(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検試料中のコムギ種特異的ＤＮＡを、ポリメラーゼ連鎖反応によって検出又は定量する方法であって、
前記被検試料中の核酸又は前記被検試料から抽出した核酸を鋳型とし、配列番号１に記載の塩基配列中の部分配列を増幅可能なプライマーペアを用いて、前記部分配列を有する核酸を増幅する工程と、
前記増幅された核酸を検出又は定量する工程と、
を含む方法であって、
前記プライマーペアが、
（ｉ）配列番号４に記載の塩基配列を含む核酸と、配列番号５に記載の塩基配列を含む核酸と、からなるプライマーペア、又は、
（ｉｉ）配列番号４に記載の塩基配列を含む核酸と、配列番号６に記載の塩基配列を含む核酸と、からなるプライマーペア、
である方法。
【請求項２】
前記プライマーペアに含まれるプライマーが、１５乃至４０塩基長の核酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ｉ）配列番号４に記載の塩基配列を含む核酸と、配列番号５に記載の塩基配列を含む核酸と、からなるプライマーペア、又は、
（ｉｉ）配列番号４に記載の塩基配列を含む核酸と、配列番号６に記載の塩基配列を含む核酸と、からなるプライマーペア
を含む、被検試料からポリメラーゼ連鎖反応によってコムギ種特異的ＤＮＡ配列を検出又は定量するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被検試料中のコムギ内在性遺伝子（以下、「種特異的遺伝子」という。）を検出及び定量する方法に関する。特に、食品素材、加工食品中に含まれる遺伝子組換えコムギの混入率を決定する際に用いる、コムギ内在性ＤＮＡ（以下、「種特異的ＤＮＡ」という。）を検出及び定量する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
日本では、現在までにトウモロコシ、ダイズ、ジャガイモ等について５０種以上の遺伝子組換え農作物（以下「ＧＭＯ」という）が、安全性審査を経て、輸入や販売を認められている。これに伴って、ＧＭＯ含有食品は、「遺伝子組換えに関する表示に係る加工食品品質表示基準第７条第１項及び生鮮食品品質表示基準第７条第１項の規定に基づく農林水産大臣の定める基準」（平成１２年３月３１日農林水産省告示第５１７号）、及び「食品衛生法施行規則及び乳及び乳製品の成分規格等に関する省令の一部を改正する省令等の施行について」（平成１３年３月１５日厚生労働省食発第７９号）に基づき、その表示が義務化されている。
【０００３】
しかし、海外では、一度安全性評価が終了すると、ＧＭＯと非ＧＭＯとが混在する形で栽培されることもある。また、収穫後の流通の過程で、非ＧＭＯが混入する可能性も否定できない。さらに、食品メーカ等が、加工食品の製造を製造業者に委託することも多く、仮に非ＧＭＯを使用するように指定して委託しても、委託された製造業者の工場でＧＭＯを使用している場合は、このＧＭＯが加工食品に微量混入してしまうことがある。したがって、表示の義務を遵守するためには、食品メーカ等は、完成した加工食品中に、ＧＭＯが混入していないかどうかを検査分析して確認することが求められる。
【０００４】
加工食品及びその原料等の被検試料中のＧＭＯ検出方法としては、ポリメラーゼ連鎖反応（以下「ＰＣＲ」という）によって組換えＤＮＡを検出する方法、酵素結合免疫吸着法（以下「ＥＬＩＳＡ法」という）によって組換え蛋白質を検出する方法等がある。加工食品の場合、加熱や加圧によって蛋白質が変性していることが多く、ＥＬＩＳＡ法では正確な検出ができないことが多い。そのため、ＰＣＲ法による検出が一般的に行われる。
【０００５】
ＧＭＯを検査分析する方法として、「ＪＡＳ分析試験ハンドブック  遺伝子組換え食品検査・分析マニュアル改訂第２版」に記載される方法や、「組換えＤＮＡ技術応用食品の検査方法について（一部改正）」（平成１５年６月１８日厚生労働省食発第０６１８００２号）に記載される方法がある。これらによれば、ＧＭＯの検査分析においては、被検試料から抽出したＤＮＡのＰＣＲ増幅が可能かどうかを確認する目的で、各農産物の種特異的ＤＮＡを検知するプライマーペアを用いてＰＣＲ法を行い、予想される長さのＰＣＲ産物が得られるか確認する必要があることが記載されている。また、被検試料中に含まれるＧＭＯを定量する場合には、その農産物が必ず持っている種特異的ＤＮＡに対する組換えＤＮＡの存在比率から、組換え体の混入率を相対的に測定する方法が用いられる。
【０００６】
例えばトウモロコシでは、５系統の承認ＧＭＯ品種それぞれに対して特異的な検知プライマーペアが開発されているほか、トウモロコシの種特異的ＤＮＡとしてＳＳＩＩＢ遺伝子の領域を検知するプライマーペアが開発されている。
【０００７】
種特異的ＤＮＡを検知するプライマーペアは、組換えＤＮＡの検出及び定量において、種特異的ＤＮＡ量の基準となるものである。そのため、増幅される種特異的ＤＮＡ領域は、ゲノムにおいてシングルコピーであることが求められる。「組換えＤＮＡ技術応用食品の検査方法について（一部改正）」（平成１５年１１月１３日食安発第１１１３００１号）では、定量ＰＣＲ法を行う際、トウモロコシ又はダイズの種特異的ＤＮＡと組換えＤＮＡとを標的とした特異的プライマー対により増幅された増幅産物をプラスミド上に連結したものを標準物質として使用している。かかる標準物質を用いて定量ＰＣＲ法を行い、被検試料についても一定時間定量ＰＣＲを行うことにより、組換えＤＮＡのコピー数と種特異的ＤＮＡのコピー数との比を正確に求めることができる。
【０００８】
トウモロコシのように複数の系統のＧＭＯ品種が存在する場合には、各系統に特異的なＤＮＡと種特異的ＤＮＡとを一つの環状ＤＮＡに組み込んだ標準物質を用いれば、各系統の混入率の測定において共通の標準物質を用いることができ、有用である。
【０００９】
また、一般に、各系統に特異的な遺伝子は入手が困難であるが、一度これらを組み込んで複製可能なＤＮＡを作製すれば、このＤＮＡ自体を複製することによって、系統特異的なＤＮＡを安定して供給することも可能となる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】「遺伝子組換えに関する表示に係る加工食品品質表示基準第７条第１項及び生鮮食品品質表示基準第７条第１項の規定に基づく農林水産大臣の定める基準」（平成１２年３月３１日農林水産省告示第５１７号）
【非特許文献２】「食品衛生法施行規則及び乳及び乳製品の成分規格等に関する省令の一部を改正する省令等の施行について」（平成１３年３月１５日厚生労働省食発第７９号）
【非特許文献３】ＪＡＳ分析試験ハンドブック  遺伝子組換え食品検査・分析マニュアル改訂第２版
【非特許文献４】「組換えＤＮＡ技術応用食品の検査方法について（一部改正）」（平成１５年６月１８日厚生労働省食発第０６１８００２号）
【非特許文献５】Kopell, E. et al.; Mitteilungen aus dem Gebiete der Lebensmitteluntersuchung und Hygiene, 88, 164、出版社：Neukomm & Zimmermann（ベルン）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
