(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
a）変性分離媒体を含むCEキャピラリーの一方の末端に核酸試料を動電的に注入する段階；
b）該核酸試料を該キャピラリーに注入するために用いたものとは逆極性の電圧を印加する段階であって、該電圧が、該変性分離媒体の中に入っていない核酸を該キャピラリーから排出させるのに十分な強さであり、かつ該変性分離媒体の中に入っていない核酸を該キャピラリーから排出させるのに十分な時間にわたって印加される、段階；
c）段階（b）の後に、段階（a）で該核酸試料を動電的に注入するために印加したものと同じ向きの電圧を用いて、該キャピラリー内の核酸を電気泳動により分離する段階
を含み、
段階（a）〜（c）が、結果的に得られる分離された種におけるシャドウピークの大きさを減少させる、
変性核酸キャピラリー電気泳動（CE）におけるシャドウピークの大きさを減少させるための方法。
【請求項２】
段階（b）の前に、キャピラリーの前記末端を、核酸試料を実質的に欠いているリザーバーに移行させる段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
段階（c）が、電気泳動により分離する前に、キャピラリーの前記末端を、電気泳動緩衝液を含む別個のリザーバーに移行させることを含む、請求項1記載の方法。
【請求項４】
シャドウピークが二本鎖DNAを含む、請求項1記載の方法。
【請求項５】
核酸試料がPCR反応混合物を含む、請求項1記載の方法。
【請求項６】
核酸試料がホルムアミドを実質的に欠いている、請求項1記載の方法。
【請求項７】
試料がホルムアミドを含む、請求項1記載の方法。
【請求項８】
核酸の変性キャピラリー電気泳動分離のための方法において、該方法が、
a）変性分離媒体を含むCEキャピラリーの一方の末端を、核酸を含む試料中に浸漬させる段階；
b）該試料からの核酸のプラグを該変性分離媒体中に導入するのに十分な時間および向きで、該CEキャピラリーに沿って電圧を印加する段階；
c）該キャピラリーの該末端を電気泳動緩衝液を含むリザーバーに移行させて、かつ該キャピラリーに沿って電圧を印加して、該プラグ中の核酸種の電気泳動分離を生じさせる段階
を含み、
改良が、
i）段階（b）の後および段階（c）の前に、該変性分離媒体の中に入っていない核酸を該キャピラリーから排出させるのに十分な強さおよび時間で、段階（b）で印加したものとは逆極性の電圧を該キャピラリーに沿って印加する段階
を含み、
それにより、シャドウピークの相対的大きさが減少する、
前記方法。
【請求項９】
段階（b）の後および段階（i）の前に、キャピラリーの前記末端を、核酸試料を実質的に欠いているリザーバーに移行させる段階をさらに含む、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
シャドウピークが二本鎖DNAを含む、請求項8記載の方法。
【請求項１１】
核酸試料がPCR反応混合物を含む、請求項8記載の方法。
【請求項１２】
核酸試料がホルムアミドを実質的に欠いている、請求項8記載の方法。
【請求項１３】
核酸試料がホルムアミドを含む、請求項8記載の方法。
【請求項１４】
a）変性分離媒体を含むCEキャピラリーの一方の末端を核酸試料と接触させて、かつ該試料からの核酸のプラグを該キャピラリー内の分離媒体中に導入するのに十分な電圧を該キャピラリーに沿って印加する段階；
b）段階（a）による該キャピラリーの該末端を該試料から取り出す段階；および
c）段階（b）の後に、該変性分離媒体の中に入っていない、該キャピラリーの先端に存在する核酸材料の少なくとも一部を排出させるのに十分な強さおよび時間で、段階（a）で印加したものとは逆極性の電圧を該キャピラリーに沿って印加する段階
を含み、
それにより、該キャピラリーを通しての該試料の電気泳動分離によって該プラグ中の核酸を分離する場合にシャドウピークの相対的大きさが減少する、
変性核酸キャピラリー電気泳動（CE）におけるシャドウピークの大きさを減少させるための方法。
【請求項１５】
シャドウピークが二本鎖DNAを含む、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
段階（b）の後および段階（c）の前に、CEキャピラリーの前記末端を、核酸試料を実質的に欠いている緩衝液中に浸漬させる段階をさらに含む、請求項14記載の方法。
【請求項１７】
段階（c）の後に、キャピラリーの前記末端を、電気泳動分離緩衝液を含むリザーバーに移行させて、かつ前記プラグ中の核酸を電気泳動により分離する段階をさらに含む、請求項14記載の方法。
【請求項１８】
核酸試料がPCR反応混合物を含む、請求項14記載の方法。
【請求項１９】
核酸試料がホルムアミドを実質的に欠いている、請求項14記載の方法。
【請求項２０】
核酸試料がホルムアミドを含む、請求項14記載の方法。
【請求項２１】
核酸試料中の核酸分子をローディングしかつ電気泳動により分離するように自動キャピラリー電気泳動デバイスに指示するためのコンピュータ実行可能命令を含むコンピュータ可読物理メモリーであって、
該命令が、
a）CEキャピラリーの一方の末端を核酸試料中に浸漬することを該デバイスにさせるための命令；
b）該試料からの核酸分子のプラグを該キャピラリーに含まれる変性分離媒体中に導入するのに十分な時間にわたって、該キャピラリーに沿って電圧を印加することを該デバイスにさせるための命令；
c）該キャピラリーの該末端を別個のリザーバーに移動することを該デバイスにさせるための命令；
d）該変性分離媒体の中に入っていない、該キャピラリーの先端に存在する核酸材料を排出させるのに十分な時間および強さで、段階（b）で印加したものとは逆極性の電圧を該キャピラリーに沿って印加することを該デバイスにさせるための命令；ならびに
e）段階（d）の後に、段階（b）で印加した向きの電圧を該キャピラリーに沿って印加し、それにより、該分離媒体中に導入された核酸分子を電気泳動により分離することを該デバイスにさせるための命令
を含む、
前記コンピュータ可読物理メモリー。
【請求項２２】
命令が、段階（d）の後および段階（e）の前に、キャピラリーの前記末端を、電気泳動分離媒体を含む別のリザーバーに移行させるための命令をさらに含む、請求項21記載のコンピュータ可読物理メモリー。
【請求項２３】
a）コンピュータプロセッサと機能的に連結しているキャピラリー電気泳動デバイスと；
b）核酸試料中の核酸分子をローディングしかつ電気泳動により分離するように該キャピラリー電気泳動デバイスに指示するためのコンピュータ実行可能命令を含むコンピュータ可読物理メモリーと
を含む、変性キャピラリー電気泳動のためのシステムであって、
該命令が、
i）CEキャピラリーの一方の末端を核酸試料中に浸漬することを該デバイスにさせるための命令；
ii）該試料からの核酸分子のプラグを該キャピラリーに含まれる変性分離媒体中に導入するのに十分な時間にわたって、該キャピラリーに沿って電圧を印加することを該デバイスにさせるための命令；
iii）該キャピラリーの該末端を別個のリザーバーに移動することを該デバイスにさせるための命令；
iv）該変性分離媒体の中に入っていない、該キャピラリーの先端に存在する核酸材料を排出させるのに十分な時間および強さで、段階（ii）で印加したものとは逆極性の電圧を該キャピラリーに沿って印加することを該デバイスにさせるための命令；ならびに
v）段階（iv）の後に、段階（ii）で印加した向きの電圧を該キャピラリーに沿って印加し、それにより、該分離媒体中に導入された核酸分子を電気泳動により分離することを該デバイスにさせるための命令
を含む、
前記システム。
【請求項２４】
命令が、段階（iv）の後および段階（v）の前に、キャピラリーの前記末端を、電気泳動分離媒体を含む別のリザーバーに移行させるための命令をさらに含む、請求項23記載のシステム。
【請求項２５】
核酸試料中の核酸分子をローディングしかつ電気泳動により分離するように自動キャピラリー電気泳動デバイスに指示するためのコンピュータ実行可能命令を含むコンピュータ可読物理メモリーであって、
該命令が、
a）CEキャピラリーの一方の末端を核酸試料中に浸漬することを該デバイスにさせるための命令；
b）該試料からの核酸分子のプラグを該キャピラリーに含まれる分離媒体中に導入するのに十分な時間にわたって、該キャピラリーに沿って電圧を印加することを該デバイスにさせるための命令；
c）該キャピラリーの該末端を別個のリザーバーに移動することを該デバイスにさせるための命令；
d）該分離媒体の中に入っていない、該キャピラリーの先端に存在する材料を排出させるのに十分な時間および強さで、段階（b）で印加したものとは逆極性の電圧を該キャピラリーに沿って印加することを該デバイスにさせるための命令；ならびに
e）段階（d）の後に、段階（b）で印加した向きの電圧を該キャピラリーに沿って印加し、それにより、該分離媒体中に導入された核酸分子を電気泳動により分離することを該デバイスにさせるための命令
を含む、
前記コンピュータ可読物理メモリー。
【請求項２６】
命令が、段階（d）の後および段階（e）の前に、キャピラリーの前記末端を、電気泳動分離媒体を含む別のリザーバーに移行させるための命令をさらに含む、請求項25記載のコンピュータ可読物理メモリー。
【請求項２７】
a）コンピュータプロセッサと機能的に連結しているキャピラリー電気泳動デバイスと；
b）核酸試料中の核酸分子をローディングしかつ電気泳動により分離するように該キャピラリー電気泳動デバイスに指示するためのコンピュータ実行可能命令を含むコンピュータ可読物理メモリーと
を含む、変性キャピラリー電気泳動のためのシステムであって、
該命令が、
i）CEキャピラリーの一方の末端を核酸試料中に浸漬することを該デバイスにさせるための命令；
ii）該試料からの核酸分子のプラグを該キャピラリーに含まれる分離媒体中に導入するのに十分な時間にわたって、該キャピラリーに沿って電圧を印加することを該デバイスにさせるための命令；
iii）該キャピラリーの該末端を別個のリザーバーに移動することを該デバイスにさせるための命令；
iv）該分離媒体の中に入っていない、該キャピラリーの先端に存在する材料を排出させるのに十分な時間および強さで、段階（ii）で印加したものとは逆極性の電圧を該キャピラリーに沿って印加することを該デバイスにさせるための命令；ならびに
v）段階（iv）の後に、段階（ii）で印加した向きの電圧を該キャピラリーに沿って印加し、それにより、該分離媒体中に導入された核酸分子を電気泳動により分離することを該デバイスにさせるための命令
を含む、
前記システム。
【請求項２８】
命令が、段階（iv）の後および段階（v）の前に、キャピラリーの前記末端を、電気泳動分離媒体を含む別のリザーバーに移行させるための命令をさらに含む、請求項27記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第119条(e)（35 U.S.C. §119(e)）の下で、2011年1月31日に出願された米国仮特許出願第61/438,070号の恩典を主張し、それらの内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、核酸の変性キャピラリー電気泳動の分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
キャピラリー電気泳動（CE）は、いくつかの技術的利点があることから、分析手法として幅広く利用されている：（i）キャピラリーは高い表面積対容積比を有し、それはより効率的な熱放散を可能にし、そのことがひいてはより迅速な分離のために高電場を用いることを可能にする；（ii）この手法はわずかな試料容積しか必要としない；（iii）ほとんどの分析物について優れた分解能に達しうる；および（iv）この手法は自動化に適している。例えば、Camilleri, editor, Capillary Electrophoresis: Theory and Practice (CRC Press, Boca Raton, 1993)（非特許文献1）；およびGrossman et al, editors, Capillary Electrophoresis (Academic Press, San Diego, 1992)（非特許文献2）。核酸、特にDNAの迅速で正確な分離の必要性が、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）産物の分析およびDNAシークエンシング断片分析において生じている。例えば、Williams, Methods 4: 227-232 (1992)（非特許文献3）；Drossman et al, Anal. Chem., 62: 900-903 (1990)（非特許文献4）；Huang et al, Anal. Chem., 64: 2149-2154 (1992)（非特許文献5）；およびSwerdlow et al, Nucleic Acids Research, 18: 1415-1419 (1990)（非特許文献6）。
【０００４】
