(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アデノウイルスゲノム内に挿入された齧歯類パルボウイルスの全ゲノムを含むことを特徴とするキメラアデノ−パルボウイルスベクターであって、
（ａ）前記アデノウイルスゲノムはＥ１及びＥ３の欠失を特徴とする、そして、
（ｂ）パルボウイルスＮＳタンパク質の発現を調節するパルボウイルスＰ４初期プロモーターの活性は、キメラ産生中にパッケージング細胞系内の前記ＮＳタンパク質の発現を抑制または遮断するように改変されるが、癌細胞内では十分に機能的であり、
ここで、前記パルボウイルスＰ４初期プロモーターは、ＴＡＴＡボックスとＮＳ開始コドン間に２つのテトラサイクリンオペレーター２エレメントを挿入することによって改変されているキメラアデノ−パルボウイルスベクター。
【請求項２】
前記パッケージング細胞は、ＨＥＫ  Ｔ−ＲＥｘ（商標）−２９３細胞である請求項１に記載のキメラアデノ−パルボウイルスベクター。
【請求項３】
前記ＮＳタンパク質の発現は、減少又は除去される請求項１又は２に記載のキメラアデノ−パルボウイルスベクター。
【請求項４】
前記ＮＳタンパク質は、ＮＳ１、及び／又はＮＳ２である請求項１〜３の何れか一項に記載のキメラアデノ−パルボウイルスベクター。
【請求項５】
前記アデノウイルスは、Ａｄ５である請求項１〜４の何れか一項に記載のキメラアデノ−パルボウイルスベクター。
【請求項６】
前記齧歯類パルボウイルスは、ＬｕＩＩＩ、マウス微小ウイルス（ＭＭＶ）、マウスパルボウイルス（ＭＰＶ）、ラット微小ウイルス（ＲＭＶ）、ラットパルボウイルス（ＲＰＶ）、ラットウイルス（ＲＶ）又はＨ１（Ｈ１−ＰＶ）である請求項１〜５の何れか一項に記載のキメラアデノ−パルボウイルスベクター。
【請求項７】
発現可能な導入遺伝子をさらに含有する請求項１〜６の何れか一項に記載のキメラアデノ−パルボウイルスベクター。
【請求項８】
前記導入遺伝子は、前記Ａｄゲノムの適合する位置に挿入される請求項７に記載のキメラアデノ−パルボウイルスベクター。
【請求項９】
前記導入遺伝子の発現は、Ｐ３８プロモーターの制御下にある請求項７又は８に記載のキメラアデノ−パルボウイルスベクター。
【請求項１０】
前記導入遺伝子の発現は、異種プロモーターの制御下にある請求項７又は８に記載のキメラアデノ−パルボウイルスベクター。
【請求項１１】
前記異種プロモーターが、ＣＭＶ、ＳＶ４０又はＴＫである請求項１０に記載のキメラアデノ−パルボウイルスベクター。
【請求項１２】
前記導入遺伝子は、マーカータンパク質をコードする遺伝子である請求項７〜１１の何れか一項に記載のキメラアデノ−パルボウイルスベクター。
【請求項１３】
前記導入遺伝子は、治療用又は免疫原性ポリペプチドをコードする遺伝子である請求項７〜１１の何れか一項に記載のキメラアデノ−パルボウイルスベクター。
【請求項１４】
前記導入遺伝子は、細胞毒性ポリペプチド、サイトカイン、ケモカイン、癌特異的ペプチド、リガンド、アダプター、アフィボディ、一本鎖抗体、及び／又は、ＰＶ腫瘍退縮及び／又はＰＶ複製を強化するポリペプチドをコードする遺伝子である請求項１３に記載のキメラアデノ−パルボウイルスベクター。
【請求項１５】
キメラアデノ−パルボウイルスベクターを調製する方法であって、下記（ｉ）及び（ｉｉ）の工程を含み、
（ｉ）パッケージング細胞が、キメラアデノ−パルボウイルスベクターを用いてトランスフェクトされ、パルボウイルスＰ４プロモーターの活性を抑制又は遮断し、パルボウイルスＮＳ転写活性化ユニットの発現を減少又は除去する条件下で培養する工程、及び、
（ｉｉ）前記キメラアデノ−パルボウイルスベクターを、細胞培養後に、前記パッケージング細胞又は培地から単離する工程であって、
ここで、前記パッケージング細胞はＨＥＫ  ２９３細胞であり、前記ベクターはドキシサイクリン（ｄｏｘ）無含有条件下で伝播させることにより、前記キメラアデノ−パルボウイルスベクターを高い力価で得る、工程、
ここで、前記キメラアデノ−パルボウイルスベクターは請求項１〜１４の何れか一項に記載のキメラアデノ−パルボウイルスベクターである、キメラアデノ−パルボウイルスベクターを調製する方法。
【請求項１６】
請求項１〜１３の何れか一項に記載のキメラアデノ−パルボウイルスベクターを含有する細胞。
【請求項１７】
請求項１〜１４の何れか一項に記載のキメラアデノ−パルボウイルスベクター、及び薬学的に許容される担体を含有する医薬組成物。
【請求項１８】
腫瘍の治療において使用するための、請求項１〜１０、１３、及び１４の何れか一項に記載のキメラアデノ−パルボウイルスベクター。
【請求項１９】
ＰＶ細胞毒性に抵抗性である癌の治療において使用するためであることを特徴とする請求項１８に記載の使用のための、請求項１〜１０、１３、及び１４の何れか一項に記載のキメラアデノ−パルボウイルスベクター。
【請求項２０】
子宮頸癌、黒色腫、肺癌、又は結腸癌を治療する方法において使用するためであることを特徴とする請求項１８又は１９に記載の使用のための、請求項１〜１０、１３、及び１４の何れか一項に記載のキメラアデノ−パルボウイルスベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アデノウイルスゲノム内に挿入された全パルボウイルスゲノムを含むことを特徴とするキメラアデノ−パルボウイルスベクターであって、（ａ）該アデノウイルスゲノムはＥ１およびＥ３の欠失を特徴とする、および（ｂ）少なくとも１つのパルボウイルスタンパク質ＮＳ、特にＮＳ１の生物学的活性は、キメラ産生工程中に（好ましくは、一過性で）抑制される、または遮断さえされるが癌細胞内では十分に機能的であるキメラアデノ−パルボウイルスベクターに関する。
【背景技術】
【０００２】
様々なタイプの癌を治療するための新規な標的化アプローチが緊急に必要とされる。腫瘍退縮性ウイルスは、正常細胞を傷つけることなく癌細胞を標的とすることができるので、癌の治療に期待が持てる。それらのなかでも、２群のウイルス、アデノウイルスおよび自律的パルボウイルスは、代替抗腫瘍薬として大きな注目を集めている。アデノウイルス（Ａｄ）は、遺伝子療法のための治療遺伝子を送達するためのベクターとして、および腫瘍退縮性ウイルス療法のための直接的細胞毒性剤として機能するように遺伝子組み換えされてきた。他方、齧歯類自律的パルボウイルス（ＰＶ）は、腫瘍退縮および腫瘍抑制特性を示し、ヒトにとって非病原性である。
【０００３】
アデノウイルス（Ａｄ）は、エンベロープを持たない２０面体の二本鎖ＤＮＡウイルスである。今日現在、大多数が呼吸もしくは消化管および眼に感染する、５０種を超える異なるヒト血清型が報告されている（非特許文献１［１］）。Ａｄ感染症は極めて一般的であり、何らかの重篤な病原性とは概して関連していない。Ａｄゲノムは３０〜３８ｋｂｐを含み、感染宿主細胞の核に送達される。Ａｄは最も多く用いられる遺伝子療法ベクターであり、最近２０年では、ワクチンおよび治療用遺伝子導入について承認された第Ｉ〜ＩＩＩ相臨床試験の２５％において使用された（非特許文献２、３［２、３］）。これは、これらのベクターが広範囲の様々な細胞タイプへ導入遺伝子を効率的に送達する能力に大きく起因する（非特許文献１［１］）。さらに、Ａｄは、遺伝子操作のための多大な能力を提供する、顕著なＤＮＡパッケージング能力を備える極めて汎用的なツールである。Ａｄゲノムは、その複製または特異的腫瘍細胞への発現を制限するために様々な方法で改変することができる（非特許文献４［４］）。さらに、分子アダプターの使用またはＡｄカプシドの遺伝子組み換えによって、Ａｄ侵入をリダイレクトしそれを癌細胞に対してより特異的なものにすることができる（非特許文献５、６［５、６］）。さらに、Ａｄは、適正製造基準（ＧＭＰ）条件下で高い力価および品質で産生することができる（非特許文献６［６］）。その結果、Ｅ１Ｂ−５５ＫおよびＥ３Ｂ領域内に欠失を備えるウイルス血清型Ａｄ２およびＡｄ５のハイブリッドであるＯＮＹＸ−０１５は、様々な腫瘍実体およびこのベクターの改変に対する臨床試験において使用可能な最初の遺伝子組み換え複製選択的ウイルスであり、Ｅ１Ｂ−５５Ｋ欠失アデノウイルスＨ１０１は、頭頸部癌治療のために２００５年、中国において市場販売承認を受けた（非特許文献７、８［７、８］）。
【０００４】
自律的齧歯類パルボウイルス（ＰＶ）は、小型の２０面体の、エンベロープを持たない一本鎖ＤＮＡウイルスである。それらのゲノムは長さ約５．１ｋｂであり、非構造的（ＮＳ１およびＮＳ２）ならびに構造的（ＶＰ１およびＶＰ２）タンパク質の発現を各々制御する２つのプロモーターＰ４およびＰ３８を含有している（非特許文献９［９］）。マウスの微小ウイルス（ＭＶＭ）およびラットＨ−１ＰＶを含む数種のＰＶは、様々な細胞および動物癌モデルにおいて腫瘍退縮性および腫瘍抑制性であることが証明されている（非特許文献１０［１０］）。さらに、ＰＶは非病原性であり、ヒトにおける低罹患率を示し、治療薬としての使用に好都合である（非特許文献１１［１１］）。Ｈ−１ＰＶは、再発性多形膠芽腫を備える患者を治療するための第Ｉ／ＩＩａ相臨床試験においてまもなく評価される予定である（非特許文献１０［１０］）。これらのＰＶの抗腫瘍特性は、少なくともある程度、悪性細胞内での優先的ウイルスＤＮＡ複製および遺伝子発現に起因する。これはＳ期への、およびより特別には細胞因子、例えば癌細胞内で過剰発現することが知られているＥ２Ｆ、ＣＲＥＢ、ＡＴＦおよびサイクリンＡへのパルボウイルスの依存性に由来し得る（非特許文献１０［１０］）。さらに、ＰＶは、悪性細胞が一般的に効率的抗ウイルス先天性免疫応答を起こす能力がないことも利用することができる（非特許文献１２［１２］）。ＰＶは、細胞周期停止（非特許文献１３［１３］）、ならびに癌細胞内で壊死（非特許文献１４［１４］）、アポトーシス（非特許文献１３、［１３，１５］）およびリポソーム依存性細胞死（非特許文献１６［１６］）を含む様々な死の経路を誘導する能力を有することが証明されている。ＮＳ１は、パルボウイルス腫瘍毒性の主要エフェクターである（非特許文献１３［１３］）。前臨床試験はＰＶの抗癌潜在能力を強調しているが、この特徴は、これらの物質の臨床用途を考えるとさらに強化されるべきである。１つの重要な限界は、ＰＶが様々な正常ヒト細胞と結合してその中に侵入し、結果として大部分の投与されたウイルス用量の腫瘍標的細胞からの隔離を生じさせるという事実に存在する。腫瘍細胞へのＰＶ侵入を再標的化する工程は、ＰＶをベースとする治療の有効性を増し、正常細胞への最終的な副作用に対する安全性をさらに提供するであろう。さらに、複製能力を有するＰＶは、導入遺伝子に適応する限定された能力を有し、短い導入遺伝子（最高３００ｂｐ）の挿入だけを容認することによりそれらを治療用導入遺伝子で武装してＰＶの抗癌有効性を強化するという戦略を妨害する。さらに、臨床用途に必要とされるＰＶの大規模生産には、依然として大きな制限が存在する。
【０００５】
パルボウイルスゲノムの一部（Ｐ４−ＮＳ１−Ｐ３８領域を含むパルボウイルス遺伝子発現カセット）だけを有しており全パルボウイルスゲノムは有していないＡｄハイブリッドベクターの開発については、既に記載がある（非特許文献１７［３６］）。例えば、非特許文献１７［３６］に記載されたハイブリッドにはＮＳ１媒介性切除および標的癌細胞内のアデノウイルス主鎖からのＰＶゲノムの遊離に必須であるＮＳ１特異的切断部位を含むＩＴＲ領域が欠如している。十分に感染性のパルボウイルス粒子を産生する可能性を排除するＶＰ遺伝子も存在しない。
【０００６】
Ｔｅｔ依存性リプレッサーによって制御されるＲｅｐ遺伝子を有するＡＡＶゲノムを含むＡｄ５アデノウイルスについては、既に記載がある（特許文献１［３７］）。ＡＡＶはディペンドウイルスであり、ＡＡＶはパルボウイルス科に属するが、パルボウイルスと比較して顕著な相違を示し、そのため明確にパルボウイルスとは明確に区別されるウイルスである。極めて重要なことに、ＡＡＶは、効率的複製についてはヘルパーウイルス、例えばアデノウイルスに左右されるが、パルボウイルス、例えばＨ−１ＰＶには複製能力がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開公報WO03/061582号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Russell, W.C., Adenoviruses: update on structure and function. J Gen Virol, 2009. 90 (Pt 1): p. 1-20.