パンコムギについては、現在のところ安全性審査を経た遺伝子組換え品はないが、近い将来の上市が予想される。このため、コムギのＧＭＯが流通した場合に備えて、コムギの種特異的ＤＮＡを検出及び定量する方法、並びにこれに用いるＰＣＲ用プライマーペアの開発が求められている。
【００１２】
コムギは他の穀物に比べ、遺伝子の存在形態に様々なバリエーションが存在する。これはコムギ品種により６倍体、４倍体、２倍体の遺伝子型が存在するからである。一般的なパンコムギの場合、遺伝子型は６倍体であるが、それぞれの遺伝子は類似している。しかし、転座などにより、部分的な相違が認められている。この様な理由から、コムギの場合、品種による遺伝子型にバリエーションが存在し、コムギの種特異的遺伝子としての次に示す条件を満たす遺伝子が発見されていない。
Ａ）    コムギ品種で普遍的に存在する。
Ｂ）    コムギ品種により存在量（検出量）が偏らない。
Ｃ）    コムギ以外の他の穀物などにより検出が影響されない。
Ｄ）    ＰＣＲ反応で定量的に増幅する。
【００１３】
コムギの場合には、例えばオオムギ、ライムギ、オーツムギなど、同じ穀物の中にゲノム構造やコードされる遺伝子の塩基配列について相同性の高い麦類がある。これらの麦類は、パンコムギとの相同性が高く、パンコムギとして誤検出される可能性が高い。このため、他の麦類や他の作物由来のＤＮＡを誤検出せず、パンコムギの種特異的ＤＮＡのみを特異的に検出できる、他の作物と交叉性が無い方法が求められている。
【００１４】
また、ＰＣＲ法により増幅される種特異的ＤＮＡ領域が複数存在すると、被検試料中のコムギを正確に定量することが困難となる。そのため、被検試料中のＧＭＯコムギの混入率を正確に定量するためには、増幅される種特異的ＤＮＡの領域が、ゲノムにおいて一定であることが望ましい。
【００１５】
さらに、定量ＰＣＲ法によってＧＭＯ混入率を求める場合は、コムギについても、種特異的遺伝子ＤＮＡと組換えＤＮＡとを標的とした特異的プライマー対によって増幅可能な領域を環状ＤＮＡ上に連結した標準物質も有用である。
【００１６】
そこで、本発明は、コムギ品種で普遍的に存在し、その存在量（検出量）が偏らず、かつ他の植物との交叉性が生じないコムギＤＮＡ（ゲノム）の部分領域を特定し、増幅するためのＰＣＲプライマーを用いた種特異的ＤＮＡの好適な検出及び定量方法を提供することを目的の一つとする。
【００１７】
さらに本発明は、コムギ種特異的ＤＮＡと組換えＤＮＡとを標的とした特異的プライマー対により増幅可能な領域を環状ＤＮＡ上に連結した標準物質を提供することも目的の一つとする。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、コムギのゲノムＤＮＡにおいて、Ｒａｉｎｅｓ  ＣＡ，  Ｌｌｏｙｄ  ＪＣ，  Ｃｈａｏ  ＳＭ，  Ｊｏｈｎ  ＵＰ，  Ｍｕｒｐｈｙ  ＧＪ．  Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｐｒｏｌｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｒｏｍ  ｗｈｅａｔ．  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  １９９１  Ａｐｒ；１６（４）：６６３−７０．に記載のＰｒｏｌｉｎｅ  ｒｉｃｈ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＰＲＰ）遺伝子の一部領域がコムギ品種に普遍的に存在することを見出した。さらに本発明者らは、ＰＲＰ遺伝子の一部領域が、他の植物との交叉性を生じること無く、ＰＣＲ反応によって増幅可能であり、コムギ種特異的ＤＮＡ配列として特異的に検出又は定量できることを見出し、本発明を完成させた。
【００１９】
即ち、本発明の第１の態様は、被検試料中のコムギ種特異的ＤＮＡを、ＰＣＲによって検出又は定量する方法であって、被検試料中の核酸又は被検試料から抽出した核酸を鋳型とし、配列番号１に記載の塩基配列中の部分配列を増幅可能なプライマーペアを用いて、当該部分配列を有する核酸を増幅する工程と、増幅された核酸を検出又は定量する工程と、を含む方法であることを要旨とする。
【００２０】
本発明の第１の態様において、プライマーペアは、配列番号２に記載の塩基配列を含む核酸と配列番号３に記載の塩基配列を含む核酸とからなるプライマーペア、配列番号４に記載の塩基配列を含む核酸と配列番号３に記載の塩基配列を含む核酸とからなるプライマーペア、並びに配列番号２に記載の塩基配列を含む核酸と配列番号５に記載の塩基配列を含む核酸とからなるプライマーペアから選択されてもよい。あるいは、配列番号４に記載の塩基配列を含む核酸と配列番号５に記載の塩基配列を含む核酸とからなるプライマーペア、配列番号２に記載の塩基配列を含む核酸と配列番号６に記載の塩基配列を含む核酸とからなるプライマーペア、並びに配列番号２に記載の塩基配列を含む核酸と配列番号７に記載の塩基配列を含む核酸とからなるプライマーペアから選択されてもよい。あるいは、配列番号４に記載の塩基配列を含む核酸と配列番号７に記載の塩基配列を含む核酸とからなるプライマーペア、並びに配列番号４に記載の塩基配列を含む核酸と配列番号６に記載の塩基配列を含む核酸とからなるプライマーペアから選択されてもよい。あるいは、上述したプライマーペアのそれぞれの核酸が有する塩基配列の少なくとも８０％の連続した塩基配列を含むプライマーペアであってもよい。
【００２１】
また、本発明の第１の態様において、上述したプライマーペアに含まれるプライマーは、１５乃至４０塩基長の核酸であってもよい。
【００２２】
本発明の第２の態様は、ＰＣＲによって被検試料からコムギ種特異的ＤＮＡ配列を検出又は定量するための、上述したプライマーペアを含むキットであることを要旨とする。
【００２３】
本発明の第３の態様は、遺伝子組換えコムギ及び非遺伝子組換えコムギが共通して有する種特異的ＤＮＡと、遺伝子組換えコムギの各系統に特異的な配列からなる１以上の遺伝子組換えコムギ特異的ＤＮＡと、を含む複製可能なＤＮＡであることを要旨とする。なお、複製可能なＤＮＡとは、宿主に対し特異的な複製開始点を有するＤＮＡをさす。
【００２４】
本発明の第４の態様は、配列番号１に記載の塩基配列と少なくとも８０％の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡを含む、複製可能な環状ＤＮＡであることを要旨とする。なお、複製可能な環状ＤＮＡは、遺伝子組換えコムギの各系統に特異的な配列からなる１以上のＤＮＡをさらに含んでいてもよい。
【００２５】
本発明の第５の態様は、上述したプライマーペアを用いてＰＣＲで増幅可能な領域を含む、複製可能なＤＮＡであることを要旨とする。なお、複製可能なＤＮＡは、遺伝子組換えコムギの各系統に特異的な配列からなる１以上のＤＮＡをさらに含んでいてもよい。
【００２６】
本発明の第６の態様は、被検試料における遺伝子組換えコムギの混入率を決定する方法であって、本発明の第３乃至第５の態様のいずれかに係る複製可能なＤＮＡを含む溶液を用いて２種類の以上の濃度希釈系列を作り、それぞれについて定量的ＰＣＲを行って、コムギ種特異的ＤＮＡ配列の部分領域と、少なくとも一種類の遺伝子組換えコムギに特異的なＤＮＡ配列の部分領域と、を増幅し、各部分領域について検量線を求める第一工程と、被検試料中に含まれる、コムギ種特異的ＤＮＡ配列の部分領域と、少なくとも一種類の遺伝子組換えコムギに特異的なＤＮＡ配列の部分領域とを、第一工程と同一の条件で定量的ＰＣＲによって増幅し、第一工程で求めた検量線を用いて、被検試料中に存在した、種特異的ＤＮＡ配列の部分領域の分子数と、遺伝子組換えコムギに特異的なＤＮＡ配列の部分領域の分子数と、を求める第二工程と、を含む方法であることを要旨とする。
