(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列：
Ｔｙｒ−Ａｉｂ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｉｂ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｘａａ１−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｉｂ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｘａａ２−Ｘａａ３（配列番号：１）
（配列中、位置２２のＸａａ１はＮａｌまたはＰｈｅであり、位置４３のＸａａ２はＣｙｓまたは存在せず、位置４４のＸａａ３はＣｙｓまたは存在せず、Ｃ末端アミノ酸は任意でアミド化され、位置４３のＸａａ２または位置４４のＸａａ３がＣｙｓならば、どちらかまたは両者は任意でＰＥＧ化される）
を含む、ペプチド。
【請求項２】
Ｘａａ１がＮａｌである、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
Ｘａａ１がＰｈｅである、請求項１に記載のペプチド。
【請求項４】
Ｘａａ２およびＸａａ３が両者とも存在しない、請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項５】
Ｘａａ２およびＸａａ３が各々Ｃｙｓである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項６】
位置４３のＣｙｓもしくは位置４４のＣｙｓのどちらかまたは両者が、１８〜２２ｋＤａのＰＥＧ分子でＰＥＧ化される、請求項１〜３または５のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項７】
ＰＥＧ分子が２０〜２１ｋＤａである、請求項６に記載のペプチド。
【請求項８】
ＰＥＧ分子が２０ｋＤａである、請求項６に記載のペプチド。
【請求項９】
各ＰＥＧが直鎖状である、請求項１〜３または５〜８のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１０】
Ｃ末端アミノ酸がアミド化される、請求項１〜９のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１１】
配列：
Ｔｙｒ−Ａｉｂ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｉｂ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｉｂ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ（ＰＥＧ２０Ｋ）−Ｃｙｓ（ＰＥＧ２０Ｋ）（配列番号：２）
（配列中、位置４４のＰＥＧ化Ｃｙｓのカルボキシル基はアミド化される）
を含む、請求項１〜３または５〜１０のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１２】
配列：
Ｔｙｒ−Ａｉｂ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｉｂ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｎａｌ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｉｂ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ（ＰＥＧ２０Ｋ）−Ｃｙｓ（ＰＥＧ２０Ｋ）（配列番号：３）
（配列中、位置４４のＰＥＧ化Ｃｙｓのカルボキシル基はアミド化される）
を含む、請求項１〜３または５〜１０のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１３】
薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と共に請求項１〜１２のいずれか一項に記載のペプチドを含む、医薬製剤。
【請求項１４】
１つまたは複数の他の治療剤を含む、請求項１３に記載の医薬製剤。
【請求項１５】
薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と共に請求項１〜１２のいずれか一項に記載のペプチドを含む、糖尿病を治療するための医薬組成物。
【請求項１６】
薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と共に請求項１〜１２のいずれか一項に記載のペプチドを含む、体重減量を誘導するための医薬組成物。
【請求項１７】
薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と共に請求項１〜１２のいずれか一項に記載のペプチドを含む、治療法で使用するための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は糖尿病の治療の分野であり、グルコース依存性インスリン分泌刺激ペプチド受容体（ＧＩＰ−Ｒ）およびグルカゴン様ペプチド−１受容体（ＧＬＰ−１−Ｒ）の両者に対する活性を示し、グルカゴン受容体（Ｇｌｕｃ−Ｒ）に関して選択的なペプチドに関する。特に、ＧＩＰ−ＲおよびＧＬＰ−１−Ｒの両者についての活性を修飾し、Ｇｌｕｃ−Ｒに関する選択性を維持するように導入されたアミノ酸置換を持つ、ＧＩＰアナログが提供される。
【背景技術】
【０００２】
ＧＩＰ（胃抑制ペプチドまたはグルコース依存性インスリン分泌刺激ペプチドの両者として公知である）は、グルコースの存在下において膵臓のβ細胞からのインスリン分泌を刺激し、したがってグルコース恒常性において生理的役割を果たすことが示されている４２アミノ酸の消化管調節ペプチドである。ＧＬＰ−１は、膵臓のβ細胞を保護し、グルカゴン分泌、胃内容物排出および食物摂取を抑制して体重減少をもたらす３７アミノ酸ペプチドである。ＧＩＰおよびＧＬＰ−１はインクレチンとして公知である。インクレチン受容体シグナル伝達はグルコース恒常性のために重要な生理的に適切な作用を発揮する。グルカゴンは膵臓によって産生される２９アミノ酸ペプチドである。このホルモンは、血糖の増加をもたらすグルコースを肝臓が放出するようにシグナル伝達する。したがって、Ｇｌｕｃ−Ｒの刺激は糖尿病の状況では所望されない。
【０００３】
健康な被験体において観察されることとは異なって、２型糖尿病のヒトにおいて、ＧＩＰは単独で非常に緩やかなグルコース低下効果を有する。しかしながら、ある程度のグルコース低下が達成された後、ＧＩＰの有効性は増加して、血糖正常被験体において観察されたものに近くなる。一方、ＧＬＰ−１は健康な被験体および糖尿病の被験体の両者におけるグルコース低下に効果的であるが、悪心を引き起こし、したがってＧＬＰ−１の完全な有効性は実現されていない。さらに、ＧＩＰおよびＧＬＰ−１の両者は、ユビキタスなプロテアーゼ（ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ  ＩＶ））によって迅速に不活性化され、このことによりインスリン分泌を刺激できないペプチドが産生され、それゆえ短期の代謝制御のためだけに使用することができる。
【０００４】
特定のＧＩＰアナログは特許文献１および特許文献２に記載されている。特定のグルカゴンアナログは特許文献３にＧＩＰ活性およびＧＬＰ−１活性の両者を示して記載されている。
【０００５】
糖尿病のための現在の治療はスルホニル尿素およびグリチニド（ｇｌｉｔｉｎｉｄｅ）等のインスリン分泌促進物質を含み、それは多くの場合に有効性の漸減を示し、２型糖尿病の患者で低血糖を引き起こし得る。それゆえ、持続的グルコース依存性様式でインスリン分泌を強化する、新しい薬剤を同定する必要がある。悪心なしにＧＬＰ−１のグルコース低下効果を保持する新しい薬剤を同定し、代謝安定性を増加させる新しい薬剤をさらに同定することも所望される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２０１０／０１６９４０号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２０１０／０１６９４４号パンフレット
【特許文献３】国際公開第２０１０／０１１４３９号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、ＧＩＰおよびＧＬＰ−１の両者についての活性を修飾し、一方でグルカゴンに関する選択性を維持するように導入されたアミノ酸置換を持つ、新規の強力で効果的なペプチドを提供する。本発明は、ＧＬＰ−１のグルコース低下効果を達成し、ＧＩＰのグルコース刺激性インスリン分泌効果を利用する。さらに、本発明の特定の化合物は、体重の減少に効果的な治療を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、配列：
