(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
マーカー遺伝子を用いて、大腸腫瘍を検出する方法であって、
（Ａ）被験者から採取した糞便中に含まれるＲＮＡを抽出する工程と、
（Ｂ）前記工程（Ａ）において得られたＲＮＡ中のマーカー遺伝子由来ＲＮＡの量を測定する工程と、
（Ｃ）前記工程（Ｂ）において測定されたマーカー遺伝子由来ＲＮＡの量と、マーカー遺伝子の種類ごとに予め設定された閾値とを比較し、測定されたマーカー遺伝子由来ＲＮＡ量が予め設定された閾値よりも多い場合に陽性と判断する工程と、
を有し、
前記マーカー遺伝子がＣＫＢ（Ｃｒｅａｔｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  Ｂ）遺伝子、ＣＯＸ−２（Ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ−２）遺伝子及びＭＭＰ−７遺伝子であることを特徴とする大腸腫瘍の検出方法。
【請求項２】
前記マーカー遺伝子として、さらに、Ｓｎａｉｌ遺伝子、ＭＭＰ−１遺伝子、及びＢ２Ｍ（β２ミクログロブリン）遺伝子からなる群より選択される１種以上の遺伝子を用いることを特徴とする請求項１記載の大腸腫瘍の検出方法。
【請求項３】
大腸腺腫又は大腸早期癌を検出することを特徴とする請求項１又は２に記載の大腸腫瘍の検出方法。
【請求項４】
前記被験者が、大腸腫瘍に罹患していると診断されたことがあり、
前記被験者から経時的に採取された糞便に対して、それぞれ、前記工程（Ａ）〜（Ｃ）を行い、当該被験者の大腸腫瘍の再発可能性をモニタリングするためになされることを特徴とする請求項１又は２に記載の大腸腫瘍の検出方法。
【請求項５】
糞便中に含まれるＲＮＡを抽出するための機器又は薬剤と、
ＣＫＢ（Ｃｒｅａｔｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  Ｂ）遺伝子由来ＲＮＡを検出するためのプローブ又はプライマーの少なくともいずれか一方と、
ＣＯＸ−２（Ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ−２）遺伝子由来ＲＮＡを検出するためのプローブ又はプライマーの少なくともいずれか一方と、及び
ＭＭＰ−７遺伝子由来ＲＮＡを検出するためのプローブ又はプライマーの少なくともいずれか一方と、
を含むことを特徴とする糞便を用いて大腸腫瘍を検出するためのキット。
【請求項６】
さらに、Ｓｎａｉｌ遺伝子、ＭＭＰ−１遺伝子、及びＢ２Ｍ（β２ミクログロブリン）遺伝子からなる群より選択される１種以上の遺伝子由来ＲＮＡを検出するためのプローブ又はプライマーの少なくともいずれか一方を含むことを特徴とする請求項５記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マーカー遺伝子を用いた大腸腫瘍、特に進行腺腫や早期癌の検出方法に関する。より具体的には、糞便に含まれているマーカー遺伝子由来ＲＮＡの量を指標として、当該糞便が採取された被験者の大腸腫瘍への罹患の有無を検出する方法に関する。
本願は、２０１０年６月１６日に日本国に出願された特願２０１０−１３７４６０号に基づく優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
大腸癌による死亡者が、増加している。大腸癌による死亡者は、全ての癌による死亡者のうち男性においては第４番目、女性においては第１番目に多い癌である（２００５年度癌死統計）。また、２０２０年の癌罹患者推計では、男性は第二位、女性は第一位になると推計されている。そこで、二次的な予防を含めた総合的な大腸癌対策が強く求められている。大腸癌は他の癌に比べて、早期に発見され適切な治療が行われた場合の５年生存率が非常に高いため、大腸癌の集団検診（ｍａｓｓ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）は、最も効果的な方法の一つである。【０００３】
大腸癌の確定診断のためには、一般的に、大腸内を直接視認できる内視鏡検査が行われており、さらに必要に応じて、患部の生検検査も行われている。しかしながら、これらの方法は侵襲的であり、かつ、高度な専門技術を要するため、集団検診のような一次スクリーニングには不適当である。【０００４】
集団検診のためには、簡便かつ非侵襲性の検出方法であることが重要である。現在利用することができる唯一の非侵襲性の方法は、潜血の有無を調べる糞便検査、すなわち便潜血検査であり、大腸癌の集団検診の標準方法として広く用いられている。しかしながら、便潜血検査は、糞便中にヘモグロビンが現れることが腫瘍に特異的なものではないことから、感度及び特異度が低く（感度３０〜９０％、特異度７０〜９８％）、偽陰性や偽陽性が少なからず存在するという欠点がある。【０００５】
非侵襲的に大腸癌を検出する方法として、糞便に含まれる成分を指標とする方法がある。糞便中には癌組織から剥離してきた細胞が含まれていることから、糞便の組成は消化管病変を反映し得ると考えられる。そこで、正常組織ではあまり発現せず、癌組織では高発現する遺伝子をバイオマーカーとし、糞便中の当該遺伝子のｍＲＮＡ量を指標として、癌罹患者と健常者とを区別している。このように、検体として糞便を用いることにより、侵襲性がなく、被験者の検査負担を飛躍的に改善することができる。【０００６】
例えば、糞便中のＫ−ｒａｓ、ｐ−５３、ＡＰＣ遺伝子変異やマイクロサテライト不安定性を検出する等のＤＮＡを用いた方法が報告されている（例えば、非特許文献１〜４参照。）。また、糞便中のタンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）等のｍＲＮＡを検出する方法や（例えば、非特許文献５〜７参照。）、糞便の細胞画分のＣＤ４４バリアントの発現を調べる方法（例えば、非特許文献８参照。）、糞便中に含まれているゲノムＤＮＡのメチル化の有無を検出する方法（例えば、非特許文献９参照）等も開発されている。【０００７】
このように、糞便中の含有量を指標として大腸癌を検出し得るバイオマーカーとして利用可能な遺伝子が多く報告されている。しかしながら、これらのバイオマーカーを用いた場合の感度は便潜血法とほぼ同程度かそれよりも低い、という問題がある。特に、集団検診においては、早期癌や癌化の可能性の高い進行腺腫といった、内視鏡的又は手術的切除によって治癒が可能な腫瘍を検出することが重要であるが、上記いずれのバイオマーカーでも、早期癌や進行腺腫の検出感度が便潜血法よりも劣っている。このため、糞便を検体として早期癌等を感度よく検出する方法の開発が強く望まれている。【０００８】