【非特許文献２】Edelstein, M.L., et al., Gene therapy clinical trials worldwide 1989-2004-an overview. J Gene Med, 2004. 6(6): p. 597- 602.
【非特許文献３】Kurreck, J., Antisense technologies. Improvement through novel chemical modifications. Eur J Biochem, 2003. 270(8): p. 1628-44.
【非特許文献４】Mathis, J.M., M.A. Stoff-Khalili, and D.T. Curiel, Oncolytic adenoviruses - selective retargeting to tumor cells. Oncogene, 2005. 24(52): p. 7775-91.
【非特許文献５】Everts, M. and D.T. Curiel, Transductional targeting of adenoviral cancer gene therapy. Curr Gene Ther, 2004. 4(3): p. 337-46.
【非特許文献６】Rein, D.T., M. Breidenbach, and D.T. Curiel, Current developments in adenovirus-based cancer gene therapy. Future Oncol, 2006. 2(1): p. 137-43.
【非特許文献７】Peng, Z., Current status of gendicine in China: recombinant human Ad-p53 agent for treatment of cancers. Hum Gene Ther, 2005. 16(9) : p. 1016-27.
【非特許文献８】Liu, T.C., E. Galanis, and D. Kirn, Clinical trial results with oncolytic virotherapy: a century of promise, a decade of progress. Nat Clin Pract Oncol, 2007. 4(2): p. 101-17.
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【非特許文献１１】Cornells, J. J., et al., Parvovirus oncosuppression, in Parvoviruses, J.R. Kerr, Cotraore, S.F., Bloom, M.E., Linden, R.M., Parrish, C.R. (Eds.), Editor. 2006, Hodder Arnold: London, p. 365-378.
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【非特許文献１３】Hristov, G . , et al., Through Its Nonstructural Protein NSl, Parvovirus H-l Induces Apoptosis via Accumulation of Reactive Oxygen Species. J Virol, 2010. 84(12): p. 5909-22.
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【非特許文献１７】Raykov et al., Gene Therapy, Vol. 9, No. 5, 2002, pp. 358-362.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
そこで、本発明が基づく課題は、（ａ）パルボウイルス産生の効率を上げる、（ｂ）癌細胞に対する特異性を増す、及び（ｃ）ＰＶ−抗腫瘍活性を補完して強化することのできる治療用導入遺伝子の挿入／発現に関する現在の限界を克服する手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
この技術的課題は、特許請求の範囲において特性付けた実施形態を提供することによって解決される。
【００１１】
１９７０年代初頭以降、ＤＮＡ組み換えテクノロジーは、生物学者がそのニーズに適応するために様々なウイルスベクターの遺伝子組み換えを行うことを可能にした［１７］。詳細には、親ウイルスを分析する［１８］ならびに親ウイルスの所望の特性を結合した新規な人工ビリオン類を得てそれらの現在の限界の一部を補償する［１８〜２５］ためにウイルスキメラを産生した。本発明に至った実験では、アデノ−パルボウイルス（Ａｄ−ＰＶ）キメラは、このキメラがＡｄヘルパー機能の同時発現を通して癌細胞内でのＰＶ複製を強化することができると予想して、ｈＨ−１ＰＶの完全ゲノムをＥ１およびＥ３領域の欠失したＡｄ５ゲノム内に挿入することによって作り出された（Ａｄ５ΔＥ１ΔＥ３）［２６〜２８］。ＰＶに基づく癌療法における長期的な利点には、さらに（ｉ）再標的化されたＡｄによる癌細胞へのＰＶゲノムの特異的送達、および（ｉｉ）ＰＶ殺滅活性を強化する治療用導入遺伝子で武装しているＡｄゲノムを含めることができる。腫瘍退縮特性が付与されたアデノウイルスベクターを使用すると、該キメラのＰＶ成分はこの抗腫瘍活性を（ｉ）その天然ＰＶプロモーター下で細胞毒性ＮＳ１タンパク質を発現する工程、および（ｉｉ）該ベクターからのＰＶ除去による抗腫瘍作用、自律複製および腫瘍全体への拡散を増幅させる工程によって強化するはずである。
【００１２】
Ａｄ−ＰＶキメラを開発する最初の試みは、製造段階で、ハイブリッドベクター複製とともにＰＶ非構造的（ＮＳ）タンパク質の強度の負の干渉に起因して失敗した。そこで、キメラ産生工程中のウイルスＮＳタンパク質の発現を厳密に制御するための戦略が考案された。このために、最初にＨ−１ＰＶ−ＴＯパルボウイルスを遺伝子組み換えしたが、このとき該ＮＳ遺伝子単位の発現を制御する初期Ｐ４プロモーターは、テトラサイクリンオペレーター（ＴＯ）エレメントを挿入することによって改変された［２９，３０］。Ｔｅｔリプレッサー（ＴｅｔＲ）を構成的に発現するＨＥＫ  Ｔ−ＲＥｘ（商標）−２９３細胞内では、Ｐ４−ＴＯの活性は完全に阻害され、結果としてＮＳ１タンパク質の発現もＰＶ複製も、テトラサイクリンに類似のドキシサイクリン（ｄｏｘ）が培地に加えられない限り検出されなかった。これとは反対に、ＴｅｔＲを発現しない癌標的細胞では、Ｐ４は野生型レベルに完全に機能的であった。これらの結果に基づくと、ＰＶ−ＴＯゲノムはＡｄ  ＤＮＡ骨格内に挿入され、Ａｄ−ＰＶ−ＴＯキメラを産生した。上記の結果と調和して、ＮＳ発現の遮断は、該キメラをＴ−ＲＥｘ（商標）−２９３細胞内で高力価にて産生させた。Ａｄ−ＰＶ−ＴＯキメラは、癌細胞へそのＰＶ成分を効率的に送達可能であることを証明し、このとき該パルボウイルスゲノムはベクターから除去され、自律複製して子孫ＰＶ粒子を産生した。極めて著明に、Ａｄ−ＰＶ−ＴＯは、様々な癌細胞系の殺滅に関して親ＰＶもしくはＡｄ（単独使用もしくは併用された）よりはるかに効率的であった。
【００１３】
これは、それからレスキューされて標的細胞内で自律増幅する感染性ウイルス（ＰＶ）分子クローンは様々なウイルスベクター（Ａｄ）によって負荷および送達され得るという最初の証明である。Ａｄ−ＰＶキメラは全部を１つに結合できるであろう癌に対する革新的ウイルス戦略、癌選択的再標的化、ウイルス腫瘍退縮および癌遺伝子療法にとっての潜在的な着手基盤を表している。
【００１４】
要約すると、本発明のキメラは、先行技術のＰＶを考慮に入れると以下の利点によって特徴付けられる。
【００１５】
第１に、本発明のキメラは、２つの分野、パルボウイルス学およびアデノウイルス学の研究および開発を結合する。パルボウイルスは、アデノウイルス分野において開発された先進技術から利益を得ることができた。他方、ＰＶは、Ａｄの抗腫瘍活性を（ｉ）強力なＰＶ  Ｐ４プロモーター下で細胞毒性ＮＳ１タンパク質を発現させる工程、および（ｉｉ）抗腫瘍作用をＰＶ複製によって増幅させ、腫瘍全体に拡散させる工程によって強化することになる。
【００１６】
第２に、本発明は、改良された抗癌有効性を有する。Ａｄ−ＰＶは、様々な癌細胞系に対して親ウイルスより強力な抗癌剤である。
【００１７】
第３に、本発明は、ＰＶ産生を改良する。Ａｄ−ＰＶは、任意のＡｄに基づくベクターと同様、臨床上の必要性と適合するＧＭＰ条件下で多量に産生される可能性がある。これは、ＰＶおよびパルボウイルスに基づくベクターを産生する際の困難を克服することができた。
【００１８】
第４に、本発明は、ＰＶ癌特異性を改良する。現在は、Ａｄ再標的化技術を利用してパルボウイルスの癌特異性を改良することが可能である。実際、癌再標的化Ａｄ（例えば、Ａｄカプシド癌特異的ペプチド、リガンド、アダプター、アフィボディ分子、一本鎖抗体等に挿入することによって得られた）（７）は、パルボウイルスゲノムの癌細胞内への特異的送達のためのビヒクルとして使用可能な第二世代のＡｄ−ＰＶキメラを開発するために使用することができた。
【００１９】
第５に、本発明は、ＰＶ抗新生物効果を改良し、革新的な抗癌戦略を開発する道を開く。Ａｄ−ＰＶは、他の治療用導入遺伝子（５ｋｂまで）がそのゲノム内に適応する能力を提供する。Ａｄゲノム内へのさらなる欠失とともに、遺伝子操作の自由空間を、３０ｋｂに拡大することができた。Ａｄ−ＰＶは、補足的遺伝子ＰＶブースター（例えば、悪性細胞内でのＰＶ腫瘍退縮および／またはＰＶ複製を強化することができた分子）および／または同時癌遺伝子療法に適応することができた。
【００２０】
第６に、本発明は、インターベンションの可能性を増す。Ａｄ−ＰＶキメラゲノムは、様々な免疫学的に特徴のあるＡｄカプシドのパネル内にカプシド形成することができ、これは同一患者への反復Ａｄ−カプシド投与を可能にし、以前の抗Ａｄ−ＰＶ液性応答を迂回し、インターベンションの可能性を増した。同様に、Ａｄ−ＰＶは、既にＰＶ治療を受けた、および既に抗ＰＶ中和抗体を発生した患者にＰＶゲノムを送達するために使用することができた。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】アデノ−パルボウイルスキメラ産生を用いたパルボウイルス非構造的タンパク質の干渉  ２９３細胞は、ｐＡｄ−ｈＨ−１またはその中で３つのＳＴＯＰコドンがＮＳオープンリーディングフレーム内に挿入されるｐＡｄ−ｈＨ−１−ＳＴＯＰを用いてトランスフェクトさせた。１週間後、細胞を溶解させ、それらの粗抽出物は、感染による第２ラウンドのウイルス増幅のために新鮮２９３細胞に接種した。これらの培養物由来の細胞溶解物は、ＣｓＣｌ超遠心分離によって２回精製し、産生されたアデノウイルス粒子は吸光度２６０ｎｍで測定した。
【図２ａ】誘導性パルボウイルスＰ４プロモーター（Ｐ４−ＴＯ）の構築  ２つのテトラサイクリンオペレーター２（ＴｅｔＯ２）エレメントをｈＨ−１ゲノム由来のＰ４プロモーター内へ挿入することによって産生されたＰ４−ＴＯプロモーターの略図。ＴＦ：転写因子。
【図２ｂ】誘導性パルボウイルスＰ４プロモーター（Ｐ４−ＴＯ）の構築  Ｐ４−ＴＯプロモーターのＤＮＡ配列。ＴＡＴＡボックス、２つのＴｅｔＯ２エレメントおよびＮＳ翻訳ＡＴＧ開始コドンが強調されている。
