意味する。
【００１５】
本明細書で用いる用語「夾雑物」は、１以上の検体の検出、定量化、分析、同定又は評価を妨害する可能性がある物質を意味する。検体は、別の検体の検出、定量化、分析、同定又は評価を妨害する可能性があるならば、夾雑物にもなりえる。
【００１６】
本明細書で用いる用語「サンプル」は、流体、液体、半固体又は固体材料の一部を意味する。
【００１７】
本明細書で用いる用語「リガンド」は、化学種であって、他の化学種と結合したり、他の化学種を引きつけたりできるものを意味する。リガンドが固体表面に結合している場合、溶解した物質が、各物質に対するリガンドの選択性に応じて、表面に結合するか、表面に保持される。
【００１８】
発明の詳細な説明
１態様では、本発明は、
ａ）荷電基を含有するリガンドを有する紙基材を用意する工程と、
ｂ）紙基材上に１種以上の検体及び１種以上の夾雑物を含有するサンプルを適用する工程と、
ｃ）紙基材上のサンプルを乾燥する工程と、
ｄ）紙基材の少なくとも一部分を抽出して検体の溶液を調製する工程と
を含むサンプル保存方法を開示する。
【００１９】
換言すれば、１種以上の検体及び１種以上の夾雑物を含有するサンプルを官能性紙基材に適用し、乾燥する。その後、紙基材の一部又は紙基材の全体を抽出して検体を含有する溶液を調製する。官能性紙基材はリガンドが化学的に導入され、その結果、官能性紙基材が荷電基を含有する。紙基材は、カードの形態とし、所望により、例えば、印刷パターンによって示された、１以上の指定サンプル適用領域を有することができる。紙基材は、適用したサンプルの識別のためのインデックス、例えばテキスト、バーコード又はＲＦＩＤタッグを有してもよい。サンプルは、液体とすることができ、紙基材によって吸収され、サンプルスポットを形成することができる。サンプルはまた、固体又は半固体組織サンプルでもよく、その場合、紙基材にプレス及び／又は基材上でふやかし、その結果、流体成分が吸収され、サンプルスポットを形成するようにできる。乾燥は、例えば熱、乾燥空気又は真空を適用することにより能動的に行うことができ、或いは、乾燥は流体成分が蒸発するまで待つことにより受動的に行うことができる。乾燥は、紙基材の水分含量が周囲雰囲気と平衡状態になるまで（典型的に、相対湿度８０％未満で紙の水分１０％以下）、或いはサンプル中の約５０％以上の揮発成分が蒸発するまで行うことができる。抽出は、例えば過剰の水性又は非水性液体中に紙基材の一部を浸漬することにより行うことができ、液体及び浸漬条件は、検体の特性及び次に用いる分析法の要求に応じて選択される。
【００２０】
リガンドは、正荷電基、例えばプロトン化アミン、４級アンモニウム基、アミジン、スルホニウム基など及び／又は負荷電基、例えばカルボン酸、スルホン酸、硫酸、リン酸、ホスホン酸などを含む。荷電基を含有するリガンドの例には、ジエチルアミノエチル−ＣＨ2ＣＨ2Ｎ+Ｈ（ＣＨ3ＣＨ2）2、トリメチルアンモニウム−Ｎ+（ＣＨ3）3、カルボキシメチル−ＣＨ2ＣＯＯ・、スルホエチル−ＣＨ2ＣＨ2ＳＯ3・及びスルホプロピル−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＳＯ3・、並びにさらに複雑な構造、例えばマルチモーダルリガンド又は双性イオンリガンドがあるが、これらに限らない。
【００２１】
ある実施形態では、本方法は、乾燥サンプルを含む紙基材を２４時間以上、具体的には１週間以上又は１ヶ月以上保存する工程ｃ'）も含む。この工程は、工程ｃ）と工程ｄ）の間に行うのに適しており、本方法の利便性のために重要である。高い保存安定性をもつことは、多数のサンプルを集め、後の段階で分析できること及びサンプルを中央分析施設などに輸送できて好都合であることを意味する。保存は、それぞれ特定な場合の検体の安定性に依存して室温（約２０〜２５℃）又は冷蔵（例えば、約４〜８℃）で行われる。検体が、室温又は例えば、熱帯条件下でなるであろう約３７℃又は４０℃までの温度に保存後、高い回収率及び高い生物活性で基材から回収できればコスト及び物流管理の観点から有利になる。
【００２２】
実施形態によっては、本方法は、サンプルを含有する紙基材から１以上の所定の領域をパンチでくり抜く又は切り取る工程ｃ''）及び基材片を抽出する工程ｄ）も含む。この工程は、工程ｃ）又は工程ｃ'）と工程ｄ）との間に行うことができ、同じサンプルスポットで幾つかの異なる分析又は平行した分析を実施できる可能性及びサンプル寸法に無関係に定量分析を実施できる可能性も与える。パンチでくり抜いたか切り取った基材片の面積に紙の厚さを掛け合わせると特定の体積が求められる、紙基材が均一にサンプルを吸収するならば、特定の体積中の検体の量を用いて元のサンプルの濃度を計算できる。本発明の方法の利点の１つは、検体を高い回収率で得られることであり、これは定量分析で必須である。別の利点は、サンプルスポット全体で検体の均一な分布が得られることであり、これも定量分析で必要不可欠なことである。
【００２３】
ある実施形態では、本方法は、紙基材を洗浄する工程ｃ'''）も含み。この工程は通常、工程ｃ）と工程ｄ）の間（例えば、工程ｃ'）及び／又は工程ｃ''）後）に行うことができ、夾雑物を除去する可能性を与える。この工程は、例えば適切に選択した水性又は非水性洗浄液中に紙基材の一部を浸漬することにより行うことができる。洗浄条件で、１以上の検体が官能性紙基材に結合し、一方、１以上の夾雑物が洗い流されるならば夾雑物は、特に効率的に除去できる。この場合、検体が基材から脱着されるように工程ｄ）での抽出時に条件を変えることが有利になることがある。洗浄液及び抽出液の特性は、紙基材、検体及び夾雑物の特徴にしたがって選択される。経験則で、水性又はある程度水性の液体、例えばバッファをタンパク質検体と共に用いる場合、低い塩含量は、荷電基を含有するリガンドと荷電基に対して反対の正味電荷をもつ検体との間の結合を促進し、高い塩含量は、疎水基と検体との結合を促進する。
【００２４】
実施形態によっては、本方法は、工程ｄ）で得られる溶液を検体の濃度、構造的完全性及び／又は生物活性について分析する工程ｅ）も含む。この工程で用いる方法は、質量分析法、イムノアッセイ又はバイオアッセイとすることができる。考えられるイムノアッセイの例には、ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙｓ）、ラジオイムノアッセイ、磁力イムノアッセイ、ラテラルフローアッセイ、ウェスタンブロッティングなどがある。通常、バイオアッセイは、物質の生物活性を評価するのに用いられ、種々の形態の細胞アッセイ又は動物試験とすることができる。
