(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
胚芽幹細胞由来マイクロベシクルを含む組成物を体細胞に処理する段階を含む誘導多能性幹細胞の製造方法（ただし、ヒトに対する医療行為を除く。）であって、
得られた上記誘導多能性幹細胞が、上記処理後４８時間以内にすべての細胞への自発的分化能力を有し、
上記マイクロベシクルが、胚芽幹細胞の懸濁液をメンブレインフィルタに通過させることにより製造され、上記マイクロベシクルの平均サイズが７０ｎｍである、誘導多能性幹細胞の製造方法。
【請求項２】
上記胚芽幹細胞が非人間である霊長類、マウス（ｍｏｕｓｅ）、鼠（ｒａｔ）、犬、猫、馬及び牛よりなる群から選択されるものから由来したものである、請求項１に記載の誘導多能性幹細胞の製造方法。
【請求項３】
上記胚芽幹細胞が形質転換された細胞である、請求項１に記載の誘導多能性幹細胞の製造方法。
【請求項４】
上記胚芽幹細胞が胚芽幹細胞特異タンパク質であるＯｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、またはＳｏｘ−２タンパク質を過発現するように形質転換された細胞である、請求項１に記載の誘導多能性幹細胞の製造方法。
【請求項５】
上記胚芽幹細胞が細胞接合分子、抗体、標的誘導タンパク質、細胞膜融合タンパク質自体及びこれらの融合タンパク質よりなる群から選択される１つ以上を発現するように形質転換された細胞である、請求項１に記載の誘導多能性幹細胞の製造方法。
【請求項６】
上記マイクロベシクルの膜が上記胚芽幹細胞の細胞膜以外の成分をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の誘導多能性幹細胞の製造方法。
【請求項７】
上記細胞膜以外の成分がサイクロデキストリンまたはポリエチレングリコールである、 請求項６に記載の誘導多能性幹細胞の製造方法。
【請求項８】
上記マイクロベシクルの膜成分が化学的に変形されたことを特徴とする、 請求項１に記載の誘導多能性幹細胞の製造方法。
【請求項９】
上記組成物が上記胚芽幹細胞由来マイクロベシクル以外の成分をさらに含むことを特徴とする、 請求項１に記載の誘導多能性幹細胞の製造方法。
【請求項１０】
上記胚芽幹細胞由来マイクロベシクル以外の成分がＢＦＡ（ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ  Ａ）、ＢＩＸ（ＢｉＰ  ｉｎｄｕｃｅｒ  Ｘ）またはＶＰＡ（ｖａｌｐｒｏｉｃ  ａｃｉｄ）である、請求項９に記載の誘導多能性幹細胞の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、胚芽幹細胞から由来したマイクロベシクルを利用して体細胞を逆分化させて誘導多能性幹細胞を製造する方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
逆分化は、成熟した細胞である体細胞が若い細胞である幹細胞に戻ることを言い、昆虫、両生類や植物などで起きる現象であって、生体内再生と関連した過程である。人間のような哺乳動物では、自然的に起きる現象ではなく、人為的な方法を用いて可能である。細胞逆分化方法は、細胞融合を利用した方式から始まった。胚芽幹細胞と体細胞を融合させれば、胚芽幹細胞の形質が優勢に現われる性質を利用して体細胞を逆分化する方法が最初に明らかにされた。その後、胚芽幹細胞（ＥＳＣｓ）のみならず、それと非常に類似な能力の幹細胞であるｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｇｅｒｍｉｎａｌ  ｃｅｌｌｓ（ＥＧＣｓ）、ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ（ＥＣＣｓ）などと体細胞の融合を通じて体細胞の逆分化を誘導する研究が進行された。
【０００３】
しかし、細胞融合が起きた細胞は、分裂が起きるかまたは分裂が起きずに融合された形態に維持される場合が無作為的に起きる。分裂が起きる細胞（ｈｙｂｒｉｄ）は、１つの核を有するが、分裂が起きない細胞（ｈｅｔｅｒｏｋａｒｙｏｎｓ）は、２つの細胞の核を同時に有する問題があるので、大部分の細胞は、癌細胞を形成し、一部の細胞だけが正常な機能をする。
【０００４】
また、細胞融合研究方式（細胞、細胞質体）は、サイズが大きい細胞の融合を助けるために細胞に被害を与えることができるＰＥＧ（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）を利用して融合を誘導したので、多くの細胞が死ぬという短所を持っている。既存の研究は、このような問題点を解決するために、胚芽幹細胞全体ではなく、その一部分のみを利用して逆分化をしようとする研究が進行された。そのうち１つの方式は、細胞から細胞質のみを分離し、核が融合時に含まれないように進行した。化学物質（ｓｔｒｅｐｔｏｌｙｓｉｎ）を利用して体細胞の細胞膜が透過性を有するようにした後、胚芽幹細胞から由来した細胞質を投与する方式を使用した。しかし、細胞質を利用した逆分化の場合、２０１０年まで胚芽幹細胞と類似な性質を持つ逆分化を成功した事例はない。