便潜血法よりも感度よく大腸癌を検出する方法として、本発明者らにより、糞便中のＣＯＸ−２（Ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ−２）遺伝子の発現量を指標とする方法が開示されている（例えば、特許文献１〜４参照。）。ＣＯＸ−２遺伝子は、大腸癌の遺伝子マーカーとして非常に優れているものの、ＣＯＸ−２遺伝子の発現量が増大しない大腸癌（ＣＯＸ−２陰性大腸癌）もあり、このようなケースを検出することができない。特許文献３には、ＭＭＰ−７（Ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−７）遺伝子やＳｎａｉｌ遺伝子等の、ＣＯＸ−２遺伝子と併用可能な遺伝子マーカーも開示されているものの、これらの遺伝子の発現量は、ＣＯＸ−２遺伝子の発現量とほぼ同様の挙動を示す場合が多く、このため、これらの遺伝子マーカーを併用した場合でも、ＣＯＸ−２陰性大腸癌の検出感度を向上させることは困難である。また、ＣＯＸ−２遺伝子、ＭＭＰ−７遺伝子、及びＳｎａｉｌ遺伝子は、癌の進行度に依存して糞便中の発現量が増大する傾向があるため、進行癌に比べて早期癌の検出感度が低いという問題もある。【０００９】
一方、大腸癌において、ＣＫＢ（Ｃｒｅａｔｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  Ｂ）及びｈｎＲＮＰ  Ｆ（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｆ）の発現量と細胞内局在が変化することが報告されている（例えば、非特許文献１０参照。）。ＣＫＢについては、その他にも、子宮癌において発現量が増大し、血清中のＣＫＢ含有量が、子宮癌マーカーとして使用可能であることも報告されている（例えば、非特許文献１１参照。）。しかしながら、糞便中のＣＫＢ含有量の大腸癌マーカーとしての利用可能性については、現在までに全く報告されていない。発現量が癌化に依存して増減するタンパク質をコードする遺伝子が、必ず臨床上有用なバイオマーカーとして利用できるとは限らないことは、当業者であれば当然理解できる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特許第４１３４０４７号公報
【特許文献２】特許第４２０６４２５号公報
【特許文献３】国際公開第２００７／０１８２５７号パンフレット
【特許文献４】国際公開第２００８／０９３５３０号パンフレット
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】シドランスキー等著（Ｄ．Ｓｉｄｒａｎｓｋｙ，ｅｔ ａｌ．）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、１９９２年、第２５６巻、第１０２〜１０５ページ。
【非特許文献２】ドン等著（Ｓ．Ｍ．Ｄｏｎｇ，ｅｔ ａｌ．）、ジャーナル・オブ・ザ・ナショナル・キャンサー・インスティテュート（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、２００１年、第９３巻、第１１号、第８５８〜８６５ページ。
【非特許文献３】トラベルソ等著（Ｇ．Ｔｒａｖｅｒｓｏ，ｅｔ ａｌ．）、ザ・ニューイングランド・ジャーナル・オブ・メディシン（Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、２００２年、第３４６巻、第５号、第３１１〜３２０ページ。
【非特許文献４】トラベルソ等著（Ｇ．Ｔｒａｖｅｒｓｏ，ｅｔ ａｌ．）、ザ・ランセット（Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ）、２００２年、第３５９巻、第４０３〜４０４ページ。
【非特許文献５】デビッドソン等著（Ｌ．Ａ．Ｄａｖｉｄｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．）、カーシノジェネシス（Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ）、１９９８年、第１９巻、第２号、第２５３〜２５７ページ。
【非特許文献６】アレキサンダー及びライハット著（Ｒ．Ｊ．Ａｌｅｘａｎｄｅｒ ａｎｄ Ｒ．Ｆ．Ｒａｉｃｈｔ）、ダイジェスティブ・デジージス・アンド・サイエンス（Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、１９９８年、第４３巻、第１２号、第２６５２〜２６５８ページ。
【非特許文献７】ヤマオ等著（Ｔ．Ｙａｍａｏ ｅｔ ａｌ．）、ガストロエンテロロジー（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ）、１９９８年、第１１４巻、第６号、第１１９８〜１２０５ページ。
【非特許文献８】サイトウ著（Ｈ．Ｓａｉｔｏ）、ジャパニーズ・ジャーナル・オブ・キャンサー・リサーチ（Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、１９９６年、第８７巻、第１０号、第１０１１〜１０２４ページ。
【非特許文献９】ナガサカ等著（Ｔ．Ｎａｇａｓａｋａ，ｅｔ ａｌ．）、ジャーナル・オブ・ザ・ナショナル・キャンサー・インスティチュート（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、２００９年、第１０１巻、第１８号、第１２４４〜１２５８ページ。
【非特許文献１０】バラスブラマニ等著（Ｍ．Ｂａｌａｓｕｂｒａｍａｎｉ，ｅｔ ａｌ．）、キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、２００６年、第６６巻、第２号、第７６３〜７６９ページ。
【非特許文献１１】ハドルソン等著（Ｈ．Ｇ．Ｈｕｄｄｌｅｓｔｏｎ，ｅｔ ａｌ．）、ガイナコロジック・オンコロジー（Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ）、２００５年、第９６巻、第７７〜８３ページ。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、糞便に含まれる成分を指標として、大腸腫瘍、特に進行腺腫や早期癌を高感度に検出する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、大腸腫瘍罹患者より提供された糞便からＲＮＡを抽出し、このＲＮＡ中に含まれているヒト遺伝子由来のＲＮＡを解析したところ、大腸腫瘍罹患者では、大腸腫瘍非罹患者（大腸に特段の疾患のない者）よりも、糞便中に含まれているＣＫＢ（Ｃｒｅａｔｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  Ｂ）遺伝子由来ＲＮＡの量が多いことを見出し、本発明を完成させた。【００１４】
すなわち、本発明は下記の構成をとる。
（１）  マーカー遺伝子を用いて、大腸腫瘍を検出する方法であって、
