(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
インフルエンザヘマグルチニンのＨＡ１サブユニットを認識して結合するヒト抗体であって、少なくともＨ１型、Ｈ２型およびＨ５型インフルエンザウイルスと、Ｈ３型インフルエンザウイルスとを中和する、ヒトモノクローナル抗体であって、重鎖可変部の相補性決定領域１が配列番号：１に示されるアミノ酸配列からなり、重鎖可変部の相補性決定領域２が配列番号：２に示されるアミノ酸配からなり、重鎖可変部の相補性決定領域３が、ＰＳＩＴＥＳＨＹＣＬＤＣＡＡＫＤＹＹＹＧＬＤＶで示されるアミノ酸配列からなり、軽鎖可変部の相補性決定領域１が、ＳＧＳＲＳＮＩＧＧＮＴＶＮで示されるアミノ酸配列からなり、軽鎖可変部の相補性決定領域２が、ＳＳＮＱＲＳＳで示されるアミノ酸配列からなり、軽鎖可変部の相補性決定領域３が、ＡＳＷＤＤＳＬＮＧＶＶで示されるアミノ酸配列からなる、ヒトモノクローナル抗体。
【請求項２】
重鎖可変部および軽鎖可変部がそれぞれ、配列番号１５および配列番号２６のアミノ酸配列からなる、請求項1に記載のヒトモノクローナル抗体。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のヒトモノクローナル抗体を含む、インフルエンザに対する受動免疫療法剤。
【請求項４】
インフルエンザに対する受動免疫療法剤の製造のための、請求項１又は２に記載のヒトモノクローナル抗体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サブタイプを超えてあらゆるインフルエンザウイルスに対して普遍的な中和活性を示す抗インフルエンザウイルス抗体、その製造方法、ならびに被験者における該抗体の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザウイルスは、オルソミクソウイルス科に属する直径約１００ｎｍの粒子サイズを有するＲＮＡエンベロープウイルスであり、内部タンパクの抗原性に基づいて、Ａ、ＢおよびＣ型に分けられる。インフルエンザウイルスは、脂質二重層構造を有するウイルスエンベロープに取り囲まれた内部ヌクレオキャプシドまたは核タンパク質と会合したリボ核酸（ＲＮＡ）のコアと、外部糖タンパク質からなる。ウイルスエンベロープの内層は、主としてマトリックスタンパク質で構成され、外層は大部分が宿主由来脂質物質で構成される。インフルエンザウイルスのＲＮＡは、分節構造をとる。世界中で大流行するインフルエンザは、Ａ型インフルエンザウイルスによるものである。Ａ型は、ヘマグルチニン（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）の２種類のエンベロープ糖タンパク質を有し、抗原性の違いによってＨＡでは１６種、ＮＡでは９種のサブタイプに区別されている。【０００３】
昨今、高病原性Ｈ５Ｎ１型トリインフルエンザウイルスが世界的に猛威を振るっており、いつヒトからヒトへ感染する新型ウイルスが登場してパンデミックを引き起こしてもおかしくない状況である。その対策として、世界的なウイルス検査体制が整備され、治療薬としてのタミフル等の大量備蓄、ワクチンの開発・製造・備蓄が進められている。しかし、それはいつどのような形で登場するか、その際、タミフル等は治療効果を示すのか、開発されたワクチンは有効なのか、それをいつ誰に接種するのか、そもそも厳戒態勢をいつ始め、いつ解除するのか、など多くの課題があいまいな形で残されたまま事態は進行している。これは、まだ実際には登場していない病原菌やウイルスに対してワクチンや治療薬を準備するという、人類史上初体験となる状況を迎えているためである。特に、ワクチン開発における課題点として、インフルエンザウイルスゲノムには、毎年多くの変異がヘマグルチニン遺伝子に導入されてａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｄｒｉｆｔ（抗原性の変化）を起こし、それがエピデミックな流行の原因となっていると考えられている。従って、流行する型と合わないワクチンを接種すると、その予防効果が期待できない。従来、インフルエンザウイルスに対して抗体治療薬（予防薬）を開発することが試みられなかった理由は、ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｄｒｉｆｔにより折角開発した薬が、開発した頃には中和できるはずのウイルスの性質が変化しており、役に立たないことを危惧するがためである。【０００４】
本発明者らは、１個体から採取した大量のＢリンパ球から作製したファージディスプレイヒト抗体ライブラリーを、１９６８〜２００４年の間に分離された１２のＨ３Ｎ２型インフルエンザウイルス株に対してスクリーニングした結果、中和活性を示す大半のクローンは抗ヘマグルチニン抗体であり、それらは１９６８〜１９７３年に分離されたウイルス株、１９７７〜１９９３年に分離されたウイルス株、または１９９７〜２００３年に分離されたウイルス株を特異的に中和する３つの群に大別されることを見出した（非特許文献１）。このことは、インフルエンザウイルスに対する抗体治療薬（予防薬）を開発しても意味がないという従来の常識を翻すものであるが、ファージ抗体ライブラリーは重鎖と軽鎖の組合せが必ずしも生体内を反映しない等の理由から、これまで真剣に検討されてこなかった。【０００５】
このような状況の下、３グループが独自に、Ｈ５型インフルエンザウイルスを中和するヒトモノクローナル抗体の単離に成功した（特許文献１、２、非特許文献２〜４）。これらの抗体は、Ｈ５型だけでなく、他のサブタイプ（例えば、Ｈ１型など）のインフルエンザウイルスに対しても中和活性を有することが示された。しかし、ヘマグルチニンの１６種のサブタイプ（Ｈ１〜Ｈ１６）はエピトープによって大きく２つのグループ（グループ１および２）に分類されるが、これらの抗体が中和活性を示したのは、そのうちのグループ１（例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ８、Ｈ９型など）に対してのみであり、グループ２に属するインフルエンザウイルス（例えば、Ｈ３、Ｈ７型など）に対しては中和活性を示さなかった。即ち、ヘマグルチニンの配列に基づく２つのグループ間の壁を越えて、広範な中和活性を発揮する抗インフルエンザウイルス抗体は未だ単離、報告されていない。
Ｘ線構造解析によりこれらの抗体とヘマグルチニンとの結合様式が示されており、ヘマグルチニンの３８位のアミノ酸が、グループ２のＨ３、Ｈ７ではアスパラギンとなっていてＮ型糖鎖修飾を受けることが明らかとなっている（非特許文献４、５）。さらに、Ｈ５の３８位にＮ型糖鎖修飾サイトを導入すると、中和抗体の結合能が７０％減少することも報告されている（非特許文献５）。また、ヘマグルチニンに変異が生じたインフルエンザウイルスが中和抗体から逃れる場合、そのような変異は、中和エピトープを含むとされるヘマグルチニン遺伝子内の５つの領域（Ａ，Ｂ，Ｃ，ＤおよびＥ領域）に主に集積することが知られている（非特許文献６、７）。これらの知見は、この２つのグループ間の壁を越えた中和抗体を取得することの困難性を示唆している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】ＷＯ  ２００７／１３４３２７
【特許文献２】ＷＯ  ２００８／０２８９４６
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．３９７，ｐｐ．３２２−３３０，２０１０
【非特許文献２】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，Ｖｏｌ．１０５，ｐｐ．５９８６−５９９１，２００８
【非特許文献３】ＰＬｏＳ  ＯＮＥ，Ｖｏｌ．３，ｐｐ．５９８６−５９９１，ｅ３９４２，２００８
【非特許文献４】Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ＆  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１６，ｐｐ．２６５−２７３，２００９
【非特許文献５】Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．３２４，ｐｐ．２４６−２５１，２００９
【非特許文献６】Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．２８９，ｐｐ．３７３−３７８，１９８１
【非特許文献７】Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，Ｖｏｌ．６２，ｐｐ．１５３−１６９，１９８２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
来るべきＨ５Ｎ１型インフルエンザのパンデミックや、さらにその先に予想されるＨ７、Ｈ９型ウイルスによるパンデミックに備え、抗原性の変化を予測してワクチンをデザインするという従来のインフルエンザに対する予防コンセプトに代わる、より普遍的で確実な新規コンセプトに基づく予防手段の開発が大いに望まれる。
したがって、本発明の目的は、ヘマグルチニンタンパク質のアミノ酸配列の保存性に基づく２つのグループ間の壁を越えて中和活性を発揮する抗インフルエンザウイルス抗体、望ましくはＨ１〜Ｈ１６型のすべてのサブタイプのインフルエンザウイルスに対して中和活性を有する抗体、並びにその製造方法を提供することである。また、本発明の別の目的は、被験者が上記のユニバーサルな中和抗体を保有しているか否かを簡便かつ比較的安価に調べることができる検査方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、アフェレーシス（成分採血）を用いて１個体から１０９個という大量のＢリンパ球を採取し、全抗体レパートリーをほぼ反映したファージディスプレイヒト抗体ライブラリーを作製し、不活性化したＨ３Ｎ２型インフルエンザウイルスを抗原として用い、パニング法により、該抗原に結合する抗体クローンを網羅的にスクリーニングした。選抜されたファージから抗体を回収し、グループ２に属するＨ３型インフルエンザウイルス、並びにグループ１に属するＨ１型、Ｈ２型およびＨ５型インフルエンザウイルスに対する中和活性を試験した結果、驚くべきことに、スクリーニングのための抗原として用いたＨ３型だけでなく、グループの異なるＨ１型、Ｈ２型およびＨ５型のインフルエンザウイルスに対しても中和活性を示す抗体を、４０クローン以上取得することに成功した。これらのクローンは６種類の異なる重鎖可変部（ＶＨ）アミノ酸配列を有していたが、いずれもＩｇＢＬＡＳＴ検索の結果、いずれもＶＨ１−６９がジャームラインであると判断された。さらにこれら６種類のクローンの持つ軽鎖可変部（ＶＬ）は、ＩｇＢＬＡＳＴ検索の結果、３種類のジャームラインに限られることが分かった。
以前に報告されているＨ５型に対する中和抗体がＶＨ１−６９もしくは類似のＶＨ１−ｅを利用していることや、Ｘ線構造解析により示された該中和抗体とヘマグルチニンとの結合様式を考えれば、本発明者らが取得した抗体がＨ３型インフルエンザウイルスを中和し得ることは極めて予想外であるといえる。しかしながら、本発明者らは、あるサブタイプを抗原として、それと反応する抗体を徹底的にスクリーニングし、その抗原とは異なるグループのサブタイプのウイルスを中和する抗体を探索すれば、グループ間の壁を越えてあらゆる型のインフルエンザウイルスを中和できる抗体を取得し得ると発想した。そこで、１０９個という通常より２オーダー大きいＢリンパ球を１個体から採取してドナーの抗体レパートリーをほぼ反映するヒト抗体ライブラリーを作製して、Ｈ３型インフルエンザウイルスと結合する抗体クローンを網羅的にスクリーニングし、Ｈ１型、Ｈ２型およびＨ５型インフルエンザウイルスに対する中和活性を調べることにより、グループ１とグループ２の両方のインフルエンザウイルスを中和できる抗体を単離することに初めて成功した。
得られた中和抗体のアミノ酸配列を解析すると、いずれの中和抗体も重鎖可変部Ｖ領域としてＶＨ１−６９遺伝子を利用していることが明らかとなった。特筆すべきことに、グループ１のインフルエンザウイルスに対して他のクローンに比べてより高い中和活性を示したクローンでは、重鎖可変部Ｖ領域に１アミノ酸の欠失が認められた。増殖、分化刺激を受けて抗体産生細胞が変化していくプロセス（抗体の成熟）は、重鎖および軽鎖をコードするＤＮＡ二本鎖の一方に切断が入り、エラーを頻繁に起こすＤＮＡポリメラーゼがこれを修復する過程で変異が導入されることにより起こるため、生じる変異のほとんどは一塩基置換に基づくアミノ酸置換である。したがって、１アミノ酸（３塩基）の欠失が起こる頻度は極端に低く、起こったとしてもその影響が悪い方向に出る場合がほとんどで、その抗体を産生しているＢ細胞を刺激して、さらに記憶細胞として体内に長く残させる機構が働く可能性はさらに低くなる。かかる技術常識を考慮すると、ＣＤＲ３以外の重鎖可変部における１アミノ酸の欠失により、主としてグループ２のインフルエンザウイルスを中和していた抗体が、グループ１に属するインフルエンザウイルスに対してもかなり強い中和活性を獲得したことは、驚くべき知見である。
本発明者らは、これらの知見に基づいてさらに研究の重ねた結果、本発明を完成するに至った。【００１０】
即ち、本発明は、
［１］Ｈ１型、Ｈ２型、Ｈ５型、Ｈ６型、Ｈ８型、Ｈ９型、Ｈ１１型、Ｈ１２型、Ｈ１３型およびＨ１６型インフルエンザウイルスからなるグループ１より選択される少なくとも１つのインフルエンザウイルスと、Ｈ３型、Ｈ４型、Ｈ７型、Ｈ１０型、Ｈ１４型およびＨ１５型インフルエンザウイルスからなるグループ２より選択される少なくとも１つのインフルエンザウイルスとを中和する、単離された抗体；
［２］少なくともＨ１型および／またはＨ５型インフルエンザウイルスと、Ｈ３型インフルエンザウイルスとを中和する、上記［１］記載の抗体；
［３］Ｈ１型〜Ｈ１６型インフルエンザウイルスを中和する、上記［１］記載の抗体；
［４］重鎖可変部Ｖ領域がＶＨ１−６９もしくはＶＨ１−ｅ遺伝子を利用している、上記［１］記載の抗体；
［５］重鎖可変部Ｖ領域にアミノ酸の欠失を含む、上記［４］記載の抗体；
［６］ＶＨ１−６９もしくはＶＨ１−ｅ遺伝子にコードされる重鎖可変部Ｖ領域において、２７番目のグリシンを欠失する変異を少なくとも含む、上記［５］記載の抗体；
［７］軽鎖可変部Ｖ領域がＶＬ１−４４、ＶＬ１−４７またはＶＬ１−５１遺伝子を利用している、上記［１］記載の抗体；
［８］ＩｇＧ型抗体とした場合の、フォーカス形成阻害試験における最小阻害濃度が１０−１１〜１０−１２Ｍのオーダーである、上記［１］記載の抗体；
［９］ヒト抗体である、上記［１］記載の抗体；
［１０］重鎖可変部の相補性決定領域１が配列番号：１に示されるアミノ酸配列からなり、かつ相補性決定領域２が配列番号：２に示されるアミノ酸配列からなる、上記［１］記載の抗体；
［１１］重鎖可変部のフレームワーク領域１が配列番号：３に示されるアミノ酸配列からなる、上記［１０］記載の抗体；
［１２］重鎖可変部Ｖ領域が配列番号：４〜９のいずれかに示されるアミノ酸配列からなる、上記［１］記載の抗体；
［１３］重鎖可変部が配列番号：１０〜１５のいずれかに示されるアミノ酸配列からなる、上記［１］記載の抗体；
［１４］重鎖可変部および軽鎖可変部がそれぞれ、以下の（ａ）〜（ｌ）：
（ａ）配列番号：１０および配列番号：１６；
（ｂ）配列番号：１０および配列番号：１７；
（ｃ）配列番号：１０および配列番号：１８；
（ｄ）配列番号：１０および配列番号：１９；
（ｅ）配列番号：１０および配列番号：２０；
（ｆ）配列番号：１０および配列番号：２１；
（ｇ）配列番号：１０および配列番号：２２；
（ｈ）配列番号：１１および配列番号：２３；
（ｉ）配列番号：１３および配列番号：２４；
（ｊ）配列番号：１４および配列番号：２５；
（ｋ）配列番号：１５および配列番号：２６；および
（ｌ）配列番号：１２および配列番号：７０
のいずれかに示される配列番号に示されるアミノ酸配列からなる、上記［１］記載の抗体；
［１５］上記［１］記載の抗体を含有してなる、インフルエンザに対する受動免疫療法剤；
［１６］インフルエンザウイルスに感染したか、感染するおそれのある哺乳類または鳥類の対象に、有効量の上記［１］記載の抗体を投与することを含む、インフルエンザに対する受動免疫療法；
［１７］投与対象がヒトである、上記［１６］記載の方法；
［１８］上記［１］記載の抗体の製造方法であって、以下の工程を含む方法；
（１）１個体から採取した約１０８個以上のＢ細胞に由来する抗体クローンを含む抗体ライブラリーを提供する工程
（２）Ｈ１型〜Ｈ１６型のいずれかのインフルエンザウイルスまたは該ウイルスのヘマグルチニンタンパク質もしくはその細胞外ドメインを抗原として、（１）の抗体ライブラリーと接触させ、該抗原と反応する抗体クローンを網羅的に選抜する工程