【００２７】
本発明の第６の態様において、第二工程で求めた、遺伝子組換えコムギに特異的なＤＮＡ配列の部分領域の分子数を、コムギ種特異的ＤＮＡ配列の部分領域の分子数で除して得られる比Ａと、遺伝子組換えコムギの標準種子を用いた定量的ＰＣＲを行って求められる、遺伝子組換えコムギの各系統に特異的なＤＮＡ配列の部分領域の分子数を、コムギ種特異的ＤＮＡ配列の部分領域の分子数で除して得られる比Ｂと、を用い、１００×Ａ／Ｂを計算して、被検試料中の遺伝子組換えコムギの混入率を決定する工程をさらに含んでいてもよい。
【００２８】
また、本発明の第６の態様において、コムギ種特異的ＤＮＡ配列の増幅を、上述したプライマーペアから選択される少なくとも１つのプライマーペアを用いて行ってもよい。
【００２９】
本発明の態様に係る方法に用いるＰＣＲ用プライマーペアは、コムギを種特異的に検出し、コムギ以外のコメ、オオムギ、ライムギ、オーツムギ、ナタネ、トウモロコシ、アワ、キビ、及びソバ等と交叉反応しない。したがって、本発明の態様に係る方法によれば、食品素材及び加工食品等の被検試料中のコムギの存在及びその量の正確な情報を得ることが可能となる。
【００３０】
もし、検査法において、ＰＣＲ用プライマーペアがコムギ以外の作物と交叉反応すると、コムギ検出の偽陽性の可能性が生じるばかりでなく、被検試料中のコムギ種特異的ＤＮＡの正確な定量は困難となりうる。また、検知法おいて増幅すべき種特異的ＤＮＡの領域は、コムギ品種に普遍的存在し、かつその存在量が一定であることが必要である。該種特異的ＤＮＡ領域の存在量がコムギ品種により一定で無い場合もまたコムギ種特異的ＤＮＡを正確に定量できない。故に、そのような方法及びプライマーペアは、正確なＧＭＯコムギの混入率を決定することができない。
【００３１】
本発明によれば、食品素材又は加工食品等の被検試料から、他の作物と交叉することなくコムギ種特異的ＤＮＡを特異的に検出又は定量する方法、及び該方法に用いるＰＣＲ用プライマーペアが提供される。本発明に係る方法は、コムギ以外の穀物との相同性が低く、かつゲノム上でシングルコピーであるコムギ種特異的ＤＮＡ配列の特異的な部分領域を、ＰＣＲによって検出又は定量する。また、本発明に係る方法により提供されるＧＭＯコムギ検知のための標準物質を用いることにより、定量ＰＣＲ法で、被検試料中のＧＭＯコムギの混入率を、ＧＭＯ系統別に精度良く求めることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】本発明の実施例２の結果を示す写真である。
【図２】本発明の実施例５に係るコムギ種特異的ＤＮＡの検出量を示すグラフである。
【図３】本発明の実施例６に係る特異性試験の結果を示すグラフである。
【図４】本発明の実施例７に係る定量ＰＣＲ装置の機種間誤差の検討結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
以下に、本明細書において用いる用語の意味等を示し、本発明の実施の形態を詳細に説明する。
【００３４】
本明細書において、用語「コムギ」は特にことわりがない限りパンコムギを意味する。
【００３５】
本発明の実施の形態に係る方法は、コムギの種特異的ＤＮＡ配列として、コムギゲノム上のＰＲＰ遺伝子領域の特定部分を検出するものである。
【００３６】
Ｒａｉｎｅｓ  ＣＡ，  Ｌｌｏｙｄ  ＪＣ，  Ｃｈａｏ  ＳＭ，  Ｊｏｈｎ  ＵＰ，  Ｍｕｒｐｈｙ  ＧＪ．  Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｐｒｏｌｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｒｏｍ  ｗｈｅａｔ．  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  １９９１  Ａｐｒ；１６（４）：６６３−７０．に記載のＷａｘｙ遺伝子のうち、国際公開第２００５／０９７９８９号パンフレットに記載のＷｘ０１２領域は、デュラムコムギで検出されない。したがって、Ｗｘ０１２領域は、コムギＤゲノム上に存在すると考えられる。各種コムギ品種において、Ｗａｘｙ遺伝子の検出量とＰＲＰ遺伝子の検出量とを比較すると、Ｗｘ０１２領域とＰＲＰ遺伝子のうち配列番号１に記載の遺伝子領域とは、ほぼ同量で検出される。しかし、Ｗｘ０１２領域と、ＰＲＰ遺伝子のうち配列番号１に記載の遺伝子領域以外の領域との比は、品種によって１：１から１：３の比率となる。このことからＰＲＰ遺伝子は、ＰＲＰ−３領域を含まないが、ＰＲＰ−１領域と類似な領域を含むと推論される。配列番号１に記載の遺伝子領域の検出量はＷｘ０１２の検出量と同様であり、またデュラムコムギでも検出されることから、コムギゲノムのＡ又はＢに存在すると推定される。コムギ遺伝子に変異を与えた遺伝子組換え品種の混入率を推定する場合、種特異的遺伝子はコムギ品種で普遍的に存在し、その存在量も普遍的である必要がある。現在市場に流通するコムギにはパンコムギ以外、デュラムコムギ、もちコムギなどが存在する為、これらのコムギ品種に共通して存在し、品種により存在量が変化しない遺伝子を種特異的遺伝子として検出することが好ましい。すなわち、市場に流通するパンコムギ品種には、ゲノムＡ又はＢが必ず存在するので、ゲノムＡ又はＢに存在する遺伝子が種特異的遺伝子として好ましい事になる。
【００３７】
ＰＲＰ遺伝子には非常に類似したシュード遺伝子が存在する。このため、加工食品中のコムギゲノムのＰＲＰ遺伝子の全長から、無作為に短い部分配列を選択すると、その領域はＰＲＰ遺伝子以外の複数の遺伝子から増幅される可能性がある。すなわちコムギ品種によっては、単位コムギあたりのＤＮＡ増幅量が一定にならない場合が想定される。そこで本発明者らは鋭意努力した結果、ＰＲＰ遺伝子の領域のうち、シュード遺伝子と交差しない配列番号１に記載の遺伝子領域が存在することを見出した。そこで、本発明の実施の形態に係る方法では、配列番号１に記載の遺伝子領域を含むＤＮＡをＰＣＲで増幅することによって、コムギ種特異的ＤＮＡを検出及び定量する。
【００３８】
配列番号１に記載の遺伝子領域の塩基長は約３３０ｂｐであり、ゲノム全長に比べ極端に短い。そのため、ＤＮＡが断片化されている可能性のある加工食品等の試料からも、コムギ種特異的ＤＮＡとして、配列番号１に記載の遺伝子領域を検出及び定量可能である。
【００３９】
尚、本明細書においてＰＣＲ法に用いるプライマーペアは、配列番号１に記載の遺伝子領域を含むＤＮＡを増幅できるプライマーペアであれば特に限定されない。プライマーペアは、増幅しようとする領域の塩基配列に基づいて、プライマー作成上の基本ルールを遵守して設計される。その際、各プライマーの融解温度（Ｔｍ）の値は、統一されていることが好ましい。また、各プライマーの長さは、１５〜４０ｂｐであり、好ましくは１５〜３０ｂｐである。ＰＣＲ用プライマーペアがコムギ以外の作物と交叉反応すると、コムギ検出において偽陽性が生じうる。また、被検試料中のコムギ種特異的ＤＮＡ配列の正確な定量が困難となりうる。これに対し、実施の形態に係るプライマーペアは、コムギ以外の作物と交叉反応せず、正確にコムギ種特異的ＤＮＡを定量することが可能となる。