【化１】
0005887335.tif 000002
（配列中、位置２２のＸａａ１はＮａｌまたはＰｈｅであり、位置４３のＸａａ２はＣｙｓまたは存在せず、位置４４のＸａａ３はＣｙｓまたは存在せず、Ｃ末端アミノ酸は任意でアミド化され、位置４３のＸａａ２または位置４４のＸａａ３がＣｙｓならば、どちらかまたは両者は任意でＰＥＧ化される）
を含むペプチドを提供する。
【０００９】
本発明の一実施形態は、Ｘａａ１がＰｈｅであるペプチドに関する。本発明の好ましい実施形態は、Ｘａａ１がＮａｌであるペプチドに関する。
【００１０】
本発明の一実施形態は、Ｘａａ２およびＸａａ３が存在しないペプチドに関する。本発明の好ましい実施形態は、Ｘａａ２およびＸａａ３が各々Ｃｙｓであるペプチドに関する。前記実施形態において、位置４４のＣｙｓのカルボキシル基のアミド化は好ましい。
【００１１】
本発明のさらに好ましい実施形態は、ペプチドが位置４３および４４のどちらかのＣｙｓで２０ｋＤａのＰＥＧ分子によりＰＥＧ化されるペプチドに関する。前記実施形態において、Ｃ末端Ｃｙｓのカルボキシル基のアミド化は好ましい。本発明の別の好ましい実施形態は、ペプチドが位置４３および４４のＣｙｓの両者で２０ｋＤａのＰＥＧ分子によりＰＥＧ化されるペプチドに関する。前記実施形態において、Ｃ末端Ｃｙｓのカルボキシル基のアミド化は好ましい。
【００１２】
本発明の一実施形態は、Ｘａａ１がＰｈｅであり、Ｘａａ２およびＸａａ３が存在しないペプチドに関する。前記実施形態において、位置４２のＣ末端Ｇｌｎのカルボキシル基のアミド化は好ましい。本発明の好ましい実施形態は、Ｘａａ１がＮａｌであり、Ｘａａ２およびＸａａ３が存在しないペプチドに関する。前記実施形態において、位置４２のＣ末端Ｇｌｎのカルボキシル基のアミド化は好ましい。
【００１３】
本発明のより好ましい実施形態は、Ｘａａ１がＰｈｅであり、Ｘａａ２およびＸａａ３が両者ともＣｙｓであり、両者は任意でＰＥＧ化され、位置４４のＣｙｓのカルボキシル基が任意でアミド化されるペプチドに関する。本発明の特に好ましい実施形態は、Ｘａａ１がＮａｌであり、Ｘａａ２およびＸａａ３がＣｙｓであり、どちらかまたは両方のＣｙｓは任意でＰＥＧ化され、位置４４のＣｙｓのカルボキシル基が任意でアミド化されるペプチドに関する。
【００１４】
本発明の特に好ましい実施形態は、Ｔｙｒ−Ａｉｂ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｉｂ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｉｂ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ（ＰＥＧ２０Ｋ）−Ｃｙｓ（ＰＥＧ２０Ｋ）（配列番号：２）であり、位置４４のＣｙｓはアミド化される。このペプチドは、Ａｉｂ２，Ａｉｂ１３，Ａｉｂ２９，Ｃｙｓ４３（ＰＥＧ２０Ｋ），Ｃｙｓ４４（ＰＥＧ２０Ｋ）−ＧＩＰと称される。
【００１５】
本発明の最も好ましい実施形態は、Ｔｙｒ−Ａｉｂ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｉｂ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｎａｌ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｉｂ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ（ＰＥＧ２０Ｋ）−Ｃｙｓ（ＰＥＧ２０Ｋ）（配列番号：３）であり、位置４４のＣｙｓはアミド化される。このペプチドはＡｉｂ２，Ａｉｂ１３，Ｎａｌ２２，Ａｉｂ２９，Ｃｙｓ４３（ＰＥＧ２０Ｋ），Ｃｙｓ４４（ＰＥＧ２０Ｋ）−ＧＩＰと称される。
【００１６】
本発明は、かかる治療を必要とする患者に対して有効量の本発明のペプチドを投与することを含む、患者の糖尿病を治療する方法も提供する。本発明は、かかる治療を必要とする患者に対して有効量の本発明のペプチドを投与することを含む、患者のインスリン非依存性糖尿病を治療する方法をさらに提供する。本発明は、かかる治療を必要とする患者に対して有効量の本発明のペプチドを投与することを含む、患者のインスリン依存性糖尿病を治療する方法をさらに提供する。
【００１７】
さらに、本発明は、かかる治療を必要とする患者に対して有効量の本発明のペプチドを投与することによって、肥満、メタボリックシンドローム、冠動脈疾患およびアテローム性動脈硬化症からなる群から選択される病態を治療する方法も提供する。さらに、本発明は、かかる治療を必要とする患者に対して有効量の本発明のペプチドを投与することによって、体重減少を誘導する方法を提供する。本発明は、かかる治療を必要とする患者に対して有効量の本発明のペプチドを投与することによって、虚弱を治療する方法または骨強度を増加させる方法も提供する。
【００１８】
さらに、本発明は、治療法で使用するための本発明のペプチドを提供する。特定の実施形態において、本発明は、糖尿病の治療のために使用する本発明のペプチドを提供する。本発明は、インスリン非依存性糖尿病の治療のために使用する本発明のペプチドを提供する。本発明は、インスリン依存性糖尿病の治療のために使用する本発明のペプチドを提供する。さらに、本発明は、肥満の治療のために使用する本発明のペプチドを提供する。加えて、本発明は、肥満、メタボリックシンドローム、冠動脈疾患およびアテローム性動脈硬化症からなる群から選択される病態の治療のために使用する本発明のペプチドを提供する。本発明は、体重減少の誘導のために使用する本発明のペプチドをさらに提供する。さらに、本発明は、虚弱の治療または骨強度を増加させるために使用するための本発明のペプチドを提供する。
【００１９】
本発明は、糖尿病の治療のための医薬品の製造での本発明のペプチドの使用も提供する。本発明は、肥満の治療のための医薬品の製造での本発明のペプチドの使用も提供する。本発明は、メタボリックシンドローム、冠動脈疾患、アテローム性動脈硬化症からなる群から選択される病態の治療のための医薬品の製造での上述されたペプチドの使用をさらに提供する。本発明は、体重減少の誘発のための医薬品の製造での本発明のペプチドの使用をさらに提供する。本発明は、虚弱の治療または骨強度の増加のための医薬品の製造での本発明のペプチドの使用も提供する。
【００２０】
加えて、本発明は、薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と共に本発明のペプチドを含む医薬製剤を提供する。さらに、本発明は、糖尿病の治療に適合した医薬製剤を提供する。本発明は、インスリン非依存性糖尿病の治療に適合した医薬製剤を提供する。本発明は、インスリン依存性糖尿病の治療に適合した医薬製剤を提供する。さらに、本発明は、肥満の治療に適合した医薬製剤を提供する。本発明は、メタボリックシンドローム、冠動脈疾患およびアテローム性動脈硬化症からなる群から選択される病態の治療に適合した医薬製剤も提供する。本発明は、体重減少の誘発に適合した医薬製剤を提供する。本発明は、虚弱の治療または骨強度の増加に適合した医薬製剤をさらに提供する。特定の実施形態において、製剤は１つまたは複数の他の治療剤をさらに含む。
【００２１】
本発明は、１つまたは複数の薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と共に本発明のペプチドを含む医薬組成物も提供する。特定の実施形態において、組成物はさらに１つまたは複数の他の治療剤を含む。
【００２２】
本発明は、ＤＰＰＩＶによる迅速な代謝不活性化を受けにくい安定分子をさらに提供する。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明の配列は、２０個の天然に存在するアミノ酸についての標準的な１文字または３文字のアミノ酸コードを含む。以下のように、他の使用されるアミノ酸コードは定義される。Ａｉｂ＝α−アミノイソ酪酸；Ｎａｌ＝１−ナフチルアラニン。
【００２４】
「Ｃ末端アミノ酸」という用語は、遊離カルボキシル基を含む、ペプチド配列中の最後のアミノ酸を指す。本発明のＣ末端アミノ酸は、位置４２のＧｌｎ、位置４３のＣｙｓまたは位置４４のＣｙｓであり得る。
【００２５】
