(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体において認知機能障害疾患の有無を検出する方法であって、個体から得られた生体サンプル中のアセチル化タウポリペプチドのレベルを検出するステップを含み、正常な対照レベルよりも高いアセチル化タウポリペプチドのレベルが、個体が認知機能障害疾患を有することを示す方法。
【請求項２】
生体サンプルが、脳脊髄液、血液、血漿または血清である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
タウオパチーを治療するための候補薬剤を同定する方法であって、
ａ）アセチルトランスフェラーゼおよびタウポリペプチドを含むサンプルを、試験薬剤と接触させるステップと、
ｂ）タウポリペプチドのアセチル化に対する試験薬剤の効果を調べるステップと
を含み、タウポリペプチドのアセチル化を低減する試験薬剤が、タウオパチーを治療するための候補薬剤であることを示す方法。
【請求項４】
タウオパチーを治療するための候補薬剤を同定する方法であって、
ａ）脱アセチル化酵素およびタウポリペプチドを含むサンプルを、試験薬剤と接触させるステップと、
ｂ）タウポリペプチドのアセチル化に対する試験薬剤の効果を調べるステップと
を含み、タウポリペプチドの脱アセチル化を増大する試験薬剤が、タウオパチーを治療するための候補薬剤であることを示す方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる、２００９年１１月６日に出願された米国仮特許出願第６１／２５８，８２２号の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
神経変性疾患とは、中年から高齢期に発症するような、重篤な、進行性の認知障害および運動機能障害もたらす、遺伝性および後天性の神経障害の不均一な群を表す。認知症の最も一般的な原因は、アルツハイマー病である。アルツハイマー病の症例の５％未満において、遺伝性因子が関与しており、症例の残りは弧発性である。
【０００３】
タウタンパク質は、中枢神経系において発現され、細胞内微小管ネットワークを安定化することによって神経構造において重要な役割を果たす。末端切断、過剰リン酸化によってか、または６種の天然に存在するタウアイソフォーム間のバランスを崩すことのいずれかによって、タウタンパク質の生理学的役割が損なわれることが、神経原線維変化（ＮＦＴ）、変性神経突起およびニューロピルスレッドの形成につながる。これらの構造は、アルツハイマー病（ＡＤ）の超微細構造的特徴に相当する。これらの構造の主要なタンパク質サブユニットは、微小管結合タンパク質タウである。ＡＤ患者の剖検において見出されるＮＦＴの量は、知性の低下を含む臨床症状と相関する。したがって、タウタンパク質は、ＡＤの病理において重要な役割を果たす。タウ遺伝子中の特定の突然変異の、染色体１７に関連するパーキンソニズムを伴う疾患、前頭側頭型認知症（ＦＴＤＰ−１７）との同時分離という最近の発見によって、タウタンパク質における特定の異常が、罹患個体における神経変性および認知症の根本的な原因であり得ることが確認された。
【０００４】
当技術分野では、タウオパチーを治療する方法が必要である。
【０００５】
文献
米国特許出願公開第２００９／０１１７５４３号；同第２００８／０１９４８０３号；同第２００６／００２５３３７号。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
細胞中のアセチル化タウポリペプチドのレベルを低下させるための方法および薬剤が提供される。個体においてタウオパチーを治療する方法も提供される。また、個体において認知機能障害疾患を診断する方法も提供される。タウオパチーを治療するのに適した薬剤を同定する方法も提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでのタウのアセチル化を表す図である。図１Ｂは、配列番号１を表す図である。
【図２】ｐ３００アセチルトランスフェラーゼによるタウのアセチル化を表す図である。
【図３】ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養におけるＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２およびＨＤＡＣ６によるタウの脱アセチル化を表す図である。
【図４】ｉｎ  ｖｉｔｒｏニューロンおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおけるタウアセチル化のＳＩＲＴ１媒介性低減を表す図である。図４Ｄは、配列番号５２を表す図である。
【図５】タウとのＳＩＲＴ１相互作用を表す図である。
【図６】タウ代謝回転およびタウユビキチン化に対するアセチル化の効果を表す図である。
【図７】病的状態下でのタウアセチル化の上昇を表す図である。
【図８】ｐ−タウに対するタウアセチル化の低減の効果を表す図である。
【図９】ヒトタウアイソフォームアミノ酸配列のアミノ酸配列アラインメントを表す図である。
【図１０】ラット、マウスおよびヒトタウ（アイソフォーム２）アミノ酸配列のアミノ酸配列アラインメントを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
定義
本明細書で使用する場合、用語「治療」、「治療すること」などは、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることを指す。効果は、疾患もしくはその症状を完全に、もしくは部分的に防ぐという点で予防的であり得る、かつ／または疾患および／もしくは疾患に起因する悪影響の部分的もしくは完全な治癒という点で治療的であり得る。本明細書で使用する場合、「治療」とは、哺乳類における、例えば、ヒトにおける疾患の任意の治療を対象とし、（ａ）疾患の素因がある可能性があるが、まだそれに罹っているとは診断されていない対象において疾患が発生するのを防ぐこと、（ｂ）疾患を阻害すること、すなわち、その進行を停止すること、（ｃ）疾患を軽減すること、例えば、疾患の退縮を引き起こして、例えば、疾患の症状を完全または部分的に除去することを含む。
【０００９】
用語「有効な量」または「治療上有効な量」とは、治療されている病状の治療のために提供するのに、そうでなければ、所望の効果（例えば、有効な免疫応答の誘導、慢性免疫機能亢進の低減など）を提供するのに十分な投与量を意味する。正確な投与量は、対象依存性変数（例えば、体重、年齢など）、疾患および達成される治療などの種々の因子に従って変わるであろう。
【００１０】
本明細書において同義的に使用される、用語「個体」、「宿主」、「対象」および「患者」とは、それだけには限らないが、マウス、ウサギ類、非ヒト霊長類、ヒトなどを含む哺乳類を指す。いくつかの実施形態では、個体は、ヒトである。いくつかの実施形態では、個体は、げっ歯類（例えば、マウス、ラットなど）またはウサギ類である。
【００１１】
「医薬上許容される賦形剤」、「医薬上許容される希釈剤」、「医薬上許容される担体」および「医薬上許容されるアジュバント」とは、一般に、安全で、非毒性で、生物学的にも、それでなくとも、望ましくないものではない、医薬組成物の調製において有用である賦形剤、希釈剤、担体およびアジュバントを意味し、獣医学的使用ならびにヒト製薬学的使用に許容される賦形剤、希釈剤、担体およびアジュバントが挙げられる。明細書および特許請求の範囲において使用される「医薬上許容される賦形剤、希釈剤、担体およびアジュバント」は、１種および２種以上のこのような賦形剤、希釈剤、担体およびアジュバントを含む。
【００１２】
本明細書で使用する場合、「医薬組成物」は、哺乳類、例えば、ヒトなどの対象へ投与するのに適した組成物を包含するものとすることを意味する。一般に、「医薬組成物」は、無菌であり、対象内で望ましくない反応を誘発できる汚染物質を含まない（例えば、医薬組成物中の化合物（類）は、製薬等級である）。医薬組成物は、経口、頬側、直腸、非経口、腹腔内、皮内、気管内などを含むいくつかの異なる投与経路によって、それを必要とする対象または患者へ投与するために設計できる。いくつかの実施形態では、組成物は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）以外の浸透促進剤を使用する経皮経路による投与に適している。その他の実施形態では、医薬組成物は、経皮投与以外の経路による投与に適している。医薬組成物は、いくつかの実施形態では、化合物と、医薬上許容される賦形剤とを含むであろう。いくつかの実施形態では、医薬上許容される賦形剤は、ＤＭＳＯ以外である。
【００１３】
本明細書で使用する場合、本発明の化合物の「医薬上許容される誘導体」は、その塩、エステル、エノールエーテル、エノールエステル、アセタール、ケタール、オルトエステル、ヘミアセタール、ヘミケタール、酸、塩基、溶媒和物、水和物またはプロドラッグを含む。このような誘導体は、このような誘導体化のための既知の方法を使用して、当業者によって容易に調製できる。製造された化合物は、実質的な毒性作用を伴わずに動物またはヒトに投与でき、医薬上活性であるか、プロドラッグであるかのいずれかである。
【００１４】
化合物の「医薬上許容される塩」とは、医薬上許容され、親化合物の所望の薬理学的活性を有する塩を意味する。このような塩として、（１）塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などといった無機酸を用いて形成されるか、もしくは酢酸、プロピオン酸、ヘキサン酸、シクロペンタンプロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、乳酸、マロン酸、コハク酸、リンゴ酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、３−（４−ヒドロキシベンゾイル）安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、１，２−エタンジスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、４−クロロベンゼンスルホン酸、２−ナフタレンスルホン酸、４−トルエンスルホン酸、カンファースルホン酸、グルコヘプタン酸、４，４’−メチレンビス−（３−ヒドロキシ−２−エン−１−カルボン酸）、３−フェニルプロピオン酸、トリメチル酢酸、第三級ブチル酢酸、ラウリル硫酸、グルコン酸、グルタミン酸、ヒドロキシナフトエ酸、サリチル酸、ステアリン酸、ムコン酸などといった有機酸を用いて形成される酸付加塩；または（２）親化合物中に存在する酸性プロトンが、金属イオン、例えば、アルカリ金属イオン、アルカリ土類イオンもしくはアルミニウムイオンによって置換されるか、または、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トロメタミン、Ｎ−メチルグルカミンなどといった有機塩基を配位させるかのいずれかの場合に形成される塩が挙げられる。
【００１５】
本発明をさらに説明する前に、本発明は、記載される特定の実施形態に制限されず、そのようなものとして、当然変わり得ることは理解されるべきである。また、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ制限されるので、本明細書に使用される技術用語は、単に、特定の実施形態を説明する目的のためのものであって、制限されることを意図しないということも理解されるべきである。
【００１６】
値の範囲が提供される場合には、その範囲の上限と下限の間の、文脈が明確に他を示さない限り、下限の単位の１０分の１までの各介在値、および記載される任意のその他の値またはその記載される範囲中の介在値は、本発明内に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限および下限は、独立に、より小さい範囲中に含まれてよく、また本発明内に包含され、記載された範囲中の任意の具体的に除外される限界に制約される。記載された範囲が、限界の一方または両方を含む場合には、それらの含まれる限界のいずれかまたは両方を除外する範囲も本発明中に含まれる。
【００１７】
特に断りのない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。本発明の実施または試験においては、本明細書に記載されるものと類似または同等の任意の方法および材料も使用できるが、好ましい方法および材料をここで記載する。本明細書に記載されるすべての刊行物は、刊行物が引用されているものと関連して、方法および／または材料を開示および記載するために参照によって本明細書に組み込まれる。
【００１８】
本明細書で使用する場合、および添付の特許請求の範囲において使用する場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が他を明確に示さない限り、複数の指示対象を含むということは注記しなければならない。したがって、例えば、「タウポリペプチド」への言及は、複数のタウポリペプチドを含み、「薬剤」への言及は、１種または複数の薬剤および当業者に公知のその同等物などへの言及を含む。さらに、特許請求の範囲は、任意の任意選択要素を除外するよう書かれ得るということを注記する。そのようなものとして、この記載は、「単独で」、「単に」などといった排他的技術用語を、特許請求の範囲の要素の記述と関連して使用するための、または「負の」制限を使用するための先行詞として役立つものとする。
【００１９】
本明細書で議論される刊行物は、本願の出願日に先行するその開示内容について単独で提供される。本明細書において、本発明が、先行発明のために、このような刊行物に先行する資格がないという容認として何も解釈されるべきではない。さらに。提供される刊行物の日付は実際の公開日とは異なる場合があり、これは、独立に確認される必要があり得る。
【００２０】
細胞中のアセチル化タウポリペプチドのレベルを低下させる方法および薬剤が提供される。個体においてタウオパチーを治療する方法も提供される。また、個体において認知機能障害疾患を診断する方法も提供される。タウオパチーを治療するのに適した薬剤を同定する方法も提供される。
【００２１】
以下の観察を行なった：１）タウがアセチル化される；２）初期のアルツハイマー病（例えば、軽度の認知機能障害）患者においてタウのアセチル化が増加する；３）疾患においてタウのアセチル化が、タウのリン酸化に先行する；４）タウが、ヒストン脱アセチル化酵素（例えば、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＨＤＡＣ６）によって脱アセチル化される；５）タウが、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（例えば、ｐ３００）によってアセチル化される。タウのアセチル化を阻害する薬剤およびアセチル化タウを脱アセチル化する薬剤が、タウを産生する細胞中の、例えば、ニューロンまたはグリア細胞中のアセチル化タウのレベルを低下させるのに適している。このような薬剤は、個体においてタウオパチーを治療するのに有用である。
【００２２】
アセチル化タウのレベルは、認知機能障害疾患の診断手段を提供でき、タウオパチーの治療に対する応答についてのマーカーとして役立ち得る。従って、アセチル化タウに特異的な抗体は、提供される種々の診断アッセイにおいて有用である。
【００２３】
タウオパチーの治療において使用するための候補薬剤の同定は、アセチル化タウの脱アセチル化を増大する薬剤を同定することによって、またはタウのアセチル化を阻害する薬剤を同定することによって実施できる。したがって、本開示内容は、タウオパチーを治療するのに適した薬剤を同定する方法を提供する。
【００２４】
神経細胞中のアセチル化タウポリペプチドのレベルを低下させる方法
本開示内容は、細胞（例えば、タウを正常に産生する細胞、例えば、ニューロンまたはグリア細胞）中のアセチル化タウ（Ａｃ−タウ）ポリペプチドのレベルを低下させる方法を提供する。本方法は、概して、細胞（例えば、神経細胞またはグリア細胞）を、細胞中のＡｃ−タウポリペプチドのレベルを低下させる薬剤、例えば、細胞中のＡｃ−タウポリペプチドを脱アセチル化するポリペプチドの活性を高める薬剤；細胞中のタウポリペプチドをアセチル化するポリペプチドの活性を低下させる薬剤などと接触させることを含む。本開示内容は、個体においてタウオパチーを治療する方法を提供する。個体において細胞（例えば、神経細胞またはグリア細胞）中のＡｃ−タウのレベルを低下させる薬剤の有効量を、それを必要とする個体に投与することを含む方法。
【００２５】
タウアミノ酸配列は、当技術分野で公知である。例えば、以下の括弧中のＧｅｎＢａｎｋ受託番号の下で見られるアミノ酸配列を参照のこと：ヒトタウ転写物変異体１  ｍＲＮＡ（ＮＭ＿０１６８３５．３）およびアイソフォーム１タンパク質（ＮＰ＿０５８５１９．２）；ヒトタウ転写物変異体２  ｍＲＮＡ（ＮＭ＿００５９１０．４）およびアイソフォーム２タンパク質（ＮＰ＿００５９０１．２）；ヒトタウ転写物変異体３  ｍＲＮＡ（ＮＭ＿０１６８３４．３）およびアイソフォーム３タンパク質（ＮＰ＿０５８５１８．１）；ヒトタウ転写物変異体４  ｍＲＮＡ（ＮＭ＿０１６８４１．３）およびアイソフォーム４タンパク質（ＮＰ＿０５８５２５．１）；ヒトタウ転写物変異体５  ｍＲＮＡ（ＮＭ＿００１１２３０６７．２）およびアイソフォーム５タンパク質（ＮＰ＿００１１１６５３９．１）；およびヒトタウ転写物変異体６  ｍＲＮＡ（ＮＭ＿００１１２３０６６．２）およびアイソフォーム６タンパク質（ＮＰ＿００１１１６５３８．１）。
【００２６】
例示的タウアミノ酸配列が、図９Ａ〜Ｄ（それぞれ、配列番号：１〜６）に表されており、ここでは、図９Ａ〜Ｄ中の配列は、：ヒトタウアイソフォーム２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００５９０１；配列番号１）；ヒトタウアイソフォーム３（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０５８５１８；配列番号２）；ヒトタウアイソフォーム４（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０５８５２５；配列番号３）；ヒトタウアイソフォーム５（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１１１６５３９；配列番号４）；ヒトタウアイソフォーム１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０５８５１９；配列番号５）；およびヒトタウアイソフォーム６（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１１１６５３８；配列番号６）である。配列番号：１〜６に示されるアミノ酸配列は、図９Ａ〜Ｄにおいてアラインされている。
【００２７】
図１０は、ヒトタウアイソフォーム１（配列番号１）、ラットタウ（配列番号７）およびマウスタウ（配列番号８）のアミノ酸配列アラインメントを表す。
【００２８】
タウポリペプチドは、配列番号：１〜６に示されるアミノ酸配列のいずれか１種の約３５０個の一続きの連続したアミノ酸に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。タウポリペプチドは、配列番号２（ヒトタウアイソフォーム３）に示されるアミノ酸配列のうち、約３５０個のアミノ酸〜約３８３個の一続きの連続したアミノ酸に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。タウポリペプチドは、配列番号４（ヒトタウアイソフォーム５）に示されるアミノ酸配列のうち、約３５０個のアミノ酸〜約４１２個の一続きの連続したアミノ酸に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。タウポリペプチドは、配列番号１（ヒトタウアイソフォーム２）に示されるアミノ酸配列のうち、約３５０個のアミノ酸〜約４００個のアミノ酸または約４００個のアミノ酸〜約４４１個の一続きの連続したアミノ酸に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。タウポリペプチドは、配列番号５（ヒトタウアイソフォーム１）に示されるアミノ酸配列のうち、約３５０個のアミノ酸〜約４００個のアミノ酸、約４００個のアミノ酸〜約５００個のアミノ酸、約５００個のアミノ酸〜約６００個のアミノ酸、約６００個のアミノ酸〜約７００個のアミノ酸または約７００個のアミノ酸〜約７５８個の一続きの連続したアミノ酸に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。タウポリペプチドは、配列番号６（ヒトタウアイソフォーム６）に示されるアミノ酸配列のうち、約３５０個のアミノ酸〜約４００個のアミノ酸、約４００個のアミノ酸〜約５００個のアミノ酸、約５００個のアミノ酸〜約６００個のアミノ酸、約６００個のアミノ酸〜約７００個のアミノ酸または約７００個のアミノ酸〜約７７６個の一続きの連続したアミノ酸に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
【００２９】
図１Ｂは、タウアイソフォーム２ポリペプチド（配列番号１）のアミノ酸配列を提供する。配列番号１に示され、図１Ｂに示されるアミノ酸配列のチューブリン結合領域は、アミノ酸２４３〜２７４、アミノ酸２７５〜３０５およびアミノ酸３３７〜３６８を含む。その他のタウポリペプチド中の対応するチューブリン結合領域は、実験的に、または図１２Ａ〜Ｄに示されるアミノ酸配列アラインメントを調べることによって容易に決定できる。
【００３０】
タウアイソフォーム２ポリペプチド（例えば、図１Ｂに表され、配列番号１に示されるような）の可能なリン酸化部位として、以下のアミノ酸：４６、５０、６９、１１１、１２３、１５３、１７５、１８１、１９５、１９８、１９９、２０２、２０５、２０８、２１０、２１２、２１４、２１７、２３１、２３５、２３７、２３８、２５８、２６２、２９３、３０５、３２０、３２４、３５２、３５６、３７３、３９４、３９６、４００、４０４、４０９、４１２、４１３、４１６および４２２が挙げられる。例えば、タウポリペプチドのセリン残基４６、１９９、２０２、２３５、２６２、３９６、４０４および４２２のうち１つもしくは複数ならびに／またはトレオニン残基５０、６９、１１１、１５３、１７５、１８１、２０５、２１２、２１７および２３１のうち１つまたは複数がリン酸化され得る。その他のタウポリペプチド中の対応するリン酸化部位は、実験的に、または図９Ａ〜Ｄおよび図１０に示されるアミノ酸配列アラインメントを調べることによって容易に決定できる。
【００３１】
タウポリペプチドは、約３５０個のアミノ酸〜約７８０個のアミノ酸、例えば、約３５０個のアミノ酸〜約３８５個のアミノ酸、約３８５個のアミノ酸〜約４１５個のアミノ酸、約４１５個のアミノ酸〜約４４５個のアミノ酸、約４４５個のアミノ酸〜約７６０個のアミノ酸または約７６０個のアミノ酸〜約７８０個のアミノ酸の長さを有し得る。いくつかの実施形態では、タウポリペプチドは、３５２個のアミノ酸、３８３個のアミノ酸、４１２個のアミノ酸、４４１個のアミノ酸、７５８個のアミノ酸または７７６個のアミノ酸の長さを有する。
【００３２】
タウポリペプチド上のいくつかのリシン（Ｌｙｓ）残基が、アセチル化され得る。例えば、タウアイソフォーム２は、それだけには限らないが、Ｌｙｓ−１６３、Ｌｙｓ−１７４、Ｌｙｓ−１８０、Ｌｙｓ−１９０、Ｌｙｓ−２６７、Ｌｙｓ−２７４、Ｌｙｓ−２８１、Ｌｙｓ−３６９およびＬｙｓ−３８５（例えば、図１Ｂに表され、配列番号１に示されるアミノ酸配列の）を含む１個または複数のアミノ酸でアセチル化され得る。その他のタウポリペプチド中の対応するアセチル化部位は、実験的に（例えば、実施例に記載されるように）、または図９Ａ〜Ｄに示されるアミノ酸配列アラインメントを調べることによって容易に決定できる。例えば、図９Ａ〜Ｄに示されるように、タウアイソフォーム２のＬｙｓ−１６３は、タウアイソフォーム３のアミノ酸１０５、タウアイソフォーム４のアミノ酸１０５、タウアイソフォーム５のアミノ酸１３４、タウアイソフォーム６のアミノ酸４８０およびタウアイソフォーム１のアミノ酸５８０に対応する。
【００３３】
いくつかの実施形態では、アセチル化タウポリペプチドは、タウアイソフォーム２ポリペプチドのＬｙｓ−１６３、Ｌｙｓ−１７４、Ｌｙｓ−１８０、Ｌｙｓ−１９０、Ｌｙｓ−２６７、Ｌｙｓ−２７４、Ｌｙｓ−２８１、Ｌｙｓ−３６９およびＬｙｓ−３８５または異なるタウアイソフォーム中の対応するリシン残基のうち２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つまたは９つでアセチル化される。いくつかの実施形態では、アセチル化タウポリペプチドは、タウアイソフォーム２ポリペプチドのアセチル化Ｌｙｓ−１６３、アセチル化Ｌｙｓ−１７４およびアセチル化Ｌｙｓ−１９０または異なるタウアイソフォーム中の対応するリシン残基を含む。いくつかの実施形態では、アセチル化タウポリペプチドは、タウアイソフォーム２ポリペプチドのアセチル化Ｌｙｓ−１６３、アセチル化Ｌｙｓ−１７４、アセチル化Ｌｙｓ−１８０、アセチル化Ｌｙｓ−１９０、アセチル化Ｌｙｓ−２６７、アセチル化Ｌｙｓ２７４、アセチル化Ｌｙｓ−２８１、アセチル化Ｌｙｓ−３６９およびアセチル化Ｌｙｓ−３８５または異なるタウアイソフォーム中の対応するリシン残基を含む。
【００３４】
タウを正常に産生する細胞（例えば、神経細胞、グリア細胞）中のアセチル化タウポリペプチドのレベルを低下させる薬剤として、細胞中のアセチル化タウポリペプチドのレベルを、薬剤の不在下での細胞中のアセチル化タウポリペプチドのレベルと比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％または８０％超低下させる薬剤が挙げられる。
【００３５】
細胞中（例えば、ニューロンまたはグリア細胞などの、タウを正常に産生する細胞中）のアセチル化タウポリペプチドのレベルの低下は、リン酸化タウのレベルの低下および／または総タウのレベルの低下をもたらし得る。したがって、いくつかの実施形態では、細胞中の（例えば、ニューロンまたはグリア細胞などのタウを正常に産生する細胞中の）アセチル化タウポリペプチドのレベルを低下させる薬剤はまた、細胞中のリン酸化タウポリペプチドのレベルも低下させる。タウを正常に産生する細胞（例えば、神経細胞、グリア細胞）中のアセチル化タウポリペプチドのレベルを低下させる薬剤は、いくつかの実施形態では、細胞中のリン酸化タウのレベルを、薬剤の不在下での細胞中のリン酸化タウのレベルと比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％または８０％超低下させる。
【００３６】
細胞中（例えば、ニューロンまたはグリア細胞などの、タウを正常に産生する細胞中）のアセチル化タウポリペプチドのレベルの低下は、総タウのレベルの低下をもたらし得る。したがって、いくつかの実施形態では、細胞中の（例えば、ニューロンまたはグリア細胞などのタウを正常に産生する細胞中の）アセチル化タウポリペプチドのレベルを低下させる薬剤はまた、細胞中の総タウポリペプチドのレベルも低下させる。タウを正常に産生する細胞（例えば、神経細胞、グリア細胞）中のアセチル化タウポリペプチドのレベルを低下させる薬剤は、いくつかの実施形態では、細胞中の総タウのレベルを、薬剤の不在下での細胞中の総タウのレベルと比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％または８０％超低下させる。
【００３７】
細胞中の（例えば、ニューロンまたはグリア細胞などのタウを正常に産生する細胞中の）アセチル化タウポリペプチドのレベルの低下は、タウポリペプチドの生物活性の増大をもたらし得る。したがって、いくつかの実施形態では、細胞中の（例えば、ニューロンまたはグリア細胞などのタウを正常に産生する細胞中の）アセチル化タウポリペプチドのレベルを低下させる薬剤はまた、細胞中のタウポリペプチドの生物活性も増大させる。タウを正常に産生する細胞（例えば、神経細胞、グリア細胞）中のアセチル化タウポリペプチドのレベルを低下させる薬剤は、いくつかの実施形態では、細胞中の活性タウポリペプチドのレベルを、薬剤の不在下での細胞中の活性タウポリペプチドのレベルと比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約５倍、少なくとも約７倍、少なくとも約１０倍または１０倍超増大させる。タウ生物活性は、例えば、微小管の安定化を含む。
【００３８】
タウ脱アセチル化を増大する薬剤
