(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＬ−２５に結合する標的結合メンバーであって、
アミノ酸配列ＳＡＳＱＧＩＳＮＹＬＮ（配列番号６）を有するＣＤＲ１と、アミノ酸配列ＹＴＳＳＬＨＳ（配列番号７）を有するＣＤＲ２と、アミノ酸配列ＱＱＹＬＡＦＰＹＴＦ（配列番号８）を有するＣＤＲ３と、を含む、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）ドメインと、
アミノ酸配列ＧＹＴＭＮ（配列番号１０）を有するＣＤＲ１と、アミノ酸配列ＬＩＮＰＹＮＧＧＴＳＹＮＱＮＦＫＧ（配列番号１１）を有するＣＤＲ２と、アミノ酸配列ＥＤＹＤＧＹＬＹＦＡＭＤＹ（配列番号１２）を有するＣＤＲ３と、を含む抗体重鎖可変領域（ＶＨ）ドメインと、
を含む、標的結合メンバー。
【請求項２】
前記標的結合メンバーが、配列番号１７のアミノ酸残基５６〜６３及び配列番号１７のアミノ酸残基６６〜７４に結合する、請求項１に記載の標的結合メンバー。
【請求項３】
前記標的結合メンバーが、配列番号１７のアミノ酸残基４６〜６３又は配列番号１７のアミノ酸残基６６〜８４からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸配列に結合する、請求項１に記載の標的結合メンバー。
【請求項４】
配列番号５の抗体軽鎖のＶＬドメインを含む、請求項１に記載の標的結合メンバー。
【請求項５】
配列番号９の抗体重鎖のＶＨドメインを含む、請求項１に記載の標的結合メンバー。
【請求項６】
前記標的結合メンバーが抗体定常領域を含む、請求項１に記載の標的結合メンバー。
【請求項７】
前記抗体定常領域がＩｇＧ１定常領域又はＩｇＧ４定常領域である、請求項６に記載の標的結合メンバー。
【請求項８】
配列番号５の抗体軽鎖及び配列番号９の抗体重鎖を含む、請求項７に記載の標的結合メンバー。
【請求項９】
前記標的結合メンバーが、Ｆａｂ抗体断片、Ｆ（ａｂ’）2抗体断片、及びｓｃＦｖ抗体断片からなる群から選択される抗体断片を含む、請求項１に記載の標的結合メンバー。
【請求項１０】
請求項１に記載の標的結合メンバーと、医薬的に許容できる担体と、を含む、組成物。
【請求項１１】
凍結乾燥粉末を含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記標的結合メンバーが、ヒトＩＬ−２５に対して５０ｐＭ以下の結合親和性を有する、請求項１に記載の標的結合メンバー。
【請求項１３】
前記標的結合メンバーがヒト化抗体を含む、請求項１に記載の標的結合メンバー。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
ＩＬ−１７Ｅとしても知られるインターロイキン−２５（ＩＬ−２５）は、ＩＬ−１７サイトカインファミリーに属するサイトカインであり、タイプ２ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ２）及びマスト細胞から分泌される。ＩＬ−２５は、多くの組織においてＩＬ−４、ＩＬ−５、及びＩＬ−１３など他のサイトカインの産生を誘導し、好酸球の増殖を刺激する。
【０００２】
ＩＬ−２５は、胃腸管に関連する慢性炎症に関与されており、ＩＬ−２５遺伝子は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）などの消化管の自己免疫疾患に関連する染色体領域内に同定されている。ＩＢＤ治療における従来の治療法では、抗生物質又はステロイド誘導体薬のいずれかを含めているが、現在のところ患者の臨床的寛解をもたらすこと、又は維持することに成功していない。
【０００３】
ＩＬ−２５は更に、ぜんそく（罹患者が全世界で３億人を超えると推測される疾患）の患者サンプルにおいて発現増加していることも証明されており、本サイトカインの過剰発現がぜんそく及び関連疾患の病態に寄与することが示唆される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
したがって、ぜんそく及び炎症性腸疾患など、ＩＬ−２５の過剰発現を特徴とする疾病及び疾患の治療に有用な、ＩＬ−２５の効果的な拮抗物質に対するニーズがある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、インターロイキン２５（ＩＬ−２５）を対象とする、抗体、及びその結合断片を含む標的結合メンバーに関する。
【０００６】
本発明は更に、ＲＨ２．５＿Ｒ７１Ｖの変異体である、マウス２Ｃ３抗体のヒト化（ＣＤＲグラフト化）版に関し、これらはまた本明細書において、それぞれ用語「ｈｕＤＤＧ９１」及び「Ｍ９」を用いて称する。このような変異体の１つを、本明細書では「Ｍ６抗体」又は「Ｍ６」と称する。Ｍ６は、例えば、ｈｕＤＤＧ９１親抗体と比較してＩＬ−２５に対する結合親和性の増強、ｈｕＤＤＧ９１親抗体と比較して受容体及び細胞系アッセイにおけるＩＬ−２５受容体の阻害能の向上、更に、発現レベルが高い、溶解性が高い、精製時に顕著なタンパク質凝集がない、並びに精製時に望まれない翻訳後修飾、タンパク質−タンパク質相互作用、及び酸化がみられないといったその他特徴などの、インビトロ及びインビボにおける多くの有利な特性を示す。
【０００７】
一実施形態において、本発明はＩＬ−２５に結合する標的結合メンバーに関し、この標的結合メンバーは、配列番号１７のアミノ酸残基４６〜６３、配列番号１７のアミノ酸残基６６〜８４、及び配列番号１７のアミノ酸残基１２９〜１３５からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸配列に結合する。特定の実施形態において、本発明の標的結合メンバーは、配列番号１７のアミノ酸残基５６〜６３、及び配列番号１７のアミノ酸残基６６〜７４に結合する。別の実施形態において、標的結合メンバーは、アミノ酸配列ＱＱＹＬＡＦＰＹＴＦ（配列番号８）を有するＣＤＲ３を含む、抗体ＶＬドメインを含む。
【０００８】
別の実施形態において、本発明はＩＬ−２５に結合する標的結合メンバーに関し、この標的結合メンバーは以下を含む。
ａ）アミノ酸配列ＳＡＳＱＧＩＳＮＹＬＮ（配列番号６）を有するＣＤＲ１と、アミノ酸配列ＹＴＳＳＬＨＳ（配列番号７）を有するＣＤＲ２と、アミノ酸配列ＱＱＹＬＡＦＰＹＴＦ（配列番号８）を有するＣＤＲ３と、を含む抗体ＶＬドメイン、及び
ｂ）アミノ酸配列ＧＹＴＭＮ（配列番号１０）を有するＣＤＲ１と、アミノ酸配列ＬＩＮＰＹＮＧＧＴＳＹＮＱＮＦＫＧ（配列番号１１）を有するＣＤＲ２と、アミノ酸配列ＥＤＹＤＧＹＬＹＦＡＭＤＹ（配列番号１２）を有するＣＤＲ３と、を含む、抗体ＶＨドメイン。
【０００９】
特定の実施形態において、標的結合メンバーは、配列番号５を含むＶＬドメインと、配列番号９を含むＶＨドメインと、を含む。更なる実施形態において、標的結合メンバーは全長抗体を含む。
【００１０】
さまざまな実施形態において、本発明は更に、本発明の標的結合メンバーをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸、かかる核酸を含む発現ベクター、及びかかる発現ベクターを保有する宿主細胞に関する。
【００１１】
別の実施形態において、本発明は標的結合メンバーの生成方法に関し、この方法は、標的結合メンバーの産生条件下で本発明の宿主細胞を培養する工程を含む。
【００１２】
更なる実施形態において、本発明は、本発明の標的結合メンバーと、医薬的に許容できる担体と、を含む組成物を提供する。
【００１３】
追加の実施形態において、本発明は、ぜんそく及び炎症性腸疾患を非限定的に含む疾病又は疾患の治療又は予防を必要とする被験体における、治療又は予防方法を包含する。
【００１４】
更なる実施形態において、本発明は、炎症性疾患、例えば、ぜんそく（アレルギー性ぜんそくを含む）及び炎症性腸疾患（例えば、クローン病及び潰瘍性大腸炎）などの疾病又は疾患の治療のための、例えば医薬組成物の形態の本発明の標的結合メンバーの使用を提供する。
【００１５】
別の実施形態において、本発明は、配列番号１７のアミノ酸残基４６〜６３、配列番号１７のアミノ酸残基６６〜８４、及び配列番号１７のアミノ酸残基１２９〜１３５からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸配列に結合する標的結合メンバーと、ＩＬ−２５への結合を競合する標的結合メンバーに関する。特定の実施形態において、標的結合メンバーは、ヒトＩＬ−２５に対して約５０ｐＭ以下の結合親和性を有する。
【００１６】
別の実施形態において、本発明は更に、以下を含む本発明の標的結合メンバーに関する。
ａ）配列番号５のアミノ酸配列と比較して１〜約２０か所のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む抗体ＶＬドメイン
ｂ）配列番号９のアミノ酸配列と比較して１〜約２０か所のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む抗体ＶＨドメイン、又は
ｃ）これらの組み合わせ。
【００１７】
更に別の実施形態において、本発明は、以下を含む本発明の標的結合メンバーの生成方法を提供する。
（ａ）ＶＬドメインをコードする核酸の出発レパートリーを提供する工程であって、かかる核酸が置換されるＣＤＲ３コード領域を含むか、又はＣＤＲ３コード領域を欠くかのいずれかである工程、
（ｂ）出発レパートリーを、アミノ酸配列ＱＱＹＬＡＦＰＹＴＦ（配列番号８）を有するＶＬ  ＣＤＲ３をコードする供与核酸と組み合わせる工程であって、かかる供与核酸がレパートリー内の１つ以上の核酸に挿入され、アミノ酸配列ＱＱＹＬＡＦＰＹＴＦ（配列番号８）を有するＶＬ  ＣＤＲ３を含むＶＬドメインをコードする核酸の生成物レパートリーを提供する工程、
（ｃ）生成物レパートリーの核酸を発現し標的結合メンバーを提供する工程、
（ｄ）配列番号１７のアミノ酸残基５６〜６３、配列番号１７のアミノ酸残基６６〜７４、及び配列番号１７のアミノ酸残基１２９〜１３５からなる群から選択される１つ以上の配列に特異的に結合する標的結合メンバーを選択する工程
（ｅ）標的結合メンバー又は、標的結合メンバーをコードする核酸を回収する工程。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
本特許又は出願書類は、少なくとも１枚のカラー印刷図面を収容している。カラー図面を備える、本特許又は特許出願公開の複製は、要請があれば、必要な手数料を支払うことにより、特許庁によって提供されるであろう。
【図１】ｈｕＤＤＧ９１／ＲＨ２．５＿Ｒ７１Ｖ抗体のκ軽鎖ヌクレオチド（配列番号１）及びアミノ酸（配列番号２）配列。アミノ酸配列中の下線はＣＤＲを示す。リーダー配列は含まれない。
【図２】ｈｕＤＤＧ９１／ＲＨ２．５＿Ｒ７１Ｖ抗体の重鎖ヌクレオチド（配列番号３）及びアミノ酸（配列番号４）配列。アミノ酸配列中の下線はＣＤＲを示す。リーダー配列は含まれない。
【図３】ｈｕＤＤＧ９１／ＲＨ２．５＿Ｒ７１Ｖ抗体をベースとした２５メンバーのコンビナトリアルライブラリをスクリーニングすることにより同定したＭ６を含む、９種の候補モノクローナル抗体の特性を示す表。イタリック体は異なるデータセットから得られた数を意味する。Ｒ７１Ｖ  Ｇ１はｈｕＤＤＧ９１抗体を意味する。２つのＲ７１Ｖ  Ｇ１の行は、２つの異なるデータセットの測定値を表す。疎水性が増した残基を黄色で強調する。
【図４Ａ】Ｍ６抗体の軽鎖（配列番号５）及びそのＣＤＲ（配列番号６〜８）のアミノ酸配列を示す。アミノ酸配列中の下線はＣＤＲの位置を示す。リーダー配列は含まれない。赤太字のアミノ酸残基は、ｈｕＤＤＧ９１／ＲＨ２．５＿Ｒ７１Ｖの親配列に対するアミノ酸置換を示す。
【図４Ｂ】Ｍ６抗体の重鎖（配列番号９）及びそのＣＤＲ（配列番号１０〜１２）のアミノ酸配列。アミノ酸配列中の下線はＣＤＲの位置を示す。リーダー配列は含まれない。
【図５】ｒｈＩＬ−４及びｒｈＩＬ−２５の存在下で自己樹状細胞により４日間刺激を受けた未感作ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞による、ＩＬ−４／ＩＬ２５誘導性ＩＬ−５産生を、ｈｕＤＤＧ９１（Ｍ９）抗体よりもＭ６が大いに抑制することを示すグラフ。ＩｇＧ１アイソタイプ抗体（ｉｓｏ）を対照として用いた。ｎ＝４例のドナー。
【図６Ａ】組み換えヒトＩＬ−２５で２４時間刺激したＬＳ１７４Ｔ細胞における、Ｍ６抗体によるｈｕＤＤＧ９１（Ｍ９）抗体と比べた、ＩＬ−２５誘導性ＧＲＯａ産生の抑制増強を示すグラフ。図６Ａ及び６Ｂ中のグラフは、２回の別の実験から得たデータを示す。
【図６Ｂ】組み換えヒトＩＬ−２５で２４時間刺激したＬＳ１７４Ｔ細胞における、Ｍ６抗体によるｈｕＤＤＧ９１（Ｍ９）抗体と比べた、ＩＬ−２５誘導性ＧＲＯａ産生の抑制増強を示すグラフ。図６Ａ及び６Ｂ中のグラフは、２回の別の実験から得たデータを示す。
【図７Ａ】２Ｍ尿素、１Ｍ  ＴＣＥＰ、ｐＨ  ３．０で反応停止したペプシン消化による、ヒトＩＬ−２５のアミノ酸残基１〜７８（配列番号１３）の配列カバーマップを示す。黒線は観察されたペプチド。
【図７Ｂ】２Ｍ尿素、１Ｍ  ＴＣＥＰ、ｐＨ  ３．０で反応停止したペプシン消化による、ヒトＩＬ−２５のアミノ酸残基７９〜１４６（配列番号１４）の配列カバーマップを示す。黒線は観察されるペプチド。
【図８Ａ】Ｈ／Ｄ交換実験でのＭ６抗体結合による、ヒトＩＬ−２５タンパク質の異なるセグメント（配列番号１５及び配列番号１６）に対する重水素化レベルの違いを示す。各ブロックはヒトＩＬ−２５ペプチドを表し、６つの時点、ｐＨ  ６で１５０秒間及び５００秒間、並びにｐＨ  ７で１５０秒間、５００秒間、１，５００秒間及び５，０００秒間でのデータを含む。紺青色は、Ｍ６抗体の結合の際保護されなかったことを示す。右側挿入部に示すように、その他の色は、オンソリューション／オフカラム交換後に、オンカラム／オフカラム交換後よりも多く重水素化されたことを示す。各イオンの第１の２つのアミノ酸残基のうちどちらかに結合された重水素が、分析（水性環境における消化／分離／質量分析）中に損失しており、Ｈ／Ｄ交換パターンにおける小さな差を説明する。
【図８Ｂ】Ｈ／Ｄ交換実験でのＭ６抗体結合による、ヒトＩＬ−２５タンパク質の異なるセグメント（配列番号１５及び配列番号１６）に対する重水素化レベルの違いを示す。各ブロックはヒトＩＬ−２５ペプチドを表し、６つの時点、ｐＨ  ６で１５０秒間及び５００秒間、並びにｐＨ  ７で１５０秒間、５００秒間、１，５００秒間及び５，０００秒間でのデータを含む。紺青色は、Ｍ６抗体の結合の際保護されなかったことを示す。右側挿入部に示すように、その他の色は、オンソリューション／オフカラム交換後に、オンカラム／オフカラム交換後よりも多く重水素化されたことを示す。各イオンの第１の２つのアミノ酸残基のうちどちらかに結合された重水素が、分析（水性環境における消化／分離／質量分析）中に損失しており、Ｈ／Ｄ交換パターンにおける小さな差を説明する。
【図９Ａ】３℃でＭ６抗体カラムを用いるｐＨ  ６及びｐＨ  ７でのオン／オフ交換後の、ヒトＩＬ−２５の異なるセグメントの重水素含量を示すグラフである。青色はオンソリューション／オフカラムであり、紫色はオンカラム／オフカラム。全ての交換時間をｐＨ  ７、２３℃等価に変換した（例えば、１５０秒間、ｐＨ  ６、３℃は１．８５秒間、ｐＨ  ７、２３℃に等しい）。各セグメントに代表されるヒトＩＬ−２５残基を各プロットの上部に示す。
【図９Ｂ】３℃でＭ６抗体カラムを用いるｐＨ  ６及びｐＨ  ７でのオン／オフ交換後の、ヒトＩＬ−２５の異なるセグメントの重水素含量を示すグラフである。青色はオンソリューション／オフカラムであり、紫色はオンカラム／オフカラム。全ての交換時間をｐＨ  ７、２３℃等価に変換した（例えば、１５０秒間、ｐＨ  ６、３℃は１．８５秒間、ｐＨ  ７、２３℃に等しい）。各セグメントに代表されるヒトＩＬ−２５残基を各プロットの上部に示す。
【図９Ｃ】３℃でＭ６抗体カラムを用いるｐＨ  ６及びｐＨ  ７でのオン／オフ交換後の、ヒトＩＬ−２５の異なるセグメントの重水素含量を示すグラフである。青色はオンソリューション／オフカラムであり、紫色はオンカラム／オフカラム。全ての交換時間をｐＨ  ７、２３℃等価に変換した（例えば、１５０秒間、ｐＨ  ６、３℃は１．８５秒間、ｐＨ  ７、２３℃に等しい）。各セグメントに代表されるヒトＩＬ−２５残基を各プロットの上部に示す。
【図９Ｄ】３℃でＭ６抗体カラムを用いるｐＨ  ６及びｐＨ  ７でのオン／オフ交換後の、ヒトＩＬ−２５の異なるセグメントの重水素含量を示すグラフである。青色はオンソリューション／オフカラムであり、紫色はオンカラム／オフカラム。全ての交換時間をｐＨ  ７、２３℃等価に変換した（例えば、１５０秒間、ｐＨ  ６、３℃は１．８５秒間、ｐＨ  ７、２３℃に等しい）。各セグメントに代表されるヒトＩＬ−２５残基を各プロットの上部に示す。
【図９Ｅ】３℃でＭ６抗体カラムを用いるｐＨ  ６及びｐＨ  ７でのオン／オフ交換後の、ヒトＩＬ−２５の異なるセグメントの重水素含量を示すグラフである。青色はオンソリューション／オフカラムであり、紫色はオンカラム／オフカラム。全ての交換時間をｐＨ  ７、２３℃等価に変換した（例えば、１５０秒間、ｐＨ  ６、３℃は１．８５秒間、ｐＨ  ７、２３℃に等しい）。各セグメントに代表されるヒトＩＬ−２５残基を各プロットの上部に示す。