【００２５】
ある実施形態では、抽出工程ｄ）で調製された溶液中の検体濃度の総夾雑物濃度に対する比は、元のサンプルと比べて、約２倍以上高く、具体的には約１０倍以上高い。この検体の相対濃縮は、抽出中に夾雑物を基材に選択的に結合すること及び／又は洗浄工程中に検体を基材に選択的に結合することにより実現できる。
【００２６】
実施形態によっては、サンプルは、生体液、例えば血液、血清、血漿、脳脊髄液、尿、細胞培養上澄、植物樹液などを含む。本発明の方法は、多数の夾雑物を含有する複雑な生体液サンプルであり、検体濃度が夾雑物濃度より何桁も少ないことが多い生体液サンプルの保存及び製造に特に適している。生体液は、分解及び／又は変性に非常に敏感な種を含有することが多く、したがって、生物活性の検体の回収率を高くできる基材を使うことが重要である。
【００２７】
ある実施形態では、夾雑物はリン脂質を含む。リン脂質は、血液中及び細胞又は細胞片を含有するサンプル中の一般の夾雑物である。夾雑物は、多くの分析法、特に、一般に薬物動態解析に用いられる質量分析法を妨害する、粘性の疎水性物質である。本発明の方法の利点はサンプルからリン脂質を除去するのに適していることである。１実施形態では、工程ｄ）で調製された溶液の検体濃度の総リン脂質濃度に対する比は元のサンプルの約２倍以上である。
【００２８】
実施形態によっては、１以上の検体は、電荷をもち、リガンドの荷電基と反対の正味電荷をもつ。この利点は、敏感なタンパク質検体の保存安定性が向上することである。さらなる利点は、洗浄工程で夾雑物を洗い流すことができることである。検体の正味電荷の符号は、検体の化学構造から計算できることが多い。タンパク質及び他の両性検体では、正味電荷は通常、ｐＨ値が等電点未満で正であり、ｐＨ値が等電点超えで負である。等電点は、多くのタンパク質について公表されており、等電点電気泳動により求めることもできる。
【００２９】
ある実施形態では、１以上の検体は荷電していて、リガンドの荷電基と同じ符号の正味電荷をもつ。この利点は、抽出回収率が増加すること及びスポットの均一性の向上が実現できることである。
【００３０】
実施形態によっては１以上の検体は、生物薬剤などのタンパク質を含む。対象となる特定タンパク質は、イムノグロブリン、例えばモノクローナル抗体、酵素、タンパク質ホルモン、例えばエリスロポエチン、インシュリンなど及び様々な群のバイオマーカーを含む。
【００３１】
ある実施形態では、１種以上の夾雑物は、荷電基を含有し、リガンドに含まれる荷電基と反対の正味電荷をもつ。この利点は、夾雑物を紙上に保持し、検体を抽出する抽出の条件を容易に設定できることである。これは、正及び負両方の荷電基を含有する双性夾雑物に適用することもできる。
【００３２】
ある実施形態の工程ａ）では、また、ベース紙をリガンド前駆体試薬と反応させてリガンドを有する紙基材を提供する。ベース紙は普通の非官能性紙とするか、リガンド前駆体との反応前に活性化試薬で紙を処理することにより活性化された紙とすることができる。通常の活性化試薬は、紙のヒドロキシル基と反応することができ、次の反応のための反応基を形成する求電子試薬である。活性化試薬の例には、エピクロロヒドリン及びジエポキシド（反応性エポキシ基を形成）、アリルグリシジルエーテル及びアリルハライド（反応性アリル基を形成）、ジビニルスルホン（反応性ビニルスルホン基を形成）、トシル及びトレシルクロリド（反応性トシレート／トレシレートを形成）などがある。直接ヒドロキシル基と反応できるリガンド前駆体試薬の例には、有機ハライド、例えばジエチルアミノエチルクロリド、２−ブロモエタンスルホン酸ナトリウム塩及び２−ブロモ酢酸；エポキシド、例えばグリシジルトリメチルアンモニウムクロリド及び反応性ビニル、例えばビニルスルホン酸ナトリウム塩がある。例えば、ガラス繊維紙上のシラノールヒドロキシル基に直接反応できるリガンド前駆体試薬の例には、官能性アルコキシシラン及びクロロシランがある。活性化紙上のエポキシ、ビニルスルホン及びトシレート／トレシレートと反応できるリガンド前駆体試薬の例には、例えば、アミン及びチオールがある。活性化紙上のアリルと反応できるリガンド前駆体試薬の例には、例えば、チオール及び重合可能な不飽和モノマーがある。荷電基を含有する重合可能なモノマーは、ベース紙上のアリル又は他の不飽和基との共重合により、ベース紙上の例えばチオールへの連鎖移動反応により、或いは例えばセリウムグラフト又はＡＴＲＰグラフト方法をベース紙から開始することのいずれかによりベース紙上にグラフト重合することができる。
【００３３】
ある実施形態の工程ａ）ではさらに、繊維パルプをリガンド前駆体試薬と反応させて共有結合リガンドを有する本質的に未変化の繊維を得、その後、連続式ウェブ抄紙機により、共有結合リガンドを有する本質的に未変化の繊維を９０重量％以上含有する紙ウェブを形成する。官能性紙の製造方法を開示するという観点でリガンド前駆体試薬及び製紙条件を以下に説明する。
【００３４】
実施形態によっては、紙基材は、１以上の検体と無電荷−電荷相互作用できる基も有する。これらの基はリガンドの一部となることができ、その場合リガンドは、マルチモーダル又は混合モードリガンドを示したり、紙繊維に独立して結合したり、或いはその両方である。無電荷−電荷相互作用には、疎水性相互作用、電子の受容体−供与体相互作用及び／又はチオフィリック相互作用がある。電子の受容体−供与体相互作用には、水素結合、π−π、カチオン−π、電荷移動、双極子−双極子、誘起双極子などの相互作用がある。無電荷−電荷相互作用ができる基を用いる利点は、タンパク質検体の高い回収率及び高い安定性を得られることである。疎水性相互作用ができる基の例には、芳香環、ヘテロ芳香環、Ｃ4−Ｃ18炭化水素鎖などがある。水素結合は、ヒドロキシル、エーテル、アミンなどで得られる。チオフィリック相互作用ができる基の例には、スルホン、チオエーテルなどがあり、一方、カチオン−π相互作用は芳香環構造などで得られる。