（Ａ）被験者から採取した糞便中に含まれるＲＮＡを抽出する工程と、
（Ｂ）前記工程（Ａ）において得られたＲＮＡ中のマーカー遺伝子由来ＲＮＡの量を測定する工程と、
（Ｃ）前記工程（Ｂ）において測定されたマーカー遺伝子由来ＲＮＡの量と、マーカー遺伝子の種類ごとに予め設定された閾値とを比較し、測定されたマーカー遺伝子由来ＲＮＡ量が予め設定された閾値よりも多い場合に陽性と判断する工程と、
を有し、
前記マーカー遺伝子がＣＫＢ（Ｃｒｅａｔｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  Ｂ）遺伝子、ＣＯＸ−２（Ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ−２）遺伝子及びＭＭＰ−７遺伝子であることを特徴とする大腸腫瘍の検出方法。
（２）  前記マーカー遺伝子として、さらに、Ｓｎａｉｌ遺伝子、ＭＭＰ−１遺伝子、及びＢ２Ｍ（β２ミクログロブリン）遺伝子からなる群より選択される１種以上の遺伝子を用いることを特徴とする前記（１）記載の大腸腫瘍の検出方法。
（３）  大腸腺腫又は大腸早期癌を検出することを特徴とする前記（１）又は（２）に記載の大腸腫瘍の検出方法。
（４）  前記被験者が、大腸腫瘍に罹患していると診断されたことがあり、
前記被験者から経時的に採取された糞便に対して、それぞれ、前記工程（Ａ）〜（Ｃ）を行い、当該被験者の大腸腫瘍の再発可能性をモニタリングするためになされることを特徴とする前記（１）又は（２）に記載の大腸腫瘍の検出方法。
（５）  糞便中に含まれるＲＮＡを抽出するための機器又は薬剤と、
ＣＫＢ（Ｃｒｅａｔｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  Ｂ）遺伝子由来ＲＮＡを検出するためのプローブ又はプライマーの少なくともいずれか一方と、
ＣＯＸ−２（Ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ−２）遺伝子由来ＲＮＡを検出するためのプローブ又はプライマーの少なくともいずれか一方と、及び
ＭＭＰ−７遺伝子由来ＲＮＡを検出するためのプローブ又はプライマーの少なくともいずれか一方と、
を含むことを特徴とする糞便を用いて大腸腫瘍を検出するためのキット。
（６）  さらに、Ｓｎａｉｌ遺伝子、ＭＭＰ−１遺伝子、及びＢ２Ｍ（β２ミクログロブリン）遺伝子からなる群より選択される１種以上の遺伝子由来ＲＮＡを検出するためのプローブ又はプライマーの少なくともいずれか一方を含むことを特徴とする前記（５）記載のキット。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の大腸腫瘍の検出方法を用いることにより、被験者から採取された糞便を検体として、当該被験者が大腸腫瘍に罹患しているか否かを判断するために有用な情報を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】実施例１において得られた、糞便中の各マーカー遺伝子由来ＲＮＡ量を、大腸腫瘍の遺伝子マーカーとして用いた場合のＲＯＣ（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）解析の結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明及び本願明細書において、大腸腫瘍は、良性・悪性に拘わらず、大腸に発生する腫瘍であればよく、大腸腺腫と大腸癌の双方が含まれる。
【００１８】
大腸癌の進行度は、治療方法を決定する上で重要な要因である。大腸癌は、一般的に臨床病期０〜ＩＶ期に分類される。本発明及び本願明細書において、各病期は、それぞれ、以下の状態を指す。
０期：癌が粘膜内に留まっている状態。
Ｉ期：癌が大腸壁内に留まっている状態。
ＩＩ期：癌が大腸壁の固有筋層を超えており、壁外にまで及んでいる状態。
ＩＩＩ期：癌がリンパ節に転移している状態。
ＩＶ期：癌が遠方の臓器やリンパ節にまで転移している状態。
【００１９】
大腸早期癌（ｅａｒｌｙ  ｃａｎｃｅｒ）、進行癌（ａｄｖａｎｃｅｄ  ｃａｎｃｅｒ）とは、壁深達度により規定されている。早期癌とは、癌の先進部が大腸壁の粘膜内又は粘膜下層に限局し、これを超えていないものであり、臨床病期のうち０期とＩ期の一部を指す。進行癌とは、癌の先進部が粘膜下層を超え固有筋層以深に届くものであり、臨床病期のうちＩ期の一部、ＩＩ期、ＩＩＩ期とＩＶ期を指す。これらは大腸癌取り扱い規約第７版（大腸癌研究会、金原出版、２００６年）に定義されている。
【００２０】
大腸腺腫（ａｄｅｎｏｍａ）も、大きさや異型度に応じて、小腺腫と進行腺腫（ａｄｖａｎｃｅｄ  ａｄｅｎｏｍａ）とに分けられる。大腸腺腫の中には、大腸早期癌、特に粘膜癌（０期癌）との鑑別が難しいものがある。中でも１０ｍｍを超える大きさの進行腺腫は、粘膜癌と同様に、将来的に粘膜下層癌（Ｉ期癌）に進展する可能性のある腫瘍として、癌に順ずるものとしている。よって、集団検診等の一次スクリーニングでは、大腸早期癌と同様に、大腸腺腫、特に進行腺腫を検出することが重要である。
【００２１】
また、本発明及び本願明細書において、「マーカー遺伝子由来ＲＮＡ」とは、マーカー遺伝子のゲノムＤＮＡの全長又は一部分から転写されたＲＮＡを意味し、当該遺伝子のｍＲＮＡであってもよく、当該ｍＲＮＡの一部分（フラグメント）であってもよい。
【００２２】
本発明及び本願明細書において、「非罹患者」とは、大腸腫瘍に罹患していない者を意味し、健常者のみならず、大腸腫瘍以外の疾患に罹患している者も含む。
【００２３】
＜ＣＫＢ遺伝子＞
本発明者らが既に明らかにしているように、糞便中のＣＯＸ−２遺伝子由来ＲＮＡ量は、大腸癌を検出するために非常に有効なバイオマーカーである（特許文献１〜４参照。）。しかしながら、ＣＯＸ−２遺伝子のみをバイオマーカーとした場合には、ＣＯＸ−２陰性の大腸癌を検出することができない。そこで、本発明者らは、ＣＯＸ−２陰性の大腸癌を検出可能なマーカー遺伝子をＣＯＸ−２遺伝子と併用することにより、集団検診等でより感度よく大腸腫瘍を検出し得ると考え、そのような新規なマーカー遺伝子の探索を行った。
【００２４】
具体的には、内視鏡検査等により大腸癌を発症していると確定診断がなされた患者であって、糞便中のＣＯＸ−２遺伝子由来ＲＮＡの量が、健常者よりも非常に多い患者（ＣＯＸ−２強陽性大腸癌罹患者）と、ＣＯＸ−２遺伝子由来ＲＮＡの量が、非罹患者と同程度しかない患者（ＣＯＸ−２陰性大腸癌罹患者）とからそれぞれ採取された糞便からｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出し、これを用いて各遺伝子の発現解析を行った。コントロールとして、健常者から採取された糞便に対しても同様に行った。なお、これらの患者及び健常者には、事前に口頭又は書面にてインフォームドコンセントを得た。また、採取された糞便の保存、ＲＮＡ抽出は、後記実施例１に記載の方法と同様にして行った。