【図３】Ｐ４−ＴＯプロモーターを含有するｐｈＨ−１−ＴＯプラスミドの誘導  （Ａ）実験設計。Ｔｅｔリプレッサーを構成的に発現するＴ−ＲＥｘ（商標）−２９３細胞は、ｐｈＨ−１もしくはｐｈＨ−１−ＴＯ分子クローンの何れかを用いてトランスフェクトし、ｄｏｘ（１ｇ／ｍＬ）を含む（＋）、または含まない（−）培地中で増殖させた。４８時間後、全タンパク質細胞抽出液をこれらの培養物から調製し、ウイルスタンパク質（ＮＳ１およびＶＰ）ならびにアクチン（負荷コントロールとして使用）の存在についてウェスタンブロッティングによって分析した。（Ｂ）ウイルス遺伝子発現がｄｏｘ誘導に応答することを示しているウェスタンブロット。タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。
【図４】ｈＨ−１−ＴＯウイルスの感染性  （Ａ）実験設計。Ｔ−ＲＥｘ（商標）−２９３細胞は、ｐｈＨ−１もしくはｐｈＨ−１−ＴＯウイルスプラスミド何れかでトランスフェクトさせ、ｄｏｘの存在下または非存在下で１週間増殖させた。細胞は、培地中で採取し溶解させた。産生されたウイルスは、ＮＢ３２４Ｋ細胞を感染させることによってさらに増幅させた。これらの培養物からの細胞溶解物を次に、ＮＢ３２４Ｋ指標細胞上でのプラークアッセイによってパルボウイルス粒子の存在について分析した。（Ｂ）プラークアッセイからの代表的画像（５ｃｍ径の領域）。
【図５】Ｔ−ＲＥｘ（商標）−２９３細胞内でのｈＨ−１−ＴＯウイルス複製のｄｏｘ依存性  （Ａ）実験フローチャート。６ウエルプレート内で増殖させたＴ−ＲＥｘ（商標）−２９３細胞は、ｈＨ−１もしくはｈＨ−１−ＴＯウイルスを用いて、１細胞当たり２，５００Ｖｇ（ウイルスゲノム）の感染多重度で感染させ、さらにｄｏｘの存在下または非存在下で増殖させた。４日後、細胞を培地内で採取し、３回の冷凍および解凍サイクルにより溶解させた。遠心分離による細胞破片の除去後、粗ウイルス調製物は、遊離ウイルスＤＮＡを除去するためにベンゾナーゼを用いて処理し、パルボウイルス特異的ｑＰＣＲのために処理した。（Ｂ）Ｖｇ／ｍＬで表示した、ｈＨ−１もしくはｈＨ−１−ＴＯパルボウイルスのｑＰＣＲ結果。
【図６】キメラｐＡｄ−ｈＨ−１−ＴＯプラスミドの誘導  （Ａ）実験フローチャート。Ｔ−ＲＥｘ（商標）−２９３細胞は、ｐＡｄ−ｈＨ−１−ＴＯプラスミドを用いてトランスフェクトし、さらに５日間ｄｏｘを含む、または含まない培地中で増殖させた。次に細胞を溶解させ、全タンパク質抽出液は、パルボウイルスＮＳ１およびＶＰタンパク質ならびにβ−チューブリン（負荷コントロール）の存在についてウェスタンブロッティングによって分析した。（Ｂ）免疫ブロットの代表的画像。タンパク質は、８％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。
【図７】アデノ−パルボウイルスキメラの産生  （Ａ）実験フローチャート。産生の第１ラウンドでは、Ｔ−ＲＥｘ（商標）−２９３細胞はキメラプラスミドｐＡｄ−ｈＨ−１−ＴＯもしくは親プラスミドｐＡｄ（ｐＡｄ５ΔＥ１ΔＥ３）もしくはｐｈＨ−１−ＴＯを用いてトランスフェクトし、ｄｏｘが補給された、（または補給されていない）培地中で増殖させた。これらの培養物からの細胞溶解物を第２ラウンドの産生において新鮮Ｔ−ＲＥｘ（商標）−２９３細胞の感染に使用し、この手順は、実施例１に記載したように培養フラスコの容量まで拡大することによって３回目を繰り返した。ウイルスストックは、ＣｓＣｌ勾配超遠心分離で２回精製し、特性解析した。（Ｂ）ウイルス調製物は、Ａｄｅｎｏ−Ｘ（商標）Ｒａｐｉｄ  Ｔｉｔｅｒ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を使用して滴定し、ＡｄＸ単位／ｍＬとして表示した。（Ｃ）精製Ａｄ−ｈＨ−１−ＴＯ  ＡｄおよびｈＨ−１−ＴＯウイルスの電子顕微鏡画像。実線は、１００ｎｍの長さを表す。
【図８】Ａｄ−ｈＨ−１−ＴＯキメラを用いて感染させた細胞内での子孫パルボウイルスのレスキューおよび産生  （Ａ）実験フローチャート。ＳｉＨａおよびＮＢ３２４Ｋ細胞をｈＨ−１−ＴＯもしくはＡｄ−ｈＨ−１−ＴＯウイルスで感染させ、培養培地は未結合ウイルスを除去するために１日後に交換した。さらに４〜５日間インキュベーションした後、細胞はそれらの培地中で採取して溶解させた。粗ウイルス調製物は、プラークアッセイによってパルボウイルスの存在について分析した。（Ｂ）指示したＭＯＩでＡｄ−ｈＨ−１−ＴＯもしくはｈＨ−１−ＴＯウイルスを用いて感染させたＳｉＨａおよびＮＢ３２４Ｋ細胞内で産生させたパルボウイルスを定量した。パルボウイルス力価は、ＰＦＵ／細胞で表示した。
【図９】Ａｄ−ｈＨ−１−ＴＯ、Ａｄコントロール、ｈＨ−１−ＴＯまたはＡｄコントロールおよびｈＨ−１−ＴＯウイルスの組み合わせを用いて感染させたヒト癌細胞系の増殖  ＨｅＬａ（Ａ）、ＣｘＣａ（Ｂ）ＭＥ−１８０（Ｃ）、Ｌｏｘ−ＩＭＶＩ（Ｄ）、ＨＣＴ−１５（Ｅ）、ＨＣＣ−２９９８（Ｆ）およびＡ５４９（Ｇ）ヒト癌細胞を９６ウエルＥ−プレート（ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ、Ｒｏｃｈｅ社）に播種し、指示した時点にＡｄ−ｈＨ−１−ＴＯキメラ、Ａｄコントロール、ｈＨ−１−ＴＯまたはＡｄベクターおよびｈＨ−１−ＴＯウイルスの組み合わせを用いて感染させた。未処理細胞をコントロールとして使用した。細胞指標値は、細胞数と比例しており、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅシステム（Ｒｏｃｈｅ社）を用いて最長１週間にわたり３０分毎に記録および測定した。３回ずつ実施した典型的実験からの平均値に相対標準誤差を添えて示した。
【図１０】Ａｄ−ｈＨ−１−ＴＯキメラはその親ウイルスと比較して腫瘍退縮活性を改善した  子宮頸癌由来ＨｅＬａ（Ａ）、ＣｘＣａ（Ｂ）、ＭＥ−１８０（Ｃ）、黒色腫ＬＯＸ−ＩＭＶＩ（Ｄ）、結腸癌ＨＣＴ−１５（Ｅ）およびＨＣＣ−２９９８（Ｆ）を９６ウエルプレートに播種し、キメラＡｄ−ｈＨ−１−ＴＯ（Ａｄ−ＰＶ）、Ａｄコントロール（Ａｄｃ）、ｈＨ−１−ＴＯパルボウイルス（ＰＶ）またはＡｄコントロールおよびｈＨ−１−ＴＯウイルスの混合物（ＰＶ＋Ａｄｃ）を用いて感染させた、または感染させなかった（−）。４日間のインキュベーション後、細胞溶解および細胞増殖を各々ＬＤＨおよびＭＴＴアッセイによって評価した。
【図１１】Ａｄ−ｈＨ−１−ＴＯキメラは正常ヒト一次細胞に対して限定された細胞毒性を有する  ヒト包皮線維芽細胞（Ａ）、ヒト口腔線維芽細胞（Ｂ）、ヒトメラノサイト（Ｃ）およびヒト星状膠細胞（Ｄ）を９６ウエルプレートに播種し、キメラＡｄ−ｈＨ−１−ＴＯ（Ａｄ−ＰＶ）、Ａｄコントロール（Ａｄｃ）、ｈＨ−１−ＴＯパルボウイルス（ＰＶ）またはＡｄコントロールおよびｈＨ−１−ＴＯウイルスの混合物（ＰＶ＋Ａｄｃ）を用いて感染させた、または感染させなかった（−）。５日間のインキュベーション後、細胞溶解および細胞増殖を各々ＬＤＨおよびＭＴＴアッセイによって評価した。
【図１２ａ】ＤＮＡ構築物  ｐＳｈｕｔｔｌｅ−ｈＨ−１−ＴＯ
【図１２ｂ】ＤＮＡ構築物  ｐＡｄ−ｈＨ−１−ＴＯ
【図１３】組み換えＡｄ−ＧＦＰおよびＨ−１ＧＦＰの形質導入効率  指示した細胞は、ＧＦＰレポーター遺伝子を有する組み換えＡｄもしくはＰＶ（ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を使用して定量した１０ＴＵ／細胞）を用いて感染させた。４８および７２時間後、細胞を採取し、フローサイトメトリーによって分析した。数値は、ＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージを表す。
【図１４】癌細胞系に対するＡｄ−ｈＨ−１−ＴＯキメラの向上した細胞毒性活性  ＨｅＬａ（ＡおよびＢ）、Ａ−５４９（ＣおよびＤ）、ＭＥ−１８０（ＥおよびＦ）、Ｌｏｘ−ＩＭＶＩ（ＧおよびＨ）、ＨＣＴ−１５（ＩおよびＪ）、ＨＣＴ２９９８（ＫおよびＬ）ならびにｐＭｅｌＬ（ＭおよびＮ）ヒト癌細胞を９６ウエル（ＬＤＨおよびＭＴＴアッセイ）もしくは９６ウエルＥ−プレート（ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ、Ｒｏｃｈｅ社）に播種し、指示したＭＯＩのＡｄ−ｈＨ−１−ＴＯキメラ（Ａｄ−ＰＶ）、Ａｄコントロール（Ａｄｃ）、ｈＨ−１−ＴＯ（ＰＶ）またはＡｄベクターおよびｈＨ−１−ＴＯウイルスの組み合わせ（ＰＶ＋Ａｄｃ）を用いて感染させた。未処理細胞（−）をコントロールとして使用した。パネルＡ、Ｃ、Ｅ、Ｇ、Ｉ、ＫおよびＭに示した数値は、材料および方法の項に記載したように計算した溶解（ＬＤＨアッセイ）もしくは生存（ＭＴＴ）細胞のパーセンテージを表す。パネルＢ、Ｄ、ＦおよびＨ、Ｊ、Ｌ、ならびにＮは、ＸＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅシステムを用いてリアルタイムで測定した、ウイルスを用いて感染させた、または感染させていない細胞の増殖曲線を示している。細胞指標値は、細胞数と比例しており、最長１週間にわたり３０分毎に記録および測定した。結果は、典型的な実験において３回ずつの測定値からの平均値を相対標準誤差バーを添えて表した。矢印は、感染時点を示している。
【図１５】正常ヒト一次細胞についてのＡｄ−ｈＨ−１−ＴＯキメラの限定された細胞毒性  ヒト包皮線維芽細胞（Ａ）、口腔線維芽細胞（Ｂ）、メラノサイト（Ｃ）および星状膠細胞（Ｄ）を９６ウエルプレートに播種し、キメラＡｄ−ｈＨ−１−ＴＯ（Ａｄ−ＰＶ）、Ａｄコントロール（Ａｄｃ）、ｈＨ−１−ＴＯパルボウイルス（ＰＶ）またはＡｄコントロールおよびｈＨ−１−ＴＯウイルスの混合物（ＰＶ＋Ａｄｃ）を用いて感染させた、または感染させなかった（−）。５日間のインキュベーション後、溶解細胞および生存細胞のパーセンテージ（％）は、各々材料および方法の項に記載したように、ＬＤＨおよびＭＴＴアッセイによって評価した。
【図１６】Ａｄ−ＰＶキメラを用いて感染させた細胞内での子孫パルボウイルスの産生、伝播および細胞毒性  （Ａ）パルボウイルスの産生：ＮＢ３２４ＫもしくはＳｉＨａ細胞は、１０（ＮＢ３２４Ｋ）もしくは１（ＳｉＨａ）のＭＯＩで使用したＡｄ−ＰＶキメラを用いて感染させ、培養培地は未結合ウイルスを除去するために１日後に交換した。さらに４〜５日間インキュベーションした後、細胞はそれらの培地中で採取し溶解させた。粗ウイルス調製物をプラークアッセイによってパルボウイルスの存在について分析した。産生したパルボウイルスの力価は、ＰＦＵ／ｍＬで表示した。（Ｂ）パルボウイルスの産生および伝播：ＮＢ３２４Ｋ細胞は、同等のゲノム量のＡｄ−ＰＶキメラもしくはＨ−１ＰＶ野生型ウイルス（投入量、１０Ｖｇ／ｃｅｌｌ（播種））を用いて感染させた。９６時間後、細胞を培地中で収集し、３回の冷凍−解凍サイクルにかけた。細胞ＤＮＡおよび非被包ウイルスＤＮＡを消化するために５０Ｕ／ｍＬのベンゾナーゼを用いた処理後、材料および方法の項に記載したように、粗細胞抽出液をｑＲＴ−ＰＣＲによって全ウイルス粒子の含量について分析した。（Ｃ）パルボウイルスの伝播：ＨｅＬａ細胞をＡｄ−ＰＶキメラ（２５Ｖｇ／細胞）を用いて感染させた。感染１０時間後、１セットの培養皿は第２ラウンドのパルボウイルス感染を防止するために０．１Ｕ／ｍＬのノイラミニダーゼを用いて処理したが（＋ＮＡ）、別のセットは未処理のまま放置した（−ＮＡ）。ベンゾナーゼ前処理した全細胞溶解物は、ウイルス粒子含量についてｑＲＴ−ＰＣＲによって分析した。（Ｄ）パルボウイルスの伝播および細胞毒性：９６ウエルプレート内で増殖させたＨｅＬａ細胞をＡｄ−ＰＶキメラを用いて感染させ、パネルＣに記載したようにＮＡを用いて処理して、または処理せずに、７２時間後にＬＤＨアッセイのために処理した。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
そこで第一の態様では、本発明は、アデノウイルスゲノム内に挿入された全パルボウイルスゲノムを含むことを特徴とするキメラアデノ−パルボウイルスベクターであって、