「ポリエチレングリコール」または「ＰＥＧ」という用語は、カップリング剤またはカップリング部分もしくは活性化部分による誘導体化を用いるかまたは用いてない、ポリアルキレングリコール化合物またはその誘導体を指す。その典型的な形態において、ＰＥＧは末端水酸基を持つ直鎖状ポリマーであり、式ＨＯ−ＣＨ２ＣＨ２−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−ＯＨ（式中ｎは約８〜４０００である）を有する。ｍＰＥＧはモノメトキシ−ポリエチレングリコールである。ＰＥＧは分子量がある程度変動するＰＥＧ化合物の混合物として典型的には生成および使用されるので、当業者は、一般的には、特定のＰＥＧ化化合物を生成するＰＥＧ化反応において使用されるＰＥＧ試薬の平均分子量の記述によって、化合物に対して付加されたＰＥＧの分子量を記述する。ＰＥＧの多数の誘導体が当該技術分野において存在する。本発明のペプチドに対して共有結合で付加されるＰＥＧ分子は、１０，０００ダルトン、２０，０００ダルトン、３０，０００ダルトンまたは４０，０００ダルトンであり得る。ＰＥＧ分子の平均は好ましくは１８，０００〜２２，０００ダルトンである。より好ましくは、平均は１９，０００〜２１，０００ダルトンである。最も好ましくは、平均は２０，０００〜２１，０００ダルトンである。ＰＥＧ分子は直鎖状または分枝状であってもよく、単独またはタンデムで存在してもよい。本発明のＰＥＧ化ペプチドは好ましくはペプチドのＣ末端に付加されたタンデムな直鎖状ＰＥＧ分子を有する。特に、ＰＥＧ分子は好ましくは、ｎが１０〜２５００であるｍＰＥＧ−２０ｋＤａマレイミド（ｍＰＥＧ  ＭＡＬ）（Ｉ）またはｍＰＥＧ−２０ｋＤａヨードアセトアミド（ＩＩ）によって、ペプチドのＣ末端の２個のシステイン残基に対して付加される。好ましくは、ｎは３５０〜６００である。より好ましくは、ｎは４２５〜４７５である。
【化２】
0005887335.tif 000003
【００２６】
「ＰＥＧ化」という用語は、本明細書において使用される時、上記のような、本発明のペプチドに対する１つまたは複数のＰＥＧ分子の共有結合による付加を意味する。例えば、本発明のペプチドは、各々のＣｙｓのチオール基に対して共有結合される２０ｋＤａ  ＰＥＧ分子により、位置４３および４４のＣｙｓでＰＥＧ化される。
【００２７】
以下の略称が本明細書において使用される。「ｔ−Ｂｕ」はｔｅｒｔ−ブチルを指し、「ｆｍｏｃ」はフルオレニルメチルオキシカルボニルを指し、「Ｐｂｆ」は２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニルを指し、「Ｔｒｔ」はトリチルまたはトリフェニルメチルを指し、「ＯｔＢｕ」はｔｅｒｔ−ブトキシルを指し、「Ｂｏｃ」はｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルを指し、「ＰｙＢＯＰ」は（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスファートを指し、「ＤＩＥＡ」はジイソプロピルエチルアミンを指し、「ＨＥＫ」はヒト胚腎臓を指し、「トリス」は２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−プロパン−１，３−ジオールを指し、「ＢＳＡ」はウシ血清アルブミンを指し、「ヘペス」は２−［４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−イル］エタンスルホン酸を指し、「ＰＢＳ」はリン酸緩衝生理食塩水を指し、「ＮＳＢ」は非特異的結合を指し、「ＨＢＳＳ」はハンクス緩衝塩溶液を指し、「ＩＢＭＸ」は１−メチル−３−（２−メチルプロピル）−７Ｈ−プリン−２，６−ジオンを指し、「ＤＭＳＯ」はジメチルスルホキシドを指す。
【００２８】
ペプチド合成
本発明のペプチドはすべて、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．のＳｙｍｐｈｏｎｙ（登録商標）自動化ペプチド合成機で固相ペプチド合成によって生成される。合成は、Ｆｍｏｃ−Ｒｉｎｋアミドポリスチレン樹脂（Ｒａｐｐ  Ｐｏｌｙｍｅｒｅ  Ｔｕｂｉｎｇｅｎ、ドイツ）で約０．７ｍｍｏｌ／ｇの置換で実行される。合成はＦｍｏｃ／ｔ−Ｂｕ固相ペプチド合成を使用して実行される。使用されるアミノ酸側鎖誘導体は、Ａｒｇ（Ｐｂｆ）、Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）、Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）、Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）、Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）、Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）、Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、Ｓｅｒ（ｔＢｕ）、Ｔｈｒ（ｔＢｕ）、Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）およびＴｙｒ（ｔＢｕ）である。カップリングは、室温で９０分間ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中のジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）およびヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）（１：１：１モル比）により活性化された約６当量のアミノ酸により行なわれる。以下の条件を位置２２でのＦｍｏｃ−（１−Ｎａｌ）−ＯＨのカップリングに使用した。ＤＭＦ中のＦｍｏｃ−（１−Ｎａｌ）−ＯＨ（３当量）、ＰｙＢＯＰ（３当量）およびＤＩＥＡ（６当量）で室温で３時間。以下の条件を位置１２でのＦｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨのカップリングに使用した。ＤＭＦ中のＦｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ（６当量）、ＰｙＢＯＰ（６当量）およびＤＩＥＡ（１２当量）で室温で１０時間。
【００２９】
同時に行う樹脂からの切断および側鎖保護基除去を、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）：トリイソプロピルシラン：１，２−エタンジチオール：メタノール：チオアニソール９０：４：２：２：２（ｖ／ｖ）を含む溶液中で室温で２時間行う。溶液を濾過し、ペプチドを冷ジエチルエーテルにより沈殿させ、３０〜４０ｍＬの水中の１０％アセトニトリル中で再溶解し、Ｃ１８の逆相ＨＰＬＣカラム（典型的にはＷａｔｅｒｓ  ＳｙｍｍｅｔｒｙＰｒｅｐ（商標）７μｍ、１９×３００ｍｍ）で１８ｍＬ／分の流速で精製した。サンプルを、５分間にわたる０〜１８％のＢ続いて１１０分間にわたる１８〜４５％のＢの２相性直線状ＡＢ勾配（ここでＡ＝０．０５％のＴＦＡ／水およびＢ＝０．０５％のＴＦＡ／アセトニトリル）により溶出する。産物は一般的には２８〜３５％のアセトニトリルで溶出される。ペプチドの純度および分子量を、シングル四重極ＭＳ検出器によりＡｇｉｌｅｎｔ  １１００シリーズＬＣ−ＭＳのシステムで確認する。分析ＨＰＬＣ分離は、１５分間にわたる６〜６０％のＢの直線状ＡＢ勾配（ここでＡ＝０．０５％のＴＦＡ／Ｈ２ＯおよびＢ＝０．０５％のＴＦＡ／アセトニトリル）により、Ｚｏｒｂａｘ（登録商標）Ｅｃｌｉｐｓｅ（商標）ＸＤＢ−Ｃ８、５μｍ、４．６ｍｍ内径×１５ｃｍカラムで流速１ｍＬ／分で行う。すべてのペプチドを＞９５％の純度まで精製し、１原子質量単位以内の計算値に対応する分子量を有することを確認した。
【実施例】
【００３０】
実施例１
【化３】
0005887335.tif 000004
【００３１】
実施例２
【化４】
0005887335.tif 000005
【００３２】
中間体１
【化５】
0005887335.tif 000006
【００３３】
中間体２
【化６】
0005887335.tif 000007
【００３４】
ｍＰＥＧ−ＭＡＬ−２０ｋＤａによるペプチドのＰＥＧ化
