(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列に対し少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたプロテアーゼ変異体であって、前記プロテアーゼ変異体のアミノ酸配列が、配列番号１のアミノ酸置換Ｎ７６Ｄ＋Ｓ８７Ｒ＋Ｇ１１８Ｒ＋Ｓ１２８Ｌ＋Ｐ１２９Ｑ＋Ｓ１３０Ａを含み、各アミノ酸位置が、前記プロテアーゼ変異体のアミノ酸配列を配列番号２で示されるバチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）のサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列と整列させることで決定される、前記バチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列中の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる、単離されたプロテアーゼ変異体。
【請求項２】
前記プロテアーゼ変異体のアミノ酸配列が、アミノ酸置換Ｓ１８８Ｄ＋Ｖ２４４Ｒを更に含む、請求項１に記載のプロテアーゼ変異体。
【請求項３】
前記プロテアーゼ変異体のアミノ酸配列が、アミノ酸置換Ｓ１８８Ｄ＋Ｎ２４８Ｒを更に含む、請求項１に記載のプロテアーゼ変異体。
【請求項４】
前記プロテアーゼ変異体が、配列番号６、７、又は８で示されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のプロテアーゼ変異体。
【請求項５】
前記プロテアーゼ変異体がサブチリシン変異体である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のプロテアーゼ変異体。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のプロテアーゼ変異体をコードしているポリヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
【請求項７】
表面、物品若しくは対象物のクリーニング方法であって、クリーニングされる物品若しくは表面の少なくとも一部を、請求項１〜５のいずれか一項に記載されるプロテアーゼ変異体の少なくとも１種に、所望される程度に前記物品又は表面をクリーニング又は洗浄するのに十分な時間にわたって及び／又は十分な若しくは有効な条件下で接触させる工程を含み、並びに所望により前記表面、物品又は対象物を水ですすぐ工程を更に含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クリーニング用途に及びクリーニング方法において有用なプロテアーゼ変異体を提供する。一態様では、本発明は、バチルス種変異体のサブチリシンポリペプチドを包含するプロテアーゼ変異体、及びこのような変異体を１種以上含むクリーニング組成物を提供する。
【背景技術】
【０００２】
セリンプロテアーゼは、幅広い特異性及び生物機能を有する様々なクラスの酵素を含む、カルボニルヒドロラーゼの亜群である（例えば、Ｓｔｒｏｕｄ，Ｓｃｉ．Ａｍｅｒ．１３１：７４〜８８を参照されたい）。セリンプロテアーゼ（例えば、サブチリシン）に対する研究は活発に行われてきたが、これらの研究の大部分は、セリンプロテアーゼがクリーニング用途及び給餌用途に有用であることに起因している。これらの用途に関するニーズに応えるため、数多くの有用なプロテアーゼ変異体が開発されてきたものの、様々な用途を目的とした、新規の改良されたプロテアーゼ及びプロテアーゼ変異体が未だ必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
一態様では、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列に対し少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むプロテアーゼ変異体であって、上記プロテアーゼ変異体のアミノ酸配列が、配列番号１の位置７６、８７、１１８、１２８、１２９、１３０、１８８、及び２４４の各アミノ酸残基に異なるアミノ酸残基による置換を含み、各アミノ酸位置が、プロテアーゼ変異体のアミノ酸配列を配列番号２で示されるバチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）のサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列と整列させることで決定される、バチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列中の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる、プロテアーゼ変異体を提供する。
【０００４】
一態様では、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列に対し少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むプロテアーゼ変異体であって、上記プロテアーゼ変異体のアミノ酸配列が、配列番号１に対する各アミノ酸位置７６、８７、１１８、１２８、１２９、及び１３０に異なるアミノ酸残基による置換を含み、かつ
（ｉ）アミノ酸位置１８８にセリン残基を含み、若しくは位置１８８にアスパラギン酸残基以外の異なるアミノ酸残基によるセリン残基の置換を含み、並びに／又は
（ｉｉ）アミノ酸位置２４８にアスパラギン残基を含み、若しくは位置２４８にアルギニン残基以外の異なるアミノ酸残基によるアスパラギン残基の置換を含み、
アミノ酸位置が、プロテアーゼ変異体のアミノ酸配列を配列番号２で示されるバチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）のサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列と整列させることで決定される、バチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列中の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる、プロテアーゼ変異体を提供する。
【０００５】
一態様では、本発明は、配列番号７又は配列番号８のアミノ酸配列に対し少なくとも９９％又は９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、プロテアーゼ変異体を提供する。
【０００６】
一態様では、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列に対し少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むプロテアーゼ変異体を提供し、上記プロテアーゼ変異体が、配列番号１に対する以下のアミノ酸置換の組：
（ｉ）上記プロテアーゼ変異体がＮ２４８Ｒ＋Ｓ１８８Ｄを含まない場合にはＮ７６Ｄ＋Ｓ８７Ｒ＋Ｇ１１８Ｒ＋Ｓ１２８Ｌ＋Ｐ１２９Ｑ＋Ｓ１３０Ａ、又は
（ｉｉ）Ｎ７６Ｄ＋Ｓ８７Ｒ＋Ｇ１１８Ｒ＋Ｓ１２８Ｌ＋Ｐ１２９Ｑ＋Ｓ１３０Ａ＋Ｓ１８８Ｄ＋Ｖ２４４Ｒ、
のうちの１つを含み、アミノ酸位置が、プロテアーゼ変異体のアミノ酸配列を配列番号２で示されるバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列と整列させることで決定される、バチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列中の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる、プロテアーゼ変異体を提供する。
【０００７】
一態様では、本発明は、親プロテアーゼのプロテアーゼ変異体であって、上記プロテアーゼ変異体が、親プロテアーゼのアミノ酸配列に対する以下のアミノ酸置換の組：
（ｉ）上記プロテアーゼ変異体がＮ２４８Ｒ＋Ｓ１８８Ｄを含まない場合にはＮ７６Ｄ＋Ｓ８７Ｒ＋Ｇ１１８Ｒ＋Ｓ１２８Ｌ＋Ｐ１２９Ｑ＋Ｓ１３０Ａ、又は
（ｉｉ）Ｎ７６Ｄ＋Ｓ８７Ｒ＋Ｇ１１８Ｒ＋Ｓ１２８Ｌ＋Ｐ１２９Ｑ＋Ｓ１３０Ａ＋Ｓ１８８Ｄ＋Ｖ２４４Ｒ、のうちの１つを含む、アミノ酸配列を含む、親プロテアーゼのプロテアーゼ変異体を提供する。
【０００８】
一態様では、本発明は、親サブチリシンのサブチリシン変異体であって、上記サブチリシン変異体が、親サブチリシンのアミノ酸配列に対する以下のアミノ酸置換の組：
（ｉ）上記サブチリシン変異体がＮ２４８Ｒ＋Ｓ１８８Ｄを含まない場合にはＮ７６Ｄ＋Ｓ８７Ｒ＋Ｇ１１８Ｒ＋Ｓ１２８Ｌ＋Ｐ１２９Ｑ＋Ｓ１３０Ａ、又は
（ｉｉ）Ｎ７６Ｄ＋Ｓ８７Ｒ＋Ｇ１１８Ｒ＋Ｓ１２８Ｌ＋Ｐ１２９Ｑ＋Ｓ１３０Ａ＋Ｓ１８８Ｄ＋Ｖ２４４Ｒ、のうちの１つを含む、アミノ酸配列を含む、親サブチリシンのサブチリシン変異体を提供する。
【０００９】
一態様では、本発明は、親プロテアーゼのプロテアーゼ変異体であって、上記親プロテアーゼが、配列番号１のアミノ酸配列に対し少なくとも９７％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有し、上記親プロテアーゼのプロテアーゼ変異体が、上記親プロテアーゼに対する以下のアミノ酸置換の組：
（ｉ）上記プロテアーゼ変異体がＮ２４８Ｒ＋Ｓ１８８Ｄを含まない場合にはＮ７６Ｄ＋Ｓ８７Ｒ＋Ｇ１１８Ｒ＋Ｓ１２８Ｌ＋Ｐ１２９Ｑ＋Ｓ１３０Ａ、又は
（ｉｉ）Ｎ７６Ｄ＋Ｓ８７Ｒ＋Ｇ１１８Ｒ＋Ｓ１２８Ｌ＋Ｐ１２９Ｑ＋Ｓ１３０Ａ＋Ｓ１８８Ｄ＋Ｖ２４４Ｒ、
のうちの１つを含み、アミノ酸位置が、プロテアーゼ変異体のアミノ酸配列を配列番号２で示されるバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列と整列させることで決定される、バチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列中の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる、親プロテアーゼのプロテアーゼ変異体を提供する。
【００１０】
一態様では、本発明は、（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列と９〜１５個のアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列、及び（ｂ）アミノ酸置換Ｎ７６Ｄ＋Ｓ８７Ｒ＋Ｇ１１８Ｒ＋Ｓ１２８Ｌ＋Ｐ１２９Ｑ＋Ｓ１３０Ａ＋Ｓ１８８Ｄ＋Ｎ２４８Ｒを含むアミノ酸配列、を含むプロテアーゼ変異体であって、
アミノ酸位置が、プロテアーゼ変異体のアミノ酸配列を配列番号２で示されるバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列と整列させることで決定される、バチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列中の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる、プロテアーゼ変異体を提供する。
【００１１】
一態様では、本発明は、本明細書に記載される本発明のプロテアーゼ変異体を少なくとも１種含む組成物を提供する。このような組成物のうち一部のものは、本発明のプロテアーゼ変異体を少なくとも１種含む洗剤組成物である。本発明のこのような組成物のうち一部のものは、少なくとも１種の追加の酵素、少なくとも１種のビルダー、及び／又は少なくとも１種の界面活性剤を含む。このような組成物のうち一部のものは、リン酸塩を含有しない。
【００１２】
一態様では、本発明は、本明細書に記載される本発明のプロテアーゼ変異体を少なくとも１種含むクリーニング組成物を提供する。このようなクリーニング組成物のうち一部のものは、液体型、ゲル型、錠剤型、粉末型、固形、又は顆粒型洗剤組成物である。このようなクリーニング組成物のうち一部のものは、洗濯洗剤組成物又は食器洗浄用洗剤組成物である。このような食器洗浄用洗剤組成物のうち一部のものは、自動食器洗浄用洗剤組成物又は食器手洗い用（又は手動洗浄用）洗剤組成物である。本発明のこのようなクリーニング組成物のうち一部のものは、更に少なくとも１種の追加の酵素、少なくとも１種のビルダー、及び／又は少なくとも１種の界面活性剤を含む。
【００１３】
一態様では、本発明は、クリーニングする必要のある物品又は表面のクリーニング方法であって、この方法が、物品又は表面を、本明細書に記載される本発明のプロテアーゼ変異体、又は本発明の組成物と接触させることを含む、方法を提供する。このような方法のうち一部のものでは、クリーニング組成物は食器洗浄用洗剤組成物であり、及びクリーニングされる物品は食器類又は食卓用食器類である。このような方法のうち一部のものでは、クリーニング組成物は自動食器洗浄用洗剤組成物又は食器手洗い用洗剤組成物であり、及びクリーニングされる物品は、食器類又は食卓用食器類である。このような方法のうち一部のものでは、クリーニング組成物は洗濯洗剤組成物であり、及びクリーニングされる物品は布製物品である。
【００１４】
他の態様では、本発明は、表面、物品、又は対象物のクリーニング方法であって、この方法は、クリーニングされる物品若しくは表面の少なくとも一部を本明細書に記載される本発明のプロテアーゼ変異体又は本発明の組成物に、所望される程度に物品又は表面をクリーニング又は洗浄するのに十分な時間にわたって及び／又は十分な若しくは有効な条件下で接触させる工程を含み、並びに所望により表面、物品又は対象物を水ですすぐ工程を更に含む、方法を提供する。
【００１５】
一態様では、本発明は、表面のクリーニング方法であって、この方法は、クリーニングされる表面を準備する工程と、表面、又はクリーニングされる物品若しくは表面の一部を、本発明のプロテアーゼ変異体の少なくとも１種又は本発明のいずれかの組成物に、所望される程度に物品又は表面をクリーニング又は洗浄するのに十分な時間にわたって及び／又は十分な若しくは有効な条件下で接触させる工程と、を含み、上記表面が、所望により、テーブル、卓上、床、天井、家具、物品、非食器類、又は非食卓用食器類である、方法を提供する。
【００１６】
一態様では、本発明は、自動食器洗浄機での食卓用食器類又は食器類のクリーニング方法であって、この方法は、（ｉ）自動食器洗浄機を準備する工程と、（ｉｉ）食卓用食器類又は食器類をクリーニングするのに十分である、任意量の本明細書に記載される自動食器洗浄用組成物を食洗機内に配置する工程と（上記組成物は場合により上記食洗機の区画又は分配器中に配置される）、（ｉｉｉ）食器又は食卓用食器類を上記食洗機内に配置する工程と、及び（ｉｖ）食洗機を操作して、食卓用食器類又は食器類をクリーニングする工程と、を含む、方法を提供する。
【００１７】
一態様では、本発明は、本明細書に記載される本発明のプロテアーゼ変異体をコードしているポリヌクレオチド配列を含む単離核酸を提供する。
【００１８】
一態様では、本発明は、配列番号１１で示されるポリヌクレオチド配列又はその相補的ポリヌクレオチド配列に対し、少なくとも９０％の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む、単離核酸を提供する。
【００１９】
一態様では、本発明は、配列番号１０で示されるポリヌクレオチド配列又はその相補的ポリヌクレオチド配列に対し、少なくとも９０％の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む、単離核酸を提供する。
【００２０】
一態様では、本発明は、配列番号９で示されるポリヌクレオチド配列又はその相補的ポリヌクレオチド配列に対し、少なくとも９０％の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む、単離核酸を提供する。
【００２１】
一態様では、本発明は、ポリヌクレオチド配列を含む単離核酸であって、遺伝子暗号の縮重を除き、配列番号９、１０、及び１１のいずれかのポリヌクレオチド配列、又はそのいずれかの相補的配列の、実質的に全長にわたり、少なくとも厳密な条件下又は非常に厳密な条件下でハイブリダイズする、単離核酸を提供する。
【００２２】
一態様では、本発明は、本明細書に記載される本発明の核酸を少なくとも１種含む発現ベクターを提供する。同様に、本明細書に記載される本発明の核酸を少なくとも１種（例えば、本発明のプロテアーゼ変異体をコードしている核酸を少なくとも１種）含む組成物も提供する。このような組成物のうち一部のものは、更に、追加の核酸を少なくとも１種、例えば、限定するものではないが、本発明のプロテアーゼ変異体、又は既知のプロテアーゼ（例えば、サブチリシン）若しくは酵素をコードしている追加の核酸を少なくとも１種含む。同様に、本明細書に記載される本発明の発現ベクター又は核酸を含む組み換え宿主細胞も提供する。このような宿主細胞のうち一部のものは、バクテリア細胞を含む。
【００２３】
一態様では、本発明は、本明細書に記載される本発明のプロテアーゼ変異体を少なくとも１種又は本発明の核酸を少なくとも１種含む細胞培養物を提供する。
【００２４】
一態様では、本発明は、プロテアーゼ変異体の製造方法であって、この方法は、本明細書に記載される本発明の組み換え宿主細胞を、プロテアーゼ変異体の産生が誘導される条件下で培養する工程を含む、方法を提供する。
【００２５】
一態様では、本発明は、プロテアーゼ変異体の製造方法であって、この方法は、本明細書に記載される本発明の組み換えプロテアーゼ発現ベクターを細胞集団に導入する工程、並びに、発現ベクターによりコードされているプロテアーゼ変異体の産生が誘導される条件下で細胞を培養培地で培養する工程、を含む、方法を提供する。このような方法のうち一部のものは、細胞又は培養培地からプロテアーゼ変異体を単離する工程を更に含む。
【００２６】
本明細書に記載される本発明の態様のうち１つ以上の態様を組み合わせて本発明の他の態様を作製してもよいことは認識されたい。本発明のこれらの態様及び他の態様は当業者にとって明白であろう。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】Ｂ．レンタス（B. lentus）のサブチリシンＧＧ３６の成熟アミノ酸配列、Ｂ．アミロリケファシエンス（B. amyloliquefaciens）のサブチリシンＢＰＮ’の成熟アミノ酸配列、並びにそれぞれＰＸ３、ＰＸ４、及びＰＸ５と表記される本発明の例示的なプロテアーゼ変異体ポリペプチドのアミノ酸配列のアラインメントを示す。
【図２】Ｂ．サブチリス（B. subtilis）発現プラスミドｐＨＰＬＴ−ＧＧ３６のプラスミドマップを提供する。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明は、例えば、限定するものではないが、特に様々なクリーニング用途に好適であり、及び有用である、セリンプロテアーゼ変異体及びサブチリシンプロテアーゼ変異体を包含する、プロテアーゼ変異体を提供する。一態様では、本発明は、本明細書に前述したプロテアーゼ変異体（例えば、サブチリシン変異体）を少なくとも１種含む組成物を包含する。このような組成物のうち一部のものは、洗剤組成物を含む。一態様では、本発明は、バチルス種のサブチリシン変異体及びそのようなサブチリシン変異体を１種以上含む組成物を提供する。本発明は、既知のプロテアーゼに、例えば、既知のセリンプロテアーゼ及び／又はサブチリシンプロテアーゼなどの既知のプロテアーゼと洗浄性能が匹敵するか又はそれよりも洗浄性能が改善された酵素組成物も提供する。
【００２９】
別途記載のない限り、本発明の実施には、分子生物学、微生物学、タンパク質精製、タンパク質工学、タンパク質及びＤＮＡの配列決定、組み換えＤＮＡ分野、並びに工業用途の酵素使用及び開発に一般的に使用される従来の技術が包含され、これらのすべては当該技術分野の範囲内のものである。
【００３０】
更に、本明細書で提供される表題は本発明の様々な態様又は実施形態を制限するものではなく、総じて本明細書において参照として用いられ得るものである。したがって、直下に定義される用語は、総じて本明細書において参照されることでより充分に定義されることになる。それでも尚、本発明に対する理解を容易にさせる目的で、多数の用語に関する定義が以下に提供される。
【００３１】
本明細書において別途記載のない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明の属する技術分野の当業者により一般に理解される意味と同様の意味を持つ。本願に記載されているものと類似した又は等価な多くの方法及び部材は本発明の実施において使用を見出すことができるが、一部の方法及び部材を本明細書に記載する。したがって、直下に定義される用語は、総じて本明細書を参照することでより充分に説明されることになる。また、本明細書で使用するとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」には、特に明示しない限り、複数形も含む。別途記載のない限り、核酸は左から右に向かって５’から３’配向になるように、並びに、アミノ酸配列は、左から右に向かってアミノ基からカルボキシ基という配向になるようにそれぞれ記載される。当業者により使用される状況に基づき、方法論、プロトコル、及び試薬は変化することから、本発明は記載される特定の方法論、プロトコル、及び試薬に制限されるものではないことは理解されるであろう。
【００３２】
本明細書全体を通じて記載されているあらゆる最大数値限定には、それよりも小さいあらゆる数値限定が、そのような小さい数値限定が本明細書に明確に記載されているかのように包含されることが意図される。本明細書全体を通じて記載される最小数値限定は、それより大きいあらゆる数値限定を、そのような大きい数値限定が本明細書に明確に記載されているかのように含む。本明細書全体を通じて記載される数値範囲は、そのようなより広い数値範囲内に入るそれよりも狭いあらゆる数値範囲を、そのようなより狭い数値範囲がすべて本明細書に明確に記載されているかのように含む。
【００３３】
プロテアーゼ（プロテイナーゼとしても既知）は、他のタンパク質を分解する能力を有する酵素タンパク質である。プロテアーゼは、ペプチド鎖又はポリペプチド鎖中のアミノ酸を連結させてタンパク質を形成するペプチド結合を加水分解することで、タンパク質の異化作用を開始する、タンパク質分解を行なうことができる。プロテアーゼの、タンパク質消化酵素としてのこのような活性は、タンパク質分解活性と呼ばれる。タンパク質分解活性の測定に関する多くの周知の手順が存在する（Ｋａｌｉｓｚ，「Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ，」Ｉｎ：Ｆｉｅｃｈｔｅｒ（ｅｄ．）Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，（１９８８））。例えば、タンパク質分解活性は、各プロテアーゼが市販の基質を加水分解する能力を解析する、比較アッセイにより確認することができる。プロテアーゼ活性又はタンパク質分解活性の解析に有用な代表的な基質としては、限定するものではないが、ジメチルカゼイン（Ｓｉｇｍａ  Ｃ−９８０１）、ウシコラーゲン（Ｓｉｇｍａ  Ｃ−９８７９）、ウシエラスチン（Ｓｉｇｍａ  Ｅ−１６２５）、及びウシケラチン（ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ９０２１１１）が挙げられる。これらの基質を用いる比色分析は当該技術分野において周知である（例えば、いずれも参照により本案件に組み込まれる国際公開第９９／３４０１１号及び米国特許第６，３７６，４５０号を参照されたい）。ｐＮＡアッセイ（例えば、Ｄｅｌ  Ｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９９：３１６〜３２０（１９７９）を参照されたい）は、勾配溶離時に回収される画分について活性酵素濃度を測定する際の用途も見出されている。このアッセイは、可溶性の合成基質、スクシニル−アラニン−アラニン−プロリン−フェニルアラニン−ｐ−ニトロアニリド（ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ）を酵素が加水分解した際にｐ−ニトロアニリンが放出される速度を測定する。加水分解反応により黄色味が生じる速度を分光光度計で４１０ｎｍにて測定する。この速度は活性酵素濃度に比例する。加えて、２８０ナノメートル（ｎｍ）での吸光度測定を使用して、合計タンパク質濃度を測定することもできる。活性酵素／合計タンパク質比は酵素の純度も与える。
【００３４】
本明細書で使用するとき、「サブチリシン」及び「サブチリシンプロテアーゼ」は、ペプチダーゼデータベースのＭＥＲＯＰＳ（Ｒａｗｌｉｎｇｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＭＥＲＯＰＳ：ｔｈｅ  ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ｄａｔａｂａｓｅ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３４  Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ，Ｄ２７０〜２７２（２００６））に記載されるようなＳ８セリンプロテアーゼファミリーの任意のメンバーを指す。ＭＥＲＯＰＳに記載されるペプチダーゼファミリーＳ８には、セリンエンドペプチダーゼのサブチリシン及びその相同体が包含される（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２９０：２０５〜２１８（１９９３））。サブチラーゼファミリーとしても既知であるファミリーＳ８は、セリンペプチダーゼファミリーのうち２番目に大きいファミリーである。現在では、Ｓ８ファミリーのうちの幾つかのメンバーの立体構造が決定されている。典型的なＳ８タンパク質の構造は、２層のヘリックス鎖に挟まれた７本鎖のβシート構造の三層から構成される。サブチリシン（Ｓ０８．００１）は、ＳＢ属（ＳＢ）の構造型である。構造が異なるのにも関わらず、サブチリシン及びキモトリプシン（Ｓ０１．００１）の活性部位が重なることは、この類似性が分岐進化ではなく収束進化の結果であることを示唆する。多くのバチルス種は、多量のサブチリシンを分泌する。本明細書で使用するとき、用語「プロテアーゼ変異体（protease variant）」、「プロテアーゼ変異体（variant protease）」、「変異型プロテアーゼ（mutant protease）」、及び「変異型プロテアーゼ（protease mutant）」は、少なくとも１箇所のアミノ酸置換、欠失、又は付加などにより、参照プロテアーゼ（野生型プロテアーゼであり得る）のアミノ酸配列とアミノ酸が少なくとも１個異なる、アミノ酸配列の異なるプロテアーゼに関して互換的に使用される。プロテアーゼ変異体（variant protease）、変異型プロテアーゼ（mutant protease）、又は変異型プロテアーゼ（protease mutant）のタンパク質分解活性は、当業者に周知である手順及び／又は本明細書に記載の手順を用い測定することができる。
【００３５】
本明細書で使用するとき、用語「サブチリシン変異体（variant subtilisin）」、「サブチリシン変異体（subtilisin variant）」、「変異型サブチリシン（mutant subtilisin）」、及び「変異型サブチリシン（subtilisin mutant）」は、少なくとも１箇所のアミノ酸置換、欠失、又は付加などにより、参照サブチリシンプロテアーゼ（野生型サブチリシンプロテアーゼであり得る）のアミノ酸配列とアミノ酸配列が異なる、サブチリシンプロテアーゼに関して互換的に使用される。サブチリシン変異体（subtilisin variant）、サブチリシン変異体（variant subtilisin）、変異型サブチリシン（mutant subtilisin）、又は変異型サブチリシン（subtilisin mutant）のタンパク質分解活性は、当業者に周知である手順及び／又は本明細書に記載の手順を用い測定することができる。
【００３６】
本明細書で使用するとき、「バチルス（Bacillus）」属としては、当業者に既知のバチルス属のすべての種を包含し、限定するものではないが、例えば、Ｂ．サブチリス（B. subtilis）、Ｂ．リケニフォルミス（B. licheniformis）、Ｂ．レンタス（B. lentus）、Ｂ．ブレビス（B. brevis）、Ｂ．ステアロサーモフィルス（B. stearothermophilus）、Ｂ．アルカロフィルス（B. alkalophilus）、Ｂ．アミロリケファシエンス（B. amyloliquefaciens）、Ｂ．クラウシイ（B. clausii）、Ｂ．ハロドュランス（B. halodurans）、Ｂ．メガテリウム（B. megaterium）、Ｂ．コアギュランス（B. coagulans）、Ｂ．サーキュランス（B. circulans）、Ｂ．ロータス（B. lautus）、及びＢ．チューリンゲンシス（B. thuringiensis）が挙げられる。バチルス属は分類上の認識を受け続けるものと認識される。したがって、属には、限定するものではないが、現在「ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Geobacillus stearothermophilus）」と命名されている、バチルス・ステアロサーモフィルス（B. stearothermophilus）などの微生物が包含される種分類を包含することが意図される。酸素の存在下での耐性内生胞子の産生は、バチルス属に定義される特徴であると考慮されるが、この特徴は、近年では名称アリシクロバチルス（Alicyclobacillus）、アンフィバチルス（Amphibacillus）、アネウリニバチルス（Aneurinibacillus）、アノキシバチルス（Anoxybacillus）、ブレビバチルス（Brevibacillus）、フィロバチルス（Filobacillus）、グラシリバチルス（Gracilibacillus）、ハロバチルス（Halobacillus）、パエニバチルス（Paenibacillus）、サリバチルス（Salibacillus）、サーモバチルス（Thermobacillus）、ウレイバチルス（Ureibacillus）、及びビルジバチルス（Virgibacillus）に対しても適用される。
【００３７】
本明細書で互換的に使用される用語「ポリヌクレオチド」及び「核酸」は、ヌクレオチドモノマーが鎖状に共有結合している任意の長さのポリマーを指す。ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）、デオキシリボヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、及びＲＮＡ（リボ核酸）、リボヌクレオチドのポリマーは、異なる生物学的機能を有するポリヌクレオチド又は核酸の例である。ポリヌクレオチド又は核酸としては、限定するものではないが、単鎖、二本鎖、又は三本鎖ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド形成体、又はプリン及びピリミジン塩基を含むポリマー、又は他の天然の、化学的に改変された、生物学的に改変された、非天然の又は誘導体化されたヌクレオチド塩基が挙げられる。次のものはポリヌクレオチドの非限定例である：遺伝子、遺伝子断片、染色体断片、発現配列タグ（ＥＳＴ）、エキソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、リボザイム、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、組み換えポリヌクレオチド、分枝状ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、及びプライマー。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド及びヌクレオチド類似体などの修飾されたヌクレオチド、ウラシル、他の糖、並びにフルオロリボース及びチオエートなどの結合基、並びに分岐ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、ヌクレオチド配列はヌクレオチド配列以外により中断される。
【００３８】
本明細書で使用するとき、用語「ベクター」は、核酸又はポリヌクレオチドを標的細胞又は組織に導入又は移行するために使用される核酸コンストラクト又はポリヌクレオチドコンストラクトを指す。ベクターは、典型的には、外来ＤＮＡを他の細胞又は組織に導入する際に使用される。概してベクターは、導入遺伝子のＤＮＡ配列、及びベクターの「骨格」として機能するより長いポリヌクレオチド配列を含む。典型的には、ベクターは、挿入された導入遺伝子などの遺伝子情報を、標的細胞又は組織で挿入断片が単離、複製、又は発現されるように、標的細胞又は組織に移動させるよう機能する。ベクターとしては、プラスミド、クローニングベクター、バクテリオファージ、ウイルス（例えば、ウイルスベクター）、コスミド、発現ベクター、シャトルベクター、カセット、及びこれに類するものなどが挙げられる。典型的には、ベクターには複製起点、マルチクローニング部位、及び選択マーカーが挙げられる。ベクターを標的細胞に挿入するプロセスは、一般に形質移入と呼ばれる。ウイルスベクターによる細胞の形質移入は、一般に形質導入と呼ばれる。一態様では、本発明には、ＤＮＡ配列を好適なホストで発現させるよう機能し得る好適な配列（例えば、分泌型のシグナルペプチド配列など）に制御可能なように連結される、プロテアーゼ変異体（例えば、前駆型又は成熟型プロテアーゼ変異体）をコードしているＤＮＡ配列を含むベクターが包含される。
【００３９】
本明細書で使用するとき、用語「発現カセット」又は「発現ベクター」は、対象とする核酸（例えば、外来核酸又は導入遺伝子）を標的細胞で発現させるにあたり組み換え的に又は合成的に生成される核酸コンストラクト又はベクターを指す。典型的には、対象とする核酸は、対象とするタンパク質を発現する。発現ベクター又は発現カセットは、典型的には外来核酸の発現を駆動又は促進するプロモーターヌクレオチド配列を含む。また、典型的には発現ベクター又はカセットは、標的細胞で特定の核酸を転写させる他の特異的な核酸配列を包含する。組み換え型発現カセットには、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ウイルス、又は核酸断片を組み込むことができる。一部の発現ベクターは、宿主細胞に非相同的なＤＮＡ断片を組み込み、発現させることができる。多くの原核生物発現ベクター及び真核生物発現ベクターが市販されている。適切な発現ベクターは、当業者の知識の範囲内で選択される。発現ベクターに組み込まれた核酸配列からタンパク質を発現させるのに適切な発現ベクターの選択は、当業者の知識の範囲内のものである。
【００４０】
ＤＮＡコンストラクトは、標的細胞又は組織に導入することのできる、人工的に構築された核酸断片である。一般的には、ＤＮＡコンストラクトは、対象とするタンパク質をコードしているヌクレオチド配列を含む、ベクターにサブクローニングされたＤＮＡの挿入断片を含む。ベクターは、バクテリア中での増殖に関係するバクテリア由来の耐性遺伝子、並びに対象とするタンパク質を微生物で発現させるためのプロモーターを含有し得る。ＤＮＡはＰＣＲによりインビトロで生成されるか、あるいは当業者に既知である任意の他の好適な技術により生成される。一部の実施形態では、ＤＮＡコンストラクトは対象とする核酸配列を含む。一部の実施形態では、配列は、制御配列（例えば、プロモータなど）などの追加の配列に制御可能なように連結される。ＤＮＡコンストラクトは、更に選択マーカーを含んでもよく、及びホメオボックスに隣接する組み込み配列を更に含んでもよい。コンストラクトは、他の相同性ではない配列を末端に組み込んで含んでもよい（例えば、スタッファー配列（stuffer sequences）又は隣接配列）。一部の実施形態では、配列末端は、ＤＮＡコンストラクトが閉環を形成するよう閉じられる。当業者に周知である技術を用いＤＮＡコンストラクトに組み込まれる、対象とする核酸配列は、野生型、変異型、又は修飾型核酸であり得る。一部の実施形態では、ＤＮＡコンストラクトは、宿主細胞染色体と配列相同性である核酸を１種以上含む。他の実施形態においては、ＤＮＡコンストラクトは、非相同的なヌクレオチド配列を１種以上含む。ＤＮＡコンストラクトをインビトロで組み換えたなら、例えば：１）非相同配列を宿主細胞の所望の標的配列に挿入する工程；及び／又は２）宿主細胞の染色体領域に変異を導入する工程（すなわち、非相同配列により内在性配列を置き換える工程）；３）標的遺伝子を欠失させる工程；及び／又は４）複製プラスミドを宿主に導入する工程；に使用することもできる。「ＤＮＡコンストラクト」は、本明細書において「発現カセット」と互換可能に使用される。
【００４１】
本明細書で使用するとき、「プラスミド」は、染色体ＤＮＡとは独立して複製することのできる染色体外のＤＮＡ分子を指す。プラスミドは二本鎖（ｄｓ）であり、及び環状であってもよく、典型的にはクローニングベクターとして使用される。
【００４２】
本明細書で使用するとき、核酸配列を細胞に導入する文脈において、用語「導入」は、核酸配列を細胞に移入させるのに好適な任意の方法を指す。導入に関する方法としては、限定するものではないが、プロトプラストの融合、形質移入、形質転換、電気穿孔法、接合、及び形質導入が挙げられる（例えば、Ｆｅｒｒａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，」ｉｎ  Ｈａｒｄｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．，ｐｐ．５７〜７２（１９８９）を参照されたい）。
【００４３】
形質転換は、遺伝子材料（例えば、ＤＮＡ）の取り込み、遺伝的組み込み、及び発現により細胞に生じる遺伝的な変更を指す。
【００４４】
本明細書で使用するとき、核酸は、他の核酸配列と機能的に関係があるよう配置された場合、他の核酸配列に「操作可能に連結」される。例えば、プロモーターがコード配列の転写に影響を与える場合、プロモーター又はエンハンサーは、ヌクレオチドコード配列に制御可能なように連結される。コード配列の翻訳が促進されるような位置に配置される場合、リボソーム結合部位は、コード配列に制御可能なように連結されてもよい。通常、「操作可能なように連結された」ＤＮＡ配列は連続的な配列である。しかしながら、エンハンサーは隣接していなくてもよい。都合の良い制限部位にてライゲーションすることで連結することができる。このような部位が存在しない場合、従来技術に従い合成オリゴヌクレオチドアダプタ又はリンカーを使用してもよい。
【００４５】
本明細書で使用するとき、用語「遺伝子」は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡセグメント）を指し、コード領域の前及び後に続く領域、並びにそれぞれのコード配列（エキソン）の間に存在する介在配列（イントロン）を包含する。
【００４６】
本明細書で使用するとき、「組み換え」が細胞に関し使用される場合、典型的には、非相同な核酸配列の導入により細胞が改質されていることを、あるいは細胞から誘導された細胞が改質されていることを意味する。例えば、組み換え細胞は、同一形態のものがネイティブ（非組み換え）形態の細胞では見られない遺伝子を含む場合があり、又は組み換え細胞は、ネイティブな遺伝子（ネイティブ形態の細胞で見られる遺伝子）ではあるが、改変されており細胞に再導入された遺伝子を含んでもよい。組み換え細胞は、細胞から核酸を移動させることなく改変された、細胞内在性の核酸を含む場合もあり、このような改変としては、遺伝子置換、部位特異的変異導入、及び当業者に既知の関連技術により得られる改変が挙げられる。組み換えＤＮＡ技術には、インビトロでの組み換えＤＮＡ産生技術、並びに組み換えＤＮＡ移動技術が包含され、ここで、これは発現又は増殖することができ、これにより組み換えポリペプチドを産生できる。ポリヌクレオチド又は核酸に関し、「組み換え（Recombination）」、「組み換える（recombining）」及び「組み換えられた（recombined）」は、概して、２つ以上の核酸若しくはポリヌクレオチド鎖若しくは断片を組み立て、又は組み合わせることで、新しいポリヌクレオチド又は核酸を生成することを指す。組み換えポリヌクレオチド又は核酸は、しばしばキメラ体と呼ばれる。核酸又はポリペプチドは、人工的なもの又は設計されたものである場合、あるいは人工的な又は設計されたタンパク質又は核酸から誘導される場合「組み換え体」である。
【００４７】
本明細書で使用するとき、用語核酸又は遺伝子「増幅」は、増幅させた核酸又は遺伝子が、開始時にゲノム中に存在していたコピー数よりもより多くのコピー数で存在する様になるように、特異的なＤＮＡ配列を不均一に複製させるプロセスを指す。一部の実施形態では、薬剤（例えば、阻害され得る酵素に関する阻害剤）の存在下で増殖させることによる細胞選別の結果、薬剤の存在下での増殖に必要とされる遺伝子産物をコードしている内在性遺伝子が複製されるか、あるいは核酸又は遺伝子産物又は両方をコードしている外因性の（即ち、導入）配列が増幅されることになる。
【００４８】
「増幅」は、核酸複製の特殊例であり、テンプレート特異性を包含する。非テンプレート特異的な複製（すなわち、複製はテンプレートに依存するものの、特定のテンプレートによるものではない）と対照的である。ここでは、テンプレート特異性は、複製の忠実度（すなわち、適切なポリヌクレオチド配列の合成度）及びヌクレオチド（リボ又はデオキシリボヌクレオチド）特異性により識別される。テンプレート特異性は、しばしば「標的」特異性に関し記載される。標的配列は、探索され他の核酸から選別されるという観点から、「標的」である。主にこの探索のために増幅技術が設計されてきた。
【００４９】
本明細書で使用するとき、用語「プライマー」は、制限消化断片の精製物として天然由来で生じるか又は合成的に生成されるかのいずれかの、核酸鎖に対して相補的であるプライマー伸長産物の合成が誘導される条件（すなわち、ヌクレオチド及びＤＮＡポリメラーゼなどの誘導剤の存在下で、かつ好適な温度及びｐＨ）下に置かれた場合に、合成の開始点として機能することができるオリゴヌクレオチド（ヌクレオチド残基のポリマー）を指す。好ましくはプライマーは増幅効率を最大にするために単鎖であるが、あるいは、二本鎖であってもよい。二本鎖の場合、プライマーは、伸長産物を調製するために使用される前に、その鎖を単離するように最初に処理される。一態様では、プライマーはオリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーは、誘導剤の存在下において、伸長産物の合成を開始するのに十分に長くなければならない。プライマーの正確な長さは、温度、プライマー源、及び使用方法などの様々な要因により異なる。
【００５０】
本明細書で使用するとき、用語「プローブ」は、精製された制限酵素消化断片として天然に生じるか又は組み換え的に若しくはＰＣＲ増幅により合成的に産生されるかのいずれかの、オリゴヌクレオチドを指し、典型的には、対象とする他のオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成することができる。プローブは一本鎖であっても二本鎖であってもよい。プローブは、特定の遺伝子配列の検出、識別、及び単離に有用である。本発明で使用される任意のプローブが、限定するものではないが酵素（例えば、ＥＬＩＳＡ、並びに酵素を用いる組織化学アッセイ）、蛍光、放射活性、及び発光系などの任意の検出系で検出され得るように、任意の「リポーター分子」によりプローブを標識することが想到される。本発明は、任意の特定の検出系又は標識に制限されることを意図しない。
【００５１】
本明細書で使用するとき、用語「標的」は、ポリメラーゼ連鎖反応に関し使用する場合、ポリメラーゼ連鎖反応に使用されるプライマーにより結合される核酸領域を指す。したがって、「標的」は他の核酸配列から探索され、選別される。ヌクレオチド「断片」は、標的とする核酸配列内部の核酸領域である。
【００５２】
本明細書で使用するとき、用語「ポリメラーゼ連鎖反応」（ＰＣＲ）は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号、及び同第４，９６５，１８８号の方法を指し、クローニング又は精製せずにゲノムＤＮＡ混合物中の標的配列断片の濃度を増加させる方法を包含する。この標的配列の増幅プロセスは当業者に周知である。
【００５３】
本明細書で使用するとき、用語「増幅剤」は、プライマー、核酸テンプレート、及び増幅酵素を除く、増幅に必要とされる試薬を指す（例えば、デオキシリボヌクレオチド三リン酸、緩衝液など）。通常、増幅剤は他の反応成分と共に反応容器（試験管、マイクロウェルなど）に配置され、収容される。
【００５４】
本明細書で使用するとき、用語「制限エンドヌクレアーゼ」又は「制限酵素」は、制限部位として既知である、ヌクレオチドに特異的な配列に又は配列近傍に存在する二本鎖又は一本鎖ＤＮＡを切断することのできる酵素（例えば、細菌性酵素）を指す。制限部位を含むヌクレオチド配列は、所定の制限エンドヌクレアーゼすなわち制限酵素により認識及び切断され、しばしばＤＮＡ断片の挿入部位になる。制限部位は、発現ベクター又はＤＮＡコンストラクト中に設計することができる。
【００５５】
「相同組み換え」は、２つのＤＮＡ分子間、又は同一の若しくはほとんど同一のヌクレオチド配列部位で対となった染色体間で生じる、ＤＮＡ断片の交換を指す。一部の実施形態では、染色体の組み込みは相同組み換えである。
【００５６】
核酸又はポリヌクレオチドが、ネイティブなポリペプチドを、又は当業者に既知の手法により操作されたポリペプチドを「コードしている」と記載される場合、このような核酸又はポリヌクレオチドは、転写及び／又は翻訳によりポリペプチド又はそれらの断片を産生できる。このような核酸のアンチセンス鎖も、同様に配列をコードすると記載される。
