(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（１）で表される化合物を含有する細胞増殖促進剤
【化１】
0005947062.tif 000005
Rはアシル基又はアシルオキシ基である。
【請求項２】
式（１）で表される化合物を含有するコラーゲン産生促進剤
【請求項３】
式（１）で表される化合物を含有する抗シワ剤
【請求項４】
式（１）で表される化合物を皮膚へ適用し、細胞増殖を促進する方法（医療行為を除く）
【請求項５】
式（１）で表される化合物を皮膚へ適用し、コラーゲン産生を促進する方法（医療行為を除く）
【請求項６】
式（１）で表される化合物を皮膚へ適用し、シワを防止する方法（医療行為を除く）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は細胞増殖促進剤、コラーゲン産生促進剤及び抗シワ剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
加齢に伴うシワやたるみの形成は、審美上重要な課題であり、皮膚組織の劣化が関与している。中でも真皮は皮膚組織の主要な部分であり、細胞外マトリクスと呼ばれ、膠原線維、弾性線維ならびに多種のプロテオグリカンにより構成されている。加齢に伴うシワやたるみの形成には、これら真皮組織を構成する膠原線維の変性、分子間架橋の形成による溶解性の低下、そしてこれら成分を作り出す皮膚線維芽細胞が大きく関わっている。特に膠原線維は細胞外マトリクスの最も主要な構成要素であり、その主体はコラーゲンである。膠原線維を構成するコラーゲンはＩ型およびIII型が主体であるが、そのほかにも基底膜に関与するIV型、VII型の他、多様なコラーゲンが存在している。そこでコラーゲンの産生を促進させて真皮コラーゲン量を適切に維持することが、シワやたるみの予防および改善に有効である。
【０００３】
これまで様々な成分による抗シワ剤が知られている。特にレチノイン酸は光加齢皮膚のような老化状態を改善できることが報告されている。（非特許文献1参照）。しかしレチノイン酸は非常に不安定であり、各種誘導体を用いても安定性は十分でなく、配合には困難が伴っていた。
【０００４】
コラーゲン産生促進剤としてはアスコルビン酸が広く知られている。（特許文献１）しかしながらアスコルビン酸も不安定であり、各種誘導体を用いても安定性は十分でなく、十分な効果を得るのは難しかった。
【０００５】
一方、桂皮酸やその誘導体は、紫外線吸収能をもつ物質として広く化粧品や医薬部外品に応用されている。（特許文献２）また、肌への効果として美白効果（特許文献３）や脂質合成促進効果（特許文献４）を有することが知られているが、真皮組織への作用については知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００２−２９３７３１号
【特許文献２】特開２００７−２０４４５９号
【特許文献３】特開昭６２−０３６３０５号
【特許文献４】特開平１１−２４６３３２号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Weiss JS et. al. JAMA. (1988) 259:527-32. Topical tretinoin improvesphotoaged skin. A double-blind vehicle-controlled study.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
製剤配合上の制約が少なく、かつ高い細胞増殖促進、コラーゲン産生、抗シワ効果を有する成分の開発が求められていた。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者等はこのような現状に鑑み、鋭意研究を重ねた結果、下記の式（１）に示される化合物に細胞増殖促進作用、コラーゲン産生促進、抗シワ効果を見出し、これに基づき抗シワ剤、および抗老化としての高い有用性を見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
【化１】
0005947062.tif 000002
Rはアシル基又はアシルオキシ基である。
【００１１】
すなわち本発明は、式（１）で表される化合物を含有する細胞増殖促進剤、コラーゲン産生促進剤、抗シワ剤であり、化合物を皮膚へ適用することにより、細胞増殖促進、コラーゲン産生促進、及び／又は皮膚のシワを防止する方法である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の物質は優れた細胞増殖促進効果、コラーゲン産生促進効果、抗シワ効果を有するものである。よって皮膚へ適用することにより、コラーゲンの産生を促進し、皮膚のコラーゲン量を適切に維持し、シワ・たるみの予防・改善に寄与し、真皮コラーゲンの変調に起因する様々な症状に有用である。また、これらは天然に存在する成分に由来しており、人又は動物に対して外用、又は内服しても安全なものである。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】細胞増殖促進効果の結果
【図２】コラーゲン産生促進効果の結果
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明について述べるがこれに限定されるものではない。
下記の式（１）は桂皮酸のパラ位に置換基を導入した誘導体であることを特徴とする。オルト、メタ位誘導体は含まれない。