【００２５】
各遺伝子の発現解析は、ＧｅｎｅＣｈｉｐ(登録商標)アレイを用いたＡｇｉｌｅｎｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｒｒａｙ解析により行った（タカラバイオ株式会社ドラゴンジェノミクスセンターに外注。）。この結果、糞便中のＣＯＸ−２遺伝子由来ＲＮＡの量は、ＣＯＸ−２強陽性大腸癌罹患者では健常者の２５．３倍であったのに対して、ＣＯＸ−２陰性大腸癌罹患者では健常者の１．４倍でしかなかった。また、ＭＭＰ−７遺伝子及びＭＭＰ−１遺伝子の各遺伝子由来ＲＮＡ量は、ＣＯＸ−２遺伝子と同様に、ＣＯＸ−２強陽性大腸癌罹患者において多く、ＣＯＸ−２陰性大腸癌罹患者では健常者に比し明らかに高くはなかった。一方で、ＣＫＢ遺伝子は、ＣＯＸ−２陰性大腸癌罹患者において、健常者よりも糞便中の発現量が２８．８倍も上昇していることが分かった。これらの結果から、大腸腫瘍罹患者では、非罹患者よりも、糞便中のＣＫＢ遺伝子由来ＲＮＡが多い傾向があること、ＣＫＢ遺伝子を大腸腫瘍のマーカー遺伝子として用いることにより、ＣＯＸ−２陽性の大腸腫瘍のみならず、ＣＯＸ−２陰性の大腸腫瘍をも検出可能であることが明らかとなった。
【００２６】
＜大腸腫瘍の検出方法＞
本発明の大腸腫瘍の検出方法は、大腸腫瘍の遺伝子マーカーとして、ＣＫＢ遺伝子を用いることを特徴とする。糞便中のＣＫＢ遺伝子由来ＲＮＡの量は、大腸腫瘍罹患者において、非罹患者よりも多くなる傾向がある。このため、糞便中のＣＫＢ遺伝子由来ＲＮＡの量を指標として、大腸腫瘍の罹患の有無を検出することができる。すなわち本発明は、大腸腫瘍の罹患の有無を調べるために、大腸腫瘍の遺伝子マーカーとして、ＣＫＢ遺伝子を用いて、糞便中の大腸腫瘍の遺伝子マーカー由来ＲＮＡを検出する方法とも言える。
【００２７】
本発明の大腸腫瘍の検出方法においては、大腸腫瘍の遺伝子マーカーとして、ＣＫＢ遺伝子以外の他のマーカー遺伝子を組み合わせて用いてもよい。２種類以上の遺伝子を組み合わせて用いることにより、大腸腫瘍をより精度よく検出することができる。ＣＫＢ遺伝子と組み合わせる他のマーカー遺伝子は、糞便中の当該遺伝子由来ＲＮＡ量が、大腸腫瘍罹患者群と非罹患者群とで有意に差がある遺伝子であれば、特に限定されるものではない。
【００２８】
本発明においては、ＣＫＢ遺伝子と組み合わせて用いるマーカー遺伝子として、ＣＯＸ−２遺伝子、ＭＭＰ−７遺伝子、Ｓｎａｉｌ遺伝子、ＭＭＰ−１遺伝子、及びＢ２Ｍ遺伝子からなる群より選択される１種以上の遺伝子を用いることが好ましい。
【００２９】
ＣＫＢ遺伝子は、糞便中の当該遺伝子由来ＲＮＡの量が、ＣＯＸ−２陰性大腸癌罹患者（ＣＯＸ−２遺伝子由来ＲＮＡの量が、非罹患者と同程度しかない大腸癌罹患者）において、非罹患者よりも高い遺伝子であったことから、大腸腫瘍の遺伝子マーカーとして利用できることが見出された。よって、本発明の大腸腫瘍の検出方法においては、大腸腫瘍のマーカー遺伝子として、ＣＫＢ遺伝子とＣＯＸ−２遺伝子とを組み合わせて用いることが特に好ましい。ＣＫＢ遺伝子とＣＯＸ−２遺伝子とを組み合わせて用いることにより、大腸腺腫や早期癌の検出感度をより向上させることができる。
【００３０】
本発明において用いられる大腸腫瘍のマーカー遺伝子の組み合わせとしては、具体的には、ＣＫＢ遺伝子とＣＯＸ−２遺伝子の組み合わせ、ＣＫＢ遺伝子とＣＯＸ−２遺伝子とＭＭＰ−７遺伝子の組み合わせ、ＣＫＢ遺伝子とＣＯＸ−２遺伝子とＳｎａｉｌ遺伝子の組み合わせ、ＣＫＢ遺伝子とＣＯＸ−２遺伝子とＭＭＰ−１遺伝子の組み合わせ、ＣＫＢ遺伝子とＣＯＸ−２遺伝子とＢ２Ｍ遺伝子の組み合わせ、ＣＫＢ遺伝子とＣＯＸ−２遺伝子とＭＭＰ−７遺伝子とＢ２Ｍ遺伝子との組み合わせ、及びＣＫＢ遺伝子とＭＭＰ−７遺伝子の組み合わせ等が挙げられる。
【００３１】
例えば、３遺伝子を組み合わせて用いることにより、ＣＫＢ遺伝子とＣＯＸ−２遺伝子とＭＭＰ−７遺伝子の組み合わせにより、ＣＫＢ遺伝子とＣＯＸ−２遺伝子とＳｎａｉｌ遺伝子の組み合わせ、ＣＫＢ遺伝子とＣＯＸ−２遺伝子とＭＭＰ−１遺伝子の組み合わせ、又はＣＫＢ遺伝子とＣＯＸ−２遺伝子とＢ２Ｍ遺伝子の組み合わせを用いた場合よりも、特に大腸腺腫の検出感度を改善し得る。また、特に、ＣＫＢ遺伝子とＣＯＸ−２遺伝子とＭＭＰ−７遺伝子とＢ２Ｍ遺伝子との４遺伝子を組み合わせて用いることにより、大腸腫瘍を非常に高精度かつ高感度に検出することができる。
【００３２】
本発明の大腸腫瘍の検出方法は、具体的には、下記の工程（Ａ）〜（Ｃ）を有する。
（Ａ）被験者から採取した糞便中に含まれるＲＮＡを抽出する工程と、
（Ｂ）前記工程（Ａ）において得られたＲＮＡ中のマーカー遺伝子由来ＲＮＡの量を測定する工程と、
（Ｃ）前記工程（Ｂ）において測定されたマーカー遺伝子由来ＲＮＡの量と、マーカー遺伝子の種類ごとに予め設定された閾値とを比較する工程。
以下、工程ごとに説明する。
【００３３】
まず、工程（Ａ）として、被験者から採取した糞便中に含まれるＲＮＡを抽出する。本工程においては、抽出したＲＮＡを常法により精製してもよい。糞便からのＲＮＡの抽出・精製方法は、特に限定されるものではなく、当該技術分野において公知のいずれの方法を用いてもよく、市販されている精製キット等を利用することもできる。なお、次の工程に移る前に、予め、工程（Ａ）において得られたＲＮＡの量や濃度を測定してもよい。ＲＮＡの量や濃度の測定方法は、特に限定されるものではなく、吸光度測定法等の当該技術分野において公知のいずれの方法を用いてもよい。
【００３４】
工程（Ａ）においてＲＮＡ抽出に供される糞便は、ヒト由来のものであれば特に限定されるものではなく、例えば、定期健診や診断等のために採取された検体等を用いることができる。また、排泄直後のものであってもよく、採取後一定期間保存されたものであってもよい。糞便の保存方法は特に限定されず、臨床検査等で糞便に対してなされる保存方法のいずれであってもよい。例えば、凍結保存や冷蔵保存された糞便をＲＮＡ抽出に用いてもよく、各種保存液に浸漬・懸濁させた状態で保存されたものを用いてもよい。糞便に添加される保存液としては、例えば、水溶性アルコール類等を有効成分とする糞便試料調製用溶液（例えば、国際公開第２０１０−０２４２５１号パンフレット参照。）等の、糞便中のＲＮＡの損傷を抑制して保存し得る溶液であることが好ましい。
【００３５】
工程（Ａ）において抽出されたＲＮＡは、そのまま工程（Ｂ）へ用いられてもよく、一定期間保存後に工程（Ｂ）へ用いられてもよい。ＲＮＡの保存は、ＲＮＡの分解を抑制して保存し得る方法であれば、いずれの方法で行ってもよく、例えば、凍結乾燥後に保存してもよく、精製水に溶解させた溶液の状態で保存してもよい。
【００３６】