【００５７】
当該技術分野において既知であるように、ＤＮＡ配列をＲＮＡポリメラーゼにより転写することでＲＮＡ配列を産生できるが、ＲＮＡ配列を逆転写酵素により逆転写することでＤＮＡ配列を産生することもできる。
【００５８】
「宿主株」又は「宿主細胞」は、対象とするＤＮＡ配列を含む発現ベクターにとって好適な宿主を指す。対象とするＤＮＡ配列は、対象とするタンパク質を宿主株又は宿主細胞で発現することができる。
【００５９】
「タンパク質」又は「ポリペプチド」は、アミノ酸残基のポリマー配列を含む。用語「タンパク質」及び「ポリペプチド」は、本明細書で互換可能に使用される。ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｊｏｉｎｔ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ（ＪＣＢＮ）に従い定義されるようなアミノ酸の三文字表記を本開示を通して使用する。遺伝子暗号の縮重に起因し、ポリペプチドは１種以上のヌクレオチド配列によりコードされる場合があることも理解されたい。
【００６０】
「プロ配列」又は「プロペプチド配列」は、シグナルペプチド配列及び成熟プロテアーゼ配列の間に存在し、プロテアーゼの分泌に必要とされるアミノ酸配列を指す。プロ配列又はプロペプチド配列の開裂により、活性な成熟型プロテアーゼが生じる。
【００６１】
用語「シグナル配列」又は「シグナルペプチド」は、成熟型又は前駆型タンパク質の分泌又は直接的な輸送に参加し得るアミノ酸残基の配列を指す。シグナル配列は、典型的には、前駆型又は成熟型タンパク質配列に対しＮ末端に位置する。シグナル配列は内在性のものであっても外来性であってもよい。外来性シグナル配列の一実施例は、バチルス・レンタス（Bacillus lentus）（ＡＴＣＣ  ２１５３６）由来のサブチリシンのシグナル配列の残部に融合させた、バチルス・スブチルスのサブチリシン由来の、７個のアミノ酸残基を含む第一シグナル配列を含む。シグナル配列は通常では成熟タンパク質には含まれない。シグナル配列は、典型的には、タンパク質の輸送後にシグナルペプチダーゼによりタンパク質から切断される。
【００６２】
用語「ハイブリッド型シグナル配列（hybrid signal sequence）」は、発現させる遺伝子に関するシグナル配列と融合させた発現宿主から配列の一部が得られる、シグナル配列を指す。一部の実施形態では、合成配列が用いられる。
【００６３】
用語、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドの「成熟」形態は、シグナルペプチド配列及びプロペプチド配列を含まない、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドの機能形態を指す。
【００６４】
用語「前駆体」タンパク質又はペプチドは、タンパク質のアミノ末端又はカルボニル末端に制御可能なように連結されたプロ配列を有している、成熟型タンパク質を指す。前駆体は、プロ配列のアミノ末端に、制御可能なように連結された「シグナル」配列を有する場合もある。前駆体は、翻訳後活性に関与する追加のポリヌクレオチド（例えば、前駆体からこのポリヌクレオチドが切断されると、成熟型のタンパク質又はペプチドが得られる）を有する場合もある。
【００６５】
アミノ酸配列又は核酸配列に関して、用語「野生型」は、アミノ酸配列又は核酸配列がネイティブであるか、又は天然に生じた配列であることを意味する。
【００６６】
本明細書でアミノ酸残基の位置に関して使用するとき、用語「対応する（「corresponding to」又は「corresponds to」又は「corresponds」）」は、タンパク質又はペプチド中の数え上げられた位置のアミノ酸残基、あるいはタンパク質又はペプチド中の数え上げられた残基に対して類似、相同、又は等価であるアミノ酸残基を指す。本明細書で使用するとき、用語「対応する領域」は、概して、関連するタンパク質又は参照タンパク質中の類似する位置を指す。
【００６７】
用語「から誘導される」及び「から得られる」は、対象とする生物株により産生されるあるいは産生され得るプロテアーゼだけでなく、このような株から単離されるＤＮＡ配列によりコードされるプロテアーゼ、及びこのようなＤＮＡ配列を含有している宿主生物で産生されるプロテアーゼも指す。更にこれらの用語は、合成ＤＮＡ配列及び／又はｃＤＮＡ由来のＤＮＡ配列によりコードされ、かつ対象とするプロテアーゼと同一の特徴を有する、プロテアーゼを指す。例示すると、「バチルスから誘導されるプロテアーゼ」は、バチルスにより天然に産生された、タンパク質分解活性を有する酵素、並びにバチルス供給源により産生されるが、遺伝子工学技術の使用を介して、セリンプロテアーゼをコードしている核酸でバチルスではない生物を形質転換することにより産生される、セリンプロテアーゼ様の酵素を指す。
【００６８】
２つの核酸又はポリペプチド配列の文脈において、用語「同一」は、以下の配列比較又は解析アルゴリズムのうちの１つを用いて評価する際に、最も一致するようにアライメントしたときに、２つの配列中の残基が同じものであることを意味する。
【００６９】
本明細書で使用するとき、用語「相同の遺伝子」は、互いに対応し、かつ同一であるか又は互いに非常に類似している、異なるが通常は関連する種由来の遺伝子のペアを指す。用語は、種分化（すなわち、新種の発生）により分離される遺伝子（例えば、オルソロガス遺伝子）、並びに遺伝子複製により分離されている遺伝子（例えば、パラロガス遺伝子）を包含する。
【００７０】
本明細書で使用するとき、用語「相同性」は、配列の類似性又は同一性を指し、同一性を指す方が好ましい。相同性は当該技術分野において既知の標準法により判定することができる（例えば、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）；Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４（１９８８）；Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡなどのソフトウェアプログラム；並びにＤｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１２：３８７〜３９５（１９８４）を参照されたい）。有用なアルゴリズムの一例はＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、累進ペアワイズアライメントを用いて、関連する配列群から複数の配列アライメントを作製する。このアルゴリズムは、アライメントを作製するために使用されるクラスタの関係性を示す、樹形図をプロットすることもできる。ＰＩＬＥＵＰは、Ｆｅｎｇ  ａｎｄ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅの累進アライメント法を単純化したものを使用する（Ｆｅｎｇ  ａｎｄ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３５：３５１〜３６０（１９８７）を参照されたい）。この方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐにより記載されるものと類似のものである（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１〜１５３（１９８９））を参照されたい。有用なＰＩＬＥＵＰパラメーターは、デフォルトのギャップ・ウェイト：３．００、デフォルトのギャップ長・ウェイト：０．１０、及びエンド・ギャップのウェイト化を含む。他の有用なアルゴリズムの例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０，（１９９０）；並びにＫａｒｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３〜５７８７（１９９３））により記載されるＢＬＡＳＴアルゴリズムである。特に有用なＢＬＡＳＴプログラムは、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２プログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：４６０〜４８０（１９９６））である。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２は、いくつかの検索パラメーターを用いる。このパラメーターのほとんどにデフォルト値を設定する。調節可能なパラメーターは、以下の値に設定する：ｏｖｅｒｌａｐ  ｓｐａｎ＝１、ｏｖｅｒｌａｐ  ｆｒａｃｔｉｏｎ＝０．１２５、ｗｏｒｄ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ（Ｔ）＝１１。ＨＳＰ  Ｓ及びＨＳＰ  Ｓ２パラメーターは、動的な値であり、検索される対象となる配列に対し、特定のデータベースの特定の配列及び組成物の組成に基づきプログラム自体によって制定される。しかしながら、値は感度が上昇するよう調整することができる。
【００７１】
参照配列と対象とする試験配列との配列同一性は、当業者により用意に判定することができる。ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列により共有される同一性は、配列をアライメントし、当該技術分野において既知の方法により同一性を判定することによって分子間での配列情報を直接比較することにより、判定される。配列類似性を判断するのに好適なアルゴリズムの例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムである。このアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０（１９９０）に記載されている。ＢＬＡＳＴ解析を実行するためのソフトウェアは、米国国立生物工学情報センター（the National Center for Biotechnology Information）により公開されている。このアルゴリズムは、まず始めに、データベース配列中の同じ長さのワードとアライメントさせた場合に、クエリー配列中の、何らかの正に値付けされた閾値スコアＴと一致するか又は基準を満たす長さＷの短い配列を同定することで、ＨＳＰ（high scoring sequence pairs）を同定することを包含する。これらの最初に隣接するワードは、ヒットすると、それらのワードを含有しているより長いＨＳＰを発見するための開始点として機能する。ワードのヒットは、累積アライメントスコアが増加し得る限り、比較される２つの配列の各々の両方向に向かって進められる。ヒットするワードの延長は、累積アライメントスコアが、得られる最大の値から、数量Ｘだけ落ち込んだ場合、累積スコアが０以下になった場合、又はいずれかの配列が末端に達した場合に停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ、及びＸは、アライメントの感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）：１１、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ＆  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５，（１９９２）を参照されたい）アラインメント（Ｂ）：５０、期待値（Ｅ）：１０、Ｍ’５、Ｎ’−４、及び両鎖の比較を使用する。
【００７２】
次に、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは２つの配列間の類似性について統計解析を実施する（例えば、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３〜５７８７，（１９９３）を参照されたい）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の測定法のうちの１つは、偶然に生じ得る２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列間の一致による見込みを識別する、最小合計類似度（smallest sum probability）（Ｐ（Ｎ））である。例えば、試験核酸をセリンプロテアーゼの核酸と比較した際の最小合計類似度が、約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、及び最も好ましくは約０．００１未満である場合、核酸は本発明のセリンプロテアーゼ核酸と類似していると考えられる。セリンプロテアーゼポリペプチドをコードしている試験核酸は、最小合計類似度の比較結果が約０．５未満、及びより好ましくは約０．２未満である場合に、特定のセリンプロテアーゼ核酸と類似していると考えられる。
【００７３】
２つ以上の核酸又はポリペプチド配列についての文脈において、「同一性（percent identical又はpercent identity）」は、２つ以上の配列を最も一致するように比較及びアライメントし、配列比較アルゴリズムを用いて又は目視検査を用いて判定したときに、２つ以上の配列が、同一であるか、あるいは核酸残基又はアミノ酸残基と、表記される割合で同一であることを指すものである。参照（すなわち、クエリー）アミノ酸配列に対する、対象とするアミノ酸配列の、「配列同一性」又は「同一性（％）」又は「配列同一性（％）」又は「アミノ酸配列同一性」は、対象とするアミノ酸配列が、配列を最適にアライメントした際の比較長さにわたってクエリーアミノ酸配列に対して表記される割合（すなわち、アミノ酸とアミノ酸を並べたときの同一度）だけ同一であることを意味する。したがって、２つのアミノ酸配列に対するアミノ酸配列同一性８０％又は同一性８０％は、最適にアライメントした２つのアミノ酸配列中のアミノ酸残基のうち８０％が同一であることを意味する。
【００７４】
参照（すなわち、クエリー）核酸配列に対する、対象とする核酸配列の、「配列同一性」又は「同一性（％）」又は「配列同一性（％）」又は「核酸配列同一性（％）」は、対象とする核酸配列が、配列を最適にアライメントした際の比較長さにわたってクエリー配列に対して表記される割合（すなわち、ヌクレオチドとヌクレオチドを並べたときの同一度）だけ同一であることを意味する。したがって、２つの核酸配列に対するヌクレオチド配列同一性８０％又は同一性８０％は、最適にアライメントした２つの核酸配列中のヌクレオチド残基のうち８０％が同一であることを意味する。
【００７５】
一態様では、クエリー配列に対する対象とする配列の「配列同一性又は配列同一性（％）」、又は「同一性（％）」は、２つの配列を最適にアライメントし、比較長さにわたって、２つの最適にアライメントした配列を比較することで、算出することができる。最適なアライメントにおいて、両方の配列の残基が一致している位置の数は、一致する位置の数を求め、一致する位置の数を比較長さ（別途記載のない限り、クエリー配列の長さである）のうちの位置の合計数で除することで決定される。得られる数に１００を乗じることで、クエリー配列に対する対象とする配列の配列同一性を算出する。
【００７６】
「最適なアライメント」又は「最適にアライメントされた」は、最も高い同一性のスコアを与える、２つ（又は２つ以上）の配列のアライメントを指す。例えば、２つのタンパク質配列の最適なアライメントは、各配列中の同一のアミノ酸残基が最多数アライメントされるように、配列を手動でアライメントさせることで、あるいはソフトウェアプログラム又は本明細書に記載の若しくは当該技術分野において既知の手順を用いることで、達成することができる。例えば、２つの核酸配列の最適なアライメントは、各配列中の同一のヌクレオチド残基が最多数アライメントされるように、配列を手動でアライメントさせることで、あるいはソフトウェアプログラム又は本明細書に記載の若しくは当該技術分野において既知の手順を用いることで、達成することができる。
【００７７】
一態様では、２つのポリペプチド配列は、配列対に関し可能性のある最も高い類似性スコアが得られるように、定義されたアミノ酸置換行列、ギャップ開始ペナルティ（ギャップオープンペナルティとも呼ばれる）、及びギャップ伸長ペナルティなどの定義されたパラメーターを用いてアライメントされたときに、「最適にアライメントされた」と見なされる。ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９（２２）：１０９１５（１９９２））は、多くの場合、ポリペプチド配列のアラインメントアルゴリズム（ＢＬＡＳＴＰなど）において、デフォルトのスコアリング置換マトリックス（scoring substitution matrix）として使用される。アライメントされた配列のうちの一方に導入された単独のアミノ酸ギャップに対し、ギャップ開始ペナルティが課せられ、ギャップの各残基位置に対しギャップ伸長ペナルティが課せられる。採用される例示的なアライメントパラメーターは：ＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列、ギャップ開始ペナルティ＝１１、及びギャップ伸長ペナルティ＝１である。アライメントスコアは、アラインメントが開始及び終了する（例えば、アライメント・ウインドウ）各配列のアミノ酸位置によって、及び、最も高い類似性スコアが得られるように、配列の他方又は両方に１つ以上のギャップを挿入することによっても、決定される。
【００７８】
２つ以上の配列同士の最適なアラインメントは、目視確認により、又は限定するものではないが、例えば、アミノ酸配列に関してはＢＬＡＳＴＰプログラム、及び核酸配列に関してはＢＬＡＳＴＮプログラムなどのようにコンピュータを用いることにより、手動で判定することができる（例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９〜３４０２（１９９７）；同様にＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）ウェブサイトを参照されたい）。
【００７９】
対象とするポリペプチドは、対象とするポリペプチドが、参照ポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は少なくとも約９９．５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む場合、参照ポリペプチドと「実質的に同一」であるものとして参照される。２つのこのようなポリペプチド間の同一性（％）は、最適に整列された２つのポリペプチド配列を目視確認することにより、又は標準的なパラメーターを用いるソフトウェアプログラム又はアルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ、ＣＬＵＳＴＡＬ）を使用することで、手入力で判定することができる。２つのポリペプチドが実質的に同一であることの１つの指標としては、第１ポリペプチドが、第２ポリペプチドと免疫的に交差反応性であることが挙げられる。典型的には、保存的なアミノ酸置換により異なるポリペプチドは、免疫学的に交差反応性である。したがって、例えば、２つのペプチドが、保存的なアミノ酸置換のみ、又は１つ以上の保存的なアミノ酸置換のみで異なっている場合、このポリペプチドは第２ポリペプチドと実質的に同一である。
【００８０】
対象とする核酸は、対象とする核酸が、参照核酸のヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は少なくとも約９９．５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む場合、参照核酸と「実質的に同一」であるものとして参照される。２つのこのような核酸間の同一性（％）は、最適に整列された２つの核酸配列を目視確認することにより、又は標準的なパラメーターを用いるソフトウェアプログラム又はアルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ、ＣＬＵＳＴＡＬ）を使用することで、手入力で判定することができる。厳密な条件下（例えば、中程度に厳密〜非常に厳密という範囲）で、２つの核酸分子が互いにハイブリッド形成することは、核酸配列が実質的に同一であることの１つの指標になる。中程度に厳密な条件〜非常に厳密な条件下、又は最も厳密な条件下で、配列番号９、配列番号１０、又は配列番号１１のポリヌクレオチド配列とハイブリッド形成させることのできるポリヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされるプロテアーゼ変異体は、それぞれ配列番号６、配列番号７、又は配列番号８のうちの任意のポリペプチド配列を有するプロテアーゼ変異体と「等価」であると見なすことができる。
【００８１】
核酸又はポリヌクレオチドは、他の成分（例えば、限定するものではないが、他のタンパク質、核酸、細胞など）から一部又は完全に分離された場合に「単離」されたことになる。同様に、ポリペプチド、タンパク質又はペプチドは、他の成分（例えば、限定するものではないが、他のタンパク質、核酸、細胞など）から一部又は完全に分離された場合に「単離」されたことになる。単離された種は、組成物中の他の種よりもモルベースで豊富に含まれる。例えば、単離種は、存在するすべての高分子種のうち、少なくとも約５０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（モルベース）を構成する。好ましくは、対象種は、本質的に均一に精製される（すなわち、従来の検出方法により組成物への他種の混入が検出されることはない）。純度及び均一度は、タンパク質又は核酸試料をアガロース又はポリアクリルアミドゲル電気泳動後に染色により可視化するなどの、当業者に周知である数多くの手法を用い測定することができる。必要に応じて、高解像度の技術、例えば高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）又は同様の手法を用いて材料を精製することができる。
【００８２】
核酸又はポリペプチドに使用される場合、用語「精製した」は、概して、当業者に周知の解析技術により測定した場合に、核酸又はポリペプチドが他の成分を本質的に含まないことを意味する（例えば、精製ポリペプチド又はポリヌクレオチドは、電気泳動ゲルで、クロマトグラフィーによる溶出で、及び／又は密度勾配遠心分離にかけた媒質中で、別個のバンドを形成する）。例えば、電気泳動ゲルで本質的に１本のバンドのみが生じる核酸又はポリペプチドは、「精製されている」。精製された核酸又はポリペプチドは、少なくとも純度約５０％であり、通常、少なくとも純度約７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、又は９９．８％以上である（例えば、モルベースの重量％で）。これに関連し、本発明は、本発明の１種以上のポリペプチド又はポリヌクレオチドなどの、本発明に関する１種以上の分子について組成物を濃縮する方法を提供する。精製又は濃縮技術の適用後に分子の濃度が実質的に上昇している場合、この組成物はその分子について濃縮されている。本発明の、実質的に純粋なポリペプチド又はポリヌクレオチド（例えば、それぞれ、本発明のプロテアーゼ変異体をコードしている実質的に純粋なプロテアーゼ変異体又はポリヌクレオチド）は、通常、特定の組成物中で、すべての高分子種の少なくとも約５５重量％、６０重量％、７０重量％、８０重量％、８５重量％、９０重量％、９１重量％、９２重量％、９３重量％、９４重量％、９５重量％、９６重量％、９７重量％、９８重量％、９９重量％又は９９．５重量％以上（モルベースで）を構成する。
【００８３】
これに関連し、本発明は、本発明に関する１種以上のポリペプチド（例えば、本発明に関する１種以上のプロテアーゼ変異体）、あるいは本発明に関する１種以上の核酸（例えば、本発明に関する１種以上のプロテアーゼ変異体をコードしている１種以上の核酸）などといった、本発明に関する１種以上の分子について組成物を濃縮する方法を提供する。精製又は濃縮技術の適用後に分子の濃度が実質的に上昇している場合、この組成物はその分子について濃縮されている。実質的に純粋なポリペプチド又はポリヌクレオチドは、通常、特定の組成物中で、すべての高分子種の少なくとも約５５重量％、６０重量％、７０重量％、８０重量％、８５重量％、９０重量％、９１重量％、９２重量％、９３重量％、９４重量％、９５重量％、９６重量％、９７重量％、９８重量％、９９重量％又は９９．５重量％以上（モルベースで）を構成する。
【００８４】
本明細書で使用するとき、用語「コンビナトリアルな変異導入」は、参照核酸配列の核酸変異体に関するライブラリを作製する方法を指す。これらのライブラリでは、変異体は所定の変異組から選択された１つ以上の変異を含有している。この方法は、所定の変異組のメンバーではないランダム変異を導入する手段も提供する。このような手法のうちのいくつかのものは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，５８２，９１４号に記載されている。このようなコンビナトリアルな変異導入法のうちのいくつかのものは、市販のキット（例えば、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）多部位特異的変異導入キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））で具現されている方法を包含する。
【００８５】
本明細書で使用するとき、プロテアーゼ変異体と関連させて使用される「改良された特性を有する」は、対応する参照プロテアーゼ（例えば、野生型又は天然に生じるプロテアーゼ）と比較した場合に、プロテアーゼ変異体が改良されていること、すなわち洗浄性能若しくはクリーニング性能が強化されていること、及び／又は場合により洗浄又はクリーニング性能は保持されたまま安定性が改良されていること若しくは強化されていることを意味する。プロテアーゼ変異体の特性の改良には、洗浄又はクリーニング性能の改良及び／又は安定性の改良が含まれ得る。一態様では、本発明は、次の特性：参照プロテアーゼ（例えば、野生型サブチリシンなどの野生型プロテアーゼ）と比較した場合に、手洗い性能の改良、食器手洗い若しくは手動洗浄性能の改良、自動食器洗浄性能の改良、洗濯性能の改良、及び／又は安定性の改良のうち１つ以上を呈する、本発明に関するプロテアーゼ変異体を提供する。
【００８６】
本明細書で使用するとき、用語「機能アッセイ」は、タンパク質活性の指標を提供するアッセイを指す。一部の実施形態では、この用語は、タンパク質が通常の性能で機能できるかに関して解析されるアッセイ系を指す。例えば、酵素の場合、機能アッセイは反応触媒時の酵素の効力を判定することを包含する。
【００８７】
本明細書で使用するとき、用語「標的特性」は、開始遺伝子から変更されることになる特性を指す。本発明が、任意の特定の標的特性に制限されることは意図しない。しかしながら、一部の実施形態では、標的特性は遺伝子産物の安定性（例えば、変性、タンパク質分解性又は他の分解要因に対する抵抗性）である一方、他の実施形態では、産生宿主による産生レベルが変更される。
【００８８】
本明細書で使用するとき、用語「特性」又はそれらの文法的に等価な表現は、核酸に関する文脈において、選別又は検出が可能な核酸の任意の特性若しくは属性を指す。これらの特性としては、限定するものではないが、ポリペプチドに対する結合性に影響する特性、特定の核酸を含む細胞に与えられた特性、遺伝子の転写に影響を与える特性（例えば、プロモーター強度、プロモーター認識、プロモーター制御、エンハンサー機能）、ＲＮＡのプロセシング（例えば、ＲＮＡスプライシング、ＲＮＡ安定性、ＲＮＡ認識、及び転写後修飾）に影響を与える特性、翻訳に影響を与える特性（例えば、強度、制御、リボソームタンパク質に対するｍＲＮＡの結合、翻訳後修飾）が挙げられる。例えば、核酸の、転写因子、ポリメラーゼ、制御因子などの結合部位を変更させることで、所望の特性を生成すること、又は所望されない特性を確認することができる。
【００８９】
本明細書で使用するとき、用語「特性」又はそれらの文法的に等価な表現は、ポリペプチド（タンパク質を包含する）に関する文脈において、選別又は検出が可能なポリペプチドの任意の特性若しくは属性を指す。これらの特性としては、限定するものではないが、酸化安定性、基質特異性、触媒活性、酵素活性、熱安定性、アルカリ安定性、ｐＨ活性プロファイル、タンパク質分解耐性、ＫＭ、ｋｃａｔ、ｋｃａｔ／ｋＭ比、タンパク質フォールディング、免疫応答の誘導、リガンドに対する結合能、受容体に対する結合能、分泌され得るか否か、細胞の表面に提示され得るか否か、多量体化し得るか否か、シグナル伝達し得るか否か、細胞の増殖を阻害し得るか否か、アポトーシスを誘導し得るか否か、リン酸化又はグリコシル化により修飾され得るか否か、及び／又は病気を処置し得るか否かなどが挙げられる。
【００９０】
本明細書で使用するとき、用語「スクリーニング」は、当該技術分野で通常使用される意味を有する。スクリーニングプロセスの一実施例では、変異型核酸、又はこの核酸にコードされているポリペプチド変異体が提供され、変異型核酸又は変異型ポリペプチドの特性はそれぞれ評価され、又は測定される。変異型核酸又は変異型ポリペプチドの特性は、測定後にそれぞれ対応する前駆体（親）核酸又は対応する親ポリペプチドの特性と比較することもできる。
【００９１】
開始材料の特性に応じて、特性の変更された核酸又はタンパク質を得る際のスクリーニング手順は当事者には明白であろう。このような変異型核酸の生成により、開始材料の改変が促進されることが意図される。したがって、当事者は、本発明が、スクリーニングされる任意の特定の特性に制限されるものではなく、以下の特性に関する記載は、例示目的のみで掲載されるものであることを認識する。任意の特定の特性に関するスクリーニング方法は、一般的に当該技術分野で記載されているものである。例えば、ある方法では、変異の前後の結合性、ｐＨ、特異性などを測定することができる。変化は変更を示す。好ましくは、スクリーニングは、複数の試料を同時にスクリーニングする、例えば、限定するものではないが、チップを利用するアッセイ、ファージディスプレイ、並びに複数の基質及び／又は指示薬を包含する、高スループットな方式で実施される。
【００９２】
本明細書で使用するとき、一部の実施形態では、スクリーニングプロセスは、対象とする変異体を変異体集団から濃縮する選別工程を一工程以上包含する。これらの実施形態の例としては、宿主生物に増殖優位性を与える変異体の選別、並びにファージディスプレイ又は任意の他のディスプレイ法が挙げられる。ディスプレイ法では、変異体の結合特性又は触媒特性に基づき、変異体を変異体集団から捕捉することができる。一部の実施形態では、変異体ライブラリはストレス（熱、プロテアーゼ、変性）にさらされ、続いてインタクトなままの変異体がスクリーニングにより識別され、又は選別により濃縮される。この用語は、選別に関する任意の好適な手段を包含することを意図するものである。実際のところ、本発明は、任意の特定のスクリーニング方法に制限されることを意図しない。
【００９３】
用語「改変核酸配列」及び「改変遺伝子」は、天然に生じる（即ち、野生型）核酸配列の欠失、挿入又は中断を包含する核酸配列を指すために、本明細書において互換的に使用される。一部の実施形態では、改変された核酸配列による発現産物は、切断型タンパク質である（例えば、改変が配列の欠失又は中断であった場合）。一部の実施形態では、切断型タンパク質は生物活性を保持している。代替的な実施形態では、改変された核酸配列の発現産物は、伸長されているタンパク質である（例えば、改変が核酸配列の挿入を含む場合）。一部の実施形態では、核酸配列にヌクレオチドが挿入されることで、切断型タンパク質が得られる（例えば、挿入により停止コドンが形成される場合）。したがって、挿入により、発現産物として、切断型タンパク質又は伸長型タンパク質のいずれかが生じ得る。
【００９４】
「変異型」核酸配列は、典型的には、変異型核酸配列の発現産物が、野生型タンパク質と比較してアミノ酸配列が変更されたタンパク質になるような、少なくとも１つのコドンの変更を宿主細胞の野生型配列中に有する核酸配列を指す。発現産物の機能的能力は変更されてもよい（例えば、酵素活性が増強されるなど）。
【００９５】
本明細書で使用するとき、語句「基質特異性の変更」は、酵素の基質特異性における変化を指す。一部の実施形態では、基質特異性の変化は、酵素の変異、又は反応条件の変更により生じる、特定の基質に対するｋｃａｔ及び／又はＫｍの変化として定義される。酵素の基質特異性は、異なる基質に対して呈する、触媒効率を比較することで測定することができる。概して、対象とする基質に対するｋｃａｔ／Ｋｍ比がより大きい変異体酵素を産生することが所望されることから、これらの定量は、変異型酵素の効率を評価する特定の用途で見られる。しかしながら、本発明は、特定の基質組成物又は基質特異性に制限されることを意図しない。
【００９６】
本明細書で使用するとき、「表面特性」は、静電荷、並びにタンパク質の表面により示される疎水性及び親水性などの特性に関して使用される。
【００９７】
用語「熱的に安定な」及び「熱安定」及び「熱安定性」は、タンパク質分解、加水分解、クリーニング、又は本発明の他のプロセス（例えば、温度が変更されるなど）時に一般的に適用される条件下で、所定の時間にわたって所定の温度に曝露した後でも、特定の程度の酵素活性をプロテアーゼが保持していることを意味する。温度変更としては、温度の上昇及び低下が挙げられる。一部の実施形態では、プロテアーゼは、例えば、変更された温度に少なくとも約６０分、約１２０分、約１８０分、約２４０分、約３００分などの所定の時間にわたって曝露された後に、少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９２％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％のタンパク質分解活性を保持する。
【００９８】
酸化安定性、キレート化安定性、熱安定性及び／又はｐＨ安定性のプロテアーゼに関する文脈において、用語「安定性の増加」は、他のプロテアーゼ（例えば、サブチリシンプロテアーゼ）及び／又は野生型酵素と比較した場合に、タンパク質分解活性が経時的により高く維持されていることを意味する。
【００９９】
酸化安定性、キレート化安定性、熱安定性及び／又はｐＨ安定性のプロテアーゼに関する文脈において、用語「安定性の減少」は、他のプロテアーゼ（例えば、サブチリシンプロテアーゼ）及び／又は野生型酵素と比較した場合に、タンパク質分解活性が経時的により低く維持されていることを意味する。
【０１００】
用語「クリーニング活性」は、タンパク質分解、加水分解、クリーニング、又は他の本発明のプロセス時に一般的に適用される条件下で、プロテアーゼ変異体又は参照プロテアーゼにより得られるクリーニング性能を指す。一態様では、物品又は表面上の、１種以上の様々な酵素反応性の染み（例えば、食物、草類、血液、牛乳又は卵タンパク質など）をクリーニングさせる、様々なアッセイを用いることで、プロテアーゼ変異体又は参照プロテアーゼのクリーニング性能を測定することもできる。プロテアーゼ変異体又は参照プロテアーゼのクリーニング性能は、物品又は表面上の染みを標準的な洗浄条件に晒し、及び染みが除去される程度を、様々なクロマトグラフィー、分光光度法、又はその他の定量法を用い評価することで判定できる。例示的なクリーニングアッセイ及び方法としては、限定するものではないが、例えば、国際公開第９９／３４０１１号及び米国特許第６，６０５，４５８号（いずれも本明細書に参照により組み込まれる）に記載のもの、並びに本発明の以下の実施例に包含されるクリーニングアッセイ及び方法が挙げられる。
【０１０１】
用語、プロテアーゼ変異体又は参照プロテアーゼの「クリーニングに有効な量」は、特定のクリーニング組成物中で、所望される程度の酵素活性を達成するようなプロテアーゼ量を意味する。このような有効量は、当業者により容易に確認され、及び使用される具体的なプロテアーゼ、クリーニング用途、クリーニング組成物の具体的な組成、及び必要とされる組成物が液体又は乾燥しているもの（例えば、顆粒状、バー状）のいずれであるのか、などの多くの要因に基づくものである。
【０１０２】
用語「クリーニング助剤」は、クリーニング組成物に含まれる、本発明のプロテアーゼ変異体以外の任意の液体、固体、又はガス状の成分を指す。本発明のクリーニング組成物は、クリーニング助剤を１種以上包含し得る。各クリーニング助剤は、典型的には、クリーニング組成物の具体的な種類及び形態（例えば、液体、顆粒、粉末、バー、ペースト、スプレー、錠剤、ゲル；又はフォーム組成物）に基づいて選択される。好ましくは、各クリーニング助剤は、組成物に使用されるプロテアーゼ酵素と適合性がある。
【０１０３】
用語「性能が増感された」は、クリーニング活性の文脈において、標準的な洗浄サイクル及び／又は複数回洗浄サイクル後に通常の評価により判定された場合に、卵、牛乳、草類又は血液などの特定の酵素反応性の染みのクリーニング活性が、増加又は増強されていることを指す。
【０１０４】
用語「性能が減感された」は、クリーニング活性の文脈において、標準的な洗浄サイクル後に通常の評価により判定された場合に、卵、牛乳、草類又は血液などの特定の酵素反応性の染みのクリーニング活性が、減少又は低下していることを指す。
【０１０５】
本発明のプロテアーゼ変異体のクリーニング活性の文脈において、用語「匹敵する性能」は、例えば、限定するものではないが、ＯＰＴＩＭＡＳＥ（商標）プロテアーゼ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）、ＰＵＲＡＦＥＣＴ（商標）プロテアーゼ製品（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）、ＳＡＶＩＮＡＳＥ（商標）プロテアーゼ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）、ＢＰＮ’−変異体（例えば、米国再発行特許第３４，６０６号を参照されたい）、ＲＥＬＡＳＥ（商標）、ＤＵＲＡＺＹＭＥ（商標）、ＥＶＥＲＬＡＳＥ（商標）、ＫＡＮＮＡＳＥ（商標）プロテアーゼ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）、ＭＡＸＡＣＡＬ（商標）、ＭＡＸＡＰＥＭ（商標）、ＰＲＯＰＥＲＡＳＥ（商標）プロテアーゼ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ；米国再発行特許第３４，６０６号及び米国特許第５，７００，６７６号；同第５，９５５，３４０号；同第６，３１２，９３６号；及び同第６，４８２，６２８号も参照されたい）、及びＢ．レンタスのプロテアーゼ変異体産物（例えば、国際公開第９２／２１７６０号、同第９５／２３２２１号及び／又は同第９７／０７７７０号に記載のものなど）などの比較又は参照プロテアーゼ（例えば、市販のプロテアーゼ）のクリーニング活性の、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％を意味する。クリーニング性能は、標準的な洗浄サイクル条件後に、通常の分光光度法による又は解析論的な手法を用いて測定する場合、草類、血液又は牛乳などの酵素反応性の染みを対象とする様々なクリーニングアッセイにおいて、本発明のプロテアーゼ変異体を参照サブチリシンプロテアーゼと比較することで判定することができる。
【０１０６】
本明細書で使用するとき、本発明の「クリーニング組成物」又は「クリーニング配合物」は、例えば、限定するものではないが、布地、布製物品、食器類、食卓用食器類、ガラス製品、コンタクトレンズ、他の固体基材、毛髪（シャンプー）（ヒト又は動物の毛髪を包含する、皮膚（石鹸又は及びクリーム）、歯（マウスウォッシュ、歯磨き粉）、物品又は対象物の表面（例えば、硬質表面、例えば、テーブル、卓上、壁、家具、床、天井、非食器類、非食卓用食器類などの硬質表面）、コンタクトレンズなどが挙げられる、クリーニングされる対象物、物品、又は表面から、化合物（例えば、所望されない化合物）を除去又は排除するのに有用な本発明の任意の組成物を指す。クリーニング組成物は、その組成が、組成物に使用されるプロテアーゼ及び他の酵素と適合するのであれば、所望されるクリーニング組成物の具体的な種類及び製品形態（例えば、液体組成物、ゲル組成物、顆粒組成物、又はスプレー組成物）に即して選択される任意の成分及び／又は添加化合物を包含する。クリーニング組成物の成分の具体的な選別は、クリーニングされる表面、対象物、物品、又は布地を考慮することにより、及び使用時のクリーニング条件に所望される組成物の形態を考慮することにより、容易に行われる。
【０１０７】
クリーニング組成物及びクリーニング配合物は、任意の対象物、物品、及び／又は表面をクリーニング、漂白、消毒、及び／又は殺菌するのに好適な任意の組成を含む。このような組成物及び配合物としては、限定するものではないが、例えば、クリーニング又は洗剤組成物（例えば、液体、錠剤、ゲル、顆粒、及び／又は固形洗濯洗浄又は洗剤組成物及びおしゃれ着用洗剤組成物など）；硬質表面クリーニング組成物及び配合物（例えば、ガラス、木、セラミック及び金属製のカウンター及び窓）；カーペットクリーナー；オーブンクリーナー；布地フレッシュナー；布地柔軟剤；及び繊維製品、洗濯用洗浄性能増進（laundry booster）クリーニング又は洗剤組成物、洗濯用添加型クリーニング組成物、及び洗濯物の染み抜き用クリーニング組成物；食器洗浄用組成物、例えば、食器手洗い用又は食器手動洗浄用組成物（例えば、食器手洗い用又は食器手動洗浄用の洗剤）及び食器自動洗浄用組成物（例えば、食器自動洗浄用洗剤）などの液体及び／又は固形組成物が挙げられる。
【０１０８】
本明細書で使用するとき、クリーニング組成物又はクリーニング配合物としては、別途記載のない限り、顆粒型又は粉末型汎用又は強力洗浄剤、特に、クリーニング洗剤；液体型、顆粒型、ゲル型、固形、錠剤型又はペースト型汎用洗浄剤、特にいわゆる強力液体（ＨＤＬ）洗剤又は強力粉末洗剤（ＨＤＤ）型；液体リネン洗剤；高起泡型のものを含む食器手洗い又は食器手洗い洗剤；食器手洗い又は食器手洗浄、食器自動洗浄、又は家事用及び業務用の様々な錠剤型、粉末型、固形、顆粒型、液体型、ゲル型及びすすぎ助剤型の食器類若しくは食卓用食器類洗浄剤；抗菌手洗浄型のもの、クリーニングバー、マウスウォッシュ、義歯クリーナー、カーシャンプー、カーペットシャンプー、風呂場クリーナーなどの液体クリーニング及び消毒剤；ヒト及び他の動物用毛髪用シャンプー及び／又は毛髪リンス；シャワージェル及びバブルバス及び金属クリーナー；加えて漂白添加剤及び「染み抜き剤」又は前処理型のクリーニング助剤；が挙げられる。一部の実施形態では、顆粒状組成物は「コンパクト」形態であり；一部の実施形態では、液体組成物は「濃縮された」形態である。
【０１０９】
本明細書で使用するとき、「布地クリーニング組成物」としては、洗濯用助剤組成物などの手動洗濯用及び自動洗濯機用洗剤組成物、並びに染みの付いた布地（例えば、衣類、下着、及び他の繊維製品）の浸け置き及び／又は前処理に使用するのに好適な組成物が挙げられる。
【０１１０】
本明細書で使用するとき、「非布地クリーニング組成物」としては、限定するものではないが、例えば、食器手洗い用若しくは食器手動洗浄用又は自動食器洗浄用洗剤組成物、口腔洗浄用組成物、義歯洗浄用組成物、及びパーソナルクレンジング組成物などの、非織物（すなわち、非布地）表面用のクリーニング組成物が挙げられる。
【０１１１】
本明細書で使用するとき、用語「洗剤組成物」又は「洗剤配合物」は、特定の布地及び／又は非布製対象物又は物品を包含する汚れた又は泥のついた対象物のための、洗浄媒質に使用することが意図される、組成物を参照する際に使用される。本発明のこのような組成物は、任意の特定の洗剤組成物又は洗剤配合物に限定されない。実際に、一部の態様では、本発明の洗剤は、本発明のプロテアーゼ変異体を少なくとも１種に加え、界面活性剤、転移酵素、加水分解酵素、酸化還元酵素、ビルダー（例えば、ビルダー塩など）、漂白剤、漂白活性化剤、ブルーイング剤、蛍光染料、ケーキング防止剤、マスキング剤、酵素活性化剤、抗酸化物質、及び／又は可溶化剤を１種以上含有する。場合によっては、ビルダー塩はケイ酸塩とリン酸塩の混合物であり、好ましくはケイ酸塩（例えば、メタケイ酸ナトリウム）をリン酸塩（例えば、トリポリリン酸ナトリウム）よりも多く含む。例えば、限定するものではないが、クリーニング組成物又は洗剤組成物などの、本発明の一部の組成物は、リン酸塩（例えば、リン酸塩又はリン酸塩ビルダー）を含有しない。
【０１１２】
本明細書で使用するとき、用語「漂白」は、物質の増白（すなわち、ホワイトニング）（すなわち、増白化）及び／又はクリーニングをもたらすのに十分な長さの時間にわたる並びに／あるいは適切なｐＨ下での並びに／あるいは温度条件下での物質（例えば、布地、洗濯物、パルプなど）又は表面の処理を指す。漂白に好適な化学物質の例としては、限定するものではないが、例えば、ＣｌＯ２、Ｈ２Ｏ２、過酸、ＮＯ２、などが挙げられる。
【０１１３】
本明細書で使用するとき、プロテアーゼ（例えば、本発明のプロテアーゼ変異体）の「洗浄性能」は、プロテアーゼ変異体が、組成にプロテアーゼ変異体を加えていない洗剤と比較して、追加のクリーニング性能を洗剤に提供するよう、洗浄に貢献することを指す。洗浄性能は、関連する洗浄条件下で比較される。一部の試験系では、洗剤組成物、泡濃度、水硬度、洗浄機構、時間、ｐＨ、及び／又は温度などの他の関連する要因を、特定の市場区分における典型的な家事用途の条件（例えば、食器手洗い又は食器手動洗浄、食器自動洗浄、食器類クリーニング、食卓用食器類クリーニング、及び布地クリーニングなど）に限定されるような様式に調節することもできる。
【０１１４】