（ａ）前記アデノウイルスゲノムはＥ１およびＥ３の欠失を特徴とする、および
（ｂ）少なくとも１つのＮＳタンパク質、特にＮＳ１の生物学的活性は、（好ましくは、一過性で）キメラ産生中のパッケージング細胞系内で抑制、又は遮断されるが癌細胞内では十分に機能的であるキメラアデノ−パルボウイルスベクターに関する。
【００２３】
当業者であれば、当該技術分野において公知の方法を用いてアデノウイルスの公知のヌクレオチド配列から出発してＥ１およびＥ３の欠失を有するアデノウイルスヌクレオチド配列に到達することができる。少なくとも１つ以上のパルボウイルスタンパク質ＮＳ（好ましくはＮＳ１および／またはＮＳ２）の生物学的活性の減少もしくは除去は、当業者に公知の数種の方法によって、例えば該タンパク質の不活性および／または短縮バージョンを生じさせる該タンパク質のアミノ酸配列を改変することによって、または好ましくは、前記タンパク質をコードする該遺伝子の発現を減少もしくは除去することによって、例えばＮＳの発現を指示するパルボウイルスＰ４初期プロモーターを改変することによって達成され得る。好ましくは、該プロモーターは、該発現を多量に産生させるためにキメラウイルスの増殖中には選択的に抑制することができるが、患者へのキメラベクター／ウイルスの治療的応用のためには回復される、つまり患者の癌細胞内でＮＳが発現するような方法で改変される。好ましくは、Ｐ４初期プロモーターは、発現を以下の実施例に記載したテトラサイクリンリプレッサーによって一過性に遮断可能な方法で改変される。ＴｅｔＲを発現しない癌細胞内では、Ｐ４プロモーターは完全に機能的である。
【００２４】
好ましくは、本発明のキメラアデノ−パルボウイルスベクターのアデノウイルスゲノムは、Ａｄ５のゲノムである。
【００２５】
本発明のキメラアデノウイルス−パルボウイルスベクターでは、該パルボウイルスは、齧歯類パルボウイルスである。好ましい齧歯類パルボウイルスは、ＬｕＩＩＩ、マウス微小ウイルス（ＭＭＶ）、マウスパルボウイルス（ＭＰＶ）、ラット微小ウイルス（ＲＭＶ）、ラットパルボウイルス（ＲＰＶ）、ラットウイルス（ＲＶ）もしくはＨ１（Ｈ１−ＰＶ）である。好ましくは、該パルボウイルスは、パルボウイルスＨ１に由来する。
【００２６】
さらに、本発明のキメラアデノ−パルボウイルスベクターは、標的細胞内へ成功裏に導入することを証明するよう、発現可能な導入遺伝子、例えば検出可能な表現型マーカーをコードする遺伝子を含有することができる。好ましくは、マーカータンパク質は、蛍光タンパク質である。これは、所望の標的細胞のトランスフェクションを容易に証明する。蛍光タンパク質をコードする適切な遺伝子の例は、ｒｆｐ−（レッド）、ｇｆｐ−（グリーン）、ｃｆｐ−（シアン）およびｙｆｐ−（イエロー）遺伝子であり、ｒｆｐ−（レッド）（Ｄｓｒｅｄ−ｃＤＮＡ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）が好ましい。本発明のキメラアデノ−パルボウイルスベクターのまた別の実施形態では、導入遺伝子は、本発明のベクターの治療上の利点を支持することができる治療用もしくは免疫原性ポリペプチドをコードする遺伝子である。そのような導入遺伝子の例は、細胞毒性ポリペプチド、サイトカイン、ケモカイン、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、癌特異的ペプチド、リガンド、アダプター、アフィボディ、一本鎖抗体および／またはＰＶ腫瘍退縮および／またはＰＶ複製を強化するポリペプチドである。
【００２７】
導入遺伝子の発現を駆動する適切な（異種）プロモーターの例は、配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質である非構造的タンパク質ＮＳ１によって強力に転写活性化されるマウスの自律的パルボウイルス微小ウイルスのＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＨＳＶ（ヘルペス単純ウイルス）ｔｋプロモーターもしくはＰ３８プロモーターである。Ｐ３８プロモーターが好ましい。発現カセット（プロモーター／例えばマーカー遺伝子／ポリアデニル化部位）は、当業者であれば容易に決定することができる適切な部位でベクター内に挿入される。
【００２８】
第二の態様では、本発明は、キメラアデノ−パルボウイルスベクターを調製する方法であって、
（ｉ）哺乳動物細胞が本発明のキメラアデノ−パルボウイルスベクターを用いてトランスフェクトされ、該パルボウイルスＮＳ転写ユニットの発現を遮断する条件下で培養される、及び、
（ｉｉ）該キメラアデノ−パルボウイルスは、該細胞を培養した後に該哺乳動物細胞もしくは該培地から単離されることを特徴とするキメラアデノ−パルボウイルスベクターを調製する方法に関する。
【００２９】
そこで、組み換え粒子は、上記のベクターを、この用語が当該技術分野で理解されているように、許容細胞（例えば、「許容」細胞は、ウイルスによって感染もしくは形質導入することができる）内に導入することによって産生される。例えばエレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈降法、マイクロインジェクション法、カチオン性もしくはアニオン性リポソーム、および核局在化シグナルと組み合わせたリポソームを含むがそれらに限定されないベクターを許容細胞内に導入する任意の方法を使用することができる。
【００３０】
当該技術分野において既知の任意の適切な許容哺乳動物細胞、例えばＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｑ、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥ２９３ＴＴ細胞およびアデノウイルスＥ１タンパク質を発現する任意のパッケージング細胞系を、本発明のキメラアデノ−パルボウイルスを産生するために使用することができる。本発明の方法の好ましい実施形態では、該哺乳動物細胞は、ＨＥＫ  Ｔ−ＲＥｘ（商標）−２９３細胞である。
【００３１】
本発明は、本発明の方法によって入手可能な組み換えキメラアデノ−パルボウイルスベクターならびにそのようなベクターを含有する細胞をさらに提供する。
【００３２】
最後に、本発明は、本発明のキメラアデノ−パルボウイルスベクターおよび薬学的に許容される担体を含有する医薬組成物ならびに遺伝子療法もしくは腫瘍を治療する方法において使用するための本発明のキメラアデノ−パルボウイルスベクターの使用にも関する。適切な担体およびそのような医薬品の調製は、当業者には公知である。適切な担体は、例えばリン酸緩衝食塩液、水、エマルジョン、例えば油／水型エマルジョン、湿潤剤、無菌溶液などを含んでいる。担体の種類は、本発明によるベクター／ウイルスの投与方法に左右される。適切な用量は、主治医によって決定され、様々な因子、例えば、患者の年齢、性別および体重、疾患の重症度、投与の種類などに左右される。
【００３３】
遺伝子療法は、本発明によるキメラアデノ−パルボウイルスベクターを用いて実施することができ、細胞は該ベクターもしくは該ウイルス粒子とのインキュベーションによって形質導入／感染される。該細胞は、生体内に存在する可能性があり、被感染細胞は、針注射、ジェット注射もしくは微粒子銃によって到達可能である。他方、形質導入される細胞も生体から単離し、該生体外で感染させ、その後に該生体に再度戻すことができる。そのような細胞は、自己細胞と呼ばれる。さらに、生体に関しては、形質導入のために同種異系細胞を使用することもできる。これに関連して、これらの細胞は、該生体に対応するＨＬＡタイプに属することが好ましい。所定のＨＬＡタイプを備える細胞を提供する方法は当業者に公知である。本発明による組み換えベクター（粒子）は、化学療法、つまり腫瘍療法へのアジュバント適用にも有用である。
【００３４】
これらをまとめると、本発明者らは、アデノウイルスの高力価および効率的遺伝子導入を齧歯類パルボウイルスの抗癌能力と組み合わせたキメラアデノウイルス−パルボウイルス（Ａｄ−ＰＶ）ベクターの産生を成し遂げた。このために、最も好ましい実施形態では、腫瘍退縮性の全ＰＶゲノムが複製欠陥性Ｅ１およびＥ３欠失Ａｄ５ベクターゲノム内へ挿入された。パルボウイルスＮＳ発現がＡｄ−ＰＶキメラの産生を阻害することを見いだしたので、本発明者らは、最も好ましい実施形態において、その配列内へテトラサイクリンオペレーターエレメントを挿入することによって、ＮＳ発現を支配するパルボウイルスＰ４初期プロモーターを遺伝子工学により作製した。これらの改変の結果、Ｐ４駆動発現は、高収率キメラ産生を可能にするテトラサイクリンリプレッサーを構成的に発現する好ましいパッケージングＴ−ＲＥｘ（商標）−２９３細胞内では遮断された。該キメラは、それから完全に感染性複製能力を有するパルボウイルス粒子が産生された癌細胞内にＰＶゲノムを効率的に送達した。注目すべきことに、Ａｄ-ＰＶキメラは様々な癌細胞系に対して、試験した正常一次ヒト細胞のパネルに対して無害のままでありながら、ＰＶおよびＡｄ親ウイルスと比較して強力な細胞毒性活性を発揮した。このＡｄ−ＰＶキメラは、導入遺伝子で武装する、または腫瘍細胞を再標的化することでその強化された腫瘍退縮能力を増強するために、さらに遺伝子操作にかけることができる新規な多用途性の抗癌剤を表す。そこで、本発明のキメラアデノウイルス−パルボウイルスベクターは、好ましくは癌治療薬として使用すべきである。標的とすることのできる癌の例は、子宮頸癌、神経膠腫、膵臓癌、黒色腫、肺癌および結腸癌であり、ＰＶ細胞毒性に抵抗性である他の癌も含まれる。
【実施例】
【００３５】
（実施例１）
材料および方法
（Ａ）細胞
ＨＥＫ２９３（形質転換ヒト胚腎）、ＮＢ３２４Ｋ（形質転換ヒト新生児腎）およびＡ５４９（肺癌）細胞系は、ＡＴＣＣ（ＬＧＳ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ社、ドイツ国ウェーゼル）およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（ドイツ国ダルムシュタット）のＨＥＫ  Ｔ−ＲＥｘ（商標）−２９３から入手した。ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タイプ１６および１８各々に対して陽性であるＨｅＬａおよびＳｉＨａ子宮頸癌細胞系は、Ｄｒ．  Ａｎｇｅｌ  Ａｌｏｎｓｏ（ＤＫＦＺ（ドイツ癌研究センター）、ドイツ国ハイデルベルク）からの寄贈品であった。ＨＰＶ６８に対して陽性であるＭＥ−１８０細胞系は、Ｄｒ．  Ｅｌｉｓａｂｅｔｈ  Ｓｃｈｗａｒｚ（ＤＫＦＺ、ドイツ国ハイデルベルク）から入手した。ＨＰＶ１６に対して陽性である初期継代の子宮頸癌由来細胞培養（ＣｘＣａ）は、Ｄｒ．  Ａｎｄｒｅａｓ  Ｋａｕｆｍａｎｎ（シャリテ・ベルリン医科大学、ドイツ国）によって提供された。結腸癌ＨＣＴ−１５およびＨＣＣ−２９９８ならびに黒色腫Ｌｏｘ−ＩＭＶＩ細胞系は、国立癌研究所（ＮＣＩ）（米国メリーランド州ベテスダ）から入手した。ヒト一次口腔線維芽細胞および包皮線維芽細胞は、Ｄｒ．  Ｍａｓｓｉｍｏ  Ｔｏｍｍａｓｉｎｏ（ＩＡＲＣ、フランス国リヨン）からの贈呈品であった。軽度に色素沈着したヒト一次成人メラノサイト（ＨＥＭａ−ＬＰ）は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（米国カリフォルニア州カールスバッド）から入手した。ヒトアストロサイトは、ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（米国カリフォルニア州サンディエゴ）から入手した。
【００３６】
ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ、ＳｉＨａ、ＣｘＣａ、Ａ５４９およびヒト一次口腔線維芽細胞は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、ドイツ国カールスルーエ）が補給されたダルベッコの変法エーグル培地（ＤＭＥＭ）中で増殖させた。Ｔ−ＲＥｘ（商標）−２９３細胞は、１０％のテトラサイクリン無含有認証ＦＢＳ（ＰＡＡ社、ドイツ国ケルベ）を含有するＤＭＥＭ中で増殖させた。ＭＥ−１８０細胞は、１０％ＦＢＳが補給されたＭｃＣｏｙ’ｓ  ５ａ変法培地中で各々増殖させた。ＨＣＴ−１５、ＨＣＣ−２９９８およびＬｏｘ−ＩＭＶＩは、１０％ＦＢＳが補給されたＲｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＲＰＭＩ）１６４０培地中で増殖させた。ヒト一次包皮線維芽細胞およびＮＢ３２４Ｋは、１０％および５％ＦＢＳ各々が補給された最小必須培地（ＭＥＭ）中で増殖させた。一次ヒト成人メラノサイトは、ＨＭＧＳを補給した培地２５４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国カリフォルニア州カールスバッド）中で増殖させた。ヒトアストロサイトは、アストロサイト培地（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、米国カリフォルニア州サンディエゴ）中で培養した。メラノサイトおよびアストロサイトの培地を除く培地は全て、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンおよび２ｍＭのＬ−グルタミンを含有していた。細胞は、３７℃および９２％湿度の５％ＣＯ２中で増殖させた。
【００３７】
（Ｂ）ウイルス
ｈＨ−１およびｈＨ−１−ＴＯウイルスは、Ｔ−ＲＥｘ（商標）−２９３細胞中で産生させた。細胞は１０ｃｍ培養皿内のテトラサイクリン無含有培地中で培養し、１０μｇ／皿のｐｈＨ−１もしくはｐｈＨ−１−ＴＯウイルス構築物何れかを用いて１２．５％コンフルエンシーで一過性トランスフェクトした。トランスフェクションの４時間後、３日および６日後、ｄｏｘ（１μｇ／ｍＬ）を培地に加えた。第７日に、細胞を培地中で採取し、３回の冷凍および解凍周期によって溶解させ、細胞破片を遠心分離によって除去した。産生したウイルスは、ＮＢ３２４Ｋ細胞を感染させることによってさらに増幅させ、ヨードキサノール勾配遠心分離で精製した。
【００３８】
Ａｄ−ｈＨ−１−ＴＯおよびＡｄコントロール（Ａｄ５ΔＥ１ΔＥ３）は、５％テトラサイクリン無含有ＦＢＳを含有する培地中で培養したＴ−ＲＥｘ（商標）−２９３細胞内での３ラウンドの産生によって産生した。第１ラウンドでは、１２ウエルプレート内の細胞は、ＰａｃＩを用いて予備消化した１μｇ／ウエルのｐＡｄ−ｈＨ−１−ＴＯもしくはｐＡｄ５ΔＥ１ΔＥ３プラスミドを用いて７５％コンフルエンシーでトランスフェクトした。トランスフェクション後、細胞は１μｇ／ｍＬのｄｏｘを用いて誘導した、または誘導しなかった。トランスフェクションの５日後、最適増殖条件を保証するために、培養培地の半分を取り替えた。トランスフェクションの７日後、細胞を培地中で採取し、３回の冷凍および解凍周期によって溶解させ、細胞破片を遠心分離によって除去した。第２ラウンドで、第１ラウンドで産生した粗ウイルス抽出物の２５％を使用して７５ｃｍ２フラスコ内で増殖させたＴ−ＲＥｘ（商標）−２９３細胞を感染させた。感染５日後、最適増殖条件を維持するために新鮮培地の半分を加えた。感染７日後、上述したように細胞を採取し、溶解させた。１７５ｃｍ２フラスコ内で実施したことを除き、第３ラウンドは第２ラウンドと同様に行った。最終ウイルスバッチは、ＣｓＣｌ勾配超遠心分離で２回精製した。
【００３９】
（Ｃ）ＤＮＡクローニング
ｐｈＨ−１−ＴＯパルボウイルスプラスミドは、ＰＣＲクローニングを通して２つのＴｅｔＯ２リプレッサーエレメントをｐｈＨ−１のＰ４プロモーター内に挿入することによって構築した［３１］。第１工程では、鋳型としてｐｈＨ−１を使用して、以下のプライマー、
ＰＣＲ１−Ｆｏｒ：５’−ＡＡＡＣＴＣＧＡＧＧＣＧＧＴＴＣＡＧＧＧＡＧＴＴＴＡＡＡＣＣ−３’、及び
ＰＣＲ１−Ｒｅｖ：５’−ＡＡＣＴＧＡＣＴＴＣＴＣＴＣＴＡＴＣＡＣＴＧＡＴＡＧＧＧＡＧＡＴＣＴＣＴＡＴＣＡＣＴＧＡＴＡＧＧＧＡＡＧＴＡＧＴＴＧＣＴＴＡＴＡＴＡＣＴＴＴＡＡＡＣＣ−３’、
ＰＣＲ２−Ｆｏｒ：５’−ＡＧＣＡＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＴＡＴＣＡＧＴＧＡＴＡＧＡＧＡＴＣＴＣＣＣＴＡＴＣＡＧＴＧＡＴＡＧＡＧＡＧＡＡＧＴＣＡＧＴＴＡＣＴＴＡＴＣＴＴＴＴＣＴＴＴＣ−３’、及び
ＰＣＲ２−Ｒｅｖ：５’−ＡＡＡＡＡＧＣＴＴＣＣＡＴＣＣＧＡＴＡＴＣＴＴＴＴＣＣＡＴＴＣＡＧ−３’を用いて２回のパラレルＰＣＲを実施した。第２工程では、第３回目のＰＣＲは、鋳型としての２つの以前に精製されたＰＣＲ産物と、プライマーとしてＰＣＲ１−ＦｏｒおよびＰＣＲ２−Ｒｅｖを用いた化学量論的混合物を使用して実施した。得られたＤＮＡ産物はＰｍｅＩ／ＥｃｏＲＶを用いて消化し、ｐｈＨ−１内の対応するフラグメントと置換するために使用した。
【００４０】
ｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＣＭＶ−ｆｒｅｅは、以下のように構築した。ｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＣＭＶ（Ｑｂｉｏｇｅｎ、ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社、ドイツ国ハイデルベルク）はＢｇｌＩＩを用いて消化し、仔ウシ腸ホスファターゼを用いて脱リン酸化し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＪ５１８３内で、アニールされたオリゴヌクレオチド５’−ＧＴＴＣＡＴＡＧＣＣＣＡＴＡＴＡＴＧＧＡＧＴＴＣＡＧＡＴＣＴＧＧＴＡＣＣＧ−３’および５’−ＣＧＧＴＡＣＣＡＧＡＴＣＴＧＡＡＣＴＣＣＡＴＡＴＡＴＧＧＧＣＴＡＴＧＡＡＣ−３’を用いて相同組み換えを受けさせた。
【００４１】
ｐＳｈｕｔｔｌｅ−ｈＨ−１は、３工程で産生した。（１）固有のＥｃｏＲＩ部位をｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＣＭＶ−ｆｒｅｅでは、ＥｃｏＲＩ位置でのアニールされたオリゴヌクレオチド５’ｐ−ＡＡＴＴＡＴＴＴＡ−３’および５’ｐ−ＡＡＴＴＴＡＡＡＴ−３’の挿入を通してＳｗａＩ部位に変化させた。（２）ｈＨ−１の５’領域は、プライマー５’−ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＧＴＣＧＡＣＴＴＴＴＧＴＧＡＴＧＣＴＣＧＴＣＡ−３’および５’−ＡＧＧＡＡＡＡＡＡＧＡＴＡＴＣＴＴＴＴＣＣＡＴＴＣＡＧＴＴＧＡ−３’を使用してＰＣＲによってｐｈＨ−１から増幅させた。ＰＣＲ産物は、ＳａｌＩ／ＥｃｏＲＶ（６３３塩基）によって消化し、同一酵素を用いて予備消化された以前に改変されたｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＣＭＶ−ｆｒｅｅーベクター内にライゲートすると、ｐＳｈｕｔｔｌｅ−５’ｈＨ−１が生じた。（３）ｈＨ−１ゲノム（４，７３０塩基）の残りの３’末端はｐｈＨ−１プラスミドからＥｃｏＲＶ／ＮｄｅＩ酵素を使用して切除し、クレノウ末端平坦化し、ＥｃｏＲＶ消化ｐＳｈｕｔｔｌｅ−５’ｈＨ−１内でライゲートすると、ｐＳｈｕｔｔｌｅ−ｈＨ−１が産生された。
【００４２】
ｐＳｈｕｔｔｌｅ−ｈＨ−１−ＳＴＯＰは、３Ｘ停止コドンをパルボウイルスＮＳコーディング配列の最初に位置するｐＳｈｕｔｔｌｅ−ｈＨ−１の固有のＥｃｏＲＶ部位内に挿入することによってクローニングした。３ＸＳＴＯＰ  ＤＮＡ二本鎖は、オリゴヌクレオチド５’−ＴＡＡＴＡＧＴＧＡＧＡＡＴＴＣＴＣＡＣＴＡＴＴＡ−３’の自己アニーリングによって産生された。
【００４３】
ｐＳｈｕｔｔｌｅ−ｈＨ−１−ＴＯ（図１２Ａ）は、ｐＳｈｕｔｔｌｅ−ｈＨ−１のＡｌｅＩ／ＥｃｏＲＶフラグメントをｐｈＨ−１−ＴＯ由来の対応する３９３塩基長ＤＮＡフラグメントと置換することによって入手した。
【００４４】
ｐＡｄ−ｈＨ−１、ｐＡｄ−ｈＨ−１−ＳＴＯＰおよびｐＡｄ−ｈＨ−１−ＴＯ（図１２Ｂ）は、ＡｄＥａｓｙ（商標）Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｍａｎｕａｌ（Ａｇｉｌｅｎｔ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ社、ドイツ国ワルトブロン）にしたがって、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＪ５１８３内へのｐＡｄ５ΔＥ１ΔＥ３を用いたｐＳｈｕｔｔｌｅ−ｈＨ−１、ｐＳｈｕｔｔｌｅ−ｈＨ−１−ＳＴＯＰもしくはｐＳｈｕｔｔｌｅ−ｈＨ−１−ＴＯ各々の組み換えによって産生した。
【００４５】
Ｅ１（ｎｔ（ヌクレオチド）４５９〜３２２８）およびＥ３（ｎｔ２７８９７〜３０４６３）遺伝子（Ａｄ５参照配列番号：ＡＣ０００００８）を含む領域が欠失したｐＡｄ５ΔＥ１ΔＥ３は、以下のように構築した。Ｅ３フランキング配列を含有するシャトルプラスミド［３２］は、ＭｌｕＩ／ＸｂａＩによって消化し、Ｋｌｅｎｏｗを用いて末端平坦化してライゲートするとｐＬｅｆｔ−Ｒｉｇｈｔが産生された。このプラスミドをＳａｌＩ／ＮｏｔＩ消化し、脱リン酸化し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＪ５１８３における相同組み換えのために、Ｅ１領域が欠失しているＳｐｅＩ−線状化ｐＴＧ３６２２［３３］とともに使用した。
【００４６】
本明細書に記載した全構築物は、クローン的に単離し、それらの全長配列を検証した。
【００４７】
（Ｄ）トランスフェクション
ＤＮＡトランスフェクションは、Ｆｕｇｅｎｅ  ＨＤ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＆  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ドイツ国マンハイム）を製造業者の取扱説明書にしたがいわずかな改変を加えて使用して実施した。プラスミドは、血清無含有培地中で２０ｎｇ／μＬの最終濃度へ希釈した。Ｆｕｇｅｎｅ  ＨＤを次に１：２．５の比率（μｇ（ＤＮＡ）：μＬ（Ｆｕｇｅｎｅ））で加え、この混合物を室温で３０〜６０分間インキュベートした。引き続いて、この混合物を細胞に滴下した。
【００４８】
（Ｅ）タンパク質の抽出
細胞ペレットは、プロテアーゼ阻害剤（完全ＥＤＴＡ−フリー、Ｒｏｃｈｅ社、ドイツ国マンハイム）および１０％グリセロールを含有する５容量のタンパク質抽出バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８、２００Ｍ  ＮａＣｌ、０．５％  ＮＰ−４０、１ｍＭ  ＤＴＴ）中に氷上で３０分間かけて溶解させた。細胞破片は４℃で１０分間にわたり１０．０００ＲＰＭで遠心分離し除去した。
【００４９】
（Ｆ）抗体
