(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
３’末端がＤＮＡであるｓｉＲＮＡを検出する方法において、以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む方法：
（ａ）検出しようとするｓｉＲＮＡの少なくとも一方の鎖の３’ＤＮＡ末端にポリデオキシアデノシン（ポリｄＡ）を付加し、ポリｄＡ付加ＲＮＡを生成する工程、
（ｂ）工程（ａ）によって生成されたポリｄＡ付加ＲＮＡにタグ配列を５’側に有するポリデオキシチミジン（ポリｄＴ）プライマーをアニーリングさせ、当該プライマーからの逆転写反応を行ってＤＮＡを合成する工程、及び
（ｃ）工程（ｂ）によって合成されたＤＮＡを検出する工程。
【請求項２】
工程（ｃ）において、合成されたＤＮＡの検出が核酸増幅法により実施される請求項１記載の方法。
【請求項３】
工程（ｃ）において、合成されたＤＮＡを定量し、工程（ａ）におけるｓｉＲＮＡの量が算出される請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記ポリｄＡの付加が、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴＤＴ）によって行われる、請求項１〜３いずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記工程（ｃ）が、前記ＤＮＡを鋳型とし、タグ配列と相同な配列を含むプライマー及び前記ｓｉＲＮＡのポリｄＡが付加された鎖と相同な配列を含むプライマーを使用してＰＣＲを実施する工程である、請求項２記載の方法。
【請求項６】
前記５’側にタグ配列を有するポリｄＴプライマーが、３’末端から５’末端方向に、ｓｉＲＮＡのＤＮＡ配列に相補的な配列、ポリｄＴ配列、タグ配列を含むプライマーである、請求項１記載の方法。
【請求項７】
ｄＡＴＰ、ＴＤＴ、逆転写酵素、５’側にタグ配列を有するポリｄＴプライマー、タグ配列と相同な配列を含むプライマーを含む、３’末端がＤＮＡであるｓｉＲＮＡを検出するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、３’末端がＤＮＡであるｓｉＲＮＡの検出方法、当該方法に使用するキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、低分子二本鎖ＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ  ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ：ｄｓＲＮＡ）を利用する遺伝子工学的手法が報告されている。
その代表的技術であるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ：ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）は、ｄｓＲＮＡによってその塩基配列特異的にｍＲＮＡが分解され、当該ｍＲＮＡにコードされるポリペプチドの発現が抑制される現象である。このようにｄｓＲＮＡによって遺伝子のサイレンシングができることがわかった発端は、線虫におけるアンチセンスを用いた研究からであった。１９９８年にＦｉｒｅらは、ｄｓＲＮＡが遺伝子サイレンシングの本体であり、アンチセンスＲＮＡ及びセンスＲＮＡは遺伝子の発現を抑制できないこと、またアンチセンスＲＮＡとセンスＲＮＡをアニールさせたｄｓＲＮＡが効率よく遺伝子の発現を抑制できることを明らかにした。前記ＲＮＡ干渉においては、Ｄｉｃｅｒと呼ばれる酵素がｄｓＲＮＡから小分子のＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ：ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）を生成させる。
【０００３】
細胞の細胞質内で起こるこの生物現象は、分子生物学的な研究ツールとして、また、医薬品の標的タンパクを探索する創薬研究などの目的のために広く使われている。一方、細胞内に人為的に送り込まれたｄｓＲＮＡは、たとえ低濃度であっても、厳密に特定するタンパク質のコピー数を抑えることができることから、合成したｄｓＲＮＡを核酸医薬品として利用しようとする医薬品開発が進められている。
上記の合成ｄｓＲＮＡとしては、哺乳類動物細胞におけるインターフェロン応答抑制の観点から、通常１５〜２５塩基対の鎖長の一本鎖ＲＮＡからなるｄｓＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）が選択される。また、各鎖の３’末端側が２〜４塩基突出したｄｓＲＮＡが使用されることが多く、さらにこの突出末端部分をＴ（チミン）特にｄＴ（デオキシチミジン）としたものがよく使用されている。