【０００５】
その他、特定因子の伝達システムがある。２００６年日本国京都大学のｙａｍａｎａｋａ研究チームは、胚芽幹細胞内の４つの遺伝子だけで逆分化が可能であることを明らかにした。４つの遺伝子（Ｏｃｔ−４、ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、ａｎｄ ｃ−Ｍｙｃ）をマウスの皮膚細胞に導入し、誘導多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ、ｉＰＳ）を製造した。細胞の全体融合ではなく、一部を合成して入れる観点から始まった研究である。ｉＰＳ技術は、初期にウイルスの能力を利用してゲノム（ｇｅｎｏｍｅ）上に遺伝子を挿入させ、強制的ＲＮＡの発現後、タンパク質が生産されるようにする方式を使用した。しかし、ウイルスの特性上、ゲノムの複数の部位に統合し、所望しない変形を発生させる問題がある。現在は、このような問題を解決するために、ｍＲＮＡ伝達方式や、タンパク質自体を伝達する方式が使用されているが、ｍＲＮＡは、分解しやすく、合成過程が難しいという短所のみならず、合成ＲＮＡの免疫反応誘発などの問題があり、タンパク質のみの伝達は、完全な逆分化を行うことが難しいということを示した。
【０００６】
したがって、前述したような問題点を克服することができる逆分化多能性幹細胞の製造方法に関する研究の必要性が要求されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らは、上記従来技術の問題点を解決するために研究した結果、胚芽幹細胞由来マイクロベシクルを利用して体細胞の逆分化を効果的で且つ安全に進行することができることを知見し、本発明を完成するようになった。
【０００８】
これより、本発明は、胚芽幹細胞由来マイクロベシクルを利用して副作用なしに体細胞の逆分化を効率的に進行し、誘導多能性幹細胞を製造する方法、上記方法によって製造された誘導多能性幹細胞などを提供しようとする。
【０００９】
しかし、本発明が達成しようとする技術的課題は、以上で言及した課題に制限されず、言及されていない他の課題は、下記の記載から当業者に明確に理解されることができる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、胚芽幹細胞由来マイクロベシクルを含む組成物を体細胞に処理する段階を含む誘導多能性幹細胞の製造方法（ただし、ヒトに対する医療行為を除く。）であって、
得られた上記誘導多能性幹細胞が、上記処理後４８時間以内にすべての細胞への自発的分化能力を有し、
上記マイクロベシクルが、胚芽幹細胞の懸濁液をメンブレインフィルタに通過させることにより製造され、上記マイクロベシクルの平均サイズが７０ｎｍである、誘導多能性幹細胞の製造方法を提供する。
【００１１】
また、本発明は、本発明の一具現例において、胚芽幹細胞由来マイクロベシクルを含む組成物を体細胞に処理して製造された誘導多能性幹細胞を提供する。
【００１２】
また、本発明は、本発明の一具現例において、上記誘導多能性幹細胞を含む細胞治療剤を提供する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明による誘導多能性幹細胞の製造方法は、マイクロベシクルの融合を利用した細胞質伝達方式を利用して副作用なしに体細胞の逆分化を効率的に進行することができ、ひいては、各個体別に免疫適合性が確保された細胞治療剤を開発するのに非常に有用に利用されることができるものと期待される。具体的に, マイクロベシクルの融合を利用した細胞質伝達方式は、細胞融合に使用されたＰＥＧ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）や細胞質注入時に使用されるＳｔｒｅｐｔｏｌｙｓｉｎなどの細胞毒性物質の使用を必要としないので、細胞の被害が少ない。また、細胞質の伝達時にマイクロベシクルは、その伝達効率が高くて、伝達内容物を保護する長所を持つので、細胞質の特異的伝達が可能である。既存の細胞質伝達研究での問題点は、核で発現するタンパク質の量に相当して細胞質の伝達効率が劣化するので、完全な逆分化が起きないということである。しかし、本発明のマイクロベシクルは、作る方式に従って細胞質の濃度を自由に調節可能であり、融合時に細胞内物質の損失を防止することができ、細胞質を利用した体細胞の逆分化の効率性を高めることができる長所がある。
【００１４】