桂皮酸は芳香族不飽和カルボン酸に分類される有機化合物であり、植物全般に広く存在し、中でもクスノキ科ニッケイ属のシナモンやカシアの樹皮から取れる香料の主成分である。Ｅ体とＺ体の２つの幾何異性体があり、どちらも使用可能であるが、安定性に優れるＥ体から誘導体化することが好ましい。
【００１５】
【化１】
0005947062.tif 000003
Rはヒドロキシ基、アルコキシ基、アシル基、アシルオキシ基から選ばれる。
【００１６】
誘導体化される置換基としてはヒドロキシ基、アルコキシ基、アシル基、アシルオキシ基から選ばれる。これらであれば特に高い細胞増殖効果、コラーゲン産生効果、抗シワ効果を得ることができる。ここで、ヒドロキシ基を導入した場合はパラ−ヒドロキシ桂皮酸又は４−ヒドロキシ桂皮酸と呼ばれる。本物質はピーナツ、トマト、ニンジン、ニンニクなどの食用植物中にも広く含まれており、酸化防止作用があることが知られている。
【００１７】
アルコキシ基としては炭素数１〜１０、特に１〜５が好ましく、具体的にはメトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、ブトキシ基、フェノキシ基、ペンチルオキシ基などがあげられる。
【００１８】
アシル基としては、炭素数１〜１０、特に２〜７のものが好ましく、具体的には、ホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチル基、バレリル基、ベンゾイル基等が挙げられる。
【００１９】
アシルオキシ基としては上記のカルボン酸とヒドロキシ基のエステルが好ましく、例えばアセトキシ基、エタノイルオキシ基、プロパノイルオキシ基等が挙げられる。
【００２０】
これらの物質は先に述べたように天然物から抽出、精製過程を経て得ることも可能であるし、元となる桂皮酸等から化学的に合成して得ることも可能である。また、一部の工程を微生物など用いて生化学的に合成してもよい。
【００２１】
本発明の抗シワ剤、コラーゲン産生促進剤および細胞増殖促進剤はこれらの１種又は２種以上を組み合わせて用いることができる。本発明で「方法」というときは、特に記載した場合を除き、ヒトに対する医療行為を含まない。また「皮膚」又は「肌」というときは、特に記載した場合を除き、その場所は限定されず、頭皮を含む体表面のあらゆる皮膚を含む。本発明の剤は、作用部位である皮膚へ適用でき、その経路としては経口または外用等が可能であるが特に外用が好ましい。
【００２２】
剤型も任意で、例えば錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等の経口用固形製剤や、内服液剤、シロップ剤等の経口用液体製剤、または、注射剤などの非経口用液体製剤など、いずれの形態にも公知の方法により適宜調製することができる。
【００２３】
本発明の化合物を製剤中に配合する場合、さらに必要により、本発明の効果を損なわない範囲内で、通常用いられる成分、例えば酸化防止剤、油分、界面活性剤、増粘剤、アルコール類、粉末成分、色材、水性成分、水、各種栄養剤等を必要に応じて適宜配合することができる。  
【００２４】
化粧料、医薬部外品等、特に好適には化粧料に広く適用することが可能であり、その剤型も、溶液系、可溶化系、乳化系、粉末分散系、水−油二層系、水−油−粉末三層系、軟膏、化粧水、ゲル、エアゾール等、任意の剤型が適用される。
【００２５】
使用形態も任意であり、例えば化粧水、乳液、クリーム、パック等のフェーシャル化粧料やファンデーション、口紅、アイシャドウ等のメーキャップ化粧料、シャンプー、コンディショナー、整髪料などの頭髪化粧料、ボディーソープ、石けん等のトイレタリー製品に広く適用可能である。
【００２６】
飲食品としては、例えば、顆粒状、粒状、ペースト状、ゲル状、固形状、または、液体状に任意に成形することができる。
【００２７】
配合量は外用として用いる場合にはそれらの種類、目的、形態、利用方法などに応じて、適宜決めることができるが、化粧料の場合には０．０００５〜５質量％が好ましく、医薬品の場合には０．１〜１０質量％が好ましい。
【００２８】
飲食品全量中に錠剤やカプセル剤等の場合は０．１〜１０質量％が好ましく、その他の飲食品では０．０００５〜５質量％が好ましい。特に、保健用飲食品等として利用する場合には、本発明の有効成分を所定の効果が十分発揮されるような量で含有させることが好ましい。
【００２９】
本発明の化合物を、皮膚外用剤、飲食品、医薬製剤等として用いる場合、優れた細胞増殖促進効果、コラーゲン産生促進作用により、抗シワ効果をもたらす。さらに、皮膚のはりや弾力保持も行われ、老化防止に役立つ。また、コラーゲン合成促剤として関節炎等の予防・治療、熱傷の初期の治療等に有効に用いられる。食品に添加した場合には、かかる食品を摂取することで、コラーゲン産生促進効果を内から発揮することが期待される。 
【００３０】
また上記症状や病態等の治療、予防、改善等の生理機能をコンセプトとして、その旨を表示した皮膚外用剤、機能性飲食品、特定保健用食品等に応用することができる。   
【００３１】
尚、本発明の細胞増殖促進剤、コラーゲン産生促進剤、抗シワ剤の添加の方法については、予め加えておいても、製造途中で添加しても良く、作業性を考えて適宜選択すれば良い。
【実施例】
【００３２】
本発明について以下に実施例を挙げるが、本発明はこれによりなんら限定されるものではない。配合量は特記しない限り質量％で示す。
【００３３】
実施例1（細胞増殖促進効果の確認試験）
参考試料１：パラ−ヒドロキシ桂皮酸（シグマ社）