【図９Ｆ】３℃でＭ６抗体カラムを用いるｐＨ  ６及びｐＨ  ７でのオン／オフ交換後の、ヒトＩＬ−２５の異なるセグメントの重水素含量を示すグラフである。青色はオンソリューション／オフカラムであり、紫色はオンカラム／オフカラム。全ての交換時間をｐＨ  ７、２３℃等価に変換した（例えば、１５０秒間、ｐＨ  ６、３℃は１．８５秒間、ｐＨ  ７、２３℃に等しい）。各セグメントに代表されるヒトＩＬ−２５残基を各プロットの上部に示す。
【図１０】ヒトＩＬ−２５（配列番号１７）のアミノ酸配列。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明は、本明細書で「Ｍ６」と称される高親和性ヒトＩＬ−２５抗体（実施例１を参照）の同定、及び、水素／重水素（Ｈ／Ｄ）交換マススペクトロメトリー（実施例３を参照）で決定される、Ｍ６抗体により結合されるヒトＩＬ−２５中のアミノ酸残基の同定に一部基づく。したがって、一実施形態において、本発明はＩＬ−２５に結合する標的結合メンバーに関し、この標的結合メンバーは、ヒトＩＬ−２５（配列番号１７）のアミノ酸残基４６〜６３、６６〜８４、及び１２９〜１３５からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸配列に結合する。このことから、本発明の標的結合メンバーは、配列番号１７のアミノ酸残基４６〜６３、配列番号１７のアミノ酸残基６６〜８４、若しくは配列番号１７のアミノ酸残基１２９〜１３５、又はこれらの任意の組み合わせに結合することができる。一実施形態において、本発明の標的結合メンバーは、配列番号１７のアミノ酸残基５６〜６３、及び配列番号１７のアミノ酸残基６６〜７４に結合する。
【００２０】
本明細書で用いるとき、「標的結合メンバー」は、哺乳類（例えば、ヒト）ＩＬ−２５タンパク質又はその一部に特異的に結合する、重鎖若しくは軽鎖の少なくとも１つの相補的決定領域（ＣＤＲ）又はそのリガンド結合部を含む免疫グロブリン分子の少なくとも一部を含む、任意のタンパク質又はペプチド含有分子を指す。このような標的結合メンバーとして更に、抗体重鎖若しくは軽鎖可変領域の少なくとも一部、抗体重鎖若しくは軽鎖定常領域の少なくとも一部、抗体フレームワーク領域の少なくとも一部、又はこれらの任意の組み合わせを挙げてもよい。このような標的結合メンバーは、インビトロ、インサイチュ、及び／又はインビボにおいて、少なくとも１つのＩＬ−２５活性若しくは結合、又はＩＬ−２５受容体活性若しくは結合について、調節、低下、拮抗、軽減、緩和、遮断、阻害、抑制、及び／又は妨害する。非限定例として、好適な本発明の標的結合メンバーは、本明細書で記載されるＭ６抗体によって認識されるヒトＩＬ−２５の阻害及び／又は中和エピトープに高い親和性で結合できる。
【００２１】
本発明の標的結合メンバーは、配列番号１７のアミノ酸残基４６〜６３、アミノ酸残基６６〜８４、及び／又はアミノ酸残基１２９〜１３５のみに結合するものに限定されない。したがって、いくつかの実施形態において、本発明の標的結合メンバーは、配列番号１７のアミノ酸残基４６〜６３、アミノ酸残基６６〜８４、及び／又はアミノ酸残基１２９〜１３５を包含しないヒトＩＬ−２５の１つ以上の別の部分に更に結合することができる。他の例では、本発明の標的結合メンバーは、配列番号１７のアミノ酸残基４６〜６３、アミノ酸残基６６〜８４、及び／又はアミノ酸残基１２９〜１３５に隣接するヒトＩＬ−２５中の１つ以上のアミノ酸残基に更に結合することができる。
【００２２】
本発明は更に、配列番号１７のアミノ酸残基４６〜６３、アミノ酸残基６６〜８４、及び／又はアミノ酸残基１２９〜１３５に含まれるヒトＩＬ−２５の１つ以上の部分、例えば、配列番号１７のアミノ酸残基４６〜６３、アミノ酸残基６６〜８４、及び／又はアミノ酸残基１２９〜１３５の少なくとも５つのアミノ酸からなるＩＬ−２５の一部などに結合する標的結合メンバーを考慮する。標的結合メンバーにより結合され得る代表的なＩＬ−２５部分として、配列番号１７のアミノ酸５６〜６３、及び／又はアミノ酸６６〜７４が挙げられる。
【００２３】
本発明の標的結合メンバーにより結合されるＩＬ−２５の領域、又はエピトープは、本発明が属する当該技術分野において周知である、いくつかの標準的な任意のエピトープマッピング手技を用いて決定できる。このような手技として、例えば、結合アッセイを伴う部位特異的突然変異誘発法、ペプチドピンでのエピトープマッピング（例えば、Ｇｅｙｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔｗｅｌｆｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ，ｐ．５１９〜５２３，Ｅｄ，Ｇ．Ｒ．Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｅｓｃｏｍ，Ｌｅｉｄｅｎ，１９８８）、Ｘ線結晶解析、及び水素／重水素（Ｈ／Ｄ）交換法（例えば、Ｈ／Ｄ交換マススペクトロメトリー）が挙げられる。
【００２４】
本明細書で記載されるように、Ｈ／Ｄ交換マススペクトロメトリーを用いて、Ｍ６抗体により認識かつ結合されるヒトＩＬ−２５中のエピトープを決定した（実施例３、並びに図８Ａ、８Ｂ及び９Ａ〜９Ｆを参照）。水から重水素系溶媒系（重水）へ移すと、タンパク質の水素原子が重陽子（水素のより重い同位体）で徐々に置換されるため、タンパク質の質量が増加する。水素／重水素交換の発生頻度は、概してタンパク質構造及び溶媒露出度によって決まる。Ｈ／Ｄ交換マススペクトロメトリーを用いて、交換度、ひいてはタンパク質構造及び溶媒露出度を測定できる。小分子、又はタンパク質結合パートナーがタンパク質標的に結合すると、その標的の交換率は、実験的に観測可能に変化する。複合体形成による溶媒を排除する表面領域は、更にゆっくりと交換される。溶媒排除領域は結合部位の位置を推定するのに有用である。例えば、抗原−抗体相互作用の場合、これらの変化はエピトープの位置を強調する。
【００２５】
典型的には、本発明の標的結合メンバーは、抗体重鎖可変領域（ＶＨ）ドメインと対となる抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）ドメインを含み、ＩＬ−２５結合ドメインを提供する。本明細書で記載される発明を行うにあたり、ｈｕＤＤＧ９１抗体ＶＬドメイン（配列番号１）中の相補的決定領域（ＣＤＲ）、特にＣＤＲ３領域をＱＱＹＬＡＦＰＹＴＦ（配列番号８）に変更することにより、ｈｕＤＤＧ９１抗体の結合親和性が改善されることが見出された。したがって、本明細書で記載される発明では、配列番号８を含むＶＬドメイン、及びかかるＶＬドメインを含む標的結合メンバーが考慮される。いくつかの実施形態において、本発明の標的結合メンバー中のＶＬドメインはまた、Ｍ６及びｈｕＤＤＧ９１抗体のＣＤＲ１（ＳＡＳＱＧＩＳＮＹＬＮ（配列番号６））及びＣＤＲ２（ＹＴＳＳＬＨＳ（配列番号７））領域も含む。本発明の標的結合メンバーに含めるためのその他好適なＶＬ  ＣＤＲ領域として、図３に示す任意のＶＬ  ＣＤＲ１領域が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態において、本発明の標的結合メンバーは、Ｍ６抗体のＶＬドメインである配列番号５を含む。
【００２６】
いくつかの実施形態において、本発明の標的結合メンバーはまた、Ｍ６及びｈｕＤＤＧ９１抗体のＣＤＲ領域に相当する配列番号１０〜１２を含むＶＨドメインも含む。本発明の標的結合メンバーに含めるためのその他好適なＶＨ  ＣＤＲ領域として、図３に示す任意のＶＨ  ＣＤＲ３領域が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、本発明の標的結合メンバーは、Ｍ６及びｈｕＤＤＧ９１抗体のＶＨドメインである配列番号９を含む。ＶＨドメインは、Ｍ６抗体のＶＬドメイン（配列番号５）以外の多くのＶＬドメインと対を作ることができる。好ましくは、ＶＨドメインは、配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３領域を含むＶＬドメインと対を作る。
【００２７】
改変されたＣＤＲ（１つ又は複数）を有する標的結合メンバー（例えば、抗体）がヒトＩＬ−２５に結合し阻害する能力を維持する限りは、本明細書で記載されるＭ６抗体のＣＤＲ配列を、挿入、置換、及び欠失により改変し、本発明の標的結合メンバー内に含めてもよい。当業者は、本明細書で記載される機能アッセイを実施することにより、この活性維持を確認することができる。本発明の標的結合メンバー中のＣＤＲは、配列番号６、７、８、１０、１１又は１２で表される対応するＭ６のＣＤＲと、例えば約５０％〜約１００％の相同性、好ましくは約８０％〜約１００％の相同性、より好ましくは約９０％〜約１００％の相同性を有してよい。一実施形態において、本発明の標的結合メンバー中のＣＤＲは、配列番号６、７、８、１０、１１又は１２で表される対応するＭ６のＣＤＲと、約１００％の相同性を有してもよい。
【００２８】
本発明による標的結合メンバーは、本明細書で記載されるＭ６抗体と実質的に同等の、又はより高い親和性でＩＬ−２５に結合できる。例えば、本発明の標的結合メンバーは、約５０ｐＭ（例えば、約５３ｐＭ）以下、例えば、約４５ｐＭ、約４０ｐＭ、約３５ｐＭ、約３０ｐＭ、約２５ｐＭ又は約２０ｐＭなどのＩＬ−２５（例えば、ヒトＩＬ−２５）に対する結合親和性を有し得る。標的結合メンバーは、一般にＩＬ−２５に特異的であろう。したがって、標的結合メンバーは、特異的結合パートナー（１つ又は複数）以外の分子に対する顕著な結合は全く示さないだろう。例えば、本明細書で記載されるＭ６抗体は、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｃ、ＩＬ−１７Ｄ、又はＩＬ−１７Ｆと交差反応しないことがわかっている。ぜんそくや類似の過程に関与する他のサイトカインに対するこのような交差反応を回避することは、本発明のいくつかの実施形態における標的結合メンバーの望ましい特徴である。
【００２９】
標的結合メンバーと抗原の親和性又は結合活性は、任意の適切な方法を用いて実験的に測定できる。（例えば、Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，「Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ」ｉｎ  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，Ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９８４）；Ｋｕｂｙ，Ｊａｎｉｓ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９９２）；及び本明細書で記載される方法を参照されたい。）特定の抗体抗原相互作用の測定される親和性は、異なる条件（例えば、塩濃度、ｐＨ）下で測定される場合に異なり得る。したがって、親和性及び他の抗原結合パラメータ（例えば、ＫＤ、Ｋａ、Ｋｄ）の測定は、好ましくは、抗体及び抗原の標準化溶液、及び本明細書で記載される緩衝剤等の標準化緩衝剤を用いて行われる。
【００３０】
例えば特異性は、特に、抗原パネルを用いるＥＬＩＳＡなどの結合アッセイ、Ｂｉａｃｏｒｅアッセイ、及び／又はＯｃｔｅｔアッセイにより測定できる。本発明による標的結合メンバーは、ＩＬ−２５を認識でき、ＩＬ−１７ファミリーの別のメンバー、特にＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｂ、ＩＬ−１７Ｃ、ＩＬ−１７Ｄ及びＩＬ−１７Ｆの任意の１つ、一実施形態においてはこれらの５つの分子の全てを認識できない。本発明による標的結合メンバーのＩＬ−２５との結合は、組み換えＩＬ−２５との競合により無効にできる。
【００３１】
異なる標的結合メンバーの結合親和性及び中和効力を適当な条件下で比較できる。
【００３２】
また、本発明は、配列番号１７のアミノ酸残基４６〜６３、配列番号１７のアミノ酸残基６６〜８４、及び配列番号１７のアミノ酸残基１２９〜１３５からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸配列に結合する本発明の標的結合メンバーと、ＩＬ−２５への結合を競合する標的結合メンバーに関する。特定の実施形態において、標的結合メンバーは、ヒトＩＬ−２５に対して約５０ｐＭ以下の結合親和性を有する。
【００３３】
どのタンパク質、抗体、及びその他拮抗物質が、本発明の標的結合メンバーとＩＬ−２５への結合を競合、及び／又はエピトープ領域を共有するのかを確認するため、本発明の標的結合メンバー（例えば、抗体）について競合アッセイを実施することができる。容易に当業者に知られるように、これらのアッセイは、タンパク質、例えば、ＩＬ−２５上の限られた結合部位に対する、拮抗物質又はリガンド間の競合を評価する。競合の前後でタンパク質及び／又は抗体を固定化又は不溶化し、例えば、デカント（タンパク質／標的結合メンバーを予め不溶化した場合）又は遠心分離（競合反応後タンパク質／抗体を沈殿した場合）により、ＩＬ−２５タンパク質に結合したサンプルを未結合のサンプルと分離する。また、標的結合メンバーがタンパク質へ結合したこと、又は結合しなかったことにより機能が変わるかどうか、例えば、標的結合メンバー分子が、例えば、ラベルの酵素活性を阻害又は強化するかどうかにより、競合結合を決定してもよい。当該技術分野において周知のような、ＥＬＩＳＡ及びその他機能性アッセイを使用してよい。
【００３４】
抗体
好ましくは、本発明の標的結合メンバーは抗体分子である。用語「抗体」には、抗体模倣薬を含む、抗体、その消化断片、特異的部分及び変異体、あるいは、単鎖抗体及びその断片を含む、抗体の構造及び／若しくは機能を模倣する抗体の部分、又はその特定断片、又はその一部を包含することを意図し、これらはそれぞれ少なくとも１つのＣＤＲを含む。機能断片としては、哺乳類のＩＬ−２５に結合する抗原結合断片が挙げられる。例えば、Ｆａｂ（例えば、パパイン消化による）、Ｆａｂ’（例えば、ペプシン消化及び部分的還元による）及びＦ（ａｂ’）2（例えば、ペプシン消化による）、ｆａｃｂ（例えば、プラスミン消化による）、ｐＦｃ’（例えば、ペプシン又はプラスミン消化による）、Ｆｄ（例えば、ペプシン消化、部分的還元及び再集合による）、Ｆｖ又はｓｃＦｖ（例えば、分子生物学的手法による）断片を非限定的に含む、ＩＬ−２５又はその部分に結合可能な抗体断片が本発明に包含される（例えば、Ｃｏｌｌｉｇａｎ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ（１９９４  ２００１）；Ｃｏｌｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ，Ｎ．Ｙ．，（１９９７  ２００１）を参照のこと）。
【００３５】
このような断片は、当該技術分野において既知であるような、及び／又は本明細書に記載のような、酵素的切断、合成又は組み換え技術により生成できる。抗体はまた、１つ以上の終止コドンが天然の終止部位の上流に導入されている抗体遺伝子を用いて、種々の切頭型で生成できる。例えば、Ｆ（ａｂ’）2重鎖部をコードする遺伝子の組み合わせは、重鎖のＣＨ1ドメイン及び／又はヒンジ領域をコードするＤＮＡ配列を含むよう設計することができる。抗体の種々の部分を従来の技術により化学的に連結でき、又は遺伝子工学技術を用いて隣接タンパク質として調製できる。
【００３６】
本明細書で用いるとき、用語「抗体」は、非マウス、好ましくはヒト抗体由来の１つ以上のタンパク質又はペプチドを有する本明細書で記載のＭ６  ＣＤＲの任意の組み合わせを含む、「キメラ」抗体及び「ヒト化」、又は「ＣＤＲグラフト化」抗体を包含することも意図する。本発明に従って、ＣＤＲがＭ６抗体由来であるキメラ又はヒト化抗体が提供される。そのため一実施形態において、抗体のヒト部分は実質的にヒトに免疫原性がない領域を含み得る。ヒト抗体由来の抗体領域は、ヒト抗体と１００％の同一性を有する必要がない。好ましい実施形態において、免疫原性を低くするために可能な限り多くのヒトアミノ酸残基が保持されるが、ヒト残基を必要に応じて改変し、ＣＤＲにより形成される抗原結合部位を支持すると同時に、抗体のヒト化を最大限にしてもよい。このような変化又は変異は、所望によりかつ好ましくは、非改変抗体に比べて、ヒト又は他の種における免疫原性が保持されている又は低下している。ヒト化抗体は、機能的に再構成されたヒト免疫グロブリン（例えば、重鎖及び／又は軽鎖）遺伝子を発現する能力をもつ非ヒト動物又は原核若しくは真核細胞により産生され得る。更に、抗体が単鎖抗体である場合、天然のヒト抗体では見出されないリンカーペプチドを含み得る。例えば、Ｆｖは、重鎖の可変領域及び軽鎖の可変領域を接続する２〜約８個のグリシン又はその他のアミノ酸残基などのリンカーペプチドを含み得る。このようなリンカーペプチドはヒト由来のものと見なされる。
【００３７】