本明細書では、用語「関連する洗浄条件」は、実際に、食器手洗い、自動食器洗浄、又は洗濯洗剤市場区分に含まれる家事で使用される、特に、洗浄温度、時間、洗浄機構、泡濃度、洗剤及び水硬度の型などの条件を意味するために使用される。
【０１１５】
用語「改良された洗浄性能」は、関連する洗浄条件下で、染み除去において、より良好な仕上がり結果が得られること、あるいは対応する野生型又は開始親プロテアーゼと比較して同様の仕上がり結果を得るにあたり必要とされるプロテアーゼ変異体が、重量ベースでより少量になることを意味して使用される。
【０１１６】
本明細書で使用するとき、用語「消毒」は、表面からの汚染物の除去、並びに物品表面上に存在する微生物を抑制又は殺傷することを指す。本発明は、任意の特定の表面、物品、又は除去される汚染物若しくは微生物に限定されることを意図しない。
【０１１７】
本明細書では、「コンパクト」形態のクリーニング組成物は、最も密度が反映されるものであり、組成の点で言えば無機充填剤塩の量が反映される。無機充填剤塩は、粉末形態の洗剤組成物の従来成分である。一般的な洗剤組成物では、充填剤塩は、典型的には組成物の合計量の約１７〜約３５重量％相当の量で存在する。対照的に、コンパクト組成物では、充填剤塩は、組成物の合計量の約１５重量％以下の量で存在する。一部の実施形態では、充填剤塩は、組成物の約１０重量％以下、より好ましくは約５％重量以下の量で存在する。一部の実施形態では、無機充填剤塩は、硫酸及び塩酸の、アルカリ塩及びアルカリ土類金属塩から選択される。一部の実施形態では、充填剤塩は硫酸ナトリウムである。
【０１１８】
所定のアミノ酸配列中のアミノ酸残基の位置は、典型的には、本明細書において、配列番号２で示されるＢ．アミロリケファシエンス（B. amyloliquefaciens）のサブチリシンＢＰＮ’アミノ酸配列の、対応するアミノ酸残基の位置に対して割り振られた番号を使用して、番号付けされる。したがって、配列番号２の、Ｂ．アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列は、参照配列として機能する。本明細書に記載されるプロテアーゼ変異体のアミノ酸配列などの、所与のアミノ酸配列を、本明細書に記載されるような整列アルゴリズムを使用してＢＰＮ’配列（配列番号２）と整列させることができ、及びサブチリシンＢＰＮ’配列中の対応するアミノ酸残基を参照することで、ＢＰＮ’配列中のアミノ酸残基と整列させた（好ましくは部分的に整列させた）所与のアミノ酸配列中のアミノ酸残基を都合よく番号付けすることができる。例えば、本発明のプロテアーゼ変異体ＰＸ４は、配列番号１に対して６個のアミノ酸置換Ｎ７６Ｄ＋Ｓ８７Ｒ＋Ｇ１１８Ｒ＋Ｓ１２８Ｌ＋Ｐ１２９Ｑ＋Ｓ１３０Ａを含むアミノ酸配列を含む、配列番号１で示されるプロテアーゼＧＧ３６のプロテアーゼ変異体として記載することができ、プロテアーゼ変異体ＰＸ４のアミノ酸残基の位置は、配列番号２で示されるサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列において対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされ、ＰＸ４のアミノ酸配列をサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列と整列させることで決定される。
【０１１９】
あるいは、プロテアーゼ変異体ＰＸ４の配列中のアミノ酸残基の位置が、ＧＧ３６のアミノ酸配列（配列番号１）中のアミノ酸残基の位置に実際に割り振られた番号を使用して番号付けされ、整列時のＢＰＮ’配列の対応するアミノ酸位置は参照されない場合、プロテアーゼ変異体ＰＸ４は、６個のアミノ酸置換Ｎ７４Ｄ＋Ｓ８５Ｒ＋Ｇ１１６Ｒ＋Ｓ１２６Ｌ＋Ｐ１２７Ｑ＋Ｓ１２８Ａを含むアミノ酸配列を含む、配列番号１を示すプロテアーゼＧＧ３６のプロテアーゼ変異体として記載することができる。
【０１２０】
概して、本明細書で使用する命名法、並びに以下に記載される細胞培養、分子遺伝学、分子生物学、核酸化学、及びタンパク質化学的な実験手順の多くは周知のものであり、当業者により一般的に採用される。Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  Ｅｄ．），Ｖｏｌｓ．１〜３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９（以降「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」として参照）、及びＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ  ｊｏｉｎｔ  ｖｅｎｔｕｒｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９４、１９９９にかけて補足）（以降「Ａｕｓｕｂｅｌ」として参照）に記載されるものなどの標準技法が、核酸組み換え法、核酸合成法、細胞培養法及び導入遺伝子の組み込み法、例えば、形質移入法、電気穿孔法に使用される。オリゴヌクレオチドの合成工程及び精製工程は、典型的には本明細書に従って実施される。概して技術及び手法は、当業者に周知の従来法、並びに本文書を通して提供される様々な一般参照に従って実施される。それらの手順は当業者に周知のものであると考えることができ、読み手には便宜上提供される。
【０１２１】
本発明のポリペプチド
本発明は、総じて「本発明のポリペプチド」として参照することのできる新規ポリペプチドを提供する。本発明のポリペプチドとしては、単離されたプロテアーゼ変異体ポリペプチド、組み換えプロテアーゼ変異体ポリペプチド、実質的に純粋なプロテアーゼ変異体ポリペプチド又は非天然に生じるプロテアーゼ変異体ポリペプチドが包含され、例えば、酵素活性（例えば、タンパク質分解活性）を有するサブチリシン変異体ポリペプチドが包含される。一態様では、本発明のポリペプチドは、クリーニング用途に有用であり、クリーニングされる必要のある物品又は表面（例えば、物品表面）のクリーニング方法に有用なクリーニング組成物に組み込むことができる。
【０１２２】
一態様では、本発明のプロテアーゼ変異体には、「サブチリシン変異体」が含まれる。一態様では、本発明は、「バチルス種（Bacillus sp.）のプロテアーゼ変異体」を提供する。一態様では、本発明は、「バチルス種のサブチリシン変異体」を提供する。
【０１２３】
一態様では、本発明は、タンパク質分解活性を有する単離されたプロテアーゼ変異体ポリペプチド、組み換えプロテアーゼ変異体ポリペプチド、実質的に純粋なプロテアーゼ変異体ポリペプチド又は非天然に生じるプロテアーゼ変異体ポリペプチドを包含し、このポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列に対し少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、又は１００％の配列同一性を有するポリペプチド配列からなり、上記プロテアーゼ変異体のアミノ酸配列は、配列番号１の位置７６、８７、１１８、１２８、１２９、１３０、１８８、及び２４４のそれぞれのアミノ酸残基に異なるアミノ酸残基による置換を含み、各アミノ酸位置は、プロテアーゼ変異体の配列番号２で示されるアミノ酸配列をバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列と整列させることで決定される（図１を参照されたい）、バチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列中の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。一態様では、このようなプロテアーゼ変異体にはサブチリシン変異体が含まれる。
【０１２４】
他の態様では、本発明は、タンパク質分解活性を有する単離されたプロテアーゼ変異体ポリペプチド、組み換えプロテアーゼ変異体ポリペプチド、実質的に純粋なプロテアーゼ変異体ポリペプチド又は非天然に生じるプロテアーゼ変異体ポリペプチド（例えば、サブチリシン変異体）を包含し、上記プロテアーゼ変異体は、配列番号１のアミノ酸配列に対し少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、又は１００％の配列同一性を有し、上記プロテアーゼ変異体のアミノ酸配列は、配列番号１の位置７６、８７、１１８、１２８、１２９、１３０、１８８、及び２４４のそれぞれのアミノ酸残基に異なるアミノ酸残基による置換を含み、各アミノ酸位置は、プロテアーゼ変異体のアミノ酸配列を配列番号２で示されるバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列と整列させることで決定される（図１を参照されたい）、バチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列中の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。同様に、単離されたプロテアーゼ変異体ポリペプチド、組み換えプロテアーゼ変異体ポリペプチド、又は非天然に生じるプロテアーゼ変異体ポリペプチドも提供され、上記プロテアーゼ変異体は、配列番号１のアミノ酸配列に対し少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、上記プロテアーゼ変異体アミノ酸配列は、配列番号１の位置７６、８７、１１８、１２８、１２９、１３０、１８８、及び２４４のそれぞれのアミノ酸残基に異なるアミノ酸残基による置換を含み、各アミノ酸位置は、プロテアーゼ変異体のアミノ酸配列を配列番号２で示されるバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列と整列させることで決定される、バチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列中の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。このようなプロテアーゼ変異体の一部のものでは、プロテアーゼ変異体のアミノ酸配列が、配列番号１のアミノ酸位置７６、８７、１１８、１２８、１２９、１３０、１８８、及び２４４のそれぞれのアミノ酸残基に異なるアミノ酸残基による置換を含むことから、−２、−１、０、＋１、＋２、＋３、＋４、＋５、＋６、＋７、若しくは＋８の合計電荷を有するプロテアーゼ変異体が生成され、又は一態様では、プロテアーゼ変異体は、−２、−１、０、＋１、＋２、＋３、若しくは＋４、又は一態様では、−２、−１、０、＋１、若しくは＋２、又は一態様では、＋１の合計電荷を有する。このようなプロテアーゼ変異体の一部のものでは、プロテアーゼ変異体のアミノ酸配列において、（ｉ）位置７６及び１８８のそれぞれのアミノ酸残基は、アスパラギン酸及びグルタミン酸からなる群から選択された、負電荷をもつアミノ酸残基により置換され；（ｉｉ）位置８７、１１８、及び２４４のそれぞれのアミノ酸残基は、アルギニン、ヒスチジン、及びリシンからなる群から選択された、正電荷をもつアミノ酸残基により置換され；並びに（ｉｉｉ）位置１２８、１２９、及び１３０のそれぞれのアミノ酸残基は、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、及びバリンからなる群から選択された、中性のアミノ酸残基により置換される。このようなプロテアーゼ変異体の一部のものでは、上記プロテアーゼ変異体のアミノ酸配列は、アミノ酸置換Ｎ７６Ｄ＋Ｓ８７Ｒ＋Ｇ１１８Ｒ＋Ｓ１２８Ｌ＋Ｐ１２９Ｑ＋Ｓ１３０Ａ＋Ｓ１８８Ｄ＋Ｖ２４４Ｒを含む。一態様では、プロテアーゼ変異体は、配列番号８で示されるアミノ酸配列を含む。
【０１２５】
他の態様では、本発明は、タンパク質分解活性を有する単離されたポリペプチド、組み換えポリペプチド、実質的に純粋なポリペプチド又は非天然に生じるポリペプチドを包含し、ポリペプチドは、配列番号６、配列番号７、及び配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、又は１００％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。
【０１２６】
一態様では、本発明は、タンパク質分解活性を有する単離されたプロテアーゼ変異体、組み換えプロテアーゼ変異体、実質的に純粋なプロテアーゼ変異体又は非天然に生じるプロテアーゼ変異体（例えば、サブチリシン変異体）を提供し、上記プロテアーゼ変異体は、配列番号１のアミノ酸配列に対し少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、上記プロテアーゼ変異体のアミノ酸配列は、配列番号１に対するアミノ酸位置７６、８７、１１８、１２８、１２９、及び１３０のそれぞれのアミノ酸残基に異なるアミノ酸残基による置換を含み、かつ（ｉ）アミノ酸位置１８８のセリン残基、若しくはアスパラギン酸残基ではない異なるアミノ酸残基による位置１８８のセリン残基の置換、及び／又は（ｉｉ）アミノ酸位置２４８のアスパラギン残基、若しくはアルギニン残基ではない異なるアミノ酸残基による位置２４８のアスパラギン残基の置換を含み、アミノ酸位置は、プロテアーゼ変異体のアミノ酸配列を、配列番号１で示されるバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列と整列させることで決定される（図１を参照されたい）、バチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列中の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。
【０１２７】
同様に、タンパク質分解活性を有する単離されたプロテアーゼ変異体、組み換えプロテアーゼ変異体、実質的に純粋なプロテアーゼ変異体又は非天然に生じるプロテアーゼ変異体も提供し、上記プロテアーゼ変異体は、配列番号１のアミノ酸配列に対し少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、上記プロテアーゼ変異体のアミノ酸配列は、配列番号１に対するアミノ酸位置７６、８７、１１８、１２８、１２９、及び１３０のそれぞれのアミノ酸残基に、異なるアミノ酸残基による置換を含み、かつ（ｉ）アミノ酸位置１８８のセリン残基、若しくはアスパラギン酸残基ではない異なるアミノ酸残基による位置１８８のセリン残基の置換、及び／又は（ｉｉ）アミノ酸位置２４８のアスパラギン残基、若しくはアルギニン残基ではない異なるアミノ酸残基による位置２４８のアスパラギン残基の置換を含み、アミノ酸位置は、プロテアーゼ変異体のアミノ酸配列を配列番号２で示されるバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列と整列させることで決定される（図１を参照されたい）、バチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列中の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。このようなプロテアーゼ変異体の一部のものでは、プロテアーゼ変異体のアミノ酸配列は、アミノ酸位置１８８にセリン残基を含み、及び／又はアミノ酸位置２４８にアルギニン残基を含む。このようなプロテアーゼ変異体の一部のものでは、プロテアーゼ変異体のアミノ酸配列が、配列番号２に対するアミノ酸位置７６、８７、１１８、１２８、１２９、及び１３０のそれぞれのアミノ酸残基に、異なるアミノ酸による置換を含むことから、−２、−１、０、＋１、＋２、＋３、＋４、＋５、＋６、＋７、若しくは＋８の合計電荷を有するプロテアーゼ変異体が生成され、又は一態様では、プロテアーゼ変異体は−２、−１、０、＋１、＋２、＋３、若しくは＋４の合計電荷を有し、又は一態様では、プロテアーゼ変異体は＋１の合計電荷を有する。このようなプロテアーゼ変異体の一部のものでは、プロテアーゼ変異体のアミノ酸配列では、（ｉ）位置７６のアミノ酸残基が、アスパラギン酸及びグルタミン酸からなる群から選択された負電荷をもつアミノ酸残基により置換され、（ｉｉ）位置８７及び１１８のそれぞれのアミノ酸残基が、アルギニン、ヒスチジン、及びリシンからなる群から選択された、正電荷をもつアミノ酸残基により置換され、並びに（ｉｉｉ）位置１２８、１２９、及び１３０のそれぞれのアミノ酸残基が、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、及びバリンからなる群から選択された非荷電（中性）のアミノ酸残基で置換される。このようなプロテアーゼ変異体の一部のものでは、プロテアーゼ変異体のアミノ酸配列は、アミノ酸置換Ｎ７６Ｄ＋Ｓ８７Ｒ＋Ｇ１１８Ｒ＋Ｓ１２８Ｌ＋Ｐ１２９Ｑ＋Ｓ１３０Ａを含む。一態様では、プロテアーゼ変異体は、配列番号７で示されるアミノ酸配列を含む。
【０１２８】
同様に、タンパク質分解活性を有する単離されたプロテアーゼ変異体、組み換えプロテアーゼ変異体、実質的に純粋なプロテアーゼ変異体又は非天然に生じるプロテアーゼ変異体も提供され、上記プロテアーゼ変異体は、配列番号１のアミノ酸配列に対し少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、上記プロテアーゼ変異体のアミノ酸配列は、配列番号１に対するアミノ酸位置７６、８７、１１８、１２８、１２９、及び１３０のそれぞれのアミノ酸残基に異なるアミノ酸残基による置換を含み、かつ（ｉ）アミノ酸位置１８８のセリン残基、若しくはアスパラギン酸残基ではない異なるアミノ酸残基による位置１８８のセリン残基の置換、及び（ｉｉ）アルギニン残基による位置２４８のアスパラギン残基の置換を含み、ここで、アミノ酸位置は、プロテアーゼ変異体のアミノ酸配列を配列番号２で示されるバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列と整列させることで決定される（図１を参照されたい）、バチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列中の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。このようなプロテアーゼ変異体の一部のものでは、プロテアーゼ変異体のアミノ酸配列が、配列番号２に対するアミノ酸位置７６、８７、１１８、１２８、１２９、及び１３０のそれぞれのアミノ酸残基に、異なるアミノ酸による置換を含むことから、−２、−１、０、＋１、＋２、＋３、＋４、＋５、＋６、＋７、若しくは＋８の合計電荷を有するプロテアーゼ変異体が生成され、又は一態様では、プロテアーゼ変異体は−２、−１、０、＋１、＋２、＋３、若しくは＋４の合計電荷を有し、又は一態様では、プロテアーゼ変異体は＋１の合計電荷を有する。このようなプロテアーゼ変異体の一部のものでは、プロテアーゼ変異体のアミノ酸配列では、（ｉ）位置７６のアミノ酸残基が、アスパラギン酸及びグルタミン酸からなる群から選択された負電荷をもつアミノ酸残基により置換され、（ｉｉ）位置８７及び１１８のそれぞれのアミノ酸残基が、アルギニン、ヒスチジン、及びリシンからなる群から選択された、正電荷をもつアミノ酸残基により置換され、並びに（ｉｉｉ）位置１２８、１２９、及び１３０のそれぞれのアミノ酸残基が、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、及びバリンからなる群から選択された非荷電（中性）のアミノ酸残基で置換される。このようなプロテアーゼ変異体の一部のものでは、プロテアーゼ変異体のアミノ酸配列は、アミノ酸置換Ｎ７６Ｄ＋Ｓ８７Ｒ＋Ｇ１１８Ｒ＋Ｓ１２８Ｌ＋Ｐ１２９Ｑ＋Ｓ１３０Ａ＋Ｎ２４８Ｒを含む。
【０１２９】
同様に、タンパク質分解活性を有する単離されたプロテアーゼ変異体、組み換えプロテアーゼ変異体、実質的に純粋なプロテアーゼ変異体又は非天然に生じるプロテアーゼ変異体も提供され、上記プロテアーゼ変異体は、配列番号１のアミノ酸配列に対し少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、上記プロテアーゼ変異体のアミノ酸配列は、配列番号１に対するアミノ酸位置７６、８７、１１８、１２８、１２９、及び１３０のそれぞれのアミノ酸残基に異なるアミノ酸残基による置換を含み、かつ（ｉ）アスパラギン酸残基による位置１８８のセリン残基の置換、及び（ｉｉ）アミノ酸位置２４８のアスパラギン残基、若しくはアルギニン残基ではない異なるアミノ酸残基による位置２４８のアスパラギン残基の置換を含み、ここで、アミノ酸位置は、プロテアーゼ変異体のアミノ酸配列を配列番号２で示されるバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列と整列させることで決定される（図１を参照されたい）、バチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列中の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。このようなプロテアーゼ変異体の一部のものでは、プロテアーゼ変異体のアミノ酸配列が、配列番号２に対するアミノ酸位置７６、８７、１１８、１２８、１２９、及び１３０のそれぞれのアミノ酸残基に、異なるアミノ酸による置換を含むことから、−２、−１、０、＋１、＋２、＋３、＋４、＋５、＋６、＋７、若しくは＋８の合計電荷を有するプロテアーゼ変異体が生成され、又は一態様では、プロテアーゼ変異体は−２、−１、０、＋１、＋２、＋３、若しくは＋４の合計電荷を有し、又は一態様では、プロテアーゼ変異体は＋１の合計電荷を有する。このようなプロテアーゼ変異体の一部のものでは、プロテアーゼ変異体のアミノ酸配列では、（ｉ）位置７６のアミノ酸残基が、アスパラギン酸及びグルタミン酸からなる群から選択された負電荷をもつアミノ酸残基により置換され、（ｉｉ）位置８７及び１１８のそれぞれのアミノ酸残基が、アルギニン、ヒスチジン、及びリシンからなる群から選択された、正電荷をもつアミノ酸残基により置換され、並びに（ｉｉｉ）位置１２８、１２９、及び１３０のそれぞれのアミノ酸残基が、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、及びバリンからなる群から選択された非荷電（中性）のアミノ酸残基で置換される。このようなプロテアーゼ変異体の一部のものでは、プロテアーゼ変異体のアミノ酸配列は、アミノ酸置換Ｎ７６Ｄ＋Ｓ８７Ｒ＋Ｇ１１８Ｒ＋Ｓ１２８Ｌ＋Ｐ１２９Ｑ＋Ｓ１３０Ａ＋Ｓ１８８Ｄを含む。
【０１３０】
同様に、タンパク質分解活性を有する単離されたプロテアーゼ変異体、組み換えプロテアーゼ変異体、実質的に純粋なプロテアーゼ変異体又は非天然に生じるプロテアーゼ変異体が提供され、上記プロテアーゼ変異体は、配列番号１のアミノ酸配列に対し少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、上記プロテアーゼ変異体のアミノ酸配列は、配列番号１に対するアミノ酸位置７６、８７、１１８、１２８、１２９、１３０、１８８、及び２４８のそれぞれに、異なるアミノ酸残基によるアミノ酸残基の置換を含み、ここで、アミノ酸位置は、配列番号２で示されるプロテアーゼ変異体のアミノ酸配列をバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列と整列させることで決定される（図１を参照されたい）、バチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列中の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。このようなプロテアーゼ変異体の一部のものでは、プロテアーゼ変異体のアミノ酸配列が、配列番号２に対するアミノ酸位置７６、８７、１１８、１２８、１２９、及び１３０のそれぞれのアミノ酸残基に、異なるアミノ酸による置換を含むことから、−２、−１、０、＋１、＋２、＋３、＋４、＋５、＋６、＋７、若しくは＋８の合計電荷を有するプロテアーゼ変異体が生成され、又は一態様では、プロテアーゼ変異体は−２、−１、０、＋１、＋２、＋３、若しくは＋４の合計電荷を有し、又は一態様では、プロテアーゼ変異体は＋１の合計電荷を有する。このようなプロテアーゼ変異体の一部のものでは、プロテアーゼ変異体のアミノ酸配列では、（ｉ）位置７６及び１８８のアミノ酸残基が、アスパラギン酸及びグルタミン酸からなる群から選択された負電荷をもつアミノ酸残基により置換され、（ｉｉ）位置８７、１１８、及び２４８のアミノ酸残基が、アルギニン、ヒスチジン、及びリシンからなる群から選択された、正電荷をもつアミノ酸残基により置換され、及び（ｉｉｉ）位置１２８、１２９、及び１３０のそれぞれのアミノ酸残基が、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、及びバリンからなる群から選択された非荷電（中性）のアミノ酸残基で置換される。このようなプロテアーゼ変異体の一部のものでは、プロテアーゼ変異体のアミノ酸配列は、アミノ酸置換Ｎ７６Ｄ＋Ｓ８７Ｒ＋Ｇ１１８Ｒ＋Ｓ１２８Ｌ＋Ｐ１２９Ｑ＋Ｓ１３０Ａ＋Ｓ１８８Ｄ＋Ｎ２４８Ｒを含む。一態様では、プロテアーゼ変異体は、配列番号６で示されるアミノ酸配列を含む。
【０１３１】
他の態様では、本発明は、タンパク質分解活性を有する単離されたプロテアーゼ変異体、組み換えプロテアーゼ変異体、実質的に純粋なプロテアーゼ変異体又は非天然に生じるプロテアーゼ変異体（例えば、サブチリシン変異体）を提供し、上記プロテアーゼ変異体は、配列番号１のアミノ酸配列に対し少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、上記プロテアーゼ変異体は、配列番号１に対する以下のアミノ酸置換の組：
（ｉ）上記プロテアーゼ変異体がＮ２４８Ｒ＋Ｓ１８８Ｄをいずれも含まない場合にはＮ７６Ｄ＋Ｓ８７Ｒ＋Ｇ１１８Ｒ＋Ｓ１２８Ｌ＋Ｐ１２９Ｑ＋Ｓ１３０Ａ、又は
（ｉｉ）Ｎ７６Ｄ＋Ｓ８７Ｒ＋Ｇ１１８Ｒ＋Ｓ１２８Ｌ＋Ｐ１２９Ｑ＋Ｓ１３０Ａ＋Ｓ１８８Ｄ＋Ｖ２４４Ｒ、
のうちの１組を含み、アミノ酸位置は、プロテアーゼ変異体のアミノ酸配列を配列番号２で示されるバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列と整列させることで決定される（図１を参照されたい）、バチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列中の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。
【０１３２】
他の態様では、本発明は、タンパク質分解活性を有する単離されたプロテアーゼ変異体、組み換えプロテアーゼ変異体、実質的に純粋なプロテアーゼ変異体又は非天然に生じるプロテアーゼ変異体（例えば、サブチリシン変異体）を提供し、上記プロテアーゼ変異体は、配列番号１のアミノ酸配列に対し少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、上記プロテアーゼ変異体は、配列番号１に対する以下のアミノ酸置換の組：
（ｉ）上記プロテアーゼ変異体がＮ２４８Ｒ＋Ｓ１８８Ｄをいずれも含まない場合にはＮ７６Ｄ＋Ｓ８７Ｒ＋Ｇ１１８Ｒ＋Ｓ１２８Ｌ＋Ｐ１２９Ｑ＋Ｓ１３０Ａ、又は
（ｉｉ）Ｎ７６Ｄ＋Ｓ８７Ｒ＋Ｇ１１８Ｒ＋Ｓ１２８Ｌ＋Ｐ１２９Ｑ＋Ｓ１３０Ａ＋Ｓ１８８Ｄ＋Ｖ２４４Ｒ、
のうちの１組を含み、アミノ酸位置は、プロテアーゼ変異体のアミノ酸配列を配列番号２で示されるバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列と整列させることで決定される（図１を参照されたい）、バチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列中の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。
【０１３３】
他の態様では、本発明は、タンパク質分解活性を有する単離されたプロテアーゼ変異体、組み換えプロテアーゼ変異体、実質的に純粋なプロテアーゼ変異体又は非天然に生じるプロテアーゼ変異体（例えば、サブチリシン変異体）を提供し、上記プロテアーゼ変異体は、配列番号１のアミノ酸配列に対し少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、上記プロテアーゼ変異体は、配列番号１に対する以下のアミノ酸置換の組：
（ｉ）上記プロテアーゼ変異体がＮ２４８Ｒ及びＳ１８８Ｄをいずれも含まない場合にはＮ７６Ｄ＋Ｓ８７Ｒ＋Ｇ１１８Ｒ＋Ｓ１２８Ｌ＋Ｐ１２９Ｑ＋Ｓ１３０Ａ、又は
（ｉｉ）Ｎ７６Ｄ＋Ｓ８７Ｒ＋Ｇ１１８Ｒ＋Ｓ１２８Ｌ＋Ｐ１２９Ｑ＋Ｓ１３０Ａ＋Ｓ１８８Ｄ＋Ｖ２４４Ｒ、
のうちの１組を含み、アミノ酸位置は、プロテアーゼ変異体のアミノ酸配列を配列番号２で示されるバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列と整列させることで決定される（図１を参照されたい）、バチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列中の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。
【０１３４】
一態様では、本発明は、親プロテアーゼ（例えば、サブチリシン）の単離されたプロテアーゼ変異体、実質的に純粋なプロテアーゼ変異体、又は組み換えプロテアーゼ変異体（例えば、サブチリシン変異体）を提供し、上記プロテアーゼ変異体は、親プロテアーゼのアミノ酸配列に対して、以下のアミノ酸置換の組のうちの１組を含むアミノ酸配列を含む：
（ｉ）上記プロテアーゼ変異体がＮ２４８Ｒ及びＳ１８８Ｄをいずれも含まない場合にはＮ７６Ｄ＋Ｓ８７Ｒ＋Ｇ１１８Ｒ＋Ｓ１２８Ｌ＋Ｐ１２９Ｑ＋Ｓ１３０Ａ、又は
（ｉｉ）Ｎ７６Ｄ＋Ｓ８７Ｒ＋Ｇ１１８Ｒ＋Ｓ１２８Ｌ＋Ｐ１２９Ｑ＋Ｓ１３０Ａ＋Ｓ１８８Ｄ＋Ｖ２４４Ｒ。
【０１３５】
一態様では、本発明は、親サブチリシンの単離されたサブチリシン変異体、実質的に純粋なサブチリシン変異体、又は組み換えサブチリシン変異体を提供し、上記サブチリシン変異体は、親サブチリシンのアミノ酸配列に対して、以下のアミノ酸置換の組のうちの１組を含むアミノ酸配列を含む：
（ｉ）上記プロテアーゼ変異体がＮ２４８Ｒ及びＳ１８８Ｄをいずれも含まない場合にはＮ７６Ｄ＋Ｓ８７Ｒ＋Ｇ１１８Ｒ＋Ｓ１２８Ｌ＋Ｐ１２９Ｑ＋Ｓ１３０Ａ、又は
（ｉｉ）Ｎ７６Ｄ＋Ｓ８７Ｒ＋Ｇ１１８Ｒ＋Ｓ１２８Ｌ＋Ｐ１２９Ｑ＋Ｓ１３０Ａ＋Ｓ１８８Ｄ＋Ｖ２４４Ｒ。
【０１３６】
他の態様では、本発明は、親プロテアーゼの単離されたプロテアーゼ変異体、組み換えプロテアーゼ変異体、又は非天然に生じるプロテアーゼ変異体（例えば、サブチリシン変異体）を提供し、上記親プロテアーゼは、配列番号１のアミノ酸配列に対し少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、上記プロテアーゼ変異体は、タンパク質分解活性を有し、かつ上記親プロテアーゼに対して、以下のアミノ酸置換の組：
（ｉ）上記プロテアーゼ変異体がＮ２４８Ｒ及びＳ１８８Ｄをいずれも含まない場合にはＮ７６Ｄ＋Ｓ８７Ｒ＋Ｇ１１８Ｒ＋Ｓ１２８Ｌ＋Ｐ１２９Ｑ＋Ｓ１３０Ａ、又は
（ｉｉ）Ｎ７６Ｄ＋Ｓ８７Ｒ＋Ｇ１１８Ｒ＋Ｓ１２８Ｌ＋Ｐ１２９Ｑ＋Ｓ１３０Ａ＋Ｓ１８８Ｄ＋Ｖ２４４Ｒ、
のうちの１組を含み、アミノ酸位置は、プロテアーゼ変異体のアミノ酸配列を配列番号２で示されるバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列と整列させることで決定される（図１を参照されたい）、バチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列中の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。
【０１３７】
他の態様では、本発明は、タンパク質分解活性を有する単離されたプロテアーゼ変異体、組み換えプロテアーゼ変異体、又は非天然に生じるプロテアーゼ変異体（例えば、サブチリシン変異体）も提供し、上記プロテアーゼ変異体は、配列番号１のアミノ酸配列に対し少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、上記プロテアーゼ変異体のアミノ酸配列は、配列番号１に対するアミノ酸位置８７、１１８、１２８、１２９、及び１３０のそれぞれのアミノ酸残基に、異なるアミノ酸残基による置換を含み、並びに（ｉ）アミノ酸位置１８８のセリン残基、若しくはアスパラギン酸残基ではない異なるアミノ酸残基による位置１８８のセリン残基の置換並びに／あるいは（ｉｉ）アミノ酸位置２４８のアスパラギン残基、若しくはアルギニン残基ではない異なるアミノ酸残基による位置２４８のアスパラギン残基の置換、並びに／あるいは（ｉｉｉ）位置７６のアスパラギン残基、又はアスパラギン酸残基ではない異なるアミノ酸残基による位置２４８のアスパラギン残基の置換、を含み、アミノ酸位置は、プロテアーゼ変異体のアミノ酸配列を配列番号２で示されるバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列と整列させることで決定される（図１を参照されたい）、バチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’中の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。このようなプロテアーゼ変異体の一部のものでは、プロテアーゼ変異体のアミノ酸配列は、アミノ酸位置１８８にセリン残基を、又はアミノ酸位置２４８にアルギニン残基を含む。このようなプロテアーゼ変異体の一部のものでは、プロテアーゼ変異体のアミノ酸配列は、配列番号１に対するアミノ酸位置８７、１１８、１２８、１２９、及び１３０のそれぞれのアミノ酸残基に異なるアミノ酸による置換を含むことから、−２、−１、０、＋１、＋２、＋３、又は＋４の正味電荷を有するプロテアーゼ変異体が生成される。このようなプロテアーゼ変異体の一部のものでは、プロテアーゼ変異体のアミノ酸配列では、（ｉ）位置７６のアミノ酸残基は、アスパラギン残基、グルタミン酸残基、又は、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、及びバリンからなる群から選択された非荷電（中性）のアミノ酸残基であり、（ｉｉ）位置１１８のアミノ酸残基は、アルギニン、ヒスチジン、及びリシンからなる群から選択された、正電荷をもつアミノ酸残基で置換され、及び（ｉｉｉ）位置１２８、１２９、及び１３０のそれぞれのアミノ酸残基は、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、及びバリンからなる群から選択された非荷電（中性）のアミノ酸残基で置換される。このようなプロテアーゼ変異体の一部のものでは、プロテアーゼ変異体のアミノ酸配列は、アミノ酸置換Ｓ８７Ｒ＋Ｇ１１８Ｒ＋Ｓ１２８Ｌ＋Ｐ１２９Ｑ＋Ｓ１３０Ａを含む。
【０１３８】
他の態様では、本発明は、タンパク質分解活性を有する単離されたプロテアーゼ変異体、組み換えプロテアーゼ変異体、又は非天然に生じるプロテアーゼ変異体（例えば、サブチリシン変異体）を提供し、上記プロテアーゼ変異体は、配列番号１のアミノ酸配列に対し少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、上記プロテアーゼ変異体は、配列番号１に対する以下のアミノ酸置換の組：
（ｉ）上記プロテアーゼ変異体がＮ２４８Ｒ、Ｓ１８８Ｄ、及びＮ７６Ｄのすべてを含まない場合にはＳ８７Ｒ＋Ｇ１１８Ｒ＋Ｓ１２８Ｌ＋Ｐ１２９Ｑ＋Ｓ１３０Ａ、又は
（ｉｉ）上記プロテアーゼ変異体がＮ７６Ｄを含まない場合にはＳ８７Ｒ＋Ｇ１１８Ｒ＋Ｓ１２８Ｌ＋Ｐ１２９Ｑ＋Ｓ１３０Ａ＋Ｓ１８８Ｄ＋Ｖ２４４Ｒ、
のうちの１つを含み、アミノ酸位置は、プロテアーゼ変異体のアミノ酸配列を配列番号２で示されるサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列と整列させることで決定される、サブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列中の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。
【０１３９】
他の態様では、本発明は、タンパク質分解活性を有する単離されたプロテアーゼ変異体、組み換えプロテアーゼ変異体、又は非天然に生じるプロテアーゼ変異体（例えば、サブチリシン変異体）を提供し、上記プロテアーゼ変異体は、（ａ）９〜１５個のアミノ酸残基が、配列番号１で示されるアミノ酸配列と異なっており、かつ（ｂ）アミノ酸置換Ｎ７６Ｄ＋Ｓ８７Ｒ＋Ｇ１１８Ｒ＋Ｓ１２８Ｌ＋Ｐ１２９Ｑ＋Ｓ１３０Ａ＋Ｓ１１８Ｄ＋Ｎ２４８Ｒを含む、アミノ酸配列からなり、アミノ酸位置は、整列させることで決定される、配列番号２で示されるサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列中の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。
【０１４０】
他の態様では、本発明は、タンパク質分解活性を有する単離されたプロテアーゼ変異体、組み換えプロテアーゼ変異体、又は非天然に生じるプロテアーゼ変異体（例えば、サブチリシン変異体）を提供し、上記プロテアーゼ変異体は、（ａ）３０個以下、２５個以下、２０個以下、１５個以下、１４個以下、１３個以下、１２個以下、１１個以下、１０個以下、９個以下、又は８個以下のアミノ酸残基が、配列番号１で示されるアミノ酸配列と異なっており、かつ（ｂ）配列番号１のアミノ酸位置７６、８７、１１８、１２８、１２９、１３０、１８８、及び２４４のそれぞれのアミノ酸残基に、異なるアミノ酸残基による置換を含む、アミノ酸配列からなり、アミノ酸位置は、プロテアーゼ変異体のアミノ酸配列を配列番号２で示されるサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列と整列させることで決定される、サブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列中の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。一部のこのようなプロテアーゼ変異体ポリペプチドは、１箇所以上のアミノ酸欠失、アミノ酸付加若しくは挿入、及び／又はアミノ酸置換により、配列番号１のポリペプチド配列と異なっている。アミノ酸置換は、典型的には、他の１９種の天然に生じるアミノ酸のうちの１種により生じ、かつ保存的な又は非保存的なアミノ酸置換であり得る。保存的なアミノ酸置換の例は、本明細書の他の箇所で議論されている。一態様では、得られるポリペプチドが、当業者に周知である標準アッセイ（例えば、本明細書に記載されるアッセイ）により測定される酵素活性（例えば、タンパク質分解活性）を呈するよう、配列中の少なくとも１個のアミノ酸が欠失しており、及び／又は少なくとも１個のアミノ酸が置換されている。
【０１４１】
タンパク質分解活性を有する一部のこのようなプロテアーゼ変異体（例えば、サブチリシン変異体）は、（ａ）２５個以下、２０個以下、１５個以下、１４個以下、１３個以下、１２個以下、１１個以下、１０個以下、９個以下、又は８個以下のアミノ酸残基が、配列番号１で示されるアミノ酸配列とは異なっており、かつ（ｂ）配列番号１のアミノ酸位置７６、８７、１１８、１２８、１２９、１３０、１８８、及び２４４のそれぞれのアミノ酸残基に置換を含むアミノ酸配列からなり、アミノ酸位置は、プロテアーゼ変異体のアミノ酸配列を配列番号２で示されるサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列と整列させることで決定される、サブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列中の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。一部のこのようなプロテアーゼ変異体ポリペプチドは、１箇所以上のアミノ酸欠失、アミノ酸付加若しくは挿入、及び／又はアミノ酸置換により、配列番号１のポリペプチド配列と異なっている。アミノ酸置換は、典型的には、他の１９種の天然に生じるアミノ酸のうちの１種により生じ、かつ保存的な又は非保存的なアミノ酸置換であり得る。例示的な保存的アミノ酸置換は、本明細書の他の箇所で議論されている。一態様では、得られるポリペプチドが、当業者に周知であるアッセイ（例えば、本明細書に記載されるアッセイ）により測定される酵素活性（例えば、タンパク質分解活性）を呈するよう、配列中の少なくとも１個のアミノ酸が欠失しており、及び／又は少なくとも１個のアミノ酸が置換されている。
【０１４２】
同様に、タンパク質分解活性を有する単離されたプロテアーゼ変異体、組み換えプロテアーゼ変異体、又は非天然に生じるプロテアーゼ変異体（例えば、サブチリシン変異体）も提供され、上記プロテアーゼ変異体は：
（ａ）３０個以下、２５個以下、２０個以下、１５個以下、１４個以下、１３個以下、１２個以下、１１個以下、１０個以下、９個以下、８個以下、７個以下、又は６個以下のアミノ酸残基が、配列番号１で示されるアミノ酸配列と異なっており；かつ
（ｂ）配列番号１のアミノ酸位置７６、８７、１１８、１２８、１２９、及び１３０のそれぞれのアミノ酸残基に、異なるアミノ酸残基による置換を含み、かつ（ｉ）アミノ酸位置１８８のセリン残基、若しくはアスパラギン酸残基ではない異なるアミノ酸残基による位置１８８のセリン残基の置換、及び／又は（ｉｉ）アミノ酸位置２４８のアスパラギン残基、若しくはアルギニン残基ではない異なるアミノ酸残基による位置２４８のアスパラギン残基の置換を含む、アミノ酸配列からなり、アミノ酸位置は、プロテアーゼ変異体のアミノ酸配列を配列番号２で示されるサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列と整列させることで決定される、サブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列中の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。一部のこのようなプロテアーゼ変異体ポリペプチドは、１箇所以上のアミノ酸欠失、アミノ酸付加若しくは挿入、及び／又はアミノ酸置換により、配列番号１のポリペプチド配列と異なっている。アミノ酸置換は、典型的には、他の１９種の天然に生じるアミノ酸のうちの１種により生じ、かつ保存的な又は非保存的なアミノ酸置換であり得る。例示的な保存的アミノ酸置換は、本明細書の他の箇所で議論されている。一態様では、得られるポリペプチドが、当業者に周知であるアッセイ（例えば、本明細書に記載されるアッセイ）により測定される酵素活性（例えば、タンパク質分解活性）を呈するよう、配列中の少なくとも１個のアミノ酸が欠失しており、及び／又は少なくとも１個のアミノ酸が置換されている。
【０１４３】
同様に、タンパク質分解活性を有する単離されたプロテアーゼ変異体、組み換えプロテアーゼ変異体、又は非天然に生じるプロテアーゼ変異体（例えば、サブチリシン変異体）も提供され、上記プロテアーゼ変異体は：
（ａ）２５個以下、２０個以下、１５個以下、１４個以下、１３個以下、１２個以下、１１個以下、１０個以下、９個以下、８個以下、７個以下、又は６個以下のアミノ酸残基が、配列番号１のアミノ酸配列と異なっており；かつ
（ｂ）配列番号１のアミノ酸位置７６、８７、１１８、１２８、１２９、及び１３０のそれぞれのアミノ酸残基に、異なるアミノ酸残基による置換を含み、かつ（ｉ）アミノ酸位置１８８のセリン残基、若しくはアスパラギン酸残基ではない異なるアミノ酸残基による位置１８８のセリン残基の置換、及び／又は（ｉｉ）アミノ酸位置２４８のアスパラギン残基、若しくはアルギニン残基ではない異なるアミノ酸残基による位置２４８のアスパラギン残基の置換を含む、アミノ酸配列からなり、アミノ酸位置は、プロテアーゼ変異体のアミノ酸配列を配列番号２で示されるサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列と整列させることで決定される、サブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列中の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。一態様では、一部のこのようなプロテアーゼ変異体は、（ｉ）アミノ酸位置１８８のセリン残基、若しくはアスパラギン酸残基ではない異なるアミノ酸残基による位置１８８のセリン残基の置換、及び（ｉｉ）アルギニン残基による位置２４８のアスパラギン残基の置換を含む。一態様では、一部のこのようなプロテアーゼ変異体は、（ｉ）アスパラギン酸残基による位置１８８のセリン残基の置換、及び（ｉｉ）位置２４８のアスパラギン残基、若しくはアルギニン残基以外の異なるアミノ酸残基による位置２４８のアスパラギン残基の置換、を含む。
【０１４４】
一部のこのようなプロテアーゼ変異体ポリペプチドは、１箇所以上のアミノ酸欠失、アミノ酸付加若しくは挿入、及び／又はアミノ酸置換により、配列番号１のポリペプチド配列と異なっている。アミノ酸置換は、典型的には、他の１９種の天然に生じるアミノ酸のうちの１種により生じ、かつ保存的な又は非保存的なアミノ酸置換であり得る。保存的なアミノ酸置換の例は、本明細書の他の箇所で議論されている。一態様では、得られるポリペプチドが、当業者に周知であるアッセイ（例えば、本明細書に記載されるアッセイ）により測定される酵素活性（例えば、タンパク質分解活性）を呈するよう、配列中の少なくとも１個のアミノ酸が欠失しており、及び／又は少なくとも１個のアミノ酸が置換されている。このようなプロテアーゼ変異体の一部のものでは、プロテアーゼ変異体のアミノ酸配列は、アミノ酸位置１８８にセリン残基を、又はアミノ酸位置２４８にアルギニン残基を含む。このようなプロテアーゼ変異体の一部のものでは、プロテアーゼ変異体のアミノ酸配列は、配列番号２に対するアミノ酸位置７６、８７、１１８、１２８、１２９、及び１３０のそれぞれのアミノ酸残基に異なるアミノ酸による置換を含むことから、−２、−１、０、＋１、＋２、＋３、又は＋４の正味電荷を有するプロテアーゼ変異体が生成される。このようなプロテアーゼ変異体の一部のものでは、プロテアーゼ変異体のアミノ酸配列では、（ｉ）位置７６のアミノ酸残基が、アスパラギン酸及びグルタミン酸からなる群から選択された負電荷をもつアミノ酸残基により置換され、（ｉｉ）位置８７及び１１８のそれぞれのアミノ酸残基が、アルギニン、ヒスチジン、及びリシンからなる群から選択された、正電荷をもつアミノ酸残基により置換され、並びに（ｉｉｉ）位置１２８、１２９、及び１３０のそれぞれのアミノ酸残基が、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、及びバリンからなる群から選択された非荷電（中性）のアミノ酸残基で置換される。このようなプロテアーゼ変異体の一部のものでは、プロテアーゼ変異体のアミノ酸配列は、アミノ酸置換Ｎ７６Ｄ＋Ｓ８７Ｒ＋Ｇ１１８Ｒ＋Ｓ１２８Ｌ＋Ｐ１２９Ｑ＋Ｓ１３０Ａを含む。