【００３５】
ある実施形態では、リガンドはさらに、１以上の芳香族又はヘテロ芳香族環構造及び／又はＣ4〜Ｃ18飽和又は不飽和直鎖、枝分れ又は脂環式炭化水素鎖を含む。炭化水素鎖は、任意には、エーテル、ヒドロキシルもしくはカルボニル酸素、アミンもしくはアミド窒素及び／又はチオエーテル、チオールもしくはスルホニル硫黄のようなヘテロ原子で置換又は中断されていてもよい。このような構造を有するリガンドの具体例には、アルキル及びアリールアミン、例えば３級Ｎ−アリール又はＮ−アルキルアリールアミン、具体的にはＮ−ベンジル−Ｎ−メチルエタノールアミン及びＮ，Ｎ−ジメチルベンジルアミン（これは、アミンの窒素を介してカップリングして４級アンモニウム基を形成できる）及びリンカー構造を介して負荷電基と結合する芳香族又はヘテロ芳香族環構造を含むリガンド、例えばＮ−ベンゾイルホモシステイン（これはチオール基を介してカップリングできる）がある。
【００３６】
実施形態によっては、リガンドは、セルロース又はガラス繊維に共有結合する。リガンドは、繊維に直接又はスペーサー又はエクステンダー構造を介して結合することができる。スペーサーは、比較的短い構造（例えば、鎖長が約１５原子未満）であり、これは、カップリング中に意図的に導入されるか、用いる特定の活性化及び／又はカップリング化学の結果として導入されるかのどちらかである。エクステンダーは、長鎖構造（例えば、ポリマー）であり、これは通常リガンドの利用率を増加するのに導入される。セルロース繊維は、炭素に結合した多数のヒドロキシル基を示し、それらは、上記の求電子試薬と反応するか、活性化されて別の種類の試薬と反応できる。ガラス繊維は、ケイ素に結合したヒドロキシル基（シラノール）を示し、それらは炭素に結合したヒドロキシル基と同様に反応できるが、それらはまた、官能性アルコキシシラン又はクロロシラン試薬で都合良く修飾される。多くの種類のセルロース繊維、例えば木綿、種々のグレードの木材パルプ、亜麻、麻、ラミー、再生セルロース繊維、バクテリアセルロースが使用できる。セルロース繊維を製紙前又は製紙中にフィブリル化して適当な紙構造を得ることができる。
【００３７】
ある実施形態では、紙基材は、約５０μｍｏｌ／ｇ以上、具体的には８６μｍｏｌ／ｇ以上、約２００μｍｏｌ／ｇ以上、約５００μｍｏｌ／ｇ以上又は約９００μｍｏｌ／ｇ以上のリガンドを有する。紙基材のリガンド含量は、５０〜２０００μｍｏｌ／ｇ、具体的には８６〜２０００μｍｏｌ／ｇ、２００〜２０００μｍｏｌ／ｇ、９００〜２０００μｍｏｌ／ｇ又は２００〜１０００μｍｏｌ／ｇにすることもできる。これらのリガンド含量は、紙の乾燥重量で計算でき、周知の滴定法（例えば、正荷電基を含有するリガンドの塩素イオン容量又は負荷電基を含有するリガンドの水素イオン容量として）により、検出の容易な荷電種（例えば、色素）の吸着容量から、例えばヘテロ原子の元素分析により、或いはＮＭＲ分光法などの分光法により求めることができる。
【００３８】
実施形態によっては、荷電基は、ｐＨ５〜ｐＨ９のｐＨ域の少なくとも一部で、例えばｐＨ６〜ｐＨ８のｐＨ域の少なくとも一部で正又は負に荷電する。多くの生体サンプルはほぼ中性のｐＨを有しており、サンプルの適用ｐＨで基が荷電していると有利である。あらゆるｐＨ域で荷電した基、例えば４級アンモニウム基、スルホン酸基及び硫酸基もあれば、あるｐＨ値の上又は下で電荷をもつ基、例えばアミン、カルボン酸などもある。リガンドは、正に荷電した基と負に荷電した基を含んでいてもよく、例えば両性即ち、双性基、具体的には、アミノ酸、ベタイン、スルホベタイン、ホスファチジルコリンなどを含有することもできる。
【００３９】
１態様では、本発明は、サンプル適用基材を開示し、これは、荷電基を含有するリガンドが化学的に導入され、指定サンプル適用領域を少なくとも１つもつ１シートの紙を含む。紙は、カードの形態にすることができ、カバー又はフレーム構造があってもなくてもよく、サンプル適用領域は、例えば、印刷又はエンボスパターンにより示すことができる。本発明のサンプル適用基材は、上記の実施形態のサンプル保存及びサンプル前処理方法に有用である。サンプル適用基材は、さらなる特徴、例えば適用したサンプルの識別のためのインデックス、具体的にはテキスト、バーコード、ＲＦＩＤタッグ及び／又はサンプルが特定のサンプル領域に適用されたかどうかを示す手段（例えば、色素指示薬）を有してもよい。紙は、１７５〜１９５ｇ／ｍ2の乾燥重量及び４７０〜５７０μｍの厚さ（ゲージ圧５３ｋＰａで）をもつことができる。
【００４０】
実施形態によっては、サンプル適用基材は、５０μｍｏｌ／ｇ以上、具体的には８６μｍｏｌ／ｇ以上又は２００μｍｏｌ／ｇ以上のリガンドを有する。サンプル適用基材のリガンド含量は５０〜２０００μｍｏｌ／ｇ、具体的には８６〜２０００μｍｏｌ／ｇ、２００〜２０００μｍｏｌ／ｇ、９００〜２０００μｍｏｌ／ｇ又は２００〜１０００μｍｏｌ／ｇにすることもできる。ある実施形態では、リガンドの荷電基は、ｐＨ５〜ｐＨ９のｐＨ域の少なくとも一部で、例えばｐＨ６〜ｐＨ８のｐＨ域の少なくとも一部で正又は負に荷電する。リガンドは、正に荷電した基と負に荷電した基とを含んでいてもよく、例えば両性、即ち双性基を含有することもできる。
【００４１】
ある実施形態では、サンプル適用基材はさらに、１種以上の検体と無電荷−電荷相互作用可能な基を含有する。これらの無電荷−電荷相互作用には、疎水性相互作用、電子の受容体−供与体相互作用及び／又はチオフィリック相互作用がある。相互作用は、例えば荷電基を含有するマルチモーダルリガンドを有する基材によって実現できる。
【００４２】
実施形態によっては、リガンドは、セルロース又はガラス繊維に共有結合する。リガンドは、繊維に直接又はスペーサー又はエクステンダー構造を介して結合することができる。共有結合は、紙の形成前の繊維又はベース紙の後処理中の繊維にリガンドを化学カップリングすることにより実現できる。
【００４３】