次に、工程（Ｂ）として、工程（Ａ）において得られたＲＮＡ中のマーカー遺伝子由来ＲＮＡの量を測定する。工程（Ｂ）におけるマーカー遺伝子由来ＲＮＡの量の測定方法は、特に限定されるものではなく、一般的に特定の塩基配列を有する核酸の量を測定する場合に用いられる公知の手法の中から、適宜選択して行うことができる。
【００３７】
なお、本発明及び本願明細書において、ＲＮＡの量を測定するとは、厳密な定量を意味するものではなく、半定量的なものであってもよく、所定の閾値等との定量的な比較が可能な程度に測定できるものであってもよい。例えば、当該技術分野において公知の手法によりマーカー遺伝子由来ＲＮＡを検出し、得られた検出結果から、濃度既知の対照試料の検出結果から作成された検量線に基づき算出することができる。マーカー遺伝子由来ＲＮＡの検出方法は、特に限定されるものではなく、当該技術分野において公知のいずれの方法を用いてもよい。例えば、マーカー遺伝子由来ＲＮＡとハイブリダイズし得るプローブを用いたハイブリダイゼーション法により検出してもよく、マーカー遺伝子由来ＲＮＡとハイブリダイズし得るプライマーとポリメラーゼとを用いた核酸増幅反応を利用した方法により検出してもよい。その他、市販されている検出用キット等を利用することもできる。
【００３８】
工程（Ｂ）における測定は、工程（Ａ）において得られたＲＮＡ中に存在するマーカー遺伝子由来ＲＮＡを直接定量的に検出してもよく、当該ＲＮＡ中のマーカー遺伝子由来ＲＮＡを核酸増幅反応により増幅させた後に定量的に検出してもよい。例えば、マーカー遺伝子由来ＲＮＡに隣接してハイブリダイズする２本のプローブを用い、ハイブリダイゼーション後にリガーゼ反応により結合させ、得られた結合体を定量的に検出する方法や、標識したプローブを用いたノザンブロッティング法を行い、ハイブリダイゼーションにより会合体を形成したプローブの量を、標識を指標として定量的に検出する方法等により、マーカー遺伝子由来ＲＮＡを直接検出することができる。
【００３９】
マーカー遺伝子由来ＲＮＡの量は微量であるため、核酸増幅反応を利用した方法により測定することもできる。例えば、工程（Ａ）において得られたＲＮＡの全量又は一部に対して、逆転写反応を行うことによりｃＤＮＡを合成した後、得られたｃＤＮＡを鋳型として核酸増幅をすることにより、マーカー遺伝子由来ＲＮＡを検出し、その量を測定することができる。ｃＤＮＡを鋳型とした核酸増幅法としては、通常ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）が行われるが、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法やＩＣＡＮ（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｎｄ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）法を用いることもできる。また、当該核酸増幅として、リアルタイムＰＣＲ等の定量的ＰＣＲを行うことにより、マーカー遺伝子由来ＲＮＡの検出と同時にその定量を簡便に行うことができる。その他、ＲＮＡからダイレクトにＲＮＡを増幅させるＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法によっても、マーカー遺伝子由来ＲＮＡを増幅させることができる。マーカー遺伝子由来ＲＮＡの増幅産物は、当該技術分野において公知の手法により定量することができる。例えば、その増幅産物を適宜、ゲルやキャピラリー電気泳動等で特異的に分離した後、それを検出することにより定量的に測定することができる。
【００４０】
また、マーカー遺伝子由来ＲＮＡの検出には、インベーダー（登録商標）法等の各種増感法を利用することもできる。増感法は、工程（Ａ）において得られたＲＮＡ中に存在するマーカー遺伝子由来ＲＮＡを、直接検出する場合と、核酸増幅反応により増幅させた後に検出する場合のいずれの場合にも利用することができる。
【００４１】
マーカー遺伝子として、ＣＫＢ遺伝子とその他の遺伝子を組み合わせて用いる場合、それぞれのマーカー遺伝子由来ＲＮＡの量を個別に測定してもよく、同時に測定してもよい。例えば、工程（Ａ）において得られたＲＮＡの全量又は一部から逆転写反応により得られたｃＤＮＡを鋳型とし、遺伝子の種類ごとに別個にＰＣＲを行って増幅産物を得てもよく、マルチプレックスＰＣＲ等を行うことにより、複数の遺伝子の増幅産物を１つの反応で得てもよい。
【００４２】
工程（Ｂ）の後、工程（Ｃ）として、工程（Ｂ）において測定されたマーカー遺伝子由来ＲＮＡの量と、マーカー遺伝子の種類ごとに予め設定された閾値とを比較する。当該閾値は、大腸癌又は進行腺腫罹患者群と、非罹患者群とを識別するための閾値である。測定されたマーカー遺伝子由来ＲＮＡ量が予め設定された閾値よりも多い場合に陽性とし、当該閾値よりも少ない場合に陰性とする。
【００４３】
工程（Ｃ）において用いられる閾値は、当業者であれば、工程（Ｂ）におけるマーカー遺伝子由来ＲＮＡ量の測定方法の種類等を考慮して、また必要な予備検査等を行うことにより、適宜設定することができる。例えば、内視鏡検査等の他の検査方法の結果から、大腸疾患に罹患していないことが分かっている集団（非罹患者群）から採取された糞便と、大腸癌若しくは大腸進行腺腫に罹患していることが分かっている集団（罹患者群）から採取された糞便とに対して、工程（Ｂ）と同じ測定方法によりマーカー遺伝子由来ＲＮＡ量を求め、両集団の測定値を比較することにより、両群を識別するための閾値を適宜設定することができる。
【００４４】
閾値の設定に際しては、所望の検出精度を考慮することもできる。非罹患者群と罹患者群の両群について、糞便中のマーカー遺伝子由来ＲＮＡ量の分布が明らかにされている場合には、例えば、大腸癌又は大腸進行腺腫の罹患者から採取された糞便中のマーカー遺伝子由来ＲＮＡ量が閾値未満となる確率（すなわち、非罹患者であると判断される確率）が所望の範囲内（例えば、１０％以下、好ましくは５％以下、より好ましくは２．５％以下、さらに好ましくは１％以下、特に好ましくは０％）となるように、閾値を設定することができる。
【００４５】
また、非罹患者群についてのみ、糞便中のマーカー遺伝子由来ＲＮＡ量の分布が明らかにされている場合には、例えば、被験者が非罹患者であると仮定した場合に、当該被験者から採取された糞便中のマーカー遺伝子由来ＲＮＡ量が、非罹患者のパーセンタイルで所望の値（例えば、９０％ｉｌｅ、好ましくは９５％ｉｌｅ、より好ましくは９７．５％ｉｌｅ、さらに好ましくは９９％ｉｌｅ、特に好ましくは１００％ｉｌｅ）となるように、閾値を設定することができる。また、当該被験者から採取された糞便中のマーカー遺伝子由来ＲＮＡ量が閾値未満である有意確率（Ｐ値）が所望の値（例えば、１０％、好ましくは５％、より好ましくは１％、さらに好ましくは０．１％）となるように、閾値を設定することができる。なお、Ｐ値は両側確率であってもよく、片側確率であってもよい。罹患者群についてのみ、糞便中のマーカー遺伝子由来ＲＮＡ量の分布が明らかにされている場合にも、同様にして閾値を設定することができる。なお、Ｐ値は、Ｍａｎｎ Ｗｈｉｔｎｅｙ′ｓ Ｕ ｔｅｓｔ等の統計学的手法により求めることができる。
