(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウェルプレート(well plate)各々のウェルを一度に撮影できるビーム直径を有する光源を顕微鏡に誘導するレンズ(lens)、ミラー(mirror)、ピンホール(pinhole)で構成された励起モジュールと、
試料のポイント位置をｘ軸またはｙ軸方向に移動させることにより試料の位置変化を制御するモーションコントローラ(motion controller)、前記光源から試料を励起して前記試料から散乱した光のラマン波長の光をフィルターリングする単数または複数のラマンフィルター、及び前記ラマンフィルターを通過した光を順次に受けて無スキャン方式で検出するＣＣＤ(Charge-coupled device)カメラを含む、試料の像を獲得する顕微鏡モジュールと、
前記モーションコントローラによって位置したポイントで獲得された単数または複数の像をカラーコーディングして細胞または生体組織の映像に変換して変換した映像を表示する映像処理モジュール、及び
試料に存在する一つ以上の分析物に各々選択的に結合する一つ以上のコア−ギャップ−シェルナノ粒子が貯蔵された貯蔵チャンバーと
を含み、
前記無スキャン方式で検出するＣＣＤ(Charge-coupled device)カメラは、試料を盛るウェルプレートの各々のウェルを個別的に一度に撮影し、モーションコントローラの制御を通じて他のウェルに移動することを特徴とし、
前記コア−ギャップ−シェルナノ粒子は、表面プラズモン共鳴を示す金属からなるコア(core)及び前記コアを取り囲んだ表面プラズモン共鳴を示す金属からなるシェル(shell)を含み、前記コアと前記シェルとの間にナノギャップ(nanogap)が形成され、前記コアおよび前記シェルが、ナノブリッジ(nanobridge)で連結されているか、または連結されていないナノ粒子で、前記ナノギャップには、光学活性分子が含まれることを特徴とし、
前記光学活性分子が、Ｃ、Ｈ、Ｏ、Ｎ、Ｓ及びそれらの組み合わせからなる群から選択される原子で構成された分子であることを特徴とし、
前記光学活性分子が、ＤＮＡストランドにより改質されていることを特徴とする、
表面増強ラマン散乱を用いた多重薬物高速スクリーニング装置。
【請求項２】
前記光源が、４００ないし７００ｎｍの波長を有することを特徴とする、請求項１に記載の表面増強ラマン散乱を用いた多重薬物高速スクリーニング装置。
【請求項３】
前記ラマンフィルターの数が、１以上２０以下であることを特徴とする、請求項１に記載の表面増強ラマン散乱を用いた多重薬物高速スクリーニング装置。
【請求項４】
前記カラーコーディングのために獲得される像の数が、１以上２０以下であることを特徴とする、請求項１に記載の表面増強ラマン散乱を用いた多重薬物高速スクリーニング装置。
【請求項５】
前記試料が、細胞であることを特徴とする、請求項１に記載の表面増強ラマン散乱を用いた多重薬物高速スクリーニング装置。
【請求項６】
前記細胞が、コア−ギャップ−シェルナノ粒子と選択的に結合してイメージングされることを特徴とする、請求項５に記載の表面増強ラマン散乱を用いた多重薬物高速スクリーニング装置。
【請求項７】
コア−ギャップ−シェルナノ粒子を試料を盛ったウェルプレートの各ウェルに添加する工程(工程１)と、
レーザービームを試料に照射して前記試料に結合されたコア−ギャップ−シェルナノ粒子から得られる特定ラマン散乱光を単数または複数のラマンフィルターを通じて無スキャン方式で検出するＣＣＤ(Charge-coupled device)カメラで検出して単数または複数の試料の像を獲得する工程(工程２)と、
前記工程２で得た単数または複数の試料の像をコンピュータープログラムでカラーコーディングして細胞または生体組織の映像に変換して変換した映像を表示する工程(工程３)と
を含み、
前記工程２のレーザービームは、ウェルプレートの各々のウェルを一度に撮影できるビーム直径を有することを特徴とし、
前記工程２の無スキャン方式で検出するＣＣＤ(Charge-coupled device)カメラは、試料を盛るウェルプレートの各々のウェルを個別的に一度に撮影し、モーションコントローラの制御を通じて他のウェルに移動することを特徴とし、
前記工程１のコア−ギャップ−シェルナノ粒子は、表面プラズモン共鳴を示す金属からなるコア(core)及び前記コアを取り囲んだ表面プラズモン共鳴を示す金属からなるシェル(shell)を含み、前記コアと前記シェルとの間にナノギャップ(nanogap)が形成され、前記コアおよび前記シェルが、ナノブリッジ(nanobridge)で連結されているか、または連結されていないナノ粒子で、前記ナノギャップには、光学活性分子が含まれ、前記光学活性分子が、Ｃ、Ｈ、Ｏ、Ｎ、Ｓ及びそれらの組み合わせからなる群から選択される原子で構成された分子であり、前記光学活性分子が、ＤＮＡストランドにより改質されていることを特徴とする、
表面増強ラマン散乱を用いた多重薬物高速スクリーニング方法。
【請求項８】
前記ラマンフィルターの数が、１以上２０以下であることを特徴とする、請求項７に記載の表面増強ラマン散乱を用いた多重薬物高速スクリーニング方法。
【請求項９】
前記工程３では、前記工程２で得た試料の像をラマンピークによってコンピューターを通じて特定色でカラーコーディングすることにより、１カラー以上２０カラー以下の多重度を有する映像を表示することを特徴とする、請求項７に記載の表面増強ラマン散乱を用いた多重薬物高速スクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラマン分析基盤高速多重薬物高速スクリーニング装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
新薬開発は、一般的に１０年以上の長い期間と８億ドル以上のおびただしい資本が投入される先進国型の戦略的開発過程である。さらにそれを行なうためには、多くの社会的インフラが必要とされる。
【０００３】
新薬開発過程は、大きく分けて基礎研究による作用点導出及び選定、化合物スクリーニングによる有効物質及び先導物質選定、候補物質の確定、前臨床／第１相臨床の臨床化研究過程、第２、３相臨床の商品化過程がある。
【０００４】
現在約３５，０００個の遺伝子作用点の中で、実際に新薬研究の対象に用いられているのは約５００種で、ゲノムプロジェクト以後その対象が継続して増加している。一旦作用点が選定されると最も相応しくて有効性があるスクリーニング方法が開発されなければならない。スクリーニング方法は、一般的に試験管で行なうインビトロアッセイ方法と実際に細胞を対象とするセルベースアッセイ方法に区分することができる。このようなスクリーニングの対象になる化合物は、巨大製薬会社の場合、少なくても数万種で多い時は数百万種で、それらすべてがスクリーニングの初期過程から用いられたりする。
【０００５】
このようなスクリーニング過程は、おびただしい費用が必要となるのでスクリーニング方法を効率的に設計して短時間に多数の化合物をスクリーニングすることができるように、諸般の装備と試薬などを高速化及び最小化しようとする努力が必要である。