凍結乾燥したペプチドを計量する（典型的には３０〜５０ｍｇ）。２．１倍モル当量のｍＰＥＧ−２０ｋＤａマレイミド（ＣＨ３Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−（ＣＨ２）３ＮＨＣＯ（ＣＨ２）２−マレイミド）（ＮＯＦ  ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥ−２００ＭＡ）（ｍＰＥＧ  ＭＡＬ）を計量し、ペプチドと合わせる。反応物を、５０／５０（ｖ／ｖ）水／アセトニトリル混合物中で、約２０ｍｇ／ｍＬのペプチド濃度に溶解する。ペプチド溶液を、１００ｍＭ酢酸アンモニウム、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７）により２倍希釈する。生じた混合物を室温で撹拌する。反応混合物を分析逆相ＨＰＬＣ（分析ＨＰＬＣ分離は、５分間にわたる０〜３０％のＢおよび続いて３０分間にわたる３０〜９０％のＢの２相性直線状ＡＢ勾配（ここでＡ＝０．０５％のＴＦＡ／Ｈ２ＯおよびＢ＝０．０５％のＴＦＡ／アセトニトリル）により、Ｗａｔｅｒｓ  ＳｙｍｍｅｔｒｙＳｈｉｅｌｄ（商標）Ｃ１８、３．５μｍ、４．６ｍｍ内径×１０ｃｍのカラムで、６０℃で流速１ｍＬ／分で行う）によってモニターし、典型的には１〜２時間の反応時間後に、ペプチドピークがほとんど完全に消失することが示される。モノＰＥＧ化ペプチドおよびジＰＥＧ化ペプチドに起因する２つのピークは、典型的にはジＰＥＧ化されたペプチドがピーク面積の合計の９０〜９５％を構成すると思われる。
【００３５】
次いでサンプルを典型的には酸性水（０．０５％  ＴＦＡ／水）で約４０ｍＬに希釈し、１５分間にわたる０〜２５％のＢ、続いて１００分間にわたる２５〜５５％のＢの２相性直線状ＡＢ勾配（ここでＡ＝０．０５％のＴＦＡ／水およびＢ＝０．０５％のＴＦＡ／アセトニトリル）により、１０ｍＬ／分の流速で、Ｃ１８逆相ＨＰＬＣカラム（典型的にはＷａｔｅｒｓ  ＳｙｍｍｅｔｒｙＰｒｅｐ（商標）７μｍ、１９×３００ｍｍ）によって精製する。産物は一般的には３５〜４０％のアセトニトリルで溶出される。精製されたペプチドは、ペプチド配列に基づいた計算したモル吸光係数を使用して、２８０ｎｍでのＵＶ吸光度によって定量される。精製後の収率は典型的には、出発ペプチドの量に基づいて７０％の範囲である。
【００３６】
実施例３
Ａｉｂ２，Ａｉｂ１３，Ａｉｂ２９，Ｃｙｓ４３（ＰＥＧ２０Ｋ），Ｃｙｓ４４（ＰＥＧ２０Ｋ）−ＧＩＰ
【００３７】
実施例４
Ａｉｂ２，Ａｉｂ１３，Ｎａｌ２２，Ａｉｂ２９，Ｃｙｓ４３（ＰＥＧ２０Ｋ），Ｃｙｓ４４  （ＰＥＧ２０Ｋ）−ＧＩＰ
実施例３および実施例４のペプチドはｍＰＥＧ−ＭＡＬを使用してＰＥＧ化した。
【００３８】
ｍＰＥＧ−ヨードアセトアミド−２０ｋＤａによるペプチドのＰＥＧ化
凍結乾燥したペプチドを計量する（典型的には３０〜５０ｍｇ）。２．１倍モル当量のｍＰＥＧ−２０ｋＤａヨードアセトアミド（ＣＨ３Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−（ＣＨ２）３ＮＨＣＯＣＨ２−Ｉ）（ＮＯＦ  ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥ−２００ＩＡ）を計量し、ペプチドと合わせる。反応物を、水性緩衝溶液ｐＨ８．５（ホウ酸、塩化カリウム、水酸化ナトリウム緩衝液０．１Ｍ＋１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）＋２０％アセトニトリル（ｖ／ｖ）中で、約１０ｍｇ／ｍＬのペプチド濃度に溶解する。次いで生じた混合物を室温で撹拌する。反応混合物を、分析逆相ＨＰＬＣ（分析ＨＰＬＣ分離は、５分間にわたる０〜３０％のＢおよび続いて３０分間にわたる３０〜９０％のＢの２相性直線状ＡＢ勾配（ここでＡ＝０．０５％のＴＦＡ／Ｈ２ＯおよびＢ＝０．０５％のＴＦＡ／アセトニトリル）により、Ｗａｔｅｒｓ  ＳｙｍｍｅｔｒｙＳｈｉｅｌｄ（商標）Ｃ１８、３．５ミクロン、４．６ｍｍ内径×１０ｃｍカラムで６０℃で流速１ｍＬ／分で行う）によってモニターし、典型的には１８時間の反応時間後に、ペプチドピークがほとんど完全に消失することが示される。モノＰＥＧ化ペプチドおよびジＰＥＧ化ペプチドに起因する２つのピークは、典型的にはジＰＥＧ化されたペプチドがピーク面積の合計の９０〜９５％を構成すると思われる。
【００３９】
次いでサンプルを典型的には酸性水（０．０５％  ＴＦＡ／水）で約５０ｍＬに希釈し、１５分間にわたる０〜２５％のＢ、続いて１００分間にわたる２５〜５５％のＢの２相性直線状ＡＢ勾配（ここでＡ＝０．０５％のＴＦＡ／水およびＢ＝０．０５％のＴＦＡ／アセトニトリル）により、１０ｍＬ／分の流速で、Ｃ１８逆相ＨＰＬＣカラム（典型的にはＷａｔｅｒｓ  ＳｙｍｍｅｔｒｙＰｒｅｐ（商標）７μｍ、１９×３００ｍｍ）によって精製した。産物は一般的には３５〜４０％のアセトニトリルで溶出される。精製されたペプチドは、ペプチド配列に基づいた計算したモル吸光係数を使用して、２８０ｎｍでのＵＶ吸光度によって定量される。精製後の収率は典型的には、出発ペプチドの量に基づいて７０％の範囲である。
【００４０】
あるいは、凍結乾燥したペプチドを計量する（典型的には３０〜５０ｍｇ）。２．１倍モル当量のｍＰＥＧ−２０ｋＤａヨードアセトアミド（ＣＨ３Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−（ＣＨ２）３ＮＨＣＯＣＨ２−Ｉ）（ＮＯＦ  ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥ−２００ＩＡ）を計量し、ペプチドと合わる。反応物を、水性緩衝溶液ｐＨ８．０（０．１Ｍ重炭酸塩緩衝液＋１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）＋２０％アセトニトリル（ｖ／ｖ）中で、約８ｍｇ／ｍＬのペプチド濃度に溶解する。次いで生じた混合物を室温の暗所で撹拌する。反応混合物を、分析逆相ＨＰＬＣ（分析ＨＰＬＣ分離は、５分間にわたる０〜３０％のＢおよび続いて３０分間にわたる３０〜９０％のＢの２相性直線状ＡＢ勾配（ここでＡ＝０．０５％のＴＦＡ／Ｈ２ＯおよびＢ＝０．０５％のＴＦＡ／アセトニトリル）により、Ｗａｔｅｒｓ  ＳｙｍｍｅｔｒｙＳｈｉｅｌｄ（商標）Ｃ１８、（３．５ミクロン、４．６ｍｍ内径ｘ×１０ｃｍカラムで６０℃で流速１ｍＬ／分で行う）によってモニターし、典型的には３時間の反応時間後に、ペプチドピークがほとんど完全に消失することが示される。モノＰＥＧ化ペプチドおよびジＰＥＧ化ペプチドに起因する２つのピークは、典型的にはジＰＥＧ化されたペプチドがピーク面積の合計の９０〜９５％を構成すると思われる。
【００４１】
次いでサンプルを典型的には酸性水（０．０５％  ＴＦＡ／水）で約５０ｍＬに希釈し、上記のように精製する。精製後の収率は典型的には、出発ペプチドの量に基づいて７０％の範囲である。
【００４２】
実施例５：配列番号：３
Ａｉｂ２，Ａｉｂ１３，Ｎａｌ２２，Ａｉｂ２９，Ｃｙｓ４３（ＰＥＧ２０Ｋ），Ｃｙｓ４４  （ＰＥＧ２０Ｋ）−ＧＩＰ
実施例５のペプチドはｍＰＥＧ−ヨードアセトアミドを使用してＰＥＧ化する。
【００４３】
アッセイ
インビトロ
本明細書において例示した化合物を下記に述べるように本質的に試験し、ＧＩＰ−ＲおよびＧＬＰ−１−Ｒに対する結合親和性（Ｋｉ）が１００ｎＭ未満であり、およびＧｌｕｃ−Ｒに対する選択性比が少なくとも１００倍であることを示す。さらに、本明細書における化合物は、ＧＩＰ−ＲおよびＧＬＰ−１−Ｒについての結合アッセイにおいて、４：１〜１：２（ＧＩＰ−Ｒ：ＧＬＰ−１−Ｒ）の間の活性比を示す（４：１はＧＩＰ−Ｒでより高い力価を示し、１：２はＧＬＰ−１−Ｒでより高い力価を示す）。
【００４４】
グルコース依存性インスリン分泌刺激ペプチド受容体（ＧＩＰ−Ｒ）結合アッセイ
ヒトグルコース依存性インスリン分泌刺激ポリペプチド受容体結合アッセイは、ｐｃＤＮＡ３．１（Ｐｒｏｍｅｇａ）−ＮｅｏＲプラスミドの中へクローン化したｈＧＩＰ−Ｒ（Ｕｓｄｉｎ，Ｔ．Ｂ．，Ｇｒｕｂｅｒ，Ｃ．，Ｍｏｄｉ，Ｗ．ａｎｄ  Ｂｏｎｎｅｒ，Ｔ．Ｉ．、ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ８４４１８．１）を使用する。ｈＧＩＰ−Ｒ−ｐｃＤＮＡ３．１／Ｎｅｏプラスミドを懸濁培養のチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−Ｓ）の中へトランスフェクションし、５００μｇ／ｍＬジェネティシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の存在下において選択する。
【００４５】
粗製原形質膜を、懸濁培養からの細胞を使用して調製する。細胞を、２５ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ＤＮＡｓｅ１（２０μ／ｍＬ）およびＥＤＴＡ不含有Ｒｏｃｈｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標）Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓを含む低張緩衝液中で氷上で溶解する。細胞懸濁物を、テフロン（登録商標）乳棒を２５ストロークで使用して、ガラスのダウンス型ホモジナイザーによりホモジナイズする。ホモジネートを４℃で１５分間１８００×ｇで遠心分離する。上清を回収し、ペレットを低張緩衝液中で再懸濁し、再ホモジナイズする。混合物を１５分間１８００×ｇで遠心分離する。第２の上清を第１の上清と合わせる。合わせた上清を１５分間１８００×ｇで再遠心分離して清澄化する。清澄化した上清を高速用チューブに移し、４℃で３０分間２５０００×ｇで遠心分離する。膜ペレットをホモジナイズ用緩衝液中で再懸濁し、使用まで−８０℃フリーザーで凍結した小分けとして保存する。
