(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃ反応性蛋白質（ＣＲＰ）の、カテプシンＫ、ＭＭＰ１、ＭＭＰ３またはＭＭＰ９による切断によって形成されるペプチド断片のＣ末端またはＮ末端に形成されるネオエピトープの定量のためのバイオアッセイの方法であって、
前記ペプチド断片を含む尿、血清、血液又は血漿の試料を、前記ネオエピトープに対する特異的結合親和性を有する免疫学的結合パートナーと接触させるステップと、
前記試料中の前記免疫学的結合パートナーのペプチド断片への結合レベルを定量するステップと
を含み、
前記免疫学的結合パートナーが、ペプチド断片のＮ末端に形成される以下のネオエピトープ
【表１】
0006039879.tif 000040
のいずれか１つに対する特異的結合親和性を有し、または、
ペプチド断片のＣ末端に形成される以下のネオエピトープ
【表２】
0006039879.tif 000041
のいずれか１つに対する特異的結合親和性を有する、方法。
【請求項２】
前記免疫学的結合パートナーが、特異的結合親和性を有するモノクローナル抗体またはモノクローナル抗体の断片である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記方法が、前記免疫学的結合パートナー及び競合物質が前記試料の存在下にてインキュベートされ、前記競合物質が試料中のペプチド断片と競合して前記免疫学的結合パートナーと結合する競合イムノアッセイとして行われる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記競合物質が合成ペプチドであるか、前記ネオエピトープが現れるように前記エピトープの由来する蛋白質が切断されることにより形成される精製天然ペプチドである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ペプチド断片のＮ末端に形成される以下のＣＲＰネオエピトープ
【表３】
0006039879.tif 000042
または、ペプチド断片のＣ末端に形成される以下のＣＲＰネオエピトープ
【表４】
0006039879.tif 000043
のいずれか１つに対する特異的結合親和性を有する免疫学的結合パートナー。
【請求項６】
モノクローナル抗体又はその結合断片である、請求項５に記載の免疫学的結合パートナー。
【請求項７】
請求項６に記載のモノクローナル抗体を産生する細胞株。
【請求項８】
請求項５または６に記載の免疫学的結合パートナーと、前記免疫学的結合パートナーに結合する競合物質とを含むイムノアッセイキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アテローム性動脈硬化の進展及びプラーク不安定性から生じる心血管事象のリスクを示す生化学マーカーを含む、心血管疾患の診断目的及び疾患の進展の予後に有益な生化学マーカーの検出のためのアッセイに関する。
【背景技術】
【０００２】
世界的に、心血管疾患（ＣＶＤ）は罹病及び死亡の主因である。現在、診断と患者の異なるリスク群への分類及び低リスク患者の診断を可能にする効果的且つ非侵襲的診断法はない。診断及び予後ツールは、主に、単純なマーカー、例えば、年齢、喫煙並びに種々の脂質及びリポ蛋白質濃度の多変量解析から成る。
【０００３】
ＣＶＤは複数の臨床症候群を包括し、それは主に狭心症、心筋梗塞（冠動脈血栓）及び脳卒中である。通常、これらの症候群はすべて複雑なアテローム性動脈硬化の続発症である。
【０００４】
アテローム性動脈硬化は小児期に内膜肥厚から始まり、動脈内膜における脂肪線条に進行し、これらの病変はそれぞれＩ型、ＩＩ型と特徴付けられる。脂肪線条はアテローム性動脈硬化の進展における最も初期の肉眼で視認可能な病変であり、すべての人種及び社会のすべてのヒトに生じる。非病原性状態では内皮細胞（ＥＣ）は白血球との付着性相互作用に抵抗性である。しかし、アテローム発生時の炎症性サイトカイン及び動脈壁における蓄積酸化リポ蛋白質の作用は、大動脈ＥＣの表面上における接着分子、例えば、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）−１及び血管細胞接着分子（ＶＣＡＭ）−１の発現を引き起こす。これは、白血球の捕捉及び内皮表面を貫通して血管壁の内膜部分への移動を許容する。プラークの発達は、置換やアポトーシスを起こす平滑筋細胞（ＳＭＣ）の増加を伴い、これはマトリックス代謝回転の増加をもたらす。コラーゲン合成の障害は線維性被膜の脆弱性及びより破裂しやすい動脈硬化性プラークをもたらし得るが、大部分の研究者らは、蛋白質分解酵素、例えば、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）及び他のプロテアーゼの作用が、プラークの破裂のリスクに重大に寄与すると考えている（Ｃｌａｒｋｓｏｎ  ａｎｄ  Ｋａｐｌａｎ  ５０９−２８）。
【０００５】
プラークは２つの異なるタイプ、「不安定」及び「安定」プラークに分けられる。しかし、詳細な組織学的分析及び分子的理解のために、より詳細な分類が用いられる場合が多い。プラークの発達には３つの主要な段階、すなわち、初期、脂肪線条、及び、複雑性／進行性プラークがある（Ｓｔａｒｙ  Ｈ．Ｃ．）。
【０００６】
動脈硬化性プラークは動脈内膜内で発達し、その組成及び構造により分類され得る。この分類では病変を８つのタイプに分類する（Ｓｔａｒｙ  Ｈ．Ｃ．）。
Ｉ．脂肪滴に満ち、脂肪滴によって拡大されたマクロファージ（マクロファージ泡沫細胞）が内膜に増加する。
ＩＩ．マクロファージ泡沫細胞が内膜ＳＭＣ内で脂肪滴とともにプロテオグリカン層の深部に蓄積する。泡沫細胞層は脂肪線条として視認可能である。ＩＩ型病変では、単球がヒトアテロームにおいて過剰発現する単球走化性蛋白質（主にＭＣＰ−１）によって内膜を貫通する。病変の初期タイプ（Ｉ型及びＩＩ型）は幼児期に始まり得、必ずしもプラークの破裂には至らない。更に、アテローム性動脈硬化の発達はＩＩＩ型病変の形成後に終了し得、プラークの形成は予測可能ではない（Ｓｔａｒｙ  Ｈ．Ｃ．）。
ＩＩＩ．ＩＩＩ型病変は脂肪線条（ＩＩ型）とアテローム（ＩＶ型）との中間病変として判定される。これらの病変は細胞外脂質のプールを含み、これにより、内膜の筋弾性層の通常密接に隣接しているＳＭＣ間の空間を拡張する。物質のプールは通常ここに存在するプロテオグリカン及びコラーゲン線維に取って代わり得るが、これはアテローム発生のこの段階においてほとんど影響なく生じる。
ＩＶ．アテロームはアテローム性動脈硬化の最初の臨床徴候である。脂質の蓄積細胞外プールによる動脈内膜におけるＳＭＣの移動及び内膜構造の崩壊が、ＩＶ型病変の顕著な特徴である。脂質コアの形成は、このＳＭＣ移動の最終結果である。脂質コアの形成は壁肥厚の増大の説明となる。脂質コアは深部内膜の大きな明瞭な輪郭をした領域であり、この動脈壁部分の通常の構造要素が高密度の泡沫細胞残遺物、遊離脂肪滴、コレステロール結晶及びカルシウム粒子に置換されている。通常、この領域に存在するＳＭＣは、アテローム性動脈硬化のこの段階において減少し、又は完全に消失する。残遺ＳＭＣは広範に分散し、伸長細胞体及び、多くの場合、異常に厚い基底膜を生成している。この段階では脂質コアを覆う層の発達が始まる。この層はコラーゲン／プロテオグリカンに富む細胞間マトリックス、脂肪滴を有する又は有しないＳＭＣ、マクロファージ及び泡沫細胞から成る。
Ｖ．ＩＶ型病変に対する応答は、線維性「被膜」を形成する修復線維組織マトリックスの形成である。通常、これらの病変は脂質コア及び不規則に積み重なり合った修復組織の層から成る。血腫及び血栓形成のような事象がこれらのタイプの病変を更に複雑にし得る。致死的ではない場合、これらの病変合併症は病変に組み込まれ、コラーゲン及びプロテオグリカンから成る修復マトリックス組織の薄層に覆われる。細胞外マトリックス蛋白質であるコラーゲン及びプロテオグリカンの含量は被膜の形成時に動脈硬化性プラークにおいて増加する。
ＶＩ．内皮の異常、例えば、亀裂、びらん、潰瘍、血腫、血栓、出血は、組み合わされると、ＶＩ型病変と命名されるより複雑な病変型となり得る。
ＶＩＩ．病変は石灰化病変と称される場合が多く、病変の５０％超がミネラルから成る。石灰化に加え、これらの病変は大量の修復線維結合組織を含む。ここに閉じ込められたＳＭＣがアポトーシスを受けて分解すると、その石灰化小器官は石灰化の一部になる。
ＶＩＩＩ．線維性病変が石灰性病変に続く。線維性病変は完全にコラーゲンから成り脂質を含み得ない（Ｓｔａｒｙ  Ｈ．Ｃ．）。
【０００７】
心血管事象はプラークの破裂の結果である場合が多く、炎症及びプロテアーゼの放出が線維性被膜の肩領域を弱体化させ、プラークにおける脂肪質が壁在血栓を誘発する血液と接触することを許容する（Ｃｌａｒｋｓｏｎ  ａｎｄ  Ｋａｐｌａｎ）。マトリックス生成の減少と併せたプロテアーゼ活性の増大による線維性被膜の菲薄化がプラーク不安定性の顕著な特徴であると考えられ、破裂のリスクを高める。プラークの不安定性及びその破裂リスクは臨床的に興味深い分野である。不安定プラーク（ＶＰ）の定義は標準化されていないが、安定プラークと比べて３つの組織学的特徴の存在を明言する一般的な見解の一致がある。
１）大きい脂質コア（総病変の４０パーセント超）
２）薄い線維性被膜（６５〜１５０マイクロメートル）
３）大量の急性炎症細胞
ＶＰを定義するための主な基準には、活発な炎症（単球、マクロファージ及びＴ細胞の存在）、大きい脂質コアを有する薄い被膜、表在血小板凝集を伴う内皮の裸出、亀裂プラーク及び動脈の９０％超の狭窄が含まれる。他の細かい基準には、表在石灰化結節、プラーク内出血、内皮機能障害及び外側の再構成が含まれる（Ｓｈｉｎ，Ｅｄｅｌｂｅｒｇ，ａｎｄ  Ｈｏｎｇ）。
【０００８】
プラーク合併症、不安定及び破裂は、医療処置及び／又は生活様式の変更によって抑制され得る。しかし、場合により、より侵襲的な方法、即ち、血管形成術又はバイパス手術が必要であり得る。
【０００９】
現在、診断ツールは、依然として開発中である静止画像解析又はＣＶＤリスクに関連する収縮期・拡張期血圧レベルのような低技術法に基づく。当該分野では高リスクにある患者をより良く同定し得る多変量解析の開発に多大な関心を向けてきた。そのようなモデルの１つがＳＣＯＲＥモデル（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｃｏｒｏｎａｒｙ  Ｒｉｓｋ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎモデル）である。１９９４年に、そして２００３年に改訂されたのであるが、欧州アテローム性動脈硬化学会（Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  Ｓｏｃｉｅｔｙ）、欧州心臓病学会（Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ）及び欧州高血圧学会（Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ）は、冠動脈心疾患の予防に関する一組の推奨を公表した。このガイドラインは、無症状の患者におけるＣＶＤリスクを評価するために、即ち、無症状の高リスク患者の同定のために開発された複数の評価法に基づく。ＳＣＯＲＥモデルは、性別、年齢、喫煙、収縮期血圧及び総コレステロール若しくはコレステロール／ＨＤＬ比をリスク因子として一体化している（Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．）。