これに加えて、本発明のマイクロベシクルを利用した方法は、生体内（ｉｎ−ｖｉｖｏ）での逆分化を誘導するようにターゲッティング（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）が可能である。特に患者の傷ついた器官内に生成される信号は、ターゲッティングの主な因子であるから、以後に生体の外だけで進行された逆分化方法が体内で行われることができる新しい手段になり得るものと予想される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
図１は、押出法で作った胚芽幹細胞由来マイクロベシクルの透過電子顕微鏡写真である。
図２は、押出法で作った胚芽幹細胞由来マイクロベシクルのサイズを示すグラフである。
図３は、胚芽幹細胞と胚芽幹細胞由来マイクロベシクルに胚芽幹細胞特異タンパク質であるＯｃｔ３／４が存在することを示す図である。
図４は、胚芽幹細胞と胚芽幹細胞由来マイクロベシクルに胚芽幹細胞特異遺伝子であるＯｃｔ３／４及びＮａｎｏｇが存在することを示す図である。
図５は、胚芽幹細胞由来マイクロベシクルを利用してマウス線維芽細胞（ＮＩＨ ３Ｔ３細胞）を逆分化した後に生成されたコロニー図である。
図６は、胚芽幹細胞由来マイクロベシクルを利用してマウス線維芽細胞（ＮＩＨ ３Ｔ３細胞）を逆分化した後に生成されたコロニーが時間が経つほど増殖することを示す図である。
図７は、胚芽幹細胞由来マイクロベシクルを利用してＧＦＰが形質転換されたマウス線維芽細胞（ＮＩＨ ３Ｔ３  ＧＦＰ細胞）を逆分化した後に生成されたコロニー図である。
図８は、逆分化したマウス線維芽細胞（ＮＩＨ ３Ｔ３逆分化細胞）に胚芽幹細胞特異タンパク質であるＯｃｔ３／４及びＮａｎｏｇが発現されることを示す図である。
図９は、逆分化したマウス線維芽細胞（ＮＩＨ ３Ｔ３逆分化細胞）が分化能力があることを示す図である。
図１０は、逆分化したマウス線維芽細胞（ＮＩＨ ３Ｔ３逆分化細胞）を分化させたとき、分化特異遺伝子であるＡＦＰ、Ｆｏｘｆ１、及びβ−III  ｔｕｂｕｌｉｎが発現されることを示す図である。
図１１は、胚芽幹細胞由来マイクロベシクルとＢＦＡ（ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ  Ａ）を同時に処理し、マウス線維芽細胞（ＮＩＨ ３Ｔ３細胞）を逆分化した後に生成されたコロニー図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、胚芽幹細胞由来マイクロベシクルを含む組成物を体細胞に処理し、体細胞の逆分化を起こすことによって、誘導多能性幹細胞を製造する方法を提供する。
【００１７】
本発明において使用される胚芽幹細胞は、人間または非人間である霊長類、マウス（ｍｏｕｓｅ）、鼠（ｒａｔ）、犬、猫、馬及び牛などから由来したものであることができるが、これに制限されるものではない。
【００１８】
本発明の「マイクロベシクル」は、由来した細胞の細胞膜成分よりなる脂質二重膜により内部と外部が区分され、細胞の細胞膜脂質と細胞膜タンパク質、核酸及び細胞成分などを有していて、元々細胞よりサイズが小さいものを意味するが、これに制限されるものではない。
【００１９】
本発明のマイクロベシクルは、胚芽幹細胞を含む懸濁液を押出、超音波分解、細胞溶解、均質化、冷凍−解凍、電気穿孔、機械的分解及び化学物質処理よりなる群から選択された方法を使用して製造することができるが、これに制限されるものではない。
【００２０】
本発明の一具現例において、上記マイクロベシクルの膜が上記胚芽幹細胞の細胞膜以外の成分をさらに含むことができる。
【００２１】
上記細胞膜以外の成分は、標的誘導物質（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）、標的細胞との細胞膜融合に必要な物質（ｆｕｓｏｇｅｎ）、サイクロデキストリン（ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ）、ポリエチレングリコールなどを含むことができる。また、上記細胞膜以外の成分は、多様な方法によって追加されることができ、細胞膜の化学的変形などを含む。
【００２２】
例えば、上記マイクロベシクルの膜成分がチオール基（−ＳＨ）またはアミン基（−ＮＨ２）を利用した化学的方法で変形されるか、上記マイクロベシクルにポリエチレングリコールを化学的に結合させることによって、上記マイクロベシクルの膜成分が化学的に変形されたものであることができる。
【００２３】
本発明のマイクロベシクル製造時に上記マイクロベシクルの膜成分を化学的に変形する段階をさらに含むことができる。
【００２４】
また、本発明の胚芽幹細胞は、形質転換された細胞を含む。具体的に、上記形質転換された細胞は、特定タンパク質、標的誘導物質、または標的細胞との細胞膜融合に必要な物質を発現するように形質転換された細胞と；これらの２個以上の組合よりなる形質転換された細胞と；を含むが、これに制限されるものではない。
【００２５】
上記胚芽幹細胞は、物質処理または遺伝子導入によって形質転換されたものであることができ、２回以上形質転換されたものであることができる。
【００２６】