タウ脱アセチル化を増大する薬剤として、アセチル化タウポリペプチドを脱アセチル化するポリペプチドの活性を増大する薬剤が挙げられる。アセチル化タウポリペプチドを脱アセチル化するポリペプチドとして、例えば、ヒストン脱アセチル化酵素、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＨＤＡＣ６などが挙げられる。アセチル化タウポリペプチドを脱アセチル化するポリペプチドの活性を増大する薬剤として、例えば、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２およびＨＤＡＣ６のうち１種または複数の活性を増大する薬剤が挙げられる。アセチル化タウポリペプチドを脱アセチル化するポリペプチドの活性を増大する薬剤としてまた、このようなポリペプチドのタンパク質レベルを増大する薬剤、例えば、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＨＤＡＣ６などをコードするヌクレオチド配列を含む核酸が挙げられる。
【００３９】
ＳＩＲＴ１
ＳＩＲＴ１（（サイレント接合型情報調節２相同体）１としても知られる（Ｓ．セレビシエ(cerevisiae)））遺伝子は、タンパク質のサーチュインファミリーのメンバー、酵母Ｓｉｒ２タンパク質の相同体をコードする。サーチュインファミリーのメンバーは、サーチュインコアドメインを特徴とし、４種のクラスにグループ分けされる。この遺伝子によってコードされるタンパク質は、サーチュインファミリーのクラスＩに含まれる。選択的スプライシングによって、複数の転写バリアントが得られる。転写バリアント１（ＮＭ＿０１２２３８．４）は、より長い転写物に相当し、より長いアイソフォーム（ＮＰ＿０３６３７０．２）をコードする。転写バリアント２（ＮＭ＿００１１４２４９８．１）は、アイソフォームｂ（ＮＰ＿００１１３５９７０．１）をコードする。
【００４０】
ＳＩＲＴ１ポリペプチドとして、タウを産生する細胞（例えば、神経細胞および／またはグリア細胞）において、アセチル化タウポリペプチドを脱アセチル化し、配列番号９に示されるアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＨ１２４９９；ヒトＳＩＲＴ１）のうちの、約４００個のアミノ酸〜約４５０個のアミノ酸または約４５０個のアミノ酸〜約５５５個の一続きの連続したアミノ酸に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられる。ＳＩＲＴ１ポリペプチドとして、タウを産生する細胞（例えば、神経細胞および／またはグリア細胞）において、アセチル化タウポリペプチドを脱アセチル化し、配列番号１０に示されるアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＰ＿０３６３７０；ヒトＳＩＲＴ１アイソフォームａ）のうちの、約５００個のアミノ酸〜約６００個のアミノ酸、約６００個のアミノ酸〜約７００個のアミノ酸または約７００個のアミノ酸〜約７４７個の一続きの連続したアミノ酸に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられる。ＳＩＲＴ１ポリペプチドとして、タウを産生する細胞（例えば、神経細胞および／またはグリア細胞）において、アセチル化タウポリペプチドを脱アセチル化し、配列番号１１に示されるアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＰ＿００１１３５９７０；ヒトＳＩＲＴ１アイソフォームｂ）の約３００個のアミノ酸〜約４００個のアミノ酸または約４００個のアミノ酸〜約４５２個の一続きの連続したアミノ酸に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられる。
【００４１】
ＳＩＲＴ１アクチベーター
いくつかのＳＩＲＴ１アクチベーターが、当技術分野で公知である。適したＳＩＲＴ１アクチベーターは、ＳＩＲＴ１ポリペプチドの酵素活性（例えば、ニューロンまたはグリア細胞中のアセチル化タウポリペプチドを脱アセチル化することにおけるＳＩＲＴ１ポリペプチドの酵素活性）を、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍または２０倍超増大し得る。いくつかの実施形態では、ＳＩＲＴ１アクチベーターは、ＳＩＲＴ１選択的アクチベーターである。
【００４２】
適したＳＩＲＴ１アクチベーターは、約１ｎＭ〜約１ｍＭ、例えば、約１ｎＭ〜約１０ｎＭ、約１０ｎＭ〜約１５ｎＭ、約１５ｎＭ〜約２５ｎＭ、約２５ｎＭ〜約５０ｎＭ、約５０ｎＭ〜約７５ｎＭ、約７５ｎＭ〜約１００ｎＭ、約１００ｎＭ〜約１５０ｎＭ、約１５０ｎＭ〜約２００ｎＭ、約２００ｎＭ〜約２５０ｎＭ、約２５０ｎＭ〜約３００ｎＭ、約３００ｎＭ〜約３５０ｎＭ、約３５０ｎＭ〜約４００ｎＭ、約４００ｎＭ〜約４５０ｎＭ、約４５０ｎＭ〜約５００ｎＭ、約５００ｎＭ〜約７５０ｎＭ、約７５０ｎＭ〜約１μＭ、約１μＭ〜約１０μＭ、約１０μＭ〜約２５μＭ、約２５μＭ〜約５０μＭ、約５０μＭ〜約７５μＭ、約７５μＭ〜約１００μＭ、約１００μＭ〜約２５０μＭ、約２５０μＭ〜約５００μＭまたは約５００μＭ〜約１ｍＭのＥＣ５０（半数効果濃度）でのＳＩＲＴ１酵素活性を増大し得る。
【００４３】
主題方法において使用するのに適しているＳＩＲＴ１アクチベーターの例として、それだけには限らないが、レスベラトロール（（Ｅ）−５−（ｐ−ヒドロキシスチリル）レゾルシノール（Ｅ）−５−（４−ヒドロキシスチリル）ベンゼン−１，３−ジオール）；または３，５，４’−トリヒドロキシ−トランス−スチルベン）；ブテイン（３，４，２’，４’−テトラヒドロキシカルコン）；ピセタノール（３，５，３’，４’−テトラヒドロキシ−トランス−スチルベン）；イソリキリチゲニン（４，２’，４’−トリヒドロキシカルコン）；フィセチン（３，７，３’，４’−テトラヒドロキシフラボン）；ケルセチン（３，５，７，３’，４’−ペンタヒドロキシフラボン）；米国特許第７，３４５，１７８号に記載されるＳＩＲＴ１アクチベーター；米国特許出願公開第２００８／０２５５５３８２号に記載されるＳＩＲＴ１アクチベーター；および米国特許出願公開第２００９／００１２０８０号に記載されるＳＩＲＴ１アクチベーターが挙げられる。上述のＳＩＲＴ１アクチベーターのいずれかの医薬上許容される塩も、主題方法において使用するのに適している。
【００４４】
例えば、適したＳＩＲＴ１アクチベーターとして、化合物がＳＩＲＴ１活性を活性化するという条件で、米国特許第７，３４５，１７８号に記載される式Ｉ〜ＸＸＶＩＩＩのいずれか１種の化合物（置換基は、米国特許第７，３４５，１７８号に記載されている）または米国特許第７，３４５，１７８号に記載される式Ｉ〜ＸＸＶＩＩＩのいずれか１種の化合物の医薬上許容される塩がある。例えば、適したＳＩＲＴ１アクチベーターとして、米国特許第７，３４５，１７８号の表４に示される化合物が挙げられる。
【００４５】
例えば、適したＳＩＲＴ１アクチベーターを、以下の表１に示す。
【００４６】
【表１】
0005851409.tif 000002
0005851409.tif 000003
0005851409.tif 000004
0005851409.tif 000005
0005851409.tif 000006
0005851409.tif 000007
0005851409.tif 000008
0005851409.tif 000009
0005851409.tif 000010
0005851409.tif 000011
0005851409.tif 000012
0005851409.tif 000013
0005851409.tif 000014
0005851409.tif 000015
0005851409.tif 000016
0005851409.tif 000017
0005851409.tif 000018
0005851409.tif 000019
0005851409.tif 000020
0005851409.tif 000021
0005851409.tif 000022
0005851409.tif 000023
0005851409.tif 000024
0005851409.tif 000025
0005851409.tif 000026
0005851409.tif 000027
0005851409.tif 000028
0005851409.tif 000029
0005851409.tif 000030
0005851409.tif 000031
0005851409.tif 000032
0005851409.tif 000033
0005851409.tif 000034
0005851409.tif 000035
0005851409.tif 000036
0005851409.tif 000037
0005851409.tif 000038
0005851409.tif 000039
0005851409.tif 000040
0005851409.tif 000041
0005851409.tif 000042
0005851409.tif 000043
0005851409.tif 000044
0005851409.tif 000045
0005851409.tif 000046
0005851409.tif 000047
0005851409.tif 000048
0005851409.tif 000049
0005851409.tif 000050
0005851409.tif 000051
0005851409.tif 000052
0005851409.tif 000053
0005851409.tif 000054
0005851409.tif 000055
0005851409.tif 000056
0005851409.tif 000057
0005851409.tif 000058
0005851409.tif 000059
0005851409.tif 000060
0005851409.tif 000061
0005851409.tif 000062
0005851409.tif 000063
0005851409.tif 000064
0005851409.tif 000065
0005851409.tif 000066
0005851409.tif 000067
0005851409.tif 000068
0005851409.tif 000069
0005851409.tif 000070
0005851409.tif 000071
0005851409.tif 000072
0005851409.tif 000073
0005851409.tif 000074
0005851409.tif 000075
0005851409.tif 000076
0005851409.tif 000077
0005851409.tif 000078
0005851409.tif 000079
0005851409.tif 000080
0005851409.tif 000081
0005851409.tif 000082
0005851409.tif 000083
0005851409.tif 000084
0005851409.tif 000085
【００４７】
適したＳＩＲＴ１アクチベーターの限定されない例として、例えば、
【００４８】
【化１】
0005851409.tif 000086
が挙げられる。
【００４９】
その他の適したＳＩＲＴ１アクチベーターとして、例えば、
【００５０】
【化２】
0005851409.tif 000087
が挙げられる。
【００５１】
ＳＲＴ１７２０、ＳＲＴ１４６０およびＳＲＴ２１８３は、選択的ＳＩＲＴ１アクチベーターである。例えば、Ｍｉｌｎｅら（２００７年）Ｎａｔｕｒｅ  ４５０：７１２頁参照のこと。
【００５２】
キノキサリン化合物であるＳＩＲＴ１アクチベーターも使用するのに適している。適したキノキサリンＳＩＲＴ１アクチベーターとして、例えば、３−ベンゼンスルホニル−１−（４−フルオロ−フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］キノキサリン−２イルアミン；２−アミノ−１−（２−エチル−フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］キノキサリン−３−カルボン酸（テトラヒドロ−フラン−２−イルメチル）−アミン；２−アミノ−１−（３−メトキシ−プロピル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］キノキサリン−３−カルボン酸シクロペンチルアミドが挙げられる。例えば、Ｎａｙａｇａｍら（２００６年）Ｊ．Ｂｉｏｌｍｏｌｅｃ．Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ１１：９５９頁参照のこと。
【００５３】
その他の適したＳＩＲＴ１アクチベーターとして、例えば、スチルベン化合物、例えば、米国特許出願公開第２００８／０２５５３８２号に記載されるような、例えば、レスベラトロールのエステル類似体が挙げられる。例えば、適したＳＩＲＴ１アクチベーターとして、例えば、３，５，４’−トリヒドロキシ−トランス−スチルベンのエステル類似体が挙げられる。
【００５４】
【化３】
0005851409.tif 000088
【００５５】
エステル類似体として、次式：
【００５６】
【化４】
0005851409.tif 000089
［式中、各Ｙおよび各Ｚは、独立に、−Ｏ（エーテル）、−Ｏ−Ｃ＝Ｏ、−Ｃ＝Ｏ−Ｏ（エステル）、−Ｏ−Ｃ＝Ｏ−Ｏ（炭酸塩）、−Ｏ−Ｃ＝Ｏ−ＮＨ、−Ｏ＝Ｏ−ＮＲ、−ＮＨ−Ｃ＝Ｏ−Ｏ、−ＮＲ−Ｃ＝Ｏ−Ｏ（カルバメート）、−ＮＨ−Ｃ＝Ｐ、−ＮＲ−Ｃ＝Ｏ、−Ｃ＝Ｏ−ＮＨ、−Ｃ＝Ｏ−ＮＲ（第一級および第二級アミド）−ＮＨ、−ＮＲ（第一級および第二級アミン）、−Ｎ（複素環式環）、−Ｓ（チオールエーテル）、およびハロゲンであり；
各ｎおよび各ｍは、独立に、１、２、３、４または５であり；
各Ａおよび各Ｂは、独立に、Ｈ、Ｒであるか、または存在せず；
各Ｖおよび各Ｗは、独立に、Ｈ、１〜６個の炭素原子の直鎖または分岐アルキル、３〜８個の炭素原子のシクロアルキル、アルコキシ、フェニル、ベンジルまたはハロゲンであり、
Ｒは、少なくとも１個の炭素原子を有するアルキル、アリールまたはアラルキルである］
の化合物が挙げられる。
【００５７】
適したＳＩＲＴ１アクチベーターとして、例えば、４’−アセトキシ−３，５−ビス（メトキシメトキシ）スチルベン；４’−アセトキシ−３，５−ジヒドロキシスチルベン；３，５−ジアセトキシ−４’−クロロアセトキシスチルベン；３，５−ジアセトキシ−４’−ヒドロキシスチルベン；３，４’−ジアセトキシ−５−ヒドロキシスチルベン；３−アセトキシ−４’５−ジヒドロキシスチルベン；および３，４，５’−トリアセトキシスチルベンが挙げられる。
【００５８】
適したＳＩＲＴ１アクチベーターとして、米国特許出願公開第２００９／００１２０８０号に記載される式Ｉ〜ＶＩのいずれか１種の化合物が挙げられる。例えば、適したＳＩＲＴ１アクチベーターとして、次式：
【００５９】
【化５】
0005851409.tif 000090
で示される化合物がある。
【００６０】
例えば、適したＳＩＲＴ１アクチベーターとして、４−メチル−Ｎ−（２（３−モルホリノメチル）イミダゾール［２，１−ｂ］チアゾール−６−イル）フェニル）−２−（ピリシン−３−イル）チアゾール−５−カルボキサミドまたはその医薬上許容される塩がある。
【００６１】
特定の場合には、Ａｃ−タウレベルを低下させる薬剤は、ＳＩＲＴ１アクチベーターではない。
【００６２】
ＨＤＡＣ６
ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）（ＥＣ番号３．５．１）は、ヒストン上のｓ−Ｎ−アセチルリシンアミノ酸からアセチル基を除去する酵素のクラスである。ＨＤＡＣ６（ｍＲＮＡ  ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ＿００６０４４．２、タンパク質ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＰ＿００６０３５．２）は、細胞質、微小管結合酵素である。ＨＤＡＣ６は、チューブリン、Ｈｓｐ９０およびコルタクチンを脱アセチル化し、その他のパートナータンパク質と複合体を形成する。
【００６３】
本明細書に記載されるように、ＨＤＡＣ６は、タウを脱アセチル化する。ＨＤＡＣ６の過剰発現は、Ａｃ−タウのレベルを低下させる。ＨＤＡＣ６の活性を高める薬剤、例えば、ＨＤＡＣ６をコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、主題方法において使用するのに適している。適したＨＤＡＣアクチベーターの限定されない例として、例えば、テオフィリン（３，７−ジヒドロ−１，３−ジメチル−１Ｈ−プリン−２，６−ジオン）；テオフィリン類似体などが挙げられる。
【００６４】
ＳＩＲＴ２
本明細書に記載されるように、ＳＩＲＴ２は、タウを脱アセチル化する。ＳＩＲＴ２の活性を高める薬剤、例えば、ＳＩＲＴ２をコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、主題方法において使用するのに適している。
【００６５】
ＳＩＲＴ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、当技術分野で公知である。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１２２３７（ヒト）；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０２２４３２（マウス）；ＮＭ＿００１００８３６８．１（ラット）；およびＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＸＭ＿００１１６８３７５．１（チンパンジー）を参照のこと。
【００６６】
タウのアセチル化を阻害する薬剤
タウアセチル化を阻害する薬剤として、タウポリペプチドをアセチル化するポリペプチドの活性を阻害する薬剤が挙げられる。タウポリペプチドをアセチル化するポリペプチドとして、アセチルトランスフェラーゼ、例えば、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、例えば、ｐ３００が挙げられる。タウポリペプチドをアセチル化するポリペプチドの活性を阻害する薬剤として、ｐ３００の活性を阻害する薬剤が挙げられる。特定の場合には、薬剤は、タウのアセチル化においてｐ３００の活性を特異的に阻害する、例えば、薬剤は、セロトニンＮ−アセチルトランスフェラーゼなどの任意のその他のアセチルトランスフェラーゼまたはｐＣＡＦ、ＧＣＮ５（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＣ５０６４１）、Ｒｔｔ１０９、ＳａｓおよびＭＯＺなどのヒストンアセチルトランスフェラーゼを実質的に阻害しない。
【００６７】
ｐ３００
Ｐ３００はまた、Ｅ１Ａ結合タンパク質ｐ３００（ＥＰ３００）としても知られる。ｐ３００（ｍＲＮＡ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１４２９．３；タンパク質、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１４２０．２）は、ヒストンアセチルトランスフェラーゼとして機能する。実施例の節において示されるように、ｐ３００もまた、タウをアセチル化する。
【００６８】
ｐ３００ポリペプチドは、タウをアセチル化するポリペプチドを含み、配列番号１２に示されるアミノ酸配列の約１８００個のアミノ酸〜約２０００個のアミノ酸、約２０００個のアミノ酸〜約２２００個のアミノ酸または約２２００個のアミノ酸〜約２４１４個の一続きの連続したアミノ酸に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００６９】
ｐ３００阻害剤
本明細書に記載されるように、ｐ３００は、タウをアセチル化し、タウ安定性を高め、タウの定常状態レベルの向上をもたらす。ｐ３００の活性を阻害し、主題方法において使用するのに適している薬剤として、それだけには限らないが、イソチアゾロンベースのヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）阻害剤；Ｌｙｓ−ＣｏＡ；リシンと共有結合している、約５個のアミノ酸〜約２０個のアミノ酸の長さのペプチドを含むＬｙｓ−ＣｏＡ誘導体；クルクミン；アナカルジン酸；ガルシノールとして知られるポリプレニル化ベンゾフェノン；ｐ３００特異的ｓｉＲＮＡ；米国特許第６，３６９，０３０号に記載される化合物；米国特許出願公開第２００９／００７６１５５号に記載されるｐ３００阻害剤；Ｍａｉら（２００９年）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１９：１１３２頁に記載される４−ヒドロキシキノリン化合物などが挙げられる。Ｌｙｓ−ＣｏＡの構造は、Ｚｈｅｎｇら（２００５年）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２７：１７１８２頁において化合物１として示されている（以下参照のこと）。いくつかの実施形態では、適したｐ３００阻害剤は、選択的ｐ３００阻害剤である。いくつかの実施形態では、適したｐ３００阻害剤は、細胞透過性である。使用するのに適している細胞透過性の、選択的ｐ３００阻害剤として、Ｚｈｅｎｇら（２００５年）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２７：１７１８２頁に記載されるものが挙げられる。
【００７０】
例えば、適したｐ３００阻害剤として、化合物１〜８が挙げられ、ここで、親の式は、以下である：
【００７１】
【化６】
0005851409.tif 000091
［式中、
化合物１では、Ｒ＝ＯＣ２Ｈ５およびＲ１＝ＣＨ３であり；
化合物２では、Ｒ＝ＯＨおよびＲ１＝ＣＨ３であり；
化合物３では、Ｒ＝ＯＣ２Ｈ５およびＲ１＝Ｃ６Ｈ１１であり；
化合物４では、Ｒ＝ＯＣ２Ｈ５およびＲ１＝Ｃ１０Ｈ２１であり；
化合物５では、Ｒ＝ＯＨおよびＲ１＝Ｃ１０Ｈ２１であり；
化合物６では、Ｒ＝ＯＣ２Ｈ５およびＲ１＝Ｃ１５Ｈ３１であり；かつ
化合物７では、Ｒ＝ＯＨおよびＲ１＝Ｃ１５Ｈ３１である]。
【００７２】
例えば、Ｍａｉら（２００９年）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１９：１１３２頁参照のこと。
【００７３】
例えば、適したｐ３００阻害剤として、次式の以下に示される化合物２〜６が挙げられる：
【００７４】
【化７】
0005851409.tif 000092
［式中、
化合物１（Ｌｙｓ−ＣｏＡ）では、Ｘ＝Ｈであり；
化合物２では、Ｘ＝ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−ＣＯ２Ｈ（配列番号１３）であり；
化合物３では、Ｘ＝ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧＹＫ−ＮＨ２（配列番号１４）であり；
化合物４では、Ｘ＝Ａｈｘ−Ｒ−Ａｈｘ−ＲＲ−Ａｈｘ−ＲＲ−Ａｈｘ−ＲＲ−Ａｈｘ−Ｋ−ＮＨ２（配列番号１５）であり；
化合物５では、Ｘ＝ＧＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＧＫ−ＮＨ２（配列番号１６）であり；かつ
化合物６では、Ｘ＝Ａｈｘ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲ−ＮＨ２（配列番号１７）であり；
Ａｈｘは、６−アミノヘキサン酸である］。
【００７５】
いくつかのｐ３００阻害剤が、当技術分野で公知である。適したｐ３００阻害剤は、ｐ３００ポリペプチドの酵素活性（例えば、タウポリペプチドのアセチル化におけるｐ３００ポリペプチドの活性）を、阻害剤の不在下でのｐ３００ポリペプチドの活性と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％または８０％超低下させ得る。
【００７６】
適したｐ３００阻害剤は、約１ｎＭ〜約１ｍＭ、例えば、約１ｎＭ〜約１０ｎＭ、約１０ｎＭ〜約１５ｎＭ、約１５ｎＭ〜約２５ｎＭ、約２５ｎＭ〜約５０ｎＭ、約５０ｎＭ〜約７５ｎＭ、約７５ｎＭ〜約１００ｎＭ、約１００ｎＭ〜約１５０ｎＭ、約１５０ｎＭ〜約２００ｎＭ、約２００ｎＭ〜約２５０ｎＭ、約２５０ｎＭ〜約３００ｎＭ、約３００ｎＭ〜約３５０ｎＭ、約３５０ｎＭ〜約４００ｎＭ、約４００ｎＭ〜約４５０ｎＭ、約４５０ｎＭ〜約５００ｎＭ、約５００ｎＭ〜約７５０ｎＭ、約７５０ｎＭ〜約１μＭ、約１μＭ〜約１０μＭ、約１０μＭ〜約２５μＭ、約２５μＭ〜約５０μＭ、約５０μＭ〜約７５μＭ、約７５μＭ〜約１００μＭ、約１００μＭ〜約２５０μＭ、約２５０μＭ〜約５００μＭまたは約５００μＭ〜約１ｍＭのＩＣ５０（半数阻害濃度）でｐ３００酵素活性を阻害し得る。
【００７７】
適したｐ３００阻害剤として、Ｃ６４６、Ｃ３７５およびＣ１４６などの化合物が挙げられる。Ｃ６４６、Ｃ３７５およびＣ１４６の構造を以下に示す。
【００７８】
【化８】
0005851409.tif 000093
【００７９】
適したｐ３００阻害剤として、Ｎ−アルキル−およびＮ−アリール−置換イソチアゾロンが挙げられ；このような化合物は、ｐ３００の阻害剤（３５μｍｏｌ／Ｌで３５〜９０％阻害）として同定されている（Ｓｔｉｍｓｏｎら（２００５年１０月１日）  Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  ４：１５２１頁）。これらのＮ置換イソチアゾロンベースの化合物を、表２および３に示す。
【００８０】
【表２】
0005851409.tif 000094
【００８１】
【表３】
0005851409.tif 000095
【００８２】
ＣＢＰ
いくつかの実施形態では、主題方法は、ＣＲＥＢ結合タンパク質（ＣＢＰ）阻害剤の使用を含む。いくつかの実施形態では、ｐ３００阻害剤はまた、ＣＢＰポリペプチドも阻害する。
【００８３】
ＣＢＰポリペプチドは、当技術分野で公知である。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００４３７１．２は、ヒトＣＢＰのアミノ酸配列を提供し；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＸＰ＿５２３２８５．２は、チンパンジーＣＢＰのアミノ酸配列を提供し；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＸＰ＿００１０９５２２５．１は、アカゲザルＣＢＰのアミノ酸配列を提供し；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿５９６８７２．３は、ラットＣＢＰのアミノ酸配列を提供し；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１０２０６０３．１は、マウスＣＢＰのアミノ酸配列を提供する。ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００４３７１．２に示されるアミノ酸配列は、配列番号５３としてここで提供される。
【００８４】
タウオパチーを治療する方法
本開示内容は、個体においてタウオパチーを治療する方法を提供する。有効量の、細胞中のアセチル化タウのレベルを低下させる薬剤、例えば、タウポリペプチドをアセチル化するアセチルトランスフェラーゼのアセチルトランスフェラーゼ活性を阻害する薬剤、アセチル化タウポリペプチドを脱アセチル化する脱アセチル化酵素の脱アセチル化酵素活性を高める薬剤などを、それを必要とする個体に投与することを含む方法。
【００８５】
タウオパチーは、少なくとも部分的には、例えば、神経原線維変化におけるタウタンパク質の病的凝集を特徴とする神経変性疾患である。タウオパチーの例として、前頭側頭型認知症、アルツハイマー病、進行性の核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症、ダウン症候群、ボクサー痴呆、封入体筋炎およびピック病としても知られる前頭側頭葉変性症が挙げられる。例示的タウオパチーとして、タウおよびアミロイド病理の共存を示す疾患、例えば、アルツハイマー病、クロイツフェルト・ヤコブ病、ボクサー痴呆、ダウン症候群、ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー病、封入体筋炎およびプリオンタンパク質脳アミロイド血管症；明確なアミロイド病理を伴わない疾患、例えば、筋萎縮性側索硬化症／パーキンソニズム−認知症コンプレックス、嗜銀性グレイン型認知症、大脳皮質基底核変性症、カルシウム沈着を伴うびまん性神経原線維変化、染色体１７に関連するパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症、ハラーホルデン・スパッツ病、多系統萎縮症、ニーマン・ピック病Ｃ型、ピック病、進行性皮質下神経膠症、進行性核上性麻痺、亜急性硬化性全脳炎およびタングル優位型（ｔａｎｇｌｅ−ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔ）アルツハイマー病が挙げられる。
【００８６】
