(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
分子量１００万〜１４０万ダルトンの鮭鼻軟骨由来のプロテオグリカンを含有することを特徴とする毛乳頭細胞のＦＧＦ−７産生促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＦＧＦ−７産生量を増大させ、毛乳頭細胞の増殖を促進するＦＧＦ−７産生促進剤及び毛乳頭細胞増殖促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
昨今、頭部の抜け毛や薄毛といった脱毛症状に悩む男女が増加している。このような症状を改善するため、発毛やヘアサイクルのメカニズムに関する研究が行われ、発毛を促進したり、脱毛を抑制する育毛成分の開発が進められている。現在、代表的な育毛成分としては、ミノキシジル（特許文献１参照）やアデノシン（特許文献２参照）が挙げられる。このような育毛成分の開発にあたり、特に近年、発毛機構に関与する因子であるＦＧＦ−７（繊維芽細胞増殖因子−７）が注目されている。このＦＧＦ−７はＦＧＦ（繊維芽細胞増殖因子）ファミリーのうちの１種であり、毛乳頭細胞で産生され、毛母細胞に作用して毛髪成長を促すことが知られている。そのため、毛乳頭細胞でのＦＧＦ−７産生量を高めることによる発毛促進が期待されている。特許文献２によれば、前述したアデノシンは、毛乳頭細胞におけるＦＧＦ−７の発現を亢進させ、毛髪の太毛化を維持・促進することが開示されている。
【０００３】
他方、プロテオグリカンは、タンパク質に糖鎖（グリコサミノグリカン）が結合した糖タンパク質の一種である。プロテオグリカンは、動物の細胞外マトリックスの主要構成成分のひとつとして軟骨組織に多く含まれており、水分の保持、骨形成、関節の潤滑及び細胞間の情報伝達等の機能を有するとされている。そのため、近年、プロテオグリカンが有する機能についての研究開発が進められている。例えば、特許文献３にはプロテオグリカンがＴＮＦ−α産生抑制作用、ＩＦＮ−γ産生抑制作用及びＩＬ−１０産生促進作用等を有することが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第２７３３９８０号公報
【特許文献２】国際公開第２００５／４４２０５号
【特許文献３】特開２００７−１３１５４８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、特許文献１に記載された育毛成分はその副作用として頭皮のかゆみやかぶれが生じることが報告されている。また、特許文献２に記載された成分をはじめとして、ＦＧＦ−７産生量を高める作用を有する成分が種々提案されているが、毛乳頭細胞でのＦＧＦ−７産生量をさらに高めることのできる成分が望まれていた。
【０００６】
他方、プロテオグリカンについては、特許文献３に記載されたように特定の機能を有するものの、毛乳頭細胞に関する機能についての報告はなく、その有効性は不明であった。
【０００７】
本発明は上述した点に鑑み案出されたもので、その目的は、ＦＧＦ−７産生促進効果に優れ、頭皮に対する安全性も高い新たなＦＧＦ−７産生促進剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らはかかる実情に鑑み鋭意研究を重ねた結果、プロテオグリカンが毛乳頭細胞における非常に優れたＦＧＦ−７産生の促進作用を有し、さらに毛乳頭細胞自体をも増殖させる作用を有することを見出し、本発明を完成させた。
【０００９】
上記課題を解決するため、本発明のＦＧＦ−７産生促進剤は、プロテオグリカンを含有することを特徴とする。これにより、毛乳頭細胞におけるＦＧＦ−７産生量を顕著に増加させることができる。また、プロテオグリカンは、天然由来物であり、食品や医薬品などにも広く用いられるものであることから安全性も高い。