ｄｓＲＮＡを医薬として開発するためには、生体内動態（組織への分布の状況、代謝速度等）の解明等も行われなければならない。しかしながら、特定分子種の低分子ＲＮＡを対象とした検出、測定技術は確立されていないのが現状である。
【０００４】
突出末端部分がＤＮＡで構成された、すなわち３’末端がＤＮＡであるｓｉＲＮＡを検出する方法として、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴＤＴ）を使用してｓｉＲＮＡの３’末端ＤＮＡにポリデオキシグアノシン（ポリｄＧ）を付加させ、生じたポリｄＧ部分にアニールするポリデオキシシチジン（ポリｄＣ）プライマーを使用する逆転写反応によりｃＤＮＡ合成を行い、この後ＰＣＲを行う方法が開発されている（例えば特許文献１）。特許文献１では、ｓｉＲＮＡの３’末端へ付加するヌクレオチドは、内因性のｍＲＮＡのポリＡテイルと区別できることからポリｄＧが望ましいとされている。このように、細胞など生体試料中に大量に存在するｍＲＮＡから微量のｓｉＲＮＡを検出するためには、ｓｉＲＮＡの３’末端へのポリデオキシアデノシン（ポリｄＡ）の付加は避けるべきことが知られている。さらに、同文献にはｓｉＲＮＡの３’末端へのポリｄＣ及びポリデオキシチミジン（ポリｄＴ）の付加はテイリングされる鎖長の制御が困難であるため、ポリｄＧが望ましいことが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２００９／０９８９８８号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、合成ｓｉＲＮＡ、例えば３’末端がＤＮＡであるｓｉＲＮＡを精度よく簡便に検出する方法及びこの方法に使用するキットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った。本発明者らは、３’末端がＤＮＡであるｓｉＲＮＡの検出において、ｓｉＲＮＡの３’末端にポリｄＡを付加させることにより、大量のｍＲＮＡの存在下においても、更にｓｉＲＮＡを特異的に精度よく簡便に検出する方法を開発することに成功し、本発明を完成させた。
【０００８】
すなわち本発明を概説すれば、
［１］３’末端がＤＮＡであるｓｉＲＮＡを検出する方法において、以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む方法：
（ａ）検出しようとするｓｉＲＮＡの少なくとも一方の鎖の３’ＤＮＡ末端にポリデオキシアデノシン（ポリｄＡ）を付加し、ポリｄＡ付加ＲＮＡを生成する工程、
（ｂ）工程（ａ）によって生成されたポリｄＡ付加ＲＮＡにタグ配列を５’側に有するポリデオキシチミジン（ポリｄＴ）プライマーをアニーリングさせ、当該プライマーからの逆転写反応を行ってＤＮＡを合成する工程、及び
（ｃ）工程（ｂ）によって合成されたＤＮＡを検出する工程、
［２］工程（ｃ）において、合成されたＤＮＡの検出が核酸増幅法により実施される［１］記載の方法、
［３］工程（ｃ）において、合成されたＤＮＡを定量し、工程（ａ）におけるｓｉＲＮＡの量が算出される［１］又は［２］記載の方法、
［４］前記ポリｄＡの付加が、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴＤＴ）によって行われる、［１］〜［３］いずれか１項に記載の方法、
［５］前記工程（ｃ）が、前記ＤＮＡを鋳型とし、タグ配列と相同な配列を含むプライマー及び前記ｓｉＲＮＡのポリｄＡが付加された鎖と相同な配列を含むプライマーを使用してＰＣＲを実施する工程である、［２］記載の方法、
［６］前記５’側にタグ配列を有するポリｄＴプライマーが、３’末端から５’末端方向に、ｓｉＲＮＡのＤＮＡ配列に相補的な配列、ポリｄＴ配列、タグ配列を含むプライマーである、［１］記載の方法、
［７］ｄＡＴＰ、ＴＤＴ、逆転写酵素、５’側にタグ配列を有するポリｄＴプライマー、タグ配列と相同な配列を含むプライマーを含む、３’末端がＤＮＡであるｓｉＲＮＡを検出するためのキット、に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の方法により、合成された３’末端がＤＮＡであるｓｉＲＮＡを特異的かつ簡便に検出し、さらにその量を測定することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の方法と従来の方法により３’末端がＤＮＡであるｓｉＲＮＡを定量し、得られたＣｔ値より作成した検量線を示す図である。