別の方法としては、図４Ａ及び４ＢのＭ６抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域全体（配列番号５及び９）をヒト定常領域及びフレームワーク領域と組み合わせ、本発明の標的結合メンバーを形成してよい。
【００３８】
本発明の標的結合メンバーの定常（Ｃ）領域をコードするヒト遺伝子は、既知の方法によるヒト胎児肝臓ライブラリ由来であってもよい。ヒトＣ領域遺伝子は、ヒト免疫グロブリンを発現かつ産生するものなど、任意のヒト細胞由来であってよい。ヒトＣＨ領域は、γ、μ、α、δ、εを含む任意のヒトＨ鎖の既知の種類、又はアイソタイプ、及びそのサブタイプ、例えば、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３及びＧ４由来であってもよい。Ｈ鎖のアイソタイプは抗体のさまざまなエフェクター機能に関与するため、所望のエフェクター機能、例えば、補体結合又は抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）の活性により、ＣＨ領域の選択が導かれるであろう。一実施形態において、ＣＨ領域はγ１（ＩｇＧ１）由来である。
【００３９】
ヒトＣＬ領域はヒトＬ鎖のアイソタイプ、κ又はλのいずれか、好ましくはκ由来であってもよい。
【００４０】
ヒト免疫グロブリンＣ領域をコードする遺伝子は、標準的なクローニング手技（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８７，１９９３））によりヒト細胞から得ることができる。ヒトＣ領域の遺伝子は、２種類のＬ鎖、５種類のＨ鎖、及びそれらのサブクラスを表す遺伝子を含有する既知のクローンから容易に入手できる。キメラ抗体断片、例えば、Ｆ（ａｂ1）2及びＦａｂは、適切に切頭化されたキメラＨ鎖遺伝子を設計することにより作製できる。例えば、Ｆ（ａｂ1）2断片のＨ鎖部をコードするキメラ遺伝子は、Ｈ鎖のＣＨ１ドメイン及びヒンジ領域をコードするＤＮＡ配列を含め、翻訳終止コドンを続けることで切頭型分子を得る。
【００４１】
一般には、一例として、Ｍ６抗体のＨ鎖及びＬ鎖抗原結合領域をコードするＤＮＡセグメントをクローニングし、これらＤＮＡセグメントをＣＨ領域及びＣＬ領域をコードするＤＮＡセグメントとそれぞれ連結してキメラ免疫グロブリンコード遺伝子を生成することにより、本発明のキメラ抗体、断片及び領域を作製する。
【００４２】
したがって一実施形態において、ヒトＣ領域の少なくとも一部をコードする第２のＤＮＡセグメントに連結された、非ヒト由来である、連結（Ｊ）セグメントを伴う機能的に再配列したＶ領域などの少なくとも抗原結合領域をコードする第１のＤＮＡセグメントを含む、融合キメラ遺伝子が作製される。
【００４３】
標的結合メンバーがヒトＩＬ−２５に結合し阻害する能力を維持する限りは、Ｍ６抗体の可変領域の配列を挿入、置換、及び欠失により改変してもよい。
【００４４】
便宜上、本明細書ではＫａｂａｔらの番号付けスキームを採用している。現在の配列を標準的なＫａｂａｔ番号付け配列に一致させるため、必要に応じて小文字数字又はハイフンで残基を表記する。
【００４５】
本発明に従って、Ｍ６抗体のＣＤＲ領域がヒト領域と結合されるＣＤＲグラフト化又はヒト化抗体については、親抗体、例えばＭ６に特異的なＦＲ領域内に残基を保持してもよい。他の抗体においてヒト化に重要であると示されている残基も保持してもよい。ＣＤＲにより形成される抗原結合部位を支持すると同時に、抗体のヒト化を最大限にするのに必要な範囲で、これらの指針に従うことができる。
【００４６】
非ヒト抗体又はヒト抗体を工学的処理又はヒト化するための方法も同様に使用でき、当該技術分野において周知である。一般に、ヒト化又は工学的処理された抗体は、例えばマウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類又はその他の哺乳動物などの（ただしこれらに限定されない）ヒト以外の供給源からの１つ以上のアミノ酸残基を有する。これらのヒトアミノ酸残基は、しばしば「インポート」残基と呼ばれ、典型的には既知のヒト配列の「インポート」可変領域、定常領域又はその他のドメインから採取される。既知のヒトＩｇ配列が、例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  ＨｅａｌｔｈのＮＣＢＩデータベースなどの公開データベース、又はＫａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ（１９８３）などの出版物に多く開示されている。
【００４７】
このようなインポートされた配列は、免疫原性を減少させるため、又は、当該技術分野において既知のように、結合、親和性、オン速度、オフ速度、結合活性、特異性、半減期、又はその他の適切な任意の特性を低減、増強又は改変するために使用することができる。一般には、可変領域及び定常領域の非ヒト配列がヒト又はその他のアミノ酸に置き換えられている一方で、非ヒト又はヒトＣＤＲ配列の一部分又は全てを維持できる。抗体は、所望により、抗原に対する高い親和性及びその他の有利な生物学的特性を伴い、ヒト化することもできる。この目的を達成するため、所望により、ヒト化抗体を、親配列及びヒト化配列の３次元モデルを使用した、親配列及びさまざまな概念的ヒト化産物の分析プロセスによって調製することが可能である。３次元免疫グロブリンモデルが一般的に利用可能であり、当業者によく知られている。選択された候補の免疫グロブリン配列について、可能性の高い３次元立体構造を図示及び表示するコンピュータプログラムが利用可能である。これらの表示を調べることにより、候補の免疫グロブリン配列の機能における残基の役割として可能性の高いものの分析、すなわち候補の免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響を及ぼす残基の分析が可能となる。このようにして、標的抗原に対する親和性の増大など、望ましい抗体特性が達成されるように、コンセンサス配列及びインポート配列から、ＦＲ残基を選択し組合せることができる。一般的に、ＣＤＲ残基は抗原結合に対する影響において、直接的かつ最も実質的に関与している。本発明の抗体のヒト化、又は操作は、（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４（１９８８））Ｓｉｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６（１９９３）；Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１（１９８７），Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：４２８５（１９９２）；Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２６２３（１９９３）、米国特許第５，７２３，３２３号、同第５，９７６，８６２号、同第５，８２４，５１４号、同第５，８１７，４８３号、同第５，８１４，４７６号、同第５，７６３，１９２号、同第５，７２３，３２３号、同第５，７６６，８８６号、同第５，７１４，３５２号、同第６，２０４，０２３号、同第６，１８０，３７０号、同第５，６９３，７６２号、同第５，５３０，１０１号、同第５，５８５，０８９号、同第５，２２５，５３９号、同第４，８１６，５６７号、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９８／１６２８０号、同ＵＳ９６／１８９７８号、同ＵＳ９１／０９６３０号、同ＵＳ９１／０５９３９号、同ＵＳ９４／０１２３４号、同ＧＢ８９／０１３３４号、同ＧＢ９１／０１１３４号、同ＧＢ９２／０１７５５号、国際公開第９０／１４４４３号、同第９０／１４４２４号、同第９０／１４４３０号、欧州特許第２２９２４６号（これらは引用されている文献も含め、それぞれ参照により全体が��明細書に組み込まれる）に記載されるもの（ただし、これらに制限されない）など任意の既知の方法を用いて実施できる。
【００４８】
本発明の標的結合メンバーのヒト定常領域は、任意の種類（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤなど）又はアイソタイプのものであってもよく、κ又はλ軽鎖を含めることができる。一実施形態においては、ヒト定常領域は、ＩｇＧ重鎖又は定義された断片、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４の、少なくとも１つのアイソタイプを含む。別の実施形態において、標的結合メンバーはＩｇＧ１重鎖及びＩｇＧ１  κ軽鎖を含む。単離された本発明の標的結合メンバーは、任意の好適なポリヌクレオチドによりコードされる本明細書で開示される抗体のアミノ酸配列を含んでもよい。好ましくは、標的結合メンバーはヒトＩＬ−２５と結合し、これにより、部分的又は実質的に、このタンパク質の少なくとも１つの生物活性を中和する。標的結合メンバー又はその特定の部分若しくはそれらの変異体は、少なくとも１つのＩＬ−２５タンパク質又は断片の少なくとも１つの生物活性を、部分的に又は好ましくは実質的に中和し、これによりＩＬ−２５のＩＬ−２５受容体に対する結合を通して、又はその他のＩＬ−２５依存性又は媒介型機序を通して、媒介される活性を阻害する。本明細書で使用するとき、「中和抗体」という用語は、アッセイに応じて約２０〜１００％、好ましくは少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％又はそれ以上、ＩＬ−２５依存活性を阻害できる抗体を意味する。ＩＬ−２５依存性活性を阻害する標的結合メンバーの能力は、好ましくは、本明細書に記載されているように及び／又は当該技術分野において既知のように、少なくとも１つの適切なＩＬ−２５タンパク質又は受容体アッセイによって評価される。
【００４９】
本発明の少なくとも１つの抗体は、Ｍ６抗体が結合する本明細書で特定される少なくとも１つのエピトープに結合する。この少なくとも１つのエピトープは、タンパク質の少なくとも一部分を含む少なくとも１つの抗体結合領域を含むことが可能であり、このエピトープは好ましくは、タンパク質の少なくとも１つの細胞外、可溶性、親水性、外部、又は細胞質部分から構成されている。一般に、本発明の標的結合メンバーは、配列番号１０、１１及び１２の少なくとも１つの相補的決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）又は少なくとも１つの重鎖可変領域の変異体及び少なくとも１つのヒト相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）（配列番号６、７及び８）又は少なくとも１つの軽鎖可変領域の変異体を含む抗原結合領域を含むようになる。
【００５０】
ヒトＩＬ−２５に結合し、定められた重鎖若しくは軽鎖可変領域、又はＣＤＲ領域を含む標的結合メンバーは、ファージディスプレイ法（Ｋａｔｓｕｂｅ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ，１（５）：８６３  ８６８（１９９８））などの適切な方法、又は当該技術分野において既知であるように、及び／若しくは本明細書で記載されるように、トランスジェニック動物で利用される方法を用いて調製できる。例えば、抗体、特異的部分、又は変異体は、適切な宿主細胞内で、コード核酸又はその一部分を用いて発現することができる。
【００５１】
上述のように、本発明は更に、本明細書に記載されるＭ６アミノ酸配列と実質的に同じである配列内のアミノ酸を含む抗体、抗原結合断片、免疫グロブリン鎖及びＣＤＲにも関する。かかる抗ＩＬ−２５抗体は、本明細書で特定されるように、自然変異又はヒトによる操作のいずれかによる、１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、又は付加を含むことができる。好ましくは、かかる抗体又は抗原結合断片及びかかる鎖若しくはＣＤＲを含む抗体は、高い親和性（例えば、ＫＤが約１０−９Ｍ以下）で、ヒトＩＬ−２５と結合することができる。本明細書に記載されている配列と実質的に同じであるアミノ酸配列は、保存的アミノ酸置換、並びにアミノ酸欠失及び／又は挿入を含む、配列を有する。保存的アミノ酸置換とは、第１のアミノ酸のものに類似した化学的及び／又は物理的特性（例えば電荷、構造、極性、疎水性／親水性）をもつ第２のアミノ酸で、第１のアミノ酸を置換することを意味する。保存的置換には、あるアミノ酸を、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）及びヒスチジン（Ｈ）；アスパラギン酸（Ｄ）及びグルタミン酸（Ｅ）；アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、チロシン（Ｙ）、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｄ及びＥ；アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、プロリン（Ｐ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、メチオニン（Ｍ）、システイン（Ｃ）及びグリシン（Ｇ）；Ｆ、Ｗ及びＹ；Ｃ、Ｓ及びＴという群の中の別のアミノ酸で置換することが含まれる。
【００５２】
当業者が行い得るアミノ酸置換の数は、上記のものを含む数多くの要因に基づく。一般的に言えば、所与の抗ＩＬ−２５抗体、断片又は変異体について、そのアミノ酸置換、挿入又は欠失の数は、本明細書で特定されるように、４０、３０、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１、例えば、１〜３０又はこの中の任意の範囲若しくは値を超えない。
【００５３】
機能上不可欠である本発明の標的結合メンバー内のアミノ酸は、部位特異的突然変異誘発又はアラニンスキャニング突然変異誘発などの、当該技術分野において既知の方法により同定できる（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ（上記）、Ｃｈａｐｔｅｒｓ  ８，１５；Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１０８１  １０８５（１９８９））。後者の手順は、分子内の全ての残基において単一アラニン突然変異を導入する。得られた突然変異分子は、例えば（ただし、これに制限されない）少なくとも１つのＩＬ−２５中和活性などの生物活性について、続いてテストされる。抗体結合にとってきわめて重要である部位もまた、結晶化、核磁気共鳴又は光親和性標識などの構造分析によって同定することができる（Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：８９９〜９０４（１９９２）及びｄｅ  Ｖｏｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５５：３０６〜３１２（１９９２））。
【００５４】
本発明の標的結合メンバーは、少なくとも１つの配列番号５〜１２の隣接アミノ酸のうち、５個ないし全てのアミノ酸から選択された、少なくとも１つの部分、配列又は組み合わせを含むことができるが、これらに限定されない。
【００５５】
標的結合メンバーは、所望により更に、配列番号５又は９のうち少なくとも１つの、隣接アミノ酸の７０〜１００％の少なくとも１つのポリペプチドを含んでもよい。
【００５６】
一実施形態において、免疫グロブリン鎖又はその一部（例えば、可変領域、ＣＤＲ）のアミノ酸配列は、配列番号５又は９の少なくとも１つの対応する鎖のアミノ酸配列と、約７０〜１００％の同一性（例えば、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、又はこの中の任意の範囲若しくは値）を有する。例えば、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号５の配列と比較してもよく、又は重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号９と比較してもよい。好ましくは、７０〜１００％のアミノ酸同一性（すなわち、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、又はこの中の任意の範囲若しくは値）は、当該技術分野において既知であるような、適切なコンピュータアルゴリズムを用いて決定される。
【００５７】
代表的な重鎖及び軽鎖可変領域の配列は、配列番号５及び９に示される。本発明の標的結合メンバー、又はその特定の変異体は、本発明の抗体から任意の数の隣接アミノ酸残基を含み得、その数は、標的結合メンバーにおける隣接残基数の１０〜１００％からなる整数の群から選択される。任意で、隣接アミノ酸のこの部分配列は、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、又はそれ以上のアミノ酸長であるか、又はその中の任意の範囲若しくは値である。更に、かかる部分列の数は、少なくとも２、３、４、又は５等の、１〜２０からなる群から選択される任意の整数であり得る。