上記本発明の他の具現例において、上記胚芽幹細胞が、１つ以上の特定タンパク質の発現を抑制するように形質転換されたものであることができる。
【００２７】
上記本発明のさらに他の具現例において、上記胚芽幹細胞が、細胞接合分子、抗体、標的誘導タンパク質、細胞膜融合タンパク質自体、及びこれらの融合タンパク質よりなる群から選択される１つ以上を発現するように形質転換されたものであることができる。
【００２８】
上記本発明のさらに他の具現例において、胚芽幹細胞が胚芽幹細胞特異タンパク質であるＯｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、またはＳｏｘ−２タンパク質を過発現するように形質転換された細胞であることができる。
【００２９】
本発明のさらに他の具現例において、上記本発明の組成物は、胚芽幹細胞由来マイクロベシクル以外の成分を追加に含むことができる。
【００３０】
例えば、胚芽幹細胞由来マイクロベシクル及び体細胞逆分化を促進する物質が含まれた組成物を体細胞に処理することができる。上記追加の物質は、ＢＦＡ（ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ  Ａ）、ＢＩＸ（ＢｉＰ  ｉｎｄｕｃｅｒ  Ｘ）、及びＶＰＡ（ｖａｌｐｒｏｉｃ  ａｃｉｄ）を含む。
【００３１】
以下、本発明の理解を助けるために好ましい実施例を提示する。しかし、下記の実施例は、本発明をさらに容易に理解するために提供されるものに過ぎず、実施例によって本発明の内容が限定されるものではない。
以下、参考形態の例を付記する。
１．  胚芽幹細胞由来マイクロベシクルを含む組成物を体細胞に処理する段階を含む誘導多能性幹細胞の製造方法。
２．  上記胚芽幹細胞が人間または非人間である霊長類、マウス（ｍｏｕｓｅ）、鼠（ｒａｔ）、犬、猫、馬及び牛よりなる群から選択されるものから由来したものである、１．に記載の誘導多能性幹細胞の製造方法。
３．  上記胚芽幹細胞が形質転換された細胞である、１．に記載の誘導多能性幹細胞の製造方法。
４．  上記胚芽幹細胞が胚芽幹細胞特異タンパク質であるＯｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、またはＳｏｘ−２タンパク質を過発現するように形質転換された細胞である、１．に記載の誘導多能性幹細胞の製造方法。
５．  上記胚芽幹細胞が細胞接合分子、抗体、標的誘導タンパク質、細胞膜融合タンパク質自体及びこれらの融合タンパク質よりなる群から選択される１つ以上を発現するように形質転換された細胞である、１．に記載の誘導多能性幹細胞の製造方法。
６．  上記マイクロベシクルの膜が上記胚芽幹細胞の細胞膜以外の成分をさらに含むことを特徴とする、１．に記載の誘導多能性幹細胞の製造方法。
７．  上記細胞膜以外の成分がサイクロデキストリンまたはポリエチレングリコールである、６．に記載の誘導多能性幹細胞の製造方法。
８．  上記マイクロベシクルの膜成分が化学的に変形されたことを特徴とする、１．に記載の誘導多能性幹細胞の製造方法。
９．  上記組成物が胚芽幹細胞由来マイクロベシクル以外の成分をさらに含むことを特徴とする、１．に記載の誘導多能性幹細胞の製造方法。
１０．  上記胚芽幹細胞由来マイクロベシクル以外の成分がＢＦＡ（ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ  Ａ）、ＢＩＸ（ＢｉＰ  ｉｎｄｕｃｅｒ  Ｘ）またはＶＰＡ（ｖａｌｐｒｏｉｃ  ａｃｉｄ）である、９．に記載の誘導多能性幹細胞の製造方法。
１１．  １．〜１０．のいずれか１つに記載の方法によって製造された誘導多能性幹細胞。
１２．  １１．に記載の誘導多能性幹細胞を含む細胞治療剤。
【００３２】
実施例１．胚芽幹細胞由来マイクロベシクルの製造
マウス胚芽幹細胞を５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度でＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）溶液３ｍＬに懸濁（ｒｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）した。上記懸濁溶液を孔サイズが１０μｍのメンブレインフィルタ（ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｆｉｌｔｅｒ）に１０回通過させた後、孔サイズが５μｍのメンブレインフィルタに１０回通過させた。５ｍＬ容量の超遠心分離チューブ（ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  ｔｕｂｅ）にそれぞれ５０％  ＯｐｔｉＰｒｅｐ  １ｍＬ、５％  ＯｐｔｉＰｒｅｐ  １ｍＬ、メンブレインフィルタを通過した細胞懸濁液３ｍＬを順に収納した。その後、１００，０００×ｇで２時間超遠心分離（ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）した。５０％  ＯｐｔｉＰｒｅｐと５％  ＯｐｔｉＰｒｅｐとの間の層でマイクロベシクルを得た。