【図２】本発明の方法により３’末端がＤＮＡであるｓｉＲＮＡを定量し、得られたＣｔ値より作成した検量線を示す図である。
【図３】本発明の方法により３’末端がＤＮＡであるｓｉＲＮＡをトータルＲＮＡ存在下で定量し、得られたＣｔ値より作成した検量線を示す図である。
【図４】本発明の３’末端がＤＮＡであるｓｉＲＮＡの検出方法の一例を模式的に示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本明細書において「ｓｉＲＮＡ」とは、１０〜５０塩基対の二本鎖領域を有するＲＮＡをいい、通常、その５’末端にリン酸、３’末端に水酸基を有している。末端は平滑末端を形成するか、もしくは１〜４塩基突出した３’末端を有している。一般に化学合成されたｓｉＲＮＡは、３’末端にＤＮＡが突出（オーバーハング）した構造であることが多く、この突出部分のＤＮＡはｄＴ（デオキシチミン残基）であることが多い。前記ｓｉＲＮＡはその製法により限定されることはなく、化学合成又は生化学的手法で人工的合成されたもの、生物体内で生成したもののいずれであってもよい。
【００１２】
本明細書において「５’側に有する」とは、ある特定の配列領域が配列全体の中央より５’末端に偏って存在することを意味する。「３’側に有する」はその逆である。
【００１３】
本明細書において「タグ配列」とは、様々なアッセイにおいてタグ配列を有する分子を、タグ配列を有しない分子から選別しやすくするために、独自に設定される配列を意味する。タグ配列は、前記の目的に適した鎖長、配列であれば特に限定はなく、任意の配列を使用することができる。例えば、シーケンスプライマーやこれらのプライマー配列を含むベクターが多数製品化されており、これらのプライマーの標的配列をタグ配列として使用することができる。
【００１４】
（１）本発明のｓｉＲＮＡを検出する方法
本発明は、３’末端がＤＮＡであるｓｉＲＮＡを検出する方法において、以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む方法である。
（ａ）検出しようとするｓｉＲＮＡの少なくとも一方の鎖の３’ＤＮＡ末端にポリデオキシアデノシン（ポリｄＡ）を付加し、ポリｄＡ付加ＲＮＡを生成する工程、
（ｂ）工程（ａ）によって生成されたポリｄＡ付加ＲＮＡにタグ配列を５’側に有するポリデオキシチミジン（ポリｄＴ）プライマーをアニーリングさせ、当該プライマーからの逆転写反応を行ってＤＮＡを合成する工程、
（ｃ）工程（ｂ）によって合成されたＤＮＡを検出する工程。
【００１５】
本発明の方法が検出するｓｉＲＮＡは、３’末端がＤＮＡであるｓｉＲＮＡである。ｓｉＲＮＡに含まれるＤＮＡの塩基種及び塩基数は特に制限されず、ｄＡ、ｄＴ、ｄＣ、ｄＧ、ｄＵの任意の塩基であり、その塩基数は１〜４塩基、好ましくは２塩基である。ｓｉＲＮＡの３’末端のＤＮＡ部分は突出部を形成していてもよく、平滑末端を形成していてもよい。いずれのｓｉＲＮＡであっても、３’末端がＤＮＡであれば本発明の方法を用いて検出することが可能である。本発明の方法は、検出しようとするｓｉＲＮＡの鎖の長さに特に限定はないが、例えば１０〜１００塩基、好ましくは１５〜５０塩基、特に好ましくは１９〜３０塩基のｓｉＲＮＡを検出することができる。
【００１６】
一般に化学合成されたｓｉＲＮＡは、３’末端にｄＴが突出した構造であることが多く、本発明の方法においては、このようなｓｉＲＮＡを好適に検出することができる。また、オーバーハングを構成する塩基の長さも特に制限されないが、通常は、１〜４塩基であり、好ましくは２塩基である。オーバーハングを構成する塩基は、全てＤＮＡであってもよく、３’末端がＤＮＡであれば３’末端以外の塩基がＲＮＡであってもよい。本発明において好ましくは、３’末端にｄＴが２塩基突出した構造のｓｉＲＮＡを検出する方法である。
【００１７】
本発明の方法によれば、２ｆＭ〜２００ｎＭのｓｉＲＮＡ、特に２０ｆＭ〜２ｎＭのｓｉＲＮＡを精度よく簡便に測定することが可能である。
【００１８】
本発明の方法で細胞や生体に由来する試料中のｓｉＲＮＡを検出することにより、細胞や生体へ投与されたｓｉＲＮＡの動態を調べることができる。ｓｉＲＮＡは短い二本鎖ＲＮＡであること、体液中又は臓器中に分布する濃度が低いことから正確な検出が困難であった。本発明の方法は、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡなど大量のＲＮＡが混在する試料であっても、３’末端のＤＮＡを指標としてｓｉＲＮＡをこれらと区別し、細胞中、組織中、器官中、体液中に分布するｓｉＲＮＡを定性的に検出し、さらに定量的に検出することが可能である。
【００１９】
＜工程（ａ）＞