PCR緩衝液などの高塩濃度緩衝液による注入を用いる変性CEによるDNAの分離では、往々にして、複数の標的特異的ピークが生じる：一本鎖（ss）DNAとして移動するメインピーク、および、二本鎖（ds）DNAまたは部分的に二本鎖であるDNAからなる可能性が高い、より速く移動する別の1つまたは複数のピーク。本明細書において「シャドウ（shadow）」ピークまたは「シャドウアーチファクト」ピークとも称する、このアーチファクトのピークの出現は、試料中の核酸種へのピークの割り当てにとって、および試料中の個々の種の定量にとって問題となる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Camilleri, editor, Capillary Electrophoresis: Theory and Practice (CRC Press, Boca Raton, 1993)
【非特許文献２】Grossman et al, editors, Capillary Electrophoresis (Academic Press, San Diego, 1992)
【非特許文献３】Williams, Methods 4: 227-232 (1992)
【非特許文献４】Drossman et al, Anal. Chem., 62: 900-903 (1990)
【非特許文献５】Huang et al, Anal. Chem., 64: 2149-2154 (1992)
【非特許文献６】Swerdlow et al, Nucleic Acids Research, 18: 1415-1419 (1990)
【発明の概要】
【０００６】
本明細書に記載するのは、変性核酸キャピラリー電気泳動（CE）におけるシャドウピークの発生を避けるため、またはその大きさを減少させるための方法である。本明細書に提供する方法は、一部には、動電的注入の後、および注入した核酸のキャピラリーを通しての分離の前に、非変性材料をキャピラリーの先端から除去する段階に依拠する。記載された方法は、試料ローディングのために動電的注入を用いる、本質的にあらゆる変性核酸キャピラリー電気泳動の状況に適用することができる。
【０００７】
1つの局面において、本明細書に記載するのは、変性核酸CEにおけるアーチファクトピークの大きさを減少させるための方法であり、該方法は、a）変性分離媒体を含むCEキャピラリーの一方の末端に変性核酸試料を動電的に注入する段階；b）核酸試料をキャピラリー内に注入するために用いたものとは逆極性または逆向きの電圧を印加する段階であって、該電圧が、少なくとも変性分離媒体の中に適正に入っていない核酸をキャピラリーから排出させるのに十分な強さであり、かつ少なくとも変性分離媒体の中に適正に入っていない核酸をキャピラリーから排出させるのに十分な時間にわたって印加される、段階；c）段階（b）の後に、段階（a）で核酸試料を動電的に注入するために印加したものと同じ極性または向きの電圧を用いて、キャピラリー内の核酸を電気泳動により分離する段階を含み、該方法は、段階（b）を欠く同じ方法と比較して、結果的に得られる電気泳動図においてアーチファクトピークの大きさ、影響、および相対的重みを減少させる。
【０００８】
1つの態様において、本方法は、段階（b）の前に、キャピラリーの前記末端を、核酸試料を実質的に欠くリザーバーに移行させる段階をさらに含む。
【０００９】
別の態様において、段階（c）は、電気泳動により分離する段階の前に、キャピラリーの前記末端を、電気泳動緩衝液を含む別個のリザーバーに移行させることを含む。
【００１０】
本明細書に記載されたこの局面および他の局面の別の態様において、アーチファクトピークは二本鎖DNAを含む。
【００１１】
本明細書に記載されたこの局面および他の局面の別の態様において、試料はPCR反応混合物を含む。
【００１２】
本明細書に記載されたこの局面および他の局面の別の態様において、核酸試料はホルムアミドを実質的に欠いている。
【００１３】
本明細書に記載されたこの局面および他の局面の別の態様において、試料はホルムアミドを含む。
【００１４】
別の局面において、本明細書に記載するのは、核酸の変性キャピラリー電気泳動分離のための方法であり、該方法は、a）変性分離媒体を含むCEキャピラリーの一方の末端を、核酸を含む試料中に浸漬させる段階；b）試料からの核酸のプラグを変性分離媒体中に導入するのに十分な時間および向きで、CEキャピラリーに沿って／それを通して電圧を印加する段階；c）キャピラリーの該末端を電気泳動緩衝液を含むリザーバーに移行させて、かつキャピラリーに沿って電圧を印加して、プラグ中の核酸種の電気泳動分離を生じさせる段階を含む。この局面において、改良は、段階（b）の後および段階（c）の前に、少なくとも変性分離媒体の中に入っていない核酸をキャピラリーから排出させるのに十分な強さおよび時間で、段階（b）で印加したものとは逆向きの電圧をキャピラリーに沿って印加する段階を含み、それにより、アーチファクトピークの相対的大きさが減少する。
【００１５】
1つの態様において、本方法は、段階（b）の後および段階（c）の前に、キャピラリーの前記末端を、核酸試料を実質的に欠くリザーバーに移行させる段階をさらに含む。
【００１６】
別の局面において、本明細書に記載するのは、変性核酸キャピラリー電気泳動（CE）におけるアーチファクトピークの大きさを減少させるための方法であり、該方法は、a）変性分離媒体を含むCEキャピラリーの一方の末端を核酸試料と接触させて、かつ試料からの核酸を含有する試料プラグをキャピラリー内の分離媒体中に導入するのに十分な電圧をキャピラリーに沿って印加する段階；b）段階（a）によるキャピラリーの該末端を試料から取り出す段階；およびc）段階（b）の後に、機能的変性分離媒体の中に入っていない（すなわち、導入された変性核酸分子の変性状態を維持するのに十分な変性剤を含む分離媒体の一部分の中に入っていない - 「機能的」変性分離媒体は、導入された変性核酸の変性状態を維持するのに十分な濃度で変性剤を有する）、キャピラリーの先端に存在する核酸材料の少なくとも一部を排出させるのに十分な強さおよび時間で、段階（a）で印加したものとは逆向きの電圧をキャピラリーに沿って印加する段階を含み、それにより、キャピラリーを通しての試料の電気泳動分離によってプラグ中の核酸を分離する場合にアーチファクトピークの相対的大きさが減少する。
【００１７】
1つの態様において、本方法は、段階（b）の後および段階（c）の前に、CEキャピラリーの前記末端を、核酸試料を実質的に欠いている緩衝液中に浸漬させる段階をさらに含む。
【００１８】
別の態様において、本方法は、段階（c）の後に、キャピラリーの前記末端を、電気泳動分離緩衝液を含むリザーバーに移行させて、かつプラグ中の核酸を電気泳動により分離する段階をさらに含む。
【００１９】
別の局面において、本明細書に記載するのは、核酸試料中の核酸分子をローディングしかつ電気泳動により分離するように自動キャピラリー電気泳動デバイスに指示するためのコンピュータ実行可能命令を含むコンピュータ可読物理メモリーであり、該命令は、a）CEキャピラリーの一方の末端を核酸試料中に浸漬することをデバイスにさせるための命令；b）試料からの核酸分子のプラグをキャピラリーに含まれる変性分離媒体中に導入するのに十分な時間にわたって、キャピラリーに沿って電圧を印加することをデバイスにさせるための命令；c）キャピラリーの該末端を別個のリザーバーに移動することをデバイスにさせるための命令；d）変性分離媒体の中に入っていない、キャピラリーの先端に存在する核酸材料を排出させるのに十分な時間および強さで、段階（b）で印加したものとは逆向きの電圧をキャピラリーに沿って印加することをデバイスにさせるための命令；ならびにe）段階（d）の後に、段階（b）で印加した向きの電圧をキャピラリーに沿って印加し、それにより、分離媒体中に導入された核酸分子を電気泳動により分離することをデバイスにさせるための命令を含む。
【００２０】
1つの態様において、命令は、段階（d）の後および段階（e）の前に、キャピラリーの前記末端を、電気泳動分離媒体を含む別のリザーバーに移行させるための命令をさらに含む。
【００２１】
別の局面において、本明細書に記載するのは、変性キャピラリー電気泳動のためのシステムであり、該システムは、a）コンピュータプロセッサと機能的に連結しているキャピラリー電気泳動デバイス、ならびに、試料リザーバーから1つまたは複数の追加的なリザーバーへのおよび該CEデバイスへのキャピラリー末端の移動を可能にするロボット工学（robotic）デバイスと；b）核酸試料中の核酸分子をローディングしかつ電気泳動により分離するようにキャピラリー電気泳動デバイスおよびロボット工学デバイスに指示するためのコンピュータ実行可能命令を含むコンピュータ可読物理メモリーとを含み、該命令は、i）CEキャピラリーの一方の末端を核酸試料中に浸漬することをロボット工学デバイスにさせるための命令；ii）試料からの核酸分子のプラグをキャピラリーに含まれる変性分離媒体中に導入するのに十分な時間にわたって、キャピラリーに沿って電圧を印加することをCEデバイスにさせるための命令；iii）キャピラリーの該末端を別個のリザーバーに移動することをロボット工学デバイスにさせるための命令；iv）変性分離媒体の中に入っていない、キャピラリーの先端に存在する核酸材料を排出させるのに十分な時間および強さで、段階（ii）で印加したものとは逆向きの電圧をキャピラリーに沿って印加することをCEデバイスにさせるための命令；ならびにv）段階（iv）の後に、段階（ii）で印加した向きの電圧をキャピラリーに沿って印加し、それにより、分離媒体中に導入された核酸分子を電気泳動により分離することをCEデバイスにさせるための命令を含む。
【００２２】
1つの態様において、命令は、段階（iv）の後および段階（v）の前に、キャピラリーの前記末端を、電気泳動分離媒体を含む別のリザーバーに移行させるための命令をさらに含む。
【００２３】
別の局面において、本明細書に記載するのは、変性核酸キャピラリー電気泳動（CE）におけるアーチファクトピークの大きさを減少させるための方法であり、該方法は、a）変性分離媒体を含むCEキャピラリーの一方の末端に核酸試料を動電的に注入する段階；b）CEキャピラリーの該末端を、核酸試料を実質的に欠いている緩衝液のリザーバーに移行させて、かつ分離媒体の膨張を引き起こすのに十分な量および時間でキャピラリーを一過性に加熱する段階；ならびにc）段階（b）の後に、核酸試料を電気泳動により分離する段階を含み、段階（a）〜（c）は、結果的に得られる分離された種におけるアーチファクトピークの相対的大きさを減少させる。膨張は、好ましくは、キャピラリーの先端に存在するあらゆる非変性核酸を排出させるのに十分な大きさである。
【００２４】
1つの態様において、一過性の加熱は、キャピラリーおよびその内容物のジュール加熱を含む。ジュール加熱は、核酸をキャピラリー内に動電的に注入するために印加した電圧とは逆向きの電圧の印加によって達成されることが好ましい。
【００２５】
別の態様において、膨張は、少なくとも、変性分離媒体の中に入っていない、キャピラリーの先端に存在する核酸材料の排出を引き起こす。
【００２６】
別の態様において、電気泳動分離段階（c）は、キャピラリーの前記末端を、電気泳動緩衝液を含む第2のまたは追加的なリザーバーに移行させることを含む。
【００２７】
別の局面において、本明細書に記載するのは、核酸の変性キャピラリー電気泳動分離のための方法であり、該方法は、a）変性分離媒体を含むCEキャピラリーの一方の末端を、核酸を含む試料中に浸漬させる段階；b）試料からの核酸のプラグを変性分離媒体中に導入するのに十分な時間および向きで、CEキャピラリーに沿って電圧を印加する段階；ならびにc）キャピラリーの該末端を電気泳動緩衝液を含むリザーバーに移行させて、かつキャピラリーに沿って電圧を印加して、プラグ中の核酸種の電気泳動分離を生じさせる段階を含む。この局面において、本方法における改良は、i）段階（b）の後および段階（c）の前に、キャピラリーの該末端を、核酸試料を実質的に欠いている緩衝液を含むリザーバーに移行させる段階；およびii）変性分離媒体の膨張を引き起こすのに十分な温度および持続時間で、少なくともキャピラリーのローディングされた該末端を加熱する段階を含み、それにより、試料からの非変性核酸がキャピラリー内の分離媒体の中に実質的に入らないように、少なくとも、変性分離媒体の中に入っていない、キャピラリーの先端に存在する材料が、キャピラリーの該末端から排出され、それにより、段階（i）および（ii）を伴わずに行った方法と比較してアーチファクトピークの相対的大きさが減少する。
【００２８】
1つの態様において、段階（ii）における加熱は、キャピラリーのジュール加熱を含む。ジュール加熱は、段階（b）および（c）で印加した電圧とは逆向きの電圧パルスを、キャピラリーに沿って印加することによって生じさせることが好ましい。
【００２９】
