(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
重鎖の可変領域を含む重鎖低分子抗体と、軽鎖の可変領域を含む軽鎖低分子抗体と、をそれぞれ別々に固定化した抗体固定化領域を独立して１以上備え、
上記重鎖低分子抗体と軽鎖低分子抗体とは、それぞれ異なる抗原を認識する抗体由来であり、
上記重鎖低分子抗体と軽鎖低分子抗体とは、１組のペアとして抗原と反応し得るよう固定化されており、
上記重鎖低分子抗体および軽鎖低分子抗体は、Ｃ末端側が担体表面に対して結合するように固定化されたものであることを特徴とする抗体固定化担体。（ただし、上記重鎖低分子抗体は軽鎖の可変領域を含まない。また、上記軽鎖低分子抗体は重鎖の可変領域を含まない。）
【請求項２】
上記重鎖低分子抗体および軽鎖低分子抗体は、それぞれ別々に担体表面の材料と結合する担体結合性ペプチドを介して担体に固定化されており、
上記担体結合性ペプチドは、重鎖低分子抗体において重鎖の可変領域のＣ末端側に、また軽鎖低分子抗体において軽鎖の可変領域のＣ末端側にそれぞれ配置されているものであることを特徴とする請求項１に記載の抗体固定化担体。
【請求項３】
上記担体表面の材料は、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリジメチルシロキサンまたはポリメタクリル酸メチルのプラスチック樹脂を変質させて親水化処理したものであることを特徴とする請求項２に記載の抗体固定化担体。
【請求項４】
上記担体結合性ペプチドは、親水性のポリスチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリジメチルシロキサンまたはポリメタクリル酸メチルに結合するペプチドであることを特徴とする請求項２または３に記載の抗体固定化担体。
【請求項５】
上記重鎖低分子抗体は、重鎖の可変領域からなる重鎖低分子抗体、または重鎖の可変領域と重鎖第１定常領域とからなる重鎖低分子抗体であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体固定化担体。
【請求項６】
上記軽鎖低分子抗体は、軽鎖の可変領域からなる軽鎖低分子抗体、または軽鎖の可変領域と軽鎖定常領域とからなる軽鎖低分子抗体であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体固定化担体。
【請求項７】
重鎖の可変領域を含む重鎖低分子抗体と、軽鎖の可変領域を含む軽鎖低分子抗体とを、それぞれ別々に担体に固定化して抗体固定化領域を作製する固定化工程を有し、
上記重鎖低分子抗体と軽鎖低分子抗体とは、それぞれ異なる抗原を認識する抗体由来であり、
上記重鎖低分子抗体と軽鎖低分子抗体とは、１組のペアとして抗原と反応し得るよう固定化され、
上記重鎖低分子抗体および軽鎖低分子抗体は、Ｃ末端側が担体表面に対して結合するように固定化されることを特徴とする抗体固定化担体の製造方法。（ただし、上記重鎖低分子抗体は軽鎖の可変領域を含まない。また、上記軽鎖低分子抗体は重鎖の可変領域を含まない。）
【請求項８】
上記固定化工程は、上記抗体固定化領域を独立して２以上備えるように複数回行われるものであることを特徴とする請求項７に記載の抗体固定化担体の製造方法。
【請求項９】
上記固定化工程は、
（ａ）上記重鎖低分子抗体および軽鎖低分子抗体の不溶性凝集体をそれぞれ変性剤にて変性させた状態で担体表面に接触させ、担体に固定化する第１の工程と、
（ｂ）上記固定化された変性状態の重鎖低分子抗体および軽鎖低分子抗体から変性剤を除去することにより、変性状態の重鎖低分子抗体および軽鎖低分子抗体をリフォールディングさせる第２の工程と、を有することを特徴とする請求項７または８に記載の抗体固定化担体の製造方法。
【請求項１０】
上記固定化工程における第１の工程および第２の工程は、重鎖低分子抗体と軽鎖低分子抗体とについて別々に行われることを特徴とする請求項９に記載の抗体固定化担体の製造方法。
【請求項１１】
上記固定化工程は、軽鎖低分子抗体について第１の工程および第２の工程が行われた後、重鎖低分子抗体について第１の工程および第２の工程が行われることを特徴とする請求項１０に記載の抗体固定化担体の製造方法。
【請求項１２】
上記第１の工程は、変性剤として０．５Ｍ〜４Ｍの尿素を用いることを特徴とする請求項９〜１１のいずれか１項に記載の抗体固定化担体の製造方法。
【請求項１３】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体固定化担体を用いて、特定の抗原を認識する重鎖低分子抗体および／または軽鎖低分子抗体をスクリーニングする工程を有することを特徴とする抗体のスクリーニング方法。
【請求項１４】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体固定化担体を用いて、特定の抗原を認識するキメラ抗体またはヒト化抗体に基づき、当該特定の抗原を認識するヒト抗体をスクリーニングする方法であって、
上記抗体固定化領域に固定化する重鎖低分子抗体は、上記キメラ抗体またはヒト化抗体由来の重鎖の可変領域を含む重鎖低分子抗体であり、
上記抗体固定化領域に固定化する軽鎖低分子抗体は、任意のヒト抗体由来の軽鎖の可変領域を含む軽鎖低分子抗体であり、
上記抗体固定化担体に、上記特定の抗原を接触させる工程（ｉ）と、
上記抗体固定化担体において、上記特定の抗原を認識する抗体固定化領域を検出する工程（ｉｉ）と、
上記工程（ｉｉ）において、検出した抗体固定化領域に固定化された軽鎖低分子抗体を、上記特定の抗原を認識するヒト抗体の軽鎖の可変領域の候補として決定する工程（ｉｉｉ）と、
を有することを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項１５】
さらに、上記工程（ｉｉｉ）で候補として決定した軽鎖低分子抗体と、任意のヒト抗体由来の重鎖の可変領域を含む重鎖低分子抗体と、を抗体固定化領域に固定化した抗体固定化担体を用いて、
上記抗体固定化担体に、上記特定の抗原を接触させる工程（ｉｖ）と、
上記抗体固定化担体において、上記特定の抗原を認識する抗体固定化領域を検出する工程（ｖ）と、
上記工程（ｖ）において、検出した抗体固定化領域に固定化された重鎖低分子抗体を、上記特定の抗原を認識するヒト抗体の重鎖の可変領域の候補として決定する工程（ｖｉ）と、
を有することを特徴とする請求項１４に記載のスクリーニング方法。
【請求項１６】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体固定化担体を用いて、特定の抗原を認識するキメラ抗体またはヒト化抗体に基づき、当該特定の抗原を認識するヒト抗体をスクリーニングする方法であって、
上記抗体固定化領域に固定化する軽鎖低分子抗体は、上記キメラ抗体またはヒト化抗体由来の軽鎖の可変領域を含む軽鎖低分子抗体であり、
上記抗体固定化領域に固定化する重鎖低分子抗体は、任意のヒト抗体由来の重鎖の可変領域を含む重鎖低分子抗体であり、
上記抗体固定化担体に、上記特定の抗原を接触させる工程（ｉ）と、
上記抗体固定化担体において、上記特定の抗原を認識する抗体固定化領域を検出する工程（ｉｉ）と、
上記工程（ｉｉ）において、検出した抗体固定化領域に固定化された重鎖低分子抗体を、上記特定の抗原を認識するヒト抗体の重鎖領域の候補として決定する工程（ｉｉｉ）と、
を有することを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項１７】
さらに、上記工程（ｉｉｉ）で決定した重鎖低分子抗体と、任意のヒト抗体由来の軽鎖の可変領域を含む軽鎖低分子抗体と、を抗体固定化領域に固定化した抗体固定化担体を用いて、
上記抗体固定化担体に、上記特定の抗原を接触させる工程（ｉｖ）と、
上記抗体固定化担体において、上記特定の抗原を認識する抗体固定化領域を検出する工程（ｖ）と、
上記工程（ｖ）において、検出した抗体固定化領域に固定化された軽鎖低分子抗体を、上記特定の抗原を認識するヒト抗体の軽鎖の可変領域の候補として決定する工程（ｖｉ）と、
を有することを特徴とする請求項１６に記載のスクリーニング方法。
【請求項１８】
請求項１４〜１７のいずれか１項に記載のスクリーニング方法により、決定されたヒト抗体の軽鎖の可変領域の候補と重鎖の可変領域の候補とを組み合わせて、ヒト抗体を製造する工程を有することを特徴とするヒト抗体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体を固定化した抗体固定化担体、特に低分子化した抗体を固定化した担体、抗体固定化担体の製造方法および当該抗体固定化担体の利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、抗原抗体反応を利用して微量物質を検出する免疫測定法（イムノアッセイ）が知られている。また、最近では、抗体の機能を利用した抗体医薬の開発が盛んである。抗体医薬は、高い効果、少ない副作用、多様な薬剤ターゲットへの作用および工業生産が可能であり、ゲノム研究で見出された標的分子に対していち早く治療法を提供できる技術として注目されている。抗体医薬は、受容体やリガンドに結合してシグナル伝達を阻害するブロッキング抗体、逆に受容体に結合しての受容体クロスリンク作用を示すシグナリング抗体、そしてＡＤＣＣ活性やＣＤＣ活性を有し細胞殺傷性を有するターゲティング抗体など種々の機能を有する。【０００３】
このような抗体医薬の開発は、一般的には遺伝子探索からはじまり、医薬品のターゲットとなる抗原の同定、当該抗原に特異的に結合する抗体の作製、そして抗体薬理効果を確認した後、最終的に大量生産するという流れで行われる。この流れのなかで、抗原に特異的に結合する抗体をスクリーニングする工程が重要であるといわれている。【０００４】
抗体をスクリーニングする技術として、ファージディスプレイ法を利用した方法が知られている。この方法は、様々な抗原特異性の抗体をファージ上に提示した抗体ライブラリを作製して、特定の抗原に特異的に結合する抗体をスクリーニングする技術である（例えば、特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】日本国公表特許公報「特表２００９−５１１８９２」（平成２１年３月１９日公開）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、上述したファージディスプレイ法を利用した抗体スクリーニング方法では、操作が煩雑で、陽性クローンの単離が困難という問題点があり、さらに擬陽性クローンを選択してしまう可能性もあり十分とはいえない。このため、ファージディスプレイ法以外に、抗体スクリーニングに利用できる新たな技術の開発が強く求められていた。【０００７】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、抗体スクリーニングにも利用可能な抗体固定化担体、抗体固定化担体の製造方法および抗体固定化担体の利用を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記目的を達成するため鋭意検討を重ねた結果、異なる抗体由来の重鎖と軽鎖とを低分子化した後、多数組み合わせて担体上に固定化することで、特定の抗原を認識する抗体を効果的にスクリーニングできる画期的な技術を開発し、本発明を完成させるに至った。すなわち本発明は、以下の構成からなるものである。【０００９】
（１）重鎖の可変領域を含む重鎖低分子抗体と、軽鎖の可変領域を含む軽鎖低分子抗体と、をそれぞれ別々に固定化した抗体固定化領域を独立して１以上備え、上記重鎖低分子抗体と軽鎖低分子抗体とは、それぞれ異なる抗原を認識する抗体由来である抗体固定化担体。【００１０】
（２）上記重鎖低分子抗体および軽鎖低分子抗体は、それぞれ別々に担体表面の材料と結合する担体結合性ペプチドを介して担体に固定化されており、上記担体結合性ペプチドは、重鎖低分子抗体において重鎖の可変領域のＣ末端側に、また軽鎖低分子抗体において軽鎖の可変領域のＣ末端側にそれぞれ配置されているものである（１）に記載の抗体固定化担体。【００１１】
（３）上記担体表面の材料は、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）またはポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）のプラスチック樹脂を変質させて親水化処理したものである（２）に記載の抗体固体化担体。【００１２】
（４）上記担体結合性ペプチドは、親水性のポリスチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）またはポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）に結合するペプチドである（２）または（３）に記載の抗体固体化担体。【００１３】
（５）上記重鎖低分子抗体は、重鎖の可変領域からなる重鎖低分子抗体、または重鎖の可変領域と重鎖第１定常領域（ＣＨ１）とからなる重鎖低分子抗体（ＦａｂＨ）である（１）〜（４）のいずれかに記載の抗体固体化担体。【００１４】
（６）上記軽鎖低分子抗体は、軽鎖の可変領域からなる軽鎖低分子抗体、または軽鎖の可変領域と軽鎖定常領域（Ｃｋ）とからなる軽鎖低分子抗体（ＦａｂＬ）である（１）〜（５）のいずれかに記載の抗体固体化担体。【００１５】
（７）重鎖の可変領域を含む重鎖低分子抗体と、軽鎖の可変領域を含む軽鎖低分子抗体とを、それぞれ別々に担体に固定化して抗体固定化領域を作製する固定化工程を有し、上記重鎖低分子抗体と軽鎖低分子抗体とは、それぞれ異なる抗原を認識する抗体由来である抗体固定化担体の製造方法。【００１６】
（８）上記固定化工程は、上記抗体固定化領域を独立して２以上備えるように複数回行われる（７）に記載の抗体固定化担体の製造方法。【００１７】
（９）上記固定化工程は、（ａ）上記重鎖低分子抗体および軽鎖低分子抗体の不溶性凝集体をそれぞれ変性剤にて変性させた状態で担体表面に接触させ、担体に固定化する第１の工程と、（ｂ）上記固定化された変性状態の重鎖低分子抗体および軽鎖低分子抗体から変性剤を除去することにより、変性状態の重鎖低分子抗体および軽鎖低分子抗体をリフォールディングさせる第２の工程と、を有する（７）に記載の抗体固定化担体の製造方法。【００１８】
（１０）上記固定化工程における第１の工程および第２の工程は、重鎖低分子抗体と軽鎖低分子抗体とについて別々に行われる（９）に記載の抗体固定化担体の製造方法。【００１９】
（１１）上記固定化工程は、軽鎖低分子抗体について第１の工程および第２の工程が行われた後、重鎖低分子抗体について第１の工程および第２の工程が行われる（１０）に記載の抗体固定化担体の製造方法。【００２０】
（１２）上記第１の工程は、変性剤として０．５Ｍ〜４Ｍの尿素を用いる（９）〜（１１）のいずれかに記載の抗体固定化担体の製造方法。【００２１】
（１３）上記（７）〜（１２）のいずれかに記載の方法によって得られた抗体固定化担体。【００２２】
（１４）上記（１）〜（６），（１３）のいずれかに記載の抗体固定化担体を用いて、特定の抗原を認識する重鎖低分子抗体および／または軽鎖低分子抗体をスクリーニングする工程を有する抗体のスクリーニング方法。【００２３】
（１５）上記（１）〜（６），（１３）のいずれか１項に記載の抗体固定化担体を用いて、特定の抗原を認識するキメラ抗体またはヒト化抗体に基づき、当該特定の抗原を認識するヒト抗体をスクリーニングする方法であって、上記抗体固定化領域に固定化する重鎖低分子抗体は、上記キメラ抗体またはヒト化抗体由来の重鎖の可変領域を含む重鎖低分子抗体であり、上記抗体固定化領域に固定化する軽鎖低分子抗体は、任意のヒト抗体由来の軽鎖の可変領域を含む軽鎖低分子抗体であり、上記抗体固定化担体に、上記特定の抗原を接触させる工程（ｉ）と、上記抗体固定化担体において、上記特定の抗原を認識する抗体固体化領域を検出する工程（ｉｉ）と、上記工程（ｉｉ）において、検出した抗体固定化領域に固定化された軽鎖低分子抗体を、上記特定の抗原を認識するヒト抗体の軽鎖の可変領域の候補として決定する工程（ｉｉｉ）と、を有するスクリーニング方法。【００２４】
（１６）さらに、上記工程（ｉｉｉ）で候補として決定した軽鎖低分子抗体と、任意のヒト抗体由来の重鎖の可変領域を含む重鎖低分子抗体と、を抗体固定化領域に固定化した抗体固定化担体を用いて、上記抗体固定化担体に、上記特定の抗原を接触させる工程（ｉｖ）と、上記抗体固定化担体において、上記特定の抗原を認識する抗体固体化領域を検出する工程（ｖ）と、上記工程（ｖ）において、検出した抗体固定化領域に固定化された重鎖低分子抗体を、上記特定の抗原を認識するヒト抗体の重鎖の可変領域の候補として決定する工程（ｖｉ）と、を有する（１５）に記載のスクリーニング方法。【００２５】
（１７）上記（１）〜（６），（１３）のいずれか１項に記載の抗体固定化担体を用いて、特定の抗原を認識するキメラ抗体またはヒト化抗体に基づき、当該特定の抗原を認識するヒト抗体をスクリーニングする方法であって、上記抗体固定化領域に固定化する軽鎖低分子抗体は、上記キメラ抗体またはヒト化抗体由来の軽鎖の可変領域を含む軽鎖低分子抗体であり、上記抗体固定化領域に固定化する重鎖低分子抗体は、任意のヒト抗体由来の重鎖の可変領域を含む重鎖低分子抗体であり、上記抗体固定化担体に、上記特定の抗原を接触させる工程（ｉ）と、上記抗体固定化担体において、上記特定の抗原を認識する抗体固体化領域を検出する工程（ｉｉ）と、上記工程（ｉｉ）において、検出した抗体固定化領域に固定化された重鎖低分子抗体を、上記特定の抗原を認識するヒト抗体の重鎖領域の候補として決定する工程（ｉｉｉ）と、を有するスクリーニング方法。【００２６】