被検試料2：パラ−アセトキシ桂皮酸（シグマ社）
比較試料1：オルト−ヒドロキシ桂皮酸（シグマ社）
比較試料２：メタ−ヒドロキシ桂皮酸（シグマ社）
比較例３：対照（無添加）
ヒト皮膚線維芽細胞を１．０×１０４
ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度で２４穴プレートに播種する。細胞が定着後、ウシ胎児血清（FBS）を１％とした培養液に交換し、１０μｇ/mLの濃度となるよう各試料を添加する。対照として無添加のウェルを設定する。各試料添加後、3日毎にそれぞれの培養液を交換し、１週間後それぞれの細胞数を比較する。各処理濃度における細胞数に対し対照を１００として細胞生育率を算出する。得られた結果を図１に示す。
【００３４】
図１から分かるように、参考試料1であるパラ−ヒドロキシ桂皮酸は、顕著な細胞賦活効果を示した。しかしながらヒドロキシル化される位置が異なる比較試料ではまったく細胞賦活効果を示さなかった。またパラ−ヒドロキシ桂皮酸をアセチル化した被検試料2ではさらに顕著な細胞賦活効果を示した。このことから本願の効果である細胞増殖効果、コラーゲン産生効果、抗シワ効果が発揮されるためには置換基の位置が重要であることが明らかになった。
【００３５】
細胞賦活効果には、線維芽細胞の足場となるコラーゲンの産生が必要である。そこで本発明品のコラーゲン産生に及ぼす効果を検証した。
【００３６】
実施例２（コラーゲン産生促進効果の比較試験）
ヒト皮膚線維芽細胞を用い、１０％FBSを含むＥａｇｌｅ‘ｓ  ＭＥＭにて２４時間培養した。次いで、パラ−ヒドロキシ桂皮酸又はパラ−アセトキシ桂皮酸を、最終濃度０．０１ｍｇ／ｍＬになるように添加し、７２時間培養後に、培養上清を回収した。この培養上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動し、ウエスタンブロッティング法によりＩ型コラーゲンＣ末端テロペプチドを検出した。試料を添加していない培養上清を対照として、検出されたバンドの濃さの比較から、Ｉ型コラーゲンＣ末端テロペプチド蛋白質量を比較した。またコラーゲン産生の陽性対照として０．１ｍｇ／ｍＬのビタミンＣを添加したものを設定した。その結果を図２に示す。
【００３７】
図２から陽性対照となるビタミンＣと同様に、本発明品はいずれもコラーゲン産生の促進効果を示した。このことから、本発明品はコラーゲン産生の促進効果を有することが明らかとなった。
【００３８】
加齢に伴うシワやたるみの形成には、これら真皮組織を構成する膠原線維の変性、分子間架橋の形成による溶解性の低下が関わっている。本発明品はこれら成分の基礎となるコラーゲンの産生を促進させ、真皮コラーゲンを改善し、シワやたるみの予防および改善に有効である。
【００３９】
参考例３（使用試験）
本発明品の肌効果を検証するため、男性パネル（シワグレード２〜５）２０名に対し参考例と比較例のクリームを半顔で、２ヶ月間、１日２回適量塗布してもらった。
【００４０】
【表１】
0005947062.tif 000004
【００４１】
製造方法
Ａ：成分１−４を加えて７０度に加熱混合する。
Ｂ：成分５−１０を加えて均一に溶解し、７０度に加熱する。
Ｃ：Ｂを攪拌している中へＡを徐々に加え、乳化する。
【００４２】
評価方法：シワ
評価部位として目尻を用い、試験前と試験後に、写真撮影、専門家による目視評価、レプリカ採取を行った。抗シワ製品評価ガイドライン（日本香粧品学会誌  Ｖｏｌ.30.Ｎｏ.4  ｐ３１６−３３２（２００６））に準拠し、グレードをつけ統計的に有用性評価を行った。
目視評価、写真評価、機器評価のすべてで有意差がある：◎
目視評価、写真評価、機器評価のうち２項目で有意差がある：○
目視評価、写真評価、機器評価のうち１項目で有意差がある：△
目視評価、写真評価、機器評価のすべてで有意差がない：×
【００４３】
評価方法：はり、たるみ、弾力
試験前と試験後に、写真撮影、専門家による目視評価、パネルへのアンケート調査を行った。はり、たるみ、弾力の程度を５段階で評価し、統計的に有用性評価を行った。
目視評価、写真評価、アンケートのすべてで有意差がある：◎
目視評価、写真評価、アンケートのうち２項目で有意差がある：○
目視評価、写真評価、アンケートのうち１項目で有意差がある：△
目視評価、写真評価、アンケートのすべてで有意差がない：×
【００４４】
以上の結果により本発明品は、細胞増殖促進効果、コラーゲン産生促進効果、および抗シワ効果を有し、はり、たるみ、弾力を改善する抗老化に優れたものであった。
【００４５】
実施例４：乳液（水中油型）
（成分）                                                        （質量％）
１．モノステアリン酸ポリオキシエチレン
（２０Ｅ．Ｏ．）ソルビタン                                          １．０
２．トリオレイン酸ポリオキシエチレン
（２０Ｅ．Ｏ．）ソルビタン                                          ０．５
３．グリセリルモノステアレート                                      １．５
４．ステアリン酸                                                    ０．５
５．ベヘニルアルコール                                              ０．５