【００３３】
実施例２．胚芽幹細胞由来マイクロベシクルの特性分析
実施例１の方法によって胚芽幹細胞で製造したマイクロベシクルをグロー放電炭素コーティング銅グリッド（ｇｌｏｗ−ｄｉｓｃｈａｒｇｅｄ  ｃａｒｂｏｎ−ｃｏａｔｅｄ  ｃｏｐｐｅｒ  ｇｒｉｄ）で３分間吸着させた。上記グリッドを蒸留水で洗浄した後、２％ウラニルアセテート（ｕｒａｎｙｌａｃｅｔａｔｅ）で１分間染色（ｓｔａｉｎｉｎｇ）し、ＪＥＭ１０１（Ｊｅｏｌ、Ｊａｐａｎ）透過電子顕微鏡で観察した結果を図１に示した。
【００３４】
図１の透過電子顕微鏡イメージに示されたように、胚芽幹細胞から押出法で製造したマイクロベシクルは、脂質二重層よりなり、サイズが１００〜２００ｎｍであり、ほぼ球形を成していることが分かる。
【００３５】
実施例１の方法によって胚芽幹細胞から製造したマイクロベシクルを５μｇ／ｍＬの濃度でＰＢＳ  １ｍＬに希釈（ｄｉｌｕｔｉｏｎ）した。マイクロベシクルが入っているＰＢＳ  １ｍＬをキュベット（ｃｕｖｅｔｔｅ）に入れ、動的光散乱粒度分析機で分析し、その結果を図２に示した。
【００３６】
図２に示されたように、マイクロベシクルのサイズは、５０〜１００ｎｍであり、平均サイズは、７０ｎｍであることが確認された。
【００３７】
実施例１の方法によって胚芽幹細胞で製造したマイクロベシクル５０μｇと胚芽幹細胞全体タンパク質（Ｗｈｏｌｅ  ｃｅｌｌ  ｌｙｓａｔｅ）１０μｇを準備した後、５ｘローディング染色剤（ｌｏａｄｉｎｇ  ｄｙｅ、２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０％  ＳＤＳ、０．５％  ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ  ｂｌｕｅ、５０％  ｇｌｙｃｅｒｏｌ）が最終的に１ｘになるように入れ、１００℃で５分間処理した。８％ポリアクリルアミドゲル（ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌ）を準備し、サンプルをローディングした。８０Ｖで２時間電気泳動した後、４００ｍＡで２時間タンパク質をＰＶＤＦ（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ）メンブレインにトランスファー（ｔｒａｎｓｆｅｒ）した。脱脂乳（Ｓｋｉｍ  ｍｉｌｋ）をＰＢＳに３％になるようにとかした後、メンブレインをこの溶液で２時間ブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）した。Ｏｃｔ３／４とベータ−アクチン（β−ａｃｔｉｎ）抗体を４℃で１２時間処理した。ＰＢＳで２回洗浄した後、それぞれペロキシダーゼ（ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）が付いている二次抗体を室温で１時間処理した。ＰＢＳで３０分間洗浄した後、ＥＣＬ（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｃｏ．  Ｎｏ．ＲＰＮ２１０６）基質（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）で確認し、図３に示した。
【００３８】
図３に示されたように、胚芽幹細胞で製造したマイクロベシクルには、胚芽幹細胞特異タンパク質であるＯｃｔ３／４タンパク質が存在することを確認した。
【００３９】
実施例１の方法によって胚芽幹細胞から製造したマイクロベシクルと胚芽幹細胞内でＲＮｅａｓｙ（登録商標）  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、Ｃａｔ．Ｎｏ．７４１０４）を使用して全体遺伝子（ＲＮＡ）を抽出した。抽出されたＲＮＡを特定遺伝子プライマーとＰＣＲ  ｋｉｔ（ＢＩＯＬＡＢ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｅ５０００）を使用して多数のｃＤＮＡを得、アガロースゲル泳動を用いて分離し、ＥＴＢＲ（Ｅｔｈｉｄｉｕｍ  Ｂｒｏｍｉｄｅ）染色で確認した。遺伝子が陽性対照群（胚芽幹細胞）と同一の量のＲＮＡが使用されたかを確認するために、常時発現（Ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ  ｇｅｎｅ）するＧＡＰＤＨ（Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ  ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓ）を一緒に確認した。この際、胚芽幹細胞特異遺伝子であるＯｃｔ−３／４のセンスプライマー（ｐｒｉｍｅｒ）として５'−ＡＧＡＣＣＡＴＧＴＴＴＣＴＧＡＡＧＴＧＣ−３'とアンチセンスプライマー（ｐｒｉｍｅｒ）として５'−ＧＡＡＣＣＡＴＡＣＴＣＧＡＡＣＣＡＣＡ−３'を使用し、他の胚芽幹細胞特異遺伝子であるＮａｎｏｇのセンスプライマーとして５'−ＣＴＡＧＴＴＣＴＧＡＧＧＡＡＧＣＡＴＣＧ−３'とアンチセンスプライマーとして５'−ＴＣＴＣＡＧＴＡＧＣＡＧＡＣＣＣＴＴＧ−３'を使用した。胚芽幹細胞由来マイクロベシクルの特性分析のための、遺伝子発現写真は、図４に示した。