（１８）さらに、上記工程（ｉｉｉ）で決定した重鎖低分子抗体と、任意のヒト抗体由来の軽鎖の可変領域を含む軽鎖低分子抗体と、を抗体固定化領域に固定化した抗体固定化担体を用いて、上記抗体固定化担体に、上記特定の抗原を接触させる工程（ｉｖ）と、上記抗体固定化担体において、上記特定の抗原を認識する抗体固体化領域を検出する工程（ｖ）と、上記工程（ｖ）において、検出した抗体固定化領域に固定化された軽鎖低分子抗体を、上記特定の抗原を認識するヒト抗体の軽鎖の可変領域の候補として決定する工程（ｖｉ）と、を有する（１７）に記載のスクリーニング方法。【００２７】
（１９）上記（１５）〜（１８）のいずれか１項に記載のスクリーニング方法により、決定されたヒト抗体の軽鎖の可変領域の候補と重鎖の可変領域の候補とを組み合わせて、ヒト抗体を製造する工程を有するヒト抗体の製造方法。
【発明の効果】
【００２８】
本発明の抗体固定化担体は、異なる抗体由来の重鎖と軽鎖とが多数組み合わされて固定化された担体であるため、特定の抗原を認識する抗体を効率的にスクリーニングすることができる。また抗体スクリーニング以外にも診断用抗体のスクリーニングにも利用できる他、抗原抗体反応を利用した種々の免疫測定法にも利用できる。【００２９】
本発明の他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十分わかるであろう。また、本発明の利点は、添付図面を参照した次の説明によって明白になるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】（ａ）は担体上に固定化された重鎖低分子抗体と軽鎖低分子抗体との１組が、抗原と反応している様子を模式的に示した図であり、（ｂ）は担体上に多数の重鎖低分子抗体と軽鎖低分子抗体との組み合わせが固定化された抗体固定化担体の構成を模式的に示す図である。
【図２】マウス抗ＲＮａｓｅ抗体由来の、Ｆａｂ Ｈ、Ｆａｂ Ｌ、Ｆａｂ ＨにＰＳ−ｔａｇを結合させた低分子抗体、ＦａｂＬにＰＳ−ｔａｇを結合させた低分子抗体をそれぞれ単独または組み合わせて固定化した担体を作製し、抗原結合活性を調べた結果を示す図である。
【図３】マウス抗ＲＮａｓｅ抗体由来の、Ｆａｂ Ｈ、Ｆａｂ Ｌ、Ｆａｂ ＨにＰＳ−ｔａｇを結合させた低分子抗体、ＦａｂＬにＰＳ−ｔａｇを結合させた低分子抗体をそれぞれ単独または組み合わせて固定化した担体を作製し、固相リフォールディング条件を検討した結果を示す図である。
【図４】マウス抗ＣＲＰ抗体、マウス抗ＲＮａｓｅ抗体、ヒト抗ＩＦＮＧ抗体およびヒト抗ＥＤ−Ｂ抗体由来の、ＦａｂＨにＰＳ−ｔａｇを結合させた低分子抗体、Ｆａｂ ＬにＰＳ−ｔａｇを結合させた低分子抗体をそれぞれ単独または組み合わせて固定化した担体を作製し、抗原としてマウスＲＮａｓｅを検出した結果を示す図である。
【図５】マウス抗ＣＲＰ抗体、マウス抗ＲＮａｓｅ抗体、ヒト抗ＩＦＮＧ抗体およびヒト抗ＥＤ−Ｂ抗体由来の、ＦａｂＨにＰＳ−ｔａｇを結合させた低分子抗体、Ｆａｂ ＬにＰＳ−ｔａｇを結合させた低分子抗体をそれぞれ単独または組み合わせて固定化した担体を作製し、抗原としてマウスＣＲＰを検出した結果を示す図である。
【図６】マウス抗ＣＲＰ抗体、マウス抗ＲＮａｓｅ抗体、ヒト抗ＩＦＮＧ抗体およびヒト抗ＥＤ−Ｂ抗体由来の、ＦａｂＨにＰＳ−ｔａｇを結合させた低分子抗体、Ｆａｂ ＬにＰＳ−ｔａｇを結合させた低分子抗体をそれぞれ単独または組み合わせて固定化した担体を作製し、抗原としてヒトＥＤ−Ｂを検出した結果を示す図である。
【図７】マウス抗ＣＲＰ抗体、マウス抗ＲＮａｓｅ抗体、ヒト抗ＩＦＮＧ抗体およびヒト抗ＥＤ−Ｂ抗体由来の、ＦａｂＨにＰＳ−ｔａｇを結合させた低分子抗体、Ｆａｂ ＬにＰＳ−ｔａｇを結合させた低分子抗体をそれぞれ単独または組み合わせて固定化した担体を作製し、抗原としてヒトＩＦＮＧを検出した結果を示す図である。
【図８】マウス抗ＲＮａｓｅ抗体由来の、Ｆａｂ Ｈ、Ｆａｂ Ｌ、Ｆａｂ ＨにＰＳ−ｔａｇを結合させた低分子抗体、ＦａｂＬにＰＳ−ｔａｇを結合させた低分子抗体をそれぞれ単独または組み合わせて固定化した担体を作製し、固定化方法の違いによる抗原結合活性の違いを調べた結果を示す図である。
【図９】マウスＦａｂ Ｈ−ＰＳライブラリ（９６０種）から選択した、ＡＦＰ高親和性の上位４０クローンについて、抗原との親和性（発光強度）を調べた結果を示す図である。
【図１０】マウスＦａｂ Ｌ−ＰＳライブラリ（９６０種）から選択した、ＡＦＰ高親和性の上位３０クローンについて、抗原との親和性を調べた結果を示す図である。
【図１１】キメラ抗体由来のＨ鎖とヒトＬ鎖ライブラリ（９６０種）の掛けあわせについて、抗原との親和性を調べた結果を示す図である。
【図１２】キメラ抗体由来のＨ鎖とヒトＬ鎖ライブラリ（９６０種）の掛けあわせのうち、上位９５クローンについて、抗原との親和性を調べた結果を示す図である。
【図１３】キメラ抗体由来のＬ鎖とヒトＨ鎖ライブラリ（９６０種）の掛けあわせについて、抗原との親和性を調べた結果を示す図である。
【図１４】キメラ抗体由来のＬ鎖とヒトＨ鎖ライブラリ（９６０種）の掛けあわせのうち、上位９４クローンについて、抗原との親和性を調べた結果を示す図である。
【図１５】ヒトＬ鎖クローンとヒトＨ鎖クローンの掛けあわせ（４０種）について、抗原との親和性を調べた結果を示す図である。
【図１６】ヒトＬ鎖クローンとヒトＨ鎖クローンの掛けあわせ（４０種）について、抗原との親和性（比活性；単位固定化Ｆａｂあたりの活性）を調べた結果を示す図である。
【図１７】上パネルは、ヒトＦａｂ Ｈ−ＰＳのクローンＮｏ．１に、ヒトＦａｂＬ−ＰＳライブラリ９６０種を組み合わせたＦａｂ抗体の結果を示し、下パネルはヒトＦａｂ Ｈ−ＰＳのクローンＮｏ．２に、ヒトＦａｂ Ｌ−ＰＳライブラリ９６０種を組み合わせたＦａｂ抗体の結果を示す図である。
【図１８】上パネルは、ヒトＦａｂ Ｈ−ＰＳのクローンＮｏ．３に、ヒトＦａｂＬ−ＰＳライブラリ９６０種を組み合わせたＦａｂ抗体の結果を示し、下パネルは、ヒトＦａｂ Ｈ−ＰＳのクローンＮｏ．４に、ヒトＦａｂ Ｌ−ＰＳライブラリ９６０種を組み合わせたＦａｂ抗体の結果を示す図である。
【図１９】ヒトＦａｂ Ｈ−ＰＳのクローンＮｏ．１１に、ヒトＦａｂＬ−ＰＳライブラリ９６０種を組み合わせたＦａｂ抗体の結果を示す図である。
【図２０】上パネルは、ヒトＦａｂ Ｌ−ＰＳのクローンＮｏ．１に、ヒトＦａｂＨ−ＰＳライブラリ９６０種を組み合わせたＦａｂ抗体の結果を示し、下パネルはヒトＦａｂ Ｌ−ＰＳのクローンＮｏ．２に、ヒトＦａｂ Ｈ−ＰＳライブラリ９６０種を組み合わせたＦａｂ抗体の結果を示す図である。
【図２１】上パネルは、ヒトＦａｂ Ｌ−ＰＳのクローンＮｏ．３に、ヒトＦａｂＨ−ＰＳライブラリ９６０種を組み合わせたＦａｂ抗体の結果を示し、下パネルはヒトＦａｂ Ｌ−ＰＳのクローンＮｏ．１１に、ヒトＦａｂ Ｈ−ＰＳライブラリ９６０種を組み合わせたＦａｂ抗体の結果を示す図である。
【図２２】ヒトＦａｂ Ｌ−ＰＳのクローンＮｏ．１２に、ヒトＦａｂＨ−ＰＳライブラリ９６０種を組み合わせたＦａｂ抗体の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本発明の実施の形態について、以下に詳細に説明する。なお、本明細書中に記載された学術文献及び特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。本明細書において特記しない限り、数値範囲を表す「Ａ〜Ｂ」は、「Ａ以上（Ａを含みかつＡより大きく）Ｂ以下（Ｂを含みかつＢより小さい）」を意味する。
【００３２】
また、文言「抗原を認識する」、「抗原と親和性を有する」および「抗原と結合する」とは、いずれも抗体成分が抗原と免疫反応することを意味し、全て同義であって互いに置き換え可能である。
【００３３】
＜１．抗体固定化担体＞
本発明にかかる抗体固定化担体は、少なくとも重鎖の可変領域を含む重鎖低分子抗体と、少なくとも軽鎖の可変領域を含む軽鎖低分子抗体と、をそれぞれ別々に固定化した抗体固定化領域を独立して１以上備え、上記重鎖低分子抗体と軽鎖低分子抗体とは、それぞれ異なる抗原を認識する抗体由来であればよく、その他の具体的な構造、材料、形態等の構成は特に限定されるものではない。
【００３４】
本発明における「低分子抗体」とは、全長抗体（whole antibody、例えばwhole IgG等）の一部分が欠損している抗体断片であって、少なくとも重鎖の可変領域（ＶＨ）または軽鎖の可変領域（ＶＬ）を含んでおり、抗原への結合能を有していればよい。好ましい低分子抗体の具体例としては、例えば、ＶＨ，ＶＬ，重鎖または軽鎖におけるＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２などを挙げることができるが、特に、重鎖低分子抗体としては、重鎖の可変領域からなるもの、または重鎖の可変領域と重鎖第１定常領域（ＣＨ１）とからなるもの（ＦａｂＨ）であることが好ましい。また、軽鎖低分子抗体としては、軽鎖の可変領域からなるもの、または軽鎖の可変領域と軽鎖定常領域（Ｃｋ）とからなるもの（ＦａｂＬ）であることが好ましい。これらの低分子抗体であれば担体に効率的に固定化することができるためである。
【００３５】
このような低分子抗体を得るには、公知のクローン化技術や化学合成法によって製造することが可能である。例えば、クローン化技術を利用すれば、上記の抗体断片（低分子抗体）をコードするＤＮＡを調製し、これを自律複製可能なベクターに挿入して組換えＤＮＡとし、これを大腸菌、枯草菌、放線菌、酵母、糸状菌、植物細胞、昆虫細胞、動物細胞などの適宜宿主に導入して形質転換体とし、その培養物から本アミノ酸配列を含むペプチドを採取することができる（例えば、Co, M. S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976 ; Better, M. and Horwitz, A. H., Methods Enzymol. (1989) 178, 476-496 ; Pluckthun, A. and Skerra, A., Methods Enzymol. (1989) 178, 497-515 ; Lamoyi, E., Methods Enzymol. (1986) 121, 652-663 ; Rousseaux, J. et al., Methods Enzymol. (1986) 121, 663-669 ; Bird, R. E. and Walker, B. W., Trends Biotechnol. (1991) 9, 132-137参照）。
【００３６】
また、上記の低分子抗体をコードするＤＮＡを調製し、小麦胚芽や大腸菌細胞抽出液などを用いて無細胞タンパク質合成系により合成することもできる。また、「固相法」または「液相法」等の慣用のペプチド化学合成法を利用して、アミノ酸を逐次、脱水縮合させて伸長させても上記低分子抗体を得ることができる。
【００３７】
特に、遺伝子組換えによる抗体の生産技術により、抗体を大量かつ安価に生産できる。このため、通常の抗体産生細胞株から、抗体産生遺伝子を分離し、該遺伝子から低分子抗体に対応する塩基配列を調整し、これを大腸菌等に組み込んで、抗原に結合する可変領域を基本骨格とした低分子抗体を製造することが好ましい。
【００３８】
以下に、低分子抗体を製造する方法について例示する。まず抗体を産生するハイブリドーマから、可変領域をコードするｍＲＮＡまたはｔｏｔａｌＲＮＡを単離する。ｍＲＮＡまたはｔｏｔａｌ ＲＮＡの単離は、公知の方法、例えば、グアニジン超遠心法（Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry（1979）18, 5294-5299）、グアニジンン・チオシアネート・ホット・フェノール法、グアニジン・チオシアネート−グアニジン・塩酸法、グアニジン・チオシアネート・塩化セシウム法、アルカリショ糖密度勾配遠心分離法、ＡＧＰＣ法（Chomczynski, P.et al., Anal. Biochem.（1987）162, 156-159）等により行ってｔｏｔａｌ ＲＮＡを調製し、mRNA Purification Kit （Pharmacia製）等を使用して目的のｍＲＮＡを調製する。また、QuickPrep mRNA Purification Kit （Pharmacia製）を用いることによりｍＲＮＡを直接調製することもできる。
【００３９】
得られたｍＲＮＡから逆転写酵素を用いて抗体可変領域のｃＤＮＡを合成する。ｃＤＮＡの合成は、AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit（生化学工業社製）等を用いて行う。また、ｃＤＮＡの合成および増幅を行うには、5&apos;-AmpliFINDER RACE Kit（Clontech製）およびＰＣＲを用いた5&apos;-RACE法（Frohman, M. A.et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA（1988）85, 8998-9002、Belyavsky, A.et al., Nucleic Acids Res.（1989）17, 2919-2932）等を使用することができる。
【００４０】
得られたＰＣＲ産物から目的とするＤＮＡ断片を精製し、ベクターＤＮＡと連結する。さらに、これより組換えベクターを作製し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。そして、目的とするＤＮＡの塩基配列を公知の方法、例えば、ジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法等により確認する。前記のようにして得られた本発明の抗体をコードする遺伝子は、公知の方法により発現させ、取得することができる。
【００４１】
大腸菌の場合、常用される有用なプロモーターの下流に、発現させる抗体遺伝子を機能的に結合させて当該遺伝子を発現させることができる。プロモーターとしては、例えばlaczプロモーター、araBプロモーターを挙げることができる。laczプロモーターを使用する場合はWardらの方法（Nature（1098）341, 544-546 ; FASEB J.（1992）6, 2422-2427）により、あるいはaraBプロモーターを使用する場合はBetterらの方法（Science（1988）240, 1041-1043）により発現することができる。産生された抗体は、サイトプラズム内に凝集しインクルージョンボディとなるが、抗体タンパク質凝集体を分離した後、抗体の構造を適切に組み直して（refold）使用すればよい。
【００４２】
なお、プロモーターと抗体遺伝子の間に、抗体分泌のためのシグナル配列を挿入し、抗体をペリプラズムに分泌させることもできる。かかる手法は当業者にとって周知である。抗体分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、pelBシグナル配列（Lei, S. P. et al J. Bacteriol.（1987）169, 4379）を使用すればよい。ペリプラズムに産生された抗体を分離した後、抗体の構造を適切に組み直して（refold）使用する。
【００４３】
複製起源としては、SV40、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、ウシパピロ８ーマウィルス（BPV）等の由来のものを用いることができ、さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは、選択マーカーとしてアミノグリコシドトランスフェラーゼ（APH）遺伝子、チミジンキナーゼ（TK）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ecogpt）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（dhfr）遺伝子等を含むことができる。
【００４４】
本発明で使用される抗体の製造のために、任意の発現系、例えば真核細胞又は原核細胞系を使用することができる。真核細胞としては、例えば樹立された哺乳類細胞系、昆虫細胞系、真糸状菌細胞および酵母細胞などの動物細胞等が挙げられ、原核細胞としては、例えば大腸菌細胞等の細菌細胞が挙げられる。
【００４５】
次に、形質転換された宿主細胞をin vitroまたはin vivoで培養して目的とする抗体を産生させる。宿主細胞の培養は公知の方法に従い行う。例えば、培養液として、DMEM、MEM、RPMI1640、IMDMを使用することができ、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできる。
【００４６】
また、上記のように発現、産生された抗体は、均一にまで精製することができる。低分子抗体の精製についても、公知の手法を利用でき特に限定されない。例えば、本発明で使用される低分子抗体の分離、精製はアフィニティーカラムを用いて行うことができる。例えば、プロテインAカラムを用いたカラムとして、Hyper D、POROS、Sepharose F.F.（Pharmacia製）等が挙げられる。その他、通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、上記アフィニティーカラム以外のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせることにより、抗体を分離、精製することができる（Antibodies A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988）。