【００１０】
より詳細な診断を行うためにはＳＣＯＲＥモデルは十分ではなく、撮像法が用いられる。従って、撮像法は主に高リスク群の患者又は研究期間中に用いられる。
【００１１】
＜撮像法＞
現在、冠動脈造影法（ＣＡＧ）は狭窄の程度を判定するための判断基準となる撮像法である。ＣＡＧは二次元にて血管腔を撮像するが、血管腔のみに限定され、血管壁を撮像しないため、ＣＡＧは安定プラークを有する動脈と不安定プラークを有する動脈とを識別することができない。ＣＡＧは患者が手術（血管形成術又はバイパス手術）を必要とするかを判定するために用いられる場合が多い。血管の狭窄箇所が進行したプラークであるかを判定するためには、他の手法、即ち、血管内冠動脈超音波（ＩＶＵＳ）又は血管顕微法が必要である。
【００１２】
ＩＶＵＳはプラーク及び血管壁の二次元断面画像を提供し、血管壁及び形態及び石灰化の程度の特徴付けには良好であるが、病変における脂質を評価するには不向きな方法であると考えられている。しかし、ＩＶＵＳは侵襲的であり、専門知識及び費用を必要とするため、その使用は広まっていない。血管顕微法はアテローム性動脈硬化を理解・同定するのに有用なもう１つの方法である。血管顕微法はプラーク表面の直接的可視化であり、プラークの色及び血栓を検出する能力を有する。しかし、血管顕微法は侵襲的で技術的に困難であり、これまでプラークの拡張の程度を検出することができていない。現在多くの関心を引いているもう１つの撮像法は磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）である。ＭＲＩは非侵襲的であり、脳卒中の高リスクにある頸動脈プラークを同定することができる。一方、小さいプラークサイズ及び冠動脈の位置のため、ＭＲＩは冠動脈を撮像するのに最適な手法ではない。他の撮像法、即ち、エラストグラフィ、サーモグラフィ及び光干渉断層撮影が開発中である（Ｓｃｈａａｒ  ｅｔ  ａｌ．）。
【００１３】
前述の撮像法はすべて開発中であり、単独ではいずれも不安定プラークを同定することができないが、破裂前に分子事象及びプラーク代謝回転を理解するのに有用なツールである。現在、早期においてＣＶＤを診断する唯一の機会は、問題となっている患者及びその患者の近親者の確立された冠動脈心疾患、末梢動脈疾患及び脳血管アテローム性動脈硬化症の一連のリスク因子を用いることである。
【００１４】
＜現在の生化学マーカー＞
現在、アテローム性動脈硬化のリスク因子としていくつかの生化学マーカーが公知である。最近、血清中の生化学マーカー濃度の測定に多くの関心が向けられている。脂質、例えば、総コレステロール、低比重リポ蛋白コレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）及び高比重リポ蛋白コレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）並びに炎症マーカー、例えば、Ｃ反応性蛋白質（ＣＲＰ）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン１８（ＩＬ−１８）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）など。
【００１５】
リポ蛋白質の中で少なくとも２つの注目すべき進展があった。ＬＤＬ粒子のサイズがアテローム性動脈硬化の進行を予測するように思われる。小さいＬＤＬ粒子の濃度上昇が大きい粒子の濃度上昇よりＣＶＤリスクに関連する（Ｇａｒｄｎｅｒ，Ｆｏｒｔｍａｎｎ，ａｎｄ  Ｋｒａｕｓｓ）。
【００１６】
ＨＤＬ−Ｃのレベルはトリグリセリドに強く関連し、高レベルのトリグリセリドはＣＨＤのより高いリスクと相関する。Ｊｅｐｐｅｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）によるコホート研究は、高ＴＧ／低ＨＤＬ−ＣがＩＨＤ（虚血性心疾患）の最大のリスク因子であることを見出した（Ｊｅｐｐｅｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．）。
【００１７】
脂質プロファイルはリスク因子の評価に重要であるが、プラーク代謝回転と関連する分子事象の理解及び測定を可能としない。多くの生化学マーカーがＣＶＤのリスク因子として示唆されているが、疾患の具体的な産物ではない。これらにはＣＲＰ及び骨ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）が含まれる（表１参照）。表１はＣＶＤの公知のマーカーの一部を概述している。
【００１８】
【表１】
0006039879.tif 000002
【００１９】
従って、心血管事象のマーカーとして一連の異なる生化学マーカーが示唆されている。Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ（２００６）は、表１に示される、Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ研究に参加した３２００人の患者における１０個の異なる生化学マーカーを測定した。その結論は、１０個の生化学マーカーの測定が標準的なリスク因子に加えて診断に適度に寄与するのみであるというものであった。１０個の生化学マーカーの中でＢ型ナトリウム利尿ペプチドレベル、Ｃ反応性蛋白質レベル及び尿中アルブミン／クレアチニン比がマーカーと死亡／心血管事象との最大の相関を示した（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）。
【００２０】
＜Ｃ反応性蛋白質＞
Ｃ反応性蛋白質（ＣＲＰ）は、異なる臨床状態、例えば、炎症、感染又は外傷に応答して肝臓によって産生される急性期血清蛋白質である（Ｇａｂａｙ  ＆  Ｋｕｓｈｎｅｒ  １９９９）。ＣＲＰの産生は罹患又は損傷組織から放出されるＩＬ−６のようなサイトカインに誘発される。ＣＲＰの生理学的役割は未知であり、その炎症促進又は抗炎症作用に関する議論は進行中である。
【００２１】
ＣＲＰがヒトにおけるＣＶＤのリスク因子であるという証拠が蓄積している。Ｒｉｄｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００２による研究では、急性心筋梗塞、脳卒中、冠血行再建又はＣＶＤによる死亡の発生について８年間追跡した２８，０００人の健常女性から成る大集団において、ＣＲＰはＬＤＬコレステロールより優れた将来の心血管事象の予測因子であることが示された。他の多くの研究もベースラインのＣＲＰレベルが心血管事象の独立したリスク因子を構成することを報告している（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９５，Ｍｅｎｄａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．１９９６，Ｋｕｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９６，Ｒｉｄｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９７，Ｔｒａｃｙ  ｅｔ  ａｌ．１９９７，Ｒｉｄｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０００）。
【００２２】
循環ＣＲＰはアテローム性動脈硬化プロセスにおいて生じる全般的な炎症を反映するだけであって、疾患の発病における能動的な構成成分ではないと推測されている。しかし、また、一連の証拠はＣＲＰがアテローム発生に役割を有するという見解を支持している。第一に、ＣＲＰを生じさせる慢性感染症もＣＶＤの増大リスクと関連する（Ｌｅｉｎｏｎｅｎ  ＆  Ｓａｉｋｋｕ  ２００２）。第二に、本発明者らは異なるレベルのアテローム性動脈硬化病変においてＣＲＰを同定した（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ  ＆  Ｖａｎｃｅ  １９８７，Ｈａｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．１９９５）。最後に、ＣＲＰはｉｎ  ｖｉｔｒｏにてアテローム発生促進特性を有することが示されている：ＣＲＰは内皮細胞を活性化して接着分子を生成し得る（Ｐａｓｃｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．２０００）。また、ＣＲＰは内皮細胞におけるｅＮＯＳの生成を減少させ（Ｖｅｎｕｇｏｐａｌ  ｅｔ  ａｌ．２００２）、マクロファージによるＬＤＬの取込みを増進し得る（Ｚｗａｋａ  ｅｔ  ａｌ．２００１）。
【００２３】
＜脳性ナトリウム利尿ペプチド＞
脳性（Ｂ型）ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）は、心室における心筋細胞の過度の伸張に応答して心室によって分泌されるペプチドホルモンである。Ｔ−ｐｒｏＢＮＰ（不活性Ｎ末端断片）は活性ホルモン（ＢＮＰ）とともにｐｒｏＢＮＰの切断と同時に血流に放出される。ＢＮＰ及びＮＴ−ｐｒｏＢＮＰは心血管事象の潜在的生化学マーカーとして示唆されている（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）。
【００２４】
＜ケモカイン＞
ケモカインもＣＶＤの潜在的マーカーである。ケモカインは炎症時に産生される低分子量サイトカインである。ＣＶＤに関連する１つの主要なケモカインは単球走化性蛋白質−１（ＭＣＰ−１）である。ＭＣＰ−１はアテローム性動脈硬化病変への単球の動員に初期の重要な役割を果たすように思われる。アテローム性動脈硬化のサルモデルを用いた研究では、ＭＣＰ−１の血漿濃度はプラークサイズ及びプラーク合併症と高度に関連していた（Ｒｅｇｉｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）。
【００２５】
＜コレステロールを含む脂質＞