【００４６】
ＧＩＰは、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ／ＮＥＮで、Ｉ−１２５−ラクトペルオキシダーゼ手技（Ｍａｒｋａｌｏｎｉｓ，Ｊ．Ｊ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１１３：２９９（１９６９））によって放射性ヨウ素で標識され、逆相ＨＰＬＣによって精製される（ＮＥＸ−４０２）。比放射能は２２００Ｃｉ／ｍｍｏｌである。ＫＤ決定は、飽和結合の代わりに、非放射性ｈＧＩＰを使用する相同競合によって実行する。受容体結合アッセイは、１％脂肪酸不含有ＢＳＡ（Ｇｉｂｃｏ、７．５％ＢＳＡ）であらかじめブロッキングした小麦胚芽凝集素（ＷＧＡ）ビーズ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｒｅ）により、シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）（Ｓｕｎ，Ｓ．，Ａｌｍａｄｅｎ，Ｊ．，Ｃａｒｌｓｏｎ，Ｔ．Ｊ．，Ｂａｒｋｅｒ，Ｊ．ａｎｄ  Ｇｅｈｒｉｎｇ，Ｍ．Ｒ．Ａｓｓａｙ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｄａｔａ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｌｉｇａｎｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  ａｓｓａｙ．Ｍｅｔａｂ  Ｅｎｇ．７：３８−４４（２００５））を使用して行う。結合緩衝液は、２５ｍＭヘペス（ｐＨ７．４）、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１％脂肪酸不含有ＢＳＡ、０．００３％  Ｔｗｅｅｎ２０およびＥＤＴＡ不含有Ｒｏｃｈｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標）Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓを含む。ｈＧＩＰおよびペプチドアナログをＰＢＳ中で溶解し、−８０℃で保存する。ペプチドアナログを結合緩衝液の中で連続的に希釈する。次いで、１０μＬの希釈したペプチドを、４０μＬのアッセイ結合緩衝液または非放射性ＧＩＰ（最終的に０．１μＭでＮＳＢ）を含むＣｏｒｎｉｎｇ（登録商標）３６３２透明底のアッセイプレートの中へ移す。次いで、９０μＬの膜（４μｇ／ウェル）、５０μＬの［１２５Ｉ］ＧＩＰ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、反応中で最終的に０．１５ｎＭ）、および５０μＬのＷＧＡビーズ（１５０μｇ／ウェル）を添加し、密封し、転倒して混合する。室温で１２時間の静置時間後に、プレートをＭｉｃｒｏＢｅｔａ（登録商標）シンチレーションカウンターにより読み取る。
【００４７】
結果は、化合物の存在下における特異的なＩ−１２５−ＧＩＰ結合のパーセントとして計算される。化合物の絶対ＩＣ５０濃度は、Ｉ−１２５−ＧＩＰのパーセント特異的結合ｖｓ添加した化合物の濃度の非線形回帰によって導き出される。ＩＣ５０濃度は、ＫＤが０．１７４ｎＭであると推測されるところで、Ｃｈｅｎｇ−Ｐｒｕｓｏｆｆの等式を使用して、Ｋｉに変換される（Ｃｈｅｎｇ，Ｙ．，Ｐｒｕｓｏｆｆ，Ｗ．Ｈ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２２，３０９９−３１０８，（１９７３））。
【００４８】
【表１】
0005887335.tif 000008
【００４９】
これらのデータは、表１のペプチドがＧＩＰ−Ｒに結合しその受容体を活性化し、そしてＧＩＰ依存性生理反応を誘導し得ることを実証する。
【００５０】
グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１−Ｒ）受容体結合アッセイ
ＧＬＰ−１受容体結合アッセイは、２９３ＨＥＫ膜から単離されたクローン化ヒトグルカゴン様ペプチド１受容体（ｈＧＬＰ−１−Ｒ）（Ｇｒａｚｉａｎｏ  ＭＰ，Ｈｅｙ  ＰＪ，Ｂｏｒｋｏｗｓｋｉ  Ｄ，Ｃｈｉｃｃｈｉ  ＧＧ，Ｓｔｒａｄｅｒ  ＣＤ，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．１９６（１）：１４１−６，１９９３）を使用する。ｈＧＬＰ−１−Ｒ  ｃＤＮＡを、発現プラスミドｐｈＤ（Ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｆｕｌｌｙ  ｇａｍｍａ−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅｄ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ，ａｎ  ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ  ｆａｃｔｏｒ．Ｇｒｉｎｎｅｌｌ，Ｂ．Ｗ．，Ｂｅｒｇ，Ｄ．Ｔ．，Ｗａｌｌｓ，Ｊ．ａｎｄ  Ｙａｎ，Ｓ．Ｂ．Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ５：１１８９−１１９２，１９８７）の中へサブクローン化する。このプラスミドＤＮＡを２９３ＨＥＫ細胞の中へトランスフェクションし、２００μｇ／ｍＬのハイグロマイシンで選択する。
【００５１】
粗製原形質膜を、懸濁培養からの細胞を使用して調製する。細胞を、２５ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ＤＮＡｓｅ１（２０μ／ｍＬ）およびＥＤＴＡ不含有Ｒｏｃｈｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標）Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓを含む低張緩衝液中で氷上で溶解する。細胞懸濁物を、テフロン（登録商標）乳棒を２５ストロークで使用して、ガラスのダウンス型ホモジナイザーによりホモジナイズする。ホモジネートを４℃で１５分間１８００×ｇで遠心分離する。上清を回収し、ペレットを低張緩衝液中で再懸濁し、再ホモジナイズする。混合物を１５分間１８００×ｇで遠心分離する。第２の上清を第１の上清と合わせる。合わせた上清を１５分間１８００×ｇで再遠心分離して清澄化する。清澄化した上清を高速用チューブに移し、４℃で３０分間２５０００×ｇで遠心分離する。膜ペレットをホモジナイズ用緩衝液中で再懸濁し、使用まで−８０℃フリーザーで凍結した小分けとして保存する。
【００５２】
グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）は、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ／ＮＥＮで、Ｉ−１２５−ラクトペルオキシダーゼ手技によって放射性ヨウ素で標識され、逆相ＨＰＬＣによって精製される（ＮＥＸ３０８）。比放射能は２２００Ｃｉ／ｍｍｏｌである。ＫＤ決定は、Ｉ−１２５のＧＬＰ−１物質中の高プロパノール含有量に起因して、飽和結合の代わりに相同競合によって実行する。ＫＤは０．９６ｎＭであると推測され、試験したすべての化合物についてのＫｉ値の計算に使用される。
【００５３】
受容体結合アッセイは、１％脂肪酸不含有ＢＳＡ（Ｇｉｂｃｏ）であらかじめブロッキングした小麦胚芽凝集素（ＷＧＡ）ビーズにより、シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）を使用して行う。結合緩衝液は、２５ｍＭヘペス（ｐＨ７．４）、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１％脂肪酸不含有ＢＳＡ、０．００３％  Ｔｗｅｅｎ２０およびＥＤＴＡ不含有Ｒｏｃｈｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標）Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓを含む。グルカゴン様ペプチド１を１ｍｇ／ｍＬでＰＢＳ中で溶解し、３０μＬの小分けで−８０℃で直ちに凍結する。グルカゴン様ペプチド１の小分けを希釈し、１時間以内に結合アッセイで使用する。ペプチドアナログをＰＢＳ中で溶解し、結合緩衝液中で連続的に希釈する。次いで、１０μＬの希釈した化合物またはＰＢＳを、４０μＬのアッセイ結合緩衝液または非放射性グルカゴン（最終的に１μＭでＮＳＢ）を含むＣｏｒｎｉｎｇ（登録商標）３６３２透明底のアッセイプレートの中へ移す。次いで、９０μＬの膜（１μｇ／ウェル）、５０μＬのＩ−１２５グルカゴン様ペプチド１（反応中で最終的に０．１５ｎＭ）、および５０μＬのＷＧＡビーズ（１５０μｇ／ウェル）を添加し、密封し、転倒して混合する。室温で１２時間の静置時間後に、プレートをＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｔｒｉｌｕｘ  ＭｉｃｒｏＢｅｔａ（登録商標）シンチレーションカウンターにより読み取る。