【００４０】
また、定量化される種特異的ＤＮＡ領域の存在量がコムギ品種によって一定で無い場合、遺伝子組換え品種の混入率を正確に定量できない。これに対し、本発明の実施の形態に係るプライマーペアにより増幅される種特異的ＤＮＡの領域は、コムギ品種に普遍的存在し、かつその存在量が一定である。
【００４１】
本発明の実施の形態に係る方法は、食品素材及び加工食品等の被検試料中のコムギの存在、及びコムギの量の正確な情報を与えるものである。したがって、本発明の実施の形態に係る方法に用いるＰＣＲ用プライマーペアは、コムギを特異的に検出し、コムギ以外のコメ、オオムギ、ライムギ、オーツムギ、ナタネ、トウモロコシ、アワ、キビ、及びソバ等の作物とは交叉反応しないことが求められる。
【００４２】
コムギ以外の作物と交叉反応しないプライマーペアとしては、例えば（ｉ）配列番号２に記載の塩基配列を含む核酸と、配列番号３に記載の塩基配列を含む核酸と、からなるプライマーペア、（ｉｉ）配列番号４に記載の塩基配列を含む核酸と、配列番号３に記載の塩基配列を含む核酸と、からなるプライマーペア、（ｉｉｉ）配列番号２に記載の塩基配列を含む核酸と、配列番号５に記載の塩基配列を含む核酸と、からなるプライマーペア、（ｉｖ）配列番号４に記載の塩基配列を含む核酸と、配列番号５に記載の塩基配列を含む核酸と、からなるプライマーペア、並びに上記（ｉ）乃至（ｉｖ）に記載のプライマーのそれぞれにおいて、各核酸が有する塩基配列の少なくとも８０％の連続した塩基配列を含む核酸のペアからなるプライマーペア等が使用可能である。これらのプライマーペアは、他の作物と交叉性なく、コムギ種特異的ＤＮＡ領域を特異的に増幅することが可能である。
【００４３】
本発明の実施の形態で用いられる被検試料は、コムギを含むか、あるいはコムギを含む可能性のある食品素材及び加工食品であり、例えばコムギの生の種子、乾燥種子、コムギ粉やミックス粉などの食品原料やその加工中間原料、パン類や麺類などの加工食品が含まれる。また、被検試料となる食品素材及び加工食品は、ヒトの食品のみならず、ペットフードの食品や飼料を含む。さらに、コムギ以外の作物とは、食品素材及び食品原料として用いられる全ての作物を意味し、例えば上述したコメ、オオムギ、ライムギ、オーツムギ、ナタネ、トウモロコシ、アワ、キビ、及びソバ等の作物である。
【００４４】
被検試料は、例えばそのまま、又は粉砕して核酸抽出に供してもよく、洗浄して乾燥させてから破砕して核酸抽出に供してもよい。被検試料から抽出して分析に用いる核酸は、通常はＤＮＡである。ＤＮＡは公知の任意の方法によって抽出してもよいが、現在は多数のＤＮＡ抽出キットが市販されており、これらを用いて抽出することができる。例えばＤＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍａｘｉキット（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、非特許文献５に記載された方法に従って、被検試料からＤＮＡを抽出してもよい。抽出したＤＮＡは、吸光度の測定などにより濃度を求め、ＰＣＲに好適な濃度まで希釈して用いることが好ましい。
【００４５】
本発明の実施の形態に係る方法において、ＰＣＲは、使用するプライマーやＤＮＡポリメラーゼを考慮して、常法に従って行うことができる。その際に、ＰＣＲ緩衝液、ｄＮＴＰ、及びＭｇＣｌ2等の試薬は調製してもよいし、市販のＰＣＲキットを用いてもよい。ＰＣＲには、上記プライマーペアの一組又は二組以上を用いてもよい。また、ＰＣＲ条件は、例えば９５℃３０秒、６３℃３０秒、及び７２℃３０秒を１サイクルとして４０サイクル行い、最後に終了反応として７２℃７分間という条件が使用可能であるが、用いるプライマーのＴｍ、増幅すべき領域の長さ、及び鋳型ＤＮＡの濃度等を考慮して、適宜変更してもよい。
【００４６】
増幅された核酸（ＰＣＲ産物）は、特定のＤＮＡ断片を同定する任意の方法で検出しうる。同定する方法としては、例えばアガロースゲル電気泳動、アクリルアミドゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、ハイブリダイゼーション、及び免疫学的方法等が使用可能である。一般的には、ＰＣＲ産物は、電気泳動パターンによって同定される。しかし、例えばエチジウムブロミドを含む０．８％のアガロースゲルによる電気泳動を行い、バンドを確認することによって検出してもよい。
【００４７】
本発明の実施の形態は、上述した検出及び定量方法で用いるプライマーペア、及びそれらのプライマーペアを含むキットも含む。プライマーは常法に従って製造することができる。また、キットは、プライマーペアと、他の試薬と、を含んでいてもよい。例えば、キットは、ｄＮＴＰ、ＭｇＣｌ2、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼなどのポリメラーゼ、緩衝液（例えばＴｒｉｓ−ＨＣｌ）、グリセロール、ＤＭＳＯ、ポジティブコントロール用ＤＮＡ、ネガティブコントロール用ＤＮＡ、及び蒸留水等を包含してもよい。キットに含まれる試薬は、それぞれ独立に梱包されていてもよいし、混合された上で梱包されていてもよい。キット中のそれぞれの試薬濃度に特に制限はなく、本発明の実施の形態に係るＰＣＲを実施可能な濃度の範囲であればよい。また、キットには、好適なＰＣＲ条件等の情報がさらに添付されていてもよい。
【００４８】
さらに、本発明の実施の形態は、定量ＰＣＲ法によってＧＭＯコムギの混入率を測定する際に有用な、標準物質を提供する。この標準物質は、非ＧＭＯコムギとＧＭＯコムギとが共通して有するコムギ種特異的ＤＮＡを、１つの環状ＤＮＡ上に連結したものである。なお、環状ＤＮＡ上に、１以上のＧＭＯコムギ特異的ＤＮＡをさらに連結してもよい。
【００４９】
本発明の実施の形態に係る標準物質は、例えば、コムギ種特異的ＤＮＡとして配列番号１に記載の塩基配列と少なくとも８０％の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡを含む、環状ＤＮＡであってもよい。
【００５０】
標準物質として用いられる複製可能なＤＮＡは、コムギ種特異的ＤＮＡが挿入されたＤＮＡ、又はコムギ種特異的ＤＮＡ及びＧＭＯコムギの系統特異的ＤＮＡが挿入されたＤＮＡであれば特に限定されない。標準物質を作製する際には、例えば、ｐＢＲ系ベクター（例；ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２８等）、ｐＵＣ系ベクター（ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８等）、λファージ系ベクター（λｇｔ１０、λｇｔ１１等）、及びこれらに改変を加えた市販のベクター等を用いることができる。
【００５１】