【０１４５】
他の態様では、本発明は、タンパク質分解活性を有する単離されたプロテアーゼ変異体、組み換えプロテアーゼ変異体、又は非天然に生じるプロテアーゼ変異体（例えば、サブチリシン変異体）を提供し、上記プロテアーゼ変異体は、配列番号７又は配列番号８に対し少なくとも９９％又は９９．５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１４６】
他の態様では、本発明は、タンパク質分解活性を有する単離されたプロテアーゼ変異体、組み換えプロテアーゼ変異体、又は非天然に生じるプロテアーゼ変異体を提供し、上記プロテアーゼ変異体は、１個以下のアミノ酸残基が、配列番号７又は配列番号８のアミノ酸配列と異なる、アミノ酸配列を含む。例えば、プロテアーゼ変異体配列は、アミノ酸の置換（非保存的又は保存的アミノ酸置換など）、アミノ酸の欠失、又はアミノ酸の挿入により、配列番号７又は配列番号８のアミノ酸配列と異なっていてもよい。
【０１４７】
一態様では、本発明は、タンパク質分解活性を有する単離されたプロテアーゼ変異体、組み換えプロテアーゼ変異体、又は非天然に生じるプロテアーゼ変異体を提供し、上記プロテアーゼ変異体は、１箇所以下のアミノ酸置換（非保存的又は保存的アミノ酸置換など）により、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１箇所以下のアミノ酸の欠失により、及び／又は１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１箇所以下のアミノ酸の欠失、アミノ酸の挿入若しくは付加により、配列番号７のアミノ酸配列と異なっているアミノ酸配列を含む。
【０１４８】
一態様では、本発明は、タンパク質分解活性を有する単離されたプロテアーゼ変異体、組み換えプロテアーゼ変異体、又は非天然に生じるプロテアーゼ変異体を提供し、上記プロテアーゼ変異体は、１箇所以下のアミノ酸置換（非保存的又は保存的アミノ酸置換など）により、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１箇所以下のアミノ酸の欠失により、及び／又は１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１箇所以下のアミノ酸の欠失、アミノ酸の挿入若しくは付加により、配列番号８のアミノ酸配列と異なっているアミノ酸配列を含む。
【０１４９】
上記のように、本発明のプロテアーゼ変異体ポリペプチドは酵素活性（例えば、タンパク質分解活性など）を有し、ひいては、例えば、限定するものではないが、食器類、食卓用食器類、布地、及び硬質表面を有する物品（例えば、テーブル、卓上、壁、家具、床、天井などの硬質表面）などのクリーニング方法などといった、クリーニング用途に有用である。本発明のプロテアーゼ変異体ポリペプチドを１種以上含む例示的なクリーニング組成物は、以下に記載される。本発明のプロテアーゼ変異体ポリペプチドの酵素活性（例えば、プロテアーゼ活性）は、当業者に周知の手順を用い、容易に測定することができる。以下に記載される実施例は、酵素活性、クリーニング性能、及び／又は洗浄性能を評価するための方法を記載する。染み除去（例えばタンパク質がこびりつくなどして生じた染みなどの除去）、硬質表面のクリーニング、又は洗濯物、食器類又は食卓用食器類のクリーニング時の本発明のプロテアーゼ変異体の性能は、当業者に周知の手順を用い、及び／又は実施例に記載される手順を用い容易に測定することができる。
【０１５０】
本発明のポリペプチドには、１箇所以上での保存的又は非保存的なアミノ酸のいずれかでの挿入、欠失、及び／又は置換などといった様々な変更を、例えば、ポリペプチドの酵素活性を実質的に変えないような場所に加えることができる。同様にして、本発明の核酸には、特定のコドンが同一の又は異なるアミノ酸をコードするように、１箇所以上で、１つ以上のコドンに含まれる１つ以上の核酸を置換して、サイレントな変化（例えば、コードされるアミノ酸が核酸変異により変更されなかった場合、ヌクレオチド配列中の変異はアミノ酸配列中にサイレント変異を生じる）を生じさせるよう、あるいは配列中の１つ以上の核酸（又はコドン）を１箇所以上で欠失させて、配列中に１つ以上の核酸（又はコドン）を付加又は挿入して、及び／又は配列中の１つ以上の核酸（又はコドン）を切断又は１箇所以上でトランケーションさせて、サイレントではない変化を生じさせるよう、複数の変化を加えることもできる。核酸配列における多くのこのような変更は、得られる配列にコードされるプロテアーゼ変異体の酵素活性を、元の核酸配列によりコードされているプロテアーゼ変異体のものと比較して実質的に変化させなくてよい。同様に、発現系（例えば、細菌による発現系）での最適な発現をもたらすコドンが１つ以上包含されるように、必要に応じて、上記１つ以上のコドンには同一のアミノ酸をコードさせたまま、本発明の核酸を改変させてもよい。
【０１５１】
一態様では、本発明のポリペプチドは、所望の酵素活性（例えば、プロテアーゼ活性又はクリーニング性能活性）を有するプロテアーゼ変異体ポリペプチドからなってもよく、これは本明細書に記載されるアミノ酸置換を有する配列からなり、かつ同様に保存的及び非保存的置換などの追加のアミノ酸置換を１箇所以上含み、ポリペプチドは、例えば、クリーニング活性又はプロテアーゼ変異体性能に反映されるような、所望の酵素活性（例えば、プロテアーゼ活性又はサブチリシン活性）を呈し、維持し、又はおおよそ維持する。本発明に従うアミノ酸置換には、例えば、限定するものではないが、１箇所以上での非保存的置換及び／又は１箇所以上での保存的なアミノ酸置換が包含され得る。保存的なアミノ酸残基置換は、典型的には、アミノ酸残基の機能分類に含まれるアミノ酸を、同様の機能分類（同一のアミノ酸残基は、機能的に相同であるとみなされ、すなわち算出された機能的相同性％で保存されている）に属する残基と交換することを包含する。保存的なアミノ酸置換は、典型的には、機能的に類似するアミノ酸によるアミノ酸置換をアミノ酸配列中に包含する。例えば、アラニン、グリシン、セリン、及びトレオニンは機能的に類似するものであり、ひいては互いに保存的なアミノ酸置換として機能し得る。アスパラギン酸及びグルタミン酸は、互いに保存的な置換として機能し得る。アスパラギン及びグルタミンは、互いに保存的な置換として機能し得る。アルギニン、リシン、及びヒスチジンは、互いに保存的な置換として機能し得る。イソロイシン、ロイシン、メチオニン、及びバリンは、互いに保存的な置換として機能し得る。フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンは、互いに保存的な置換として機能し得る。
【０１５２】
他の保存的なアミノ酸置換基も想定され得る。例えば、アミノ酸は、類似した機能又は化学構造若しくは組成（例えば、酸性、塩基性、脂肪族、芳香族、イオウ含有）により分類することができる。例えば、脂肪族群には：グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）が包含され得る。互いに保存的な置換であるとみなされるアミノ酸を含有する他の群には：芳香族：フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；イオウ含有：メチオニン（Ｍ）、システイン（Ｃ）；塩基性：アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）、ヒスチジン（Ｈ）；酸性：アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；非極性非荷電残基：システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）、及びプロリン（Ｐ）；親水性の非荷電残基：セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）、及びグルタミン（Ｑ）、が包含される。更なるアミノ酸分類については、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ（１９８４）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ（２ｄ  Ｅｄ．１９９３），Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙを参照されたい。上記の置換基と共に、本明細書においてポリペプチド配列を列挙することで、保存的に置換されたすべてのポリペプチド配列の一欄を提供する。
【０１５３】
上記の部類のアミノ酸残基には、同様に又は代替的に好適であり得る、より保存的な置換が存在する。より保存的な置換のための保存的な群としては：バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リシン−アルギニン、アラニン−バリン、及びアスパラギン−グルタミンが挙げられる。したがって、例えば、特定の一態様では、本発明は、タンパク質分解活性を有する単離されたプロテアーゼ変異体又は組み換えプロテアーゼ変異体（例えば、サブチリシン変異体）を提供し、上記プロテアーゼ変異体ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列に対し少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は９９．５％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、上記プロテアーゼ変異体のアミノ酸配列は、配列番号１に対するアミノ酸位置７６、８７、１１８、１２８、１２９、及び１３０のそれぞれのアミノ酸残基に、異なるアミノ酸残基による置換を含み、並びに（ｉ）アミノ酸位置１８８のセリン残基、若しくはアスパラギン酸残基ではない異なるアミノ酸残基による位置１８８のセリン残基の置換及び／又は（ｉｉ）アミノ酸位置２４８のアスパラギン残基、若しくはアルギニン残基ではない異なるアミノ酸残基による位置２４８のアスパラギン残基の置換を含み、アミノ酸位置は、プロテアーゼ変異体のアミノ酸配列を配列番号２で示されるサブチリシンＢＰＮ’配列と最適に整列させることで決定される、ＢＰＮ’のアミノ酸配列中の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされ、プロテアーゼ変異体配列中のアミノ酸位置７６、８７、１１８、１２８、１２９、又は１３０以外の位置のアミノ酸残基は、保存的なアミノ酸置換により、（ＢＰＮ’番号付けスキームを用い整列させることで決定される）配列番号１中の対応するアミノ酸位置と異なっており、得られるプロテアーゼ変異体は所望される酵素活性又はクリーニング活性を呈し、又は維持する。本発明のプロテアーゼ変異体における、他のアミノ酸による１つのアミノ酸の保存的な置換は、プロテアーゼ変異体の酵素活性又はクリーニング活性を有意に変更させることを見込むものではない。得られるプロテアーゼの酵素活性又はクリーニング活性は、標準的なアッセイ及び本明細書に記載されるアッセイを用い、容易に測定することができる。したがって、プロテアーゼ変異体には、所望される酵素活性又はクリーニング活性は維持させたまま、上記の箇所以外の１箇所以上に、追加の保存的なアミノ酸置換を含有させてもよい。一部の態様では、プロテアーゼ変異体のアミノ酸配列中の置換の少なくとも１０％、２０％、５０％、６０％、又は７０％以上（例えば、少なくとも７５％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％）は、配列番号１に対する本発明のプロテアーゼ変異体のポリペプチド配列における、アミノ酸位置７６、８７、１１８、１２８、１２９、及び１３０以外のアミノ酸位置での１箇所以上のアミノ酸残基の、それぞれ置換されるポリペプチド配列のアミノ酸残基とそれぞれ同様の機能的に相同な分類（任意の好適な分類系により判定される）に含まれる１個以上のアミノ酸残基による置換を含み、ここで、アミノ酸位置は、配列番号２と整列され、ＢＰＮ’番号付けスキームを用いることで番号付けされる。
【０１５４】
本発明の保存的に置換された変異体のポリペプチド配列（例えば、本発明のプロテアーゼ変異体）は、ポリペプチド配列中のアミノ酸に、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１４％未満、１３％未満、１２％未満、１１％未満、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、又は６％未満の僅かな割合で、あるいはポリペプチド配列中のアミノ酸に５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、又は１％未満の僅かな割合で、同類の保存的置換基のアミノ酸から保存的に選択されたアミノ酸による置換を含有する。
【０１５５】
本明細書内の他の箇所で詳細に記載されるように（及び下記実施例に記載されるように）、本発明のポリペプチドは、既知のサブチリシンを含む既知のプロテアーゼに匹敵し得るクリーニング活性を有し得る。例示的な既知のサブチリシンプロテアーゼとしては、限定するものではないが、例えば、Ｂ．レンタスのサブチリシンＧＧ３６（本明細書では「ＧＣＩ−Ｐ０３６」とも呼ばれる）、Ｂ．アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’、Ｂ．アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’−Ｙ２１７Ｌ、及びＢ．クラウシイＰＢ９２（本明細書では「ＧＣＩ−Ｐ０３７」とも呼ばれる）が挙げられる。比較参照のため本明細書で使用される他の既知のサブチリシンプロテアーゼは、「ＧＣＩ−Ｐ０３８」とも呼ばれる。
【０１５６】
Ｂ．レンタスのサブチリシンＧＧ３６の成熟タンパク質（ＧＣＩ−Ｐ０３６）のアミノ酸配列は：
ＡＱＳＶＰＷＧＩＳＲＶＱＡＰＡＡＨＮＲＧＬＴＧＳＧＶＫＶＡＶＬＤＴＧＩＳ：ＴＨＰＤＬＮＩＲＧＧＡＳＦＶＰＧＥＰＳＴ：ＱＤＧＮＧＨＧＴＨＶＡＧＴＩＡＡＬＮＮＳＩＧＶＬＧＶＡＰＳＡＥＬＹＡＶＫＶＬＧＡＳＧＳＧＳＶＳＳＩＡＱＧＬＥＷＡＧＮＮＧＭＨＶＡＮＬＳＬＧＳＰＳＰＳＡＴＬＥＱＡＶＮＳＡＴＳＲＧＶＬＶＶＡＡＳＧＮＳＧＡＧＳＩＳＹＰＡＲＹＡＮＡＭＡＶＧＡＴＤＱＮＮＮＲＡＳＦＳＱＹＧＡＧＬＤＩＶＡＰＧＶＮＶＱＳＴＹＰＧＳＴＹＡＳＬＮＧＴＳＭＡＴＰＨＶＡＧＡＡＡＬＶＫＱＫＮＰＳＷＳＮＶＱＩＲＮＨＬＫＮＴＡＴＳＬＧＳＴＮＬＹＧＳＧＬＶＮＡＥＡＡＴＲ（配列番号１）である。
【０１５７】
Ｂ．アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’の成熟タンパク質のアミノ酸配列は：
ＡＱＳＶＰＹＧＶＳＱＩＫＡＰＡＬＨＳＱＧＹＴＧＳＮＶＫＶＡＶＩＤＳＧＩＤＳＳＨＰＤＬＫＶＡＧＧＡＳＭＶＰＳＥＴＮＰＦＱＤＮＮＳＨＧＴＨＶＡＧＴＶＡＡＬＮＮＳＩＧＶＬＧＶＡＰＳＡＳＬＹＡＶＫＶＬＧＡＤＧＳＧＱＹＳＷＩＩＮＧＩＥＷＡＩＡＮＮＭＤＶＩＮＭＳＬＧＧＰＳＧＳＡＡＬＫＡＡＶＤＫＡＶＡＳＧＶＶＶＶＡＡＡＧＮＥＧＴＳＧＳＳＳＴＶＧＹＰＧＫＹＰＳＶＩＡＶＧＡＶＤＳＳＮＱＲＡＳＦＳＳＶＧＰＥＬＤＶＭＡＰＧＶＳＩＱＳＴＬＰＧＮＫＹＧＡＹＮＧＴＳＭＡＳＰＨＶＡＧＡＡＡＬＩＬＳＫＨＰＮＷＴＮＴＱＶＲＳＳＬＥＮＴＴＴＫＬＧＤＳＦＹＹＧＫＧＬＩＮＶＱＡＡＡＱ（配列番号２）である。
【０１５８】
Ｂ．アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’−Ｙ２１７Ｌの成熟タンパク質（「ＦＮＡ」とも呼ばれる）のアミノ酸配列は：
ＡＱＳＶＰＹＧＶＳＱＩＫＡＰＡＬＨＳＱＧＹＴＧＳＮＶＫＶＡＶＩＤＳＧＩＤＳＳＨＰＤＬＫＶＡＧＧＡＳＭＶＰＳＥＴＮＰＦＱＤＮＮＳＨＧＴＨＶＡＧＴＶＡＡＬＮＮＳＩＧＶＬＧＶＡＰＳＡＳＬＹＡＶＫＶＬＧＡＤＧＳＧＱＹＳＷＩＩＮＧＩＥＷＡＩＡＮＮＭＤＶＩＮＭＳＬＧＧＰＳＧＳＡＡＬＫＡＡＶＤＫＡＶＡＳＧＶＶＶＶＡＡＡＧＮＥＧＴＳＧＳＳＳＴＶＧＹＰＧＫＹＰＳＶＩＡＶＧＡＶＤＳＳＮＱＲＡＳＦＳＳＶＧＰＥＬＤＶＭＡＰＧＶＳＩＱＳＴＬＰＧＮＫＹＧＡＬＮＧＴＳＭＡＳＰＨＶＡＧＡＡＡＬＩＬＳＫＨＰＮＷＴＮＴＱＶＲＳＳＬＥＮＴＴＴＫＬＧＤＳＦＹＹＧＫＧＬＩＮＶＱＡＡＡＱ（配列番号３）である。
【０１５９】
ＰＢ９２（ＧＣＩ−Ｐ０３７）参照サブチリシンプロテアーゼの成熟タンパク質のアミノ酸配列は：
ＡＱＳＶＰＷＧＩＳＲＶＱＡＰＡＡＨＮＲＧＬＴＧＳＧＶＫＶＡＶＬＤＴＧＩＳＴＨＰＤＬＮＩＲＧＧＡＳＦＶＰＧＥＰＳＴＱＤＧＮＧＨＧＴＨＶＡＧＴＩＡＡＬＮＮＳＩＧＶＬＧＶＡＰＮＡＥＬＹＡＶＫＶＬＧＡＳＧＳＧＳＶＳＳＩＡＱＧＬＥＷＡＧＮＮＧＭＨＶＡＮＬＳＬＧＳＰＳＰＳＡＴＬＥＱＡＶＮＳＡＴＳＲＧＶＬＶＶＡＡＳＧＮＳＧＡＧＳＩＳＹＰＡＲＹＡＮＡＭＡＶＧＡＴＤＱＮＮＮＲＡＳＦＳＱＹＧＡＧＬＤＩＶＡＰＧＶＮＶＱＳＴＹＰＧＳＴＹＡＳＬＮＧＴＳＭＡＴＰＨＶＡＧＡＡＡＬＶＫＱＫＮＰＳＷＳＮＶＱＩＲＮＨＬＫＮＴＡＴＳＬＧＳＴＮＬＹＧＳＧＬＶＮＡＥＡＡＴＲ（配列番号４）である。
【０１６０】
参照サブチリシンプロテアーゼＧＣＩ−Ｐ０３８の成熟タンパク質のアミノ酸配列は：
ＡＱＳＶＰＷＧＩＳＲＶＱＡＰＡＡＨＮＲＧＬＴＧＳＧＶＫＶＡＶＬＤＴＧＩＳＴＨＰＤＬＮＩＲＧＧＡＳＦＶＰＧＥＰＳＴＱＤＧＮＧＨＧＴＨＶＡＧＴＩＡＡＬＮＮＳＩＧＶＬＧＶＡＰＮＡＥＬＹＡＶＫＶＬＧＡＳＧＳＧＳＶＳＳＩＡＱＧＬＥＷＡＧＮＮＶＭＨＶＡＮＬＳＬＧＬＱＡＰＳＡＴＬＥＱＡＶＮＳＡＴＳＲＧＶＬＶＶＡＡＳＧＮＳＧＡＧＳＩＳＹＰＡＲＹＡＮＡＭＡＶＧＡＴＤＱＮＮＮＲＡＳＦＳＱＹＧＡＧＬＤＩＶＡＰＧＶＮＶＱＳＴＹＰＧＳＴＹＡＳＬＮＧＴＳＭＡＴＰＨＶＡＧＡＡＡＬＶＫＱＫＮＰＳＷＳＮＶＱＩＲＮＨＬＫＮＴＡＴＳＬＧＳＴＮＬＹＧＳＧＬＶＮＡＥＡＡＴＲ（配列番号５）である。
【０１６１】
本発明の核酸
本発明は、単離された核酸、非天然に生じる核酸、又は組み換え核酸（本明細書ではポリヌクレオチドとも呼ばれる）を提供する。これらの核酸は、総じて本発明のポリペプチドをコードしている「本発明の核酸」又は「本発明のポリヌクレオチド」として呼ばれる。以下に記載のすべてのものを包含する本発明の核酸は、本発明のポリペプチドの組み換え体を産生（例えば、発現）するのに、典型的には、対象とするポリペプチドをコードしている配列又はそれらの断片を含むプラスミド発現ベクターによる発現を介して産生するのに有用である。上述のように、ポリペプチドには、例えば、酵素活性（例えば、タンパク質分解活性）を有する、サブチリシン変異体ポリペプチドなどのプロテアーゼ変異体ポリペプチドが包含され、プロテアーゼ変異体ポリペプチドは、クリーニング用途、及びクリーニングする必要のある物品又は表面（例えば、物品の表面）をクリーニングするためのクリーニング組成物に有用である。
【０１６２】
一態様では、本発明は、上記の、表題「本発明のポリペプチド」と付けられた節及び本明細書の何処かに記載される、任意のポリペプチド（任意の融合タンパク質などが包含される）をコードしているヌクレオチド配列を含む、単離された核酸、組み換え核酸、実質的に純粋な核酸又は非天然に生じる核酸を提供する。本発明は、上記の、及び本明細書の何処かに記載の、本発明の任意のポリペプチドを２つ以上の組み合わせをコードしているヌクレオチド配列を含む、単離された核酸、組み換え核酸、実質的に純粋な核酸又は非天然に生じる核酸も提供する。
【０１６３】
例えば、一態様では、本発明は、タンパク質分解活性を有するプロテアーゼ変異体（例えば、サブチリシン変異体）をコードするポリヌクレオチド配列を含む、単離された核酸、組み換え核酸、実質的に純粋な核酸又は非天然に生じる核酸を提供し、上記プロテアーゼは、配列番号１のアミノ酸配列に対し少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、上記プロテアーゼ変異体のアミノ酸配列は、配列番号１の位置７６、８７、１１８、１２８、１２９、１３０、１８８、及び２４４のそれぞれのアミノ酸残基に異なるアミノ酸残基による置換を含み、各アミノ酸位置は、プロテアーゼ変異体のアミノ酸配列を配列番号２で示されるバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列と整列させることで決定される（図１を参照されたい）、バチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列中の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。このようなプロテアーゼ変異体の一部のものは、配列番号１のアミノ酸位置７６、８７、１１８、１２８、１２９、１３０、１８８、及び２４４のそれぞれのアミノ酸残基に異なるアミノ酸による置換を含むアミノ酸配列を含むことから、−２、−１、０、＋１、＋２、＋３、又は＋４の正味電荷を有するプロテアーゼ変異体が生成される。このようなプロテアーゼ変異体の一部のものでは：（ｉ）位置７６及び１８８のそれぞれのアミノ酸残基は、アスパラギン酸及びグルタミン酸からなる群から選択された負電荷をもつアミノ酸残基により置換され；（ｉｉ）位置８７、１１８、及び２４４のそれぞれのアミノ酸残基は、アルギニン、ヒスチジン、及びリシンからなる群から選択された正電荷をもつアミノ酸残基により置換され；及び（ｉｉｉ）位置１２８、１２９、及び１３０のそれぞれのアミノ酸残基は、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、及びバリンからなる群から選択された中性のアミノ酸残基により置換される。このようなプロテアーゼ変異体の一部のものでは、上記プロテアーゼ変異体のアミノ酸配列は、アミノ酸置換Ｎ７６Ｄ＋Ｓ８７Ｒ＋Ｇ１１８Ｒ＋Ｓ１２８Ｌ＋Ｐ１２９Ｑ＋Ｓ１３０Ａ＋Ｓ１８８Ｄ＋Ｖ２４４Ｒを含む。
【０１６４】
一態様では、本発明は、配列番号６で示されるアミノ酸配列を含むプロテアーゼ変異体（例えば、サブチリシン変異体）をコードしているポリヌクレオチド配列を含む単離された核酸、組み換え核酸、実質的に純粋な核酸又は非天然に生じる核酸を提供する。他の態様では、本発明は、配列番号９のポリヌクレオチド配列、又はその相補的なポリヌクレオチド配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のヌクレオチド配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む、単離された核酸、組み換え核酸、実質的に純粋な核酸又は非天然に生じる核酸を提供する。一態様では、本発明は、配列番号９のポリヌクレオチド配列又はその相補的ポリヌクレオチド配列を含む、単離された核酸、組み換え核酸、実質的に純粋な核酸又は非天然に生じる核酸を提供する。
【０１６５】
一態様では、本発明は、配列番号８で示されるアミノ酸配列を含むプロテアーゼ変異体（例えば、サブチリシン変異体）をコードしているポリヌクレオチド配列を含む単離された核酸、組み換え核酸、実質的に純粋な核酸又は非天然に生じる核酸を提供する。他の態様では、本発明は、配列番号１１のポリヌクレオチド配列、又はその相補的なポリヌクレオチド配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のヌクレオチド配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む、単離された核酸、組み換え核酸、実質的に純粋な核酸又は非天然に生じる核酸を提供する。一態様では、本発明は、配列番号１１のポリヌクレオチド配列又はその相補的ポリヌクレオチド配列を含む、単離された核酸、組み換え核酸、実質的に純粋な核酸又は非天然に生じる核酸を提供する。
【０１６６】
一態様では、本発明は、タンパク質分解活性を有するプロテアーゼ変異体（例えば、サブチリシン変異体）をコードするポリヌクレオチド配列を含む、単離された核酸、組み換え核酸、実質的に純粋な核酸又は非天然に生じる核酸を提供し、上記プロテアーゼ変異体は、配列番号１のアミノ酸配列に対し少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、上記プロテアーゼ変異体のアミノ酸配列は、配列番号１に対するアミノ酸位置７６、８７、１１８、１２８、１２９及び１３０のそれぞれのアミノ酸残基に、異なるアミノ酸残基による置換を含み、並びに（ｉ）アミノ酸位置１８８のセリン残基、若しくはアスパラギン酸残基ではない異なるアミノ酸残基による位置１８８のセリン残基の置換、及び／又は（ｉｉ）アミノ酸位置２４８のアスパラギン残基、若しくはアルギニン残基ではない異なるアミノ酸残基による位置２４８のアスパラギン残基の置換を含み、アミノ酸位置は、プロテアーゼ変異体のアミノ酸配列を配列番号２で示されるサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列と整列させることで決定される、サブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列中の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。このようにコードされるプロテアーゼ変異体の一部のものは、アミノ酸位置１８８にセリン残基を、又はアミノ酸位置２４８にアルギニン残基を含むアミノ酸配列を含む。一態様では、一部のこのようなプロテアーゼ変異体は、（ｉ）アミノ酸位置１８８のセリン残基、若しくはアスパラギン酸残基ではない異なるアミノ酸残基による位置１８８のセリン残基の置換、及び（ｉｉ）アルギニン残基による位置２４８のアスパラギン残基の置換を含む。一部のこのようなプロテアーゼ変異体は、（ｉ）アスパラギン酸残基による位置１８８のセリン残基の置換、及び（ｉｉ）位置２４８のアスパラギン残基、若しくはアルギニン残基ではない異なるアミノ酸残基による位置２４８のアスパラギン残基の置換を含む。このようなプロテアーゼ変異体の一部のものは、配列番号１のアミノ酸位置７６、８７、１１８、１２８、１２９、及び１３０のそれぞれのアミノ酸残基に異なるアミノ酸による置換を含むアミノ酸配列を含むことから、−２、−１、０、＋１、＋２、＋３、又は＋４の正味電荷を有するプロテアーゼ変異体が生成される。このようなプロテアーゼ変異体の一部のものでは：（ｉ）位置７６のアミノ酸残基が、アスパラギン酸及びグルタミン酸からなる群から選択された負電荷をもつアミノ酸残基により置換され、（ｉｉ）位置８７及び１１８のそれぞれのアミノ酸残基が、アルギニン、ヒスチジン、及びリシンからなる群から選択された、正電荷をもつアミノ酸残基により置換され、及び（ｉｉｉ）位置１２８、１２９、及び１３０のそれぞれのアミノ酸残基が、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、及びバリンからなる群から選択された非荷電のアミノ酸残基で置換される。
【０１６７】
一態様では、本発明は、配列番号７で示されるアミノ酸配列を含むプロテアーゼ変異体（例えば、サブチリシン変異体）をコードするポリヌクレオチド配列を含む、単離された核酸、組み換え核酸、実質的に純粋な核酸又は非天然に生じる核酸を提供する。
【０１６８】
他の態様では、本発明は、配列番号１０のポリヌクレオチド配列、又はその相補的なポリヌクレオチド配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のヌクレオチド配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む、単離された核酸、組み換え核酸、実質的に純粋な核酸又は非天然に生じる核酸を提供する。一態様では、本発明は、配列番号１０のポリヌクレオチド配列又はその相補的ポリヌクレオチド配列を含む、単離された核酸、組み換え核酸、実質的に純粋な核酸又は非天然に生じる核酸を提供する。
【０１６９】
同様に、タンパク質分解活性を有するプロテアーゼ変異体をコードしているポリヌクレオチド配列を含む、単離された核酸、組み換え核酸、実質的に純粋な核酸又は非天然に生じる核酸も提供され、上記プロテアーゼ変異体（例えば、サブチリシン変異体）は：
（ａ）２５個以下、２０個以下、１５個以下、１４個以下、１３個以下、１２個以下、１１個以下、１０個以下、９個以下、８個以下、７個以下、又は６個以下のアミノ酸残基が、配列番号１のアミノ酸配列と異なっており；かつ
（ｂ）配列番号１のアミノ酸位置７６、８７、１１８、１２８、１２９、及び１３０のそれぞれのアミノ酸残基に異なるアミノ酸残基による置換を含み、かつ（ｉ）アミノ酸位置１８８のセリン残基、若しくはアスパラギン酸残基ではない異なるアミノ酸残基による位置１８８のセリン残基の置換、及び／又は（ｉｉ）アミノ酸位置２４８のアスパラギン残基、若しくはアルギニン残基ではない異なるアミノ酸残基による位置２４８のアスパラギン残基の置換を含む、アミノ酸配列からなり、アミノ酸位置は、プロテアーゼ変異体のアミノ酸配列を配列番号２で示されるバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列と整列させることで決定される、バチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列中の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。このようにコードされるプロテアーゼ変異体の一部のものは、（ｉ）アミノ酸位置１８８のセリン残基、若しくはアスパラギン酸残基ではない異なるアミノ酸残基による位置１８８のセリン残基の置換、及び（ｉｉ）アルギニン残基による位置２４８のアスパラギン残基の置換を含む、アミノ酸配列を含む。このようにコードされるプロテアーゼ変異体の一部のものは、アスパラギン酸残基による位置１８８のセリン残基の置換を含み、かつ（ｉｉ）位置２４８のアスパラギン残基、若しくはアルギニン残基ではない異なるアミノ酸残基による位置２４８のアスパラギン残基の置換を含む、アミノ酸配列を含む。
【０１７０】
他の態様では、本発明は、タンパク質分解活性を有する単離されたプロテアーゼ変異体、組み換えプロテアーゼ変異体、実質的に純粋なプロテアーゼ変異体又は非天然に生じるプロテアーゼ変異体（例えば、サブチリシン変異体）を提供し、上記プロテアーゼ変異体は、（ａ）２５個以下、２０個以下、１５個以下、１４個以下、１３個以下、１２個以下、１１個以下、１０個以下、９個以下又は８個以下のアミノ酸残基が、配列番号１で示されるアミノ酸配列と異なっており、かつ（ｂ）配列番号１の位置７６、８７、１１８、１２８、１２９、１３０、１８８、及び２４４のそれぞれのアミノ酸にアミノ酸残基の置換を含む、アミノ酸配列からなり、アミノ酸位置は、プロテアーゼ変異体のアミノ酸配列を配列番号２で示されるバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列と整列させることで決定される、バチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’中の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。
【０１７１】
一態様では、本発明は、配列番号９、１０、及び１１のうちの任意のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む、単離された核酸、組み換え核酸、実質的に純粋な核酸又は非天然に生じる核酸を提供する。
【０１７２】
本発明の核酸は、任意の好適な合成法、操作法及び／又は単離技術、又はこれらの組み合わせを用いることで生成することができる。例えば、本発明のポリヌクレオチドは、当業者に周知の固相合成法などの標準的な核酸合成技術を用い製造することもできる。このような技術では、典型的には最大で５０個又はそれ以上のヌクレオチド塩基の断片が合成され、次いで（例えば、酵素的な若しくは化学的な連結方法、又はポリメラーゼによる組み換え方法により）連結されることで、本質的に任意の所望の連続的な核酸配列が生成される。本発明の核酸の合成は、例えば、Ｂｅａｕｃａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２２：１８５９〜６９に記載される古典的なホスホラミダイト法、又は例えば典型的には自動合成法で実施される、Ｍａｔｔｈｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）ＥＭＢＯ  Ｊ．３：８０１〜０５に記載の方法を用いて、化学的な合成により促進することも（又は代替的に実施することも）できる。本発明の核酸は、自動ＤＮＡ合成装置を用い製造することもできる。カスタマイズされた核酸は、Ｔｈｅ  Ｍｉｄｌａｎｄ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ（ｍｃｒｃ＠ｏｌｉｇｏｓ．ｃｏｍ）、ｔｈｅ  Ｇｒｅａｔ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ（ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ  ｗｅｂｓｉｔｅ  ａｄｄｒｅｓｓ  ｇｅｎｃｏ．ｃｏｍ）、Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．（Ａｌａｍｅｄａ，Ｃａｌｉｆ．）、及びＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）などの各種供給業者に発注することができる。核酸を合成する他の技術及び関連する原理は、例えば、Ｉｔａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３（１９８４）及びＩｔａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８：１０５６（１９８４）に記載されている。
【０１７３】
核酸の改変に有用な組み換えＤＮＡ技術は当該技術分野において周知である。例えば、制限エンドヌクレアーゼによる消化、ライゲーション、逆転写、及びｃＤＮＡ産生、並びにポリメラーゼ連鎖反応（例えば、ＰＣＲ）などの技法が知られており、当業者により容易に選択される。有用な組み換えＤＮＡ技術及びそれらに関連する原理は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、及びこの第３版（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４〜１９９９）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ；並びにＢｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ，「Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，」ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｖｏｌ．１５２，Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡに記載されている。
【０１７４】
本発明のヌクレオチドは、本発明のプロテアーゼ変異体のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドとハイブリッド形成することのできる、又はこれをＰＣＲ増幅することのできるオリゴヌクレオチドプローブを１つ以上用い、ｃＤＮＡライブラリ（本明細書に記載のものを含む、当該技術分野で一般的に使用される変異導入技術を用いて生成される）をスクリーニングすることでも得ることができる。ｃＤＮＡクローンのスクリーニング及び単離手順、及びＰＣＲによる増幅手順は当業者に周知のものであり、例えば、Ｂｅｒｇｅｒ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、及びＡｕｓｕｂｅｌ（すべて上掲）に記載される。本発明の核酸のうち一部のものは、天然に生じるポリヌクレオチド主鎖（例えば、酵素又は親プロテアーゼをコードしているポリヌクレオチド）を、例えば既知の変異導入法（例えば、部位特異的変異導入、部位特異的飽和変異導入、及びインビトロでの組み換え）を用い改変することで得ることができる。
【０１７５】
本発明の改変プロテアーゼ変異体の製造方法
本発明のプロテアーゼ変異体をコードしている本発明の改変ポリヌクレオチドを生成するのに好適な様々な方法が当該技術分野において既知であり、限定するものではないが、例えば、部分飽和変異導入、系統的変異導入法、挿入変異、欠失変異、ランダム変異、部位特異的変異導入、及び定向進化、並びに様々な他の組み換え手法が挙げられる。改変ポリヌクレオチド及びタンパク質（例えば、プロテアーゼ変異体）の製造法としては、ＤＮＡシャフリング法（例えば、Ｓｔｅｍｍｅｒ  ＷＰ，９１（２２）：１０７４７〜５１（１９９４）を参照されたい）、遺伝子の非相同組み換えに基づく例えばＩＴＣＨＹ（Ｏｓｔｅｒｍｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，７（１０）：２１３９〜４４（１９９９）），ＳＣＲＡＣＨＹ（Ｌｕｔｚ  ｅｔ  ａｌ．９８（２０）：１１２４８〜５３（２００１）），ＳＨＩＰＲＥＣ（Ｓｉｅｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９（５）：４５６〜６０（２００１））、及びＮＲＲ（Ｂｉｔｔｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０（１０）：１０２４〜９（２００１）；Ｂｉｔｔｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０１（１８）：７０１１〜６（２００４））などの方法、並びにランダム及び標的変異を挿入、欠失、及び／又は挿入するためのオリゴヌクレオチドの使用に基づく方法（Ｎｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０（１２）：１２５１〜５（２００２）；Ｃｏｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０（１２）：１２４６〜５０（２００２）；Ｚｈａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．４（１）：３４〜９（２００３），Ｇｌａｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９（１２）：３９０３〜１３（１９９２），Ｓｏｎｄｅｋ  ａｎｄ  Ｓｈｏｒｔｌｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９（８）：３５８１〜５（１９９２），Ｙａｎｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３２（２０）：ｅ１５８（２００４），Ｏｓｕｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３２（１７）：ｅ１３６（２００４），Ｇａｙｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２９（３）：Ｅ９（２００１），及びＧａｙｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０（１６）：ｅ８４（２００２））が挙げられる。
【０１７６】
本発明のプロテアーゼ変異体を製造するためのベクター、細胞、及び方法
本発明は、本明細書に記載の本発明のポリヌクレオチドを少なくとも１種含む単離された又は組み換えベクター（例えば、本明細書に記載の本発明のプロテアーゼ変異体をコードしているポリヌクレオチド）、本発明の核酸又はポリヌクレオチドを少なくとも１種含有する単離された又は組み換えプロテアーゼ発現ベクター又は発現カセット、本発明の核酸又はポリヌクレオチドを少なくとも１種含有する単離された、実質的に純粋の、又は組み換えＤＮＡコンストラクト、本発明のポリヌクレオチドを少なくとも１種含有する単離された又は組み換え細胞、本発明のポリヌクレオチドを少なくとも１種含む細胞を含有している細胞培養物、本発明の核酸又はポリヌクレオチドを少なくとも１種含有する細胞培養物、並びにこのようなベクター、核酸、発現ベクター、発現カセット、ＤＮＡコンストラクト、細胞、細胞培養物、又はこれらの任意の組み合わせ又はこれらの混合物などを１種以上含有する組成物を提供する。
【０１７７】
一態様では、本発明は、本発明の核酸又はポリヌクレオチドを少なくとも１種含む本発明のベクター（例えば、発現ベクター又はＤＮＡコンストラクト）を少なくとも１つ含む組み換え細胞を提供する。このような組み換え細胞の一部のものは、このような少なくとも１つのベクターにより形質転換又は形質移入される。このような細胞は、典型的には宿主細胞と呼ばれる。このような細胞の一部のものは、細菌細胞、例えば、限定するものではないが、バチルス・スブチリス細胞などのバチルス種細胞を含む。本発明は、本発明のプロテアーゼ変異体を少なくとも１種含む組み換え細胞（例えば、組み換え宿主細胞）も提供する。
【０１７８】
一態様では、本発明は、本発明の核酸又はポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。一態様では、ベクターは、本発明のプロテアーゼ変異体をコードしている本発明のポリヌクレオチド配列が、効果的な遺伝子発現に必要とされる核酸断片に、又は追加の核酸断片に、制御可能なように連結される発現ベクター又は発現カセットである（例えば、プロモーターは、本発明のプロテアーゼ変異体をコードしている本発明のポリヌクレオチドに、制御可能なように連結される）。ベクターには、転写終結配列、及び／又は抗菌剤を含有している培地で増殖させることによりプラスミドを感染させた宿主細胞を持続的に維持培養することを可能にする、抗菌耐性遺伝子などの選別遺伝子を含ませてもよい。
【０１７９】
発現ベクターは、プラスミド又はウイルスＤＮＡから誘導することができ、あるいは代替的な実施形態では、これらの両方の要素を含有する。例示的なベクターとしては、限定するものではないが、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９９０）（例えば、第３章を参照されたい）のｐＸＸ、ｐＣ１９４、ｐＪＨ１０１、ｐＥ１９４、ｐＨＰ１３（Ｈａｒｗｏｏｄ  ａｎｄ  Ｃｕｔｔｉｎｇ（ｅｄｓ．））；９２頁に記載のＢ．スブチリスに好適な複製プラスミド；Ｐｅｒｅｇｏ，Ｍ．（１９９３）バチルス・スブチルスの遺伝的操作用の一体型ベクター（６１５〜６２４頁）；Ａ．Ｌ．Ｓｏｎｅｎｓｈｅｉｎ，Ｊ．Ａ．Ｈｏｃｈ，ａｎｄ  Ｒ．Ｌｏｓｉｃｋ（ｅｄ．），Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  Ｇｒａｍ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉａ：ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．が挙げられる。
【０１８０】
対象とするタンパク質（例えば、プロテアーゼ変異体）を細胞で発現及び産生させる際、改変プロテアーゼをコードしているポリヌクレオチドのコピーを少なくとも１つ及び好ましくは複数含む発現ベクターを少なくとも１つ用い、プロテアーゼの発現に好適な条件下で細胞を形質転換する。一態様では、プロテアーゼ変異体（並びにベクターに含有される他の配列）をコードしているポリヌクレオチド配列は宿主細胞のゲノムに組み込まれ、一方、他の態様では、プロテアーゼ変異体をコードしているポリヌクレオチド配列を含むプラスミドベクターは自律性の染色体外配列として細胞内に留まる。本発明は、染色体外の核酸配列、並びに宿主細胞のゲノムに組み込まれる組み込みヌクレオチド配列の両方を提供する。本明細書に記載のベクターは、本発明のプロテアーゼ変異体の産生に有用である。一態様では、プロテアーゼ変異体をコードしているポリヌクレオチドコンストラクトは、プロテアーゼ変異体をコードしているポリヌクレオチドを細菌染色体に組み込み及び場合により増幅することのできるベクター上に存在する。組み込むための部位の例には、当業者に周知の部位が包含される。一部の実施形態では、本発明のプロテアーゼ変異体をコードしているポリヌクレオチドの転写は、選択されたプロテアーゼ前駆体用の野生型プロモーターによりもたらされる。一部の他の実施形態では、プロモーターは、プロテアーゼ前駆体と非相同的なものであるものの、宿主細胞中で機能するものである。具体的には、細菌宿主細胞で使用するのに好適なプロモーターの例としては、限定するものではないが、例えば、ａｍｙＥ、ａｍｙＱ、ａｍｙＬ、ｐｓｔＳ、ｓａｃＢ、ｐＳＰＡＣ、ｐＡｐｒＥ、ｐＶｅｇ、ｐＨｐａＩＩプロモーター、Ｂ．ステアロサーモフィルスのマルトース生成型アミラーゼ遺伝子、Ｂ．アミロリケファシエンス（ＢＡＮ）アミラーゼ遺伝子、Ｂ．サブチリスのアルカリプロテアーゼ遺伝子、Ｂ．クラウシイのアルカリプロテアーゼ遺伝子、Ｂ．プミリスのキシロシダーゼ遺伝子、Ｂ．チューリンゲンシスのｃｒｙＩＩＩＡ、及びＢ．リケニフォルミスのα−アミラーゼ遺伝子が挙げられる。追加のプロモーターとしては、限定するものではないが、Ａ４プロモーター、並びにファージλＰＲ又はＰＬプロモーター、及び大腸菌ｌａｃ、ｔｒｐ又はｔａｃプロモーターが挙げられる。