最近、血清中のコレステロール濃度の測定に多くの関心が向けられている（総コレステロール並びに低比重リポ蛋白コレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）及び高比重リポ蛋白コレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）の濃度）。リポ蛋白マーカーの中で少なくとも２つの注目すべき進展があった。第一に、ＬＤＬ粒子サイズからアテローム性動脈硬化の進行の程度が予測されるように思われる。小ＬＤＬ粒子の濃度上昇は、大粒子の濃度上昇よりＣＶＤリスクに関連する（Ｇａｒｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ）。第二に、ＬＤＬ粒子のオレイン酸コレステリル含量はＣＶＤリスクの特に重要なマーカーになり得る。サルにおいて、オレイン酸コレステリルを有するリポ蛋白粒子コアの高濃度化は、より重度の冠動脈アテローム性硬化と強く且つ正に関連し（Ｒｕｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ）、ＬＤＬ及びＨＤＬコレステロール濃度の寄与に相加的であった。実験動物におけるこれらの知見は、低比率のリノール酸コレステリル（逆に、高比率のオレイン酸コレステリル）を有する血漿リポ蛋白質が正常な対照と比べてＣＨＤ（冠動脈心疾患）の合併症を有する患者に典型であることを示した従前のヒト研究（Ｌａｗｒｉｅ  ｅｔ  ａｌ）によって更に支持される。
【００２６】
ＨＤＬ−Ｃのレベルはトリグリセリドと強く関連し、高レベルのトリグリセリドはＣＨＤのより高いリスクと相関する。Ｊｅｐｐｅｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ）によるコホート研究は、高ＴＧ／低ＨＤＬ−ＣがＩＨＤ（虚血性心疾患）の最大のリスク因子であることを見出した。
【００２７】
これらの脂質プロファイルはリスク因子の評価に重要であるが、プラーク代謝回転と関連する分子事象の理解及び測定を可能としない。多くの生化学マーカーがＣＶＤのリスク因子として示唆されているが、これらは疾患の具体的な産物ではない。これらにはＣＲＰ及びＡｐｏＥが含まれる。
【００２８】
＜リポ蛋白質＞
ＣＶＤを予測するために最も一般的に用いられるバイオマーカーは、コレステロール濃度である（総コレステロール及びコレステロール／ＨＤＬ比）。これらは他のリスク因子、例えば、血圧及びＬＤＬレベルとともに用いられる。前述のＳＣＯＲＥモデルでは両方の因子が用いられる。ＬＤＬは血中にコレステロールを輸送し、酸化ＬＤＬの蓄積はアテローム性動脈硬化を促進し得るため、ＬＤＬレベルは重要である（Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ）。加えて、ＣＨＤとトリグリセリド（ＴＧ）レベルとの有意な関連が見出され、ＣＨＤの増大リスクはＬＤＬ−Ｃ及びＨＤＬ−Ｃレベルから独立して増大ＴＧレベルと関連したが、コレステロールレベルはＣＶＤの主要なリスク因子の１つであると見なされる（Ｊｅｐｐｅｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ）。
【００２９】
＜ＡＰＯ−Ｅ＞
アポリポ蛋白質Ｅはカイロミクロン、ＶＬＤＬ及びＨＤＬに見出される。アポリポ蛋白質Ｅは主に肝臓で合成されるが、他の多くの臓器、例えば、脳、脾臓、腎臓でも合成される（Ｓｉｅｓｔ  ｅｔ  ａｌ．１９９５）。ＡｐｏＥは２つの受容体（ＬＤＬ受容体及びＡｐｏＥ特異的カイロミクロンレムナント受容体）のリガンドとして作用することによってリポ蛋白代謝に重要な役割を果たす。ＡｐｏＥとこれらの受容体との相互作用はコレステロールの代謝調節の基盤を付与する。ａｐｏＥ遺伝子座における遺伝子多型は３つの対立遺伝子（６つのａｐｏＥ表現型を決定するε２，ε３及びε４）が大部分の集団に見出されることとなる。アイソフォームは１１２及び１５８位において１つのアミノ酸だけ互いに異なる。ＡｐｏＥ２は両方の残基においてシステインを有し、Ｅ４は両方の位置においてアルギニンを有する。ＡｐｏＥ３は１１２位においてシステインを、１５８位においてアルギニンを含む。対立遺伝子頻度は様々な集団において異なる。研究の中にはａｐｏＥ多型とアテローム性動脈硬化との関連の可能性を評価したものがある。１４の観察研究のメタアナリシスではε４対立遺伝子が男女の間で冠動脈疾患と関連することを示した（Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９６）。更に、ε４対立遺伝子は頸動脈アテローム性硬化と関連している（Ｔｅｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．１９９６，Ｃａｔｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９７，Ｈａｒａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．２００２）。
【００３０】
ＡｐｏＥは２９９アミノ酸長であり、リポ蛋白質、脂溶性ビタミン及びコレステロールをリンパ系へ、更には血液循環へ輸送する。ＡｐｏＥは主に肝臓で合成される。現在、保存低比重リポ蛋白受容体遺伝子ファミリーに属するＡｐｏＥの哺乳動物受容体は７つある。
【００３１】
＜更なる生化学マーカー＞
微量アルブミン尿（Ｍｉｃｒｏａｌｂｕｍｉｎｕｒｅａ）（アルブミン／クレアチニンレベル）も潜在的な独立したマーカーである。尿中アルブミン排泄率は腎臓の変化のマーカーであり、クレアチニンの微量の上昇と比べてアテローム性動脈硬化を示し得る（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）。
【００３２】
プロコラーゲンマーカーの中でＩＩＩ型コラーゲン代謝回転速度のマーカー（ＰＩＩＩＮＰ）は高血圧の予後マーカーとして研究され、心筋梗塞と関連している。Ｓａｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．は腹部大動脈瘤（ＡＡＡ）と血中プロコラーゲン（ＰＩＩＩＮＰ）の濃度との相関を検討した。彼らは、ＩＩＩ型コラーゲン代謝回転がＡＡＡ患者において増加し、増進した合成、増進した分解又は両方の組合せによるものであり得ることを示した。同じ実験において、Ｉ型プロコラーゲン（ＰＩＣＰ）のカルボキシ末端プロペプチドが測定され、動脈瘤嚢にＩ型コラーゲンの加速度的な合成はなかった。
【００３３】
＜プラークの蛋白質プロファイル＞
ヒト動脈はより大きい若しくは弾性の動脈、中間若しくは筋性の動脈並びに小動脈に分けられ得る。血管壁は内弾性板及び外弾性板によって分離された内膜、中膜及び外膜から成る。内膜は結合組織、平滑筋細胞及び少数の分離マクロファージから成る。内膜の境界は内皮の管腔表面と内弾性板との間の層と定義され得る。
【００３４】
動脈内膜は更に２つの層に分けられ得る。プロテオグリカン層と称される内層は豊富なプロテオグリカン、平滑筋細胞及びマクロファージから成る。下層、筋弾性層は豊富な平滑筋細胞及び弾性線維から成る。通常の状態では内膜の２つの層は光学顕微鏡によってどうにか視認可能であるが、内膜肥厚が生じると明確且つ著明である。中膜は動脈壁の筋部分であり、平滑筋細胞、エラスチン、コラーゲン原線維から成る。
【００３５】
外膜、外層は高度に微小血管であり、コラーゲン、弾性線維、平滑筋細胞及びリンパ管を含む。
【００３６】
ヒト動脈硬化性プラークは、線維状コラーゲン、エラスチン、プロテオグリカン及びＳＭＣから成る線維性被膜に覆われた脂質に富むコアを特徴とする。プロテオグリカンヒアルロナンは、事象、例えば、脂質蓄積、血栓及び細胞増殖・移動を調節し、また、組織の物質特性に作用することによって病変発達に作用する可能性を有する細胞外マトリックスの主要な非線維状構成成分である（Ｗｉｇｈｔ  １９９５）。浸潤ＡｐｏＥ及びＣＲＰも存在し、本発明者らは、アテローム性動脈硬化症の異なる段階において冠動脈の動脈硬化性プラークにおいて両方の局在を示した。？？参照
【００３７】
＜ヒトにおけるＡｐｏＥ及びＣＲＰの分布＞
下記の表２はヒト体内のＡｐｏＥ及びＣＲＰの分布を示す。
【００３８】
【表２】
0006039879.tif 000003
【００３９】
下記の表３は、ｉｎ  ｖｉｖｏ及び／又はｉｎ  ｖｉｔｒｏにて示されるＡｐｏＥ及びＣＲＰと蛋白質との公知の相互作用を示す。
【００４０】
【表３】
0006039879.tif 000004
【００４１】
＜ヒトにおけるコラーゲンの分布＞
コラーゲンはヒトの身体に広範に分布し、即ち、ヒトの身体における蛋白質の質量の約３０％はコラーゲンから成る。表４に主要なコラーゲンタイプがその主要な組織分布ととともに一覧されている。
【００４２】
【表４】
0006039879.tif 000005
【００４３】
Ｉ型コラーゲンは最も豊富なコラーゲンであり、大部分の結合組織に見出される。Ｉ型コラーゲンは特に骨及び皮膚の構造に重要である。ヒトの身体におけるコラーゲンの主要含量は骨及び皮膚に分布し、主要なコラーゲン成分はＩ及びＩＩＩ型コラーゲンである。ＩＩＩ型コラーゲンは大動脈の主要構成成分であり、Ｉ型コラーゲンに富む組織にもより少ない量にて見出される。加えて、ＩＶ型コラーゲンは基底膜及び血管・神経周囲に見出される。Ｖ型コラーゲンの最も一般的な局在は、Ｉ及びＩＩＩ型コラーゲンと関連して特徴的なコラーゲン原線維内である（Ｇａｒｒｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ）。
【００４４】
一部のコラーゲンは限定された組織分布を有し、例えば、ＩＩ型はほとんど軟骨に見出される（Ｍａｙｎｅ  Ｒ．）。
【００４５】
コラーゲン原線維は２つ以上のコラーゲンタイプから成る場合が多い。例えば、Ｉ型コラーゲン原線維は少量のＩＩＩ，Ｖ及びＸＩＩ型を含む場合が多く、一方、軟骨のＩＩ型コラーゲン原線維はＩＸ及びＸＩ型も含む。
【００４６】
＜動脈におけるコラーゲン＞
動脈には６つのタイプのコラーゲンが見出され（Ｉ，ＩＩＩ，ＩＶ，Ｖ，ＶＩ及びＶＩＩＩ型）、Ｉ及びＩＩＩ型が最も豊富であり、コラーゲン含量の８０〜９０％である。Ｉ及びＩＩＩ型は血管壁でも最も多い。Ｉ及びＩＩＩ型は動脈壁の３つのすべての層内に異なる量にて共分布しているように思われ、Ｉ及びＩＩＩ型コラーゲンの合成は内膜に位置している傾向にある（Ｍａｙｎｅ  Ｒ）。
【００４７】
＜プラークにおけるコラーゲン及び他の構造蛋白質の代謝回転＞
動脈硬化性プラークの発達の間、コラーゲンが線維性被膜に蓄積する（Ｓｔａｒｙ  Ｈ．Ｃ．）。Ｋａｔｓｕｄａ  ｅｔ  ａｌ（１９９２）による研究では、Ｉ，ＩＩＩ及びＩＶ型コラーゲンがヒト大動脈組織における病変のすべての段階において肥厚内膜において見出された。ＶＩ型コラーゲンが内膜細胞の領域における基底膜に分布し、進展した病変では伸長ＳＭＣ周囲にも検出された。Ｉ及びＩＩＩ型の従前の研究はアテローム硬化性動脈壁における同等の分布のエビデンスを提供している（Ｓｈｅｋｈｏｎｉｎ  ｅｔ  ａｌ）。ＭｃＣｕｌｌａｇｈ  ｅｔ  ａｌ（１９８０）によれば、ＩＩＩ型が正常なヒト大動脈中膜において最も多いコラーゲンである（抽出可能なコラーゲンの約７０％）。Ｅｒｉｋｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ（２００６）による最近の研究は、狭窄の程度に依存するヒト大動脈弁における総コラーゲン含量の減少を見出した。狭窄の分子機構は、アテローム性動脈硬化に類似すると考えられている。健常な大動脈弁では、コラーゲン含量は主にＩ及びＩＩＩ型である。狭窄の間、コラーゲンの総含量は減少し、それはおそらくＩ型コラーゲンの代謝回転の増大によって生じる。Ｉ型コラーゲンは総コラーゲンの約６０〜７０％を占め、一方、ＩＩＩ型コラーゲンの割合は健常弁及び石灰化弁において３０〜４０％であった。