工程（ａ）において、検出しようとするｓｉＲＮＡの少なくとも一方の鎖の３’ＤＮＡ末端にポリｄＡを付加し、ポリｄＡ付加ｓｉＲＮＡを生成させる。ｓｉＲＮＡの３’ＤＮＡ末端へ付加させるポリｄＡの長さは特に制限されないが、例えば１０〜３０塩基、好ましくは１５〜２５塩基の長さである。ポリｄＡの付加は、ＤＮＡ末端へｄＡＴＰ（アデノシン三リン酸）を付加させる活性を有する酵素を使用してポリｄＡテイリング反応により達成される。例えば、ＴＤＴとｄＡＴＰを使用して、テイリング反応を実施することができる。ＴＤＴによるポリｄＡのテイリング反応は、ＴＤＴの由来と付加するポリｄＡの長さに応じて、適宜酵素濃度、反応バッファー組成を調節すればよく、市販されるＴＤＴには推奨される反応条件が示されている。
【００２０】
なお、上記工程（ａ）において、二本鎖の状態のｓｉＲＮＡにポリｄＡを付加してもよく、一本鎖の状態に遊離したｓｉＲＮＡの一方の鎖にポリｄＡを付加してもよい。
【００２１】
＜工程（ｂ）＞
工程（ｂ）において、工程（ａ）によって生成されたポリｄＡ付加ＲＮＡを鋳型として、タグ配列を５’側に有するポリｄＴプライマーをアニーリングさせ、当該プライマーからの逆転写反応を行ってＤＮＡを合成する。タグ配列を５’側に有するポリｄＴプライマーは、３’末端から５’末端の方向に、ポリｄＴ配列領域及びタグ配列領域を有する。前記プライマーは各領域の３’末端及び／又は５’末端に任意の配列をさらに有していても良い。
【００２２】
ポリｄＴ配列領域は、デオキシチミジンのホモポリマーであり、ポリｄＡ付加ｓｉＲＮＡのポリｄＡ配列領域にアニールする。ポリｄＴ配列領域の全体がポリｄＡにアニーリングする必要はなく、逆転写反応が可能であればポリｄＡ領域の一部分及び／又はポリｄＴ配列領域の一部分がアニーリングしてもよい。ポリｄＴ配列領域の塩基長は、例えば５〜４０塩基、好ましくは１０〜３０塩基である。本発明の一態様として、ポリｄＴ配列領域の３’末端に、ｓｉＲＮＡの３’末端を含むＤＮＡ配列に相補的な配列を有するプライマーを使用することができる。すなわち、３’末端から５’末端方向に、検出しようとするｓｉＲＮＡのＤＮＡ配列に相補的な配列、ポリｄＴ配列、タグ配列を含むプライマーを使用することができる。例えば、３’末端にｄＴが２塩基突出した構造のｓｉＲＮＡの場合、ｓｉＲＮＡのＤＮＡ配列に相補的な配列はｄＡ−ｄＡとなる。このようなプライマーは、ポリｄＡ付加ｓｉＲＮＡにアニールする位置が定まり、後に続く逆転写反応の特異性が向上する。
【００２３】
タグ配列の鎖長及び塩基の並びは特に制限されないが、タグ配列は、工程（ｂ）に続く工程（ｃ）において使用するプライマーの配列と相同な配列となることから、通常、ＰＣＲ用プライマーとして利用可能な程度の長さであることが好ましい。例えば、タグ配列の塩基長は、約１０〜３０塩基、好ましくは約１５〜２５塩基である。通常、検出しようとするｓｉＲＮＡの配列と類似した配列や自己相補的な配列を含まないタグ配列が好ましい。
【００２４】
タグ配列を５’側に有するポリｄＴプライマーは、ポリｄＴ配列領域が工程（ａ）のポリｄＡ付加ｓｉＲＮＡのｄＡ領域とアニーリングして逆転写反応のプライマーとして機能し、ポリｄＡが付加したｓｉＲＮＡの鎖を鋳型として、プライマーの３’末端からＤＮＡが伸長する。タグ配列を５’側に有するポリｄＴプライマーとポリｄＡ付加ｓｉＲＮＡのアニーリングは、一般的な手法によって適宜実施することが可能であるが、例えば、７０℃で１０分間保持した後に氷冷することにより実施してもよい。
【００２５】
逆転写反応は、当業者であれば、逆転写酵素を利用した一般的な手法によって適宜実施することが可能であり、その種類は特に限定されない。逆転写酵素は逆転写活性、すなわちＲＮＡを鋳型としてこれに相補的なＤＮＡを合成する活性を有するものであれば本発明に使用でき、このような逆転写酵素としては、モロニーマウス白血病ウイルス由来逆転写酵素（ＭＭＬＶ由来逆転写酵素）やトリ骨髄芽球症ウイルス由来逆転写酵素（ＡＭＶ由来逆転写酵素）等のウイルス由来の逆転写酵素、サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ等）や好熱性バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｃａ  ＤＮＡポリメラーゼ等）等の真正細菌由来の耐熱性の逆転写酵素が例示される。逆転写反応のための市販の試薬又はキット等も適宜利用することができる。
【００２６】
逆転写反応の反応条件は使用する逆転写酵素に応じて適宜設定することができる。例えば、ＭＭＬＶ由来逆転写酵素を使用する場合は、４２℃で６０分間保持する反応条件で実施することができる。また、逆転写反応後、逆転写酵素を失活させても良い。逆転写酵素の失活は熱処理又は化学的処理により実施される。熱処理は熱感受性逆転写酵素を使用する場合に実施することができ、例えば８５℃で５分間処理する。化学的処理は、例えばフェノール−クロロホルム処理等、公知の方法が挙げられる。