【００５４】
結果は、化合物の存在下における特異的なＩ−１２５−グルカゴン様ペプチド１結合のパーセントとして計算される。化合物の絶対ＩＣ５０濃度は、Ｉ−１２５−グルカゴン様ペプチド１のパーセント特異的結合ｖｓ添加した化合物の濃度の非線形回帰によって導き出される。ＩＣ５０濃度は、Ｃｈｅｎｇ−Ｐｒｕｓｏｆｆの等式を使用してＫｉに変換される。
【００５５】
【表２】
0005887335.tif 000009
【００５６】
これらのデータは、表２のペプチドがＧＬＰ−１−Ｒに結合し、したがってその受容体を活性化し、ＧＬＰ−１依存性生理反応を誘導し得ることを実証する。
【００５７】
グルカゴン受容体（ｈＧｌｕｃＲ）結合アッセイ
グルカゴン受容体結合アッセイは、２９３ＨＥＫ膜から単離されたクローン化ヒトグルカゴン受容体（Ｌｏｋ，Ｓ，ｅｔ．ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １４０（２），２０３−２０９（１９９４））を利用する。ｈＧｌｕｃＲ  ｃＤＮＡを、発現プラスミドｐｈＤ（Ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｆｕｌｌｙ  ｇａｍｍａ−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅｄ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ，ａｎ  ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ  ｆａｃｔｏｒ．Ｇｒｉｎｎｅｌｌ，Ｂ．Ｗ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ５：１１８９−１１９２（１９８７））の中へサブクローン化する。このプラスミドＤＮＡを２９３ＨＥＫ細胞の中へトランスフェクトし、２００μｇ／ｍＬハイグロマイシンで選択する。
【００５８】
粗製原形質膜を、懸濁培養からの細胞を使用して調製する。細胞を、２５ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ＤＮＡｓｅ１（２０μ／ｍＬ）およびＥＤＴＡ不含有Ｒｏｃｈｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標）Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓを含む低張緩衝液中で氷上で溶解する。細胞懸濁物を、テフロン（登録商標）乳棒を２５ストロークで使用して、ガラスのダウンス型ホモジナイザーによりホモジナイズする。ホモジネートを４℃で１５分間１８００×ｇで遠心分離する。上清を回収し、ペレットを低張緩衝液中で再懸濁し、再ホモジナイズする。混合物を１５分間１８００×ｇで遠心分離する。第２の上清を第１の上清と合わせる。合わせた上清を１５分間１８００×ｇで再遠心分離して清澄化する。清澄化された上清を高速用チューブに移し、４℃で３０分間２５０００×ｇで遠心分離する。膜ペレットをホモジナイズ用緩衝液中で再懸濁し、使用まで−８０℃フリーザーで凍結した小分けとして保存する。
【００５９】
グルカゴンは、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ／ＮＥＮで、Ｉ−１２５−ラクトペルオキシダーゼ手技によって放射性ヨウ素で標識され、逆相ＨＰＬＣによって精製される（ＮＥＸ２０７）。比放射能は２２００Ｃｉ／ｍｍｏｌである。ＫＤ決定は、Ｉ−１２５グルカゴン物質中の高プロパノール含有量に起因して、飽和結合の代わりに相同競合によって実行する。ＫＤは２．６２ｎＭであると推測され、試験したすべての化合物についてのＫｉ値の計算に使用される。
【００６０】
受容体結合アッセイは、１％脂肪酸不含有ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｇｉｂｃｏ、７．５％ＢＳＡ）であらかじめブロッキングした小麦胚芽凝集素（ＷＧＡ）ビーズにより、シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）を使用して行う。結合緩衝液は、２５ｍＭ  ４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）（ｐＨ７．４）、２．５  ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１％脂肪酸不含有ＢＳＡ、０．００３％  Ｔｗｅｅｎ２０およびＥＤＴＡ不含有Ｒｏｃｈｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標）Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓを含む。グルカゴンを１ｍｇ／ｍＬで０．０１ＮのＨＣｌ中で溶解し、３０μＬの小分けで−８０℃で直ちに凍結する。グルカゴンの小分けを希釈し、１時間以内に結合アッセイで使用する。ペプチドアナログをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で溶解し、結合緩衝液中で連続的に希釈する。次いで、１０μＬの希釈した化合物またはＰＢＳを、４０μＬのアッセイ結合緩衝液または非放射性グルカゴン（最終的に１μＭで非特異的結合（ＮＳＢ））を含むＣｏｒｎｉｎｇ（登録商標）３６３２透明底のアッセイプレートの中へ移す。次いで、９０μＬの膜（３μｇ／ウェル）、５０μＬのＩ−１２５グルカゴン（反応中で最終的に０．１５ｎＭ）、および５０μＬのＷＧＡビーズ（１５０μｇ／ウェル）を添加し、密封し、転倒して混合する。室温で１２時間の静置時間後に、プレートをＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｔｒｉｌｕｘ  ＭｉｃｒｏＢｅｔａ（登録商標）シンチレーションカウンターにより読み取る。
【００６１】
結果は、化合物の存在下における特異的なＩ−１２５−グルカゴン結合のパーセントとして計算される。化合物の絶対ＩＣ５０濃度は、Ｉ−１２５−グルカゴンのパーセント特異的結合ｖｓ添加した化合物の濃度の非線形回帰によって導き出される。ＩＣ５０用量はＣｈｅｎｇ−Ｐｒｕｓｏｆｆ等式を使用して、Ｋｉに変換される。
【００６２】
【表３】
0005887335.tif 000010
【００６３】
これらのデータは、表３のペプチドがＧｌｕｃ−Ｒについてより選択的ではなく、したがってＧｌｕｃ−Ｒ媒介性の生理反応を開始しないことを実証する。
【００６４】
細胞内ｃＡＭＰを生成するｈＧＩＰ−Ｒ細胞の機能的活性化
ｃＡＭＰ機能的アッセイは、上述したｈＧＩＰ−Ｒ結合アッセイのために単離した同一のクローン化ＧＩＰ−Ｒ細胞株を使用する。細胞をペプチドで刺激し、細胞内で生成されたｃＡＭＰをＣｉｓＢｉｏ  ｃＡＭＰ  Ｄｙｎａｍｉｃ  ２  ＨＴＲＦ（登録商標）アッセイキット（６２ＡＭ４ＰＥＢ）を使用して定量する。簡潔には、細胞内で誘導されたｃＡＭＰは、細胞溶解緩衝液の存在下においてｃＡＭＰ−ｄ２捕捉抗体に対する結合によって検出される。第２の検出抗体（ａｎｔｉ−ｃＡＭＰ  Ｃｒｙｐｔａｔｅ）を添加してサンドイッチを生成し、次いでこれをＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｅｎｖｉｓｉｏｎ（登録商標）装置を使用して検出する。
【００６５】