ある実施形態では、リガンドはさらに、１以上の芳香族又はヘテロ芳香族環構造及び／又はＣ4〜Ｃ18飽和又は不飽和直鎖、枝分れ又は脂環式炭化水素鎖を含んでおり、該炭化水素鎖は、任意には、エーテル、ヒドロキシルもしくはカルボニル酸素、アミン、４級アンモニウムもしくはアミド窒素及び／又はチオエーテル、チオールもしくはスルホニル硫黄のようなヘテロ原子で置換又は中断されていてもよい。このような構造を有するリガンドの具体例には、Ｎ−ベンジル−Ｎ−メチルエタノールアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルベンジルアミン及び種々のアルカリアミン（これは、アミンの窒素を介してカップリングできる）及びリンカー構造を介して負荷電基と結合する芳香族又はヘテロ芳香族環構造を含むリガンド、例えばＮ−ベンゾイルホモシステイン（これはチオール基を介してカップリングできる）がある。
【００４４】
１態様では、本発明は、
ａ）セルロース繊維パルプを用意する工程と、
ｂ）繊維パルプをリガンド前駆体試薬と反応させて共有結合リガンドを有する本質的に未変化の繊維を得る工程と、
ｃ）連続式ウェブ抄紙機により、共有結合リガンドを有する本質的に未変化の繊維を９０重量％（乾燥重量として測定）以上含有する紙ウェブを製造する工程と
を含む官能性紙の製造方法を開示する。
【００４５】
本方法は、例えば上記の実施形態にしたがうサンプル保存及びサンプル前処理方法に有用であるサンプル適用基材の製造に適している。本方法の利点は、工業生産に適当な条件下で高いリガンド含量を実現できること、機械的特性及び血液などの生体サンプルの吸収性が良好な基材を製造でき、試薬溶液中に浸漬したデリケートな湿潤紙の物理的な取り扱いを必要としないことである。連続式ウェブ抄紙機は、工業規模の紙の製造に好ましい装置である。水性繊維パルプを連続的に金網（ｓｉｅｖｉｎｇ  ｃｌｏｔｈ）に供給し、そこで紙ウェブが、形成し、水切りされる。連続プレス及び乾燥後、さらなる加工のために紙ウェブを、例えば切ってリールにする。得られた紙の特性は、種々の手抄きシート形成機で製造された実験室規模の手抄きシートとは非常に異なり、連続式ウェブ抄紙機用の繊維パルプへの要求も手抄きシート形成機と比べてより厳密になる
繊維パルプは、リガンド前駆体との反応前に活性化試薬で処理することにより活性化された普通の非官能性繊維を含む。通常の活性化試薬は、繊維のヒドロキシル基と反応することができ、次の反応のための反応基を形成する求電子試薬である。活性化試薬の例には、エピクロロヒドリン及びジエポキシド（反応性エポキシ基を形成）、アリルグリシジルエーテル及びアリルハライド（反応性アリル基を形成）、ジビニルスルホン（反応性ビニルスルホン基を形成）、トシル及びトレシルクロリド（反応性トシレート／トレシレートを形成）などがある。直接ヒドロキシル基と反応できるリガンド前駆体試薬の例には、有機ハライド、例えばジエチルアミノエチルクロリド、２−ブロモエタンスルホン酸ナトリウム塩及び２−ブロモ酢酸；エポキシド、例えばグリシジルトリメチルアンモニウムクロリド及び反応性ビニル、例えばビニルスルホン酸ナトリウム塩がある。活性化繊維上のエポキシ、ビニルスルホン及びトシレート／トレシレートと反応できるリガンド前駆体試薬の例には、例えば、アミン及びチオールがある。活性化繊維上のアリルと反応できるリガンド前駆体試薬の例には、例えば、チオール及び重合可能な不飽和モノマーがある。荷電基を含有する重合可能なモノマーは、繊維上のアリル又はその他の不飽和基との共重合により、繊維上の例えばチオールへの連鎖移動反応により、或いは例えばセリウムグラフト又はＡＴＲＰグラフト方法を繊維から開始することのいずれかにより繊維上にグラフト重合することができる。
【００４６】
実施形態によっては、工程ｂ）で、繊維パルプをリガンド前駆体試薬と反応させて５０μｍｏｌ／ｇ以上、具体的に８６μｍｏｌ／ｇ以上又は２００μｍｏｌ／ｇ以上の共有結合リガンドを有する本質的に未変化の繊維を得る。
【００４７】
ある実施形態では、工程ｃ）で形成される紙ウェブは、共有結合リガンドを有する本質的に未変化の繊維を９６重量％、具体的には９８又は９９重量％以上含有する。繊維は、本質的に未変化である（即ち、繊維が未修飾繊維に比べ過剰に微細物を形成せずに繊維構造を保つ）ので、修飾繊維の機械的特性は十分に良好であり、未修飾の強化繊維を添加する必要はない。この利点は、紙基材の全ての表面がサンプル成分との相互作用に利用できることである。
【００４８】
実施形態によっては、工程ｂ）で用いるリガンド前駆体試薬は求電子試薬であり、反応は、約１〜１０重量％のアルカリ、具体的には約２〜８重量％のアルカリ存在下で起こる。アルカリはヒドロキシル基と試薬との反応を促進するのに必要であるが、繊維の物理及び／又は化学分解を抑制するためにアルカリ濃度を高くしすぎないのが有利である。また、酸性の反応条件は、通常、セルロースの分解を引き起こすので回避するのが有利である。
【００４９】
ある実施形態では、リガンドは荷電基を含有する。この利点は、官能性紙が上記の別の実施形態のサンプル保存方法でのサンプル適用基材として非常に適していることである。
【００５０】
ある実施形態では、リガンドは、１以上の芳香族又はヘテロ芳香族環構造及び／又はＣ4〜Ｃ18飽和又は不飽和直鎖、枝分れ又は脂環式炭化水素鎖を含んでおり、該炭化水素鎖は、任意には、エーテル、ヒドロキシルもしくはカルボニル酸素、アミンもしくはアミド窒素及び／又はチオエーテル、チオールもしくはスルホニル硫黄のようなヘテロ原子で置換又は中断されていてもよい。
【００５１】
実施形態によっては、本方法はさらに、紙ウェブを切って少なくとも１つのサンプル適用カードにする工程ｄ）及び少なくとも１つの指定サンプル適用領域を紙ウェブ上に印刷及び／又はエンボス加工する工程ｅ）を含む。これらの工程は、工程ｃ）後に任意の順序で行うことができ、結果として、上記の別の実施形態に記載したサンプル保存方法に有効なサンプル適用基材を製造する。
【００５２】
繊維パルプは高純度綿セルロースを含む。しかし、繊維パルプは、他の材料、例えば、脱リグニン木材パルプ及び／又はリサイクル紙からなることもできる。出発材料は、例えば、３１ＥＴＦとして知られており、少量の塩酸（湿潤紙力に寄与する）を含有し、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社の一部であるＷｈａｔｍａｎ社から販売されている既製の綿セルロース紙とすることができる。既製紙は、本発明の方法での使用のためには、最初にフィブリル化する必要がある。或いは、製紙プロセスを施す前のセルロース繊維を直接用いることができる。