【００１０】
また、本発明のＦＧＦ−７産生促進剤は、このプロテオグリカンの分子量が１００万ダルトン以上であることも好ましい。これにより、安定した活性を示し、毛乳頭細胞におけるＦＧＦ−７産生量を顕著に増加させるプロテオグリカンの分子量が選択される。
【００１１】
また、本発明のＦＧＦ−７産生促進剤は、プロテオグリカンがコンドロイチン硫酸プロテオグリカンであることも好ましい。これにより、好適なプロテオグリカンの種類が選択される。
【００１２】
また、本発明のＦＧＦ−７産生促進剤は、プロテオグリカンが魚類の軟骨組織から得られたものであることも好ましい。これにより、ＦＧＦ−７産生促進活性を有するプロテオグリカンの好適な原材料が選択される。
【００１３】
また、本発明のＦＧＦ−７産生促進剤において、魚類の軟骨組織が鮭の鼻軟骨であることも好ましい。これにより、ＦＧＦ−７産生促進活性を有するプロテオグリカンを多く含んでおり、効率よく得ることができる原材料が選択される。
【００１４】
さらに、本発明の毛乳頭細胞増殖促進剤は、プロテオグリカンを含有する。これにより、毛乳頭細胞を顕著に増加させることができる。また、プロテオグリカンは、天然由来物であり、食品や医薬品などにも広く用いられるものであることから安全性も高い。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、以下のような優れた効果を有するＦＧＦ−７産生促進剤及び毛乳頭細胞増殖促進剤が得られる。
（１）優れたＦＧＦ−７産生促進作用を有し、天然物由来の安全性の高いＦＧＦ−７産生促進剤が得られる。
（２）１００万ダルトン以上のプロテオグリカンを選択することにより安定した作用効果が得られる。
（３）優れた毛乳頭細胞増殖促進作用を有し、天然物由来の安全性の高い毛乳頭細胞増殖促進剤が得られる。
（４）毛乳頭細胞の増殖が促進されると共に、増殖した毛乳頭細胞それぞれのＦＧＦ−７産生量が促進されるＦＧＦ−７産生促進剤及び毛乳頭細胞増殖促進剤が得られる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】実施例１における培養１日目の毛乳頭細胞の相対生細胞数を示すグラフである。
【図２】実施例１における培養３日目の毛乳頭細胞の相対生細胞数を示すグラフである。
【図３】実施例２における培養１日目のＦＧＦ−７産生量を示すグラフである。
【図４】実施例２における培養３日目のＦＧＦ−７産生量を示すグラフである。
【図５】培養１日目の毛乳頭細胞の相対生細胞数及び相対ＦＧＦ−７産生量を示すグラフである。
【図６】培養３日目の毛乳頭細胞の相対生細胞数及び相対ＦＧＦ−７産生量を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明のＦＧＦ−７産生促進剤及び毛乳頭細胞増殖促進剤には有効成分としてプロテオグリカンが含まれる。このプロテオグリカンは、プロテオグリカンを含有する生物組織から得られる。生物組織としては、プロテオグリカンが含まれるものであればよいが、プロテオグリカンを多量に含み、食品加工の分野で通常廃棄される部位として安価に入手可能である観点から、魚類、軟体動物、鳥類若しくは哺乳類の軟骨組織又は魚類、軟体動物、鳥類若しくは哺乳類の皮が好ましい。特に限定されないが、例えば、魚類の軟骨組織としてはサケの鼻軟骨（氷頭）、エイの軟骨又はサメの軟骨、鳥類の軟骨組織としては、鶏の胸軟骨若しくは膝軟骨、哺乳類の軟骨組織としては、ウシの喉軟骨若しくは気管支軟骨又はクジラの軟骨等が好ましく、魚類の軟骨組織であるサケの鼻軟骨又はエイの軟骨がより好ましい。なお、上述の軟骨組織とは、硝子軟骨、弾性軟骨若しくは線維軟骨をはじめ、軟骨基質、軟骨細胞又は軟骨膜等を有する組織のことをいい、軟骨周辺部位の組織も含まれる。