【０００６】
多数の化合物をスクリーニングする過程は、技術的に容易で再現性が高くなければならない。作用点が酵素の場合は、すでによく確立されたスクリーニング方法と試薬が多いので比較的容易に行なうことが可能である。しかし、多くの細胞内過程がタンパク質間の相互作用に起因するため、タンパク質相互作用に基づいたスクリーニングは、新薬先導物質発掘のための分析方法の中で最も効率性が高い方法であり、その大切さが強調される理由は、第一に生体内でタンパク質は他のタンパク質との結合を通じて機能を示し、第二に遺伝子及びタンパク質発現の変化、細胞内位置の変化、翻訳後修飾を通じた構造の変化はタンパク質結合の変化を誘導し、第三に窮極的に細胞内で起きる代謝及び信号伝達過程の活性、制御の変化を招来し、第四に遺伝子変異（mutation）によるタンパク質相互作用の異常は疾病と直結するという点である。このようなタンパク質間の相互作用を測定するための技術としては、ＦＲＥＴ（FluorescenceResonance Energy Transfer）、ＢＲＥＴ（Bioluminescence Resonance Energy Transfer）そしてＦＰ（Fluorescence Polarization）などの技法が開発され、容易に測定することができる装備も多く開発された。最近では、自動化された顕微鏡装備を用いたＨＣＳ（High-content Screening）技法が導入されているが、９６ウェル、３８４ウェルプレートなどに細胞を培養した後、化合物を処理することによって細胞内タンパク質の量的変化と移動と係わった多くの現象を迅速かつ定量的な方法で測定することができるようになった。このようなＨＣＳ技法は、既存の酵素測定方法やリポーターシステムが提供する酵素活性度、プロモーターの強度、タンパク質の増減などの単純な情報以上にタンパク質の相互作用やＣａ＋＋ｉｎｆｌｕｘのような従来の方法で、大規模スクリーニングが難しかった生理的現象さえ測定することができるようになり、現在巨大製薬会社や研究所で活用中にある。
【０００７】
薬効スクリーニングの通常的な作業過程は、化合物の分注、希釈、スクリーニング成分混合、培養及び検出、スクリーニングデータの分析及び結果報告で構成され、この一連の過程を迅速かつ効率的に処理するために小型化及び自動化された高速多重スクリーニング（High Throughput Screening,以下ＨＴＳ）システムを活用している。通常先進製薬会社の場合、現在数百万種の化合物ライブラリを保有していて、新規作用点導出時ごとにＨＴＳ施設を活用して全体化合物に対する生物活性データを確保している。今後導出される数千種の新薬作用点に対して、保有ライブラリをより迅速かつ効率的にスクリーニングするためには、ＱＣ機能、重複したデータに対する間違い検査、相対的活性（％Activity）の計算及びＩＣ５０、Ｋｉ、Ｋｍのような生化学的数値を算出するためのカーブフィッティング（curve-fitting）道具を提供しなければならない。それのためには、一度のスクリーニングを通じて多くのデータを得ることができるＨＴＳが必要なのである。この新技術の基本概念は、伝統的な方式から脱して実験室自動化を通じて無作為の合成化合物を大量に、速かに効能を評価することで、新物質合成自動化（ＣＣＬ）、分子設計及び体系的情報管理と連係して新薬開発候補物質導出のための所要時間を最小限に縮めることができる。
【０００８】
一日に１万種以上の化合物に対するスクリーニングが可能なＨＴＳ技術のためには、さまざまな前提要件が必要であり、それを要約すると下記のようになる。
【０００９】
（１）迅速性：迅速なスクリーニングは一日にスクリーニングすることができる化合物の数を増加させることで、結果的に短時間にスクリーニング過程を終了させてそれにより経費を節減することが可能になる。
【００１０】
（２）スクリーニング経費：スクリーニングに用いられる試薬は、全体スクリーニング過程で必要となる経費の中で非常に大きな部分を占めるので、少しでもより経済的なスクリーニング方法を考案しなければならない。
【００１１】
（３）小型化：小型化は試薬経費を節減させることができる最も良い方法であるのみならず、スクリーニングの所要時間を短縮することができる方法である。そして、実験室の空間を減らすことができる。
【００１２】
（４）自動化：自動化はスクリーニングの速度を高めるだけでなく、結果の再現性も向上させることができる。特に、３８４ウェルや１５３６ウェルマイクロプレートを用いたスクリーニング過程で、実験者間の誤差を減らすためには自動化が必要である。
【００１３】
（５）スクリーニング感度：検出方法の感度は、使用されるサンプルの量と直接的に係る。感度が低いサンプルをスクリーニングするためにはより多くの時間が必要とされるので、検出感度が高くなければならない。
【００１４】
（６）非放射能方法：現在までＨＴＳ方法の中で約５０％が放射能物質を使用する。しかし、放射能物質は特別な管理が求められる廃棄物を発生させ時間的、空間的、費用的な面で非経済的である。
【００１５】
（７）単純化：ろ過、分離、洗浄、消滅、固体状態を要求する方法は、追加的な経費と工程を必要とするので、スクリーニング過程は液体状態で最大限単純化しなければならない。
【００１６】
製薬会社は、今まで化合物の化学的アプローチ方法と既存のＨＴＳ技術に莫大な投資をしてきて、結果的に新薬候補物質の数が急激に増加し、このように発掘された候補物質は１次スクリーニング過程（標的発掘及び検証、候補物質発掘）より収率が低い２次スクリーニング過程（候補物質最適化）を経なければならない。１次と２次スクリーニング過程の効率差異は、新薬開発過程で深刻なボトルネック現象を招来するようになる。したがって、経済的な費用支出を通じて２次スクリーニングで発生するデータの品質をある程度水準以上に維持しながらも効率を高めて、１次スクリーニング過程との調和を合わせることが新薬開発過程で主な挑戦課題となった。
【００１７】
ハイコンテントスクリーニング（ＨＣＳ）は、「生きている細胞内の多様な標的を時間的、空間的に分解能が高い高感度蛍光映像を基にして複合的かつ機能的にスクリーニングする技術」と定義することができる。ＨＣＳの根幹になる技術は、細胞を基盤とする分析法、時間及び空間的に高分解能を有する蛍光測定を通じたリアルタイム生体細胞イメージング、高速及びハイコンテント自動化分析法などの詳細技術からなり、このようなＨＣＳ分析装備としては、代表的に図１のパーキンエルマー社のオペラシステムを挙げることができる。
【００１８】
前記オペラシステムという装備で得ることができる典型的な細胞分析データは、図２に示したとおりである。まず一フィールド内で数十個の群集した細胞群をイメージで得て、その中で細胞核、細胞壁などの部分を区分して示す。その過程で一部分の細胞はプログラム上のイメージから除去して有意な細胞イメージのみを残しておいた後、最終的に図２に示したように２カラーイメージを得るようになる。
【００１９】