いくつかの実施形態では、主題方法は、タウポリペプチドのアセチル化を阻害する薬剤を投与することを含む。上記で説明したように、タウアセチル化を低減する薬剤として、タウポリペプチドをアセチル化するポリペプチドの活性を阻害する薬剤が挙げられる。タウポリペプチドをアセチル化するポリペプチドとして、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、例えば、ｐ３００が挙げられる。ｐ３００の活性を阻害するいくつかの薬剤が上記に、例えば、表２に開示されている。
【００８７】
いくつかの実施形態では、主題方法は、Ａｃ−タウポリペプチドの脱アセチル化を増大する薬剤を投与することを含む。上記に論じられるように、タウ脱アセチル化を増大する薬剤として、Ａｃ−タウポリペプチドを脱アセチル化するポリペプチドの活性を高める薬剤が挙げられる。タウを脱アセチル化するポリペプチドとして、例えば、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＨＤＡＣ６などが挙げられる。アセチル化タウポリペプチドを脱アセチル化するポリペプチドの活性を高める薬剤として、例えば、ＳＩＲＴ１の活性を高める薬剤が挙げられる。ＳＩＲＴ１のいくつかのアクチベーターが上記に、例えば、表１に提供されている。アセチル化タウポリペプチドを脱アセチル化するポリペプチドの活性を高める薬剤として、例えば、ＳＩＲＴ２の活性を高める薬剤が挙げられる。アセチル化タウポリペプチドを脱アセチル化するポリペプチドの活性を高める薬剤として、例えば、ＨＤＡＣ６の活性を高める薬剤が挙げられる。
【００８８】
いくつかの実施形態では、主題方法は、タウポリペプチドのアセチル化を阻害する薬剤およびＡｃ−タウポリペプチドの脱アセチル化を増大する薬剤を投与することを含む。タウオパチーの治療において、Ａｃ−タウポリペプチド脱アセチル化を増大する薬剤（単数または複数）およびタウポリペプチドアセチル化を低減する薬剤（単数または複数）の個々の投与に加えて、併用療法を使用してもよい。例えば、ＳＩＲＴ１アクチベーター（またはＳＩＲＴ２アクチベーターまたはＨＤＡＣ６アクチベーター）と、ｐ３００（またはＣＢＰ）阻害剤との組合せを、タウオパチーの治療のための併用療法において使用してもよい。併用療法は、いくつかの実施形態では、単剤療法においてタウ脱アセチル化酵素ポリペプチドまたはタウアセチルトランスフェラーゼの阻害剤を投与することよりも、タウオパチーの治療において有効である。タウポリペプチドのアセチル化を阻害する薬剤および／またはＡｃ−タウポリペプチドの脱アセチル化を増大する薬剤は、本明細書において、「活性薬剤（ａｃｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔｓ）」または「活性薬剤（ａｃｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔ）」と呼ばれる。いくつかの実施形態では、タウポリペプチドのアセチル化を阻害する薬剤およびＡｃ−タウポリペプチドの脱アセチル化を増大する薬剤は、併用療法において投与される場合、相乗作用をもたらす。
【００８９】
個体においてタウオパチーを治療するための主題方法は、概して、個体において、有効量の、神経細胞においてタウポリペプチドのアセチル化を阻害する薬剤および／またはタウを産生する細胞（例えば、神経細胞および／またはグリア細胞）においてＡｃ−タウポリペプチドの脱アセチル化を増大する薬剤を投与することを含む。いくつかの実施形態では、主題方法は、単剤療法、例えば、有効量の単一の活性薬剤、例えば、タウを産生する細胞（例えば、神経細胞および／またはグリア細胞）においてタウポリペプチドのアセチル化を阻害する薬剤を投与することを含む。いくつかの実施形態では、主題方法は、単剤療法、例えば、有効量の単一の活性薬剤、例えば、タウを産生する細胞（例えば、神経細胞および／またはグリア細胞）においてＡｃ−タウポリペプチドの脱アセチル化を増大する薬剤を投与することを含む。いくつかの実施形態では、主題方法は、併用療法、例えば、細胞（例えば、ニューロン；グリア細胞）においてタウポリペプチドのアセチル化を阻害する薬剤と、細胞（例えば、ニューロン；グリア細胞）においてＡｃ−タウポリペプチドの脱アセチル化を増大する薬剤を、組み合わせた有効な量で投与することを含む。
【００９０】
活性薬剤の有効量とは、タウオパチーの少なくとも１つの症状を寛解させるのに、例えば、有害な症状を軽減するのに、および／またはタウオパチーの結果として損なわれた通常の機能を高めるのに有効な量である。例えば、いくつかの実施形態では、活性薬剤の有効量とは、タウオパチーを有する個体の脳において神経原線維病変の数を減少させるのに有効な量である。主題方法が、併用療法を含む場合には、活性薬剤の組み合わせた有効な量とは、組み合わせて、タウオパチーを有する個体の脳において神経原線維病変の数を減少させるのに有効である量である。いくつかの実施形態では、活性薬剤の有効量とは、個体において認知機能を高めるのに有効である量である。主題方法が、併用療法を含む場合には、活性薬剤の組み合わせた有効な量とは、組み合わせて、個体において認知機能を高めるのに有効である量である。
【００９１】
製剤、投与量および投与経路
活性薬剤（例えば、タウポリペプチドのアセチル化を阻害する薬剤；Ａｃ−タウポリペプチドの脱アセチル化を増大する薬剤）を、治療的投与のために種々の製剤に組み込んでもよい。さらに詳しくは、活性薬剤を、適当な医薬上許容される担体または希釈剤と組み合わせることによって医薬組成物に製剤してもよく、固体、半固体、液体またはガス状形態の調製物、例えば、散剤、顆粒剤、溶液、注射用薬剤、吸入剤、ゲル、ハイドロゲル、マイクロスフェア等に製剤してもよい。そのようなものとして、活性薬剤の投与は、患部組織への送達などの局所、経口、カテーテル媒介性、くも膜下腔内、口内、非経口、腹腔内、皮内、経皮、気管内投与などを含む、種々の方法で達成され得る。活性薬剤は、投与後に全身性であってもよく、または局所投与、壁内投与の使用もしくは移植部位で活性用量を保持するよう作用するインプラントの使用によって限局性であってもよい。
【００９２】
いくつかの実施形態では、活性薬剤（単数または複数）は、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過するよう製剤される。血液脳関門（ＢＢＢ）による薬物送達のための１つの戦略は、マンニトールもしくはロイコトリエンなどの浸透圧的手段またはブラジキニンなどの血管作用性物質の使用によって生化学的にのいずれかによるＢＢＢの破壊を必要とする。ＢＢＢ破壊剤は、組成物が血管内に注射によって投与される場合には、活性薬剤と同時投与してもよい。ＢＢＢを通過するためのその他の戦略は、グルコースおよびアミノ酸担体などの担体媒介性トランスポーター、インスリンまたはトランスフェリンの受容体媒介性経細胞輸送およびｐ−糖タンパク質などの能動拡散トランスポーターを含む内因性輸送システムの使用を必要とし得る。本明細書に開示される方法において使用して、血管上皮の壁を通過する輸送を促進するために、能動輸送部分を活性薬剤とコンジュゲートしてもよい。あるいは、ＢＢＢの後ろに控える薬物送達は、オンマイヤリザーバー（Ｏｍｍａｙａリザーバー）によるような頭蓋への直接的な治療薬のくも膜下腔内送達によるものである。
【００９３】
医薬組成物は、所望の製剤に応じて、動物またはヒト投与のために医薬組成物を製剤するためによく使用されるビヒクルとして定義される、希釈剤の医薬上許容される、非毒性の担体を含み得る。希釈剤は、組合せの生物活性に影響を及ぼさないように選択される。このような希釈剤の例として、蒸留水、緩衝水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、リンガー溶液、デキストロース溶液およびハンクス溶液がある。さらに、医薬組成物または製剤は、その他の担体、アジュバントまたは非毒性の、非治療的、非免疫原性安定剤、賦形剤などを含み得る。組成物はまた、ｐＨ調整剤および緩衝剤、毒性調整剤、湿潤剤および洗剤などの生理学的条件に近づけるためのさらなる物質も含み得る。
【００９４】
種々の種類の投与に適している製剤に関するさらなる指針は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，  ＰＡ，  第１７版（１９８５年）に見出すことができる。薬物送達の方法についての短い概要については、Ｌａｎｇｅｒ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７〜１５３３頁（１９９０年）を参照のこと。
【００９５】
医薬組成物は、予防的および／または治療的処置のために投与できる。活性薬剤の毒性および治療効力は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％にとって致死的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療上有効な用量）を決定することを含む、細胞培養および／または実験動物において標準的な製剤手順に従って決定できる。毒性作用および治療作用間の用量比は、治療係数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比として表され得る。大きな治療係数を示す化合物が好ましい。
【００９６】
細胞培養および／または動物研究から得られたデータを、ヒトのための投与量の処方範囲において使用してもよい。活性薬剤の投与量は、通常、毒性の低いＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内に並ぶ。投与量は、使用される剤形および利用される投与経路に応じて、この範囲内で変わり得る。
【００９７】
医薬組成物を製剤するために使用される成分は、好ましくは、高純度のものであり、有害である可能性のある混入物を実質的に含まない（例えば、少なくとも食品（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｏｄ）（ＮＦ）等級、一般に、少なくとも分析等級、より日常的には、少なくとも製剤等級）。さらに、ｉｎ  ｖｉｖｏ使用に意図される組成物は、通常、無菌である。所与の化合物が、使用前に合成されなければならない限り、得られる生成物は、通常、合成または精製工程の間に存在し得るあらゆる毒性の可能性がある薬剤、特に、あらゆるエンドトキシンを実質的に含まない。非経口（ｐａｒｅｎｔａｌ）投与用の組成物も無菌であり、実質的に等張性であり、製造管理および品質管理に関する基準（Ｇｏｏｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ）（ＧＭＰ）条件の下で製造される。
【００９８】
有効な量の、特定の患者に与えられる活性薬剤（単数または複数）は、種々の因子に依存し、そのうちのいくつかは、患者毎に異なるだろう。有能な臨床医ならば、タウオパチーを治療するために患者に投与するための活性薬剤の有効量を決定できよう。臨床医は、ＬＤ５０動物データおよび阻害剤について入手可能なその他の情報を使用することによって、投与経路に応じて、個体の最大安全用量を決定できる。例えば、静脈内に投与される用量は、治療用組成物が投与されている流体がより大きいことを考えて、くも膜下腔内に投与される用量よりも多いものであり得る。同様に、身体から迅速に除去される組成物は、治療濃度を維持するために、高用量で、または反復用量で投与され得る。有能な臨床医は、通常の技術を利用することで、日常的な臨床試験の過程で、特定の治療薬の投与量を最適化することができよう。
【００９９】
製剤
主題治療法（例えば、個体において、細胞（例えば、ニューロン；グリア細胞）中のアセチル化タウポリペプチドのレベルを低下させること；タウオパチーを治療すること）の実施では、所望の生理学的効果（例えば、個体において神経細胞および／またはグリア細胞中のアセチル化タウポリペプチドのレベルの低下；認知機能の増大；神経原線維病変の低減；タウオパチーの有害な効果の低減など）をもたらすことができる任意の従来手段を使用して、活性薬剤（単数または複数）を宿主に投与してもよい。したがって、治療的投与のために、薬剤を種々の製剤中に組み込んでもよい。より詳しくは、活性薬剤を、適当な、医薬上許容される担体または希釈剤と組み合わせることによって医薬組成物に製剤してもよく、固体、半固体、液体またはガス状形態の調製物、例えば、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、軟膏、溶液、坐剤、注射用物質、吸入剤およびエアゾールに製剤してもよい。
【０１００】
薬の剤形では、活性薬剤（単数または複数）をその医薬上許容される塩の形態で投与してもよく、または活性薬剤を、単独で、もしくは適当な関連で、ならびに、その他の医薬上有効な化合物と組み合わせて使用してもよい。以下の方法および賦形剤は、単に例示的なものであって、決して制限ではない。
【０１０１】
経口製剤のために、活性薬剤を、単独で、または錠剤、散剤、顆粒剤またはカプセル剤を製造するために、適当な添加剤と、例えば、ラクトース、マンニトール、コーンスターチまたはジャガイモデンプンなどの従来の添加剤と；結晶セルロース、セルロース誘導体、アラビアガム、コーンスターチまたはゼラチンなどの結合剤と；コーンスターチ、ジャガイモデンプンまたはカルボキシメチルセルロースナトリウムなどの崩壊剤と；タルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤と；必要に応じて、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、保存料および矯味剤と組み合わせて使用してもよい。
【０１０２】
活性薬剤は、活性薬剤を、水性または非水性溶媒、例えば、植物油またはその他の同様のオイル、合成脂肪酸グリセリド、高級脂肪酸またはプロピレングリコールのエステルに、必要に応じて、可溶化剤、等張化剤、懸濁剤、乳化剤、安定剤および保存料などの従来の添加剤とともに溶解、懸濁または乳化することによって注射用製剤に製剤してもよい。
【０１０３】
活性薬剤は、吸入によって投与されるエアゾール製剤において使用してもよい。本発明の化合物は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などといった加圧された許容される噴射剤中に製剤してもよい。
【０１０４】
さらに、活性薬剤を、乳化基剤または水溶性基剤などの種々の基剤と混合することによって坐剤に製造してもよい。活性薬剤は、坐剤によって直腸投与してもよい。坐剤は、体温で融解するが、室温で固化する、ココアバター、カーボワックスおよびポリエチレングリコールなどのビヒクルを含み得る。
【０１０５】
各投与量単位、例えば、小さじ１杯、大さじ１杯、錠剤または坐剤が、１種または複数の活性薬剤を含有する組成物を所定の量含有する、シロップ、エリキシルおよび懸濁液などの経口投与または直腸投与用の単位剤形が提供され得る。同様に、注射または静脈内投与用の単位剤形は、滅菌水、通常の生理食塩水または別の医薬上許容される担体中の溶液として組成物中の活性薬剤（単数または複数）を含み得る。
【０１０６】
本明細書で使用する場合、用語「単位剤形」とは、ヒトおよび動物対象のための単一の投与量として適した物理的に別個の単位を指し、各単位は、医薬上許容される希釈剤、担体またはビヒクルと関連して所望の効果をもたらすのに十分な量に算出された、所定量の活性薬剤を含有する。活性薬剤の単位剤形の仕様は、使用される個々の活性薬剤および達成されるべき効果および宿主中での各活性薬剤と関連する薬動力学に依存する。
【０１０７】
その他の投与様式も、主題発明とともに使用されよう。例えば、活性薬剤を、坐剤に製剤してもよく、いくつかの場合には、エアゾールおよび経鼻組成物に製剤してもよい。坐剤の場合、ビヒクル組成物は、従来の結合剤および担体、例えば、ポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドを含む。このような坐剤は、約０．５％〜約１０％（ｗ／ｗ）、例えば、約１％〜約２％の範囲の有効成分を含有する混合物から形成され得る。
【０１０８】
経鼻製剤は、通常、鼻腔の粘膜に対して刺激作用を引き起こさず、毛様体機能を大きくは妨げないビヒクルを含む。水、生理食塩水水溶液またはその他の公知の物質などの希釈剤を使用してもよい。経鼻製剤は、また、保存料、例えば、それだけには限らないが、クロロブタノールおよび塩化ベンザルコニウムも含有してもよい。鼻腔粘膜による活性薬剤の吸収を促進するために、界面活性剤が、存在する場合もある。
【０１０９】
活性薬剤は、注射用物質として投与してもよい。通常、注射用組成物は、液体溶液または懸濁液として調製され；注射の前に、液体ビヒクル中の溶液または懸濁液に適した固体形態をも調製してもよい。調製物はまた、乳化されてもよく、または活性薬剤は、リポソームビヒクル中にカプセル化されてもよい。
【０１１０】
適した賦形剤ビヒクルとして、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどおよびそれらの組合せがある。さらに、必要に応じて、ビヒクルは、少量の補助的物質、例えば、湿潤剤または乳化剤またはｐＨ緩衝剤を含有し得る。このような剤形を調製する実際の方法は、当業者には公知であり、明らかとなろう。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｅａｓｔｏｎ，  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ、第１７版、１９８５年参照のこと。投与される組成物または製剤は、いずれにしても、治療されている対象において所望の状態を達成するのに適切な活性薬剤の量を含有するであろう。
【０１１１】
ビヒクル、アジュバント、担体または希釈剤などの医薬上許容される賦形剤は、一般に容易に入手可能である。さらに、ｐＨ調整剤および緩衝剤、張力調整剤、安定剤、湿潤剤などといった医薬上許容される補助的物質は、一般に容易に入手可能である。
【０１１２】
経口製剤
いくつかの実施形態では、活性薬剤は、このような薬剤を必要とする個体への経口送達のために製剤される。
【０１１３】
経口送達には、活性薬剤を含む製剤は、いくつかの実施形態では、腸溶性コーティング材料を含む。適した腸溶性コーティング材料として、ヒドロキシプロピルメチル酢酸コハク酸セルロース（ＨＰＭＣＡＳ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート（ＨＰＭＣＰ）、酢酸フタル酸セルロース（ＣＡＰ）、ポリビニルフタリックアセテート（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ  ｐｈｔｈａｌｉｃ  ａｃｅｔａｔｅ）（ＰＶＰＡ）、Ｅｕｄｒａｇｉｔ（商標）およびセラックが挙げられる。
【０１１４】
適した経口製剤の１つの限定されない例として、活性薬剤は、１種または複数の製薬賦形剤とともに製剤され、米国特許第６，３４６，２６９号に記載される腸溶コーティングでコーティングされる。例えば、活性薬剤および安定剤を含む溶液を、医薬上許容される賦形剤を含むコア上にコーティングして、活性薬剤がコーティングされたコアを形成する。活性薬剤がコーティングされたコアにサブコーティング層を施し、次いで、これを腸溶コーティング層でコーティングする。コアは、一般に、医薬上不活性の成分、例えば、ラクトース、デンプン、マンニトール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、デンプングリコール酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、色素、アルギン酸の塩、タルク、二酸化チタン、ステアリン酸、ステアレート、微結晶セルロース、グリセリン、ポリエチレングリコール、クエン酸トリエチル、クエン酸トリブチル、プロパニルトリアセテート、二塩基性リン酸カルシウム、三塩基性リン酸ナトリウム、硫酸カルシウム、シクロデキストリンおよびヒマシ油を含む。活性薬剤に適した溶媒として、水性溶媒が挙げられる。適した安定剤として、アルカリ金属およびアルカリ土類金属、リン酸塩および有機酸塩および有機アミンの塩基が挙げられる。サブコーティング層は、１種または複数の接着剤、可塑剤および粘着防止剤を含む。適した粘着防止剤として、タルク、ステアリン酸、ステアレート、フマル酸ステアリルナトリウム、グリセリルベヘナート、カオリンおよびアエロジルが挙げられる。適した接着剤として、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ゼラチン、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、酢酸ビニル（ＶＡ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、メチルセルロース（ＭＣ）、エチルセルロース（ＥＣ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート（ＨＰＭＣＰ）、酢酸フタル酸セルロース（ＣＡＰ）、キサンタンガム、アルギン酸、アルギン酸の塩、Ｅｕｄｒａｇｉｔ（商標）、アクリル酸メチル／メチルメタクリレートと、ポリビニルアセテートフタレート（ＰＶＡＰ）の共重合体が挙げられる。適した可塑剤として、グリセリン、ポリエチレングリコール、クエン酸トリエチル、クエン酸トリブチル、プロパニルトリアセテートおよびヒマシ油が挙げられる。適した腸溶性コーティング材料として、ヒドロキシプロピルメチル酢酸コハク酸セルロース（ＨＰＭＣＡＳ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート（ＨＰＭＣＰ）、酢酸フタル酸セルロース（ＣＡＰ）、ポリビニルフタリックアセテート（ＰＶＰＡ）、Ｅｕｄｒａｇｉｔ（商標）およびセラックが挙げられる。
【０１１５】
適した経口製剤はまた、以下のうちいずれかとともに製剤された活性薬剤を含む：微粒剤（例えば、米国特許第６，４５８，３９８号参照のこと）；生分解性マクロマ（例えば、米国特許第６，７０３，０３７号参照のこと）；生分解性ハイドロゲル（例えば、ＧｒａｈａｍおよびＭｃＮｅｉｌｌ（１９８９年）Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ５：２７〜３６頁参照のこと）；生分解性粒状ベクター（例えば、米国特許第５，７３６，３７１号参照のこと）；生体吸収性ラクトンポリマー（例えば、米国特許第５，６３１，０１５号参照のこと）；持続放出タンパク質ポリマー（例えば、米国特許第６，６９９，５０４号；Ｐｅｌｉａｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．参照のこと）；ポリ（ラクチド−コ−グリコリド／ポリエチレングリコールブロック共重合体（例えば、米国特許第６，６３０，１５５号；Ａｔｒｉｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．参照のこと）；生体適合性ポリマーおよびポリマー内に分散された金属カチオン安定化剤の粒子を含む組成物（例えば、米国特許第６，３７９，７０１号；Ａｌｋｅｒｍｅｓ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．参照のこと）およびマイクロスフェア（例えば、米国特許第６，３０３，１４８号；Ｏｃｔｏｐｌｕｓ，Ｂ．Ｖ．参照のこと）。
【０１１６】
適した経口製剤はまた、以下のうちいずれかとともに製剤された活性薬剤を含む：Ｅｍｉｓｐｈｅｒｅ（登録商標）（Ｅｍｉｓｐｈｅｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）；ＴＩＭＥＲｘ、デキストロースの存在下で、水中の強力な結合剤ゲルを形成する、キサンタンおよびローカストビーンガムを組み合わせる親水性マトリックス（Ｐｅｎｗｅｓｔ）；Ｇｅｍｉｎｅｘ（商標）（Ｐｅｎｗｅｓｔ）；Ｐｒｏｃｉｓｅ（商標）（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）；ＳＡＶＩＴ（商標）（Ｍｉｓｔｒａｌ  Ｐｈａｒｍａ  Ｉｎｃ．）；ＲｉｎｇＣａｐ（商標）（Ａｌｚａ  Ｃｏｒｐ．）；Ｓｍａｒｔｒｉｘ（登録商標）（Ｓｍａｒｔｒｉｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）；ＳＱＺｇｅｌ（商標）（ＭａｃｒｏＭｅｄ，Ｉｎｃ．）；Ｇｅｏｍａｔｒｉｘ（商標）（Ｓｋｙｅ  Ｐｈａｒｍａ，Ｉｎｃ．）；Ｏｒｏｓ（登録商標）Ｔｒｉ−ｌａｙｅｒ（Ａｌｚａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）などといった担体。
【０１１７】
また、使用するのに適したものとして、米国特許第６，２９６，８４２号（Ａｌｋｅｒｍｅｓ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）；米国特許第６，１８７，３３０号（Ｓｃｉｏｓ，Ｉｎｃ．）などに記載されるものなどの製剤がある。
【０１１８】
また、本明細書において使用するのに適したものとして、腸管吸収促進剤を含む製剤がある。適した腸管吸収促進剤として、それだけには限らないが、カルシウムキレート剤（例えば、クエン酸塩、エチレンジアミン四酢酸（ｔｅｔｒａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ））；界面活性剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム、胆汁酸塩、パルミトイルカルニチンおよび脂肪酸のナトリウム塩）；毒素（例えば、閉鎖結合毒素）などが挙げられる。
【０１１９】
放出制御製剤
いくつかの実施形態では、活性薬剤は、放出制御製剤に製剤される。
【０１２０】
使用するのに適した放出制御製剤は、いくつかの持続放出剤形のいずれか１種を意味するととることができる。以下の用語は、本開示内容の目的上、放出制御と実質的に等価であると考えられ得る：連続的放出、放出制御、遅延放出、デポー、段階的放出、長期放出、プログラム放出、延期性放出、比例放出、遷延放出、貯蔵型、抑制、緩放出、間隔放出、持続放出、タイムコート、時限放出、遅延作用、延長作用、多層時間作用、長時間作用型、長期作用、反復作用、緩作用型、持続作用、持続作用医薬および延長放出。これらの用語のさらなる議論は、Ｌｅｓｃｚｅｋ  Ｋｒｏｗｃｚｙｎｓｋｉ、Ｅｘｔｅｎｄｅｄ−Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ、１９８７年（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）に見出すことができる。
【０１２１】
種々の放出制御技術が、極めて広範囲の薬物剤形を対象とする。放出制御技術として、それだけには限らないが、物理的システムおよび化学的システムが挙げられる。
【０１２２】
物理的システムとして、それだけには限らないが、律速膜を有するリザーバーシステム、例えば、マイクロカプセル化、マクロカプセル化および膜システム；律速膜を有さないリザーバーシステム、例えば、中空繊維、超微孔性セルローストリアセテートおよび多孔性ポリマー基質および発泡体；非多孔性、ポリマー性またはエラストマーマトリックス（例えば、浸食され得ない、浸食され得る、環境物質移入、および分解性）に物理的に溶解されたシステムならびに非多孔性、ポリマー性またはエラストマーマトリックス（例えば、浸食され得ない、浸食され得る、環境物質移入、および分解性）に物理的に分散された材料を含むモノリシックシステム；外側の制御層と化学的に同様または異なるリザーバー層を含む積層構造；およびその他の物理的方法、例えば、浸透圧的ポンプまたはイオン交換樹脂上への吸着が挙げられる。
【０１２３】
化学的システムとして、それだけには限らないが、ポリマーマトリックスの化学的浸食（例えば、不均一または均一な浸食）またはポリマーマトリックスの生物学的浸食（例えば、不均一または均一な）が挙げられる。放出制御のためのシステムのカテゴリーについてのさらなる考察は、Ａｇｉｓ  Ｆ．  Ｋｙｄｏｎｉｅｕｓ、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、１９８０年（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）に見出すことができる。
【０１２４】
経口投与用に開発されているいくつかの放出制御製剤がある。これらは、それだけには限らないが、浸透圧制御胃腸送達システム；水力学的圧力制御胃腸送達システム；微孔性膜透過制御胃腸送達装置を含む膜透過制御胃腸送達システム；胃液耐性腸標的放出制御胃腸送達装置；ゲル拡散制御胃腸送達システム；カチオン性およびアニオン性薬物を含むイオン交換制御胃腸送達システムを含む。放出制御薬物送達システムに関するさらなる情報は、Ｙｉｅ  Ｗ．  Ｃｈｉｅｎ、Ｎｏｖｅｌ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、１９９２年（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）に見出すことができる。これらの製剤の一部をここで、より詳細に論じる。
【０１２５】