【００４６】
具体的には、工程（Ｂ）において測定されたＣＫＢ遺伝子由来ＲＮＡの量（以下、ＣＫＢ由来ＲＮＡ量）が、予め設定された閾値よりも多い場合に、前記被験者はＣＫＢ陽性であり、当該閾値よりも少ない場合には、前記被験者はＣＫＢ陰性である、と判断する。ＣＫＢ由来ＲＮＡ量は、大腸腫瘍罹患者群において、非罹患者群よりも高くなる傾向がある。このため、ＣＫＢ陽性であるという検出結果が得られた被験者は、大腸腫瘍に罹患している可能性が高い。このため、本発明の大腸腫瘍の検出方法を集団検診等の一次スクリーニングに用い、ＣＫＢ陽性と判断された被験者に対して内視鏡検査等を行うことにより、確定診断を行うことができる。このように、本発明の大腸腫瘍の検出方法により得られた検出結果は、大腸腫瘍の診断のための情報として有用である。つまり、本発明の大腸腫瘍の検出方法により、大腸腫瘍の診断のための情報を提供することができる。
【００４７】
このように、糞便中のＣＫＢ由来ＲＮＡ量は、大腸腫瘍の発症の有無に依存しており、大腸腫瘍が発症している被験者群のほうが、大腸腫瘍を発症していない被験者群よりも高くなる傾向がある。このため、本発明の大腸腫瘍の検出方法は、大腸腫瘍の再発可能性のモニタリングに利用することができる。具体的には、大腸腫瘍に罹患していると診断されたことがある被験者から、経時的に糞便を採取する。採取された各糞便に対して、それぞれ上記工程（Ａ）〜（Ｃ）を行う。例えば、外科的処理等により、既に発症していた大腸腫瘍の病変部を切除した被験者から、経時的に糞便中のＣＫＢ由来ＲＮＡ量を測定した場合には、得られた測定値が予め設定された閾値よりも高くなった場合に、当該糞便が採取された時点において、当該被験者では大腸腫瘍が再発した可能性が高い、と判断できる。
【００４８】
本発明の大腸腫瘍の検出方法における感度や特異度は、設定される閾値により適宜調整することができる。例えば、十分に高い感度を得たい場合、すなわち大腸腫瘍の罹患があることを検出しようとする場合には、閾値は、大腸腫瘍の罹患者から採取された糞便中のマーカー遺伝子由来ＲＮＡ量が閾値未満となる確率（すなわち、非罹患者であると判断される確率）が１％以下、特に好ましくは０％となるように設定することが好ましい。一方、健康診断等の一次スクリーニングに用いる場合には、多少感度が犠牲になるとしても、特異度が高いことが好ましい。このため、例えば、健常者から採取された糞便中のマーカー遺伝子由来ＲＮＡ量が閾値を越える確率（すなわち、罹患者であると判断される確率）が十分に小さくなるように、例えば１０％以下、好ましくは５％以下となるように閾値を設定することもできる。このように、本発明の大腸腫瘍の検出方法においては、所望の感度・特異度に合わせて、閾値を設定することができる。
【００４９】
マーカー遺伝子として、ＣＫＢ遺伝子とその他の遺伝子を組み合わせて用いた場合には、マーカー遺伝子ごとに、それぞれ閾値と比較し、陽性か陰性かを判断する。少なくとも１のマーカー遺伝子が陽性である被験者は、大腸腫瘍に罹患している可能性が高い。大腸腫瘍のタイプによっては、複数の大腸腫瘍マーカーのうち、あるマーカー遺伝子が陽性であったとしても、別のマーカー遺伝子は陰性となる場合も多い。このため、マーカー遺伝子を複数種類組み合わせて用いることにより、大腸腫瘍検出の感度を向上させることができる。
【００５０】
また、前記工程（Ａ）及び（Ｂ）において用いられる試薬や機器等を備えるキットを用いることにより、本発明の大腸腫瘍の検出方法をより簡便に実施することができる。当該キットは、具体的には、糞便中に含まれるＲＮＡを抽出するための機器又は薬剤と、ＣＫＢ遺伝子由来ＲＮＡを検出するためのプローブ又はプライマーの少なくともいずれか一方と、を含み、糞便を用いて大腸腫瘍を検出するために用いられる。
【００５１】
糞便中に含まれるＲＮＡを抽出するための機器又は薬剤としては、例えば、採取された糞便を均質化し、当該糞便に含まれていた細胞から核酸を抽出させた懸濁物を調製するために用いられる懸濁用溶液、得られた懸濁物からＲＮＡを回収・精製するための試薬等が挙げられる。当該懸濁用溶液としては、糞便から核酸を回収する際に一般的に用いられる溶液の中から適宜選択して用いることができる。当該懸濁用溶液としては、具体的には、フェノール溶液、クロロホルム溶液等が挙げられる。また、当該懸濁用溶液は、チオシアン酸グアニジン、界面活性剤、キレート剤等のＲＮＡ分解酵素阻害剤を含んでいることが好ましい。懸濁物からＲＮＡを回収・精製するための試薬等としては、例えば、エタノール溶液、シリカ等の無機担体等が挙げられる。
【００５２】
また、工程（Ａ）は、市販されている核酸精製キット等を利用することができるため、市販されている核酸精製キットと、ＣＫＢ遺伝子由来ＲＮＡを検出するためのプローブ又はプライマーとを組み合わせたものを、本発明のキットとすることもできる。
【００５３】
ＣＫＢ遺伝子由来ＲＮＡを検出するためのプローブ又はプライマーとしては、ＣＫＢ遺伝子由来ＲＮＡ、又は当該ＲＮＡから得られたｃＤＮＡの一部と特異的にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドを用いることができる。なお、ＣＫＢ遺伝子由来ＲＮＡ等とハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドは、当該技術分野において公知のいずれの手法で設計・作製されてもよい。
【００５４】
例えば、ＣＫＢ遺伝子由来ＲＮＡの検出を、糞便から抽出されたＲＮＡを鋳型として逆転写反応によりｃＤＮＡを合成した後、得られたｃＤＮＡを鋳型としてＣＫＢ遺伝子由来ＲＮＡを検出するためのプライマーを用いてＰＣＲ等の核酸増幅反応を行い、得られた増幅産物を検出する方法により行われる場合には、逆転写反応に用いる逆転写酵素、ランダムプライマー、ヌクレオチド、バッファー等や、ＰＣＲに用いるポリメラーゼ、標識ヌクレオチド、非標識ヌクレオチド、バッファー、ＰＣＲ装置等を、本発明のキットに含ませてもよい。
その他、ヒトをはじめとする動物から排泄された糞便を採取するための採便棒や採取容器等も、本発明のキットに含ませることができる。
【実施例】
【００５５】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００５６】
［実施例１］
＜糞便サンプル＞