しかし、今までハイコンテントスクリーニング方法は蛍光分析を基盤にしていて、前記蛍光分析に使用される蛍光標識物質は時間が経つにつれて蛍光強度が弱くなり（ｐhotobleaching）、活性させる光の波長が非常に狭くて発光する光の波長が非常に広くて互いに異なる蛍光物質間に干渉が起きる短所を有している。また、使用することができる蛍光物質の数が極めて制限されている。
【００２０】
したがって、効果的な高速薬物スクリーニングのために、物質間に干渉がなく、スペクトルのピークがシャープで多重検出が可能な新しい方法が求められている。
【００２１】
一方、最近はラマン分光学が関心を集めている。
【００２２】
その中でも、表面増強ラマン散乱法（Surface Enhanced Raman Scattering,ＳＥＲＳ）は、金、銀などの金属ナノ構造の荒い表面に分子が吸着する時、ラマン散乱の強度が１０６〜１０８倍以上急激に増加する現象を用いた分光法である。光を有形媒質に通過させる場合、ある程度の量は固有方向から逸脱するが、このような現象はラマン散乱として知られている。散乱した光の中で一部が光の吸収及び電子の高いエネルギー準位に励起するにことによって固有の刺激された光と振動数が相異して、ラマン放出スペクトルの波長はサンプル内の光吸収分子の化学組成及び構造特性を示すので、ラマン分光法は現在とても早い速度で発展しているナノ技術と結合して、ただ一つの分子を直接測定することができる高感度の技術に発展可能であり、特にメディカルセンサーとして緊要に使用することができるので多くの期待を集めている。この表面増強ラマン分光法（ＳＥＲＳ）効果は、プラズモン共鳴の現象と係わって、ここで金属ナノ粒子は金属内の電導電子の集団カップリングによって入射電磁気放射線に応答して明確な光学的共鳴を示すので、本質的に金、銀、銅及び他の特定金属のナノ粒子は、電磁気放射線の集中化効果を向上させる小型アンテナとして作用することができる。このような粒子近くに位置した分子は、ラマン分光法分析に対してずっと大きな感度を示す。
【００２３】
したがって、ＳＥＲＳセンサーを用いて多様な疾病と関連した遺伝子、タンパク質（バイオマーカー）の早期診断を行なおうとする研究が活発に進行されている。ラマン分光法は、他の分析法（赤外線分光法）方法とは異なり様々な長所を有している。赤外線分光法は、分子の双極子モーメントの変化がある分子の場合、強い信号を得ることができる一方、ラマン分光法は分子の誘導偏極率変化がある非極性分子の場合にも強い信号を得ることができるので、ほとんどすべての有機分子が固有のラマンシフト（Raman Shift,ｃｍ−１）を有している。また水分子による干渉の影響を受けないので、タンパク質、遺伝子などの生体分子（biomolecules）の検出により相応しい。しかし、長年の研究にもかかわらず、信号強度が低いことから実用化される水準に至ることはできなかった。
【００２４】
それで、本発明者らは前記ラマン分光学を用いた高速多重薬物高速スクリーニング装置を開発するために研究中、ラマン信号増幅の効果を示すだけでなく、高い再現性によって商用化に非常に重要な前提条件である信号の再現性と定量性問題を克服することができる、コアとシェルを含み、コアとシェルの間にナノギャップが形成されているナノ粒子を製造して、前記ナノ粒子のシェルの表面に検出しようとする分析物を認識することができるバイオ分子を機能化して一つ以上の分析物を含むサンプルに露出させた後、レーザー励起（excitation）及び多重ラマンフィルターと検出器を用いて単数または複数のラマンピークを得てそれに相応するカラーコーディングを行なうことで高速で多重スクリーニングすることができる装置を開発して、本発明を完成した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２５】
本発明の目的は、単数または複数の多重カラーコーディングが可能な、ラマン分光学を用いた多重薬物高速スクリーニング装置を提供することにある。
【００２６】
本発明の他の目的は、前記多重薬物高速スクリーニング装置を用いた多重薬物高速スクリーニング方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２７】
前記目的を達成するために、本発明は光源を顕微鏡に誘導するレンズ、ミラー、ピンホールで構成された励起モジュール、
試料の位置変化を制御するモーションコントローラ、前記光源から試料を励起して前記試料から散乱した光のラマン波長の光をフィルターリングする単数または複数のラマンフィルター、及び前記ラマンフィルターを通過した光を順次に受けて検出する検出器を含む、試料の像を獲得する顕微鏡モジュール、及び
前記モーションコントローラによって位置したポイントで獲得された単数または複数の像をカラーコーディングして細胞または生体組織の映像に変換して変換した映像を表示する映像処理モジュールを含む、表面増強ラマン散乱を用いた多重薬物高速スクリーニング装置を提供する。ここで、前記多重薬物高速スクリーニング装置は、コア−ギャップ−シェルナノ粒子が貯蔵された貯蔵チャンバーをさらに含むことができる。
【００２８】
また本発明は、
コア−ギャップ−シェルナノ粒子を検出しようとする試料に添加する工程（工程１）、
レーザービームを試料に照射して前記試料に結合されたコア−ギャップ−シェルナノ粒子から得られる特定ラマン散乱光を単数または複数のラマンフィルターを通じて検出器で検出して単数または複数の試料の像を獲得する工程（工程２）、及び
前記工程２で得た単数または複数の試料の像をコンピュータープログラムでカラーコーディングして細胞または生体組織の映像に変換して変換した映像を表示する工程（工程３）とを含む表面増強ラマン散乱を用いた多重薬物高速スクリーニング方法を提供する。
【発明の効果】
【００２９】
本発明によるスクリーニング装置及び方法は、自己発光を測定するのではなく、コア−ギャップ−シェルナノ粒子から発生するラマン信号を測定するので物質間に干渉がなく、表面増強ラマン散乱効果が最大化されたコア−ギャップ−シェルナノ粒子を使用するので、ラマン信号を約１０１２倍に増幅させて高い再現性を示し、検出器としてスキャナではないＣＣＤカメラを使用することによって、試料を盛るウェルプレートの各々のウェルを個別に一度に撮影して、モーションコントローラの制御を通じて他のウェルに移動してまたすぐ撮影するので、高速で多重薬物をスクリーニングすることができ、多重カラーコーディングが可能なので、各種薬物スクリーニングに有用に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】従来の蛍光基盤の細胞分析用薬物検索器を示す写真である。
【図２】従来の蛍光基盤の細胞分析用薬物検索器で得た２カラーの細胞イメージである。
【図３】本発明によるラマン分光法基盤高速多重薬物高速スクリーニング装置の概念図である。
【図４】本発明によるラマン分光法基盤高速多重薬物高速スクリーニング方法に使用されるコア−ギャップ−シェルナノ粒子の一例を示す。
【図５】製造例１〜３で製造したナノ粒子を用いて本発明の装置で表面増強ラマン散乱スペクトルを測定したグラフである。
【図６】製造例１〜３で製造したナノ粒子で散乱するラマン光を選択的に透過させる狭帯域フィルター（narrow band pass filter）の波長領域を示したグラフである。