【００５８】
当業者には明らかなように、本発明には、本発明の少なくとも１つの生物活性抗体が含まれている。生物活性抗体は、ネイティブ（非合成）、内因性又は関連する、及び既知の抗体のものの、少なくとも２０％、３０％、又は４０％、及び好ましくは少なくとも５０％、６０％、又は７０％、及び最も好ましくは少なくとも８０％、９０％又は９５％〜１０００％の比活性を有する。酵素活性及び基質特異性のアッセイ及び定量測定の方法は、当業者にとって周知である。
【００５９】
別の態様においては、本明細書で記載されるように、本発明は標的結合メンバーに関連し、有機部分の共有結合連結によって修飾される。かかる修飾は、改善された薬物動態特性（例えば、増大した、生体内での血清半減期）を持つ抗体又は抗原結合断片を産生することができる。有機部分は、直線状又は分岐した親水性ポリマー基、脂肪酸基、又は脂肪酸エステル基であり得る。特定の実施形態においては、親水性ポリマー基は、約８００〜約１２０，０００ダルトンの分子重量を有し、ポリアルカングリコール（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ））、糖質ポリマー、アミノ酸ポリマー又はポリビニルピロリドンであり得、脂肪酸又は脂肪酸エステル基は、約８〜約４０の炭素原子を含み得る。
【００６０】
本発明の修飾された標的結合メンバーは、直接的又は間接的に抗体に共有結合される、１つ以上の有機部分を含むことができる。本発明の抗体又は抗原結合断片に結合されるそれぞれの有機部分は、独立して、親水性ポリマー基、脂肪酸基、又は脂肪酸エステル基であり得る。本明細書で使用するとき、「脂肪酸」という用語は、モノカルボン酸及びジカルボン酸を包含する。本明細書で使用するとき、「親水性ポリマー基」という用語は、オクタンよりも水への可溶性の高い有機ポリマーを意味する。例えばポリリシンは、オクタンに対するよりも水に対する溶解度が高い。よって、ポリリシンの共有結合付着により修飾された抗体が、本発明に包含されている。本発明の抗体を修飾するために適切な親水性ポリマーは、直線状又は分岐状であり得、例えば、ポリアルカングリコール（例えば、ＰＥＧ、モノメトキシ−ポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）、ＰＰＧ等）、糖質（例えば、デキストラン、セルロース、オリゴ糖、多糖等）、親水性アミノ酸のポリマー（例えば、ポリリシン、ポリアルギニン、ポリアスパラギン酸等）、ポリアルカンオキシド（例えば、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレンオキシド等）、及びポリビニルピロリドンを含む。好ましくは、本発明の抗体を修飾する親水性ポリマーは、個別の分子体として、約８００〜約１５０，０００ダルトンの分子量を有する。例えば、ＰＥＧ5000及びＰＥＧ20,000を使用することができ、下付き文字は、ポリマーの平均分子量（ダルトン）である。親水性ポリマー基は、１〜約６アルキル、脂肪酸、又は脂肪酸エステル基と置換され得る。脂肪酸又は脂肪酸エステル基と置換される親水性ポリマーは、適切な方法を採用することによって調製することができる。例えば、アミン基を含むポリマーは、脂肪酸又は脂肪酸エステルのカルボキシレートとカップリングさせることができ、脂肪酸又は脂肪酸エステル上の活性化カルボキシレート（例えば、Ｎ，Ｎ−カルボニルジイミダゾールで活性化されたもの）は、ポリマー上のヒドロキシル基とカップリングさせることができる。
【００６１】
本発明の抗体を修飾するために適切な脂肪酸及び脂肪酸エステルは、飽和され得るか、又は１つ以上の不飽和単位を含有し得る。本発明の抗体を改変するために適切な脂肪酸としては、例えば、ｎ−ドデカン酸（Ｃ１２、ラウリン酸）、ｎ−テトラデカン酸（Ｃ１４、ミリスチン酸）、ｎ−オクタデカン酸（Ｃ１８、ステアリン酸）、ｎ−エイコサン酸（Ｃ２０、アラキジン酸）、ｎ−ドコサン酸（Ｃ２２、ベヘン酸）、ｎ−トリアコンタン酸（Ｃ３０）、ｎ−テトラコンタン酸（Ｃ４０）、シス−ＤＥＬＴＡ９−オクタデカン酸（Ｃ１８、オレイン酸）、全てのシス−ＤＥＬＴＡ５，８，１１，１４−エイコサテトラエン酸（Ｃ２０、アラキドン酸）、オクタンジオン酸、テトラデカンジオン酸、オクタデカンジオン酸、ドコサンジオン酸などが挙げられる。適切な脂肪酸エステルは、直線状又は分岐状の低級アルキル基を含む、ジカルボキシル酸のモノエステルを含む。低アルキル基は、１〜約１２、好ましくは１〜約６の炭素原子を含み得る。
【００６２】
修飾された標的結合メンバーは、１つ以上の改変剤との反応など、適切な方法を使用して調製することができる。本明細書で使用するとき、用語「改変剤」は、活性化基を含む適切な有機基（例えば親水性ポリマー、脂肪酸、脂肪酸エステル）を意味する。「活性化基」とは、適切な条件下で第２の化学基と反応し、これにより改変剤と第２の化学基との間に共有結合を形成することのできる、化学部分又は官能基である。例えば、アミン反応性活性化基は、トシル酸、メシル酸、ハロ（クロロ、ブロモ、フルオロ、ヨード）等の求電子性基、Ｎ−ヒドロキシスクシニミジルエステル（ＮＨＳ）等を含む。チオールと反応できる活性化基は、例えば、マレイミド、ヨードアセチル、アクリロリル、ピリジルジスルフィド、５−チオール−２−ニトロベンゾ酸チオール（ＴＮＢ−チオール）等を含む。アルデヒド官能基は、アミン又はヒドラジド含有分子と結合することができ、アジド基は、三価リン基と反応して、ホスホルアミド化又はホスホルイミド結合を形成することができる。分子中に活性化基を導入するための適切な方法が、当該技術分野において既知である（例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ：Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９６）参照）。活性化基は、有機基（例えば、親水性ポリマー、脂肪酸、脂肪酸エステル）に直接的に、又はリンカー部分（例えば、二価のＣ1  Ｃ12基、ここで１つ以上の炭素原子は酸素、窒素、又はイオウなどのヘテロ原子に置換できる）を介して、結合することができる。適切なリンカー部分としては、例えば、テトラエチレングリコール、−−（ＣＨ2）3−−、−−ＮＨ−−（ＣＨ2）6−−ＮＨ−−、−−（ＣＨ2）2−−ＮＨ−−、及び−−ＣＨ2−−Ｏ−−ＣＨ2−−ＣＨ2−−Ｏ−−ＣＨ2−−ＣＨ2−−Ｏ−−ＣＨ−−ＮＨ−−が挙げられる。リンカー部分を含む改変剤は、例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）の存在下で、モノ−Ｂｏｃ−アルキルジアミン（例えば、モノ−Ｂｏｃ−エチレンジアミン、モノ−Ｂｏｃ−ジアミノへキサン）を脂肪酸と反応させることにより、遊離アミンと脂肪酸カルボキシレートとの間のアミド結合を形成することによって、生成可能である。Ｂｏｃ保護基を、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）処理により生成物から除去し、記載されているようにもう１つのカルボン酸塩にカップリングし得る一級アミンを露出させることができ、あるいは、これを無水マレイン酸と反応させ、結果として得られた生成物を環化させて脂肪酸の活性化マレイミド誘導体を生成することができる。（例えば、参照によりこの教示の全体が本明細書に組み込まれるＴｈｏｍｐｓｏｎらの国際公開第９２／１６２２１号を参照されたい。）
【００６３】
本発明の改変された標的結合メンバーは、ヒト抗体又は抗原結合断片を改変剤と反応させることによって生成することができる。例えば、有機部分は、アミン反応性変性剤、例えば、ＰＥＧのＮＨＳエステルを採用することによって、非部位特異的方法で抗体に結合させることができる。抗体又は抗原結合断片のジスルフィド結合（例えば鎖内ジスルフィド結合）を還元することによって、修飾されたヒト抗体又は抗原結合断片を調製することもできる。このとき、還元された抗体又は抗原結合断片をチオール反応性修飾剤と反応させて、本発明の修飾された抗体を生産することが可能である。本発明の抗体の特異的部位も結合する有機部分を含む改変されたヒト抗体及び抗原結合断片を、逆タンパク質分解（Ｆｉｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，３：１４７  １５３（１９９２）；Ｗｅｒｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，５：４１１  ４１７（１９９４）；Ｋｕｍａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．６（１０）：２２３３  ２２４１（１９９７）；Ｉｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２４（１）：５９  ６８（１９９６）；Ｃａｐｅｌｌａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，５６（４）：４５６  ４６３（１９９７））などの好適な方法、及び、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ：Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９６）に記載される方法を用いて調製することができる。
【００６４】
本発明の方法及び組成物に有用な標的結合メンバーは、ＩＬ−２５への結合親和性が高く、かつ所望により毒性が低いことを特徴とする。具体的には、可変領域、定常領域、及びフレームワークのような個々の構成要素が、個々に及び／又は集合的に、所望によりかつ好ましくは低い免疫原性を有する、本発明の標的結合メンバーが本発明で有用である。本発明で用いることのできる標的結合メンバーは、所望により、長期間測定可能な程度症状を緩和する患者を治療する能力、並びに低い及び／又は許容できる毒性を特徴とする。低い若しくは許容できる免疫原性、及び／又は高い親和性、並びに他の好適な特性は、得られる治療結果に寄与することができる。「低い免疫原性」は、本明細書では、治療される患者の約７５％未満、若しくは好ましくは約５０％未満で有意にＨＡＨＡ、ＨＡＣＡ若しくはＨＡＭＡ応答が増加する、及び／又は、治療される患者において低い力価（二重抗原酵素免疫アッセイで測定したとき約３００未満、好ましくは約１００未満）が増加することとして定義される（Ｅｌｌｉｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ  ３４４：１１２５  １１２７（１９９４）、参照により全体が本明細書に組み込まれる）。
【００６５】
また、少なくとも２種の抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル、ヒト化抗体である、二重特異的、異種特異的、異種結合性又は類似の抗体を用いてもよい。この場合では、結合特異性のうち一方は少なくとも１つのＩＬ−２５タンパク質に対するものであり、他方は任意の他の抗原に対するものである。二重特異的抗体の製造方法は、当該技術分野において既知である。伝統的に、二重特異的抗体の組み換え体生成は、２種の免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の共発現に基づき、ここで２本の重鎖は異なる特異性を有する（ミルスタイン及びクエロ（Cuello）、Ｎａｔｕｒｅ、３０５巻、５３７頁（１９８３年））。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖のランダムな組み合わせのために、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は１０種の異なる抗体分子の可能な混合物を生成し、これらのうち１種のみが正しい二重特異的構造を有する。正しい分子の精製（通常アフィニティクロマトグラフィー工程により行われる）は、かなり面倒であり、生成物の収率は低い。類似する手順が、例えば、国際公開第９３／０８８２９号、米国特許第６，２１０，６６８号、同第６，１９３，９６７号、同第６，１３２，９９２号、同第６，１０６，８３３号、同第６，０６０，２８５号、同第６，０３７，４５３号、同第６，０１０，９０２号、同第５，９８９，５３０号、同第５，９５９，０８４号、同第５，９５９，０８３号、同第５，９３２，４４８号、同第５，８３３，９８５号、同第５，８２１，３３３号、同第５，８０７，７０６号、同第５，６４３，７５９号、同第５，６０１，８１９号、同第５，５８２，９９６号、同第５，４９６，５４９号、同第４，６７６，９８０号、国際公開第９１／００３６０号、国際公開第９２／００３７３号、欧州特許第０３０８９号、Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：３６５５（１９９１）、Ｓｕｒｅｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １２１：２１０（１９８６）に開示されており、これらはそれぞれ参照により全体が本明細書に組み込まれる。
【００６６】
ＩＬ−２５
当該技術分野においてＩＬ−１７Ｅとしても周知であるＩＬ−２５は、商業的供給源（例えば、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＭＮ，ＵＳＡ））より入手でき、あるいは当該技術分野において入手可能なＩＬ−２５の配列を参照してクローニング又は合成することができる。ヒトＩＬ−２５の配列（配列番号１７）を図３に示す。抗体の産生又はイムノアッセイでの使用には、ＩＬ−２５タンパク質（例えば、組み換えＩＬ−２５タンパク質）の任意の断片又は断片の組み合わせ、特にＮ末端が切頭化されているものを使用できる。例えば、市販の組み換えヒトＩＬ−２５（ＩＬ−１７Ｅ）は成熟タンパク質配列のＴｙｒ  ３３〜Ｇｌｙ  １７７（登録番号Ｑ９Ｈ２９３）を含み、市販のマウスＩＬ−２５はマウスＩＬ−１７Ｅの残基Ｖａｌ  １７〜Ａｌａ  １６９（登録番号ＮＰ＿５４２７６７）を含む。
【００６７】
核酸分子
本明細書に提供されている情報を用いて、少なくとも１つの本発明の標的結合メンバーをコードする本発明の核酸分子は、本明細書に記述される方法又は当該技術分野において既知の方法を用いて入手することができる。
【００６８】
本発明の核酸分子は、ｍＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｔＲＮＡ若しくは任意の他の形態のようなＲＮＡ、又はクローニングにより得られる若しくは合成的に生成されるｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡが挙げられるがこれらに限定されないＤＮＡの形態、又はこれらの任意の組み合わせであってもよい。ＤＮＡは、三本鎖、二本鎖、若しくは一本鎖、又はこれらの任意の組み合わせであってもよい。ＤＮＡ又はＲＮＡの少なくとも１本の鎖の任意の部分は、センス鎖としても知られるコード鎖であってもよく、又はアンチセンス鎖と呼ばれる、非コード鎖であってもよい。
【００６９】
本発明の単離された核酸分子として、本明細書に記載されるように、及び／又は当該技術分野において既知のように、１つ以上のイントロン（例えば、少なくとも１つの重鎖（例えば配列番号１０〜１２）又は軽鎖（例えば配列番号６〜８）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３といった少なくとも１つのＣＤＲの少なくとも１つの特異的部分であってこれらに制限されない）を所望により伴うオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む核酸分子；抗ＩＬ−２５可変領域（例えば、配列番号５又は９）のコード配列を含む核酸分子；及び、上記に説明されているものとは実質に異なるヌクレオチド配列を含むものでありながら、遺伝コードの縮退に起因して、少なくとも１つの抗ＩＬ−２５抗体を依然としてコードする核酸分子を挙げてよい。当然のことながら、遺伝子コードは、当該技術分野においてよく知られている。したがって、当業者には、本発明の特異的な抗ＩＬ−２５抗体をコードする、これらの変性核酸変異体を作製することは、日常的であるだろう。例えば上記のオースベルらを参照されたく、かかる核酸変異体は、本発明に含まれる。
【００７０】
本明細書に記されているように、抗ＩＬ−２５抗体をコードする核酸を含む本発明の核酸分子には、単独で抗体断片のアミノ酸配列をコードするもの；完全長抗体又はその一部分についてのコード配列、１つの抗体、断片又は一部分についてのコード配列並びに付加的配列、例えばスプライシング及びポリアデニル化シグナルを含む、転写、ｍＲＮＡプロセッシングにおいて役割を果たす転写された非翻訳配列（例えば、リボソーム結合及びｍＲＮＡの安定性）といった非コード５’及び３’配列を含むが、これらに限定されない、付加的な非コード配列を伴う、少なくとも１つのイントロンなどの、前述の付加的なコード配列を伴うか否かを問わない、少なくとも１つのシグナルリーダー又は融合ペプチドのコード配列、付加的なアミノ酸（例えば、付加的な機能を提供するものなど）についてコードする付加的なコード配列、が含まれる可能性があるが、これらに限定されない。したがって、抗体をコード化する配列は、抗体断片又は部分を含む融合された抗体の精製を促進するペプチドをコード化する配列等のマーカー配列に融合させることができる。