コムギ以外の作物にも、ＧＭＯコムギに挿入された配列と同一の外来ＤＮＡ配列を挿入し、ＧＭＯ作物を作製する場合がある。そのため、外来ＤＮＡ配列のみを検出すると、ＧＭＯコムギ由来なのか、コムギ以外のＧＭＯ作物由来なのかが判別できない場合がある。そのため、ＧＭＯコムギを検出する場合は、遺伝子組換えにより挿入された外来ＤＮＡ配列のみを増幅して検出するのではなく、外来ＤＮＡ配列の上流及び下流に存在する種特異的配列を含む領域を増幅することが好ましい。したがって、ＧＭＯ系統特異的配列を検出するためのプライマーは、各系統のＧＭＯコムギに挿入された外来ＤＮＡ配列と、その上流及び下流に存在する種特異的配列と、を含む領域を増幅できるプライマーであることが好ましい。かかるプライマーは、例えばダイズについて報告された非特許文献５に記載の方法又はそれに準じた方法に従って、作製される。上記標準物質に挿入されるＧＭＯコムギの各系統に特異的な配列は、かかるプライマーで増幅できるＤＮＡ配列から選択されてもよい。
【００５２】
標準物質に挿入するコムギ種特異的ＤＮＡと、ＧＭＯコムギ特異的ＤＮＡとが決定された後、普通コムギゲノム及びＧＭＯコムギゲノムを鋳型としたＰＣＲを行って、種特異的ＤＮＡ断片及びＧＭＯコムギ特異的ＤＮＡ断片をクローニングする。さらに、クローニングした種特異的ＤＮＡ断片及びＧＭＯコムギ特異的ＤＮＡ断片と、上述した環状ＤＮＡのクローニングサイトと、を同一の制限酵素で切断し、クローニングした種特異的ＤＮＡ断片及びＧＭＯコムギ特異的ＤＮＡ断片を、環状ＤＮＡの切断された部位に連結することにより、標準物質が作製される。制限酵素は、公知のものを適宜選択して使用することができ、例えば、ＥｃｏＲＩ、ＳｐｅＩ、ＥｃｏＲＶ、ＳｍａＩ、ＳａｃＩ、ＮｏｔＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、及びＸｈｏＩ等が使用可能である。
【００５３】
次に、作製された標準物質を含む溶液について、２種以上の希釈系列を作り、それぞれについて定量的ＰＣＲを行うと、コムギ種特異的ＤＮＡ配列及びＧＭＯ特異的ＤＮＡ配列の部分領域のそれぞれについて、検量線を求めることができる。さらに、本発明の実施の形態に係る標準物質は、定性ＰＣＲにおけるコムギ種特異的ＤＮＡ配列及びＧＭＯ特異的ＤＮＡ配列のポジティブコントロールとしても利用することができる。
【００５４】
本発明の実施の形態は、標準物質を用いたＰＣＲにより、被検試料におけるＧＭＯコムギの混入率を決定する方法を包含する。該方法は、標準物質を用いて、特定の配列の検量線を求める第一工程と、被検試料中に含まれるコムギ種特異的ＤＮＡ配列の部分領域、及びＧＭＯコムギ特異的ＤＮＡ配列の部分領域を第一工程と同一の条件のＰＣＲによって一定時間増幅し、第一工程で得られた検量線を用いて、被検試料中に存在したコムギ種特異的ＤＮＡ配列の部分領域及びＧＭＯコムギ特異的ＤＮＡ配列の部分領域の分子数を求める第二工程と、を含む。
【００５５】
被検試料におけるＧＭＯコムギの混入率を求める際には、第二工程で求めた、被検試料中に含まれるＧＭＯコムギ特異的ＤＮＡ配列の部分領域の分子数を、コムギ種特異的ＤＮＡ配列の部分領域の分子数で除して得られる比Ａを算出する。また、遺伝子組換えコムギの標準種子を用いた定量的ＰＣＲを行って求められる、ＧＭＯコムギの各系統に特異的なＤＮＡ配列の部分領域の分子数を、コムギ種特異的ＤＮＡ配列の部分領域の分子数で除して得られる比Ｂを算出する。次に、式１００×Ａ／Ｂを計算することにより、被検試料中の遺伝子組換えコムギの混入率を算出可能である。比Ｂは、非特許文献３において「内標比」と呼ばれるものであり、純粋なＧＭ系統の各種子ら抽出したＤＮＡにおける、種特異的遺伝子に対する組換え遺伝子の比率である。内標比は、各組換え系統種子で一定の比率を示す。
【００５６】
本発明の実施の形態に係るＧＭＯコムギ混入率の決定方法において行われる各ＰＣＲ工程は、別々に実施してもよいし、同時に実施してもよい。なお、各ＰＣＲ工程は、検量線を作成するために行ったＰＣＲと、略同一の速度で核酸の増幅反応が起こる条件で行うことが好ましい。かかる条件としては、例えば、検量線を作成するために行ったＰＣＲと温度及びサイクルを同一とする条件が挙げられる。また、ＧＭＯコムギの混入率の算出は、種特異的ＤＮＡの量と組換えＤＮＡの量とを別個に測定した結果から算出してもよい。あるい、ＧＭＯコムギの混入率は、非特許文献３の方法に従って、リアルタイムＰＣＲ装置により種特異的ＤＮＡと組換えＤＮＡとを同時に増幅して算出してもよい。尚、本発明の実施の形態において「組換えＤＮＡ」とは、人為的にコムギに導入した任意の外来性ＤＮＡであり、例えば外来性遺伝子をコードする領域、未転写もしくは未翻訳領域、リンカー領域、及びベクター部分のＤＮＡを意味する。
【実施例】
【００５７】
以下の実施例において、以下に示す試料、試薬、装置、及び条件を使用した。
（１）試料
コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ）としては、国内産コムギ４品種（Ａ〜Ｄ）及び外国産コムギ１９品種（Ｅ〜Ｗ）の乾燥種子を用いた。
【００５８】
デュラムコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ｄｕｒｕｍ）は１品種の乾燥種子を用いた。
【００５９】
トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）としては、デントコーンの乾燥種子を用いた。
【００６０】
ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）としては、遺伝子組換えダイズであるＲｏｕｎｄｕｐ  Ｒｅａｄｙ  Ｓｏｙ系統後代品種の乾燥種子を用いた。
【００６１】
コメ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）としては、コシヒカリ種の乾燥種子を用いた。
【００６２】
オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）としては、在来の５品種の乾燥種子を用いた。
【００６３】
オーツムギ（Ａｖｅｎａ  ｓａｔｉｖａ）としては、市販品種の乾燥種子を用いた。
【００６４】
ライムギ（Ｓｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ）としては、市販の２品種の乾燥種子を用いた。
【００６５】
ナタネ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）としては、ｃａｎｏｌａ種の乾燥種子を用いた。
【００６６】
アワ（Ｓｅｔａｒｉａ  ｉｔａｌｉｃａ  Ｂｅａｕｖｏｉｓ）としては、モチアワ種の乾燥種子を用いた。
【００６７】
キビ（Ｐａｎｉｃｕｍ  ｍｉｌｉａｃｅｕｍ  Ｐａｎｉｃｕｍ）としては、モチキビ種の乾燥種子を用いた。
【００６８】
マイロ（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｓｕｂｇｌａｂｒｅｓｃｅｎｓ）としては、市販品の乾燥種子を用いた。
【００６９】
ソバ（Ｆａｇｏｐｙｒｕｍ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）としては、在来品種の乾燥種子を用いた。
【００７０】
（２）試薬
試料からのＤＮＡ抽出には、以下の試薬を使用した。
ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）（試薬特級）（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）