【図７】製造例１〜３で製造したナノ粒子で散乱するラマン光を選択的に透過させる各々の狭帯域フィルターを使用する場合、選択的にイメージングされることを示す写真である。
【図８】製造例１〜３で製造したナノ粒子で散乱するラマン光を選択的に透過させる各々の狭帯域フィルターを使用して得た、各々のイメージを合わせて示した写真である。
【図９】製造例４〜６で製造したＰＥＧコーティングされたナノ粒子のイメージである。
【図１０】細胞にナノ粒子を添加しない対照群（ａ）と製造例５で製造したＰＥＧコーティングされたナノ粒子を添加した実験群（ｂ）を本発明の装置で測定したイメージで、２種の狭帯域フィルター（「Ｆｉｌｔｅｒ１」及び「Ｆｉｌｔｅｒ２」）を用いて各々測定したイメージである。
【図１１】製造例４で製造したＰＥＧコーティングされたナノ粒子を添加した実験群で３部分を指定してその領域で発見される細胞を本発明の装置で測定したイメージで、２種の狭帯域フィルター（「Ｆｉｌｔｅｒ１」及び「Ｆｉｌｔｅｒ２」）を用いて各々測定したイメージである。
【図１２】製造例５で製造したＰＥＧコーティングされたナノ粒子を添加した実験群で３部分を指定して、その領域で発見される細胞を本発明の装置で測定したイメージで、２種の狭帯域フィルター（「Ｆｉｌｔｅｒ１」及び「Ｆｉｌｔｅｒ２」）を用いて各々測定したイメージである。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
以下、本発明を詳しく説明する。
【００３２】
本発明は、光源を顕微鏡に誘導するレンズ、ミラー、ピンホールで構成された励起モジュール、
試料の位置変化を制御するモーションコントローラ、前記光源から試料を励起して前記試料から散乱した光のラマン波長の光をフィルターリングする単数または複数のラマンフィルター、及び前記ラマンフィルターを通過した光を順次に受けて検出する検出器を含む、試料の像を獲得する顕微鏡モジュール、及び
前記モーションコントローラによって位置したポイントで獲得された単数または複数の像をカラーコーディングして細胞または生体組織の映像に変換して変換した映像を表示する映像処理モジュールとを含む、表面増強ラマン散乱を用いた多重薬物高速スクリーニング装置を提供する。
【００３３】
以下、添付の図３を参照して、本発明の実施例を詳しく説明する。
【００３４】
まず、図中で同一の構成要素または部品はできる限り同一参照符号で示していることに留意しなければならない。本発明を説明するにおいて、関連する公知機能あるいは構成に対する具体的な説明は、本発明の要旨を曖昧にさせないようにするために省略する。
【００３５】
図３は、本発明によるラマン分光法基盤高速多重薬物高速スクリーニング装置の概念図である。
【００３６】
本発明による高速多重薬物高速スクリーニング装置は、励起モジュール、顕微鏡モジュール及び映像処理モジュールに区分することができる。このような役割モジュールの区分は説明のための区分であるだけで、相互に排他的で独立的なものでではないことがあり得、相互に一定領域で重なるか一つの領域でふたつ以上の役割モジュールが重複し得ることを明言しておく。
【００３７】
励起モジュール
本発明による装置において、励起モジュールは光源（ＬＳ）１０で発生するレーザービームを顕微鏡内部に誘導する役割をする。
【００３８】
ここで、前記光源（ＬＳ）１０は近赤外線（ＮＩＲ）レーザーまたは可視光線レーザーであり得る。前記可視光線は、４００ないし７００ｎｍの波長を有するものであり得るが、一実施例として前記可視光線は、５１４．５ｎｍの波長であり得る。バイオ分野で可視光線の光源を用いた場合、自家蛍光（autofluorescence）が発生して、自家蛍光はラマン信号の減少をもたらし得るので主に近赤外線光源を用いたラマンイメージ実験が行なわれてきた。ところで、ラマン信号は光源の波長の４乗に反比例するので可視光線の光源を用いる場合にラマン信号の強度を増加させることができる。それで、自家蛍光を減少させることさえできれば近赤外線より可視光線の場合の方が、光学装置がさらに発達しているので光学系を最適化するのには可視光線の光源を使用することが有利である。
【００３９】
光源（ＬＳ）１０で発生されるレーザービームは、スペイシャルフィルター２０を通過してビーム直径が増加して多数のレンズ、ミラーとピンホールを通じて約１０ｍｍのビーム直径に集光されて顕微鏡モジュールに進入することができる。
【００４０】
顕微鏡モジュール
本発明による装置において、顕微鏡モジュールは試料の位置変化を制御するモーションコントローラ５０、前記レーザービームを使用して試料を励起して前記試料から散乱した光のラマン波長の光をフィルターリングする単数または複数のラマンフィルター４０、及び前記ラマンフィルター４０を通過した光を順次に受ける検出器１１１を含む。
【００４１】
顕微鏡に進入したレーザービームは、光分離装置２１によって反射して対物レンズ（ＭＯ）３０に進行する。ここで、前記光分離装置２１には、光分離鏡、二波長鏡、着脱可能な鏡などを使用することができる。
【００４２】
前記ラマン波長の光をフィルターリングする単数または複数のラマンフィルター４０の数は、１以上２０以下で、５以上２０以下であることが好ましい。
【００４３】
また、前記ラマンフィルターは、帯域フィルターを使用することができ、狭帯域フィルターを使用することが好ましいが、それに制限されない。
【００４４】
前記検出器１１１は、スキャン方式または無スキャン方式で作動する検出器なら制限なしに使用することができ、例えば、スキャン方式検出器では、ＰＭＴ（Photomultiplier tube）類の検出器またはＡＰＤ（Avalanche photodiode）類の検出器を使用することができ、無スキャン方式検出器では、ＣＣＤ（Charge-coupled devicｅ）カメラを使用することができる。
【００４５】
試料は、分析物を含む細胞であり得、前記分析物は例えば、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、グリコプロティン、リポプロテイン、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸、糖、炭水化物、オリゴサッカライド、ポリサッカライド、脂肪酸、脂質、ホルモン、代謝産物、サイトカイン、ケモカイン、受容体、神経伝達物質、抗原、アレルゲン、抗体、基質、補助因子、抑制剤、薬物、薬学物質、営養物、プリオン、毒素、毒物、爆発物、殺虫剤、化学無機剤、生体有害性製剤、放射線同位元素、ビタミン、ヘテロサイクリック芳香族化合物、発ガン物質、突然変異誘発要因、痲酔剤、アンフェタミン、バルビツレート、幻覚剤、廃棄物または汚染物を挙げることができる。また、分析物が核酸の場合、前記核酸は遺伝子、ウイルスＲＮＡ及びＤＮＡ、バクテリアＤＮＡ、かびＤＮＡ、哺乳動物ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ＲＮＡ及びＤＮＡ断片、オリゴヌクレオチド、合成オリゴヌクレオチド、改質されたオリゴヌクレオチド、単一鎖及び二重鎖の核酸、自然的及び合成核酸を挙げることができる。前記試料は、装置外部でラマン信号を増幅するために図４に示したコア−ギャップ−シェルナノ粒子と結合するか、装置内で貯蔵チャンバー（未図示）に貯蔵されたコア−ギャップ−シェルナノ粒子が試料に露出することで結合することができる。