【００１８】
生物組織からのプロテオグリカンの製造方法としては、生物組織を水、酸性水溶液又は塩基性水溶液等の水系溶媒に浸漬し、溶媒中に抽出することにより得られ、一例として、特開２０１２−２０１６１４号公報に記載の方法により好適に製造することができる。この公報にはサケや鶏、サメ、エイの軟骨等からコンドロイチン硫酸プロテオグリカンが効率よく得られることが記載されている。さらに、サケや鶏、サメ、エイの軟骨等の生物組織を０．２重量％以下と低濃度の水酸化ナトリウム水溶液に浸漬させ、１５〜２０℃程度の常温条件下で抽出することによっても好適に製造することができる。この方法によれば、１００〜１４０万ダルトンという比較的大きな分子量を有するコンドロイチン硫酸プロテオグリカンが効率よく回収される。なお、回収されたプロテオグリカンの分子量を好適な範囲とするため、さらに透析処理や限外濾過処理等を施すことも可能である。プロテオグリカンの分子量はコアタンパク質に結合するグリコサミノグリカン（この場合においては、コンドロイチン硫酸）の数量に影響されることから、プロテオグリカンに結合していたグリコサミノグリカンが分解されることなく略完全体として抽出され、回収された場合には、１００〜１４０万ダルトンの分子量を呈すると考えられる。この方法に基づいて製造されたコンドロイチン硫酸プロテオグリカンとして、株式会社リナイス製品の「プロテオグリカンＬＳ」（サケ鼻軟骨由来、分子量１００万ダルトン〜１４０万ダルトン）があり、本発明のプロテオグリカンとして好適に用いられる。
【００１９】
また、本発明において用いられるプロテオグリカンは上述の製造方法で製造されたものに限定されず、公知の製造方法によって得られたプロテオグリカンも用いることができる。また、プロテオグリカンとして、プロテオグリカンを含む生物組織そのものを用いることも可能である。
【００２０】
プロテオグリカンの分子量は、優れたＦＧＦ−７産生促進作用及び毛乳頭細胞増殖促進作用が安定して得られる観点から、分子量が１００万ダルトン以上であることが好ましく、１２０万ダルトン以上とすることが特に好ましい。プロテオグリカンは生物の軟骨組織等の生体材料から得られるため、その製造方法や生物組織の状態等により、製造されたプロテオグリカンの品質にばらつきが生じることがある。本願発明者らは、分子量が５０万ダルトン以下の比較的小さなプロテオグリカン、すなわち、グリコサミノグリカンの結合量が少ないか、又はコアタンパク質自体の分解が生じたプロテオグリカンは、ＦＧＦ−７産生促進作用及び毛乳頭細胞増殖促進作用が低減することを確認している。そのため、プロテオグリカンの分子量を、優れたＦＧＦ−７産生促進作用及び毛乳頭細胞増殖促進作用を確保するための判断基準とすることができる。なお、プロテオグリカンの分子量は、クロマトグラフィーにより決定され、特にゲル濾過クロマトグラフィーにより決定されることが好ましい。
【００２１】
本発明のＦＧＦ−７産生促進剤は、毛乳頭細胞におけるＦＧＦ−７の分泌量を増加させ、毛母細胞を賦活し、毛髪成長を促進させる。また、本発明の毛乳頭細胞増殖促進剤は、毛乳頭細胞を賦活し、毛乳頭細胞の増殖を促して、毛髪成長を促進させる。これらＦＧＦ−７産生促進剤及び毛乳頭細胞増殖促進剤は、育毛剤や養毛剤、発毛促進剤として頭皮や頭髪に使用でき、抜け毛や薄毛といった脱毛症状の改善や予防に用いることができる。また、本発明の効果を失わない範囲において、他の有効成分と組み合わせて配合剤又は併用剤として使用することも可能である。さらに、これらＦＧＦ−７産生促進剤及び毛乳頭細胞増殖促進剤を、頭皮用製剤や頭髪用化粧品等に適用することも可能である。頭皮用製剤や頭髪用化粧品には、クリーム、乳液、軟膏、ジェル、パウダー、スカルプケア用品、シャンプー、コンディショナー、トニック、白髪染め、ローション、スタイリング剤等が含まれる。