別の局面において、本明細書に記載するのは、変性核酸キャピラリー電気泳動（CE）におけるアーチファクトピークの大きさを減少させるための方法であり、該方法は、a）変性分離媒体を含むCEキャピラリーの一方の末端を核酸試料と接触させて、かつ試料からの核酸のプラグをキャピラリー内の分離媒体中に導入するのに十分な電圧をキャピラリーに沿って印加する段階；b）段階（a）によるキャピラリーの該末端を試料から取り出す段階；およびc）段階（b）の後に、キャピラリーの内容物の膨張を引き起こすのに十分な量および時間で、キャピラリーに熱を加える段階であって、該膨張が、少なくとも、変性分離媒体の中に入っていない、キャピラリーの先端に存在する材料の排出をもたらす、段階を含み、それにより、キャピラリーを通しての試料の電気泳動分離によってプラグ中の核酸を分離する場合にアーチファクトピークの大きさが減少する。
【００３０】
1つの態様において、段階（c）は、キャピラリーのジュール加熱を含む。ジュール加熱は、核酸のプラグをキャピラリー内に導入するために印加したものとは逆向きの電圧の印加によって達成されることが好ましい。
【００３１】
別の態様において、本方法は、段階（b）の後および段階（c）の前に、CEキャピラリーの前記末端を、核酸試料を実質的に欠いている緩衝液中に浸漬させる段階をさらに含む。
【００３２】
別の態様において、本方法は、段階（c）の後に、キャピラリーの前記末端を、電気泳動分離緩衝液を含むリザーバーに移行させて、かつプラグ中の核酸を電気泳動により分離する段階をさらに含む。
【００３３】
別の局面において、本明細書に記載するのは、核酸試料中の核酸分子をローディングしかつ電気泳動により分離するように自動キャピラリー電気泳動デバイスに指示するためのコンピュータ実行可能命令を含むコンピュータ可読物理メモリーであり、該命令は、a）CEキャピラリーの一方の末端を核酸試料中に浸漬することをデバイスにさせるための命令；b）試料からの核酸分子のプラグをキャピラリーに含まれる分離媒体中に導入するのに十分な時間にわたって、キャピラリーに沿って電圧を印加することをデバイスにさせるための命令；c）キャピラリーの該末端を別個のリザーバーに移動することをデバイスにさせるための命令；d）分離媒体の中に入っていない、キャピラリーの先端に存在する材料を排出させるのに十分な時間および強さで、段階（b）で印加したものとは逆向きの電圧をキャピラリーに沿って印加することをデバイスにさせるための命令；ならびにe）段階（d）の後に、段階（b）で印加した向きの電圧をキャピラリーに沿って印加し、それにより、分離媒体中に導入された核酸分子を電気泳動により分離することをデバイスにさせるための命令を含む。
【００３４】
1つの態様において、命令は、段階（d）の後および段階（e）の前に、キャピラリーの前記末端を、電気泳動分離媒体を含む別のリザーバーに移行させるための命令をさらに含む。
【００３５】
別の局面において、本明細書に記載するのは、変性キャピラリー電気泳動のためのシステムであり、該システムは、a）いずれもコンピュータのプロセッサと機能的に連結している、CEデバイス、ならびに、試料リザーバーから1つまたは複数の追加的なリザーバーへのおよび該CEデバイスへのキャピラリー末端の移動を可能にするロボット工学デバイスと；b）核酸試料中の核酸分子をローディングしかつ電気泳動により分離するようにキャピラリー電気泳動デバイスおよびロボット工学デバイスに指示するためのコンピュータ実行可能命令を含むコンピュータ可読物理メモリーとを含み、該命令は、i）CEキャピラリーの一方の末端を核酸試料中に浸漬することをロボット工学デバイスにさせるための命令；ii）試料からの核酸分子のプラグをキャピラリーに含まれる分離媒体中に導入するのに十分な時間にわたって、キャピラリーに沿って電圧を印加することをCEデバイスにさせるための命令；iii）キャピラリーの該末端を別個のリザーバーに移動することをロボット工学デバイスにさせるための命令；iv）分離媒体の中に入っていない、キャピラリーの先端に存在する材料を排出させるのに十分な時間および強さで、段階（ii）で印加したものとは逆向きの電圧をキャピラリーに沿って印加することをCEデバイスにさせるための命令；ならびにv）段階（iv）の後に、段階（ii）で印加した向きの電圧をキャピラリーに沿って印加し、それにより、分離媒体中に導入された核酸分子を電気泳動により分離することをCEデバイスにさせるための命令を含む。
【００３６】
システムの1つの態様において、命令は、段階（iv）の後および段階（v）の前に、キャピラリーの前記末端を、電気泳動分離媒体を含む別のリザーバーに移行させるための命令をさらに含む。
【００３７】
本明細書で用いる場合、「アーチファクトピーク」とは、核酸種の変性キャピラリー電気泳動分離において検出されるシグナルピーク（例えば、標識核酸種からの蛍光シグナルのピーク）のことであり、その大きさまたは相対的位置は、所与の変性分離マトリックス組成を用いる電気泳動のローディングおよび分離の条件に応じて異なりうる。すなわち、アーチファクトピークは、同じ試料のアリコートを、同じ変性分離マトリックスを通して、異なるローディングおよび／または分離条件の下で、キャピラリー電気泳動にかけた場合に存在し、ピークは、互いに位置がずれているか、互いに大きさがずれているか、または単にあるセットのローディング／分離条件下では存在するが別の条件下では検出されないかのいずれかである。本明細書中の他所で考察するように、アーチファクトピークの主な源は、変性CEにおける非変性DNAまたは部分的にのみ変性したDNAの存在である - 二本鎖DNAは一本鎖DNAよりも速く移動する傾向があるため、分離における所与の核酸種の二本鎖形態の存在は、所与の長さの一本鎖DNAのメインピークに先行して移動するスプリットピークまたは「シャドウ」ピークをもたらす。
【００３８】
本明細書で用いる場合、「アーチファクトピークの相対的大きさを減少させる」という語句は、あるセットのローディングおよび電気泳動条件の下で生じるかまたは検出される関心対象のピークの大きさを基準とした、アーチファクトのキャピラリー電気泳動シグナルピークの大きさが、参照基準セットの条件下でのそのピークの相対的大きさと比較して少なくとも10％減少することを指す。一般に、アーチファクトピークの減少のための本明細書に記載されたような諸段階を取り入れて、あるセットのCEローディングおよび／または電気泳動条件によって生じるアーチファクトピークの大きさを、それらの段階を行わない点を除いて同じ条件下でのローディングおよび分離によって生じる大きさと比較する。所与の分離における所与のアーチファクトピークおよび好ましくはすべての同様なアーチファクトピークの大きさは、所与の検出条件下で（例えば、蛍光検出、ここで本明細書で用いる場合、シグナルは、それがバックグラウンドレベルの少なくとも2倍になるまでは「検出された」とはみなされない）、アーチファクトピークが存在しないことまで含めて、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％またはそれ以上減少することが好ましい。
【００３９】
本明細書で用いる場合、「変性分離媒体」という語句は、分離媒体の中に入ってそこを通って移行する変性DNAの変性（すなわち、一本鎖）状態を維持するのに十分な量のDNA変性剤、例えば尿素を含む、CE分離媒体のことを指す。「変性分離媒体」は、二本鎖DNAを必ずしも変性させないが試料がキャピラリーに適用された場合に変性されている分子の二本鎖形態の再形成（または再生（re-naturation））を防ぐ濃度で、変性剤を含んでもよいことに留意されたい。試料がキャピラリー内の変性分離媒体の中に「入った」という場合には、DNA試料が貫入しているかまたは移動している分離媒体（分離マトリックスゲル）の一部分における変性剤の濃度が、分離したDNAストランドの再生を制止する程度に十分に高くなければならない。例えば、変性剤がキャピラリーの末端で分離媒体から拡散して、キャピラリー先端で変性剤の勾配が生じている場合、変性DNA試料は、再生を阻止する程度に変性剤が十分に多い媒体中の場所へと到達するまでは、「変性分離媒体」の中に入っていない。一般的に用いられる変性分離媒体は、8M尿素を用いて調製される。選択した分離媒体またはマトリックスと適合性のある他の変性剤を用いることもできる。
【００４０】
本明細書で用いる場合、「核酸試料」という用語は、その中の核酸種のCE分離および検出のための、関心対象の試料中の核酸のことを指す。核酸試料は、その用語が本明細書で用いられる場合、1から数千またはそれ以上の異なる核酸種、例えば、DNA分子を有しうる。
【００４１】
本明細書で用いる場合、「核酸試料を実質的に欠く」という語句は、核酸試料が全く存在しないか、または、所与のCE手順に適用される検出条件下でのキャピラリー電気泳動に関する検出閾値未満のレベルで存在する核酸（または核酸試料）を有する、液体媒体、溶液または緩衝液のことを指す。例えば、動電的に注入した核酸試料からの核酸種を含有するキャピラリーの末端を、本明細書に記載したようにキャピラリーを加熱するかまたは逆極性パルスを印加する前に、核酸試料リザーバーまたは容器から「核酸試料を実質的に欠く」媒体、溶液または緩衝液を含む第2のリザーバーに移行させる場合には、第2のリザーバー内にその試料からの核酸が全くないことが好ましい。しかし、第2のリザーバー内に、例えば、試料が投入される前のキャピラリー先端のリザーバー内への浸漬に起因する、またはキャピラリー先端の浸漬と浸漬の間のすすぎ洗いが不完全なことに起因する核酸が存在することは、キャピラリーを経て最終的に分離される第2のリザーバー由来の何らかの量の核酸が、そのCE実施のためのデバイスについての検出閾値未満であるか、またはバックグラウンドシグナルと同じもしくはそれ未満である限り、可能である。「核酸試料を実質的に欠く」リザーバー内には核酸が全くないことが依然として好ましいものの、1つの態様において、そのようなリザーバーは、正確な定量およびバンドの割り当てを可能にするために試料核酸以外の核酸を有することが可能であり、リザーバー内のそのような核酸のサイズは、分離されることになる試料中の関心対象の種のものとは異なる（すなわち、CEキャピラリーを経て電気泳動により分解しうる）必要があると考えられる。
【００４２】
本明細書で用いる場合、「前記分離媒体の膨張を引き起こすのに十分な量および時間で」、キャピラリーを「一過性に加熱する」という語句は、CEキャピラリーの少なくとも一部分に対して、キャピラリー内の分離媒体を膨張させるのに十分な熱を加えることを指す - この膨張により、例えば、キャピラリーの先端に存在する液体は、キャピラリーから周囲の媒体、溶液または緩衝液の中へと押し出されると考えられる。加熱は例えば、キャピラリーの試料注入用先端の付近、またはキャピラリーの全長にわたっての他の何らかの比較的狭い位置に限局させることができる - キャピラリーのいずれかの末端からある程度の距離でのマトリックスの膨張は、キャピラリー内のゲルは容易には圧縮されないことから、キャピラリーの末端から液体を押し出すのに十分な圧力を生じるであろうと一般に予想される。または、加熱を、より全体的に行うこと、またはキャピラリーの幅広い部分にわたって行うこともできる。加熱は、それがCE実施の分離フェーズの間は維持されないという点で「一過性」であってよい。一過性の加熱のための時間は、加熱の様式および度合いに応じて異なりうるが、一般に、およそ数秒（例えば、3秒、5秒、7秒、10秒またはそれ以上）から約1分であると考えられる。一過性の加熱において加えられる温度はさまざまでありうるが、100℃未満、例えば、95℃、90℃、88℃、85℃、83℃、80℃、78℃、75℃、73℃、70℃、68℃、65℃、63℃、60℃またはそれ未満であるべきであり、かつ、一般に約40℃を上回ると考えられる。当業者は、慣例的な範囲を超えない実験を用いて、機能する時間と温度の組み合わせを決定することができる。加熱は一過性であることが好ましいものの、所与の試料中の少なくとも関心対象の種のTmを上回る温度が分離の間じゅう維持されるような連続加熱も想定している。
【００４３】
本明細書で用いる場合、「ジュール加熱」という語句は、導電性材料、例えばCE分離媒体の、その中に電流を流すことによる加熱のことを指す。
【００４４】
本明細書で用いる場合、「逆極性」という語句は、参照基準とは逆の向きで印加される電圧のことを指す。本明細書に記載された方法に関連して、逆極性電圧は、CEキャピラリーへの核酸試料の動電的注入の後に、試料を動電的に注入するために印加したものとは逆の極性で印加される。「逆向き」という用語は、本明細書において逆極性と互換的に用いられる。
【００４５】