（３）（２）で選抜された各抗体クローンから抗体分子を回収する工程
（４）（３）で得られた各抗体について、グループ１より選択される少なくとも１つのインフルエンザウイルスと、グループ２より選択される少なくとも１つのインフルエンザウイルスとに対する中和活性を試験する工程
（５）グループ１に属するインフルエンザウイルスとグループ２に属するインフルエンザウイルスの両方を中和した抗体を産生するクローンを用いて該抗体を産生させ、該抗体を回収する工程
［１９］抗体がヒト抗体である、上記［１８］記載の方法；
［２０］抗体ライブラリーがファージディスプレイライブラリーである、上記［１８］記載の方法；
［２１］抗体クローン数が１０１０〜１０１１である、上記［２０］記載の方法；
［２２］前記Ｂ細胞がアフェレーシスにより採取される、上記［１８］記載の方法；
［２３］前記（２）において、Ｂ細胞を採取した個体が感染歴のないインフルエンザウイルス分離株またはそのヘマグルチニンタンパク質もしくはその細胞外ドメインを抗原として用いることを特徴とする、上記［１８］記載の方法；
［２４］前記インフルエンザウイルス分離株がＨ１、Ｈ２またはＨ３型である、上記［２３］記載の方法；
［２５］前記インフルエンザウイルス分離株が、Ｂ細胞を採取した個体が感染歴のないヘマグルチニンサブタイプに属する、上記［２３］記載の方法；
［２６］前記インフルエンザウイルス分離株がＨ５、Ｈ７またはＨ９型である、上記［２５］記載の方法；
［２７］前記（４）において、少なくともＨ１型および／またはＨ５型インフルエンザウイルスと、Ｈ３型インフルエンザウイルスとに対する中和活性を試験することを特徴とする、上記［１８］記載の方法；
［２８］抗体をＩｇＧ型に変換する工程をさらに含む、上記［２０］記載の方法；
［２９］被験者における上記［１］記載の抗体の検出方法であって、以下の工程を含む方法；
（１）Ｈ１型〜Ｈ１６型のいずれかのサブタイプのヘマグルチニンを被験者に接種する工程
（２）接種後、抗体産生細胞が十分に増幅された時点で被験者より血液を採取する工程
（３）該血液中の、グループ１より選択されるサブタイプのヘマグルチニンと、グループ２より選択されるサブタイプのヘマグルチニンとの両方に結合し、かつＶＨ１−６９もしくはＶＨ１−ｅ遺伝子にコードされる重鎖可変部Ｖ領域を有する抗体を提示する抗体産生細胞の有無を調べる工程
［３０］被験者における上記［１］記載の抗体の検出方法であって、以下の工程を含む方法；
（１）グループ１より選択されるサブタイプのヘマグルチニンと、グループ２より選択されるサブタイプのヘマグルチニンとを、それぞれ別個に被験者に接種する工程
（２）各ヘマグルチニン接種後、抗体産生細胞が十分に増幅された時点で被験者より血液を採取する工程
（３）各血液中の、接種したヘマグルチニンとは異なるグループより選択されるサブタイプのヘマグルチニンに結合し、かつＶＨ１−６９もしくはＶＨ１−ｅ遺伝子にコードされる重鎖可変部Ｖ領域を有する抗体を提示する抗体産生細胞の有無を調べる工程
などを提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、全てのヘマグルチニンサブタイプのインフルエンザウイルスに対して中和活性を有するヒト抗体を提供することができる。該中和抗体を受動免疫することにより、ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｄｒｉｆｔはもとよりａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｓｈｉｆｔが起こった場合でも、有効にインフルエンザを予防または治療することが可能となる。また、本発明により、被験者がグループの枠組みを越えてインフルエンザウイルスに対する中和活性を示す抗体を産生する記憶Ｂ細胞を有しているか否かを判定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１−１】ファージディスプレイヒト抗体ライブラリーからＨ３Ｎ２ウイルス株でスクリーニングされた各抗体の１２種類のＨ３Ｎ２ウイルス株すべてと、１つのＨ１Ｎ１ウイルス株に対する結合活性を、ＥＬＩＳＡの結果で示した図である。
【図１−２】ファージディスプレイヒト抗体ライブラリーからＨ３Ｎ２ウイルス株でスクリーニングされた各抗体の１２種類のＨ３Ｎ２ウイルス株すべてと、１つのＨ１Ｎ１ウイルス株に対する結合活性を、ＥＬＩＳＡの結果で示した図である。
【図２】Ｇｒｏｕｐ１１およびＧｒｏｕｐ２２に分類されたクローンが、いずれのＨ３型インフルエンザウイルス株を抗原としてスクリーニングされたものであるかを示す図である。
【図３】Ｇｒｏｕｐ１１に分類された各抗体クローンのスクリーニングに使用されたインフルエンザウイルス株およびその単離数を示した図である。
【図４】Ｇｒｏｕｐ１１に分類されたクローンのＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列を示した図である。ＦＲ０４５−０９２のＦＲ１領域に表示された．は欠失アミノ酸を表す。
【図５】Ｇｒｏｕｐ１１に分類されたクローンとＨ１株およびＨ５株に対して中和活性を示すことが既報である抗体の重鎖可変部のアミノ酸比較結果を示した図である。ＦＲ０４５−０９２のＦＲ１領域に表示された．は欠失アミノ酸を表す。
【図６】Ｇｒｏｕｐ１１に分類されたクローンのＨ３Ｎ２インフルエンザウイルス株に対する結合活性を、ＥＬＩＳＡの結果で示した図である。
【図７】Ｇｒｏｕｐ１１に分類されたクローンがＨ３及びＨ１両株のＨＡを認識していることをウエスタンブロットで示した図である。
【図８】Ｇｒｏｕｐ１１に分類されたクローンのＨ３型およびＨ１型インフルエンザウイルスに対する赤血球凝集抑制活性を検討した図である。
【図９】Ｇｒｏｕｐ１１に分類されたクローンのＨ３型およびＨ１型インフルエンザウイルスに対するＦｏｃｕｓ形成阻害活性を検討した図である。
【図１０】マウスモノクローナル抗体Ｃ１７９のＨ３型インフルエンザウイルスに対する結合活性を、Ｇｒｏｕｐ１１に分類されたクローンが競合阻害するか否かをＥＬＩＳＡで検討した図である。Ｆａｂ−ｐ３抗体（Ｆ０２２−３６０，Ｆ０２６−１４６，Ｆ０２６−４２７，Ｆ０４５−０９２，Ｆ００５−１２６）の共存下および非共存下（Ｎｏ  Ｆａｂ−ｐ３）でのＣ１７９のインフルエンザＡソ連型ニューカレドニア株に対するＥＬＩＳＡ。Ｆ００５−１２６はインフルエンザＡソ連型ニューカレドニア株ＨＡに反応しないネガティブコントロール。
【図１１】Ｇｒｏｕｐ１１に分類されたクローンのＨ３型インフルエンザウイルスに対する結合活性を、マウスモノクローナル抗体Ｃ１７９が競合阻害するか否かをＥＬＩＳＡで検討した図である。Ｃ１７９の共存下（Ｃ１７９（＋））および非共存下（Ｃ１７９（−））での、Ｆａｂ−ｐ３抗体（Ｆ０２２−３６０，Ｆ０２６−１４６，Ｆ０２６−４２７，Ｆ０４５−０９２）のインフルエンザＡソ連型ニューカレドニア株に対するＥＬＩＳＡ。
【図１２】Ｈ３型インフルエンザウイルスに対して幅広い株特異性を有する図２記載の抗体クローンＦ００５−１２６とＧｒｏｕｐ１１に分類されたＨ３型およびＨ１型インフルエンザウイルスの両者を認識する抗体クローンがエピトープを共有するか否かをＥＬＩＳＡで検討した図である。Ｆａｂ−ｐ３抗体（Ｆ０２２−３６０，Ｆ０２６−１４６，Ｆ０２６−４２７，Ｆ０４５−０９２，Ｆ００５−１２６，Ｆ０１９−１０２）の共存下および非共存下（Ｎｏ  Ｆａｂ−ｐ３）での、Ｆａｂ−ＰＰ型Ｆ００５−１２６のインフルエンザＡ香港型愛知株に対するＥＬＩＳＡ。Ｆａｂ−ｐ３型Ｆ００５−１２６は競合阻害のポジティブコントロール。Ｆ０１９−１０２はインフルエンザＡ香港型愛知株に反応しないネガティブコントロール。
【図１３】Ｇｒｏｕｐ１１に分類されたクローンのＨ３型インフルエンザウイルス由来ヘマグルチニン発現細胞に対する結合性をＦＡＣＳ解析した図である。灰色のピークはすべてネガティブコントロールＦ００８−０３８のピーク、実線のピークはそれぞれａ）Ｆ０２６−４２７、ｂ）Ｆ０４５−０９２、ｃ）Ｆ４９のピークである。
【図１４】Ｈ３型、Ｈ５型、Ｈ２型およびＨ１型インフルエンザウイルスに対する各ＩｇＧ抗体の中和活性測定の結果を示す図である。縦軸；感染抑制率（％）、横軸；抗体濃度（μｇ／ｍＬ）
【図１５−１】インフルエンザウイルスＡ／Ｈ３Ｎ２型愛知株ＨＡ０およびＨＡ１に対するＦａｂクローンの反応性を示す図である。灰色のピークはＭｏｃｋ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ、緑色のピークはｐＤｉｓｐ−Ａｉｃ６８ＨＡ０  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ、桃色のピークはｐＤｉｓｐ−Ａｉｃ６８ＨＡ１  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎを示す。
【図１５−２】インフルエンザウイルスＡ／Ｈ３Ｎ２型愛知株ＨＡ０およびＨＡ１に対するＦａｂクローンの反応性を示す図である。灰色のピークはＭｏｃｋ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ、青色のピークはｐＤｉｓｐ−Ｆｕｋ８５ＨＡ０  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ、橙色のピークはｐＤｉｓｐ−Ｆｕｋ８５ＨＡ１  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎを示す。
【図１６】ＨＡ分子上のエピトープＢを認識する抗体Ｆ００４−１０４とＧｒｏｕｐ１１に分類された抗体クローンがエピトープを共有するか否かをＥＬＩＳＡで検討した図である。ＩｇＧ抗体（Ｆ０２６−４２７ＩｇＧ，Ｆ０４５−０９２ＩｇＧ，Ｆ００４−１０４ＩｇＧ）の共存下および非共存下（Ｎｏ  ＩｇＧ）での、Ｆａｂ−ｐ３型モノクローナル抗体Ｆ０２６−４２７ｐ３，Ｆ０４５−０９２ｐ３，Ｆ００４−１０４ｐ３およびマウス由来抗インフルエンザＡ／Ｈ３Ｎ２型抗体Ｆ４９のインフルエンザＡ／Ｈ３Ｎ２型パナマ株に対するＥＬＩＳＡ。
【図１７−１】インフルエンザウイルスの亜型および株ごとのＨＡ１およびＨＡ２のアミノ酸配列を示した図である。
【図１７−２】インフルエンザウイルスの亜型および株ごとのＨＡ１およびＨＡ２のアミノ酸配列を示した図である。
【図１８】Ａｉｃ６８株インフルエンザウイルス由来のヘマグルチニンの１３６番目セリン残基をスレオニンまたなアラニンに置換した変異ヘマグルチニン発現細胞に対する各ＨＡ抗体の結合性をＦＡＣＳ解析した図である。灰色のピークはＭｏｃｋ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ、緑色のピークは野生型Ａｉｃ６８のＨＡ、青色のピークはＡｉｃ６８のＨＡのＳ１３６Ｔ、桃色のピークはＡｉｃ６８のＨＡのＳ１３６Ａを示す。
【図１９】各Ｈ３Ｎ２型インフルエンザウイルス由来のＨＡ１の１４２―１４６番目アミノ酸または１３３−１３７番目アミノ酸をそれぞれ相互に置換した変異ＨＡ１発現細胞に対するＦ０４５−０９２の結合性をＦＡＣＳ解析した図である。灰色のピークはＭｏｃｋ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ、緑色のピークは野生型、桃色のピークは１４２−１４６番目のアミノ酸配列を移植したキメラ１４２Ａ、青色のピークは１３３−１３７番目のアミノ酸配列を移植したキメラ１３３Ａに対する反応性を示す。
【図２０】各Ｈ３Ｎ２型インフルエンザウイルス由来のＨＡ１の１４２―１４６番目アミノ酸または１３３−１３７番目アミノ酸をそれぞれ相互に置換した変異ＨＡ１領域の９１−２６０番目アミノ酸部分の３次元構造を示した図である。レセプター結合領域を橙色、Ａｉｃ６８＿Ｗｉｌｄの１３３−１３７番目アミノ酸を青色、１４２―１４６番目アミノ酸を水色、Ｗｙｏ０３＿Ｗｉｌｄの１３３−１３７番目アミノ酸を赤色、１４２―１４６番目アミノ酸を桃色、Ｆｕｋ８５＿Ｗｉｌｄの１３３−１３７番目アミノ酸を緑色、１４２―１４６番目アミノ酸を黄緑色で示す。
【図２１】Ｈ３Ｎ２型インフルエンザウイルスのＨＡ１領域の９１−２６０アミノ酸部分の３次元構造とともに、各抗体よって認識されるＨＡ１領域の部位および該部位をＥＭＡＣ法で決定するために使用したウイルス株名を示した図である。レセプター結合領域を橙色、それぞれの抗ＨＡ抗体が認識する部位を桃色で表す。レセプター結合領域内のアミノ酸番号を黒、抗原認識部位のアミノ酸番号を青で示し、抗原認識部位でありかつレセプター結合領域に含まれるアミノ酸は、青で示す。
【図２２】ＨＡ１のサイトＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅに結合する各抗ＨＡ抗体とＦ０４５−０９２抗体との競合実験を示した図である。左グラフはＦ０４５−０９２を、右グラフは抗ＨＡ抗体のｃｐ３型をｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒとして使用した（＋：ｃｐ３抗体あり、−：ｃｐ３抗体なし）。使用したウイルス株はグラフ左下に表示した。Ｎｏ  Ｆａｂ−ｐｐ：ｐｐ型抗体に代わりＰＢＳ、Ｎｏ  Ａｂ：全ての抗体に代わりＰＢＳ。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本明細書において、インフルエンザウイルスは、現在知られているすべてのサブタイプ、及び将来単離、同定されるサブタイプをも含む。インフルエンザウイルスの現在知られているサブタイプとしては、ヘマグルチニンのＨ１〜１６から選ばれる型とノイラミニダーゼのＮ１〜９から選ばれる型との組合せからなるサブタイプが挙げられる。
【００１４】
インフルエンザウイルスは、ヘマグルチニンのアミノ酸配列の類似性によって２グループに大別されている。本明細書では、Ｈ１型、Ｈ２型、Ｈ５型、Ｈ６型、Ｈ８型、Ｈ９型、Ｈ１１型、Ｈ１２型、Ｈ１３型およびＨ１６型インフルエンザウイルスからなる群をグループ１とし、Ｈ３型、Ｈ４型、Ｈ７型、Ｈ１０型、Ｈ１４型およびＨ１５型インフルエンザウイルスからなる群をグループ２とする。本グループのカテゴリー選別の際には、ノイラミニダーゼの型は考慮されない。将来単離、同定される新規サブタイプについても、ヘマグルチニンのアミノ酸配列の類似性に基づいて、グループ１またはグループ２に分類される。
【００１５】
本発明は、上記グループ１（Ｈ１型、Ｈ２型、Ｈ５型、Ｈ６型、Ｈ８型、Ｈ９型、Ｈ１１型、Ｈ１２型、Ｈ１３型およびＨ１６型）より選択される少なくとも１つのインフルエンザウイルスと、上記グループ２（Ｈ３型、Ｈ４型、Ｈ７型、Ｈ１０型、Ｈ１４型およびＨ１５型）より選択される少なくとも１つのインフルエンザウイルスとを中和する、単離された抗体を提供する。好ましくは、本発明の中和抗体は、グループ１のうち少なくともＨ１型および／またはＨ５型インフルエンザウイルスを中和し、グループ２のうち少なくともＨ３型インフルエンザウイルスを中和するものである。より好ましくは、本発明の中和抗体は、グループ１のうちＨ９型インフルエンザウイルスをさらに中和し、グループ２のうちＨ７型インフルエンザウイルスをさらに中和するものである。特に好ましくは、本発明の中和抗体は、Ｈ１型〜Ｈ１６型インフルエンザウイルスすべてを中和するものであり、最も好ましくは、将来単離、同定される新規ヘマグルチニンサブタイプのインフルエンザウイルスをも中和するものである。
【００１６】
本発明の中和抗体は、以下の工程（１）〜（５）を含む方法により製造することができる。
（１）１個体から採取した約１０８個以上のＢ細胞に由来する抗体クローンを含む抗体ライブラリーを提供する工程
（２）Ｈ１型〜Ｈ１６型のいずれかのインフルエンザウイルスまたは該ウイルスのヘマグルチニンタンパク質もしくはその細胞外ドメインを抗原として、（１）の抗体ライブラリーと接触させ、該抗原と反応する抗体クローンを網羅的に選抜する工程
（３）（２）で選抜された各抗体クローンから抗体分子を回収する工程
（４）（３）で得られた各抗体について、グループ１より選択される少なくとも１つのインフルエンザウイルスと、グループ２より選択される少なくとも１つのインフルエンザウイルスとに対する中和活性を試験する工程
（５）グループ１に属するインフルエンザウイルスとグループ２に属するインフルエンザウイルスの両方を中和した抗体を産生するクローンを用いて該抗体を産生させ、該抗体を回収する工程
【００１７】