【００４０】
図４に示されたように、胚芽幹細胞で製造したマイクロベシクルには、胚芽幹細胞特異遺伝子であるＯｃｔ３／４とＮａｎｏｇが発現されていることを確認した。
【００４１】
実施例３．胚芽幹細胞由来マイクロベシクルを利用した体細胞の逆分化
６ウェルプレートに０．１％ゼラチンをコーティングし、ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞８×１０４ｃｅｌｌｓを接種した後、６ウェルで２４時間培養した。その後、各ウェルをＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）で洗浄し、実施例１の方法によって胚芽幹細胞で製造したマイクロベシクルを１００μｇ／ｍＬの濃度で２ｍＬを線維芽細胞培地（ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｓｉｎ）に希釈し、上記培養されたＮＩＨ ３Ｔ３細胞に処理した。４８時間後、各ウェル当たり２〜３個程度の群集（ｃｏｌｏｎｙ）を確認することができ、サイズは、約１０〜１００μｍ間で確認され、これを電子顕微鏡で観察した結果は、図５に示した。
【００４２】
図５に示されたように、胚芽幹細胞由来マイクロベシクルを利用してＮＩＨ ３Ｔ３細胞を逆分化させた後、群集を誘導することができることを確認した。
【００４３】
各ウェルをＰＢＳで洗浄し、０．１×ＴＥ（Ｔｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ）４００μＬを入れた。１分後、ピペットを利用して１ｘＴＥを１０μＬを群集部位に流し、ピペットのチップ（ｔｉｐ）が群集を囲むように差し込んだ後、吸入し、取り出した。上記取り出した群集は、胚芽幹細胞培地（ｋｎｏｃｋ  ｏｕｔ  ＤＭＥＭ、１５％  ｋｎｏｃｋ  ｏｕｔ  ＦＢＳ、１０ｎｇ／ｍｌ  ＬＩＦ、０．１ｍＭ  ２−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、４ｍＭ  Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎ、Ｇｅｎｔａｍｙｓｉｎ  １０μｇ／ｍＬ、１００Ｕ／ｍＬ  Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）５００μＬに希釈し、０．１％ゼラチンコーティングされた２４ウェルに接種し、５日以上培養した。
【００４４】
細胞が８０％以上満たされた時点に１×ＴＥを利用して全体細胞を胚芽幹細胞培地２ｍＬに希釈し、０．１％ゼラチンコーティングされた６ウェルに継代した。同一の方法を用いて８０％再び満たされた時点に培地８ｍＬに希釈し、０．１％ゼラチンコーティングされた１００ｍｍ培養ディッシュで継代を行い、その後、２〜３日に一度ずつ継代を進行した。
【００４５】
図６に示されたように、５日以上群集の増殖を観察した結果、群集が継続的に増殖することを確認した。
【００４６】
実施例４．誘導多能性幹細胞の起源確認
ＮＩＨ ３Ｔ３細胞にレトロウイルス（ｐＭＳＣＶ）を利用してゲノム（ｇｅｎｏｍｅ）上にＧＦＰ遺伝子を注入した。変形された細胞は、緑色蛍光を示す一方で、マイクロベシクルを作った胚芽幹細胞は、蛍光を示さない。６ウェルプレートに０．１％ゼラチンをコーティングし、ＮＩＨ  ３Ｔ３  ＧＦＰ細胞８×１０４を接種し、２４時間培養した。その後、各ウェルをＰＢＳで洗浄し、実施例１によって製造された胚芽幹細胞由来マイクロベシクルを１００μｇ／ｍＬの濃度で２ｍＬを線維芽細胞培地（ＤＭＥＭ、１０％  ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｓｉｎ）に希釈し、ＮＩＨ  ３Ｔ３  ＧＦＰ細胞に処理した。４８時間後、各ウェル当たり２〜３個程度の群集を確認することができ、サイズは、約１０〜１００μｍの間で確認され、電子顕微鏡で観察した結果は、図７に示した。
【００４７】
図６及び図７に示されたように、従来の研究において短くは７日から３０日までの長い時間の逆分化期間を有するのに対し、本発明の胚芽幹細胞由来マイクロベシクルを使用した場合、４８時間ぶりに群集を形成することが分かり、これは、逆分化期間を顕著に短縮させることができることを意味する。
【００４８】
実施例５．誘導多能性幹細胞の特徴確認