【００４６】
前記コア−ギャップ−シェルナノ粒子は、シェルの表面に検出しようとする分析物を認識することができるバイオ分子が機能化されていて、試料に露出するようになると試料の中で該当の分析物と選択的に結合して分析物の形態をイメージングするようになる。
【００４７】
ここで、前記ナノ粒子に機能化するバイオ分子の例としては、抗体、抗体断片、遺伝操作抗体、単一鎖抗体、受容体タンパク質、結合タンパク質、酵素、抑制剤タンパク質、レクチン、細胞癒着タンパク質、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、核酸またはアプタマーを挙げることができる。機能化は、ナノ粒子表面にバイオ分子を静電気的引力で付着させるか、直接結合させるかまたはリンカーを通じて作用基化でき、このような機能化方法は特別に制限されない。
【００４８】
本発明において、前記コア−ギャップ−シェルナノ粒子は、コア（core）及び前記コアを取り囲んだシェル（shell）を含み、前記コアとシェルの間にナノギャップが形成されて、前記コアとシェルはナノブリッジで連結されるかまたは連結されていないナノ粒子で、前記ナノギャップには光学活性分子が含まれる。
【００４９】
ここで、前記光学活性分子は、Ｃ、Ｈ、Ｏ、Ｎ、Ｓ及びそれらの組合からなる群から選択される原子で構成された分子なら制限されず、また金属イオン、金属イオンのキレート、または金属ナノ粒子を使用することもできる。具体的に、本発明で使用される信号物質は、蛍光有機分子、非蛍光有機分子、無機ナノ粒子、ラマン活性分子を包括する広義の概念で、発色が可能な標識物質を制限なしに含むことができ、ラマン活性分子であることが好ましい。本発明で使用される用語、「ラマン活性分子」は、本発明のナノ粒子が一つ以上の分析物に付着した時ラマン検出装置による分析物の検出及び測定を容易にする物質を意味する。ラマン分光法に使用され得るラマン活性分子は、有機原子、分子または無機原子、分子等を含む。具体的に、ラマン活性分子の例として、ＦＡＭ、Ｄａｂｃｙｌ、ＴＡＭＲＡ、ＴＲＩＴＣ（テトラメチルロダミン−５−イソチオシアネート）、ＭＧＩＴＣ（マラキトグリーンイソチオシアネート）、ＸＲＩＴＣ（Ｘ−ロダミン−５−イソチオシアネート）、ＤＴＤＣ（３，３−ジエチルチアジカルボシアニンアイオダイド）、ＴＲＩＴ（テトラメチルロダミンイソチオール）、ＮＢＤ（７−ニトロベンズ−２−１，３−ジアゾール）、フタル酸、テレフタル酸、イソフタル酸、パラ−アミノベンゾサン、エリトロシン、ビオチン、ジゴキシゲニン（digoxigenin）、５−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシ、フルオレセイン、５−カルボキシ−２’，４’，５’，７’−テトラクロロフルオレセイン、５−カルボキシフルオレセイン、５−カルボキシロダミン、６−カルボキシロダミン、６−カルボキシテトラメチルアミノフタロシアニン、アゾメチン、シアニン（Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５）、キサンチン、スクシンイルフルオレセイン、アミノアクリジン、量子点、炭素同素体、シアニド、チオール、クロリン、ブロム、メチル、リンまたは硫黄などがあるがそれに制限されないで、使用されたラマン活性分子が明確なラマンスペクトルを示さなければならないし、互いに異なる類型の分析物と特に結合するか関連され得なければならない。ラマン分析時に使用する励起レーザー波長と共鳴してより高いラマン信号強度を示す分子であることが好ましい。
【００５０】
前記光学活性分子は、ナノギャップに含まれ得るが、前記ナノ粒子に機能化するバイオ分子に共有結合または静電気的引力で改質されて内部−ナノギャップに位置するか、またはバイオ分子とは別個にコア粒子の表面に光学活性分子を共有結合、または静電気的引力で結合させることができる。バイオ分子に光学活性分子を改質させる場合、光学活性分子の位置を調節することができるという特徴がある。すなわち、コアに改質されるバイオ分子末端に近くの位置に光学活性分子を改質する場合、ナノ粒子で光学活性分子はコアに近く位置することができ、それを調節して光学活性分子をナノギャップに位置させることが可能である。例えば、光学活性分子の位置にしたがってラマン信号が変わり得、内部−ギャップに位置する場合、ラマン信号が最も強く検出され得るので、高い均一性と再現性のある信号を発生させることができる。
【００５１】
ここで、前記コア−ギャップ−シェルナノ粒子のナノギャップに含まれる光学活性分子の種類にしたがって特定ラマンピークが発生するようになり、前記特定ラマンピークは、それに相応するラマンフィルターを通じてＣＣＤカメラのような検出器で検出して試料（細胞）の像を獲得するようになり、前記試料（細胞）の像はコンピュータープログラムを通じてカラーコーディングされて試料（細胞）の映像に変換して表示される。
【００５２】
本発明で使用する用語「コア」は、表面プラズモン共鳴を示す金属からなり、直径が１ないし９００ｎｍの球形または球形と類似の形態の粒子を意味する。表面プラズモン共鳴を示す金属として、金、銀または銅を使用することができる。
【００５３】
本発明で使用する用語「シェル」は、前記コアを取り囲んでいる表面プラズモン共鳴を示す金属からなるコーティング層を意味する。前記シェルの厚さは、０．１ないし９００ｎｍで、好ましくは１ｎｍないし１００ｎｍである。前記シェルとコアの間にはナノギャップが形成されているので、コアとシェルの間には空間が形成されている特徴がある。表面プラズモン共鳴を示す金属として金、銀または銅を使用することができる。
【００５４】
本発明で使用する用語「ナノギャップ」は、前記コアとシェルの間に形成されている空間を意味する。ナノギャップの厚さは、０．０１ｎｍないし１００ｎｍであることが好ましい。前記ナノギャップ空間によってコアとシェルを区分することができ、前記ナノギャップによってコアとシェルがまったく接触しないこともあり得、一部領域ではコアとシェルがナノブリッジによって接触していることがあり得る。したがって、本発明で使用される「ナノギャップ」が必ずコアとシェルの間を完全に分離する空間を意味するものではない。
【００５５】
本発明で使用される用語「ナノブリッジ」は、直径が０．５ないし２０ｎｍである前記コアとシェルを連結するナノギャップに存在するブリッジを意味する。本発明のナノ粒子は、コアとシェルの間に「ナノブリッジされたナノギャップ」または「ナノブリッジがないナノギャップ」を含むことができる。
【００５６】
本発明で使用される用語「光学活性分子」は、励起光源によってラマン散乱光を出す分子を意味する。前記光学活性分子は、表面プラズモン共鳴を有するコア及びシェルの間のナノギャップに位置して表面増強ラマン散乱効果を最大化させる。
【００５７】