【００２２】
本発明の組成物に含まれるプロテオグリカンは、上述したように天然の生体材料から得られる成分であり、サプリメント等の食品及び化粧品等に広く使用されている。そのため、安全性が高く、肌に対する刺激も少ないため、安心して使用することができる。また、プロテオグリカンは水溶性であるため、有機溶剤を溶媒として使用する必要がなく、本発明のＦＧＦ−７産生促進剤及び毛乳頭細胞増殖促進剤を液剤とした際においても、水を溶媒とした低刺激な処方を実現することができる。
【００２３】
本発明のＦＧＦ−７産生促進剤におけるプロテオグリカンの好ましい配合量は、目標とする作用効果、投与方法、投与対象及び剤形によって変化するため、特に限定されないが、剤形中に０．０１〜１０重量％が好ましく、０．１〜５重量％がより好ましく、０．１〜３重量％が特に好ましい。また、毛乳頭細胞増殖促進剤におけるプロテオグリカンの好ましい配合量は、目標とする作用効果、投与方法、投与対象及び剤形によって変化するため、特に限定されないが、剤形中に０．００１〜３重量％が好ましく、０．０１〜１重量％がより好ましく、０．０１〜０．５重量％が特に好ましい。
【００２４】
さらに、本発明のＦＧＦ−７産生促進剤及び毛乳頭細胞増殖促進剤は、医薬品として、バップ、テープ、軟膏、クリーム、ローション、座剤等の非経口投与剤（経皮吸収剤）とすることも可能である。また、錠剤、顆粒剤、カプセル剤又は内服用液剤等の経口製剤とすることもできる。また、ＦＧＦ−７産生促進作用及び毛乳頭細胞増殖促進作用を研究するための試薬として本発明のＦＧＦ−７産生促進剤及び毛乳頭細胞増殖促進剤を用いることも可能である。
【００２５】
本発明のＦＧＦ−７産生促進剤及び毛乳頭細胞増殖促進剤を育毛剤や化粧品、医薬品として製剤化する際には、従来慣用されている方法により種々の形態に調製することができる。この場合、通常製剤用の担体や賦形剤など、化粧品や医薬品の添加剤として許容されている添加剤を用いて製剤化することができる。また、プロテオグリカンのバイオアベイラビリティーや安定性を向上させるために、マイクロカプセル、微粉末化、シクロデキストリン等を用いた包接化などの製剤技術を含むドラッグデリバリーシステムを用いることもできる。
【００２６】
次に、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例によってなんら限定されるものではない。
【実施例】
【００２７】
［実施例１］
１．毛乳頭細胞増殖試験
ヒト毛乳頭細胞（白色人種２２歳男性、頭頂部由来、製品番号：ＣＡ６０２０５ａ、東洋紡績株式会社製品）を１ウェルあたり、１．２×１０４細胞／０．３ｍＬとなるように４８ウェル培養プレート（製品番号：６７７１８０、株式会社グライナー・ジャパン製品）に播種した。なお、培地は、毛乳頭細胞専用培地（製品番号：ＴＭＴＰＧＭ−２５０、東洋紡績株式会社製品）を用いた。ＣＯ２インキュベーター内（５％ＣＯ２、３７℃）で１日培養して５０％コンフルエントとした後、以下表１に示す被験物質を含む培地に置換した。
【００２８】
【表１】
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【００２９】