【００２７】
以上の逆転写反応により、３’末端から５’末端方向に、ｓｉＲＮＡの一方の鎖に対応するｃＤＮＡ、ポリｄＴ、タグ配列を含む構造のＤＮＡが合成される。
【００２８】
＜工程（ｃ）＞
本発明の工程（ｃ）は、工程（ｂ）によって合成されたＤＮＡを検出する工程である。当該ＤＮＡを検出する方法は当技術分野の一般的な手法が使用できる。本工程においてｓｉＲＮＡに由来するＤＮＡが検出された場合、本発明が適用された試料中にｓｉＲＮＡが存在することが示される。更にＤＮＡを検出・定量することにより、前記試料中に存在するｓｉＲＮＡの量を知ることができる。例えば、合成されたＤＮＡの検出を核酸増幅法により実施することができる。前記ＤＮＡを鋳型とした核酸増幅反応を実施し、増幅産物の有無を調べることにより、ｓｉＲＮＡを検出することができる。さらに、例えば前記増幅産物の量と増幅効率に基づいて工程（ａ）に供されたｓｉＲＮＡの量を算出することができる。すなわち、本発明により試料中のｓｉＲＮＡの定性的及び定量的検出方法が提供される。
【００２９】
核酸増幅法は公知の技術、例えば、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）、Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｎｄ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ（ＩＣＡＮ）、Ｌｏｏｐ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＬＡＭＰ）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＮＡＳＢＡ）、Ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＳＤＡ）、Ｌｉｇａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＬＣＲ）、Ｒｏｌｌｉｎｇ  Ｃｉｒｃｌｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ法（ＲＣＡ法）、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＴＭＡ）などの方法を用いることができる。
【００３０】
以下、ＰＣＲを例に説明する。一般に、ＰＣＲは鋳型となるＤＮＡの末端領域にアニーリングするプライマー対を用いて実施される。鋳型となるＤＮＡは一本鎖であっても二本鎖であっても実施することが可能である。ＤＮＡを増幅するためのプライマーは、当業者であれば鋳型となるＤＮＡの配列情報に基づいて容易に設計及び合成することが可能である。本発明の一態様として、例えばタグ配列と相同な配列を含むプライマー及びｓｉＲＮＡのポリＡが付加された鎖と相同な配列を含むプライマーからなるプライマー対を使用することができる。ｓｉＲＮＡのポリＡが付加された鎖と相同な配列とは、ｓｉＲＮＡのポリＡが付加された鎖の全長に相同な配列及びその一部分に相同な配列を含む。例えば、ｓｉＲＮＡのセンス鎖を検出する場合は、３’突出部のＤＮＡ配列を除き、センス鎖の配列のｒＡはｄＡ、ｒＧはｄＧ、ｒＣはｄＣ、ｒＵはｄＴに置き換えた配列又はその一部を有するセンス鎖特異的プライマーが使用できる。同様に、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖を検出する場合は、３’突出部のＤＮＡ配列を除き、アンチセンス鎖の配列のｒＡはｄＡ、ｒＧはｄＧ、ｒＣはｄＣ、ｒＵはｄＴに置き換えた配列又はその一部を有するアンチセンス鎖特異的プライマーが使用できる。これらのｓｉＲＮＡに特異的プライマーを使用することにより、配列特異的にｓｉＲＮＡを検出することが可能となる。また、これらのセンス鎖及びアンチセンス鎖特異的プライマーは、いずれか一方を使用してもよく、両方を使用してもよい。本明細書において「相同な配列」とは、同一又は類似の配列を有することを意味する。一般に、ＰＣＲにおいてプライマーとして機能するオリゴヌクレオチドは、鋳型にアニーリングしてその３’末端からＤＮＡが伸長可能なものであり、プライマーの３’末端と鋳型がアニーリングすることが重要である。つまり、プライマーと鋳型は必ずしも完全にアニーリングする必要が無いことが当技術分野で知られている。本明細書において、ある配列に相同な配列は、当該ある配列の相補的な配列にアニーリング可能な配列であり、例えば２０塩基の配列に数個の相補的ではない塩基を含む配列同士であっても、アニーリングすれば相同な配列と言える。ある配列同士がアニーリングするかどうかを確認する方法は、当技術分野において一般的な方法である。プライマーを設計するためのプログラムソフトウエアが多数開発されており、配列同士がアニーリングするか容易に予測することが可能である。また、実際にオリゴヌクレオチドを合成してアニーリングを確認することも容易である。