したがって、好ましい様態として前記コア−ギャップ−シェルナノ粒子は、ｉ）金コア及び銀シェルからなり金コアと銀シェルの間にナノギャップが形成されているナノ粒子、ｉｉ）銀コア及び金シェルからなり銀コアと金シェルの間にナノギャップが形成されているナノ粒子、ｉｉｉ）金コア及び金シェルからなり金コアと金シェルの間にナノギャップが形成されているナノ粒子、ｉｖ）銀コア及び銀シェルからなり銀コアと銀シェルの間にナノギャップが形成されているナノ粒子からなる群から選択されるナノ粒子であり得るが、前記コア−ギャップ−シェルナノ粒子は金コア及び金シェルからなり金コアと金シェルの間にナノギャップが形成されているナノ粒子であることが最も好ましい。また、コアを成す粒子の模様に制限を受けない。
【００５８】
特に、前記コアとシェルが一部領域で接触している場合には、ナノブリッジを通じて接触する。すなわち、コア上にシェルが形成される場合、コア表面全体からシェルの間にナノギャップが形成できるが、一部領域でシェルを形成する物質一部が内部でナノブリッジを形成してコアと接触される構造を有することができる。それは図４に示されたように、シェルが形成される過程で一部がコアの方に形成され得るし、それによってナノブリッジが形成され得る。ナノブリッジの個数は、一つ以上からナノギャップを形成することができる限度内で制限を受けない。直径が０．５ｎｍないし２０ｎｍであることが好ましい。ナノブリッジは、コアとシェルの構造をさらに安定的に維持するようにし、ＳＥＲＳの信号をより増加させる要素の一つになり得る。
【００５９】
前記ナノギャップによってコアとシェルの間に空間が形成されていて、このようなナノギャップに位置する光学活性分子は、表面プラズモン共鳴を有する前記コア及びシェルによって表面増強ラマン散乱（surface-enhanced Raman scattering，ＳＥＲＳ）効果が最大化されてラマン信号が増幅される。特に、ナノギャップの再現性が非常に高いだけでなく、信号の定量性、結果の再現性、合成の簡便性、費用、プローブの安定性などを画期的に改善することができる。
【００６０】
試料から放出される光は、光分離装置２１を通過してラマンフィルター４０を通過することで、フィルターリングされて特定ラマン波長のみが検出器１１１を通じて検出される。
【００６１】
前記ラマンフィルター４０は、特定ラマン波長のみが通過することができる単数または複数のラマンフィルターを、好ましくは１以上２０以下、より好ましくは５以上２０以下で具備することができる。試料から放出される光を互いに異なるラマン波長のフィルターに順次に通過させて、通過した特定ラマン波長を検出器を通じて検出することで１以上２０個以下の多重像を得ることができる。
【００６２】
上述したように、前記ラマンフィルターには帯域フィルターを使用することができ、狭帯域フィルターを使用することが好ましい。
【００６３】
前記検出器１１１、例えば無スキャン方式のＣＣＤカメラは前にズームレンズを設置して倍率の調節ができる。それは光学イメージを具現する光学顕微鏡の機能を強化して光学イメージをより詳しく観察することができるようにする。
【００６４】
前記モーションコントローラ（Motion controller）５０は、前記試料のポイント位置をｘ軸またはｙ軸方向に移動させる役割をする。ウェル上で試料の一ポイント（ウェル）でラマンフィルター個数にしたがって多数のラマン映像が得られれば、モーションコントローラ５０の制御を通じて試料の他のポイント（ウェル）に移動して、そのポイントのラマン映像を測定する。本発明による装置で検出器として例えば、無スキャン方式のＣＣＤカメラを使用する場合、試料を盛るウェルプレートの各々のウェルを個別的に一度に撮影して、モーションコントローラの制御を通じて他のウェルに移動してまた撮影するので、高速スクリーニングが可能である。
【００６５】
追加で、前記顕微鏡モジュールは、試料が位置する外部チャンバー内部の雰囲気を維持させることができる雰囲気維持部（未図示）を設置することができ、前記雰囲気維持部は前記チャンバー内側の温度、湿度、ｐＨなどを制御することができる。
【００６６】
映像処理モジュール
前記映像処理モジュールは、モーションコントローラによって位置したポイントで獲得された単数または複数の像をカラーコーディングして細胞または生体組織の映像に変換し、変換した映像を表示する役割をする。
【００６７】
前記映像処理モジュールは、コンピューターであることが好ましい。前記ＣＣＤカメラで得たデータは、プロセッサによって処理されたデータは主記憶装置に保存することができる。標準分析物に対する放出プロファイルのデータは、また主記憶装置またはＲＯＭに保存することができる。プロセッサは、ラマン活性基板での分析物からの放出スペクトルを比較してサンプルの分析物類型を確認することができる。プロセッサは検出装置からのデータを分析して多くの分析物の成分及び／または濃度を測定することができる。互いに異なるように具備されたコンピューターは特定履行に使用することができる。したがって、システムの構造は、本発明の相異している実施様態により異なり得る。データ収集作業以後、典型的にデータはデータ分析作業に送る。分析作業を容易にするのために、検出装置によって得られたデータは上述したようにデジタルコンピューターを使用して典型的に分析するでしょう。典型的に、コンピューターは検出装置からのデータ収容及び保存だけでなく収集されたデータの分析及び報告のために適切にプログラミングすることができる。
【００６８】
一つ以上のラマンフィルターを通じて分析された一つ以上のラマンピークは、ソフトウェアを通じて各々のピークに互いに異なった色のイメージを入力すると、カラーコーディングされて該当する色を有したイメージを通じて細胞または生体組織の映像に変換して変換した映像をモニターを通じて表示するようになる。
【００６９】
したがって、本発明による装置は、試料に存在する一つ以上の分析物質（特定細胞）に選択的に結合する一つ以上のコア−ギャップ−シェルナノ粒子を添加することで、高解像度の表面増強ラマン散乱スペクトルを得ることができ、特に無スキャン方式のＣＣＤカメラを使用して試料を盛ったウェルプレートの各々のウェルを個別的に一度に撮影して、モーションコントローラの制御を通じて他のウェルに移動してまた撮影することで、多重薬物を高速でスクリーニングすることができる。
【００７０】
以上のように、本発明による装置を例示した図を参照して説明したが、本明細書に開示された図によって本発明が限定されるのではなく、本発明の技術思想範囲内で当業者によって多様な変形が成り立ち得ることはもちろんである。
【００７１】
また本発明は、
前記コア−ギャップ−シェルナノ粒子を検出しようとする試料に添加する工程（工程１）、レーザービームを試料に照射して前記試料に結合されたコア−ギャップ−シェルナノ粒子から得られる特定ラマン散乱光を単数または複数のラマンフィルターを通じて検出器で検出して単数または複数の試料の像を獲得する工程（工程２）、及び
前記工程２で得た単数または複数の試料の像をコンピュータープログラムでカラーコーディングして細胞または生体組織の映像に変換して変換した映像を表示する工程（工程３）とを含む表面増強ラマン散乱を用いた多重薬物高速スクリーニング方法を提供する。