以下の抗体をウェスタンブロット分析のために使用した：マウスモノクローナル抗β−チューブリン（クローンＴＵＢ  ２．１、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、米国ミズーリ州セントルイス）、マウスモノクローナル抗アクチン（Ｃｌｏｎｅ  Ｃ４、ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社、フランス国イルキルシュ）、ポリクローナル抗ＮＳ１  ＳＰ８抗血清（Ｄｒ．  Ｎａｔｈａｌｉｅ  Ｓａｌｏｍｅ、ＡＴＶ−ＤＫＦＺ、ドイツ国ハイデルベルクによって提供された）［３４］およびポリクローナル抗ＶＰ２抗血清（Ｄｒ．  Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｅ  Ｄｉｎｓａｒｔ、ＡＴＶ−ＤＫＦＺ、ドイツ国ハイデルベルクからの贈呈品）［３１］。
【００５０】
（Ｇ）パルボウイルスの滴定
（１）プラークアッセイ
２０，０００細胞／ｃｍ２の密度で増殖させたＮＢＫ細胞は、１時間にわたり粗ウイルス抽出物の連続希釈液で感染させ、その後に接種菌は５％のＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンが補給された最小必須培地（Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）中の０．６８％のＢａｃｔｏ（商標）Ａｇａｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社、ドイツ国ハイデルベルク）のオーバーレイと置換した。感染７日後、生細胞を１８時間にわたりＰＢＳ中に希釈したニュートラルレッド（０．２ｍｇ／ｍＬ）を含有するＢａｃｔｏ（商標）ａｇａｒ（０．８５％）のオーバーレイを用いて染色した。プラークを計数し、力価は１ｍＬ当たりのプラーク形成単位（ＰＦＵ）として表示した。
【００５１】
（２）定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）
粗ウイルス抽出物は、遊離ウイルスゲノムＤＮＡを除去するために３７℃で３０分間にわたり５０Ｕ／ｍＬのｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）ヌクレアーゼ［超純粋グレード、（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ社、ドイツ国シュタインハイム）］を用いて消化した。ウイルスＤＮＡをウイルスから遊離させるため、１０μｍの各サンプルを５６℃で３０分間かけて計４０μｍのアルカリ性溶解バッファー（ＴＥバッファー中の１Ｍ  ＮａＯＨ）中に溶解させた。溶解は、９６０μＬの４０ｍＭのＨＣｌを加えることによって停止させた。ウイルスＤＮＡの定量は、以前に記載されたように［２８］、ＮＳ１特異的ＴａｑＭａｎ（商標）プローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、ドイツ国ダルムシュタット）を用いたリアルタイムｑＰＣＲによって実施した。この方法を用いると、１ＰＦＵのｈＨ−１−ＴＯおよび１Ａｄ  Ｘ単位（下記参照）のＡｄ−ｈＨ−１−ＴＯが各々粒子を含有するおよそ５００および１００ウイルスゲノムに対応すると計算された。
【００５２】
（Ｈ）アデノウイルスの滴定
組み換えアデノウイルス力価は、Ｔ−ＲＥｘ（商標）−２９３細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）の感染３日後にＡｄｅｎｏ−Ｘ（商標）Ｒａｐｉｄ  Ｔｉｔｅｒ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、フランス国サン・ジェルマン・アン・レー）を使用して決定し、Ａｄ  Ｘ単位／ｍＬと表示した。
アデノウイルスの物理的粒子の濃度は、吸光度２６０ｎｍで測定した精製ウイルスのＤＮＡ含量から推定した。１の吸光度は、アデノウイルス粒子１．１×１０１２個／ｍＬに対応する［３５］。
【００５３】
（Ｉ）電子顕微鏡検査
炭素被覆した３００メッシュの銅製格子を２分間にわたり５μｍアリコートのウイルス懸濁液に面するように配置し、２％酢酸ウラニルを用いて３０秒間染色し、およそ１分間乾燥させた。顕微鏡写真は、８０ｋＶの加速電圧を使用してＺｅｉｓｓ  １０Ａ透過型電子顕微鏡（Ｚｅｉｓｓｓ社、ドイツ国オーバーコッヘン）を用いて３８，０００倍の倍率で撮影した。倍率インジケータは、グレーティングレプリカを用いた比較によってルーチン的に制御した。
【００５４】
（Ｊ）乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）アッセイおよびＭＴＴアッセイ
ヒト細胞を最初に、癌細胞は４，０００細胞／ウエルおよび一次細胞は８，０００〜１０，０００細胞／ウエルの密度で９６ウエルプレートに播種した。例外的に、メラノサイトおよびアストロサイトは人工培地（（Ａ）に指示した）中で増殖させ、その後１０％熱不活性化ＦＢＳが補給されたＤＭＥＭ倍地に播種した。感染後、全細胞は１ウエル当たり２００μＬの容量で５％熱不活性化ウシ血清が補給された対応する基礎培地中で維持した。癌細胞および一次細胞を各々４および５日間にわたりインキュベートし、その後以前に記載されたように［１３］、ＬＤＨおよびＭＴＴについてアッセイした。
【００５５】
ＬＤＨは、ＣｙｔｏＴｏｘ  ９６非放射性細胞毒性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社、米国ワイオミング州マディソン）を使用して測定し、４９２ｎｍでＥＬＩＳＡリーダーによって読み取った。非馴化培地によって与えられるバックグラウンド値を減じた後、感染もしくは非感染培養中の溶解した細胞の分画を馴化培地中のＬＤＨ活性対対応する培養物の全ＬＤＨ活性の比率から計算した。全ＬＤＨ活性は、９％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含有する１０×バッファーの添加による細胞溶解後に決定した。同一細胞培養を使用してＬＤＨ遊離およびＭＴＴ活性を決定した。ＭＴＴ活性（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムブロミド）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ社、ドイツ国シュタインハイム）は、５７０ｎｍでＥＬＩＳＡリーダーを用いて読み取った。感染細胞の生存率は、対応する吸光度対１００％として任意に採取した非感染細胞の吸光度の比率として表示した。
【００５６】
（Ｋ）ウイルス細胞変性効果（ＣＰＥ）のリアルタイム検出
細胞は、４，０００細胞／ウエル（さもなければ、ＨＣＣ−２９９８に対しては８，０００細胞／ウエル）の密度で９６ウエルＥ−プレート（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ社、ドイツ国マンハイム）に播種した。２４〜７２時間後、細胞は、Ａｄ−ｈＨ−１−ＴＯ、Ａｄ５ΔＥ１ΔＥ３（Ａｄコントロール）、ｈＨ−１−ＴＯまたはＡｄコントロールおよびｈＨ−１−ＴＯウイルスの組み合わせを用いて感染させた。ウイルス媒介性細胞変性効果（ＣＰＥ）を反映する細胞増殖は、リアルタイムで３０分毎にｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ社、ドイツ国マンハイム）を用いて監視した。図示した増殖曲線は、少なくとも３回の繰り返しの平均値に相対標準誤差を添えて表している。
【００５７】
（実施例２）
テトラサイクリン誘導性Ｐ４プロモーターを有するパルボウイルスｈＨ−１−ＴＯの産生
キメラＡｄ−ＰＶゲノムを有するアデノウイルスの産生を目的とした最初の試みは、パルボウイルスＮＳタンパク質（ＮＳ１である可能性が極めて高い）がＡｄ−ＰＶキメラ産生を妨害するという事実のために失敗した（図１）。実際、ＮＳオープンリーディングフレーム内の停止コドンの導入は、Ａｄ産生を正常レベルへレスキューすることができた（図１）。これらの結果に照らして、ＮＳ遺伝子の発現を制御するパルボウイルス初期Ｐ４プロモーターは、キメラ産生中のその活性を厳密に制御するために改変された。Ｔ−ＲＥｘ（商標）テクノロジー［２９，３０］を利用し、Ｐ４プロモーターを操作し、２つのテトラサイクリンオペレーター２エレメント（ＴｅｔＯ２）［３０］をＴＡＴＡボックスとＮＳ開始コドンとの間に挿入することによってそれを誘導させることが可能か試験した（図２ＡおよびＢ）。この改変では、Ｐ４プロモーター活性は、テトラサイクリンリプレッサー（ＴｅｔＲ）を構成的に発現するＴ−ＲＥｘ（商標）−２９３細胞内でドキシサイクリン（ｄｏｘ）の非存在下では抑制されるが、存在下では誘導されると予測された［３０］。これとは反対に、ＴｅｔＲを発現しない癌細胞内では、Ｐ４プロモーターは完全に機能的であるはずである。この改変パルボウイルスは、感染性分子クローンから産生され、ｐｈＨ−１−ＴＯと命名された（図２）。
【００５８】
ｐｈＨ−１−ＴＯ由来のパルボウイルスタンパク質の発現が予想通りに誘導性であるかを検証するために、Ｔ−ＲＥｘ（商標）−２９３細胞をｐｈＨ−１−ＴＯもしくは親ｐｈＨ−１を用いてトランスフェクトし、２日間インキュベートし、パルボウイルスＮＳ１およびＶＰタンパク質のウェスタンブロッティング検出のために採取および処理した（図３Ａ）。親ｐｈＨ−１ウイルスベクターを用いてトランスフェクトした細胞では、ｄｏｘの添加は全ＮＳ１タンパク質レベルに影響を及ぼさなかった（図３Ｂ）。これとは反対に、ｐｈＨ−１−ＴＯトランスフェクト細胞では、ＮＳ１の検出はｄｏｘの存在下においてのみ観察され、Ｐ４−ＴＯプロモーターの活性がＯＮ／ＯＦＦスイッチ機構の制御下にあることを証明している。誘導条件下では、ＮＳ１タンパク質レベルは親ウイルスベクターを使用して達成されたレベルに類似しており、これはＴｅｔＯ２の挿入が、ｄｏｘが培養培地に供給された場合、ＮＳ産生を損傷させなかったことを示している。ＮＳ１タンパク質がカプシドタンパク質をコードするＶＰ遺伝子の転写を制御するパルボウイルスｐ３８プロモーターを転写活性化することは公知である。ＮＳ１産生の抑制と一致して、ドキシサイクリン無含有条件下で増殖させたｐｈＨ−１−ＴＯトランスフェクトＴ−ＲＥｘ（商標）−２９３細胞内ではＶＰ１およびＶＰ２のわずかな発現しか観察されなかった。対照的に、ＶＰタンパク質は、ｄｏｘが培地に加えられた場合、これらの細胞内に蓄積した（図３Ｂ）。
【００５９】
次に、ｐｈＨ−１−ＴＯを用いたトランスフェクションが感染性子孫ビリオンの産生を生じさせるか調査した。この目的ために、Ｔ−ＲＥｘ（商標）−２９３細胞をｐｈＨ−１−ＴＯもしくはｐｈＨ−１構築物を用いてトランスフェクトし、計７日間にわたりｄｏｘの存在下または非存在下で増殖させた。これらの培養物由来の細胞溶解物を、次にＮＢ３２４Ｋ細胞を感染させるために使用した。さらに７日後、細胞を再び溶解させ、プラークアッセイによって測定されたようにＮＢ３２４指標細胞内で感染させる、殺滅する、および伝播することができる完全ビリオンの存在について試験した（図４Ａ）。予測通り、親ｈＨ−１ウイルスは、ｄｏｘの存在とは無関係に類似レベルで産生した。これとは反対に、ｄｏｘは有意なレベルでｈＨ−１−ＴＯビリンを産生するためのＴ−ＲＥｘ（商標）−２９３トランスフェクションの間に必要とされ（図４Ｂ）、親ウイルスを用いて得られた力価と匹敵するウイルス力価を産生した。これらの結果は、Ｐ４プロモーター領域内へのＴｅｔＯ２の挿入が（ｉ）Ｔ−ＲＥｘ（商標）−２９３細胞内でのＰＶ産生をｄｏｘ誘導に依存性にさせる、（ｉｉ）ＴｅｔＲを発現しないＮＢＫ３２４のような細胞内ではデ・ノボ（ｄｅ  ｎｏｖｏ）産生したｈＨ−１−ＴＯウイルス粒子が完全に感染性であり自律複製することができるのでパルボウイルス生活環の全経過と完全に適合することを証明している。
【００６０】