【００４７】
また、後述するように、本発明では低分子抗体には担体結合性ペプチドをタグとして有しているため、形質転換体からの生成物を含む溶液を担体表面に接触させることにより、担体表面に直接吸着させて、分離精製することができる。生成物を含む溶液とは、目的となる低分子抗体を含み、かつ宿主に起因する不要な夾雑物が存在する溶液全般を指す。例えば、菌体破砕液、菌体破砕液を遠心分離して得られた可溶性画分、菌体破砕液を遠心分離して得られた不溶性画分を可溶化したもの、細胞膜画分、細胞壁画分、細胞から分泌生産された分泌物、体液、またはこれらの不完全な精製物等を含む。
【００４８】
さらに、組換えＤＮＡを導入することによって異種遺伝子を宿主内で大量に発現させた場合、生成されたタンパク質による宿主への悪影響を避けるため、不溶性凝集体（封入体（inclusion body））として生成されることがある。上記低分子抗体が不溶性凝集体として生成されていても、変性剤で不溶性凝集体を可溶化後そのまま担体表面に固定化することができ、しかも固定化させた状態で変性剤を除去することによって上記低分子抗体がリフォールディングされる場合もある。
【００４９】
また、不溶性凝集体に対してだけではなく、何らかの原因によって、立体構造が変性されていても、本発明の低分子抗体であれば、そのまま担体表面に固定化することができる。しかも固定化させた状態で適当なリフォールディングバッファを加えることによってリフォールディングできる場合もある。変性の原因としては、加熱、凍結、高圧、超音波、紫外線、Ｘ線、かくはん、吸着、希釈などの物理的な原因と、極端な酸性またはアルカリ性、有機溶媒、重金属塩、変性剤、界面活性剤などの化学的な原因がある。
【００５０】
以上の低分子抗体を取得するための方法は、低分子抗体のみならず、後述する抗体、例えば完全ヒト抗体を取得する際にも利用可能であり、適宜説明を援用できることを付言しておく。
【００５１】
また、抗体固定化領域は、少なくとも１つ以上設けられていればよく、その数は特に限定されない。より好適には、抗体固定化領域は、独立して２以上備えられるものであることが好ましい。
【００５２】
「独立して２以上備える」とは、１つの抗体固定化領域には、１組の重鎖低分子抗体と軽鎖低分子抗体とが固定化されており、このような抗体固定化領域が担体上に独立して２以上存在することを意図している。また「重鎖低分子抗体と軽鎖低分子抗体とは、それぞれ異なる抗原を認識する抗体由来」である。これは重鎖低分子抗体と軽鎖低分子抗体とが、それぞれ異なる抗原と結合性を有する抗体から作製されたものであることを意図している。例えば、重鎖は抗インターフェロンγ（ＩＦＮＧ）抗体由来であり、軽鎖は抗インターロイキン６受容体（ＩＬ−６Ｒ）抗体由来である場合等を例示できる。また抗体の元々の由来生物については、ヒトが好ましいが、ヒト限られず、ニワトリ、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、サル等の種々の脊椎動物由来の抗体を利用できる。
【００５３】
本発明において、担体とは、抗体を固定化できるものであればよく、通常水に不溶のものが用いられる。担体は、樹脂、ナイロン、ニトロセルロース、多糖、ガラスまたは金属から選択される材料の膜、ビーズ、ゲルまたは基板であり、該担体は必要に応じてガラス、セラミックス、金属、プラスチック等の支持体上にある。
【００５４】
図１（ａ），（ｂ）に本発明にかかる抗体固定化担体の構造の一例を模式的に示す。図１（ａ）は担体上に固定化された重鎖低分子抗体と軽鎖低分子抗体との１組が、抗原と反応している様子を模式的に示した図であり、（ｂ）は担体上に多数の重鎖低分子抗体と軽鎖低分子抗体との組み合わせが固定化された様子を模式的に示す図である。
【００５５】
本発明における抗体固定化担体では、図１（ａ），（ｂ）に示すように、重鎖低分子抗体および軽鎖低分子抗体は、それぞれ別々に担体結合性ペプチドを介して担体に固定化されている。つまり、重鎖低分子抗体と軽鎖低分子抗体とは、１つの抗体固定化領域に１組のペアとして、別々の分子として単独で固定化されているものである。なお、重鎖低分子抗体と軽鎖低分子抗体とは、抗体固定化領域に固定化する際にそれぞれ別々に固定化されていればよく、抗体固定化領域に固定化された後であれば、相互作用していてもよく、またＳ−Ｓ結合等が形成されていてもよい。
【００５６】
重鎖低分子抗体および軽鎖低分子抗体は「担体結合性ペプチド」を介して担体に固定化されている。抗体を固定化する際に、重鎖および軽鎖の可変領域がそれぞれ抗原抗体反応に寄与できるように、Ｃ末端側が担体表面に対して垂直に結合し、抗原結合部位が外側を向き、立体的に正常な配置を取る形態で固定化されていることが好ましい。それゆえ、「担体結合性ペプチド」は、重鎖低分子抗体においては、重鎖の可変領域のＣ末端側に配置されており、また軽鎖低分子抗体においては、軽鎖の可変領域のＣ末端側にそれぞれ配置されていることが好ましい。
【００５７】
ここで「担体結合性ペプチド」とは、担体表面の材料と結合する機能を有するペプチドであればよく、その他の具体的なアミノ酸配列や長さ等については特に限定されない。なお、本発明において「結合」にはペプチドと担体表面とが、本発明の意図する用途に利用できる程度の強度で相互作用する意であり、担体表面と親和性を有し吸着する場合を含む。
【００５８】
例えば、担体表面の材料は、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）またはポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）等のプラスチック樹脂を変質させて親水化処理したものであることが好ましい。このような材料を担体表面の材料とする場合、担体結合性ペプチドとしては、上記親水化処理したプラスチック樹脂のそれぞれに対して結合する機能を有するペプチドが挙げられる。例えば、親水性のポリスチレンを担体表面の材料とした場合は、親水性のポリスチレンに結合するペプチドを選択するといった具合である。
【００５９】
担体結合性ペプチドとして、親水化処理したプラスチック樹脂のそれぞれに対して結合する機能を有するペプチドは既にいくつか報告されている公知のものを適宜利用することができる。例えば、親水性のポリスチレンに結合するペプチド（以下、「ＰＳ−ｔａｇ」と称する場合もある。）としては、後述する実施例に使用しているもの以外にも、例えば国際公開公報ＷＯ２００９／１０１８０７Ａ１号公報等に記載のペプチドを利用することができる。具体的には、Ｎ末端側からＣ末端側に向けて順にＲＸＸＸＲＲＸＲＲ（Ｒ：アルギニン、Ｘ：イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、メチオニン（Ｍ）、セリン（Ｓ）またはトレオニン（Ｔ）の一つまたは複数の組み合わせ。本願配列表の配列番号１１に示す）という配列である。より具体的には、ＷＯ２００９／１０１８０７Ａ１号公報の配列番号１〜２０に記載のアミノ酸配列を有するペプチドを利用できる。なお、後述する実施例では、Ｘを全てイソロイシンとしたＰＳ−ｔａｇを用いている。
【００６０】
また、親水性のポリカーボネート（ＰＣ）に結合する機能を有するペプチドとしては、例えば、特表２００４−５１８４４２（特願２００３−５７１２４８）号公報に記載されているペプチドを利用することができる。また、本発明者らが独自に見出したＰＣに結合する機能を有するペプチドである本願配列表の配列番号１２〜１７にアミノ酸配列を有するペプチドも利用可能である。なお、本願配列表の配列番号１２〜１７のペプチドは本出願時点において未公知である。
【００６１】
また、ポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）に結合する機能を有するペプチドとしては、例えば、(芹澤らの文献（Langmuir 2007, 23, 11127-11133）に記載されているペプチドや、本発明者らが独自に見出したＰＣに結合する機能を有するペプチドである本願配列表の配列番号１５，１８および１９に示すアミノ酸配列を有するペプチドを利用することができる。なお、本願配列表の配列番号１５，１８および１９のペプチドは本出願時点において未公知である。
【００６２】
上記例示の中でも、後述する実施例に示すように、担体表面の材料として親水処理したポリスチレンを用い、担体結合性ペプチドとして親水性のポリスチレンに結合するペプチドを用いることが特に好ましい。この組み合わせであれば、界面活性剤や変性剤の存在下でもペプチドが担体と強固に結合するためである。
【００６３】
上記担体結合性ペプチドは、低分子抗体のＣ末端と直接結合していてもよいし、適当なリンカー配列を介して結合していてもよい。また、担体結合性ペプチドのＣ末端側にＨｉｓタグ等の公知のタグ配列を設けてもよい。
【００６４】
また、担体表面の材料として好適なプラスチック樹脂表面は、一般的に疎水性であるが、この表面に各種の親水化処理を行うことで、親水性の樹脂表面を有する担体とすることができる。例えば、ポリスチレン表面であれば、ＵＶ＋Ｏ3処理やプラズマ酸化処理を行うことにより、親水性のポリスチレン表面を有する担体を調製できる。かかる親水化処理方法も国際公開公報ＷＯ２００９／１０１８０７Ａ１号公報に記載の方法を利用できる。
【００６５】
本発明の担体（基板）材料としては、樹脂以外に、種々の金属材料、ガラス板、セラミックス板等の従来公知の材料を用いることができ、特に限定されない。この担体材料の表面に、上述したプラスチック樹脂を設けて本発明の抗体固定化担体の基板とすることができる。担体の形態としては、板状（容器やウェルの壁面及び底面を含む）でもよいし、粒状でもよい。特開２００７−２７９０１８号公報に記載されているように、マイクロウェルプレートの流体取扱部（各ウェル）内に表面が親水化処理された粒状プラスチック基板を充填すれば、ウェル内に低分子抗体を含む溶液を注入するだけで粒状プラスチック基板表面に低分子抗体を固定化することができる。
【００６６】
また、本発明の抗体固定化担体は、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ法）用のセンサーチップとしても利用できる。例えば、金の基板上に親水性のポリスチレン等のプラスチック樹脂の薄膜を形成し、そこに抗体を固定化すればよい。
【００６７】
上述してきたように、本発明の抗体固定化担体における複数の抗体固定化領域には、異なる抗体由来の重鎖低分子抗体と軽鎖低分子抗体とが組み合わせを変えて固定化されている。すなわち、本発明の抗体固定化担体の各抗体固定化領域には、その組み合わせの数だけ、それぞれ異なる重鎖と軽鎖とを有する抗体が固定化されている構成といえる。このような抗体固定化領域の数は多ければ多いほど効率的な抗体スクリーニングを行うことができるため好ましい。例えば、１０２個、１０４個、１０６個、１０７個等が好ましい数としてあげられる。特に、ヒトの生体内での抗体の重鎖と軽鎖との組み合わせ数は、１０７個と言われている。重鎖低分子抗体を１０３個、軽鎖低分子抗体を１０３個それぞれ調製すれば、これらの組み合わせ数は１０６個となる。また、重鎖低分子抗体を１０４個、軽鎖低分子抗体を１０３個それぞれ調製すれば、これらの組み合わせ数は１０７個となる。それゆえ、抗体固定化領域の数をヒト生体内の抗体の組み合わせと同程度とすることができ、１つの抗体固定化担体上にヒト生体内の抗体産生システムを再現できる（In Vitro Domain Shuffling技術）。
【００６８】
本発明者らは、後述する実施例に示すように、親水性ポリスチレン結合性ペプチドをそれぞれ融合したＦａｂＨおよびＦａｂ Ｌ断片をプラスチック担体上に逐次的に固定化し、会合させることで抗体が本来有する抗原特異性を回復させ、ＦａｂＨならびにＦａｂ Ｌの組み合わせを網羅的に変えることで抗体断片のライブラリを基板上に創出させることが可能であることを実証した。本発明者らにより開発された「In Vitro Domain Shuffling技術」によれば、担体上に様々な重鎖低分子抗体・軽鎖低分子抗体を固定化し、抗原結合活性を評価することが可能となる。つまり、抗体ライブラリを作製することができるため、本抗体固定化担体を用いてイムノアッセイを行うことにより、抗原タンパク質に特異的な抗体(重鎖、軽鎖鎖の組み合わせ)を同定することが可能となる。それゆえ、抗体医薬候補のスクリーニングや診断用抗体のスクリーニングに非常に有用である。
【００６９】
特に、抗体固定化担体に複数の抗体固定化領域を設ける場合、重鎖低分子抗体および軽鎖低分子抗体の担体上の位置情報（座標情報）について、ＰＣ等の公知の演算装置で情報管理しておくことが好ましい。この構成により、例えば、抗体固定化担体に対して、ある疾病の原因物質（抗原、ターゲット分子）を接触させた場合に、シグナルが得られた座標から抗原特異性の高い重鎖と軽鎖とを特定することができる。また、固定化した重鎖および軽鎖の遺伝子情報もリンクさせておくことにより、抗原特異性の高い抗体遺伝子を得ることもできる。
【００７０】
以上のように、本発明によれば、例えば、抗体医薬開発における時間、コスト、労力を大幅に削減でき、有用な抗体および抗体遺伝子を網羅的に取得可能である。さらに、患者の個人差にも対応した抗体医薬開発が可能となる（テーラーメード抗体医薬）。
【００７１】
＜２．抗体固定化担体の製造方法＞
本発明にかかる抗体固定化担体の製造方法は、重鎖の可変領域を含む重鎖低分子抗体と、軽鎖の可変領域を含む軽鎖低分子抗体とを、それぞれ別々に担体に固定化して抗体固定化領域を作製する固定化工程を有し、上記重鎖低分子抗体と軽鎖低分子抗体とは、それぞれ異なる抗原を認識する抗体由来であればよく、その他の工程、条件、材料等については、従来公知のものを利用でき、特に限定されるものではない。また、より好適には、上記固定化工程は、上記抗体固定化領域を独立して２以上備えるように複数回行われるものであることが好ましい。本製造方法は、上記＜１＞欄で述べた抗体固定化担体を製造する方法と換言できるため、上記＜１＞欄の説明と重複する部分は上記説明を適宜援用できる。それゆえ、重複する説明は省略し、製造方法に特化した部分について説明する。
【００７２】
例えば、重鎖低分子抗体・軽鎖低分子抗体を遺伝子組換え技術により調製する場合、上述したように不溶性凝集体として得られることが一般的である。この不溶性凝集体を用いる場合は、まず不溶性凝集体を回収するために、変性剤を用いて可溶化させる。その後、多段階の透析を行って変性剤を除去して再活性化（リフォールディング）させ、精製し定量した後、上記固定化工程を行って、担体に固定化する方法を利用できる（いわゆる液相リフォールディング法）。一方、不溶性凝集体を回収するために、変性剤を用いて可溶化させた状態で担体と接触させ、その後変性剤を除去して、リフォールディングさせることもできる（いわゆる固相リフォールディング法）。本発明では、いずれの方法でも利用できるが、収率、効率性（工程とコスト）から、固相リフォールディング法を行うことが好ましい。
【００７３】
すなわち、上記固定化工程には、（ａ）上記重鎖低分子抗体および軽鎖低分子抗体の不溶性凝集体をそれぞれ変性剤にて変性させた状態で担体表面に接触させ、担体に固定化する第１の工程と、（ｂ）上記固定化された変性状態の重鎖低分子抗体および軽鎖低分子抗体から変性剤を除去することにより、変性状態の重鎖低分子抗体および軽鎖低分子抗体をリフォールディングさせる第２の工程と、を有することが好ましい。
【００７４】
上記（ａ）第１の工程において使用する溶液に含まれる低分子抗体の濃度についても特に限定されず適宜設定できるが、０．１μｇ／ｍｌ〜５００μｇ／ｍｌが好ましく、０．５μｇ／ｍｌ〜２００μｇ／ｍｌがより好ましく、１μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌがさらに好ましい。
【００７５】
ここで「変性剤」としては、一般的なタンパク質変性剤や界面活性剤等を用いることができ、特に限定されるものではないが、例えば尿素、塩酸グアニジン等のタンパク質変性剤、ＳＤＳ、ＣＨＡＰＳ等の界面活性剤を挙げることができる。変性剤の濃度も使用する低分子抗体の量や種類に応じて適宜設定でき限定されない。例えば、後述する実施例に示すように、低分子抗体が５〜１００μｇ／ｍｌである場合、変性剤としては０．５Ｍ〜８Ｍの尿素を用いることが好ましく、０．５Ｍ〜４Ｍの尿素を用いることがより好ましく、さらに０．５Ｍ〜２Ｍの尿素を用いることがより好ましい。なお、このとき凝集抑制剤としてＴｗｅｅｎ２０等の界面活性剤を併用してもよい。変性剤は、例えば、まず不溶性凝集体を高濃度の変性剤存在下（例えば、８Ｍ）で可溶化し、その後希釈して好ましい変性剤濃度（０．５Ｍ〜２Ｍ）にしてから担体に接触させて固定化する方法でもよい。
【００７６】
変性の時間や固定化の時間についても、低分子抗体の量や種類に応じて適宜設定でき限定されない。固定化工程の場合は、低分子抗体の溶液と担体とを接触させる時間を例えば、１０分〜１０時間、より好ましくは３０分〜５時間、さらに好ましくは１時間〜３時間行うことが好ましい。
【００７７】
（ｂ）の第２の工程において、変性剤を除去する方法も公知の手法を利用でき限定されないが、例えば後述する実施例に示すように、一般的なｂｕｆｆｅｒにて洗浄することにより、変性剤を除去できる。なお、上記（ａ）、（ｂ）の工程において使用する低分子抗体を可溶化させるための緩衝液や、変性剤を除去するための洗浄液の組成についても従来公知のものを使用でき特に限定されない。例えば、後述する実施例に記載したものを好適に使用することができる。