【００７２】
まず、工程１は、コア−ギャップ−シェルナノ粒子が含まれた試薬を検出しようとする細胞を含む試料に添加する工程である。
【００７３】
前記工程１で、前記コア−ギャップ−シェルナノ粒子は、シェルの表面に検出しようとする分析物（細胞）を認識することができるバイオ分子が機能化されていて、試料に露出するようになると試料の中で該当の分析物と結合することで、光学活性分子が含まれているナノ粒子のラマン信号でその形態をイメージングすることができるようになる。
【００７４】
ここで、前記コア−ギャップ−シェルナノ粒子は上述したように、ｉ）金コア及び銀シェルからなり金コアと銀シェルの間にナノギャップが形成されているナノ粒子、ｉｉ）銀コア及び金シェルからなり銀コアと金シェルの間にナノギャップが形成されているナノ粒子、ｉｉｉ）金コア及び金シェルからなり金コアと金シェルの間にナノギャップが形成されているナノ粒子、ｉｖ）銀コア及び銀シェルからなり銀コアと銀シェルの間にナノギャップが形成されているナノ粒子からなる群から選択されるナノ粒子であり得、前記コア−ギャップ−シェルナノ粒子は、金コア及び金シェルからなり金コアと金シェルの間にナノギャップが形成されているナノ粒子であることが最も好ましい。
【００７５】
前記工程１の前記コア−ギャップ−シェルナノ粒子の分析物上への露出は、本発明によるスクリーニング装置外部で行なわれるか、本発明によるスクリーニング装置内部で行なわれ得る。
【００７６】
次に、工程２はレーザービームを試料に照射して前記試料から得られる特定ラマン散乱光を単数または複数のラマンフィルターを通じて検出器で、例えばＣＣＤカメラで検出して単数または複数の試料の像を獲得する工程である。
【００７７】
本発明によるスクリーニング装置は、特定ラマン波長のみが通過することができる単数または複数のラマンフィルターを、好ましくは１以上２０以下、さらに好ましくは５以上２０以下で具備することができるので、試料から放出される光を互いに異なるラマン波長のフィルターに順次に通過させて、通過した特定ラマン波長を検出器を通じて検出することで、１以上２０以下の多重像を得ることができる。
【００７８】
上述したように、前記ラマンフィルターには帯域フィルターを使用することができ、狭帯域フィルターを使用することが好ましい。
【００７９】
前記検出器、例えばＣＣＤカメラは前にズームレンズを設置して倍率の調節ができる。それは光学イメージをより詳しく観察することを可能にする。
【００８０】
次に、工程３は、前記工程２で得た単数または複数の試料の像をコンピュータープログラムでカラーコーディングして、細胞または生体組織の映像に変換して変換した映像を表示する工程である。
【００８１】
前記工程３では、工程２で得た単数または複数の試料の像をラマンピークにしたがってコンピューターを通じて特定色でカラーコーディングすることで、１カラー以上２０カラー以下の多重度を有する映像を表示することができる。
【００８２】
本発明によるスクリーニング装置及び方法は、自己発光を測定するのではなく、コア−ギャップ−シェルナノ粒子から発生するラマン信号を測定するので、物質間で干渉がなく、表面増強ラマン散乱効果が最大化されたコア−ギャップ−シェルナノ粒子を使用するので、ラマン信号を約１０１２倍に増幅させて高い再現性を示し、検出器としてスキャナではないＣＣＤカメラを使用することで、試料を盛るウェルプレートの各々のウェルを個別的に一度に撮影して、モーションコントローラの制御を通じて他のウェルに移動してまたすぐ撮影するので、高速で多重薬物をスクリーニングすることができ、多重カラーコーディングが可能なので、各種薬物スクリーニングに有用に用いることができる。
【００８３】
以下、本発明を下記の実施例によってより詳細に説明する。但し、下記の実施例は本発明を例示するだけのものであって、本発明の内容が下記の実施例によって限定されるのではない。
【００８４】
＜製造例１〜３＞コア−ギャップ−シェルナノ粒子の製造
非常に正確な位置調節能力を有したラマン染料改質プラットホーム（Raman-dye modification platform）でＤＮＡストランド（strand）を用いて、内部−ナノギャップを有した単一ＮＮＰナノ粒子を下記の方法で製造した。
【００８５】
典型的な製造方法として、ＤＮＡが改質された金ナノ粒子（２０ｎｍ粒子；ＤＮＡ配列：製造例１［3’-HS-(CH2)3-(Dabcyl)-A10-PEG18-AAACTCTTTGCGCAC-5’］、製造例２［3’-HS-(CH2)3-(Cy3)-A10-PEG18-AAACTCTTTGCGCAC-5’］及び製造例３［3’-HS-(CH2)3-(TAMRA)-A10-PEG18-AAACTCTTTGCGCAC-5’］）をS.J.Hurst,A.K.R.Lytton-Jean,C.A.Mirkin,Anal.Chem.2006年,第78巻,ｐ.8313）の文献にしたがって製造した。前記ＤＮＡが改質された金ナノ粒子のコアを取り囲んだシェル（Ａｕ）を形成するために、前記ＤＮＡが改質された金ナノ粒子を金前駆体（ＨＡｕＣｌ４）、還元剤（ＮＨ２ＯＨ−ＨＣｌ）及び１％ポリ−Ｎ−ビニル−２−ピロリドン（poly-N-vinyl-2-pyrrolidone；ＰＶＰ；ＭＷ４０，０００）とホスフェート−バッファー溶液（０．３Ｍ  ＮａＣｌ；１０ｍＭ  ＰＢ；ｐＨ７．４）で反応させて、常温で３０分間やわらかくボルテキシング（vortexing）した。シェルの形成過程によるナノ粒子の形態変化を確認するために、シード（seeds；ＤＮＡが改質された金ナノ粒子、１ｎＭ）の量を基準にして、金前駆体（ＨＡｕＣｌ４）、還元剤（ＮＨ２ＯＨ−ＨＣｌ）の量を調節した。
【００８６】
具体的に、ＤＮＡが改質された金ナノ粒子溶液（１００μｌ；０．３Ｍ  ＰＢＳで１ｎＭ濃度）は、５０μｌの１％ＰＶＰ溶液と混合した。前記溶液を各々１．５μｌ、５．２μｌ、１０．３μｌまたは３０．４μｌのヒドロキシルアミンヒドロクロライド溶液（１０ｍＭ）と混合させた後、各々１．５μｌ、５．２μｌ、１０．３μｌまたは３０．４μｌのクロロ金酸溶液（５ｍＭ）と混合させた。反応物の量によって、多様なナノ構造が形成された。
【００８７】
＜製造例４〜６＞ＰＥＧコーティングされたコア−ギャップ−シェルナノ粒子の製造
前記製造例１−３で製造した各々のナノ粒子のシェル表面に細胞実験に適合して培養液でナノ粒子をよく分散させるＰＥＧコーティングされた金−銀コア−シェルナノ粒子を製造した（「Ｄａｂｃｙｌ」（製造例４）、「Ｃｙ３」（製造例５）、「ＴＡＭＲＡ」（製造例６）；図９参照）。
【００８８】
具体的に、ＰＥＧをコーティングする方法では、金ナノ粒子に一般的に使用されているプロトコールを導入して製作しました。ナノ粒子のシェル表面コーティングにｍＰＥＧ−ＳＨ（ＭＷ〜５ｋＤａ）を用いて、主に「W.Peter Wuelfing,Stephen M.Gross,Deon T.Miles,and Royce W.Murray,J.Am.Chem.Soc.1998年,第120巻,p.12696」の文献を参照して製造例４〜６を製作した。
【００８９】