ｈＨ−１−ＴＯウイルスの増殖をＴ−ＲＥｘ（商標）−２９３細胞中で詳細に調査した。細胞にｈＨ−１−ＴＯもしくはｈＨ−１ウイルスの何れかを接種し、ｄｏｘの存在下または非存在下で４日間にわたり増殖させ、未結合ウイルス粒子を排除するために２４時間毎に１回培地を交換した。次に細胞を培地中に溶解させ、パルボウイルス産生をパルボウイルス特異的ｑＰＣＲによって評価した（図５Ａ）。上記に提示した結果と一致して、Ｔ−ＲＥｘ（商標）−２９３細胞内でのｈＨ−１−ＴＯウイルスの産生は、培養物をｄｏｘの存在下で増殖させた場合にのみ効率的であり、該誘導因子の非存在下ではウイルス力価の６０分の１へ減少した（図５Ｂ）。しかし、ｄｏｘの存在下でのｈＨ−１−ＴＯの産生はｈＨ−１の産生のおよそ６分の１であり、これはＰ４プロモーター領域内へ導入された改変がこれらの細胞内でのウイルスの適合性をわずかに減少させることを示唆していた。
【００６１】
（実施例３）
アデノ−パルボキメラの産生
実施例２に提示した結果により、全パルボウイルスｈＨ−１−ＴＯゲノムを複製欠損性アデノウイルスベクター（Ａｄ５ΔＥ１ΔＥ３）のＤＮＡ骨格内に挿入すると、ｐＡｄ−ｈＨ−１−ＴＯキメラベクターが産生された。最初に、Ｐ４−ＴＯプロモーター領域がＡｄゲノム内にいったん挿入された場合、そのＴｅｔＲ感受性を維持するか試験した。この目的ため、Ｔ−ＲＥｘ（商標）−２９３細胞はｐＡｄ−ｈＨ−１−ＴＯキメラベクターを用いてトランスフェクトし、ｄｏｘを用いて、または用いずに５日間増殖させた。これらの細胞由来の全タンパク質抽出物を、次にウェスタンブロッティングによってパルボウイルスＮＳ１およびＶＰタンパク質の存在について分析した（図６Ａ）。図６Ｂに例示したように、ＮＳ１はｄｏｘが細胞に提供された場合にのみ検出された。以前の結果（図３Ｂ）と一致して、ＮＳ１発現は、ＶＰ１およびＶＰ２カプシドタンパク質発現の誘導と相関していた。これらの結果は、Ａｄ構成（ｃｏｎｔｅｘｔ）におけるＰ４−ＴＯ遺伝子発現のＴｅｔＲ感受性を確証した。
【００６２】
次に、ｐＡｄ−ｈＨ−１−ＴＯ構築物からＡｄ−ＰＶキメラビリオンを産生することが可能であるか調査した。陰性コントロールとして野生型Ｐ４プロモーター（本発明者らはそれからキメラビリオンを産生することができなかった）（図１）を含有するｐＡｄ−ｈＨ−１ベクターを使用し、陽性コントロールとしてそのＥ１／Ｅ３遺伝子欠失がプロデューサーとして使用された２９３細胞によって補完される親Ａｄプラスミドを使用した。産生の第１ラウンドでは、Ｔ−ＲＥｘ（商標）−２９３細胞をｐＡｄ−ｈＨ−１−ＴＯ、ｐＡｄ−ｈＨ−１もしくはｐＡｄプラスミドを用いてトランスフェクトし、７日間にわたりｄｏｘを含有する（または含有しない）培地中で増殖させた後に溶解させた。次に粗細胞抽出物を使用してウイルス増幅の連続２回のラウンドにおいて新鮮Ｔ−ＲＥｘ（商標）−２９３を再感染させた（図７Ａ）。最終細胞溶解物は、次に塩化セシウム（ＣｓＣｌ）勾配遠心分離によって精製し、ウイルスストックはアデノウイルス複製アッセイを使用して滴定した。ウイルス調製物はさらにそれらの純度を制御するために電子顕微鏡分析にかけた。以前の結果と一致して（図１）、ｐＡｄ−ｈＨ−１キメラベクターは検出可能なウイルス粒子を産生することができなかった。対照的に、Ａｄ−ｈＨ−１−ＴＯキメラウイルスは、ｄｏｘが培養培地に加えられない限り、Ｔ−ＲＥｘ（商標）−２９３細胞内で産生した。これらの結果は、親ＮＳタンパク質（ＮＳ１である可能性が極めて高い）がアデノウイルスキメラウイルス複製の阻害の原因であるという上記の証拠と一致していた。著明にも、Ａｄ−ｈＨ−１−ＴＯキメラウイルスの産生は機能的ＴｅｔＲの存在下で可能であっただけではなく、Ａｄコントロールの収率範囲内に含まれていたので極めて効率的であった（図７Ｂ）。電子顕微鏡分析は、Ａｄ−ｈＨ−１−ＴＯとＡｄコントロールウイルスとの差を示さず、産生したＡｄ−ｈＨ−１−ＴＯウイルスストック内のパルボウイルス汚染も示さなかった（図７Ｃ）。これらをまとめると、これらの結果は、パルボウイルスＮＳ転写ユニットを一過性で遮断することによって、Ｔ−ＲＥｘ（商標）−２９３パッケージング細胞系内において高力価でＡｄ−ＰＶキメラウイルスを産生可能であることを証明している。
【００６３】
（実施例４）
アデノ／パルボキメラからの感染性パルボウイルスのレスキュー
次に、形質転換させた標的細胞をＡｄ−ｈＨ−１−ＴＯキメラウイルス粒子を用いて感染させることによって完全に感染性のパルボウイルスを産生することが可能であるか調査した。パルボウイルス産生について許容性である２つの細胞系、つまり子宮頸癌由来ＳｉＨａおよびＳＶ４０形質転換ＮＢ３２４Ｋを精製Ａｄ−ｈＨ−１−ＴＯもしくはｈＨ−１−ＴＯウイルスを用いて感染させ、２４時間後に培養培地を１回交換して未結合ウイルスを除去し、４日間（ＳｉＨａ）もしくは５日間（ＮＢ３２４Ｋ）にわたりインキュベートした。感染細胞を次に培地中に溶解させ、粗抽出物をプラークアッセイによって感染性パルボウイルス粒子の存在について分析した（図８Ａ）。初期作業仮説を検証するために、自律複製感染性パルボウイルスは、Ａｄ−ｈＨ−１−ＴＯキメラビリオンを用いてＮＢ３２４ＫおよびＳｉＨａ細胞両方を感染させるとレスキューされた（図８Ｂ）。これらの結果は、標的細胞へ自律的パルボウイルスを送達するための新規なツールとしてＡｄ−ＰＶキメラを使用することができるという概念を実証する。
【００６４】
（実施例５）
Ａｄ−ｈＨ−１−ＴＯキメラの強化された腫瘍退縮能力
Ｈ−１ＰＶが多数の癌細胞に細胞変性効果（ＣＰＥ）を誘導することは公知である［１０］。予備実験は、ｈＨ−１およびｈＨ−１−ＴＯパルボウイルスがＨｅＬａ細胞に対する類似の細胞毒性活性を有することを示しており、これはＰ４プロモーター領域内に導入された改変が該ウイルスの腫瘍退縮活性を改変しなかったことを示唆している。
【００６５】
ここで、ＭＴＴ（細胞増殖の分析）およびＬＤＨ（細胞溶解の分析）アッセイによって、ヒト癌細胞および正常細胞培養物のパネルに対するＡｄ−ｈＨ−１−ＴＯキメラおよび両方の親ウイルス（ＡｄコントロールおよびｈＨ−１−ＴＯ）の細胞毒性活性を比較した。これらの実験から得られた結果は、表１ならびに図１０および１１に報告した。
【００６６】
【表１】
0005895051.tif 000002
【００６７】
第１工程では、ｈＨ−１−ＴＯパルボウイルス感染症に感受性であることが公知であるＨｅＬａ細胞内のＡｄ−ｈＨ−１−ＴＯキメラの細胞毒性活性を評価した。以前の結果と一致して、単独で、またはＡｄコントロールと組み合わせて使用したｈＨ−１−ＴＯは、ＨｅＬａ細胞を極めて効率的に殺滅した。Ａｄ−ｈＨ−１−ＴＯを用いてより強固な細胞毒性作用が観察されたが、これはこれらの実験条件下では、ＰＶ細胞増殖抑制性および細胞毒性能力が、いったんＡｄベクター内に負荷されると維持される、または強化さえされることを示している。Ａｄコントロール単独は、ｈＨ−１−ＴＯよりもはるかに弱い細胞毒性および細胞増殖抑制活性を示したので、キメラＡｄ−ｈＨ−１−ＴＯの細胞毒性活性は、これらの細胞内では主としてＰＶ成分に起因すると結論付けられた（図１０Ａ）。
【００６８】
第２工程では、そのＰＶ成分が他の点ではＰＶ直接感染に抵抗性である腫瘍細胞を殺滅することを該キメラが可能にするか試験した。この目的のために、パルボウイルス細胞毒性に抵抗性であり、子宮頸癌（ＭＥ−１８０および低継代ＣｘＣａ）、黒色腫（Ｌｏｘ−ＩＭＶＩ）および結腸（ＨＣＴ−１５およびＨＣＣ−２９９８）悪性腫瘍に由来する５種の異なる細胞系を使用する実験を実施した。
【００６９】
ＡｄおよびｈＨ−１−ＴＯウイルス（単独もしくは組み合わせて使用された）による感染は、これらの細胞の増殖にほとんど作用を示さなかった。これは、はるかに毒性が強く、分析した全ての腫瘍細胞系を効率的に殺滅したＡｄ−ｈＨ−１−ＴＯキメラと顕著に対照的であって、該キメラが由来する親ウイルスにおける腫瘍退縮活性を改良したことを示している（図１０Ｂ〜Ｆ）。
【００７０】
第３工程では、該ＰＶがＡＤベクターによって送達された場合にＰＶ細胞毒性の腫瘍特異性が維持されるかどうかを検証することが重要であった。このために、該キメラの細胞毒性を様々な起源のヒト一次細胞、つまり正常包皮線維芽細胞、口腔線維芽細胞、メラノサイトおよびアストロサイトにおける、親ウイルスの細胞毒性と比較した。
【００７１】
ＭＴＴおよびＬＤＨアッセイのために細胞を処理する前のウイルスインキュベーション時間は、癌細胞に比較して一次培養中では１日長かったが（５日間対４日間）、該キメラは正常細胞を殺滅することに関しては癌細胞に対して以前に報告されたものと同一能力を示さなかった。詳細には、ヒト包皮線維芽細胞内で細胞毒性は見いだされなかったが（図１１Ａ）、他方分析した他の一次培養物についてはほんのわずかな細胞毒性作用だけが観察された（図１１Ｂ〜Ｄ）。
【００７２】
次に、Ａｄ−ｈＨ−１−ＴＯキメラおよびコントロールウイルスによる腫瘍細胞殺滅の動力学をｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅシステムを使用して詳細に調査した。このデバイスを用いると、細胞の増殖および生存性をリアルタイムで監視することができる。ＬＤＨおよびＭＴＴアッセイによって、Ａ５４９肺癌を添加して以前に分析された癌細胞系をＡｄ−ｈＨ−１−ＴＯキメラおよびコントロールウイルスを用いて感染させ、さらに５〜７日間増殖させ、３０分毎に細胞密度を測定した。図９は、感染対未処理細胞の増殖曲線を示している。Ａｄコントロールウイルスは、ＨｅＬａ細胞の細胞増殖に限定された作用を有していたが、パルボウイルスｈＨ−１−ＴＯは増殖を効率的に抑制し、ほぼ全ての細胞の死を誘導することができた。この顕著な殺滅活性は、パルボウイルスがキメラによって送達された場合にも同様の程度まで達成された（図９Ａ）。Ａｄ−ｈＨ−１−ＴＯキメラの細胞毒性作用が、該キメラベクターからのＰＶレスキューのために必要とされた時間によっておそらく指定されると思われるｈＨ−１−ＴＯによって誘導される時間（約２４時間）に比較して遅延されることは注目に値する。以前の結果に一致して（表１）、ＣｘＣａ、ＭＥ−１８０、Ｌｏｘ−ＩＭＶＩ、ＨＣＴ−１５およびＨＣＣ−２９９８はｈＨ−１−ＴＯ細胞毒性に対する完全な抵抗性を生じさせ、それらの増殖曲線はこのウイルスによっては極めてわずかな影響しか受けなかった（図９Ｃ〜Ｆ）。他方、Ａｄコントロールを用いた感染は結腸癌由来ＨＣＣ−２９９８のみにおける強度の細胞毒性作用（図９Ｇ）、子宮頸癌由来ＣｘＣａ（図９Ｂ）およびＭＥ−１８０（図９Ｃ）（前者についてはウイルスが１００の高ＭＯＩ濃度で使用された場合のみ）における細胞抑制性作用を誘導したが、メラノサイトＬｏｘ−ＩＭＶＩ（図９Ｄ）および結腸癌ＨＣＴ−１５（図９Ｅ）の全部において細胞毒性を誘導しなかった。これらの結果は、ＡｄコントロールがｈＨ−１−ＴＯと一緒にサブ投与された場合は変化しなかった。これとは反対に、ＬＤＨおよびＭＴＴアッセイにおいて以前に観察されたように、該Ａｄ−ｈＨ−１−ＴＯキメラは全感染コントロールと比較してはるかに毒性が強かった。このウイルスは試験した全細胞系を効率的に殺滅し、感染の２０〜４０時間後には既に強力な細胞毒性作用を誘導した（図９Ｂ〜Ｆ）。肺癌由来Ａ５４９のｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ増殖監視は、ＨｅＬａ細胞に類似することを示した。この細胞系は、ｈＨ−１−ＴＯおよびキメラＡｄ−ｈＨ−１−ＴＯ細胞毒性の両方に感受性で生じたが（図９Ｇ）、これは該キメラの腫瘍退縮能力がパルボウイルスに本来は許容性である癌細胞系において保存されていることを確証した。まとめると、これらの結果は、Ａｄ−ｈＨ−１ＴＯキメラの改良された腫瘍退縮活性を強調している。
【００７３】
（実施例６）
Ａｄ−ＦＶキメラの強化された腫瘍毒性能力