腸溶コーティングは、不愉快な副作用のリスクを低減するためか、そうでなければ胃環境への曝露の分解に付され得る薬物の安定性を維持するために、胃における薬物の放出を妨げるよう錠剤に適用される。この目的上使用されるほとんどのポリマーは、水性培地におけるその溶解度が、ｐＨ依存性であり、それらが、胃において通常遭遇するものよりも高いｐＨを有する条件を必要とするという事実によって機能するポリ酸である。
【０１２６】
１つの例示的種類の経口放出制御構造として、固体または液体剤形の腸溶コーティングがある。腸溶コーティングは、即時吸収のために腸液中で崩壊するよう設計される。腸溶コーティングを有する製剤中に組み込まれている活性薬剤の吸収の遅延は、消化管を通る移動の速度に依存し、そのため、胃排出の速度が重要な因子である。何人かの研究者によって、顆粒剤などのマルチプルユニット型剤形が、シングルユニット型よりも優れている場合があると報告されている。したがって、例示的一実施形態では、活性薬剤は、腸溶コーティングされたマルチプルユニット型剤形に含有され得る。例示的一実施形態では、活性薬剤剤形は、不活性コア材料上に活性薬剤−腸溶コーティング剤固体分散物の顆粒剤をスプレーコーティングすることによって調製される。これらの顆粒剤は、良好なバイオアベイラビリティを有する薬物の長期吸収をもたらし得る。
【０１２７】
通常の腸溶コーティング剤として、それだけには限らないが、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メタクリル酸（ｍｅｔｈａｃｒｙｃｌｉｃ  ａｃｉｄ）−メタクリル酸エステルコポリマー、ポリビニルアセテートフタレートおよび酢酸フタル酸セルロースが挙げられる。Ａｋｉｈｉｋｏ  Ｈａｓｅｇａｗａ、Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｏｌｉｄ  ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｎｉｆｅｄｉｐｉｎｅ  ｗｉｔｈ  ｅｎｔｅｒｉｃ  ｃｏａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ  ｔｏ  ｐｒｅｐａｒｅ  ａ  ｓｕｓｔａｉｎｅｄ−ｒｅｌｅａｓｅ  ｄｏｓａｇｅ  ｆｏｒｍ、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．３３：１６１５〜１６１９頁（１９８５年）。最初から、溶解時間、コーティング厚および直径圧潰強さの最適組合せを有するように設計された腸溶コーティングされた剤形を達成するための試験に基づいて、種々の腸溶コーティング材料を選択してもよい。Ｓ．Ｃ．  Ｐｏｒｔｅｒら、Ｔｈｅ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｅｎｔｅｒｉｃ  Ｔａｂｌｅｔ  Ｃｏａｔｉｎｇｓ  Ｍａｄｅ  Ｆｒｏｍ  Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ  Ａｃｅｔａｔｅ−ｐｈｔｈａｌａｔｅ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ａｃｅｔａｔｅ  Ｐｈｔｈａｌａｔｅ、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２２：４２ｐ（１９７０年）。
【０１２８】
別の種類の有用な経口放出制御構造として、固体分散物がある。固体分散物は、融解（融合）、溶媒もしくは融解−溶媒法によって調製された固体状態の不活性担体またはマトリックス中の、１種または複数の有効成分の分散物として定義され得る。Ａｋｉｈｉｋｏ  Ｈａｓｅｇａｗａ、Ｓｕｐｅｒ  Ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ  ｆｒｏｍ  Ｓｏｌｉｄ  Ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  Ｅｎｔｅｒｉｃ  Ｃｏａｔｉｎｇ  Ａｇｅｎｔｓ、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．３６：４９４１〜４９５０頁（１９９８年）。固体分散物はまた、固体（ｓｏｌｉｄ−ｓｔａｔｅ）分散物とも呼ばれ得る。用語「共沈させる」はまた、溶媒法によって得られた調製物を指すために使用され得る。
【０１２９】
複数成分混合物では、表面からの成分の溶解速度がその他の成分によって影響を受け得るので、担体の選択は、分散された活性薬剤の溶解特徴に対して影響を有し得る。例えば、水溶性担体は、マトリックスからの活性薬剤の迅速な放出をもたらし得る、または、難溶性もしくは不溶性の担体は、マトリックスからの活性薬剤の緩放出につながり得る。活性薬剤の溶解度も、担体との何らかの相互作用のために増大され得る。
【０１３０】
固体分散物において有用な担体の例として、それだけには限らないが、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドンおよびヒドロキシプロピルメチル−セルロースなどの水溶性ポリマーが挙げられる。別の担体として、ホスファチジルコリンが挙げられる。ホスファチジルコリンは、両性であるが、水に不溶性の脂質であり、ホスファチジルコリン固体分散物中の非結晶状態の、そうでなければ不溶性の活性薬剤の溶解度を改善し得る。
【０１３１】
その他の担体として、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油が挙げられる。水に難溶性の活性薬剤は、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレートおよびカルボキシメチルエチルセルロースなどの腸溶ポリマーおよび非腸溶ポリマー、ヒドロキシプロピルメチルセルロースとともに固体分散物システム中に含めてもよい。別の固体分散物剤形は、種々の割合のエチルセルロースおよびステアリン酸との活性薬剤の組み込みを含む。
【０１３２】
固体分散物を調製するためによく知られている種々の方法がある。これらは、それだけには限らないが、融解法、溶媒法および融解−溶媒法を含む。
【０１３３】
別の放出制御剤形として、イオン交換樹脂および活性薬剤間の複合体がある。イオン交換樹脂−薬物複合体は、酸性および塩基性薬物の持続放出製剤を製剤化するために使用されてきた。例示的一実施形態では、イオン交換樹脂−薬物複合体粒子にポリマーフィルムコーティングが提供され、これらの粒子からの薬物放出を拡散制御されるようにする。Ｙ．Ｒａｇｈｕｎａｔｈａｎら、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ−ｒｅｌｅａｓｅｄ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ  Ｉ：  Ｃｏｄｅｄ  ｉｏｎ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｒｅｓｉｎ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  ｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐａｎｏｌａｍｉｎｅ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｄｒｕｇｓ、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ７０：３７９〜３８４頁（１９８１年）参照のこと。
【０１３４】
注射用マイクロスフェアは、別の放出制御剤形である。注射用マイクロスフェアは、非水相分離技術および噴霧乾燥技術によって調製され得る。マイクロスフェアは、ポリ乳酸またはコポリ（乳酸／グリコール酸）  Ｓｈｉｇｅｙｕｋｉ  Ｔａｋａｄａ、Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  Ａｍｏｒｐｈｏｕｓ  Ｆｏｒｍ  ｏｆ  ａ  Ｗａｔｅｒ−Ｓｏｌｕｂｌｅ  ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ  Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  ｆｏｒ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｆｒｏｍ  Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１４：１１４６〜１１５０頁（１９９７年）およびエチルセルロース、Ｙｏｓｈｉｙｕｋｉ  Ｋｏｉｄａ、Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  Ｄｉｓｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ  ｆｒｏｍ  Ｅｔｈｙｌ  Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  Ｍｉｃｒｏｃａｐｓｕｌｅｓ、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．３５：１５３８〜１５４５頁（１９８７年）を使用して調製され得る。
【０１３５】
使用してもよいその他の放出制御技術として、それだけには限らないが、Ｅｌａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能な、ＳＯＤＡＳ（Ｓｐｈｅｒｏｉｄａｌ  Ｏｒａｌ  Ｄｒｕｇ  Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ）、ＩＮＤＡＳ（Ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ  Ｄｒｕｇ  Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ）、ＩＰＤＡＳ（Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｄｒｕｇ  Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ）、ＭＯＤＡＳ（Ｍｕｌｔｉｐｏｒｏｕｓ  Ｏｒａｌ  Ｄｒｕｇ  Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ）、ＥＦＶＡＳ（Ｅｆｆｅｒｖｅｓｃｅｎｔ  Ｄｒｕｇ  Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ）、ＰＲＯＤＡＳ（Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  Ｏｒａｌ  Ｄｒｕｇ  Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ）およびＤＵＲＥＤＡＳ（Ｄｕａｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ）が挙げられる。ＳＯＤＡＳは、放出制御ビーズを使用する多粒子剤形である。ＩＮＤＡＳは、難溶性薬物の溶解度を高めるように設計された薬物送達技術のファミリーである。ＩＰＤＡＳは、高密度放出制御ビーズおよび即時放出顆粒の組合せを使用する多粒子錠剤形成である。ＭＯＤＡＳは、放出制御シングルユニット剤形である。各錠剤は、薬物放出の速度を制御する半透性多孔性（ｍｕｌｔｉｐａｒｏｕｓ）膜によって囲まれた内部コアからなる。ＥＦＶＡＳは、発泡性薬物吸収システムである。ＰＲＯＤＡＳは、即時放出および放出制御ミニ錠剤の組み合わせを使用する多粒子製剤のファミリーである。ＤＵＲＥＤＡＳは、１剤形内で二重の放出速度を提供する二層錠剤製剤である。これらの剤形は当業者に公知であるが、これらの剤形のうち特定のものを、ここでより詳細に論じる。
【０１３６】
ＩＮＤＡＳは、水に難溶性の薬物の溶解度および吸収特徴を改善するために特に開発された。溶解度、特に、消化管中の流体内での溶解は、水に難溶性の薬物の全体的な経口バイオアベイラビリティの決定において重要な因子である。溶解度を増強することによって、薬物の全体的なバイオアベイラビリティを増大し、結果として、投与量を低減できる。
【０１３７】
ＩＰＤＡＳは、潜在的刺激物質および潰瘍発生薬の胃腸耐容性を増大し得る多粒子錠剤技術である。腸管保護は、消化管中の刺激物質リポ酸塩の分散を広めるＩＰＤＡＳ製剤の多粒子性によって促進される。個々のビーズの放出制御特徴によって、高濃度の活性薬剤が局所的に放出されることおよび全身に吸収されることを避けることができる。両アプローチの組合せは、活性薬剤の潜在的害を最小にするのに役立ち、その結果、患者にとって利益になる。
【０１３８】
ＩＰＤＡＳは、多数の高密度放出制御ビーズからなる。各ビーズは、包埋された活性薬剤を有するマイクロマトリックスの最初の製造と、それに続く、このマイクロマトリックスの、ｉｎ  ｖｉｖｏで律速半透膜を形成するポリマー溶液でのコーティングとを含む２ステッププロセスによって製造され得る。ひと度、ＩＰＤＡＳ錠剤は摂取されると、胃中で崩壊し、ビーズを遊離し得る。これらのビーズは、続いて、例えば、摂食状態とは無関係に、制御された、漸進的方法で、十二指腸中に入り、消化管に沿って通過し得る。活性薬剤の放出は、マイクロマトリックス中およびそれに続く、律速半透膜中の孔中の拡散プロセスによって起こる。ＩＰＤＡＳ錠剤からの放出速度は、最適化された臨床的利益と関連する薬物特異的吸収プロフィールを送達するようにカスタマイズしてもよい。活性の迅速な発現が必要であれば、錠剤中に即時放出顆粒を含めてもよい。個々の滴定に低減した用量が必要である場合には、薬物放出に実質的に支障をきたすことなく、錠剤を、投与に先立って破壊してもよい。
【０１３９】
ＭＯＤＡＳは、水溶性薬剤の吸収を制御するために使用され得る薬物送達システムである。物理的に、ＭＯＤＡＳは、ｉｎ  ｖｉｖｏで形成される半透膜による律速拡散のプロセスによって薬物放出を操作する非崩壊錠製剤である。拡散プロセスは、本質的に、胃腸液への薬物の提示速度を決定し、その結果、身体への取り込みが制御される。ＭＯＤＡＳは、賦形剤を最小にしか使用しないために、容易に小投与量サイズの形態に適応できる。各ＭＯＤＡＳ錠剤は、活性薬物と賦形剤とを含有するコアとして始まる。このコアを不溶性ポリマーと可溶性賦形剤の溶液でコーティングする。ひと度、錠剤が摂取されると、消化管液が、外側コーティング中の可溶性賦形剤を溶解し、実質的に、不溶性ポリマーを残し得る。結果として生じるものは、消化管からの液体を水溶性薬物の内部薬物コアとつなげる小さい、狭いチャンネルのネットワークである。この液体は、これらのチャンネルを通過してコアに入り、薬物を溶解し、得られた薬物の溶液は、制御された方法で広がり得る。これは、制御された溶解および吸収の両方を可能にし得る。このシステムの利点は、錠剤の実質的に全表面にわたって錠剤の薬物放出孔が分布していることである。これは、均一な薬物吸収を促進し、積極的な一方向の薬物送達を低減する。ＭＯＤＡＳは、内部コアおよび外側の半透膜の両方とも個々の薬物の送達必要条件に適合するよう変更され得るという点で極めて柔軟な剤形を表す。特に、内部コアへの賦形剤の添加は、より予測可能な放出および吸収速度を促進する錠剤内の微小環境を生じさせるのに役立ち得る。即時放出外側コーティングの添加によって、組合せ製剤の開発が可能となり得る。
【０１４０】
さらに、ＰＲＯＤＡＳを使用して活性薬剤を送達してもよい。ＰＲＯＤＡＳは、直径１．５〜４ｍｍのサイズ範囲の放出制御ミニ錠剤の製造に基づく多粒子薬物送達技術である。ＰＲＯＤＡＳ技術は、多粒子および親水性マトリックス錠剤アプローチの混成であり、一剤形では、これらの薬物送達システムの両方の利益を組み込み得る。
【０１４１】
ＰＲＯＤＡＳは、最も基本的な形態では、即時放出顆粒を直接圧縮して、活性薬剤を含有する個々のミニ錠剤を製造することを含む。これらのミニ錠剤を、続いて、最終剤形に相当するハードゲルおよびカプセル剤に組み込む。この技術のより有益な使用は、放出制御製剤の製造においてである。この場合には、顆粒内に種々のポリマーの組合せを組み込むことが、個々のミニ錠剤各々からの薬物の放出速度を遅延し得る。続いて、これらのミニ錠剤を、さらなる遅延放出特性を提供するように、放出制御ポリマー溶液でコーティングしてもよい。高度に水溶性の薬物またはおそらくは胃刺激物質である薬物の場合には、製剤が、消化管の、より遠位の領域に達するまで放出が遅延され得る場合、さらなるコーティングが必要である場合もある。ＰＲＯＤＡＳ技術の１つの価値は、それによって、各々、異なる放出速度を有するミニ錠剤の組合せが、１つの剤形に組み込まれる、製剤化するための固有の柔軟性にある。特定の期間にわたって、制御された吸収を潜在的に可能にすることと同様に、これもまた、消化管中の特定の吸収部位への薬物の標的化送達を可能にし得る。異なる有効成分を用いて製剤化されたミニ錠剤を使用する組合せ製剤もまたあり得る。
【０１４２】
ＤＵＲＥＤＡＳは、活性薬剤を製剤化するために使用され得る二相錠剤化技術である。ＤＵＲＥＤＡＳは、剤形からの薬物の２種の異なる放出速度または二重放出を提供するように開発された。用語二相とは、錠剤化プロセスの間に起こる２つの別個の直接圧縮事象を指す。例示的実施形態では、即時放出顆粒を最初に圧縮し、これに放出制御要素の添加を続け、次いで、これを、この最初の錠剤上に圧縮する。これによって、最終剤形において見られる特徴的な二層が形成できる。
【０１４３】
放出制御特性は、親水性ポリマーの組合せによって提供され得る。特定の場合には、治療的効果の迅速な発現を促進するために、活性薬剤の迅速な放出が望ましい場合がある。したがって、錠剤の１つの層が、即時放出顆粒として製剤されてもよい。対照的に、錠剤の第２の層は、例えば、親水性のポリマーの使用によって、制御された方法で薬物を放出し得る。この放出制御は、親水性ポリマーマトリックスによる拡散および浸食の組合せに起因し得る。
【０１４４】
ＤＵＲＥＤＡＳ技術のさらなる進展として、放出制御組合せ剤形の製造がある。この例では、２種の異なる活性薬剤を、二層錠剤に組み込んでもよく、各層からの薬物の放出が、組合せの治療的効果を最大にするように制御される。
【０１４５】
活性薬剤は、上記の放出制御剤形のいずれか１種に組み込んでもよく、またはその他の従来剤形に組み込んでもよい。各用量中に含有される活性薬剤の量は、個々の患者の必要性および適応症に合うよう調整してよい。当業者ならば、またこの開示内容を読むことで、活性薬剤の送達およびそのバイオアベイラビリティを最適化するために、放出制御製剤において活性薬剤のレベルおよび放出速度を調整する方法は容易に認識するであろう。
【０１４６】
吸入製剤
活性薬剤は、いくつかの実施形態では、吸入経路のための薬剤送達システムによって患者に投与される。活性薬剤は、吸入による投与に適した形態に製剤され得る。投与の吸入経路は、吸入された薬物は血液脳関門を迂回できるという利点を提供する。薬剤送達システムは、気管支の粘膜内層への活性薬剤の送達による呼吸療法に適したものである。活性薬剤は、容器から活性薬剤を排出するための圧縮ガスの力に依存するシステムによって送達され得る。この目的上、エアゾールまたは加圧パッケージが使用され得る。
【０１４７】
本明細書において、用語「エアゾール」は、治療適用部位へ圧力下で噴射剤ガスによって運ばれる(carries)微細液体または固体粒子を指すように、その従来の意味で使用される。本発明において医薬エアゾールが使用される場合には、エアゾールは、液体担体と噴射剤との混合物に溶解、懸濁または乳化され得る活性薬剤を含有する。エアゾールは、溶液、懸濁液、エマルジョン、散剤または半固体調製物の形態であり得る。本発明において使用されるエアゾールは、患者の気道を通る、細かい、固体粒子としてか、または液体ミストとしての投与用に意図される。当業者に公知の種々の種類の噴射剤を使用してよい。適した噴射剤として、それだけには限らないが、炭化水素またはその他の適したガスが挙げられる。加圧されたエアゾールの場合には、投与量単位は、定量を送達するための値を提供することによって決定され得る。
【０１４８】
活性薬剤はまた、ガス中に実質的に均一な大きさの極めて細かい液体粒子を生成する機器である噴霧器を用いる送達用に製剤してもよい。例えば、活性薬剤を含有する液体が液滴として分散される。小さい液滴は、噴霧器の排出管を通る気流によって運ばれ得る。結果として生じたミストが患者の気道中に入り込む。
【０１４９】
滑沢剤、担体または噴射剤を伴って、または伴わずに、活性薬剤を含有する粉末組成物を、治療を必要とする哺乳類に投与してもよい。この実施形態は、吸入によって粉末医薬組成物を投与するための従来装置を用いて実施できる。例えば、活性薬剤と、ラクトースまたはデンプンなどの適した粉末基剤との粉末混合物を、単位剤形で、例えば、散剤が吸入器の助けを借りてそれから投与され得る、カプセル剤またはカートリッジ、例えば、ゼラチンまたはブリスターパックで提示してもよい。
【０１５０】
本開示内容に関連して使用してもよい、いくつかの異なる種類の吸入法がある。活性薬剤は、基本的に３つの異なる種類の吸入用製剤に製剤化してもよい。第１に、活性薬剤は、低沸点噴射剤を用いて製剤化してもよい。このような製剤は、一般に、従来の定量吸入器（ＭＤＩ）によって投与される。しかし、従来のＭＤＩを、米国特許第５，４０４，８７１号および同第５，５４２，４１０号内に論じられるように、患者の吸気体積および流速を測定する技術を利用することによって反復できる投与を行う能力を高めるよう改変してもよい。
【０１５１】
あるいは、活性薬剤は、水性またはエタノール性溶液に製剤化し、従来の噴霧器によって送達してもよい。いくつかの実施形態では、このような溶液製剤は、米国特許第５，４９７，７６３号；同第５，５４４，６４６号；同第５，７１８，２２２号；および同第５，６６０，１６６号内に開示されるものなどの装置およびシステムを使用してエアロゾル化される。
【０１５２】
活性薬剤は、ドライパウダー製剤に製剤化してもよい。このような製剤は、パウダーのエアゾールミストを作製した後にドライパウダー製剤を簡単に吸入することによって投与すればよい。このように実施する技術は、１９９８年７月７日に発行された米国特許第５，７７５，３２０号および１９９８年４月２１日に発行された米国特許第５，７４０，７９４号内に記載されている。
【０１５３】
投与量
使用される投与量は、達成されるべき臨床目標に応じて変わるが、適した投与量範囲は、最大約１μｇ〜約１，０００μｇまたは約１０，０００μｇの活性薬剤を提供するものであり、単回用量で投与され得る。あるいは、活性薬剤の標的投与量は、薬剤の投与後、最初の２４〜４８時間内に採取された宿主血液のサンプル中、約０．１〜１０００μＭ、約０．５〜５００μＭ、約１〜１００μＭまたは約５〜５０μＭの範囲におよそあると考えられ得る。
【０１５４】
用量レベルは、特定の化合物、症状の重篤度および副作用に対する対象の感受性の関数として変わり得るということは当業者ならば容易に理解するであろう。所与の化合物の好ましい投与量は、種々の手段によって当業者によって容易に決定できる。
【０１５５】
投与経路
活性薬剤は、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｅｘ  ｖｉｖｏ法、ならびに全身および局所投与経路を含む、任意の利用可能な方法および薬物送達に適した経路を使用して個体に投与される。
【０１５６】
従来および医薬上許容される投与経路として、鼻腔内、筋肉内、気管内、皮下、皮内、局所適用、静脈内、直腸、経鼻、経口ならびにその他の腸内および非経口投与経路が挙げられる。投与経路は、必要に応じて、組み合わせてもよく、または薬剤および／または所望の効果に応じて調整してもよい。活性薬剤は、単回用量で投与しても、複数回用量で投与してもよい。いくつかの実施形態で、活性薬剤は、経口投与される。その他の特定の実施形態では、活性薬剤は、吸入経路によって投与される。いくつかの実施形態では、活性薬剤は、鼻腔内に投与される。
【０１５７】
活性薬剤は、全身または局所経路を含む、任意の利用可能な従来法および従来薬物の送達に適した経路を使用して宿主に投与してもよい。一般に、本開示内容によって考慮される投与経路として、腸内、非経口および吸入経路が挙げられるが、必ずしもそれに限定されない。
【０１５８】
吸入投与以外の非経口投与経路として、局所、経皮、皮下、筋肉内、眼窩内、関節内、脊髄内、胸骨内および静脈内経路、すなわち、消化管を介して以外の任意の投与経路が挙げられるが、必ずしもそれに限定されない。非経口投与は、薬剤の全身または局所送達を達成するために行われ得る。全身送達が望ましい場合は、投与は、通常、医薬品の侵襲性または全身吸収性の局所または粘膜投与を含む。
【０１５９】
活性薬剤はまた、腸内投与によって対象に送達され得る。腸内投与経路として、経口および直腸（例えば、坐剤を使用する）送達が挙げられるが、必ずしもそれに限定されない。
【０１６０】
皮膚または粘膜を介した活性薬剤の投与方法として、適した医薬品の局所適用、経皮透過、注射および上皮投与が挙げられるが、必ずしもそれに限定されない。経皮透過には、吸収促進剤またはイオン導入が適した方法である。イオン導入透過は、数日以上の期間、破壊されていない皮膚を介して電気的パルスによってその製剤を継続的に送達する、市販の「パッチ」を使用して達成してもよい。
【０１６１】
治療とは、少なくとも、宿主を苦しめる病的状態と関連している症状の寛解を意味し、ここで、寛解は、少なくとも、パラメータ、例えば、タウオパチーなどの治療されている病的状態と関連している症状の規模の低減を指すように、広い意味で使用される。そのようなものとして、治療はまた、病的状態または少なくともそれと関連している症状が、完全に阻害される、例えば、起きないようにされる、または停止される、例えば、宿主が、病的状態または少なくとも病的状態を特徴づける症状をもはや患わないように終結される状況を含む。
【０１６２】
さまざまな対象（ここで、用語「対象」は、本明細書において、用語「個体」、「宿主」および「患者」と同義的に使用される）は、主題方法に従って治療可能である。一般に、このような対象は、「哺乳動物」または「哺乳類」であり、これらの用語は、食肉目（例えば、イヌおよびネコ）、げっ歯目（例えば、マウス、モルモットおよびラット）および霊長目（例えば、ヒト、チンパンジーおよびサル）を含めた哺乳綱内の生物を説明するために広く使用されている。多数の実施形態で、対象は、ヒトとなる。
【０１６３】
治療に適した対象
主題治療法を用いる治療に適した個体として、タウオパチーと診断されている個体；タウオパチーを有し、本明細書に論じられる薬剤以外の薬剤で治療された、このような治療に応答しなかったか、または最初に応答し、その後、再発した個体が挙げられる。
【０１６４】
診断方法
本開示内容は、個体において認知機能障害疾患を診断する方法を提供する。方法は、一般に、個体から得られた生体サンプルにおいてアセチル化タウポリペプチドのレベルを検出することを含む。正常な対照レベルより高いアセチル化タウポリペプチドのレベルは、個体が認知機能障害疾患を有することを示す。本開示内容はまた、個体が認知機能障害疾患を発症するリスクを調べる方法を提供する。方法は、一般に、個体から得られた生体サンプル中のアセチル化タウポリペプチドのレベルを検出することを含む。正常な対照レベルよりも高いアセチル化タウポリペプチドのレベルは、個体が、認知機能障害疾患を発症する一般集団よりも高いリスクにあることを示す。
【０１６５】
正常な対照レベルよりも、少なくとも約１０％高い、少なくとも約１５％高い、少なくとも約２０％高い、少なくとも約２５％高い、少なくとも約５０％高い、少なくとも約２倍高い、少なくとも約５倍高い、少なくとも約１０倍高いまたは１０倍超高い、生体サンプル（例えば、神経細胞および／またはグリア細胞を含む生体サンプル；神経細胞および／またはグリア細胞に由来する生体サンプル（例えば、神経細胞溶解物；グリア細胞溶解物）など）中のアセチル化タウポリペプチドのレベルは、生体サンプルが得られた個体が、認知機能障害疾患を有するか、認知機能障害疾患を有する一般集団よりも高いリスクにあることを示す。
【０１６６】
軽度認知機能障害（ＭＣＩ、初発認知症または孤立性記憶機能障害としても知られる）は、その年齢および教育に期待されるものを超えるが、その日常活動を大きくは干渉しない認知機能障害を有する個体に与えられる診断である。ＭＣＩは、正常な加齢と認知症との間の境界段階または移行段階であると考えられている。ＭＣＩは、種々の症状を示し得るが、記憶喪失が主な症状である場合には、「健忘ＭＣＩ」と呼ばれ、アルツハイマー病のリスク因子として頻繁に見られる。研究によって、健忘ＭＣＩの個体は、１年におよそ１０％〜１５％の割合で、ほぼ確実なアルツハイマー病に進行する傾向があることが示唆されている。さらに、個体が記憶以外のドメイン機能障害を有する場合には、非健忘シングルまたはマルチプルドメインＭＣＩとして分類され、これらの個体は、その他の認知症（例えば、レビー小体を有する認知症）に変わる可能性がより高いと考えられている。
【０１６７】
ＭＣＩは、アルツハイマー病のリスク因子であるので、ＭＣＩの診断は、初期アルツハイマー病の診断につながる。ＭＣＩの診断は、臨床的観察、神経画像検査、血液検査および神経心理学的検査を含む、多くの臨床的判断および包括的な臨床評価を必要とする。正常な対照レベルよりも高いＡｃ−タウポリペプチドのレベルは、個体が認知機能障害疾患を有することを示す。したがって、Ａｃ−タウポリペプチドの測定値を使用して、ＭＣＩおよびタウオパチー、例えば、アルツハイマー病を検出し、診断できる。