実施例３の方法によって４０日以上増殖された群集（ＮＩＨ ３Ｔ３由来逆分化細胞）、胚芽幹細胞、及びＮＩＨ ３Ｔ３細胞の全体タンパク質（Ｗｈｏｌｅ  ｃｅｌｌ  ｌｙｓａｔｅ）をＤＣ（Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ）に定量し、それぞれ５０μｇを準備した後、５ｘローディング染色剤が最終的に１ｘになるように入れ、１００℃で５分間処理した。８％ポリアクリルアミドゲル（ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌ）を準備し、サンプルをローディングした。８０Ｖで２時間電気泳動した後、４００ｍＡで２時間タンパク質をＰＶＤＦ（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ）メンブレインにトランスファー（ｔｒａｎｓｆｅｒ）した。メンブレインは、適用する抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）ごとに異なるブロッキングバッファー（ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）を使用した。Ａｃｔｉｎの場合、脱脂乳（Ｓｋｉｍ  ｍｉｌｋ）をＰＢＳに３％になるようにとかし、Ｏｃｔ３／４の場合、脱脂粉乳（ｎｏｎ  ｆａｔ  ｄｒｙ  ｍｉｌｋ）をＰＢＳに５％になるようにとかし、Ｎａｎｏｇの場合は、１０％  ｎｏｎ  ｆａｔ  ｄｒｙ  ｍｉｌｋ  １０％になるようにとかした後、メンブレインをこの溶液で２時間ブロッキングした。Ｏｃｔ３／４とＮａｎｏｇとベータ−アクチン（β−ａｃｔｉｎ）抗体を４℃で１２時間処理した後、ＰＢＳで２回洗浄した後、それぞれペロキシダーゼ（ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）が付いている二次抗体を室温で１時間処理した。ＰＢＳで３０分洗浄した後、ＥＣＬ（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｃｏ．Ｎｏ．ＲＰＮ２１０６）基質（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）で確認し、図８に示した。
【００４９】
図８に示されたように、胚芽幹細胞由来マイクロベシクルによって逆分化したＮＩＨ ３Ｔ３逆分化細胞（誘導多能性幹細胞）には、胚芽幹細胞特異タンパク質であるＯｃｔ３／４及びＮａｎｏｇが発現されていることを確認した。
【００５０】
実施例６．誘導多能性幹細胞の自発的分化機能確認
実施例３の方式で４０日以上増殖された誘導された多能性細胞の機能を確認するために、すべての細胞への自発的分化能力を確認した。胚芽幹細胞は、 胚様体（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｂｏｄｙ）になった場合、自発的にすべての細胞に分化する能力を有する。同じ原理で懸滴方式（ｈａｎｇｉｎｇ  ｄｒｏｐ  ｍｅｔｈｏｄ）で誘導された細胞を強制的に団結するように誘導した。群集細胞をｔｒｙｐｓｉｎを使用して浮遊させ、３．３×１０４／ｍＬの濃度で分化培地（ＩＭＤＭ、２０％  ＦＢＳ、４ｍＭ  Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎ、Ｇｅｎｔａｍｙｓｉｎ  １０μｇ／ｍＬ、１００Ｕ／ｍＬ  Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）に希釈した。希釈させた溶液を３０μＬ（１×１０３個）ずつバクテリア培養ディッシュ天井面に付着させて、二日間団結するように誘導した。天井面に団結された細胞を分化培地で洗浄し、さらに二日間バクテリアディッシュで浮遊させたまま培養した。図８は、バクテリアディッシュに団結された形態に浮遊された誘導多能性幹細胞の写真である。同じ過程でＮＩＨ ３Ｔ３細胞と胚芽幹細胞を懸滴方式で団結するように誘導した。
【００５１】
分化培地に３個／ｍＬの個数で胚様体（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｂｏｄｙ）を希釈し、０．１％ゼラチンコーティングされた６ウェルに２ｍＬを注入し、培養した。１６日間８日ごとに２回培養液を交替した。図９は、分化誘導後細胞の様子を示す。
【００５２】
分化した細胞をＲＮｅａｓｙ（登録商標）  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、Ｃａｔ．Ｎｏ．７４１０４）を使用して全体遺伝子（ＲＮＡ）を抽出した。抽出されたＲＮＡを特定遺伝子プライマーとＰＣＲ  ｋｉｔ（ＢＩＯＬＡＢ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｅ５０００）を使用して多数のｃＤＮＡを得、アガロースゲル泳動を用いて分離し、ＥＴＢＲ（Ｅｔｈｉｄｉｕｍ  Ｂｒｏｍｉｄｅ）染色で確認した。遺伝子が陽性対照群（胚芽幹細胞）と同じ量のＲＮＡが使用されたかを確認するために、常時発現（Ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ  ｇｅｎｅ）するＡｃｔｉｎを一緒に確認した。