【００７８】
また、上記固定化工程における第１の工程および第２の工程は、重鎖低分子抗体と軽鎖低分子抗体とで別々に行われることが好ましい。すなわち、重鎖低分子抗体と軽鎖低分子抗体とについて別々に多段階（例えば二段階）で固定化することが好ましい。例えば、軽鎖低分子抗体について上記（ａ）の第１の工程を行って担体上に変性した軽鎖低分子抗体を固定化させる。その後、（ｂ）の第２の工程を行って変性した軽鎖低分子抗体をリフォールディングさせる。次いで重鎖低分子抗体について同様に（ａ）第１の工程、（ｂ）第２の工程を行うことが好ましい。後述する実施例に示すように、重鎖低分子抗体と軽鎖低分子抗体とを別々に固定化した場合は、重鎖低分子抗体と軽鎖低分子抗体とを混合した状態で担体と接触させ固定化工程を行った場合に比べて、顕著に抗原結合活性が優れたためである。
【００７９】
このように、重鎖低分子抗体と軽鎖低分子抗体とを別々に多段階で固定化する場合、いずれの低分子抗体を先に担体に固定化するかの順序についても特に限定されないが、軽鎖低分子抗体について第１の工程および第２の工程を行って固定化した後、重鎖低分子抗体について第１の工程および第２の工程を行って固定化することが好ましい。この順で固定化した場合、後述する実施例に示すように、担体上の抗体の抗原結合能をより一層高めることができるためである。
【００８０】
上述した抗体固定化担体の製造方法によれば、低分子化した、異なる抗体由来の重鎖と軽鎖とが多数組み合わされて固定化された担体を効率よく製造することができる。なお、本発明には、上述した製造方法にて得られた抗体固定化担体も包含されることを念のため付言しておく。
【００８１】
＜３．抗体のスクリーニング方法＞
本発明にかかる抗体のスクリーニング方法は、上述した抗体固定化担体を用いて、特定の抗原を認識する重鎖低分子抗体および／または軽鎖低分子抗体をスクリーニングする工程を有していればよく、その他の工程、条件、材料等については、従来公知のものを利用でき、特に限定されるものではない。本発明のスクリーニング方法によって選択された重鎖低分子抗体および／または軽鎖低分子抗体を再クローニングすることで完全長抗体を取得することができる。
【００８２】
ここで「特定の抗原」として、例えば抗体医薬や診断用抗体の標的物質を用いた場合、抗体医薬や診断用抗体を取得することができる。例えば、抗体医薬の候補抗体を選別する場合であれば、上述した抗体固定化担体に対して、抗体医薬の標的物質（抗原）を接触させ、当該抗原を特異的に認識する抗体を選別すればよい。なお、抗原結合活性を評価する手法についても公知の手法を利用でき限定されないが、例えば後述する実施例に示すように、ビオチン化抗原を用いたＥＬＩＳＡ法等によって評価できる。
【００８３】
また、スクリーニング方法に用いる「特定の抗原」には、検出の便宜のため、標識されていることが好ましい。標識に用いる標識物質としては、特に制限はなく、例えば、蛍光色素、酵素、タンパク質、放射性同位体、化学発光物質、ビオチン、呈色標識物質等を挙げることができる。
【００８４】
蛍光色素としては、一般に抗原であるポリペプチドやポリヌクレオチド等の物質を標識して、検出や定量に用いられるものが好適に使用でき、特に限定されるものではない。例えば、フルオレシン・イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ＨＥＸ（4,7,2’,4’,5’,7’-hexachloro-6-carboxylfluorescein、緑色蛍光色素）、フルオレセイン（fluorescein）、ＮＥＤ（商品名、Applied Biosystems社製、黄色蛍光色素）、あるいは、６−ＦＡＭ（商品名、Applied Biosystems社製、黄緑色蛍光色素）、ローダミン（rhodamin）またはその誘導体（例えば、テトラメチルローダミン（ＴＭＲ））、Alexa Fluor（Invitrogen）、Cy Dye （GE Healthcare）、Quantum Dot（Invitrogen）等を挙げることができる。
【００８５】
また、呈色標識物質としては、コロイド金属および着色ラテックスなどが挙げられる。コロイド金属の代表例としては、白金コロイド、金コロイドなどが挙げられる。コロイド金属の粒子の大きさは、通常は、直径３ｎｍ〜１００ｎｍ程度とされる。着色ラテックスの代表例としては、赤色および青色などのそれぞれの顔料で着色されたポリスチレンラテックスなどの合成ラテックスが挙げられる。ラテックスとして天然ゴムラテックスのような天然ラテックスも使用できる。着色ラテックスの大きさは、直径数十ｎｍ〜数百ｎｍ程度から選択することができる。これらの呈色標識物質は、市販品をそのまま使用できるが、場合によりさらに加工し、または、それ自体公知の方法で製造することもできる。
【００８６】
本発明のスクリーニング方法によって選択された重鎖低分子抗体および／または軽鎖低分子抗体、またこれら低分子抗体をクローニングして得られた完全長抗体は、in vivoでの治療および予防用途への利用、in vitroおよびin vivoでの診断用途への利用、in vitroでのアッセイおよび試薬用途への利用等の抗原抗体反応を含む種々の免疫測定法に用いることができる。なお、ヒトへのin vivoでの治療、予防および診断用途へ利用する場合は、実質的に純粋な完全ヒト抗体または少なくとも９０〜９５％、より好ましくは９８〜９９％以上のヒト由来の抗体部分を有するヒト化抗体が好ましい。本発明のスクリーニング方法で選別された抗体のアミノ酸配列を解析して、完全ヒト抗体等を作製する技術については公知の手法を利用すればよい。
【００８７】
また、本発明には、上述した抗体固定化担体を用いて、特定の抗原を認識するキメラ抗体またはヒト化抗体に基づき、当該特定の抗原を認識するヒト抗体（完全ヒト抗体）をスクリーニングする方法も包含される。
【００８８】
ヒトに対して、任意の抗原を免疫して抗体を製造することは生命倫理上、許されない。このため、現在の抗体医薬は、マウス抗体の可変領域とヒト抗体の定常領域とからなるキメラ抗体や、マウス抗体の抗原結合部位（ＣＤＲ；complementary determining region、相補性決定領域）のみをヒト抗体へ移植したヒト化抗体としてもっぱら開発されている。しかし、より抗原性が少なく安全性が高い完全ヒト抗体の開発が強く求められている。
【００８９】
本発明に係るスクリーニング方法は、上記要望に応えて開発されたものであり、上述した抗体固定化担体を用いたIn Vitro Domain Shuffling技術を用いて、キメラ抗体やヒト化抗体と実質的に同等かそれ以上の抗原特異性を有する完全ヒト抗体を取得するものである。具体的には以下の工程を備える。
【００９０】
すなわち、上記スクリーニング方法の第一の態様は、特定の抗原を認識するキメラ抗体またはヒト化抗体に基づき、当該特定の抗原を認識するヒト抗体（完全ヒト抗体）をスクリーニングする方法であって、上記抗体固定化領域に固定化する重鎖低分子抗体は、上記キメラ抗体またはヒト化抗体由来の重鎖の可変領域を含む重鎖低分子抗体であり、上記抗体固定化領域に固定化する軽鎖低分子抗体は、任意のヒト抗体由来の軽鎖の可変領域を含む軽鎖低分子抗体であり、上記抗体固定化担体に、上記特定の抗原を接触させる工程（ｉ）と、上記抗体固定化担体において、上記特定の抗原を認識する抗体固体化領域を検出する工程（ｉｉ）と、上記工程（ｉｉ）において、検出した抗体固定化領域に固定化された軽鎖低分子抗体を、上記特定の抗原を認識するヒト抗体の軽鎖の可変領域の候補として決定する工程（ｉｉｉ）と、を有するものである。
【００９１】
さらに、上記工程（ｉｉｉ）で候補として決定した軽鎖低分子抗体と、任意のヒト抗体由来の重鎖の可変領域を含む重鎖低分子抗体と、を抗体固定化領域に固定化した抗体固定化担体を用いて、上記抗体固定化担体に、上記特定の抗原を接触させる工程（ｉｖ）と、上記抗体固定化担体において、上記特定の抗原を認識する抗体固体化領域を検出する工程（ｖ）と、上記工程（ｖ）において、検出した抗体固定化領域に固定化された重鎖低分子抗体を、上記特定の抗原を認識するヒト抗体の重鎖の可変領域の候補として決定する工程（ｖｉ）と、を有することが好ましい。
【００９２】
本スクリーニング方法の第一の態様を概念的に説明すると以下の通りである。上記抗体固定化担体は、好ましい態様として、重鎖低分子抗体と軽鎖低分子抗体とがそれぞれ別々に固定化された抗体固定化領域を複数備えるものである。ここで、当該抗体固定化領域における重鎖低分子抗体として、既に特定の抗原に対する抗原特異性が確認されているキメラ抗体またはヒト化抗体由来の重鎖の可変領域を含む重鎖低分子抗体を固定化する。一方、軽鎖低分子抗体の部位には、任意のヒト抗体由来の軽鎖の可変領域を含む軽鎖低分子抗体を固定化する。つまり、既知の重鎖低分子抗体はキメラ抗体またはヒト化抗体由来の重鎖の可変領域を含むもの（好ましくは１種類のみ）に対して、ヒト抗体由来の軽鎖のライブラリから任意に選択された軽鎖の可変領域を含む軽鎖低分子抗体が組み合わされた、複数種類の抗体固定化領域を備える抗体固定化担体を調製することになる。このとき、ヒト抗体の軽鎖の多様性は約１０３個といわれているため、抗体固体化領域は約１０３個で調製することが好ましい。最後に、上記構成を有する抗体固定化担体に対して、抗原を接触させ、抗原結合活性の高い抗体固定化領域を特定し、当該領域に固定化された軽鎖低分子抗体を選出する。この軽鎖低分子抗体を、上記特定の抗原を認識するヒト抗体の軽鎖の可変領域の候補として決定することになる。
【００９３】
次いで、別途準備した抗体固定化担体の抗体固定化領域に、上記選出したヒト抗体の軽鎖の可変領域を含む軽鎖低分子抗体を固定化する。そして、重鎖低分子抗体として、複数の任意のヒト抗体由来の重鎖の可変領域を含む重鎖低分子抗体を固定化する。つまり、候補として選出されたヒト抗体の軽鎖の可変領域を含む軽鎖低分子抗体に対して、ヒト抗体由来の重鎖のライブラリから任意に選択された重鎖の可変領域を含む低分子抗体が組み合わされた、複数種類の抗体固定化領域を備える抗体固定化担体を調製することになる。このとき、ヒト抗体の重鎖の多様性は約１０４個といわれているため、抗体固体化領域は約１０４個で調製することが好ましい。最後に、上記構成を有する抗体固定化担体に対して、抗原を接触させ、抗原結合活性の高い抗体固定化領域を特定し、当該領域に固定化された重鎖低分子抗体を選出する。この重鎖低分子抗体を、上記特定の抗原を認識するヒト抗体の重鎖の可変領域の候補として決定することになる。なお、抗体固定化領域は約１０４個で調製することが好ましいが、作業時間や手間を低減するために、抗体固定化領域を数個〜１０２個、あるいは１０２個〜１０３個とすることもできる。かかる場合であっても、本願発明を利用すれば、十分に優れた効果を有する完全ヒト抗体を取得できる。
【００９４】
かかる方法により、ヒト抗体ライブラリから、特定の抗原に対して高い結合活性を有する軽鎖と重鎖の組み合わせを選出することができる。上記選出した軽鎖と重鎖を組み合わせることにより、キメラ抗体またはヒト化抗体と同等かそれ以上の抗原結合活性を有する完全ヒト抗体を得ることができる。
【００９５】
また、上記の態様では、まずキメラ抗体またはヒト化抗体の重鎖と組み合わせて、抗原特異性の高いヒト抗体の軽鎖の候補を選出したが、本発明はこの態様に限られない。例えば、まずキメラ抗体またはヒト化抗体の軽鎖と組み合わせて、ヒト抗体の重鎖ライブラリから任意に選択した重鎖低分子抗体の候補を選出した後、かかる重鎖の候補と組み合わせて、抗原特異性の高いヒト抗体の軽鎖の候補を選出する方法であってもよい。
【００９６】
すなわち、本発明のスクリーニング方法の第二の態様として、上記抗体固定化担体を用いて、特定の抗原を認識するキメラ抗体またはヒト化抗体に基づき、当該特定の抗原を認識するヒト抗体をスクリーニングする方法であって、上記抗体固定化領域に固定化する軽鎖低分子抗体は、上記キメラ抗体またはヒト化抗体由来の軽鎖の可変領域を含む軽鎖低分子抗体であり、上記抗体固定化領域に固定化する重鎖低分子抗体は、任意のヒト抗体由来の重鎖の可変領域を含む重鎖低分子抗体であり、上記抗体固定化担体に、上記特定の抗原を接触させる工程（ｉ）と、上記抗体固定化担体において、上記特定の抗原を認識する抗体固体化領域を検出する工程（ｉｉ）と、上記工程（ｉｉ）において、検出した抗体固定化領域に固定化された重鎖低分子抗体を、上記特定の抗原を認識するヒト抗体の重鎖領域の候補として決定する工程（ｉｉｉ）と、を有するものであってもよい。
【００９７】
さらに、上記工程（ｉｉｉ）で決定した重鎖低分子抗体と、任意のヒト抗体由来の軽鎖の可変領域を含む軽鎖低分子抗体と、を抗体固定化領域に固定化した抗体固定化担体を用いて、上記抗体固定化担体に、上記特定の抗原を接触させる工程（ｉｖ）と、上記抗体固定化担体において、上記特定の抗原を認識する抗体固体化領域を検出する工程（ｖ）と、上記工程（ｖ）において、検出した抗体固定化領域に固定化された軽鎖低分子抗体を、上記特定の抗原を認識するヒト抗体の軽鎖の可変領域の候補として決定する工程（ｖｉ）と、を有することが好ましい。
【００９８】
また、上記のスクリーニング方法では、いったんヒト抗体の軽鎖（あるいは重鎖）を候補として選出した後、当該候補である軽鎖（あるいは重鎖）と組み合わせて、抗原結合活性が高いヒト抗体由来の重鎖（あるいは軽鎖）の候補を選出するという二段階の方法であったが、本発明は、かかる態様に限られない。例えば、（ａ）キメラ抗体またはヒト化抗体由来の重鎖（あるいは軽鎖）と組み合わせて、抗原結合活性の高いヒト抗体の軽鎖（あるいは重鎖）を候補として選出する工程、（ｂ）キメラ抗体またはヒト化抗体由来の軽鎖（あるいは重鎖）と組み合わせて、抗原結合活性の高いヒト抗体の重鎖（あるいは軽鎖）を候補として選出する工程、を別々に行い、上記（ａ），（ｂ）の工程のそれぞれから選出されたヒト抗体の軽鎖および重鎖の候補を組み合わせて、より抗原結合活性に優れる完全ヒト抗体を得てもよい（三段階）。かかる態様であれば、選出されたヒト抗体の軽鎖候補と重鎖候補とについて、それぞれ複数の組み合わせで、抗原結合活性を調べることができる点で好ましい。
【００９９】
加えて、本発明には、上記スクリーニング方法により、決定されたヒト抗体の軽鎖の可変領域の候補と重鎖の可変領域の候補とを組み合わせて、ヒト抗体を製造する工程を有するヒト抗体の製造方法も包含される。つまり、本発明のヒト抗体の製造方法は、スクリーニング方法を一工程として含むものと換言できる。
【０１００】
ヒト抗体の軽鎖ライブラリまたは重鎖ライブラリから選出された軽鎖と重鎖の候補から、完全ヒト抗体を製造する方法については、従来公知の手法を用いることができ、特に限定されるものではない。例えば、上述した「低分子抗体」を得る場合に利用するクローン化技術や化学合成法によって製造することが可能であり、その説明を援用する。例えば、クローン化技術を利用すれば、上記の抗体をコードするＤＮＡを調製し、これを自律複製可能なベクターに挿入して組換えＤＮＡとし、これを大腸菌、動物細胞などの適宜宿主に導入して形質転換体とし、その培養物から本アミノ酸配列を含むペプチドを採取することができる。その他、無細胞タンパク質合成系や慣用のペプチド化学合成法を利用してもよい。また抗体の精製についても、公知の手法を利用でき特に限定されない。
【０１０１】
本発明は、以上説示した各構成に限定されるものではなく、明細書に記載した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された文献の全てが参考として援用される。以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はかかる実施例のみに限定されるものではない。
【実施例】
【０１０２】
＜１．材料＞
（１）インクルージョンボディ可溶化用ｓｏｌｕｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．５）
６Ｍ  塩酸グアニジン、１０ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、２×ＰＢＳ
（２）Ｆａｂ精製用Ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．５）…Ａ液
８Ｍ  尿素、２０ｍＭ  イミダゾール、２×ＰＢＳ
（３）Ｆａｂ精製用Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．５）…Ｂ液
８Ｍ  尿素、４００ｍＭ  イミダゾール、２×ＰＢＳ
（４）固相リフォールディング用親水性ポリスチレン担体（ＰＳプレート）
組織培養用９６ウェルマイクロプレート（ＡＧＣ Ｔｅｃｈｎｏｇｌａｓｓ ＃３８６１−０９６）。
（５）ＥＬＩＳＡ用発色液
ＡＢＴＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ：＃００−２００１）１００μｌを０．１Ｍ  クエン酸ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ４．０）、０．０３％Ｈ２Ｏで１００倍希釈して使用した。
（６）Ｆａｂ発現用ベクター：ｐＥＴ２２ （Ｎｏｖａｇｅｎ）
（７）発現用宿主：大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ）
＜２．使用した抗体遺伝子の文献＞
（１）抗ＲＮａｓｅ抗体
Katakura Y, Kobayashi E, Kurokawa Y, Omasa T, Fujiyama K, Suga K.