抗体ライブラリー作製のための抗体産生細胞であるＢ細胞を採取するドナーは、インフルエンザウイルスに感染歴のある任意の哺乳動物（例えば、ヒト、ブタ、ウマ等）もしくは鳥類（ニワトリ、カモなど）であれば特に制限はなく、本発明の中和抗体を受動免疫する対象に応じて、それと同種の動物を適宜選択することができるが、好ましくはヒトである。ヒトの場合、ドナーの年齢、性別、ワクチン接種の有無等は特に制限されないが、インフルエンザウイルスの感染経験が多いことが望ましいので、好ましくは２０歳以上、より好ましくは３０歳以上、さらに好ましくは４０歳以上、特に好ましくは５０歳以上であるが、これらに限定されない。グループの枠組みを越えて中和活性を発揮する抗体は、グループ内やサブタイプ内のあらゆるウイルス分離株を中和し得るので、当該中和抗体の産生細胞を保有するドナーは、毎年の季節性インフルエンザを発症しにくいと考えられる。したがって、過去一定期間、Ａ型インフルエンザを発症した履歴のないヒトがより望ましい。
【００１８】
通常の抗体ライブラリー作製に用いられるＢ細胞の採取のための採血量は２０〜３０ｍｌ程度であり、この量の血液中に含まれるＢ細胞の量は約１０７個である。高病原性Ｈ５Ｎ１型トリインフルエンザウイルスに対するヒト中和抗体を単離したいずれのグループも、複数の提供者から通常量の血液を採取してそれらを合わせることにより、約１０１０クローンの抗体ライブラリーを作製しているのに対し、本発明者らは、あるサブタイプのヘマグルチニンに結合する抗体を徹底的（網羅的）に取得することを意図して、全抗体レパートリーを反映するサイズの抗体ライブラリーの作製を試みた。即ち、通常１回のヒトからの採血量としては２００〜３００ｍｌ程度が限度であり、したがって、この方法では、採取できるＢ細胞量はせいぜい約１０８個である。そこで、本発明者らは、アフェレーシスを用いることによりそれ以上の量の血液中に含まれるＢ細胞を１個体より採取した。好ましくは、本発明の目的に用いられる抗体ライブラリーは、１０９個以上のＢ細胞から構築される。例えば、ヒト１個体から約１０９個のＢ細胞を採取するためには、アフェレーシスにより約３Ｌの血液からＢ細胞を分取すればよい。
抗体ライブラリー作製のための抗体産生細胞は、１個体由来の約１０８個以上、好ましくは約１０９個以上のＢ細胞が含有される限り、別個体由来の抗体産生細胞をさらに含んでもよい。具体的には、例えば、アフェレーシスにより約３Ｌ相当量の単核球を回収した後、例えば、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ密度勾配などによりＢ細胞を単離・回収することができる。
【００１９】
抗体ライブラリーとしては、例えば、ファージディスプレイライブラリー、ＥＢウイルスによりＢ細胞を不死化して得られるライブラリー、Ｂ細胞とミエローマ細胞とを融合して得られるハイブリドーマライブラリーなどが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、ファージディスプレイライブラリーを用いることができる。
【００２０】
本明細書における、ファージディスプレイヒト抗体ライブラリーの作製方法としては、例えば、以下のものが挙げられるが、これに限定されない。
用いられるファージは特に限定されないが、通常繊維状ファージ（Ｆｆバクテリオファージ）が好ましく用いられる。ファージ表面に外来タンパク質を提示する方法としては、ｇ３ｐ（ｃｐ３）、ｇ６ｐ（ｃｐ６）〜ｇ９ｐ（ｃｐ９）のコートタンパク質のいずれかとの融合タンパク質として該コートタンパク質上で発現・提示させる方法が挙げられるが、よく用いられるのはｃｐ３もしくはｃｐ８のＮ末端側に融合させる方法である。ファージディスプレイベクターとしては、１）ファージゲノムのコートタンパク質遺伝子に外来遺伝子を融合した形で導入して、ファージ表面上に提示されるコートタンパク質をすべて外来タンパク質との融合タンパク質として提示させるものの他、２）融合タンパク質をコードする遺伝子を野生型コートタンパク質遺伝子とは別に挿入して、融合タンパク質と野生型コートタンパク質とを同時に発現させるものや、３）融合タンパク質をコードする遺伝子を有するファージミドベクターを持つ大腸菌に野生型コートタンパク質遺伝子を有するヘルパーファージを感染させて融合タンパク質と野生型コートタンパク質とを同時に発現するファージ粒子を産生させるものなどが挙げられるが、１）の場合は大きな外来タンパク質を融合させると感染能力が失われることがあるため、そのような場合、抗体ライブラリーの作製のためには２）または３）のタイプが用いられる。
【００２１】
具体的なベクターとしては、Ｈｏｌｔら（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１１：４４５−４４９，２０００）に記載されるものが例示される。例えば、ｐＣＥＳ１（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４：１８２１８−１８２３０，１９９９参照）は、１つのラクトースプロモーターの制御下にｃｐ３のシグナルペプチドの下流にκＬ鎖定常領域をコードするＤＮＡとｃｐ３シグナルペプチドの下流にＣＨ３をコードするＤＮＡ、Ｈｉｓ−ｔａｇ、ｃ−ｍｙｃ  ｔａｇ、アンバー終止コドン（ＴＡＧ）を介してｃｐ３コード配列とが配置されたＦａｂ発現型ファージミドベクターである。アンバー変異を有する大腸菌に導入するとｃｐ３コートタンパク質上にＦａｂを提示するが、アンバー変異を持たないＨＢ２１５１株などで発現させると可溶性Ｆａｂ抗体を産生する。また、ｓｃＦｖ発現型ファージミドベクターとしては、例えばｐＨＥＮ１（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７，１９９１）等が用いられる。
一方、ヘルパーファージとしては、例えばＭ１３−Ｋ０７、ＶＣＳＭ１３等が挙げられる。
また、別のファージディスプレイベクターとして、抗体遺伝子の３’末端とコートタンパク質遺伝子の５’末端にそれぞれシステインをコードするコドンを含む配列を連結し、両遺伝子を同時に別個に（融合タンパク質としてではなく）発現させて、導入されたシステイン残基同士によるＳ−Ｓ結合を介してファージ表面のコートタンパク質上に抗体を提示し得るようにデザインされたもの（Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ社のＣｙｓＤｉｓｐｌａｙＴＭ技術）等も挙げられる。
【００２２】
本明細書において、調製される抗体ライブラリーの種類としては、ナイーブ／非免疫ライブラリー、合成ライブラリー、免疫ライブラリー等が挙げられる。
ナイーブ／非免疫（ｎｏｎ−ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）ライブラリーは、正常な動物が保有するＶＨおよびＶＬ遺伝子をＲＴ−ＰＣＲにより取得し、それらをランダムに上記のファージディスプレイベクターにクローニングして得られるライブラリーである。通常、正常動物の末梢血、骨髄、扁桃腺などのリンパ球（好ましくは末梢血リンパ球）由来のｍＲＮＡ等が鋳型として用いられる。疾病履歴などのＶ遺伝子のバイアスをなくすため、抗原感作によるクラススイッチが起こっていないＩｇＭ由来のｍＲＮＡのみを増幅したものを特にナイーブライブラリーと呼んでいる。代表的なものとしては、ＣＡＴ社のライブラリー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７，１９９１；Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１４：３０９−３１４，１９９６参照）、ＭＲＣ社のライブラリー（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２：４３３−４５５，１９９４参照）、Ｄｙａｘ社のライブラリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９９（上述）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１４：７９６９−７９７４，２０００参照）等が挙げられる。
合成ライブラリーは、ヒトＢ細胞内の機能的な特定の抗体遺伝子を選び、Ｖ遺伝子断片の、例えばＣＤＲ３等の抗原結合領域の部分を適当な長さのランダムなアミノ酸配列をコードするＤＮＡで置換し、ライブラリー化したものである。最初から機能的なｓｃＦｖやＦａｂを産生するＶＨおよびＶＬ遺伝子の組み合わせでライブライリーを構築できるので、抗体の発現効率や安定性に優れているとされる。代表的なものとしては、Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ社のＨｕＣＡＬライブラリー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２９６：５７−８６，２０００参照）、ＢｉｏＩｎｖｅｎｔ社のライブラリー（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１８：８５２，２０００参照）、Ｃｒｕｃｅｌｌ社のライブラリー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２：３９３８，１９９５；Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２７２：２１９−２３３，２００３参照）等が挙げられる。合成ライブラリーを用いる場合は、重鎖可変部のＶ遺伝子断片としてＶＨ１−６９もしくはＶＨ１−ｅ遺伝子断片を用いることが望ましい。
免疫（ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）ライブラリーは、ワクチン接種を受けた者など、標的抗原に対する血中抗体価が上昇したヒトから採取したリンパ球、あるいは体外免疫法により標的抗原を人為的に免疫したヒトリンパ球等から、上記ナイーブ／非免疫ライブラリーの場合と同様にしてｍＲＮＡを調製し、ＲＴ−ＰＣＲ法によってＶＨおよびＶＬ遺伝子を増幅し、ライブラリー化したものである。最初から目的の抗体遺伝子がライブラリー中に含まれるので、比較的小さなサイズのライブラリーからでも目的の抗体を得ることができる。しかし、ワクチン接種により接種したウイルスのサブタイプに特異的な抗体が増幅されるので、ヒトの場合、Ｈ１〜Ｈ３型の、それに対する抗体が数多く体内に存在すると見積もられるヘマグルチニンサブタイプのインフルエンザウイルスをワクチン接種すると、サブタイプ内の特定の分離株のみしか中和できない狭い範囲の中和活性を有する抗体が増幅されて、目的の中和抗体が隠れてしまう恐れがある。したがって、ワクチン接種する場合は、これまで広い範囲での感染が報告されていないサブタイプ（例えば、ヒトの場合、Ｈ５、Ｈ７、Ｈ９等）のインフルエンザウイルスのワクチンを接触することが好ましい。
【００２３】
ライブラリーの多様性は大きいほどよいが、現実的には、以下のパニング操作で取り扱えるファージ数（１０１１〜１０１３ファージ）と通常のパニングでクローンの単離および増幅に必要なファージ数（１００〜１，０００ファージ／クローン）を考慮すれば、１０８〜１０１１クローン程度が適当である。好ましくは、ＶＨおよびＶＬ遺伝子についてそれぞれ１０９および１０６クローン、ＦａｂもしくはｓｃＦｖクローン数として１０１０〜１０１１クローンである。
【００２４】
ＥＢウイルスによる不死化により抗体ライブラリーを作製する方法としては、例えばＰＬｏｓ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ４（５）：ｅ１７８  ０９２８−９９３６（２００７）に記載の方法が挙げられるが、これに限定されない。大多数の人は伝染性単核球症の無症状感染としてＥＢウイルスに感染した経験があるので免疫を有しているが、通常のＥＢウイルスを用いた場合にはウイルス粒子も産生されるので、適切な精製を行うべきである。ウイルス混入の可能性のないＥＢシステムとして、Ｂリンパ球を不死化する能力を保持するがウイルス粒子の複製能力を欠損した組換えＥＢウイルス（例えば、潜伏感染状態から溶解感染状態への移行のスイッチ遺伝子における欠損など）を用いることもまた好ましい。
【００２５】
マーモセット由来のＢ９５−８細胞はＥＢウイルスを分泌しているので、その培養上清を用いれば容易にＢリンパ球をトランスフォームすることができる。この細胞を例えば血清及びペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）添加培地（例：ＲＰＭＩ１６４０）もしくは細胞増殖因子を添加した無血清培地で培養した後、濾過もしくは遠心分離等により培養上清を分離し、これに抗体産生Ｂリンパ球を適当な濃度（例：約１０７細胞／ｍＬ）で浮遊させて、通常２０〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃で通常０．５〜２時間程度インキュベートすることにより抗体産生Ｂ細胞株を得ることができる。ヒトの抗体産生細胞が混合リンパ球として提供される場合、大部分の人はＥＢウイルス感染細胞に対して傷害性を示すＴリンパ球を有しているので、トランスフォーメーション頻度を高めるためには、例えばヒツジ赤血球等とＥロゼットを形成させることによってＴリンパ球を予め除去しておくことが好ましい。また、可溶性抗原を結合したヒツジ赤血球を抗体産生Ｂリンパ球と混合し、パーコール等の密度勾配を用いてロゼットを分離することにより標的抗原に特異的なリンパ球を選別することができる。さらに、大過剰の抗原を添加することにより抗原特異的なＢリンパ球はキャップされて表面にＩｇＧを提示しなくなるので、抗ＩｇＧ抗体を結合したヒツジ赤血球と混合すると抗原非特異的なＢリンパ球のみがロゼットを形成する。従って、この混合物からパーコール等の密度勾配を用いてロゼット非形成層を採取することにより、抗原特異的Ｂリンパ球を選別することができる。
【００２６】
トランスフォーメーションによって無限増殖能を獲得した抗体分泌細胞は、抗体分泌能を安定に持続させるためにマウスもしくはヒトの骨髄腫細胞と戻し融合させることができる。骨髄腫細胞としては、例えばマウス骨髄腫細胞としてＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０、ＡＰ−１等が、ヒト骨髄腫細胞としてＳＫＯ−００７、ＧＭ  １５００−６ＴＧ−２、ＬＩＣＲ−ＬＯＮ−ＨＭｙ２、ＵＣ７２９−６等が挙げられる。
【００２７】
細胞融合により抗体ライブラリーを作製する方法としては、通常のモノクローナル抗体作製のためのハイブリドーマ調製を準用することができる。即ち、ドナーから採取したＢ細胞と、上記の骨髄腫細胞とを融合させることにより、抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。
【００２８】
融合操作は既知の方法、例えばケーラーとミルスタインの方法［ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２５６巻、４９５頁（１９７５年）］に従って実施することができる。融合促進剤としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧなどが用いられる。ＰＥＧの分子量は特に制限はないが、低毒性で且つ粘性が比較的低いＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００が好ましい。ＰＥＧ濃度としては例えば１０〜８０％程度、好ましくは３０〜５０％程度が例示される。ＰＥＧの希釈用溶液としては無血清培地（例：ＲＰＭＩ１６４０）、５〜２０％程度の血清を含む完全培地、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、トリス緩衝液等の各種緩衝液を用いることができる。所望によりＤＭＳＯ（例：１０〜２０％程度）を添加することもできる。融合液のｐＨとしては、例えば４〜１０程度、好ましくは６〜８程度が挙げられる。
【００２９】
Ｂ細胞数と骨髄細胞数との好ましい比率は、通常１：１〜２０：１程度であり、通常２０〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃で通常１〜１０分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。
【００３０】
ハイブリドーマのスクリーニング、育種は通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加して、５〜２０％ＦＣＳを含む動物細胞用培地（例：ＲＰＭＩ１６４０）もしくは細胞増殖因子を添加した無血清培地で行われる。ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンの濃度としては、例えばそれぞれ約０．１ｍＭ、約０．４μＭおよび約０．０１６ｍＭ等が挙げられる。ヒト−マウスハイブリドーマの選択にはウワバイン耐性を用いることができる。ヒト細胞株はマウス細胞株に比べてウワバインに対する感受性が高いので、１０−７〜１０−３Ｍ程度で培地に添加することにより未融合のヒト細胞を排除することができる。
【００３１】