上記のＰＣＲによりＤＮＡ断片（増幅産物）の生成が検出された場合に、被検試料中に目的のｓｉＲＮＡが存在するものと判定される。公知の方法によりＰＣＲ、ならびに増幅産物の検出を実施することができ、市販されている試薬及びキット等を適宜利用することができる。
【００３１】
前記ＰＣＲには定量ＰＣＲ、特にリアルタイムＰＣＲを利用することができる。例えば、既知量のｓｉＲＮＡに本発明の方法を適用し、増幅されるＤＮＡ量やＣｔ値をもとに作成した検量線に基づいて、試料中の検出しようとするｓｉＲＮＡの量を定量することが可能である。リアルタイムＰＣＲにはインターカレーターを使用する方法、プローブ（Ｔａｑｍａｎプローブ、サイクリングプローブ等）を使用する方法等が知られているが、いずれの方法も本発明に使用することができる。これらのＰＣＲは、当技術分野において良く知られている技術であり、市販の試薬又はキット等も適宜利用することができる。
【００３２】
工程（ｃ）におけるＤＮＡを検出する方法として、前記核酸増幅法の他に、検出プローブによる測定（ドットブロットハイブリダイゼーション法、サザンハイブリダイゼーション法等）、アレイ解析法等による検出が挙げられる。また、タグ配列を利用して工程（ｂ）で合成されたＤＮＡを一般的な核酸検出方法、例えば電気泳動法によって検出することができる。
【００３３】
（２）本発明のｓｉＲＮＡを検出するためのキット
本発明は、前記（１）の検出方法を実施するためのキットを提供する。当該キットには、ｄＡＴＰ、ＴＤＴ、逆転写酵素、５’側にタグ配列を有するポリｄＴプライマー、タグ配列と相同な配列を含むプライマーが含まれる。
【００３４】
本発明のキットは、さらに本発明の検出方法に使用する試薬類を含むことができる。例えば、ＴＤＴの反応バッファー、逆転写酵素の反応バッファー、ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒを含むキットが挙げられる。ＴＤＴの反応バッファーはｄＡＴＰを含有するものが好適である。以上の試薬の他、対照となるｓｉＲＮＡ、対照となるｓｉＲＮＡの一方の鎖と相同な配列を含むプライマー、取扱説明書等をさらに含むことができる。
【００３５】
本発明のキットは、さらに前記（１）の工程（ｃ）で使用するＤＮＡの検出のための試薬を含むことができる。前記試薬としては、例えば核酸増幅法に使用可能なＤＮＡポリメラーゼやその反応バッファーが例示される。
【実施例】
【００３６】
以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３７】
実施例１  ポリｄＧ付加反応を利用した合成ｓｉＲＮＡ定量法との比較
合成ｓｉＲＮＡの定量法として報告のあるポリｄＧ付加反応を利用した人工合成ｓｉＲＮＡの定量法と本発明の方法を比較した。
（１）ｓｉＲＮＡの調製
それぞれ配列番号１及び配列番号２に示される配列からなる２つのＲＮＡ鎖で構成されるＧＬ３−ｓｉＲＮＡ（タカラバイオ社製）の溶液を２００ｎＭとなるように調製した。なお、このｓｉＲＮＡは、３’末端の２塩基はｄＴであり、それ以外はリボヌクレオチドである。このｓｉＲＮＡ溶液を１０倍ずつ希釈し、２ｆＭまで段階的に希釈した。
【００３８】
（２）ＤＮＡ付加反応
ＴＤＴによる合成ｓｉＲＮＡの３’末端へのデオキシヌクレオチド付加反応を行った。この反応の基質にｄＡＴＰを使用することで、ポリｄＡ付加を行うことができ、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）を使用することでポリｄＧ付加を行うことができる。
【００３９】
実施例１−（１）で調製した各濃度ｓｉＲＮＡ溶液５μＬ、１４Ｕ／μＬ  ＴＤＴ（タカラバイオ社製）１μＬ、添付の５×ＴＤＴ  Ｂｕｆｆｅｒを５μＬ、１０ｍＭ  ｄＡＴＰ又はｄＧＴＰ（タカラバイオ社製）５μＬ、４０Ｕ／μＬ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（タカラバイオ社製）１μＬを含む反応溶液２５μＬを調製し、３７℃で３０分間保温した。
【００４０】
（３）逆転写反応