Ｈ−１ＰＶは多数の癌細胞に細胞変性効果を誘導することは公知である［１０］。しかし、Ｈ−１ＰＶ細胞毒性に対して弱度に感受性もしくは完全に抵抗性である癌細胞系もまた存在する。本発明者らの実験は、ｈＨ−１およびｈＨ−１−ＴＯパルボウイルスがＬＤＨアッセイによって測定されたＨｅＬａ細胞に対して類似の細胞毒性活性を発揮することを示しており、これはＰ４プロモーター領域内に導入された改変が該パルボウイルスの腫瘍退縮活性を改変しなかったことを示している。
【００７４】
Ａｄ−ｈＨ−１−ＴＯ（Ａｄ−ＰＶ）キメラならびに両の親ウイルス［Ａｄコントロール（Ａｄｃ）およびｈＨ−１−ＴＯ（ＰＶ）］の細胞毒性活性を、高感受性細胞（子宮頸癌由来ＨｅＬａ、黒色腫ｐＭｅｌＬ）、低感受性細胞（肺癌由来Ａ５４９）および抵抗性細胞（子宮頸癌由来ＭＥ−１８０、黒色腫Ｌｏｘ−ＩＭＶＩ、結腸癌ＨＣＴ−１５およびＨＣＣ−２９９８）を含むＨ−１ＰＶ感染に対する感受性が相違するヒト癌細胞系のパネルと比較した。
【００７５】
第１工程では、Ａｄ５およびＨ−１ＰＶによる感染に対するこれらの細胞の感受性は、ＧＦＰレポーター遺伝子を有する組み換えウイルス（Ａｄ−ＧＦＰもしくはＨ−１−ＧＦＰ）を使用することによって決定した。図１３に示したように、感染４８および７２時間後に実施したＦＡＣＳ分析は、Ａｄ−ＧＦＰおよびＨ−１−ＧＦＰが類似方法でＨｅＬａおよびＡ５４９を形質導入するが、Ａｄ−ＧＦＰの方がＨ−１ＰＶ細胞毒性に対して抵抗性であると以前同定された細胞系を形質導入することにおいてＨ−１ＧＦＰよりはるかに効率的であることを明らかにした。予想されたように、（それらの表面上でＡｄ受容体が欠如する）ｐＭｅｌＬ細胞は、Ｈ−１ＧＦＰによって効率的に形質導入されたが、Ａｄ−ＧＦＰによっては効率的に形質導入されなかった（図１３）。
【００７６】
第２工程では、ウイルス細胞毒性をＭＴＴアッセイ（細胞生存性の分析）、ＬＤＨアッセイ（細胞溶解の分析）およびＸＣｅｌｌＩｇｅｎｃｅ（細胞増殖率のリアルタイム分析）によって評価した。
【００７７】
（ｉ）Ａｄ−ＰＶキメラの細胞毒性活性を最初にＨｅＬａ細胞中で評価し、これを親ウイルスの細胞毒性活性と比較した（図１４Ａ）。細胞は、同等量の様々なウイルスで感染させた。以前の試験結果と一致して、ＬＤＨおよびＭＴＴアッセイは、使用したＰＶが単独で、またはＡｄコントロールと組み合わせてＨｅＬａ細胞を極めて効率的に殺滅することを明らかにした。類似の細胞毒性作用は、Ａｄ−ＰＶキメラを用いて観察されたが、これはこれらの実験条件下では、ＰＶ細胞毒性能力が、Ａｄベクターに送達されると維持されることを示している。Ａｄｃ単独はＰＶに比較してはるかに毒性が低かったので、本発明者らは、これらの細胞におけるキメラＡｄ−ＰＶの細胞毒性が主としてＰＶ成分に起因すると結論付けた（図１４Ａ）。これらの試験結果と一致して、ＸＣｅｌｌＩｇｅｎｃｅシステムを使用した細胞増殖曲線の分析は、ＡｄｃウイルスがＨｅＬａ細胞の増殖に限定された作用しか有さないが、ＰＶはこれらの細胞の増殖を効率的に抑制して細胞死を誘導することができると証明した（図１４Ｂ）。この注目すべきＨｅＬａ細胞増殖抑制および殺滅は、ＰＶが該キメラによって送達された場合に類似の程度まで達成された。Ａｄ−ＰＶキメラの細胞毒性作用は、これらの細胞において該キメラベクターからのＰＶレスキューのために必要とされた時間とおそらく一致するＰＶによって誘導される時間に比較しておよそ２４時間遅延されたことは注目に値する。Ａ５４９細胞もＰＶおよびキメラＡｄ−ＰＶ細胞毒性の両方に感受性であることが見いだされたが、これはＨ−１ＰＶの腫瘍退縮能力が該キメラウイルスによって維持されることを確証している（図１４ＣおよびＤ）。Ａ５４９がＨｅＬａ細胞よりもＨ−１ＰＶ感染症に低感受性であるという事実と一致して、これらの細胞を効率的に殺滅するためには、１０倍高い濃度のＰＶもしくはＡｄ−ＰＶキメラが必要とされた。
【００７８】
（ｉｉ）本発明者らは次に、該キメラが、Ｈ−１ＰＶ感染に対して抵抗性であると以前同定された腫瘍細胞、つまりＭＥ−１８０、Ｌｏｘ−ＩＭＶＩ、ＨＣＴ−１５およびＨＣＣ−２９９８を殺滅することができるか試験した（図１４）。ＭＴＴおよびＬＤＨアッセイは、ＡｄおよびＰＶウイルス（単独または組み合わせて使用された）による感染がこれらの細胞に細胞毒性作用をほとんど有さないことを証明した。極めて対照的に、Ａｄ−ＰＶキメラは、はるかに毒性が強く、分析した全ての腫瘍細胞系を効率的に殺滅したが、これは該キメラが由来する親ウイルスと比較して改良された腫瘍退縮活性を有することを示している（図１４Ｅ、Ｇ、ＩおよびＫ）。動態分析は、上記の細胞系の増殖がＰＶによって極めてわずかにしか妨害されないことを示しており、これはそれらのパルボウイルスに対する有意な抵抗性を確証している（図１４Ｆ、Ｈ、ＪおよびＬ）。他方、Ａｄｃウイルスはこれらの細胞において様々な毒性作用を有しており、その範囲は完全増殖抑制（ＨＣＣ−２９９８：図１４Ｌを参照）もしくは増殖遅滞（ＭＥ−１８０：図１４Ｆを参照）から完全抵抗性（Ｌｏｘ−ＩＭＶＩおよびＨＣＴ−１５：各々、図１４ＨおよびＪを参照）に及んだ。同様の結果は、ＡｄｃをＰＶと併用した場合にも得られた。興味深いことに、Ａｄ−ＰＶキメラはいずれの親ウイルスよりもはるかに毒性が強いことが見いだされ、全細胞の増殖を抑制し、感染２０〜４０時間後には既に強力な細胞毒性作用を誘導した（図１４Ｆ、Ｈ、ＪおよびＬ）。
【００７９】
（ｉｉｉ）コントロールとして、この分析にはＡｄ−５受容体−ｎｕｌｌ  ｐＭｅｌＬ細胞系［（３０）］も含めた。図１４ＭおよびＮに示したように、これらの細胞はＰＶ細胞毒性に感受性であったが、ＡｄｃおよびＡｄ−ＰＶキメラの両方に対して完全に抵抗性であり、これは該キメラがＡｄ取り込み能力がある細胞においてのみ細胞毒性を発揮することを示している（図１４ＭおよびＮ）。
【００８０】
第３工程では、ＰＶがＡＤベクターによって送達された場合にＰＶ細胞毒性の腫瘍特異性が維持されるか検証することが重要であった。このために、該キメラの細胞毒性を、ＬＤＨおよびＭＴＴアッセイを使用して、様々な起源のヒト一次細胞、つまり正常包皮線維芽細胞、口腔線維芽細胞、メラノサイトおよびアストロサイトにおける親ウイルスの細胞毒性と比較した。癌細胞と比較して長期間（５日間対４日間）のウイルスインキュベーション後にさえ、正常細胞は、上述した癌細胞の高感受性と極めて対照的に、Ａｄ−ＰＶキメラの細胞毒性活性に対して完全に抵抗性（包皮線維芽細胞）またはほんのわずかに感受性（口腔線維芽細胞、メラノサイトおよびアストロサイト）であることが見いだされた（図１５Ａ〜Ｄ）。
【００８１】
まとめると、これらの結果は、ＡｄおよびＰＶ親ウイルスと比較してＡｄ−ＰＶキメラの改良された腫瘍退縮活性を示している。
【００８２】
（実施例７）
アデノ／パルボキメラからの感染性パルボウイルス粒子の産生
本発明者らは、Ａｄ−ＰＶキメラウイルス粒子を用いた形質転換標的細胞の感染後に完全に感染性のパルボウイルスが産生されるか調査した。パルボウイルス産生について許容性の２種の細胞系、つまりＳＶ４０形質転換ＮＢ３２４Ｋおよび子宮頸癌由来ＳｉＨａ細胞を使用した。精製Ａｄ−ＰＶを用いた感染後、粗細胞抽出物をプラークアッセイによって感染性パルボウイルス粒子の存在について分析した。初期試験結果にしたがって、自律複製感染性パルボウイルスは、Ａｄ−ＰＶキメラビリオンを用いてＮＢ３２４ＫおよびＳｉＨａ細胞両方を感染させると産生された（図１６Ａ）。Ｈ−１ＰＶ産生は、２工程で、最初に初期ウイルスバッチを産生するためにＨＥＫ２９３細胞を該ウイルスゲノムを有するプラスミドを用いてトランスフェクトし、その後３〜４日間にわたりＮＢ３２４Ｋ細胞を感染してこのバッチを増幅させ、ルーチン的に実施した。本発明者らは、感染後にＮＢ３２４Ｋ細胞内で産生したＰＶ粒子の収量を同等のゲノム量のＨ−１ＰＶおよびＡｄ−ＰＶキメラと比較した。図１６Ｂに示したように、プロデューサー細胞をＨ−１ＰＶまたはＡｄ−ＰＶキメラのいずれで感染させたかには無関係に類似のＰＶ力価が得られた。ＡＤ−ＰＶキメラ感染細胞によって産生したＰＶ粒子が癌細胞集団内で実際に隣接細胞を感染させ、その中で増殖することができるか検証するために、ＨｅＬａ細胞内で「ウイルス伝播」アッセイを実施した。第１ラウンドの感染中のＰＶ産生（Ａｄ−ＰＶ→ＰＶ変換）と全ＰＶ産生とを区別するために、細胞をノイラミニダーゼ（ＮＡ）を用いて、または用いずに処理した。感染１０時間後に、ＮＡは、該Ｈ−１ＰＶ受容体の重要な成分であるシアル酸の加水分解を触媒することによってＨ−１ＰＶが細胞血漿膜に結合するのを防止することが公知であり［３８］、このため、子孫ウイルスの伝播およびその後の増幅を阻害しながら事前に感染させた細胞中でのウイルス複製を妨害しない。図１６Ｃに示したように、感染７２時間後のＰＶ収量は、ＮＡの非存在下で培養されたＨｅＬａ細胞内では有意に高く、これは培養中でのＰＶ伝播の証拠を提供している。さらに、ＮＡの存在下でのＰＶ収量がＰＶおよびＡｄ−ＰＶ感染細胞と類似であったことも重要である（データは示していない）。まとめると、これらの結果は、Ａｄ−ＰＶキメラのＰＶ成分が該キメラから効率的にレスキューされ、一次ＰＶ産生を生じさせ、その後に第２ラウンドのＰＶ増幅が続くことを示唆している。これは、Ａｄ−ＰＶ感染細胞によって産生および遊離されたＰＶ粒子が隣接癌細胞を殺滅する能力を測定することによって確証した。ＨｅＬａ細胞をＡｄ−ＰＶにより低ＭＯＩ（０．２および０．４ＩＵ／細胞）で感染させ、次に７２時間にわたりＮＡの存在下または非存在下で増殖させ、その後にＬＤＨアッセイのために処理した。図１６Ｄに示したように、Ａｄ−ＰＶ感染後にＮＡが培養培地に加えられた場合は、ほんのわずかな細胞しか該キメラによって殺滅されなかった。これは、ＮＡ処理が第２ラウンドの感染を防止し、これにより該キメラによって最初に衝突された細胞分画の殺滅を制限するという事実と一致している。これとは対照的に、ＮＡの非存在下で増殖させた細胞の全集団は感染後７２時間以内に死滅したが、これはキメラ感染細胞によって産生したＰＶ粒子が隣接癌細胞に伝播してそれらを効率的に殺滅することができることを示唆している（図１６Ｄ）。
【００８３】
これらの結果は、自律的パルボウイルスを標的細胞に送達するための新規なツールとしてＡｄ−ＰＶキメラを使用することができる、および該キメラによって細胞内にいったん持ち込まれると、該ＰＶゲノムが遊離され、完全に感染性のパルボウイルス子孫粒子のデ・ノボ合成を開始するという概念実証を提供する。
【００８４】
参照文献のリスト
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【図１】
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【図２ａ】
0005895051.tif 000004
【図２ｂ】
0005895051.tif 000005
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図９−４】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１４−３】
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【図１４−４】
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【図１４−５】
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【図１４−６】
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【図１４−７】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【配列表】
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