大腸小腺腫（腫瘍の大きさが５〜９ｍｍ）患者１０名、大腸進行腺腫（腫瘍の大きさが１０ｍｍ以上）患者が２４名、大腸癌患者１１１名（早期癌２５名、進行癌８６名）、上部消化管癌患者１２名（胃腫瘍患者１０名、食道癌患者２名）、及び健常者１１３名から、糞便を提供していただいた。各患者は、内視鏡的・組織学的に確定診断がなされた患者である。本実施例においては、大腸に腫瘍性病変（但し、５ｍｍ未満の腺腫性ポリープや過形成ポリープは含まない）や、明らかな炎症性変化が認められず、出血性病変、全身性疾患、及び進行性の癌のない人を健常者とした。また、大腸癌患者１１１名のうち、病期０期が１１名、病期Ｉ期が２４名、病期ＩＩ期が３７名、病期ＩＩＩ期が２５名、病期ＩＶ期が１４名であった。なお、これらの患者及び健常者には、事前に口頭又は書面にてインフォームドコンセントを得た。
検体（糞便サンプル）は、内視鏡検査又は生検から２〜４週間後であって、手術又は内視鏡的切除の前に採取された。採取された糞便サンプルは、まず４℃で保存された後、保存開始後２４時間以内に−８０℃に移し、ＲＮＡ抽出処理を行うまで保存した。【００５７】
＜糞便サンプルからのＲＮＡ抽出・精製＞
滅菌済みの５ｍＬチューブに、約０．５ｇの凍結した糞便サンプルと、３ｍＬのＩｓｏｇｅｎ（ニッポンジーン社製）を加えた後、ホモジナイザーで混合して、均一化させた。得られたスラリーを、滅菌済み１．５ｍＬチューブに約０．７ｍＬずつ分注した後、１２，０００×ｇで５分間、４℃で遠心し、その上清を新しい滅菌済み１．５ｍＬチューブに分注した。各チューブに０．３ｍＬのＩｓｏｇｅｎと０．３ｍＬのクロロホルムをそれぞれ加え、チューブを３０秒間激しくボルテックスにかけて撹拌した後、１２，０００×ｇで１５分間、４℃で遠心した。得られた水相を、チューブ上面からコンタミネーションを生じないように注意して回収し、新しい１．５ｍＬチューブに移した。等量の７０％エタノール溶液を加えた後、チューブを３０秒間激しくボルテックスにかけて攪拌した。得られた混合液から、ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてＲＮＡを抽出・精製した。精製されたＲＮＡは、ＮａｎｏＤｒｏｐ  １０００（ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ社製）を用いて定量した。以後の解析に用いるまで、ＲＮＡは−８０℃にて保存した。【００５８】
＜マーカー遺伝子由来ＲＮＡ量の測定＞
精製されたＲＮＡとランダムヘキサマーと逆転写酵素Ｍ−ＭＬＶ（ＲＮａｓｅＨ−；タカラバイオ社製）とを用いて、最終容量が２０μＬの反応液中で、使用説明書に従ってｃＤＮＡを合成した。
合成されたｃＤＮＡを鋳型として、定量的リアルタイムＰＣＲを行うことにより、当該ｃＤＮＡ中のＣＫＢ遺伝子、ＣＯＸ−２遺伝子、ＭＭＰ−７遺伝子、Ｓｎａｉｌ遺伝子、ＭＭＰ−１遺伝子、及びＢ２Ｍ遺伝子に対して、糞便中の各遺伝子由来ＲＮＡから合成されたｃＤＮＡの量を定量した。これらのマーカー遺伝子を検出するためのＴａｑＭａｎ（登録商標）プライマー・プローブセットは、アプライドバイオシステムズ社より市販されているものを、それぞれ用いた。なお、これらのセットに含まれているプローブは、５’端側に蛍光物質ＦＡＭがラベルされており、３’端側には消光物質がラベルされているレポータープローブである。具体的には、１μＬのｃＤＮＡ溶液と、１μＬの２０×ＴａｑＭａｎ  ｐｒｉｍｅｒｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｂｅ  ｍｉｘｔｕｒｅ（アプライドバイオシステムズ社製）とに滅菌済み精製水を加えて最終容量を２０μＬに調製したものを、ＰＣＲ反応溶液とした。遺伝子ごとにそれぞれ調製したＰＣＲ溶液を、９５℃で２０秒間処理した後、９５℃で３秒間、６２℃で３０秒間を６０サイクルの反応条件で、７５００  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍｓ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて、リアルタイムに蛍光強度を測定しながら核酸増幅（ＰＣＲ）した。コピー数を計算する対照試料（標準物質）として、各遺伝子のｃＤＮＡが入ったプラスミドを使用し、同時に増幅した。  
測定の結果得られたマーカー遺伝子由来ＲＮＡ量（コピー数）に対する統計学的処理は、Ｍａｎｎ Ｗｈｉｔｎｅｙ′ｓ Ｕ ｔｅｓｔにより行った。また、全ての統計学的処理は、両側検定で行い、Ｐ値＜０．０５を統計上有意であるとした。
なお、マーカー遺伝子由来ＲＮＡの大部分が当該遺伝子由来のｍＲＮＡであることから、以下、ｍＲＮＡと記載する。【００５９】
＜免疫学的便潜血検査（ＩＦＯＢＴ（ｓｉｎｇｌｅ））＞
マーカー遺伝子由来ＲＮＡ量の測定に用いたものと同一の糞便に対して、免疫学的便潜血検査（ＭＰＡ）法（１回）を行い、潜血の有無を検出した。免疫学的便潜血検査は、市販の便潜血キット「マグストリーム（登録商標）ＨｅｍＳｐ−Ｎ」（磁性粒子凝集反応薬）（富士レビオ社製、製品番号：２１４７９４）を用いて、添付のプロトコールに従って行った。【００６０】
＜各マーカー遺伝子のｍＲＮＡ量の測定結果＞
各マーカー遺伝子のｍＲＮＡのコピー数を表１に示す。表１中、上段の数値は平均値であり、下段はレンジである。また、「Ｏｔｈｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ」は上部消化管癌患者の結果を示す。この結果、糞便中のＣＫＢのｍＲＮＡ量は、ＣＯＸ−２等の公知の大腸癌マーカーと同様に、大腸癌、及び大腸進行腺腫の大腸腫瘍罹患者群において、健常者群よりも有意に多いことが分かった。すなわち、これらの結果から、適当な閾値を設定することにより、糞便中のＣＫＢ遺伝子由来ＲＮＡ量を指標として大腸腫瘍を検出し得ることが明らかである。特に、ＣＫＢのｍＲＮＡ量は、ＣＯＸ−２等よりも大腸進行腺腫患者群におけるコピー数が、健常者群よりも有意に多かったことから、大腸進行腺腫をより高い感度で検出可能であるといえる。【００６１】
【表１】
0005851400.tif 000002
【００６２】
＜カットオフ値の設定＞
各マーカー遺伝子の大腸腫瘍罹患者と非罹患者を識別するための閾値（カットオフ値）を設定するために、健常者群、大腸癌群、及び大腸進行腺腫群における各マーカー遺伝子のコピー数を解析した。
表２に、健常者群における、各マーカー遺伝子のコピー数の平均値、標準偏差（ＳＤ）、中央値、９５パーセンタイル値、及び９７．５パーセンタイル値を示す。また、表３及び表４に、大腸癌群及び大腸進行腺腫群における、各マーカー遺伝子のコピー数の平均値、標準偏差（ＳＤ）、中央値、及び２５パーセンタイル値を示す。これらの結果から、ＣＫＢ遺伝子のカットオフ値を１４５０、ＣＯＸ−２遺伝子のカットオフ値を５８、ＭＭＰ−７遺伝子のカットオフ値を５、Ｓｎａｉｌ遺伝子のカットオフ値を９、ＭＭＰ−１遺伝子のカットオフ値を３７、Ｂ２Ｍ遺伝子のカットオフ値を２１０００と設定した。【００６３】
【表２】
0005851400.tif 000003
【００６４】
【表３】
0005851400.tif 000004
【００６５】
【表４】