【００４８】
Ｖ型コラーゲンも、進展したアテローム性動脈硬化病変において増加し、大動脈中膜及びプラークの内皮下領域において、細胞外マトリックス全体にわたって分布する（ＭｃＣｕｌｌａｇｈ  ｅｔ  ａｌ）。
【００４９】
動脈硬化性プラークに見出される主なコラーゲンタイプは、Ｉ及びＩＩＩ型であるという見解の一致があるように思われ、それらが健常血管及びアテローム硬化性血管において同等に分布しているかは更に研究される必要がある。
【００５０】
Ｋａｔｓｕｄａ  ｅｔ  ａｌ（１９９２）による研究では、より進展した病変のアテロームの中心部にコラーゲンは検出されなかった。
【００５１】
＜エラスチン＞
エラスチンは身体において最も安定な蛋白質の１つであり、その弾性及び弾力によって生じる大部分の結合組織に見出される。エラスチンは動脈壁の蛋白質含量を独占し、主要な細胞外マトリックス蛋白質である。
【００５２】
エラスチンは弾性線維における主な構成成分であり、石灰化に関連する。血管石灰化は血管壁内の２つの異なる部位（内膜及び中膜）において生じる。内膜石灰化は主に壊死性コア内にてアテローム性動脈硬化に関連する。石灰化弾性線維はプラークが最も破裂しやすいプラーク肩部を構成し、弾性線維の石灰化がプラーク安定性に作用し得ることを示唆している（Ｂｏｂｒｙｓｈｅｖ  Ｙ．Ｖ．）。アテローム性動脈硬化では、弾性線維の含量は脂質沈着とともに減少し、これはエラスチン分解酵素に対する感受性の亢進を生じさせる。これにより、コラーゲンとは対照的に、エラスチンの含量は、病変が発達するにつれて減少する。
【００５３】
＜ヒトにおけるエラスチンの分布＞
表５はヒトの身体におけるエラスチンの分布を示す。
【００５４】
【表５】
0006039879.tif 000006
【００５５】
表６はｉｎ  ｖｉｖｏ及び／又はｉｎ  ｖｉｔｒｏにて示されるエラスチンと蛋白質との公知の相互作用を示す。
【００５６】
【表６】
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【００５７】
＜マトリックス構成成分としてのプロテオグリカン＞
プロテオグリカン（ＰＧ）は、主に血管壁の細胞間マトリックスに局在する多糖蛋白質である（Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ  ａｎｄ  Ｗａｇｎｅｒ  １９８１）。ＰＧは、結合領域を通じてコア蛋白質に共有結合したＧＡＧと称される１つ以上の長い非分岐高ポリアニオン糖側鎖の存在を特徴とする高分子である。ＧＡＧの反復単位は、アミノ糖（Ｎ−アセチル−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）又はＮ−アセチル−ガラクトサミン（ＧａＩＮＡｃ））及びヘキスロン酸（グルクロン酸（ｇｌｕｃｏｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）（ＧｌｃＡ）又はイズロン酸（ＩｄｏＡ））から成る。反復単位における糖の一方又は両方は１つ以上の硫酸基を含む（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｌｅｅ  ２００７）。ＧＡＧ鎖に加え、大部分のコア蛋白質はＮ−及び／又はＯ−結合オリゴ糖を保有する。
【００５８】
＜ＰＧの分類及び命名＞
ＰＧは高分子の極めて異質の群である。単一タイプのコア蛋白質は結合ＧＡＧ鎖の数及びタイプの点で異なり得る。鎖長及び鎖に沿った硫酸化残基の構成も異なる。
【００５９】
反復二糖類単位の構造によってＧＡＧの４つの主なクラスが識別される。コンドロイチン硫酸（ＣＳ）及びデルマタン硫酸（ＤＳ）、ヘパリン硫酸（ＨＳ）及びヘパリン、ヒアルロナン並びにケラチン硫酸（ＫＳ）。
【００６０】
ヒアルロナンはＧＡＧの最も単純なものである。他のすべてと対照的に、ヒアルロナンは硫酸化糖を含まない。その二糖類単位はすべて同一であり、その鎖長は膨大であり、ヒアルロナンはコア蛋白質に結合していない。
【００６１】
ＫＳは硫酸化ポリラクトサミン鎖である。ＫＳ−Ｉは元々角膜において説明され、コア蛋白質においてアスパラギン残基にＮ結合し、一方、ＫＳ−ＩＩ又は軟骨ＫＳはセリン又はスレオニン残基にＯ結合している（Ｆｕｎｄｅｒｂｕｒｇｈ  ２０００）。
【００６２】
ＰＧはいくつかのパラメータによって分類され得る。
結合ＧＡＧ鎖（ＣＳ／ＤＳ−又はＨＳ含有ＰＧ）
細胞に関する組織分布（細胞外及び基底膜ＰＧ、細胞結合ＰＧ又は細胞内ＰＧ）
コア蛋白質相同性（ヒアレクタン（ｈｙａｌｅｃｔａｎ）、小さなロイシンに富むＰＧ（ＳＬＲＰ）
【００６３】
コンドロイチン／デルマタン硫酸ＰＧ（バーシカン、アグリカン、ニューロカン及びブレビカン）はヒアルロナン結合プロテオグリカンのファミリーに属する。この遺伝子ファミリーは集合的にヒアレクタン（ｈｙａｌｅｃｔａｎ）と称される。各ファミリーメンバーは特徴的な分布を有し、アグリカンは軟骨において顕著であり、ニューロカン及びブレビカンは中枢神経系において顕著であり、バーシカンは血管壁を含む様々な軟組織に存在する。バーシカンの遺伝子及び蛋白質構造はドメインテンプレートに従う。アミノ末端球状末端（Ｇ１）はＧＡＧヒアルロナンに結合し、カルボキシ末端球状ドメイン（Ｇ３）は、２つの上皮増殖因子（ＥＧＦ）ドメイン及び補体調節領域に隣接するＣ型レクチンから成る蛋白質のセレクチンファミリーに類似する。バーシカンコア蛋白質の中央領域は、バーシカンのＣＳ結合領域を指定する２つの大きなエクソンにコードされる。エクソン７にコードされる領域はαＧＡＧと称され、一方、エクソン８にコードされる領域はβＧＡＧと称される。バーシカンの選択的スプライシングから４つのｍＲＮＡ転写物が生じ、コア蛋白質の長さ及び結合ＧＡＧの数が異なるＶ０，Ｖ１，Ｖ２及びＶ３を生じさせる（Ｄｏｕｒｓ−Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ）。ヒトバーシカンにおける潜在的ＧＡＧ結合部位の数は、Ｖ０では１７〜２３、Ｖ１では１２〜１５、Ｖ２では５〜８、Ｖ３では０である（Ｗｉｇｈｔ  ６１７−２３）。
【００６４】
デコリン及びバイグリカンは、３つのクラス（Ｉ，ＩＩ及びＩＩＩ）及び異なるサブファミリーに分類される少なくとも９つのメンバーを含むＳＬＲＰファミリーのメンバーである。それらはすべて、強い蛋白質−蛋白質相互作用を成すロイシンに富むリピートを含む中央ドメインの強い存在を成すロイシンに富むリピートを含む中央ドメインの存在を特徴とする。デコリン及びバイグリカンはクラスＩのメンバーであり、ファミリーの中で最も高い相同性を示し（約５７％）、プロペプチドを有する唯一のＳＬＲＰである。プロペプチドは種にわたって高度に保存され、ＧＡＧ鎖の合成に関与する最初の酵素であるキシロシルトランスフェラーゼの認識配列として機能し得る。
【００６５】
バーシカン、デコリン及びバイグリカンは、哺乳動物動脈壁のマトリックスにおける主要なＣＳ／ＤＳ  ＰＧである（Ｗｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．１９８６）。バーシカンＶ０コア蛋白質のサイズは３７０ｋＤａであり、３６ｋＤａのデコリン及び３８ｋＤａのバイグリカンよりほぼ１０倍大きい。側鎖は広範なサイズを示すが、概して各々平均約４０〜９０ｋＤａである。
【００６６】
ヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）は、細胞結合及び細胞周囲ＰＧの５つの異なるクラスに分類され、哺乳動物細胞表面、基底膜及びＥＣＭのＨＳの少なくとも９５％を占める。細胞結合ＨＳＰＧは膜内在性シンデカン及び固着グリピカンを含む。細胞周囲ＨＳＰＧは主にパールカン、アグリンを含む。これらのＰＧは、インテグリンを介した細胞膜との密接な関連のために細胞周囲型と称される（Ｗｈｉｔｅｌｏｃｋ  ａｎｄ  Ｉｏｚｚｏ）。
【００６７】
パールカンは、ほぼすべての基底膜並びに間葉系臓器及び結合組織に発現するモジュラーＨＳＰＧであり、脊椎及び無脊椎動物に見出される最大の単鎖ポリペプチドの１つである。パールカンの５つのモジュール及びそのＨＳ側鎖は、例えば、線維芽細胞増殖因子２、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）及び他のマトリックス蛋白質との多数の分子相互作用に関与する。ヒトパールカンのコア蛋白質は約４７０ｋＤａであり、多くのＯ結合オリゴ糖及び４本のＨＳ側鎖とともに８００ｋＤａを超える分子量に達し得る（Ｋｎｏｘ  ａｎｄ  Ｗｈｉｔｅｌｏｃｋ）。
【００６８】
＜プロテオグリカンの分布＞
プロテオグリカン（ＰＧ）はヒトの身体のほぼあらゆる部位に分布する高分子である。ＰＧの構造及びサイズは極めて異なる。すべてのＰＧの基本構造はコア蛋白質及び少なくとも１つであるが、多くの場合、多くの炭水化物鎖、すなわちグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）を含む。ＰＧは細胞内、細胞表面及び細胞外マトリックスに見出され得る。ＰＧの構造多様性は多くの生物学的機能を示唆するものであり、表７を参照されたい。
【００６９】
【表７】
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【００７０】
＜動脈におけるプロテオグリカン＞
少なくとも５つのタイプのＰＧが動脈壁の細胞外マトリックスに存在する。ヒアルロナンと相互作用して大凝集体を形成するバーシカン；コラーゲン及びエラスチンのような原線維マトリックス構成成分と相互作用する、小さいロイシンに富むデコリン及びバイグリカン；基底層の構成成分であるヘパラン硫酸−パールカン並びにケラチン硫酸−ルミカン（Ｔａｌｕｓａｎ  ｅｔ  ａｌ．）。
【００７１】
バーシカンはアテローム性動脈硬化病変に蓄積するいくつかのＥＣＭ分子の１つである。多くの研究が、バーシカンが明らかにＬＤＬに結合することができることを示すが、概して、バーシカンは壊死性コアの脂質に富む中央部には検出されない（Ｅｖａｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ．）。
【００７２】
ルミカンはマクロファージに直接結合し、且つマクロファージの移動を増進することが示されている。従って、ルミカンは血管内膜におけるマクロファージの挙動に影響を及ぼすとともに、進展したアテローム性動脈硬化病変の特徴を示す壊死性コアの形成を刺激し得る（Ｆｕｎｄｅｒｂｕｒｇｈ  ｅｔ  ａｌ．１９９７）。
【００７３】