６．スクワラン                                                      ８．０
７．カルボキシビニルポリマー                                        ０．１
８．パラオキシ安息香酸メチル                                        ０．１
９．水酸化ナトリウム                                                ０．０５
１０．精製水                                                            残量
１１．パラ−アセチル桂皮酸                                          ０．０３
１２．エチルアルコール                                              ５．０
１３．香料                                                          ０．０５
【００４６】
（製造方法）
Ａ：成分１〜６を７０℃で均一に混合溶解する。
Ｂ：成分７〜１０を均一溶解し、７０℃に加熱する。
Ｃ：ＡにＢを加えて乳化する。
Ｄ：室温まで冷却後、成分１１〜１３を加えて均一に混合し乳液を得た。
【００４７】
参考例５：軟膏剤
（成分）                                                          （質量％）
１．ステアリン酸                                                    １８．０
２．セタノール                                                        ４．０
３．酢酸ｄｌ−α―トコフェロール                                      ０．２
４．トリエタノールアミン                                              ２．５
５．グリセリン                                                        ５．０
６．グリチルリチン酸ジカリウム                                        ０．５
７．パラ−エトキシ桂皮酸                                              ５．０
８．ペンチレングリコール                                              ０．１
９．精製水                                                            残量
【００４８】
（製造方法）
Ａ．成分１〜３を加熱混合し、７５℃に保つ。
Ｂ．成分４〜９を混合し、７５℃に保つ。
Ｃ．ＡにＢを徐々に加え、軟膏剤を得た。
【００４９】
実施例６：ローション剤
（成分）                                                          （質量％）
１．モノラウリン酸ポリオキシエチレン
（２０Ｅ．Ｏ．）ソルビタン                                            １．２
２．エチルアルコール                                                    ８．０
３．パラオキシ安息香酸エチル                                            ０．１
４．グリセリン                                                          ５．０
５．１，３−ブチレングリコール                                          ６．５
６．パラ−ブチリルオキシ桂皮酸                                          ０．１
７．精製水                                                              残量
【００５０】
（製造方法）
Ａ．成分１〜３を混合溶解する。
Ｂ．成分４〜７を混合溶解する。
Ｃ．ＡとＢを混合して均一にし、ローション剤を得た。
【００５１】
参考例７：リキッドファンデーション（水中油型クリーム状）
（成分）                                                          （質量％）
１．１，３―ブチレングリコール                                          ５．０
２．水素添加大豆リン脂質                                                ０．５
３．酸化チタン                                                          ５．０
４．ベンガラ                                                            ０．１
５．黄酸化鉄                                                            １．０
６．黒酸化鉄                                                            ０．０５