実施例１−（２）でポリｄＡ付加反応を行った反応液５μＬに、６μＭ  オリゴｄＴプライマー（配列番号３）５μＬ添加し、全量を１０μＬにした上で、７０℃、５分の熱処理後、氷上で急冷してアニーリングさせた。前記オリゴｄＴプライマーは３’末端に２４塩基のポリｄＴ配列領域、５’末端にＰＣＲ増幅を行うためのタグ配列を有する。
【００４１】
一方、実施例１−（２）でポリｄＧ付加反応を行った反応液にも６μＭ  オリゴｄＣプライマー（配列番号６）５μＬ添加し、同様にアニーリングさせた。前記オリゴｄＣプライマーは３’末端に１７塩基のポリｄＣ領域、５’末端にＰＣＲ増幅を行うためのタグ配列を有する。
アニーリングさせた反応液を、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）  ＲＴ  ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ（Ｐｅｒｆｅｃｔ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ）（タカラバイオ社製）を使用して４２℃、１５分で逆転写反応を行った後、８５℃、５秒で逆転写酵素を失活させる条件で、一本鎖のＤＮＡを合成した。
【００４２】
（４）ｓｉＲＮＡの増幅及び検出
実施例１−（３）で調製したＤＮＡを鋳型にＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ（商標）（Ｐｅｒｆｅｃｔ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ）（タカラバイオ社製）を使用してリアルタイムＰＣＲを行った。このＰＣＲ増幅にはタグ配列プライマー（配列番号４）とｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖由来プライマー（配列番号５）を使用した。
【００４３】
図１にリアルタイムＰＣＲにより得られたＣｔ値（核酸増幅量がある一定量に達する時の温度サイクル数）とｓｉＲＮＡの量から作成した検量線を示す。実線はポリｄＡ付加反応を利用して定量した結果を示し、破線はポリｄＧ付加反応を利用して定量した結果を示す。ＰＣＲ増幅効率はそれぞれの検量線の傾きより求めた。ポリｄＧ付加反応を利用したｓｉＲＮＡの定量法と比較して、ポリｄＡ付加反応を利用したｓｉＲＮＡ定量法の方が小さいＣｔ値が得られ、またＰＣＲ増幅効率も１００パーセントに近い値が得られ、理想的なＰＣＲ増幅が行われていることが示された。このことは、ポリｄＡ付加反応を利用したｓｉＲＮＡ定量法、すなわち本発明の方法はより広い範囲である６×１０１１コピー（２００ｎＭ）から６×１０３コピー（２ｆＭ）のｓｉＲＮＡを検出可能であることを示し、著しい検出感度の向上を達成した。理想的なＰＣＲ増幅さらには幅広い濃度範囲で検出が可能なことから、本発明の方法は検出精度が高く、信頼性の高いｓｉＲＮＡの検出方法であることが示された。
【００４４】
実施例２  ポリｄＡ付加による合成ｓｉＲＮＡの定量例
配列番号７及び配列番号８に示される配列を有するＰＬＫ１−ｓｉＲＮＡ、並びに配列番号９及び配列番号１０に示される配列を有するＭｅｔＬｕｃ２−ｓｉＲＮＡを合成し、実施例１−（１）のｓｉＲＮＡ溶液の調製及び（２）のＤＮＡ付加反応と同様の方法によりポリｄＡ付加反応を行った。
【００４５】
続いてポリｄＡ付加反応を行った反応液５μＬに、６μＭ  オリゴｄＴプライマー（ＡＡ）（配列番号１３）５μＬ添加し、全量を１０μＬにした上で、７０℃、５分の熱処理後、氷上で急冷しアニーリングさせた。本実験例で使用したｓｉＲＮＡは３’末端にｄＴが２塩基突出した構造を有するため、３’末端にｄＴの２塩基突出に相補的な配列ｄＡ−ｄＡを有する前記オリゴｄＴプライマー（ＡＡ）は１つの定められた位置にアニーリングすることができる。前記オリゴｄＴプライマー（ＡＡ）は、さらに２４塩基のポリｄＴ領域、５’末端にＰＣＲ増幅を行うためのタグ配列領域を有する。
アニーリングさせた反応液を、ＢｌｕｅＰｒｉｎｔ（登録商標）  ＲＴ  ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ（ｆｏｒ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ）（タカラバイオ社製）を使用して４２℃、１５分で逆転写反応を行った後、８５℃、５秒で逆転写酵素失活させる条件で、一本鎖のＤＮＡを合成した。
【００４６】
調製したＤＮＡを鋳型として、実施例１−（４）と同様にリアルタイムＰＣＲを行った。リアルタイムＰＣＲに使用したｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖由来プライマーを配列番号１１（ＰＬＫ１−ｓｉＲＮＡ）及び配列番号１２（ＭｅｔＬｕｃ２−ｓｉＲＮＡ）に示す。得られたＣｔ値より検量線を作成した。この検量線を図２に示す。図２より、これらのｓｉＲＮＡを使用した場合でも６×１０９（２ｎＭ）から６×１０４コピー（２０ｆＭ）のｓｉＲＮＡを検出可能であり、実施例１と同様に幅広い定量範囲であった。