ハイブリドーマの選択にはフィーダー細胞やある種の細胞培養上清を用いることが好ましい。フィーダー細胞としては、ハイブリドーマの出現を助けて自身は死滅するように生存期間が限られた異系の細胞種、ハイブリドーマの出現に有用な増殖因子を大量に産生し得る細胞を放射線照射等して増殖力を低減させたもの等が用いられる。例えば、マウスのフィーダー細胞としては、脾細胞、マクロファージ、血液、胸腺細胞等が、ヒトのフィーダー細胞としては、末梢血単核細胞等が挙げられる。細胞培養上清としては、例えば上記の各種細胞の初代培養上清や種々の株化細胞の培養上清が挙げられる。
【００３２】
標的抗原に対する抗体をファージディスプレイ法で選別する工程をパニングという。具体的には、Ｈ１型〜Ｈ１６型のいずれかのインフルエンザウイルスまたは該ウイルスのヘマグルチニンタンパク質もしくはその細胞外ドメインを固定化した担体と、ファージライブラリーとを接触させ、非結合ファージを洗浄除去した後、結合したファージを担体から溶出させ、大腸菌に感染させて該ファージを増殖させる、という一連の操作を２〜４回程度繰り返すことにより、抗原特異的な抗体を提示するファージを濃縮する。本発明の場合、抗原となるインフルエンザウイルスは、ホルマリン処理により不活性されていてもよい。抗原として使用するインフルエンザウイルス分離株は、Ｂ細胞を採取した個体が感染歴のないものであることが好ましい。該個体が以前に感染したウイルス分離株を抗原として用いた場合、狭い範囲でしか中和活性を示さない抗体クローンがドミナントとなって本発明が目的とする中和抗体が隠れてしまうおそれがあるためである。したがって、好ましくは、Ｂ細胞を採取した個体が感染歴のないヘマグルチニンサブタイプに属するインフルエンザウイルスまたはそのヘマグルチニンを、抗原として使用され得る。例えば、Ｈ５型、Ｈ７型、Ｈ９型のインフルエンザウイルスが挙げられる。あるいは、Ｈ１〜Ｈ３型のサブタイプに属するインフルエンザウイルス分離株を抗原とする場合であれば、例えば、Ｂ細胞を採取した個体が生まれる前に流行した分離株等を使用することが望ましい。
【００３３】
各サブタイプのヘマグルチニンをコードするｃＤＮＡ配列は公知であり、通常の遺伝子組換え技術を用いて、所望のサブタイプの組換えヘマグルチニンを製造することができる。さらに、ヘマグルチニンの三量体細胞外ドメイン構造は、上記非特許文献６に記載の方法に準じて調製することができる。
【００３４】
抗原を固定化する担体としては、通常の抗原抗体反応やアフィニティークロマトグラフィーで用いられる各種担体、例えばアガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス、金属などからなるマイクロプレート、チューブ、メンブレン、カラム、ビーズなど、さらには表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）のセンサーチップなどが挙げられる。抗原の固定化には物理的吸着を用いてもよく、また、通常タンパク質あるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。例えばビオチン−（ストレプト）アビジン系等が好ましく用いられる。非結合ファージの洗浄には、ＢＳＡ溶液などのブロッキング液（１−２回）、Ｔｗｅｅｎ等の界面活性剤を含むＰＢＳ（３−５回）などを順次用いることができる。クエン酸緩衝液（ｐＨ５）などの使用が好ましいとの報告もある。特異的ファージの溶出には、通常酸（例：０．１Ｍ塩酸など）が用いられるが、特異的プロテアーゼによる切断（例えば、抗体遺伝子とコートタンパク質遺伝子との連結部にトリプシン切断部位をコードする遺伝子配列を導入することができる。この場合、溶出するファージ表面には野生型コートタンパク質が提示されるので、コートタンパク質のすべてが融合タンパク質として発現しても大腸菌への感染・増殖が可能となる）や可溶性抗原による競合的溶出、あるいはＳ−Ｓ結合の還元（例えば、前記したＣｙｓＤｉｓｐｌａｙＴＭでは、パニングの後、適当な還元剤を用いて抗体とコートタンパク質とを解離させることにより抗原特異的ファージを回収することができる）による溶出も可能である。酸で溶出した場合は、トリスなどで中和した後で溶出ファージを大腸菌に感染させ、培養後、常法によりファージを回収する。
尚、抗原を担体に固定化する代わりに、酵母ディスプレイを用いて細胞膜上にヘマグルチニン三量体を発現させることもできる。
【００３５】
パニングにより抗原特異的抗体を提示するファージが濃縮されると、これらを大腸菌に感染させた後プレート上に播種してクローニングを行う。再度ファージを回収し、抗体価測定法（例：ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＦＩＡ等）やＦＡＣＳ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ）あるいはＳＰＲ（Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）を利用した測定により抗原結合活性を確認する。
【００３６】
上記で得られたファージ抗体クローンを大腸菌に感染させて、培養上清から抗体を回収する工程としては、例えば、ファージディスプレイベクターとして抗体遺伝子とコートタンパク質遺伝子の連結部にアンバー終止コドンが導入されたベクターを用いる場合には、該ファージをアンバー変異を持たない大腸菌（例：ＨＢ２１５１株）に感染させると、可溶性抗体分子が産生されペリプラズムもしくは培地中に分泌されるので、細胞壁をリゾチームなどで溶解して細胞外画分を回収し、上記と同様の精製技術を用いて行うことができる。Ｈｉｓ−ｔａｇやｃ−ｍｙｃ  ｔａｇを導入しておけば、ＩＭＡＣや抗ｃ−ｍｙｃ抗体カラムなどを用いて容易に精製することができる。また、パニングの際に特異的プロテアーゼによる切断を利用する場合には、該プロテアーゼを作用させると抗体分子がファージ表面から分離されるので、同様の精製操作を実施することにより目的の抗体を精製することができる。本発明の場合、抗体の中和活性は、Ｆａｂ型よりＩｇＧ型の完全抗体の方が１００〜１０００倍程度高いので、後述の実施例の通り、得られたファージクローンからプラスミドＤＮＡを回収し、ＩｇＧのＦｃに結合するドメインに相当する配列を遺伝子操作により付加し、大腸菌に形質転換を行い、培養する。培養上清から回収された抗体をＩｇＧセファロースカラムで精製した後、中和活性の検定に供試する。
【００３７】
ＥＢウイルスによる不死化や細胞融合により得られた抗体産生細胞株から目的の抗体を選抜する方法としては、例えば、上記の抗原を蛍光標識して不死化細胞や融合細胞と反応させた後、蛍光活性化セルソータ（ＦＡＣＳ：Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｅｒ）を用いて抗原と結合する細胞を分離することによっても選択することができる。この場合、標的抗原に対する抗体を産生するハイブリドーマや不死化Ｂ細胞を直接選択することができるので、クローニングの労力を大いに軽減することが可能である。
【００３８】
標的抗原に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのクローニングには種々の方法が使用できる。
アミノプテリンは多くの細胞機能を阻害するので、できるだけ早く培地から除去することが好ましい。但し、ヒトハイブリドーマについては通常融合後４〜６週間程度はアミノプテリン添加培地で維持される。ヒポキサンチン、チミジンはアミノプテリン除去後１週間以上後に除去するのが望ましい。クローンが出現し、その直径が１ｍｍ程度になれば培養上清中の抗体量の測定が可能となる。
【００３９】
抗体量の測定は、例えば標的抗原またはその誘導体あるいはその部分ペプチドを直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質（例：１２５Ｉ，１３１Ｉ，３Ｈ，１４Ｃ）、酵素（例：β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素）、蛍光物質（例：フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネート）、発光物質（例：ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニン）などで標識した抗免疫グロブリン（ＩｇＧ）抗体（もとの抗体産生細胞が由来する動物と同一種の動物由来のＩｇＧに対する抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合した標的抗原に対する抗体を検出する方法、抗ＩｇＧ抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、上記と同様の標識剤で標識した標的抗原またはその誘導体あるいはその部分ペプチドを加え、固相に結合した標的抗原に対する抗体を検出する方法などによって行うことができる。
【００４０】
クローニング方法としては限界希釈法が通常用いられるが、軟寒天を用いたクローニングやＦＡＣＳを用いたクローニング（上述）も可能である。限界希釈法によるクローニングは、例えば以下の手順で行うことができるがこれに限定されない。
上記のようにして抗体量を測定して陽性ウェルを選択する。適当なフィーダー細胞を選択して９６ウェルプレートに添加しておく。抗体陽性ウェルから細胞を吸い出し、完全培地（例：１０％  ＦＣＳ（Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ／Ｃａｌｆ  Ｓｅｒｕｍ）およびＰ／Ｓ添加ＲＭＰＩ１６４０）中に３０細胞／ｍＬの密度となるように浮遊させ、フィーダー細胞を添加したウェルプレートに０．１ｍＬ（３細胞／ウェル）加え、残りの細胞懸濁液を１０細胞／ｍＬに希釈して別のウェルに同様にまき（１細胞／ウェル）、さらに残りの細胞懸濁液を３細胞／ｍＬに希釈して別のウェルにまく（０．３細胞／ウェル）。目視可能なクローンが出現するまで２〜３週間程度培養し、抗体量を測定・陽性ウェルを選択し、再度クローニングする。ヒト細胞の場合はクローニングが比較的困難なので、１０細胞／ウェルのプレートも調製しておく。通常２回のサブクローニングでモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを得ることができるが、その安定性を確認するためにさらに数ヶ月間定期的に再クローニングを行うことが望ましい。
【００４１】
ハイブリドーマはインビトロまたはインビボで培養することができる。
インビトロでの培養法としては、上記のようにして得られるモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを、細胞密度を例えば１０５〜１０６細胞／ｍＬ程度に保ちながら、また、ＦＣＳ濃度を徐々に減らしながら、ウェルプレートから徐々にスケールアップしていく方法が挙げられる。
インビボでの培養法としては、例えば、腹腔内にミネラルオイルを注入して形質細胞腫（ＭＯＰＣ）を誘導したマウス（ハイブリドーマの親株と組織適合性のマウス）に、５〜１０日後に１０６〜１０７細胞程度のハイブリドーマを腹腔内注射し、２〜５週間後に麻酔下に腹水を採取する方法が挙げられる。
【００４２】
モノクローナル抗体の分離精製は、通常のポリクローナル抗体の分離精製と同様に免疫グロブリンの分離精製法［例：塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例：ＤＥＡＥ、ＱＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法など］に従って行われる。
以上のようにして、ハイブリドーマを温血動物の生体内又は生体外で培養し、その体液または培養物から抗体を採取することによって、特定のヘマグルチニンサブタイプのインフルエンザウイルスに結合するモノクローナル抗体をスクリーニングすることができる。
【００４３】
このようにして得られたモノクローナル抗体が、グループの枠組みを越えてインフルエンザウイルスを中和しうるか否かの検定は、グループ１より選択される少なくとも１つのインフルエンザウイルスと、グループ２より選択される少なくとも１つのインフルエンザウイルスとに対する中和活性を試験することにより行われる。
通常、インフルエンザウイルスに対する中和活性の検討は、赤血球凝集抑制（ＨＩ：Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）試験にて行われる場合が多い。インフルエンザウイルスは、ヘマグルチニンの頭部領域を介して、赤血球表面に存在するシアル酸を含む糖鎖（シアロ糖鎖）をインフルエンザウイルス受容体として、赤血球に結合する。結果として、インフルエンザウイルスによって赤血球は凝集する。インフルエンザウイルスに対して中和活性のある抗体は、ヘマグルチニンを認識して結合するため、インフルエンザウイルスの赤血球凝集性は中和抗体によって抑制されることとなる。従って、赤血球凝集抑制の有無が中和活性の有無の指標となる。ヘマグルチニンの赤血球凝集に関与する領域はａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｄｒｉｆｔを起こしやすいが、その領域のうちシアル酸結合に関与するアミノ酸はインフルエンザウイルスの亜型を通じて高度の保存される傾向があり、広範な中和活性を有する本発明の中和抗体は該アミノ酸をエピトープとして認識している可能性が示唆される。あるいは、、本発明における中和活性の試験方法としては、例えば、フォーカス形成阻害試験（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｖｏｌ．２８，ｐｐ１３０８−１３１３（１９９０））が挙げられる。即ち、被検抗体の存在下および非存在下にインフルエンザウイルスと宿主細胞とを接触させ、宿主細胞へのウイルス感染によるフォーカス形成を被検抗体が有意に阻害するか否かにより、中和活性の有無やその程度を判定する。
【００４４】
中和活性が試験されるインフルエンザウイルスのサブタイプは特に制限されないが、グループ１では少なくともＨ１型および／またはＨ５型インフルエンザウイルスを含むことが好ましく、グループ２では少なくともＨ３型インフルエンザウイルスを含むことが好ましい。あるいは、グループ１としてＨ９型、グループ２としてＨ７型のインフルエンザウイルスに対する中和活性を、さらに調べることも好ましい。
【００４５】
中和活性試験の結果、グループ１より選択される少なくとも１つのインフルエンザウイルスと、グループ２より選択される少なくとも１つのインフルエンザウイルスとを中和することが確認された抗体分子を産生するクローンを用い、当該抗体分子を大量に製造することができる。使用した抗体ライブラリーがファージディスプレイライブラリーの場合、目的の中和抗体のＦａｂやｓｃＦｖを提示するファージクローンを大腸菌に感染させて培養し、Ｆａｂ型抗体やｓｃＦｖ型抗体を調製してもよいが、中和活性を顕著に増強する目的で、それらをＩｇＧ型に変換することがより好ましい。例えば、ＦａｂからＩｇＧへの変換は、ファージＤＮＡからＶＨＣＨ１およびＶＬＣＬをコードする断片を切り出し、Ｆｃ領域をコードする断片を含むプラスミド中に挿入することにより重鎖および軽鎖をコードするＤＮＡを含むプラスミドを構築し、これをＣＨＯ細胞などの動物細胞にトランスフェクトして培養することにより、培養上清中にＩｇＧ型抗体を分泌させることにより行うことができる。得られた抗体は、自体公知の方法により精製・回収することができる。
また、使用した抗体ライブラリーがＥＢウイルス不死化Ｂ細胞や細胞融合によるハイブリドーマの場合、上記のようにインビトロまたはインビボで抗体分子を産生させ、常法により精製することにより回収することができる。
【００４６】
得られた中和抗体について、免疫系が採用しているステップ（体細胞突然変異と選択）を模倣してｉｎ  ｖｉｔｒｏで抗原に対するアフィニティーを増強させることができる。抗体遺伝子への変異導入の方法としては、ｃｈａｉｎ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ法、修復系を欠損し変異を起こしやすい大腸菌やエラープローンＰＣＲを用いたランダム変異導入法、ＣＤＲウォーキングなどが挙げられる。抗原に対するアフィニティーが向上した中和抗体の選択は、変異導入によってできた変異ライブラリーからの高親和性中和抗体をスクリーニングすることにより行われる。例えば、１）選択に用いる抗原量を低濃度にして高アフィニティーの抗体ファージを回収する方法、２）洗浄条件を厳しく設定し抗原からはずれにくい抗体ファージを回収する方法、３）拮抗反応を利用した方法などが用いられ得る。
【００４７】