【０１６８】
Ａｃ−タウポリペプチドのレベルは、Ａｃ−タウに特異的な試薬、例えば、タウのアセチル化型を認識するが、非アセチル化−タウポリペプチドは認識しない抗体（例えば、抗Ａｃ−タウ：以下に記載されるＡｂ７０８）を使用することによって決定してもよい。Ａｃ−タウ特異的抗体は、標準免疫プロトコールを使用して作製してもよい。例えば、１個または複数のリシン残基（例えば、タウアイソフォーム２のＬｙｓ−１６３、および／または、Ｌｙｓ−１７４および／またはＬｙｓ−１９０）でアセチル化されたタウペプチドを使用して、適当な宿主動物（例えば、ウサギ、ヤギ、ヒツジなど）を免疫してもよい。２回目の追加免疫の約１０日後、ＥＬＩＳＡを使用して抗体力価を決定できる。通常、高抗体力価を得るのに２回の追加免疫で十分である。
【０１６９】
いくつかの生体サンプルを使用してＡｃ−タウレベルを検出できる。例えば、脳脊髄液、血漿、血清、血液、尿、脳生検サンプルを使用して、個体のＡｃ−タウレベルを決定できる。タウタンパク質の変化（断片化、脱リン酸化、脱アセチル化など）またはサンプル中の血液の血液凝固を防ぐために、得られたサンプルに、サンプルの採取時または採取後に酵素阻害剤を補給してもよい。使用してもよい酵素阻害剤として、ホスファターゼ阻害剤、例えば、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、オカダ酸、ピロリン酸、リン酸、フッ化ナトリウム、β−グリセロリン酸およびシクロスポリンＡならびにプロテアーゼ阻害剤、例えば、アプロチニン、アンチパイン、ペプスタチン、ロイペプチン、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＰＭＳＦ（フェニルメタンスルホニルフロリド）およびＴＬＣＫ（トシルリシンクロロメチルケトン）が挙げられる。サンプルは、新鮮に入手し、試験してもよく、またはＡｃ−タウレベルを測定する前にサンプルを保存してもよい。サンプルは、例えば、４℃以下、例えば、−２０℃以下で保存してもよい。
【０１７０】
年齢対応非認知症個体、例えば、正常な認知能力を有する固体から得た対応する生体サンプルを、対照として使用する。さらに、Ａｃ−タウレベルを、正規化対照、例えば、ＭＣＩを有する患者および正常な個体間で同程度のレベルで存在することがわかっているタンパク質、例えば、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ）、ＨＰＲＴ１（ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ−１）を基準として正規化してもよい。
【０１７１】
Ａｃ−タウレベルは、例えば、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、タンパク質ブロット（ウエスタンブロット）アッセイなどといったイムノアッセイにおいて、抗ａｃ−タウ抗体を使用して測定してもよい。例示的実施形態では、サンドイッチＥＬＩＳＡを使用してもよい。Ａｃ−タウタンパク質を、サンドイッチＥＬＩＳＡ法などによって測定する場合には、Ａｃ−タウタンパク質に特異的な抗体と組み合わせて使用される抗体は、アイソフォームの種類およびアセチル化状態に関らずタウタンパク質を認識する抗体（本明細書において以後、「非特異的抗タウタンパク質抗体」とも呼ばれ、使用される）である。非特異的抗タウタンパク質抗体の具体的な例として、Ｉｎｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓから市販されている抗タウタンパク質モノクローナル抗体ＨＴ７（タウタンパク質のアミノ酸番号１５９〜１６３と結合する）およびＢＴ２（タウタンパク質のアミノ酸番号１９３〜１９８と結合する）が挙げられる。
【０１７２】
スクリーニング法
本開示内容は、タウオパチーの治療において使用するのに適した候補薬剤を同定する方法を提供する。主題スクリーニング法は、一般に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ法であり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞において実施しても、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞不含アッセイ系において実施してもよい。
【０１７３】
いくつかの場合には、本方法は、ａ）ｉ）アセチル化タウを脱アセチル化する酵素と、ｉｉ）アセチル化タウポリペプチドとを含むサンプルを、試験薬剤と接触させることと；ｂ）タウポリペプチドのアセチル化度に対する試験薬剤の効果を調べることとを含む。タウポリペプチドの脱アセチル化を増大する試験薬剤は、タウオパチーを治療するための候補薬剤である。方法は、例えば、アセチル化タウを脱アセチル化する酵素を産生する細胞と、アセチル化タウポリペプチドを使用して、細胞ベースのアッセイにおいてｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施でき、前記方法は、細胞を試験薬剤と接触させることを含む。方法は、細胞不含アッセイ系においてｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施でき、例えば、ここでは、細胞不含系において、アセチル化タウを脱アセチル化する酵素およびアセチル化タウポリペプチドを、試験薬剤と接触させる。
【０１７４】
その他の場合には、方法は、ａ）ｉ）タウポリペプチドをアセチル化する酵素と、ｉｉ）非アセチル化タウポリペプチドとを含むサンプルを、試験薬剤と接触させることと、ｂ）タウポリペプチドのアセチル化度に対する薬剤の効果を調べることを含む。タウポリペプチドのアセチル化を阻害する試験薬剤が、タウオパチーを治療するための候補薬剤である。方法は、例えば、タウポリペプチドをアセチル化する酵素を産生する細胞と、非アセチル化タウポリペプチドとを使用して、細胞ベースのアッセイにおいてｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施でき、前記方法は、細胞を試験薬剤と接触させることを含む。方法は、細胞不含アッセイ系においてｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施でき、例えば、ここでは、細胞不含系において、タウをアセチル化する酵素および非アセチル化タウポリペプチドを、試験薬剤と接触させる。
【０１７５】
主題スクリーニング法は、一般に、適当な対照、例えば、試験薬剤を欠く対照サンプルを含む。一般に、種々の濃度に対する差示的反応を得るために、異なる薬剤濃度を有する複数のアッセイ混合物が平行して流される。一般に、これらの濃度のうち１種は、陰性対照、すなわち、ゼロ濃度または検出レベル未満として働く。
【０１７６】
スクリーニングアッセイにさまざまなその他の試薬を含めてもよい。これらは、最適タンパク質−タンパク質結合を促進するために、および／または非特異的もしくはバックグラウンド相互作用を低減するために使用される、塩、中性タンパク質、例えば、アルブミン、洗剤などといった試薬を含む。プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗菌薬などといったアッセイの効率を改善する試薬も使用してよい。アッセイ混合物の成分は、必要な結合またはその他の活性を提供する任意の順序で加える。インキュベーションは、任意の適した温度、一般に、４℃から４０℃の間で実施する。インキュベーション期間は、最適活性のために選択するが、迅速なハイスループットスクリーニングを促進するように最適化してもよい。一般に、０．１から１時間の間で十分となる。
【０１７７】
本明細書で使用する場合、用語「調べること」とは、定量的および定性的に調べることの両方を指し、そのようなものとして、用語「調べること」は、本明細書において、「アッセイすること」、「測定すること」などと同義的に使用される。
【０１７８】
用語「候補薬剤」、「試験薬剤」、「薬剤」、「物質」および「化合物」は、本明細書において同義的に使用される。候補薬剤は、合成、半合成および天然に存在する無機または有機分子を含む、多数の化学的クラスを包含する。候補薬剤は、合成または天然化合物の大きなライブラリー中に見られるものを含む。例えば、合成化合物ライブラリーは、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．  （Ｔｒｅｖｉｌｌｅｔ，Ｃｏｒｎｗａｌｌ，ＵＫ）、ＣｏｍＧｅｎｅｘ（Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）およびＭｉｃｒｏＳｏｕｒｃｅ  （Ｎｅｗ  Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＣＴ）から市販されている。稀有な化学ライブラリーは、Ａｌｄｒｉｃｈ  （Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，Ｗｉｓ．）から入手可能であり、使用も可能である。あるいは、細菌、真菌、植物および動物抽出物の形態の天然化合物のライブラリーは、Ｐａｎ  Ｌａｂｓ  （Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ）から入手可能であり、容易に製造できる。
【０１７９】
候補薬剤は、５０ダルトンを超え、約２，５００ダルトン未満の分子量を有する、小さい有機または無機化合物であり得る。候補薬剤は、タンパク質との構造的相互作用に必要な官能基、例えば、水素結合を含み得、少なくとも１個のアミン、カルボニル、ヒドロキシルまたはカルボキシル基を含み得、少なくとも２つの官能化学基を含有し得る。候補薬剤は、上記の官能基のうち１種または複数で置換された、環状（ｃｙｃｌｉｃａｌ）炭素または複素環式構造および／または芳香族もしくは多環芳香族構造を含み得る。候補薬剤はまた、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造類似体またはそれらの組合せを含む生体分子の中にも見られる。
【０１８０】
試験薬剤は、小さい分子であり得る。試験分子は、最適な個々の小分子であり得る。または、いくつかの場合には、スクリーニングされる小分子試験薬剤は、コンビナトリアルライブラリー、すなわちいくつかの化学的「ビルディングブロック」を組み合わせることによる化学合成または生物学的合成のいずれかによって作製された多様な化学化合物の収集物に源を発する。例えば、ポリペプチドライブラリーなどの直鎖コンビナトリアル化学ライブラリーは、アミノ酸と呼ばれる一連の化学ビルディングブロックを、所与の化合物長（すなわち、ポリペプチド化合物中のアミノ酸の数）について、あらゆる可能性のある方法で組み合わせることによって形成される。このような化学ビルディングブロックのコンビナトリアル混合によって、数百万種の化学化合物を合成できる。実際、理論上は、１００種の互換性のある化学ビルディングブロックの体系的なコンビナトリアル混合が、１億種の四量体化合物または１００億種の五量体化合物の合成をもたらす。例えば、Ｇａｌｌｏｐら、（１９９４年）、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、３７（９）、１２３３〜１２５１頁参照のこと。コンビナトリアル化学ライブラリーの調製およびスクリーニングは、当技術分野で周知である。コンビナトリアル化学ライブラリーとして、それだけには限らないが、例えば、Ｈｏｂｂｓら、（１９９３年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、９０：６９０９〜６９１３頁に記載される、ヒダントイン、ベンゾジアゼピンおよびジペプチドなどのダイバーソマー(diversomers)；Ｃｈｅｎら、（１９９４年）、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１１６：２６６１〜２６６２頁に記載される、小化合物ライブラリーの類似有機合成；Ｃｈｏら、（１９９３年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６１：１３０３〜１３０５頁に記載される、オリゴカルバメート；Ｃａｍｐｂｅｌｌら、（１９９４年）、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、５９：６５８〜６６０頁に記載される、ペプチジルホスホネート；および例えば、チアゾリジノンおよびメタチアザノンを含有する有機小分子ライブラリー（米国特許第５，５４９，９７４号）、ピロリジン（米国特許第５，５２５，７３５号および同第５，５１９，１３４号）、ベンゾジアゼピン（米国特許第５，２８８，５１４号）が挙げられる。
【０１８１】
多数のコンビナトリアルライブラリーが、例えば、ＣｏｍＧｅｎｅｘ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）；Ａｓｉｎｅｘ（Ｍｏｓｃｏｗ，Ｒｕｓｓｉａ）；Ｔｒｉｐｏｓ，Ｉｎｃ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）；ＣｈｅｍＳｔａｒ，Ｌｔｄ．（Ｍｏｓｃｏｗ，Ｒｕｓｓｉａ）；３Ｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｅｘｔｏｎ，Ｐａ．）；およびＭａｒｔｅｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤ）から市販されている。
【０１８２】
細胞ベースのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ
上記のように、いくつかの実施形態では、主題スクリーニング法は、細胞ベースのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイである。上記のように、いくつかの実施形態では、主題スクリーニング法は、脱アセチル化酵素を産生する細胞およびアセチル化タウポリペプチドを、試験薬剤と接触させることと；細胞中のＡｃ−タウポリペプチドのレベルに対する試験薬剤の効果を調べることとを含む。上記のように、いくつかの実施形態では、主題スクリーニング法は、タウポリペプチドをアセチル化する酵素を産生する細胞および非アセチル化タウポリペプチドを、試験薬剤と接触させることと；細胞中のＡｃ−タウポリペプチドのレベルに対する試験薬剤の効果を調べることとを含む。
【０１８３】
細胞中のアセチル化タウのレベルを、試験薬剤の不在下での細胞中のアセチル化タウポリペプチドのレベルと比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％または８０％超低減させる試験薬剤が、タウオパチーを治療するための候補薬剤と考えられる。
【０１８４】
いくつかの異なる種類の細胞、例えば、マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）；一次ニューロン培養物、例えば、皮質ニューロン；神経細胞系統（例えば、不死化神経細胞系統）などを使用してもよい。特定の場合には、スクリーニングは、ニューロンが、ヒトドナー、非ヒト霊長類、げっ歯類などから入手されている、一次ニューロン培養物を使用して実施する。代替実施形態では、ニューロンは、胚幹細胞またはＰＣ１２などの神経細胞系統または神経芽腫細胞系統などの分化によって得られる。
【０１８５】
適した細胞系統として、それだけには限らないが、ヒト神経膠腫細胞系統、例えば、ＳＶＧｐ１２（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−８６２１）、ＣＣＦ−ＳＴＴＧ１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１７１８）、ＳＷ  １０８８（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１２）、ＳＷ  １７８３（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１３）、ＬＬＮ−１８（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２６１０）、ＬＮＺＴＡ３ＷＴ４（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１１５４３）、ＬＮＺＴＡ３ＷＴ１１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１１５４４）、Ｕ−１３８  ＭＧ（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１６）、Ｕ−８７  ＭＧ（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１４）、Ｈ４（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１４８）およびＬＮ−２２９（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２６１１）；ヒト髄芽細胞腫由来細胞系統、例えば、Ｄ３４２  Ｍｅｄ（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１８７）、Ｄａｏｙ（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１８６）、Ｄ２８３  Ｍｅｄ（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１８５）；ヒト腫瘍由来ニューロン様細胞、例えば、ＰＦＳＫ−１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２０６０）、ＳＫ−Ｎ−ＤＺ（ＡＴＣＣＣＲＬ−２１４９）、ＳＫ−Ｎ−ＡＳ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２１３７）、ＳＫ−Ｎ−ＦＩ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２１４２）、ＩＭＲ−３２（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１２７）など；マウス神経細胞系統、例えば、ＢＣ３Ｈ１  （ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１４４３）、ＥＯＣ１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２４６７）、Ｃ８−Ｄ３０（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２５３４）、Ｃ８−Ｓ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２５３５）、Ｎｅｕｒｏ−２ａ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１３１）、ＮＢ４１Ａ３（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１４７）、ＳＷ１０（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２７６６）、ＮＧ１０８−１５（ＡＴＣＣ  ＨＢ−１２３１７）；ラット神経細胞系統、例えば、ＰＣ−１２（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１７２１）、ＣＴＸ  ＴＮＡ２（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２００６）、Ｃ６（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１０７）、Ｆ９８（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２３９７）、ＲＧ２（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２４３３）、Ｂ３５（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２７５４）、Ｒ３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２７６４）、ＳＣＰ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１７００）、ＯＡ１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−６５３８）が挙げられる。
【０１８６】
１種または複数の脱アセチル化酵素、アセチルトランスフェラーゼおよびタウ（アセチル化または非アセチル化）が、スクリーニングにおいて使用される細胞に対して内因性であり得る。いくつかの実施形態では、１種または複数の脱アセチル化酵素、アセチルトランスフェラーゼおよびタウ（アセチル化または非アセチル化）が、外因的に、例えば、宿主細胞を、１種または複数のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（単数または複数）を含む核酸（例えば、発現構築物（単数または複数））を用いて遺伝子組換えすることによって提供され；遺伝性組換えされた宿主細胞を試験薬剤と接触させる。外因的に提供される場合は、脱アセチル化酵素は、Ａｃ−タウを脱アセチル化するとわかっている脱アセチル化酵素であり得、アセチルトランスフェラーゼは、非アセチル化タウをアセチル化して、Ａｃ−タウを生じさせるとわかっているアセチルトランスフェラーゼであり得る。
【０１８７】
特定の実施形態では、アセチルトランスフェラーゼは、ｐ３００ポリペプチド（ｍＲＮＡ  ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ＿００１４２９．３．タンパク質ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＰ＿００１４２０．２）である。特定の場合には、ｐ３００ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸（例えば、発現構築物）を、宿主細胞に導入し、ここで、ヌクレオチド配列は、タウポリペプチドをアセチル化し、配列番号１２に示されるアミノ酸配列の、一続きの連続した約１８００個のアミノ酸〜約２０００個のアミノ酸、約２０００個のアミノ酸〜約２２００個のアミノ酸または約２２００個のアミノ酸〜約２４１４個のアミノ酸に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むｐ３００ポリペプチドをコードする。これらの実施形態では、宿主細胞は、ｐ３００ポリペプチドをコードする発現構築物を用いて遺伝子組換えされている。
【０１８８】
特定の場合には、脱アセチル化酵素をコードするヌクレオチド配列を含む核酸（例えば、発現構築物）を宿主細胞に導入し、前記ヌクレオチド配列は、ｉ）アセチル化タウポリペプチドを脱アセチル化し、ｉｉ）配列番号９（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＨ１２４９９；ヒトＳＩＲＴ１）に示されるアミノ酸配列の一続きの連続した約４００個のアミノ酸〜約４５０個のアミノ酸または約４５０個のアミノ酸〜約５５５個のアミノ酸に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％もしくは１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＳＩＲＴ１ポリペプチドをコードするか；またはヌクレオチド配列は、ｉ）アセチル化タウポリペプチドを脱アセチル化し、ｉｉ）配列番号１０（ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＰ＿０３６３７０；ヒトＳＩＲＴ１アイソフォームａ）に示されるアミノ酸配列の一続きの連続した約５００個のアミノ酸〜約６００個のアミノ酸、約６００個のアミノ酸〜約７００個のアミノ酸もしくは約７００個のアミノ酸〜約７４７個のアミノ酸に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％もしくは１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＳＩＲＴ１ポリペプチドをコードするか；またはヌクレオチド配列は、ｉ）アセチル化タウポリペプチドを脱アセチル化し、ｉｉ）配列番号１１（ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＰ＿００１１３５９７０；ヒトＳＩＲＴ１アイソフォームｂ）に示されるアミノ酸配列の一続きの連続した約３００個のアミノ酸〜約４００個のアミノ酸もしくは約４００個のアミノ酸〜約４５２個のアミノ酸に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％もしくは１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＳＩＲＴ１ポリペプチドをコードする。これらの実施形態では、宿主細胞は、ＳＩＲＴ１ポリペプチドをコードする発現構築物を用いて遺伝子組換えされる。
【０１８９】
特定の場合には、タウポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸（例えば、発現構築物）を、細胞に導入し、前記ヌクレオチド配列は、配列番号１〜６に示されるアミノ酸配列のいずれか１種の一続きの連続した約３５０個のアミノ酸に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタウポリペプチドをコードするか；またはヌクレオチド配列は、配列番号２（ヒトタウアイソフォーム３）に示されるアミノ酸配列の一続きの連続した約３５０個のアミノ酸〜３８３個のアミノ酸に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタウポリペプチドをコードするか；またはヌクレオチド配列は、配列番号４（ヒトタウアイソフォーム５）に示されるアミノ酸配列の一続きの連続した約３５０個のアミノ酸〜約４１２個のアミノ酸に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタウポリペプチドをコードするか；またはヌクレオチド配列は、配列番号１（ヒトタウアイソフォーム２）に示されるアミノ酸配列の一続きの連続した約３５０個のアミノ酸〜約４００個のアミノ酸もしくは約４００個のアミノ酸〜約４４１個のアミノ酸に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％もしくは１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタウポリペプチドをコードするか；またはヌクレオチド配列は、配列番号５（ヒトタウアイソフォーム１）に示されるアミノ酸配列の一続きの連続した約３５０個のアミノ酸〜約４００個のアミノ酸、約４００個のアミノ酸〜約５００個のアミノ酸、約５００個のアミノ酸〜約６００個のアミノ酸、約６００個のアミノ酸〜約７００個のアミノ酸もしくは約７００個のアミノ酸〜約７５８個のアミノ酸に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％もしくは１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタウポリペプチドをコードするか；またはヌクレオチド配列は、配列番号６（ヒトタウアイソフォーム６）に示されるアミノ酸配列の一続きの連続した約３５０個のアミノ酸〜約４００個のアミノ酸、約４００個のアミノ酸〜約５００個のアミノ酸、約５００個のアミノ酸〜約６００アミノ酸、約６００個のアミノ酸〜約７００個のアミノ酸もしくは約７００個のアミノ酸〜約７７６個のアミノ酸に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％もしくは１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタウポリペプチドをコードする。
【０１９０】
例えば、アセチルトランスフェラーゼ（例えば、ｐ３００ポリペプチド）および／またはタウポリペプチドおよび／または脱アセチル化酵素（例えば、ＳＩＲＴ１ポリペプチド）をコードするヌクレオチド配列を、適した発現ベクターに導入してもよい。発現ベクターは、適した宿主細胞に導入される。発現ベクターは、一般に、プロモーター配列の付近に位置する好都合な制限部位を有し、ポリヌクレオチド配列の挿入を提供する。転写開始領域、ポリペプチド（例えば、アセチルトランスフェラーゼ（例えば、ｐ３００ポリペプチド）、タウポリペプチドまたは脱アセチル化酵素（例えば、ＳＩＲＴ１ポリペプチド））をコードするヌクレオチド配列および転写終結領域を含む転写カセットを調製してもよい。転写カセットを種々のベクター、例えば、プラスミド；レトロウイルス、例えば、レンチウイルス；アデノウイルスなどに導入してもよく、前記ベクターは、細胞中に、通常、少なくとも約１日の期間、より一般的には、少なくともおよそ数日〜数週間の期間、一過性にまたは安定に維持され得る。