本明細書で用いる場合、「ホルムアミドを実質的に欠く」という語句は、CEキャピラリー上にローディングされた核酸試料が、ホルムアミドを完全に欠くか、または試料中のDNAを適正もしくは完全に変性させるのに十分な濃度のホルムアミドを欠くことを意味する。ホルムアミドをベースとするCE用の核酸ローディング溶液は、例えば、13.3％もしくはそれ以上の、15％もしくはそれ以上の、25％もしくはそれ以上の、50％もしくはそれ以上の、60％もしくはそれ以上の、70％もしくはそれ以上の、またはさらには80％もしくは80％を上回るホルムアミド、またはそれ以上を含めて、10％ホルムアミドまたはそれ以上の最終濃度を与える傾向がある。ホルムアミドを「実質的に欠く」試料は、ホルムアミドが全く存在しないことが好ましいが、特定の態様において、ホルムアミドが10％未満、好ましくは5％未満、より好ましくは2％未満、より好ましくは1％未満で存在することもできる。試料がPCR反応混合物である場合には、反応混合物中にホルムアミドが全く存在しないことが好ましい。いくつかの態様において、CEキャピラリー上へのローディングの前に、PCR反応物から採取した試料にホルムアミドを変性剤として加えることができるが、本明細書に記載された方法を用いると、ホルムアミドローディング緩衝液を用いることなく、PCR試料のCE上のシャドウアーチファクトを避けるかまたはその大きさを減少させることができることは強調しておく。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】多重PCR増幅の際にさまざまな時点で採取した試料に対して行ったキャピラリー電気泳動分離の一例を示している。白の矢印を付したNSA 95は、95ヌクレオチドの箇所で移動する非特異的アンプリコンを示す。残りの灰色の矢印は、シャドウアーチファクトバンドを示している。
【図２】サーモスタット制御式のカートリッジ本体の内部にあり、突出した試料ローディング末端（陰極）および試料非ローディング末端（陽極）を伴う、変性分離媒体を含むキャピラリーを含むCE設備の略図を示している。試料ローディング末端は、加熱されたDNA試料中への浸漬を可能にする保持器の中に配置されている。キャピラリーのローディング末端を1つの位置から別の位置に移行させるためのロボット工学的素子は示されていない。
【図３】温度を27℃から、35℃、45℃および55℃へと上昇させて分離を行った、CEの結果を示している。矢印はシャドウピークの位置を表示している。
【図４】35℃、55℃、60℃および85℃を含む注入温度の後に1つの温度で分離を行ったCEの結果を示している。NSA 95、メインピークおよびシャドウピークの位置を示している。
【図５】注入を85℃および95℃で行ったCEの結果を示している。
【図６】図6A〜6Hは、キャピラリー内および試料ローディングキャピラリー先端で起こると仮定した一連の注入関連イベントの略図を示している。本発明は理論に限定されることを意図していない；しかし、以下は、シャドウ形成に至る、提唱される一連のイベントを図式的に示している。図6Aは、注入の前のキャピラリーを示している。キャピラリー先端の拡大図を示し、CEゲル（変性CE分離媒体）およびゲルと周囲の媒体との境界面を示している。図6Bは、注入の開始時のキャピラリー先端での状況を示している。注入電流がその中に流れると、CEゲルが熱くなって膨張すると仮定している。膨張により、少量のゲルが試料中に押し出される。注入の間に、図6Cにさらに示されているように、変性DNAがキャピラリーゲルマトリックスの中に動電的に流入する（多数の黒の丸印として示されている）。図6Dは、注入が完了した後に仮定される状況を示している - キャピラリーマトリックスの冷却により、それが収縮することが可能になる。変性DNA（一本鎖DNAまたはssDNA）のプラグが変性分離媒体の中に入り、キャピラリー内でのゲルの収縮によって、キャピラリーの先端に空隙が生じ、それが試料溶液で満たされる。それが冷却されるに従い、ゲルの先端にある試料溶液中のssDNAは再生を起こして、レンガ状パターンで示すようなdsDNAを形成しうる。ゲル中の尿素変性剤は、ゲルの中に入ったssDNAの再生を防止する。図6Eは、キャピラリーの先端を試料から分離用の緩衝液リザーバーに移動させた場合に起こると仮定される状況を示している。先端にはssDNAおよびdsDNAが存在する。図6Fおよび6Gは、分離を行う際に起こると仮定した状況を示している。分離用電圧を印加すると、dsDNAがゲルの中に入る。ゲル中の尿素は、ssDNAの再生を防止するには十分であるが、二本鎖であるDNAが周囲温度でゲルの中に入った場合にそれを変性させることはできない。dsDNAはより速く移動し、メインピーク中のssDNAに追いついて、シャドウピークを形成する。図6Hは、移動しているDNAが、キャピラリーの加熱（恒温）部分の中に入った場合に起こると仮定したイベントを示している - カートリッジの温度に依存して、dsDNAは、ssDNAへと変性して、スプリットピークを形成するか、または二本鎖のままであり、シャドウピークを保たせるかのいずれかであると仮定している（レンガ状パターン）。より遅く移動するssDNA（多数の黒の丸印）は、分離の間じゅう一本鎖のままである。
【図７】キャピラリー内および試料ローディングキャピラリー先端で起こると仮定した代替の（または同時の）一連の注入関連イベントの略図を示している。本発明は理論に限定されることを意図していない；しかし、以下は、シャドウ形成の一因となる、提唱される一連のイベントを図式的に示している。図7は、注入後のキャピラリーを示している - キャピラリーが注入後に冷却されるに従って、変性分離媒体の中に入ったssDNA（黒の点で示されている）、および変性剤が希釈されていて再生が可能になっている境界面のゲルの帯域に入ったDNA（横縞で示されている）が存在するようになる。ひとたび非変性DNAがゲルの中に入ると、図6に図示されているように、シャドウピークおよび／またはスプリットピークとなりうる。
【図８】図8A〜8Dは、種々の単一増幅産物および多重増幅産物に対するパルス非印加、RPパルスおよび「正常」パルスの印加の結果を示している。図8Aには、シングルプレックス反応が示されている。図8Bは、3-プレックス（3-plex）PCR反応産物による同様の実験の結果を示している。図8Cおよび8Dは、2種類の高次多重増幅反応に関して、RPおよび「正常」パルシングをパルス無しと比較した結果を示している。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
詳細な説明
PCR緩衝液などの高塩濃度緩衝液による注入を用いるDNAの変性キャピラリー電気泳動分離では、往々にして、複数の標的特異的ピークが生じる：一本鎖（ss）DNAとして移動するメインピーク、および、二本鎖（ds）DNAまたは部分的に二本鎖であるDNAを含む可能性が高い、より速く移動する別のピーク。本明細書において「シャドウ」ピークまたは「シャドウアーチファクト」ピークとも称する、そのようなさらなるアーチファクトのピークの出現は、試料中の核酸種へのピークの割り当てにとって、および試料中の個々の種の定量にとって問題となる。
【００４８】
本明細書に記載するのは、シャドウピークを避けるため、またはその大きさを減少させるための方法である。1つの局面において、本明細書に記載された方法は、キャピラリー内へのDNAの動電的注入の後、キャピラリーを経る核酸種の分離を開始する前に、変性分離媒体の中に入っていないDNAをキャピラリー先端から取り除くために取り入れられる1つまたは複数の段階を伴う。理論に拘束されることは望まないが、キャピラリーの先端からのそのような材料の除去は、非変性DNAがキャピラリーの中に入ってシャドウアーチファクトピークを形成することを防止しうると考えられる。そのようなアプローチは、シャドウアーチファクトピークが生じる、あらゆる変性核酸CE分離に幅広く適用可能である。それらは特に、それらが例えば、PCR反応と干渉する恐れのあるホルムアミドなどの薬剤の使用を必要としないという点で、PCR反応産物の変性核酸CE分離によく適している。このことは、サイクルの間に反復的な場面でPCR反応の試料採取を可能にし、それをCE分離と組み合わせると、反応の経過にわたるアンプリコンの増幅プロファイルの生成が得られるだけでなく、各々のアンプリコン産物のサイズ識別による、多重増幅における複数の種のモニタリングも可能になる。絶対に必要というわけではないが、CEキャピラリー内の変性分離媒体の中への核酸試料の注入は、試料中の核酸が変性している際に行うことが好ましい。PCR反応からの直接的な注入の場合、このことは、試料が、92℃〜95℃で行われることが最も一般的であるストランド分離段階の間に注入されることを意味しうる。注入がPCR反応混合物または他の反応混合物から直接的でない場合には、キャピラリー上への動電的注入の前に、熱および／またはホルムアミドなどの薬剤を、DNAを変性させるために用いることができる。
【００４９】
1つの態様において、本方法は、動電的注入段階の後、および注入した試料の電気泳動分離の前に、逆極性パルスを印加する段階を含む。理論に拘束されることは望まないが、短時間の逆極性パルスは、キャピラリー先端に存在する非変性（または再生を起こした）DNAを、先端の末端の空間、または変性剤が希釈されているゲルマトリックスの帯域のいずれかに放出させると考えられる。逆極性パルスは、非変性DNAをキャピラリーの末端から排出させるのに十分であるが、キャピラリー内の変性分離媒体の中に入った変性試料核酸が以後の電気泳動段階において分離されることが保たれるような持続時間および強さのものである。逆極性パルスは、非変性DNAが再び入ることが起こらないように、キャピラリー先端が核酸試料から取り出された後に印加されることが好ましく、パルスは、語句に関して本明細書に定義したような、核酸試料を実質的に欠いている溶液または緩衝液の第2または別個のリザーバー内に先端が浸漬されている時に印加されることがさらに好ましい。
【００５０】
この局面において、逆極性パルスの持続時間および強さは、さまざまでありうる。パルスが長いほど、注入した核酸（非変性および変性の両方）の多くが排出され、パルスが強いほど多くが排出されることは、当業者には明らかであるはずである。このように、注入される材料の量、またはキャピラリーの先端に存在していて先端から排出される材料の量は、逆極性パルスの持続時間および強さと直接関係している。したがって、より長い持続時間にわたる比較的弱いパルスが機能することができ、比較的短い持続時間にわたる極めて強いパルスも同様である。一般的な経験則として、注入された材料の約半分を「ローディングしない（unload）」とする条件が、シャドウアーチファクトの減少と優れた核酸検出および分解能とのバランスをとる上で最もよく機能することが見いだされている。特定のあるセットの条件に限定されることは望まないが、10kVでの15秒間の注入は、15kVでの3秒間の逆極性パルスと合わせると、よく機能することが見いだされている。逆極性パルシングの最適な時間および強さは、CE緩衝液調合物の違いによってある程度影響を受ける可能性があるが、その違いが著しいことは予想されず、一般的に用いられる緩衝液調合物では特にそうであることには留意されたい。当業者は、所与の緩衝液調合物と機能すると考えられる、あるセットの強さおよび持続時間の条件を、最小限の実験を用いて決定しうると予想される。試料の塩組成または緩衝液組成が注入特性に影響を及ぼしうることもさらに留意されたい。しかし、本明細書に記載された逆極性アプローチは、PCR緩衝液中の試料といった標準的な試料条件による注入に関して機能するだけでなく、本明細書において実証しているように、ホルムアミドのような非イオン性溶媒による注入に関しても機能することが見いだされている。
【００５１】
注入に関しては、結果にごくわずかな影響しか及ぼさずに、時間を電圧へと換えることが容易である。逆極性段階のためには、高電圧のより短いパルスは、より低い電圧の長いパルスよりも、シャドウ抑制にとって良く機能する傾向がある。このため、これらの実験のために用いたシステムの最大電圧は15kVであったが、15kVよりも高い電圧は逆極性パルスにとってさらに良く機能する可能性があり、必要に応じて、それに対応して時間を短縮させる。したがって、例えば、17kV、18kV、20kV、22kV、24kV、26kVまたはそれ以上という高い電圧は、本明細書に記載された方法に有用でありうる。
【００５２】
別の態様において、本方法は、動電的試料注入の後、および注入した試料の電気泳動分離の前に、変性分離マトリックスの膨張を引き起こすのに十分な様式で、例えば、分離マトリックスの全体または一部分を一過性に加熱することによって、キャピラリーを一過性に処理する段階を含む。理論に拘束されることは望まないが、膨張は、キャピラリーの先端に存在していて変性分離媒体の中に入っていない非変性DNAを物理的に排出させると考えられる。処理は、排出後に非変性DNAが再び入ることを避けるために、キャピラリーを核酸試料（例えば、PCR反応からの）から取り出した後に行われるべきであり、キャピラリー先端が、試料核酸を実質的に欠いている溶液のリザーバー内に浸漬されている際に行われることが好ましい。キャピラリー内の変性分離媒体またはマトリックスは、ローディング時に変性しているDNAの変性状態を維持させるのには十分であるものの、必ずしも、キャピラリーの中に入る時に変性していないDNAを変性させるのに十分である必要はない。このようにして、注入後のキャピラリーの先端でのマトリックスの膨張および非変性DNAの排出により、電気泳動分離を行う場合に通常であればシャドウピーク形成をもたらす二本鎖DNAが除去される。
【００５３】