ＱＩＡＧＥＮ  ＤＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ  ＧｍｂＨ）
ＱＩＡＧＥＮ  ＤＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ  ＧｍｂＨ）
【００７１】
ＤＮＡの電気泳動には、以下の試薬を使用した。
酢酸（試薬特級）（和光純薬工業株式会社）
トリス［ヒドロキシメチル］アミノメタン（Ｔｒｉｓ）（試薬特級）（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）
エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）（試薬特級）（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）
アガロース粉末”ＬＯ３「ＴａＫａＲａ」”（宝酒造株式会社）
エチジウムブロミド（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）
ブロムフェノールブルー（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）
キシレンシアノール（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）
ＤＮＡマーカー”１ｋｂラダー”（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．）
ＤＮＡマーカー”１００ｂｐラダー”（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．）
【００７２】
定性的ＰＣＲには、以下の試薬を使用した。
ＤＮＡポリメラーゼ”ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ”（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）
×１０  ＰＣＲ  バッファーＩＩ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）
【００７３】
プラスミドの作製及び精製には、以下の試薬を使用した。
ＤＮＡポリメラーゼ”ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ”（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）
×１０  ＰＣＲ  バッファーＩＩ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）
ＤＮＡポリメラーゼ”ＫＯＤ”（東洋紡績株式会社）
×１０  ＰＣＲ  バッファーＩＩ（東洋紡績株式会社）
ＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ  ｗｉｔｈ  ＴＯＰ１０Ｆ’  Ｃｅｌｌｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏ．）
酵母エキストラクト（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）
トリプトン  ペプトン（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）
ＮａＣｌ（試薬特級）（和光純薬工業株式会社）
アガー粉末（ＴＡＫＡＲＡ  ＢＩＯ）
Ｄ［−］−α−Ａｍｉｎｏｂｅｎｚｙｌｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ（Ａｍｐｉｃｉｌｉｎ）Ｓｏｄｉｕｍ  Ｓａｌｔ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）
ＱＩＡＧＥＮ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ  ＧｍｂＨ）
エタノール（試薬特級）（和光純薬工業株式会社）
２−プロパノール（試薬特級）（和光純薬工業株式会社）
トリス［ヒドロキシメチル］アミノメタン（Ｔｒｉｓ）（試薬特級）（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）
エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）（試薬特級）（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）
制限酵素”ＥｃｏＲＩ”（宝酒造株式会社）
制限酵素”ＳａｃＩ”（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．）
制限酵素”ＸｂａＩ”（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．）
Ｃａｌｆ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
フェノール（試薬特級）（和光純薬工業株式会社）
クロロホルム（試薬特級）（和光純薬工業株式会社）
イソアミルアルコール（試薬特級）（和光純薬工業株式会社）
【００７４】
定量的ＰＣＲには、ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲマスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した。
【００７５】
（３）装置
試料からのＤＮＡ抽出には、粉砕器”Ｍｕｌｔｉ  Ｂｅａｄｓ  Ｓｈｏｃｋｅｒ  ＭＢ３０１”（安井器械株式会社．）を使用した。
【００７６】
ＤＮＡの電気泳動には、電気泳動装置”Ｍｕｐｉｄ  ２”（Ａｄｖａｎｃｅ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）を使用した。
【００７７】
定性的ＰＣＲには、サーマルサイクラー”ＰＴＣ−２００”（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．）を使用した。
【００７８】
定量的ＰＣＲには、定量的ＰＣＲ装置”ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ”（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した。
【００７９】
（４）条件
プライマー及びプローブの合成は、Ｏｐｅｒｏｎ社に委託した。
【００８０】
制限酵素消化は、各制限酵素のマニュアルに従い実施した。すなわち、各ＤＮＡ溶液と酵素に添付の×１０バッファー、蒸留水、及び制限酵素を混合し、通常３７℃２時間反応した。
【００８１】
制限酵素消化後のＤＮＡ断片は、アガロースゲル電気泳動で分離した。ゲルからの精製はＱＩＡＧＥＮ社製キットを使用した。すなわち、目的ＤＮＡを含んだゲルを加熱融解し、ＤＮＡをシリカ膜に結合させた。次に、エタノールを含む溶液等でシリカ膜を洗浄した後、蒸留水で溶出した。
【００８２】