【０１９１】
タウポリペプチドは、融合タンパク質、例えば、タウおよび融合パートナーを含むポリペプチドであり得る。適した融合パートナーとして、ｉｎ  ｖｉｖｏで増強された安定性（例えば、増強された血清半減期）を付与するペプチドおよびポリペプチド；精製の容易性を提供するペプチドおよびポリペプチド、例えば、（Ｈｉｓ）ｎ、例えば、６Ｈｉｓなど；細胞からの融合タンパク質の分泌を提供するペプチドおよびポリペプチド；エピトープタグを提供するペプチドおよびポリペプチド、例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、血球凝集素（ＨＡ；例えば、ＣＹＰＹＤＶＰＤＹＡ；配列番号１８）、ＦＬＡＧ（例えば、ＤＹＫＤＤＤＤＫ；配列番号１９）、ｃ−ｍｙｃ（例えば、ＣＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ；配列番号２０）など；検出可能なシグナルを提供するペプチドおよびポリペプチド、例えば、検出可能な生成物を生成する酵素（例えば、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ）もしくはそれ自体が検出可能であるタンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質など；多量体化を提供するペプチドおよびポリペプチド、例えば、多量体化ドメイン、例えば、免疫グロブリンのＦｃ部分などが挙げられる。
【０１９２】
発現構築物を作製するための種々の操作は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施してもよく、または適当な宿主細胞、例えば、大腸菌において実施してもよい。各操作後、得られた構築物をクローニングし、ベクターを単離し、ＤＮＡをスクリーニングまたは配列決定して、構築物の正確性を確実にすることができる。配列を制限分析、配列決定などによってスクリーニングしてもよい。
【０１９３】
試験薬剤の効果を調べることは、一般に、細胞中のアセチル化タウポリペプチドのレベルを調べることによって実施する。Ａｃ−タウレベルは、例えば、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、タンパク質ブロット（ウエスタンブロット）アッセイなどといったイムノアッセイにおいて、Ａｃ−タウに特異的な抗Ａｃ−タウ抗体（「抗Ａｃ−タウ抗体」）を使用して測定できる。抗Ａｃ−タウ抗体は、検出可能な標識を含むことができ、標識を検出することによって抗Ａｃ−タウのアセチル化タウとの結合を調べることができる。あるいは、抗Ａｃ−タウ抗体のアセチル化タウとの結合は、抗Ａｃ−タウ抗体と結合する検出可能に標識された二次抗体を使用して検出してもよい。細胞を放射標識されたアセチルドナー化合物を含む液体培養培地中で培養し、その結果、細胞によって産生された任意のアセチル化タウが、放射標識されたアセチル基を含むことができ、ここで、アセチル化タウのレベルが、放射標識されたアセチル化タウを検出することによって実施される。Ａｃ−タウのレベルは、無傷の細胞中で、または細胞溶解物中で、または細胞から単離されたＡｃ−タウを使用して測定できる。
【０１９４】
細胞不含ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ
上記のように、いくつかの実施形態では、主題スクリーニング法をｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞不含アッセイ系において実施する。上記のように、いくつかの実施形態では、主題スクリーニング法は、細胞不含系において、ｉ）アセチル化タウを脱アセチル化する酵素およびｉｉ）アセチル化タウポリペプチドを、試験薬剤と接触させることを含む。上記のように、いくつかの実施形態では、主題スクリーニング法は、細胞不含系において、ｉ）タウポリペプチドをアセチル化する酵素およびｉｉ）非アセチル化タウポリペプチドを、試験薬剤と接触させることを含む。
【０１９５】
使用されるポリペプチド（例えば、アセチル化タウを脱アセチル化する酵素およびアセチル化タウポリペプチド；またはタウポリペプチドをアセチル化する酵素および非アセチル化タウポリペプチド）は精製してもよく、例えば、前記ポリペプチドは、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％純粋であり、例えば、その他の高分子および／または混入物を含まない。ポリペプチドは、組換えによって製造し、次いで、精製してもよく；ポリペプチドは、天然由来のポリペプチドから精製してもよく；またはポリペプチドは合成してもよい（例えば、細胞不含化学合成法を使用して）。
【０１９６】
アセチル化タウのレベルを、試験薬剤の不在下でのアセチル化タウポリペプチドのレベルと比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％または８０％超低減させる試験薬剤が、タウオパチーを治療するための候補薬剤と考えられる。
【０１９７】
アセチル化タウを脱アセチル化する適した酵素は、上記のとおりである。例えば、適した酵素は、神経細胞においてアセチル化タウポリペプチドを脱アセチル化し、配列番号９（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＨ１２４９９；ヒトＳＩＲＴ１）に示されるアミノ酸配列の一続きの連続した約４００個のアミノ酸〜約４５０個のアミノ酸もしくは約４５０個のアミノ酸〜約５５５個のアミノ酸に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％もしくは１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであるか、または神経細胞においてアセチル化タウポリペプチドを脱アセチル化し、配列番号１０（ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＰ＿０３６３７０；ヒトＳＩＲＴ１アイソフォームａ）に示されるアミノ酸配列のうちの、約５００個のアミノ酸〜約６００個のアミノ酸、約６００個のアミノ酸〜約７００個のアミノ酸もしくは約７００個のアミノ酸〜約７４７個の一続きの連続したアミノ酸に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％もしくは１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであるか、または神経細胞においてアセチル化タウポリペプチドを脱アセチル化し、配列番号１１（ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＰ＿００１１３５９７０；ヒトＳＩＲＴ１アイソフォームｂ）に示されるアミノ酸配列のうちの、約３００個のアミノ酸〜約４００個のアミノ酸もしくは約４００個のアミノ酸〜約４５２個の一続きの連続したアミノ酸に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％もしくは１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
【０１９８】
タウポリペプチドをアセチル化する適した酵素として、タウをアセチル化し、配列番号１２に示されるアミノ酸配列の一続きの連続した約１８００個のアミノ酸〜約２０００個のアミノ酸、約２０００個のアミノ酸〜約２２００個のアミノ酸または約２２００個のアミノ酸〜約２４１４個のアミノ酸に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むアセチルトランスフェラーゼがある。
【０１９９】
適切なタウポリペプチドは、配列番号１〜６に示されるアミノ酸配列のいずれか１種の一続きの連続した約３５０個のアミノ酸に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか；または配列番号２（ヒトタウアイソフォーム３）に示されるアミノ酸配列の一続きの連続した約３５０個のアミノ酸〜３８３個のアミノ酸に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか；または配列番号４（ヒトタウアイソフォーム５）に示されるアミノ酸配列のうちの、一続きの連続した約３５０個のアミノ酸〜約４１２個のアミノ酸に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか；または配列番号１（ヒトタウアイソフォーム２）に示されるアミノ酸配列のうちの、一続きの連続した約３５０個のアミノ酸〜約４００個のアミノ酸もしくは約４００個のアミノ酸〜約４４１個のアミノ酸に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％もしくは１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか；または配列番号５（ヒトタウアイソフォーム１）に示されるアミノ酸配列のうちの、一続きの連続した約３５０個のアミノ酸〜約４００個のアミノ酸、約４００個のアミノ酸〜約５００個のアミノ酸、約５００個のアミノ酸〜約６００個のアミノ酸、約６００個のアミノ酸〜約７００個のアミノ酸もしくは約７００個のアミノ酸〜約７５８個のアミノ酸に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％もしくは１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか；または配列番号６（ヒトタウアイソフォーム６）に示されるアミノ酸配列のうちの、一続きの連続した約３５０個のアミノ酸〜約４００個のアミノ酸、約４００個のアミノ酸〜約５００個のアミノ酸、約５００個のアミノ酸〜約６００アミノ酸、約６００個のアミノ酸〜約７００個のアミノ酸もしくは約７００個のアミノ酸〜約７７６個のアミノ酸に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％もしくは１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられる。
【０２００】
アセチル化タウポリペプチドは、例えば、タウポリペプチドと、タウポリペプチドをアセチル化する酵素とを産生する神経細胞系統において組換えによって製造してもよい。アセチル化タウポリペプチドはまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで非アセチル化タウポリペプチドを化学的にアセチル化することによって製造してもよい。
【０２０１】
試験薬剤の効果を調べることは、一般に、アセチル化タウポリペプチドのレベルを調べることによって実施する。Ａｃ−タウレベルは、例えば、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、タンパク質ブロット（ウエスタンブロット）アッセイなどといったイムノアッセイにおいて、Ａｃ−タウに特異的な抗Ａｃ−タウ抗体（「抗Ａｃ−タウ抗体」）を使用して測定できる。抗Ａｃ−タウ抗体は、検出可能な標識を含むことができ、標識を検出することによって抗Ａｃ−タウのアセチル化タウとの結合を調べることができる。あるいは、抗Ａｃ−タウ抗体のアセチル化タウとの結合は、抗Ａｃ−タウ抗体と結合する検出可能に標識された二次抗体を使用して検出してもよい。いくつかの実施形態では、アセチル化タウポリペプチドは、放射標識されたアセチルドナーを含む液体培地中で培養される細胞によって産生され、その結果、細胞によって産生されたアセチル化タウは、１、２または３個以上の放射標識されたアセチル基を含む。これらの場合、調べる工程は、放射活性薬剤で標識されたタウポリペプチドの量を調べることによって実施できる。
【０２０２】
Ｉｎ  ｖｉｖｏスクリーニング
上記のように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニングアッセイによって同定された候補薬剤は、ｉｎ  ｖｉｖｏでニューロンおよび／またはグリア細胞中のＡｃ−タウポリペプチドのレベルを低下させるその能力について試験できる。あるいは、試験薬剤を、ｉｎ  ｖｉｖｏでＡｃ−タウポリペプチドレベルを低下させるものについて評価することもできる。
【０２０３】
認知機能障害の非ヒトモデルを使用して、試験薬剤をスクリーニングし、Ａｃ−タウポリペプチドのレベルを低下させる候補薬剤を同定してもよい。例示的非ヒトモデルとして、アルツハイマー病のトランスジェニック動物モデル、ヒトタウを過剰発現するトランスジェニック動物モデル、認知機能障害および／またはタウ陽性神経原線維変化を示すトランスジェニック動物モデルが挙げられる。いくつかのこのような非ヒト動物モデルは、当技術分野で公知である。トランスジェニック非ヒト動物モデルとは、タウオパチーなどのヒト神経変性疾患に関与している導入遺伝子を含有し、アルツハイマー病などの認知症を示す非ヒト動物（例えば、げっ歯類）を指し、以下の例示的トランスジェニック非ヒト動物：ＬＩＤマウス（Ｙａｋａｒ  Ｓら、１９９９年、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９６；７３２４〜７３２９頁）、プレセニリンおよびβアミロイド中の突然変異のトランスジェニック動物保有者（Ｈｏｃｋ  Ｂ  Ｊ、Ｊｒ．、Ｌａｍｂ  Ｂ  Ｔ、２００１年、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ１７：Ｓ７−１２）、その他の突然変異および変更の動物保有者（ＵＳ２００３０２２９９０７、進行性の神経疾患を有するトランスジェニック非ヒト哺乳類；ＵＳ２００３０１４５３４３、ヒトｐ２５を発現するトランスジェニック動物；ＵＳ２００３０１３１３６４、表現型が調節されたトランスジェニック動物モデルを製造する方法およびそれから製造された動物；ＵＳ２００３０１０１４６７、アルツハイマー病のトランスジェニック動物モデル；ＵＳ２０００３００９３８２２、神経変性疾患のトランスジェニック動物モデル；米国特許第６，７１７．０３１号、アルツハイマー病のトランスジェニックマウスモデルを選択する方法；米国特許第６，５９３，５１２号、ヒトタウ遺伝子を発現するトランスジェニックマウス；米国特許第６，５６３．０１５号、突然変異株ヒトＡＰＰを発現し、コンゴーレッド染色プラークを形成するトランスジェニックマウス；米国特許第６．４５５，７５７号、ヒトＡＰＰおよびＴＧＦ−βを発現するトランスジェニックマウスは、脳血管アミロイド沈着を示す；米国特許第６．４５２，０６５号、天然プレセニリン１ヌルバックグラウンドで非天然野生型および家族性アルツハイマー病突然変異株プレセニリン１タンパク質を発現するトランスジェニックマウス；Ｗ００３０５３１３６、アルツハイマー病の三重トランスジェニックモデル：ＷＯ０３０４６１７２が挙げられる。一般に、正常レベルのＡｃ−タウおよび／またはタウよりも高いレベルを有するタウオパチーの任意の動物モデルを、ｉｎ  ｖｉｖｏスクリーニングアッセイにおいて使用して、タウおよび／またはＡｃ−タウのレベルを低下させる化合物を同定してもよい。
【０２０４】
非ヒト動物モデル中に存在するＡｃ−タウのレベルを調べることに加えて、これらの非ヒト動物モデルはまた、主題ｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニング法(単数または複数)によって同定された候補薬剤の有効性を評価するために使用してもよい。候補薬剤の有効性は、例えば、認知などのタウオパチーと関連している症状の改善を評価することによって、ＭＣＩの動物モデルにおいて試験してもよい。
【実施例】
【０２０５】
以下の実施例は、当業者に、本発明の製造および使用方法の完全な開示および説明を提供するために提示されるものであって、本発明者らが発明と考えるものを制限しようとするものではなく、以下の実験がすべてまたは実施された唯一の実験であると意味しようとするものでもない。使用される数字（例えば、量、温度など）に関して、正確度を確実にするように努力したが、いくらかの実験誤差および偏差を考慮すべきである。特に断りのない限り、部分は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏温度であり、圧力は大気圧またはその近傍のものである。標準的な略語が使用される場合もある。例えば、ｂｐ、塩基対；ｋｂ、キロベース；ｐｌ、ピコリットル；ｓまたはｓｅｃ、秒；ｍｉｎ、分；ｈまたはｈｒ、時間；ａａ、アミノ酸；ｋｂ、キロベース；ｂｐ、塩基対；ｎｔ、ヌクレオチド；ｉ．ｍ．、筋肉内（筋肉内に）；ｉ．ｐ．、腹腔内（腹膜内に）；ｓ．ｃ．、皮下（皮下に）；ｗｔ、野生型など。
【実施例１】
【０２０６】
タウのアセチル化は、その分解を阻害し、タウオパチーの一因となる
試験手順
化学物質および試薬
Ｃ６４６は、Ｃｈｅｍｂｒｉｄｇｅ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から入手した。Ｃ３７（Ｃ６４６の不活性類似体）は合成した。ＥＸ５２７（Ｔｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｅｌｌｉｓｖｉｌｌｅ，ＭＯ）、レスベラトロール（ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）、ＭＧ−１３２（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、シクロヘキシミド（Ｓｉｇｍａ）、Ａβ４２ペプチド（ｒＰｅｐｔｉｄｅ，Ｂｏｇａｒｔ，ＧＡ）および組換えタウ（ｒＰｅｐｔｉｄｅ）は購入した。Ａβ４２オリゴマーは、記載されるように調製した。Ｃｈｅｎら（２００５年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０：４０３６４頁。
【０２０７】
一次抗体
２種のタウのアセチル化ペプチド（Ａｂｇｅｎｔ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）に対して、２種のウサギポリクローナル抗Ａｃ−タウ抗血清を作製した。ＰＨＦ１抗体は贈与された。その他の抗体は入手し、示した濃度で使用した：タウ５（１：５０００；Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）、抗ｐ３００（１：５００；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）、抗ＧＡＰＤＨ（１：１００００；Ｓｉｇｍａ）、抗チューブリン（１：１００００；Ｓｉｇｍａ）、抗ＦＬＡＧ（１：２０００；Ｓｉｇｍａ）、ｐ−タウのＡＴ８（１：５００；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）、抗Ｓｉｒ２（１：２０００；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）、抗血球凝集素（抗ＨＡ）（１：１０００；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）。二次抗体：ペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗ウサギおよび抗マウスＩｇＧ（１：２０００；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）。
【０２０８】
発現プラスミド
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における発現のために、ｈＴａｕｗｔ、ｈＴａｕ２ＫＲ（Ｋ１７４Ｒ、Ｋ１８０Ｒ）、ｈＴａｕ３ＫＲ（Ｋ１６３Ｒ、Ｋ１７４Ｒ、Ｋ１８０Ｒ）、ｐ３００、ＳＩＲＴ１、Ｈ３６３Ｙ（ＳＩＲＴ１）、ＳＩＲＴ２、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ６およびＨＡ−ユビキチンをコードするｃＤＮＡを、ｐｃＤＮＡ３．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。細菌におけるタンパク質発現のために、ｈＴａｕｗｔ  ｃＤＮＡを、ＧＳＴ−融合タンパク質発現のためにｐＧＥＸ４Ｔ−１ベクターにクローニングした。一次ニューロンにおける発現のために、ｈＴａｕｗｔ、ｈＴａｕ３ＫＲ、ｈＴａｕＰ３０１をコードするｃＤＮＡおよびｃｒｅリコンビナーゼを、レンチウイルスＦＵＧＷベクターにクローニングした。
【０２０９】
マウス
動物に関するすべての手順は、カリフォルニア大学サンフランシスコ校の動物実験委員会（Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）の指針に従った。ＰＳ１９マウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から入手した。ｈＴ−ＰＡＣ−Ｎ系統は贈与された。ＳＩＲＴ−ヌルおよびＳＩＲＴ１Ｆ／Ｆマウスは、Ｆｒｅｄ  Ａｌｔ（Ｈａｒｖａｒｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ）によって提供された。
【０２１０】
細胞培養および一時的トランスフェクション
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞およびＭＥＦを、１０％ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補給したダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、３７℃で増殖させた。過剰発現のために、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてトランスフェクションを実施した。ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドトランスフェクションのために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１２ウェル培養プレートに１×１０５個細胞／ウェルで播種した。１２時間後、１０ｎＭ  ＯＮ−ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓ  ＳＭＡＲＴプールｓｉＲＮＡ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ−Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）を用い、リポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、製造業者のプロトコールに従って細胞をトランスフェクトした。ＳＩＲＴ１  ｓｉＲＮＡ（Ｌ−０９４６９９−０１）、ＳＩＲＴ２  ｓｉＲＮＡ（Ｌ−００４８２６−００）、ＨＤＡＣ６  ｓｉＲＮＡ（Ｌ−００３４９９−００）、ｐ３００  ｓｉＲＮＡ（Ｌ−００３４８６−００）およびＰＣＡＦ  ｓｉＲＮＡ（Ｌ−００５０５５−００）を、特定の細胞遺伝子を標的とするために使用し；ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ  Ｎｏｎ−Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｓｉＲＮＡ＃１（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）を、陰性対照として使用した。ｓｉＲＮＡトランスフェクションの約４８時間後、プラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ｈＴａｕｗｔを、同じ培養プレートにトランスフェクトした。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲまたはウエスタンブロット分析のために、２４時間後に細胞を回収した。
【０２１１】
一次ニューロン培養およびレンチウイルス感染
出生直後０日または１日のスプラーグ−ドーリーラットの仔（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）またはＳＩＲＴ１Ｆ／Ｆマウスの皮膚から、初代培養を確立した。精製した細胞を、ポリ−オルニチンコーティングしたプレート上、Ｂ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補給したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地中、１６０，０００細胞／ｍｌでプレーティングした。すべての処理は、特に断りのない限り、Ｎ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補給したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ  培地中７〜１３ＤＩＶで実施した。
【０２１２】
レンチウイルスは、記載されるように作製し、精製し、感染のために使用した。Ｃｈｅｎら（２００５）前掲。組換えレンチウイルスは、２９３Ｔ細胞へのシャトルベクター（ＦＵＧＷ）、２種のヘルパープラスミド、δ８．９パッケージングベクターおよびＶＳＶ−Ｇエンベロープベクターの同時トランスフェクションによって製造し、超遠心分離法によって精製した。ウイルス力価は、Ｇｌａｄｓｔｏｎｅ−ＵＣＳＦ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙでｐ２４酵素結合免疫吸着測定法によって測定した。
【０２１３】
細胞および組織のホモジナイゼーションならびにウエスタンブロット解析
細胞またはヒトもしくはマウス脳組織を、５ｍＭニコチンアミド（Ｓｉｇｍａ）および１μＭトリコスタチンＡ（Ｓｉｇｍａ）を含む、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ）、１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）（Ｓｉｇｍａ）、ホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）およびＨＤＡＣ阻害剤を含有するＲＩＰＡバッファーに溶解した。超音波処理後、ヒトまたはマウス脳組織から得た溶解物を４℃、１７０，０００ｇで１５分間および４℃、１８，０００ｇで１０分間遠心分離した。上清を回収し、ウエスタンブロットによって分析した。イムノブロットのバンドを増強した化学発光（Ｐｉｅｒｃｅ）によって可視化し、デンシトメトリーおよびＱｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅ  ４．０ソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）によって定量化した。
【０２１４】
Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏアセチル化アッセイ
反応を、記載されるように実施した。Ｐａｇａｎｓら（２００５年）ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌ３：ｅ４１。手短には、アセチル化バッファー（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０、１０％グリセロール、１ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）および１０ｍＭ酪酸Ｎａ）中、１μｇのヒト組換えタウ、２ｎＭのアセチルＣｏＡ（Ｓｉｇｍａ）および１μｌの精製ＧＳＴ−ｐ３００を、一定に振盪しながら、３０℃で３０分間インキュベートした。２Ｘ  ＬＤＳサンプリングバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えることによって反応を停止し、続いて、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）およびウエスタンブロット分析を行なった。
【０２１５】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析
ｉｎ  ｖｉｔｒｏアセチル化反応から得たサンプルを、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルに流し、クーマシーブルーで染色した。およそ６５ｋＤａのバンドを切り出し、分析のためにＳｔａｎｆｏｒｄ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙに送った。Ｐｒｏｍｅｇａ  ＭＳ等級トリプシンを用いて一晩、ゲル内消化を行なった。消化に先立って、ゲル切片をおよそ１ｍｍ×１ｍｍ角に切断し、５ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）を用いて還元し、アクリルアミドを用いてアルキル化した。ペプチドを抽出し、スピードバックを使用して乾燥させ、その後、再構成し、分析した。