バイグリカンは線維性被膜に見出される。バーシカン及びバイグリカンはＬＤＬに対する親和性を有し、不溶性複合体を形成し、これはＬＤＬの酸化を促進する。バイグリカンはリポ蛋白質を動脈壁に捕捉することによってアテローム性動脈硬化の発病に寄与し得る。動脈内膜のプロテオグリカン代謝の変化はアテローム性動脈硬化の初期病変を構成し、プロテオグリカンの蓄積はアテローム性動脈硬化の進行に基本的な役割を果たす（Ｋｕｎｚ  Ｊ．）。
【００７４】
パールカンは、質量分析ベースの分析及び免疫組織化学によって内膜の細胞外マトリックスの中心成分の１つとしてヒト内膜過形成にて報告された。
【００７５】
表８は、正常及びアテローム性動脈硬化血管におけるＰＧの免疫組織化学的染色でのいくつかのＰＧの分布を示す（Ｅｖａｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ）。
【００７６】
【表８】
0006039879.tif 000009
【００７７】
＜マトリックス再構築におけるプロテオグリカンの関与＞
非ヒト霊長類におけるアテローム性動脈硬化の進行の研究は、特定のＰＧの蓄積が病変の重症度及び細胞・増殖因子の分布により異なることを示し、アテローム性動脈硬化の進行時に異なるＰＧが異なる役割を果たすことを示唆した。異なるレベルの特定のＰＧは、線維性マトリックス構成成分、例えば、エラスチン及びコラーゲンの構造配置の変化への寄与によって組織の物質特性に直接作用し得る。
【００７８】
バーシカン及びヒアルロナンは、マトリックスにおける同様の局在を示し、アテローム発生におけるその２つの間の凝集体形成を示唆する。早期病変におけるバーシカン及びヒアルロナンの著明な増加は、早期アテローム性動脈硬化病変、例えば、ＳＭＣ及び白血球の増殖・移動に役割を果たすことを示唆し得る。更に、バーシカン及びヒアルロナンはヒト再狭窄病変の主要なマトリックス構成成分であり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにて血管損傷後の新たな内膜肥厚に寄与することが示されている。また、早期アテローム発生における大量のバーシカンは、バーシカンのコンドロイチン硫酸鎖へのリポ蛋白質の結合により、細胞外マトリックスに脂質の捕捉を増大させやすくし得る。この見解は、移植動脈疾患におけるバーシカンとアポ蛋白質（ａ）及びアポリポ蛋白質Ｅとの共局在によって支持される（Ｅｖａｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ）。プラークからのバーシカンの喪失はマトリックス不安定をもたらし得る。
【００７９】
このことは、血管損傷後に認められるバーシカン遺伝子のアップレギュレーションから更に明らかである。この場合、バーシカンは、アテローム性動脈硬化のすべての段階、すなわち、早期の発達プラークの内膜のみならず、進展した病変にわたり、脂質で満たされた壊死性コアの境界及びプラーク−血栓界面にても同定された（Ｗｉｇｈｔ  ａｎｄ  Ｍｅｒｒｉｌｅｅｓ  ２００５）。これらの所見は脂質の蓄積、炎症及び血栓にバーシカンが関与していると見なす。更に、バーシカンはＥＣＭのアセンブリ及び弾性線維原線維形成の調節に重要な役割を果たし、これは血管疾患時のＥＣＭ再構築において基本的に重要である（Ｗｉｇｈｔ  ａｎｄ  Ｍｅｒｒｉｌｅｅｓ  ２００５）。
【００８０】
動脈細胞生物学におけるバイグリカンの役割は不明瞭である。一部の免疫組織化学的研究は、ヒト再狭窄病変においてコラーゲンＩ及びＩＩＩ染色とのバイグリカンの関連を示している（Ｅｖａｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ．）。
【００８１】
マトリックス蛋白質としてのバイグリカンの重要性は、バイグリカン遺伝子のヌル変異に対してホモ接合性のＢＡＬＢ／ｃＡマウスの作製によって更に述べられ、この場合、バイグリカン欠損雄マウスの５０％が大動脈破裂の結果として寿命の最初の３カ月以内に突然死した。この所見は、大動脈壁の構造・機能的一体性にバイグリカンが不可欠であること、また、ヒトにおける大動脈解離・破裂の発病におけるバイグリカン遺伝子欠損の潜在的役割を示唆する（Ｈｅｅｇａａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．２００７）。
【００８２】
他の研究は、バイグリカンが霊長類動脈においてエラスチンと関連する主要なＰＧであることを示しており、これらの所見はヒト冠動脈疾患の所見に類似している（Ｅｖａｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ）。
【００８３】
デコリンはコラーゲンに結合し、且つコラーゲン原線維形成を調節することが示されている（Ｂｒｏｗｎ  ａｎｄ  Ｖｏｇｅｌ）（Ｄａｎｉｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）。
【００８４】
＜プロテアーゼのプロファイル＞
プロテアーゼはペプチド結合を加水分解し、アテロームにおけるコラーゲン、プロテオグリカン及びエラスチンのような細胞外マトリックス蛋白質の分解に関与する。表９を参照されたい。動脈硬化性プラークには３つの主なタイプ（メタロプロテイナーゼ（即ち、ＭＭＰ）、セリンプロテアーゼ及びシステインプロテアーゼ（即ち、カテプシン））が見出される。カテプシン及びＭＭＰは、すべての細胞外マトリックス蛋白質の分解に関与する。プラーク安定性にはマトリックスが不可欠であるため、プロテアーゼによる線維性被膜からのその除去はプラーク破裂を引き起こし得る（Ｓｔａｒｙ  Ｈ．Ｃ）。
【００８５】
表９に動脈硬化性プラークに見出される種々のプロテアーゼが一覧にされている。
【００８６】
【表９】
0006039879.tif 000010
【００８７】
プラークにおけるＭＭＰ発現の主要源はマクロファージ及びＳＭＣ活性に関連する疑いがある。プラークにおけるマクロファージは豊富なＭＭＰ−１，−８，−９及び−１３を含み、ｉｎ  ｓｉｔｕにてコラーゲン及びプロテオグリカン分解部位と共局在する（Ｋｕｎｚ  Ｊ．）。更に、自身のデータは動脈硬化性プラークにおけるＭＭＰ−８及びカテプシンＫの局在を示唆する。
【００８８】
＜マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）＞
ＭＭＰは、ＥＣＭの大部分の構成成分を分解することができるエンドペプチダーゼの大きな一群である。現在、２５超のＭＭＰが同定されている。メタロプロテアーゼは、金属原子、典型的には亜鉛を含む活性部位を特徴とし、チモーゲンとして分泌される。特定の組織阻害物質ＴＩＭＰがＭＭＰの活性を調節する。様々なＭＭＰが動脈硬化性プラークに見出される。それらはほとんどの場合、ＳＭＣ及びマクロファージにおいてプラーク肩部内にて線維性被膜に接するマクロファージにあり、線維性被膜内に同定されることは稀である（Ｋｕｎｚ  Ｊ．）。］
【００８９】
ＭＭＰはその基質特異性によって異なる群に分類される。Ｉ，ＩＩ，ＩＩＩ及びＶ型コラーゲンのような線維状コラーゲン、更にプロテオグリカンも分解するコラゲナーゼ；プロテオグリカン、ＩＶ，Ｖ，ＶＩＩ型コラーゲン及びエラスチンを分解するゼラチナーゼ；プロテオグリカン及びエラスチンに対して活性を示すストロメライシン（Ｒｏｕｉｓ  Ｍ）。これらの３つのサブグループは動脈硬化性プラークにおけるマトリックス再構築に関して特に興味深い。
【００９０】
＜ゼラチナーゼ＞
不溶性エラスチンは、ともにＭＭＰのゼラチナーゼファミリーに属するＭＭＰ−２及び−９によって消化される。ＭＭＰ−９は、動脈硬化性プラークのサイズ及び組成に作用する重要な役割を有する。不安定なヒト動脈硬化性プラーク及びプラークの脆弱領域では、ＭＭＰ−９のより高い発現及び濃度が認められている。更に、ＭＭＰ−９は、安定狭心症患者と比べて不安定狭心症患者においてより多く、冠動脈プラークにおいて細胞内に見出される（活発な合成を示す）。血中ＭＭＰ−９濃度は、冠状動脈アテローム性動脈硬化と関連して上昇し、有害な心血管事象を予測する（Ｓｕｎｄｓｔｒｏｍ  ａｎｄ  Ｖａｓａｎ）。Ｋｕｚｕｙａ  ｅｔ  ａｌ（２００６）による最近の研究は、ＭＭＰ−２が線維性被膜におけるＳＭＣの蓄積に関与し、これにより、プラーク不安定性を誘発することを示す。
【００９１】
＜ストロメライシン＞
ＭＭＰ−３はストロメライシンプロテアーゼに属し、エラスチン及びプロテオグリカンを分解することができる。Ｙａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ（２００２）による研究は、ＭＭＰ−３が女性における心筋梗塞の遺伝的リスクを予測する信頼できる手段であることが判明し得ることを示す。
【００９２】
＜コラゲナーゼ＞
ＭＭＰ−１，−８及び−１３はすべて動脈硬化性プラークにおいて同定され、プロテオグリカン及びＩ，ＩＩＩ型コラーゲンを分解する。
【００９３】
ＭＭＰ−１，−８及び−１３はコラゲナーゼであり、コラーゲンを２つの断片に切断し、その断片はＭＭＰ−２，−３又は−９によって更に分解される。
【００９４】
ＭＭＰ−８は、ヒトアテロームには一般的に見出されないが動脈硬化性プラークにおいて同定されている好中球によって発現される。ＭＭＰ−８は、Ｉ型コラーゲンを優先的に選択し（Ｈｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ）、ＭＭＰ−１及び１３より３倍大きいＩ型コラーゲンの分解活性を有するため、線維性被膜の分解に部分的に関与し得る。このことはＴｕｒｕ  ｅｔ  ａｌ（２００６）によって支持され、この研究では、血漿中のＭＭＰ−８含量は安定プラークを有する患者より不安定プラークを有する患者で著しく多い。
【００９５】
ＭＭＰ−１３はバイグリカンに対する高特異性を有し、ＳＬＲＰを切断することが報告されている。特定の切断部位（．．．Ｇ１７７／Ｖ１７８）におけるＭＭＰ−１３によるバイグリカンの分解はＭｏｎｆｏｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）によって従前に示され、骨関節炎における軟骨分解の早期検出に重要な役割を果たすことが提案されている。
【００９６】
＜カテプシン＞
ヒトシステインカテプシンは、カテプシンＢ，Ｋ，Ｌ及びＳを含む１１のメンバーから成り、主に細胞のエンドソーム／リソソームコンパートメント内に発現する。カテプシンはプロテオグリカン、コラーゲン及びエラスチンの加水分解を触媒することができる。
【００９７】
腹部大動脈瘤（ＡＡＡ）において、正常大動脈と比べて高レベルのカテプシンＳ，Ｋ及びＬが見出された。正常ヒト血管ＳＭＣは免疫染色により検出可能なカテプシンＫを含まないが、動脈硬化性プラーク内の細胞は明らかに陽性である。カテプシンＫは、破裂しやすい領域、例えば、線維性被膜、プラーク肩部及びプラーク破裂の実際の部位に局在する（Ｃｈａｐｍａｎ  ｅｔ  ａｌ）。カテプシンＳは動脈硬化性プラークにおいてエラスチン分解の増大領域と共局在することが見出され、アテローム性動脈硬化の減少がカテプシンＳ及びＫ欠損マウスにおいて認められる（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ）。