【０１８１】
本発明のプロテアーゼ変異体は、微生物及び真菌を包含する任意の好適なグラム陽性細菌の宿主細胞で産生され得る。例えば、一部の実施形態では、プロテアーゼ変異体は真菌及び／又は微生物由来の宿主細胞で産生される。一部の実施形態では、宿主細胞は、バチルス種、ストレプトマイセス種（Streptomyces sp.）、エシェリキア種（Escherichia sp.）、又はアスペルギルス種（Aspergillus sp.）である。一部の実施形態では、プロテアーゼ変異体は、バチルス種の宿主細胞により産生される。本発明のプロテアーゼ変異体の産生での使用が見出されるバチルス種宿主細胞の例としては、限定するものではないが、Ｂ．リケニフォルミス、Ｂ．レンタス、Ｂ．スブチリス、Ｂ．アミロリケファシエンス、Ｂ．レンタス、Ｂ．ブレビス、Ｂ．ステアロサーモフィルス、Ｂ．アルカロフィルス、Ｂ．コアギュランス、Ｂ．サーキュランス、Ｂ．プミリス、Ｂ．チューリンゲンシス、Ｂ．クラウシイ、及びＢ．メガテリウム、並びにバチルス属内の他の生物が挙げられる。一部の実施形態では、Ｂ．スブチリス宿主細胞は、プロテアーゼ変異体の産生に使用される。米国特許第５，２６４，３６６号及び同第４，７６０，０２５号（再発行特許第３４，６０６号）は、本発明のプロテアーゼ変異体の産生に使用することができる様々なバチルス宿主株を記載するが、他の好適な株も使用することができる。
【０１８２】
本発明のプロテアーゼ変異体の産生に使用することができる幾つかの工業用菌種としては、非組み替え型（すなわち、野生型）のバチルス種株、並びに天然に生じる変異体株及び／又は組み換え株が挙げられる。一部の実施形態では、宿主株は組み換え株であり、宿主には、対象とするポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドが導入されている。一部の実施形態では、宿主株はＢ．スブチリス宿主株であり、特に組み換え型のバチルス・スブチルス宿主株である。数多くのＢ．スブチリス株が既知であり、限定するものではないが、例えば、１Ａ６（ＡＴＣＣ  ３９０８５）、１６８（１Ａ０１）、ＳＢ１９、Ｗ２３、Ｔｓ８５、Ｂ６３７、ＰＢ１７５３〜ＰＢ１７５８、ＰＢ３３６０、ＪＨ６４２、１Ａ２４３（ＡＴＣＣ  ３９，０８７）、ＡＴＣＣ  ２１３３２、ＡＴＣＣ  ６０５１、ＭＩ１１３、ＤＥ１００（ＡＴＣＣ  ３９，０９４）、ＧＸ４９３１、ＰＢＴ  １１０、及びＰＥＰ  ２１１株（例えば、Ｈｏｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７３：２１５〜２２８（１９７３）を参照されたい）（同様に米国特許第４，４５０，２３５号及び同第４，３０２，５４４号、及び欧州特許第０１３４０４８号を参照されたい、これらの各々は参照によりその全文が組み込まれる）。発現宿主細胞としてのＢ．スブチリスの使用は当業者に周知である（例えば、Ｐａｌｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １９：８１〜８７（１９８２）；Ｆａｈｎｅｓｔｏｃｋ  ａｎｄ  Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６５：７９６〜８０４（１９８６）；及びＷａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ６９：３９〜４７（１９８８）を参照されたい）。
【０１８３】
一部の実施形態では、バチルス宿主細胞は、次の遺伝子：ｄｅｇＵ、ｄｅｇＳ、ｄｅｇＲ及びｄｅｇＱのうち少なくとも１つの遺伝子が変異又は欠失しているバチルス種のものである。好ましくは、変異はｄｅｇＵ遺伝子に生じ、より好ましくは変異はｄｅｇＵ（Ｈｙ）３２である。例えば、Ｍｓａｄｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：８２４〜８３４（１９９０）及びＯｌｍｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２５３：５６２〜５６７（１９９７））を参照されたい。好ましい宿主株は変異ｄｅｇＵ３２（Ｈｙ）を保有しているバチルス・スブチルスである。一部の実施形態では、バチルス宿主は、ｓｃｏＣ４（例えば、Ｃａｌｄｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８３：７３２９〜７３４０（２００１）を参照されたい）；ｓｐｏＩＩＥ（例えば、Ａｒｉｇｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３１：１４０７〜１４１５（１９９９）を参照されたい）；及び／又はｏｐｐＡ又はｏｐｐオペロンの他の遺伝子（例えば、Ｐｅｒｅｇｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５：１７３〜１８５（１９９１）を参照されたい）に変異又は欠失を含む。実際に、本発明の改変バチルス株の一部の実施形態での使用が見出される、ｏｐｐＡ遺伝子の変異などの同様の表現型を生じる、ｏｐｐオペロンに生じる任意の変異が想到される。一部の実施形態では、これらの変異は単独で生じるものの、他の実施形態では変異の組み合わせが存在する。一部の実施形態では、本発明のプロテアーゼ変異体の産生に使用することができる改変されたバチルス宿主細胞株は、上記の遺伝子のうちの１つ以上に予め変異を含んでいるバチルス宿主株である。加えて、内因性のプロテアーゼ遺伝子に関する変異及び／又は欠失を含むバチルス種宿主細胞の使用も見出される。一部の実施形態では、バチルス宿主細胞はａｐｒＥ及びｎｐｒＥ遺伝子の欠失を含む。他の実施形態では、バチルス種宿主細胞ではプロテアーゼ遺伝子が５つ欠失している一方で、他の実施形態では、バチルス種宿主細胞ではプロテアーゼ遺伝子が９つ欠失している（例えば、米国特許第２００５／０２０２５３５号を参照されたい）。
【０１８４】
宿主細胞は、本発明のプロテアーゼ変異体を少なくとも１種コードしている核酸を少なくとも１つ用い、当該技術分野において既知の任意の好適な手段により形質転換される。ベクターに組み込まれる場合でも、あるいはプラスミドＤＮＡを存在させずに使用される場合でも、いずれにせよ、核酸は典型的には微生物に導入され、一部の実施形態では、好ましくは大腸菌細胞又は形質転換受容性のバチルス細胞に導入される。プラスミドＤＮＡコンストラクト又はベクターを利用して、核酸（例えば、ＤＮＡ）をバチルス細胞又は大腸菌細胞に導入する方法、及びこのようなプラスミドＤＮＡコンストラクト又はベクターにより細胞を形質転換する方法は周知である。一部の実施形態では、プラスミドは、続いて大腸菌細胞から単離され、バチルス細胞に導入される。しかしながら、必ずしも大腸菌などの微生物を介在させる必要はなく、一部の実施形態では、ＤＮＡコンストラクト又はベクターは直接バチルス宿主に導入される。
【０１８５】
当業者であれば、本発明の核酸又はポリヌクレオチド配列をバチルス細胞に導入するのに好適な方法は充分に承知している（例えば、Ｆｅｒｒａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，」ｉｎ  Ｈａｒｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄ．），Ｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．（１９８９），ｐｐ．５７〜７２；Ｓａｕｎｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５７：７１８〜７２６（１９８４）；Ｈｏｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．９３：１９２５〜１９３７（１９６７）；Ｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３：１３１〜１３５（１９８６）；及びＨｏｌｕｂｏｖａ，Ｆｏｌｉａ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３０：９７（１９８５）；Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１６８：１１〜１１５（１９７９）；Ｖｏｒｏｂｊｅｖａ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．７：２６１〜２６３（１９８０）；Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５１：６３４（１９８６）；Ｆｉｓｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３９：２１３〜２１７（１９８１）；及びＭｃＤｏｎａｌｄ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３０：２０３（１９８４）を参照されたい）。実際に、プロトプラスト形質転換及び会合（congression）を包含する形質転換、形質導入、及び原形質融合などの方法は周知であり、本発明での使用に適する。本発明のプロテアーゼ変異体をコードしている核酸を含むＤＮＡコンストラクト又はベクターを宿主細胞に導入するために、形質転換法が使用される。当該技術分野において既知である、バチルス細胞の形質転換方法としては、部分的に相同である常在性プラスミドを保持する形質転換受容性細胞による、ドナープラスミドの取り込みを包含する、プラスミドマーカーレスキュー形質転換などの方法が挙げられる（Ｃｏｎｔｅｎｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｓｍｉｄ  ２：５５５〜５７１（１９７９）；Ｈａｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２３：１８５〜１９１（１９９０）；Ｗｅｉｎｒａｕｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５４：１０７７〜１０８７（１９８３）；及びＷｅｉｎｒａｕｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：１２０５〜１２１１（１９８７））。この方法では、導入するドナープラスミドは、染色体の形質転換を模倣する方法で、常在性の「ヘルパー」プラスミドの相同領域を組み換える。
【０１８６】
一般的に使用される方法に加えて、一部の実施形態では、宿主細胞は、本発明のプロテアーゼ変異体をコードしている核酸を含むＤＮＡコンストラクト又はベクターにより直接的に形質転換される（すなわち、増幅に中間細胞が使用されず、あるいは別の方法では、ＤＮＡコンストラクト又はベクターは、宿主細胞への導入前に使用されない）。本発明のＤＮＡコンストラクト又はベクターの宿主細胞への導入法には、プラスミド又はベクター中に挿入せずに核酸配列（例えば、ＤＮＡ配列）を宿主細胞に導入するための、当該技術分野において既知の物理的及び化学的方法が包含される。このような方法としては、限定するものではないが、塩化カルシウム沈殿、電気穿孔法、ネイキッドＤＮＡ法、及びリポソーム法などが挙げられる。更なる実施形態では、ＤＮＡコンストラクト又はベクターは、プラスミドに挿入されず、プラスミドと共に同時形質転換に使用される。加えて、更なる実施形態では、選択マーカーは、当該技術分野において既知の方法により、改変バチルス株から削除される（Ｓｔａｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５８：４１１〜４１８（１９８４）；及びＰａｌｍｅｒｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ２４７：２５５〜２６４（２０００）を参照されたい）。
【０１８７】
一部の実施形態では、本発明の形質転換細胞は、従来の栄養培地で培養される。温度及びｐＨなどの、好適な特異的な培養条件は、当業者には既知のものである。また、一部の培養条件は、Ｈｏｐｗｏｏｄ（２０００）Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｊｏｈｎ  Ｉｎｎｅｓ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｎｏｒｗｉｃｈ  ＵＫ；Ｈａｒｄｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）などの科学文献に見出すことができる。一態様では、本発明は、本発明のプロテアーゼ変異体を少なくとも１種又は本発明の核酸を少なくとも１種含む培養物（例えば、細胞培養物）を提供する。同様に、本発明の核酸、ベクター、又はＤＮＡコンストラクトを少なくとも１つ含む組成物も提供する。
【０１８８】
一部の実施形態では、本発明のプロテアーゼ変異体を少なくとも１種コードしている少なくとも１つのポリヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞を、本発明のプロテアーゼの発現を可能にする条件下で、好適な栄養培地で培養した後、得られるプロテアーゼを培養物から回収する。細胞培養に使用する培地には、宿主細胞を増殖させるのに好適な、適切な添加剤を含有している最少培地又は複合培地などといった任意の従来の培地を含む。好適な培地は、販売元から入手することができ、又は公開されている処方に従って調製することもできる（例えば、ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎのカタログのように）。一部の実施形態では、細胞より産生されたプロテアーゼは、限定するものではないが、例えば、遠心沈降又は濾過による培地からの宿主細胞の分離、上清のタンパク質成分の沈殿又は塩（例えば、硫酸アンモニウム）を用いる濾過、クロマトグラフィー精製（例えば、イオン交換、ゲル濾過、親和性など）などの従来法により培養培地から回収される。本発明のプロテアーゼ変異体の回収又は精製に好適な任意の方法を使用することができる。
【０１８９】
一態様では、組み換え宿主細胞により産生されたプロテアーゼ変異体は、培養培地に分泌される。精製の助けとなるドメインをコードしている核酸配列を使用して、可溶性タンパク質の精製を容易にすることもできる。プロテアーゼ変異体をコードしているポリヌクレオチド配列を含むベクター又はＤＮＡコンストラクトには、プロテアーゼ変異体の精製を容易にするために、精製を容易にするドメインをコードしている核酸配列を更に含ませることもできる（例えば、Ｋｒｏｌｌ，Ｄ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２：４４１〜５３（１９９３）を参照されたい）。このような、精製を容易にするドメインとしては、限定するものではないが、例えば、固定化させた金属による精製を可能にする、ヒスチジン−トリプトファンモジュールなどの金属キレートペプチド（Ｐｏｒａｔｈ  Ｊ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．３：２６３〜２８１（１９９２））、固定化させた免疫グロブリンによる精製を可能にする、プロテインＡドメイン、及びＦＬＡＧＳを用いる伸展／アフィニティ精製系（Ｉｍｍｕｎｅｘ  Ｃｏｒｐ．，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）に利用することのできるドメインが挙げられる。精製ドメイン及び非相同的なタンパク質間に、ファクターＸＡ又はエンテロキナーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）などの、開裂させることのできるリンカー配列を包含させることによっても精製が促進されることが見出されている。
【０１９０】
本発明のプロテアーゼ変異体などの酵素の酵素活性の検出及び測定アッセイは周知である。例えば、本発明のプロテアーゼ変異体などのプロテアーゼの活性を検出及び測定するための様々なアッセイも当業者には既知である。具体的なアッセイを、カゼイン又はヘモグロビンからの酸可溶性ペプチドの放出に基づき、２８０ｎｍ下での吸光度として測定され、又はフォリン法を用いる比色測定により測定されるプロテアーゼ活性の測定に利用することができる（例えば、Ｂｅｒｇｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ」ｖｏｌ．５，Ｐｅｐｔｉｄａｓｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ，Ｖｅｒｌａｇ  Ｃｈｅｍｉｅ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ（１９８４）を参照されたい）。他の例示的なアッセイは、可溶性の発色性基質を包含する（例えば、Ｗａｒｄ，「Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ，」ｉｎ  Ｆｏｇａｒｔｙ（ｅｄ．）．，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｌｏｎｄｏｎ，（１９８３），ｐｐ．２５１〜３１７を参照されたい）。他の例示的なアッセイとしては、限定するものではないが、スクシニル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−パラニトロアニリドアッセイ（ＳＡＡＰＦｐＮＡ）及び２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸ナトリウム塩アッセイ（ＴＮＢＳアッセイ）が挙げられる。当該技術分野において既知のものである多数の更なる参照文献により、好適な方法が提供される（例えば、Ｗｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１１：７９１１〜７９２５（１９８３）；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２３：１１９〜１２９（１９９４）；及びＨｓｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４２：２２１〜２２７（１９９９）を参照されたい）。
【０１９１】
宿主細胞での成熟プロテアーゼ（例えば、本発明の成熟プロテアーゼ変異体）の産生レベルを判定するために、様々な方法を使用することができる。このような方法としては、限定するものではないが、例えば、プロテアーゼに特異的なポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のいずれかを利用する方法が挙げられる。例示的な方法としては、限定するものではないが、例えば、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、及び蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）が挙げられる。これらのアッセイ及びその他のアッセイは当該技術分野において周知のものである（例えば、Ｍａｄｄｏｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５８：１２１１（１９８３）を参照されたい）。
【０１９２】
他の態様では、本発明は、本発明の成熟型のプロテアーゼ変異体を製造又は産生する方法を提供する。成熟型のプロテアーゼ変異体は、シグナルペプチド配列又はプロペプチド配列を含まない。この方法の一部のものは、例えば、バチルス・スブチルス細胞などのバチルス種細胞といった、組み換え細菌宿主細胞により、本発明のプロテアーゼ変異体を製造又は産生させることを含む。一態様では、本発明は、本発明のプロテアーゼ変異体の産生方法であって、この方法は、本発明のプロテアーゼ変異体をコードしている核酸を含む組み換えプロテアーゼ発現ベクターを含む組み換え宿主細胞を、プロテアーゼ変異体の産生を誘導する条件下で培養する工程を含む、方法を提供する。このような方法の一部のものは、更に、培養物からプロテアーゼ変異体を回収する工程を含む。
【０１９３】
一態様では、本発明は、本発明のプロテアーゼ変異体の製造方法であって、この方法は：（ａ）本発明のプロテアーゼ変異体をコードしている核酸を含む組み換えプロテアーゼ発現ベクターを細胞集団（例えば、バチルス・スブチルス細胞などの細菌細胞）に導入する工程；並びにｂ）発現ベクターによりコードされているプロテアーゼ変異体の産生を誘導する条件下で培養培地中で細胞を培養する工程、を含む、方法を提供する。このような方法のうち一部のものは、（ｃ）細胞又は培養培地からプロテアーゼ変異体を単離する工程、を更に含む。
【０１９４】
本発明のクリーニング組成物
他の態様では、本発明は、本発明のポリペプチド（例えば、プロテアーゼ変異体）を１種以上含む組成物（例えば、クリーニング組成物）を提供する。このような組成物は、賦形剤若しくは担体、及び／又は他の代替物、成分、若しくは材料を少なくとも１つ含み得る。本明細書で更に記載されるように、本発明のプロテアーゼ変異体を包含する本発明のポリペプチドは、洗濯物クリーニング用途、食器自動洗浄用途、食器手洗い用途、硬質表面クリーニング用途、及び本明細書に記載される他の用途を包含する、各種クリーニング用途に有用である。したがって、例えば一態様では、本発明は、本発明のポリペプチド（例えば、プロテアーゼ変異体）を少なくとも１種含むクリーニング組成物を提供する。上記のように、このようなクリーニング組成物としては、限定するものではないが、例えば、食器自動洗浄用及び手洗い用洗剤組成物、洗濯洗剤組成物（例えば、液体及び粉末洗濯洗剤組成物など）、硬質表面クリーニング組成物（限定するものではないが、例えば、非食器類、非食卓用食器類、テーブル、卓上、家具、壁、床、天井などの硬質表面）が挙げられる。クリーニングする必要のある物品又は表面をクリーニングする方法に有用である、このようなクリーニング組成物は、例えば、限定するものではないが、賦形剤、担体、及び／又は他の代替物、成分、又は材料を少なくとも１つ含み得る。一態様では、本発明は、本明細書及び本案件を通して記載される本発明の任意の組成物（例えば、クリーニング組成物又は洗剤組成物）を提供し、上記組成物は、本案件を通して及び本明細書に記載される本発明の任意のポリペプチド（例えば、本発明の任意のプロテアーゼ変異体又はサブチリシン変異体）を含有するが、ここで、上記組成物は食器自動洗浄用組成物（例えば、自動食器洗浄用洗剤組成物）ではない。
【０１９５】
特に記載がない限り、本明細書に提供される成分又は組成物の濃度はすべて、成分又は組成物の活性レベルに対するものであり、市販の供給源に存在し得る不純物、例えば、残留溶媒又は副生成物は除外される。酵素成分の重量は活性タンパク質の合計に基づくものである。百分率及び比率はすべて、別途記載のない限り重量で計算される。百分率及び比率はすべて、別途記載のない限り組成物全体を基準にして計算される。例示された洗剤組成物において、酵素濃度は、組成物の合計重量に基づき純粋な酵素濃度として表現され、かつ別途記載のない限り、洗剤成分は組成物の合計重量に基づき表現される。
【０１９６】
本明細書で示されるように、一部の実施形態では、本発明のクリーニング組成物は更に補助剤を１種以上含んでもよく、限定するものではないが、補助剤としては、例えば、界面活性剤を１種以上、ビルダー、漂白剤、漂白活性化剤、漂白触媒、他の酵素、酵素安定化剤、キレート剤、蛍光増白剤、汚れ遊離ポリマー、移染剤、分散剤、抑泡剤、染料、香料、着色剤、充填剤塩、ヒドロトロープ、光活性化剤、蛍光発色剤、布地コンディショナー、加水分解性界面活性剤、保存料、抗酸化剤、収縮防止剤、防皺剤、殺菌剤、防かび剤、色スペックル、銀ケア剤、防曇化剤及び／又は抗腐食剤、アルカリ供給源、可溶化剤、担体、加工助剤、色素、すすぎ助剤（例えば、クリーニングされる物品の表面から水を吸収することにより水滴が形成されるのを防ぐための界面活性剤を少なくとも１種含有している、液滴形成型のものではなく薄いシート形態のすすぎ助剤）、及び／又はｐＨ調整剤（例えば、米国特許第６，６１０，６４２号、同第６，６０５，４５８号、同第５，７０５，４６４号、同第５，７１０，１１５号、同第５，６９８，５０４号、同第５，６９５，６７９号、同第５，６８６，０１４号及び同第５，６４６，１０１号を参照されたい。これらのすべては参照により本案件に組み込まれる）が挙げられる。クリーニング組成物材料の具体例は以下に詳細に例示する。所望のクリーニング組成物において、クリーニング助剤が本発明のプロテアーゼ変異体と適合性でない場合、これら２つの成分を組み合わせることが適切になるまでの間、クリーニング助剤とプロテアーゼ変異体を分離させておく（すなわち、互いに接触させずにおく）のに好適な方法が使用される。このような分離手法には、当該技術分野において既知の任意の好適な方法が包含される（例えば、ゲルキャップ法、カプセル封入、錠剤、物理的分離など）。
【０１９７】
本発明のクリーニング組成物は、例えば、洗濯用途、硬質表面クリーニング用途、食器手洗い又は食器手動洗浄用途、食器自動洗浄用途、眼鏡クリーニング用途、並びに義歯、歯、毛髪、及び皮膚のクリーニングなどの化粧品用途に好都合に採用される。低温の溶液で効果が増加するという独特の利点に起因し、本発明のプロテアーゼ変異体酵素は、洗濯用途及び食器洗浄用途（食器手洗い及び自動洗浄用途を含む）に適する。更に、本発明のプロテアーゼ変異体酵素は、固体、ゲル、顆粒、及び／又は液体洗剤組成物及び／又は配合物を包含する、固体、ゲル、顆粒、及び／又は液体組成物での使用が見出される。
【０１９８】
本発明のプロテアーゼ変異体は、クリーニング助剤製品での使用も見出される。一部の実施形態では、本発明のプロテアーゼ変異体は、低温の溶液を用いるクリーニング用途及び方法で有用である。一態様では、本発明は、本発明の酵素プロテアーゼ変異体を少なくとも１種含むクリーニング助剤組成物を提供し、このクリーニング助剤組成物は、更なる漂白効果が所望される場合に、洗浄プロセスに包含させるのに理想的に適している。このような場合の例としては、限定するものではないが、例えば、低温溶液クリーニング用途が挙げられる。一部の実施形態では、助剤組成物はその最も単純な形態であり、すなわち、本発明のプロテアーゼ変異体１種以上である。一部の実施形態では、助剤組成物は、クリーニング過程で添加するために、単位容量形態でパッケージングされている。一部の実施形態では、助剤組成物は、クリーニング過程で添加するために、単位容量形態でパッケージングされており、助剤組成物には過酸素源が採用され、漂白効果の増加が所望される。限定するものではないが、例えば、丸剤、錠剤、ゲルキャップ、又は予め計量された粉末若しくは液体などの他の一回用量単位が挙げられる、任意の好適な一回用量単位形態を使用することができる。したがって、一態様では、本発明は、本発明のプロテアーゼ変異体を少なくとも１種含むクリーニング組成物を提供し、この組成物は、一回用量のプロテアーゼ変異体を提供するような好適な一回用量単位の好適な形態（例えば、液体、粉末、固形、丸剤、錠剤、ゲルキャップ、又は他の好適な形態）で配合される。このような洗浄製品は、限定するものではないが、例えば、機械又は手洗い洗濯法及び用途、食器自動洗浄法又は食器手洗い法及び用途などの各種クリーニング方法及び用途に有用である。このようなクリーニング方法及び用途は、低温又は低ｐＨ条件下で実施することができる。一部の実施形態では、充填剤を少なくとも１種及び／又は担体材料を少なくとも１種包含させて、組成物の容量を増量させる。好適な充填剤又は担体材料としては、限定するものではないが、例えば、様々な硫酸塩、炭酸塩及びケイ酸塩並びにタルク、及びクレイなどが挙げられる。液体組成物に好適な充填剤又は担体材料としては、限定するものではないが、例えば、水、又はポリオール及びジオールなどの低分子量の一級及び二級アルコールが挙げられる。このようなアルコールの例としては、限定するものではないが、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール及びイソプロパノールが挙げられる。一部の実施形態では、組成物は、このような充填剤又は担体材料を約５％〜約９０％含有する。このような組成物に酸性の充填剤を含有させて、リーニング方法又は用途で得られる溶液のｐＨを低下させることもできる。あるいは、一部の実施形態では、以下により詳細に記載されるような１種以上の補助成分がクリーニング助剤とし含有される。
【０１９９】
本発明のクリーニング組成物及びクリーニング助剤は、有効量の本発明のプロテアーゼ変異体を少なくとも１種、単独で、又は他のプロテアーゼ及び／若しくは追加の酵素との組み合わせで必要とする。必要とされる酵素レベルは、本発明のプロテアーゼ変異体を１種以上添加することで達成される。典型的には、クリーニング組成物は、本発明のプロテアーゼ変異体のうち少なくとも１種を、少なくとも約０．０００１重量％〜約２０重量％、約０．０００１〜約１０重量％、約０．０００１〜約１重量％、約０．００１〜約１重量％、又は約０．０１〜約０．１重量％含む。一態様では、本発明の組成物（例えば、本発明のクリーニング組成物）は、本発明の活性プロテアーゼ変異体のうち少なくとも１種を、組成物１ｇあたり約０．０１ミリグラム（ｍｇ）〜約１０ｍｇ、約０．０１〜約５ｍｇ、約０．０１ｍｇ〜約２ｍｇ、約０．０１〜約１ｍｇ、約０．５ｍｇ〜約１０ｍｇ、約０．５〜約５ｍｇ、約０．５〜約４ｍｇ、約０．５〜約４ｍｇ、約０．５〜約３ｍｇ、約０．５〜約２ｍｇ、約０．５〜約１ｍｇ、約０．１〜約１０ｍｇ、約０．１〜約５ｍｇ、約０．１〜約４ｍｇ、約０．１〜約３ｍｇ、約０．１〜約２ｍｇ、約０．１〜約２ｍｇ、約０．１〜約１ｍｇ、約０．１〜約０．５ｍｇ含む。
【０２００】
本発明のクリーニング組成物は、典型的には、水性クリーニング操作での使用時に、洗浄水のｐＨが約５．０〜約１１．５又は更には約７．５〜約１０．５になるように配合される。液体製品組成物又は配合物の未希釈時ｐＨは、典型的には約３．０〜約９．０又は約３．０〜約５．０である。顆粒状洗濯製品組成物は、典型的にはｐＨが約９〜約１１になるよう配合される。食器手洗い用及び自動食器洗浄用洗剤組成物は、方法及び具体的な用途に依存して、典型的には、ｐＨが約８〜約１１．５になるよう、例えば、限定するものではないが、約８〜約１０、約９〜約１１．５、及び約９．５〜約１１．５のｐＨ範囲になるよう配合される。推奨される使用量でのｐＨを制御する技術には、緩衝剤、アルカリ、酸などの使用を含み、当業者には周知である。
【０２０１】
好適な低ｐＨのクリーニング組成物は、典型的には、未希釈時ｐＨが約３〜約５であり、典型的には、このようなｐＨ環境で加水分解される界面活性剤を含まない。このような界面活性剤としては、エチレンオキシド部分を少なくとも１つ又は更にはエチレンオキシドを約１〜約１６モル含むアルキル硫酸ナトリウム界面活性剤が挙げられる。このようなクリーニング組成物は、典型的には、未希釈時ｐＨが約３〜約５であるクリーニング組成物をもたらすのに十分な量のｐＨ調整剤、例えば、水酸化ナトリウム、モノエタノールアミン、又は塩酸などを含む。このような組成物は、典型的には、酸に安定な酵素を少なくとも１種含む。一部の実施形態では、組成物は液体である一方、他の実施形態では固体である。このような液体組成物のｐＨは、典型的には未希釈時ｐＨとして測定される。このような固形組成物のｐＨは、上記組成物の固形分１０％の溶液として測定され、ここで、溶媒は蒸留水である。これらの実施形態では、別途記載のない限り、ＰＨの測定はすべて２０℃で行われた。
【０２０２】
一部の実施形態では、本発明のプロテアーゼ変異体が顆粒状組成物又は液体組成物に採用された場合、保存時に、プロテアーゼ変異体を他の顆粒状組成物の成分から保護するために、プロテアーゼ変異体は、カプセル封入された粒子の形態であることが望ましい。加えて、カプセル封入は、クリーニング過程でプロテアーゼ変異体の利用能を制御する手段でもある。一部の実施形態では、カプセル封入は、プロテアーゼ変異体及び／又は追加の酵素の性能を上昇させる。この観点から、本発明のプロテアーゼ変異体は、当該技術分野において既知の任意の好適な封入剤によりカプセル封入される。一部の実施形態では、封入剤は、典型的には、本発明のプロテアーゼ変異体に関する触媒の少なくとも一部を封入する。一般的には、封入剤は、水溶性及び／又は水分散性である。一部の実施形態では、封入剤のガラス転移温度（Ｔｇ）は０℃以上である。ガラス転移温度は、国際公開第９７／１１１５１号により詳細に記載される。封入剤は、典型的には、炭水化物、天然又は合成ゴム、キチン、キトサン、セルロース及びセルロース誘導体、ケイ酸塩、リン酸塩、ホウ酸塩、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、パラフィンワックス、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。封入剤が炭水化物である場合、典型的には、単糖、オリゴ糖、多糖、及びこれらの組み合わせから選択される。一部の典型的な実施形態では、封入剤はデンプンである（例えば、欧州特許第０  ９２２  ４９９号；米国特許第４，９７７，２５２号、同第５，３５４，５５９号、及び同第５，９３５，８２６号を参照されたい）。一部の実施形態では、封入剤は、熱可塑性プラスチック、アクリロニトリル、メタクリロニトリル、ポリアクリロニトリル、ポリメタクリロニトリル及びこれらの混合物から製造されるプラスチック製のマイクロスフェア、並びに限定するものではないが、使用が見出される、ＥＸＰＡＮＣＥＬ（登録商標）（Ｓｔｏｃｋｖｉｋｓｖｅｒｋｅｎ，Ｓｗｅｄｅｎ）により供給されるもの、並びにＰＭ  ６５４５、ＰＭ  ６５５０、ＰＭ  ７２２０、ＰＭ  ７２２８、ＥＸＴＥＮＤＯＳＰＨＥＲＥＳ（登録商標）、ＬＵＸＳＩＬ（登録商標）、Ｑ−ＣＥＬ（登録商標）、及びＳＰＨＥＲＩＣＥＬ（登録商標）（ＰＱ  Ｃｏｒｐ．，Ｖａｌｌｅｙ  Ｆｏｒｇｅ，ＰＡ）などの市販のマイクロスフェアである。
【０２０３】
本明細書に記載されるとき、本発明のプロテアーゼ変異体は、限定するものではないが、例えば、クリーニング、洗濯、食器手洗い、及び食器自動洗浄洗剤組成物を包含する、クリーニング方法及び用途での使用が特に見出される。これらの用途では、様々な環境ストレス下に酵素を配置する。本発明のプロテアーゼ変異体は、様々な条件下でのタンパク質分解活性及び安定性に起因し、クリーニング用途などで現在使用されている多くの酵素を上回る利点を提供する。
【０２０４】
実際に、洗浄に関与するプロテアーゼが晒される、洗剤の配合、洗浄水の容量、洗浄水の温度、及び洗浄時間の長さの変更を含む、各種洗浄条件が存在する。加えて、異なる地理的条件下で使用される洗剤配合物では、洗浄水中に、関連する成分が異なる濃度で存在する。例えば、欧州の洗剤は一般的には１００万分率（ｐｐｍ）が４５００〜５０００の洗剤成分を洗浄水中に含有する一方、日本の洗剤は典型的には約６６７ｐｐｍの洗剤成分を洗浄水に有する。北アメリカ、特に合衆国では、一般的には約９７５ｐｐｍの洗剤成分が洗浄水中に存在する。
【０２０５】
低濃度洗剤系には、約８００ｐｐｍ未満の洗剤成分が洗浄水に存在する洗剤が包含される。洗浄水中に約６６７ｐｐｍの洗剤成分が存在していることから、日本の洗剤は、典型的には低濃度洗剤系と見なされる。
【０２０６】
中間濃度洗剤には、約８００ｐｐｍ〜約２０００ｐｐｍの洗剤成分が洗浄水中に存在する洗剤が包含される。洗浄水中に約９７５ｐｐｍの洗剤成分が存在していることから、北アメリカの洗剤は、一般に中間濃度洗剤系であると見なされる。ブラジルでは、典型的には洗浄水中に約１５００ｐｐｍの洗剤成分が存在する。
【０２０７】
高濃度洗剤系には、約２０００ｐｐｍ超の洗剤成分が洗浄水中に存在しているものが包含される。洗浄水中に約４５００〜５０００ｐｐｍの洗剤成分が存在していることから、欧州の洗剤は、一般に高濃度洗剤系であると見なされる。
【０２０８】
ラテンアメリカの洗剤は、概して高起泡性のリン酸ビルダー洗剤であり、洗浄水中に約１５００〜６０００ｐｐｍの範囲の洗剤成分が存在していることから、ラテンアメリカで使用されている洗剤の範囲は、中間濃度及び高濃度洗剤の両方に入り得る。上記のように、ブラジルでは、典型的には洗浄水中に約１５００ｐｐｍの洗剤成分が存在する。しかしながら、高起泡性のリン酸ビルダー洗剤が使用されている他の地域では、例えば、限定するものではないが、他のラテンアメリカの国々では、洗浄水中に、洗剤成分が最大で約６０００ｐｐｍ存在している高濃度洗剤系が使用されている場合がある。
【０２０９】
前述の内容を考慮すると洗剤組成物の濃度は、世界中の典型的洗浄溶液で、約８００ｐｐｍ未満の洗剤組成物（「洗剤濃度が低い地域」）、例えば、日本の約６６７ｐｐｍのものから、中間では約８００ｐｐｍ〜約２０００ｐｐｍの洗剤組成物（「洗剤濃度が中程度の地域」）、例えば、アメリカの約９７５ｐｐｍ及びブラジルの約１５００ｐｐｍのもの、そして約２０００ｐｐｍ超の洗剤組成物（「洗剤濃度が高い地域」）、例えば、欧州の約４５００ｐｐｍ〜約５０００ｐｐｍのもの、及び高起泡性リン酸ビルダーの地域では約６０００ｐｐｍのものへと幅広く変化することが明白である。
【０２１０】
典型的な洗浄溶液の濃度は経験的に判断される。例えば、米国では、一般的な洗濯機の洗浄溶液容量は約６４．４Ｌである。したがって、洗剤濃度が約９７５ｐｐｍの洗浄溶液を得るためには、６４．４Ｌの洗浄溶液に約６２．７９ｇの洗剤組成物を添加しなくてはならない。この量は、消費者により、洗浄水に洗剤用の軽量カップを用い量り入れられる典型的な量である。
【０２１１】
更なる例として、異なる地域では異なる洗浄温度が使用される。日本で使用されている洗浄温度は、典型的には、欧州で使用されているものよりも低い。例えば、北アメリカ及び日本での洗浄水の温度は、典型的には約１０℃〜約３０℃（例えば、約２０℃）の間である一方、欧州の洗浄水の温度は、典型的には約３０℃〜約６０℃（例えば、約４０℃）である。しかしながら、エネルギーの節約の観点から、多くの消費者は冷水を用いる洗浄法に切り替えている。加えて、一部の更なる地域では、典型的には洗濯並びに食器洗浄用途には冷水が使用されている。一部の実施形態では、本発明の「冷水洗浄」は、約１０℃〜約４０℃、又は約２０℃〜約３０℃、又は約１５℃〜約２５℃の洗浄温度、並びに約１５℃〜約３５℃の範囲内の他のすべての組み合わせの洗浄温度、及び１０℃〜４０℃の範囲に含まれる全範囲の洗浄温度を使用するものである。
【０２１２】
更なる例では、異なる地理条件下では、一般に異なる硬度の水が用いられている。水硬度は、通常、Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋混合物のガロンあたりのグレインとして記載される。硬度は、水に含まれるカルシウム（Ｃａ２＋）及びマグネシウム（Ｍｇ２＋）の尺度である。米国ではほとんどの水は硬水であるが、硬水の程度は異なる。中硬水（６０〜１２０ｐｐｍ）〜硬水（１２１〜１８１ｐｐｍ）は、百万分率で６０〜１８１（百万分率をＵＳガロンあたりのグレインに変換したものは、ｐｐｍ数を１７．１当量のグレイン毎ガロンで除算したものに相当する）の鉱物を含有する。
【０２１３】
【表１】
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【０２１４】
欧州の水硬度は、典型的には、約１８０（１０．５）ｐｐｍ（グレイン毎ガロン）超（例えば、約１８０〜約３４３ｐｐｍ（約１０．５〜約２０．０））のＣａ２＋／Ｍｇ２＋混合物である（例えば、約２５７ｐｐｍ（１５グレイン毎ガロン）のＣａ２＋／Ｍｇ２＋混合物）。北アメリカの水硬度は、典型的には日本の水硬度よりも高いものの、欧州の水硬度未満である。例えば、北アメリカの水硬度は、約３〜約１０グレイン（約５１〜約１７１ｐｐｍ）、約３〜約８グレイン（約５１〜約１３７ｐｐｍ）又は約６グレイン（１０３ｐｐｍ）であり得る。日本の水硬度は、典型的には北アメリカの水硬度よりも低く、通常Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋混合物は約６９ｐｐｍ（４）未満であり、例えば、約３グレイン毎ガロン（５１ｐｐｍ）である。
【０２１５】
したがって、一部の態様では、本発明は、少なくとも一組の洗浄条件（例えば、水温、水硬度、及び／又は洗剤濃度）下で驚くべき洗浄性能を示すプロテアーゼ変異体を提供する。一部の態様では、本発明のプロテアーゼ変異体の洗浄性能は、他のサブチリシンプロテアーゼに匹敵する。一部の態様では、本発明のプロテアーゼ変異体は、市販されている現行のサブチリシンプロテアーゼを上回る洗浄性能を呈する。したがって、本発明の一部の態様では、本明細書に提供されるプロテアーゼ変異体は、酸化安定性、熱安定性、様々な条件下でのクリーニング性能、及び／又はキレート化安定性が改良されている。加えて、本発明のプロテアーゼ変異体は、洗剤を単独で含有せず、あるいは洗剤をビルダー及び安定剤との組み合わせとしても含有しないクリーニング組成物での使用が見出されている。
【０２１６】
一態様では、本発明は、組成物の重量に基づき約０．００００１重量％〜約１０重量％の濃度で存在する本発明のプロテアーゼ変異体を少なくとも１種と、組成物の重量に基づき残部の分のクリーニング助剤を１種以上（例えば、約９９．９９９重量％〜約９０．０重量％）とを含む、クリーニング組成物を提供する。他の態様では、本発明は、組成物の重量の約０．０００１重量％〜約１０重量％、約０．００１重量％〜約５重量％、約０．００１重量％〜約２重量％、又は約０．００５重量％〜約０．５重量％の濃度で存在する本発明のプロテアーゼ変異体を少なくとも１種と、クリーニング助剤を１種以上含むクリーニング組成物の残部（例えば、約９９．９９９９重量％〜約９０．０重量％、約９９．９９９重量％〜約９８重量％、約９９．９９５重量％〜約９９．５重量％）とを含む、クリーニング組成物を提供する。
【０２１７】
一部の態様では、本発明のクリーニング組成物は、本発明のプロテアーゼ変異体を少なくとも１種に加えて、クリーニング性能及び／又は布地ケア及び／又は食器手洗い又は食器手動洗浄及び／又は食器自動洗浄利益を提供する追加の酵素を１種以上含む。好適な酵素の例としては、限定するものではないが、例えば、ヘミセルラーゼ、セルラーゼ、ペルオキシダーゼ、プロテアーゼ、キシラナーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、ペクテートリアーゼ、マンナナーゼ、ケラチナーゼ、還元酵素、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、タンナーゼ、ペントサナーゼ、マラナーゼ、β−グルカナーゼ、アラビノシダーゼ、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチナーゼ、ラッカーゼ、及び／又はアミラーゼ、中性メタロプロテアーゼ酵素（「ｎｐｒＥ」と略記）、又はこれらの混合物が挙げられる。一部の態様では、クリーニング組成物は、本発明のプロテアーゼ変異体を少なくとも１種に加えて、例えば、追加の少なくとも１種のプロテアーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、セルロース、及び／又はアミラーゼなどの、従来適用され得る酵素を含む追加の酵素の組み合わせ（すなわち「カクテル」）を含む。
【０２１８】
本明細書で提供されるプロテアーゼ変異体に加えて、任意の他の好適なプロテアーゼも本発明の組成物に使用することができ、本発明の組成物に含まれ得る。一態様では、本発明は、本発明のプロテアーゼ変異体を少なくとも１種及び追加のプロテアーゼを少なくとも１種含む組成物（例えば、クリーニング組成物）を提供する。好適なプロテアーゼとしては、動物、植物、又は微生物由来のものが挙げられる。一実施形態では、微生物のプロテアーゼを含ませることができる。化学的に又は遺伝的に改変させた変異型プロテアーゼを含ませることもできる。一態様では、少なくとも１種の追加のプロテアーゼはセリンプロテアーゼであり、好ましくはアルカリ性微生物のプロテアーゼ又はトリプシン様プロテアーゼである。アルカリ性プロテアーゼの例としては、サブチリシン、特にバチルス由来のサブチリシンが挙げられる（例えば、サブチリシン、Ｂ．レンタスのサブチリシン（すなわち、ＧＧ３６）、Ｂ．アミロリケファシエンスのサブチリシン（すなわち、ＢＰＮ’）、サブチリシンＣａｒｌｓｂｅｒｇ、サブチリシン３０９、サブチリシン１４７、ＰＢ９２、及びサブチリシン１６８）。更なる例としては、米国再発行特許第３４，６０６号、米国特許第５，９５５，３４０号、同第５，７００，６７６号、同第６，３１２，９３６号、及び同第６，４８２，６２８号に記載される変異型プロテアーゼ（すなわち、プロテアーゼ変異体）が挙げられる。これらの各々は参照により本案件に組み込まれる。追加のプロテアーゼとしては、限定するものではないが、トリプシン（例えば、ブタ又はウシ由来）、及び国際公開第８９／０６２７０号に記載のフサリウムプロテアーゼが挙げられる。本発明のプロテアーゼ変異体を少なくとも１種含む本発明の組成物は、市販のプロテアーゼ酵素も少なくとも１種含み得る。本発明の組成物での使用が見出される市販のプロテアーゼ酵素としては、限定するものではないが、例えば、ＭＡＸＡＴＡＳＥ（登録商標）、ＭＡＸＡＣＡＬ（商標）、ＭＡＸＡＰＥＭ（商標）、ＯＰＴＩＣＬＥＡＮ（登録商標）、ＯＰＴＩＭＡＳＥ（登録商標）、ＰＲＯＰＥＲＡＳＥ（登録商標）、ＰＵＲＡＦＥＣＴ（登録商標）、ＰＵＲＡＦＥＣＴ（登録商標）ＯＸＰ、ＰＵＲＡＭＡＸ（商標）、ＥＸＣＥＬＬＡＳＥ（商標）、及びＰＵＲＡＦＡＳＴ（商標）（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）；ＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）、ＳＡＶＩＮＡＳＥ（登録商標）、ＰＲＩＭＡＳＥ（登録商標）、ＤＵＲＡＺＹＭ（商標）、ＰＯＬＡＲＺＹＭＥ（登録商標）、ＯＶＯＺＹＭＥ（登録商標）、ＫＡＮＮＡＳＥ（登録商標）、ＬＩＱＵＡＮＡＳＥ（登録商標）、ＮＥＵＴＲＡＳＥ（登録商標）、ＲＥＬＡＳＥ（登録商標）及びＥＳＰＥＲＡＳＥ（登録商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）；Ａ２３０Ｖ＋Ｓ２５６Ｇ＋Ｓ２５９Ｎを有するＫＡＰバチルス・アルカロフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）のサブチリシン（花王）；及びＢＬＡＰ（商標）Ｂ．レンタスプロテアーゼ、ＢＬＡＰ  Ｘ、及びＢＬＡＰ  Ｓ（Ｈｅｎｋｅｌ  Ｋｏｍｍａｎｄｉｔｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ  ａｕｆ  Ａｋｔｉｅｎ，Ｄｕｅｓｓｅｌｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）が挙げられる。本発明の組成物に含ませることのできる追加のプロテアーゼとしては、国際公開第９５／２３２２１号、同第９２／２１７６０号、米国特許出願公開第２００８／００９０７４７号、及び米国特許第５，８０１，０３９号、同第５，３４０，７３５号、同第５，５００，３６４号、同第５，８５５，６２５号、米国再発行特許第３４，６０６号、同第５，９５５，３４０号、同第５，７００，６７６号、同第６，３１２，９３６号、及び同第６，４８２，６２８号、及び様々なその他の特許に記載のものが挙げられる。メタロプロテアーゼを本発明の組成物に含ませることもできる。このようなメタロプロテアーゼとしては、限定するものではないが、例えば、国際公開第０７／０４４９９３号に記載される中性のメタロプロテアーゼ酵素（ｎｐｒＥ）が挙げられる。