【０２１６】
ナノ逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を、Ｅｋｓｉｇｅｎｔ  ２Ｄ  ｎａｎｏＬＣ（Ｅｋｓｉｇｅｎｔ，Ｄｕｂｌｉｎ，ＣＡ）を用い、水中の０．１％ギ酸からなるバッファーＡおよびアセトニトリル中の０．１％ギ酸からなるバッファーＢを用いて行った。Ｄｕｒａｇｅｌ  Ｃ１８（Ｐｅｅｋｅ，Ｒｅｄｗｏｏｄ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）マトリックスを自己充填した融合シリカカラムを、５％  Ｂから４０％  Ｂへの直線勾配を用い、４５０ｎｌ／分の流速で８０分間かけて使用した。ナノＨＰＬＣを、ナノ−エレクトロスプレーイオン化法のためのＡｄｖｉｏｎ  Ｎａｎｏｍａｔｅ（Ｉｔｈａｃａ，ＮＹ）と適合して、質量分析計へとつなげた。質量分析計は、ＬＣＱ  Ｄｅｃａ  ＸＰ  Ｐｌｕｓ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）であり、データ依存獲得モードで設定して、２のダイナミックイクスクルージョン（ｄｙｎａｍｉｃ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ）設定を用い、上位３種の最も強いイオンでＭＳ／ＭＳを実施した。生データからＤＴＡファイルを抽出し、Ｍａｓｃｏｔを用いて系統的に探索した。タンパク質の割り当てには、確立＞９５％を有する少なくとも２種のペプチドを必要とした。
【０２１７】
Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ脱アセチル化アッセイ
反応を、確立された手順から改変した。Ｐａｇａｎｓら（２００５年）前掲。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ヒトＦＬＡＧタグをつけたＳＩＲＴ１プラスミドまたはニセプラスミドを用いて、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてトランスフェクトした。２４時間後、細胞を溶解バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％  ＮＰ−４０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよびプロテアーゼ阻害剤カクテル）に溶解した。４℃、１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、等量の上清タンパク質を、ＦＬＡＧ  Ｍ２アガロースビーズ（Ｓｉｇｍａ）とともに４℃で３時間免疫沈降させた。免疫沈降したビーズを溶解バッファーで２回、脱アセチル化バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．０、４ｍＭ  ＭｇＣｌ２および０．２ｍＭ  ＤＴＴ）で１回洗浄し、一定に振盪しながら、脱アセチル化バッファー中でｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｃ−タウとともに３０℃で３時間インキュベートした。２Ｘ  ＬＤＳサンプリングバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えることによって反応を停止し、ウエスタンブロットによって分析した。
【０２１８】
Ｉｎ  Ｖｉｖｏユビキチン化アッセイ
公開された研究から手順を改変した。Ｏｈら（２００９年）Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １１：２９５。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ＦＬＡＧタグをつけたヒトタウおよびＨＡ−ユビキチンをコードする発現ベクターを用い、Ｍｙｃ−ＳＩＲＴ１（野生型またはＨ３６３Ｙ突然変異体）を用い、または用いずにトランスフェクトした。２時間インキュベートした後、細胞を、「ダルベッコ改変イーグル培地」中で、ＥＸ５２７、レスベラトロールまたはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で処理し、２０時間インキュベートした。ＭＧ−１３２（２０μＭ）を加え、４時間インキュベートした。細胞をユビキチン化バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよびプロテアーゼ阻害剤カクテル）に溶解した。上清タンパク質を、ＦＬＡＧ  Ｍ２アガロースビーズ（Ｓｉｇｍａ）とともに４℃で３時間免疫沈降させた。反応物を、ユビキチン化バッファーを用いて少なくとも３回洗浄し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗ＨＡ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いるウエスタンブロットによって分析した。
【０２１９】
ＧＳＴ融合タンパク質の精製および相互作用アッセイ
ヒトタウをコードする全長ｃＤＮＡを、ｐＧＥＸ−４Ｔ−１細菌発現ベクター（Ｓｉｇｍａ）にサブクローニングし、ＢＬ２１（ＤＥ３）株に形質転換した。１００μＭイソプロピル  β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシドを用いて誘導した後、細菌細胞を回収し、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００およびプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ）を有するリン酸緩衝生理食塩水中で超音波処理した。グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグをつけたヒトタウまたはＧＳＴタンパク質を、グルタチオン−アガロースビーズ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）を用いて精製した。
【０２２０】
ＧＳＴプルダウンアッセイでは、精製ＧＳＴタウのビーズ結合型を、ＦＬＡＧタグをつけたヒトＳＩＲＴ１を用いてトランスフェクトされていない（内因性ＳＩＲＴ１との相互作用のために）またはトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞から得られた溶解物とともにインキュベートした。ビーズを、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００またはＮｏｎｉｄｅｔ−４０を含有する溶解バッファーを用いて少なくとも３回洗浄し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗ＳＩＲＴ１抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）または抗ＦＬＡＧ抗体（Ｓｉｇｍａ）を用いるウエスタンブロットによって分析した。
【０２２１】
共免疫沈降アッセイでは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をｐｃＤＮＡ３．１−ｈＴａｕ−ＦＬＡＧを用いてトランスフェクトした。Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で可溶化した溶解物を、ＦＬＡＧ  Ｍ２アガロースビーズとともに４℃で３時間インキュベートした。ビーズを、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（０．５％）を含有する溶解バッファーを用いて少なくとも３回洗浄し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗ＳＩＲＴ１抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）または抗ＦＬＡＧ抗体（Ｓｉｇｍａ）を用いるウエスタンブロットによって分析した。
【０２２２】
Ｃ６４６の特性決定、選択的ｐ３００阻害剤
コンピュータによるドッキングスクリーニングによって、Ｃ６４６を、ｐ３００の推定阻害剤の１種として同定した。Ｂｏｗｅｒｓら（２０１０年）Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  １７：４７１。好都合な分光光度的アッセイを実施して、それをｐ３００阻害剤として確認し（Ｋｉｍら（２０００年）Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２８０：３０８）、続けて一連の二次的アッセイを行った。連結分光光度的アッセイでは、アセチルトランスフェラーゼ反応生成物ＣｏＡＳＨが、アルファケトグルタレートデヒドロゲナーゼの基質となり、これは、ＮＡＤをＮＡＤＨに変換し、その結果、３４０ｎｍのＵＶ吸光度が増大する。Ｋｉｍら（２０００年）、前掲。続いて、放射活性ｐ３００  ＨＡＴアッセイを実施して、Ｃ６４６のＩＣ５０を直接測定した。Ｃ６４６によるｐ３００対その他のアセチルトランスフェラーゼの特異的阻害をさらに調べた。これらのアセチルトランスフェラーゼは、セロトニンＮ−アセチルトランスフェラーゼおよびＨＡＴｓ  ｐＣＡＦ、ＧＣＮ５、Ｒｔｔ１０９、ＳａｓおよびＭＯＺを含んでいた。
【０２２３】
データ分析
Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍを用いて統計分析を実施した。１種の変数を有する複数（≧３）の平均間の相違を、一元配置分散分析およびＴｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒポストホックテストによって評価した。２種の平均間の相違は、対応または独立両側ｔ検定を用いて評価した。Ｐ＜０．０５を有意と考えた。
【０２２４】
結果
タウは、ｉｎ  Ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  Ｖｉｖｏでアセチル化される
タウがアセチル化されることを実証するために、組換えタウを、１４Ｃ−アセチル−補酵素Ａとともに、組換えアセチルトランスフェラーゼｐ３００またはｐＣＡＦ（ｐ３００／ＣＢＰ結合因子）とともにインキュベートした。ｐＣＡＦではなくｐ３００とともにインキュベートすることが、タウアセチル化につながったが、予測されたようにアセチル基をヒストンに移す点ではｐ３００およびｐＣＡＦは両方とも活性であった（図１Ａ）。マトリックス支援レーザー脱離／イオン化−時間飛行型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）分光法によって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでｐ３００によってアセチル化された複数のリシンが同定された。タウ配列（２Ｎ４Ｒ、４４１個のアミノ酸）中、３８３個の残基のうち合計２３個の推定アセチル化リシンを検出した（約８６．８％のカバー度；表４）。数個の推定アセチル化リシンが、ＮおよびＣ末端領域中にあり；１３個が微小管−結合ドメイン中にあった（図１Ｂおよび表４）。推定アセチル化Ｎ末端リシン（例えば、リシン１６３、１７４および１８０）は、すべての質量分析法（ＭＳ）分析において、アセチル化されていると思われた。微小管−結合ドメイン中のものは、一部のＭＳ分析においてアセチル化されると思われ、これは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでこれらの部位での可変性のアセチル化を示唆する（表４）。
【０２２５】
【表４】
0005851409.tif 000096
0005851409.tif 000097
【０２２６】
表４は、ｐ３００の存在下でのヒトタウペプチドの推定修飾を表す。リシンを有するペプチドのみが示されている。３種の独立した分析から得られる総カバー度：３８３／４４１（８６．８％）。推定アセチル化リシンは、太字で下線が引かれている。複数の観察の中の各ペプチドの最高のＳＥＱＵＥＳＴ  ＸＣｏｒｒスコアが示されている。ＸＣｏｒｒスコアのカットオフは、２．５である。リシンはまた、非アセチル化であるとも観察されている。
【０２２７】
ｉｎ  ｖｉｖｏでタウアセチル化を調べるために、位置１６３および１７４および１８０にアセチル化リシンを含有する合成タウペプチド（２Ｎ４Ｒタウアイソフォームのアミノ酸１６０〜１８２；図１０中で下線が引かれている）を使用してポリクローナル抗体（抗Ａｃ−タウ、Ａｂ７０８）を作製した。非アセチル化リシンを有する同じペプチドを使用して対照抗体を作製した（抗タウ、Ａｂ７０７）。ａｃ−タウに対するＡｂ７０８の特異性を試験するために、組換えヒトタウ（４４１；２Ｎ４Ｒアイソフォーム）を、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）単独またはＧＳＴ−ｐ３００とともにインキュベートした。Ａｂ７０８を用いるイムノブロッティングによって、ＧＳＴ−ｐ３００とともにインキュベーションした後に強いタウシグナルを検出したが、ＧＳＴ単独とともにインキュベーションした場合では検出しなかった（図１Ｃ）。対照的に、Ａｂ７０７またはタウ５抗体は、ＧＳＴまたはＧＳＴ−ｐ３００のいずれかとともに同様のレベルの総タウ（ｔ−タウ）を検出した（図１Ｃ）。したがって、Ａｂ７０８は、細胞不含状態下でｐ３００によるタウアセチル化を特異的に認識する。タウを用いてトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞では、ｐ３００の過剰発現は、Ａｂ７０８を用いて検出されるａｃ−タウのレベルを著しく上昇させたが、ｔ−タウのレベルの増大は中程度であり、このことは、Ａｂ７０８は、培養細胞においてｐ３００によって誘導されるａｃ−タウを選択的に認識することを示唆する（図１Ｄ）。リシン１６３、１７４および１８０の突然変異（Ｔａｕ３ＫＲ）は、ａｃ−タウレベルを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるｔ−タウレベルに対して低減させた（図１Ｅ）。Ｔａｕ２ＫＲ（Ｋ１７４Ｒ／Ｋ１８０Ｒ）において２個のリシンが突然変異された場合も、より小さいものであるが、依然、有意な低減が観察された（図１Ｅ）。これらの知見は、Ａｂ７０８は、位置１６３、１７４または１８０でのヒトタウアセチル化およびおそらくはタウ上のその他のアセチル化リシンを認識するが、非アセチル化タウを認識しないことを示唆する。
【０２２８】
ｉｎ  ｖｉｖｏでａｃ−タウを検出するために、ヒトタウｃＤＮＡ（１Ｎ４Ｒ）を発現し、Ｐ３０１Ｓ突然変異（Ｐ１９）を有するトランスジェニックマウス（Ｙｏｓｈｉｙａｍａら（２００７年）Ｎｅｕｒｏｎ５３：３３７）から得た、または２種の主なタウアイソフォームとして０Ｎ３Ｒおよび０Ｎ４Ｒを有する全ヒト野生型ＭＡＰＴ（ｈＴ−ＰＡＣ−Ｎ）を発現するトランスジェニックマウス（ＭｃＭｉｌｌａｎら（２００８年）Ｊ  Ｃｏｍｐ  Ｎｅｕｒｏｌ  ５１１：７８８頁）から得た脳溶解物を用いてウエスタンブロットを実施した。ヒトおよびマウスタウは、Ａｂ７０８およびＡｂ７０７を作製するために使用される領域中の３つの位置で異なる（図１０）。Ａｂ７０８は、Ｐ１９およびｈＴ−ＰＡＣ−Ｎマウスから得た溶解物において特異的シグナルを検出したが、非トランスジェニック（ＮＴＧ）同腹仔から得たものでは検出しなかった（図１Ｆ）。これらの知見は、Ａｂ７０８は、ヒトａｃ−タウの種々のアイソフォームを認識するが、マウスａｃ−タウは認識しないことを示唆する。ヒトｔ−タウを認識する対照抗体Ａｂ７０７は、マウスタウも認識しない。ＮＴＧマウスにおける内因性タウは、タウ５抗体を用いて検出された（図１Ｆ）。
【０２２９】
ラットタウは、Ａｂ７０８を作製するために使用される領域においてはマウスタウよりもヒトタウと同様である（図１０）。Ａｂ７０８は、ラット一次皮質ニューロンにおいて内因性ａｃ−タウを検出した（図１Ｇ）。ａｃ−タウ／ｔ−タウのレベルは、ニューロンが５〜１２日ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（ＤＩＶ）で成熟するのにつれて徐々に上昇し、これは、タウアセチル化が、発達によって調節される（図１Ｇ）ことを示唆する。しかし、Ａｂ７０８によって検出されるラットタウのアイソフォームは、規定されたままである。
【０２３０】
図１Ａ〜Ｇ。タウは、ｉｎ  Ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  Ｖｉｖｏでアセチル化される。（Ａ）オートラジオグラフィーによって示される、細胞不含条件下でのｐＣＡＦではなくｐ３００によるｈ−タウ（２Ｎ４Ｒ）のアセチル化。（Ｂ）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分光法によって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでｐ３００によってｈ−タウ上にａｃ−リシンを同定した。赤：アセチル基を有するリシン（Ｋ）。下線を引いたもの：ＭＳ分析によってカバーされた配列。青色のボックス：微小管−結合ドメイン。（Ｃ〜Ｅ）Ａｂ７０８は、ａｃ−タウを特異的に認識する。（Ｃ）Ａｂ７０８は、ＧＳＴ−ｐ３００による組換えタウアセチル化のみを認識し、ＧＳＴ単独と一緒の非アセチル化タウを認識しなかった。Ａｂ７０７およびタウ５抗体を用いて、同様のレベルのｔ−タウが検出された。（Ｄ）ｐ３００の過剰発現は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてＡｂ７０８を用いて検出されるａｃ−タウを著しく増強した。タウ５を用いて検出されたｔ−タウのレベルは、ｐ３００を用いても、用いなくても同様であった。ブロットは、＞５回の実験を代表するものである。（Ｅ）Ａｂ７０８によって認識される、推定アセチル化リシン部位。野生型タウを発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞中のａｃ−タウ／ｔ−タウレベルを１と設定した。ｎ＝４。＊、Ｐ＝０．０１２；＊＊Ｐ＝０．００３；＊＊＊、Ｐ＝０．０００３（Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒポストホック分析を用いる一元配置分散分析）。（Ｆ）Ａｂ７０８は、ＰＳ１９またはｈＴ−ＰＡＣ−Ｎトランスジェニックマウスの脳においてヒトａｃ−タウを認識するが、非トランスジェニック（ＮＴＧ）同腹仔では認識しない。ヒトｔ−タウは、Ａｂ７０７抗体を用いて検出され；ヒトおよびマウスｔ−タウは、タウ５抗体を用いて検出された。ヒト、マウスおよびラットタウ間の配列類似性については図１０参照のこと。（Ｇ）Ａｂ７０８陽性ａｃ−タウのレベルは、それらが培養において成熟するにつれて（ＤＩＶ＝５〜１２）、一次ラットニューロンにおいて上昇した。２〜３回の独立実験からのｎ＝２〜７。＊＊＊、Ｐ＜０．００１  （ＤＩＶ５対ＤＩＶ８またはＤＩＶ１２）；＊＊、Ｐ＜０．０１  （ＤＩＶ５対ＤＩＶ９〜１１）。値は平均±ＳＥＭである（Ｅ、Ｇ）。
【０２３１】
ｐ３００アセチルトランスフェラーゼによるタウのアセチル化
タウアセチル化における内因性ｐ３００またはｐＣＡＦの役割を調べるために、ヒトタウｃＤＮＡ（２Ｎ４Ｒ）を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ｐ３００またはｐＣＡＦをターゲッティングするｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトし（図２Ａ）、ａｃ−タウまたはｔ−タウに対する効果を評価した。ｐ３００を阻害することによって、ａｃ−タウのレベルを大幅に低下させたが、ｔ−タウは低下しなかった（図２Ｂ、２Ｃ）。対照的に、ｐＣＡＦを阻害することは、なんら効果がなかった（図２Ｂ、２Ｃ）。これらの知見は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究の結果（図１Ａ）と一致する。次いで、一次ニューロンをＣ６４６、４００ｎＭのＫｉを有するｐ３００のピラゾロン含有小分子阻害剤で処理した。Ｂｏｗｅｒｓら（２０１０年）前掲。細胞不含条件下で、１０μＭのＣ６４６は、ｐ３００を高度に選択的に阻害する（８６％阻害対６種のその他のアセチルトランスフェラーゼの＜１０％）。Ｂｏｗｅｒｓら（２０１０年）、前掲。Ｃ６４６（２０μＭ）を用いるｐ３００の阻害は、８時間以内に一次ニューロン中のａｃ−タウのレベルを劇的に低下させた。ｔ−タウのレベルは変化しないままであった（図２Ｄ）。ｐ３００は、転写コアクチベーターである。ＧｏｏｄｍａｎおよびＳｍｏｌｉｋ（２０００）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １４：１５５３頁。しかし、リアルタイム逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いて定量化されたように、８時間のＣ６４６処理は、タウ転写物を抑制しなかった。したがって、ｐ３００の短期（８時間）阻害は、ｔ−タウレベルに影響を及ぼすことなくタウを脱アセチル化する。２０時間のＣ６４６を用いる長期処理は、ｔ−タウに対するａｃ−タウのレベル（ａｃ−タウ／ｔ−タウ）を低下させたが、ｔ−タウのものも低下させた（図２Ｅ）。
【０２３２】
図２Ａ〜Ｅ。タウは、ｐ３００アセチルトランスフェラーゼによってアセチル化される。（Ａ〜Ｃ）ｐＣＡＦではなくｐ３００を阻害することによって、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中のａｃ−タウが低減した。（Ａ）ｓｉＲＮＡトランスフェクションによるｐ３００またはｐＣＡＦ発現の阻害。対照のｓｉＲＮＡがトランスフェクトされた細胞中のｐ３００／ＧＡＰＤＨまたはｐＣＡＦ／ＧＡＰＤＨのレベルを１と設定した。＊＊＊、Ｐ＝０．０００６（ｐ３００対対照）またはＰ＜０．０００１（ｐＣＡＦ対対照）。（Ｂ）対照ｓｉＲＮＡ（ＣＴＲＬ）またはｐ３００もしくはｐＣＡＦをターゲッティングするｓｉＲＮＡでトランスフェクトされた細胞中のｐ３００またはｐＣＡＦ、ａｃ−タウ、ｔ−タウおよびＧＡＰＤＨのレベルを示す代表的ウエスタンブロット（３回の実験からの）。（Ｃ）ｐＣＡＦではなくｐ３００の阻害は、ａｃ−タウレベルを低下させた。対照ｓｉＲＮＡがトランスフェクトされた細胞中のａｃ−タウ／ＧＡＰＤＨまたはｔ−タウ／ＧＡＰＤＨのレベルを１と設定した。ｎ＝５〜６。＊＊、Ｐ＝０．００８（対応ｔ検定）。（Ｄ）一次ラット皮質ニューロンにおいて、Ｃ６４６（２０μＭで８時間）を用いてｐ３００を強く阻害することによって、ｔ−タウレベルに影響を及ぼすことなく、ａｃ−タウが排除された。左：３回の実験からの代表的ウエスタンブロット。右：ビヒクル処理細胞におけるａｃ−タウ／ｔ−タウレベルを１と設定した。ｎ＝３。＊＊＊、Ｐ＝０．０００１（独立ｔ検定）。（Ｅ）一次皮質ニューロンにおける、Ｃ６４６（２０μＭで２０時間）を用いる長期処理は、ｔ−タウを低下させた。ブロットは２回の実験の代表的なものである。値は平均±ＳＥＭ（Ａ、Ｃ〜Ｅ）である。
【０２３３】
培養物中でのＳＩＲＴ１によるタウの脱アセチル化
タウを脱アセチル化する酵素を調べるために、ＦＬＡＧタグをつけたＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＨＤＡＣ５またはＨＤＡＣ６をコードする発現ベクターを、ヒトタウを発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。すべてのＨＤＡＣは高レベルで発現された（図３Ａ）。ＨＤＡＣ６は、ＳＩＲＴ１およびＳＩＲＴ２よりも低レベルで発現されるが、チューブリンアセチル化を排除し（Ｈｕｂｂｅｒｔら（２００２年）Ｎａｔｕｒｅ４１７：４５５頁）、これは、十分な発現（図３Ｂ）を示唆した。ＳＩＲＴ１の過剰発現によって、Ａｂ７０８陽性ａｃ−タウのレベルが低下した。ＳＩＲＴ２およびＨＤＡＣ６過剰発現もまた、より少ない程度にではあるが、ａｃ−タウを低下させた（図３Ｂ、３Ｃ）。ＳＩＲＴ１およびＨＤＡＣ６を過剰発現する細胞におけるｔ−タウのレベルもまた低減した。それにもかかわらず、ＳＩＲＴ１過剰発現によってａｃ−タウ／ｔ−タウ比は大幅に低下した（図３Ｄ）。ＨＤＡＣ６またはＳＩＲＴ２過剰発現によって誘導される、ａｃ−タウ／ｔ−タウの中程度の低減は、統計上有意ではなかった（図３Ｄ）。
【０２３４】
ａｃ−タウに対する内因性ＨＤＡＣの効果を調べるために、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２またはＨＤＡＣ６の発現を、ｓｉＲＮＡを用いて阻害した（図３Ｅ）。対照ｓｉＲＮＡに対して、標的ｓｉＲＮＡは、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２およびＨＤＡＣ６のレベルを大幅に低下させた。中程度の阻害にもかかわらず、ＨＤＡＣ６は、ａｃ−チューブリンレベルを増大させた（図３Ｆ）。しかし、ＳＩＲＴ１の阻害だけは、ａｃ−タウレベルを増大し、タウの脱アセチル化における内因性ＳＩＲＴ１の関与を示唆した（図３Ｇ）。ＳＩＲＴ１過剰発現がｔ−タウを低減するという観察結果と一致して、ＳＩＲＴ１阻害は、ｔ−タウの増大の傾向につながった（図３Ｇ）。それにもかかわらず、ＳＩＲＴ２でもＨＤＡＣ６でもなくＳＩＲＴ１の阻害は、ｔ−タウに対するａｃ−タウ（ａｃ−タウ／ｔ−タウ）のレベルを大幅に上昇させた（図３Ｈ）。これらの結果は、ＳＩＲＴ１がタウ脱アセチル化に関与しているという直接的な支持を提供した。本発明者らの知見は、今までのところ、タウ脱アセチル化における、ＳＩＲＴ２またはＨＤＡＣ６（両方ともチューブリンを脱アセチル化する）の顕著な役割を支持しない（Ｈｕｂｂｅｒｔら（２００２年）前掲；Ｎｏｒｔｈら（２００３年）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  １１：４３７頁）。しかし、ｓｉＲＮＡトランスフェクションを用いて、ＳＩＲＴ２またはＨＤＡＣ６の部分サイレンシングしか達成されないので、その関与は排除できない。
【０２３５】
タウ脱アセチル化におけるＳＩＲＴ１の役割をさらに調べるために、ＳＩＲＴ１を有する（ＳＩＲＴ１＋／＋）か、またはＳＩＲＴ１を有さない（ＳＩＲＴ１−／−）低継代マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）を、ヒトタウｃＤＮＡを用いてトランスフェクトした。ＳＩＲＴ１を欠失することは、ａｃ−タウレベルを大幅に上昇させた。ｔ−タウの増加は、統計的有意性には達せず、これは、ＭＥＦでは、ＳＩＲＴ１がタウを脱アセチル化することを示唆する。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞では、リシン１６３、１７４および１８０をアルギニンに突然変異させた場合（Ｔａｕ３ＫＲ）、ａｃ−タウのレベルは大幅に低下した（図３Ｉ）。ＳＩＲＴ１過剰発現は、ＴａｕＷＴ細胞においてａｃ−タウを低減させたが、Ｔａｕ３ＫＲ細胞では、低減は、かなり減弱された（図３Ｉ）。これらの結果は、リシン１６３、１７４および１８０の脱アセチル化にＳＩＲＴ１を関与させる。しかし、ＳＩＲＴ１は、ａｃ−タウを、Ｔａｕ３ＫＲ細胞において、ＴａｕＷＴ細胞においてよりも低レベルに低減し、これは、ＳＩＲＴ１は、位置１６３、１７４および１８０のものの他、さらなるリシン残基を脱アセチル化できるであろうと示唆する（図３Ｉ）。
【０２３６】