【００９８】
カテプシンＬ及びＫは、いくつかのプロテオグリカン及びＩ，ＩＩ型コラーゲンを分解し、カテプシンＫは共有結合的に架橋された三重らせん内にて分解し、一方、カテプシンＬは非らせんテロペプチド領域においてのみ切断する。カテプシンＫは線維性被膜及びプラーク肩部に局在する。正常動脈におけるカテプシンＫの発現は極めて低い。早期ヒトアテローム性動脈硬化病変は内膜及び中膜ＳＭＣにおけるカテプシンＫの発現を示した。進展した動脈硬化性プラークにおいて、カテプシンＫは主に線維性被膜のマクロファージ及びＳＭＣに局在した（Ｌｕｔｇｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ）。カテプシンＫ蛋白質レベルは、正常動脈と比べてアテローム性動脈硬化病変において上昇したが、一方、カテプシンＫのｍＲＮＡレベルは、アテローム性動脈硬化血管及び正常動脈において同様であった。更に、カテプシンＫのｍＲＮＡ及び蛋白質レベルは、早期アテローム性動脈硬化病変及び血栓を含む病変と比べて、進展しているが安定したヒト動脈硬化性プラークにおいて最大であることが示された（Ｃｈａｐｍａｎ  ｅｔ  ａｌ）。
【００９９】
カテプシンＳは、早期ヒトアテローム性動脈硬化病変及び脂肪線条において内膜及び中膜ＳＭＣにほんのわずかに発現する。進展したヒト動脈硬化性プラークにおいて、カテプシンＳは線維性被膜のマクロファージ及びＳＭＣに局在した。血管自体及びプラーク微小血管の管腔の内側を覆うＥＣも、カテプシンＳを発現した。更に、カテプシンＳのｍＲＮＡ及び蛋白質レベルは、正常動脈と比べてヒトアテロームにおいて増大した（Ｌｕｔｇｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ）。カテプシンＳはプロテオグリカン、エラスチン及びコラーゲンを分解することができる（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ）。
【発明の概要】
【０１００】
現在、ＣＶＤリスクの決定は、アテローム性動脈硬化進行の後期（線維性プラーク破裂の有意なリスクがある時点）において行われている。早期及び後期におけるアテローム性動脈硬化又はＣＶＤリスクに関する情報を提供する診断又は予後アッセイの必要性がある。Ｋａｔｓｕｄａ  ｅｔ  ａｌ（１９９２）の知見は、進展病変からのコラーゲンの除去の酵素機構があることを示唆し、実際に動脈硬化におけるネオエピトープの主要な役割を示唆している。
【０１０１】
本発明は、プロテイナーゼによる動脈硬化性プラークの蛋白質の切断によって形成されるネオエピトープを含むペプチド断片の定量のためのバイオアッセイの方法を提供し、該方法は、該ペプチド断片を含む試料を、該ネオエピトープに対する特異的結合親和性を有する免疫学的結合パートナーと接触させるステップと、該試料中の該免疫学的結合パートナーのペプチド断片への結合レベルを定量するステップとを含む。
【０１０２】
該アッセイの結果は、特定の患者における動脈硬化性プラークの破裂のリスクの程度又は患者の動脈硬化性プラークの不安定状態を示す指標を生成し得る。
【０１０３】
閾値を越える該指標の値を有する患者は、プラーク撮像法（上述の撮像法を含む）による更なる検査又はアテローム性動脈硬化の処置のための薬剤の処方又はアテローム性動脈硬化の外科的処置を推奨され得、そのようなフォローアップ検査又は処置は本発明の方法の一部を成し得る。
【０１０４】
動脈硬化性プラークの蛋白質は、ルミカン、バーシカン、パールカン、デコリン、バイグリカン、ＩＩＩ型コラーゲン、ＣＲＰ、ＡｐｏＥ及びエラスチンを含む。Ｉ型コラーゲンは動脈硬化性プラークの蛋白質であるとは見なされない。動脈硬化性プラークに存在し、身体のどの部位よりも高い程度に動脈硬化性プラークにおいてプロテアーゼに晒される蛋白質が特に興味深い。
【０１０５】
該免疫学的結合パートナーは、Ｃ末端ネオエピトープ又はＮ末端ネオエピトープを含むペプチド断片に対する特異的結合親和性を有し得る。
【０１０６】
プロテオグリカンアッセイ
該ペプチド断片は、プロテオグリカンバーシカン（配列番号１）、ルミカン（配列番号２）、パールカン（配列番号３）、バイグリカン（配列番号４）及びデコリン（配列番号５）の断片でよく、それらはすべて正常及びアテローム性動脈硬化血管において同定される。プロテオグリカンは、エラスチン及びコラーゲンとともに、動脈硬化性プラーク及びプラーク被膜を構成する主な蛋白質の一部である。プロテオグリカンの含量は、アテローム性動脈硬化の進行時に異なり、その結果、プロテオグリカンの潜在的ネオエピトープは病期及び疾患進行の良好なマーカーになる。特に、バーシカン及びルミカンは多くの他の臓器には豊富ではないため、これにより、それらはより特異的な生化学マーカー候補になる。
【０１０７】
動脈硬化性プラークにおいて多くの異なるプロテアーゼが文献により報告されているように、複数の候補プロテアーゼがプラークにおけるプロテオグリカンの消化に関与し得る。おそらく、これは最終的にプラーク破裂に至る広範の複雑なプロセスの結果である。しかし、本発明者らの評価では、初期相は一定範囲のＭＭＰから成り得、一方、後期はマトリックスのカテプシン分解により依存し得、病期に依存して異なるネオエピトーププロファイルとなる。本発明者らは、表４に一覧表示される酵素がルミカン、バーシカン、バイグリカン、パールカン及びデコリンを生じさせ、少なくとも以下の切断生成物を生じさせると判定した。
【０１０８】
【表１０Ａ】
0006039879.tif 000011
【表１０Ｂ】
0006039879.tif 000012
【０１０９】
従って、本発明の方法では、好ましくは、該ペプチド断片は、上記部分配列のいずれの配列にもおける記号「＊」を付された部位におけるプロテアーゼによるバーシカン、ルミカン、パールカン、デコリン又はバイグリカンの切断によって形成されるネオエピトープを含む。
【０１１０】
更に、本発明の方法では、好ましくは、該ペプチド断片は、バーシカン、ルミカン、デコリン、パールカン及びバイグリカンの以下の部分配列のいずれの配列にもおける部位における１つ（又はそれ以上）のプロテアーゼによるプロテオグリカン（バーシカン、ルミカン、パールカン、デコリン及びバイグリカン）の切断によって形成されるネオエピトープを含み、或いは免疫学的結合パートナーは以下の配列の１つと特異的に反応する。
【０１１１】
【表１１】
0006039879.tif 000013
【０１１２】
好ましくは、該免疫学的結合パートナーは、切断されていない状態のバーシカン、ルミカン、デコリン、パールカン及びバイグリカンと反応しない。好ましくは、該免疫学的結合パートナーは、生成断片のそれぞれのｃ末端及びＮ末端を過ぎて延長している場合、上記一覧の該配列と反応しない。
【０１１３】
免疫学的結合パートナーは、バーシカン、ルミカン、デコリン、パールカン及びバイグリカンタイプの切断によって形成されるＣ末端又はＮ末端ネオエピトープと特異的に反応する免疫学的結合パートナーでもよい。
【０１１４】
従って、好適な免疫学的結合パートナーは、ペプチドのＮ末端において表１１における以下の配列のいずれかの又はペプチドのＣ末端において表１２における以下の配列と特異的に反応し得る。
【０１１５】
【表１２】
0006039879.tif 000014
【０１１６】
【表１３】
0006039879.tif 000015
【０１１７】
同様にアッセイされ得るネオエピトープを決定する更なる切断部位は、プロテオグリカン又は他の動脈硬化性プラーク蛋白質を本明細書で述べられる任意の酵素と反応させ、そうして生成されるペプチドを単離して配列決定することによって同定され得る。
【０１１８】
＜コラーゲンアッセイ＞
該ペプチド断片はＩＩＩ型コラーゲンの（配列番号１５３）、好ましくは、成熟ＩＩＩ型コラーゲンの、即ち、ＩＩＩ型コラーゲンプロペプチドの断片ではない断片でもよい。動脈硬化性プラークにおける主な蛋白質はＩ，ＩＩＩ型コラーゲン及びエラスチンであり、一方、プロテオグリカンはプラークのマトリックスにわずかに寄与するのみである。動脈硬化性プラークに見出される３つの主要な蛋白質中、Ｉ及びＩＩＩ型コラーゲンが優位であり、一方、エラスチンは動脈における蛋白質プロファイルを占めるが、プラークにおける主要な蛋白質成分ではない。Ｉ型コラーゲンはヒトの身体全体にわたって豊富であり、一方、ＩＩＩ型はより限定された組織位置を有し、これにより、本発明者らの見解では生化学マーカーとしてより特異的な候補を構成する。
【０１１９】
動脈硬化性プラークにおける多くの異なるプロテアーゼが文献により報告されているように、複数の候補プロテアーゼがプラークにおけるコラーゲンの消化に寄与し得る。おそらく、これは、最終的にプラーク破裂に至る広範の複雑なプロセスの結果である。しかし、本発明者らの評価では、初期相は一定範囲のＭＭＰから成り得、一方、後期はマトリックスのカテプシンＫ分解により依存し得、疾患レベルに依存して異なるネオエピトーププロファイルとなる。本発明者らは、以下の表に一覧表示される酵素が少なくとも以下の切断部位においてＩＩＩ型コラーゲンを切断すると判定した。
【０１２０】
【表１４Ａ】
0006039879.tif 000016
【表１４Ｂ】
0006039879.tif 000017
【表１４Ｃ】
0006039879.tif 000018
【表１４Ｄ】
0006039879.tif 000019
【表１４Ｅ】
0006039879.tif 000020
【０１２１】
従って、本発明の方法では、好ましくは、該ペプチド断片は、ＩＩＩ型コラーゲンの上記部分配列のいずれの配列にもおける記号「＊」を付された部位におけるプロテアーゼによるＩＩＩ型コラーゲンの切断によって形成されるネオエピトープを含む。
【０１２２】
更に、本発明の方法では、好ましくは、該ペプチド断片は、＊間におけるＩＩＩ型コラーゲンの上記部分配列のいずれの配列にもおける部位における１つ（又はそれ以上）のプロテアーゼによるＩＩＩ型コラーゲンの切断によって形成されるネオエピトープを含み、または免疫学的結合パートナーは上記表のエントリーにおける＊間に伸長する配列と特異的に反応する。
【０１２３】
好ましくは、該免疫学的結合パートナーは、切断されていない状態のＩＩＩ型コラーゲンと反応しない。好ましくは、該免疫学的結合パートナーは、それぞれの切断部位を過ぎて延長している場合、上記一覧の該配列と反応しない。
【０１２４】
免疫学的結合パートナーは、ＩＩＩ型コラーゲンの切断によって形成されるＣ末端又はＮ末端ネオエピトープと特異的に反応する免疫学的結合パートナーでよい。
【０１２５】
従って、好適な免疫学的結合パートナーは、ペプチドのＮ末端において以下の配列（各配列の後に配列番号）又はペプチドのＣ末端において以下の配列と特異的に反応し得る。
【０１２６】
【表１５】
0006039879.tif 000021
【０１２７】
【表１６】
0006039879.tif 000022
【０１２８】