７．ステアリン酸                                                        ０．９
８．モノステアリン酸グリセリン                                          ０．３
９．セトステアリルアルコール                                            ０．４
１０．モノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０Ｅ．Ｏ．）ソルビタン        ０．２
１１．トリオレイン酸ポリオキシエチレン（２０Ｅ．Ｏ．）ソルビタン        ０．２
１２．ジエチルアミノヒドロキシベンゾイル安息香酸ヘキシル                ２．０
１３．アクリル酸・メタクリル酸アルキル共重合体  （※４）                ０．５
１４．トリエタノールアミン                                              １．５
１５．グリセリン                                                        ５．０
１６．フェノキシエタノール                                              ０．３
１７．精製水                                                              残量
１８．パラ−メトキシ桂皮酸                                              １．０
１９．香料                                                              ０．０２
※４  ペミュレンＴＲ−２（ＮＯＶＥＯＮ社製）
【００５２】
（製造方法）
Ａ：成分１〜６を分散する。
Ｂ：Ａに成分７〜１２を加え７０℃で均一に混合する。
Ｃ：成分１３〜１７を７０℃で均一に混合する。
Ｄ：ＣにＢを加え乳化し、室温まで冷却する。
Ｅ：Ｄに成分１８、１９を添加し均一に混合して水中油型クリーム状リキッドファンデーションを得た。
【００５３】
上記で調製した種々の化粧料又は皮膚外用剤は、細胞増殖促進効果、コラーゲン産生効果に優れ、これを皮膚に適用することにより、きめ・はり・シワが改善すると同時に肌色を明るくし、抗老化作用を示すものであった。また、副作用がなく保存安定性に優れるものであった。
【００５４】
以下、本発明の細胞増殖促進剤、コラーゲン産生促進剤、抗シワ剤を食品に配合する場合における配合例を示す。尚、本発明は以下の配合例に限定されない。
【００５５】
参考例８：錠剤
（成分）                                                          （質量％）
１．乳糖                                                            ２４．０
２．結晶セルロース                                                  ２０．０
３．コーンスターチ                                                  １５．０
４．パラ−ヒドロキシ桂皮酸                                            ５．０
５．グリセリン脂肪酸エステル                                          ５．０
６．二酸化ケイ素                                                      １．０
７．デキストリン                                                      残量
【００５６】
Ａ.成分１〜７を均一に混合し、常法に従って錠剤を得た。
【００５７】
実施例９：清涼飲料
（成分）                                                          （質量％）
１．果糖ブドウ糖液糖                                                ３０．０   
２．乳化剤                                                            ０．５
３．パラ−アセトキシ桂皮酸                                            １．０
４．香料                                                              適量 
５．精製水                                                            残量
【００５８】
Ａ.成分１〜５を均一に混合し、常法に従って清涼飲料を得た。
【００５９】
これらの食品、飲料は線維芽細胞の賦活効果、コラーゲン産生促進効果、および抗シワ効果を有し、優れた効果を示すものであった。
【図１】
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【図２】
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