図３Ａ〜Ｉ。ＳＩＲＴ１は、培養物においてタウを脱アセチル化する。（Ａ〜Ｄ）ＳＩＲＴ１過剰発現は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてａｃ−タウレベルを低下させた。（Ａ）抗ＦＬＡＧ抗体を用いてＦＬＡＧタグをつけたＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＨＤＡＣ５またはＨＤＡＣ６の発現を示すウエスタンブロット。ブロットは、２〜３回の実験を代表するものである。（Ｂ）ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＨＤＡＣ５またはＨＤＡＣ６を過剰発現する細胞における、ａｃ−タウ、ｔ−タウ、チューブリンおよびａｃ−チューブリンのレベルを示すウエスタンブロット。ブロットは、２〜３回の実験を代表するものである。（Ｃ）ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２またはＨＤＡＣ６の過剰発現は、ａｃ−タウ／ＧＡＰＤＨのレベルを大幅に低下させた。ＳＩＲＴ１またはＨＤＡＣ６過剰発現によってｔ−タウのレベルも低下した。６〜１０回の独立した実験からのｎ＝９〜１８。＊＊＊、Ｐ＜０．００１（ニセ対ＳＩＲＴ１またはニセ対ＨＤＡＣ６）；＊＊、Ｐ＜０．０１（ニセ対ＳＩＲＴ２）（二元配置分散分析およびＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉポストホックテスト）。（Ｄ）ＳＩＲＴ１の過剰発現は、ａｃ−タウ／ｔ−タウを大幅に低減した。６〜１０回の独立した実験からのｎ＝９〜１８、＊＊＊、Ｐ＜０．００１（ニセ対ＳＩＲＴ１）（一元配置分散分析およびＴｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒポストホックテスト）。（Ｅ〜Ｈ）ＳＩＲＴ１の阻害は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてａｃ−タウを上昇させた。（Ｅ）ｓｉＲＮＡトランスフェクションによって媒介されるＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２またはＨＤＡＣ６発現の阻害、２〜３回の実験からのｎ＝４〜６。＊＊、Ｐ＝０．００１５；  ＊＊＊、Ｐ＝０．０００１（ＳＩＲＴ２対対照）またはＰ＝０．００１（ＨＤＡＣ６対対照）（対応ｔ検定）。（Ｆ）対照ｓｉＲＮＡまたはＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２またはＨＤＡＣ６をターゲッティングするｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトされた細胞における、ａｃ−タウ、ｔ−タウ、チューブリンおよびａｃ−チューブリンのレベルを示すウエスタンブロット。ブロットは、２〜３回の実験を代表するものである。（Ｇ〜Ｈ）ＳＩＲＴ１の阻害は、ａｃ−タウ／ＧＡＰＤＨ（Ｇ）またはａｃ−タウ／ｔ−タウ（Ｈ）のレベルを大幅に上昇させた。２〜３回の実験からのｎ＝４〜６。＊、Ｐ＜０．０５（対応ｔ検定）。対照ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされた細胞における、脱アセチル化酵素／ＧＡＰＤＨ（Ｅ）、ａｃ−タウまたはｔ−タウ／ＧＡＰＤＨ（Ｇ）およびａｃ−タウ／ｔ−タウ（Ｈ）のレベルを１と設定した。（Ｉ）ＳＩＲＴ１によるＴａｕ３ＫＲの脱アセチル化。左：ａｃ−タウ、ｔ−タウ、ＦＬＡＧタグをつけたＳＩＲＴ１およびＧＡＰＤＨのレベルを示す代表的ウエスタンブロット。右：ニセトランスフェクトされた、野生型タウを発現する細胞におけるａｃ−タウ／ｔ−タウレベルを１と設定した。４〜１０回の独立した実験からのｎ＝１０〜２０。＊＊＊、Ｐ＜０．００１；ｎｓ、有意ではない（一元配置分散分析およびＴｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒポストホック分析）。値は、平均±ＳＥＭ（Ｃ〜Ｅ、Ｇ〜Ｉ）である。
【０２３７】
ＳＩＲＴ１は、一次ニューロンおよびｉｎ  Ｖｉｖｏにおいてタウアセチル化を低減する
一次ニューロンでは、ａｃ−タウ／ｔ−タウは、ニューロンが成熟するにつれ増加した（図１Ｇ）が、全長ＳＩＲＴ１のレベルは低下した（図４Ａ）。ＳＩＲＴ１がタウを脱アセチル化するという考えと一致して、ＳＩＲＴ１のレベルは、発達の間、一次ニューロン中のａｃ−タウ／ｔ−タウのレベルと負の相関関係にあった（図４Ｂ）。ＳＩＲＴ１がニューロンにおいてタウアセチル化を負に調節するかどうかを調べるために、ＳＩＲＴ１コンディショナルノックアウトマウス（ＳＩＲＴ１Ｆ／Ｆ）（Ｃｈｕａら（２００５年）Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂ  ２：６７）から得たニューロンに、ｃｒｅリコンビナーゼ（Ｌｅｎｔｉ−ｃｒｅ）を発現するレンチウイルスベクターを感染させることによって、ニューロンにおいてＳＩＲＴ１を欠失させた（図４Ｃ）。対照は、空のベクター（Ｌｅｎｔｉ−ｃｏｎ）での感染とした。ＳＩＲＴ１Ｆ／Ｆニューロンはまた、ヒトタウを発現するレンチウイルスベクターを用いて感染させた。ＳＩＲＴ１を欠失させることによって、ｔ−タウに対するアセチル化ヒトタウのレベルが大幅に上昇し（図４Ｃ）、これは、ニューロンにおいて、ＳＩＲＴ１がタウを脱アセチル化することを示す。
【０２３８】
ｉｎ  ｖｉｖｏでのマウスタウのアセチル化に対するＳＩＲＴ１欠失の効果を調べるために、マウスおよびヒト間で１００％保存されている、微小管−結合領域（２６４〜２８７）をターゲッティングする別のａｃ−タウ特異的抗体（図４Ｄ）を開発した。組換えタウをｐ３００とともにインキュベートして、アセチル化を誘導した。Ａｂ７０８と同様、抗体９ＡＢは、ＧＳＴ−ｐ３００による組換えタウアセチル化を認識したが、ＧＳＴ単独とともにインキュベートされたタウは認識せず、９ＡＢは非ａｃ−タウと交差反応しないことを示唆した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞では、ｐ３００の過剰発現は、９ＡＢを用いて検出されるａｃ−タウのレベルを著しく上昇させたが、ｔ−タウのものは中程度だけであった。したがって、９ＡＢもまた、培養細胞においてｐ３００によって誘導されたａｃ−タウを選択的に認識する（図４Ｅ）。マウス脳では、９ＡＢは、ｔａｕ−／−マウスには存在しなかった低レベルのａｃ−タウを検出した。ＳＩＲＴ１を欠失させるために、ＳＩＲＴ１＋／−マウスを非近交系バックグラウンドで交雑させ、これにより、近交系バックグラウンドでのＳＩＲＴ１−ヌルマウスの胎生期致死を部分的に救出した。Ｃｈｅｎら（２００３年）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １００：１０７９４頁。ＳＩＲＴ１を欠失させることは、脳におけるａｃ−タウのレベルを大幅に増強し、ＳＩＲＴ１がｉｎ  ｖｉｖｏでタウを脱アセチル化するという直接的な証拠を提供した（図４Ｆ）。
【０２３９】
図４Ａ〜Ｆ。ＳＩＲＴ１は、ニューロンにおいて、およびｉｎ  Ｖｉｖｏでタウアセチル化を低減する。（Ａ）培養における成熟の間の（ＤＩＶ５〜１１）一次皮質ニューロンにおけるＳＩＲＴ１の発現を示すウエスタンブロット。ブロットは、２〜３回の独立した培養を代表するものである。（Ｂ）ｔ−タウに対する内因性ａｃ−タウのレベルは、一次ラットニューロン培養物（ＤＩＶ５〜９）におけるＳＩＲＴ１のレベルと負に相関した。ＤＩＶ＝５でのＳＩＲＴ１またはａｃ−タウ／ｔ−タウのレベルを１と設定した。ｎ＝２０独立測定値。Ｐ＝０．０００７、Ｐｅａｒｓｏｎ相関係数ｒ２＝０．４７９１。（Ｃ）ニューロンにおいてＳＩＲＴ１を欠失させることは、ｔ−タウに対するａｃ−タウのレベルを上昇させた。ＳＩＲＴ１Ｆ／Ｆマウスから培養されたニューロンを、対照ウイルスまたはｃｒｅリコンビナーゼを発現するウイルス（Ｌｅｎｔｉ−ｃｒｅ）に感染させた。両培養物ともｈ−タウを発現するレンチウイルスベクターを用いて感染した。ｎ＝８。Ｐ＝０．００１、（独立ｔ検定）。（Ｄ）アセチル特異的抗体（９ＡＢ）は、ＧＳＴ−ｐ３００によってアセチル化されたタウを認識したが、非ａｃ−タウは認識しなかった。また、９ＡＢを作製するために使用した抗原の配列も示される。（Ｅ）ｐ３００を過剰発現することは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において９ＡＢ陽性ａｃ−タウを増強した。タウ５を用いて検出されるｔ−タウのレベルは、ｐ３００過剰発現を有しても、有さなくても同様であった。ブロットは、３回の独立した実験を代表するものである。（Ｆ）ＳＩＲＴ１の欠失は、脳においてｔ−タウに対するａｃ−タウを上昇させた。左：ａｃ−タウ、ｔ−タウおよびＧＡＰＤＨのレベルを示す代表的ウエスタンブロット。右：ＳＩＲＴ１＋／＋、ＳＩＲＴ１＋／−およびＳＩＲＴ１−／−脳におけるａｃ−タウ／ｔ−タウのレベル。ｎ＝３〜６匹のマウス／遺伝子型。＊、Ｐ＝０．０２（ＳＩＲＴ１＋／−対ＳＩＲＴ１−／−）（一元配置分散分析およびＴｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒポストホックテスト）。値は、平均±ＳＥＭである（Ｃ、Ｆ）。
【０２４０】
ＳＩＲＴ１はタウと直接相互作用する
ＳＩＲＴ１は、核中に主に局在するが、細胞質と往復され得る。ＳＩＲＴ１が、タウを直接脱アセチル化するかどうかを調べるために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ脱アセチル化アッセイを実施した。ｐ３００によってアセチル化された組換えタウを、ＳＩＲＴ１過剰発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞から免疫沈降されたＳＩＲＴ１とともにインキュベートした。ａｃ−タウ／ｔ−タウレベルは、免疫沈降されたＳＩＲＴ１（図５Ａ）の存在下で大幅に低かった。ＳＩＲＴ１が、ｉｎ  ｖｉｖｏでタウと直接的に相互作用することを確認するために、ＧＳＴプルダウンアッセイを実施した。ビーズが結合しているＧＳＴ−タウは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において発現されたＦＬＡＧ−ＳＩＲＴ１またはトランスフェクトされていない細胞における内因性ＳＩＲＴ１と相互作用したが、ＧＳＴ単独は相互作用しなかった（図５Ｂ）。さらに、共免疫沈降アッセイでは、抗ＦＬＡＧ抗体との免疫沈降後、抗ＳＩＲＴ１抗体を用いて内因性ＳＩＲＴ１を検出し、ＦＬＡＧタグをつけたタウを発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞において汎タウ抗体（タウ５）を用いてタウを検出した（図５Ｃ）。
【０２４１】
図５Ａ〜Ｃ。ＳＩＲＴ１は、タウと相互作用する。（Ａ）ＳＩＲＴ１は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでａｃ−タウを直接的に脱アセチル化した。免疫沈降されたＳＩＲＴ１の不在下でのａｃ−タウ／ｔ−タウレベルを１と設定した。ａｃ−タウを、Ａｂ７０８抗体を用いて検出した。２回の実験からのｎ＝５。＊＊、Ｐ＝０．００６３（独立ｔ検定）。（Ｂ）ＧＳＴプルダウンアッセイ。ＧＳＴ−タウタンパク質（レーン７〜９）またはＧＳＴ単独（レーン４〜６）を、ＦＬＡＧタグをつけたＳＩＲＴ１を用いてトランスフェクトされた細胞の溶解物またはトランスフェクトされていない細胞の溶解物とともにインキュベートした。レーン１、４および７：０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００；レーン２、５および８：０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００；レーン３、６および９：０．５％  ＮＰ−４０。示されるデータは、２回の実験を代表するものである。低い方のバンドは、これまでに観察されたＳＩＲＴ１の切断生成物に相当する可能性が高い。ＯｈｓａｗａおよびＭｉｕｒａ（２００６年）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ５８０：５８７５頁。（Ｃ）共免疫沈降アッセイ。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ＦＬＡＧタグをつけたヒトタウをコードするプラスミドを用いてトランスフェクトした。２４時間後、細胞溶解物を回収し、抗ＦＬＡＧ抗体を用いて免疫沈降させ、タウ５または抗ＳＩＲＴ１抗体を用いてイムノブロットした。レーン１〜２：インプット；レーン３：一次抗体なし；レーン４：抗ＦＬＡＧ抗体。値は平均±ＳＥＭ（Ａ）である。
【０２４２】
ＳＩＲＴ１欠損は、タウアセチル化を増大し、ｐ−タウの分解を抑制する
ＳＩＲＴ１は、クラスＩＩＩリシン脱アセチル化酵素として、多様な生物において長寿を支持し、促進する。ＳＩＲＴ１は、内分泌の調節およびカロリー制限に対する行動反応に加え、神経変性疾患に強く関与している。ＧａｎおよびＭｕｃｋｅ（２００８年）Ｎｅｕｒｏｎ５８：１０。ＡＤ脳では、ＳＩＲＴ１レベルは大幅に低下し、低減は、タウ蓄積および凝集と相関すると思われる。したがって、欠損したＳＩＲＴ１活性は、タウオパチーの一因となり得る。一次ニューロンでは、特異的阻害剤ＥＸ５２７（Ｎａｐｐｅｒら（２００５年）Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ４８：８０４５頁）を用いてＳＩＲＴ１を阻害することによって、ａｃ−タウ、ＡＴ８陽性ｐ−タウならびにｔ−タウが著しく増大した（図６Ａ）。ｔ−タウに対するａｃ−タウまたはｐ−タウのレベルは、ＥＸ５２７処理で大幅に増大した（図６Ａ）。したがって、ＳＩＲＴ１欠損によって誘導されたａｃ−タウの増大は、一次ニューロンにおける病原性ｐ−タウの蓄積を伴う。マウス脳では、ＳＩＲＴ１を欠失させることは、ａｃ−タウを高め、また、ＡＴ８陽性ｐ−タウを増大した（図６Ｂ）。
【０２４３】
タウアセチル化の上昇が、どのように高レベルのｐ−タウにつながるのか？リシンのアセチル化は、そのユビキチン化を妨げ、ＵＰＳによって通常分解されるタンパク質、例えば、ｐ５３、Ｒｕｎｘ３、β−カテニンおよびその他の調節因子を安定化し得る。タウはユビキチン化され、タウ、特に、ｐ−タウの分解は、プロテアソーム媒介性経路を含むので、アセチル化がタウユビキチン化を妨げ、その分解を抑制すると仮定された。
【０２４４】
この仮説を調べるために、タンパク質代謝回転の調節におけるアセチル化リシンの関与を評価した。ヒト野生型タウ（ｈＴａｕｗｔ）およびヒトｔａｕ３ＫＲ（ｈＴａｕ３ＫＲ）の代謝回転速度を比較した。一次皮質ニューロンを、Ｌｅｎｔｉ−ｈＴａｕｗｔおよびＬｅｎｔｉ−ｈＴａｕ３ＫＲに感染させ、ＣＨＸで処理した（図６Ｃ）。Ｌｅｎｔｉ−ｈＴａｕ３ＫＲの感染の結果、Ｌｅｎｔｉ−ｈＴａｕｗｔのものよりもかなり弱いＡｂ７０８陽性シグナルが得られ、Ａｂ７０８がリシン１６３、１７４および１８０のアセチル化を認識するというさらなる支持を提供した。これら３個のリシンをアルギニンに突然変異させることによって、おそらくは３つの部位でユビキチン化を持続的に阻止することによってタウの半減期が大幅に増大した（図６Ｄ）。これらの結果は、アセチル化リシンはユビキチン化され得るという考えを支持する。
【０２４５】
アセチル化の増強がユビキチン化を阻止し得るかどうかを直接調べるために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、タウおよび血球凝集素（ＨＡ）タグをつけたユビキチンをコードする発現プラスミドを用いてトランスフェクトし、次いで、ＥＸ５２７を用いて処理して、ＳＩＲＴ１を阻害し、ＭＧ１３２を用いて処理して、プロテアソーム媒介性分解を阻止した。ユビキチン化タウを、抗ＦＬＡＧ抗体とともに免疫沈降させ、抗ＨＡ抗体を用いて検出した。ＥＸ５２７はタウのポリユビキチン化を用量依存的に防ぎ、タウユビキチン化は、アセチル化の増強によって抑制されるということを示した（図６Ｅ）。ＥＸ５２７はまた、予測されたようにａｃ−タウレベルを上昇させた（図６Ｆ）。対照的に、ＳＩＲＴ１媒介性脱アセチル化は、タウユビキチン化を増強すると思われる。ＳＩＲＴ１の活性化に間接的に関与している可能性があるレスベラトロールでの処理は、野生型ＳＩＲＴ１を用いてトランスフェクトされた細胞においてタウユビキチン化を大幅に増大したが、Ｈ３６３Ｙ突然変異体でトランスフェクトされたものでは増大しなかった。
【０２４６】
次いで、タウのアセチル化の増強が、内因性タウの代謝回転を遅くするかどうかを直接調べた。一次ニューロンを、ＥＸ５２７を用いて処理してタウアセチル化を増強し、また、シクロヘキシミド（ＣＨＸ）で処理して、新規タンパク質の翻訳を阻害した。一次ニューロン中の内因性ラットタウは、約５時間の半減期を有していた。ＳＩＲＴ１を、ＥＸ５２７を用いて阻害することによって、タウ代謝回転が遅くなり、ｔ−タウの半減期を用量依存的に増大した（図６Ｇ、６Ｈ）。この考えと一致して、ａｃ−タウは、ｔ−タウのものよりも遅く分解されると思われる。一次ニューロンでは、ＣＨＸは５時間後ｔ−タウレベルを著しく低下させたのに対し、ａｃ−タウレベルは８時間後にわずかに低減したのみであった。さらに、１０μＭのＥＸ５２７を用いるＳＩＲＴ１の阻害は、ａｃ−タウの代謝回転を阻止し、その蓄積につながった（図６Ｉ、６Ｊ）。高用量のＥＸ５２７（５０μＭ）は、ａｃ−タウのより顕著な蓄積をもたらした（図６Ｉ）。ＥＸ５２７を用いる処理はまた、ＡＴ８陽性ｐ−タウの分解を用量依存的に阻止した（図６Ｋ）。
【０２４７】
図６Ａ〜Ｋ。アセチル化は、そのユビキチン化を阻害することによってタウ代謝回転を遅くする。（Ａ）ＥＸ５２７（５０μＭ）を用いてＳＩＲＴ１を阻害することによって、ラット一次ニューロン中のａｃ−タウおよびｐ−タウが上昇した（ＤＩＶ＝１０）。左：代表的なウエスタンブロット。ｐ−タウはＡＴ８を用いて検出した。右：ビヒクル処理した細胞におけるａｃ−タウ／ｔ−タウまたはｐ−タウ／ｔ−タウのレベルを１と設定した。ｎ＝６独立処理。＊＊＊、Ｐ＜０．００１；＊、Ｐ＜０．０５（対応ｔ検定）。（Ｂ）ＳＩＲＴ１の欠失は、脳においてＡＴ８陽性ｐ−タウを増大させた。ｎ＝３〜４匹のマウス／遺伝子型。＊、Ｐ＜０．０５（ＳＩＲＴ１＋／＋対ＳＩＲＴ１−／−）（一元配置分散分析およびＴｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒポストホックテスト）。（ＣおよびＤ）一次ニューロンにおいて、Ｔａｕ３ＫＲは、野生型タウよりも安定であった。細胞をＬｅｎｔｉ−ｈＴａｕｗｔまたはＬｅｎｔｉ−ｈＴａｕ３ＫＲに感染させ、感染（ＤＩＶ＝９）の４日後にＣＨＸを用いて８〜３２時間処理した。（Ｃ）ａｃ−タウ、ｔ−タウおよびＧＡＰＤＨを示す２回の実験の代表的なウエスタンブロット。（Ｄ）ｔ−タウの代謝回転は、Ｔａｕ３ＫＲを発現する細胞において遅かった。時間０で回収された細胞におけるｔ−タウ／ＧＡＰＤＨレベルを１と設定した。２回の実験からｎ＝３〜５。＊、Ｐ＝０．０４（８時間）、Ｐ＝０．０１５（２４時間）；＊＊＊、Ｐ＜０．０００１（３２時間）（各時点の非対応ｔ検定）。（ＥおよびＦ）ＳＩＲＴ１阻害剤ＥＸ５２７（１〜５０μＭ）は、タウユビキチン化を抑制し、ａｃ−タウを用量依存的に上昇させた。ブロットは、３回の実験を代表するものである。（Ｇ〜Ｋ）ＳＩＲＴ１阻害剤ＥＸ５２７は、ラット一次ニューロン（ＤＩＶ＝８）においてタウの半減期を用量依存的に増大する。ニューロンを、ＥＸ５２７（１０〜５０μＭ）の存在下または不在下で、ＣＨＸを用いて０〜８時間処理した。ＥＸ５２７を用いるか、用いない、ニューロンにおけるｔ−タウ（Ｇ）、ａｃ−タウ（Ｉ）またはｐ−タウ（Ｋ）の代謝回転を示す３回の実験の代表的なウエスタンブロット（ＨおよびＪ）。ｔ−タウ（Ｈ）またはａｃ−タウ（Ｊ）の代謝回転は、ＥＸ５２７の処理によって著しく遅くなった。時間０に回収された細胞におけるｔ−タウ／チューブリンまたはａｃ−タウ／チューブリンのレベルを１と設定した。ｎ＝３。＊＊、Ｐ＜０．０１；＊＊＊、Ｐ＜０．００１（二元配置分散分析、ＥＸ５２７処理対ビヒクル処理）。値は平均±ＳＥＭ（Ａ〜Ｂ、Ｄ、Ｇ、Ｉ）である。
【０２４８】
病的状態におけるタウアセチル化の上昇
タウの分解が、そのアセチル化によって遅くなったので、アセチル化は、プロテアソーム媒介性経路によって通常は分解されるｐ−タウの蓄積の一因となる重要な初期事象であると仮定した。一次ニューロンでは、低レベルのアミロイドβ（Ａβ）オリゴマー、ＡＤにおける重要な病原体を用いる処理によって、ａｃ−タウのレベルが用量依存的に増大した（図７Ａ）。高レベルのａｃ−タウが、同様のレベルのｈＴａｕｗｔを発現するものよりも、ＦＴＤ関連突然変異（ｈＴａｕＰ３０１Ｌ）を保持するヒトタウを発現する一次ニューロンにおいて観察された（図７Ｂ）。これらの知見は、タウアセチル化が、ストレス、例えば、Ａβ蓄積またはＦＴＤ関連突然変異によって増大することを示唆する。
【０２４９】
種々の程度のタウ病理を有する患者の前頭皮質におけるタウアセチル化を調べた。ＢｒａａｋおよびＢｒａａｋ（１９９１年）Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｂｅｒｌ．８２：２３９頁。Ｂｒａａｋステージ１〜２または３〜４の患者は、Ｂｒａａｋステージ０の患者よりも、脳溶解物の可溶性画分中に大幅に高いレベルのａｃ−タウを有していた（図７Ｃ）。Ａｂ７０８は、ヒトタウを過剰発現するトランスジェニックマウスにおいて種々のヒトタウアイソフォームを認識できる（図１Ｄ）。しかし、すべてのアイソフォームを検出するタウ５とは異なり、Ａｂ７０８は、ＡＤ脳において一部のアイソフォームを選択的に検出すると思われる（図７Ｃ）。ＰＨＦ−１（図１Ｄ）またはＡＴ８を用いて検出された過剰リン酸化タウは、ステージ５〜６の患者においてのみ観察され、初期Ｂｒａａｋステージの患者の前頭皮質における大幅なＮＦＴの欠如と一致する（ＢｒａａｋおよびＢｒａａｋ（１９９１年）前掲）。したがって、これらの知見は、増強されたタウアセチル化は、タウの過リン酸化およびＮＦＴ形成に進行するという考えを支持する。しかし、Ｂｒａａｋステージ５〜６の患者、特に、ステージ６で、前頭皮質にＮＦＴを有するものでは、ａｃ−タウのレベルは、軽度から中程度のステージの患者よりもわずかに低かった。この末期低減は、ニューロンの相当な喪失またはＮＦＴ中へのａｃ−タウの隔離、ひいては、溶解物の不溶性画分中に残存することによって説明することができる。
【０２５０】
図７Ａ〜Ｄ。タウアセチル化は、病的状態下で増大される。（Ａ）タウアセチル化は、一次皮質ニューロン（ＤＩＶ＝１１）において低レベルのＡβオリゴマーによって増大した。３回の実験からｎ＝５。＊＊、Ｐ＝０．００３（一元配置分散分析およびＴｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒポストホックテスト）（Ｂ）タウアセチル化は、一次ニューロンにおいて（ＤＩＶ＝１３）家族性ＭＡＰＴ突然変異と関連していた。Ｌｅｎｔｉ−ｈＴａｕｗｔに感染したニューロンにおけるａｃ−タウ／ｔ−タウレベルを１と設定した。３回の実験からｎ＝９。＊、Ｐ＝０．０１３（独立ｔ検定）。（Ｃ）種々のＢｒａａｋステージ（０〜５）の、ヒト脳におけるａｃ−タウ、ｔ−タウおよび過剰リン酸化タウのレベルを示す代表的ウエスタンブロット（Ｂｍ−２２、上側頭回）。（Ｄ）軽度（Ｂｒａａｋステージ１〜２）から中程度（Ｂｒａａｋステージ３〜４）レベルのタウ病理を有する患者において、Ａｃ−タウレベルは増大した。ｎ＝８〜１８症例／Ｂｒａａｋ範囲。＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１、一元配置分散分析Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒホストホック分析。値は平均±ＳＥＭ（Ａ、Ｂ、Ｄ）。
【０２５１】
タウアセチル化を低減することによって、ＦＴＤ関連突然変異によって誘発されるｐ−タウが排除される。
タウアセチル化が、ｐ−タウ蓄積の一因であるという仮設を調べるために、タウアセチル化を阻害することによってｐ−タウが排除され、タウオパチーから保護されるかどうかを調べた。一次ニューロンにおいて、小分子Ｃ６４６を用いてｐ３００を阻害することによって、ｔ−タウレベルに影響を及ぼすことなくａｃ−タウが排除された（図８Ａ）。ＡＴ８抗体を用いて検出された、セリン２０２でリン酸化された病原性タウも、Ｃ６４６を用いる２時間の処理以内に無効になったことは顕著である。その不活性の類似体Ｃ３７は効果がなかった（図８Ｂ）。これらの結果は、脱アセチル化は、ｐ−タウの分解を選択的に増強することを示唆し、ｐ−タウ種は、ｈＴａｕＰ３０１Ｌを発現する一次ニューロン、タウオパチーの細胞モデルでは、ＵＰＳ経路によって選択的に分解されるという観察結果と一致し、ＡＴ８陽性ｐ−タウもまた、Ｃ６４６処理によって減少した（図８Ｃ）。タウを低減することによって、ＡＤおよびＦＴＤＰ−１７のマウスモデルにおいて認知機能が改善され（Ｒｏｂｅｒｓｏｎら（２００７年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１６：７５０頁およびＳａｎｔａｃｒｕｚら（２００５年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０９：４７６頁）、興奮毒性から保護される（Ｒｏｂｅｒｓｏｎら（２００７年）前掲）。これらの結果から、リシンアセチル化を調節することが、神経変性タウオパチーにおいて、タウ、特に、ｐ−タウの病原性形態のレベルを低下させるための新規治療戦略として見なされる。
【０２５２】
図８Ａ〜Ｄ。タウアセチル化を低減することによって、ｐ−タウが排除される。（Ａ）Ｃ６４６（２０μＭ）が、一次皮質ニューロン（ＤＩＶ＝９）において２時間以内にａｃ−タウおよびＡＴ８陽性ｐ−タウを排除した。２回の実験の代表的なウエスタンブロット。（Ｂ）Ｃ６４６（２０μＭ）は、ｐ−タウを排除した。非処理細胞におけるｐ−タウ／ＧＡＰＤＨのレベルを１と設定した。ｎ＝４。＊＊＊、Ｐ＜０．０００１（独立ｔ検定）。（Ｃ）Ｃ６４６（２０μＭ）は、ｈＴａｕＰ３０１Ｌを発現する一次ニューロン（ＤＩＶ＝１２）においてＡＴ８陽性ｐ−タウを排除した。左、２回の実験の代表的なウエスタンブロット。右、対照化合物（Ｃ３７）で処理した細胞におけるｐ−タウ／ＧＡＰＤＨのレベルを１と設定した。ｎ＝７。＊＊＊、Ｐ＝０．０００１（独立ｔ検定）。（Ｄ）タウアセチル化がタウ媒介性神経変性の一因となり得る方法の仮説のモデル。破線および灰色の因子は、まだ調べられていない経路を示す。値は、平均±ＳＥＭである（Ｂ〜Ｃ）。
【０２５３】
本発明を、その特定の実施形態を参照して記載したが、当業者によって、本発明の趣旨および範囲から逸脱せず、種々の変法を行ってもよく、等価物を置換してもよいということは理解されるべきである。さらに、本発明の目的、趣旨および範囲に対して、特定の状況、材料、組成物、方法、工程または複数の工程を適合させるように、多数の改変を行ってもよい。すべてのこのような改変は添付の特許請求の範囲内にあるものとする。
【図１Ａ】
0005851409.tif 000098
【図１Ｂ】
0005851409.tif 000099
【図１Ｃ】
0005851409.tif 000100
【図１Ｄ】
0005851409.tif 000101
【図１Ｅ】
0005851409.tif 000102
【図１Ｆ】
0005851409.tif 000103
【図１Ｇ】
0005851409.tif 000104
【図２Ａ】
0005851409.tif 000105
【図２Ｂ】
0005851409.tif 000106
【図２Ｃ】
0005851409.tif 000107
【図２Ｄ】
0005851409.tif 000108
【図２Ｅ】
0005851409.tif 000109
【図３Ａ】
0005851409.tif 000110
【図３Ｂ】
0005851409.tif 000111
【図３Ｃ】
0005851409.tif 000112
【図３Ｄ】
0005851409.tif 000113
【図３Ｅ】
0005851409.tif 000114
【図３Ｆ】
0005851409.tif 000115
【図３Ｇ】
0005851409.tif 000116
【図３Ｈ】
0005851409.tif 000117
【図３Ｉ】
0005851409.tif 000118
【図４Ａ】
0005851409.tif 000119
【図４Ｂ】
0005851409.tif 000120
【図４Ｃ】
0005851409.tif 000121
【図４Ｄ】
0005851409.tif 000122
【図４Ｅ】
0005851409.tif 000123
【図４Ｆ】
0005851409.tif 000124
【図５Ａ】
0005851409.tif 000125
【図５Ｂ】
0005851409.tif 000126
【図５Ｃ】
0005851409.tif 000127
【図６Ａ】
0005851409.tif 000128
【図６Ｂ】
0005851409.tif 000129
【図６Ｃ】
0005851409.tif 000130
【図６Ｄ】
0005851409.tif 000131
【図６Ｅ】
0005851409.tif 000132
【図６Ｆ】
0005851409.tif 000133
【図６Ｇ】
0005851409.tif 000134
【図６Ｈ】
0005851409.tif 000135
【図６Ｉ】
0005851409.tif 000136
【図６Ｊ】
0005851409.tif 000137
【図６Ｋ】
0005851409.tif 000138
【図７Ａ】
0005851409.tif 000139
【図７Ｂ】
0005851409.tif 000140
【図７Ｃ】
0005851409.tif 000141
【図７Ｄ】
0005851409.tif 000142
【図８Ａ】
0005851409.tif 000143
【図８Ｂ】
0005851409.tif 000144
【図８Ｃ】
0005851409.tif 000145
【図８Ｄ】
0005851409.tif 000146
【図９Ａ】
0005851409.tif 000147
【図９Ｂ】
0005851409.tif 000148
【図９Ｃ】
0005851409.tif 000149
【図９Ｄ】
0005851409.tif 000150
【図１０】
0005851409.tif 000151
【配列表】
0005851409000001.app