【００５３】
最終製品での所望の繊維長を踏まえた繊維加工により、意図する紙構造に必要な程度まで、例えば、精製機又はビーター中でセルロース繊維原料にフィブリル化を行うことが好ましい。加工された材料は、例えば、モールド、フォードリニア又はツインワイヤ抄紙機を用いる従来の連続式ウェブ紙製造方法によりシートに形成できる。高純度の紙シートを得るために、精製脱塩水を製紙プロセスの間ずっと用いることができる。製造された紙は、例えば１７５〜１９５ｇ／ｍ2の乾燥重量及び４７０〜５７０μｍの厚さ（ゲージ圧５３ｋＰａで）をもつことができる。
【実施例】
【００５４】
実施例１−セルロース繊維上へのジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基のカップリング
２５０ｇの３１ＥＴＦ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社の一部であるＷｈａｔｍａｎ社から販売のコットンセルロース紙）を２５００ｍｌの脱塩水に分散し、２６８ｍｌの水酸化ナトリウム（４７重量％）を添加することによりフィブリル化した。１５分間の混合後、２７５ｍｌのジエチルアミノエチルクロリド塩酸水溶液（６５重量％）を添加し、混合物を３３〜３５℃に加熱し、１時間混合した。得られた混合物を濾過し、洗浄し、正荷電基の導入、イオン容量及び含水量について試験した。
【００５５】
繊維のイオン容量を滴定で評価したところ０．２７ｍｍｏｌ／ｇであり、含水量（繊維）が８．４％であった。
【００５６】
この繊維から実施例２に記載したように手抄きシートを作成することに成功した。
【００５７】
実施例２−ＤＥＡＥ紙の手抄きシート
４〜４．５ｇ（乾燥重量）のコンジュゲート繊維を１０００ｍｌの脱塩水に分散し、３０秒〜１分間ブレンドした。約１０Ｌの脱塩水が入れてある手抄きシート形成機に得られた混合物を注ぎ、穏やかに混合した。得られた混合物を２０〜３０秒間沈澱させ、その後、排水した。メッシュベース及び湿潤繊維マトリックスをユニットから取り出し、優しく吸収紙に水分を吸収させて余分な水を除去し、続いてマトリックスを１００〜１０５℃で乾燥して手抄きシートを製造することに成功した。
【００５８】
実施例３−セルロース繊維上へのジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基のカップリング
２０ｋｇの３１ＥＴＦ紙を２００Ｌの脱塩水に分散し、その後２１．４Ｌの水酸化ナトリウム（４７重量％）を添加し、１５分間混合した。次に、２２Ｌのジエチルアミノエチルクロリド塩酸（６５重量％）を添加し、混合物を３３〜３５℃に加熱し、１時間混合した。混合物を遠心分離し、洗浄し、良好なコンジュゲイション、容量及び含水量について試験した。イオン容量は０．２３ｍｍｏｌ／ｇであり、含水量は５．９４％であった。
【００５９】
実施例４−抄紙機によるＤＥＡＥ紙
実施例３からの２０ｋｇのＤＥＡＥカップリング繊維を必要に応じて脱塩水に分散し、パイロット規模のモールド抄紙機で製紙した。均一に血液をスポットすることができる均一な紙製品を得、塩素イオン容量は０．２〜０．３ｍｍｏｌ／ｇの範囲であった。
【００６０】
実施例５−３１ＥＴＦパルプの調製
２５０ｇ（乾燥重量）の３１ＥＴＦ紙を脱塩水とともにパルプ製造機（キッチンブレンダー）中でパルプ化した。パルプをブフナー漏斗で濾過して余分な水を除去し、さらに修飾や分析せずに使用した。
【００６１】
実施例６−スルホキシエチルセルロースの調製
１０Ｌのフランジフラスコに５２７ｇのパルプ化３１ＥＴＦ繊維（乾燥重量約１２５ｇ）を加えた。５Ｌのプロパン−２−オールを添加し、パルプを縦型攪拌機Ｈｅｉｄｏｌｐｈ社製ＲＺＲ２０４１を用いて１０分間撹拌した。１０７ｍｌのＮａＯＨ水溶液（４７％ｗ／ｖ）を添加し、混合物をさらに１０分間撹拌させた。２２ｇ（０．１ｍｏｌ）の２−ブロモエタンスルホン酸ナトリウム塩を撹拌している溶液に少しずつ加えた。反応を電熱式ｉｓｏ−マントルを用いて８０〜８４℃の内部温度で３０分間加熱環流した。連続撹拌しながら反応を室温まで放冷した。固形物をブフナー漏斗で濾過し、中性のｐＨが得られるまで脱塩水で洗浄した。
【００６２】
実施例７−スルホキシエチルセルロース手抄きシートの製造
４．４ｇのスルホキシエチルセルロース及び１Ｌの脱塩水をパルプ製造機に加えて、３０秒間ふやかした。手抄きシート形成機を用いて、得られたパルプから手抄きシートを形成した。吸収紙に水分を吸収させて手抄きシートを乾燥し、その後、１００℃のオーブンで終夜乾燥した。分析データ：滴定によるＨ+イオン容量０．４５ｍｍｏｌ／ｇ、Ｈ2Ｏ含量９．２４％
実施例８−正電荷をもつメチレンブルー色素とスルホキシエチルセルロースとの相互作用
直径４７ｍｍのディスクを実施例７に記載したスルホキシエチルセルロース手抄きシートから得た。ギルソンピペットを用いて１ｍｌのメチレンブルー水溶液（０．１５７ｍｍｏｌ／Ｌ）をアルミニウムプランチェット（同位体分析トレ−）に収めたディスクの中心に移した。サンプルを１００℃のオーブン中で１５分間乾燥し、終夜デシケーターに入れた。色素を含有するディスクを別のプラスチックジャーに入れ、ビュレットを用いて１０ｍｌの脱塩水を添加し、ジャーを１５秒間手で振盪し、さらに分析前に１５秒間振盪した。紫外可視分光光度計Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ２０００を用いて上澄の６６２ｎｍの吸光度を測定した。
【００６３】
実施例９−メチレンブルー色素とＤＥＡＥセルロースとの相互作用
直径４７ｍｍのディスクを実施例４で製造したＤＥＡＥセルロース紙から得た。ギルソンピペットを用いて１ｍｌのメチレンブルー水溶液（０．１５７ｍｍｏｌ／Ｌ）をアルミニウムプランチェットに収めたディスクの中心に移した。サンプルを１００℃のオーブン中で１５分間乾燥し、終夜デシケーターに入れた。色素を含有するディスクを別のプラスチックジャーに入れ、ビュレットを用いて１０ｍｌの脱塩水を添加し、ジャーを１５秒間手で振盪し、さらに分析前に１５秒間振盪した。紫外可視分光光度計Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ２０００を用いて上澄の６６２ｎｍの吸光度を測定した。