【００７１】
ポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチド
本発明は、本明細書で開示されるポリヌクレオチドに対して、選択的なハイブリダイゼーション条件下で、ハイブリダイズする単離核酸を提供する。したがって、本実施形態のポリヌクレオチドは、このようなポリヌクレオチドを含む核酸を単離、検出、及び／又は定量するために使用することができる。例えば、本発明のポリヌクレオチドを使用して、蓄積されたライブラリにおける部分又は全長クローンを同定、単離、又は増幅することができる。一部の実施形態においては、ポリヌクレオチドは、単離された、又はそうでなければヒト又は哺乳類核酸ライブラリからのｃＤＮＡに相補的なゲノム配列又はｃＤＮＡ配列である。
【００７２】
好ましくは、ｃＤＮＡライブラリは全長配列の少なくとも８０％、好ましくは全長配列の少なくとも８５％又は９０％、及びより好ましくは全長配列の少なくとも９５％を含む。ｃＤＮＡライブラリは、稀な配列の発現量を増大させるために正規化され得る。ストリンジェンシーが低度又は中程度のハイブリダイゼーション条件が、典型的であり（ただし排他的ではなく）、相補的な配列に比べて低い配列同一性をもつ配列を伴い、利用される。ストリンジェンシーが中程度及び高度の条件は、所望により、より高い同一性をもつ配列について利用することができる。低ストリンジェンシーな条件は、約７０％の配列同一性をもつ配列の選択的ハイブリダイゼーションを可能にし、オルソロガス又はパラロガスな配列を同定するために利用できる。
【００７３】
所望により、本発明のポリヌクレオチドは本明細書に記載されているポリヌクレオチドによってコードされる抗体の少なくとも一つの部分をコードすることになる。本発明のポリヌクレオチドは、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドに対する選択的ハイブリダイゼーションのために利用可能な核酸配列を包含する。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ、上記、Ｃｏｌｌｉｇａｎ、上記を参照されたい。これらはそれぞれ参照により全体が本明細書に組み込まれる。
【００７４】
核酸のコンストラクション
本発明の単離された核酸は、当技術分野にて周知のように、（ａ）組み換え方法、（ｂ）合成技術、（ｃ）精製技術、又はそれらの組み合わせを使用して形成することができる。
【００７５】
核酸は、本発明のポリヌクレオチドに加えて、便利に配列を含むことができる。例えば、１つ以上のエンドヌクレアーゼ制限酵素認識部位を含むマルチクローニングサイトを、核酸に挿入して、ポリヌクレオチドの単離に役立てることができる。また、翻訳可能な配列を挿入して、本発明の翻訳されたポリヌクレオチドの単離に役立てることができる。例えば、ヘキサヒスチジンマーカー配列は、本発明のタンパク質を精製するための便利な手段を提供する。本発明の核酸（コード配列を除く）は、所望により、本発明のポリヌクレオチドのクローニング及び／又は発現のためのベクター、アダプター、又はリンカーである。
【００７６】
追加の配列をかかるクローン化及び／又は発現配列に追加して、クローン化及び／又は発現におけるそれらの機能を最適化して、ポリヌクレオチドの単離を助けることができるか、又は細胞へのポリヌクレオチドの導入を改善することができる。クローン化ベクター、発現ベクター、アダプター、及びリンカーの使用は、当該技術分野においてよく知られている。（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ、上記、又はＳａｍｂｒｏｏｋ、上記を参照されたい）。
【００７７】
核酸を構築するための組み換え方法
例えば、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、又はこれらの任意の組み合せのような本発明の単離核酸組成物は、当業者に既知の任意の数のクローニング手順を用いて生物源から得ることができる。いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下で選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブが、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡライブラリ内の望ましい配列を同定するために使用される。ＲＮＡの単離、並びにｃＤＮＡ及びゲノムライブラリの構築は、当業者にとって周知である。（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ、上記、又はＳａｍｂｒｏｏｋ、上記を参照されたい）。
【００７８】
核酸のスクリーニング及び単離方法
本明細書で開示されているような、本発明のポリヌクレオチドの配列に基づいたプローブを用いて、ｃＤＮＡ又はゲノムライブラリをスクリーニングすることができる。同じ又は異なる生体内の相同遺伝子を単離するため、ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡ配列とハイブリッド形成するためにプローブを使用することができる。当業者であれば、アッセイ中でさまざまな度合のハイブリダイゼーションストリンジェンシーを用いることができ、ハイブリダイゼーション又は洗浄培地のいずれかがストリンジェントであり得るということは明らかだろう。ハイブリダイゼーションのための条件がストリンジェントになるにつれて、二重鎖形成が生じるための、プローブと標的の間に必要な相補性の程度は大きくなる。ストリンジェンシーの程度は、温度、イオン強度、ｐＨ、及びホルムアミドのような部分的な変性溶媒の存在、のうちの、１つ以上によって制御され得る。例えば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、例えば０％〜５０％の範囲内のホルムアミド濃度の操作を通して反応溶液の極性を変えることにより都合良く変更される。検出可能な結合のために必要な相補性（配列同一性）の程度は、ハイブリダイゼーション媒質及び／又は洗浄媒質のストリンジェンシーに応じて変化する。相補性の程度は、最適には１００％、又は７０〜１００％、又はその中の任意の範囲若しくは値である。しかしながら、プローブ及びプライマー内のわずかな配列変動は、ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄培地のストリンジェンシーを低減させることで補償できるということを理解すべきである。
【００７９】
ＲＮＡ又はＤＮＡの増幅方法は、当該技術分野において周知であり、本明細書中で紹介する教示及び指針に基づいて、過度の実験なしに、本発明に従って使用可能である。既知のＤＮＡ又はＲＮＡ増幅方法としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及び関連する増幅プロセス（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号、同第４，８００，１５９号、同第４，９６５，１８８号（Ｍｕｌｌｉｓら）、同４，７９５，６９９号、及び同第４，９２１，７９４号（Ｔａｂｏｒら）、同第５，１４２，０３３号（Ｉｎｎｉｓ）、同第５，１２２，４６４号（Ｗｉｌｓｏｎら）、同第５，０９１，３１０号（Ｉｎｎｉｓ）、同第５，０６６，５８４号（Ｇｙｌｌｅｎｓｔｅｎら）、同第４，８８９，８１８号（Ｇｅｌｆａｎｄら）、米国特許第４，９９４，３７０号（Ｓｉｌｖｅｒら）、同第４，７６６，０６７（Ｂｉｓｗａｓ）、同第４，６５６，１３４号（Ｒｉｎｇｏｌｄ）参照）及び二本鎖ＤＮＡ合成のためのテンプレートとして標的配列に対するアンチセンスＲＮＡを用いるＲＮＡ媒介増幅（米国特許第５，１３０，２３８号（Ｍａｌｅｋら）、商標名ＮＡＳＢＡ）が挙げられるが、これらに限定されず、これらの参考文献の全内容は参照により本明細書に組み込まれる。（例えば、オースベル、上記、又はサムブルック、上記を参照されたい）。
【００８０】
例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を用いて、ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリから直接、本発明のポリヌクレオチド及び関連する遺伝子の配列を増幅することができる。ＰＣＲ及び他のインビトロ増幅方法はまた、例えば、発現すべきタンパク質をコードする核酸配列をクローン化する、サンプル中の所望のｍＲＮＡの存在を検出するため、核酸の配列決定のため、又は他の目的のためのプローブとして用いるための核酸を作製するのに有用である場合がある。インビトロ増幅方法を通して当業者を導くのに十分な技術の例は、Ｂｅｒｇｅｒ（上記）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ（上記）及びＡｕｓｕｂｅｌ（上記）、並びにＭｕｌｌｉｓら、米国特許第４，６８３，２０２号（１９８７）、及びＩｎｎｉｓら、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）に見られる。ゲノムＰＣＲ増幅用の市販キットは当該技術分野において既知である。例えば、アドバンテージ−ＧＣゲノミックＰＣＲキット（Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ＧＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ）（クローンテック（Clontech））を参照のこと。更に、例えば、Ｔ４遺伝子３２タンパク質（ベーリンガー・マンハイム（Boehringer Mannheim））を用いて、長いＰＣＲ産物の収率を改善することができる。
【００８１】
核酸を構築するための合成方法
本発明の単離核酸は、既知の方法による直接化学合成によっても調製可能である（例えば、オースベルら、上記を参照）。化学合成は、一般に、相補的配列とのハイブリダイゼーション、又は単鎖をテンプレートとして使用するＤＮＡポリメラーゼでの重合によって、二本鎖ＤＮＡに変換可能な単鎖オリゴヌクレオチドを産生する。当業者であれば、ＤＮＡの化学合成が約１００以上の塩基の配列に限定され得る一方で、より長い配列は、より短い配列の連結によって得ることができることを認識するであろう。
【００８２】
組み換え発現カセット
本発明は、本発明の核酸を含む組み換え発現カセットを更に提供する。本発明の核酸配列、例えば本発明の抗体をコードするｃＤＮＡ又はゲノム配列を用いて、少なくとも１種の所望の宿主細胞に導入できる組み換え発現カセットを構築することができる。組み換え発現カセットは、典型的には、意図される宿主細胞においてポリヌクレオチドの転写を導く、転写開始調節配列に機能的に連結される、本発明のポリヌクレオチドを含む。相同性及び非相同性（すなわち、外因性）プロモーターの両方を採用して、本発明の核酸の発現を指向することができる。
【００８３】
いくつかの実施形態では、プロモーター、エンハンサー、又は他の構成要素として機能する単離核酸を、本発明のポリヌクレオチドの発現を上方又は下方調節するために、本発明のポリヌクレオチドの非異種形の適切な位置（上流、下流、又はイントロン内）に導入することができる。例えば、内因性プロモーターを、突然変異、欠失、及び／又は置換により、インビボ又はインビトロで改変することができる。
【００８４】
ベクター及び宿主細胞
本発明は、本発明の単離核酸分子を含むベクター、組み換えベクターで遺伝子組み換えされている宿主細胞、及び当該技術分野において周知であるような組み換え技術による少なくとも１つの抗ＩＬ−２５抗体の産生にも関連する。例えばＳａｍｂｒｏｏｋら上掲書、Ａｕｓｕｂｅｌら上掲書を参照されたい。これらはそれぞれ参照により全体が本明細書に組み込まれる。
【００８５】
ポリヌクレオチドは、所望により、宿主の増殖についての選択マーカーを含有するベクターに連結することができる。一般に、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈殿物のような沈殿物内、又は荷電脂質との複合体内に導入される。ベクターがウイルスである場合は、適切なパッケージング細胞株を用いてインビトロでこれをパッケージングし、その後、宿主細胞内に形質導入することができる。
【００８６】
ＤＮＡ挿入物は、適切なプロモーターに機能的に連結されるべきである。発現コンストラクトは更に、転写開始、終結のための部位、及び転写された領域に、翻訳のためのリボソーム結合部位を含む。コンストラクトにより発現する成熟した転写産物のコード部分は、好ましくは、翻訳されるべきｍＲＮＡの最後に適切に位置する開始及び終止コドン（例えば、ＵＡＡ、ＵＧＡ、又はＵＡＧ）で始まる翻訳を含み、哺乳類又は真核生物細胞の発現ではＵＡＡ及びＵＡＧが好ましい。
【００８７】
発現ベクターは、好ましくは少なくとも１つの選択可能なマーカーを含むが、これは任意である。このようなマーカーとしては、例えば、メトトレキサート（ＭＴＸ）、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ、米国特許第４，３９９，２１６号、同第４，６３４，６６５号、同第４，６５６，１３４号、同第４，９５６，２８８号、同第５，１４９，６３６号、同第５，１７９，０１７号）、アンピシリン、ネオマイシン（Ｇ４１８）、ミコフェノール酸、又は真核細胞培養に耐性のあるグルタミン合成酵素（ＧＳ、米国特許第５，１２２，４６４号、同第５，７７０，３５９号、同第５，８２７，７３９号）、並びに、大腸菌及び他の細菌又は原核生物において培養するためのテトラサイクリン又はアンピシリン耐性遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない（上記の特許は、参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる）。上記の宿主細胞に対して適切な培養培地及び条件は、当該技術分野において知られている。適切なベクターは、当事者にとって容易に明白となる。ベクターコンストラクトの宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染、又は他の既知の方法により影響を受ける場合がある。このような方法については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ（上記）、第１  ４、１６  １８章、Ａｕｓｕｂｅｌ（上記）、第１、９、１３、１５、１６章等のように、当該技術分野において記述されている。
【００８８】
本発明の少なくとも１つの抗体は、融合タンパク質等の修飾された形態で発現され得、分泌シグナルだけでなく、追加の相同性機能領域も含み得る。例えば、追加アミノ酸の領域、特に荷電アミノ酸を抗体のＮ末端に追加して、精製中又は後次の処理及び保存中に、宿主細胞における安定性及び持続性を改善することができる。また、ペプチド部分を本発明の抗体に追加して、精製を促進することもできる。抗体又は少なくとも１つのその断片の最終調製前に、かかる領域を除去することができる。このような方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ（上記）、１７．２９  １７．４２及び１８．１  １８．７４章、Ａｕｓｕｂｅｌ（上記）、１６、１７及び１８章のような、多くの標準的な実験室マニュアルに記載されている。
【００８９】
当業者であれば、本発明のタンパク質をコードする核酸の発現に利用可能な多数の発現系について精通している。
【００９０】
別の方法としては、本発明の核酸は、本発明の抗体をコードする内因性ＤＮＡを含む宿主細胞内で、（操作により）オン切換えすることにより、宿主細胞中で発現させることができる。このような方法は、例えば、米国特許第５，５８０，７３４号、同第５，６４１，６７０号、同第５，７３３，７４６号、及び同第５，７３３，７６１号に記載されているように、当該技術分野において周知であり、これらは参照により全体が本明細書に組み込まれる。
【００９１】