ｈＧＩＰ−Ｒ−ＣＨＯ−Ｓ細胞を、Ｅｎｚｙｍｅ−Ｆｒｅｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｍｅｄｉａ  ５−００４−Ｂ）でサブコンフルエントな組織培養ディッシュから採取する。細胞を低速度でペレットにし、ｃＡＭＰアッセイ緩衝液［０．１％脂肪酸不含有ＢＳＡ（Ｇｉｂｃｏ、７．５％ＢＳＡ）、５００μＭ  ＩＢＭＸを含む、ＭｇおよびＣａ含有ＨＢＳＳ（ＧＩＢＣＯ、１４０２５−０９２）中の２５ｍＭヘペス］で３回洗浄し、次いで１ｍＬあたり３１２，０００細胞の最終的な濃度に希釈する。ｈＧＩＰおよびペプチドを５倍ストック溶液として調製し、ｃＡＭＰアッセイ緩衝液の中で連続的に希釈し、同様に、ｃＡＭＰスタンダードカーブを−２０℃で保存したＰＢＳ中の２，８４８ｎＭ  ｃＡＭＰの凍結ストックから調製する。アッセイを開始するために、４０μＬの細胞懸濁物を、黒色の組織培養用の処理をしていないハーフウェルのプレート（ＣｏＳｔａｒ  ３６９４）へ移し、続いて１０μＬの５倍ペプチド希釈物を添加する。細胞を室温で１時間放置する。反応をＣｉｓＢｉｏ溶解緩衝液の中で希釈した２５μＬのｃＡＭＰ−ｄ２捕捉抗体（ＣｉｓＢｉｏ）の添加によって停止し、次いでｔｉｔｅｒ−ｔｅｋシェーカーで穏やかに混合する。１５分間の溶解後に、２５μＬの検出抗体（抗ｃＡＭＰ  Ｃｒｙｐｔａｔｅ（ＣｉｓＢｉｏ））を添加し、穏やかに混合する。溶解した細胞および抗体混合物を、室温で１時間後に、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｅｎｖｉｓｉｏｎ（登録商標）を使用して読み取る。Ｅｎｖｉｓｉｏｎ（登録商標）ユニットをｃＡＭＰスタンダードカーブを使用して、ｎＭ  ｃＡＭＰ／ウェルに変換する。各ウェル中で生成されたｎｍｏｌｅ  ｃＡＭＰを、ｈＧＩＰ対照で観察された最大反応のパーセントに変換する。相対的なＥＣ５０値は、パーセント最大反応ｖｓ添加したペプチドの濃度を使用して、非線形回帰分析によって導き出される。
【００６６】
【表４】
0005887335.tif 000011
【００６７】
これらのデータは、表４のペプチドがＧＩＰ−Ｒを結合および活性化し、それによってＧＩＰ−Ｒ媒介性の生理反応を開始できることを実証する。
【００６８】
細胞内ｃＡＭＰを生成するｈＧＬＰ−１−Ｒ細胞の機能的活性化
ｃＡＭＰ機能的アッセイは、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｎｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）（Ｇｒａｚｉａｎｏ  ＭＰ，Ｈｅｙ  ＰＪ，Ｂｏｒｋｏｗｓｋｉ  Ｄ，Ｃｈｉｃｃｈｉ  ＧＧ，Ｓｔｒａｄｅｒ  ＣＤ，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．１９９３  Ｏｃｔ  １５；１９６（１）：１４１−６）の中へクローン化したｈＧＬＲ−１−Ｒのトランスフェクションから単離した、ｈＧＬＰ−１−Ｒ発現細胞のクローンを使用し、２９３ＨＥＫ細胞の中へトランスフェクションする。ｈＧＬＰ−１−Ｒ細胞をペプチドで刺激し、細胞内で生成されたｃＡＭＰをＣｉｓＢｉｏ  ｃＡＭＰ  Ｄｙｎａｍｉｃ  ２  ＨＴＲＦ（登録商標）アッセイキット（６２ＡＭ４ＰＥＢ）を使用して定量する。簡潔には、細胞内で誘導されたｃＡＭＰは、細胞溶解緩衝液の存在下においてｃＡＭＰ−ｄ２捕捉抗体（ＣｉｓＢｉｏ）に対する結合によって検出される。第２の検出抗体（抗ｃＡＭＰ  Ｃｒｙｐｔａｔｅ（ＣｉｓＢｉｏ））を添加してサンドイッチを生成し、次いでこれをＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｅｎｖｉｓｉｏｎ（登録商標）装置を使用して検出する。
【００６９】
ｈＧＬＰ−１−Ｒ−２９３ＨＥＫ細胞を、Ｅｎｚｙｍｅ−Ｆｒｅｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｍｅｄｉａ  ５−００４−Ｂ）でサブコンフルエントな組織培養ディッシュから採取する。細胞を低速度でペレットにし、ｃＡＭＰ  ＤＭＥＭアッセイ緩衝液［０．５％ＦＢＳおよび２ｍＭグルタミンならびに５００μＭ  ＩＢＭＸを含むＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ−３１０５３）中の１０ｍＭヘペス］で３回洗浄し、次いで１ｍＬあたり５０，０００細胞の最終的な濃度に希釈する。ｈＧＬＰ−１およびペプチドを５倍ストック溶液として調製し、ｃＡＭＰ  ＤＭＥＭアッセイ緩衝液の中で連続的に希釈し、同様に、ｃＡＭＰスタンダードカーブを−２０℃で保存したＰＢＳ中の２，８４８ｎＭ  ｃＡＭＰの凍結ストックから調製する。アッセイを開始するために、４０μＬの細胞懸濁物を、黒色の組織培養用の処理をしていないハーフウェルのプレート（ＣｏＳｔａｒ  ３６９４）へ移し、続いて１０μＬの５倍ペプチド希釈物を添加する。細胞を１時間室温で放置する。反応をＣｉｓＢｉｏ溶解緩衝液の中へ希釈した２５μＬのｃＡＭＰ−ｄ２捕捉抗体（ＣｉｓＢｉｏ）の添加によって停止し、次いでｔｉｔｅｒ−ｔｅｋシェーカーで穏やかに混合する。１５分間の溶解後に、２５μＬの検出抗体（抗ｃＡＭＰ  Ｃｒｙｐｔａｔｅ（ＣｉｓＢｉｏ））を添加し、穏やかに混合する。溶解した細胞および抗体混合物を、室温で１時間後に、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｅｎｖｉｓｉｏｎ（登録商標）を使用して読み取る。Ｅｎｖｉｓｉｏｎ（登録商標）ユニットをｃＡＭＰスタンダードカーブを使用して、ｎＭ  ｃＡＭＰ／ウェルに変換する。各ウェル中で生成されたｎｍｏｌｅｓ  ｃＡＭＰを、ｈＧＬＰ−１対照で観察された最大反応のパーセントに変換する。相対的なＥＣ５０値は、パーセント最大反応ｖｓ添加したペプチドの濃度を使用して、非線形回帰分析によって導き出される。
【００７０】
【表５】
0005887335.tif 000012
【００７１】
これらのデータは、表５のペプチドがＧＬＰ−１−Ｒを結合および活性化し、それによってＧＬＰ−１−Ｒ媒介性生理反応を開始できることを実証する。
【００７２】
食餌誘導性肥満（ＤＩＯ）マウスにおける食物摂取、体重および身体組成に対するインビボの効果
３〜４か月齢のオス食餌誘導性肥満（ＤＩＯ）マウスを使用する。動物を１２時間の明／暗サイクル（２２：００で明かりがつく）で、温度が制御された（２４℃）施設中で個別に収容し、食物および水に自由に接近させる。施設に２週間順化させた後に、各群が類似した平均体重および脂肪量を有するように、マウスを処理群（ｎ＝８〜１０／群）に無作為化する。実験前にマウスを手技に慣れさせるために７日間媒質溶液を皮下注射（ｓｃ）し計量する。
【００７３】
ＤＩＯマウスに媒質または媒質中で溶解したペプチドアナログ（用量範囲１０〜１００ｎｍｏｌ／ｋｇ）をｓｃ注射によって投与し、３日ごとに２〜４週間、暗サイクルの開始の３０〜９０分前に自由に食物を与える。体重および食物の重量＋ホッパーを同時に測定する。直前の２４時間で消費された食物は、前日のものから現在のホッパー＋食物の重量を引くことによって計算する。体重の絶対変化は、第１の注射前に動物の体重を引くことによって計算する。１日目および１４日目に、総脂肪量は、Ｅｃｈｏ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ）装置を使用して、核磁気共鳴（ＮＭＲ）によって測定する。除脂肪量は総体重から脂肪量を引くことによって計算する。
【００７４】
【表６】
0005887335.tif 000013
【００７５】
【表７】
0005887335.tif 000014
【００７６】
表６ａおよび６ｂのデータは、１４日間のＤＩＯマウス研究において、実施例３、４および５は、媒質処理マウスと比較した場合、累積食物摂取および体重を減少させたことを示す。体重減少は主として脂肪量の減少のためであった。＊ｐ＜０．０１、＊＊ｐ＜０．００１ｖｓ媒質（ダネット検定）
【００７７】
ＤＩＯマウスにおける２週間の処理後の経口グルコース耐性試験の間の血糖エクスカーションに対する効果
上記のＤＩＯ研究における化合物の最終注射の５６時間後、動物で経口グルコース耐性試験を行った。簡潔には、マウスをグルコース耐性試験の開始１６時間前に絶食させた。時刻０で、動物に経口強制投与により２ｇ／ｋｇデキストロースを与える。血液を、グルコースチャレンジの０、１５、３０、６０および１２０分間後に採取する尾部採血によって回収する。グルコース濃度はグルコメーターによって測定する。
【００７８】
【表８】
0005887335.tif 000015
【００７９】
【表９】
0005887335.tif 000016
【００８０】
表７ａおよび７ｂ中のこれらのデータは、実施例３、４および５が経口グルコース負荷に後続するグルコースエクスカーションを有意に減少させることを示す。統計的有意性はダネット検定によって評価した。
【００８１】
食餌誘導性肥満（ＤＩＯ）のＬｏｎｇ  Ｅｖａｎｓラットにおける、食物摂取、体重および身体組成に対する効果