同様にアッセイされ得るネオエピトープを決定する更なる切断部位は、ＩＩＩ型コラーゲン又は他の動脈硬化性プラーク蛋白質を本明細書で述べられる任意の酵素と反応させ、そうして生成されるペプチドを単離して配列決定することによって同定され得る。
【０１２９】
＜ＣＲＰ及びＡｐｏＥアッセイ＞
該ペプチド断片はＣＲＰ（配列番号６５８）又はＡｐｏＥ（配列番号６５９）の断片でもよい。好ましくは、ＡｐｏＥでは、選択断片はＡｐｏＥのすべての同定アイソタイプ、ε２，ε３及びε４において生じる。
【０１３０】
ＣＲＰ及びＡｐｏＥがヒトの身体全体にわたって豊富であるとしても、アテローム性動脈硬化組織におけるその局在により、それらは局所プロテアーゼの作用に晒される。これにより、これらの分子は生化学マーカーとして良好且つ特異的な候補である。
【０１３１】
動脈硬化性プラークにおける多くの異なるプロテアーゼが文献により報告されているように、複数の候補プロテアーゼがプラークにおけるＣＲＰ及びＡｐｏＥの消化に寄与し得る。おそらく、これは、最終的にプラーク破裂に至る広範の複雑なプロセスの結果である。しかし、初期相は一定範囲のＭＭＰから成り得、一方、後期はマトリックスのカテプシンＫ分解により依存し得、疾患レベルに依存して異なるネオエピトーププロファイルとなる。本発明者らは、純粋天然蛋白質の一定範囲のｉｎ  ｖｉｔｒｏ切断を通じて、以下の表に一覧表示される酵素が少なくとも以下の切断部位（＊を付す）においてＣＲＰ及びＡｐｏＥを切断すると判定した。
【０１３２】
【表１７】
0006039879.tif 000023
【０１３３】
従って、本発明の方法では、好ましくは、該ペプチド断片は、ＣＲＰ及びＡｐｏＥの以下の部分配列のいずれの配列にもおける記号「＊」が付された部位におけるプロテアーゼによるＣＲＰ及びＡｐｏＥの切断によって形成されるネオエピトープを含み、または免疫学的結合パートナーは以下の配列の１つにおける＊間に画定される配列と特異的に反応する。
【０１３４】
【表１８】
0006039879.tif 000024
【０１３５】
従って、好適な免疫学的結合パートナーは、ペプチドのＮ末端において以下の配列又はペプチドのＣ末端において以下の配列と特異的に反応し得る。
【０１３６】
【表１９】
0006039879.tif 000025
【０１３７】
【表２０】
0006039879.tif 000026
【０１３８】
同様にアッセイされ得るネオエピトープを決定する更なる切断部位は、ＣＲＰ及びＡｐｏＥまたは他の動脈硬化性プラーク蛋白質を本明細書で述べられる任意の酵素と反応させ、そうして生成されるペプチドを単離して配列決定することによって同定され得る。
【０１３９】
＜エラスチンアッセイ＞
該ペプチドはエラスチン（配列番号７３５）の断片でもよい。エラスチンはヒトの身体全体にわたって豊富であるとしても、アテローム性動脈硬化組織におけるその局在はそれを局所プロテアーゼの作用に晒させ、そのためにこれらの分子は動脈硬化性プラーク代謝回転の生化学マーカーとして良好且つ特異的な候補である。
【０１４０】
動脈硬化性プラークにおける多くの異なるプロテアーゼが文献により報告されているように、複数の候補プロテアーゼがプラークにおけるエラスチンの消化に寄与し得る。おそらく、これは、最終的にプラーク破裂に至る広範の複雑なプロセスの結果である。しかし、初期相は一定範囲のＭＭＰから成り得、一方、後期はマトリックスのカテプシンＫ分解により依存し得、疾患レベルに依存して異なるネオエピトーププロファイルとなる。本発明者らは、純粋天然蛋白質の一定範囲のｉｎ  ｖｉｔｒｏ切断を通じて、以下の表に一覧表示される酵素が少なくとも以下の切断部位（＊を付す）においてエラスチンを切断すると判定した。
【０１４１】
【表２１】
0006039879.tif 000027
【０１４２】
従って、本発明の方法では、好ましくは、該ペプチド断片は、エラスチンの以下の部分配列のいずれの配列にもおける記号「＊」が付された部位におけるプロテアーゼによるエラスチンの切断によって形成されるネオエピトープを含み、或いは免疫学的結合パートナーは以下の配列の１つにおける＊間に画定される配列と特異的に反応する。
【０１４３】
【表２２】
0006039879.tif 000028
【０１４４】
従って、好適な免疫学的結合パートナーは、ペプチドのＮ末端において以下の配列又はペプチドのＣ末端において以下の配列と特異的に反応し得る。
【０１４５】
【表２３】
0006039879.tif 000029
【０１４６】
【表２４】
0006039879.tif 000030
【０１４７】
同様にアッセイされ得るネオエピトープを決定する更なる切断部位は、エラスチン又は他の動脈硬化性プラーク蛋白質を本明細書で述べられる任意の酵素と反応させ、そうして生成されるペプチドを単離して配列決定することによって同定され得る。
【０１４８】
上述の２つ以上のペプチドのアッセイは別個に行われ、それらの結果は組み合わせられ得、又は上述の２つ以上のペプチドはともに測定され得る。
【０１４９】
本発明によるアッセイの結果は、診断又は予後値の総合指数を形成するために１つ以上の他の測定バイオマーカーと組み合わせられ得る。
【０１５０】
本明細書で用いられる「免疫学的結合パートナー」という用語は、ポリクローナル及びモノクローナル抗体、更に抗体の特異的な結合断片、例えば、Ｆａｂ又はＦ（ａｂ’）２も含む。従って、該免疫学的結合パートナーはモノクローナル抗体又は特異的結合親和性を有するモノクローナル抗体の断片でよい。
【０１５１】
本明細書で用いられる「蛋白質」という用語は、リポ蛋白質及びプロテオグリカン並びに他の蛋白（または非蛋白）の天然複合体を含む。
【０１５２】
一般的に、本発明に従って不均一及び均一フォーマット、サンドイッチアッセイ、競合アッセイ、酵素結合アッセイ、放射免疫アッセイなどを含むあらゆる既知のイムノアッセイフォーマットが用いられ得る。従って、任意に、該方法は、該免疫学的結合パートナー及び競合物質が該試料の存在下にてインキュベートされ、競合物質が免疫学的結合パートナーと結合するために試料中のペプチド断片と競合する競合イムノアッセイとして行われる。
【０１５３】
該競合物質は、該ネオエピトープを示すためにネオエピトープが属する蛋白質の切断によって形成される合成ペプチド又は精製天然ペプチドでもよい。従って、ペプチドは、バーシカン、ルミカン、パールカン、デコリン、バイグリカン、ＩＩＩ型コラーゲン、ＡｐｏＥ、ＣＲＰ又はエラスチンに由来し得る。
【０１５４】
１つの好適な方法は、任意のこれらの蛋白質の断片のネオエピトープ若しくは動脈硬化性プラークに由来する他の蛋白質由来のペプチド断片上のネオエピトープに結合するモノクローナル抗体、又はその抗体結合断片を用いた競合イムノアッセイでよい。マイクロタイタープレートの固体表面上に被覆された、適切に選択された合成ペプチドは、モノクローナル抗体又は結合断片への結合について試料と競合し得る。或いは、モノクローナル抗体又は結合断片によって認識されるネオエピトープを保有する１つ以上のこれらの蛋白質由来の精製天然断片が、固体表面上に用いられ得る。更に別の代替例は、モノクローナル抗体又は結合断片を固体表面上に固定化し、次に、試料を、シグナル分子、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ又はビオチンに適切に結合した合成ペプチドと共インキュベートすることである。試料は尿、血清、血液、血漿又は他の、例えば、動脈硬化性プラーク生検の試料でもよい。
【０１５５】
一部の好ましい方法では、試料は患者由来の試料であり、方法は、該ペプチド断片の該結合の定量レベルを、（ａ）比較できる健常患者及び／又は（ｂ）アテローム性動脈硬化病態の特徴を示す数値と比較するステップと、任意に、高レベルの測定ペプチド（通常、高レベルの結合によって示される）をより重症度の該病態と関連付けるステップとを更に含む。
【０１５６】
本発明の一態様は、上述のネオエピトープを認識するモノクローナル抗体の開発に関する。これは、当該蛋白質分子のアミノ酸配列に由来する合成ペプチド（上記一覧表示された配列又はそこで終止する配列を含む）でマウスを免疫化し、選択マウス由来脾臓細胞を骨髄腫細胞に融合し、関連合成ペプチド上のネオエピトープへの結合についてモノクローナル抗体を試験することによって達成され得る。ネオエピトープに対する特異性は、合成ペプチドとの反応性及び（Ｃ末端ネオエピトープに対する）Ｃ末端延長形態の免疫ペプチド若しくは（Ｎ末端ネオエピトープに対する）Ｎ末端延長形態の免疫ペプチドとの反応性の欠如を必要とすることによって確実にされ得る。天然蛋白質に対する結合能の欠如を確定するために、ネオエピトープに対する抗体も評価され得る。或いは、ネオエピトープに対する特異性は、抗体の反応性が末端アミノ酸の１つに共有結合したビオチン又は他の官能基の存在が負に依存するよう求めることによって確実にされ得る。
【０１５７】
本発明は、上記に示される部分配列のいずれか１つの部分配列における末端部位におけるプロテアーゼによる該蛋白質の切断によって形成されるネオエピトープと特異的に免疫反応する免疫学的結合パートナーを含み、例えば、モノクローナル抗体又はその結合断片でもよい。
【０１５８】
本発明は、上記に示される部分配列のいずれか１つの部分配列における配列の末端部位における動脈硬化性プラーク蛋白質の切断によって形成されるＣ末端又はＮ末端ネオエピトープに対するモノクローナル抗体を産生する細胞株を含む。
【０１５９】
本発明は、上記に示されるこれらの蛋白質の部分配列のいずれか１つの部分配列における該蛋白質の切断によって形成されるＣ末端又はＮ末端ネオエピトープを含むペプチドを更に提供する。そのようなペプチドはイムノアッセイで用いるために、該ペプチドに対する免疫反応を生じさせるためにハプテンとして担体にコンジュゲートされ、又は固体表面に固定化され、又は検出可能なマーカーにコンジュゲートされ得る。
【０１６０】
本発明は、上記に示される部分配列のいずれか１つの部分配列における該蛋白質の切断によって形成されるＣ末端又はＮ末端ネオエピトープを含むペプチドをコードする単離核酸分子を更に含む。
【０１６１】
本発明は、発現シグナルと、上記に示される部分配列のいずれか１つの部分配列における該蛋白質の切断によって形成されるＣ末端又はＮ末端ネオエピトープを含むペプチドの発現をコードするコード配列とを含む核酸配列を含むベクターを更に含み、そのようなベクターで形質転換され、該ペプチドを発現する宿主細胞を更に含む。
【０１６２】