キャピラリー内の変性分離マトリックスの膨張を引き起こすために十分な処理には、いくつかの態様において、例えば、マトリックスを膨張させるために必要な温度および時間で、キャピラリーの全体または一部分を一過性に加熱することが含まれうる。分離マトリックスは圧縮可能ではないため、キャピラリーの全長に沿った本質的にあらゆるポイントでの加熱は、そのポイントでマトリックスを膨張させて、キャピラリーの全長にわたって圧力を引き起こし、最終的には、非変性DNAを含むキャピラリーの先端で材料の排出をもたらしうると考えられる。一過性に加えられる熱は、CEの注入または分離段階におけるCEカートリッジ本体のサーモスタット式の設定温度を上回ることが好ましい。加えられる温度は、非変性DNAの所望の排出を達成するのに十分な、分離媒体の膨張が起こる限り、さまざまでありうる。しかし、温度は一般に100℃未満、例えば、95℃、90℃、88℃、85℃、83℃、80℃、78℃、75℃、73℃、70℃、68℃、65℃、63℃、60℃またはそれ未満であると考えられ、しかし一般に約40℃を上回ると考えられる。
【００５４】
マトリックスの加熱は、いくつかの態様において、例えば、キャピラリーの一部分と接触している素子のサーモスタット制御式加熱によって達成されうる。素子は、マイクロプロセッサによって制御することができる。1つの態様において、加熱素子はペルチエ型半導体加熱素子である - そのような素子は、ペルチエ加熱が急速で容易に制御され、しかも、効率的なペルチエ型加熱素子の所要専有面積または空間が、他の型の素子よりも一般的に小さいという点で有用である。
【００５５】
一過性の加熱は、ジュール加熱、すなわち、キャピラリー内の分離マトリックスに電流を通すことによって引き起こされる加熱によって達成されうる。しかし、ジュール加熱を用いる場合には、電流は試料を注入するために用いた電流とは逆向きのものであるべきである - そうでなければ、加熱効果は、非変性DNAがまずキャピラリーの先端に、さらには分離マトリックスの中に入ることによって相殺される可能性が高い。分離マトリックス内の非変性DNAは、続いて、CE過程の分離フェーズの間にシャドウピークを形成すると考えられる。逆極性パルスを介したジュール加熱は、本明細書中の実施例に記載されたようにして行うことができ、当業者は一般に、注入後にキャピラリーの先端に存在する非変性材料を排出させるためにマトリックスを加熱および膨張させるのに必要な電流の強さおよび持続時間（またはその範囲）を決定することができる。一般に、この目的に必要な加熱は、およそ10kVまたはそれ以上、例えば、12kV、14kV、15kV、16kV、17kV、18kV、20kV、22kV、24kV、26kVまたはそれ以上の電圧のパルスによって達成されうると予想される。ジュール加熱パルスの対応する持続時間は、電圧が高くなるにつれて減少すると考えられるが、10kVのパルスでは約5〜7秒の時間が、10kVで15秒間の注入後の妥当な出発点になる。10kVで15秒間の試料注入後の、15kVで3秒間の逆極性電圧の印加は、この局面にとってよく機能する。当業者は、所与のシステムで機能するジュール加熱パルス条件を、慣例的な実験を用いて容易に決定することができる。
【００５６】
シャドウアーチファクトを減少させるための、動電的注入後のキャピラリーの少なくとも一部分の一過性の加熱に関連して、いくつかのさらなる点について検討することができる。第1に、シャドウアーチファクトが、先端を試料から電気泳動分離用のリザーバーに移行させる際のローディングされた先端の冷却によって引き起こされる限りにおいて、冷却が収縮を引き起こすか、それとも冷却が部分的再生を許容するか、またはその両方であるかにかかわらず、移行期間の際および変性分離媒体を通しての分離を開始しうる前の何らかの他の遅延の際に、ローディングされた先端の温度を再生を許容しない温度（すなわち、核酸種のTmを上回る温度）に維持することにより、シャドウピークを限定するかまたは避けることができ、いくつかの態様においては、おそらくは追加的な加熱または逆極性パルシングの必要性を伴わないと特に想定している。または、いくつかの態様においては、シャドウピークの発生および／または大きさをさらに減少させるため、または消失させるために、そのような温度維持と逆極性パルシングの組み合わせを使用しうることも想定している。そして、1つのアプローチでは、ローディング、移行および分離段階の間じゅう少なくとも関心対象の種のTmを上回る温度に維持することが、同程度の効果を有する。
【００５７】
その上さらに、いくつかの態様においては、分離を開始する直前に、キャピラリーのローディングされた先端を核酸のTmを上回る温度に単に加熱することが、ローディングされた先端におけるあらゆる部分的にまたは完全に再生を起こした種を変性させる効果を有することも想定している。この効果は、本明細書中の他所で考察した膨張／排出効果とは別のもの、またはそれに加わるものであると考えられる。それを行うための1つのアプローチは、電気泳動緩衝液リザーバーを、核酸種のTmを上回る温度に加熱することであると考えられる。このアプローチの下では、試料注入後の先端移行の際にある程度の再生が存在したとしても、電気泳動を開始する時点にはストランドは再び変性していると考えられ、それぞれの種は単一のピークとして移動すると考えられる。このアプローチの下では、加熱された緩衝液リザーバーからの蒸発を避けるための段階を取り入れるべきである。そのような段階には、例えば、リザーバーの上に緊密に適合するカバーを含めることが含まれうる - 濃縮および逆流を避けるためにカバーそれ自体を加熱することができる。そのようなカバーは、例えば、カバーを通して、またはその周りに、ローディングされたキャピラリー先端をリザーバーに導入することを可能にするデザインを含む。1つの態様においては、ローディングされたキャピラリー末端を、加熱された緩衝液リザーバーの中に配置することを可能にするために、カバーを取り外すかまたはずらし、カバーはその後、試料分離のための位置に動かして戻すことができる。カバーに代わるものとして、電気泳動緩衝液用の加熱されたリザーバーを、例えば、鉱油または蝋状物質で覆うことも可能であると想定している。
【００５８】
電気泳動緩衝液リザーバーを、核酸種のTmを上回る温度に加熱することに代わるものの1つは、ローディングされた先端を、電気泳動緩衝液リザーバー中への浸漬の直前に、加熱されたブロックと接触させること、または少なくとも近接させることである。加熱されたブロックは、例えば、緩衝液の表面のすぐ上にあってもよい。ブロックは、ブロックの急速な制御加熱を可能にするペルチエ加熱によって加熱することが好都合であると考えられる - ブロックが急速に加熱されれば、実施の間じゅう温度を維持する必要はない。ローディングされた先端を浸漬の前に加熱することが必要な時にのみブロックを加熱することにより、ブロックが近傍の電気泳動緩衝液の蒸発を引き起こすことについての問題を抑えることができる。
【００５９】
CEアーチファクト、特にシャドウ型アーチファクトを減少させるため、または防止するための、本明細書に記載された方法に関する、そのほかの考慮事項は、本明細書の以下、およびそれに続く実施例に記載されている。
【００６０】
キャピラリー電気泳動：
変性キャピラリー電気泳動は当業者に周知である。手短に述べると、核酸試料を試料から、キャピラリーの投入末端でキャピラリー内の変性分離媒体中に注入して、キャピラリー末端に電場を印加する。PCR反応混合物または他の試料といった試料中の種々の核酸成分は、それらの電気泳動特性の違いが理由で、検出器のポイントへと異なる速度で移動する。結果的に、それらは検出器（通常はUVまたは蛍光検出器）に異なる時間で到達する。一連の検出ピークとして提示される結果は、各ピークが理想的には試料の1つの核酸成分または種を表す。ピーク面積またはピーク高さは、混合物における成分の初期濃度を示す。
【００６１】
CEキャピラリーそれ自体は多くの場合には石英であるが、当業者に公知の他の材料を用いることもできる。
【００６２】
単一キャピラリーおよび複数キャピラリーのいずれの能力も有する、市販のCEシステムが数多く存在する。本明細書に記載された方法は、核酸試料の変性CEのためのあらゆるデバイスまたはシステムに対して適用可能である。アーチファクトピークを避けるため、または減少させるために、本明細書に記載された方法を適用することのできるCEデバイスの非限定的な例には、いくつか例を挙げると、Applied Biosystems, Inc.（ABI）のgenetic analyzer、モデル310（単一キャピラリー）、3130（4キャピラリー）、3130xL（16キャピラリー）、3500（8キャピラリー）、3500xL（24キャピラリー）、3730（48キャピラリー）および3730xL（96キャピラリー）、Agilent 7100デバイス、Prince Technologies, Inc.のPrinCE（商標）Capillary Electrophoresis System、Lumex, Inc.のCapel-105（商標）CEシステム、ならびにBeckman CoulterのP/ACE（商標）MDQシステムが含まれる。
【００６３】
本明細書に記載された方法は、潜在的には、マイクロ流体分離（分離が、ガラス、シリコンまたは他の基板の内部または表面にエッチングされたマイクロチャネルを通して行われる）における有用性も有しうるが、好ましい態様において、本方法はマイクロ流体分離を含まず、しかしその代わりに、長さがおよそ10〜60cmまたはそれ以上である単一または複数の円筒状キャピラリーチューブを通しての分離を使用する。
【００６４】
自由溶液中の異なるサイズのポリヌクレオチドについて電荷-摩擦抵抗比は同じであるため、電気泳動分離には篩い分け媒体の存在が必要である。適用可能な篩い分け媒体にはゲルが含まれるが、線状ポリアクリルアミド、ヒドロキシアルキルセルロース（HEC）、アガロース、および酢酸セルロースなどの非ゲル性液体ポリマーを用いることもできる。キャピラリー電気泳動のために用いうる他の分離媒体には、いくつか例を挙げると、水溶性ポリマー、例えば、ポリ(N,N'-ジメチルアクリルアミド)（PDMA）、ポリエチレングリコール（PEG）、ポリ(ビニルピロリドン)（PVP）、ポリエチレンオキシド、多糖類およびプルロニックポリオール；さまざまなポリ(ビニルアルコール)（PVAL）関連ポリマー、ポリエーテル-水混合物、リオトロピック高分子液晶が非限定的に含まれる。例えば、Liu et al., 162 Capillary Electrophoresis of Nucleic Acids: Volume I: Introduction to the Capillary Electrophoresis of Nucleic Acids. 203 (2000)に記載された分離媒体、ならびにGuttaman et al. 22 LCGC North America 896 (2004)およびSunada, W. M. et al., 18 Electrophoresis 2243 (1997)に記載された分離媒体を参照されたく、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み入れられる。
【００６５】
キャピラリー電気泳動のための分離媒体のその他の非限定的な例には、米国特許第5,569,364号、第5,567,292号、第5,019,232号、第6,001,232号、第5,290,418号、第5,213,669号、第5,264,101号、第5,164,055号、第5,151,464号、第5,126,021号、第4,769,408号、第4,582,868号、および米国特許出願公開第2009/0214638号に開示されたものが含まれ、それらの内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００６６】
適用可能なCE分離マトリックスは、核酸CEを変性させるために必要な変性剤の存在と適合性があり、その一般的な一例は8M尿素である。
【００６７】
アーチファクトピークを含む任意の所与のピークの大きさは、ほとんどの場合、核酸、例えばDNAによるUV吸収、または核酸に結びつけられた1つもしくは複数の標識による蛍光発光のいずれかに基づいて、光学的に決定される。核酸CE検出のために適用しうるUVおよび蛍光検出器は、当技術分野において周知である。
【００６８】
本明細書に記載されたような方法が、アーチファクトピークを減少させるための本明細書に記載された段階を伴わずに同じ条件下で行われたCEと比較して、アーチファクトピークの大きさを減少させたか否かを判定するためには、当業者は、同じ試料の別個のアリコートに対して、両方のセットの条件下（すなわち、シャドウピークアーチファクトを減少させるための本明細書に記載された段階を伴うかまたは伴わない）でCEを実施して、分離された種の位置および大きさを比較する。2つのCE分離の間でバンドの大きさまたは位置にずれのある場合に、アーチファクトピークの変化を決定する。
【００６９】
システム