４〜５か月齢のオス食餌誘導性肥満のＬｏｎｇ  Ｅｖａｎｓラットを使用する。動物を１２時間の明／暗サイクル（２２：００で明かりがつく）で、温度が制御された（２４℃）施設中で個別に収容し、食物（食餌ＴＤ９５２１７）および水に自由に接近させる。動物は少なくとも２週間施設に順化させる。０日目に、身体組成をＱＮＭＲによって決定し、ラットを体重、％脂肪および％除脂肪重量に基づいてそれぞれの群（ｎ＝６／群）に無作為化する。化合物を１、４、８、１１および１５日目に皮下注射によって投与する。１４日目に、身体組成をＱＮＭＲによって再び決定し、１６日目に動物を計量し、サンプルのために尾より採血して、血漿グルコース、脂質、インスリン、グルカゴンおよびＰＹＹを決定する。ＣＯ２による安楽死後に、曝露決定の分析のために心臓を突き刺すことによって、血液サンプルを採取する。
【００８２】
１６日にわたる実施例３および４の投与は、除脂肪重量のパーセンテージの増加および脂肪量のパーセンテージの減少によって、媒質処理ＤＩＯラットと比較して、ＤＩＯラットの体重および身体組成の変化を産生した。例えば、１６日にわたる１０ｎｍｏｌ／ｋｇ用量の実施例３の投与後に、除脂肪重量は０．６％増加し、脂肪量は１．３％減少した。同様に、１６日にわたる３０ｎｍｏｌ／ｋｇ用量の実施例３の投与後に、除脂肪重量は１．３％増加し、脂肪量は２．３％減少した。さらに、１６日にわたる３０ｎｍｏｌ／ｋｇ用量の実施例４の投与後に、除脂肪重量は０．４％増加し、脂肪量は１．８％減少した。同様に、１６日にわたる１００ｎｍｏｌ／ｋｇ用量の実施例４の投与後に、除脂肪重量は１．８％増加し、脂肪量は３．２％減少した。
【００８３】
実施例３および４の投与は、媒質処理マウスと比較して、ＤＩＯラットにおけるトリグリセリドおよび総コレステロールを含む血漿脂質の量を低下させ、遊離脂肪酸の量を増加させた。例えば１０ｎｍｏｌ／ｋｇ用量の実施例３の投与後に、トリグリセリドおよび総コレステロールは、５０７．３ｍｇ／ｄＬおよび１０４ｍｇ／ｄＬ（媒質）から２６２．１ｍｇ／ｄＬおよび９１ｍｇ／ｄＬへそれぞれ減少し、遊離脂肪酸は０．６９ｍＥｑ／Ｌから０．９４ｍＥｑ／Ｌへ増加した。同様に３０ｎｍｏｌ／ｋｇ用量の実施例３の投与後に、トリグリセリドおよび総コレステロールは、５０７．３ｍｇ／ｄＬおよび１０４ｍｇ／ｄＬ（媒質）から２３３．５ｍｇ／ｄＬおよび９４ｍｇ／ｄＬへそれぞれ減少し、遊離脂肪酸は０．６９ｍＥｑ／Ｌから１．０１ｍＥｑ／Ｌへ増加した。さらに１０ｎｍｏｌ／ｋｇ用量の実施例４の投与後に、トリグリセリドおよび総コレステロールは、８０８．１ｍｇ／ｄＬおよび１２７ｍｇ／ｄＬ（媒質）から４８８．７ｍｇ／ｄＬおよび１１０ｍｇ／ｄＬへそれぞれ減少した。同様に３０ｎｍｏｌ／ｋｇ用量の実施例４の投与後に、トリグリセリドおよび総コレステロールは、８０８．１ｍｇ／ｄＬおよび１２７ｍｇ／ｄＬ（媒質）から２１２．２ｍｇ／ｄＬおよび１０４ｍｇ／ｄＬへそれぞれ減少し、遊離脂肪酸は０．６７ｍＥｑ／Ｌから０．８２ｍＥｑ／Ｌへ増加した。
【００８４】
正常なラットにおける静脈内グルコース耐性試験の間の血糖エクスカーションに対する効果
正常なオスＷｉｓｔａｒラット（２２５〜２５０ｇ）を研究で使用する。動物は餌を与えた体重および血糖に基づいた群へと無作為化する。動物に、試験開始の１６時間前に媒質またはペプチドアナログ（用量３〜４００μｇペプチド含有量／ｋｇ）を注射する。食物は注射時に除去する。アッセイ前に動物に麻酔（腹腔内フェノバルビタール６５ｍｇ／ｋｇ）し、２つのカテーテルを挿入するが、それらは１つは頚静脈中および他は頚動脈中である。時刻０で、動物に静脈カテーテルを介して０．５ｇグルコース／ｋｇを与える。時刻０（グルコース前）、グルコースチャレンジ後の２、４、６、１０、２０および３０分で頚動脈から血液を回収する。グルコース濃度はグルコメーターによって測定する。インスリンはＭｅｓｏｓｃａｌｅ（登録商標）によって測定する。有効性は、インスリン曲線下の合計面積（＝ｔ＋０から３０分を積分した血漿インスリン値）の増加として測定され、加えて静脈内グルコースチャレンジに後続するグルコースエクスカーションの測定値であるグルコース曲線下の面積を測定した。
【００８５】
実施例３および４の投与は、媒質処理ラットと比較して、インスリンＡＵＣを増加させ、グルコースＡＵＣを減少させた。例えば５０μｇ／ｋｇ用量の実施例３の投与後に、インスリンＡＵＣは５５ｎｇ＊分／ｍＬ（媒質）から１３７ｎｇ＊分／ｍＬへ増加し、グルコースＡＵＣは７８３０ｍｇ＊分／ｄＬ（媒質）から６７８０ｍｇ＊分／ｄＬへ減少した。同様に２００μｇ／ｋｇ用量の実施例３の投与後に、インスリンＡＵＣは５５ｎｇ＊分／ｍＬ（媒質）から１８３ｎｇ＊分／ｍＬへ増加し、グルコースＡＵＣは７８３０ｍｇ＊分／ｄＬ（媒質）から７０２０ｍｇ＊分／ｄＬへ減少した。さらに５０μｇ／ｋｇ用量の実施例４の投与後に、インスリンＡＵＣは４４ｎｇ＊分／ｍＬ（媒質）から１５０ｎｇ＊分／ｍＬへ増加し、グルコースＡＵＣは８０１０ｍｇ＊分／ｄＬ（媒質）から７７３０ｍｇ＊分／ｄＬへ減少した。同様に２００μｇ／ｋｇ用量の実施例４の投与後に、インスリンＡＵＣは４４  ｎｇ＊分／ｍＬ（媒質）から１６１ｎｇ＊分／ｍＬへ増加し、グルコースＡＵＣは８０１０ｍｇ＊分／ｄＬ（媒質）から７４２０ｍｇ＊分／ｄＬへ減少した。
【００８６】
５０μｇ／ｋｇ用量の実施例５の投与後に、インスリンＡＵＣは４１ｎｇ＊分／ｍＬ（媒質）から１３３ｎｇ＊分／ｍＬへ増加し、グルコースＡＵＣは７７３９ｍｇ＊分／ｄＬ（媒質）から７２０２ｍｇ＊分／ｄＬへ減少した。同様に２００μｇ／ｋｇ用量の実施例５の投与後に、インスリンＡＵＣは４１ｎｇ＊分／ｍＬ（媒質）から１２４ｎｇ＊分／ｍＬへ増加し、グルコースＡＵＣは７７３９ｍｇ＊分／ｄＬ（媒質）から７３５１ｍｇ＊分／ｄＬへ減少した。
【００８７】
骨についての効果
実施例４は、６か月齢の卵巣を切除した（ＯｖＸ；Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４４：２００８−２０１５を参照されたい）Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットで評価した。０、２．９、９．７または２９ｎｍｏｌ／ｋｇの用量を、外科手術後９日目に開始する皮下注射としてラットに毎日与えた。処理を３５日間続け、実施例４の用量は、擬似手術のＯｖＸラットと比較して、飼料消費および体重を、応答して最大８％まで減少させた。体重減少は減少した脂肪量のためであり、ＯｖＸラットにおける除脂肪重量に対する変化は観察されなかった。実施例４は、ＯｖＸラットにおける非絶食時血清グルコースおよびトリグリセリドを減少させた。化合物は、用量依存的に骨無機質含量および腰椎の骨無機質密度のＯｖＸ誘導性減量を防止したが、大腿皮質骨中央部では効果がなかった。実施例４は、ＯｖＸラットの大腿骨および腰椎の骨無機質密度または骨無機質含量に悪影響を及ぼさなかった。体重の減量（この研究では８％）が直接骨量に影響を与え得ることに注目されたい。骨強度は負荷依存性であり、重量減量は重量を支える骨に対してより少ない負荷をもたらし、結果としてより少ない効果が、重量（すなわち大腿皮質骨）を支える骨の骨についてのパラメータで観察される。統計的有意性を、一元配置分散分析続いてダネット検定によって評価した。
【００８８】
【表１０】
0005887335.tif 000017
【００８９】
【表１１】
0005887335.tif 000018
【００９０】
表８および９中のデータは、実施例４がＯｖＸラットのＢＭＣおよびＢＭＤを改善することを示す。
【００９１】
本発明の化合物は、様々な経路によって投与される医薬組成物として好ましくは製剤化される。最も好ましくは、かかる化合物は非経口投与のためのものである。かかる医薬組成物およびこれを調製するプロセスは当該技術分野において周知である。例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｔ．ａｌ．編、第１９版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、１９９５年）を参照されたい。
【００９２】
本発明の化合物は、一般的には広い投薬量範囲にわたり効果的である。例えば、１週間あたりの投薬量は、１〜２４ｍｇのペプチドコンジュゲートまたは０．０１４〜０．３４３ｍｇ／体重ｋｇの範囲内である。いくつかの実例では、前記範囲の下限より下の投薬量レベルは適切以上であり得、一方他の実例ではさらに高用量をいかなる有害な副作用を引き起こさずに用いることができ、それゆえ上記の投薬量範囲はいかなる方法でも本発明の範囲を限定するようには意図されない。実際に投与する化合物の量は、治療される病態、選ばれる投与経路、投与される実際の化合物（複数可）、個々の患者の年齢、体重および応答、ならびに患者の症状の重症度を含む、関連状況に照らして医師によって決定されることが理解されるだろう。
【００９３】
本発明の他の修飾は本発明の範囲から逸脱せずに当業者に明らかである。
【配列表】
0005887335000001.app