【００６４】
実施例１０−メチレンブルー色素と非修飾セルロース（３１ＥＴＦ）との相互作用
直径４７ｍｍのディスクを３１ＥＴＦ紙（Ｒｅｅｌ＃：９５５２７３、Ｆｕｒｎｉｓｈ＃：９５７０）から得た。ギルソンピペットを用いて１ｍｌのメチレンブルー（０．１５７ｍｍｏｌ／Ｌ）水溶液をアルミニウムプランチェットに収めたディスクの中心に移した。サンプルを１００℃のオーブン中で１５分間乾燥し、終夜デシケーターに入れた。色素を含有するディスクを別のプラスチックジャーに入れ、ビュレットを用いて１０ｍｌの脱塩水を添加し、ジャーを１５秒間手で振盪し、さらに分析前に１５秒間振盪した。紫外可視分光光度計Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ２０００を用いて上澄の６６２ｎｍの吸光度を測定した。
【００６５】
実施例１１−負電荷をもつオレンジＩＩ色素とスルホキシエチルセルロースとの相互作用
直径４７ｍｍのディスクを実施例７に記載したスルホキシエチルセルロース手抄きシートから得た。ギルソンピペットを用いて１ｍｌのオレンジＩＩ（ＣＡＳ  Ｎｏ．６４１０−０９−９、０．１４２ｍｍｏｌ／Ｌ）水溶液をアルミニウムプランチェットに収めたディスクの中心に移した。サンプルを１００℃のオーブン中で１５分間乾燥し、終夜デシケーターに入れた。色素を含有するディスクを別のプラスチックジャーに入れ、ビュレットを用いて１０ｍｌの脱塩水を添加し、ジャーを１５秒間手で振盪し、さらに分析前に１５秒間振盪した。紫外可視分光光度計Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ２０００を用いて上澄の４８５ｎｍの吸光度を測定した。
【００６６】
実施例１２−オレンジＩＩ色素とＤＥＡＥセルロースとの相互作用
直径４７ｍｍのディスクを実施例４で製造したＤＥＡＥセルロース紙から得た。ギルソンピペットを用いて１ｍｌのオレンジＩＩ（０．１４２ｍｍｏｌ／Ｌ）水溶液をアルミニウムプランチェットに収めたディスクの中心に移した。サンプルを１００℃のオーブン中で１５分間乾燥し、終夜デシケーターに入れた。色素を含有するディスクを別のプラスチックジャーに入れ、ビュレットを用いて１０ｍｌの脱塩水を添加し、ジャーを１５秒間手で振盪し、さらに分析前に１５秒間振盪した。紫外可視分光光度計Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ２０００を用いて上澄の４８５ｎｍの吸光度を測定した。
【００６７】
実施例１３−オレンジＩＩ色素と非修飾セルロース（３１ＥＴＦ）との相互作用
直径４７ｍｍのディスクを３１ＥＴＦ紙（Ｒｅｅｌ＃：９５５２７３、Ｆｕｒｎｉｓｈ＃：９５７０）から得た。ギルソンピペットを用いて１ｍｌのオレンジＩＩ（０．１４２ｍｍｏｌ／Ｌ）水溶液をアルミニウムプランチェットに収めたディスクの中心に移した。サンプルを１００℃のオーブン中で１５分間乾燥し、終夜デシケーターに入れた。色素を含有するディスクを別のプラスチックジャーに入れ、ビュレットを用いて１０ｍｌの脱塩水を添加し、ジャーを１５秒間手で振盪し、さらに分析前に１５秒間振盪した。紫外可視分光光度計Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ２０００を用いて上澄の４８５ｎｍの吸光度を測定した。
【００６８】
実施例１４−正電荷をもつ検体の回収率
表１にメチレンブルーと化学的に修飾した基材との相互作用の結果を示す（実施例８及び９）。
【００６９】
【表１】
0006018589.tif 000002
上記の抽出方法より、両方の化学的に修飾した繊維で検体の回収率に増加が認められる。この回収率はさらに、繊維を抽出溶剤に長時間浸漬することで増加する。抽出収率が基材を水中に浸漬した時間の長さに依存するかどうかを調べるために、ベンチマークとして非修飾３１ＥＴＦ繊維を用いて別の試験を行った（実施例９及び１０）。表２に結果を示す。
【００７０】
【表２】
0006018589.tif 000003
抽出時間は検体の回収率に有意な影響を与えることはない。
【００７１】
しかしながら、ＤＥ基材は、これらの実験中、かなりの量の抽出溶剤（Ｈ2Ｏ）を吸収した。さらなる調査を行って、色素を抽出するのに添加した水の体積が基材によって吸収されずに抽出を行うのに十分な体積であったのかを調べた。
【００７２】
この理論を確認するために、０．３１６ｍｍｏｌ／Ｌ及び１．５７ｍｍｏｌ／Ｌのメチレンブルー溶液をディスクの表面に添加した。表３の結果から、メチレンブルーの回収率が７０％に増加し、３１ＥＴＦベンチマークの２０％に比べて著しく増加したことがわかる。
【００７３】
【表３】
0006018589.tif 000004
ＳＥ及びＤＥＡＥ基材両方へのメチレンブルーの添加は紙の表面へ著しい影響を与える。図１は、両方の化学的に修飾した繊維への色素の分散を示す。ＳＥセルロース上では、正電荷をもつ色素がスポットの中心部分に濃縮されたパターンになり、一方、ＤＥＡＥセルロース基材上では、正電荷をもつ色素が均一に分散した。未処理３１ＥＴＦ基材上では、ＳＥセルロース基材と同様なパターンが形成した（図３）。
【００７４】
実施例１５−負電荷をもつ検体の回収率
上述したように、負電荷をもつ検体の代表としてオレンジＩＩ色素を用いた。この調査の実験手順は、正電荷をもつ検体のための上記手順と同じであった。
【００７５】
表４から、負電荷をもつ基材からの負電荷をもつ検体の回収率は、目標とする７５％の検体の抽出を超えることが明らかである。興味深いことに、正電荷をもつ基材の場合、同じ抽出手順後、検体の回収は認められなかった。
【００７６】
【表４】
0006018589.tif 000005
例示目的で、負電荷及び正電荷をもつ基材の両方の表面上でのオレンジＩＩの目視比較を図２に示す。ＤＥＡＥ基材上で認められた中心に濃縮された着色も、上記の抽出データと合致し、一方、ＳＥセルロース基材では、着色は均一に分布する。未処理３１ＥＴＦ紙の着色分布は、ＳＥセルロース上と比べ若干中心にある。
【００７７】
実施例１６−基材上のリン脂質の保持