上記のようにして得られた本発明の中和抗体の多くは、重鎖可変部Ｖ領域としてＶＨ１−６９もしくはＶＨ１−ｅ遺伝子を利用している。この点は、これまでに報告されている、グループ１の複数のサブタイプのインフルエンザウイルスを中和する種々の抗体と共通する特徴であり、同じＶ遺伝子断片を利用しながら、中和活性を示す範囲に決定的な差異があることは興味深い。また、本発明の中和抗体は、軽鎖可変部Ｖ領域としてＶＬ１−４４、ＶＬ１−４７またはＶＬ１−５１遺伝子のみの利用が見られることは特徴的である。また、本発明の中和抗体は、ＩｇＧ型抗体とした場合の、フォーカス形成阻害試験における最小阻害濃度が１０−１１〜１０−１２Ｍのオーダーであり、これまでに報告されている、グループ１の複数のサブタイプのインフルエンザウイルスを中和するいずれの抗体よりも中和活性が高い。
【００４８】
抗体は、Ｂ細胞分化の過程で免疫グロブリン遺伝子の再編成、即ち、重鎖可変部のＶ、Ｄ、Ｊ領域の組換えまたは軽鎖可変部のＶ、Ｊ領域の組換えが生じた後、さらに可変領域の塩基配列に体細胞突然変異が誘発される。その結果、抗原に対してより親和性の高い可変部を有する抗体を生み出しうる。従って、Ｂ細胞由来の抗体クローンである本発明の中和抗体は、元々の免疫グロブリン遺伝子に体細胞突然変異が生じたアミノ酸配列を有する中和抗体をも含みうる。また、中和抗体とインフルエンザウイルス抗原との抗原抗体複合体形成に際して、ヘマグルチニン分子との接触点が全て重鎖可変部であるため、中和抗体のインフルエンザウイルスとの親和性に実質的に寄与すると考えられる部位は重鎖可変部であると予想されたが、軽鎖可変部のバリエーションにも収束が見られることから、本発明の中和抗体では軽鎖可変部も一定の役割を果たしていることが示唆される。また、本発明の中和抗体では抗原との結合に関して相補性決定領域３（ＣＤＲ３）の寄与が小さいので、重鎖可変部Ｖ領域に存在する相補性決定領域１および２がより重要である。本明細書において、重鎖可変部Ｖ領域（軽鎖可変部Ｖ領域）とは、重鎖（軽鎖）の可変部を構成する再編成後のＶ領域を指し、例えば、フレームワーク領域１、２および３と相補性決定領域１および２を含む領域であり得る。また、重鎖（軽鎖）可変部は、抗体をＦａｂ領域のうちの定常部ではない部分を指し、例えば、フレームワーク領域１、２および３と相補性決定領域１、２および３を含む領域であり得る。したがって、本発明の中和抗体の好ましい一例としては、例えば、重鎖可変部の相補性決定領域１として配列番号：１のアミノ酸配列を有し、かつ相補性決定領域２として配列番号：２のアミノ酸配列を有する中和抗体が挙げられる。
また、本発明ではグループ２に属するＨ３型のインフルエンザウイルスに対する中和活性を持ちながら、さらにグループ１に属するＨ１型、Ｈ２型およびＨ５型に対して他のクローンと比して顕著な中和活性を有するクローンを得ている。本クローンはその他のクローンと異なり重鎖可変部のフレームワーク領域１の１アミノ酸（配列番号：２７における２７番目のグリシン）が欠失した構造である。従って、重鎖可変部のフレームワーク領域１が配列番号：３に示されるアミノ酸配列からなる中和抗体も本発明の中和抗体として好ましく挙げることができる。
さらに具体的な例としては、重鎖可変部Ｖ領域が配列番号：４〜９のいずれかに示されるアミノ酸配列からなる中和抗体、重鎖可変部が配列番号：１０〜１５のいずれかに示されるアミノ酸配列からなる中和抗体、あるいは重鎖可変部（配列番号：１０〜１５）および軽鎖可変部（配列番号：１６〜２６、７０）がそれぞれ以下の組み合わせに示されるアミノ酸配列からなる中和抗体が挙げられる
（ａ）配列番号：１０、配列番号：１６；
（ｂ）配列番号：１０、配列番号：１７；
（ｃ）配列番号：１０、配列番号：１８；
（ｄ）配列番号：１０、配列番号：１９；
（ｅ）配列番号：１０、配列番号：２０；
（ｆ）配列番号：１０、配列番号：２１；
（ｇ）配列番号：１０、配列番号：２２；
（ｈ）配列番号：１１、配列番号：２３；
（ｉ）配列番号：１３、配列番号：２４；
（ｊ）配列番号：１４、配列番号：２５；
（ｋ）配列番号：１５、配列番号：２６：または
（ｌ）配列番号：１２、配列番号：７０
【００４９】
また、前記の抗体の重鎖可変部のアミノ酸配列（配列番号：１０〜１５）をコードする塩基配列としてそれぞれ配列番号：７１〜７６に示される塩基配列、軽鎖可変部のアミノ酸配列（配列番号：１６〜２６、７０）をコードする塩基配列としてそれぞれ配列番号：７７〜８８に示される塩基配列が挙げられる。従って、本発明の中和抗体は、重鎖可変部が配列番号：７１〜７６のいずれかに示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列からなる中和抗体、あるいは重鎖可変部および軽鎖可変部がそれぞれ以下の組み合わせに示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列からなる中和抗体が挙げられる
（ａ）配列番号：７１、配列番号：７７；
（ｂ）配列番号：７１、配列番号：７８；
（ｃ）配列番号：７１、配列番号：７９；
（ｄ）配列番号：７１、配列番号：８０；
（ｅ）配列番号：７１、配列番号：８１；
（ｆ）配列番号：７１、配列番号：８２；
（ｇ）配列番号：７１、配列番号：８３；
（ｈ）配列番号：７２、配列番号：８４；
（ｉ）配列番号：７４、配列番号：８５；
（ｊ）配列番号：７５、配列番号：８６；
（ｋ）配列番号：７６、配列番号：８７；または
（ｌ）配列番号：７３、配列番号：８８
【００５０】
以上のことから、本発明の方法は、従来法よりも広い範囲で、即ちグループの壁さえも越えて中和活性を発揮し得る抗体を提供できるだけでなく、従来法と比較してより中和活性の高い抗体を提供し得るので、極めて有用である。
【００５１】
本発明の方法によって得られるインフルエンザウイルス中和抗体は、その中和活性の広さから、従来の中和抗体が認識するエピトープとは異なる箇所を認識するものと考えられる。本発明の中和抗体が認識するエピトープを明らかにすることができれば、該エピトープのアミノ酸配列を含むペプチド（抗原性を有するアミノ酸配列）はインフルエンザウイルス用ワクチンまたは該抗原性を有するペプチドをコードする塩基配列を含む核酸（遺伝子）はインフルエンザ検査用試薬、検査用試薬キットとして有用である。免疫学的反応性エピトープを特定する方法としては、公知の方法で決定することができるが、例えば、１）ヘマグルチニンを酵素処理又は化学的処理により調製した限定分解物と本発明で取得した中和抗体のＩｇＧ型抗体の反応性を調べる方法、２）アミノ酸配列データベースを参照して合成したオーバーラップペプチドと本発明で取得した中和抗体のＩｇＧ型抗体の反応性を調べる方法などが挙げられる。
【００５２】
ヘマグルチニンは転写・翻訳の後、前駆体としてグリコシル化を受けるが、グリコシル化を受けたヘマグルチニンはＨＡ１とＨＡ２の２つのサブユニットに開裂されることが知られている。表１に各インフルエンザウイルスのＨＡ１サブユニットおよびＨＡ２サブユニットのアミノ酸配列と配列番号の対応関係を示す。
【００５３】
【表１】
0006018916.tif 000002
0006018916.tif 000003
【００５４】
既報の３グループが同定したＨ５型およびＨ１型に反応性を示す抗体は、重鎖可変部にＶＨ１−６９を利用している点で本発明の抗体と共通しており、エピトープが共通している可能性が示唆された。即ち、ＨＡ２サブユニット（膜融合に関与する領域）内にエピトープがあることが予想された。しかし本予想に反して、本願発明者らは、本発明の中和抗体は、既報の上記抗体とエピトープを競合した抗体（Ｃ１７９）（Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ＆  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１６，ｐｐ．２６５−２７３，２００９）とは競合しないことを明らかにした。これは、ＶＨ１−６９を利用していてもエピトープまでが共通するものではないことを裏付けるものである。さらに、本発明の中和抗体には赤血球凝集抑制（ＨＩ）活性が見られることから、ＨＡ１サブユニット（細胞レセプター結合領域）を認識して結合することが示唆されるものである。
【００５５】
ＶＨ１−６９のＣＤＲ２領域に存在するイソロイシン（配列番号：２７のアミノ酸配列の５４番目アミノ酸）およびフェニルアラニン（配列番号：２７のアミノ酸配列の５５番目アミノ酸）は連続する疎水性アミノ酸残基であり、疎水性の先端部を形成し、疎水性クラスターと相互作用することが知られている。本発明の中和抗体は前記イソロイシンがフェニルアラニンに置換されており、疎水性クラスターとの結合性になんらかの影響を与えている可能性が示唆される。ヘマグルチニンには高度にアミノ酸保存された疎水性ポケット、即ちシアル酸結合部位が存在し、該シアル酸結合部位はエピトープ候補として挙げられる（Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３３３，ｐｐ．４２６−４３１，１９８８）。そのようなシアル酸結合部位を形成するアミノ酸としては、例えば、Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／６８インフルエンザウイルスＨＡ１の９８番目チロシン、１５３番目トリプトファン、１５５番目スレオニン、１８３番目ヒスチジン、１９０番目グルタミン酸、１９４番目リシン、１３４番目〜１３８番目アミノ酸、２２４番目〜２２８番目アミノ酸など（亜型、株が異なるインフルエンザウイルスの場合は、対応するアミノ酸）が挙げられる。従って、それらのアミノ酸を含む領域がエピトープである可能性が考えられる。また、インフルエンザウイルスのＨＡ１には、変異が蓄積しやすい５つのサイト（Ａ、Ｂ（Ｂ１、Ｂ２）、Ｃ（Ｃ１、Ｃ２）、Ｄ、Ｅ領域）が報告されている（Ｐ．Ａ．Ｕｎｄｅｒｗｏｏｄ，Ｊ．ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．ｖｏｌ．６２，１５３−１６９，１９８２；Ｗｉｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．２８９，３６６−３７８，１９８１）。本発明において、Ａ領域とは配列番号：２８の１２１番目〜１４６番目アミノ酸、または該アミノ酸領域に対応する領域、Ｂ１領域とは配列番号：２８の１５５番目〜１６３番目アミノ酸、または該アミノ酸領域に対応する領域、Ｂ２領域とは配列番号：２８の１５５番目〜１６３番目、または該アミノ酸領域に対応する領域、Ｃ１領域とは配列番号：２８の５０番目〜５７番目アミノ酸、または該アミノ酸領域に対応する領域、Ｃ２領域とは配列番号：２８の２７５番目〜２７９番目アミノ酸、または該アミノ酸領域に対応する領域、Ｄ領域とは配列番号：２８の２０７番目〜２２９番目アミノ酸、または該アミノ酸領域に対応する領域、Ｅ領域とは配列番号：２８の６２番目〜８３番目アミノ酸、または該アミノ酸領域に対応する領域をそれぞれ指す。本発明の抗体、特にＦ０４５−０９２は、ＨＡ１に存在するＡ領域、Ｂ１領域およびＢ２領域近傍を認識する抗体と競合したことから、Ａ、Ｂ領域近傍がエピトープである可能性が示唆される。
【００５６】
本発明の中和抗体は、グループの枠組みを越えてあらゆるヘマグルチニンサブタイプのインフルエンザウイルスを中和することができるので、ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｄｒｉｆｔによる季節性インフルエンザだけでなく、ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｓｈｉｆｔによるパンデミックに対しても有効な予防および／または治療手段となり得る。すなわち、該中和抗体を投与することにより、あらゆるサブタイプのインフルエンザウイルスに対する受動免疫を行うことができ、任意のインフルエンザウイルスの感染により発症した患者に対する治療効果、および発症もしくは感染のおそれのある対象に対する予防効果が期待できる。しかも、本発明の中和抗体は、元々ヒト体内に存在した抗体であるため、副作用の危険がまずないと考えられる。
【００５７】
本発明の中和抗体は、それ自体として、あるいは薬理学的に許容し得る担体とともに混合して医薬組成物とした後に、インフルエンザに対する受動免疫療法剤として用いることができる。
ここで、薬理学的に許容される担体としては、製剤素材として慣用の各種有機あるいは無機担体物質が用いられ、賦形剤、溶剤（分散剤）、溶解補助剤、懸濁化剤、安定化剤、等張化剤、緩衝剤、ｐＨ調節剤、無痛化剤などとして配合される。また必要に応じて、保存剤、抗酸化剤などの製剤添加物を用いることもできる。
賦形剤の好適な例としては、乳糖、白糖、Ｄ−マンニトール、Ｄ−ソルビトール、デンプン、α化デンプン、デキストリン、結晶セルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、アラビアゴム、プルラン、軽質無水ケイ酸、合成ケイ酸アルミニウム、メタケイ酸アルミン酸マグネシウムなどが挙げられる。
溶剤の好適な例としては、注射用水、生理的食塩水、リンゲル液、アルコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ゴマ油、トウモロコシ油、オリーブ油、綿実油などが挙げられる。
溶解補助剤の好適な例としては、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ−マンニトール、トレハロース、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、サリチル酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなどが挙げられる。
懸濁化剤の好適な例としては、ステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリンなどの界面活性剤；例えばポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースなどの親水性高分子；ポリソルベート類、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油などが挙げられる。
安定化剤の好適な例としては、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ピロ亜硫酸ナトリウム、ロンガリット、メタ亜硫酸水素ナトリウムなどが挙げられる。
等張化剤の好適な例としては、塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ−マンニトール、Ｄ−ソルビトール、ブドウ糖などが挙げられる。
緩衝剤の好適な例としては、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩などの緩衝液などが挙げられる。
ｐＨ調節剤の好適な例としては、塩酸、水酸化ナトリウムなどの酸または塩基が上げられる。
無痛化剤の好適な例としては、ベンジルアルコールなどが挙げられる。
保存剤の好適な例としては、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸などが挙げられる。
抗酸化剤の好適な例としては、亜硫酸塩、アスコルビン酸塩などが挙げられる。
【００５８】
前記医薬組成物の剤形としては、例えば注射剤（例：皮下注射剤、静脈内注射剤、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤、動脈内注射剤など）、点滴剤等の注入型製剤が挙げられる。
医薬組成物は、製剤技術分野において慣用の方法、例えば日本薬局方に記載の方法等により製造することができる。以下に、製剤の具体的な製造法について詳述する。医薬組成物中の抗体含量は、剤形、投与量などにより異なるが、例えば約０．１ないし１００重量％である。
【００５９】
例えば、注射剤は、抗体を分散剤（例：ポリソルベート８０，ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０，ポリエチレングリコール，カルボキシメチルセルロース，アルギン酸ナトリウムなど）、保存剤（例：メチルパラベン，プロピルパラベン，ベンジルアルコール，クロロブタノール，フェノールなど）、等張化剤（例：塩化ナトリウム，グリセリン，Ｄ−マンニトール，Ｄ−ソルビトール，ブドウ糖など）などと共に水性溶剤（例：蒸留水，生理的食塩水，リンゲル液等）あるいは油性溶剤（例：オリーブ油，ゴマ油，綿実油，トウモロコシ油などの植物油、プロピレングリコール等）などに溶解、懸濁あるいは乳化することにより製造される。この際、所望により溶解補助剤（例：サリチル酸ナトリウム，酢酸ナトリウム等）、安定化剤（例：ヒト血清アルブミン等）、無痛化剤（例：ベンジルアルコール等）等の添加物を用いてもよい。注射液は、必要に応じて、例えばメンブレンフィルター等を用いた濾過滅菌などの滅菌処理を行い、通常、アンプル等の適当な容器に充填される。