Cloning of cDNA and Characterization of Anti-RNase A Monoclonal Antibody 3A21
Journal of Fermentation and Bioengineering. 82, 312-314 (1996)
（２）抗ＣＲＰ抗体
Dong Hwan Choi, Katakura Y, Ninomiya K, Shioya S.
Rational Screening of Antibodies and Design of Sandwich Enzyme Linked Immunosorbent Assay on the Basis of a Kinetic Model
Journal of Bioscience and Bioengineering.105, 261-272 (2008)
（３）抗ＥＤ−Ｂ抗体および抗ＩＦＮＧ抗体
Alessandro Pini, Francesca Viti, Annalisa Santucci, Barbara Carnemollai, Luciano Zardii, Paolo Neri, and Dario Neri
Design and Use of a Phage Display Library
The Journal of Biological Chemistry. 273, 21769−21776 (1998)
＜３．低分子抗体（ＦａｂおよびＰＳ−ｔａｇ融合Ｆａｂ）の調製＞
上記文献はいずれもｓｃＦｖ遺伝子に関する文献である。このため、本実施例ではＦａｂ遺伝子についてはｓｃＦｖ遺伝子からＶＨ，ＶＬドメイン部分に相当する遺伝子をＰＣＲで単離し、ＣＨ１ドメインおよびＣｋドメインの遺伝子と融合して調製した。実施例で使用したＦａｂおよびＰＳ−ｔａｇ融合Ｆａｂのアミノ酸配列は以下の通りである。なお、使用したＦａｂおよびＰＳ−ｔａｇ融合ＦａｂのＮ末端部は開始コドンであるメチオニン（Ｍ）とした。また、ＰＳ−ｔａｇなしの場合はＣ末端部にｐＥＴ２２由来の配列の末尾にヒスチジンタグ（Ｈ×６）を、またＰＳ−ｔａｇ有りの場合はｐＥＴ２２由来の配列の間にＰＳ−ｔａｇ配列を加え、Ｃ末端部分にヒスチジンタグ（Ｈ×６）を付加した。
・マウス抗ＲＮａｓｅ抗体由来のＦａｂ−Ｈ（Ｆａｂ Ｈ）…配列番号１
・ＰＳ−ｔａｇ融合マウス抗ＲＮａｓｅ抗体由来のＦａｂ−Ｈ（Ｆａｂ Ｈ−ＰＳ）…配列番号２
・マウス抗ＲＮａｓｅ抗体由来のＦａｂ−Ｌ（Ｆａｂ Ｌ）…配列番号３
・ＰＳ−ｔａｇ融合マウス抗ＲＮａｓｅ由来のＦａｂ−Ｌ（Ｆａｂ Ｌ−ＰＳ）…配列番号４
・ＰＳ−ｔａｇ融合マウス抗ＣＲＰ抗体由来のＦａｂ−Ｈ（Ｆａｂ Ｈ−ＰＳ）…配列番号５
・ＰＳ−ｔａｇ融合マウス抗ＣＲＰ抗体由来のＦａｂ−Ｌ（Ｆａｂ Ｌ−ＰＳ）…配列番号６
・ＰＳ−ｔａｇ融合ヒト抗ＥＤ−Ｂ抗体由来のＦａｂ−Ｈ（Ｆａｂ Ｈ−ＰＳ）…配列番号７
・ＰＳ−ｔａｇ融合ヒト抗ＥＤ−Ｂ抗体由来のＦａｂ−Ｌ（Ｆａｂ Ｌ−ＰＳ）…配列番号８
・ＰＳ−ｔａｇ融合ヒト抗ＩＦＮＧ抗体由来のＦａｂ−Ｈ（Ｆａｂ Ｈ−ＰＳ）…配列番号９
・ＰＳ−ｔａｇ融合ヒト抗ＩＦＮＧ抗体由来のＦａｂ−Ｌ（Ｆａｂ Ｌ−ＰＳ）…配列番号１０
具体的な低分子抗体（ＦａｂおよびＰＳ−ｔａｇ融合Ｆａｂ）の調製方法は以下の通りである。【０１０３】
（Ａ）大腸菌の培養
まず、２×ＹＴ培地（Ａｍｐ、Ｃｍ含有）１０ｍｌに組換え大腸菌を植菌し、３７℃で一晩、前培養した。次いで、ＯｖｅｒｎｉｇｈｔＥｘｐｒｅｓｓ培地（Ｎｏｖａｇｅｎ）（Ａｍｐ、Ｃｍ含有）５０ｍｌに前培養液をＯＤ６００＝０．１になるように加え、３７℃、２００ｒｐｍで２４時間培養した。最後に、培養後、遠沈管に培養液を移して２０分間遠心分離し、上清を取り除いた。なお、抗生物質Ａｍｐ及びＣｍの濃度についてＡｍｐは５０μｇ／ｍｌ、Ｃｍは３４μｇ／ｍｌになるよう培地に添加した。【０１０４】
（Ｂ）インクルージョンボディの回収
まず、ペレット状の菌体にＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ）２．５ｍｌ、リゾチーム１ｍｇ／ｍｌ、ＢｅｎｚｏｎａｓｅＮｕｃｌｅａｓｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ）  ２．０μｌ加えてｖｏｒｔｅｘした。次いで、エッペンチューブに分注し、遠心分離した（４℃、２００００×ｇ、２０分間）。次に、上清を除去し、蒸留水を８００μｌ添加後、ｖｏｒｔｅｘして再び遠心分離した（４℃、２００００×ｇ、２０分）。続いて、上清を除去後、インクルージョンボディを回収した。最後に、ｓｏｌｕｂｉｌｉｚａｔｉｏｎｂｕｆｆｅｒを５ｍｌ加え、インクルージョンボディを溶解した。【０１０５】
（Ｃ）アフィニティクロマトグラフィーによる精製
以下の手順で可溶化した低分子抗体を変性状態で精製した。まず、Ａ液、Ｂ液を調製した。次に、クロマトグラフィーシステム（ＡＫＴＡ）を起動し、ＬｉｎｅＡ、ＢにＡ液、Ｂ液をセットした。ＬｉｎｅＡ、ＢをそれぞれＡ液、Ｂ液で置換し、Ｈｉｓ ＴｒａｐＴＭ ＨＰカラム（ＧＥ  ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ）を取り付けた。次いで、Ａ液を流速１ｍｌ／ｍｉｎでカラムに供給し、カラム内を平衡化した。可溶化した低分子抗体を流速１ｍｌ／ｍｉｎで供給し、カラムに吸着させた。Ａ液を流速１ｍｌ／ｍｉｎでカラムに供給し、洗浄した。続いて、Ｂ液を流速１ｍｌ／ｍｉｎでカラムに供給し、ＦａｂおよびＰＳ−ｔａｇ融合Ｆａｂを回収した。回収後、低分子抗体を８Ｍ尿素−１×ＰＢＳに対して一晩透析した。【０１０６】
＜４．ビオチン化抗原の調製＞
まず、抗原（１ｍｇ／ｍｌ）を１×ＰＢＳ  １Ｌに対して透析した。次に、ビオチンアミドカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを１ｍｇ量り取り、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド  １０μｌ加え、溶解させた（Ｃ溶液）。透析後の抗原をサンプル瓶に移し、Ｃ溶液を１０μｌ加えて室温で１時間、ゆるやかに撹拌した。その後、１×ＰＢＳ  １Ｌに対して一晩透析した。【０１０７】
＜５．マウス抗ＲＮａｓｅ抗体由来の低分子抗体を用いた抗体固定化担体＞
マウス抗ＲＮａｓｅ抗体由来の低分子抗体を、親水性ＰＳプレート上に固相リフォールディング法により固定化した。具体的には、まず低分子抗体Ｆａｂ Ｈ、Ｆａｂ Ｈ−ＰＳ (またはＦａｂ Ｌ、Ｆａｂ Ｌ−ＰＳ)の終濃度が１００μｇ／ｍｌ、尿素の終濃度が４Ｍ、Ｔｗｅｅｎ２０の終濃度が１％となるように希釈し、室温で１０分間インキュベートした。次いで、親水性ＰＳプレートに１００μｌ添加し、２５℃で１時間インキュベートした。その後、０．１％ ＰＢＳＴで５回洗浄し、Ｆａｂ Ｈを親水性ＰＳプレート上でリフォールディングさせた。Ｆａｂ Ｌ、Ｆａｂ Ｌ−ＰＳおよびＦａｂ Ｈ−ＰＳに対しても上記と同様の操作を行い、それぞれ親水性ＰＳプレート上に固定化させた。【０１０８】
作製した抗体固定化担体は以下の６通り。
・Ｆａｂ Ｈを固定化した担体（Ｈ）
・Ｆａｂ Ｌを固定化した担体（Ｌ）
・Ｆａｂ Ｈ−ＰＳを固定化した担体（Ｈ−ＰＳ）
・Ｆａｂ Ｌ−ＰＳを固定化した担体（Ｌ−ＰＳ）
・Ｆａｂ Ｈ−ＰＳを担体に固定化した後、Ｆａｂ Ｌ−ＰＳを固定化した担体（Ｈ−ＰＳ／Ｌ−ＰＳ）
・Ｆａｂ Ｌ−ＰＳを担体に固定化した後、Ｆａｂ Ｈ−ＰＳを固定化した担体（Ｌ−ＰＳ／Ｈ−ＰＳ）
これらの抗体固定化担体を用いて、それぞれの抗原結合活性をＥＬＩＳＡ法により調べた。具体的には、まず低分子抗体を固定化したＰＳプレートに２％ ＢＳＡ−ＰＢＳＴを３００μｌ添加し、２５℃で１時間インキュベートした。次にＰＢＳＴで５回洗浄後、０．２％ ＢＳＡ−ＰＢＳＴで０〜５μｇ／ｍｌに希釈したビオチン化抗原（マウスＲＮａｓｅ）を１００μｌ添加し、２５℃で１時間インキュベートした。次いでＰＢＳＴで５回洗浄後、０．２％ ＢＳＡ−ＰＢＳＴで５０００倍希釈したＨＲＰ標識ストレプトアビジンを１００μｌ添加し、２５℃で１時間インキュベートした。最後にＰＢＳＴで５回洗浄後、発色液を１００μｌ加えて２５℃で３０分間インキュベートし吸光度を測定した。結果を図２に示す。同図に示すように、Ｌ−ＰＳ／Ｈ−ＰＳのみ抗原結合活性が得られた。【０１０９】
＜６．固相リフォールディング条件の検討＞
マウス抗ＲＮａｓｅ抗体由来の低分子抗体を親水性ＰＳプレートに固定化する際の固相リフォールディング条件を検討した。具体的な方法は、低分子抗体（Ｆａｂ Ｈ，Ｆａｂ Ｈ−ＰＳ，Ｆａｂ ＬまたはＦａｂ Ｌ−ＰＳ）の終濃度を５μｇ／ｍｌとし、尿素の終濃度を４Ｍ、２Ｍ、１Ｍ、０．５Ｍとした以外は、上記＜５＞と同じ方法で親水性ＰＳプレート上に固定化した。低分子抗体の組み合わせを変えて、操作を繰り返し、以下の５種類の抗体固定化担体を作製した。
・Ｆａｂ Ｈを固定化した後、Ｆａｂ Ｌ−ＰＳを固定化した担体（Ｈ＋Ｌ−ＰＳ）
・Ｆａｂ Ｌ−ＰＳを担体に固定化した後、ＦａｂＨを固定化した担体（Ｌ−ＰＳ＋Ｈ）
・Ｆａｂ Ｌを担体に固定化した後、ＦａｂＨ−ＰＳを固定化した担体（Ｌ＋Ｈ−ＰＳ）
・Ｆａｂ Ｈ−ＰＳを担体に固定化した後、ＦａｂＬ−ＰＳを固定化した担体（Ｈ−ＰＳ＋Ｌ−ＰＳ）
・Ｆａｂ Ｌ−ＰＳを担体に固定化した後、ＦａｂＨ−ＰＳを固定化した担体（Ｌ−ＰＳ＋Ｈ−ＰＳ）
これらの抗体固定化担体を用いて、それぞれの抗原結合活性をＥＬＩＳＡ法により調べた。ＥＬＩＳＡ法は、用いたビオチン化抗原（マウスＲＮａｓｅ）の濃度を１μｇ／ｍｌとした以外は、上記＜５＞と同じ方法で行った。結果を図３に示す。【０１１０】
同図に示すように、尿素の濃度が０．５Ｍ〜２Ｍの場合、Ｌ−ＰＳ＋Ｈ−ＰＳ、Ｈ−ＰＳ＋Ｌ−ＰＳ、Ｌ＋Ｈ−ＰＳ、Ｈ＋Ｌ−ＰＳ、Ｌ−ＰＳ＋Ｈの順で活性が高かった。なお、尿素の濃度が４Ｍでは、Ｌ−ＰＳ＋Ｈ−ＰＳのみに活性が確認された。【０１１１】
＜７．マウス抗ＣＲＰ抗体、マウス抗ＲＮａｓｅ抗体、ヒト抗ＩＦＮＧ抗体およびヒト抗ＥＤ−Ｂ抗体由来の低分子抗体を用いた抗体固定化担体＞
マウス抗ＣＲＰ抗体、マウス抗ＲＮａｓｅ抗体、ヒト抗ＩＦＮＧ抗体およびヒト抗ＥＤ−Ｂ抗体由来の、Ｆａｂ Ｈ−ＰＳ、Ｆａｂ Ｌ−ＰＳをそれぞれ単独または組み合わせて固定化した担体を作製した。まず各種Ｆａｂ Ｌ−ＰＳを親水性ＰＳプレートに固定化した後、各種Ｆａｂ Ｈ−ＰＳを固定化した。固定化の方法は、各種Ｆａｂ Ｌ−ＰＳ，Ｆａｂ Ｈ−ＰＳの終濃度を５μｇ／ｍｌとし、尿素の終濃度を２Ｍとした以外は、上記＜５＞，＜６＞と同様の操作で行った。各種Ｆａｂ Ｌ−ＰＳ，Ｆａｂ Ｈ−ＰＳの組み合わせを変えて操作を繰り返し、最終的に各種Ｆａｂ Ｌ−ＰＳ，Ｆａｂ Ｈ−ＰＳの全ての組み合わせた１６種類の抗体固定化担体と、各種Ｆａｂ Ｌ−ＰＳまたはＦａｂ Ｈ−ＰＳのみを固定化した抗体固定化担体８種類を作製した。【０１１２】
抗原としてマウスＲＮａｓｅ、マウスＣＲＰ、ヒトＥＤ−ＢまたはヒトＩＦＮＧを用いて、それぞれの抗原結合活性をＥＬＩＳＡ法により調べた。ＥＬＩＳＡ法は、上記＜６＞と同じ方法で行った。それぞれの検出結果を図４〜図７に示す。図中、「ｗ／ｏ  Ｈ」はＦａｂ Ｈ−ＰＳを固定化せず、Ｆａｂ Ｌ−ＰＳのみ固定化したことを示す。同様に「ｗ／ｏ  Ｌ」はＦａｂ Ｌ−ＰＳを固定化せず、Ｆａｂ Ｈ−ＰＳのみ固定化したことを示す。また例えば、グラフの縦軸が「Ｈ  ＥＤ−Ｂ」である場合の「Ｌ  ＥＤ−Ｂ」のバーは、ヒト抗ＥＤ−Ｂ抗体由来のＦａｂ Ｌ−ＰＳとＦａｂ Ｈ−ＰＳとが固定化されたＰＳプレートの抗原結合活性の結果を示す。【０１１３】
図４に示すように、抗原としてマウスＲＮａｓｅを用いた場合、マウス抗ＲＮａｓｅ抗体由来のＦａｂ Ｌ−ＰＳとＦａｂ Ｈ−ＰＳとが固定化されたＰＳプレートのみが抗原結合活性を有していた。図５に示すように、抗原としてマウスＣＲＰを用いた場合、軽鎖ではマウス抗ＣＲＰ抗体由来のＦａｂ Ｌ−ＰＳの抗原結合活性が高かった。しかし、重鎖ではヒト抗ＥＤ−Ｂ抗体由来のＦａｂ Ｈ−ＰＳの抗原結合活性が高く、これら両者の組み合わせが最も抗原結合活性が高かった。図６に示すように、抗原としてヒトＥＤ−Ｂを用いた場合、重鎖がヒト抗ＥＤ−Ｂ抗体由来以外のＦａｂ Ｈ−ＰＳである場合、マウス抗ＣＲＰ抗体由来のＦａｂ Ｌ−ＰＳの抗原結合活性が高かった。一方、重鎖・軽鎖の組み合わせとしてみた場合は、ヒト抗ＥＤ−Ｂ抗体由来のＦａｂ Ｌ−ＰＳとＦａｂ Ｈ−ＰＳの組み合わせが最も抗原結合活性が高かった。一方、図７に示すように、抗原としてヒトＩＦＮＧを用いた場合、Ｆａｂ Ｈ−ＰＳ、Ｆａｂ Ｌ−ＰＳともに特異性が認められず、Ｆａｂ Ｈ依存的に抗原に結合するものと考えられる。【０１１４】
＜８．固定化方法の違いによる低分子抗体の抗原結合活性の検討＞
マウス抗ＲＮａｓｅ抗体由来の、Ｆａｂ Ｈ、Ｆａｂ Ｌ、ＦａｂＨ−ＰＳ、Ｆａｂ Ｌ−ＰＳをそれぞれ単独または組み合わせて固定化した担体を作製するに際して、固定化方法の違いによる抗原結合活性の違いを検討した。具体的には、(i) 重鎖低分子抗体または軽鎖低分子抗体をそれぞれ単独で固定化した場合、(ii) 重鎖低分子抗体および軽鎖低分子抗体を混合した状態で同時に固定化した場合、(iii) 重鎖低分子抗体および軽鎖低分子抗体について逐次的に多段階で固定化した場合で比較した。具体的な方法は以下の通り。【０１１５】