1つの局面において、試料中の核酸の分離および検出のためのシステムであって、シャドウアーチファクトピークの発生またはその大きさを減少させるための、本明細書に記載されたような段階を遂行することによってバンド割り当ておよび定量の改良を可能にするシステムを、本明細書において提供する。特に、本明細書で提供するのは、熱変性させた核酸試料の動電的注入の後、注入のために用いたのと同じ向きにある電流を用いる分離の前に、逆極性パルスを短時間にわたり印加するか、またはキャピラリーの少なくとも一部分を一過性に加熱するか、またはその両方（例えば、逆極性パルスが分離媒体およびキャピラリーを加熱する場合を含む）のいずれかを行うCEシステムである。本明細書に記載されたシステムは、試料からの動電的ローディング、逆極性パルシングおよび／または加熱、ならびに分離の段階、特に記載された方法を行うために必要な段階を可能とするように、マイクロプロセッサで制御され、自動化されていることが好ましい。また、システムが、核酸を注入する試料リザーバーから、注入された核酸の電気泳動分離の前に、キャピラリーに逆極性パルスおよび／または熱を加えるCE分離ユニットへとキャピラリー末端を移行させるのに十分なハードウェアを含むことも好ましい。より好ましくは、システムは、核酸が注入される試料リザーバーから、キャピラリーの逆極性パルシングまたは熱処理の間には別個のリザーバーへ、さらに続いて、注入した核酸の電気泳動分離のためのCE分離ユニットへとキャピラリー末端を移行させるのに十分なハードウェアを含むと考えられる。システムは、便宜上、制御温度を維持するために、および混入の可能性を最小限にするために、単一の筐体の中に含めることができる。本明細書に記載された方法のために必要に応じてキャピラリー末端をx、yおよびz方向に移動させることのできる、いくつかのロボット工学装置の任意のものを用いて、試料からCE分離ユニットへと、または試料から別個のリザーバーへ、さらにCE分離ユニットへとキャピラリー末端を容易に移行させることができる。試料注入、キャピラリー移行、逆極性または熱の印加、およびCE分離ユニットへのキャピラリー移行の過程は、自動化されていることが好ましい。
【００７０】
さらに1つの態様においては、システムは、コンピュータプロセッサと、アーチファクトピーク、例えばシャドウアーチファクトピークの発生または大きさを減少させるための本明細書に記載されたような段階を含む、核酸CEを変性させるための本明細書に記載された段階を行うようにシステムに指示するコンピュータ実行可能命令を含むコンピュータ可読の物理メモリーまたは有形メモリーとを含むと考えられる。コンピュータ可読メモリーは、コンピュータ可読物理メモリーであること、すなわち、シグナルではないことが好ましい。記載されたような命令を実行しうるコンピュータプロセッサは、当技術分野において周知であり、アーチファクトが減少した核酸CEの変性を成し遂げる、本明細書に記載された段階の自動化を可能にするプロセッサ／アクチュエーター連係についても同様である。
【００７１】
システムは最低限、以下のものを含むと考えられる：
a．コンピュータプロセッサと機能的に連結しているキャピラリー電気泳動（CE）デバイス、ならびに、キャピラリー末端を試料リザーバーからCE分離ユニットの緩衝液リザーバーを含む1つまたは複数の追加的なリザーバーへとx、yおよびz次元で移動させることが可能なロボット工学デバイス；
b．核酸試料中の核酸分子をローディングしかつ電気泳動により分離するようにキャピラリー電気泳動デバイスに指示するためのコンピュータ実行可能命令を含むコンピュータ可読の物理メモリーまたは有形メモリー、ここで命令は、以下のものを含む機能的モジュールとして配置されうる：
i． CEキャピラリーの一方の末端を核酸試料中に浸漬することをロボット工学デバイスにさせるための命令を含む、第1の移行モジュール；
ii．該試料からの核酸分子のプラグをキャピラリーに含まれる変性分離媒体中に導入するのに十分な時間にわたって、キャピラリーに沿って電圧を印加することをCEデバイスにさせるための命令を含む、ローディングモジュール；
iii．キャピラリーのローディングされた末端を別個のリザーバーに移動することをロボット工学デバイスにさせるための命令を含む、第2の移行モジュール；
iv．変性分離媒体の中に入っていない、キャピラリーのローディングされた先端に存在する材料を排出させるのに十分な時間および強さで、段階（ii）で印加したものとは逆極性の電圧をキャピラリーに沿って印加することをCEデバイスにさせるための命令を含む、逆極性モジュール；ならびに
v．段階（iv）の後に、段階（ii）で印加した向きの電圧をキャピラリーに沿って印加し、それにより、変性分離媒体中に導入された核酸分子を電気泳動により分離することをデバイスにさせるための命令を含む、分離モジュール。
【００７２】
1つの態様において、分離モジュールの命令は、段階（iv）の後および段階（v）の前に、キャピラリーの前記末端を、電気泳動分離媒体を含む別のリザーバーに移行させるための命令を含む。
【００７３】
CEデバイスは最低限、電源、キャピラリー用の保持器、および、装着されたキャピラリーの各末端にある、2つの電気泳動緩衝液リザーバーを含むと考えられる。CEデバイスは、電源からの電圧を、いずれもの向き（すなわち、順極性および逆極性）で、好ましくはプログラム可能なルーチンとして、印加する能力を有すると考えられる - すなわち、順極性から逆極性への切り替えが、使用者がその時点で介入する必要なしに達成されることが好ましい。デバイスはまた、キャピラリーのローディング先端の遠位にあるキャピラリーの一部分と機能的に連結した検出器も一般に含むと考えられる。
【００７４】
本発明の諸態様は、コンピュータ可読媒体上に記録されたコンピュータ実行可能命令によって規定され、実行された場合にコンピュータに方法の諸段階を行わせる、機能的モジュールを通じて記述することができる。モジュールは、わかりやすくするために機能別に分けられる。しかし、モジュール／システムはコードの離散的ブロックに対応する必要はなく、記述された機能が、さまざまな媒体上に記憶されたさまざまなコード部分の実行によって行われうること、および何度も実行されうることが理解されるはずである。その上、モジュールは他の機能を行うこともでき、それ故にモジュールが何らかの特定の機能または機能のセットを有するものに限定されないことも認識されるはずである。
【００７５】
コンピュータ可読記憶媒体は、コンピュータによるアクセスが可能な、入手可能な任意の有形媒体または物理媒体であってよい。コンピュータ可読記憶媒体には、コンピュータ可読命令、データ構造、プログラムモジュールまたは他のデータなどの情報の記憶のための、あらゆる方法または技術に実装される、揮発性および非揮発性、着脱式および非着脱式の有形媒体が含まれる。コンピュータ可読記憶媒体には、RAM（ランダムアクセスメモリー）、ROM（読み出し専用メモリー）、EPROM（消去可能プログラマブル読み出し専用メモリー）、EEPROM（電気的消去可能プログラマブル読み出し専用メモリー）、USBメモリー、ハードディスク、フラッシュメモリーまたは他のメモリー技術、タブレット型デバイス、スマートフォンデバイス、CD-ROM（コンパクトディスク読み出し専用メモリー）、DVD（デジタル多用途ディスク）または他の光学記憶媒体、インターネットまたはイントラネットを支えるものなどの伝送媒体、磁気カセット、磁気テープ、磁気ディスク記憶または他の磁気記憶媒体、他の型の揮発性および非揮発性メモリー、ならびに、前記のものの任意の適した組み合わせを含む、所望の情報を記憶するために用いることができて、コンピュータによるアクセスが可能な他のあらゆる有形媒体が非限定的に含まれる。本明細書で用いる場合、コンピュータ可読記憶媒体またはコンピュータ可読物理メモリーには、例えば、ラジオ放送、電気信号、光パルス、搬送波などのような、有形でなく一時的な形態のシグナル伝送は含まれない。
【００７６】
1つまたは複数のコンピュータ可読媒体上に具現化されるコンピュータ可読データは、命令を、例えば、1つまたは複数のプログラムの一部として定めることができ、それらがコンピュータによって実行される結果として、コンピュータに対して、本明細書に記載された機能の1つまたは複数、および／またはそのさまざまな態様、変形および組み合わせを行うように指示する。そのような命令は、数多くのプログラミング言語の任意のもの、例えば、Java、J#、Visual Basic、C、C#、C++、Fortran、Pascal、Eiffel、Basic、COBOLアセンブリ言語など、またはそれらの種々の組み合わせで書くことができる。そのような命令が具現化されるコンピュータ可読媒体は、本明細書に記載されたシステムまたはコンピュータ可読記憶媒体の構成要素の1つまたは複数の上にあってよく、そのような構成要素の1つまたは複数にわたって分散していてもよい。
【００７７】
コンピュータ可読媒体は、そこに記憶された命令を任意のコンピュータリソースにロードして、本明細書で考察した本発明の諸局面を遂行させることができるような、可搬型であってもよい。加えて、上記のコンピュータ可読媒体上に記憶された命令は、ホストコンピュータ上で動くアプリケーションプログラムの一部として具現化される命令に限定されないことも認識されるはずである。そうではなくて、命令は、本発明の諸局面を遂行するようにコンピュータをプログラムするために使用しうる、あらゆる種類のコンピュータコード（例えば、ソフトウェアまたはマイクロコード）として具現化されうる。コンピュータ実行可能命令は、適したコンピュータ言語またはいくつかの言語の組み合わせで書くことができる。基本的な計算生物学の方法は当業者に公知であり、例えば、Setubal and Meidanis et al., Introduction to Computational Biology Methods (PWS Publishing Company, Boston, 1997)；Salzberg, Searles, Kasif, (Ed.), Computational Methods in Molecular Biology, (Elsevier, Amsterdam, 1998)；Rashidi and Buehler, Bioinformatics Basics: Application in Biological Science and Medicine (CRC Press, London, 2000)およびOuelette and Bzevanis Bioinformatics: A Practical Guide for Analysis of Gene and Proteins (Wiley & Sons, Inc., 2nd ed., 2001)に記載されている。
【００７８】
本明細書に記載された媒体およびシステムのある態様の機能的モジュールは最低限、試料注入を指示するローディングモジュール（10）、ローディングされたキャピラリーを別個のリザーバーへと移行させることを指示する移行モジュール（20）、逆極性パルスの印加を指示する逆極性モジュール（30）、および分離モジュール（40）を含む。
【００７９】
ローディングモジュール（1）は、試料リザーバーからの試料をCEキャピラリーへと動電的に注入することを制御または指示するための命令のセットを含みうる。CEキャピラリーへの核酸の動電的注入のために適合化されたマイクロプロセッサ制御システムは当業者に周知である。
【００８０】
移行モジュール（20）は、ローディングされたキャピラリー先端を1つのリザーバーから別のものへと移行させるようにロボット工学移行デバイスに指示するための命令のセットを含みうる。この目的に十分なマイクロプロセッサ制御式のロボット工学デバイスおよびソフトウェアは、当技術分野において周知であり、ローディングされた先端を、x、yおよびz次元で指定位置へと平行移動させることができる。
【００８１】
逆極性モジュール（30）は、CE電源からの電流出力の向きの反転を可能にするかまたは指示する、ならびに、ローディングモジュールの命令に従って印加された電圧とは逆向きの電圧の、時間指定され、制御された印加を可能にするかまたは指示する、システムおよび／または命令セットを含みうる。
【００８２】
分離モジュール（40）は、逆極性パルシング後に、ローディングされた試料の分離を生じさせるために、CEキャピラリーに沿って、「順極性」向き電圧、すなわち、ローディングモジュールの命令に従って印加されたのと同じ向きの電圧の制御された印加を指示するシステムおよび／または命令セットを含みうる。
【００８３】
別の態様において、逆極性モジュール（30）は、加熱モジュール（50）に置き換えられるか、またはそれが追加される。加熱モジュールは、例えば、あらゆる種類の抵抗加熱素子またはペルチエ型加熱素子を含む、マイクロプロセッサ制御式の加熱素子を指示すべきである。加熱モジュールは、CEデバイス上にあるかそれに接続されているCEキャピラリーに対する、所望の温度または温度範囲までの一過性の熱の印加を指示する。
【００８４】
明らかに、CEデバイス用の検出器も、マイクロプロセッサで制御されうるか、またはそうでなければ連携されうる。分離されたCE産物検出のためのハードウェアおよびソフトウェア構成は当技術分野において周知である。
【００８５】
本発明はしたがって、アーチファクトが減少したキャピラリー電気泳動のための方法を行うためのシステム（およびコンピュータシステムにそれを行わせるためのコンピュータ可読媒体）を提供する。
【００８６】