注射剤は、上記液剤を真空乾燥などによって粉末とし、用時溶解（分散）して使用することもできる。真空乾燥法の例としては、凍結乾燥法、スピードバックコンセントレーター（ＳＡＶＡＮＴ社）を用いる方法などが挙げられる。凍結乾燥を行う際には、−１０℃以下に冷却されたサンプルを用いて、実験室ではフラスコ中で、工業的にはトレイを用いて、あるいはバイアル中で凍結乾燥させることが好ましい。スピードバックコンセントレーターを用いる場合は、０〜３０℃程度で、約２０ｍｍＨｇ以下、好ましくは約１０ｍｍＨｇ以下の真空度で行われる。乾燥させる液剤中には、リン酸塩などの緩衝剤を添加してｐＨを３〜１０程度とすることが好ましい。真空乾燥により得られる粉末製剤は長期間安定な製剤として、用時注射用水、生理食塩水、リンゲル液等に溶解、もしくはオリーブ油，ゴマ油，綿実油，トウモロコシ油、プロピレングリコール等に分散することにより注射剤とすることができる。
【００６０】
必要に応じて、上記抗体に他の治療用薬剤を併用することもできる。例えば、治療薬剤としては、タミフル、リレンザ、アマンタジンなどが挙げられる。
あるいは、必要に応じて、上記抗体に他の治療用薬剤を結合させることもできる。抗体は、インフルエンザウイルスが存在する部位またはその近傍に薬剤を運搬するとともに、ウイルスの細胞への侵入を阻害し、一方、薬剤は、ウイルスを死滅させるか、インフルエンザの症状を治療、軽減又は改善する。薬剤は、インフルエンザの治療薬剤として使用されている、又は使用されようとする、すべての薬剤を含む。そのような薬剤は、例えば合成又は天然の、低分子量又は高分子量の、タンパク質性又は非タンパク質性の、或いは核酸又はヌクレオチド性の物質である。抗体と薬剤との結合は、好ましくはリンカーを介して行われる。リンカーは、例えば置換又は未置換の脂肪族性アルキレン鎖を含み、その両末端に、抗体又は薬剤の官能基と結合可能な基、例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミド基、エステル基、チオール基、イミドカルボネート基、アルデヒド基などを含むものである（抗体工学入門、地人書館、１９９４年）。
必要に応じて、医薬を細胞内に運搬しやすくするために、リポソームに封入することもできる。好ましいリポソームは、正電荷リポソーム、正電荷コレステロール、膜透過性ペプチド結合リポソームなどである（中西守ら，タンパク質核酸酵素４４：１５９０−１５９６（１９９９）、二木史朗，化学と生物４３：６４９−６５３（２００５）、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５９：４３２５−４３３３（１９９９）など）。
【００６１】
本発明の中和抗体の投与は、非経口投与、例えば静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、経皮投与などである。
抗体の有効成分量は、１回の用量あたり１００〜２，５００μｇ／ｍｌである、或いはヒト成人患者体重１ｋｇあたり１．０〜１０ｍｇの量であるが、これらに限定されないものとする。
投与回数は、例えば１〜２週間に１回の頻度で１〜数回の投与又は２〜３週間に１回の投与で約２ヶ月間である。
【００６２】
本発明の中和抗体は、ヒトのインフルエンザの予防および／または治療用としてだけでなく、ニワトリ等の鳥類、ブタ、ウマなどの非ヒト哺乳動物に投与することにより、それらの動物におけるインフルエンザの予防および／または治療用としても用いることができ、そうすることにより、ヒトへの感染のリスクを未然に低減することができる。これらの動物に適用する場合でも、上記と同様の製剤化手法が用いられ得る。
【００６３】
本発明の中和抗体は、元々ヒト体内に存在した抗体をスクリーニングにより単離したものである。このような抗体は極めて稀に存在するのではなく、ある程度の頻度でヒトが既に保有しているものと見るほうが自然である。したがって、本発明の中和抗体を産生する能力のある個体は、新型インフルエンザに対しても抵抗性であると考えられる。一方で、このような抗体を産生する能力のない個体は、新型インフルエンザに対して脅威にさらされているといえる。当該中和抗体を保有しているか否かを比較的簡便に判定することができれば、中和抗体非保有者に対しては、受動免疫による予防を優先的に講じることが望ましいと判定することができる。
【００６４】
したがって、本発明はまた、被験者における本発明の中和抗体の検出方法であって、以下の工程を含む方法；
（１）Ｈ１型〜Ｈ１６型のいずれかのサブタイプのヘマグルチニンを被験者に接種する工程
（２）接種後、抗体産生細胞が十分に増幅された時点で被験者より血液を採取する工程
（３）該血液中の、グループ１より選択されるサブタイプのヘマグルチニンと、グループ２より選択されるサブタイプのヘマグルチニンとの両方に結合し、かつＶＨ１−６９もしくはＶＨ１−ｅ遺伝子にコードされる重鎖可変部Ｖ領域を有する抗体を提示する抗体産生細胞の有無を調べる工程
あるいは、以下の工程を含む方法；
（１）グループ１より選択されるサブタイプのヘマグルチニンと、グループ２より選択されるサブタイプのヘマグルチニンとを、それぞれ別個に被験者に接種する工程
（２）各ヘマグルチニン接種後、抗体産生細胞が十分に増幅された時点で被験者より血液を採取する工程
（３）各血液中の、接種したへマグルチニンとは異なるグループより選択されるサブタイプのヘマグルチニンに結合し、かつＶＨ１−６９もしくはＶＨ１−ｅ遺伝子にコードされる重鎖可変部Ｖ領域を有する抗体を提示する抗体産生細胞の有無を調べる工程
を提供する。
少量の採血により目的の中和抗体を検出するためには、目的の抗体を産生するＢリンパ球の増幅と濃縮が必要となる。そこで、ヘマグルチニン接種による誘導と、異なるグループに属するヘマグルチニンとの結合活性および本発明の中和抗体の大半に共通するＶ遺伝子断片の利用を指標とすることとにより、該中和抗体の有無を検出しようとするものである。
【００６５】
以下に実施例を示して、本発明をより詳細に説明するが、これらは単なる例示であって、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【実施例】
【００６６】
採血
１９７４年生まれの小児科医より、アフェレーシスにより血液３Ｌ相当量の単核球を回収した。採血は、２００４年５月に行なった。【００６７】
ヒトファージ抗体ライブラリー調製
ファージディスプレイ法によりヒトファージ抗体ライブラリーを調製した。採血により得られた成分血からＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅにより約１０９個のリンパ球を回収し、ＲＮＡを単離した。そこからｃＤＮＡを増幅し、抗体のＨｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ（ＶＨ）およびＬｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ（ＶＬ）のライブラリーをそれぞれ構築した。Ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎおよびＬｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎのクローン数は、それぞれ約１０９および１０６個であった。次に、Ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎとＬｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎを組み合わせてＦａｂ−ｃｐ３型のヒトファージ抗体ライブラリーを構築した。約１０１０個のクローンを含むライブラリーである。【００６８】
使用したインフルエンザウイルス株
本実施例では以下のインフルエンザウイルス株を使用した。以下の実施例において特に断りがなければ、各略称は下記のインフルエンザウイルス株を表すものである。
（Ｈ３Ｎ２型）
Ａｉｃ６８：  Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／６８，  Ｆｕｋ７０：  Ａ／Ｆｕｋｕｏｋａ／１／７０，  Ｔｏｋ７３：  Ａ／Ｔｏｋｙｏ／６／７３，Ｙａｍ７７：    Ａ／Ｙａｍａｎａｓｈｉ／２／７７，    Ｎｉｉ８１：    Ａ／Ｎｉｉｇａｔａ／１０２／８１，    Ｆｕｋ８５：Ａ／Ｆｕｋｕｏｋａ／Ｃ２９／８５，Ｇｕｉ８９：  Ａ／Ｇｕｉｚｈｏｕ／５４／８９，Ｋｉｔ９３：  Ａ／Ｋｉｔａｋｙｕｓｈｕ／１５９／９３，Ｓｙｄ９７：  Ａ／Ｓｙｄｎｅｙ／５／９７，Ｐａｎ９９：  Ａ／Ｐａｎａｍａ／２００７／９９，Ｗｙｏ０３：  Ａ／Ｗｙｏｍｉｎｇ／３／２００３，ＮＹ０４：  Ａ／Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ／５５／２００４
（Ｈ１Ｎ１型）
ＮＣ９９：  Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９，ＳＩ０６：  Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ  Ｉｓｌａｎｄ／３／２００６【００６９】
スクリーニング
パニング法によりスクリーニングを行った。ホルマリン処理により不活化したインフルエンザウイルス株をイムノチューブにコーティングした後、チューブ内にコーティングされたウイルス株とファージ抗体ライブラリーとの抗原抗体反応を行った。ＰＢＳによりチューブを洗浄後、抗原に結合しているファージを酸で溶出して直ちに中和し、回収した。回収したファージは大腸菌に感染させ、回収率を算出するとともにファージ抗体を調製した。このファージを用いて上記操作を繰り返した。この操作を３回行い、溶出したファージを大腸菌に感染させ、ＬＢＧＡ  ｐｌａｔｅ上で一晩培養し、ｓｉｎｇｌｅコロニーを得た。このコロニーを単離してＦａｂ−ｃｐ３抗体を調製し、スクリーニングに使用したウイルス株に対する結合活性をＥＬＩＳＡにより確認した。結合活性を示したクローンをｐｏｓｉｔｉｖｅクローンとして、更なる解析をおこなった。【００７０】
Ｆａｂ−ｃｐ３型抗体の調製
スクリーニングで得られたファージを感染させた大腸菌を、０．０５％  グルコース、１００μｇ／ｍｌアンピシリン、１ｍＭ  ＩＰＴＧの入ったＹＴに植菌し、３０℃で一晩振とう培養した。大腸菌から分泌されたＦａｂ−ｃｐ３型抗体を含む培養上清を遠心分離により回収し、ＥＬＩＳＡ、ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ  ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロッティング、フローサイトメーター等の実験に使用した。【００７１】
ＥＬＩＳＡ
ホルマリン処理により不活化したウイルス株溶液を、９６ｗｅｌｌのマキシソープ加え、３７℃で１時間コーティングした。Ｗｅｌｌからウイルス溶液を除き、５％  ＢＳＡ／ＰＢＳを加えて１時間ブロッキングし、ＢＳＡ溶液を除去後、Ｆａｂ−ｃｐ３型抗体が含まれている大腸菌培養上清を入れて、１時間反応させた。０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０の入ったＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で洗った後、ｒａｂｂｉｔ  ａｎｔｉ−ｃｐ３抗体を入れて１時間反応させた。さらにＰＢＳＴで洗浄後、ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ＨＲＰを入れて１時間反応させた。ＰＢＳＴで洗浄し、ＨＲＰの基質であるＯＰＤ溶液を入れて室温で反応させ、２Ｎの硫酸で反応を停止後、４９２ｎＭの波長でＯＤを測定した。特に記述のない限り、反応はすべて３７℃で行った。【００７２】
単離した抗体クローンのシークエンス解析
ウイルス抗原に対しＰｏｓｉｔｉｖｅであったクローンのＨｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ（ＶＨ）およびＬｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ（ＶＬ）の塩基配列を、シークエンス反応により確認した。【００７３】
単離されたクローンのグループ分け
クローンのＶＨ塩基配列確認後、アミノ酸配列に変換しその配列を単離したクローン間で比較した。ＶＨのアミノ酸配列類似性、特にＣＤＲ３配列における類似性を中心に、クローンをグループ分けした。【００７４】
ウエスタンブロッティング
ホルマリン処理したウイルス株を、非還元の状態でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行って分画したのち、ＰＶＤＦ膜に転写した。ＰＶＤＦ膜を２．５％スキムミルクの入ったＰＢＳＴで１時間ブロッキングしてＰＢＳＴで洗ったのち、培養上清中のＦａｂ−ｃｐ３型抗体と１時間反応させた。ＰＢＳＴで洗浄後、ｒａｂｂｉｔ  ａｎｔｉ−ｃｐ３抗体と１時間反応させ、さらにＰＢＳＴで洗浄後、ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ＨＲＰと１時間反応させた。ＰＢＳＴで洗浄後、ＥＣＬ溶液と４−５分反応させ、ＣＣＤカメラによりバンドを検出した。反応はすべて室温で行った。【００７５】
Ｆａｂ−ｐｐ型抗体の調製
Ｆａｂ−ｃｐ３型抗体クローンのプラスミドＤＮＡを、遺伝子操作によりＦａｂ−ｐｐ型（ＰＰはｐｒｏｔｅｉｎ  ＡのＦｃ結合ドメイン）に改変したのち、大腸菌をトランスフォームした。この大腸菌を、０．０５％  グルコース、１００μｇ／ｍｌアンピシリン、１ｍＭ  ＩＰＴＧの入ったＹＴに植菌し、３０℃で一晩振とう培養した。大腸菌から分泌されたＦａｂ−ｐｐ型抗体を含む培養上清を遠心分離により回収し、硫安沈殿後ＰＢＳに溶解し、ＩｇＧセファロースカラムで精製した後、ＨＩ活性、ウイルス中和活性等の実験に使用した。【００７６】
ＨＩ活性測定
精製したＦａｂ−ｐｐ型抗体をＰＢＳで段階希釈し、１ｗｅｌｌあたり４ＨＡユニットのウイルス溶液とそれぞれ混和し、１時間室温で反応させた。赤血球を添加して混和後、室温で３０分から１時間反応させた。結果は、抗体の希釈倍率で表している。【００７７】
Ｎライブラリーより単離されたクローンのＨ３Ｎ２インフルエンザウイルス株に対する結合活性
Ｎライブラリースクリーニングにより単離された抗体クローンの、スクリーニングに使用した１２種類のＨ３Ｎ２ウイルス株すべてと、１つのＨ１Ｎ１ウイルス株に対する結合活性を、ＥＬＩＳＡの結果で示した。スクリーニングで単離されたクローンがウイルス株に対しどのようなｃｒｏｓｓ  ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙを示すかを確認した実験である。結果を図１に示す。
単離されたクローンは、各ウイルスに対する結合活性の程度に従いグループごとに分類し、一番左にグループ番号を表記した。”クローン名”の右となりのカラムの”単離数”は、スクリーニングで単離されたクローンのうち同じＶＨアミノ酸配列を示すクローンの数であり、さらに右となりの”単離ウイルス株”は、それらクローンが、どのウイルス株でのスクリーニングで単離されたかを示した。
ＥＬＩＳＡの数値は、次のように処理した。
１以上：赤
０．５以上１未満：オレンジ
０．１以上０．５未満：黄色
０．１未満：白
一番右端のウエスタンブロッティング（ＷＢ）の欄は、実験を行ったクローンのみの結果である。ＨＡの位置にバンドが検出できたクローンは、”ＨＡ”と表記し、それ以外の位置にバンドが検出されたクローンは現在のところ何を認識しているのかわからないため”？”としてある。空欄は、実験を行っていない。【００７８】
Ｎライブラリースクリーニング結果
Ｈ３Ｎ２株の各スクリーニングで拾ったクローンの数（ＥＬＩＳＡによる確認を行う前）と、そのうち、Ｇｒｏｕｐ１１およびＧｒｏｕｐ２２に分類されたクローン（図１）が、どのウイルス株でのスクリーニングで単離されたかを示した（図２）。
Ｇｒｏｕｐ１１はＨ３−Ｈ１両株を抗原として認識する抗体クローンのグループ、Ｇｒｏｕｐ２２はＨ３株１２種類すべてを認識するが、Ｈ１株は認識しない抗体クローンのグループである。【００７９】
Ｇｒｏｕｐ１１に属するクローンの単離状況
Ｇｒｏｕｐ１１に分類された各抗体クローン単離時のスクリーニングウイルス株およびそのスクリーニングにおける単離数を示した（図３）。
各クローンのＶＨ配列を元に（ＶＬ配列は考慮に入れていない）、同一ＶＨ配列を持つクローンの単離数を示してある。【００８０】
Ｇｒｏｕｐ１１に属するクローンのアミノ酸配列
Ｇｒｏｕｐ１１に分類されたクローンのＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列を示した（図４）。
（１）ＶＨアミノ酸配列