誘導多能性幹細胞の自発的分化能力を確認した結果、ＮＩＨ ３Ｔ３逆分化細胞の内胚葉（ｅｎｄｏｄｅｒｍ、ＡＦＰ）、中胚葉（ｍｅｓｏｄｅｒｍ、Ｆｏｘｆ１）、及び外胚葉（ｅｃｔｏｄｅｒｍ、ｂ−III  ｔｕｂｕｌｉｎ）に分化することを確認することができた。この際、ＡＦＰは、センスプライマーとして５'−ＡＡＣＴＣＴＧＧＣＧＡＴＧＧＧＴＧＴＴ−３'とアンチセンスプライマーとして５'−ＡＡＡＣＴＧＧＡＡＧＧＧＴＧＧＧＡＣＡ−３'を使用し、Ｆｏｘｆ１は、センスプライマーとして５'−ＣＧＴＧＴＧＴＧＡＴＧＴＧＡＧＧＴＧＡＧ−３'とアンチセンスプライマーとして５'−ＣＴＣＣＧＴＧＧＣＴＧＧＴＴＴＣＡ−３'を使用し、ｂ−III  ｔｕｂｕｌｉｎは、センスプライマーとして５'−ＴＴＴＴＣＧＴＣＴＣＴＡＧＣＣＧＣＧＴＧ−３'とアンチセンスプライマーとして５'−ＧＧＣＣＣＴＧＧＧＣＡＣＡＴＡＣＴＴＧＴＧ−３'を使用した。ＮＩＨ ３Ｔ３逆分化細胞（誘導多能性幹細胞）の自発的分化能力を確認するための、遺伝子の発現可否に対する写真は、図１０に示した。
【００５３】
図１０に示されたように、ＮＩＨ ３Ｔ３逆分化細胞には、内胚葉、中胚葉、外胚葉の遺伝子が発現されていることを確認し、これは、ＮＩＨ ３Ｔ３逆分化細胞が自発的な分化能力があることを示す結果である。
【００５４】
実施例７．胚芽幹細胞由来マイクロベシクルとＢＦＡの同時処理による体細胞の逆分化
６ウェルプレートに０．１％ゼラチンをコーティングし、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞８×１０４ｃｅｌｌを接種した後、６ウェルで２４時間培養した。各ウェルをＰＢＳで洗浄した後、実施例１によって製造された胚芽幹細胞由来マイクロベシクル１００μｇ／ｍＬの濃度とＢＦＡ（ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ  Ａ）２μＭの濃度にそれぞれ２ｍＬを線維芽細胞培地（ＤＭＥＭ、１０％  ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｓｉｎ）に希釈し、上記培養されたＮＩＨ ３Ｔ３細胞に処理した。４８時間後、各ウェル当たり２〜３個程度の群集を確認することができ、サイズは、約１０〜１００μｍの間で確認され、これを電子顕微鏡で観察した結果は、図１１に示した。
【００５５】
図１１に示されたように、胚芽幹細胞由来マイクロベシクルとＢＦＡを同時に処理した場合にも、群集を誘導することができることを確認した。
【００５６】
各ウェルをＰＢＳで洗浄し、０．１×ＴＥ（Ｔｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ）４００μＬを入れる。１分後、ピペットを利用して１ｘＴＥ  １０μＬを群集部位に流し、ピペットのチップ（ｔｉｐ）が群集を囲むように差し込んだ後、吸入し、取り出す。上記取り出した群集は、胚芽幹細胞培地（ｋｎｏｃｋ  ｏｕｔ  ＤＭＥＭ、１５％  ｋｎｏｃｋ  ｏｕｔ  ＦＢＳ、１０ｎｇ／ｍＬ  ＬＩＦ、０．１ｍＭ  ２−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、４ｍＭ  Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎ、Ｇｅｎｔａｍｙｓｉｎ  １０μｇ／ｍＬ、１００Ｕ／ｍＬ  Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）５００μＬに希釈し、０．１％ゼラチンコーティングされた２４ウェルに接種し、５日以上培養した。
【００５７】
図１１に示されたように、群集が継続的に増殖することを確認した。
【００５８】
前述した本発明の説明は、例示のためのものであり、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者は、本発明の技術的思想や必須な特徴を変更することなく、他の具体的な形態で容易に変形が可能であることを理解することができる。したがって、以上で記述した実施例は、すべての面で例示的なものであり、限定的なものではないことを理解すべきである。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明による誘導多能性幹細胞の製造方法は、マイクロベシクルの融合を利用した細胞質伝達方式を使用することによって、副作用なしに体細胞の逆分化を効率的に進行することができ、各個体別に免疫適合性が確保された細胞治療剤を開発するのに非常に有用に利用されることができるものと期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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