本明細書に記載されたシステムおよびコンピュータ可読媒体は、アーチファクトが減少したキャピラリー電気泳動を行うための本発明の単なる例示的な態様に過ぎず、本発明の範囲を限定することは意図していない。本明細書に記載されたシステムおよびコンピュータ可読媒体の変形が可能であり、それらは本発明の範囲内に含まれるものとする。
【００８７】
機械のモジュール、またはコンピュータ可読媒体において用いられるそれらは、さまざまな機器構成をとることができる。例えば、機能を単一の機械に付与することもでき、または複数の機械に分散させることもできる。
【００８８】
本明細書に開示されたいくつかの局面および態様は、例えば、以下の番号付きの項目のいずれかによって例示することができる：
1.  a）変性分離媒体を含むCEキャピラリーの一方の末端に核酸試料を動電的に注入する段階；
b）該核酸試料を該キャピラリーに注入するために用いたものとは逆極性の電圧を印加する段階であって、該電圧が、該変性分離媒体の中に入っていない核酸を該キャピラリーから排出させるのに十分な強さであり、かつ該変性分離媒体の中に入っていない核酸を該キャピラリーから排出させるのに十分な時間にわたって印加される、段階；
c）段階（b）の後に、段階（a）で該核酸試料を動電的に注入するために印加したものと同じ向きの電圧を用いて、該キャピラリー内の核酸を電気泳動により分離する段階
を含み、
段階（a）〜（c）が、結果的に得られる分離された種におけるアーチファクトピークの大きさを減少させる、
変性核酸キャピラリー電気泳動（CE）におけるアーチファクトピークの大きさを減少させるための方法。
2.  段階（b）の前に、キャピラリーの前記末端を、核酸試料を実質的に欠いているリザーバーに移行させる段階をさらに含む、項目1記載の方法。
3.  段階（c）が、電気泳動により分離する前に、キャピラリーの前記末端を、電気泳動緩衝液を含む別個のリザーバーに移行させることを含む、項目1記載の方法。
4.  アーチファクトピークが二本鎖DNAを含む、項目1記載の方法。
5.  核酸試料がPCR反応混合物を含む、項目1記載の方法。
6.  核酸試料がホルムアミドを実質的に欠いている、項目1記載の方法。
7.  試料がホルムアミドを含む、項目1記載の方法。
8.  核酸の変性キャピラリー電気泳動分離のための方法において、該方法が、
a）変性分離媒体を含むCEキャピラリーの一方の末端を、核酸を含む試料中に浸漬させる段階；
b）該試料からの核酸のプラグを該変性分離媒体中に導入するのに十分な時間および向きで、該CEキャピラリーに沿って電圧を印加する段階；
c）該キャピラリーの該末端を電気泳動緩衝液を含むリザーバーに移行させて、かつ該キャピラリーに沿って電圧を印加して、該プラグ中の核酸種の電気泳動分離を生じさせる段階
を含み、
改良が、
i）段階（b）の後および段階（c）の前に、該変性分離媒体の中に入っていない核酸を該キャピラリーから排出させるのに十分な強さおよび時間で、段階（b）で印加したものとは逆極性の電圧を該キャピラリーに沿って印加する段階
を含み、
それにより、アーチファクトピークの相対的大きさが減少する、
前記方法。
9.  段階（b）の後および段階（i）の前に、キャピラリーの前記末端を、核酸試料を実質的に欠いているリザーバーに移行させる段階をさらに含む、項目8記載の方法。
10.  アーチファクトピークが二本鎖DNAを含む、項目8記載の方法。
11.  核酸試料がPCR反応混合物を含む、項目8記載の方法。
12.  核酸試料がホルムアミドを実質的に欠いている、項目8記載の方法。
13.  核酸試料がホルムアミドを含む、項目8記載の方法。
14.  a）変性分離媒体を含むCEキャピラリーの一方の末端を核酸試料と接触させて、かつ該試料からの核酸のプラグを該キャピラリー内の分離媒体中に導入するのに十分な電圧を該キャピラリーに沿って印加する段階；
b）段階（a）による該キャピラリーの該末端を該試料から取り出す段階；および
c）段階（b）の後に、該変性分離媒体の中に入っていない、該キャピラリーの先端に存在する核酸材料の少なくとも一部を排出させるのに十分な強さおよび時間で、段階（a）で印加したものとは逆極性の電圧を該キャピラリーに沿って印加する段階
を含み、
それにより、該キャピラリーを通しての該試料の電気泳動分離によって該プラグ中の核酸を分離する場合にアーチファクトピークの相対的大きさが減少する、
変性核酸キャピラリー電気泳動（CE）におけるアーチファクトピークの大きさを減少させるための方法。
15.  アーチファクトピークが二本鎖DNAを含む、項目14記載の方法。
16.  段階（b）の後および段階（c）の前に、CEキャピラリーの前記末端を、核酸試料を実質的に欠いている緩衝液中に浸漬させる段階をさらに含む、項目14記載の方法。
17.  段階（c）の後に、キャピラリーの前記末端を、電気泳動分離緩衝液を含むリザーバーに移行させて、かつ前記プラグ中の核酸を電気泳動により分離する段階をさらに含む、項目14記載の方法。
18.  核酸試料がPCR反応混合物を含む、項目14記載の方法。
19.  核酸試料がホルムアミドを実質的に欠いている、項目14記載の方法。
20.  核酸試料がホルムアミドを含む、項目14記載の方法。
21.  核酸試料中の核酸分子をローディングしかつ電気泳動により分離するように自動キャピラリー電気泳動デバイスに指示するためのコンピュータ実行可能命令を含むコンピュータ可読物理メモリーであって、
該命令が、
a）CEキャピラリーの一方の末端を核酸試料中に浸漬することを該デバイスにさせるための命令；
b）該試料からの核酸分子のプラグを該キャピラリーに含まれる変性分離媒体中に導入するのに十分な時間にわたって、該キャピラリーに沿って電圧を印加することを該デバイスにさせるための命令；
c）該キャピラリーの該末端を別個のリザーバーに移動することを該デバイスにさせるための命令；
d）該変性分離媒体の中に入っていない、該キャピラリーの先端に存在する核酸材料を排出させるのに十分な時間および強さで、段階（b）で印加したものとは逆極性の電圧を該キャピラリーに沿って印加することを該デバイスにさせるための命令；ならびに
e）段階（d）の後に、段階（b）で印加した向きの電圧を該キャピラリーに沿って印加し、それにより、該分離媒体中に導入された核酸分子を電気泳動により分離することを該デバイスにさせるための命令
を含む、
前記コンピュータ可読物理メモリー。
22.  命令が、段階（d）の後および段階（e）の前に、キャピラリーの前記末端を、電気泳動分離媒体を含む別のリザーバーに移行させるための命令をさらに含む、項目21記載のコンピュータ可読媒体。
23.  a）コンピュータプロセッサと機能的に連結しているキャピラリー電気泳動デバイスと；
b）核酸試料中の核酸分子をローディングしかつ電気泳動により分離するように該キャピラリー電気泳動デバイスに指示するためのコンピュータ実行可能命令を含むコンピュータ可読物理メモリーと
を含む、変性キャピラリー電気泳動のためのシステムであって、
該命令が、
i）CEキャピラリーの一方の末端を核酸試料中に浸漬することを該デバイスにさせるための命令；
ii）該試料からの核酸分子のプラグを該キャピラリーに含まれる変性分離媒体中に導入するのに十分な時間にわたって、該キャピラリーに沿って電圧を印加することを該デバイスにさせるための命令；
iii）該キャピラリーの該末端を別個のリザーバーに移動することを該デバイスにさせるための命令；
iv）該変性分離媒体の中に入っていない、該キャピラリーの先端に存在する核酸材料を排出させるのに十分な時間および強さで、段階（ii）で印加したものとは逆極性の電圧を該キャピラリーに沿って印加することを該デバイスにさせるための命令；ならびに
v）段階（iv）の後に、段階（ii）で印加した向きの電圧を該キャピラリーに沿って印加し、それにより、該分離媒体中に導入された核酸分子を電気泳動により分離することを該デバイスにさせるための命令
を含む、
前記システム。
24.  命令が、段階（iv）の後および段階（v）の前に、キャピラリーの前記末端を、電気泳動分離媒体を含む別のリザーバーに移行させるための命令をさらに含む、項目23記載のシステム。
25.  a）変性分離媒体を含むCEキャピラリーの一方の末端に核酸試料を動電的に注入する段階；
b）該CEキャピラリーの該末端を、核酸試料を実質的に欠いている緩衝液のリザーバーに移行させて、かつ該分離媒体の膨張を引き起こすのに十分な量および時間で該キャピラリーを一過性に加熱する段階；ならびに
c）段階（b）の後に、該核酸試料を電気泳動により分離する段階
を含み、
段階（a）〜（c）が、結果的に得られる分離された種におけるアーチファクトピークの大きさを減少させる、
変性核酸キャピラリー電気泳動（CE）におけるアーチファクトピークの相対的大きさを減少させるための方法。
26.  一過性の加熱がキャピラリーのジュール加熱を含む、項目25記載の方法。
27.  ジュール加熱が、核酸をキャピラリー内に動電的に注入するために印加した電圧とは逆極性の電圧の印加によって達成される、項目26記載の方法。
28.  膨張が、変性分離媒体の中に入っていない、キャピラリーの先端に存在する核酸材料の排出を引き起こす、項目25記載の方法。
29.  電気泳動分離段階（c）が、キャピラリーの前記末端を、電気泳動緩衝液を含む第2のリザーバーに移行させることを含む、項目25記載の方法。
30.  アーチファクトピークが二本鎖DNAを含む、項目25記載の方法。
31.  核酸試料がPCR反応混合物を含む、項目25記載の方法。
32.  核酸試料がホルムアミドを実質的に欠いている、項目25記載の方法。
33.  核酸試料がホルムアミドを含む、項目25記載の方法。
34.  核酸の変性キャピラリー電気泳動分離のための方法において、該方法が、
a）変性分離媒体を含むCEキャピラリーの一方の末端を、核酸を含む試料中に浸漬させる段階；
b）該試料からの核酸のプラグを該変性分離媒体中に導入するのに十分な時間および向きで、該CEキャピラリーに沿って電圧を印加する段階；
c）該キャピラリーの該末端を電気泳動緩衝液を含むリザーバーに移行させて、かつ該キャピラリーに沿って電圧を印加して、該プラグ中の核酸種の電気泳動分離を生じさせる段階
を含み、
改良が、
i）段階（b）の後および段階（c）の前に、該キャピラリーの該末端を、核酸を実質的に欠く緩衝液を含むリザーバーに移行させる段階；ならびに
ii）該変性分離媒体の膨張を引き起こすのに十分な温度および持続時間で、該キャピラリーの少なくとも該末端を加熱する段階
を含み、
それにより、該試料からの非変性核酸が該キャピラリー内の該分離媒体の中に実質的に入らないように、少なくとも、該変性分離媒体の中に入っていない、該キャピラリーの先端に存在する材料が、該キャピラリーの該末端から排出され、それにより、段階（i）および（ii）を伴わずに行った方法と比較してアーチファクトピークの大きさが減少する、
前記方法。
35.  段階（ii）における加熱が、キャピラリーのジュール加熱を含む、項目34記載の方法。
36.  ジュール加熱を、段階（b）および（c）で印加した電圧とは逆極性の電圧をキャピラリーに沿って印加することによって生じさせる、項目35記載の方法。
37.  アーチファクトピークが二本鎖DNAを含む、項目34記載の方法。
38.  核酸試料がPCR反応混合物を含む、項目34記載の方法。
39.  核酸試料がホルムアミドを実質的に欠いている、項目34記載の方法。
40.  核酸試料がホルムアミドを含む、項目34記載の方法。
41.  a）変性分離媒体を含むCEキャピラリーの一方の末端を核酸試料と接触させて、かつ該試料からの核酸のプラグを該キャピラリー内の分離媒体中に導入するのに十分な電圧を該キャピラリーに沿って印加する段階；
b）段階（a）による該キャピラリーの該末端を該試料から取り出す段階；ならびに
c）段階（b）の後に、該キャピラリーの内容物の膨張を引き起こすのに十分な量および時間で、該キャピラリーに熱を加える段階であって、該膨張が、該変性分離媒体の中に入っていない、該キャピラリーの先端に存在する材料の排出をもたらす、段階
を含み、
それにより、該キャピラリーを通しての該試料の電気泳動分離によって該プラグ中の核酸を分離する場合にアーチファクトピークの大きさが減少する、
変性核酸キャピラリー電気泳動（CE）におけるアーチファクトピークの相対的大きさを減少させるための方法。
42.  段階（c）が、キャピラリーのジュール加熱を含む、項目41記載の方法。
43.  ジュール加熱が、核酸のプラグをキャピラリーに導入するために印加した電圧とは逆極性の電圧の印加によって達成される、項目42記載の方法。
44.  アーチファクトピークが二本鎖DNAを含む、項目41記載の方法。
45.  段階（b）の後および段階（c）の前に、CEキャピラリーの前記末端を、核酸試料を実質的に欠いている緩衝液中に浸漬させる段階をさらに含む、項目41記載の方法。
46.  段階（c）の後に、キャピラリーの前記末端を、電気泳動分離緩衝液を含むリザーバーに移行させて、かつ前記プラグ中の核酸を電気泳動により分離する段階をさらに含む、項目41記載の方法。
47.  核酸試料がPCR反応混合物を含む、項目41記載の方法。
48.  核酸試料がホルムアミドを実質的に欠いている、項目41記載の方法。
49.  核酸試料がホルムアミドを含む、項目41記載の方法。