(i) 単独で固定化する場合
まずＦａｂ Ｈ、Ｆａｂ Ｈ−ＰＳ、Ｆａｂ ＬまたはＦａｂ Ｌ−ＰＳのいずれかについて、終濃度が２００μｇ／ｍｌ、尿素の終濃度が４Ｍ、Ｔｗｅｅｎ２０の終濃度が１％となるように希釈し、室温で１０分間インキュベートした。次いで、親水性ＰＳプレートに１００μｌ添加し、２５℃で１時間インキュベートした。その後、ＰＢＳＴで５回洗浄し、Ｆａｂ Ｈ、Ｆａｂ Ｈ−ＰＳ、Ｆａｂ ＬまたはＦａｂ Ｌ−ＰＳのいずれかを親水性ＰＳプレート上でリフォールディングさせた。抗原結合活性の結果を図８（ａ）に示す。【０１１６】
(ii) 混合して固定化する場合
まずＦａｂ ＨまたはＦａｂ Ｈ−ＰＳと、Ｆａｂ ＬまたはＦａｂ Ｌ−ＰＳとの組み合わせについて、それぞれの低分子抗体の終濃度が２００μｇ／ｍｌとし（組み合わせの合計で４００μｇ／ｍｌ）、尿素の終濃度が４Ｍ、Ｔｗｅｅｎ２０の終濃度が１％となるように希釈し、室温で１０分間インキュベートした。次いで、親水性ＰＳプレートに１００μｌ添加し、２５℃で１時間インキュベートした。その後、ＰＢＳＴで５回洗浄し、低分子抗体の組み合わせを親水性ＰＳプレート上でリフォールディングさせた。抗原結合活性の結果を図８（ｂ）に示す。【０１１７】
(iii) 逐次多段階にて固定化する場合
低分子化抗体の終濃度を２００μｇ／ｍｌとした以外は、上記＜５＞と同様の操作にて固定化した。抗原結合活性の結果を図８（ｃ）に示す。【０１１８】
図８（ａ）〜（ｃ）に示すように、上記(i) 単独で固定化する場合および(ii) 混合して固定化する場合のいずれも抗原結合活性はほとんど認められず、(iii) 逐次多段階にて固定化する場合のみ抗原結合活性が認められた。特に、Ｆａｂ ＬまたはＦａｂ Ｌ−ＰＳを担体に固定化した後、Ｆａｂ ＨまたはＦａｂ Ｈ−ＰＳを固定化した場合に優れた抗原結合活性が認められた。【０１１９】
＜９．マウス抗体ライブラリからの抗ＡＦＰ抗体のスクリーニング実験＞
まず、１次スクリーニングとして、抗原に親和性の重鎖（Ｈ鎖）および軽鎖（Ｌ鎖）のスクリーニングを行った。具体的な手順は、以下の通りである。【０１２０】
（１）ＡＦＰ免疫マウスからの抗体遺伝子の増福；
抗原として、肝がんの診断マーカーであるαフェトプロテイン（ＡＦＰ）を用いた。ＡＦＰ５０μｇをマウスに１週間おきに４回免疫し、５週目に脾臓を摘出した。脾臓中のＴｏｔａｌ ＲＮＡを回収し、ＲＴ−ＰＣＲで抗体のＦａｂ ＨおよびＦａｂ Ｌ遺伝子群を増幅させた。Ｆａｂ ＨおよびＦａｂ Ｌ遺伝子群をＰＳ−ｔａｇ融合タンパク質発現ベクターｐＥＴ−ＰＳ１９−６のＮｄｅ Ｉ／Ｎｏｔ Ｉサイトにライゲーションした。ライゲーション後のベクターで大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｒｏｓｅｔｔａを形質転換し、ＬＢ−アンピシリンプレート上でシングルコロニー化させた。Ｆａｂ Ｈ遺伝子群を導入した大腸菌をＦａｂ Ｈ−ＰＳ大腸菌ライブラリ（１×１０５コロニー）、ＦａｂＬ遺伝子群を導入した大腸菌をＦａｂ Ｌ−ＰＳ大腸菌ライブラリ（１×１０５コロニー）とした。【０１２１】
（２）マイクロプレートを用いるＰＳ−ｔａｇ融合Ｆａｂ Ｈ（Ｆａｂ Ｈ−ＰＳ）およびＰＳ−ｔａｇ融合Ｆａｂ Ｌ（Ｆａｂ Ｌ−ＰＳ）のハイスループット生産；
まず、９６ウェルディープウェルプレート（グライナー社製、７８０２７１）の各ウェルに５０μｇ／ｍｌアンピシリンおよび３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含むＯｖｅｒｎｉｇｈｔＥｘｐｒｅｓｓ ＴＢ培地（メルク）を１ｍｌ加えた。これらを２０プレート分用意した。次に、ＬＢ−アンピシリンプレート上でシングルコロニー化したＦａｂＨ−ＰＳ大腸菌ライブラリからシングルコロニーを採取し、上述のディープウェルプレートの各ウェルに植菌した。次いで、Ｆａｂ Ｌ−ＰＳ大腸菌ライブラリからも同様にシングルコロニーを植菌した。具体的には、Ｆａｂ Ｈ−ＰＳ大腸菌ライブラリ、Ｆａｂ Ｌ−ＰＳ大腸菌ライブラリそれぞれ１０プレート（９６０コロニー）ずつ植菌した。その後、ディープウェルプレートを３７℃、１，４００ｒｐｍで２４時間培養した。【０１２２】
（３）菌体破砕ならびにインクルージョンボディの可溶化；
ディープウェルプレートを５０００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ遠心分離を行い、上清を除去した。次に、菌体破砕液（Ｂｕｇｂｕｓｔｅｒ２０ｍｌ，Ｌｙｓｏｚｙｍｅ ２０ｍｇ，ｂｅｎｚｏｎａｚｅ ６μｌ）を各ウェルに２００μｌずつ添加し、１８００ｒｐｍ、３７℃で1時間振盪させた。次いで、５０００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ遠心分離後、上清を除去し、イオン交換水を各ウェルに２００μｌずつ添加し、懸濁させた。この操作を2回繰り返した。その後、５０００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ遠心分離した後、可溶化液（８Ｍ Ｕｒｅａ ＰＢＳ ５０ｍｌ，メルカプトエタノール３５μｌ）を各ウェルに５００μｌずつ加え、２５℃、１４０００ｒｐｍで1時間振盪させた。続いて、５０００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ遠心分離を行い、上清に含まれるＦａｂ Ｈ−ＰＳおよびＦａｂ Ｌ−ＰＳを以下のとおり精製した。【０１２３】
（４）フィルタープレートによるＦａｂ Ｈ−ＰＳおよびＦａｂ Ｌ−ＰＳの精製；
９６ウェルフィルタープレート（ワットマン）に５０％Ｎｉ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ（ＧＥ ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ）レジンを２００μｌ／ｗｅｌｌずつ添加した。４００μｌ次いで、２００μｌのＢｉｎｄｉｎｇＢｕｆｆｅｒ １（８Ｍ尿素−２×ＰＢＳ、２０μＭイミダゾール）で平衡化した。各ｗｅｌｌにディープウェルプレートから５００μｌのサンプルをフィルタープレートに添加した。ピペッティングで穏やかにレジンとサンプルを混和し、２０分間インキュベートした。サンプル溶液をアスピレーターで吸引して除去し、４００μｌのＢｉｎｄｉｎｇＢｕｆｆｅｒ １で1回、さらに２００μｌのＢｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ １で２回洗浄した。さらに、２００μｌのＢｉｎｄｉｎｇＢｕｆｆｅｒ ２（８Ｍ尿素−１×ＰＢＳ、２０μＭイミダゾール）で洗浄し、アスピレーターで溶液を除去した。【０１２４】
その後、(i)２５０μlのＥｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（８Ｍ 尿素−４００ｍＭイミダゾール−１×ＰＢＳ）を添加し、２０分間インキュベートすることでレジンに吸着したＦａｂＨ−ＰＳおよびＦａｂ Ｌ−ＰＳを溶出した。次いで、(ii)フィルタープレートと８００μl用９６ウェルディープウェルプレート（グライナー）を重ね、遠心分離（５００ｇ，５ｍｉｎ）により溶出液を回収ディープウェルプレート内に回収した。この操作を２回行った。その後、再度、上記(i)および(ii)の操作を行った。【０１２５】
（５）Ｆａｂ Ｈ−ＰＳライブラリおよびＦａｂＬ−ＰＳライブラリからのＡＦＰ高親和性クローンの単離；
スクリーニング用９６ウェルＰＳ ｐｌａｔｅとして蛍光測定用Ｂｌａｃｋｐｌａｔｅ （ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ＃３５３２４１）を用いた。ＰＳ ｐｌａｔｅに３０Ｗで1分間酸素プラズマを照射し、ＰＳ ｐｌａｔｅの表面を親水化した。１．３３％Ｔｗｅｅｎ  ＰＢＳを７５μｌずつ添加後、ＦａｂＨ−ＰＳライブラリまたはマウスＨ鎖ライブラリを２５μｌずつ各ウェルに添加した。これを４℃で一晩インキュベートした。次いで、０．１％ＴｗｅｅｎＰＢＳにて洗浄後、２％ＢＳＡ−０．１％Ｔｗｅｅｎ ＰＢＳを各ウェルに２７０μｌ添加し、1時間ブロッキングした。次に、０．１％Ｔｗｅｅｎ ＰＢＳにて洗浄後、０．２％ＢＳＡ−０．１％Ｔｗｅｅｎ ＰＢＳを用いて１μｇ／ｍｌのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７標識ＡＦＰを作製し、各ウェルに１００μｌずつ添加後、遮光して１時間インキュベートした。０．１％Ｔｗｅｅｎ ＰＢＳにて洗浄後、蛍光プレートリーダー（ＴＥＣＡＮ ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００）を用いて蛍光強度を測定した（励起波長：６４５ｎｍ、蛍光波長：６７８ｎｍ）。【０１２６】
蛍光強度の高い順からＦａｂ Ｈ−ＰＳクローンを４０種類、ＦａｂＬ−ＰＳクローンを３０種類選択し、次の工程に用いた。その結果を図９，図１０に示す。なお、図中、棒グラフは吸着量（左側目盛）を示し、点は蛍光強度（右側目盛）を示す。なお、Ｈ鎖の９６０クローンの平均シグナル強度（蛍光強度）は、１０８６であった。また、Ｌ鎖の９６０クローンの平均シグナル強度（蛍光強度）は、１０２８であった。【０１２７】
（６）In Vitro Domain Shufflingを用いるＦａｂライブラリプレートの作成とＡＦＰ高親和性Ｆａｂのスクリーニング；
上記で選択したＦａｂ Ｈ−ＰＳクローンを４０種類、Ｆａｂ Ｌ−ＰＳクローンを３０種類用いて、基板上に１２００種類（Ｈ鎖：４０種×Ｌ鎖：３０種）の抗体ライブラリを作製し、抗原結合性を評価した（２次スクリーニング）。具体的な手順は以下の通りである。【０１２８】
スクリーニング用３８４ウェルＰＳ ｐｌａｔｅとして蛍光測定用Ｂｌａｃｋｐｌａｔｅ （ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ＃３５３２８５）を用いた。ＰＳ ｐｌａｔｅに３０Ｗで1分間酸素プラズマを照射し、ＰＳ ｐｌａｔｅの表面を親水化した。１．３３％Ｔｗｅｅｎ  ＰＢＳを３０μｌずつ添加後、ＦａｂＬ−ＰＳライブラリ上位３０クローンを１０μｌずつ各ウェルに添加した。これを２５℃で２時間インキュベートした。次いで、１．３３％Ｔｗｅｅｎ  ＰＢＳを３０μｌずつ添加後、ＦａｂＨ−ＰＳ ライブラリ上位４０クローンを１０μｌずつ各ウェルに添加した。これを２５℃で２時間インキュベートした。０．１％ＴｗｅｅｎＰＢＳにて洗浄後、２％ＢＳＡ−０．１％Ｔｗｅｅｎ ＰＢＳを各ウェルに８０μｌ添加し、1時間ブロッキングした。０．１％Ｔｗｅｅｎ ＰＢＳにて洗浄後、０．２％ＢＳＡ−０．１％Ｔｗｅｅｎ ＰＢＳを用いて１μｇ／ｍｌのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７標識ＡＦＰを作製し、各ウェルに１００μｌずつ添加後、遮光を施し1時間インキュベートした。０．１％Ｔｗｅｅｎ ＰＢＳにて洗浄後、蛍光プレートリーダー（ＴＥＣＡＮｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００）を用いて蛍光強度を測定した（励起波長：６４５ｎｍ、蛍光波長：６７８ｎｍ）。【０１２９】
蛍光強度のシグナルが５０００以上となった重鎖と軽鎖との組み合わせを抗ＡＦＰ抗体として判定した。その結果、（Ｈ３，Ｌ４）、（Ｈ３，Ｌ６）、（Ｈ３，Ｌ１２）、（Ｈ６，Ｌ６）、（Ｈ８，Ｌ６）、（Ｈ８，Ｌ１５）、（Ｈ１９，Ｌ９）、（Ｈ２０，Ｌ９）、（Ｈ３５，Ｌ６）の９種類が、肝がん診断用の抗ＡＦＰ特異的抗体として判定した。なお、括弧の中のＨは重鎖を意味し、数字は図９に示すＨ鎖の順位である。同様に、括弧の中のＬは軽鎖を意味し、数字図１０に示すＬ鎖の順位である。つまり、これらの重鎖と軽鎖の組み合わせが抗ＡＦＰ抗体として利用可能であることがわかった。【０１３０】
＜１０．ヒト抗体ライブラリを用いたキメラ抗体からヒト抗体への変換＞
In Vitro Domain Shuffling技術を用いて、キメラ抗体と同等かそれ以上の抗原特異性を有する完全ヒト抗体を取得することを目的として、以下の実験を行った。【０１３１】
（１）ヒト抗体遺伝子の増福；
ヒト脾臓Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ （クロンテック, ＃６３６５２５）から、ＲＴ-ＰＣＲでヒト抗体のＦａｂ ＨおよびＦａｂ Ｌ遺伝子群を増幅した。ＦａｂＨおよびＦａｂ Ｌ遺伝子群をＰＳ−ｔａｇ融合タンパク質発現ベクターｐＥＴ−ＰＳ１９−６のＮｄｅＩ／Ｎｏｔ Ｉサイトにライゲーションした。ライゲーション後のベクターで大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｒｏｓｅｔｔａを形質転換し、ＬＢ−アンピシリンプレート上でシングルコロニー化させた。Ｆａｂ Ｈ遺伝子群を導入した大腸菌をＦａｂ Ｈ−ＰＳ大腸菌ライブラリ（１×１０６コロニー）、ＦａｂＬ遺伝子群を導入した大腸菌をＦａｂ Ｌ−ＰＳ大腸菌ライブラリ（１×１０６コロニー）とした。【０１３２】