抗体、その特定された部分又は変異体の産生にとって有用な細胞培養の一例としては哺乳動物細胞がある。哺乳類細胞系は、しばしば単層の細胞の形態をとるが、哺乳類細胞の懸濁液又はバイオリアクターも使用可能である。無傷なグリコシル化タンパク質を発現可能な多数の適切な宿主細胞株が当該技術分野において開発されており、これにはＣＯＳ−１（例えば、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５０）、ＣＯＳ−７（例えば，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５１）、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ２１（例えば、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１０）、ＣＨＯ（例えば、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６１０）及びＢＳＣ−１（例えば、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２６）細胞株、Ｃｏｓ−７細胞、ＣＨＯ細胞、ｈｅｐ  Ｇ２細胞、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、その他同様物を含み、これらは例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．）（ｗｏｒｌｄ  ｗｉｄｅ  ｗｅｂ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ）から容易に入手できる。好適な宿主細胞には、骨髄腫及びリンパ腫細胞等のリンパ系起源の細胞を含む。特に好ましい宿主細胞はＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞（ＡＴＣＣ登録番号ＣＲＬ−１５８０）及びＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ登録番号ＣＲＬ−１８５１）である。特に好ましい実施形態では、組み換え細胞は、Ｐ３Ｘ６３Ａｂ８．６５３又はＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞である。
【００９２】
これらの細胞の発現ベクターは、以下の発現制御配列の１つ以上を含み、複製起点、プロモーター（例えば、後期又は早期ＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター（米国特許第５，１６８，０６２号、同第５，３８５，８３９号）、ＨＳＶ  ｔｋプロモーター、ｐｇｋ（ホスホグリセリン酸キナーゼ）プロモーター、ＥＦ−１  αプロモーター（米国特許第５，２６６，４９１号）、少なくとも１つのヒト免疫グロブリンプロモーター、エンハンサー、及び／又はリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位（例えば、ＳＶ４０大型Ｔ  ＡｇポリＡ追加部位）、及び転写終了配列等の、プロセシング情報部位を含むが、それらに限定されない。例えば、オースベルら、上記、サムブルックら、上記を参照のこと。本発明の核酸又はタンパク質の生成に有用な他の細胞は既知であり、及び／又は、例えば、アメリカ培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）の細胞株及びハイブリドーマのカタログ（ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ）若しくは他の既知の若しくは商業的供給源から入手可能である。
【００９３】
真核宿主細胞が利用される場合は、通常、ベクター内にポリアデニル化又は転写ターミネーター配列が組み込まれる。ターミネーター配列の一例は、ウシ成長ホルモン遺伝子からのポリアデニル化配列である。転写の正確なスプライシングのための配列も、同様に含めることができる。スプライシング配列の一例としては、ＳＶ４０由来のＶＰ１イントロンがある（Ｓｐｒａｇｕｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４５：７７３〜７８１（１９８３））。加えて、宿主細胞内の複製を制御するための遺伝子配列を、当該技術分野において既知のとおりに、ベクター内に組み込むことができる。
【００９４】
組成物
本発明はまた、非天然組成物、混合物、又は形態で提供される、本明細書に記載されるような、及び／又は当該技術分野において既知であるような、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、又はそれ以上の標的結合メンバーを含む、少なくとも１つの標的結合メンバー組成物を提供する。このような組成物の百分率は、当該技術分野において既知であるように、又は本明細書に記載されるように、重量、体積、濃度、容量モル濃度、又は液体若しくは乾燥溶液、混合物、懸濁液、エマルション、又はコロイドとしての容量モル濃度によるものである。
【００９５】
本発明の組成物は更に、調節、処置、又は治療が必要な細胞、組織。器官、動物又は患者に対する少なくとも１つの抗ＩＬ−２５標的結合メンバーを含み、所望により、少なくとも１つのＴＮＦ拮抗物質（例えば、ＴＮＦ抗体又は断片、可溶性ＴＮＦ受容体又は断片、それらの融合タンパク質、又は小分子ＴＮＦ拮抗物質などであるが、これらに限定されない）、抗リウマチ薬（例えば、メトトレキセート、オーラノフィン、アウロチオグルコース、アザチオプリン、エタネルセプト、金チオリンゴ酸ナトリウム、硫酸ヒドロキシクロロキン、レフルノミド、スルファサルジン）、筋弛緩剤、麻薬、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、鎮痛剤、麻酔剤、鎮静剤、局所麻酔剤、神経筋遮断薬、抗菌剤（例えば、アミノグリコシド、抗真菌剤、駆虫薬、抗ウイルス剤、カルバペネム、セファロスポリン、フルオロキノロン、マクロライド、ペニシリン、スルホンアミド、テトラサイクリン、その他の抗菌剤）、抗乾癬剤、コルチコステロイド、アナボリックステロイド、糖尿病関連薬、ミネラル、栄養薬、甲状腺薬、ビタミン、カルシウム関連ホルモン、止瀉剤、鎮咳剤、制吐剤、抗潰瘍剤、緩下剤、抗凝血剤、エリスロポエチン（例えば、エポエチンアルファ）、フィルグラスチム（例えばＧ−ＣＳＦ、Ｎｅｕｐｏｇｅｎ）、サルグラモスチム（ＧＭ−ＣＳＦ、Ｌｅｕｋｉｎｅ）、免疫化薬、免疫グロブリン、免疫抑制薬（例えば、バシリキシマブ、シクロスポリン、ダクリズマブ）、成長ホルモン、ホルモン補充薬、エストロゲン受容体調節薬、散瞳薬、毛様筋調節薬、アルキル化剤、抗代謝剤、有糸分裂阻害剤、放射性医薬品、抗うつ薬、抗躁病薬、抗精神病薬、抗不安薬、催眠薬、交感神経作動薬、刺激薬、ドネペジル、タクリン、ぜんそく薬、ベータ作動薬、吸入ステロイド、ロイコトリエン阻害薬、メチルキサンチン、クロモリン、エピネフリン又は類似薬、ドルナーゼアルファ（Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅ）、サイトカイン又はサイトカイン拮抗物質から選択される、少なくとも１つを更に含む、好適かつ有効量の組成物又は医薬組成物のうち任意の少なくとも１つを含むことができる。このようなサイトカインの、非限定的な例としては、ＩＬ−１〜ＩＬ−２３のいずれかが含まれ、これらに限定されない。適切な投与量は、当該技術分野において周知である。例えば、Ｗｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ａｎｄ  Ｌａｎｇｅ，Ｓｔａｍｆｏｒｄ，Ｃｏｎｎ．（２０００）；ＰＤＲ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ，Ｔａｒａｓｃｏｎ  Ｐｏｃｋｅｔ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ  ２０００，Ｄｅｌｕｘｅ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｔａｒａｓｃｏｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｌｏｍａ  Ｌｉｎｄａ，Ｃａｌｉｆ．（２０００）を参照されたい。これらはそれぞれ、参照により全体が本明細書に組み込まれる。
【００９６】
このような抗癌剤又は抗感染薬はまた、本発明の少なくとも１つの抗体に関連、結合、同時処方、又は同時投与される毒素分子も含むことができる。毒素は任意に作用して、病原性細胞又は組織を選択的に死滅させることができる。病原細胞は、癌細胞又は他の細胞であり得る。かかる毒素は、限定されないが、例えば、リシン、ジフテリア毒、ヘビ毒、又は細菌毒の少なくとも１つから選択される、毒素の少なくとも１つの機能的細胞毒性ドメインを含む、精製又は組み換え毒素又は毒素断片であり得る。毒素という用語は、ヒト及び他の哺乳類において、死に至り得る毒素性ショックを含む、任意の病原状態をもたらし得る任意の自然発生する突然変異若しくは組み換え細菌又はウイルスによって産生される内毒素及び外毒素のいずれも含む。かかる毒素には、腸毒素産生の大腸菌熱に不安定なエンテロトキシン（ＬＴ）、熱安定エンテロトキシン（ＳＴ）、赤痢菌細胞毒素、アエロモナス属エンテロトキシン、中毒性ショック症候群毒素−１（ＴＳＳＴ−１）、ブドウ球菌エンテロトキシンＡ（ＳＥＡ）、Ｂ（ＳＥＢ）、又はＣ（ＳＥＣ）、連鎖球菌エンテロトキシン等を含み得るが、それらに限定されない。かかる細菌として、エンテロトキシン大腸菌（ＥＴＥＣ）種、腸管出血性大腸菌（例えば、セロタイプ０１５７：Ｈ７の株）、ブドウ球菌種（例えば、黄色ブドウ球菌、化膿レンサ球菌）、赤痢菌種（例えば、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｂｏｙｄｉｉ、及びＳｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉ）、サルモネラ種（例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｃｈｏｌｅｒａ−ｓｕｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）、クロストリジウム種（例えばＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｉｃｉｌｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、カンピロバクター種（例えば、Ｃａｍｐｈｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ、Ｃａｍｐｈｌｏｂａｃｔｅｒ  ｆｅｔｕｓ）、ヘリコバクター種（例えば、Ｈｅｌｉｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｎ）、アエロモナス種（例えば、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓｏｂｒｉａ、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｃａｖｉａｅ）、Ｐｌｅｉｓｏｍｏｎａｓ  ｓｈｉｇｅｌｌｏｉｄｅｓ、エルシニア腸コリティカ、ビブリオ種（例えば、コレラ菌、腸炎ビブリオ）、クレブシエラ種、緑膿菌、及び連鎖球菌の株が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Ｓｔｅｉｎ，ｅｄ．，ＩＮＴＥＲＮＡＬ  ＭＥＤＩＣＩＮＥ，３ｒｄ  ｅｄ．，ｐｐ  １  １３，Ｌｉｔｔｌｅ，Ｂｒｏｗｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｂｏｓｔｏｎ，（１９９０）；Ｅｖａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎｓ：Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌ，２ｄ．Ｅｄ．，ｐｐ  ２３９  ２５４，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｂｏｏｋ  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９１）；Ｍａｎｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，３ｄ．Ｅｄ．，Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  Ｌｉｖｉｎ��ｓｔｏｎｅ，Ｎ．Ｙ．（１９９０）；Ｂｅｒｋｏｗ  ｅｔ  ａｌ，ｅｄｓ．，Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ，１６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍｅｒｃｋ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｒａｈｗａｙ，Ｎ．Ｊ．，１９９２；Ｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，７６：１２１  １３４（１９９１）；Ｍａｒｒａｃｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４８：７０５  ７１１（１９９０）を参照されたい。参照により、これら参考文献の内容は全て本明細書に組み込まれる。
【００９７】
本発明の組成物は更に、任意の適切な助剤のうち少なくとも１つ、例えば、希釈剤、結合剤、安定剤、緩衝剤、塩、親油性溶媒、保存料、アジュバント等を含むことができるが、これらに限定されない。医薬的に許容できる助剤が好ましい。このような無菌溶液の、非制限例及びその調製方法は、Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．）１９９０などのように（ただし、これらに限定されない）、当該技術分野において周知である。当該技術分野において周知のように、又は本明細書に記載されるように、抗ＩＬ−２５標的結合メンバー、断片又は変異体組成物の投与方法、溶解性及び／又は安定性に好適な医薬的に許容できる担体を、慣行的に選択することができる。
【００９８】
本発明の組成物で有用な医薬賦形剤及び添加剤には、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、及び炭水化物（例えば、糖であって、単糖類、二糖類、三糖類、四糖類及びオリゴ糖、アルジトール、アルドン酸、エステル化糖等の誘導化糖類、並びに多糖類又は糖ポリマーが挙げられる）が包含されるが、これらに限定されず、これらは、単独で又は組み合わせて存在することができ、単独で又は１〜９９．９９重量％又は体積％での組み合わせを含んでいる。典型的なタンパク質賦形剤には、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）等の血清アルブミン、組み換えヒトアルブミン（ｒＨＡ）、ゼラチン、カゼイン等を含む。緩衝能においても機能し得る代表的なアミノ酸／抗体構成要素には、アラニン、グリシン、アルギニン、ベタイン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、システイン、リシン、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、フェニルアラニン、アスパルテーム等を含む。好ましいアミノ酸の１つはグリシンである。
【００９９】
本発明における使用に適した糖質賦形剤は、例えば、フルクトース、マルトース、ガラクトース、グルコース、Ｄ−マンノース、ソルボース等の単糖、ラクトース、スクロース、トレハロース、セロビオース等の二糖、ラフィノース、メレジトース、マルトデキストリン、デキストラン、スターチ等の多糖、及びマンニトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、キシリトールソルビトール（グルシトール）、ミオイノシトール等のアルジトールを含む。本発明で使用するのに好ましい炭水化物賦形剤は、マンニトール、トレハロース、及びラフィノースである。
【０１００】
組成物はまた、緩衝剤又はｐＨ調整剤を含むこともでき、典型的には緩衝剤は有機酸又は塩基から調製された塩である。代表的な緩衝剤には、クエン酸、アスコルビン酸、グルコン酸、炭酸、酒石酸、コハク酸、酢酸、又はフタル酸の塩などの有機酸塩；トリス、塩酸トロメタミン、又はリン酸緩衝剤が挙げられる。本組成物における使用に適した緩衝剤は、クエン酸などの有機酸塩である。
【０１０１】
加えて、本発明の組成物は、ポリビニルピロリドン、フィコール（ポリマー糖）、デキストレート（例えば、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン等のシクロデキストリン）、ポリエチレングリコール、着香剤、抗菌剤、甘味料、抗酸化剤、帯電防止剤、界面活性剤（例えば、「ＴＷＥＥＮ  ２０」及び「ＴＷＥＥＮ  ８０」等のポリソルベート）、脂質（例えば、リン脂質、脂肪酸）、ステロイド（例えば、コレステロール）、及びキレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）等のポリマー賦形剤／添加剤を含むことができる。
【０１０２】