臨床及び製薬産業は、分析前のサンプルを浄化するのに必要な時間を短縮することにより乾燥血液スポット（ＤＢＳ＝ｄｒｉｅｄ  ｂｌｏｏｄ  ｓｐｏｔ）法のワークフローを著しく低減しようとしている。
【００７８】
この要求を満たすために、この実施例では、質量分析を妨害する血液中の望ましくない物質と結合するイオン繊維の能力を調査し、さらに特定すると、この実施形態では、基材上のリン脂質の保持に注目する。
【００７９】
この調査で用いたアゾレクチンは、大豆から得られるリン脂質の混合物であり、例えばＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社から品番１１１４５として得られる。実施例１４に記載したように、０．２％ｗ／ｖのアゾレクチンのＣＨＣｌ3溶液（１ｍｌ）を各ディスクの中心に添加し、乾燥させた。各基材の中心から５ｍｍをパンチでくり抜き、ＭｅＯＨ：ＣＨ2Ｃｌ2（７０：３０）で抽出して質量分析を行った。
【００８０】
ギルソンピペットで０．２％ｗ／ｖのアゾレクチンのＣＨＣｌ3溶液（１ｍｌ）を各基材（ＳＥ、ＤＥＡＥ、３１ＥＴＦ）の表面（４７ｍｍ直径）に移し、周囲温度で風乾させた。各ディスクから５ｍｍをパンチでくり抜き、ＭｅＯＨ：ＣＨ2Ｃｌ2（２ｍｌ、７０：３０）を含有するガラスバイアル中で１５秒間振盪し、高分解能のＫｒａｔｏｓ社製Ｃｏｎｃｅｐｔ−ＩＳ±０．００１Ｄａを正イオンモードで用いて質量分析をした。
【００８１】
この調査で用いたアゾレクチン及び非修飾ベンチマーク３１ＥＴＦ両方の質量スペクトルをそれぞれ図４及び５に示す。
【００８２】
図４に示すアゾレクチンのスペクトルには、ｍ／ｚ＝３６５、５１８、５２７、５４２、６８９、７０７、７３９、７６２、７８１、８０５、８４５に相対強度＞１０％のピークが認められる。
【００８３】
上述したように、図５にベンチマーク調査のスペクトルを示す。非修飾３１ＥＴＦでは、ｍ／ｚ＝３６５、５５３、５６９、６８６、９４４に相対強度＞１０％のピークが認められる。
【００８４】
これらのピークは、アゾレクチンを含浸したスルホキシエチルセルロース及びジエチルアミノエチルセルロース基材の、それぞれ図６及び７に示すスペクトルで認められるピークと一致し、セルロース繊維のフラグメンテーションによるものである。
【００８５】
全ての基材の質量スペクトルで、アゾレクチンのピークと一致するピークが認められない。この調査から実施例１４に概要を示した手順後にリン脂質が基材上で保持されて抽出されないことが推定される。
【００８６】
実施例１７−ＤＢＳからのタンパク質の回収
ヒトの血液（約４．５ｍＬ）をＥＤＴＡ処理バキュテナーチューブに吸引した。このチューブから９９５μＬの血液を採り、５μＬ（５μｇ／μＬ）の蛍光抗体ＥＣＬ  Ｐｌｅｘ  Ｇｏａｔ−α−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ−Ｃｙ５（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を含有するエッペンドルフチューブに移した。その後、エッペンドルフチューブを穏やかに回転し、抗体を血液と約５分間混合させた。
【００８７】
５つの基準紙、即ちＷｈａｔｍａｎ  ＦＴＡ  ＤＭＰＫ−Ｃ、Ｗｈａｔｍａｎ＃９０３  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓａｖｅｒ  Ｃａｒｄ、Ｗｈａｔｍａｎ  Ｐｒｏｔｒａｎ  ＢＡ８５（全てＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）、Ｍｕｎｋｔｅｌｌ  ＴＦＮ（Ｍｕｎｋｔｅｌｌ社製）及びＡｈｌｓｔｒｏｍ２２６（Ａｈｌｓｔｒｏｍ社製）を共有結合的に修飾されたプロトタイプとともに、スパイクした血液（１５μＬ）で３つスポットした。その後、紙を約２時間室温で乾燥した。紙からＤＢＳをパンチでくり抜き、１２ｍｍディスクを得、１．５ｍＬのチューブに入れ、５００μＬのＰＢＳ−Ｔバッファ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）を添加した。サンプルを振盪機Ｈｅｉｄｏｌｐｈ社製Ｕｎｉｍａｘ１０１０により約１９０ｒｐｍで終夜振盪した。約２０時間後、振盪を終了し、ディスクをチューブから取り出し、Ｔｙｐｈｏｏｎ分析前室温で２時間乾燥させた。５μＬの抽出溶液を＃９０３カードの裏面にスポットし、直接Ｔｙｐｈｏｏｎで分析し、同様にスポットした一連のＥＣＬ  Ｐｌｅｘ  Ｇｏａｔ−α−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ−Ｃｙ５の標準溶液から定量した。
【００８８】
【表５】
0006018589.tif 000006
スパイク無しの血液も上記のように紙にスポットし、乾燥し、抽出し、その後、Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製ヒトトランスフェリンＥＬＩＳＡキット及びＥＬＩＳＡスターターアクセサリーパッケージ（品番Ｅ８０−１２８及びＥ１０１）を業者の取り扱い説明にしたがって用いて抽出物中のヒトトランスフェリン含量を測定した。
【００８９】
【表６】
0006018589.tif 000007
合成モデル系を用いてＤＥＡＥセルロース紙及び２つのリファレンス紙も評価した。合成モデル系は１５μＬスポットとして紙上に適用した。スポット溶液はＣｙ５−ＩｇＧ抗体（即ち、Ｃｙ５蛍光色素で標識したＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製ＥＣＬ  Ｐｌｅｘ  Ｇｏａｔ−α−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ−Ｃｙ５抗体、２５ｎｇ／μＬ）、トランスフェリン（２５ｎｇ／μＬ）、ＢＳＡ（５０ｍｇ／ｍＬ）及び水を含有した。乾燥スポットをＰＢＳ−Ｔ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳバッファ）を用いて終夜室温で抽出し、Ｔｙｐｈｏｏｎイメージデンシトメトリー（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製Ｔｙｐｈｏｏｎ蛍光スキャナー）及びＥＬＩＳＡを用いて分析した。
【００９０】