（２）マイクロプレートを用いるＰＳ−ｔａｇ融合Ｆａｂ Ｈ（Ｆａｂ Ｈ−ＰＳ）およびＰＳ−ｔａｇ融合Ｆａｂ Ｌ（Ｆａｂ Ｌ−ＰＳ）のハイスループット生産；
９６ウェルディープウェルプレート（グライナー社製、７８０２７１）の各ウェルに５０μｇ／ｍｌアンピシリンおよび３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含むＯｖｅｒｎｉｇｈｔＥｘｐｒｅｓｓ ＴＢ培地（メルク）を１ｍｌ加えた。これらを２０プレート分用意した。ＬＢ−アンピシリンプレート上でシングルコロニー化したＦａｂＨ−ＰＳ大腸菌ライブラリからシングルコロニーを採取し、上述のディープウェルプレートの各ウェルに植菌した。Ｆａｂ Ｌ−ＰＳ大腸菌ライブラリからも同様にシングルコロニーを植菌した。（Ｆａｂ Ｈ−ＰＳ大腸菌ライブラリ、ＦａｂＬ−ＰＳ大腸菌ライブラリそれぞれ１０プレート（９６０コロニー）ずつ）。ディープウェルプレートを３７℃、１，４００ｒｐｍで２４時間培養した。【０１３３】
（３）菌体破砕ならびにインクルージョンボディの可溶化；
ディープウェルプレートを５０００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ遠心分離を行い、上清を除去した。次いで、菌体破砕液（Ｂｕｇｂｕｓｔｅｒ ２０ｍｌ、Ｌｙｓｏｚｙｍｅ ２０ｍｇ、 ｂｅｎｚｏｎａｚｅ ６μｌ）を各ウェルに２００μｌずつ添加し、１８００ｒｐｍ、３７℃で１時間振盪させた。５０００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ遠心分離後、上清を除去し、イオン交換水を各ウェルに２００μｌずつ添加し、懸濁させた。この操作を２回繰り返した。続いて、５０００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ遠心分離後、可溶化液（８Ｍ Ｕｒｅａ ＰＢＳ ５０ｍｌ、メルカプトエタノール ３５μｌ）を各ウェルに５００μｌずつ加え、２５℃、１４０００ｒｐｍで１時間振盪させた。次に、５０００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ遠心分離を行い、上清に含まれるＦａｂ Ｈ−ＰＳおよびＦａｂ Ｌ−ＰＳを以下のとおり精製した。【０１３４】
（４）フィルタープレートによるＦａｂ Ｈ−ＰＳおよびＦａｂ Ｌ−ＰＳの精製；
９６ウェルフィルタープレート（ワットマン）に５０％Ｎｉ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ（ＧＥ ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ）レジンを２００μｌ／ｗｅｌｌずつ添加した。４００μｌ次いで２００μｌのＢｉｎｄｉｎｇＢｕｆｆｅｒ １（８Ｍ尿素−２ｘＰＢＳ、２０μＭイミダゾール）で平衡化した。各ｗｅｌｌにディープウェルプレートから５００μｌのサンプルをフィルタープレートに添加した。ピペッティングで穏やかにレジンとサンプルを混和し、２０分間インキュベートした。その後、サンプル溶液をアスピレーターで吸引して除去し、４００μｌのＢｉｎｄｉｎｇＢｕｆｆｅｒ １で１回、さらに２００μｌのＢｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒで２回洗浄した。次に、２００μｌのＢｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ ２（８Ｍ尿素−１×ＰＢＳ、２０μＭイミダゾール）で洗浄し、アスピレーターで溶液を除去した。【０１３５】
続いて、(i)２５０μｌのＥｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（８Ｍ 尿素−４００ｍＭイミダゾール−１×ＰＢＳ）を添加し、２０分間インキュベートすることでレジンに吸着したＦａｂＨ−ＰＳおよびＦａｂ Ｌ−ＰＳを溶出した。次に、(ii)フィルタープレートと８００μｌ用９６ウェルディープウェルプレート（グライナー）を重ね、遠心分離（５００ｇ、５ｍｉｎ）により溶出液を回収ディープウェルプレート内に回収した。この操作を２回行った。再度、(i)および(ii)の操作を行った。【０１３６】
（５）In Vitro Domain Shufflingを用いたリツキサン（登録商標） キメラＦａｂ Ｈ−ＰＳ／ヒトＦａｂ Ｌ−ＰＳライブラリの評価（９６０クローン中９５クローンの選抜）；
既に上市されているリツキサン（登録商標）をモデル抗体として、キメラ抗体と同等かそれ以上の抗原特異性を有する完全ヒト抗体の取得を試みた。なお、リツキサン（登録商標）は、ＣＤ２０を標的とし、細胞性リンパ腫に適用される抗体医薬である。なお、抗原であるＣＤ２０抗原は、エピトープ部分が既に公開されている。このため、当該エピトープペプチドのみを固相合成法にて合成し、Ｎ末端部分にＦＩＴＣを付加した蛍光標識エピトープペプチドを作製し、抗原として用いた。具体的な手順は以下の通りである。【０１３７】
スクリーニング用３８４ウェルＰＳ ｐｌａｔｅとして蛍光測定用Ｂｌａｃｋ ｐｌａｔｅ （ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ＃３５３２８５）を用いた。ＰＳ ｐｌａｔｅに３０Ｗで１分間酸素プラズマを照射し、ＰＳ ｐｌａｔｅの表面を親水化した。次に、１．３３％Ｔｗｅｅｎ  ＰＢＳを２７μｌずつ添加後、ヒトＦａｂ Ｌ−ＰＳライブラリを９μｌ各ウェルに添加した。リツキサン（登録商標）キメラＦａｂ Ｈ−ＰＳを２Ｍ Ｕｒｅａ １％ＴｗｅｅｎＰＢＳ， ２５０μｇ／ｍｌに調製したものを４μｌ添加後、２時間インキュベートした。続いて、０．１％ＴｗｅｅｎＰＢＳにて洗浄後、２％ＢＳＡ −０．１％Ｔｗｅｅｎ ＰＢＳを各ウェルに８０μｌ添加し、１時間ブロッキングした。次いで、０．１％Ｔｗｅｅｎ ＰＢＳにて洗浄後、０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０および５％ヒト血清を含む１μｇ／ｍｌのＦＩＴＣ標識抗原溶液を作製し、各ウェルに４０μｌずつ添加後、遮光を施し1時間インキュベートした。０．１％Ｔｗｅｅｎ ＰＢＳにて洗浄後、蛍光プレートリーダー（ＴＥＣＡＮ ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００）を用いて蛍光強度を測定した（励起波長：４８６ｎｍ、蛍光波長：５２０ｎｍ）。【０１３８】
キメラＨ鎖とヒトＬ鎖ライブラリ（９６０種）の掛けあわせた結果の結果を図１１に示す。図中、縦軸は蛍光強度、横軸はヒトＬ鎖の種類を示す。掛けあわせのうち、最も高い蛍光強度は６４３５であり、平均蛍光強度は２４６６であった。キメラＨ鎖との掛けあわせ９６０クローン中、蛍光強度が４０００以上のＬ鎖について、検出された蛍光強度の高い順に９５クローンを選択した。【０１３９】
（６）In Vitro Domain Shufflingを用いたリツキサン（登録商標） キメラＦａｂＨ−ＰＳ／ヒトＦａｂ Ｌ−ＰＳライブラリ Ｔｏｐ９５クローンの評価；
上記選択したＬ鎖９５クローンについて、キメラ抗体のＨ鎖との組み合わせ並びに単独の比活性を評価した。【０１４０】
スクリーニング用９６ウェルＰＳ ｐｌａｔｅとして蛍光測定用Ｂｌａｃｋｐｌａｔｅ （Ｇｒｅｉｎｅｒ ＃６５５０７６）を用いた。ＰＳｐｌａｔｅに３０Ｗで１分間酸素プラズマを照射し、PS plateの表面を親水化した。ヒトＦａｂ Ｌ−ＰＳ Ｔｏｐ９５クローンとリツキサン（登録商標）Ｆａｂ Ｈ−ＰＳキメラを混合し、終濃度として尿素２Ｍ、Ｔｗｅｅｎ２０ １％、キメラ Ｆａｂ Ｈ−ＰＳ２５μｇ／ｍｌとした。コントロールとして、終濃度０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０および２Ｍ尿素のヒトＦａｂＬ−ＰＳライブラリ溶液（すなわち、キメラＦａｂ Ｈ−ＰＳを含まない）も調製した。これらを各ウェル１００μｌずつ添加し、２時間インキュベートした。０．１％ＴｗｅｅｎＰＢＳにて洗浄後、２％ＢＳＡ−０．１％Ｔｗｅｅｎ ＰＢＳを各ウェルに２７０μｌ添加し、1時間ブロッキングした。０．１％Ｔｗｅｅｎ ＰＢＳにて洗浄後、０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０および５％ヒト血清を含む１μｇ／ｍｌのＦＩＴＣ標識抗原溶液を作製し、各ウェルに１００μｌずつ添加後、遮光を施し１時間インキュベートした。０．１％ＴｗｅｅｎＰＢＳにて洗浄後、蛍光プレートリーダー（ＴＥＣＡＮ ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００）を用いて蛍光強度を測定した（励起波長：４８６ｎｍ、蛍光波長：５２０ｎｍ）。【０１４１】
結果を図１２に示す。図中、上部パネルがヒトＬ鎖の上位９５クローンとキメラ抗体のＨ鎖との組み合わせの蛍光強度を示し、下部パネルがヒトＬ鎖の９５クローン単独の蛍光強度を示す。上部パネルに示すように、ヒトＬ鎖の上位９５クローンとキメラ抗体のＨ鎖との組み合わせのうち、蛍光強度が６０００以上増加したものは６１クローン（６３．８％）、４０００以上増加したものは７７クローン（８１．９％）、２０００以上増加したものは９３クローン（９８．９％）であり、最大で１４１３１増加したクローンもあった。スクリーニングしたヒトＬ鎖の多くがキメラ抗体由来のＨ鎖と組み合わせた際に、抗原結合力が大幅に上昇することが明らかとなった。【０１４２】
（７）In Vitro Domain Shufflingを用いたヒトＦａｂ Ｈ−ＰＳライブラリ／リツキサン（登録商標）キメラＦａｂＬ−ＰＳの評価（９６０クローン中９４クローンの選抜）；
次に、キメラ抗体のＬ鎖とヒトのＨ鎖ライブラリ（９６０種類）とを掛けあわせて、好適なヒトＨ鎖をスクリーニングした。【０１４３】
スクリーニング用３８４ウェルＰＳ ｐｌａｔｅとして蛍光測定用Ｂｌａｃｋｐｌａｔｅ （ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ＃３５３２８５）を用いた。ＰＳ ｐｌａｔｅに３０Ｗで１分間酸素プラズマを照射し、PS plateの表面を親水化した。１．３３％Ｔｗｅｅｎ  ＰＢＳを２７μｌずつ添加後、ヒトＦａｂＨ−ＰＳライブラリを９μｌ各ウェルに添加した。リツキサン（登録商標） キメラＦａｂＬ−ＰＳを２Ｍ Ｕｒｅａ １％ＴｗｅｅｎＰＢＳ，２５０μｇ／ｍｌに調製したものを４μｌ添加後、２時間インキュベートした。次いで、０．１％Ｔｗｅｅｎ ＰＢＳにて洗浄後、２％ＢＳＡ−０．１％Ｔｗｅｅｎ ＰＢＳを各ウェルに８０μｌ添加し、１時間ブロッキングした。０．１％ＴｗｅｅｎＰＢＳにて洗浄後、０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０および５％ヒト血清を含む１μｇ／ｍｌのＦＩＴＣ標識抗原溶液を作製し、各ウェルに４０μｌずつ添加後、遮光を施し１時間インキュベートした。０．１％ＴｗｅｅｎＰＢＳにて洗浄後、蛍光プレートリーダー（ＴＥＣＡＮ ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００）を用いて蛍光強度を測定した（励起波長：４８６ｎｍ、蛍光波長：５２０ｎｍ）。【０１４４】
キメラ抗体由来のＬ鎖とヒトＨ鎖ライブラリ（９６０種）の掛けあわせた結果を図１３に示す。図中、縦軸が蛍光強度、横軸はヒトＨ鎖の種類を示す。掛けあわせのうち、最も高い蛍光強度は１２０７４であり、平均蛍光強度は２７１６であった。キメラ抗体由来のＬ鎖との掛けあわせたヒトＨ鎖９６０クローン中、蛍光強度が４０００以上のＨ鎖について、検出された蛍光強度の高い順に９４クローンを選択した。【０１４５】
（８）In Vitro Domain Shufflingを用いたヒトＦａｂ Ｈ−ＰＳライブラリＴｏｐ９４クローン／リツキサン（登録商標）キメラＦａｂＬ−ＰＳの評価；
上記選択したＨ鎖９４クローンについて、キメラ抗体のＬ鎖との組み合わせ並びに単独の比活性を評価した。【０１４６】
スクリーニング用９６ウェルＰＳ ｐｌａｔｅとして蛍光測定用Ｂｌａｃｋｐｌａｔｅ （Ｇｒｅｉｎｅｒ ＃６５５０７６）を用いた。ＰＳｐｌａｔｅに３０Ｗで１分間酸素プラズマを照射し、ＰＳ ｐｌａｔｅの表面を親水化した。８Ｍ尿素−ＰＢＳに溶解したヒトＦａｂＨ−ＰＳライブラリＴｏｐ９４クローンとリツキサン（登録商標）Ｆａｂ Ｌ−ＰＳキメラを混合し、終濃度として尿素２Ｍ、Ｔｗｅｅｎ２０１％、キメラＦａｂ Ｌ−ＰＳ ２５μｇ／ｍｌとした。コントロールとして、終濃度０．１％Ｔｗｅｅｎ２０および２Ｍ尿素のヒトＦａｂ Ｈ−ＰＳライブラリ溶液（すなわち、キメラＦａｂ Ｌ−ＰＳを含まない）も調製した。これらを各ウェル１００μｌずつ添加し、２時間インキュベートした。０．１％Ｔｗｅｅｎ ＰＢＳにて洗浄後、２％ＢＳＡ−０．１％Ｔｗｅｅｎ ＰＢＳを各ウェルに２７０μｌ添加し、１時間ブロッキングした。０．１％ＴｗｅｅｎＰＢＳにて洗浄後、０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０および５％ヒト血清を含む１μｇ／ｍｌのＦＩＴＣ標識抗原溶液を作製し、各ウェルに１００μｌずつ添加後、遮光を施し１時間インキュベートした。０．１％ＴｗｅｅｎＰＢＳにて洗浄後、蛍光プレートリーダー（ＴＥＣＡＮ ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００）を用いて蛍光強度を測定した（励起波長：４８６ｎｍ、蛍光波長：５２０ｎｍ）。【０１４７】