本発明による組成物における使用に好適なこれら及び追加の既知の医薬賦形剤及び／又は添加剤は、当該技術分野において既知であり、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＆  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ」１９ｔｈ  ｅｄ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｌｉａｍｓ，（１９９５）及び「Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ」５２ｎｄ  ｅｄ．，Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ，Ｍｏｎｔｖａｌｅ，Ｎ．Ｊ．（１９９８）に記載されており、これらの開示は参照によって全体が本明細書に組み込まれる。好適な担体又は賦形剤材料は、糖質（例えば、単糖類及びアルジトール）及び緩衝剤（例えば、クエン酸）又はポリマー剤である。
【０１０３】
治療適用
一態様において、本発明は、治療を必要とする被験体（例えば、ヒト）の気道過敏症を予防又は低減する方法を提供し、この方法はＩＬ−２５に結合する標的結合メンバー、特に抗体分子を被験体に投与する工程を含む。別の態様において、本発明は、治療を必要とする被験体のぜんそくを予防、低減、又は治療する方法を提供し、この方法はＩＬ−２５に結合する標的結合メンバー、特に抗体分子を被験体に投与する工程を含む。ぜんそくにはアレルギー性ぜんそくが含まれる。
【０１０４】
上記の方法は、ＩＬ−２５が役割を果たすさまざまな疾病及び疾患において治療可能性を有する、ＩＬ  ２５への結合及び好ましくはその作用の拮抗に有用な本発明による標的結合メンバー（その組成物を含む）を用いて実行することができる。ぜんそくに加え、このような疾病として、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、例えば、クローン病、及び潰瘍性大腸炎などの炎症が関与するその他病状が挙げられる。また、本方法は、付随する実施例中に記載のように得られるＩＬ−２５に結合するその他の標的結合メンバー（その組成物を含む）を用いて実行することもできる。
【０１０５】
本発明による標的結合メンバー（その組成物を含む）を、ヒト又は動物被験体における治療（予防的治療を含む）又は診断方法に使用することができる。このような治療又は診断方法（予防的治療を含んでもよい）は、かかる被験体に有効量の本発明の標的結合メンバーを投与する工程を含んでもよい。代表的な疾病及び疾患について、更に以下で説明する。
【０１０６】
ヒト又は動物被験体に投与するための薬剤の製造における、本発明の標的結合メンバー（その組成物を含む）の使用が更に提供される。
【０１０７】
抗ＩＬ−２５標的結合メンバーを用いて治療効果をもたらし得る臨床的適応として、ＩＬ−２５が病理的影響を有する任意の病状が含まれる。したがって、一般には、本発明の標的結合メンバーは、不必要なＴｈ２応答又は２型応答に関与する任意の病状の治療に用いることができる。例えば、本発明の標的結合メンバーは、アレルギー及びぜんそく、特にぜんそくの治療に用いることができる。
【０１０８】
抗ＩＬ−２５処置を、注射（例えば、静脈内）により、又は局所送達法により投与してもよい。抗ＩＬ−２５は遺伝子媒介技術により送達できる。別の配合方法により、経口又は坐剤経路に適した製剤を提供できる。投与経路は、疾患への特別な配慮をした上で、効果を最適化するように、又は副作用を極力抑えるように、処置の物理化学的性質により決定され得る。
【０１０９】
本発明に従って、提供された組成物を個体に投与できる。投与は、好ましくは「治療的有効量」での投与であり、この量は患者への利益を示すのに十分な量である。そのような利益は、少なくとも１つの症状の少なくとも改善であってもよい。実際の投与量、並びに投与速度及び時間経過は、治療対象の性質及び重篤度によって決まる。治療の処方（例えば、投与量などの決定）は、一般医及び他の医師の責任の範囲内である。抗体の適切な用量は当該技術分野において周知である。Ｌｅｄｅｒｍａｎｎ  Ｊ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４７：６５９〜６６４；Ｂａｇｓｈａｗｅ  Ｋ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  ４：９１５〜９２２を参照されたい。
【０１１０】
正確な投与量は、多くの要因、例えば抗体が診断のためのものであるのか、それとも治療のためのものであるのか、治療される領域の大きさ及び場所、抗体の厳密な性質（例えば、全長抗体、断片又は二重特異性抗体）、並びに抗体に結合させた任意の検出可能な標識又は他の分子の性質によって決まる。典型的な抗体の投与量は、０．５ｍｇ〜１．０ｇの範囲内にあり、これは、適宜ボーラスとして、又は数時間にわたる注入として、必要用量を達成するように静脈内に投与され得る。その他投与方法として、同等の総累積投与量を達成するような、数時間にわたる静脈内注入が挙げられる。これは成人患者の単回治療における投与量であり、小児及び乳児に対しては比例的に調節でき、また他の抗体形式に対しても分子量に比例して調節できる。治療は医師の裁量により、毎日、週２回、週１回又は月１回の間隔で繰り返すことができる。
【０１１１】
更なる投与方法は、留置デバイスへのプレコーティング、ないしは別の方法による取り込みを利用するものであり、そのための抗体の最適量は、適切な実験により決定される。
【０１１２】
本発明のいくつかの好ましい実施形態における抗体分子は、Ｆ（ａｂ）又はｓｃＦｖなどのモノマー断片である。かかる抗体断片は、比較的半減期が短いという利点を有し、受容体のクラスター化により引き起こされ得る血小板活性化のリスクを低下させることができる。血小板活性化を生じさせるクラスター化は、例えば、ＩＬ−２５分子、又はＩＬ−２５とＦｃγＲＩＩ分子のいずれかのものであり得る。
【０１１３】
全長抗体が使用される場合、好ましくは血小板を活性化及び／又は破壊できない形態である。ＩｇＧ４アイソタイプあるいはＩｇＧ１主鎖由来の「デザイナー」アイソタイプ（新規Ｆｃ遺伝子構築物、国際公開第９９／５８５７２号、Ｃｌａｒｋ、Ａｒｍｏｕｒ、Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ）が好ましい選択肢である。Ｆ（ａｂ’）２などの更に小さい抗体断片を使用してもよい。更に、二重エピトープ特異性（例えば、ｓｃＦｖ  ２Ｃ３により認識されるエピトープに対して）を有する全長抗体又は断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）２又は二重特異性抗体）を使用してよい。そのような実施形態は受容体クラスター化を促進し得るが、個々の受容体への高い会合速度がこの問題を排除できる。
【０１１４】
本発明の標的結合メンバーは、通常、標的結合メンバーに加えて少なくとも１つの構成成分を含むことができる医薬組成物の形態で投与される。
【０１１５】
本発明の標的結合メンバーは、単独で又は他の処置と組み合わせて、治療される病状により同時に又は順次投与できる。他の処置としては、適切な投与量である、非ステロイド性抗炎症薬（例えば、アスピリン、パラセタモール、イブプロフェン、又はケトプロフェン）若しくはアヘン剤（例えば、モルヒネ）などの鎮痛薬の投与、制吐剤の投与、又はぜんそくに対して活性を持つ少なくとも１つのその他化合物、一般的には、気道弛緩を引き起こすか粘液クリアランスを向上させる気管支拡張薬、例えばβ−アゴニスト（例えば、サルブタモール、サルメテロール）、クロモグリク酸二ナトリウム、ステロイド、若しくはＰＤＥＩＶ阻害剤の投与を挙げてもよい。
【０１１６】
アッセイ方法
本発明は、本明細書において提供される標的結合メンバーのＩＬ−２５への結合を生じさせる、又は可能にする工程を含む方法を提供する。先に述べたように、そうした結合は、インビボで、例えば、標的結合メンバー又は標的結合メンバーをコードする核酸の投与の後に起こる場合があり、あるいはインビトロで、例えば、ＥＬＩＳＡ、Ｂｉａｃｏｒｅアッセイ、Ｏｃｔｅｔアッセイ、ウェスタンブロット法、免疫細胞化学法、免疫沈降法、又は親和性クロマトグラフィーで起こる場合がある。
【０１１７】
ＩＬ−２５への標的結合メンバーの結合量を決定できる。定量化は、診断対象であり得る試験サンプル中の抗原の量と関連付けることができる。
【０１１８】
サンプルにおける抗体の反応性は、任意の適切な手段により決定できる。ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）は１つの実行可能な手段である。放射性標識抗原を非標識抗原（試験サンプル）と混合し、抗体に結合させる。結合抗原を非結合抗原から物理的に分離し、抗体と結合した放射性抗原の量を決定する。試験サンプル中に存在する抗原が多いほど、より少ない放射性抗原が抗体に結合することになる。レポーター分子に連結された抗原又は類縁体を用いる、非放射性抗原との競合結合アッセイも利用できる。レポーター分子は、スペクトル上区別される吸収又は発光特性を有する蛍光色素、蛍光体又はレーザー色素であってもよい。好適な蛍光色素としては、フルオレセイン、ローダミン、フィコエリトリン及びＴｅｘａｓ  Ｒｅｄが挙げられる。好適な発色性色素としては、ジアミノベンジジンが挙げられる。
【０１１９】
その他のレポーターとしては、着色、磁性又は常磁性のラテックスビーズなどの高分子コロイド粒子又は微粒子材料、及び、直接的又は間接的に、検出可能シグナルを視覚的に観察させる、電子的に検出させる、ないしは別の方法で記録させる、生物学的又は化学的に活性な薬剤が挙げられる。これらの分子は、例えば、発色若しくは変色する、又は電気的性質に変化をもたらす、反応を触媒する酵素であってもよい。これらは、エネルギー状態間の電子遷移が特徴的なスペクトル吸収又は発光をもたらすように分子的に励起可能であり得る。これらは、バイオセンサーと共に使用される化学物質を含んでもよい。ビオチン／アビジン又はビオチン／ストレプトアビジンとアルカリホスファターゼとの検出系を使用してもよい。
【０１２０】
個々の抗体−レポーター複合体により生成されるシグナルを用いて、サンプル（正常及び試験）中の関連する抗体結合の定量化可能な絶対又は相対データを得ることができる。
【０１２１】
また、本発明は、競合アッセイにおいて抗原レベルを測定するための上記のような標的結合メンバーの使用、すなわち、本発明により提供されるような標的結合メンバーを競合アッセイにおいて使用することによりサンプル中の抗原レベルを測定する方法も提供する。これは、非結合抗原からの結合抗原の物理的分離が必要とされない場合にあり得る。結合の際に物理的又は光学的変化が起こるようにレポーター分子を標的結合メンバーに連結することは、１つの実行可能な手段である。レポーター分子は、検出可能な、好ましくは測定可能なシグナルを、直接的又は間接的に生成できる。レポーター分子の連結は、直接的又は間接的、共有結合的、例えば、ペプチド結合又は非共有結合的であってもよい。ペプチド結合による連結は、抗体及びレポーター分子をコードする遺伝子融合の組み換え発現の結果であってもよい。
【０１２２】
また、本発明は、本発明による標的結合メンバーを、例えば、バイオセンサー系において使用することによる、抗原レベルの直接的測定を提供する。
【０１２３】
当業者は、好み及び一般的知識に従って好適な結合様式を選択できる。
【実施例】
【０１２４】
本発明の例示的実施形態の説明を続ける。
【０１２５】
実施例１：Ｍ６（高親和性ヒト化ＩＬ−２５抗体）の生成
ＩＬ−２５への結合親和性が改善された変異体の生成には、マウス２Ｃ３モノクローナル抗ＩＬ２５抗体のヒト化（ＣＤＲグラフト化）版であるｈｕＤＤＧ９１を親分子として選択した。リーダー配列を除くｈｕＤＤＧ９１のκ軽鎖配列を図１（配列番号２）に示しており、ここではＫａｂａｔにより定義されるＣＤＲループのアミノ酸配列に下線を引いている。ｈｕＤＤＧ９１重鎖の配列（配列番号４）を図２に示しており、ここではＫａｂａｔにより定義されるＣＤＲのアミノ酸配列に下線を引いている。ｈｕＤＤＧ９１はＲＨ２．５＿Ｒ７１Ｖとしても知られている。マウス２Ｃ３モノクローナル抗ＩＬ２５抗体の生成及び特徴付けは、国際出願ＰＣＴ／ＧＢ２００８／００１３６５号（国際公開第２００８／１２９２６３号として２００８年１０月３０日に公開されており、この内容はその全てを参照として本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０１２６】
ｈｕＤＤＧ９１の変異体を生成するために、標準的な手順を用いてｈｕＤＤＧ９１配列を基にファージディスプレイライブラリを構築した。Ｆａｂライブラリをビオチン化ＩＬ−２５に対してパニングした。ＥＬＩＳＡにより、ｈｕＤＤＧ９１（ＩｇＧ４）と同等又はより高い結合を示すＦａｂを選択した。
【０１２７】
以下のようにＦａｂをｍＡｂに転換した。５種類の軽鎖及び５種類の重鎖（ｈｕＤＤＧ９１の軽鎖及び重鎖を含む）のコンビナトリアルライブラリを設計した。このライブラリで用いた軽鎖及び重鎖は、軽鎖ＣＤＲ１及びＣＤＲ３アミノ酸配列、並びに重鎖ＣＤＲ  ３配列において互いに異なる。これらの軽鎖及び重鎖を用いて、合計２５種類のｍＡｂ（ＩｇＧ１）を構築し、ＨＥＫ２９３細胞内でスモールスケールで発現させ、精製した。ＩＬ−２５結合親和性、細胞阻害、及び受容体阻害について、以下のように各ｍＡｂを試験した。
・ＩＬ−２５結合親和性は、標準的なＩＬ−２５  ＥＬＩＳＡ及びＢｉａｃｏｒｅ結合アッセイを用いて決定した。ヒトＩＬ−２５に対して５０ｐＭ未満のＫD、かつヒトＩＬ−１７Ａ、Ｃ、Ｄ、及びＦに対して１００ｎＭ超のＫDを有する候補体を選択した。
・細胞阻害は、標準的なＴＫ−１０ヒト腎がん細胞系アッセイ（ＩＬ−２５応答性、ＩＬ−２５及びＩＬ−８の読み取り、可溶性ＩＬ−２５Ｒと親ｍＡｂとの間の差を識別可能）及びＣＤ４＋Ｔ細胞系アッセイを用いて評価した。ＴＫ−１０アッセイでは、ｈｕＤＤＧ９１親抗体より低いＩＣ５０、及び１０ｎＭのｍＡｂ濃度においてＩＬ−２５放出の＞９０％阻害を示すｍＡｂを選択した。ＣＤ４＋Ｔ細胞アッセイでは、親ｈｕＤＤＧ９１が示すより高い又は同程度のＩＬ−５産生阻害を引き起こすｍＡｂを選択した。
・受容体阻害は、ビーズベースの電気化学発光イムノアッセイ（ＥＣＬＩＡ）の変法を用いて評価した。１０ｎＭのｍＡｂ濃度においてｈｕＤＤＧ９１親抗体と比較して、受容体に対するＩＬ−２５結合のＩＣ５０を３倍超減少させる候補体を選択した。
【０１２８】
この基準に基づき、９種類の候補ｍＡｂを選択した（図３）。全ての候補体は、許容可能な発現レベルを示し、ＨＥＫ２９３内で発現させ、標準的な手順で精製すると望ましいＳＥ−ＨＰＬＣ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ特性を呈した。続いて、これら９種類の候補体を、１０Ｌスケールでチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞内で一時的に発現させ、Ｍａｂ  Ｓｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて精製し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で緩衝液交換して濃縮した。９種の候補ｍＡｂのそれぞれのＩＬ−２５結合親和性は、ｈｕＤＤＧ９１と比較して顕著に向上した。更に、発現レベル、同一性（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、溶解性、凝集（ＳＥ−ＨＰＬＣ）、翻訳後修飾、タンパク質−タンパク質相互作用、及び酸化について、常用の手技及びアッセイを用いて各ｍＡｂを試験した。ＣＨＯ中で発現させ、精製し、標準的条件下で処理すると、候補体ｍＡｂのうちいくつかは、濃縮中の沈殿、低収率、並びに／又は好ましくないＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＳＥ−ＨＰＬＣ特性を呈した。
【０１２９】
発現レベルが優れる、溶解性が高い、精製時に顕著なタンパク質凝集がない、並びに精製時に望まれない翻訳後修飾、タンパク質−タンパク質相互作用、及び酸化がみられないことから、Ｍ６と名付けた１つのｍＡｂを更なる実験に選択した。
【０１３０】
実施例２：Ｍ６抗体の特徴
材料及び方法
ＬＳ  １７４Ｔヒト結腸上皮細胞アッセイ
ヒト結腸上皮細胞株ＬＳ  １７４Ｔ（ＣＬ−１８８）をＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手し、１０％  ＦＢＳ、ペニシリン、及びストレプトマイシンを追加したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））中、３７℃、５％  ＣＯ2下で維持した。細胞を、９６ウェルの組織培養プレートに、密度１×１０５細胞／ｍＬ、総容量１００μＬで播種し、一晩付着させた。ＩＬ−２５抗体（Ｍ６及びＭ９）を、一定量のＩＬ−２５タンパク質（最終濃度１０ｎｇ／ｍＬ）の組み換えヒトＩＬ−２５タンパク質（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ）と予め複合体化し、３倍希釈又は３．３倍（ハーフログ）希釈系列で容量設定したさまざまな量の抗ＩＬ−２５抗体と混合し、３７℃で１時間インキュベートした。細胞培養培地をゆっくりと吸引してＩＬ−２５タンパク質／ＩＬ−２５抗体複合体で置き換え、その後細胞を一晩（１８〜２２時間）インキュベートした。続いて、培養プレートを１２００ｒｐｍで２分間遠心分離して細胞残渣の持ち越しを排除し、次に上清を回収し、ＥＬＩＳＡ法（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ））を用いてＧＲＯａについてアッセイした。