【表７】
0006018589.tif 000008
実施例１８−紙のエピクロロヒドリン（ＥＣＨ）及びアリルグリシジルエーテル（ＡＧＥ）活性化
ａ）ＥＣＨ活性化
濾紙シート８×５ｃｍをポリエチレンスペーサーネットとともに巻き、１５０ｍｌのＢｅｌｌｃｏスピナーフラスコに入れ、９．９ｍｌのＮａＯＨ（５０％、）と９６ｍｌの脱塩水との混合物をフラスコに添加した。約５分間の撹拌後、１５ｍｌのＥＣＨをフラスコに添加し、激しく撹拌し始めた。その後、反応溶液を３０℃に加熱し、約２〜２．５時間撹拌した。その後、反応を終了し、反応溶液を除去し、水を加えることにより濾紙シートをフラスコ中で洗浄した。続いて、これを４回、各洗浄の間約３０分間置いて繰り返した。その後、これらの濾紙を直ちにさらなるリガンドカップリングに用いた。
【００９１】
ｂ）ＡＧＥ活性化
濾紙シート８×５ｃｍをポリエチレンスペーサーネットとともに巻き、１５０ｍｌのＢｅｌｌｃｏスピナーフラスコに入れ、１００ｍｌのＮａＯＨ（２Ｍ）を添加し、撹拌し始めた。３０分間後、ＮａＯＨ溶液の一部（３５ｍｌ）を除去し、フラスコに６５ｍｌのＡＧＥを添加した。その後、反応溶液を５０℃に加熱し、終夜激しく撹拌した。約２０時間後、反応を終了し、反応溶液を除去し、濾紙シートをフラスコ中で、水を加えて洗浄（１２０ｍｌ、５分間放置）し、続いてＥｔＯＨを加えて洗浄（１２０ｍｌ、２０分間放置して残留ＡＧＥを洗い流）し、水を加えて洗浄（１２０ｍｌ×３回、各洗浄間：約３０分間）した。濾紙シートを終夜室温で乾燥し、ヨウ素着色でアリル基を試験し、元素分析に送った。
【００９２】
実施例１９−活性化紙へのリガンドのカップリング
ａ）Ｎ−ベンゾイルホモシステインチオラクトンのカップリング
９．１ｇ（３５ｍｍｏｌ）のＮ−ベンゾイル−ＤＬ−ホモシステインチオラクトンを１００ｍｌの水及び１４．８ｍｌのＮａＯＨ（５０％溶液）とともにフラスコに入れた。その後混合物を４０℃に加熱し、４時間撹拌した。ＨＣｌを添加することにより、溶液のｐＨをｐＨ７〜８に調整した（ｐＨレベルが白色塩が沈澱するｐＨ７未満になることを回避した）。
【００９３】
ＡＧＥ活性化紙シート（実施例１８ｂ）を５０ｍｌのプラスチックＦａｌｃｏｎチューブに入れた。その後、チューブに加水分解リガンド溶液（上記）及び０．３ｇの２，２−アゾビス（２−メチルプロピオンアミジン）塩酸塩（ラジカル開始剤）を添加した。チューブを６０℃の振盪台に終夜置いた。約２２時間後、反応を終了し、
チューブ中で紙シートを水で洗浄（５０ｍｌ×５回、各洗浄間：３０分間）した。紙シートを終夜室温で乾燥した。乾燥した紙シートを元素分析した。窒素含量は１．２９％であり、相当するリガンド含量は乾燥紙１ｇあたり０．９２ｍｍｏｌであった。
【００９４】
【化１】
0006018589.tif 000009
ｂ）ベンジルメチルエタノールアミンのカップリング
ＥＣＨ活性化紙シート（実施例１８ａ）を１５０ｍｌのＢｅｌｌｃｏスピナーフラスコにいれた。フラスコに、１０９．５ｍｌの水及び２０．８ｇ（２０．５ｍｌ）のＮ−ベンジル−Ｎ−メチルエタノールアミンを添加した。５分間の撹拌後、０．３４ｍｌのＮａＯＨ（５０％溶液）を添加し、混合物を４０℃に加熱した。その後、反応を４０℃で終夜撹拌した。約２０時間後、反応を終了し、紙シートを最初にフラスコ中で１回水で洗浄し、続いて、結晶皿で４回水で洗浄（２００ｍｌ×４回、各洗浄間：２０分間）した。紙シートを終夜 室温で乾燥させた。乾燥した紙シートを元素分析及びメタニルイエロー着色で分析した。窒素含量は０．２５％であり、相当するリガンド含量は乾燥紙１ｇあたり０．１８ｍｍｏｌであった。
【００９５】
【化２】
0006018589.tif 000010
ｃ）ヘパリンのカップリング
ＥＣＨ活性化紙シート（実施例１８ａ）を１５０ｍｌのＢｅｌｌｃｏスピナーフラスコにいれた。フラスコに、６．５ｇのヘパリンの水溶液（１２２ｍｌ）及び８ｍｌのＮａＯＨ（５０％溶液）を添加した。３０℃で終夜撹拌して反応を進行させた。その後、紙シートを最初にフラスコ中で１回水で洗浄し、続いて、結晶皿で４回水で洗浄（２００ｍｌ×４回、各洗浄間：２０分間）した。紙シートを終夜室温で乾燥させた。
ｄ）ＮＨ2のカップリング
ＥＣＨ活性化紙シート（実施例１８ａ）をＢｅｌｌｃｏスピナーフラスコ（１５０ｍｌ）にいれた。フラスコに、１２．５％のアンモニア水溶液を添加し、３０℃で終夜撹拌して反応を進行させた。その後、紙シートを最初にフラスコ中で１回水で洗浄し、続いて、結晶皿で４回水で洗浄（２００ｍｌｘ４、各洗浄間：２０分間）した。紙シートを終夜室温で乾燥させた。
【００９６】
実施例２０−保存安定性
修飾及び非修飾紙に血液を実施例１７と同様にスポットし、乾燥した。紙サンプルを−２０℃、＋２２℃又は＋３７℃のいずれかの温度で様々な期間保存した後、紙サンプルをパンチでくり抜き、抽出し、ＣＲＰ（Ｃ反応性タンパク）及び実施例１７と同様にヒトトランスフェリンについて分析した。ＣＲＰは、ＢｉｏＶｅｎｄｏｒ社製ヒトＣＲＰ  ＥＬＩＳＡキット（品番ＲＨ９６１ＣＲＰ０１ＨＲ）を製造業者の取り扱い説明にしたがって用いて求めた。
【００９７】
【表８】
0006018589.tif 000011
【００９８】
【表９】
0006018589.tif 000012
本明細書では、具体例を挙げて、最良の形態を含む本発明を開示するとともに、当業者が装置又はシステムの製造及び使用並びに方法の実行を含めて本発明を実施できるようにしている。本発明の要旨は、特許請求の範囲に規定された通りで、当業者が想起できる他の例を含むことができる。このような他の例は、特許請求の範囲の文言と異ならない構造要素を有するか、特許請求の範囲の文言と実質的に異ならない均等な構造要素を含むならば、特許請求の範囲に含まれる。様々な実施形態の特徴及び／又は本発明の態様を組合せて、さらなる実施形態を構成することができる。
【図１】
0006018589.tif 000013
【図２】
0006018589.tif 000014
【図３】
0006018589.tif 000015
【図４】
0006018589.tif 000016
【図５】
0006018589.tif 000017
【図６】
0006018589.tif 000018
【図７】
0006018589.tif 000019