制限酵素消化プラスミドの脱リン酸化の際には、制限酵素消化後、脱塩処理したプラスミドをＣＩＡＰ（ＧＩＢＣＯ社製）と専用バッファーを混合し、３７℃で３０分間反応した。反応後フェーノル処理によりＣＩＡＰを失活せしめ、エタノール沈殿で脱リン酸化プラスミドを回収した。
【００８３】
ＤＮＡのライゲーションには、宝酒造株式会社製ＤＮＡライゲーション・キットＶｅｒ．２を使用した。すなわち、目的ＤＮＡを混合し、キットの反応混合液（ｓｏｌｎ  Ｉ）を等量加え、１６℃で３０分間静置することによりＤＮＡをライゲーションした。
【００８４】
形質転換には、東洋紡績株式会社製Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＤＨ５aを使用した。融解した１０〜５０mＬのコンピテントセルを氷上でＤＮＡと３０分間混合静置し、４２℃で５０秒間ヒートショック後、氷上に戻し、２分後３７℃に暖めておいたＳＯＣ培地を４５０mＬ添加、３７℃で１時間インキュベートした。この溶液をサークルグロー培地Amp+プレートに１００mＬ／ｐｌａｔｅ展開し、３７℃で１６時間培養した。
【００８５】
プラスミド精製の目的での培養は、培地サークルグローを用いて実施した。プラスミド産生の選択圧にはＡｍｐ耐性を利用し、終濃度１００mｇ／ｍＬのアンピシリンを用いた。培養は、３７℃の試験管振盪器で、１４乃至１６時間行った。
【００８６】
ＰＣＲには、アプライドバイオシステムズ社製ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを使用した。なお、表１に記載の反応組成を用い、表２に記載の反応条件を用いた。
【表１】
0005917788.tif 000002
【表２】
0005917788.tif 000003
【００８７】
ＴＡクローニングはインビトロジェン社製ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングシステムを用いた。方法は同社マニュアルに従い実施した。
【００８８】
ＤＮＡのシーケンシングはベックマンコールター社製ＣＥＱ８０００を用い実施した。方法は同社マニュアルに従い実施した。キットとして同社ＤＴＣＳ  Ｑｕｉｃｋ  Ｓｔａｒｔマスターミックスを用いた。
【００８９】
リアルタイムＰＣＲには、ＴａｑＭａｎ法を使用した。キットには、ＴＡＫＡＲＡプレミックスＥｘ  Ｔａｑ(登録商標)（Ｐｅｒｆｅｃｔ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ）  Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．ＲＲ０３９Ａを使用した。リアルタイムＰＣＲを実施する際には、各種ゲノムＤＮＡ濃度を希釈せずにテンプレートとした。また、表３のようにプレミックス、ＲＯＸ、プライマー、及びプローブを混合して、マスターミックスを調整した。次に、１６mＬ／ウェルのマスターミックスと４mＬ／ウェルのテンプレートＤＮＡとを混合し、表４に記載の条件に従って反応を開始させた。
【表３】
0005917788.tif 000004
【表４】
0005917788.tif 000005
【００９０】
テンプレートＤＮＡ（Ｐｌａｓｍｉｄ  ｐＷＩＧ０４）は、表５のように希釈した。希釈には、５ｎｇ／mＬのＣｏｌＥ１溶液を用いた。
【表５】
0005917788.tif 000006
【００９１】
少量の種子の粉砕する場合、マルチビーズショッカーを粉砕機として使用した。粉砕の際には、２ｍＬチューブに種子を１粒入れ、金属コーンを入れふたをし、２０００ｒｐｍ、１０秒間２回粉砕し、粉砕された粉末から直接ＤＮＡ抽出した。
【００９２】
ゲノムＤＮＡの調製には、ＱＩＡＧＥＮ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを使用した。操作は、キットマニュアルに従った。具体的には、粉砕種子に４００mＬのＡＰ１溶液、４mＬのＲＮａｓｅＡを添加し、攪拌した。次に、６５℃で１０分間インキュベートした。インキュベート中に、２、３回攪拌した。次に、１３０mＬのＡＰ２を添加し、攪拌後１０分間氷上で放置した。次に、遠心分離（１５０００ｒｐｍ＝２００００ｇ、５分、室温）し、上清をＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒに全量アプライし、さらに遠心分離（１５０００ｒｐｍ、２分、室温）した。次に、デカントでパススルー上清を別容器に移し１．５容積（６７５mＬ）のＡＰ３／Ｅを添加し、攪拌した。次に、半量をＳｐｉｎカラムにアプライし、遠心分離（１００００ｒｐｍ、１分、室温）した。フロースルーを捨て、残量を同処理した。その後、新しいチューブにカラムをおき、５００mＬのＡＷ添加、遠心分離（１００００ｒｐｍ、１分、室温）した。同処理後、フロースルーを捨て、さらに遠心分離（１５０００ｒｐｍ，２分、室温）した。１．５ｍＬの新しいチューブにカラムをおき５０mＬのＡＥを添加し、、室温に５分間放置した後、遠心分離（１００００ｒｐｍ、１分、室温）した。
【００９３】
ＤＮＡの定量には、分光光度計（ＧｅｎｅＳｐｅｃ）を使用した。定量を実施する際には、５ｍｍのセルを用い、希釈率を１とした。また、対照にＫｉｔ溶出液（ＡＥ）を用いた。
【００９４】
（実施例１：標準プラスミドの構築）
国内産コムギの品種Ａの種子よりゲノムＤＮＡを抽出し、抽出したＤＮＡを鋳型にして、表６に記載のプライマーを用いＰＣＲを行った。
【表６】
0005917788.tif 000007
【００９５】
得られた増幅ＤＮＡをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社ＴＯＰＯ  ＴＡ  ｃｌｏｎｉｎｇキットを用い、ベクターｐＣＲ４  ＴＯＰＯにＴＡクローニングした。次に、得られた、プラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩで消化後、３５０ｂｐの断片を電気泳動ゲルからの切出し法により精製した。その後、国際公開第２００７／１３２７６０号パンフレットに記載のｐＷＩＧ０２を制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、脱リン酸化後、ここに精製断片をライゲーションし、標準プラスミドｐＷＩＧ０４を構築した。得られたクローンは制限酵素マッピングにより挿入断片を確認後、ＤＮＡシーケンシングにより全配列の確認を行った。確認された配列は全て目的配列と一致した。
【００９６】
（実施例２：ＰＲＰ遺伝子中の増幅領域の検索）
ＰＲＰ遺伝子のうち、コムギ品種により検出量の変動が無い領域の検索を行った。コムギＰＲＰ遺伝子はオオムギのＰＲＰ遺伝子と相同性が有ることから、オオムギとは交差しない領域をプライマーとする事が望ましい。そこでオオムギ５品種に交差せず、コムギ３品種で増幅するプライマー領域を検索した。表７に記載のフォワード側プライマーＰＲＰ８Ｆを、リバース側プライマーＰＲＰｄｓ６Ｒ又はＰＲＰｄｓ７Ｒと組合せて、検索を行った。その結果、図１に示すように、フォワード側プライマーＰＲＰ８Ｆとリバース側プライマーＰＲＰｄｓ６Ｒとの組み合わせを用いると、コムギからはＰＣＲ産物が増幅するが、オオムギからはＰＣＲ産物が増幅しないことが確認された。また、フォワード側プライマーＰＲＰ８Ｆとリバース側プライマーＰＲＰｄｓ７Ｒとの組み合わせを用いた場合も、コムギからはＰＣＲ産物が増幅するが、オオムギからはＰＣＲ産物が増幅しないことが確認された。