【０２１９】
一態様では、本発明は、本発明のプロテアーゼ変異体を少なくとも１種及びリパーゼを少なくとも１種含む組成物（例えば、クリーニング組成物）を提供する。好適なリパーゼとしては、限定するものではないが、例えば、微生物又は真菌由来のものが挙げられる。化学的に又は遺伝的に改質された変異型リパーゼを組成物に含ませることもできる。有用なリパーゼの例としては、ヒュミコラ・ラヌギノサ（Humicola lanuginosa）のリパーゼ（例えば、欧州特許第２５８  ０６８号及び同第３０５  ２１６号を参照されたい）、リゾムコール・ミエヘイ（Rhizomucor miehei）のリパーゼ（例えば、欧州特許第２３８  ０２３号を参照されたい）、カンジダ（Candida）のリパーゼ、例えばＣ・アンタルクチカ（C. antarctica）のリパーゼなど（例えば、Ｃ・アンタルクチカのリパーゼＡ又はＢ；例えば、欧州特許第２１４  ７６１号を参照されたい）、シュードモナス（Pseudomonas）のリパーゼ、例えば、Ｐ．アルカリゲネス（P. alcaligenes）のリパーゼ及びＰ．シュードアルカリゲネス（P. pseudoalcaligenes）のリパーゼなど（例えば、欧州特許第２１８  ２７２号を参照されたい）、Ｐ．セパシア（P. cepacia）のリパーゼ（例えば、欧州特許第３３１  ３７６号を参照されたい）、Ｐ．スタッツェリ（P. stutzeri）のリパーゼ（例えば、独国特許第１，３７２，０３４号を参照されたい）、Ｐ．フルオレッセンス（P. fluorescens）のリパーゼ、バチルスのリパーゼ（例えば、Ｂ．スブチリスのリパーゼ（Ｄａｒｔｏｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １１３１：２５３〜２６０（１９９３））；Ｂ．ステアロサーモフィルスのリパーゼ（例えば、日本国特許第６４／７４４９９２号を参照されたい）；及びＢ．プミラスのリパーゼ（例えば、国際公開第９１／１６４２２号を参照されたい））が挙げられる。
【０２２０】
加えて、数多くのクローン化されたリパーゼを本発明の組成物（例えば、クリーニング組成物）に使用することも見出されており、このようなリパーゼとしては、限定するものではないが、例えば、ペニシリウム・カメンベルチ（Penicillium camembertii）のリパーゼ（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １０３：６１〜６７（１９９１））、ジオトリカム・カンディダム（Geotricum candidum）のリパーゼ（Ｓｃｈｉｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０６：３８３〜３８８（１９８９））、及び様々なクモノスカビのリパーゼ、例えば、Ｒ．デレマー（R. delemar）のリパーゼ（Ｈａｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １０９：１１７〜１１３（１９９１））、Ｒ．ニベウス（R. niveus）のリパーゼ（Ｋｕｇｉｍｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５６：７１６〜７１９（１９９２））及びＲ．オリザエ（R. oryzae）のリパーゼが挙げられる。
【０２２１】
クチナーゼなどの他の種類の脂肪分解酵素も本発明の一部の実施形態での使用が見出されており、限定するものではないが、例えば、シュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）由来のクチナーゼ（国際公開第８８／０９３６７号を参照されたい）、及びフザリウム・ソラニ・ピシ（Fusarium solani pisi）由来のクチナーゼ（国際公開第９０／０９４４６号を参照されたい）が挙げられる。
【０２２２】
その他の好適なリパーゼとしては、Ｍ１  ＬＩＰＡＳＥ（商標）、ＬＵＭＡ  ＦＡＳＴ（商標）、及びＬＩＰＯＭＡＸ（商標）（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）；ＬＩＰＯＬＡＳＥ（登録商標）及びＬＩＰＯＬＡＳＥ（登録商標）ＵＬＴＲＡ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）；及びＬＩＰＡＳＥ  Ｐ（商標）「アマノ」（天野エンザイム，日本）などの市販のリパーゼが挙げられる。
【０２２３】
一部の実施形態では、本発明は、本発明のプロテアーゼ変異体を少なくとも１種、及び組成物の重量に基づき約０．００００１重量％〜約１０重量％の濃度で存在する追加のリパーゼを少なくとも１種、並びに組成物の重量に基づき残部でクリーニング助剤を１種以上含む、組成物（例えば、クリーニング組成物）を提供する。一態様では、本発明のクリーニング組成物は、本発明のプロテアーゼ変異体を少なくとも１種に加えて、組成物の重量に基づき約０．０００１重量％〜約１０重量％、約０．００１重量％〜約５重量％、約０．００１重量％〜約２重量％、又は約０．００５重量％〜約０．５重量％の濃度の少なくとも１種のリパーゼを含む。
【０２２４】
同様に、本発明の少なくとも１種の変異体及び少なくとも１種のアミラーゼを含む組成物（例えば、クリーニング組成物）も包含される。アルカリ溶液での使用に好適な任意のアミラーゼ（例えば、α及び／又はβ）もこのような組成物に含ませるのに有用である場合がある。好適なアミラーゼとしては、限定するものではないが、例えば、微生物又は真菌由来のものが挙げられる。化学的に又は遺伝的に改変させた変異型アミラーゼを含ませることもできる。本発明の組成物での使用が見出されるアミラーゼとしては、限定するものではないが、例えば、Ｂ．リケニフォルミス（例えば、英国特許第１，２９６，８３９号を参照されたい）から得られるα−アミラーゼが挙げられる。本発明の組成物での使用が見出される市販のアミラーゼとしては、限定するものではないが、例えば、ＤＵＲＡＭＹＬ（登録商標）、ＴＥＲＭＡＭＹＬ（登録商標）、ＦＵＮＧＡＭＹＬ（登録商標）、ＳＴＡＩＮＺＹＭＥ（登録商標）、ＳＴＡＩＮＺＹＭＥ  ＰＬＵＳ（登録商標）、ＳＴＡＩＮＺＹＭＥ  ＵＬＴＲＡ（登録商標）、及びＢＡＮ（商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）、並びにＰＯＷＥＲＡＳＥ（商標）、ＲＡＰＩＤＡＳＥ（登録商標）及びＭＡＸＡＭＹＬ（登録商標）Ｐ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）が挙げられる。
【０２２５】
一態様では、本発明は、プロテアーゼ変異体を少なくとも１種又はアミラーゼを少なくとも１種含むクリーニング組成物を提供し、アミラーゼは、組成物の重量に基づき約０．００００１重量％〜約１０重量％の濃度で存在し、組成物の重量に基づき残部には、クリーニング助剤が１種以上存在する。他の態様では、本発明は、プロテアーゼ変異体を少なくとも１種、及びアミラーゼを少なくとも１種含むクリーニング組成物を包含し、組成物には、組成物の重量に基づき約０．０００１重量％〜約１０重量％、約０．００１重量％〜約５重量％、約０．００１重量％〜約２重量％、約０．００５重量％〜約０．５重量％の濃度でアミラーゼが存在する。
【０２２６】
任意の好適なセルラーゼも本発明のクリーニング組成物での使用が見出され得る。一態様では、本発明は、本発明のプロテアーゼ変異体を少なくとも１種及び／又はセルラーゼを少なくとも１種含むクリーニング組成物を提供する。好適なセルラーゼとしては、限定するものではないが、例えば、微生物又は真菌由来のものが挙げられる。化学的に又は遺伝的に改変させた変異型セルラーゼも本発明の組成物に含まれ得る。好適なセルラーゼとしては、限定するものではないが、例えば、ヒュミコラ・インソレンス（Humicola insolens）のセルラーゼ（例えば、米国特許第４，４３５，３０７号を参照されたい）及び色調ケア効果のあるセルラーゼ（例えば、欧州特許第０  ４９５  ２５７号を参照されたい）が挙げられる。更なる好適なセルラーゼは当該技術分野において既知である。本発明のの組成物での使用が見出され、かつ組成物に含ませることのできる市販のセルラーゼとしては、限定するものではないが、例えば、ＣＥＬＬＵＺＹＭＥ（登録商標）、ＣＡＲＥＺＹＭＥ（登録商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）、及びＫＡＣ−５００（Ｂ）（商標）（花王株式会社）が挙げられる。一部の実施形態では、セルラーゼは、野生型又は変異型成熟セルラーゼの一部又は断片として組み込まれ、変異型ではＮ末端の一部が欠損している（例えば、米国特許第５，８７４，２７６号を参照されたい）。一態様では、本発明のクリーニング組成物は、本発明のプロテアーゼ変異体を少なくとも１種、及び組成物の重量に基づき約０．００００１重量％〜約１０重量％の濃度の追加のセルラーゼを少なくとも１種、並びに組成物の重量に基づき残部で１種以上のクリーニング助剤を含む。他の態様では、本発明は、本発明のプロテアーゼ変異体を少なくとも１種と、組成物の重量に基づき約０．０００１重量％〜約１０重量％、約０．００１重量％〜約５重量％、約０．００１重量％〜約２重量％、約０．００５重量％〜約０．５重量％の濃度の少なくとも１種のセルラーゼを含む、クリーニング組成物を提供する。
【０２２７】
洗剤組成物での使用に好適な任意のマンナナーゼも使用が見出され、ひいては本発明のクリーニング組成物に含まれ得る。一態様では、本発明は、本発明のプロテアーゼ変異体を少なくとも１種及びマンナナーゼを少なくとも１種含むクリーニング組成物を提供する。好適なマンナナーゼとしては、限定するものではないが、例えば、微生物又は真菌由来のものが挙げられる。化学的に又は遺伝的に改変させた変異型マンナナーゼも本発明の組成物に包含され得る。様々なマンナナーゼが本発明の組成物に有用であり、かつ組成物に含ませ得ることが既に分かっている（例えば、米国特許第６，５６６，１１４号、同第６，６０２，８４２号及び同第６，４４０，９９１号に記載のマンナナーゼを参照されたい。これらの各々は参照により本案件に組み込まれる）。一態様では、本発明は、本発明のプロテアーゼ変異体を少なくとも１種及び組成物の重量に基づき約０．００００１重量％〜約１０重量％の濃度で存在するマンナナーゼを少なとも１種、並びに組成物の重量に基づき残部でクリーニング助剤を１種以上含む、クリーニング組成物を提供する。一部のこのようなクリーニング組成物では、各マンナナーゼは組成物に約０．０００１重量％〜約１０重量％、約０．００１重量％〜約５重量％、約０．００１重量％〜約２重量％、又は約０．００５重量％〜約０．５重量％の濃度で存在する。
【０２２８】
ペルオキシダーゼを過酸化水素又は過酸化水素供給源（例えば、過炭酸塩、過ホウ酸塩又は過硫酸塩）と組み合わせて本発明の組成物に使用してもよい。オキシダーゼを酸素と組み合わせて本発明の組成物に使用してもよい。これらの種類の酵素は両方とも「溶液を漂白」する（すなわち、布地を一緒に洗浄溶液で洗浄する場合に、布地の染料が、その染料で染色されている布から他の布へと色移りするするのを予防する）ために、好ましくは増感剤と共に使用される（例えば、国際公開第９４／１２６２１号及び国際公開第９５／０１４２６号を参照されたい）。本発明の組成物に含ませるのに好適なペルオキシダーゼ／オキシダーゼとしては、限定するものではないが、例えば、植物、微生物、又は真菌由来のものが挙げられる。化学的に又は遺伝的に改変させた変異型ペルオキシダーゼ又はオキシダーゼも本発明の組成物に包含され得る。一態様では、本発明は、本発明のプロテアーゼ変異体を少なくとも１種及びペルオキシダーゼを少なくとも１種及び／又はオキシダーゼ酵素を少なくとも１種含むクリーニング組成物を提供する。それぞれのペルオキシダーゼ又はオキシダーゼは、組成物の重量に基づき約０．００００１重量％〜約１０重量％の濃度で組成物に存在し、組成物の重量に基づき残部にはクリーニング助剤が１種以上存在する。他の態様では、本発明は、本発明のプロテアーゼ変異体を少なくとも１種、並びにペルオキシダーゼを少なくとも１種及び／又は少なくともオキシダーゼ酵素を含有する、クリーニング組成物を提供し、それぞれのペルオキシダーゼ又はオキシダーゼは、組成物の重量に基づき約０．０００１重量％〜約１０重量％、約０．００１重量％〜約５重量％、約０．００１重量％〜約２重量％、又は約０．００５重量％〜約０．５重量％の濃度で存在する。
【０２２９】
一態様では、本発明は、本発明のプロテアーゼ変異体を少なくとも１種及び使用が見出される追加の酵素を１種以上、例えば、限定するものではないが、ペルヒドロラーゼを含有する、組成物（例えば、クリーニング組成物）を提供する（例えば、国際公開第０５／０５６７８２号を参照されたい）。
【０２３０】
他の態様では、本発明は、本発明のプロテアーゼ変異体を少なくとも１種、並びに例えば、プロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、マンナナーゼ、及び／又はセルラーゼなどを更に１種以上包含する上記１種以上の酵素の混合物、を含有する、組成物（例えば、クリーニング組成物）を提供する。実際に、これらの酵素の多様な混合物が本発明の組成物での使用を見出され得ることは想到されている。プロテアーゼ変異体及び追加の１種以上の酵素の濃度は、いずれも独立して約１０％までの範囲で変化し、クリーニング組成物の残部は１種以上のクリーニング助剤からなることも想到される。クリーニング助剤の具体的な選択は、クリーニングされる表面若しくは物品（例えば、食器類、食卓用食器類、又は布製物品）又は布地、並びに使用時のクリーニング条件下で組成物に所望される形態（例えば、食器手洗い用又は自動食器洗浄用洗剤用途）について考慮することで容易になされる。
【０２３１】
一態様では、本発明は、本発明のプロテアーゼ変異体を少なくとも１種（及び所望により必要に応じて追加の酵素を少なくとも１種）、及びクリーニング助剤を１種以上含む組成物（例えば、クリーニング組成物）を提供する。好適なクリーニング助剤の例としては、限定するものではないが、例えば、界面活性剤、ビルダー、漂白剤、漂白活性化剤、漂白触媒、他の酵素、酵素安定化剤、キレート剤、蛍光増白剤、汚れ遊離ポリマー、移染剤、移染防止剤、触媒材料、過酸化水素、過酸化水素源、予形成過酸、高分子分散剤、クレイ汚れ除去剤、構造弾性化剤、分散剤、抑泡剤、染料、香料、着色剤、充填剤塩、ヒドロトロープ、光活性化剤、蛍光発色剤、布地コンディショナー、布地柔軟剤、担体、ヒドロトロープ、加工助剤、溶媒、色素、加水分解性界面活性剤、保存料、抗酸化剤、収縮防止剤、防皺剤、殺菌剤、防かび剤、色スペックル（color speckles）、銀ケア、防曇剤及び／又は抗腐食剤、アルカリ源、可溶化剤、担体、加工助剤、色素、及びｐＨ調整剤（例えば、米国特許第６，６１０，６４２号、同第６，６０５，４５８号、同第５，７０５，４６４号、同第５，７１０，１１５号、同第５，６９８，５０４号、同第５，６９５，６７９号、同第５，６８６，０１４号及び同第５，６４６，１０１号を参照されたい、これらのすべては参照により本案件に組み込まれる）。クリーニング組成物材料の具体例は以下に詳細に例示する。上記のように、所望のクリーニング組成物において、クリーニング助剤が本発明のプロテアーゼ変異体と適合性でない場合、これらの成分を組み合わせることが適切になるまでの間、クリーニング助剤とプロテアーゼを分離させておく（すなわち、互いに接触させずにおく）のに好適な方法が使用される。このような分離手法には、当該技術分野において既知の任意の好適な方法が包含される（例えば、ゲルキャップ法、カプセル封入、錠剤、物理的分離など）。
【０２３２】
一部の態様では、本発明の組成物（例えば、クリーニング組成物）は、タンパク質系の汚れを除去する必要のある表面をクリーニングするのに有用な又は効果的な本発明のプロテアーゼ変異体を、有効量で少なくとも１種含有する。このようなクリーニング組成物としては、硬質表面、洗濯物、布地、食器、食卓用食器類、又は食器類（例えば、食器手洗い若しくは食器手動洗浄又は食器自動洗浄）をクリーニングするなどの用途用のクリーニング組成物が挙げられる。実際に、一部の実施形態では、本発明は布地クリーニング組成物を提供するが、他の実施形態では、本発明は非布地用クリーニング組成物を提供する。特に、本発明は、本発明のプロテアーゼ変異体を少なくとも１種含むクリーニング組成物も提供し、このようなクリーニング組成物は、パーソナルケア、例えば口腔ケア（歯磨き剤、歯磨きペースト、マウスウォッシュなど、並びに義歯洗浄用組成物など）、皮膚及び毛髪クリーニング、並びに眼鏡クリーニングに好適である。本発明は、任意の形態（すなわち、液体、顆粒状、棒状、固形、半固形、ゲル、乳濁液、錠剤、カプセル剤など）の洗剤組成物を包含することを意図する。
【０２３３】
例として、本発明のプロテアーゼ変異体の使用が見出される数種類のクリーニング組成物が以下により詳細に記載される。本発明のクリーニング組成物が洗濯機を用いる洗浄に使用するのに好適な組成物として配合される一部の実施例では、本発明の組成物は、好ましくは界面活性剤を少なくとも１種、及びビルダー化合物を少なくとも１種、並びにクリーニング助剤を１種以上（例えば、クリーニング助剤は有機高分子化合物、漂白剤、追加の酵素、抑泡剤、分散剤、石鹸酸化カルシウム分散剤（lime-soap dispersants）、汚れ懸濁剤及び再付着防止剤、並びに腐食防止剤からなる群から１種以上選択される）含有する。一部の実施形態では、洗濯用組成物は柔軟剤も１種以上含有する（すなわち、追加のクリーニング助剤として）。本発明のプロテアーゼ変異体を１種以上添加することのできる追加の例示的な洗濯物又は布地クリーニング組成物及び配合物は、以下の実施例に表される。
【０２３４】
本発明の組成物は、固形又は液体形態で洗剤添加製品として使用することも見出される。このような添加剤製品は、従来の洗剤組成物の性能を補う及び／又は強化することが意図されるものであり、クリーニングプロセスの任意の段階で添加できる。組成物を２０℃で測定した場合に、一部の実施形態では、洗濯洗剤組成物の密度は約４００〜約１２００ｇ／リットルであり、一方で他の実施形態では、約５００〜約９５０ｇ／リットルの範囲である。
【０２３５】
一態様では、本発明は、本発明のプロテアーゼ変異体を少なくとも１種含む、米国特許第６，６０５，４５８号に提供されるようなクリーニング組成物を提供する。一部の実施形態では、本発明のプロテアーゼ変異体を少なくとも１種含む組成物は、コンパクトな顆粒状布地クリーニング組成物である一方、他の実施形態では、組成物は着色された布地を洗濯するのに有用な顆粒状の布地クリーニング組成物であり；他の実施形態では、組成物は洗浄性能により柔軟効果を提供する顆粒状の布地クリーニング組成物であり、更なる実施形態では、組成物は強力液体布地クリーニング組成物である。一部の実施形態では、本発明のプロテアーゼ変異体を少なくとも１種含む組成物は、米国特許第６，６１０，６４２号及び同第６，３７６，４５０号に記載されるものなどの布地クリーニング組成物である。欧州又は日本の洗浄条件に特に有用な、本発明のプロテアーゼ変異体を少なくとも１種含む顆粒状の洗濯洗剤組成物（例えば、米国特許第６，６１０，６４２号を参照されたい）も提供される。
【０２３６】
一部の態様では、本発明は、本明細書に提供されるプロテアーゼ変異体を少なくとも１種含む硬質表面クリーニング組成物を提供する。このような組成物の一部のものには、米国特許第６，６１０，６４２号、同第６，３７６，４５０号、及び同第６，３７６，４５０号に記載されるような、プロテアーゼ変異体を少なくとも１種含む硬質表面クリーニング組成物が包含される。
【０２３７】
一態様では、本発明は、本明細書で提供されるプロテアーゼ変異体を少なくとも１種含む、食器手洗い用又は自動食器洗浄用洗剤組成物を提供する。このような組成物の一部のものには、米国特許第６，６１０，６４２号、及び同第６，３７６，４５０号に記載されるような、硬質表面クリーニング組成物が包含される。
【０２３８】
一態様では、本発明は、食器手動洗浄若しくは食器手洗い又は食器自動洗浄法に使用するための、本発明のプロテアーゼ変異体を少なくとも１種及び／又は界面活性剤を少なくとも１種及び／又は追加のクリーニング助剤（有機高分子化合物、起泡剤、ＩＩ属金属イオン、溶媒、ヒドロトロープ、及び追加の酵素から選択される）を少なくとも１種含有するクリーニング組成物を提供する。
【０２３９】
本発明のクリーニング組成物が食器自動洗浄機を用いる方法に使用するのに好適な組成物として配合される一部の実施例では、本発明の組成物は、典型的には界面活性剤を少なくとも１種及び／又はビルダー化合物を少なくとも１種含有し、かつクリーニング助剤、好ましくは有機高分子化合物、漂白剤、追加の酵素、抑泡剤、分散剤、石鹸酸化カルシウム分散剤、汚れ懸濁剤及び再付着防止剤及び腐食防止剤からなる群から選択されるクリーニング助剤を含有し得る。本発明のプロテアーゼ変異体を１種以上添加することのできる追加の例示的な食器洗浄用組成物及び配合物は、以下の実施例に記載される。
【０２４０】
他の態様では、本発明は、口腔ケア（例えば、歯及び義歯のクリーニング）に有用な本発明のプロテアーゼ変異体を少なくとも１種含む口腔ケア組成物を提供する。このような組成物に有用でありかつ含ませることのできる口腔ケア組成物の成分としては、米国特許第６，３７６，４５０号に記載のものが挙げられる。本発明の組成物は、クリーニング助剤及び米国特許第６，３７６，４５０号、同第６，６０５，４５８号、及び同第６，６１０，６４２号に記載される化合物も更に含有し得る（これらのすべては本明細書に参照により組み込まれる）。
【０２４１】
本発明のクリーニング組成物は、任意の好適な形態に配合され、好ましくは配合者により選択される任意のプロセスにより配合され、その非限定例では米国特許第５，８７９，５８４号、同第５，６９１，２９７号、同第５，５７４，００５号、同第５，５６９，６４５号、同第５，５６５，４２２号、同第５，５１６，４４８号、同第５，４８９，３９２号、及び同第５，４８６，３０３号に記載されており、これらのすべては参照により本案件に組み込まれる。低ｐＨのクリーニング組成物が所望される場合、このような組成物のｐＨは、モノエタノールアミンなどの物質又は塩化水素（ＨＣｌ）などの酸性物質の添加により調整される。
【０２４２】
本発明の目的には必須でないが、以下に例示される助剤の非限定的リストは、本クリーニング組成物での使用に好適である。一部の実施形態では、これらの助剤は、例えば、クリーニングされる基材を処理する際のクリーニング性能を補助又は強化させるために、あるいは香料、着色剤、又は染料などの場合にはクリーニング組成物の美観を改善するために組み込まれる。これらの助剤が本発明のプロテアーゼ変異体に加えて存在することは理解されたい。このような追加成分の明確な性質及びそれらを組み込む濃度は、組成物の物理的形態及びそれが使用される洗浄作業の性質に依存する。好適な助剤としては、限定するものではないが、例えば、界面活性剤、ビルダー、キレート化剤、移染防止剤、付着助剤、分散剤、追加の酵素、及び酵素安定剤、触媒材料、漂白活性化剤、漂白増進剤、過酸化水素、過酸化水素源、予形成過酸、高分子分散剤、クレイ汚れ除去剤／再付着防止剤、増白剤、抑泡剤、染料、香料、構造弾性化剤、布地柔軟剤、担体、ヒドロトロープ、加工助剤及び／又は色素が挙げられる。以下の開示に加え、このような他の助剤の好適な例及び使用濃度は、米国特許第５，５７６，２８２号、同第６，３０６，８１２号、及び同第６，３２６，３４８号に記載されており、これらは参照により組み込まれる。上述の助剤成分は、本発明のクリーニング組成物の残部を構成し得る。
【０２４３】
一部の態様では、本発明のクリーニング組成物は、少なくとも１種の界面活性剤及び／又は界面活性剤系を含み、界面活性剤は、非イオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、両性界面活性剤、双極性界面活性剤、半極性非イオン性界面活性剤及びこれらの混合物から選択される。一部の低ｐＨクリーニング組成物の実施形態（例えば、未希釈時ｐＨが約３〜約５の組成物の場合）では、このような界面活性剤がこのような組成物の酸性成分により加水分解される恐れがあると考えられることから、典型的には組成物はアルキルエトキシル化硫酸塩を含有しない。一部の実施形態では、界面活性剤はクリーニング組成物の約０．１重量％〜約６０重量％の濃度で存在する一方、代替的な実施形態では約１重量％〜約５０重量％の濃度で、あるいは更に他の実施形態では約５重量％〜約４０重量％の濃度で存在する。
【０２４４】
一部の態様では、本発明のクリーニング組成物は、洗剤ビルダー又はビルダー系を１種以上含む。少なくとも１種のビルダーを組み込むこのような組成物のうち、一部のものでは、クリーニング組成物は、クリーニング組成物の少なくとも約１重量％、約３重量％〜約６０重量％又は更には約５重量％〜約４０重量％のビルダーを含む。ビルダーとしては、限定するものではないが、例えば、ポリリン酸のアルカリ金属、アンモニウム及びアルカノールアンモニウム塩、アルカリ金属ケイ酸塩、アルカリ土類及びアルカリ金属炭素塩、アルミノケイ酸塩、ポリカルボン酸塩化合物、エーテルヒドロキシポリカルボン酸塩、無水マレイン酸とエチレン又はビニルメチルエーテルのコポリマー、１，３，５−トリヒドロキシベンゼン−２，４，６−トリスルホン酸、及びカルボキシメチルオキシコハク酸、ポリ酢酸の様々なアルカリ金属、アンモニウム及び置換アンモニウム塩、例えばエチレンジアミンテトラ酢酸及びニトリロ三酢酸、並びにポリカルボン酸塩、例えばメリト酸、コハク酸、クエン酸、オキシジコハク酸、ポリマレイン酸、ベンゼン１，３，５−トリカルボン酸、カルボキシメチルオキシコハク酸、及びこれらの可溶性塩が挙げられる。任意の好適なビルダーが、本発明の様々な組成物で使用を見出されることは想到される。
【０２４５】
このような組成物の一部のものでは、ビルダーは水溶性の水硬度イオン錯体（例えば、封鎖ビルダー）、例えば、クエン酸塩及びポリリン酸塩など（例えば、トリポリリン酸ナトリウム及びトリポリリン酸ナトリウム六水和物、トリポリリン酸カリウム、並びにトリポリリン酸ナトリウム及びカリウムの混合物など）を形成する。当該技術分野において既知のものが挙げられる（例えば、欧州特許第２  １００  ９４９号を参照されたい）、任意の好適なビルダーが本発明での使用を見出されることが想到される。
【０２４６】
本発明のクリーニング組成物の一部のものは、プロテアーゼ変異体を少なくとも１種に加えて、キレート化剤を少なくとも１種含む。好適なキレート化剤としては、限定するものではないが、例えば、銅、鉄、及び／又はマンガンキレート化剤及びこれらの混合物が挙げられる。キレート化剤を少なくとも１種使用する実施形態では、本発明のクリーニング組成物は、対象とするクリーニング組成物の約０．１重量％〜約１５重量％又は更には約３重量％〜約１０重量％のキレート化剤を含有する。
【０２４７】
本明細書に提供されるクリーニング組成物の一部のものは、プロテアーゼ変異体を少なくとも１種に加えて、付着助剤を少なくとも１種含有する。好適な付着助剤としては、限定するものではないが、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリカルボキシレート、ポリテレフタル酸などの汚れ遊離ポリマー、クレイ、カオリナイト、モンモリロナイト、アタパルジャイト（atapulgite）、イライト、ベントナイト、ハロイサイト、及びこれらの混合物が挙げられる。
【０２４８】
本明細書に記載されるように、本発明の一部の実施形態では、再付着防止剤の使用が見出される。一部の実施形態では、非イオン性界面活性剤の使用が見出される。これらの非イオンの界面活性剤は、汚れの再付着の防止にも使用が見出される。一部の実施形態では、再付着防止剤は、当該技術分野において既知の非イオン性界面活性剤である（例えば、欧州特許第２  １００  ９４９号を参照されたい）。
【０２４９】
一部の実施形態では、本発明のクリーニング組成物は、１種以上の移染防止剤を含む。適したポリマー移染防止剤としては、限定するものではないが、ポリビニルピロリドンポリマー、ポリアミンＮ−オキシドポリマー、Ｎ−ビニルピロリドンとＮ−ビニルイミダゾールのコポリマー、ポリビニルオキサゾリドン及びポリビニルイミダゾール又はこれらの混合物が挙げられる。移染防止剤が少なくとも１種使用される実施形態では、本発明のクリーニング組成物は、クリーニング組成物の重量に基づき約０．０００１重量％〜約１０重量％、約０．０１重量％〜約５重量％、又は更には約０．１重量％〜約３重量％を含む。
【０２５０】
一部の実施形態では、ケイ酸塩が本発明の組成物に含まれる。このような実施形態では、ケイ酸ナトリウム塩（例えば、二ケイ酸ナトリウム、メタケイ酸ナトリウム、及び結晶質フィロケイ酸塩）の使用が見出される。一部の実施形態では、ケイ酸塩は約１％〜約２０％の濃度で存在する。一部の実施形態では、ケイ酸塩は組成物の約５重量％〜約１５重量％の濃度で存在する。
【０２５１】
更なる追加の実施形態では、本発明のクリーニング組成物は分散剤も含む。好適な水溶性有機物質としては、例えば、限定するものではないが、ホモポリマー若しくはコポリマーの酸又はそれらの塩が挙げられ、ポリカルボン酸は、炭素原子２個分を超えない程度に互いに離れている少なくとも２個のカルボキシルラジカルを含む。
【０２５２】
一部の更なる実施形態では、クリーニング組成物に使用される酵素（例えば、本発明のプロテアーゼ変異体又は他の追加の酵素）は、任意の好適な技術により安定化されている。一部の実施形態では、本明細書で採用される酵素は、カルシウムイオン及び／又はマグネシウムイオンを酵素に供給する、最終組成物中のカルシウムイオン及び／又はマグネシウムイオンの水溶性供給源の存在によって安定化される。一部の実施形態では、酵素安定剤としては、オリゴ糖、多糖、及び無機二価金属塩、例えばアルカリ土類金属（カルシウム塩など）が挙げられる。酵素安定化に関する様々な技術が、本発明での使用を見出されることは想到される。例えば、一部の実施形態では、本明細書で採用される酵素は、水溶性の亜鉛（ＩＩ）、カルシウム（ＩＩ）及び／又はマグネシウム（ＩＩ）イオンを最終組成物に存在させることで安定化され、最終組成物は、これらのイオン並びに他の金属イオン（例えば、バリウム（ＩＩ）、スカンジウム（ＩＩ）、鉄（ＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、アルミニウム（ＩＩＩ）、スズ（ＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、及びオキソバナジウム（ＩＶ））を酵素に提供する。塩酸塩及び硫酸塩も、本発明の一部の実施形態での使用が見出される。好適なオリゴ糖及び多糖（例えば、デキストリン）の例は、当該技術分野において既知である（例えば、国際公開第０７／１４５９６４号を参照されたい）。一部の実施形態では、本発明の組成物での使用が見出されるホウ素含有化合物（例えば、ホウ酸塩、４−ホルミルフェニルボロン酸）及び／又はトリペプチドアルデヒドなどの、可逆的なプロテアーゼ阻害剤も所望により安定性を更に改善するために使用が見出される。
【０２５３】
一部の実施形態では、漂白剤、漂白活性化剤、及び／又は漂白触媒が本発明の組成物に含まれる。一部の実施形態では、本発明のクリーニング組成物は、無機及び／又は有機漂白化合物を含む。無機漂白剤としては、限定するものではないが、過水和物塩（例えば、過ホウ酸塩、過炭酸塩、過リン酸塩、過硫酸塩、及び過ケイ酸塩）が挙げられる。一部の実施形態では、無機過水和物塩はアルカリ金属塩である。一部の実施形態では、無機過水和物塩が、更なる保護はされずに結晶質の固体として含まれるが、一部の他の実施形態では、この塩はコーティングされる。当該技術分野において既知の任意の好適な塩が本発明の組成物での使用を見出される（例えば、欧州特許第２  １００  ９４９号を参照されたい）。
【０２５４】
一部の実施形態では、漂白活性化剤が本発明の組成物に使用される。漂白活性化剤は、典型的に、６０℃以下の温度で洗浄中に漂白作用を増強する有機過酸前駆体である。本明細書に用いるのに好適な漂白活性化剤としては、過加水分解条件下で好ましくは約１〜約１０個の炭素原子、特に約２〜約４個の炭素原子を有する脂肪族ペルオキシカルボン酸及び／又は任意に置換された過安息香酸を与える化合物が挙げられる。追加の漂白活性化剤は当該技術分野において既知であり、本発明の組成物での使用が見出される（例えば、欧州特許第２  １００  ９４９号を参照されたい）。
【０２５５】
加えて、一部の実施形態では、及び、本明細書に記載されるように、本発明のクリーニング組成物は、少なくとも１種の漂白触媒を更に含む。一部の実施形態では、マンガントリアザシクロノナン及び関連する錯体、並びにコバルト、銅、マンガン、及び鉄錯体も使用が見出される。追加の漂白触媒も本発明での使用が見出される（例えば、米国特許第４，２４６，６１２号、同第５，２２７，０８４号、及び同第４，８１０４１０号；国際公開第９９／０６５２１号；及び欧州特許第２  １００  ９４９号を参照されたい）。
【０２５６】
一部の実施形態では、本発明のクリーニング組成物は、触媒金属錯体を１種以上含有する。一部の実施形態では、金属を含有している漂白触媒の使用が見出される。一部の実施形態では、金属系漂白触媒は、規定の漂白触媒活性に関する遷移金属カチオン（例えば、銅、鉄、チタン、ルテニウム、タングステン、モリブデン、又はマンガンカチオン）、漂白触媒活性をわずかに有する又は全く有さない補助金属カチオン（例えば、亜鉛又はアルミニウムカチオン）、及び触媒及び補助金属カチオン用の規定の安定性定数を有する隔離剤（sequestrate）を含有する触媒系からなり、特にエチレンジアミンテトラ酢酸、エチレンジアミンテトラ（メチレンホスホン酸）及びこれらの水溶性塩が使用される（例えば、米国特許第４，４３０，２４３号を参照されたい）。一部の実施形態では、本発明のクリーニング組成物は、マンガン化合物により触媒される。このような化合物及び使用濃度は当該技術分野において周知である（例えば、米国特許第５，５７６，２８２号を参照されたい）。更なる実施形態では、本発明のクリーニング組成物でのコバルト漂白触媒の使用が見出され、組成物にはコバルト漂白触媒が含まれる。様々なコバルト漂白触媒が当該技術分野において既知であり（例えば、米国特許第５，５９７，９３６号及び同第５，５９５，９６７号を参照されたい）、既知の手順により容易に調製される。
【０２５７】
一部の更なる実施形態では、本発明のクリーニング組成物は、大多環状剛性配位子（ＭＲＬ）の遷移金属錯体を含有する。実際的な事柄として、限定するためではないが、一部の実施形態では、本発明により提供される組成物及びクリーニングプロセスを水性洗浄媒質中に少なくとも１億分の１のオーダーの有益なＭＲＬ種を提供するように調整して、約０．００５ｐｐｍ〜約２５ｐｐｍ、約０．０５ｐｐｍ〜約１０ｐｐｍ、及び約０．１ｐｐｍ〜約５ｐｐｍのＭＲＬを洗浄溶液中に提供することができる。
【０２５８】
一部の実施形態では、本遷移金属系漂白触媒の遷移金属としては、限定するものではないが、例えば、マンガン、鉄及びクロムが挙げられる。好ましいＭＲＬとしては、限定するものではないが、例えば、特定の架橋型超剛性配位子（例えば、５，１２−ジエチル−１，５，８，１２−テトラアザビシクロ（６．６．２）ヘキサデカン）が挙げられる。好適な遷移金属ＭＲＬは、既知の手順により容易に調製される（例えば、国際公開第２０００／３２６０１号及び米国特許第６，２２５，４６４号を参照されたい）。
【０２５９】
一態様では、本発明は、錠剤型の洗剤として配合される自動食器洗浄用洗剤組成物を提供する。このような錠剤は、本発明のプロテアーゼ変異体が少なくとも１種及び例えばビルダー塩などのビルダーを含む。一部のこのような錠剤は、錠剤組成物１００グラムあたり少なくとも３グラム（ｇ）の水酸化ナトリウムと等価のアルカリ性、及び少なくとも１．４グラム／立方センチメートルの密度を有する。ビルダー塩はケイ酸塩とリン酸塩の混合物を含んでよく、好ましくはケイ酸塩（例えば、メタケイ酸ナトリウム）をリン酸塩（例えば、トリポリリン酸ナトリウム）よりも多く含む。一部のこのような錠剤は、界面活性剤成分を不含であり、特に、食器自動洗浄機で使用するのに適している。
【０２６０】
一態様では、本発明のクリーニング組成物は、金属ケア剤を含む。金属ケア剤は、アルミニウム、ステンレス鋼、及び第一鉄以外の金属（例えば、銀及び銅）を包含する金属の、変色、腐食及び／又は酸化の、予防及び／又は減少に有用である。好適な金属ケア剤としては、欧州特許第２  １００  ９４９号、国際公開第９４２６８６０号及び国際公開第９４／２６８５９号に記載のものが挙げられる。一部のこのようなクリーニング組成物では、金属ケア剤は亜鉛塩である。一部のこのようなクリーニング組成物は、約０．１重量％〜約５重量％の１種以上の金属ケア剤を含む。
【０２６１】
上記のように、本発明のクリーニング組成物は、任意の好適な形態に配合され、好ましくは配合者により選択される任意のプロセスにより調製され、その非限定例は、米国特許第５，８７９，５８４号、同第５，６９１，２９７号、同第５，５７４，００５号、同第５，５６９，６４５号、同第５，５１６，４４８号、同第５，４８９，３９２号、及び同第５，４８６，３０３号に記載されており、これらのすべては参照により本案件に組み込まれる。低ｐＨのクリーニング組成物が所望される一部の他の実施形態では、このような組成物のｐＨは、塩化水素（ＨＣｌ）などの酸性成分を添加することで調整される。
【０２６２】
本明細書で開示されるクリーニング組成物は、部位（例えば、表面、食器類、食卓用食器類又は布地）をクリーニングする際の使用が見出される。典型的には、このような部位の少なくとも一部を、未希釈形態又は洗浄溶液に希釈された状態の、本発明のクリーニング組成物と接触させ、そしてその後、所望により、その部位を洗浄及び／又はすすいでもよい。本発明の目的に関して、「洗浄」には、限定するものではないが、擦ること及び機械的撹拌が含まれる。一部の実施形態では、クリーニング組成物は、約５００ｐｐｍ〜約１５，０００ｐｐｍの濃度の溶液として採用される。洗浄溶媒が水である場合、水温は、典型的には、約５℃〜約９０℃であり、部位が布地を含む場合、水と布地との割合は、典型的には、約１：１〜約３０：１である。
【０２６３】
クリーニング組成物の製造及び使用プロセス
本明細書に記載の本発明のクリーニング組成物は、配合者により選択される、任意の好適な形態に配合すること及び任意の好適なプロセスにより調製することができる（例えば、米国特許第５，８７９，５８４号、同第５，６９１，２９７号、同第５，５７４，００５号、同第５，５６９，６４５号、同第５，５６５，４２２号、同第５，５１６，４４８号、同第５，４８９，３９２号、同第５，４８６，３０３号、同第４，５１５，７０５号、同第４，５３７，７０６号、同第４，５１５，７０７号、同第４，５５０，８６２号、同第４，５６１，９９８号、同第４，５９７，８９８号、同第４，９６８，４５１号、同第５，５６５，１４５号、同第５，９２９，０２２号、同第６，２９４，５１４号及び同第６，３７６，４４５号を参照されたい）。
【０２６４】
一部の実施形態では、本発明のクリーニング組成物は、錠剤、カプセル、分包剤、パウチ、及び多区画パウチなどの単位容量形態で提供される。一部の実施形態では、単位用量形式は、多区画パウチ（すなわち他の単位用量形式）内の成分を制御放出するよう設計される。好適な単位容量及び制御放出形式は、当該技術分野において既知である（単位容量及び制御放出形式での使用に好適な材料に関しては、例えば、欧州特許第２  １００  ９４９号、国際公開第０２／１０２９５５号、米国特許第４，７６５，９１６号及び同第４，９７２，０１７号、及び国際公開第０４／１１１１７８号を参照されたい）。一部の実施形態では、単位容量形態は、水溶性フィルム又は水溶性パウチで包装された錠剤として提供される。様々な形態の単位投与法が欧州特許第２  １００  ９４７号に提供され、及び当該技術分野において既知である。
【０２６５】
本発明の方法
本発明は、限定するものではないが、例えば、食器類、食卓用食器類、布製物品、洗濯物、及びパーソナルケア用品などをクリーニング又は洗浄する方法を包含する、クリーニングする必要のある物品又は表面（例えば、硬質表面）をクリーニング又は洗浄する方法、並びに例えば、物品の硬質表面などの硬質又は軟質表面をクリーニング又は洗浄する方法を提供する。
【０２６６】
一態様では、本発明は、クリーニングする必要のある物品、対象物、又は表面のクリーニング方法であって、この方法が、物品又は表面（又はクリーニングされることが所望される物品又は表面の一部）を、本発明の任意のプロテアーゼ変異体又は本発明の組成物に、所望される程度に物品、対象物若しくは表面をクリーニングするのに十分な時間にわたって及び／又は好適若しくは有効な条件下で接触させる工程を含む、方法を提供する。一部のこのような方法は更に、物品、対象物又は表面を水ですすぐ工程を更に含む。このような方法のうち一部のものでは、クリーニング組成物は食器洗浄用洗剤組成物であり、及びクリーニングされる物品又は対象物は、食器類又は食卓用食器類である。食器類は、食事を提供する又は食事を飲食するのに一般的に使用される皿類である。食器類は、限定するものではないが、例えば、皿、プレート、カップ、ボウルなどであり得る。食卓用食器類はより幅広い用語であり、限定するものではないが、例えば、皿、カトラリー、ナイフ、フォーク、スプーン、箸、ガラス製品、ピッチャー、ソース入れ、及び飲用グラスなどが挙げられ；食卓用食器類には食事を提供する又は食事を飲食するためのこれらの任意の物品又は類似の物品が包含される。このような方法のうち一部のものでは、クリーニング組成物は自動食器洗浄用洗剤組成物又は食器手洗い用洗剤組成物であり、及びクリーニングされる物品又は対象物は、食器類又は食卓用食器類である。このような方法のうち一部のものでは、クリーニング組成物は、例えば、粉末洗濯洗剤組成物又は液体洗濯洗剤組成物などの洗濯洗剤組成物であり、クリーニングされる物品は布製物品である。
【０２６７】
一態様では、本発明は、所望によりそれぞれクリーニング又は洗浄する必要のある布製物品をクリーニング又は洗浄する方法を提供する。このような方法の一部のものは、プロテアーゼ変異体（限定するものではないが、例えば、布地又は洗濯クリーニング組成物など）を含有する組成物及びクリーニングする必要のある布製物品又は洗濯物を準備する工程、所望される程度に布地又は洗濯物をクリーニング又は洗浄するのに十分な又は有効な条件下で布地製品又は洗濯物（又はクリーニングすることが所望される物品の一部）を組成物と接触させる工程、を含む。
【０２６８】
一態様では、本発明は、所望によりクリーニングする必要のある物品又は表面（例えば、硬質表面）をクリーニング又は洗浄するための方法を提供し、この方法は、クリーニング又は洗浄される物品又は表面を準備する工程、並びに物品又は表面（又はクリーニング又は洗浄することが所望される物品又は表面の一部）を少なくとも１種の本発明のプロテアーゼ変異体、又はこのようなプロテアーゼ変異体を少なくとも１種含有する本発明の組成物と、所望される程度に物品又は表面をクリーニング又は洗浄するのに十分な時間にわたって及び／又は十分な若しくは有効な条件下で接触させる工程を含む。このような組成物としては、限定するものではないが、例えば、本発明のクリーニング組成物又は洗剤組成物が挙げられる（限定するものではないが、例えば、食器手洗い用洗剤組成物、食器手洗い用クリーニング組成物、洗濯洗剤又は布地洗剤又は洗濯物若しくは布地洗浄組成物、液体洗濯洗剤、液体洗濯用クリーニング組成物、粉末洗濯洗剤組成物、粉末洗濯用クリーニング組成物、食器自動洗浄洗剤組成物、洗濯増進クリーニング又は洗剤組成物、洗濯クリーニング助剤、及び洗濯前染み抜きスポッティング組成物などが挙げられる）。必要に応じて、場合によっては、特に追加のクリーニング又は洗浄が所望される場合には、この方法は１回以上繰り返すことができる。例えば、一部の例では方法は所望により更に物品又は表面をクリーニング又は洗浄するのに十分な若しくは有効な時間にわたって物品又は表面を少なくとも１種のプロテアーゼ変異体又は組成物と接触させたままにしておくことも含む。一部のこのような方法は更に、物品又は表面を水ですすぐことも包含する。一部のこのような方法は、少なくとも１種の本発明のプロテアーゼ変異体又は本発明の組成物を再度物品又は表面と接触させる工程、並びに所望される程度に物品又は表面をクリーニング又は洗浄するのに十分な時間にわたって物品若しくは表面を少なくとも１種のプロテアーゼ変異体又は組成物と接触させたままにしておく工程を更に含む。このような方法のうち一部のものでは、クリーニング組成物は食器洗浄用洗剤組成物であり、及びクリーニングされる物品は食器類又は食卓用食器類である。このような方法のうち一部のものでは、クリーニング組成物は自動食器洗浄用洗剤組成物又は食器手洗い用洗剤組成物であり、及びクリーニングされる物品は、食器類又は食卓用食器類である。このような方法のうち一部のものでは、クリーニング組成物は洗濯洗剤組成物であり、及びクリーニングされる物品は布製物品である。