0005851400.tif 000005
【００６６】
＜各マーカー遺伝子の大腸癌検出の感度及び特異度＞
上記で設定したカットオフ値を用いて各サンプルの陽性・陰性を判断し、大腸癌検出の感度及び特異度を算出し、免疫学的便潜血検査（ＩＦＯＢＴ（ｓｉｎｇｌｅ））の結果と比較した。算出結果を表５に示す。この結果、ＣＯＸ−２遺伝子は、感度・特異度共に免疫学的便潜血検査よりも良好であったが、ＣＫＢ遺伝子は、特異度は免疫学的便潜血検査と同等であったものの、感度は免疫学的便潜血検査よりも低かった。表５中、「９５％ＣＩ」は９５％信頼区間（％）である。なお、以降の全てのサンプルの感度及び特異度に対するＰ値の算出は、χ２検定（ｃｈｉ−ｓｑｕａｒｅ  ｔｅｓｔ、カイ二乗検定）により行った。また、全ての統計学的処理は、両側検定で行い、Ｐ値＜０．０５を統計上有意であるとした。【００６７】
【表５】
0005851400.tif 000006
【００６８】
＜各マーカー遺伝子のＲＯＣ解析＞
各マーカー遺伝子の大腸腫瘍検出用マーカーとしての性能を調べるため、ＲＯＣ（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）解析を行った。ＲＯＣ解析は、ＰＡＳＷ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ｖｅｒ．１８（ＩＢＭ製）を用いて作図した。解析結果を表６及び図１に示す。図１は、縦軸を感度、横軸を(１−特異度)として、ＲＯＣ曲線を引いた。【００６９】
【表６】
0005851400.tif 000007
【００７０】
この結果、ＣＫＢ遺伝子由来ＲＮＡ量は、ＣＯＸ−２遺伝子由来ＲＮＡ量、ＭＭＰ−７遺伝子由来ＲＮＡ量、Ｂ２Ｍ遺伝子由来ＲＮＡ量、及び免疫学的便潜血検査と同様に、曲線の下の領域の面積が０．５以上であり、大腸腫瘍を検出するためのマーカーとして、良好であることがわかった。【００７１】
＜複数マーカー遺伝子を組み合わせた場合の大腸癌検出の感度及び特異度＞
ＣＫＢ遺伝子とその他のマーカー遺伝子を組み合わせた場合の大腸癌検出の感度及び特異度を算出し、比較した。算出結果を表７及び８に示す。【００７２】
【表７】
0005851400.tif 000008
【００７３】
【表８】
0005851400.tif 000009
【００７４】
この結果、２種類のマーカー遺伝子を併用する場合には、ＣＫＢ遺伝子とＣＯＸ−２遺伝子の組み合わせが最も感度が良好であった。特に、単独では、ＣＫＢ遺伝子はＭＭＰ−１遺伝子よりも検出感度が低かったにも関わらず、ＣＫＢ遺伝子とＣＯＸ−２遺伝子の組み合わせは、ＭＭＰ−１遺伝子とＣＯＸ−２遺伝子の組み合わせよりも感度が良好であった。【００７５】
＜各マーカー遺伝子の病期ごとの大腸腫瘍検出の感度＞
上記で設定したカットオフ値を用いて各サンプルの陽性・陰性を判断し、病期ごとの大腸腫瘍検出の感度及び特異度を算出し、免疫学的便潜血検査（ＩＦＯＢＴ（ｓｉｎｇｌｅ））の結果と比較した。算出結果を表９に示す。表９中、「０＿Ｃａ」〜「ＩＶ＿Ｃａ」は、それぞれ、大腸癌の病期０期〜ＩＶ期を示す。この結果、ＣＫＢ遺伝子は、０期の大腸癌を免疫学的便潜血検査よりも高い感度で検出し得ることがわかった。【００７６】
【表９】
0005851400.tif 000010
【００７７】
＜複数マーカー遺伝子を組み合わせた場合の病期ごとの大腸腫瘍検出の感度＞
ＣＫＢ遺伝子とその他のマーカー遺伝子を組み合わせた場合の病期ごとの大腸腫瘍検出の感度を算出し、比較した。算出結果を表１０に示す。この結果、ＣＫＢ遺伝子にその他の遺伝子、特にＣＯＸ−２遺伝子やＭＭＰ−７遺伝子を組み合わせることにより、単独では感度が低かった大腸腫瘍の検出感度を高められることが明らかとなった。中でも、ＣＫＢ遺伝子とＣＯＸ−２遺伝子に、更にＭＭＰ−７遺伝子、Ｓｎａｉｌ遺伝子、ＭＭＰ−１遺伝子、又はＢ２Ｍ遺伝子を組み合わせて用いることにより、非常に高い感度で大腸進行腺腫や０期やＩ期の癌を検出し得ることが分かった。特に、適切なカットオフ値を設定することにより、大腸進行腺腫を５０％以上という非常に高い感度で検出し得ることもわかった。【００７８】
【表１０】
0005851400.tif 000011
【００７９】
＜複数マーカー遺伝子を組み合わせた場合の累積病期の大腸腫瘍検出の感度＞
ＣＫＢ遺伝子とその他のマーカー遺伝子を組み合わせた場合の累積病期の大腸腫瘍検出の感度を算出し、免疫学的便潜血検査（ＩＦＯＢＴ（ｓｉｎｇｌｅ））の結果と比較した。算出結果を表１１に示す。表１１中、「Ａｄ〜０＿Ｃａ」〜「Ａｄ〜ＩＶ＿Ｃａ」は、それぞれ、大腸進行腺腫から大腸癌の各病期までの累積病期を示す。表１１では、比較対象として、ＣＯＸ−２遺伝子単独で用いた場合と、ＣＯＸ−２遺伝子とＭＭＰ−１遺伝子を組み合わせた場合も示している。これらの結果からも、ＣＫＢ遺伝子に他のマーカー遺伝子を組み合わせて用いることにより、高感度で大腸腫瘍を検出し得ること、さらにＣＯＸ−２遺伝子を組み合わせて用いることにより、特にＣＯＸ−２遺伝子とＭＭＰ−７遺伝子を組み合わせて用いることにより、非常に高い感度で大腸腫瘍を検出し得ることが明らかである。【００８０】
【表１１】
0005851400.tif 000012
【００８１】
さらに、ＣＫＢ遺伝子とＣＯＸ−２遺伝子とＭＭＰ−７遺伝子とＢ２Ｍ遺伝子との４遺伝子を組み合わせた場合の大腸癌検出の感度及び特異度、並びに累積病期の大腸腫瘍検出の感度を算出し、ＣＯＸ−２遺伝子のみを用いた場合、ＣＯＸ−２遺伝子とＭＭＰ−７遺伝子とを組み合わせて用いた場合、ＣＯＸ−２遺伝子とＢ２Ｍ遺伝子とを組み合わせて用いた場合、ＣＯＸ−２遺伝子とＣＫＢ遺伝子とを組み合わせて用いた場合と、及び免疫学的便潜血検査（ＩＦＯＢＴ（ｓｉｎｇｌｅ））の結果と比較した。算出結果を表１２及び１３に示す。この結果、ＣＫＢ遺伝子とＣＯＸ−２遺伝子とＭＭＰ−７遺伝子とＢ２Ｍ遺伝子とを組み合わせて用いた場合が、最も高感度であった。特に、これらの４遺伝子を組み合わせた場合の感度は、有意確率（Ｐ値）が０．００１以下と非常に小さく、高い精度が要求される臨床検査においても十分に有用であることが示唆された。【００８２】
【表１２】
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【００８３】
【表１３】
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【産業上の利用可能性】
【００８４】
本発明の大腸腫瘍の検出方法を用いることにより、大腸腫瘍、特に大腸進行腺腫や０期とＩ期の癌の罹患の有無を精度よく検査することができるため、本発明の大腸腫瘍の検出方法は、糞便試料を用いた臨床検査等の分野、特に高い信頼性と安全性が要求される臨床検査等の分野において利用が可能である。
【図１】
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