なお、上記表１における被験物質のうち、プロテオグリカンについては、培地に１０ｍｇ／ｍＬとなるように溶解させてフィルター滅菌した後、培地で各試験濃度まで希釈して調整した。ミノキシジルはエタノールに溶解させて６０ｍＭ溶液とした後、終濃度が６０μＭとなるように培地に添加した。アデノシンはＤＭＳＯに溶解させて２５ｍｇ／ｍＬ溶液とした後、フィルター滅菌し、終濃度が２５μｇ／ｍＬとなるように培地に添加した。また、アデノシン溶液の溶媒対照としてＤＭＳＯのみからなる試験区（０．１％  ＤＭＳＯ）を設けた。他方、ミノキシジル溶液の溶媒であるエタノールについては、溶媒としての濃度が０．１％であるところ、一般にエタノール濃度が０．１％以下であれば細胞に全く影響しないため、エタノールのみからなる試験区は設けなかった。
【００３０】
上記表１に示す被験物質を含む培地に置換後、１日間培養し、培養上清を回収した。この培養上清を用いて、それぞれの細胞の増殖性を生細胞数測定試薬ＳＦ（ナカライテスク株式会社製品）により測定した。測定は、ｎ＝５で行った。また、被験物質を含む培地に置換した後に３日間培養した培養上清についても、同様に回収して生細胞数の測定を行った。回収した培養上清は−８０℃にて保存し、後日ＦＧＦ−７産生量の測定に用いた。生細胞数の測定は、具体的には、次のようにして行った。細胞を３００μＬのＤＰＢＳで一度洗浄した後、生細胞測定試薬ＳＦを１０％含む培地を１ウェルにつき３００μＬ添加した。添加から３０分後及び９０分後に生成したＷＳＴ−８のホルマザン色素の吸光度をマイクロプレートリーダーにて測定波長４５０ｎｍで測定した。９０分−３０分の値から１時間あたりの吸光度変化量を算出し、被験物質無添加（コントロール）の値を１００としたときの相対値として相対生細胞数を算出した。また、比較試験区間での有意差検定を行った。検定はｓｔｕｄｅｎｔのＴ検定として行い、Ｐ＜０．０５（帰無仮説が５％未満）のものを有意差ありと判断し、図中に＊印にて記した。培養１日目の結果を以下表２及び図１に、培養３日目の結果を以下表３及び図２に示す。なお、図及び表中の「サンプル濃度」とは、プロテオグリカンの濃度を示している。
【００３１】
【表２】
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【００３２】
【表３】
0005847975.tif 000004
【００３３】
表２及び図１より、培養１日目における生細胞数の結果をみると、プロテオグリカン濃度が０．１ｍｇ／ｍＬ以上の試験区において、有意に毛乳頭細胞の生細胞数が増加した。また、生細胞数の増加の割合は、プロテオグリカン濃度が高くなるに従って、濃度依存的に上昇した。例えば、培地中のプロテオグリカン濃度を１０ｍｇ／ｍＬとした場合には、生細胞数は無添加試験区の２０６％に達した。このように、プロテオグリカンは、非常に高い細胞増殖促進効果があることがわかった。また、表３及び図２より、培養３日目における生細胞数の結果をみると、プロテオグリカン濃度が１ｍｇ／ｍＬ以上の試験区において有意に毛乳頭細胞の生細胞数が増加しており、１０ｍｇ／ｍＬ濃度の試験区では、生細胞数は無添加試験区の約１７３％にまで増加した。これらの結果より、プロテオグリカンは、非常に高い毛乳頭細胞増殖促進効果があることがわかった。また、プロテオグリカンを添加した全濃度域で細胞増殖の阻害は観察されず、プロテオグリカンによる細胞毒性は認められなかった。なお、培養３日目よりも培養１日目の結果の方が、生細胞数が有意に増加するプロテオグリカンの濃度範囲が広く、細胞増加率も高い結果となっているが、これは、培養３日目では毛乳頭細胞がコンフルエント状態となり、全体としてこれ以上増殖できないために差が小さくなった可能性が考えられた。
【００３４】
［実施例２］
２．ＦＧＦ−７産生試験