【０２６９】
一態様では、本発明は、自動食器洗浄機で食卓用食器類又は食器類をクリーニングする方法であって、この方法は、自動食器洗浄機を準備する工程、食卓用食器類又は食器類をクリーニングするのに十分な量の、本発明のプロテアーゼ変異体を少なくとも１種含む自動食器洗浄用組成物又は本発明の組成物を食洗機に配置する工程（例えば、組成物を適切に配置することにより、又は食洗機の洗剤区画又は分配器中に配置することにより）、食洗機の中に食器類は又は食卓用食器類を配置する工程、並びに食卓用食器類又は食器類がクリーニングされるよう食洗機を操作する工程（例えば、製造元による取り扱い説明に従って）を含む、方法を提供する。このような方法は、本明細書に記載される任意の食器自動洗浄組成物を含むことができ、組成物には、限定するものではないが例えば、本明細書に記載される任意のプロテアーゼ変異体が含まれる。使用される食器自動洗浄組成物の量は、製造元の取扱説明又は指示に従って容易に測定することができ、本明細書に記載されるものを含む本発明のプロテアーゼ変異体を少なくとも１種（例えば、液体、粉末、固体、ゲル、錠剤など）含む任意の形態の食器自動洗浄組成物が採用され得る。
【０２７０】
一態様では、本発明は、所望によりクリーニングする必要のある表面、物品又は対象物のクリーニング方法であって、この方法は、所望される程度に物品又は表面をクリーニング又は洗浄するのに十分な時間にわたって及び／又は十分な若しくは有効な条件下で、物品又は表面（又はクリーニングすることが所望される物品又は表面の一部）を少なくとも１種の本発明のプロテアーゼ変異体又は未希釈形態若しくは洗浄溶液に希釈した状態の本発明のクリーニング組成物に接触させることを含む。次いで必要に応じて表面、物品又は対象物を（所望により）洗浄して及び／又はすすいでもよい。本発明の目的に関し、「洗浄」には、限定するものではないが、擦ること及び機械的撹拌が含まれる。一部の実施形態では、クリーニング組成物は、約５００ｐｐｍ〜約１５，０００ｐｐｍの濃度の溶液（例えば水溶液）として採用される。洗浄溶媒が水である場合、水温は、典型的には、約５℃〜約９０℃であり、部位が布地を含む場合、水と布地との割合は、典型的には、約１：１〜約３０：１である。
【０２７１】
一態様では、本発明は、洗濯機中で洗濯物又は布製物品をクリーニングする方法であって、この方法は、洗濯機を準備する工程、洗濯物又は布製物品をクリーニングするのに十分な量の、本発明のプロテアーゼ変異体を少なくとも１種含有する洗濯洗剤組成物を洗濯機に配置する工程（例えば、組成物を適切に配置することにより、又は洗濯機の洗剤区画又は分配器中に配置することにより）、洗濯機の中に洗濯物又は布製物品を投入する工程、並びに食卓用食器類又は食器類がクリーニングされるよう洗濯機を操作する工程（例えば、製造元による取り扱い説明に従って）を含む、方法を提供する。このような方法は、本明細書に記載される任意の洗濯洗浄洗剤組成物を含むことができ、組成物には、限定するものではないが例えば、本明細書に記載される任意のプロテアーゼ変異体が含まれる。使用される洗濯洗剤組成物の量は、製造元の取扱説明又は指示に従って容易に測定することができ、本明細書に記載されるものを含む本発明のプロテアーゼ変異体が少なくとも１種（例えば、固体、粉末、液体、錠剤、ゲル、など）含む任意の形態の食器自動洗浄組成物が採用され得る。
【０２７２】
その他の例示的なクリーニング方法は、以下の実施例で提供される。
【０２７３】
本発明の更なる態様
一態様では、本発明は、本明細書及び本案件を通して記載される本発明の任意の組成物（例えば、クリーニング組成物又は洗剤組成物）を提供し、この組成物は、本案件を通して及び本明細書に記載される本発明の任意のポリペプチド（例えば、本発明の任意のプロテアーゼ変異体又はサブチリシン変異体）を含むが、ここで、上記組成物は食器自動洗浄用組成物ではない。一態様では、本発明は、本案件を通して及び本明細書に記載される本発明のプロテアーゼ変異体を含む組成物を提供するが、但し、上記組成物は親プロテアーゼのプロテアーゼ変異体を含む食器自動洗浄洗剤組成物を含まず、上記親プロテアーゼは配列番号１のアミノ酸配列に対し少なくとも９７％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、上記親プロテアーゼの上記プロテアーゼ変異体は、上記親プロテアーゼに対し以下のアミノ酸置換の組：
（ｉ）上記プロテアーゼ変異体がＮ２４８Ｒ＋Ｓ１８８Ｄを含まない場合にはＮ７６Ｄ＋Ｓ８７Ｒ＋Ｇ１１８Ｒ＋Ｓ１２８Ｌ＋Ｐ１２９Ｑ＋Ｓ１３０Ａ、又は
（ｉｉ）Ｎ７６Ｄ＋Ｓ８７Ｒ＋Ｇ１１８Ｒ＋Ｓ１２８Ｌ＋Ｐ１２９Ｑ＋Ｓ１３０Ａ＋Ｓ１８８Ｄ＋Ｖ２４４Ｒ、
（ｉｉｉ）及びビルダー、
のうちの１つを含み、アミノ酸位置が、プロテアーゼ変異体のアミノ酸配列を配列番号２で示されるバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列と整列させることで決定される、バチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列中の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。一態様では、このような組成物は洗剤組成物である。一態様では、このような組成物はクリーニング組成物である。一態様では、このような組成物は液体洗剤又は粉末洗剤組成物である。一態様では、このような組成物は液体型、ゲル型、錠剤型、粉末型、固形、又は顆粒型のクリーニング組成物である。一態様では、このような組成物は自動食器洗浄用洗剤組成物である。一態様では、このような組成物はリン酸を含有していないクリーニング組成物である。任意の態様では、上記組成物は追加の酵素を少なくとも１種含む。上記組成物の任意の態様では、上記組成物は、少なくともヘミセルラーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、ペルオキシダーゼ、プロテアーゼ、キシラナーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、ペクテートリアーゼ、マンナナーゼ、ケラチナーゼ、還元酵素、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、タンナーゼ、ペントサナーゼ、マラナーゼ、β−グルカナーゼ、アラビノシダーゼ、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチナーゼ、及びラッカーゼからなる群から選択することのできる追加の酵素を少なくとも１種含む。上記組成物の任意の態様では、上記組成物は、ヘミセルラーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、ペルオキシダーゼ、プロテアーゼ、キシラナーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、ペクテートリアーゼ、マンナナーゼ、ケラチナーゼ、還元酵素、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、タンナーゼ、ペントサナーゼ、マラナーゼ、β−グルカナーゼ、アラビノシダーゼ、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチナーゼ、及びラッカーゼからなる群から選択される追加の酵素を２種以上含んでもよい。上記組成物の任意の態様では、上記組成物は、少なくとも１種のビルダー及び／又は少なくとも１種の界面活性剤を更に含み得る。
【０２７４】
一態様では、本発明は、クリーニングする必要のある物品又は表面のクリーニング方法であって、この方法が、物品又は表面を上記組成物と接触させることを含む、方法を提供する。上記方法の一態様では、上記方法は物品又は表面を水ですすぐことを更に含む。上記方法の一態様では、クリーニング組成物は食器洗浄用洗剤組成物であり、クリーニングされる物品は食器類又は食卓用食器類である。上記方法の一態様では、クリーニング組成物は自動食器洗浄用洗剤組成物であり、クリーニングされる物品は食器類は又は食卓用食器類である。
【０２７５】
一態様では、本発明は、表面、物品又は対象物のクリーニング方法であって、この方法は、所望される程度に物品又は表面をクリーニング又は洗浄するのに十分な時間にわたって及び／又は十分な若しくは有効な条件下で、クリーニングされる物品又は表面の少なくとも一部を上記のいずれかの組成物に接触させる工程を含み、並びに所望により表面、物品又は対象物を水ですすぐ工程を更に含む、方法を提供する。
【０２７６】
一態様では、本発明は、自動食器洗浄機での食卓用食器類又は食器類のクリーニング方法であって、この方法は、（ｉ）食器自動洗浄機を準備する工程、（ｉｉ）食卓用食器類又は食器類をクリーニングするのに十分である、任意量の上記組成物又は食器自動洗浄組成物を食洗機内に配置する工程であって、上記組成物は場合により上記食洗機の区画又は分配器中に配置される、工程、（ｉｉｉ）食器類又は食卓用食器類を食洗機内に配置する工程、及び（ｉｖ）食洗機を操作して、食卓用食器類又は食器類をクリーニングする工程、を含む、方法を提供する。
【実施例】
【０２７７】
以降の実施例は、例示目的で提供されるものであり、本発明の特定の態様を更に例示するが、発明の範囲を制限するものとして考慮されるものではない。
【０２７８】
以降の及び本明細書のいずれかに記載される実施例の開示では、次の略記が適用される：ＰＩ（プロテイナーゼ阻害剤）、ｐｐｍ（１００万分率）；Ｍ（モル）；ｍＭ（ミリモル）；μＭ（マイクロモル）；ｎＭ（ナノモル）；ｍｏｌ（モル）；ｍｍｏｌ（ミリモル）；μｍｏｌ（マイクロモル）；ｎｍｏｌ（ナノモル）；ｇｍ（グラム）；ｍｇ（ミリグラム）；μｇ（マイクログラム）；ｐｇ（ピコグラム）；Ｌ又はｌ（リットル）；ｍｌ及びｍＬ（ミリリットル）；μｌ又はμＬ（マイクロリットル）；ｃｍ（センチメートル）；ｍｍ（ミリメートル）；μｍ（マイクロメートル）；ｎｍ（ナノメートル）；Ｕ（ユニット）；Ｖ（ボルト）；ＭＷ（分子量）；ｓｅｃ（秒）；ｍｉｎ（分）；ｈ又はｈｒ（時間）；℃（セ氏温度）；ＮＤ（測定されず）；ｒｐｍ（毎分回転）；ＧＨ（ドイツ硬度）；Ｈ２Ｏ（水）；ｄＨ２Ｏ（脱イオン水）；ＨＣｌ（塩化水素酸）；ａａ（アミノ酸）；ｂｐ（塩基対）；ｋｂ（キロ塩基対）；ｋＤ（キロダルトン）；ｃＤＮＡ（コピーＤＮＡ又は相補的ＤＮＡ）；ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）；ｓｓＤＮＡ（単鎖ＤＮＡ）；ｄｓＤＮＡ（二本鎖ＤＮＡ）；ＲＮＡ（リボ核酸）；ＭｇＣｌ２（塩化マグネシウム）；ＮａＣｌ（塩化ナトリウム）；ＢＰＮ’（バチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシン）；ＰＢ９２（バチルス・クラウシイのサブチリシン）；ｗ／ｖ（重量対体積）；ｖ／ｖ（体積対体積）；ｗ／ｗ（重量体重量）；ｇ（重力）；ＯＤ（吸光度）；ｐｐｍ（百万分率）；ＯＤ２８０（２８０ｎｍでの光学密度）；ＯＤ６００（６００ｎｍでの光学密度）；Ａ４０５（４０５ｎｍでの吸光度）；ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）；ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水［１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．２］）；ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）；ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）；ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）；ＴＲＩＳ又はＴｒｉｓ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）；ＨＥＰＥＳ（Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ−［２−エタンスルホン酸］）；ＨＢＳ（ＨＥＰＥＳ生理緩衝液）；Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｔｒｉｓ［ヒドロキシメチル］アミノメタン−塩酸塩）；ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）；ＳＡ（シナピン酸（ｓ，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシケイ皮酸）；ＴＣＡ（トリクロロ酢酸）；ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）；Ｔａｑ（サーマス・アクアチクスＤＮＡポリメラーゼ）；クレノウ（ＤＮＡポリメラーゼＩラージ（クレノウ）フラグメント）；ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）；ｂｌａ（β−ラクタマーゼ又はアンピシリン−耐性遺伝子）；ＨＤＬ（高密度の液体）；ＨＤＤ（強力粉末洗剤）；ＨＳＧ（高起泡性顆粒洗剤）；ＣＥＥ（中央及び東ヨーロッパ）；ＷＥ（西ヨーロッパ）；洗剤に対する参照で用いられる場合のＮＡ（北アメリカ）；洗剤に対する参照で用いられる場合のＪａｐａｎ及びＪＰＮ（日本）；ＣＦＴ（Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｔｅｓｔ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，Ｖｌａａｒｄｉｎｇｅｎ，ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）；Ｐ＆Ｇ及びＰｒｏｃｔｅｒ  ＆  Ｇａｍｂｌｅ（Ｐｒｏｃｔｅｒ  ＆  Ｇａｍｂｌｅ，Ｉｎｃ．，Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，ＯＨ）；ＤＮＡ２．０（ＤＮＡ２．０，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）；Ｃｏｒｎｉｎｇ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）；ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）；Ｓｉｇｍａ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）；ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）；Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）；Ｑｉａｇｅｎ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）；Ｓｉｅｇｆｒｉｅｄ  Ｈａｎｄｅｌ（Ｓｉｅｇｆｒｉｅｄ  Ｈａｎｄｅｌ  ＡＧ，Ｚｏｆｉｎｇｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）；Ｍｏｎｓａｎｔｏ（Ｍｏｎｓａｎｔｏ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）；Ｗｉｎｔｅｒｓｈａｌｌ（Ｗｉｎｔｅｒｓｈａｌｌ  ＡＧ，Ｋａｓｓｅｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ）；ＢＡＳＦ（ＢＡＳＦ  Ｃｏ．，Ｆｌｏｒｈａｍ  Ｐａｒｋ，ＮＪ）；Ｈｕｎｔｓｍａｎ（Ｈｕｎｔｓｍａｎ  Ｐｅｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．，Ｓａｌｔ  Ｌａｋｅ  Ｃｉｔｙ，ＵＴ）；Ｅｎｉｃｈｅｍ（Ｅｎｉｃｈｅｍ  Ｉｂｅｒｉｃａ，Ｂａｒｃｅｌｏｎａ，Ｓｐａｉｎ）；Ｆｌｕｋａ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＡＧ（Ｆｌｕｋａ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＡＧ，Ｂｕｃｈｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）；Ｇｉｓｔ−Ｂｒｏｃａｄｅｓ（Ｇｉｓｔ−Ｂｒｏｃａｄｅｓ，ＮＶ，Ｄｅｌｆｔ，ｔｈｅ  ＮＮｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）；Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ（Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．，Ｍｉｄｌａｎｄ，ＭＩ）；ＲＢ（Ｒｅｃｋｉｔｔ−Ｂｅｎｃｋｉｓｅｒ，Ｓｌｏｕｇｈ，ＵＫ）。
【０２７９】
本明細書で使用するとき、一部の記載では３桁の数値表記を提供する目的で冒頭の各桁に「０」が示される（例えば、「００１」は「１」と同様であり、すなわち「Ａ００１Ｃ」は「Ａ１Ｃ」と同様である。一部の一欄では、冒頭の「０」は記載されない。加えて、本明細書で使用するとき、「Ｘ」は任意のアミノ酸を指す。
【０２８０】
本明細書で提供される、例示された洗剤組成物において、酵素濃度は、組成物の合計重量に基づき純粋な酵素濃度として表現され、かつ別途記載のない限り、洗剤成分は組成物の合計重量に基づき表現される。略記される用語は以下の意味を持つ：
【０２８１】
【表２−１】
0006018044.tif 000003
【０２８２】
【表２−２】
0006018044.tif 000004
【０２８３】
北アメリカ（ＮＡ）及び西ヨーロッパ（ＷＥ）の強力液体洗濯（ＨＤＬ）洗剤に関しては、予め計量した液体洗剤（ガラス瓶内）を、９５℃のウォーターバスに２時間にわたって配置することで、市販の洗剤中に存在する酵素の加熱不活性化を実施する。ＮＡ及びＷＥの自動食器洗浄用洗剤を加熱不活性化するためのインキュベート時間は８時間である。不活性化率を正確に判定するために、未加熱及び加熱洗剤のどちらも、洗剤を溶解させて５分以内にアッセイする。酵素活性はＡＡＰＦアッセイにより試験する。
【０２８４】
加熱不活性化した洗剤の酵素活性の試験に関しては、洗剤の希釈標準溶液は加熱不活性化母液から調製した。所望される条件を満たすよう、適切な水硬度（例えば、６グレイン毎ガロン（１０３ｐｐｍ（ｇｐｇ））又は１２ｇｐｇ（２０６ｐｐｍ））及び緩衝剤を洗剤溶液に加えた。瓶をボルテックスにかけるか反転させるかして溶液を混合する。市販の洗剤の一部を以降の実施例に記載する。
【０２８５】
（実施例１）
プロテアーゼ変異体の作製
本発明のプロテアーゼ変異体ポリペプチド及びこのようなプロテアーゼ変異体をコードしている本発明の核酸は、当業者に周知の各種標準法を一つ以上用い作製することができる。例えば、本発明のプロテアーゼ変異体をコードしている核酸は、結果として得られるプロテアーゼ変異体が、配列番号１で示されるＧＧ３６のアミノ酸配列に対し一箇所以上の所望のアミノ酸位置で所望のアミノ酸置換（変異）を含むよう、配列番号１８で示されるＢ．レンタスのプロテアーゼＧＧ３６をコードしているヌクレオチド配列をコードしているプラスミドＤＮＡの部位特異的変異導入により作製することができる。例えば、当業者は、（プロテアーゼＧＧ３６のポリペプチドをコードしている）配列番号１８のヌクレオチド配列を用いる、標準的な部位特異的変異導入手法を容易に選択して、プロテアーゼＧＧ３６（配列番号１）の一箇所以上の位置のアミノ酸に所望のアミノ酸置換を含んでいるプロテアーゼ変異体のポリペプチドをコードしている核酸を製造することができる。更に、当業者は、配列番号１８のヌクレオチド配列を用い、容易に既知の部位特異的変異導入手法を採用して、７６、８７、１１８、１２８、１２９、１３０、１８８、２４４、及び２４８からなる群から選択されるＧＧ３６（配列番号１）の一箇所以上の位置にアミノ酸置換を含むプロテアーゼ変異体ポリペプチドをコードしている核酸を生成することができ、各アミノ酸位置は、対象とするプロテアーゼ変異体のアミノ酸配列を配列番号２で示されるバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’アミノ酸配列と整列させることで決定される、ＢＰＮ’中の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。
【０２８６】
このような手順は、例えば、非保存的な及び保存的なアミノ酸置換を包含する追加のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、及び／又はアミノ酸挿入又は付加を含む、ＰＸ３変異体、ＰＸ４変異体、及びＰＸ５変異体などの、プロテアーゼ変異体ＰＸ３（配列番号６）、ＰＸ４（配列番号７）、及びＰＸ５（配列番号８）、並びにこれらの各々のプロテアーゼ変異体をコードしている核酸を生成するにあたり同様に容易に採用することができる。
【０２８７】
プロテアーゼＧＧ３６がコードしているヌクレオチド配列は以下のとおりのものである：
ｇｔｇａｇａａｇｃａａａａａａｔｔｇｔｇｇａｔｃｇｔｃｇｃｇｔｃｇａｃｃｇｃａｃｔａｃｔｃａｔｔｔｃｔｇｔｔｇｃｔｔｔｃａｇｔｔｃａｔｃｇａｔｃｇｃａｔｃｇｇｃｔｇｃｔｇａａｇａａｇｃａａａａｇａａａａａｔａｔｔｔａａｔｔｇｇｃｔｔｔａａｔｇａｇｃａｇｇａａｇｃｔｇｔｃａｇｔｇａｇｔｔｔｇｔａｇａａｃａａｇｔａｇａｇｇｃａａａｔｇａｃｇａｇｇｔｃｇｃｃａｔｔｃｔｃｔｃｔｇａｇｇａａｇａｇｇａａｇｔｃｇａａａｔｔｇａａｔｔｇｃｔｔｃａｔｇａａｔｔｔｇａａａｃｇａｔｔｃｃｔｇｔｔｔｔａｔｃｃｇｔｔｇａｇｔｔａａｇｃｃｃａｇａａｇａｔｇｔｇｇａｃｇｃｇｃｔｔｇａｇｃｔｃｇａｔｃｃａｇｃｇａｔｔｔｃｔｔａｔａｔｔｇａａｇａｇｇａｔｇｃａｇａａｇｔａａｃｇａｃａａｔｇＧＣＧＣＡＡＴＣＡＧＴＧＣＣＡＴＧＧＧＧＡＡＴＴＡＧＣＣＧＴＧＴＧＣＡＡＧＣＣＣＣＡＧＣＴＧＣＣＣＡＴＡＡＣＣＧＴＧＧＡＴＴＧＡＣＡＧＧＴＴＣＴＧＧＴＧＴＡＡＡＡＧＴＴＧＣＴＧＴＣＣＴＣＧＡＴＡＣＡＧＧＴＡＴＴＴＣＣＡＣＴＣＡＴＣＣＡＧＡＣＴＴＡＡＡＴＡＴＴＣＧＴＧＧＴＧＧＣＧＣＴＡＧＣＴＴＴＧＴＡＣＣＡＧＧＧＧＡＡＣＣＡＴＣＣＡＣＴＣＡＡＧＡＴＧＧＧＡＡＴＧＧＧＣＡＴＧＧＣＡＣＧＣＡＴＧＴＧＧＣＣＧＧＧＡＣＧＡＴＴＧＣＴＧＣＴＴＴＡＡＡＣＡＡＴＴＣＧＡＴＴＧＧＣＧＴＴＣＴＴＧＧＣＧＴＡＧＣＧＣＣＧＡＧＣＧＣＧＧＡＡＣＴＡＴＡＣＧＣＴＧＴＴＡＡＡＧＴＡＴＴＡＧＧＧＧＣＧＡＧＣＧＧＴＴＣＡＧＧＴＴＣＧＧＴＣＡＧＣＴＣＧＡＴＴＧＣＣＣＡＡＧＧＡＴＴＧＧＡＡＴＧＧＧＣＡＧＧＧＡＡＣＡＡＴＧＧＣＡＴＧＣＡＣＧＴＴＧＣＴＡＡＴＴＴＧＡＧＴＴＴＡＧＧＡＡＧＣＣＣＴＴＣＧＣＣＡＡＧＴＧＣＣＡＣＡＣＴＴＧＡＧＣＡＡＧＣＴＧＴＴＡＡＴＡＧＣＧＣＧＡＣＴＴＣＴＡＧＡＧＧＣＧＴＴＣＴＴＧＴＴＧＴＡＧＣＧＧＣＡＴＣＴＧＧＡＡＡＴＴＣＡＧＧＴＧＣＡＧＧＣＴＣＡＡＴＣＡＧＣＴＡＴＣＣＧＧＣＣＣＧＴＴＡＴＧＣＧＡＡＣＧＣＡＡＴＧＧＣＡＧＴＣＧＧＡＧＣＴＡＣＴＧＡＣＣＡＡＡＡＣＡＡＣＡＡＣＣＧＣＧＣＣＡＧＣＴＴＴＴＣＡＣＡＧＴＡＴＧＧＣＧＣＡＧＧＧＣＴＴＧＡＣＡＴＴＧＴＣＧＣＡＣＣＡＧＧＴＧＴＡＡＡＣＧＴＧＣＡＧＡＧＣＡＣＡＴＡＣＣＣＡＧＧＴＴＣＡＡＣＧＴＡＴＧＣＣＡＧＣＴＴＡＡＡＣＧＧＴＡＣＡＴＣＧＡＴＧＧＣＴＡＣＴＣＣＴＣＡＴＧＴＴＧＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＡＧＣＣＣＴＴＧＴＴＡＡＡＣＡＡＡＡＧＡＡＣＣＣＡＴＣＴＴＧＧＴＣＣＡＡＴＧＴＡＣＡＡＡＴＣＣＧＣＡＡＴＣＡＴＣＴＡＡＡＧＡＡＴＡＣＧＧＣＡＡＣＧＡＧＣＴＴＡＧＧＡＡＧＣＡＣＧＡＡＣＴＴＧＴＡＴＧＧＡＡＧＣＧＧＡＣＴＴＧＴＣＡＡＴＧＣＡＧＡＡＧＣＴＧＣＡＡＣＴＣＧＴＴＡＡ（配列番号１８）。
【０２８８】
上記に示されるように、配列番号１８のＤＮＡ配列は、シグナルペプチドをコードしているヌクレオチド配列（上記で下線付けされず、小文字で示される箇所）、プロペプチドをコードしているヌクレオチド配列（上記で下線付けされ、小文字で示される箇所）、及び成熟型ＧＧ３６ポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列（上記で大文字で示される箇所）を含む。
【０２８９】
以下に提供されるタンパク質配列ＧＧ３６では、シグナルペプチド配列は小文字で示され、プロペプチド配列は下線付けされていない小文字で示され、かつ成熟プロテアーゼＧＧ３６配列は大文字で示される：
ｖｒｓｋｋｌｗｉｖａｓｔａｌｌｉｓｖａｆｓｓｓｉａｓａａｅｅａｋｅｋｙｌｉｇｆｎｅｑｅａｖｓｅｆｖｅｑｖｅａｎｄｅｖａｉｌｓｅｅｅｅｖｅｉｅｌｌｈｅｆｅｔｉｐｖｌｓｖｅｌｓｐｅｄｖｄａｌｅｌｄｐａｉｓｙｉｅｅｄａｅｖｔｔｍＡＱＳＶＰＷＧＩＳＲＶＱＡＰＡＡＨＮＲＧＬＴＧＳＧＶＫＶＡＶＬＤＴＧＩＳＴＨＰＤＬＮＩＲＧＧＡＳＦＶＰＧＥＰＳＴＱＤＧＮＧＨＧＴＨＶＡＧＴＩＡＡＬＮＮＳＩＧＶＬＧＶＡＰＳＡＥＬＹＡＶＫＶＬＧＡＳＧＳＧＳＶＳＳＩＡＱＧＬＥＷＡＧＮＮＧＭＨＶＡＮＬＳＬＧＳＰＳＰＳＡＴＬＥＱＡＶＮＳＡＴＳＲＧＶＬＶＶＡＡＳＧＮＳＧＡＧＳＩＳＹＰＡＲＹＡＮＡＭＡＶＧＡＴＤＱＮＮＮＲＡＳＦＳＱＹＧＡＧＬＤＩＶＡＰＧＶＮＶＱＳＴＹＰＧＳＴＹＡＳＬＮＧＴＳＭＡＴＰＨＶＡＧＡＡＡＬＶＫＱＫＮＰＳＷＳＮＶＱＩＲＮＨＬＫＮＴＡＴＳＬＧＳＴＮＬＹＧＳＧＬＶＮＡＥＡＡＴＲ（配列番号１９）。
【０２９０】
本明細書においてポリペプチドＰＸ３として参照され、配列番号１に対してアミノ酸置換Ｎ７６Ｄ＋Ｓ８７Ｒ＋Ｇ１１８Ｒ＋Ｓ１２８Ｌ＋Ｐ１２９Ｑ＋Ｓ１３０Ａ＋Ｓ１８８Ｄ＋Ｎ２４８Ｒ（ＰＸ３のポリペプチド配列を、配列番号２で示されるＢＰＮ’ポリペプチド配列と整列することで決定される、ＢＰＮ’番号付与を用いる）を有する、成熟型のプロテアーゼ変異体のアミノ酸配列は：
ＡＱＳＶＰＷＧＩＳＲＶＱＡＰＡＡＨＮＲＧＬＴＧＳＧＶＫＶＡＶＬＤＴＧＩＳＴＨＰＤＬＮＩＲＧＧＡＳＦＶＰＧＥＰＳＴＱＤＧＮＧＨＧＴＨＶＡＧＴＩＡＡＬＤＮＳＩＧＶＬＧＶＡＰＲＡＥＬＹＡＶＫＶＬＧＡＳＧＳＧＳＶＳＳＩＡＱＧＬＥＷＡＧＮＮＲＭＨＶＡＮＬＳＬＧＬＱＡＰＳＡＴＬＥＱＡＶＮＳＡＴＳＲＧＶＬＶＶＡＡＳＧＮＳＧＡＧＳＩＳＹＰＡＲＹＡＮＡＭＡＶＧＡＴＤＱＮＮＮＲＡＤＦＳＱＹＧＡＧＬＤＩＶＡＰＧＶＮＶＱＳＴＹＰＧＳＴＹＡＳＬＮＧＴＳＭＡＴＰＨＶＡＧＡＡＡＬＶＫＱＫＮＰＳＷＳＮＶＱＩＲＲＨＬＫＮＴＡＴＳＬＧＳＴＮＬＹＧＳＧＬＶＮＡＥＡＡＴＲ（配列番号６）である。
【０２９１】
本明細書においてポリペプチドＰＸ４として参照され、配列番号１に対してアミノ酸置換Ｎ７６Ｄ／Ｓ８７Ｒ／Ｇ１１８Ｒ／Ｓ１２８Ｌ／Ｐ１２９Ｑ／Ｓ１３０Ａ（ＰＸ４のポリペプチド配列を、配列番号２で示されるＢＰＮ’ポリペプチド配列と整列することで決定される、ＢＰＮ’番号付与を用いる）を含む、成熟型のプロテアーゼ変異体（サブチリシン変異体）のアミノ酸配列は：
ＡＱＳＶＰＷＧＩＳＲＶＱＡＰＡＡＨＮＲＧＬＴＧＳＧＶＫＶＡＶＬＤＴＧＩＳＴＨＰＤＬＮＩＲＧＧＡＳＦＶＰＧＥＰＳＴＱＤＧＮＧＨＧＴＨＶＡＧＴＩＡＡＬＤＮＳＩＧＶＬＧＶＡＰＲＡＥＬＹＡＶＫＶＬＧＡＳＧＳＧＳＶＳＳＩＡＱＧＬＥＷＡＧＮＮＲＭＨＶＡＮＬＳＬＧＬＱＡＰＳＡＴＬＥＱＡＶＮＳＡＴＳＲＧＶＬＶＶＡＡＳＧＮＳＧＡＧＳＩＳＹＰＡＲＹＡＮＡＭＡＶＧＡＴＤＱＮＮＮＲＡＳＦＳＱＹＧＡＧＬＤＩＶＡＰＧＶＮＶＱＳＴＹＰＧＳＴＹＡＳＬＮＧＴＳＭＡＴＰＨＶＡＧＡＡＡＬＶＫＱＫＮＰＳＷＳＮＶＱＩＲＮＨＬＫＮＴＡＴＳＬＧＳＴＮＬＹＧＳＧＬＶＮＡＥＡＡＴＲ（配列番号７）である。
【０２９２】
本明細書においてポリペプチドＰＸ５として参照され、配列番号１に対してアミノ酸置換Ｎ７６Ｄ／Ｓ８７Ｒ／Ｇ１１８Ｒ／Ｓ１２８Ｌ／Ｐ１２９Ｑ／Ｓ１３０Ａ／Ｓ１８８Ｄ／Ｖ２４４Ｒ（ＰＸ３のポリペプチド配列を、配列番号２で示されるＢＰＮ’ポリペプチド配列と整列することで決定される、ＢＰＮ’番号付与を用いる）を含む、成熟型のプロテアーゼ変異体（サブチリシン変異体）アミノ酸配列は：
ＡＱＳＶＰＷＧＩＳＲＶＱＡＰＡＡＨＮＲＧＬＴＧＳＧＶＫＶＡＶＬＤＴＧＩＳＴＨＰＤＬＮＩＲＧＧＡＳＦＶＰＧＥＰＳＴＱＤＧＮＧＨＧＴＨＶＡＧＴＩＡＡＬＤＮＳＩＧＶＬＧＶＡＰＲＡＥＬＹＡＶＫＶＬＧＡＳＧＳＧＳＶＳＳＩＡＱＧＬＥＷＡＧＮＮＲＭＨＶＡＮＬＳＬＧＬＱＡＰＳＡＴＬＥＱＡＶＮＳＡＴＳＲＧＶＬＶＶＡＡＳＧＮＳＧＡＧＳＩＳＹＰＡＲＹＡＮＡＭＡＶＧＡＴＤＱＮＮＮＲＡＤＦＳＱＹＧＡＧＬＤＩＶＡＰＧＶＮＶＱＳＴＹＰＧＳＴＹＡＳＬＮＧＴＳＭＡＴＰＨＶＡＧＡＡＡＬＶＫＱＫＮＰＳＷＳＮＲＱＩＲＮＨＬＫＮＴＡＴＳＬＧＳＴＮＬＹＧＳＧＬＶＮＡＥＡＡＴＲ（配列番号８）である。
【０２９３】
成熟型のプロテアーゼ変異体（サブチリシン変異体）ＰＸ３をコードしている核酸配列は：
ＧＣＧＣＡＡＴＣＡＧＴＧＣＣＡＴＧＧＧＧＡＡＴＴＡＧＣＣＧＴＧＴＧＣＡＡＧＣＣＣＣＡＧＣＴＧＣＣＣＡＴＡＡＣＣＧＴＧＧＡＴＴＧＡＣＡＧＧＴＴＣＴＧＧＴＧＴＡＡＡＡＧＴＴＧＣＴＧＴＣＣＴＣＧＡＴＡＣＡＧＧＴＡＴＴＴＣＣＡＣＴＣＡＴＣＣＡＧＡＣＴＴＡＡＡＴＡＴＴＣＧＴＧＧＴＧＧＣＧＣＴＡＧＣＴＴＴＧＴＡＣＣＡＧＧＧＧＡＡＣＣＡＴＣＣＡＣＴＣＡＡＧＡＴＧＧＧＡＡＴＧＧＧＣＡＴＧＧＣＡＣＧＣＡＴＧＴＧＧＣＣＧＧＧＡＣＧＡＴＴＧＣＴＧＣＴＴＴＡＧＡＣＡＡＴＴＣＧＡＴＴＧＧＣＧＴＴＣＴＴＧＧＣＧＴＡＧＣＧＣＣＧＡＧＡＧＣＧＧＡＡＣＴＡＴＡＣＧＣＴＧＴＴＡＡＡＧＴＡＴＴＡＧＧＧＧＣＧＡＧＣＧＧＴＴＣＡＧＧＴＴＣＧＧＴＣＡＧＣＴＣＧＡＴＴＧＣＣＣＡＡＧＧＡＴＴＧＧＡＡＴＧＧＧＣＡＧＧＧＡＡＣＡＡＴＣＧＴＡＴＧＣＡＣＧＴＴＧＣＴＡＡＴＴＴＧＡＧＴＴＴＡＧＧＡＣＴＧＣＡＧＧＣＡＣＣＡＡＧＴＧＣＣＡＣＡＣＴＴＧＡＧＣＡＡＧＣＴＧＴＴＡＡＴＡＧＣＧＣＧＡＣＴＴＣＴＡＧＡＧＧＣＧＴＴＣＴＴＧＴＴＧＴＡＧＣＧＧＣＡＴＣＴＧＧＡＡＡＴＴＣＡＧＧＴＧＣＡＧＧＣＴＣＡＡＴＣＡＧＣＴＡＴＣＣＧＧＣＣＣＧＴＴＡＴＧＣＧＡＡＣＧＣＡＡＴＧＧＣＡＧＴＣＧＧＡＧＣＴＡＣＴＧＡＣＣＡＡＡＡＣＡＡＣＡＡＣＣＧＣＧＣＣＧＡＴＴＴＴＴＣＡＣＡＧＴＡＴＧＧＣＧＣＡＧＧＧＣＴＴＧＡＣＡＴＴＧＴＣＧＣＡＣＣＡＧＧＴＧＴＡＡＡＣＧＴＧＣＡＧＡＧＣＡＣＡＴＡＣＣＣＡＧＧＴＴＣＡＡＣＧＴＡＴＧＣＣＡＧＣＴＴＡＡＡＣＧＧＴＡＣＡＴＣＧＡＴＧＧＣＴＡＣＴＣＣＴＣＡＴＧＴＴＧＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＡＧＣＣＣＴＴＧＴＴＡＡＡＣＡＡＡＡＧＡＡＣＣＣＡＴＣＴＴＧＧＴＣＣＡＡＴＧＴＡＣＡＡＡＴＣＣＧＣＡＧＡＣＡＴＣＴＡＡＡＧＡＡＴＡＣＧＧＣＡＡＣＧＡＧＣＴＴＡＧＧＡＡＧＣＡＣＧＡＡＣＴＴＧＴＡＴＧＧＡＡＧＣＧＧＡＣＴＴＧＴＣＡＡＴＧＣＡＧＡＡＧＣＴＧＣＡＡＣＴＣＧＴＴＡＡ（配列番号９）である。
【０２９４】
成熟型のプロテアーゼ変異体（サブチリシン変異体）ＰＸ４をコードしている核酸配列は：
ＧＣＧＣＡＡＴＣＡＧＴＧＣＣＡＴＧＧＧＧＡＡＴＴＡＧＣＣＧＴＧＴＧＣＡＡＧＣＣＣＣＡＧＣＴＧＣＣＣＡＴＡＡＣＣＧＴＧＧＡＴＴＧＡＣＡＧＧＴＴＣＴＧＧＴＧＴＡＡＡＡＧＴＴＧＣＴＧＴＣＣＴＣＧＡＴＡＣＡＧＧＴＡＴＴＴＣＣＡＣＴＣＡＴＣＣＡＧＡＣＴＴＡＡＡＴＡＴＴＣＧＴＧＧＴＧＧＣＧＣＴＡＧＣＴＴＴＧＴＡＣＣＡＧＧＧＧＡＡＣＣＡＴＣＣＡＣＴＣＡＡＧＡＴＧＧＧＡＡＴＧＧＧＣＡＴＧＧＣＡＣＧＣＡＴＧＴＧＧＣＣＧＧＧＡＣＧＡＴＴＧＣＴＧＣＴＴＴＡＧＡＣＡＡＴＴＣＧＡＴＴＧＧＣＧＴＴＣＴＴＧＧＣＧＴＡＧＣＧＣＣＧＡＧＡＧＣＧＧＡＡＣＴＡＴＡＣＧＣＴＧＴＴＡＡＡＧＴＡＴＴＡＧＧＧＧＣＧＡＧＣＧＧＴＴＣＡＧＧＴＴＣＧＧＴＣＡＧＣＴＣＧＡＴＴＧＣＣＣＡＡＧＧＡＴＴＧＧＡＡＴＧＧＧＣＡＧＧＧＡＡＣＡＡＴＣＧＴＡＴＧＣＡＣＧＴＴＧＣＴＡＡＴＴＴＧＡＧＴＴＴＡＧＧＡＣＴＧＣＡＧＧＣＡＣＣＡＡＧＴＧＣＣＡＣＡＣＴＴＧＡＧＣＡＡＧＣＴＧＴＴＡＡＴＡＧＣＧＣＧＡＣＴＴＣＴＡＧＡＧＧＣＧＴＴＣＴＴＧＴＴＧＴＡＧＣＧＧＣＡＴＣＴＧＧＡＡＡＴＴＣＡＧＧＴＧＣＡＧＧＣＴＣＡＡＴＣＡＧＣＴＡＴＣＣＧＧＣＣＣＧＴＴＡＴＧＣＧＡＡＣＧＣＡＡＴＧＧＣＡＧＴＣＧＧＡＧＣＴＡＣＴＧＡＣＣＡＡＡＡＣＡＡＣＡＡＣＣＧＣＧＣＣＡＧＣＴＴＴＴＣＡＣＡＧＴＡＴＧＧＣＧＣＡＧＧＧＣＴＴＧＡＣＡＴＴＧＴＣＧＣＡＣＣＡＧＧＴＧＴＡＡＡＣＧＴＧＣＡＧＡＧＣＡＣＡＴＡＣＣＣＡＧＧＴＴＣＡＡＣＧＴＡＴＧＣＣＡＧＣＴＴＡＡＡＣＧＧＴＡＣＡＴＣＧＡＴＧＧＣＴＡＣＴＣＣＴＣＡＴＧＴＴＧＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＡＧＣＣＣＴＴＧＴＴＡＡＡＣＡＡＡＡＧＡＡＣＣＣＡＴＣＴＴＧＧＴＣＣＡＡＴＧＴＡＣＡＡＡＴＣＣＧＣＡＡＴＣＡＴＣＴＡＡＡＧＡＡＴＡＣＧＧＣＡＡＣＧＡＧＣＴＴＡＧＧＡＡＧＣＡＣＧＡＡＣＴＴＧＴＡＴＧＧＡＡＧＣＧＧＡＣＴＴＧＴＣＡＡＴＧＣＡＧＡＡＧＣＴＧＣＡＡＣＴＣＧＴＴＡＡ（配列番号１０）である。
【０２９５】
成熟型のプロテアーゼ変異体（サブチリシン変異体）ＰＸ５をコードしている核酸配列は：
ＧＣＧＣＡＡＴＣＡＧＴＧＣＣＡＴＧＧＧＧＡＡＴＴＡＧＣＣＧＴＧＴＧＣＡＡＧＣＣＣＣＡＧＣＴＧＣＣＣＡＴＡＡＣＣＧＴＧＧＡＴＴＧＡＣＡＧＧＴＴＣＴＧＧＴＧＴＡＡＡＡＧＴＴＧＣＴＧＴＣＣＴＣＧＡＴＡＣＡＧＧＴＡＴＴＴＣＣＡＣＴＣＡＴＣＣＡＧＡＣＴＴＡＡＡＴＡＴＴＣＧＴＧＧＴＧＧＣＧＣＴＡＧＣＴＴＴＧＴＡＣＣＡＧＧＧＧＡＡＣＣＡＴＣＣＡＣＴＣＡＡＧＡＴＧＧＧＡＡＴＧＧＧＣＡＴＧＧＣＡＣＧＣＡＴＧＴＧＧＣＣＧＧＧＡＣＧＡＴＴＧＣＴＧＣＴＴＴＡＧＡＣＡＡＴＴＣＧＡＴＴＧＧＣＧＴＴＣＴＴＧＧＣＧＴＡＧＣＧＣＣＧＡＧＡＧＣＧＧＡＡＣＴＡＴＡＣＧＣＴＧＴＴＡＡＡＧＴＡＴＴＡＧＧＧＧＣＧＡＧＣＧＧＴＴＣＡＧＧＴＴＣＧＧＴＣＡＧＣＴＣＧＡＴＴＧＣＣＣＡＡＧＧＡＴＴＧＧＡＡＴＧＧＧＣＡＧＧＧＡＡＣＡＡＴＣＧＴＡＴＧＣＡＣＧＴＴＧＣＴＡＡＴＴＴＧＡＧＴＴＴＡＧＧＡＣＴＧＣＡＧＧＣＡＣＣＡＡＧＴＧＣＣＡＣＡＣＴＴＧＡＧＣＡＡＧＣＴＧＴＴＡＡＴＡＧＣＧＣＧＡＣＴＴＣＴＡＧＡＧＧＣＧＴＴＣＴＴＧＴＴＧＴＡＧＣＧＧＣＡＴＣＴＧＧＡＡＡＴＴＣＡＧＧＴＧＣＡＧＧＣＴＣＡＡＴＣＡＧＣＴＡＴＣＣＧＧＣＣＣＧＴＴＡＴＧＣＧＡＡＣＧＣＡＡＴＧＧＣＡＧＴＣＧＧＡＧＣＴＡＣＴＧＡＣＣＡＡＡＡＣＡＡＣＡＡＣＣＧＣＧＣＣＧＡＴＴＴＴＴＣＡＣＡＧＴＡＴＧＧＣＧＣＡＧＧＧＣＴＴＧＡＣＡＴＴＧＴＣＧＣＡＣＣＡＧＧＴＧＴＡＡＡＣＧＴＧＣＡＧＡＧＣＡＣＡＴＡＣＣＣＡＧＧＴＴＣＡＡＣＧＴＡＴＧＣＣＡＧＣＴＴＡＡＡＣＧＧＴＡＣＡＴＣＧＡＴＧＧＣＴＡＣＴＣＣＴＣＡＴＧＴＴＧＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＡＧＣＣＣＴＴＧＴＴＡＡＡＣＡＡＡＡＧＡＡＣＣＣＡＴＣＴＴＧＧＴＣＣＡＡＴＣＧＴＣＡＡＡＴＣＣＧＣＡＡＴＣＡＴＣＴＡＡＡＧＡＡＴＡＣＧＧＣＡＡＣＧＡＧＣＴＴＡＧＧＡＡＧＣＡＣＧＡＡＣＴＴＧＴＡＴＧＧＡＡＧＣＧＧＡＣＴＴＧＴＣＡＡＴＧＣＡＧＡＡＧＣＴＧＣＡＡＣＴＣＧＴＴＡＡ（配列番号１１）である。
【０２９６】
当業者に周知である例示的な部位特異的変異導入手順としては、限定するものではないが、例えば、最大でプラスミドＤＮＡ中の異なる５箇所の部位に同時に部位特異的変異導入を行なうことのできる、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）多部位特異的変異導入キット（ＱＣＭＳ；Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ−Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）に具現化されている、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）多部位特異的変異導入法が挙げられる。他の既知の変異導入法の例は本明細書の他箇所で記載する。本明細書に記載されるような、本発明のプロテアーゼ変異体、例えば、プロテアーゼ変異体ポリペプチドＰＸ３、ＰＸ４、及びＰＸ５をコードしている本発明の核酸は、周知の遺伝子合成法及び／又は融合ＰＣＲ法を用い、当業者により、例えば、配列番号１８で示されるプロテアーゼＧＧ３６をコードしているヌクレオチド配列から容易に作製することもできる（例えば、米国特許第２００６／０２５２１５５号を参照されたい。この案件は、実験例を教示するため、参照により本明細書に組み込まれる）。
【０２９７】
プロテアーゼ変異体をコードしている核酸も、例えば古典的なホスホラミダイト法（例えば、Ｂｅａｕｃａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２２：１８５９〜６９（１９８１）を参照されたい）又はＭａｔｔｈｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．３：８０１〜０５（１９８４）に記載される方法を用いる、化学合成により作製することができ、合成は、例えば典型的には自動化された合成法として実施される。あるいは、プロテアーゼ変異体をコードしている核酸は、Ｍｉｄｌａｎｄ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｄｌａｎｄ，Ｔｅｘａｓ）（国際的なウェブサイトのアドレスはｏｌｉｇｏｓ．ｃｏｍ）、Ｇｒｅａｔ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ（国際的なウェブサイトのアドレスはｇｅｎｃｏ．ｃｏｍ）、Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ａｌａｍｅｄａ，Ｃａｌｉｆ．）（現Ｑｉａｇｅｎ，国際的なウェブサイトｑｉａｇｅｎ．ｃｏｍを参照されたい）、又はＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）などの各種外注業者に外注することもできる。核酸を合成する他の技術及び関連する原理は、例えば、Ｉｔａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３（１９８４）及びＩｔａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８：１０５６（１９８４）に記載されている。
【０２９８】
一態様では、例えば、プロテアーゼ変異体をコードしている核酸を遺伝子合成法を使用して作製する場合、このような核酸は、例えば、ＢｇｌＩＩなどの隣接する制限部位と共に設計することができ、これは変異体をコードしている核酸を、ＢｇｌＩＩにより切断することもできる本明細書に記載されるＢ．サブチリス発現プラスミドｐＨＰＬＴ−ＧＧ３６などの発現プラスミド（例えば、Ｂ．サブチリス発現プラスミド）の中にクローン化するために使用することができる。この例示的なＢ．サブチリスの発現ベクターｐＨＰＬＴは、Ｂ．リケニフォルミスＬＡＴプロモーター（Ｐｌａｔ）、ＨＰＡ２プロモーター、並びにレプリカーゼ遺伝子（ｒｅｐｐＵＢ）、ネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）、及びブレオマイシン耐性マーカー（ｂｌｅｏ）などのｐＵＢ１１０由来の追加の配列（例えば、ＭｃＫｅｎｚｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｓｍｉｄ，１５：９３〜１０３（１９８６）を参照されたい）を含有する（米国特許第６，５６６，１１２号の図４も参照されたい）。ｐＨＰＬＴ−ＧＧ３６のプラスミドマップは図２に提供し、発現カセット配列ＧＧ３６は以下に提供する。本明細書に記載されるＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）多部位特異的変異導入キット（ＱＣＭＳキット）又は融合ＰＣＲ法に関しては、本発明のプロテアーゼ変異体を作製する際に、Ｂ．レンタスＧＧ３６をコードしている核酸を含むｐＨＰＬＴ−ＧＧ３６プラスミドをＤＮＡテンプレートとして使用することができる。例示的な構成では、融合ＰＣＲに関してＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＱＣＭＳ製品取扱説明書に、及び米国特許出願第２００６／０２５２１５５号に記載されるように、所望される変異を含有しているヌクレオチドプライマーを、ｐＨＰＬＴ−ＧＧ３６プラスミド中のＧＧ３６をコードしている核酸とアニールさせ、ＤＮＡポリメラーゼにより伸長させる。表１−１は、部位特異的変異導入に使用することができるプライマーの例示的なヌクレオチド配列を提供する。
【０２９９】
【表３】
0006018044.tif 000005
【０３００】
各プロテアーゼ変異体への変異の組み込みは、最終的なプロテアーゼ変異体が得られるまで、多段階で実施することができる。製造元により説明されるようにローリングサークル型増幅（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用することで、Ｂ．サブチリス（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）細胞を形質転換させる前に、ＱＣＭＳ又は融合ＰＣＲライゲーション反応に含有される変異型プラスミドを増幅させることができる。
【０３０１】
当該技術分野において既知の手順（例えば、国際公開第０２／１４４９０号を参照されたい）を用い、形質転換受容性のＢ．サブチリス細胞（表現型：ΔａｐｒＥ，ΔｎｐｒＥ，ｏｐｐＡ，ΔｓｐｏＩＩＥ，ｄｅｇＵＨｙ３２，ΔａｍｙＥ：：（ｘｙｌＲ，ｐｘｙｌＡ−ｃｏｍＫ））を、変異体プラスミド又は１μＬのローリングサークル型増幅反応物により形質転換させることで、プロテアーゼ陽性の形質転換体を得ることができる。バクテリアは、キシロース誘導型プロモーター（例えば、Ｈａｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２１：７６３〜７７５（１９９６）を参照されたい）の制御下にｃｏｍＫ遺伝子を導入することで、形質転換受容性にすることができる。プロテアーゼ変異体の陽性のクローンを、スキムミルク／寒天プレートで選別し、単離し、配列決定し、及びフラスコ振盪培養法でプロテアーゼ変異体タンパク質を産生させることで、十分な量の評価用酵素試料を生成することができる。
【０３０２】
（実施例２）
バチルス・スブチルスでのプロテアーゼ変異体の産生
１０ｍＬのＴＳＢ（トリプシン及び大豆系ブロス）培地中で、Ｂ．サブチリス形質転換体を３７℃で一晩増殖させることで、プロテアーゼ変異体（例えば、サブチリシン変異体）を生成した。一晩培養物の２５０μＬのアリコートを、１００ｍＬの振盪フラスコ内の２５ｍＬのＭＯＰＳ系合成培地に移し、３７℃で６８時間増殖させた。基本培地からＮＨ４Ｃｌ、ＦｅＳＯ４及びＣａＣｌ２を除外し、３ｍＭのＫ２ＨＰＯ４を使用し、かつ基本培地に６０ｍＭの尿素、７５ｇ／Ｌのグルコース、及び１％のソイトンを添加したことを除き、本質的に当該技術分野において既知であるように（Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１１９：７３６〜７４７，１９７４を参照されたい）合成培地を調製した。また、微量栄養素は、１Ｌあたり４００ｍｇのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１００ｍｇのＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ、１００ｍｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、５０ｍｇのＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１００ｍｇのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、１００ｍｇのＮａＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、１００ｍｇのＮａ２Ｂ４Ｏ７・１０Ｈ２Ｏ、１０ｍＬの１ＭのＣａＣｌ２、及び１０ｍＬの０．５Ｍのクエン酸ナトリウムを含有する１００Ｘ原液として構成した。対象とするプロテアーゼを培養培地から単離した。
【０３０３】
（実施例３）
プロテアーゼ変異体試料の純度を測定するための解析法
この実施例では、Ｂ．サブチリス培養物から得られる組み換えプロテアーゼ変異体（例えば、サブチリシン変異体）の純度を測定するために使用される方法を記載する。ゲル電気泳動及び高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、それぞれ単一のバンド又は単一のピークが観察された場合、プロテアーゼ変異体は高純度であるとみなされた。
【０３０４】
ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の存在下での、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＰＡＧＥ）を当該技術分野において既知である通りに実施した（Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｎａｔｕｒｅ，２２７：６８０〜６８５，１９７０）。但し、自己分解を防ぐため、タンパク質試料の変性（例えば、ＳＤＳを含有している試料緩衝液中１００℃で１０分）前にプロテアーゼ活性を失活させる必要があった。プロテアーゼの失活は、タンパク質試料を１ｍＭのＰＭＳＦと共に室温で３０分間インキュベートするか、あるいは８％のトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を用い、氷上で３０分間タンパク質を沈殿させるかして行った。ｐＨ  ７．４５でタンパク質試料をｎａｔｉｖｅ  ＰＡＧＥにかけた。ゲル緩衝液は、２０ｍＭのヒスチジン及び５０ｍＭの３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）からなり、かつ５％のポリアクリルアミドゲルのアクリルアミド：ビスアクリルアミド比は２０：１であった。タンパク質試料をスラブゲルの頂部に充填し、陰極に向けて電気泳動した。電気泳動（タンク用）緩衝液にはｐＨを６．３に調整した同様のヒスチジン／ＭＯＰＳ緩衝液を使用した。電気泳動（３５０Ｖで約１〜２時間）後、タンパク質をゲル中で固定させるためゲルを８％の酢酸に漬浸させ、続いて当該技術分野で記載されるようにクーマシーブリリアントブルーＲ２５０で染色し、ゲル上のタンパク質のバンドの位置を求めた。