【０１３１】
結果
Ｍ６の配列分析により、ｈｕＤＤＧ９１配列に対して合計３ヶ所のアミノ酸置換が明らかとなり、その全てが軽鎖のＣＤＲ３に存在していた（図３を参照）。Ｍ６の軽鎖（配列番号５）及び重鎖（配列番号９）、並びにそれらのＣＤＲのアミノ酸配列を図４に示す。
【０１３２】
Ｂｉａｃｏｒｅ法により、Ｍ６が、ｈｕＤＤＧ９１のヒトＩＬ２５に対する親和性よりも３〜５倍高いヒトＩＬ−２５に対する結合親和性を有することが確認された（図３）。更に、Ｍ６はＩＬ−２５に対して選択性があると同時に、ヒトＩＬ−１７Ａ、Ｃ、Ｄ又はＦには結合しなかった。Ｍ６の種間交差反応を、カニクイザルＩ２−２５  ｃｙｎｏＩＬ−２５及びげっ歯類（マウス）ＩＬ−２５について評価した。ｃｙｎｏＩＬ−２５との種間交差反応は、５倍以内のヒトＩＬ−２５の親和性、受容体リガンドの阻害、及びＴＫ−１０細胞系アッセイにより示された。これらの基準を用いて、Ｍ６がｃｙｎｏ及びマウスＩＬ−２５の両方に結合したと判定された。
【０１３３】
実施例１に記載の細胞系アッセイを用いて、Ｍ６がｈｕＤＤＧ９１に対して増強した受容体阻害を呈すことにより、ｈｕＤＤＧ９１と比較してＩＣ５０が３倍超低下することを証明した（図３）。更に、実施例１に記載の細胞系アッセイを用いると、Ｍ６はｈｕＤＤＧ９１と比較してヒトＩＬ２５の細胞阻害の増強を示した（図３及び５）。この結果は、上述のように実施したＬＳ１７４Ｔヒト結腸上皮細胞アッセイ（図６Ａ及び６Ｂ）により確認された。
【０１３４】
実施例３：Ｍ６により認識されるヒトＩＬ−２５内エピトープのＨ／Ｄ交換マッピング
課題を解決するための手段
Ｍ６抗体により認識されるヒトＩＬ−２５内推定エピトープを、ＥｘＳａｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍｏｎｍｏｕｔｈ  Ｊｕｎｃｔｉｏｎ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）が実施するＥｘＳａｒ（商標）水素／重水素交換マススペクトロメトリーを用いてマッピングした。
【０１３５】
材料及び方法
Ｉ．ＩＬ−２５の消化／分離最適化
（１）氷上でＩＬ−２５を溶かした。
（２）１８×１００μＬのアリコートに分け、１つ以外を凍らせた。
（３）１０μＬの０．２８ｍｇ／ｍＬ（１６．６μＭ）ＩＬ−２５と３０μＬのＰＢＳ（ｐＨ  ７．０）を水中で混合した。→［ＩＬ−２５］＝０．０７ｍｇ／ｍＬ（４．２μＭ）。
（４）４０μＬの（３）をさまざまな反応停止液と混合した。
（５）５５μＬをＥｘＳＡＲシステムに注入した。
（６）緩衝液Ａ（Ｈ２Ｏ中０．０５％  ＴＦＡ）中、２００μＬ／分でペプシン固定化カラムにサンプルを通した。
（７）消化断片を逆相トラップカラムにロードし、２００μＬ／分で３分間、緩衝液Ａにより脱塩した。
（８）２３分間で１３％→４０％の直線勾配の緩衝液Ｂ（９５％アセトニトリル、５％  Ｈ２Ｏ、０．００２５％  ＴＦＡ）を用い、Ｃ１８カラムにより消化ペプチドを分離した。
（９）ペプチドをマススペクトロメトリーで検出した。
【０１３６】
ＩＩ．Ｍ６の固定化
４．１．Ｍ６固定化の実験手順
＜樹脂上への抗体の結合＞
（１）１．５ｍＬの０．９６ｍｇ／ｍＬ  Ｍ６を氷上で溶かした。
（２）４００μＬを用いた（未使用の材料は再凍結した）。
（３）４ｍｇのＮａＣＮＢＨ3（８７．５μモル）を１．５ｍＬのねじぶた付きバイアル瓶に加えた。→ＰＯＲＯＳ  ＡＬ  １ｇあたり４０ｍｇのＮａＣＮＢＨ3。
（４）４００μＬの抗体溶液をバイアル瓶に加えた。
（５）ＰＯＲＯＳ  ＡＬ樹脂を加える前に、ＮａＣＮＢＨ3が溶解しているかを確認した。
（６）１００ｍｇのＰＯＲＯＳ  ＡＬをバイアル瓶に入れた。
（７）室温で３時間振盪しながらカップリング反応をインキュベートした。
（８）５×８０μＬの２．８Ｍ  Ｎａ2ＳＯ4を、１時間あたり一部ずつ、合計４００μＬ加えた。→［抗体］＝０．４８ｍｇ／ｍＬ、［ＮａＣＮＢＨ3］＝５．０ｍｇ／ｍＬ［Ｎａ2ＳＯ4］＝１．４Ｍ。
（９）この混合液を室温で一晩振盪した。
（１０）濾過用漏斗を用いて大量のＰＢＳ緩衝液（ｐＨ  ７．０）で混合液を洗浄した。
【０１３７】
＜キャッピング＞
（１１）２５０μＬのエタノールアミン（ＦＷ＝６１．０８、密度＝１．０１２ｇ／ｍＬ、８．３ミリモル、〜１Ｍ）を３．５ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ  ７．０）に混合し、この溶液のｐＨを氷酢酸（〜２００μＬ）でｐＨ  ７．２に調整することにより、キャッピング溶液を調製した。この溶液の最終量は約４ｍＬである。
（１２）４ｍｇのＮａＣＮＢＨ３を５００μＬのキャッピング溶液に溶解した。→［ＮａＣＮＢＨ3］＝８ｍｇ／ｍＬ、［エタノールアミン］＝〜１Ｍ。
（１３）洗浄した乾燥樹脂をＮａＣＮＢＨ3溶液に再懸濁した。
（１４）室温で２時間浸透した。
（１５）この混合液を濾過し、濾過用漏斗を用いて大量のＰＢＳ（ｐＨ  ７．０）で洗浄した。
（１６）樹脂ケークを０．７５ｍＬのＰＢＳ緩衝液（ｐＨ  ７．０）に再懸濁した。
（１７）結合した材料を冷蔵庫内４℃で保管した。
【０１３８】
ＩＩＩ．Ｍ６カラムの結合能テストの実験手順
＜緩衝液の調製＞
（１）５０ｍＭクエン酸水溶液（ｐＨ  ６．０）を調製した。
（２）５０ｍＭクエン酸、２ｍＭ  Ｆｏｓｃｈｏｌｉｎｅ−１２水溶液（ｐＨ  ６．０）を調製した。
（３）ＰＢＳ水（ｐＨ  ７．０）を調製した。
（４）（１）、（２）又は（３）のいずれかを「緩衝液Ｈ」として用いた。
【０１３９】
＜結合能テスト＞
（５）流量５００μＬ／分の緩衝液Ａ（Ｈ2Ｏ中０．０５％  ＴＦＡ）及び２．１ｍｍ×３０ｍｍのステンレス製カラムホルダーを用いて、ｍＡｂカラム（１０４μＬ）を６００μＬのＰＯＲＯＳ樹脂に結合したＭ６で充填した。
（６）カラムに出入りする試薬の送出及び捕獲用にセットされたラインを伴う、３℃に設定した冷却ユニットのリザーバ槽中に抗体カラムを置いた。試薬及びサンプル濾過用の投入ラインに沿って２マイクロメートルのフリットを置いた。
（７）抗体カラムを２×２５０μＬの「緩衝液Ｈ」で平衡化した。ｐＨ試験紙を用いて、ラインの最終部で溶液のｐＨを試験し、ｐＨが中性であることを確認した。
（８）１０μＬの０．２８ｍｇ／ｍＬ（１６．６μＭ）ＩＬ−２５と３０μＬの「緩衝液Ｈ」を混合した。→［ＩＬ−２５］＝４．１μＭ（１６６ピコモル当量）。
（９）上記混合液を平衡化した抗体カラム上に注入した。
（１０）シリンジポンプを用いて２００μＬの「緩衝液Ｈ」（５００μＬのＨａｍｉｌｔｏｎシリンジに入れた）を３℃のカラムに送り、５×４０μＬの画分を回収した。
（１１）シリンジポンプを用いて２００μＬの０．８％ギ酸を３℃のカラムに送り、５×４０μＬの画分を回収した。
（１２）１０μＬの０．２８ｍｇ／ｍＬ（１６．６μＭ）ＩＬ−２５と３０μＬの「緩衝液Ｈ」を混合することにより、ガラス製インサート内に対照注入液を調製した。
（１３）画分又は対照サンプルを含有する全てのインサートを遠心分離し、インサートの壁上の液体を全て沈降させた。インサートを内部にいれた状態でバイアル瓶に蓋をしてラベルを付けた。
（１４）中性及び酸性画分、並びに対照サンプルを、冷却スタックトレイ４の３〜２３の奇数の位置に、対照サンプル、中性洗浄液１、２、３、４、５、及び酸性洗浄液１、２、３、４、５の順に保持した。
（１５）１１本の蓋をした空のバイアル瓶を、冷却スタックトレイ４の４〜２４の偶数の位置に置いた。
（１６）各画分を２０μＬの２Ｍ尿素、１Ｍ  ＴＣＥＰ（ｐＨ  ３．０）と混合した。
（１７）５５μＬの反応停止した溶液を、ペプシンカラムを含まないＥｘＳＡＲシステムに注入した。
（１８）サンプルを、緩衝液Ａ（０．０５％  ＴＦＡ）中２００μＬ／分でトラップカラムにロードし、３分間脱塩し、２３分間で１３％〜４０％の直線勾配の緩衝液Ｂ（９５％アセトニトリル、５％  Ｈ２Ｏ、０．００２５％  ＴＦＡ）で溶出した。
（１９）溶出液を、ＭＳ１：セントロイドモードのマススペクトロメトリーで分析した。
【０１４０】
ＩＶ．オンソリューション／オフカラム交換の実験手順
＜緩衝液の調製＞
（１）Ｈ2Ｏ中５０ｍＭクエン酸、２ｍＭ  Ｆｏｓｃｈｏｌｉｎｅ−１２（ｐＨ  ６．０）を調製した。
（２）Ｈ2Ｏ中ＰＢＳ、２ｍＭ  Ｆｏｓｃｈｏｌｉｎｅ−１２（ｐＨ  ７．０）を調製した。
（３）Ｈ2Ｏ中ＰＢＳ（ｐＨ  ７．０）を調製した。
（４）（１）〜（３）を「交換液Ｈ」として用いた。
（５）１部のＨ2Ｏ中ＰＢＳ（ｐＨ  ７．０）と３部の「交換液Ｈ」を混合することにより「交換液ＨＨ」を調製した。
（６）Ｄ2Ｏ中５０ｍＭクエン酸、２ｍＭ  Ｆｏｓｃｈｏｌｉｎｅ−１２（ｐＨ  ６．０）を調製した。
（７）Ｄ2Ｏ中ＰＢＳ、２ｍＭ  Ｆｏｓｃｈｏｌｉｎｅ−１２（ｐＨ  ７．０）を調製した。
（８）Ｄ2Ｏ中ＰＢＳ（ｐＨ  ７．０）を調製した。
（９）（６）〜（８）を「交換液Ｄ」として用いた。
（１０）１部のＨ2Ｏ中ＰＢＳ（ｐＨ  ７．０）と３部の「交換液Ｄ」を混合することにより「交換液ＨＤ」を調製した。
【０１４１】
＜オンソリューション＞
（１）３℃の冷却ボックスの内部にｍＡｂカラム（総容積１０４μＬ）を置き、平衡化した。
（２）２×２５０μＬの０．８％ギ酸でｍＡｂカラムを洗浄した。
（３）ｍＡｂカラムを２×２５０μＬの「交換液ＨＤ」で洗浄し、カラムを平衡化した。
（４）１０μＬの０．２８ｍｇ／ｍＬ（１６．６μＭ）ＩＬ−２５と３０μＬの「交換液Ｄ」を３℃で混合した。→［ＩＬ−２５］＝０．０７ｍｇ／ｍＬ（４．２μＭ）、［Ｄ２Ｏ］＝７５％（オン交換としてタイマーをスタートする）
（５）混合液を１５０、５００、１，５００又は５，０００秒間３℃でインキュベートした。
（６）混合液（４０μＬ）をｍＡｂカラム上に注入した。
（７）３℃の１００μＬの「交換液ＨＤ」でｍＡｂカラムを洗浄した。
【０１４２】
＜オフカラム＞
（８）２００μＬの冷却した「交換液ＨＨ」でｍＡｂカラムを洗浄した（オン交換時間が停止し、Ｈ2Ｏがカラムに触れた瞬間にオフ交換時間が開始する）。
（９）７５、２５０、７５０又は２，５００秒間２３℃でインキュベートした。
【０１４３】
＜溶出＞
（１０）１２０μＬの冷却した０．８％ギ酸をｍＡｂカラム上に注入した（酸性液がカラムに導入された瞬間にオフ交換時間が停止する）。
（１１）更に４０μＬの冷却した０．８％ギ酸を注入し、ｍＡｂカラムから抗原を溶出した。
（１２）ガラス製インサートを用いてこの４０μＬ画分を回収した。
【０１４４】
＜分析＞
（１３）２０μＬの冷却した２Ｍ尿素、１Ｍ  ＴＣＥＰ（ｐＨ  ３．０）を４０μＬ画分に加えた。
（１４）５５μＬの反応停止した交換済みサンプルを、ペプシンカラム及びＣ１８カラム（ペプシンカラム総容積１０４μＬ；ペプシンカラム上流速２００μＬ／分；Ｃ１８勾配２３分間で１３％〜４０％の緩衝液Ｂ）を含むＥｘＳＡＲシステムに注入した。消化時間を３分間に設定した。
（１５）溶出液をＭＳ１：プロファイルの質量分析計により分析した。
【０１４５】
Ｖ．オンカラム／オフカラム交換の実験手順
＜オンカラム＞
（１）２３℃の冷却ボックスの内部にｍＡｂカラム（総容積１０４μＬ）を置き、平衡化した。
（２）２×２５０μＬの０．８％ギ酸でｍＡｂカラムを洗浄した。
（３）ｍＡｂカラムを「交換液ＨＨ」で洗浄し、カラムを平衡化した。
（４）１０μＬの０．２８ｍｇ／ｍＬ（１６．６μＭ）ＩＬ−２５と３０μＬの「交換液Ｈ」を３℃で混合した。→［ＩＬ−２５］＝０．０７ｍｇ／ｍＬ（４．２μＭ）、［Ｄ2Ｏ］＝０％
（５）混合液をｍＡｂカラム上に注入した。
（６）１００μＬの「交換液ＨＨ」で洗浄した。
（７）２００μＬの「交換液ＨＤ」をｍＡｂカラム上に通すことでオン交換反応を開始した（オン交換時間開始）。
（８）ｍＡｂカラムを１５０、５００、１，５００又は５，０００秒間３℃でインキュベートした。
【０１４６】
＜オフカラム＞５．２と同様。
【０１４７】
＜溶出＞上記手順ＩＶ、工程１０〜１４と同様。
【０１４８】
＜分析＞上記手順ＩＶ、工程１５と同様。
【０１４９】
ＶＩ．完全重水素化実験の実験手順
＜完全重水素化サンプルの調製＞
（１）１０μＬの０．２８ｍｇ／ｍＬ（１６．６μＭ）ＩＬ−２５と３０μＬの「交換液Ｄ」を混合した。
（２）混合液を６０℃で３時間加熱した。
（３）室温まで冷却した。
（４）４０μＬの混合液をｍＡｂカラムにロードした。
（５）１００μＬの「交換液ＨＤ」をｍＡｂカラム内に注入した。
【０１５０】
＜溶出＞上記手順ＩＶ、工程１０〜１４と同様。
【０１５１】
＜分析＞上記手順ＩＶ、工程１５と同様。
【０１５２】
各イオンの第１の２つのアミノ酸残基上に結合されたいかなる重水素が、分析（水性環境における消化／分離／質量分析）中に損失した。これにより図８Ａ及び８ＢのＨ／Ｄ交換パターンにおける小さな差が説明される。非重水素化実験、オン交換実験、及び完全重水素化実験を各タンパク質について実施した。非重水素化実験は、イオン、並びに重水素を含まない各イオンの正確なｍ／ｚの同定を目的とした。完全重水素化実験により、分析（水性環境における消化／分離／質量分析）中に各イオンにおける重水素損失が確認された。これらの種類の実験では、ＬＣＭＳ分析前、及びオン又はオンオフ交換反応後の重陽子数を逆算することができる。オンオフ交換実験では、オフ交換時間はオン交換時間の半分であった。これは、同じｐＨ値において固有のＨ→Ｄ交換率は固有のＤ→Ｈ交換率の半分であるという事実による。
【０１５３】
結果
ＩＬ−２５消化
さまざまな条件を用いて、ペプシンでＩＬ−２５を消化した。ペプシンによるＩＬ−２５の最適な消化は、２部の希釈ＩＬ−２５溶液を１部の２Ｍ尿素、１Ｍ  ＴＣＥＰ（ｐＨ  ３．０）で反応停止し、２００μＬ／分のペプシンカラムで消化した際に得られた。最適分離条件は、２３分間で１３％から４０％の直線勾配の緩衝液Ａ中緩衝液Ｂ（９５％アセトニトリル、５％  Ｈ２Ｏ、及び０．００２５％  ＴＦＡ）を用いるＣ１８カラムであった。ペプシン消化後のＩＬ−２５の配列カバー度は１００％（＝１４６／１４６；図７Ａ及び７Ｂ）であった。
【０１５４】
Ｍ６の固定化及びＭ６カラムの結合能テスト
ペプシン消化を行わないＩＬ−２５サンプルは、８．５分の位置に１本のクロマトグラフピークを示した。サンプルはきれいな状態だと思われた。Ｍ６は、シッフ塩基の化学的性質によりＰＯＲＯＳ  ＡＬ樹脂上にうまく結合した。ＥｘＳＡＲにより、表１に示す３つの異なる条件でＭ６カラムの結合能を試験した。ｍ／ｚ＝１８７５（＋１８）及び１９８５（＋１７）の完全なピークが結果として生じた。試験した全ての結合条件において、中性洗浄液ではＩＬ−２５が溶出されなかったことから、ロードした全てのＩＬ−２５（１６６ピコモル）が中性条件でＭ６カラムに結合したことが示された。ＩＬ−２５は非特異的にＭ６カラムに固着できる。ロードしたＩＬ−２５の１７〜１８％のみが、洗剤非存在下の酸性洗浄液中に回収された。ＩＬ−２５を繰り返しロードすると、Ｍ６カラムの背圧も徐々に増加する。回収率は、Ｆｏｓｃｈｏｌｉｎｅ−１２の添加により改善された。
【０１５５】
【表１】
0005887337.tif 000002
【０１５６】
「温度」と「中性」との間の列のタイトルは「ペプシン」である。
【０１５７】
エピトープ同定
＜溶液中ＩＬ−２５のオン交換実験＞
溶液中ＩＬ−２５のオン交換実験を２３℃、ｐＨ  ７で実施した。
【０１５８】
ＩＬ−２５は比較的動的なタンパク質であることがわかった。
【０１５９】
＜Ｍ６カラムを用いる、又は用いないＩＬ−２５のオン／オフ交換実験＞
アミノ酸残基５６〜６３及び６６〜７４を包含するセグメントにおいて、最大の保護が観察された（図８Ａ及び９Ｃ、表２）。アミノ酸残基４６〜６３及び６６〜８４を包含する類似セグメントは、一貫して弱い保護を示した（図８Ａ、９Ｃ及び９Ｄ、表２）。アミノ酸残基１２９〜１３５を包含するセグメントにおいて、境界レベルの保護が観察された（図８Ｂ、９Ｅ及び９Ｆ、表２）。
【０１６０】
【表２】
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【０１６１】
本明細書で引用する全ての特許、公開特許、及び引用文献による教示はその全体が参照により組み込まれる。
【０１６２】
本発明は、その例示的実施形態を参照にして具体的に示され、記載されてきたが、当業者らは、添付の特許請求に包含される本発明の範囲から逸脱することなく、形態及び詳細におけるさまざまな変更をこれに加えることができることを理解する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図１０】
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【配列表】
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