実施例１において回収した培養１日目及び培養３日目の各試験区の培養上清を用い、この培養上清中に含まれているＦＧＦ−７量を測定した。ＦＧＦ−７量の測定はＦＧＦ７Ｈｕｍａｎ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（製品番号：ａｂ１００５１９、アブカム株式会社製品）を用いて行った。得られた測定値に関し、比較試験区間での有意差検定を行った。検定はｓｔｕｄｅｎｔのＴ検定として行い、Ｐ＜０．０５（帰無仮説が５％未満）のものを有意差ありと判断し、図中に＊印にて記した。培養１日目の結果を以下表４及び図３に、培養３日目の結果を以下表５及び図４に示す。なお、図及び表中の「サンプル濃度」とは、プロテオグリカンの濃度を示している。
【００３５】
【表４】
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【００３６】
【表５】
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【００３７】
表４及び図３より、培養１日目におけるＦＧＦ−７産生量の測定結果をみると、プロテオグリカン濃度が０．０１〜１ｍｇ／ｍＬの濃度範囲の試験区において、有意なＦＧＦ−７産生量の増加がみられた。また、表５及び図４より、培養３日目では、プロテオグリカン濃度が０．１ｍｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬの濃度範囲の試験区においてＦＧＦ−７産生量が有意に増加した。培養１日目及び３日目の両方において、プロテオグリカン濃度が１ｍｇ／ｍＬの試験区は非常に高いＦＧＦ−７産生量の増加がみられ、無添加試験区と比較して、約６倍（培養１日目）及び約１４．６倍（培養３日目）の産生量が上昇した。このように、プロテオグリカンは、非常に高いＦＧＦ−７産生促進効果があることがわかった。
【００３８】
さらに、表４に示す培養１日目におけるＦＧＦ−７産生量の測定値について、無添加（コントロール）の値を１００としたときの相対値として相対ＦＧＦ−７産生量を算出した。この相対ＦＧＦ−７産生量と表２に示す相対生細胞数との比較を図５に示す。同様に、表５に示す培養３日目におけるＦＧＦ−７産生量の測定値について、無添加（コントロール）の値を１００としたときの相対値として相対ＦＧＦ−７産生量を算出した。この相対ＦＧＦ−７産生量と表３に示す相対生細胞数との比較を図６に示す。これらの結果によれば、アデノシンを添加した試験区は、ＦＧＦ−７産生量の増加率が細胞の増殖率と略同じであり、アデノシンによるＦＧＦ−７産生量増加は細胞数が増えたことによるものと考えられる。他方、プロテオグリカンを添加した試験区は、添加濃度が０．０１〜１ｍｇ／ｍＬの濃度範囲において、ＦＧＦ−７産生量の増加率が細胞の増殖率よりも大きく、特に０．１〜１ｍｇ／ｍＬの濃度範囲においては、ＦＧＦ−７産生量の増加率が細胞の増殖率よりも著しく大きくなることがわかった。
【００３９】
以上述べた実施例は全て本発明を例示的に示すものであって限定的に示すものではなく、本発明は他の種々の変形態様及び変更態様で実施することができる。従って本発明の範囲は特許請求の範囲及びその均等範囲によってのみ規定されるものである。
【産業上の利用可能性】
【００４０】
本発明にかかるＦＧＦ−７産生促進剤及び毛乳頭細胞増殖促進剤は、優れたＦＧＦ−７産生促進効果及び毛乳頭細胞増殖効果を有するため、医薬、研究用試薬、育毛剤、頭皮用製剤、頭髪化粧品及び食品（サプリメント、健康食品、機能性食品、特定保健用食品等も含む）等の産業において幅広く役立つものである。
【要約】
【課題】ＦＧＦ−７産生促進効果に優れ、頭皮に対する安全性も高い新たなＦＧＦ−７産生促進剤を提供すること。
【解決手段】ＦＧＦ−７産生促進剤は、プロテオグリカンを含有する。
【選択図】なし【図１】
0005847975.tif 000007
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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