結果を図１４に示す。図中、上部パネルがヒトＨ鎖の上位９４クローンとキメラ抗体のＬ鎖との組み合わせの蛍光強度を示し、下部パネルがヒトＨ鎖の９４クローン単独の蛍光強度を示す。上部パネルに示すように、ヒトＨ鎖の上位９４クローンとキメラ抗体のＬ鎖との組み合わせのうち、蛍光強度が２０００以上増加したものは１７クローン（１８．１％）、１０００以上増加したものは８３クローン（６７．０％）であり、最大で５２７２増加したクローンもあった。スクリーニングしたヒトＨ鎖の多くがキメラ抗体由来のＬ鎖と組み合わせた際に、抗原結合力が大幅に上昇することが明らかとなった。【０１４８】
（９）In Vitro Domain Shufflingを用いたヒトＦａｂ Ｈ−ＰＳライブラリ／ヒトＦａｂＬ−ＰＳの評価；
次に、上記（５）〜（８）において選別したヒトＦａｂ Ｌ−ＰＳおよびヒトＦａｂ Ｈ−ＰＳの中から抗原への結合能が高いクローンを、ヒトＦａｂ Ｌ−ＰＳ  ５種類（クローンＮｏ．１，２，３，１１，１２）、ヒトＦａｂ Ｈ−ＰＳ  ８種類（クローンＮｏ．１，２，３，４，１１，３２，４８，８５，９１）を選択し、組み合わせた場合の抗原結合力を評価した。コントロールとして、リツキサン（登録商標）キメラＦａｂＬ−ＰＳおよびキメラＦａｂ Ｈ−ＰＳも用いた。なお、ここで示すヒトＦａｂ Ｌ−ＰＳのクローンＮｏ．は、図１１，図１２に示すものと同一であり、またヒトＦａｂ Ｈ−ＰＳのクローンＮｏ．は図１３，図１４に示すものと同一である。具体的な手順は以下の通りである。【０１４９】
まず、スクリーニング用９６ウェルＰＳ ｐｌａｔｅとして蛍光測定用Ｂｌａｃｋ ｐｌａｔｅ（Ｇｒｅｉｎｅｒ #６５５０７６）を用いた。ＰＳ ｐｌａｔｅに３０Ｗで１分間酸素プラズマを照射し、ＰＳ ｐｌａｔｅの表面を親水化した。次に、８Ｍ尿素−ＰＢＳ−１%Ｔｗｅｅｎ ２０中にてヒトＦａｂ Ｈ−ＰＳの各クローン，ヒトＦａｂ Ｌ−ＰＳの各クローン、リツキサン（登録商標）キメラＦａｂ Ｌ−ＰＳおよびキメラＦａｂ Ｈ−ＰＳがそれぞれ１ｍｇ／ｍｌとなるように調製した。【０１５０】
ＰＶＣ製プレートの各ウェルに１％Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳを７２μｌ、８Ｍ尿素および１％Ｔｗｅｅｎ ２０含むＰＢＳを２４μｌ加え、それぞれウェルにＦａｂＬ−ＰＳおよびＦａｂ Ｈ−ＰＳを１２μｌずつ添加した（総液量１２０μｌ、Ｆａｂ Ｌ−ＰＳおよびＦａｂ Ｈ−ＰＳの終濃度１００μｇ／ｍｌ、尿素の終濃度２Ｍ、Ｔｗｅｅｎ２０の終濃度１％）。なお、比較としてＦａｂＨ−ＰＳ、Ｆａｂ Ｌ−ＰＳどちらか一方を含まないサンプルも調製した。これらをＢｌａｃｋｐｌａｔｅの各ウェルに１００μｌずつ添加し、２５℃で２時間インキュベートした。次に、０．１％Ｔｗｅｅｎ ＰＢＳにて洗浄後、２％ＢＳＡ −０．１％Ｔｗｅｅｎ ＰＢＳを各ウェルに２７０μｌ添加し、1時間ブロッキングした。０．１％Ｔｗｅｅｎ ＰＢＳにて洗浄後、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０および５％ヒト血清を含む １μｇ／ｍｌのＦＩＴＣ標識抗原溶液を作製し、各ウェルに１００μｌずつ添加後、遮光を施し1時間インキュベートした。最後に、０．１％Ｔｗｅｅｎ ＰＢＳにて洗浄後、蛍光プレートリーダー（ＴＥＣＡＮ ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００）を用いて蛍光強度を測定した（励起波長：４８６ｎｍ、蛍光波長：５２０ｎｍ）。【０１５１】
ヒトＦａｂ Ｈ−ＰＳクローン  ８種類、ヒトＦａｂＬ−ＰＳクローン  ５種類を用いて合計４０種類のヒトＦａｂをＰＳプレート上に作製し、ＦＩＴＣ標識抗原との親和性を評価した結果を図１５に示す。同図に示すとおり、コントロールであるキメラＦａｂＨ−ＰＳ／キメラＦａｂＬ−ＰＳの組み合わせよりも高いシグナルを示すヒトＦａｂ Ｈ−ＰＳ／ヒトＦａｂ Ｌ−ＰＳの組み合わせが多数存在した。【０１５２】
得られたシグナル強度をＦａｂ Ｈ−ＰＳ／ＦａｂＬ−ＰＳの固定化量で除し、比活性（すなわち、単位Ｆａｂあたりのシグナル強度）を算出した結果を図１６に示す。同図に示すとおり、ヒトＦａｂＨ−ＰＳ／ヒトＦａｂ Ｌ−ＰＳの組み合わせは、キメラＦａｂＨ−ＰＳ／キメラＦａｂ Ｌ−ＰＳと同等もしくはそれ以上の比活性を示すものが多く得られた。したがって、本発明を利用することによって、キメラ抗体から完全ヒト抗体を製造できることが明らかとなった。【０１５３】
（１０）In Vitro Domain Shufflingを用いたヒトＦａｂ Ｈ−ＰＳ／ヒトＦａｂ Ｌ−ＰＳライブラリの評価；
本実験では、上記（５）〜（８）において選別したヒトＦａｂ Ｈ−ＰＳの中から抗原への結合能が高いクローンとして、ヒトＦａｂ Ｈ−ＰＳ  ５種類（クローンＮｏ．１，２，３，４，１１）を選び、これらに対し、In Vitro Domain Shufflingを用いてヒトＦａｂ Ｌ−ＰＳライブラリ９６０クローンを掛けあわせ、抗原に対する親和力を評価した。具体的な手順は以下の通りである。【０１５４】
まず、スクリーニング用３８４ウェルＰＳ ｐｌａｔｅとして蛍光測定用Ｂｌａｃｋ ｐｌａｔｅ（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ＃３５３２８５）を用いた。ＰＳ ｐｌａｔｅに３０Ｗで１分間酸素プラズマを照射し、ＰＳ ｐｌａｔｅの表面を親水化した。１．３３%Ｔｗｅｅｎ  ＰＢＳを２７μｌずつ添加後、ヒトＦａｂ Ｌ−ＰＳライブラリを９μｌ各ウェルに添加した。次いで、ヒトＦａｂＨ−ＰＳ各クローンを２Ｍ Ｕｒｅａ １%Ｔｗｅｅｎ ＰＢＳ，２５０μｇ／ｍｌに調製したものを４μｌ添加後、２時間インキュベートした。０．１%Ｔｗｅｅｎ ＰＢＳにて洗浄後、２%ＢＳＡ−０．１%Ｔｗｅｅｎ ＰＢＳを各ウェルに８０μｌ添加し、１時間ブロッキングした。０．１%Ｔｗｅｅｎ ＰＢＳにて洗浄後、０．１%Ｔｗｅｅｎ ２０および５％ヒト血清を含む１μｇ／ｍｌのＦＩＴＣ標識抗原溶液を作製し、各ウェルに４０μｌずつ添加後、遮光を施し１時間インキュベートした。最後に、０．１%Ｔｗｅｅｎ ＰＢＳにて洗浄後、蛍光プレートリーダー（ＴＥＣＡＮｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００）を用いて蛍光強度を測定した（励起波長：４８６ｎｍ、蛍光波長：５２０ｎｍ）。【０１５５】
（１１）In Vitro Domain Shufflingを用いたヒトＦａｂ Ｈ−ＰＳライブラリ／ヒトＦａｂＬ−ＰＳの評価；
同様に、上記（５）〜（８）において、高いシグナル強度が検出された上位５クローン(ヒトＦａｂ Ｌ−ＰＳ  ５種類（クローンＮｏ．１，２，３，１１，１２）に対し、In Vitro Domain Shufflingを用いてヒトＦａｂ Ｈ−ＰＳライブラリ９６０クローンを掛けあわせ、抗原に対する親和力を評価した。具体的な手順は以下の通りである。【０１５６】
まず、スクリーニング用３８４ウェルＰＳ ｐｌａｔｅとして蛍光測定用Ｂｌａｃｋ ｐｌａｔｅ（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ＃３５３２８５）を用いた。ＰＳ ｐｌａｔｅに３０Ｗで１分間酸素プラズマを照射し、ＰＳ ｐｌａｔｅの表面を親水化した。１．３３%Ｔｗｅｅｎ  ＰＢＳを２７μｌずつ添加後、ヒトＦａｂ Ｈ−ＰＳライブラリを９μｌ各ウェルに添加した。ヒトＦａｂＬ−ＰＳ各クローンを２Ｍ Ｕｒｅａ １%Ｔｗｅｅｎ ＰＢＳ，２５０μｇ／ｍｌに調製したものを４μｌ添加後、２時間インキュベートした。０．１%Ｔｗｅｅｎ ＰＢＳにて洗浄後、２%ＢＳＡ−０．１%Ｔｗｅｅｎ ＰＢＳを各ウェルに８０μｌ添加し、１時間ブロッキングした。その後、０．１%Ｔｗｅｅｎ ＰＢＳにて洗浄後、０．１%Ｔｗｅｅｎ ２０および５％ヒト血清を含む１μｇ／ｍｌのＦＩＴＣ標識抗原溶液を作製し、各ウェルに４０μｌずつ添加後、遮光を施し１時間インキュベートした。最後に、０．１%Ｔｗｅｅｎ ＰＢＳにて洗浄後、蛍光プレートリーダー（ＴＥＣＡＮｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００）を用いて蛍光強度を測定した（励起波長：４８６ｎｍ、蛍光波長：５２０ｎｍ）。【０１５７】
上述のように、キメラＦａｂ Ｈ−ＰＳおよびキメラＦａｂＬ−ＰＳと混合した際に高い検出シグナルが得られるヒトＦａｂ Ｈ−ＰＳクローン  ５種及びヒトＦａｂＬ−ＰＳ  ５種クローンを選別し、これらに対してそれぞれヒトＦａｂ Ｌ−ＰＳライブラリ９６０クローン又はヒトＦａｂＨ−ＰＳライブラリ９６０クローンを網羅的に会合させ、ＰＳ ｐｌａｔｅ上にヒトＦａｂＨ−ＰＳ／ヒトＦａｂ Ｌ−ＰＳからなるＦａｂ抗体９６００種類を作製した。これらヒトＦａｂＨ−ＰＳ／ヒトＦａｂ Ｌ−ＰＳに対する蛍光標識抗原の親和力を評価した結果を図１７〜図２２に示す。【０１５８】
より詳細には、図１７の上パネルは、ヒトＦａｂ Ｈ−ＰＳのクローンＮｏ．１に、ヒトＦａｂ Ｌ−ＰＳライブラリ９６０種を組み合わせたＦａｂ抗体の結果を示し、図１７の下パネルはヒトＦａｂＨ−ＰＳのクローンＮｏ．２に、ヒトＦａｂ Ｌ−ＰＳライブラリ９６０種を組み合わせたＦａｂ抗体の結果を示す。同様に、図１８の上パネルは、ヒトＦａｂＨ−ＰＳのクローンＮｏ．３に、ヒトＦａｂ Ｌ−ＰＳライブラリ９６０種を組み合わせたＦａｂ抗体の結果を示し、図１８の下パネルは、ヒトＦａｂＨ−ＰＳのクローンＮｏ．４に、ヒトＦａｂ Ｌ−ＰＳライブラリ９６０種を組み合わせたＦａｂ抗体の結果を示す。図１９は、ヒトＦａｂＨ−ＰＳのクローンＮｏ．１１に、ヒトＦａｂ Ｌ−ＰＳライブラリ９６０種を組み合わせたＦａｂ抗体の結果を示す。【０１５９】
また、図２０の上パネルは、ヒトＦａｂ Ｌ−ＰＳのクローンＮｏ．１に、ヒトＦａｂ Ｈ−ＰＳライブラリ９６０種を組み合わせたＦａｂ抗体の結果を示し、図２０の下パネルはヒトＦａｂＬ−ＰＳのクローンＮｏ．２に、ヒトＦａｂ Ｈ−ＰＳライブラリ９６０種を組み合わせたＦａｂ抗体の結果を示す。図２１の上パネルは、ヒトＦａｂＬ−ＰＳのクローンＮｏ．３に、ヒトＦａｂ Ｈ−ＰＳライブラリ９６０種を組み合わせたＦａｂ抗体の結果を示し、図２１の下パネルはヒトＦａｂＬ−ＰＳのクローンＮｏ．１１に、ヒトＦａｂ Ｈ−ＰＳライブラリ９６０種を組み合わせたＦａｂ抗体の結果を示す。図２２は、ヒトＦａｂＬ−ＰＳのクローンＮｏ．１２に、ヒトＦａｂ Ｈ−ＰＳライブラリ９６０種を組み合わせたＦａｂ抗体の結果を示す。【０１６０】
これらの図に示すように、キメラＦａｂ Ｈ−ＰＳ／ヒトＦａｂ Ｌ−ＰＳ又はヒトＦａｂ Ｈ−ＰＳ／キメラＦａｂ Ｌ−ＰＳからなるＦａｂ抗体に比べて、同等もしくはそれ以上に高いシグナルが得られるヒトＦａｂ Ｈ−ＰＳ／ヒトＦａｂ Ｌ−ＰＳの組み合わせが多数検出された。特に、１００００以上のシグナル強度が得られたヒトＦａｂ Ｈ−ＰＳ／ヒトＦａｂ Ｌ−ＰＳの組み合わせは抗原に対して極めて高い親和力を有している可能性が高い。このため、これらの詳細な親和力評価を実施すれば、キメラＦａｂ Ｈ−ＰＳ／キメラＦａｂ Ｌ−ＰＳからなるキメラ抗体よりも親和力の高く、副作用に少ない完全ヒト抗体クローンが獲得可能である。
【産業上の利用可能性】
【０１６１】
本発明は、抗体のスクリーニングのための基盤技術として利用でき、スクリーニングされた重鎖低分子抗体、軽鎖低分子抗体を完全長抗体に再クローニングすることにより、例えば、抗体医薬や診断薬としての利用が可能である。
【図１】
0005851391.tif 000002
【図２】
0005851391.tif 000003
【図３】
0005851391.tif 000004
【図４】
0005851391.tif 000005
【図５】
0005851391.tif 000006
【図６】
0005851391.tif 000007
【図７】
0005851391.tif 000008
【図８】
0005851391.tif 000009
【図９】
0005851391.tif 000010
【図１０】
0005851391.tif 000011
【図１１】
0005851391.tif 000012
【図１２】
0005851391.tif 000013
【図１３】
0005851391.tif 000014
【図１４】
0005851391.tif 000015
【図１５】
0005851391.tif 000016
【図１６】
0005851391.tif 000017
【図１７】
0005851391.tif 000018
【図１８】
0005851391.tif 000019
【図１９】
0005851391.tif 000020
【図２０】
0005851391.tif 000021
【図２１】
0005851391.tif 000022
【図２２】
0005851391.tif 000023
【配列表】
0005851391000001.app