【０３０５】
プロテアーゼ試料の純度は、ＭｏｎｏＳカチオン交換カラム、及びそれに続いてＴＳＫ  ２０００ゲル濾過カラムを用いるＨＰＬＣ解析により確認した。カチオン交換カラムによるＨＰＬＣは、１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ５．５）を用い実施し、結合していたプロテアーゼの溶出には濃度を１０〜３００ｍＭで線状勾配させたリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ５．５）を用いた。ゲル濾過カラムによるＨＰＬＣは、０．２５Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ  ５．５）で実施した。タンパク質の溶出プロファイルを２８０ｎｍでモニターし、対象とするプロテアーゼの局在を求め、試料の純度（％）を測定した。
【０３０６】
（実施例４）
プロテアーゼ変異体の濃度の測定
この実施例では、プロテアーゼ変異体の濃度を測定するために使用した方法を記載する。一部の実験では、以下に記載のように、算出された吸光係数（ε）を用い２８０ｎｍで吸収（吸光度）測定を行い、活性部位を滴定することで、生成したタンパク質溶液中のタンパク質濃度を測定した。
【０３０７】
２８０ｎｍでの吸光係数を酵素分子あたりのトリプトファン（Ｔｒｐ，ε＝５，６００Ｍ−１・ｃｍ−１）及びチロシン（Ｔｙｒ，ε＝１，３３０Ｍ−１・ｃｍ−１）の数から算出した。ＰＢ９２プロテアーゼに関し、モル吸光係数はε１％に相当する２６，１００Ｍ−１・ｃｍ−１（Ｔｒｐ残基３個＋Ｔｙｒ残基７個）であり、２８０ｎｍ＝９．７（Ｍｒ＝２６，７２９Ｄａ）であった。トリプトファン及び／又はチロシン残基の数が変更された変異型プロテアーゼの場合には、適宜補正を行った。
【０３０８】
活性部位を滴定し、活性な酵素分子の濃度評価を得た。広く使用されている方法であるＮ−トランスシンナモイルイミダゾールによるアシル化（Ｂｅｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８８：５８９０〜５９３１，１９６６）は、ＰＢ９２プロテアーゼに関しては充分に機能しなかったことから、この方法の代わりに、不可逆的阻害剤であるＰＭＳＦを用いる方法を行った。この方法では、酵素濃度が既知（２８０ｎｍでの吸光度から）のプロテアーゼ溶液をそれぞれ０．２５、０．５０、０．７５、１．００及び１．２５当量のＰＭＳＦと混合し、１０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ  ６．５）中で室温で１時間反応させた。スクシニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−フェニル−アラニル−パラ−ニトロアニリド（ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ）を基質として用い、残存プロテアーゼ活性を分光光度的に測定した。これらの実験に関し、ＰＭＳＦの純度（及びひいては濃度）をＮＭＲ−分光法により測定し、ＰＭＳＦ原液はイソプロパノールで調製した。活性部位滴定の結果は、ＨＰＬＣ法による純度の確認から得られたタンパク質濃度と一致することが判明した。
【０３０９】
（実施例５）
アッセイ
この実施例では、本発明のプロテアーゼ変異体の安定性及びクリーニング性能の評価方法を記載する。
【０３１０】
ＡＡＰＦ加水分解方法
プロテアーゼ変異体を６８℃で１時間インキュベート後にＡＡＰＦアッセイを用いプロテアーゼ活性をアッセイすることで、セリンプロテアーゼ変異体の熱安定性を測定した。アッセイ条件下での、参照プロテアーゼ（例えば、野生型ＧＧ３６＝ＧＣＩ−Ｐ０３６）の残存活性は約５０％であった。使用した装置は：平底ＭＴＰ（Ｃｏｓｔａｒ番号９０１７）、Ｂｉｏｍｅｋ  ＦＸ及び／又はＢｉｏｍｅｋ  ＦＸｐロボット（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  Ｐｌｕｓ  ３８４  ＭＴＰリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）、ｉＥＭＳ恒温器／振盪器（１ｍｍ振幅）（Ｔｈｅｒｍｏ／Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）、シーリングテープ（Ｎｕｎｃ番号２３６３６６）、及びアイスバスであった。グリシン緩衝液は３．７５ｇのグリシン（メルク番号１．０４２０１．１０００）を９６０ｍＬの水に溶解させて調製した。１ｍＬの５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）−８０（Ｓｉｇｍａ番号Ｐ−８０７４）及び１０ｍＬの１０００ｍＭのＣａＣｌ２（Ｍｅｒｃｋ番号１．０２３８２．１０００）（２９．４ｇを２００ｍＬに溶解させた）原液をこの溶液に加えた。４ＮのＮａＯＨによりｐＨを１０．５に調整し、容量を１０００ｍＬにメスアップさせた。グリシン、ＣａＣｌ２及びＴＷＥＥＮ（登録商標）−８０の最終濃度はそれぞれ５０ｍＭ、１０ｍＭ及び０．００５％であった。恒温器は６８℃（インキュベートの際）及び２５℃（ＡＡＰＦアッセイの際）に設定した。空の希釈及びインキュベーションプレートにそれぞれ９０μＬ及び１９０μＬのグリシン緩衝液を加えた。次に希釈プレートに上清を１０μＬ加え、続いて希釈プレートから１０μＬを取りインキュベーションプレートに加えた。次いでインキュベーションプレートから混合物を１０μＬ取り、ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ基質を含有している予熱したプレートに加えた。ＭＴＰリーダーで４１０ｎｍにてｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡプレートを読み取った（ｔ＝０測定）。インキュベーションプレートをテープで覆い、４００ｒｐｍで振盪させながら６８℃で１時間インキュベートした。インキュベーション終了後にプレートを恒温器から取り出し、氷上で少なくとも５分冷却させた。インキュベーションプレートから混合物を１０μＬ取り、ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ基質を含有しているプレートに移し、プレートを４１０ｎｍで読み取った（ｔ＝６０測定）。残存活性（％）は次のように算出した：
残存活性（％）：（ｔ＝６０時点でのｍＯＤ／分）／（ｔ＝０時点でのｍＯＤ／分）×１００
界面活性剤及びキレート安定性アッセイ
ＬＡＳ及びＬＡＳ／ＥＤＴＡの存在下で、試験プロテアーゼをそれぞれインキュベーションした後に、ＡＡＰＦアッセイを用い測定された残存活性の関数として、ＬＡＳ及びＬＡＳ／ＥＤＴＡの安定性を測定した。
【０３１１】
ＬＡＳ安定性アッセイ法
試薬：
ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム塩（＝ＬＡＳ）：Ｓｉｇｍａ  Ｄ−２５２５
ＴＷＥＥＮ（登録商標）−８０：Ｓｉｇｍａ  Ｐ−８０７４
トリス緩衝液（酸不含）：Ｓｉｇｍａ  Ｔ−１３７８）；６．３５ｇを約９６０ｍＬの水に溶解させ；４ＮのＨＣｌによりｐＨを８．２に調整した。ＴＲＩＳの最終濃度は５２．５ｍＭである。
【０３１２】
ＬＡＳ原液：１０．５％のＬＡＳ／ＭＱ水溶液（＝１０．５ｇ／１００ｍＬのＭＱ）として調製
トリス緩衝液−１００ｍＭ／ｐＨ  ８．６（１００ｍＭのＴｒｉｓ／０．００５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）−８０）
ＴＲＩＳ−Ｃａ緩衝液（ｐＨ  ８．６）（１００ｍＭのＴＲＩＳ／１０ｍＭのＣａＣｌ２／０．００５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）−８０）
ハードウェア：
平底ＭＴＰ（Ｃｏｓｔａｒ番号９０１７）
Ｂｉｏｍｅｋ  ＦＸ
ＡＳＹＳマルチピペッター
Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  ＭＴＰリーダー
ｉＥＭＳ恒温器／振盪器
Ｉｎｎｏｖａ  ４３３０恒温器／振盪器
Ｂｉｏｈｉｔマルチチャンネルピペット
ＢＭＧ  Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｒ振盪器
５２．５ｍＭのＴＲＩＳ緩衝液（ｐＨ  ８．２）を用い、０．０６３％のＬＡＳ溶液を調製した。１００ｍｇ／ｍＬのｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ原液（ＤＭＳＯ中）１ｍＬを１００ｍＬ（１００ｍＭ）のトリス緩衝液（ｐＨ  ８．６）に加えることで、ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ希釈標準溶液を調製した。上清を希釈するため、平底プレートに希釈緩衝液を充填し、上清のアリコートを添加し、充分混合した。希釈比は増殖プレート中の対照プロテアーゼの濃度（ＡＡＰＦ活性）に依存して決定した。所望されるタンパク質濃度は８０ｐｐｍであった。
【０３１３】
１９０μＬの０．０６３％のＬＡＳ緩衝液／ウェルに希釈上清を１０μＬ加えた。ＭＴＰをテープで覆い、数秒振盪させた後、２００ｒｐｍで撹拌させつつＡＳＰについては２５℃若しくは３５℃、又はＢＰＮ’若しくはＧＧ３６については４５℃の恒温器（Ｉｎｎｏｖａ  ４２３０）に６０分間配置した。１０分のインキュベーション後、各ウェル中の混合物１０μＬを、ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ実験溶液を１９０μＬ含有している新しいＭＴＰに移し、初期活性（ｔ＝１０分）を測定した。これらの溶液を充分に混合し、ＭＴＰリーダーを用いＡＡＰＦ活性を測定した（２５℃にて５分毎に２０回）。
【０３１４】
更にインキュベーションの６０分後に１０μＬの溶液をインキュベートプレートから取り出し、最終活性（ｔ＝６０分）を測定した。次に上記のように、ＡＡＰＦ活性を測定した。次のように残存ＡＡＰＦ活性及び開始ＡＡＰＦ活性の比を算出することで試料の安定性を判定した：
残存活性（％）＝（ｔ−６０値）＊１００／（ｔ−１０値）。
【０３１５】
ＬＡＳ／ＥＤＴＡの安定性アッセイ法
代表的なアニオン性界面活性剤（ＬＡＳ＝直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩、具体的には、ドデシルベンゼン硫酸ナトリウムＤＯＢＳ）及びＥＤＴＡ二ナトリウムの存在下でのプロテアーゼ変異体の安定性を、所定の条件下でのインキュベーション後に測定し、かつＡＡＰＦアッセイを用いて残存活性を測定した。試薬は、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム塩（ＤＯＢＳ，Ｓｉｇｍａ  Ｎｏ．Ｄ−２５２５）、ＴＷＥＥＮ（登録商標）−８０（Ｓｉｇｍａ  Ｎｏ．Ｐ−８０７４）、ＥＤＴＡ二ナトリウム（Ｓｉｅｇｆｒｉｅｄ  Ｈａｎｄｅｌ  Ｎｏ．１６４５９９−０２）、ＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ  Ｎｏ．Ｈ−７５２３）、未負荷緩衝液：５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（１１．９ｇ／Ｌ）＋０．００５％  ＴＷＥＥＮ（登録商標）−８０（ｐＨ  ８．０）、負荷緩衝液：５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（１１．９ｇ／Ｌ）、０．１％（ｗ／ｖ）ＤＯＢＳ（１ｇ／Ｌ）、１０ｍＭのＥＤＴＡ（３．３６ｇ／Ｌ）（ｐＨ  ８．０）、参照プロテアーゼ及びプロテアーゼ変異体培養上清（２００〜４００μｇ／ｍＬのタンパク質を含有）を使用した。装置は、希釈プレートとしてＶ又はＵ底ＭＴＰ（それぞれＧｒｅｉｎｅｒ  ６５１１０１及び６５０１６１）、未負荷及びＬＡＳ／ＥＤＴＡ緩衝液用平底ＭＴＰ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ９０１７）、並びにｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡプレート、Ｂｉｏｍｅｋ  ＦＸ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  Ｐｌｕｓ  ３８４  ＭＴＰリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）、ｉＥＭＳ恒温器／振盪器（１ｍｍ振幅）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、及びシーリングテープ：Ｎｕｎｃ（２３６３６６）を使用した。
【０３１６】
ｉＥＭＳ恒温器／振盪器（Ｔｈｅｒｍｏ／Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）は２９℃に設定した。培養上清を、未負荷緩衝液を含有しているプレートで約２５ｐｐｍ濃度に希釈した（マスター希釈プレート）。マスター希釈プレートから、２０μＬのサンプルを取り、未負荷緩衝液を１８０μＬ含有しているプレートに加え、最終インキュベーション濃度２．５ｐｐｍを得た。含有物を混合し、室温で維持し、このプレートでＡＡＰＦアッセイを実施した。マスター希釈プレートから、２０μＬのサンプルを取り、１８０μＬ負荷緩衝液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（１１．９ｇ／Ｌ）、０．１％（ｗ／ｖ）ＤＯＢＳ（１ｇ／Ｌ）、１０ｍＭのＥＤＴＡ（３．３６ｇ／Ｌ）（ｐＨ  ８．０））を含有しているプレートに加えた。溶液を混合し、直ちに２９℃のｉＥＭＳ振盪器に４００ｒｐｍで振盪させながら３０分間配置した。３０分間のインキュベーション後、ＡＡＰＦアッセイをストレスプレート上で実施した。（ＯＤ＝光密度吸光度）次のように残留及び開始ＡＡＰＦ比を算出することにより、サンプルの安定性を判定した：残存活性（％）＝（ｍＯＤ／分（ストレス負荷））＊１００／（ｍＯＤ．／分（ストレス未負荷））。
【０３１７】
（実施例６）
ＰＸ３変異体の洗浄性能試験
この実施例では、市販の食器用洗剤及び洗濯洗剤でのＰＸ３プロテアーゼ変異体（例えば、サブチリシン変異体）及びＧＣＩ−Ｐ０３８参照サブチリシンの食器洗浄性能及び布地クリーニング性能の評価に好適な方法を記載する。
【０３１８】
食器洗浄性能
市販の食器用洗剤で本発明のプロテアーゼ変異体（例えば、サブチリシン変異体）及びＧＣＩ−Ｐ０３８参照サブチリシンの食器洗浄性能を測定するために使用した方法を以下に記載する。
【０３１９】
プロテアーゼ変異体の性能を様々な自動食器洗浄条件下で試験した。食器用洗剤の組成は表６−１及び６−２に示す。これらの洗剤はｗｆｋ  Ｔｅｓｔｍａｔｅｒｉａｌｓ（ｗｗｗ．ｔｅｓｔｇｅｗｅｂｅ．ｄｅ／ｅｎ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ／）から市販されており、ｗｆｋ  Ｔｅｓｔｍａｔｅｒｉａｌｓの表記に基づき参照されるプロテアーゼ変異体について解析するために、これらの洗剤は酵素を含有させていない販売元から得た。
【０３２０】
【表４】
0006018044.tif 000006
【０３２１】
【表５】
0006018044.tif 000007
【０３２２】
それぞれの種類の染み（卵黄、ひき肉及び溶き卵、並びに牛乳と溶いた卵）の調製に関するプロトコルを以下に提供する。試験皿にそれぞれの種類の染みをもたらす前に、皿は十分に洗浄した。試験前から皿表面にある種のしつこい染みが残っている場合もあることから、皿を十分に洗浄しておくことは特に不可欠である。新しい皿は試験の初回に使用する前にも３回しっかりと洗浄した。
【０３２３】
ステンレス鋼上の卵黄染みの調製
これらの実験で使用されるステンレス鋼シート（１０×１５ｃｍ；片面をブラシ処理済み）を、市販の高アルカリ性洗剤（例えば、ＥＣＯＬＡＢ（登録商標）洗剤；Ｈｅｎｋｅｌ）を用いて研究用食洗機で９５℃で十分に洗浄することで、清潔でグリースの除去されたシートを用意した。これらのシートからは初回使用前に反りをとった。卵黄により染みを付ける前にシートを保温キャビネット内で８０℃で３０分間乾燥させた。ブラシ処理する表面には染み処理前には触れなかった。同様に、表面上には水染み又は毛羽立ちは存在させなかった。冷却したシートは染み処理前に秤量した。
【０３２４】
１０〜１１個の卵の黄身（卵黄２００ｇ）を白身から取り分けて卵黄を調製した。ガラス製ビーカーの中で黄身をフォークで撹拌し、均一な黄身懸濁液にした。次に黄身を濾し（約０．５ｍｍのメッシュ）、粗い粒子及び卵の殻の破片を取り除いた。
【０３２５】
ステンレス鋼シートの各ブラシがけした面上１４０ｃｍ２に、平らなブラシ（２．５”（６．３５ｃｍ））を使用して２．０±０．１ｇの卵黄懸濁液を可能な限り均一に塗り広げた。縁には約１ｃｍ幅の未染み処理部位を残した（必要に応じて接着テープを使用した）。染み処理したシートを室温で４時間（最大で２４時間）水平に乾燥させた（シートの縁で液滴が形成されるのを防ぐため）。
【０３２６】
卵黄タンパク質を変性させるため、シートを脱塩熱湯水に３０秒間漬けた（必要に応じて保持デバイスを使用して）。次いでシートを再度８０℃で３０分間乾燥させた。乾燥させ、冷却させた後、シートを秤量した。秤量後、シートは洗浄試験にかける前に少なくとも２４時間寝かせた（２０℃、相対湿度４０〜６０％）。試験要件を満たすため、１０００±１００ｍｇ／１４０ｃｍ２（変性後の卵黄）のシートのみを試験に使用した。シートは洗浄した後、８０℃の保温キャビネットで３０分乾燥させ、冷却させた後に再度秤量した。洗浄によりシートから放出された卵黄の重量（ｍｇ）を、染み付けさせ変性させた卵黄の重量（ｍｇ）で除し１００を乗じることで、クリーニング性能（％）を算出した。
【０３２７】
磁器プレート上のひき肉及び卵の染みの調製
これらの実験では、ＥＮ  ５０２４２、１４９５型、０２１９番のデザート皿（Ａｒｚｂｅｒｇ，直径１９ｃｍ，白色，施釉磁器）を使用した。合計２２５ｇの赤身の豚肉及び牛肉（５０：５０比）を細かいみじん切りにし、低温に維持した。混合物を２度肉挽き機にかけた。温度が３５℃を超えて上昇しないようにした。次にひき肉２２５ｇを７５ｇの卵（白身及び黄身は予め一緒に混ぜておいた）と混ぜた。次に使用前に調製物を−１８℃で３ヶ月間冷凍した。豚が利用できない場合には牛肉１００％を使用した。これらは互換可能である。
【０３２８】
挽肉と卵の混合物（３００ｇ）を室温に戻し、８０ｍＬの脱塩水と混合した。混合物を台所用ハンドブレンダーを用い、２分間均質化させた。フォークを使用して挽肉／卵／水混合物を各白色磁器プレートに３ｇずつ塗り広げた。縁には塗布しない縁部を２ｃｍ幅で残した。塗布した量は１１．８±０．５ｍｇ／ｃｍ２であった。余熱した保温キャビネットでプレートを１２０℃で２時間乾燥させた。プレートは冷却されたら即使用のため準備した。
【０３２９】
食器洗浄試験後、挽肉のタンパク質性の汚れの残留度をより良好に識別させるために、プレートにはニンヒドリン溶液（１％エタノール溶液）を噴霧した。着色反応を促進させるため、プレートは保温キャビネットで８０℃で１０分加熱させた。洗浄性能の評価は、ＩＫＷの写真カタログ（ＩＫＷ−Ｔｈｅ  Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ，Ｔｏｉｌｅｔｒｙ，Ｐｅｒｆｕｍｅｒｙ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）を参照して挽肉残滓の着色反応を視覚的に識別することで行った。
【０３３０】
ステンレス鋼上の卵／牛乳染みの調製
これらの実施例で使用したステンレス鋼シート（１０×１５ｃｍ；片面をブラシ処理済み）は、グリースを除去しシートを清潔にするために市販の高アルカリ性洗剤を用い研究用食洗機で９５℃で十分に洗浄した。シートはセルロース性の布で拭いて乾燥させた。ブラシ処理する表面には染み処理前には触れなかった。同様に、表面上には水染み又は毛羽立ちは存在させなかった。染み処理前に８０℃の保温キャビネットにシートを３０分配置した。冷却したシートは染み処理前に秤量した。
【０３３１】
未加工の全卵の黄身及び白身（卵３〜４個；約１６０ｇ／卵）をボウルに入れ、泡立て器でかき混ぜた。次に混合物に５０ｍＬの半脱脂乳（脂肪分１．５％、超高温、均質化）を加えた。泡立たせないよう牛乳及び卵をかき混ぜた。平らなブラシを使用して１．０±０．１ｇの卵／牛乳混合物をステンレス鋼シートに均一に塗り広げた。分布を確認するためにはかりを使用した。シートの短端には約１．０ｃｍの縁を残した。染み処理したシートを室温で４時間（最大で２４時間）水平に乾燥させた（シートの縁で液滴が形成されるのを防ぐため）。
【０３３２】
シートを脱塩熱湯水に３０秒間漬けた（必要に応じて保持デバイスを使用して）。次いでシートを再度８０℃で３０分間乾燥させた。乾燥させ、冷却させた後、シートを秤量した。秤量後、シートは、洗浄試験にかける前に少なくとも２４時間寝かせた（２０℃、相対湿度４０〜６０％）。試験要件を満たすため、１９０±１０ｍｇ卵黄／牛乳のシートのみを試験に使用した。
【０３３３】
シートは、洗浄した後、８０℃の保温キャビネットで３０分乾燥させ、冷却させた後に再度秤量した。洗浄によりシートから放出された卵黄／牛乳の重量（ｍｇ）を、染み処理した卵黄／牛乳の重量（ｍｇ）で除し１００を乗じることで、クリーニング性能（％）を算出した。
【０３３４】
洗浄装置及び条件
上記のように調製した、染み処理した食器及びステンレス鋼シートを配置し、自動食洗機（Ｍｉｅｌｅ  Ｇ６９０ＳＣモデル）で洗浄試験を実施した。規定量の洗剤を使用した。試験温度は５０℃であった。水硬度は３７５．９ｐｐｍであった（２１°ＧＨ（ドイツ硬度））。
【０３３５】
上記のように、挽肉で染み処理したプレートを洗浄後、０〜１０の光学的評価スケールを用い視覚的に評価した。「０」はプレートが完全に汚れたままであることを意味し、「１０」はプレートが清潔であることを意味する。これらの値は、酵素を含有している洗剤の染み除去又は汚れ除去（ＳＲ）能に相当する。
【０３３６】
卵黄又は卵黄／牛乳で染み処理したステンレス鋼プレートは、洗浄した後、洗浄後の染み残留度を測定するために重量測定法で解析した。サブチリシン変異体ＰＸ３及び参照サブチリシンＧＣＩ−Ｐ０３８を洗浄当たり０〜３０ｍｇ／活性タンパク質の濃度で試験した。
【０３３７】
様々な洗浄試験に関し、結果を表６−３〜６−６に提供する。これらのそれぞれの実験では、洗浄あたりに異なる活性プロテアーゼ濃度を用いた。参照サブチリシンＧＣＩ−Ｐ０３８の洗浄性能は「１００」として記載し、一方変異体の洗浄性能はこの値と比較して記載した。例えば、参照サブチリシンＧＣＩ−Ｐ０３８が４５％の染み除去性能を有し、変異体が５２％の染み除去性能を有した場合、サブチリシン変異体について得られた結果は５２／４５×１００＝１１６の性能指数（ＰＩ）として示される。したがって、試験した両方の洗剤において、サブチリシン変異体ＰＸ３は、食器洗浄用途でのタンパク質性の染み除去に関し、参照サブチリシンＧＣＩ−Ｐ０３８よりも効果的であり、あるいは同程度に効果的であった。
【表６】
0006018044.tif 000008
【表７】
0006018044.tif 000009
＊これらの特定の条件下でのＧＣＩ−Ｐ０３８ｗａの汚れ除去率は１００％であった。
【表８】
0006018044.tif 000010
【表９】
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【０３３８】
（実施例７）
洗浄性能試験
本実施例は、市販の洗濯洗剤中での本発明のプロテアーゼ変異体の布地クリーニング性能の評価に好適な方法である。
【表１０】
0006018044.tif 000012
＊  略記：Ｐｒｏｃｔｅｒ  ＆  Ｇａｍｂｌｅ（Ｐ＆Ｇ）；Ｒｅｃｋｉｔｔ  Ｂｅｎｃｋｉｓｅｒ（ＲＢ）；強力液体洗剤（ＨＤＬ）；強力顆粒洗剤（ＨＤＧ）。
【０３３９】
血液牛乳インク（ＢＭＩ）微小標本アッセイ
プロテアーゼ変異体の染み除去性能は、市販の洗剤でマイクロタイタープレート（ＭＴＰ）スケールで評価することができる。３７℃／３００ｒｐｍ／相対湿度９０％でＭＴＰプレートで３日間増殖させた培養物の培養ブロスを濾過し、参照プロテアーゼ酵素（例えば、参照サブチリシン）試料及びプロテアーゼ変異体試料を得た。装置は、９６ウェルポリスチレンプレート（Ｃｏｓｔａｒ番号９０１７の培地結合型の平底）、Ｂｉｏｍｅｋ  ＦＸ及び／又はＢｉｏｍｅｋ  ＦＸｐ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  Ｐｌｕｓ  ３８４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）、１ｍｍ振幅のｉＥＭＳ恒温器／振盪器（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）及びシーリングテープ（Ｎｕｎｃ番号２３６３６６）を使用した。試薬は、５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ  ８．０）又は５ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ  ７）緩衝液、中硬水用の３：１のＣａ：Ｍｇ（ＣａＣｌ２：ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ）；１５０００グレイン毎ガロン（ｇｐｇ）（２５７０６ｐｐｍ）の原液の６ｇｐｇ（１０３ｐｐｍ）希釈物、プレートあたり２枚のＢＭＩ（血液／牛乳／インク）微小標本：ＣＦＴにより加工されたＥＭＰＡ−１１６ＢＭＩ木綿標本：ウェルあたり２枚の、予洗しパンチ加工した微小標本、及びプロテアーゼ活性の存在しないことを確認することのできる、熱失活させた市販のＴＩＤＥ（登録商標）２Ｘ洗剤を使用した。本アッセイにおいて、プロテアーゼは基質及び遊離顔料及び基質由来の不溶性粒子を加水分解する。
【０３４０】
【表１１】
0006018044.tif 000013
【０３４１】
恒温器は所望の温度に設定する（１６℃又は３２℃）。まず始めに、酵素マスター希釈プレートから約１０ｐｐｍのサンプルを１０μＬ取り、上掲の１９０μＬの洗剤希釈標準溶液を含有させたＢＭＩ２−スウォッチプレートに添加するアッセイプレート中でプロテアーゼ変異体の最終濃度が０．５ｐｐｍになるよう容量を調整する。プレートを直ちにｉＥＭＳ恒温器に移し、１４００ｒｐｍで振盪しながら所定の温度で３０分間インキュベートする。インキュベーション後、上清１００μＬを新しい９６ウェルプレートに移し、ＭＴＰリーダーで、４０５ｎｍ及び／又は６００ｎｍで吸光度を測定する。１枚又は２枚のマイクロスウォッチと、プロテアーゼサンプルを無添加の洗剤とを含有している対照ウェルも、試験に包含させる。４０５ｎｍでの吸光度測定値はより高い値を提供し、かつ顔料除去を追跡するのに対し、６００ｎｍでの測定は濁度及び洗浄度を追跡する。
【０３４２】
染み除去能の算出：
得られた吸光度値をブランク値（酵素を除く基質）について補正し、加水分解活性を測定する。各試料（例えば、プロテアーゼ変異体酵素又は参照プロテアーゼ酵素）に関し、性能指数（ＰＩ）を算出する。性能指数は、同様のタンパク質濃度下でプロテアーゼ変異体の性能（実測値）と標準参照プロテアーゼの性能（理論値）とを比較する。加えて、標準酵素のＬａｎｇｍｕｉｒ等式のパラメーターを用いることで、理論値が算出できる。性能指数（ＰＩ）が１超（ＰＩ＞１）の場合、参照プロテアーゼ酵素（例えば、野生型サブチリシン）と比較してプロテアーゼ変異体がより良好であることを意味する；すなわち、性能指数が１超である場合、プロテアーゼ変異体の、対象とする染み減少、消去、又は除去性能が、参照プロテアーゼ酵素の同様の又は類似する染み減少又は除去性能と比較して、強化又は改善されていることを意味する。ＰＩが１（ＰＩ＝１）である場合、プロテアーゼ変異体が参照プロテアーゼ酵素と同等に又はおおよそ同等に機能することを意味する（すなわち、プロテアーゼ変異体の、対象とする染み減少、消去、又は除去性能が、参照プロテアーゼ酵素の同様の又は類似する染み減少又は除去性能と比較して、同等又はおおよそ同等であることを意味する）。ＰＩが１未満（ＰＩ＜１）である場合、プロテアーゼ変異体は参照プロテアーゼ酵素と比較して良好に機能しないことを意味する（すなわち、プロテアーゼ変異体の、対象とする染み減少、消去、又は除去性能が、参照プロテアーゼ酵素の同様の又は類似する染み減少又は除去性能と比較して、減少しており又は参照よりも低いことを意味する）。したがって、ＰＩ値は、特定の環境又は条件下での対象とする染み減少、消去、又は除去性能が、参照プロテアーゼ酵素の同様の又は類似する染みの除去性能と比較して改善され又は強化されたプロテアーゼ変異体、並びに特定の環境下での使用がより望ましくないプロテアーゼ変異体、例えば、対象とする染み減少、消去、又は除去性能が、参照プロテアーゼ酵素の同様の又は類似する染み減少又は除去性能と比較して、減少しているプロテアーゼ変異体を識別する）。
【０３４３】
（実施例８）
ＰＸ３、ＰＸ４、及びＰＸ５プロテアーゼ変異体のクリーニング性能
洗濯用途でのＢＭＩ微小標本アッセイ
洗濯用途での、変異体ＰＸ４及びＰＸ５のクリーニング性能を判定するために実施した実験結果を、表８−１に示す。熱不活性化させた市販のＴＩＤＥ（登録商標）２Ｘ  Ｆｒｅｅ（Ｐ＆Ｇ；「ＮＡ  ＨＤＬ」）ＴＩＤＥ  Ｆｒｅｅ（Ｐ＆Ｇ；「ＮＡ  ＨＤＤ」）を試験洗剤として使用した。２００μＬ容量で１４００ｒｐｍで震盪させながら０．２ｐｐｍの変異体を２５℃で３０分用い、ＢＭＩ染み処理した微小標本に対するクリーニング性能を試験した。ＧＣＩ−Ｐ０３６変異体の性能を性能指数（Ｐｉ）で定量した。性能指数（Ｐｉ）は、親タンパク質ＧＣＩ−Ｐ０３６の性能に対する変異体の性能の比である。サブチリシンＦＮＡ（ＢＰＮ’−Ｙ２１７Ｌ）及びＧＣＩ−Ｐ０３６−Ｓ８７Ｎ−Ｇ１１８Ｖ−Ｓ１２８Ｌ−Ｐ１２９Ｑ−Ｓ１３０Ａタンパク質も試験した。
【０３４４】
【表１２】
0006018044.tif 000014
【０３４５】
（実施例９）
ＰＸ３、ＰＸ４、及びＰＸ５プロテアーゼ変異体のクリーニング性能
焼き付けた卵黄の洗浄用途に関する微小標本アッセイ
市販の洗濯洗剤（ＣＡＬＧＯＮＩＴ（登録商標）（Ｒｅｃｋｉｔｔ−Ｂｅｎｃｋｉｓｅｒ）及びＣＡＳＣＡＤＥ（登録商標）（Ｐ＆Ｇ））中でのプロテアーゼ変異体（例えば、サブチリシン変異体）の染み除去性能をマイクロタイタープレート（ＭＴＰ）スケールで測定した。３７℃／３００ｒｐｍ／相対湿度９０％でＭＴＰプレートで３日間増殖させた培養物の培養ブロスを濾過し、サブチリシン変異体の試験用試料を得た。装置は以下のものを使用した：Ｂｉｏｍｅｋ  ＦＸロボット（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）、ＳｐｅｃｔｒａＭＡＸマイクロタイタープレート（ＭＴＰリーダー（３４０型、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）、ｉＥＭＳ恒温器／振盪器（Ｔｈｅｒｍｏ／Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）、平底ＭＴＰ（Ｃｏｓｔａｒ  ９０１７型、インキュベート後に反応プレートを読み取るために使用）、並びにＶ底ＭＴＰ（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ６５１１０１、上清の前希釈に使用）。ＣＦＴ  Ｖｌａａｒｄｉｎｇｅｎから得たＣＳ−３８微小標本（卵黄と色素を混合し、加熱して経時処理したもの）を基材として使用した。ウェル当たり２つの標本を使用した。Ｃａｌｇｏｎｉｔ  ５ｉｎ１の自動食器洗浄用（ＡＤＷ）の錠剤を使用して洗剤溶液を調製した。錠剤中に存在するプロテアーゼ活性を失活させるために、２１ｇの錠剤をミリＱ水に溶解させ、ウォーターバスで６０℃に加熱した。溶液を室温に冷却し、水の容量を７００ｍＬに調整した。最終濃度３ｇ／Ｌになるよう溶液を更に水で希釈した。１．４６ｍＬのＣａ／Ｍｇ混合物（Ｃａ／Ｍｇ混合物（（３：１）、１．９２ＭのＣａＣｌ２＝２８２．３ｇ／ＬのＣａＣｌ２・２Ｈ２０；０．６４ＭのＭｇＣｌ２＝１３０．１ｇ／ＬＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ）、１５０００ｇｐｇ（２５７０６ｐｐｍ））を添加して、水硬度を２１°ＧＨ（３７５．９ｐｐｍ）に調整した。酵素試料を１０ｍＭのＮａＣｌ／０．１ｍＭのＣａＣｌ２／０．００５％のＴＷＥＥＮ（登録商標）−８０溶液に予希釈し、適切な濃度で試験した。
【０３４６】
恒温器を４０℃又は５０℃の所望の温度に設定し、空のＶ底プレート（＝希釈プレート）に７２μＬの希釈緩衝液と、続いて８μＬの上清を加えた。次いで、希釈プレートから９μＬをとり、微小標本を入れた、１７１μＬの洗剤溶液の入っているプレートに加えインキュベートした。微小標本プレート（洗剤及び酵素が入っている）をテープで覆い、恒温器／震盪器に１４００ｒｐｍで３０分間配置した。インキュベーション後、７５μＬの反応混合物を空のＦ底プレートに移し、ヘアドライヤーを用い脱気した後にＭＴＰリーダーで４０５ｎｍにて吸光度を読み取った。１つ又は２つの微小標本を含有させ、参照サブチリシンは添加せずに試料を含有させたブランク対照も同様に試験でインキュベートした。
【表１３】
0006018044.tif 000015
＊  略記：Ｐｒｏｃｔｅｒ  ＆  Ｇａｍｂｌｅ（Ｐ＆Ｇ）；及びＲｅｃｋｉｔｔ  Ｂｅｎｃｋｉｓｅｒ（ＲＢ）。
【０３４７】
染み除去能の算出：
得られた吸光度値をブランク値（酵素を除く基質）について補正し、加水分解活性を測定した。各試料（例えば、プロテアーゼ変異体酵素又は参照プロテアーゼ酵素）に関し、性能指数（ＰＩ）を算出した。性能指数は、同様のタンパク質濃度下でプロテアーゼ変異体の性能（実測値）と参照プロテアーゼの性能（理論値）とを比較する。加えて、標準酵素のＬａｎｇｍｕｉｒ等式のパラメーターを用いることで、理論値が算出できる。性能指数（ＰＩ）が１（ＰＩ＞１）超の場合、参照プロテアーゼ酵素（例えば、野生型サブチリシン）と比較してプロテアーゼ変異体がより良好であることを意味する；すなわち、性能指数が１超である場合、プロテアーゼ変異体の、対象とする染み（例えば、卵黄と色素を混ぜ、加熱することで経時処理した染み）の減少、消去、又は除去性能が、参照プロテアーゼ酵素の同様の又は類似する染みの減少又は除去性能と比較して、強化又は改善されていることを意味する。ＰＩが１（ＰＩ＝１）である場合、プロテアーゼ変異体が参照プロテアーゼ酵素と同等に又はおおよそ同等に機能することを意味する（すなわち、プロテアーゼ変異体の、対象とする染み減少、消去、又は除去性能が、参照プロテアーゼ酵素の同様の又は類似する染み減少又は除去性能と比較して、同等又はおおよそ同等であることを意味する）。ＰＩが１未満（ＰＩ＜１）である場合、プロテアーゼ変異体は参照プロテアーゼ酵素と比較して良好に機能しないことを意味する（すなわち、プロテアーゼ変異体の、対象とする染み減少、消去、又は除去性能が、参照プロテアーゼ酵素の同様の又は類似する染み減少又は除去性能と比較して、減少しており又は参照よりも低いことを意味する）。したがって、ＰＩ値は、特定の環境又は条件下での対象とする染み減少、消去、又は除去性能が、参照プロテアーゼ酵素の同様の又は類似する染みの除去性能と比較して改善され又は強化されたプロテアーゼ変異体、並びに特定の環境下での使用がより望ましくないプロテアーゼ変異体、例えば、対象とする染み減少、消去、又は除去性能が、参照プロテアーゼ酵素の同様の又は類似する染み減少又は除去性能と比較して、減少しているプロテアーゼ変異体を識別する）。
【０３４８】
プロテアーゼ変異体（例えば、変異型サブチリシン）のクリーニング性能は、微小標本アッセイを用い判定した（ＣＳ−３８標本、例えば、卵黄と色素を混ぜ、加熱することで経時処理した染みに関するアッセイ）。変異体のＬＡＳ／ＥＤＴＡ安定性、熱安定性及びＴＣＡによるタンパク質沈殿判定も上記の方法を用い測定した。結果を表９−２に示す。
【表１４】
0006018044.tif 000016
【０３４９】
表９−２に示されるように、プロテアーゼ変異体は、様々な洗剤組成物中で、５０℃にて、参照プロテアーゼＧＧ３６と比較して、強化又は改善されたクリーニング性能を示した。特に、変異体ＰＸ３は、５０℃ではＣＡＬＧＯＮＩＴ（登録商標）５ｉｎ  １及びＣＡＳＣＡＤＥ（登録商標）Ｃｏｍｐｌｅｔｅ中でプロテアーゼＧＧ３６よりも良好なクリーニング性能を、４０℃ではＣＡＬＧＯＮＩＴ（登録商標）５ｉｎ  １のクリーニング性能（ＰＩ値））とほぼ同様のクリーニング性能を示した。ＰＸ４変異体は、５０℃ではＣＡＬＧＯＮＩＴ（登録商標）５ｉｎ  １及びＣＡＳＣＡＤＥ（登録商標）Ｃｏｍｐｌｅｔｅ中で、並びに４０℃ではＣＡＬＧＯＮＩＴ（登録商標）５ｉｎ  １中で、プロテアーゼＧＧ３６よりも有意に大きなクリーニング性能（ＰＩ値）を示した。したがって、プロテアーゼＧＧ３６と同様のクリーニング性能を達成するにあたり、必要とされるＰＸ４プロテアーゼの量はより少量であるものと予想される。加えて、特筆すべき事に、ＰＸ４変異体は、低温でさえもプロテアーゼＧＧ３６と比較して実質的に良好なクリーニング性能を示した。プロテアーゼ変異体ＰＸ５は、５０℃ではＣＡＬＧＯＮＩＴ（登録商標）５ｉｎ  １及びＣＡＳＣＡＤＥ（登録商標）Ｃｏｍｐｌｅｔｅ中でプロテアーゼＧＧ３６よりも良好なクリーニング性能を、４０℃ではＣＡＬＧＯＮＩＴ（登録商標）５ｉｎ  １のクリーニング性能（ＰＩ値））とほぼ同様のクリーニング性能を示した。
【０３５０】
（実施例１０）
液体洗濯洗剤組成物
本実施例は、本発明の液体洗濯洗剤組成物に関する様々な配合を提供する。本発明のプロテアーゼ変異体を少なくとも１種添加することのできる例示的な本発明のプロテアーゼ変異体を下表１０−１及び１０−２に提供する。少なくとも１種の本発明のプロテアーゼ変異体を、得られる配合物（組成物）の重量の約０．０００１〜約１０重量％の濃度で各配合物に含ませることができる。配合者の求めるニーズに基づき、配合物は、配合者により決定される代替的な濃度のプロテアーゼ変異体を含み得る。
【０３５１】
【表１５】
0006018044.tif 000017
＃１：１ＮのＨＣｌ水溶液を加え、配合物の未希釈時ｐＨを約３〜約５の範囲に調整した。
【０３５２】
配合物（Ｉ）及び（ＩＩ）のｐＨは約５〜約７であり、かつ配合物（ＩＩＩ）〜（Ｖ）のｐＨは約７．５〜約８．５である。
【０３５３】
【表１６】
0006018044.tif 000018
【０３５４】
（実施例１１）
食器手洗い用液体洗剤組成物
本実施例は、本発明の食器手洗い用液体洗剤組成物に関する様々な配合を提供する。本発明のプロテアーゼ変異体を少なくとも１種添加することのできる例示的な食器手洗い用液体洗剤組成物が以下に提供され得る。少なくとも１種の本発明のプロテアーゼ変異体を、得られる配合物（組成物）の重量の約０．０００１〜約１０重量％の濃度で各配合物に含ませることができる。配合者の求めるニーズに基づき、配合物は、配合者により決定される代替的な濃度のプロテアーゼ変異体を含み得る。
【０３５５】
【表１７】
0006018044.tif 000019
配合物（Ｉ）〜（ＶＩ）のｐＨは約８〜約１１である。
【０３５６】
（実施例１２）
自動食器洗浄用液体洗剤組成物
本実施例は、本発明の自動食器洗浄用液体洗剤組成物に関する様々な配合を提供する。本発明のプロテアーゼ変異体を少なくとも１種添加することのできる例示的な自動食器洗浄用液体洗剤組成物が以下に提供され得る。少なくとも１種の本発明のプロテアーゼ変異体を、得られる配合物（組成物）の重量の約０．０００１〜約１０重量％の濃度で各配合物に含ませることができる。配合者の求めるニーズに基づき、配合物は、配合者により決定される代替的な濃度のプロテアーゼ変異体を含み得る。
【０３５７】
【表１８】
0006018044.tif 000020
【０３５８】
（実施例１３）
粒状及び／又は錠剤型洗濯用組成物
本実施例は、粒状及び／又は錠剤型洗濯用組成物に関する様々な配合を提供する。本発明のプロテアーゼ変異体を少なくとも１種添加することのできる例示的な粒状及び／又は錠剤型洗濯用組成物が以下に提供され得る。少なくとも１種の本発明のプロテアーゼ変異体を、得られる配合物（組成物）の重量の約０．０００１〜約１０重量％の濃度で各配合物に含ませることができる。配合者の求めるニーズに基づき、配合物は、配合者により決定される代替的な濃度のプロテアーゼ変異体を含み得る。
【０３５９】
【表１９】
0006018044.tif 000021
＊  香料、染料、増白剤／ＳＲＰ１／Ｎａカルボキシメチルセルロース／蛍光漂白剤／ＭｇＳＯ４／ＰＶＰＶＩ／抑泡剤／高分子量ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）／クレイ。
【０３６０】
（実施例１４）
食器自動洗浄用高濃度洗剤組成物
本実施例は、本発明の食器自動洗浄用高濃度洗剤組成物に関する様々な配合を提供する。本発明のプロテアーゼ変異体を少なくとも１種添加することのできる例示的な食器自動洗浄用高濃度洗剤組成物が以下に提供され得る。少なくとも１種の本発明のプロテアーゼ変異体を、得られる配合物（組成物）の重量の約０．０００１〜約１０重量％の濃度で各配合物に含ませることができる。配合者の求めるニーズに基づき、配合物は、配合者により決定される代替的な濃度のプロテアーゼ変異体を含み得る。
【０３６１】
【表２０】
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＊増白剤／染料／ＳＲＰ１／Ｎａカルボキシメチルセルロース／蛍光漂白剤／ＭｇＳＯ４／ＰＶＰＶＩ／抑泡剤／高分子量ＰＥＧ／クレイ。
処方（Ｉ）〜（ＶＩ）のｐＨは約９．６〜約１１．３である。
【０３６２】
（実施例１５）
錠剤型洗剤組成物
本実施例は、錠剤型洗剤組成物に関する様々な配合を提供する。標準的な１２ヘッド式ロータリープレスを用い、粒状食器洗浄洗剤組成物を１３ＫＮ／ｃｍ２の圧力で圧縮させることで、本発明のプロテアーゼ変異体が少なくとも１種添加され得る以下の本発明の例示的な錠剤型洗剤組成物を調製する。少なくとも１種の本発明のプロテアーゼ変異体を、得られる配合物（組成物）の重量の約０．０００１〜約１０重量％の濃度で各配合物に含ませることができる。配合者の求めるニーズに基づき、配合物は、配合者により決定される代替的な濃度のプロテアーゼ変異体を含み得る。
【０３６３】
【表２１】
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＊増白剤／ＳＲＰ１／Ｎａカルボキシメチルセルロース／蛍光漂白剤／ＭｇＳＯ４／ＰＶＰＶＩ／抑泡剤／高分子量ＰＥＧ／クレイ。
配合物（Ｉ）〜（ＶＩＩ）のｐＨは約１０〜約１１．５であり；配合物（ＶＩＩＩ）のｐＨは約８〜約１０であった。配合物（Ｉ）〜（ＶＩＩＩ）の錠剤重量は約２０グラム〜約３０グラムである。
【０３６４】
（実施例１６）
液体硬質表面クリーニング洗剤
本実施例は、本発明の液体硬質表面クリーニング洗剤組成物に関する様々な配合を提供する。本発明のプロテアーゼ変異体を少なくとも１種添加することのできる例示的な液体硬質表面クリーニング洗剤組成物が以下に提供され得る。少なくとも１種の本発明のプロテアーゼ変異体を、得られる配合物（組成物）の重量の約０．０００１〜約１０重量％の濃度で各配合物に含ませることができる。配合者の求めるニーズに基づき、配合物は、配合者により決定される代替的な濃度のプロテアーゼ変異体を含み得る。
【０３６５】
【表２２】
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処方（Ｉ）〜（ＶＩＩ）のｐＨは約７．４〜９．５である。
【０３６６】
本案件で引用されるすべての特許及び刊行物は、本発明が関連するレベルの当業者の指針になる。当業者は、本発明が、言及した目的が達成され、意図した結果及び利点に加え固有の性質が得られるよう良好に調整されることを認識する。本明細書に記載の組成物及び方法は、実施形態のうちの代表的なものであり、例示であり、本発明の範囲を制限することを意図するものではない。当業者であれば、本細書で開示される本発明には、本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく様々な変更及び修正を加えることができることは容易に認識するであろう。
【０３６７】
本明細書に例示的に記載される本発明は、任意の成分の非存在下で、本開示に特記されていない制限下で実施することもできる。採用された用語及び表現は説明の観点から使用されるものであり、限定するものではなく、このような用語及び表現の使用により、本明細書に示されかつ記載される特徴の任意の等価物又はその一部を排除することを意図するものではなく、主張される本発明の範囲内で様々な修正が可能であることが認識される。したがって、本発明は、実施形態及び任意的な特徴により具体的に開示されているが、本明細書に開示されている概念の修正及び変更は当業者の手助けとなるであろうし、かつこのような修正及び変更は、本願により定義されるような本発明の範囲内であるものとみなされることは理解すべきである。
【０３６８】
本発明は、本明細書において広範に及び総括的に記載されてきた。包括的な本開示に当てはまるより狭い種及び下位の集団のそれぞれも本発明に一部を形成する。本開示は、具体的に本明細書に引用される材料を制限する場合又はしない場合のいずれにせよ、属から任意の対象を外すことになる条件又は負の制限付きで、本発明の概説を包含するものである。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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