Ｇｒｏｕｐ１１に属するクローンは、ＮＣＢＩのＩｇＢｌａｓｔでのＧｅｒｍｌｉｎｅの検索で、ＩＧＨＶ１−６９＊０１とのＩｄｅｎｔｉｔｙが最も高かったことから、ＩＧＨＶ１−６９＊０１がＧｅｒｍｌｉｎｅであると判断した。
その結果より、ＩＧＨＶ１−６９＊０１と各クローンのＶＨアミノ酸配列の比較を行っている。”ＧｅｒｍｌｉｎｅとのＩｄｅｎｔｉｔｙ（％）ＦＲ１−ＦＲ３”は、ＩＧＨＶ１−６９＊０１のＦＲ１からＦＲ３までのアミノ酸配列とのＩｄｅｎｔｉｔｙを算出した。また、ＩＧＨＶ１−６９＊０１のアミノ酸配列と比較した結果、アミノ酸が異なる部分は、色を変えて強調してある。ただし、ＣＤＲ３およびＦＲ４に関しては、クローンの各配列間で異なるアミノ酸の色を変えて強調した。
（２）ＶＬアミノ酸配列
Ｆ０２２−３６０と同じＶＨアミノ酸配列を持つクローンは現在のところ１５個単離されているが、そのうち１２個のクローンのＶＬ配列をシークエンス解析したところ、７種類のＶＬが判明した。その結果、Ｆ０２２−３６０の持つＶＨ配列には、７種類のＶＨ−ＶＬの組み合わせがあることがわかった。その７種類のうち、グレーで強調してあるＶＬ配列が、Ｆ０２２−３６０の組み合わせである。それ以外のＶＨ配列を持つクローンに関しては、表記のクローンのＶＬ配列しか確認していないため、今のところ組み合わせとしては１種類のみしか確認できていない。また、Ｆ０２６−２４５のＶＬ配列は未確認である。
各ＶＬのアミノ酸配列のＧｅｒｍｌｉｎｅは、ＶＨ同様ＮＣＢＩのＩｇＢｌａｓｔで検索を行い、最もｉｄｅｎｔｉｔｙが高いものとした。いくつかの３種類のＧｅｒｍｌｉｎｅが検出されたため、ＩＧＬＶ１−４４＊０１を元にクローンの各配列を比較し、異なるアミノ酸は色を変えて強調してある。【００８１】
過去に報告のあったＨ１−Ｈ５を中和するクローンで、Ｇｅｒｍｌｉｎｅが１−６９である抗体と、Ｇｒｏｕｐ１１に属するクローンとのＶＨアミノ酸配列の比較
Ｈ１−Ｈ５両株を中和するヒト抗体は、過去に３報（正確には４報）の論文で報告されており、すべてのクローンのＧｅｒｍｌｉｎｅがＩＧＨＶ１−６９であったことから、これらクローンとＧｅｒｍｌｉｎｅ  ＩＧＨＶ１−６９＊０１およびＧｒｏｕｐ１１に分類されたクローンのアミノ酸配列の比較を行った（図５）。
ＩＧＨＶ１−６９＊０１と同じアミノ酸は、バーで示した。
また、各論文のＶｏｌｕｍｅおよびＰａｇｅは、以下のとおりである。
２００９  Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．：Ｖｏｌ．１６  ２６５−２７３
２００９  Ｓｃｉｅｎｃｅ：Ｖｏｌ．３２４  ２４６−２５１（２００８  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ：Ｖｏｌ．３  ｅ３９４２がクローン単離に関する論文である）
２００８  ＰＮＡＳ：Ｖｏｌ．１０５  ５９８６−５９９１【００８２】
Ｇｒｏｕｐ１１に属するクローンのＨ３Ｎ２インフルエンザウイルス株に対する結合活性
Ｇｒｏｕｐ１１に分類されるクローンの、スクリーニングに使用したＨ３株１２種類とＨ１株に対する結合活性を、ＥＬＩＳＡにより確認した。各ウイルス株に対するアッセイは２連で行い、平均値および標準偏差を計算した（図６）。【００８３】
Ｇｒｏｕｐ１１に属するクローンのウエスタンブロッティング
Ｇｒｏｕｐ１１に分類されるクローンがＨ３及びＨ１両株のＨＡを認識していることを示した実験である（図７）。
サンプルはすべて非還元の状態でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行っている。
図７の上半分はＦ０２２−３６０およびＦ０４５−０９２のデータ、図７の下半分のデータはＦ０２６−１４６およびＦ０２６−４２７のデータである。また左右の違いは、データを取り込む際の露光時間の違いである。
Ｆ０３２−０９３はＨ３株Ａ／ｋｉｔａｋｙｕｓｈｕ／１５９／９３のＨＡに対するｐｏｓｉｔｉｖｅコントロールであり、Ｆ０７８−１５５はＨ１株Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９のＨＡに対するｐｏｓｉｔｉｖｅコントロールである。【００８４】
Ｇｒｏｕｐ１１に属するクローンのＨＩ活性
Ｇｒｏｕｐ１１に分類されるクローンがＨＩ活性を持つかどうかの確認を行った（図８）。
ＨＩＵは抗体濃度１００μｇ／ｍｌから２倍ずつ希釈した時の希釈倍率で表記した。【００８５】
Ｆａｂ−ｐｐ型抗体による中和活性
Ｇｒｏｕｐ１１に分類されるクローンがＨ３およびＨ１インフルエンザウイルス株を中和するかどうかについて確認を行った（図９）。
２５０および１００μｇ／ｍｌのＦａｂ−ｐｐ型抗体を添加時のＦｏｃｕｓ形成阻害率を％Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎで表した。【００８６】
Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＥＬＩＳＡ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｃ１７９  ｂｙ  Ｆａｂ−ｐ３
インフルエンザＡソ連型ニューカレドニア株ワクチンを吸着させたイムノプレートに、同株を中和するマウスモノクローナル抗体Ｃ１７９を、Ｆａｂ−ｐ３抗体（Ｆ０２２−３６０，Ｆ０２６−１４６，Ｆ０２６−４２７，Ｆ０４５−０９２，Ｆ００５−１２６）の共存下および非共存下で反応させた（Ｆ００５−１２６はインフルエンザＡソ連型ニューカレドニア株ＨＡに反応しないネガティブコントロール）。次に、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ（ＭＢＬ社製）を反応させ、ＯＰＤで発色させてワクチンに結合したＣ１７９を検出した。
Ｆａｂ−ｐ３抗体（Ｆ０２２−３６０，Ｆ０２６−１４６，Ｆ０２６−４２７，Ｆ０４５−０９２，Ｆ００５−１２６）の共存下および非共存下でのＥＬＩＳＡの値に有意な差は認められなかった（図１０）。したがって、Ｃ１７９のワクチンに対する反応は、Ｆ０２２−３６０，Ｆ０２６−１４６，Ｆ０２６−４２７，Ｆ０４５−０９２によって阻害されないことがわかった。このことから、Ｃ１７９とＦ０２２−３６０，Ｆ０２６−１４６，Ｆ０２６−４２７，Ｆ０４５−０９２の認識エピトープは異なることが示唆された。【００８７】
Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＥＬＩＳＡ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｆａｂ−ｐ３  ｂｙ  Ｃ１７９
インフルエンザＡソ連型ニューカレドニア株ワクチンを吸着させたイムノプレートに、Ｆａｂ−ｐ３抗体（Ｆ０２２−３６０，Ｆ０２６−１４６，Ｆ０２６−４２７，Ｆ０４５−０９２，Ｆ００５−１２６）を、Ｃ１７９の共存下および非共存下で反応させた。次に、ウサギ抗ｐ３ポリクローナル抗体と反応させた後、ＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ（ＭＢＬ社製）を反応させ、ＯＰＤで発色させてワクチンに結合したＦａｂ−ｐ３抗体を検出した。
Ｃ１７９の共存下および非共存下でのＥＬＩＳＡの値に有意な差は認められなかった（図１１）。したがって、Ｆ０２２−３６０，Ｆ０２６−１４６，Ｆ０２６−４２７，Ｆ０４５−０９２のワクチンに対する反応は、Ｃ１７９によって阻害されないことがわかった。このことからも、Ｆ０２２−３６０，Ｆ０２６−１４６，Ｆ０２６−４２７，Ｆ０４５−０９２とＣ１７９の認識エピトープが異なることが示唆された。【００８８】
Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＥＬＩＳＡ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｆ００５−１２６  ｂｙ  Ｆａｂ−ｐ３
インフルエンザＡ香港型愛知株ワクチンを吸着させたイムノプレートに、Ｆａｂ−ＰＰ型モノクローナル抗体Ｆ００５−１２６を、Ｆａｂ−ｐ３抗体（Ｆ０２２−３６０，Ｆ０２６−１４６，Ｆ０２６−４２７，Ｆ０４５−０９２，Ｆ００５−１２６，Ｆ０１９−１０２）の共存下および非共存下で反応させた（Ｆ０１９−１０２はインフルエンザＡ香港型愛知株に反応しないネガティブコントロール）。次に、ＨＲＰ標識したウサギＩｇＧを反応させ、ＯＰＤで発色させてワクチンに結合したＦａｂ−ＰＰ型Ｆ００５−１２６を検出した。
Ｆ００５−１２６はインフルエンザＡソ連型ニューカレドニア株には反応しないが、インフルエンザＡ香港型の複数株に幅広く反応し、かつ中和する抗体である。Ｆ０２２−３６０，Ｆ０２６−１４６，Ｆ０２６−４２７，Ｆ０４５−０９２もインフルエンザＡ香港型の複数株に幅広く反応するため、認識するエピトープが近い可能性が考えられた。そこで、Ｆ００５−１２６との競合阻害実験を行った。Ｆａｂ−ｐ３抗体（Ｆ０２２−３６０，Ｆ０２６−１４６，Ｆ０２６−４２７，Ｆ０４５−０９２，Ｆ０１９−１０２）の共存下および非共存下（Ｎｏ  Ｆａｂ−ｐ３）での、Ｆａｂ−ＰＰ型Ｆ００５−１２６のインフルエンザＡ香港型愛知株ワクチンに対する反応性を調べた結果、ＥＬＩＳＡの値に有意な差は認められなかった（図１２）。ポジティブコントロールとして、Ｆａｂ−ｐ３型Ｆ００５−１２６を共存させた場合は、ＥＬＩＳＡの値が有意に減少した。したがって、Ｆ００５−１２６のワクチンに対する反応は、Ｆ０２２−３６０，Ｆ０２６−１４６，Ｆ０２６−４２７，Ｆ０４５−０９２によって阻害されないことがわかった。このことから、Ｆ００５−１２６とＦ０２２−３６０，Ｆ０２６−１４６，Ｆ０２６−４２７，Ｆ０４５−０９２の認識エピトープは異なることが示唆された。【００８９】
Ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｆ０２６−４２７  ａｎｄ  Ｆ０４５−０９２  ｗｉｔｈ  ＨＡ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｏｎ  ２９３Ｔ  ｃｅｌｌｓ
インフルエンザＡ香港型山梨株のＨＡ遺伝子を発現ベクターｐＮＯＷのクローニングサイトに挿入し、ｐＮＯＷ−Ｙａｍ７７ＨＡを作製した。ｐＮＯＷ−Ｙａｍ７７ＨＡとリポフェクトアミンＬＴＸを混合し、２９３Ｔ細胞に加えてトランスフェクションを行った。２４時間培養後、トランスフェクションした細胞を回収し、２．５％  ＢＳＡ−ＰＢＳ−０．０５％  Ｎａ−Ｎ３で４℃で３０分間ブロッキング後、Ｆａｂ−ｐ３抗体（Ｆ０２６−４２７，Ｆ０４５−０９２，Ｆ００８−０３８）と４℃で３０分間反応させた（Ｆ００８−０３８は山梨株ＨＡに反応しないネガティブコントロール）。次に、細胞をウサギ抗ｐ３ポリクローナル抗体と反応させた後、Ａｌｅｘａ４８８標識抗ウサギＩｇＧ（Ｐｉｅｒｃｅ社製）と反応させ、ＦＡＣＳ解析を行った。同様にして、ポジティブコントロールとして、細胞を抗インフルエンザＡ香港型マウスモノクローナル抗体Ｆ４９と反応させた後、Ａｌｅｘａ４８８標識抗マウスＩｇＧ（Ｐｉｅｒｃｅ社製）と反応させ、ＦＡＣＳ解析を行った。
インフルエンザＡ香港型山梨株ＨＡに反応しないネガティブコントロールＦ００８−０３８に比べて、Ｆ０２６−４２７，Ｆ０４５−０９２はＦＡＣＳのピークシフトが起こった（図１３）。したがって、Ｆ０２６−４２７，Ｆ０４５−０９２は山梨株ＨＡに対する抗体であると考えられた。【００９０】
完全型ヒトＩｇＧのインフルエンザウイルスに対する中和活性測定
［試料・試薬］
１．精製完全型ヒトＩｇＧ抗体
Ｆ０２６−４２７（Ｌｏｔ．１００６１４），Ｆ０４５−０９２（Ｌｏｔ．１００６１４）
２．ウイルス
以下のウイルス株を使用した。
Ｈｕｍａｎ  Ｈ３Ｎ２；Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／１９６８株，Ａ／Ｋｉｔａｋｙｕｓｙｕ／１５９／１９９３株
Ａｖｉａｎ  Ｈ３Ｎ８；Ａ／Ｂｕｄｇｅｒｉｇａｒ／Ａｉｃｈｉ／１／１９７７株
Ｐａｎｄｅｍｉｃ  Ｈ１Ｎ１；Ａ／Ｓｕｉｔａ／１／２００９ｐｄｍ株
Ｓｗｉｎｅ  Ｈ１Ｎ１；Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｈｏｋｋａｉｄｏ／２／１９８１株
Ｈｕｍａｎ  Ｈ１Ｎ１；Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９株
Ｈｕｍａｎ  Ｈ２Ｎ２；Ａ／Ｏｋｕｄａ／１９５７株
Ａｖｉａｎ  Ｈ２Ｎ２；Ａ／ｄｕｃｋ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／２７３／１９７８株
Ａｖｉａｎ  ｒｅａｓｓｏｒｔａｎｔ  Ｈ５Ｎ１；
Ａ／ｄｕｃｋ／Ｍｏｎｇｏｌｉａ／５４／２００１（Ｈ５Ｎ２）株ＨＡ  ｘ  Ａ／ｄｕｃｋ／Ｍｏｎｇｏｌｉａ／４７／２００１（Ｈ７Ｎ１）株ＮＡ  ｘ  Ａ／ｄｕｃｋ／Ｈｏｋｋａｉｄｏ／４９／９８（Ｈ９Ｎ２）株ｉｎｔｅｒｎａｌ
Ｈｕｍａｎ  Ｈ５Ｎ１；Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４株
Ｈｕｍａｎ  Ｈ５Ｎ１；Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／２００５株
Ｈｕｍａｎ  Ｈ５Ｎ１；Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５株
３．細胞・培地
ＭＤＣＫ細胞を１０％ＦＣＳ含ＭＥＭで継代し、中和試験およびウイルス感染後培養は、０．４％ＢＳＡ含ＦＣＳ不含ＭＥＭを使用した。
４．ＰＡＰ染色用試薬
Ｍｏｕｓｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｏ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ＮＰ（Ｃ４３）
Ｒａｂｂｉｔ  ａｎｔｉ  ｓｅｒｕｍ  ｔｏ  ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（ｗｈｏｌｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）  ｃａｐｐｅｌ  ５５４３６
Ｇｏａｔ  ａｎｔｉ  ｓｅｒｕｍ  ｔｏ  ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ（ｗｈｏｌｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）  ｃａｐｐｅｌ  ５５６０２
Ｒａｂｂｉｔ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ａｎｔｉ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＰＡＰ）  ｃａｐｐｅｌ  ５５９６８
３，３’−Ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎ  Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｃｈｒｏｒｉｄｅ  Ｓｉｇｍａ  Ｄ５６３７
過酸化水素  試薬特級  Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  １３−１９１０−５
［実験方法］
Ｆ０２６−４２７、Ｆ０４５−０９２の各クローンのＶＨおよびＶＬアミノ酸配列を有するヒトＩｇＧ抗体を作成し、中和活性試験に用いた。各精製ヒトＩｇＧ抗体溶液を０．４％ＢＳＡ含有ＭＥＭで２５０μｇ／ｍＬ、および１００μｇ／ｍＬに希釈し、さらに１００μｇ／ｍＬ溶液を原液として４倍段階希釈した。得られた各抗体希釈液に１００ＦＦＵに調整した各サブタイプのインフルエンザウイルス液を等量添加し、３７℃で１時間中和反応を行った。予め１０％ＦＣＳ含有ＭＥＭで継代培養しておいたＭＤＣＫ細胞を９６ｗｅｌｌプレートで単層培養し、ＰＢＳ（−）で洗浄した後、中和反応後の反応液を３０μＬ／ｗｅｌｌずつ添加した０．４％ＢＳＡ含有ＭＥＭで、３７℃で１時間ウイルスを吸着させた。中和反応液を除去し、ＰＢＳ（−）で１回洗浄した後、０．４％ＢＳＡ含有ＭＥＭを５０μＬ／ｗｅｌｌずつ添加し、ＣＯ２存在下３７℃で１６時間培養を行った。培養液を除去後、１００％エタノールで細胞を固定し、乾燥した。その後、酵素抗体法（ＰＡＰ法）により感染細胞を染色し、顕微鏡下で感染細胞数をカウントして感染抑制率を算出した。結果を図１４に示す。
Ｆ０２６−４２７は、ヒトＨ３Ｎ２株、鳥Ｈ３Ｎ８株、ヒトＨ１Ｎ１株、ヒトＨ２Ｎ２株、またわずかながらヒトＨ５Ｎ１株に対して中和活性を示した。一方、Ｆ０４５−０９２は、ヒトＨ３Ｎ２株、鳥Ｈ３Ｎ８株、ヒトＨ１Ｎ１株、ヒトおよび鳥Ｈ２Ｎ２株、また、弱いながらもヒトおよび鳥Ｈ５Ｎ１株に対しても中和活性を示した。以上の結果から、Ｆ０２６−４２７、Ｆ０４５−０９２は、一部を除きヒト由来株および鳥由来株に反応性を示し、ブタ由来株には反応性を示さないことが示唆された。【００９１】
Ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｆ０２６−４２７  ａｎｄ  Ｆ０４５−０９２  ｗｉｔｈ  ＨＡ０  ａｎｄ  ＨＡ１  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｏｎ  ２９３Ｔ  ｃｅｌｌｓ
インフルエンザＡ／Ｈ３Ｎ２型愛知株ＨＡ０およびＨＡ１遺伝子を発現ベクターｐＤｉｓｐｌａｙのクローニングサイトに挿入し、ｐＤｉｓｐ−Ａｉｃ６８ＨＡ０，ｐＤｉｓｐ−Ａｉｃ６８ＨＡ１を作製した。同様に、インフルエンザＡ／Ｈ３Ｎ２型福岡株ＨＡ０およびＨＡ１遺伝子を発現ベクターｐＤｉｓｐｌａｙのクローニングサイトに挿入し、ｐＤｉｓｐ−Ｆｕｋ８５ＨＡ０，ｐＤｉｓｐ−Ｆｕｋ８５ＨＡ１を作製した。これらの４種類のプラスミドとリポフェクトアミンＬＴＸをそれぞれ混合し、２９３Ｔ細胞に加えてトランスフェクションを行った。ネガティブコントロールとしてプラスミド無しで、リポフェクトアミンＬＴＸのみを２９３Ｔに加えたものも用意した（Ｍｏｃｋ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）。２４時間培養後、トランスフェクションした細胞を回収し、２．５％  ＢＳＡ−ＰＢＳ−０．０５％  Ｎａ−Ｎ３で４℃で３０分間ブロッキング後、Ｆａｂ−ＰＰ抗体（Ｆ０２６−４２７ＰＰ，Ｆ０４５−０９２ＰＰ）、抗インフルエンザＡ／Ｈ３Ｎ２型抗体Ｆ４９、ウサギ抗Ｖ５タグ抗体と４℃で３０分間反応させた。ポジティブコントロールとして、抗インフルエンザＡ／Ｈ３Ｎ２型愛知株Ｆａｂ−ＰＰ抗体Ｆ００３−１３７ＰＰを、ｐＤｉｓｐ−Ａｉｃ６８ＨＡ０およびｐＤｉｓｐ−Ａｉｃ６８ＨＡ１をトランスフェクションした細胞およびＭｏｃｋ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎの細胞と４℃で３０分間反応させた。同様に、ポジティブコントロールとして、インフルエンザＡ／Ｈ３Ｎ２型福岡株Ｆａｂ−ＰＰ抗体Ｆ０１９−１０２ＰＰを、ｐＤｉｓｐ−Ｆｕｋ８５ＨＡ０およびｐＤｉｓｐ−Ｆｕｋ８５ＨＡ１をトランスフェクションした細胞およびＭｏｃｋ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎの細胞と４℃で３０分間反応させた。次に、Ｆａｂ−ＰＰ抗体と反応させた細胞をＡｌｅｘａ４８８標識抗ヒトＩｇＧ（Ｐｉｅｒｃｅ社製）と、Ｆ４９と反応させた細胞をＡｌｅｘａ４８８標識抗マウスＩｇＧ（Ｐｉｅｒｃｅ社製）と、ウサギ抗Ｖ５タグ抗体と反応させた細胞をＡｌｅｘａ４８８標識抗ウサギＩｇＧ（Ｐｉｅｒｃｅ社製）とそれぞれ反応させ、ＦＡＣＳ解析を行った。
Ｆ０４５−０９２ＰＰは、ＨＡが発現していないコントロールのＭｏｃｋ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎの細胞に比べて、インフルエンザＡ／Ｈ３Ｎ２型愛知株ＨＡ０，ＨＡ１およびインフルエンザＡ／Ｈ３Ｎ２型福岡株ＨＡ０，ＨＡ１発現細胞に反応してＦＡＣＳでピークシフトが起こった（図１５−１）。Ｆ０２６−４２７ＰＰは、ＨＡが発現していないコントロールのＭｏｃｋ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎの細胞に比べて、インフルエンザＡ／Ｈ３Ｎ２型愛知株ＨＡ０，ＨＡ１発現細胞に弱いながら反応してＦＡＣＳでピークシフトが起こった（図１５−２）。Ｖ５タグ抗体はＨＡ０，ＨＡ１の発現を確認する抗体であり、いずれのＨＡ０，ＨＡ１発現細胞でも十分に発現していることを示している。Ｆ００４−１３７ＰＰ，Ｆ０１９−１０２ＰＰもそれぞれＨＡ０，ＨＡ１に十分反応している。Ｆ４９はＨＡ０には反応したがＨＡ１には反応しなかった。
Ｆ０２６−４２７，Ｆ０４５−０９２がＨＡ１に反応していることから、これらの抗体が認識するエピトープは、ＨＡ１分子上に存在すると考えられ、Ｆ０２６−４２７，Ｆ０４５−０９２と同様に幅広い株特異性を持つＦ４９とは認識エピトープが異なると考えられた。近年報告されてきた株特異性の広いＶＨ１−６９ジャームライン由来の抗体の認識エピトープは、主にＨＡ２領域であり、フュージョン活性を阻害することにより中和活性を有すると考えられている。しかし、ＶＨ１−６９ジャームライン由来の記載のＦ０２６−４２７，Ｆ０４５−０９２の認識エピトープはＨＡ１領域であり、図８で明らかなように、ＨＩ活性を有することにより中和活性を示すと考えられる。このような性質を示す抗体は前例がなく、全く新規の性質を持つ抗体である。さらに、図１６で明らかなように、Ｆ０２６−４２７，Ｆ０４５−０９２の認識エピトープは、エピトープＢ近傍であると考えられた。【００９２】
Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＥＬＩＳＡ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｂｙ  Ｆ００４−１０４
インフルエンザＡ／Ｈ３Ｎ２型パナマ株ワクチンを吸着させたイムノプレートに、Ｆａｂ−ｐ３型モノクローナル抗体Ｆ０２６−４２７ｐ３，Ｆ０４５−０９２ｐ３，Ｆ００４−１０４ｐ３およびマウス由来抗インフルエンザＡ／Ｈ３Ｎ２型抗体Ｆ４９を、ＩｇＧ抗体（Ｆ０２６−４２７ＩｇＧ，Ｆ０４５−０９２ＩｇＧ，Ｆ００４−１０４ＩｇＧ）の共存下および非共存下（Ｎｏ  ＩｇＧ）で反応させた。次に、ワクチンに結合したＦａｂ−ｐ３抗体を検出するために、ウサギ由来抗ｐ３抗体を反応させた後、ＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体を反応させ、ＯＰＤで発色させた。また、Ｆ４９を検出するために、ＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体を反応させ、ＯＰＤで発色させた。結果を図１６に示す。
同じ種類の抗体どうしのＥＬＩＳＡ活性の阻害はすべて有意に認められた。Ｆ０４５−０９２ＩｇＧ，Ｆ００４−１０４ＩｇＧは、Ｆ０２６−４２７ｐ３，Ｆ０４５−０９２ｐ３，Ｆ００４−１０４ｐ３のＥＬＩＳＡ活性をすべて阻害した。また、Ｆ０２６−４２７ＩｇＧはＦ００４−１０４ｐ３のＥＬＩＳＡ活性を阻害した。一方、Ｆ０２６−４２７ＩｇＧはＦ０４５−０９２ｐ３を有意に阻害しなかったが、これはＦ０４５−０９２の結合活性がＦ０２６−４２７の結合活性に比べて非常に強いためだと考えられた。Ｆ４９は、用いたＩｇＧ抗体による有意なＥＬＩＳＡ活性の阻害は認められなかった。
Ｆ００４−１０４はエスケープミュータント解析の結果、ＨＡ１分子上の１５９番目および１９０番目のアミノ酸配列近傍が認識エピトープであることが明らかになっている抗体である（図１７−１、図１７−２）。競合ＥＬＩＳＡの結果から、Ｆ０２６−４２７，Ｆ０４５−０９２の認識エピトープは、Ｆ００４−１０４の認識エピトープに近いと考えられた。従って、Ｆ０２６−４２７，Ｆ０４５−０９２の認識エピトープは、ＨＡ１分子上の１５９番目および１９０番目のアミノ酸配列近傍であると推測された。【００９３】
Ｆ０４５−０９２、Ｆ０２６−４２７の１３６番アミノ酸変異体に対する反応性
Ａｉｃ６８株ＨＡの１３６番目のセリン残基をスレオニン（変異体Ａｉｃ６８Ｓ１３６Ｔ）あるいはアラニン（変異体Ａｉｃ６８Ｓ１３６Ａ）に変換した変異ＨＡを作製した。これらの変異体と野生型Ａｉｃ６８株Ａｉｃ６８ｗｔを２９３Ｔ細胞上に発現させ、Ｆ０２６−４２７、Ｆ０４５−０９２、Ｆ００３−１３７、Ｆ０３５−０１５、Ｆ０３３−０３８と反応させた後、フローサイトメトリー解析により反応性を調べた。結果を図１８に示す。
その結果、Ｆ０３５−０１５、Ｆ０３３−０３８は２つの変異体に対して反応性が変化しなかった。Ｆ０４５−０９２のＡｉｃ６８Ｓ１３６Ｔに対する反応性は、Ａｉｃ６８ｗｔに対するよりも少し弱くなっていた。Ｆ０４５−０９２のＡｉｃ６８Ｓ１３６Ａに対する反応性は更に弱くなっていた。１３６番目のセリン残基の変異がＦ０４５−０９２によるＨＡの認識に影響を及ぼしていることから、１３６番目の残基がＦ０４５−０９２のＨＡ認識エピトープ、もしくはその近傍にあるアミノ酸であることが推測された。【００９４】
ＦＣＭ  ａｎａｌｙｓｅｓ  ｏｆ  Ｆ０４５−０９２  ｆｏｒ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ＨＡ  １３３Ａ  ａｎｄ  １４２Ａ
Ａｉｃ６８株ＨＡの１４２−１４６番目のアミノ酸配列に、Ｗｙｏ０３株ＨＡの１４２−１４６番目のアミノ酸配列を移植してキメラＨＡ（Ａｉｃ６８＿１４２Ａ）を作製した。これとは逆に、Ｗｙｏ０３株ＨＡの１４２−１４６番目のアミノ酸配列に、Ａｉｃ６８株ＨＡの１４２−１４６番目のアミノ酸配列を移植してキメラＨＡ（Ｗｙｏ０３＿１４２Ａ）を作製した。一方、Ｆｕｋ８５株ＨＡの１４２−１４６番目のアミノ酸配列に、Ａｉｃ６８株ＨＡの１４２−１４６番目のアミノ酸配列を移植してキメラＨＡ（Ｆｕｋ８５＿１４２Ａ）を作製した。更に、Ｆｕｋ８５株ＨＡの１３３−１３７番目のアミノ酸配列に、Ｗｙｏ０３株ＨＡの１３３−１３７番目のアミノ酸配列を移植してキメラＨＡ（Ｆｕｋ８５＿１３３Ａ）を作製した。これらの変異体と野生型Ａｉｃ６８株ＨＡ（Ａｉｃ６８＿Ｗｉｌｄ）、野生型Ｗｙｏ０３株ＨＡ（Ｗｙｏ０３＿Ｗｉｌｄ）、野生型Ｆｕｋ８５株ＨＡ（Ｆｕｋ８５＿Ｗｉｌｄ）を２９３Ｔ細胞上に発現させ、Ｆ０４５−０９２と反応させた後、フローサイトメトリー解析により反応性を調べた（ＥＭＡＣ法［ｅｐｉｔｏｐｅ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｈｉｍａｅｒａｓ］；Ｏｋａｄａ  ｅｔ  ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．９２，３２６−３３５，２０１１）。結果を図１９および図２０に示す。
Ｆ０４５−０９２は、Ａｉｃ６８＿Ｗｉｌｄに対して十分強い反応性を示すが、Ｗｙｏ０３株の１４２−１４６番目のアミノ酸配列を移植したキメラＡｉｃ６８＿１４２Ａにはほとんど反応しなかった。逆に、Ｆ０４５−０９２は、Ｗｙｏ０３＿Ｗｉｌｄに対してほとんど反応性を示さないが、Ａｉｃ６８株の１４２−１４６番目のアミノ酸配列を移植したキメラＷｙｏ０３＿１４２Ａには十分強く反応した。このことから、Ｗｙｏ０３株の１４２−１４６番目のアミノ酸配列が、Ｆ０４５−０９２によるＨＡの認識を阻害することがわかった。Ｗｙｏ０３株の１４２−１４６番目のアミノ酸配列には、比較的分子量の大きいアミノ酸残基が多く、抗体がＨＡに結合する際に立体障害を引き起こす可能性が考えられた。一方、Ｆ０４５−０９２は、Ｆｕｋ８５＿Ｗｉｌｄに対して非常に弱く反応するが、Ｗｙｏ０３株ＨＡの１３３−１３７番目のアミノ酸配列を移植したキメラＦｕｋ８５＿１３３Ａに対して強く反応する。Ｆ０４５−０９２がＨＡを認識するためには、１３３−１３７番目のアミノ酸配列は、Ｆｕｋ８５株タイプより、Ｗｙｏ０３株タイプの方が好ましいと考えられた。従って、１３３−１３７番目のアミノ酸配列がＦ０４５−０９２の認識エピトープ、もしくは近傍にあることが推測された。【００９５】
競合実験に使用した抗ＨＡ抗体のＨＡ１抗原認識部位
プロテインデータバンクよりＨ３のＨＡタンパクＸ線結晶構造解析ファイル（１ＨＡ０）をダウンロードし、Ｒａｓｍｏｌ  ２．７．５のソフトでＨＡ１領域の９１−２６０アミノ酸部分の３次元構造を構築した（図２１）。ＥＭＡＣ法に従い、各Ｈ３Ｎ２抗体の各Ｈ３Ｎ２インフルエンザウイルスに対する抗原認識部位を予め推測した。例えば、Ｆ０３３−０３８は、Ａｉｃ６８株ＨＡに対してＡ領域およびＢ領域が抗原認識部位であると判断された。【００９６】
ＨＡ１のサイトＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅに結合する抗ＨＡ抗体とＦ０４５−０９２抗体との競合実験
ＥＭＡＣ法により、認識する抗原部位の判明している抗ＨＡ抗体（Ｆ０４１−３４２、Ｆ０４１−３６０、Ｆ０１９−１０２、Ｆ００４−１１１、Ｆ０３３−０３８、Ｆ０１０−０７３、Ｆ０１０−０１４、Ｆ００４−１３６、Ｆ０１０−０７７、Ｆ００８−０５５、Ｆ００８−０３８、Ｆ００８−０４６、Ｆ０１０−０３２、Ｆ０３５−０１５、Ｆ０３７−１１５、Ｆ００４−１０４、Ｆ００３−１３７）と、Ｆ０４５−０９２抗体との競合ＥＬＩＳＡを行った。結果を図２２に示す。
各抗ＨＡ抗体のＦａｂ−ｐｐおよびＦａｂ−ｃｐ３型を調製し、ｐｐ型抗体とともにｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒとしてｃｐ３型抗体を入れて抗原上で競合させた後、ｐｐ型抗体の抗原に対する結合活性を測定した。具体的には、ホルマリンにより不活性化したＨ３Ｎ２ウイルス株をイムノプレートにコーティングし、５％  ＢＳＡでブロッキングした。至適濃度のＦａｂ−ｐｐ抗体と、２０μｇ／ｍｌのＦ０４５−０９２のｃｐ３型抗体、または、大腸菌培養上清を２０倍濃縮したＦａｂ−ｃｐ３型抗体を５０μｌずつ混ぜ、ブロッキングの終了したイムノプレートに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで洗浄後、抗原に結合したｐｐ型抗体を検出するためｒａｂｂｉｔ  ａｎｔｉ−ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  −ＨＲＰ抗体を添加し、さらに３７℃で１時間インキュベートした。プレート洗浄後、ＨＲＰの基質であるＯＰＤを添加して２０分反応させた後、２Ｎ  硫酸で反応を止め、４９２ｎｍの波長でサンプルのＯＤを測定した。
使用したＨ３Ｎ２型ウイルス株は以下の通りである。
Ａｉｃ６８：Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／６８
Ｙａｍ７７：Ａ／Ｙａｍａｎａｓｈｉ／２／７７
Ｓｙｄ９７：Ａ／Ｓｙｄｎｅｙ／５／９７
Ｐａｎ９９：Ａ／Ｐａｎａｍａ／２００７／９９
Ｆ０４５−０９２抗体は、サイトＣを認識するＦ０４１−３４２，Ｆ０４１−３６０、サイトＥを認識するＦ０１９−１０２、ＣとＥ両サイトを認識するＦ００４−１１１抗体とは全く競合せず、ＣおよびＥのサイトには結合していないと考えられた。一方、サイトＡ，Ｂをともに認識する抗ＨＡ抗体（Ｆ０３３−０３８、Ｆ０１０−０７３、Ｆ０１０−０１４、Ｆ００４−１３６、Ｆ０１０−０７７）は、Ｆ０４５−０９２と非常によく競合していた。レセプター結合領域の周りにあるサイトＡのみを認識する抗体（Ｆ０３５−０１５）、サイトＢのみを認識する抗体（Ｆ００８−０５５、Ｆ００８−０３８、Ｆ００８−０４６、Ｆ０１０−０３２、Ｆ０３７−１１５、Ｆ００４−１０４）、サイトＢ２／Ｄを認識する抗体（Ｆ００３−１３７）とは、Ｆ００８−０３８以外の抗体は、Ｆ０４５−０９２抗体と競合はするもののＡ，Ｂ両サイトを認識する抗体ほどの競合結果は得られなかった。Ｆ０４５−０９２抗体は、サイトＡ、Ｂおよび、その間にありウイルスの型を超えてアミノ酸の保存度の高いレセプター結合領域のあたりを認識している可能性が示唆された。このことは、Ｆ０４５−０９２がＨＩ活性を示したこととも一致している。
【産業上の利用可能性】
【００９７】
本発明により、全サブタイプのインフルエンザウイルスに対して中和活性を有するヒト抗体をスクリーニングすることができる。また、本発明により、予め被験者がインフルエンザウイルスに対して抗体を有しているか否かについても評価することができる。人類にとって、新型ウイルスによるパンデミックをいかに阻止するか、たとえ起こったとしても感染拡大をいかに防ぐか、そして真に有効なワクチンを開発して多くのヒトに接種できるまでの時間をいかに稼ぐか、その方法の開発が重要な課題である。現在実施されている対策は、世界的なウイルスモニタリング体制整備、タミフル等の治療薬の大量備蓄、ワクチンに開発・製造・備蓄であるが、新型ウイルスがどのような形をして登場するかは、実際に起こるまではわからない。本発明は、新しい有力な解決策のひとつであり、保健医療への貢献は莫大である。
本出願は、米国仮特許出願番号６１／３８０，０５１および６１／４５２，７８５、ならびに米国非仮特許出願番号１３／１９８，１４７を基礎としており、その内容はすべて本明細書に包含されるものとする。
［配列表］
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【図３】
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【図８】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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