【表７】
0005917788.tif 000008
【００９７】
（実施例３：プローブの検索）
実施例２の検討により、種特異的遺伝子のＰＣＲ増幅領域として、ＰＲＰ８Ｆ及びＰＲＰｄｓ６Ｒで増幅される領域と、ＰＲＰ８Ｆ及びＰＲＰｄｓ７Ｒで増幅される領域とが好ましい事が確認された。そこで、これらの領域に対してプライマーに適合するプローブを設計した。プローブの設計はプライマー設計支援ソフト、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ、又はＰｒｉｍｅｒ３（Ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｒｉｍｅｒ３  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｐｒｉｍｅｒ３  ｗｅｂ  ｓｉｔｅ  ｗａｓ  ｆｕｎｄｅｄ  ｂｙ  Ｈｏｗａｒｄ  Ｈｕｇｈｅｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ａｎｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．  ｕｎｄｅｒ  ｇｒａｎｔｓ  Ｒ０１−ＨＧ００２５７  （ｔｏ  Ｄａｖｉｄ  Ｃ．  Ｐａｇｅ）  ａｎｄ  Ｐ５０−ＨＧ０００９８  （ｔｏ  Ｅｒｉｃ  Ｓ．  Ｌａｎｄｅｒ）．：  ｈｔｔｐ：／／ｆｒｏｄｏ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｉｍｅｒ３／ｐｒｉｍｅｒ３＿ｗｗｗ．ｃｇｉ）を使用した。設計したプローブ配列を表８に示す。設計したプローブ配列から、蛍光標識プローブを合成した。なお、蛍光標識プローブにおいて、５‘末端を蛍光物質としてＦＡＭで修飾し、３’末端をクエンチャーとしてＴＡＭＲＡで修飾した。
【表８】
0005917788.tif 000009
【００９８】
（実施例４：リアルタイムＰＣＲの条件設定）
実施例３で合成した蛍光標識プローブを用い、標準プラスミドｐＷＩＧ０４を鋳型にして、ＴａｑＭａｎ法によるリアルタイムＰＣＲの条件設定を行った。具体的には、プライマー濃度、プローブ濃度、ＰＣＲ反応温度、及び時間についての各パラメーターを可変させ、リアルタイムＰＣＲの最適条件を見出した。選択された条件を以下に示す。
【表９】
0005917788.tif 000010
【表１０】
0005917788.tif 000011
【００９９】
（実施例５：コムギ品種における普遍性の確認）
実施例４でリアルタイムＰＣＲの最適条件を見出した後、コムギ品種２３種について、ＴａｑＭａｎ法によるリアルタイムＰＣＲにより、コムギ種特異的ＤＮＡの検出量を比較した。プライマーとしては、配列番号４に記載のＰＲＰ８Ｆと配列番号６に記載のＰＲＰｄｓ６Ｒとを用いた。また、プローブには、配列番号７に記載のＰＲＰ３−Ｔａｑを用いた。その結果、図２に示すように、２３種類総てのコムギ品種からＰＲＰが検出され、ＰＲＰのコムギ種特異的遺伝子としての普遍性が確認された。
【０１００】
（実施例６：特異性の確認試験）
本発明の実施の形態に係る方法で他の作物と交差しないことを確認する目的で、特異性試験を実施した。他の作物として、オオムギ、オーツムギ、ライムギ、コメ、マイロ、ナタネ、トウモロコシ、ソバ、アワ、及びキビを用いた。これら他の作物からＤＮＡを抽出し、実施例４で見出した最適条件に従って、抽出したＤＮＡを鋳型にしてリアルタイムＰＣＲを行った。プライマーとしては、配列番号４に記載のＰＲＰ８Ｆと、配列番号５に記載のＰＲＰｄｓ６Ｒとを用いた。また、プローブには、配列番号７に記載のＰＲＰ−Ｔａｑ３を用いた。図３に示すように、コムギで検出された値に対し、これら他の作物の非特異的検出率はオオムギ５品種全てで０．２％以下であり、他の作物は０．０５%以下であった。したがって、非特異的検出率はコムギ検出における標準誤差をはるかに下回り、これら他の作物が、コムギ種特異的遺伝子の定量に影響を及ぼさないことが確認された。
【０１０１】
（実施例７：定量ＰＣＲ装置の機種間誤差の検討）
定量ＰＣＲ装置は多種類の装置が販売されており、装置ごとに性能が異なる場合もある。そこで本発明の実施の形態に係るプライマーセット及びプローブを用いて、その定量値に、定量ＰＣＲ装置の機種間誤差が生じるかどうかを検討した。定量ＰＣＲ  装置はＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製ＰＲＩＳＭ７７００及びＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７５００  リアルタイムＰＣＲシステムを用いた。ＰＣＲ反応試薬としてはＴＡＫＡＲＡプレミックスＥｘ  Ｔａｑ（登録商標）（Ｐｅｒｆｅｃｔ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ）  Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．ＲＲ０３９Ａを使用した。プライマーセットはＰＲＰ８Ｆ、ＰＲＰｄｓ６ＲをプローブはＰＲＰ−Ｔａｑ３を用いた。鋳型には実施例１に記載したプラスミドｐＷＩＧ０４を用いた。プラスミドｐＷＩＧ０４を一反応あたり、１００００、３１６２３、１００００、３１６２、１０００、３１６、１００、３２コピー含むように希釈列を作成した。定量ＰＣＲ反応は実施例４に示す方法を用いた。その結果、図４に示すように、両機共に鋳型ＤＮＡ希釈範囲で同様な増幅を示す事が確認された。したがって、本発明の実施の形態に係るプライマーセットとプローブは機種間誤差を生じさせないことが確認された。
【０１０２】
（配列表の説明）
本明細書の配列表に記載された配列番号１乃至１７は、以下の配列を示す。
［配列番号：１］  ＰＲＰ遺伝子中の部分塩基配列。
［配列番号：２］  フォワードプライマーＰＲＰ３Ｆの塩基配列。
［配列番号：３］  リバースプライマーＰＲＰｄｓ３Ｒの塩基配列。
［配列番号：４］  フォワードプライマーＰＲＰ８Ｆの塩基配列。
［配列番号：５］  リバースプライマーＰＲＰｄｓ６Ｒの塩基配列。
［配列番号：６］  リバースプライマーＰＲＰＰｄｓ７Ｒの塩基配列。
［配列番号：７］  プローブの塩基配列。
【０１０３】
本明細書において塩基を略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｃｏｍｍｉｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号、あるいは当該分野における慣用略号を用いる。以下に、略号の例を示す。
【０１０４】
ａ  ：  アデニン、ｔ  ：  チミン、ｇ  ：  グアニン、ｃ  ：  シトシン。
なお、ＰＲＰのＧｎｅｂａｎｋ番号はＸ５２４７２であり、ＰＲＰ−ＥＳＴのＧｎｅｂａｎｋ番号はＣＶ７７２８１９であり、オオムギＰＲＰのＧｎｅｂａｎｋ番号はＢＥ６０１８９７であり、オオムギＰＲＰｃＤＮＡのＧｎｅｂａｎｋ番号はＣＢ８８１６１１である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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