本発明の更に別の態様は、上述の方法を実施するために好都合に用いられ得るキットに関する。そのようなキットは、（１）合成ペプチドで被覆されたマイクロタイタープレートと、（２）該合成ペプチドと反応する本発明のモノクローナル抗体若しくは抗体結合断片と、（３）標識抗マウスＩｇＧ免疫グロブリンとを含み得る。或いは、そのようなキットは、（１）精製天然蛋白質断片で被覆されたマイクロタイタープレートと、（２）該蛋白質のいずれか１つの断片上のネオエピトープを認識し、該精製断片と反応するモノクローナル抗体と、（３）標識抗マウスＩｇＧ免疫グロブリンとを含み得る。或いは、そのようなキットは、（１）ストレプトアビジンで被覆されたマイクロタイタープレートと、（２）ビオチンに結合した合成ペプチドと、（３）該蛋白質断片上のネオエピトープを認識し、該合成ペプチドと反応するモノクローナル抗体と、（４）標識抗マウスＩｇＧ免疫グロブリンとを含み得る。更に別の代替例は、（１）ストレプトアビジンで被覆されたマイクロタイタープレートと、（２）ビオチンに結合した合成ペプチドと、（３）該蛋白質断片上のネオエピトープを認識し（該合成ペプチドと反応し）、西洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートしたモノクローナル抗体とを含むキットでよい。
【０１６３】
従って、本発明は、本明細書で述べられる免疫学的結合パートナー並びに該免疫学的結合パートナーに結合する競合物質、並びに、任意に、１つ以上の洗浄試薬、緩衝液、停止試薬、酵素標識、標識酵素のための基質、較正基準、抗マウス抗体及び該イムノアッセイを行うための使用説明書を含むイムノアッセイキットを含む。
【０１６４】
本明細書で述べられるアッセイは患者におけるアテローム性動脈硬化症の診断に有用である。加えて、検査は疾患の進行の評価及び治療に対する応答のモニタリングに有用である。本発明の免疫学的結合パートナーは、本明細書で述べられる動脈硬化性プラーク蛋白質の切断産物の存在又は位置を示すために免疫染色でも用いられ得る。
【０１６５】
本発明は、添付図面を参照して更に説明され、例示される。
【図面の簡単な説明】
【０１６６】
【図１】ＩＩＩ型病変を含む大動脈試料に対してモノクローナルマウス抗体を用いたバイグリカン染色（それぞれ２，４，４及び１０倍）を示す図である。
【図２】ＩＩＩ型病変を含む大動脈試料に対してモノクローナルマウス抗体を用いたカテプシンＫ染色（それぞれ２，４，１０及び１０倍）を示す図である。
【図３】Ｖ型病変を含む大動脈試料に対してモノクローナルマウス抗体を用いたバイグリカン染色（それぞれ２，４，１０及び１０倍）を示す図である。
【図４】Ｖ型病変を含む大動脈試料に対してモノクローナルマウス抗体を用いたカテプシンＫ染色（それぞれ２，４，１０及び１０倍）を示す図である。
【図５】プロテアーゼ：ＭＭＰ２、ＭＭＰ３、ＭＭＰ８、カテプシンＫ、カテプシンＳ、カテプシンＢ及びカテプシンＬによって生じるバイグリカンの切断産物を示す図である。Ｍ＝着色マーカー（Ｒａｉｎｂｏｗ  ｍａｒｋｅｒ）、−ｅｎｚ＝酵素消化なし、実施例２においてゲル上で泳動。
【図６】実施例４において得られた競合試験結果を示す図である。
【図７】実施例４において得られた競合試験結果を示す図である。
【図８】実施例４において得られた競合試験結果を示す図である。
【図９】実施例６において得られた競合試験結果を示す図である。
【図１０】実施例７において得られた競合試験結果を示す図である。
【図１１】実施例７において得られた競合試験結果を示す図である。
【実施例１】
【０１６７】
プロテオグリカン及びプロテアーゼの局在の分析のため、左冠動脈下行枝（ＬＡＤ）由来のヒト動脈試料の免疫組織化学染色を行った。以下、カテプシンＫプロテアーゼ及びバイグリカンの共局在が示される。
【０１６８】
図１及び２に見られる免疫組織化学染色はバイグリカン及びカテプシンＫの共局在を明らかにした。これは、バイグリカンがカテプシンＫの好ましい基質であることを示唆し得る。動脈硬化性プラークが形成された大動脈試料に対して同じ免疫組織化学染色を行い、この結果として正常な大動脈構造はマクロファージ泡沫細胞浸潤及び石灰化に置き換えられた。これらの免疫染色を図３及び４にまとめる。
【０１６９】
バイグリカン及びカテプシンＫの免疫組織化学染色は進行性アテローム性動脈硬化病変に共局在することが示された。これらの結果はともにバイグリカンにおける特異的なカテプシンＫ切断部位の仮説を生じさせ、アテローム性動脈硬化病変におけるネオエピトープ生成の増加をもたらす。この仮説を試験するため、本発明者らはバイグリカンを異なるプロテアーゼで切断した。
【実施例２】
【０１７０】
分解断片の評価のためのバイグリカンの分解。ウシ関節軟骨由来のバイグリカン（Ｂ８０４１−Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）をプロテアーゼ（ＭＭＰ２、ＭＭＰ３、ＭＭＰ８、カテプシンＫ、カテプシンＳ、カテプシンＢ及びカテプシンＬ）によって切断した。上述のプロテアーゼの酵素切断によって生じたプロテオグリカンの断片を１０％のＮｕＰａｇｅ（登録商標）Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル上に分離し、その後、「Ｓｉｌｖｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ」−銀染色キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社カタログ番号ＬＣ６１００、ロット番号３４１０９９）によって銀染色した。蛋白質分解で得られたバイグリカンの分離及び銀染色の結果を図５に示す。
【実施例３】
【０１７１】
オボアルブミンにコンジュゲートしたＩＩＩ型コラーゲン由来ペプチドでマウスを免疫化した。ビオチンにコンジュゲートしたスクリーニングペプチド配列との反応性について血清をスクリーニングした。モノクローナル抗体分泌クローンを作製し、スクリーニング配列を用いてスクリーニングした。ＩＩＩ型コラーゲン由来の隣接配列で連続する標的ペプチドの伸長バージョン（除外ペプチド）との反応性の欠如及びナンセンスペプチドとの反応性の欠如についてクローンを調べた。
【０１７２】
標的配列、免疫原、スクリーニング配列及び除外配列は以下の通りであった。
【０１７３】
【表２５】
0006039879.tif 000031
【実施例４】
【０１７４】
＜ＩＩＩ型コラーゲンネオエピトープモノクローナル抗体のヒト尿との反応性＞
免疫ペプチドを競合物質として用いて競合アッセイ形式にて実施例３からの選択モノクローナル抗体クローンのヒト尿との反応性を判定した。典型的な手順では、９６ウェルストレプトアビジン被覆プレートを振盪しながら２０℃でＰＢＳ−ＢＴＥ中１０ｎｇ／ｍＬビオチンペプチドで３０分間コートし、５倍洗浄緩衝液で洗浄した。２０μｌの希釈試料（尿又はペプチド溶液）を加えた。下記に詳述する１００μＬの未精製抗体溶液（細胞培養液由来の上清）を加えた。プレートを３００ｒｐｍで振盪しながら２０℃で１時間インキュベートし、次に、５倍洗浄緩衝液で洗浄した。１００μＬの二次抗体−ＰＯＤ（１：５０００）を加え、３００ｒｐｍで振盪しながら２０℃で１時間インキュベートし、その後、５倍洗浄緩衝液で洗浄した。１００μＬのＴＭＢを加え、３００ｒｐｍで振盪しながら暗室で１５分間インキュベートし、その後、停止液１００μＬを加えた。ＥＬＩＳＡリーダー上で６５０ｎｍを対照として４５０ｎｍにてプレートを読み取った。従って、抗体に対するプレート上のペプチドと溶液中のペプチドとの間の競合が生じ、ペルオキシダーゼ発色反応によりプレート結合抗体を定量した。
【０１７５】
図６に４つの異なるクローンの結果が認められる。抗体が各々尿中の関連する配列を検出することがわかる。
【０１７６】
免疫ペプチドとＭＭＰ９によってｉｎ  ｖｉｔｒｏにて切断された天然ＩＩＩ型コラーゲンとの間の抗体結合の競合を試験するため、１つの選択クローンに対して更なる競合試験を行った。切断コラーゲン、ペプチドＫＮＧＥＴＧ及びその配列の伸長バージョンの結果を図７に示す。抗体が免疫ペプチド配列及び酵素切断コラーゲンに結合するが、伸長配列には結合しないことがわかる。
【０１７７】
図８に同じクローンに関する更なる競合試験が認められ、この場合、競合物質はそれぞれ、ペプチドＫＮＧＥＴＧ、ヒト血清、ラット血清、ＦＣＳ（ウシ胎仔血清）及び動脈硬化性プラーク抽出物であった。抗体がペプチド、プラーク抽出物及びヒト血清と反応するが、ラット血清又はＦＣＳとは反応しないことがわかる。
【実施例５】
【０１７８】
＜デコリン、バイグリカン及びバーシカン配列に対する抗血清の産生＞
抗血清を産生させ、実施例３のようにモノクローナル抗体を得たが、以下の免疫原、スクリーニング配列及び除外配列を用いた。
【０１７９】
【表２６】
0006039879.tif 000032
【実施例６】
【０１８０】
＜デコリンネオエピトープモノクローナル抗体のヒト尿との反応性＞
１つの抗デコリン未精製モノクローナル抗体（ＮＢ６２）を用いて概して実施例５のように競合ＥＬＩＳＡを行った。
【０１８１】
図９に結果を示す。これに対して抗体が産生され、選択されたペプチド配列及び尿に対する反応が認められるが、無関連ペプチド配列に対する反応は認められない。
【実施例７】
【０１８２】
＜バーシカンネオエピトープモノクローナル抗体のヒト尿との反応性＞
配列に対する２つの抗バーシカン未精製モノクローナル抗体（ＮＢ６４）を用いて概して実施例５のように競合ＥＬＩＳＡを行った。
【０１８３】
それぞれのクローンの結果を図１０及び１１に示す。それぞれの場合、これに対して抗体が産生され、選択されたペプチド配列及び尿に対する反応が認められるが、無関連ペプチド配列ＮＢ１８に対する反応は認められない。
【０１８４】
本明細書では、特に明示されない限り、条件の１つのみが満たされることを要求する演算子「排他的ｏｒ」と対照的に、「又は」という語は言及条件の一方又は両方が満たされる場合に真値を返す演算子の意味で用いられる。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語は「〜から成る」を意味するというよりも「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という意味で用いられる。上記に認められた従来の教示はすべて参照して本明細書に組み込まれる。
【０１８５】
［参考文献リスト］
【表２７Ａ】
0006039879.tif 000033
【表２７Ｂ】
0006039879.tif 000034
【表２７Ｃ】
0006039879.tif 000035
【表２７Ｄ】
0006039879.tif 000036
【表２７Ｅ】
0006039879.tif 000037
【表２７Ｆ】
0006039879.tif 000038
【表２７Ｇ】
0006039879.tif 000039
【図６】
0006039879.tif 000044
【図７】
0006039879.tif 000045
【図８】
0006039879.tif 000046
【図９】
0006039879.tif 000047
【図１０】
0006039879.tif 000048
【図１１】
0006039879.tif 000049
【図１】
0006039879.tif 000050
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
0006039879.tif 000054
【配列表】
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