【００４７】
実施例３  トータルＲＮＡ含有サンプルにおけるｓｉＲＮＡの定量例
トータルＲＮＡ中に存在する低分子ＲＮＡやｍＲＮＡなどポリＡを有するＲＮＡによる反応系へ影響を確認するため、一定量のトータルＲＮＡが含まれる条件で人工合成ｓｉＲＮＡを定量した。
【００４８】
実施例１−（１）のｓｉＲＮＡ調製と同様の方法でＧＬ３−ｓｉＲＮＡの希釈系列を作成した。なお、希釈には４０ｎｇ／μＬ  ＮＩＨ３Ｔ３細胞由来のトータルＲＮＡ溶液を使用し、ＤＮＡ付加反応に使用するｓｉＲＮＡ溶液５μＬあたり２００ｎｇのトータルＲＮＡを加えた。
その後、実施例２と同様の方法で一本鎖のＤＮＡを合成し、続いて実施例１−（４）のｓｉＲＮＡの増幅及び検出と同様の方法でリアルタイムＰＣＲを行った。
得られたＣｔ値より検量線を作成した。この検量線を図３に示す。図３より、トータルＲＮＡを加えていないコントロールと比較して、トータルＲＮＡによる反応系への影響はほとんど観察されず、ポリＡを有する夾雑ＲＮＡを含有するサンプルの場合でも６×１０９（２ｎＭ）から６×１０４（２０ｆＭ）コピーのｓｉＲＮＡを検出可能であり、実施例１と同様に幅広い検出範囲であった。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
本発明により、合成ｓｉＲＮＡ、例えば３’末端がＤＮＡであるｓｉＲＮＡを精度よく簡便に検出する方法及びこの方法に使用するキットが提供される。本発明は、細胞中や生体中のｓｉＲＮＡを検出する方法に使用され、基礎研究、医療への応用研究分野において極めて有用である。
【配列表フリーテキスト】
【００５０】
SEQ ID NO:1: Synthetic oligonucleotide GL3-siRNA. Nucleotides 1 to 19 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides.
SEQ ID NO:2: Synthetic oligonucleotide GL3-siRNA. Nucleotides 1 to 19 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides.
SEQ ID NO:3: poly dA primer with tag sequence.
SEQ ID NO:4: Tag sequence primer.
SEQ ID NO:5: Antisense primer for GL3-siRNA.
SEQ ID NO:6: poly dC primer with tag sequence.
SEQ ID NO:7: Synthetic oligonucleotide PLK1-siRNA. Nucleotides 1 to 19 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides.
SEQ ID NO:8: Synthetic oligonucleotide PLK1-siRNA. Nucleotides 1 to 19 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides.
SEQ ID NO:9: Synthetic oligonucleotide MetLuc-siRNA. Nucleotides 1 to 19 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides.
SEQ ID NO:10: Synthetic oligonucleotide MetLuc-siRNA. Nucleotides 1 to 19 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides.
SEQ ID NO:11: Antisense primer for PLK1-siRNA
SEQ ID NO:12: Antisense primer for MetLuc-siRNA
SEQ ID NO:13: Oligo dT primer(AA)
【図１】
0005887078.tif 000002
【図２】
0005887078.tif 000003
【図３】
0005887078.tif 000004
【図４】
0005887078.tif 000005
【配列表】
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