50.  核酸試料中の核酸分子をローディングしかつ電気泳動により分離するように自動キャピラリー電気泳動デバイスに指示するためのコンピュータ実行可能命令を含むコンピュータ可読物理メモリーであって、
該命令が、
a）CEキャピラリーの一方の末端を核酸試料中に浸漬することを該デバイスにさせるための命令；
b）該試料からの核酸分子のプラグを該キャピラリーに含まれる分離媒体中に導入するのに十分な時間にわたって、該キャピラリーに沿って電圧を印加することを該デバイスにさせるための命令；
c）該キャピラリーの該末端を別個のリザーバーに移動することを該デバイスにさせるための命令；
d）該分離媒体の中に入っていない、該キャピラリーの先端に存在する材料を排出させるのに十分な時間および強さで、段階（b）で印加したものとは逆極性の電圧を該キャピラリーに沿って印加することを該デバイスにさせるための命令；ならびに
e）段階（d）の後に、段階（b）で印加した向きの電圧を該キャピラリーに沿って印加し、それにより、該分離媒体中に導入された核酸分子を電気泳動により分離することを該デバイスにさせるための命令
を含む、
前記コンピュータ可読物理メモリー。
51.  命令が、段階（d）の後および段階（e）の前に、キャピラリーの前記末端を、電気泳動分離媒体を含む別のリザーバーに移行させるための命令をさらに含む、項目50記載のコンピュータ可読媒体。
52.  a）コンピュータプロセッサと機能的に連結しているキャピラリー電気泳動デバイスと；
b）核酸試料中の核酸分子をローディングしかつ電気泳動により分離するように該キャピラリー電気泳動デバイスに指示するためのコンピュータ実行可能命令を含むコンピュータ可読物理メモリーと
を含む、変性キャピラリー電気泳動のためのシステムであって、
該命令が、
i）CEキャピラリーの一方の末端を核酸試料中に浸漬することを該デバイスにさせるための命令；
ii）該試料からの核酸分子のプラグを該キャピラリーに含まれる分離媒体中に導入するのに十分な時間にわたって、該キャピラリーに沿って電圧を印加することを該デバイスにさせるための命令；
iii）該キャピラリーの該末端を別個のリザーバーに移動することを該デバイスにさせるための命令；
iv）該分離媒体の中に入っていない、該キャピラリーの先端に存在する材料を排出させるのに十分な時間および強さで、段階（ii）で印加したものとは逆極性の電圧を該キャピラリーに沿って印加することを該デバイスにさせるための命令；ならびに
v）段階（iv）の後に、段階（ii）で印加した向きの電圧を該キャピラリーに沿って印加し、それにより、該分離媒体中に導入された核酸分子を電気泳動により分離することを該デバイスにさせるための命令
を含む、
前記システム。
53.  命令が、段階（iv）の後および段階（v）の前に、キャピラリーの前記末端を、電気泳動分離媒体を含む別のリザーバーに移行させるための命令をさらに含む、項目52記載のシステム。
【００８９】
前記の詳細な説明および以下の実施例は例示的であるに過ぎず、本発明の範囲に対する限定として解釈されるべきではないことは理解されよう。当業者には明らかと考えられる、開示された態様に対するさまざまな変更および改変を、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、加えることができる。さらに、特定された特許、特許出願および刊行物はすべて、例えば、本発明とともに用いられる可能性のある、そのような刊行物に記載された方法を記述および開示する目的で、参照により本明細書に明示的に組み入れられる。これらの刊行物は、本出願の出願日よりも前のそれらの開示のためのみに提供される。これに関連するいかなるものも、本発明が先行発明を理由として、または他の何らかの理由で、そのような開示に先行する権利を与えられないことを本発明者らが承認したものとみなされるべきではない。これらの文書の日付に関する記述またはそれらの内容に関する表現はすべて、本出願者らが入手可能であった情報に基づいており、これらの文書の日付または内容の正しさに関するいかなる承認でもない。
【実施例】
【００９０】
実施例1：シャドウピークの性質の検討
シャドウピークの性質を、まず、試料注入後にCE分離を行う温度を変化させることによって検討した。分離は、95℃での注入後に27℃、35℃、45℃、および55℃までで行った。図3は、分離を27℃の代わりに35℃で行ったところシャドウの移動が増加し、続いて45℃で行ったところ移動が減少し、続いて分離を55℃で行ったところ再び移動が増加したことを示している。移動シフトの変化（break）は、シャドウ材料の状態遷移を示している。
【００９１】
シャドウピークの性質を、試料を注入する温度を変化させ、分離用には単一の温度を用いることによってさらに検討した。注入を35℃、55℃、60℃および85℃で行い、その後に35℃で分離を行った。35℃および55℃では、シャドウピークのみが観察された。図4に示されているように、急激な遷移が55℃〜60℃の間で認められ、そのポイントでメインピークが明らかになった。ローディングの温度を上昇させたところ、メインピークの大きさの増大がもたらされた。メインピークおよびシャドウピークは同じ起源を有すること - 注入の温度を上昇させるとシャドウピークがメインピークに変換される - が結論づけられた。
【００９２】
しかし、注入の温度を85℃から95℃にさらに上昇させた場合には、メインピークとシャドウピークとの割合は感知しうるほどには変化しないことが見いだされた（図5参照）。注入の間および注入後にメインおよびシャドウのアイソフォームが形成されること、ならびにシャドウアイソフォームはカートリッジ温度に応じて状態遷移を起こすことが結論づけられた。前述の実験で認められた挙動から、メインピークは一本鎖DNAであり、一方、シャドウは、ゲル温度に応じて融解しうる二本鎖DNAまたは部分的に二本鎖であるDNAであるとの仮説を立てた。
【００９３】
理論に拘束されることは望まないが、図6A〜6Hは、シャドウピークを生じると仮定した一連のイベントを図式的に説明している。図6Aは、注入の前のキャピラリーを図式的に説明している。注入の開始時には（図6B）、注入電流がその中に流れると、CEゲルが熱くなって膨張すると仮定している。膨張により、少量のゲルが試料中に押し出される。注入の間に、変性DNAがキャピラリーゲルマトリックスの中に動電的に流入する（図6Cに多数の黒のドットとして示されている）。注入が完了した後に、キャピラリーマトリックスの冷却により、それが収縮することが可能になる。変性DNA（一本鎖DNAまたはssDNA）のプラグが変性分離媒体の中に入り、キャピラリー内でのゲルの収縮によって、キャピラリーの先端に空隙が生じ、それが試料溶液で満たされる。それが冷却されるに従い、ゲルの先端にある試料溶液中のssDNAは再生を起こして、レンガ状パターンで示したようなdsDNAを形成しうる（図6Dおよび6E）。ゲル中の尿素変性剤はゲルの中に入ったssDNAの再生を防止するが、キャピラリーの先端は試料から分離用の緩衝液リザーバーへと移動され、先端の空隙内に捕捉された液体中でdsDNAが形成される（図6E）。ssDNAはゲル中にあり、かつdsDNAは先端に存在する。図6Fおよび6Gは、分離を行う際に起こると仮定した状況を示している。分離用電圧を印加すると、dsDNAがゲルの中に入る。ゲル中の尿素は、ssDNAの再生を防止するには十分であるが、二本鎖であるDNAが周囲温度でゲルの中に入った場合にそれを変性させることはできない。dsDNAはより速く移動し、メインピーク中のssDNAに追いついて、シャドウピークを形成する。図6Hは、移動しているDNAが、加熱されたカートリッジ本体の中に入った場合に起こると仮定したイベントを示している - カートリッジの温度に依存して、dsDNAは、ssDNAへと変性して、スプリットピークを形成するか、または二本鎖のままであり、シャドウピークを保たせるかのいずれかであると仮定している（レンガ状パターン）。より遅く移動するssDNA（多数の黒の丸印）は、分離の間じゅう一本鎖のままである。
【００９４】
キャピラリー内および試料ローディングキャピラリー先端で起こると仮定した代替の（または同時の）一連の注入関連イベントが、図7に示されている。本発明は理論に限定されることを意図していない；しかし、以下は、シャドウ形成の一因となる、提唱される別の一連のイベントを例示している。図7は、注入後のキャピラリーを示している - キャピラリーが注入後に冷却されるに従って、変性分離媒体の中に入ったssDNA（黒の点で示されている）、および変性剤が希釈されていて再生が可能になっている境界面のゲルの帯域に入ったDNA（横縞で示されている）が存在するようになる。ひとたび非変性DNAがゲルの中に入ると、図6に図示されているように、シャドウピークおよび／またはスプリットピークとなりうる。
【００９５】
実施例2．分離の前にキャピラリーの先端からdsDNAを取り除くことにより、シャドウピークアーチファクトが減少する
注入後にキャピラリーの先端でdsDNAが形成された場合にシャドウピークが形成されうることを認識した上で、本明細書では、キャピラリーの先端にある材料を取り除く段階により、シャドウアーチファクト発生または大きさを減少させうることを提唱し、そのことを実証した。
【００９６】
短時間の逆極性（RP）パルスを、注入後のキャピラリーに印加した。これを、注入と同じ極性でのパルスの印加と比較した。図8A〜8Dは、種々の単一増幅産物および多重増幅産物に対するパルス非印加、RPパルスおよび「正常」パルスの印加の結果を示している。図8Aには、シングルプレックス反応が示されている。RPパルスは、パルス無しの実施と比較して、シャドウピーク（赤の矢印）の相対的大きさを明らかに減弱させた。「正常」パルスでの実施は有意差を示さなかった - 理論に拘束されることは望まないが、「正常」パルスは、先端が核酸試料を実質的に欠く試料リザーバー内にある時に行った場合でさえ、キャピラリーの先端に存在する再生を起こしたDNAをキャピラリーの中にさらに押し入れる役を果たすのみであると考えられる。
【００９７】
図8Bは、3-プレックスPCR反応産物による同様の実験の結果を示している。
【００９８】
図8Cおよび8Dは、2種類の高次多重増幅反応に関して、RPおよび「正常」パルシングをパルス無しと比較した結果を示している。RPパルスは、シャドウ形成を明らかに減少させる。
【００９９】
これらの結果に鑑みて、動電的注入後のキャピラリーに対する逆極性パルスの印加は、変性キャピラリー電気泳動においてシャドウアーチファクトピークを避けるために有用である。
【０１００】
実施例3．注入後、ローディングされた先端が核酸試料を実質的に欠く媒体中に浸漬されている時に、CE分離マトリックスの膨張を引き起こすこと
ローディングされたCEキャピラリーの先端に存在する非変性DNAを取り除くための別のアプローチについて、以下のように試験した。注入後に、ローディングされた先端を、電気泳動緩衝液を含有するリザーバー（分離のために用いる別個のリザーバー形態であることが好ましいが、必ずしもそうでなくともよい）に移動させる。先端がそのリザーバー内に浸漬されている時に、キャピラリーの一部分、例えば、2〜20cmの一部分を、キャピラリー内のマトリックスの膨張を引き起こすのに十分な時間にわたって、例えば90℃に加熱する（または、85℃、80℃、75℃、72℃、70℃、68℃、66℃、64℃、62℃、60℃またはそれ未満に、しかし好ましくは少なくとも45℃に加熱する）。温度は、熱を加える時間に応じて調節することができる。一般に、より高い温度に対しては、より短い時間が必要であると考えられる。また、キャピラリーの加熱される部分のサイズを大きくすること（例えば、キャピラリー長の10％から、キャピラリー長の20％、キャピラリー長の30％、キャピラリー長の40％、キャピラリー長の50％、キャピラリー長の60％、キャピラリー長の70％、キャピラリー長の80％、キャピラリー長の90％、またはそれ以上、キャピラリーの本質的に全長までを含む（例えば、ジュール加熱を行う場合））により、非変性DNAをキャピラリーの先端から取り除くために必要な時間および加熱温度を低減させることができる。時間は、例えば、約3〜30秒またはそれ以上であってよく、用いる温度に応じて調節することができる。所定の時間（これは、温度および時間の所与の組み合わせに対して、慣例的な実験のみの範囲内で決定することができる）にわたる加熱の後に、先端を分離用電圧の印加のために分離用リザーバーに移行させるか、または追加の移行を行うことなく分離用電圧を直接印加する。
【０１０１】
ローディングされた先端が核酸試料を実質的に欠く媒体中に浸漬されている時にキャピラリーマトリックスの膨張を引き起こすためにキャピラリーを処理することにより、以後の分離および検出に際してのシャドウピーク形成を低減させることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図６Ｈ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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