＜実験例１＞表面増強ラマン散乱スペクトル評価
製造例１〜３で製造したナノ粒子を用いて、本発明の装置で表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）スペクトルを測定した。表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）スペクトルは、自主的に製作して保有しているナノ・ラマン分光器（Axiovert200,Zeiss）を通じて測定した。
【００９０】
まず、製造例１〜３で製造したナノ粒子を含む各溶液で２０ｕｌをカバーガラスにスピンコーティングしてスペクトル測定用サンプルを製作した。６６０ｎｍの励起レーザーを光源に使用して、５０ｎＷで１ｍＷの励起レーザービームを顕微鏡対物レンズ（oil-immersion microscope objective(×100,1.3numerical aperture;×50,0.5numerical aperture;Zeiss）に集中してそれを通じて現れるラマン信号が液化窒素で冷凍された（−１２５℃）ＣＣＤ（charge-coupled device）を通じて収集された。すべてのデータは、背景信号を除去して修正（baseline-correction）して表面増強ラマン散乱スペクトルが得られ、その結果を図５に示した。
【００９１】
図５は、製造例１〜３で製造したナノ粒子を用いて本発明の装置で表面増強ラマン散乱スペクトルを測定したグラフである。
【００９２】
図５に示されたように、製造例１〜３で製造したナノ粒子を用いて本発明の装置で表面増強ラマン散乱スペクトルを測定した結果、各々のナノ粒子が互いに異なる固有のピークを示すことが分かった。
【００９３】
また、製造例１〜３で製造したナノ粒子を含む各々の溶液で散乱するラマン光を選択的に透過させる狭帯域フィルターを捜すために、６６０ｎｍの励起レーザーを光源に使用して得られる波長でスペクトルのＸ軸をｎｍ単位の波長に転換して製造例１〜３のナノ粒子のラマンスペクトルから選択されたピーク領域と各々のシグナルを選択的にフィルターリングするための狭帯域フィルターの詳細スペックを捜し出して、その結果を下記に示した。
【００９４】
製造例１のナノ粒子に最適化した「Ｆｉｌｔｅｒ１」：ｃｅｎｔｅｒ＝７０７ｎｍ、ＦＷＨＭ＝１．５ｎｍ
製造例２のナノ粒子に最適化した「Ｆｉｌｔｅｒ２」：ｃｅｎｔｅｒ＝７１５ｎｍ、ＦＷＨＭ＝１．５ｎｍ
製造例３のナノ粒子に最適化した「Ｆｉｌｔｅｒ３」：ｃｅｎｔｅｒ＝７４０ｎｍ、ＦＷＨＭ＝１．５ｎｍ
【００９５】
図６は、製造例１〜３で製造したナノ粒子で散乱するラマン光を選択的に透過させる狭帯域フィルターの波長領域を示したグラフである。
【００９６】
図６に示されたように、製造例１〜３で製造したナノ粒子各々のラマン散乱光固有の波長帯があることを分かり、このことから各々のナノ粒子に最適化した狭帯域フィルターを設定することができた。
【００９７】
さらに製造例１〜３で製造したナノ粒子が特定狭帯域フィルターでのみ選択的にイメージングされることを調べるために、製造例１〜３で製造したナノ粒子を含む溶液に６６０ｎｍの励起レーザーを光源として照射し、前記で捜した狭帯域フィルター（「Ｆｉｌｔｅｒ１」、「Ｆｉｌｔｅｒ２」及び「Ｆｉｌｔｅｒ３」）を順に使用してみて、その結果を図７に示した。また、前記のように製造例１〜３で製造したナノ粒子を含む溶液各々の最適化した狭帯域フィルターを使用して得たイメージを合わせたものを図８に示した。
【００９８】
図７は、製造例１〜３で製造したナノ粒子で散乱するラマン光を選択的に透過させる各々の狭帯域フィルターを使用する場合、選択的にイメージングされることを示す写真である。
【００９９】
図８は、製造例１〜３で製造したナノ粒子で散乱するラマン光を選択的に透過させる各々の狭帯域フィルターを使用して得た各々のイメージを合わせて示した写真である。
【０１００】
図７〜８に示されたように、製造例１〜３で製造したナノ粒子各々はそれらに最適化された狭帯域フィルターを使用する場合にのみ、選択的にイメージングされることが分かった。また、製造例１〜３で製造したナノ粒子から得られるラマン散乱光を合わせても得ることができることが分かった。
【０１０１】
＜実験例２＞多重カラー細胞イメージング評価
製造例４〜５で製造したナノ粒子を用いて本発明の装置で多重カラー細胞イメージングを測定した。
【０１０２】
具体的に、９６ウェル−プレートにＨｅＬａ細胞（子宮頚部癌細胞）をウェル当り２万個ずつシーディング（seeding）して、２０〜２４時間インキュベーター中で培養した。培養された細胞はＰＢＳバッファーで洗浄後、製造例４〜５で製造したナノ粒子が含まれた細胞培養液を入れてまたインキュベーター中で６時間培養する。培養された細胞は、ＰＢＳバッファーで洗浄して冷たい固定バッファー（ＢＤ  ｃｙｔｏｆｉｘＴＭ）を入れて１５分間細胞を固定する。細胞固定後、固定バッファーは除去してＰＢＳバッファーで２回洗浄後、またＰＢＳバッファーを入れて冷蔵保管しながら準備する。このように準備したサンプルに６６０ｎｍの励起レーザーを照射して得られるラマン散乱光を前記実験例１で捜し出した狭帯域フィルター（「Ｆｉｌｔｅｒ１」及び「Ｆｉｌｔｅｒ２」）を使用してイメージングした。その結果を図１０〜１２に示した。
【０１０３】
図１０は、細胞にナノ粒子を添加しない対照群（ａ）と製造例５で製造したＰＥＧコーティングされたナノ粒子を添加した実験群（ｂ）を本発明の装置で測定したイメージで、２種の狭帯域フィルター（「Ｆｉｌｔｅｒ１」及び「Ｆｉｌｔｅｒ２」）を用いて各々測定したイメージである。
【０１０４】
図１１は、製造例４で製造したＰＥＧコーティングされたナノ粒子を添加した実験群で３部分を指定して、その領域で発見される細胞を本発明の装置で測定したイメージで、２種の狭帯域フィルター（「Ｆｉｌｔｅｒ１」及び「Ｆｉｌｔｅｒ２」）を用いて各々測定したイメージである。
【０１０５】
図１２は、製造例５で製造したＰＥＧコーティングされたナノ粒子を添加した実験群で３部分を指定してその領域で発見される細胞を本発明の装置で測定したイメージで、２種の狭帯域フィルター（「Ｆｉｌｔｅｒ１」及び「Ｆｉｌｔｅｒ２」）を用いて各々測定したイメージである。
【０１０６】
図１０〜１２に示されたように、製造例５で製造したＰＥＧコーティングされたナノ粒子のシグナルを選択的に透過させる「Ｆｉｌｔｅｒ２」でのみ細胞イメージが示されることを確認することができた。すなわち、このイメージは、細胞の自家蛍光ではない製造例５で製造したＰＥＧコーティングされたナノ粒子が細胞に吸い付いて示すイメージのみを選択的に示すことを確認することができた。
【符号の説明】
【０１０７】
１０：光源
２０：スペイシャルフィルター
２１：光分離装置
３０：対物レンズ
４０：ラマンフィルター
５０：モーションコントローラ
６０：ミラー
１１０：コンピューター
１１１：検出器（ＣＣＤカメラ）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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